Brevet FR2834997A1 — publié le 20030725

L'invention se rapporte à de nouvelles séquences issues de champignons producteurs d'ochratoxine A (OTA) ou de citrinine ainsi qu'à une procédé de détection de ces types de champignons, dans lequel on recherche la présence d'une séquence selon l'invention. La mycoflore est estimée à plus de 200 000 espèces. Parmi elles, les moisissures (fungi imperfecti), qui se retrouvent partout, posent de graves problèmes au niveau de la santé et de l'alimentation de l'homme et des animaux. Elles peuvent provoquer : - l'altération des denrées alimentaires, - des mycoses et des allergies , - et des intoxications par leurs métabolites appelés mycotoxines. Les mycotoxines sont des métabolites secondaires, c'est-à-dire qu'elles ne sont pas nécessaires au développement du champignon comme le sont les acides aminés, les acides gras, les acides nucléiques ou les protéines. Mais elles peuvent provoquer des répercussions importantes sur la sécurité alimentaire et sanitaire de l'homme et des animaux. On a pu déterminer les nombreux genres de champignons toxinogènes ainsi que les mycotoxines qu'ils peuvent produire : Champignons : Mycotoxines : Denrées : Aspergillus Aflatoxines, Maïs, arachides, graines Stérigmatocystine, coton, potiron, riz, Ochratoxine A. coton, potiron, riz, haricots, tissus d'animaux (jambon, lard, saucisses), lait et dérivés. Fusarium Trichotécènes, Blé, maïs, orge, riz, Zéaralénone, seigle, avoine, noix. Fumosines, Fusarine, Moniliformine. Penicillium Patuline, Citrinine, Fruits et jus de fruits, blé, Pénitrem A, Acide riz, fromage, noix. cyclopiazonique, Ochratoxine A. Alternaria Altemariol, Acide Fruits, légumes et produits ténuazonique. dérivés de pommes et tomates. Claviceps Alcaloïdes de l'ergot. Blé et dérivés, seigle. (D'après A. Pfohl-Leszkowicz, in Les mycotoxines dans l'alimentation: évaluation et gestion du risque . Ed. Tec & Doc, Paris, 1999). La préoccupation concernant des mycotoxines se fait sentir de plus en en plus chez les industriels de l'alimentation et le corps médical qui doivent éviter les risques de contamination. Pour cela, il est nécessaire de disposer de techniques puissantes qui permettent de détecter la source, le champignon producteur de la mycotoxine avant que cette dernière ne soit synthétisée dans tout milieu favorable. Il est donc intéressant de disposer des techniques dites préventives contre la production de la mycotoxine. Cette méthode devra être simple d'utilisation et d'exécution, spécifique à un micro-organisme ou à un groupe de micro-organismes ayant la capacité de produire le même groupe de mycotoxines. En plus, cette méthode doit donner des réponses assez rapides et répétitives. IL existe des méthodes de détection et de quantification des mycotoxines. Parmi celles-ci, on trouve la chromatographie en couche mince (TLC), la chromatographie liquide haute performance (HPLC) avec détection en fluorimétrie (Shephard et al. 1995). On trouve aussi l'électrophorèse capillaire, la chromatographie en phase gazeuse (CPG) avec spectrométrie de masse ainsi que les immuno-essais. Toutes ces méthodes ont leurs avantages et inconvénients. De même on connaît des méthodes pour doser l'OTA dans le sang, les aliments et les urines. Cependant, elles restent des méthodes de détection des mycotoxines après leur production. Or, il serait intéressant de prévoir tout risque de production de mycotoxines afin d'agir pour éviter cette production. Dans ce cas il faut cibler les champignons producteurs de mycotoxines La détection des champignons producteurs de mycotoxines se fait, d'une façon conventionnelle, par dénombrement sur boite de Pétri suivi d'une identification et d'une classification morphologique et physiologique. Toutefois, cette approche est laborieuse, longue et nécessite une expérience confirmée dans la taxonomie des champignons. Pour ces raisons, des méthodes rapides de détection de ces microorganismes sont nécessaires. Plusieurs méthodes rapides de détection des champignons toxinogènes ont été décrites dans la littérature. Parmi celles-ci on peut citer les méthodes immunologiques, basées sur les antigènes de surfaces, et la détermination de la quantité d'ergosterol, présent dans l'échantillon, par des méthodes analytiques. Ces approches ont toutefois le désavantage de ne pas être spécifiques. Ainsi, les anticorps dirigés contre les antigènes de surface du genre Penicillium réagissent avec le genre Aspergillus et la détermination de l'ergostérol quantifie la présence de tous les champignons, y compris les levures, dans l'échantillon. Par contre, la méthode basée sur l'amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) est très spécifique. Elle permet de distinguer les sous espèces (Hamelin et al., 1993, CUIT. Genet. 25 :107-13) et mêmes des souches de la même espèce (Bidouchka et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol. 59:1752-5). De plus, si les amorces sont bien choisies, cette technique permettra, dans la majorité des cas, de différencier les souches toxinogènes des non toxinogènes dans la même sous espèce. Ceci peut être réalisé en ciblant des gènes de la voie de biosynthèse des mycotoxines chez les champignons producteurs. Cependant, les connaissances de la biologie moléculaire des champignons ne sont encore que balbutiantes et parcellaires. Actuellement, seuls des gènes de la voie de biosynthèse des trois groupes de mycotoxines : aflatoxines (et leur intermédiaire stérigmatocystine), patuline, fumonisines, ont été caractérisés. Ainsi, on a caractérisé les gènes pks codant pour des polycétones synthétases (PKS) dans la production : - d'aflatoxines (pksA ) [Chang et al. 1995. Mol Gen Genet. 248:270-277; Trail et al. 1995.App. Env. Microbiol. 61 :2665- 2673; Mahanti et al. 1994.Americain Phytopathological Society Meeting, Albuquerque, NM.; Mahanti et al., 1996. Appl. Env. Microbiol., 1996, 62 :191-195], - la patuline (6-MSAS) [Beck et al. (1990). Eur. J. Biochem. 192, 487-498], et , - les fumonisines (fum5) [Proctor et al. 1999. A. Fungal Genet Biol. 27:100-11]. On peut cibler ces gènes pour la détection des champignons producteurs de ces trois mycotoxines. Il est nécessaire de trouver de nouvelles méthodes pour la détection des champignons producteurs d'autres mycotoxines. La Demanderesse a découvert qu'on peut détecter avec précision et rapidité des champignons producteurs d'ochratoxine A (OTA) ou de citrinine, en recherchant la présence de nouvelles séquences nucléotidiques, codant pour des motifs protéiques précis. Ces nouvelles séquences protéiques et nouvelles séquences nucléotidiques sont des objets de l'invention, et présentent une utilité industrielle très claire, en ce qu'elles peuvent être utilisées pour détecter les champignons producteurs d'ochratoxine A ou de citrinine de façon spécifique. Une méthode de détection de tels champignons, dans laquelle on détecte la présence de séquences selon l'invention est également un objet de l'invention. Ainsi, l'invention se rapporte à une séquence protéique isolée comprenant la séquence REALAMDPQQRX1LX2EX3X4YE, (SEQ ID N 41) dans laquelle X1 est choisi parmi L/V/M/1, X2 est choisi parmi L/M, X3 est choisi parmi V/T et X4 est choisi parmi V/A, et comprenant également de préférence la séquence H/K/R GP S/C M/L/A T/V I/L DDTACSSS L/M V/I A/C L/V/F H/N (SEQ ID N 42), ou à une séquence protéique isolée comprenant la séquence SEQ ID N 43 TX1FVEX2HGTGTQX3GD, dans laquelle X1 est choisi parmi D/A, X2 est choisi parmi C/A et X3 est choisi parmi F/L, et comprenant également de préférence la séquence SEQ ID N 44 (GYARGEA). De préférence les séquences selon l'invention sont issues d'un champignon, notamment d'un champignon produisant de la citrinine ou de l'ochratoxine A. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence selon l'invention comprend une séquence choisie parmi SEQ ID N 1 à SEQ ID N 10. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence selon l'invention est une séquence choisie parmi SEQ ID N 1 à SEQ ID N 10. La recherche de séquences nucléiques codant pour des séquences protéiques selon l'invention permet de détecter de façon spécifique la présence d'un champignon produisant de la citrinine ou de l'ochratoxine A dans un échantillon, en particulier biologique ou alimentaire. Ainsi, l'invention se rapporte également à une séquence nucléique isolée codant pour une séquence protéique selon l'invention, notamment une séquence nucléique comprenant l'une des séquences SEQ ID N 11à SEQ ID N 20, en particulier une séquence nucléique choisie parmi SEQ ID N 11à SEQ ID N 20. L'invention se rapporte également à une amorce utile pour l'amplification d'une séquence nucléique selon l'invention, et comprenant entre 18 et 25 bases consécutives de ladite séquence. De façon préférée, ladite amorce est choisie parmi une séquence SEQ ID N 21 à SEQ ID N 40. L'invention se rapporte également à un procédé de détection d'une souche de champignon productrice de citrinine ou d'ochratoxine A dans un échantillon, comprenant l'étape de détection d'au moins une séquence nucléique selon l'invention, en particulier au moins une séquence SEQ ID N 11 à SEQ ID N 20 dans ledit échantillon, de préférence au moins une séquence SEQ ID N 11à SEQ ID N 17 ou SEQ ID N 18 à SEQ ID N 20. La détection peut s'effectuer de diverses manières, qui sont toutes connues de l'homme du métier. Dans un cas particulièrement préféré, le procédé de détection selon l'invention comprend les étapes de : a) amplification de l'ADN ou l'ARN présent dans ledit échantillon, notamment en utilisant au moins une amorce selon l'invention, et en particulier au moins l'une des amorces SEQ ID N 21 à SEQ ID N 40, b) détection du fragment amplifié permettant d'en déduire la présence de ladite souche productrice dans ledit échantillon. Dans un autre mode de réalisation, le procédé de détection selon l'invention comprend les étapes de : a) hybridation de l'ADN ou l'ARN présent dans ledit échantillon avec une sonde issue de l'une des séquences nucléiques selon l'invention, notamment SEQ ID N 11à SEQ ID N 20, b) déduction de la présence de ladite souche dans ledit échantillon par présence d'un signal d'hybridation. Une sonde est dite issue d'une séquence nucléique lorsqu'elle permet de détecter ladite séquence nucléique ou sa séquence complémentaire par hybridation dans des conditions de forte stringence. Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. Ces conditions peuvent aisément être déterminées par un homme du métier, en fonction de la taille de la sonde, et du pourcentage en bases AT et GC dans la sonde. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes. L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCl + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e. : 42 C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20 C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20 C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60 C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al. (1989 Molecular cloning : a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.). De préférence, les sondes selon l'invention comprennent plus de 50 bases consécutives d'une séquence SEQ ID N 11à SEQ ID N 20, de façon plus préférée plus de 75 bases, de façon encore plus préférée plus de 100 bases, de façon la plus préférée plus de 150 bases consécutives. L'invention se rapporté également à des outils permettant la mise en #uvre d'un procédé de détection de champignons producteurs d'ochratoxine ou de citrinine. Ainsi, l'invention se rapporte à un support ou une puce à ADN présentant à sa surface au moins une séquence nucléotidique selon l'invention, et de préférence une séquence choisie parmi SEQ ID N 11à SEQ ID N 20, de préférence au moins une séquence SEQ ID N 11à SEQ ID N 17 ou SEQ ID N 18 à SEQ ID N 20. La puce à ADN selon l'invention peut également comprendre, à sa surface, une sonde issue de l'une des séquences nucléotidiques selon l'invention, issue notamment de SEQ ID N 11à SEQ ID N 20. La puce selon l'invention peut présenter à sa surface, au moins 2 séquences selon l'invention, de préférence au moins 3, de façon plus préférée au moins 5, de façon encore plus préférée au moins 7, de façon la plus préférée toutes les séquences selon l'invention, notamment toutes les séquences SEQ ID N 11à SEQ ID N 20. Dans un mode de réalisation particulier, la puce selon l'invention présente à sa surface les séquences SEQ ID N 11 à SEQ ID N 17, ou des sondes issues de ces séquences. Dans un mode de réalisation particulier, la puce selon l'invention présente à sa surface les séquences SEQ ID N 18 à SEQ ID N 20, ou des sondes issues de ces séquences. La technique des puces à ADN consiste à placer sur une surface de quelques millimètres carrés ou centimètres carrés (puces à plus ou moins haute densité) plusieurs centaines de séquences d'ADN spécifiques d'un organisme donné. Ces sondes sont hybridées avec des fragments d'ADN, généralement obtenus par RTPCR. L'hybridation éventuelle desdits fragments est alors observée, et indique la présence ou l'absence du gène exprimé, ou de l'organisme étudié. Ainsi, pour mettre en #uvre le procédé selon l'invention, on peut fabriquer des amorces spécifiques à partir d'au moins une des séquences nucléotidiques qui seront décrites ci-après, les amorces étant des fragments d'acides nucléiques comprenant environ de 18 à 25 bases et étant un fragment consécutif de la séquence nucléotidique qui permet de reconnaître et d'amplifier spécifiquement la séquence nucléotidique totale par la méthode PCR ou RT-PCR (Reverse Transcription-PCR); les amorces étant fabriquées selon les méthodes courantes connues en biologie moléculaire), ou un fragment complémentaire d'un tel fragment. On extrait ensuite l'ADN ou l'ARN d'un champignon, et l'on amplifie la séquence à l'aide des deux amorces par PCR ou RT-PCR. Les exemples non exhaustifs et non limitatifs suivants vont illustrer l'invention. Procédure expérimentale Pour les exemples de 1 à 10, a) on cultive un champignon b) on extrait son ADN, c) on amplifie l'ADN par PCR en utilisant des exemples non exhaustifs et non limitatifs d'amorces fabriquées à partir des séquences nucléotidiques de l'invention. Pour ces exemples, les méthodes communes sont les suivantes : 1) Cultures des champignons et extraction de leur ADN : Les champignons sont cultivés dans le milieu PDB, Potato Dextrose Broth (Lot 139844XB, Exp MAR 04, Difco Laboratories). C'est un milieu déshydraté en poudre de composition : Extrait de pomme de terre, 200 g/L ; 20 g/L. La préparation consiste en l'utilisation de 24g de poudre par litre d'eau distillée. Le pH final est ajusté à 5. 1 +/- 0. 2 (à 25 C) La culture en milieu liquide se fait dans des Erlenmeyer de 250ml à raison de 100ml de PDB dans chacun. Les Erlenmeyer ainsi remplis sont fermés avec du coton cardé puis stérilisés pendant 15 min à 120 C. L'ensemencement des milieux liquides est réalisé à partir des spores conservées, sur gélose inclinée, à 4 C. Un morceau de gélose est alors découpé à l'aide d'une anse de platine et mis dans l'Erlenmeyer stérilement. Les cultures sont incubées sous agitation (160 tours/min) à 25 C. Après 1 à 2 jours de croissance, selon que le champignon pousse vite ou pas, 1 à 5ml de cette préculture vont servir à ensemencer un nouvel Erlenmeyer contenant 100ml de PDB. Cette culture est mise à pousser à 25 C sous agitation (160 tours par minutes) pendant 16 à 20 heures afin d'avoir des cellules jeunes et en phase exponentielle de croissance avant d'être récupérées pour faire l'extraction d'ADN génomique. Le prélèvement du matériel fongique se fait par filtration sous vide. Après 16 à 20 heures de croissance, la culture liquide est filtrée sous vide (système Millipore) sur une membrane en nitrocellulose de 0.45um. Le mycélium est récupéré sur le filtre alors que le milieu de culture passe au travers des pores de la membrane. Le matériel fongique est alors fixé à l'azote liquide et conservé jusqu'à une utilisation ultérieure à -70 C. La lyse cellulaire est réalisée en combinant une solution chimique et une action physique. - Peser 300 mg de mycélium dans un tube Falcon (14 ml) - Ajouter 5 ml de tampon de lyse cellulaire et 12,5 ml de protéinase K à 20mg/ml Composition du tampon de lyse : Tris HCI, pH 7.4, 100 mM EDTA, pH 8.0, 20 mM NaCl, 250 mM SDS, 2 % - Effectuer le broyage avec l'ultra thurax - Répartir le volume dans des Eppendorfs (de 2 ml) - Incuber lh à 37 C - Incuber 30 min à 65 C (retournement des tubes toutes les 10 min) - Ajouter 1 vol de phénol/chloroforme - Centrifuger 1 h à 4000 rmp - Récupérer la phase supérieure (noter le volume) - Ajouter 6 ml de RNAse A (50 mg/ml) - Incuber 2 à 3 h à 37 C - Ajouter 1 vol de chloroforme - Centrifuger 10 min à 4000 rpm - Récupérer la phase supérieure (noter le volume) - Ajouter 1 vol de chloroforme - Centrifuger 10 min à 4000 rpm - Récupérer la phase supérieure (noter le volume) - Ajouter 1 vol d'isopropanol (précipitation de l'ADN) - Centrifuger 10 min à 13000 rmp - Eliminer le surnageant - Laver le culot avec 100 ml d'EtOH 70% - Eliminer l'éthanol et sécher le culot - Resuspendre l'ADN avec 70 ml d'eau stérile - Effectuer le dosage puis stocker à -20 C L'extraction de l'ADN est réaliséejuste après. Le protocole est le suivant : Les 8001 de matériel fongique soniqué sont mis dans un Eppendorfstérile. Ajouter 5 l de RNase A (à 50mg/ml, Euromedex), mélanger par inversion. Incuber 1 heure à 37 C dans un bain-marie. Ajouter 10 III de protéinase K (à 20 mg/ml, Euromedex), mélanger par inversion. Incuber 30 min à 65 C avec inversion toutes les 10 min. Ajouter 800ul de phénol-chloroforme-alcool isoamylique (Sigma) (sous la hotte) . Mélanger par inversion jusqu'a émulsion. Centrifuger 15 min à 13 000 rotations par minutes (rpm) Prélever 750 l de phase supérieure, les transférer dans un nouveau tube Eppendorf stérile et ajouter 750ul de phénol-chloroforme. Mélanger par inversion jusqu'à émulsion. Centrifuger 15 min à 13 000 rpm. Prélever 660 l de phase supérieure, les transférer dans un nouveau tube Eppendorf stérile et ajouter 660ul de chloroforme afin de piéger les résidus de phénol. Mélanger par inversion. Centrifuger 5 min à 13 000 rpm Prélever 560 l de phase supérieure, les transférer dans un nouveau tube Eppendorf stérile pour effectuer une précipitation de l'ADN. Ajouter du NaCl à [150mM final], Ajouter 2 v/v d'éthanol 95 % (à-20 C) Incuber 1 heure à -20 C Centrifuger 15 min à 13 000 rpm Vider le surnageant et laver le culot obtenu avec 50 l d'éthanol 70 %. Centrifuger 5 min à 13 000 rpm. Vider le surnageant et sécher le culot à l'air, le tube renversé sur du papier Resuspendre le culot dans 50 l de tampon TE avec un cône coupé pour ne pas casser l'ADN lors du "up and down". Tampon TE : 1 OmM Tris-HCl (pH 7,4) ImM EDTA (pH 8,0) La solution est stérilisée par filtration (filtre 0,22um, Millipore) Stocker l'ADN génomique à -20 C 2) Amplification par PCR : L'amplification est réalisée par utilisation d'un kit PCR : Core System 1 (Promega) Composants du kit : Taq DNA polymerase 10X buffer w/15mM MgCl2 PCR Nucleotide Mix: dNTP, 1 OmM Taq DNA polymerase, 5u/ l Mélange réactionnel: * amorce 1 : 0.5 (il *amorce 2 : 0.5 l matrice ADN: 0.3 l Taq DNA polymerase 10X buffer w/15mM MgCl2: 5 l PCR Nucleotide Mix: 1 l Taq DNA polymerase: 0.251 Eau déionisée stérile : qsp50 L (soit 42.45 l) Pour un ADN génomique testé, mettre tous les composés dans un microtube PCR (Fisher) de 0.21 stérile et placé dans la glace. Ajouter une goutte d'huile minérale (Sigma). L'ensemble des tubes sont placés alors dans le thermo-cycler (Stratagène). La PCR peut démarrer selon le programme suivant : 1ère étape : dénaturation initiale 96 C pendant 5min, 1 cycle 2ème étape : pendant 40 cycles dénaturation à 96 C pendant 1 minute hybridation de 60 C pendant 1 minute élongation à 72 C pendant 2min 3ème étape : élongation terminale 72 C pendant lOmin, 1 cycle 4ème étape : stockage à 6 C pendant 99min, 99cycles Les souches de champignons testées ainsi que les mycotoxines qu'elles produisent sont: Mycotoxine Produite Ochra- Citrinine Afla- Zéara- Tricho- Fumon toxine A (cit) toxine lénone thécènes isines (ota) (afl) (zea) (tr) (fum) Aspergillus carbonarius X M333 Aspergillus ochraceus X NRRL3174 Aspergillus melleus X NRRL 3519 Aspergillus sulfureus X NRRL 4077 Penicillium viridicatum X NRRL3711 Penicillium citrinum X NRRL 1843 Monascus ruber X Fusarium verticilloides X NRRL 6442 Fusarium graminearum X NRRL 5883 Fusarium culmorum X NRRL 3288 Aspergillus flavus X Exemple 1. Concerne la séquence nucléotidique AOKS1.1. (SEQ ID N 11) Les amorces sont constituées des fractions suivantes, fabriquées à partir de la séquence AOKS 1.1 : SI : 5'-AAGGATCGTCGACCGGCGTGTA-3' (SEQ ID N 21) S2 : 5'-GCCGCCTCGTCCCACATATGAC-3' (SEQ ID N 22) Exemple 2. Concerne la séquence nucléotidique AOKS1. (SEQ ID N 12) Les amorces sont constituées des fractions suivantes, fabriquées à partir de la séquence AOKS 1 : S3 : 5'-ACGGTGAATGCCGCGTCGTAGT-3' (SEQ ID N 23) S4 : 5'-GCATCGTGATACCCATGCTGCG-3' (SEQ ID N 24) Exemple 3. Concerne la séquence nucléotidique AOKS9. (SEQ ID N 13) Les amorces sont constituées des fractions suivantes, fabriquées à partir de la séquence AOKS9 : S5 : 5'-GGACGAGATCCAAGGCTCGCAG-3' (SEQ ID N 25) S6 : 5'-TGGGCACCCATGTGGAAACAGA-3' (SEQ ID N 26) Exemple 4. Concerne la séquence nucléotidique PVKS6. (SEQ ID N 20) Les amorces sont constituées des fractions suivantes, fabriquées à partir de la séquence PVKS6 : S7 : 5'-ATCATGGCCTCGTGCGAAAT-3' (SEQ ID N 39) S8 : 5'-CGCCCGATGGATCCTGTAAG-3' (SEQ ID N 40) Exemple 5. Concerne la séquence nucléotidique PVKS9. (SEQ ID N 14) Les amorces sont constituées des fractions suivantes, fabriquées à partir de la séquence PVKS9 : S9 :5'-AACGGCTGCTGCTCGAGACT-3' (SEQ ID N 29) S10 : 5'-CAGAAGGTTGGTTCCCGCTG-3' (SEQ ID N 30) Exemple 6. Concerne la séquence nucléotidique PVKS 11. (SEQ ID N 18) Les amorces sont constituées des fractions suivantes, fabriquées à partir de la séquence PVKS 11 : SI 1 : 5'-AGCGATTGCAGCGGGAAGT-3' (SEQ ID N 35) S12: 5'-GCCCGTGTATAGACGCTCCG-3' (SEQ ID N 36) Exernple 7. Concerne la séquence nucléotidique PVKS 15. (SEQ ID N 17) Les amorces sont constituées des fractions suivantes, fabriquées à partir de la séquence PVKS15 : SI 3: 5'-GCAGCAGCGAATTCTTCTGGA-3' (SEQ ID N 33) S14: 5'-CTGGTGCCGTTACGAAGGGA-3' (SEQ ID N 34) Exemple 8. Concerne la séquence nucléotidique ACKS9. (SEQ ID N 16) Les amorces sont constituées des fractions suivantes, fabriquées à partir de la séquence ACKS9 : S15: 5'-TGCTAGCTGCGACTGGGATG-3' (SEQ ID N 31) SI 6: 5'-GGCGTTTCAGAACCACAGCA-3' (SEQ ID N 32) Exemple 9. Concerne la séquence nucléotidique ACKS 10. (SEQ ID N 19) Les amorces sont constituées des fractions suivantes de la séquence ACKS10 : S 17: 5'-TCCATCTCGCGTGTCAGAGC-3' (SEQ ID N 37) SI 8:5'-ATCAAAGCCTCTTGCGCCAC-3' (SEQ ID N 38) Exemple 10. Concerne la séquence nucléotidique CTKS3. (SEQ ID N 14) Les amorces sont constituées des fractions suivantes, fabriquées à partir de la séquence CTKS3 : S 19 : 5'-CCTCCGTATTCGTTGGCGTC-3' (SEQ ID N 27) S20 : 5'-AAAGCTTGCTCTCCGCAACG-3' (SEQ ID N 28) Les résultats de ces 10 expériences sont résumés dans le tableau suivant (X : montre une amplification avec un signal positif) : Mycotoxine produite Réponse après PCR avec les séquences testées (S) SI I S3 I S5 I S7 I S9 I SU I S13 I S15 I S17 S19 ota cit afl zea tr fum / / / / / / / / / / S2 S4 S6 S8 S10 S12 S14 S16 S18 20 Aspergillus oui X X X X X carbonarius M333 Aspergillus oui X X X ochraceus NRRL 3174 Aspergillus oui X melleus NRRL3519 Aspergillus oui X sulfureus NRRL 4077 Pénicillium oui X X X X X X viridicatum NRRL 3711 Penicillium oui X X citrinum NRRL 1843 Monascus oui X X ruber Fusarium oui verticilloides NRRL 6442 Fusarium oui graminearum NRRL 5883 Fusarium oui culmorum NRRL 3288 Aspergillus oui flavus Ces résultats montrent que : - les amorces fabriquées à partir des séquences nucléotidique s AOKS1.1, AOKS1, PVKS6, PVKS9, PVKS11, PVKS15, ACKS9 et ACKS10 permettent de détecter des souches de champignons productrices d'ochratoxine A (OTA), - les amorces fabriquées à partir de la séquence AOKS9 permettent de détecter à la fois les souches de champignons productrices d'ochratoxine A et les souches de champignons productrices de citrinine, - les amorces fabriquées à partir de la séquence nucléotidique CTKS3 permettent de détecter des souches de champignons productrices de citrinine, - les amorces fabriquées à partir de toutes ces séquences nucléotidiques ne permettent pas de détecter les souches productrices d'aflatoxine, de zéaralénone, de tricothécènes ou de fumonisines. Les séquences nucléotidiques selon l'invention sont donc bien spécifiques et originales. Exemple 11. Cet exemple est destiné à confirmer que les amorces utilisées en PCR sont aussi utilisables en RT-PCR. On cultive les champignons comme précédemment, on extrait leur ARN et on l'amplifie par RT-PCR (PCR après reverse transcription ). Par rapport à la PCR, on pratique les étapes initiales suivantes : I) Extraction d'ARN: Peser 300 mg de mycélium, ajouter 1 ml de Trizol, broyer et laisser 5mn à température ambiante, Ajouter 200 III de chloroforme, mélanger 15 s et laisser 2 à 3 mn à température ambiante, Centrifuger 15 mn à 13000 rpm à 4 C et récupérer la phase supérieure Ajouter 500 III d'isopropanol, mélanger et laisser 10 mn à température ambiante Centrifuger 20 mn à 13000 rpm à 4 C, éliminer le surnageant et ajouter 1 ml d'éthanol 75 % puis vortexer Centrifuger 5 mn à 13000 rpm à 4 C, éliminer le surnageant, sécher le culot, ajouter 50 III d'eau DEPC et placer 10 mn à 55-60 C II) Reverse transcription: Sur 5 g d'ARN totaux ajouter: 1 l de polydT 11 l qsp d'eau MilliQ stérile. Incuber le mélange 5 mn à 70 C, puis refroidir sur glace Ajouter par la suite: 4 ul de tampon 5X 2 l de dNTP à 100 mM 1 III de RNAsine 1 l d'eau MilliQ stérile Incuber 5 mn à 37 C Ajouter 1 III de reverse transcriptase Placer lh à 42 C puis 15 mn à 70 C Ajouter 60 l d'eau MilliQ stérile Analyser sur gel d'agarose Les exemples testés sont les trois paires d'amorces correspondant respectivement aux séquences AOKS1.1, AOKS1et AOKS9 (S1/S2 - S3/S4 S5/S6) déjà utilisées dans les exemples précédents de PCR. Les champignons testés ont été Aspergillus carbonarius M333 et Aspergillus ochraceus NRRL 3174, deux souches productrices seulement d'ochratoxine A. Les signaux positifs (X) de l'amplification confirment que les amorces utilisées sont aussi utiles en RT-PCR, comme le montrent les résultats résumés dans le tableau suivant : Mycotoxine Produite Réponse après RTPCR OTA Cit Afl Zea Tr Fum S1 S5 / / S2 S6 Aspergillus X X X carbonarius M333 Aspergillus X X X ochraceus NRRL 3174 Ainsi, les exemples de la présente invention démontrent que l'utilisation de séquences selon l'invention permet de détecter les champignons producteurs d'ochratoxine A ou de citrinine de façon spécifique, sans détecter les champignons produisant d'autres mycotoxines, comme l'aflatoxine, la Zéaralénone, les Trichothécènes ou les Fumonisines. Revendications 1. Séquence protéique isolée comprenant la séquence REALAMDPQQRXILX2EX3X4YE, (SEQ ID N 41) dans laquelle X1 est choisi parmi L/V/M/I, X2 est choisi parmi L/M, X3 est choisi parmi V/T et X4 est choisi parmi V/A. 2. Séquence selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre la séquence SEQ ID N 42 +(aa positif) G P S/C M/L/A T/V I/L D D T A C S S S L/M V/I A/C L/V/F H/N. 3. Séquence protéique isolée comprenant la séquence SEQ ID N 43 TX1FVEX2HGTGTQX3GD, dans laquelle X1 est choisi parmi D/A, X2 est choisi parmi C/A et X3 est choisi parmi F/L. 4. Séquence selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre la séquence SEQ ID N 44 GYARGEA. 5. Séquence selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce qu'elle est issue d'un champignon, en particulier produisant de la citrinine ou de l'ochratoxine A. 6. Séquence selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence choisie parmi SEQ ID N 1 à SEQ ID N 10. 7. Séquence selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une séquence choisie parmi SEQ ID N 1 à SEQ ID N 10. 8. Séquence nucléique isolée codant pour une séquence protéique selon l'une des revendications précédentes. 9. Séquence nucléique selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi SEQ ID N 11à SEQ ID N 20. 10. Amorce pour l'amplification d'une séquence nucléique selon l'une des revendications 8 ou 9, comprenant entre 18 et 25 bases consécutives de ladite séquence. 11. Amorce selon la revendication 10, choisie parmi SEQ ID N 21 à SEQ ID N 40. 12. Procédé de détection d'une souche de champignon productrice de citrinine ou d'ochratoxine A dans un échantillon, comprenant l'étape de détection d'au moins une séquence nucléique selon l'une des revendications 8 ou 9 dans ledit échantillon. 13. Procédé de détection selon la revendication 12, comprenant les étapes de : a) amplification de l'ADN ou l'ARN présent dans ledit échantillon, notamment en utilisant au moins une amorce selon la revendication 10 ou 11, b) détection du fragment amplifié permettant d'en déduire la présence de ladite souche productrice dans ledit échantillon. 14. Procédé de détection selon la revendication 12, comprenant les étapes de : a) hybridation de l'ADN ou l'ARN présent dans ledit échantillon avec au moins une sonde issue de l'une des séquences nucléiques selon la revendication 8 ou 9, b) déduction de la présence de ladite souche dans ledit échantillon par présence d'un signal d'hybridation. 15. Puce à ADN présentant à sa surface au moins une séquence selon la revendication 8. 16. Puce selon la revendication 15, présentant à sa surface au moins une séquence selon la revendication 9, ou une sonde issue d'une séquence selon la revendication 9. 17. Puce selon la revendication 16, présentant à sa surface au moins 2 séquences selon la revendication 9, ou deux sondes issues de deux séquences selon la revendication 9.