Brevet FR2834719A1 — publié le 20030718

ration de l'aspect et de la douceur de la peau L'invention se rapporte au domaine de l'analyse microblologique des gaz. La contamination biologique par l'air est un sujet de préoccupation impor tant dans de nombreux secteurs d'activité, par exemple, la transmission de mala dies nosocomiales en milieu hospitalier ou les épidémies de légionellose véhicu lées par des aérosols des systèmes de climatisation et en particulier les aéro réfrigérants. Les industriels des secteurs agroalimentaire, pharmaceutique ou cosméti que, qui mettent en _uvre des produits pouvant constituer de bons milieux de croissance pour des microorganismes, consacrent beaucoup d'efforts pour créer et maintenir dans leurs installations industrielles, des zones "propres", voire "stéri les", afin de les protéger de toute contamination aéroportée. Le contrôle de la qualité de l'air à l'intérieur des bâtiments d'habitation, pro fessionnels ou institutionnels, plus particulièrement par la détermination de la blo contamination de l'air, est une opération de grande importance au regard de la population y stationnant, en particulier lorsqu'il y a des personnes âgées, des en fants en bas âge ou des personnes immunodéprimées qui constituent une popula tion plus fragile que la moyenne, vis à vis d'agressions microbiennes. Par blo-contamination, on entend tout organisme vivant ou produit secrété par des microorganismes, pouvant développer des effets néfastes sur la santé ou des effets d'altération sur des produits, par exemple les bactéries, les champi gnons, les levures, les virus, les toxines et par extension les allergènes. 11 n'existe actuellement aucun instrument de mesure en temps réel, qui soit d'utilisation simple tout en permettant de mesurer la blocontamination d'une phase gazeuse, ni aucune méthode de référence d'une telle mesure. De nombreux dispositifs de collecte et d'analyse d'échantillons d'air sont disponibles commercialement, basés sur le principe de blo-impaction, selon lequel on dirige un flux contrôlé du fluide à analyser, sur la surface d'un liquide ou d'un milieu de culture visqueux ou solide de type "boite de Pétri". Parmi les nombreu ses variantes disponibles, on peut citer pour référence les dispositifs dénommés commercialement comme suit: RCS Microbial Air Sampler_ de Biotest Diagnos tics Corp.; Air-O-Cell bloaerosol sampling cassettes_ de Zefon Intl.; MicroBio MB1 Plus Air Sampler_ de Spiral Biotech; BioCapture Air Sampler_ de Meso Systems Technology Inc.; ou MAS Air Sampler_de Merck; Cascade Impactor_ de Thermo Andersen. Outre un rendement de collecte souvent discutable, la méthode mise en _uvre avec de tels appareils, nécessite une culture préalable à la détermination, ce qui impose un délai d'au moins un jour. Les méthodes de détection et/ou d'analyse de microorganismes en solution reposent en général sur des méthodes d'immunofluorescence, de croissance bac térienne, de typage d'ADN ou d'ARN, ou d'ATPmétrie, dont la complexité de mise en _uvre est fonction du détail des informations souhaitées. Par exemple pour un typage d'ADN ou d'ARN, le temps de préparation de l'échantillon analysable est de l'ordre de quelques heures si l'on intègre notamment les phases de Iyse de cel lule, d'extraction et de purification du matériel génétique et d'amplification, ce qui rend impossible, leur mise en _uvre dans des mesures en temps réel ou quasi réel. Une nouvelle méthode de type cytométrie de flux a été décrite dans le bre vet américain publié sous le numéro 6,256,096. Cette méthode consiste à détecter les particules marquées fluorescentes au moyen d'un un détecteur CCD (dénom mé en langue anglaise: charge coupled device) couplé à une technique TDI (dé nommée en langue anglaise: time delayed integration). Ce système permet de visualiser les bactéries sur un écran d'ordinateur et de gagner quelques facteurs multiplicatifs pour le rapport signal / bruit par rapport à des détecteurs CCD classiques, grâce au traitement d'image TDI fondé sur la photomultiplication, rendant possible la détection de faibles quantités de microor ganismes. C'est pourquoi l'invention a pour objet un procédé d'analyse, de détermina tion et/ou de contrôle de la qualité microblologique d'un gaz comprenant les éta pes successives suivantes: Une étape (a), de collecte d'un échantillon de gaz à analyser, Une étape (b), de transfert de la phase gazeuse vers la phase liquide, des microorganismes contenus dans l'échantillon gazeux résultant de l'étape (a), Une étape (c) de marquage des microorganismes contenus dans l'échantil lon liquide résultant de l'étape (b), Une étape (d) de détection des microorganismes présents dans l'échantillon liquide marqué résultant de l'étape (c). Par échantillon gazeux, on désigne plus particulièrement, soit un prélève ment d'air de l'atmosphère d'un local, soit un prélèvement du ciel d'un réacteur ou d'une cuve, soit un prélèvement d'une bouteille de gaz comprimé, soit un prélè vement d'un générateur de gaz mettant en _uvre les techniques de distillation, de perméation, d'adsorption, d'absorption, de complexation, de diffusion, ou une combinaison desdites méthodes, soit un prélèvement d'un réservoir dans lequel le gaz est en contact avec son liquide. Le liquide de collection est plus particulièrement de l'eau, de l'eau pepto née, de l'eau avec des tensioactifs ou un milieu de culture de microorganismes. Selon une première variante du procédé tel que défini précédemment, I'étape (b) consiste en une étape (b) de transfert de la phase gazeuse vers une phase solide, suivie d'une étape (b2) de transfert de la phase solide vers une phase liquide; Selon une deuxième variante du procédé tel que défini précédemment, celle-ci comprend une étape (e,) de détermination de la concentration en microor ganismes présents dans l'échantillon, par traitement des signaux détectés, lors de l'étape (d) au moyen d'un ordinateur fonctionnant à l'aide d'un logiciel dédié. Selon une troisième variante du procédé tel que défini précédemment, celle - ci comprend une étape de (f) de collecte de l'échantillon issu de l'étape (d). Selon une quatrième variante du procédé tel que défini précédemment, cel le - ci comprend u ne étape (e2) de transformation des signaux détectés, lo rs de l'étape (d), message binaire "Oui ou Non" au moyen d'un ordinateur fonctionnant à l'aide d'un logiciel dédié. L'invention a plus particulièrement pour objet le procédé ou une variante du procédé tels que décrits précédemment dans lesquelles, I'étape (d) est une étape de mesure par cytométrie de flux. L'invention a aussi pour objet un dispositif, apte à mettre en _uvre le pro cédé et ses variantes tels que définis précédemment. Le dispositif tel que défini ci dessus comprend: Le dispositif tel que défini ci dessus comprend: Au moins un moyen de collection d'échantillons de gaz à analyser; Au moins un moyen de transfert des microorganismes contenus dans l'échantillon gazeux collecté par ledit moyen de collection vers une phase liquide, pour former un échantillon liquide; Au moins un moyen de marquage des microorganismes contenus dans le- dit échantillon liquide; Au moins un moyen de détection des microorganismes présents dans l'échantillon liquide marqué. Comme moyen de collection il y a par exemple les collecteurs à cyclone dans lesquels le flux gazeux est lavé par un liquide. Pour des prélèvements d'échantillons de petite quantité' le moyen de collection il y a par exemple, un moyen mettant en _uvre les technologies dites MEMS (micro electromechanical systems en langue anglaise) ou encore la micro 1 5 fluidique. Selon un aspect particulier du dispositif tel que défini précédemment, celui ci comprend au moins un moyen de traitement des signaux détectés. Le moyen de traitement et/ou d'analyse du système de mesure peut com porter plusieurs systèmes de commande. 11 est possible de collecter l'échantillon liquide après passage dans la cellule de mesure pour réaliser en différé des analyses microbiologiques plus poussées. La détection de microorganismes ou de seuils de contamination en micro organisme peut déclencher des systèmes actifs d'alarme, arrêter une production ou déclencher sa mise en quarantaine ou encore activer des procédures telles que l'augmentation de la ou vitesse des flux laminaires ou l'augmentation de la ventilation d'extraction ou déclencher la décontamination. L'utilisation d'un dispositif de mesure en continu, permet également d'optimiser le fonctionnement des systèmes de protection qui permettent de conserver des zones "grises"' "propres" ou "blanches" qui ne nécessitent pas de stérilité. L'archivage récurrent des données de l'analyseur constitue un élément im portant dans la démarche qualité ainsi que dans le respect des procédures liées à la mise en _uvre des démarches dites démarche HACCP ou des bonnes prati ques de fabrication (BPF). Selon un autre aspect du dispositif tel que défini précédemment, le moyen de détection est un cytomètre de flux Selon un autre aspect particulier de la présente invention, le dispositif tel que défini précédemment, détecte et analyse la présence de blocontaminants dans l'échantillon de gaz à analyser en temps réel ou quasi-réel. Selon un autre aspect particulier, de la présente invention, le dispositif tel que décrit précédemment est un système intégré, autonome et fonctionnant auto 1 0 matiquement. L'invention a aussi pour objet l'utilisation du dispositif tel que défini précé demment pour contrôler la qualité microblologique de l'air de locaux d'habitation, de locaux hospitaliers ou de locaux industriels et / ou de détecter la bio contamination de l'atmosphère dans des locaux d'habitation, des locaux hospita liers ou des locaux industriels. Le contrôle de la qualité de l'air à l'intérieur des bâtiments d'habitation, pro fessionnels ou institutionnels, plus particulièrement par la détermination de la blo contamination de l'air, est une opération de grande importance au regard de la population y stationnant, en particulier lorsqu'il y a des personnes âgées, des en fants en bas âge ou des personnes immunodéprimées qui constituent une popula tion plus fragile que la moyenne, vis à vis d'agressions microbiennes. Par bio-contamination, on entend tout organisme vivant ou produit secrété par des microorganismes, pouvant développer des effets néfastes sur la santé ou des effets d'altération sur des produits, par exemple les bactéries, les champi gnons, les levures, les virus, les toxines et par extension les allergènes. Il n'existe actuellement aucun instrument de mesure en temps réel, qui soit d'utilisation simple tout en permettant de mesurer la biocontamination d'une phase gazeuse, ni aucune méthode de référence d'une telle mesure. La figure 1 illustre un tel dispositif. Le moyen 1 est un blocollecteur dont la fonction est de transférer les microorga nismes présents dans l'atmosphère gazeuse à un liquide ou un solide. Le moyen 2 est un conteneur des réactifs de marquage. Le moyen 3 est un conteneur de liquide de rinçage et de décontamination. Le moyen 4 est une cellule de mesure des espèces marquées. Le moyen 5 est un conteneur servant à recueillir les déchets. Le moyen 6 est un ordinateur qui présente les résultats obtenus. Les seringues sont actionnées par un système qui déplace le piston. Les moyens S1 et S2 sont des seringues qui servant à prélever du liquide prove nant du blocollecteur et à l'injecter dans le tuyau de réaction (T). Les moyens S1 et S2 fonctionnent en couple pour assurer un débit en continu. Les moyens S3 et S4 sont des seringues qui servent à prélever et à injecter du réactif de marquage contenu dans le moyen 2. Le moyen T est un tuyau de réaction. Le temps de séjour dans T correspond au temps de marquage. Les moyens V1 à V6 sont des vannes. Les lignes en pointillé sont les tuyaux qui permettent d'envoyer les résidus dans le moyen 5. Pour amener le liquide aux différents moyens, les seringues en pairs (S1/S2 et S3/S4) fonctionnent comme des pompes. Les seringues couplées for ment une pompe qui peut marcher en continu. En dehors des vannes de l'échantillonnage et de l'injection on y trouve des vannes de rinçage (Vl 1 à V14) et des vannes de "purge" (V5, V6, V9, V10). L'utilisation des seringues en tant que pompes permet au système d'être compact et par conséquent peu gênant dans des espaces restreints. Le dispositif illustré par la figure 1, effectue l'ensembles des étapes du pro cédé et ses variantes, qui sont l'objet de la présente invention. La biocollection consiste à transférer les microorganismes qui sont suspen dus dans le gaz vers un milieu liquide ou solide. Les biocollecteurs de type "cy clone" créent un tourbillon de gaz qui renvoie les particules vers la paroi du blocol lecteur grâce à leur inertie. La paroi est ensuite rincée avec du liquide afin de ré cupérer les microorganismes. La vitesse de collection varie en générale entre 1 OOUmin et 1 OOOUmin. Les blocollecteurs de type "impacteur", renvoient le gaz a une certaine vi tesse suffisante pour assurer la traversée de microorganismes de la surface du li quide de collection. La vitesse de collection de l'impacteur est de l'ordre de quel ques dizaines de litres par minute. Les deux types de biocollecteurs décrits ci dessus peuvent être intégrés en tant que premier élément du dispositif. Le blocol lecteur choisi, a une sortie de liquide vers les seringues S1 et S2. Le marquage est nécessaire pour rendre les microorganismes visibles dans I'étape suivante du protocole du dispositif. Le marquage est choisi en fonction de type d'analyse. Lorsque l'on souhaite effectuer un dénombrement des microorganismes sans prêter attention à leur espèce une coloration comme le LIVE/DEAD Ba cLight pour les bactéries ou le LIVE/DEAD Yeast Viability Kit_ de Molecular Probes sont utilisés. Lorsque l'on souhaite une détection plus spécifique, il faut utiliser des anti corps ou des sondes nucléiques marquées avec un fluorophore qui correspond au système d'excitation, qui permettent ainsi une détection par fluorescence. On peut aussi mettre en _uvre le marquage enzymatique, la détection électrochimique ou la détection massique ou optique. Le réactif de marquage est injecté en continu (quand l'échantillon est injecté) par les seringues S3 et S4. La détection est effectuée par réception de signaux induits par le marquage des microorganismes présents dans le liquide. Selon le marquage, on peut utiliser un système de cytométrie de flux avec lecture par CCD et acquisition de l'intensité par TDI, un système de cytométrie de flux classique, un système mettant en _uvre les puces à ADN bioélectroniques ou bien un scanner de fluorescence classique de blopuces classiques. La traduction des signaux reçus, est réalisée par ordinateur avec un logiciel dédié et le résultat est présenté soit sous forme soit binaire (OUI/NON), soit d'un résultat quantitatif. Le liquide est amené à travers de la cellule de détection (4) par le pompage en continue des seringues S1 ou S2 et S3 ou S4. Un système de communication par ondes radio pourrait être ajouté pour des automates placé dans des endroits peu fréquentés ou un système entière ment autonome est souhaité. Description du protocole Le blocollecteur échantillonne le gaz à un débit d'environ 5 litres à 1000 li tres par minute, dans environ 1 ml à 100 ml de liquide. Le liquide de collection est de préférence de l'eau, de l'eau peptonée, de l'eau avec des tensioactifs ou un milieu de culture de microorganismes. Quand le biocollecteur a échantillonné suffisamment de gaz pour que la concentration des microorganismes dans le liquide dépasse le seuil de détection du module de lec- ture, environ de 0,5 ml à 10 ml de liquide est aspiré par une des deux seringues S1 ou S2 fonctionnant de façon alternée, pour permettre une marche globale en continue du dispositif, selon les positions ouvertes ou fermées des vannes. (Van- nes V1, V5, V11 fermées et V3 ouverte pour la seringue S1 et vannes V4, V6, V12 fermées et V2 ouverte pour la seringue S2). Les seringues de réactif S3 et S4 fonctionnent elles aussi, de façon alter née. L'une injecte I réactif pendant que l'autre s'en remplit. La vitesse de remplis sage est supérieur a la vitesse d'injection qui a pour résultat que le relais entre les deus seringues se fait sans que le débit tombe à zéro. Le débit au niveau du mo dule de détection est la somme des débits d' injection d'échantil lon et de réactif en volume par unité de temps. Le volume/débit de réactif injecté est égal ou inférieur au volume/débit d'échantillon. Les débits sont détermines par le temps d'incubation requis pour la réaction de marquage qui dure généralement de 15 minutes à 1 heure. Si le volume du tuyau avant le module de détection est fixe, le temps d'incubation va être déterminé par la somme de débits des seringues S1/S2 et S3/S4. Lorsque le liquide se trouve dans le module de détection il est illuminé par un faisceau de lumière de longueur d'onde qui correspond à la longueur d'excitation du fluorophore utilisé. Si des microorganismes sont présents, un dé- tecteur de photons collecte les photons correspondants à la longueur d'ondes d'émission du fluorophore. Ce collecteur de photons peut étre un dispositif CCD (dénommé:"charged coupled devices" en langue anglaise) ou un tube photomulti- plicateur. Les signaux sont interprétés par un logiciel dédié qui donne les résultats sous forme de concentration en microorganismes dans l'atmosphère gazeuse. Revendications 1. Procédé d'analyse, de détermination et/ou de contrôle de la qualité mi croblologique d'un gaz comprenant les étapes successives suivantes: Une étape (a), de collecte d'un échantillon de gaz à analyser, Une étape (b), de transfert de la phase gazeuse vers la phase liquide, des microorganismes contenus dans l'échantillon gazeux résultant de l'étape (a), Une étape (c) de marquage des microorganismes contenus dans l'échantil lon liquide résultant de l'étape (b), Une étape (d) de détection des microorganismes présents dans l'échantillon liquide marqué résultant de l'étape (c). 2. Procédé tel que défini à la revendication 1, dans lequel l'étape (b) consiste en une étape (b,) de transfert de la phase gazeuse vers une phase so lide, suivie d'une étape (b2) de transfert de la phase solide vers une phase liquide. 3. Procédé tel que défini à l'une des revendications 1 ou 2, comprenant en outre une étape (e) de détermination de la concentration en microorganismes présents dans l'échantillon, par traitement des signaux détectés, lors de l'étape (d) au moyen d'un ordinateur fonctionnant à l'aide d'un logiciel dédié. 4. Procédé tel que défini à l'une des revendications 1 ou 2, comprenant en outre une étape de (f) de collecte de l'échantillon issu de l'étape (d). 5. Procédé tel que défini à l'une des revendications 1 ou 2, comprenant en outre une étape (e2) de transformation des signaux détectés, lors de l'étape (d), message binaire "Oui ou Non" au moyen d'un ordinateur fonctionnant à l'aide d'un logiciel dédié. 6. Procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 5, dans lequel l'étape (d) est une étape de mesure par cytométrie de flux. 7. Dispositif apte à mettre en _uvre le tel que défini à l'une des revendica tions 1 à 6.comprenant: Au moins un moyen de collection d'échantillons de gaz à analyser; Au moins un moyen de transfert des microorganismes contenus dans l'échantillon gazeux collecté par ledit moyen de collection vers une phase liquide, pour former un échantillon liquide; Au moins un moyen de marquage des microorganismes contenus dans le dit échantillon liquide; Au moins un moyen de détection des microorganismes présents dans l'échantillon liquide marqué. 8. Dispositif tel que défini à la revendication 7, comprenant en outre au moins un moyen de traitement des signaux détectés. 9. Dispositif tel que défini à l'une des revendications 7 ou 8, dans lequel, le moyen de détection est un cytomètre de flux 10. Dispositif tel que défini à l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce qu'il détecte et analyse la présence de biocontaminants dans l'échantillon de gaz à analyser en temps réel ou quasi-réel. 11. Dispositif tel que défini à l'une des revendications 7 à 10, caractérisé en qu'il s'agit d'un système intégré, autonome et fonctionnant automatiquement. 12. Utilisation du dispositif tel que défini à l'une des revendications 7 à 10, pour contrôler la qualité microblologique de l'air de locaux d'habitation, de locaux hospitaliers ou de locaux industriels et / ou de détecter la bio-contamination de l'atmosphère dans des locaux d'habitation, des locaux hospitaliers ou des locaux