Brevet FR2836681A1 — publié le 20030905

L'invention concerne un composé phosphocalcique modifié par un composé gem-biphosphonique, un procédé pour sa préparation, ainsi que son utilisation pour l'élaboration d'une composition injectable. Le dérèglement de l'activité osseuse d'un individu est à l'origine de nombreuses pathologies osseuses telles que l'ostéoporose, la maladie de Paget ou les tumeurs ostéolytiques. Compte tenu notamment de l'augmentation de la longévité des personnes, l'ostéoporose est devenu un problème de santé publique et de nombreuses recherches ont été entreprises pour y remédier. Les pathologies osseuses considérées étant provoquées par un déséquilibre du remodelage osseux au profit de l'activité des ostéoclastes, l'une des voies de traitement envisagée a consisté à diminuer l'activité des ostéoclastes, en vue de ralentir la dégradation de la matière osseuse. Les recherches effectuées sur divers acides gembiphosphoniques ont montré leur pouvoir inhibiteur de l'activité des ostéoclastes (G. A. Rodan, et al., Therapeutic Approaches to Bone Diseases, 1 septembre 2000, vol. 289, Science, p. 1508-1514). L'usage de certains d'entre eux comme médicament a été admis dans divers pays, notamment l'étidronate, le clodronate, le pamidronate, l'alendronate, le risedronate, le tiludronate et l'ibandronate. Des données ont été publiées pour d'autres composés acides gembiphosphoniques, notamment le zoledronate, l'incadronate, l'olpadronate, le neridronate. Les acides gem-biphosphoniques qui sont utilisés à ce jour pour le traitement de lésions osseuses sont utilisés par voie systémique et génèrent de ce fait quelques effets secondaires indésirables. Ils peuvent provoquer des troubles rénaux lorsqu'ils sont administrés par voie intraveineuse, et des troubles du système digestif, notamment des oesophagites ou des ulcères de l'estomac, lorsqu'ils sont administrés par voie orale [ (Lin J. H., Bone 1996 ; 18 ; 75-85) ou (Thiébauld D. et al., Osteroporos Int 1994 ; 76-73)]. Un autre inconvénient de l'administration par voie orale réside dans le faible taux d'absorption du principe actif sur la matière osseuse. . On connaît par ailleurs des compositions injectables destinées à former des substituts osseux. FR-2715853 décrit des compositions pour bio-matériaux de résorption/substitu- tion de tissus de soutien, comprenant une phase minérale composée de BCP ou de calcium-titane-phosphate, et une phase aqueuse liquide comprenant une solution aqueuse d'un polymère dérivé de la cellulose. Ces compositions injectables ne contiennent aucun principe actif. On connaît également des substituts osseux non injectables, qui se présentent sous forme d'implants. Par exemple, H. Denissen, et al (J. Periodontal, vol. 71, n 2, Février 2000, p. 280-296) décrit des implants d'hydroxyapatite modifiée par adsorption d'un acide gem-biphosphonique particulier, à savoir l'acide (3-diméthylamino-l-hydroxy- propylidène)-l, l-biphosphonique ou olpadronate. La libération in situ de l'acide favoriserait la reconstruction osseuse. Cependant, l'hydroxyapatite elle-même présente l'inconvénient d'être très faiblement résorbable. Le but de la présente invention est de fournir une composition contenant un principe actif inhibant l'activité des ostéoclastes et qui puisse être administrée sans produire les effets secondaires liés à une administration par voie systémique ou à l'utilisation d'un implant solide. C'est pourquoi la présente invention a pour objet un composé phosphocalcique modifié, un procédé pour sa préparation, ainsi que son utilisation comme principe actif dans une composition injectable. Le composé phosphocalcique modifié selon la présente invention peut être obtenu en ajoutant un acide gem-biphosphonique ou l'un de ses sels de métal alcalin ou alcalinoterreux à une suspension d'un composé phosphocalcique précurseur dans l'eau ultra-pure, en agitant le milieu réactionnel à température ambiante, puis en récupérant par centrifugation le composé formé. Le composé peut être ensuite purifié par lavage à l'eau ultra-pure, suivi d'une filtration et d'un séchage à l'air à température ambiante. Le composé phosphocalcique précurseur est choisi parmi les orthophosphates de calcium ayant une solubilité dans l'eau supérieure à 10-122 mol 1-1. A titre d'exemple, on peut citer le BCP qui est un mélange d'hydroxyapatite et de phosphate tricalcique ss (généralement désigné par ss-TCP), le CDA qui est une hydroxyapa- tite déficiente en calcium (obtenue par exemple par hydrolyse alcaline d'un orthophosphate de calcium acide), et le P-TCP. Par eau ultra-pure, on entend dans ce texte une eau ayant une résistivité voisine de 18 MQ cm. L'agitation à température ambiante est maintenue de préférence pendant une durée entre 1 h et 72 h, par exemple pendant 48 heures. La nature de l'agitation et la granulométrie du composé phosphocalcique précurseur ont un effet sur la proportion de composé gem-biphosphonique qui peut être greffé. Il est donc préférable, lorsqu'une granulométrie donnée a été choisie pour le composé phosphocalcique précurseur, d'adapter l'agitation de sorte à ne pas modifier ladite granulométrie. Les acides ou les sels qui peuvent être utilisés comme composés gem-biphosphoniques répondent à la formule (OY) (OX) P (0) -CR1R2~P (0) (OX) (OY) dans laquelle X ou Y représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un cation de métal alcalin ou alcalino-terreux, RI représente H, OH ou un halogène, et R2 représente : un hydrogène ou un halogène, un radical alkyle, un radical aminoalkyle dans lequel le groupe amino porte éventuellement un substituant alkyle, un radical alkylamino, un radical alkyle portant un substituant aromatique com- prenant au moins un atome N, un radical alkyle portant un groupe thioéther aromatique. Lorsque R et/ou R représentent un halogène, Cl est particulièrement préféré. Lorsque R2 est un radical alkyle, on préfère les alkyles ayant de 1 à 6 atomes de carbone. Lorsque R2 est un radical aminoalkyle, on préfère les radicaux NH2 (CH) n- dans lesquels n est inférieur à 6. Lorsque R2 est un radical alkylaminoalkyle, on préfère les radicaux R'R"N (CH2) m- dans lesquels R'et R"représentent indépendamment l'un de l'autre H, ou un radical alkyle ayant au plus 5 atomes de carbone, et, m est inférieur à 6. Lorsque R2 est un radical alkylamino, on préfère les radicaux RCNH- dans lesquels Rc est un cycloalkyle ayant de 3 à 7 atomes de carbone. Lorsque R2 est un radical alkyle portant un substituant aromatique comprenant au moins un atome N, on préfère les alkyles ayant au plus 3 atomes de carbone et portant un groupe pyridinyle ou imidazolyle. Lorsque R2 est un radical alkyle portant un groupe thio- éther aromatique, on préfère les alkyles ayant au plus 3 atomes de carbone et portant un groupe phénylthio dans lequel le groupe phényle porte éventuellement un substituant halogène. Parmi ces composés gem-biphosphoniques, on peut citer : 'l'étidronate (R = OH, R2 = CH3), 2 : le clodronate (RI = Cl, R2 = Cl), 2 le pamidronate (R = OH, R =-CHzCINH), 2 'l'alendronate (R = OH, R2 =-2) 3NH2), 2 le risedronate (RI = OH, R2 =-CH2-3-pyridine), 2 le tiludronate (R = H, R2 =-CI-S-CeH-Cl), l'ibandronate (R'OH, R2 =-CH2-CH2-N (CH3) pentyle), 2 : le zoledronate (RI = OH, R2 =-CH2-imidazole), 'l'incadronate (R = H, R2 =-NH- (cycloheptyle)), # l'olpadronate (R1 = OH, R2 = CH2-CH2-N (CH3) 2), le neridronate (R1 = OH, R2 = -(CH2)5NH2). Les acides dans lesquels R2 est un radical alkyle portant un substituant aromatique comprenant au moins un atome N, tels que le zoledronate ou le risedronate, sont particulièrement préférés. Un composé phosphocalcique modifié selon l'invention est caractérisé par la composition chimique suivante : Ca (io-a) (Mg, K, Na) b (P04) 6-c (HP041 C03) d (OH) 2-e (F, Cl, COs) f [ (OA) (OE) P (0)-CRlR2~p (0) (OA) (OE)] g, dans laquelle A et E représentent H ou néant, et où RI et R2 ont la signification donnée ci-dessus, et 0 La teneur en acide gem-biphosphonique d'un composé phosphocalcique modifié peut être déterminée par spectroscopie UV-visible selon la méthode décrite par Ames, B. N., notamment dans Methods in Enzymology, Colowick, S. P. and Kaplan, N. O. Eds., Academic Press, Orlando, 1966, vol. 8, pp. 115-118. Elle peut en outre être déterminée par RMN liquide 31p. La caractérisation du composé phosphocalcique modifié peut être effectuée essentiellement par la RMN du solide 31p MAS qui montre à la fois la présence du support phosphocalcique et celle du principe actif. Un autre objet de l'invention est une composition utilisable par injection pour le traitement d'ostéoporose ou de récidives de tumeurs lytiques par inhibition de l'activité ostéoclastique. Ladite composition est une suspension du composé phosphocalcique modifié défini ci-dessus dans une solution ou un gel biocompatible présentant une viscosité permettant le transport de granules de taille comprise entre 40 um et 500 um. A titre d'exemple, on peut citer les hydrogels d'intérêt biologique décrits dans Chem. Rev. (2001) ; 101 (7) : 1869-1879, notamment les hydrogels dérivés de la cellulose ou à base d'hyaluronate de sodium. Le choix du diamètre particulaire est guidé par la cinétique de résorption d'une part et la rhéologie à l'injection d'autre part. Les particules de diamètre inférieur à 40um présentent une cinétique de biorésorption trop rapide et les particules de diamètre supérieur à 500 um présentent des problèmes de rhéologie à l'injection. Il est toutefois entendu qu'une faible proportion de particules (jusqu'à 10% en volume) peut avoir un diamètre inférieur à 40um ou supérieur à 500um. Une composition injectable selon l'invention contient de préférence de 40 % à 75 % en masse de composé phosphocalcique modifié, de 60 % à 25 % en masse d'hydrogel, et éventuellement divers additifs. Les additifs sont choisis parmi les composés capables d'introduire divers ions d'intérêt biologique tels que par exemple : K+, Na+, Zn\ Mg, C03', HPO',, F' ou Cl'. La composition peui être préparée en mettant en sus- pension dans le milieu approprié le composé phosphocalcique modifié préparé dans une étape préliminaire. Il peut en outre être préparé en précipitant le composé phosphocalcique modifié in situ, à partir d'un hydrogel défini comme précédemment et préalablement chargé en ions phosphates (respectivement calcium) dans lequel sera ajoutée une solution appropriée contenant des ions calcium (respectivement phosphates) et la concentration souhaitée en acide biphosphonique. Le mode d'association entre la matrice phosphocalcique et l'acide biphosphonique est différent suivant la matrice phosphocalcique utilisée, et cette différence se traduit par une efficacité biologique différente lors de tests in vitro sur des cultures d'ostéoclastes. La composition selon l'invention, sous forme injectable, permet de traiter localement un problème osseux sur les principaux sites à risques identifiés (col du fémur et corps vertébraux), à l'aide d'un principe actif connu pour son utilisation par voie systémique qui présente divers inconvénients rappelés précédemment. En outre, la phase phosphocalcique, qui joue le rôle de vecteur du principe actif, exerce un effet complémentaire en ce sens qu'elle permet de maintenir l'acide gem-biphosphonique en place, et qu'elle constitue une source de calcium et de phosphate nécessaire pour la stimulation du remodelage osseux. L'hydroxyapatite (HA) décrite dans l'art antérieur comme matrice d'un implant imprégné d'un principe actif ne fait pas partie des composés phosphocalciques utilisables dans la présente invention, car elle a une solubilité relativement faible, elle possède intrinsèquement un caractère faiblement résorbable, et l'introduction d'acide gem-biphosphonique diminue le potentiel de résorbabilité des composés phosphocalciques de manière générale. Les exemples La présente invention est décrite plus en détail par les exemples suivants, qui sont donnés à titre d'illustration, mais auxquels l'invention n'est pas limitée. Les composés et réactifs suivants ont été utilisés : eau ultra-pure : eau ayant une résistivité voisine de 18 MQ cm 'zoledronate de sodium : acide gem biphosphonique commercialisé par la société Novartis 'tiludronate de sodium : acide gem biphosphonique commercialisé par la société Sanofi-Synthélabo 'CDA voie NaOH : hydroxyapatite déficiente en calcium obtenue par hydrolyse de phosphate dicalcique dihydraté avec une solution aqueuse de NaOH), sous forme de granules ayant une granulométrie entre 40-80 um) 'CDA voie ammoniaque (hydroxyapatite déficiente en calcium obtenue par hydrolyse de phosphate dicalcique dihydraté avec de l'ammoniaque), sous forme de granules ayant une granulométrie entre 40-80 um 'P-TCP, sous forme de granules ayant une granulométrie entre 40-80 um. Exemple 1 Préparation d'un composé phosphocalcique modifié On a préparé une suspension de phosphate de calcium en introduisant 700 mg de BCP ayant une granulométrie de 40- 80 um, dans 3, 5 ml d'eau ultra-pure, et on a ajouté 56 mg (0, 14 mmol) de zoledronate. On a placé la suspension dans un tube maintenu à température ambiante, et on a agité par un agitateur rotatif à 16 tr/min pendant 48 h. Ensuite, on a centrifugé la suspension et on a séparé le culot du surnageant. La phase solide a ensuite été lavée plusieurs fois avec de l'eau ultra-pure, puis filtrée et séchée à température ambiante. Le procédé a également été mis en oeuvre à partir des composés phosphocalciques suivants : CDA voie NaOH, CDA voie ammoniaque et ss-TCP. Caractérisation des composés phosphocalciques modifiés La quantité de zoledronate incorporée dans chacune des matrices phosphocalciques a été déterminée par différence, en dosant la quantité de zoledronate présente dans le surnageant. Ce dosage a été effectué, sur la solution surnageante séparée du culot après centrifugation, par RMN liquide 31p à partir de courbes d'étalonnage préalablement établies. Il peut également être effectué par spectroscopie UV-visible selon la méthode précitée décrite par Ames. Les résultats obtenus pour chacun des composés phosphocalciques précurseurs sont donnés dans le tableau cidessous. T (%) indique la teneur en zoledronate dans le produit final, exprimée en mg de principe actif pour 100 mg de composé phosphocalcique, et P (%) indique le pourcentage de zoledronate fixé sur le composé par rapport à la quantité introduite dans le milieu réactionnel : Précurseur T (%) P (%) BCP 1 13 CDA voie NaOH 5, 2 65 CDA voie ammoniaque 6, 4 80 ss-TCP 6, 4 80 La figure 1 représente le spectre RMN liquide 31p du surnageant obtenu après centrifugation du milieu réactionnel correspondant au précurseur CDA (voie NaOH). L'intégration des signaux rend compte de l'abondance de chaque espèce et le déplacement chimique (caractéristique de l'espèce) est porté en abscisse. Le pic 1 représente la teneur en zoledronate, le pic 2 représente le phosphate relargué dans le milieu par le composé phosphocalcique et le pic 3 représente la référence NaH2PO4- Le spectre RMN liquide 31p des composés obtenus à partir des autres précurseurs (sauf l'hydroxyapatite) est analogue et l'on remarque dans tous les cas un relargage de phosphate en cours de réaction. La caractérisation des solides obtenus montre deux modes d'association différents du zoledronate suivant la nature du t composé phosphocalcique de départ. La figure 2 représente une photographie par microscopie électronique à balayage (M. E. B.) effectuée sur le composé issu du P-TCP. Elle montre qu'une forme de zoledronate (probablement associée à du calcium) cristallise à la surface de la matrice phosphocalcique. Le même phénomène est observé dans le cas du BCP. Les données RMN'du solide 31p MAS sont représentées sur la figure 3 pour le composé issu du P-TCP. Le spectre 1 acquis en mode CP (Polarisation Croisée) permet d'observer sélectivement le zoledronate incorporé. Les signaux fins rendent compte de sa présence sous une forme cristalline. Le spectre 2 enregistré en mode découplage proton permet d'observer sélectivement le support ss-TCP non altéré. Le spectre RMN du solide 31p CP-MAS est représenté sur la figure 4 pour le composé issu du CDA (voie ammoniaque). Le signal du zoledronate (pic 1) est très large. Aucune phase cristalline n'est détectée à la surface du matériau, ce qui indique probablement une chimisorption du zoledronate à la surface du CDA. Le pic 2 est caractéristique du CDA. Exemple 2 Préparation de composés phosphocalciques modifiés par le tiludronate et l'acide méthylène biphosphonique On a préparé une suspension de phosphate de calcium en introduisant 700 mg de P-TCP ayant une granulométrie de 40- 80 um, dans 3,5 ml d'eau ultra pure, et on a ajouté 52,5 mg (0,14 mmol) de tiludronate. On a placé la suspension dans un tube maintenu à température ambiante, et on a agité par un agitateur rotatif à 16 tr/min pendant 48 h. Ensuite, on a centrifugé la suspension et on a séparé le culot du surnageant. La phase solide a ensuite été lavée plusieurs fois avec de l'eau ultra-pure, puis filtrée et séchée à température ambiante. Une réactivité semblable à celle enregistrée avec le zoledronate est observée. La figure 5 montre le spectre RMN 31p CP-MAS du ss-TCP traité par le tiludronate. Le tiludronate peut être observé sous forme d'une phase cristalline (massif 1 constitué de signaux fins) déposée sur la phase phosphocalcique (qui apparaît faiblement (massif 2) dans ces conditions d'enregistrement du spectre. Exemple 3 Préparation d'une composition injectable On a préparé une composition injectable à partir de chacun des.. composés modifiés obtenus dans les exemples 1 et 2, à l'exception des composés modifiés obtenus à partir d'hydroxyapatite, selon le procédé suivant. Pour chaque composé modifié, on a préparé des granules dont 95% en volume avaient un diamètre particulaire équivalent compris entre 40 et 80 um, et on a introduit ces granules dans une solution aqueuse contenant 3% d'hydroxypropylméthylcellulose comprenant 21% en masse de groupe méthyle et 8% en masse de groupe hydroxypropyle avec un degré de polymérisation égal à 110, de façon à obtenir une composition comprenant 49% en masse de granules. Chacune des compositions ainsi préparées a été introduite dans un flacon de verre et stérilisée à l'autoclave à 1210C pendant 20 minutes. Exemple 4 Tests in vitro de phosphates de calcium modifiés Des cellules osseuses totales, isolées à partir d'os longs de lapins nouveaux-nés, ont été utilisées pour évaluer l'efficacité de l'association du composé phosphocalcique modifié. Les performances du BCP modifié et du CDA voie ammoniaque modifié obtenus dans l'exemple 1 ont été mesurées et comparées avec celle du précurseur phosphocalcique respectif non traité par l'acide gem-biphosphonique. Pour chaque essai, on a chargé dans un premier puit de culture deux pastilles de dentine de cachalot (composé de référence pour la mesure de la résorption) et une pastille de composé phosphocalcique non traité, et dans un second puit de culture, deux pastilles de dentine et une pastille de composé phosphocalcique traité en surface. L'activité de résorption des ostéoclastes dans ces conditions de culture a été évaluée (après 5 jours) par trois paramètres différents : 1-Le nombre de total de lacunes formées à la surface de la dentine de cachalot 2-La surface moyenne des lacunes 3-La surface de dentine résorbée. Il apparaît que : 'En présence de pastilles de BCP modifiées par 1 % de zoledronate en poids, l'activité de résorption résiduelle des cellules osseuses du modèle était indétectable. 'En présence de pastilles de CDA modifiées par 6,4 % de zoledronate en poids, l'activité de résorption des cellules était réduite d'environ 80 % par rapport au contrôle sans zoledronate. Ces résultats montrent que les performances du matériau résultent non pas de la seule quantité de zoledronate fixée sur la matrice phosphocalcique, mais aussi de la vitesse de relargage du zolédronate, et ils confirment un effet à distance de la matrice phosphocalcique modifiée. Revendications 1. Composé phosphocalcique caractérisé en ce qu'elle présente la composition chimique suivante : Ca (io-a) (Mg, K, Na) b (P04) 6-c (HP04, COs) d (OH) 2-e (F,Cl,CO3) f [ (OA) (OE) P (0)-CRlR2~p (0) (OA) (OE)] g, dans laquelle 0 O 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R et/ou R représentent Cl. 3. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R2 est un radical ayant de 1 à 6 atomes de carbone. 4. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R2 est un radical aminoalkyle NH2 (CH) n- dans lequel n est inférieur à 6. 5. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R2 est un radical alkylaminoalkyle R'R"N (CH2) m- dans lequel R'et R"représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un radical alkyle ayant au plus 5 atomes de carbone, et m est inférieur à 6. 6. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R2 est un radical alkylamino RCNH- dans lequel RC est un cycloalkyle ayant de 3 à 7 atomes de carbone. 7. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R2 est un radical alkyle ayant au plus 3 atomes de carbone et portant un groupe pyridinyle ou imidazoyle. 8. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R2 est un radical alkyle ayant au plus 3 atomes de carbone et portant un groupe phénylthio dans lequel le groupe phényle porte éventuellement un substituant halogène. 9. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que RI est OH, R2 est-CH2-imidazole, A et E représentent H. 10. Procédé de préparation d'un composé phosphocalcique modifié selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter un acide gem-biphosphonique ou l'un de ses sels de métal alcalin ou alcalino-terreux à une suspension d'un composé phosphocalcique précurseur dans l'eau ultrapure, à agiter le milieu réactionnel à température ambiante, puis en récupérer par centrifugation le composé formé. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le composé formé est purifié par lavage à l'eau ultrapure, suivi d'une filtration et d'un séchage à l'air à température ambiante. 12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le composé phosphocalcique précurseur est choisi parmi les orthophosphates de calcium ayant une solubilité dans l'eau supérieure à 10-122 mol 1-1. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le composé phosphocalcique est choisi parmi le BCP, le CDA qui est une hydroxyapatite déficiente en calcium et le ss- TCP. 14. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'agitation à température ambiante est maintenue pendant une durée entre 1 h et 72 h. 15. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les acides ou les sels utilisés comme composés gembiphosphoniques répondent à la formule (OY) (OX) P (0)- CR1R2~p (0) (OX) (OY) dans laquelle X ou Y représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un cation de métal alcalin ou alcalino-terreux, R représente H, OH ou un halogène, et R2 représente : * un hydrogène ou un halogène, * un radical alkyle, * un radical aminoalkyle dans lequel le groupe amino porte éventuellement un substituant alkyle, * un radical alkylamino, * un radical alkyle portant un substituant aromatique com- prenant au moins un atome N, * un radical alkyle portant un groupe thioéther aromatique. 16. Composition utilisable par injection pour le traitement d'ostéoporose ou de récidives de tumeurs lytiques par inhibition de l'activité ostéoclastique, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une suspension du composé phosphocalcique modifié selon la revendication 1, dans une solution ou un gel biocompatible présentant une viscosité permettant le transport de granules de taille comprise entre 40 um et 500 um. 17. Composition selon la revendication 16, caractérisée en ce que le gel biocompatible est un hydrogel d'intérêt biologique. 18. Composition selon la revendication 17, caractérisée en ce que le gel est un hydrogel dérivé de la cellulose ou un gel à base d'hyaluronate de sodium.