Brevet FR2841246A1 — publié le 20031226

La présente invention est relative à un peptide issu de la protéine G du virus de la rage, ligand du récepteur de basse affinité des neurotrophines (p75NTR) ) et à ses applications comme vecteur pour le transport ciblé de molécules d'intérêt dans des cellules exprimant ce récepteur, utile pour le traitement des maladies génétiques ou acquises, impliquant un dysfonctionnement de ces cellules, notamment les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer. Le virus de la rage (RV) est un virus neurotrope responsable d'une encéphalomyélite mortelle chez l'homme et les mammifères domestiques et sauvages, transmis généralement par la morsure d'un animal infecté présentant des signes cliniques de la maladie. Ce virus est un Lyssavirus (famille des Rhabdoviridae) ; il est classé dans le génotype 1 (GTl), les génotypes GT2 à GT7 correspondant respectivement au virus Lagos Bat (LB), Mokola (Mok), Duvenhague (Duv) et aux Lyssavirus de chauve-souris d'origine européenne (EBL de types 1 et 2) ou australienne (ABL). Les Lyssavirus sont des virus enveloppés comprenant une unique glycoprotéine (G), associée en trimères, sous forme de spicules formant des protrusions à la surface de l'enveloppe lipidique. La glycoprotéine G a trois fonctions majeures : (i) du fait de son interaction avec des récepteurs cellulaires, elle permet la fixation du virus aux cellules et est le déterminant majeur du neurotropisme des Lyssavirus, (ii) elle induit une immunité protectrice, humorale (anticorps neutralisants) et cellulaire, et (iii) elle permet la fusion de l'enveloppe virale avec la membrane cellulaire, par un processus dépendant du pH. La glycoprotéine G du virus de la rage (RVG) est une protéine transmembranaire de type 1 de 505 acides aminés comprenant un domaine externe de 439 acides aminés, un domaine transmembranaire de 22 acides aminés et un domaine C-terminal de 44 acides aminés. Trois sites potentiels de N-glycosylation ont été localisés : le premier situé au niveau de l'acide aminé en position 32 est glycosylé de façon très inefficace, le second en position 204 ou 247 est glycosylé uniquement dans certaines souches et le troisième, situé en position 319 est toujours glycosylé. Le repliement, le transport intracellulaire et l'oligomérisation ont été analysés pour les souches Pasteur et ERA et il a été montré que la glycoprotéine G acquiert une organisation trimérique au niveau du réticulum endoplasmique. Un peptide de fusion potentiel a été localisé dans la région correspondant aux résidus d'acides aminés des positions 102 à 179. La structure antigénique de la glycoprotéine G a été caractérisée de façon extensive à l'aide d'anticorps monoclonaux dirigés contre cette glycoprotéine. Environ 50 mutants de la glycoprotéine G résistants à la neutralisation par le virus de la rage (souche CVS) ont été isolés et classés en sites antigéniques indépendants en fonction de leur mutation et de leur réactivité avec les anticorps monoclonaux anti-G. Deux sites conformationnels immunodominants (site II et site III), deux sites mineurs (site a et épitope linéaire) et plusieurs autres épitopes ont été localisés dans le domaine externe de la glycoprotéine G : - le site II est un site antigénique majeur, reconnu par 70 % des anticorps monoclonaux ; il est constitué par les résidus d'acides aminés correspondant aux positions 34 à 42 et 184 à 210, reliés par un pont disulfure entre les cystéines en position 35et 207, - le site III est un site conformationnel constitué par les résidus des positions 330 à 340 ; joue un rôle essentiel dans la propagation et le pouvoir pathogène du virus : (i) la mutation du résidu Arg333 conduit à une perte de virulence pour les animaux adultes, le mutant Arg333 est capable d'infecter des neurones périphériques, mais se propage uniquement dans un nombre limité de catégories de neurones du système nerveux central et (ii) la mutation du résidu Lys330 abolit la pénétration du virus dans les neurones sensoriels et moteurs, après une infection par voie intramusculaire, - le site a est constitué par les résidus des positions 342 et 343 et l'épitope linéaire est constitué par les résidus correspondants aux positions 251 à 264. La glycoprotéine G du virus de la rage adopte au moins deux conformations, dénommées N (neutre) et I (inactive pour la fusion). La glycoprotéine G en conformation I n'est plus reconnue par les anticorps monoclonaux du site II, mais le virus peut-être neutralisé par des anticorps monoclonaux qui ne reconnaissent pas le virus lorsque la protéine est en conformation N. Cette propriété a été utilisée pour isoler des mutants résistants à la neutralisation induite en conditions acides ; les mutations correspondantes ont été localisées dans la région N-terminale de la glycoprotéine (entre les résidus correspondant aux positions 10 à 15) et à d'autres positions contrôlant le changement de conformation (positions 44, 282, 392 et 396). À l'exception des étapes très précoces et finales de l'infection, au cours desquelles ils se multiplient dans des tissus non-neuronaux (glandes salivaires par exemple), les Lyssavirus se multiplient et se propagent exclusivement à l'intérieur des neurones. Le virus pénètre directement au niveau des terminaisons nerveuses du site d'inoculation ou après une multiplication limitée dans les myotubes ; il est ensuite transporté le long des axones, dans les corps cellulaires des neurones moteurs et sensoriels où il se réplique. Le bourgeonnement viral a lieu essentiellement dans les compartiments internes des neurones infectés 'et le virus est transporté au niveau des synapses par l'intermédiaire de vésicules. Différents récepteurs potentiels du virus de la rage et de sa glycoprotéine G ont été proposés : des phospholipides (Perrin et al., Annales Virologie, 1982,133, 403-422 ; Rupprecht et al., Curr. Topics in Microbiol. And Immunol., 1994,187, 1-339 ; Superti et al., Archives of Virol., 1984, 81, 321-328), des gangliosides (Superti et al., J. Gen. Virol., 1986,67, 47-56) et des protéines spécifiques des neurones, incluant le récepteur nicotinique de l'acétylcholine (Lentz et al., Science, 1984,226, 847-848 ; Brain Research, 1986, 1, 211-219), la molécule d'adhésion des cellules neurales (NCAM, Thoulouze et al., J. Virol., 72,7181-7190) et le récepteur de basse affinité des neurotrophines p75NTR (Tuffereau et al. EMBO Journal, 1998,17, 7250-7259). La p75NTR est une glycoprotéine de type I de la superfamille des récepteurs du TNF, comprenant un domaine externe (ectodomaine) incluant quatre domaines riches en cystéine (CRD pour Cystein Rich Domain), impliqués dans la liaison du ligand et la dimérisation du récepteur, une tige riche en sérine et thréonine qui est très glycosylée, ainsi qu'un domaine intracellulaire incluant un signal de mort cellulaire, potentiellement impliqué dans l'apoptose (Chao et al., J Neurol., 1994,25, 1373-1385). La p75NTR est exprimée dans de nombreux tissus neuronaux et non- neuronaux chez le sujet jeune. Chez l'adulte, son expression est plus limitée ; elle est détectée dans plusieurs catégories de neurones, principalement au niveau des synapses, ainsi que dans d'autres tissus tels que le muscle, l'oreille interne, les testicules et les glandes sous-maxillaires. La p75NTR lie le NGF (Nerve Growth Factor) et d'autres neurotrophines, telles que le BDNF (Brain-Derived Nerve Factor) et les neurotrophines NT-3 et NT-4/5. Le domaine de liaison au récepteur des neurotrophines n'a pas été identifié de façon précise ; il a été montré que quelques acides aminés basiques sont indispensables, suggérant l'existence d'interactions ioniques entre les neurotrophines, chargées positivement, et le domaine externe, riche en résidus cystéine. L'hétéropolymère formé par la liaison des neurotrophines au récepteur p75NTR.peut éventuellement s'associer avec une protéine de la famillle Trk (TrkA, B ou C, en fonction du ligand) pour former un site de haute affinité pour les neurotrophines ; le complexe p75NTR-NGF-TrkA est internalisé dans des vésicules et transporté de façon rétrograde au niveau des corps cellulaires des neurones (Lalli G. et,al., J. Cell Biol., 2002, 156, 2, 233-239). Poursuivant leurs travaux, les Inventeurs ont maintenant identifié un fragment peptidique de la glycoprotéine G du virus de la rage, capable de se lier spécifiquement au récepteur p75NTR. Ce peptide, ligand du récepteur p75NTR représente un vecteur capable d'adresser (ou cibler) et d'internaliser (par endocytose) des molécules d'intérêt de façon efficace et spécifique dans des cellules exprimant ce récepteur, en particulier dans les neurones. En conséquence, la présente invention a pour objet un peptide, constitué par les résidus d'acides aminés 318 à 352 de la glycoprotéine G mature du virus de la rage. Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide, il présente la séquence suivante : FNKTX MEADAHYXZX3X4X5X6WXEX$LPSX9X1 oCLXi, X, ZGX 13RCH, (SEQ ID NO:1), dans laquelle : X1 représente L ou I, X2 représente K, T ou N, X3 représente S ou P, X4 représente V ou I, X5 représente R, Q, M, L, I, S, K, G ou E, X6 représente T ou E, X7 représente N, I, T ou E, X8 représente I ou L, Xg représente K, T ou N, XIO représente G ou E,X1l : R ou E, X12: A ou V et X13 représente G ou E. De manière préférée, ledit peptide est constitué par la séquence SEQ ID NO:2 : FNKTLMEADAHYKSVRTWNEILPSKGCLRVGGRCH. De manière avantageuse, du fait de sa capacité de liaison avec p75NTR, ledit peptide permet un adressage spécifique aux cellules neuronales ainsi qu'une intemalisation de molécules d'intérêt dans les cellules neuronales, notamment pour le traitement de maladies neurodégénératives. En effet, ce peptide se lie de manière spécifique au récepteur de basse affinité du NGF (p75NTR) et plus particulièrement au premier domaine riche en cystéines (CRD1) dudit récepteur, alors que les neurotrophines se fixent sur les deuxième et troisième domaines riche en cystéines (CRD2 et 3). De manière surprenante, lé peptide selon l'invention présente effectivement des propriétés d'adressage et d'intemalisation dans les cellules neuronales, alors que ce n'est pas le cas pour le peptide correspondant strictement au site III (positions 330-340) ; effet, le fragment 318-329 de la glycoprotéine mature du virus de la rage, à l'extrémité N-terminale et notamment la présence d'une phénylalanine à l'extrémité N-terminale (correspondant à la position 318 de la glycoprotéine mature) et le fragment 341-352 de la glycoprotéine du virus de la rage mature, à l'extrémité C-terminale et notamment la présence d'une histidine en position C-terminale, dans le peptide selon l'invention sont nécessaires pour obtenir l'activité recherchée. De manière plus précise, le mécanisme d'action du peptide selon l'invention peut être considéré comme le suivant : - ciblage de la molécule d'intérêt à des cellules particulières, par l'intermédiaire de sa liaison au peptide selon l'invention ; cette liaison est de préférence (mais non exclusivement) covalente et s'effectue par l'intermédiaire d'un linker clivable, qui après clivage, libérera la molécule d'intérêt dans la cellule ; ledit linker contient avantageusement un pont S-S qui sera réduit, un ester qui sera clivé dans les compartiments acides de la cellule ou un glycane. - intemalisation du complexe peptide selon l'invention + molécule d'intérêt dans des vésicules d'endocytose et - libération de la molécule d'intérêt directement au niveau de son site d'action. De manière avantageuse, dans le cadre de l'invention, un peptide de fusion n'est pas nécessaire. Le peptide selon l'invention peut être obtenu, de manière avantageuse soit par synthèse chimique, soit par expression dans des systèmes d'expression classique (bactéries, baculovirus recombinants, levures...) et purification à l'aide d'anticorps anti-G dirigés contre l'un des sites antigéniques contenus dans le dit peptide. La présente invention a également pour objet une molécule complexe, caractérisée en ce qu'ellel comprend un peptide tel que défini ci-dessus, associé, de manière covalente ou non, à une molécule d'intérêt, apte à traiter une maladie neurodégénérative. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite molécule complexe, ledit peptide et ladite molécule d'intérêt sont liés de manière covalente par l'intermédiaire d'un lieur convenable. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit lieur est clivable dans la cellule et comprend soit un pont S-S, soit un ester, soit un glycane. Le peptide selon l'invention est associé à la molécule d'intérêt par toute méthode connue : - lorsqu'il s'agit de peptides, l'association est réalisée par liaison peptidique ; - lorsque la molécule d'intérêt n'est pas un peptide, l'association est réalisée à l'aide de systèmes de couplage ; - des associations non covalentes sont également possibles. La présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour un peptide tel que défini ci-dessus (peptide issu de la glycoprotéine du virus de la rage). Selon un mode de réalisation avantageux de ladite molécule d'acide nucléique, elle présente la séquence suivante : ttc aac aaa ace Ri atg gaa gct gat gct cac tac R2 R3 R4 R5 R6 tgg R7 gag Rs atc ccc tca R9 Rio tgt ctg Ri RIZ gga R13 agg tgt cat, dans laquelle : R1 représente un codon L ou un codon I, R2 représente un codon K, un codon T ou un codon N, R3 représente un codon S ou un codon P, R4 représente un codon V ou un codon I, R5 représente un codon R, un codon, Q, un codon M, un codon L, un codon I, un codon S, un codon K, un codon G ou un codon E, R6 représente un codon T ou un codon E, R7 représente un codon N, un codon I, un codon T ou un codon E, R8 représente un codon I ou un codon L, R9 représente un codon K, un codon T ou un codon N, R10 représente un codon G ou un codon E, R11représente un codon R ou un codon E, R12 représente un codon A ou un codon V et R13 représente un codon G ou un codon E. De manière préférée, ladite molécule d'acide nucléique présente la séquence suivante : ttc aac aaa acc ctg atg gaa gct gat gct cac tac aag tca gtc cgg acc tgg aat gag atc atc ccc tca aag ggg tgt ctg aga gtt gga ggg agg tgt cat (SEQ ID NO:3) La présente invention a également pour objet des vecteurs contenant une molécule d'acide nucléique codant un peptide tel que défini ci-dessus et des cellules hôtes (bactéries, virus et notamment baculovirus et levures, notamment) comprenant ces vecteurs. De tels vecteurs, convenablement sélectionnés, sont utiles comme vecteurs de thérapie génique. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend essentiellement (i) un produit sélectionné dans le groupe constitué par une molécule complexe telle que définie cidessus, une molécule d'acide nucléique nue telle que définie ci-dessus ou un vecteur tel que défini ci-dessus, ladite molécule d'acide nucléique ou ledit vecteur étant associés à une molécule d'intérêt et (ii) au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. La présente invention a également pour objet un outil de criblage spécifique de molécules modulant la liaison entre la glycoprotéine du virus de la rage 8 1 et le récepteur de basse affinité des neurotrophines (p75NTR) spécifique des cellules neuronales, caractérisé en ce qu'il comprend : - des cellules exprimant le peptide, constitué par les résidus d'acides aminés 318 à 352 de la glycoprotéine G mature du virus de la rage, tel que défini ci- dessus (élément de liaison 1) ; et - des cellules exprimant le récepteur de basse affinité des neurotrophines (p75NTR), de préférence, uniquement le CRD 1 dudit récepteur (élément de liaison 2). En variante, au moins l'un des deux éléments de liaison est sous une forme soluble : - la forme soluble du peptide est constituée par les résidus d'acides aminés 318 à 352 de la glycoprotéine G mature du virus de la rage, obtenue de préférence par synthèse. - la forme soluble du récepteur de basse affinité des neurotrophines (p75NTR) est constituée d'au moins le fragment CRD1 et d'au plus l'ectodomaine du récepteur p75 fusionné à un fragment Fc d'une immunoglobuline IgGl humaine. La présente invention a en outre pour objet une méthode de sélection de ligands spécifiques du récepteur p75, caractérisée en ce qu'elle comprend essentiellement : - la mise en contact d'un outil de criblage tel que défini ci-dessus, dans un milieu approprié avec un ligand potentiel marqué et - la mesure du produit marqué éventuellement lié. La méthode mise en #uvre peut être soit une méthode directe, soit une méthode par compétition. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre du peptide de la présente invention, au Tableau résumant les séquences de la Demande ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels : - La figure 1 illustre l'expression de la protéine recombinante p75-Fc dans les cellules COS : la figure 1A illustre la structure du récepteur p75NTR (p75-Fc) soluble dimérique comprenant le domaine externe ou ectodomaine du p75NTR (p75ECD) fusionné au domaine Fc de la chaîne lourde d'une IgG1 humaine (hIgG1Fc) du récepteur soluble p75-Fc ; la figure 1B illustre l'analyse, en Western-blot, de l'expression de la protéine p75-Fc dans le surnageant de cellules COS transfectées de façon transitoire par le plasmide recombinant (P-p75/Fc), et la figure 1C illustre l'analyse, en SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie, de la protéine p75-Fc purifiée en colonne de protéine A-Sépharose. - La figure 2 illustre l'analyse de l'interaction du récepteur soluble p75-Fc avec le virus de la rage : - la figure 2A illustre l'analyse en ELISA ; la figure 2B montre que la protéine p75-Fc neutralise la souche CVS. - La figure 3 illustre l'interaction entre le mutant srr et la protéine p75-Fc ou des anticorps monoclonaux anti-G (figure 3A) ; les complexes immuns sont analysés par SDS-PAGE et autoradiographie (figure 3B). - La figure 4 illustre la liaison des mutants srr à une forme membranaire du récepteur p756 : la figure 4A illustre l'expression de la RVG à la surface cellulaire ; la figure 4B illustre la liaison des cellules marquées Sf21-p75 à des monocouches de cellules BSR infectées par le CVS ou des mutants srr. - La figure 5 illustre la maturation des mutants srr. - La figure 6 la liaison de 125I-RVG aux cellules PC12 : figure 6A : résultats obtenus par incubation de 20 ng/ml de125I-RVG ou de 10 ng/ml de l2sl-NGF avec des cellules PC 12 en présence de compétiteurs non radioactifs ; figure 6B : plot Scatchard. - La figure 7 illustre la liaison de la RGV aux mutants CRD1 : des mutations ponctuelles dans le plasmide CRD et la protéines est exprimée dans des cellules COS-7 ; les cellules sont biotinylées à leurs surface, lysées et les extraits sont précipités avec des billes de streptavidine, puis le récepteur p75 est détecté par Western-blot. - Les figures 8A et 8B illustrent la liaison de 125I-RVG aux mutants ponctuels de CRD1. Tableau résumant les séquences de la Demande SEQ ID NO: 1 : Séquence générale du peptide correspondant aux résidus 318-352 de la protéine G mature du virus de la rage 10 SEQ ID NO:2 : Séquence particulière du peptide correspondant aux résidus 318-352 de la protéine G mature du virus de la rage (souche CVS) SEQ ID NO:3 : Séquence nucléique codant pour le peptide de SEQ ID N0:2 SEQ ID NO:4 : amorce RAI SEQ ID NO:5 : amorce RB 12 SEQ ID NO:6 : amorce RB 13 SEQ ID NP:7: amorce RB 14 SEQ ID NO:8 : amorce RB 10 SEQ ID NO:9 : amorce RAI SEQ ID N0:10 : amorce RB5 SEQ ID NO:11 : amorce RA12 SEQ ID NO: 12 : amorce RA13 SEQ ID NO: 13 : amorce RA9 SEQ ID NO: 14: amorce SEQ ID NO:15 : amorce EXEMPLE 1 : MATERIELS ET METHODES 1) Cellules, virus et anticorps - Les cellules BSR (Sato et al., Arch. Virol., 1977,53, 269-273), un clone de cellules BHK-21, sont cultivées dans du milieu MEM modifié par Glasgow (GIBCO BRL) supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal, à 37 C, dans un incubateur humide, en présence de 5 % de C02. Elles sont utilisées pour produire le virus de la rage (RV) et le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) (Thoulouze, J. Virol., 1998, 72, 7181-7190). - Les cellules COS-7 (fournies par Brian Seed, MGH Boston), sont cultivées dans du milieu DMEM (GIBCO BRL) supplémenté avec 10 % de sérum f#tal bovin, à 37 C, dans un incubateur humide, en présence de 5 % de C02. - Les cellules Sf21 de Spodoptera frugiperda (INVITROGEN) sont cultivées à 28 C dans du milieu TC100 (GIBCO BRL) supplémenté avec 10 % de sérum f#tal bovin. - Les cellules PC12 sont cultivées dans un milieu MEM (GIBCO BRL), en présence de sérum de veau f#tal à 10 %. - Le virus de la rage de souche CVS (Challenge Virus Strain) est amplifié et titré par la technique des plages, selon les protocoles décrits dans Raux et al., Virology, 1995,210, 400-408. Dix clones de CVS, qui ont été antérieurement utilisés pour sélectionner des mutants qui sont neutralisés à pH acide (Raux et al., 1995 précité), ont été utilisés dans cette sélection. - Un baculovirus recombinant exprimant la p75NTR humaine (Tuffereau et al., J. Gen. Viral., 2001,82, 2861-2867) a été utilisé pour infecter des cellules Sf21. - Un anticorps polyclonal anti-IgG est utilisé (Jackson Laboratories) - Des anticorps monoclonaux sont également mis en #uvre : . les anticorps monoclonaux anti-G 30AA5 et 40DC2 se lient au site II (Préhaud et al., J. Viral., 1988, 62, 1-7), . Les anticorps monoclonaux 50AD1et 41 BC2 se lient au site III (Tuffereau et al., Viral., 1989, 172, 206-212) . L'anticorps monoclonal 9B4 se lie au site a (Benmansour et al., J. Viral., 1991, 65, 4198-4203), . L'anticorps monoclonal 17D2 se lie à l'épitope linéaire (Lafay et al., J Gen. Viral., 1996,77, 339-346) et . L'anticorps 21H8 se lie à la conformation spécifique des conditions acides (Raux et al., 1995, précité) Ces anticorps sont préparés et caractérisés, conformément aux méthodes connues de l'homme du métier. 2) Constructions p75 Des mutants dans lesquels le domaine riche en cystéine (CRD) est délété sont obtenus par la technique de PCR-recombinante, utilisant un plasmide p75 comprenant la totalité de la séquence codante du gène p75 humain, amplifié avec des oligonucléotides spécifiques et sous-cloné dans le site BamHI du plasmide pcDNAI [Invitrogen, réf. V490-20, 1992 (bactéries MC1061/P3, sélection ampicilline+tétracycline)], comme matrice et des amorces spécifiques pour introduire des délétions CRD dans la partie extracellulaire de la protéine. Le Tableau I ci-après précise les amorces qui ont été utilisées pour obtenir les mutants de délétion. Tableau 1 : amorces (SEQ ID NO : 4 à 13) utilisées pour les mutants de délétion Nom du PCR : fragment a PCR : fragment b mutant CRD1 RAI gcgggatcccgggcgatgggggcag RA11: aaccagaccgtgtgtgaggagatccctggc RB12 : gccagggatctcctcacacacggtctggtt RB5 : cgcggatcctcatcacaccggggatgtggc CRD1-2 RA1: gcgggatcccgggcgatgggggcag RA12 : gacgacgccgtgtgcgaggagatccctggc RB13 : gccagggatctcctcgcacacggcgtcgtc RB5 : cgcggatcctcatcacaccggggatgtggc CRDI-2-3 RAI : gcgggatcccgggcgatgggggcag RAI 3 : cagaacaccgtgtgcgaggagatccctggc RB14: gccagggatctcctcgcacacggtgttctg RB5 : cgcggatcctcatcacaccggggatgtggc CRD2-3-4 RAI : gcgggatcccgggcgatgggggcag RA9 : tcccttggaggtgcctgcctggacagcgtg RB10: cacgctgtccaggcaggcacctccaaggga RB5 : cgcggatcctcatcacaccggggatgtggc Dans une première étape, deux fragments de PCR (a et b) sont obtenus puis une PCR de fusion est réalisée en utilisant les amorces RAI et RB5 et les fragments PCR a+b. Des mutations ponctuelles sont introduites dans CDR1 à l'aide du kit de mutagenèse dirigée QuickChangeTM (Stratagene). Les mutations sont introduites dans le gène par amplification à l'aide de l'ADN-polymérase Pfu TurboTM et de deux amorces synthétiques portant la mutation désirée. L'incorporation des amorces génère un plasmide muté. Après amplification, la matrice d'ADN (méthylée ou hémi-méthylée) est digérée pendant 1 heure à 37 C par l'endonucléase C DpnI et le produit de digestion est utilisé pour transformer des bactéries MCI 061. 3) Expression d'un récepteur p75 soluble (p75-Fc) Un vecteur d'expression contenant l'ectodomaine du récepteur p75NTR (acides aminés 1 à 222, numéro d'accession Genbank n M 14764 et Johnson et al., Cell, 1986,47, 545-554) cloné en phase avec le domaine constant de la chaîne lourde d'une IgG1 humaine (Aruffo et al., Cell, 1990,61, 1303-1313 ; Langner et al., Arch. Virol., 1993,130, 157-170) a été construit (figure 1A) en suivant les étapes suivantes. Un fragment d'ADNc de la p75NTR a été amplifié par PCR à l'aide de la polymérase Tfu (PROMEGA) et d'un couple d'amorces comprenant une amorce sens, complémentaire de la séquence signal, contenant un site XhoI (5'CGCGGGCTCGAGATGGACGGGCCGCGC3', SEQ ID N0:14) et une amorce anti-sens correspondant à la séquence 3' de la tige O-glycosylée, contenant un site BamHI 5' GCGGATCCCATCGGCCAGGGATC3', SEQ ID NO:15). Le produit d'amplification obtenu est digéré par les enzymes BamHI et XhoI et inséré entre les sites correspondant du plasmide (Langner et al., Arch. Virol., 1993,130, 157-170) pour donner le plasmide recombinant P-p75/Fc. L'insert cloné dans le plasmide recombinant P-p75/Fc a été vérifié par séquençage. Des cellules COS ont été transfectées de façon transitoire par le plasmide recombinant P-p75/Fc par la technique du DEAE-dextran. Le surnageant de culture a été récolté 72 h après la transfection, clarifié par centrifugation à basse vitesse et chargé sur une colonne de protéine A-Sépharose (SIGMA). La protéine p75Fc a été éluée dans un tampon 0,1M glycine pH 3 et neutralisée par addition de 1 M Tris HCl pH8, à la concentration finale 50 mM. La protéine ainsi obtenue a été dialysée contre un tampon PBS (10 mM phosphate (pH 7), 137 mM NaCl, 2,6 mM KC1), à l'aide du système de dialyse FastDialyzer Interbiotech (INTERCHIM) et conservée à - 80 C. La concentration en protéine a été déterminée par la méthode de Bradford à l'aide d'un réactif commercial (PIERCE). La protéine purifiée a été analysée par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDSPAGE) et coloration au Bleu de Coomassie et par Western-blot, à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-p75. 4) Préparation de RVG et de VSVG Les glycoprotéines de RV (RVG) et de VSV (VSVG) sont purifiées en utilisant la méthode décrite par Gaudin Y. et al., (Virology, 1992,187, 627-632) légèrement modifiée. Brièvement, les virus purifiés sont traités avec 1 % de CHAPS (3-[(3-cholaminopropyl)diméthyl-ammonio-1-propane sulfonate) en présence d'un mélange d'inhibiteurs de protéases (chymostatine, leupeptine, antipapaine et pepstatine à 2 g/ml chaque et 16 g d'aprotinine par ml) pendant 30 minutes à 37 C. Les virions solubilisés sont déposés sur un gradient de saccharose à 20 % dans du PBS contenant 1 % de CHAPS et centrifugés pendant 1 heure (SW41, 35K, 4 C). Les surnageants contenant la majorité des glycoprotéines sont concentrés dans un Centricon 30 (Amicon) puis chargés sur gradient de saccharose à 5-20 % dans 10 mM de NaCl, 10 mM de tampon Tris pH8 contenant 1 % de CHAPS et centrifugés pendant 16 heures à 35. 000 tours par minute dans un rotor SW41 (Beckman). Les fractions contenant la glycoprotéine trimérique correspondant au coefficient de sédimentation 9S sont mélangées et chargées sur une colonne DEAETrisacryl (IBF, Biotechnics) dans un mélange de NaCI 10 mM, Tris 10 mM pH 8 contenant 1% de CHAPS. Les glycoprotéines sont éluéés par un tampon comprenant 250 mM NaCI, 20 mM Tris 10 mM pH 7,5 contenant 1% de CHAPS. Le détergent est éliminé par des dialyses successives contre du tampon PBS et la concentration en protéine est déterminée par la méthode de quantification de Bradford. Le produit protéique final consiste en des rosettes pures de RVG ou de VSVG, ayant en moyenne 10 trimères par rosette et à une concentration allant de 0,8 à 1 mg/ml. 5) Méthodes d'étude de la liaison RVG ou peptide selon l'invention-récepteur p75 : Tests de liaison de la RVG ou du peptide selon l'invention 5.a. Méthode à la (i-galactosidase Des cellules COS-7 transfectées ont été traitées avec 10 g de RVG purifié dans 1,5 ml de milieu DMEM contenant 10 % de sérum foetal bovin (FBS) pendant 2 heures à température ambiante. Les cellules sont lavées 3 fois et fixées à l'aide de 4 % de paraformaldéhyde froid. Les cellules sont ensuite incubées avec des anticorps spécifiques anti-G et un anticorps anti-souris de chèvre conjugué à la j3-galactosidase (Southem Biotechnology Associates), en utilisant un substrat X-Gal tel que décrit dans Tuffereau et al., (EMBO J., 1998, 17, 7250-7259). 15 5.b. Méthode mettant en #uvre de la RVG ou un peptide selon l' invention radiomarqué L'iodation de la RVG ou d'un peptide selon l'invention est réalisée par la méthode à la lactoperoxidase jusqu'à obtention d'une activité spécifique moyenne de 7,5 x 107 cpm/ug. La RVG ou le peptide selon l'invention radiomarqué est purifiée par chromatographie d'exclusion de taille en utilisant une colonne Séphadex G25. Pour les essais de compétition de fixation, les cellules sont mises en suspension dans des tubes Eppendorf avec 20 ng/ml de 125I-RVG (environ 30 pM, en considérant un trimère accessible à la fixation par rosette) dans du PBS contenant 1 mg/ml de sérumalbumine bovine (BSA), 1 mM de MgCl2, et 0,5 mM de CaCl2, en présence ou en l'absence de compétiteurs non radioactifs (froids). Les tubes sont ensuite soumis à une agitation douce à 4 C pendant au moins 2 heures pour favoriser la fixation, et le ligand lié est séparé du ligand libre par une centrifugation rapide des cellules dans une microcentrifugeuse Eppendorfà 4 C. La fixation non-spécifique (bruit de fond) est déterminée par l'utilisation d'un excès de RVG non-marquée (400 fois). 5.c. Neutralisation des virus par un anticorps monoclonal anti-G ou par le récepteur soluble p75-Fc Des virus CVS [103 unités formant plage (ufp ou pfu) ] sont incubés avec des liquides d'ascites (dilué au 1/100) d'anticorps 30AA5 ou avec différentes quantités de p75-Fc ou d'anticorps anti-G (de 1 à 10 g). Lorsque cela est spécifié, 10 g d'anticorps anti-d'IgG humaines sont ajoutés et incubés pendant 1 h à 37 C. L'efficacité de la neutralisation est mesurée par la technique des plages sur des cellules BSR : le titre viral est déterminé par des expériences de formation de plaques sur des monocouches de cellules BSR. 5.d. Immunoprécipitation de la RVG par des anticorps monoclonaux anti-G ou par le p75-Fc Des cellules BSR (106 cellules dans des boîtes de 35 mm) sont infectées avec chaque virus (multiplicity of infection ou moi 2). 24 heures après l'infection, les cellules sont radiomarquées pendant 1 heure à 37 C avec 50 Ci de 35 S-méthionine et de 35S -cystéine (Promix, Amersham) dans un milieu MEM sans méthionine ni cystéine (GIBCO). Des extraits cellulaires dans un tampon TRIS (0,05 M Tris-HCI pH 8 ; 0,15 M NaCl), supplémenté avec 1 % de CHAPS (3-[(3- cholaminopropyl)diméthyl-ammonio-1-propane sulfonate) en présence d'un mélange d'inhibiteurs de protéases (chymostatine, leupeptine, antipapaïne et pepstatine à 2 g/ml chaque et 16 ug d'aprotinine par ml). Après incubation de 30 min dans de la glace, les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation à 12 000 g, pendant 15 min. Les extraits cellulaires sont incubés 1 heure à 4 C avec différents anticorps monoclonaux (2 l de liquide d'ascite) ou de p75-Fc (4 g) pré-adsorbé sur de la protéine A-Sépharose. Les immuns-complexes sont analysés par SDS-PAGE à 12 %. La RVG immunoprécipitée est détectée par autoradiographie (films Kodak Biomax). 5.e. SDS-PAGE et analyse par immunoemnreinte Des échantillons de protéine sont portés à ébullition pendant 5 min dans un tampon de Laemmli. L'électrophorèse est réalisée dans un gel SDS-PAGE discontinu. Les protéines sont ensuite colorées au Bleu de Coomassie puis transférées sur des membranes de nitrocellulose (BA85, Schleicher et Schuell). Les membranes sont saturées avec 5 % de lait écrémé dans un tampon, TBS (Tris-buffer saline) contenant 0 ;05 % de Tween 20 pendant 30 min puis incubées pendant 1 heure avec un anticorps de chèvre anti-souris conjugué à la peroxydase (Sigma). Les immunscomplexes sont détectés après lavage dans un tampon TBS-Tween par chemiluminescence (ECL). 5.f. ELISA Du virus de la rage (souche CVS), purifié selon les techniques classiques telles que décrites dans Gaudin et al. (Virol., 1992,187, 627-632), a été dilué dans du tampon TD (137 M NaCI, 5 mM KCI, 0,7 mM NaHP04, 25mM TrisHCI, pH 7,5), réparti dans une plaque à 96 puits (50 ng/puits dans 50 l), puis les plaques ont été séchées une nuit à 37 C. Les plaques ont été saturées par une solution de PBS contenant 10 % (P/V) de poudre de lait écrémé. Des dilutions sériées de la protéine p75-Fc purifiée ou d'une IgG humaine (JACKSON) ont été ajoutées (50 l/puits) puis la plaque a été incubée 2 h à 37 C dans un incubateur humide. Les plaques ont été ensuite rincées trois fois avec du tampon PBS contenant 1 % de poudre de lait écrémé. Un anticorps anti-IgG humaine couplé à la phosphatase alcaline (SIGMA), dilué au 1/1000 dans le même tampon a été ajouté dans chaque puits (50 l) et la plaque a été incubée 1 h à 37 C. Les plaques ont ensuite été rincées trois fois avec du tampon PBS, puis une solution de p-nitrophényl-phosphate (1,33 mM dans 1 M Tris HCI, pH 8) a été ajoutée dans chaque puits (200 ul) et la densité optique a été mesurée à 405 nm, à l'aide d'un spectrophotomètre (Mini Reader, DYNATECH). 5.g. Fixation des cellules Sf 21 exprimant le récepteur p75 aux cellules BSR infectées par le virus de la rage Des essais de fixation entre des cellules BSR infectées par différents mutants et des cellules d'insectes (Sf21) infectées par un baculovirus recombinant et exprimant le p75NTR à leur surface (p75-Sf21) ont déjà été décrits (Tuffereau C. et al., J Gen. Virol., 2001,82, 2861-2867). Brièvement, une suspension de cellules p75-Sf21 radiomarquées est ajoutée à une monocouche de cellules BSR infectées par différents mutants (moi de 2 pour 30 h) et incubées pour 30 minutes à température ambiante. Les cellules p75-Sf21 non fixées sont éliminées par trois lavages au PBS et la fixation spécifique est mesurée par comptage de la radioactivité associée aux cellules BSR infectées. Parallèlement, l'expression de RVG à la surface des cellules BSR infectées par le virus de la rage est déterminée par une immunoprécipitation de surface en utilisant des anticorps anti-G (30AA5 et 21H8) selon la technique décrite dans Tuffereau C. et al., (J Gen. Viral., 2001,82 : 2861-2867). 6) Sélection de mutants RVG (mutants srr) Des clones de virus CVS (106 pfu) sont incubés avec 5 g de p75Fc, pendant 1 heure à 37 C, puis avec 10 g d'IgG anti-humaines pendant 1 heure à 37 C. Le virus non-neutralisé est étalé sur une monocouche de cellules BSR dans des plaques de 24 puits. Après 3 heures à 37 C, les cellules surnageantes sont collectées et soumises à un nouveau cycle de neutralisation-amplification. Chaque clone est amplifié trois ou quatre fois, en présence de p75-Fc et d'IgG anti-humaines et les plaques testées pour la sélection de variants. Les plaques sont prélevées, amplifiées dans des cellules BSR et chaque variant est soumis à un test de neutralisation utilisant du p75-Fc et des IgG anti-humaines. Seuls les variants présentant une résistance à la neutralisation par p75-Fc supérieure à 90 % ont été de nouveau amplifiés et caractérisés. L'ARN total est extrait des cellules BSR infectées à l'aide du kit RNAgents total RNA (Promega). L'ADN complémentaire (ADNc) du gène RVG est obtenu par la technique de RT-PCR : avec de la transcriptase inverse d'AMV (Promega) puis ensuite avec de la Taq polymerase (Promega) en utilisant des amorces spécifiques du gène RVG. Le fragment d'ADNc est alors purifié et séquence en utilisant un kit de séquençage à la T7 (T7-sequencing kit, Amersham). 7) Expériences d'impulsion-chasse Les expériences sont réalisées comme décrit dans Gaudin et al. (Gaudin etal., J. Virol., 1997,71, 3742-3750). Des monocouches de cellules BSR sont infectées par du virus CSV ou des mutants srr à une moi de 5. Après 24 heures, les cellules sont préincubées dans un milieu sans méthionine ni cystéine pendant 1 heure. Les cellules sont ensuite marquées avec 100 Ci de 35-S-méthionine et 35S-cystéine (Promix, Amersham), pendant 3 min. Un milieu préchauffé contenant un excès de méthionine et de cystéine non marquées est ajouté pour des périodes de chasse. Les cellules sont lysées et la RVG est immunoprécipitée, comme indiqué en 5.d. EXEMPLE 2: Expression d'une forme soluble du récepteur p75 La forme soluble du récepteur p75 est obtenue conformément à l'exemple 1.3). Les résultats de l'analyse du surnageant cellulaire présentés à la figure 1B montrent la présence d'une protéine reconnue par des anticorps anti-p75, qui possède un poids moléculaire apparent d'environ 97,4 kD, correspondant à celui attendu pour une protéine de fusion p75-Fc. La protéine p75-Fc est également reconnue par un anticorps monoclonal reconnaissant un épitope conformationnel de la p75 (anticorps ME20.4 reconnaissant les domaines riches en cystéine (CRDs 3 et 4) et par un sérum polyclonal anti-IgG humaine. La p75-Fc a été purifiée sur une colonne de protéine A-Sepharose avec un rendement de 5 jg/ml. L'analyse en SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie, de la protéine purifiée montre que la protéine p75-Fc obtenue est pure à 90 % (figure 1 C). EXEMPLE 3 : de l'interaction entre la protéine soluble p75-Fc et le virus de la rage (Tests ELISA et de neutralisation) - Analyse en ELISA La liaison du récepteur soluble avec le virus de la rage a été analysée en ELISA, selon le protocole décrit à l'exemple 1.5.f. Un test ELISA a été utilisé pour étudier la fixation du récepteur soluble au virus de la rage. Une boîte est ensemencée avec du virus de la rage (lignée CVS) et incubée avec différentes quantités de p75-Fc ou d'immunoglobulines G humaines. Une expérience représentative est présentée à la figure 2A. La p75Fc se fixe au virus de manière concentration-dépendante, avec un Kd estimé de 400 nM. Les immunoglobulines G humaines ne se fixent pas au virus de la rage dans les mêmes conditions. L'interaction spécifique entre la forme soluble du récepteur p75 et le virus de la rage indique qu'aucun cofacteur n'est requis pour cette interaction. Ceci est en accord avec la capacité de la p75-Fc à co-précipiter avec la RVG solubilisée à partir du virus par des détergents sous forme de monomères ou de trimères. - Neutralisation du pouvoir infectieux du virus de la rage La capacité de la protéine soluble p75-Fc à neutraliser le pouvoir infectieux du virus de la rage a été étudiée, conformément au protocole décrit à l'exemple 1.5.c. Les titres ne diminuent pas en présence de p75-Fc jusqu'à 20 g et sont brutalement diminués de moitié en présence de concentrations plus élevées de la molécule. Bien que le test ELISA montre que la p75-Fc interagit avec le virus de la rage, elle ne neutralise pas efficacement son pouvoir infectieux (figure 2B). EXEMPLE 4 : et caractérisation des mutants Srr A. Sélection des mutants Le but est de cartographier le domaine de la RVG impliqué dans la fixation de la p75 par la sélection de mutants qui ne sont pas neutralisés par la forme soluble du récepteur. Ainsi, on a augmenté l'efficacité neutralisante de la protéine chimère p75-Fc : l'efficacité neutralisante est dépendante du nombre de molécules d'immunoglobulines fixées au virus (Flamand A. et al., Virology, 1993, 194 :302- 313). L'hypothèse a été faite que la fixation de la p75-Fc au virus ne prévient pas l'interaction entre le virus de la rage et les cellules et dès lors l'infection. Pour augmenter le pouvoir neutralisant du récepteur soluble p75-Fc, une étape d'incubation avec une immunoglobuline G anti-humaine spécifique de la partie Fc de la chimère a été ajoutée. Cet anticorps ne doit pas interférer avec l'interaction entre le récepteur p75-Fc et la RVG, qui se produit au niveau de la partie N-terminale du récepteur p75. Le virus a préalablement été incubé avec une quantité allant de 1 à 10 g de p75-Fc, puis avec 10 g d'immunoglobuline G anti-humaine (Tableau H). Tableau II : Neutralisation du virus de la rage par la protéine soluble p75-Fc Agents neutralisants Neutralisation Anticorps monoclonaux anti-G (30AA5) (1) > 99,99 % Protéine p75-Fc seule (2) Protéine p75-Fc+anticorps anti-Fc humain (3) > 90 % IgG humaine seule (4) Anticorps anti-Fc humain seule (5) IgG humaine + Anticorps anti-Fc humain (6) Bien que l'anticorps anti-Fc humain seul n'affecte pas le pouvoir infectieux du virus de la rage, une neutralisation significative (> 90 %) a été obtenue quand cet anticorps est ajouté aux complexes virus/p75-Fc. Cependant, une incubation avec un anticorps neutralisant spécifique du site II (30AA5) aboutit à un effet neutralisant identique (> 99,99 %) et une augmentation de la concentration en anticorps n'améliore pas significativement la neutralisation. Pour augmenter la chance de sélection d'un mutant, 10 populations clonées de CVS 3 ont été soumises à plusieurs passages, en présence de 5 g de p75Fc et de 10 g d'anticorps anti-immunoglobuline G humaine. Les particules virales sont amplifiées sur des monocouches de cellules BSR qui n'expriment pas le récepteur p75NTR mais expriment d'autres récepteurs conduisant à l'infection cellulaire et à l'amplification des mutants Srr. Plusieurs populations virales se sont révélées plus résistantes à la neutralisation par la p75-Fc et les immunoglobulines G anti-humaines. Après trois ou quatre passages en conditions neutralisantes, les copulations virales clonées ont été titrées par la technique de formation de plaques en présence ou en l'absence de la p75-Fc et d'anticorps anti-Fc. Des plaques ndividualisées ont été prélevées, amplifiées et de nouveau mises en présence avec la p75-Fc et l'anticorps anti-immunoglobuline G humaine. Au total, 14 mutants provenant de 8 clones CVS ont été isolés. Neuf ont été totalement caractérisés. Le gène complet de la glycoprotéine a été séquence )our quatre d'entre eux et des séquences partielles ont été obtenues pour les autres Tableau III). Tableau III : Caractérisation des variants résistants à la neutralisation par la protéine p75-Fc Nom du Virus Phénotype des AA n Nature de la Codon mutant plaques substitution 2-4 CVS clone 2 Petit 352 H#R CAT->CGT 4-1 CVS clone 4 Petit 352 H#R CAT#CGT 5-4 CVS clone 5 Grand 318 FV TTCGTC 6-5 CVS clone 6 Petit 318 F#S TTC#TCC 7-5 CVS clone 7 Grand 352 H#Y CAT#TAT 8-2 CVS clone 8 Grand 318 F#V TTC->GTC 8-4 318 F#V TTC#GTC 9-1 CVS clone 9 Petit 352 H#R CATCGT 10-5 CVS clone 10 Petit 318 F#S TTC#TCC Comme supposé, en fonction de la procédure de sélection, les deux mutants issus du même clone (n 8) contiennent la même mutation. Aucun mutant n'a été isolé de deux des clones (n 1 et 3), alors qu'un (clone 3) est devenu globalement résistant à la neutralisation. Le clone 1 était encore neutralisé par la p75-Fc + l'anticorps antiimmunoglobuline G humaine, même après quatre passages en présence de ces molécules. Seules quatre substitutions différentes ont été identifiées sur les huit mutants indépendants. Deux ont été localisées à la position 318 de la glycoprotéine virale (F318V et F318S) à proximité du site de N-glycosylation et deux ont été localisées à la position 352 (H352R et H352Y). Les mutants F318S et H352R conduisent à la formation de petites plaques sur des cellules BSR. Les deux autres mutants donnent des plaques de plus grandes tailles (Tableau III). B. Caractérisation des mutants srr 1. Interaction avec un anticorps anti-G Aucune mutation n'a été antérieurement décrite aux positions 318et 352. L'interaction entre les mutants et les anticorps anti-G dirigés contre le site II (30AA5, 40DC2), le site III (50AD1, 41BC2), le site a (9B4), l'épitope linéaire (17D2) et l'anticorps spécifique de la conformation liée aux conditions acides (21H8) a été étudiée. Cinq de ces anticorps sont neutralisants et neutralisent les mutants Srr (Tableau IV). Tableau IV : des mutants srr avec les anticorps monoclonaux anti-G 21HSa Site abc Site III Site III Site aaa Site P75-Fc" 30AA5- 41BC2ac 50AD1bc 9B4 linéairea 40DC2 17D2 CVS + + + + + + + F318V + + + + + +F318S + + + + + +H352Y + + + + + +H352R + + + + + ± a: caractérisation par imunoprécipitation b : caractérisation par immunofluorescence c: caractérisation par neutralisation. La RVG de différents mutants Srr est immunoprécipitée par tous les mticorps testés, mais pas par la p75-Fc, alors que la glycoprotéine CVS est mmunoprécipitée par tous les anticorps et par la p75-Fc (Fig. 3A). Comme l'anticorps 50AD1 (spécifique du site III) est une immunoglobuline M et ne peut pas être suivie )ar immunoprécipitation, sa fixation aux mutants du virus de la rage a été suivie par mmunofluorescence. Cette fixation a été trouvée normale (Fig. 3B). Pour réaliser l'immunofluorescence, les cellules BSR infectées par la ;ouche CVS ou les mutants srr depuis 18 heures, sont incubées avec l'anticorps 50AD1 (dilution 100 dans un tampon EPT, pH 7,4 : NaCl 150 mM, Na2HP04 7,4 nM, KH2P04 2,4 mM : ) pendant deux heures, puis lavées et fixées par traitement en présence de paraformaldéhyde 4 % dans l'EPT pendant 15 minutes, lavées et incubées avec l'anticorps secondaire conjugué FITC (Pierce) dilué 100 fois dans e tampon EPT pendant 1 heure à l'obscurité. Les cellules sont observées avec un microscope à fluorescence Olympus B40. Ces résultats suggèrent que les mutations 318 et 352 sont localisées à l'extérieur du site antigénique préalablement caractérisé (Tableau III). 2. Interaction avec le p75NTR fixé à la membrane La fixation des glycoprotéines de mutants Srr à la forme fixée à la membrane du p75NTR a été étudiée. II a été démontré que la fixation entre des cellules BSR infectées par le virus de la rage et des cellules Sf21infectées par un virus recombinant et exprimant la p75-Fc à leur surface (p75-Sf21) est spécifique (Tuffereau C. et al., J Gen. Virol., 2001,82 : 2861-2867). L'expression de la forme mutée de la RVG de srr a été suivie par immunoprécipitation avec deux anticorps anti-G (Fig. 4A). Les cellules infectées par les mutants F318V et H342Y expriment deux fois plus de glycoprotéines que les cellules infectées par le CVS, alors qu'une quantité identique de protéines a été détectée dans les cellules infectées par les mutants F318S et H352R. Aucune cellule p75-Sf21 radiomarquée ne se fixe à la monocouche cellulaire ayant été infectée avec n'importe lequel des mutants Srr quand bien même ils contiennent une quantité normale de la glycoprotéine à leur surface. A l'inverse on détecte une fixation très importante quand la monocouche a été infectée avec du CVS (Fig. 4B). Les substitutions des acides aminés 318 ou 352 abolissent l'interaction avec le p75NTR qu'elle soit sous forme soluble ou sous la forme d'un récepteur fixé à la membrane. 3. Repliement de la RVG des mutants Srr : Les profils de migration des glycoprotéines des mutants F318V et H352 sont modifiés (Fig. 3A et 4A). La RVG migre comme un doublet chez le CVS (2/3 des molécules portant deux chaînes sucrées et 1/3 des molécules portant une seule chaîne sucrée), alors que les glycoprotéines de Srr migrent comme un triplet. Ces différences corrèlent avec le phénotype des plaques : F318V et H352R produisant des plaques plus petites que CVS. Cela suggère que le transport/repliement de la glycoprotéine puisse être affecté dans ces mutants. Des expériences d'impulsion-chasse (Gaudin Y., J. Viral., 1997, 71, 3742-3750) ont été utilisées pour comparer la maturation de la RVG chez les mutants Srr (F318S et H352R) et chez le CVS. Immédiatement après l'impulsion une RVG de CVS néo-synthétisée, immunoprécipitée par l'anticorps 17D2, migre comme un doublet : une bande correspondant à l'addition d'une chaîne sucrée à haute teneur en mannose et une correspondant à l'addition de deux chaînes sucrées. L'addition des sucres complexes dans l'appareil de Golgi augmente le poids moléculaire se traduisant par la présence de bandes additionnelles de haut poids moléculaire et par une diminution/disparition des bandes plus petites. Aucune différence majeure' n'est observée entre le CVS et les mutants après 20 minutes de chasse. Les bandes les plus larges apparaissent plus lentement chez les mutants que chez le CVS. La glycoprotéine immature (la bande la plus petite) est encore présente après 120 minutes de chasse chez les mutants Srr (F318S et H352R). EXEMPLE 5 : de l'affinité de liaison RVG-récepteur p75 La RVG est radiomarquée (125I-RVG), de manière à obtenir une activité spécifique de 7,5.104 cpm/ng, à l'aide de la méthode à la lactoperoxydase (voir exemple 1.5.b). Sa liaison aux cellules PC 12 est mesurée en présence d'un excès de RVG froide, de NGF ou de VSVG. Des expériences comparatives sont effectuées en parallèle avec du NGF froid. Les deux ligands se lient aux cellules P12 (figure 6A) ; protéine contrôle VSVG ne déplace aucun des deux ligands. On observe qu'un excès de NGF froid n'entre pas en compétition dans la liaison de l'125I-RVG; un excès de RVG froid ne déplace pas l'125I-NGF. Des résultats similaires sont obtenus avec des cellules PC 12 qui expriment le récepteur p75 mais pas trk. Ces résultats illustrent la spécificité de la liaison de RVG pour le récepteur p75. La liaison de RVG aux cellules PC 12 présente une haute affinité, avec un Kd de 355 pM (figure 6B). EXEMPLE 6 : en évidence du site de liaison du récepteur p75 Différents mutants p75 ont été construits pour mettre en évidence le site de liaison. Pour maintenir un repliement correct des mutants, l'intégrité de chaque CRD est préservée. Les mutants contiennent 1, 2 ou 3 CRD connectés via un linker 0- glycosylé aux domaines TM et cytoplasmique du l'hp75. Des cellules COS-7 sont transfectées avec différents plasmides et l'expression des mutants est analysée par Western-blot avec un anticorps anti-domaine cytoplasmique de p75. Les différents mutants migrent sur un gel SDS-PAGE, conformément à leur poids moléculaire. Dans le cas du mutant CRD1, la protéine migre en tant que doublet. L'expression à la surface cellulaire de tous les mutants a été confirmée par immunofluorescence, bien qu'à des taux différents. RVG se lie à tous les mutants, à l'exception de celui dans lequel CRD1 est délété. Par ailleurs, seul CRD est nécessaire pour obtenir une liaison de RVG. L'analyse des différents mutants montre notamment que la glutamine en position 33 est nécessaire pour la liaison à RVG ; en effet, la mutation Q33E abolit complètement la liaison à RVG, alors qu'une mutation en position 32 (N32Q) n'a pas d'effet sur la liaison (figure 7 et figures 8A et 8B). Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en #uvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 ) Peptide, constitué par les résidus d'acides aminés 318 à 352 de la glycoprotéine G mature du virus de la rage. 2 ) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par la séquence SEQ ID NO:1 suivante : FNKTXiMEADAHYX2X3X4X5X6WXEXBLPSX9XIaCLX 1XZGX 13RCH, dans laquelle : X1 représente L ou I, X2 représente K, T ou N, X3 représente S ou P, X4 représente V ou I, X5 représente R, Q, M, L, I, S, K, G ou E, X6 représente T ou E, X7 représente N, I, T ou E, X8 représente I ou L, X9 représente K, T ou N, XIO représente G ou E,X11R ou E, X12: A ou V et X13 représente G ou E. 3 ) Peptide selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est constitué par la séquence SEQ ID NO:2 : FNKTLMEADAHYKSVRTWNEILPSKGCLRVGGRCH. 4 ) Molécule complexe, caractérisée en ce qu'elle comprend un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, associé à une molécule d'intérêt, apte à traiter une maladie neurodégénérative. 5 ) Molécule complexe selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit peptide et ladite molécule d'intérêt sont liés de manière covalente par l'intermédiaire d'un lieur convenable. 6 ) Molécule complexe selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisée en ce que ledit lieur comprend soit un pont S-S, soit un ester, soit un glycane. 7 ) Molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 8 ) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle présente la séquence suivante : ttc aac aaa acc Ri atg gaa gct gat gct cac tac R2 R3 R4 R5 R6 tgg R7 gag R8 atc ccc tca R9 R10 tgt ctg R111 R12 gga R13 agg tgt cat, dans laquelle : R1 représente un codon L ou un codon I, R2 représente un codon K, un codon T ou un codon N, R3 représente un codon S ou un codon P, R4 représente un 28 1 codon V ou un codon I, R5 représente un codon R, un codon, Q, un codon M, un codon L, un codon I, un codon S, un codon K, un codon G ou un codon E, R6 représente un codon T ou un codon E, R7 représente un codon N, un codon I, un codon T ou un codon E, R8 représente un codon I ou un codon L, R9 représente un codon K, un codon T ou un codon N, Rio représente un codon G ou un codon E, R1représente un codon R ou un codon E, R12 représente un codon A ou un codon V et R13 représente un codon G ou un codon E. 9 ) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 7 ou la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est constituée par la séquence SEQ ID NO:3 suivante : ttc aac aaa acc ctg atg gaa gct gat gct cac tac aag tca gtc cgg acc tgg aat gag atc atc ccc tca aag ggg tgt ctg aga gtt gga ggg agg tgt cat. 10 ) Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il inclut une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 7 à 9. 11 ) Cellule hôte, caractérisée en ce qu'elle inclut un vecteur selon la revendication 10. 12 ) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend essentiellement (i) un produit sélectionné dans le groupe constitué par une molécule complexe selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, une molécule d'acide nucléique nue selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 ou un vecteur selon la revendication 10, ladite molécule d'acide nucléique ou ledit vecteur étant associés à une molécule d'intérêt et (ii) au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 13 ) Outil de criblage spécifique de molécules modulant la liaison entre la glycoprotéine du virus de la rage et le récepteur de basse affinité des neurotrophines (p75NTR) spécifique des cellules neuronales, caractérisé en ce qu'il comprend : - des cellules exprimant le peptide, constitué par les résidus d'acides aminés 318 à 352 de la glycoprotéine G mature du virus de la rage, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 (élément de liaison 1) ; - des cellules exprimant le récepteur de basse affinité des neurotrophines (p75NTR), de préférence, uniquement le CRD dudit récepteur (élément de liaison 2). 14 ) Outil de criblage spécifique de molécules modulant la liaison entre la glycoprotéine du virus de la rage et le récepteur de basse affinité des neurotrophines (p75NTR) spécifique des cellules neuronales, caractérisé en ce qu'au moins l'un des deux éléments de liaison, à savoir le peptide constitué par les résidus d'acides aminés 318 à 352 de la glycoprotéine G mature du virus de la rage ou le récepteur de basse affinité des neurotrophines (p75NTR) est sous une forme soluble. 15 ) Outil de criblage selon la revendication 14, caractérisé en ce que la forme soluble du récepteur de basse affinité des neurotrophines (p75NTR) est constituée d'au moins le fragment CRDlet au plus par l'ectodomaine du récepteur p75 fusionné à un fragment Fc d'une immunoglobuline IgG1 humaine. 16 ) Méthode de sélection de ligands spécifiques du récepteur p75, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la mise en contact d'un outil de criblage selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, dans un milieu approprié avec un ligand potentiel marqué et - la mesure du produit marqué éventuellement lié.