Brevet FR2843115A1 — publié le 20040206

La présente invention est relative à un mélange de peptides issus des protéines C et NS3 du virus de l'hépatite C (VHC) ainsi qu'à ses applications en tant que médicament (dans des compositions immunogènes, aptes à stimuler la production de lymphocytes T CD4+ anti-VHC in vivo et donc utiles pour la prévention et le traitement des infections à VHC) ou en tant que réactif de diagnostic de lymphocytes T spécifiques du VHC. notamment pour évaluer l'état immunitaire des patients. Le virus de l'hépatite C (VHC) a été identifié en 1989 comme étant l'agent étiologique majeur des hépatites non-A non-B (Kato et al., P.N.A.S., 1990. 87,9524-). L'homme est le seul hôte connu du VHC mais le virus peut être transmis expérimentalement aux chimpanzés. Le VHC infecte les hépatocytes, mais également certaines cellules du système immunitaire comme les lymphocytes, les monocytes et les cellules dendritiques. La transmission du virus est essentiellement parentérale. Toutefois, comme les infections de novo sont rarement décelables. la voie de contamination demeure inconnue dans plus de 40% des cas. La prévalence de l'hépatite C est élevée dans la population générale, de l'ordre de 1 à 2% en Afrique, en Amérique, en Europe ainsi qu'en Asie du sud-est (Alter et al.. Blood, 1995, 85, 1681-). Elle pourrait atteindre 5% dans certaines régions de Chine et dans le pacifique-ouest. Au Moyen-Orient, la prévalence varie de 1 jusqu'à 12%. Ainsi, il est estimé que 170 millions d'individus dans le monde sont porteurs du VHC. Le VHC fait partie du genre Hepacivirus au sein de la famille des Flaviviridae. C'est un virus à ARN brin positif de 9,4 kb. Le génome possède un cadre de lecture ouvert principal qui code pour un long polypeptide clivable en 8 protéines. La protéine de capside (Core ou C. 191 acides aminés) possède une capacité de liaison à l'ARN viral et constitue la nucléocapside virale. Elle participe également à des effets cytopathogènes directs. Les glycoprotéines El et E2 sont insérées dans l'enveloppe du virus et impliquées dans les interactions avec les cellules hôtes notamment via le récepteur CD81. La protéine NS2 possède une fonction métalloprotéase impliquée notamment dans le clivage NS2/NS3. NS3 (631 acides aminés. le premier acide aminé de la protéine NS3 correspond à celui situé en position 1007 dans la séquence de la polyprotéine du VHC) et NS4 participent à la fois à une activité sérine protéase et ARN hélicase. Les protéines NS5A et NS5B sont des polymérases à ARN participant à la réplication du génome du VHC. Dans ce qui suit. la numérotation des acides aminés est indiquée en référence à la séquence de la polyprotéine du VHC de génotype la (SWISSPROT P26664 et Choo et al., P. N.A.S., 1991.88, 2451-2455) : il y a lieu de noter que cette numérotation est identique pour tous les génotypes du VHC dans la mesure où leurs polyprotéines présentent la même taille. Le VHC peut être classifié en 6 génotypes ou clades (désignés de 1- 6) et jusqu'à 100 sous-types (désignés par a, b. c, etc). Cette classification selon Simmonds et al. (J. Gen. Virol., 1993, 74, 2391-) est basée sur une analyse phylogénétique des séquences NS5. La variabilité inter-génotypique affecte également, mais à différents degrés, les autres protéines virales. Les génotypes 1-3 ont une distribution mondiale, les génotypes 4 et 5 sont présents principalement en Afrique tandis que le génotype 6 est principalement distribué en Asie. Au sein d'un individu infecté. les VHC ne représentent pas une espèce homogène mais constituent de nombreuses quasi-espèces. Ce phénomène est le résultat de l'apparition de mutations au sein du génome dues à la faible fidélité de réplication de la polymérase virale. Le VHC occasionne chez l'homme des infections aiguës pouvant se résoudre naturellement mais peut conduire dans plus de 80% des cas à la persistance du virus. La phase aiguë est relativement bénigne avec seulement 20 à 30% des personnes infectées développant des symptômes ou des signes cliniques. Environ 60% des patients ont une augmentation des transaminases témoignant d'une hépatite chronique. Les études épidémiologiques indiquent que 20% des individus porteurs du virus développent une cirrhose après une vingtaine d'années suivie d'une décompensation hépatique, voire d'un hépatocarcinome. Dans les pays industrialisés, le VHC est responsable au total de 20% des hépatites aiguës, de 60% des carcinomes hépatocellulaires et de 30% des transplantations hépatiques. Les traitements actuels (interféron-alpha / ribavirine) permettent la guérison d'environ 50% des patients en phase chronique. Contrairement à l'infection par le VIH, l'infection par le VHC n'est pas systématiquement persistante. De nombreux patients infectés arrivent en effet à surmonter l'infection grâce à une réponse immunitaire efficace. Des lymphocytes T auxiliaires (T helper) pourraient être impliqués dans le contrôle précoce de la réplication virale (Thimme et al; J Exp. Med.. 2001.194. 1395). En effet, une forte activité des lymphocytes T auxiliaires. spécifiques des protéines C, NS3, NS4 et NS5. et de type Th1(c'est-à-dire sécrétant des interleukines telles que l'IL2 et l'IFNy) est associée au processus de guérison spontanée (Diepolder et al.. Lancet, 1995, 346. 1006- ; Pape et al.. J. Virol. Hepat. Suppl.. 1999. 1, 36; Gerlach et al., Gastroenterology. 1999, 117. 933). A l'inverse, une réponse T helper Th2 (c'est-àdire caractérisée par la sécrétion d'IL4 et d'IL5) est associée à un mauvais pronostic de l'évolution de l'infection à VHC (Tai et al.. J. Biomed. Sci., 2001,8, 321). L'implication des lymphocytes T auxiliaires dans l'évolution de l'infection à VHC a été confortée par des analyses immunogénétiques révélant une corrélation entre la guérison spontanée et les allèles HLA de classe II (HLA-DRB1*1101/DQB1*03 ; Thurzs et al., J. Virol. Hepat.. 1997, 4, 215). En revanche, chez les patients infectés chroniques, un nombre restreint d'épitopes T sont capables de restimuler, in vitro, les lymphocytes T issus du sang périphérique ou de prélèvements hépatiques et il est donc difficile de mesurer la production d'interféron y par les lymphocytes T auxiliaires, après stimulation par les protéines virales (Core. NS3, NS4 et NS5). Il semblerait que l'orientation de la réponse immunitaire vers un profil du type ThO/Th2, ainsi qu'une tolérance aux antigènes viraux soient à l'origine de cette perte de l'immunité antivirale et donc de la persistance du VHC. Les réponses cellulaires médiées par les lymphocytes T CD4+ auxiliaires sont très souvent impliquées dans les mécanismes anti-viraux. Spécifiques des antigènes, les lymphocytes T CD4+ sont en effet capables de détecter la présence d'un agent pathogène et sous l'effet de cette reconnaissance, de déclencher une réponse immunitaire. La reconnaissance des antigènes conduit en effet à leur activation. Une fois activés, les lymphocytes T CD4+ sécrètent la plupart des cytokines nécessaires au recrutement de cellules effectrices que sont les lymphocytes CD8+ cytotoxiques et les lymphocytes B producteurs d'anticorps. Ils interviennent également dans l'activation des cellules par des contacts cellulaires et par exemple induisent l'activation par le CD40 des cellules dendritiques présentatrices de l'antigène. Enfin. ils peuvent jouer eux-mêmes le rôle d'effecteurs en produisant des lymphokines anti-virales comme l'IFN-y et TNF-a. Que le rôle bénéfique des lymphocytes T CD4+ dans la résolution de l'infection par le VHC résulte d'une action directe ou indirecte, il constitue un important argument en faveur de vaccins dirigés contre le VHC et capables de stimuler une forte réponse CD4+ de type Thl. En particulier. l'utilisation de peptides capables de stimuler ces cellules constituerait une approche vaccinale très intéressante à la fois efficace et économiquement viable. Toutefois, les peptides que reconnaissent les lymphocytes T auxiliaires sont difficiles à définir en raison du polymorphisme des molécules HLA II. En effet. les lymphocytes T CD4+ ne reconnaissent les antigènes que sous la forme de peptides présentés par les molécules HLA II. Plus précisément, l'activation des lymphocytes T CD4+ se fait sous l'effet de la présentation de peptides par les molécules HLA II que portent les cellules présentatrices (APC). Ces peptides, appelés épitopes T. résultent de la dégradation protéolytique des antigènes par l'APC. Ils ont des longueurs variables généralement de 13à 25 acides aminés et possèdent une séquence qui les rend capables de se lier aux molécules HLA II. Les molécules HLA II sont des hétérodimères, capables de lier un répertoire important de peptides ayant des séquences très différentes. Il existe quatre types de molécules HLA II par individu (2 HLA-DR. 1 HLA-DQ et 1 HLA-DP). la molécule HLA-DR dont la chaîne ss est codée par le gène DRB étant la plus exprimée. Ces isoformes possèdent des propriétés de liaison différentes entre elles, ce qui implique qu'elles peuvent lier des peptides différents d'un même antigène. Elles sont très polymorphes et on a dénombré au moins 200 allèles différents pour DRBI. Les molécules issues des locus DRB3, DRB4, DRB5 et DPB1 sont moins polymorphes. Du fait de ce polymorphisme, chaque individu reconnaît dans un antigène un ensemble de peptides dont la nature dépend des molécules HLA II qui le caractérisent. Au polymorphisme des molécules HLA II, il faut ajouter la difficulté de trouver des séquences conservées entre les différentes souches de VHC. Un des moyens le plus utilisé pour définir les épitopes T CD4+ de type auxiliaire est de mesurer la capacité de peptides à faire proliférer les cellules mononucléées d'individus ayant été en contact avec l'antigène considéré. Un certain nombre d'Auteurs ont identifié des peptides du VHC comme étant des épitopes T chez les patients étudiés : - Diepolder et al.. précités, ont montré l'existence d'épitopes du VHC issus de la protéine NS3 (NS3 1248-1261. NS3 1388-1407, NS3 1450-1469) reconnus par des lignées T auxiliaires obtenus à partir de patients en phase aiguë. - Lamonaca et al. (Hepatology. 1999. 30. 10888) ont identifié cinq épitopes majeurs (Core 21-40. NS3 1253-1272, NS4 1767-1786. NS4 1907-1926, NS4 1909-1929), selon une approche similaire. - Tabatabai et al. (Hum. Immunol. 1999.60, 105) ont identifié plusieurs épitopes majeurs (NS3 1384-1401. NS3 1454-1471) chez un unique patient chroniquement infecté ; ces épitopes sont capables d'induire la prolifération et la production d'IL-2. - Godkin et al. (Eur. J. Immunol.. 2001, 31, 1438) ont identifié plusieurs épitopes T helper restreints par l'allèle HLA-DRI1, chez plusieurs patients non-virémiques ou chroniquement infectés. - Hoffmann et al. (Hepatology. 1995, 21, 632) ont démontré que les cellules mononucléées du sang périphérique de patients en phase chronique reconnaissaient plusieurs peptides dérivés de la protéine Core, et Il existe d'autres études similaires, toutes basées sur les réponses de cellules mononucléées de patients infectés par le VHC (Woitas et al., J. Immunol., 1997, 159, 1012 ; Lechmann et al. , Hepatology, 1996,24, 790 ; Leroux-Roels et al. , Hepatology, 1996. 23, 8 ; Lohr et al., Liver, 1996, 16. 174. Les peptides épitopes T identifiés dans ces études, qui sont issus des protéines les plus conservées du VHC (C et NS3), sont illustrés au Tableau I. Tableau 1 : Séquences des peptides C et NS3 identifiés comme étant des épitopes T par des tests de prolifération Peptide Restriction Référence Peptide Restriction Référence HLA HLA Cl-24 - Woitas C131-150 - Hoffmann C21-40 DRB1*1101 Lamonaca C133-152 - Leroux-Roels DQB1*0301 C20-44 Woitas C138-162 Lechmann Lechmann. C23-42- Hoffmann C141-155 DRU Godkin C31-45 DR11 Godkin C142-161 - Hoffmann C39-63 DR4 Lechmann C141-160 - Woitas C41-60- Lamonaca C145-164 - Leroux-Roels C47-70- Lohr C148-172 DRU Woitas Lechmann C55-74- Hoffmann C153-172 - Hoffmann C66-85- Hoffmann C157-176- Leroux-Roels C73-92- Leroux-Roels C161-180 DRBI *08032 Kaneko C71-90- Lamonaca C168-192- Woitas Lechmann C79-103- Woitas N1205-1221 DRU Godkin Lechmann C81-100 - Lamonaca N12.t2-1261 Diepolder C85-104- Leroux-Roels N1248-1261 DRB1*0404 Diepolder DRB1*1101 DRB1*1201 DRB1*1301 DRB1*1601 C91-110- Lamonaca N1248-1267 Diepolder C97-116 - Leroux-Roels N1245-1269 DR11 Godkin Lamonaca C101-115 - 1 Lohr N1253-1272 DQBl *0301 Lamonaca Clll-130 DRB1*08032 Kaneko N1293-1331- Tabatai C109-128 - Leroux-Roels N1388-1407 DRBI *1501 Diepolder Hoffmann C120-139 - 1 Hoffmann N1384-1401 - Tabatai C121-140 - Leroux-Roels Nui450-1469 DRBI*1302 Diepolder C118-142 Woitas N1447-1464 Tabatai C128-152- Woitas N1454-1471 - Tabatai # Lechmann - Non déterminé - ~ et variants de ces peptides dont le peptide minimum N 25 1-1 259. Il ressort du Tableau I que les séquences des épitopes T varient d'une étude à l'autre. traduisant le manque de précision de cette approche. Il est en effet difficile, au \ u de la diversité des réponses observées, de définir des séquences épitopes T pour l'ensemble de la population caucasienne. Ces séquences ne sont adaptées qu'aux patients ayant servi à ces travaux. Ces différences de réponse s'expliquent d'une part par la représentativité des échantillons qui n'est pas évaluée. En particulier, dans les études où les patients ne sont pas typés pour leurs molécules HLA, nul ne sait si les différents allèles sont représentés selon les fréquences de la population générale. La réponse de nombreux patients à un peptide particulier peut alors résulter d'un biais de l'échantillonnage et non de la capacité effective d'un peptide à être reconnu par l'ensemble des patients. D'autre part, dans le cas de l'infection par le VHC. plusieurs études ont été effectuées sur des patients infectés de manière chronique. Du fait de la persistance du virus chez ces sujets, il est possible qu'ils présentent une tolérance aux épitopes T les plus efficaces à être présentés. Dans ce contexte, les épitopes les plus intéressants pourraient avoir disparu de la réponse immunitaire qui se maintiendrait pour des épitopes moins stimulants mais qui ne parviendrait pas à éliminer le virus. Cette hypothèse est d'ailleurs émise par Tabatabai et al., précité. Ces tests de prolifération sont donc insuffisants pour définir des séquences adaptées à la vaccination de l'ensemble de la population. Parmi les peptides ayant une activité de stimulation de lymphocytes T identifiés, quelques uns seulement se lient aux molécules HLA II (Tableau II). Tableau II : Liaison des peptides C et NS3 aux molécules HLA II Peptides Liaison à C21-40 DRBI*1501 N1242-1261 DRBI*0101, 1501,0401,0404, 1101, 1302,0701,0802,0901, DRB5* 0101 N1248-1267 DRBl*0101, 1501, 0401, 0404 1101, 1302,0701,0802,0901 N1248-1261 DRB1*0101, 15 01, 0401, 0404, 0405, 1101, 1302,0802,0901 N1253-1272 DRB1*0101, 0401, 1101, 701, 1501, 1302,0802,0901 N 1388-1407 AUCUN N1450 1469 AUCUN Dans l'article aux noms de Diepolder et al.. précité, les Auteurs ont en effet étudié pour 5 peptides de la protéine NS3. la capacité à lier des molécules HLA II fréquemment rencontrées. De fait. ils ont montré que l'épitope NS3 1248-1261 ou des peptides variants (1242-1261 et 1248-1267) présentent une capacité de liaison pour 9 à 10 allèles HLA-DR à savoir : DRB1*0101. 1501. 0401, 0404, 0405, 110 1, 1302, 0802, 0901 et DRB5*0101. En revanche. les peptides 1388-1407 et 1450-1469 sont inactifs. Dans l'article de Lamonaca et al.. précité, les Auteurs ont également montré, par des tests de liaison, que le peptide Core 21-40 se lie à DRB 1 * 1501 et que le peptide NS3 1253-1272 se lie à DRBI*0101. 0401, 1101. 701, 1501, 1302, 0802, 0901. Il ressort de ce qui précède qu'aucun peptide du VHC se liant aux molécules HLA II les plus fréquemment rencontrées dans la population caucasienne, n'a été identifié pour la protéine C qui est la plus conservée et donc particulièrement adaptée à la vaccination contre les différents génotypes du VHC. En outre, parmi les peptides de la protéine NS3 ayant une activité de stimulation de lymphocytes T qui ont été étudiés, un seul peptide se lie aux molécules HLA II les plus fréquemment rencontrées dans la population caucasienne. Il existe un nombre important de molécules HLA II dont la répartition n'est pas homogène dans le monde. Ainsi. dans une population donnée un ensemble d'allèles regroupe à lui seul l'essentiel des allèles de la population. Par exemple en France qui est une population caractéristique de la population caucasienne (USA, Europe), seuls 7 allèles du locus DRB1 dépassent les 5 %. Il s'agit des allèles DRBI*0101, DRBI*0301, DRBl*0401. DRB1*0701, DRBl*1101, DRBl*1301 et DRB 1 * 1501 qui représentent à eux seuls 64% de la population. Ces mêmes allèles sont les plus abondants allèles HLA-DR dans les autres populations caucasiennes. Leur fréquence varie entre 53% (en Espagne) à 82% (au Danemark). Pour les EtatsUnis et le Canada, ils représentent respectivement 58 et 55% des allèles de la population. Les molécules HLA-DRB3. -DRB4 et DRB5 qui sont des molécules HLA-DR dont la chaîne p n'est pas codée par le gène DRB 1 sont présentes également avec des fréquences alléliques importantes. car elles sont moins polymorphes que les molécules DRB1. Leur fréquence allélique est en effet de 9. 2% pour DRB3*0101, 28,4% pour DRB4*0101 et 7,9% pour DRB5*0101. Elles couvrent donc à elles seules 45% de la fréquence allélique. Enfin, les molécules HLA-DP4 qui regroupent les molécules codées par les allèles DPB 1 *0401 et DPB 1 *0402 sont les molécules HLA II les plus abondantes en Europe et aux Etats-Unis. Leur fréquence allélique est en effet de 40 % et #1 % respectivement, ce qui signifie qu'elles sont l'une ou l'autre trouvées chez environ 76% des individus. Les peptides présents dans une séquence peptidique et qui lient l'ensemble de ces allèles inclus donc les épitopes T de la majorité de la population. C'est pourquoi les Inventeurs se sont donnés pour but de pourvoir à un ensemble de peptides aptes à être incorporés dans une composition immunogène et à stimuler des lymphocytes T CD4+ anti-VHC, chez la majorité des individus cauca- siens européens ou d'Amérique du Nord, pour induire effectivement une réponse proliférative spécifique contre des composants du virus. Un tel ensemble a pour propriété d'être efficace chez un grand nombre de sujets, alors que les peptides de l'art antérieur sont actifs chez quelques individus et sont inactifs chez la majorité des autres individus, parce que ces derniers ne reconnaissent pas les protéines du VHC par les mêmes déterminants. Pour ce faire, les Inventeurs ont identifié les séquences de peptides issus des protéines C et NS3 du VHC restreints aux molécules HLA II prépondérantes dans les populations caucasiennes et ils ont montré que les peptides issus de la protéine C, de préférence associés à des peptides issus de la protéine NS3, induisent effectivement une réponse immunogène et protectrice chez un grand nombre d'individus. En outre, ces peptides qui reconnaissent des lymphocytes T spécifiques d'HCV chez les patients infectés, sont utiles pour le diagnostic de l'état immunitaire de ces patients vis-à-vis du virus de l'hépatite C. La présente invention a en conséquence pour objet un mélange de peptides, caractérisé en ce qu'il inclut au moins deux peptides différents issus du virus de l'hépatite C (VHC). dont l'un au moins est un peptide issu de la protéine C, se liant à au moins quatre molécules HLA II différentes dont la fréquence allélique est supérieure à 5 % dans la population caucasienne, avec une activité de liaison Conformément à l'invention. ledit mélange comprend également, outre ledit peptide C tel que défini ci-dessus. un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes CD8+. CD4+ ou B et plus particulièrement des épitopes issus d'une protéine du VHC, notamment au moins un peptide issu de la protéine NS3, se liant à au moins quatre molécules HLA II différentes dont la fréquence allélique est supérieure à 5 % dans la population caucasienne, avec une activité de liaison L'invention englobe les peptides issus des protéines C et NS3 de n'importe quel génotype du VHC. Conformément à l'invention. on entend par "molécules HLA II différentes" aussi bien des molécules HLA DP et DQ codées par des allèles différents que des molécules DR codées par des gènes différents ou des allèles différents d'un même gène. Avantageusement. les dites molécules HLA II sont choisies parmi les molécules HLA-DRI, HLA-DR3, HLA-DR4. HLA-DR7, HLA-DR11, HLA-DR13, HLA-DR15, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5 et HLA-DP4. De manière particulièrement avantageuse, les dites molécules HLA II sont codées respectivement par les allèles HLA DRBl*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRBl*0701, DRBl*1101, DRB1*I301, DRB1*1501, DRB3*0101, DRB4*0101, DRB5*0101, DP*0401 et DP*0402. Un tel mélange de peptides permet d'obtenir, de manière surprenante, une réponse proliférative T CD4+ (stimulation des lymphocytes T CD4+) et ce, chez la grande majorité de la population caucasienne à protéger et quel que soit le génotype du VHC concerné : on peut donc considérer qu'un tel mélange constitue un premier pas vers une composition immunogène universelle , apte à être effectivement utilisée dans un vaccin. Selon une disposition avantageuse dudit mélange, les peptides issus de la protéine C du virus de l'hépatite C, sont sélectionnés dans le groupe constitué par : a) les peptides correspondant aux positions 19-47, 27-51, 31-57, 104-133 et 127-167. b) les peptides d'au moins 11acides aminés inclus dans les peptides tels que définis en a), et c) les peptides dérivés des peptides tels que définis en a) ou en b) par substitution de résidu (s) cystéinesitué(s) à proximité des extrémités N et/ou C terminales par des résidus alanine (C #A). Avantageusement, les peptides d'au moins 11acides aminés tels que définis en b) sont sélectionnés dans le groupe constitué par : - le peptide inclus dans le peptide 27-51 correspondant aux positions 27-41, - le peptide inclus dans le peptide 31-57 correspondant aux positions 31-45, et - les peptides inclus dans le peptide 127-167 correspondant respectivement aux positions 127-149, 131-145, 131-148. 131-167, 134-148 et 148- 167. Avantageusement, les peptides tels que définis en c) sont sélectionnés dans le groupe constitué par le peptide dérivé du peptide C 127-149 de séquence TAGFADLMGYIPLVGAPLGGAAR (SEQ ID NO: 5). Selon une autre disposition avantageuse dudit mélange, les peptides issus de la protéine NS3, sont sélectionnés dans le groupe constitué par : d) les peptides correspondant respectivement aux positions 1007- 1037,1036-1055, 1052-1072, 1076-1093, 1127-1153. 1149-1172,1174-1195, 1190- 1212,1206-1239, 1246-1275. 1275-1304, 1361-1387. 1377-1403, 1404-1432,1456- 1481, 1495-1513, 1524-1553 et 1552-1583, e) les peptides d'au moins 11acides aminés inclus dans les peptides précédents, et f) les peptides dérivés des peptides tels que définis en d) ou en e) par substitution de résidu (s) cystéinesitué(s) à proximité des extrémités N et C terminales par des résidus alanine (C # A). Avantageusement. les peptides d'au moins 11acides aminés tels que définis en e) sont sélectionnés dans le groupe constitué par : - les peptides inclus dans le peptide 1007-1037 correspondant respectivement aux positions 1007-1021. 1015-1029. 1015-1037, 1019-1033 et 1020- 1034, - les peptides inclus dans le peptide 1174-1195 correspondant respectivement aux positions 1174-1188. 1174-1192 et 1178-1192. - les peptides inclus dans le peptide 1190-1212 correspondant respectivement aux positions 1190-1204 et 1192-1206. - les peptides inclus dans le peptide 1246-1275 correspondant respectivement aux positions 1246-1260, 1246-1264, 1250-1264 et 1261-1275, - les peptides inclus dans le peptide 1377-1403 correspondant respectivement aux positions 1381-1395. 1381-1397. 1381-1403 et 1383-1397, - le peptide inclus dans le peptide 1495-1513 correspondant respectivement aux positions 1495-1509, - les peptides inclus dans le peptide 1524-1553 correspondant respectivement aux positions 1524-1552. 1524-1538. 1528-1542, 1528-1552,1529- 1543,1534-1548, 1538-1552 et 1540-1553. et - les peptides inclus dans le peptide 1552-1583 correspondant respectivement aux positions 1559-1573 et 1563-1577. Avantageusement. les peptides tels que définis en f) sont sélectionnés dans le groupe constitué par : - le peptide dérivé du peptide 1076-1093 de séquence GVAWTVYHGAGTRTIASP (SEQ ID NO: 10), - le peptide dérivé du peptide 1149-1172 de séquence RGSLLSPRPISYLKGSSGGPLLAP (SEQ ID NO: 13), - le peptide dérivé du peptide 1377-1403 de séquence GKAIPLEVIKGGRHLIFCHSKKKADEL (SEQ ID NO: 20), - le peptide dérivé du peptide 1456-1481 de séquence TAVTQTVDFSLDPTFTIETITLPQDA (SEQ ID NO: 22). et - le peptide dérivé du peptide 1524-1553 de séquence GAAWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVAQD (SEQ ID NO: 24) et les peptides inclus dans la séquence SEQ ID NO: 24 correspondant respectivement aux positions 1524-1538, 1524-1552, 528-1552. 1538-1552 et 1540-1553. Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit mélange, il inclut des peptides issus des protéines C et NS3 du VHC de génotype 1, de préférence de sous-type 1 a ou 1 b. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux dudit mélange, il inclut 2 à 6 peptides différents issus des protéines C et NS3, tels que définis ci-dessus, l'ensemble des peptides se liant à au moins 10 molécules HLA II dont la fréquence allélique est supérieure à 5 % dans la population caucasienne. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lesdits peptides sont sélectionnés dans le groupe constitué par les peptides issus de la protéine C correspondant respectivement aux positions 27-51, 131-167, 127-149, 131-148, 148-167 et les peptides issus de la protéine NS3 correspondant respectivement aux positions 1007-1037, 1015-1037. 1036-1055. 1174-1192. 1190-1212, 1246-1264, 1381-1403, 1381-1397. 1524-1553. 1528-1552 et 1552-1583. Par exemple: - le peptide C 19-47 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1, DR7, DR11, DR13, DR15. DRB5 et DP402 codées par les allèles tels que définis ci-dessus. - le peptide C 31-57 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1, DR7, DR11, DR13. DR1, DRB5, DP401 et DP402 codées par les allèles tels que définis ci-dessus. - le peptide C 104-133 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1, DR7, DR11 et DRB5 codées par les allèles tels que définis ci-dessus, - le peptide C 127-149 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1, DR7, DR11. DR15et DRB5 codées par les allèles tels que définis ci-dessus, - le peptide NS3 1007-1037 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1. DR3. DR4. DR7. DR11. DR13. DR15. DRB4, DRB5 et DP402 codées par les allèles tels que définis ci-dessus. - le peptide NS3 1036-1055 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1. DR4. DR11, DRB4 et DRB5. codées par les allèles tels que définis ci-dessus, - le peptide NS3 1052-1080 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1. DR4, DR7, DR11, DR15, DRB4 et DRB5, codées par les allèles tels que définis ci-dessus. - le peptide NS3 1076-1093 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1. DR7. DR11. DR15, et DRB5. codées par les allèles tels que définis ci-dessus, - le peptide NS3 1127-1153 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1. DR7. DRI1, DR13, et DRB5, codées par les allèles tels que définis ci-dessus, - le peptide NS3 1149-1172 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1. DR7, DR15, DRB4, et DRB5. codées par les allèles tels que définis ci-dessus, - le peptide NS3 1174-1195 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1, DR4. DR7, DR11, DR15. DRB4, et DRB5. codées par les allèles tels que définis ci-dessus - le peptide NS3 1190-1212 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1, DR4. DR7, DR11, DR 15et DRB5, codées par les allèles tels que définis ci-dessus. - le peptide NS3 1206-1239 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1. DR4, DR7, DR11et DRB5. codées par les allèles tels que définis cidessus, - le peptide NS3 1246-1275 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1, DR4. DR7. DR11, DR13et DR15. codées par les allèles tels que définis ci-dessus. - le peptide NS3 1275-1304 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1. DR4, DR7, DR11, Dry, DRB3 et DP401 codées par les allèles tels que définis ci-dessus. - le peptide NS3 1361-1387 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1. DR7. DR15 et DRB5 codées par les allèles tels que définis ci-dessus, - le peptide NS3 1377-1403 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1, DR7. DRU, DRI3, DRB4 et DRB5 codées par les allèles tels que définis ci-dessus. - le peptide NS3 1404-1432 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1. DR4. DR7, DR15et DRB5 codées par les allèles tels que définis cidessus. - le peptide NS3 1456-1481 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRI. DR3. DR4. DR7, DR11. DR13, DR15, DRB3, DRB4 et DRB5 codées par les allèles tels que définis ci-dessus. - le peptide NS3 1495-1513 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1. DR7. Daru. DR15. DRB3. DRB4 et DRB5 codées par les allèles tels que définis ci-dessus. - le peptide NS3 1524-1553 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1. DR4, DR7, DRI 1. DR15. DRB3. DRB4, DRB5 et DP402 codées par les allèles tels que définis ci-dessus, - le peptide NS3 1552-1583 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1. DR7, Drill. Doris. DRB5. DP401 et DP402 codées par les allèles tels que définis ci-dessus. Conformément à l'invention, les peptides inclus dans ledit mélange sont sous forme. soit de peptides individualisés, soit d'une protéine de fusion comprenant la séquence desdits peptides. Lesdits peptides individualisés sont préparés selon les procédés classiques de synthèse en parallèle sur phase solide et ladite protéine de fusion est préparée selon les techniques classiques d'ADN recombinant, dans un système d'expression approprié. Ladite protéine de fusion comprend les séquences desdits peptides directement reliées entre-elles par une liaison peptidique ou bien séparées par des séquences exogènes. c'est-à-dire des séquences autres que celles présentes à cette position dans la séquence des protéines C et NS3 du VHC. notamment les séquences d'autres épitopes T CD4+. CD8+ ou B. par exemple du VHC. La présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour une protéine de fusion telle que définie ci-dessus. L'invention a également pour objet tout vecteur recombinant, notamment plasmide ou virus. comprenant au moins une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus, placée sous le contrôle des éléments nécessaires à la transcription de ladite molécule, notamment sous le contrôle d'un promoteur et d'un terminateur de transcription. L'invention concerne également les cellules hôtes, notamment bactéries, levures ou cellules de mammifère, transformées à l'aide d'un vecteur tel que défini ci-dessus, de manière à intégrer de façon stable dans leur génome ou à maintenir de manière stable, au moins une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus. La présente invention a également pour objet une composition immunogène anti-VHC, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins : - un mélange de peptides issus d'une protéine C et d'une protéine NS3 du VHC. tels que définis ci-dessus, et/ou - une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus, ou - un vecteur approprié tel que défini ci-dessus, notamment un virus, en association avec au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et éventuellement au moins un adjuvant. Les adjuvants utilisés sont des adjuvants classiquement utilisés dans les compositions vaccinales, tels que l'hydroxyde d'alumine et le squalène. On peut utiliser entre autres des vecteurs viraux tels que les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus et les AAV, dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d'intérêt ; on peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance capable d'assurer une protection desdites séquences dans l'organisme ou lui permettant de franchir la membrane des cellules-hôte, par exemple une préparation de liposomes, de lipides ou de polymères cationiques. ou bien l'injecter directement dans la cellule hôte, sous forme d'ADN nu. Par exemple. l'utilisation d'ADN nu pour l'immunisation constitue une approche vaccinale efficace : elle consiste à injecter dans l'organisme hôte à vacciner, un ADN nu codant pour un antigène protéique ; cet ADN permet une synthèse prolongée de l'antigène par les cellules de l'hôte ainsi qu'une présentation durable de cet antigène au système immunitaire. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition immunogène. lesdits peptides sont sous forme de peptides modifiés ou bien associés à des liposomes ou à des lipides. notamment sous forme de lipopeptides. La partie lipidique du lipopeptide est notamment obtenue par addi- tion d'un motif lipidique sur une fonction a-aminée desdits peptides ou sur une fonc- tion réactive de la chaîne latérale d'un acide aminé de la partie peptidique ; elle peut comprendre une ou plusieurs chaînes dérivées d'acides gras en C4-20- éventuellement ramifiées ou insaturées (acide palmitique, acide oléique, acide linoléique, acide lino- lénique, acide 2-amino hexadécanoïque. pimélautide, trimétauxide) ou un dérivé d'un stéroïde. Le procédé de préparation de tels lipopeptides est notamment décrit dans les Demandes Internationales WO 99/40113ou WO 99/51630. La partie lipidique préfé- rée est notamment représentée par un groupe Na-acétyl-lysine NE(palmitoyl), égale- ment dénommé Ac-K(Pam). Le peptide modifié est notamment obtenu par modification d'au moins une liaison peptidique-CO-NH- de la chaîne peptidique desdits peptides par introduction d'une liaison de type rétro ou rétro-inverso (-NH-CO-) ou d'une liaison différente de la liaison peptidique (méthylène amino. carba, cétométhylène, méthylène-oxy...) ou bien par substitution d'au moins un acide aminé de la chaîne peptidique desdits peptides par un acide aminé non protéinogénique, c'est à dire un acide aminé n'entrant pas dans la constitution d'une protéine naturelle, notamment un acide aminé dont le carbone portant la chaîne latérale, à savoir le groupe-CHR- est remplacé par un motif n'entrant pas dans la constitution d'un acide aminé naturel. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition immunogène. ledit mélange de peptides est associé : - à un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes CD8+ (reconnus spécifiquement par les lymphocytes T cytotoxiques et présentés par les molécules HLA 1) et plus particulièrement des épitopes CD8+ issus d'une protéine du VHC tels que les peptides C 2-10, 28-36. 35-44, 41-49, 42-50, 85- 98,88-97, 127-140. 131-140. 132-140. 167-176.178-187, 181-190 ; les peptides El 220-227. 233-242. 234-242. 363-371 ; les peptides E2 401-411, 460-469,489-496, 569-578,621-628. 725-733 ; les peptides NS2 826-838, 838-845 ; les peptides NS3 1073-1081. 1169-1177. 1287-1296. 1395-1403. 1406-1415 ;les peptides NS4A 1585- 1593, 1666-1675 ; les peptides NS4B 1769-1777.1789-1797, 1807-1816, 1851-1859 ; le peptide NS5A 2252-2260 et les peptides NS5B 2588-2596. 2727-2735 (Rehermann et al., Current Topics in Microbiology and Immunology. 2000,242; 299), - à d'autres peptides comprenant des épitopes CD4+ multiples, tels que le peptide de la toxine tétanique TT (positions 830-846), le peptide de l'hémagglutinine à'Influenza HA (positions 307-319). PADRE (Pan DR Epitope, Alexandre J. et al.. Immunity. 1994. 1, 9. 751-761) et le peptide LSA3 de Plasmodium falciparum et/ou - à un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes B. plus particulièrement des épitopes B issus d'une protéine du VHC reconnus spécifiquement par des anticorps dirigés contre ces derniers, tels que le peptide C 5-27 (Khanna et al., Acta Virologica. 1998, 42, 141-145), le peptide NS4 1698-1719 (Khanna et al., précité) et le peptide NS5 2295-2315 (Khudyakov et al., Virology, 1995, 206. 666-672). Les peptides C et NS3selon l'invention, inclus dans les mélanges, tels que définis ci-dessus ont été avantageusement sélectionnés à l'aide d'un test de liaison HLA II/peptides comprenant : - la purification des molécules HLA II d'intérêt, c'est-à-dire celles concernant plus de 5 % d'une population donnée et notamment les molécules HLA DR1, DR3. DR4. DR7. DR11, DR13, DR15. DRB3. DRB4. DRB5 et DP4, - l'incubation des molécules HLA II ainsi purifiées, avec différentes concentrations de fragments chevauchants et couvrant la séquence de la protéine C ou de la protéine NS3 et avec un réactif RI ou traceur constitué d'un fragment peptidique associé à un marqueur non radioactif, tel que la biotine et dont la séquence est différente desdits peptides ; le réactif RI ou traceur est choisi de manière à ce qu'il présente une affinité vis-à-vis de l'une des molécules HLA II d'intérêt, telle qu'il puisse être utilisé à une concentration - le transfert des complexes obtenus sur une plaque de type ELISA, préalablement sensibilisée avec un anticorps spécifique de toutes les molécules DR ou DP, - la révélation des complexes molécules HLA II/réactif RI, fixés au fond de la plaque au moyen de conjugués convenables, tels que streptavidine-phos- phatase et d'un substrat fluorescent. - la sélection des peptides comprenant des épitopes différents, c'est- à-dire les plus représentatifs des différentes zones d'interaction entre la protéine C ou la protéine NS3 et les molécules HLA II et - le choix des peptides les plus adaptés, en fonction de la fréquence des allèles vis-à-vis desquels ils présentent une activité de liaison Ces tests permettent, de manière non ambiguë, d'associer à chaque molécule HLA II, les séquences des fragments capables de s'y lier ou au contraire qui ne s'y lient pas. Cette démarche permet de définir des compositions immunogènes incluant des peptides qui se lient au plus grand nombre de molécules HLA II différentes et qui peuvent être ainsi avantageusement protectrices pour la majorité des patients, même si l'on ne connaît pas leurs génotype HLA. Cette démarche a en outre l'avantage de permettre la sélection de peptides significativement plus spécifiques vis-à-vis du VHC que les démarches cherchant à sélectionner des peptides sur la base de leur capacité à stimuler les lymphocytes T CD4+ (tests de prolifération). Les conditions d'incubation sont propres à chaque molécule HLA II (temps d'incubation. pH. réactif RI, concentration en HLA II ou en réactif RI). Le réactif RI est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences suivantes : . PKYVKQNTLKLAT (HA 306-318, SEQ IDNO: 75), spécifique des allèles DRBl*0101,DRBl*0401.DRBl*1101 et DRB*OlOI, . EAEQLRAYLDGTGVE (A3 152-166. SEQ ID NO: 79). spécifique de l'allèle DRB1*1501, . AKTIAYDEEARGLE (MT 2-16, SEQ ID NO: 77), spécifique de l'allèle DRB 1*0301. . AAYAAAKAAALAA (YKL, SEQ ID NO: 76), spécifique de l'allèle DRB 1*0701. . TERVRLVTRHIYNREE (B1 21-36, SEQ ID NO: 78), spécifique de l'allèle DRB1*1301, . ESWGAVWRIDTPDKLTGPFT (LOL 191-210. SEQ ID NO: 80), spécifique de l'alIèle DRB3*0101, # AGDLLAIETDKATI (E2/E168, SEQ ID NO: 81). spécifique de l'allèle DRB4*0101. et . EKKYFAATQFEPLAARL (Oxy 271-287. SEQ ID NO: 82) spécifique des allèles DP*0401 et DP*0402. D'autres réactifs RI peuvent être utilisés, notamment ceux décrits dans Southwood et al. (J. Immunol., 1998, 160. 3363-3373). La présente invention a également pour objet un vaccin destiné à la prévention et au traitement des infections à VHC. caractérisé en ce qu'il inclut une composition immunogène telle que définie ci-dessus. La présente invention a également pour objet des peptides issus de la protéine C ou de la protéine NS3 d'un VHC. notamment de génotype la ou lb, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par : les peptides issus de la protéine C, tels que définis ci-dessus, à l'exclusion du peptide C 31-45, et les peptides issus de la protéine NS3 choisis parmi : - les peptides correspondant respectivement aux positions 1007- 1037, 1036-1055. 1052-1072, 1076-1093, 1127-1153. 1149-1172,1174-1195, 1190- 1212, 1206-1239. 1275-1304, 1361-1387, 1377-1403. 1404-1432, 1456-1481, 1495- 1513, 1524-1553 et 1552-1583 et les peptides d'au moins 11acides aminés inclus dans les peptides précédents, - les peptides correspondant respectivement aux positions 1246-1260 et 1261-1275. - les peptides dérivés des peptides précédents par substitution de résidu (s) cystéine situé(s) à proximité des extrémités N et C terminales par des résidus alanine (C # A), et - les peptides dérivés des peptides précédents, tels que définis cidessus. De tels peptides qui contiennent un épitope CD4+, apte à avoir une activité de liaison par des lymphocytes T CD4+ spécifiques desdits peptides présents chez des patients infectés par le VHC sont donc utiles comme réactifs de diagnostic d'une infection à VHC. La présente invention a également pour objet un réactif de diagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'un des peptides C ou NS3, tels que définis ci-dessus, lesdits peptides étant éventuellement marqués ou complexés, sous la forme de complexes multimériques. La présente invention a également pour objet un procédé d'évaluation de l'état immunitaire d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de détection de la présence de cellules T CD4+ spécifiques des peptides C et/ou NS3, tels que définis ci-dessus ; ladite détection est réalisée, de manière avantageuse par l'un des tests suivants : test de prolifération, test ELISPOT [voir par exemple la Demande Internationale WO 99/51630 ou Gahéry-Ségard et al. J. Virol., 2000,74, 1964-) ] ou cytométrie de flux en présence de complexes multimériques constitués à partir desdits peptides E6 et/ou E7. De manière plus précise : * pour ce qui concerne le test de prolifération : Une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec les peptides sélectionnés selon l'invention ou des lymphocytes T clonés) est cultivée pendant 3 à 5 jours en présence des peptides sélectionnés et au besoin de cellules présentatrices appropriées telles que des cellules dendritiques. des PBMC autologues ou hétérologues. des cellules lymphoblastoïdes telles que celles obtenues après infection par le virus EBV ou des cellules génétiquement modifiées. La prolifération des cellules est mesurée par incorporation de thymidine tritiée dans l'ADN des cellules. Les peptides sélectionnés conformément à l'invention, permettent de révéler dans la suspension initiale la présence de cellules spécifiques de ces peptides. * pour ce qui concerne le test ELISPOT : Le test ELISPOT permet de révéler la présence de cellules T spécifiques d'un peptide sélectionné conformément à l'invention et sécrétant de l'IFN-y. De manière plus précise, les cellules T sont révélées par mesure de la sécrétion d'IFN-y après incubation des PMBC des patients avec les peptides sélec- tionnés selon l'invention. conformément à la méthode décrite dans Gahéry-Ségard et al., J. Virol., 2000.74. 1964. * pour ce qui concerne la mise en #uvre de complexes multimériques et notamment de complexes tétramériques : - on met en contact un échantillon biologique, de préférence des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) avec des complexes tétramériques marqués produits à partir de complexes entre des peptides C et/ou NS3 tels que définis ci-dessus et des molécules HLA de classe II solubles et l'on - analyse les cellules marquées, notamment par cytométrie de flux. De manière avantageuse, préalablement à la mise en contact de l'échantillon biologique avec ledit complexe. on l'enrichit en cellules T CD4+, en le mettant en contact avec des anticorps anti-CD4, pour enrichir ledit échantillon. Les tétramères sont préparés, comme précisé, par exemple dans E.J. Novak et al. (J. Clin. Investig., 1999, 104. R63-R67) ou dans M. J. Kuroda et al. (J. Virol., 2000, 74, 18. 8751 -8756). Brièvement, les tétramères sont fabriqués en incubant, pendant 72 heures à 37 C et dans un tampon phosphate citrate 10 mM, NaCl 0,15 M à un pH compris entre 4.5 et 7. des molécules HLA II solubles et biotinylées avec un excès de 10 de peptides C et/ou NS3, identifiés et sélectionnés conformément à l'invention. La forme tétramérisée est obtenue en ajoutant à la préparation de la streptavidine marquée par un fluorochrome en quantité quatre fois moindre (mole à mode) que de molécules HLA II. L'ensemble est incubé une nuit à température ambiante. Pour utiliser ces tétramères, on met en contact une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec les peptides C et/ou NS3 sélectionnés conformément à la présente invention ou des lymphocytes T clonés) avec un ou plusieurs tétramères (10 à 20 mg/ml) pendant 1 à 3 heures. Après lavage, la suspension est analysée par cytométrie de flux : on visualise le marquage des cellules par les tétramères grâce au fait que ces constructions sont fluorescentes. La cytométrie de flux permet de séparer les cellules marquées par les tétramères des cellules non marquées et d'effectuer ainsi un tri cellulaire. La présente invention a ainsi, en outre, pour objet une méthode de tri de lymphocytes T spécifiques du VHC. caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : - incubation ou mise en contact. d'une suspension de cellules à trier avec un ou plusieurs tétramères marqués formés à partir de complexes entre des peptides C et/ou NS3 tels que définis ci-dessus et des molécules HLA II solubles, et - tri des cellules marquées par les tétramères. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions. qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'au dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre les séquences des peptides issus des protéines C et NS3 qui ont été étudiés. Pour simplifier les différents peptides ont été dénommés 1C à 6C et 8N à 29N. - la figure 2 illustre l'activité de liaison d'une première série de peptides des protéines C et NS3, vis-à vis des molécules HLA II prépondérantes dans la population caucasienne. Les valeurs correspondent aux IC50- exprimées en nM. Les valeurs inférieures à 1000 nM, correspondant aux peptides présentant une bonne affinité pour les molécules HLA II. sont indiquées en gras. nd : non déterminé. - la figure 3 illustre l'activité de liaison, vis-à vis des molécules HLA II prépondérantes dans la population caucasienne, d'une seconde série de peptide des protéines C et NS3. dérivés de la première série. Les valeurs correspondent aux IC50, exprimées en nM. Les valeurs inférieures à 1000 nM, correspondant aux peptides présentant une bonne affinité pour les molécules HLA II, sont indiquées en gras. nd : non déterminé. - la figure 4 illustre l'immunogénicité in vivo de 3 peptides de la protéine NS3 présentant une forte affinité pour HLA-DR1 (8N 1007-1037, 15N 1174- 1195 (15N) et 28N 1524-1553. mesurée par un test de prolifération des splénocytes de souris transgéniques pour les molécules HLA-DRI humaines, prélablement immunisées par chacun des peptides (figure 4A) ou par un mélange de ces peptides (figure 4B). Les peptides 3C 93-107. 6C 148-173 et 12N 1094-1119 qui possèdent une faible affinité pour HLA-DRI sont utilisés comme contrôle. Les valeurs correspondent à l'index de prolifération des splénocytes. - la figure 5 illustre l'immunogénicité in vitro de 6 peptides de la protéine NS3 présentant une forte affinité pour au moins 4 molécules HLA II différentes prépondérantes dans la population caucasienne (8N 1007-1021, 8N 1019- 1033, 15N 1178-1193, 28N 1538-1552. 18N 1250-1264 et 8N 1024-1037), mesurée par un test ËLISPOT. à partir de 3 lignées de lymphocytes T CD4+ issues d'un individu séronégatif (POI4/A. P014/B et P014/C) ; les lymphocytes T ont été préalablement stimulés in vitro par des cellules dendritiques de ce même individu chargées par le mélange de peptides) puis le nombre de lymphocytes T sécréteurs d'IFN-y.a été mesuré en présence de cellules dendritiques non chargées issues du même individu et en présence de ces peptides seuls ou en mélange (mix HCV) ou bien en l'absence de peptides (- peptide). Les valeurs indiquées correspondent au nombre de lymphocytes T sécréteurs d'IFN-y. Il doit être bien entendu. toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1: DETERMINATION DES CONDITIONS DES TESTS DE LIAISON PEPTIDES/MOLECULES HLA II 1) Peptides Tous les peptides sont synthétisés selon la stratégie Fmoc en synthèse parallèle sur phase solide, purifiés par HPLC et contrôlés par spectrométrie de masse (ES-MS). a) Première série de peptides L'activité de liaison des peptides des protéines C et NS3 du VHC aux molécules HLA II. a été testée à partir de 25 fragments de grandes tailles (entre 15 et 34 acides aminés). choisis selon deux critères : - présence de plusieurs résidus aromatiques ou hydrophobes qui sont les principaux résidus d'ancrage pour les molécules HLA-DR et HLA-DP, et - bonne probabilité de pouvoir être synthétisés. Les séquences des peptides sélectionnés, issues du génoype la, sont présentées dans le Tableau III ci-dessous. Tableau III : de la première série de peptides nom Séquence Taille numéro IC 19-47 PQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVR ~29 SEQ1DNO:1~ 2C 31-57 VGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERSQ 27 SQ ID NO: 3C 93.107 WAGWLLSPRGSRPSW IS SEQ IDN0:3 4C 104-133 RPSWGPTDPRRRSRNLGKYIDTL TCGFADL 30 SEQ ID NO: 5C 127-149 TAGFADLMGYIPLVGAPLGGAAR ~23 SEQ1DNO:5 6C 148-173 ARALAHGVRVLEDGVNYATGNLPGAS 26 SEQ ID NO: 6 8N 1007-1037 GRE1LLGPADGMVSKGWRLLAPITAYAQQTR 31 SEQ ID NO: 7 9N 1036-1055 TRGLLGCIITSLTGRDKNQV 20 SEQ ID NO: 8 ION 1052-1072 KNQVEGEVQIVSTA.4QTFLAT 21 SEQ ID NO: 9 11N 1076-1093 GVAWTVYHGAGTRT1ASP 18 SEQ ID NO: 10 12N 1094-1119 KGPVIQMYTNVDQDLVGWPAPQGSRS 26 SEQ ID NO: 11 13N 1127-1153 SSDLYLVTRHADV1PVRRRGDSRGSLL 27 SEQ ID NO: 12 14N 1149-1172 RGSLLSPRPISYLKGSSGGPLLAP 24 SEQ ID NO : 13 15N 1174-1195 GHAVGIFRAAVCTRGVAKAVDF 22 SEQ ID NO: 14 16N 1190-1212 AKAVDFIPVENLETTMRSPVFTD 23 SEQ ID NO: 15 17N 1206-1239 RSPVFTDNSSPPVVPQSFQVAHLHAPTGSGKSTK 34 SEQtDNO: 16 18N 1246-1275 AQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHG1D 30 SEQ ID NO: 17 19N 1275-1304 DPNIRTGVRT1TTGSP1TYSTYGKFLADGG ~30 SEQ ID NO: 18 22N 1362-1387 1EEVALSTTGE1PFYGKAIPLEVJKG 26 SEQ ID NO: 19 23N 1377-1403 GKAIPLEVIKGGRHLIFCHSKKKADEL 27 SEQIDN0:20 24N 1404-1432 AAKLVALGINAVAYYRGLDVSVIPTSGDV 29 SEQIDN0:21 26N 1456-1481 TAVTQTVDFSLDPTFTIET1TLPQDA 26 SEQIDN0:22 27N 1495-1513 K.PG1YRFVAPGERPSGMFD 19 SEQ ID NO: 23 28N 1524-1553 GAAWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVAQD 30 SEQ ID NO: 24 29N 1552-1583 QDHLEFWEGVFTGLTHIDAHFLSQTKQSGENL 32 SEQ ID NO: 25 * les résidus alanine correspondant à la substitution d'un résidu cysteme de la séquence de la poiyproteine au VHO sont indiqués en gras. b) deuxième série de peptides Tous les peptides de la première série se liant à au moins 6 molécules HLA II et certains peptides se liant à au moins 5 molécules HLA II ont été découpés en peptides de 15acides aminés afin d'identifier plus précisément les zones d'interaction (peptides 8N. 9N, ION, 15N, 16N, 18N, 19N, 23N. 27N, 28N, 29N, 1 C, 2C et 5C). Seul le peptide 26 n'a pas été étudié en raison de la difficulté à le synthétiser. Le peptide 6C qui est très chevauchant avec le peptide 5C et qui en combinaison avec ce dernier se lie à 6 molécules HLA II a également été étudié. La séquence de l'ensemble de ces peptides est présentée dans le Tableau IV et la figure 1. Tableau IV : Séquences de la deuxième série de peptides nom Séquence numéro 8N 1007-1037 GRE1LLGPADCMVSKGWRLL.APtTAYA TR SEQ ID NO: 7 8 1007-1021 -GREILLGPADGMVSK SEQ ID'O: 26 SN 101 I-1025 LLGPADGMVSKGWRL SEQ ID NO: 27 8N 1015-1029 ADGMVSKGWRLLAPI SEQ ID NO : 288N 1019-1033 VSKGWRLLAPITAYA SEQ ID NO : 298N 1020-1034 SKGWRLLAPITAYAQ SEQ ID NO: 30 8N 1024-1037 RLLAPITAYAQQTR SEQ ID NO: 31 15N 1174-1195 GHAVGIFRAAVCTR~GVAKAVDF SEQ ID NO: 14 15N 1174-1188 GHAVGIFRAAVCTRG SEQ ID NO : 32 15N 1178-1192 GIFR.4AVCTRGV.4KA SEQ ID NO: 33 15N 1181-1195 RAAVCTRGVAKAVDF SEQ ID NO: 34 28N 1524-1553 GAAWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVAQD SEQ ID NO: 24 28N 1524-1538 GAAWYELTPAETTVR SEQ 1DN0:35 28N 1528-1542 YELTPAETTVRLRAY SEQ ID NO: 36 28N 1529-1543 ELTPAETTVRLRAYM SEQ ID NO: 37 28N 1534-1548 ETTVRLRAYMNTPGL SEQ ID NO: 38 28N 1538-1552 RLRAYMNTPGLPVAQ SEQ ID NO: 39 28N 1540-1553 RAYMNTPGLPVAQD SEQ ID NO: 40 18- 1246-1275 AQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYIV1SKAHGID SEQ ID NO: 17 18N 1246-1260 AQGYKVLVLNPSVAA SEQ ID NO: 41 18N 1250-1264 KVLVLNPSVAATLGF SEQ ID NO: 42 18N 1255-1269 NPSVAATLGFGAYMS SEQ ID NO : 43 18N 1261-1275 TLGFGAYMSKAHGiD~~~~~~~~~~~~~~~SEQ ID NO: 44 1C 19-47 PQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVR SEQ ID NO : 2C 31-57 VGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERSQ SEQ ID NO : 21C 19-33 PQDVKFPGGGQIVGG SEQ ID NO : 45 IC 27-41 GGGQIVGGVYLLPRRG SEQ ID NO : 46 2C 31-45 GGVYLLPRRGPRLGV SEQ ID NO : 2C 43-57 RLGVRATRKTSERSQ SEQ ID NO: 48 5C 127-149 T.4GFADLMGYIPLVG.4PLGGA.4R SEQ ID NO: 5 6C 148-173 ARALAHGVRVLEDGVNYATGNLPGAS SEQ ID NO: 6 5C 127-141 TAGFADLMGYtPLVG SEQ ID NO: 49 5C 131-145 ADLMGYIPLVGAPLG SEQ ID NO: 50 5C 134-148 MGYIPLVGAPLGGAA SEQ ID NO: 51 C 141-155 GAPLGGAARALAHG SEQ ID NO: 52 6C 148-163 ARALAHGVRVLEDGV SEQ ID NO : 536C 152-166 AHGVRVLEDGVNYAT SEQ ID NO: 54 6C159-173 EDGVNYATGNLPGAS SEQtDIv0:55 16N 1190-1212 AKAVDFIPVENLETTMRSPVFTD SEQ ID NO: 15 16N 1190-1204 AKAVDFIPVENLETT SEQ ID NO: 56 16N 1192-1206 AVDF1PVENLETTMR SEQ ID NO: 57 16N 1196-1210 IPVENLETTMRSPVF SEQ ID NO: 58 16N 1199-1212 ENLETTMRSPVFTD SEQ ID NO: 59 ION 1052-1072 KNQVEGEVQIVST AAQTFLA T SEQ ID NO : 9]ON 1052-1066 KNQVEGEVQIVSTAA SEQ ID NO: 60 ION 1056-1070 EGEVQIVSTAAQTFL SEQ ID NO: 61 23N 1377-1403 GKAIPLEVIKGGRHLIFCHSKKKADEL SEQ ID NO : 20 23N 1377-1391 GKAIPLEVIKGGRHL SEQ ID NO: 62 23N 1381-1395 PLEVIKGGRHLIFCH SEQ ID NO : 23N 1383-1397 EVIKGGRHLIFCHSK SEQ ID NO : 64 23N 1389-1403 RHL1FCHSKKKADEL SEQ ID NO: 65 2711495-1513 KPGIYRFVAPGERPSGMFD I SEQ ID NO: 23 27N 1495-1509 KPG1YRFVAPGERPS SEQ ID NO: 66 27N 1500-1513 RFVAPGERPSGMFD SEQ ID NO: 67 29N 1552-1583 QDHLEFWEGVFTGLTHIDAHFLSQTKQSGENL SEQ ID NO: 25 29N 1554-1568 HLEFWEGVFTGLTHI SEQ ID NO: 68 29N 1565-1579 LTHIDAHFLSQTKQS SEQ ID NO: 69 29N 1559-1573 EGV1TGLTHIDAHFL SEQ ID NO: 70 29N 1563-1577 TC, LI 1 IIII)AHFLSQTK SEQ ID NO: 71 29N 1569-1583 DAHFLSQTKQSGE\:L SEQ ID NO: 72 9N 1036-1055 TRCLLCCIITSLTGRDKNQV SEQ ID NO: 8 9N 1036-1050 RGLLGCIITSLTGRD SEQ ID NO : 73 9N 1041-1055 GCIITSLTGRDKNQV SEQ ID NO : 74 19N 1275-1304 DPNIRTGVRTITTGSPITYSTYGKFLADGG SEQ ID NO: 18 19N 1275-1289 DPNIRTGVRTITTGS SEQ ID NO : 83 19N 1279-1293 RTGVRTITTGSPITY SEQ ID NO : 19N 1283-1297 RTITTGSP1TYSTYG SEQ ID NO: 85 8419N 1290-1304 PITYSTYGKFLADGG SEQ ID NO: 86 2) Molécules HLA II a) Choix des allèles 12 molécules HLA II (10 molécules HLA-DR et 2 molécules HLADP) les plus abondantes dans la population française et dont les fréquences alléliques sont caractéristiques de la population caucasienne, ont été sélectionnées (Tableau VIII): - molécules HLA-DR dont la chaîne p est codée par le gène DR1 Il s'agit des molécules HLA-DR1, -DR3, -DR4,-DR7, -DR11, DR13 et -DR15 dont la chaîne (3 est codée par les allèles du locus DRB1 dont la fréquence dépasse les 5 % dans la population française : DRB1*0101, DRB 1*0301, DRB1*0401.DRB1*070I.DRBI*I 101, DRB 1 * 1301 et DRB1*1501 qui représentent à eux seuls 64 % de la population. Ces mêmes allèles sont les allèles HLA-DR les plus abondants dans les autres populations caucasiennes. Leur fréquence varie entre 53 % (en Espagne) et 82 % (au Danemark). Pour les Etats-Unis et le Canada, ils représentent respectivement 58 et 55 % des allèles DR de la population. - molécules HLA-DR dont la chaîne (3 n'est pas codée par le gène DR1 II s'agit des molécules HLA-DRB3. -DRB4 et -DRB5 dont la chaîne est codée par les allèles les plus fréquents dans la population française : HLADRB3*0101 (9. 2 %). HLA-DRB4*0101 (28,4 %). et HLA-DRB5*0101 (7,9 %). Ces molécules couvrent à elles seules 45 % de la fréquence allélique. - molécules HLA-DP Il s'agit des molécules HLA-DP4 qui regroupent les molécules codées par les allèles DPB1 *0401 et DPBI*0402. Ces molécules DP4 sont les molécules HLA II les plus abondantes en Europe et aux Etats Unis. Leur fréquence allélique est en effet de 40 et 11% respectivement ce qui signifie qu'elles sont l'une ou l'autre trouvées chez environ 76% des individus. Les peptides présents dans une séquence protéique et qui lient l'ensemble de ces molécules incluent donc les épitopes T CD4+de la majorité de la population. b) purification des molécules HLA II Les molécules HLA II sont purifiées par immunoaffinité à partir de différentes lignées homozygotes de lymphocytes B humains transformées par le virus Epstein Barr (EBV). L'origine des lignées EBV et les différents allèles qui les caractérisent sont décrits dans les Tableaux V et VI ci-dessous . Tableau V : Spécificité DR des lignées EBV Lignées Spécificité Allèle Autres DRB1 Allèles DRB LG2* DR DRB l *0 I O HOM2 DR DRB 1 *O 1 O SCHU DR15 DRBI*1501 DRB5*0101 MAT* DR3 DRB!*0301 DRB3*OlOI STEILIN DR3 DRB 1*0301 DRB3*0101 BOLETH DR4 DRB1*0401 DRB4*0101 PREISS DR4 DRB1*0401 DRB4*0101 PITOUT DR7 DRB 1 *0701 DRB4*0 10 SWEIGv OR!1 ORB! *1101 DRB3*0202 HHKB DR13 DRB1*130I DRB3*0101 Strang et al. J. Gen Virol., 1990, 71, 423. @@ Tsukui et al., Cancer Res., 1996, 56. 3967 Tableau VI : Lignées EBV exprimant DP4 Lignées Spécificité Allèle Allèle référence DP DPAI DPBI HOM2 DP4 DPAI*0103 DPB1*0401 BOLETH DP4 DPA1*0103 DPBI*0401 @ PITOUT DP4 DPA I *O l 03 DPBI*0401 SOUTH WOOD et au J. Immunol., 1998,160, 3363- 3373 HHKB DP4 DPAI*0103 DPBl*040l DAVENPORTH et al, P. N.A.S., 1995, 92, 6567. SHU DP4 DPA1*0103 DPB 1 *0402 MLF DP4 DPA 1 *0103 DPB 1 *0402 BM92 DP4 DP A] *0 J 03 DPB 1 *0402 - l'origine ces lignées est aecrne sur le site mternet de la collection européenne ae Cu@ture cellulaire (http: // fuse iv. co. uk'ca i-n r/.) Les molécules HLA-DR et HLA-DP sont immunopurifiés au moyen des anticorps monoclonaux respectivement L243 (Smith et al.. P.N.A.S., 1982, 79, 608-612) et B7/21 (WATSON et al., Nature. 1983, 304. î58-361), selon les protocoles décrits dans Texier et al.(J. Immunol.. 2000. 164. 3177 : Eur. J. Immunol., 2001, 31, 1837). 3) Tests de liaison HLA 11/peptides a) principe des tests Les tests de liaison des peptides aux molécules HLA-DP et HLA- DR sont des tests en compétition avec une révélation immuno-enzymatique, dérivés de ceux mis au point pour des molécules HLA-DR (HLA-DR1: MARSHALL et al., J. Immunol., 1994. 152, 4946- ; HLA-DRI. -DR2. -DR3, -DR4,-DR7, -DR1 1 et -DR13 : Demande de Brevet FR 99 0879 et TEXIER et al.. précités). Les tests de liaison sont réalisés de la manière suivante : molécules HLA-DR ou HLA-DP sont diluées dans des plaques à 96 puits en polypropylène. dans du tampon phosphatelOmM, NaCl 150 mM, dodécyl maltoside (DM) 1 mM. citrate 10 mM, thimérosal 0.003%, à un pH et une dilution appropriés pour chaque molécule. Un peptide traceur biotinylé (Tableau VIII) est ajouté à une concentration donnée, ainsi que plusieurs concentrations de peptides à tester (peptide compétiteur). A la fin de l'incubation à 37 C (entre 24 et 72 heures selon les molécules), les échantillons sont neutralisés avec 50 L de tampon Tris HC1 450 mM, pH 7,5, thimérosal 0.003 %, BSA 0.3 %. DM 1 mM. Ils sont ensuite transférés sur des plaques ELISA maxisorp (96 puits) sur lesquels les anticorps anti-DP ou anti-DR ont été préalablement adsorbés. L'incubation des échantillons sur ces plaques est réalisée pendant deux heures à température ambiante. Des lavages sont effectués entre chaque étape en tampon Tris HC1 0.1 M. pH 7.5. Tween-20 0,05%. Le peptide biotinylé lié aux molécules HLA II est détecté par l'addition de 100 L/puits du conjugué streptavidine-phosphatase alcaline (45 minutes) dilué au 1/2000 dans le tampon Tris lOmM. pH 7, NaCI 0,15M. Tween 20 0.05%, BSA 0.2%, thimérosal 0,003%, puis de 200 (.iL/puits du substrat 4-méthyl-umbelliféryl-phosphate (MUP) à la concentration de 100 M. en tampon NaHCO3 0.05M. pH 9,8, MgCh lmM. L'émission de fluorescence par le produit de la réaction enzymatique est mesurée à 450 nm après excitation à 365 nm. La liaison maximale est déterminée en incubant le peptide traceur biotinylé avec la molécule HLA II en l'absence de peptide compétiteur. La spécificité de liaison est contrôlée par l'addition d'un excès de peptide non biotinylé. Le bruit de fond obtenu ne diffère pas significativement de celui obtenu en incubant le peptide biotinylé sans les molécules HLA II. Les résultats sont exprimés sous la forme de la concentration de peptide compétiteur qui inhibe 50% de la liaison maximale du peptide traceur biotinylé (IC50). b) Conditions et sensibilité des tests Pour chaque test de liaison, la concentration en molécules HLA II, la concentration du peptide traceur, le pH d'incubation et le temps d'incubation ont été optimisés comme précisé dans le Tableau VII ci-après. TABLEAU VII : Conditions des tests de liaison aux molécules HLA II Allèles dilution Traceurs Concentration pH Temps traceur optimal d'incubation (nM) (h) DRB1*OlOi 1/40à 1r00 HA 306-318 1 6 24 DRB1*0301 l'IOàI!40 MT2-16 200 4,5 72 DRB 1 *0401 1/20à 1/100 HA 306-318 30 6 24 DRB 1 *0701 1/20 à 1/100 YKL 10 5 24 DRBP1101 120 à l'100 HA 306-318 20 5 24 DRB I * 1301 1 ' 10 à 1 l40 Bl 21-36 200 4,5 72 DRB1*1501 110 à 1/100 A3 152-166 10 4,5 72 DRB5*0101 1/10 à 1/100 HA 306-318 10 5,5 24 DRB3*0101 1/10 à 1/100 Lol 191-120 10 5,5 24 DRB4*0101 1/10 à 1!100 E2/E168 10 5 72 DBPI*401 1/20 à 1/400 Oxy 271-287 10 24 DPB1*4O2 1 20 à 11100 Oxy 271-287 10 24 La sensibilité de chaque test est reflétée par les IC observées avec les peptides non-biotinylés qui correspondent aux traceurs et les résultats obtenus sont illustrés au Tableau VIII ci-après. Tableau VIII : Sensibilité des tests de liaison au molécules HLA II prépondérantes dans la population caucasienne Allèles Fréquence Peptides Séquences IC50 (SEQ ID NO: 75 à 82) (nM) DRBi *O101 9.3 1-1 A 306-318 PKYVKQNTLKLAT 31 DRBI*0401 5.6 HA 306-3 18 PKYVKQNTLKLAT 44 DRB1*1101 9. 2 HA 306-318 PKYVKQNTLKLAT 38 DRB1*0701 14.0 YKL AAYAAAKAAALAA 34 DRBI*0301 10.9 MT 2-16 AKTIAYDEEARRGLE 100 DRB1*1301 6. 0 BI 21-36 TERVRLVTRHIYNREE 330 DRB1*1501 8. 0 A3 152-166 EAEQLRRAYLDGTGVE 14 DRB5*0101 7. 9 HA 306-318 PKYVKQNTLKLAT 6. 5 DRB3*0101 9. 2 Lol 191-120 ESWGAVWRIDTPDKLTGPFT 5 DRB4*0101 28.4 E2/E168 AGDLLAIETDKATI 2 DPBI*401 40 0@ 271-287 EKKYFAATQFEPLAARL 10 DPB1*402 11 Ovy37i-287 EKKYFAATQFEPLAARL 10 Les fréquences indiquées, issues de Colombani (HLA: fonctions immunitaires et applications médicales. 1993. Eds John Libbey Eurotext). qui sont les fréquences alléliques en France, sont représentatives de celles de la population caucasienne. EXEMPLE 2 : ACTIVITES DE LIAISON DES PEPTIDES C et NS3 VIS-A-VIS DES MOLECULES HLA II PREPONDERANTES DANS LA POPULATION CAUCASIENNE. 1) Première série de peptides (figure 2) L'activité de liaison des peptides longs tels que définis à l'exemple 1, vis à vis des 12 molécules HLA II prépondérantes dans la population caucasienne (HLA-DR1, -DR3. -DR4. -DR7. -DR11, -DR13, -DR15, -DRB3, -DRB4. -DRB5, DP401, et -DP402 ; tableau VIII ) a été mesurée dans les conditions précisées à l'exemple 1. Les résultats illustrés par la figure 2 montrent que chaque peptide se lie avec une bonne affinité (IC50 Parmi ces derniers. les peptides 26N, 8N, 28N, IC, ION, 15N, 19N, 29N, 2C, 16N, 18N, 23N. 27N. 5C, 9N, UN, 13N, 14N, 17N, 24N. 4C et 22N se lient avec une bonne affinité à au moins 4 molécules HLA II différentes. 2) Deuxième série de peptides (figures 3 et Tableau IX) Les résultats illustrés par la figure 3 et le Tableau IX permettent de préciser les zones d'interaction des peptides avec les différentes molécules HLA II. Tableau IX: Activités de liaison des peptides 9N et 29N vis-à-vis des molécules HLA II prépondérantes dans la population caucasienne. DR1 DR3 DR4 DR7 DR11 DR13 DR15 DRB3 DRB4 DRB5 9N 1036-1055 51 >100000 950 2600 700 >100000 5500 1000 53 9N 1036-1050 16 >100000 350 2500 1100 >100000 1550 300 2000 9N 10411055 190 62500 2900 25000 2600 >100000 525 65000 11 29N 1552-1583 170 6750 4000 750 90 27333 60 25000 333 29N 1559-1573 29 >100000 3000 18 7 >100000 305 >100000 32 29N 1563-1577 8 3900 2100 16 817 3250 13 40000 12 29N 1569-1583 950 >100000 10500 3000 22 >100000 2800 >100000 21000 EXEMPLE 3 : IMMUNOGENICITE DE PEPTIDES NS3 IN VIVO CHEZ DES SOURIS TRANSGENIQUES POUR UNE MOLECULE HLA II La capacité des peptides ayant une bonne affinité pour les molécules HLA II tels que définis ci-dessus à induire une réponse immunitaire, a été évaluée par un test de prolifération in vitro, chez des souris transgéniques pour les molécules HLA-DR1 (Wilkinson et al., Infect. Immunity. 1999,67, 1501-; Rosloniec et al., J. Exp. Med., 1997. 185. 1113-). préalablement immunisés avec ces peptides. Plus précisément, le protocole utilisé est le suivant : 25 g de chacun des peptides 8N 1007-1037, 15N 1174-1195. 28N 1524-1553, 3C 93-107, 6C 148-173 et 12N 1094-1119, séparément, ou bien 10 g et 25 g d'un mélange des mêmes peptides 8N. 15N et 28N ont été émulsifiés dans du montanide et injectés, par voie sous-cutanée. à un groupe de 5 souris. 15jours après, une deuxième injection a été effectuée dans les mêmes conditions. Dix jours après cette deuxième injection, les animaux ont été sacrifiés et leur rate prélevée. Les splénocytes ont été mis en culture dans du milieu HL-1(BIOWHITTAKER) supplémenté par 1% de sérum de souris, en présence de 5ug/ml de chacun des peptides utilisés pour l'injection, ou en l'absence de peptide. Après 4 jours de culture, 1 Ci de thymidine tritiée (AMERSHAM, LIFE TECHNOLOGIE) a été rajoutée pendant 16 h. L'incorporation de la thymidine tritiée a ensuite été mesurée à l'aide d'un compteur béta (microbéta 1450, PERKIN ELMER). Les résultats sont exprimés en index de prolifération (nombre de CPM en présence de peptide/nombre de CPM en l'absence de peptide). Les résultats montrent que les peptides 8N1007-1037, 15N 1174- 1195 et 28N 1524-1553 qui possèdent une forte capacité de liaison à la molécule HLA-DR1 (IC50 de respectivement 2, 3 et 2 nM) induisent une forte réponse immunitaire chez ces souris alors que les peptides 3C93-107. 6C148-173 et 12N1094- 1119 qui possèdent un faible capacité de liaison à cette molécule (IC50 de respectivement 6333. 10000 et > 10000 nM) n'induisent pas d'effet (figure 4A). Ces résultats montrent également que l'injection d'un mélange de peptides n'a pas d'effet délétère sur la réponse immunitaire et permet d'induire une forte réponse contre chacun des peptides du mélange (figure 4B). Ces résultats confirment que les peptides sélectionnés par le test de liaison aux molécules HLA II sont capables d'induire une forte réponse CD4+ chez les individus immunisés. Ils indiquent donc que les peptides sélectionnés peuvent être utilisés dans des compositions immunogènes pour la vaccination contre l'hépatite C. EXEMPLE 4 : IMMUNOGENICITE DE PEPTIDES NS3 IN VITRO La capacité des peptides ayant une bonne affinité pour les molécules HLA II à induire in vitro une stimulation de lymphocytes T spécifiques a été évaluée à partir de prélèvements sanguins de personnes séronégatives pour le VHC. Il s'agit d'évaluer la capacité à recruter des lymphocytes précurseurs CD4+ alors qu'ils sont chez un individu naïf à une très faible fréquence c'est-à-dire d'effectuer une immunisation in vitro au moyen de ces peptides. a) Matériels et méthodes Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ont été séparées sur un gradient de Ficoll. Les PBMCs ont ensuite été mises en culture dans du milieu AIM V (LIFE TECHNOLOGIES) et incubées dans des flasques, à l'étuve à 37 C en présence de 5% CO2. Après une nuit d'incubation, les cellules non adhérentes ont été récupérées, déposées sur une colonne LS+ (MYLTENYI), puis les lymphocytes T CD4+ aini purifiés ont été congelés. Les cellules adhérentes ont été incubées pendant 5 jours, dans du milieu AIM V contenant 1000U/ml de GM-CSF et 1000U/ml d'IL-4. puis les cellules différenciées en cellules dendritiques ont ensuite été cultivées pendant 2 jours, en présence de lug/ml de LPS. 1000 U/ml d'IL-4 et 1000 U/ml de GM-CSF, de manière à induire leur maturation. Les cellules dendritiques matures (100 000 cellules/puits) ont alors été incubées avec un mélange de peptides (10 g de chaque peptide), pendant 5 heures à 37 C. Les cellules dendritiques matures ont ensuite été lavées puis incubées, en présence des lymphocytes T CD4+ (100 000 cellules/puits) préalablement décongelés, dans du milieu contenant 1000 U/ml d'IL-6 et lOng/ml d'IL-12. Après 7 jours, la culture a été restimulée une première fois. au moyen de cellules dendritiques matures préalablement décongelées et chargées par le mélange de peptides, dans du milieu contenant de l'IL-2 (10 U/ml) et de l'IL-7 (5ng/ml). 7 jours plus tard, la culture a été restimulée, de façon similaire, dans un milieu ne contenant pas d'IL-2. Après deux stimulations supplémentaires, dans les conditions précédentes. les cellules ont été testées en ELISPOT. de la façon suivante : Des anticorps anti-IFN y (1-D1K, MABTECH) dilués à 1 g/ml dans du tampon PBS ont été adsorbés sur des plaques de nitrocellulose (MILLIPORE) pendant Iheure à 37 C. Les plaques ont ensuite été lavées avec du PBS puis saturées avec du milieu RPMI contenant 10 % SVF (100|il/puits). pendant 2 h à 37 C. Les cellules dendritiques matures préalablement décongelées (10000 cellules/puits) et 10 000 lymphocytes à tester ont ensuite été ajoutés dans les plaques et incubées 24 h à 37 C, en présence ou en l'absence d'un seul peptide ou d'un mélange de peptides. Après un lavage avec du tampon PBS puis avec du PBS Tween 0.05%, 100 l d'anticorps secondaire anti-IFN-y conjugué à la biotine (7-B6-l-biotin, MABTECH), dilué à 1 g/ml dans du PBS contenant 0,05% Tween 20 et 1% BSA. a été ajouté dans chaque puits. Après une heure d'incubation, les plaques ont été lavées à nouveau et incubées avec 100 l/puits d'Extravidin-AKP (n 2636, SIGMA.). diluée au 1/5000 dans du PBS contenant 0. 05 % Tween 20 et 1 % BSA. La révélation de la réaction immunoenzymatique a ensuite été réalisée à l'aide du kit n 170-6432 (BIORAD) b) Résultats Les PBMC d'un patient séronégatif (POI4) ont été testées selon le protocole tel que défini ci-dessus. avec le mélange des peptides suivants : 8N 1007- 1021, 8N 1019-1033,15N 1178-1192, 28N 1538-1552, 18N 1250-1264 et 8N 1024- 1037. Après 4 restimulations, un ELISPOT a été réalisé sur différents puits. Trois lignées spécifiques ont pu être mises en évidence (figure 5). Ces trois lignées répondent en présence du mélange de peptides (mix) mais pas en l'absence du mélange. Chaque lignée répond à au moins un des peptides du mélange. La lignée P014/A répond au peptide 15N 172-186 et au peptide 18N 244-258 (figure 5A). La lignée P014/B répond au peptide 8N 13-27 (figure 5B) et la lignée P014/C aux peptides 15N 172-186 et 28N 532-546 (figure 5C). EXEMPLE 5 : DETECTION DE LYMPHOCYTES T SPECIFIQUES DU VHC A L'AIDE DES PEPTIDES C ET NS3. La capacité des peptides possédant une affinité élevée pour les molécules HLA de classe II tels que définis ci-dessus. à détecter des lymphocytes T spécifiques du virus de l'hépatite C (VHC). a été testée in vitro par le dosage des cytokines IFN-y, IL-2, IL-4 et IL-10 produites par les lymphocytes T issus de PBMC de patients infectés de façon chronique par le VHC. De manière plus précise, les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de patients infectés de façon chronique par le VHC ont été séparées sur gradient de Ficoll, à partir d'un prélèvement sanguin hépariné. Les PBMC isolées ont ensuite été cultivées à 37 C, dans des plaques à 96 puits contenant du milieu RPMI 1640 (GIBCO) complet (10 % sérum humain 10 %, 100 UI/ml pénicilline et 10 g/ml streptomycine), seul ou en présence : - d'un mélange des peptides C 19-47 et 31-57, d'un mélange des peptides C 127-149 et 148-173 ou des peptides NS3 1007-1037. 1036-1055, 1074- 1195, 1190-1212. 1377-13403. 1524-1553, 1552-1583. chacun à la concentration de 10 ug/ml, - d'un mélange de l'ensemble de ces peptides, chacun à la concentration de 110 ug/ml, 55 ug/ml ou 11 g/ml. ou - de phytohémagglutinine (PHA) ou de toxine tétanique (TT), chacune à la concentration de 2.5 ug/ml . Les surnageants de culture ont été récoltés à 24h ou 48h et stockés à -80 C jusqu'à l'analyse. Les cytokines éventuellement présentes dans les surnagents ont été dosées de la façon suivante : Des plaques à 96 puits (Maxisorp, NUNC) ont été recouvertes de 100 l d'anticorps anti-IFN-y, IL-2. IL-4 et IL-10 (BECTON DICKINSON, 2 g/ml) dans du tampon carbonate 0,1 M. pH 8,6 et incubées 2h à 37 C. Après trois lavages successifs avec du tampon PBS contenant 0. 05 % de Twen 20, les plaques ont été saturées avec 200 l de PBS contenant 3 % de sérum albumine bovine (BSA, SIGMA), pendant 2h à température ambiante. 50 l de surnageant de culture (en double). ainsi qu'une une gamme étalon de cytokines recombinantes humaines (rH-IFN-y. rH-IL-2. rH-IL-4 et rH-IL-10 ; BECTON DICKINSON) ont ensuite été ajoutés dans chaque puits et les plaques ont été incubées pendant 12h à + 4 C. Après trois lavages successifs avec du tampon PBS contenant 0,05 % de Twen 20,100 l d'anticorps secondaires anti-IFN-y. IL-2, IL-4 et IL-10 (BECTON DICKINSON, 1 g/ml) dans du tampon PBS contenant 1 % de BSA ont été ajoutés dans les puits puis les plaques ont été incubées lh à température ambiante. Après quatre lavages successifs avec du tampon PBS contenant 0,05 % de Twen 20,100 l de streptavidine-peroxydase (SIGMA) diluée au 1/10000 dans du tampon PBS contenant 0,1% BSA ont été ajoutés dans les puits, puis les plaques ont été incubées 30 min à température ambiante. Après quatre lavages successifs avec du tampon PBS contenant 0,05 % de Twen 20,100 l d'orthophényldiamine (OPD, SIGMA, 400 pg/ml) dans du tampon citrate 50 mM ont été ajoutés dans les puits et les plaques ont été incubées à température ambiante, puis la réaction a été stoppée par ajout de 50 l d'HCl 2N. La densité optique a ensuite été mesurée à 540 nM et l'analyse quantitative des cytokines a été réalisée à l'aide du logiciel Deltasoft (DS3-1.518FII994 E. BERCHTOLD & BIOMETALLICS INC). Les résultats, exprimés en pg/ml. sont présentés au Tableau X. Tableau X : Dosage de cytokines produites par les lymphocytes T de patients infectés chroniques, après stimulation par les peptides C et NS3, seuls ou en mélange. PHA TT M110 M55 M11 1C 5C 8N 9N 15N 16N 23N 28N 29N ~~~ + 2C + 6C ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ IL2 ~ 1002 610 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 72 58 patient IFNy ~ 1979 815 IL4 5638 - - - - - - - - - - - - IL10 497 79 27 11* 156 123 63* IL2 ~ NT 6 3 3 3 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ patient IFNy ~ NT 441, - - - - - - - - - - - - 829 IL4 NT - - - - - - - - - - - - - IL10 - NT - - - - - - - - - - - 67 IL2 125 22 20 patient IFN[gamma]@ - 342 IL4 - - - - - - - - - - - - IL10 NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT IL2 ~ 60 ~ 4 8 B ~ ~ ~ 29.1 ~ ~ ~ ~ ~ patient IFNy ~ 9902 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 862 IL4 9 - - - - - - - -' - - - - 57 IL10 NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT IL2 - 1402' 171 7 8 7 2 5 patient IFNy ~ 8542 83 ~ ~ ~ ~ 137 ~ ~ ~ ~ 57 093 IL4 127 24 8 35 23 ~11 44 IL10 ~ 8551 IL2 1337 695 136 130 159 100 ~85 ~51 ~76 60 patient IFNy ~ 2447 212 - 067 IL4 ~ 632 IL10 665 40 32 43 58 55 86 31* IL2 18874 55 82 2,4 3,4 - 12* 2,4* patient IFNY ~ 474 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 630 IL4 251 IL10 242 - - - - - - - - - - - - - IL2 207 48 ~44 ~17 patient IFNy ~ 2249 078 IL4 55 - - - - - - - - - - - - - IL10 207 64 ~109 85 64 16 41 58 43 - 54 21 38patient IL2 153 - - - - - - - - 18 - - - 659 - - - - - - - - - - - ~ ~ ~ IFNv ~ ~187 - - - - - - - - - - - - IL4 ~ 453 - - - - - - - - - - - - - IL10 ~ 182 ~ 129. 40 ~ 31 ~ ~ 18 ~ ~ 29 * dosage à 24h au lieu de 48 h : non testé: - : non détecté Le Tableau X montre que 8 patients sur 9 présentent des cellules spécifiques d'au moins un des peptides C ou NS3. sécrétrices d'IL-2, IFN-y, d'IL-4 ou d'IL-10. Il montre également qu'un mélange de peptides C et NS3 permet de détecter des lymphocytes T spécifiques du VHC au moins aussi efficacement que les peptides utilisés séparément, et qu'il augmente même la sensibilité de cette détection (voir patient 342). Ces résultats indiquent que les peptides ayant une bonne affinité pour les molécules HLA II tels que définis ci-dessus, peuvent être utilisés dans un test de diagnostic de l'état immunitaire de patients vis-à-vis de l'infection par le VHC. REVENDICATIONS 1 ) Mélange de peptides, caractérisé en ce qu'il inclut au moins deux peptides différents issus du virus de l'hépatite C, dont l'un au moins est un peptide issu de la protéine C, se liant à au moins quatre molécules HLA II différentes dont la fréquence allélique est supérieure à 5 % dans la population caucasienne, avec une activité de liaison 2 ) Mélange de peptides selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il inclut, outre ledit peptide issu de la protéine C, au moins un peptide issu de la protéine NS3, se liant à au moins quatre molécules HLA II différentes dont la fréquence allélique est supérieure à 5 % dans la population caucasienne, avec une activité de liaison 3 ) Mélange de peptides selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que les dites molécules HLA II sont choisies parmi les molécules HLA-DR1, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DR11, HLA-DR13, HLA-DR15, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5 et HLA-DP4. 4 ) Mélange de peptides selon la revendication 3, caractérisé en ce que les dites molécules HLA II sont codées respectivement par les allèles HLA DRBl*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRBl*1101, DRBl*1301, DRB1*1501, DRB3*0101,DRB4*0101,DRB5*0101,DP*0401 et DP*0402. 5 ) Mélange de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les peptides issus de la protéine C du virus de l'hépatite C, sont sélectionnés dans le groupe constitué par : a) les peptides correspondant respectivement aux positions 19-47, 27-51, 31-57, 104-133 et 127-167, b) les peptides d'au moins 11acides aminés inclus dans les peptides tels que définis en a), et c) les peptides dérivés des peptides tels que définis en a) ou en b) par substitution par des résidus alanine (C # A), de résidu (s) cystéinesitué(s) en position + 1 ou + 2, relativement au résidu d'acide aminé en position N terminale et/ou en position -1, - 2 ou - 3, relativement au résidu d'acide aminé en position C terminale. 6 ) Mélange de peptides selon la revendication 5, caractérisé en ce que les peptides d'au moins 11acides aminés tels que définis en b) sont sélectionnés dans le groupe constitué par : - le peptide inclus dans le peptide 27-51 correspondant aux positions 27-41, - le peptide inclus dans le peptide 31-57 correspondant aux positions 31-45, et - les peptides inclus dans le peptide 127-167 correspondant respectivement aux positions 127-149,131-145, 131-148,131-167, 134-148 et 148-167. 7 ) Mélange de peptides selon la revendication 5, caractérisé en ce les peptides tels que définis en c) sont sélectionnés dans le groupe constitué par le peptide dérivé du peptide C 127-149 de séquence SEQ ID NO: 5. 8 ) Mélange de peptides selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que les peptides issus de la protéine NS3, sont sélectionnés dans le groupe constitué par : d) les peptides correspondant respectivement aux positions 1007- 1037,1036-1055, 1052-1072,1076-1093, 1127-1153,1149-1172, 1174-1195,1190- 1212,1206-1239, 1246-1275,1275-1304, 1361-1387,1377-1403, 1404-1432,1456- 1481,1495-1513, 1524-1553 et 1552-1583, e) les peptides d'au moins 11acides aminés inclus dans les peptides précédents, et f) les peptides dérivés des peptides tels que définis en d) ou en e) par substitution par des résidus alanine (C # A), de résidu (s) cystéinesitué(s) en position + 1 ou + 2, relativement au résidu d'acide aminé en position N terminale et/ou en position-1, - 2 ou - 3, relativement au résidu d'acide aminé en position C terminale. 9 ) Mélange de peptides selon la revendication 8, caractérisé en ce que les peptides d'au moins 11acides aminés tels que définis en e) sont sélectionnés dans le groupe constitué par : - les peptides inclus dans le peptide 1007-1037 correspondant respectivement aux positions 1007-1021,1015-1029, 1015-1037,1019-1033 et 1020- 1034, - les peptides inclus dans le peptide 1174-1195 correspondant respectivement aux positions 1174-1188, 1174-1192 et 1178-1192, - les peptides inclus dans le peptide 1190-1212 correspondant respectivement aux positions 1190-1204 et 1192-1206, - les peptides inclus dans le peptide 1246-1275 correspondant respectivement aux positions 1246-1260,1246-1264, 1250-1264 et 1261-1275, - les peptides inclus dans le peptide 1377-1403 correspondant respectivement aux positions 1381-1395,1381-1397, 1381-1403 et 1383-1397, - le peptide inclus dans le peptide 1495-1513 correspondant respectivement aux positions 1495-1509, - les peptides inclus dans le peptide 1524-1553 correspondant respectivement aux positions 1524-1552, 1524-1538,1528-1542, 1528-1552,1529- 1543, 1534-1548, 1538-1552 et 1540-1553, et - les peptides inclus dans le peptide 1552-1583 correspondant respectivement aux positions 1559-1573 et 1563-1577. 10 ) Mélange de peptides selon la revendication 8, caractérisé en ce que les peptides tels que définis en f) sont sélectionnés dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 10, 13, 20, 22 et 24 et les séquences dérivées de la séquence SEQ ID NO: 24 correspondant respectivement aux positions 1524-1538, 1524-1552, 1528-1552,1538-1552 et 1540-1553. 11 ) Mélange de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il inclut des peptides issus des protéines C et NS3 du Virus de l'hépatite C de génotype 1. 12 ) Mélange de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il inclut 2 à 6 peptides différents issus des protéines C et NS3, l'ensemble des peptides se liant à au moins 10 molécules HLA II dont la fréquence allélique est supérieure à 5 % dans la population caucasienne. 13 ) Mélange de peptides selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il inclut des peptides sélectionnés dans le groupe constitué par les peptides issus de la protéine C correspondant respectivement aux positions 27-51,131-167, 127-149, 131-148,148-167 et les peptides issus de la protéine NS3 correspondant respective- ment aux positions 1007-1037,1015-1037, 1036-1055,1174-1192, 1190-1212,1246- 1264,1381-1403, 1381-1397,1524-1553, 1528-1552 et 1552-1583. 14 ) Mélange de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il est sous forme d'une protéine de fusion comprenant la séquence desdits peptides. 15 ) Molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour une protéine de fusion selon la revendication 14. 16 ) Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'acide nucléique selon la revendication 15. 17 ) Cellule, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur selon la revendication 16. 18 ) Composition immunogène anti-VHC, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins : - un mélange de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, et/ou - une molécule d'acide nucléique selon la revendication 15, ou - un vecteur recombinant selon la revendication 16, en association avec au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et éventuellement au moins un adjuvant. 19 ) Composition immunogène selon la revendication 18, caractérisée en ce que lesdits peptides sont sous forme de peptides modifiés ou bien associés à des liposomes ou à des lipides, notamment sous forme de lipopeptides. 20 ) Composition immunogène selon la revendication 18 ou la revendication 19, caractérisée en ce que ledit mélange de peptides est associé : - à un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes CD8+ et plus particulièrement des épitopes CD8+ issus d'une protéine du VHC tels que les peptides C 2-10,28-36, 35-44, 41-49, 42-50, 85-98,88-97, 127- 140,131-140, 132-140,167-176, 178-187,181-190 ; les peptides El 220-227, 233- 242,234-242, 363-371 ; les peptides E2 401-411,460-469, 489-496,569-578, 621- 628,725-733 ; les peptides NS2 826-838,838-845 ; les peptides NS3 1073-1081, 1169-1177, 1287-1296, 1395-1403,1406-1415 ; les peptides NS4A 1585-1593,1666- 1675 ; les peptides NS4B 1769-1777,1789-1797, 1807-1816,1851-1859 ; le peptide NS5A 2252-2260 et les peptides NS5B 2588-2596, 2727-2735. - à d'autres peptides comprenant des épitopes CD4+ multiples, tels que le peptide de la toxine tétanique TT (positions 830-846), le peptide de l'hémagglutinine d'Influenza HA (positions 307-319), PADRE et le peptide LSA3 de Plasmodium falciparum et/ou - à un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes B, plus particulièrement des épitopes B issus d'une protéine du VHC reconnus spécifiquement par des anticorps dirigés contre ces derniers, tels que tels que le peptide C 5-27, le peptide NS4 1698-1719 et le peptide NS5 2295-2315. 21 ) Vaccin, caractérisé en ce qu'il inclut une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 18 à 20. 22 ) Peptides issus d'une protéine C ou NS3 du VHC caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par : les peptides issus de la protéine C, tels que définis à l'une quelconque des revendications l, 3 à 7, 11, 13 et 14, à l'exclusion du peptide C 31-45, et les peptides issus de la protéine NS3 choisis parmi : - les peptides correspondant respectivement aux positions 1007- 1037,1036-1055, 1052-1072,1076-1093, 1127-1153,1149-1172, 1174-1195,1190- 1212,1206-1239, 1275-1304,1361-1387, 1377-1403,1404-1432, 1456-1481,1495- 1513,1524-1553 et 1552-1583 et les peptides d'au moins 11 acides aminés inclus dans les peptides précédents, tels que définis aux revendications 8 et 9, - les peptides correspondant respectivement aux positions 1246-1260 et 1261-1275, tels que définis à la revendication 9, - les peptides dérivés des peptides précédents par substitution par des résidus alanine (C # A), de résidu (s) cystéinesitué(s) en position + 1 ou + 2, relativement au résidu d'acide aminé en position N terminale et/ou en position -l, - 2 ou - 3, relativement au résidu d'acide aminé en position C terminale, tels que définis aux revendications 8 et 10, et - les peptides dérivés des peptides précédents, tels que définis aux revendications 11 et 14. 23 ) Réactif de diagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un peptide selon la revendication 22 ou un mélange de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, éventuellement marqué ou complexé, sous la forme de complexes multimériques. 24 ) Procédé d'évaluation de l'état immunitaire d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de détection de la présence de cellules T CD4+ spécifiques des peptides C et/ou NS3 tels que définis aux revendications 1 à 14. 25 ) Méthode de tri de lymphocytes T spécifiques du VHC, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : - mise en contact, d'une suspension de cellules à trier avec un ou plusieurs tétramères marqués formés à partir de complexes entre des peptides C et/ou NS3 tels que définis aux revendications 1 à 14 et des molécule HLA II solubles , et - tri des cellules marquées par les tétramères.