Brevet FR2840321A1 — publié le 20031205

L'invention est relative à un promoteur spécifique des tissus végétaux mettant en place des parois secondaires. Les parois cellulaires des plantes assurent le maintien de l'intégrité structurale des cellules végétales et la résistance mécanique des tissus végétaux ; elles jouent également un rôle important dans la signalisation intercellulaire. Les parois cellulaires sont des structures dynamiques dont la composition et la morphologie changent au cours du développement et de la différenciation des cellules. Chez les plantes, on distingue deux types de parois cellulaires : les parois primaires, élastiques, qui sont synthétisées lors de la croissance cellulaire au début du développement de la plante, et les parois secondaires, rigides et épaisses, qui sont mises en place en fin de croissance et de différenciation. Les parois des deux types sont principalement composées de polysaccharides (cellulose, hémicelluloses et pectines), et de composés aromatiques, notamment des lignines ; elles contiennent également des protéines. Toutefois, la composition, les proportions, et l'organisation structurelle de ces constituants sont différentes dans les parois primaires et les parois secondaires. La composition et la structure des parois secondaires ont une influence majeure sur les qualités des plantes au champ (par exemple résistance à la verse ou aux attaques des phytopathogènes) ainsi que dans le cadre de différentes utilisations industrielles. Par exemple, la teneur en lignine et en hémicellulose, ainsi que l'organisation de ces constituants au sein de la paroi secondaire, jouent un rôle essentiel dans les qualités nutritionnelles des plantes destinées à l'alimentation humaine ou animale, ainsi que dans les propriétés du bois, ou celles des produits à base de fibres de cellulose (textile, papier). Pour cette raison, la modification par génie génétique, des voies de biosynthèse des constituants de la paroi secondaire fait l'objet de nombreuses recherches. Il a ainsi été proposé d'agir sur des enzymes de la voie de biosynthèse des lignines, dans des applications diverses telles que l'amélioration du rendement en pâte à papier, ou de la digestibilité des fourrages [Cinnamoyl CoA réductase (CCR : Demande PCT WO 9712982 ; Demande PCT W09839454) ; acide caféique 0-méthyltransférase (COMT : Demande PCT W09423044 ; OBA et ALLEN, J. Dairy Sci., 82,135-142, 1999) ; Caféoyl Coenzyme A 3-0 méthyltransférase (CCoAOMT : Demande EP 0516958 ; et al., Transgenic Res. 10,457-464, 2001) ; CAD (LAPIERRE et al., Plant Physiol., 119,153- 164,1999) ; 4CL (HU et al., Nat. Biotech. 17,808-812, 1999) . Dans le même type d'applications, il a également été proposé d'agir sur des enzymes de la voie de biosynthèse des hémicelluloses, par exemple la glucane synthétase (Demande PCT WO 99/67404) ou l'UDP-Glucose-6 déhydrogénase (Demande PCT WO 99/29875). La régulation de gènes impliqués dans la formation des parois a également été proposée pour prévenir la verse des céréales (par exemple, gène Fukei 71, NISHIKUBO et al., Plant Cell Physiol., 41,776- 784, 2000). De manière classique, pour agir sur une protéine endogène, on exprime dans la même cellule une séquence d'ADN exogène dont le produit de transcription ou de traduction intervient de manière positive ou négative, selon l'application envisagée, sur l'expression ou l'activité de ladite protéine. A titre d'exemples, on citera les techniques de suppression antisens ou de co- suppression, qui sont actuellement fréquemment mises en #uvre pour moduler l'expression de divers gènes cibles. Il est préférable, dans un grand nombre de cas, de cibler l'expression de cette séquence exogène à certaines cellules et certains tissus, afin d'éviter toute interférence avec d'autres fonctions de la plante. Ainsi, pour agir sur des voies de biosynthèse des constituants des parois secondaires, il est souhaitable de disposer de promoteurs spécifiques de ces tissus. Dans le cadre de travaux concernant les gènes impliqués dans la biosynthèse des parois végétales, les Inventeurs ont constaté qu'une protéine, précédemment référencée sur GenBank sous le n d'accession BAB09906 dans le cadre du séquencage complet du génome d'Arabidopsis thaliana, était une P-xylosidase spécifiquement exprimée dans la fraction pariétale. Le gène codant pour cette protéine est dénommé ci-après AtBXL1. Les Inventeurs ont également isolé le promoteur du gène AtBXL1, et ont exprimé le gène rapporteur uidA (GUS) codant pour la P-glucuronidase sous contrôle de ce promoteur. Ils ont ainsi observé que l'expression du gène rapporteur était restreinte aux tissus (xylème et fibres lignifiées) contenant des parois secondaires en cours de formation. La séquence de 1988 pb en amont du codon d'initiation de la traduction du gène AtBXL1, et qui comprend le promoteur dudit gène, est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1. Un promoteur possédant un profil d'expression similaire à celui du promoteur AtBXL1 a été décrit précédemment . il s'agit du promoteur du gène EgCAD (FEUILLET et al., Plant Molecular Biology, 27,651-654, 1995 ; SAMAJ et al., Planta, 204(4), 437-443,1998). Toutefois, l'analyse des séquences de ces promoteurs montre qu'ils présentent une structure différente : le promoteur du gène AtBXLl possède une boîte de réponse à l'éthylène (ERE, localisée en-164 en amont du codon d'initiation de la traduction) et une boîte de réponse aux gibbérellines (P-Box, en-289 en amont du codon d'initiation de la traduction) mais pas de boîte de réponse à l'auxine ; le promoteur du gène EgCAD possède des boîtes de réponse à l'auxine (AuxRR-Core, en-305 en amont du codon d'initiation de la traduction), et à l'acide abcissique (ABRE, en-157 en amont du codon d'initiation de la traduction) mais pas de boîtes de réponse à l'éthylène, ou de boites de réponse aux gibbérellines. La présente invention a pour objet un polynucléotide constituant un promoteur spécifique des tissus végétaux impliqués dans la formation des parois secondaires, caractérisé en ce qu'il comprend les séquences de régulation de la transcription du promoteur du gène AtBXLl d'Arabidopsis thaliana. Selon un mode de réalisation préféré d'un promoteur conforme à l'invention, il comprend le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1. La présente invention englobe tout promoteur constitué par un fragment d'acide nucléique comprenant les domaines fonctionnels du promoteur du gène AtBXL1. L'homme du métier peut, à partir du polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1, identifier ces domaines fonctionnels, ainsi que les motifs d'ADN impliqués dans la fonction de chacun d'entre eux, par des techniques connues en elles-mêmes de dissection des promoteurs, par exemple en déterminant le niveau et la spécificité de l'activité promotrice de mutants de délétion de ce polynucléotide, et/ou par des techniques telles que celles des empreintes sur l'ADN (footprints), en incubant le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1, ou des portions de celui-ci, avec des extraits nucléaires de cellules de tissus impliqués dans la formation des parois secondaires, ainsi qu'avec des extraits nucléaires de cellules de tissus dans lesquels le promoteur du gène AtBXLl est inactif. L'invention englobe également : - les cassettes d'expression, comprenant, outre un promoteur conforme à l'invention, un gène d'intérêt placé sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur, ou un site permettant l'insertion dudit gène d'intérêt ; - les vecteurs recombinants, résultant de l'insertion d'un promoteur ou d'une cassette d'expression conformes à l'invention dans un vecteur hôte. Un promoteur conforme à l'invention peut être utilisé pour exprimer spécifiquement un polynucléotide d'intérêt dans les tissus végétaux impliqués dans la formation des parois secondaires. Ledit polynucléotide d'intérêt peut être notamment une séquence d'ADN permettant de moduler l'expression d'une enzyme de la voie de biosynthèse des constituants de la paroi secondaire, par exemple par cosuppression ou suppression antisens, ou par production d'ARN interférents. Il peut s'agir également de tout gène codant pour une protéine d'intérêt que l'on souhaite exprimer spécifiquement au niveau des parois secondaires. L'invention a en outre pour objet des cellules végétales et des plantes transgéniques transformées par au moins une molécule d'acide nucléique comprenant un promoteur conforme à l'invention. Les cellules transformées et les plantes transgéniques conformes à l'invention sont également utilisables comme modèles pour étudier et/ou modifier l'expression de différents gènes au niveau des parois secondaires. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'obtention du promoteur du gène AtBXL1, et son utilisation pour exprimer un gène hétérologue dans les tissus impliqués dans la formation des parois secondaires. EXEMPLE 1 : INSERTION DE GENES HETEROLOGUES SOUS CONTROLE DU PROMOTEUR DU GENE ATBXLI Le promoteur du gène AtBXLl est amplifié par PCR à partir d'ADN génomique d'Arabidopsis thaliana, écotype Wassilevskija (WS), en utilisant les amorces suivantes : P1 : 5'-GGG GCT GCA GGT GCT TTA TTA TAA CAA GAC AT-3' P2 : 5'-CCC CCA AGC TTA ATT CGT TCT AGT GTT TTC-3' L'amplification est effectuée à l'aide de la polymérase Pfu (PROMEGA) selon le protocole préconisé par le fournisseur. La séquence du produit d'amplification est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO:1. Ce produit d'amplification est cloné dans le plasmide pBSKS- (STRATAGENE). 1) Insertion du gène uidA sous contrôle du promoteur du gène AtBXLl : Le plasmide pBSKS- renfermant le promoteur du gène AtBXL1 est digéré par PstI et HindIII et le fragment Pstl-HindIII contenant le promoteur du gène AtBXLl est cloné entre les sites correspondants du plasmide pCAMBIA1391Xb, en phase avec la séquence codante uidA (GUS) codant pour la P-glucuronidase (JEFFERSON, Ann. N Y Acad. Sci., 700,53-73, 1993). La construction obtenue, dénommée ci-après pCAMBIA1391Xb(promAtBXLI), est schématisée sur la Figure 1. Légende de la Figure 1 : P35S : promoteur 35S du CaMV; T35S : séquence terminatrice du CaMV ; hpt : séquence codant l'hygromycine phosphotransférase ; promoteur AtBXL1 : séquence du promoteur d'AtBXL1 ; uidA : séquence codante de la ss-glucuronidase ; TNos : terminateur de la nopaline synthase ; BG : frontière gauche de l'ADN-T ; BD : frontière droite de l'ADN-T. 2) Insertion de l'ADNc de la CCR d'Arabidopsis thaliana en orientation antisens sous contrôle du promoteur du gène AtBXLl ; L'ADNc du gène AtCCRl (n d'accès GenBank : AF320624) est inséré, en orientation antisens dans le plasmide pCAMBIA1391Xb (promAtBXL1) en remplacement de la séquence codante uidA. La construction obtenue est schématisée sur la Figure 2. Légende de la Figure 2 : P35S : promoteur 35S du CaMV; T35S : séquence terminatrice du CaMV ; hpt : séquence codant l'hygromycine phosphotransférase ; promoteur AtBXL1 : séquence du promoteur d'AtBXL1 ; AtCCRl : ADNc d'AtCCRI en orientation antisens ; TNos : terminateur de la nopaline synthase ; BG : frontière gauche de l'ADN-T ; BD : frontière droite de l'ADN-T. 3) Insertion de l'ADNc de la F5H de peuplier en orientation sens sous contrôle du promoteur du gène AtBXLl : L'ADNc de la F5H de peuplier (n d'accès GenBank : AJ010324) est inséré, en orientation sens dans le plasmide pCAMBIA1391Xb (promAtBXL1) en remplacement de la séquence codante uidA. La construction obtenue est schématisée sur la Figure 3. Légende de la Figure 3 : P35S : promoteur 35S du CaMV; T35S : séquence terminatrice du CaMV ; hpt : séquence codant l'hygromycine phosphotransférase ; promoteur AtBXLl : séquence du promoteur d'AtBXL1 ; F5H: ADNc de la F5H de peuplier en orientation sens ; TNos : terminateur de la nopaline synthase ; BG : frontière gauche de l'ADNT ; BD : frontière droite de l'ADN-T. Ces différentes construction sont transférées dans des bactéries de la souche C58pMP90 d'Agrobacterium tumefaciens (KONCZ et SCHELL, Mol Gen Genet 204 : 383-396, 1986) en vue de la transformation des plantes. EXEMPLE 2 : OBTENTION DE PLANTES TRANSGENIQUES EXPRIMANT UN GENE HETEROLOGUE SOUS CONTROLE DU PROMOTEUR DU GENE ATBXL1. La transformation des plants d'Arabidopsis thaliana est effectuée par trempage des bourgeons floraux dans la solution d'Agrobacterium tumefaciens, comme décrit par CLOUGH et BENT, (Plant J., 16,735-743, 1998). Les transformants primaires sont sélectionnés sur milieu Arabidopsis (ESTELLE et SOMMERVILLE, Mol. Gen. Genet. 206,200-206, 1987) contenant 50 mg/L d'hygromycine, et auto-pollinisés afin d'obtenir des individus homozygotes pour l'insertion. Les graines issues des autopollinisations sont récoltées après complet séchage des tiges. Seules les lignées ségrégeant 3:1 pour la résistance à l'hygromycine et possédant une seule insertion homozygote sont conservées pour l'analyse de l'expression du gène hétérologue par détection de son activité. 1) Expression du gène uidA L'activité (3-glucuronidase est recherchée par analyse histochimique sur des coupes de différents organes (racines, feuilles, fleurs et siliques) des plantes fraichement récoltées. La détection est effectuée comme décrit par JEFFERSON et al. (EMBO J. 6,3901-3907, 1987), en présence d'acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl p- D-glucuronique (XGluc, BIOSYNTH AG), dans du tampon phosphate de potassium 100mM, pH7, contenant 0,1% de Triton X100, ainsi que lOmM de K3Fe(CN)6 et lOmM de K4Fe(CN)6 pour éviter la diffusion des produits intermédiaires de la réaction. On observe une expression spécifique de la ssglucuronidase au niveau des tissus vasculaires et des fibres de tous les organes testés, et notamment au niveau du xylème (protoxylème et métaxylème) et du cambium intrafasciculaire. Aucune expression n'est observée dans les autres tissus. Cette répartition correspond à une expression spécifique des tissus dans lesquels s'effectue la formation de parois secondaires. 2) Expression de l'ADNc AtCCR en antisens : La diminution de l'activité CCR résultant de l'expression de l'ADNc d'AtCCR1 en antisens, est recherchée dans les transformants homozygotes par un test biochimique, comme décrit par CHABANNES et al.(Plant J., 28,257-270, 2001), et évaluée par l'analyse quantitative et qualitative des lignines des hampes florales matures. L'analyse quantitative est effectuée par test Klason (DENCE et al., Lignin determination, p 33-61, Methods of Lignin Chemistry, C. DENCE, S. LIN eds, SPRINGER VERLAG, Berlin, 1992). L'analyse qualitative est effectuée par thioacidolyse (LAPIERRE et al., Res. Chem. Intermed. 21, 397,412, 1995). Une baisse de l'activité CCR se traduit par la diminution de la quantité de lignines totales, l'augmentation du rapport S/G, et la diminution des liaisons labiles beta-0-4 comme décrit par PIQUEMAL et al.(Plant J., 13,71-83, 1998). 3) Expression de la F5H : L'activité F5H résultant de l'expression de la F5H de peuplier est recherchée dans les transformants homozygotes par un test biochimique (réaction de MAULE) sur des coupes fines de hampes florales matures, et par analyse quantitative et qualitative des lignines des hampes matures des transformants homozygotes. Les analyses quantitatives et qualitatives des lignines sont effectuées comme indiqué ci-dessus pour la CCR. L'activité F5H se traduit par la présence d'unités S de lignine dans les vaisseaux du xylème, qui se manifeste par une coloration rouge du xylème par la réaction de MÂULE, par l'augmentation du rapport S/G des lignines totales, et l'augmentation des liaisons labiles beta-0-4 comme décrit par FRANKE et al . , Plant J. , 22(3), 223-234, 2000). REVENDICATIONS 1) Polynucléotide constituant un promoteur spécifique des tissus végétaux impliqués dans la formation des parois secondaires, caractérisé en ce qu'il comprend les séquences de régulation de la transcription du promoteur du gène AtBXLl d'Arabidopsis thaliana. 2) Polynucléotide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID NO: 1. 3) Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 ou 2. 4) Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 ou 2. 5) Cellule végétale transformée par au moins un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 ou 2. 6) Plante transgénique transformée par au moins un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 ou 2. 7) Utilisation d'un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 ou 2 pour exprimer un polynucléotide d'intérêt dans un tissu végétal impliqué dans la formation des parois secondaires.