Brevet FR2835847A1 — publié le 20030815

La présente invention porte sur l'identification d'un nouveau récepteur mélatoninergique, et plus particulièrement pour le récepteur de la mélatonine de rat de type MT]. Elle porte en particulier sur l'identification d'une séquence d'acides nucléiques codant ce récepteur ainsi que sur les vecteurs recombinants comportant ces séquences et les cellules hôtes contenant les vecteurs. Les utilisations des cellules hôtes pour le criblage de molécules agonistes ou antagonistes du récepteur de la mélatonine font également partie de l'invention. De nombreuses études ont mis en évidence ces dix dernières années l'implication de la mélatonine (N-acétyl-5-méthoxytryptamine) dans de nombreux phénomènes physiopathologiques ainsi que dans le contrôle du rythme circadien. Ces différents effets s'exercent par l'intermédiaire de récepteurs spécifiques de la mélatonine. Ces récepteurs sont des protéines membranaires appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G. Ils sont exprimés à la surface des cellules et sont capables de recevoir un signal extracellulaire et de le transmettre à la cellule via leur interaction avec des protéines G. Des études de biologie moléculaire ont permis de cloner chez l'homme deux sous-types réceptoriels hMT, et hMT2 (Neuron, 1994, 13, pp 1177- 1185 ; Proc. Natl. Acad. Sci., 1995,92, pp 8734-8738). Des composés interagissant sélectivement avec l'un ou l'autre de ces récepteurs peuvent être pour le clinicien d'excellents médicaments potentiels pour le traitement des pathologies liées au système mélatoninergique. Afin de pouvoir mieux comprendre les fonctions physiologiques de chacun de ces sous-types réceptoriels et de déterminer leur intérêt thérapeutique potentiel, des études chez l'animal, en particulier chez le rat, sont nécessaires. En effet, les fonctions physiologiques des récepteurs mélatoninergiques MT, et MT2 ne sont pas encore bien déterminées tant au niveau central que périphérique. Des études pharmacologiques réalisées sur récepteurs MT, humain et ovin transfectés dans des cellules eucaryotes ont montré des différences importantes entre ces deux espèces tant d'un point de vue affinité qu'activité (Soc. Neurosci. Abstract, 2001,184. 2). Ainsi, des études avec des ligands dont l'affinité et l'activité auront bien été caractérisées en fonction de l'espèce étudiée permettront une meilleure approche thérapeutique. En particulier, les différences d'affinité observées sur les récepteurs humain et de rat permettront de corréler l'index thérapeutique d'une molécule au ratio dose minimale active/dose minimale dépourvue d'effet secondaire ou toxique obtenu dans les études de toxicologie réalisées chez le rat. Plus particulièrement, l'ADNc codant le récepteur complet MTi de rat a été cloné après amplification par RT-PCR à partir d'ARN de cerveau total de rat, puis séquencé. La séquence nucléotidique obtenue par le séquençage de l'ADNc est présentée à la figure 1 (SEQ ID NO 1). La séquence d'acides aminés déduite de la séquence de la figure 1 est présentée en figure 2 (SEQ ID NO 2). L'invention a ainsi pour objet une séquence d'acides nucléiques codant le récepteur mélatoninergique de rat de type Mati, caractérisée par la séquence de la figure 1. Une séquence d'acides nucléiques selon l'invention comprend notamment : une séquence d'ADN génomique, caractérisée par la séquence de la figure 1, une séquence d'ARN messager, produit de transcription de la séquence d'ADN génomique, - ou une séquence d'ADNc, produit de la transcription inverse de la séquence d'ARN messager. Par séquence d'acides nucléiques , il doit être compris une séquence nucléotidique isolée de son contexte naturel. Il s'agit notamment de séquences isolées, amplifiées et/ou purifiées et éventuellement modifiées par génie génétique. On entend par ADNc ou ADN complémentaire , un acide nucléique résultant de la transcription inverse d'un ARN messager. Les inventeurs ont observé que la séquence codante d'ADN génomique du récepteur couplé aux protéines G selon l'invention était différente de la séquence d'ADNc isolée. Ils ont pu mettre en évidence la structure du gène, caractérisé par la présence de deux exons séparés par un intron. Une séquence d'acides nucléiques selon l'invention peut être aisément isolée par amplification spécifique par RT-PCR à partir d'extraits d'ARN messager de cellules du cerveau de rat, ou par amplification d'ADN génomique de rat, par exemple à l'aide du couple d'amorces ci-dessous : 5'-GCGCGGGGCTACAGGATGAT-3' 5'-ACCCCAACCAGGGAGCGTAAC-3'. L'invention concerne aussi des variants de la séquence d'acides nucléiques de la figure 1. Les variants de la séquence d'acides nucléiques sont notamment : - des séquences capables de s'hybrider dans des conditions stringentes avec une séquence d'acides nucléiques de la figure 1 ou une séquence complémentaire de celle-ci, et codant un polypeptide ayant essentiellement les mêmes propriétés que le récepteur codé par la séquence de la figure 1 ; les séquences d'acides nucléiques déduites de la séquence d'acides aminés de la figure 2, selon le code génétique, - des formes alléliques pathologiques de la séquence de la figure 1. Par conditions stringentes , on entend les conditions qui permettent l'hybridation spécifique de deux séquences d'ADN simple brin à environ 65 C par exemple dans une solution de 6 x SSC, 0, 5% SDS, 5X Denhardt's solution et 100 u. g d'ADN carrier non spécifique ou toute autre solution de force ionique équivalente et après un lavage à 65 C, par exemple dans une solution d'au plus 0,2 x SSC et 0, 1% SDS ou toute autre solution de force ionique équivalente. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm). Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 81,5 + 0,41 (% G + C) + 16,6Log (concentration en cations)-0, 63 (% formamide) - (600/nombre de bases). Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T). Les conditions de stringence peuvent donc être adaptées par l'homme du métier selon la taille de la séquence, la teneur en GC et tout autre paramètre, selon notamment les protocoles décrits dans Sambrook et al., 2001 (Molecular Cloning : A laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor, laboratory press, Cold Spring Harbor, New York). On entend par formes alléliques pathologiques , toute séquence isolée chez le rat correspondant à une forme mutée de la séquence de la figure 1, et dont les mutations sont impliquées dans une pathologie spécifique. Ces mutations peuvent être un ou plusieurs changement (s) nucléotidique (s) ou une ou plusieurs délétion (s) ou insertion (s) de fragments de séquences nucléotidiques. Les sondes d'hybridation pour la reconnaissance spécifique des séquences d'acides nucléiques codant un récepteur mélatoninergique de rat de type MT, selon l'invention font également partie de l'invention. De telles sondes sont caractérisées en ce qu'elles correspondent à un fragment d'une longueur d'au moins 50 nucléotides, de préférence entre 150 et 250 nucléotides d'une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. Les sondes peuvent être couplées directement ou indirectement avec un marqueur radioactif ou non-radioactif, on peut citer notamment le 32Pou le 35S parmi les composés radioactifs ou encore la biotine, l'avidine et la streptavidine ou tout type de composés fluorescents ou bioluminescents ou chimioluminescents parmi les composés non-radioactifs. L'invention fournit également des amorces utiles pour l'amplification et l'isolement des séquences d'acides nucléiques codant un récepteur mélatoninergique de rat de type MT, selon l'invention. Ces amorces ainsi définies comprennent notamment les séquences suivantes : 5'-GCGCGGGGCTACAGGATGAT-3' 5'-ACCCCAACCAGGGAGCGTAAC-3'. Les amorces peuvent comprendre en outre dans leur partie 5'des séquences non spécifiques du gène, notamment des sites de restriction pour faciliter le clonage des séquences amplifiées dans un vecteur, ou encore des séquences codant des étiquettes, épitopes ou séquences signal pour faciliter l'expression et/ou la purification des polypeptides. Des amorces comprenant une séquence étiquette et des sites de restriction appropriés pour le clonage du produit d'amplification dans un plasmide sont aussi décrites dans l'exemple 1. L'invention a trait également aux séquences d'acides nucléiques susceptibles d'être obtenues par l'amplification à l'aide des amorces définies ci-dessus. Les méthodes d'amplification à l'aide des amorces de l'invention sont connues de l'homme du métier et sont en particulier la méthode PCR qui comprend l'utilisation d'une polymérase thermostable ou la méthode RT-PCR qui permet l'amplification d'ADN à partir d'un échantillon d'ARN messager en effectuant préalablement à l'amplification une étape de transcription inverse. Il existe en outre de nombreuses techniques alternatives à la PCR. Citons à titre d'exemple, les méthodes d'amplification isotherme telles que la TMA (transcription mediated amplification), la NASBA (nucleic acid sequence based amplification), la 3SR (self sustained sequence replication) ou l'amplification par déplacement de brin (strand displacement amplification). L'invention concerne aussi un vecteur recombinant comprenant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. Par vecteur, il faut comprendre tout type de vecteur permettant l'introduction de la séquence d'acides nucléiques dans une cellule hôte et éventuellement l'expression du polypeptide codé par la séquence d'acides nucléiques dans la cellule hôte. Un tel vecteur est par exemple le plasmide pSrMT 1 déposé à la CNCM le 31.01. 2002 sous le numéro 1-2791. Dans un mode de réalisation préféré, le vecteur recombinant selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend des séquences d'ADN nécessaires à l'expression dudit récepteur dans une cellule hôte. Ces séquences sont notamment des séquences promotrices appropriées pour l'expression des gènes dans les cellules hôtes et des séquences terminatrices en aval de la séquence codante qui incluent un site de poly-adénylation. Des exemples de séquences promotrices sont la séquence du promoteur du cytomégalovirus (CMV) ou encore la séquence du promoteur SV40 qui permettent une expression constitutive et forte des séquences codantes placées en aval respectivement dans les cellules de mammifères et les cellules d'insecte. Il existe un grand nombre de vecteurs d'expression utilisables. De tels vecteurs d'expression comprennent, entre autres, des vecteurs chromosomiques, épisomiques ou dérivés de virus, en particulier, des vecteurs dérivés des plasmides bactériens, des bactériophages, des transposons, des plasmides et chromosomes de levure, des virus tels que les baculovirus, les papovirus et en particulier SV40, les adénovirus, et les rétrovirus et des vecteurs dérivés de leurs combinaisons, notamment les cosmides et les phagemides. Parmi les vecteurs d'expression particulièrement préférés pour l'expression hétérologue de récepteurs membranaires dans les cellules de mammifères, on citera les vecteurs pCI-neo (promega ; N'accession U47120) et pcDNA3 comprenant le promoteur du CMV, le vecteur bicistronique pIRESneo/pIREShyg (Clontech NO cat 6061-1) ou encore le vecteur pSG5 (Stratagène) comprenant le promoteur SV40. Pour permettre la sécrétion des protéines traduites dans la lumière du réticulum endoplasmique des cellules eucaryotes ou dans l'espace périplasmique des bactéries ou dans tout autre environnement extra-cellulaire, les vecteurs peuvent comprendre des séquences codant les signaux de sécrétion appropriés sur le polypeptide exprimé. L'invention porte aussi sur les cellules hôtes transformées par les vecteurs recombinants. Dans un mode de réalisation particulier, les cellules hôtes sont des bactéries, telles que, par exemple, E. coli, les streptococci, les staphylococci, Streptomyces et B. subtilis, de préférence Escherichia coli. La transformation de cellules hôtes bactériennes est en particulier utile pour l'amplification et le stockage des vecteurs recombinants de l'invention. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les cellules hôtes sont des cellules eucaryotes. Des cellules hôtes eucaryotes utilisables sont notamment des cellules de levures telles que S. cerevisiae ou de champignons filamenteux tels que Aspergillus, des cellules d'insectes telles que les cellules S2 de Drosphila ou Sf9 de spodoptera, ou encore des cellules de plantes. De manière préférée, les cellules hôtes eucaryotes sont des cellules de mammifères et en particulier des lignées cellulaires de mammifères, notamment les cellules CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, HepG2, L (TK-), AtT20, Caco-2 et de manière encore préférée, les lignées CHO-K1 ou HEK 293. Il est ainsi possible d'exprimer le récepteur selon l'invention dans une cellule hôte appropriée, de préférence une cellule hôte eucaryote, par l'introduction dans la cellule hôte du vecteur recombinant de l'invention. L'homme du métier sait aussi purifier ledit récepteur à partir des cellules eucaryotes l'exprimant. Différentes méthodes de purification des récepteurs couplés aux protéines G sont décrites dans l'état de la technique (Eckard CP et Beck-sickinger AG, Curr Med Chem 2000 7 : 897-910 ; Ohtaki T et al., J Biol Chem 1998 273 : 15464-15473 ; Hayashi MK, Haga TJ, Biochem (tokyo) 1996 120 : 1232-1238). Citons à titre d'exemple, les purifications par précipitation au sulfate d'ammonium ou à l'éthanol, sur colonne de chromatographie à échange d'ions, par chromatographie d'affinité, par chromatographie d'exclusion par la taille, par chromatographie en phase inverse ou encore par chromatographie liquide à haute performance. Il est aussi envisageable de purifier le récepteur de l'invention à l'aide des techniques électrophorétiques de séparation des protéines selon leur taille et/ou leur charge. La méthode de chromatographie d'affinité consiste en particulier à exprimer dans une cellule hôte, un récepteur recombinant présentant un épitope ou une séquence étiquette (tag) spécifique en amont ou en aval de la séquence codante, à récupérer les protéines membranaires ou les protéines totales de la cellule hôte puis à purifier les récepteurs sur colonne d'affinité fixant les protéines exprimant l'épitope ou tag spécifique. Selon ce mode de purification particulier, le vecteur d'expression comprend en plus les séquences étiquette (tag) pour la purification du polypeptide exprimé dans les cellules hôtes. L'invention concerne également un polypeptide caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence d'acides nucléiques selon la séquence de la figure 1 (SEQ ID NO 1) ou par tout variant selon l'invention de la séquence de la figure 1. En particulier, l'invention concerne un polypeptide comportant la séquence d'acides aminés de la figure 2 (SEQ ID NO 2). L'invention porte aussi sur les fragments de ce polypeptide présentant une activité de récepteur mélatoninergique, en particulier, les fragments de ce polypeptide comprenant les sept domaines transmembranaires. Il est en outre connu que certains fragments des récepteurs appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G sont capables de stimuler directement la protéine G indépendamment de la présence d'un agoniste. Par exemple, Hebert et al. ont montré que la deuxième et troisième boucle intracellulaire du récepteur couplé aux protéines G HT1AR permettent le couplage dudit récepteur aux protéines G et leur stimulation (Hebert TE et al., J Biol Chim 1996 271 : 16384-16392). Ainsi, l'invention porte sur les fragments du polypeptide décrit plus haut, lesdits fragments étant capables de stimuler directement les protéines G, et de mimer ainsi l'activité du récepteur en présence d'un agoniste. Inversement, les fragments de récepteurs couplés aux protéines G délétés de tout ou partie des régions impliquées dans la dimérisation du récepteur ou dans l'interaction avec les protéines G peuvent être utilisés avantageusement afin d'inhiber l'action d'un agoniste (Varrault A. et al., J Biol Chem 1994 269 : 16720-16725). Par conséquent, l'invention porte aussi sur les fragments du polypeptide décrit plus haut, capables d'inhiber l'action d'un agoniste. Ainsi, selon les modes de réalisations de l'invention, les fragments de séquences polypeptidiques de l'invention sont compris dans un des 7 domaines transmembranaires ou dans la partie intracytoplasmique (première, deuxième et troisième boucle intracellulaire) ou encore dans la partie extérieure à la cellule (partie N-terminale ou première, deuxième ou troisième boucle extracellulaire). Les polypeptides ou fragments de polypeptides de l'invention sont sous la forme des protéines natives ou font partie d'une protéine de fusion de taille plus importante. En particulier, les polypeptides de l'invention sont fusionnés à des séquences d'acides aminés supplémentaires qui contiennent les signaux nécessaires à la traduction, la stabilité, la sécrétion et/ou la purification de la protéine recombinante correspondante. Les anticorps dirigés contre les polypeptides et fragments de polypeptides décrits plus haut font également partie de l'invention. Ces anticorps trouvent leur intérêt pour détecter et/ou quantifier l'expression des récepteurs à la surface des cellules. Lorsque les anticorps sont spécifiquement dirigés contre le site de reconnaissance du ligand du récepteur, ces anticorps peuvent aussi être utilisés en tant qu'antagonistes du récepteur. L'invention vise à la fois les anticorps polyclonaux et monoclonaux. Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par l'immunisation d'un hôte vivant approprié avec lesdits polypeptides purifiés ou leurs fragments contenant les épitopes que l'on souhaite identifier et/ou quantifier. Les anticorps formés à partir d'un sérum de l'hôte immunisé sont ensuite récupérés notamment par la mise en contact des sérums avec les polypeptides purifiés et par la récupération de ces anticorps à partir des complexes antigène-anticorps formés. Les anticorps monoclonaux sont notamment obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes de Kohler et Milstein. Les anticorps selon l'invention peuvent aussi être des anticorps chimériques, des anticorps humanisés ou des fragments Fab ou F (ab') 2. Il est en particulier possible, de cloner les gènes codant les deux chaînes des anticorps monoclonaux produits par des hybridomes, ceux-ci pouvant être manipulés in vitro et réintroduits ensuite dans des cellules secrétrices, telles des lignées lymphoïdes ou autres, après leur réinsertion dans les vecteurs d'expression appropriés aux cellules choisies. Les anticorps selon l'invention sont aussi susceptibles d'être couplés à un autre composé, notamment un marqueur, afin d'obtenir un signal détectable ou quantifiable. Les cellules hôtes exprimant le récepteur mélatoninergique de type MT 1 selon l'invention peuvent être utilisées dans des études de liaison au récepteur pour le criblage de molécules qui se fixent au récepteur, le procédé comprenant les étapes suivantes : a) la culture de cellules hôtes eucaryotes transformées par un vecteur recombinant selon l'invention permettant l'expression du récepteur MT 1 de rat ; b) la mise en contact des cellules hôtes en culture ou de leur membrane avec un composé candidat ; c) la détermination d'une liaison éventuelle au récepteur en présence du composé candidat par des études de compétition vis à vis de la mélatonine marquée, de la 2-iodo-mélatonine marquée ou de tout autre ligand marqué présentant une bonne affinité pour le récepteur de l'invention. Les cellules hôtes exprimant le récepteur mélatoninergique de type MT 1 selon l'invention peuvent être par ailleurs avantageusement utilisées pour le criblage de composés qui se fixent au récepteur et l'activent (agonistes de ce récepteur) ou qui inhibent l'activation dudit récepteur (antagonistes). L'invention porte ainsi sur un procédé de criblage pour l'identification de molécules agonistes du récepteur Mati, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la culture de cellules hôtes eucaryotes transformées par un vecteur recombinant selon l'invention permettant l'expression dudit récepteur ; b) la mise en contact des cellules hôte en culture avec un composé candidat ; c) la détermination d'un signal éventuel généré par le récepteur mélatoninergique en présence du composé candidat. Selon les modes de réalisation du procédé, le signal à déterminer, généré par l'activation du récepteur MTl par le composé candidat peut être une stimulation ou une inhibition de l'adénylate cyclase, une liaison du 35SGTPy, une activité MAP kinase ou encore une augmentation de l'inositol triphosphate intracellulaire, et plus généralement tout type de signal susceptible d'être modulé positivement ou négativement par les protéines G. Dans un mode de réalisation préféré, le signal généré par le récepteur MT 1 en présence d'un de ses agonistes est déterminé à l'aide d'un système rapporteur comprenant l'utilisation d'une cellule recombinante exprimant la sous-unité a de la protéine G16 de manière stable ou transitoire et la quantification de la concentration en calcium intracellulaire. L'expression constitutive de la sous-unité a de la protéine G16 permet que toute réponse antagoniste se traduise essentiellement par une augmentation de la concentration en calcium intracellulaire. Ainsi, l'invention porte sur un procédé de criblage pour l'identification de molécules agonistes comprenant les étapes suivantes : a) la culture de cellules hôtes eucaryotes transformées par un vecteur recombinant selon l'invention permettant l'expression du récepteur MTl, lesdites cellules hôtes exprimant en plus une sous-unité a de la protéine G de manière constitutive ; b) la quantification de la concentration en calcium intracellulaire dans les cellules en culture en présence et en absence des molécules à cribler ; c) la sélection des molécules en présence desquelles la concentration en calcium intracellulaire est augmentée. Dans le procédé ci-dessus, les cellules hôtes sont modifiées de telle manière que toute activation du récepteur conduit à une élévation de la concentration en calcium intracellulaire. On utilisera par exemple des cellules COS7, CHO ou HEK293 exprimant de façon stable ou transitoire la sous-unité Gal6. La concentration de calcium intracellulaire est déterminée à l'aide d'un marqueur, notamment un marqueur fluorescent. L'invention porte également sur un procédé d'identification de la présence de molécules antagonistes comprenant les étapes suivantes : a) la culture de cellules hôtes eucaryotes transformées par un plasmide recombinant selon l'invention permettant l'expression du récepteur MTl en présence d'un agoniste ; b) la mise en contact des cellules hôtes en culture avec un composé candidat ; c) la détermination d'une diminution du signal éventuel généré par le récepteur couplé aux protéines G en présence du composé candidat et de l'agoniste par rapport au signal généré avec l'agoniste seul. Les agonistes et antagonistes identifiés par un tel procédé sont également visés par l'invention. L'invention porte aussi sur l'utilisation d'une séquence d'acides nucléiques codant un récepteur mélatoninergique de type MTl selon l'invention pour le criblage de molécules agonistes et antagonistes dudit récepteur. Elle concerne également l'utilisation des cellules hôtes ci-dessus mentionnées pour le criblage de molécules agonistes et antagonistes dudit récepteur. Avantageusement, l'expression du transcrit codant le récepteur MT 1 dans des cellules ou des tissus est étudiée par hybridation des ADNc ou ARNm dans des kits constitués de puces à ADN , ou micro-réseaux ou macro-réseaux sur lesquels sont fixés des sondes spécifiques du gène de l'invention dont l'expression est recherchée. Par puce à ADN , il faut comprendre tout type de support permettant la fixation stable d'une quantité d'acides nucléiques, l'hybridation des acides nucléiques fixés sur le support avec une séquence contenue dans un extrait d'ADN ou d'ARN préalablement marqué, puis la quantification de l'hybridation. Les technologies des puces à ADN sont en particulier décrites par Sambrook et al. (voir plus haut). De même, des kits permettant la détection de formes anormales du récepteur MT 1 font également partie de l'invention. Ces tests peuvent être de nature immunologique comprenant l'utilisation d'anticorps spécifiques de régions du récepteur susceptibles de contenir des structures anormales. Ces kits peuvent également être une puce à protéines constituée d'un support sur lequel est fixée une séquence d'acides aminés selon l'invention ou un anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un polypeptide ou un fragment de polypeptide selon l'invention. De telles puces à protéines permettent la détection à grande échelle de structures anormales de plusieurs protéines, ou la détection des interactions particulières du récepteur avec d'autres molécules. En particulier, l'invention porte sur une séquence nucléotidique anti-sens, capable d'inhiber l'expression des séquences d'acides nucléiques selon l'invention, et caractérisée en ce qu'elle correspond à une séquence d'acides nucléiques simple brin capable de s'hybrider dans des conditions stringentes au brin codant d'une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Séquence d'acides nucléiques codant le récepteur mélatoninergique de rat de type MT, (SrMTi). (SEQ ID NO 1) Figure 2 : Séquence d'acides aminés du récepteur mélatoninergique de rat de type Mati. (SEQ ID NO 2) Figure 3 : Profil hydrophile du récepteur mélatoninergique de rat de type Mati. Exemple 1-Identification et isolement d'une séquence d'acides nucléiques codant un nouveau récepteur mélatoninergique de type MT 1 Les exons 1 et 2 codant pour le récepteur MT 1 de rat ont été isolés à partir d'ADN génomique par des techniques de RT-PCR en utilisant des amorces dégénérées ou non conçues à partir de la comparaison des séquences humaine et rat du récepteur MT 1 : Les amorces sens sont 5'-GGRMGRCCRCGRCCSTCSTGG-3'pour l'exon 1 et 5'TAGGATATACAGTAACAAGAAT-3'pour l'exon2. Les amorces antisens sont 5'TTRTTCTTCGAGTCCTTGMGT-3'pour l'exon 1 et 5'-ATGTAACTAGCCACGAAGAGC-3'pour l'exon 2. Les séquences nucléotidiques des deux exons ont été déterminées à partir d'une réaction de terminaison de chaîne et en utilisant un séquenceur d'ADN automatique ABI 377 (Applied Biosystems). Les séquences nucléotidiques des exons 1 et 2 ont permis de concevoir de nouvelles amorces nucléotidiques permettant d'amplifier le récepteur MT 1 de rat dans sa totalité (de-57 à +1104 ; +1 correspond au A du codon d'initiation ATG) Un ADNc a été isolé par RT-PCR à partir d'ARNm de cerveaux de rats à l'aide des amorces sens 5'-GAGCTTAAGCTTGCGCGGGGCTACAGGATGAT-3'et anti sens 5'-GGATCCGGTACCACCCCAACCAGCGAGCGTAAC-3'. Ces amorces ont été définies à partir de la séquence théorique obtenue, et contiennent en plus les séquences des sites de restriction Hind III et Kpn 1 (soulignées dans la séquence d'oligonucléotides) permettant un clonage orienté dans le vecteur d'expression nommé pcDNA3-Cflag. Ce vecteur a été obtenu en insérant, dans le vecteur pcDNA3.1 (+) (Invitrogen), une séquence codant pour le peptide DYKDDDDK en 3'du site Kpn I. La séquence amplifiée par RT-PCR a été insérée dans le vecteur d'expression pcDNA3-Cflag en phase avec la séquence codant pour les peptides DYKDDDDK puis la séquence nucléotidique a été déterminée à partir d'une réaction de terminaison de chaîne et en utilisant un séquenceur d'ADN automatique ABI 377 (Applied Biosystems). La traduction de la séquence nucléotidique théorique en acides aminés produit une séquence en protéine de 363 acides aminés. Cette séquence possède un certain nombre de critères structuraux typiques des récepteurs couplés aux protéines G : incluant 7 domaines transmembranaires contenant chacun environ 20-30 acides aminés hydrophobes et le motif NRY présent dans la deuxième boucle intracellulaire. La séquence nucléotidique (SRMTI) ainsi obtenue est présentée dans la figure 1 (SEQ ID NO 1). La séquence d'acides aminés, déduite de la séquence nucléotidique est présentée dans la figure 2 (SEQ ID NO 2). L'analyse du profil hydrophile de la séquence à l'aide de la méthode de Kyte et Doolittle est présentée en figure 3. Elle confirme l'existence de sept domaines transmembranaires hydrophobes ainsi que la présence du motif NRY dans la deuxième boucle intracellulaire. Ces résultats attestent que la séquence d'acides nucléiques isolée code pour un nouveau récepteur couplé aux protéines G de type mélatoninergique. Exemple 2-Vecteur recombinant et lignées cellulaires exprimant de façon stable la séquence codant un récepteur MT 1 selon l'invention L'ADNc tel qu'isolé dans l'Exemple 1 a été cloné dans le vecteur d'expression pcDNA3-Cflag (pcDNA3, Invitrogen). Ce vecteur, nommé pSrMT 1, comprend une origine de réplication bactérienne permettant de multiplier le plasmide recombinant pcDNA3- SrMT 1-C flag obtenu en grand nombre de copies. Le vecteur comprend en outre un gène de résistance à l'ampicilline pour la sélection des clones bactériens, un gène de résistance à la généticine (G418) permettant la sélection de clones de cellules eucaryotes ayant incorporés l'ADNc SAMT, codant pour le récepteur MT 1 de rat. Enfin, les séquences clonées dans le vecteur sont sous le contrôle du promoteur du CMV qui permet une expression forte du gène cloné dans la cellule hôte eucaryote. Le plasmide recombinant décrit ci-dessus est introduit dans les cellules CHO-K1 (American type culture collection, CCL61) maintenues dans un milieu Ham-F12 avec 10% de sérum de veau foetal, 2mM de glutamine, 500 lU/ml de pénicilline et 500 g/ml de streptomycine en utilisant la méthode de transfection à la lipofectamine comme décrit par le fournisseur (Life Technologies, France). Les clones exprimant ledit récepteur sont sélectionnés avec 500 u-g/ml de G418 et testés pour l'expression du récepteur, par une technique d'immunofluorescence, en utilisant un anticorps IgG reconnaissant le peptide DYKDDDDK. Ces expériences permettent de confirmer l'expression du récepteur dans la cellule CHO-K1. Exemple 3-Etude de liaison avec des radioli2ands Les expériences de liaison au récepteur sont réalisées en utilisant la 2-[1251]-iodomélatonine comme radioligand de référence (Pharmacol. Exp. Therap., 1999, 290, pp. 334-340). Une préparation membranaire de cellules transfectées (40 J, g/ml) diluée dans un tampon de liaison (50 mM Tris-HCl, pH 7,4 contenant 5 mM MgClz) est additionnée à la 2- [I]- iodomélatonine (0,025 nM) et au composé à tester. La liaison non spécifique est déterminée en présence de mélatonine 1 J. M. Après 60 minutes d'incubation à 37 C, la réaction est stoppée par filtration rapide à travers un filtre GF/B préimprégné avec une solution à 0, 5% (v/v) de polyethylèneimine. Les filtres sont lavés trois fois avec 1 ml de tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 froid. La radioactivité retenue est déterminée à l'aide d'un compteur à scintillation liquide. Les résultats permettent de déterminer les affinités de liaison des composés testés (IC5o). Exemple 4-Procédé de criblage pour l'identification de molécule agoniste du récepteur MT 1 de rat Mesure du calcium intracellulaire au FLIPR Les cellules CHO-K1 exprimant le produit du gène codé par la séquence de la figure 1 et la sous-unité a de la protéine G16 sont dissociées la veille de l'expérience et ensemencées (45000 cellules/puits) sous un volume de 100 jl/puits dans des plaques de culture 96 puits (costar) noires à fond clair. Le jour de l'expérience, 100p. l de kit calcium (Molecular Devices), 2, 5mM final de probénécide et 10 mM final de tampon Hépès sont ajoutés dans chaque puits et les cellules sont incubées pendant 1 heure à 37 C. Les plaques de cellules sont ensuite placées dans un fluorimètre de type FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader). L'expérience est réalisée à température ambiante. Le temps d'exposition (0,4 sec) et l'intensité du laser (15 à 18 ampères) sont ajustés afin d'obtenir des valeurs basales de fluorescence entre 5000 et 10000 unités. La mesure de la fluorescence est effectuée sur toute la plaque toutes les secondes pendant les 60 premières secondes puis toutes les 6 secondes pendant 1 minute. Des ligands de différentes catégories, préalablement solubilisés et répartis à une concentration définie sur des plaques 96 puits, sont mis en contact avec les cellules. L'addition des produits à tester s'effectue en cours d'expérience à 10 secondes grâce à un dispositif de distribution comprenant 96 cônes noirs (50 dz d'une solution [x5] sont ajoutés dans chaque puits à la vitesse de 70 J. l/sec et une hauteur de 200 1). La réponse calcique se caractérise par une augmentation transitoire de la fluorescence immédiatement après l'addition des ligands actifs. Des solutions d'ATP 10 M et de tampon HBSS sont incluses dans chaque plaque de ligands et servent respectivement de contrôle positif et négatif de la réponse calcique. REVENDICATIONS 1. Séquence d'acides nucléiques codant le récepteur MT 1 de rat, caractérisée par la séquence suivante (SEQ ID NO 1) : CGTATATTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCTTG ATTACGCCAAGCTCGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCGCGCGCCT GCAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGCGCGGGGCTACAGG ATGATGGCCCTGGCTGTGCTGCGGTAAGTCACCCAGGGGACCATGAAGGGCAATGTCAGCG AGCTTCTCAACGCCTCTCAGCAGGCTCCAGGCGGCGGGGAGGAAATAAGATCGCGGCCGTC GTGGCTGGCCTCTACACTGGCCTTCATCCTCATCTTTACTATCGTGGTGGACATCCTGGGA ACCTGCTGGTCATCCTGTCTGTGTATCGCAACAAGAAGCTCAGGAACGCAGGGAATATATT TGTGGTGAGTTTAGCTGTGGCAGACCTCGTGGTGGCTATTTACCCATTTCCCTTGGCGCTG ACGTCTATACTTAACAATGGATGGAACCTGGGATATCTGCATTGTCAAGTTAGTGCCTTCC TAATGGGCCTGAGTGTCATTGGCTCGGTATTCAACATCACCGGGATCGCTATGAACCGCTA CTGCTACATTTGCCACAGTCTCAAGTATGATAGGATATACAGTAACAAGAATTCCCTGTGC TACGTGTTCCTGATATGGACACTGACACTCATAGCCATCATGCCCAACCTGCAAACCGGAA CTCTCCAGTACGACCCCCGGATCTACTCCTGTACCTTCACCCAGTCCGTCAGCTCGGCGTA CACAATTGCCCTGGTGGTTTTCCATTTCGTAGTCCCAATGATTATTGTCACTTTCTGCTAC TTAAGGATATGGATCCTGGTTCTTCAGGTCAGACGGAGGGTAAAACCGGACAGCAAACCCA AACTGAAGCCGCAGGACTTCAGGAACTTTGTCACCATGTTTGTAGTTTTTGTACTTTTTGC CCTGTGCTGGGCCCCACTCAACTTCATAGGTCTTATTGTGGCCTCAGATCCGGCCACCATG GCCCCCAGGATCCCGGAGTGGCTCTTCGTGGCTAGTTACTACCTGGCGTATTTCAACAGCT GCCTCAACGCAATCATATACGGACTACTGAACCAAAATTTCAGAAAGGAGTACAAGAGGAT TATCATCTCACTGTGCACAGCTAAGATGTTCTTTGTGGACAGTTCAAATGATGCAGCAGAT AAGATTAAATGTAAGCCCTCTCCACTAATAACCAATAATAATTTAATAAAGGTGGACTCTG TTGGTACCGACTACAAGGACGACGATGACAAGTAATCTAGAGCGGCCGCGGGCCCATCGAT TTTCCACCCGGGTGGGGTACCAGGTAAGTGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTA CAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCTGGCGTTACCCAACTTA ATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGA TCGCCCTTCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGAGATCCAATTTTTAAGTGGATA ATGNGTTAAACTACTGATTCTAATTGGTTGGGTATTTTAGATTCACAGTCCCAGGCTCATT TCAGGCCCCTCAGT 2. Séquence d'acides nucléiques capable de s'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence de la revendication 1 et codant un polypeptide ayant essentiellement les mêmes propriétés que le récepteur codé par la séquence de la revendication 1. 3. Séquence d'acides nucléiques déduite selon le code génétique de la sequenz d'acides aminés suivante (SEQ ID NO 2) : 5 10 15 Met Lys Gly Asn Val Ser Glu Leu Leu Asn Ala Ser Gln Gln Ala 20 25 30 Pro Gly Gly Gly Glu Glu Ile Arg Ser Arg Pro Ser Trp Leu Ala 35 40 45 Ser Thr Leu Ala Phe Ile Leu Ile Phe Thr Ile Val Val Asp Ile 50 55 60 Leu Gly Asn Leu Leu Val Ile Leu Ser Val Tyr Arg Asn Lys Lys 65 70 75 Leu Arg Asn Ala Gly Asn Ile Phe Val Val Ser Leu Ala Val Ala 80 85 90 Asp Leu Val Val Ala Ile Tyr Pro Phe Pro Leu Ala Leu Thr Ser 95 100 105 Ile Leu Asn Asn Gly Trp Asn Leu Gly Tyr Leu His Cys Gln Val 110 115 120 Ser Ala Phe Leu Met Gly Leu Ser Val Ile Gly Ser Val Phe Asn 125 130 135 Ile Thr Gly Ile Ala Met Asn Arg Tyr Cys Tyr Ile Cys His Ser 140 145 150 Leu Lys Tyr Asp Arg Ile Tyr Ser Asn Lys Asn Ser Leu Cys Tyr 155 160 165 Val Phe Leu Ile Trp Thr Leu Thr Leu Ile Ala Ile Met Pro Asn 170 175 180 Leu Gln Thr Gly Thr Leu Gln Tyr Asp Pro Arg Ile Tyr Ser Cys 185 190 195 Thr Phe Thr Gln Ser Val Ser Ser Ala Tyr Thr Ile Ala Leu Val 200 205 210 Val Phe His Phe Val Val Pro Met Ile Ile Val Thr Phe Cys Tyr 215 220 225 Leu Arg Ile Trp Ile Leu Val Leu Gln Val Arg Arg Arg Val Lys 230 235 240 Pro Asp Ser Lys Pro Lys Leu Lys Pro Gln Asp Phe Arg Asn Phe 245 250 255 Val Thr Met Phe Val Val Phe Val Leu Phe Ala Leu Cys Trp Ala 260 265 270 Pro Leu Asn Phe Ile Gly Leu Ile Val Ala Ser Asp Pro Ala Thr 275 280 285 Met Ala Pro Arg Ile Pro Glu Trp Leu Phe Val Ala Ser Tyr Tyr 290 295 300 Leu Ala Tyr Phe Asn Ser Cys Leu Asn Ala Ile Ile Tyr Gly Leu 315 320 325 Leu Asn Gln Asn Phe Arg Lys Glu Tyr Lys Arg Ile Ile Ile Ser 320 325 330 Leu Cys Thr Ala Lys Met Phe Phe Val Asp Ser Ser Asn Asp Ala 335 340 345 Ala Asp Lys Ile Lys Cys Lys Pro Ser Pro Leu Ile Thr Asn Asn 350 355 360 Asn Leu Ile Lys Val Asp Ser Val Gly Thr Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys *** 4. Séquence d'acides nucléiques anti-sens capable d'inhiber l'expression d'une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle correspond à une séquence d'acides nucléiques simple brin, capable de s'hybrider dans des conditions stringentes au brin codant de la séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 3. 5. Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 3. 6. Vecteur recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce que le vecteur est un plasmide comprenant les séquences nécessaires à l'expression du récepteur MT, de rat dans une cellule hôte. 7. Vecteur recombinant selon la revendication 6, caractérisé en ce que les séquences nécessaires à l'expression du récepteur MT 1 de rat comprennent une séquence du promoteur du cytomégalovirus (CMV) ou une séquence du promoteur SV40. 8. Plasmide pSrMT 1 déposé à la CNCM le 31.01. 2002 sous le numéro 1-2791. 9. Cellule hôte caractérisée en ce qu'elle est transformée par le vecteur recombinant selon l'une des revendications 5 à 8. 10. Cellule hôte selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite cellule hôte est une bactérie. 11. Cellule hôte selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite cellule hôte est une cellule eucaryote. 12. Cellule hôte selon la revendication 11, caractérisée en ce que ladite cellule hôte provient d'une lignée CRO-K1 (American type culture collection, CCL61). 13. Cellule hôte selon la revendication 12, caractérisée en ce que ladite cellule hôte exprime en plus la sous-unité a de la protéine G de manière stable ou transitoire. 14. Polypeptide caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 3. 15. Polypeptide selon la revendication 14 comportant la séquence d'acides aminés suivante (SEQ ID NO 2) : 5 10 15 Met Lys Gly Asn Val Ser Glu Leu Leu Asn Ala Ser Gln Gln Ala 20 25 30 Pro Gly Gly Gly Glu Glu Ile Arg Ser Arg Pro Ser Trp Leu Ala 35 40 45 Ser Thr Leu Ala Phe Ile Leu Ile Phe Thr Ile Val Val Asp Ile 50 55 60 Leu Gly Asn Leu Leu Val Ile Leu Ser Val Tyr Arg Asn Lys Lys 65 70 75 Leu Arg Asn Ala Gly Asn Ile Phe Val Val Ser Leu Ala Val Ala 80 85 90 Asp Leu Val Val Ala Ile Tyr Pro Phe Pro Leu Ala Leu Thr Ser 95 100 105 Ile Leu Asn Asn Gly Trp Asn Leu Gly Tyr Leu His Cys Gln Val 110 115 120 Ser Ala Phe Leu Met Gly Leu Ser Val Ile Gly Ser Val Phe Asn 125 130 135 Ile Thr Gly Ile Ala Met Asn Arg Tyr Cys Tyr Ile Cys His Ser 140 145 150 Leu Lys Tyr Asp Arg Ile Tyr Ser Asn Lys Asn Ser Leu Cys Tyr 155 160 165 Val Phe Leu Ile Trp Thr Leu Thr Leu Ile Ala Ile Met Pro Asn 170 175 180 Leu Gln Thr Gly Thr Leu Gln Tyr Asp Pro Arg Ile Tyr Ser Cys 185 190 195 Thr Phe Thr Gln Ser Val Ser Ser Ala Tyr Thr Ile Ala Leu Val 200 205 210 Val Phe His Phe Val Val Pro Met Ile Ile Val Thr Phe Cys Tyr 215 220 225 Leu Arg Ile Trp Ile Leu Val Leu Gln Val Arg Arg Arg Val Lys 230 235 240 Pro Asp Ser Lys Pro Lys Leu Lys Pro Gln Asp Phe Arg Asn Phe 245 250 255 Val Thr Met Phe Val Val Phe Val Leu Phe Ala Leu Cys Trp Ala 260 265 270 Pro Leu Asn Phe Ile Gly Leu Ile Val Ala Ser Asp Pro Ala Thr 275 280 285 Met Ala Pro Arg Ile Pro Glu Trp Leu Phe Val Ala Ser Tyr Tyr 290 295 300 Leu Ala Tyr Phe Asn Ser Cys Leu Asn Ala Ile Ile Tyr Gly Leu 315 320 325 Leu Asn Gln Asn Phe Arg Lys Glu Tyr Lys Arg Ile Ile Ile Ser 320 325 330 Leu Cys Thr Ala Lys Met Phe Phe Val Asp Ser Ser Asn Asp Ala 335 340 345 Ala Asp Lys Ile Lys Cys Lys Pro Ser Pro Leu Ile Thr Asn Asn 350 355 360 Asn Leu Ile Lys Val Asp Ser Val Gly Thr Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys *** 16. Polypeptide caractérisé en ce qu'il correspond à un fragment d'un polypeptide selon l'une des revendications 14 ou 15 et en ce qu'il présente une activité de récepteur mélatoninergique de type Mati. 17. Polypeptide caractérisé en ce qu'il correspond à un fragment d'un polypeptide selon l'une des revendications 14 ou 15, et en ce qu'il est capable de stimuler directement les protéines G. 18. Polypeptide caractérisé en ce qu'il correspond à un fragment d'un polypeptide selon l'une des revendications 14 ou 15, et en ce qu'il est capable d'inhiber l'action d'un agoniste. 19. Amorces pour l'amplification d'une séquence codant un polypeptide selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisées en ce qu'elles comprennent les séquences suivantes : 5'-GCGCGGGGCTACAGGATGAT-3' 5'-ACCCCAACCAGGGAGCGTAAC-3'. 20. Sonde d'hybridation pour la reconnaissance spécifique des séquences d'acides nucléiques codant le récepteur MT1 de rat selon l'une des revendications 1 ou 3, caractérisée en ce qu'elle correspond à un fragment d'une longueur d'au moins 50 nucléotides, de préférence entre 150 et 250 nucléotides, d'une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 ou 3. 21. Anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé : soit contre un polypeptide codé par une séquence d'acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ; soit contre un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 14 à 18. 22. Anticorps selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps monoclonal. 23. Procédé d'identification de molécules capables de se fixer au récepteur mélatoninergique de type MT l selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la culture de cellules hôtes eucaryotes transformées par un vecteur recombinant selon l'une des revendications 6,7 ou 8 ; b) la mise en contact des cellules hôtes en culture ou de leur membrane avec un composé candidat ; c) la détermination d'une liaison éventuelle au récepteur en présence du composé candidat par des études de compétition vis à vis de la mélatonine marquée, de la 2-iodo-mélatonine marquée ou de tout autre ligand marqué présentant une bonne affinité pour le récepteur de l'invention. 24. Procédé d'identification de la présence de molécules agonistes du récepteur MT1 de rat, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. la culture de cellules hôtes eucaryotes transformées par un vecteur recombinant selon l'une des revendications 6,7 ou 8 ; b. la mise en contact des cellules hôtes en culture avec un composé candidat ; c. la détermination d'un signal éventuel généré par le récepteur MTl de rat en présence du composé candidat. 25. Procédé de criblage d'un agoniste du récepteur MT, de rat, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. la culture de cellules hôtes selon la revendication 13 en présence ou en absence d'une ou de plusieurs molécules à cribler ; b. la quantification de la concentration en calcium intracellulaire dans les cellules en culture en présence et en absence des molécules à cribler ; c. la sélection des molécules en présence desquelles la concentration en calcium intracellulaire est augmentée. 26. Procédé d'identification de la présence de molécules antagonistes comprenant les étapes suivantes : a. la culture de cellules hôtes eucaryotes transformées par un vecteur recombinant selon l'une des revendications 5 à 8 dans des conditions permettant l'expression du récepteur MT, de rat en présence d'un agoniste ; b. la mise en contact des cellules hôtes en culture avec un composé candidat ; c. la détermination d'une diminution du signal éventuel généré par le récepteur MT 1 de rat en présence du composé candidat et de l'agoniste par rapport au signal généré avec l'agoniste seul. 27. Utilisation d'une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 3 pour le criblage d'un agoniste du récepteur MT 1 de rat. 28. Utilisation des cellules hôtes selon la revendication 13 pour le criblage d'un agoniste du récepteur MT 1 de rat. 29. Puce à ADN contenant des séquences selon l'une des revendications 1 à 3. 30. Kit pour la détection d'une structure anormale du récepteur MT 1 de rat, caractérisé en ce qu'il comprend : - soit des anticorps selon l'une des revendications 21 ou 22 ; soit des polypeptides selon l'une des revendications 14 à 18. 31. Puce à protéine contenant un anticorps selon l'une des revendications 21 ou 22 ou un polypeptide selon l'une des revendications 14 à 18.