Brevet FR2843970A1 — publié le 20040305

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine de la préparation d'acides gras à partir des lipides contenus dans les graines de certains végétaux. ETAT DE LA TECHNIQUE Les acides gras sont des acides carboxyliques ayant divers degrés d'insaturation et une grande variété de poids moléculaires. Les acides gras sont utilisés dans la fabrication d'une grande variété de produits, tels que les 10 savons et les tensioactifs, les lubrifiants, les peintures et les revêtements, ou encore les bougies, ainsi que dans une grande diversité d'autres produits de l'agriculture et de l'industrie, notamment dans le domaine agroalimentaire. Classiquement, les acides gras sont produits par hydrolyse chimique d'une huile, par exemple par l'action de la chaleur et de la pression en 15 présence d'eau, afin de rompre les liaisons entre l'acide et l'alcool constitutifs des lipides contenus dans les huiles. Bien que les acides gras ont été produits par synthèse chimique, une partie importante de ces derniers est préparée à partir d'huiles naturelles. On connaît aussi des procédés de préparation d'acides gras par 20 hydrolyse d'un milieu contenant des lipides sous l'action d'une lipase capable d'hydrolyser les lipides respectivement en acides gras et alcools, principalement le glycérol. L'hydrolyse de l'huile d'olive en utilisant la lipase de Candida rugosa a été décrite par LINFIELD et ai. (LINFIELD W M et al., 1984, J. AM. Oil Chem. Soc. vol. 61:1067-1071). Cependant, l'hydrolyse 25 nécessitait un traitement préalable de l'huile substrat de départ avec une terre de blanchiment. L'hydrolyse de l'huile de soja par la lipase a été décrite par PARK et al. (PARK Y K et al. 1988, J. Am. Oil Chem. Soc., vol. 61: 252-254). Cependant une lipolyse presque complète nécessitait l'utilisation de deux 30 lipases distinctes. Le brevet américain publié sous le n US 5,932,458 décrit un procédé d'hydrolyse d'une huile à l'aide d'une lipase immobilisée. Notamment, la lipase peut être obtenue par broyage de graines d'avoine, puis élimination des lipides par extraction avec un solvant. Pour effectuer la réaction d'hydrolyse, la lipase immobilisée est ensuite mise en contact avec de l'huile de soja dans un solvant organique, le 2,2,4-triméthylpentane. RAO et al. (RAO KSVA et al., 1992, Res. Ind., vol.37:36) décrivent une méthode d'hydrolyse utilisant un broyat de graines de ricin, dans lequel 5 la lipase endogène de la graine, qui est libérée des sphérosomes intracellulaires par le broyage des graines, est utilisée pour hydrolyser les lipides endogènes de ces graines broyées. De même, JACHMANIAN et al. (JACHMANIAN I et al., 1995, J Agric. Food Chem. vol. 43(11): 2992-2996) ont étudié l'hydrolyse des lipides d'un broyat de graines de colza germées, 10 sous l'action de la lipase endogène. Toutefois, ces études d'hydrolyse des lipides par les lipases endogènes impliquent de choisir précisément le stade de développement des graines utilisées, puisque les lipases ne sont produites qu'au moment de la germination. De plus, ces études visent exclusivement à montrer que les graines entières sont des sources de lipase. Aucun essai d'extraction des acides gras et des alcools n'est donc décrit. DESCRIPTION DE l'INVENTION Le demandeur s'est attaché à mettre au point un procédé amélioré de préparation d'acides gras, par hydrolyse des lipides contenus dans les graines d'une plante, qui soit simple, rapide, et qui permette l'obtention d'un haut rendement d'hydrolyse. En particulier, le demandeur s'est attaché à 25 mettre au point un procédé amélioré ne nécessitant pas une étape d'extraction de l'huile préalable à la mise en contact de la lipase avec les lipides dont l'hydrolyse, respectivement en acides gras et alcools, est recherchée. De manière surprenante, on a montré selon l'invention qu'une 30 hydrolyse quasi-complète des lipides contenus dans des graines de plantes pouvait être obtenue en faisant agir une lipase exogène dans un milieu réactionnel hétérogène solide/liquide dans lequel le substrat lipidique est présent. Plus précisément, on a montré selon l'invention, qu'une lipase 35 exogène placée dans un milieu réactionnel substrat hétérogène solide/liquide, lequel milieu réactionnel est soumis à un traitement d'homogénéisation drastique à haute pression ou par ultrasons, conserve son activité catalytique d'hydrolyse des lipides contenus dans la solution substrat ainsi traitée. On a également montré selon l'invention qu'une lipase exogène était capable d'effectuer une hydrolyse complète ou quasi-complète des lipides présents, dans ce milieu réactionnel hétérogène solide/liquide, sous la forme d'une émulsion constituée de gouttelettes d'huile dispersées dans un milieu aqueux, et que les acides gras résultant de l'hydrolyse des lipides contenus 10 dans ladite émulsion pouvaient être facilement récupérés, par exemple par simple extraction. Il a enfin été montré selon l'invention qu'un traitement de graines de plantes par broyage et homogénéisation permettait de rendre accessible la plus grande partie des lipides initialement contenus dans les graines à 15 I'action d'une lipase exogène. La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'acides gras par hydrolyse in situ des lipides contenus dans les graines d'une plante, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) broyage des graines en milieu aqueux jusqu'à l'obtention d'une 20 suspension de particules solides d'un diamètre inférieur à 500 pm; b) ajout d'une lipase exogène dans la suspension obtenue à l'étape a); c) homogénéisation de la suspension contenant la lipase jusqu'à l'obtention d'un homogénat constitué d'une émulsion des lipides contenus initialement dans les graines, en mélange avec les particules solides des 25 graines; d) hydrolyse des lipides contenus dans l'homogénat obtenu à l'étape c) à une température comprise entre 15 C et 55 C, pendant une durée comprise entre 15 minutes et 5 heures; e) récupération des acides gras résultant de l'hydrolyse des lipides 30 réalisée à l'étape d). Etape de broyage des graines Selon le procédé ci-dessus, l'étape a) de broyage est réalisée à l'aide d'un broyeur à couteauxde type " Waring Blendor " dans un milieu aqueux. En général, I'obtention de particules solides d'un diamètre moyen inférieur à 5 500 pm peut être obtenu par une durée de broyage des graines dans le milieu aqueux de quelques minutes, de préférence entre 1 et 10 minutes et de manière tout à fait préférée entre 2 et 7 minutes, par exemple pendant une durée de 5 minutes. Le milieu aqueux de broyage est préférentiellement de l'eau mais peut 10 être également toute solution tampon, telle que par exemple les deux solutions tampons ci-dessous: * Tampon phosphate 0,1M obtenu à partir du dihydrogénophosphate de sodium dihydrate NaH2 P04, 2H20 et équilibré à pH 7,0 avec l'hydroxyde 15 de sodium Na OH. * Tampon tris (hydroxyméthyl) aminométhane ajusté à pH 7 avec de l'acide chlorhydrique. Autres milieux d'hydrolyse: réactivité en milieu NaCI 0,1 M. Toutefois, le recours à une solution tampon n'est pas privilégiée car une solution tampon est susceptible d'introduire des composés contaminants indésirables qu'il est difficile ou long d'éliminer, dans la suite du procédé. De préférence, lors de l'étape a) de broyage, les graines sont ajoutées au milieu aqueux à raison d'une proportion inférieure à 20%, de préférence 25 inférieure à 15%, en poids total du milieu aqueux contenant les graines. Pour une proportion de graines supérieure à 20% en poids total du milieu aqueux, l'étape a) de broyage est difficile, voire impossible à réaliser, du fait d'une viscosité trop grande du milieu aqueux. De plus, pour une proportion des graines supérieure à 20% en poids total du milieu aqueux 30 contenant les graines, l'étape e) de récupération des acides gras est difficile à réaliser de manière optimale, du fait d'une proportion de phase solide trop élevée. De préférence, la proportion en poids des graines, par rapport au poids total du milieu aqueux contenant les graines, est inférieure à 15%. En revanche, si les limites supérieures en proportion de poids des graines indiquées ci-dessus sont respectées, une cinétique optimale de la réaction d'hydrolyse et un degré d'hydrolyse d'au moins 95% des lipides sont obtenus quelle que soit la proportion en poids de graines utilisées, pour un 5 rapport poids de lipase/poids de graines donné. Ainsi, on a montré que la cinétique d'hydrolyse et le degré d'hydrolyse des lipides contenus dans les graines était identique avec un milieu aqueux de broyage contenant respectivement 10% et 13,5 % en poids de graines, par rapport au poids total du milieu aqueux contenant les graines, pour un rapport poids de 10 lipase/poids de graines identique. La lipase exogène, ajoutée à l'étape b) dans la suspension hétérogène liquide/solide obtenue à la fin de l'étape a), peut être de toute nature. Elle peut être une lipase obtenue à partir de microorganismes des genres Rhizopus, Mucor, Alcaligenes, Candida, Aspergillus, Pseudomonas, 15 Humicola, Thermomyces ou encore Penicillium ou à partir des lipases des végétaux. A titre illustratif, on peut utiliser la lipase obtenue à partir de Candida rugosa, comme décrit dans les exemples. De préférence, la lipase exogène est ajoutée à raison de 100 à 500 20 unités, de préférence de 150 à 400 unités de lipase, par gramme du poids des graines traitées à l'étape a). Une unité de lipase correspond à la quantité de lipase requise pour libérer 1 pmole d'acide gras à partir de glycéride, par minute, en conditions optimales d'activité catalytique de l'enzyme. On a en effet montré selon l'invention qu'une bonne cinétique d'hydrolyse était obtenue avec une quantité de lipase d'environ 100 unités par gramme de graines de départ et que le degré d'hydrolyse obtenu avec ce rapport lipase/graines atteignait environ 75% d'hydrolyse des lipides contenus initialement dans les graines. Pour des rapports lipase/graines supérieurs, la cinétique d'hydrolyse est encore améliorée et l'hydrolyse des lipides est presque complète. Ainsi, un degré d'hydrolyse des lipides supérieur à 90% est obtenu avec un rapport lipase/graines de 166 unités de lipase par gramme de poids de graines traitées à l'étape a). Pour des rapports encore supérieurs lipase/graines, bien que la cinétique d'hydrolyse soit accrue, le degré d'hydrolyse n'est pas significativement amélioré. Ainsi, pour un rapport lipase/graines de 333 unités de lipase par gramme du poids de graines traitées à l'étape a), un degré d'hydrolyse des lipides d'environ 95% est obtenu. Etape d'homogénéisation de la suspension de broyat de graines contenant la lipase exogène. A l'étape c), I'homogénéisation de la suspension liquide/solide contenant initialement des particules grossières de graines inférieures à 500 pm est réalisée jusqu'à l'obtention d'un homogénat constitué d'une émulsion des lipides contenus initialement dans les graines, en mélange avec les particules solides des graines. L'étape c) d'homogénéisation de la suspension hétérogène liquide/solide et contenant la lipase exogène peut être réalisée par tout moyen connu en soi. De préférence, l'étape c) d'homogénéisation est réalisée par homogénéisation sous pression ou encore par homogénéisation par 20 sonication. Homogénéisation sous pression Pour réaliser l'étape c) par homogénéisation sous pression, on peut 25 utiliser un homogénéisateur à haute pression tel que l'homogénéisateur du type Lab 1000 commercialisé par la Société APV (Evreux, France), selon les recommandations du fabricant. De préférence, I'homogénéisation sous pression est réalisée à une pression comprise entre 25 et 1000 bars, de préférence entre 100 et 500 30 bars, par exemple à 150 bars. Le saut de pression provoqué au milieu produit une onde de choc contribuant à la désintégration des cellules de la graine et disperse les lipides contenus dans la graine. De manière tout à fait préférée, l'étape c) d'homogénéisation sera 35 réalisée par deux cycles successifs d'homogénéisation sous pression. De manière surprenante, I'homogénéisation sous pression n'affecte pas l'activité spécifique de la lipase exogène. De plus, il a été observé que la réalisation de plusieurs cycles d'homogénéisation sous pression accroît le rendement final d'extraction des 5 acides gras, même si un tel traitement inhibe faiblement l'activité'de la lipase exogène. Ainsi, bien que l'étape c) d'homogénéisation peut être effectuée par 1 à 4 cycles de passages dans un homogénéisateur à haute pression, des résultats optimaux sont obtenus avec deux cycles d'homogénéisation à 10 haute pression. Dans ce cas, le rendement d'extraction des acides gras à la fin du procédé est accru sans affecter drastiquement l'activité de la lipase exogène. Homogqénéisation par sonication Selon une alternative avantageuse, l'étape c) d'homogénéisation de la suspension contenant la lipase exogène peut être réalisée par sonication de ladite suspension jusqu'à l'obtention d'un homogénat constitué d'une émulsion des lipides contenus initialement dans les graines, en mélange 20 avec les particules solides des graines. Pour réaliser l'étape c) d'homogénéisation par sonication, la suspension particules solides à laquelle a été ajoutée la lipase exogène est traitée par des ultrasons à une puissance supérieure à 20 Watts. La fréquence des ultrasons ne semble pas un paramètre essentiel du 25 traitement. Pour réaliser l'étape d'homogénéisation par sonication, on peut utiliser notamment le générateur d'ultrasons de type Vibracell commercialisé par la Société Bioblock Scientific (lllkrisch, France). On a montré selon l'invention qu'une bonne cinétique d'hydrolyse des 30 lipides ainsi qu'un haut degré d'hydrolyse étaient obtenus avec une puissance d'ultrasons supérieure à 20 Watts. Ainsi, pour une puissance d'ultrasons de 28 Watts, le degré d'hydrolyse après 120 minutes de réaction enzymatique atteint presque 90%. Pour des puissances d'ultrasons supérieures, la cinétique d'hydrolyse des lipides est encore accrue et le 35 degré d'hydrolyse augmente encore. Par exemple, un degré d'hydrolyse des lipides d'environ 95% est obtenu avec une puissance d'ultrasons de 82 Watts. De préférence, on utilise une puissance d'ultrasons comprise entre 20 et 200 Watts, et de manière tout à fait préférée entre 20 et 100 Watts. La durée de l'étape d'homogénéisation par sonication est avantageusement comprise entre 10 secondes et 10 minutes, de préférence entre 30 secondes et 5 minutes. Pour une durée de sonication de 30 secondes à la puissance de 64 Watts, on a observé une cinétique moyenne d'hydrolyse des lipides conduisant à un degré d'hydrolyse après 120 minutes 10 de réaction supérieur à 85%. Dans les mêmes conditions, une durée de sonication de 1 minute améliore considérablement la cinétique réactionnelle et un degré d'hydrolyse supérieur à 90% est atteint après 120 minutes de réaction. Des durées supérieures de sonication accroissent encore la cinétique 15 réactionnelle sans augmenter significativement le degré d'hydrolyse final. Quelle que soit la nature de l'étape c) d'homogénéisation, par homogénéisation à haute pression ou par homogénéisation par sonication, les degrés d'hydrolyse des lipides obtenus à la fin du procédé sont comparables. Ils sont en général supérieurs à 95%, dans les conditions 20 optimales indiquées ci-dessus. De même, les résultats obtenus dans les exemples montrent que le rendement final d'extraction des acides gras résultant de l'hydrolyse des lipides est sensiblement le même, que l'étape c) d'homogénéisation ait été réalisée par homogénéisation sous pression ou encore par homogénéisation 25 par sonication. On remarque toutefois qu'une homogénéisation sous pression produit des résultats légèrement supérieurs à ceux obtenus avec une homogénéisation par sonication. Le rendement total de l'extraction des acides gras à la fin du procédé est, dans le cas d'une homogénéisation sous 30 pression, supérieur de 6,5% au rendement observé lorsque l'étape c) d'homogénéisation a été réalisée par sonication. L'observation au microscope de l'homogénat obtenu à l'étape c) montre que cet homogénat est formé de gouttelettes lipidiques qui s'agrègent en petits amas formant une émulsion, I'homogénat contenant en outre de 35 nombreux débris solides des graines, notamment des débris de coque des graines ainsi que des débris cellulaires. La taille des gouttes grasses est en moyenne comprise entre 5 et 15 pm et leur surface apparaît fine et lisse, ce qui suggère que la stabilisation de l'interface huile/eau des gouttelettes ne fait pas intervenir de particules solides. Ainsi, I'homogénat contient les lipides contenus initialement dans les graines sous la forme d'une émulsion liquide/liquide avec l'eau présente dans le milieu aqueux que constitue ledit homogénat. Etape d'hydrolyse des lipides L'étape d) d'hydrolyse des lipides contenus dans l'homogénat obtenu à l'étape c) est réalisée par l'incubation de l'homogénat à une température comprise entre 15 C et 55 C, pendant une durée comprise entre 15 minutes et 5 heures. Durant cette étape, la lipase exogène catalyse la réaction d'hydrolyse des lipides, notamment des triglycérides, contenus sous la forme d'une émulsion liquide/liquide dans l'homogénat, respectivement en les différents acides gras constitutifs desdits lipides, d'une part, et des divers alcools, notamment le glycérol, avec lesquels lesdits acides gras étaient estérifiés 20 dans les sphérosomes des graines. Pour une température de 22 C, on observe une bonne cinétique d'hydrolyse des lipides associée à un degré d'hydrolyse supérieur à 85%. Lorsque l'on augmente la température de réaction, la cinétique d'hydrolyse des lipides s'accroît, ainsi que le degré d'hydrolyse final. Toutefois, un degré 25 d'hydrolyse d'environ 95% est déjà obtenu après 120 minutes de réaction à la température de 27 C. A des températures supérieures, la cinétique réactionnelle augmente, alors que le degré d'hydrolyse n'est pas significativement amélioré. Le procédé de préparation d'acides gras par hydrolyse in situ de 30 I'invention peut donc être réalisé à température ambiante sans nécessiter un chauffage du milieu réactionnel constitué de l'homogénat obtenu à l'étape c), ce qui rend ce procédé simple de mise en oeuvre et en outre peu onéreux. En outre, la possibilité de réaliser l'étape d) d'hydrolyse à basse température, par exemple entre 20 C et 30 C permet d'éviter, ou à tout le 35 moins de réduire, I'hydrolyse simultanée d'autres composés indésirables tels O10 que les glucosinolates, dont les produits d'hydrolyse soufrés engendrent des troubles thyrodiens chez l'homme et l'animal. En effet, à une température égale ou inférieure à 30 C, la myrosinase, qui est l'enzyme responsable de l'hydrolyse des glucosinolates, est peu active, I'activité catalytique optimale de cette enzyme se situant entre 40 C et 70 C. De plus, le fait qu'une bonne cinétique d'hydrolyse des lipides associée à un haut degré d'hydrolyse final soient atteints pour de larges plages de températures de l'étape d) d'hydrolyse, rend le procédé de l'invention particulièrement simple à réaliser, puisqu'aucune régulation 10 précise de la température de réaction n'est requise. Avantageusement, la durée de l'étape d) d'hydrolyse des lipides peut être adaptée en fonction de la température de réaction choisie. Toutefois, elle peut être réalisée de manière optimale pour une durée comprise entre 60 et 120 minutes à une température de réaction égale ou supérieure à 27 C. Le procédé de préparation d'acides gras par hydrolyse in situ des lipides contenus dans les graines d'une plante ci-dessus est très reproductible. On a montré que la différence de degré d'hydrolyse entre 0 et 15 minutes de réaction varie de manière linéaire avec le rapport pondéral lipase exogène/poids des graines. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, le demandeur pense que le haut niveau d'hydrolyse des lipides obtenus grâce au procédé de l'invention est due notamment à la nature spécifique de l'homogénat obtenu à l'issue de l'étape c) dudit procédé. L'étape c) d'homogénéisation permet en effet une rupture physique de la structure macroscopique des graines et une 25 libération dans le milieu aqueux des lipides contenus initialement dans les sphérosomes, qui sont des vésicules intracellulaires entourées d'une membrane. Le demandeur pense qu'au cours de l'étape c) d'homogénéisation, la lipase se localise sur toute la surface de l'interface huile/eau des gouttelettes lipidiques générées ce qui permet une hydrolyse 30 rapide et aussi complète que possible desdits lipides substrats qui sont facilement accessibles à l'enzyme. Etape de récupération des acides gras L'étape e) de récupération des acides gras résultant de l'hydrolyse des lipides réalisés à l'étape d) peut être effectuée par toute méthode d'extraction des lipides connus de l'homme du métier. De préférence, l'étape e) de récupération des acides gras comprend les étapes suivantes: el) séparation des acides gras des autres constituants de l'homogénat obtenu à l'étape d), sous la forme d'une émulsion; e2) extraction des acides gras à partir de l'émulsion, avec un solvant. Selon un mode de réalisation préféré de l'étape el), les acides gras sont séparés des autres constituants de l'homogénat obtenu à l'étape d) par obtention d'un milieu liquide à trois phases, respectivement une phase solide, une phase aqueuse et une phase d'émulsion lipidique, par 15 centrifugation de l'homogénat, puis récupération de la phase d'émulsion lipidique. L'obtention du milieu liquide triphasique est préférentiellement réalisée par centrifugation du milieu hétérogène liquide/solide réactionnel à la fin de l'étape d) d'hydrolyse. Le cas échéant, plusieurs centrifugations successives peuvent être réalisées afin d'améliorer le rendement du 20 procédé. A l'issue de la ou des centrifugations, on obtient un milieu triphasique comprenant respectivement (i) un culot solide comprenant essentiellement les débris solides des graines, coques ou débris cellulaires, (ii) une phase aqueuse et (iii) une phase huileuse sous la forme d'une émulsion. La phase huileuse sous la forme d'une émulsion constitue la phase enrichie en acides gras résultant de l'hydrolyse des lipides initialement contenus dans les graines. Cette phase huileuse représente environ 7 à 10% en poids du poids total du milieu réactionnel obtenu à la fin de l'étape d) d'hydrolyse. La phase d'émulsion huileuse est séparée des deux autres phases respectivement aqueuses et solides, par exemple par simple prélèvement à la surface du milieu triphasique obtenu après centrifugation. Lorsque plusieurs centrifugations successives sont réalisées, les fractions d'émulsions huileuses sont réunies en vue de procéder à l'étape e2) 35 d'extraction des acides gras avec un solvant. De préférence, l'extraction des acides gras est réalisée avec un solvant choisi parmi l'eau, un alcool, un ester, un carbonate organique ou une cétone. On a préférentiellement recours à l'eau pour l'extraction des acides gras sous forme d'une émulsion. On a préférentiellement recours à l'éthanol pour l'extraction des acides gras et l'obtention de concentrats, ainsi que pour la transformation ultérieure des acides gras en esters éthyléniques, pour des applications diverses, notamment dans des solvants, des lubrifiants, des cosmétiques, des 10 conservateurs, etc... On a préférentiellement recours à un ester ou à un carbonate organique pour la transformation ultérieure des acides gras, in situ ou ex situ. Le solvant précipite les protéines et les phospholipides contenus dans l'émulsion et solubilise les acides gras. La fraction de composés précipités et 15 la fraction d'acides gras solubilisés peuvent être aisément séparées, par exemple par centrifugation. Afin d'améliorer encore le rendement final du procédé, on procédera avantageusement à plusieurs cycles d'extraction avec le solvant, les fractions d'intérêt contenant les acides gras obtenus à la fin de chaque cycle 20 d'extraction étant ensuite réunies. De préférence, le solvant utilisé est l'éthanol, qui peut être par exemple ajouté à l'émulsion contenant les acides gras à raison de 1,5 à 2 volumes d'éthanol par volume d'émulsion. L'étape e2) d'extraction des acides gras à partir de l'émulsion à l'aide 25 d'un solvant est avantageusement suivie d'une étape e3) de séchage de la solution d'extraction contenant les acides gras. Avantageusement, l'étape de séchage peut être réalisée par simple évaporation, à pression atmosphérique ou encore sous vide jusqu'à atteindre un séchage complet des acides gras. Selon une autre alternative, I'étape e3) de séchage peut être une étape de séchage modéré dans lequel seul le solvant est éliminé, le milieu aqueux résiduel étant conservé. Le cas échéant, lorsque l'étape e3) de séchage des acides gras est réalisée de la manière modérée indiquée ci-dessus, le mélange acides 35 gras/eau peut être séparé par centrifugation. Selon ce mode de mise en oeuvre spécifique de l'étape e3) du procédé, la qualité des acides gras obtenus à la fin du procédé est la meilleure, car l'eau retient d'éventuelles impuretés tels que des peptides solubles dans l'alcool ou encore des traces de phospholipides. La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants. FIGURES La Figure 1 illustre la cinétique d'hydrolyse enzymatique in situ des 10 lipides endogènes de la graine de colza par la lipase issue de Candida rugosa avec une étape d'homogéinisation réalisée par sonication. La Figure 2 illustre les cinétiques d'hydrolyse enzymatique in situ des lipides endogènes de la graine de colza par la lipase issue de Candida 15 rugosa: comparaison des outils de cassage cellulaire, sonication ou homogénéisation haute pression. La Figure 3 illustre le pourcentage cumulé des lipides totaux extraits par centrifugation des milieux issus de l'hydrolyse enzymatique in situ de 20 l'huile de colza, après sonication ou homogénéisation La Figure 4 illustre les cinétiques comparatives d'hydrolyse enzymatique in situ des lipides endogènes de la graine de colza par la lipase issue de Candida rugosa (1):effet de la teneur en matière sèche dans le 25 milieu La Figure 5 illustre les cinétiques comparatives d'hydrolyse enzymatique in situ des lipides endogènes de la graine de colza par la lipase issue de Candida rugosa (2): effet de la puissance ultrasonore dissipée dans 30 le milieu. La Figure 6 illustre les cinétiques comparatives d'hydrolyse enzymatique in situ des lipides endogènes de la graine de colza par la lipase issue deCandida rugosa (3): effet de la durée du traitement ultrasonore. 35 La Figure 7 illustre les cinétiques comparatives d'hydrolyse enzymatique in situ des lipides endogènes de la graine de colza par la lipase issue de Candida rugosa (4): effet de la température sur la vitesse de réaction. La Figure 8 illustre les cinétiques comparatives d'hydrolyse enzymatique in situ des lipides endogènes de la graine de colza par la lipase issue de Candida rugosa (5): effet de la quantité de lipase introduite dans le milieu. La Figure 9 illustre l'hydrolyse enzymatique in situ des lipides endogènes de la graine de colza par la lipase issue de Candida rugosa: effet de la quantité de lipase introduite dans le milieu sur son activité spécifique et la vitesse initiale. La Figure 10 est un cliché photographique de microscopie photonique (grossissement x100) de l'homogénat à la fin de l'étape d'hydrolyse des lipides. La Figure 11 est un cliché photographique de microscopie photonique (grossissement x1000) de l'homogénat à la fin de l'étape d'hydrolyse des lipides La Figure 12 est un cliché photographique de microscopie photonique 25 (grossissement x400) de l'homogénat à la fin de l'étape d'hydrolyse des lipides EXEMPLES EXEMPLE 1: Homogénéisation par sonication A. MATERIEL ET METHODES 1. Prétraitement par broyage humide Les graines de colza sont additionnées d'eau de manière à obtenir les proportions 1: 8 en masses, respectivement. Ce mélange est alors versé dans un mixeur ménager de type " Warring blendor ". Le broyage est alors effectué pendant 5 minutes en ayant soin de ramener dans le fond du bol les particules qui adhèrent aux parois. Parallèlement, la lipase issue de Candida rugosa (Lipolyve, Lyven, Cagny, France) est solubilisée dans l'eau de 5 manière à obtenir une concentration de 10 mg/ ml. Quatre-vingt-dix grammes du broyat de graine précédemment obtenu sont additionnées de 10 grammes de solution enzymatique dans un bécher à double enveloppe de 150 ml. A ce stade, le milieu contient 10 % en masse de graines de colza et une quantité de lipase correspondant à 300 UL / g de graines. 2. Traitement par les ultrasons et mesure des cinétiques Le mélange obtenu après broyage à sec ou en présence d'eau est ensuite traité par les ultrasons (Vibracell, Bioblock Scientific, lilkirch, France) 5 minutes à 59 W (70% de période active). Le milieu est refroidi pendant la sonication par circulation d'eau froide dans la paroi du bécher. Après cette 15 étape, le courant d'eau froide est immédiatement remplacé par celui provenant d'un bain thermostaté à 37 C. On laisse alors le milieu évoluer sous agitation magnétique (250 rpm) pendant 120 minutes. Le suivi de la réaction est assuré par une série de prélèvement réalisés à des temps prédéterminés. Lors de ceux-ci, 1,5 ml de milieu sont transférés dans un tube 20 contenant 1 ml d'acide chlorhydrique et 5 ml de chloroforme. Après agitation vigoureuse, la phase organique est prélevée, séchée avec Na2SO4 anhydre, puis diluée 10 fois avant d'être injectée en CPG pour analyse dans une colonne capillaire BPX5 (SGE) dimensions 12m x 0,32 mm; épaisseur du film: 0,25 pm. Température du four: Gradiant de 80 C pendant 1 min 25 (10 C/min) 16 C jusqu'à 140 C; 7 C/min jusqu'à 300 C; 15 C/min jusqu'à 360 C maintenu pendant 10 min. Température du détectant 365 C. B. RESULTATS ET DISCUSSION Les cinétiques d'hydrolyse obtenues sont présentées sur la figure 1. Les résultats montrent qu'une bonne cinétique d'hydrolyse des lipides est obtenue, puisque la réaction d'hydrolyse atteint un plateau après seulement minutes de réaction. Le degré d'hydrolyse atteint 90%. EXEMPLE 2: Homogénéisation sous pression. Comparaison avec l'homogqénéisation par sonication. La présence d'amas cellulaires ne libérant pas la totalité des lipides 5 inclus dans les cellules qu'ils contiennent nous a amené à chercher un autre outil de remplacement assurant une rupture plus complète des cellules de la graine. Déjà utilisé dans des domaines variés en agroalimentaire, I'homogénéiseur haute pression nous est paru être une alternative envisageable. Wasche et a/. (1993, Wasche A., Luck T. Holley W, 1993. 10 " Influence of technological parameters and protein properties on the aqueous extraction and demulsification of oil from rapeseed " In Food proteins: Structure and functionality developed from the 4th Symposium on food, Schwenke K.D. (Ed.) Weinheim 198-200), ont par ailleurs décrit ce procédé comme efficace pour l'extraction aqueuse d'huile de colza. Cet outil 15 a été choisi pour sa compatibilité avec le travail à l'échelle industrielle en plus de sa robustesse. Son principe de fonctionnement consiste à forcer le liquide à émulsionner au moyen d'une pompe à débit constant, au travers de l'espace de quelques pm laissé libre par une vanne de contre-pression. La pression en amont de cette dernière devient alors très forte, et la 20 décompression brutale en aval de cette vanne entraîne la rupture des macrostructures telles que les cellules. La description détaillée du mode de fonctionnement de ce type d'appareil a été par ailleurs décrite en détail par Lecluse W.J. (1979, Homogénéisations à haute pression, préparation d'émulsions et de dispersions. Information Chimie 191, 1-8). Ce procédé a 25 pour avantage d'être continu et d'obliger le traitement homogène de tout le milieu, contrairement à la sonication pour laquelle les particules ne passent dans la zone active que périodiquement. A. MATERIEL ET METHODES La lipase est ajoutée au milieu après broyage 5 minutes des graines en présence d'eau. L'étape de sonication est quant à elle remplacée par deux cycles d'homogénéisation par un homogénéisateur Lab 1000 (APV, Evreux, France) muni de deux étages d'homogénéisation. La pression du 35 premier étage d'homogénéisation est réglée à 150 bars, celle du second étage étant fixée à 20 bars, en accord avec les résultats publiés par Wâsche et al.(1993) et avec les recommandations du fournisseur. La teneur en graine du milieu est de 13,5% en masses et le rapport lipase / graines est fixé à 333 UL /g de graines, afin de pouvoir comparer les cinétiques mesurées avec 5 celles déjà obtenues auparavant avec l'utilisation des ultrasons. Comme lors des précédents essais, le chronomètre est déclenché à l'addition de la lipase, soit juste avant le début du passage du milieu dans l'homogénéisateur. B.RESULTATS La comparaison des cinétiques obtenues avec sonication ou homogénéisation, tous les autres paramètres restant par ailleurs identiques, peut être effectuée au moyen de leur représentation graphique présentée sur la figure 2. Les deux cinétiques obtenues ont un profil similaire, mais ne sont cependant pas superposables. En effet, la courbe obtenue suite aux essais faisant intervenir l'homogénéisation montre une hydrolyse moins rapide que lors de l'utilisation des ultrasons. Cependant, il est à noter que le maximum 20 de degré d'hydrolyse (DH) obtenu après deux heures de réaction est similaire dans les deux cas. L'obtention d'un DH de l'ordre de 95% en 2 heures montre clairement que l'homogénéisation est capable de générer des conditions adéquates pour l'hydrolyse enzymatique in situ des lipides du colza. Il aurait été 25 possible que la violence du traitement subi par le milieu dégrade la lipase, la rendant inactive. Par ailleurs, les essais de ce nouveau matériel ont été réalisés sans aucune optimisation. La vitesse d'hydrolyse mesurée ne représente donc pas a priori un optimum de réactivité, et la gamme de pressions d'homogénéisation possibles pour l'appareil utilisé est assez 30 étendue. Ainsi, il est possible de faire varier la pression d'homogénéisation, mais aussi sur le nombre de passages effectués ou la pression du second étage d'homogénéisation. Conclusion Les premiers résultats cinétiques obtenus lors de l'hydrolyse enzymatique des lipides du colza assistée par l'homogénéisation montrent que celle-ci est possible dans ces conditions de procédé. Même si sa vitesse 5 initiale est inférieure à celle obtenue lorsque la réaction est réalisée après sonication, le DH final reste identique. EXEMPLE 3: Analyse des caractéristiques physico-chimiques de l'homoqénat obtenu à l'étape c) du procédé 1. Définitions et abréviations AG: acides gras MG: monoglycérides DG: diglycérides TG: triglycérides UL: Unité Lipase, correspondant à la quantité de lipase nécessaire pour libérer 1 pmol. d'acide gras par minute, à partir de glycérides en conditions optimales de fonctionnement. Inhibition: perte réversible ou irréversible d'une partie de l'activité d'une 20 enzyme suite à un phénomène physique ou du fait d'une interaction avec une ou plusieurs molécules US: ultrasons CPG: chromatographie en phase gazeuse DH: degré d'hydrolyse, défini comme étant le pourcentage de liaisons ester 25 rompues lors de l'hydrolyse de l'huile en acides gras. AS: Activité spécifique, définie comme la vitesse de formation des acides gras rapportée à la quantité de préparation enzymatique introduite. 2. Caractérisation de l'émulsion 2.1 Préparation d'hydrolysat et d'émulsion Protocole de préparation de I'hvdrolvsat: Un litre de milieu à 15 % en masse est préparé par passage de 5 minutes au mixer de 150g de graines de colza dans 850mL d'H20. Après 35 passage au mixer, la quantité de milieu récupérée est pesée afin d'estimer la quantité de graines (15 % de la masse récupérée). L'hydrolyse est réalisée avec l'enzyme " LIPOLYVE CC " dont la concentration est 30 unités/mg. La solution d'enzyme est préparée dans de l'eau afin d'obtenir après mélange avec le milieu une concentration d'enzyme de l'ordre de 300 unités 5 par gramme de graines et une concentration de graines dans le milieu de l'ordre de 13.5 % en masse. La solution d'enzyme est ajoutée au milieu et le tout est passé à l'homogénéisateur 2 cycles à 350 bars. L'homogénat (milieu passé à l'homogénéisateur) ainsi récupéré est placé dans un réacteur à 37 C avec 10 agitation à 250 rpm durant deux heures. L'hydrolysat (homogénat après 2 heures d'hydrolyse à 37 C) est finalement conservé à 4 C. Protocole de récupération de l'émulsion: L'émulsion est préparée à partir de l'hydrolysat par centrifugation. Après agitation, I'hydrolysat est centrifugé 5 minutes à vitesse maximale. Lors de la dernière préparation d'émulsion, I'hydrolysat a été centrifugé 5 minutes à 7600 G. Lors de la centrifugation, les différentes phases sont séparées et il est possible de récupérer l'émulsion par filtration sur une maille 20 fine. Le culot est ensuite remis en suspension dans la phase aqueuse avant d'être centrifugé une deuxième fois dans les mêmes conditions. L'émulsion formée est ainsi récupérée deux autres fois. Après trois centrifugations, seule l'émulsion est conservée et stockée à 4 C. De cette manière, il est possible de récupérer 75g d'émulsion à partir 25 de 1000g d'hydrolysat. 2-2 Calcul de la densité de l'émulsion Les calculs de densité ont été réalisés par pesée de volumes précis (pesée de 5mL dans une fiole jaugée). Le résultat obtenu est une moyenne 30 de trois mesures réalisées sur des émulsions indépendantes. Densité de l'émulsion: 0,943 /L 0,004 g/mL 2-3 Détermination de la matière sèche La détermination de la matière sèche permet de calculer la quantité 35 d'eau contenue dans l'émulsion. La quantité de matière sèche est calculée par pesée d'un certain volume d'émulsion (environ 4mL) avant et après passage de 6 heures dans une étuve à 103 C. Pour éviter des pertes d'émulsion par projections, le volume d'émulsion pesé est mélangé à du sable avant d'être placé à l'étuve. Toujours pour éviter les pertes, les pesées 5 sont effectuées avec la coupelle en aluminium contenant l'émulsion, avec le sable et avec la spatule ayant servi à mélanger le sable et l'émulsion. La quantité restante après 6 heures à 103 C représente la matière sèche. La différence de poids nous renseigne sur la quantité d'eau contenue dans l'émulsion. Ce test à été effectué sur trois émulsions indépendantes. Quantité d'eau contenue dans l'émulsion: 32,5 +I 0,6 % d'H20 2-4 Détermination de la teneur en acide On attend par l'huile la quantité d'acides gras issus de l'hydrolyse des 15 triglycérides des lipides des graines broyées. La teneur en huile de notre émulsion est déterminée selon une "méthode simplifiée par extraction à l'hexane" (Norme V 03-908). Pour des raisons de sécurité, il a été utilisé du cyclohexane et non de l'hexane. Cette teneur est déterminée sur la matière sèche nous ayant permis 20 de calculer la quantité d'eau contenue dans l'émulsion. Pour éviter de fausser les résultats, la coupelle en aluminium contenant la matière sèche ainsi que la spatule ont été placées dans la cartouche du soxhlet. Après 6 heures d'extraction à chaud, les soxhlets sont démontés et le cyclohexane évaporé sous vide. Teneur en huile = ((mi - mo) / messai) X 100 m0: tare du ballon en grammes ml: masse ballon après évaporation du cyclohexane en grammes messai: masse d'émulsion, en grammes, utilisée pour obtenir la matière sèche Teneur en huile de l'émulsion: 58,3 +L 1,3 % 30 2-5 Dosage des protéines selon la méthode Kjeldahl Le dosage des protéines contenues dans l'émulsion se fait indirectement par dosage de l'azote selon la méthode Kjeldahl: minéralisation et distillation à la vapeur. Le protocole suivi pour le dosage des protéines sur l'émulsion dérive de la note d'application fournie avec le système de minéralisation " TECATOR 2020 Digestor ": * prise d'essai d'environ 300mg (pesée au mg près) placée dans tube de minéralisation * ajout de deux " Kjeltabs CK " (Thompson & Capper LTD, Ref. AA17) * ajout de 12mL d'H2SO4 95% puis légère agitation * fixation de la tête d'aspiration sur les tubes, aspiration maximum * tubes introduits dans bloc de minéralisation " TECATOR 2020 Digestor" à 420 C * au bout de 5 minutes, réglage de l'aspiration pour conserver les vapeurs acides à l'intérieur de la tête d'aspiration en ayant une position correcte de l'anneau de condensation * minéralisation poursuivie pendant une heure pour obtenir une solution limpide de couleur bleu/vert * après 20 minutes de refroidissement, la distillation est réalisée avec l'appareil Kjeltec 1026 * introduction dans le distillateur d'une fiole conique contenant 25mL de solution d'indicateur (acide borique 4 %, vert de bromocrésol lx10 0-3%, rouge de méthyle 7x104%) * distillation sur l'appareil Kjeltec 1026 avec les réglages suivants: Alkali 2 (3 volumes sont parfois nécessaires), Delay 2 et Steam 36 * titration du distillat avec une solution d'acide chlorhydrique 25 0.0136 N Deux dosages de l'azote ont été réalisés sur chacune des trois émulsions indépendantes. % Azote = ((VHclessai VHCIblanc) X NHCI X 14.007 x 100) / m V: volume HCI utilisé pour la titration en mL m: masse d'échantillon d'émulsion en milligrammes %Protéines = %Azote x F F: facteur de conversion de l'azote en protéines, dans notre cas 6.25 Teneur en protéines de l'émulsion: 7,24 +/L 0,47 % 26 Dosage du phosphore contenu dans l'émulsion Dosage colorimétrique du phosphore contenu dans l'émulsion selon la Norme NF-T 60-227 Tableau 1: Préparation de la gamme étalon pour le dosage du phosphore [PO421 mg/mL 0. 4 0.2 0.1 0.05 0 Vanadate 0.25% (pL) 800 800 800 800 800 Molybdate 5% (pL) 800 800 800 800 800 HNO3 6N (pL) 240 320 360 380 400 H2PO4, HNO3 6N (pL) 160 80 40 20 O * de la même manière les échantillons sont préparés directement dans les cuves avec 400pL de cendres dissoutes dans l'acide, 800pL de Vanadate 0.25% et 800pL de Molybdate 5% * après 20 minutes (formation du complexe vanadomolybdique), I'absorbance de la gamme étalon et des échantillons est mesurée à 460nm * avec la courbe étalon, on obtient pour chaque échantillon une concentration en phosphore dans les cendres dissoutes * la teneur en phosphore de l'émulsion est finalement calculée avec la masse d'émulsion connue Le dosage du phosphore a été réalisé sur trois émulsions indépendantes. Teneur en phosphore = ([P0421 x 0.05) x (100 / m) [P042-] concentration en phosphore des cendres dissoutes en mg/mL m: masse de la prise d'essai en grammes Teneur en phosphore de l'émulsion: 0,148 +/ 0,004 % Il est aussi possible avec ce dosage d'estimer le pourcentage en masse des phospholipides en multipliant la teneur en phosphore par un facteur 26. Nous obtenons donc ainsi: Teneur en phospholipides de l'émulsion: 3,8 +L 0,1 % 2-7 Caractéristiques de l'émulsion Nous pouvons maintenant faire une synthèse des composants de l'émulsion 20 avec leurs proportions respectives. L'émulsion est composée de: 32,5 % d'H20 +/ 0,6% 58,3 % d'huile +/. 1,3% 7,24 % de protéines +*. 0,47% 3,8 % de phospholipides +/. 0,1% L'émulsion a une densité de 0,943 +/. 0,004% EXEMPLE 4: Extraction des acides iras après hydrolyse des lipides. 30 A. MATERIEL ET METHODES Les milieux utilisés pour réaliser ces essais sont obtenus par homogénéisation sous pression ou par homogénéisation par sonication, comme indiqué dans les Exemples 1 et 2 L'homogénéisation par sonication a été réalisée par sonication continue à la puissance de 82 W. Quarante grammes de milieu hydrolysé sont centrifugés 5 min à 2500 g. La phase aqueuse et l'émulsion sont transférés dans une ampoule à 5 décanter o elles sont mélangées avec 30 ml de méthanol puis 30 ml de chloroforme. Cette mixture est centrifugée 5 minutes, puis la phase chloroformique est prélevée, tandis que le reste est extrait une seconde fois par 30 ml de chloroforme. La masse de matière grasse ainsi extraite est pesée après 10 évaporation sous vide du chloroforme. Pour sa part, le culot est pesé avant d'être complété avec de l'eau distillée jusqu'à obtention de la masse initiale de milieu traité. L'ensemble est ensuite homogénéisé par agitation vigoureuse 30 secondes. Cette nouvelle suspension est alors traitée comme le milieu initial par centrifugation puis 15 extraction de la matière grasse des phases supérieures au solvant. Au total, 4 cycles sont effectués de cette manière, le dernier culot obtenu étant lui aussi extrait par le chloroforme et le méthanol après avoir été remis en suspension dans 15 ml d'eau distillée. Un bilan sur les lipides pourra ainsi être réalisé. Chaque essai a été réalisé à trois reprises pour déterminer l'erreur sur la valeur expérimentale B. RESULTATS Si l'étude cinétique de la réaction d'hydrolyse in situ des lipides du 25 colza après mise en interaction des glycérides et de la lipase par homogénéisation donne une bonne idée des possibilités de ce type de procédé en terme de réactivité, l'étude de l'extractibilité des acides gras formés est primordiale. En effet, c'est surtout en vue d'améliorer le rendement d'extraction des lipides que l'homogénéisation a été testée en 30 tant qu'outil de cassage cellulaire. Ces essais vont donc permettre de comparer l'extractibilité à l'eau des lipides suivant le type de procédé utilisé. Le pourcentage cumulé des lipides totaux extraits après chaque cycle de lavage est présenté sur la figure 3. La comparaison des résultats obtenus pour une hydrolyse faisant intervenir la sonication ou l'homogénéisation nous 35 montre une extractibilité des lipides identique lors du premier cycle. Cependant, le pourcentage total des lipides extraits au cours des cycles suivants est nettement plus élevé si le milieu a subi un traitement d'homogénéisation sous pression. En effet, une différence de 6,5% est observée sur le rendement total. Cette différence montre que l'homogénéisation du milieu à haute 5 pression libère une plus grande quantité d'acides gras sous forme d'émulsion. Ceci suggère que la rupture des parois cellulaires est plus étendue que lors des expériences faisant intervenir la sonication. La similitude entre les rendements d'extraction lors du premier cycle de centrifugation semblerait indiquer que les interactions entre les particules 10 de l'émulsion et les débris cellulaires sont à peu près équivalentes dans les *deux cas. Conclusion La préparation des milieux d'hydrolyse par broyage suivi 15 d'homogénéisation permet d'améliorer nettement le rendement total d'extraction des acides gras produits lors de la réaction. La différence mesurée après 4 cycles de lavage / centrifugation est de 6,5%. Par contre, l'extractibilité observée après le premier cycle d'extraction aqueuse laisse penser que les interactions entre les gouttelettes d'émulsion et les débris 20 cellulaires du culot sont du même ordre dans le cas de l'utilisation des ultrasons ou de l'homogénéisation sous pression. EXEMPLE 5: Conditions optimales de quantités de graines dans le milieu de broyage de départ A. MATERIEL ET METHODES. Quantité de graines. La proportion de graines introduites dans le milieu conditionne 30 directement le taux de remplissage du réacteur en substrat glycéridique. En effet, lors de l'augmentation de la teneur en graines du milieu, celuici est logiquement enrichi en glycérides et en protéines, qui représentent respectivement 46,5 et 18 % de la masse fraîche des graines de colza utilisées.En conséquence, on a fait varier la quantité de graines dans le 35 milieu dans la limite des possibilités du matériel. La réponse mesurée au cours de cette étude est l'évolution du degré d'hydrolyse (DH) au cours du temps. Procédé Le protocole de mesure des cinétiques réactionnelles est réalisé avec utilisation du broyage humide comme étape de prétraitement avant sonication. Afin que cette dernière étape du procédé ne soit pas limitante, la sonde à ultrasons a été réglée à sa puissance maximale, soit 82 W avec une période active de 100 %. Deux teneurs en graines ont été testées: 10 et 10 13,5%. Au delà, la sonde à ultrasons s'échauffe, ce qui présente un risque de détérioration du matériel. Comme précédemment, chaque essai a été réalisé à trois reprises afin de s'assurer de la reproductibilité. B. RESULTATS Les cinétiques obtenues, présentées sur la figure 4, sont superposables, aux erreurs expérimentale près. La vitesse d'hydrolyse y est rapide pendant les 30 premières minutes, pour se ralentir ensuite progressivement jusqu'à atteindre un pallier après 60 minutes de réaction, pour une valeur optimale de DH de 95%. De toute évidence, I'efficacité de la lipase ne semble pas être affectée par cette variation de la teneur en matière sèche. Ceci semble logique car si la proportion de graines introduite dans le milieu diffère, le rapport enzyme / graine ne varie pas. Ceci signifie que ni le ratio glycérides/ lipase ni la proportion de protéines par rapport à l'enzyme n'ont évolué. Ainsi, l'apport de 25 composés potentiellement inhibiteurs est contrebalancé par l'ajout en parallèle d'une proportion identique de lipase. Le seul paramètre qui aurait pu être limitant est la quantité d'eau disponible pour que la réaction ait lieu. Les résultats expérimentaux montrent que ce n'est pas le cas. Cependant, le type de procédé utilisé ne permet guère d'augmenter 30 plus la quantité de graine présente dans le milieu, car la sonde à ultrasons s'échauffe rapidement. Par ailleurs, le broyage devient impossible à réaliser dès 20% de teneur en graines pour cause de trop forte viscosité. Enfin, la décantation centrifuge n'est plus possible si la proportion de phase solide (culot) est trop élevée. Conclusion La réactivité ne semble pas affectée par l'augmentation de la teneur en matière sèche dans le réacteur. Cependant, la viscosité du milieu 5 croissant rapidement avec la proportion de graines, notre matériel ne permet pas de réaliser des essais avec un milieu comportant une quantité plus élevée de graines. EXEMPLE 6: Conditions optimales de l'homogénéisation par 10 sonication Puissance des ultrasons On a montré que l'efficacité de la lipase lors de l'hydrolyse des glycérides dépend étroitement des interactions que ces deux familles de molécules parviennent à établir entre elles. Les ondes ultrasonores étant 15 I'outil de cette mise en contact par le biais de la création d'interface, il est donc raisonnable de penser que de leur intensité va dépendre la réactivité dans le milieu. Procédé Un mélange contenant 15 % de graines de colza dans l'eau distillée est broyé pendant 5 minutes dans un mixeur ménager de type " Warring blendor ". Parallèlement, la lipase issue de Candida rugosa (Lipolyve, Lyven, Cagny, France) est solubilisée dans l'eau de manière à obtenir une concentration de 10 mg I ml. Quatre-vingt-dix grammes du broyat de graine 25 précédemment obtenu sont additionnées de 10 grammes de solution enzymatique dans un bécher à double enveloppe de 150 ml. A ce stade, le milieu contient 13,5 % en masse de graines de colza et une quantité de lipase correspondant à 333 UL / g de graines. Le mélange est ensuite traité par les ultrasons (Vibracell, Bioblock Scientific, 30 Illkirch, France) 5 minutes à 12, 28, 47, 64 ou 82 W (100% de période active) selon les essais. Le milieu est refroidi pendant la sonication par circulation d'eau froide dans la paroi du bécher. Après cette étape, le courant d'eau froide est immédiatement remplacé par celui provenant d'un bain thermostaté à 37 C. On laisse alors le milieu évoluer sous agitation 35 magnétique (250 rpm) pendant 120 minutes. Le suivi de la réaction est assuré par une série de prélèvement réalisés à des temps prédéterminés. Lors de ceux-ci, 1,5 ml de milieu sont transférés dans un tube contenant 1 ml d'acide chlorhydrique et 5 ml de chloroforme. Après agitation vigoureuse, la phase organique est prélevée, séchée avec Na2SO4 anhydre, puis diluée 10 5 fois avant d'être injectée en CPG pour analyse. Chaque essai a été réalisé à trois reprises pour déterminer l'erreur sur la valeur expérimentale B. RESULTATS L'effet de la puissance ultrasonore dissipée dans le milieu réactionnel 10 est présenté sur la Figure 5. La superposition des courbes de cinétique d'hydrolyse en fonction du temps nous permet une comparaison des différents résultats obtenus. Il apparaît de suite sur ce graphique que plus la puissance ultrasonore utilisée est forte, plus la vitesse de réaction est élevée. Cette observation vérifie l'importance du rôle de l'étape de sonication du 15 milieu. En effet, elle conditionne en grande partie la réactivité, et ces essais montrent que le contrôle de la puissance ultrasonore dissipée est primordial. Nous avions vu que les ultrasons permettent de briser les parois cellulaires et ainsi de libérer les lipides que renferme la graine. Le mécanisme de cette rupture cellulaire est lié à la cavitation engendréepar les ultrasons. 20 L'intensité de celle-ci dépendant de la puissance des ondes acoustiques qui la génère, il semble donc logique que l'augmentation de la puissance fournie par la sonotrode se concrétise au sein du milieu par une meilleure mise en interaction des lipides et de la lipase. Il s'ensuit alors une exaltation de la réactivité, que l'on peut observer au travers de l'amélioration des cinétiques 25 de croissance du DH lors de l'augmentation de la puissance de sonication utilisée. Ainsi, les résultats obtenus confirment l'importance de la mise en interaction de la lipase et des lipides pour que l'hydrolyse des glycérides ait lieu de manière optimale. Conclusion La comparaison des cinétiques d'hydrolyse in situ des lipides de la graine pour différentes puissances de sonication utilisées durant la préparation du milieu nous permet de montrer une influence positive de la 35 puissance ultrasonore utilisée. L'augmentation de celle-ci permet un meilleur cassage des cellules de la graine, ce qui améliore la mise en interactions des lipides et de la lipase. Ces résultats confirment donc l'hypothèse de travail selon laquelle la réactivité du milieu réactionnel est étroitement liée aux interactions lipides /lipase. EXEMPLE 7: Conditions optimales de l'homogénéisation par sonication - Durée de la sonication. Nous venons de montrer que la puissance de sonication influe fortement sur la cinétique réactionnelle. Ce paramètre est également à 10 coupler avec la durée de traitement ultrasonore appliqué. Dans cet exemple, on vise à déterminer l'influence du temps de sonication. Procédé La période de sonication a été fixée tour à tour à 30 sec., 1 min. , 2 min., 3 min. et 5 min pour une puissance ultrasonore fixée à 64 W. L'évolution du DH en fonction du temps est utilisé comme réponse, chaque essai étant répété à trois reprises pour s'assurer de sa reproductibilité. B RESULTATS Les résultats sont présentés sur la Figure 6. Les cinétiques obtenues lors de l'hydrolyse des lipides du colza in situ avec différentes durées de sonication à 64W sont représentées sur la figure 6. Les vitesses d'hydrolyse observées sont d'autant plus rapides que la 25 durée de la période de passage du milieu aux ultrasons est longue. Cependant, les courbes obtenues pour 3 et 5 minutes de traitement du milieu par les ultrasons sont superposables, aux erreurs expérimentales près.D'après ces résultats, la durée de sonication du milieu joue donc un rôle positif jusqu'à un certain point. Pour des temps de traitement supérieurs, un 30 plateau est atteint. L'effet positif de la durée de sonication semble logique au vu des résultats obtenus dans le cadre des essais sur l'impact de la puissance ultrasonore dissipée dans le milieu. L'augmentation du temps de passage 35 aux ultrasons favorise leur action. Il s'ensuit une disruption plus complète des parois cellulaires, ce qui améliore l'accessibilité de la lipase à son substrat lipidique. Autrement dit, I'augmentation de la durée de sonication favorise les interactions entre l'huile de la graine et la lipase, ce qui explique une augmentation de la réactivité. Le pallier se justifie quant à lui l'aboutissement 5 à un maximum du processus de lyse cellulaire pour lequel la puissance sonore introduite dans le milieu devient limitante pour la poursuite de la dégradation des structures biologiques de la graine. En conséquence, on atteint un maximum de réactivité pour une puissance ultrasonore donnée. Les résultats présentés dans l'exemple indiquent qu'une période de 10 sonication de 3 minutes est suffisante pour mener l'hydrolyse dans des conditions optimales. Par contre, pour toute durée inférieure de traitement, la réactivité sera moindre. Conclusion La durée de sonication du milieu est un paramètre important, qui joue un rôle positif sur la réactivité. L'explication de ces observations est proche de celle avancée pour justifier l'influence de la puissance ultrasonore appliquée au milieu. Un maximum est observé pour une durée de traitement supérieure ou égale à 3 minutes, au delà desquelles il n'y a plus 20 d'amélioration des interactions entre la lipase et son substrat. EXEMPLE 8: Conditions optimales de l'étape d'hydrolyse des lipides Température de la réaction d'hydrolyse. A. MATERIEL ET METHODES La puissance ultrasonore dissipée dans le milieu est de 82 W et la température est fixée à 22, 27, 32, 37 ou 42 C. Les différentes cinétiques de DH obtenues sont comparées entre elles. Chaque essai est répété 3 fois et un écart-type est calculé. B.RESULTATS Les résultats obtenus pour chaque température sont représentés sur la figure 7 pour permettre une comparaison. On observe que les cinétiques obtenues pour les hydrolyses réalisées à 42 C et 37 C sont totalement superposables et semblent très légèrement supérieures à celles obtenues 35 pour une température de 32 C ou 27 C. L'évolution du DH pour les réactions menées à 27 C est quant à elle la plus faible, mais reste malgré tout assez proche de celle observée pour les autres températures. Ces résultats démontrent clairement qu'une réactivité correcte peut avoir lieu pour des températures inférieures à 37 C. En fait, ce paramètre 5 paraît avoir une faible incidence sur la vitesse d'hydrolyse dans la plage de 20 C explorée. Selon toute vraisemblance, il doit être possible de réaliser l'hydrolyse des triglycérides du colza sans que celle des glucosinolates ne se produise. En effet, une température de réaction proche, voire inférieure à 300C paraît défavorable pour une activité optimale de la myrosinase (enzyme 10 responsable de l'hydrolyse des glucosinolates), puisque son optimum de fonctionnement se situe entre 40 et 70 C (Maheshwari et al., 1981 Maheshwari P.N., Stanley D.W., Gray J.J., 1981, Detoxification of rapeseed products. J. Food Protection, Vd. 44(6): 459-470). A contrario, la lipase montre une activité optimale ou sub-optimale pour des températures de 15 lI'ordre de 30 C. La capacité pour la lipase de travailler à des températures inférieures à celles utilisées jusqu'à présent présente également un intérêt au niveau de la consommation énergétique, qui peut de cette façon être diminuée. Enfin, ces essais montrent qu'une régulation très précise de la température n'est 20 pas nécessaire, puisque la lipase assure l'hydrolyse optimale des triglycérides de la graine en acides gras sur une plage d'environ 10 C et perd peu d'activité au delà. Conclusion Les essais de modification de température du milieu lors de l'hydrolyse in situ de lipides de la graine de colza montrent que cette réaction est peu sensible à ce paramètre. Ceci nous ouvre des perpectives en terme d'élimination de la réaction parasite d'hydrolyse des glucosinolates hydrosolubles et inoffensifs pour la santé en des composés soufrés gênants 30 par leur toxicité tant sur le plan nutritionnel que pour le catalyseurs industriels d'hydrogénation. Une réflexion plus approfondie est donc à poursuivre sur ce point. La faible sensibilité de la réaction à la température permet également une économie énergétique supplémentaire et l'absence de nécessité d'assurer une régulation fine de ce paramètre. 35 EXEMPLE 9: Conditions optimales de l'étape d'hydrolyse des lipides Rapport Unités de lipase/Poids de graines de départ. La quantité de lipase est un second facteur déterminant pour la réactivité. La détermination de ce paramètre permet ainsi de déterminer 5 I'influence du rapport enzyme / graines sur la réactivité et sur l'efficacité de la lipase, notamment en ce qui concerne des inhibitions de l'enzyme par des composés de la graine. A. MATERIEL ET METHODES Procedure Le protocole suivi est identique aux exemples précédents, avec une puissance ultrasonore fixée à 82 W, une température de 37 C. La quantité de lipase est quant à elle variable selon les essais, les différents rapports 15 lipase / graines testés étant de 27,7, 55, 111, 222 et 333 UL I g de graines. Tout comme lors des expérimentations précédentes, chaque point a été réalisé 3 fois afin de déterminer la barre d'erreur expérimentale. B.RESULTATS Les cinétiques obtenues pour les différentes concentrations en lipase sont exposées sur la figure 8. On observe que la croissance du DH en fonction du temps est d'autant plus rapide que la quantité d'enzyme introduite est élevée. D'autre part aucun optimum de réactivité en fonction de la quantité de lipase ajoutée ne semble atteint. Ces résultats confirment le rôle positif du rapport enzyme /substrat sur la réactivité. Afin de mieux appréhender la relation entre le rapport lipase /graine et la cinétique réactionnelle, on a étudié les vitesses initiales moyennes d'hydrolyse mesurées entre 0 et 15 minutes. La différence de DH entre 0 et 30 15 minutes a par conséquent été calculée à partir des résultats présentés sur cette figure. Cette réponse est bien représentative de la vitesse moyenne d'hydrolyse pendant cette période, puisque: [AG] DH= x100 [A(J] + [MGJ + 2 [DG] + 3[TL(] O: [AG] est la concentration molaire en AG, [MG] est la concentration molaire en MG, [DG] est la concentration molaire en DG, [TG] est la concentration molaire en TG. Dans la formule ci-dessus, le dénominateur représente concentration totale en radicaux acides gras, qu'il soient sous forme libre ou liée au glycérol. Cette somme reste par conséquent constante, quel que soit le DH. La différence de DH entre 0 et 15 minutes est donc égale à la quantité d'acides gras produits durant cette période, normalisée par la quantité de 10 radicaux acide gras totaux. Par ailleurs, on a également rapporté la vitesse initiale moyenne d'hydrolyse à la masse de poudre enzymatique introduite dans le milieu. L'activité spécifique moyenne (AS) ainsi calculée nous permettra ainsi de déceler un éventuel effet du rapport lipase /graine sur les performances de 15 cette enzyme. Les résultats des calculs, accompagnés de leur barre d'erreur expérimentale sont présentés sur la figure 9. La différence de DH entre 0 et 15 minutes semble varier linéairement avec le rapport lipase/graines. Un ajustement linéaire a été réalisé pour confirmer cette tendance. Le coefficient de détermination de cette droite est 20 de 0,97, ce qui signifie une bonne linéarité des résultats. Par ailleurs, la droite d'ajustement passe par toutes les barres d'erreurs, ce qui suggère que les écarts observés entre la théorie et les valeurs expérimentales sont explicables. La proportionnalité entre la quantité d'enzyme et la vitesse initiale de 25 réaction nous indique que ce facteur est limitant de l'hydrolyse, pour des conditions de procédé de mise en contact données. Par ailleurs, la droite de régression passe par zéro. On ne trouve donc pas d'inhibition pour les faibles quantités de lipase. Cette observation est par ailleurs confortée par les calculs d'activité 30 spécifique qui indiquent que l'enzyme conserve, aux erreurs expérimentales près, une efficacité relativement constante quelle qu'en soit la concentration. Cependant, ces données n'indiquent pas pour autant que l'efficacité de la lipase à l'interface est optimale. En effet, les résultats obtenus dans les exemples précédents montrent que les étapes de cassage des parois 35 cellulaires jouent un rôle très important sur celle-ci. L'exemple le plus illustratif est la puissance de sonication du milieu, qui doit être optimale. Malgré la linéarité de la vitesse initiale de réaction en fonction de la quantité de lipase ajoutée, une inhibition compétitive à l'interface des lipides en émulsion reste présente. Conclusion Conformément à ce qui a déjà été évoqué dans la littérature ou dans les précédents rapports d'avancement, la quantité de lipase introduite a un effet positif sur la cinétique d'hydrolyse des lipides de la graine. Le calcul des 10 vitesses initiales nous permet de montrer que cette réponse varie linéairement avec la quantité d'enzyme ajoutée au milieu, l'activité spécifique restant quant à elle relativement stable. Il en est déduit que malgré une inhibition engendrée par une compétition pour la fixation à l'interface, la quantité de lipase introduite dans le milieu est un facteur limitant de 15 I'hydrolyse. EXEMPLE 10: Caractéristiques de I'homoqaénat. A. MATERIEL ET METHODES Mode opératoire Les milieux observés sont préparés selon le même protocole que lors de l'étude de la réactivité présentée dans l'exemple précédent. Le rapport lipase / graine est fixé à 333 UL / g de graines. Le cassage cellulaire est pour 25 sa part assuré par un broyage humide 5 minutes suivi d'une période de 5 min. de sonication à 82 W. La proportion de graine introduite est de 13,5 % en masses. Les milieux ainsi obtenus sont laissés à réagir jusqu'à hydrolyse totale. Une aliquote du milieu d'hydrolyse est ensuite dilué 10 fois avant 30 d'être monté entre lame et lamelle. L'observation se fait par transmission à l'aide d'un microscope optique Nikon Eclipse E600 (Nikon, Japon), muni d'oculaires grossissant 10x et d'objectifs plan fluor xO10, x40 et x100 du même fournisseur. Les prises de vues sont réalisées grâce à une caméra digitale DMX 1200 (Nikon, Japon), les images étant enregistrées dans un ordinateur par le logiciel Lucia G (Nikon, Japon). Aucun retraitement de celles-ci n'a été effectué ulterieurement B. RESULTATS Trois grossissements ont été utilisés pour la réalisation des clichés. Une vue d'ensemble a tout d'abord été prise. La Figure 10 illustre les différents constituants du milieu ainsi que son organisation après broyage et hydrolyse. C'est au sein de celle-ci que la lipase évolue et réagit avec les lipides de la graine. Sur la Figure 10, on peut déjà distinguer les différentes structures observées macroscopiquement lors de la centrifugation du milieu. Les lipides situés au premier plan sont nets, tandis que les plus grosses particules qui reposent sur la lamelle après décantation sont plus floues. Sur la figure 10, les débris de coque très importants en taille sont notamment présents. Leurs 15 dimensions sont de l'ordre de 100 à 200pm. Etant donné leur faible épaisseur, il n'est quasiment jamais possible de les voir autrement que de face. Les restes des cellules lysées sont également visibles. Si certaines de celles-ci, telles celles situées en haut de la figure 10, sont totalement vides, d'autres semblent en revanche moins affectées par les différents traitements 20 de cassage subis. C'est le cas de l'amas cellulaire sombre localisé en bas de la figure 9. Les acides gras en émulsion sont également visible au premier plan. Sur la figure 10, les acides gras apparaissent sous la forme d'une 25 granulation présente sur toute la surface observée. On remarque que les gouttelettes lipidiques ne semblent pas se disperser mais plutôt s'agréger en petits amas. Ce phénomène est important pour l'efficacité de l'étape d'extraction car il indique que les tensioactifs de toutes natures qui garnissent les globules gras ne créent pas de répulsion entre ces derniers. 30 En cas de difficultés pour la rupture de l'émulsion, seule la rigidité de l'interface peut être mise en cause. Une meilleure vision de l'émulsion est possible à plus fort grossissement. C'est ce type de vue qui est montrée dans la figure 11. Cette photographe a été prise à partir de la couche grasse séparée par 35 centrifugation, à un grossissement total de 1 000x. Cette illustration permet d'observer plus précisément les gouttelettes lipidiques. Une barre d'échelle fournit une référence pour la taille de ces gouttes grasses. Leurs dimensions sont comprises entre 5 et 15 pm. Leur surface apparaît fine et lisse, ce qui suggère que la stabilisation de l'interface est moléculaire, et ne fait pas 5 intervenir de particule solide. Ainsi, cette observation microscopique montre que l'hydrolyse in situ se déroule au niveau d'un système émulsionné liquide /liquide. Par ailleurs, la photo de la Figure 11 met en évidence que la centrifugation du milieu permet une bonne séparation des lipides et des 10 débris cellulaires issus du cassage de la graine. Par ailleurs, la tendance déjà observée à plus faible grossissement qu'ont les gouttelettes à s'associer pour former des agrégats est confirmée par cette prise de vue plus fine. Enfin, au vu de la taille des globules gras observés, comprise globalement entre 5 et 15 pm, il est vraisemblable qu'un début de 15 coalescence ait déjà eu lieu. En effet, d'après Wâsche et al. (1993), (Wâsche A., Luck T., Holley W., 1993. Influence of technological parameters and protein properties on the aqueous extraction and demulsification of oil from rapeseed, In Food proteins: Structure and functionality developed from the 4th Symposium on food, Schwenke K.D. (c. f.) Weinheim 198-200), la taille 20 des oléosomes de la graine de colza est comprise entre 0,5 et 1,5 Pm, soit fois moindre que celle observée ici. Cette coalescence peut résulter soit de la fusion de globules gras durant le traitement de cassage des structures cellulaires natives, soit d'une instabilité naturelle de l'émulsion formée. La première hypothèse semble cependant la plus vraisemblable, car aucune 25 évolution visible de la taille des globules gras ne semble avoir eu lieu durant la centrifugation. La figure 12 est un cliché photographique pris à un grossissement intermédiaire de 400x, montre le détail d'un groupe de cellules ayant subi le procédé d'hydrolyse. Sur cette photographie, il est possible de distinguer 30 nettement des cellules entièrement vidées de leur contenu, mais aussi des cellules renfermant encore une partie de leurs constituants. Sur la figure 12, on observe qu'une homogénéisation par sonication aboutit à la perforation des parois cellulaires, sans casser complètemen t la cellule puisqu'un grand nombre de cellules sont vidées sans pour autant que 35 leurs parois n'apparaissent endommagées à ce grossissement. Conclusion L'observation microscopique des milieux réactionnels est riche en 5 enseignements. Elle permet ainsi de visualiser le milieu dans lequel évolue la lipase lors de la réaction. Les photomicrographies présentées dans les figures 10 à 12 nous permettent notamment de localiser les lipides et de mieux appréhender les interactions qui ont lieu à leur surface. Ainsi, on sait désormais que la stabilisation de l'interface lipides / eau ne fait pas intervenir 10 de particules solides, l'hydrolyse des glycérides ayant par conséquent lieu au sein d'un système liquide /liquide. Par ailleurs, les globules gras ne paraissent pas se repousser, ce qui facilite l'extraction des acides gras. Au niveau cellulaire, les observations réalisées confirment que le broyage des graines les casse relativement grossièrement, tandis que la sonication agit 15 plus finement en perforant les parois cellulaires sans en modifier la structure de masse. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'acides gras par hydrolyse in situ des lipides 5 contenus dans les graines d'une plante, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) broyage des graines en milieu aqueux jusqu'à l'obtention d'une suspension de particules solides d'un diamètre inférieur à 500 pm; b) ajout d'une lipase exogène dans la suspension obtenue à l'étape a); c) homogénéisation de la suspension contenant la lipase jusqu'à l'obtention d'un homogénat constitué d'une émulsion des lipides contenus initialement dans les graines, en mélange avec les particules solides des graines; d) hydrolyse des lipides contenus dans l'homogénat obtenu à l'étape c) à 15 une température comprise entre 15 C et 55 C, pendant une durée comprise entre 15 minutes et 5 heures; e) récupération des acides gras résultant de l'hydrolyse des lipides réalisée à l'étape d). 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'à l'étape a), les graines sont ajoutées au milieu aqueux à raison d'une proportion inférieure à 20%, de préférence inférieure à 15%, en poids total du milieu aqueux contenant les graines. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'à l'étape b), la lipase est ajoutée à raison de 100 à 500 Unités, de préférence de 150 à 400 Unités de lipase par gramme du poids des graines traitées*- à l'étape a). 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape c) d'homogénéisation est réalisée par homogénéisation sous pression ou par homogénéisation par sonication. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'homogénéisation 35 sous pression est réalisée par un ou plusieurs cycles d'homogénéisation à une pression comprise entre 25 et 1000 bars, de préférence entre 100 et 500 bars. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'homogénéisation 5 sous pression est réalisée par deux cycles d'homogénéisation à haute pression. 7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'homogénéisation par sonication est réalisée à une puissance d'ultrasons supérieure à 20 10 Watts. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'étape e) de récupération des acides gras comprend les étapes suivantes: el) séparation des acides gras des autres constituants de l'homogénat 15 obtenu à l'étape d), sous la forme d'une émulsion; e2) extraction des acides gras à partir de l'émulsion avec un solvant. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'à l'étape el), les acides gras sont séparés des autres constituants de l'homogénat obtenu à 20 l'étape d) par obtention d'un milieu liquide à trois phases, respectivement une phase solide, une phase aqueuse et une phase d'émulsion lipidique, par centrifugation de l'homogénat, puis récupération de la phase d'émulsion lipidique. 10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'à l'étape e2) les acides gras sont extraits par l'eau ou par un solvant choisi parmi un alcool, un ester, un carbonate organique, une cétone. 11. Procédé selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que 30 l'étape e2) d'extraction des acides gras est suivie d'une étape e3) de séchage de la solution contenant les acides gras.