Brevet FR2836688A1 — publié le 20030905

La présente invention se rapporte à de nouveaux moyens d'augmenter la résistance dés plantes au stress photooxydant. L'exposition des plantes à une intensité lumineuse élevée peut conduire à une absorption de lumière excédant les capacités d'utilisation par la fonction photosynthétique qui entraîne l'apparition d'espèces actives de l'oxygène (superoxyde, peroxyde d'hydrogène, hydroxyle). Ces molécules sont très réactives et si elles ne sont pas détoxifiées, elles provoquent un stress oxydant qui altère la structure et la fonction du chloroplaste conduisant à une inhibition de 11 activité photosynthétique. Ce phénomène peut se manifester même sous des intensités lumineuses modérées lorsque la plante est exposée à de basses températures (WISE, Photosynth. Res. 45, 79-97, 1995), ou bien lorsqu'elle est placée en conditions de sécheresse (SMIRNOFF 1 New Phytol., 125, 27-58, 1993), ou de carence minérale. J-25, 27-58, 1993), Le stress photo-oxydant est néfaste pour les plantes, par exemple pour des variétés tropicales peu adaptées au froid, ou bien pour des végétaux qui sont plantés aux premiers jours du printemps, et doivent donc croître à basse température. Les symptômes observés sont : blanchiment des feuilles, apparition de nécroses, baisse de la croissance. Ainsi, la recherche de nouveaux moyens de lutte contre ce stress photo-oxydant constitue un réel besoin. Des analyses biochimiques de plantes après exposition à une lumière de forte intensité, montrent l'accumulation de différentes protéines appartenant à la famille des LHCPs liant les chlorophylles a/b (ADAMSKA et al., Eur. J. Biochem., 260,453-460, 1999). Parmi ces protéines on citera celles de la famille des ELIPs (Early Light Induced Proteins) (ADAMSKA, Physiologia Plantarum, 100, 794-805, 1997). Par exemple, 2 protéines ELIP, respectivement dénommées ELIP1 et ELIP2, ont été mises en évidence chez Arabidopsis thaliana (At). Des séquences homologues à celles de ces ELIPs ont également été identifiées chez d'autres plantes ; dans le cas des céréales, on citera notamment le riz (Os), le mais (Zm) et le blé (ah). La Figure 1 représente l'alignement des séquences de quelques ELIPs. L'arbre généalogique de ces ELIPs, élaboré à l'aide de séquences représentatives des différentes classes, est représenté sur la Figure 2. Les ELIPs de riz peuvent être regroupées en 2 classes, codées respectivement par des gènes situés sur le chromosome 1 et le chromosome 7 (2 gènes ont été identifiés sur le chromosome 7). Les ELIPs de mais peuvent également être regroupées en 2 classes ; en revanche, les séquences actuellement disponibles d'ELIPs de blé semblent appartenir à une même classe. Certaines classes comprennent plusieurs EST ou gènes, présentant de légères variations, laissant supposer un polymorphisme pour ces gènes. Les ELIPs ont une expression transitoire ; leurs gènes ne sont majoritairement transcrits qu'en réponse à différents stress environnementaux (forte intensité lumineuse, basse température, stades spécifiques de développement de la plante, ABA) (ADAMSKA, 1997, publication précitée). La quantité d'ELIPs dans les cellules végétales est en outre étroitement contrôlée par des régulations posttraductionnelles : intégration des ELIPs dans la membrane des thylakoides, instabilité et dégradation des ELIPs (ADAMSKA, 1997, publication précitée). Différentes observations suggèrent une corrélation entre le stress et la présence d'ELIPs. En revanche, il n'avait jusqu'à présent pas été possible de déterminer si ces protéines jouaient un rôle effectif dans la résistance au stress. Il a au contraire été rapporté que la diminution ou la suppression partielle de l'expression des ELIPs n'entraînait pas de phénotype particulier (GRUBE, Thèse de Doctorat : Untersuchung der expression eines frühen lichtinduzierten Proteins des Tabaks , Université de Hanovre, 1999, cité dans MONTANE et al., Gene, 258,1-8, 2000). Certains auteurs se sont d'autre part intéressés à la voie de transport des ELIP's jusqu'aux membranes des thylakoïdes : un mode d'insertion spontanée a été proposé par KRUSE et al. (Eur. J. Biochem., 208, 195-202, 1992), et KIM et al. (J. Biol. Chem., 274, 4715-4721, 1999) qui y ajoute l'intervention d'une voie faisant intervenir des nucléotides triphosphates. Mais ces hypothèses, basées sur des expériences in vitro n'ont pas été confirmées in vivo. Dans la présente invention, les Inventeurs ont mis en évidence une voie préférentielle de transport et d'intégration in vivo des ELIPs dans les membranes des thylakoïdes des chloroplastes ; cette voie fait intervenir un complexe transporteur dénommé cpSRP (pour Chloroplast Signal Recognition Particle). Les Inventeurs ont ainsi observé que des mutations inactivant la sous-unité cpSRP43 (mutant chaos) du complexe cpSRP affectaient l'ensemble des ELIPs. Dans les plantes contenant la mutation chaos les ELIPs ne s'accumulent plus en conditions de stress photo-oxydant, et on observe parallèlement une forte augmentation de la sensibilité au stress. En outre, les Inventeurs ont également constaté que la surexpression d'ELIPs chez ces mutants restaure une résistance au stress photo-oxydant comparable à celle des plantes sauvages. Ces résultats permettent de proposer l'utilisation des ELIPs dans des applications où la résistance au stress photo-oxydant est recherchée, en particulier dans le domaine végétal. La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'au moins une protéine de la famille ELIP, ou d'un polynucléotide codant pour ladite protéine, pour l'obtention de plantes présentant une résistance accrue au stress photo-oxydant. En particulier la présente invention a pour objet un procédé pour accroître la résistance d'une plante au stress photo-oxydant, comprenant la transformation de ladite plante par au moins un polynucléotide codant pour une protéine de la famille ELIP, et l'expression de ladite protéine dans ladite plante. Ce procédé peut être mis en oeuvre par les méthodes usuelles, connues en elles-mêmes, du génie génétique et de la transgénèse végétale. Classiquement, on utilisera une cassette d'expression, dans laquelle on placera un polynucléotide codant pour la protéine ELIP que l'on souhaite exprimer sous contrôle de séquences de régulation de l'expression (notamment promoteur et terminateur de transcription) appropriées. Le gène d'intérêt peut également être associé à d'autres éléments de régulation tels que des activateurs. D'autres éléments tels que les introns, enhancers, séquences de polyadénylation et dérivées peuvent également être présents dans la séquence nucléique d'intérêt, pour améliorer l'expression ou le fonctionnement du gène transformant. La cassette d'expression peut aussi contenir des séquences 5' non traduites dites leader . De telles séquences peuvent améliorer la traduction. On peut par exemple utiliser le promoteur du CsVmV (virus de la mosaïque des nervures du manioc) décrit dans la Demande PCT WO 97/48819. On peut également utiliser un promoteur hétérologue ; de très nombreux promoteurs utilisables pour la transformation de cellules végétales sont connus en euxmêmes. A titre d'exemples non-limitatifs de promoteurs utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera : - des promoteurs constitutifs forts, tels que le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), ou ses dérivés, ou le promoteur de l'ubiquitine ; - des promoteurs inductibles, par exemple par la lumière, tel que celui de la petite sous-unité de la ribulose-biphosphate-carboxylase de différentes espèces végétales, le froid, ou la sécheresse, tel que celui de l'ASR (ABA-water stress-ripening-induced protein) décrit dans la Demande PCT WO 01/83756. Parmi les terminateurs de transcription pouvant être utilisés, on citera notamment le terminateur polyA 35S de CaMV 1 ou le terminateur polyA NOS 1 qui correspond à la région en 3'non-codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline. La cassette d'expression ainsi obtenue peut éventuellement être insérée dans un vecteur capable de se répliquer dans une cellule-hôte, ou de s'insérer dans l'ADN chromosomique de celle-ci. La transformation de cellules végétales peut être réalisée par diverses méthodes telles que, par exemple, le transfert du polynucléotide d'intérêt dans les protoplastes végétaux après incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylène-glycol en présence de cations divalents (Ca 2+), l'électroporation (FROMM et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 82,5824, 1985), l'utilisation d'un canon à particules, notamment selon la méthode décrite par FINER et al. (Plant Cell Report, 11, 323-328, 1992), ou la micro-injection cytoplasmique ou nucléaire (NEUHAUS et al., Theor. Appl. Genet., 75 (1), 30-36,1987). On peut aussi infecter les cellules végétales par un hôte cellulaire bactérien comprenant le vecteur contenant le polynucléotide d'intérêt. L'hôte cellulaire peut être Agrobacterium tumefaciens (AN et al., Plant Physiol., 81,86- 91, 1986), ou A. rhizogenes (GUERCHE et al., Mol-. Gen. Genet., 206, 382, 1987). Dans ce cas, de manière préférentielle, la transformation des cellules végétales est réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extrachromosomique inducteur de tumeurs Ti d'A. tumefaciens, en utilisant un système binaire (WATSON et al., ADN recombinant, Ed. De Boeck Université, 273-292,1994). Pour la transformation des monocotylédones, on pourra également appliquer par exemple la méthode décrite par ISHIDA et al. (Nature Biotechnology, 14, 745-750, 1996). L'invention concerne également les plantes transgéniques obtenues par un procédé conforme à l'invention, ainsi que les descendants de ces plantes. L'invention englobe également les produits obtenus à partir de ces plantes, tels qu'organes ou tissus végétaux, cellules, semences etc. La présente invention peut également être mise en oeuvre dans le cadre de la sélection de plantes possédant une résistance améliorée au stress photo-oxydant. Elles présentent un intérêt tout particulier dans le cadre de la sélection assistée par marqueurs (SAM), qui permet de mettre en oeuvre les techniques de rétrocroisements accélérés consistant à utiliser la liaison existant entre un marqueur moléculaire et un gène d'intérêt agronomique, en l'occurrence codant pour une ELIP, pour transférer celui-ci dans différents génotypes afin de leur apporter une résistance accrue au stress photo-oxydant. La présente invention peut également être mise en oeuvre pour suivre l'intégration d'un allèle du gène ELIP favorable à la résistance au stress photo-oxydant, par exemple dans le cadre de techniques d'introgression par croisement successifs entre plantes présentant cet allèle. La présente invention peut également être utilisée dans le cadre d'études phylogénétiques, de la caractérisation de relations génétiques parmi les variétés végétales, de l'identification de croisements ou d'hybridations somatiques, de la localisation de segments chromosomiques affectant les caractères monogéniques, du clonage basé sur les cartes génétiques, et de l'identification de QTL (Quantitative Trait Loci) et/ou de PQL (Protein Quantitative Loci). La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'au moins une protéine de la famille ELIP, ou d'un anticorps dirigé contre ladite protéine, ou d'un polynucléotide représentant tout ou partie du gène de ladite protéine pour l'évaluation de la résistance d'une plante au stress photo-oxydant. Dans ce cadre, l'invention a en particulier pour objet un procédé d'évaluation de la résistance d'une plante à un stress photo-oxydant, caractérisé en ce que l'on soumet ladite plante à un stress photo-oxydant, et en ce que l'on détermine le niveau d'expression par ladite plante d'au moins une protéine de la famille ELIP. Pour soumettre une plante à un stress photooxydant, on la place dans des conditions environnementales qui favorisent la production d'espèces actives de l'oxygène par la lumière. Ces conditions peuvent par exemple être obtenues en soumettant la plante à une très forte lumière, éventuellement combinée au froid, et/ou à la sécheresse, et/ou à une carence minérale. Le niveau d'expression des protéines de la famille ELIP peut être évalué par exemple par quantification des transcrits d'un ou plusieurs gènes ELIP ; cette évaluation peut s'effectuer aisément, par différentes techniques connues en elles-mêmes, par exemple à l'aide d'oligonucléotides dérivés des séquences de ces gènes. Il peut également être évalué par dosage direct de la ou des protéine (s) ELIP concernée (s), en utilisant par exemple les techniques classiques de dosage immunologique, de type ELISA, transfert immunoélectrophorétique, etc. Des anticorps anti-ELIP utilisables pour la mise en oeuvre de ce procédé peuvent être obtenus facilement par les méthodes classiques de préparation d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux, en immunisant un animal avec une protéine ELIP extraite de plantes, ou bien produite par génie génétique. On peut également identifier des allèles des gènes ELIP favorables à la résistance au stress photooxydant, à partir de lignées de plantes déjà connues pour présenter naturellement une résistance élevée à ce type de stress. Ces allèles peuvent être isolés et séquencés et leurs séquences comparées avec celles des gènes ELIP provenant de variétés moins tolérantes, afin d'identifier des polymorphismes associés à ces allèles, par exemple des polymorphismes situés au niveau de la séquence codante ou du promoteur du gène. Des sondes et/ou des amorces nucléotidiques permettant la détection de ces polymorphismes peuvent ensuite être utilisés pour sélectionner des plantes possédant ces allèles favorables. Les méthodes conformes à l'invention d'identification de plantes possédant une résistance accrue au stress photo-oxydant, peuvent être mises en oeuvre notamment dans le cadre de la sélection assistée par marqueurs, ou pour le suivi de l'introgression dans des plantes d'un caractère de résistance au stress photo-oxydant. La présente invention peut être mise en oeuvre chez toutes les espèces de plantes dans lesquelles un accroissement de la résistance au stress photo-oxydant est souhaitable. Il peut s'agir de dicotylédones ou de monocotylédones, notamment de céréales, de plantes ornementales, ou de plantes destinées à l'alimentation humaine ou animale, etc. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs montrant la capacité des protéines ELIP à augmenter la résistance de plantes à un stress photo-oxydant. EXEMPLE 1 : TRANSPORT DES ELIPs AUX MEMBRANES DES THYLAKOÏDES PAR LA VOIE CPSRP Les Inventeurs ont étudié le transport des ELIPs chez un double mutant déficient pour les sous-unités cpSRP43 et 54 de la voie cpSRP. I-Obtention du double mutant chaos/ffc 1) Croisement de 2 simples mutants chaos et ffc Deux mutants d'Arabidopsis thaliana sont utilisés : - le simple mutant chaos déficient pour la sousunité cpSRP43 du complexe de transport cpSRP de part l'insertion d'un élément Ds à l'extrémité 3'de la région codante du gène chaos (KLIMYUK et al., Plant Cell, 11,87-99, 1999). - le simple mutant ffc déficient pour la sousunité cpSRP54 du complexe de transport cpSRP de part l'insertion d'un fragment d'ADN de 10 kb dans l'intro 8 du gène ffcl-2 (AMIN et al., Plant Physiol., 121,61-71, 1999), Un croisement entre les simples mutants chaos et ffc produit une génération F1 de type sauvage. Des doubles mutants (chaos/ffc) déficients pour les sous-unités cpSRP54 et 43 sont sélectionnés à partir de la génération F2. 2) Sélection des doubles mutants chaos/ffc Les protéines membranaires d'Arabidopsis thaliana de type sauvage (WT) 1 simple mutant (ffc, chaos) et double mutant (chaos/ffc) sont extraites comme décrit par GILLET et al. (Plant. J., 16, 257-262, 1998) et leur concentration est dosée en utilisant la méthode de Lowry (Sigma-Aldrich). 10 jg de chacun des extraits de protéines membranaires sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en condition dénaturante et transférées sur des membranes de nitrocellulose comme décrit par AMIN et al, 1999, précité. Les membranes sont incubées avec des anticorps anti-cpSRP43 (dilution au 1 : 10 000) et anti-cpSRP54 (dilution 1 : 2 500) couplés à la phosphatase alcaline, puis révélées par le ligand de la phosphatase alcaline. Les résultats sont représentés dans la Figure 3. Légende de la Figure 3 ligne cpSRP43 = détection par anticorps anti-cpSRP43 ligne cpSRP54 = détection par anticorps anti-cpSRP54 piste WT = type sauvage piste chaos = simple mutant chaos (cpSRP43-) piste ffc = simple mutant ffc (cpSRP54-) piste chaos/ffc = double mutant chaos/ffc (cpSRP43-/cpSRP54-) Les résultats révèlent une bande correspondant à la présence de la sous-unité cpSRP43 chez le WT et le simple mutant ffc, et une bande correspondant à la présence de la sous-unité cpSRP54 chez le WT et le simple mutant chaos. Les résultats montrent que les effets des mutations chez les simples mutants ffc et chaos sont additifs chez le double mutant ffc/chaos. Le double mutant chaos/ffc est déficient pour les sous-unités cpSRP 43 et 54 (double mutation cpSRP43-/cpSRP54-). Il-Caractérisation du double mutant f. fc/chaos Après une germination in vitro des graines à 23/17 C (jour/nuit), pendant une photopériode de 8 heures/jour, les jeunes plantes de 2 semaines sont transférées dans le sol, dans une chambre de croissance à 23/17 C (jour/nuit), sous une densité de flux de photons de 300 umol/m/seconde, avec une photopériode de 8 heures/jour et 60/85% d'humidité. Toutes les analyses sont effectuées sur des feuilles collectées au stade végétatif, avant la floraison (stade de la rosette). 1) Analyse phénotypique Les simples mutants chaos et ffc présentent une chlorose vert pâle due à la perte de pigments photosynthétiques. Les doubles mutants chaos/ffc contiennent beaucoup moins de pigments que l'un ou l'autre des simples mutants et de ce fait apparaissent plus jaunes que ces derniers. 2ì Analyses physiologiques a) Analyse des pigments photosynthétiques Des disques de 0,8 cm de diamètre sont découpés dans les feuilles issues de plants d'Arabidopsis de type sauvage (WT), simple mutant (chaos, ffc) et double-mutant (chaos/ffc) puis congelés dans l'azote liquide. Les pigments photosynthétiques sont analysés par HPLC selon le procédé décrit par HAVAUX et TARDY (Plant Physiol., 113,913-923, 1996). Les résultats sont représentés dans la Figure 4. Légende de la Figure 4 En abscisse : ffc/chaos = double mutant cpSRP54-/cpSRP43- ffc = simple mutant cpSRP54- chaos = simple mutant cpSRP43- WT = sauvage En ordonnée : pigments photosynthétiques (ng/mm2) B = chlorophylle a 0 = chlorophylle b 0 = néoxanthine = violaxanthine, anthéraxanthine, zéaxanthine 0 = lutéine Es = ss-carotène Les résultats montrent que les simples mutants chaos et ffc ont perdu respectivement 40% et 60% de leurs pigments photosynthétiques. Le double mutant chaos/ffc présente une diminution de 85% des chlorophylles, une diminution de 67% des caroténoides et une diminution de 87% du ss-carotène. Toutefois, la diminution de ces pigments n'altère pas le rapport chlorophylle a/b, lequel est similaire chez les doubles mutants chaos/ffc et le contrôle WT (2, 00, 1). b) Analyse de l'ultra structure des chloroplastes et des thylakoides Des échantillons de feuille d'environ 1 mm2 sont fixés comme décrit par CARDE et al. (Biol. Cell, 44, 315-324, 1982). Les micrographes de ces échantillons sont réalisés avec un microscope électronique à transmission CM10 ou TECNAI (FEI) à 80 kV. Les micrographes électroniques des chloroplastes des doubles mutants chaos/ffc révèlent une diminution considérable de la taille des grana et des lamellae par rapport au WT, contrairement à l'ultrastructure chloroplastique des simples mutants ffc et chaos qui n'est pas altérée. Néanmoins, la taille et le nombre des chloroplastes par cellule déterminés par microscopie confocale ne sont pas différents du WT. De ce fait, la diminution de la pigmentation chez le double mutant est associée à un défaut de développement des membranes des thylakoides. c) Analyse de la concentration en chlorophylle dans les systèmes photosynthétiques 1 et Il (PSI et PSII) Les spectres d'émission de fluorescence de la chlorophylle de suspensions de membranes de thylakoides sont enregistrés dans l'azote liquide (77 K). Les membranes des thylakoides sont préparées comme décrit par ROBINSON et YOKUM (Biochem. Biophys. Acta, 590, 97-106, 1980), et la concentration en chlorophylle des préparations membranaires est déterminée dans 80% d'acétone (ARNON, Plant Physiol., 24,1-15, 1949). Les spectres d'émission de fluorescence de la chlorophylle sont mesurés à l'aide d'un spectrofluorimètre à fibres optiques (Perkin-Elmer LS50B) en utilisant les préparations de thylakoides diluées à des concentrations en chlorophylle de 50 g/ml dans 20 mM HEPES/NaOH, 3 mM MgCl2, pH 7,5. Les spectres d'émission de fluorescence de la chlorophylle présentent généralement 3 pics distincts : pics à 680 nm et 690 nm dus à la chlorophylle a associée au PSII (apoprotéines CP43 et CP47 de la chlorophylle a des antennes internes de PSII avec une contribution des protéines LHCII), et pic à 730 nm du à la chlorophylle a associée principalement au PSI (protéines LHCI) (GOVINDJEE, Aust. J. Plant Physiol., 22, 131-160,1995). Les membranes des thylakoides (400 l) sont congelées dans l'azote liquide et l'émission de fluorescence de la chlorophylle est excitée à 440 nm. Les résultats sont représentés dans la Figure 5. Légende de la Figure 5 En abscisse : longueur d'onde (nm) En ordonnée : intensité de fluorescence relative - = type sauvage (WT) +++ = double mutant cpSRP43-/cpSRP54- (chaos/ffc) Les résultats montrent que les spectres d'émission de fluorescence de la chlorophylle présentent 3 pics distincts à environ 680 nm (F680), 690 nm (F690) et 730 nm (F730). Les pics F680 et F690 sont attribués aux chlorophylles associées au photosystème PSII. Le pic F730 est attribué aux molécules de chlorophylle associées principalement au système photosynthétique PSI. Les résultats montrent également que le pic de fluorescence PSI (F730) est significativement réduit chez le double mutant chaos/ffc par rapport au WT, contrairement aux bandes de fluorescence PSII (pics F680 et F690), suggérant une diminution drastique des protéines LHCIs en comparaison de PSII. L'efficacité photochimique maximale de PSII est déterminée in vivo en mesurant la fluorescence de la chlorophylle (Fv/Fm) dans les feuilles adaptées à l'obscurité pendant 30 minutes, à température ambiante, comme précédemment décrit par KLIMYUK et al., 1999, précité. Les résultats sont représentés dans la Figure 6a. Légende de la Figure 6a En abscisse : WT = type sauvage chaos = simple mutant cpSRP43- ffc = simple mutant cpSRP54chaos/ffc = double mutant cpSRP43-/cpSRP54- En ordonnée : efficacité photochimique : Fv/Fm (obscurité) Ces résultats montrent que le paramètre de fluorescence Fv/Fm du double mutant (chaos/ffc) est proche de celui mesuré dans les feuilles du type sauvage (WT) et des simples mutants (chaos, ffc), indiquant que le photosystème PSII est correctement assemblé et photochimiquement compétent chez le double mutant. Le rendement quantique réel de la photochimie de PSII (C) dans des feuilles exposées à la lumière est évalué en présence de densités croissantes de flux de photons. Les résultats sont représentés dans la Figure 6b. Légende de la Figure 6b En abscisse : densité de flux de photons (mol/m/sec) En ordonnée : rendement quantique = type sauvage (WT) M = simple mutant cpSRP43- (chaos) = simple mutant cpSRP54- (ffc) . = double mutant cpSRP43-/cpSRP54- (chaos/ffc) Les résultats montrent que le rendement quantique de la photochimie de PSII du doublé mutant est très différent des autres génotypes (WT, simples mutants), indiquant un transport photosynthétique d'électrons dans les feuilles du double mutant rapidement saturé à mesure que la densité du flux de photons augmente, jusqu'à un rendement quantique de PSII presque nul à une densité d'environ 500 jj. mol/m/sec. Le transport d'électrons n'est pas inhibé dans le simple mutant chaos par rapport au WT (rendements quantiques similaires), alors que le simple mutant ffc présente un transport d'électrons intermédiaire entre celui du WT et celui du simple mutant chaos. L'ensemble de ces résultats indique chez le double mutant, un blocage du transport d'électrons à un site différent du système PSII, suggérant que ce transport est limité par le faible taux de complexes PSI. 3) Analyses biochimiques a) Analyse du taux de LHCPs et d'ELIPs L'analyse du contenu en LHCPs et en ELIPs est réalisée chez des plantes au stade rosette, en conditions normales (CC : densité de flux de photons de 300 pmol/m/sec) ou soumises à un stress lumineux (LL : densité de flux de photons de 5 mol/m/sec ; HL : densité de photons de 500- 1000 mol/m/sec, respectivement). LHCPs Les protéines membranaires sont extraites et analysées par Western blot comme décrit au paragraphe I-2). Les échantillons de protéines membranaires sont déposés sur le gel à 2 ou 3 concentrations différentes pour assurer une linéarité de l'immunodétection colorimétrique. Chaque expérience est répétée au moins 3 fois. Dans une première série d'expériences, le taux en LHCPs est évalué chez les plantes en conditions normales (CC). La dilution des sérums polyclonaux utilisés est indiquée entre parenthèses suivie des quantités de protéine membranaire chargées sur le gel : anti-Lhcal (1 : 3000) 5/3, 5/2, 5 Lg ; anti-Lhca2 (1 : 200) 5/3,5/2, 5 ig ; anti-Lhca3 (1 : 1000) 2,5/1, 5/0,75 Lg ; anti-Lhca4 (1 : 3000) 10/7/5 g ; anti-Lhcbl (1 : 5000) 1/0,5/0, 2 Lg ; anti-Lhcb2 (1 : 1000) 1, 5/1/0, 75 Lg ; anti-Lhcb3 (1 : 30) 3/2/1,5 mg ; anti-Lhcb4 (1 : 2500) 2, 5/1/0, 5 zu ; anti-Lhcb5 (1 : 100) 1, 5/1/0, 75 mg ; anti-Lhcb6 (1 : 750) 6/4/3 ptg. Les résultats sont représentés dans les figures 7a et 7b. Légende des Figures 7a et 7b pistes 1 à 3 = type sauvage (WT) pistes 4 à 6 = double mutant (chaos/ffc) (a) ligne Lhcal = détection par des anticorps anti-Lhcal ligne Lhca2 = détection par des anticorps anti-Lhca2 ligne Lhca3 = détection par des anticorps anti-Lhca3 ligne Lhca4 = détection par des anticorps anti-Lhca4 (b) ligne Lhcbl = détection par des anticorps anti-Lhcbl 1 Il ligne Lhcb2 = détection par des anticorps anti-Lhcb2 ligne Lhcb3 = détection par des anticorps anti-Lhcb3 ligne Lhcb4 = détection par des anticorps anti-Lhcb4 ligne Lhcb5 = détection par des anticorps anti-Lhcb5 ligne Lhcb ligne Lhcb6 = détection par des anticorps anti-Lhcb6 Les résultats montrent qu'en conditions normales tous les contenus en LHCPs testées sont diminués par la double mutation cpSRP43'/cpSRP54', à l'exception de la ,, rotéine Llcb4 donprotéine Lhcb4 dont. le contenu représente environ 130% de celui du WT. Les protéines Lhcal, Lhca3 et Lhcb3 ne sont plus détectées dans le double mutant chaos/ffc. Les protéines Lhca4, Lhcb2 et Lhcb5 sont détectées à l'état de trace, n'excédant pas 10% du contenu du WT. Les protéines Lhca2, Lhcbl et Lhcb6 sont détectées à un taux équivalent à 50% du contenu du WT. Dans une seconde série d'expériences, le contenu en protéines Lhcbl et Lhcb3 a été évalué chez les plantes en conditions normales (CC) et en condition de stress lumineux (LL). La dilution des sérums utilisés est indiquée (entre parenthèses) suivie des quantités de protéines membranaires chargées sur gel : anti-Lhcbl (1 : 5000) 1/0,2 F9 ; anti-Lhcb3 (1 : 30) 3/1,5 peg. Les résultats sont représentés dans la Figure 7c. Légende de la Figure 7c pistes 1 à 4 = type sauvage (WT) pistes 5 à 8 = double mutant (chaos/ffc) pistes 1, 2,5 et 6 = croissance en conditions de stress lumineux (LL) pistes 3,4, 7 et 8 = croissance en conditions normales (CC) ligne Lhcbl = détection par anticorps anti-Lhcbl ligne Lhcb3 = détection par anticorps anti-Lhcb3 Les résultats montrent que le WT présente une légère diminution du contenu en LHCPs lorsque l'intensité lumineuse décroît. En revanche, le double mutant présente des contenus en protéine Lhcb3 indétectables quelle que soit l'intensité lumineuse, et le contenu en protéine Lhcbl, bien que légèrement augmenté quand l'intensité lumineuse est faible, demeure toujours inférieur à celui du WT à la même intensité lumineuse. Ces résultats montrent que la diminution du contenu en LHCPs est due à l'absence des sous-unités cpSRP43 et 54 et non à un effet secondaire généré chez le double mutant par un stress lumineux. ELIPs La teneur en ELIPs a été évaluée chez les plantes en conditions normales (CC) et en condition de stress lumineux (HL). L'extraction et la quantification des protéines sont réalisées comme décrit par PÖTTER et KLOPPSTECH, Eur. J. Biochem., 214,779-786, 1993. La détection des ELIPs à deux concentrations (20 et 0, 5 Lg) est effectuée en utilisant un sérum de lapin antiELIP dilué au 1 : 2000 et un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin couplé à la phosphatase alcaline (Sigma, Munich, Allemagne). Les résultats sont représentés dans la Figure 8. Légende de la Figure 8 pistes 1 à 4 = type sauvage (WT) pistes 5 à 8 = double mutant (chaos/ffc) pistes 1, 2,5 et 6 = croissance en conditions normales (CC) pistes 3,4, 7 et 8 = croissance en conditions de stress lumineux (HL) Les résultats montrent que très peu d'ELIPs sont détectées chez le double mutant chaos/ffc par rapport au WT, et ce quelle que soit l'intensité lumineuse. L'ensemble de ces résultats indique que la double mutation cpSRP43-/cpSRP54- affecte de façon similaire le contenu en LHCPs et en ELIPs, et que la voie cpSRP est impliquée dans le transport des LHCPs et des ELIPs vers les membranes des thylakoides. b) Analyse du taux de protéines importées par les voies autres que cpSRP Outre la voie cpSRP, il existe 3 autres voies de transport des protéines du stroma vers les membranes des thylakoïdes ou le lumen : les voies ApH, Sec, et d'insertion spontanée. L'influence de la double mutation cpSRP43-/cpSRP54- est évaluée par la détection à l'aide d'anticorps spécifiques de protéines importées spécifiquement par chacune de ces voies : la protéine OE23 transportée par la voie ApH, les protéines psbS et psbW transportées - par la voie d'insertion spontanée et la protéine PC transportée par la voie Sec. L'influence de la double mutation est également évaluée vis à vis de la protéine d'enveloppe chloroplastique (E37) et un composant de la machinerie de transport chloroplastique (ClpC). La dilution des sérums polyclonaux utilisés est indiquée (entre parenthèse) suivie des quantités de protéine membranaire chargées sur le gel : anti-E37 (1 : 6000) 10/5/2 pIg, anti-ClpC (1 : 4000) 5/3,5/2 pug, anti-PC (1 : 5000) 10/5/2 u-g, anti-OE23 (1 : 10000) 3/1, 25/0, 5 pig, anti-psbS (1 : 4000) 10/5/2 g, anti-psbW (1 : 2000) 60/40/30 g. les résultats sont représentés dans les Figures 9a, 9b, 9c et 9d. Légende de la Figure 9a ligne E37 = détection par anticorps anti-E37 ligne Clpc = détection par anticorps anti-Clpc pistes 1 à 3 = type sauvage (WT) pistes 4 à 6 = double mutant cpSRP43-/cpSRP54- (chaos/ffc) Les résultats montrent un excès de 30% des protéines E37 et Clpc chez le double mutant chaos/ffc par rapport au WT. Légendes des Figures 9b, 9c et 9d pistes 1 à 3 = type sauvage (WT) pistes 4 à 6 = double mutant cpSRP43-/cpSRP54- (chaos/ffc) (a) ligne OE23 = détection par anticorps anti-OE23 (b) ligne psbS = détection par anticorps anti-psbS ligne psbW = détection par anticorps anti-psbW (c) ligne PC = détection par anticorps anti-PC Les résultats montrent, pour les 3 voies de transport ApH, Sec et d'insertion spontanée, des quantités plus élevées de protéines importées spécifiquement par chacune de ces voies chez le double mutant, en comparaison du WT. Ces résultats montrent que les voies de transport vers les thylakoïdes ou le lumen, autres que la voie cpSRP, ne sont pas affectées par la double mutation. III-CONCLUSION Les ELIPS ne sont pas présentes chez le double mutant. Elles sont également absentes chez le simple mutant cpSRP43. En revanche, elles sont présentes chez le simple mutant cpSRP54, et ce, à un niveau comparable au WT (niveau normal). D'après les résultats des précédentes analyses, la sous-unité cpSRP43 est impliquée dans le transport des ELIPs jusqu'aux membranes des thylakoides. De plus, l'étude des taux de LHCPs et d'ELIPs, par les analyses physiologiques et biochimiques montrent le rôle indépendant mais additif des sous-unités du complexe cpSRP. Ces résultats montrent que l'importation dans les membranes des thylakoïdes des ELIPs s'effectue de façon prédominante, voire exclusive, par la voie cpSRP Analyses biochimiques : Le taux de LHCPs baisse de moitié chez les simples mutants, et est pratiquement nul chez les doubles mutants. Le taux d'ELIPs est pratiquement nul chez le double mutant, ainsi que chez le simple mutant cpSRP43-. Les protéines acheminées par les 3 autres voies (insertion spontanée, ApH, et Sec) sont présentes à des taux comparables au WT chez le double et les simples mutants. Analyses microscopiques : Le nombre et la forme des chloroplastes sont les mêmes chez les mutants et le WT. La structure des thylakoides est affectée uniquement chez le double mutant. On n'observe pas de différence notable entre le simple mutant cpSRP43-et le WT. La photosynthèse chez le simple mutant cpSRP 43n'est pas inhibée, contrairement à celle du double mutant cpSRP43-/cpSRP54-. Une très faible quantité d'ELIPs est trouvée chez le double mutant, indiquant que la voie cpSRP est impliquée dans le transport de ces protéines vers les membranes des thylakoides. Le simple mutant chaos affecté pour les LHCPs intègre également moins d'ELIPs. Ainsi, la double mutation affecte les LHCPs et les ELIPs. EXEMPLE 2 : LE ROLE DES ELIPs DANS LA RESISTANCE AU STRESS PHOTO-OXYDANT I-Choix d'un modèle d'étude : le mutant cpSRP43- 1) Le mutant chaos (cpSRP4 3-) Le simple mutant chaos a été identifié au sein d'une population constituée de 217 lignées indépendantes dl Arabidopsis thaliana dl écotype Landsberg erecta contenant un élément dérivé de l'élément transposable de la dissociation du mais (Ds). L'auto-pollinisation d'une plante de la lignée 348/74/A conduit à une descendance présentant un phénotype de mutant chlorotique récessif (KLIMYUK et al., Pol. Gen. Genet., 249,357-365, 1995). Le mutant a été nommé chaos. Une pâle coloration est observée tout au long du cycle végétatif de la plante et affecte uniformément tous les tissus aériens. 2) Analyse du contenu en ELIPs en conditions de stress photooxydant Des plantes âgées de 4 à 5 semaines, portant la simple mutation cpSRP43- (mutant chaos) sont soumises à un stress lumineux (1000 mol/m/sec) associé à un stress froid (6-7 C) pendant 4 jours, avec une photopériode de 8 heures/jour. Les protéines membranaires sont extraites et 10 g sont analysés par Western blot tel que décrit au paragraphe I-2) de l'Exemple 1. Les résultats sont représentés dans la Figure 10. Légende de la Figure 10 piste M = marqueur de poids moléculaire (kDa) piste 1 = protéines membranaires du WT piste 2 = protéines membranaires du mutant chaos Les résultats montrent qu'au cours du stress, le contrôle sauvage accumule les ELIPs contrairement au mutant chaos qui est presque totalement dépourvu d'ELIPs. Par contre, les ELIPs sont toujours présentes chez les mutants cpSRP54- (résultat non représenté). 3) Observations des lignées cpSRP43- (mutant chaos) et cpSRP54- (mutant ffc) en conditions de stress photo-oxydant Les analyses des lignées sont réalisées chez des plantes au stade rosette, en conditions normales (50 u. mol/m''/sec à 23 C) ou soumises à un stress lumineux (1000 (. Lmol/m/sec) associé à un stress froid à 6-7 C. a) Analyse phénotypique des mutants chaos et ffc En conditions normales, les mutants chaos et ffc présentent une couleur vert pâle en comparaison du WT. En conditions de stress, on remarque l'apparition de pigments anthocyanes chez le WT et le mutant ffc. En revanche, on remarque chez le mutant chaos l'apparition de nécroses et de taches blanches, indiquant une sensibilité au stress oxydant. b) Analyse biochimique des mutants chaos (cpSRP43-) et ffc (cpSRP54-) Les résultats phénotypiques sont confirmés par des expériences de mesure de la thermoluminescence de la chlorophylle à l'aide d'un tube photomultiplicateur d'Hamamatsu (R36) comme décrit par HAVAUX, Israel J. Chem., 38,246-256, 1998. Les échantillons de feuilles adaptés à l'obscurité pendant 15 minutes sont chauffés de 25 à 170 C, à un rythme de 7 C/minute. Les résultats sont représentés dans la Figure 11. Légende de la Figure 11 En abscisse : température (C) En ordonnée : thermoluminescence (au = unités arbitraires) W = type sauvage chaos = simple mutant cpSRP43- (2 mutants alléliques) ffc = simple mutant cpSRP54- Les résultats montrent que la thermoluminescence du simple mutant ffc est similaire à celle du WT. En revanche, la thermoluminescence de 2 simples mutants alléliques chaos est considérablement augmentée par rapport au WT. Les résultats indiquent que le mutant ffc est résistant au stress photo-oxydant au même titre que le WT. En revanche, le mutant chaos est sensible au stress-photooxydant. 4) Contrôle de la nature du stress Les mêmes expériences ont été réalisées en absence d'oxygène. Les résultats montrent une disparition des symptômes décrits précédemment au paragraphe 3) de l'Exemple 2. Ce contrôle confirme que c'est bien un stress oxydant qui est la cause de tels symptômes. Ces résultats suggèrent donc une corrélation entre la sensibilité au stress oxydant et l'absence d'ELIPs. II-Surexpression des ELIPs dans le mutant cpSRP43- Pour démontrer la relation entre la présence d'ELIPs et la résistance au stress photo-oxydant la complémentation spécifique en ELIPs de la lignée dépourvue de sous-unité cpSRP 43 (mutant chaos) a été effectuée. Cette expérience a été menée à bien grâce à la surproduction d'ELIPs chez le mutant chaos (cpSRP 43-). 1) Vecteurs et préparation des constructions utilisées A partir de deux clones gnomiques d'Arabidopsis thaliana (numéros d'accession GenBank AB022223 et Z97336), les séquences codant pour deux ELIPs, ELIP1 et ELIP2, respectivement, sont amplifiées par RT PCR en utilisant les amorces suivantes : Amorces pour ELIP1 en 3'CGGGATCCTTTAGCTTTAGACTAGAGTCCC en 5'ATAAGAATGCGGCCGCCATGCAGTCAGTTTTCGCTGCT Amorces pour ELIP2 en 3'CGGGATCCATTCATGGGCAAATCGTATTAA en 5'ATAAGAATGCGGCCGCAATGGCAACAGCATCGTTCAAC Les séquences soulignées conduisent à l'insertion du site de restriction BamHI (G/GATCC) en 3'et du site de restriction NotI (GC/GGCCGC) en 5'des fragments de PCR. Les principales étapes du clonage sont schématisées dans la Figure 12. Chacun des fragments de PCR est intégré dans le vecteur pRT-Q/NotI/Asd, qui dérive du vecteur pRT 100 comme décrit par UBERLACKER et WERR (Molecular Breeding, 2, 293- 295,1996), en aval du promoteur 35S : P35S-ELIP1 (El) et P35S-ELIP2 (E2). Une fois que la construction chimérique est créée dans pRT-Q/NotI/Asd, elle est associée à un marqueur de sélection (gène de résistance à l'hygromycine). Les fragments El et E2 flanqués par des sites de restriction AscI sont liés au site unique SmaI, préalablement converti en site AscI, du vecteur pGPTV, et permettent ainsi le transfert de la totalité de la cassette d'expression dans le vecteur binaire (pGPTV-E1 et pGPTV-E2). 2) Transformation d'Arabidopsis La transformation d'Arabidopsis thaliana déficiente en cpSRP43 (mutant chaos) par la construction pGPTV-El ou pGPTV-E2 est réalisée via Agrobacterium tumefaciens, par infiltration sous vide (CLOUGH et BENT, The Plant Journal, 16,735-743, 1998). La plupart des descendants (transformants chaos) sont génétiquement uniformes (non chimériques) et la variation clonale associée à la culture de tissus et leur régénération est minimisée. La descendance transformée est hémizygote pour le transgène à un locus donné. 3) Analyse biochimique du contenu en ELIPs de transformants chaos Le niveau d'expression des ELIPs en absence de stress dans des transformants chaos comprenant la construction 35S-ELIP2 a été estimé par Western blot. Les résultats sont représentés dans la Figure 13. Légende de la Figure 13 piste M = marqueur de poids moléculaire (kDa) piste 1 = mutant chaos pistes 2 et 3 = transformants chaos E2-3 et E2-4, respectivement ; la bande correspondant aux ELIPs est indiquée par une flèche. Les résultats montrent que les 2 transformants sont capables d'accumuler les ELIPs contrairement au mutant chaos. Ils indiquent également que le transformant E2-4 (piste 3) accumule plus d'ELIPs que le transformant E2-3 (piste 2). Bien que la voie principale ait besoin de protéines chaos, une surexpression avec un promoteur fort conduit à une accumulation d'ELIPs. 4) Observations des transformants chaos a) Analyse phénotypique Des plants âgés de 4 à 5 semaines du mutant chaos et des deux transformants chaos E2-3 et E2-4, sont soumis à un stress lumineux (1000 mol/m/sec) associé à un stress froid (6-7 C) pendant 4 jours, avec une photopériode de 8 heures/jour. En conditions de stress froid/lumière, on peut remarquer une gamme de résistance corrélée au niveau d'expression des ELIPs. Cette gamme se caractérise par des nécroses et des taches blanches chez les plantes sensibles (mutants chaos), qui diminuent chez les plantes transgéniques ayant acquis une résistance intermédiaire (transformant E2-3) jusqu'à disparaître chez le transformant E2-4 ce qui témoigne de la restauration de la résistance au stress photo-oxydant. Ces résultats indiquent que les transformants chaos comprenant la construction 35S-ELIP2 sont capables de développer une résistance au stress froid/lumière, et que cette résistance est fonction du niveau d'expression du transgène. b) Analyse biochimique L'analyse de la thermoluminescence de la chlorophylle chez des transformants chaos comprenant la construction 35S-ELIP2 est réalisée comme décrit au paragraphe I-3) b) de l'Exemple 2. Les résultats sont représentés dans la Figure 14. Légende de la Figure 14 En abscisse température (OC) En ordonnée : thermoluminescence (au = unités arbitraires) wt = type sauvage cao = mutant chaos El-11, E2-1, El-4, E2-3, E2-4 = transformants à différents niveaux d'expression d'ELIPs (El-ll Les résultats montrent que la thermoluminescence de la chlorophylle est maximale ( > 2000) pour le mutant chaos sensible au stress photo-oxydant et minimale ( Seul le transformant E2-4 présente une thermoluminescence égale à celle du WT, indiquant une réapparition d'une résistance au stress photo-oxydant du type WT. Ces résultats confirment que l'expression des ELIP confère une résistance au stress photo-oxydant. 5) Modèle proposé Ces résultats sont en accord avec l'une des hypothèses de fonction des ELIPs qui piégeraient les chlorophylles a libres, empêchant ainsi la production d'espèces actives d'oxygène, et procurant de ce fait une protection contre la photo-oxydation. Ce modèle est représenté dans la Figure 15. 6) Activité des photosystèmes L'activité du photosystème II (PSII) est évaluée par la mesure de la fluorescence de la chlorophylle (Fv/Fm) comme décrit au paragraphe II-2) c) de l'Exemple 1. Les résultats sont représentés dans la Figure 16. Légende de la Figure 16 En abscisse : type sauvage (wt), mutant chaos (chaos), transformants chaos (E1-11, E2-1, E2-3, El-4 et E2-4) En ordonnée : Rendement quantique maximum de la photochimie du PSII mesuré par le paramètre de fluorescence (Fv/Fm) Les résultats montrent l'efficacité photochimique du PSII pour le WT. Les transformants E1-11 et E2-1 ont une activité photochimique du PSII similaire à celle du-mutant chaos (environ 0,3) ; les transformants El-4 et E2-3 ont une activité photochimique du PSII intermédiaire (environ 0, 5) ; seul le transformant E2-4 possède une activité photochimique du PSII comparable à celle du WT (environ 0,6). Ces résultats indiquent que la présence d'ELIPs préserve les photosystèmes. REVENDICATIONS 1) Utilisation d'au moins une protéine de la famille ELIP, ou d'un polynucléotide codant pour ladite protéine pour l'obtention de plantes présentant une résistance accrue au stress photo-oxydant. 2) Procédé pour accroître la résistance d'une plante au stress photo-oxydant, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de ladite plante par moins un polynucléotide codant pour une protéine de la famille ELIP, et l'expression de ladite protéine dans ladite plante. 3) Plante transgénique susceptible d'être obtenue par un procédé selon la revendication 2. 4) Plante transgénique selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une céréale. 5) Produit obtenu à partir d'une plante transgénique selon une quelconque des revendications 3 ou 4, choisi parmi les organes ou tissus végétaux, les cellules et les semences. 6) Utilisation d'au moins une protéine de la famille ELIP, ou d'un anticorps dirigé contre ladite protéine, ou d'un polynucléotide représentant tout ou partie du gène de ladite protéine, pour l'évaluation de la résistance d'une plante au stress photo-oxydant. 7) Procédé d'évaluation de la résistance d'une plante à un stress photo-oxydant, caractérisé en ce que l'on soumet ladite plante à un stress photo-oxydant modéré, et en ce que l'on détermine le niveau d'expression par ladite plante d'au moins une protéine de la famille ELIP. 8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le niveau d'expression de ladite protéine de la famille ELIP est déterminé par quantification des transcrits du gène codant pour ladite protéine. 9) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que'le niveau d'expression de ladite protéine de la famille ELIP est déterminé par dosage immunologique de ladite protéine. 10) Utilisation d'au moins une protéine de la famille ELIP, ou d'un anticorps dirigé contre ladite protéine, ou d'un polynucléotide représentant tout ou partie du gène de ladite protéine, pour la sélection de plantes résistantes au stress photo-oxydant.