Brevet FR2839454A1 — publié le 20031114

novirhabdovirus chez les poissons. La presente invention concerne un dispositif pour la micro-injection de liquide en milieu confine in vivo. En particulier, la presente invention concerne un dispositif permettant de realiser des injections sous-retiniennes de petite volumes controlees et automatisees par vole transvitreenne dans un globe oculaire, notamment un globe oculaire de grande taille. II est connu de realiser des injections sous-retiniennes pour le transfert de gene ou le transfert de cellules dans la refine d'un animal de grande taille, dans le domaine de la therapie genique oculaire. Dans une methode par stereotaxie, pour le dosage automatique du liquide a injecter, Russel et al. (A Manual, Remotely Actuated Injector For SubRetinal Gene Therapy in Non-Human Primates. IOVS March 1S, 2001, vol. 42, N 4) decrivent l'utilisation d'un moteur electrique pas a pas qui pousse le piston d'une seringue de 100 pI de type Hamilton reliee a une micropipette de verre ayant une extremite de 10 um de diametre prealablement positionnee dans l'espace sous-retinien de singes, avec un micromanipulateur. Le volume injecte est contr61e par le moteur electrique pas a pas. Cette methode ne permet pas au chirurgien une grande maniabilite de la canule ce qui limite le choix du site d'injection sur la retine. Par ailleurs Fong-Qi Liang et al. (Intraocular Delivery of Recombinant Virus, Methods in Molecular Medicine, vol. 47: Vision Research Protocols, pp. 125-139) decrivent des injections intraoculaires transvitreennes de virus recombinant dans des yeux de chiens. Selon cette technique, une aiguille gauges est introduite par une incision sclerotomique a travers le corps vitreux. La canule est connectee a une seringue a piston de caoutchouc renfermant le liquide viral a injecter, cette seringue a piston etant reliee a une seringue annexe 1 ml de type Hamilton remplie de liquide salin. Le chirurgien dirige l'aiguille de la canule dans la zone cible, et un assistant tient la seringue annexe remplie de liquide salin. Lorsque l'aiguille atteint la retine, sur ordre du chirurgien, I'assistant injecte brusquement un volume ; predefini de fluide au niveau de la seringue annexe de liquide salin, ce qui donne ileu a une injection de virus purifie dans ltespace sous-retinien. Le chirurgien a une grande liberte de manceuvre pour introduire et positionner la canule sur un site precis de la retine. Toutefois, la poussee du liquide est manuelle et necessite la presence d'un assistant. L'injection sous-retinienne n'est pas reproductible. Pour ['injection transvitreenne de solutions virales, les praticiens vent confrontes a des problemes de falbles volumes precis a delivrer, sans perte de solution virale et de precision du site de ['injection elle-meme. L'homme du metier confronte au probleme de ['injection precise de microquantites est tense d'utiliser, pour une injection automatisee, des fluides non compressibles tels que de l'eau ou du liquide salin ou bien une commande electrique, par exemple un moteur electrique pas a pas. Avec un moteur electrique pas a pas, de liaisons mecaniques, ou de fluides non compressibles, des phenomenes de courses mortes et de jeux de transmission vent induits par le mode de transmission de la pression et induisent eux-memes de ['imprecision sur la quantite de liquide delivree. Dans la presente invention, de fa,con surprenante, on utilise, pour ['injection precise de microquantites, un fluide compressible. La compression du fluide est utilisee comme tampon qui absorbe le jeu, les vibrations et les microchocs et le chirurgien peut actionner la pedale en fonction de ce qu'il volt. Ainsi le systeme automatique permet l'amortissement de phenomenes indesirables induits par les systemes dtinjection connus. Dans un mode de realisation particulier, la pedale permet la mise en cauvre de la pression et son arret. La pression est prereglee a une valeur donnee de la pression du liquide a injecter. Le chirurgien a de ce fait un controle visuel direct de la taille de la cavite cree par le decollement, encore appele "bleb" quand il injecte, et peut arreter ['injection des que la taille du decollement retinien voulu est atteint. On peut toutefois prevoir un dispositif ou la pedale permettrait non seulement la mise en oeuvre de la pression mais egalement le reglage de celle-ci. En effet, lorsquton utilise de faibles diametres de canule d'injection, un phenomene de perte de charge est cree qui cree lui-meme une force resistante retransmise a la pedale de commande. Le chirurgien peut ressentir le retour d'effort sur la commande, ce qui lui permet de moduler ['effort applique a la pedale. Ainsi, le systeme decrit dans la presente inverition permet de combiner les deux avantages. D'une part, la piece tenue par le chirurgien lors de 1'injection est maniable, et le site d'injection, choisi par exemple sur la refine est done facilement atteint. D'autre part, le systeme est automatise et est toutefois completement controle par le chirurgien lui meme. Ainsi, le dispositif selon ['invention pour la micro-injection de liquide en milieu confine comprend: - une seringue a piston portent une canule d'injection de faible diametre, - des moyens d'entranement du piston pour ['injection, - des moyens de commande pour les moyens d'entranement du piston, les moyens d'entranement etant du type pneumatique commandes par un organe mobile actionnable par un operateur, les volumes d'injection etant inferieur a environ 800,ul. Par"canule", on entend ici un dispositif a manchon adaptable sur l'extremite distale d'une seringue et qui comporte, a son extremite distale, une aiguille de falble diametre. Les "canules" vent definies par la dimension de cette aiguille de falble diametre. Les moyens de connexion entre la seringue et le generateur de pression vent de preference souples et permettent ainsi une bonne manipulation de la seringue par ltoperateur, contrairement a tout autre systeme mecanique. Selon ['invention, le fluide de commande est un gaz compressible qui induit une action directe sur le piston: la mise en aeuvre du dispositif ntinduit pas de creation de jeux et les imprecisions vent absorbees. Le chirurgien opere un controle visuel de ['injection et peut delivrer la pression pneumatique par action sur la pedale, sans avoir recours a un assistant. Les problemes de controle du volume et de perte de solution virale vent ainsi resolus. On decrit ici une methode d'application d'une substance therapeutique dans un espace confine, notamment a l'interieur du corps d'un patient et plus particulierement dans l'espace sous-retinien, le procede comportant les etapes consistent a fournir un element tubulaire allonge comportant une extremite proximale et une extremite distale, ledit element tubulaire comportant une canule a son extremite distale et ltextremite proximale etant connectee a une seringue a piston mobile empli d'une substance therapeutique a injecter, et a connecter ladite seringue a un systeme a air comprime, la seringue et le systeme etant adaptes pour communiquer pneumatiquement par des moyens de connexion flexible, a fournir des moyens pour controler la pression a ['aide d'un organe mobile actionnable par un operateur, a positionner l'extremite distale de ['element tubulaire sur le tissu a traiter, et a injecter la substance therapeutique et controler visuellement le volume injecte. Dans ['application aux injections sous-retiniennes par vole transvitreenne, il est possible d'injecter a differents endroits sur la retine, de preference autour de la papille. La figure 1 represente de fa,con schematique un dispositif selon la presente invention. A la figure 2, le dispositif de seringue est plus particulierement represente. La figure 3 represente une canule de 44 gauges utilisable selon ['invention, en vue de face. A la figure 4 vent representees des images retiniennes montrant ['expression de la GFP (Green Fluorescent Protein de la meduse Aequorea l s victoria exprimee dans la refine apres injection sous-retinienne de vecteurs recombinants portent le gene de la GFP chez le chien. Selon ['invention, de preference les volumes d'injection vent compris entre environ 20 et environ 600,ul, de facon encore preferee entre environ 50 et environ 250,ul. De preference, dans le dispositif selon ['invention, le volume du reservoir de la seringue est inferieur a environ 1 000,ul. De preference, selon ['invention, pour les injections sous-retiniennes par vole transvitreenne, la taille de la canule est de preference comprise entre 28 et 44 gauges et dans un mode particulier de l'ordre de 44 gauges. Pour ['injection de cellules une canule de 28 a 33 gauges sera preferee et pour ['injection de vecteurs une canule de 44 gauges sera preferee. Dans le dispositif selon ['invention, les moyens d'entranement comprennent un reservoir de gaz sous pression relic a la seringue a piston, par une unite de controle comportant un detendeur reglable a commande electronique. De preference, selon ['invention, le reservoir de gaz contient de l'air sec epure, notamment de l'air de qualite medicale. De preference, selon ['invention, I'espace confine est ltespace sous retinien, notamment l'espace confine situe entre la couche des photorecepteurs et l'epithelium pigmentaire retinien. La micro-injection decrite ici peut avoir toutefois d'autres applications notamment en therapie genique ou therapie cellulaire. Dans ces techniques, il est interessant qu'un unique operateur injectant de petites quantites de liquide en espace confine puisse operer un controle visuel du site de ['injection et controler la quantite injectee. Plusieurs sites d'injection dans l'oeil, de vecteurs ou de cellules, peuvent etre vises: sous-retinien par vole transvitreenne, intravitreen (dans le vitre) et intracamerulaire (dans la chambre anterieure). Un medicament de therapie oculaire, genique ou cellulaire, injecte selon l'une quelconque des voies ci-dessus, pourrait etre compose du dispositif pre-conditionne avec un certain volume de vecteurs ou de cellules. La therapie genique s'entend d'une therapie genique realisee a ['aide de vecteurs viraux, non viraux ou d'ADN nut II peut s'agir de tout vecteur porteur d'un gene therapeutique ou non therapeutique, queue que soit son origine. Des applications diagnostiques vent aussi envisageables. Pour ['injection sous-retinienne par vole transvitreenne, la longueur de l'aiguille portee par la canule est adaptee a la taille de ['ceil. Dans d'autres applications, elle est adaptee a l'approche de l'espace confine a atteindre. Un mode de realisation particulier des moyens d'entranement de piston et des moyens de commande pour ces moyens d'entranement est decrit aux figures 1 et 2. Ainsi les moyens d'entranement du type pneumatique peuvent etre constitu es par u n systeme d'extraction et d'i njection de flu ide visqueux connu sous le nom de DORC VFINFE qui met en ceuvre un reducteur de pression electronique et un systeme a aspiration Venturi alimente avec une pression externe de 5 a 6 bars, par exemple. De tels systemes vent usuellement utilises pour des injections et extractions intraoculaires de grand volume a savoir piusieurs millilitres, usuellement 10 a 20 ml qui mettent en ceuvre du liquide visqueux. En ce qui concerne la therapie genique, les volumes injectes vent par exemple de l'ordre de 50 a 250,ul, et cette technique dtinjection intraoculaire necessite de realiser ['injection de petite volumes, sans perte de produit et de preference de fac,on au moins partiellement automatisee. Le generateur de pression est selon ['invention connecte au piston d'une seringue d'injection de micro-quantites par des moyens de connexion etanches aux gaz et aux liquides. Comme cela appara^'t a la figure 1, ces moyens d'entranement du type pneumatique comprennent une unite de commande 1 comportant un detenteur 2 relic a un reservoir 3 de gaz, par exemple une bouteille ou le reseau de l'hopital. Une pedale 4, par exemple a pied, commande ['injection S du gaz dans le sens de la fleche 5, en direction du piston 9 de la seringue 10. Les moyens de connexion et de conduite 7, 8 du gaz du reservoir 3 a ['unite centrale 1 et de ['unite 1 au piston 9 de la seringue 10, ainsi que les moyens de connexion 6 de la conduite 8 a la seringue 10 vent etanches. Les moyens de conduite 8 du gaz vent au moins partiellement souples pour permettre la manipulation de la seringue 10 par ltoperateur. Par ailleurs, au relachement de la pedale, le systeme remet la pression a zero dans le circuit. Dans le mode de realisation du dispositif d'injection 10 represente a la figure 2 et a la figure 3 pour le detail de la canule 17, le tube de connexion 18 au generateur de pression 1 comporte un raccord 11 au generateur. Ce raccord est lui-meme relic par un raccord double luer-iock male/male 12, connecte a un raccord femelle/femelle 13 lui meme relic a un autre raccord male/male 14 partiellement engage dans le corps 15 d'une seringue 16 de 1 ml sur laquelle est adaptee une canule 17: le manchon 24 porte une aiguille 23 de 44 gauges. Une piece de jonction clipante 21 est prevue entre le raccord male/male 14 et le corps de la seringue 15. Par ailleurs, de preference, un capuchon 20 de blocage de la canule est prevu, afin notamment que la canule ne se desolidarise pas du corps de la seringue sous l'effet de la pression qui parvient par la conduite 18 dans le corps 15 de la seringue 16 et pousse le piston de caoutchouc 19 qui clot le volume du reservoir 22 de la seringue. Ainsi, dans le mode particulier de realisation decrit, les elements composant le dispositif de seringue a piston vent notamment: - un raccord double luer-lock male-male (Vycon): 12 - raccord femelle/femelle (Pack de vitreoctomie AILON Total plus, Alcon surgical):13 - raccord mfile/male (Pack de vitreoctomie AILON Total plus, Alcon surgical): 14 - une piece de jonction metallique clip: 21 - seringue de 1 ml: 16 - une canule 17 a aiguille 23 de 44 gauges portee par le manchon 24 adapte a la seringue capuchon de blocage de la canule (morceau du capuchon de protection d'un catheter avec ailettes Becton-Dickinson): 20 La canule de 44 gauges representee a la figure 3 a pour references commerciales: chez DORC International B.V. ("INJEC.NMLD 0.1 TIP STERILE"). Dans le mode de realisation particulier, le materiau de l'aiguille venant au contact de la refine est du polyimide. Comme cela appara^'t a la figure 3, I'aiguille 23 portee par le manchon 24 de la canule 17 presente un diametre exterieur de 0,1 mm. ExemPIe Apres avoir rempli la seringue de 1 ml avec la solution a injecter, I'operateur retire le manche du piston de la seringue tout en conservant da n s la seringu e la pa rtie du piston en caoutchouc. L'operateu r ad apte alors l es raccords femel le/fem el le et m al e/ma le a la seri n g u e et l es y fixe a ['aide de la piece de liaison metallique. L'operateur fixe alors le raccord double luer-lock male/male et effectue le branchement du raccord femelle du generateur de pression controlee sur le raccord male double luer-lock. Une fois la canule fixee a l'extremite de la seringue, elle y est bloquee par ['insertion du capuchon. Apres avoir mis en route le generateur de pression, et fait le choix de la pression adaptee, I'operateur realise une sclerotomie sur ['ceil, il insere la canule a travers le vitre jusquta la refine et active ['injection en enfon,cant I'interrupteur a pied, sous son propre controle visuel. Resultats A ['aide de ce nouveau dispositif, des injections sousretiniennes de virus MV (Adeno-Associated Virus) recombinant et portent le gene marqueur de la gfp (rMVgfp) ont ete realisees dans l'aeil de chien Beagle. Des injections sous-retiniennes de 50 a 100,ul de solution virale ont conduit a des detachements retiniens de 0,6 et 1,3 cm2 respectivement. Un transfert de gene effficace a ete obtenu avec 90-100 % des photorecepteurs et cellules de l'epithelium pigmente transduits au niveau de ia zone ciblee. Comme cela appara^'t a la figure 4, des images du fond de ['ceil montrent ltexpression de la GFP a differents temps apres injection de rMV- 2.CMVgfp chez deux chiens, BD1 (A a D) et BD2 (E a H). La morphologic de la refine a ete controlee tout au long de ['experimentation et aucune anomalie n'a ete detectee. (A et E). point dtinjection. Cicatrices pigmentees dues a deux tentatives d'injection negative (obstruction de la canule). Les images fluorescentes montrent ['expression de la GFP a 6 jours (B. F), 30 jours (C, G) et 90 jours postinjection. REVENDICATIONS 1. Dispositif pour la micro-injection de liquide en milieu confine comprenant au moins: - une seringue (16) a piston (9, 19) portent une canule d'injection (23) de faible diametre, - - des moyens d'entranement du piston pour ['injection, - des moyens de commande pour les moyens d'entranement du piston,; les moyens d'entranement etant du type pneumatique commandes par un organe mobile actionnable par un operateur, 1 es volumes d'injection etant inferieurs a environ 800 pI. 2. Dispositif selon la revendication 1, caracterise en ce que les volumes - - d'injection vent compris entre 20 et 600 pI. 3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, caracterise en ce que les volumes d'injection vent compris entre 50 et 250 IJI. 4. Dispositif selon l'une des revendications 1 a 3, caracterise en ce que la taille de la canule (23) est inferieure comprise entre 28 et 44 gauges. 5. Dispositif selon l'une des revendications 1 a 4, caracterise en ce que le volume du reservoir (22) de la seringue est. inferieur a environ 1 000 pI.: 6. Dispositif selon l'une des revendications 1 a 5, caracterise en ce que les moyens d'entranement comprennent un reservoir de gaz (3) sous pression relic a la seringue (16) a piston (9, 19) par une unite de controle (1) comportant un detendeur (2) reglable a commande (4) electronique. 7. Dispositif selon l'une des revendications 1 a 6, caracterise en ce que le reservoir de gaz contient de l'air sec epure, notamment de qualite medicale. 8. Dispositif selon l'une des revendications 1 a 7, caracterise en ce que la longueur de l'aiguille 23 portee par la canule 17 est adaptee a la taille