Brevet FR2844521A1 — publié le 20040319

La présente invention concerne un procédé pour mesurer l'activation d'une cellule effectrice appartenant au système immunitaire ou modifiée in vitro par un anticorps monoclonal (AcMo) ou polyclonal, caractérisé en ce qu'il comprend une mise en contact de cellules exprimant le récepteur CD 16 dans un milieu réactionnel en présence de l'anticorps et de l'antigène dudit anticorps et une mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le récepteur CD16. L'immunothérapie à l'aide d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux est en passe de devenir un des aspect les plus importants de la médecine. En revanche, les résultats obtenus lors d'essais cliniques apparaissent contrastés. En effet, il peut s'avérer que l'anticorps monoclonal ne soit pas suffisamment efficace. Aujourd'hui, la recherche s'oriente sur le fragment Fcy de l'immunoglobuline afin d'améliorer les propriétés des anticorps. A terme, cela devrait permettre l'obtention d'anticorps qui interagissent et activent les récepteurs des cellules effectrices (macrophage, lymphocyte T, H et NK). L'activité biologique de certaines immunoglobulines G est dépendante de la structure des oligosaccharides présents sur la molécule, et notamment sur sa partie Fc. Les molécules IgG de toutes les sous-classes humaines et murines possèdent un Noligosaccharide fixé au domaine CH2 de chaque chaîne lourde (au résidu Asn 297 pour les IgG humaines). L'influence de ce résidu glycannique sur la capacité de l'anticorps à interagir avec des molécules effectrices (Fc récepteurs et complément) a été démontrée. L'inhibition de glycosylation d'une IgGl humaine, par culture en présence de Tunicamycine, provoque par exemple une diminution de 50 fois de l'affinité de cet anticorps pour le récepteur FcyRI présent sur les monocytes et macrophages (Leatherbarrow et al, 1985). La fixation au récepteur FcyRIII est également affectée par la perte de carbohydrates sur l'IgG, puisqu'il a été décrit qu'une IgG3 non glycosylée est incapable d'induire une lyse de type ADCC par l'intermédiaire du récepteur FcyRIII des cellules NK (Lund et al, 1990). Mais, au-delà de la présence nécessaire de ces résidus glycanniques, c'est plus précisément l'hétérogénéité de leur structure qui peut aboutir à des différences dans la capacité à engager des fonctions effectrices. Des profils de galactosylation variables en fonction des individus (IgGl humaines sériques) ont été observés. Ces différences reflètent probablement des disparités dans l'activité des galactosyltransférases et autres enzymes entre les clones cellulaires de ces individus (Jefferis et al, 1990). Alors que cette hétérogénéité normale des processus post-traductionnels génère différentes glycoformes (même dans le cas d'anticorps monoclonaux), elle peut conduire à des structures atypiques associées à certains états pathologiques comme l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, pour lesquelles une proportion importante de résidus agalactosylés a été mise en évidence (Parekh et al, 1985). Devant la complexité posée par la relation existante entre les différentes structures glycanniques et l'activité des anticorps, il serait utile de pouvoir discriminer rapidement quels sont les anticorps efficaces et permettre ainsi de sélectionner des lignées cellulaires produisant des anticorps ayant une meilleur efficacité ou des propriétés spécifiques dans l'activation ou l'inhibition de certains composants du système immunitaire. Dans la demande FR 0004685 du 12 avril 2000 (LFB), nous avions décrit un nouveau procédé de préparation d'un anticorps monoclonal capable d'activer les cellules effectrices exprimant le FcyRIII. Dans ce procédé, on teste des anticorps monoclonaux provenant d'hybridomes ou de lignées transfectées dans un mélange réactionnel comprenant les cellules cibles desdits anticorps, des cellules effectrices comprenant des cellules exprimant le FcyRIII et des IgG polyvalentes. Ainsi, on peut déterminer le pourcentage de lyse des cellules cibles et sélectionner des anticorps monoclonaux qui activent les cellules effectrices provoquant une lyse significative des cellules cibles (activité ADCC de type FcyRIII). Par exemple, la partie Fab de l'anticorps anti-D va se fixer sur l'antigène Rhésus D porté par les hématies. Suite à cette fixation, sa partie Fc se fixe alors sur le récepteur Fc gamma RIII ou CD 16 de la cellule effectrice (cellule NK). Ce sandwich induit la sécrétion de substances chimiques de type perforines qui vont lyser le globule rouge. Il s'agit donc d'une cytotoxicité cellulaire anticorps dépendante (CCDA) ou ADCC en anglais. Pour se rapprocher des conditions physiologiques, le test est effectué en présence d'immunoglobulines polyvalentes humaines. Dans le cadre de l'invention, on a trouvé que la fixation d'un anticorps sur son ligand peut induire une activation de la cellule Jurkat transfectée CD16 induisant la sécrétion d'IL2. Une forte corrélation est observée entre la sécrétion d'IL2 par Jurkat CD16 et l'activité ADCC médiée par le CD16 des cellules effectrices. L'invention propose l'utilisation du test jurkat CD16 par mesure d'IL2 sécrétée comme alternative aux tests ADCC, en particulier pour un suivi ou le criblage d'activité biologique d'anticorps à usage thérapeutique. Description Ainsi, la présente invention se rapporte à un procédé pour mesurer l'activation d'une cellule effectrice appartenant au système immunitaire, transformée ou non, par un anticorps monoclonal (AcMo) ou polyclonal, caractérisé en ce qu'il comprend une mise en contact de cellules exprimant le récepteur CD16 dans un milieu réactionnel en présence de l'anticorps et de l'antigène dudit anticorps et une mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le récepteur CD16. En entend par cellule transformée, une cellule modifiée génétiquement de sorte à exprimer un récepteur, en particulier le récepteur CD16. De préférence, on utilise une lignée Jurkat transfectée avec un vecteur d'expression codant pour le récepteur CD16 comme cellule effectrice. Cette lignée est particulièrement avantageuse car elle est immortalisée et se développe indéfiniment dans des milieux cultures. Parmi les cytokines que l'on peut quantifier au moins une cytokine sélectionnée parmi IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6..., TNFa et IFNy. On choisit avantageusement l'interleukine IL-2. Le taux de cytokine produite est un marqueur d'activation ou d'inhibition des cellules effectrices. De préférence le taux d'interleukine IL2 sécrétée reflète la qualité de l'anticorps fixé par le récepteur CD 16 quant à son intégrité (fonction FC) et à son efficacité (site antigénique) de liaison à l'antigène. La mesure du taux d'IL2 est corrélée à une activité du type ADCC. Dans un autre aspect, l'invention concerne un procédé pour évaluer l'efficacité d'un anticorps monoclonal ou polyclonal, caractérisé en ce qu'il comprend une mise en contact de cellules effectrice du système immunitaire, transformée ou non, exprimant le récepteur CD16 dans un milieu réactionnel en présence d'un anticorps et de l'antigène dudit anticorps et une mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le récepteur CD 16. Ce procédé est particulièrement adapté pour évaluer l'efficacité d'un anticorps monoclonal ou polyclonal de spécificité anti-Rh D du globule rouge humain. Dans un autre aspect, l'invention concerne un procédé pour évaluer la capacité d'une cellule à produire un anticorps monoclonal efficace, caractérisé en ce qu'il comprend une mise en contact de cellules effectrice du système immunitaire, transformée ou non, exprimant le récepteur CD16 dans un milieu réactionnel en présence d'un anticorps et de l'antigène dudit anticorps et une mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le récepteur CD16. Ce procédé peut être mise en #uvre pour des cellules utilisées pour la production d'anticorps thérapeutiques, telles que CHO, YB2/0, les cellules lymphoblastoïdes humaines, les cellules d'insectes et les cellules de myélomes murines. Ce procédé peut également être appliquée à l'évaluation de la production d'AcMo par des plantes transgéniques ou de mammifères transgéniques. Dans un aspect complémentaire, l'invention vise un procédé pour évaluer l'efficacité et de l'intégrité d'anticorps polyclonaux après une étape ou plusieurs étape de purification, caractérisé en ce qu'il comprend une mise en contact de cellules effectrice du système immunitaire, transformée ou non, exprimant le récepteur CD 16 dans un milieu réactionnel en présence de l'anticorps purifié et de l'antigène dudit anticorps et une mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le récepteur CD 16. Les procédés décrits ci-dessus peuvent éventuellement être réalisés en présence d'immunoglobulines humaines (IVIg). A titre d'exemple, on sélectionnera les anticorps pour lesquels une augmentation supérieure à 100%, 250%, 500%, ou 1000% du taux de libération d'IL-2 est observée par rapport au contrôle en absence d'anticorps ou un anticorps donné comme référence négative. L'invention vise également l'utilisation du procédé décrit ci-dessus pour sélectionner des anticorps efficace pour un traitement thérapeutique. A l'inverse, l'invention vise également à évaluer la capacité de réponse des cellules effectrices du patient lorsqu'elles sont mises en présence d'un anticorps monoclonal ou polyclonal donné destiné à traiter le patient et qu'elles sont mises dans les conditions décrites de l'invention. Légende Figure 1 : du test ADCC CMN. Les cellules mononuclées en présence de Tégéline (IVIg) sont incubées avec les anticorps anti-Rhésus D et des hématies Rhésus + (cible). Après une nuit à 37 C, on mesure la lyse des hématies par mesure de l'hémoglobine relarguée dans le milieu réactionnel. Figure 2 : Description du test ADCC NK Les cellules NK purifiées sont incubées avec les anticorps anti-Rhésus D et des hématies Rhésus + (cible). Après une nuit à 37 C, on mesure la lyse des hématies par mesure de l'hémoglobine relarguée dans le milieu réactionnel. Figure 3 : Résultats ADCC NK et inhibition par l'anti-CD16 3G8 . Figure 4 : du test Jurkat CD16 . Des cellules Jurkat CD 16 sont mélangées avec différents anticorps anti-D en présence d'hématies rhésus + et de PMA. Après une nuit d'incubation, la libération d'IL-2 dans le surnageant est quantifiée par ELISA. Figure 5 : Résultats du test Jurkat CD16. Commentaires : les anticorps positifs en ADCC-NK induisent une sécrétion d'IL2 en présence de Jurkat CD 16 et de leur cible. Exemple 1 : Jurkat CD16 Anticorps témoins : Anticorps polyclonaux WinRho, anticorps monoclonal DF5-EBV, anticorps monoclonal DF5-YB2/0 Principe : Ce test estime la capacité des anticorps anti-D à se fixer sur le récepteur CD16 (Fc gamma RIII) exprimé sur les cellules Jurkat CD16 et à induire la secrétion d'IL2. Ce test consiste à mettre en contact en P96 : anticorps anti-D, les hématies Rhésus positives traitées à la papaïne, les cellules Jurkat CD16 et du PMA. Après une nuit d'incubation à 37 C, on centrifuge les P96 et on dose dans le surnageant la quantité d'IL2 secrétée. Mode opératoire Matériel Anticorps témoins positif : Poly-D WinRho, DF5 YB2/0. Anticorps témoins négatifs : DF5 Hématies Rhésus positif Cellules Jurkat CD 16 Kit dosage IL2 : de chez R/D. Methode Traitement à la papaïne des hématies. 1ml de culot d'hématies incubé avec 1ml d'une solution de papaïne (lmg/ml) diluées en PBS incubée lOmn à 37 C. Puis 3 lavages en H20-NaCI O.15M. Mélange réactionnel : -Anticorps : 50 l d'une dilution à 150ng/ml en IMDM 5% SVF -PMA 50 l d'une dilution à 40ng/ml en IMDM 5% SVF -Hématies traitées à la papaïne. 50 l à 8 106/ml en IMDM 5% SVF -Jurkat CD16. 50 l à 2xlO6/ml en IMDM 5% SVF Incubation 1 nuit à 37 C Puis centrifugation des plaques, prélèvement de 100 l de surnageants et dosage d'IL2 avec le kit commercial. lecture à 450nm. On donne les valeurs (en pg/ml) sous forme d'histogramme pour chaque échantillon. Exemple 2 : Corrélation in vitro entre ADCC et libération d'IL-2 de Jurkat CD16. Pour cette étude, 3 anticorps monoclonaux anti-D ont été comparés. Mab DF5-EBV a été produit par des Lymphocytes B humain obtenus chez un donneur immunisé D-négatif et immortalisés par transformation avec EBV. Cet anticoprs a été utilisé comme contrôle négatif étant donné qu'il a été montré qu'il est incapable d'éliminer les globules rouges rhésus positifs de la circulation lors d'un essai clinique. L'anticorps monoclonal (Mab) DF5-YB2/0 a été obtenu en exprimant la séquence primaire de EBV-DF5 dans la lignée YB2/0. L'anticorps monoclonal R297 et d'autres anticorps recombinants ont également été exprimés dans YB2/0. On a testé ces anticorps in vitro pour leur capacité à induire une lyse des globules rouges traités à la papaïne en utilisant des cellules PBL comme effecteur. Tous les tests ont été effectués en présence d'immunoglobulines humaines (IVIg) de sorte à reconstituer les conditions physiologiques. On pense que les IVIg se lient avec une haute affinité au FcgammaRI (CD64). Les deux Mab DF5-YB2/0 et R297 induisent une lyse des globules rouges à un niveau comparable à celui des anticorps WinRho. En revanche, le Mab DF5-EBV est complètement inefficace. Dans une deuxième série d'expérience, des cellules NK purifiées et des globules rouges non traités ont été utilisés comme effecteur et cibles respectivement. Après 5 heures d'incubation, les Mabs antiD-R297 et DF5-YB2/0 se sont montrés capables de provoquer la lyse des globules rouges, alors que DF5-EBV reste inefficace. Dans ces deux expériences, la lyse des globules rouges a été inhibée par Mab 3G8 dirigé contre le FcgammaRIII (CD 16). Pris ensemble, ces résultats démontrent que l'ADCC provoquée par Mab R297 et Mab DF5-YB2/0 implique le FcgammaRIII exprimé à la surface des cellules NK. Dans le cadre de l'invention, une troisième série d'expériences a mis en valeur un test in vitro à l'aide de cellule Jurkat CD16 pour évaluer l'efficacité d'anticorps anti-D. Les Mab ont été incubés pendant la nuit avec des globules rouges rhésus positifs et des cellules Jurkat CD 16. La libération d'IL-2 dans le surnageant à été évaluée par ELISA. Une forte corrélation entre l'ADCC et l'activation des cellules Jurkat a été observée, ce qui implique que ce test peut être utilisé pour faire la discrimination des Mabs anti-D en fonction de leur réactivité envers FcgammaRIII ( CD 16). En conclusion, ces données montrent l'importance des modifications posttraductionnelles de la structure des anticorps pour leur activité ADCC spécifique du FcgammaRIII. La libération de cytokines telles que IL-2 reflète cette activité. REFERENCES Jefferis, R., Lund, J., Mizutani, H., Nakagawa, H., Kawazoe, Y., Arata, Y. and Takahashi, N. A comparative study of the N-linked oligosaccharides structure of human IgG Subclass proteins. Biochem. J., 268 : 529-537 (1990). Leatherbarrow, R. J., Rademacher, T. W., Dwek, R.A., Woof, J. M., Clark, A., Burton, D.R., Richardson, N. and Feinstein, A. Effector functions of monoclonal aglycosylated mouse IgG2a ; and activation of complement component CI and interaction with human Fc receptor. Molec. Immun. 22, 407-415 (1985). Lund, J., Tanaka, T., Takahashi, N., Sarmay, G., Arata, Y. and Jefferis, R. A protein structural change in aglycosylated IgG3 correlates with loss of hu Fcy RI and hu FcyRIII binding and/or activation. Molec. Immun. 27, 1145-1153 (1990). Parekh, R. B., Dwek, R.A., Sutton, B.J., Fernandes, D. L., Leung, A., Stanworth, D., Rademacher, T. W., Mizuochi, T., Taniguchi, T., Matsuta, K., Takeuchi, F., Nagano, Y., Miyamoto, T. and Kobata, A. Asssociation of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature, 316 : 452-457 (1985). 1. Procédé pour mesurer l'activation d'une cellule effectrice appartenant au système immunitaire, transformée ou non, par un anticorps monoclonal (AcMo) ou polyclonal, caractérisé en ce qu'il comprend une mise en contact de cellules exprimant le récepteur CD16 dans un milieu réactionnel en présence de l'anticorps et de l'antigène dudit anticorps et une mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le récepteur CD 16. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la cellule effectrice est une cellule Jurkat exprimant le récepteur CD 16. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'on quantifie au moins une cytokine sélectionnée parmi IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, TNFa et IFNy. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on quantifie l'interleukine IL-2. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le taux de cytokine produite est un marqueur d'activation ou d'inhibition des cellules effectrices. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le taux d'interleukine IL2 sécrétée reflète la qualité de l'anticorps fixé par le récepteur CD16 quant à son intégrité (fonction FC) et à son efficacité (site antigénique) de liaison à l'antigène. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le taux d'interleukine IL2 sécrétée est corrélé à une activité du type ADCC. 8. Procédé pour évaluer l'efficacité d'un anticorps monoclonal ou polyclonal, caractérisé en ce qu'il comprend une mise en contact de cellules effectrice du système immunitaire exprimant le récepteur CD 16 dans un milieu réactionnel en présence d'un anticorps et de l'antigène dudit anticorps et une mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le récepteur CD 16. 9. Procédé selon la revendication 8 pour évaluer l'efficacité d'un anticorps monoclonal ou polyclonal de spécificité anti-Rh du globule rouge humain. 10. Procédé pour évaluer la capacité d'une cellule à produire un anticorps monoclonal efficace, caractérisé en ce qu'il comprend une mise en contact de cellules effectrice du système immunitaire, transformée ou non, exprimant le récepteur CD16 dans un milieu réactionnel en présence d'un anticorps et de l'antigène dudit anticorps et une mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le récepteur CD 16. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les cellules produisant des anticorps sont choisies parmi CHO, YB2/0, les cellules lymphoblastoïdes humaines, les cellules d'insectes et les cellules de myélomes murines ou tout autre cellule d'expression. 12. Procédé pour évaluer l'efficacité et de l'intégrité d'anticorps polyclonaux après une étape ou plusieurs étape de purification, caractérisé en ce qu'il comprend une mise en contact de cellules effectrice du système immunitaire, transformée ou non, exprimant le récepteur CD16 dans un milieu réactionnel en présence de l'anticorps purifié et de l'antigène dudit anticorps et une mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le récepteur CD 16. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on sélectionne les anticorps pour lesquels une augmentation supérieure à 100%, 250%, 500%, ou 1000% du taux de libération d'IL-2 est observée par rapport au contrôle en absence d'anticorps ou en présence d'un anticorps donné comme référence négative. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le mélange réactionnel comprend des d'immunoglobulines humaines (IVIg). 15. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 14 pour évaluer la production d'AcMo par des plantes transgéniques ou de mammifères transgéniques. 16. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 14 pour sélectionner des anticorps efficace pour un traitement thérapeutique. 17. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 14 pour évaluer la capacité des cellules effectrices d'un patient en réponse à un anticorps monoclonal ou polyclonal approprié pour son traitement.