Brevet FR2846006A3 — publié le 20040423

FR 2846006 A3 20040423 FR 0213060 A 20021018 PROCEDE PERFECTIONN DE TRANSFERT G NIQUE DANS UNE PLANTE PAR MICRO-VIBRATION La présente invention concerne une technique de 5 transfert génique, et plus particulièrement, un procédé de transfert génique dans une plante par micro-vibration et injection dans l'ovaire. Une voie classique pour effectuer un transfert génique dans une plante comprend les étapes suivantes (1) clonage du gène ou des gènes provenant de sources appropriées et recombinaison du ou des gènes clonés avec un vecteur d'ADN approprié (plasmide) utilisé comme porteur de gène; (2) transfert de la partie du porteur abritant le ou les 15 gènes clonés dans des cellules végétales par des méthodes appropriées de façon à former des cellules transgéniques, lesdites méthodes comprenant la méthode de bombardement au pistolet à particules, la méthode à médiation par Agrobacterium, la micro-injection, 20 l'électroporation, la méthode à médiation par un virus et la méthode au PEG (méthode au polyéthylène glycol), etc. (3) les méthodes mentionnées ci-dessus nécessitent toutes l'aide d'une culture de tissu végétal pour transférer 25 les cellules transgéniques au moyen d'une régénération dans des plantes transgéniques ayant des racines, des tiges et des feuilles; (4) examen et triage des plantes transgéniques réussies et bonnes. Les méthodes mentionnées cidessus ont toutes leurs propres caractéristiques; cependant, elles ont également certains inconvénients communs qui ne sont pas prêts d'être surmontés. L'un des inconvénients est que le rendement n' est pas toujours satisfaisant. Habituellement, 35 un procédé transgénique est plus susceptible d' être réussi si une technique de culture de tissu avec un rendement de régénération élevé est disponible. Malheureusement, dans beaucoup de cas, la technique de culture de tissu n'est pas encore bien établie à ce jour. Ceci est l'une des principales raisons faisant que le succès du transfert 5 génique est si rare dans de nombreuses récoltes. De ce point de vue, une nouvelle approche de procédé transgénique étant capable d'augmenter le rendement de transfert et ne reposant pas sur le recours à une culture de tissu sera de grande valeur. L'objectif de la présente invention est atteint par les opérations consistant à: (1) à un intervalle de temps approprié après la pollinisation, injecter l'ADN contenant le ou les gènes exotiques dans la loge d'un ovaire de plante 15 conformément à une série d'étapes opératoires pour faire en sorte que l'ADN entoure le ou les ovules à l'intérieur de la loge; (2) immerger immédiatement l'ovaire entier dans l'eau et faire vibrer l'eau par des ondes ultrasoniques; la 20 vibration augmente le mouvement de l'ADN injecté autour du ou des ovules de façon à augmenter l'opportunité du transfert génique dans l'oosphère fécondée. La présente invention a donc pour objet un 25 procédé de transfert génique dans une plante, le transfert étant réalisé par micro-vibration et les étapes suivantes étant conduites: - le stigmate est coupé après que la fleur soit pollinisée et que les tubes polliniques se soient 30 proprement développés; - un passage est défini allant du style à la loge; - de l'ADN exotique est ensuite injecté par le passage dans l'ovaire pour remplir la loge; - l'ovaire est soumis à un traitement par un dispositif 35 de micro-vibration pour augmenter le mouvement de l'ADN exotique de façon à augmenter la possibilité pour lui de pénétrer dans 1' ovule et de pénétrer davantage l' oosphère se fécondant lorsqu' une fusion oosphère-anthérozode (sperme) se produit, et à augmenter la possibilité de la recombinaison d' ADN 5 entre 1' ADN exotique et le chromosome de l' oosphèreanthérozode (c'est-à-dire le transfert génique). En particulier, la micro-vibration peut être effectuée à l'aide d'un traitement par ultrasons. Conformément à un premier mode de réalisation de 10 l' invention, le passage est défini par pénétration d'une aiguille d' injection à partir de la position de coupe du style vers la loge à l'intérieur de l'ovaire, et l'aiguille est ensuite retirée. Conformément à un autre mode de réalisation de 15 1' invention, le passage est défini par pénétration d' une aiguilMe d'injection à partir de la position de coupe du style vers la loge à 1' intérieur de 1' ovaire et par pénétration à travers toute la paroi de 1' ovaire jusqu' à proximité du réceptacle, et l'aiguille est ensuite retirée. 20 La présente invention porte également sur une graine transgénique obtenue à partir de l'oosphère transgénique fécondée obtenue par le procédé de 1' invention, ainsi que sur une plante transgénique obtenue à partir de la graine transgénique telle que définie ci25 dessus, et toute partie de ladite plante transgénique. La présente invention porte également sur un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé de l' invention comprenant: - un moyen pour couper le ou les stigmates; - un moyen pour définir un passage dans l'ovaire; - un moyen pour injecter l'ADN exotique; et - un dispositif de micro-vibration. En particulier, le moyen pour définir un passage peut être une aiguille et le moyen pour injecter l'ADN 35 exotique peut être choisi parmi une seringue et un dispositif d' injection pour analyse par chromatographie en phase gazeuse. Un procédé perfectionné de transfert génique dans une plante par microvibration est donc proposé. Tout d'abord, les stigmates sont coupés à un intervalle de temps approprié après pollinisation, en particulier pas à plus de 32 heures de la pollinisation. Un minuscule passage d'ADN est ensuite défini par pénétration de l'aiguille d' injection de position de la coupe au niveau du style et 10 vers la loge à 1' intérieur de l' ovaire, ou en pénétrant davantage à travers la paroi de l'ovaire jusqu'à proximité du réceptacle. L'ADN exotique (acide désoxyribonucléique) contenant le ou les gènes à transférer est injecté dans la loge par le passage. Après injection, l'ovule à l'intérieur de l'ovaire est entouré par 1'ADN exotique dans la loge. L' ovaire est ensuite immergé dans de 1' eau qui est amenée à vibrer par un traitement de micro-vibration. La micro-vibration peut être créée par un dispositif à ultrasons. Par une bonne maîtrise du temps, le traitement 20 de micro-vibration permettra à 1'ADN injecté d' avoir une plus grande aptitude à pénétrer dans l'ovule et à rencontrer 1' oosphère se fécondant. Ceci augmentera la possibilité de la recombinaison d'ADN, c'est-à-dire le transfert génique, entre l'ADN exotique et les chromosomes 25 d' oosphère fécondée. L' oosphère fécondée transgénique se développera alors naturellement en une graine transgénique. Finalement une plante transgénique entière peut être obtenue à partir d' une graine transgénique par germination et croissance végétative. Le mode opératoire entier est 30 simple et facile à effectuer, et ne nécessite pas le recours à une culture de tissu. Le procédé de cette invention a une valeur élevée et un potentiel élevé pour une application pratique, étant donné qu'il est très simple, peu coteux, avec un rendement élevé dans 35 l'amélioration génétique de la plante et qu' il est bénéfique pour la sécurité de l'environnement. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description suivante en liaison avec les dessins annexés qui montrent, à des fins d' illustration seulement, un mode de réalisation préféré conformément à la présente invention. BR VE DESCRIPTION DES DESSINS - la Figure 1 est un diagramme des étapes du procédé de 10 la présente invention; - la Figure 2 montre des parties d' une fleur d' une plante; et - la Figure 3 montre les étapes de coupe, de pénétration et d'injection; et - la Figure 4 montre une autre manière d'effectuer l'étape de pénétration; et - la Figure 5 montre 1' étape de micro- vibration de la présente invention. Si l'on se réfère aux Figures 2 à 5, on peut voir que le procédé perfectionné du transfert génique dans une plante, selon la présente invention, comprend quatre étapes qui sont: - étape de coupe 10: couper le stigmate à un intervalle 25 de temps approprié après pollinisation (généralement pas plus de 32 heures après la pollinisation); - étape de pénétration 20: former un minuscule passage ou tunnel à I' aide d' une aiguille d' injection pour pénétrer du style vers la loge; - étape d'injection 30: injecter de 1' ADN de l'extérieur dans la loge de l'ovaire par le passage; - étape de micro-vibration 40: immerger 1' ovaire dans l'eau et réaliser une micro-vibration de l'eau pendant une période de temps (généralement pas plus de 15 35 secondes). Les quatre étapes sont effectuées en continu. Pour l'étape de coupe 10, on se référera à la Figure 2 qui montre la fleur de la plante et comprend le stigmate 11, le style 12, l'ovaire 13, la loge 131, l'ovule 132, le placenta 133, la tige florale 14, le réceptacle 15, 5 le calice 16, le pétale 17 et l'étamine 18. Après pollinisation, lorsque les tubes polliniques atteignent le ou les ovules, on utilise un outil pour couper le stigmate il à la position du style 12 comme représenté. Pour l'étape de pénétration 20, un minuscule 10 passage 21 est défini entre le style 12 et la loge 131 à l'aide d'une aiguille d'injection pour pénétrer dans l'emplacement de la coupe du style 12 et vers l'ovaire 13 jusqu'à la loge, comme représenté sur la Figure 3, ou en allant plus loin à travers la loge 131 pour pénétrer dans 15 la paroi de l'ovaire et réaliser une ouverture 34 sur celle-ci comme représenté sur la Figure 4, puis on retire l'aiguille pour définir le minuscule passage 21. Pour l'étape d'injection 30, l'ADN 31 est injecté dans la loge 131 par une aiguille 33 du dispositif 20 d'injection 32 par le passage 21 pour permettre à l'ADN 31 d'entourer l'ovule 132. Si le passage 21 est défini par pénétration comme représenté sur la Figure 4, un peu d'ADN 31 pourrait s'écouler hors de l'ouverture 34, mais ceci ne fait pas obstacle à l'obtention du résultat du transfert 25 génique, ce qui a été montré par des essais répétés. Pour l'étape de micro-vibration 40, on prend un récipient 41 rempli d'eau et on ajuste l'orientation de la branche ou de la tige 42 pour ajuster la fleur tournée vers le bas (l'ovaire 13 en haut et le style 12 en bas), de 30 telle sorte que l'ovaire 13 est immergé dans l'eau à l'intérieur du récipient 41 (la totalité de la fleur peut être immergée dans l'eau pour laisser l'ovaire 13 être complètement entouré par l'eau). On conduit la microvibration de l'eau pendant une période de temps appropriée 35 (par exemple pas plus de 15 secondes) pour augmenter l'opportunité du transfert de l'ADN 31 dans l'oosphère à l'intérieur de l'ovule pendant le processus de fécondation. La micro-vibration peut être réalisée par un traitement par ultrasons. Par micro-vibration, l'ADN 31 a une plus grande 5 possibilité de pénétrer dans l'ovule 132 pendant le processus de fécondation. En outre, aux alentours de la période de fécondation, la partie de paroi de cellule de l'oosphère est mince et la cellule de l'oosphère est quelque peu semblable à un protoplaste. Cette caractéristique permet à l'ADN 31 d'entrer facilement dans l'oosphère, en particulier au moment o la fusion oosphèreanthérozode (c'est-à-dire la fécondation) a lieu. Le traitement de micro-vibration augmente également la possibilité à un plus grand degré. Il en résulte que l'opportunité de la recombinaison entre l'ADN exotique 31 et les chromosomes de l'oosphère fécondée, c'est-à-dire le transfert génique, est également accrue. L'ovule 132 contenant l'oosphère fécondée transgénique est capable de former une graine transgénique par un développement naturel 20 par la suite, puis une plante transgénique complète peut être obtenue à partir de la graine transgénique sans l'aide d'une culture de tissu. Il va de soi que, dans ce procédé, l'apparition de transfert génique dépend de cinq facteurs principaux: 1 - l'existence de l'ADN injecté 31 qui contient le ou les gènes exotiques; 2 - les cellules d'anthérozode se déplaçant vers l'oosphère à l'intérieur des tubes polliniques qui s'étendent après pollinisation; 3 - une ou des cellules d'oosphère à l'intérieur du ou des ovules 132; 4 - l'apparition d'une fusion d'oosphère-anthérozode (c'est-à-dire fécondation) à l'intérieur de l'ovule et 5 - le traitement par micro-vibration qui augmente le mouvement de l'ADN 31. Pour traiter tous ces facteurs de façon à rendre le transfert génique capable de se produire avec une plus grande possibilité, une maîtrise précise des étapes dans le temps est très importante pour toutes les étapes dans le procédé de la présente invention. La présente invention non seulement permet d'atteindre l'objectif du transfert génique, mais également présente les cinq avantages suivants: 1 - Augmenter le taux de succès du transfert génique dans une plante: l'ADN est injecté dans l'ovaire à un intervalle de temps approprié après la pollinisation, puis traité par micro-vibration pour augmenter de façon significative le taux de succès du transfert 15 génique. 2 - Réduire les cots de réalisation dans la recherche de génie génétique: la présente invention adopte la voie naturelle du processus de reproduction de la plante 20 pour parvenir à l'objectif du transfert génique. Il est simple et facile à faire. De plus, on trouve qu'à l'aide de ce procédé, le rendement est supérieur aux voies classiques utilisées pour transférer un ou des gènes dans les plantes. Ce mode opératoire ne 25 nécessite pas d'avoir recours à une culture de tissu pour produire une plante transgénique complète à partir d'une cellule transgénique. Une telle caractéristique est tout à fait de valeur pour économiser du temps et des frais, en particulier pour 30 les espèces de plantes pour lesquelles la technique de culture de tissu n'a pas encore été bien établie. 3 - Bénéficier à la sécurité de l'environnement le procédé de la présente invention ne nécessite pas de 35 technique de culture de tissu et ne repose pas sur une médiation par une bactérie dans la totalité du procédé de transfert génique, d'o il résulte que le problème de contamination et de pollution de l'environnement peut être fortement réduit. 4 - Facile à pratiquer et à effectuer à l'aide du procédé de la présente invention, la pratique et la compétence du transfert génique est facile à apprendre et à enseigner. Une fois que la technique pour une plante spécifique a été bien déterminée et établie, y 10 compris le moment de l'injection, la fréquence et la force de la micro-vibration, et la période de temps pour le traitement de micro-vibration, l'expérience de transfert génique pourrait devenir un travail de routine et être facilement effectuée par un assistant, 15 même non spécialisé dans les domaines de la génétique et de la biologie moléculaire. La partie principale du travail expérimental peut être réalisée dans les champs ou dans des serres à l'aide simplement d'une seringue de dimension appropriée (ou un dispositif 20 d'injection initialement mis au point pour l'analyse par chromatographie en phase gazeuse) et d'un dispositif induisant une micro-vibration. Il n'est pas nécessaire d'avoir recours à des instruments et des équipements coteux. - Particulièrement approprié et utile pour les plantes ayant de multiples graines produites dans un fruit, si le fruit est issu d'une simple fleur pollinisée, telle que la tomate et la pastèque: étant donné que 30 l'ovaire est l'unité de base à traiter dans ce procédé, celui-ci est particulièrement utile et de valeur pour les plantes présentant des graines multiples produites dans un fruit issu d'une simple fleur. Apparemment le taux de succès peut être 35 augmenté si de multiples graines peuvent être obtenues à partir d'un seul traitement expérimental. On peut s'attendre à un taux de succès d'autant plus élevé que davantage de graines peuvent être obtenues à partir d'un ovaire traité (fleur). En agriculture, il existe de nombreuses récoltes qui portent des fruits 5 contenant des graines multiples qui se développent à partir de simples fleurs pollinisées. Leurs espèces se répartissent en différentes familles taxonomiques, comprenant Orchidaceae, Cucurbitaceae, Leguminosae, Solanaceae, Rosaceae, Cruciferae, Rutaceae, Myrtaceae, 10 Liliaceae, Passifloracae, Oxalidaceae, Vitaceae, Actinidiaceae et Caricaceae, etc.. Nous estimons qu'environ 2/3 des récoltes horticoles sont de ce type, et la plupart de ces récoltes manquent encore de bonnes recherches de culture de tissu. En fait, les recherches de culture de tissu n'ont même pas encore été commencées dans beaucoup de ces récoltes, et de même le travail de génie génétique. Par conséquent, le procédé de cette invention va avoir un potentiel très important pour l'application dans l'amélioration 20 génétique de nombreuses récoltes. Alors que nous avons présenté et décrit le mode de réalisation selon l'invention, il apparaîtra à l'homme du métier que d'autres modes de réalisation peuvent être réalisés sans s'écarter du domaine de la présente 25 invention. REVENDICATIONS 1 - Procédé de transfert génique dans une plante, caractérisé par le fait qu'on réalise ce transfert par micro-vibration en conduisant les étapes suivantes: - le stigmate (11) est coupé après que la fleur soit pollinisée et que les tubes polliniques se soient proprement développés; - un passage (21) est défini allant du style (12) à la 10 loge (131); - de l'ADN exotique (31) est ensuite injecté par le passage (21) dans l'ovaire (13) pour remplir la loge (131); - l'ovaire (13) est soumis à un traitement par un 15 dispositif de microvibration pour augmenter le mouvement de l'ADN exotique (31) de façon à augmenter la possibilité pour lui de pénétrer dans l'ovule (132) et de pénétrer davantage l'oosphère se fécondant lorsqu'une fusion oosphèreanthérozoide se produit, et 20 à augmenter la possibilité de la recombinaison d'ADN entre l'ADN exotique et le chromosome de l'oosphèreanthérozode (c'est-àdire le transfert génique). 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on effectue la micro-vibration à l'aide 25 d'un traitement par ultrasons. 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que le passage (21) est défini par pénétration d'une aiguille d'injection (33) à partir de la position de coupe du style (12) vers la loge (131) à 30 l'intérieur de l'ovaire (13), et l'aiguille (33) est ensuite retirée. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que le passage (21) est défini par pénétration d'une aiguille d'injection (33) à partir de 35 la position de coupe du style (12) vers la loge (131) à l'intérieur de l'ovaire (13) et par pénétration à travers toute la paroi de l'ovaire (13) jusqu'à proximité du réceptacle (15), et que l'aiguille (33) est ensuite retirée. - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, 5 caractérisé par le fait que le stigmate (11) est coupé pas plus de 32 heures après la pollinisation. 6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que le traitement de microvibration est conduit pendant pas plus de 15 secondes. 7 - Semence transgénique obtenue à partir de l'oosphère transgénique obtenue par le procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 6. 8 - Plante transgénique obtenue à partir de la semence transgénique telle que définie à la revendication 15 7, et toute partie de ladite plante trasngénique. 9 - Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 6 comprenant: - un moyen pour couper les stigmates (11); - un moyen pour définir un passage (21) dans l'ovaire (13), ledit moyen pouvant être une aiguille; - un moyen pour injecter l'ADN exotique (31), choisi notamment parmi une seringue et un dispositif d' injection pour analyse par chromatographie en phase gazeuse; et 25 - un dispositif de micro-vibration.