Brevet FR2834637A1 — publié le 20030718

Utilisation d'une nouvelle classe de médicaments pour le traitement de maladies parasitaires. L'invention se rapporte à l'utilisation d'une nouvelle classe de médicaments pour le traitement de maladies parasitaires. La nouvelle classe de médicaments visée par l'invention se rapporte plus particulièrement à des molécules ligands du récepteur périphérique des benzodiazépines (PBR). Dans le cadre de la lutte contre les maladies parasitaires et plus spécifiquement, contre le paludisme et la toxoplasmose, il est devenu primordial d'identifier de nouvelles molécules susceptibles de conduire au développement de nouvelles voies thérapeutiques efficaces. Durant ces dernières années, la résistance aux agents antiinfectieux dans les traitements contre le paludisme, s'est intensifiée et propagée à de nombreux pays. La résistance à la chloroquine, médicament classique pour le traitement du paludisme, a été constatée dans la quasi totalité des pays touchés par le paludisme : sud-est asiatique, Afrique, Amérique du sud et Océanie. En outre, de nombreuses régions du sud-est asiatique ont développé des résistances à tous les médicaments actuellement connus, conduisant à une recrudescence de la propagation de la maladie. D'autre part, il n'existe pas actuellement de médicaments contre les formes kystiques quiescentes de T. gondii. Or il s'avère que cette forme particulière de T. gondii est susceptible de se réveiller et d'engendrer des encéphalites toxoplasmiques mortelles chez les malades immuno-déprimés (cancer, greffes, SIDA, ...) Ces constatations ont conduit les inventeurs à rechercher des molécules à activité anti-parasitaire, utilisant une voie thérapeutique originale afin de compléter l'arsenal des molécules aujourd'hui disponibles. La présente invention est donc relative à l'utilisation d'au moins une molécule ligand du récepteur périphérique des benzodiazépines (PBR) pour la fabrication de médicaments destinés au traitement de maladies parasitaires. Le PBR est un récepteur dynamique constitué de trois sousunités : le récepteur de 18 kD de l'isoquinoléine (PK11195), le canal anionique voltage-dépendant de 32 kD qui lie les benzodiazépines et le transporteur des purines. Cette famille de molécules ligands du PBR n'a jamais été envisagée pour le traitement de maladies parasitaires. Le principal avantage de l'invention est de fournir non seulement une nouvelle famille de médicaments mais aussi d'ouvrir la voie vers d'autres familles de médicaments. En effet, la voie thérapeutique utilisée par les médicaments selon l'invention est nouvelle et constitue ainsi une direction nouvelle de recherche. Par ailleurs, certaines de ces molécules peuvent présenter des effets indésirables neurologiques ce qui signifie que ce type de molécules est doué d'un tropisme neurologique particulièrement intéressant, compte tenu des particularités de certaines maladies parasitaires comme la toxoplasmose ou le paludisme. En effet, des formes kystiques de T. gondii et des formes matures de P. falciparum (forme pernicieuse, paludisme cérébral) peuvent se localiser dans le cerveau. Plus particulièrement, la présente invention est relative à l'utilisation de molécules ligands du récepteur périphériques des benzodiazépines (PBR) de formule générale (I): où X est un atome d' halogène choisi parmi F, Cl, Br ou I, un atome d' hydrogène, OH, COOH, SH, NH2, OR, COOR, SR, NHR ou NRR', où R et R' identiques ou différents, représentent une chaîne alkyle de 1 à 4 C, R1 est un atome d'hydrogène, une chaîne alkyle de 1 à 4 C ou forme avec R4 une liaison de type C-N, R2 est un atome d'hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée de 1 à 6 C, comportant le cas échéant un groupement NHR ou NRR', où R et R' identiques ou différents, représentent une chaîne alkyle de 1 à 4 C, R3 est un atome d'hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée de 1 à 2 C formant un cycle avec R4, R4 forme avec R1 une liaison C-N, une chaîne hydrocarbonée de 1 à 2 C formant un cycle avec R3 ou un atome d'hydrogène. De préférence, le composé répond à la formule (II): où X est un atome d' halogène choisi parmi F, Cl, Br ou I, un atome d'hydrogène, OH, COOH, SH, NH2, OR, COOR, SR, NHR ou NRR', où R et R' identiques ou différents, représentent une chaîne alkyle de 1 à 4 C, R1 est un atome d'hydrogène, une chaîne alkyle de 1 à 4 C, R2 est un atome d'hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée de 1 à 6 C, comportant le cas échéant un groupement NHR ou NRR', où R et R' identiques ou différents, représentent une chaîne alkyle de 1 à 4 C, ou à la formule (III): où X est un atome d'halogène choisi parmi F, Cl, Br ou I, un atome d' hydrogène, OH, COOH, SH, NH2, OR, COOR, SR, NHR ou NRR', où R et R' identiques ou différents, représentent une chaîne alkyle de 1 à 4 C, R2 est un atome d'hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée de 1 à 6 C, comportant le cas échéant un groupement NHR ou NRR', où R et R' identiques ou différents, représentent une chaîne alkyle de 1 à 4 C. La présente invention vise plus spécifiquement deux composés, respectivement, de formule (IV): à savoir le 1-(2-chlorophényl)-N-méthyl-N-(1-méthylpropyl)-3-isoquinoléinecarboxamide, ci-après désigné par l'appellation isoquinoléine , ou de formule (V) : à savoir le 7-chloro-l-(2-diéthylamino-éthyl)-5-(2-fluoro- phényl)-1,3-dihydro-benzo[e][1,4]diazepin-2-one dont la dénomination commune internationale est le flurazépam. Les maladies parasitaires visées par l'invention sont de préférence dues à des agents pathogènes de la famille des Apicomplexa, en particulier Toxoplasma gondii et Plasmodium falciparum. Les médicaments selon l'invention présentent un effet inhibiteur dose dépendant vis-à vis du (des) parasite(s). Cet effet inhibiteur sera mieux compris à la lecture de l'exemple 1. Ils peuvent en outre être avantageusement utilisés en multithérapie, conjointement et/ou en compléments de drogues anti-parasitaires, de préférence la chloroquine et/ou la méfloquine. Par multithérapie, on entend une indication thérapeutique proposant plusieurs principes actifs qui vont agir en synergie. L'exemple 1 fournit un exemple de bithérapie : la chloroquine est administrée conjointement avec l'isoquinoléine. Etant donné que le mécanisme d'action des médicaments selon l'invention est différent des mécanismes d'action actuellement connus pour le traitement de maladies parasitaires, il n'existe pas de compétition entre les différents principes actifs connus et ceux de l'invention. De plus, l'isoquinoléine est active sur des souches de Plasmodium multi-résistantes aux médicaments, en particulier la souche Dd2 de Plasmodium falciparum, tandis que le flurazépam a la particularité de présenter une activité sur tous les stades parasitaires de Plasmodium Falciparum. On qualifie une souche de multirésistante lorsqu'un traitement par des médicaments tels que la chloroquine ou la méfloquine ne produit aucune amélioration sur l'état du patient. Avantageusement, le médicament est formulé de manière à permettre une administration orale ou intraveineuse. De manière appropriée, les doses administrées par voie orale sont comprises entre 10 g et 0,5 mg/kg. La présente invention vise également l'utilisation du récepteur périphérique des benzodiazépines (PBR) comme ligand pour le criblage de molécules à activité anti-parasitaire. Les médicaments selon l'invention ouvrent de nouvelles possibilités de recherche en matière de maladies parasitaires. A ce titre, le criblage de molécules grâce au PBR est une méthode particulièrement avantageuse. Elle propose de plus un test d'inhibition de l'activité antiparasitaire caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : - incubation des cellules avec des concentrations variables de parasites et/ou d'inhibiteurs à tester, - puis, mise en contact du milieu incubé avec les molécules telles qu'utilisées dans les revendications 1 à 6 et éventuellement des inhibiteurs. Ce test d'inhibition permet : - soit de tester de nouvelles applications des molécules (nouveaux parasites envisageables) - soit de tester de nouvelles molécules, obtenues par exemple après criblage - soit de tester de nouvelles combinaisons de médicaments. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent, avec référence aux figures 1 à 7, qui représentent, respectivement : - Les figures 1A, 1B, 2A, 2B, 3A et 3B montrent l'effet inhibiteur dose-dépendant de l'isoquinoléine et du flurazépam sur T. gondii (Fig. A) et sur P. falciparum (Fig. B), seul (Fig. 1 et 2) ou en combinaison (Fig. 3). - Les figures 4A et 4B présentent l'activité inhibitrice de la chloroquine et de l'isoquinoléine sur la souche Dd2 de P. falciparum. - Les figures 5A et 5B permettent de constater l'effet dose-dépendant de la chloroquine seule ou en combinaison avec l'isoquinoléine sur la souche Hb3 de P. falciparum. - Les figures 6A à 6D montrent les modifications subies par les trophozoïtes de P. falciparum en présence des médicaments selon l'invention. - La figure 7 présente l'activité anti-parasitaire du flurazépam sur les différents stades parasitaires de P. falciparum. Exemple 1 : Test des agents antimicrobiens 1. Matériels et méthodes Culture in vitro de P. falciparum. Les essais ont été réalisés avec deux souches adaptées à la culture de Plasmodium falciparum : la souche HB3 sensible à la chloroquine et la souche Dd2 résistante à la méfloquinochloroquine. Les parasites ont été maintenus sur des érythrocytes humains de type 0+ dans un milieu de culture RPMI 1640 (GibcoBRL) complémenté avec NaHC03 27,5 mM, HEPES 20 mM (acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique) (pH 7,4), dans du glucose 11 mM et 7,5% (vol/vol) de sérum humain AB+ inactivé par la chaleur, sous atmosphère à 5% de C02, 5% d'02 et 90% de N2 à 37 C (18). Les essais ont été réalisés sur des plaques à 96 puits. Différentes concentrations de médicament ont été ajoutées aux cultures de parasite asynchrones ou synchrones (0,5% de parasitémie et 18% d'hématocrites) en présence de 0,5 Ci de [3H]hypoxanthine (Amersham, 1 mCi/ml) par puits. Après incubation pendant 48 heures à 37 C sous atmosphère de contrôle, les cellules ont été recueillies dans chaque puits à l'aide d'un dispositif automatique (MicrobetaTM 1450) sur des filtres en fibres de verre. Les filtres séchés contenant la radioactivité liée aux parasites ont été soumis à une mesure à l'aide d'un compteur de scintillations. Toutes les concentrations de médicament ont été testées deux ou trois fois en triple dans chaque essai. L'inhibition de la croissance pour chaque concentration a été déterminée par comparaison de la radioactivité incorporée dans la culture traitée avec celle incorporée dans les cultures témoins (exemptes de médicament) présentes sur la même plaque. Culture in vitro de T. gondii. Des tachyzoïtes de la souche 76K de Toxoplasma gondii ont été cultivés dans des fibroblastes de prépuce humain (HFF) dans le milieu Dulbecco-Eagle (DMEM, Biowhittaker, Belgique) complémenté avec 10% de sérum de veau foetal (Dutscher), glutamine 2 mM (Sigma) et 0,05 mg/ml de gentamycine (Sigma). Les essais ont été réalisés sur des plaques à 6 puits. La monocouche de cellules HFF a été infectée avec 2 x 105 parasites par puits et 6 heures plus tard, les médicaments ont été ajoutés dans les gammes de concentrations décrites cidessus, seuls ou en combinaison entre eux. Après encore 48 heures de culture (5% de C02, 37 C), les tachyzoïtes intracellulaires ont été marqués par impulsions à l'aide de 2uCi de [3H]uracil (Amersham) par puits pendant 6 heures. Dans ce test, seuls les parasites ont été marqués en raison de l'absence de phosphoribosyltransférase dans les cellules hôtes, alors que cette enzyme de sauvetage est présente dans les tachyzoïtes de T. gondii (1). Après marquage, les cellules infectées ont été lysées avec du détergent et les acides nucléiques marqués par radioactivité ont été précipités par TCA et récupérés sur des filtres en fibres de verre. La radioactivité liée aux parasites a été mesurées à l'aide d'un compteur de scintillations (2). Tous les médicaments ont été testés deux ou trois fois en triple dans chaque essai. Agents antimicrobiens. On a utilisé les agents antimicrobiens suivants (fournis par les fabricants indiqués) : chloroquine (CQ), flurazépam (Fz), 1-(2-chlorophényl)-N-méthyl-N-(1-méthylpropyl)-3-isoquinoléine -carboxamide (IsoQ) (Sigma Chemical Co., St Louis, Mo) et méfloquine (Institut Pasteur de Lille, France). On a dissout initialement IsoQ dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration de 3,3 mg/ml et Fz dans le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM, Biowhittaker, Belgique) complémenté avec 10% de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur (FCS, Dutscher), glutamine 2 mM (Sigma) et 0,05 mg/ml de gentamycine (Sigma), à une concentration de 5 mg/ml. Le milieu de culture décrit ci-dessus (DMEN-FCS) a été utilisé pour la culture intracellulaire de tachyzoïtes de T. gondii. CQ et MQ ont été dissous initialement dans du méthanol à 70% à des concentrations de 5 mg/ml, du DMSO contenant DMEN-FCS ou RPMI-FCS et du méthanol nécessaire pour dissoudre les médicaments testés et n'ont présenté aucune fonction sur T. gondii et P. falciparum, respectivement. On a préparé les dilutions immédiatement avant chaque essai. Pour P. falciparum, on a testé les concentrations suivantes de chaque agent (seul ou en combinaison) : CQ et MQ à 9,19, 37,75 et 150 ng/ml). Pour T. gondii, Fz et IsoQ ont été testés seuls ou en combinaison, aux concentrations suivantes : 5,10, 25,40, 50,70 et 80 pg/ml. 2. Résultats Les expériences décrites ci-dessus ont permis de mettre en évidence l'effet inhibiteur dose-dépendant des molécules ligands du récepteur périphérique des benzodiazépines (PBR) sur la multiplication et la croissance des souches de Plasmodium falciparum et de Toxoplasma gondii. Les figures 1A, 1B, 2A, 2B, 3A et 3C présentent les résultats sous forme de graphique. Les concentrations correspondant à 50% d'inhibition (CI50) ont été déterminées graphiquement. Elles sont résumées dans le tableau suivant : Isoquinoléine Flurazépam T. gondii Entre 10 et 20 g/ml Entre 25 et 50 g/ml (Fig. 1A) (Fig. 2A) P. falciparum Entre 20 et 25 g/ml Entre 10 et 20 g/ml (Fig. 1B) (Fig. 2B) Tableau I : CI50 de l'isoquinoléine et de flurazépam sur T. gondii et P. falciparum. Une comparaison des figures 3A et 3B avec les figures 1A à 2B, montre que les drogues exercent un effet additif. De plus, l'isoquinoléine conserve une activité inhibitrice sur une souche de P. falciparum (souche Dd2) résistante à la chloroquine et à la méfloquine (Fig. 4A et 4B). La CI50 de l'isoquinoléine est alors de 25g/ml. Enfin, l'utilisation des molécules ligands du PBR n'altère pas les effets anti-parasitaires des drogues anti-paludiques déjà connues telles que la chloroquine ou la méfloquine. Les figures 5A et 5B permettent de constater l'effet dosedépendant de la chloroquine seule ou en combinaison avec l'isoquinoléine sur la souche Hb3 de P. falciparum. On peut constater qu'une diminution importante de l'activité parasitaire est obtenue pour une concentration comprise entre 9,08 et 18,2 nM de chloroquine lorsqu' elle est en combinaison avec l'isoquinoléine alors que cette même diminution n'est observée qu' entre 36,3 et 72,7 nM de chloroquine quand celleci est utilisée seule. Exemple 2 : Evaluation de la morphologie de P. falciparum et de T. gondii, développement et réplication 1. Matériels et méthodes La morphologie, le développement et la réplication de cultures asynchromes ou synchrones de P. falciparum ont été évalués dans des cultures par observation au microscope optique de frottis de sang fins colorés au Giemsa. Des frottis issus des cultures exemptes de médicament ont été utilisés chaque fois à titre de témoins. La parasitémie a été mesurée par numération de 1000 hématies et la valeur obtenue est indiquée comme le pourcentage de la totalité des érythrocytes parasités. Des parasites morphologiquement normaux et anormaux sont inclus dans les mesures. Pour la microscopie électronique de transmission, les tachyzoïtes de T. gondii (souche 76K) cultivés dans des cellules HFF ou des hématies infectées par P. falciparum (souche Hb3) ont été traités avec Fz ou IsoQ pendant deux jours. Les parasites intracellulaires traités ont été fixés dans du glutaraldéhyde à 2,5% préparé dans un tampon cacodylate 0,1 M et fixés ultérieurement dans Os04 à 1% dans le même tampon. Après déshydration à l'éthanol, le culot a été inclus dans Epon. On a découpé une série de coupes minces à l'aide d'un ultramicrotome et on les a recueilli sur des grilles à barres longitudinales. Après coloration avec de l'acétate d'uranyle à 2% préparé dans de l'éthanol à 50% et incubation avec une solution de citrate de plomb, on a observé les coupes à l'aide d'un microscope électronique Hitachi H- 600. 2. Résultats Pour P. falciparum, les images démontrent, au niveau ultrastructural, une altération profonde du réticulum endoplasmique et de la vacuole digestive. Cette vacuole, nécessaire à la survie du parasite, est parfois absente lorsque les parasites sont soumis à la drogue. Lorsqu'elle est présente, elle se caractérise par une diminution de son volume et par la réduction importante du cristal d'hémozoîne intravacuolaire habituellement observé dans les stades matures du parasite (composé de polymère du noyau hémique provenant de l'hémoglobine ou de la ferriprotoporphyrine IX). Cela se rapproche de l'inhibition toxique de la polymérisation de l'hème chez P. falciparum décrit pour la chloroquine et la méfloquine. Références : (1) Lin L. et al. (1999) Phenolic aporphine- benzylisoquinoline alkaloids from Thalictrum faberi. Phytochemistry 50 :829-834. (2) François G. et al. (1996) Naphtylisoquinoline alkaloids exhibit strong growth-inhibiting activities against Plasmodium falciparum et P. berghei in vitro structure activity relationships of dioncophyline C. Ann. Trop. Med. Parasitol. 90 :115-123. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'au moins une molécule ligand du récepteur périphérique des benzodiazépines (PBR) pour la fabrication de médicaments destinés au traitement de maladies parasitaires. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les molécules ligands du récepteur périphérique des benzodiazépines (PBR) sont des composés de formule (I) : où X est un atome d'halogène choisi parmi F, Cl, Br ou I, un atome d' hydrogène, OH, COOH, SH, NH2, OR, COOR, SR, NHR ou NRR', où R et R' identiques ou différents, représentent une chaîne alkyle de 1 à 4 C, R1 est un atome d' hydrogène, une chaîne alkyle de 1 à 4 C ou forme avec R4 une liaison de type C-N, R2 est un atome d'hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée de 1 à 6 C, comportant le cas échéant un groupement NHR ou NRR', où R et R' identiques ou différents, représentent une chaîne alkyle de 1 à 4 C, R3 est un atome d'hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée de 1 à 2 C formant un cycle avec R4, R4 forme avec Ri une liaison C-N, une chaîne hydrocarbonée de 1 à 2 C formant un cycle avec R3 ou un atome d'hydrogène. 3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que les molécules répondent à la formule (II): où X est un atome d'halogène choisi parmi F, Cl, Br ou I, un atome d' hydrogène, OH, COOH, SH, NH2, OR, COOR, SR, NHR ou NRR', où R et R' identiques ou différents, représentent une chaîne alkyle de 1 à 4 C, R1 est un atome d'hydrogène, une chaîne alkyle de 1 à 4 C, R2 est un atome d'hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée de 1 à 6 C, comportant le cas échéant un groupement NHR ou NRR', où R et R' identiques ou différents, représentent une chaîne alkyle de 1 à 4 C. 4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que le composé répond à la formule (IV) : 5. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le composé répond à la formule (III) : où X est un atome d'halogène choisi parmi F, Cl, Br ou I, un atome d' hydrogène, OH, COOH, SH, NH2, OR, COOR, SR, NHR ou NRR', où R et R' identiques ou différents, représentent une chaîne alkyle de 1 à 4 C, R2 est un atome d'hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée de 1 à 6 C, comportant le cas échéant un groupement NHR ou NRR', où R et R' identiques ou différents, représentent une chaîne alkyle de 1 à 4 C. 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le composé répond à la formule (V) : 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce les maladies parasitaires sont dues à des agents pathogènes de la famille des Apicomplexa. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les agents pathogènes sont Toxoplasma et Plasmodium, en particulier Toxoplasma gondii et Plasmodium Falciparum. 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les médicaments présentent un effet inhibiteur dose dépendant vis-à vis du (des) parasite(s). 11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les médicaments sont utilisés en multithérapie, conjointement et/ou en compléments de drogues anti-parasitaires, de préférence la chloroquine et/ou la méfloquine. 12. Utilisation selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que le composé est actif sur des souches de Plasmodium multi-résistantes aux médicaments, en particulier la souche Dd2 de Plasmodium falciparum. 13. Utilisation selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce que le composé est actif sur tous les stades parasitaires de Plasmodium falciparum. 14. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le médicament est formulé de manière à permettre une administration orale ou intraveineuse. 15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que les doses administrées par voie orale sont comprises entre 10 g et 0,5 mg/kg. 16. Utilisation du récepteur périphérique des benzodiazépines (PBR) comme ligand pour le criblage de molécules à activité anti-parasitaire. 17. Test d'inhibition de l'activité anti-parasitaire caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : - incubation des cellules avec des concentrations variables de parasites et/ou d'inhibiteurs à tester, - puis, mise en contact du milieu incubé avec les molécules telles qu'utilisées dans l'une quelconque des revendications 1 à 6.