Brevet FR2837490A1 — publié le 20030926

La présente invention concerne de nouveaux dérivés partiellement estérifiés de l'acide 1-hydroxyméthylène-1,1-bisphosphonique ou bisphosphonate, des compositions pharmaceutiques les comprenant, leur application en thérapeutique, notamment pour le traitement des tumeurs cancéreuses. Elle a trait également à un procédé de préparation de ces dérivés. Les dérivés des acides 1-hydroxyméthylène-1,1-biphosphoniques présentent des propriétés anti-tumorales remarquables et leurs applications médicales font donc l'objet de recherches approfondies. Ces dérivés, qui sont caractérisés par une liaison P-C-P, sont des analogues stables de pyrophosphate et sont résistants à l'hydrolyse enzymatique. En particulier, ils sont utilisés grâce à leurs propriétés inhibitrices de la résorption osseuse pour traiter de nombreuses maladies caractérisées par un métabolisme anormal du calcium. La résorption osseuse est accrue de manière pathologique dans les métastases de certains cancers, tels que cancers du sein ou de la prostate, et de façon accélérée dans les différents types d'ostéoporose dont celle liée à l'âge. Les patients présentant ce type de métastases peuvent actuellement bénéficier de protocoles de traitements incluant des bisphosphonates (Diel et al., 2000 ; Lipton, 2000 ; et al., 2000). Il est à souligner que le système osseux est le troisième site commun de métastases et que plus de 80% des patients décédés d'un cancer présentent des tumeurs osseuses à l'autopsie. Cette action anti-ostéoclastique des bisphosphonates se ferait par induction de l'apoptose dans les ostéoclastes (Luckman et al., 1998) via une inhibition de la voie du mévalonate et de la synthèse du cholestérol. Les bisphosphonates inhibent, in vitro, la prolifération de cellules tumorales mammaires (Fromigue et al., 2000 ; Hiraga et al., 2001 ; Jagdev et al., 2001 ; Senaratne et al., 2000 ; Yoneda et al., 2000) et de cellules tumorales de prostate (Lee et al., 2001). Cette inhibition in vitro est due à l'apoptose des cellules tumorales et s'accompagne d'une réduction de l'expression du gène bcl-2 (Senaratne et al., 2000) et d'une activation de caspases (Fromigue et al., 2000). A côté des effets précédents, les bisphosphonates peuvent avoir plusieurs actions complémentaires, telle l'inhibition de l'adhésion, in vitro, de cellules tumorales mammaires à des lamelles osseuses (Boissier et al., 1997 ; Van der Pluijm et al., 1996), l'induction in vitro de l'apoptose de cellules de myélomes (Shipman et al., 1997,1998, 2000a) ou l'inhibition de l'activité (mais non pas de la production) de métalloprotéases matricielles par des cellules de carcinomes mammaires ou de prostate (Boissier et al., 2000 ; Ichinose et al., 2000 ; Teronen et al., 1997). Les bisphosphonates ont également été utilisés dans le traitement de leucémies lymphoblastiques (Ogihara et al., 1995 ; Takagi et al., 1998). Les cellules leucémiques induisent une angiogenèse dans la moelle osseuse, angiogenèse nécessaire à leur prolifération. Le traitement des leucémies lymphoblastiques par les bisphosphonates s'accompagnent d'une baisse importante de l'angiogenèse (Perez-Atayde et al., 1997). Des données récentes soulignent l'implication très probable de facteurs angiogéniques dans le développement de métastases osseuses. Ainsi, Van der Pluijm et al. (2001), dans un travail utilisant un modèle murin in vivo de métastases expérimentales de cellules mammaires (MDA MB 231), ont émis l'hypothèse que l'augmentation de l'expression de facteurs angiogénique (VEGF) et ostéolityque (PTH) par les cellules tumorales serait impliquée dans l'ostéotropisme et l'ostéolyse des métastases osseuses. Si à l'heure actuelle, l'activité anti proliférative des bisphosphonates sur les cellules tumorales in vitro est bien établie, le fait que les bisphosphonates présenteraient une action anti tumorale in vivo est une question encore ouverte. Quelques données sembleraient en faveur d'une action anti proliférative des bisphosphonates, in vivo, au niveau des foyers métastatiques osseux. Ainsi, selon Hiraga et al. (2001), les bisphosphonates feraient diminuer la charge tumorale des cellules métastatiques des os. Cependant, aucune donnée concernant une action anti tumorale des bisphosphonates in vivo sur les tumeurs primaires n'a été, à notre connaissance, rapportée. Le métabolisme des bisphosphonates par l'organisme est faible et la fraction active des produits ne représenterait que 3 à 7 % de la quantité absorbée. Cette faible biodisponibilité des bisphosphonates par voie orale résulte de leur faible lipophilie (Lin, 1996) qui est due à leur haute ionisation au pH physiologique. Leur absorption est encore réduite en raison de la forte charge négative et de la taille relativement importante de ces molécules (Ruifrok and Mol, 1983 ; Pade and Stavchanvsky, 1997). De plus, l'absorption des bisphosphonates est encore réduite par leur forte complexation avec le calcium et les autres ions divalents dans l'espace intestinal (Lin, 1996). Leur administration est souvent associée à des troubles gastriques et à d'autres effets secondaires (Adami and Zamberlan., 1996 ; Mondelo et al., 1997). Afin d'améliorer leurs effets thérapeutiques, différentes solutions ont été proposées. La première consiste en l'utilisation d'un vecteur peptidique greffé sur la chaîne latérale de l'acide hydroxybisphosphonique (Ezra et al., 2000). D'autres études suggèrent d'encapsuler la drogue dans des microsphères (Patashnik et al., 1997) ou dans des liposomes (Ylitalo et al., 1998). La présente invention a donc pour but de proposer de nouveaux dérivés de bisphosphonates présentant une biodisponibilité améliorée et une efficacité thérapeutique satisfaisante. Deux procédés de synthèse décrits dans la littérature permettent l'obtention des acides 1-hydroxyméthylène 1,1-bisphosphoniques. Le premier permet d'accéder aux produits désirés en une seule étape. Il consiste à chauffer un mélange d'acide carboxylique en présence d'acide phosphoreux et de trichlorure de phosphore à 100 C pendant plusieurs heures. Les conditions de cette réaction ont été très étudiées. En effet, depuis 1970, plus de cinquante brevets et articles ont été publiés. Les inconvénients de cette méthode sont cependant nombreux. En effet, les conditions opératoires drastiques ne sont pas adaptées à des substrats fragiles. De plus, l'extraction du bisphosphonate du milieu réactionnel est souvent délicate à mettre en #uvre. La seconde procédure est une méthode indirecte qui passe par la synthèse d'esters 1-hydroxyméthylène-1,1-bisphosphoniques suivi d'une étape de déalkylation. Les a-cétophosphonates sont couramment préparés suivant la réaction de Michaelis Arbuzov, à partir d'un phosphite de structure P (OR)3 d'un chlorure d'acide. L'ester bisphosphonique est ensuite normalement obtenu par une réaction de l'a-cétophosphonate avec un dialkylphosphite HOP(OR)2. L'étape de déalkylation est réalisée soit par hydrolyse en milieu acide chlorhydrique soit par un traitement au bromotriméthylsilane suivie d'une méthanolyse. Malheureusement, ces deux procédés de synthèse ne permettent pas d'accéder à des acides 1-hydroxyméthylène-1,1-bisphosphoniques partiellement estérifiés. La présente invention a donc également pour but de proposer des procédés de préparation de bisphosphonates permettant d'introduire régiosélectivement une ou plusieurs fonctions esters sur les groupements acides phosphoniques. La présente invention a donc pour objet des dérivés de bisphosphonate de formule (I) suivante : dans laquelle R1, R2 et R3, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle, aryle, acyloxyalkyle ou hétérocycle, A représente un radical de formule -(CH2)n-R4, R4 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle, un radical aryle, un hétérocycle ou un radical de formule -NR5R6, R5 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, n est un entier de 0 à 24 inclusivement, à l'exclusion des composés de formule (I) dans laquelle Ri, R2 et R3 représentent simultanément un atome d'hydrogène, leurs isomères optiques et géométriques, leurs racémates, leurs sels, leurs hydrates et leurs mélanges. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant dans un support pharmaceutiquement acceptable au moins un composé de formule (I) tel que décrit ci-dessus, éventuellement en association avec un autre actif thérapeutique. Elle concerne aussi l'utilisation d'au moins un composé de formule (I) pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à traiter une maladie caractérisée par un métabolisme du calcium anormal, tel que des cancers ou l'ostéoporose. La présente invention a enfin pour objet un procédé de préparation des composés de formule (1). De manière avantageuse, au moins deux des substituants R1, R2 et R3 sont différents d'un atome d'hydrogène. Selon un mode particulièrement préféré de l'invention, les substituants R1, R2 et R3, qui sont différents d'un atome d'hydrogène, sont identiques. Les radicaux alkyle, aryle, hétérocycle et acyloxyalkyle précédemment cités sont éventuellement substitués par au moins un groupement choisi parmi un radical aryle, un radical hétérocycle, un radical hétérocycloalkyle, un radical alkyle, un radical alkényle, un radical alkynyle, un radical alkylthio, un atome d'halogène, de préférence CI, F, Br, un radical hydroxyle, un groupement N02, un radical alkoxy, un groupe ester (-COOR), un groupe aminé -NRR', une fonction acide, un groupement amide (-CONHR ou-NHCOR), où R et R' représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un radical alkyle, aryle, hétéroaryle ou acyloxyalkyle. Selon la présente invention, le terme "alkyle" désigne plus particulièrement un radical hydrocarboné linéaire, ramifié ou cyclique ayant de 1 à 24, de préférence 1 à 12, atomes de carbone tels que méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, tert-butyle, pentyle, néopentyle, n-hexyle. Les groupes en Ci-Ce sont particulièrement préférés. Les groupes méthyle et éthyle sont tout particulièrement préférés. Les radicaux alkyle peuvent éventuellement être interrompus par un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence N, S, 0 ou P. Le terme alkényle se réfère à un radical hydrocarboné présentant au moins une insaturation éthylénique et le terme alkynyle se réfère à un radical hydrocarboné présentant au moins une insaturation acétylénique. Les groupes aryle sont des systèmes hydrocarbonés aromatiques mono-, bi- ou tri-cycliques ayant de 6 à 18 atomes de carbone. On peut notamment citer, à titre d'exemples, un radical phenyl, a-naphtyl, (3-naphtyl ou antracényl. Les groupes alkoxy correspondent aux groupes alkyle définis ci-dessus reliés au noyau par l'intermédiaire d'une liaison -0- (éther). Les groupes alkylthio correspondent aux groupes alkyle définis cidessus reliés au reste du composé par l'intermédiaire d'une liaison -S- (thioéther). Les radicaux acyloxyalkyle correspondent aux groupes acyloxy reliés au reste du composé par l'intermédiaire d'une chaîne alkylène (C1-24), de préférence de C1-4. On peut notamment citer le radical acyloxyméthyle ou pivaloyloxyméthyle. Par halogène , on entend un atome de fluor, de chlore, de brome ou d'iode. Par hétéroatome , on entend un atome choisi parmi 0, N et S. Les groupes arylalkyle sont des groupes comprenant un reste aryle tel que défini ci-dessus lié au reste du composé au moyen d'une chaîne alkylène. Les groupes hétérocycles ou hétérocycloalkyle sont des groupes comportant de 5 à 18 maillons cycliques comprenant un ou plusieurs hétéroatomes (généralement N, 0, S ou P), de préférence de 1 à 5 hétéroatomes endocycliques. Ils peuvent être mono-, bi- ou tri-cycliques. Ils peuvent être aromatiques ou non. Préférentiellement, et plus particulièrement pour R5, il s'agit d'hétérocycles aromatiques. Des exemples de groupes hétérocycliques aromatiques sont les groupes pyridine, pyridazine, pyrimidine, pyrazine, furane, thiophene, pyrrole, oxazole, thiazole, isothiazole, imidazole, pyrazole, oxadiazole, triazole, thiadiazole et triazine. Des exemples de bicycles sont notamment les groupes quinoline, isoquinoline et quinazoline (pour deux cycles à 6 sommets) et indole, benzimidazole, benzoxazole, benzothiazole et indazole (pour un cycle à 6 sommets et un cycle à 5 sommets). Des hétérocycles non aromatiques sont notamment pipérazine, pipéridine, etc. Les composés préférés présentent une formule (1) dans laquelle R1, R2 et R3 représentent un atome d'hydrogène ou un radical alkyle de C1-12, plus particulièrement de C1-6. Les composés préférés présentent une formule (I) dans laquelle R1, R2 et R3 représentent le radical méthyle ou éthyle. Les composés préférés présentent une formule (I) dans laquelle A représente un radical de formule -(CH2)n-R4, dans laquelle n est entier de 1 à 12 inclusivement, de préférence de 1 à 6 inclusivement, avantageusement de 1 à 3 inclusivement. Les composés préférés présentent une formule (I) dans laquelle R4 représente un radical alkyle C1-C6, un radical hétérocycle, un radical phényle, ou un radical de formule -NR5R6, dans laquelle R5 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un radical alkyle de C1-6, dans laquelle avantageusement n est un entier de 1 à 6 inclusivement, de préférence de 1 à 3 inclusivement. Selon un mode particulier de l'invention, les composés préférés présentent une formule (I) dans laquelle A représente un radical choisi parmi : Les composés selon l'invention présentent l'avantage d'avoir une biodisponibilité améliorée et donc un effet thérapeutique très satisfaisant. En effet, sans vouloir se lier à une quelconque théorie de l'invention, les liaisons esters des composés selon l'invention augmentent leur lipophilie et par ce biais notamment les composés semblent mieux passer la barrière gastro-instestinale lorsqu'ils sont administrés par voie orale, les liaisons esters sont ensuite lysées pour libérer l'acide bisphosphonique correspondant. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation de composés de formule (1). Ce procédé de préparation présente de nombreux avantages. Il est simple à mettre en #uvre industriellement et permet d'obtenir un rendement élevé en bisphosphonates. Le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes : - la mise en contact d'au moins un halogénure d'acide de formule (II) : ACOX, ou d'un a-cétophosphonate de formule (III) : avec au moins un phosphite silylé de formule (IV) : P[(OSialk3)x][OR3]3-x (IV) dans lesquelles R1, R2 et R3, identiques ou différents, représentent un radical alkyle, aryle, acyloxyalkyle, ou hétérocycle, A étant tel que défini ci-dessus, X représente un atome d'halogène, de préférence le chlore, alk représente un radical alkyle de C1-6, x représente 2 ou 3, - une hydrolyse des composés obtenus à l'étape précédente. Le radical alkyle de C1-6 est tel que défini précédemment. L'atome d'halogène peut être un atome de chlore, de brome, d'iode ou de fluor, de préférence X est l'atome de chlore. Lorsque R1 et R2 sont différents de l'atome d'hydrogène, le procédé de préparation des composés de formule (I) comprend avantageusement les étapes suivantes : - la mise en contact d'au moins un halogénure d'acide de formule (II) : ACOX avec au moins un phosphite de formule (V) : P(OR1)(OR2)(OR), avec R1, R2 et R, identiques ou différents, représentent un radical alkyle, aryle, acyloxyalkyle, ou hétérocycle, pour former un a-cétophosphonate de formule (III), - la mise en contact de l'a-cétophosphonate obtenu à l'étape précédente avec au moins un phosphite silylé de formule (IV) tel que défini ci-dessus, - une hydrolyse des composés obtenus à l'étape précédente. Plus précisément, lorsque R1, R2 et R3 sont différents de l'atome d'hydrogène, le phosphite silylé de formule (IV) de préférence mis #uvre correspond à un composé de formule (IV) dans laquelle x vaut 2. Plus précisément, lorsque R1 et R2 sont différents de l'atome d'hydrogène et R3 représente un atome d'hydrogène, le phosphite silylé de formule (IV) de préférence mis #uvre correspond à un composé de formule (IV) dans laquelle x vaut 3. Lorsque R1 est différent de l'atome d'hydrogène et R2 représente un atome d'hydrogène, le procédé de préparation des composés de formule (I) comprend avantageusement les étapes suivantes : - la mise en contact d'au moins un halogénure d'acide de formule (II) : ACOX ; avec au moins un phosphite silylé de formule (IV) : P[(OSialk3)x][OR3]3-x (IV) dans lesquelles R3 représente un radical alkyle, aryle, acyloxyalkyle, ou hétérocycle, A étant tel que défini ci-dessus, X représente un atome d'halogène, de préférence le chlore, alk représente un radical alkyle de C1-6, x représente un entier de 0 à 3, - une hydrolyse des composés obtenus à l'étape précédente. Généralement, la mise en contact avec le composé silylé est avantageusement réalisée de manière st#chiométrique. Cependant, lorsque l'on souhaite obtenir des composés de formule (I) dans laquelle R1 et R3 sont différents de l'atome d'hydrogène et R2 représente un atome d'hydrogène, le procédé de préparation est avantageusement mis en #uvre par la mise en contact d'au moins 1 équivalent molaire d'au moins un halogénure d'acide de formule (II) : ACOX ; avec au moins deux équivalents-molaires d'au moins un phosphite silylé de formule (IV). Le procédé de préparation des composés de formule (I) lorsque R1 est différent de l'atome d'hydrogène et R2 et R3 représentent un atome d'hydrogène, est avantageusement mis en #uvre avec une mise en contact d'au moins un halogénure d'acide de formule (II) : ACOX ; avec au moins un phosphite silylé de formule (IV) dans laquelle x vaut 2 et une mise en contact du produit ainsi obtenu avec au moins un phosphite silylé de formule (IV) dans laquelle x vaut 3. L'hydrolyse du procédé de préparation des composés de formule (1) s'effectue généralement dans un solvant capable de fournir des protons, tel que notamment le méthanol ou l'éthanol. De préférence, le solvant utilisé est le méthanol. Les rendements obtenus en composés de formule (I) sont quasiquantitatifs. En outre, ce procédé présente l'avantage de mettre en #uvre in situ successivement les étapes mentionnées ci-dessus, sans nécessité de transférer des produits. De manière générale, les étapes du procédé selon l'invention peuvent être réalisées à température ambiante (18-30 C) et à pression atmosphérique. Bien entendu, il est à la portée de l'homme du métier de varier ces conditions, si nécessaire. Plus précisément, il est à noter que les réactions avec le phosphite silylé peuvent être exothermiques, sans toutefois présenter de réactions secondaires. Ce caractère exothermique peut rendre nécessaire de mettre en #uvre ces réactions à des températures plus basses que l'ambiante, plus particulièrement à des températures comprises entre -70 C et 20 C, notamment lorsque l'on met en oeuvre les chlorure de nitrobenzoyle. Les étapes qui précédent l'étape d'hydrolyse du procédé selon l'invention peuvent être mises en #uvre en masse ou dans un solvant, tel que CHCI3, THF, CH3CN, CH2CI2, ou l'éther. Avantageusement, elles sont mises en oeuvre en masse. L'étape d'hydrolyse est réalisée avantageusement pendant 1 à 4 heures, plus particulièrement pendant environ deux heures. Elle est de préférence mise en #uvre à température ambiante, entre 18 et 30 C. Après l'étape d'hydrolyse, le procédé selon l'invention comprend de préférence la purification du composé de formule (I) obtenu. Cette purification est réalisée par tout moyen connu en soi. De préférence, on réalise une purification par au moins deux lavages successifs dans un solvant approprié, notamment l'éther. Les produits de départ du procédé selon l'invention sont des produits commercialisés et sont donc facilement accessibles. Concernant les phosphites, le tris triméthylsilyl phosphite est commercial. En revanche, les autres phosphites sont préparés selon le procédé suivant. Le dialkylphosphite est traité par une solution d'ammoniaque concentrée à 0 C. Après évaporation de l'eau, le sel obtenu est traité par de l'hexaméthyldisilazane pendant 4 heures à reflux. Le schéma réactionnel est le suivant. Des schémas réactionnels du procédé selon l'invention sont représentés à la figure 1. Un autre objet de la présente invention concerne toute composition pharmaceutique comprenant dans un support pharmaceutiquement acceptable au moins un composé de formule (I) tel que décrit ci-dessus. Il s'agit avantageusement d'une composition pharmaceutique pour le traitement ou la prophylaxie des maladies caractérisées par un métabolisme du calcium anormal, tel que des cancers ou l'ostéoporose. Pour les cancers, il s'agit plus particulièrement des cancers du sein, de la prostate ou des leucémies. Les tumeurs malignes solides se répartissent en carcinomes (95%) et sarcomes (5%). Le développement des carcinomes et des sarcomes est corrélé à la mise en place d'une vascularisation des tumeurs, dénommée angiogenèse. Toute inhibition de cette angiogenèse tumorale permet de faire régresser, ou pour le moins de suspendre ou de retarder le développement des tumeurs. Or, il a été trouvé de manière surprenante que les composés de formule (1) ont non seulement un effet sur les tumeurs, mais également un effet sur l'angiogenèse. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont utilisables notamment pour le traitement de tumeurs malignes, plus précisément le traitement de tumeurs malignes solides. Elles sont également utilisables pour inhiber partiellement ou totalement l'angiogenèse tumorale. L'invention concerne également l'utilisation d'un composé tel que défini ciavant pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la mise en #uvre d'une méthode de traitement ou de prophylaxie du corps humain ou animal. L'invention concerne également une méthode de traitement d'une maladie caractérisée par un métabolisme du calcium anormal, tel que des cancers ou l'ostéoporose, comprenant l'administration à un sujet, notamment humain, d'une dose efficace d'un composé ou d'une composition pharmaceutique tels que définis ci-avant. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention comprennent avantageusement un ou plusieurs excipients ou véhicules, acceptables sur le plan pharmaceutique. On peut citer par exemple des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. Des agents ou véhicules utilisables dans des formulations (liquides et/ou injectables et/ou solides) sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales, l'acacia, etc. Les compositions peuvent être formulées sous forme de suspension injectable, de gels, huiles, comprimés, suppositoires, poudres, gélules, capsules, etc., éventuellement au moyen de formes galéniques ou de dispositifs assurant une libération prolongée et/ou retardée. Pour ce type de formulation, on utilise avantageusement un agent tel que la cellulose, des carbonates ou des amidons. Les composés ou compositions selon l'invention peuvent être administrés de différentes manières et sous différentes formes. Ainsi, ils peuvent être injectés par voie systémique ou orale, de préférence systémique, comme par exemple par voie intraveineuse, intra-musculaire, sous-cutanée, trans-dermique, intra-artérielle, etc. Pour les injections, les composés sont généralement conditionnés sous forme de suspensions liquides, qui peuvent être injectées au moyen de seringues ou de perfusions, par exemple. Il est entendu que le débit et/ou la dose injectée peuvent être adaptés par l'homme du métier en fonction du patient, de la pathologie, du mode d'administration, etc. Typiquement, les composés sont administrés à des doses pouvant varier entre 0,1 g et 500 mg/kg de poids corporel, plus généralement de 0,01 à 10 mg/kg, typiquement entre 0,1 et 10 mg/kg. En outre, des injections répétées peuvent être réalisées, le cas échéant. D'autre part, les compositions selon l'invention peuvent comprendre, en outre, d'autres agents ou principes actifs. D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Légende des Figures Figure 1 : Schémas réactionnels du procédé de préparation de composés selon l'invention. A a la même définition que précédemment. Figures 2 et 3 : Inhibition de la prolifération in vitro des cellules tumorales A 431 par BP1 (Figure 2) et BP2 (Figure 3) respectivement, après 24,48 et 72 h de culture. Les résultats représentent le nombre de cellules SE (barres). *P Figure 4 : Inhibition de la croissance in vivo des tumeurs A 431 par BP1 et BP2. Les cellules A431 implantées chez la souris nude provoquent le développement de tumeurs sous cutanées. Une semaine après l'injection des cellules, les tumeurs sont traitées par BP1 et BP2 à des doses de 0. 006, 0. 06 et 0.6 mg/souris, 2 fois par semaine pendant 5 semaines. Les résultats représentent le volume tumoral SE (barres). *P Figure 5 : Analyse immunohistochimique de l'angiogenèse des tumeurs A 431. Les cellules endothéliales ont été détectées avec un marqueur spécifique (GSL 1 ). Les résultats représentent la surface SE (barres) des cellules endothéliales quantifiée par analyse d'images (NIH image). *P Bibliographie générale sur le sujet. - Adami S. and Zamberlan N. (1996) Adverse effects of bisphosphonates. A comparative review. Drug Saf. 14, 158- 170. - Boissier S., Ferrerras M., Peyruchaud O., Magnetto S., Ebetino F., Colombel, Delmas P., Delaissé JM and Clézardin P. (2000). Bisphosphonates inhibit breast and cancer prostate carcinoma cell invasion, an early event in the formation of bone metastases. Cancer Res., 60,2949-2954. - Boissier S., Magnetto S., Frappart L., Cuzin B., Ebetino F., Delmas P. and Clézardin P. (1997). 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EXEMPLES Sauf mention contraire, les pourcentages donnés sont exprimés en poids. Rdt signifie rendement. PREPARATION DE COMPOSES SELON L'INVENTION Préparation du méthyl di(triméthylsilyl)phosphite Dans un tétracol muni d'une agitation mécanique, d'un réfrigérant, d'une ampoule à introduction, d'un thermomètre et d'une arrivée d'azote on ajoute goutte à goutte 100ml d'une solution d'ammoniaque concentrée dans 83 g de dimethylphosphonate que l'on aura si nécessaire distillé auparavant. La solution ainsi obtenue est évaporée sous pression réduite. Après des co-évaporations répétées avec de la pyridine (100ml) et du benzène (2X100ml), le solide blanc obtenu est traité par 140 ml . Le mélange ainsi obtenu est porté à reflux pendant 6 heures. La solution est ensuite distillée pour donner le composé attendu Rdt=58 % Eb 74-76(20 mm Hg) 31P {1H} RMN (CDC13): 5=127.6 1H RMN (CDC13): 8=0.19 (s,18H,Me3Si), 3. 30 (d, 3H, JpH =8 Hz, MeO). Procédé de synthèse de l'acide 1-hydroxymethylene-1,1-bisphosphonique. Un équivalent de chlorure d'acide est placé dans un tricol pourvu d'un aimant sous atmosphère inerte (Ar). 2 équivalents de tris(trimethylsilyl)phosphite sont ajoutés à température ambiante sous agitation. La solution est ensuite laissée à température ambiante pendant quelques minutes. L'hydrolyse est effectuée dans le méthanol à 25 C pendant 1 heure. Les fractions volatiles sont évaporées sous vide. Les produits sont purifiés par lavage à l'éther. Acide (1-hydroxy-1-phosphono-éthyl)-phosphonique. Poudre blanche. Rendement = 98%. 31P {1H} RMN (D20): 8=19.4 1H RMN (D20): 8=1.48 (t, 3H, 3J= 16 Hz, CH3COH). Acide (1-hydroxy-1-phenyl-phosphono-ethyl)-phosphonique. Poudre blanche. Rendement=90%. 31P {1H} RMN (D20): 8=19.0. 1H RMN (D2O): 5=3.31 (t, 2H, 3J= 14 Hz, CH2COH), 7. 26-7.32 (m, 4H, C6H5), 7. 38 (t, 1H,3J= 7. 5 Hz, C6H5). Acide (hydroxy-phenyl-phosphono-methyl)-phosphonique. Poudre blanche. Rdt = 91 %. 31P {1H} RMN (D20): 8= 16.0.'H RMN (D20): 8=7.08-7.13 (m, 4H, C6H5), 7. 46 (t, 3J= 5 Hz, 1H, C6H5). 13C {1H} RMN (D20): 8=78.76 (t, 1J= 145. 75 Hz, COH), 128.9 , 130.8, 131.2, 138.6 (C6H5). Acide (hydroxy-p-nitrophényl-phosphono-methyl)-phosphonique. Poudre blanche. Rdt= 85%. 31P {1H} RMN (D20): 8=15.3. 1H RMN (D20): 8=7.89 (d, 2H,3J= 8.5 Hz, C6H4), 8.15(d, 2H,3J= 8.5 Hz, C6H4). 13C {1H} RMN (D20): 8= 75. 28 (t, 1J= 149 Hz, COH), 124.67, 128.15 ;146.13 , 148.35 (C6H4). Mode opératoire général des produits du type A-C(OH)PO(OH)2PO(OMe)2 Dans un tétracol muni d'une agitation mécanique, d'un réfrigérant, d'une ampoule à introduction, d'un thermomètre et d'une arrivée d'azote on ajoute goutte à goutte 1 équivalent de trimethylphosphite dans 1 équivalent de chlorure d'acide à 0 C. Après deux heures de réaction à température ambiante, l'a-cétophosphonate de diméthyle est complètement formée (l'évolution de la réaction est suivie en RMN 31 P). On ajoute ensuite goutte à goutte 1 équivalent de tris(triméthylsilyl)phosphite. La solution est agitée ensuite pendant 15 minutes. Le méthanol est ensuite ajouté et la solution agitée pendant deux heures à température ambiante. Le solvant et les fractions volatiles sont ensuite évaporés. Le produit obtenu se présente sous forme de poudre blanche. Il est ensuite purifié par des lavages successifs à l'éther. Acide [(Diméthoxy-phosphoryl)-hydroxy-phényl-méthyl]-phosphonique Poudre blanche. Rdt=91% 31P {1H} RMN (D20): 8=23.58 (d,2J= 27 Hz) ; 12. 92 (d,2J= 27 Hz) . 1H RMN (D20): 8=7.73 (d, 2H, 3J= 6. 0 Hz, C6H5) ; 7.46-7.43 (m, 3H# C6H5); 3.79 (d, 3H, 3J= 10.0 Hz, OCH3) ; 3. 63 (d, 3H, 3J= 10.0 Hz, OCH3). Acide [(Diméthoxy-phosphoryl)-hydroxy-éthyl]-phosphonique Poudre blanche. Rdt=91 % 31P {1H} RMN (D20): 8=29.1 (d, 2J= 27 Hz) ; 19.90(d, 2J= 27 Hz). 1H RMN (D20): 8=7.73 (d, 2H,3J= 6. 0 Hz, C6H5) ; 7.46-7.43 (m, 3H# C6H5); 3.79 (d, 3H, 3J= 10. 0 Hz, OCH3) ; 3. 63 (d, 3H, 3J= 10. 0 Hz, OCH3). Mode opératoire général des produits du type AC (OH)PO(OH)OMePO(OH)(OMe) Dans un tétracol muni d'une agitation mécanique, d'un réfrigérant, d'une ampoule à introduction, d'un thermomètre et d'une arrivée d'azote on ajoute goutte à goutte 2 équivalents de methyl bis(trimethylsilyl)phosphite dans 1 équivalent de chlorure. Après 10 minutes de réaction à température ambiante, la solution est méthanolysée pendant deux heures. Le solvant et les fractions volatiles sont ensuite évaporés. Le produit obtenu se présente sous forme de poudre blanche. Il est ensuite purifié par des lavages successifs à l'éther. Monométhyl ester de l'acide [Hydroxy-(hydroxy-méthoxy-phosphoryl)phényl-méthyl] phosphonique. Poudre blanche. Rdt =90 % 31P {1H} RMN (D20): 8=18,50 . 1H RMN (D20): 8=7.43-7.41 (m, 2H, C6H5) ; 7.15- 7. 05 (m, 3H, C6H5); 3.79 (d, 6H, 3J= 6. 0 Hz, OCH3) Monométhyl ester de l'acide [([Hydroxy-(hydroxy-méthoxy-phosphoryl)- éthyl] phosphonique Poudre blanche. Rdt=90% 31P {1H} RMN (D20): 8=23.9. 1H RMN (D20): 2.96 (d, 6H,3J= 6. 0 Hz, OCH3) ; 1. 07- 0. 98 (m, 3H, CH3). Monométhyl ester de l'acide [Hydroxy-(hydroxy-méthoxy-phosphoryl)-2phényl-éthyl] phosphonique. Poudre blanche. Rdt=90% 31P {1H} RMN (D20): 8=20.79 .1H RMN (D20): 5=7.26-7.11 (m, 5H, C6H5) ; 3.79 (d, 6H, 3J= 6. 0 Hz, OCH3); 3. 15 (t, 2H,3J= 10. 0 Hz, C6H5-CH2) Mode opératoire général des produits du type A- C(OH)PO(OH)(OMe)PO(OMe)2 Dans un tétracol muni d'une agitation mécanique, d'un réfrigérant, d'une ampoule à introduction, d'un thermomètre et d'une arrivée d'azote on ajoute goutte à goutte 1 équivalent de trimethylphosphite dans 1 équivalent de chlorure d'acide à 0 C. Après deux heures de réaction à température ambiante, l'a-cétophosphonate de diméthyle est complètement formée (l'évolution de la réaction est suivie en RMN 31 P) On ajoute ensuite goutte à goutte 1 équivalent de méthyl bis(triméthylsilyl)phosphite. La solution est agitée ensuite pendant 15 minutes. Le méthanol est ensuite ajouté et la solution est agitée pendant deux heures à température ambiante. Le solvant et les fractions volatiles sont ensuite évaporés. Le produit obtenu se présente sous forme d'huile incolore. Il est ensuite purifié par des lavages successifs à l'éther. Diméthyl ester de l'acide [Hydroxy-(hydroxy-méthoxy-phosphoryl)-phénylméthyl]-phosphonique Poudre blanche. Rdt= 90 %. 31P {1H} RMN (CDC13): 8=16.74 (d,2J= 47 Hz) ; 14.52 (d,2J= 47 Hz) . 1H RMN (D20): 8=8.60-8.40 (s, 2H, OH) ; (d, 2H, 3J= 8. 0 Hz, C6H5) ; 7.04-6.97 (m, 3H# C6H5) ; 3.47 (d, 3H, 3J= 10. 0 Hz, OCH3) ; 3. 34 (d, 3H, 3J= 10. 0 Hz, OCH3) ; 3. 23 (d, 3H,3J= 10. 0 Hz, OCH3). Diméthyl ester de l'acide [Hydroxy-(hydroxy-methoxy-phosphoryl)-ethyl]phosphonique 31P {1H} RMN (CDC13): 8=20.46 (d, 2J= 48 Hz) ; 18.67(d, 2J= 48 Hz). 1H RMN (D20): 8=8.98 (s, 2H, OH) 3.92(d, 3H,3J= 10. 0 Hz, OCH3) ; 3. 88 (d, 3H, 3J= 10. 0 Hz, OCH3) ; 3. 86 (d, 3H, 3J= 10.0 Hz, OCH3) ; 1. 67 (t,3H,3JH-P=15.5 Hz). ACTIVITES ANTI-PROLIFERATIVES ET ANTI-INVASIVES DE COMPOSES SELON L'INVENTION Deux bisphosphonates dénommés BP1 et BP2 dont les formules figurent cidessous ont été testés sur des modèles cellulaires et animaux. BP1 n'étant pas partiellement estérifié correspond à un exemple comparatif. Tests in vitro Matériel et méthodes : Les bisphosphonates BP1 et BP2 ont été testés sur différentes lignées cellulaires : - FRCjun MRA, lignée de fibrosarcome murin après transfection de cellules FR3T3 par l'oncogène jun-4, - Cellules A 431 de tumeur épidermoïde humaine, ces cellules présentent une boucle autocrine au VEGF (vascular endothelial growth factor) et entraînent une fois implantées chez des souris immunodéprimées un développement rapide de tumeurs fortement angiogéniques, - Cellules MDA MB 435 de tumeur mammaire humaine, - Cellules HUV-EC-C, cellules endothéliales de cordon ombilical humain (HUVEC) transformées, - Cellules BBC, cellules endothéliales de capillaires cérébraux bovins. La prolifération cellulaire en présence de différentes doses de BP1 ou de BP2 à été mesurée par un test MTT après 24,48 et 72 h de culture. Résultats in vitro : Les bisphosphonates (0,1-2 mM) inhibent la prolifération des cellules FRCjunMRA, MDA MB 435 et A 431 de manière temps et dose dépendants (Fig. 2 et 3). A titre d'exemple BP2 (2 mM) inhibe la prolifération des 3 lignées cellulaires respectivement de 40%, 60% et 30% après 48 h de culture. Un temps de traitement de 72 h par BP2 (2 mM) entraîne une inhibition de 80% de la prolifération des cellules A 431 (P Un test d'exclusion au bleu trypan montre que BP1 et BP2 n'induisent pas de toxicité cellulaire, même à des concentrations supérieures à 5 mM. Par ailleurs, les bisphosphonates (0,1-2 mM) inhibent également la prolifération des cellules endothéliales HUV EC C et BBC de manière temps et dose dépendants. Tests de toxicité Des souris immunodéprimées, non tumorées, ont été traitées par BP1 et BP2 à différentes concentrations s'échelonnant de 0,06 à 6mg par injection et par souris. Les souris recevaient une injection par jour pendant une semaine. Le poids des animaux était mesuré avant, pendant et après le traitement. Les doses de BP1 inférieures à 6 mg/injection et toutes les doses de BP2 testées (0,06 - 6 mg/injection) n'ont pas montré de signes de toxicité tels perte de poids, diarrhée, infection ou anémie chez les animaux traités. Tests in vivo Matériel et méthodes : Des cellules A 431 ont été injectées en sous cutanée chez des souris immunodéprimées. Les souris développaient des tumeurs en une semaine. Les souris porteuses de tumeurs étaient placées arbitrairement en groupe témoin, et des groupes traités par BP1 et BP2 à différentes concentrations. Les souris recevaient en sous cutanée à proximité de la tumeur deux fois par semaine, 0,1 ml de PBS seul pour les témoins (n=6), ou du PBS contenant soit BP1 soit BP2 aux doses suivantes : 0,006 (n=6) ; 0,06 (n=6) ou 0,6 mg/injection (n=6). Les tumeurs étaient mesurées toutes les semaines et leur volume V déterminé par la formule : V = (4/3) #R12R2 où R1 est le rayon 1 et R2 le rayon 2, avec R1 Après sacrifice des animaux et prélèvements des tumeurs, ces dernières étaient pesées fixées, incluses en paraffine puis coupées. Les cellules endothéliales des vaisseaux tumoraux mis en place durant l'angiogenèse tumorale étaient visualisées par des techniques immunohistochimiques (GSL 1). L'angiogenèse tumorale a été déterminée par analyse d'images à l'aide d'un programme NIH image. Résultats in vivo Le traitement avec les bisphosphonates inhibent la croissance des tumeurs A 431 et est maximale même aux doses les plus faibles (Fig. 4). Après 5 semaines de traitement, BP1 et BP2 (0,6mg/injection/souris) inhibent la croissance des tumeurs A 431 respectivement de 40% et 56% (P Au contraire des résultats obtenus in vitro, les résultats in vivo montrent que BP2 est plus efficace que BP1. Par ailleurs, l'inhibition de la croissance des tumeurs A 431 chez les animaux traités est corrélée à une inhibition de l'angiogenèse intratumorale (Fig. 5). Cette inhibition, démontrée par une baisse significative de la surface occupée par les cellules endothéliales par unité de surface, est notée dès les plus faibles valeurs de BP1 et BP2. A notre connaissance, les bisphosphonates synthétisés sont les premiers à présenter une action anti tumorale in vivo sur la tumeur primaire, leurs effets étant corrélés à une baisse de l'angiogenèse. REVENDICATIONS 1- Dérivés de bisphosphonate, caractérisés en ce qu'ils présentent la formule (I) suivante : dans laquelle Ri, R2 et R3, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle, aryle, acyloxyalkyle, ou hétérocycle, A représente un radical de formule -(CH2)n-R4, R4 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle, un radical aryle, un hétérocycle ou un radical de formule -NR5R6, R5 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, n est un entier de 0 à 24 inclusivement, à l'exclusion des composés de formule (I) dans laquelle Ri, R2 et R3 représentent simultanément un atome d'hydrogène, ses isomères optiques et géométriques, ses racémates, ses sels, ses hydrates et leurs mélanges. 2- Dérivés selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'au moins deux des substituants Ri, R2 et R3 sont différents d'un atome d'hydrogène. 3- Dérivés selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que les substituants Ri, R2 et R3, qui sont différents d'un atome d'hydrogène, sont identiques. 4- Dérivés selon l'une des revendications 1, 2 ou 3, caractérisés en ce que R1, R2 et R3 représentent un atome d'hydrogène ou un radical alkyle de C1-12, plus particulièrement de C1-6. 5- Dérivés selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que R1, R2 et R3 représentent le radical méthyle ou éthyle. 6- Dérivés selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que A représente un radical de formule -(CH2)n-R4, dans laquelle R4 représente un radical alkyle C1-C6, un radical hétérocycle, un radical phényle, ou un radical de formule -NR5R6, dans laquelle R5 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un radical alkyle de C1-6, dans laquelle avantageusement n est entier de 1 à 6 inclusivement, de préférence de 1 à 3. 7- Dérivés selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que A représente un radical choisi parmi : 8- Procédé de préparation de composés de formule (1), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - la mise en contact d'au moins un halogénure d'acide de formule (II) : ACOX, ou d'un a-cétophosphonate de formule (III) : avec au moins un phosphite silylé de formule (IV) : P[(OSialk3)x][OR3]3-x (IV) dans lesquelles R1, R2 et R3, identiques ou différents, représentent un radical alkyle, aryle, acyloxyalkyle, ou hétérocycle, A étant tel que défini dans l'une des revendications précédentes, X représente un atome d'halogène, de préférence le chlore, alk représente un radical alkyle de C1-6, x représente 2 ou 3, - une hydrolyse des composés obtenus à l'étape précédente. 9- Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - la mise en contact d'au moins un halogénure d'acide de formule (II) : ACOX avec au moins un phosphite de formule (V) : P(OR1 )(OR2)(OR), avec R1, R2 et R, identiques ou différents, représentent un radical alkyle, aryle, acyloxyalkyle, ou hétérocycle, pour former un a-cétophosphonate de formule (III), - la mise en contact de l'a-cétophosphonate obtenu à l'étape précédente avec au moins un phosphite silylé de formule (IV) tel que défini à la revendication précédente, - l'hydrolyse des composés obtenus à l'étape précédente. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le phosphite silylé est un composé de formule (IV) dans laquelle x vaut 2. 11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le phosphite silylé est un composé de formule (IV) dans laquelle x vaut 3. 12. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on met en contact au moins un halogénure d'acide de formule (II) : ACOX ; avec au moins un phosphite silylé de formule (IV) dans laquelle x vaut 2, puis on met en contact le produit ainsi obtenu avec au moins un phosphite silylé de formule (IV) dans laquelle x vaut 3. 13. Composition pharmaceutique comprenant, dans un support pharmaceutiquement acceptable, au moins un composé de formule (I) tel que défini dans l'une des revendications 1 à 7. 14. Composition pharmaceutique selon la revendication précédente, pour le traitement ou la prophylaxie des maladies caractérisées par un métabolisme du calcium anormal. 15. Composition pharmaceutique selon la revendication 13, pour le traitement de tumeurs malignes, plus particulièrement le traitement de tumeurs malignes solides. 16. Composition pharmaceutique selon la revendication 13, pour inhiber partiellement ou totalement l'angiogenèse tumorale. 17. Utilisation d'un composé tel que défini selon l'une des revendications 1 à 7 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la mise en oeuvre d'une méthode de traitement ou de prophylaxie du corps humain ou animal.