Brevet FR2844277A1 — publié le 20040312

La présente invention concerne d'une manière générale l'industrie microbiologique et spécifiquement une bactérie produisant un L-aminoacide qui appartient au genre Escherichia et qui est dépourvue de gène mlcactif, ainsi qu'un procédé de production de ce L-aminoacide. La protéine Mlc est un régulateur global (répresseur) du métabolisme des glucides (Decker et al, Mol. Microbiol. 1998,27:2:381- 90; Kimata et al, Mol-Microbiol, 1998, 29:6:1509-19 ; Plumbridge, Mol. Microbiol, 1998,27:2:369-80). On a montré que la protéine Mlc régule l'expression de plusieurs gènes et de plusieurs opérons, à savoir le gène ptsG (Kimata et al, Mol. Microbiol, 1998,29:6:1509-19 ; Plumbridge, Mol Microbiol, 1998, 29:4:1053-63 ; Kim et al, J Biol Chem, 1999, 274:36:25398-402 ; Plumbridge, Mol Microbiol 1999, 33:2:260-73 ; Tanaka et al, Genes Cells, 1999,4:7:391-9) qui code une sous-unité liée à la membrane, IICB (Glc), du système de la glucose phosphotransférase (PTS), l'opéron ptsHIcrr codant des protéines PTS générales (Kimata et al, Mol Microbiol, 1998, 29:6:1509-19 ; Plumbridge, Mol Microbiol, 1998, 29:4:1053-63 ; Kim et al, J Biol Chem, 1999, 274:36:25398-402 ; Plumbridge, Mol Microbiol 1999,33:2:260-73 ; Tanaka et al, Genes Ce Ils, 1999,4:7:391-9), l'opéron manXYZ codant l'enzyme II du mannose PTS (Plumbridge, Mol Microbiol, 1998, 29:4:1053-63), le gène malT qui code l'activateur du régulon maltose (Decker et al, Mol Microbiol 1998, 27 :2:381-90). Les gènes du régulon mlc sont également régulés positivement par le complexe CRP-cAMP (Chapon et Colb, J. Bacteriol., 1983,156:1135- 43 ; Decker et al, Mol. Microbiol., 1998,27:2:381-90 ; Kimata et al, Mol. Microbiol., 1998, 29:6:1509-19 ; Plumbridge, Mol. Microbiol., 1998, 27 :2:369-80 ; Plumbridge, Mol. Microbiol., 1998,29:4:1053-63 ; Kim et al, J. Biol. Chem, 1999,274:36:25398-402 ; Plumbridge, Mol. Microbiol 1999, 33 :2:260-73 ; Tanaka et al, Genes Cells, 1999, 4:7:391-9). La régulation de la transcription du gène mlcest très complexe. Tout d'abord, elle est régulée négativement par la protéine Mlc elle-même. La EIICB (Glc) non phosphorylée (produit du gène ptsG) peut séquestrer la protéine Mlc depuis son site de liaison par une interaction protéineprotéine directe et induire de ce fait l'expression du régulon m/c en réponse au glucose (Tanaka et al, EMBO J, 2000,19:20, 5344-52 ; Lee et al, EMBO J, 2000,19:20:5353-61 ; Nam et al, EMBO J, 2001,20:3:491-8). Deuxièmement, la transcription du gène mlc est réalisée par deux promoteurs, P1 et P2 (Shin et al, J. Biol. Chem. 2001,276:28:25871-75). Le promoteur P1 est reconnu seulement par l'ARN polymérase, contenant le facteur sigma domestique #70(E#70), tandis que le promoteur P2 peut être reconnu par E#70 et E#32, contenant le facteur sigma de choc thermique. Ainsi, le gène m/c appartient à une classe de gènes transcrits à partir de promoteurs multiples incluant un promoteur reconnu par l'ARN polymérase en association avec le facteur sigma alternatif pour réagir à différentes conditions environnementales. De plus, un site de liaison de CRP hautement conservé est présent dans le promoteur mlc (Shin et al, J. Biol. Chem. 2001,276:28:25871-75). Dans des populations de Escherichia coli qui croissent dans un environnement limité concernant le glucose, on a trouvé des mutations polygéniques dans les gènes mgl, mlc et malT (Manch K. Genetics, 1999, 153 :1:5-12). Cependant, l'inactivation du gène m/c pour produire un L-aminoacide n'a pas été décrite. La présente invention a pour but d'augmenter le rendement de souches produisant un L-aminoacide et de fournir un procédé de production d'un L-aminoacide au moyen de ces souches. La demanderesse a considéré que le transport de glucides assuré par PTS peut constituer l'étape limitant la vitesse dans la surproduction de certains aminoacides et que l'inactivation du produit du gène m/c, qui régule négativement l'expression de gènes de PTS, semble être nécessaire pour augmenter la production d'aminoacides, et a constaté que l'inactivation du gène m/c codant le répresseur du métabolisme des glucides peut augmenter la production d'un L-aminoacide comme la L-thréonine dans une bactérie appartement au genre Escherichia. Ainsi, la présente invention concerne une bactérie produisant un L-aminoacide qui appartient au genre Escherichia et qui a été modifiée de manière que son gène m/c soit inactivé. De préférence, la bactérie produisant un L-aminoacide produit de la L-thréonine et, de préférence encore, cette bactérie a été modifiée pour augmenter l'expression de l'opéron L-thréonine. La présente invention concerne également un procédé de production d'un L-aminoacide qui comprend les étapes de culture de la bactérie précédente dans un milieu pour produire et accumuler le L-aminoacide en question dans le milieu et de collecte du L-aminoacide à partir du milieu. De préférence, dans le procédé selon la présente invention, le L-aminoacide est la L-thréonine. La bactérie selon la présente invention est une bactérie produisant un L-aminoacide appartenant au genre Escherichia qui a été modifiée de manière que son gène m/c soit inactivé. L'expression "bactérie produisant un L-aminoacide" utilisée ici désigne une bactérie capable de provoquer l'accumulation d'un L-aminoacide dans le milieu dans lequel la bactérie est cultivée. Cette capacité de production d'un L-aminoacide peut être conférée ou augmentée par culture. L'expression "bactérie produisant un L-aminoacide" utilisée ici désigne également une bactérie capable de produire et d'accumuler un L-aminoacide dans un milieu de culture en une quantité plus importante qu'une bactérie de type sauvage ou qu'une souche mère de E. coli, comme la souche K-12 de E coli. L'expression "bactérie appartenant au genre Escherichia" signifie que la bactérie est attribuée au genre Escherichia conformément à la classification familière à l'homme du métier en microbiologie. Le microorganisme appartenant au genre Escherichia qui est utilisé selon la présente invention peut être par exemple Escherichia coli (E. coli). Toutefois, la bactérie appartenant au genre Escherichia qui peut être utilisée selon la présente invention n'est pas limitée particulièrement et on peut mentionner par exemple les bactéries décrites par Neidhardt, F. C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1987, Vol. 2, p. 1208, tableau 1). L'expression "gène mlc inactivé" signifie que le gène m/c est modifié de telle manière qu'il code une protéine mutante ayant une moindre capacité de régulation ou une protéine totalement inactive. Elle signifie aussi que la région d'ADN modifiée est incapable d'assurer l'expression naturelle de la protéine Mlc du fait d'une délétion d'une partie du gène ou d'une modification d'une région adjacente du gène. L'inactivation du gène m/c codant le répresseur de PTS entraîne une augmentation de l'apport d'une source de carbone comme le glucose dans la cellule de la bactérie produisant un L-aminoacide. Le gène mlc code la protéine Mlc qui est un régulateur global du métabolisme des glucides. La séquence nucléotidique de gènes mlc provenant de différents organismes a été décrite. Parmi ces gènes, par exemple, le gène mlc de E. coli peut être utilisé dans la présente invention. Le gène mlc de E, coli (gi:16129552 ; numéros 1665368 à 1666588 dans GenBank numéro d'accès NC~000913.1) est situé entre les gènes bl593 et ynfL sur le chromosome de la souche K-12 de E coli et code la protéine Mlc de E coli (406 résidus d'aminoacides). Le gène mlc selon la présente invention inclut aussi un ADN codant une protéine ayant une séquence d'aminoacides incluant une substitution, une délétion, une insertion, une addition ou une inversion d'un ou plusieurs résidus d'aminoacides dans la séquence d'aminoacides codée par le gène mlc de E, coli, et est capable de réguler le métabolisme des glucides. Comme ADN de ce type, on peut mentionner par exemple un ADN qui peut être hybridé au gène mlc de coli dans des conditions stringentes ou un ADN ayant une homologie de 90 % ou plus, de préférence de 95 % ou plus, de préférence encore de 99 % ou plus, avec la séquence nucléotidique du gène mlc de E. coli. Les conditions stringentes sont par exemple des conditions dans lesquelles les ADN sont hybridés entre eux à une concentration de sel correspondant à des conditions normales de lavage en hybridation de Southern, c'est-à-dire 1 x SSC, 0,1 % SDS, de préférence 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, à 60 C. L'inactivation du gène peut être réalisée par des procédés conventionnels comme un traitement de mutagenèse utilisant une irradiation UV ou un traitement avec la nitrosoguanidine (N-méthyl-N'nitro-N-nitrosoguanidine), la mutagenèse dirigée, la rupture de gènes utilisant une recombinaison homologue et/ou la mutagenèse par insertiondélétion (Datsenko K. A. et Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97 :12:6640-45) qui peut être appelée également "intégration due à Red". La bactérie produisant un L-aminoacide selon la présente invention n'est pas limitée particulièrement et il peut s'agir par exemple d'une bactérie produisant de la L-thréonine. Ainsi, selon la présente invention, il est possible d'utiliser comme bactérie une bactérie produisant de la L-thréonine qui a été modifiée de manière que son gène mlc soit inactivé. Il est possible d'améliorer la bactérie selon la présente invention en augmentant l'expression d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la biosynthèse de la L-thréonine. De tels gènes sont par exemple les gènes de l'opéron L-thréonine, c'est-à-dire l'opéron thr, qui comprend de préférence le gène thrA mutant codant l'aspartokinase homosérine déshydrogénase I qui est résistant à une rétro-inhibition par la thréonine, le gène thrB qui code l'homosérine kinase, le gène thrC qui code la thréonine synthase. Une autre bactérie préférée est une bactérie qui est modifiée de manière à présenter une expression accrue du gène rhtA qui code une protéine transmembranaire supposée. Une autre bactérie préférée est une bactérie qui est modifiée de manière à présenter une expression accrue du gène aspC qui code l'aspartate aminotransférase (aspartate transaminase) (demande de brevet russe n 2002104983). Une bactérie particulièrement préférée est une bactérie qui est modifiée de manière à présenter une expression accrue du gène aspC, du gène thrA mutant, du gène thrB, du gène thrCet du gène rht4 et qui est modifiée de manière à inactiver le gène mlc. Comme souche mère de la bactérie selon la présente invention, il est possible d'utiliser des bactéries produisant de la L-thréonine appartenant au genre Escherichia comme la souche VKPM B-3996 de E, coli (brevet US n 5 175 107, brevet US n 5 705 371), la souche NRRL- 21593 de E. coli (brevet US n 5 939 307), la souche FERM BP-3756 de E. coli (brevet US n 5 474 918), les souches FERM BP-3519 et FERM BP-3520 de E. coli (brevet US n 5 376 538), la souche MG442 de E coli (Gusyatiner et al., Genetika (en russe), 14,947-956 (1978)), les souches VL643 et VL2055 de E. coli(EP 1 149 911 A). La bactérie selon la présente invention peut être obtenue par inactivation du gène mlc d'une bactérie ayant une aptitude inhérente à produire un L-aminoacide. A titre d'alternative, la bactérie selon la présente invention peut être obtenue en conférant l'aptitude à produire un L-aminoacide à une bactérie dont le gène mica déjà été inactivé. Les procédés de préparation d'ADN plasmidique, de digestion et de ligature d'ADN, de transformation, de sélection d'un oligonucléotide comme amorce et analogues peuvent être des procédés courants bien connus de l'homme du métier. Ces procédés sont décrits par exemple dans Sambrook, J., Fritsch, E. F., et Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Le procédé selon la présente invention est un procédé de production d'un L-aminoacide comprenant les étapes de culture de la bactérie selon la présente invention dans un milieu de culture pour produire et accumuler un L-aminoacide dans le milieu et de collecte du L-aminoacide à partir du milieu. De préférence, ce procédé est un procédé de production de L-thréonine qui comprend les étapes de culture de la bactérie selon la présente invention dans un milieu de culture pour produire et accumuler la L-thréonine dans le milieu et de collecte de la L-thréonine à partir du milieu. La culture, la collecte et la purification du L-aminoacide à partir du milieu peuvent être réalisées d'une manière similaire à un procédé de fermentation conventionnel dans lequel un aminoacide est produit au moyen d'une bactérie. Le milieu utilisé pour la culture peut être un milieu synthétique ou un milieu naturel à condition qu'il contienne une source de carbone, une source d'azote et des minéraux et, si nécessaire, des quantités appropriées de substances nutritives nécessaires pour la croissance de la bactérie. La source de carbone peut inclure différents glucides comme le glucose et le saccharose, et différents acides organiques. Selon le mode d'assimilation du micro-organisme utilisé, il est possible d'utiliser un alcool comme l'éthanol et le glycérol. Comme source d'azote, il est possible d'utiliser l'ammoniac et différents sels d'ammonium comme le sulfate d'ammonium, ainsi que d'autres composés azotés comme les amines, une source d'azote naturelle comme la peptone, un hydrolysat de soja et des micro-organismes à fermentation digérés. Comme minéraux, il est possible d'utiliser le monophosphate de potassium, le sulfate de magnésium, le chlorure de sodium, le sulfate ferreux, le sulfate de manganèse et le chlorure de calcium, par exemple. Comme vitamines, il est possible d'utiliser par exemple la thiamine et un extrait de levure. La culture est réalisée de préférence dans des conditions aérobies sous forme de culture secouée et de culture agitée sous aération, à une température de 20 à 40 C, de préférence de 30 à 38 C. Habituellement, le pH de la culture est situé entre 5 et 9, de préférence entre 6,5 et 7,2. Le pH de la culture peut être ajusté avec l'ammoniac, le carbonate de calcium, différents acides, différentes bases et des tampons. Habituellement, une culture de 1 à 5 jours conduit à l'accumulation du L-aminoacide voulu dans le milieu liquide. Après la culture, les solides comme les cellules peuvent être retirés du milieu de culture liquide par centrifugation ou filtration sur membrane, et le L-aminoacide peut ensuite être recueilli et purifié par échange d'ions, concentration et cristallisation. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui suit d'exemples non limitatifs et qui se réfère aux dessins annexés dans lesquels : la figure 1 indique la position relative des amorces mIcIL et mIcIR sur le plasmide pACYC184 utilisé pour l'amplification du gène cat; et la figure 2 illustre la construction d'un fragment d'ADN chromosomique comprenant un gène m/c inactivé. Exemple 1 : Construction d'une souche ayant un gène m/c inactivé 1. Délétion du gène m/c La délétion du gène mica été réalisée au moyen du procédé développé initialement par Datsenko et Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97(12), 6640-6645) et appelé "intégration due à Red". Ce procédé comprend la production des amorces de PCR mlcIL (SEQ ID NO : 1) et micIR (SEQ ID NO : 2), qui sont complémentaires de la région adjacente au gène m/c ou au gène conférant une résistance à un antibiotique au plasmide formant matrice, respectivement. Le plasmide pACYC184 (NBL Gène Sciences Ltd., UK) (numéro d'accès GenBank/EMBL X06403) a été utilisé comme matrice dans la réaction de PCR. Les conditions de PCR étaient les suivantes : étape de dénaturation pendant 3 min à 95 C ; profil pour les deux premiers cycles : 1 min à 95 C, 30 s à 34 C, 40 s à 72 C ; profil pour les 30 derniers cycles : 30 s à 95 C, 30 s à 50 C, 40 s à 72 C ; étape finale : 5 min à 72 C. Le produit de PCR de 935 pb obtenu (figure 1, SEQ ID NO : 3) a été purifié dans un gel d'agarose et utilisé pour l'électroporation de la souche MG1655 de E coli contenant le plasmide pKD46 ayant une aptitude à la réplication sensible à la température. Le plasmide pKD46 (Datsenko et Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45) inclut un fragment d'ADN de 2154 nucléotides (31088-33241) du phage , (numéro d'accès GenBank J02459) qui contient les gènes du système de recombinaison homologue # Red (gènes y, ss, exo) sous le contrôle du promoteur ParaB inductible par l'arabinose. Le plasmide pKD46 est nécessaire pour l'intégration du produit de PCR dans le chromosome de la souche MG1655. Des cellules électrocompétentes ont été préparées de la manière suivante : une culture d'une nuit de la souche MG1655 de coli cultivée à 30 C dans du milieu LB additionné d'ampicilline (100 ml/1) a été diluée 100 fois avec 5 ml de milieu SOB (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) contenant de l'ampicilline et du L-arabinose (1 mM). La culture obtenue a été cultivée sous aération à 30 C jusqu'à une D0600 d'environ 0,6 après quoi elle a été rendue électrocompétente en étant concentrée 100 fois et elle a été lavée trois fois avec de l'eau désionisée glacée. L'électroporation a été réalisée avec 70 l de cellules et environ 100 mg de produit de PCR. Après l'électroporation, les cellules ont été incubées avec 1 ml de milieu SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) à 37 C pendant 2,5 h, après quoi elles ont été étalées sur des boîtes de L-gélose et cultivées à 37 C pour sélectionner les recombinants CmR (résistant au chloramphénicol). Puis, pour éliminer le plasmide pKD46,2 passages sur L-gélose contenant du chloramphénicol à 42 C ont été réalisés et les colonies obtenues ont été testées en ce qui concerne la sensibilité à l'ampicilline. 2. Vérification de la délétion du gène mlc par PCR Les mutants contenant la délétion du gène m/c, marqués avec le gène de résistance à Cm, ont été vérifiés par PCR. Les amorces spécifiques de locus mIcPL (SEQ ID NO : 4) et mIcPR (SEQ ID NO : 5) ont été utilisées en PCR pour la vérification. Les conditions de la vérification par PCR étaient les suivantes : étape de dénaturation pendant 3 min à 94 C ; profil pour les 30 cycles : 30 s à 94 C, 30 s à 52 C, 2 min à 72 C ; étape finale : 7 min à 72 C. Le produit de PCR obtenu dans la réaction avec l'ADN des cellules de la souche mère MG1655 Mlc+ à titre de matrice avait une longueur de 1492 nucléotides (figure 2, SEQ ID NO : 6). Le produit de PCR obtenu dans la réaction avec l'ADN des cellules de la souche mutante MG1655 Amlc::cat à titre de matrice avait une longueur de 1191 nucléotides (figure 2, SEQ ID NO : 7). 3. Construction d'une souche produisant de la L-thréonine ayant un gène mlc inactivé La souche de E coli TDH7/pRT614 (VKPM B-5318, brevet US n 6 132 999) produisant de la L-thréonine a été transduite pour présenter une résistance à Cm par le processus standard de transduction de P1 (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). La souche MG1655 Amlc::cat a été utilisée comme donneur. On a vérifié par PCR que la souche résultante TDH7Amlc::cat/pRT614 avait une délétion #mlc::cat au moyen des amorces mIcPL (SEQ ID NO : 4) et mIcPR (SEQ ID NO : 5). La souche de E. coli VKPM B-5318 a été déposée dans la collection de cellules de microorganismes du All-Union Research Institute of Antibiotics (N de dépôt 2070) et aussi dans la National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) à 113545 Moscou, 1 Dorozhny Proezd, 1 (N de dépôt VKPM B-5318) le 3 mai 1990. Exemple 2 : Production de L-thréonine par une souche de E. coli ayant un gène m/c inactivé. Les souches de E co/iTDH7/pRT614 et TDH7#mlc::cat/pRT614 ont été cultivées pendant 18 à 24 h à 37 C sur des boîtes de L-gélose contenant de la streptomycine (50 g/ml). Puis, une anse de cellules a été transférée à 50 ml de bouillon L de composition suivante : tryptone : 10 g/1, extrait de levure : 5 g/1, NaCI : 5 g/1. Les cellules (50 ml, D0540 : 0,12 u.o.) cultivées à 37 C pendant 4 h sur une secoueuse (140 tr/min) ont été utilisées pour ensemencer 450 ml de milieu pour la fermentation. La fermentation par lots a été réalisée dans un fermenteur de laboratoire ayant une capacité de 1,0 # sous aération (1/1 wm) sous agitation à une vitesse de 1200 tr/min à 39 C. Le pH a été maintenu automatiquement à 6,6 avec de l'ammoniaque à 8 %. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous. La composition du milieu de fermentation (g/1) était la suivante : Glucose 100,0 NH4CI 1,75 KH2P04 1,0 MgS04, 7H20 0,8 FeS04, 7H20 0,01 MnS04, 5H2O 0,01 Mameno (dénomination commerciale) 0,15 Bétaïne 1,0 Le glucose et le sulfate de magnésium ont été stérilisés séparément et le pH a été ajusté à 6,6. Tableau 1 Souche Quantité de Rendement DCW, g/1 Durée de thréonine, % culture, h g/l TDH7/pRT614 12,6 13,3 16,6 22,8 TDH7mlc::cat/pRT614 16,9 18,2 16,8 21,7 Comme le montre le tableau 1, l'inactivation du gène m/c améliorait l'accumulation de L-thréonine par la souche productrice de Lthréonine TDH7/pRT614. REVENDICATIONS 1. Bactérie produisant un L-aminoacide appartenant au genre Escherichia, caractérisée en ce que ladite bactérie a été modifiée pour inactiver le gène m/c. 2. Bactérie selon la revendication 1, caractérisée en ce que le L-aminoacide est la L-thréonine. 3. Bactérie selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle a été modifiée pour augmenter l'expression de l'opéron L-thréonine. 4. Procédé de production d'un L-aminoacide, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de culture de la bactérie selon l'une quelconque des revendications précédentes dans un milieu pour produire et accumuler ledit L-aminoacide dans le milieu et de collecte du L-aminoacide à partir du milieu. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le L-aminoacide est la L-thréonine.