Brevet FR2833967A1 — publié le 20030627

L'invention est relative au domaine des ferments lactiques et à leur utilisation pour intensifier la flaveur de produits alimentaires affinés. Elle est tout particulièrement destinée à des fromages et des spécialités fromagères, et notamment des fromages de type pâte pressée sans flore de surface, dont la flore est essentiellement composée de bactéries lactiques, tels que le St Paulin, le Gouda et le Cheddar. Ces fromages ont très peu d'arôme lorsqu'ils sont jeunes et n'acquièrent leurs qualités aromatiques qu'après un affinage très long qui peut aller de 6 à 12 mois. Les industriels fromagers cherchent donc des moyens d'intensifier la flaveur des fromages jeunes ou à raccourcir les durées d'affinage pour l'obtention de fromages matures ou plus typés . Ces dernières années, il a été montré que le catabolisme des acides aminés était une voie majeure de formation de molécules aromatiques dans les fromages et que les bactéries lactiques et plus particulièrement les lactocoques qui sont largement utilisés comme levain dans l'industrie, avaient les activités enzymatiques nécessaires à la transformation des acides aminés en composés d'arôme (pour revue, cf. YVON et RIJNEN, International Dairy Journal, 11, 185-201,2001). Chez les bactéries lactiques, la première étape de la transformation des acides aminés en composés d'arômes est une transamination, qui nécessite la présence d'un cétoacide accepteur du groupement aminé. Précédemment, les Inventeurs ont montré qu'un facteur limitant de la conversion des acides aminés en molécules aromatiques était la faible production de cétoacides par les bactéries lactiques, et que l'addition de cétoacides tels que l'a-cétoglutarate dans les caillés fromagers avant l'affinage permettait une augmentation du catabolisme des acides aminés, et notamment de celui des acides aminés ramifiés (leucine, valine, isoleucine), aromatiques (phénylalanine, tryptophane, et tyrosine) et de la méthionine par les lactocoques présents dans ces caillés, aboutissant à une nette intensification de la flaveur des fromages (PCT WO 98/48645 ; YVON et al., International Dairy Journal, 8,889-898, 1999). Parmi les modes d'addition de cétoacides proposés dans la Demande PCT WO 98/48645, figure l'utilisation de souches bactériennes capables de produire de l'a-cétoglutarate à partir du glutamate présent, lui, en grande quantité dans les fromages. Ce mode d'addition est potentiellement très avantageux, du fait que sa mise en oeuvre peut s'effectuer par simple incorporation d'une ou plusieurs de ces souches dans le ferment fromager. Les Inventeurs ont ainsi démontré qu'une souche de Lactococcus lactis génétiquement modifiée, possédant une activité glutamate déshydrogénase, laquelle catalyse la transformation du glutamate en a-cétoglutarate était capable de produire suffisamment d'a-cétoglutarate pour intensifier fortement la transformation des acides aminés en composés d'arôme (RIJNEN et al., Applied and Environmental Microbiology, 66,1354- 1359,2000). Toutefois, l'utilisation de souches génétiquement modifiées dans l'industrie agroalimentaire pose actuellement de nombreux problèmes, notamment réglementaires. En examinant les autres voies possibles de formation d'a-cétoglutarate chez les bactéries lactiques, les Inventeurs ont constaté que les bactéries capables de fermenter le citrate avaient théoriquement les activités enzymatiques nécessaires à la formation d'a-cétoglutarate à partir du citrate et du glutamate naturellement présents dans le lait ou le fromage. Un petit nombre de bactéries lactiques sont capables de fermenter le citrate. Il s'agit principalement de Lactococcus lactis ssp. diacetylactis et des leuconostocs (HUGENHOLZ, FEMS Microbiology Reviews, 12, 165-178,1993). Certains lactobacilles hétérofermentaires tels que Lb. plantarum et Lb. casei semblent également capables, dans une moindre mesure, de fermenter le citrate (PALLES et al., Journal of Applied Microbiology, 85,147-154, 1998). A cause de leur capacité à produire du diacétyle, les L. lactis ssp. diacetylactis et les leuconostocs sont largement utilisés en cultures mixtes dans l'industrie des fromages frais, du beurre, du babeurre, du cottage cheese et des fromages jeunes. Elles sont également utilisées pour augmenter la flaveur douce des fromages de Cheddar à taux réduit de matière grasse (MIDJE et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48,1630-1636, 2000). Les voies de formation du diacétyle ont été bien étudiées et de nombreuses stratégies d'ingénierie métabolique ont été proposées pour obtenir des souches produisant de grandes quantités de diacétyle (HUGENHOLTZ et al., Applied and Environmental Microbiology, 66,4112-4114, 2000 ; BOUMERDASSI et al., Applied and Environmental Microbiology, 63,2293- 2299,1997 ; MONNET et al., Applied and Environmental Microbiology, 66,5518-5520, 2000 ; US 4,304, 862, EP 0 937 774, PCT WO 98/07843). Les bactéries lactiques capables de fermenter le citrate possèdent une citrate perméase et une citrate lyase qui permettent respectivement le transport du citrate à l'intérieur des cellules et sa conversion en oxaloacétate (OAA) et acétate. Chez L. lactis diacetylactis et chez les leuconostocs, la majeure partie de l'OAA est ensuite décarboxylée par l'OAA-décarboxylase en pyruvate. Celui-ci est finalement transformé en acétate et en lactate, et également en acétoïne et en diacétyle (HUGENHOLZ et STARRENBURG, Applied Microbiology and Biotechnology, 38,17- 22,1992 ; COGAN, Journal of Dairy Research, 48,489-495, 1981). Chez Lactobacillus plantarum et Lactobacillus pentosus, une partie de l'oxaloacétate est d'autre part transformée en succinate (LINDGREN et al., FEMS Microbiology Letters, 66,209-214, 1990 ; CSELOVSZKY et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 37, 94-97,1992). L'oxaloacétate peut également servir d'accepteur de groupement aminé pour l'aspartate aminotransférase qui catalyse la transamination entre le glutamate et l'oxaloacétate pour donner l'aspartate et l'a-cétoglutarate. Cette activité aspartate aminotransférase est ubiquitaire chez les bactéries et a été mise en évidence chez de nombreuses bactéries lactiques et en particulier chez Lactococcus lactis (DUDLEY et STEELE, Microbiology, 147,215- 224,2001). La Figure 1 résume l'ensemble de ces voies de fermentation du citrate. Les bactéries qui fermentent le citrate apparaissent donc théoriquement capables de produire de l'a-cétoglutarate à partir de citrate et de glutamate. Cependant, en pratique, elles utilisent pendant leur croissance le citrate présent dans le lait et le métabolisent très rapidement. Ainsi, dans les caillés fabriqués avec des levains contenant des Lactococcus lactis subsp. diacetylactis ou des Leuconostoc, il ne reste plus de citrate au moment où l'affinage des fromages commence, tandis que dans les caillés fabriqués avec des bactéries incapables de métaboliser le citrate, la concentration de citrate au même stade de fabrication est de l'ordre de 8 à 10 mM. Les Inventeurs ont eu l'idée d'utiliser des souches possédant les activités citrate lyase et aspartate aminotransférase nécessaires à la transformation du citrate en a-cétoglutarate, mais n'ayant plus d'activité citrate perméase responsable de l'utilisation rapide du citrate pendant leur croissance ; ils ont émis l'hypothèse que dans ces souches citrate perméase négatives, le citrate ne serait plus utilisé pendant la phase de croissance, et pourrait ensuite diffuser lentement, de façon passive, à l'intérieur des cellules, pendant l'affinage du fromage. Ainsi, le citrate pourrait être progressivement dégradé en OAA et une partie de celui-ci pourrait être utilisée par l'aspartate aminotransférase pour transformer le glutamate en a-cétoglutarate. L'a-cétoglutarate généré pourrait être utilisé pour la transformation des acides aminés en molécules d'arôme. Chez les lactocoques et les leuconostocs, le gène codant pour la citrate perméase se trouve sur un plasmide. Ce plasmide est assez stable mais peut être éliminé en ajoutant dans les milieux de culture de l'acridine orangé qui inhibe sélectivement la réplication de l'ADN plasmidique (KEMPLER et McKAY, Applied and Environmental Microbiology, 37,316-323, 1979). En utilisant cette technique, les Inventeurs ont isolé à partir de 3 souches de L. lactis subsp. diacetylactis des mutants n'utilisant plus le citrate pendant leur croissance, et les ont utilisés pour vérifier leur hypothèse. Les Inventeurs ont ainsi démontré que ces souches étaient capables de produire de l'a-cétoglutarate dans des milieux contenant du citrate et du glutamate, dans des conditions de pH similaires aux conditions d'affinage (pH 5,2). De plus, en présence d'un acide aminé, tel que phénylalanine ou leucine, le cétoglutarate est utilisé pour transformer l'acide aminé en composés d'arôme. De façon intéressante, les métabolites obtenus sont majoritairement des acides carboxyliques qui sont des composés d'arômes puissants. La présente invention a pour objet l'utilisation d'une souche de bactérie lactique possédant une activité citrate-lyase et une activité aspartate aminotransférase et ne possédant que peu ou pas d'activité citrate perméase, pour produire de l'a-cétoglutarate à partir de citrate et de glutamate. Avantageusement, ladite souche appartient à une espèce choisie parmi Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Leuconostoc, Lactobacillus plantarum et Lactobacillus pentosus. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, ladite souche est utilisée pour augmenter la dégradation des acides aminés en composés d'arômes par des bactéries lactiques, notamment dans le cadre de l'affinage de produits alimentaires fermentés, par exemple des produits laitiers, et en particulier de fromages, notamment dans le cas de pâtes pressées sans flore de surface, tels que les fromages à croûte artificielle. Dans le cadre de la mise en oeuvre de la présente invention pour la fabrication de produits alimentaires fermentés, une ou plusieurs souches de bactéries lactiques possédant une activité citrate-lyase et une activité aspartate aminotransférase et ne possédant que peu ou pas d'activité citrate perméase, sont utilisées comme ferment, ou incorporées à un ferment comprenant d'autres souches de bactéries lactiques. Dans ce dernier cas, ces autres souches seront de préférence choisies parmi des bactéries utilisant peu ou pas de citrate, afin que la teneur en citrate en fin de fermentation soit suffisante pour permettre la formation d'a-cétoglutarate. En particulier, ces autres bactéries lactiques pourront être choisies parmi les espèces Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactobacillus delbrueckii lactis, Lactobacillus delbrueckii bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Streptococcus thermophilus. La présente invention fournit également un procédé d'obtention de souches utilisables pour la production d'a-cétoglutarate, conformément à l'invention. Ce procédé comprend l'obtention, à partir de souches de bactérie lactique capable de fermenter le citrate, de mutants citrate-perméase négatifs (CitP-), et la détermination de l'activité aminotransférase desdits mutants. Des mutants CitP-peuvent être facilement obtenus, dans le cas des espèces chez lesquelles le gène codant la citrate perméase est à localisation plasmidique, tels que les lactocoques et des leuconostocs, en curant une souche capable de fermenter le citrate du plasmide portant le gène de la citrate perméase. Ceci peut être effectué par exemple, par culture dans un milieu contenant de l'orangé d'acridine, comme indiqué ci-dessus, ou par cultures successives dans un milieu ne contenant pas de citrate (COLLINS et HARVEY, Journal of Dairy Sciences, 42,32-35, 1962). Alternativement, des mutants CitP-peuvent être obtenus par disruption du gène codant pour la citrate perméase, en utilisant des techniques classiques de biologie moléculaire permettant l'obtention de mutants de qualité alimentaire ("food-grade"). Les mutants CitP-peuvent ensuite être sélectionnés sur la base de la perte de leur capacité à assimiler le citrate présent dans le milieu de culture. On peut par exemple utiliser le milieu décrit par KEMPLER et McKAY (Applied and Environmental Microbiology, 39,926-927, 1980), sur lequel les clones possédant l'équipement enzymatique nécessaire à l'assimilation du citrate forment des colonies de couleur bleu foncé. Sur ce milieu, les clones ne possédant plus d'activité citrate perméase forment des colonies de couleur blanche. On peut également sélectionner, à l'aide de ce milieu, des souches ne possédant (naturellement ou après mutation) qu'une faible capacité à transporter le citrate, qui peuvent également être utilisées pour la mise en oeuvre de la présente invention. Ces souches forment des colonies ne possédant qu'une très faible coloration bleue. On peut également cribler les mutants sur la base de l'absence ou de l'altération du gène citrate perméase, par les techniques classiques d'hybridation ou d'amplification PCR, à l'aide de sondes d'acide nucléique ou d'amorces obtenues à partir de la séquence de ce gène. Des souches dépourvues d'activité citrate perméase peuvent également être trouvées parmi des mutants spontanés CitP-de bactéries lactiques capables de fermenter le citrate. Il peut s'agir notamment de mutants spontanés CitP-de L. lactis subsp. diacetylactis qui ont été classés comme L. lactis subsp. lactis bien qu'ils possèdent une activité citrate-lyase (COLLINS et HARVEY, Journal of Dairy Sciences, 42,32-35, 1962). Dans ce cas, le criblage de ces souches peut se faire à partir de bactéries lactiques ne fermentant pas le citrate, en détectant la présence des gènes codant pour les sous-unités de la citrate lyase, par les techniques classiques de biologie moléculaire, ou bien en détectant la production de citrate lyase, par exemple par des techniques immunologiques (DAVID et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 44,68-74, 1995), ou bien en détectant la capacité de cellules provenant d'une culture à utiliser le citrate après perméabilisation des cellules (par exemple, traitement au toluène/acétone ou à l'éthanol). Les souches possédant une activité citrate-lyase et ne possédant que peu ou pas d'activité citrate perméase, obtenues par l'une ou l'autre des stratégies indiquées cidessus, possèdent dans la plupart des cas une activité aspartate aminotransférase, cette activité étant très répandue chez les bactéries lactiques. Avantageusement, on pourra toutefois effectuer une étape de criblage supplémentaire, permettant de sélectionner les souches capables de produire une quantité d'a-cétoglutarate appropriée pour le type d'utilisation souhaitée. Cette étape s'effectue en déterminant la quantité d'a-cétoglutarate produit par la souche à tester à partir du glutamate et en présence de citrate. Cette détermination peut s'effectuer selon les méthodes classiques, de dosage d'activité enzymatique, en incubant les bactéries à tester dans un milieu réactionnel contenant du citrate et du glutamate, ainsi que les cofacteurs nécessaires à l'activité aminotransférase et à l'activité citrate-lyase. Les produits de la réaction de transamination peuvent être dosés par des techniques classiques de chromatographie. Les souches possédant le niveau souhaité de production d'a-cétoglutarate seront sélectionnées. Généralement, on sélectionnera de préférence des souches capable de produire au moins 0,5 umoles/ml d'a- cétoglutarate pour une concentration bactérienne de 1010 ufc (unités formant colonies) /ml après 10 heures d'incubation à 37 C dans du tampon phosphate 100 mM à pH 5, 2 contenant 50 uM de phosphate de pyridoxal, 3 mM de MgCl2, 10 mM de citrate et 10 mM de glutamate. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui illustre l'obtention de mutants citrate perméase négatifs à partir de bactéries capables de fermenter le citrate, et l'utilisation de ces mutants pour la production d'a- cétoglutarate et l'augmentation de la production de composés d'arômes par des bactéries lactiques. EXEMPLE 1 : ISOLEMENT DE MUTANTS CITRATE PERMEASE NEGATIFS A PARTIR DE SOUCHES DE L. LACTIS DIACETYLACTIS Des mutants CitP-ont été isolés à partir de 3 souches de L. lactis diacetylactis désignées ci-après A, B, C, en les cultivant en présence d'acridine orangé qui inhibe sélectivement la réplication de l'ADN plasmidique. Chaque souche est d'abord cultivée dans un milieu M17-lactose (TERZAGHI et SANDINE, Applied Microbiology, 29,80-813, 1975). Les cultures en fin de phase exponentielle de croissance sont diluées à 103 cellules par ml dans le même milieu contenant de 0 à 25 ug d'acridine orangé par ml. Pour chaque souche, la culture ayant poussé, après 24 à 48 h, avec la plus forte concentration en acridine orangé, est diluée et étalée sur des boites contenant le milieu de sélection de KEMPLER et McKAY (Applied and Environmental Microbiology, 39, 926-927,1980). Après 48 h d'incubation à 30 C, les colonies blanches sont isolées et repiquées sur milieu M17-lactose. Le génotype CitP-de ces clones a ensuite été vérifié : la perte du plasmide de 5,5 Kb portant le gène CitP a été vérifiée par électrophorèse de l'ADN plasmidique extrait en utilisant le kit KIAprep Spin, miniprep (QUIAGEN S. A., France). L'absence d'amplification par PCR à l'aide d'amorces dérivées de la séquence du gène CitP (5'-ATG-ATG-AAT-CAC-CCG-3'et 5'-ACT-TCA-ATG-TGA-C-3') montre également que le gène CitP est absent dans ces mutants. EXEMPLE 2 : UTILISATION DU CITRATE PAR LES 3 SOUCHES DE L. LACTIS DIACETYLACTIS ET LEURS SOUCHES DERIVEES CitP-AU COURS DE LEUR CROISSANCE SUR LAIT Pour cette étude, une souche de L. lactis subsp. lactis TIL 46 (ne possédant pas l'activité citrate-lyase) et sa souche dérivée CitP+ ont été utilisées comme contrôles. La souche dérivée CitP+ a été obtenue par électroporation du plasmide pFL3 contenant le gène CitP (MAGNI et al., FEMS Microbiology Letters, 118,75-82, 1994) dans la souche TIL 46. Les 3 souches initiales de L. lactis diacetylactis (A, B et C) et les 3 souches dérivées CitPobtenues à l'exemple 1, ainsi que les 2 souches contrôles sont cultivées dans du lait. Pour cela, 50 ml de lait reconstitué à 10% à partir de poudre de lait NILAC (NIZO, Ede, The Netherlands) et stérilisé 10 min à 1100C sont ensemencés à 2% avec des précultures cultivées également sur lait. Ces précultures sont obtenues en inoculant une série de tubes de lait NILAC à des concentrations de 0,5, 1, 2 et 4% avec une préculture cultivée sur milieu M17-lactose. La préculture sur lait la plus développée mais non coagulée est utilisée pour inoculer la culture. La croissance des souches est suivie par mesure de la densité optique à 480 nm après avoir effectué une dilution au 1/10ème avec une solution d'EDTA à 5 mM pH 12, et par mesure du pH. La densité optique et le pH sont mesurés toutes les 2 heures jusqu'à coagulation. En même temps un prélèvement de 1 ml est effectué pour doser le citrate résiduel. Dans ce prélèvement, les cellules bactériennes sont éliminées par centrifugation 5 min à 8000 rpm, puis les protéines sont précipitées par addition d'acide trichloroacétique à une concentration finale de 10%. Après centrifugation pendant 5 min à 13500 rpm, le citrate est dosé dans le surnageant par HPLC. Dix pl de surnageant sont injectés sur une colonne AMINEX (300 mm x 9,6 mm, BIORAD) équilibrée avec une solution d'H2SO4 10 mM et maintenue à 30 C. L'élution est réalisée en condition isocratique avec la solution d'H2SO4 10 mM à un débit de 0.8 ml/min et la détection est effectuée par mesure de l'absorbance à 210 nm. Une gamme étalon est réalisée par injection de quantités croissantes d'une solution standard de citrate de sodium (50 à 100 nmoles). La Figure 3 montre pour chaque souche citeet la souche citP+ correspondante (), la courbe d'acidification du lait (courbes en traits pointillés), qui reflète la croissance des souches, et l'utilisation du citrate du lait au cours de cette croissance (courbes en traits continus). La suppression du plasmide contenant le gène CitP ne modifie pas significativement la vitesse d'acidification des souches, ce qui indique que la perte de l'activité citrate perméase n'affecte pas ou peu la croissance des souches. Par contre, on peut noter des différences importantes de vitesses d'acidification entre souches. La souche C acidifie le plus rapidement (pH 5 après 6 heures de culture), la souche A acidifie le plus lentement (pH 5,3 après 11 h de culture) et la souche B est intermédiaire (pH 5 après 8 h de culture). Tandis que les souches de L. lactis diacetylactis CitP+ utilisent 96 à 98% du citrate pendant leur croissance, les souches dérivées CitP-n'en utilisent que très peu. De façon similaire, les 2 souches de L. lactis subsp. lactis n'utilisent pas le citrate au cours de leur croissance sur lait. Il reste donc dans les caillés obtenus avec les souches CitP-entre 8 et 9 mM de citrate. EXEMPLE 3 : PRODUCTION D'a-CETOGLUTARATE ET D'ASPARTAT PAR LES SOUCHES CitP-DERIVEES DE L. LACTIS DIACETYLACTIS A PARTIR DE CITRATE ET DE GLUTAMATE A PH 5,2 (PH DU FROMAGE) Pour déterminer le rôle de l'activité citrate-lyase dans la production d'a-cétoglutarate à partir de citrate et de glutamate, la souche de L. lactis subsp. lactis, ne possédant pas l'activité citrate lyase (TIL46) a été utilisée comme contrôle. La capacité des souches à produire de l'a-cétoglutarate et de l'aspartate à partir de citrate et de glutamate a été évaluée en incubant des cellules, préalablement cultivées sur lait et récoltées en fin de phase exponentielle de croissance, dans un milieu liquide à pH 5,2. Ce milieu se compose d'un tampon phosphate 100 mM pH 5,2 contenant 50 uM de phosphate de pyridoxal (cofacteur des aminotransférases), 3 mM de MgCl2 (cofacteur de la citrate-lyase), 10 mM de citrate et 10 mM de glutamate. Les cellules de chaque souche, provenant de 5 ml de culture sur lait à une DO 480 nm de 4 ( 10 cellules, sont incubées dans 1 ml du milieu de réaction. Des aliquotes sont prélevées après 1,2, 5,10, 20,40, 70 heures et 7 jours d'incubation à 37 C et les cellules sont éliminées par centrifugation 12 (8000 rpm, 5 min. ). Le citrate, l'a-cétoglutarate, l'acétate et le lactate sont dosés dans le surnageant par HPLC. La séparation et le dosage des acides sont effectués sur une colonne AMINEX comme décrit ci-dessus pour le dosage du citrate. L'aspartate est dosé à l'aide d'un analyseur automatique d'acides aminés LC 3000 (BIOTRONIK) dans les conditions préconisées par le fabricant de l'appareil. Les contrôles effectués dans le milieu de réaction dans lequel soit le glutamate, soit le citrate ont été omis montraient qu'aucune des souches ne produit d'a-cétoglutarate ni d'aspartate en absence de ces constituants. Le tableau I ci-dessous montre pour chaque souche la quantité de citrate utilisée et les quantités d'a-cétoglutarate, d'aspartate, d'acétate et de lactate formées après 10 heures d'incubation. Tableau 1 Souches A CitP-BCitP-C CitP-TIL46 Citrate utilisé (mM) 0, 4 4 0, 5 0 o-cétoglutarate formé (mM) 0, 1 1, 8 0, 150 Aspartate formé (mM) 0, 5 1, 4 0, 1 0 Acétate formé (mM) 1 7, 8 1 0 Lactate formé (mM) 0, 9270 Comme attendu, la souche TIL 46 qui ne possède pas de citrate lyase n'utilise pas du tout le citrate. Parmi les souches possédant une citrate lyase, la souche CitPdérivée de la souche B utilise la plus grande quantité de citrate et produit le plus d'a-cétoglutarate. Cette souche produit également la plus grande quantité d'aspartate et d'acétate. Les 2 autres souches Cit-consomment peu de citrate et forment assez peu d'a-cétoglutarate. EXEMPLE 4 : DEGRADATION DES ACIDES AMINES (PHENYLALANINE ET LEUCINE) PAR LES SOUCHES CitP-DERIVEES DE L. LACTIS DIACETYLACTIS DANS UN MILIEU CONTENANT DU CITRATE ET DU GLUTAMATE A pH 5,2. (UTILISATION DE L'a-CETOGLUTARATE FORME POUR LA TRANSAMINATION DES ACIDES AMINES). La capacité des différentes souches à utiliser l'a-cétoglutarate formé à partir du citrate et du glutamate pour la transamination des acides aminés, a été évaluée en incubant les cellules de chaque souche dans le même milieu que celui décrit ci-dessus, auquel 2 mM de leucine ou de phénylalanine ont été ajoutés. Pour suivre la dégradation des acides aminés, 0,05 uM de phénylalanine ou de leucine tritiée ont été ajoutés comme traceurs. Comme pour les essais précédents, des aliquotes ont été prélevées après 10,20, 40 et 70 heures d'incubation à 37 C. Dans ces prélèvements, les cellules sont éliminées par centrifugation et les métabolites formés sont analysés par HPLC avec une détection de radioactivité comme décrit précédemment (YVON et al., Applied and Environmental Microbiology, 63,414-419, 1997). La Figure 4 montre les métabolites formés à partir de la phénylalanine (A : N : phényipyruvate, : phényllactate, 0 : phénylacétate) et de la leucine (B : N : cétoisocaproate, : hydroxyisocaproate, 0 : isovalérate) par les différentes souches. Les résultats sont exprimés en pourcentage de l'acide aminé de départ. Aucune des souches ne dégrade significativement ni la phénylalanine ni la leucine dans les milieux de réaction ne contenant pas de citrate. En présence de citrate et de glutamate dans le milieu de réaction, la souche B CitP-, qui produit le plus d'a-cétoglutarate, dégrade également la plus grande quantité de phénylalanine et de leucine. Les 2 autres souches CitP- (A et C), qui produisent peu d'a-cétoglutarate ne dégradent que très faiblement la leucine mais la souche A dégrade une quantité un peu plus importante de phénylalanine. En revanche, la souche de L. lactis TIL46 ne dégrade que très peu la phénylalanine et pas du tout la leucine. Il est intéressant de noter que les métabolites majeurs formés par les souches CitP-sont des acides carboxyliques (phénylacétate et isovalérate) qui sont des composés d'arôme puissants. Ainsi, l'a-cétoglutarate formé à partir du citrate et du glutamate est bien utilisé pour la transamination des acides aminés présents dans le milieu. Le dosage de l'a-cétoglutarate restant dans les milieux en fin de réaction montre d'ailleurs que dans les milieux contenant un acide aminé (phénylalanine ou leucine), la quantité d' &alpha;-cétoglutarate restant est beaucoup plus faible que dans les milieux n'en contenant pas. REVENDICATIONS 1) Utilisation d'une souche de bactérie lactique possédant une activité citrate-lyase et une activité aspartate aminotransférase et ne possédant que peu ou pas d'activité citrate perméase, pour produire de l'a-cétoglutarate à partir de citrate et de glutamate. 2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite souche appartient à une espèce choisie parmi Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Leuconostoc, Lactobacillus plantarum, et Lactobacillus pentosus. 3) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite souche est utilisée pour augmenter la dégradation des acides aminés en composés d'arômes par des bactéries lactiques. 4) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite souche est utilisée pour l'affinage d'un produit alimentaire fermenté. 5) Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit produit alimentaire est un fromage ou une spécialité fromagère. 6) Procédé d'obtention de souches utilisables pour la production d'a-cétoglutarate selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend l'obtention de mutants citrate-perméase négatifs à partir de souches de bactéries lactiques capables de fermenter le citrate, (CitP-), et la sélection parmi lesdits mutants, de ceux capables de produire de l'a-cétoglutarate dans un milieu contenant du citrate et du glutamate.