Brevet FR2845245A1 — publié le 20040409

MODELE ANIMAL DE LA MALADIE DE PARKINSON L'invention est relative à un modèle animal de la maladie de Parkinson. Elle est en outre relative à l'utilisation de cet animal pour cribler des molécules susceptibles d'agir à l'encontre de la maladie de Parkinson. La maladie de Parkinson est une affection neurodégénérative fréquente dont la prévalence est proche de 2% après l'âge de 65 ans [de Rijk et al., 1997]. Les signes cardinaux de la maladie sont rigidité, bradykinésie, tremblement de repos et bonne réactivité, au moins initiale à la lévodopa. Les troubles sont dus à une perte massive des neurones dopaminergiques de la substantia nigra. Les causes de la maladie restent inconnues mais l'intervention de facteurs de susceptibilité génétique est fortement suspectée [Wood, 1997]. De nombreuses formes familiales avec une transmission dominante ont été rapportées. Des mutations du gène codant pour la synucléine alpha, localisé en 4q21-q23, ont été décrites dans un petit nombre de familles avec un début précoce et une aggravation rapide [Polymeropoulos et al., 1997; Krüger et al., 1998]. D'autres loci/gènes ont été décrits (pour revue voir Lansbury et Brice, 2002). Un second locus est situé en 2pl3 [Gasser et al., 1998]. Un syndrome parkinsonien de transmission autosomique récessive (AR-JP) a été décrit au Japon [Yamamura et al., 1973 ; Ishikawa and Tsuji, 1996]. Il se manifeste avec les signes cardinaux de la maladie de Parkinson avec certaines particularités : début précoce, en règle avant l'âge de 40 ans; ii) présence d'une dystonie, souvent aux membres inférieurs; iii) fluctuations au cours de la journée ; iv) évolution lentement progressive mais toujours associée à des dyskinésies sous lévodopa. L'examen neuropathologique révèle une perte massive des neurones de la substantia nigra pars compacta mais sans corps de Lewy, stigmate histopathologique de la maladie de Parkinson idiopathique [Yamamura et al., 1973 ; et al., 1994]. Une liaison génétique entre la maladie dans des familles japonaises et des marqueurs en 6q25. 2-27 a été démontrée qui définit le locus PARK2 [Matsumine et al., 1997]. Deux équipes ont ensuite décrit des familles PARK2 hors du Japon, en particulier aux Etats Unis, en Europe et au Moyen Orient [Jones et al., 1998 ; et al., 1998]. Kitada et al [Kitada et al., 1998] ont mis en évidence des délétions des exons (3-7) ou de l'exon 4 d'un nouveau gène, appelé parkine, dans 4 familles japonaises. Différentes mutations de ce gène, incluant la délétion de l'exon 3, ont été depuis mises en évidence chez de nombreux patients avec une origine géographique variée (Lansbury et Brice, 2002). Ces mutations représentent environ 50% des cas autosomiques récessifs et 20% des cas isolés ayant débuté avant l'âge de 45 ans (Lucking et al, 2000). La demande WO 00/31253 (RHONE POULENC RORER et INSERM) décrit la mise en évidence et la caractérisation, dans 38 familles principalement européennes avec un syndrome parkinsonien de début précoce, de la présence de nouvelles altérations génétiques affectant le gène de la parkine humaine. Cette demande mentionne en outre la possibilité d'obtenir par "knock-in" ou également par "knock-out" du gène sauvage des mammifères présentant les altérations identifiées, par recombinaison homologue, . De tels mammifères peuvent être des rongeurs ou des canidés. La demande WO 01/16176 (BIOFRONTERA PHARMACEUTICALS GMBH) quant à elle envisage l'obtention de souris contenant des séquences codant la parkine de souris présentant diverses mutations et délétions. Les délétions envisagées son réparties dans toute la séquence génomique. Les phénotypes des souris ainsi envisagées ne sont pas précisés et il est donc impossible de déterminer leur possible utilisation comme modèle de la maladie de Parkinson et comme outil de criblage de molécules susceptibles de traiter cette maladie. Un seul exemple décrit l'obtention de souris dont le gène codant la parkine a été délété de la totalité de l'exon 3 (positions 300-540 de la séquence ID N 7). L'hypothèse de l'expression d'une protéine tronquée de 105 acides aminés de séquence SEQ ID N 7 est formulée sur une base purement théorique dans le tableau 1. Cette hypothèse n'est pas supportée par des résultats expérimentaux. En outre la caractérisation des souris délétées de l'exon 3 n'est pas décrite et a fortiori rien n'indique que ces souris présentent un phénotype reproduisant celui de la maladie de Parkinson chez l'homme. De la même manière Kessler et al ont mentionné dans un abrégé (Society for Neuroscience Abstracts, 25, n l-2, 52,1999) la possibilité de fabriquer des souris présentant une mutation inactivante dans l'exon 4 de leur gène codant la parkine. Les auteurs ne donnent aucune indication sur le phénotype des animaux et indiquent seulement que l'analyse phénotypique sera présentée . Il ressort de cette analyse de l'état de la technique que diverses tentatives pour obtenir des animaux modèles avaient été mises en #uvre, mais qu'aucune n'avait abouti à la mise en évidence chez des souris d'un phénotype ressemblant aux symptômes de la maladie de Parkinson chez l'homme. De manière inattendue les demandeurs ont obtenu des souris présentant pour la première fois un phénotype représentatif et reproduisant la neuropathologie rencontrée chez l'homme. Un premier objet de l'invention concerne donc un animal transgénique non-humain présentant un phénotype reproduisant certains aspects de la maladie de Parkinson chez l'homme. Ainsi un tel animal exprime des marqueurs caractéristiques de la maladie de Parkinson chez l'homme. Les animaux selon la présente invention peuvent présenter une augmentation du taux de CDCrel-1par rapport à celui observé chez les animaux dont le gène de la parkine n'a pas été modifié (animaux sauvages). CDCrel-1joue un rôle négatif dans la régulation de l'exocytose et est une protéine connue comme partenaire de la parkine. La parkine initie la dégradation de CDCrel-1. Les animaux chez lesquels le gène de la parkine a été délété montrent une augmentation des niveaux d'expression de UCHL1 et de l'alpha-synucleine par rapport aux animaux sauvages dans lesquels le gène de la parkine n'a pas été modifié. Une mutation faux sens dans le gène codant l'enzyme UCHL-1 a été identifiée dans deux membres d'une famille allemande atteints d'une maladie de Parkinson transmise selon un mode autosomique dominant (Leroy et al, 1998). Les animaux selon la présente invention peuvent aussi présenter un taux en cholecystokinine supérieur, préférentiellement au moins environ deux fois supérieur, à celui observé chez les animaux dont le gène de la parkine n'a pas été modifié (animaux sauvages). La cholecystokinine co-existe avec la dopamine dans les neurones ventraux tegmentaux et de la substantia nigra et modulent les effets moteurs centraux de la dopamine par l'intermédiaire des récepteurs nigral or striatal cholecystokinin-A (excitation) et cholecystokinin-B (inhibition). Une altération des niveaux des récepteurs cholecystokinin et cholecystokinin a aussi été observée dans les cerveaux de patients Parkinsoniens. Les animaux chez lesquels le gène de la parkine a été délété montrent des déficits dans la transmission synaptique dans l'hippocampe par rapport aux animaux sauvages, ce qui est cohérent avec une diminution du relargage de neurotransmetteurs. Les animaux selon la présente invention peuvent aussi présenter une aptitude à explorer un environnement étranger moins développée que celle observée chez les animaux dont le gène de la parkine n'a pas été modifié (animaux sauvages). Les animaux selon la présente invention peuvent aussi présenter une aptitude à l'exploration spontanée, pouvant être mesurée par le test du labyrinthe, inférieure à celle observée chez les animaux dont le gène de la parkine n'a pas été modifié (animaux sauvages). On entend par animal transgénique tout animal non-humain présentant une modification de son génome. La modification du génome résulte avantageusement d'une altération ou une modification d'un gène. Cette modification peut être due à l'action d'agents altérants ou mutagènes classiques ou bien effectuée par mutagenèse dirigée, comme cela est décrit dans Matériels et Méthodes. La modification du génome peut également résulter d'une insertion de gène (s) de remplacement de gène (s) dans sa (leur) forme sauvage ou mutée. De manière préférentielle un animal selon la présente invention comprend un gène codant pour la parkine dont l'exon 3 a été partiellement délété. La délétion peut s'étendre sur une partie substantielle de l'extrémité 3' de l'exon 3. Ainsi une telle délétion peut s'étendre environ à partir des positions 30,50, 60,70, 80, ou 100 jusqu'à 1 a position 241 de l'exon 3, le terme environ signifiant que position de début de la délétion peut s'étendre de plus ou moins 5 nucléotides autour de la position indiquée précisément. Avantageusement au moins environ 179 nucléotides de l'extrémité 3' de l'exon 3 ont été délétés. Préférentiellement au moins une partie de la délétion a lieu entre environ les positions 63 et 241 du gène de la parkine de souris. Préférentiellement au moins une partie de la délétion de l'exon 3 a lieu entre environ les positions 1670 et 1848 de la séquence SEQ ID N 1. Dans la séquence SEQ ID N 1, la délétion préférentielle de 1097 nucléotides couvre la région 1670 à 2766 (tgaaacaaatg....gtaatcattcat). Dans cette séquence, l'exon 3 se trouve en position 1608-1848. La délétion emporte donc l'extrémité 3' de l'exon 3 entre les positions 1670 et 1848, soit 179pb et l'extrémité 5' de l'intron 3 entre les positions 1849 et 2766, soit 918pb. Ce qui fait au total une délétion de 1097pb. Dans un tel animal au moins une partie de l'intron 3 du gène codant pour la parkine peut avoir été délété. La délétion peut s'étendre sur une partie substantielle de l'extrémité 5' de l'intron 3. Ainsi une telle délétion peut s'étendre environ à partir de la position 1 jusqu'à la position 600,700, 800, 900 ou 950 de l'intron 3, le terme environ signifiant que la délétion peut s'étendre de plus ou moins 5 nucléotides autour de la position indiquée précisément. Avantageusement au moins environ 918 nucléotides de l'extrémité 5' de l'intron 3 ont été délétés, et préférentiellement au moins une partie de la délétion a lieu entre environ les positions 1 et 918 de l'intron 3 du gène de la parkine de souris. En outre d'autres introns ou exons peuvent être délétés. De manière préférentielle un tel animal produit un ou des ARN messagers dont la traduction aboutit à des protéines correspondant à des formes tronquées de la parkine animale, telle que la parkine de souris. Avantageusement les séquences ADN correspondant à ou aux ARN messagers comprennent les séquences SEQ ID N 13 et/ou SEQ ID N 15. De manière préférentielle un tel animal est susceptible d'exprimer deux protéines correspondant à des formes tronquées de la parkine animale, telle que la parkine de souris. De telles protéines sont avantageusement des protéines de 105 et 106 acides aminés. De telles protéines sont susceptibles de présenter les séquences SEQ ID N 14 et SEQ ID N 16. Les modifications du génome sont avantageusement effectuées sur des cellules souches embryonnaires et ou sur les pronucléi. Si les modifications sont effectués sur les pronucléi, la transgenèse est effectuée par micro-injection d'une solution d'ADN dans le génome d'un zygote. La microinjection se fait après la fécondation de l'oocyte par le spermatozoïde et avant que les deux pronucléi mâle et femelle n'aient fusionné pour donner le noyau de l'ovocyte. Dans le cadre de la présente invention, l'animal est avantageusement un mammifère. En particulier il peut s'agir d'une souris, d'un rat ou d'un lapin obtenu selon les techniques classiques de transgenèse. A titre d'exemple illustrant l'un des procédés de transgenèse, on peut citer la méthode d'électroporation d'une construction génique contenant les gènes modifiés dans des cellules souches embryonnaires de souris et, après sélection, transfert des cellules porteuses de l'évènement génétique désiré dans un blastocyste receveur tel que cela est décrit dans Matériels et Méthodes. A cet égard, le modèle animal de l'invention est obtenu par électroporation d'une cassette d'expression comprenant un acide nucléique. De manière préférentielle, cet acide nucléique est un ADN qui peut être un ADN génomique (ADNg) ou un ADN complémentaire (ADNc). Un autre objet de l'invention concerne une cellule extraite du modèle animal tel que décrit précédemment ainsi que son utilisation pour la mise en évidence de composés destinés au traitement des maladies neurodégénératives, de préférence la maladie de Parkinson. La mise en évidence de composés décrits précédemment repose sur la mise en contact de cellules extraites du modèle animal de l'invention avec un composé ou un mélange de composés supposé(s) avoir une action et de mesurer ensuite le ou les effet(s) des composés au niveau des cellules entières, dans des homogènats de cellules ou sur une fraction subcellulaire. La présente invention est également relative à l'utilisation d'un animal, tel que décrit précédemment, pour la mise en évidence de composés destinés au traitement des maladies neurodégénératives, de préférence la maladie de Parkinson. En effet, grâce à ses propriétés avantageuses qui reproduisent très fidèlement les caractéristiques de la maladie de Parkinson ce modèle permet, en comparaison des modèles connus, la mise en évidence de composés particulièrement adaptés au traitement de la maladie de Parkinson, notamment, telle que décrite chez l'homme. Ces composés peuvent être des molécules chimiques, des molécules peptidiques ou protéiques, des anticorps, des molécules chimériques ainsi que des ADNs antisens ou des ribozymes. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de criblage de composés destinés au traitement des maladies neurodégénératives comprenant les étapes suivantes : -administration du composé à tester à l'animal à tester, et -observation de l'évolution d'un ou plusieurs marqueurs caractéristiques reproduisant la neuropathologie observée chez l'homme. Avantageusement ledit marqueur est le taux de CDCrel-1, le taux en cholecystokinine, ou le taux en UCHL-1. La présente invention a en outre pour objet des protéines présentant ou comprenant les séquences SEQ ID N 14 et SEQ ID N 16, ainsi que des protéines présentant une identité d'au moins 65%, préférentiellement d'au moins 75%, et encore plus préférentiellement d'au moins 85% ou 95% avec l'une de ces protéines. La présente invention a en outre pour objet les acides nucléiques dont les séquences sont décrites dans la présente demande et les séquences complémentaires de ces acides nucléiques, ainsi des acide nucléique ayant une identité d'au moins 65%, préférentiellement d'au moins 75%, et encore plus préférentiellement d'au moins 85% ou 95%, d'identité en nucléotides avec un de ces acides nucléiques. Selon encore un autre aspect, l'invention est relative à un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique tel que défini ci-avant. Le pourcentage d'identité entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptide dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des gaps ) par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences. Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auquel il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans le package de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor , Madison, WISCONSIN. A titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être effectué à l'aide du logiciel BLAST (versions BLAST 1. 4.9 de mars 1996, BLAST 2. 0.4 de février 1998 et BLAST 2. 0.6 de septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (S. F Altschul et al, J. Mol. Biol. 1990 215 : S. F Altschul et al, Nucleic Acids Res. 1997 25: 3389-3402). Blast recherche des séquences similaires/homologues à une séquence requête de référence, à l'aide de l'algorithme d'Altschul et al. La séquence requête et les bases de données utilisées peuvent être peptidiques ou nucléiques, toute combinaison étant possible. Par conditions d'hybridation de forte stringence au sens de la présente invention, on entendra les conditions suivantes : 1- Compétition des membranes et PRE HYBRIDATION : -Mélanger : 40 l ADN sperme de saumon (10mg/ml)+ 40 l ADN placentaire humain (lOmg/ml) - Dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace le mélange. - Oter le SSC 2X et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes. - Ajouter le mélange des deux ADNs dénaturés. - Incubation à 42 C pendant 5 à 6 heures, avec rotation. 2- Compétition de la sonde marquée : - Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 (ni ADN Cot I, selon la quantité de répétitions. - Dénaturer 7 à 10 mn à 95 C. - Incuber à 65 C pendant 2 à 5 heures. 3- Hybridation : - Oter le mix de pré hybridation. - Mélanger 40 III ADN sperme de saumon + 40 III ADN placentaire humain ; dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace. - Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mix formamide, le mélange des deux ADN et la sonde marquée/ADN Cot I dénaturée. - Incuber 15 à 20 heures à 42 C, avec rotation. 4- Lavages : - Un lavage à température ambiante dans du SSC 2X, pour rincer. - 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0,1% à 65 C. - 2 fois 15 minutes à 65 C SSC IX et SDS 0,1% à 65 C. Envelopper les membranes dans du Saran et exposer. Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur variable de 20 nucléotides à plusieurs centaines de nucléotides. Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier. Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985,"Nucleic acid hybridization : a practical approach", Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford) ou encore dans l'ouvrage de F. AUSUBEL et al (1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y). La figure la illustre la stratégie d'inactivation du gène de la Parkin chez la souris. La figure lb représente un transfert de Southern d'échantillons biologiques issues de souris sauvages (WT), mutantes (-/-) ou hétérozygotes (+/-). La figure 2 représente un transfert de type Western révélé à l'aide d'anticorps antiparkin (71-91). La figure 3 illustre l'évolution du poids corporel des souris sauvages et mutantes selon l'invention. La figure 4 illustre l'activité en champs ouverts de souris males vieilles 170 jours durant deux périodes consécutives de 3 minutes immédiatement après l'introduction de la souris dans la cage de motilité et température rectale prise juste avant l'introduction dans la cage. La figure 5 illustre l'alternance dans un labyrinthe en T. On a laissé un mâle de 140 jours explorer 3 minutes le labyrinthe quand un de ses bras ont été bloqué. Le jour suivant l'animal a été rendu au labyrinthe avec les deux bras ouverts. Le premier bras à être visité a été noté. Des souris de type sauvages (n=10) ont montré une probabilité plus importante à visiter le bras précédemment inconnu par rapport à des souris mutantes Parkine. La figure 6 illustre un essai de suspension à un fil. Les figures 7 A à E illustrent les propriétés des synapses collatéralles-CA1 de Schaeffer d'hippocampe chez les souris mutantes Parkin et de type sauvage. Figure 7 A : en surimpression obtenus par stimulations croissantes d'une souris de type sauvage (+/ +, et d'une souris de mutante parkin (-/-). Figure 7 B : de l'EPSPS en fonction de l'intensité de (triangles pleins : souris mutantes ; cercles ouverts : souris de type sauvage). Figure 7 C : Amplitudes en fonction de l'intervalle entre les stimulations. Figure 7 D : facilitation améliorée après des stimulations de basse fréquence répétées. Figure 7 E : à long terme (LTP) normal dans les deux génotypes. Les figures 8a et 8b représentent schématiquement les processus d'épissage chez les souris sauvages et mutantes. Les figures 9a et 9b représentent respectivement les deux formes de jonction exon 2-4 chez les mutants. Les figures 10a et lOb représentent respectivement les deux formes de jonction exon 2-4 chez le sauvage. La présente invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent mais qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. EXEMPLES Inactivation du gène Parkine chez la souris, par recombinaison homologue 1-Clonage du gène codant la parkine de souris et réalisation du vecteur de recombinaison homologue Une banque génomique de souris 129SvJ réalisée dans le phage lambda FIX II (Stratagene, réf : 946313) a été criblée avec une sonde cDNA correspondant au produit du gène Parkine de Rat. Un clone (n 6) contenant un insert de plus de 12 Kb a été identifié. Son analyse par digestion enzymatique, séquençage partiel et comparaison avec les séquences humaine et de rat disponibles, a révélé qu'il contenait l'exon 3 du gène Parkine de souris, bordé dans son extrémité 5' par environ 2,4 Kb de séquence de l'intron 2. Un fragment EcoRI-EcoRI de 2772 pb contenant l'exon 3 a été sous-cloné et séquence dans sa totalité. Sa séquence est la séquence SEQ ID N 1. L'exon 3 est compris entre les positions 1608 et 1848 de cette séquence. Il a été utilisé pour l'obtention par PCR du bras court du vecteur de recombinaison homologue. Deux oligonucléotides ont été réalisés pour amplifier une séquence de 1092 pb contenant 1030 pb à l'extrémité 3' de l'intron 2 et 62 pb à l'extrémité 5' de l'exon 3 du gène Parkine. Sa séquence est la séquence SEQ ID N 2. L'oligonucléotide utilisé en 3' apporte un site de clonage EcoRI (ccg gaa ttc gtg tcc ttg gtg gta gat tca SEQ ID N 3), celui utilisé en 5' apporte un site BamHI (cgc gga tcc tga ctt ctc ctc cgt ggt ctc SEQ ID N 4). Le produit d'amplification a été cloné dans le plasmide pGEX2T (Amersham Pharmacia Biotech) aux sites EcoRI et BamHI. Le site Xhol contenu dans le bras court a été détruit après digestion par Xhol, remplissage des extrémités cohésives par la Klenow et ligation des bouts francs générés. Le bras court a ensuite été ressorti de ce plasmide intermédiaire après digestion dans les sites EcoRI et BamHI et cloné aux même sites dans le plasmide pPN2T, fourni par le laboratoire du Dr E. Rubin (Berkeley ,USA). Ce plasmide contient une cassette de sélection positive permettant l'expression du gène de résistance au G418 et deux cassettes (en tandem) de sélection négative qui permettent l'expression du gène TK qui confère une sensibilité au ganciclovir. Le plasmide obtenu est noté : pPN2T-BC Park. Le bras long du vecteur de recombinaison homologue a été obtenu en clonant dans un plasmide pBluescript II (BSII, Stratagene), aux sites EcoRI et Sali, un fragment d'ADN génomique de 7kb, issue du clone n 6. Ce fragment EcoRI - Sali provient d'une région située en 3' de l'exon 3 du gène Parkine. Le site EcoRI se trouve à 1164 pb de l'extrémité 5' de cet exon. Le site NotI de ce plasmide intermédiaire a ensuite été détruit (ouverture par l'enzyme de restriction Notl, remplissage des extrémités cohésives par la Klenow et ligation). Un nouveau site de clonage NotI a été introduit dans le polylinker du plasmide au site Sali en utilisant un adaptateur (tcgaagcggccgct SEQ ID N 5). Enfin, un site XhoI a été introduit au site EcoRI du polylinker en utilisant un adaptateur (ctcgagcggctcgag SEQ ID N 6). Un séquençage révélera que le site EcoRI a été détruit de manière involontaire lors de ce clonage. Le fragment génomique de 7 Kb a été excisé par digestion enzymatique NotI-XhoI et cloné dans le plasmide pPN2T-BC PARK en utilisant les mêmes sites. Le plasmide obtenu, qui est le vecteur de recombinaison final, est noté : pPN2T-BC/BL Park. Avant électroporation dans les cellules ES, il sera linéarisé par digestion enzymatique avec Notl. Dans cette construction, le gène Parkin est interrompu par la cassette qui confère la résistance à la néomycine, à l'intérieur de l'exon 3. Les 62 premiers acides nucléiques de celui ci sont conservés. La délétion introduite couvre une région de 1097 pb. Elle concerne les 179 (239-241pb, c'est la taille de l'exon 3 dans sa totalité) derniers acides nucléiques de l'exon 3 et les 918 premiers acides nucléiques de l'intron 3. 2-Outils de criblage de l'événement de recombinaison homologue a- PCRs Trois couples d'oligonucléotides ont été utilisés pour cribler les cellules ES recombinées. Couple A : tttccaaatgtgtcagtttc SEQ ID N 7/ tttgagtaagagccactaagg SEQ ID N 8 Couple B : tgttccacatacacttcattc SEQ ID N 9/ tttgagtaagagccactaagg SEQ ID N 10 Couple C : cagtattgttttgccaagttc SEQ ID N 11/ tttgagtaagagccactaagg SEQ ID N 12 Les conditions de le PCR sont les suivantes : Mélange réactionnel 50fg d'ADN, 1,5 l de solution des 4 dNPTs 4x25mM, 4 l de chacun des oligonucléotides à lOOng/ul, 10 l de MgCl2 mM, 10 l de tampon Taq lOx, 0,5 l de Taq Polymérase à 5U/ l (Perkin Elmer), eau QSP lOOul Cycles d'amplification 8 minutes à 95 C, puis 50 cycles à 95 C, 0,5 minute, 53 C, 0,5 minute, 72 C 1 minute, enfin 10 minutes à 72 C. b-Southern-blot Une sonde externe au vecteur de recombinaison et située en 5'de celui-ci, permet de discriminer un allèle sauvage du gène Parkin et un allèle ayant réalisé l'événement de recombinaison homologue. Après digestion enzymatique par l'endonucléase BamHI, la sonde marquée révèle un fragment de 6Kb pour l'allèle sauvage et un fragment de 5Kb pour l'allèle muté. Les conditions de réalisation des Southern-blots sont celles connu de l'homme de l'art (Molecular Cloning, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press). 3-Culture cellulaire Le vecteur de recombinaison homologue a été électroporé dans les cellules ES CK35 provenant de l'Institut Pasteur. 288 clones résistants à la double sélection (Neo/TK) ont été repiqués sous microscope. L'analyse par PCR, puis par Southern-blot du matériel génétique de ces cellules a permis de sélectionner 41 clones ayant réalisés l'événement de recombinaison homologue dans le gène Parkin. 4-Obtention des souris mutantes Deux des clones sélectionnés ont été microinjectés dans des blastocystes de souris C57B1/6. Les souris chimères obtenu ont transmis à leur descendance la mutation introduite dans le gène Parkin. A l'état homozygote, les souris sont viables et fertiles. 5. Analyse de l'expression de la parkine Production d'Anticorps : un anticorps contre la parkine de souris a été obtenu dans des lapins selon les méthodes décrites par Stichel et al (2000). un peptide a été synthétisé correspondant aux résidus 71-92 de la parkine. Ce peptide a été couplé à GFAP. Des lapins blancs New Zealand ont été injectés en sous cutané avec 150-250 g de protéine émulsifiée dans du Keyhole Limpet HemacyoninO. Cette injection a été suivie de 9 rappels. Les lapins ont été saignés 2 semaines après le dernier rappel et le sérum purifié par colonne d'affinité a été employé pour des études d'immunotransfert. Transfert de type Western : échantillons de tissu de souris transgèniques et des souris contrôle ont été homogénéisés avec l'aide d'un hachoir de tissu dans un tampon de lyse composé de 50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10 % (w/v) glycerol, 1 % Triton X-100 (v/v), 1. 5 mM MgC12 et un cocktail d'inhibiteur de protéases. La concentration de protéine dans la préparation brute a été mesurée selon le test de Bradford. Les transfert ont été effectués avec des homogénats de cerveau de souris sur des gels 10 % acrylamide avec du tampon MOPS (NuPAGE, Invitrogen). L'anticorps anti-Parkine a été employé à 1/500 et révélé avec l'anti-lapin de chèvre conjugué à la péroxydase (Jackson ImmunoResearch) à 1/1000. La protéine a été révélée avec un kit ECL (Amersham-Pharmacia). 6. Electrophysiologie de l'hippocampe Des tranches d'hippocampe d'approximativement 500 m d'épaisseur ont été préparées à partir du cerveau de souris mutantes mâles âgées de 64 à 68 semaines. Ces souris ont été établies sur un fond génétique mixte des souches C57B1/6 et 129sv. Des souris de fonds génétique mixte C57B1/6 x 129sv sauvages, de sexe identique et d'age comparable, ont été utilisées comme témoins. Les tranches d'hippocampe ont été incubées dans une chambre d'enregistrement à submersion dans laquelle un liquide céphalo-rachidien artificiel (LCRA) était perfusé en permanence à 2.5-3 ml/min. Ce LCRA contenait 124 mM de NaCl, 3 mM de KCI, 1. 25 mM de NaH2P04, 1. 3 mM de MgS04, 2 mM de CaCl2, 26 mM de NaHC03 et 10 mM de glucose. Il était saturé par bullage d'un mélange gazeux de 95 % O2 / 5 % CO2 et chauffé à 31.5 = 0.5 C. Des champs de potentiels post-synaptiques excitateurs (PPSE) ont été enregistrés en situation extracellulaire dans le stratum radiatum du secteur CA1 de l'hippocampe. Pour cela, des stimulations de 0.1ms de durée ont été appliquée à intensité constante sur le trajet des fibres collatérales de Schaeffer. Les propriétés synaptiques suivantes ont été évaluées : transmission basale, facilitation synaptique en réponse à des paires de stimuli, facilitation synaptique en réponse à des trains de stimuli à basse fréquence et potentialisation à long-terme. Les trois dernières propriétés ont été analysées à l'aide de stimulations créant des PPSE d'environs la moitié de la taille maximale pour chaque tranche. L'analyse de la facilitation synaptique en réponse à des paires de stimuli a été réalisée en appliquant successivement 5 paires de stimuli à intervalles décroissants de 400,200, 100,50 et 25 ms. La facilitation synaptique en réponse à des trains de stimuli de basse fréquence a été explorée en portant deux trains de 30 stimuli à 70 ms d'intervalle espacés de 30 secondes, les PPSE ayant été mesurés sur la moyenne de ces 2 trains. Pour induire la potentialisation à long terme, de brefs trains de stimuli à haute fréquence ont été appliqués selon un protocole connu sous le nom de stimulation thêta consistant en 5 salves de 5 impulsions chacune, chaque salve comprenant des stimuli se répétant à 100 Hz et étant séparée de la suivante par 200 ms. 7. Études Comportementales La taille de détritus et la mortalité ont été observés et enregistrés dans la colonie se multipliant. Le fonds des souris employées est noté dans chaque paragraphe cidessous. Les animaux ont été étudiés pour les signes de symptômes Parkinsoniens. Des études comportementales ont été effectuées en aveugle quant à l'identité des animaux étant évalués. 1. Observations comportementales à long terme : souris transgéniques et des animaux de type sauvages de pur 129SV et de fonds mélangés (50/50 129SV/C57B16) ont été observés tous les mois, jusqu'à l'âge de 24 mois. 2. Taux de croissance et température de corps : les groupes de souris de fonds mélangé ont été suivis pour des changements du poids de corps employant à intervalles réguliers une balance Mettlar Toledo. La température de corps a été mesurée via une investigation rectale. 3. Activité en champ ouvert : les animaux de fonds mélangé ont été placés dans une boîte Perspex (41 x 28 cm) avec une croix la divisant en 4 compartiments égaux. L'opérateur assis à 2 m de la cage a compté chaque fois l'animal a croisé les lignes de la croix plus de deux périodes consécutives de 3 minutes. 4. Alternance spontanée : des animaux de fond mélangé ont été placés dans un labyrinthe en forme de T ayant un bras bloqué. On leur a permis 3 minutes d'explorer le labyrinthe. Le jour suivant ils ont été replacés dans le même labyrinthe, cette fois avec les deux bras ouverts. On leur a permis d'entrer dans un bras de leur choix et l'attente et le choix du bras ont été enregistré. Quand l'animal a choisi un bras le premier jour et a choisi l'autre bras le deuxième jour, l'alternance a été considérée comme ayant eu lieu. 5. Force de prise : force de prise des groupes d'animaux fond mélangé a été mesurée en employant le compteur de force prise de Columbus. Suspension à un fil : animaux de fond mélangé ont été placés sur un fil de soie à coudre tendu entre deux postes de métal. Le temps sur le fil et le temps écoulé jusqu'à ce qu'un pied arrière ait été placé sur le fil ont été enregistrés. Le refus de saisir a été aussi noté. 8. Transcriptome : Autographiques Les études d'expression de gène ont été effectuées sur homogénats de souris de 10 semaine, 6 mois, 12 mois et 18 mois ayant un fond mélangé. Des régions cérébrales de 10 mutants Parkine et de 10 souris de type sauvages (5 femmes et 5 mâles) ont été disséquées, coupées dans des tranches épaisses d'au moins 0. 5 cm et immédiatement poolées dans 10 volumes de Réactif de Stabilisation d'A.R.N. RNALATER (QIAGEN). Après incubation durabt une nuit dans le réactif à 2-8 C, le tissu a été enlevé du réactif de stabilisation RNALATER et transféré à-80 C pour le stockage. L'A. R.N. total a été isolé du tissu à l'aide de RNeasy Kit Mini (QIAGEN). Brièvement, 600 1 d'amortisseur de lyse a été ajouté à 50 mg de tissu et homogénéisé immédiatement (Polytron) jusqu'à ce que lysat complètement homogène ait été obtenu. D'autres étapes ont été exécutées selon les instructions du fabricant, incluant un traitement à la DNase. La concentration d'A.R.N. et la qualité ont été déterminés en employant le Bioanalyser Agilent 2100. Analyse de l'expression des gènes Toutes les expériences ont impliqué 10 souris par groupe d'étude et ont été évaluées sur Murine U74Av2Array, représentant 12000 sondes correspondant à 6000 gènes et 6000 ESTs sur une puce. De l'ADN Double-brin a été synthétisé à partir de 10 g d'A. R.N. total en employant le SuperSript Choice System (Life Technologies) et une amorce poly (dT)24 une séquence promotrice de la ARNpolymérase. T7 (Genset). Trois transcriptions différentes in vitro employant le même cDNA double brin comme matrice en présence de UTP et CTP biotinylés ont été effectuées à l'aide de l'Enzo BioArray kit(Affymetrix et Enzo Diagnostics). Pour chaque groupe, 3 cRNAs biotinylés ont été purifiés, fragmentés et poolés avant l'hybridation avec les puces, pendant 16 h dans un four à 45 C. Les puces ont été alors lavées, teintées avecde la streptavidinphycoerythrine avec amplification par anticorps et scannées avec un Affymetrix Genechip. Chaque échantillon d'A. R.N. étiqueté a été hybridé à 3 puces différentes. PCR de confirmation en temps réel: Chaque gène montrant une régulation (> 1. 6) après l'analyse, a été évalué par PCR en temps réel à l'aide d'un LightCycler (Roche Biochemicals Moléculaire). 2 g d'A. R.N. total de chaque groupe a été employé pour la transcription inverse avec oligo (dT) 16 (procédure de réaction RT : Biosystems kit N8080234). Des amorces spécifiques correspondant au gène représenté sur les puces ont été conçues à l'aide du logiciel Vector NTI. Les amorces ont amplifié des fragments de 100 à 200 bp. 9 Études protéomiques Les études ont été effectuées sur des souris de 2 et 12 mois ayant un fond pur 129SV. Les animaux ont été anesthésiés par du pentobarbital de sodium (60 mg/kg ip) et perfusés avec du milieu salin intercardiaque. Les cerveaux ont été retirés et le cortex, le striatum et le reste du tissu cérébral ont été prélevés et congelés rapidement. Les échantillons ont enuite été lyophilisés durant 48h . Les tissus lyophilisés (10 mg) ont été resuspendus dans 80 III de tampon (Tris-HCL/Tris-Base 0. 032 M, 1.2% v/v Triton 100X) et la préparation chauffée à 100 C pendant 5 minutes. Après une homogéinisation des tissus, 7.5 III d'une solution contenant100mM de Pefabloc et 100 mM d'EDTA, 5.32 III d'une solution de DNAse 1 et 32 III d'une solution de RNAse (0. 5M Tris-HCL, pH 7,0.05M MgC12, RNAseA 200 U/ml) ont successivement été ajoutés. Après 10 minutes d'incubation, les protéines ont été solubilisées par l'addition de 105 mg d'Urée, 38 mg de Thiouréé et 47 l d'une solution contenant 21 % de tampon chaps. Les échantillons protéiques ont ensuite été conservés à température ambiante pendant 10 minutes puis vortéxés et centrifugés pendant 5 minutes à 14 000 g et 45 minutes à 100 000g. Les extraits protéiques ont ensuite été aliquotés et conservés à-80 C ou immédiatement chargés sur un gel de première dimension. Des colorants fluorescents ont été conjugués aux protéines solubilisées via des liaisons N-hydroxysuccinimidyl , afin que 10 % de chaque protéine soit marqués. Cinquante g d'extraits protéiques de souris parkine mutantes ou sauvages ont été marqués avec 400pm de dyes Cy5 and Cy2 respectivement (Amersham Biosciences, Inc). Un mélange de la totalité des échantillons a également été préparé et marqué avec du colorant Cy3 afin d'être utilisé comme standard interne dans tous les gels. Les réactions de marquage ont été réalisées à température ambiante dans le noir pendant 30 minutes puis stoppées par l'addition d'un excès de lysine froide pendant 10 minutes à température ambiante. Les échantillons ont ensuite été dilués dans un volume égal d'une solution contenant 7 M d'Urée, 2M de Thiourée, 4 % de Chaps, 67 mM de DTT, 1 % de Pharmalytes 3-10, et 0. 2 % v/v triton 100X. Les gels d'électrophorèse de première dimension ont été réalisés à partir de gradients de pH immobilisés (Immobiline Dry Strip, pH 4. 5-6, 5.5-6.7, 6-9/18cm, APB) et déposés sur un appareil d'électrophorèse horizontal (Multiphor II, APB). Les gels de première dimension (0.5x3x180mm), contenant les Immobilines NL 3-10, ont été réhydratés dans une solution contenant 6M d'Urée, 2 M de thiourée, 1% v/v de Chaps, 0. 5 % de Pharmalytes 3-10 , 0. 4 % de DTT. L'isoéletrofocalisation a ensuite été réalisée en chargeant 50 g de protéines marquées (pour les gels analytiques ) ou 500 g de protéines non marquees (pour les gels préparatifs). La pénétration des échantillons dans les gels de première dimension se fait grâce à l'application d'un gradient de courant électrique (50V pendant 2H, 100V pendant 2H, 300V pendant 2H). La migration a ensuite lieu pendant 16 H à 2000V et 18H à 3500V pour les gradients de pH 4. 5-6 et 5. 5-6.7et 1H à 600V suivie de 9H à 3500 V pour les gradients de pH 6-9. Après l'isolélectrofocalisation, les gels sont équilibrés pendant 10 min dans une solution tris-HC 0.1M, 0.5 % v/w DTT, 36 % Urée, 30 % v/w glycérol, suivis de 10 minutes supplémentaires dans la même solution excepté le DTT qui est remplacé par de l' iodoacetamide 4,5 %. Dans la seconde dimension, les bandelettes de première dimension sont appliquées sur des gels SDS - PAGE (13 % T, 2. 54 % C). La migration s'effectue à 10 C dans une cuve Iso-Dalt pendant 1. 50 H à 50mA, puis 1. 50 H à 100mA et enfin toute la nuit à 185 mA. Les gels bidimensionnel sont directement scannés grâce à une caméra ProXpress de chez Perkin Elmer (Norwalk, CT, USA). Les différentes images d'un même gel sont normalisées en ajustant le temps d'exposition selon le nombre de maximum pixels observés sur chaque image. Les protéines non marquées (gels préparatifs) sont détectées par une coloration au Sypro-Ruby. Toutes les images générées sont exportées sous format tiff pour les analyses d'images ultérieures. Les analyses statistiques et quantification d'expression protéique ont été menées grâce au logiciel DECYDER-BVA software (Amersham Bioscience). Analyse par spectrométrie de masse. Les taches d'intérêt ont été excisées et digérées par de la trypsine toute la nuit à 37 C en utilisant un robot automatique (DIGESTPRO, ABIMED). Les échantillons digérés ont ensuite été séchés au speedvac. Les analyses de masse ont été réalisées sur un système LC-Packings, incluant un injecteur (Famos), un concentrateur (Switchos), et une unité de pompage (Ultimate). Le système de chromatographie en phase liquide (LC) est en interface avec un spectromère de masse à trappe ionique (ThermoFinnigan LCQ ion trap) qui fonctionne avec le logiciel Xcalibur. Les spectres de masse sont analysés avec le logiciel SpectrumMill (millenium Pharmaceuticals). Caractérisation des souris mutantes Parkin 1-Absence de protéine de Parkin dans les souris dont l'exon 3 a été supprimé Un fragment de 12Kb d'ADN génomique d'une souris 129SV a été cloné. Ce fragment a contient l'exon 3. Une délétion a été introduite à l'extrémité 3 ' de cet exon. La preuve de la délétion est apportée par la figure lb. Ce caractère est transmis héréditairement. Les souris portant la mutation homozygote sont viables et fertiles. Les études de mortalité dans la colonie n'ont montré aucun excès de mortalité par rapport aux animaux de type sauvage. On observe chez les souris mutées la même taille moyenne de détritus que chez des souris de type sauvage. Des transferts de type Western à l'aide d'un anticorps dirigés contre la séquence 71- 91 ont indiqué que le la bande de 52kDa, correspondant à la protéine parkine, avait disparu dans les souris mutantes (figure 2). Les souris ont donc une mutation menant à la destruction de leur capacité à produire la protéine parkine. 2- Analyse des ARN messagers des souris sauvages et mutantes Les Northern-blots que nous avons réalisé à l'aide d'une sonde nucléotidique correspondant au cDNA de rat du gène Parkin, nous ont permis d'observer l'existence dans le cerveau, le cervelet, le c#ur, le rein et le foie de souris sauvages, de trois transcrits du gène Parkin de tailles 4,1 Kb, 2,5 Kb et 1,4 Kb. Chez les souris porteuses à l'état homozygote d'une délétion et du gène de résistance à la néomycine dans l'exon 3 du gène Parkin, nous avons mis en évidence la présence d'un transcrit de taille inférieure à 4 Kb, dans ces mêmes tissus. Afin de caractériser ce transcrit de 4 Kb, nous avons réalisé une série de Northernblots à partir d'ARN messagers de souris sauvages et mutantes, que nous avons hybridé avec 5 sondes correspondant chacune à l'exon 2, l'exon 3, l'exon 4, l'exon 5 ou l'exon 6 du gène Parkin. Ces sondes ont été obtenues à partir du cDNA de rat, qui présente une forte homologie de séquence avec celui de la souris et par PCR. Chez les souris sauvages, les 5 sondes reconnaissent le transcrit de 4,1Kb. Pour ceux de 2,5 Kb et 1,4 Kb, il y a hybridation avec les sondes exons 2,3, 4,5, mais pas avec la sonde exon 6. Ce qui suggère que ces deux derniers ARNm codent pour des formes de taille réduite de la protéine Parkin et pour des séquences protéiques différentes audelà de l'exon 5 (en fonction des séquences 3' ajoutées par les jeux des épissages). Chez la souris mutante, nous avons montré que l'exon 3 est absent du transcrit trouvé chez les animaux mutants, tandis que les exons 2, 4, 5 et 6 sont présents. Ce résultat suggère l'existence d'un épissage alternatif chez les souris mutantes qui élimine l'exon 3 muté et raboute les exons 2 et 4. Le transcrit de 4,1 Kb présent chez les souris sauvages, privé de la séquence de 241 paires de bases de l'exon 3, pourrait donner naissance à l'ARNm observé chez les souris mutantes. En ce qui concerne les transcrits de 2,5 Kb et 1,4 Kb qui sont composés de l'exon 3 et dont on ne retrouve pas les équivalents réduits en taille chez les souris mutantes, la délétion de l'extrémité 3' de l'exon 3 et son remplacement par la cassette de résistance à la néomycine conduirait au knock-out de ces deux formes. Chez les souris mutantes, l'épissage entre les exons 2 et 4 que nous décrivons, provoque un changement du cadre de lecture, introduit des codons stops dans la séquence nucléotidique et conduit à la formation d'un protéine tronquée de 105 acides aminés de séquence SEQ ID N 15 qui conserve les 57 premiers acides aminés N ter de la protéine Parkin. Afin de vérifier que le site donneur d'épissage de l'exon 2 et le site accepteur de l'exon 4 utilisés correspondent bien aux sites décrit dans la littérature, nous avons séquence la région de la jonction exons 2-4. A partir d'ARN messagers de souris mutantes, mais aussi de souris sauvages, nous avons réalisé une RT-PCR en utilisant comme amorces un oligonucléotide à l'extrémité 3' de l'exon 2 (aller) et un oligonucléotide à l'extrémité 5' de l'exon 4 (retour) comme illustré sur la figure 8. Les produits bruts des RT-PCR ont été séquences Chez la souris mutantes, la séquence révèle les points suivants : L'exon 3 n'est pas présent dans l'ARNm de taille inférieur à 4 Kb. Le gène de sélection (Néo) inséré dans l'exon 3 n'est pas présent dans ce transcrit. L'ARNm de taille inférieur à 4 Kb est composé de deux transcrits. Ils ont en commun l'exon 2. Au delà de l'exon 2 deux séquences (SEQ ID N 13 et 15), sont imbriquées sur le graphe fourni par le séquenceur, comme l'illsustre la figure 9. L'une d'elle correspond à la séquence de l'exon 4, d'écrite chez la souris dans l'article de Kitada T et al. (Mammalian Genome 11,417-421, 2000) (figure 9, formel). Ce qui indique qu'il y a un épissage alternatif entre l'exon 2 et l'exon 4 du gène Parkin génétiquement modifié. Cet épissage utilise le site donneur de l'exon 2 et le site accepteur de l'exon 4, décrits dans la littérature. L'autre séquence introduit un codon CAG entre l'exon 2 et l'exon 4 (figure 9, forme 2). Il est intéressant de noter que la présence du codon CAG supplémentaire en 5' de l'exon 4 correspond à ce qui est décrit pour les transcrits du gène Parkin chez l'homme et le rat. Chez la souris sauvage, la séquence révèle également l'existence de deux formes (SEQ ID N 17 et 18), au niveau de l'exon 4, avec ou sans le codon CAG à la jonction entre l'exon 3 et l'exon 4 (figure 10 a et b). Protéines produites à partir de l'ARNm Parkin présent chez les souris mutantes : Que ce soit pour le forme 1 ou la forme 2, l'épissage alternatif entre l'exon 2 et l'exon 4 que nous décrivons chez les souris mutantes, conduit à un changement du cadre de lecture et à la production de protéines potentielles tronquées de 105 et 106 acides aminés respectivement (SEQ ID N 14 et 16), qui conservent les 57 premiers acides aminés de la protéine sauvage. 3- Études comportementales Les souris transgèniques semblent normales, sans modification évidente de comportement et sans handicap. Les plus vieilles souris transgèniques homozygotes (24 mois) ne montrent pas de changements manifestes comportementaux. 4- Diminution du poids corporel et de la température du corps chez les souris mutantes Le poids a été significativement réduit du sevrage à l'age de 500 jours chez les souris présentant un fond mixte (figure 3). Cette différence a été observée chez les souris et mâles et femelles. La température rectale a été aussi significativement réduite chez les souris présentant un fond mixte (37.20.2 versus 38.50.16 , p 5-Déficits dans les capacités d'étude et d'exploration des souris mutantes Les animaux mutants se sont montrés significativement moins prêt à explorer dans un environnement différent (figure 4). Les animaux mutants ont aussi montré des niveaux d'alternance spontané significativement plus bas dans l'exploration du bras inconnu d'un labyrinthe T, un essai qui est habituellement utilisé afin de révéler des déficits dans la mémoire de travail (figure 5). Cela indique que des souris mutantes parkine désirent moins explorer, ou sont moins capables de se rappeler ce qu'elles avaient exploré. Cela pourrait être lié avec une réduction de motilité ou un niveau réduit d'acuité mentale, ces deux symptômes qui étant associés à la maladie de Parkinson. De plus, bien qu'il n'y ait aucun changement de la force musculaire, pendant la deuxième exposition sur un appareil mesurant la prise, moins de souris mutantes que de souris sauvages acceptaient le test. Il est possible que des souris de type sauvages se souviennent que cet essai était inconfortable (figure 6). Ces données suggèrent qu'il y ait un déficit de mémoire ou d'attention chez les souris mutantes. 6. Altérations synaptiques dans la transmission synaptique chez les souris mutantes Parkine La protéine CDCrel-1 est abondante dans le cerveau où elle joue un rôle inhibiteur dans l'exocytose. Le fait que la protéine Parkine ait CDCrel-1 pour substrat et participe à sa dégradation nous a conduit à examiner les conséquences de l'absence de Parkine sur les propriétés des synapses de l'hippocampe chez les souris mutantes. Nous avons tout d'abord analysé la transmission synaptique basale en portant des stimuli isolés d'intensité croissante au niveau des collatérales de Schaeffer. La forme des champs de PPSE glutamatergiques ainsi générés était semblable chez les souris mutantes et les souris sauvages. Il n'y avait pas de signes d'excitabilité anormale tels que des déformations dus au déclenchement de potentiels d'action multiples. Cependant, l'amplitude des champs de PPSE était plus faible chez les souris mutantes Parkine (Fig. 7, A, B). Au plan statistique, une comparaison des amplitudes des PPSE mesurés à 9 intensités de stimulation à l'aide d'une analyse de variance à 2 facteurs (ANOVA) a montré une différence hautement significative entre les coupes provenant d'animaux mutants et d'animaux sauvages (F1,116 = 23.42 ; Nous avons ensuite examiné la facilitation synaptique en réponse à des paire de stimuli (FSPS). Cette propriété se réfère au phénomène par lequel le second stimulus d'une paire déclenche un PPSE dont l'emplitude est augmentée lorsque les stimuli se succèdent à des intervalles suffisamment courts ( Nous avons enfin analysé une forme de plasticité synaptique appelée potentialisation à long-terme (PLT) qui est dépendante de l'activation des récepteurs NMDA postsynaptiques au niveau des synapses Schaeffer-CAl (Bliss et Collingridge, 1993). L'application de trains courts de stimuli à haute fréquence selon un protocole connu sous le nom de stimulation thêta (voir matériel et méthodes) a provoqué chez les souris mutantes comme chez les souris témoins une augmentation stable et durable de l'efficacité de la transmission synaptique (Fig. 7, E). L'ANOVA des amplitudes des PPSE mesurés 1, 5,10, 15,20, 30,45, 60 et 90 min après stimulation thêta n'a pas montré de différence significative entre les génotypes (F1,117 = 0. 3823, P > 0.6), indiquant que la potentialisation post-tétanique, la potentialisation à court-terme et la PLT se sont développés selon un décours temporel et dans des proportions identiques dans les tranches préparées à partir d'animaux des deux groupes. Ces observations démontrent que la délétion de la protéine Parkine produit une altération significative de la transmission synaptique basale au niveau des synapses formées entre les collatérales de Schaeffer et les cellules de la région CAL Elles démontrent par ailleurs, au plan des propriétés de facilitation synaptique en réponse à des paire de stimuli ou a des simulations multiples à basse fréquence, que la délétion de Parkine accentue l'augmentation des PPSE évoquée par stimulations répétées des synapses. Des études antérieures ont établi que les interventions expérimentales conduisant à diminuer la libération de neurotransmetteur se traduisent dans les tranches d'hippocampe par une augmentation des phénomènes de facilitation synaptique (Creager et al., 1980 ; et Haas, 1985 ; 1989). De ce fait, l'observation conjointe d'une diminution de la taille des PPSE induits par des stimulations isolées et de l'augmentation de la facilitations induite par des stimulations répétées suggère que l'oblitération ciblée de la protéine Parkine conduit à une diminution de la libération pré-synaptique de neurotransmetteur. A l'inverse, la PLT n'est pas affectée chez les mutants Parkine, ce qui suggère que les propriétés neuronales post-synaptiques ne sont pas altérés dans cette région du cerveau. Il est admis que la plasticité synaptique dans l'hippocampe pourrait être impliquée dans des processus cellulaires qui sous-tendent la mémoire et l'apprentissage (Bliss et Collingridge, 1993). Les déficits cognitifs observés dans le comportement des mutants Parkine pourraient être liés à des altérations dans la libération de neurotransmetteur. 7-Modifications de l'expression des gènes et des protéines chez les souris mutantes parkine Les études d'études d'expression de gène ont montré un doublement de l'expression de CCK chez des souris ayant un fond mixte à 10 semaines et àl2 mois (Tableau 1). Des changements dans les niveaux de cholecystokinine et des récepteurs à la cholecystokinine ont aussi été observés dans le cerveau de patients Parkinsoniens (1984 de Diamant et al, Studler et 1982 al) Les études protéomiques ont montré une augmentation de l'expression de CDCREL-1 et de UCH-L1 chez des souris 129SV (Tableau 1). Des mutations dans le gène de l'UCHL-1 ont été impliquées dans la pathogenèse d'une forme familiale de la maladie de Parkinson à transmission autosomique dominante (E. Leroy et al, 1998 ) Tableau 1. Modification de l'expression des gènes et des protéines chez les souris mutantes Gène/Protéine Expression Région du Age cerveau Cholecystokinine Augmentée x2 Striatum 2 mois (gène) Cdcrel-1 Augmentée x1.2-1.5 Striatum 2 mois (protéine) Augmentée x1.3-1.5 Striatum 12 mois UCH-L1 Augmentée x1.3-1.5 Striatum 2 mois (protéine) Augmentée x1.3 Striatum 12 mois REFERENCES Beites et al, Nature Neurosci. (1999), 2: 434-439. Bliss, T. V.P. and Collingridge, G. L. Nature (1993), 361 : Creager, et al, J. Physiol. (Lond. ) (1980), 299 : De Rijk et al, J Neurol Neurosurg Psychiatry (1997), 62: 10-5 Diamond et al, Adv Neurol (1984), 40:483-8 Dunwiddie, T. V. and Haas, H.L. J. Physiol. (Lond. ) (1985), 369 : Hetier et al, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. (1988), 337:13-7. 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Neurosci. 12 (1989) 13-31. REVENDICATIONS 1. Animal transgénique non-humain caractérisé en ce qu'il présente un phénotype reproduisant certains aspects de la maladie de Parkinson chez l'homme et en ce qu'il comprend un gène codant pour la parkine dont l'exon 3 a été partiellement délété 2. Animal selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend un gène codant pour la parkine dont au moins environ 179 nucléotides de l'extrémité 3' de l'exon 3 ont été délétés. 3. Animal selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'au moins une partie de la délétion a lieu entre environ les positions 63 et 241 de l'exon 3 du gène de la parkine de souris. 4. Animal selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'au moins une partie de la délétion a lieu entre environ les positions 1670 et 1848 de la séquence SEQ ID N 1. 5. Animal selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend un gène codant pour la parkine dont au moins une partie de l'intron 3 a été délété. 6. Animal selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend un gène codant pour la parkine dont au moins environ 918 nucléotides de l'extrémité 5' de l'intron 3 ont été délétés. 7. Animal selon la revendication 1 caractérisé en ce au moins une partie de la délétion a lieu entre environ les positions 1 et 918 de l'intron 3 du gène de la parkine de souris. 8. Animal selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il produit un ou des ARN messagers dont la traduction aboutit à des protéines correspondant à des formes tronquées de la parkine animale, telle que la parkine de souris. 9. Animal selon la revendication 8 caractérisé en ce que la traduction du ou des ARN messagers aboutit à des protéines de 105 et/ou 106 acides aminés. 10. Animal selon la revendication 8 caractérisé en ce que les séquences ADN, correspondant à l'ARN messager ou aux ARN messagers, comprennent les séquences SEQ ID N 13 et/ou SEQ ID N 15. 11. Animal selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il exprime une ou des protéines correspondant à des formes tronquées de la parkine animale, telle que la parkine de souris. 12. Animal selon la revendication 11caractérisé en ce que les protéines sont avantageusement des protéines de 105 et/ou 106 acides aminés. 13. Animal selon la revendication 11caractérisé en ce que les protéines comprennent les séquences SEQ ID N 14 et/ou SEQ ID N 16, ou une partie de ces séquences. 14. Animal selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est un mammifère. 15. Animal selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est une souris, un rat ou un lapin. 16. Animal selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il présente une augmentation du taux de CDCrel-1par rapport à celui observé chez les animaux dont le gène de la parkine n'a pas été modifié. 17. Animal selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il présente un taux en cholecystokinine supérieur, préférentiellement au moins environ deux fois supérieur, à celui observé chez les animaux dont le gène de la parkine n'a pas été modifié. 18. Cellule extraite d'un animal selon l'une des revendications 1 à 17. 19. Utilisation d'un animal ou d'une cellule selon l'une des revendications 1 à 18 pour la mise en évidence de composés destinés au traitement des maladies neurodégénératives 20. Utilisation d'un animal ou d'une cellule selon l'une des revendications 1 à 18 pour la mise en évidence de composés destinés au traitement la maladie de Parkinson. 21. Procédé de criblage de composés destinés au traitement des maladies neurodégénératives comprenant les étapes suivantes : -administration du composé à tester à un animal à tester selon l'une des revendications 1 à 17, et -observation de l'évolution d'un ou plusieurs marqueurs caractéristiques reproduisant la neuropathologie observée chez l'homme. 22. Procédé selon la revendication 21 caractérisé en ce que ledit marqueur est le taux de CDCrel-1ou le taux en cholecystokinine ou UCHL-1 23. Protéine présentant la séquence SEQ ID N 16. 24. ADN présentant la séquence SEQ ID N 13. 25. ADN présentant la séquence SEQ ID N 15.