Brevet FR2840220A1 — publié le 20031205

Méthode de traitement prophylactique de la malaria, ou procédé de préparation d'un médicament destiné au traitement prophylactique de la malaria. La présente invention concerne une nouvelle méthode de traitement prophylactique de la malaria, ou un procédé de préparation d'un médicament destiné au traitement prophylactique de la malaria, ainsi qu'une méthode d'identification de molécules susceptibles d'être employées pour la préparation d'un tel médicament. La malaria, appelée encore paludisme, est la plus importante des parasitoses humaines, sévissant à l'état endémique dans plus de 100 pays. Le paludisme, avec 300 à 500 millions de cas et plus de 1 million de morts par an dans le monde (OMS 1997), reste l'une des maladies les plus préoccupantes par sa fréquence, sa recrudescence et sa létalité. Plus de 90 % des cas surviennent en Afrique subsaharienne et la mortalité concerne essentiellement les enfants de moins de 5 ans. Le paludisme est dû à l'infection par un protozoaire du genre Plasmodium (Phylum Apicomplexa). Quatre espèces sont pathogènes chez l'homme : P. falciparum, responsable de la majorité des cas et de la gravité du paludisme, P. vivax, P. ovale et P. malariae. Le cycle du parasite se déroule successivement chez l'hôte définitif, un moustique femelle du genre Anopheles, et chez un hôte intermédiaire vertébré (en l'occurrence l'homme). Il comporte trois phases successives de multiplication : une phase de sporogonie (multiplication sexuée) chez le moustique, une phase de schizogonie (multiplication asexuée) intra-hépatocytaire et une phase de schizogonie intra-érythrocytaire chez l'hôte vertébré. La phase hépatique est asymptomatique chez l'homme, et dure de 7 à 15 jours dans le cas de P. falciparum. Les signes cliniques, parfois graves, surviennent lors de la phase érythrocytaire. Trois approches sont couramment développées dans le cadre de la mise au point d'un vaccin anti-palustre (Miller & Hoffman Nat Med 1998). Une première approche consiste à cibler la phase pré-érythrocytaire, pour prévenir à la fois la maladie, par interruption du cycle parasitaire au niveau du foie, et la transmission au moustique, qui se fait lors de la phase érythrocytaire. Ce type de vaccin est destiné à induire soit des réponses anticorps dirigées contre des protéines de surface des sporozoïtes, pour inhiber leur pénétration dans les hépatocytes, soit des réponses cellulaires T dirigées contre les hépatocytes infectés exprimant à leur surface des peptides d'origine plasmodiale au sein de molécules du CMH. Une deuxième approche consiste à limiter la multiplication des stades érythrocytaires du parasite, pour diminuer la morbidité et la mortalité associées à l'infection par Plasmodium. Ce type d'approche vise à empêcher l'infection des globules rouges par les mérozoïtes en induisant des réponses anticorps neutralisantes dirigées contre des protéines de surface des mérozoïtes. Enfin, une troisième approche consiste à bloquer la transmission au moustique en induisant chez les personnes vaccinées des réponses anticorps dirigées contre des protéines essentielles aux premiers stades du développement parasitaire chez le moustique. Ces anticorps sont transmis au moustique en même temps que les gamétocytes, à l'occasion d'un repas sanguin. Ce type d'approche ne vise pas à protéger le sujet vacciné mais à empêcher l'infection de l'entourage. Ces trois types d'approche sont également combinés au sein de stratégies vaccinales dirigées contre plusieurs stades du développement parasitaire, selon l'idée que seul un vaccin multivalent multi-stades pourra être efficace contre un parasite aussi complexe que Plasmodium (Hoffinan et al Nat Med 1998). Le développement de médicaments ou de vaccins actifs sur la phase pré- érythrocytaire présente un intérêt majeur pour la prophylaxie du paludisme à la fois chez les sujets à risque en zone d'endémie (enfants et femmes enceintes) et chez les voyageurs se rendant en zone d'endémie (plus de 20 millions par an en Europe) Actuellement, les mécanismes moléculaires de pénétration des sporozoïtes dans les hépatocytes restent mal connus. Deux protéines de surface du sporozoïte, la circumsporozoite protein (CSP) et la thrombospondin-related adhesive protein (TRAP), ont été impliquées dans le ciblage des sporozoïtes au niveau du foie, essentiellement via l'interaction avec les heparan-sulfate proteoglycans présents à la surface des hépatocytes (Cerami et al. Cell 1992 ; Frevert et al. J ExP. Med. 1993 ; Robson et al. EMBO J. 1995). Les sporozoïtes peuvent pénétrer dans les hépatocytes selon deux mécanismes distincts (Mota et al Science 2001) : soit par effraction de la membrane plasmique des hépatocytes, qui aboutit à la présence de sporozoïtes cytoplasmiques qui peuvent migrer à travers plusieurs cellules, soit par intemalisation au sein d'une vacuole parasitophore. Seuls les sporozoïtes intemalisés au sein d'une vacuole parasitophore se différencient en schizontes hépatiques et mérozoïtes. Il a été maintenant constaté que la molécule CD81 est nécessaire à l'intemalisation des sporozoïtes de Plasmodium au sein d'une vacuole parasitophore nécessaire à la schizogonie. En l'absence de CD81, quelques sporozoïtes de Plasmodium parviennent à pénétrer dans les hépatocytes au sein d'une vacuole, mais cette vacuole, n'est pas fonctionnelle et les sporozoïtes internalisés sont rapidement éliminés, avant d'avoir pu se différencier en schizontes matures (mérozoïtes). La présente invention concerne donc une méthode de traitement prophylactique de l'homme contre une infection par un parasite du genre Plasmodium, ladite méthode consistant à inhiber la pénétration par formation d'une vacuole parasitophore fonctionnelle des sporozoïtes dans les cellules hépatiques, formation nécessaire à la schizogonie et au cycle infectieux de Plasmodium. Par vacuole fonctionnelle, on entend selon la présente invention une vacuole dont la formation va permettre la différentiation des sporozoïtes en mérozoïtes, par opposition aux vacuoles non fonctionnelles décrites précédemment dans lesquelles les sporozoïtes internalisés sont rapidement éliminés avant d'avoir pu se différencier. La vacuole fonctionnelle est celle qui permet le développement de la maladie à son stade hépatique. La capacité de pénétration des sporozoïtes par formation d'une vacuole parasitophore fonctionnelle peut être observée in vitro selon la méthode décrite dans les exemples ci-après. La présente invention concerne également l'utilisation d'un inhibiteur de pénétration par formation d'une vacuole parasitophore fonctionnelle des sporozoïtes dans les cellules hépatiques, pour la prophylaxie d'une infection par un parasite du genre Plasmodium chez l'homme. De manière avantageuse, la pénétration par formation de la vacuole parasitophore fonctionnelle est inhibée par inhibition de l'interaction des molécules CD81 des hépatocytes avec un ligand associé à Plasmodium. La présente invention concerne donc également une méthode d'inhibition de la pénétration des sporozoïtes des parasites du genre Plasmodium dans les cellules hépatiques humaines par formation d'une vacuole parasitophore fonctionnelle, par inhibition de l'interaction des molécules CD81 des hépatocytes avec un ligand associé à Plasmodium. Cette méthode peut être mise en #uvre in vivo, ex vivo ou in vitro selon les procédures appropriées bien connues de l'homme du métier. Le parasite du genre Plasmodium est choisi parmi P. vivax, P. malariae, P. ovale et P. falciparum, préférentiellement P. falciparum. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, l'inhibition de la pénétration par formation de la vacuole fonctionnelle est obtenue au moyen d'un inhibiteur de l'interaction des molécules CD81 des hépatocytes avec un ligand associé à Plasmodium. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'inhibition de la pénétration par formation de la vacuole fonctionnelle est obtenue au moyen d'un agent inducteur, induisant la formation d'un inhibiteur de l'interaction des molécules CD81 des hépatocytes avec un ligand associé à Plasmodium par l'organisme auquel il est administré. L'agent inducteur est en particulier un antigène qui provoque une réponse immunitaire dans l'organisme auquel il est administré, qui se traduit par la formation de l'inhibiteur de l'interaction CD81/ligand. Par inhibiteur de l'interaction des molécules CD81 des hépatocytes avec un ligand associé à Plasmodium, on entend tout agent permettant le blocage de l'interaction nécessaire à la formation de la vacuole parasitophore, entre les molécules CD81 des hépatocytes avec un ligand associé à Plasmodium, tant au niveau de la molécule CD81, qu'au niveau de Plasmodium ou au niveau de l'interaction de Plasmodium avec les cellules hépatiques. Il s'agira par exemple d'un inhibiteur agissant au niveau des molécules CD81, en bloquant leur aptitude à interagir avec le ligand associé à Plasmodium, en particulier d'un anticorps anti-CD81, comme par exemple les anticorps anti-CD81 humains 1D6 (Levy & al., Annu Rev Immunol, 1998), Z81 (Azorsa & al., J Immunol Methods, 1999) ou M38 (Fukudome & al., J Virol, 1992), de préférence 1D6. Il s'agira aussi d'un inhibiteur agissant au niveau d'un ligand associé à Plasmodium nécessaire à la formation de la vacuole parasitophore, en bloquant leur aptitude à interagir avec la molécule CD81, comme par exemple un anticorps de ce ligand associé à Plasmodium. Par ligand associé à Plasmodium, on entend selon l'invention tout ligand de la molécule CD81 des cellules hépatiques humaines dont l'interaction avec ladite molécule conduit à la formation de la vacuole parasitophore fonctionnelle nécessaire au développement de l'infection. Le ligand peut être produit par Plasmodium et interagir de manière directe ou indirecte avec la molécule CD81.. Le ou les ligands associés à Plasmodium interagissant avec le CD81 pour la formation de la vacuole parasitophore sont identifiés selon les méthodes usuelles connues de l'homme du métier, et notamment les méthodes identifiées dans les exemples ci-après. Par anticorps, on entend selon l'invention des anticorps polyclonaux ou des anticorps monoclonaux. De manière générale, les anticorps anti-CD81 humains,comme les anticorps des ligands/antigènes associés à Plasmodium sont préparés selon les méthodes usuelles connues de l'homme du métier. Pour la mise en #uvre de la méthode de traitement prophylactique selon l'invention, l'inhibiteur ou l'agent inducteur sont avantageusement administrés sous une forme pharmaceutique appropriée. Toutes les formes pharmaceutiques peuvent être employées dans la méthode selon l'invention, qu'elles soient destinées à une administration orale, par injection, topique ou encore percutanée. De préférence, la forme pharmaceutique sera appropriée pour une administration orale ou par injection, en particulier par injection sous-cutanée ou intramusculaire. De telles préparations pharmaceutiques, leurs constituants et leur mode de préparation sont bien connues de l'homme du métier, notamment décrites dans Gilman & al. (Goodman and Gilman's : The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th ed., 1990, Pergamon Press ; Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA), Avis & al (Pharmaceutical Dosage Forms : Parenteral Médications, 1993, Dekker, New York) ou Lieberman & al. (Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, 1990, Dekker, New York). Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, la forme pharmaceutique appropriée est une préparation vaccinale dont l'administration thérapeutique et/ou prophylactique va induire la formation d'un inhibiteur de l'interaction des molécules CD81 des hépatocytes avec le (s) asocié (s) àPlasmodium par l'organisme auquel il est administré. De telles préparations vaccinales, leurs constituants et leur mode de préparation sont bien connues de l'homme du métier, notamment décrites dans Vaccines (3eme Ed., 1999, Stanley A. Plotkin and Walter A. Orenstein eds, Philadelphia : B. Saunders Company). Selon un premier mode particulier de réalisation de l'invention, la préparation vaccinale comprend un peptide naturel ou synthétique susceptible d'induire la formation de l'inhibiteur, et une forme pharmaceutique appropriée pour son administration. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la préparation vaccinale comprend un vecteur permettant l'expression d'un polypeptide antigène induisant dans l'organisme auquel il est administré, la formation d'un inhibiteur de l'interaction des molécules CD81 des hépatocytes avec le ligand associé à Plasmodium par l'organisme auquel il est administré. De tels vecteurs, notamment constitués par des virus recombinants, des plasmides ou des vecteurs bactériens, leurs constituants, comme leurs modes de préparation et d'administration sont bien connus de l'homme du métier, notamment décrits par Bonaldo & al. (J Mol Biol 2002 Jan 25 ;315(4):873-885), & Torres (Viral Immunol 2001 ;14(4):339-48), Bramson & Wan (Expert Opin Biol Ther 2002 Jan;2(l):75-85), S. Schlesinger (Expert Opin Biol Ther 2001 Mar;l(2):177-91), Polo & al. (Dev Biol (Basel) 2000;104:181-5), C. Locht (Pharm. Sci. Technol. Today. 2000 Apr;3(4):121-128.), ou également décrits notamment dans les demandes de brevet EP 162 752, EP 913 157 et les références citées dans ces documents. Il est entendu également qu'au regard de la capacité d'évolution des agents pathogènes en réponse à la pression des agents prophylactiques, l'identification des ligands associés à Plasmodium et plus particulier à P. falciparum, interagissant avec la molécule CD-81 pour permettre la formation de la vacuole parasitophore est également un objet de la présente invention. La présente invention concerne donc également un procédé d'identification des ligands de Plasmodium interagissant de manière directe ou indirecte avec la molécule CD-81 des cellules hépatiques de mammifères, en particulier l'homme, pour permettre la pénétration des sporozoïtes par formation de la vacuole parasitophore nécessaire au cycle infectieux de Plasmodium, par des méthodes usuelles comme le Far western blot (Guichet et al. Nature 1997; Identification of Protein Interactions by Far Western Analysis. In Current Protocols in Molecular Biology, chap. 20. 6, M. Ausubel et al., Eds., Wiley, New York, 2002), le co-immunoiprécipitation (Detection of ProteinProtein Interactions by Coprecipitation, in Current Protocols in Molecular Biology, 20. 5, M. Ausubel et al., Eds., Wiley, New York, 2000) ou Purification sur colonne (GST-pulldown assay) (Affinity Purification of Proteins Binding to GST Fusion Proteins, in Current Protocols in Molecular Biology, 20. 2, M. Ausubel et al., Eds., Wiley, New York, 2000) et analyse en spectrométrie de masse ou encore le criblage d'une banque d'expression (Phage-Based Expression Cloning to Identify Interacting Proteins, in Current Protocols in Molecular Biology, 20. 3, M. Ausubel et al., Eds., Wiley, New York, 2000). Les ligands identifiés par la méthode selon l'invention sont ensuite employés dans la méthode de traitement thérapeutique et/ou prophylactique telle que définie précédemment. Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention ci-dessus, sans toutefois chercher à en restreindre la portée. Les techniques de laboratoire employées dans les exemples ci-après sont les techniques usuelles employées dans les laboratoires en matière de biologie, biochimie ou de génie génétique, décrites notamment dans les ouvrages de référence suivants : - Current Protocols in Molecular Bioloy Volumes 1 et 2, Ausubel F. M. et al, publiés par Greene Publishing Associates et Witcy -Interscience (1989, 2000) - Molecular cloning T. Maniatis, E. F. Fritsch. J. Sambrook, 1982. 1. Analyses in vivo chez la souris Des souris sauvages et des souris déficientes en CD81 (Maecker et al. J Exp Med 1997) ont été inoculées par voie intraveineuse par des sporozoïtes de Plasmodium yoelii, souche 265BY (4000 sporozoïtes par souris). Huit souris sauvages sur 9, et 6 souris cd9 ko sur 6 ont développé une parasitémie (frottis sanguins positifs), témoignant d'un développement hépatique complet du parasite. Par contre, aucune souris cd81 ko sur 6 n'a développé de parasitémie. Après injection intrapéritonéale de globules rouges parasités, 2 souris cd81 ko sur 2 ont développé une parasitémie patente (frottis sanguins positifs). Ces résultats démontrent un blocage au niveau pré-érythrocytaire, et non érythrocytaire, du développement de P. yoelii chez les souris déficientes en CD81. 2. Analyses in vitro chez la souris a. souris déficientes en CD81 Des cultures primaires d'hépatocytes de souris normales et déficientes en CD81 (Maecker et al. J Exp Med 1997) ont été inoculées par des sporozoïtes de Plasmodium yoelii (Mazier et al. C R Séances Acad Sci. 1982). Après 48h de culture, les schizontes hépatiques ont été révélés par immunomarquage à l'aide d'un sérum polyclonal provenant de souris immunisées par le peptide 172 de l'HSP-70 (Heat Shock Protein 70) (Motard et al. Int Immunol. 1995). Ce sérum polyclonal reconnaît l'HSP70 de P. yoelii et de P. falciparum. Les anticorps anti-HSP70 ont été révélés par un anticorps anti-Ig de souris couplé à la fluorescéine (Goat Anti-Mouse FITC conjugate, Sigma ref F2653) dilué au 1/500. Alors que des schizontes sont systématiquement observés dans les hépatocytes normaux, aucun n'a été détecté dans les hépatocytes de souris déficientes en CD81. b. effets des anticorps anti-CD81 Des cultures primaires d'hépatocytes de souris sauvages ont été inoculées par des sporozoïtes de P. yoelii en présence d'anticorps dirigés contre la molécule CD81 murine. Trois anticorps monoclonaux ont été testés : Eatl et Eat2 (Maecker et al. Hybridoma 2000), 2F7 (Boismenu et al. Science 1996). Utilisés à la concentration de 10 g/ml, ces anticorps ont entraîné une diminution du nombre de schizontes de 60% pour Eatl, de 80 à 95% pour Eat2, et aucune inhibition avec 2F7. Aucune inhibition n'a été obtenue lorsque Eat2 a été ajouté après la pénétration des sporozoïtes (3 heures postinoculation). c. analyse de la pénétration des sporozoïtes de P. yoelii dans les hépatocytes normaux ou déficients en CD81 Les sporozoïtes pénétrent initialement les hépatocytes par effraction membranaire et migrent à travers plusieurs cellules avant d'infecter un hépatocyte au sein d'une vacuole parasitophore (Mota et al. Science 2001). La capacité des sporozoïtes à migrer à travers les hépatocytes en l'absence de CD81 a été analysée à l'aide d'un test au dextran fluorescent (wound-repair assay, Mota et al. Science 2001). Des cultures primaires d'hépatocytes de souris normales et de souris déficientes en CD81 ont été inoculées par des sporozoïtes de P. yoelii en présence de dextran fluorescent à la concentration de 1 mg/ml (tetramethyl-rhodamine dextran, 10000 MW, anionic, lysine fixable, Molecular Probes ref D1868). Le nombre de cellules dextran-positives était identique dans les hépatocytes normaux et les hépatocytes déficients en CD81, 1 heure post-inoculation. CD81 n'est donc pas nécessaire à la migration des sporozoïtes à travers les cellules. L'internalisation des sporozoïtes au sein d'une vacuole parasitophore a été analysée par marquage des sporozoïtes intracellulaires à l'aide d'un anticorps monoclonal dirigé contre la circumsporozoite protein (CSP) de P. yoelii (NYS1, Charoenvit et al. Infect Immun 1987), utilisé à la concentration de lOug/ml et révélé par un anticorps anti-Ig de souris couplé à la fluorescéine (Goat Anti-Mouse FITC conjugate, Sigma ref F2653) dilué au 1/500. La diffusion de la CSP au sein de la vacuole permet la visualisation de cette dernière autour du sporozoïte (Hollingdale et al. Am J Trop Med Hyg 1983, Pradel et al. Hepatology 2001). Dans les hépatocytes normaux, le nombre de sporozoïtes internalisés dans une vacuole atteint son maximum entre 2 et 3 heures post-inoculation. Vingt quatre heures après inoculation, tous ces sporozoïtes se sont transformés en schizontes hépatiques. Au contraire, dans les hépatocytes déficients en CD81, le nombre de sporozoïtes intemalisés dans une vacuole est extrêmement réduit (environ 10% de la normale) et ces parasites disparaissent rapidement des cultures, aucun parasite ne persistant 24 heures post-inoculation, probablement en raison d'anomalies de la vacuole parasitophore. L'effet des anticorps anti-CD81 sur l'intemalisation des sporozoïtes de P. yoelii au sein d'une vacuole a été analysé par marquage anti-CSP comme ci-dessus. L'anticorps Eat2 à la concentration de lOug/ml a entraîné une diminution de 50% du nombre de sporozoïtes intemalisés 2 heures post-inoculation, pour une diminution de 80% du nombre de schizontes à 48h. La différence observée résulte probablement de l'intemalisation de sporozoïtes dans une vacuole anormale, entraînant l'élimination de ces parasites entre 2 et 48h post-inoculation. 3. Analyses in vitro chez l'homme : effets des anticorps anti-CD81 Des cultures primaires d'hépatocytes humains ont été inoculées par des sporozoïtes de P.falciparum (souche NF54) (Mazier et al. Science 1985) en présence d'anticorps dirigés contre la molécule CD81 humaine. Cinq anticorps monoclonaux ont été utilisés : 1D6 (Levy et al. Annu Rev Immunol 1998), 5A6 (Oren et al. Mol Cell Biol 1990), Z81 (Azorsa et al. J Immunol Methods 1999), TS81 (Charrin et al. J Biol Chem 2001) et M38 (Fukudome et al. J Virol. 1992). Trois à quatre jours après infection, les schizontes de P. falciparum ont été révélés à l'aide du sérum polyclonal de souris dirigé contre l'HSP70 et un conjugué FITC dilué au 1/500. L'anticorps 1D6 entraîne une diminution du nombre de schizontes de 70 à 75 % à la concentration de 10 g/ml. Les autres anticorps sont moins actifs (20 à 40% pour M38,15 à 20% pour Z81) ou pas actifs (TS81 et 5A6) à la concentration de 10 g/ml. L'effet des anticorps anti-CD81 sur la capacité des sporozoïtes à migrer à travers les cellules a été évalué à l'aide du dextran fluorescent. Des cultures primaires d'hépatocytes humains ont été inoculées par des sporozoïtes de P.falciparum en présence de dextran-rhodamine et en présence ou non de 1D6 (10 g/ml). Le nombre de cellules dextran positives en présence d'anticorps est identique à celui des contrôles, 1 heure post-inoculation. L'effet des anticorps anti-CD81 sur la capacité des sporozoïtes à pénétrer dans les hépatocytes au sein d'une vacuole parasitophore a été évalué à l'aide d'un marquage par un anticorps monoclonal dirigé contre la CSP de P. falciparum (E9, don de G. Pluschke, Swiss Tropical Institute, Bâle, Suisse) révélé à l'aide d'un conjugué FITC dilué au 1/500. L'anticorps 1D6 à la concentration de 10 g/ml a entraîné une diminution de 70% du nombre de sporozoïtes internalisés 2 heures post-inoculation, comparable à la diminution de 70% du nombre de schizontes à 72h. 4. Identification d'un ligand parasitaire a. Far western blot (Guichet et al. Nature 1997) (Identification of Protein Interactions by Far Western Analysis. In Current Protocols in Molecular Biology, chap. 20. 6, M. Ausubel et al., Eds., Wiley, New York, 2002). Des extraits de protéines sont réalisés à partir de suspensions de sporozoïtes, puis les protéines sont séparées par SDS-PAGE en conditions non réductrices. Après transfert sur membrane, la présence d'une protéine interagissant avec CD81 est alors révélée à l'aide d'une protéine CD81 recombinante fusionnée à la GST et d'anticorps de souris anti-GST, eux-mêmes révélés à l'aide d'anticorps anti-Ig de souris couplés à la peroxydase. Des résultats préliminaires montrent que la protéine recombinante CD81 humaine-GST reconnaît une protéine d'environ 140 kDa dans les extraits préparés à partir de sporozoïtes de P. falciparum. La même démarche est en cours avec P. yoelii et une protéine recombinante CD81-GST murine. b. Coprécipitation, analyse en spectrométrie de masse (Detection of Protein-Protein Interactions by Coprecipitation, in Current Protocols in Molecular Biology, 20. 5, M. Ausubel et al., Eds., Wiley, New York, 2000). Une protéine de fusion CD81-GST est incubée avec un extrait de protéines de sporozoïtes, puis précipitée avec un anticorps anti-GST ou avec un anticorps anti-CD81 (co-immunoprécipitation). La présence d'une protéine parasitaire dans le précipitat est ensuite déterminée par SDS-PAGE suivie d'une identification par analyse en spectrométrie de masse. c. Purification sur colonne (GST-pulldown assay), analyse en spectrométrie de masse (Affinity Purification of Proteins Binding to GST Fusion Proteins, in Current Protocols in Molecular Biology, 20. 2, M. Ausubel et al., Eds., Wiley, New York, 2000). Une protéine de fusion CD81-GST est purifiée sur billes d'agarose-glutathion. La protéine de fusion fixée sur les billes est ensuite incubée avec un extrait de protéines de sporozoïtes. Après lavages et élution, la ou les protéines parasitaires fixé (e)s la protéine de fusion CD81-GST sont analysé (e)s SDS-PAGE et identifié(e)s par spectrométrie de masse. e. Criblage d'une banque d'expression (Phage-Based Expression Cloning to Identify Interacting Proteins, in Current Protocols in Molecular Biology, 20. 3, M. Ausubel et al., Eds., Wiley, New York, 2000). Les ARN totaux d'une suspension de sporozoïtes sont extraits et utilisés pour la synthèse d'une banque de cDNA dans un vecteur phage lambda (de type #gt11par exemple). Les clones obtenus sont transférés sur filtres de nitrocellulose et criblés à l'aide d'une protéine CD81 recombinante. Le ou les clones positifs sont analysés par séquençage de l'insert et confrontation aux banques de données. REFERENCES Azorsa DO, Moog S, Cazenave JP, Lanza F. A general approach to the generation of monoclonal antibodies against members of the tetraspanin superfamily using recombinant GST fusion proteins. J Immunol Methods. 1999 Oct 29;229(1-2):35- 48. Boismenu R, Rhein M, Fischer WH, Havran WL. A role for CD81 in early T cell development. Science. 1996 Jan 12;271(5246):198-200. Cerami C, Frevert U, Sinnis P, Takacs B, Clavijo P, Santos MJ, Nussenzweig V. The basolateral domain of the hepatocyte plasma membrane bears receptors for the circumsporozoite protein of Plasmodium falciparum sporozoites. Cell 1992 Sep 18;70(6):1021-33. Charoenvit Y, Leef MF, Yuan LF, Sedegah M, Beaudoin RL. Characterization of Plasmodium yoelii monoclonal antibodies directed against stage-specific sporozoite antigens. Infect Immun. 1987 Mar;55(3):604-8. Charrin S, Le Naour F, Oualid M, Billard M, Faure G, Hanash SM, Boucheix C, Rubinstein E. The major CD9 and CD81 molecular partner. Identification and characterization of the complexes. J Biol Chem. 2001 Apr 27;276(17):14329-37. Frevert U, Sinnis P, Cerami C, Shreffler W, Takacs B, Nussenzweig V. Malaria circumsporozoite protein binds to heparan sulfate proteoglycans associated with the surface membrane of hepatocytes. J Exp Med. 1993 May 1;177(5):1287-98. Fukudome K, Furuse M, Imai T, Nishimura M, Takagi S, Hinuma Y, Yoshie O. Identification of membrane antigen C33 recognized by monoclonal antibodies inhibitory to human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-l)-induced syncytium formation: altered glycosylation of C33 antigen in HTLV-1-positive T cells. J Virol. 1992 Mar;66(3):1394-401. Guichet, A. et al. 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Motard A, Marussig M, Renia L, Baccam D, Landau I, Mattei D, Targett G, Mazier D. Immunization with the malaria heat shock like protein hsp70-l enhances transmission to the mosquito. Int Immunol. 1995 Jan;7(1):147-50. Oren R, Takahashi S, Doss C, Levy R, Levy S. TAPA-1, the target of an antiproliferative antibody, defines a new family of transmembrane proteins. Mol Cell Biol. 1990Aug;10(8):4007-15. Pradel G, Frevert U. Malaria sporozoites actively enter and pass through rat Kupffer cells prior to hepatocyte invasion. Hepatology. 2001 May;33(5):1154-65. Robson KJ, Frevert U, Reckmann I, Cowan G, Beier J, Scragg IG, Takehara K, Bishop DH, Pradel G, Sinden R, et al. Thrombospondin-related adhesive protein (TRAP) of Plasmodium falciparum: expression during sporozoite ontogeny and binding to human hepatocytes. EMBO J. 1995 Aug 15;14(16):3883-94. WHO Weekly Epidemiological Record. 1997; 72 : 269-276. Revendications 1. Utilisation d'un inhibiteur de l'interaction des molécules CD81 des hépatocytes avec un ligand associé à Plasmodium, inhibant la pénétration des sporozoïtes dans les cellules hépatiques humaines par formation d'une vacuole parasitophore fonctionnelle, pour la préparation d'un médicament destiné à la prophylaxie d'une infection par un parasite du genre Plasmodium chez l'homme. 2. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le parasite du genre Plasmodium est choisi parmi P. vivax, P. malariae, P. ovale et P. falciparum, préférentiellement P. falciparum. 3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'inhibition de la pénétration par formation de la vacuole fonctionnelle est obtenue au moyen d'un agent inducteur, induisant la formation par l'organisme auquel il est administré d'un inhibiteur de l'interaction des molécules CD81 des hépatocytes avec un ligand associé à Plasmodium. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'inhibiteur de l'interaction des molécules CD81 des hépatocytes avec le ligand associé à Plasmodium, est un inhibiteur agissant au niveau des molécules CD81, en particulier un anticorps anti-CD81. 5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3,caractérisée en ce que l'inhibiteur de l'interaction des molécules CD81 des hépatocytes avec le ligand associé à Plasmodium, est un inhibiteur agissant au niveau du ligand de Plasmodium interagissant avec le CD81, en particulier un anticorps anti-ligand de Plasmodium. 6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'inhibiteur ou l'agent inducteur est administré sous une forme pharmaceutique appropriée. 7. Utilisation selon l'une des revendications 3 à 6,caractérisée en ce que l'agent inducteur est administré sous une forme de préparation vaccinale dont l'administration prophylactique va induire la formation par l'organisme auquel il est administré d'un inhibiteur de l'interaction des molécules CD81 des hépatocytes avec un ligand associé à Plasmodium. 8. Méthode d'inhibition ex vivo ou in vitro de la pénétration des sporozoïtes des parasites du genre Plasmodium dans les cellules hépatiques humaines par formation d'une vacuole parasitophore fonctionnelle, caractérisée en ce qu'elle consiste à inhiber l'interaction des molécules CD81 des hépatocytes avec un ligand associé à Plasmodium. 9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'interaction est inhibée au moyen d'un inhibiteur tel que défini dans l'une des revendications 4 ou 5.