Brevet FR2844511A1 — publié le 20040319

Composés peptidiques destinés à la prévention et au traitement d'affections chez les mammifères. Composés peptidiques destinés à la prévention et au traitement d'affections chez 5 les mammifères et en particulier chez l'homme, les canidés, les félidés et les équidés dont l'immunité protectrice dépend de la stimulation de lymphocytes T de type Thl et notamment d'un état d'hypersensibilité de type retardée. Composés peptidiques destinés également au diagnostic de l'immunité à 10 médiation cellulaire dépendant de lymphocytes T de type Thl utilisant diverses méthodes " in vivo " et " in vitro ". Au cours de la réponse immunitaire, le lymphocyte T constitue une source importante de cytokines. Leur production est induite après stimulation de façon 15 spécifique en présence d'antigènes ou non spécifique en présence de mitogènes (concanaviline A, phytohémagglutinine). S'il est clairement établi que les lymphocytes T, et parmi eux surtout les lymphocytes CD4+, représentent la source principale de cytokines, les souspopulations T impliquées dans ce phénomène sont diverses et semblent varier 20 en fonction du stimulus. On peut diviser de manière très schématique les réponses immunitaires en deux grandes catégories qualitativement distinctes, les réponses humorales qui mettent en jeu la production d'anticorps par les lymphocytes B et les réponses 25 cellulaires (réaction d'hypersensibilité retardée, réactions cytotoxiques) pour lesquelles les cellules effectrices sont des lymphocytes T. Il apparaît que dans la majorité des modèles expérimentaux et des situations cliniques étudiées, les cytokines d'origine lymphocytaire sont essentiellement produites par les cellules T auxilaires CD4+ (ou helper) dont le rôle est de moduler ou de réguler 30 l'immunité humorale et cellulaire et qui reconnaissent l'antigène en association avec les molécules de classe Il du complexe majeur d'histocompatibilité. Un concept majeur a émergé en 1985 lorsque T. Mosmann et R.Coffman ont proposé que les cellules lymphocytaires T CD4+ exprimant des fonctions auxiliaires étaient en fait hétérogènes. Ainsi, grâce à l'étude de clones -2 lymphocytaires T CD4+ de souris, cultivés à long terme, ces auteurs ont décrit l'existence de deux sous-populations majeures que l'on peut distinguer grâce à leur profil de sécrétion de cytokines à savoir les cellules Th1 (pour T helper de type 1) et les cellules Th2 (pour T helper de type 2). Prenons comme exemple la leishmaniose, qui est une infection parasitaire endémique voire épidémique de régions tropicales et subtropicales du monde. Les leishmania, protozoaires flagellés de la famille des trypanosomatidae et du genre Leishmania, sont les agents pathogènes responsables de ces maladies. Les nombreuses études portant sur les réponses immunitaires au cours des leishmanioses murines expérimentales ont conduit à la démonstration du rôle prépondérant de l'immunité à médiation cellulaire et de l'existence d'une dualité de la réponse immunologique. Il existe fondamentalement deux types de 15 réponses à l'encontre des leishmanies: l'une qualifiée de " sensibilité ", l'autre de " résistance ". C'est par le biais des lymphokines qu'elles sécrètent que les différentes sous-populations de lymphocytes T (CD4+) limitent ou exacerbent l'infection. Il a ainsi été démontré que la sous-population de lymphocytes T auxiliaires de type Thl (producteur d'interféron gamma et d'interleukine 2) était 20 capable d'éliminer les formes amastigotes intracellulaires par le biais de l'activation des macrophages (Reiner S.L et aI., Annu Rev Immunol, 1995, 13, 151-177. Review). Inversement la sous population de lymphocytes T auxiliaires de type Th2 (producteur d'interleukine 4) est responsable de l'exacerbation de la maladie. Chez l'homme, certains faits sont de nature comparable. Chez le chien (hôte naturel " réservoir " réceptif au cycle évolutif de L.infantum), la dualité de la réponse immunologique est vraisemblable. Seule une étude menée par Pinelli et aI. (Infect. Immun., 62:229, 1994) sur des animaux expérimentalement et 30 naturellement infectés par L.infantum, a permis de montrer que l'asymptomatisme du chien (état clinique fréquemment rencontré) s'accompagnait de l'absence d'une réponse humorale et du développement d'une immunité à médiation cellulaire de type Thl avec une réaction -3 d'hypersensibilité de type retardée positive et des taux élevés d'interleukine 2 et de TNF-cL circulant dans les liquides biologiques. Un bon candidat vaccinal se doit donc de correspondre à un ou plusieurs 5 antigènes parasitaires fortement immunogène(s) capables soit de bloquer la différenciation des lymphocytes Th2 (Gurunathan S et al., J.Exp Med, 1997 Oct 6, 186, 1137-1147) (mode d'intervention comparable aux traitements de " désensibilisation ", couramment pratiqués dans les cas d'allergie), soit de favoriser l'émergence de lymphocytes Thl assurant la mise en place d'une 10 immunité protectrice. Envisager de vacciner contre les leishmanies reste encore aujourd'hui problématique. Les tentatives sont nombreuses mais les résultats sont faibles et/ou contradictoires. Nous pouvons citer l'utilisation de parasites vivants, de 15 parasites irradiés et de parasites tués entiers (Moreau Y et coll, 1994, Médecine et Armées, 22, 1, 89-93) qui ont donné des niveaux de protection variable chez les souris et chez l'homme. Dans les années 80, des extraits purifiés d'antigènes parasitaires ont été utilisés 20 chez le chien en induisant une exacerbation de la maladie: fraction LIF2 et vaccin anti-idiotypique de l'équipe du Dr Montjour. (CHAUVY, J " Essais d'immunothérapie sur une population canine en zone d'endémie leishmanienne " thèse n036.1993-OGUNKOLADE B.W et coll. Vet Parasitol.), GP63 ou lipophosphoglucane (MOREAU Y et col, Médecine et Armées, 1994, 22,1, 8925 93) n'ont pas donné de résultat satisfaisant. Actuellement, plusieurs molécules sont à l'essai et sont en attente de résultat final. Citons la protéine de heat shock HSP83 de Leishmania major qui stimule la voie Thl et la protéine DP72 (JAFFE.C et al, J of Immunol, 1990, 144, 699-706). Cependant, aucun des protocoles actuels d'immunisation ne permet d'obtenir un niveau suffisant de 30 protection ou n'est en tout cas reproductible. A ce jour, aucun travail n'a été effectué avec des peptides de synthèse. -4 La présente invention consiste en un complexe immunomodulateur utilisant un ou plusieurs peptides avec un adjuvant induisant soit une immunostimulation du système lymphocytaire T de type Thl de façon reproductible, soit une immunomodulation d'une réponse de type Th2 vers celle de type Thl. Il est important de souligner deux faits essentiels. Premièrement, les cellules Thl et Th2 exercent, par le biais de certaines des cytokines qu'elles produisent, un effet de contrerégulation réciproque, ce qui explique pourquoi dans la majorité des cas on observe une alternance de réponses à médiation cellulaire et humorale. Ainsi, les réponses immunitaires qui prévilegient une réaction de 10 lymphocytes T de type Thl, c'est à dire avec des organismes induisant une immunité dépendant des lymphocytes T, sont fréquemment associées à une faible réponse humorale; c'est le cas par exemple des infections mycobactériennes. Inversement, une réponse qui privilégie la production d'anticorps sera le plus 15 souvent associée soit à la participation des lymphocytes T de type Th2 soit à un déficit relatif de l'immunité cellulaire spécifique; c'est le cas de la leishmaniose viscérale. Deuxième donnée fondamentale, les lymphocytes pleinement différenciés en cellules de type Thl et Th2 ne préexistent pas chez l'hôte naf non sensibilisé. Au cours d'une réponse immunitaire physiologique suite à 20 laquelle, le plus souvent, les antigènes sont rapidement éliminés, les cellules CD4+ activées, plutôt que de s'exprimer soit par un phénotype de type Thl soit par un phénotype de type Th2 sécrètent habituellement des cytokines spécifiques de type Thl et Th2. C'est ce qui explique que, chez l'homme, la démonstration de l'existence d'une dichotomie Thl/Th2 a nécessité l'étude d'un 25 réseau cytokinique à partir de lymphocytes non pas de sujets normaux normalement immunisés mais de patients présentant des maladies chroniques telles des infections parasitaires, des allergies ou des maladies autoimmunes. La polarisation des réponses immunitaires vers un phénotype Th1 ou Th2 a été 30 associée à de nombreuses situations pathologiques. Pour les infections à leishmania, Trypanozoma, Candida, et autres organismes intracellulaires comme Mycobacterium et Listeria une réponse Th1 corrèle avec la résistance au pathogène.D'autre part, certaines affections comme les dermites -5 atopiques canines, les allergies et l'asthme conduisent à l'exacerbation d'une réponse de type Th2. Le recours à des immunostimulants permettant le passage d'une réponse Th2 à une réponse Thl, donc le passage d'un état d'hypersensibilité immédiate à un état d'hypersensibilité de type retardée devrait induire une guérison. Prenons comme exemple l'asthme pour laquelle la communauté médicale s'inquiète devant le nombre croissant d'individus qui en souffre: environ 200 millions de personnes dans le monde et selon l'OMS 180000 en sont mortes en 10 1997. En France 2000 personnes meurent d'asthme chaque année. L'asthme est un état inflammatoire chronique des voies respiratoires o interviennent de nombreuses cellules du système immunitaire. La maladie devient chronique à cause de l'accumulation quasi permanente de 15 médiateurs de l'inflammation, ainsi que du recrutement quasi incessant de polynucléaires éosinophiles destructeurs: ces cellules s'accumulent dans la muqueuse bronchique et libèrent des protéines basiques qui détruisent l'épithélium bronchique. Les dégâts que causent ces protéines basiques entraînent une hyperactivité des bronches: les terminaisons nerveuses qui 20 innervent les bronches sont mises à nu et ne sont plus protégées des agressions extérieures. Rappelons que les lymphocytes T activés libèrent notamment de l'interleukine 4, qui déclenche la production d'immunoglobulines E. Cette " orientation 25 allergique " encore nommée voie Th2, s'oppose aux réactions anti- infectieuses de la voie Thl: dans le cadre de la lutte contre une bactérie (le bacille de la tuberculose, par exemple), les lymphocytes T activés libèrent de l'interleukine 2 et de l'interféron gamma. L'interféron gamma active les cellules présentatrices d'antigène qui, à leur tour, produisent de l'interleukine 12. Ainsi, I'interleukine 4 30 oriente les réactions immunitaires vers les réactions allergiques, tandis que l'interféron gamma semble promouvoir les réactions de type défense. Or cette orientation du système immunitaire serait imprimée très tôt, chez le tout jeune enfant. Chez un nourrisson exposé à un agent pathogène, le système immunitaire s'oriente vers la voie défensive: ce sont les lymphocytes T producteurs d'interleukine 2 et d'interféron gamma qui sont activés les premiers et qui le resteront. Ces enfants auront moins de risques allergiques. En revanche, des nourrissons élevés en milieu aseptisé ont des risques d'être 5 confrontés à un environnement riche en allergènes et pauvres en microorganismes pathogènes. Si tel est le cas, le système immunitaire encore immature va activer les lymphocytes T qui sécrètent l'interleukine 4, conférant au système immunitaire 10 une orientation allergique, laquelle favorise l'asthme. Cette hypothèse, issue des travaux de Tim Mosman et Robert Coffann, de l'institut de biologie moléculaire et cellulaire DNAX, à Palo Alto, expliquerait l'augmentation de la prévalence de la maladie asthmatique dans les pays industrialisés. Une réorientation des réactions immunitaires de personnes sensibles en limitant la voie allergique Th2 de la réponse immunitaire vers une activation de la voie Thl serait une possibilité de traitement de l'asthme. Nous pouvons étendre ce phénomène aux autres formes d'hypersensibilité 20 immédiate. L'hypersensibilité immédiate est la forme d'allergie la plus fréquente et résulte de la synthèse d'immunoglobulines E (IgE), des anticorps spécifiques des allergènes de l'environnement. Ces immunoglobulines E se fixent sur des cellules dont les mastocytes sont les éléments clés. Le contact de l'allergène et 25 des immunoglobulines E active les mastocytes qui libèrent les médiateurs de l'inflammation: c'est la dégranulation des mastocytes. On regroupe sous le nom d'anaphylaxie et de maladies atopiques toutes les manifestations cliniques liées aux phénomènes d'hypersensibilité immédiate, qui résultent de la production d'immunoglobulines E, les grands coupables de l'allergie. Toutefois, 30 l'anaphylaxie correspond à un mécanisme physiopathologique indépendant de tout facteur héréditaire (c'est par exemple, le choc anaphylactique dus aux venins d'hyménoptères), tandis que 'atopie traduit une aptitude génétique particulière à produire en excès des immunoglobulines E dirigées contre diverses substances naturelles de l'environnement atmosphérique (les pollens, les -7 moisissures, les polluants), domestique (les acariens, les blattes, les mammifères) ou professionnel, et aussi contre les aliments; il en résulte des allergies respiratoires (asthme, rhinites), cutanées (urticaires, eczéma atopique), ophtalmiques et digestives. Dans ces pathologies, deux points doivent être cités 1- les évènements en cascade déclenchés par la fixation du complexe allergène - IgE sur différentes populations cellulaires et notamment sur les mastocytes 2- le rôle des cytokines qui, par l'intermédiaire de la synthèse des IgE, 10 participent à la phase de sensibilisation, d'une part, et à la pérennisation de la réaction allergique d'autre part. Aujourd'hui, les traitements qui endiguent les syndromes d'origine allergique font partie de l'arsenal anti-inflammatoire (antihistaminiques et corticodes). La place 15 prépondérante prise par les cytokines dans les mécanismes fondamentaux de l'hypersensibilité immédiate ouvre des perspectives pour de nouvelles thérapies ciblées: on espère notamment faire basculer l'équilibre Thl/Th2 en faveur de la voie Th1 et moduler la signalisation cellulaire induite par les cytokines lorsqu'elles se fixent sur leurs récepteurs situés sur les lymphocytes, mais aussi 20 sur les mastocytes et sur les éosinophiles. La présente invention est relative aux dérivés spécifiques de 2 peptides du parasite Leishmania, ainsi qu'à l'utilisation des dits fragments comme réactifs de diagnostic in vitro et in vivo, et comme réactifs induisant une stimulation des 25 lymphocytes T de type Thl assurant une inhibition du développement des lymphocytes de type Th2 notamment pour la prévention et le traitement d'affections liées à un état d'hypersensibilité immédiate donc un état immunitaire de type Th2. Les deux peptides dénommés A16E et A16G présentent les séquences en acides aminés suivantes: -8 A16E: (16 acides aminés): A-A-R-C-A-R-C-R-E-G-Y-S-L-T-D-E A16G: (16 acides aminés): A-A-S-S-T-P-S-P-G-S-G-C-E-V-D-G Dans le peptide A16E, C peut être indifféremment remplacé par S, et L par I. Dans le peptide A16G, C peut être indifféremment remplacé par S, et S par C. Le composé peptidique selon l'invention est constitué de dérivés possibles des peptides A16E et A16G, ces dérivés comportant au moins cinq acides aminés contigus pris dans les séquences A16E, séquences identifiées en annexe en SEQ ID NO 1 à 44, ou A16G, séquences identifiées en annexe en SEQ ID NO 45 à 88, et de préférence au moins 8 acides aminés contigus, par exemple: 15 A-A-R-C-A-R-C-R ou A-A-S-S-T-P-S-P Les peptides obtenus par synthèse et leurs dérivés sont rendus immunogéniques par liaisons à des porteurs (grosses molécules type KLH), et sont administrés aux mammifères en présence d'un adjuvant, de préférence le muramyl dipeptide (MDP). De façon préférentielle, le rapport protéine/adjuvant est compris entre 1/0,1 et 1/6. Dans le cas d'une infection par des leishmanies, les études effectuées chez le 30 chien ont permis de déterminer la dose vaccinale optimale à 100pg de muramyl dipeptide pour 50 gag de protéines injectées. On observe toutefois un début de réponse dès 30 pg de protéines injectées. Le mécanisme d'action spécifique du composé peptidique obtenu selon l'invention est vérifié à l'aide de méthodes classiques permettant le dosage des peptides, leur identification et à l'aide de méthodes plus spécifiques démontrant que le composé peptidique innovant agit soit par immunostimulation du système 5 lymphocytaire de type Thl, soit par immunomodulation d'un type Th2 vers un type Thl. Pour chaque mammifère étudié (chien par exemple), une analyse sérologique est effectuée avec les peptides A16E et/ou A1 6G. Un examen parasitologique est effectué à partir d'échantillon prélevé directement sur le candidat étudié, chien par exemple. Un frottis à partir de la ponction de moelle osseuse est effectué sur lame. Ce 15 frottis, une fois fixé au méthanol est coloré au May Gr mwald Giemsa et observé au microscope à immersion (x 1000). Des prélèvements de moelle osseuse sont mis en culture dans le milieu de culture biphasique NNN (Novy and Mac Neal, 1904, 4. Infec. Dis., 1:1-30) dont 20 du RPMI 1640 additionné de 20% de sérum de veau foetal décomplémenté constitue la phase liquide. Des repiquages à l'aveugle sont réalisés tous les quatre à six jours. Les cultures sont régulièrement observées en microscopie photonique (x 400) pendant 20 mn. Les parasitèmies sont quantifiées comme suit: +/-: formes allongées réfringentes immobiles +: 1 à 5 formes promastigotes mobiles/champs ++: > 5 formes promastigotes mobiles/champs culture à confluence Mise en évidence de l'implication d'une immunité à médiation cellulaire de type Thl: - 1 0 Des leishmanies de formes promastigotes sont cultivées dans des milieux de culture standards. Des parasites de fin de phase exponentielle (6-7 jours) sont récoltés. Le culot parasitaire est lavé trois fois par centrifugation (2500g, 15mn, C) en tampon PBS. Après avoir vérifié la viabilité des parasites à l'aide d'un colorant vital (le bleu de trypan), une suspension contenant 2 x 108 parasites par ml est inactivée en tampon PBS contenant 0,01% de merthiolate (Pinelli et al., 1994, Infect. Immun. 62: 229-235). Ceci constitue les leishmanines pour le test d'intradermoréaction (I DR). L'étude de la réponse immunitaire de type Thl ci-après est effectuée sur des chiens. Les chiens sont placés en décubitus latéral et une tonte délicate et non irritante 15 est effectuée sur zone thoracique d'environ 5 cm sur 10 cm en arrière du coude. Quatre cercles de 1 Omm de diamètre sont délimités à l'aide d'un feutre. On injecte au centre des cercles 0,1 ml de solution en intradermoinjection. Deux cercles reçoivent de la solution de leishmanines et les 2 autres cercles reçoivent 20 de la solution saline merthiolée en contrôle négatif. La lecture de l'intra-dermo réaction (IDR) s'effectue 48 heures plus tard au moyen d'une réglette allergologue. Le test est considéré positif si la moyenne de deux diamètres d'induration 25 observée est supérieure ou égale à 5 mm. L'observation d'un érythème sans induration sera considérée comme un test négatif (Pinelli et al., 1994, Infect. Immun., 62: 229-335; Marty et al., 1994, trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg., 88, 658-659). Les IDR peuvent être également réalisées avec une solution de peptides A16E 30 ou A16G ou de leurs dérivés et de MDP, par exemple dans des proportions de pg de peptides pour 20pg de MDP. La présente invention concerne donc également un produit de diagnostic in vivo mettant en évidence un état d'hypersensibilité retardée immunitaire de type Thl - il1 par l'utilisation de peptides A16E et/ou A16G et leurs dérivés en intra-dermo réaction chez le mammifère. On peut également procéder au dosage du monoxyde d'azote (NO) pour 5 connaître l'activité destructrice des monocytes des Leishmanies. La synthèse de NO par les monocytes est en effet un signe de destruction des leishmanies par les monocytes ayant été activés par les cytokines de type interféron gamma (I FNy). Le NO possède une haute réactivité chimique. En présence d'eau et d'oxygène, cette molécule est rapidement oxydée de façon stochiométrique et forme ainsi des nitrites (NO2-) selon la réaction: 4 NO + 02 + 2H20 -- 4 NO2- + 4 H+ Les nitrites s'accumulent dans les milieux et sont facilement détectables chimiquement par la méthode de Griess. A 50 pl de surnageant de cultures de monocytes à tester, on ajoute 60 pl de Griess B (N-(1-Naphtyl)ethyl-enediamine 0,3%). La réaction colorimétrique se développe à l'abri de la lumière pendant 2 minutes. Les densités optiques obtenues à 540 nm sont corrigées par la soustraction des DO obtenues sur les 20 puits contenant le milieu de culture seul. Les valeurs obtenues sont reportées sur une courbe étalon (DO = f(NO2-) réalisée à partir de concentrations connues de NO2-. Pour ce test, les monocytes et les lymphocytes sont isolés à partir de sang 25 veineux des chiens. Les monocytes sont mis en culture pendant 3 jours à raison de 105 cellules par puits dans les chambres de culture (Labtek) dans un milieu RPMI 1640 complet (contenant 25mM d'HEPES; 2 mM de L-glutamine, 100 U de pénicilline par mi), à 37 C dans une atmosphère humide contenant 5% de CO2. Après 3 jours de culture, les macrophages sont lavés en milieu RPMI 30 complet, additionnés de milieu frais. Les cellules sont mises en incubation soit seules, soit en présence de 5pg de peptides, soit en présence de lymphocytes autologues. - 12 Lorsqu'ils sont utilisés, les lymphocytes cultivés séparément sont lavés, comptés et additionnés aux macrophages dans la proportion de 2 lymphocytes par macrophage. On effectue également un test de prolifération lymphocytaire. Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) des chiens sont séparées sur gradient de Ficoll (densité 1,078) par centrifugation à 800g pendant 20 mn à température ambiante. Ces cellules sont mises en culture en plaque de 96 puits à la concentration de 2.105 cellules par puits en présence de 2pg par ml 10 de Concanavalin A (Sigma), de 5 pg par ml de ES P (excrétion - sécrétion promastigotes) ou 20 ml de surnageants de culture récoltés en phase stationnaire de la croissance des promastigotes (SP) par puits, et en absence de tout additif dans un volume de 200 ml de milieu RPMI 1640 contenant 5% de sérum de veau foetal décomplémenté, 2 mM de L-glutamine, 100 U de pénicilline 15 par ml, 100 mg de streptomycine par ml. Les concentrations optimales d'antigènes et de mitogènes ont été déterminées dans des expériences préalables. Les PBMC sont incubées pendant 72 heures dans une atmosphère humide à 370C en présence de 5% de C02 puis pendant 20 heures avec 0,5 pCi de 3H thymidine. Les cellules sont récoltées sur filtre et l'incorporation de la 20 radioactivité est déterminée par comptage en liquide scintillant (compteur y). Tous les tests sont réalisés en triplicata. Une méthode immunohistochimique plus rapide et plus sensible utilisant le BrdU (5-bromo-2'-désoxyuridine), un analogue structural de la thymidine est aussi 25 utilisée pour mesurer la prolifération cellulaire (BrdU, cell prolifération détection kit 111, Boehringer Mannheim, Allemagne). Dans nos expériences le BrdU est additionné pendant 18 heures après 72 heures d'incubation. Les cellules qui ont incorporé le BrdU dans leur ADN sont facilement détectables en présence d'un anticorps monoclonal dirigé contre le BrdU. 30 Les réponses prolifératives sont exprimées en indices de stimulation qui représentent le rapport de la moyenne de prolifération après stimulation sur la moyenne de prolifération en absence d'antigène. - 13 La prolifération lymphocytaire a aussi été estimée par des lectures visuelles en microscopie photonique (-: négatif; +/-: légère prolifération; +: petite prolifération en moins de 5 points par champs microscopique; ++: prolifération moyenne en plus de 5 points; +++: forte prolifération). Parallèlement à l'étude de l'activation spécifique des lymphocytes T de type Thl par intradermoréaction, dosage de NO (le NO est synthétisé par les monocytes activés par les cytokines des cellules T de type Thl) et prolifération lymphocytaire, un suivi sérologique par immunofluorescence classique utilisant 10 des lames coatées par des promastigotes (méthode de référence sérologique pour la leishmaniose canine) est effectué. Pour le déroulement des études, d'autres techniques particulières ont été utiles. Méthode d'épreuve infectieuse: L'épreuve infectieuse consiste à injecter en intraveineuse 106 promastigotes en phase métacyclique traités au complément de chien sain et de 5.106 macrophages péritonéaux de chien sain, infectés in vitro par des amastigotes. Les promastigotes et les macrophages infectés sont dilués dans du sérum 20 physiologique stéril pour un volume final de 1,5 ml. Ce mélange est effectué juste avant l'injection. Détection des immunoglobulines de type G2 (IgG2) de chiens, spécifiques des 25 peptides A16E et A16G et de leurs dérivés: Cette détection s'effectue par méthode ELISA selon la technique de microtitration de Kweider et al (J.lmmunol, 1987, 138, 299) en utilisant un conjugué anti IgG2. Pour cette méthode, les peptides sont biotinylés avant coating sur microplaques. Cette liaison à de grosses molécules de type biotine a notamment pour effet de 30 rendre les peptides A16E ou A16G ou leurs dérivés plus antigéniques. Les peptides peuvent également être reliés par de la glutaraldéhyde ou associés à des corps de polylysine (présentation de type OCTOPUS par exemple). - 14 Le caractère innovant du composé peptidique selon l'invention ne réside pas seulement dans l'induction d'une réponse cellulaire spécifique de type Thl mais également dans la production de faibles taux d'anticorps de type IgG2. Ces IgG2 sont détectables par diverses méthodes in vitro, par exemple: ELISA, DOT 5 BLOT, WESTERN BLOT, IMMUNOCHROMATOGRAPHIE, LATEX et toute autre méthode in vitro faisant intervenir un système de conjugué ou autres systèmes de visualisation de la réaction Ag - Ac. Il peut par exemple être utilisé un système ELISA sur un support plastic, et un système WESTERN BLOT sur membranes de nitrocellulose ou autres polymères faisant intervenir un conjugué 10 enzymatique. Des supports de latex peuvent également être utilisés. Les peptides A16E, A16G et leurs dérivés peuvent également être conjugués par exemple à des radio-isotopes, des molécules fluorescentes, des molécules luminescentes ou des particules de couleurs. En effet, certains travaux préliminaires chez l'homme (KAWANO.P et ai, Parasite Immunol, 1995, 17, 451-458) et chez le chien (NIETO C.G et ai, Vet Immunol and Immunopathology, 199, 67, 117-130) démontrent que les isotypes d'lgG seraient des marqueurs de la dichotomie immunitaire Thl/Th2. Plus précisément, un chien atteint de leishmaniose avec des signes cliniques probants présente un 20 taux élevé d'anticorps principalement d'isotype IgGl alors qu'un chien asymptomatique présente des anticorps spécifiques d'isotype IgG2. Les chiens ayant reçu notrecomposé peptidique présentent des taux faibles d'lgG2 spécifiques des peptides A16E et/ou A16G, ce qui est conforme à l'expansion préférentielle de lymphocytes T de type Thl. 25 La détection de la présence d'lgG2 spécifiques des peptides A1 6E et A16G et de leurs dérivés permet notamment: - de mettre en évidence une réponse humorale dépendant de lymphocytes Thl et donc de mettre en évidence un état immunitaire de type Thl 30 - de mettre en évidence un état d'hypersensibilité retardée, - de suivre la réponse immune chez les mammifères vaccinés ou traités, - de suivre l'efficacité d'un traitement chimiothérapeutique et/ou immunothérapeutique. - 15 - 2844511 Le composé peptidique comprenant des peptides A16E et/ou A16G et leurs dérivés et de l'adjuvant, selon l'invention peut être administré de diverses manières. Il est cependant administré de façon préférentielle par quatre voies: - soit par injection sous cutanée 5 - soit par injection intra dermique - soit par injection intra musculaire - soit par voie orale D'autres modes d'administration peuvent être employés comme la voie 10 parentérale ou intraveineuse. De façon générale, un vaccin se présente sous une forme injectable composée d'une fraction lyophilisée que l'on reprend par une fraction liquide ou diluant. Les doses utilisées pour la prévention et l'immunothérapie sont différentes, et sont 15 également différentes selon le mode d'injection: - par voie sous cutanées et intra musculaires injection d'une dose (50pg de peptides et 1OOpg d'adjuvant) chez les chiens quels que soient la race et le sexe pour un effet préventif injection de demi doses (25pg de protéines excrétées secrétées et 50pg d'adjuvant) pour l'immunothérapie des chiens leishmaniens. - par voie intra dermo: - injection de demi dose chez les chiens leishmaniens pour un effet préventif - injection de quart de dose chez les chiens leishmaniens pour un effet thérapeutique. Les méthodes d'injections sont reprises dans les exemples d'immunothérapie et de vaccination. RESULTATS EN IMMUNOTHERAPIE - 16 Selon les spécialistes comme PINELLI (PINELLI, E et ai, Infect Immun, 1994, 62.229-235) les chiens leishmaniens correspondant à l'activation du système lymphocytaire de type Th2 présentent une réponse en anticorps élevée. Cette production accrue en anticorps correspond à l'hyper protéinémie et induit l'apparition d'immun complexes entraînant une atteinte rénale (augmentation de la créatinine et de l'urée sanguines). Nous avons donc essayé de moduler vers un état Thl en administrant à des 10 chiens parfaitement leishmaniens par voie intra dermo des doses du composé peptidique. Le suivi de l'état immunitaire ainsi que l'observation clinique sont effectuées avant et après le traitement. Exemple 1: chienne MANON Une chienne de race Epagneul breton âgée de 4 ans, appartenant à Mr P présente de nombreuses lésions cutanées accompagnées d'un état de fatigue général et un aspect maigre, le tout évoquant une leishmaniose canine. Le vétérinaire, le Dr LM diagnostique une leishmaniose. Ce diagnostic est confirmé par une observation directe au microscope de leishmanies à partir d'un 20 calque cutané et une analyse sérologique qui donne un titre en immunofluorescence leishmaniose positif à 1/3200. L'analyse de l'état immunitaire avant toute injection permet d'affirmer que le chien est bien dans un état immunitaire de type Th2 avec un titre en anticorps élevé ainsi que des tests IDR et dosages de NO négatifs. Nous instaurons une 25 immunothérapie qui consiste à effectuer par voie intradermo 2 injections de pg de peptides (1/2 A16E, % A16G) chaque injection étant espacée de 3 semaines. Une semaine après la seconde injection la chienne MANON retrouve de l'appétit et une certaine vitalité. Le Dr LM commence à observer une légère amélioration 30 cutanée. Un mois après la dernière injection, MANON a retrouvé un aspect clinique normal avec notamment une augmentation de poids de 1 kg et une disparition à 80% de toutes lésions cutanées. L'analyse de l'état immunitaire permet d'affirmer une baisse de titre en anticorps anti leishmania qui descend à 1/400 en - 1 7 immunofluorescence. Parallèlement, l'IDR (IDR effectuée avec des leishmanines et également avec les peptides A16E et A16G), le dosage de NO et la prolifération lymphoblastique se sont positives. De plus, après traitement, la chienne MANON présente des IgG2 spécifiques des 2 peptides, IgG2 dosées par 5 méthode ELISA et Western Blot. Ces IgG2 spécifiques étaient absentes avant tout traitement. Une recherche de parasites par culture sur milieu NNN s'avère négative. 8 mois après le traitement la chienne MANON ne présente aucune modification. Les analyses biologiques permettent d'affirmer que MANON est toujours en état 10 immunitaire Thl. Exemple 2: Chien JUP Un chien mâle de race Rottweiler, JUP âgé de 5 ans appartenant à Mr D 15 présente les signes cliniques spécifiques de la leishmaniose. Selon le Dr GX, présence de nombreuses squames brillantes, dépilation péri oculaire droite, lésions ulcéreuses au niveau des 2 coudes antérieurs et un état de fatigue prononcé. Les analyses biologiques avec notamment une sérologie leishmaniose positive au 1/400 en immunofluorescence confortent le diagnostic clinique. Une immunothérapie consistant à effectuer par voie intradermo 3 injections de pg de composé vaccinal peptidique (peptide A16E) (1/2 dose), chaque injection étant espacée de 10 jours, est instaurée. L'analyse de l'état immunitaire avant toute injection démontre que le chien JUP développe un système immunitaire de type Th2 avec une parasitémie fortement positive à partir de la 25 moelle osseuse. Un mois après la dernière injection, les signes cliniques leishmaniens de JUP rétrocèdent avec notamment une cicatrisation des lésions ulcéreuses, une disparition importante des squames ainsi qu'une dépilation péri oculaire presque 30 inexistante. La sérologie présente toujours un titre en immunofluorescence égal au 1/400. Par contre l'analyse de la réponse cellulaire permet d'affirmer que JUP présente un état Thl actif avec une IDR (IDR effectuée avec des leishmanines et également avec le peptide A16E), un dosage de NO et une prolifération lymphoblastique positifs. - 18 Parallèlement, la parasitémie s'est négativée (culture de moelle osseuse en milieu NNN). Au niveau humoral, le chien JUP présente des IgG2 spécifiques du peptide A16E après le traitement, IgG2 dosées en ELISA et en Western Blot. La présente invention consiste donc bien en un composé peptidique thérapeutique qui induit le passage d'un état immunitaire de type Th2 avec production importante d'anticorps qui exacerbe les manifestations cliniques vers un état immunitaire de type Thl entraînant la guérison. RESULTATS EN VACCINATION Afin d'évaluer l'efficacité du composé peptidique vaccinal selon l'invention, le composé vaccinal est testé sur 5 chiens parfaitement sains. Ces 5 chiens 15 présentent une sérologie leishmaniose négative, une parasitémie négative ainsi que des tests de réponse cellulaire spécifique à Leishmania parfaitement négatifs. De plus, aucun des 5 chiens ne présente des IgG2 spécifiques d'un ou des 2 peptides A16E et/ou A16G. Ces 5 chiens vivent dans un endroit exempt de tout phlébotome. Nous définissons 3 groupes de chiens: 1- groupe témoins (placebo) - témoin négatif: chien LILI de race Pointer, sexe femelle, âge: 3 ans - Témoin adjuvant seul: chienne MIMI de race Epagneul Breton, sexe femelle. 25 Age: 6 ans 2- Groupe chiens vaccinés avec peptides seuls - chienne MAMA de race braque de Weymar, sexe femelle. Age: 2 ans et demi => peptide A16E chienne NUNU de race Pointer, sexe mâle. Age: 2 ans et demi => peptide 30 A16G 3- groupe chien vacciné avec peptides A16E et A16G - Chien LEON de race Epagneul Breton, sexe mâle. Age: 4 ans. Le schéma d'injection vaccinale est le suivant: - 19 - 2844511 JO 1iê'e injection 1 dose en sous cutanée J28 J84 -> 4 semaines + 2iè'ne injection - 8 semaines + épreuve infectieuse 1 dose en sous cutanée Un suivi clinique des 5 chiens est effectué toutes les deux semaines. Les analyses biologiques sont schématisées de la façon suivante: JOlère injection _J282 nde injection J84 J84 +2 mois épreuve + 56 infectieuse J14 Analyses biologiques J analyses biologiques analyses biologiques Les analyses biologiques consistent en: - analyses biochimiques: urée, créatines, transaminases - analyses hématologiques: numération, formule - sérologie leishmaniose: immunofluorescence quantitative anti leishmania, 20 dosage par ELISA des IgG2 spécifiques des peptides Al6E et/ou Al6G - tests de réponse cellulaire: IDR (Intra Dermo Réaction) effectuée avec des leishmanines et également avec les peptides A16E et Al6G, dosage du NO et prolifération lymphoblastique Il faut ajouter à ces analyses, la recherche des Leishmania par observation directe au microscope et culture sur milieu NNN à partir de moelle osseuse après l'épreuve infectieuse. RESULTATS: Suivi clinique: Aucune manifestation clinique importante n'est apparue pendant toute cette étude. Il faut noter un léger amaigrissement et l'apparition de quelques squames chez la chienne LILI, 4 mois après l'épreuve infectieuse. -20 Suivi biologique 1- Les paramètres biochimiques et hématologiques sont restés normaux tout au long de cette étude. 2- Sérologie leishmaniose et parasitémie: Avant toute injection, les 5 chiens présentent des sérologies et parasitémies négatives. Le tableau ciaprès montre les réponses sérologiques obtenues lors de nos expériences et le suivi de la parasitémie (analyses effectuées 2 mois et 12 mois après l'épreuve infectieuse). SEROLOGIE PARASITEMIE (sur ponction de moelle) Chiens IF ELISA Examen Culture sur quantitative IgG2 direct Milieu NNN Chiens LILI + + témoins MIMI + ++ Chiens MAMA (A16E) + (0.700) immunisés NUNU (A16G) - + (0.520) LEON (A1 6E+A16G) - + (0.780) Légende: IF: immunofluorescence (considérée positive si le titres est > 1/100) ELISA: Cutt off=0.300 en DO (densité optique) 15 Parasitémie: culture sur milieu NNN - = absence ++ = plus de 5 formes promastigotes mobiles/champs Seuls les chiens immunisés présentent des anticorps spécifiques d'isotype IgG2 20 (ELISA envers les peptides correspondants) ainsi que des parasitémies négatives. Il faut noter une légère apparition d'anticorps totaux (1/200 en IF) chez tous les chiens après l'épreuve infectieuse. Seuls les chiens témoins (LILI et MIMI) présentent des parasitémies positives 25 ainsi qu'une absence d'anticorps spécifiques IgG2 anti peptides. -21 - * Réponse à médiation cellulaire Avant toute injection, les 5 chiens présentent une réponse à médiation cellulaire envers Leishmania infantum parfaitement négative. Selon le tableau suivant, seuls les chiens immunisés présentent des tests de prolifération lymphoblastique, des activités leismanicides intramacrophagiques positives associées à la production de NO par les monocytes. Le tableau suivant montre les réponses obtenues de type cellulaire (analyses 10 effectuées 2 mois après l'épreuve infectieuse). IDR Dosage Test de prolifération CHIENS Du NO lymphoblastique Leishmanines A16E A16G (en pM) Chiens LILI + - - 0,3 - 1,1 (3) témoins MIMI - 0,2 - 1,2 (3,1) MAMA (A16E) + + limite 2,6 + 2,1 (3,1) Chiens NUNU (A16G) + Limite + 2,8 ++ 3,1 (3,6) immunisés LEON (A16E + + + 4,2 +++ 3,7 (3,8) A16G) Légende: * IDR: Le test Intra Dermo Réaction est considéré positif (+) si l'induration est > 5 mm 48h après l'intradermoinjection. * Dosage du NO: * Test de prolifération lymphoblastique: les résultats sont exprimés par lecture en microscopie photonique et en indices de stimulation (entre parenthèses, indice de stimulation + Concanavalin A). - 22 - 2844511 De par cette analyse, les composés peptidiques avec l'adjuvant induisent bien une immunité à médiation cellulaire de type Thl protecteur auquel il faut ajouter une induction d'anticorps d'isotype IgG2. Le mélange des deux peptides à concentration égale donne une réponse cellulaire plus marquée (taux de NO synthétisé par les monocytes activés élevé) - 23 REVENDICATIONS 1- Composition destinée à la prévention ou au traitement d'affections chez les 5 mammifères et en particulier chez l'homme, les canidés, les félidés et les équidés dont l'immunité protectrice dépend de la stimulation de lymphocytes de type Thl et notamment d'un état d'hypersensibilité retardée caractérisée en ce qu'elle contient: - des dérivés de la séquence de 16 acides aminés suivante (Al6E): A - A - R - C - A - R - C - R - E - G - Y - S - L - T - D - E. dans laquelle C peut être remplacé par S, et L par 1, ces dérivés peptidiques étant constitués d'au moins 8 acides aminés contigus pris dans ladite séquence A16E (SEQ ID NO 1 à 44) - et des dérivés de la séquence de 16 acides aminés suivante (Al6G) A - A - S - S - T - P - S - P - G - S - G - C - E - V - D - G. dans laquelle C peut être remplacé par S, et S par C, ces dérivés peptidiques étant constitués d'au moins 8 acides aminés contigus pris dans ladite séquence A16G (SEQ ID NO 45 à 88) - et un adjuvant qui induit de préférence une réponse à médiation cellulaire, 2- Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que les dérivés des séquences A16E et A16G sont associés de préférence à la même 25 concentration 3- Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que l'adjuvant est du muramyl dipeptide. 4- Composition selon la revendication 3, caractérisé en ce que le muramyl dipeptide est associé aux dérivés des séquences peptidiques Al6E et A16G, dans un rapport en poids peptide sur adjuvant de 1/0,1 à 1/6. -24 - Composition selon les revendications 3 ou 4, caractérisée en ce que le muramyl dipeptide est associé aux dérivés des séquences peptidiques A16E et A16G, dans un rapport de 50pg de protéines pour 1OOpg de muramyl dipeptide. 6- Utilisation de la composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour la fabrication d'un médicament, ou d'un vaccin, ou d'un réactif de diagnostic in vitro et in vivo, pour l'induction ou le diagnostic chez le mammifère du passage d'un état immunitaire de type Th2 vers un état 10 immunitaire de type Thl. 7- Utilisation de la composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour la fabrication d'un médicament, ou d'un vaccin, ou d'un réactif de diagnostic in vitro et in vivo, pour l'induction ou le diagnostic chez le 15 mammifère d'anticorps spécifiques et plus particulièrement d'isotype IgG2. 8- Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les dérivés des séquences peptidiques Al6E et Al 6G sont reliés à des grosses molécules de type KLH pour les rendre immunogènes. 9- Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou 8, conditionnée sous une forme telle qu'elle peut être administrée par différentes voies: sous cutanée, intradermique, intramusculaire, intraveineuse, parentale et orale. -Produit de diagnostic in vivo caractérisé en ce qu'il contient la composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 8, pour la détection d'une réaction d'hypersensibilité retardée par injection intradermique du dit produit chez les mammifères et en particulier chez l'homme, les canidés, les félidés 30 et les équidés. 11- Produit de diagnostic in vitro caractérisé en qu'il contient la composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 8, pour la détection d'une réponse humorale et particulièrement des IgG2, permettant notamment la -25 mise en évidence d'un état immunitaire de type Thl et d'un état d'hypersensibilité retardée, le suivi de la réponse immune chez les mammifères vaccinés ou traités, et le suivi de l'efficacité d'un traitement chimiothérapeutique et/ou immunothérapeutique. 12- Kit de diagnostic in vitro comportant le produit de diagnostic selon la revendication i1, caractérisé en ce que les dérivés des séquences peptidiques A16E ou A16G, sont reliés à des grosses molécules de type biotine ou polylysine pour les rendre plus antigéniques. 13- Kit de diagnostic in vitro comportant le produit de diagnostic selon la revendication i1, caractérisé en ce que les dérivés des séquences peptidiques AI 6E ou Ai 6G, sont reliés par de la glutaraldéhyde. 1 5 14- Kit de diagnostic in vitro comportant le produit de diagnostic selon la revendication 11, ou selon l'une des revendications 12 et 13, caractérisé en ce que les dérivés des séquences peptidiques A16E ou A16G, sont liés à un support solide. 15- Kit de diagnostic in vitro selon la revendication 14 caractérisé en ce que les dérivés des séquences peptidiques A16E ou A16G, sont liés à des membranes de nitrocellulose ou autres polymères, des supports de latex et divers matériels de plastic (polymère). 16- Kit de diagnostic in vitro selon la revendication 12, caractérisé en ce les dérivés des séquences peptidiques A16E ou A16G, sont conjugués à des radio- isotopes, des molécules fluorescentes, des molécules luminescentes, des enzymes et des particules de couleur.