Brevet FR2838066A1 — publié le 20031010

dispositif de visualisation du jeu vidéo. PROCEDE ET AUTOMATE D'EXTRACTION D'ACIDES NUCLEIQUES A PARTIR D'UN MELANGE COMPLEXE La présente invention relève du domaine de l'analyse d'échantillons biologiques et, plus particulièrement, de l'analyse du contenu bactérien de mélanges complexes, notamment d'échantillons alimentaires. L'invention concerne un procédé d'extraction des acides nucléiques de microorganismes contenus dans un mélange complexe. La présen.e invention a en outre pour objets une cartouche de filtration ainsi qu'un automate d'extraction des acides nuclélques de microorganismes contenus dans un mélange complexe, lesdits cartouche et automate étant utiles pour la mise en oeuvre du procédé d'extraction selon l'invention. L'invention concerne enfin un dispositif pour l'extraction et la détection eVou la quantification des acides nucléiques de microorganismes contenus dans un mélange complexe, ledit dispositif comprenant un automate d'extraction d'acides nucléiques conforme à l'invention, couplé à un automate d'amplification en chane thermo-dépendante desdits acides nucléiques. Le comportement actuel du public, représentant les consommateurs potentiels, est syrnptomatique d'une préoccupation de santé et sécurité générales, en ce que sont exigées toujours plus de garanties sur l'innocuité, les qualités et la provenance des produits disponibles sur le marché. Du reste, ce phénomène a pris beaucoup d'ampleur ces dernières années et continue d'aller croissant. Aussi convient-il d'apporter des réponses solides au public afin de satisfaire son besoin de certitudes et d'assurances. A cet égard, les pouvoirs publics et autres autorités et organismes compétents en matière de santé publique et vigilance sanitaire imposent des contrôles réguliers afin de veiller au strict respect des normes de sécurité et de qualit=, notamment dans ie domaine de l'alimentation par les producteurs, fabricants, distributeurs et restaurateurs. La qualité du contrôle microbiologique est un point crucial auquel il convient de veiller tout au long de la chane entre le producteur et le consommateur. Le principe de tels contrôles repose sur des méthodes d'analyse fondées sur des techniques courantes de chimie ou biochimie analytique, parmi lesquelles la chromatographie, la résonance magnétique nucléaire et la spectrométrie de masse, ainsi que des techniques de biologie moléculaire permettant, par exemple, de détecter des acides nuclélques spécifiques d'organismes notamment pathogènes par PCR ou hybridation à I'aide de sondes. Ces contrôles peuvent être effectués à grande échelle, notamment au niveau d'une exploitation agricole ou d'une industrie de production. De plus, ils sont parfois pratiqués dans l'urgence. En l'occurrence lorsque les prod u its suspects sont déjà d isponibles à la vente, il convient d 'évaluer I'innocuité desdits produits dans les plus brefs délais afin, le cas échéant, d'ordonner leur retrait du marché avant une éventuelle contamination de masse. En particulier, les contrôles sanitaires sont pratiqués dans le cadre de l'évaluation du niveau de contamination d'aliments à risque, tels les viandes, poissons, laitages et aliments susceptibles d'avoir subi des altérations résultant d'éventuelles variations sensibles de température lors du franchissement des différentes étapes de la " chane du froid >>, ainsi qu'en matière de préservation et surveillance de l'environnement, s'agissant par exemple du contrôle du niveau de pollution des sources et réseaux urbains d'eau potable. Selon des applications plus médicales, la pureté des extraits d'acides nucléiques issus de prélèvements biologiques de patients ou sujets à risque est un critére essentiel pour la mise en _uvre de méthodes diagnostiques et notamment, la réalisation de tests de dépistage ou prédisposition vis-à-vis de maladies génétiques. En tout état de ause, les prélèvements effectués in situ doivent être traités dans les plus brefs délais tout en assurant efficacité et sécurité optimales. L'une des premières étapes du traitement des prélèvements biologiques peut notamment consister à manipuler in vitro les acides nucléiques à des fins d'analyse qualitative eVou quantitative et plus précisément, à isoler lesdits acides nucléiques de leur environnement cellulaire. Les acides nuclélques, ADN et ARN, sont la cible d'interactions multiples, liées aux processus blologiques dans lesquels lesdits acides nucléiques jouent un rôle fondamental. A titre d'exemple, ces derniers interagissent directement avec les enzymes responsables de l'expression des gènes, ainsi qu'avec les facteurs protéiques de réqulation de ladite expression, celle-ci constituant un processus blologique fondamental contribuant à la survie, au développement et au renouvellement des cellules. De tels complexes associant les acides nuclélques d'intérêt à des protéines eVou d'autres acides nucléiques compliquent considérablement l'isolement et la purification des seuis acides nuclélques recherchés. Afin de surmonter cette difficulté, les méthodes conventionnelles d'extraction des acides nucléiques sacrifient généralement le temps de mise en _uvre au profit du degré de pureté des extraits obtenus. En principe, de telles méthodes comprennent au moins les trois étapes suivantes: (i) la Iyse des enveloppes cellulaires permettant de libérer les acides nuclélques dans le milieu; (ii) la dénaturation des complexes acides nucléiques-protéines; et (iii) la séparation des acides nuclélques d'intérêt des autres macromolécules (Sambrook et Russel. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3rr ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) Ces méthodes conventionnelles, bien que conservant pour la plupart la trame représentée par les trois étapes énoncées supra, ont été empiriquement modifiées en fonction des différents objectifs à atteindre. Ainsi, leur mise en uvre diffère sensiblement selon que le but poursuivi consiste à isoler (i) les ADN eVou les ARN, (ii) à partir de cellules d'organismes procaryotes ou eucaryotes, sachant que dans le cas des organismes procaryotes, il convient le cas échéant de (iii) discriminer les ADN de nature plasmidique ou chromosomique. Dans la trame sus-visée, figure une étape essentielle consistant à extraire les acides nucléiques au moyen de solvants organiques, tels le phénol, le chloroforme, I'alcool isoamylique, ou un mélange de ceux-ci. Les acides nucléiques recherchés, contenus dans la phase aqueuse, sont alors recuoillis après séparation des phases organique et aqueuse par centrifugation. La mise en _uvre d'une telle étape représente une, si ce n'est la limitation principale des procédures d'extraction des acides nuclélques selon l'art antérieur. En effet, la centrifugation nécessaire à la séparation des phases organique et aqueuse constitue un obstacle majeur à l'automatisation de la méthode en imposant d'une part, I'intervention nécessaire de l'expérimentateur et d'autre part, des coûts élevés de mise en _uvre du fait d'instailations coûteuses et volumineuses. En outre, les traitements mécaniques infligés aux molécules d'acides nucléiques en solution, pipetages successifs et centrifugations répétées, génèrent des contraintes de cisaillement occasionnant la rupture desdites molécules de part en part et, en conséquence, la réduction de leur taille à l'issue de l'extraction. En définitive, la plupart des méthodes conventionnelles de Iyse cellulaire permettent d'extraire les acides nucléiques, non pas sous leur forme native, mais sous la forme de fragments de grande taille (50 kb). La purification subséquente des extraits d'acides nucléiques à l'aide de solvants organiques, tel un mélange phénol-chloroforme, peut entraner un cisaillement desdits acides nucléiques, générant alors des fragments de taille hètérogène et inférieure à 50 kb. Un tel ce, en s'affranchissant des multiples centrifugations jusque-là nécessaires. Brièvement, une émuision est générée par l'addition de solvant au Iysat cellulaire, ladite émuision étant chauffée pour entraner la séparation des phases. Une étape d'extraction finale au chloroforme est réalisée. Nonobstant sa possible automatisation, cette méthode ne résout pas le problème posé par l'art antérieur, et notamment lié à l'utilisation de solvants organiques. Bien que l'extraction au moyen desdits solvants élimine efficacement les contaminants, à savoir les détergents utilisés dans I'étape de Iyse des cellules ainsi que les protéines, ils restent néanmoins fortement toxiques. En conséquence, leur manipulation nécessite vigilance et parcimonie, et doit être confinée au niveau de postes de sécurité dotés de systèmes de ventilation appropriés. Afin d'obvier aux inconvénients évoqués supra et présentés par les méthodes d'extraction des acides nuclélques de 1'état de la technique, lesdites méthodes étant difficilement conciliables avec les impératifs de sécurité, efficacité et rentabilité de l'industrie ou du laboratoire d'analyses moderne, une approche alternative a été décrite dans la demande internationale WO 93/01312. Cette demande divulgue une cartouche de préparation d'acides nucléiques, notamment d'ADN génomique, à partir d'un échantillon de sang, de cellules de tissus ou de cellules en culture, autrement dit des suspensions de cellules eucaryotes relativement homogènes, dans un fluide blologique ou un milieu de culture. La demande internationale WO 93/01312 décrit en outre un dispositif lO et un procédé utilisant ladite cartouche. Ainsi, la cartouche comprend notamment une enceinte de dialyse délimitée par des membranes de dialyse. Le cas échéant, la cartouche comprend en outre un filtre de rétention des noyaux des cellules. La demande internationale WO 93/01312 propose un procédé de préparation, c'est-à-dire d'isolement et purification des acides nucléiques à partir d'un échantillon contenant des cellules eucaryotes, par Iyse des noyaux, dégradation des protéines et purification desdits acides nuclélques par dialyse. La technologie relative à la cartouche d'extraction décrite dans la demande internationale WO 93/01312 n'est cependant pas adaptée à une extraction des acides nucléiques de procaryotes présents, le cas échéant, dans des mélanges complexes hétérogènes, tels que des échantillons alimentaires bruts, non préalablement modifiés par exemple par dessiccation, et dont les constituants sont pour partie solides et pour partie liquides. En l'espèce, I' invention vise à proposer un procédé d 'extraction d'acides nucléiques de procaryotes automatisable et adapté au traitement d'un milieu de départ complexe. Ainsi, le procédé selon l'invention, entièrement automatisable, répond ainsi à un souci de rationalisation et d'économie en ce qu'il: (i) est directement applicable à l'extraction d'acides nucléiques à partir de prélèvements bruts, quand bien même ceux-ci seraient complexes et hétérogènes en terr,es de composition et structure; (ii) permet une extraction rapide, réalisable en moins de 3 heures; (iii) fournit des résultats reproductibles; (iv) permet de traiter simultanément jusqu'à douze échantillons différents, tout en assurant leur traçabilité à chaque étape; (v) peut être mis en ceuvre par du personnel non qualifié; (vi) ne requiert ni intervention ni surveillance de la part de l'expérimentateur, si ce n'est éventuellement d e ma nière très ponctuelle, led it expérimentateu r se trouve alors disponible pour effectuer, en parallèle des extractions en cours, d'autres opérations ou travaux; et (vii) peut être mis en _uvre en routine à l'échelle du laboratoire d'analyses ou de l'industrie, sans nécessiter de lourds investissements en matière d'équipements. L'invention concerne donc un procédé d'extraction des acides nucléiques de microorganismes contenus dans un mélange complexe, notamment alimentaire, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes: (10) la clarification dudit mélange par filtration; (12) la rétention des microorganismes contenus dans le filtrat sur un dispositif de type cartouche de filtration 40 (cf. Figure 3); (14) la Iyse des microorganismes in situ; (16) la récupération des acides nuclélques à partir de la cartouche de filtration 40; et (13) la concentration et la purification des acides nucléiques par chromatographie d'adsorption liquide-solide (Figure 1, voie A). Alternativement, la purification et la concentration des acides nucléiques sont réalisées, non pas par chromatographie, mais par dialyse et filtration. En ce cas, ledit procédé comprend, outre les étapes 10, 12 et 14 sus-citées (représentant le tronc commun aux voies A et B; cf. Figure 1), au moins les étapes suivantes: (20) la purification des acides nuclélques par dialyse in situ; (16) la récupération des acides nuclélques à partir de la cartouche 40; et (22) la concentration des acides nacléiques (Figure 1, voie B). Il est fait référence, au niveau des étapes 12, 14 et 20 à un " dispositif de type cartouche de filtration " 40 (Figure 3). L'on entend par une telle désignation, ainsi que par les termes et expressions équivalents " cartouche ", " cartouc:he d'extraction " et " cartouche de filtration ", un système comprenant un filtre de rétention 42 inséré entre deux demi- coquilles 44 en polymère, moulées et soudées à leur périphérie, tel que représenté sur la Figure 3, A et B (cas o le procédé d'extraction est effectué selon la voie A de la Figure 1), ou alternativement, un filtre de rétention 42 inséré entre deux membranes de dialyse 46, tel qu'illustré par la Figure 3, C et D (cas de mise en _uvre de la voie B de la Figure 1). Ledit système présente des spécificités originales du fait des caractéristiques des filtres le composant. En effet, comme le montre la description détaillée de l' invention ci-a près, la sélection des filtres est u n élément essentiel d'obtention du résultat escompté. Une description de la cartouche de filtration 40 objet de la présente invention est fournie infra. Au sens de la présente invention, I'" extraction " des acides nucléiques comprend à la fois l'isolement desdits acides nucleiques de leur environnement blologique naturel, leur purification et leur concentration. Le degré de pureté et la concentration des acides nucléiques extraits à l'aide du procédé selon i'invention sont tels que lesdits acides nuclélques peuvent faire l'objet d'une détection par des méthodes aussi sensibles que la PCR et ce, directement et sans n'avoir à subir aucun traitement supplémentaire d'élimination des contaminants résiduels susceptibles d'inhiber ou altérer la spécificité et la sensibilité desdites méthodes, et notamment des réactions de PCR. Les " acides nucléiques " comprennent, conformément à l'acception usuelle, les ADN et les ARN. Il est évident que ledit procédé peut être utilisé aussi bien dans le cadre de l'extraction des seuis ADN, moyennant I'addition de RNAses une étape que l'homme du métier saura choisir sans difficultés, que des seuis ARN, grâce à l'addition de DNAses et d'antiRNAses, que des ADN et ARN. Par " acides nucléiques d'intérêt ", procédure d'analyse qualitative eVou quantitative subséquente. L'on entend ici par solvant généré par l'application d'un gradient de pression. A cet égard, le passage à travers le tamis constitué par la membrane poreuse permet de séparer deux liquides, le perméat ou filtrat qui est passé à travers les pores de ladite membrane, et le rétentat qui est enrichi par rapport au liquide initial en espèces de diamètre moyen supérieur à celui des pores. Parmi les techniques de filtration, il y a lieu de distinguer notamment I'ultrafiltration et la microfiltration. L'ultrafiltration utilise des membranes microporeuses dont le diamètre des pores est généralement compris entre 1 et 100 nm. De telles membranes laissent passer les petites molécules (eau, sels) et retiennent les molécules de masse molaire élevoe (polymères, protéines, colioides). Nonobstant l'intervalle relatif au diamètre des pores indiqué supra, il est d'usage d'utiliser, pour caractériser la membrane dans le domaine de l'ultrafiltration, la notion de seuil de coupure plutôt que celle de taille des pores. En effet, le seuil de coupure est défini comme la masse, exprimée en daltons, de la molécule retenue à 90 voire 95 % par la membrane en 1 5 question. Quant à la microfiltration, elle consiste en un procédé de séparation solide-liquide mettant en _uvre des membranes dont le diamètre moyen des pores est compris entre 0,1 et 10 m environ. Ce procédé permet donc de retenir les particules en suspension. Les procédés de filtration peuvent étre mis en _uvre selon différents modes et configurations, le type d'écoulement et la géométrie du dispositif hébergeant la membrane ayant un effet déterminant sur le rendement de la séparation. Des exemples de modes et configurations possibles sont donnés ci-après à titre indicatif. En filtration frontale, le liquide contenant les espèces à séparer est amené perpendiculairement à la membrane tandis qu'en mode tangentiel, la membrane poreuse est balayée tangentiellement par ledit liquide. La configuration plane facilite les opérations de montage/démontage et est utilisable avec des fluides visqueux. Cependant, le risque d'émergence de phénomènes limitants tels que définis infra, dont en particulier le colmatage, doit être considéré lors de la mise en _uvre du procédé de filtration en configuration plane. La configuration en spirale consiste en une membrane plane enroulée sur elle-même. Le filtrat est alors collecté au niveau de la lumière centrale. Cette configuration est avantageuse du point de vue de sa compacité, mais rend le nettoyage de la membrane ardu et le démontage du système de filtration impossible. De plus, elle génère des phénomènes de colmatage non négligeables. Selon la configuration tubulaire, la membrane tapisse l'intérieur d'une matrice cylindrique en acier poreux ou en fibre de verre. L'alimentation en solution à filtrer se fait par l'intérieur de la matrice, ladite solution traversant ensuite la membrane sous l'effet de la pression et le filtrat étant alors récupéré à l'extérieur de la matrice. Ce système présente I'avantage d'un nettoyage aisé par simple inversion du flux de filtration mais exige des volumes d'installations importants. Le choix des conditions opératoires du procédé de filtration est généralement régi par le souci de réduire les phénomènes limitants, parmi lesquels l'encrassemer,t de la membrane, ou colmatage, et la polarisation de concentration. Le colmatage consiste en des phénomènes physiques, chimiques et biologiques qui se produisent à l'interface membrane-solution. Il se caractérise par une modification des propriétés filtrantes de la membrane lors de son utilisation du fait notamment de phénomènes de dépôt et/ou d'adsorption provoquant une accumulation de matière dans les pores, puis à la surface de ladite membrane. Le colmatage a pour conséquence immédiate l'obstruction des pores, ce qui entrane des variations à la fois de perméabilité et de sélectivité dont l'impact sur l'efficacité de la séparation s'avère attentatoire et parfois dramatique. Les membranes utilisées ayant ia propriété d'effectuer des séparations à l'échelle moléculaire ou particulaire, I'accumulation des espèces (molécules ou particules), progressivement ralenties puis arrêtées à la surface desdites rnembranes, est un phénomène inéluctable, inhérent aux procédés de filtration. Led it phénomène, appelé polarisation de concentration, génère un flux de diffusion de la membrane vers le c_ur de la solution à traiter, c'est-à-dire en direction opposée à celle du flux de filtration que l'expérimentateur souhaite imposer à ladite solution. La polarisation de concentration induit en conséquence une diminution du flux de filtration, une variation de sélectivité, le dépôt lié à l'accumulation jouant éventuellement le rôle de " seconde membrane ", et un colmatage des pores de la membrane du fait de précipitations ou gélifications superficielles, les espèces accumulées formant des réseaux d'aspect quasi-solide. Au cours de l'étape 10 du procédé d'extraction selon 1'invention, le matériel de départ, à savoir le mélange complexe, est filtré afin de retenir les particules dont le diamètre moyen est supérieur à environ 12 um, et de préférence supérieur à environ 8 m. L'on entend par " membrane " ou " filtre " au sens de la présente invention, tout dispositif conforme à la définition de " membrane permsélective " telle qu'énoncoe supra. Le procédé de filtration mis en _uvre dans l'étape 10 est de type microfiltration frontale, ladite microfiltration étant réalisée en mode plan, sous vide. Les paramètres de mise en _uvre de cette étape de microfiltration ont été dictés par le double objectif à atteindre, à savoir d'une part discriminer par la taille les débris contenus dans le mélange complexe et comprenant éventuellement des cellules eucaryotes, qu'il convient d'éliminer, et les cellules procaryotes, pour lesquelles le niveau de perte toléré doit être minimal, et d'autre part éviter tout phénomène limitant tei que le colmatage et la polarisation de concentration. A cette fin, I'étape 10 est réalisoe à 1'aide d'un filtre constitué d'un matériau adapté au traitement des liquides visqueux fortement chargés en particules, tels le polypropylène et le nitrate de cellulose, ledit filtre étant à usage unique afin c!'éviter tout risque de contamination entre les différents échantillons suscep';bles d'être traités simuitanément. Le diamètre moyen des pores dudit filtre est compris entre 5 et 12,um, et de préférence sensiblement égal à 8,um. L'étape 12 du procédé d'extraction objet de la présente invention consiste en une microfiltration réalisée en mode plan, tangentiel, sous vide. Le filtre de rétention 42 utilisé dans cette étape, incorporé dans la cartouche de filtration 40, a été choisi afin de séparer sélectivement les espèces contenues dans le filtrat issu de l'étape 10 et d'enrichir en lO microorganismes, tout en laissant passer autant de débris et espèces indésirables que possible. Les critères guidant le choix du filtre, à savoir un pourcentage de perte des microorganismes dans le filtrat minimal et une absence de phénomènes susceptibles de limiter l'efficacité de la filtration, ont conduit les inventeurs à sélectionner un filtre en nitrate de cellulose pour l'uniformité de structure de ses pores ainsi que son haut pouvoir d'adsorption non spécifique. Le filtre 42 ainsi choisi présente un diamètre moyen des pores situé entre 0,22 et 0,55 um, avec une valeur préférée de l'ordre de 0,45 m. L'étape 14 du procédé d'extraction selon l'invention est relative à la Iyse chimique et/ou mécanique des microorganismes contenus dans le rétentat issu de l'étape 12 dudit procédé. Comme indiqué précédemment, cette étape est réalisée in sit, c'est-à-dire au niveau même de la cartouche de filtration 40. L'objectif recherché par les inventeurs était de mettre au point une procédure de Iyse à la fois: (i) efficace; (ii) adaptée à la biodiversité des mélanges complexes de départ, comprenant éventuellement des bactéries à Gram positif et des spores dont la Iyse est. si l'on s'en tient aux méthodes classiques, longue et difficile; et enfin (iii) adaptable à l'automatisation du procédé global. Par Iyse chimique, I'on entend l'action sur les cellules procaryotes d'un détergent, ledit détergent étant contenu par exemple dans un tampon de Iyse comprenant notamment: - du 1ris-HCI (pH entre environ 7,0 et 9,0, de préférence égal à environ 8,0; et concentration entre environ 25 et 400 mM, de préférence égale à environ 100 mM); - de l'EDTA (pH entre environ 7,0 et 9,0, de préférence égal à envi,on 8,0; et concentration entre environ 10 et 100 mM, de préférence égale à environ 40 mM); - du NaCI (de 50 à 800 mM environ, de préférence environ mM); - du SDS (entre 0,5 et 8 % environ, de préférence environ 2 %); les quatre composants ci-dessus formant un tampon appelé TENS (Kuske et al. 1998. Appl. Environ. Microbiol. 64: 2463-2472); et - du Chelex-100 (entre 3 et 60 % environ, de préférence environ 15 %). Ce traitement chimique est administré à chaud, I'expression " à chaud " couvrant, au sens de la présente invention, des températures comprises entre 60 et 100 C, et de préférence avoisinant 70 C. Le traitement mécanique, effectué alternativement ou subséquemment à laIyse chimique, consiste en l'ultrasonication des cellules procaryotes eVou des résidus issus de la Iyse chimique, fixés sur le filtre de rétention 42, ladite ultrasonication étant effectuée dans les mêmes conditions de tampon et température que la Iyse chimique. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, I'étape 14 du procédé d'extraction comprend un traitement chimique suivi d'un traitement mécanique, lesdits traitements étant tels que décrits supra. Des agents chaotropiques hautement dénaturants peuvent éventuellement être ajoutés au tampon de Iyse, afin d'inhiber les activités DNAses et RNAses susceptibles de réd u ire le rendement d 'extraction des acides nucléiques. Les agents chaotropiques propres à une utilisation dans le cadre du procédé selon l'invention comprennent, sans s'y limiter, le thiocyanate de guanidium, le chlorure de guanidium, I'urée, I'acide perchlorique, I'acide trichloroacétique, le thiocyanate de sodium, I'iodure de sodium, I'isothiocyanate de guanidium et le bromure d'hexadécyl triméthyl ammonium (CTAB). Selon un mode de mise en _uvre du procédé d'extraction objet de la présente invention (Figure 1, voie A), au cours de l'étape 16, la solution contenant les acides nucléiques d'intérêt est récupérée par aspiration à partir de la cartouche 40. Avantageusement, au moins un lavage de ladite cartouche 40 est effectué avec du tampon TE 1X, ceci afin de minimiser les pertes e n acid es n u cléiq u es. Ensuite, I'étape 18 vise à concentrer et purifier les acides nucléiques sur une colonne de silice. Il est ici fait appel à la chromatographie d'adsorption liquide-solide, mode de séparation basé sur la répartition des solutés entre l'adsorbant fixe et la phase liquide mobile. En l'occurrence, la silice est un adsorbant dipolaire. La fixation par adsorption est due à l'établissement de liaisons secondaires de surface, ou ilaisons dipôle-ion, entre l'adsorbant et la molécule adsorbée. L'étape 18 se décompose alors en au moins quatre sous-étapes: 181) la dilution de l'extrait d'acides nucléiques, notamment en présence d'éthanol absolu, ceci afin d'optimiser la liaison desUits acides .. . nucleques a la slce; 182) le dépôt du mélange sur une colonne de silice; 183) un ou plusieurs lavages de ladite colonne, suivis de son séchage; et 184) I'élution des acides nucléiques retenus sur la colonne de silice. Lors de la sous-étape 182, les acides nuclélques sont adsorbés sur la silice en présence de fortes concentrations de sels chaotropiques, lesquels éliminent l'eau des molécules hydratées du soluté. Les polysaccharides, ainsi que les protéines ne s'adsorbent pas et sont éliminés au cours de la sous-étape 183. Dans le cadre de la sous-étape 184, I'élution des acides nucléiques purifiés est effectuee en conditions de faible salinité. De manière préférée, les sous-étapes 181 à 184 sont effectuées sous vide afin d'éviter tout recours à d'éventuelles centrifugations, notamment pour éluer le tampon de lavage ainsi que la solution d'acides nucléiques. Selon un au.re mode de mise en _uvre du procédé d'extraction lO conforme à l'invention (Figure 1, voie B), les produits issus de la Iyse des cellules (étape 14) sont soumis à une dialyse in situ, au moyen des membranes de d;aiyse 46 contenues dans la cartouche d'extraction 40 (Figure 3, C et D). Cette étape de dialyse correspond à l'étape 20 représentée sur la Figure 1 (voie B). La dialyse est un processus connu de l'homme du métier, consistant en un transfert de matière passif qui s'établit spontanément sous l'influence d'une différence de potentiels chimiques entre les solutions situées de part et d'autre de la membrane. S'agissant de l'extraction des acides nuclélques à partir de microorganismes, il convient d'éliminer les petites molécules, dont la masse est inférieure à un seuil compris entre 30 et 90 kDa, et de préférence d'environ 60 kDa, iesdites molécules étant susceptibles d'inhiber ou contaminer les réactions subséquentes de détection et d'identification, notamment les réactions de PCR. La dialyse selon l'étape 20 est réalisée en tampon TE 1X (Tris-HCI mM pH 8,0 et EDTA 1 mM pH 8,0), à une température d'au moins C, I'élévation de température se substituant à l'agitation mécanique convention nelle, en ce qu'elle occasion ne u ne excitation des molécu les et une turbulence au sein de la solution. A cet égard, la dialyse est effectuée à une température comprise entre 45 et 65 C, et de préférence à 56 C. 1; Les membranes de dialyse 46 utilisées doivent satisfaire aux critères suivants: (i) offrir une résistance suffisante aux variations de température, et notamment à une température élevée telle que requise lors de l'étape de Iyse des cellules (étape 14); (ii) conserver leur intégrité malgré l'application éventuelle d'ultrasons lors de ladite étape de Iyse; (iii) présenter des seuils de coupure relativement élevés afin d'enrichir et de purifier de manière optimale le rétentat contenant les acides nucléiques d'intérêt; et (iv) ne pas présenter une affinité trop forte vis-à-vis desdits acides nucléiques ou trop faible à l'égard des protéines, telle que la récupération des acides nucléiques ne serait pas totale, une partie non négligeable restant fixée aux membranes, ou s'accompagnerait de celle d'espèces non désirées, les protéines étant facilement relarguées par les membranes. Pour ce faire, les membranes de dialyse 46 sont par exemple constituées de cellulose régénérée, et présentent un seuil de coupure compris entre 50 et 70 kDa, et de préférence 60 kDa. Selon ce mode de mise en _uvre, I'étape 22 du procédé d'extraction a pour but de générer in fine une solution d'acides nucléiques aussi pure et concentrée que possible, afin d'assurer le succès de la détection des microorganismes présents dans le mélange complexe initial, lesdits acides nucléiques servant de cibles pour la mise en _uvre de méthodes analytiques fines telles que la PCR quantitative. Pour répondre à cet objectif, la solution d'acides nuclélques dialysée, issue de l'étape 20, est récupérée par aspiration à partir de la cartouche d'extraction 40 au cours de l'étape 16 du procédé objet de I'invention (Figure 1, voie B). Avantageusement, au moins un lavage de la cartouche 40 est effectué avec du tampon TE 1X. Selon un premier mode de mise en _uvre de l'étape de concentration 22, il est fait appel à la chromatographie d'adsorption liquide- solide. En ce cas, I'extrait d'acides nucléiques issu de l'étape 16 est homogénéisé puis déposé sur une colonne de silice. Après lavages, les acides nucléiques sont élués à l'aide d'un volume minimal, de l'ordre de ,ul, d'un tampon de faible salinité, par exemple du TE 1X. Selon ce mode de mise en _uvre, I'étape 22 est de préférence réalisée sous vide. Alternativement, l'étape 22 consiste en une ultrafiltration tangentielle effectuée sous vide, sur une membrane dont le seuil de coupure est compris entre 40 et 60 kDa, et de préférence d'environ 50 kDa. De manière préférée, ladite membrane est en polyéthersulfone, matériau qui présente un très faible taux d'adsorption vis-à-vis des acides nuclélques. Il peut être avantageux d'introduire une étape supplémentaire 24 entre les étapes 20 et 16 du procédé d'extraction selon la présente invention, ladite étape 24 consistant en une filtration de la solution d'acides nuclélques obtenue après diaiyse (Figure 1, voie B). En l'espèce, la filtration est effectuée au moyen d'une membrane inerte vis-à-vis desdits acides nucléiques, notamment de type polyéthersulfone, présentant un diamètre moyen des pores compris entre 0,025 et 1 um, ceci afin d'éliminer les molécules résiduelles de haut poids moléculaire susceptibles de générer un colmatage lors de la mise en _uvre de l'étape 24 eVou perturber l'analyse ultérieure des acides nucléiques recueillis, en particulier par PCR quantitative. La filtration selon l'étape 24 consiste en une filtration frontale réalisée en mode plan, sous vide. Selon un mode de réalisation préféré, le procédé d'extraction objet de la présente invention comprend des étapes préliminaires additionnelles, ayant pour but de faciliter les manipulations subséquentes du mélange complexe représenté, par exemple, par un échantillon alimentaire tel qu'un produit carné de type viande hachée, ou un produit laitier de type fromage. Lesdites étapes préliminaires consistent à: 26) broyer l'échantillon complexe, notamment alimentaire; et 28) prétraiter enzymatiquement et chimiquement le broyat ainsi obtenu. L' invention concerne également u ne cartouche de filtration 40 utile pour la mise en _uvre des étapes 12 et 14 (Figure 1, voie A), ou 12, 14 et (voie B) du procédé d'extraction des acides nuclélques de microorganismes. s Lorsque l'étape de concentration et purification est effectuée par chromatographie (étape 18), la cartouche 40 comprend un filtre de rétention 42 en nitrate de cellulose, dont le diamètre moyen des pores est de préférence de 0,45 m, inséré entre deux demi-coquilles moulées et soudées 44, lesdites demi-coquilles formant une enceinte 48 (Figure 3, A et B). Des canaux radiaux 50 sont disposés de manière circulaire sur le filtre 42. Un dispositif support d'aiguille 52 et aiguille 54 permet l'entrée et la sortie de produits. Un septum ou une cavité cylindrique de réception d'un disque de matière élastomère à perçage axial de faible diamètre auto obturant 56 assure l'étanchéité de la cartouche 40 au niveau du support l 5 d'aiguille 52. Lorsque l'étape de dialyse 20 est mise en _uvre, la cartouche 40 comprend un support plan de faible épaisseur, à lumière centrale 58, sur les deux faces 60 duquel sont fixées des membranes de dialyse 46 présentant les propriétés sus-citées, lesdites membranes 46 délimitant une enceinte de dialyse (Figure 3, C et D). Un filtre de rétention 42, porté par le support, scinde l'encointe de dialyse en deux compartiments. Des bagues intermédiaires 62 sont disposées au niveau de chaque compartiment, entre la membrane de dialyse 46 et le filtre de rétention 42. L'invention a en outre pour objet un automate d'extraction des acides nuclélques de microorganismes contenus dans un mélange complexe, notamment alimentaire, ledit automate étant utile pour la mise en _uvre du procédé d'extraction selon l'invention. Par la connexion entre deux étapes essentielles. Comme schématisé sur la Figure 2 ci-après, I'automate selon la présente invention comprend au moins trois modules. s Le premier desdits modules (module 80) effectue les étapes 10 et 12 du procédé d'extraction représenté à la Figure 1. Le second module (module 82) met en _uvre alternativement l'étape 14 (voie A), ou les étapes 14, 20, et 16, ou encore les étapes 14, ,24 et 16 dudit procédé (voie B). Le troisième module (module 84) réalise les étapes 16 et 18 (voie A), ou l'étape 22 (voie B). L'invention vise également un dispositif pour l'extraction et la détection et, le cas échéant, la quantification des acides nucléiques de microorganismes contenus dans un mélange complexe, notamment lS alimentaire, ledit dispositif comprenant un automate d'extraction d'acides nucléiques conforme à la présente invention, couplé à un automate d'amplification en chane thermo-dépendante desdits acides nucléiques. Dans un mode de réalisation préféré, l'automate d'amplification en charne thermo-dépendante incorporé dans le dispositif selon l'invention est de type rotatif. Un automate d'amplification en chane thermo-dépendante de séquences d'acides nucléiques utilisable dans le cadre du dispositif selon la présente invention a été décrit dans la demande de brevet US n O9/981070 béneficiant de la priorité de la demande de brevet français n 0010029. Un exemple d'un tel dispositif comprend notamment: (i) une cartouche comportant une pluralité de chambres réactionnelles, contenant des couples d'amorces pour l'amplification de séquences nucléotidiques spécifiques, auxquelles se trouve relié un réservoir d'alimentation en extrait d'acides nuclélques purifiés servant de matrices lors de ladite amplification; (ii) une platine de chauffage dont au moins deux zones distinctes peuvent être portées à au moins deux températures différentes et maintenues constante, chaque température correspondant ainsi à une étape donnée d'un cycle d'amplification, à savoir l'étape de dénaturation, d'hybridation ou d'élongation; (iii) des moyens de déplacement relatif entre la cartouche et la platine, led it déplacement assu rant u ne exposition cyclique des chambres réactionnelles à la température de chacune des zones de la platine, ce qui permet d'enchaner automatiquement les cycles de la réaction d'amplification se déroulant à l'intérieur desdites chambres. La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures suivantes: lO - Fiqure 1: schéma du procédé d'extraction des acides nucléiques. - Fiqure 2: schéma de l'automate d'extraction d'acides nucléiques. Y sont positionnés ies trois modules, à savoir le module 80 effectuant les étapes 10 et 12 du procédé d'extraction, le module 82 effectuant alternativement l'étape 14 (voie A), ou les étapes 14, 20 et 16, ou encore les étapes 14, 20, 24 et 16 (voie B), et le module 84 effectuant les étapes 16 et 18 (voie A), ou l'étape 22 (voie B). - Fiqure 3: schemas de deux prototypes de cartouche de filtration 40. Figure 3A et B: cartouche de filtration 40 lorsque la voie A du procédé d'extraction est mise en _uvre. Figure 3A: schéma de la cartouche 40. Figure 3B: schéma du système d'entrée et sortie des produits comprenant le support de l'aiguille 52 et l'aiguille 54. Figure 3C: vue éclatée de la cartouche 40 comprenant les membranes de dialyse 46 (voie B du procédé d'extraction). Figure 3D: schéma de la cartouche 40 comprenant les membranes de dialyse 46, montée et prête à être utilisée. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants, donnés à titre purement illustratif. ll est entendu que la présente invention ne se limite en aucune façon auxdits exemples. EXEMPLES Le procédé d'extraction d'acides nucléiques objet de l' invention a été testé sur deux mélanges alimentaires complexes, à savoir un produit carné de type steak haché et un fromage à pate molle commercialisé sous la marque Babybel. Ces mélanges complexes ont été inoculés par des quantités connues de quatre microorganismes différents (Staphylococcus aureus, Listeria monocytogens, Escherichia coli et Salmonella ser. Enteritidis), lesdits microorganisnnes étant choisis afin de vérifier l'efficacité d'extraction par le procédé selon l' invention des acides nucléiques de bactéries à Gram positif et à Gram négatif. I - Broyage de l'échantillon alimentaire Conformément aux normes éditées et diffusées par l'Association Française de Normalisation (AFNOR) et la Fédération Internationale de Laiterie (FIL) actuellement en vigueur, I'échantillon alimentaire a été broyé à l'aide d'un stomacher afin de préparer une suspension-mère. La prise d'essai de l'échantillon alimentaire, de 25 g, a été suspendue au 1/1 Oème dans un diluant, conformément aux normes NFV 08-010 (mars 1996, Editions AFNOR, Paris, France), NF V 04-501 (avril 1998, Editions AFNOR) et FIL 122C: 1996 (décembre 1996, Editions FIL, Bruxalles, Belgique). Selon lesUites normes, la composition du diluant est fonction du type d'aliment considéré. Dans la présente espèce, le steak haché et le fromage ont respectivement été suspend us dans de l'eau peptonnée tamponnée et du citrate de sodium à 20 g/l. Les suspensions ainsi obtenues ont été broyées pendant 3 minutes. Des aliquotes de 10 ml de broyat, correspondant à 1 g d'aliment de départ, ont été prélevées aux fins de l'extraction des acides nucleiques. Il - Prétraitement enzymatique et chimique de l'échantillon alimentaire Cette étape permet d'hydrolyser les globules de matière grasse et les micelles protéiques, afin de s'affranchir des phénomènes tels le colmatage susceptibles d'abaisser le rendement des étapes ultérieures de filtration. Les compositions des solutions de prétraitement ont été déterminées de manière em pi rique, à la lu mière d'u ne étude bibl iograph ique (Driehu is et Teernstra 1992. Neth. Milk Dairy J. 46: 209-215; Starbuck et al. 1992. Lett. Appl. Microblol. 15: 248-252; Yang et Lundahl 1994. Anal. Biochem. 218: 210-221; Rijpens et a/. 1996. Appl. Environ. Microbiol. 62: 1683 1688). Les adjuvants ajoutés à chaque aliquote de 10 ml étaient composés de 0,2 g de trypsine pour le broyat de steak haché, et 0,2 g de pancréatine, mM d'EDTA, 5 % de Triton et 4 % d'acide cholique pour le broyat de fromage. lS Les échantillons ont été incubés à 25 C pendant 1 heure, cette étape d'incubation ne permettant ni une croissance bactérienne significative, ni une Iyse " prématurée " des cellules procaryotes, deux phénomènes susceptibies de nuire au rendement de la procédure. lil - Microfiltration du broyat alimentaire (étape 10) 111-1- Mise au point du protocole Eu égard aux impératifs relatifs à l'évitement du colmatage, il a été choisi des filtres en polypropylène dont le diamètre moyen des pores est de 8 m. La microfiltration a été réalisée en mode plan, sous vide. Chaque 10 ml de broyat alimentaire prétraité a été filtré. Selon qu'il s'agissait de steak haché ou de fromage, le dispositif de microfiltration a été lavé avec 15 ml de tampon TE 1X (Tris-HCI 10 mM pH 8,0 et EDTA 1 mM pH 8,0) ou 10 ml de Triton 0,5 % (dilué dans de l'eau distillée stérile) préchauffé à 50 C, respectivement. Cette étape de lavage vise à limiter la perte de matériel, en particulier de bactéries d'intérêt, et diluer les échantillons de manière à éviter les colmatages, notamment lors de l'étape suivante de rétention sur filtre. A l'issue de l'étape de microfiltration, 20 et 25 ml de filtrat contenant les bactéries cibles ont été récupérés pour chaque 10 ml de broyat initial de fromage et de steak haché, respectivement. 111-2- Conditions de mise en _uvre par l'automate Cette étape est réalisée au sein du module 80 de 1'automate, à 1'aide d'un entonnoir équipé d'un filtre, I'ensemble constituant un consommable à usage unique (Figure 2. La microfiltration est effectuée en mode plan. Un système de distribution de liquides (broyat alimentaire d'une part et tampon de lavage, TE 1X ou Triton 0,5 % préchauffé à 50 C, d'autre part) est assuré par une pompe péristaltique. IV- Rétention des microorganismes (étape 12) IV-1- Mise au point du protocole Après nombre de tests de filtres de rétention eu égard aux impératifs relatifs à l'évitement du colmatage, les meilleurs résultats ont été observés avec des filtres en nitrate de cellulose dont le diamètre moyen des pores est de 0,45,um. Le filtrat de 40 ml a été filtré sur le filtre de rétention 42 ainsi sélectionné. Le filtrat a été écarté et le filtre de rétention 42 placé dans un tube en verre. IV-2- Conditions de mise en _uvre par l'automate Le filtrat de 40 ml est directement amené dans la cartouche 40 insérée sous l'entonncir, à l'entrée du module 80 de 1'automate (Figure 2) . Un bac de déchet est prévu, permettant d'évacuer le filtrat. Toutes les aiguilles de distribution des liquides 54 sont à usage unique. L'alimentation en liquide (filtrat) est assurée par la pompe péristaltique du module 80, également utilisée aux fins de la microfiltration selon l'étape précédente. V- Lyse des microcrganismes cibles (étape 14) V-1Mise au point du protocole A l' issue de l'étape précédente, le filtre de rétention 42 a été déposé dans un tube en verre, ce matériau étant totalement perméable aux ultrasons. Le rétentat fixe au filtre 42 a été suspendu dans 1,5 ml de tampon de Iyse TENS 2X - Chelex- 100 15 % (Tris-HCI 100 mM pH 8,0; EDTA 40 mM pH 8,0; NaCI 200 ml\A, SDS 2 % et Chelex-100 15 %). * Le tube en verre contenant le filtre de rétention 42 et le tampon de Iyse a été incubé au bain-marie pendant 20 min à 70 C. Le tube a ensuite été placé dans un bain à sonication de 120 W. La sonication a été effectuée à 70 C pendant 40 min et à 40 % de la puissance maximale du sonicateur, soit une puissance comprise entre 40 et 60 W. et de préférence 50 W. V-2- Conditions de mise en _uvre par l'automate La cartouche positionnée au niveau du module 80 de l'automate est remplie par 1 ml de tampon de Iyse TENS 2X - Chelex-100 15 % à l'aide de la pompe péristaltique dudit module 80, ces 2 ml correspondant au volume interne de la cartouche 40. La cartouche 40 est ensuite placée par l'expérimentateur dans un bac à ultrasons au niveau du module 82 de l'automate (Figure 2). Pendant le traitement chimique d'une durée de 20 min. le bac à ultrasons sert de bain-marie ajusté à 70 C. Afin de compléter la Iyse, les ultrasons sont ensuite activés pendant min et à une puissance de 50 W. le bain-marie restant réglé à une température de 70 C. Pour éviter tout phénomène de dialyse éventuel pendant l'étape de Iyse mécanique, le bac à ultrasons est rempli de tampon de Iyse TENS 2X - Chelex-100 15 %. Vl - Concentration et purification des acides nucléiques par chromatographie d'adsorption liquide-solide (voie A; étapes 16 et 18) Vl1- Mise au poin+ du Protocole Les acides nuclélques ont été purifiés et concentrés à l'aide d'une colonne de silice, teile que disponible dans le système " Nucieospin Plant L " (Macherey-Nagel, Duren, Allemagne). Une colonne de silice a été placée sur une chambre à vide lS permettant de traiter plusieurs échantillons simultanément. Ladite chambre était constituée d'une cuve en verre munie d'un manomètre et d'un couvercle en polypropylène, ledit couvercle pouvant recevoir, sur sa face externe, les colonnes et, sur sa face interne, les aiguilles à usage unique assurant le transfert de liquide. Le cas échéant, le vide de chaque colonne pouvait être réglé à l'aide d'un robinet amovible. Dans la cuve en verre, se trouvait un support permettant de placer des tubes en-dessous de chaque aiguille afin de récupérer les divers liquides (tampon de liaison et éthanol, solutions de lavage, éluat). Les acides nuclélques (1 volume) ont été mélangés avec 1 volume de tampon de liaison (tampon C4 " du système commercialisé sus-cité) et 1 volume d'éthanol absolu. Ce mélange a été agité vigoureusement pendant 30 secondes puis déposé sur une colonne telle que décrite ci dessus. La colonne dé silice a d'abord été lavée avec 1 ml de tampon de lavage " CQW ", puis avec 2 ml de tampon " C5 ", lesdits tampons étant fournis dans le système " Nucleospin Plant L ". Le tube placé dans la cuve en verre et contenant les déchets issus des étapes de lavage a été vidé. Le vide a ensuite été appliqué pendant 12 minutes aux fins du séchage de la colonne. ul de tampon " CE " préchauffés à 70 C ont incubé sur la colonne pendant 5 minutes. Après élution sous vide dans un tube neuf, I'étape précédente a été répétée une fois. Les acides nuclélques ont alors été élués sous vide pendant 5 minutes. Le volume d'acides nucléiques ainsi purifiés se situait entre 15 et 250,ul, et de préférence 200,ul. Vl-2- Conditions de mise en ceuvre par l'automate Le module 84 dévolu à la purification et la concentration des acides nucléiques permet ue traiter simultanément quatre échantillons indépendants. Après chargement manuel des quatre cartouches 40 issues du module 82, le cycle de purification et concentration (étape 18 de la voie A du procédé représenté sur la Figure 1) se déroule de manière entièrement automatique. Le Iysat cellulaire contenu dans la cartouche (1 ml) est retiré de ladite cartouche 40 par aspiration (voie A; étape 16). La cartouche 40 est ensuite lavée avec 1 ml de TE 1X afin de limiter la perte en acides nucléiques d'intérêt. La solution d'acides nucléiques (2 ml) est alors transférée dans un nouveau tube et homogénéisée avec un volume de tampon de liaison [" C4 " (système " Nucleospin Plant L ")] et un volume d'éthanol absolu. Ce mélange est prélevé puis déposé sur une colonne de silice, colonne préalablement installée par l'opérateur. Un système d'aspiration permet de filtrer le mélange. La colonne est ensuite lavoe à l'aide des tampons " CQW " puis " C5 " du système sus-cité. Les acides nucléiques sont alors élués dans du tampon " CE " (système " Nucleospin Plant L >). Dans le module 84, tous les accessoires, tels les tubes de mélange, seringues, embouts de seringue et pièges à échantillon, sont à usage unique, évitant ainsi tout risque de contaminations inter-échantillons. Vll - Purification des acides nuclélques par dialyse (voie B; étape 20) L'étape 2O, ainsi que les étapes subséquentes de récupération 16 et concentration des acides nucléiques d'intérêt 22 (voie B; Figure 1), représente une alternative à la concentration et la purification desdits acides nucléiques par chromatographie d'adsorption liquide-solide (voie A; étapes 16 et 18; Figure 1). Vl1-1- Mise au point du protocole Le Iysat a été récupéré et le tube en verre contenant le filtre de rétention 42 rincé avec 1 ml de tampon TE 1X. Le Iysat a été placé dans un boudin de dialyse en cellulose régénérée, présentant un seuil de coupure de 60 kDa. Le boudin de dialyse a été introduit dans un flacon stérile contenant 250 ml de tampon TE 1X, soit un volume de tampon de dialyse 100 fois supérieur au volume de Iysat, ceci afin de faciliter le passage des impuretés contenues dans ledit Iysat vers le tampon de dialyse. Le flacon a été incubé dans un bain-marie à 40 C pendant 2 heures, sous une agitation de 40 rpm. Le tampon de dialyse a alors été changé et le flacon réincubé dans les mêmes conditions pendant 14 heures afin d'éliminer les impuretés résid uelles. V11-2- Conditions de mise en _uvre Par l'automate Selon le mode de mise en _uvre du procédé d'extraction à présent considéré (voie B), la Iyse cellulaire (étape 14) et la dialyse du Iysat ainsi obtenu (étape 20) sont effectuées au niveau du module 82 de 1'extracteur, tandis que la phase finale de concentration des acides nucléiques (étape 22) est réalisée au sein du module 84 dudit extracteur. Le bain à ultrasons contenant le tampon de Iyse TENS 2X- Chelex- 15 %, dans lequel est immergée la cartouche 40, est vidé par aspiration et rempli avec du tampon de dialyse TE 1X. La dialyse est effectuée à 56 C sans agitation. Le tampon de dialyse est renouvelé régulièrement afin d'optimiser la durée de cette étape, réduite à seulement 6 heures au sein de 1'automate au lieu des 16 heures requises en laboratoire. Les membranes de dialyse 46 utilisées sont en cellulose régénérée et présentent un seuil de coupure compris entre 50 et 70 kDa, et de préférence 60 kDa. Vlil - Récupération et concentration des acides nucléiques d'intérêt (voie B; étapes 16 et 22) Vill-1- Mise au point du protocole Les acides nucléiques dialysés ont été filtrés sous pression sur des unités d'ultrafiltration tangentielle à usage unique du type Vivaspin 20 (Sartorius, Miecourt, Suisse), composées d'une membrane en polyéthersulfone dont le seuil de coupure est de 50 kDa. Les acides nucléiques retenus par les unités d'ultrafiltration ont ensuite été resuspendus dans 50,ul de tampon TE 1X. V111-2- Conditions de mise en _uvre par l'automate Les 2 ml de solution d'acides nucléiques dialysés contenus dans la cartouche 40 sont retirés de ladite cartouche 40 par aspiration (voie B; étape 16). La cartouche 40 est ensuite lavée avec 2 ml de tampon TE 1X afin de limiter la perte en acides nuclélques d'intérêt. La solution d'acides nuclélques, d'un volume de 4 ml, est transférce au niveau du module 84 de l'automate (Figure 2). S Les acides nucléiques y sont concentrés sur une membrane d' u ltrafiltration en polysthersulfone, dont le seu il de coupu re est de 50 kDa. La concentration est effectuée par filtration tangentielle sous pression. Un volume de 50,ul de TE 1X est ensuite déposé sur la membrane. Des pipetages répétés permettent de resuspendre les acides nuclélques, lesquels sont alors prélevés à l'aide d'une micropipette par l'opérateur. REVENDICATIONS 1. Procédé d'extraction des acides nuclélques de microorganismes contenus dans un mélange complexe, notamment alimentaire, comprenant au moins les étapes suivantes: (10) la clarification dudit mélange par filtration; (12) la rétention des microorganismes contenus dans le filtrat sur un dispositif de type cartouche de filtration (40); (14) la Iyse des microorganismes in situ; (16) la récupération des acides nucléiques à partir de la cartouche de filtration (40); et (18) la concentration et la purification des acides nuclélques par chromatographie d'adsorption liquide-solide. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la cartouche (40) utilisée dans les etapes (12) et (14) comprend un filtre de rétention (42) . 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape (18) est réalisée sur une colonne de silice. 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel l'étape (18) comprend au moins les sous-étapes suivantes: (1 81) la dilution de l'extrait d'acides nucléIques; (182) le dépôt du mélange sur une colonne de silice; (183) au moins un lavage suivi du séchage de la colonne; et (184) I'élution des acides nuclélques retenus dans la colonne de silice. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel les sous-étapes (181) à (184) sont réalisées sous vide. 6. Procédé d'extraction des acides nucléiques de microorganismes contenus dans un mélange complexe, notamment alimentaire, comprenant au moins les étapes suivantes: (10) la clarification dudit mélange par filtration; (12) la rétention des microorganismes contenus dans le filtrat sur un dispositif de type cartouche de filtration (40); (14) la Iyse des microorganismes in situ; (20) la purification des acides nuclélques par dialyse in situ; (16) la récupération des acides nucléiques à partir de la cartouche de filtration (40j; et (22) la concentration des acides nuclélques. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel la cartouche (40) utilisée dans les étapes (12), (14) et (20) comprend un filtre de rétention (42) inséré entre deux membranes de dialyse (46). 8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, dans lequel l'étape (20) consiste en une dialyse, au moyen des membranes de dialyse (46) contenues dans la cartouche (40), lesdites membranes présentant un seuil de couqure compris entre 50 et 70 kDa, et de préférence sensiblement égal à 60 kDa, et la dialyse étant effectuée à une température située entre 45 et C, et de préférence à 56 C. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, dans lequel une étape supplémentaire (24) est insérée entre les étapes (20) et (16), ladite étape (24) consistant en une filtration de la solution d'acides nucléiques dialysée à l'aide d'une membrane dont le diamètre moyen des pores est compris entre 0,025 et 1 m. 10. Procédé selon la revendication 1 ou 6 dans lequel l'étape (10) consiste en une microfiltration frontale, réalisée au moyen d'un filtre à usage unique, dont le diamètre moyen des pores est compris entre 5 et 12 m, et de préférence sensiblement égal à 8,um. 11. Procédé selon la revendication 1 ou 6, dans lequel l'étape (12) consiste en une microfiltration tangentielle, réalisée à l'aide du filtre de rétention (42) contenu dans la cartouche (40), ledit filtre (42) étant en nitrate de cellulose et présentant un diamètre moyen des pores de 0,22 à 0,55 m, et de préférence 0,45 um. 12. Procédé selon la revendication 1 ou 6, dans lequel l'étape (14) comprend un traitement de Iyse chimique consistant en l'action à chaud, en particulier à 70 C, du détergent contenu dans un tampon de Iyse comprenant: - du Tris-HCI (pH entre environ 7,0 et 9,0, de préférence égal à environ 8,0; et concentration entre environ 25 et 400 mM, de préférence égale à environ 100 mM); - de l'EDTA (pH entre environ 7,0 et 9,0, de préférence égal à environ 8,0; et concentration entre environ 10 et 100 mM, de préférence égale à environ 40 mM); - du NaCI (de 50 à 800 mM environ, de préférence environ mM); - du SDS (entre 0,5 et 8 % environ, de préférence environ 2 %); les quatre composants ci-dessus formant du TENS; et du Chelex-100 (entre 3 et 60 % environ, de préférence environ 15 %). 13. Procédé selon la revendication 1 ou 6, dans lequel l'étape (14) comprend un traitement de Iyse mécanique consistant en I'ultrasonication des microorganismes, effectuce à chaud, en particulier à C, dans un tampon comprenant du TENS et du Chelex-100, de préférence du TENS 2X et du Chelex-100 15 %. 14. Procédé selon la revendication 1 ou 6, dans lequel l'étape (14) comprend le traitement de lyse chimique selon la revendication 12, et le traitement de Iyse mécanique selon la revendication 13. 15. Procédé selon la revendication 1 ou 6, comprenant en outre les étapes préliminaires suivantes: (26) le broyage de l'échantillon complexe, notamment alimentaire; et (28) le prétraitement enzymatique et chimique du broyat obtenu. 16. Cartouche d'extraction (40) des acides nucléiques de microorganismes utile pour la mise en _uvre du procédé selon la revendication 1, ladite cartouche (40) comprenant un filtre de rétention (42) en nitrate de cellulose présentant un diamètre moyen des pores de 0,22 à 0,55 m, et de préférence 0,45,um. 17. Cartouche d'extraction (40) des acides nucléiques de microorganismes utile pour la mise en _uvre du procédé selon la revendication 6, ladite cartouche (40) comprenant: - un filtre de rétention (42) en nitrate de cellulose présentant un diamètre moyen des pores de 0,22 à 0,55,um, et de préférence 0,45,um; et - des membranes de dialyse (46) dont le seuil de coupure est compris entre 50 et 70 kDa, et de préférence sensiblement égal à 60 kDa. 18. Automate d'extraction des acides nucléiques de microorganismes contenus dans un mélange complexe, notamment alimentaire, pour la mise en _uvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14. 19. Automate selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend au moins trois modules (8O, 82, 84), le premier desUits modules effectuant les étapes (10) et (12), le second l'étape (14) et le troisième les étapes (16) et (18) du procédé d'extraction selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 20. Automate selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend au moins trois modules (80, 82, 84), le premier desdits modules effectuant les étapes (10) et (12), le second les étapes (14), (20) et (16), ou les étapes (14), (20), (24) et (16), et le troisième l'étape (22) du procédé d'extraction selon l'une quelconque des revendications 6 à 9. 21. Dispositif pour l'extraction, la détection et, le cas échéant, la quantification des acides nucleiques de microorganismes contenus dans un mélange complexe, notamment alimentaire, comprenant un automate d'extraction d'acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, couplé à un automate d'amplification en chane thermo dépendante desdits acides nucléiques. 22. Dispositif selon la revendication 21, dans lequel l'automate