Brevet FR2844520A1 — publié le 20040319

La présente invention concerne l'utilisation d'un anticorps pour la fabrication d'un médicament destiné à induire la sécrétion d'au moins une cytokine par une cellule effectrice appartenant au système immunitaire, ledit anticorps étant caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé de sélection comprenant une mise en contact de cellules effectrices du système immunitaire exprimant le récepteur CD16, transformées ou non, dans un milieu réactionnel en présence de l'anticorps à tester et de l'antigène dudit anticorps et une mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le récepteur CD 16. L'immunothérapie à l'aide d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux est en passe de devenir un des aspect les plus importants de la médecine. En revanche, les résultats obtenus lors d'essais cliniques apparaissent contrastés. En effet, il peut s'avérer que l'anticorps monoclonal ne soit pas suffisamment efficace. Aujourd'hui, la recherche s'oriente sur le fragment Fcy de l'immunoglobuline afin d'améliorer les propriétés des anticorps. A terme, cela devrait permettre l'obtention d'anticorps qui interagissent et activent les récepteurs des cellules effectrices (macrophage, lymphocyte T, H et NK). La fixation d'un anticorps sur son ligand peut induire une activation de certaines cellules effectrices via leurs récepteurs Fc. Une des conséquences de l'activation des cellules est non seulement l'induction de propriétés fonctionnelles, comme l'ADCC ou l'activation du complément, mais aussi la production de cytokines. Ces cytokines, produites au site d'activation des effecteurs, peuvent exercer différentes activités biologiques. Or, dans le cadre de l'invention, on a trouvé que l'activation les récepteurs des cellules effectrices produits des réponses très différentes conduisant à la libération d'une ou plusieurs cytokines. Ces cytokines sont responsables de l'activation ou de l'inhibition de certains composants du système immunitaire selon le cas. Ainsi, le problème est de savoir qu'elle est la capacité d'un anticorps donné à stimuler la production de cytokines par les cellules effectrices et quelles sont les conséquences d'une telle activation en fonction de la nature des cytokines libérées. Il peut s'avérer par exemple q'un même anticorps dirigé contre un antigène donné soit complètement inefficace lors qu'il est produit dans des lignées de myélome de souris, alors qu'il se montre très efficace lors qu'il est produit dans d'autres lignées cellulaires. Ainsi, l'objectif est d'utiliser des anticorps qui ont été préalablement sélectionnés pour leur capacité à activer tels ou tels composants du système immunitaire, par exemple l'ADCC ou au contraire qui sont incapables d'induire une réponse cytotoxique. A cet effet, on a trouvé que la fixation d'un anticorps sur son ligand peut induire une activation de la cellule Jurkat transfectée CD16 induisant la sécrétion d'IL2. Une forte corrélation est observée entre la sécrétion d'IL2 par Jurkat CD16 et l'activité ADCC médiée par le CD16 des cellules effectrices. L'invention propose donc d'utilisation des anticorps sélectionnés par un test jurkat CD16 par mesure d'IL2 sécrétée ou d'autres cytokines, ce qui permet de garantir l'activité biologique desdits anticorps pour un usage thérapeutique. Description Ainsi, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'un anticorps pour la fabrication d'un médicament destiné à induire la sécrétion d'au moins une cytokine par une cellule effectrice appartenant au système immunitaire, ledit anticorps étant caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé de sélection comprenant une mise en contact de cellules effectrices du système immunitaire exprimant le récepteur CD 16, transformées ou non, dans un milieu réactionnel en présence de l'anticorps à tester et de l'antigène dudit anticorps et une mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le récepteur CD 16. On entend par cellule transformée, une cellule modifiée génétiquement de sorte à exprimer un récepteur, en particulier le récepteur CD 16. De préférence, on utilise pour la sélection des anticorps une lignée Jurkat transfectée avec un vecteur d'expression codant pour le récepteur CD16 comme cellule effectrice. Cette lignée est particulièrement avantageuse car elle est immortalisée et se développe indéfiniment dans des milieux cultures. Lesdites cytokines libérées sont des interleukines, des interférons et des facteurs de nécrose tissulaire (TNF), Ainsi, l'anticorps sélectionné a la capacité d'induire la sécrétion d'au moins une cytokine choisie parmi IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10,... TNFa et IFN ? les cellules effectrices du système immunitaire exprimant le récepteur CD16. De préférence, l'anticorps sélectionné a la capacité d'induire la sécrétion d'IL-2 par les cellules effectrices du système immunitaire exprimant le récepteur CD 16. Le taux d'interleukine IL2 sécrétée reflète la qualité de l'anticorps fixé par le récepteur CD 16 quant à son intégrité (fonction FC) et à son efficacité (site antigénique) de liaison à l'antigène. La mesure du taux d'IL2 est corrélée à une activité du type ADCC. En outre, l'anticorps peut être sélectionné après avoir été purifié. La sélection peut se faire sur des anticorps produits par des cellules couramment utilisées pour la production d'anticorps thérapeutiques, telles que CHO, YB2/0, les cellules lymphoblastoïdes humaines, les cellules d'insectes et les cellules de myélomes murines. La sélection peut également être appliquée à l'évaluation aux anticorps produits par des plantes transgéniques ou de mammifères transgéniques. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps sélectionné est capable d'induire la sécrétion d'au moins une cytokine par une cellule leucocytaire, en particulier de la famille des NK (natural killer) ou par des cellules du groupe monocytes-macrophages. L'invention se rapporte également l'utilisation des anticorps sélectionnés décrits cidessus spécifiques d'un antigène qui provient d'une cellule pathologique ou d'un organisme pathogène pour l'homme. Cet anticorps est un anticorps monoclonal ou polyclonal. Par exemple, l'anticorps est un anticorps monoclonal ou polyclonal de spécificité anti Rhésus du globule rouge humain. L'anticorps selon l'invention peut également être un anticorps dirigé contre des virus pathogènes pour l'homme, contre des antigènes de tumeurs malignes ou contre les antigènes d'une bactérie ou d'un parasite pathogène pour l'homme. Avantageusement, l'anticorps sélectionné montre une augmentation supérieure à 100%, 250%, 500%, ou 1000% du taux de libération d'IL-2 par rapport au contrôle en absence d'anticorps ou en présence d'un anticorps donné comme référence négative. Les procédés décrits ci-dessus peuvent éventuellement être réalisés en présence d'immunoglobulines humaines (IVIg). Dans un aspect supplémentaire, l'invention vise l'utilisation desdits anticorps sélectionnés comme support thérapeutique en médecine humaine, notamment pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des maladies autoimmunes, inflammatoires, des cancers et des infections par des agents pathogènes. Dans un autre aspect, l'invention porte sur un kit permettant d'évaluer l'activité biologique d'un anticorps comprenant des moyens et des réactifs nécessaires pour le dosage d'au moins une cytokine, par exemple IL-2, IFN et/ou TNF, et des cellules effectrices exprimant un ou plusieurs récepteurs FcR, notamment le récepteur CD 16. Légende FIGURE 1 : Libération de cytokine (IL-2, IFN et TNF) de leucocytes induits par des anticorps en présence de leur cible. A- Schéma d'activation des leucocytes. B- Les leulocytes ont été incubés avec différents anticorps en présence d'hématies. Après une nuit d'incubation, la libération de TNFa et IFN ? le surnageant a été quantifiée par ELISA. FIGURE 2 : Libération de cytokine (IFN, TNF) de cellules NK induites par des anticorps en présence de leur cible (LFB-R297-RBC) - 13/06/02 A- Schéma d'activation des cellules NK. B-Des cellules NK purifiées ont été mélangées avec différents anticorps anti-D en présence d'hématies rhésus +. Après une nuit d'incubation, la libération de TNFa et IFN ? dans le surnageant a été quantifiée par ELISA. FIGURE 3 : Libération de cytokine (IFN, TNF) de cellules NK induites par des anticorps en présence de leur cible (LFB-R297-RBC) - 13/08/02 Des cellules NK purifiées ont été mélangées avec différents anticorps anti-D en présence d'hématies rhésus +. Après une nuit d'incubation, la libération de TNFa et IFN ? dans le surnageant a été quantifiée par ELISA. FIGURE 4 : Libération d'IL2 de Jurkat CD16 induites par un anti-CD20 A- Schéma d'activation de cellule Jurkat. B- Des cellules Jurkat CD 16 ont été mélangées avec différents anticorps anti-CD20 en présence d'hématies rhésus + et de PMA. Après une nuit d'incubation, la libération d'IL-2 dans le surnageant a été quantifiée par ELISA. FIGURE 5 : Libération d'IL2 de Jurkat CD16 induites par un anti-D A- Schéma d'activation de cellule Jurkat. B- Des cellules Jurkat CD16 ont été mélangées avec différents anticorps anti-D en présence d'hématies rhésus + et de PMA. Après une nuit d'incubation, la libération d'IL-2 dans le surnageant a été quantifiée par ELISA. Exemple 1 : Jurkat CD16 Anticorps témoins : Anticorps polyclonaux WinRho, anticorps monoclonal DF5-EBV, anticorps monoclonal DF5-YB2/0 Principe : Ce test estime la capacité des anticorps anti-D à se fixer sur le récepteur CD16 (Fc gamma RIII) exprimé sur les cellules Jurkat CD16 et à induire la secrétion d'IL2. Ce test consiste à mettre en contact en P96 : anticorps anti-D, les hématies Rhésus positives traitées à la papaïne, les cellules Jurkat CD16 et du PMA. Après une nuit d'incubation à 37 C, on centrifuge les P96 et on dose dans le surnageant la quantité d'IL2 secrétée. Mode opératoire Matériel Anticorps témoins positif: Poly-D WinRho, DF5 YB2/0. Anticorps témoins négatifs : DF5 Hématies Rhésus positif Cellules Jurkat CD 16 Kit dosage IL2 : Quantikine de chez R/D. Méthode Traitement à la papaïne des hématies. 1ml de culot d'hématies incubé avec 1ml d'une solution de papaïne (Img/ml) diluées en PBS incubée lOmn à 37 C. Puis 3 lavages en H20-NaCl 0.15M. Mélange réactionnel : -Anticorps : 50 l d'une dilution à 150ng/ml en IMDM 5% SVF -PMA 50 l d'une dilution à 40ng/ml en IMDM 5% SVF -Hématies traitées à la papaïne. 50 l à 8 106/ml en IMDM 5% SVF -Jurkat CD 16. 50 ul à 2x 106/ml en IMDM 5% SVF Incubation 1 nuit à 37 C Puis centrifugation des plaques, prélèvement de 100(il de surnageants et dosage d'IL2 avec le kit commercial. lecture à 450nm. On donne les valeurs (en pg/ml) sous forme d'histogramme pour chaque échantillon. Exemple 2 : de cellules NK et production d'IL2 et d'IFNy Modèle de mise au point : lignée cellulaire Jurkat transfectée avec le gène codant pour le récepteur CD 16. Applications : renforcement d'une réponse anti-tumorale. L'IL2 induit une activation des lymphocytes T et des cellules NK pouvant aller jusqu'à une stimulation de la prolifération cellulaire. L'IFNy stimule l'activité des CTLs et peut renforcer l'activité des macrophages. Exemple 3 : activation de monocytes macrophages et production de TNF et d'ILIRa Applications : renforcement de la phagocytose et induction de propriétés antiinflammatoires. Le TNF stimule la prolifération des macrophages et des lymphocytes infiltrant les tumeurs. L'IL-IRa est une cytokine qui entre en compétition avec l'ILl au niveau de son récepteur et exerce ainsi un effet anti-inflammatoire. Exemple 3 : activation de cellules dendritiques et production d'IL10 Applications : induction d'une tolérance spécifique à certains antigènes. L'ILIO est une molécule inhibitrice de l'activation de différentes cellules effectrices et de la production de cytokines. 1. Procédé de sélection d'un anticorps pour la fabrication d'un médicament destiné à induire la sécrétion d'au moins une cytokine par une cellule effectrice appartenant au système immunitaire, comprenant une mise en contact de cellules effectrices du système immunitaire exprimant le récepteur CD16, transformées ou non, dans un milieu réactionnel en présence de l'anticorps à tester et de l'antigène dudit anticorps et une mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le récepteur CD16. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est mis en #uvre avec une cellule Jurkat exprimant le récepteur CD 16. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que les cytokines libérées sont des interleukines. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que les cytokines libérées sont des interférons. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que les cytokines libérées sont des facteurs de nécrose tissulaire (TNF). 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que l'anticorps sélectionné a la capacité d'induire la sécrétion d'au moins une cytokine choisie parmi IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, TNFa et IFNy par les cellules effectrices du système immunitaire exprimant le récepteur CD16. 7. Procédé selon la revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ce que l'anticorps sélectionné a la capacité d'induire la sécrétion d'IL-2 par les cellules effectrices du système immunitaire exprimant le récepteur CD 16. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'anticorps est sélectionné après avoir été purifié. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'antigène provient d'une cellule pathologique ou d'un organisme pathogène pour l'homme. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'anticorps sélectionné est capable d'induire la sécrétion d'au moins une cytokine par une cellule leucocytaire, en particulier de la famille des NK (natural killer) ou par des cellules du groupe monocytes-macrophages. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'anticorps est un anticorps monoclonal ou polyclonal. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'anticorps est un anticorps de specificité anti Rhésus du globule rouge humain. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'anticorps est un anticorps dirigé contre des virus pathogènes pour l'homme. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'anticorps est un anticorps dirigé contre des antigènes de tumeurs malignes. 15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'anticorps est un anticorps dirigé contre les antigènes d'une bactérie ou d'un parasite pathogène pour l'homme. 16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que l'anticorps sélectionné montre une augmentation supérieure à 100%, 250%, 500%, ou 1000% du taux de libération d'IL-2 par rapport au contrôle en absence d'anticorps ou en présence d'un anticorps donné comme référence négative. 17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16 dans lequel l'anticorps sélectionné est utile comme support thérapeutique en médecine humaine. 18. Procédé selon l'une des revendications 1 à 17 dans lequel l'anticorps sélectionné est destiné à la fabrication d'un médicament pour le traitement des maladies autoimmunes, inflammatoires, des cancers et des infections par des agents pathogènes. 19. Kit permettant d'évaluer l'activité biologique d'un anticorps comprenant des moyens et des réactifs nécessaires et des cellules effectrices exprimant le récepteur CD16 pour la mise en mise du procédé selon l'une des revendications 1 à 18 permettant le dosage d'au moins une cytokine, notamment IL-2, IFN et TNF.