Brevet FR2844808A1 — publié le 20040326

La présente invention a pour objet une méthode d'analyse de groupements spécifiques constituant les héparines ou les héparines de bas poids moléculaire. Lors du procédé de préparation de l'Enoxaparine (Lovenox) (US5,389,618) à partir de l'héparine pure, L'étape de procédé de dépolymérisation alcaline en phase aqueuse produit une transformation partielle mais caractéristique des glucosamines des terminaisons réductrices des chaînes oligosaccharidiques. La première étape de cette transformation consiste en une épimerisation glucosamine Ce type de dérivé n'est obtenu que pour les chaînes oligosaccharidiques dont la glucosamine terminale est 6-0 sulfatée. Le pourcentage de chaînes oligosaccharidiques dont la terminaison est modifiée par une liaison 1,6-anhydro est une caractéristique structurale du mélange d'oligosaccharide du Lovenox et doit pouvoir être mesuré. La présente invention consiste donc en une méthode d'analyse des héparines, des héparines de bas poids moléculaire et plus particulièrement du Lovenox. La méthode d'analyse selon l'invention est la suivante : L'échantillon à doser est dépolymérisé par action d'héparinases puis le cas échéant le dépolymérisat obtenu est réduit puis on effectue une analyse par chromatographie liquide Haute Performance. La méthode telle que définie plus haut est donc caractérisée en ce que l'on recherche la présence de chaînes oligosaccharides dont la terminaison est modifiée par une liaison 1,6-anhydro ( Groupements 1,6 anhydro ). En particulier, l'échantillon à doser est tout d'abord dépolymérisé de façon exhaustive par un mélange d'héparinases et notamment d'héparinase 1 (EC 4.2.2.7.), d'héparinase 2 (heparin lyase II) et d'héparinase 3 (EC4.2.2.8.)). ( Ces enzymes sont commercialisées par la société Grampian Enzymes). L'invention a donc pour objet une méthode d'analyse des héparines ou des héparines de bas poids moléculaire caractérisée en ce qu'on effectue les étapes suivantes : 1)Dépolymérisation de l'échantillon par action d'héparinases 2)le cas échéant réduction du dépolymérisat 3)Dosage par Chromatographie liquide Haute Performance. L'invention a plus particulièrement pour objet la méthode telle que définie plus haut caractérisée en ce que les héparinases sont sous forme d'un mélange d'héparinase 1 (EC 4. 2.2.7.), d'héparinase 2 (heparin lyase II) et d'héparinase 3 (EC.4.2.2.8.) Le dépolymérisat ainsi préparé est ensuite traité de préférence par une solution de NaBH4 dans l'acétate de sodium. Cette dernière opération permet de réduire spécifiquement les extrémités réductrices qui ne sont pas sous la forme 1,6 anhydro (produits décrit dans la demande de brevet WO 01/72762). Enfin, pour pouvoir quantifier les disaccharides 1 et 2 décrits plus bas, l'échantillon d'héparine de bas poids moléculaire, dépolymérisé par les héparinases, doit être réduit par l'action d'un agent réducteur tel que NaBH4. L'invention a donc plus particulièrement pour objet la méthode telle que définie plus haut caractérisée en ce que l'héparine dépolymérisée est ensuite réduite. L'invention a tout particulièrement pour objet la méthode telle que définie précédemment caractérisée en ce que l'agent de réduction est le NaBH4. On pourra éventuellement utiliser un autre sel de métal alcalin du borohydrure tel que le lithium ou le potassium. Le dosage des terminaisons 1,6 anhydro est ensuite réalisé par CLHP (Chromatographie Liquide Haute Performance) et en particulier par chromatographie échangeuse d'anions. La méthode de dosage selon l'invention permet de bien différencier le Lovenox des autres héparines de bas poids moléculaire qui ne renferment pas ces dérivés 1,6anhydro . Inversement, la méthode de dosage selon l'invention permet de s'assurer que des héparines de bas poids moléculaire ne remplissent pas les caractéristiques physico-chimiques du Lovenox et donc sont de nature différente. La méthode de dosage selon l'invention peut-être appliquée au procédé industriel lors des contrôles d'échantillons au cours du procédé, afin d'assurer une standardisation du procédé de fabrication du Lovenox et obtenir des lots uniformes. Après dépolymérisation enzymatique et réduction des extrémités réductrices, on trouve les dérivés 1,6-anhydro du Lovenox sous 4 formes essentielles. L'invention a donc également pour objet la méthode telle que décrite précédemment caractérisée en ce que les résidus 1,6-anhydro obtenus lors de la réaction de dépolymérisation sont les suivants : Tous les oligosaccharides ou polysaccharides qui comportent l'extrémité 1,6-anhydro sur l'unité disaccharidique terminale et qui ne possèdent pas un 2-0 sulfate sur l'acide uronique, du dit disaccharide terminal, sont totalement dépolymérisés par les héparinases et sous la forme des disaccharides 1 et 2. Par contre, Lorsque le dit saccharide terminal comporte un 2-0 sulfate sur l'acide uronique et qu'il est sous la forme mannosamine, le dérivé 1,6 anhydro se retrouve sous la forme du tétrasaccharide 1 (forme résistante aux héparinases). Le trisaccharide 1 (voir plus bas), est également présent dans le mélange. Il est issu d'un autre processus de dégradation qui conduit à la structure ci-après (phénomène de peeling observé dans lors de la dépolymérisation chimique du Lovenox. Les autres constituants du mélange ne sont pas caractéristiques uniquement du Lovenox. On trouve bien entendu les 8 disaccharides élémentaires de la chaîne héparinique. Ces 8 disaccharides élémentaires sont commercialisés entre autre par la société Sigma. D'autres disaccharides ont été identifiés dans le mélange par la méthode selon l'invention : disaccharides #IISgal et IVSgal qui ont pour origine la 2-0 desulfatation alcaline de -IdoA(2S)-GlcNS(6S)- et de -IdoA(2S)-GlcNSconduisant à la formation de 2 acides galacturoniques. Il ne sont pas habituellement présents dans la structure originelle de l'héparine (U. M. Desai et Coll. Arch. Biochem. Biophys., 306 (2) 461-468 (1993). Les oligosaccharides comportant des glucosamines 3-0 sulfatés résistent au clivage par les héparinases et restent présents sous forme de tétrasaccharides. Dans le cas de la plupart des héparines de bas poids moléculaire, l'héparine est extraite du mucus de porc, et ces tétrasaccharides principaux sont représentés plus bas. Ils sont resistants à la dépolymérisation enzymatique et sont le reflet des séquences affines à l'antithrombine III. Ils sont symbolisés ainsi : IIa-IISglu et AIIa-IVsgl-u. (S.YAMADA, K. YOSHIDA, M. SUGIURA, K. SUGAHARA, K-H KHOO, H. R. MORRIS, A. DELL, J.Biol.Chem. ; 270 (7), 4780-4787 (1993) Le dernier constituant du mélange clivé par les héparinases est la terminaison glycosérine #GlcA-Gal-Gal-Xyl- Ser (K. SUGAHARA, H.TSUDA, K.YOSHIDA, S.YAMADA, J.Biol.Chem. ; 270 (39), 22914-22923 (1995) ; K.SUGAHARA, S.YAMADA, K.YOSHIDA,P. de WAARD, J.F.G. VLIEGENTHART ; J.Biol.Chem. ; 267 (3), 1528-1533 (1992). Ce dernier est généralement presque absent du Lovenox (Voir RMN à l'exemple 5). Un autre aspect de l'invention se situe au niveau du procédé de chromatographie utilisé pour la détermination des groupements 1,6-anhydro. Tout d'abord il s'agit de séparer les différents polysaccharides obtenus après dépolymérisation et traitement par un agent réducteur tel que le NaBH4. La chromatographie d'échange d'anions (SAX) est la méthode séparative la plus adaptée à un tel mélange complexe. Les colonnes remplies d'une phase stationnaire du type Spherisorb SAX de granulométrie 5 m et d'une longueur de 25 cm peuvent être utilisées. Tous les diamètres de colonne classiques, compris entre lmm et 4. 6 mm sont utilisables. L'appareillage utilisé peut-être un chromatographe permettant la formation de gradient d'élution avec un détecteur UV, plus préférablement muni d'une barrette de diodes afin de pouvoir réaliser des spectres UV des constituants et d'enregistrer des signaux complexes, résultant de la différence entre les absorbances à 2 longueurs d'ondes différentes et permettant la détection spécifiques des oligosaccharides acétylés. Pour permettre ce type de détection, des phases mobiles transparentes dans l'UV jusqu'à 200 nm sont préférables. Ceci exclut les phases mobiles classiques à base de NaCl qui ont par ailleurs l'inconvénient de nécessiter un chromatogramme passivé afin de résister au pouvoir corrosif des chlorures. La phase mobile utilisée ici sera de préférence à base de perchlorate de sodium, mais les sels de méthane sulfonate ou phosphate peuvent aussi être utilisés. Le pH préconisé pour la séparation est de 2 à 6,5. Préférentiellement, on utilisera un pH voisin de 3. Il est contrôlé ici par addition d'un sel tel que le phosphate possédant un pouvoir tampon à pH = 3 meilleur que celui des perchlorates. A titre d'exemple, on donne ci-après des conditions standard de séparation chromatographique : Solvant A : NaH2P04 2,5mM porté à pH 2,9 par addition de H3PO4 Solvant B : NaC104 1N- NaH2P04 2,5mM porté à pH 3,0 par addition de H3PO4 Le gradient d'élution peut être le suivant : T=Omin : %B = 3 ; T= 40 min : = 60 ; T = 60 min : %B = 8 0 La présente invention a donc également pour objet une méthode d'analyse telle que définie plus haut par séparation par chromatographie par échange d'anions caractérisée en ce qu'on utilise la phase mobile transparente dans l'UV jusqu'à 200nM. L'invention a plus particulièrement pour objet une phase mobile telle que définie plus haut à base de perchlorate de sodium, de sels de méthane sulfonate ou de sels de phosphate. Un autre aspect tout à fait important se trouve dans la méthode de détection. Une méthode a été développée afin d'accroître la spécificité de la détection UV. Comme les polysaccharides non acétylés ont tous, à un pH donné, un spectre UV assez proche, il est possible de détecter sélectivement les sucres acétylés en prenant comme signal la différence entre l'absorbance à 2 longueurs d'onde choisies de telle manière que l'absorptivité des saccharides non acétylés s'annule. Dans le cas ci-dessous, on choisira 202 nm et 230 nm comme longueurs d'onde de détection et de référence et l'on notera le signal 202 - 230 nm. Le détecteur le plus adapté à cette technique est le détecteur DAD 1100 de la société Agilent Technologies. Dans ce cas, une double détection sera réalisée à 234 nm d'une part, et à 202-230 nm d'autre part. Le principe de détection sélective des oligosaccharides acétylés est illustré sur la figure ci-dessous dans laquelle le spectre UV d'un disaccharide sulfaté Delta ls est comparé avec celui d'un disaccharide acétylé Delta la Norm 600 DIS 500 \ 400 300 Ma zoo N O O M N NI 100 100 - r 0 ######### 200 220 240 260 280 nm La présente invention a donc également pour objet une méthode d'analyse telle que définie plus haut par séparation par chromatographie par échange d'anions caractérisée en ce que la méthode de détection permet de détecter sélectivement les sucres acétylés. L'invention a également tout particulièrement pour objet une méthode d'analyse telle que définie plus haut par séparation par chromatographie par échange caractérisé en ce que la détection sélective des sucres acétylés s'effectue en prenant comme signal la différence entre l'absorbance à 2 longueurs d'onde choisies de telle manière que l'absorptivité des saccharides non acétylés s'annule. La quantification des 4 résidus 1,6-anhydro décrits plus haut nécessite une sélectivité suffisante du système chromatographique vis à vis de tous les autres constituants du mélange. Or, les 2 disaccharides 1 et 2, en général co- élués, sont mal résolus par rapport à Alla, surtout que ce dernier est présent sous la forme de ses 2 anomères a et ss. L'identité des 2 disaccharides 1 et 2 peut être facilement vérifiée car ils se forment en quelques heures à température ambiante dans une solution aqueuse de Ails portée à pH 13 par addition de NaOH. Cependant, si la double détection est utilisée, les oligosaccharides acétylés #IVa, Alla, Ailla, Ala, AIIa-IVs.1, et IIa-IIsqiu sont facilement identifiables. Les causes de dédoublement des pics sont les formes anomères d'une part, et dans une moindre mesure l'épimérisation glucosamine # mannosamine présente partiellement pour Ails, IIIs et #Is lorsqu'ils sont en position terminale dans la chaîne oligosaccharidique. Pour pouvoir quantifier les disaccharides 1 et 2, l'échantillon d'héparine de bas poids moléculaire, dépolymérisé par les héparinases, est réduit par l'action NaBH4 . Anomère a + Anomère ss Cette réduction a pour avantage de supprimer les anoméries [alpha] # P par ouverture du cycle oligosaccharidique terminal. Le chromatogramme obtenu est plus simple puisque les anoméries sont supprimées et surtout la réduction de Alla diminue sa rétention sur la colonne et permet un dosage facile des disaccharides 1 et2. Les exemples de chromatogrammes décrits dans les figures 1 et 2 ci-après illustrent bien ces phénomènes et les avantages de cette méthode. Enfin, l'invention a également pour objet les dérivés saccharidiques nouveaux obtenus par la mise en #uvre du procédé de dépolymérisation et de réduction choisis parmi le disaccharide 1, le disaccharide 2, le disaccharide 3 et le Trisaccharide 1. Les exemples ci-dessous illustrent l'invention sans toutefois avoir un caractère limitatif Exemple 1 : La dépolymérisation enzymatique est réalisée pendant 48heures à température ambiante en mélangeant 50 /il d'une solution à 20 mg/ml de l'héparine de bas poids moléculaire à doser, 200 /il dune solution 100mM acide acétique/NaOH à pH 7. 0 contenant 2 mM d'acétate de calcium et 1 mg/ml de BSA avec 50 /il de la solution mère des 3 héparinases. La réduction est réalisée sur 601 du produit dépolymérisé par les héparinases en rajoutant 10 /il d'une solution de NaBH4 à 30 g/1 dans l'acétate de sodium 100 mM préparée extemporanément. On notera que les héparinases sont conservées à - 30 C. Les héparinases sont en solution tampon et leur titre est de 0.5 UI/ml (Composition de la solution tampon : solution aqueuse pH 7 de KH2PO4 à une concentration 0. 01 mole/1 et additionnée de sérum d'albumine bovine (BSA) à 2 mg/ml). Exemple 2 : RMN du Disaccharide 3 obtenu selon le procédé décrit plus haut Spectre proton dans D20, 400 MHz, T=298K, 8 en ppm : 3,34(1H, dd, J=7 et 2Hz, H2), 3,72 (1H, t, J=8Hz, H6), 3,90 (1H, m, H3), 4,03 (1H, s, H4), 4,20 (1H, d, J=8Hz, H6), 4,23 (1H, t, J=5Hz, H3'), 4,58 (1H, m, H2'), 4,78 (1H, m, H5), 5,50 (1H, s, Hl), 5,60 (1H, dd, J=6 et lHz, H1'), 6,03 (1H, d, J=5Hz, H4')]. Exemple 3 RMN du Tetrasaccharide 1 obtenu selon le procédé décrit plus haut. Spectre proton dans D20, 400 MHz, T=298K, 8 en ppm : 3,15(1H, s, H2), 3,25 (1H, m, H2 " ) , 3,60 (1H, m, H3''), entre 3,70 et 4,70 (14H, massif, H3/H4/H6, H2'/H3'/H4'/H5', H4''/H5''/H6'', H2 " ' /H3 " ' ) , 4,75 ( 1H, m, H5 ) , entre 5,20 et 5,40 (2H, m, Hl' et Hl''), 5,45 (1H, m, Hl'''), 5,56 (1H, m, Hl), 5,94 (1H, d, J=5Hz, H4) Exemple 4 : RMN du Trisaccharide 1 obtenu selon le procédé décrit plus haut. Spectre dans D20, 600 MHz (8en ppm): 3,28 (1H, m), 3,61 (1H, t, 7Hz), 3,79 (1H, t, 7Hz), 3,95 (1H, d, 6Hz), 4,00 (1H, s), 4,20 (1H, m), 4,28 (2H, m), 4,32 (1H, d, 4Hz), 4,41 (1H, s), 4,58 (1H, s), 4,61 (1H, s), 4,90 (1H, s large), 5. 24 (1H, s) , 5,45 (1H, s) , 5, 95 (1H, s) . Exemple 5 : RMN du AGlcA-Gal-Gal-Xyl-Ser Spectre dans D20, 500 MHz (8 en ppm): 3,30 (1H, t, 7Hz), 3,34 (1H, t, 8Hz), 3,55 (1H, t, 7Hz), 3,60 (1H, t, 7Hz), entre 3,63 et 3,85 (10H, m), 3,91 (2H, m), 3,96 (1H, dd, 7 et 2Hz), entre 4,02 et 4,10 (3H, m), 4,12 (1H, d, 2Hz), 4,18 (1H, m), 4,40 (1H, d, 6Hz), 4,46 (1H, d, 6Hz), 4,61 (1H, d, 6Hz), 5,29 (1H, d, 3Hz), 5,85 (1H, d, 3Hz). Exemple 6 : Principe de la quantification Dans la méthode selon l'invention, il est fait comme hypothèse, largement admise, que tous les oligosaccharides insaturés contenus dans le mélange ont la même absorptivité molaire, égale à 5500 mole-1.1. cm-1. Il est donc possible de déterminer le pourcentage en poids de tous les constituants du mélange dépolymérisé dans l'héparine de bas poids moléculaire de départ. Pour les 4 dérivés 1,6 anhydro qui correspondent aux pics 7,8,13 et 19, on obtient les pourcentages en poids suivants: % w/w +8 =ioo- 443 (Area + Areag ) 7+8 - #MWx#Areax % / =100# 545#Area13 #MWx#Areax ... 1210-Area13 % w/w9 =100 . 1210 Area,3 loWW19- L.,Mwx . AreaX Area7 , Area8 , Areal3 et Areaig correspondent aux aires de chacun des pics 7,8,13 et 19. Les masses molaires de chacun de ces 4 composés sont respectivement 443,443, 545 et 1210. #MW -Area correspond au rapport de l'aire de chaque pic du chromatogramme par la masse molaire du produit correspondant. Si Mw est la masse moyenne de l'héparine de bas poids moléculaire étudiée, le pourcentage de chaînes oligosaccharidiques se terminant par un cycle 1,6 anhydro est obtenu de la façon suivante : f%w/\V7+8 %W/WB %w/w, ll.6anhydro - Mw ' C 443 + 5 1210 j Les masses moléculaires des constituants sont les suivantes : Oligosacchari Oligosacchari Masse de de après réduction moléculaire 1 1 741 2 20 401 3 3 734 4 21 461 5 22 461 6 23 503 7 7 443 8 8 443 9 24 503 10 25 563 11 26 563 12 27 563 13 13 545 14 28 605 15 29 1066 16 30 665 17 31 965 18 32 1168 19 19 1210 Nomenclature des saccharides et correspondance avec les pics selon les figures 1 et 2 IdoA : acide -a-L-Idopyranosyluronique; GlcA: : acide -p-D-Glucopyranosyluronique; #GlcA :acide 4,5-insaturaté : acide 4-déoxy-a-L-threohex-4-enepyranosyluronique Gal : D-Galactose ; Xyl : xylose ; GlcNAc : 2-deoxy-2-acetamido-a-D-glucopyranose; GlcNS : 2-deoxy-2-sulfamido-a-D-glucopyranose; 2S : 2-0 sulfate , 3S : 3-0 sulfate , 6S : 6-0 sulfate 1 AGlcApi-3 Galpi-3 Galpi-4 Xyl ss1-O-Ser 2 : acide 4-désoxy-a-L-thréo-hex-enepyranosyluronique- (1# 4)-2-désoxy-2-acétamido-a-D-glucopyranosyl sel de sodium 3 : AGlcApl-3 Galpl-3 Gai Pi -4 Xyl (31-O-CH2-COOH 4 : acide 4-deoxy-a-L-threo-hex-4-enegalactopyranosyluro- nique-(1# 4)-2-deoxy-2-sulfamido-p-D-glucopyranose sel de disodium 5 : acide 4-désoxy-a-L-thréo-hex-enepyranosyluronique- (1# 4)-2-désoxy-2-sulfamido- -a-D-glucopyranosyl sel de disodium 6 : acide 4-désoxy-a-L-thréo-hex-enepyranosyluronique- (1- 4)-2-désoxy-2-acétamido-6-O-sulfo-a-D-glucopyranosyl sel de disodium 7 : acide 4-deoxy-a-L-threo-hex-4-enepyranosyluronique- (1 4)-1,6-anhydro-2-deoxy-2-sulfamido-p-D-glucopyranose sel de disodium (disaccharide 1) 8 : acide 4-deoxy-a-L-threo-hex-4-enepyranosyluronique- (1 4)-1,6-anhydro-2-deoxy-2-sulfamido-(3-D-mannopyranose sel de disodium (Disacharide 2) 9 : acide 4-désoxy-2-0-sulfo-a-L-thréo-hex-enepyranosylu- ronique-(1# 4)-2-désoxy-2-acétamido-a-D-glucopyranosyl sel de disodium 10 : acide 4-deoxy-a-L-threo-hex-4-enegalactopyrano- syluronique-(1--> 4) -2-deoxy-2-sulfamido-6-O-sulfo-(3-D- glucopyranose sel de triisodium 11 : acide 4-désoxy-a-L-thréo-hex-enepyranosyluronique- (1# 4)-2-désoxy-2-sulfamido-6-0-sulfo-a-D-glucopyranosyl sel de trisodium 12 : acide 4-désoxy-2-0-sulfo-a-L-thréo-hex-enepyrano- syluronique- (1# 4)-2-désoxy-2-sulfamido-a-D-glucopyranosyl sel de trisodium 13 : acide 4-deoxy-2-0-sulfo-a-L-threo-hex-4-enepyrano- syluronique- (1# 4)-1,6-anhydro-2-deoxy-2-sulfamido--D- glucopyranose sel de trisodium (Disaccharide 3) 14 : acide 4-désoxy-2-0-sulfo-a-L-thréo-hex-enepyrano- syluronique- (1# 4)-2-désoxy-2-acétamido-6-0-sulfo-a-Dglucopyranosyl sel de trisodium 15 : acide 4-désoxy -a-L-thréo-hex-enepyranosyluronique- (1# 4)-2-désoxy-2-acétamido-6-0-sulfo-a-D-glucopyranosyl- (1--> 4)-acide P-D-glucopyranosyluronique-(1-> 4)-2-désoxy-2- sulfamido-3-O-sulfo-a-D-glucopyranosyl) sel de pentasodium 16 : acide 4-désoxy-2-0-sulfo-a-L-thréo-hex-enepyrano- syluronique- (1# 4)-2-désoxy-2-sulfamido-6-0-sulfo-a-D- glucopyranosyl sel de tétrasodium 17 : acide 4-désoxy-a-L-thréo-hex-enepyranosyluronique- (1 4)-2-désoxy-2-acétamido-6-O-sulfo-a-D-glucopyranosyl- (1 4)-acide -D-glucopyranosyluronique-(1 4)-2-désoxy-2- sulfamido-3,6-di-O-sulfo-a-D-glucopyranosyl) sel d'hexasodium 18 : acide 4-désoxy-2-0-sulfo-a-L-thréo-hex- enepyranosyluronique-(1 4)-2-désoxy-2-sulfamido-6-O-sulfo-D- glucopyranosyl-(1# 4)-acide-2-0-sulfo a-L-idopyranosyluronique sel d'hexasodium 19 : acide 4-désoxy-2-0-sulfo-a-L-thréo-hex-enepyrano- syluronique-(1# 4)-2-désoxy-2-sulfamido-6-0-sulfo-a-D- glucopyranosyl-(1# 4)-acide-2-0-sulfo a-L-idopyrano- syluronique-(1-> > 4) -1, 6-anhydro-2-deoxy-2-sulfamido-P-D- mannopyranose, sel de heptasodium (tetrasaccharide 1) 20 : acide 4-désoxy-a-L-thréo-hex-enepyranosyluronique- (1 4)-2-désoxy-2-acétamido-a-D-glucitol sel de sodium 21 : acide 4-deoxy-a-L-threo-hex-4-enegalactopyrano- syluronique-(1# 4)- 2-deoxy-2-sulfamido-p-D-glucitol sel de disodium 22 : acide 4-désoxy-a-L-thréo-hex-enepyranosyluronique- (1# 4)-2-désoxy-2-sulfamido-a-D-glucitol sel de disodium 23 : acide 4-désoxy-a-L-thréo-hex-enepyranosyluronique- (1# 4)-2-désoxy-2-acétamido-6-0-sulfo-a-D-glucitol sel de disodium 24 : acide 4-désoxy-2-0-sulfo-a-L-thréo-hex-enepyrano- syluronique- (1# 4)-2-désoxy-2-acétamido-a-D-glucitol sel de disodium 25 : acide 4-deoxy-a-L-threo-hex-4-enegalactopyrano- syluronique-(1-> 4)- 2-deoxy-2-sulfamido-6-0-sulfo-(3-D- glucitol sel de triisodium 26 : acide 4-désoxy-a-L-thréo-hex-enepyranosyluronique- (1# 4)-2-désoxy-2-sulfamido-6-0-sulfo-a-D-glucitol sel de trisodium 27 : acide 4-désoxy-2-0-sulfo-a-L-thréo-hex-enepyrano- syluronique- (1# 4)-2-désoxy-2-sulfamido-a-D-glucitol sel de trisodium 28 : acide 4-désoxy-2-0-sulfo-a-L-thréo-hex-enepyrano- syluronique- (1# 4)-2-désoxy-2-acétamido-6-0-sulfo-a-Dglucitol sel de trisodium 29 : acide 4-désoxy -a-L-thréo-hex-enepyranosyluronique- (1- 4)-2-désoxy-2-acétamido-6-0-sulfo-a-D-glucopyranosyl-(1- 4)-acide (3-D-glucopyranosyluronique-(1 4)-2-désoxy-2- sulfamido-3-O-sulfo-a-D-glucitol) sel de pentasodium 30 : acide 4-désoxy-2-0-sulfo-a-L-thréo-hex-enepyrano- syluronique-(1-> 4)-2-désoxy-2-sulfamido-6-O-sulfo-a-D- glucitol sel de tétrasodium 31 : acide 4-désoxy -a-L-thréo-hex-enepyranosyluronique- (1# 4)-2-désoxy-2-acétamido-6-0-sulfo-a-D-glucopyranosyl- (1 4)-acide (3-D-glucopyranosyluronique-(1- 4)-2-désoxy-2- sulfamido-3,6-di-O-sulfo-a-D-glucitol) sel d'hexasodium 32 : acide 4-désoxy-2-0-sulfo-a-L-thréo-hex- enepyranosyluronique-(1- 4)-2-désoxy-2-sulfamido-6-0-sulfoa-D-glucopyranosyl-(1- 4)-acide -2-O-sulfo a-L- idopyranosyluronique sel d'hexasodium (forme réduite par NaBH4) . REVENDICATIONS 1) Méthode d'analyse des héparines ou des héparines de bas poids moléculaire caractérisée en ce qu'on effectue les étapes suivantes : 1 - Dépolymérisation de l'échantillon par action d'héparinases 2 - le cas échéant réduction du dépolymérisat 3-Dosage par Chromatographie liquide Haute Performance. 2) Méthode telle que définie à la revendication 1 caractérisée en ce que l'on recherche la présence de chaînes oligosaccharides dont la terminaison est modifiée par une liaison 1,6anhydro. 3) Méthode telle que définie à la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que les héparinases sont sous forme d'un mélange d'héparinase 1 (EC 4. 2.2.7.), d'héparinase 2 (heparin lyase II) et d'héparinase 3 (EC.4.2.2.8.) 4) Méthode telle que définie à la revendication 1 caractérisée en ce que l'héparine dépolymérisée par action d'héparinase (dépolymérisat) est ensuite soumise à un agent de réduction. 5) Méthode telle que définie à la revendication 4 caractérisée en ce que l'agent de réduction est le NaBH4 ou un sel de métal alcalin de l'anionborohydrure. 6) Méthode telle que définie à la revendication 1 dans laquelle la méthode chromatographique utilisée est une chromatographie par échange d'anion. 7) Méthode telle que définie à la revendication 6 caractérisée en ce que l'on utilise une phase mobile transparente dans l'UV jusqu'à 200 nm. 8) Méthode telle que définie à la revendication 6 ou 7 caractérisée en ce que la phase mobile utilisée est à base de perchlorate de sodium, les sels de méthane sulfonate ou les sels de phosphate. 9) Méthode telle que définie à la revendication 6 caractérisée en ce qu'on utilise une méthode de détection permettant de détecter sélectivement les sucres acétylés. 10) Méthode telle que définie à la revendication 9 caractérisée en ce que la détection sélective des sucres acétylés s'effectue en prenant comme signal la différence entre l'absorbance à 2 longueurs d'onde choisies de telle manière que l'absorptivité des saccharides non acétylés s'annule. 11) Méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce que les résidus 1-6 anhydro obtenus lors de la réaction de dépolymérisation sont les suivants :