Brevet FR2843973A1 — publié le 20040305

L'invention concerne la production de protéines hétérologues chez des bactéries à Gram-positif, notamment des bactéries lactiques. A coté de leurs usages traditionnels dans l'industrie agro-alimentaire, les bactéries lactiques sont actuellement de plus en plus utilisées en tant que cellules hôtes pour la production de protéines hétérologues d'intérêt. Ces protéines d'intérêt peuvent être de nature très variée, et il est donc souhaitable de disposer du choix le plus large possible d'outils d'expression pour pouvoir optimiser leur production en fonction des spécificités de chacune d'entre elles. De manière générale, il est nécessaire d'utiliser des promoteurs forts, permettant d'obtenir un niveau d'expression suffisant du gène d'intérêt. Dans certains cas, on peut utiliser des promoteurs constitutifs ; dans d'autres cas (par exemple lorsque le produit du gène d'intérêt est toxique pour la bactérie hôte ou risque d'interférer avec le métabolisme de celleci), il est préférable d'utiliser des promoteurs inductibles, permettant de déclencher ou d'arrêter l'expression au moment souhaité. Bien que les bactéries lactiques possèdent de nombreux gènes dont la transcription est régulée par divers facteurs, on ne dispose à l'heure actuelle que d'un choix relativement restreint de promoteurs inductibles utilisables en pratique pour la construction de cassettes d'expression de gènes d'intérêt (pour revue, cf. DE VOS, Curr. Op. Microbiol., 2,289-295, 1999). En effet, cette utilisation demande non seulement que les promoteurs concernés soient régulables, mais encore qu'il existe un différentiel d'expression suffisant entre les différents états d'induction ; idéalement, l'expression doit atteindre un niveau élevé en conditions d'induction, et pouvoir être totalement bloquée en conditions de noninduction. En outre, il est nécessaire de pouvoir maîtriser facilement les facteurs intervenant dans la régulation de ces promoteurs. Lors de travaux précédents, visant à identifier des protéines exportées de L. lactis (POQUET et al., J. Bacteriol., 180,1904-1912, 1998), les Inventeurs ont cloné, en fusion avec le gène rapporteur #SPNuc, un fragment d'ADN génomique de la souche L. lactis MG1363, comprenant un gène dénommé à l'époque nlp3 (new lipoprotein 3) , dont le produit présente des homologies avec une protéine de S. pneumoniae impliquée dans le transport des métaux. La séquence de ce fragment est disponible sur GENBANK sous le numéro U95834. Les Inventeurs ont également observé que le gène nlp3 était négativement régulé par des cations métalliques divalents, notamment Zn2+ (POQUET et al. Use of a new reporter tool to demonstrate metal regulation of nlp3, a gene putatively involved in metal uptake in Lactococcus lactis ; 6th Symposium on Lactic Acid Bacteria, Veldhoven, Pays-Bas, 19-23 septembre 1999). D'autre part, dans le cadre du séquençage complet du génome de L. lactis IL1403, le gène nlp3, renommé zitS, a été identifié en tant que constituant d'un opéron, dénommé zitRSQP (BOLOTIN et al., Antonie van Leeuwenhoek, 76,27-76, 1999 ; BOLOTIN et al., Genome Res. 11,731, 2001). Par homologie avec des séquences connues, des fonctions putatives dans le transport du zinc ont été attribuées aux gènes de cet opéron. Ainsi, le produit du gène zitP constituerait la perméase du système de transport, les produits du gène zitS et du gène zitQ assureraient respectivement la liaison avec le substrat et la liaison avec l'ATP, et le produit du gène zitR, qui présente des homologies avec la famille de répresseurs transcriptionnels marR, serait impliqué dans la régulation du transport du zinc. Il n'avait jusqu'à présent pas été envisagé d'utiliser le système de régulation de l'opéron zitRSQP pour .contrôler l'expression de gènes hétérologues. En effet, bien qu'une régulation négative puisse être déclenchée par l'ajout de zinc (POQUET et al., 1999 précité), le niveau d'expression de base observé en l'absence de cette régulation négative n'apparaissait pas suffisant pour permettre une production satisfaisante de protéines d'intérêt. En outre, on ignorait si le répresseur putatif ZitR était effectivement impliqué dans la répression de l'expression de cet opéron, et si d'autres régulateurs, notamment les régulateurs pléiotropes flp, décrits comme intervenant dans la régulation du transport du zinc chez L. lactis (GOSTICK et al., Mol. Microbiol., 31,1523-35, 1999 ; SCOTT et al., FEMS Microbiol. Lett., 192,85-89, 2000), pouvaient également être impliqués, soit en tant que corépresseurs, soit au contraire en tant qu'activateurs éventuels. Or, en poursuivant leurs études sur la régulation de l'opéron zitRSQP, les Inventeurs ont constaté, en présence de très faibles concentrations en Zn2+, un niveau maximal d'expression beaucoup plus fort que ce que l'on pouvait supposer d'après les expérimentations antérieures, et qui permet d'atteindre un facteur d'induction supérieur à 100. En outre, ils ont constaté que l'expression était indépendante des régulateurs flp, et pouvait être totalement contrôlée par l'intermédiaire de la protéine ZitR. L'étude de la structure du promoteur de l'opéron zitRSQP de L. lactis a permis aux Inventeurs de mettre en évidence, outre les éléments classiquement présents dans les promoteurs bactériens, à savoir les boites-35 (TTGACA) et-10 (TATAAT) séparées par 17pb, une séquence en palindrome chevauchant la boîte -35, qui représente très probablement le site de fixation de ZitR. Les observations rapportées ci-dessus permettent de supposer que la régulation de zitRSQP s'effectue selon le mécanisme suivant : le répresseur ZitR peut former avec le Zn2+ intracellulaire un complexe présentant une affinité très importante pour le site de fixation chevauchant la boîte -35 ; le complexe ZitR-Zn2+ fixé sur le palindrome empêche l'accès de l'ARN polymérase à la boîte -35, et réprime donc la transcription ; en revanche, la forme non-complexée de ZitR ne se fixe pas sur le site-35, permettant la transcription de l'opéron, qui s'effectue alors avec une grande efficacité. La régulation de l'opéron zitRSQP par l'intermédiaire de ZitR dépend donc de la concentration intracellulaire en Zn2+, elle-même fonction de la disponibilité en Zn2+ dans le milieu de culture. L'opéron zitRSQP représente très probablement un système de transport du zinc de très haute affinité qui n'est utilisé par la bactérie que dans des conditions de carence en zinc très sévère, pour permettre la survie cellulaire ; en revanche, dans les conditions de culture habituelles sur milieux riches, le zinc est présent en abondance dans l'environnement, et transporté dans la cellule par des systèmes de moindre affinité que le complexe ZitSPQ, dont la synthèse est alors réprimée. Ces propriétés du système de régulation de l'opéron zitRSQP de L. lactis mises en évidence par les Inventeurs permettent de proposer son utilisation pour la production de protéines d'intérêt dans des bactérieshôtes, notamment des bactéries Gram-positif, et en particulier des bactéries lactiques. La présente invention a pour objet les différents aspects de cette utilisation. Selon une première variante, la présente invention a pour objet une cassette d'expression constituée par : - un promoteur bactérien, dénommé ci-après pZn, contenant un site de fixation pour la protéine ZitR de Lactococcus lactis, lequel site comprend la séquence suivante : AAAAATAANGTNNNNNNNTTGACATTATTTTT (SEQ ID N0:1), dans laquelle TTGACA représente la boîte -35 dudit promoteur, et N représente A, C, G, ou T ; - une séquence codant pour un polypeptide présentant au moins 80%, de préférence au moins 85%, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité avec la protéine ZitR de Lactococcus lactis (GENBANK AAK06214), placée sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur ; - au moins un site de restriction permettant l'insertion d'une séquence nucléotidique d'intérêt sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, le promoteur pZn comprend la séquence suivante : AAAAATAANGTNNNNNNNTTGACATTATTTTTNNNNNNNNNTATAAT (SEQ ID NO:2) dans laquelle TATAAT représente la boîte-10 dudit promoteur. Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit promoteur pZn contient un site de fixation pour la protéine ZitR de Lactococcus lactis comprenant la séquence suivante : AAAAATAAYGTTAACTGGTTGACATTATTTTT (SEQ ID NO:3), dans laquelle Y représente T ou C. A titre d'exemple de promoteurs pZn utilisables pour la construction d'une cassette d'expression conforme à l'invention, on citera : - le promoteur pZn de la souche MG1363 de Lactococcus lactis, qui comprend la séquence : AAAAATAATGTTAACTGGTTGACATTATTTTTACTTTGCTATATAATTAACCAGTA (SEQ ID NO:4) ; - le .promoteur pzn de la souche IL1403 de Lactococcus lactis, qui comprend la séquence : AAAAAATAACGTTAACTGGTTGACATTATTTTTTCTTTGCTATATAATTAACCAGTA (SEQ ID N0:5) Selon une seconde variante, la présente invention a pour objet une cassette d'expression constituée par : - un promoteur bactérien pzn, tel que défini ci-dessus ; - au moins un site de restriction permettant l'insertion d'une séquence nucléotidique d'intérêt sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur. La présente invention a également pour objet des cassettes d'expression résultant de l'insertion d'une séquence nucléotidique d'intérêt dans une cassette d'expression conforme à la première ou à la seconde variante de l'invention, sous contrôle transcriptionnel du promoteur pZn. Ladite séquence nucléotidique d'intérêt peut être toute séquence que l'on souhaite exprimer sous contrôle transcriptionnel du promoteur pzn. Il peut s'agir notamment de toute séquence codant pour une protéine hétérologue d'intérêt que l'on désire produire dans une bactérie-hôte ; ladite protéine peut le cas échéant être une protéine de fusion, associant des séquences polypeptidiques d'origine diverse. Sont exclues toutefois les cassettes d'expression conformes à la première variante de l'invention et comprenant tout ou partie de la séquence codant pour la protéine ZitS de L. lactis, fusionnée à un gène rapporteur. Des cassettes d'expression conformes à l'invention peuvent, le cas échéant, comprendre en outre les éléments nécessaires pour permettre l'adressage de la protéine d'intérêt à la surface cellulaire, ou sa sécrétion dans le milieu de culture. Dans ce cadre, la présente invention a pour objet des cassettes d'expression résultant de l'insertion d'une séquence nucléotidique codant pour un peptide d'adressage extracellulaire, et d'au moins un site de restriction permettant le clonage d'une séquence nucléotidique d'intérêt en fusion traductionnelle avec ledit peptide d'adressage, sous contrôle transcriptionnel du promoteur pZn, dans une cassette d'expression conforme à l'invention. Ledit peptide d'adressage peut être par exemple un peptide signal de sécrétion, un domaine transmembranaire, un signal d'ancrage à la paroi, etc. De nombreux peptides d'adressage utilisables dans le cadre de la présente invention sont connus en eux mêmes. A titre d'exemples non limitatifs, on citera les peptides décrits dans la publication de POQUET et al. (1998, précité), ou dans la publication de LE LOIR et al. (Appl. Environ. Microbiol., 67,4119-4127, 2001). Pour la production de protéines sécrétées, un peptide d'adressage extracellulaire préféré est le peptide signal de la protéine Exp4 de L. lactis, qui répond à la séquence : MKKINLALLTLATLMGVSSTAVVFA (SEQ ID NO: 6). La présente invention a également pour objet tout vecteur recombinant comprenant un insert constitué par une cassette d'expression conforme à l'invention. La présente invention a également pour objet des bactéries à gram-positif transformées par au moins une cassette d'expression conforme à l'invention. De préférence, il s'agit de bactéries lactiques, notamment des lactocoques, des lactobacilles ou des streptocoques thermophiles. Le cas échéant, il peut s'agir de bactéries provenant de souches bactériennes comportant une ou plusieurs modifications de leur génome, visant à améliorer la production et/ou la sécrétion de protéines exprimées dans lesdites bactéries, et/ou à éviter leur dégradation. Par exemple, dans le cadre de la production de protéines exportées, on peut utiliser une souche bactérienne dans laquelle l'activité protéasique PrtP et/ou l'activité protéasique HtrA sont inactives, telle que celle décrite dans la Demande PCT WO 00/39309 ou une souche bactérienne surproduisant une protéine permettant de stabiliser les protéines exportées, telle que la protéine Nlp4 de Lactococcus lactis, ou un de ses homologues (POQUET et al. 1998, publication précitée). La présente invention a également pour objet l'utilisation de cassettes d'expression ou de vecteurs recombinants conformes à l'invention pour la production de protéines d'intérêt dans une bactérie à gram-positif, notamment des bactéries lactiques. Les cassettes d'expression conformes à la première variante de l'invention peuvent être utilisées dans une bactérie-hôte, pour contrôler le moment de l'expression d'un gène d'intérêt inséré dans le site de clonage, et le niveau de cette expression. Lorsque l'on cultive la bactérie-hôte en présence d'une quantité de zinc en excès par rapport à ses besoins, l'expression du gène d'intérêt est totalement réprimée. La déplétion en Zn2+ du milieu de culture (qui peut s'effectuer simplement par addition d'un agent chélateur des cations divalents, tel que l'EDTA) permet de lever la répression, et de provoquer l'expression du gène. Le niveau d'expression peut être facilement régulé par la quantité d'agent chélateur ajouté. On peut aussi mettre en culture la bactériehôte dans un milieu comprenant une quantité de zinc juste suffisante pour couvrir ses besoins pendant une période donnée de la culture (par exemple pendant la phase de croissance). Dans ce cas, l'épuisement du zinc à l'issue de cette période provoque l'expression du gène d'intérêt. Dans ce cadre, la présente invention a pour objet un procédé de production d'une protéine d'intérêt dans une bactérie à gram-positif, et notamment une bactérie lactique, caractérisé en ce qu'il comprend : - l'introduction dans ladite bactérie d'une cassette d'expression conforme à la première variante de l'invention, comprenant une séquence codant pour ladite protéine d'intérêt ; - la culture de ladite bactérie dans un milieu contenant une quantité de Zn2+ suffisante pour réprimer l'expression de ladite protéine ; - l'induction de la production de ladite protéine par déplétion en Zn2+dudit milieu ; - la récupération de la protéine produite. Selon un mode de mise en #uvre préféré du procédé conforme à l'invention, la déplétion en Zn2+ dudit milieu est obtenue par addition d'un chélateur des cations divalents. Selon un autre mode de mise en #uvre préféré de la présente invention, la déplétion en Zn2+ dudit milieu est obtenue par culture de la bactérie jusqu'à épuisement du Zn2+ initialement présent dans le milieu. D'après les expérimentations effectuées par les Inventeurs sur la souche modèle MG1363 de L. lactis, le maintien pendant toute la durée de la culture d'une quantité de Zn2+ suffisante pour réprimer l'expression sous contrôle du système pzn/ZitR peut être assuré par l'utilisation d'un milieu contenant en début de culture, de l'ordre de 1 à 2 M de Zn2+, le seuil de répression totale pouvant être estimé à entre 100nM et 1 M de Zn2+. La concentration en Zn2+ du milieu en dessous de laquelle on obtient la levée complète de la répression de pzn est très faible (de l'ordre du nanomolaire, et au maximum de quelques nanomolaires). La quantité de chélateur des cations divalents nécessaire pour effectuer la déplétion en Zn2+ et induire l'expression sous contrôle du promoteur 1zn varie selon la quantité de Zn2+ apportée initialement au milieu de culture ; à titre indicatif, dans le cas de la souche MG1363, pour un milieu de culture riche tel que le milieu M17, une déplétion en Zn2+ permettant d'induire une expression maximale peut être obtenue à partir d'une concentration d'EDTA de l'ordre de 0,1 mM ; milieu SA, qui contient lOnM de Zn2+ une déplétion en Zn2+ permettant d'induire une expression maximale peut être obtenue à partir d'une concentration d'EDTA de l'ordre de 0,01 mM. Les quantités de Zn2+ et d'agent chélateur de cations mentionnées ci-dessus sont données à titre indicatif. A partir de ces indications, et des autres informations fournies par le descriptif de la présente invention, l'homme du métier peut facilement déterminer, par des tests préalables, effectués par exemple en plaçant un gène rapporteur sous contrôle du système pzn/ZitR dans une cassette d'expression conforme à l'invention, les quantités les plus appropriées selon l'espèce ou la souche bactérienne concernée, les conditions opératoires mises en #uvre, telles que le milieu utilisé, les modalités de l'ajout de Zn2+ et/ou d'agent chélateur (par exemple, en une seule fois, en plusieurs fois, en continu, etc.), et le niveau d'expression souhaité. Des cassettes d'expression conformes à la seconde variante de l'invention seront utilisées de préférence dans des souches de bactéries, notamment de lactocoques, dans lesquelles le répresseur ZitR endogène est inactif, ainsi qu'éventuellement le complexe ZitSPQ. Dans ces conditions, le promoteur pZn constitue un promoteur fort, permettant l'expression de la protéine d'intérêt pendant toute la durée de la culture. L'inactivation du récepteur ZitR et du complexe ZitSPQ peut s'effectuer de manière connue en elle-même, notamment par mutagenèse dirigée de l'opéron zitRSQP. Dans ce cadre, la présente invention a pour objet un procédé de production d'une protéine d'intérêt dans une bactérie à gram-positif dans laquelle le répresseur ZitR endogène est inactif, caractérisé en ce qu'il comprend : - l'introduction dans ladite bactérie d'une cassette d'expression conforme à la seconde variante de l'invention, comprenant une séquence codant pour ladite protéine d'intérêt ; - la culture de ladite bactérie ; - la récupération de la protéine produite. La présente invention peut être mise en #uvre par exemple : - dans le domaine de la production de protéines hétérologues d'intérêt thérapeutique par génie génétique, pour mieux contrôler la production de ces protéines par les cultures de bactéries transformées ; en industrie agro-alimentaire, notamment dans la fabrication de produits fermentés, pour contrôler selon le stade de la fermentation, la production de protéines d'intérêt permettant notamment d'influer sur la qualité du produit fermenté fini. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs, illustrant la construction de cassettes d'expression conformes à l'invention. EXEMPLE 1 : REGULATION DE ZIT PAR ZN2+ CHEZ L. LACTIS L'expression de zit en fonction de la concentration en Zn2+ du milieu est mesurée par 2 techniques différentes: *La mesure de l'activité Nuc de la fusion ZitRS-AspNuc, portée par le plasmide pVE8020, dans la souche de L. lactis MG1363. Le plasmide pVE8020 résulte du clonage du fragment d'ADN chromosomique de la souche MG1363 correspondant à pZnzitRzitS' (GenBank U95834) dans le plasmide pFUN (POQUET et al., 1998, précité ; GenBank AF038666). *La quantification de l'ARNm de zitS dans la souche MG1363 sauvage (expression endogène de zitS et dans la souche MG1363 transformée par pVE8020). Effet du zinc sur l'activité Nuc sous contrôle du promoteur pZn La mesure de l'activité Nuc (nucléase de Staphylococcus aureus) est effectuée sur des boîtes de culture contenant du milieu chimiquement défini SA (JENSEN et HAMMER, Appl. Env. Microbiol. 59, 4363-66, 1993), qui comprend une quantité minimale de chacun des éléments nécessaires à la croissance bactérienne, et est notamment pauvre en zinc (10 nM de ZnS04). On effectue sur ce milieu un dépôt d'une solution de Zn 2+ (20 p.1 de ZnS04 à 0, 1M) sous forme d'une strie traversant la boîte. Après absorption du dépôt de Zn2+, on effectue 2 dépôts de bactéries sous forme de 2 stries parallèles entre elles, et coupant perpendiculairement la strie de zinc : un dépôt témoin, (souche MG1363 transformée par un plasmide (pVE8009) portant la fusion Usp-AspNuc sous contrôle du promoteur Usp) et un dépôt de la souche MG1363 transformée par pVE8020 (MG1363(pVE8020)). L'incubation pendant une -nuit à 30 C des boîtes permet la croissance des bactéries et la création d'un gradient de concentrations en Zn2+ décroissantes par diffusion à partir de la strie de ZnS04. On réalise un test coloré de l'activité nucléasique, en déposant sur les boîtes une surcouche de détection contenant du bleu de toluidine et en incubant à 37 C (LACHICA et al., Appl. Microbiol., 21,585-87, 1971 ; LE LOIR et al., J. Bacteriol., 176, 5135-39, 1994) . l'activité Nuc est détectée par le virage au rose de la surcouche de détection, formant un halo autour des stries de dépôts bactériens. Alors que le halo observé autour de la strie correspondant au dépôt témoin est de taille et d'intensité constante sur toute la longueur de la strie bactérienne (ce qui indique que ni l'activité nucléasique d' Usp-AspNuc, ni son exportation, ni son expression ne dépendent du Zn2+, celui observé autour de la strie correspondant au dépôt MG1363(pVE8020) est limité à l'extrémité la plus éloignée du dépôt de zinc, où sa largeur et son intensité sont comparables à celles observées pour le dépôt témoin ; l'intensité décroît à l'approche du dépôt de zinc, et on n'observe aucun halo au voisinage de l'intersection avec celui-ci. Il apparaît donc que des concentrations élevées de zinc répriment l'expression du promoteur de l'opéron zitRSQP. Effet de l'EDTA sur l'activité Nuc sous contrôle du promoteur pZn La mesure de l'activité Nuc est effectuée sur des boites de culture contenant du milieu M17 (TERZAGHI and SANDINE, Appl. Environ. Microbiol., 29,807-13, 1975) riche en zinc. On effectue un dépôt d'une solution d'EDTA (20 l à O,1M), ainsi qu'un dépôt de la souche MG1363 contenant le plasmide témoin, et un dépôt de la souche MG1363(pVE8020) sous forme de stries, -comme décrit cidessus. Après incubation à 30 C pendant une nuit, l'activité Nuc est détectée comme décrit ci-dessus. Le halo observé autour de la strie correspondant au dépôt témoin est, comme celui observé dans le cas du zinc, de taille et d'intensité constante sur toute la longueur de la strie. En revanche, de façon surprenante, celui observé autour de la strie correspondant au dépôt MG1363(pVE8020) est, au voisinage du dépôt d'EDTA, beaucoup plus intense que celui du dépôt témoin ; l'intensité décroît très rapidement lorsque l'on s'éloigne de cette intersection. Il apparaît donc que l'EDTA induit l'expression du promoteur de l'opéron zitRSQP. Le niveau d'expression apparaît en outre plus élevé que celui observé à distance de la strie de zinc dans l'expérimentation précédente, et en outre plus élevé que celui du témoin, contrôlé par le promoteur Usp : on peut donc atteindre un très fort niveau d'induction de pZn zitR grâce à des concentrations en EDTA qui n'affectent pas la croissance bactérienne (comme 0,1M en M17). Evaluation quantitative de l'effet de l'EDTA sur l'activité Nuc sous contrôle du promoteur pZn Pour évaluer quantitativement l'effet de l'EDTA sur l'activité Nuc exprimée sous contrôle du promoteur de l'opéron zitRSQP, les expérimentations suivantes sont effectuées : La souche MG1363 transformée par pVE8020 est cultivée en milieu M17 supplémenté en érythromycine à 5 eug/1, jusqu'en phase exponentielle (DOroo = 0,3) ou stationnaire (DO600 = 1,2). Cette culture est divisée en 4 sous-cultures ; 3 d'entre elles sont alors additionnées d'EDTA à diverses concentrations finales (3,3 mM ; 0,33 mM ; 0,033 mM) ; la quatrième ne reçoit pas d'addition d'EDTA (0 mM EDTA). Après- 30 min ou lh30 d'incubation, des échantillons de chaque culture sont prélevés. Le nombre de cellules de chaque échantillon est normalisé en adaptant le volume de façon à obtenir un nombre de cellules équivalent à celui celui de 1 ml de culture à D06oo = 1- Les cellules sont ensuite lysées et précipitées par un traitement à l'acide trichloroacétique concentré (16,7%), lavées à l'acétone (80%) et reprises dans 100 ul de tampon Tris (50 mM pH7) . 10 l de chaque échantillon ainsi traité sont déposés sur une boîte contenant du milieu de détection de l'activité Nuc (LACHICA et al., 1971 ; LE LOIR et al., 1994, précité). L'activité Nuc est évaluée par la caille du halo et l'intensité de la coloration rose autour de chaque dépôt. Pour une évaluation quantitative du niveau d'activité, on dépose sur la même boîte une gamme étalon de protéine Nuc purifiée (dilution de 4 en 4 à partir de 400 ng). On constate que la taille du halo et l'intensité de la coloration varient en fonction de la concentration en EDTA qui a été utilisée pour traiter les cellules. En l'absence d'EDTA, on observe un halo très fin sans coloration nette ; à 0,033 mM d'EDTA, on observe un fin halo, nettement coloré en rose ; à 0,33 mM, on observe un halo large, de coloration rose très intense. On n'observe aucune augmentation de la taille et de l'intensité du halo de 0,33 à 3,3 mM. Aucune différence significative de la taille et de l'intensité du halo n'est notée entre l'addition d'EDTA effectuée en phase exponentielle et celle effectuée en phase stationnaire, ni entre les deux temps d'incubation (30 mn ou 1h 30). Ces résultats indiquent que le niveau d'induction de l'expression de pZn augmente avec la concentration en EDTA ajoutée, jusqu'à un seuil de saturation (qui est atteint en milieu M17, dans les conditions expérimentales décrites . ici, pour une concentration en EDTA de l'ordre de 0,33 mM, quelle que soit la phase de croissance et le temps d'incubation). La comparaison avec la gamme étalon de protéine Nuc purifiée permet d'estimer que le niveau d'induction obtenu par addition de 0,33 mM d'EDTA en milieu M17 est de l'ordre de 100. Effet du zinc sur la transcription de l'opéron zit Les souches utilisées sont la souche sauvage de L. lactis subsp cremoris MG1363, et sa dérivée mutante FNR (double mutant flpA flpB, SCOTT et al., 2000, précité ; GOSTICK et al., 1999, précité). Les gènes f1p sont .des régulateurs pléiotropes intervenant notamment dans le transport du zinc : chez FNR, la concentration intracellulaire en zinc est sept à huit fois plus faible que celle de la souche sauvage (GOSTICK et al., 1999, précité). A partir d'une préculture d'une nuit de chaque souche en milieu SA supplémenté en érythromycine à 5 g/l, et pour FNR uniquement, en tétracycline à 5 g/l, on effectue une culture à 30 C en milieu SA (dont la concentration en Zn2+ est de lOnM). En phase exponentielle précoce (DO600 0,07 à 0,08), cette culture est divisée en deux parties : l'une (+) est additionnée de ZnSO pour obtenir une concentration finale en Zn2 de 2 M (qui n'affecte pas la croissance) ; (-) ne reçoit aucune addition. La culture est poursuivie sans modification jusqu'en phase exponentielle (DO600 = 0,2) ou stationnaire (D06oo - 0,8). L'ARN des bactéries est alors extrait selon le protocole décrit par RAYA et al., (J. Bacteriol., 180,3174-80, 1998). Après l'extraction, la concentration en ARN est évaluée par mesure de la D0260 : 60 ug d'ARN sont déposés sur un gel à 1% d'agarose. Après migration et transfert sur une membrane de nylon, les transcrits zitRS sont détectés par transfert de Northern, avec une sonde spécifique du gène zitS. Les résultats sont illustrés par la Figure 1. Ces résultats montrent que l'on n'observe un ARNm spécifique de la taille attendue pour z1tRS qu'en l'absence (-) d'addition de Zn2+ et jamais en sa présence (+) quelle que soit la souche, et quelle que soit la phase de croissance au moment de l'addition. Cela montre 1) que la répression par le Zn2+ de l'expression de l'opéron zit s'effectue au niveau transcriptionnel, 2) qu'elle est totale pour une concentration en Zn2+ du milieu de 2 M, et 3) qu'elle est indépendante des gènes flp, puisqu'elle s'exerce dans le mutant FNR. Ce dernier point indique que la régulation par le Zn 2+ dépend entièrement du régulateur zizi. En absence d' addition de Zn2+, on observe un niveau d'expression très fort, sauf pour la souche MG1363 en phase exponentielle, où l'on observe qu'une faible expression. Ces résultats indiquent que malgré la très faible concentration en Zn2+ (10 nM) du milieu SA de départ, la concentration intracellulaire en Zri-- au r:101.e:: t de la phase exponentielle où a été effectué le prélèvement est encore suffisante, dans le cas de la souche MG1363, pour réprimer fortement la transcription de l'opéron zit. En revanche, en phase stationnaire, après épuisement du Zn2+ présent dans le milieu, l'expression est très forte. Dans le cas de la souche FNR, la concentration en Zn2+ de 10 nM du milieu de départ est insuffisante pour assurer, même pendant la phase exponentielle, une concentration en Zn2+ intracellulaire réprimant la transcription de l'opéron zit. Il apparaît donc que l'induction de l'expression dépend directement de la concentration intracellulaire en Zn2+, et que celle-ci doit être très faible pour obtenir une expression maximale. Ceci peut être obtenu notamment . 1) En abaissant la concentration extracellulaire en Zn2+ ; celle-ci doit en effet être très inférieure à lOnM, où l'on observe encore une répression importante. L'abaissement de la concentration extracellulaire en Zn2+ peut par exemple s'effectuer par l'addition d'un agent chélateur comme l'EDTA (quelle que soit la phase de croissance), ou en opérant en phase stationnaire, dans des conditions où le Zn2+ initialement présent dans le milieu a été consommé par les bactéries au cours de la croissance, ou par une combinaison de ces deux moyens. 2) En utilisant des mutants dans lesquels le transport du zinc est affecté, et qui possèdent de ce fait .une concentration en Zn2+ intra-cellulare très faible, tels que la souche FNR mentionnée ci-cessus. EXEMPLE 2 : CONSTRUCTION DE VECTEURS D'EXPRESSION SOUS CONTROLE DU SYSTEME DE REGULATION DE L'OPERON ZITRSQP Construction de plasmides contenant le système de régulation de l'opéron zitRSQP Plasmide pDIll Le système promoteur-régulateur P::d-Z2 R de la souche MG1363 est obtenu par amplification PCR (kit DyNAzyme EXT de FINNZYMES) d'une partie de l'insert pznzitRzitS' (GenBank U95834) du plasmide pVE8020 avec les oligonucléotides oligo 9 et oligo MUT : Oligo 9 : 5' -CTAATGAGCGGGCTTT T T-3' ( SEQ ID 1G : 7) Oligo MUT : 5'-GCTCTAGAGCGGGATCCTTCATCGAAACTCTTCAG-3' (SEQ ID NO: 8) Oligo 9 s'hybride avec le site de clonage multiple (MCS) de pFUN, et permet d'amplifier tout insert cloné dans ce vecteur. Oligo MUT permet d'éliminer le site de fixation potentiel des ribosomes (RBS) de ziS et pour faciliter le clonage du fragment PCR : sa séquence, située dans la zone de chevauchement entre zitR et zitS, présente deux mutations (soulignées) dans le RBS (la séquence sauvage 5'-GGAGGAG-3' est mutée en 5'-TGAAGAG- 3', complémentaire de 5' -CTCTTCA-3' dans l' oligo MUT) et les deux sites de restriction BamHI et Xbal (en gras). La séquence de la région du plasmide pVE8020 à partir de laquelle est effectuée l'amplification (SEQ ID NO: 9) est représentée sur la Figure 2. Les chiffres à gauche de la séquence correspondent à la numérotation de la séquence entière du plasmide pVE8020. Les zones d'appariement des amorces oligo 9 et oligo MUT sont représentées en gras et avec des flèches. Les séquences codant pour ZitR et une partie de ZitS sent indiquées. Les RBS (sites de fixation des ribosomes) potentiels de zitR et zitS sont encadrés, et les codons d'initiation de la traduction ATG sont soulignés. Les boites-35 et-10 du promoteur sont encadrées et surlignées en gris ; le site potentiel d'initiation de la transcription est indiqué par un soulignement double. Le produit d'amplification de 700 pb est traité par le fragment Klenow (PolIK) de l'ADN polymérase d'Escherichia coli, puis par XbaI. Ce fragment modifié est purifié et clone dans le vecteur pFUN, préalablement digéré par EcoRV et XbaI : le mélange de ligaton (fragment + pFUN + ligase du phage T4) est utilisé pour électroporer la souche MG1363 de Lactococcus lactis, et des clones résistant à l'érythromycine sont sélectionnés sur milieu solide M17 + glucose 0,5% + érythromycine 5 g/mL. Un de ces clones, contenant un plasmide recombinant de 8,2 kb, dénommé ci-après pDIll, est choisi. Les étapes de la construction de ce plasmide sont représentées sur la Figure 3a. Il contient la totalité de la séquence codant pour ZitR, ainsi qu'une séquence 5' comprenant le promoteur pZn. Cette séquence 5' (SEQ ID N0:10) est représentée ci-après (jusqu'au site potentiel d'initiation de la transcription): GATCTGTCAGCTGGTTCAACTAGCGGTGGTCAAACTGTTAGTAATAAAACTTATTGT TTTGATGTTCGGCTTAAGGATGGAAGGATTTTTCAAATAAAAAAG7AAAAAATAATG TTAACTGGTTGACATTATTTTTACTTTGCTATATAATTAACCAGTA Plasmide pDI12 pDIll est digéré par EcoRI et EcoRV et traité par PolIK pour obtenir un fragment linéaire de 8,18 kb dépourvu des sites de restriction du MCS de pFUN (ce qui permet de les introduire ultérieurement ailleurs dans la construction), puis traité par la ligase du phage T4. La souche MG1363 est électroporée par le mélange de ligation, et un clone résistant à l'érytnrcmycine et contenant le plasmide pDI12 est sélectionné comme décrit ci-dessus. Plasmide pDI15 Le plasmide recombinant pDI15 est un dérivé de pDI12 dans lequel le site de restriction NsiI (localisé entre les gènes ermAM et repD, en position 20'La de pDI12) est éliminé, ce qui permet de l'introduire ultérieurement ailleurs dans la construction. pDI15 est digéré par NsiI et traité par la ligase du phage T4. Après ligation, et transformation de MG1363, des clones résistant à l'érythromycine sont sélectionnés comme précédemment. Un clone contenant un plasmide recombinant ce 8,18 kb insensible à la digestion par NsiI est choisi : ce plasmide est dénommé ci-après pDI15. Les étapes de la construction de pDI15 sont représentées sur la Figure 3b. Construction de plasmides contenant un gène rapporteur sous contrôle du système de régulation de l'opéron zitRSQP Plasmide pDI24 pDI24 comprend les éléments suivants : une séquence codant pour une protéine rapporteur permettant de tester le système, suivie par un terminateur. La protéine rapporteur choisie est NucB, la forme dépourvue de peptide signal de la nucléase Nuc de Staphylococcus aureus (SHORTLE, Gene, 22, 181-189, 1983). Son cadre ouvert de lecture est clone dans le plasmide pSEC1 (ou pVE3684, CHATEL et al, Clin. Diagn. Lab. Immunol., 8,545-551, 2001) sous le contrôle du promoteur pnis (inductible par la nisine) pour la transcription, et des signaux d'Usp45 de L. lactis pour la traduction (RBSUsp45 et codon d'initiation) et la sécrétion (peptide signal PSUsp45) : l'ensemble pms-RBSUsp45-?sp =5 est cloné dans pDI24. Le terminateur choisi est le terminateur T1T2 (PESCHKE et al, J. Mol. Biol., 186,547-555, 1985) qui provient du plasmide pVE5239 (DIEYE et al, J. Bacteriol., 183,4157-4166, 2001). Pour la construction de pDI24, pSEC1 est digéré par XhoI, traité par l'ADN polymérase du phage T, et digéré par ClaI, pour obtenir une forme linéaire de 3,8 kb. En parallèle, pVE5239 est digéré par SacI, traité par l'ADN polymérase du phage T4, et digéré par ClaI, pour obtenir un fragment de 217 pb contenant: le terminateur T1T2. Ce fragment est purifié et ligaturé avec la forme linéaire du vecteur pSEC1, et le mélange de ligation est utilisé pour transformer la souche TG1 d'E. coli. Des clones résistant au chloramphénicol sont sélectionnés sur boîtes LBT + chloramphénicol 12,5 g/mL. Un de ces clones, contenant un plasmide de 4 kb dénommé pDI24, est choisi. Les étapes de la construction ae pDI24 sont représentées sur la Figure 4. Plasmides pDI1224 et pDI151 La fusion PSUsp45-NucB est placée sous le contrôle du système d'expression pzn-zitR dans les plasmides pDI12 et pDI15, pour produire les plasmides pDI1224 et pDI151. pDI1224 pDI12 est digéré par XbaI, traité par l'ADN polymérase du phage T4, puis digéré par BaHI, pour obtenir une forme linéaire de 8,1 kb. En parallèle, pDI24 est digéré par SacII, traité par l'ÀDN polymérase du phage T4, et digéré par BamHI, pour obtenir un fragment de 932 pb contenant le cadre ouvert de lecture de la protéine rapporteur NucB (sous le contrôle de RBSUsp45 et de PSUsp45), et le terminateur de transcription T1T2. Ce fragment de 932 pb est purifié et ligaturé avec la forme linéaire du vecteur pDI12, et le produit de ligation utilisé pour transformer MG1363. Les transformants sont sélectionnés sur du milieu solide M17 + glucose 0,5%, + érythromycine 5|Lig/mL + EDTA 0,2 mM. L' EDTA permet d'induire, grâce au système Pzn-zitR, l'expression du rapporteur, et donc d'effectuer un premier crible du phénotype Nuc+ des clones recombinants. Le test d'activité Nuc est effectué selon le protocole décrit par LE LOIR et al, (J. Bacteriol. 176,5135-5139, 1994). pDI151 pDI15 et pDI1224 sont digérés par BaHI et SnaBI : cela donne lieu, pour le premier, à un vecteur linéaire tronqué dans le gène ermAM (qui confère la résistance à l' érythromycine) , et, pour le second, à un fragment complémentaire de 2,043 kb qui contient : le système d'expression pzn-zitR, la protéine rapporteur Jc3 (sous le contrôle de RBSUsp45 et PSUsp45 ) , le terminateur T1T2 et la partie 5' du gène erl- A'T éliminée de pDI15. Le mélange de ligation est utilisé pour transformer MG1363, et les plasmides reccnbinants sélectionnés de la même manière que pour obtenir pDI1224, ce qui permet de confirmer que le clonage reconstitue le gène ermAM intact et rétablit la capacité des clones recombinants à résister à l'érythromycine. pDI1224 et pDI151, dont les tailles sont respectivement de 9 et 12 kb, sont identiques à l'exception de la présence ou de l'absence du site .',-si (présent en position 2014 dans pDI1224). Tous deux portent le système d'expression pZn-zitR. Les étapes de construction de pDI1224 et pDI151 sont représentées sur la Figure 5. L'insert de ces plasmides contenant le gène rapporteur codant pour NucB, sous contrôle du système d'expression pZn-zitR, est schématisé sur la Figure 6. EXEMPLE 3 : CONSTRUCTION DE PLASMIDES CONTENANT UNE SEQUENCE CODANT POUR UN PEPTIDE SIGNAL DE SECRETION Ces plasmides sont construits par substitution du signal de sécrétion PSUsp45 des plasmides pSEC et pDI151 par le système de sécrétion d'Exp4. La séquence codant pour le peptide signal d'Exp4 (PSExp4), accompagnée des signaux de traduction d'Exp4, c'est-à-dire son RBS [ou RBSExp4j et son ccdon d'initiation de la traduction) est clonée à partir du plasmide pVE8022 (POQUET et al, 1998), en utilisant les oligonucléotides Exp4-5 et Exp4-3, dont les séquences sont : Exp4-5 : 5'-GTTCTAAGGATCCATTAACTTAAGGAG-3' (SEQ ID NO: 11) Exp4-3 : 5'-AAGTAGATGCATCAGCAAATACAACGGC-3' (SEQ ID NO: 12) Ces amorces sont basées sur la partie 5' du gène exp4 de MG1363 (GenBank U95836)). Exp4-5 et Exp4-3 introduisent des sites de restriction (en gras) aux extrémités de FSExp4 pour faciliter son clonage, respectivement BamHI en 5' (en amont de RBSExp4 [codé par AGGAAG dans Exp-5j) et hv'S1I en 3' (en aval du site de clivage potentiel de PSExp4). Le site NsiI est introduit à une position qui permet le clonage de PSExp4 en phase avec NucB et qui perturbe peu la séquence : deux acides aminés se trouvent insérés à l'extrémité N-terminale de NucB, Asp qui est le premier acide aminé de la forme mature d'Exp4 (codé par GAT dans Exp4-3) et Ala qui provient de l' insertion de NsiI (codé par GCA dans Exp4-3). L'introduction d'une charge négative (Asp) et d'un petit acide aminé (Ala) en aval du peptide signal d'une protéine sécrétée est une situation favorable pour une bonne efficacité de sécrétion (du fait de l'orientation correcte du peptide signal dans la membrane c'est l'extrémité C-terminale chargée négativement qui est transloquée à travers la membrane, alors que l'extrémité N-terminale chargée positivement reste du côté cytoplasmique). L'amplification par Exp4-5 et Exp4-3 à partir de l'ADN du plasmide pVE8022 produit un fragment de 117 pb. Le peptide codé par ce fragment répond à la séquence MKKINLALLTLATLMGVSSTAVVFADA (SEQ ID NO:13) qui correspond à la séquence du peptide signal d'Exp4, jusqu'au site prédit de clivage (indiqué par une flèche) suivi de deux acides aminés insérés en amont de NucB. Pour le clonage d'une protéine d'intérêt à la place de NucB, un troisième acide aminé sera introduit dans certains cas pour que PSExp4 et la protéine d'intérêt soient en phase. Ceci peut s'effectuer par exemple en introduisant la séquence :NATGCATCA (SEQ ID NO: 14) à l'extrémité 5' de l'amorce 5' qui servira à l'amplification PCR du cadre de lecture de ladite protéine d'intérêt. Cette séquence introduit un site NsiI (en gras) et un codon (TCA) correspondant à un petit acide aminé (Ser), qui ne perturbe que peu la structure de la protéine. Le fragment de 117 pb résultant de l'amplification PCR du plasmide pVE8022 avec les oligonucléotides Exp4-5 et Exp4-3, est digéré avec BamHI et NsiI. Ce fragment (PSExp4)est clone dans le vecteur pDI151, ou dans le vecteur pSEC1, délétés de PSUsp45 par digestion par BamHI et NsiI. Le mélange de ligation est utilisé pour transformer MG1363 ou TG1, et les clones résistant à l'antibiotique correspondant (respectivement érythromycine ou chloramphénicol) sont sélectionnés. Les plasmides résultants, pDI151-PSExp4, et pSEC-PSExp4, sont respectivement représentés sur les Figures 7 A et 7B. REVENDICATIONS 1) Cassette d'expression constituée par : - un promoteur bactérien, dénommé ci-après pZn, contenant un site de fixation pour la protéine ZitR de Lactococcus lactis, lequel site comprend la séquence suivante : AAAAATAANGTNNNNNNNTTGACATTATTTTT (SEQ ID N0:1), dans laquelle TTGACA représente la boite -35 dudit promoteur, et N représente A, C, G, ou T ; - une séquence codant pour un polypeptide présentant au moins 80% d'identité avec la protéine ZitR de Lactococcus lactis, placée sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur ; - au moins un site de restriction permettant l'insertion d'une séquence nucléotidique d'intérêt sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur. 2) Cassette d'expression selon la revendication 1, caractérisée en ce que le promoteur pZn comprend la séquence suivante : AAAAATAANGTNNNNNNNTTGACATTATTTTTNNNNNNNNNTATAAT (SEQ ID NO:2), dans laquelle TATAAT représente la boîte -10 dudit promoteur. 3) Cassette d'expression selon la revendication 2, caractérisée en ce que le promoteur pZn comprend une séquence choisie parmi : - la séquence : AAAAATAATGTTAACTGGTTGACATTATTTTTACTTTGCTATATAATTAACCAGTA (SEQ ID N0:4) ; - la séquence : AAAAAATAACGTTAACTGGTTGACATTATTTTTTCTTTGCTATATAATTAACCAGTA (SEQ ID N0:5) 4) Cassette d'expression constituée par : - un promoteur bactérien pZn, tel que défini dans les revendications 1 à 3 ; - au moins un site de restriction permettant l'insertion d'une séquence nucléotidique d'intérêt sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur. 5) Cassette d'expression résultant de l'insertion d'une séquence nucléotidique codant pour un peptide d'adressage extracellulaire, et d'au moins un site de restriction permettant le clonage d'une séquence nucléotidique d'intérêt en fusion traductionnelle avec ledit peptide d'adressage, sous contrôle transcriptionnel du promoteur pZn, dans une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 1 à 4. 6) Cassette d'expression selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit peptide d'adressage extracellulaire est un peptide signal de séquence : MKKINLALLTLATLMGVSSTAVVFA (SEQ ID NO: 6). 7) Cassette d'expression résultant de l'insertion d'une séquence nucléotidique d'intérêt sous contrôle transcriptionnel du promoteur pZn, dans une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 1 à 6, à l'exclusion des cassettes d'expression comprenant tout ou partie de la séquence codant pour la protéine ZitS de L. lactis, fusionnée à un gène rapporteur. 8) Vecteur recombinant comprenant un insert constitué par une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 1 à 7. 9) Bactérie à gram-positif transformée par au moins une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 1 à 7. 10) Bactérie selon la revend-cation 9, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie lactique. 11) Utilisation d'une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 1 à 7, ou d'un vecteur recombinant selon la revendication 8, pour la production d'une protéine d'intérêt dans une bactérie à gram-positif.