Brevet FR2836927A1 — publié le 20030912

La présente invention concerne l'identification de mutations et de polymorphismes du gène de l'acétyl-Coenzyme A-carboxylase-a (ACC-a), et leur application diagnostique pour la détection d'une susceptibilité au cancer, en particulier du cancer du sein et/ou de l'ovaire. Le cancer du sein est une affection très fréquente, qui touche près de 10 % des femmes du monde occidental. Dans les familles prédisposées, la transmission du risque se fait selon un mode autosomal dominant (Ford D. et al., 1998), et les tumeurs mammaires sont fréquemment associées à d'autres cancers, notamment le cancer de l'ovaire. L'étude de familles prédisposées a permis d'identifier deux gènes majeurs de prédisposition au cancer du sein : BRCAL, localisé en 17q21 (Miki Y. et aL, 1994) et BRCA2, localisé en 13q12-13 (Wooster R. et al., 1995). La majorité des cas familiaux de cancers du sein et/ou de l'ovaire sont liés à des mutations du gène BRCA1 (Ford D. et al., 1998). La protéine BRCA1 et le gène codant pour cette protéine sont décrits dans les demandes de brevet EP 699 754 et EP 705 902. La fonction de la protéine BRCA1 est encore mal connue et l'étude de sa localisation cellulaire a fait l'objet de controverses. Seuls deux domaines remarquables de cette protéine ont été mis en évidence : un domaine en doigts de zinc à l'extrémité amino-terminale (Miki Y. et al., 1994), et un domaine BRCT (BRCA 1 C-terminale) à l'extrémité carboxy-terminale (Koonin E. V. et al., 1996 ; Callebaut 1. et Mornon J. P., 1997 ; Bork P. et al., 1997). Une étude plus approfondie (Callebaut 1. et Mornon J. P., 1997) a permis de montrer que le domaine BRCT est constitué par la duplication d'un module d'une centaine d'acides aminés comportant des séquences très conservées. Ce module BRCT est retrouvé au sein d'une quarantaine de protéines présentes dans diverses espèces (Bork P. et al., 1997). Parmi les protéines à BRCT dont la fonction est caractérisée, la plupart sont impliquées dans les mécanismes de réparation de l'ADN et de contrôle du cycle cellulaire. Des travaux préalables des inventeurs portant sur le rôle fonctionnel de BRCA1 ont permis de mettre en lumière une nouvelle interaction protéine-protéine impliquant d'une part la protéine BRCAL, plus particulièrement le domaine BRCT, et, d'autre part, l'acétyl-Coenzyme A-carboxylase-a (ACC-a). L'ADNc de ACC-a humain (SEQ ID n 129) a été cloné en 1995 par Abu-Elheiga et al. Sa séquence est très conservée chez l'homme, le rat, le poulet et la levure, en particulier au niveau des sites de liaison à la biotine, à l'ATP et au coenzyme A. La séquence protéique de ACC-a humaine est indiquée par SEQ ID n 130. L'ACC-a est une enzyme cytoplasmique de 265 kDa, impliquée dans le contrôle de la biogenèse des acides gras à chaîne longue. Plus spécifiquement, l'ACC-a catalyse la conversion d'acétyl CoA en malonyl CoA, une réaction qui constitue la première étape dans la voie de synthèse des acides gras. La synthèse d'acides gras par les cellules tumorales, en particulier si elle est indépendante de signaux de régulation, pourrait constituer une source d'énergie significative pour la prolifération de ces cellules. Dans ce sens, des travaux récents se sont attachés à étudier le rôle de la synthase d'acides gras (Fatty Acid Synthase, FAS) dans les processus tumoraux (Kuhajda F. P., 2000). La FAS est en effet l'enzyme principale de cette voie de synthèse puisqu'elle réalise la transformation terminale produisant l'acide gras palmitat. D'autre part, l'activité carboxylase de ACC-a étant partagée par d'autres enzymes, telles que la pyruvate carboxylase ou la propionyl CoA carboxylase, l'ACC-a n'a pas été considérée comme une cible de choix dans les études portant sur le rôle de la voie de synthèse des acides gras dans les processus tumoraux. L'identification in vivo de l'existence d'un complexe endogène BRCA1/ACC-a, associée au fait que des mutations familiales du gène BRCA1 identifiées comme facteur de prédisposition au cancer bloquent la formation de ce complexe, a conduit les inventeurs à rechercher si le gène ACC-a constitue en tant que tel un facteur de risque de développement d'un cancer, notamment par l'intermédiaire de son interaction avec BRCA 1. Ainsi, la recherche de mutations germinales du gène ACC-a dans une série de cas familiaux de cancer du sein et/ou de l'ovaire a-t-elle mis en évidence deux altérations, 4213 C > G et 6812 C > T, provoquant une substitution d'un acide aminé pour un autre dans la séquence protéique : Leu1405Vai et Ala2271Vai. Ces mutations n'ont pas été détectées sur 280 chromosomes de la population générale. Par ailleurs, l'identification de nombreux variants polymorphes dans le gène ACC-a a permis d'effectuer une étude cas-témoins comparant la fréquence de ces polymorphismes chez des femmes atteintes de cancer du sein et dans une population témoin. Cette étude a montré que certains polymorphismes du gène ACCa sont associés à une augmentation (1866+67T > C OR=1,766 (1,178-2, 648)) ou une diminution (610-16T > C OR= 0,537 (0,311-0, 927)) du risque de développer un cancer du sein. Dans le cadre de la présente demande, les positions des mutations ou polymorphismes du gène ACC-a sont indiquées d'après la nomenclature de Dunnen et Antonarakis (2000). Brièvement, selon cette nomenclature, les substitutions sont indiquées par le symbole " > ", "G > 1" indiquant que G est remplacé par T. Les délétions sont désignées par"del", les insertions par"ins". Les mutations introniques sont indiquées par le numéro d'intron précédé de"IVS", ou par une position dans l'ADNc, suivi d'un nombre positif ou négatif. Le nombre positif indique la position par rapport au G du site donneur d'épissage GT. Le nombre négatif indique la position par rapport au G du site accepteur d'épissage AG. En l'absence de toute autre précision, le terme"mutation"ou "altération" utilisé ci-dessous désigne indifféremment un polymorphisme, une mutation germinale ou une mutation somatique. L'invention a donc pour objet une méthode de diagnostic in vitro d'un cancer ou risque de cancer chez un individu, dans laquelle on détecte une altération de la séquence du gène ACC-a ou de l'expression de ACC-a, par rapport à une population contrôle, ladite altération étant indicative d'un cancer ou d'un risque accru de développer un cancer. Le sujet de la méthode de diagnostic selon l'invention est généralement un être humain, mais cette méthode peut également être étendue à tout mammifère, le cas échéant. Préférentiellement, ledit cancer est un cancer du sein ou de l'ovaire. Dans le cadre de la présente invention,"une altération de l'expression de ACC-a"indut une variation positive ou négative du niveau d'expression du gène ACC-a ou de la protéine ACC-a. Le niveau d'expression du gène ACC-a peut être déterminé par mesure de la quantité de transcrits (ARNm) par tout moyen connu, tel que Northern Biot ou TaqMan. La quantité de protéine exprimée peut être évaluée par des techniques quantitatives ou semi-quantitatives tel que le Western Blot, ou par mesure de l'activité enzymatique, en quantifiant la carboxylation de l'acetyl CoA en malonyl CoA. Des protocoles de mesures de l'activité catalytique d'une enzyme donnée sont notamment décrits dans des manuels tels que Methods in Enzymology (Colowick S. P., Kaplan N. O. et autres, 1955 et suite) bien connus de l'homme du métier. De telles analyses peuvent être effectuées dans les tissus cibles, par exemple à partir d'une biopsie mammaire ou de l'ovaire, à partir d'extraits de ces tissus, ou à partir d'autres matériels biologiques tels que des prélèvements sanguins. Selon un mode particulier, la méthode de diagnostic selon l'invention recherche une altération germinale de la séquence du gène ACC-a et/ou de la séquence du promoteur de ce gène, ladite altération étant indicative d'une prédisposition à développer un cancer. Préférentiellement un polymorphisme 1866+67T > C ou 610-16T > C dans le gène ACC-a ou en une altération germinale produisant une substitution Leu1405Vai ou Ala2271Vai dans la séquence de la protéine ACC-a peuvent être recherchés. Selon un autre aspect, la méthode de diagnostic recherche une altération somatique de la séquence du gène ACC-a et/ou du promoteur de ce gène dans un échantillon biologique, ladite altération étant indicative d'une tumeur prénéoplasique ou néoplasique. Ledit échantillon biologique peut être un prélèvement de tissu, un prélèvement sanguin ou tout autre échantillon biologique permettant d'obtenir l'ADN génomique. La mise en évidence d'un allèle ou d'une altération somatique ou germinale (mutation) de ACC-a tels que mentionnés ci-dessus peut se faire selon différentes méthodes bien connues de l'homme du métier. Cette mise en évidence comprend en général deux étapes principales que sont l'extraction d'un échantillon de l'ADN génomique et la détection de l'allèle variant. Avantageusement, l'ADN extrait est amplifié par toute méthode connue en soi, telle que la méthode PCR (polymerase chain reaction), avant analyse de la variation allélique. Il existe un grand nombre de méthodes analytiques qui peuvent être utilisées pour détecter une altération germinale ou somatique de la séquence du gène ACC-a telle que précédemment décrite. La détection peut être effectuée par une méthode automatisée ou par une méthode visuelle directe. En général, cette détection requiert une technique de détection de mutation, éventuellement une réaction d'amplification et optionnellement un système de génération de signal. Ainsi, cette détection de variants peut être réalisée en mettant en oeuvre une ou plusieurs méthodes de différents types, telles que notamment : - méthodes de séquençage, telles que le séquençage direct d'ADN, le séquençage par hybridation (avec utilisation de sondes d'oligonucléotides), - méthodes basées sur l'hybridation, telles que l'hybridation spécifique d'allèle (ASO), la technique de 5'-exonucléase (Taqman), l'hybridation sur puces à ADN (microarrays ou oligo-chips), - techniques de ligation, telles que la technique de ligation d'oligonucléotides (OLA), - techniques d'incorporation, tel que le miniséquençage , - techniques physico-chimiques, telles que la chromatographie liquide à haute pression en conditions dénaturantes (DHPLC), la spectrométrie de masse, - les techniques avec enzymes de restriction, telles que la PCR générant des sites de restriction ou la technique RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Cette mise en évidence d'un variant peut comprendre plus particulièrement les étapes suivantes : - extraction d'un échantillon de l'ADN génomique d'un sujet ; - amplification de l'ADN ; - éventuellement transfert de l'ADN amplifié sur un support de détection du variant ; - détection du variant. La présente invention concerne également les moyens utilisés pour la détection d'une altération germinale ou somatique de la séquence du gène ACC-a. La présente invention concerne ainsi un acide nucléique (ADN ou ARN) isolé comprenant une séquence partielle du gène ou de l'ADNc de ACC-a, dans laquelle une mutation associée à un cancer ou d'un risque accru de développer un cancer est présente. Préférentiellement, ladite mutation est un polymorphisme sélectionné parmi le groupe constitué de 360+86 T > C, 361-22 C > T, 610-16 T > C, 692-37 T > G, 898-3 A > C, 1009-29 G > A, 1009-18 insT, 1866+67 T > C, 2052+59 G > T, 2921+50 delC, 3364-10 T > C, 3597-45 C > A, 4048-92 T > G, 4048-60 T > C, 4090-16 T > C, 4090-29 G > A, 4666-7 C > G, 5713-84 T > C, 5713-75 G > A, 5931-32 A > G, 6164- 30 T > A et 1812 A > G, et ladite mutation est sélectionnée parmi le groupe constitué de 4213 C > G et 6812 C > T. Préférentiellement encore, ledit polymorphisme est sélectionné parmi le groupe constitué de 1866+67T > C ou 610-16T > C. En particulier, un acide nucléique selon l'invention comprend une séquence partielle du gène ACC-a contenant le nucléotide 1866+67 C ou 610-16 C, ou une séquence partielle du gène ACC-a ou de l'ADNc de ACC-a contenant le nucléotide 4213 G ou 6812 T. La séquence partielle du gène ou de l'ADNc de ACC-a présente au moins 13 bases, de préférence au moins 17 et encore mieux au moins 30. De préférence, elle présente moins de 200 nucléotides et préférentiellement encore moins de 100 bases. L'acide nucléique selon l'invention peut être d'origine naturelle ou être synthétisé par des techniques bien connues de l'homme du métier. Selon un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique isolé selon l'invention peut être amplifié à l'aide d'un couple d'amorces choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquence SEQ ID n01 à 128. Un acide nucléique comprenant une séquence partielle du gène ou de l'ADN de ACC-a, dans laquelle une mutation associée à un cancer ou à un risque accru de développer un cancer est présente, est utile pour détecter la présence de mutations dans la séquence du gène ACC-a. Les exemples suivants illustrent l'invention : Exemple 1 : Analyse des altérations germinales du gène ACC-a : Identification de la structure exon-intron du gène ACC-A : La structure génomique de ACC-a n'a pas été caractérisée jusqu'à présent. Seules les séquences du transcrit de ACC-a ont été caractérisées et la séquence codante et celle de 5'UTR (untranslated region) ont été décrites dans la littérature (Abu-Elheiga L. et al., 1995 ; Ha et al., 1994). Le criblage des bases de données GenBank (htgs database, http ://www. ncbi. nlm. nih. gov : 80/BLAST/) a permis d'identifier plusieurs clones contenant les séquences génomiques humaines du chromosome 17 homologues à l'ADNc de ACC-a (AC002346, AC007900, AC068400, AC016482, AC016482, AC027803, AC023315). La structure exon-intron de ACC-a a été établie par alignement de ces clones sur l'ADNc de ACC-a : la partie codante (7041 nucléotides) (Ntvt000664, U19822), les séquences 5'UTR décrites par Ha et al (1994), ainsi que celles identifiées dans la base EST (AA972009, AW188201, A1911311, BF154865, A1566190, AV699661). Cette analyse a indiqué que le gène ACC-a comprend au moins 3 exons non-codants contenant les séquences 5'UTR et 54 exons codants, dont le dernier contient la région 3'UTR d'après l'analyse de sa séquence. La séquence 3'UTR a été déterminée sur la base des nombreuses EST correspondant à cette région identifiées parmi des EST humains de GenBank. La région 3'UTR de ACC-a contient deux signaux de polyadénylation dont le premier se trouve à 1838 paires de bases et le deuxième à 2300 paires de bases du codon Stop. Les amorces permettant, à partir de l'ADN génomique, l'amplification par PCR des fragments contenant des exons du gène ACC-a sont décrites dans le Tableau 1. Méthodes de détection des altérations du gène ACC-a.: La connaissance de la structure exon-intron du gène ACC-a a permis de rechercher ses altérations au niveau de l'ADN génomique. La totalité de la séquence codante et les séquences introniques entourant chacun des exons codant du gène ACC-a ont été analysées pour la présence de variants par la méthode des hétéroduplex (Sinilnikova et al., 1999) sur l'ADN génomique extrait à partir de prélèvements sanguins. Une amplification par PCR des fragments contenant des exons entourés de séquences 5'-et 3'-introniques de 100 à 200 nucléotides chacune est effectuée à l'aide des amorces de séquence SEQ ID n01 à 128 et de Taq Platinum Polymerase (Gibco Life Technologies). L'amplification s'effectue selon le protocole standard, mais en présence de dATP marqué à l'isotope 33p (Amersham). Les produits de PCR sont dénaturés pendant quatre minutes à 98 C et subissent ensuite un retour progressif à la température ambiante pendant 30 minutes afin de favoriser la renaturation des fragments simple brin d'ADN. Lorsqu'il existe une altération sur l'un des allèles amplifiés, trois sortes de fragments double brin sont générés : les homoduplex de séquence sauvage, les homoduplex de séquence mutée et les hétéroduplex. La migration des produits de PCR est réalisée dans l'appareil d'électrophorèse verticale (Gibco Life Technologies), dans le gel MDE (TEBU), le tampon TBE 0,6X, à 11 mA. Après la migration, le gel est séché à 80 C sous vide (Bio-Rad) et ensuite autoradiographié (film Kodak BioMax M) à température ambiante. Tableau 1. Amorces permettant l'amplification par PCR des fragments contenant des exons du gène ACC-a à partir de l'ADN génomique. Fragment de PCR Exon Région Amorce sense SEQ ID n"Amorce anti-sense SEQ ID n' (pb) A 5'UTR GGATAACGTTCCCATCTCCA 1 AATTTATCAAAGGCAGACTTCTAAA 2 611 B 5'UTR ATCGGCATCGCCTCACAT 3 CCGATCTGGATAGTGTGGAG 4 500 C 5'UTR ATGCTGAGCAAAACAGGAAT 5 AACACAAAAGCCTACAGTTTGAT 6 213 1 codant TCCACGTCTCAGCTATGGTT 7 AGGAAAAGGCAAAGCAGTCT 8 463 2 codant CTTCACAGGATGCAGTTGTG 9 GGAGGCAGAAAGGCTAAAAT 10 381 3 codant TCTTTTCCTCCA TTGTTGCT 11 TTGGAAGTCCTATGTTTGGG 12 316 4 codant TAATGCTGTTTGTCCTGTGG 13 AGATATCCCCTTGTGCCTAA 14 299 5 codant TGTACCTCAAGAAACAGGGC 15 GAGCCCAGCACATGTTAAAC 16 283 6 codant GGGGAGGACAAGACAAATACAT 17 TTCAAAAGAGGTAAGTCCCAAA 18 283 7 codant CATCCACTCTCAGTTTTGGG 19 GTACATATCACGAGCCAGGC 20 309 8 codant TTAAAGGGAGAAAAATGCCAGT 21 TTTCTGGGCATCCAAATTATAG 22 282 9 codant GGACATCTGCTTGTTGAAATCA 23 GAATCGTTGCTTAAAATGCCAT 24 407 10 codant TCAGTGAGAGGCTGTAGTGGTC 25 TGTGACTCAGATAGGAGGTGCT 26 352 11 codant GAATGTTTTAGGGAGTGGCTCC 27 GTTTCCCACTCCAGAGGAAGTC 28 386 12 codant TGGCCTTTATCATTTTTGTGTG 29 ACAGCAGATGATTCCTATTCCC 30 386 13 codant GCCTCCCAAAGTGTTAGGAT 31 TTTCCAGGTAGATCAAGAACCA 32 363 14 codant TGGAGATTTTCATTGCTAGCTG 33 AATGGGTCTTTGAGCTTCAGTC 34 295 15 codant GGAAATGCTACAATCAATAATGTT 35 CAGGACACTGACAAAAATAATGA 36 306 16 codant TTCATTTGGAGCTGTACCTGG 37 ACAAATGAGTACCAAGAAAAGCCT 38 308 17 codant TCAGGATTTTTTTTCTTTGAAGGT 39 AGTGGTAGGATTACAGGCACAAG 40 378 18 codant GTCAAATTAGGTGTGGTCCAAC 41 AGCTAAAGAAAACACTGGCAAA 42 352 19 codant TTGACTTCCCTCCTGGTAGC 43 AAACAGCTTTCTTTTCCTCCC 44 382 20 codant GGGTTCCGTAGGGCTCAAGT 45 CTGAGGCAGTTTTGTGAGGAAT 46 496 Fragment de PCR Exon Région Amorce sense SEQ ID n Amorce anti-sense SEQ ID n"(pb) 21 codant AGATTCCTACTGGTCGTGCTATA 47 TGCTTTCCAATTTCTTGAAGTC 48 321 22 codant TGGAATGTCGTGGAGGTAAAT 49 GTTGACAGGAGGGGGCTTAG 50 307 23 codant TTTCTTCTCACTGCTCGTCTCA 51 CTCTGGCCATAGCCATCAAA 52 334 24 codant CTTCTTTACCACATTGTTTAGGG 53 CATTTGTTCTGAGGAAAACGTGA 54 419 25 codant TCTGTTTTATCTGTGATGCCTG 55 GAGGTAAGAGTCCAGATAGGCAG 56 296 26 codant GGCACAGAGAGATTATGGCATT 57 AAGGCCAGAGAACTAGAACTGAC 58 318 27 codant TCTCCCCACAGAGCACCTT 59 TGTTCATTTTTTGCCCTACATTT 60 354 28 codant CAGAGCTGCCAAACTGGAGC 61 GCTCAGGACTCCCTAGCAGATAA 62 269 29 codant CTCTGCAACCTGACCCTACTTC 63 AAGATGAGACCCCAAAACACAG 64 328 30 codant TTGAGCCCAGGCTAAGATAGATT 65 GGGTAAAAGGATGAATTCTTTCC 66 318 31 codant GGCAGTGGTTTCAATTTGCT 67 CAGCCAGTAGAAAGGGGACA 68 323 32 codant AGGGCCGAATGGGATAAAAT 69 AAGTTGTAGCAGCAGCATAAGAAA 70 186 33 codant TTGTTACTAATTGCCAACTTCTGC 71 TCCCAAAGTGCTGGGATTAC 72 269 34 codant GTGATGGTTATGCGGAGGAT 73 AGGCAACAGGAAGCACAAGT 74 345 35 codant TGTAGCTCATTTTTGTTGCTCA 75 TGTTCTCTCTCAGCAGAAGCATA 76 452 36 codant CTTCACCAAGTGCCTTATGATTC 77 CCTGTTTCCAAGTCCAAGTGAG 78 358 37 codant TGCATCTCCACAAACCAACCTC 79 TGGGTCTTCTATAACAAGGACG 80 404 38 codant TGTGCAAAAAAAGCCCCTCTAG 81 TTCTAGCCAAAACCGCATCTGA 82 320 39 codant GGAAAAGAAGGCAAAACCAGAT 83 CCAACAAGACTACCATGCTCCA 84 351 40 codant TTTGTAGTTTCCCACAGGGAGTT 85 GGTGTCTTAAGGAATTTTCACAAA 86 577 41 codant AAACCTAAGAAGTGATGTGGCA 87 TTCTTCAAGGTTATGAACAGCTG 88 321 42 codant GCACATAAAGCCCTGGCATTA 89 AATGCTCTCATTTGGGACTGAG 90 351 43 codant TGTGTGTGTTGTTGTCAATCAA 91 GTCAATGGGCAGCAAAAGAT 92 410 44 codant TAGTCCCTCAGAACAACCAACC 93 AGAAGGCAAAATATGGCTGTAAG 94 455 45 codant TAGGATTCTTCCAGCTGAAGATTG 95 AGGGCTGGTTTTCAGGTCTTTCT 96 413 46 codant CCCCAAAATAATCCCCCAAAC 97 TGGGCATGGCTATAATCCAATA 98 337 47 codant TCCCCTGCTCTCTGTGTTTGT 99 TCCTGATGTATTCACAGGCAC 100 294 48 codant CCAAACATGATGATCTTGATGAA 101 GTCTCAGAGAGGGCAGAATCC 102 420 49 codant ATAAGGAGGCTCTTCGTGGC 103 TTTGGAATCACAGGATGTGG 104 394 Fragment de PCR Exon Région Amorce sense SEQ ID n"Amorce anti-sense SEQ ID no (pb) 50 codant GTCTACAAATTGTAACTGGCCTCA 105 TCAAATGCTTCAGTGCCTCCTC 106 300 51 codant GATGTTGAGCTTCCCGTGAT 107 GCTTATGAGCCTGTGTGCAA 108 326 52 codant TTTCCCTCCAGACTGAGCAT 109 GACTCTTTGCTGGCGAGACT 110 320 53 codant ACGGAGCACACTTTTGGAGT 111 TCCAAAGAAATTAGCCCTCCT 112 295 54-1 codant GGGCAGTTCTTTAGCTGTCCT 113 GGTCTCCTGTGCCTTCTCAT 114 296 54-2 3'UTR CGGGCAGAAGTCATAAGGAT 115 GTGCAGGGAGTGGAGGACTA 116 306 54-3 3'UTR TCCTCTCGTTTCAGGTTATGC 117 GCTCACAGTTTTGCCCTCAT 118 504 54-4 3'UTR AGGCACTGGAGAGGAATGAT 119 TGAGTGTGGAGGCACCATTA 120 511 54-5 3'UTR TGTGGAGAGCCAGTGAGATAGA 121 GCAGTTAGCTGCACTAAAGGAA 122 516 54-6 3'UTR CAAGAAAAGAACTTACTGATTCCTCTG 123 AAGCAAATAGCCAGCAATGG 124 457 54-7 3'UTR CCTGGTGGAAGGTACAGGTG 125 CATAATTTGGTGGGGAGAGG 126 288 54-8 3'UTR CTGTCCAGGCATGTCTTCAG 127 ACTGAGCCCCTGCTGAAAG 128 498 Tous les échantillons présentant des anomalies dans ce test ont été ensuite séquencés afin d'identifier l'altération détectée par analyse des hétéroduplex. La réaction de séquençage est effectuée à l'aide de la trousse Big Dye Terminator (Applied Biotechnologies). L'analyse électrophorétique est réalisée dans l'appareil ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). - Echantillons testés : La recherche de mutations et de polymorphismes du gène ACC-a a été effectuée sur l'ADN génomique de 66 individus appartenant aux 43 familles présentant des cas multiples de cancer du sein et/ou de l'ovaire. Ces familles avaient un résultat négatif au test de recherche des mutations germinales des gènes de prédisposition au cancer du sein BRCA1 et BRCA2. La fréquence des variants polymorphes du gène ACC-a a été analysée dans une étude cas-témoins. Le groupe de cas est constitué de 372 cas incidents de cancer du sein invasif diagnostiqués chez les femmes avant l'âge de 46 ans. Le groupe de témoins correspond à 206 échantillons issus de la population générale. La méthode de chi2 a été utilisée pour l'analyse statistique des données de l'étude castémoins. Exemple 2 : Mutations germinales et variants polymorphes du gène ACC-a associés au cancer du sein : La recherche de mutations et de polymorphismes du gène ACC-a a été effectuée sur l'ADN génomique de 66 individus appartenant aux 43 familles présentant des cas multiples de cancer du sein et/ou de l'ovaire. Cette analyse a démontré une conservation extrêmement forte de la séquence codante du gène, étant donné que 21 sur 22 des polymorphismes identifiés ont été trouvés dans les séquences introniques (360+86 T > C, 361-22 C > T, 610-16 T > C, 692-37 T > G, 898-3 A > C, 1009-29 G > A, 1009-18 insT, 1866+67 T > C, 2052+59 G > T, 2921+50 delC, 3364-10 T > C, 3597-45 C > A, 4048-92 T > G, 4048-60 T > C, 4090-16 T > C, 4090-29 G > A, 4666-7 C > G, 5713-84 T > C, 5713-75 G > A, 5931- 32 A > G, 6164-30 T > A). Le changement nucléotidique du seul polymorphisme se trouvant dans la région codante (1812 A > G Gln604Gln) n'induit pas de changement de l'acide aminé concerné. Les polymorphismes introniques situés dans les éléments régulateurs de l'épissage peuvent être associés à une efficacité et une spécificité tissulaire différentes de l'épissage du transcrit (Mendell et Dietz, 2001). Deux mutations germinales du gène ACC-a provoquant une substitution d'un acide aminé pour un autre dans la séquence protéique (Leu1405Val et Ala2271 Val) ont été découvertes dans la série de familles de cancer du sein analysée. Ces mutations n'ont pas été détectées sur 280 chromosomes de la population générale. La fréquence des polymorphismes identifiés a été comparée dans une étude cas-témoins chez des femmes atteintes de cancer du sein et dans une population témoin. Cette étude a montré que le polymorphisme intronique du gène ACC-a 1866+67T > C est plus fréquent chez les femmes atteintes (114 sur 366) que dans la population témoin (42 sur 206) : OR=1, 766, intervalle de confiance de 95 % (1, 178-2, 648). Un autre polymorphisme intronique 610-16T > C, a été trouvé moins fréquemment chez les femmes atteintes (44 sur 372) que dans la population témoin (24 sur 120) : OR=0, 537, intervalle de confiance de 95 % (0, 311-0, 927). Ces résultats son statistiquement significatifs et indiquent que les allèles de ACC-a 1866+67C et 610-16C sont associés aux variations du risque de développer un cancer du sein. BIBLIOGRAPHIE Ford D. et al. (1998). Genetic heterogeneity and penetrance analysis of the BRCA 1 and BRCA2 genes in breast cancer families. Am. J. Hum. Genet. 62 : 676-689. Miki Y. et al. (1994). A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA 1. Science. 266 : 66-71. Wooster R. et al. (1995). Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2. Nature. 378 : 789-792. Koonin E. V. et al. (1996). BRCA1 protein products : Functionnal motifs. Nat. Genet. 13 : 267-269. - Callebaut 1. et Mornon J. P. 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Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle on recherche une altération germinale de la séquence du gène ACC-a et/ou de la séquence du promoteur de ce gène, ladite altération étant indicative d'une prédisposition à développer un cancer. 4. Méthode selon la revendication 3, dans laquelle ladite altération consiste en un polymorphisme 1866+67T > C ou 610-16T > C dans le gène ACC-a ou en une altération germinale produisant une substitution Leu1405Vai ou Ala2271Vai dans la séquence de la protéine ACC-a. 5. Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle on recherche une altération somatique de la séquence du gène ACC-a et/ou du promoteur de ce gène dans un échantillon biologique, ladite altération étant indicative d'une tumeur pré-néoplasique ou néoplasique. 6. Acide nucléique isolé comprenant une séquence partielle du gène ou de l'ADNc de ACC-a, dans laquelle un polymorphisme sélectionné parmi le groupe constitué de 1866+67T > C ou 610-16T > C est présent. 7. Acide nucléique selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite séquence partielle du gène ACC-a contient le nucléotide 1866+67 C ou 610-16 C. 8. Acide nucléique isolé comprenant une séquence partielle du gène ou de l'ADNc de ACC-a, dans laquelle une mutation sélectionnée parmi le groupe constitué de 4213 C > G et 6812 C > T est présente. 9. Acide nucléique selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite séquence partielle de l'ADNc de ACC-a contient le nucléotide 4213 G ou 6812 T.