Brevet FR2836475A1 — publié le 20030829

PROCEDE DE DETECTION DE LIGANDS DU RECEPTEUR DE LA LEPTINE La présente invention est relative à un procédé de détection de ligands du récepteur de la leptine par mise en oeuvre du transfert d'énergie entre des protéines de fusion composées de récepteurs de la leptine et de protéines donneurs ou accepteurs d'énergie. Elle est en outre relative à des protéines de fusion pour la mise en oeuvre de ce procédé. La leptine est une protéine présentant un poids moléculaire de 16 kDa qui est sécrétée par les adipocytes. Cette protéine est associée à la sensation de satiété, et joue un rôle majeur dans le contrôle de la prise de poids, la consommation d'énergie, la formation osseuse, l'angiogénèse mais aussi dans d'autres fonctions physiologiques telles que le déclenchement de la puberté et le contrôle de la reproduction ou la régulation de la réponse immunitaire régulée par les lymphocytes T. Le récepteur de la leptine (OBR) appartient à la famille des récepteurs aux cytokines. Il est composé, comme l'illustre la figure 1 d'une chaine polypeptidique unique comprenant un domaine transmembranaire (Tartaglia et al., J. Biol. Chem, 272,6093-6096, 1995). Six isoformes différentes de l'OBR ayant des domaines C-terminaux de longueurs différentes ont été décrits. Ces isoformes dérivent toutes, par épissages alternatifs, d'un gène unique. Il existe également une forme soluble des OBR contenant le site de liaison à la leptine qui correspond au domaine extracellulaire des formes membranaires. Cette forme soluble générée de façon post-traductionelle par protéolyse à la membrane plasmique à partir des formes membranaires se retrouve dans le sang. Une autre forme soluble de l'OBR résultant d'une mutation générant un codon stop avant le domaine transmembranaire est également trouvée dans certaines cas très rares. L'activation de l'OBR apparaît être responsable de tous les effets connus de la leptine tels que la perte de poids et tous les phénomènes impliqués dans les désordres pondéraux. Les propriétés inhibitrices de la leptine vis à vis de la synthèse osseuse ont ainsi été récemment mises en évidence. La leptine agit en inhibant l'activité des ostéoblastes, une population de cellules responsables de la formation de l'os. Modifier la leptinémie pourrait permettre de traiter les maladies liées à une diminution de la densité osseuse comme par exemple l'ostéoporose ou à l'inverse celles liées à une calcification importante. En 1999 Xu et al (Proc Natl Acad Sci U S A 96,151-156) ont décrit une méthode de détection des interactions protéine-protéine dans des cellules vivantes. Cette méthode a en outre fait l'objet de la demande de brevet W099/66324. Cette méthode, appelée BRET (pour Bioluminescent Resonance Energy Transfer ou transfert d'énergie de bioluminescence par résonance), est basée sur un phénomène naturel, l'émission de fluorescence par des organismes marins. La transformation enzymatique, par la luciférase de Renifla (Luc), d'un substrat qui peut traverser la membrane génère une bioluminescence, qui à son tour excite un accepteur d'énergie tel que la protéine fluorescente jaune (YFP ou yellow fluorescent protein en anglais). Cette méthode correspond à la LRET (pour Luminescent Resonance Energy Transfer) décrite par Wang et al (Mol Gen Genet 264 : 578-587 (2001)). L'efficacité du transfert d'énergie dépend de la proximité physique et des orientations respectives de l'accepteur et du donneur. Ainsi la co-expression de la luciférase et de la YFP n'est pas suffisante pour induire un transfert d'énergie car la distance entre les deux partenaires doit être inférieure à 100À. Afin d'étudier l'interaction entre deux partenaires d'interaction potentiels la première protéine a été fusionnée à la luciférase et la seconde protéine à la YFP. Si les deux protéines interagissent un transfert d'énergie peut être observé. Selon les connaissances actuelles l'activation de l'OBR se ferait par l'intermédiaire d'un complexe tétramèrique composé de deux janus kinase 2 (JAK2) et de deux OBR. L'activation du récepteur induite par la leptine induirait un changement dans la conformation de l'OBR, qui lui même activerait une JAK2, qui à son tour transphosphorylerait une autre JAK2 puis le récepteur OBR. Depuis, la méthode de BRET a été mise en oeuvre sur un nombre limité de récepteurs, présentant une structure très différente du récepteur de la leptine. Ainsi quelques auteurs décrivent la mise en oeuvre de la méthode sur des récepteurs de la famille des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) tels que les récepteurs p 2 adrénergiques (Angers et ai, 2000, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 10. 1073), cholesystokines de type A (CCK ; Cheng et al, 2001. Bill. Chem. 276 : 48040-48047), et de la thyrotropin releasing hormon (Kroeger et al, 2001, J. Bol. Chem. 276 : 12736-12743). Ces récepteurs de taille importante présentent une structure complexe comprenant 7 domaines transmembranaires. Enfin Boute et ai (2001, Mol Pharmacol 60 : 640-645) ont décrit le suivi de l'activation du récepteur de l'insuline en utilisant le BRET. Le récepteur de l'insuline est constitué de dimères covalents, et non de complexes non covalents comme le récepteur de la leptine. En outre il comprend une partie intracellulaire assez longue. Enfin les auteurs montrent que le changement de BRET induit par l'insuline ne peut être mis en oeuvre que sur le récepteur solubilisé. En quelques dizaines d'années, l'obésité est devenue un problème majeur de santé publique dans les pays industrialisés où elle touche maintenant 20 à 30 % de la population. Ces chiffres devraient encore croître de façon alarmante dans les années à venir. Du fait de ses origines multifactorielles qui prennent leurs sources à des degrés plus ou moins importants parmi des facteurs environnementaux d'une part (comportements alimentaires, accès à la nourriture, dépense énergétique,...) et des origines génétiques multiples d'autre part, l'obésité constitue un véritable défi pour la médecine. De même les maladies de l'os, telles que l'ostéoporose, touchent une partie de plus en plus importante de la population. La découverte de nouvelles molécules permettant de traiter les diverses maladies liées au récepteur de la leptine, telles que l'obésité et l'ostéoporose, est donc un enjeu majeur de la santé publique. Il n'existe cependant pas de procédé de criblage spécifique d'agonistes ou d'antagonistes du récepteur de la leptine pouvant être mis en oeuvre à haut flux. Les demandeurs se sont donc attachés à la mise en oeuvre d'un test de criblage rapide, spécifique et efficace d'agonistes ou d'antagonistes du récepteur de la leptine. Ils ont montré de manière surprenante que le changement de BRET induit par la leptine pouvait être mis en oeuvre sur l'un des isoformes du récepteur de la leptine, mais qu'elle ne pouvait être mis en oeuvre avec tous les isoformes. Ils ont en outre montré que la mise en oeuvre du BRET sur le récepteur de la leptine est optimale dans certaines conditions opératoires. La présente invention est donc relative à un procédé de détection de ligands du récepteur de la leptine par mise en oeuvre du transfert d'énergie de résonance entre une première protéine de fusion composée d'un récepteur de la leptine, ou d'une partie substantielle d'un récepteur de la leptine, et d'une protéine donneur d'énergie, ou d'une partie substantielle et active d'une protéine donneur d'énergie, et une seconde protéine de fusion composée d'un récepteur de la leptine, ou d'une partie substantielle d'un récepteur de la leptine, et d'une protéine accepteur d'énergie, ou d'une partie substantielle et active d'une protéine accepteur d'énergie. Elle est en outre relative à des protéines de fusion pour la mise en oeuvre de ce procédé, ainsi qu'à des acides nucléiques codant ces protéines. Elle a de plus pour objet un procédé de traitement curatif ou préventif de maladies liées à la leptine consistant à administrer un ligand sélectionné par le procédé défini ci-dessus à un patient atteint par la dite maladie. Un premier objet de la présente invention est donc une protéine de fusion caractérisée en ce qu'elle est composée d'un récepteur de la leptine, ou d'une partie substantielle d'un récepteur de la leptine et d'une protéine accepteur ou donneur d'énergie, ou d'une partie substantielle et active d'une protéine accepteur ou donneur d'énergie. Les protéines de fusion selon la présente invention sont composées en substance d'une partie correspondant à une partie ou la totalité de la séquence d'un récepteur de la leptine et d'une partie correspondant à une protéine donneur ou accepteur d'énergie. Elles peuvent néanmoins comprendre d'autres séquences d'acides aminés, issues d'autres protéines, telles que des séquences signal. Ainsi la séquence SEO ID N04 est constituée d'une partie de la séquence SEO ID ? 2 et d'autres séquences, et en particulier de la séquence signal de l'interleukine 3 de souris. De manière avantageuse la protéine donneur d'énergie est la luciférase de Renilla. Elle peut néanmoins être toute autre protéine donneur d'énergie telle que le spectre d'émission du donneur chevauche suffisamment le spectre d'excitation de l'accepteur pour permettre un transfert d'énergie efficace entre les deux partenaires. Elle peut ainsi être la GFP, si le transfert d'énergie est le FRET, ou encore l'aequorine si le transfert d'énergie est le CRET. L'aequorine peut être obtenue et utilisée comme décrit dans la demande de brevet EPO 187 519, ou dans l'article de Inouye et al. (PNAS USA 82 : 3154- 3158 (1985)). La protéine fluorescente accepteur d'énergie est quant à elle préférentiellement la DsRed, la GFP ou un mutant de cette protéine, tel que la YFP, l'EYFP, la GFP sauvage, la GFPS65T, ou la Topaz. Elle peut néanmoins être toute autre protéine fluorescente accepteur d'énergie telle que le spectre d'excitation de l'accepteur et le spectre d'émission du donneur se chevauchent suffisamment pour permettre un transfert d'énergie efficace entre les deux partenaires. Ces protéines sont connues de l'homme du métier qui peut trouver leurs séquences dans la littérature, notamment dans le revue de Blinks et al. (Pharmacol. Rev. 28 : 1-93 (1976)). En particulier la GFP est décrite par Tsien (Annu. Rev. Biochem. 67 : 509-544 (1998)) et son clonage par Prasher et al. (Gene 111 : 229-233 (1992)). Le clonage de la DsRed est quant à lui décrit par Matz et al. (Nat. Biotechnol. 17 : 969-973 (1999)). Pour la Rluc de l'homme du métier peut se référer à Blinks et al. (Pharmacol. Rev. 28 : 1-93 (1976)) ou encore à Lorenz et al. (PNAS 88 : 4438-4442 (1991)). De manière avantageuse l'isoforme du récepteur de la leptine, compris en totalité ou en partie dans la protéine de fusion, est une isoforme courte, ou présentant un domaine intracellulaire court. Une telle isoforme comprend avantageusement un domaine intracellulaire Box1, mais ne comprend pas de domaine intracellulaire Box 3. De manière préférentielle cette isoforme est l'isoforme OBRs et encore plus préférentiellement l'isoforme OBRs humain. Cette isoforme peut néanmoins être originaire de toute autre espèce. Elle peut aussi être toute autre isoforme, préférentiellement courte, et encore plus préférentiellement comprenant au moins le domaine extracellulaire de l'OBR, telle la forme soluble de l'OBR contenant le site de liaison à la lepitne décrite par Lee et al (Nature 379,632-635 (1996)), Gavrilova et al (JBC 272 : 30546-30551 (1997)) Maamr. et al. (Endocrinology 142 : 4389-4393 (2001)) ou Clement et al. (Nature 392 : 398-401 (1998)). Selon un mode de mise en oeuvre particulièrement préférentiel l'isoforme est l'isoforme OBRs humaine de séquence SEQ ID 02. Elle peut aussi être un variant de cette protéine présentant une identité d'au moins 65%, préférentiellement d'au moins 75%, et encore plus préférentiellement d'au moins 85% ou 95%, avec la séquence SEQ In 02. La protéine de fusion peut ne comprendre qu'une partie de l'isoforme OBRs humaine. Avantageusement elle comprend la partie comprise entre les acides aminés 46 et 866 de la séquence SEQ ID02. La partie correspondant au récepteur à la leptine peut ainsi présenter la séquence SEQ ID04 ou un variant de cette séquence présentant une identité d'au moins 65%, préférentiellement d'au moins 75%, et encore plus préférentiellement d'au moins 85% ou 95%. De manière particulièrement avantageuse la protéine de fusion donneur présente la séquence SEQ ID ? 6 ou un variant de cette séquence présentant une identité d'au moins 65%. De manière particulièrement avantageuse la protéine de fusion accepteur présente la séquence SEQ ID ? 8 ou un variant de cette séquence présentant une identité d'au moins 65%. D'autres objets de la présente invention sont des acides nucléiques codant pour ces protéines. De tels acides nucléiques peuvent être des ADN complémentaires ou gnomiques, ou des ARN. Ces acides nucléiques ou polynucléotides peuvent être sous forme simple chaîne ou sous la forme de duplex. Ils sont de manière particulièrement avantageuse des ADN complémentaires. De manière préférentielle l'invention a pour objet un acide nucléique ayant une identité d'au moins 65%, préférentiellement d'au moins 75%, et encore plus préférentiellement d'au moins 85% ou 95%, d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N05 ou SEQ ID N07. Selon encore un autre aspect, l'invention est relative à un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique tel que défini ci-avant, et plus particulièrement un acide nucléique de séquences nucléotidiques SEQ ID ? 5 et SEQ ID N07, ou un acide nucléique de séquence complémentaire. Le pourcentage d'identité entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptide dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des gaps ) par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences. Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auquel il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans le package de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN. A titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être effectué à l'aide du logiciel BLAST (versions BLAST 1.4. 9 de mars 1996, BLAST 2.0. 4 de février 1998 et BLAST 2.0. 6 de septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (S. F Altschul et ai, J. Mol. Biol. 1990 215 : 403-410, S. F Altschul et al, Nucleic Acids Res. 1997 25 : 3389- 3402). Blast recherche des séquences similaires/homologues à une séquence requête de référence, à l'aide de l'algorithme d'Altschul et al. La séquence requête et les bases de données utilisées peuvent être peptidiques ou nucléiques, toute combinaison étant possible. Par conditions d'hybridation de forte stringence au sens de la présente invention, on entendra les conditions suivantes : 1-Compétition des membranes et PRE HYBRIDATION : - Mélanger : 40ul ADN sperme de saumon (10mg/ml) + 40 pi ADN placentaire humain (10mg/ml) - Dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace le mélange. - Oter le SSC 2X et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes. - Ajouter le mélange des deux ADNs dénaturés. - Incubation à 420C pendant 5 à 6 heures, avec rotation. 2-Compétition de la sonde marquée : - Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 1-11 ADN Cot t, selon la quantité de répétitions. - Dénaturer 7 à 10 mn à 95 C. - Incuber à 650C pendant 2 à 5 heures. 3-Hybridation : - Oter le mix de pré hybridation. - Mélanger 40 ui ADN sperme de saumon + 40 u ! ADN placentaire humain ; dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace. - Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mix formamide, le mélange des deux ADN et la sonde marquée/ADN Cot 1 dénaturée. - Incuber 15 à 20 heures à 42 C, avec rotation. 4-Lavages : - Un lavage à température ambiante dans du SSC 2X, pour rincer. - 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0, 1% à 65 C. - 2 fois 15 minutes à 65 C SSC 1X et SDS 0, 1% à 65 C. Envelopper les membranes dans du Saran et exposer. Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur variable de 20 nucléotides à plusieurs centaines de nucléotides. Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier. Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985,"Nucleic acid hybridization : a practical approach", Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford) ou encore dans l'ouvrage de F. AUSUBEL et al (1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y). Les protéines objets de la présente invention peuvent être obtenues par tous moyens connus de l'homme du métier. Elles sont néanmoins avantageusement obtenues par expression des acides nucléiques tels que décrits ci-dessus, codant pour ces protéines, éventuellement insérés dans des vecteurs d'expression, dans des cellules avantageusement choisies, suivie éventuellement par une extraction et une purification qui peut être totale ou partielle. L'invention est également relative à un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'invention. Avantageusement, un tel vecteur recombinant comprendra un acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques suivants : a) un acide nucléique codant pour une protéine ayant au moins 65% d'identité en acides aminés avec une séquence SEQ ID D ? 6 ou SEQ ID ? 8 ou un fragment peptidique ou un variant de cette dernière ; b) un acide nucléique comprenant un polynucléotide ayant une séquence SEQ ID N05 ou SEQ ! D ? 7, ou un fragment ou un variant de ce dernier ; c) un acide nucléique ayant au moins 65% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique ayant une séquence SEQ ID ? 5 ou SEQ ID D ? 7 ou un fragment ou un variant de ce dernier ; d) un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquences SEQ ID ? 5 ou SEQ ID N07, ou un fragment ou un variant de ce dernier. Par vecteur au sens de la présente invention on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme de simple brin ou double brin. Selon un mode de réalisation, le vecteur d'expression comprend, outre un acide nucléique conforme à l'invention, des séquences régulatrices permettant d'en diriger la transcription et/ou la traduction. Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention comprendra notamment les éléments suivants : (1) des éléments de régulation de l'expression de l'acide nucléique à insérer, tels que des promoteurs et des enhanceurs ; (2) la séquence codante comprise dans l'acide nucléique conforme à l'invention à insérer dans un tel vecteur, ladite séquence codante étant placée en phase avec les signaux de régulation décrits aux (1) ; et (3) des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées. En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée, des marqueurs ou des marqueurs de sélection. A titre d'exemples, les promoteurs pour cellules eucaryotes comprendront le promoteur de la thymidine kinase du virus HSV ou encore le promoteur de la métallothionéine-L de souris. De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de SAMBROOK et al. (1989,"Molecular Cloning : A Laboratory Manual, " 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ) ou encore aux techniques décrites par FULLER et al. (1996, Immunology in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al). Les vecteurs préférés selon l'invention sont des plasmides, tels que par exemple les vecteurs pCDNA3 (Invitrogen), pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen), psi174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene). Il peut s'agir également de vecteurs de type baculovirus tel que le vecteur pVL1 392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N CRL 1711) dérivées de Spodoptera frugiperda. Il peut encore s'agir de vecteurs adénoviraux tels que l'adénovirus humain de type 2 ou 5. Un vecteur recombinant selon l'invention peut aussi être un vecteur rétroviral ou encore un vecteur adéno-associé (AAV). De tels vecteurs adéno- associés sont par exemple décrits par FLOTTE et al. (1992, Am. J. Respir. Ce/l Mo/. Biol., 7 : 349-356 La présente invention a en outre pour objets des cellules comprenant une protéine, un acide nucléique ou un vecteur tels que décrits ci dessus, ou des fragments de ces cellules, des Iysats de ces cellules ou encore des membranes de ces cellules. De telles cellules peuvent être cellules isolées d'un organisme et cultivées dans un milieu de croissance adéquat. Elles sont néanmoins préférentiellement des lignées cellulaires. Ainsi de telles lignées sont de manière particulièrement avantageuse les lignées cellulaires HEK 293, COS (ATCC NOCRL 1650), COS-M6 et HeLa (ATCC N CCL2), ou encore Cv 1 (ATCC N CCL70), Sf-9 (ATCC N CRL 1711), CHO (ATCC NOCCL-61) ou 3T3 (ATCC NOCRL-6361). Les membranes de ces cellules peuvent être préparées par toute méthode connue de l'homme du métier. Préférentiellement elles seront préparées par broyage mécanique des cellules puis centrifugation des suspensions obtenues, comme illustré dans les exemples qui suivent. La présente invention est en outre relative à des compostions comprenant des cellules telles que décrites ci dessus et de la saponine. La présente invention est en outre relative à un procédé de détermination de la liaison de composés au récepteur de la leptine comprenant les étapes consistant à : - mettre en contact ledit composé avec une protéine de fusion donneur d'énergie telle que décrite ci dessus, et une protéine de fusion accepteur d'énergie telle que décrite ci dessus, ou des cellules, ou des fragments, ou des Iysats, ou des membranes de cellules comprenant une telle protéine, et un substrat enzymatique adéquat, et -à mesurer le transfert d'énergie. Préférentiellement ledit procédé est mis en oeuvre avec des cellules traitées par de la saponine. Les protéines de fusion donneur d'énergie et les protéines de fusion accepteur d'énergie sont choisies de manière à ce que l'énergie résultant de l'activation du donneur puisse être transférée de manière efficace à l'accepteur. Dans un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, la protéine de fusion donneur d'énergie est une protéine de fusion entre le récepteur de la leptine, ou une partie substantielle du récepteur de la leptine et la luciférase ou une partie substantielle de la luciférase, auquel cas le substrat est avantageusement la coelenterazine. Dans un mode de mise en oeuvre préférentiel dudit procédé, la protéine de fusion accepteur d'énergie est une protéine de fusion entre le récepteur de la leptine, ou une partie substantielle du récepteur de la leptine et la YFP ou une partie substantielle de la YFP. Dans un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, le transfert d'énergie mesuré en présence du composé à tester est comparé à celui mesuré en absence du composé à tester. Préférentiellement le procédé est mis en oeuvre sur des membranes des cellules, telles que décrites ci dessus. De manière préférentielle les protéines donneur et accepteur selon la présente invention sont choisies afin que le transfert d'énergie se fasse par résonance BRET, ou LRET. Néanmoins un tel transfert d'énergie peut être effectué par FRET (pour Fluorescent Resonance Energy Transfer ou transfert d'énergie de fluorescence par résonance) ou encore par CRET (pour Chemioluminescent Resonance Energy Transfer ou transfert d'énergie de chimioluminescence par résonance). Quelque soit le type de transfert d'énergie les couples protéine de fusion donneur/protéine de fusion accepteur d'énergie sont choisis afin de permettre un tel transfert. Le CRET consiste en un transfert d'énergie entre l'aequorine, qui est une luciférase, et la GFP. Le FRET consiste en un transfert d'énergie entre deux protéines de la famille des GFP ayant des spectres différents. Pour la mise en oeuvre de ces transferts l'homme du métier peut se référer à Baubet et al. (PNAS USA 97 : 7260-7265 (2000)) pour la CRET, à Matyus (J Photochem Photobiol B 12 : 323-337 (1992)) et Pollok et Heim (Trends Cell Biol 9 : 57-60 (1999)) pour la FRET. Un autre objet de la présente invention est un procédé de criblage ou de détection de composés destinés à la prévention et/ou au traitement de pathologies liées à la leptine comprenant les étapes consistant à : - mettre en contact ledit composé avec une protéine de fusion donneur d'énergie telle que décrite ci dessus, et une protéine de fusion accepteur d'énergie telle que décrite ci dessus, ou des cellules en absence ou présence de saponine, ou des fragments, ou des Iysats, ou des membranes de cellules comprenant de telles protéines, et éventuellement un substrat enzymatique adéquat, et -à mesurer le transfert d'énergie. Un tel procédé peut être utilisé pour le criblage d'agonistes ou d'antagonistes du récepteur de la leptine. Le procédé selon la présente invention est compatible avec les plaques à 96 ou 384 puits généralement utilisées. Il ne nécessite pas l'utilisation de molécules radioactives, est sensible, reproductible, rapide et le résultat est facile à lire. En effet ce procédé a un bon rapport signal/bruit de fonds et une faible réactivité croisée avec d'autres ligands que la leptine. Ceci s'explique au moins en partie par le fait que la détection de l'activation de l'OBR est directement effectuée au niveau du récepteur, ce qui permet d'éliminer des sources possibles de réactivité croisée à d'autres niveaux des voies de signalisation comme on peut l'observer dans le cas de dosages basés sur des gènes rapporteur ou sur la croissance de cellules. De plus ce procédé n'est pas limité à une voie de transduction ayant un signal spécifique mais au contraire est susceptible de détecter toutes les molécules interagissant avec les OBR. Cette caractéristique est particulièrement intéressante pour la mise en oeuvre de criblage à grande échelle, puisque de plus en plus de ligands de récepteurs membranaires s'avèrent activer certaines voies mais pas d'autres voies. La présente invention est en outre relative à l'utilisation de composés sélectionnés par un procédé consistant à : - mettre en contact ledit composé avec une protéine de fusion donneur d'énergie, et une protéine de fusion accepteur d'énergie telle que décrite cidessus, ou des cellules, ou des fragments, ou des Iysats, ou des membranes de cellules comprenant une telle protéine, et éventuellement un substrat enzymatique adéquat, et -à mesurer le transfert d'énergie, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement curatif ou préventif de maladies liées à la leptine ou à son récepteur. Elle a enfin pour objet un procédé de traitement curatif ou préventif de maladies liées à la leptine ou à son récepteur comprenant les étapes de : - sélection dudit composé par un procédé consistant à : +mettre en contact ledit composé avec une protéine de fusion donneur d'énergie et une protéine de fusion accepteur d'énergie, ou des cellules, ou des fragments, des Iysats, ou des membranes de cellules comprenant une telle protéine, et un substrat enzymatique adéquat, et +à mesurer la le transfert d'énergie, et - d'administration dudit composé à un patient atteint par la dite maladie. De telles maladies peuvent être des maladies liées à une diminution de la densité osseuse comme par exemple l'ostéoporose ou à l'inverse celles liées à une calcification importante. Elles peuvent aussi être des maladies ayant un effet sur le poids, telles que l'obésité, le diabète ou l'anorexie. Les composés de l'invention peuvent être formulés dans des compositions pharmaceutiques en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasal, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, etc. Préférentiellement, les compositions pharmaceutiques contiennent des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Enfin le procédé selon la présente invention permet aussi le criblage de sérum de patients obèses pour la présence ou l'absence de leptine non fonctionnelle ou encore le criblage de molécules interférant avec la dimèrisation de l'OBR. La figure 1 représente schématiquement les protéines de fusion. Box1 représente le site de liaison de JAK2 ; Box3 représente le site de liaison des protéines STAT ; TM représente le domaine trans-membranaire. Les figures 2a et 2b illustrent l'expression des constructions OBR dans des cellules COS estimée par des expériences de radio-marquage utilisant la 1251leptine comme radio-ligand. Dans les figures 2a et 2b le contenu cellulaire total en OBR et le pourcentage de sites de liaison à la surface des cellules sont respectivement mesurés. La figure 2c illustre la localisation cellulaire de l'expression des constructions OBRI-YFP et OBRs-YFP en présence et en absence de leptine. La figure 2d illustre l'activation de JAK2 par différentes constructions OBR. La figure 2e illustre l'effet de la stimulation par la leptine de cellules coexprimant le gène rapporteur pour STAT3 et différentes constructions OBR. La figure 3 illustre la dimérisation constitutive de OBR. Des cellules HEK 293 exprimant les différentes constructions OBR indiquées sont incubées en présence de coelenterazine. Le transfert d'énergie est mesurée à l'aide d'un luminomètre. Les figures 4a et 4b illustrent l'effet de la liaison de la leptine sur le BRET constitutif des OBR. Figure 4a : des cellules HeLa exprimant les différentes constructions OBR indiqués sont incubées en présence de leptine avant d'initier la réaction de la luciférase. Le transfert d'énergie est mesurée à l'aide d'un luminomètre. Figure 4b : L'effet de la leptine est comparé dans des cellules entières en absence ou présence de saponine, des Iysats totaux et des préparations membranaires. Les figures 5a à 5e illustrent l'optimisation et la caractérisation du changement du BRET induit par la leptine sur les OBRs. Des membranes préparées à partir de cellules HeLa ou COS co-exprimant OBRs-Luc et OBRs-YFP ont été pré-incubées avec ou sans leptine avant d'initier la réaction de la luciférase. Figure 5a : Optimisation des niveaux d'expression de OBRs-Luc et de OBRsYFP relatifs et absolus. Figure 5b : Variation du signal de BRET induit par la leptine en fonction du temps. Figure 5c : Courbes dose-réponse BRET/concentration en leptine sur membrane et cellules intacte en présence de saponine (0.05%). Figure 5d : Compétition de la liaison de la 1251-leptine par augmentation des concentrations croissantes de la leptine. Figure 5e : Spécificité des changements de BRET induits par la leptine. Les membranes ont été pré-incubées avec des concentrations saturantes d'érythropoiétine (EPO, 10U/ml), de trombopoiétine (TPO, 10 nM), de granulocyte macrophage colony stimulator factor (GM-CSF, 250 ng/ml), d'interleukine 3 (IL3, 280 ng/ml), d'interleukine 6 (IL6, 100 ng/ml), de prolactine (PRL, 200 ng/ml), de stem cell factor a (SCFa, 250 ng/ml), d'epidermal growth factor (EGF, 100 ng/ml), d'insuline (Ins, 100 nM), de lipopolysaccharide (LPS, 100 ng/ml) et de tumor necrosis factor a (TNFa, 50ng/ml). La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent. Matériels et Méthodes utilisés dans les exemples Constructions plasmidigues. transfections et culture cellulaire. Les protéines de fusion OB-R-YFP et OB-R-Luc ont été construites par ligation de la YFP et de Luc à l'extrémité C-terminale des récepteurs par des techniques classiques de biologie moléculaire. Les régions codantes de YFP obtenues à partir du vecteur pGFPtpz-N1 Cytogem&commat;-Topaze (Packard, Meriden, CT) ont été insérées dans le site EcoRV de pcDNA3/CMV (Invitrogen, Groningen, Netherlands) qui contient un site polylinker modifié. La région codante de Renilla luciferase a été obtenue à partir de pRL-CMV (Promega, Madison, WI) et insérée dans le site EcoRV du pcDNA3modifié. Les régions codantes de OBRI et OBRs (don de Dr. Gainsford, Royal Melbourne Hospital, Victoria, Australia) ont été insérées dans les deux vecteurs décrits ci dessus, respectivement dans les sites de clonage EcoR1/BamH1 et Nhe1. Les codons Stop ont été délétés par mutagenèse dirigée et la phase de la protéine de fusion a été ajustée. Les lignées cellulaires HEK 293, COS-M6 et HeLa ont été cultivées dans du DMEM complété avec les composants suivants : 10% (v/v) FBS, 4.5 g/litre glucose, 100 U/ml pénicilline, 0.1 mg/ml streptomycine, 1 mM glutamin (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Les transfections transitoires ont été effectuées en utilisant le réactif de transfection FuGene 6 (Roche, Baie, Suisse). Microscopie par Fluorescence. Deux jours après la transfection avec les constructions YFP, les cellule ont été incubées avec 100 nM leptine durant 60 min et 0.01 mM bis-benzamidine durant 15 min avant d'être lavées dans du PBS et fixées durant 20 min à température ambiante dans une solution froide de 4% paraformaldéhyde dans du PBS. Les coupes sont observées par microscopie fluorescente en utilisant des filtres FITC et DAPI. Préparation des membranes et solubilisation. Les cellules ont été placées dans la glace, lavées deux fois dans du PBS à la température de la glace et détachées de manière mécanique dans un tampon 1 (5 mM Tris, 2 mM EDTA, pH 7.4, 5 mg/litre d'inhibiteur de la trypsine de soja, 5 mg/litre de leupeptin, et 10 mg/litre de benzamidine) à la température de la glace. Les suspensions cellulaires sont homogénéisées avec un homogénéiser Poltron (Janke & Kunkel Ultra-Turrax T25) trois fois durant 5 sec. Le Iysat est centrifugé à 450 X g durant 5 min à 40C et le surnageant est centrifugé à 48000 X g durant 30 min à 4 C. Le culot final est lavé deux fois dans du tampon 1 et resuspendu dans une solution (75 mM Tris (pH 7.4), 12.5 mM MgCI2, 5 mM EDTA avec des inhibiteurs de protéases, comme décrits ci dessus) et immédiatement utilisé dans des expériences de liaison de ligands radioactifs ou des expériences de BRET. Immunoprécipitation de JAK2 Des cellules HeLa ont été co-transfectées avec des plasmides exprimant JAK2 marquée par HA2 (don de Dr. Wojchowski, Pennsylvania State University, Pennsylvania, USA) et des plasmides contenant différentes constructions d'OBR. Les cellules ont été Iysées dans du tampon de lyse (10 mM Tris, 150 mM NaCI, 5 mM EDTA, 5% glycerol, 0,02% NaN3, NP40 0, 1%, orthovanadate 1 mM, 5 mg/litre d'inhibiteur de la trypsine de soja et 10 mg/litre de benzamidine) et centrifugées durant 15 min à 13000 rpm. La fraction soluble a été immunoprécipitée durant 2h avec un anticorps polyclonal antiJAK2 (HR-758) (1 ! -tg/ml) (Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Immmunoabsorption SDS-Paqe Les immunoprécipitats JAK2 ont été dénaturés dans la solution (62.5 mM Tris/HCI (pH 6.8), 5% SDS, 10% glycerol et 0. 05% bleu de bromophenol), à 1000C durant 10 minutes. Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE en 7 % de poly-acrylamide et transferées sur nitrocellulose. L'immuno-détection a été effectuée avec un anticorps anti-phosphotyrosine 4G10 (2 ug/ml) (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY). L'immunoréactivité a été révélée en utilisant un anticorps secondaire approprié couplé à la peroxydase de raifort et le réactif chimio-luminescent ECL (Amersham, Aylesbury, UK). Test de liaison de la 1251-sentine Des cellules transfectées ont été carencées en sérum dans du DMEM (1% BSA) 24 h avant les expériences de liaison. Pour mesurer la liaison de la leptine à la surface des cellules, des cellules ont été lavées deux fois avec du PBS à la température de la glace et incubées dans un tampon de liaison (DMEM, 25 mM Hepes pH 7.4, 1% BSA) contenant 100000 cpm/puits de 1251- leptine (PerkinElmer life sciences, Paris, France) en absence ou en présence de 200 nM de leptin non radioactive (leptine humaine recombinante (PerroTech Inc, USA) durant 4 h à 4 C. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS à la température de la glace, Iysées dans 1N NaOH et la radioactivité déterminée dans un compteur à radiations gammma. Afin de mesurer la quantité totale de leptine se liant dans l'extrait, les cellules ont été mises en suspension dans 1.5 ml de tampon de liaison contenant 0. 15% de digitonine durant 2h à 4 C. Les extraits ont été centrifugés durant 30 min dans une centrifugeuse Eppendorf à vitesse maximale à 4 C. Le surnageant (0.2 ml) a été incubé avec 100000 cpm de Neptine en présence ou en absence de 200 nM de leptine dans un volume total de 0.25 ml avec agitation toute la nuit à 4 C. 0.5 ml de y-globuline (1.25 mg/ml) et 0.5 ml de polyethylene glycol 6000 (25% p/v) ont été ajoutés pour précipiter les complexes récepteur-ligand, qui sont obtenus par centrifugation (17000 x g durant 3 min). Le culot est lavé avec 1 ml de polyéthylene glycol 6000 12 % (p/v) puis compté. Activation du gène rapporteur Des cellules HeLa ont été co-transfectées avec 2.6 fl9 de plasmide portant le gène reporteur STAT3 (don de Dr. Levy, New York University, New York, USA), 200 pg de pcDNA3 comprenant la région codante de la Renilla luciferase (utilisée comme témoin interne) et avec 1.4 fl9 des différentes constructions OBR ou avec le véhicule seul. 48 heures après la transfection, les cellules ont été carencées durant la nuit en DMEM (1% BSA) avant la stimulation par 1 nM de leptine durant 6-8 heures. Les cellules ont alors été lavées et Iysées dans un tampon de lyse passive (Promega Corporation, Madison, WI) durant 15 minutes à température ambiante. Les Iysats totaux ont été centrifugé durant 2 minutes à 15000 rpm et les surnageants ont été utilisés dans un test de dosage de la Luciferase ( (Promega Corporation, Madison, WI) en utilisant un luminomètre Berthold (Lumat LB 9507). Les résultats sont exprimés par le rapport des activités luciférase de luciole ( (firefly)/luciférase de Reniffa. Mesure de BRET 48 heures après la transfection des cellules HeLa, COS et HEK 293 exprimant OBR ont été détachées et lavées avec du PBS. 1-2x105 cellules ont été distribuées dans des plaques optiques à 96 puits (Packard Instrument Company, Meriden, CT) en absence ou en présence de ligands, à 25 C. Des membranes préparées à partir de cellules exprimant OBR ont été utilisées pour les mesures de BRET. Le substrat, la coelenterazine h (Molecular Probes, Eugene, OR) est ajouté à une concentration finale de 5 pM et la lecture est faite avec un fluoro/luminométre Fusion TM (Packard Instrument Company, Meriden, CT) qui permet l'intégration séquentielle des signaux de luminescence détectés avec deux filtres (filtre Luc : 485 10 nm ; filtre YFP : 530 12. 5 nm). Le rapport BRET est défini comme la différence de l'émission à 530 nm/485 nm des protéine de fusion Luc et YFP co-transfectées et l'émission à 530 nm/485 nm de la protéine de fusion Luc seule. Les résultats sont exprimés en unités milliBRET (mBU), 1 unité mBRET correspondant à la valeur du rapport BRET multiplié par 1000. Les ligands suivants ont été utilisés pour déterminer la spécificité du dosage : érythropoiétine humaine recombinante (EPO), insuline (Ins), lipopolysaccharide (LPS, Sigma Aldrich, St Louis, USA), trombopoiétine Humaine recombinante (TPO), GM-CSF, interleukine 3 (IL3), interleukine 6 (IL6), prolactine (PRL), SCF, facteur EGF etfacteurTNFa. Exemple 1 : Expression fonctionnelle des protéines de fusion OBR La forme longue (OBRI) et la forme courte (OBRs) des OBR on été fusionnées à leurs extrémités C-terminale avec la YFP ou la Luc (Fig. 1). L'expression de ces protéines de fusion a été confirmée dans des cellules COS transfectées dans des expériences de liaison avec la 1251-leptin (Fig. 2a). Des résultats similaires ont été obtenus dans des cellules HeLa transfectées. L'expression à la surface des cellules des protéines de fusion et des récepteurs de type sauvage exprimés dans les cellules COS varient entre 5 et 10 %, ce qui est en accord avec des valeurs déjà décrites. Des valeurs similaires sont obtenues dans des cellules HEK 293 exprimant des OBR endogènes (14 i : 3 %). La localisation des protéines de fusion OBR dans les cellules HeLa a été étudiée par microscopie de fluorescence en utilisant les protéines de fusion avec YFP. La fluorescence due à OBRI-YFP est repartie ponctuellement dans les cellules tandis que celle due à OBRs-YFP est localisée dans des plaques. La stimulation par'la leptine localise OBRI-YFP dans de grandes plaques intracellulaires correspondant probablement au compartiment endosomal. La localisation de OBRs-YFP ne change pas de manière significative. Les résultats obtenus par microscopie à fluorescence confirment la localisation prédominante de OBR dans le compartiment intracellulaire et sont cohérents avec la localisation déjà décrite de la protéine de fusion OBRIGFP dans des cellules COS. L'expression fonctionnelle des protéines de fusion est évaluée par mesure de l'activation de la voie JAK-STAT. Les kinases JAK2 sont associées avec les domaines intracellulaires de OBRs et OBRI. La liaison de ligands induit la trans-phosphorylation de JAK2 et la phosphorylation de OBRI mais pas d'OBRs. OBRI phosphorylé fournit ensuite un site d'accrochage pour les protéines STAT, qui sont activées par phosphorylation de la tyrosine après liaison au récepteur. Les protéines STAT activées dimèrisent alors et sont transloquées au noyau où elles stimulent la transcription de gènes par l'intermédiaire d'éléments de réponse au STAT comme décrit par Tartaglia (1997, J Biol Chem 272, 6093-6096). Comme le montre la figure 2c toutes les constructions OBRs induisent la phosphorylation de JAK2 ce qui indique une activation de JAK2. L'activité du gène rapporteur STAT3 est activée d'un facteur 2-4 par OBRI-wt et les protéines de fusion OBRI tandis que les isoformes courtes n'ont pas d'effet sur l'activité du gène rapporteur. Ces résultats indiquent que les protéines de fusion OBR sont fonctionnellement exprimées dans les cellules HeLa. Exemple 2 : Dimerisation constitutive de OBR dans des cellules vivantes. La dimèrisation de OBR-Luc et OBR-YFP a été étudiée dans des cellules vivantes. Des transferts d'énergie significatifs ont été observés entre OBRs-Luc et OBRs-YFP ainsi qu'entre OBRI-Luc et OBRI-YFP, exprimés dans des quantités équimolaires, ce qui indique que des homo-dimères constitutifs existent pour les deux récepteurs (Fig. 3 a, b). L'existence des hétérodimères OBRs/OBRI dans les cellules vivantes est démontrée par la détection de BRET entre OBRs-Luc et OBRI-YFP ainsi qu'entre OBRI-Luc et OBRs-YFP. La spécificité de ces interactions est illustrée par l'absence de transfert significatif entre OBRs-Luc et OBRI-Luc et une protéine fusion entre l'YFP et le récepteur de l'insuline décrite récemment (Boute et al., 2001 précédemment cités). Ces résultats indiquent que les isoformes courtes et longues sont impliqués dans des hétéro et homo complexes dans les cellules vivantes. Exemple 3 : Effet de la liaison de la leptine sur le BRET constitutif des OBR : Afin d'évaluer les effets agonistes sur le BRET constitutif les cellules ont été pré-incubées avec la leptine avant d'initier la réaction de la luciférase avec son substrat. Aucun changement dans le BRET constitutif n'est observé avec les homodimères OBRI et les deux combinaisons d'hétéro dimères OBRs/OBRI alors que le BRET est augmenté avec les homo dimères OBRs (Fig. 4 a). Les changements de BRET des homo dimères OBRs induits par la leptine ont ensuite été mesurés dans différentes préparations cellulaires. La rupture mécanique des cellules dans un tampon hypotonique améliore de manière significative l'augmentation du BRET par la leptine tandis que le BRET basal reste inchangé. Des résultats similaires ont été obtenus avec la fraction membranaire après séparation du cytosol. Tandis que tous les couples OBRs-Luc/OBRs-YFP contribuent au BRET basal, seuls les récepteurs exposés à la surface de la cellule (5-10 %) peuvent être stimulés par la leptine qui est imperméable aux membranes dans des cellules intactes. La disruption des membranes cellulaires augmente la fraction d'OBR accessible à la leptine et qui est responsable de l'augmentation du BRET induit par la leptine. Des résultats similaires ont été obtenus sur cellules traitées avec la saponine. Ce composant fait des trous dans les membranes et permet la pénétration des protéines comme la leptine dans les compartiments intracellulaires ou se trouve la majorité des OBRs. Aucun changement de BRET induit par la leptine n'a été observé dans des expériences analogues effectuées avec des préparations à partir de cellules exprimant des homo-dimères OBRI-ou des hétéro-dimères OBRs/OBRI. Les quantités de et les rapports de OBRs-Luc et OBRs-YFP ont ensuite été modulés afin d'optimiser le BRET induit par la leptine (Fig. 5a). Les meilleurs résultats sont obtenus quand 500 ng d'ADN codant pour OBRs-Luc et 250 ng d'ADN codant pour OBRs-YFP sont utilisés. Dans ces conditions optimisées une concentration saturée de leptine induit une augmentation d'un facteur 2-2. 5 du signal BRET basal dans des cellules incubées avec la saponine ou membranes préparées à partir de cellules exprimant des homo-dimères OBRs. Cette augmentation est fonction du temps. Les valeurs maximales sont atteintes après 20 minutes d'incubation avec 1 nM leptine à température ambiante (Fig. 5b). Pour des concentrations supérieures en leptine, les valeurs maximales sont obtenues après 5 minutes d'incubation à température ambiante. L'effet de la leptine est dose-dépendant avec un EC50 d'environ 100 pM (Fig. 5c), ce qui est en accord avec les valeurs de Ki obtenues avec les protéines de fusion OBRs-Luc (116 pM) et OBRsYFP (35 pM) (Fig 5 d). La spécificité du test est démontrée par l'absence de BRET induite par le ligand par une concentration saturante de plusieurs cytokines et d'autres ligands de récepteurs membranaires tels que l'érythropoiétine, la trombopoiétine, le GM-CSF, l'IL3, l'IL6, la PRL, le SCFa, l'EGF, l'insuline, le LPS et le TNFa. REVENDICATIONS 1. Protéines de fusion caractérisée en ce qu'elle est composée d'un récepteur de la leptine, ou d'une partie substantielle d'un récepteur de la leptine et d'une protéine donneur d'énergie ou accepteur d'énergie, ou d'une partie substantielle et active d'une protéine donneur d'énergie ou accepteur d'énergie. 2. Protéine de fusion selon la revendication 1 caractérisée en ce que le récepteur de la leptine est une isoforme courte, ou présentant un domaine intracellulaire court ou une forme soluble contenant le site de liaison à la leptine. 3. Protéine de fusion selon la revendication 1 caractérisée en ce que le récepteur de la leptine est une isoforme comprenant un domaine intracellulaire Box1, mais ne comprenant pas de domaine intracellulaire Box 3. 4. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que le récepteur de la leptine est l'isoforme OBRs. 5. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que le récepteur de la leptine est l'isoforme OBRs humaine de séquence SEQ ID N02, ou un variant de ce récepteur présentant une identité d'au moins 65% avec la séquence SEQ ID ? 2 6. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que la séquence du récepteur de la leptine est la séquences des acides aminés 46 à 866 de l'isoforme OBRs humaine de séquence SEQ ID N'2, ou un variant de cette séquence présentant une identité d'au moins 65%. 7. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce le récepteur de la leptine présente la séquence SEQ ID N04, ou un variant de cette séquence présentant une identité d'au moins 65%. 8. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que la protéine est une luciférase. 9. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que la protéine est la GFP ou un mutant de cette protéine ou la DsRed 10. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que le mutant de la GFP est la YFP, l'EYFP, la GFP sauvage, la GFPS65T, ou la Topaz. 11. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce qu'elle présente la séquence SEQ ID ? 6 ou un variant de cette séquence présentant une identité d'au moins 65%. 12. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce qu'elle présente la séquence SEQ ID N08 ou un variant de cette séquence présentant une identité d'au moins 65%. 13. Acide nucléique codant pour l'une des protéines selon l'une des revendications 1 à 12. 14. Acide nucléique selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il présente la séquence SEQ ID ? 5. 15. Acide nucléique selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il présente la séquence SEQ ID ? 7. 16. Acide nucléique présentant une identité d'au moins 65% avec une séquence selon l'une des revendications 14 et 15. 17. Acide nucléique hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence selon l'une des revendications 14 et 15. 18. Cellule comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 13 à 17. 19. Cellule exprimant une protéine selon l'une des revendications 1 à 12 20. Fragments de cellules selon l'une des revendications 18 et 19. 21. Lysat de cellules selon l'une des revendications 18 et 19. 22. Membranes de cellules selon l'une des revendications 18 et 19. 23. Composition comprenant des cellules selon l'une des revendications 18 et 19 et de la saponine. 24. Procédé de détermination de la liaison de composés au récepteur de la leptine comprenant les étapes consistant à : - mettre en contact ledit composé avec une protéine de fusion donneur d'énergie selon l'une des revendications 1 à 12, et une protéine de fusion aUV% ilUL=iUI U % ilylÇ OUIUII I UllÇ UCO lesvcillulvaLlullb Z a 1L, uu uso wsIIUIco, ou des fragments, ou des Iysats, ou des membranes de cellules comprenant une telle protéine, et éventuellement un substrat enzymatique adéquat, et -à mesurer le transfert d'énergie. 25. Procédé selon la revendication 24 caractérisé en ce que la protéine de fusion donneur d'énergie est une protéine de fusion entre le récepteur de la leptine, ou une partie substantielle du récepteur de la leptine et la luciférase ou une partie substantielle de la luciférase. 26. Procédé selon la revendication 24 caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre avec les cellules traitées avec de la saponine 27. Procédé selon la revendication 24 caractérisé en ce que la protéine de fusion accepteur d'énergie est une protéine de fusion entre le récepteur de la leptine, ou une partie substantielle du récepteur de la leptine et la YFP ou une partie substantielle de la YFP. 28. Procédé selon la revendication 24 caractérisé en ce que le substrat est la coelenterazine. 29. Procédé selon la revendication 24 caractérisée en ce que le transfert d'énergie mesuré en présence du composé à tester est comparé à celui mesuré en absence du composé à tester. 30. Procédé de criblage ou de détection de composés destinés à la prévention et/ou au traitement de pathologies liées à la leptine comprenant les étapes consistant à : - mettre en contact ledit composé avec une protéine de fusion donneur d'énergie selon l'une des revendications 1 à 12, et une protéine de fusion accepteur d'énergie selon l'une des revendications 1 à 12, ou des cellules en absence ou présence de saponine, ou des fragments, ou des Iysats, ou des membranes de cellules comprenant une telle protéine, et éventuellement un substrat enzymatique adéquat, et -à mesurer le transfert d'énergie. 31. Procédé de criblage d'agonistes ou d'antagonistes du récepteur de la leptine comprenant les étapes consistant à : - mettre en contact les agonistes ou d'antagonistes potentiels avec une protéine de fusion donneur d'énergie selon l'une des revendications 1 à 12, et une protéine de fusion accepteur d'énergie selon l'une des revendications 1 à 12, ou des cellules en absence ou présence de saponine, ou des fragments, ou des Iysats, ou des membranes de cellules comprenant une telle protéine, et éventuellement un substrat enzymatique adéquat, et -à mesurer le transfert d'énergie.