Brevet FR2840920A1 — publié le 20031219

(41) de chacune des pales (2) forme une amorce de vrille. L' invention concerne un procede de production d' un polysaccharide ayant le motif repetitif suivant: 4) - a-L-Fucp-(1 - 4)- a-L-Fucp-(1 - 3)- Q-DGIcp-(1 1 a-D-Galp 1 Q-D-G IcpA a-D-Galp ou Fucp, Glcp, Galp, et GlcpA designent des groupes fucose, glucose, galactose, et acide glucuronique respectivement. L'invention concerne egalement un microorganisme de la famille des Enterobacteriaceae utilise pour la mise en ceuvre de ce procede. 11 est connu, par exemple de FR 95 00898 deposee par la societe BIOEUROPE, que les polysaccharides contenant du L-fucose presentent des proprietes interessantes dans le domaine cosmetique, ameliorant le toucher, le pouvoir hydratant, la capacite de stabiliser des emulsions, et le pouvoir de remanence des parfums. Des effets avantageux de polysaccharides contenant du L-fucose vent egalement connus dans la lutte contre les allergies. Par exemple SHOJI HASEGAWA, M.D., TORU BABA, M.D. et YOSHIAKI HORI, M.D., The Journal of Investigative Dermatology, 75, 284-287, 1980, decrivent ['action curative du L-fucose contre les allergies de contact induites par le dinitrochlorobenzene. JANA STANKOVA et MAREK ROLA-PLESZCZYNSKI, Cellular Immunology, 83, 83-91, 1984 ont encore montre que le L-fucose inhibe specifiquement certaines fonctions Iymphocytaires telles que la proliferation d'antigenes specifiques. II existe done un besoin permanent pour de nouveaux procedes permettant de produire avec des rendements industrials de tels polysaccharides. Un but de ['invention est de satisfaire ce besoin. On atteint ce but au moyen d'un procede de production d'un polysaccharide ayant le motif repetitif suivant: 4) - a-L-Fucp-(14)- a-L-Fucp-(13)- p-D-GIcp-(1 - 1 a-D-Galp 3 (I) 1 6-D-GlcpA 1 5 a-D-Galp ou Fucp, Glcp, Galp, et GlcpA designent des groupes fucose, glucose, galactose, et acide glucuronique respectivement, comprenant a) la croissance, par fermentation aerobic dans un milieu nutritif aqueux, du microorganisme de la famille des Enterobacteriaceae depose a la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes sous le N 1-2744, puis b) le recueil audit polysaccharide a partir du mout obtenu a la fin de ltetape a). Selon une caracteristique preferentielle de ce procede, prealablement a l'etape b), on sou met led it mout de cu ltu re a u n traitement proteolytiq ue. L'invention concerne aussi le microorganisme ou N souche " de la famille des Enterobacteriaceae, depose a la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes sous le N 1-2744, ci-apres designe par BEC1645, et ses mutants capables de former un polysaccharide de formule (I). L'invention concerne enfin l'utilisation dans des applications cosmetiques du polysaccharide de formule (I) secrete par BEC1645. A la suite de recherches poussees, la souche BEC 1645 a ete isolee des boues d'un bassin de lagunage de rejets industrials. Ces effluents ont pour origine une unite de fabrication de derives d'acides amines et plus particulierement d'acide glutamique. g de boues ont ete mis en suspension dans 90 ml d'eau peptonee tamponnee. Afin de revivifier les microorganismes, cette suspension a ete incubee a temperature ambiante pendant 2 heures environ. 1 ml de cette suspension a ensuite servi a inoculer 10 ml d'un milieu de culture comportant, par litre,17 g de tryptone, 3 g de peptone papanique de soja, 2,5 g de glucose, 2,5 g de phosphate dipotassique et 5 g de chlorure de sodium, le milieu de culture ayant ete, prealablement a ['inoculation, sterilise par autoclavage a 120 C pendant 20 minutes. Le milieu de culture a ensuite ete incube 24 heures a 30 C. Puis un prelevement du milieu de culture a ete etale sur un milieu gelose additionne de 15 g /I d'agar-agar, puis incube pendant environ 48 heures a 30 C. On a ensuite isole les colonies qui presentaient un aspect mucode puis selectionne, parmi elles, la souche BEC 1645. La souche BEC 1645 a ete deposee a la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, conformement aux provisions du Traite de Budapest. Cette souche a re,cu le numero d'enregistrement 1-2744, en date du 25 octobre 2001. La souche BEC 1645 a ete identifiee par sequencage de l'ADNr 165 par I'lnstitut Pasteur de Lille (France). Selon l'lostitut Pasteur de Lille, la souche BEC1645 appartient a la famille des Enterobacteriaceae. Dans ltetat actuel des barques de donnees, il nta pas ete possible de definir de fa,con precise le genre et l'espece. Wile semble proche du genre Enterobacter en presentant a la fois 98% d'homologie de sequence avec les souches Enterobacter sp.16-31 et Enterobacter sp. 3-45. Ces deux souches ont ete decrites dans la litterature comme ayant la meme sequence d'ADNr 16S, et etant proches a la fois du genre Enterobacter et du genre Pantoea, ce dernier etant une nouvelle nomination de souches d'Enterobacter. La taxonomie est indiquee ci-dessous (National Center for Biotechnology Information - NCBI taxonomy database): Bacteria Proteobacteria gamma subdivision Enterobacteriaceae Enterobacter La morphologic de la souche BEC 1645 est celle d'un bacille, Gram negatif, formant de petites colonies translucides sur milieu gelose. Des tests biochimiques (galerie API 20E) ont conduit au profil biochimique suivant: Beta galactosidase + Arginine dihydrolase + Lysine decarboxylase Ornithine decarboxylase + Utilisation du citrate + Production d'H2S Urease Tryptophane desaminase Production d'indole Production d'acetone + Gelatinase Utilisation du glucose + Utilisation du mannitol + Utilisation de l'inositol + Utilisation du sorbitol + Utilisation du rhamnose Utilisation du saccharose + Utilisation du melibiose + Utilisation de l'amygdaline + Utilisation de l'arabinose + Cytochrome oxydase + et signifient que la souche a reagi positivement (croissance) ou negativement, respectivement, pour chacun des tests. L'identification selon ce profil biochimique est celle d'une Enterobacter cloacae. La presente invention concerne aussi les souches mutantes obtenues a, oartir de la souche BEC 1645. Des souches mutantes utiles peuvent etre obtenues par simple selection de mutants spontanes isoles a partir d'une culture en fermenteur, ou bien en soumettant une culture de BEC 1645 a 1'action d'un facteur mutagene, par exemple un rayonnement energetique (rayons U.V., rayons X par exemple) ou un agent chimique [par exemple 1 'ozone, I'acide n itreux, la NTG(N-methyl-N '-n itro-N-nitrosoguan id ine) ou l'EMS (ethane-methane-sulfonate)] en vue de tuer une portion importante des micro organismes, en cultivant les micro-organismes et en selectionnant ceux produisant davantage de polysaccharides. Les recherches ont montre que le procede selon ['invention permettait de produire au moyen de souches BEC1645 ou des mutants de BEC1645, un polysaccharide de formule (I) et done comportant du L-fucose. Pour cela, on procede selon les etapes successives suivantes: a) inoculation, a ['aide d'une culture de la souche BEC 1645, d'un milieu aqueux comportant une source de glucide assimilable par ladite souche, b) croissance de ladite souche BEC 1645 par fermentation aerobic audit milieu, c) recueil du polysaccharide a partir du mout obtenu a la fin de l'etape b). Le polysaccharide est produit par fermentation aerobic dans des conditions reglees d'un milieu nutritif aqueux approprie, inocule avec la souche BEC 1645. Le milieu nutritif peut etre tout milieu usuel contenant des sources de carbone, d'azote et des sels mineraux. En general, des glucides (par exemple du glucose, du fructose, du maltose, du saccharose, du mannitol, de l'amidon, du strop de mas, du sorbitol, etc.) peuvent etre utilises isolement ou en combinaison comme sources de carbone assimilables dans le milieu nutritif. Une source de carbone preferee est le glucose. De preference, la quantite de glucides dans le milieu sera comprise entre environ 2 et 6% du poids du milieu. Comme source d'azote, on peut utiliser diverges matieres proteiques, par exemple de l'extrait autolytique de levure, des hydrolysats de caseine ou de proteines vegetales (soja, ble ou feverole par exemple), de la liqueur de trempage du mas, etc. De preference, la source d'azote sera un melange d'un hydrolysat de proteines de ble et d'un extrait autolytique de levure et representera entre 0,05 et 0,5% du poids du milieu nutritif. Comme sels mineraux, on peut utiliser les sels habituellement employee dans les milieux nutritifs. Des exemples non limitatifs vent les phosphates, sulfates, chlorures et carbonates de sodium, potassium, ammonium, calcium et magnesium. On peut conduire la fermentation a des temperatures de l'ordre de 20 a 35 C, de preference de 25 a 30 C, a un pH d'environ 6,0 a 7,5, dans des conditions d 'aeration et d 'agitation, pendant des durees de l 'ordre de 2 a 6 jou rs. La fermentation peut etre effectuee dans un fermenteur classique en inoculant, a ['aide d'une culture de la souche BEC 1645, du milieu nutritif prealablement sterilise, par exemple par chauffage a une temperature de l'ordre de 120 C ou par filtration steri I isante. A la fin de la periode de fermentation, le mout de culture est soumis a un traitement proteolytiq ue, puis autoclave, et refroidi. Le prod u it resultant est alors traite pour separer le polysaccharide, par exemple par precipitation de ce dernier a ['aide d'un alcool (par exemple le methanol, I'ethanol, le propanol ou l'isopropanol) ou autre non solvent (tel que ['acetone) du polysaccharide, puis purifie par essorage et ravage du precipite. Si desire, on peut clarifier le mout de fermentation par filtration avant de proceder 3 la precipitation du polysaccharide. Le produit purifie peut etre mis sous forme de solution aqueuse ou etre seche en une poudre, par exemple pour le stockage. Un conservateur peut etre egalement ajoute au produit. Sous forme liquide, le produit purifie comporte essentiellement un polysaccharide se presentant sous la forme d'une solution visqueuse, a tres faible odeur, et dont ['unite repetitive se presente sous la forme d'un hexasaccharide comportant du fucose, du galactose, du glucose et de l'acide glucuronique selon un rapport molaire de 2: 2: 1: 1. L'unite repetitive a la formule developpee suivante: 4) - a-L-Fucp-(14)a-L-Fucp-(13)-,B-D-Glcp-(1 a-D-Galp 8-D-GlcpA 4 a-D-Galp ou Fucp, Glcp, Galp, et GlcpA designent des groupes fucose, glucose, galactose, et acide glucuronique respectivement, Selon toute vraisemblance, le polysaccharide appartient a la famille des acides colaniques dont la structure a ete publiee par CESCUTTI, P.; TOFFANIN, R.; SUTHERLAND, I.W., Carbobydr. Res., 1999, 315,159-168. De maniere surprenante, la Demanderesse a decouvert que, comme le montre le graphique 1, les comportements rheologiques du polysaccharide produit selon ['invention et du polysaccharide mentionne dans la revendication 2 du brevet FR95 00898, ci apres designe par Fucogel, vent tres proches. Selon toute vraisemblance les proprietes viscosantes, le pouvoir autoemulsionnant, et le comportement rheofluidifiant du polysaccharide produit selon ['invention vent done proches de celles du Fucogel@. La Demanderesse est parvenue a fabriquer des polysaccharides a chaines plus courses a partir du polysaccharide original A (d'un poids moleculaire superieur a 000 Da) issu de la souche BEC 1645. Par des techniques d'hydrolyse controlee, elle est parvenue a obtenir deux autres polysaccharides B et C dont les poids moleculaires moyens apparents vent compris entre 4000 Da et 6000 Da, de preference d'environ 5000 Da, et compris entre 14000 Da et 16000 Da, de preference d'environ 15000 Da, respectivement. L'hydrolyse est realisee par chauffage d'une solution aqueuse du polysaccharide A a une temperature comprise entre 70 et 120 C, de preference entre 80 et 105 C, pendant une duree variant de deux a six heures selon le poids moleculaire recherche, en presence de generateurs de protons constitues soit d'un acide inorganique tel que l'acide chlorhydrique ou sulfurique a des concentrations connues de l'homme de ['art, soit de resines generatrices de protons a des concentrations comprises entre 5 et 10%, poids/poids, par rapport a la quantite de polysaccharide A contenue dans la solution. II sera utilise preferentiellement des resines generatrices de protons, ctest-a dire generant des protons qui entrainent une coupure de liaisons glycosidiques avec fixation d'une molecule d'eau, en particulier une resine choisie parmi les resines d'origine organique telles que commercialisees sous les denominations Amberlyst 15( ou Amberlyst 36, ou des resines d'origine minerale telles que les families des Montmorillonites et des Zeolithes, et plus particulierement, dans cette derriere famille, les resines commercialisees sous les noms de BetaO, MordeniteO et Pentasil. Les poids moleculaires des polysaccharides ainsi obtenus vent evalues par chromatographie d'exclusion sur une colonne Ultragel 250- 7,8 x 300mm (Waters), par rapport a une gamme d'etalonnage realisee avec des solutions de polyethylene glycol de differents poids moleculaires, les conditions operatoires utilisees etant connues de l'homme de ['art. Les polysaccharides B et C a chaines plus courses ainsi obtenus possedent la meme composition relative en fucose, galactose, glucose et acide glucuronique que le polysaccharide A non hydrolyse. De plus l'enchamement structural de ces groupes est preserve. Les polysaccharides B et C se presentent sous forme de solutions sensiblement non visqueuses, c'est-adire stecoulant librement, ou, apres deshydratation de ces solutions, sous forme de poubres. La similitude des comportements rheologiques du polysaccharide produit selon ['invention et du Fucogel et la presence du motif fucose dans ['unite repetitive, permettent de prevoir des applications identiques, telles que par exemple celles decrites dans le brevet FR 2 750 863 relatif a une composition destinee a favoriser la desquamation de la peau, dans le brevet FR 2 750 864 relatif a une composition destinee a stimuler les defenses immunitaires, ou dans le brevet FR 2 741 180 relatif a une composition demaquillante. En outre, WOLF F., BUNGER J., REPKE S., TRAUPE B., JUSTELC., MENDEZ PINTO M.M., HOPPE U. et SAUERMANN G., 19th IFSCC Congress, Vol1, 129-143, Sidney 1996, ont montre que le Fucogel possedait des proprietes anti- adhesion tres importantes vis-a-vis de staphylococcus epidermidis, proprietes supposees liees a sa structure, et qui trouvent des applications dans les formulations cosmetiques. 11 est done egalement tres probable que le polysaccharide selon ['invention possede les memes proprietes d'anti-adhesion vis-a-vis de tels microorganismes. L'utilisation du polysaccharide produit selon ['invention est done particulierement adaptee dans le domaine cosmetique, pour fabriquer par exemple des produits pour le contour des yeux, des laits pour le corps, des produits pour peaux fragiles, des produits d'hygiene infantile, des compositions destinees a favoriser la desquamation de la peau ou a stimuler les defenses immunitaires, des compositions demaquillantes, des lotions aqueuses ou hydroalcooliques, des compositions parfumees aqueuses ou hydroalcooliques, des laits et emulsions fluides, des cremes de veins, des cremes de jour, des cremes de nun', des produits solaires et produits apres-solaires, des produits apres-rasage, des produits demaquillants, des shampooings, des produits dthygiene intime, et des produits anti-age. L'exemple non limitatif suivant est donne en vue d' ill ustrer ['invention. Un polysaccharide riche en fucose est produit par la souche BEC 1645, par fermentation d'un milieu a base de glucose. Cette production steffectue selon le protocole suivant. Preparation du milieu de culture: Glucose: 30 g/l Peptone de ble: 3 g/l Extrait autolytique de levure: 1 g/l K2504:1 g/l NaCI:1 g/l MgSO4 7 H20: 0,2 g/l CaCI: 0,002 g/l Afin d'eviter le developpement de coloration trop importante du milieu de culture, la sterilisation (20 minutes a 120 C) s'effectue en deux etapes distinctes: - Sterilisation d'une solution concentree de glucose (200 g/l). - Sterilisation d'une solution des autres constituents (sels et sources azotees). On procede ensuite au melange des deux solutions, de maniere a obtenir un milieu de culture ayant la composition ci-dessus. Preparation de l'inoculum 500 ml du milieu de culture ainsi prepares vent alors inocules avec une culture de la BEC 1645 sur milieu gelose, puis incubes, sous agitation, a 25 C, pendant heures environ. Fermentation principale 12 litres de milieu de culture disposes dans une cuve de fermentation Biolafitte d'un volume utile de 12 litres vent alors inocules avec 500 ml d'inoculum, puis places en fermentation. Les conditions de fermentation vent les suivantes: temperature: 25 C Aeration: 1,5 vvm (181 d'air/mn) pH: 7,00 (regule par une solution de soude) On laisse la culture se poursuivre dans ces conditions pendant 72 a 96 heures. En fin de culture, on mesure une viscosite du milieu de 10000 Mpa.s a 30 C, et une teneur en fucose de 1,5 a 2 I, soit une teneur en polysaccharide d'environ 6g/l. Extraction du polysaccharide: Le pH du mout de fermentation (12 litres) est ajuste a 8,5 puis est soumis a un traitement proteolytique a une temperature comprise entre 50 C et 60 C pendant 3 heures a ['aide de 12 ml d'Alcalase (subtilisine A de bacillus licheniformis vendue par la societe NOVO NORDISK). Le mout de fermentation est ensuite autoclave a 120 C pendant 20 minutes. Apres refroidissement, on ajoute 480 g de chlorure de sodium. On ajoute ensuite 24 iitres d'ethanol 95, soit 2 volumes par volume de mout. Le polysaccharide precipite, et apres decantation pendant quelques heures, on elimine le surnageant. Le precipite est ensuite essore et lave sur Buchner. Le precipite est alors seche en etuve a 40 C pendant 24 a 48 heures. Le polysaccharide se presente alors sous forme de poudre ayant une teneur en fucose d'environ 20%. Cette poudre peut ensuite etre mise en solution dans l'eau a une concentration de 1% par exemple. La viscosite de cette solution est d'environ 1000 a 2000 Mpa.s (Viscosimetre Brookfield DV-II+ modele LV, mobile SP 31, chambre SC4-31/13R, C). Bien entendu, la presente invention ntest pas limitee au mode de realisation decrit et represente fourni a titre d'exemple illustratif et non limitatif. : 1 1 REN/ENDICATIONS 1. Microorganisme de la [amille des Enterobacteriaceae, caracterise en ce qu'il presente le profit biochimique suivant: Beta galactosidase + Arginine dihydrolase + Lysine decarboxylase Ornithine decarbfoxylase + Utilisation du citrate + Production d'H2S Urease Tryptophane desaminase Production d'indole Production d'acetone + Celatinase Utilisation du glucose + Utilisation du mannitol + Utilisation de l'inositol + Utilisation du sorbitoi + Utilisation du rhamnose Utilisation du saccharose + Utilisation du melibiose + Utilisation de l'amygdaline + Utilisation de ltarabinose + Cytochrome oxydase ou + et - signifient que la souche a reagi positivement ou negativement, respectivement, pour chacun des tests. 2. Microorganisme selon la revendication 1 depose a la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes sous le N 1-2744. 3. Mutant dfun microorganisme selon I,une quelconque des revendications 1 et 2. 4. Procede de production d'un polysaccharide ayant le motif repetitif suivant: 4) - a-L-Fucp-1 >4- a-L-Fucp-13)-,B-D-Glcp-(1 - a-D-Galp ,B-D-GlcpA a-D-Galp ou Fucp' Glcp, Galp, et GlcpA designent des groupes fucose, glucose, galactose, et acide glucuronique respectivement, comprenant a) la croissance d'un microorganisme selon l'une quelconque des revendications precedentes par fermentation aeroble dans un milieu nutritif aqueux, pU15 b) le recueil audit polysaccharide a partir clu mout obtenu a la fin de l'etape a). 5. Procede selon la revendication 4, caracterise en ce que, prealablement a l'etape b), on soumet led it mout de culture a u n traitement proteolytiq ue. 6. Procede selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, caracterise en ce que ledit milieu nutritif comporte entre 2 et 6% en poids de glucides ettou entre 0,05 et 0,5% en poids d'une source d'azete. 7. Procede selon l'une quelconque des revendications 4 a 6, caracterise en ce qu'on conduit ladite fermentation a une temperature comprise entre 25 et 30 C, et a un pH compris entre 6,0 et I,5. 308. Utilisation cosmetique d'un polysaccharide obtenu par la mise en ocuvre d'un