Brevet FR2835255A1 — publié le 20030801

La présente invention concerne un test pour identifier des inhibiteurs des bêta-sécrétases, qui comprend les étapes consistant à immobiliser une protéine bêta-sécrétase sur un support solide, à la mettre en contact avec un composé à tester en présence d'un inhibiteur de bêta-sécrétase marqué, et à comparer le niveau de liaison de l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué en présence et en l'absence du composé à tester, afin d'évaluer si le composé à tester est un inhibiteur des bêta-sécrétases. De plus, la présente invention concerne un procédé de criblage d'inhibiteurs des bêta-sécrétases, de nouveaux inhibiteurs de bêtasécrétases et leur utilisation en tant qu'inhibiteurs de bêta-sécrétases marqués pour l'identification d'inhibiteurs de bêta-sécrétases, un système pour identifier des inhibiteurs de bêta-sécrétases, ainsi que de nouveaux inhibiteurs de bêta-sécrétases pour leur utilisation dans le traitement de la maladie d'Alzheimer et d'autres amyloïdoses cérébrovasculaires. La maladie d'Alzheimer (MA) est un trouble dégénératif du cerveau, caractérisé au niveau clinique par une perte progressive de la mémoire, de l'orientation temporelle et spatiale, de la cognition, du raisonnement, du jugement et de la stabilité émotionnelle. La MA est une cause courante de la démence progressive chez l'homme et est l'une des causes principales de décès aux EtatsUnis. La MA a été observée dans toutes les races et tous les groupes ethniques du monde, et représente un problème sanitaire majeur à l'heure actuelle et pour l'avenir. On ne dispose actuellement d'aucun traitement qui prévienne d'une manière efficace la MA ou inverse les symptômes cliniques et la pathophysiologie sous-jacente (pour revue, voir Annu. Rev. Cell. Biol., 1994,10, 373-403). Un examen histopathologique du tissu cérébral, obtenu après autopsie ou provenant de spécimens neuro-chirurgicaux chez des personnes affectées, révèle l'apparition de plaques amyloïdes et d'enchevêtrements neurofibrillaires dans le cortex cérébral de ces patients. Des altérations analogues sont observées chez les patients présentant une trisomie 21 (syndrome de Down) et une hémorragie cérébrale héréditaire avec amyloïdose de type Dutch. Les enchevêtrements neurofibrillaires sont des faisceaux sans liaison membranaire de filaments protéines anormaux, et les études biochimiques et immunochimiques ont conduit à la conclusion selon laquelle leur sous-unité protéique principale est une forme phosphorylée altérée de la protéine tau (pour revue, voir Annu. Rev. Neurosci., 1994,17, 489-517). Des études biochimiques et immunologiques ont révélé que le composant protéine dominant de la plaque amyloïde est une protéine d'environ 4,2 kilodalton (kD), ayant d'environ 39 à 43 acides aminés. Cette protéine a reçu le nom de peptide A-bêta-amyloïde, et quelquefois bêta/A4 ; dans l'invention, on l'appellera A-bêta. En plus du dépôt de l'A-bêta dans les plaques amyloïdes, l'A-bêta se trouve aussi dans les parois des artiérioles méningées et parenchymateuses, des petites artères, des capillaires et quelquefois des veinules. L'A-bêta a été purifié pour la première fois, avec description d'un acide aminé partiel, en 1984 (Biochem. Biophys. Res. Commun., 1984,120, 885- 890). L'isolement et les données relatives à la séquence des 28 premiers acides aminés sont décrits dans le brevet US n 4 666 829. Des preuves manifestes accumulées au cours des dix dernières années ont révélé que l'A-bêta est un polypeptide interne qui dérive d'une protéine membranaire intégrale de type 1, appelée protéine précurseur de l'amyloïde bêta (APP). L'APP est normalement produite par de nombreuses cellules, tant in vivo que dans des cellules en culture, qui proviennent de différents animaux et humains. L'A-bêta provient du clivage de l'APP par un ou plusieurs systèmes enzymatiques (protéases) appelés collectivement des sécrétases. L'existence d'au moins quatre activités protéolytiques a été postulée. Elles comprennent la ou les bêta-sécrétases, qui génèrent le site N-terminal de 1'A-bêta, la ou les alpha-sécrétases, avec clivage autour de la liaison peptidique 16/17 de l'A-bêta, et les gamma-sécrétases, qui génèrent des fragments de A-bêta C-terminaux se terminant sur les positions 38,39, 40, 42 et 43, ou générant des précurseurs étendus C-terminaux, qui sont ensuite tronqués pour donner les polypeptides ci-dessus. De nombreuses lignes de preuve donnent à penser que l'accumulation anormale de l'A-bêta joue un rôle clé dans la pathogenèse de la MA. Tout d'abord, l'A-bêta est la protéine principale que l'on trouve dans les plaques amyloïdes. Deuxièmement, l'A-bêta est neurotoxique et peut être relié, dans le cadre d'une relation de cause à effet, avec la mort neuronale observée chez les patients présentant une MA. Troisièmement, des mutations d'ADN faux-sens sur la position 717 de l' isoforme 770 de l'APP peuvent être trouvées chez les membres affectés, mais non chez les membres non-affectés de plusieurs familles présentant une forme génétiquement déterminée (familiale) de MA. En outre, plusieurs autres mutations d'APP ont été décrites dans des formes familiales de la MA. Quatrièmement, des changements neuropathologiques analogues ont été observés chez des animaux transgéniques qui surexpriment des formes mutantes de l'APP humain. Cinquièmement, les individus présentant un syndrome de Down présentent un dosage génique accru d'APP, et développent une MA précoce. Prises ensemble, ces observations donnent fortement à penser que les dépôts d'A-bêta peuvent être reliés par une relation de cause à effet avec la MA. On suppose que l'inhibition de la production de l'Abêta va prévenir et réduire la dégénérescence neurologique, par une régulation de la formation des plaques amyloïdes, une réduction de la neurotoxicité et d'une manière générale une médiation de la pathologie associée à la production de l'A-bêta. Une technique de traitement devrait donc se fonder sur des médicaments qui inhibent la formation de l'A-bêta in vivo. Des procédés de traitement pourraient cibler la formation de l'A-bêta par l'intermédiaire des enzymes mises en jeu dans la maturation protéolytique de l'APP. Les composés qui inhibent l'activité des bêta- ou des gamma-sécrétases, directement ou indirectement, pourraient réguler la production de l'A-bêta. Des bêta-sécrétases ont été décrites dans de nombreuses publications, parmi lesquelles la demande EP 0 855 444, la demande PCT WO 0017369, la demande PCT WO 0058479, la demande PCT WO 0047618 et les demandes PCT WO 0100663 et WO 0100665. Deux gènes, BACE (des synonymes en sont l'Asp-2, la mémapsine-2) et BACE-2 (des synonymes en sont l'Asp-1, la mémapsine-1), codent des bêta-sécrétases qui appartiennent à la famille des aspartate-protéases recouvrant la membrane. On pense qu'il s'agit là des premières enzymes de la cascade de dégradation de l'APP, qui conduit à la production du peptide A-bêta, lequel est responsable du dépôt amyloïde dans le cerveau des patients MA. D'un point de vue théorique, l'inhibition de la bêta-sécrétase devrait protéger de la MA en déviant la voie amyloïdogène de la dégradation de l'APP vers la voie non-amyloïdogène par l'intermédiaire d'un clivage de l'APP par l'alpha-sécrétase. Les souris BACE -/- se sont révélées être viables, en dépit de l'expression ubiquitaire du BACE dans la plupart des tissus, et de sa forte expression dans le cerveau et le pancréas (Nature Neurosci., 2001,4, 231- 232). La découverte selon laquelle il n'y a pas d'effets secondaires indésirables manifestes associés à une déficience en BACE chez les souris suggère que l'inhibition du BACE chez l'homme pourrait ne pas avoir de toxicité fondée sur un mécanisme, problème qui fait l'objet de discussions intenses pour la gamma-sécrétase, laquelle régule la signalisation Notch vitale. Des techniques de criblage cellulaire des inhibiteurs de la production de l'A-bêta, des méthodes de test pour la suppression in vivo de la production de l'A-bêta, et des analyses utilisant des membranes ou des extraits cellulaires pour la détection de l'activité de sécrétase, sont connues dans la technique et sont décrites dans de nombreuses publications, parmi lesquelles la demande PCT WO 98/22493, le brevet US n 5 703 129 et le brevet US n 5 593 846, tous ces documents étant incorporés ici à titre de référence. L'analyse standard de la bêta-sécrétase est une analyse par fluorescence qui se fonde sur le clivage d'un substrat peptidique portant un fluorophore et un extincteur. Quand on l'utilise à des fins de criblage, cette analyse a tendance à donner des résultats "faussement positifs", du fait que les composés présentent une fluorescence propre ou du fait qu'ils sont fortement colorés, ou encore par ce qu'ils absorbent l'enzyme et précipitent de la solution. En conséquence, un autre technique de test présente un grand intérêt pour le criblage des inhibiteurs. D'une manière surprenante, on a trouvé que, par marquage de la mimétique de l'état de transition des bêta-sécrétases avec une radio-activité suffisamment élevée, elles peuvent être utilisées en tant que sondes directes pour la liaison des sites actifs à la bêta-sécrétase. La présente invention concerne un test pour identifier des inhibiteurs des bêta-sécrétases, qui comprend les étapes consistant à immobiliser une protéine de bêta-sécrétase sur un support solide, à la mettre en contact avec un composé à tester en présence d'un inhibiteur de bêta-sécrétase marqué, et à comparer le niveau de liaison de l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué en présence et en l'absence du composé à tester, afin d'évaluer si le composé à tester est un inhibiteur des bêta-sécrétases. De plus, la présente invention concerne un procédé de criblage d'inhibiteurs des bêta-sécrétases, de nouveaux inhibiteurs de bêtasécrétases et leur utilisation en tant qu'inhibiteurs de bêta-sécrétases marqués pour l'identification d'inhibiteurs de bêta-sécrétases, un système pour identifier les inhibiteurs de bêta-sécrétases, ainsi que de nouveaux inhibiteurs de bêta-sécrétases pour leur utilisation dans le traitement de la maladie d'Alzheimer et d'autres amyloïdoses cérébrovasculaires. L'invention sera mieux comprise en regard de la description ci-après et des dessins annexés, qui représentent des exemples de réalisation de l'invention, lesdits dessins sont tels que : La figure 1 correspond à la formule des blocs constitutifs de formule (I). La figure 2 correspond à la formule des blocs constitutifs tritiés de formule (I), où le tritium est indiqué par la lettre T. La figure 3 est un graphique représentant des courbes d'inhibition établies par des inhibiteurs peptidomimétiques publiés (peptide H-4848 (Bachem), décrit dans Nature, 1999,402, 537, et peptide H-5108 (Bachem) décrit dans J. Am. Chem. Soc., 2000,122, 3522), et d'autres inhibiteurs dirigés vers des sites actifs. Le graphique montre aussi que le test ne tend pas à donner de bons résultats avec des composés fortement colorés (au rouge Congo) ou les "composés collants", qui antérieurement étaient considérés comme faussement positifs dans l'analyse FRET. La figure 4 présente la liaison à l'équilibre du composé tritié A au BACE purifié tel que décrit dans l'exemple 6(A). L'analyse de Scatchart révèle un isotherme d'un site de liaison unique, et une inhibition compétitive par le peptide H-4848 (B). La figure 5 donne une évaluation des composés peptidomimétiques en tant qu'inhibiteurs de bêta-sécrétases dans le test de la présente invention sur une large gamme de valeurs de la CI.50 (A). Elle présente aussi une corrélation des CI50 pour 19 inhibiteurs peptido-mimétiques du BACE, obtenus par l'analyse FRET et l'analyse de liaison compétitive des radioligands (B). La figure 6 présente l'effet de la BSA sur l'inhibition de la liaison, illustré sur un nuage de points (en anglais : scatter plot) (% de dpm témoin dans des plaques cocktail regroupant la plaque (P) et la colonne (C) (3200 points de données). Le résultat illustre l'hétérogénéité de l'inhibition de la liaison, observée sans BSA dans le tampon de liaison. D'un point de vue idéal, chaque composé qui est représenté par un point doit donner une inhibition identique dans le pool colonne et dans le pool plaque, avec un nuage de points le long de la diagonale (A). Inhibition de la liaison sans BSA, sur un graphique à nuage de points (% dpm témoin dans les plaques cocktail regroupant la plaque (P) et la colonne (C)(3200 points de données). Ce résultat illustre l'homogénéité de l'inhibition de la liaison, que l'on observe avec la BSA dans la température de liaison (B). La figure 7 présente l'inhibition dose-dépendante de la liaison à un radioligand du composé H-4848 (Bachem, décrit dans Nature, 1999,402, 537) sous l'influence de 0,02 % d'acide cholique (cercles noirs), de 0,02 % de Tween 20 (cercles blancs) et de 0,1 % de sérumalbumine bovine (BSA, triangles noirs). La présente invention propose un test pour identifier des inhibiteurs des bêta-sécrétases, qui comprend les étapes consistant à immobiliser la protéine bêta-sécrétase sur un support solide, à ajouter un composé à tester, puis un inhibiteur marqué de bêta-sécrétases, à incuber les composants du test pour obtenir la liaison à l'équilibre, et à mesurer la quantité liée de l'inhibiteur marqué de bêta-sécrétases. Dans le cadre de l'invention, une "bêta-sécrétase" est une aspartyl-protéase qui génère le site N-terminal de l'A-bêta. Les bêta-sécrétases préférées sont le BACE et le BACE-2 humains. On préfère tout spécialement le BACE et le BACE-2 humains qui sont codés par les séquences nucléotidiques décrites respectivement dans les séquences SEQ ID N l et SEQ ID N 2. La bêta-sécrétase peut être une bêta-sécrétase complète ou une bêta-sécrétase tronquée présentant au moins le site actif. De préférence, la bêta-sécrétase est une bêta-sécrétase complète. Les bêtasécrétases peuvent contenir des substitutions d'acides aminés, si ces substitutions n'altèrent pas d'une manière générale l'activité de bêta-sécrétase. Les substitutions d'acides aminés dans les protéines et les polypeptides, qui n'altèrent pas fondamentalement l'activité biologique, sont connues dans la technique et décrites par H. Neurath et R. L. Hill dans "The Proteins", Académie Press, New York (1979). Six classes générales de chaînes latérales d'acides aminés, catégorisées comme décrit ci-dessus, comprennent la Classe I (Cys) ; la Classe II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly) ; la Classe III (Asn, Asp, Gln, Glu) ; la Classe IV (His, Arg, Lys) ; Classe V (Ile, Leu, Val, Met) et la Classe VI (Phe, Tyr, Trp). Les bêta-sécrétases peuvent contenir en outre des séquences de plusieurs acides aminés pour lesquelles codent des séquences "de liaison". Ces séquences apparaissent en conséquence des vecteurs d'expression utilisés pour l'expression recombinante des bêta-sécrétases. Les bêta-sécrétases de la présente invention peuvent aussi contenir des séquences spécifiques attachées au site N- ou C-terminal, qui se lient d'une manière préférée à un matériau support d'affinité. On peut citer à titre d'exemples de ces séquences les séquences contenant au moins deux résidus adjacents d'histidine (voir le brevet européen EP 282042). Ces séquences se lient d'une manière sélective aux résines chélates de nickel à base d'acide nitrilotriacétique. Les bêta-sécrétases qui contiennent une telle séquence spécifique peuvent donc être séparées sélectivement des polypeptides restants, ou être attachées à un support solide pour immobilisation. La séquence d'ADNc du BACE de la bêta-sécrétase codant pour six résidus His C-terminaux est présentée dans la séquence SEQ ID N l. On peut utiliser dans ce test une bêta-sécrétase naturelle ou produite par recombinaison. Une "protéine recombinante" est une protéine isolée, purifiée ou identifiée grâce à une expression dans une cellule hétérologue, cette cellule ayant subi une transduction ou une transfection, d'une manière transitoire ou stable, avec un vecteur d'expression recombinant manipulé pour assurer l'expression de la protéine dans le cellule hôte. Une bêta-sécrétase recombinante peut être produite dans des cellules procaryotes, par exemple de E. coli, dans une levure, par exemple S. pombe, ou dans des cellules eucaryotes, par exemple des cellules d'insectes HEK 293, Sf9. De préférence, on utilise des cellules d'insectes Sf9 pour une forte expression d'une bêta-sécrétase recombinante. La bêta-sécrétase utilisée dans l'analyse peut être purifiée. Le terme "purifié", tel qu'utilisé dans l'invention, désigne des polypeptides qui sont éliminés de leur environnement naturel ou de la source de production par recombinaison, isolés ou séparés, et qui pour au moins 60 % et plus particulièrement pour au moins 80 % sont exempts d'autres composants, par exemple des membranes et des microsomes, avec lesquels ils peuvent être naturellement associés. Nonobstant ce qui précède, un tel descripteur n'empêche en rien la présence, dans un seul et même échantillon, de variants d'épissage ou d'autres variants protéiques (variants de glycosylation) dans le même échantillon, qui par ailleurs est homogène. Une protéine ou un polypeptide est généralement considéré comme "essentiellement purifié" si un échantillon qui le contient présente une banque protéique principale sur un gel électrophorétique d'acrylamide coloré au bleu de Coomassie. Le terme "immobilisation", tel qu'utilisé dans l'invention, peut désigner une immobilisation directe d'une bêta-sécrétase sur un support solide, ou une immobilisation indirecte d'une bêta-sécrétase par l'intermédiaire d'un lieur fixé ou par utilisation d'un lieur additionnel. Le lieur fixé peut être constitué de résidus d'histidine, ou encore le lieur peut être la streptavidine ou un anticorps, de préférence un anticorps dirigé vers la bêta-sécrétase. Le support solide peut être constitué de microplaques ou de perles. De préférence, les micro-plaques utilisées dans cette analyse peuvent être blanches ou noires, et on préfère les plaques Optiplate blanches (Optiplate Packard). La réaction de revêtement est mise en #uvre avec une concentration de protéine de 1 à 50 ug/ml, de préférence de 10 pg/ml. Pour la réaction de revêtement, on utilise un tampon ajusté à une gamme de pH de 3 à 8, de préférence de 5 à 6. On préfère tout spécialement un tampon citrate ajusté à pH 5,5. Le tampon de liaison dans lequel est effectuée l'analyse de liaison peut être un tampon ajusté à une gamme de pH de 2,5 à 6. De préférence, le tampon est un tampon citrate ou acétate ajusté à pH 3,5 à 4,5. On préfère tout spécialement un tampon citrate à pH 4,1. Le tampon de liaison peut contenir une protéine à grande masse moléculaire, dont la présence prévient une liaison non-spécifique. De préférence, la protéine est le BSA (Fig. 6A et B). Tout spécialement, la concentration du BSA dans le tampon de liaison est de 0,1 % m/v. Le tampon de liaison peut aussi contenir un détergent non-ionique ou un détergent ionique. De préférence, le détergent nonionique est le Tween 20. De préférence, le détergent ionique est l'acide cholique ou l'acide désoxycholique. Plus particulièrement, le détergent ionique est l'acide cholique. Tout spécialement, la concentration du détergent non-ionique ou du détergent ionique dans le tampon de liaison est de 0,02 %. La présence d'acide cholique dans le tampon de liaison pourrait réduire encore plus la CIso d'une substance à l'essai en la divisant par 3 à 4 par rapport à la présence de Tween 20 (Fig. 7). Les composants de l'analyse sont incubés jusqu'à l'ajustement de la liaison à l'équilibre pendant 10 minutes à 24 heures à la température ambiante ou à 4 C. De préférence, les composés d'analyse sont incubés à la température ambiante pendant 1,5 heures. Telle qu'utilisée dans l'invention, l'expression "inhibiteur de bêta-sécrétases" désigne tout composé qui se lie d'une manière spécifique au site actif d'une bêta-sécrétase et de ce fait inhibe le clivage d'un substrat de bêta-sécrétase naturel, par exemple l'APP. La présente invention concerne des études de liaison compétitive destinées au criblage d'inhibiteurs spécifiques du site actif des bêta-sécrétases. Si l'on compare les résultats obtenus avec les composés à tester dans l'analyse compétitive de la présente invention et dans une analyse FRET (Fig. 5A et B), on pourrait voir que les composés à tester qui inhibent la liaison d'un inhibiteur de bêta-sécrétase marqué à une bêta-sécrétase inhibent aussi l'activité protéolytique des bêta-sécrétases, en conduisant à la production d'A-bêta sur une large plage de valeurs de la CIso. Ainsi, la liaison d'inhibiteurs des bêta-sécrétases marqués à des bêta-sécrétases isolées est utile pour identifier des inhibiteurs de la production de l'A-bêta par l'intermédiaire d'analyses de liaison compétitive. De plus, on pourrait montrer que les analyses de liaison compétitive avec des inhibiteurs de bêta-sécrétases marqués ne s'appliquent pas à des composés fortement colorés (rouge Congo) ou à des composés "collants", qui antérieurement étaient considérés comme faussement positifs dans d'autres formats d'analyse (Fig. 3). La présente invention concerne aussi de nouveaux inhibiteurs des bêta-sécrétases qui sont des composés peptido-mimétiques à base d'un mimétique d'état de transition non-clivable. Les inhibiteurs des bêta-sécrétases de la présente invention sont des peptido-mimétiques de formule (I) : Y-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-W, où P1 est défini comme étant la leustatine, la chastatine ou la tyrstatine, P2 est défini comme étant Asn, P3 est défini comme étant Val, Cpe, Che ou Cha, P4 est défini comme étant Glu, Pi' est défini comme étant Val, P2' est défini comme étant Ala, P3' est défini comme étant Glu, P4' est défini comme étant Tyr, Cha, Phe (I) ouTyr(I2), Y est défini comme étant aucun résidu, un résidu ou plusieurs résidus d'acides aminés, et W est défini comme étant aucun résidu, un résidu ou plusieurs résidus d'acides aminés, ainsi que n'importe quelle combinaison de ceux-ci. De préférence, Y est aucun acide aminé. De préférence, W est aucun acide aminé. Les formules de la leustatine, de la chastatine, de la tyrstatine, de Cpe, de Che et de Cha, sont définies dans la figure 1. Les inhibiteurs des bêta-sécrétases utilisés dans le test de la présente invention sont présentés dans le tableau ci-après. On peut citer à titre d'exemples spécifiques de formule (I) les composés A, B, C et D présentés dans la partie inférieure du tableau. Identité Inhibiteur CI50 ( M) du FRET 3Hcomposé RLBA H-5108 Glu-Val-Asn- O-Ala-Glu-Phe 0,29 0,1 5512 DiPropN-métadibenzoïque Rénine-cyclhexacide 19 7,5 3268 Glu-Val-Asn- Alasta-Val-AIa-Glu-Phe-NH2 1,7 2 3271 Glu-Val-Asn- Phesta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2 0,09 0,15 3616 Hyp-Ava- Phesta-Val-Ala-NH2 1000 1000 3617 Hyp-Abu- Phesta-Val-Ala-NH2 1000 1000 3618 Hyp-Apro- Phesta-Val-Ala-NH2 140 130 3619 Hyp-Cmp- Phesta-Val-Ala-NH2 1000 1000 3620 Hyp-Alasta- Phesta-Val-Ala-NH2 170 135 3621 Hyp-Valsta- Phesta-Val-Ala-NH2 18 22,2 3622 Hyp-Leusta- Phesta-Val-Ala-NH2 25 45,7 3623 Hyp-Val-Asn- Phesta-Val-Ala-NH2 10 9,5 3273 Glu-Gly-Asn- TyrOBzsta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2 25 15 3363 Hyp-Ava- TyrOBzsta-Val-Ala-NH2 40 30 1733 Glu-Ala-Asn- Leusta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2 4,7 7 1753 Glu-Val-Asn- Leusta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2 0,12 0,]5 1756 Asn- Leusta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2 80 100 1736 Leusta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2 1000 1000 2062 Glu-Val-Asn- Leusta-Val-Ala-NH2 0,75 0,2 D Glu-Val-Asn- Leusta-Val-Ala-Glu-Tyr-NH2 0,05 0,05 C Glu-Val-Asn- Leusta-Val-Ala-Glu-Cha-NH2 0,18 0,05 B Glu-Val-Asn- Leusta-Val-Ala-Glu-Phe(I)-NH2 0,09 0,03 A Glu-Val-Asn- Leusta-Val-Ala-Glu-Tyr(12)-NH2 0,06 0,02 Les analogues d'état de transition à l'intérieur des peptides sont disposés les uns en-dessous des autres. 0 est défini comme dans Science 290,200, 150-153. Hyp est défini comme étant l'hydroxyproline, Ava est défini comme étant l'acide #-aminovalérique, Abu est défini comme étant l'acide y-aminobutyrique, Apro est défini comme étant l'acide p-aminopropionique, Cmp est défini comme étant la carboxyméthylpipéridine, et TyrOBzsta est défini comme étant la tyrosyl-0-benzylstatine. Les inhibiteurs de bêta-sécrétases peptidomimétiques peuvent être chimiquement synthétisés par utilisation de procédés classiques connus dans la technique, de préférence des procédés à l'état solide, tels que les procédés de Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 1963,85, 2149-2154) et Atherton et Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis : A Practical Approach (IRL Press Oxford 1989). La présente invention concerne aussi des inhibiteurs de bêta-sécrétases de formule (I) pour la préparation d'inhibiteurs de bêta-sécrétases marqués, et des inhibiteurs de bêta-sécrétases de formule (I) qui sont marqués. Telle qu'utilisée dans l'invention, l'expression "inhibiteur de bêta-sécrétases marqué" désigne les "inhibiteurs de bêta-sécrétases" qui sont marqués. Par "marqué", ou "inhibiteur de bêta-sécrétases marqué", on entend que les composés inhibiteurs correspondants contiennent un marqueur qui convient à une détection dans un test ou après administration à un mammifère. Les marqueurs appropriés sont connus de l'homme de métier et comprennent par exemple les radio-isotopes, les groupes fluorescents, la biotine (en liaison avec une complexation à la streptavidine) et les groupes de photo-affinité. Les radio-isotopes pouvant être utilisés sont connus de l'homme de métier et comprennent par exemple les isotopes des halogènes (tels que le chlore, le fluor, le brome et l'iode), et les métaux, parmi lesquels le technétium et l'indium. Les radio-isotopes préférés comprennent 3H, 11C, 18F, 32P, 33P, 35S, 123I, 125I et 131I. On préfère tout spécialement 3H, 125I et 131I. Les composés radiomarqués de l'invention peuvent être préparés par des techniques classiques de radiomarquage bien connues de l'homme de métier. On va décrire ci-dessous en détail une technique appropriée de synthèse. Les inhibiteurs des bêta-sécrétases de l'invention peuvent être radiomarqués directement (c'est-à-dire par incorporation du radiomarqueur directement dans les composés) ou indirectement (c'est-à-dire par incorporation du radiomarqueur dans les composés par l'intermédiaire d'un agent chélatant, l'agent chélatant ayant été incorporé dans les composés). De même, le radiomarquage peut être isotopique ou non-isotopique. Avec un radiomarquage isotopique, un atome ou un groupe d'atomes déjà présents dans les composés de l'invention est remplacé par le radio-isotope. Avec un radiomarquage non-isotopique, le radioisotope est ajouté aux composés sans remplacement d'un groupe déjà existant. Les composés directement ou indirectement radiomarqués, ainsi que les composés radiomarqués isotopiques et non-isotopiques, entrent dans le cadre des "inhibiteurs des bêta-sécrétases radiomarqués" tels qu'utilisés en liaison avec la présente invention. Ce radiomarquage doit de même être raisonnablement stable, tant du point de vue chimique que métabolique, par application des normes reconnues dans la technique. De même, bien que les composés de l'invention puissent être marqués de différentes manières avec un grand nombre de radio-isotopes différents, comme le comprendra l'homme de métier, ce radiomarquage doit être réalisé de façon à ne pas affecter d'une manière significative l'affinité élevée de liaison et la forte spécificité de l'inhibiteur des bêta-sécrétases, non-marqué, pour les bêta-sécrétases. Par "non-affecté d'une manière significative", on entend que l'affinité et la spécificité de liaison ne sont pas affectées par plus d'environ trois unités logarithmiques, de préférence pas plus d'environ deux unités logarithmiques, plus particulièrement pas plus d'une unité logarithmique, tout particulièrement pas plus d'environ 500 %, encore plus particulièrement pas plus d'environ 250 %, et, tout spécialement, l'affinité et la spécificité de liaison ne sont pas affectées du tout. Pour les inhibiteurs de bêta-sécrétases radiomarqués, le marqueur peut apparaître sur une position quelconque de l'inhibiteur de bêta-sécrétases, et il peut avoir un isotope radioactif, ou deux, ou plus, intégrés dans sa structure. Les composés radiomarqués préférés de l'invention sont les inhibiteurs de bêta-sécrétases radiomarqués au tritium. Des composés radiomarqués particulièrement préférés de l'invention sont les composés radiomarqués de formule (I) dans laquelle un ou deux isotopes radioactifs, ou plus, sont intégrés dans la structure, et où le radiomarqueur est situé sur Pl, P3 et/ou P4'. On préfère tout spécialement les inhibiteurs de bêta-sécrétases de formule (I) dans laquelle le radiomarqueur se trouvant sur Pl, P3 et/ou P4' est 3H ou 123I,125I ou 131I. La figure 2 présente les blocs constitutifs tritiés de formule (I) pouvant être intégrés sur les positions Pl, P3 et P4'. Comme décrit dans l'exemple 4, un inhibiteur de bêta-sécrétase de formule (I), avec de la diiodotyrosine en position P4' (composé A) peut être choisi pour le radiomarquage, car l'iode peut être remplacé par du 3H par réduction sur palladium. La réduction donne un composé qui d'un point de vue chimique ne peut être distingué du composé A. L'inhibiteur de bêta-sécrétase radiomarqué peut avoir une activité massique comprise entre 500 mCi/mmol et 60 Ci/mmol. De préférence, son activité massique est de 55 Ci/mmol. L'inhibiteur de bêta-sécrétase radiomarqué et lié peut être mesuré par addition d'un scintillateur. De préférence, le scintillateur est le MicrScint20 ou le Microscint40 (Packard). Alternativement, on sait dans la technique qu'il est possible d'utiliser une analyse de proximité par scintillation (SPA) dans le cadre du test de la liaison par compétition des radioligands de l'invention. Par exemple, des protéines purifiées peuvent être immobilisées sur le support pour SPA, ce après quoi le support est ensuite incubé avec un inhibiteur des bêta-sécrétases marqué, en présence d'un composé à tester. Le support pour SPA, du fait même de sa structure, renforce le signal de scintillation radioactif des composés radioactifs liés, sans renforcer le signal radioactif des composés radioactifs libres en solution. En conséquence, l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué et lié est détecté et quantifié par comptage par scintillation en présence de l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué et libre. Il est bien entendu que le procédé permettant de séparer l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué et lié de l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué et libre peut être réalisé par différentes techniques. Par exemple, le procédé de séparation comprend, mais sans limitation, le lavage, la filtration ou la centrifugation. Le procédé de séparation veut faciliter la quantification de l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué et lié. En conséquence, l'opération de séparation veut elle aussi englober les techniques homogènes, par exemple la SPA, où l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué et libre in situ n'est pas séparé de l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué et lié. Dans la présente invention, on a découvert que les composés radiomarqués ci-dessus sont utiles en tant qu'inhibiteurs des bêta-sécrétases, de sorte que les composés radiomarqués de l'invention peuvent aussi être utilisés à des fins thérapeutiques et à des fins de radioimagerie (QJ Nucl. Med., 1997, 41(2), 163-169) et d'imagerie PET (Clin. Geriatr. Med., 2001, 17(2), 255- 279) . Telle qu'utilisée dans l'invention, l'expression "composé à tester" désigne tout composé en cours de criblage pour inhiber la liaison de l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué à une bêta-sécrétase, et qui donc inhibe la production de l'A-bêta, par utilisation du test de l'invention. Il est bien entendu qu'un "composé à tester", qui est actif dans le test de l'invention pour ce qui est d'inhiber la liaison au BACE, peut être utilisé ultérieurement dans l'analyse de l'invention en tant qu'"inhibiteur de bêta-sécrétases marqué" tel que défini ci-dessus, une fois que le composé a été marqué. Il est aussi bien entendu qu'un "composé à tester", qui est actif dans le test de l'invention pour ce qui est d'inhiber la liaison au BACE, peut être utilisé ultérieurement dans des compositions pharmaceutiques destinées au traitement des troubles neurologiques dégénératifs mettant en jeu la production de l'A-bêta, de préférence pour le traitement de la MA. Tel qu'utilisé dans l'invention, un "inhibiteur de bêta-sécrétases marqué et lié" désigne la liaison totale de l'inhibiteur de bêta-sécrétases marqué, y compris la liaison spécifique et la liaison non-spécifique. La liaison non-spécifique est évaluée par compétition avec une concentration à saturation d'un autre inhibiteur connu de bêta-sécrétases. La liaison spécifique d'un inhibiteur de bêta-sécrétases marqué est donc déterminée par soustraction, à partir de la liaison totale de l'inhibiteur de bêta-sécrétases marqué, de la liaison non-spécifique. Telle qu'utilisée dans l'invention, la "concentration inhibitrice" désigne la concentration à laquelle 1"'inhibiteur potentiel de la bêta-sécrétase", sélectionné dans le test de l'invention, déplace 50 % d'un inhibiteur marqué. Des exemples de la "concentration inhibitrice" varient de la CIso à la CI90, et il s'agit de préférence de la CI50, de la CI6o, de la CI-70, de la CI80 ou de la CI90, qui représentent respectivement 50,60, 70, 80 et 90 % de déplacement de l'inhibiteur marqué. Plus particulièrement, la "concentration inhibitrice" est mesurée en tant que CIso. Il est bien entendu qu'une désignation de la CI50 correspond à la concentration inhibitrice à la moitié du maximum. La CIso d'un inhibiteur des bêta-sécrétases marqué, utilisé dans le test et le procédé de la présente invention, peut être inférieure ou égale à 5 uM. Plus particulièrement, la CIso est inférieure ou égale à 1 uM. Tout spécialement, la CIso est inférieure ou égale à 0,25 uM. La présente invention concerne aussi le test décrit ci-dessus, dans lequel l'inhibiteur de bêta-sécrétases marqué a la formule (I). Une autre forme de réalisation de la présente invention concerne des inhibiteurs de bêta-sécrétases marqués de formule (I) pour leur utilisation dans le test de l'invention, tel que décrit ci-dessus. De plus, la présente invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur de bêta-sécrétases marqué pour l'identification de composés inhibiteurs de bêta-sécrétases. Pour cette utilisation, l'inhibiteur de bêta-sécrétases marqué peut avoir la formule (I), et peut comprendre un marqueur radioactif, ou plus particulièrement un marqueur au tritium. La présente invention concerne en outre un procédé de criblage de composés capables d'inhiber une activité de bêta-sécrétase, qui comprend la mesure de la liaison d'un inhibiteur de bêta-sécrétase marqué à une bêtasécrétase en présence d'un composé à tester, et la détermination de la capacité du composé à tester à entrer en compétition avec l'inhibiteur de bêta-sécrétases marqué pour la liaison au site actif. La présente invention concerne aussi le procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel l'inhibiteur de bêtasécrétases marqué a la formule (I). De plus, la présente invention concerne des inhibiteurs de bêta-sécrétases marqués pour leur utilisation dans le procédé tel que décrit ci-dessus. Dans une autre forme de réalisation, la présente invention concerne un système pour identifier un inhibiteur de bêta-sécrétases, comprenant un polypeptide de bêta-sécrétase naturel ou obtenu par recombinaison, et un inhibiteur de bêta-sécrétases marqué. Dans une autre forme de réalisation, la présente invention concerne un système comprenant les composants nécessaires à la mise en #uvre du test ou du procédé de la présente invention, choisis dans le groupe de : un support solide pour immobilisation de la protéine bêta-sécrétase, une protéine bêta-sécrétase, un tampon de revêtement, un inhibiteur de bêta-sécrétases marqué et un tampon de liaison. De plus, la présente invention concerne de nouveaux inhibiteurs de bêta-sécrétases, identifiés par le test et le procédé de la présente invention. Ils peuvent ensuite eux-mêmes être utilisés pour identifier de nouveaux inhibiteurs de bêta-sécrétases. La présente invention propose en outre une composition pharmaceutique comprenant un véhicule acceptable d'un point de vue pharmaceutique et une quantité efficace d'un point de vue thérapeutique d'un inhibiteur de bêta-sécrétases, identifié par le test et le procédé de la présente invention, ainsi qu'un sel de celui-ci acceptable d'un point de vue pharmaceutique. L'expression "acceptable d'un point de vue pharmaceutique" ou "pharmaceutiquement acceptable" est utilisée dans l'invention pour désigner les composés, matériaux, compositions et/ou formes posologiques qui, dans le cadre d'un sain jugement médical, conviennent à une utilisation en contact avec les tissus des êtres humains et des animaux sans phénomènes excessifs de toxicité, d'irritation, de réponse allergique, ou d'autres problèmes ou complications, acceptables avec un rapport avantage/risque acceptable. Telle qu'utilisée dans l'invention, l'expression "sels acceptables d'un point de vue pharmaceutique" désigne les dérivés des composés décrits, où le composé précurseur est modifié par la préparation de sels avec un acide ou une base. On peut-citer à titre d'exemples nonlimitatifs de sels acceptables d'un point de vue pharmaceutique les sels avec des acides minéraux ou organiques de résidus basiques tels que les amines ; les sels de métaux alcalins ou les sels organiques de résidus acides tels que les acides carboxyliques ; et analogues. Les sels acceptables d'un point de vue pharmaceutique comprennent les sels non-toxiques classiques ou les sels de l'ammonium quaternaire du composé précurseur, formés par exemple à partir d'acides inorganiques ou organiques non-toxiques. Par exemple, ces sels non-toxiques classiques comprennent ceux qui dérivent d'acides inorganiques tels que l'acide chlorhydrique, bromhydrique, sulfurique, sulfamique, phosphorique, nitrique et analogues ; et les sels préparés à partir d'acides organiques tels que l'acide acétique, propionique, succinique, glycolique, stéarique, lactique, malique, tartrique, citrique, ascorbique, pamoïque, maléique, hydroxymaléique, phénylacétique, glutamique, benzoïque, salicylique, sulfanilique, 2-acétoxybenzoïque, fumarique, benzènesulfonique, toluènesulfonique, méthanesulfonique, éthanedisulfonique, oxalique, iséthionique, et analogues. Les sels acceptables d'un point de vue pharmaceutique de la présente invention peuvent être synthétisés à partir du composé précurseur qui contient un fragment basique ou acide, par des procédés chimiques classiques. D'une manière générale, on peut préparer ces sels par réaction de la forme acide libre ou base libre de ces composés avec une quantité st#chiométrique de la base ou de l'acide approprié, dans de l'eau ou dans un solvant organique, ou dans un mélange des deux ; d'une manière générale, on préfère les milieux non-aqueux tels que l'éther, l'acétate d'éthyle, l'éthanol, l'isopropanol ou l'acétonitrile. On pourra trouver des listes de sels appropriés dans Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ème édition, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, page 1418, dont la teneur est incorporée ici à titre de référence. On entend par "composé stable" et "structure stable", un composé qui est suffisamment robuste pour survivre à un isolement, jusqu'à un degré utile de pureté à partir d'un mélange réactionnel, et à une formulation en un agent thérapeutique efficace. L'invention a également pour objet un inhibiteur de bêta-sécrétases identifié par le test et le procédé de la présente invention, comme médicament. En particulier, un tel inhibiteur peut être utilisé pour le traitement ou la prévention de la maladie d'Alzheimer ou d'autres amyloïdoses cérébrovasculaires. En outre, la présente invention concerne l'utilisation de tels inhibiteurs de bêta-sécrétases identifiés par le test et le procédé de la présente invention, pour préparer un médicament destiné au traitement ou à la prévention de la maladie d'Alzheimer et d'autres amyloïdoses cérébrovasculaires. Les inhibiteurs des bêta-sécrétases identifiés par le test de liaison compétitive de la présente invention peuvent être utiles pour le traitement ou la prévention des troubles neurologiques et d'autres troubles mettant en jeu l'A-bêta, l'APP et/ou des macromolécules associées à l'A-bêta/APP, et d'autres macromolécules associées au centre actif de la liaison du BACE. La présente invention concerne en outre une méthode de traitement d'un patient présentant une maladie d'Alzheimer ou une autre amyloïdose cérébrovasculaire ou ayant une prédisposition pour la maladie d'Alzheimer ou une autre amyloïdose cérébrovasculaire, qui comprend l'administration, au patient, d'une dose efficace d'un point de vue pharmaceutique d'un composé permettant d'inhiber la bêta-sécrétase, et identifié par le test et le procédé de la présente invention. L'invention va être mieux comprise en regard des exemples ci-après. Sauf mention contraire, on utilise conformément aux instructions des fabricants les réactifs du commerce auxquels il est fait référence dans les exemples. Exemple 1 : Clonage et expression du BACE Un ADNc codant pour l'aspartylprotéase humaine BACE et BACE-2 a été modifié par amplification PCR dans la région 5'-non-codante pour optimiser la reconnaissance ribosomique par une séquence de Kozack, et le rendement de clonage par échange des codons riches en GC et au niveau de l'extrémité d'amorçage 3' par addition d'une séquence codant pour les résidus 6xHis, dans le but de permettre une purification rapide de la protéine recombinante (respectivement SEQ ID N l et SEQ ID N 2). L'ATG de départ est trouvé sur la position 16 des séquences SEQ ID N l et 2. L'expression dans des cellules d'insectes Sf9 (Glycoconj. J, 1999, 16(2), 109-123) par l'intermédiaire d'un baculovirus recombinant a conduit à des rendements plus élevés qu'une expression dans des cellules de E. Coli, de S. pombe ou HEK 293. Ainsi, l'ADNc a été cloné dans le vecteur pFASTBAC1 (Life Technologies Inc. ) sous forme d'un fragment BamHI x XbaI pour expression dans des cellules d'insectes, et le produit de la PCR a été confirmé par séquençage. Après recombinaison dans le génome du baculovirus, l'ADN viral purifié a été transformé dans les cellules d'insectes. Les cellules Sf9 ont été cultivées à 27 C dans un milieu TC100 (BioWhittaker) avec 5 (v/v) de sérum de f#tus de veau. On a produit des stocks de virus ayant un titre de 1,5 x 109 ufp/ml. Pour une production à grande échelle de BACE et de BACE-2, on a infecté avec une MOI de 1, des fermenteurs de 24 litres de cellules Sf9. Exemple 2 : Purification d'un BACE complet On a mis en suspension 50 g (poids net) de cellules Sf9 dans 750 ml de PBS, 2 % de Triton X-100, et on a homogénéisé avec un homogénéisateur en verre tenu à la main. L'homogénéisât a été agité sur de la glace pendant 30 minutes, puis centrifugé à 100 000 g pendant 20 minutes. Le surnageant a été ajusté à pH 8,0 et placé sur une colonne de Ni2+NTA-sépharose 2,6 x 2,5 cm (Qiagen, Allemagne) qui a été équilibrée dans un tampon phosphate 50 mM, Tris 100 mM, NaCl 100 mM, 0,1 % de Triton X-100, pH 8,0. La colonne a ensuite été lavée avec ce tampon puis avec du phosphate de sodium 50 mM pH 7,4, NaCl 1000 mM, 0,1 % de Triton X-100. La colonne a ensuite été éluée avec du phosphate de sodium 50 mM pH 7,4, NaCl 100 mM, imidazole 200 mM, 0,1 % de Triton X-100 (10 volumes de colonne). Les fractions combinées contenant le BACE complet ont été placées sur une colonne HiTrap Q de 5 ml (Pharmacia, Suisse), et le matériau non-lié a été recueilli. Ce matériau a ensuite été dilué au 1/10 dans du Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 10 mM, 0,1 % de Triton, et replacé sur une deuxième colonne HiTrap Q de 5 ml qui a été équilibrée dans du Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 10 mM, 0,1 % de Triton X-100. La colonne a été lavée dans ce tampon et éluée avec un gradient de Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 1 Mm, 0,1 % de Triton X-100 (20 volumes de colonne). Les fractions contenant le BACE ont été combinées, dialysées contre du Tris-HCl 50 mM pH 8,0, 0,1 % de Triton X-100, et placées sur une colonne Mono S HR5/5 (Pharmacia, Suisse). Le matériau non-lié, contenant le BACE, a été combiné et conservé à 4 C. Exemple 3 : Synthèse du peptide Composé A On a procédé à une synthèse en phase solide en écoulement continu sur un système de synthèse de peptides Pioneer Peptide Synthesis System, en partant d'une résine Tenta Gel S RAM (0,25 mmol/g (Rapp Polymère GmbH, Tübingen, Allemagne) en suivant la méthode décrite par Atherton et Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis : A Practical Approach (IRL Press Oxford 1989). Le groupe Fmoc, labile vis-à-vis des bases, a été utilisé pour l'a-amino-protection. Les chaînes latérales ont été protégées par les groupes protecteurs suivants : -Asn(Trt) et Glu(OtBu). On a utilisé dans la synthèse de la Fmoc-statine (Neosystem) et de la Fmoc-3,5-diiodoL-tyrosine (Fluka) du commerce. 2,5 équivalents de Fmocacides aminés ont été activés avec une quantité équivalente de tétrafluoroborate d'o-(1,2-dihydro- 2-oxopyrid-1-yl)-N,N,N',N'-tétraméthyluronium (TPTU) et de N,N-diisopropyléthylamine (base de Hünig). La déprotection de Fmoc a été réalisée avec 20 % de pipéridine dans le DMF. On a traité 0,200 g de Glu(OtBu)-Val-Asn(Trt)statine-Val-Ala-Glu(OtBu)-Tyr(I2)-amide résine Tenta Gel S avec 5 ml d'un mélange de 95 % de TFA, de 2,5 % de H2O, de 2,5 % de triisopropylsilane pendant 5 heures. Le mélange réactionnel a été concentré et versé dans du diéthyléther, et le précipité a été recueilli par filtration et lyophilisé à partir d'eau. Le peptide brut a été purifié par CLHP préparative en phase inversée. On a obtenu le Glu-Val-Asn-Statine-Val-Ala-Glu-Tyr(I2)-NH2 homogène (composé A ; 12 mg, MH+ = 1231,3). On a synthétisé d'une manière analogue d'autres inhibiteurs des bêta-sécrétases. Exemple 4 : Tritiation du composé A (Compound A = composé A) On a dissous 9,3 mg (0,069 mmol) du composé A dans 1 ml de méthanol (Merck n 1. 06009.1000) et 6 gouttes d'eau. Après addition de 7 l de triéthylamine (Fluka puriss n 90335) et 4 mg de palladium à 10% sur charbon (Degussa type 101ND), on a agité pendant 1 heure la suspension dans une atmosphère de tritium gazeux. On a utilisé un équipement de tritiation de RC Tritec AG, 9053 Teufen (Helv. Chim. Acta, 1985,68, 1880). Après élimination des composants volatils du tritium, le résidu a été mis en suspension dans un mélange 9/1 de méthanol et d'eau. Après une rapide sonication, la suspension a été filtrée sur Millex-HV 0,45 uM (Cat. N SL HV013 NL). Le filtrat a été dilué à 100 ml d'un mélange 9/1 de méthanol et d'eau. L'activité totale de 3H était de 108,54 mCi, et la pureté radiochimique était de 84 % d'après une CLHP (colonne Vydac 5 u, 4,6 x 250 mm, débit 1 ml/min, solvant A : 95 % d'eau, 5 % d'acétonitrile, 1 de TFA ; solvant B : TFA 10 mM dans un mélange 3/1 d'eau et d' acétonitrile ; gradient B : 0 à 40 % en 30 minutes, temps de rétention 23,27 minutes, X = 254 nm). L'activité massique était de 55 Ci/mmol, telle que déterminée par spectrométrie de masse. Le filtre Millex-HV a été rincé plusieurs fois par un mélange 9/1 d'eau et de méthanol, et l'on a obtenu un autre lot du peptide, à 66 mCi. Une purification de ce lot par CLHP a donné 43,4 mCi du composant A tritié, ayant une pureté de 100 % d'après une CLHP. Une RMN-3H a montré un pic unique au voisinage de 7 ppm, ce qui excluait la présence de tout tritium labile. Exemple 5 : Analyse FRET pour la caractérisation de nouveaux inhibiteurs des bêta-sécrétases Tous les dosages d'enzymes ont été effectués à 20 C sur un FLUOstar (BMG Lab Technologies, D-77656 Offenburg) par utilisation de plaques de microtitrage à 96 puits (DYNEX Microfluor 2, Chantilly, VA, Etats-Unis). Le volume d'analyse était de 100 ul. D'une manière représentative, des inhibiteurs dissous dans du diméthylsulfoxyde ont été placés à différentes concentrations dans un puits, puis on a ajouté le tampon et l'enzyme. La concentration du diméthylsulfoxyde a été maintenue en-dessous de 4 %. La réaction enzymatique a été lancée par addition du substrat. Les conditions de pH et de tampon dans lesquelles les expériences ont été effectuées sont indiquées sur la figure et dans les légendes du tableau. La progression de l'augmentation de la fluorescence a été mesurée à émission = 520 nm, l'excitation de la fluorescence étant à #excitaton = 430 nm. La cinétique de la réaction a été suivie périodiquement pendant 30 minutes pour différentes concentrations du substrat. Les signaux détectés ont été convertis en moles de substrat hydrolysées par seconde. Les données cinétiques ont été déterminées graphiquement à partir de courbes de Lineweaver-Burke. Il convient d'observer que les données obtenues quand on faisait varier la concentration du substrat devaient être corrigées pour tenir compte de l'effet de la capacité d'extinction en excès, qui est représentative de tous les substrats FRET utilisés dans l'invention. Les analyses ont été effectuées pour les concentrations d'enzyme qui assuraient une progression linéaire de la formation du produit. Exemple 6 : Analyse de liaison compétitive des radioligands (RLBA) Des plaques de microtitrage à 96 puits (Optiplate Packard) ont été revêtues d'une protéine BACE purifiée par utilisation d'une concentration de 1 pg/ml dans un tampon citrate de sodium 30 mM ajusté à pH 5,5. On a réalisé le revêtement par incubation de 100 l par puits pendant 1 à 3 jours à 4 C. La plaque a ensuite été lavée avec 2 x 300 l par puits de citrate 10 mM pH 4,1. On a placé dans chaque puits 100 l d'un tampon de liaison (citrate 30 mM, NaCl 100 mM, 0 Il % de BSA, pH 4,1). Le composé à tester (peptide H-4848 sur les figures 4A et B) a été ajouté en une quantité de 5 l à partir d'une solution mère de DMSO ou de dilutions appropriées. A cette fin, le traceur (composé A tritié) a été placé à raison de 10 pi par puits à partir d'une solution mère à 10 mCi/ml dans un tampon de liaison. Après 1,5 à 2 heures d'incubation dans une chambre humide à la température ambiante, la plaque a été lavée avec 2 x 300 l par puits d'eau, et tapotée sur une serviette sèche. Après addition de 50 l par puits de MicroScint20 (Packard), la plaque a été scellée, et on l'a faite vibrer pendant 5 secondes. La radioactivité liée a été comptée sur un Topcount (Packard). La liaison totale est habituellement de 2000 à 10 000 cpm par puits, essentiellement en fonction de la pureté et de la concentration de la protéine BACE. La liaison non-spécifique, telle qu'évaluée par compétition avec > 1 uM de peptide H-4848 (Bachem n H-4848) est d'une manière représentative de 30 à 300 cpm par puits. Les CIso sont calculés par Microsoft Excel FIT. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessus décrits et représentés, à partir desquels on pourra prévoir d'autres modes et d'autres formes de réalisation, sans pour autant sortir du cadre de l'invention. LEGENDE DES DESSINS Fig. 1 Leustatin = Leustatine Chastatin (cyclohexylalastatin) = Chastatine (cyclohexylalastatine) Tyrstatin = Tyrstatine Fig. 2 Leustatin = Leustatine Chastatin (cyclohexylalastatin) = Chastatine (cyclohexylalastatine) Tyrstatin = Tyrstatine Fig. 3 cpm bound = cpm liés statins = statines sticky = collant control = témoin congored = rouge Congo Fig. 4A 3H adsorbtion isotherm = isotherme d'adsorption 3H bound 3H (cpm) = 3H lié (cpm) no inhibitor = pas d'inhibiteur Fig. 4B Scatchart plot = courbe de scatchart Fig. 5A Identité Inhibiteur CI50 (uM) du FRET 3Hcomposé RLBA H-5108 Glu-Val-Asn- O-Ala-Glu-Phe 0,29 0,1 5512 DiPropN-métadibenzoïque Rénine-cyclhexacide 19 7,5 3268 Glu-Val-Asn- Alasta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2 1,7 2 3271 Glu-Val-Asn- Phesta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2 0,09 0,15 3616 Hyp-Ava- Phesta-Val-Ala-NH2 1000 1000 3617 Hyp-Abu- Phesta-Val-Ala-NH2 1000 1000 3618 Hyp-Apro- Phesta-Val-Ala-NH2 140 130 3619 Hyp-Cmp- Phesta-Val-Ala-NH2 1000 1000 3620 Hyp-Alasta- Phesta-Val-Ala-NH2 170 135 3621 Hyp-Valsta- Phesta-Val-Ala-NH2 18 22,2 3622 Hyp-Leusta- Phesta-Val-Ala-NH2 25 45,7 3623 Hyp-Val-Asn- Phesta-Val-Ala-NH2 10 9,5 3273 Glu-Gly-Asn- TyrOBzsta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2 25 15 3363 Hyp-Ava- TyrOBzsta-Val-Ala-NH2 40 30 1733 Glu-Ala-Asn- Leusta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2 4,7 7 1753 Glu-Val-Asn- Leusta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2 0,12 0,15 1756 Asn- Leusta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2 80 100 1736 Leusta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2 1000 1000 2062 Glu-Val-Asn- Leusta-Val-Ala-NH2 0,75 0,2 D Glu-Val-Asn- Leusta-Val-Ala-Glu-Tyr-NH2 0,05 0,05 C Glu-Val-Asn- Leusta-Val-Ala-Glu-Cha-NH2 0,18 0,05 B Glu-Val-Asn- Leusta-Val-Ala-Glu-Phe(I)-NH2 0,09 0,03 A Glu-Val-Asn- Leusta-Val-Ala-Glu-Tyr(I2)-NH2 0,06 0,02 Fig. 6A Tampon d'analysesansBSA Fig. 6B Tampon d'analyseavecBSA Fig. 7 3Hbound(%ofcontrol)= 3Hlié(%parrapportautémoin) Inhibitor= Inhibiteur Cholicacid= Acidecholique Revendications 1. Inhibiteur de bêta-sécrétase de formule (I) Y-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-W, caractérisé en ce que Pl est défini comme étant la leustatine, la chastatine ou la tyrstatine, P2 est défini comme étant Asn, P3 est défini comme étant Val, Cpe, Che ou Cha, P4 est défini comme étant Glu, PI' est défini comme étant Val, P2' est défini comme étant Ala, P3' est défini comme étant Glu, P4' est défini comme étant Tyr, Cha, Phe (I) ouTyr(I2), Y est défini comme étant aucun résidu, un résidu ou plusieurs résidus d'acides aminés, et W est défini comme étant aucun résidu, un résidu ou plusieurs résidus d'acides aminés, ainsi que n'importe quelle combinaison de ceux-ci. 2. Inhibiteur de bêta-sécrétase selon la revendication 1, pour la préparation d'un inhibiteur de bêta-sécrétase marqué. 3. Inhibiteur de bêta-sécrétase selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est marqué. 4. Inhibiteur de bêta-sécrétase selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est radiomarqué sur une ou plusieurs des positions P3, Pl ou P4'. 5. Utilisation d'un inhibiteur de bêta-sécrétase marqué selon la revendication 3 ou 4, pour l'identification de composés inhibiteurs des bêta-sécrétases. caractérisée en ce que l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué est un inhibiteur de bêta-sécrétase marqué au tritium. 7. Test pour identifier des inhibiteurs de bêta-sécrétases, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) immobiliser une protéine bêta-sécrétase, (b) ajouter un composé à tester, puis un inhibiteur de bêta-sécrétase marqué, (c) incuber les composants du test, et (d) mesurer l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué et lié. 8. Test selon la revendication 7, caractérisé en ce que la bêta-sécrétase est une bêta-sécrétase isolée et essentiellement purifiée. 9. Test selon la revendication 7, caractérisé en ce que la bêta-sécrétase est produite par recombinaison et purifiée. 10. Test selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que la bêta-sécrétase est une bêta-sécrétase complète. 11. Test selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que la bêta-sécrétase est choisie dans le groupe consistant en BACE et BACE-2. 12. Test selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisé en ce que l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué est un inhibiteur de bêta-sécrétase marqué par un marqueur radioactif. 13. Test selon la revendication 12, dans lequel le marqueur radioactif est le tritium. 14. Test selon l'une quelconque des revendications 7 à 13, dans lequel l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué est un inhibiteur de bêta-sécrétase marqué selon la revendication 3. 15. Test selon l'une quelconque des revendications 7 à 14, caractérisé en ce que l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué présente une concentration inhibitrice d'environ 1 M, ou moins. 16. Test selon l'une quelconque des revendications 7 à 15, caractérisé en ce que les composants du test sont incubés dans un tampon de liaison contenant éventuellement de la BSA. 17. Test selon l'une quelconque des revendications 7 à 16, caractérisé en ce que les composants du test sont incubés dans un tampon de liaison contenant éventuellement un détergent non-ionique. 18. Test selon la revendication 17, caractérisé en ce que le détergent non-ionique est le Tween 20. 19. Test selon l'une quelconque des revendications 7 à 16, caractérisé en ce que les composants du système d'analyse sont incubés dans un tampon de liaison contenant éventuellement un détergent ionique. 20. Test selon la revendication 19, caractérisé en ce que le détergent ionique est choisi dans le groupe comprenant l'acide cholique et l'acide désoxycholique. 21. Inhibiteur de bêta-sécrétase marqué selon la revendication 3, pour son utilisation dans le test selon l'une quelconque des revendications 7 à 20. 22. Procédé de criblage de composés capables d'inhiber une activité bêta-sécrétase, caractérisé en ce qu'il comprend la mesure de la liaison d'un inhibiteur de bêta-sécrétase marqué à une bêta-sécrétase, en présence d'un composé à tester, et la détermination de la capacité du composé à tester, à entrer en compétition avec l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué pour la liaison au site actif. 23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que la bêta-sécrétase est une bêta-sécrétase isolée et essentiellement purifiée. 24. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que la bêta-sécrétase est produite par recombinaison et purifiée. 25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 24, caractérisé en ce que la bêta-sécrétase est une bêta-sécrétase complète. 26. Procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 25, caractérisé en ce que la bêta-sécrétase est choisie dans le groupe consistant en BACE et BACE-2. 27. Procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 26, caractérisé en ce que l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué est un inhibiteur de bêta-sécrétase marqué par un marqueur radioactif. 28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que le marqueur radioactif est le tritium. 29. Procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 28, caractérisé en ce que l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué est un inhibiteur de bêta-sécrétase selon la revendication 3. 30. Inhibiteur de bêta-sécrétase marqué, pour son utilisation dans le procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 29. 31. Système pour identifier un inhibiteur de bêta-sécrétase, caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide de bêta-sécrétase naturel ou produit par recombinaison, et un inhibiteur de bêta-sécrétase marqué. 32. Système selon la revendication 31, caractérisé en ce que l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué porte un marqueur radioactif. 33. Système selon la revendication 32, caractérisé en ce que l'inhibiteur de bêta-sécrétase marqué porte un marqueur au tritium. 34. Système, caractérisé en ce qu'il comprend les composants nécessaires à la mise en #uvre du système d'analyse selon l'une quelconque des revendications 7 à 20, ou le procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 29. 35. Inhibiteur de bêta-sécrétases, caractérisé en ce qu'il est identifié par le test selon l'une quelconque des revendications 7 à 20, ou le procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 29. 36. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable et une quantité thérapeutiquement efficace d'un inhibiteur de bêta-sécrétases selon la revendication 35. 37. Utilisation d'au moins un inhibiteur de bêta-sécrétases identifié par le test selon l'une quelconque des revendications 7 à 20 ou le procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 29, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention de la maladie d'Alzheimer ou d'autres amyloïdoses cérébrovasculaires. 38. Inhibiteur de bêta-sécrétases identifié par le test selon l'une quelconque des revendications 7 à 20 ou le procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 29, comme médicament. 39. Inhibiteur de bêta-sécrétases identifié par le test selon l'une quelconque des revendications 7 à 20 ou le procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 29, pour le traitement ou la prévention de la maladie d'Alzheimer ou d'autres amyloïdoses cérébrovasculaires.