Brevet FR2840322A1 — publié le 20031205

La présente invention propose des procédés pour tester le potentiel d'un agent pour inhiber l'activité catalytique de l'héparanase. Les procédés de l'invention recouvrent l'immobilisation d'un substrat de l'héparanase via une protéine de liaison à un substrat de l'héparanase. Les procédés sont simples à réaliser et peuvent être mis en oeuvre de manière adaptée dans des systèmes robotiques pour HTS. L'héparane sulfate et les protéoglycanes à héparane sulfate (HSPG) sont présents dans la matrice extracellulaire (ECM) ainsi que sur la surface cellulaire. Ils jouent un rôle important dans la régulation de processus cellulaires tels que l'adhésion cellulaire, la migration, la différenciation et la prolifération (Jackson, R.L., Busch, S.J., et Cardin, A.L. (1991) Glysosaminoglycans: Molecular properties, protein interactions and role in physiological processes. Physiol. Rev. 71 481-539, Kjellen, L. et Lindahl, U. (1991) Proteoglycans: structures and interactions. Annu. Rev. Biochem. 60,443-475, Wight, T. N., Kinsella, M.G., et Qwarnstromn, E. E. (1992) The role of proteoglycans in cell adhesion, migration, and prolifération. Curr. Opin. Cell Biol. 4, 793-801). De plus, ils interagissent avec de nombreuses molécules, y compris les facteurs de croissance (par exemple, les facteurs de croissance fibroblastique et le facteur de croissance dérivé par plaquette), les cytokines, les protéines de la matrice extracellulaire, les lipoprotéines, et les protéines (3-amyloïdes (IshaiMichaeli, R., Eldor, E., et Vlodavsky, I. (1990) Heparanase activity expressed by platelets, neutrophils and lymphoma cells releases active fibroblast growh factor from extracellular matrix. Cell Reg. 1, 833-842, Schlessinger, J., Lax, I., et Lemmon, M. (1995) Régulation of growth factor activation by proteoglycans: what is the role in the low affinity receptors? Cell. 83,357-60, Najjam, S., Gibbs, R. V., Gordon, M.Y., et Rider, C. C. (1997) Characterization of human recombinant interleukin 2 binding to heparin and heparan sulfate using an ELISA approach. Cytokine. 9, 1013-22, Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivercrona, T., et Vlodavsky, I. (1992) Lipoprotein, lipase enhances binding of lipoproteins to heparan sulfate on cell surfaces and extracellular matrix. J. Clin. Invest. 90, 2013-2021, Schulz, J. G., Megow, D., Reszka, R., Villringer, A., Einhaupl, K. M., et Dirnagl, U. (1998) Evidence that glypican is a receptor mediating betaamyloid neurotoxicity in PC12 cells. Eur J Neurosci. 10, 2085-93). La libération de ces protéines par les protéases ou les glycosidases fournit un mécanisme de régulation pour l'induction de la croissance, la chimiotaxie, et l'extravasation des cellules dans les processus normaux et maladifs. L'héparanase est une endo-(-D)-glucuronidase qui dégrade les protéoglycanes à héparane sulfate (HSPG) sur des sites spécifiques. Son activité a été détectée dans un certain nombre de types cellulaires comprenant les plaquettes humaines, les fibroblastes, les neutrophiles, les lymphocytes T activés, les monocytes et les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) (Ishai-Michaeli, R., Eldor, A., et Vlodavsky, I. (1990) Heparanase activity expressed by platelets, neutrophils and lymphoma cells releases active fibroblast growth factor from extracellular matrix. Cell Reg. 1, 833-842, Schlessinger, J., Lax, I., et Lemmon, M. (1995) Régulation of growth factor activation by proteoglycans: what is the role of the low affinity receptors ? Cell. 83, 357-60, Najjam, S., Gibbs, R. V., Gordon, M.Y., et Rider, C. C. (1997) Characterization of human recombinant interleukin 2 binding to heparin and heparan sulfate using an ELISA approach. Cytokine. 9,1013-22, Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivercrona, T., et Vlodavsky, I. (1992) Lipoprotein, lipase enhances binding of lipoproteins to heparan sulfate on cell surfaces and extracellular matrix. J. Clin. Invest. 90,2013-2021, Schulz, J.G., Megow, D., Reszka, R., Villringer, A., Einhaupl, K. M., et Dirmagl, U. (1998) Evidence that glypican is a receptor mediating beta-amyloid neurotoxicity in PC12 cells. Eur J Neurosci. 10,2085-93, Kosir, M.A., Quinn, C. C., Zukowski, K. L., Grignon, D. J., et Ledbetter, S. (1997) Human prostate carcinoma cells produce extracellular heparanase. J. Surg. Res. 67,98-105, Godder, K., Vlodavsky, I., Eldor, A., Weksler, B. B., Haimovvitz-Friedman, A., et Fuks, Z. (1991) Heparanase activity in cultured endothelial cells. J. Cell Physiol. 148,274-280, Bame, K.J. (1993) Release of heparan sulfate glycosaminoglycans from proteoglycans in Chinese hamster ovary cells does not require proteolysis of the core protein. J. Biol. Chem. 268, 19956-19964). De plus, des niveaux d'héparanase élevés sont associés aux mélanomes et à d'autres types de cellules tumorales (Vlodavsky, I., Fuks, Z., BarNer, M., Ariav, Y., et Schirrmacher, V. (1983) Lymphoma cell mediated degradation of sulfated proteoglycans in the subendothelial extracellular matrix relationship to tumor cell metastasis. Cancer Res. 43,2704-2711, Vlodavsky, I., Eldor, A., Haimovitz-Friedman, A., Metzner, Y., Ishai-Michaeli, R., Lider, 0., Naparstek, Y., Cohen, I. R., et Fuks, Z. (19=2) Expression of heparanase by platelets and circulating cells of the immune system: possible involvement in diapedesis and extravasation. Invasion Metastasis 12,112-127, Nakajima, M., Irimura, T., DiFerranta, D., DiFerranta, N., et Nicholson, G. L. (1983) Heparan sulfate dégradation: relation to tumor invasion an metastatic properties of mouse B16 melanoma sublines. Science 220, 611-613, Ikuta, M., Podyma, K. A., Maruyama, K., Enomoto, S., Yanagishita, M. (2001) Expression of heparanase in oral cancer cell lines and oral cancer tissues. Oral Oncol 37,177-184). Les preuves suggèrent que le clivage des chaînes HS de HSPG par l'héparanase conduit au désassemblage de l'ECM et facilite la migration cellulaire. Il s'agit d'un processus important dans l'invasion tissulaire par les cellules tumorales malignes transportées par le sang et les leucocytes (Hanahan, D., et Folkman, J. (1996) Patterns and Emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenensis. Cell, 86,353-364, Zetter, B. R., (1998) Angiogenesis and tumor metastasis. Ann. Rev. Med. 49, 407-424, Nakajima, M., Irimura, T., et Nicholson, G.L. (1988) Heparanase and tumor metastasis J. Cell Biochem. 36, 157-167). En fait, le traitement des animaux expérimentaux avec des inhibiteurs de l'héparanase a considérablement réduit l'incidence des métastases pulmonaires (Vlodavsky, I., Mohsen, M., Lider, 0., Svahn, C.M., Ekre, H.P., Vigoda, M., Ishai-Michaeli, R., Peretz, T. (1995) Inhibition of tumor metastasis by heparanase inhibiting species of heparin. Invasion Metastasis 14,290-302, Parish, C. R., Coombe, D.R., Kakobsen, K. B., et Underwood, P.A. (1987) Evidence that sulphated polysaccharides inhibit tumor metastasis by blocking tumor cell-derived heparanase. Int. J. Cancer 40,511-517. Parish, C. R., Freeman, C., Brown, K.J., Francis, D. J., et Cowden, W. B. (1999) Identification of sulfated oligosaccharide-based inhibitors of tumor growth and metastasis using novel in vitro assays for angiogenesis and heparanase activity. Cancer Res. 59, 3433-3441), indiquant que les inhibiteurs de l'héparanase peuvent être appliqués pour inhiber l'invasion et la métastase de cellules tumorales. On a trouvé que la capacité des lymphocytes activés, des macrophages et des granulocytes à pénétrer dans l'ECM et à migrer vers les tissus cibles dépendait de l'activité héparanase (Lider, 0., Baharav, E., Mekori, Y.A., Miller, T., Naparstek, Y., Vlodavsky, I., et Cohen, I. R. (1989) Suppression of expérimental autoimmune diseases and prolongation of allograft survival by treatment of animais with low doses of heparins. J. Clin. Invest. 83, 752-756). En réponse à divers signaux d'activation (par exemple, les complexes immuns, les antigènes, les composés azotés), l'héparanase est libérée de compartiments intracellulaires (par exemple, les lysosomes, les granules spécifiques), suggérant son implication dans les réponses inflammatoires et autoimmunes. Le traitement des animaux expérimentaux avec les inhibiteurs de l'héparanase a réduit de manière importante l'incidence de l'hypersensibilité de type retardée à médiation de lymphocytes T, l'encéphalomyélite autoimmune expérimentale et l'arthrite adjuvante (Willenborg, D. O., et Parish, C.R. (1988) Inhibition of allergic encephalomyelitis in rats by treatment with sulfated polysaccharides. J. Immunol. 140, 3401-3405), indiquant que les composés inhibiteurs de l'héparanase peuvent être appliqués pour inhiber les maladies autoimmunes et inflammatoires. Ainsi, l'héparanase joue un rôle dans la dégradation de la matrice extracellulaire. Elle est impliquée dans l'inflammation, l'angiogenèse tumorale et la métastase. Malgré les preuves impliquant le caractère attractif de l'héparanase comme cible thérapeutique pour une intervention, le développement des médicaments a été freiné par le manque d'un procédé à haut débit pour tester la capacité d'agents à inhiber l'activité de l'héparanase. Des tests d'héparanase ont été effectués en utilisant des HSPG associés à l'ECM radiomarqués (Bartlett, et al., (1995) Comparative analysis of the ability of leukocytes, endothelial cells and platelets to dégrade the subendothelial basement membrane: Evidence for cytokine dependence and détection of a novel sulfatase. Immunol. Cell Biol. 73 : 113-124, Vlodavsky et al. (1992) Expression of heparanase by platelets and circulating cells of the immune system: Possible involvement in diapedesis and extravasation. Invasion Metastasis 12: 112-127). Le matériel radiomarqué libéré de l'ECM par clivage par l'héparanase est détecté. Un des désavantages est que les protéases sont souvent nécessaires pour exposer les chaînes HS à une dégradation par l'héparanase. L'analyse par filtration sur gel est difficile à adopter pour le haut débit. L'utilisation d'une substance radiomarquée implique de disposer du matériau selon les standards de sécurité. Satho et al. (Satho, A et al. (1999) Comparison of methods of immobilization to enzyme-linked immunosorbent assay plates for the détection of sugar chains. Anal. Biochem. 275,231-235) rapportent des procédés pour lier de manière covalente des oligosaccharides sur des plaques de microtitration revêtues de copolymère méthylvinyléther-anhydride maléique (MMAC). Ces procédés sont lourds parce qu'ils nécessitent plusieurs réactions chimiques pour lier des oligosaccharides sur les plaques revêtues de MMAC. Certains des réactifs et des solvants organiques peuvent détruire les plaques de microtitration. De plus, le rendement global peut être très bas après plusieurs étapes de réactions chimiques. Freeman et Parish rapportent un procédé rapide pour mesurer l'activité héparanase (Freeman, C., et Parish, C. R. (1997) A rapid quantitative assay for the détection of mammalian heparanase activity. Biochem. J. 325,229-237). La glycoprotéine riche en histidine de poulet (cHRG) a été couplée à du Sepharose et utilisée pour isoler le HS non digéré. Bien que le procédé sépare les produits clivés par l'héparanase du substrat HS, le procédé nécessite de grandes quantités de cHRGSepharose pour diminuer quantitativement le HS non différé des mélanges réactionnels. De plus, la manipulation de billes de Sepharose associée à des procédés de chromatographie sur colonne et de centrifugation ne se prête pas au criblage à haut débit. Ben-Artzi et al. (Ben-Artzi et al. (2001) Methods of screening for potential anti-metastatic and antiinflammatory agents using mammalian heparanase as a probe. Brevet US n 6 190 875) rapportent un essai à haut débit pour mesurer l'activité héparanase. En utilisant du HS ou certains types d'espèces d'héparine comme substrat, la réaction à l'héparanase est effectuée sur des plaques de microtitration de 96 puits et arrêtée par l'addition de bleu de tétrazolium. Le bleu de tétrazolium réagit avec les extrémités réactives des sucres exposés par clivage à l'héparanase. Le nombre de clivages du substrat mesuré par calorimétrie. L'essai nécessite l'utilisation de grandes quantités de HS comme substrat (50 g de HS par 100 l) et une période d'incubation d'au moins 2 heures (2 à 24 heures). Ces exigences de l'essai, bien que non optimale du point de vue de la procédure, fournissent des conditions qui favorisent le clivage des sucres du substrat HS. La mesure d'un plus grand nombre de sucres réactifs est nécessaire pour compenser à un certain degré le faible rapport signal à bruit de fond. Un autre inconvénient de l'essai provient de l'utilisation d'un sel de tétrazolium qui est réactif avec de nombreux types de groupes, et peut ainsi donner des résultats inexacts. La pureté des réactifs d'essai et des composés test est donc un problème. L'activité catalytique de l'héparanase peut aussi être inhibée indirectement par un agent qui prévient ou altère la liaison du substrat de l'héparanase au facteur de croissance fibroblastique (FGF). Parce que ces agents peuvent potentiellement bloquer les évènements de signalement cellulaire à intermédiaire FGF, ce sont des candidats potentiels comme agents thérapeutiques du cancer et des maladies provoquées par une néovascularisation anormale (Folkman, J. (1995) Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other diseases, Nat. Med. 1, 27-31). La présente invention propose un procédé pour tester le potentiel d'un agent pour inhiber de l'activité catalytique de l'héparanase, comprenant les étapes consistant à : faire interagir une protéine de liaison du substrat de l'héparanase immobilisée sur un support solide avec un substrat de l'héparanase marqué pour fournir un substrat de l'héparanase marqué immobilisé, faire interagir une solution d'enzyme héparanase avec le substrat de l'héparanase marqué immobilisé en présence de l'agent, et détecter la présence ou l'absence du marqueur dans la solution isolée du support solide, pour déterminer si l'agent a le potentiel d'inhiber l'héparanase. Le substrat de l'héparanase marqué peut être lié à un pont d'immobilisation qui se lie aux molécules immobilisées sur un support solide, pour fournir un substrat de l'héparanase marqué immobilisé par pontage. La présente invention propose aussi un procédé pour tester la capacité d'un agent à inhiber la liaison entre le facteur de croissance fibroblastique (FGF) et le substrat de l'héparanase, comprenant les étapes consistant à : faire interagir en solution du FGF immobilisé sur un support solide avec l'agent et le substrat d'héparanase marqué, et détecter la présence ou l'absence du marqueur dans la solution isolée du support solide, pour déterminer si l'agent a la capacité d'inhiber la liaison entre le facteur de croissance fibroblastique (FGF) et le substrat de l'héparanase. La figure 1A est une illustration graphique des produits de digestion de l'héparanase du F2FITC-HS élués d'une Superose 6-FPLC. La figure 1B est une illustration graphique des produits de digestion par l'héparanase du 3H-HS élues d'une Superose 6-FPLC. La figure 2 est une illustration graphique de la liaison en fonction de la concentration de FGF à des plaques de microtitration à pH 7,5 et pH 9,5. La figure 3 est une illustration graphique de la liaison en fonction de la concentration de F2FITC-HS à des plaques revêtues de FGF. La figure 4 est une illustration graphique de l'activité héparanase par le produit exprimé de cellules CHO transfectées. La figure 5 est une illustration graphique de la digestion en fonction de la concentration d'héparanase du F2FITC-HS sur des plaques revêtues de FGF. La figure 6 est une illustration graphique de l'élution d'une Superose 6-FPLC du produit de digestion de l'héparanase de l'essai de l'héparanase F2FITCHS/FGF. La figure 7 est une illustration graphique de la progression de la digestion par l'héparanase. La figure 8 est une illustration graphique de la dépendance de l'activité héparanase au pH. La figure 9, un diagramme de dispersion d'identification sur plaque contre les unités de fluorescence (UF) dans l'essai F2FITC-HS/FGF, présente le signal d'activité héparanase totale, c'est-à-dire, l'intensité de fluorescence moyenne du produit de digestion après addition de l'héparanase sans aucun inhibiteur potentiel, et montre le signal du bruit de fond, c'est-à-dire, l'intensité de fluorescence moyenne du tampon d'essai. La figure 10 est un diagramme de dispersion présentant les facteurs Z' calculés pour les plaques indiquées. La figure 11A est une illustration graphique de la liaison en fonction de la concentration de EU-HS aux plaques revêtues de FGF. La figure 11B, un diagramme de la concentration d'héparanase contre les unités fluorimétriques à résolution de temps (FRT), présente la digestion en fonction de la concentration d'héparanase du Eu-HS sur des plaques revêtues de FGF. La figure 12A est une illustration graphique de la liaison en fonction de la concentration de F2ITC-HSbiotine aux plaques revêtues de SA. La figure 12B est une illustration graphique de la digestion en fonction de la concentration d'héparanase de la F2ITC-HS-biotine sur des plaques revêtues de SA. La figure 13A est une illustration graphique de la liaison en fonction de la concentration de Eu-HSbiotine aux plaques revêtues de SA dans un diagramme de concentration contre FRT mesurée. La figure 13B est une illustration graphique de la digestion en fonction de la concentration d'héparanase de la Eu-HS-biotine sur des plaques revêtues de SA dans un diagramme de concentration contre FRT mesurée. La présente invention propose des procédés pour mesurer l'activité héparanase et pour tester le potentiel d'inhibition de l'activité héparanase d'un ou de plusieurs agents. Les procédés de la présente invention sont simples à réaliser. Ils peuvent aussi être mis en oeuvre de manière adaptée dans des systèmes robotiques pour le criblage à haut débit (HTS). Le composant HS des HSPG in vivo sert de récepteur de faible affinité pour le facteur de croissance fibroblastique (FGF) sur la surface cellulaire. Après le clivage par l'héparanase, le complexe FGF/HS est libéré de la surface cellulaire pour stimuler la prolifération cellulaire. Au cours de l'angiogenèse, de la métastase, et de l'inflammation, une activité héparanase élevée favorise la libération du complexe FGF/HS de la surface cellulaire, de la matrice extracellulaire et de la membrane basale. La présente invention peut utiliser le caractère physiologique approprié de l'activité catalytique de l'héparanase à l'activité du complexe FGF/substrat de l'héparanase de la surface cellulaire pour cribler des agents pour leur potentiel à inhiber l'activité catalytique héparanase. La présente invention recouvre les essais dans lesquels le substrat de l'héparanase est immobilisé par l'intermédiaire d'une protéine de liaison du substrat de l'héparanase. La présente invention implique l'interaction d'une protéine de liaison du substrat de l'héparanase immobilisée avec un substrat de l'héparanase marqué. La protéine de liaison du substrat de l'héparanase est immobilisée sur un support solide. Après l'interaction d'une protéine de liaison du substrat de l'héparanase immobilisée avec un substrat de l'héparanase marqué, le substrat de l'héparanase marqué se lie à la protéine de liaison du substrat de l'héparanase immobilisée, ce qui donne une protéine de liaison du substrat de l'héparanase- substrat de l'héparanase marqué immobilisé. La protéine de liaison du substrat de l'héparanase- substrat de l'héparanase marqué immobilisé est incubée avec une solution d'enzyme héparanase pour permettre à l'héparanase le clivage enzymatique du substrat de l'héparanase marqué. Les fragments clivés provenant de la digestion par l'enzyme en solution sont libérés dans la solution. La solution des produits de digestion de l'enzyme est testée isolée du support solide, pour mesurer le marquage pour la détermination de l'activité catalytique de l'héparanase. Cette incubation d'héparanase en absence d'un agent test sert à établir le point de 100% de l'activité catalytique de l'héparanase, à partir duquel le pourcentage d'inhibition de l'activité héparanase dû à un agent test peut être calculée. Dans le test du potentiel d'inhibition de l'activité catalytique de l'héparanase d'un agent, l'enzyme héparanase et la protéine de liaison du substrat de l'héparanase - substrat de l'héparanase marqué immobilisé sont incubées en présence de l'agent. La solution des produits de digestion de l'enzyme est testée isolée du support solide, pour mesurer le marquage pour déterminer si l'agent a le potentiel .d'inhiber l'héparanase. Un pourcentage d'inhibition de l'activité héparanase peut être calculé pour un agent en se basant sur le point établi de 100% d'activité catalytique héparanase. La protéine de liaison de substrat de l'héparanase peut être n'importe quelle protéine, peptide ou fragment de celle-ci, qui se lie au substrat de l'héparanase. Les exemples comprennent le FGF, le VEGF, et le PDGF. Le FGF peut être naturel ou synthétique. Le FGF peut être obtenu bon marché par clonage et expression, par exemple, comme décrit dans Prats et al. (Prats H et al. (1989) High molecular mass forms of basic fibroblast growth factor are initiated by alternative CUG codons. Proc Natl Acad Sci USA 86,1836-40). L'enzyme héparanase peut être naturelle ou synthétique. L'héparanase peut être obtenue par clonage et expression, par exemple, comme décrit dans l'exemple 2. Le substrat de l'héparanase marqué contient un substrat de l'héparanase et au moins un marqueur attaché au substrat de l'héparanase, pour la détection. Dans la présente invention, le substrat de l'héparanase se rapporte à un substrat qui peut être clivé en produits de dégradation par l'enzyme héparanase, et qui a la capacité de se lier au FGF. Le substrat de l'héparanase peut être choisi parmi l'héparane sulfate (HS), les protéoglycanes à héparane sulfate (HSPG) et les analogues de l'héparane sulfate. Les analogues de l'héparane sulfate selon la présente invention sont des analogues qui sont clivés par l'enzyme héparanase. Bien que l'héparine soit en général considérée comme un inhibiteur de l'héparanase, certaines espèces d'héparine qui se comportent comme des substrats de l'héparanase (Ben-Artzi, H et al. brevet US n 6 190 875) sont aussi considérés comme des analogues de l'héparane sulfate selon la présente invention. Cependant, les caractéristiques structurales de l'héparine nécessaires pour la liaison au FGF sont indiquées comme différentes de celles suffisantes pour le déplacement du ssFGF lié au HS sur les surfaces cellulaires et l'ECM (Ben-Artzi, H et al., brevet US n 6 190 875, Ishai-Michaeli, R. et al. (1992) Importance of size and sulfation of heparin in release of ssFGF from the vascular endothelium and extracellular matrix. Biochemistry 31: 2080-2088). Ainsi, les espèces d'héparine qui ne déplacent pas le ssFGF in vivo n'auraient pas la même signification physiologique dans un essai utilisant le FGF immobilisé comme l'héparane sulfate, par exemple. Le au moins un marqueur pour le substrat de l'héparanase peut être choisi parmi les molécules fluorescentes, chimioluminescentes et chromogènes. Le substrat de l'héparanase peut être marqué avec un ou plusieurs marqueurs. Si on le souhaite, le(s) marqueur(s) pour le substrat de l'héparanase peut être choisi pour sa capacité à fournir une détection de signal sensible. Un marqueur fluorescent se rapporte à un fluorophore ou à un groupe contenant un fluorophore. Parce que le fluorophore émet la lumière absorbée à une longueur d'onde caractéristique, le substrat de l'héparanase marqué de manière fluorescente est détectable en utilisant les moyens de détection de la fluorescence connus. Le marqueur fluorescent peut être, par exemple, la fluorescéine (comme, par exemple, l'isothiocyanate de fluorescéine FITC ou F2FITC), les chélates de lanthanide, la rhodamine, etc. Les lanthanides couramment disponibles dans le commerce sont l'europium (Eu), le samarium (Sm), le terbium (Tb) et le dysprosium (Dy). L'utilisation du FITC comme marqueur permet une détection sensible de l'intensité de fluorescence et peut être utilisé de manière avantageuse pour tester un grand nombre d'agents. Le F2FITC présente une photostabilité de fluorescence légèrement meilleure, et nécessite moins d'extinction que le FITC. L'Eu-chélate, un chélate de lanthanide, présente une décomposition par fluorescence longue. Les essais utilisant le Euchélate peuvent éliminer la contribution de toute fluorescence détectée due à l'agent à tester. Récemment, les essais fluorimétriques en résolution de temps (FRT) utilisant des Eu-chélates comme fluorophores ont été largement utilisés pour le HTS (Hemmila, I., Dakubu, S., Mukkala, V. M., Siitari, H., Lovgren, T/. (1984) Europium as a label in timeresolved immunofluorometric assays. Anal. Biochem. 137, 335-343 ; Hemmila, I. et Webb, S (1997) Time-resolved fluorometry : An overview of the labels and core technologies for drug screening applications. Drug Discovery Today 2, 373-381). Ces fluorophores présentent une unité de fluorescence intense et de longue durée de vie, ce qui permet de mesurer la fluorescence après un délai. Cela élimine les coups de bruit de fond des émissions de fluorescence à courte durée de vie des fluorophores organiques qui accompagnent l'échantillon, parce qu'ils se seront décomposés avant la détection. Cette fluorescence retardée, en combinaison avec un déplacement de Stokes important (340-625 nm), réduit efficacement les émissions de bruit de fond et contribue à la sensibilité de l'essai. Les essais développés en utilisant du Eu marqué-HS et du Eu marqué-biotine-HS présentent un sensibilité supérieure à ceux utilisant le marqueur FITC. Le Eu(DPTA), DPTA étant le 1- (p- isothio-cyanatobenzyl) diéthylènetriamine-Nl, Nl, N2, N3, N3-acide pentaacétique, est aussi sensible, toutefois il est plus sensible que le Eu-chélate aux conditions acides de la digestion par l'héparanase (c'est-à-dire, pH 5,4). Quand un marqueur fluorescent est utilisé, les échantillons de digestion enzymatique sont passés à travers une source de lumière, telle qu'un laser émettant à la longueur d'onde d'excitation du fluorophore. La fluorescence est mesurée en lisant les photons émis à la longueur d'onde d'émission du fluorophore. Par exemple, la longueur d'excitation pour la fluorescence est d'environ 494 nm, et pour le Eu chélate elle est d'environ 340 nm. La longueur d'onde d'émission pour la fluorescéine, par exemple, est d'environ 518 nm et d'environ 615 pour le Eu-chélate. Un exemple d'un marqueur radioactif est le tritium (3H). Un exemple de marqueur chromogène est le paranitrophényle (PNP). Le ou les agents criblés peuvent être de n'importe quel type. Ils peuvent être des agents naturels ou fabriqués par l'homme (synthétiques). Par exemple, les agents peuvent être des composés à molécule de petite taille, des peptides, des protéines ou des anticorps. On sait que l'activité catalytique d'une enzyme peut être inhibée en liant un anticorps au site actif. Tel qu'utilisé ici, le terme "anticorps" se rapporte à n'importe quelle immunoglobine monoclonale ou polyclonale, ou à un fragment d'une immunoglobine, par exemple, Fab 1 ou Fab 2. L'immunoglobine peut être un anticorps "humanisé" qui comprend des régions d'anticorps fusionnées ou greffées, parmi lesquelles au moins une des régions est dérivée d'un anticorps humain. Le substrat de l'héparanase est immobilisé sur un support solide qui est approprié pour des objectifs de tests in vitro. Les exemples de support solide comprennent une plaque de microtitration, des billes de sepharose et des billes de polymère. Le procédé est sensible. Seulement environ 1 sur 10 sites de clivage potentiels sur le substrat de l'héparanase marqué sont masqués du fait de la liaison au FGF. La capacité de haut débit de l'essai du substrat de l'héparanase marqué/FGF peut être réalisée en l'adaptant à un système robotique. Par exemple, un débit de criblage supérieur à 25 000 composés par jour a été obtenu pour l'essai FGF/FITC-HS en utilisant un système uHTS Zeiss. Pour éliminer tout résultat positif dû à la fluorescence intrinsèque des composés tests, l'essai FGF/EU-HS, par exemple, peut être utilisé pour retester les agents qui ont été testés positif dans l'essai FITC-HS/FGF. Sous un autre aspect de l'invention, le substrat de l'héparanase est lié à au moins un marqueur et à un pont d'immobilisation. Un pont d'immobilisation, dans la présente invention, est un groupe ou des groupes (a) qui est capable de se lier au substrat de l'héparanase, (b) qui, quand il est lié au substrat de l'héparanase marqué, (i) n'interfère pas avec l'activité catalytique de l'héparanase du substrat de l'héparanase marqué, et (ii) n'interfère pas avec ou n'ajoute pas de signaux superflus à la mesure d'au moins un marqueur, et (c) qui se lie à une molécule capable d'être immobilisée sur un support solide. On fait interagir le substrat de l'héparanase marqué lié à un pont d'immobilisation avec la molécule immobilisée qui se lie spécifiquement au pont d'immobilisation. On fait ensuite réagir le substrat de l'héparanase marqué immobilisé par pontage obtenu avec l'héparanase. Les produits de clivage de l'héparanase sont libérés comme fragments marqués en solution. On mesure ensuite la solution pour le marqueur isolé du support. Par exemple, le pont d'immobilisation et la molécule correspondante immobilisée sur un support solide peuvent être la biotine et la streptavidine (SA) ou l'avidine, respectivement. Dans un mode de réalisation de la présente invention, le substrat de l'héparanase est HS, le marqueur est un marqueur fluorescent et le pont d'immobilisation et la molécule correspondante immobilisée sur un support solide sont la biotine et la streptavidine, respectivement. La biotine se lie au sucre terminal de la chaîne HS plutôt qu'aux sites de clivage de l'héparanase. Ainsi, la liaison de la biotine-HS à marquage fluorescent à la SA ne doit pas interférer avec l'action catalytique de l'héparanase. Dans l'alternative à l'utilisation d'un substrat de l'héparanase qui est attaché à au moins un marqueur et à un pont d'immobilisation, le substrat de l'héparanase peut être lié à un pont d'immobilisation sans marqueur. Sous cet aspect de l'invention, un essai testant le potentiel d'inhibition de l'activité catalytique d'un agent en utilisant un substrat de l'héparanase marqué immobilisé par le FGF est effectué comme indiqué précédemment. De plus, un essai testant l'agent utilisant un substrat de l'héparanase lié à un pontage immobilisé est effectué. Cet essai utilisant un substrat de l'héparanase lié à un pont d'immobilisation peut être utilisé de manière avantageuse pour déterminer si l'activité inhibitrice de l'héparanase des agents tests que l'on trouve inhiber l'activité de l'héparanase dans l'essai du FGF/substrat de l'héparanase marqué est confirmé. La CI50 se rapporte à la concentration d'un agent nécessaire pour inhiber 50% d'une activité spécifique mesurée. Dans la présente invention, l'activité mesurée spécifique à laquelle on se rapporte est l'activité catalytique de l'héparanase. Une CI50 peut être obtenue pour chaque agent test. D'autres informations concernant la détermination de la CI50 peuvent être trouvées dans l'exemple 16. La détection de la présence ou de l'absence d'un marqueur dans la solution de produits de digestion enzymatiques est effectuée sur un site isolé du support solide. La mesure est effectuée sur le site isolé, de telle manière que la mesure du marqueur n'est pas biaisée par un marqueur qui peut rester immobilisé sur le support solide. Il n'est pas nécessaire que le site isolé du support solide soit à une distance quelconque du support solide. La mesure du marqueur peut être effectuée à proximité du support solide, par exemple, avec l'utilisation d'un écran contre la détection d'un marqueur restant sur le support solide, et être isolée du support solide selon la présente invention. Les agents qui ont été déterminés comme inhibant l'activité de l'héparanase par le procédé de l'essai du FGF/substrat de l'héparanase marqué ont été testés dans des essais de cinétique comme dans l'exemple 17. Les résultats (non présentés ici) ont indiqué que ces agents étaient des inhibiteurs compétitifs ou mixtes de l'héparanase au site actif enzymatique de l'héparanase. Les exemples 18 à 21 apportent aussi une validation de l'essai du FGF/substrat de l'héparanase marqué. La présente invention comprend aussi un procédé pour cribler les agents pour déterminer s'ils interfèrent avec les interactions HS/FGF, car ils peuvent libérer des fragments de substrat de l'héparanase même en absence d'héparanase. De plus, ces agents peuvent être des agents thérapeutiques utiles dans le traitement du cancer et des malades provoquées par une néovascularisation anormale. La liaison du substrat de l'héparanase marqué à des plaques revêtues de FGF peut être contrôlée (voir les figures 3 et 11A). On ajoute le substrat de l'héparanase marqué aux plaques revêtues de FGF en une quantité capable de se lier au FGF immobilisé. Le surnageant est mesuré pour le marqueur isolé du support solide, qui doit fournir une mesure du bruit de fond. Dans le test d'un agent, on fait interagir l'agent et le substrat de l'héparanase marqué en solution avec le FGF immobilisé. Le surnageant est testé isolé du support solide pour détecter la présence ou l'absence du marqueur, pour déterminer si l'agent a la capacité d'inhiber la liaison entre le facteur de croissance fibroblastique et le substrat de l'héparanase. Les agents capables d'inhiber la liaison présenteront une mesure plus élevée du marqueur dan le surnageant par rapport à la mesure du bruit de fond. Ainsi, la présente invention propose aussi l'utilisation du procédé décrit précédemment pour l'identification d'inhibiteurs de liaison entre le FGF et le substrat de l'héparanase. De plus, l'utilisation de ces agents qui inhibent la liaison entre le FGF et le substrat de l'héparanase pour la préparation d'un médicament pour le traitement du cancer et des maladies provoquées par une néovascularisation anormale est proposée. Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne l'utilisation des procédés de la présente invention pour l'identification d'inhibiteurs de l'activité catalytique de l'héparanase. Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un kit comprenant les composants nécessaires pour réaliser un procédé de la présente invention choisis dans le groupe comprenant un support solide, une protéine de liaison de substrat de l'héparanase qui est ou peut être immobilisée sur le support solide, un substrat de l'héparanase marqué et l'héparanase. Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un kit comprenant les composants nécessaires pour réaliser un procédé de la présente invention choisis dans le groupe comprenant un support solide, une molécule qui est ou peut être immobilisée sur le support solide et qui se lie spécifiquement à un pont d'immobilisation, un pont d'immobilisation capable de se lier à un substrat de l'héparanase, un substrat de l'héparanase marqué et l'héparanase. De plus, la présente invention concerne des nouveaux inhibiteurs de l'activité catalytique de l'héparanase et des nouveaux inhibiteurs de la liaison entre le FGF et le substrat de l'héparanase identifiés par les procédés de la présente invention. La présente invention propose en outre une composition pharmaceutique comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable et une quantité thérapeutiquement efficace d'un inhibiteur de l'activité catalytique de l'héparanase identifié par les procédés de la présente invention ; ainsi que les sels pharmaceutiquement acceptables de ceux-ci. De plus, la présente invention propose un procédé pour la production d'une composition pharmaceutique comprenant les étapes des procédés de la présente invention, modifiant l'agent identifié et formulant l'agent obtenu avec un véhicule ou un diluant pharmaceutiquement acceptable. La phrase "pharmaceutiquement acceptable" est employée ici pour se rapporter aux composés, substances, compositions et/ou posologies qui sont, dans la portée d'un jugement médical valable, adaptés pour une utilisation en contact avec les tissus d'êtres humains et d'animaux sans toxicité, irritation, réponse allergique excessives, ou autre problème ou complication, proportionné à un rapport avantage/risque raisonnable. Tel qu'utilisé ici, "sels pharmaceutiquement acceptables" se rapporte aux dérivés des agents identifiés dans lesquels l'agent parent est modifié en fabriquant des sels acides ou basiques de celui-ci. Les exemples de sels pharmaceutiquement acceptables comprennent, mais sans y être limité, les sels acides minéraux ou organiques de résidus basiques tels que les amines ; les sels alcalins ou organiques de résidus acides tel que les acides carboxyliques ; et similaires. Les sels pharmaceutiquement acceptables comprennent les sels non toxiques conventionnels ou les sels d'ammonium quaternaire du composé parent formé, par exemple, à partir d'acides non toxiques inorganiques ou organiques. Par exemple, ces sels non toxiques conventionnels comprennent ceux dérivés d'acides inorganiques tels que les sels chlorhydrique, bromhydrique, sulfurique, sulfamique, phosphorique, nitrique et similaires ; et les sels préparés à partir d'acides organiques tels que les sels acétique, propionique, succinique, glycolique, stéarique, lactique, malique, tartrique, citrique, ascorbique, pamoïque, maléique, hydroxymaléique, phénylacétique, glutamique, benzoïque, salicylique, sulfanilique, 2-acétoxybenzoïque, fumarique, benzène sulfonique, toluène sulfonique, méthane sulfonique, éthane disulfonique, oxalique iséthionique, et similaires. Les sels pharmaceutiquement acceptables de la présente invention peuvent être synthétisés à partir de l'agent parent qui contient une fraction basique ou acide par de procédés chimiques conventionnels. En général, ces sels peuvent être préparés en faisant réagir les formes acides ou basiques libres de ces composés avec une quantité stoechiométrique de la base ou de l'acide approprié dans de l'eau ou dans un solvant organique, ou dans un mélange des deux ; en général, les milieux non aqueux comme l'éther, l'acétate d'éthyle, l'éthanol, l'isopropanol, ou l'acétonitrile sont préférés. Les listes des sels adaptés sont trouvés dans Pharmaceutical Sciences de Remington, 17ème édition, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418, dont la description est incorporée ici par référence. Les agents identifiés par le procédé de la présente invention peuvent être modifiés pour obtenir (i) un site d'action, un spectre d'activité modifiés, et/ou (ii) une meilleure puissance, et/ou (iii) une diminution de la toxicité (indice thérapeutique amélioré), et/ou (iv) une diminution des effets secondaires, et/ou un déclenchement de l'action, une durée de l'effet, modifiés, et/ou (vi) des paramètres cinétiques modifiés (résorption, distribution, métabolisme et excrétion), et/ou (vii) des paramètres physico-chimiques modifiés (solubilité, hygroscopicité, couleur, goût, odeur, stabilité, état), et/ou (viii) une spécificité générale, une spécificité d'organe/tissu, améliorées, et/ou (ix) une forme d'application améliorée et une voie par (i) estérification des groupes carboxyle, ou (ii) estérification des groupes hydroxyle avec des acides de carbone, ou (iii) estérification des groupes hydroxyle en, par exemple, phosphates, pyrophosphates ou sulfates ou hémisuccinates, ou (iv) formation de sels pharmaceutiquement acceptables, ou (v) formation de complexes pharmaceutiquement acceptables, ou (vi) synthèse de polymères pharmacologiquement actifs, ou (vii) introduction de fractions hydrophiles, ou (viii) introduction/échange de substituants sur des aromates ou des chaînes latérales, changement du type de substituant, ou (ix) modification par introduction de fractions isostères ou bioisostères, ou (x) synthèse de composés homologues, ou (xi) introduction de chaînes latérales ramifiées, ou (xii) conversion de substituants alkyle en analogues cycliques, ou (xiii) dérivatisation du groupe hydroxyle en cétals, acétals, ou (xiv) N-acétylation en amides, phénylcarbamates, ou (xv) synthèse de bases, imines de Mannich, ou (xvi) transformation de cétones ou d'aldéhydes en base de Schiff, oximes, acétals, cétals, énolesters, oxazolidines, thiozolidines, ou combinaisons de ceuxci ; et (b) formulation du produit de ladite modification avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable ou un véhicule/diluant acceptable pour des compositions ou produits de fragrance ou de flaveur. De plus, la présente invention se rapporte à l'utilisation des inhibiteurs de l'activité catalytique de l'héparanase identifiés par les procédés de la présente invention pour la préparation d'un médicament pour le traitement des maladies autoimmunes et inflammatoires et du cancer, en particulier de l'angiogenèse tumorale et de la métastase. Ayant désormais décrit la présente invention en termes généraux, elle deviendra mieux comprise par référence aux exemples spécifiques, qui sont compris ici à titre d'illustration seulement, et ne sont pas destinés à être limitatifs sauf indication contraire, en rapport avec les figures suivantes. EXEMPLES En ce qui concerne les exemples suivants, l'héparane sulfate de rein bovin a été obtenu de Seikagaku Corp. La fluorescéin-5-isothiocyanate (FITC "isomère I") et l'Oregon Green 488 isothiocyanate (F2FITC) ont été obtenus chez Molecular Probes. DELFIA Eu-DTPA-ITC chélate, Wash Concentrate, Enhancement Solution viennent de Perkin-Elmer Life Sciences. La Biotine-LC-Hydrazide a été obtenue chez Pierce. La Nacétylmannosamine est de Lancaster. La sérumalbumine bovine (BSA), le Triton X 100 et le Tween 20 étaient de Roche Molecular Biochemicals. EXEMPLE 1 : CLONAGE, EXPRESSION ET PURIFICATION DE FGF Le bFGF a été cloné et exprimé comme décrit (Prats et al. (1989) High molecular mass forms of basic fibroblast growth factor are initiated by alternative CUG codons. Proc Natl Acad Sci USA 86, 1836-40). Les cellules de E. coli exprimant le bFGF ont été resuspendues dans un tampon de lyse (20 mM NaPO4, 5 mM EDTA, pH 7, 0) à un rapport de 1 g de cellules/5 ml de tampon de lyse. Des comprimés de cocktail d'inhibiteurs de protéases (sans EDTA ; Roche Molecular Biochemicals) et du lysozyme (200 microgrammes/ml) ont été ajoutés, et la suspension a été agitée pendant 30 minutes à 4 C. L'échantillon a été soniqué, de la RNAase et de la DNAase (Roche Molecular Biochemicals) ont été ajoutées (1 microgramme/ml), et l'échantillon a été incubé pendant 30 minutes supplémentaires. Après la centrifugation de l'échantillon à 20 000 x g pendant 20 minutes, le surnageant a été filtré à travers un filtre de 0,8 micron et chargé sur une colonne de SP sepharose équilibrée avec 20 mM NaP04, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,0. Après le lavage de la colonne avec un tampon d'équilibrage, le bFGF a été élué de la colonne avec 20 mM NaP04, 600 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,0. La fraction éluée a été concentrée et chargée sur une colonne d'héparine Sepharose qui avait été équilibrée avec le tampon d'élution SP Sepharose. Le bFGF a été élué avec 20 mM NaP04, 2 M NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,0. Le bFGF purifié a été concentré après l'addition de 1 mM DTT à l'échantillon. Pour induire la formation d'oligomère, le bFGF concentré a été dialysé pendant 72 heures à 4 C contre de multiples changements de tampon de dialyse (50 mM NH4C03, 50 mM NaCl, pH 8,0). EXEMPLE 2 : CLONAGE, EXPRESSION ET PURIFICATION DE L'HEPARANASE Un clone de l'ADNc d'héparanase humaine de taille complète a été obtenu à l'ATCC. En utilisant la séquence publiée dans GenBank (n d'accès AF152376), des oligomères ont été conçus pour amplifier par PCR le cadre de lecture ouvert (ORF) comprenant 1632 pb, tout en ajoutant en même temps (i) des sites de restriction pour le sous-clonage (5' KpnI-3' NotI), (ii) en ajoutant à l'extrémité C-terminale de l'ORF un épitope étiquette de 6 acides aminés ("EE-tag", NH2-EFMPMECOOH), précédée d'un lieur flexible de 4 acides aminés (SGSG) et suivie par un résidu Ala unique précédant le codon STOP. L'amorce sens (SEQ ID N : 1) était 5'GGGTACCATGCTGCTGCGCTCGAAGCCTGCGCTGCCGCCGCCGCTGATGCTGS3'. L'amorce antisens (SEQ ID N . 2) était 5'ATAGTTTAGCGGCCGCTCACGCTTCCATCGGCATGAATTCACCAGAACCAGAGA TGCAAGCAGCAACTTTGGCATTTCTTATCACAAAAAAACTATATGAG3'. L'amplimère a été obtenu en utilisant une polymérase à correction d'épreuve et le plasmide de l'ATCC comme matrice. L'amplimère obtenu a été digéré avec KpnI et NotI et sous-cloné dans le vecteur d'expression mammifère pEFBOS. La séquence de l'ORF cloné a été vérifiée avant la co-transfection de cellules CHO avec la construction d'expression de l'héparanase et un vecteur de sélection NEO. Des cellules de Hamster chinois déficientes pour la dihydrofolate réductase (CHOdhfr-) ont été utilisées comme hôte pour la transfection. On a fait pousser les cellules (2 x 105 cellules/puits) sur du DMEM supplémenté avec 10% (v/v) de FBS plus 100 M de Nahypoxanthine et 16 M de thymidine (1 X HT) dans une plaque de culture de tissu à 6 puits. La transfection a été effectuée par l'addition à la culture de 0,5 ug d'ADN plasmidique codant pour les gènes de l'héparanase (pEF-BOS), de la résistance à la néomycine (pRSV-Neo) et de la dihydrofolate réductase (pSV-dhfr), dans un rapport de 15 :1:1, en présence de 2 l de réactif FuGene6 (Roche Molecular Biochemicals). Après 72 heures d'incubation dans un incubateur à CO2 à 37 C, le milieu de culture a été remplacé avec du DMEM moins HT supplémenté avec 10% de FBS dialysé. La culture transfectée a en outre été incubée pendant 4 à 8 semaines avec un changement de milieu trois fois/semaine. Les cellules ayant survécu au milieu sélectif ont ensuite été transférées dans des boîtes de 150 mm ensemencées avec 1 x 106 cellules/boîte dans du milieu DMEM moins HT contenant 10% de FBS dialysé et en augmentant les concentrations de méthotrexate (MTX) de 0,1 à 3,0 M. Un clone désigné CHOB3 a été sélectionné parmi plus de 100 colonies qui présentaient l'activité héparanase. L'expression de l'héparanase par le clone CHOB3 est d'environ 4 fois supérieure à celle des cellules CHO non transfectées. La production d'héparanase avec le clone CHOB3 a été effectuée par les deux procédés suivants . a) production d'héparanase dans des flacons rotatifs : des flacons rotatifs Corning de 850 cm2 ont été utilisés. Chaque bouteille a été inoculée avec 2,4 x 107 cellules dans 150 ml de DMEM supplémenté avec 10% (v/v) de FBS dialysé plus 3 uM de MTX et 25 mM de tampon Hepes. Un lot de 100 bouteilles a été préparé en incubant les bouteilles pendant 5 à 7 jours sur un casier de flacons rotatifs, roulant à une vitesse de 5 tours/minute. Les culots de cellules ont été collectés des bouteilles après trypsinisation par centrifugation après un lavage par un tampon phosphate de solution saline. b) Production d'héparanase dans une culture en suspension : un bioréacteur de 10 1 contenant 7 1 de milieu Excel 301 (JRH) supplémenté avec 5% de FBS dialysé, 3 uM MTX, de l'acide pluronique 0,1% et 25 mM Hepes a été inoculé avec une culture de CHOB3 pour donner une concentration cellulaire initiale de 5 x 105 cellules/ml. La culture en suspension a été incubée à 35 C pendant 4 à 5 jours, quand la densité cellulaire a atteint 3 x 106. Les cellules ont été récoltées pour l'isolation et la purification de l'héparanase. Des cellules CHO exprimant l'héparanase ont été suspendues dans du tampon de lyse (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, pH 7,5) à 2 x 107 cellules/ml, des comprimés de cocktail d'inhibiteurs de protéases ont été ajoutés (Roche Molecular Biochemicals), et l'échantillon a été soniqué brièvement. L'échantillon a ensuite été agité à 4 C pendant 30 minutes, suivi par une centrifugation à 100 000 x g pendant 60 minutes. La fraction soluble ("100kxg-sup") a été passée à travers des filtres de 0,8 et 0,45 microns, et utilisée pour des essais enzymatiques. Pour confirmer que l'activité observée dans le "100kxg-sp" était due à l'héparanase, une petite quantité d'héparanase a été purifiée par un procédé essentiellement tel que décrit (Prats et al. (1989) High molecular mass forms of basic fibroblast growth factor are initiated by alternative CUG codons. Proc Natl Acad Sci USA 86, 1836-40). EXEMPLE 3 : PREPARATION DE HS MARQUE PAR LA FLUORESCEINE (FITC-HS OU F2FITC-HS) Du HS a été marqué ave de l'Oregon Green 488 isothiocyanate (F2FITC) et un autre HS a été marqué avec de la fluorescéine-5-isothiocyanate (FITC) par la procédure telle que décrite. En général, du HS de rein bovin (60 mg) a été dissous dans 16 ml de Na2C03 1M (pH 9,35). Du FITC (94 mg) ou du F2FITC (103 mg) dans 0,8 ml de DMSO a été ajouté lentement (goutte à goutte) à la solution de HS et agité à 4 C pendant 18 heures dans l'obscurité. La réaction a été arrêtée par du tris-HCl 1M, pH 8,0 (0,5 ml), et la solution agitée à température ambiante pendant 20 minutes. L'échantillon a ensuite été appliqué sur une colonne de Sephadex G-25 (2,5 x 30 cm) dans du PBS pour éliminer le réactif FITC en excès. Les fractions contenant le HS marqué à la fluorescéine ont été rassemblées. Le niveau de marquage à la fluorescéine a été estimé par lecture de l'absorbance à 490 nm (e = 72 000 M-1) . En général, le rapport molaire de la fluorescéine au HS était de 0,6. EXEMPLE 4 : PREPARATION DU HS-MARQUE PAR LE Eu-CHELATE Du HS (3,3 mg) a été dissous dans 0,2 ml de Na2C03 0, 2 M (pH 9, 35) . A la solution a été ajouté du DELFIA Eu-DTPA-ITC chélate (1 mg dans 0,1 ml de H20), et agité à température ambiante pendant 1 heure suivi par 14 heures à 4 C. L'échantillon a ensuite été chargé sur une colonne de Sephadex G-50 (qualité fine, 1,5 x 50 cm) dans du TBS (50 mM Tris, pH 7,5,100 mM NaCl). Avant le chargement de l'échantillon, la colonne a été chargée avec 10 mg de BSA (pour saturer les liaisons non spécifiques) et 20 ml d'EDTA 20 mM, suivi par 60 ml de TBS. Les fractions contenant le HS marqué au Eu ont été rassemblées. Le niveau de marquage a été estimé à l'aide d'une courbe standard de concentrations connues de solutions de Eu-chelate. En général, le rapport molaire du Eu-chelate au HS était de 0,54. EXEMPLE 5 : PREPARATION DE BIOTINE-HS Du HS (4,5 mg) a été dissous dans 0,2 ml de H20 suivi par 0,6 ml de méthanol. A la solution ont été ajoutés 5,0 mg de biotine-LC hydrazide suivi par 4 l de NaHC03 0,5 M dans du méthanol à 10%. On a laissé la réaction se dérouler à 50 C pendant 1 jour. Du NaCNBH3 (25 mg) a ensuite été ajouté à la solution. La solution a été clarifiée par l'addition de 0,2 ml de H20. La réaction a incubé à 50 C pendant 2 jours. Deux quantités supplémentaires (25 mg chacune) de NaCNBH3 ont été ajoutées et la réaction incubée à 50 C pendant 2 jours après chaque addition. L'échantillon a ensuite été concentré par vide sous accélération à 0,3 ml, dilué avec H20 à 0,5 ml, et chargé sur une colonne de Sephadex G-25 dans du PBS. Les fractions contenant le HS ont été rassemblées, et le pH ajusté à 9,4 par l'addition de 30 l de Na2CO3 1 M. EXEMPLE 6 : PREPARATION DE BIOTINE-HS MARQUEE A LA FLUORESCEINE (F2FITC-HS-BIOTINE) Du F2FITC (0,8 mg dans 80 l de DMSO) a été ajouté à la solution de biotine-HS de l'exemple 5 sous agitation et la réaction s'est déroulée à 4 C pendant la nuit dans l'obscurité. L'échantillon a été chargé sur une colonne de Sephadex G-25 et élué avec du PBS. Les fractions contenant de la biotine-HS marquée avec du F2FITC ont été rassemblées. Le niveau de marquage à la fluorescéine a été estimée par lecture de l'absorbance à 490 nm. Le rapport de fluorescéine à HS était de 0,6. EXEMPLE 7 : PREPARATION DE BIOTINE-HS MARQUE PAR EU-CHELATE (Eu-HS-BIOTINE) A la solution de biotine-HS (0,34 ml, 4,5 mg/ml dans du PBS) préparée comme décrit dans l'exemple 5 ont été ajoutés 6,5 mg de Na2C03 pour ajuster le pH à 9,4. Du Eu-DTPA-ITC chélate (1 mg) a été dissous dans 0,1 ml d'acétate de sodium 10 mM (pH 4,8) et 50 l de cette solution ont été ajoutés à la solution de biotine-HS sous agitation. La réaction a été agitée pendant 1 heure à 25 C, suivi par 15 heures à 4 C et 4 heures supplémentaires à 25 C. L'échantillon a ensuite été chargé sur une colonne de Sephadex G-50 (qualité fine, 1,5 x 50 cm) dans du TBS. Avant le chargement de l'échantillon, la colonne a été chargée avec 10 mg de BSA (pour saturer les liaisons non spécifiques) et 20 ml d'EDTA 20 mM, suivi par 60 ml de TBS. Les fractions contenant le HS marqué au Eu ont été rassemblées. Le niveau de marquage a été estimé à l'aide d'une courbe standard de concentrations connues de solutions de Eu-chélate. Le rapport molaire de Euchélate à HS était de 0,34. EXEMPLE 8 : PREPARATION DE HS MARQUE AU 3H Du HS marqué au 3H a été préparé comme décrit précédemment (26). En général, le HS (10 mg) a été dissous dans 0,38 ml d'hydrate d'hydrazine contenant 7,6 mg de sulfate d'hydrazine et le mélange chauffé à 100 C pendant 2 heures dans une fiole de verre bouchée. Le mélange a été refroidi et séché sous argon. Du toluène (0,4 ml) a été ajouté et le mélange séché par évaporation rotative sous vide. Cette procédure a été répétée deux fois. Le résidu a été dissous dans 0,9 ml de NaCl 1M et dessalé sur une colonne de Sephadex G-25 dans de l'eau. Le matériau dessalé a été chargé sur une colonne Dowex 50 (X-8, forme Na+1) (1,0 cm x 3,0 cm) et lavé ave 5 ml d'eau. Les fractions "écoulement direct" et "lavage" ont été rassemblées et lyophilisées. Le HS N-déacétylé obtenu a été dissous dans 0,5 ml de NaHC03 0,5 M contenant du méthanol à 10% (v/v), refroidi à 0 C dans un bain de glace et 30 l de [3H] anhydride acétique (3 mCi, 500 mCi/mmole) dans du toluène, ajoutés. Le mélange a été agité vigoureusement à 0 C pendant 3 heures. Un supplément de 0,5 ml de Na2C03 0,5 M, 20 pl de MeOH et 25 l d'anhydride acétique ont été ajoutés sous agitation pendant 30 minutes à 0 C. Cette procédure a été répétée encore une fois. Après avoir réchauffé le mélange à température ambiante, le toluène a été éliminé sous un flux d'argon et la solution dessalée sur une colonne de Sephadex G-25 dans de l'acétate d'ammonium 20 mM, pH 6,8. Le HS marqué au [3H] a été rassemblé, et des aliquots stockés à -20 C. EXEMPLE 9 : ESSAIS DE L'HEPARANASE UTILISANT DES PLAQUES RECOUVERTES DE FITC-HS, DE F2FITC-HS OU DE FGF (TEST FITC-HS/FGF) Du FGF (1,97 mg/ml) a été dilué avec du PBS à 18,75 pg/ml et revêtu sur des plaques noires solides High Binding à 384 puits de Costar (40 pl/puits) à 4 C, pendant la nuit. Les plaques ont été bloquées avec du BSA/PBS 1% (60 ul/puits) à 37 C pendant 1 heure et lavées avec du PBS/Tween 20 0,02% (60 ul/puits, 4 fois). Du FITC-HS ou du F2FITC-HS (0,15 pg/puits/40 l dans du PBS, BSA 1%, Tween 20 0,02%) a été ajouté et incubé à 37 C pendant 1 à 1,5 heures. Les plaques ont été lavées avec du PBS/Tween 20 0,02% (60 ul/puits, trois fois). De l'héparanase brute de cellules CHO transfectées (1 l de "100kxg-sup" de l'exemple 2 contenant 5 pg de protéines totales dans du tampon de lyse) et de l'héparanase purifiée (20 ng) ont été chacune diluées avec 40 l de tampon d'essai (acétate de sodium 50 mM, pH 5,0, BSA 0,2 mg/ml, N-acétyl-mannosamine 5 mM, Triton X-100 0,05%), ajoutées dans chaque puits, et incubées à 37 C pendant 30 minutes. La réaction enzymatique a été arrêtée par addition de 5 ul/puits de Tris-HCl 1 M, pH 8,0. La solution (35 ul/puits) a ensuite été transférée sur une plaque de microtitration pour une lecture de fluorescence (excitation à 485 nm et émission à 535 nm) sur un lecteur Victor 2 (Perkin Elmer Life Sciences). EXEMPLE 10 CIBLAGE A HAUT DEBIT (HTS) DE L'ACTIVITE HEPARANASE UTILISANT FITC-HS SUR DES PLAQUES RECOUVERTES DE FGF L'essai de l' héparanase FITC-HS/FGF HTS a été mis en oeuvre en utilisant un système Zeiss uHTS, qui comprend un pipeteur de 384 puits, trois pipeteurs de 96 puits, deux laveurs, deux distributeurs Multidrop, quatre distributeurs Cybidrop, trois incubateurs et deux lecteurs HTS Zeiss. Des plaques de microtitration (384 puits) ont été revêtues avec du FGF, bloquées avec de la BSA et stockées à 4 C jusqu'à 3 semaines. Les 'plaques ont été lavées avec du PBS/Tween 20 0,02% suivi par une incubation avec du FITC-HS. Pour la digestion par l'héparanase, l'enzyme brute du "100kxg-sup" (1 pl/puits) de l'exemple 2 a été utilisée. Toutes les étapes pour les mouvements de la plaque, le transfert de liquide, et les mesures de fluorescence ont été effectuées par des robots. Le rapport global du signal au bruit de fond était de 7,5 (figure 9) et le facteur Z' moyen était de 0,32 (figure 10). Les agents ayant le potentiel d'inhiber l'activité catalytique de l'héparanase inhibant plus de 65% de l'activité à une concentration de 25 uM ont été identifiés. Parce que certains de ces agents potentiels étaient des agents fluorescents, ils ont aussi été testés dans l'essai Eu-HS/FGF (exemple 11) sur un Zeiss uHTS, et les agents testés positifs ont été confirmés comme inhibiteurs de l'héparanase. EXEMPLE 11 ESSAIS DE L'HEPARANASE UTILISANT HS MARQUE PAR Eu(DTPA) SUR DES PLAQUES REVETUES DE FGF (ESSAIS Eu-HS/FGF) Du FGF a été revêtu sur des plaques de microtitration à 384 puits comme dans l'exemple 9. Les plaques ont été bloquées avec du BSA/PBS 1% (50 pl/puits) à 37 C pendant 1 heure et lavées avec du TBS (60 ul/puits, trois fois). Du HS marqué par Eu (40 ul/puits, 0,375 ug/ml dans du TBS, BSA 0,5%, Tween 20 0,02%) a été ajouté aux plaques et incubé à 37 C pendant 1 heure. Les plaques ont ensuite été lavées avec du TBS (60 pl/puits, trois fois). De l'héparanase brute (1 l de "100kxg-sup" de l'exemple 2 contenant 5 pg de protéines totales dans du tampon de lyse) ou de l'héparanase purifiée (20 ng) a été diluée avec 40 l de tampon d'essai (acétate de sodium 50 mM, pH 5,4, BSA 0,2 mg/ml, N-acétyl-mannosamine 5 mM, Triton X-100 0,025%), ajouté dans chaque puits, et incubé à 37 C pendant 30 minutes. La réaction a été arrêtée par l'addition de Tris-HCl 1, 0 M, pH 8, 0 (5 ul/puits) . La solution (8 pl/puits) a été transférée sur une plaque de microtitration et mélangée avec 60 pl/puits de Enhancement Solution à température ambiante pendant 30 minutes. Le signal a été quantifié par lecture de fluorescence résolue dans le temps (FRT) aux longueurs d'onde de EX (340 nm)/EM (615 nm) sur un lecteur Wallace Victor 2. EXEMPLE 12 HTS UTILISANT Eu-HS SUR DES PLAQUES REVETUES DE FGF L'essai de l'héparanase utilisant du Eu-HS comme substrat a été mis en oeuvre dans un système uHTS Zeiss. Le mouvement de la plaque et le transfert de liquide ont été effectués par robotique. La mesure de FRT a été effectuée hors-ligne sur un lecteur Victor 2. EXEMPLE 13 TEST HEPARANASE UTILISANT FITC-HS-BIOTINE (OU F2FITC- HS-BIOTINE) SUR DES PLAQUES REVETUES DE SPREPTAVIDINE (SA) (TEST FITC-JS-BIOTINE/SA) Pour préparer la FITC-HS-biotine, du HS a d'abord été traité avec de la biotine-LC-hydrazide pour attacher le groupe biotine au sucre terminal du HS. L'imine obtenue a ensuite été réduite en amine par le NaCNBH3. La substance marquée (biotine-HS) a ensuite été purifiée par passage sur une colonne de filtration sur gel et marquée avec du FITC comme décrit dans "Procédés". La figure 12A présente une liaison en fonction de la concentration de la F2FITC-HS-biotine aux plaques revêtues de SA. La liaison a atteint un plateau quand 1 ug/puits de F2FITC-HS-biotine a été utilisé. Pour l'essai de l'héparanase, 0,5 pg/puits de F2FITC-HS-biotine a été utilisé. Une digestion en fonction de la concentration d'héparanase du F2FITC-HS lié à des plaques revêtues de SA est présentée sur la figure 12B. De la streptavidine (10 ug/ml dans du PBS, 40 pl/puits) a été revêtue sur des plaques de microtitration Enhancement Surface noires solides à 384 puits (Becton Dickinson) à 4 C pendant la nuit. Les plaques ont été bloquées avec de la BSA 1% (40 ul/puits) à 37 C pendant 1 heure (ou à 4 C pendant la nuit) et lavées avec du TBS (50 pl/puits, trois fois). De la F2FITC-HS-biotine (40 ul/puits, 12,5 ug/ml) dans de la BSA 1%, TBS, a été ajoutée aux plaques et incubée à 37 C pendant 1 heure. Les plaques ont été lavées avec du TBS. Parce que l'interaction biotine/SA est extrêmement forte (Kd = 10-16 M), très peu d'agents (par exemple, les agents de type biotine) peuvent être capables de bloquer cette interaction. De l'héparanase brute (1 l de "100kxg-sup" contenant 5 g de protéines totales dans du tampon de lyse) ou de l'héparanase purifiée (20 ng) a été diluée avec 40 l de tampon d'essai (acétate de sodium 50 mM, pH 5,4, BSA 0,2 mg/ml, N-acétyl-mannosamine 5 mM), ajoutée dans chaque puits, et incubée à 37 C pendant 25 minutes. Un molaire de Tris-HCl, pH 8,0 (5 pl/puits) a été ajouté et 35 pl/puits de solution ont été transférés sur une plaque de microtitration pour une lecture de fluorescence (excitation à 470 nm et émission à 535 nm). EXEMPLE 14 : TEST HEPARANASE UTILISANT Eu-HS-BIOTINE SUR DES PLAQUES REVETUES DE SA (TEST Eu-HS-BIOTINE/SA) De la biotine-HS a été marquée avec du Eu(DTPA)ITC. La liaison de la Eu-HS-biotine sur des plaques revêtues de SA est présentée sur la figure 13A, qui est similaire à celle de la F2FITC-HS-biotine. Une digestion en fonction de la concentration d'héparanase est aussi similaire à celle de la F2FITC-HS-biotine (figure 13B) . Des plaques ont été revêtues avec de la streptavidine et bloquées avec de la BSA, comme décrit ci-dessus. De la Eu-HS-biotine (40 ul/puits, 7,5 ug/ml) dans de la BSA 1%, TBS, a été ajoutée aux plaques et incubée à 37 C pendant 1 heure. Les plaques ont été lavées avec du TBS. De l'héparanase brute (1 l de "100kxg-sup" de l'exemple 2 contenant 5 g de protéines totales dans du tampon de lyse) ou de l'héparanase purifiée (20 ng) a été diluée avec 40 l de tampon d'essai (acétate de sodium 50 mM, pH 5,4, BSA 0,2 mg/ml, N-acétyl-mannosamine 5 mM), ajoutée dans chaque puits, et incubée à 37 C pendant 25 minutes. Un molaire de Tris-HCl, pH 8,0 (5 ul/puits) a été ajouté et 8 pl/puits de solution ont été transférés sur une plaque de microtitration contenant 60 pl/puits de "Enhancement Solution". La fluorescence résolue dans le temps a été mesurée par un lecteur Victor 2. Les agents qui ont été identifiés par les essais de criblage Eu-HS/FGF comme ayant un potentiel d'inhibition de l'héparanase ont été testés dans cet essai (Eu-HS-biotine/SA). Les résultats ont indiqué que les CI50 étaient similaires dans les deux essais (données non présentées). EXEMPLE 15 TEST HEPARANASE TSF UTILISANT Eu-HS COMME SUBSTRAT SUR DES PLAQUES REVETUES DE FGF Pour développer un essai de l'héparanase FRT, du HS a été marqué avec du Eu-chélate (DTPA) ITC. La figure 11A présente une liaison en fonction de la concentration de Eu-HS à des plaques revêtues de FGF. La liaison atteint un plateau à 20 ng/puits de Eu-HS. Du Eu-HS (15 ng/puits) a été incubé avec des plaques revêtues de FGF et lavé abondamment avec du TBS, le EuHS a été digéré avec l'héparanase. La figure 11B présente une digestion en fonction du temps du EuHS par l'héparanase purifiée. Après 30 minutes, le rapport signal à bruit de fond a atteint 8,0. EXEMPLE 16 DETERMINATION DES CI50 Pour la détermination de la CI50 d'agents testés pour l'activité inhibitrice de l'héparanase, les agents ont été dissous dans du DMSO à une concentration de 10 mM. Un aliquot (4 l) a été encore dilué avec du DMSO (16 l) à une concentration de 2 mM. Une série de dilutions de 1 :3 du DMSO ont été effectuées pour obtenir une gamme de concentrations de 0,1 uM à 2 mM. Chaque échantillon a encore été dilué 25 fois avec le tampon d'essai. Des aliquots (30 pl/puits) ont ensuite été ajoutés aux plaques d'essai contenant des substrats immobilisés. Un aliquot (20 ng/10 ul/puits) d'héparanase purifiée a ensuite été ajouté, et les plaques ont été incubées à 37 C pendant 20 à 30 minutes. Les réactions ont été arrêtées par l'addition de 1,0 M de Tris-HCl, pH 8, 0 (5 ul/puits). Les signaux ont été quantifiés par la lecture, soit de la fluorescence, soit de la FRT sur un lecteur Victor 2. Le pourcentage d'inhibition de l'activité catalytique de l'héparanase par un agent à diverses concentrations a été calculé par la formule suivante : % d'inhibition = 100* [l-(Fs-Fb)/(Ft-Fb)], où Fs est le signal de fluorescence de l'échantillon qui comprenait l'agent, Fb est le signal de fluorescence en absence d'héparanase et de l'agent, Ft est le signal de fluorescence en présence d'héparanase, mais pas de l'agent. EXEMPLE 17 ANALYSE CINETIQUE Une analyse mécanique des agents déterminés pour inhiber l'activité de l'héparanase dans le FGF/substrat de l'héparanase marqué de la présente invention a été effectuée en mesurant l'activité héparanase à diverses concentrations de HS marqué en présence des agents. En général, diverses concentrations de HS marqué ont été immobilisées sur des plaques d'essai. Des solutions d'héparanase (avec ou sans agents) ont ensuite été ajoutées dans des puits (40 pl/puits) contenant diverses concentrations de HS marqué immobilisé, et incubées à 37 C pendant 25 minutes. Les réactions ont été arrêtées par l'addition de 1,0 M de Tris-HCl, pH 8,0 (5 pl/puits), et le marqueur a été mesuré séparément. Les activités héparanase des solutions de réaction ne contenant pas d'agent et les activités inhibitrices de l'héparanase des agents ont ensuite été quantifiées. Les activités héparanase sans agent inhibiteur et avec diverses concentrations d'un agent inhibiteur ont été analysées par des graphes en double réciproque de 1/v contre 1/s, où v est la vitesse de réaction et s est la concentration du substrat. Le mécanisme d'inhibition (compétitif, non compétitif, incompétitif ou mixte) d'un agent inhibiteur a ensuite été déterminé par les pentes et les intersections (axes x et y) des courbes présentées à diverses concentrations inhibitrices. EXEMPLE 18 F2FITC-HS (OU FITC-HS) COMME SUBSTITUT DE L'HEPARANASE Dans l'essai de l'héparanase utilisant du F2FITCHS (ou du FITC-HS) comme substrat sur des plaques revêtues de FGF (exemple 9), les produits digérés ont été analysés par analyse FPLC de filtration sur gel. Toyoshima a rapporté que le FITC-HS est un substrat quand le rapport molaire de FITC à HS est inférieur à 1,0 (26). Du HS a été marqué avec du F2FITC à un rapport molaire de 0,6. (Le rapport molaire du FITC serait le même). Pour confirmer qu'il s'agit d'un substrat de l'héparanase, les produits digérés ont été analysés par filtration sur gel (supersose 6)-FPLC (figure 1A). Pour une comparaison, du [3H] HS comme substrat a aussi été digéré avec de l'héparanase et les produits analysés par FPLC (figure 1B). Dans les deux cas, les produits digérés ont été élués à des positions similaires, indiquant que le FITC-HS et le [3H] HS sont des substrats pour l'héparanase. EXEMPLE 19 LIAISON DES F2FITC-HS SUR DES PLAQUES REVETUES DE FGF La liaison du F2FITC-HS à diverses concentrations de FGF (forme oligomère) revêtu sur des plaques de microtitration de 384 puits a été étudiée. La figure 2 montre que la liaison a atteint un plateau quand du FGF à une concentration de 18,75 ug/ml (ou 0,75 ug/40 pl/ puits) a été revêtu sur les plaques. Les résultats ont aussi montré que la liaison du F2FITC-HS était supérieure quand le FGF était revêtu à un pH de 7,5, plutôt qu'à un pH de 9,5. Quand la même expérience a été effectuée en utilisant du FGF monomère (la forme qui est réduite par le DTT), la liaison était plus faible. Il n'est pas clair si la liaison plus faible observée était due à une faible efficacité du revêtement ou à une faible affinité de liaison du FGF monomère (PM, 16k). On a trouvé que la liaison du F2FITC-HS était plus forte quand le FGF était revêtu sur des plaques Costar "à forte liaison" que sur des plaques "ordinaires". La figure 3 présente une liaison en fonction de la concentration du F2FITC-HS au FGF revêtu à la concentration de 18,75 ug/ml. La liaison a atteint un plateau quand 0,1 à 0,2 pg/puits de F2FITCHS a été utilisé. EXEMPLE 20 DIGESTION PAR L'HEPARANASE DE F2FITC-HS SUR DES PLAQUES REVETUES DE FGF Du F2FITC-HS a été lié à des plaques revêtues de FGF et digéré avec le "100kxg-sup" de cellules CHO transfectées (exemple 2). Comme le montre la figure 4, l'intensité de fluorescence dans le milieu a augmenté par rapport au tampon de lyse, indiquant que des fragments de F2FITC-HS étaient libérés dans le milieu après la digestion par l'héparanase. Comme témoin, quand du F2FITC-HS a été incubé avec le "100kxg-sup" de cellules non transfectées, aucun accroissement de fluorescence important n'a été observé. Une digestion en fonction de la concentration d'héparanase du F2FITCHS est présentée sur la figure 5. L'augmentation de l'intensité de fluorescence libérée dans le milieu était proportionnelle quand des quantités d'héparanase accrues étaient utilisées. EXEMPLE 21 MESURE DE L'INTENSITE DE FLUORESCENCE DUE A LA DIGESTION PAR L'HEPARINASE DE F2FITC-HS Pour confirmer que l'intensité de fluorescence observée dans le milieu tait due à la digestion par l'héparanase du F2FITC-HS, quatre ensembles d'expériences ont été réalisées. Premièrement, après digestion par l'héparanase, les produits clivés dans le milieu ont été analysés par Superose 6-FPLC (figure 6). Le matériel fluorescent a été élué plus lentement que celui du F2FITC-HS intact, indiquant la production de fragments de F2FITC-HS par la réaction de l'héparanase. Deuxièmement, une digestion du F2FITC-HS par l'héparanase en fonction du temps a été effectuée. Le degré d'hydrolyse a été contrôlé par la libération de fragments digérés dans le milieu et le matériel non digéré restant sur la plaque. Comme le montre la figure 7, l'intensité de fluorescence a augmenté dans le surnageant après digestion, alors que l'intensité de fluorescence associée à la plaque a diminué, indiquant que du F2FITC-HS a été dégradé et libéré dans le milieu. Troisièmement, l'activité héparanase a été mesurée dans le "100kxg-sup" à différents pH, et on a trouvé que le pH optimal pour l'activité était de 5,1 (figure 8), compatible avec celui rapporté dans la littérature (Freeman, C. et Parish, C. (1998) Human platelet heparanase: purification, characterization and catalytic activity. Biochem. J. 330, 1341-1350). Quatrièmement, du F2FITC-HS a été digéré avec de l'héparanase purifiée. Une courbe de digestion en fonction de la concentration similaire à celle présentée sur la figure 4 a aussi été observée. D'autres informations concernant les figures sont les suivantes : Figure 1 : analyse des produits digérés par l'héparanase par Superose 6-FPLC. (A) Du F2FITC-HS (20 l, 1, 9 mg/ml) a été dilué avec 80 pl d'acétate de sodium 50 mM, pH 5,0, BSA 0,1 mg/ml et N-acétylmannosamine 5 mM. Un aliquot (20 pl) a été digéré avec de l'héparanase exprimée par des cellules CHO transfectées, à savoir, du "100kxg-sup" (5 l dans le tampon de lyse, comme décrit dans les "Procédés") à 37 C pendant 20 heures. L'échantillon a ensuite été dilué ave du PBS et chargé sur une Superose 6-FPLC dans du PBS à un débit de 0,25 ml/minute. Collecte de 0,5 ml/fraction. Un aliquot (25 l) dans chaque fraction a été prélevé et transféré sur une plaque de microtitration de 384 puits pour un comptage de fluorescence. (B) Du HS marqué au 3H (20 l, 2,6 mg/ml) a été dilué avec le tampon comme décrit dans (A). Un aliquot (20 l) a été digéré avec de l'héparanase et les produits ont été analysés par Superose 6-FPLC comme décrit dans (A). La radioactivité dans chaque fraction a été mesurée par un compteur de scintillation. Figure 2 : revêtement en fonction de la concentration de FGF à 2 pH différents. Du FGF (1, 81 mg/ml) a été dilué, soit avec du PBS (pH 7,5), soit avec du Na2C03 50 mM et du NaCl 100 mM (pH 9,5) à diverses concentrations (2,5 pg/ml à 50 pg/ml). Des aliquots (40 ul/puits) ont été revêtus sur des plaques de microtitration de 384 puits (plaques "High Binding" noires solides de Costar) à 4 C, pendant la nuit. Les plaques ont été bloquées ave de la BSA 1% dans du PBS à 37 C, 1 heure, et lavées avec du PBS. Du F2FITC-HS (1,5 pg/puits/40 l dans du PBS, BSA 1%, Tween 20 0,02%) a été ajouté et incubé à 37 C pendant 1 heure. Les plaques ont ensuite été lavées avec du PBS/Tween 20 0,02%. La substance liée a ensuite été éluée des plaques avec du SDS 0,1% dans du PBS et quantifiée par intensité de fluorescence. UF est une unité de fluorescence mesurée par un lecteur Victor 2. Figure 3 : liaison en fonction de la concentration en F2FITC-HS aux plaques revêtues de FGF. Du FGF (18,75 pg/ml dans du PBS) a été revêtu sur des plaques de 384 puits (40 pl/puits) à 4 C, pendant la nuit, et bloquées avec de la BSA 1%/PBS. Diverses quantités (0,012 à 0,375 pg/40 ul/puits) de F2FITC-HS dans du PBS, BSA 1%, Tween 20 0,02%, ont été ajoutées et incubées à 37 C pendant 1 heure. Les plaques ont ensuite été lavées avec du PBS/Tween 20 0,02%. Le matériel lié a été élué avec du SDS 0,1% dans du PBS et quantifié par mesure de fluorescence. Figure 4 : activité héparanase du produit exprimé de cellules CHO transfectées. Du FGF a été revêtu sur des plaques de microtitration et incubé avec du F2FITC-HS comme décrit. Le F2FITC-HS lié a été traité avec l'échantillon "100kxg-sup" de cellules CHO transfectées et non transfectées (échantillon de 1 pl dans du tampon de lyse dilué avec 40 l de tampon d'essai dans chaque puits) à 37 C pendant 30 minutes. Comme témoin, du F2FITC-HS lié a aussi été traité avec le tampon de lyse (1 l de tampon de lyse dilué avec 40 l de tampon d'essai dans chaque puits). Les réactions ont été arrêtées par addition de 1,0 M de Tris-HCl, pH 8,0 (5 pl/puits). Des aliquots (35 pl/puits) ont été prélevés pour une lecture de fluorescence. Figure 5 : digestion en fonction de la concentration d'héparanase du F2FITC-HS sur des plaques revêtues de FGF. L'essai F2FITC-HS/FGF a été effectué comme décrit, si ce n'est que diverses quantités d'héparanase dans du "100kxg-sup" de cellules CHO transfectées ont été utilisées. Figure 6 . analyse sur Superose 6-FPLC des produits digérés dan l'essai F2FITC-HS/FGF. L'essai F2FITC-HS/FGF utilisant de l'héparanase brute a été effectué comme décrit. Après la digestion, le mélange réactionnel dans le milieu (140 l combiné à partir de 4 puits) a été chargé sur une Superose 6-FPLC dans du PBS. Des fractions ont été collectées et l'intensité de fluorescence dans chaque fraction a été comptée comme décrit sur la figure 1. Comme témoin, du F2FITC-HS intact a aussi été chargé sur une Superose 6FPLC et analysé. Figure 7 : progression de la digestion par l'héparanase. L'essai F2FITC-HS/FGF utilisant de l'héparanase brute a été effectué comme décrit. A divers temps de la digestion, du Tris-HCl 1,0 M, a été ajouté dans les puits (5 ul/puits) pour arrêter les réactions. Le surnageant a été prélevé pour analyser les fragments F2FITC-HS clivés par mesure de fluorescence (o). Le F2FITC-HS non digéré restant sur les plaques a été extrait avec du SDS 0,1% dans du PBS et analysé par mesure de fluorescence (?). Figure 8 : dépendance de l'activité héparanase au pH. Du FGF a été revêtu sur des plaques de microtitration et incubé avec du F2FITC-HS comme décrit. De l'héparanase brute a été diluée dans de l'acide citrique 50 mM-tampon Na2HP04 à divers pH (3,6 à 7,0) contenant 0,2 mg/ml de BSA et de la N-acétylmannosamine 5 mM. La réaction de l'héparanase a ensuite été effectuée à divers pH à 37 C pendant 1 heure. Du F2FITC-HS lié a aussi été incubé avec du tampon à divers pH (sans héparanase) et utilisé comme bruit de fond. L'activité héparanase a été calculée après soustraction de la fluorescence du bruit de fond. Figure 9 : signal et bruit de fond de l'essai F2FITC-HS/FGF sur Zeiss uHTS. L'essai F2FITC-HS/FGF a été effectué sur un système uHTS Zeiss pour cribler les inhibiteurs. Pour chaque plaque d'essai à 384 puits, les puits dans les colonnes 1 et 2 contenaient seulement le tampon d'essai (c'est-à-dire, pas d'héparanase ou de composés test). L'intensité de fluorescence moyenne de ces puits a été utilisée comme "bruit de fond". Les puits dans les colonnes 3 et 4 contenaient de l'héparanase, mais pas de composés test. L'intensité de fluorescence moyenne de ces puits a été utilisée comme "signal total". Ces deux valeurs ont été utilisées pour le calcul du % d'inhibition par un composé spécifique (les composés testés ont été placés dans les puits des colonnes 5 à 24). Pour vérifier la qualité du crible, le "signal total" et le "bruit de fond" des plaques criblées ont été portés sur un graphe. L'axe des X représente le numéro d'identification sur la plaque et l'axe des Y représente l'intensité de fluorescence. Si le "signal total" pour une plaque particulière était supérieur ou inférieur à la moyenne plus ou moins 2 fois les écarts type (M +/- 2s), cette plaque a été retestée. Figure 10 : facteur Z' de l'essai F2FITC-HS/FGF sur Zeiss uHTS. Le facteur Z' a été calculé à partir de chaque plaque d'essai par la formule : facteur Z' = 1-3 (sT + sB) / (mT - mB) , où mT - moyenne du signal total (puits dans les colonnes 3 et 4), mB - moyenne du bruit de fond (puits dans les colonnes 1 et 2) , sT = écart type du signal total, et sB = écart type du bruit de fond. Pour vérifier la qualité de l'écran, les facteurs Z' des plaques ont été portés sur un graphe. L'axe des X représente le numéro d'identification sur la plaque et l'axe des Y représente le facteur Z'. Si le facteur Z' pour une plaque particulière était inférieur à la moyenne moins 2 fois les écarts type (M - 2s), la plaque a été retestée. Les valeurs Z', qui étaient situées entre environ 0,3 et 0,7, indiquent la cohérence et la compatibilité de l'essai. Figure 11 : (A) Liaison du Eu-HS aux plaques revêtues de FGF. Des plaques à 384 puits ont été revêtues avec du FGF (0,75 ug/40 pl/puits), suivi par le blocage avec de la BSA, comme décrit. Les plaques ont ensuite été incubées avec diverses quantités de Eu-HS à 37 C pendant 1 heure et lavées avec du TBS . Le Eu-HS lié a ensuite été élué des plaques avec du SDS 0,1%/TBS (40 ul/puits). Un aliquot (8 l) a été prélevé et mélangé avec 60 l de "Enhancement Solution" pour la mesure de FRT. (B) Digestion en fonction de la concentration d'héparanase du Eu-HS sur des plaques revêtues de FGF. L'essai Eu-HS/FGF a été effectué comme décrit, si ce n'est que diverses quantités d'héparanase purifiée ont été utilisées. Figure 12 : (A) Liaison de la F2FITC-HS-biotine aux plaques revêtues de SA. Des plaques à 384 puits ont été revêtues avec de la SA, suivi par le blocage avec de la BSA comme décrit. Les plaques ont ensuite été incubées avec diverses quantités de F2FITC-HS-biotine à 37 C pendant 1 heure, et lavées avec du TBS. La F2FITC-HS-biotine liée a ensuite été éluée des plaques avec du SDS 0,1%/TBS (40 ul/puits), et la fluorescence a été mesurée. (B) Digestion en fonction de la concentration d'héparanase de la F2FITC-HS-biotine sur des plaques revêtues de SA. L'essai F2FITC-HS-biotine/SA a été effectué comme décrit, si ce n'est que diverses quantités d'héparanase purifiée ont été utilisées. Figure 13 : (A) Liaison de la Eu-HS-biotine aux plaques revêtues de SA. Des plaques à 384 puits ont été revêtues avec de la SA, suivi par le blocage avec de la BSA comme décrit. Les plaques ont ensuite été incubées avec diverses quantités de Eu-HS-biotine à 37 C pendant 1 heure, et lavées avec du TBS. La Eu-HS-biotine liée a ensuite été éluée des plaques avec du SDS 0,1%/TBS (40 ul/puits). Un aliquot (8 l) a été prélevé et mélangé ave 60 pl de "Enhancement Solution" pour la mesure de FRT. (B) Digestion en fonction de la concentration d'héparanase de la Eu-HS-biotine sur des plaques revêtues de SA. L'essai Eu-HS-biotine/SA a été effectué comme décrit, si ce n'est que diverses quantités d'héparanase purifiée ont été utilisées. REVENDICATIONS 1. Procédé pour tester le potentiel d'un agent pour inhiber l'activité catalytique de l'héparanase, comprenant les étapes consistant à : faire interagir des molécules immobilisées sur un support solide avec un substrat de l'héparanase marqué lié à un pont d'immobilisation, dans lequel les molécules immobilisées se lient au pont d'immobilisation, pour fournir un substrat de l'héparanase marqué immobilisé par pontage, faire interagir une solution d'enzyme héparanase avec le substrat de l'héparanase marqué immobilisé par pontage en présence de l'agent, et détecter la présence ou l'absence du marqueur dans la solution isolée du support solide, pour déterminer si l'agent présente le potentiel pour inhiber l'héparanase. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le pont d'immobilisation est la biotine et les molécules immobilisées sont choisies parmi les molécules de streptavidine et d'avidine, et leurs mélanges. 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel les molécules immobilisées sont des molécules de streptavidine. 4. Utilisation des procédés selon les revendications 1 à 3, pour l'identification d'inhibiteurs de l'activité catalytique de l'héparanase. 5. Kit comprenant les composants nécessaires pour réaliser le procédé selon les revendications 1 à 3, choisi dans le groupe comprenant un support solide, une molécule qui est ou peut être immobilisée sur le support solide et qui se lie spécifiquement à un pont d'immobilisation, un pont d'immobilisation capable de se lier à un substrat de l'héparanase, un substrat de l'héparanase marqué et l'héparanase.