Brevet FR2838442A1 — publié le 20031017

siRNAS INHIBITEURS DE L'EXPRESSION DE GENES RESPONSABLES DE L'INACTIVATION DE LA P53 ET LEUR UTILISATION DANS LE TRAITEMENT DES CANCERS. La présente invention concerne le domaine de l'investigation et du traitement génétiques de pathologies humaines, tout spécialement des cancers résultant de l'inactivation de la protéine p53. Plus particulièrement, l'invention a pour objet des oligonucléotides capables d'inhiber l'expression de gènes responsables de l'inactivation de la protéine p53 et leur utilisation pour traiter ou prévenir l'apparition de cancers. La p53 est le produit d'un gène suppresseur de tumeurs, muté dans plus de 50% des tumeurs chez l'homme. La p53 est ainsi considéré comme un gardien du génome . Elle est activée dans les cellules en cas de stress génotoxique et participe à divers processus dont l'induction du processus de mort programmée. Dans 74% des cas de mutation monoallélique, l'inactivation de la p53 est due à une mutation ponctuelle aboutissant à l'expression d'une protéine de taille normale, mais mutée. On considère généralement que la forme mutée forme des hétéromères avec le produit de l'allèle sauvage sur lequel elle agit comme un transdominant négatif et bloque son activité. La forme mutante semble également avoir une activité oncogénique en elle-même. Ainsi, des formes mutées de la p53 sont capables d'activer le gène MDR, qui facilite la résistance des cellules cancéreuses aux chimiothérapies. De plus, l'expression de mutants de la p53 est associée à une plus forte angiogénèse tumorale, sans doute en raison du fait que les formes mutantes de la p53 répriment l'expression de la thrombospondine, l'un des plus puissants répresseurs de l'angiogénèse, et activent le VEGF et le B-FGF, deux puissants activateurs de l'angiogénèse. De plus, les cellules dans lesquelles une forme mutée de la p53 s'exprime perdent divers niveaux de régulation. En particulier elles ne sont plus capables d'entamer un processus de mort programmée, qui constitue l'un des processus majeurs de protection contre la tumorisation. La restauration d'une activité p53 sauvage entraîne, dans des cellules tumorales en culture, la restauration de cette réponse cellulaire. Ainsi, l'inhibition de l'expression des formes mutées de la p53 représente potentiellement un outil puissant en thérapie anti-cancéreuse. Il n'y a, à l'heure actuelle, aucun moyen efficace de restaurer une activité p53 dans les cellules cancéreuses humaines. En ce qui concerne les cancers dans lesquels les deux allèles sont inactivés, des tentatives de restauration de l'activité p53 par thérapie génique sont envisagées. Ces approches sont compliquées par l'utilisation de vecteurs viraux et se montrent pour le moment peu efficaces. Par ailleurs, il a été observé spécifiquement dans les cancers cervicaux liés à l'infection par le virus HPV des cellules du col de l'utérus, que la p53 peut-être inactivée par la surexpression d'une protéine virale. En effet, ce virus code pour une protéine, la protéine E6, qui inactive la p53. Dans ce type de cancers, c'est l'inhibition de la protéine E6 qui pourra restaurer une activité p53 sauvage. L'invention vise à offrir de nouveaux moyens permettant d'activer la p53 en inhibant l'expression de gènes responsables de son inactivation. Ce but est atteint grâce à des oligonucléotides établis sur la base du concept de l'interférence ARN désigné RNA'inh ou RNAi ou encore siRNA . L'approche siRNA a été mise en évidence dans les plantes, puis il a été montré, dans la demande de brevet internationale No. WO 01/75164, que celle-ci fonctionne chez la drosophile et plus récemment dans les cellules de mammifères (Elbashir, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., and Tuschl, T. (2001a). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interférence in cultured mammalian cells. Nature 411, 494- 498 ; Elbashir, S. M., Martinez, J., Patkaniowska, A., Lendeckel, W., and Tuschl, T. (2001b). Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. Embo J 20,6877-6888.). Les inventeurs se sont intéressés à la mise en #uvre des RNAi dans le traitement de pathologies humaines et notamment de cancers. Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont permis de mettre en évidence qu'il était ainsi possible de réprimer de manière très efficace et très spécifique l'expression d'une forme mutante de la p53. L'invention à donc pour objet un oligonucléotide double brin caractérisé en ce qu'il est constitué de deux séquences oligonucléotidiques complémentaires comprenant chacune à la même extrémité 3' ou 5' un à cinq nucléotides non appariés formant des bouts simples brins débordant de l'hybride, l'une desdites séquences oligonucléotidiques étant complémentaire d'une séquence cible appartenant à une molécule d'ADN ou d'ARN messager d'un gène responsable de l'inactivation de la p53. Avantageusement les deux séquences oligonucléotidiques ont la même taille. Du fait de la loi d'appariement des bases, on désignera aussi indistinctivement ci-après par oligonucléotide de l'invention, l'une ou l'autre des séquences de l'oligonucléotide double brin de l'invention qui est complémentaire d'une séquence cible appartenant à une molécule d'ADN ou d'ARN messager d'un gène responsable de l'inactivation de la p53, qui peut donc être aussi simple ou double brin. On entend de façon générale par oligonucléotide un polynucléotide de 2 à 100, et plus généralement de 5 à 50, nucléotides de type ribo-, désoxyribo- ou mixte. La partie de la séquence oligonucléotidique qui est hybridée et complémentaire de la séquence cible a de préférence une taille comprise entre 15 et 25 nucléotides et tout préférentiellement de 20 à 23 nucléotides. Au moins la partie hybridée des oligonucléotides de l'invention est de préférence un hybride ARN/ARN ou ADN/ARN. En effet, les hybrides ARN/ARN ou ADN/ARN sont plus stables que les hybrides ADN/ADN ou les acides nucléiques simples brins utilisés dans des stratégies anti-sens. Dans le cas d'hybride ADN/ARN, on préfère que le brin sens soit un ADN et le brin antisens un ARN. Les oligonucléotides doubles brins de l'invention comprennent de préférence à l'extrémité 3' de chaque brin de 1 à 5 nucléotides de préférence de 2 à 3 et tout préférentiellement 2 nucléotides débordant de l'hybride. Ces nucléotides débordant de l'hybride peuvent être ou non complémentaire de la séquence cible. Avantageusement ils ne sont pas complémentaires de la cible de façon à ne pas déclencher un processus d' amplification potentiel qui diminue la sélectivité de ces oligonucléotides. Ils peuvent être des ribo- ou désoxyribonucléotides que l'hybride soit ARN/ARN ou ARN/ADN. Ainsi, dans une forme de réalisation particulière de l'invention, les nucléotides débordant de l'hybride sont des nucléotides quelconque par exemple des Thymines. On peut représenter un oligonucléotide double brin de l'invention de la façon suivante, où chaque tiret correspond à un nucléotide et où chaque brin comprend à son extrémité 3' deux thymines débordant de l'hydride : 5'--------------------TT3' 3'TT--------------------5' La séquence des oligonucléotides de l'invention est complémentaire d'une séquence cible appartenant à une molécule d'ADN ou d'ARN messager d'un gène que l'on souhaite réprimer spécifiquement. Bien que l'on préfère des oligonucléotides parfaitement complémentaires de la séquence cible, la séquence oligonucléotidique peut comprendre quelques nucléotides mutés par rapport à la séquence cible dès lors que les propriétés de répression du gène visé ne sont pas altérées. Ainsi, une séquence oligonucléotidique de l'invention peut comprendre de 1 à 3 nucléotides mutés. Ces nucléotides mutés peuvent donc être ceux débordant de l'hybride ou des nucléotides à l'intérieur de la séquence oligonucléotide. Ainsi un oligonucléotide de l'invention peut être un hybride parfait ou comprendre un ou plusieurs mismatch au sein du double brin. On préfère toutefois que la partie de la séquence oligonucléotidique qui est hybridée soit parfaitement complémentaire de la séquence cible alors que les nucléotides débordant de l'hybride peuvent être quelconques et notamment des thymines. Les oligonucléotides de l'invention sont généralement constitués de bases nucléotidiques naturelles (A, T, G, C, U), mais peuvent aussi comprendre des nucléotides modifiés ou des nucléotides portant des groupements réactifs ou des agents de pontage ou agents intercalant pouvant réagir avec la séquence cible complémentaire à l'oligonucléotide. Une première forme de mise en #uvre préférée de l'invention concerne des oligonucléotides présentant une séquence complémentaire d'une séquence polynucléotidique spécifique du gène de la p53 mutée. Il s'agit donc d'oligonucléotides dont la séquence porte une mutation par rapport à la séquence de la p53 sauvage. La séquence du gène de la p53 est donnée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO.1 (figure 1). Des séquences du gène de la p53 comprenant une mutation sont dans le tableau 1 ci-dessous où la mutation est soulignée. Tableau 1 Position P53 sauvage P53 mutée R273H GAGGTGCGTGTTTGTGC GAGGTGCATGTTTGTGC (SEQ ID N0.2) (SEQ ID NO.10) R248Q GCATGAACCGGAGGCCCAT GCATGAACCAGAGGCCCAT (SEQ ID N0.3) (SEQ ID N0.11) R248W GCATGAACCGGAGGCCCAT GCATGAACTGGAGGCCAT (SEQ ID N0.4) (SEQ ID N0.12) R249S GCATGAACCGGAGGCCCAT GCATGAACCGGAGTCCCAT (SEQ ID N0.5) (SEQ ID N0.13) G245S CTGCATGGGCGGCATGAAC CTGCATGGGCAGCATGAAC (SEQ ID N0.6) (SEQ ID N0.14) R282W TGGGAGAGACCGGCGCACA TGGGAGAGACTGGCGCACA (SEQ ID N0.7) (SEQ ID N0.15) R175H TGTGAGGCACTGCCCCCAC TGTGAGGCGCTGCCCCCAC (SEQ ID N0.8) (SEQ ID N0.16) C242S TAACAGTTCCTGCATGGGCG TAACAGTTCCTCCATGGGCG (SEQ ID N0.9) (SEQ ID N0.17) Ainsi, des oligonucléotides selon l'invention sont complémentaires d'une séquence cible appartenant au gène de la p53 mutée portant l'une au moins des mutations données dans le tableau 1. Ces oligonucléotides sont capables de discriminer de manière efficace entre la forme sauvage et la forme mutée de la p53. En effet, la stratégie est de bloquer l'expression de la forme mutée pour réactiver la forme sauvage et induire dans les cellules un processus de mort programmé pour lequel la forme sauvage est indispensable, et/ou bloquer un processus induit par la forme mutée de la p53. En outre, cette capacité de discrimination des oligonucléotides de l'invention permet de ne toucher que les cellules cancéreuses et d'épargner les cellules normales, qui n'expriment pas cette forme mutée. Une seconde forme de mise en #uvre préférée de l'invention concerne des oligonucléotides présentant une séquence complémentaire d'une séquence polynucléotidique spécifique du gène de la protéine E6 d'un HPV. La séquence du gène de la protéine E6 de HPV16 est donnée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO. 18 (figure 2). Les oligonucléotides de l'invention peuvent être préparés par les méthodes conventionnelles de synthèse chimique ou biologique des oligonucléotides. L'invention envisage aussi les oligonucléotides couplés à des substances favorisant ou permettant leur pénétration, le ciblage ou l'adressage dans les cellules, il peut s'agir de lipides, de protéines, polypeptides ou peptides. En effet, les oligonucléotides de l'invention sont destinés à être internalisés dans les cellules et avantageusement dans certains cas, jusque dans le noyau des cellules, où ils vont interagir avec des molécules d'acide nucléiques portant la séquence cible de l'oligonucléotide. Les oligonucléotides de l'invention sont utiles pour réprimer de manière très efficace et très spécifique un gène ou un ensemble de gènes responsables de l'inactivation de la p53. L'invention a donc aussi pour objet le traitement ou la prévention des maladies induites par une inactivation de la protéine p53 et tout particulièrement les cancers résultant de l'expression de la protéine p53 mutée. On peut citer tout particulièrement, l'utilisation de ces oligonucléotides pour prévenir l'apparition de cancers chez les sujets exprimant une forme mutée de la p53 dans le cas du syndrome de Li Fraumeni. L'invention a donc aussi pour objet le traitement ou la prévention des maladies induites par une inactivation de la protéine p53 et tout particulièrement les cancers résultant de l'expression de gènes inhibiteurs de la p53. Tout spécifiquement, l'invention concerne des oligonucléotides capables d'inhiber l'expression de la protéine E6 de HPV et donc utiles pour la préparation de médicaments destinés à prévenir ou traiter les cancers cervicaux. L'invention à donc pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant un oligonucléotide décrit précédemment ou un ensemble d'oligonucléotide différents et l'utilisation de ces oligonucléotides, seuls ou couplés à des substances de transport, comme médicament. Les oligonucléotides peuvent être soit transfectés dans des cellules, notamment tumorales, qui seront ensuite injectées, soit injectés dans les tissus par exemple des tumeurs déjà développées, par exemple par voie locale, systémique ou aérosols etc, avec agents de vectorisation éventuellement nécessaires. Les oligonucléotides seront utilisés à des concentrations suffisantes en fonction de l'application et de la forme d'administration utilisée avec des excipients pharmaceutiques appropriés. Les oligonucléotides de l'invention sont également utiles comme outils de diagnostic permettant d'établir in vitro le profil génétique d'un patient à partir d'un échantillon cellulaire de celui-ci. La mise en #uvre des oligonucléotides de l'invention dans un tel procédé d'analyse permet de connaître la réponse des cellules cancéreuses de ce patient et d'établir un traitement personnalisé ou encore d'ajuster le traitement d'un patient soumis à une chimiothérapie. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant l'inactivation de la p53 mutée. Il sera fait références aux dessins en annexe dans lesquels : - La figure 1 représente la séquence du gène de la p53 sauvage. - La figure 2 représente la séquence du gène de la protéine E6 de HPV16. La figure 3 représente l'inhibition des formes sauvages et mutées de la p53 par les siRNAs correspondants. - Les figures 4 et 5 représentent le niveau de p53 suivi par Western Blot dans des cellules p53 négatives transfectées par des siRNAs RNA/RNA ou RNA/DNA en même temps qu'avec des vecteurs d'expression pour les formes sauvages ou mutées de la p53. - Les figures 6,7 et 8 représentent les conséquences fonctionnelles de l'inhibition de la p53 mutée, avec la restauration des fonctions de la p53 sauvage. Exemple 1 : Préparation des oligonucléotides. Les trois siRNAs du tableau 2 ci-dessous ont été préparés, l'un dirigé contre la forme sauvage de la p53, et l'autre dirigé contre la forme mutée exprimée chez un patient et ayant donné lieu à l'établissement d'une lignée. Cette mutation correspond à l'une des trois observées le plus fréquemment dans les tumeurs humaines. Un siRNA dirigé contre la protéine E6 de HPV représenté également dans le tableau 2 ci-dessous a aussi été préparé. Tableau 2 p53 Sense: 5' GCAUGAACCGGAGGCCCAUTT SEQ ID N0.19 sauvage Anti: 5' AUGGGCCUCCGGUUCAUGCTT SEQ ID N0.20 p53 MT1 Sense: 5' GCAUGAACUGGAGGCCCAUTT SEQ ID NO.21 (r248w) Anti: 5' AUGGGCCUCCAGUUCAUGCTT SEQ ID N0.22 p53 MT2 Sense . 5' UCAUGAACUGGAGGCCCAUTT SEQ ID NO.23 (r248w) Anti : 5' AUGGGCCUCCAGUUCAUGATT SEQ ID N0.24 HPV-16-S2 Sense: 5' CCACAGUUAUGCACAGAGCTT SEQ ID NO.25 Anti: 5' GCUCUGUGCAUAACUUGGTT SEQ ID N0.26 Les nucléotides en gras dans la p53 sauvage sont ceux qui sont mutés dans la forme mutante et qui sont en italique dans la séquence de la p53 mutée (p53 MT). Exemple 2 : Effet des oligonucléotides de l'exemple 1 sur l'expression de la p53 sauvage ou mutée dans divers types cellulaires. La figure 3 représente l'inhibition des formes sauvages et mutées de la p53 par les siRNAs correspondants. A : Les cellules H1299-NCI, qui n'expriment pas la p53, ont été transfectées (en utilisant la lipofectamine) par des vecteurs d'expression (400 ng) de la p53 sauvage (WT) ou mutée (MT). Les siRNAs (en dose croissante : 0,125 ng, 250 ng, 500 ng et 1000 ng) dirigés contre la forme sauvage (WT), la forme mutée (MT1 et MT2), ou un siRNA irrelevant (CTRL) ont été transfectées en même temps. Les cellules ont été collectées 24 heures après, et analysées par Western blot avec un anticorps dirigé contre la p53 B : Les cellules H1299-NCI, qui n'expriment pas la p53, ont été transfectées (en utilisant la lipofectamine) par des vecteurs d'expression (400 ng) de la p53 sauvage (WT), mutée (MT) ou un mélange des deux (WT+MT), comme indiqué. Les siRNAs (400 ng) dirigés contre la forme sauvage (WT), la forme mutée (MT), ou un siRNA irrelevant (CTRL) ont été transfectés en même temps. Les cellules ont été collectées 24 heures après, et analysées par Western blot avec un anticorps dirigé contre la p53 (DO1, Santa Cruz), ou l'actine cellulaire (Sigma) pour contrôler la quantité de protéines utilisée dans le test. Note : l'expression de la forme mutée de la protéine stabilise la forme sauvage. C : Des cellules exprimant la forme sauvage de la p53 (U20S, provenant d'un ostéosarcome) ont été transfectées avec un siRNA dirigé contre la forme sauvage (WT) de la p53 ou avec un siRNA irrelevant (C). Quarante huit heures après, les cellules ont été traitées à, un agent génotoxique qui induit la stabilisation de la p53. Les cellules ont été collectées après 48 heures, et analysées comme dans A. D : Des cellules MDA 087 (provenant d'un patient atteint d'un syndrome de Li Fraumeni et exprimant le mutant R248W ont été transfectées avec un siRNA dirigé contre la forme sauvage (WT) ou la forme mutante (MT) de la p53, ou encore avec un siRNA irrelevant (C) (1,6 g), traitées à la Doxorubicyne (0,2 jig/ml) 48 heures après et récoltées au bout de 24 heures. Les extraits cellulaires ont été analysés par Western blot comme ci-dessus. Dans tous les cas, le siRNA dirigé contre la forme mutée de la protéine inhibe la forme mutée et le siRNA dirigé contre la forme sauvage inhibe la forme sauvage. De plus, il n'y a pas de réaction croisée , puisque le siRNA dirigé contre la forme sauvage n'a pas d'effet sur la forme mutée et vice versa. Il faut noter que l'expression du mutant stabilise la protéine sauvage lorsqu'elle est co-exprimée. En conséquence, l'inhibition du mutant ramène, par cet effet indirect, la forme sauvage à son niveau de base, sans qu'il y ait inhibition de l'expression de la protéine. Exemple 3 : Effet des oligonucléotides ARN/ARN et ADN/ARN. Des siRNAs dirigés contre la p53 sauvage ou une forme mutante ont été préparés soit sous forme de siRNA RNA/RNA, soit sous forme d'hybride DNA/RNA. Dans ce dernier cas, plusieurs combinaisons ont été testées, avec des fréquences de nucléotides RNA différentes et comprenant le brin DNA soit sur l'antisens, soit sur le sens. Ces oligonucléotides sont représentés dans le tableau 3 cidessous. Les siRNAs ont été introduits par transfection en utilisant la lipofectamine dans des cellules p53 négatives, en même temps que des vecteurs d'expression pour les formes sauvages ou mutées de la p53. Le niveau de p53 a été suivi par Western Blot. Les résultats sont montrés dans la figure 4 pour les hybrides de la série Hl et sur la figure 5 pour les hybrides de la série H2. Tableau 3 wta Sense: 5' GCAUGAACCGGAGGCCCAUTT SEQ IS NO. 27 Anti: 5' AUGGGCCUCCGGUUCAUGCTT SEQ IS NO. 28 wt Hl Sense: 5' GCAUGAACCGGAGGCCCAUTT SEQ IS NO. 29 D/R Anti: 5' AUGGGCCUCCGGUUCAUGCTT SEQ IS NO. 30 wt Hl Sense: 5' GCAUGAACCGGAGGCCCAUTT SEQ IS NO. 31 R/D Anti: 5' AUGGGCCUCCGGUUCAUGCTT SEQ IS NO. 32 wt H2 Sense: 5' GCATGAACCGGAGGCCCATTT SEQ IS NO. 33 D/R Anti: 5' AUGGGCCUCCGGUUCAUGCTT SEQ IS NO. 34 wt H2 Sense: 5' GCAUGAACCGGAGGCCCAUTT SEQ IS NO. 35 R/D Anti: 5' ATGGGCCUTCCGGTTCATGCTT SEQ IS NO. 36 Mtl Sense: 5' GCAUGAACUGGAGGCCCAUTT SEQ IS NO. 37 (r248w) Anti: 5' AUGGGCCUCCAGUUCAUGCTT SEQ IS NO. 38 b Mtl Hl Sense: 5' GCAUGAACUGGAGGCCCAUTT SEQ IS NO. 39 D/R Anti: 5' AUGGGCCUCCAGUUCAUGCTT SEQ IS NO. 40 Mtl Hl Sense: 5' GCAUGAACUGGAGGCCCAUTT SEQ IS NO. 41 R/D Anti: 5' AUGGGCCUCCAGUUCAUGCTT SEQ IS NO. 42 Mtl H2 Sense: 5' GCATGAACTGGAGGCCCATTT SEQ IS NO. 43 D/R Anti: 5' AUGGGCCUCCAGUUCAUGCTT SEQ IS NO. 44 Mtl H2 Sense: 5' GCATGAACTGGAGGCCCATTT SEQ IS NO. 45 R/D Anti: 5' AUGGGCCUCCAGUUCAUGCTT SEQ IS NO. 46 a : en gras les nucléotides DNA ; b : le nucléotide muté est souligné. La figure 4 montre que les hybrides Hl D/R sont aussi efficaces que les siRNAs pour inhiber l'expression des gènes. Les cellules H1299-NCI, qui n'expriment pas la p53, ont été transfectées (en utilisant la lipofectamine) par des vecteurs d'expression (400 ng) de la p53 sauvage (WT), mutée (MT) ou un mélange des deux (WT+MT), comme indiqué. Un vecteur CMV-GFP a été transfecté également comme contrôle interne. Les siRNAs (400 ng) dirigés contre la forme sauvage (WT), la forme mutée (MT), ou un siRNA irrelevant (CTRL) ont été transfectées en même temps. Les cellules ont été collectées 24 heures après, et analysées par Western blot avec un anticorps dirigé contre la p53 (DO1, Santa Cruz), ou la GFP (Santa Cruz) pour contrôler l'efficacité de transfection. Note : l'expression de la forme mutée de la protéine stabilise la forme sauvage. La figure 5 montre que les hybrides H2 D/R sont aussi efficaces que les siRNAs pour inhiber l'expression des gènes. Les cellules H1299-NCI, qui n'expriment pas la p53, ont été transfectées (en utilisant la lipofectamine) par des vecteurs d'expression (400 ng) de la p53 sauvage (WT), mutée (MT) ou un mélange des deux (WT+MT), comme indiqué. Les siRNAs (400 ng) dirigés contre la forme sauvage (WT) , la forme mutée (MT) , ou un siRNA irrelevant (CTRL) ont été transfectées en même temps. Les cellules ont été collectées 24 heures après, et analysées par Western blot avec un anticorps dirigé contre la p53 (DO1, Santa Cruz). Exemple 4 : Effet des siRNAs sur les fonctions de la p53 sauvage. La figure 6 montre l'effet du siRNA mtl dans des cellules qui expriment les formes sauvages et mutées de la p53. Les cellules H1299-NCI, qui n'expriment pas la p53, ont été transfectées (en utilisant la lipofectamine) par un vecteur reporter comportant le gène de la luciférase sous contrôle d'un élément de réponse à la p53 et des vecteurs d'expression (400 ng) de la p53 sauvage (WT), mutée (MT) ou un mélange des deux (WT+MT), comme indiqué. Les siRNAs (400 ng) dirigés contre la forme sauvage (WT), la forme mutée (MT), ou un siRNA irrelevant (CTRL) ont été transfectées en même temps. Les cellules ont été collectées 24 heures après et analysées pour l'expression de la luciférase. La p53 sauvage seule active le vecteur reporter, et la coexpression de la forme mutante inhibe cette activité. La co-transfection du siRNA sauvage inhibe l'expression de la protéine sauvage et donc l'activation résiduelle du gène reporter. La co-transfection des siRNAs mtl et mt2, au contraire, restaure cette activation en bloquent sélectivement l'expression de la forme mutée et en empêchant son effet de transdominant négatif sur la forme sauvage. La figure 7 montre un résultat similaire sur l'expression d'une des cibles de la p53, la protéine inhibitrice de la prolifération cellulaire p21, dans des cellules traitées comme dans la figure 6. L'expression de p21 est activée par la p53 sauvage et inhibée lorsque le mutant est co-exprimé. Cette inhibition est levée en présence du siRNA mtl. Exemple 5 : Effet du siRNAmtl sur les fonctions de la p53 sauvage. Une lignée stable exprimant la forme sauvage ou mutée de la p53 a été transfectée avec 400 ng de siRNAs en utilisant la lipofectamine. Les cellules ont ensuite été soumises à un stress génotoxique en utilisant la dauxorubicine (200 ng/ml). La figure 8 montre l'analyse du cycle cellulaire de ces cellules par incorporation de Iodure de propidium et analyse au FACS. Les cellules non transfectées avec la forme mutante, et donc n'exprimant que la forme sauvage (cellules PCDNA) montrent un fort pourcentage d'arrêt en Gl en présence de dauxorubicine. Le traitement de ces cellules par le siRNA sauvage, en diminuant la p53 sauvage, réduit cet arrêt en Gl. Les cellules qui expriment la forme mutée et sauvage (R248W) s'arrêtent peu en Gl en présence de dauxorubicine, montrant que la forme mutée inhibe l'activité de la forme sauvage. Quand ces cellules sont traitées avec le siRNA mtl, elles récupèrent une capacité normale (à comparer avec les contrôles PCDNA non traitées) de s'arrêter en Gl, montrant la restauration de l'activité p53 sauvage dans ces cellules. REVENDICATIONS 1) Oligonucléotide double brin caractérisé en ce qu'il est constitué de deux séquences oligonucléotidiques complémentaires comprenant chacune à la même extrémité 3' ou 5' un à cinq nucléotides non appariés formant des bouts simples brins débordant de l'hybride, l'une desdites séquences oligonucléotidiques étant complémentaire d'une séquence cible appartenant à une molécule d'ADN ou d'ARN messager d'un gène de la p53 mutée ou du gène de la protéine E6 d'un HPV. 2) Oligonucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la partie de la séquence oligonucléotidique qui est hybridée et complémentaire de la séquence cible a de préférence une taille comprise entre 15 et 25 nucléotides et tout préférentiellement de 20 à 23 nucléotides. 3) Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la partie hybridée est un hybride ARN/ARN ou ADN/ARN. 4) Oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la partie hybridée est un hybride ADN/ARN où le brin sens est un ADN et le brin antisens un ARN. 5) Oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente à chaque extrémité 3' des séquences oligonucléotidiques deux nucléotides débordant de l'hybride. 6) Oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la partie de la séquence oligonucléotidique hybridée est parfaitement complémentaire de la séquence cible et en ce que le(s) nucléotide(s) débordant de l'hybride ne sont pas complémentaires de la séquence cible. 7) Oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est couplé à une substance favorisant ou permettant sa pénétration, le ciblage ou l'adressage dans les cellules. 8) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications précédentes. 9) Utilisation d'un oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 7 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement des cancers induits par la p53 mutée. 10) Utilisation d'un oligonucléotide selon l' une des revendications 1 à 7 pour la préparation d' une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou traitement des cancers cervicaux. 11) Utilisation d'un oligonucléotide l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour connaître in vitro la réponse des cellules cancéreuses d'un patient et établir un traitement personnalisé ou encore d'ajuster le traitement d'un patient soumis à une chimiothérapie.