Brevet FR2844806A1 — publié le 20040326

SYSTEMES D'EXPRESSION DE PROTEINES TOXIQUES, VECTEURS ET PROCÉDÉ DE FABRICATION DE PROTEINES TOXIQUES DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE La présente invention se rapporte à des systèmes d'expression de protéines toxiques, à des vecteurs d'expression comprenant un de ces systèmes, à des cellules procaryotes transformées par ces systèmes, ainsi qu'à un procédé de synthèse d'une protéine toxique utilisant ces systèmes d'expression. Elle permet par exemple la surproduction dans une cellule procaryote, par exemple Escherichia coli (E.coli), de protéines ou peptides hydrophobes toxiques, par exemple la surproduction de domaines transmembranaires de protéines d'enveloppe de virus. Elle trouve de nombreuses applications notamment dans la recherche concernant les mécanismes d'infections virales et dans recherche et la mise au point de nouveaux principes actifs pour lutter contre les infections virales. Dans la description qui suit, les références entre crochets [ ] renvoient à la liste de références annexée. Etat de la technique La détermination de la structure tridimensionnelle (3D) est une étape décisive dans la compréhension structurale et fonctionnelle des protéines. De très grands efforts et moyens ont été, et sont, mis en oeuvre pour parvenir à ce but, et se sont amplifiés avec l'accumulation des données apportées par les programmes de séquençage des génomes [1]. Les deux principales techniques permettant l'établissement de ces structures des protéines sont la diffraction des rayons X, réalisée à partir de protéines cristallisées, et la résonance magnétique nucléaire (RMN) effectuée à partir de protéines en solution. La RMN, bien adaptée à l'étude de protéines de masse moléculaire inférieure à 20 kDa, nécessite cependant, comme la diffraction des RX, la production de grandes quantités de matériel. Elle implique en outre dans la plupart des cas de préparer du matériel enrichi en 15N et/ou 13C. Dans ce contexte, la bactérie est un moyen de production largement utilisé par la communauté scientifique [2]. La surexpression de protéines dans la bactérie ne s'effectue cependant pas sans problèmes. En effet, elle donne lieu à trois cas de figures : - Le premier cas, idéal, est celui où la protéine est surproduite sous une forme correctement repliée dans l'espace lors de sa synthèse in vivo. Ce n'est pas une situation rare, mais elle n'est pas fréquente non plus. Elle concerne essentiellement les protéines solubles et de taille réduite, c'est à dire d'environ 20 à 50 kDa. - Le deuxième cas, le plus courant, est celui où la protéine est surproduite et agrégée sous la forme de corps d'inclusion. Cela concerne les protéines polytopiques et/ou de grande taille. Dans ce cas, la cinétique de repliement de la protéine est nettement plus lente que sa vitesse de biosynthèse. Cela favorise l'exposition au solvant aqueux des régions hydrophobes de la protéine qui sont normalement enfouies au coeur de celle-ci, et génère des interactions non spécifiques qui conduisent à la formation d'agrégats insolubles. Suivant le degré de désordre de ce repliement, les corps d'inclusions peuvent être solubilisés/dépliés dans des conditions non natives, avec de l'urée ou de la guanidine. La protéine solubilisée est ensuite soumise à différents traitements comme la dialyse ou la dilution pour favoriser, dans certains cas avec succès, un repliement 3D natif. - Le troisième cas est celui où l'expression engendre une toxicité d'un degré variable. Celui-ci va de l'absence de produit d'expression si la bactérie parvient à s'adapter, à la mort de celle-ci si le produit est trop toxique. C'est un cas qui se présente assez fréquemment et le plus souvent avec des protéines ou des domaines de protéines membranaires, comme par exemple ceux des protéines d'enveloppe du virus de l'hépatite C [5] ou du virus d'immunodéficience humain [6] . Le problème de toxicité concerne essentiellement l'expression de protéines membranaires, c'est à dire de protéines présentant un domaine hydrophobe. Or ces protéines présentent un intérêt grandissant. Elles sont d'une part relativement nombreuses puisque l'établissement des différents génomes confirme qu'elles représentent environ 30% des protéines potentiellement codées par ces génomes [7]. Elles constituent d'autre part 70% des cibles thérapeutiques et leur altération est à l'origine de nombreuses maladies génétiques [8]. Il est donc essentiel de mettre au point des méthodes facilitant ou permettant l'expression de telles protéines ou de leur partie membranaire. Des efforts ont été faits dans ce sens avec par exemple la mise au point de souches bactériennes, soit tolérant mieux l'expression de protéines membranaires [9, 10], soit ayant une régulation plus stricte du mécanisme d'expression comme dans le cas de la souche E. coli BL21(DE3)pLysS développée par Stratagene. Cependant, ces améliorations ne permettent pas de supprimer le phénomène de toxicité dans tous les cas, en particulier lors de l'expression de peptides hydrophobes correspondant à des ancres membranaires. L'un des enjeux médicaux majeurs actuels concerne le traitement de l'hépatite C. Celle-ci est provoquée par le virus de l'hépatite C (VHC) de la famille des flaviviridae et qui infecte spécifiquement les cellules hépatiques [11]. Ce virus est constitué d'un ARN positif d'environ 9500 bases qui code pour une polyprotéine de 3033 résidus [13], symbolisé sur la figure 1 annexé par le rectangle 1A. Cette polyprotéine est clivée après expression par des protéases endogènes et exogènes pour donner naissance à 10 protéines différentes. Deux d'entre elles, appelées El et E2, sont glycosylées et forment l'enveloppe du virus. Elles possèdent chacune des domaines membranaires appelés TM, en particulier TME1 pour la protéine El et TME2 pour la protéine E2. Les positions de clivage qui les génèrent sont indiquées sur la figure 1 par des flèches avec, mentionné au-dessous, un nombre qui correspond à la position dans la polyprotéine du premier acide aminé de séquence résultant du clivage. Les protéines El et E2 sont symbolisées par un rectangle. La partie blanche de chaque rectangle correspond à l'ectodomaine (ed) et la partie grisée à la région transmembranaire (TM). La séquence primaire des TM est indiquée dans le bas de la figure en code à une lettre, avec des nombres correspondant à la position des acides aminés dans la polyprotéine situés aux extrémités de ces domaines. Les étoiles indiquent les acides aminés hydrophobes. Ces domaines membranaires ou régions membranaires du virus ont des propriétés d'association particulières qui conditionnent la structuration de l'enveloppe du virus [12]. A ce titre, ils constituent des cibles thérapeutiques potentielles. La compréhension du mécanisme d'association du virus nécessite des études de la structure 3D de ces domaines notamment par les techniques précitées, ce qui implique de produire ces peptides en quantité abondante, et en plus de préférence par voie biosynthétique pour permettre un marquage isotopique 15N et/ou 13C. Les différents essais d'expression de El de l'art antérieur, notamment dans E. coli [14] [5] ou dans des cellules d'insecte sf9 infectées par baculovirus [15], n'ont pas permis de surproduire cette protéine El, notamment du fait de la toxicité induite par son expression, y compris dans les souches E. coli BL21(DE3)pLysS dites résistantes décrites cidessus. Il n'y a pas eu d'essai de surexpression de la protéine E2 dans la bactérie. Ces problèmes de toxicité sont essentiellement dus à la région C-terminale des deux protéines, riche en acides aminés hydrophobes qui forment des domaines transmembranaires assurant l'ancrage à la membrane du réticulum endoplasmique. Il existe donc un réel besoin pour un système d'expression de protéines toxiques qui ne présente pas les inconvénients, limitations, défauts et désavantages des techniques de l'art antérieur. En outre, il existe un réel besoin d'un vecteur d'expression comprenant un tel système d'expression de protéines toxiques permettant de mettre en #uvre un procédé de fabrication de protéines toxiques qui ne présente pas les inconvénients, limitations, défauts et désavantages des techniques de l'art antérieur. EXPOSÉ DE L'INVENTION Le but de la présente invention est précisément de fournir un système d'expression d'une protéine toxique, qui réponde, entre autres, aux besoins indiqués ci-dessus. Ce but, et d'autres encore, sont atteints, conformément à l'invention, par un système d'expression caractérisé en ce qu'il comprend successivement, dans le sens 5'-3', une séquence nucléotidique codant pour le dipeptide Asp-Pro, appelée ci-dessous séquence dp, et une séquence nucléotidique (pt) codant pour une protéine toxique (Pt). Ce système sera identifié cidessous par : dp-pt. Selon un mode particulièrement préféré de la présente invention, le système d'expression comprend en outre, en amont de la séquence dp, une séquence nucléotidique (ps) codant pour une protéine soluble (Ps). Cette protéine soluble peut être par exemple la glutathion S-transférase (GST) ou la thiorédoxine (TrX) ou une autre protéine soluble équivalente. Ce système d'expression selon l'invention sera identifié cidessous par : ps-dp-pt. Le système d'expression dp-pt de la présente invention, qui comprend une séquence codant pour AspPro (DP en code à une lettre) placée en amont de la séquence nucléotidique de la protéine toxique, permet de manière tout à fait inattendue de supprimer l'effet toxique de la protéine pour la cellule hôte. En outre, les inventeurs ont noté que, de manière tout à fait surprenante, la suppression de toxicité de la protéine chez l'hôte est encore plus efficace avec le système d'expression ps-dp-pt, lorsque le peptide toxique est produit en fusion C-terminale avec une protéine soluble, par exemple la glutathion S-transférase ou la thiorédoxine, avec la séquence Asp-Pro insérée entre la protéine soluble et le peptide toxique. Le système d'expression dp-pt ou ps-dp-pt de la présente invention permet la surproduction de protéines toxiques dans des cellules hôtes, en particulier de protéines hydrophobes, notamment de peptides qui correspondent à, ou qui comprennent, des domaines hydrophobes de protéines ancrées aux membranes. Il peut s'agir par exemple d'une protéine membranaire ou un domaine d'une protéine membranaire. Il peut s'agir par exemple d'une protéine d'un virus, par exemple d'un virus de l'hépatite C, d'un virus du sida, ou de tout autre virus pathogène pour l'humain et de manière générale pour les mammifères. Par exemple, le système dp-pt ou ps-dp-pt de l'invention permet de surproduire chez un hôte tel que E.coli les domaines transmembranaires des protéines El et E2 du virus de l'hépatite C, appelées TME1 et TME2, correspondant respectivement aux séquences : TME1 : 347-MIAGAHWGVLAGIAYFSMVGNWAKVLWLLLFAGVDA-383 Séquence IDn l TME2 : 717-MEYWLLFLLLADARVCSCLWMMLLISQAEA-746 Séquence IDn 2 alors que cela n'était pas possible avec les techniques de l'art antérieur. Les séquences nucléotidiques utilisables pour constituer le système dp-pt de l'invention codant pour les protéines TME1 (dp-pt(TME1)) ou TME2 (dp-pt(TME2)) peuvent être toutes les séquences possibles codant respectivement pour les protéines de fusion DP-TME1 et DP-TME2. Les séquences codant pour les protéines TME1 et TME2 peuvent être par exemple, avantageusement, respectivement, des séquences IDn 3 et IDn 4 de la liste de séquences annexée. Pour obtenir le système dp-pt la séquence dp codant pour le dipeptide Asp-Pro (DP) est ajoutée à ces séquences. Les séquences nucléotidiques utilisables pour constituer le système ps-dp-pt de l'invention codant pour les protéines TME1 (ps-dp-pt(TME1) ou TME2 (ps-dppt(TME2)) peuvent être toutes les séquences possibles codant respectivement pour les protéines de fusion PsDP-TME1 et Ps-DP-TME2. Il peut s'agir par exemple, avantageusement, des séquences IDn 34, IDn 35 et IDn 36 de la liste de séquences annexée pour TME1, permettant d'obtenir une protéine chimère Ps-DP-TME1. Il peut s'agir par exemple, avantageusement, des séquences IDn 37, IDn 38 et IDn 39 de la liste de séquences annexée pour TME2, permettant d'obtenir une protéine chimère Ps-DP-TME2. En effet, les séquences nucléotidiques précitées présentent des codons optimisés pour l'expression de TME1 et TME2 dans une bactérie, par exemple chez E. coli. Il existe un grand nombre de séquences de l'ARN du VHC produisant un phénotype infectieux : ces séquences sont également utilisables dans la présente invention. La séquence codant pour le dipeptide Asp-Pro peut être par exemple : gacccg, ou toute autre séquence codant pour ce dipeptide. La séquence codant pour la GST peut être par exemple celle présente dans les plasmides pGEXKT dont la séquence correspond à la séquence IDn 29 de la liste de séquence annexée ou toute séquence équivalente, c'est à dire codant pour cette protéine soluble. La séquence codant pour la TrX peut être par exemple celle présente dans le plasmide d'expression pET32a+ dont la séquence correspond à la séquence IDn 30 de la liste de séquence annexée ou toute séquence équivalente, c'est à dire codant pour cette protéine soluble. Pour la fabrication de la protéine toxique, le système d'expression dp-pt ou ps-dp-pt de l'invention est placé à l'intérieur d'une cellule hôte par exemple par clonage dans un plasmide approprié et ceci par les techniques habituelles de transformation d'un hôte dans les techniques de recombinaison génétique. Le plasmide dans lequel le système d'expression de la présente invention peut être cloné pour former ce vecteur sera choisi notamment en fonction de la cellule hôte. Il peut s'agir par exemple du plasmide pT7-7 (séquence IDn 33 de la liste de séquences annexée), d'un plasmide de la série pGEX (par exemple de séquence IDn 31 de la liste de séquences annexée), commercialisé par exemple par la société Pharmacia, ou un plasmide de la série pET32 (par exemple de séquence IDn 32 de la liste de séquences annexée), commercialisé par exemple par la société Novagen. Les plasmides de la série pGEX et de la série pET32 seront avantageusement utilisés pour la mise en #uvre de la présente invention. En effet, ils comprennent déjà une séquence ps codant pour une protéine soluble (Ps), respectivement pour la glutathion S-transférase et pour la thiorédoxine. Aussi, avantageusement, le système dp-pt sera cloné dans ces plasmides en aval de cette séquence ps codant pour la protéine soluble. La présente invention se rapporte donc également à un vecteur d'expression comprenant un système d'expression selon l'invention dp-pt ou ps-dp-pt ; en particulier un vecteur comprenant un système d'expression dp-pt selon l'invention et la séquence oligonucléotidique du plasmide pT7-7, ou un vecteur comprenant un système d'expression ps-dp-pt selon l'invention et la séquence oligonucléotidique d'un plasmide pGEX ou d'un plasmide pET32. Par exemple, les vecteurs d'expression de la présente invention, convenant à un hôte bactérien tel que E. coli, et permettant la surexpression de la protéine membranaire TME1 précitée, peuvent avoir avantageusement une séquence oligonucléotidique choisie parmi les séquences IDn 40 (avec pGEXKT), IDn 42 (avec pET32a+) et IDn 44 (avec pT7-7) de la liste de séquences annexée. Par exemple, les vecteurs d'expression de la présente invention, convenant à un hôte bactérien tel que E. coli, et permettant la surexpression de la protéine membranaire TME2 précitée, peuvent avoir avantageusement une séquence oligonucléotidique choisie parmi les séquences IDn 41 (avec pGEXKT), IDn 43 (avec pET32a+) et IDn 45 (avec pT7-7) de la liste de séquences annexée. En effet, les vecteurs d'expression précités présentent des codons optimisés pour l'expression des protéines chimères de la présente invention, incluant TME1 et TME2, dans une bactérie, par exemple chez E. coli. La présente invention se rapporte également à une cellule procaryote transformée par un vecteur d'expression selon l'invention. Cette cellule procaryote transformée par le vecteur d'expression de la présente invention doit de préférence permettre la surexpression de la protéine toxique pour laquelle code le vecteur. Ainsi, toute cellule hôte capable de d'exprimer le vecteur d'expression de la présente invention est utilisable, par exemple E.coli, avantageusement, la souche E. coli BL21(DE3)pLysS. La présente invention se rapporte également à un procédé de fabrication d'une protéine toxique par recombinaison génétique comprenant les étapes suivantes : - transformer une cellule hôte avec un vecteur d'expression selon l'invention, - cultiver la cellule hôte transformée dans des conditions de culture telles qu'elle fabrique une protéine de fusion comprenant le dipeptide Asp-Pro suivi de la séquence peptidique de la protéine toxique à partir dudit vecteur d'expression, et - isoler ladite protéine de fusion, et - cliver ladite protéine de fusion pour récupérer la protéine toxique. Les étapes de transformation, de culture, ainsi que de l'isolement de la protéine chimère fabriquée peuvent être réalisées par les techniques habituelles de recombinaison génétique, par exemple par des techniques telles que celles qui sont décrites dans le document [25] . L'étape consistant à isoler la protéine de fusion peut être réalisée par les techniques habituelles connues de l'homme du métier pour isoler une protéine d'un extrait cellulaire. La protéine de fusion fabriquée par le procédé de l'invention a une séquence Protéine soluble-AspPro-protéine toxique . Dans la présente description, le dipeptide Asp-Pro est aussi appelé DP suivant le code à une lettre des acides aminés. Par exemple, lorsque la protéine toxique est TME1, la protéine de fusion peut avoir la séquence IDn 46 de la liste de séquences annexée, qui correspond à la protéine de fusion GST-DP-TME1 ; la séquence IDn 48 de la liste de séquences annexée, qui correspond à la protéine de fusion TrX-DP-TME1 ; ou la séquence IDn 50 de la liste de séquences annexée, qui correspond à la protéine de fusion M-DP-TME1 de la liste de séquences annexée. Par exemple, lorsque la protéine toxique est TME2, la protéine de fusion peut avoir la séquence IDn 47 de la liste de séquences annexée, qui correspond à la protéine de fusion GST-DP-TME2 ; la séquence IDn 49 de la liste de séquences annexée, qui correspond à la protéine de fusion TrX-DP-TME2 ; ou la séquence IDn 51 de la liste de séquences annexée, qui correspond à la protéine de fusion M-DP-TME2 de la liste de séquences annexée. L'étape de clivage de cette protéine de fusion peut être réalisée avantageusement au moyen d'acide formique qui clive la protéine de fusion au niveau du dipeptide Asp-Pro. Elle peut être réalisée par ailleurs par toute technique appropriée connue de l'homme du métier pour récupérer une protéine d'un échantillon à partir d'une protéine de fusion. Les inventeurs sont les premiers à avoir trouvé un système réellement efficace pour produire et même de surproduire, notamment dans la bactérie Escherichia coli (E. coli) des peptides hydrophobes correspondant aux domaines membranaires des protéines El et E2 de l'enveloppe du virus de l'hépatite C, dont l'expression est létale pour le microorganisme. Le champ d'applications de la présente invention concerne principalement la production de peptides hydrophobes à grande échelle notamment pour la recherche fondamentale et industrielle. En outre, la production de la protéine chimère constituée de la protéine soluble, du dipeptide Asp-Pro, et du peptide hydrophobe peut être utilisée dans un but fonctionnel, notamment pour renseigner sur le degré d'oligomérisation du domaine membranaire ou encore sur sa capacité d'hétéropolymérisation. Les protéines de fusion, ou protéines chimères, sont produites via leur ADN codant présent par exemple dans des plasmides commerciaux et à la suite desquels est introduit en phase l'ADN codant pour la séquence Asp-Pro suivi de celui codant pour le peptide toxique. Cette application peut être commercialisée sous la forme de plasmides d'expression bactériens qui incluront la séquence du site Asp-Pro, en aval de celle des protéines solubles déjà présentes. Le plasmide correspondant sera décrit par exemple comme un outil facilitant la production par voie biologique de peptides ou protéines membranaires toxiques. Ainsi, la présente invention est applicable à tout système de surexpression de protéines recombinantes, avec ou sans fusion à une protéine soluble comme par exemple la GST, ou la thiorédoxine, incluant une séquence Asp-Pro non naturelle insérée en amont d'une séquence codant pour un domaine toxique de la protéine, par exemple un domaine membranaire d'une protéine. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à l'homme du nétier à la lecture des exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif en référence à la Liste de séquences et aux figures annexées. Brève description de la liste de séquences annexée - Séquences IDn l et 2 : respectivement, séquences peptidiques de TME1 et de TME2. - Séquences IDn 3 et 4 : respectivement, séquences codant pour le peptide TME1 et le peptide TME2. - Séquences IDn 5 et 6 respectivement, oligonucléotide (+) d'insertion dans pT7-7 (OL13(+)) et oligonucléotide (-) d'insertion dans pT7-7 (OL14 (-) ) . - Séquences IDn 7 et 8 respectivement, ADN sens codant de TME1 + site cla I en 3' et ADN sens anticodant de TME1 + site cla I en 5' (séquence complémentaire de la séquence IDn 7). - Séquences IDn 9 et 10 respectivement, oligonucléotide sens codant (OL11(+)) et oligonucléotide sens anticodant (OL12(-)) pour la synthèse de TME1. - Séquence IDn ll oligonucléotide (+) d'insertion dans pGEXKT sans site dp (OL15(+)). - Séquence IDn 12 : oligonucléotide (+) d'insertion dans pGEXKT avec site dp (OL17(+)). - Séquence IDn 13 : oligonucléotide (-) d'insertion dans pGEXKT (OL16(-)). - Séquence IDn 14 oligonucléotide (+) d'insertion dans pET32a (OL18(+))(s'hybride au segment 915-932 de pGEXKT). Séquences IDn 15 et 16 respectivement, oligonucléotides (+) (OL19(+)) et (-) (OL20(-)) d'insertion dans pT7-7 de l'ADN codant pour MDPTME1. Séquences IDn 17 et 18 respectivement, oligonucléotide (+) d'insertion dans pT7-7 (OL23(+)) et oligonucléotide (-) d'insertion dans pT7-7 (OL24(-)) . Séquences IDn 19 et 20 : respectivement, ADN sens codant pour TME2 + site de Nde I en 5' et Hind III en 3' ; et ADN sens anticodant de TME2 + site Nde I en 3' et Hind III en 5' (séquence complémentaire de IDn 17) . Séquences IDn 21 et 22 respectivement, oligonucléotides sens codant (OL21(+) ) et anticodant (OL22(-)) pour la synthèse de TME2. Séquence IDn 23 : oligonucléotide (+) d'insertion dans pGEXKT sans site dp (OL25(+)). Séquences IDn 24 et 25 respectivement, oligonucléotides (+) (OL27(+)) et (-) (OL26(-)) d'insertion dans pGEXKT avec site dp. Séquences IDn 26 et 27 respectivement, oligonucléotides (+) (OL28(+)) et (-) (OL29(-)) d'insertion dans pT7-7 de l'ADN codant pour MDPTME2. Séquence IDn 28 fin de la séquence de la protéine soluble GST suivie du site thrombine codée dans le plasmide pGEXKT. Séquence IDn 29 : ADN codant pour la protéine GST dans le plasmide pGEXKT. Séquence IDn 30 : ADN codant pour la thiorédoxine (TrX) dans le plasmide pET32a+. Séquences IDn 31, 32 et 33 : respectivement, plasmides d'expression pGEXKT, pET32a+ et pT7-7. Séquences IDn 34, 35 et 36 : respectivement, systèmes d'expression selon l'invention codant pour les protéines de fusion GST-DP-TME1, TrX-DP-TME1 et M-DP-TME1. Séquences IDn 37, 38 et 39 respectivement, systèmes d'expression selon l'invention codant pour les protéines de fusion GST-DP-TME2, TrX-DP-TME2 et M-DP-TME2. Séquences IDn 40 et 41 : respectivement, vecteurs d'expression pGEXKT-dp-ptTME1 et pGEXKT-dp-ptTME2 selon l'invention codant pour les protéines de fusion GST-DP-TME1 et GST-DP-TME2. Séquences IDn 42 et 43 : respectivement, vecteurs d'expression pET32a-dp-ptTME1 et pET32a-dp-ptTME2 selon l'invention codant pour les protéines de fusion TrX-DP-TME1 et TrX-DP-TME2 (codent par le brin complémentaire). Séquences IDn 44 et 45 : respectivement, vecteurs d'expression pT7-7-dp-ptTMEl et pT7-7-dp-ptTME2 selon l'invention codant pour les protéines de fusion MDP-TME1 et M-DP-TME2. Séquences IDn 46 et 47 : respectivement, protéines de fusion GST-DP-TME1 et GST-DP-TME2 selon l'invention obtenues à partir des plasmides pGEXKT- dp-ptTMEl et pGEXKT-dp-ptTME2. Séquences IDn 48 et 49 : respectivement, protéines de fusion TrX-DP-TME1 et TrX-DP-TME2 selon l'invention obtenues à partir des plasmides pET32a- dp-ptTME1 et pET32a-dp-ptTME2 Séquences IDn 50 et 51 : respectivement, protéines de fusion M-DP-TME1 et M-DP-TME2 selon l'invention obtenues à partir des plasmides pT7-7-dp-ptTMEl et pT7-7-dp-ptTME2. Séquences IDn 52 et 53 : respectivement, protéines GST et TrX codées par le vecteur pGEXKT et pET32a+. Brève description des figures - Figure 1 : représentation schématique d'une partie de la polyproptéine du VHC et séquence peptidique des domaines membranaires C-terminaux des protéines d'enveloppe El et E2. Les séquences peptidiques représentées correspondent au type infectieux #D00831 et #M67463 pour TME1 et TME2 respectivement obtenus de la banque publique de séquences Du Laboratoire Européen de Biologie Moléculaire ( European Molecular Biology Laboratory ) (EMBL). - Figure 2 : création de l'ADN codant pour le domaine membranaire C-terminal de la protéine d'enveloppe El du VHC et séquences additionnelles en 5' et 3' pour clonage dans différents plasmides. Les séquences représentées sur cette figure sont reportées dans la liste de séquences annexée. - Figure 3 : création de l'ADN codant pour le domaine membranaire C-terminal de la protéine d'enveloppe E2 du VHC et séquences additionnelles en 5' et 3' pour clonage dans différents plasmides. Les séquences représentées sur cette figure sont reportées dans la liste de séquences annexée. Figure 4, panneaux A à F : toxicité des domaines membranaires exprimés dans la bactérie et suppression de cette toxicité par insertion d'un site dp. Les panneaux A, C et E sont des représentations graphiques de mesures de la densité optique (DO) à 600 nm en fonction du temps (t) en heures de la production de différentes protéines dans une bactérie utilisant ou non le système d'expression de la présente invention. Les panneaux B, D et F sont des représentations des gels de migration des protéines respectivement des panneaux A, C et E. - Figures 5 A et B : surexpression des protéines chimères thiorédoxine-Asp-Pro-Pt (Pt = domaines membranaires des protéines) dans la bactérie. La figure 5A est une représentation graphique de mesures de la densité optique (DO) à 600 nm en fonction du temps en heures de la production de différentes protéines dans une bactérie utilisant ou non le système d'expression de la présente invention. La figure 5B est une représentation d'un gel de migration des protéines de la figure 5A. - Figure 6 : expression et purification de la protéine de fusion (ou chimère) GST-TME2, et comparaison avec la GST seule. Cette figure représente en haut les séquences peptidiques de GST et GST-TME2, et en bas les gels obtenus par électrophorèse montrant que contrairement à GST seule, GST-TME2 est insoluble. Cette dernière est produite sous forme de corps d'inclusion qui ne peuvent pas se replier correctement. - Figures 7A et 7B : représentations graphiques de résultats expérimentaux comparatifs montrant l'effet du dipeptide DP (séquence oligonucléotidique dp-pt conforme à la présente invention) et du dipeptide DP et de la protéine soluble (séquence oligonucléotidique psdp-pt conforme à la présente invention) sur la synthèse des protéines toxiques TME1 et de TME2 conformément à la présente invention. EXEMPLES Dans ces exemple, les oligonucléotides utilisés ont été commandés aux Laboratoires EUROBIO (http://www.eurobio.fr/); les plasmides ont été préparés avec le kit QlAprep (marque de commerce) de QIAGEN (http://www.qiagen.com/); les séquences d'ADN ont été séquencées avec le kit ABI PRISM (marque déposée) BigDye (marque de commerce) Terminator cycle d'Applied Biosystems (http://home.appliedbiosystems.com/); les souches d'E. coli BL21(DE3) et BL21(DE3)pLysS ont été obtenues chez Stratagene (http://www.stratagene.com/); les souches C41 et C43 (BL2KDE3)) ont été fournies par le Dr. Bruno Miroux (CNRS-CEREMOD, Centre de recherches sur l'endocrinologie moléculaire et le développement ; les enzymes de restriction et modification d'ADN ont été obtenues chez New England Biolabs (http://www.neb.com/neb/); les électrophorèses de protéines ont été réalisées avec un miniprotean 3 (marque de commerce) des Laboratoires Bio-Rad (http://www.bio-rad.com); le plasmide pCR (marque déposée) T7 topo TA a été obtenu chez Invitrogen (http://www.invitrogen.com/); le plasmide pET32a+ a été obtenu chez Novagen (http://www.novagen.com); les plasmides pT7-7 et pGPl-2 et la souche K38 [22] ont été demandés au Prof. Tabor (Department of Biological Chemistry, Harvard Médical School) ; le plasmide pGEX-KT a été demandé au Prof. Dixon (Department of Biological Chemistry, University of Michigan Médical School) ; les autres produits ont été obtenus chez Sigma (http://sigma.aldrich.com). Dans les exemples suivants, la production des peptides TME1 et TME2 a été dans un premier temps réalisée sans le système d'expression de la présente invention, puis en fusion avec une protéine soluble, et enfin en fusion avec la GST avec insertion du site AspPro ( DP en codage à une lettre) entre la protéine soluble et TME1 ou TME2. L'abréviation SEQ IDn est utilisée pour séquence IDn et renvoie à la liste de séquences annexée. Exemple 1 : Synthèse du système d'expression 1. 1) CONSTRUCTION DES VECTEURS D'EXPRESSION pT7-7-ptTME1 ET pT7-7-ptTME2 L'ADN codant pour les deux domaines a été synthétisé de novo à partir des oligonucléotides appropriés. Les codons ont été choisis suivant leur plus grande fréquence d'utilisation dans la bactérie, telle qu'elle a été quantifiée par Sharp et col. [17]. Les constructions sont décrites sur la figure 2 annexée pour TME1 et sur la figure 3 annexée pour TME2. Chaque ADN synthétique a été généré en utilisant un jeu de deux oligonucléotides longs et chevauchants, OL11(SEQ IDn 9) et OL12 (SEQ n 10) pour TME1 et OL21(SEQ IDn 19) et OL22 (SEQ IDn 20) pour TME2, qui ont été amplifiés après hybridation avec deux oligonucléotides externes choisis en fonction du clonage dans un plasmide donné. Ainsi les clonages dans pT7-7 ont été réalisés en utilisant le jeu d'oligonucléotides externes OL13 (SEQ IDn 5) et OL14 (SEQ IDn 6) pour TME1 et OL23 (SEQ IDn 15) et OL24 (SEQ IDn 16) pour TME2. Chaque ADN synthétique a été généré en utilisant un jeu de quatre oligonucléotides : deux longs et chevauchants et deux courts et externes. Les ADN ont été amplifiés par la méthode de réaction de polymérisation en chaîne ( polymérase chain reaction ) dite de "PCR" [18] puis clonés dans un plasmide bactérien pCR (marque de commerce) T7 topo TA. Les ADN synthétisés ont été séquences puis sous-clonés dans le vecteur d'expression bactérien pT7-7 [19] en utilisant les sites de restriction Nde I en 5' et Cla I ou Hind III en 3'. Sur la figure 2 : A : Séquence peptidique TME1 du sous-type #D00831. La numérotation correspond à la position de la séquence dans la polyprotéine comme décrit sur la figure 1. B : Séquence d'ADN codant pour le domaine membranaire avec des codons optimisés pour l'expression dans la bactérie. C et D : Stratégie d'amplification sans matrice de l'ADN. Le sens codant et le sens anticodant des oligonucléotides sont indiqués respectivement par les signes (+) et (-). Les oligonucléotides longs sont chevauchants d'une vingtaine de bases pour créer l'amorce puis la matrice. Les oligonucléotides courts permettent d'amplifier la matrice par PCR en intégrant les sites de restriction désirés et suivant les plasmides utilisés. L'insertion dans pT7-7 a été réalisée avec le couple d'oligonucléotides OL13 (SEQ IDn 5) et OL14 (SEQ IDn 6), via un sous-clonage dans pCRT7 topo, en intégrant les sites Nde I et Hind III. L'insertion dans pGEXKT a été effectuée suivant la même méthode avec le couple d'oligonucléotides OL15 (SEQ IDn ll) et OL16 (SEQ IDn 13) en intégrant les sites BamH I et EcoR I. L'insertion du site dp (gacccg) et le clonage dans pGEXKT ont été effectués avec le couple d'oligonucléotides OL17 (SEQ IDn 12) et OL16 (SEQ IDn 13). La construction dans pGEXKT a été transférée dans pET32a qui code pour la thiorédoxine avec le couple d'oligonucléotides OL18 (SEQ IDn 14) et OL16 (SEQ IDn 13). L'oligonucléotide OL18 (SEQ IDn 14) s'hybride dans la région terminale de l'ADN codant pour la GST dans pGEXKT. La séquence amplifiée intègre la fin de la GST (SDLSGGGGG) suivie du site thrombine (LVPRGS) (SEQ IDn 28), du site DP et du passage membranaire. Après clonage, l'ADN inséré dans pET32a permet d'exprimer la chimère thiorédoxineSDLSGGGGGLVPRGS-DP-TME1 (SEQ IDn 48). Sur la figure 3 : La légende est identique à la figure 2, mais La séquence peptidique est celle du sous-type #M67463. L'insertion dans pT7-7 a été réalisée avec le couple d'oligonucléotides OL23 et OL24 (respectivement SEQ IDn 17 et SEQ IDn 18) via un sous-clonage dans pCRT7 topo en intégrant les sites Nde I et Hind III. L'insertion dans pGEXKT a été effectuée suivant la même méthode avec le couple d'oligonucléotides OL25 et OL26 (respectivement SEQ IDn 23 et SEQ IDn 25) intégrant les sites BamH I et EcoR I. L'insertion du site dp (gacccg) et le clonage dans pGEXKT ont été effectués avec le couple d'oligonucléotides OL27 et OL26 (respectivement SEQ IDn 24 et SEQ IDn 25). L'insertion dans pET32a a été effectuée comme décrit sur la figure 2 en utilisant le couple d'oligonucléotides OL18 et OL26 (respectivement SEQ IDn 14 et SEQ IDn 25). 1. 2) CONSTRUCTION DES VECTEURS D'EXPRESSION pGEXKT-ptTME1, pGEXKT-ptTME2 pGEXKT-dp-ptTME1 ET pGEXKT-dp-ptTME2 Les vecteurs d'expression pGEXKT-ptTMEl et pGEXKT-ptTME2 ont été construits par PCR comme décrits sur les figures 2 et 3 annexées. L'ADN-matrice utilisé pour amplifier les ADN codant pour TME1 ou TME2 est celui cloné dans les plasmides pT7-7. Le clonage dans le plasmide pGEXKT [20, 21] de TME1 a été réalisé en utilisant les jeux d'oligonucléotides OL15 (SEQ IDn ll) et OL16 (SEQ IDn 13) permettant l'insertion des sites de restriction BamH I en 5' et EcoR I en 3'. Le clonage de TME2 dans le même vecteur a été réalisé en utilisant les jeux d'oligonucléotides OL25 (SEQ IDn 21) et OL26 (SEQ IDn 23). Comme indiqué dans la figure 2, l'insertion du site dp en position N-terminale de TME1 a été réalisée en remplaçant l'oligonucléotide 5' OL15 (SEQ IDn ll) par l'oligonucléotide OL17 (SEQ IDn 12). L'insertion du site dp en position N-terminale de TME2 a été réalisée en remplaçant l'oligonucléotide 5' OL25 (SEQ IDn 21) par l'oligonucléotide OL27 (SEQ IDn 22), comme montré dans la figure 3. 1. 3) CONSTRUCTION DES VECTEURS D'EXPRESSION pET32a-dp-TME1 ET pET32a-dp-TME2 Les vecteurs d'expression pET32a-dp-TME1 et pET32a-dp-TME2 ont été construits par PCR comme décrits sur les figures 2 et 3 annexées, en utilisant le jeu d'oligonucléotides indiqué. L'oligonucléotide amont intègre un site EcoR V et s'hybride avec la région terminale de gène codant pour la GST. Il permet d'intégrer la queue de 5 glycines et le site de clivage par la thrombine présents dans le plasmide. L'oligonucléotide en aval est le même que celui utilisé pour le clonage dans pGEXKT. L'insertion dans le plasmide pET32a se fait par les sites MsC I/EcoR V en 5' et EcoR I en 3'. Il permet d'insérer en phase à la fin de la séquence de la thiorédoxine la queue de 5 glycines, le site de clivage par la thrombine, le site DP et le passage membranaire. Le plasmide d'origine pET32a, qui sert de témoin, code pour la thiorédoxine suivie d'une séquence intégrant divers éléments qui n'ont pas été supprimés et qui contribuent pour une bonne part à la masse de la protéine chimère fabriquée. L'ADN-matrice utilisé pour amplifier les ADN codant pour TME1 ou TME2 est celui cloné dans les plasmides pGEXKT-dp-ptTME1 ou pGEXKT-dp-ptTME2. Pour TME1, le clonage dans pET32a+ a été réalisé en utilisant les jeux d'oligonucléotides OL18 (SEQ IDn 14) et OL16 (SEQ IDn 13). Le clonage de TME2 dans le même vecteur a été réalisé en utilisant les jeux d'oligonucléotides OL18 (SEQ IDn 14) et OL26 (SEQ IDn 23), comme indiqué dans la figure 3. Exemple 2 : Expression de séquences codant pour les protéines TME1 et TME2 seules L'expression des séquences codant pour les domaines seuls TME1 et TME2 a été testée par induction thermique ou chimique et en utilisant différentes souches bactériennes comme décrit ci-après. 2. 1) SYSTEME D'INDUCTION THERMIQUE Le système développé par Tabor [22] permet d'exprimer une protéine par induction thermique en utilisant deux vecteurs dans une même bactérie, pT7-7 et pGPl-2. Le plasmide pT7-7 contient l'ADN à exprimer, placé sous contrôle d'un promoteur 10 reconnu par l'ARN polymérase du phage T7. Le plasmide pGPl-2 contient le gène codant pour la polymérase du phage T7, placé sous le contrôle d'un promoteur #pL. Ce promoteur est réprimé par un répresseur thermosensible, cI857, présent lui aussi dans pGPl-2. A 30 C, cI857 est normalement exprimé et réprime le promoteur #pL, ce qui bloque l'expression de la polymérase et donc aussi celle de la protéine d'intérêt. L'induction est déclenchée par un passage de la culture de 37 à 42 C pendant 15-30 min, puis l'expression se poursuit à 37 C. Ce système est donc particulièrement bien adapté lorsqu'il est nécessaire de contrôler strictement l'expression d'une protéine donnée, notamment si celle-ci est toxique pour la bactérie. 2. 2) SYSTEME D'INDUCTION CHIMIQUE Le même plasmide pT7-7 contenant l'ADN à exprimer est cette fois introduit dans des bactéries E. coli de type BL21(DE3) (B F- dcm omtP hsdS (rB-mB-) gal # (DE3) et BL21(DE3)pLysS (B F- dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal # (DE3) [pLysS Camr]). Ces bactéries ont été modifiées pour contenir dans le génome une copie du gène codant pour l'ARN polymérase du phage T7, placé sous contrôle d'un promoteur lacUV5 inductible par l'isopropyle-1- thio--D-galactoside (IPTG). Dans ce cas, les bactéries sont cultivées à leur température optimum de 37 C ou moins si nécessaire. L'expression est induite par addition d'IPTG dans la culture. La souche BL21(DE3)pLysS est particulièrement bien adaptée aux protéines dont l'expression basale est toxique pour la bactérie hôte. En effet, la présence du plasmide pLysS permet l'expression continue et à un faible niveau de lysozyme du phage T7. Celui-ci inhibe la polymérase du phage T7, dont la faible expression en absence d'induction pourrait permettre l'expression basale de protéine toxique. Les inventeurs ont aussi testé l'expression des domaines membranaires seuls dans des souches appelées C41 et C43 [10] qui ont été sélectionnées pour résister à l'expression de protéines membranaires toxiques. Ces souches sont dérivées de la souche BL21(DE3) et sont utilisées de la même façon que cette dernière. 2. 3) TESTS D'EXPRESSION Suivant le système testé, les plasmides correspondants ont été introduits par transformation dans les différentes souches d'E. coli : K38 (HfrC #) pour le système d'induction thermique de Tabor ou les différentes souches BL21 pour l'induction chimique. Le tableau 1 suivant résume les tests effectués. Tableau 1 Induction Souche Plasmide Thermique K38 pT7-7 + pGP1-2 Chimique BL21 (DE3) pT7-7 Chimique BL21 (DE3) pLysS pT7-7 Chimique C41 (BL21(DE3)) pT7-7 Chimique C43 (BL21 (DE3)) pT7-7 Dans chaque cas, une dizaine de transformants ont été mis en culture pour tester l'expression. Brièvement, les bactéries ont été mises en culture dans 5 ml de LB (10 g tryptone, 5 g extrait de levure, 5 g NaCl, qsp 1 litre H20) complémenté avec 50 ug/ml d'ampicilline (nécessaire pour maintenir pT7-7 dans la bactérie) et 60 ug/ml de kanamycine (nécessaire pour maintenir pGPl-2 dans la bactérie) puis cultivées jusqu'à saturation soit à 30 C pour K38, soit à 37 C pour BL21(DE3). Les cultures sont ensuite diluées au 1/10 dans le même milieu de culture et cultivées jusqu'à une densité optique (DO) de 1 mesurée à 600 nm sur un spectrophotomètre Philips PU8740 (marque de commerce). L'expression est ensuite induite soit thermiquement (K38) à 42 C pendant 15 min, soit chimiquement (BL21(DE3)) par addition de 1 mM d'IPTG. Elle est poursuivie pendant 3-5 heures à 37 C. La DO600nm des cultures est mesurée à différents temps. A la fin de l'expression, un volume de culture contenant l'équivalent de 0,1 DO de bactéries est prélevé. Les bactéries sont récoltées par centrifugation et suspendues dans 50 ul de solution de lyse (SL : Tris-Cl 50 mM, pH 8,0, EDTA 2,5 mM, SDS 2%, urée 4 M, P-mercaptoéthanol 0,7 M). Après quelques minutes à température ambiante, 10 l sont déposés sur gel de polyacrylamide 16,5% pour électrophorèse de type "Tricine" [23] qui permet de bien séparer les protéines de petite masse moléculaire. Sur la figure 4 : Panneaux A, C et E : Les bactéries ont été transformées avec les plasmides pT7-7, pT7-7-TME1, pT7-7-TME2 (panneau A), pGEXKT, pGEXKT-TME1, pGEXKT-TME2 (panneau C) et pGEXKT-dp-TME1, pGEXKT-dp-TME2 (panneau E) puis mises en culture et induites comme décrit ci-dessus. La croissance bactérienne a été suivie en mesurant l'augmentation de turbidité de chaque culture par mesure de la densité optique à 600 nm en fonction du temps en heures. Panneaux B, D, F : Les bactéries ont été prélevées au temps indiqué dans le texte et traitées comme décrit ci-dessus. Elles ont ensuite été déposées sur gel d'électrophorèse, soit 16,5% d'acrylamide de type "Tricine" (panneau B), soit 14% d'acrylamide de type Laemmli SDS-PAGE (panneaux D et F). L'électrophorèse montrée dans le panneau F a migré plus longtemps que celle montrée dans le panneau D, ceci pour améliorer la séparation des bandes dans la zone des 30000 Da. Après migration, les gels ont été colorés 10 minutes par du bleu de Coomassie dans une solution de 40% méthanol, 10% d'acide acétique, 0,1% bleu de Coomassie R250, puis décolorés dans une solution 10% méthanol, 10% acide acétique, 1% glycérol. Quelque soit le système testé, la première observation est que la fréquence de transformation des bactéries a été faible. Pour les bactéries qui ont pu être sélectionnées, le résultat des tests d'expression a été systématiquement négatif. Un exemple est donné sur la figure 4, panneaux A et B, avec les séries BL21(DE3)pLysS {[pT7-7], [pT7-7-TMEl] ou [pT7-7-TME2]}. Comme l'illustre la comparaison des courbes de croissance du panneaux A de la figure 4, les inventeurs ont constaté avec les clones transformés avec pT7-7-TME1 ou pT7-7-TME2 et résistants sur milieu solide, que l'induction stoppe quasi-immédiatement la croissance bactérienne, contrairement aux clones contenant le plasmide seul. De même, comme c'est visible sur la figure 4(B), aucune bande de protéines migrant dans la région correspondant à la masse moléculaire des produits d'expression (- 3-4000 Da) ou d'oligomères de ceux-ci ({1, 2,3, ...}) x masse moléculaire) n'est en effet observable. L'explication la plus probable à cette situation est que l'expression des domaines membranaires est très toxique pour la bactérie. La difficulté d'obtenir des transformants laisse supposer qu'une expression basale, même très faible, suffit à les tuer. Ceci montre aussi que le système pLysS n'est pas parfait pour prévenir cette expression basale. Parmi les bactéries qui résistent à l'étape de transformation, l'induction de l'expression des domaines hydrophobes devient immédiatement létale. Les systèmes utilisés permettent effectivement de protéger la bactérie hôte d'une expression basale, mais dès que celle-ci est induite, la toxicité est immédiate et les bactéries sont tuées. Exemple 3 : Expression de séquences codant pour les protéines de fusion GST-TME1 et GST-TME2 Les vecteurs d'expression ont été construits comme décrit dans l'exemple 1, puis introduits dans les bactéries BL21(DE3)pLysS. Les bactéries BL21(DE3)pLysS ont été utilisées par soucis de comparaison avec les expériences précédentes car l'expression de la GST ou de ses chimères ne nécessite pas le système DE3-pLysS. L'induction de l'expression a été effectuée avec de l'IPTG comme pour celle des domaines seuls. Les caractéristiques des protéines produites sont résumées dans le tableau 2 suivant. Tableau 2 Chimère, Taille, Masse, Plasmide Construction abréviation aa Da pGEXKT GST, G 1M-D239 239 27469 GST-TME1, pGEXKT-T1 GT1 1M-S233-347M-A383 269 30506 GST-TME2, pGEXKT-T2 GT2 1M-S233-717E-A746 263 30191 Les acides aminés (aa) sont indiqués avec le code à une lettre. La numérotation des séquences est effectuée par rapport aux protéines d'origine, GST et polyprotéine virale. Celle qui fait référence aux domaines membranaires est indiquée en italiques. Les panneaux C et D de la figure 4 annexée montrent les résultats obtenus. Les courbes de croissance des bactéries transformées avec les différents plasmides montrent que l'expression des chimères GT1 et GT2 est toxique. Comme on peut le voir sur le gel d'électrophorèse de type Laemmli SDS-PAGE 14% [24], l'expression de TME1 fusionné à la GST s'accompagne de l'absence de bande migrant à la taille attendue de 30 kDa. Ceci laisse supposer qu'un très faible niveau d'expression de la chimère est suffisant pour tuer les bactéries. Par contre, la chimère GSTTME2 est cette fois visible sur le gel d'électrophorèse, dans la zone de masse moléculaire attendue de 30 kDa. Le niveau d'expression reste toutefois limité. La protéine produite n'est pas soluble malgré la présence de la GST dans la fusion. En effet, comme le montre la figure 6 annexée, les essais de solubilisation, repliement et purification de la chimère GST-TME2 ont été un échec. Pour obtenir les résultats représentés sur cette figure 6, les protéines GST et GST-TME2 ont été exprimées comme décrit sur la figure 4 à partir de 150 ml de milieu de culture. Les bactéries ont ensuite été récoltées par centrifugation et suspendues KP04 20 mM pH 7. 7, NaCl 0.1M, EDTA 1 mM, NaN3 1 mM) pour avoir 100 DO/ml. Deux ml de chaque culture sont prélevés pour sonication par pulses de 30 sec à 15% d'amplitude. Après sonication, Un prélèvement est effectué pour électrophorèse. Il correspond au puits To sur la figure 6 (correspondant au total ). Une première centrifugation à basse vitesse (5000xg, 15 minutes) permet de séparer les bactéries non cassées et les corps d'inclusion des protéines solubles ou membranaires. Ces dernières se retrouvent dans le surnageant et un prélèvement est effectué. Il correspond au puits Surn sur la figure 6. La fraction contenant la GST seule est ensuite traitée avec une résine d'affinité qui permet de fixer puis d'éluer spécifiquement cette protéine (puits Af du gel GST sur la figure 6). La fraction contenant la protéine non soluble GST-TME2 est traitée soit avec un détergent doux comme le triton X100 (TX100), en présence ou en absence de NaCl, soit avec un détergent plus solubilisant mais plus déstructurant comme le sarkosyl, avant d'être à nouveau diluée dans du TX100 et passée sur résine d' af f inité . Les résultats de la figure 6 montrent que la GST est présente dans la fraction soluble, à la différence de la fusion GST-TME2, ce qui indique que cette dernière est insoluble. Le surnageant contenant la GST est passé sur une résine d'agarose-GSH capable de fixer la GST. Celle-ci est ensuite éluée avec un excès de GSH (puits indiqué Af du gel GST sur la figure 6). Le culot contenant la fusion GST-TME2 n'est pas solubilisé en présence d'un détergent doux comme le TX100 (avec ou sans NaCl ajouté, puits TX100 +/NaCl du gel GST-TME2) mais il peut être solubilisé avec un détergent plus agressif comme le sarkosyl. Cependant, après dilution de la protéine ainsi solubilisée dans du TX100, un détergent doux qui doit favoriser son repliement, la protéine n'est pas retenue sur la résine d'affinité, contrairement à la GST, ce qui suggère que la protéine de fusion ne peut être repliée. Ces tests indiquent de façon claire que la protéine GST-TME2 est produite sous forme de corps d'inclusion que l'on ne peut pas replier correctement. Exemple 4 : Expression de vecteurs d'expression codant pour les protéines de fusion incluant un site Asp-Pro et un site GST La construction des vecteurs a été réalisée comme décrit plus haut et pour les deux vecteurs codant pour les protéines chimères GST-TME1 et GST-TME2, pour donner naissance aux vecteurs codant pour les protéines chimères GST-Asp-Pro-TME1 et GST-Asp-Pro-TME2. Elles sont résumées dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 Chimère ; Taille, Masse, Plasmide Construction Abréviation fig. 4 aa Da pGEXKT- GST-DP-TME1 ; 1M-S233 dp-347M- 271 30718 dp-T1 GDPT1 A383 pGEXKT- GST-DP-TME2 ; iM-S233-dp-777E- 265 30403 dp-T2 GDPT2 A746 Les acides aminés (aa) sont indiqués avec le code à une lettre. La numérotation des séquences est effectuée par rapport aux protéines d'origine, GST et polyprotéine virale. Celle qui fait référence aux domaines membranaires est indiquée en italiques. Les vecteurs ont été testés comme décrit dans le paragraphe précédent. Les résultats obtenus sont illustrés sur les panneaux E et F de la figure 4 annexée. Les courbes de croissance des bactéries transformées avec les différents plasmides montrent que l'expression des chimères GdpTl et GdpT2 est nettement moins toxique que dans les cas précédents. Le panneau F montre que cette fois, TME1 est produite du fait de la présence du site de clivage DP. Son niveau d'expression, tel qu'on peut le voir dans le panneau F, est relativement moyen mais significatif. GST-DP-TME2 est nettement surproduit. Les deux protéines migrent dans leur zone de masse moléculaire attendue. L'effet de l'addition du dipeptide DP est aussi significatif qu'inattendu : il amplifie l'expression des domaines et supprime leur toxicité. Cet effet d'atténuation de la toxicité n'est pas connu pour le dipeptide DP, dont la seule propriété rapportée à ce jour est sa capacité à être coupé par l'acide formique. L'effet étant observé sur deux peptides différents et tous deux initialement toxiques pour la bactérie, on peut donc raisonnablement penser que cette propriété peut s'étendre à d'autres peptides hydrophobes et toxiques. Les inventeurs ont vérifié que le site peut être effectivement clivé par l'acide formique : la coupure est lente et demande environ 7 jours à température ambiante. Les essais d'expression à basse température (20 C) pendant toute une nuit de ces chimères ont permis de mettre en évidence qu'elles sont produites sous forme native. En effet, il est possible de détecter une activité GST transférase dans la fraction membranaire des bactéries. De plus, cette activité est mesurée en solution lorsque les membranes sont solubilisées en présence d'un détergent non ionique comme le ss-D dodécylmaltoside, après centrifugation. Exemple 5 : Expression de vecteurs d'expression codant pour les protéines de fusion incluant un site Asp-Pro et un site codant pour la thiorédoxine (TrX) Les vecteurs d'expression pET32a-TrX, pET32a-TrX-dp-TMEl et pET32a-TrX-dp-TME2 ont été construits comme décrit ci-dessus et ont été ensuite introduits dans les bactéries BL21(DE3)pLysS. Les bactéries BL21(DE3)pLysS ont été utilisées par soucis de comparaison avec les expériences précédentes car l'expression de la GST ou de ses chimères ne nécessite pas le système DE3-pLysS. Les clones positifs ont été mis en culture et induits comme décrit ci-dessus. L'induction de l'expression a été effectuée avec de l'IPTG comme pour celle des domaines seuls. Les caractéristiques des protéines produites sont résumées dans le tableau 4 suivant. Tableau 4* Chimère ; Taille, Masse, Plasmide Construction Abréviation fig. 4 aa Da pET32a Thiorédoxine ; TrX 1M-C189 189 20397 pET32a- TrX-DP-TME1 ; 1M-S115-PK- 171 17796 Gend-dp-T1 TDPT1 Gend-dp-Ti pET32a- TrX-DP-TME2 ; 1M-S115-PK- 165 17481 Gend-dp-T2 TDpT2 Gend-dp-T2 * : Tl = TME1 et T2 = TME2 Les acides aminés (aa) sont indiqués avec le code à une lettre. La numérotation des séquences est effectuée par rapport aux protéines d'origine, GST et polyprotéine virale. Celle qui fait référence aux domaines membranaires est indiquée en italiques. Gend fait référence à la séquence C-terminale de la GST provenant des constructions avec le plasmide pGEXKT. Elle correspond à la séquence peptidique primaire SDLSGGGGGLVPRGS. Les chimères thiorédoxineSDLSGGGGGLVPRGS-DP-(TME1 ou TME2) sont plus courtes que la protéine codée dans le vecteur d'origine car l'insertion est effectuée immédiatement après la thiorédoxine. Sur la figure 5 : A : la croissance bactérienne a été suivie en mesurant l'augmentation de turbidité de chaque culture par densité optique à 600 nm en fonction du temps. B : les bactéries ont été prélevées comme indiqué pour la figure 4. Elles ont ensuite été déposées sur gel d'électrophorèse 14% d'acrylamide de type Laemmli SDS-PAGE et traitées comme indiqué pour la figure 4. Comme attendu, et comme le montrent les courbes de croissance représentées sur la figure 5A annexée des bactéries transformées avec les différents plasmides, l'expression des chimères TrX-DP-TME1 et TrX-DP-TME2 suivant la présente invention n'est pas toxique. Le gel d'électrophorèse représenté sur la figure 5B annexé de type Laemmli SDS-PAGE 14% [24] montre que chaque chimère est surproduite. La présente invention permet donc de fabriquer par recombinaison génétique des peptides hydrophobes correspondant aux domaines membranaires des protéines El et E2 de l'enveloppe du virus de l'hépatite C, dont l'expression a été reconnue comme létale dans les techniques de l'art antérieur. En outre, l'effet étant observé sur deux peptides vraiment différents et tous deux initialement toxiques pour la bactérie, indique que la présente invention concerne d'autres peptides hydrophobes et toxiques. Exemple 6 : Effet du dipeptide DP sur la toxicité des domaines transmembranaires TME1 et TME2 exprimés sans protéine de fusion dans la bactérie Cet exemple permet d'évaluer l'effet antitoxique du dipeptide DP inséré en absence de protéine de fusion GST ou TrX conformément à la revendication 1 annexée. A) Matériels : Les plasmides pT7-7-ptTMEi et pT7- 7-ptTME2 sont ceux qui sont décrits dans l'exemple 1. Les plasmides pT7-7-dp-ptTME1 et pT7-7-dp-ptTME2 ont été construits et clonés dans pT7-7 (SEQ IDn 33) comme décrits dans l'exemple 1 mais en utilisant les sites Nde I (5') et EcoR I (3') du plasmide. Les oligonucléotides amont (5') intègrent la séquence dp (gacccg) après la 1ère méthionine (atg). Les matrices utilisées pour générer chaque ADN ont été les plasmides pT7-7-ptTME1 et pT7-7-ptTME2. Les séquences ont été vérifiées après clonage. Les oligonucléotides utilisés sont les suivants : i) Clonage de la séquence codant pour (M)DPTME1 dans pT7-7: OL19 (+) : 5'- CGCATATGGACCCGATCGCTGGTGCT -3' (Nde I souligné) = (SEQ IDn 15 de la liste de séquences annexée) ; OL20 (-) : 5'-GAATTCCTAAGCGTCAACACCAGC-3' (EcoR I souligné) = (SEQ IDn 16 de la liste de séquences annexée). ii) Clonage de la séquence codant pour (M)DPTME2 dans pT7-7: OL28 (+) : 5'- CGCATATGGACCCGGAATACGTTGTTC-3' (Nde I souligné) = (SEQ IDn 26 de la liste de séquences annexée) ; OL29 (-) 5'-CAGAATTCCTAAGCTTCAGCCTGAGAG-3' (EcoR I souligné) = (SEQ IDn 27 de la liste de séquences annexée). Les vecteurs d'expressions pT7-7-dp-ptTMEl et pT7-7-dp-ptTME2 obtenus sont présentés sur la liste de séquences annexée (SEQ IDn 44 et SEQ IDn 45). B) Légende des Figures 7A et B annexées : la souche bactérienne BL21(DE3)pLysS a été transformée soit avec le plasmide seul soit avec les différentes versions de pT7-7 intégrant les 4 constructions exprimant TME1, M-DP-TME1 (figure 7A) ou TME2, M-DPTME2 (figure 7B). M représente la méthionine, elle est présente en position N-terminale des peptides lorsque les protéines toxiques sont fabriquées suivant la présente invention avec le plasmide pT7-7. La croissance des différents clones a été comparée après induction par l'IPTG, suivant le protocole identique à l'induction chimique décrite dans l'exemple 2, et moyennée sur les valeurs de DO de 4 clones différents pour chaque construction. C) Résultats: Les figures 7A et 7B montrent que les bactéries ayant un plasmide exprimant des protéines TME1 et TME2 croissent moins vite après induction que la souche témoin qui est transformée avec le vecteur pT7-7 seul. Ces résultats montrent que les souches transformées avec les plasmides exprimant les versions M-DP-TME1 (SEQ IDn 50) et M-DP-TME2 (SEQ IDn 51) selon l'invention croissent significativement mieux que celles qui expriment les TM sans DP. Ceci est vrai pour TME1 et encore plus nettement pour TME2. La conclusion est que l'insertion N-terminale de DP conformément à la présente invention contribue de manière surprenante à une diminution significative de la toxicité de l'expression des domaines membranaires, notamment en absence d'une protéine de fusion soluble comme la GST ou la thiorédoxine. Liste des références [1] Christendat D., Yee A., Dharamsi A., Kluger Y., Gerstein M., Arrowsmith C.H., and Edwards A.M., (2000), Prog. Biophys. Mol. Biol. 73, 339-345 ; [2] Hammarstrom M., Hellgren N., Van Den Berg S., Berglund H., and Hard T., (2002), Protein Sci. 11, 313-321 ; [3] Falson P. (1992), Biotechniques 13, 20-22 ; [4] Falson P., Penin F., Divita G., Lavergne J. P., Di Pietro A., Goody R. 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(1970) Nature 227,680-685. [25] Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular cloning, A laboratory manual, second edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, 1989. REVENDICATIONS 1. Système d'expression caractérisé en ce qu'il comprend successivement, dans le sens 5'-3', une séquence nucléotidique codant pour le dipeptide Asp-Pro et une séquence nucléotidique codant pour une protéine toxique. 2. Système d'expression selon la revendication 1, dans lequel la protéine toxique est une protéine membranaire ou un domaine d'une protéine membranaire. 3. Système d'expression selon la revendication 1, dans lequel la protéine toxique est une protéine membranaire ou un domaine d'une protéine membranaire d'une enveloppe de virus. 4. Système d'expression selon la revendication 3, dans lequel le virus est choisi parmi le virus de l'hépatite C, le virus du sida, un virus pathogène pour l'homme, un virus pathogène pour un mammifère. 5. Système d'expression selon la revendication 1, dans lequel la protéine toxique est une protéine transmembranaire ou un domaine d'une protéine transmembranaire du virus de l'hépatite C. 6. Système d'expression selon la revendication 1, dans lequel la protéine toxique est une protéine de séquence IDn l ou IDn 2 de la liste de séquences annexée. 7. Système d'expression selon la revendication 1, dans lequel la séquence nucléotidique codant pour la protéine toxique est choisie parmi la séquence IDn 3 et la séquence IDn 4 de la liste de séquences annexée. 8. Système d'expression selon la revendication 7, dans lequel la séquence nucléotidique codant pour le dipeptide Asp-Pro est gacccg. 9. Système d'expression selon la revendication 1, comprenant en outre, en amont de la séquence AspPro, une séquence nucléotidique codant pour une protéine soluble. 10. Système d'expression selon la revendication 9, dans lequel la protéine soluble est la glutathion Stransférase ou la thiorédoxine. 11. Système d'expression selon la revendication 1, codant pour une protéine de fusion ayant une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences IDn 46, IDn 47, IDn 48, IDn 49, IDn 50 et IDn 51 de la liste de séquences annexée. 12. Système d'expression selon la revendication 9, ledit système ayant une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences IDn 34, IDn 35, IDn 36, IDn 37, IDn 38, et IDn 39 de la liste de séquences annexée. 13. Vecteur d'expression bactérien comprenant un système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 cloné dans un plasmide. 14. Vecteur d'expression bactérien comportant un système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 et la séquence oligonucléotidique du plasmide pT7-7. 15. Vecteur d'expression bactérien constitué de la séquence IDn 44 ou IDn 45 de la liste de séquences annexée. 16. Vecteur d'expression bactérien comportant un système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 et la séquence oligonucléotidique d'un plasmide choisi parmi pGEXKT, pET32a. 17. Vecteur d'expression bactérien selon la revendication 16 constitué d'une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences IDn 40, IDn 41, IDn 42 et IDn 43 de la liste de séquences annexées. 18. Cellule procaryote transformée par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 13 à 17. 19. Cellule procaryote E. coli selon la revendication 18. 20. Procédé de fabrication d'une protéine toxique par recombinaison génétique comprenant les étapes suivantes : - transformer une cellule hôte avec un système d'expression selon la revendication 1 ou avec un vecteur d'expression selon la revendication 13, - cultiver la cellule hôte transformée dans des conditions de culture telles qu'elle fabrique une protéine de fusion comprenant le dipeptide Asp-Pro suivi de la séquence peptidique de la protéine toxique à partir dudit vecteur d'expression, et - isoler ladite protéine de fusion. 21. Procédé selon la revendication 20, comprenant en outre une étape consistant à cliver ladite protéine de fusion pour récupérer la protéine toxique. 22. Procédé selon la revendication 21, dans lequel l'étape consistant à cliver ladite protéine de fusion pour récupérer la protéine toxique est réalisée en faisant agir de l'acide formique sur la protéine de fusion. 23. Procédé selon la revendication 20, dans lequel la cellule hôte est E. coli. 24. Procédé selon la revendication 20, dans lequel le système d'expression code pour une protéine de fusion ayant une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences IDn 46, IDn 47, IDn 48, IDn 49, IDn 50 et IDn 51 de la liste de séquences annexée. 25. Procédé selon la revendication 20, dans lequel le système d'expression a une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences IDn 34, IDn 35, IDn 36, IDn 37, IDn 38, et IDn 39 de la liste de séquences annexée. 26. Procédé selon la revendication 20, dans lequel le vecteur d'expression est constitué d'une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences IDn 40, IDn 41, IDn 42, IDn 43, IDn 44 et IDn 45 de la liste de séquences annexées. 27. Protéine de fusion ayant une séquence peptidique choisie dans le groupe constitué des séquences IDn 46, IDn 47 IDn 48, IDn 49, IDn 50 et IDn 51 de la liste de séquences annexée.