Brevet FR2834988A1 — publié le 20030725

UTILISATION DE DENDRIMERES PHOSPHORES COMME MEDICAMENTS. La présente invention est relative à l'utilisation de dendrimères phosphorés comme médicaments, notamment dans le traitement des maladies liées à une aggrégation anormale des protéines. Depuis environ dix ans, la recherche sur la chimie des dendrimères s'est considérablement développée, du fait de leur structure (polymères poly-fonctionnels ordonnés) et de leurs propriétés particulières, liées à la présence d'un nombre important de fonctionnalités à leurs extrémités ; cette recherche a conduit à la synthèse d'autres structures correspondant à des dendrimères contenant du phosphore, telles que celles décrites par C. Galliot et al. (Science 1997, 277, 1981-1984), C. Larré et al. (J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 4029-4030) ou par D. Prévôté et al. (J. Org. Chem., 1997, 62, 14,4834-4841). Des dendrimères contenant du phosphore, qui sont fonctionnalisés au niveau des couches internes et qui comprennent des amines tertiaires protonées comme terminaisons ont été décrits dans la Demande internationale WO 01/38335 et présentent des propriétés particulièrement intéressantes, en tant que vecteurs de transfert d'acides nucléiques. Les Inventeurs ont maintenant trouvé, de manière inattendue, que de tels dendrimères avaient, en tant que tels, des propriétés thérapeutiques et notamment des propriétés dans le traitement des maladies liées à une aggrégation anormale des protéines, telles que les maladies neurodégénératives et notamment les maladies à prions. La présente invention a, en conséquence pour objet des dendrimères phosphorés polycationiques, constitués : - d'une couche centrale sous la forme d'un noyau Po comprenant 2 à 8 groupements fonctionnalisés et notamment le groupement de formule générale la (aussi dénommé N3P3) : \ N% N V\# (la) # ou le groupement de formule générale Ib : S=P - de n couches intermédiaires, identiques ou différentes, chacune desdites couches intermédiaires étant constituée d'unités P1 répondant à la formule II : L-M -C = N -N-P # # ## (II) R1 R2 E # dans laquelle : L est un atome d'oxygène, de phosphore ou de soufre, M représente l'un des groupes suivants : # un groupe aromatique di-, tri- ou tétrasubstitué par des groupes alkyles, des groupes alcoxy, des groupements insaturés du type oléfinique en Ci -Ci 2, azoïque, acétylènique, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, ou # un groupe alkyle ou alcoxy comportant plusieurs substituant tels que définis lorsque M est un groupe aromatique, R1 et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, de soufre, d'azote ou des halogènes avec R2 étant le plus souvent différent de R1, n est un nombre entier compris entre 1 et 11, E est un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote, ledit atome d'azote pouvant être lié à un groupe alkyle, alcoxy ou aryle, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, - une couche externe constituée d'unités P2, identiques ou différentes, et répondant à la formule III : dans laquelle : R5 représente un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, W représente l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, tous ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, R3 et R4, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un groupe alkyle en C1-C5, X représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C5 ou est absent, et Z représente un ion halogènure, un groupe alkylCOO- ou tout autre groupement anionique comportant des atomes de carbone, d'oxygène, de soufre, d'azote, de phosphore ou d'halogènes, ou est absent, en tant que médicament et notamment pour utilisation dans le traitement des affections associées à une agrégation anormale des protéines. Un groupe de formule II préféré est notamment le groupe suivant : Un groupe de formule III préféré est notamment le groupe suivant : R3 #HN#(Ct-t?)p#NX oùp=là5 #R4 Z, tels que décrits dans la Demande internationale WO 01/38335. De manière encore plus préférée, R2 représente un groupe méthyle ; X représente un atome d'hydrogène, R3 et R4 représentent des groupes éthyle et p = 2. On peut obtenir plusieurs types de produits désignés de manière générale par la formule A-[Gn], dans laquelle A définit le type d'unité terminale et Gn définit le nombre de couches d'unités intermédiaires P1 (correspondant au nombre de générations) : - la série des composés 2-[Gn] présente des unités terminales de formule III préférée, dans lesquelles X représente un atome d'hydrogène, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyle, Z est un ion chlorure et n est un nombre entier compris entre 1 et 10 (voir la figure 3 de la Demande Internationale WO 01/38335 et la figure 1) ; les composés CL408, CL404 et CL410 correspondent respectivement à des dendrimères 2-G3,2-G4 et 2-G5. - la série des composés 3-[Gn] présente des unités terminales de formule III, dans lesquelles X est vide, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyle, Z est vide et n est un nombre entier compris entre 1 et 10 (voir la figure 3 de la Demande Internationale WO 01/38335) ; - la série des composés 4-[Gn] présente des unités terminales de formule III, dans lesquelles X représente un groupe méthyle, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyle, Z est un ion iodure et n est un nombre entier compris entre 1 et 10 (voir la figure 3 de la Demande Internationale WO 01/38335) ; - la série des composés 5-[Gn] présente des unités terminales de formule III, dans lesquelles X représente un groupe méthyle, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyle, Z est un groupe CH3COO- et n est un nombre entier compris entre 1 et 10 (voir la figure 3 de la Demande Internationale WO 01/38335). - la série des composés l-[Gn] présente des unités terminales Cl2 et n est un nombre entier compris entre 1 et 10 (voir la figure 3 de la Demande Internationale WO 01/38335) (produits intermédiaires pour la préparation des dendrimères selon l'invention). Le procédé de préparation de ces dendrimères est également décrit dans la Demande Internationale WO 01/38335. Les maladies à prions ou encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles (ESST) sont provoquées par des agents transmissibles non conventionnels (ATNC), encore appelés prions, dont la nature précise reste contestée à ce jour. Les ESST comprennent essentiellement chez l'homme la maladie de Creutzfeld-Jakob (MCJ ou CJD pour Creutzfeld-Jakob disease), le Kuru, le syndrome de Gerstamnn-Stràussler-Scheinker et l'insomnie familiale fatale, la tremblante chez le mouton et la chèvre et l'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB ou BSE pour bovine spongiform encephalopathy) chez les bovins ; d'autres encéphalopathies ont été mises en évidence chez les félidés, chez le vison ou certains animaux sauvages, tels que le cerf ou l'élan. Ces maladies sont d'évolution constamment fatale et il n'existe, à l'heure actuelle, aucun traitement efficace. Dans les ESST, il existe une accumulation d'une protéine de l'hôte, la PrP (ou protéine à prion), sous une forme anormale (PrPres), principalement dans le système nerveux central ; PrPres copurifie avec l'infectiosité et son accumulation précède l'apparition des lésions histologiques. Les deux isoformes de la PrP présentent la même séquence en acides aminés, mais diffèrent dans leur structure secondaire : PrPres (pour résistante) présente un contenu significativement plus élevé en feuillets plissés ss, alors que la PrP normale (PrPsens) (pour sensible) présente un plus grand nombre d'hélices a. Deux propriétés biochimiques permettent, généralement de distinguer ces deux isoformes : - la PrPres est partiellement résistante aux protéases, notamment à la protéinase K (PK), qui entraîne un clivage de son extrémité N-terminale. Après action de la PK, la PrPres est souvent appelée PrP27-30, à cause du poids moléculaire apparent de la forme biglycosylée ; est généralement admis que le site de clivage de la PrPres se situe entre les acides aminés 89 et 90 (Prusiner et al., Cell, 1984,38, 127-134 ; Prusiner et al., Cell, 1998,93, 337-348), pour les souches habituelles ; la PrPres est insoluble dans les détergents non-ioniques, tels que le Triton X100 ou le Triton XI 14. - la forme normale de la protéine du prion (PrPsens) est en principe complètement dégradée par les protéases et est parfaitement soluble en présence de détergents non-ioniques. Il a été établi récemment que l'agent de l'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) était passé à l'homme et s'exprimait sous une nouvelle forme phénotypique appelée nouveau variant de la maladie de Creutzfeld-Jakob (vMCJ) (Collinge et al., 1999). Si peu de cas humains ont été jusqu'à présent décrits (106 cas en septembre 2001), l'importance de l'ESB au Royaume-Uni et l'augmentation des cas d'ESB en France, posent clairement la question d'une possible épidémie en France et de son ampleur. De nombreuses molécules ont été testées pour leur activité dans les maladies à prion. Ainsi, des produits antiviraux tel que l'amantadine (Terzano et al., Arch Neurol, 1983,40, 555-559) ou la vidarabine (Furlow et al., 1982) n'ont pas montré d'effet significatif. Des molécules dont l'amphotéricine B (substance anti-fongique), ou les anticancéreux tels que la doxorubicine et son dérivé l'anthracycline -4'-iodo-4'désoxydoxorubicine (IDX), ne font que retarder légèrement l'apparition de la forme anormale de la protéine à prion chez l'animal et n'ont pas d'effet une fois les signes cliniques présents (Demaimay et al., 1999) ; et al., 1997). Une autre molécule, qui est un colorant de l'amyloïde, à savoir le rouge Congo, a une efficacité in vitro remarquable, mais son utilisation est limitée du fait de sa faible capacité à passer la barrière hémato-encéphalique et de sa forte activité carcinogène intrinsèque. D'autres approches thérapeutiques, plus prometteuses, ont été proposées : elles sont basées sur l'utilisation : - d'anticorps dirigés contre la PrP (Peretz et al., 2001), - de chlorpromazine ou - d'un agent anti-malarique, la quinacrine, Ces produits ont montré une efficacité en culture de cellules (Korth et al., 2001) et sont actuellement testés chez des patients. Enfin, une étude a rapporté l'élimination de PrPres dans des cultures de cellules de neuroblastomes murins infectés, ainsi que dans des homogénats de cerveaux infectés, par des polyamines branchées comme des dendrimères de polyamidoamides, de polypropylène imines ou de polyéthylène imines (Suppattapone et al., 1999, PNAS, 96,25, 14529-14534). Les dendrimères décrits dans l'article de Supattapone et al. sont différents des dendrimères selon la présente invention : ils ne comportent pas de phosphore, ils comportent des groupements NH2 (amines primaires), ils sont hydrophiles et leur structure ne permet pas de moduler facilement leurs propriétés. De manière surprenante, les dendrimères phosphorés tels que définis ci-dessus permettent d'inhiber la transformation de la forme normale des prions (PrPsens) en la forme PrPres pathogène, à des concentrations de l'ordre de 18 à 300 nM (valeur de la concentration inhibant 50 % de l'infection ou ICso), alors qu'il semblait jusqu'à présent que des dendrimères comprenant des amines tertiaires ne pouvaient pas avoir d'activité thérapeutique (Supattapone et al. précité). Pour un dendrimère de génération 4, la valeur de l'ICso est de 18 nM. Ces valeurs sont tout à fait remarquables. De manière préférée, les dendrimères phosphores de 3ième, 4ième et 5ième génération (G3, G4 et G5) avec 48,96 ou 192 terminaisons amines tertiaires, sont particulièrement intéressants comme médicaments anti-prion. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre les formules générales des dendrimères testés. - la figure 2 illustre l'action de concentrations croissantes de trois dendrimères, dénommés respectivement CL408 (G3), CL404 (G4) et CL410 (G5) sur des cellules de neuroblastome de souris N2a infectées de façon stable par la souche de prion 22L (lignées dénommées N2a58/22L) (Nishida et al., 2000), traitées pendant trois jours par CL408, CL404 ou CL410. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : des dendrimères. Ils sont préparés selon les conditions exposées dans la Demande Internationale WO 01/38335. En particulier, les dendrimères phosphorés de 3ième 4ième et 5ième génération (G3, G4 et G5) avec 48,96 ou 192 terminaisons amines tertiaires (initalement sous forme de chlorhydrates), sont préparés (figure 1). Les masses moléculaires de ces composés sont respectivement de 16285,33202 et 68537 Daltons. EXEMPLE 2 : Efficacité comparée des trois dendrimères. 1. Matériel et Méthodes L'utilisation de cultures cellulaires infectées par les prions permet de tester des molécules à visée thérapeutique d'une façon plus rapide que chez l'animal (Caughey et al., 1993). Dans le cas présent, les cultures cellulaires utilisées sont les suivantes : lignées neuronales murines N2a infectées avec différentes souches de prions (Chandler, 22L, 139A) (Nishida et al., 2000). L'efficacité des dendrimères dans ces modèles est représentée principalement par la diminution de l'accumulation et/ou de la génération de PrPres en culture. La détection de la PrPres est réalisée par une méthode classique d'immunoréplique (Western-blot). Brièvement, les lysats cellulaires sont digérés à la protéinase K et les protéines sont transférées sur une membrane de nitrocellulose après réalisation d'une électrophorèse en condition dénaturante (SDS-PAGE). La protéine PrP est ensuite révélée par chemiluminescence après fixation d'un premier anticorps anti-PrP et d'un deuxième anticorps marqué à la peroxydase. 2. Résultats Les cellules de neuroblastomes de souris N2a ont été préalablement transfectées par l'ADNc du gène sauvage de la PrP de souris, puis infectées de façon stable par la souche de prion 22L (Nishida et al., J. Virol, 2000,74, 320-325). Cette lignée cellulaire infectée est dénommée N2a58/22L. Pour tester l'efficacité des dendrimères, 2 X 105 cellules/boîte de Pétri de 35 mm sont mises en culture à JO et le jour suivant (Jl) ; les différents agents sont directement ajoutés au milieu de culture à différentes concentrations (entre 0,01 et 10 g de dendrimères/ml). A J3, la PrPres est détectée dans les cultures par une technique classique de Western-Blot, après digestion à la protéinase K (Nishida et al., J. Virol, 2000,74,320-325). La figure 2 illustre les résultats obtenus : La détection de PrPres par immunoblot est réalisée sur des lysats digérés à la protéinase K de cellules N2a58/22L, traitées pendant 3 jours avec différentes concentrations de CL410 (figure 2A), de CL404 (figure 2B) ou de CL408 (figure 2C). Après quantification, les courbes doses/réponses permettent d'établir les valeurs des CI50 (concentration inhibant 50 % de la formation de la PrPres) pour les 3 dendrimères testés. Les CI50 sont de : - 65 nM pour CL 410 (4,5 g/ml), - 300 nM pour CL 408 (5 g/ml), - 18 nM pour CL 404 (0,6 g/ml). A titre de comparaison, le Superfect, qui est un agent de type dendrimère connu pour son activité "anti-prion" sur les cellules infectées (Supattapone et al., 1999) à une CI50 de 0,4 g/ml (il s'agit d'une molécule dont le poids moléculaire n'est pas déterminé). Toutefois, les expériences de Suppattapone sont effectuées à pH 3,6 alors que dans la présente invention les expériences sont mises en #uvre à pH physiologique. Le Tableau ci-après illustre les effets dose/réponse : concentration en g/ml CL 404 CL 408 CL 410 10 0,5 15 2,8 5 0,6 52 41 1 15 70 81 0,5 77 87 98 0,1 98 90 99 0,05 98 91 100 La colonne 1 de ce Tableau correspond aux concentrations initiales en dendrimères. Les colonnes 2,3 et 4 correspondent au pourcentage de PrPres restant par rapport au contrôle non traité. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en #uvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. BIBLIOGRAPHIE Caughey et al., J. Viral, 1993, 67, 643-650 Collinge et al., Lancet, 1999, 354, 317-323 Demaimay et al., J. Virol, 1999, 73, 3511-3513 Furlow et al., Lancet, 1982, 2, 564-565 Galliot et al., Science, 1997, 277, 1981-1984 Korth et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2001,98, 9836-9841 Larré et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 4029-4030 Nishida et al., J. Virol, 2000,74, 320-325 Peretz et al., Nature, 2001, 412, 739-743 Prévôté et al., J. Org. Chem., 1997, 62, 14, 4834-4841). Prusiner et al., Cell, 1984, 38, 127-134 Prusiner et al., Cell, 1998, 93, 337-348 Suppattapone et al., 1999, PNAS, 96, 25, 14529-14534 Tagliavini et al., Science, 1997, 276, 1119-1122. Terzano et al., Arch Neurol, 1983,40, 555-559 REVENDICATIONS 1 ) Dendrimères phosphorés polycationiques, constitués : - d'une couche centrale sous la forme d'un noyau central Po comprenant 2 à 8 groupements fonctionnalisés, - de n couches intermédiaires, identiques ou différentes, chacune desdites couches intermédiaires étant constituée d'unités P1 répondant à la formule II : L-M -C = N -N - P # # # (II) R1 R2 E dans laquelle : L est un atome d'oxygène, de phosphore ou de soufre, M représente l'un des groupes suivants : # un groupe aromatique di-, tri- ou tétrasubstitué par des groupes alkyles, des groupes alcoxy, des groupements insaturés du type oléfinique en Ci-Ci 2, azoïque, acétylènique, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, ou # un groupe alkyle ou alcoxy comportant plusieurs substituant tels que définis lorsque M est un groupe aromatique, R1 et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, de soufre, d'azote ou des halogènes avec R2 étant le plus souvent différent de R1, n est un nombre entier compris entre 1 et 11, E est un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote, ledit atome d'azote pouvant être lié à un groupe alkyle, alcoxy ou aryle, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, - une couche externe constituée d'unités P2, identiques ou différentes, et répondant à la formule III : dans laquelle : R5 représente un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, W représente l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, tous ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes. R3 et R4, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un groupe alkyle en C1-C5, X représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C5 ou est absent, et Z représente un ion halogènure, un groupe alkylCOO- ou tout autre groupement anionique comportant des atomes de carbone, d'oxygène, de soufre, d'azote, de phosphore ou d'halogènes, ou est absent, comme médicament. 2 ) Dendrimères, tels que définis à la revendication 1, pour utilisation dans le traitement des affections associées à une aggrégation anormale des protéines. 3 ) Dendrimères selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisés en ce que le noyau central Po est sélectionné dans le groupe constitué par le groupement de formule générale la : ou le groupement de formule générale Ib : S=P 4 ) Dendrimères selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce qu'ils présentent des couches intermédiaires constituées d'unités P1 de formule II, dans lesquelles L est un atome d'oxygène, R1 est un atome d'hydrogène, R2 représente un groupe méthyle et E est un atome de soufre. 5 ) Dendrimères selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'ils présentent des unités terminales de formule III, dans lesquelles X représente un atome d'hydrogène, R5 est un atome d'hydrogène, W représente un groupe (CH2)2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyle, Z est un ion chlorure et n est un nombre entier compris entre 1 et 11. 6 ) Dendrimères selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu' ils présentent des unités terminales de formule III, dans lesquelles X représente un groupe méthyle, R5 est un atome d'hydrogène, W représente un groupe (CH2)2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyle, Z est un groupe CH3COO- et n est un nombre entier compris entre 1 et 11. 7 ) Composition anti-prion, caractérisée en ce qu'elle comprend un dendrimère phosphoré polycationique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 8 ) Utilisation d'un dendrimère, tel que défini aux revendications 1 à 6 pour la préparation d'un médicament destiné à traiter les maladies associées à une aggrégation anormale des protéines.