Brevet FR2839080A1 — publié le 20031031

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte à un procédé de production d'un produit d'expression d'un ADN codant ne protéine E7 mutée de HPV-16, par des cellules de Pichia pastoris. ART ANTERIEUR Plusieurs espèces de papillomavirus humain, ou HPV, sont considérées aujourd'hui comme les agents causals de cancers. En particulier, les HPV de types 16,18, 31,33 et 51 sont fréquemment associés aux cancers ano-génitaux, y compris le cancer du col utérin de la femme. Plus de 50% des carcinomes squameux du col utérin sont associés au papillomavirus HPV de type 16. Les oncoprotéines virales E6 et E7 de HPV sont fortement impliquées dans les mécanismes moléculaires par lesquels ces virus contribuent au développement de ces cancers. Ces deux oncoprotéines agissent en inactivant les régulateurs du cycle cellulaire que constituent la protéine p53 et la protéine du rétinoblastome, provoquant ainsi l'événement initiateur de la progression à étapes multiples vers le cancer. En général, les tumeurs malignes sont constituées de cellules cancéreuses porteuses d'antigènes associés (TAA) ou d'antigènes spécifiques (TSA) et d'un micro-environnement stromal particulier, caractérisées par une hypervascularisation, ou néoangiogénèse, qui peut être accompagnée d'une paralysie des cellules immunitaires, c'est-à-dire à un état d'immunosuppression. Initialement, l'immunosuppression reste localisée au niveau de la tumeur, puisque l'individu est encore capable de se défendre contre les autres agressions telles que des infections. Cependant, avec la dissémination métastatique, l'immunosuppression peut s'étendre et se généraliser, comme l'atteste la fragilité aux infections du cancéreux au stade terminal . Cette immunosuppression met en jeu des facteurs paralysants qui sont produits par les cellules cancéreuses ou par les cellules de leur environnement. La paralysie locale des cellules du système immunitaire, ou immunosuppression, représente donc une arme majeure des cellules cancéreuses qui leur permet d'échapper au système immunitaire de l'hôte. Cet état d'immunosuppression a aussi été observé dans les cancers provoqués par une infection par HPV-16. Cette immunosuppression constitue aujourd'hui un obstacle technique majeur dans la mise au point de compositions vaccinales préventives ou curatives à l'encontre des cancers provoqués par une infection par HPV-16. En effet, les stratégies vaccinales anti-HPV-16 actuelles privilégient l'induction d'une prolifération de cellules T-cytotoxiques reconnaissant spécifiquement certains antigènes produits par HPV-16, en particulier les protéines E6 et E7, lorsqu'ils sont associés aux antigènes de classe # du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) à la surface membranaire des cellules cancéreuses infectées. ' Certains auteurs ont associé l'immunosuppression observée dans des cancers provoqués par HPV-16 à l'observation de niveaux d'expression réduits des molécules de classe # du MHC à la surface des cellules cancéreuses du col utérin (Cruz et al., 1999), ou encore à une réduction de l'expression de la chaîne delta du récepteur des cellules T (TCR) chez des patients exprimant une dysplasie pré-néoplastique (Muderspach et al., 2000). D'autres auteurs ont associé l'état d'immunosuppression à un défaut de réponse des cellules T à d'éventuels signaux produits par les cellules tumorales et transmis aux cellules immunitaires en provoquant leur apoptose, par exemple du fait d'une interaction Fas/Fas-ligand (Schoell et al., 1999). D'autres auteurs ont observé que l'immunosuppression associée à un cancer provoqué par une infection par HPV était concomitante à une augmentation de IL-10 (El Sherif et al. 2001 ; Giannini et al. 1998 ; Giannini et al. 2002) et de TGF-bêta-1 (Giannini et al. 1998) ainsi qu'à une réduction de l'IFN-gamma sous-épithélial (El Sherif et al. , 2001). Des travaux antérieurs des inventeurs relatés dans la demande internationale publiée sous le n WO 00/03732 , ont montré que, dans le cas du cancer du col utérin provoqué par HPV, la protéine E7 du papillomavirus était impliquée dans une immunosuppression locale au niveau des tumeurs ou de cellules infectées. L'immunosuppression induite par la protéine E7 a été caractérisée par l'inhibition de la prolifération des cellules T stimulées par le PPD ou le toxoïde tétanique, l'inhibition de la prolifération des cellules T stimulées par des cellules allogéniques, la surproduction d'IFN-a (cytokine immunosuppresive )par les cellules présentant l'antigène (APC). Afin de réduire ou de bloquer l'immunosuppression induite par la protéine E7 soluble de HPV, il a été proposé l'utilisation de dérivés non toxiques de la protéine E7 comme antigène en vue de l'induction d'anticorps dirigés spécifiquement contre la protéine E7 extracellulaire. En vue de fabriquer des composés immunogènes dérivés de E7 dépourvus des effets délétères de la protéine native, il a été proposé de modifier la protéine E7 native, soit par modification chimique, soit par modification génétique, notamment en opérant des insertions, des délétions ou des substitutions de résidus d'acides aminés destinées à diminuer ou supprimer les sites fonctionnels délétères de la protéine native. Dans ce contexte, il a été décrit une protéine E7 modifiée chimiquement, dénuée d'activité immunosuppressive, après traitement de la protéine E7 native par le glutaraldéhyde. Les modifications chimiques proposées pour réduire ou bloquer les propriétés d'immunosuppression de la protéine E7 native, telles que décrites dans l'état de la technique, visent à ajouter un groupe chimique au squelette carboné de la protéine E7 native, par couplage d'une fonction réactive de l'un des acides aminés de cette protéine avec une fonction aldéhyde, carboxamide ou maléimide, sans altération de la séquence en acides aminés de la protéine native, c'est-à-dire sans apporter de modifications significatives à la structure primaire de la protéine E7. De fait, les diverses compositions immunogènes anti-E7 décrites dans l'état de la technique, en vue de la réalisation de préparations vaccinales préventives ou curatives à l'encontre de cancers provoqués par une infection par HPV-16, qui visent prioritairement l'induction d'une réponse immunitaire par la production de lymphocytes cytotoxiques (CTL) spécifiques de la protéine E7 exprimée à la surface des cellules infectées, contiennent, en tant qu'antigène, soit la protéine E7 complète, éventuellement modifiée chimiquement (Gérard et al., 2001) soit des peptides dérivés de la protéine E7 (Muderspach et al., 2000 ; Schoell, 1999 - précités). Dans tous les cas, y compris lorsque des peptides dérivés de la protéine E7 native sont utilisés, il n'a pas été introduit de modification dans la séquence d'acides aminés de la protéine native, et par conséquent dans la structure primaire d'acides aminés initiale. Cela s'explique simplement par la volonté de conserver intacts les épitopes d'intérêt de la protéine E7 native afin de favoriser l'induction d'une réponse immunitaire, en particulier la production de cellules CTL, capables de reconnaître spécifiquement et efficacement la protéine E7 native produite par les cellules infectées. Et même lorsqu'une réorganisation de la structure primaire en acides aminés de la protéine E7 est envisagée, en vue de la production d'une protéine immunogène ayant des propriétés carcinogènes, ou transformantes réduites, il est porté une grande attention à la conservation d'au moins une copie complète de la séquence d'acides aminés de la protéine E7 native au sein du composé immunogène réarrangé, afin de maintenir présent, au sein dudit composé immunogène, l'ensemble des épitopes potentiels de la protéine E7 native. Ainsi, Osen et al. (2001) ont décrit la construction d'un ADN codant un composé immunogène susceptible d'induire la production de lymphocytes cytotoxiques (CTL) reconnaissant spécifiquement la protéine E7 native exprimée à la surface des cellules cancéreuses infectées par HPV-16, dans une stratégie vaccinale anti-HPV avec de l'ADN, et non directement avec un composé immunogène peptidique. Afin d'éviter tout événement de recombinaison qui pourrait aboutir à une surproduction de protéine E7 native, ou tout au moins d'une protéine recombinée possédant les propriétés carcinogènes de la protéine E7 native, ces auteurs ont construit un ADN codant pour une protéine immunogène dans laquelle l'ensemble des épitopes de la protéine E7 native est représenté, bien que chacun des domaines peptidiques, respectivement (i) domaine 1-10, (ii) domaine 11-40, (iii) domaine 41-70 et (iv) domaine 71-98, aient été intervertis dans le composé peptidique immunogène final. Ces auteurs insistent sur la nécessité de produire un composé peptidique immunogène ayant conservé tous les épitopes CTL potentiels de la protéine E7 native, tout en ayant simultanément perdu ses propriétés de transformation cancéreuses des cellules. En dernier lieu, ces auteurs suggèrent d'accroître encore l'innocuité du composé peptidique immunogène réarrangé, en ce qui concerne son pouvoir cancérigène, en supprimant le domaine de liaison de la protéine E7 native à la protéine pRB du rétinoblastome, allant de l'acide aminé 21 à l'acide aminé 26 de E7, responsable de l'activité carcinogène de la protéine E7 native. Toutefois, ce mode de réalisation d'un composé peptidique immunogène non carcinogène n'a pas été concrètement réalisé. DESCRIPTION DE L'INVENTION L'invention a trait à un procédé pour la fabrication du produit d'expression de l'ADN codant pour la protéine E7 mutée telle que définie dans la présente description. La séquence en acides aminés de référence de la protéine E7 native est, par exemple, la séquence décrite par Seedorf et al. (1985) dont le numéro d'accès dans la base de données Swissprot est N P03129. Acides nucléiques de l'invention Il est décrit un acide nucléique codant la protéine E7 mutée de séquence SEQ ID N 1 , ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire. De préférence, tout acide nucléique et tout polypeptide tels que décrits se présentent sous une forme isolée ou purifiée. Le terme purifié ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative. Un polynucléotide ou un polypeptide est à l'état purifié après une purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur. Les termes acide nucléique , polynucléotide , oligonucléotide ou encore séquence nucléotidique englobe des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN d'au moins deux nucléotides, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme de duplex. Le terme nucléotide désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (i) un analogue d'une purine, (ii) un analogue d'une pyrimidine, ou (iii) un sucre analogue, de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N WO 95/0 4064. Aux fins de la présente invention, un premier nucléotide est considéré comme étant complémentaire d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les bases complémentaires sont A et T ( ou A et U), et C et G. Selon un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique codant la protéine E7 mutée de séquence SEQ ID N 1 comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N 2. L'invention décrit également tout acide nucléique codant la protéine E7 mutée de séquence SEQ ID N 1 se distinguant de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 2 par une ou plusieurs substitutions d'un nucléotide dans les codons du cadre de lecture ouvert codant la protéine E7 mutée, par exemple en vue d'une adaptation de la séquence nucléotidique en fonction de l'usage préférentiel des codons dans l'organisme hôte dans laquelle l'expression de cette séquence nucléotidique est recherchée, dès lors que la ou les substitutions d'un nucléotide sont silencieuses , c'est- à-dire qu'elles n'entraînent, lors de leur traduction, aucune modification dans la séquence d'acides aminés SEQ ID N 1. Un acide nucléique tel que défini ci-dessus est utile principalement lorsqu'il est mis en oeuvre pour la production du produit d'expression correspondant. En conséquence, l'acide nucléique codant la protéine E7 mutée comprend, de préférence, un polynucléotide régulateur contrôlant l'expression de la protéine E7 mutée dans une cellule hôte procaryote ou eucaryote. Le polynucléotide régulateur comprend au moins une séquence promoteur capable d'initier la transcription de l'ADN codant la protéine E7 mutée de l'invention dans la cellule hôte choisie. Ce polynucléotide régulateur peut aussi comprendre d'autres séquences nucléotidiques favorisant l'expression de l'ADN codant la protéine E7 mutée, par exemple des séquences activatrices de la transcription bien connues de l'homme du métier. Préférentiellement, on choisira un promoteur dit inductible , c'est- à-dire un promoteur sensible à la présence d'un composé inducteur, ledit promoteur dirigeant la transcription de l'ADN placé sous son contrôle uniquement en présence du composé inducteur. Le promoteur LacZ est un exemple illustratif d'un tel promoteur inductible. Un autre promoteur inductible est le promoteur AOX1, inductible par le méthanol , par exemple le promoteur AOX1 contenu dans le vecteur pPIC9K (Réf. V175-20, Société Invitrogen) utilisé dans les exemples. Selon l'invention, toute technique classique de biologie moléculaire, de microbiologie et d'ADN recombinant connue de l'homme du métier peut être utilisée afin de préparer un acide nucléique tel que défini ci-dessus. De telles techniques sont décrites par exemple par Sambrook et al. (1989). Glover (1985), Gait (1984) et Ausubel et al. (1989). Selon un mode de réalisation préféré, ledit acide nucléique comprend un polynucléotide régulateur contrôlant l'expression de la protéine E7 mutée dans la levure, et encore plus spécifiquement dans les cellules de levure de l'espèce Pichia pastoris. L'acide nucléique comprenant un ADN codant la protéine E7 mutée selon l'invention, placé sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur tel que défini ci-dessus est inclus dans une cassette d'expression. Cassettes d'expression Une telle cassette d'expression peut comprendre, outre le polynucléotide régulateur de l'ADN codant la protéine E7 mutée, des séquences non traduites localisées du côté 5' du cadre ouvert de lecture, dites séquences leader , capables d'augmenter la traduction du produit d'expression, ou des séquences dites terminateur bien connues de l'homme du métier. De manière tout à fait préférée, une cassette d'expression telle que définie ci-dessus comprend en outre une séquence codant pour un peptide signal en vue de la production d'un polypeptide de fusion entre ledit peptide signal et la protéine E7A21-26, afin de favoriser la sécrétion du produit d'expression de l'ADN codant la protéine E7A21-26 et retrouver celui-ci principalement à l'extérieur des cellules, par exemple dans le surnageant de culture cellulaire. De préférence, la séquence nucléotidique codant le peptide signal est localisée immédiatement du côté 5' de la séquence nucléotidique codant la protéine E7A21-26. En général, une cassette d'expression telle que définie ci-dessus comprend en outre un polynucléotide marqueur de sélection, par exemple le gène his, afin de sélectionner positivement les cellules hôtes transformées par celle-ci. Vecteurs recombinants L'invention décrit également un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression tels que définis ci-dessus. Par vecteur au sens de la présente invention, on entend une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme simple brin ou double brin. Un vecteur recombinant tel que décrit est indifféremment un vecteur de clonage ou un vecteur d'expression. Il peut s'agir d'un vecteur d'origine bactérienne ou virale. Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs Pbr322 (ATCC37017) ou encore des vecteurs tels que PAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suède) et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, Etats-Unis). On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pWE9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SA, p NH8A, p NH16A, p NH18A, p NH46A, p WLNEO, p SV2CAT, p OG44, pXTI, pSG (Stratagene). Selon un premier mode de réalisation, un vecteur recombinant est utilisé afin d'amplifier l'acide nucléique ou la cassette d'expression qui y est insérée, après transformation ou transfection de l'hôte cellulaire désiré. Selon un second mode de réalisation, il s'agit d'un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression tels que définis ci-dessus, en vue de la transformation d'une cellule hôte choisie pour la production du produit d'expression de l'ADN codant la protéine E7A21-26 selon l'invention. Un vecteur recombinant comprend avantageusement aussi des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriée. Une cassette d'expression telle que définie ci-dessus constitue un mode de réalisation particulier d'un vecteur recombinant. Une première famille de vecteurs recombinants préférée est constituée des vecteurs d'expression fonctionnels dans les cellules de levure, et de manière tout à fait préférée les vecteurs d'expression fonctionnels dans les cellules de la levure Pichia pastoris. Un exemple illustratif d'un tel vecteur est le vecteur pNIV5114 dont le procédé de fabrication est détaillé dans les exemples, à partir du vecteur pPIC9K (Réf. V175-20-Société Invitrogen). Une seconde famille de vecteurs recombinants préférés est constituée des vecteurs d'expression fonctionnels dans les cellules de mammifères, y compris l'homme, incluant les vecteurs viraux, y compris les adénovirus recombinants et les virus adéno-associés recombinants, par exemple un adénovirus recombinant humain de type 2 ou de type 5 bien connu de l'homme du métier. A titre illustratif, il peut s'agir du vecteur recombinant p CDNA.3li- E7A21-26 dont le procédé de préparation est détaillé à l'exemple 6. Pour permettre l'expression de l'acide nucléique codant la protéine E7 mutée, un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus doivent être introduits dans une cellule hôte. Cellules hôtes recombinantes L'invention décrit également une cellule hôte transformée par un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur recombinant tels que définis ci-dessus. De manière tout à fait préférée, ladite cellule hôte transformée est une cellule de levure de l'espèce Pichia pastoris. Préférentiellement, on utilisera les cellules de la souche SMD 1168 (his4, pep4) de Pichia pastoris (Réf. C 175-00, Société Invitrogen). On utilise avantageusement les cellules de Pichia pastoris, respectivement : - GS115 (his4) (Réf. C181-00-lnvitrogen; ATCC N 20864); - KM71 (his4; aox1:: ARG4 ; arg4) (C183-00-lnvitrogen, ATCC n 201178). Procédé d'obtention d'un acide nucléique codant la protéine E7A21- 26. L'invention décrit un procédé pour la fabrication d'un acide nucléique codant la protéine E7 mutée de séquence SEQ ID n 1, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : (a) réaliser une mutagenèse dirigée de l'acide nucléique codant la protéine E7 native par amplification dudit acide nucléique à l'aide respectivement d'une première amorce nucléotidique de séquence SEQ ID n 4, et d'une seconde amorce nucléotidique hybridant avec l'extrémité 3' de l'ADN codant la protéine E7 native . (b) récupérer l'ADN amplifié. La première amorce nucléotidique, de séquence SEQ ID n 4, comprend le codon codant le résidu thréonine en position 20 de la séquence d'acides aminés de la protéine E7 native (nucléotides 14 à 16) précédant immédiatement le codon codant l'acide aminé glutamine en position 27 de la séquence en acides aminés de la protéine E7 native (nucléotides 17 à 19), ce qui permet l'obtention d'un produit final d'amplification dans lequel les nucléotides inclus dans les codons codant les acides aminés 21 à 26 de la protéine E7 native ont été délétés. La seconde amorce nucléotidique utilisée à l'étape (a) d'amplification peut comprendre, outre une séquence hybridant avec l'extrémité 3' de l'ADN codant la protéine E7 native, également un ou plusieurs sites de reconnaissance par des endonucléases. De préférence, on utilisera, comme seconde amorce nucléotidique, l'amorce de séquence SEQ ID N 5, qui comprend la séquence du site de reconnaissance de l'endonucléase EcoRl. L'acide nucléique codant la protéine E7A21-26 est inséré dans un vecteur de clonage ou dans un vecteur d'expression, à un site d'insertion prédéterminé, par exemple par ligation dudit acide nucléique avec l'acide nucléique du vecteur, après avoir préalablement ouvert le vecteur hôte, par exemple par coupure nucléotidique à l'aide d'une endonucléase de restriction, de préférence au niveau d'un polysite de clonage. De préférence, on utilisera le vecteur de clonage pPIC9K commercialisé sous la référence V175-20 par la Société Invitrogen. Avantageusement, l'ADN codant la protéine E7A21-26 est inséré dans ce vecteur au niveau du site de restriction BamHI-Ecori, en aval de la séquence du vecteur codant le peptide signal MFaFactor. Procédé de production du produit d'expression de l'ADN codant la protéine mutée E7A21-26 dans des cellules de levure. L'invention est relative à un procédé pour la production du produit d'expression de l'ADN codant la protéine E7 mutée selon l'invention, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : (a) culture de cellules de la levure Pichia pastoris transformées par un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus ; (b) récupération du surnageant de culture à l'issue de l'étape (a) ; et (c) purification du produit d'expression à partir du surnageant de culture obtenu à l'étape (b). De préférence, les cellules de la levure Pichia pastoris, transformées par un vecteur recombinant selon l'invention sont des cellules de la souche SMD 1168 (his4, pep4). De manière préférée, le vecteur recombinant utilisé pour transformer les cellules de levure est le vecteur pNIV5114 dont le procédé de préparation est décrit à l'exemple 1, et qui est préalablement clivé, par exemple par l'endonucléase Bglll, avant d'être introduit dans les cellules de levure. Préférentiellement, les cellules de Pichia pastoris recombinantes cultivées à l'étape (a) ont été préalablement sélectionnées pour leur capacité à produire de grandes quantités du produit d'expression de l'ADN codant la protéine E7A21-26. Selon un aspect préféré, les cellules recombinantes capables de synthétiser à haut niveau le produit d'expression de l'ADN codant la protéine E7A21-26 sont les cellules possédant un grand nombre de copies du vecteur recombinant. Lorsque le vecteur recombinant comprend le gène marqueur de sélection His, comme c'est le cas du vecteur Pniv5114, les cellules de Pichia pastoris contenant le plus grand nombre de copies du vecteur recombinant peuvent être sélectionnées sur leur capacité à se multiplier en présence de fortes concentrations du composé G418, par exemple des concentrations du composé G418 allant jusqu'à 4mg/ml. De manière avantageuse, l'étape (a) de culture des cellules de Pichia pastoris transformées, et préalablement sélectionnées pour leur haute capacité de synthèse du produit d'expression de l'ADN codant la protéine E7A21-26, sont inoculées dans un réacteur de fermentation approprié contenant un milieu de culture adapté. Durant une première phase (i) de culture, les cellules inoculées dans le milieu de culture sont cultivées en vue de leur multiplication. Durant cette phase (i) de culture, le pH du milieu est avantageusement maintenu à une valeur inférieure à 5, afin de bloquer, ou tout au moins de réduire, le relarguage ou la sécrétion de protéines contaminantes autres que le produit d'expression de l'ADN codant la protéine E7A21-26, dans le milieu de culture. La température de culture est avantageusement maintenue aux alentours de 30 C, de préférence entre 27 C et 33 C, et de manière tout à fait préférée entre 29 C et 31 C. Avantageusement, cette phase (i) de préculture est réalisée sous agitation constante de la culture cellulaire, par exemple à une vitesse allant de 100 à 1000 tours/minute. Avantageusement, l'oxygène dissous est maintenu à une concentration pondérale d'environ 20%, par exemple au moyen d'une agitation comprise entre 300 et 1000 tours/minute. Cette phase (i) de préculture est poursuivie jusqu'à l'apparition d'un premier pic de consommation de l'oxygène dissous, qui est classiquement observé après environ 18 heures de culture. La phase (i) de préculture est suivie d'une phase (ii) de culture pendant laquelle les cellules de Pichia pastoris transformées sont placées dans des conditions de milieu de culture induisant la production d'une grande quantité du produit d'expression de l'ADN codant la protéine E7A21- 26. Afin d'induire la synthèse dudit produit d'expression, on ajoute au milieu de culture le composé inducteur auquel le promoteur inductible est sensible. Dans le cas des cellules de Pichia pastoris décrites à l'exemple 1, qui sont transformées par une cassette d'expression comprenant le promoteur inductible AOX1, on ajoute du glycérol, le composé inducteur correspondant, au milieu de culture. De manière tout à fait préférée, on ajuste le pH du milieu de culture à une valeur au moins égale à 5, préférentiellement à une valeur comprise entre 5 et 6. L'ajustement du pH au moment de l'induction de la synthèse du produit d'expression de l'ADN codant la protéine E7A21-26 permet d'assurer une stabilité optimale du produit d'expression ainsi synthétisé, qui possède un pl d'environ 4,5. En général, la température au moment de l'étape (ii) de culture est maintenue aux alentours de 30 C. Il est également possible d'abaisser la valeur de température au moment de l'étape (ii) de culture aux alentours de 25 C, de préférence entre 23 et 27 C et mieux entre 24 C et 26 C, afin de réduire significativement la production concomitante de protéines contaminantes autres que le produit d'expression de l'ADN codant la protéine E7A21-26. La quantité du produit d'expression de l'ADN codant la protéine E7A21-26 peut être encore accrue par l'addition de méthanol au milieu de culture au moment de l'apparition d'un second pic de consommation de l'oxygène dissous, puis maintient de la concentration de méthanol durant la totalité de l'étape (ii) de culture . En général, le second pic de consommation de l'oxygène dissous est observé environ 3 heures après l'induction de la synthèse du produit d'expression de l'ADN codant la protéine E7A21-26 par l'addition de glycérol. Avantageusement, le méthanol est maintenu à une concentration comprise entre 3 et 7g/l, de préférence entre 4 et 6 g/l et de manière préférée à environ 5g/l. Avantageusement, la durée de l'étape (ii) de culture est comprise entre 20 et 40 heures, de préférence entre 25 et 35 heures et est en général d'environ 30 heures. A l'étape (b) du procédé de production du produit d'expression de l'ADN codant la protéine E7A21-26, on récupère le surnageant de culture selon toute technique connue, par exemple par centrifugation de la biomasse, puis filtration du surnageant de culture. A l'étape (c ) du procédé ci-dessus, le produit d'expression est ensuite purifié selon toute technique connue de l'homme du métier, par exemple par purification chromatographique. De préférence, on utilisera une purification par chromatographe telle qu'une colonne de Q Sepharose XL comme décrit à l'exemple 1. L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants. Figure 1, un cliché SDS-PAGE de E7A21-26. Figure 2 , un cliché Western-Blot de E7A21-26 ; Figure 3, un cliché d'une isoélectrofocalisation sur agarose de E7A21-26 ; EXEMPLES Exemple 1 : Préparation de la protéine E7 mutée de HPV-16 selon l'invention 1. 1. Préparation et clonage de l'acide nucléique codant la protéine E7 mutée. Pour le clonage du gène de la protéine E7 sauvage dans le vecteur pPIC9K (Invitrogen), propice à l'expression de protéines en Pichia pastoris, nous sommes partis d'un plasmide pNIV5101. Ce plasmide est le vecteur pMALcRI contenant le gène de E7 de HPV-16 (plasmide fourni par le laboratoire d'Arsène Burny). La cassette E7 est isolée de pNIV5101 après une double digestion Ncol-Sa/I. Les extrémités sont rendues blunt et le fragment est inséré dans le plasmide pPIC9K ouvert par Snabl. Dans cette construction, la E7 exprimée possède une Tyrosine supplémentaire en position aminoterminale. Ce résidu supplémentaire a été délété par mutagenèse dirigée (Kit : Transformer Site-directed mutagenesis, Clontech) et à l'aide d'un oligonucléotide synthétique : 5'GAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCATGGAGATACACCTAC3' (SEQ ID N 3). La séquence en gras correspond à la fin du gène de la séquence signal de MFa-factor. Le plasmide résiduel pNIV5102 code pour l'expression de E7 HPV- 16 sauvage en P. pastoris. La cassette signal MFa-factor-E7 , isolée de pNIV5102 après une digestion BamHI-EcoRI biunt, est introduite dans le vecteur pBluescript (Stratagene)ouvert par BamHI-EcoRI blunt pour la délétion des AA 21-26. Ce plasmide est nommé pNIV5103. La délétion A21-26 et l'introduction d'un site EcoRI après le codon STOP est réalisée par mutagenèse dirigée et à l'aide de deux oligonucléotides : a) 5'GCAACCAGAGACAACTCAATTAAATGACAGCTCAG3' (SEQ ID N 4). Le codon en gras correspond à celui de l'AA 20 alors que le codon souligné code pour l'AA 27 ; b) 5'GTTCTCAGAAACCATAATGAATTCATGTTTCAGGACCCACAG3' (SEQ ID N 5). La séquence en gras correspond au site EcoRI. Cette construction, appelée pNIV5109, contient donc la cassette signal MFa-factor -E7A21-26. La construction finale consiste en l'ouverture de pPIC9K par BamHI-EcoRI et l'introduction de la cassette signal MFafactor -E7A21-26 isolée de pNIV5109 après une digestion BamHI-EcoRI. Le plasmide d'expression final porte le numéro pNIV5114. 1. 2. Transformation des cellules de levure Pichia pastoris avec le vecteur d'expression recombinant codant la protéine E7 mutée de l'invention. La composition des différents milieux utilisés dans l'exemple est celle décrite dans le manuel distribué par la Société Invitrogen : Multi Copy Pichia Expression Kit . La souche SMD1168 de P. pastoris (Réf. C 175-00-lnvitrogen) est transformée avec le plasmide pNIV5114, préalablement digéré par Bglll, par la méthode des sphéroplastes. Brièvement, les levures sont lavées successivement avec de l'eau, du milieu SED et du sorbitol 1 M. Après centrifugation, les cellules sont resuspendues dans le tampon SCE pour être digérées par la zymolyase selon le protocole décrit dans le manuel Invitrogen. Les sphéroplastes sont récoltés par une centrifugation de 750g pendant 10min. Après un lavage au sorbitol 1 M, les sphéroplastes sont lavés avec le tampon CaS et transformés avec 10 g de pNIV5114 digéré par Bg/II. Les levures sont étalées sur un milieu gélosé RBD sur lequel est coulé de l'agar mou RD. Les transformants His+ sont étalés sur différentes boîtes YPD+Agar contenant des concentrations croissantes de G418 (de 0. 5 à 4mg/ml) afin de sélectionner des levures possédant un grand nombre de copies du gène de E7A21-26. Après repiquage des colonies résistantes, l'expression de la E7A21-26 est évaluée de la manière suivante. Des précultures de certaines colonies sont réalisées dans le milieu BMGY (voir Invitrogen). Lorsque la DOeoonm atteint une valeur comprise entre 2-6, une partie de cette préculture est centrifugée et les cellules sont resuspendues dans le milieu BMMY contenant une concentration finale en méthanol de 0.5%. Le test d'induction de l'expression au méthanol peut se prolonger pendant plusieurs jours Pour chaque intervalle de temps, des aliquotes sont prélevés. La présence de E7A21-26 dans le surnageant des cultures est visualisée en SDS-PAGE, après coloration au bleu de Coomassie ou après Western blotting révélé avec un anticorps monoclonal anti-E7 (Santa Cruz, dilution 1000X). Une Master Cell Bank du clone pNIV5114 n 1 est réalisée. Une Working Cell Bank, dérivée d'une ampoule de la MCB, est formée pour les productions de la E7A21-26 en bioréacteur. 1. 3. Production de la protéine E7 mutée de l'invention à haut rendement, à l'échelle industrielle. a)préculture : 100ml de milieu BMGY sont inoculés avec 150 l du glycérol de la souche P.pastoris recombinante (incubation à 30 C pendant +/- 24h, vitesse d'agitation de 250rpm) afin de déterminer le temps de génération de la souche. 100ml de milieu BMGY sont inoculés avec xml de la préculture 1 pour obtenir une DO600nm finale de +/- 30 au moment de l'inoculation du bioréacteur (incubation à 30 C pendant +/- 24h, vitesse d'agitation de 250rpm). b)bioréacteur : Le bioréacteur Bioflo III (New Brunswick) est rempli par 1,75 litre de Basait [Sait Medium pH 5 contenant de l'anti-mousse (0.5ml) et des PTM1 salts (8ml) avant d'être inoculé par la préculture 2 (température de 30 C, vitesse d'agitation de 300rpm). L'oxygène dissous est maintenu à 20% grâce à une agitation comprise entre 300 et 1000rpm. Après +/- 18h de fermentation, le 1er pic de consommation de l'oxygène dissous apparaît. A ce moment, 150ml de glycérol à 50% en poids sont ajoutés. Le pH du milieu est monté de 5 à 6. +/- 3 heures plus tard, au moment du 2ème pic de consommation de l'oxygène dissous, 10g de méthanol sont ajoutés et la concentration en méthanol est maintenue durant toute l'induction à 5g/litre (monitoring par un détecteur de méthanol, PTI Instruments). L'induction procède pendant 25- 30h. La biomasse est centrifugée pendant 30min à 1000rpm, le surnageant est filtré sur un filtre Sartopure PP2 (porosité 1.2pm). c) Milieux utilisés BMGY Medium Yeast Extract 10g/L Peptone 20g/L Tampon Phosphate potassium 100mM pH6 YNB avec (NH4)2 S04 mais sans amino-acides (Invitrogen) 13.4g/L Biotine 400ug/L Glycérol 10ml/L Basai Salts Medium Acide phosphorique 85% 26.7 ml/L Sulfate de calcium 0. 93 g IL Sulfate de potassium 18.2 g /L Sulfate de Mg.7H20 14. 9 g/L Hydroxyde de potassium 4.13 g /L Glycérol 40. 0 g /L PTM1 Trace Salts Sulfate cuprique 5H20 6. 0 g/L lodure de sodium 0.08 g/L Sulfate de manganèse H20 3.0 g/L Molybdate de sodium.2H20 0. 2 g/L Acide borique 0.02 g/L Chlorure de cobalt 0. 5 g/L Chlorure de zinc 20.0 g/L Sulfate ferreux 7H2O 65. 0 g/L Biotine 0.2 g/L Acide sulphurique 5. 0 ml/L 1. 4 Purification de la protéine E7 mutée selon l'invention Le surnageant de culture est dilué 4 fois avec de l'eau et le pH de la solution est ensuite ajusté à pH7. 5. Le mélange est directement appliqué sur une colonne de Q sépharose XL (2.6 x 12cm) conditionnée dans le tampon 20mM Tris-HCI pH7. 5 à une vitesse de 30ml/min. La colonne est ensuite lavée avec le tampon de conditionnement et avec le tampon contenant 400mM NaCI. La E7A21-26 est éluée de la colonne par l'application d'un gradient en NaCI de 400 à 650mM (15 volumes colonnes). Les fractions contenant la E7A21-26 sont rassemblées, concentrées par ultrafiltration sur une membrane YM10 (Amicon) et appliquées sur une colonne de filtration moléculaire Superdex 200 (1. 6 x 60cm) conditionnée dans le tampon PBS pH 7. 2. Les fractions purifiées de E7A21-26 sont rassemblées. Les endotoxines éventuelles des préparations de E7A21-26 sont ensuite éliminées par un traitement au Triton X-114. Les protéines sont dosées par le test Micro BCA (Pierce) et stockées à -20 C La E7A21-26 se présente en SDS-PAGE sous la forme d'un doublet de bandes de 14 et 16kDa (Figure 1). Ces deux bandes sont immunoréactives. Des fractions aliquotes de E7A21-26 ont été incubées pendant 33 jours à 37 C. Nous n'observons pas de changements du comportement électrophorétique de l'échantillon (Figure 2). Ces résultats indiquent que la E7A21-26 est stable à cette température pendant au moins 1mois. Le western blot confirme cette stabilité. La E7A21-26 est très stable également à-20 et +4 C (plusieurs mois). La E7A21-26 possède un point isoélectrique acide compris entre 5 et 5,4 (Figure 3). REFERENCES . AUSUBEL F M, Brent R. Kingstone Re, Moore DD, Seidaman JG, Smith JA Struhl K editors , (1989), Current protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience. . CRUZ , I. et al., 1999, Br. J. Cancer, vol.81 ; 881-889. . EL SHERIF AM étal., 2001, J. Pathol, 195(2): 179-185 . GAIT (ed.), 1984, Nucleic acid hybridization. . GERARD C M, 2001, Vaccine, vol.19 : 2583-2589. . GIANNINI et al., 1998, Clin. EXP. Immunol, 113(2) : 183-189. . GIANNINI ET AL., 2002, Int. J. 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Procédé pour la production du produit d'expression de l'ADN codant la protéine E7 mutée du Papillomavirus HPV-16 de séquence SEQ ID N 1 dans une cellule de levure, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Transformation d'une culture de cellules de levure du genre Pichia pastoris avec un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique codant la protéine E7 mutée de séquence SEQ ID N 1, ledit acide nucléique comprenant aussi un polynucléotide régulateur du ype promoteur inductible ; b) Sélection des cellules de levures transformées par le vecteur ; c) Culture des cellules transformées sélectionnées à l'étape b) ; d) Purification du produit d'expression à partir du surnageant de culture obtenu à l'issue de l'étape c). 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, à l'étape c), durant une première phase (i) de culture, les cellules inoculées dans le milieu de culture sont cultivées en vue de leur multiplication. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que, durant la première phase de culture (i), le pH du milieu est maintenu à une valeur inférieure à 5. 4. Procédé selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que, durant la première phase de culture (i), la température de culture est maintenues entre 27 C et 33 C, de préférence entre 29 C et 31 C. 5. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4 , caractérisé en ce que la phase (i) de préculture est suivie d'une phase (ii) de culture pendant laquelle les cellules de Pichia pastoris transformées sont placées dans des conditions de milieu de culture induisant la production d'une grande quantité du produit d'expression de l'ADN codant la protéine E7A21-26 de séquence SEQ ID N 1, par ajout d'un composé inducteur auquel le promoteur inductible est sensible. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le promoteur inductible est le promoteur AOX1 et le composé inducteur est le glycérol. 7. Procédé selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que, durant la phase (ii) de culture, on ajuste le pH à une valeur au moins égale à 5, préférentiellement à une valeur comprise entre 5 et 6. 8. Procédé selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que la température de la phase (ii) de culture est d'environ 30 C.. 9. Procédé selon l'un des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que, à l'étape (ii) de culture, la température est abaissée à une température comprise entre 23 C et 27 C. 10. Procédé selon l'une des revendications 5 à 9, caractérisé en ce que la durée de la phase (ii) de culture est comprise entre 20 et 40 heures, de préférence ente 25 et 35 heures.