Brevet FR2834292A1 — publié le 20030704

L'invention concerne un procédé d'obtention d'un extrait biologiquement actif de sangsues, l'extrait obtenu, une composition pharmaceutique utilisée comme médicament comportant cet extrait. On connaît déjà l'utilisation de sangsues pour préparer des extraits biologiquement actifs ayant des propriétés médicales, notamment sur le système nerveux, cardiovasculaire, immunitaire. Le document RU 2,129, 428 décrit la préparation d'extraits de sangsues ayant une action psychosomatique. Le document RU 1,552, 420 décrit la préparation d'extraits ayant une action antithrombotique, thrombolytique, antiathérosclérotique. Le document RU 2,153, 325 décrit notamment la préparation d'un extrait d'un homogénat de sangsues médicinales, notamment à partir des sécrétions de glandes salivaires, du sang ou du tube digestif possédant une activité anti-stress et antioxydante. Le document US 5,977, 056 décrit une méthode de traitement de la thrombose utilisant un extrait de glands salivaires de sangsues comprenant un polypeptide (substance stable analogue à la prostacycline), capable de dissoudre des agrégats de plaquettes), éventuellement en combinaison avec des anticoagulants tels que l'hirudine. La thrombose est une maladie à l'origine du blocage de la circulation de vaisseaux sanguins notamment vers des organes vitaux tels que le cerveau ou le coeur. En outre, le document brevet FR 2,603, 188 décrit l'utilisation d'extraits de sangsues lyophilisés en poudre possédant une activité enzymatique à effet cosmétique (stimulation des échanges de protéines et de lipides). Toutefois les méthodes connues de l'art antérieur présentent un certain nombre d'inconvénients. Tout d'abord, l'administration des extraits de sangsues connus est à l'origine d'irritations et de réactions allergiques. En outre, la préparation d'extraits selon les méthodes connues nécessitent une quantité importante de matériau biologique, de sangsues, et requièrent des conditions d'élevage et d'extraction délicates. L'invention vise à pallier les inconvénients de l'art antérieur en proposant un procédé d'obtention d'un extrait efficace sans effet secondaire. L'invention vise également une méthode de production et d'extraction simple des composés actifs. A cet effet, les inventeurs ont démontré, de manière très surprenante, que les propriétés pharmaceutiques et/ou cosmétiques des extraits de sangsues étaient dues en grande partie à une bactérie symbiote des sangsues, Aeromonas hydrophila. Cette bactérie produit une grande partie voire la totalité des substances actives qui peuvent être obtenues de la salive des sangsues, en particulier des liposomes, des complexes déstabilases, des substances analogues à la prostacycline, des inhibiteurs de thrombine et de chymothrypsine, de la trypsine, la kallicréine du plasma sanguin, certaines enzymes de granulocytes, des substances immunostimulantes, des substances antithrombotiques et hypotensives. En outre, les inventeurs ont montré que l'administration directement de telles bactéries Aeromonas isolées des sangsues à des individus hôtes présente des effets toxiques. Aussi les inventeurs ont réussi à obtenir à partir de sangsues un extrait qui à la fois possède les propriétés recherchées, et ne provoque pas d'effets indésirables, ces effets semblant résulter des propriétés de membranes de ces bactéries. A cet effet l'invention concerne selon un premier aspect un procédé d'obtention d'un extrait actif de sangsues, comprenant les étapes : - prélèvement dans des sangsues de bactéries Aeromonas productrices des substances actives de l'extrait - culture de ces bactéries dans un milieu approprié - séparation des bactéries du milieu de culture - extraction d'au moins une partie des substances actives produites par ces bactéries, de manière à obtenir un extrait bactérien actif. Selon un mode de réalisation, l'extraction comprend une extraction primaire comportant la lyse des bactéries Aeromonas et la récupération d'au moins une partie du surnageant séparé de la fraction membranaire des bactéries lysées, le surnageant comprenant au moins une partie des substances actives. Selon un mode de réalisation l'extraction comprend en outre au moins une étape d'extraction secondaire de substances actives de la fraction membranaire des bactéries issue de l'extraction primaire. L'extrait bactérien actif comprend le surnageant de la lyse des bactéries et/ou le surnageant d'au moins une extraction secondaire. Selon un mode de réalisation le procédé comprend, entre l'étape de séparation du milieu de culture et l'étape d'extraction, une étape de conservation des bactéries par lyophilisation ou analogue. Les sangsues sont typiquement des sangsues Hirudo medicinalis. Selon un autre aspect l'invention concerne un extrait de sangsues, plus spécialement de bactéries Aeromonas isolées de sangsues, non irritant, susceptible d'être obtenu par le procédé décrit précédemment. Selon une réalisation l'extrait comprend au moins une substance biologiquement active choisie parmi : la dopamine, la 5 hydroxytriptamine, l'acétylcholine, le GABA, la sérotonine, la substance P, les peptides vasoactifs, l'encéphaline, la somatostatine, la déstabilase, la hyaluronidase, la kinnogénase, la kininase, la triglycéride estérase, la cholestérolestérase les inhibiteurs de kallicréine, la trypsine, la thrombine, la bdelline, l'égline, les antioxydants, la 6-céto-prostaglandine, les protéases neutres de granulocytes. Selon une réalisation l'extrait comprend au moins une substance à activité anti-stress. Selon un autre aspect l'invention concerne un procédé de sélection de composés régulateurs de la production d'au moins une substance biologiquement active par des bactéries Aeromonas, comprenant comprend l'addition d'au moins un composé testé au milieu de culture des bactéries et la mesure des quantités produites desdites substances et/ou de l'effet thérapeutique de l'extrait. Selon un autre aspect l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un tel extrait et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Cette composition pharmaceutique peut être prévue pour une administration en combinaison avec un agent anti-coagulant, antithrombique, thrombolytique. Selon une réalisation cette composition est une composition anti-stress. Selon un autre aspect l'invention concerne l'utilisation d'un tel extrait comme médicament. En particulier l'invention concerne l'utilisation d'un tel extrait pour la préparation d'un médicament anti-coagulant, antithrombique, thrombolytique, contre l'oedème, immunostimulant, hypotenseur et anti-inflammatoire, antihypoxie, lipolytique. L'invention concerne aussi une utilisation (non médicamenteuse) d'un tel extrait comme agent relaxant ou comme agent stimulant ou comme agent antiinflammatoire. D'autres objets et avantages de l'invention sont présentés dans la description détaillée qui suit illustrée par la figure 1 qui représente un exemple de procédé d'obtention d'un extrait de bactéries Aeromonas. Exemple 1. Les sangsues sont lavées à l'aide d'une seringue avec de l'alcool puis de l'eau stérile. A l'aide d'une seringue stérile on prélève des sangsues le sang intestinal dans le tube digestif, puis en condition stérile le prélèvement est distribué uniformément dans plusieurs boites de Pétrie sur milieu agar-extrait de boeuf. Après incubation une journée à 28 C, les colonies développées dans les boites sont réensemencées sur support solide (variante n l, agar-extrait de boeuf) ou sur support liquide (variante n 2, milieu de culture liquide). La culture en milieu liquide, avec croissance exponentielle des bactéries incubées pendant 24 heures à 28 C, s'accompagne d'une décroissance du pH du milieu jusqu'à 5-6. L'analyse microscopique montre des colonies se développant formant une structure en bâton. On sépare suite les bactéries du milieu de culture avec centrifugation à 5000- 6000 tours/minute environ pendant 15 minutes à température ambiante. Pour la variante de culture sur milieu solide, les cellules se développant sur milieu solide avec incubation à 28 C. Les bactéries sont de petite taille (diamètre d'environ 2 jum) d'un aspect brillant translucide de couleur jaune. Les cellules sont lavées avec de l'eau distillée, puis lysées aux ultrasons à 22 kHz pendant 2-3 minutes. Les parois cellulaires insolubles dans l'eau sont séparées par centrifugation pendant 30 minutes à 17000-20000 rotation/minute à 4 C. Le précipité est lavé plusieurs fois avec de l'eau distillée. La culture sur milieu solide peut être effectuée jusqu'à 11 fois dans cette réalisation. Le surnageant final est récupéré puis lyophilisé. La figure 1 précise une variante de réalisation dans laquelle on procède à 3 centrifugations successives après la lyse par ultrasons. En effet, on effectue après la lyse une première centrifugation à 2000 tours/minute pendant 30 minutes, de manière à obtenir un surnageant SN-1 et les membranes cellulaires séparées. Puis la fraction membrane cellulaire séparée est remise en suspension puis centrifugée, conduisant à un surnageant SN-2 et à la fraction membranaire qui est elle même remise en suspension puis centrifugée jusqu'à obtenir un surnageant SN-3. L'extrait final de bactéries Aeromonas utilisé pour la préparation de produits actifs pourra être le surnageant Son-1, SN-2, SN-3 ou un mélange de plusieurs d'entre eux. Les surnageants SN-2 et surtout SN-3 contiennent d'avantage de substances biologiquement actives décrites précédemment extraites des membranes cellulaires. Exemple 2. Les inventeurs ont effectué des études pour démontrer l'action non allergisante, non irritante, et la non toxicité des extraits d'Aeromonas. L'influence a été étudiée sur la peau et le foie d'animaux selon la méthode décrite dans la référence numéro 1. Les études ont été menées sur 90 cobayes. La préparation a été appliquée quotidiennement pendant 30 jours à des concentrations de 0, 001% (n=30), 0, 01% (n=30) et 0, 1% (n=15), pour le contrôle on a utilisé une solution physiologique (0,85% NaCl, n=15). Les résultats démontrent que le surnageant ne possède pas d'action irritante et allergisante sur la peau, n'altère pas la structure de la peau, ne provoque pas d'effet néfaste sur le comportement général des individus étudiés : ces individus ne subissent pas de modifications de poids et d'état général (conservation de l'appétit, de la motricité, poil brillant). Exemple 3 : Détermination de l'activité antithrombique de l'extrait final. L'activité antithrombique de l'extrait actif est démontrée à l'aide de tests appropriés. Les inventeurs ont montré que l'activité antithrombique de l'extrait était due à la présence d'hirudine, révélée par la prolongation du temps de coagulation du fibrinogène par la thrombine. On peut par exemple utiliser le test-thrombine 30 lU/ml de Behringwerke décrit notamment dans le brevet US 5 563 041. En particulier le mélange comprend 0,1 ml d'une solution de fibrinogène à 0,3%, 0, 1% d'une préparation d'extrait bactérien Aeromonas (ou une solution de NaCI à 0,9% pour le contrôle) incubée 1,5 minutes à 30 C, et 0,1 ml d'une solution de thrombine. On obtient par exemple des valeurs 5-78 ATU mg'' L'activité anti-thrombine est démontrée pour les bactéries en culture sur support solide après les 7-8 premiers ré-ensemencements sur phase solide, et pour les cultures sur support liquide pour les premiers ré-ensemencements. Exemple 4 : Activité d'inhibiteur de la kallikréine du plasma sanguin Toutes les préparations obtenues issues du ré-ensemencement sur phase solide (plus de 8 fois) et sur phase liquide (3 fois), présentent une activité d'inhibiteur de kallikréine indépendamment de l'activité anti-thrombine de l'hirudine. Cette détermination utilise un test du temps de recalcification du plasma sanguin. L'activité d'inhibiteur de kallikréine est déterminée en mesurant le temps de prolongation de recalcification du plasma sanguin : la prolongation de la durée d'une période par deux correspond à deux unités APC (unités antiprocoagulantes) de l'inhibiteur. Le mélange utilisé comprend 0,2 ml de plasma sanguin, 0,1 ml de la préparation d'extrait bactérien des sangsues (ou 0,9% NaCI pour le contrôle) incubée 1,5 minute à 37 C et 0, 1 ml une solution 0,25 M Ca C12On obtient par exemple des valeurs 50-250 APC mg'' Exemple 5. Toutes les préparations d'extrait bactérien inhibent l'activation de la phase de contact de la coagulation sanguine. Les résultats ont été effectués en utilisant du plasma sanguin activé par du sulfate dextrane en présence d'un substrat chromogénique S-2302 utilisé selon la méthode du"point final" : la réaction est stoppée 10 minutes après l'addition de substrat. A405 : 0. 2-0. 95 Exemple 6. L'activité caséinase et BAME-estérase de l'extrait sanguin est pratiquement nulle. Par contre, l'activité déstabilase est démontrée dans toutes les préparations d'extrait bactérien obtenu après re-ensemencement sur phase solide. Cette activité est démontrée à la fois pour les eaux flushing et pour les précipités de pulpe après la centrifugation des cellules bactériennes de sangsues. Résultat aprèsl6 heures d'incubation à 37 C : 49- 825 mm2/mg. Les cellules obtenues cultivées en phase liquide ne présentent pas d'activité déstabilase. L'activité déstabilase a été analysée sur des portions de fibrine stabilisée. Exemple 7. Une activité lipolytique non spécifique a été démontrée à la fois pour des cellules issues d'une culture sur support solide et une culture en milieu liquide. Les substrats utilisés sont notamment le para-nitrophénylacétate, le glycerol-3- (I-CI4) -trioléate et le cholestéro !- (I-C')-oléate. Résultats avec les substrat utilisés suivants : - le para-nitrophénylacétate : 5 10-8-26 10-8 M mg-'après 10 minutes d'incubation - la glycérine-3-(I-C14)-thrioléate : 2 10-8-8. 6 10-8 M mg-'après 60 minutes d'incubation - la cholestérine-(I-C14)-oléate 18 10-8 - 42 10-8 M mg''après 60 minutes d'incubation. Exemple 8. L'extrait bactérien comprend en outre des substances analogues à la prostacycline, repérés à la fois sur phase liquide et sur phase solide (25-78 ug mg-'). Ce repérage a utilisé un test radioimmunologique à la 6-ceto-prostaglandine Fla. L'extrait bactérien comprend dix fois plus de prostaglandine que les sécrétions des glandes salivaires des sangsues médicinales. Le niveau de thromboformation est de 10 à 15 %, comparé à 80-95 % pour le contrôle. Le contenu de prostaglandine a été calculé à partir de la quantité de 6-céto PGFIa en utilisant le jeu de réactifs [I25I]-6-céto-prostaglandine FIa du système d'essai Amersham. Exemple 9. L'activité déstabilase (enzyme fibrinolytique hydrolisant des polymères de fibrine agissant en dissolvant le caillot constitué) a également été démontrée en utilisant des plaques de fibrine stabilisée (Baskova et Nikonov, 1991), et par une méthode spectrophotométrique utilisant un substrat chromogène L- ?-Glu-pNA à une longueur d'onde de 405 nm (Svendsen et al., 1972). Exemple 10. La réduction du degré de formation de thrombose a été également démontrée par une injection intraveineuse d'extrait bactérien de sangsues en utilisant la méthode de Wessler. L'action anti-thrombique et thrombolytique de l'extrait bactérien a été démontrée en utilisant le modèle de thrombose veineuse de Wessler et al. (1959), modifié par Markwardt et al. (1989). Les expériences ont été effectuées sur des rats mâles ayant un poids corporel de 220+30 g, les animaux ayant été anesthésiés par de l'aminazine. La thrombose a été stimulée par du sérum sanguin humain activé par du verre avec fermeture consécutive de la section de la veine juguler. Le dégré de thrombose a été estimé par des méthodes macroscopiques et des mesures de poids (Markwardt et al., 1989). Résultat : pour 1 ml d'une solution d'extrait bactérien injecté en intravéneuse avant 5 minutes de thromboformation (contrôle : 85 % NaCl) : 10 à 15% de thromboformation (80 à 95% chez les témoins). Grâce à l'extrait bactérien obtenu, les inventeurs ont développé une méthode évitant l'isolement et la purification complexe d'un extrait de sangsues. En effet, la culture de bactéries Aeromonas permet d'obtenir des quantités importantes d'extrait bactérien biologiquement actif, non toxique et sans effet secondaire irritant comparé aux méthodes d'extraction classique. L'invention propose également l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace à un patient, de manière à dissoudre ou désagréger des agrégats plaquettaires. L'extrait bactérien peut être incorporé avantageusement dans une composition pharmaceutique qui peut être administrée à un patient de manière orale ou parentérale. Par parentérale on entend notamment une administration sous cutanée, intraveineuse, intra-articulaire, une injection intra-trachéique, des techniques d'infusion. D'autres moyens d'administration tels qu'une administration topique peuvent être utilisés, l'extrait bactérien peut être utilisé comme ingrédient d'onguents ou de suppositoires. Selon une réalisation une composition pharmaceutique incorporant l'extrait comprend typiquement un excipient ou un transporteur qui est préférablement choisi de manière que la formulation puisse être administrée en intraveineuse, telle qu'une solution saline stérile. Par exemple pour l'hirudine, la formulation intraveineuse comprend typiquement une quantité d'hirudine suffisante pour qu'après l'administration aux patients, la concentration dans le sang d'hirudine soit de l'ordre de 10 à 100 unités d'hirudine/ml Le terme transporteur pharmaceutiquement acceptable est utilisé pour désigner un matériau non toxique, solide ou liquide diluant ou encapsulant, qui ne réagit pas sur le composé actif de manière négative pour son efficacité. On utilise par exemple des transporteurs liquides appropriés tels qu'une solution aqueuse stérile, une solution saline, une solution aqueuse de dextrose, une solution de sucre, de l'éthanol, du glycol et des huiles. Des comprimés et capsules destinés à une administration orale peuvent contenir des excipients habituels tels que des agents liants, des agents lubrifiants, etc. Des préparations liquides orales peuvent être sous forme de suspension aqueuse ou huileuse, de solution, d'émulsion, de sirop, d'élixir ou analogue, ou peuvent être présentées sous forme d'un produit en poudre reconstituable en présence d'eau ou d'un autre transporteur approprié. De telles préparations liquides peuvent contenir des additifs habituels tels que des agents de suspension, des agents émulsifiants, des transporteurs non aqueux. L'application topique peut être sous forme d'une suspension aqueuse ou huileuse, d'une solution, d'une émulsion, d'un gel notamment. La dose unitaire d'une composition pharmaceutique selon l'invention peut contenir une quantité appropriée d'extrait bactérien. Le dosage optimal pharmaceutiquement acceptable et la dose pour un patient donné (notamment l'homme) dépend de plusieurs facteurs notamment l'activité de l'individu, son âge, son poids corporel, son état de santé général, son état d'anxiété, l'objet du traitement, la maladie traitée. Par exemple, une dose systémique d'extrait bactérien de l'ordre de 0, 01 à 100 mg/kg de poids corporel, de préférence 0,05 à 10 mg ! kg, peut être utilisée. La formulation selon l'invention peut être avantageusement administrée en combinaison avec des anticoagulants, des thrombolytiques, des fibrinolytiques, des agents fibrinogénolytiques ou analogues, qui peuvent augmenter la capacité de la composition à inhiber la thrombose. On peut utiliser comme anticoagulant un polypeptide tel que le l'hirudine ou l'hémentine issu de différentes espèces de sangsues (voir le document US 4 390 630, WO 91/15576). Compte tenu de l'absence d'effets secondaires et des propriétés biologiques spécifiques et avantageuses de l'extrait obtenu à partir des bactéries Aeromonas à l'aide du procédé décrit, par rapport aux extraits obtenus jusqu'à présent par extraction directe sur les sangsues, les inventeurs en déduisent que les extraits bactériens n'ont pas la même composition que les extraits de l'art antérieur. Les inventeurs émettent l'hypothèse que certains composés à l'origine d'effets secondaires sont absents, et/ou que certains composés spécifiques inhibant ces effets sont isolés d'Aeromonas lors de l'extraction. Par ailleurs les exemples décrivent l'utilisation qui peut être thérapeutique ou non thérapeutique des extraits obtenus, en particulier selon la concentration de l'extrait actif en substances actives, et l'importance du trouble de l'individu. Ainsi l'utilisation sera non thérapeutique si l'extrait (à la concentration appropriée) est destiné à une personne comme stimulant ou comme agent anti-inflammatoire, cette personne n'étant pas dans un état pathologique. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un extrait bactérien actif de sangsues, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes : - prélèvement dans le tube digestif des sangsues de bactéries Aeromonas productrices d'au moins une partie des substances actives de l'extrait - culture de ces bactéries dans un milieu approprié - séparation des bactéries du milieu de culture - extraction des bactéries, d'au moins une partie des substances actives produites par ces bactéries, de manière à obtenir un extrait bactérien actif. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'extraction comprend une extraction primaire comportant la lyse des bactéries Aeromonas et la récupération d'au moins une partie du surnageant séparé de la fraction membranaire des bactéries lysées, le surnageant comprenant au moins une partie des substances actives. 3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'extraction comprend en outre au moins une étape d'extraction secondaire de substances actives de la fraction membranaire des bactéries issue de l'extraction primaire. 4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que l'extrait bactérien actif comprend le surnageant de la lyse des bactéries et/ou le surnageant d'au moins une extraction secondaire. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend, entre l'étape de séparation du milieu de culture et l'étape d'extraction, une étape de conservation des bactéries par lyophilisation ou analogue. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que les sangsues sont des sangsues Hirudo medicinalis. 7. Extrait bactérien de sangsues, plus spécialement de bactéries Aeromonas isolées de sangsues, non irritant, susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 8. Extrait bactérien selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il comprend au moins une substance biologiquement active choisie parmi : la dopamine, la 5 hydroxytriptamine, l'acétylcholine, le GABA, la sérotonine, la substance P, les peptides vasoactifs, l'encéphaline, la somatostatine, la déstabilase, les inhibiteurs de kallicréine, la thrombine, la trypsine, les protéases neutres de granulocytes, la hyaluronidase, la kininase, la cholestérolestérase, la thrombine, la bdelline, l'égline, les antioxydants, la 6-céto-prostaglandine. 9. Composition pharmaceutique comprenant un extrait selon la revendication 7 ou 8, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 10. Composition pharmaceutique selon la revendication 9 pour une administration en combinaison avec un anti-coagulant. Il. Composition pharmaceutique selon la revendication 9 pour une administration en combinaison avec un agent antithrombique, thrombolytique, fibrinolytique. 12. Extrait selon la revendication 7 ou 8 en tant que médicament. 13. Utilisation d'un extrait selon la revendication 7 ou 8 pour la préparation d'un médicament anti-coagulant, anti-inflammatoire, antithrombique, thrombolytique, contre l'oedème, immunostimulant, hypotenseur, anti-inflammatoire, antihypoxie, lipolytique.