Brevet FR2842813A1 — publié le 20040130

Anticorps d'isotypes particuliers anti antigènes d'Excrétion Sécrétion de promastigotes ou d'amastigotes de Leishmania sp utilisés comme marqueurs de la protection, de la résistance et de la guérison des mammifères aux leishmanioses et aux infections à micro-organismes pathogènes intracellulaires, et comme effecteurs d'immunothérapie. La présente invention concerne la détection et l'utilisation d'anticorps d'isotype IgG2 spécifiques d'antigènes d'excrétion sécrétion de Leishmania permettant: - la mise en évidence d'une immunité à médiation cellulaire dépendant de lymphocytes T de type Thl, - le suivi de la réponse immune après vaccination ou traitement, - l'évaluation de l'efficacité d'un traitement chimiothérapeutique et/ou immunothérapeutique, chez les mammifères et en particulier chez l'homme, les canidés, les félidés et les équidés, - l'évaluation d'un état de résistance à la leishmaniose, - l'établissement d'une immunothérapie. La présente invention concerne également: - la mise en évidence d'une réponse humorale spécifique représentée par des IgG d'isotype IgG2 chez le chien et/ou d'autres isotypes chez d'autres mammifères, réponse humorale reliée à une réponse à médiation cellulaire dépendant de lymphocytes T de type Thl, - la détection de ces IgG spécifiques du parasite Leishmania sp en utilisant des antigènes d'Excrétion Secrétion (ES) parfaitement définis et - le rôle neutralisant de ces IgG caractérisé par l'inhibition de la prolifération des formes amastigotes ou promastigotes de Leishmania. Le complexe vaccinal thérapeutique constitué d'ES produits dans un milieu axénique et asérique défini tel que décrit dans la demande de Brevet d'invention française N 01/07606 du 11 Juin 2001 induit une immunostimulation du système lymphocytaire de type Th1 assurant la mise en place d'une immunité protectrice. Cette immunité à médiation cellulaire qui se caractérise par une activation des lymphocytes et des macrophages et par la synthèse de cytokines spécifiques de la voie Thi, est reliée à une immunité humorale caractérisée par la production d'IgG spécifiques neutralisant d'isotypes particuliers. On peut diviser de manière très schématique les réponses immunitaires en deux grandes catégories qualitativement distinctes, les réponses humorales qui mettent en jeu la production d'anticorps par les lymphocytes B, et les réponses cellulaires (réaction d'hypersensibilité retardée, réactions cytotoxiques) pour lesquelles les cellules effectrices sont des lymphocytes T. Il apparaît que dans la majorité des modèles expérimentaux et des situations cliniques étudiées, les cytokines d'origine lymphocytaire sont essentiellement produites par les cellules T auxiliaires CD4+ (ou helper) dont le rôle est de moduler ou de réguler l'immunité humorale et cellulaire et qui reconnaissent l'antigène en association avec les molécules de classe Il du complexe majeur d'histocompatibilité. Un concept majeur a émergé en 1985 lorsque T. Mosmann et R. Coffman ont proposé que les cellules lymphocytaires T CD4+ exprimant des fonctions auxiliaires étaient en fait hétérogènes. Ainsi, grâce à l'étude de clones lymphocytaires T CD4+ de souris, cultivés à long terme, ces auteurs ont décrit l'existence de deux sous-populations majeures que l'on peut distinguer grâce à leur profil de sécrétion de cytokines à savoir les cellules Thi (pour T helper de type 1) et les cellules Th2 (pour T helper de type 2). Prenons comme exemple la leishmaniose, qui est une infection parasitaire endémique voire épidémique de régions tropicales et subtropicales du monde. Les leishmania, protozoaires flagellés de la famille des trypanosomatidae et du genre Leishmania, sont les agents pathogènes responsables de ces maladies. Les nombreuses études portant sur les réponses immunitaires au cours des leishmanioses murines expérimentales ont conduit à la démonstration du rôle prépondérant de l'immunité à médiation cellulaire et de l'existence d'une dualité de la réponse immunologique. Il existe fondamentalement deux types de réponses à l'encontre des leishmanies: l'une qualifiée de " sensibilité ", l'autre de " résistance ". C'est par le biais des lymphokines qu'elles sécrètent que les différentes sous-populations de lymphocytes T (CD4+) limitent ou exacerbent l'infection. Il a ainsi été démontré que la sous-population de lymphocytes T auxiliaires de type Thl (producteur d'interféron gamma et d'interleukine 2) était capable d'éliminer les formes amastigotes intracellulaires par le biais de l'activation des macrophages (Reiner S.L et al., Annu Rev Immunol, 1995, 13, 151-177. Review). Inversement, la sous-population de lymphocytes T auxiliaires de type Th2 (producteur d'interleukine 4) est responsable de l'exacerbation de la maladie. Chez l'homme, certains faits sont de nature comparable. Chez le chien (hôte naturel " réservoir " réceptif au cycle évolutif de L.infantum), la dualité de la réponse immunologique existe vraisemblablement. Seule une étude menée par Pinelli et ai. (Infect. Immun., 62:229, 1994) sur des animaux expérimentalement et naturellement infectés par L.infantum, a permis de montrer que l'asymptomatisme du chien (état clinique fréquemment rencontré) s'accompagnait de l'absence d'une réponse humorale et du développement d'une immunité à médiation cellulaire de type Thi avec une réaction d'hypersensibité de type retardée positive et des taux élevés d'interleukine 2 et de TNF-a circulant dans les liquides biologiques. La polarisation des réponses immunitaires vers un phénotype Thl ou Th2 a été associée à de nombreuses situations pathologiques. Pour les infections à Leishmania, Trypanozoma, Candida et autres organismes intracellulaires comme Mycobacterium et Listeria une réponse Thl corrèle avec la résistance au pathogène. La présente invention consiste notamment à détecter des anticorps dont la production accompagne la polarisation d'une immunité à médiation cellulaire vers une voie de type Thl. Selon les spécialistes comme Pinelli (Pinelli.E et ai. Infect. Immun, 1994, 62:229-235) les chiens leishmaniens correspondant à l'activation du système lymphocytaire de type Th2 présentent une réponse anticorps élevée. Cette production accrue en anticorps correspond à une hyperprotéinémie et induit l'apparition d'immunocomplexes entraînant une atteinte rénale (augmentation de la créatine et de l'urée sanguine). Néanmoins, certains travaux préliminaires chez l'homme (KAWANO. P et aI, Parasite Immunol, 1995, 17, 451-458) et chez le chien (NIETO C.G et ai, Vet Immunol and Immunopathology, 1999, 67, 117-130) annoncent que les isotypes d'lgG seraient des marqueurs de la dichotomie immunitaire Thl/Th2. Plus précisément, un chien atteint de leishmaniose avec des signes cliniques probants présente un taux élevé d'anticorps principalement d'isotype IgG, alors qu'un chien asymptomatique présente des anticorps spécifiques d'isotype IgG2. La spécificité de ces isotypes à un antigène parfaitement déterminé n'a jamais été établie. Les chiens ayant reçu le complexe vaccinal thérapeutique décrit dans la demande de brevet d'invention française N0 01/07606 précitée présentent des taux significatifs d'lgG2 spécifiques des protéines sécrétées, ce qui est conforme à l'expansion préférentielle de lymphocytes T de type Thl. A contrario, les chiens ayant reçu un placebo ne présentent pas d'lgG2 spécifiques. La présente invention a également pour but de démontrer que les IgG2 de chien reliés au système Thl sont spécifiques d'un antigène parfaitement défini: les antigènes d'excrétion secrétion de Leishmania (ES). Ces IgG2 de chien sont plus précisément spécifiques d'une protéine dénommée PSA " Protein Surface Antigen " qui est l'antigène majeur des antigènes ES libérés par les 2 stades parasitaires. La PSA présente un épitope " immunologiquement silencieux " lors d'une infection par des leishmanies chez l'homme ou le chien, cet épitope situé dans la région carboxyterminale conservée est reconnu par les IgG de chien. Cette zone d'antigènes majeurs a été caractérisée par l'élaboration d'anticorps monoclonaux (AMC). Deux banques d'expression d'ADNc des formes promastigotes et des formes amastigotes de Leishmania ont été criblées immunologiquement à l'aide de l'AMC F5 afin d'identifier les immunogènes majeurs des AES. Ceci a permis d'isoler l'ADNc d'un clone donné qui code une protéine excrétée sécrétée de la famille des PSA. Ces protéines PSA présentent des domaines répétés riches en leucine caractéristiques. L'analyse des séquences ADNc révèle une séquence peptidique correspondant exactement à l'extrémité COOH-terminale des PSA isolées (voir figure 1: représentation schématique de l'extrémité COOH terminale des PSA reconnue par l'anticorps monoclonal F5). Au moyen d'une protéine recombinante codant pour la partie carboxyterminale des PSA, il a été démontré que les patients ou les chiens atteints de leishmaniose sont incapables de produire des anticorps contre le ou les épitopes portés par la protéine recombinante (voir figure 2: Analyse de la réponse humorale de patients et de chiens naturellement infectés vis à vis de la proteine recombinante 6(His)-COOH- PSA), alors qu'ils produisent des anticorps contre les antigènes ES natifs, donc contre d'autres épitopes présents sur les PSA natives. Par contre les chiens immunisés avec les AES de promastigotes de Leishmania infantum présentent des anticorps d'isotype IgG2 spécifiques de la partie carboxyterminale (voir figure 3: Analyse de la réponse humorale de chiens immunisés par des AES de promastigotes de Leishmania infantum vis à vis de la protéine recombinante 6(His)-COOH-PSA) La présente invention a également pour but de démontrer qu'après chimiothérapie ou immunothérapie, les IgG2 de chien spécifiques des antigènes ES de Leishmania et notamment de la partie carboxyterminale de la PSA apparaissent avec l'amélioration significative de l'état général de chiens atteints de Leishmaniose. Comme toutes les maladies à transmission vectorielle, les leishmanioses se caractérisent par un cycle évolutif qui est relativement simple puisqu'il se partage entre deux hôtes, mammifères et insectes (phlébotomes) et comprend deux formes principales: - une forme flagellée appelée promastigote, présente dans le tube digestif du vecteur phlébotome o il se multiplie avant d'acquérir sa forme infectante pour l'hôte mammifère, encore appelée métacyclique; - une forme non flagellée appelée amastigote, présente chez l'hôte mammifère dont le chien et l'homme. Un autre but de l'invention est de mettre en évidence que les IgG2 de chien reliés au système Th1 ont une activité neutralisante envers la prolifération des amastigotes et des promastigotes de Leishmania sp. Afin d'étudier la synthèse spécifique d'anticorps IgG2 chez le chien, 2 types d'expériences sont effectués après immunisation par le complexe vaccinal thérapeutique constitué d'ES: 1. Rôle de l'effet " in vitro " d'immunsérum de chiens sur les cinétiques de multiplication des différents stades du parasite Leishmania infantum. 2. Dosage des IgG2 spécifiques anti antigènes d'excrétion sécrétion de Leishmania. Pour nos expériences, nous avons utilisé le complexe vaccinal composé d'antigènes d'excrétion sécrétion de promastigotes démontré dans la demande de brevet française N0 01/07606 susmentionnée. Les chiens sont immunisés selon le schéma suivant: 4 semaines 4 semaines lèri injection 2nde injection > prélèvement sanguin pour étude des sous cutanée sous cutanée immunsérums et des anticorps. Un autre type d'expérience est effectué: dosage des IgG2 spécifiques anti antigènes ES de Leishmania chez des chiens leishmaniens traités par chimiothérapie. Pour cette expérience, nous avons utilisé, comme antigène, la protéine recombinante codant pour la partie carboxyterminale des PSA. Les méthodes utilisées sont les suivantes: a. Matériel parasitaire: La culture de promastigotes de Ieishmania infantum MON.1 est récoltée en phase stationnaire de croissance. Les parasites sont lavés 3 fois dans 15 ml de PBS stérile (centrifugation à 40C à 5000 tours pendant 10 min) puis repris dans 1 ml de PBS. La différenciation promastigote/amastigote et donc la multiplication des amastigotes nécessitent 0,5.106 parasites par mi de milieux de culture MAA20 pH ,8 en boîte de culture incubée à 370C et sous 5% de C02 (conditions représentatives de l'environnement phagolysosomial); la prolifération des promastigotes nécessite 106 parasites par ml de milieux de culture RPMI 20% pH 7,2 en boîte de culture incubée à 250C (conditions représentatives du phlébotome). Un test de viabilité au bleu Trypan D à 0,4% en PBS ainsi qu'un comptage en cellule de Thomas doit être fait afin de resuspendre les parasites en PBS stérile tels qu'ils soient à 10r/m1. b. Préparation des sérums: Un aliquot de chaque sérum est décomplémenté par passage au bain-marie pendant 45 min à 560C puis centrifugé 12 min à 12000 tours pour éviter les agglutinines. Dans un premier temps, le taux sérique en anticorps n'étant pas connu, une gamme de dilution aléatoire est réalisée. Pour 106 parasites, il faut mettre en contact 20p1l de sérum: * 1er essai sérum pur: 5.106 parasites (répartis en RPMI et MAA) soit (5.106 X 20)/106 = 100 pl de sérum pur. ò 2è2e essai dilution au 2 50 pl de sérum pur + 50 pI de Tampon PBS stérile. * 3ème essai dilution au %: 25 pli de sérum pur + 75 pl de PBS stérile. * 4ème essai dilution au 1/8: 12,5 pl de sérum pur + 87,5 pi de PBS stérile c. Contact Promastigotes -Anticorps: Les contacts sont réalisés dans des tubes à eppendorff de 1,5 ml o 5.106 parasites sont traités par 100 pl de sérum pendant 30 min sur la glace (temps minimum nécessaire à un promastigote pour infecter un macrophage). L'excès d'anticorps est ensuite lavé deux fois par 1 ml de PBS et par une centrifugation à 5000 tours de 10 min et cela à 2 reprises. d. Analyses: Un aliquot de 10li de chaque essai est alors pris juste après contact pour réaliser un test de viabilité au bleu Trypan et une numération en cellule de Thomas, l'excédent servant à la mise en culture à partir de laquelle un comptage est réalisé quotidiennement. * Prolifération des promastigotes (milieu RPMI 20%) Un comptage en cellule de Thomas à partir de chaque essai est réalisé quotidiennement pour suivre la cinétique de multiplication. A partir d'un aliquot de chaque essai de culture, un frottis parasitaire fixé au méthanol puis coloré au May-Grunvald-Giemsa est réalisé quotidiennement o le pourcentage de forme promastigotes, sphéromastigotes et amastigotes est déterminé par le comptage de 100 parasites. * Prolifération des amastigotes (milieu MAA 20) A partir d'un second aliquot de chaque essai de culture, une numération en cellule de Thomas est effectuée afin de suivre la cinétique de multiplication. Les calculs d'inhibition de croissance sont réalisés sur le modèle suivant: Le nombre de parasites traités avec le sérum sain (= Ns) -> 100% de croissance Le nombre de parasites traités avec le sérum immunisé (=Ni) -* x% de croissance % inhibition = 100 - (Ni x 100)/Ns e. Etudes des anticorps: Les anticorps totaux IgG des chiens antiLeishmania sont détectés par immunofluorescence classique utilisant des lames coatées par des promastigotes (méthode de référence sérologique pour la leishmaniose canine). La détection des IgG2 spécifiques des ESP s'effectue par ELISA selon la technique de microtitration de Kweider et ai (J.immunol, 1987, 138:299) en utilisant les ESP comme antigènes et un conjugué anti IgG2. f. Analyses effectuées: Une étude complète d'inhibition de la prolifération des amastigotes et des promastigotes est effectuée sur 2 chiens: Chienne MINON: Braque de Weymar femelle de 4 ans, vaccinée avec ESP Chienne MUMA: Epagneul Breton, femelle de 7 ans, contrôle placebo Un test de viabilité des promastigotes est effectué sur 6 autres chiens en étude expérimentale et 4 chiens en étude terrain (essai du complexe vaccinal ES en zone endémique) comparativement à 2 chiens témoins. q. Etude des anticorps chez des chiens leishmaniens traités par chimiothérapie: Pour la 3ème expérience, des sérums de 5 chiens atteints de leishmaniose viscérale et traités par du glucantime pendant 1 à 2 mois, provenant du Dr B ont été analysés. Les anticorps totaux IgG des chiens anti Leishmania sont détectés par immunofluorescence et la détection des anticorps IgG2 spécifiques des ESP s'effectue par ELISA comme précédemment décrit (cf: e: étude des anticorps) mais en utilisant comme antigène la protéine recombinante codant pour la partie carboxyterminale des PSA. RESULTATS: 1. Etude surla prolifération des promastigotes de L.infantum: * L'étude suivante est réalisée sur des parasites mis en contact avec un sérum de chien sain ou immunisé 4 fois avec des produits d'excrétion-sécrétion de promastigotes (ESP) et avant challenge. : 10 Déterminée par un test au bleu Trypan , la viabilité des promastigotes était de 100% avant contact avec le sérum. Après 30 min de contact, la viabilité avec le sérum sain était toujours de 100% à toutes les dilutions alors qu'avec le sérum immunisé aux ESP elle n'était plus que de 50% avec le sérum pur, 73% avec le sérum dilué au Y2, 92% et 94% avec respectivement le sérum dilué au 1/4 et 1/8 (voir figure 4: Cinétiques de prolifération des promastigotes après 30 minutes de contact avec différentes dilutions de sérums (Pur (A); /2 (B) % (C); 1/8 (D)) de chien sain (S) Muma et immunisé avec des ESP (1) Minon). Le tableau ci-après décrit l'évolution du pourcentage d'inhibition de la croissance des promastigotes après contact de 30 minutes avec sérum de chien immunisé (ESP) par rapport au sérum de chien sain. Pourcentage 1jour 2eme jour 3eme jour 4eme jour Moyenne d'inhibition I pur/ S pur 93% 92% 98% 73% 89% %/2 S 2 94% 94% 84% 90% 90% | 1/4 / S 79% 60% 45% 0% 46% 11/81S 1/8 ND 81% 90% 81% 84% Interprétation: L'inhibition de la croissance avec le sérum anti-ESP (chien MINON) par rapport au sérum sain approche les 90% quelle que soit la dose (mise à part pour la dilution au Y4, erreurs de manipulations ?). Il apparaît que la valeur seuil d'activité de ce sérum n'est pas atteint avec cette gamme de dilutions, du moins l'effet cytotoxique est puissant et la croissance des promastigotes est fortement ralentie à toutes les dilutions de sérums. 2. Etude surla prolifération des amastigotes de L.infantum * L'étude suivante est réalisée sur les cultures en MAA.20 pour différenciation en amastigotes, de promastigotes traités avec un sérum d'avant challenge de chien sain ou immunisé 4 fois avec des ESP (voir figure 5: Cinétiques de prolifération des amastigotes après 30 minutes de contact avec différentes dilutions de sérums (Pur (A); 1/2 (B) /4 (C); 1/8 (D)) de chien sain (S) Muma et de chien immunisé avec des ESP (1) Minon). Le tableau ci-après indique les pourcentages d'inhibition de la multiplication des amastigotes après 30 minutes de contact avec sérum de chien immunisé (ESP) par rapport au sérum de chien sain: % inhibition 1e jour 2eme jour 3ème jour Moyenne Ip/Sp 66% 68% 61% 65% 1 Y /2S Y/2 47% 60% 42% 51% | 14 / S 1/4 24% 47% 47% 39% I 1/8/S1/8 15% 18% 24% 19% Interprétations: Une inhibition de la croissance est constatée sur la cinétique de croissance des amastigotes lorsque avant différenciation les promastigotes ont été mis en contact avec un sérum anti-ESP. La croissance des amastigotes se trouve alors ralentie et cela de façon proportionnelle à la concentration de sérum. Plus le sérum du chien immunisé aux ESP est concentré, plus la multiplication des amastigotes se trouve inhibée. Il y a donc un effet de dose dépendance. 3. Résultats obtenus sur d'autres chiens: La moyenne de viabilité des promastigotes après contact avec du sérum de chien immunisé par le complexe vaccinal ESP est de 16,8% (5 chiens vaccinés) et de 72,9% (5 chiens plabebo) pour du sérum de chiens non immunisés. Aussi, des anticorps de chien immunisé non reliés au complément sont cytotoxiques pour les promastigotes. Le tableau ci-après indique les pourcentages de viabilité des promastigotes après contact, avec des sérums de chiens immunisés et non immunisés avec les ESP. Chiens Tl* T2* Etudes expérimentales analysés (Control) (Controi) E O G K 7 16 Placebo Placebo Vaccin Vaccin Vaccin Placebo Pourcentage 100% 100% 85.70/c 61.9% 22.4% 100.1 12.8% 76.2% de viabilité Chiens T1* T2* Etudes sur le terrain analysés (Control (Control) HC 046 HC 051 LB 120 RR 019 Placebo Vaccin Placebo Vaccin Pourcentage 100% 100% 66.7% 15.7% 73.8% 22.9% de viabilité * Chiens Tl et T2: chiens sains non immunisés et n'ayant pas reçu de placebo. 4. Corrélation entre les anticorps de chien et l'effet des sérums sur la viabilité des promastigotes Selon le tableau ci-dessous (Corrélation IgG2 anti ESP/inhibition prolifération des promastigotes), la baisse du pourcentage de viabilité des promastigotes correspond à la présence d'lgG2 spécifiques du complexe vaccinal ESP. Chiens MINOI MUMA E O G K 7 16 IgG totales Par IF* IgG2 spécifiques de ESP** par 0.391 0.108 0.065 0.104 0.299 0.299 0.310 0.056 ELISA Pourcentag 50% 100% 85.7% 61.9% 22.4% 10.1% 12.8% 76.2% de viabilité Chiens HC 046 HC 051 LB 120 RR 019 IgG totales par IF* IgG2 spécifiques de ESP** 0.054 0.321 0.065 0.386 par ELISA Pourcentage de 66.7% 15.7% 73.8% 22.9% viabilité * IF: Immunofluorescence: négative: taux début du traitement pour 4 chiens. Le cinquième est décédé 2 mois après le traitement, il présentait une augmentation en IgG totales (1/200 au 1/800) et était négatif en IgG2 dirigés contre la partie carboxyterminale des PSA. Par contre, les 4 autres chiens guérissent et présentent des lgG2 contre la partie carboxyterminale des PSA. Il apparaît donc que la capacité à produire des anticorps IgG2 contre cet épitope spécifique des PSA accompagne l'évolution vers la guérison des chiens. Ce sont donc bien les IgG2 qui sont responsables de la lyse des amastigotes et promastigotes de Leishmania sp in vitro et de la neutralisation de leur prolifération. L'analyse de sérums de 3 chiens leishmanien traités par le complexe vaccinal ESP donne exactement le même type de résultat, c'est à dire une apparition d'lgG2 spécifiques (de la partie carboxyterminale des PSA des ESP) corrélant avec une activité du sérum neutralisant la prolifération des promastigotes de Leîshmania infantum " in vitro " et une immunité à médiation cellulaire de type Thl. Ces IgG2, chez le chien, ou autres isotypes particuliers chez les autres mammifères reliés à une immunité cellulaire de type Thl, sont détectables par diverses méthodes in vitro, par exemple: ELISA, DOT BLOT, WESTERN BLOT, IMMUNOCHROMATOGRAPHIE, IMMUNO NEPHELOMETRIE, RIA, IMMUNO PRECIPITATION, ELECTRO SYNERESE et tout autre méthode in vitro faisant intervenir un système de conjugué ou autres systèmes de visualisation de la réaction Ag-Ac. Ainsi, les immunoglobulines selon l'invention peuvent être utilisées pour un produit de diagnostic permettant de détecter un ou des épitopes portés par les extrémités NH2 et COOH terminales de la Protein Surface Antigen excrétée sécrétée par Leishmania sp. Il peut par exemple être utilisé un système ELISA sur support plastic et un système WESTERN BLOT sur membranes de nitrocellulose ou autres polymères faisant intervenir un conjugué enzymatique. Des supports de latex peuvent également être utilisés. Des radio-isotopes, des molécules fluorescentes, des molécules luminescentes ou des particules de couleur peuvent être couplés à ces divers antigènes pour être utilisés comme conjugués. Des collodes métalliques peuvent également être utilisés. Par ailleurs, les antigènes d'excrétion sécrétion d'amastigotes ou de promastigotes de Leishmania sp et plus particulièrement la partie carboxyterminale de la Protein Surface Antigen sous forme purifiée ou protéine recombinante sont couplés à des grosses molécules de biotine, avidine, streptavidine ou tout autre protéine pour les rendre plus accessibles. Ainsi, les anticorps d'isotype IgG2 selon l'invention peuvent être utilisés chez les mammifères comme marqueurs d'un état immunitaire de type à médiation cellulaire dépendante de lymphocytes T et préférentiellement de lymphocytes T de type Th1, comme marqueurs de la résistance à la leishmaniose et aux infections à micro-organismes pathogènes intracellulaires chez les mammifères, comme marqueurs de la vaccination immunoprophylactique et immunothérapeutique pour les infections à micro-organismes pathogènes intracellulaires, et comme effecteurs d'immunothérapie pour les leishmanioses et les infections à micro-organismes pathogènes intracellulaires. REVENDICATIONS 1. Immunoglobulines caractérisées en ce qu'elles sont des immunoglobulines d'isotypes IgG particuliers spécifiques des antigènes d'excrétion sécrétion de promastigotes ou d'amastigotes de Leishmania sp 2. Immunoglobulines selon la revendication 1 caractérisées en ce qu'elles sont spécifiques de la Protein Surface Antigen des antigènes d'excrétion sécrétion des promastigotes ou des amastigotes de Leishmania sp. 3. Immunoglobulines selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisées en ce qu'elles sont spécifiques de la partie carboxyterminale de la Protein Surface Antigen des antigènes d'excrétion sécrétion des promastigotes ou des amastigotes de Leishmania sp. 4. Immunoglobulines selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisées en ce qu'elles sont d'isotypes IgG2 chez le chien et d'isotypes particuliers chez les autres mammifères, isotypes reliés à une immunité à médiation cellulaire dépendante des lymphocytes T de type Thl. 5. Immunoglobulines selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce qu'elles lysent les amastigotes et promastigotes de Leishmania sp in vitro et neutralisent leur prolifération. 6. Utilisation des immunoglobulines selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 comme marqueur d'une immunité à médiation cellulaire permettant notamment la mise en évidence d'une immunité à médiation cellulaire dépendante de lymphocytes T et préférentiellement de lymphocytes T de type Thl chez les mammifères. 7. Utilisation des immunoglobulines selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 comme marqueurs de la résistance à la leishmaniose et aux infections à micro-organismes pathogènes intracellulaires chez les mammifères. 8. Utilisation des immunoglobulines selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 comme marqueurs de la vaccination immunoprophylactique et immunothérapeutique chez les mammifères pour les leishmanioses et les infections à micro-organismes pathogènes intracellulaires 9. Immunoglobulines selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 comme effecteurs d'immunothérapie dans le cadre des leishmanioses et des infections à micro-organismes pathogènes intracellulaires chez les mammifères. 10. Utilisation des immunoglobulines selon les revendications 1 à 5 pour un produit de diagnostic in vitro détectant un ou des épitopes portés par les extrémités NH2 et COOH terminales de la Protein Surface Antigen excrétée sécrétée par Leishmania sp.