Brevet FR2842210A1 — publié le 20040116

Déterminants de pathogénicité utilisables comme cibles pour l'élaboration de moyens de prévention et de contrôle d'infections bactériennes et/ou de la dissémination systémique. L'invention a pour objet des déterminants de pathogénicité utilisables comme cibles pour l'élaboration de moyens de prévention et de contrôle d'infections bactériennes et/ou de la dissémination systémique. Les traitements actuels des maladies infectieuses d'origine bactérienne sont basés sur l'inhibition de cibles bactériennes essentielles in vitro à l'aide d'antibiotiques. Ces cibles sont conservées dans de nombreuses espèces bactériennes et permettent de traiter différents types d'infections. Cependant, les antibiotiques à large spectre sont actifs sur la flore commensale de l'hôte, ce qui favorise l'acquisition et le transfert des mécanismes de résistance à ces antibiotiques, d'o une limitation de l'efficacité des traitements antibiotiques actuels. Il existe donc un besoin de nouveaux traitements antibactériens. L'invention fournit à cet égard, une nouvelle stratégie ayant pour but de cibler spécifiquement les bactéries pathogènes sans altérer de façon significative leur croissance au niveau de leur porte d'entrée dans l'organisme hôte, o elles se trouvent en situation de commensalisme. Ces pathogènes sont notamment les bactéries responsables d'infections systémiques sévères telles que E.coli, de façon générale les Entérobactéries, les Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Neisseria et pour les gram positifs, les bactéries du genre Staphylocoque, Entérocoque et Streptocoque. On sait que, de manière spécifique, les bactéries responsables des infections graves sont capables de croître en présence de sérum et sont résistantes à l'action bactéricide du complément. Cette résistance permet une dissémination de l'infection via le sang aux différents tissus de l'organisme de l'hôte. Ces propriétés sont conférées par des facteurs de pathogenicité/virulence. Parmi ceux fréquemment cités, on mentionnera la barrière physique que représente la capsule pour l'accès du complément à la membrane bactérienne, les acides sialiques de la capsule ou de l'antigène O qui favorisent la fixation du facteur H sur c3b, et des protéines de surface particulières telles que PorA (Neisseria gonorrhoeae), YadA (Yersinia pestis), protéine M (Streptococcus pyogenes) qui fixent le facteur H, tous ces facteurs empêchant l'activation du complément. D'autres protéines exprimées ou fixées par les pathogènes se sont révélées importantes pour la résistance au complément et provoquent le clivage les facteurs du complément, ou inhibent leurs fixation à la surface de la bactérie. (Rautemaa R.; Meri S., Microbes and Infection 1999, 1:785-794). Le lipopolysaccharide (LPS) des gram négatifs est reconnu comme un facteur de virulence, mais le rôle de ses différents constituants sur la résistance au sérum n'a pas été établi pour toutes les espèces bactériennes. Par exemple, dans certaines études chez E.coli, l'antigène O est considéré comme déterminant (Burns S.M. Hull S.I. Infect Immun, 1998, Sept 66(9):4244-53); dans d'autres études, l'antigène O serait moins déterminant que les antigènes capsulaires pour la résistance au sérum (Russo T. et al., Infect Immun, 1995, Apr. 63(4):1263-9). D'autre part, l'importance de ces facteurs sur la colonisation intestinale est méconnue. Les inventeurs ont procédé à une analyse systématique de mutants d'inactivation des gènes nécessaires à la synthèse des polysaccharides de surface et démontré, dans des souches d'Escherichia coli responsables d'infections extraintestinales EXPEC, quels étaient les gènes essentiels pour la résistance au sérum et la dissémination dans le sang. Ces résultats ont été liés à l'étude de l'effet sur la virulence et la colonisation intestinale dans un modèle animal. L'invention vise donc une nouvelle méthodologie pour définir les cibles nécessaires à la virulence, et non essentielles in vitro, et fournir ainsi de-nouveaux agents anti-infectieux et spécifiques des bactéries pathogènes, en particulier de E. col! extra-intestinale, responsables d'infections sévères. Elle vise également les produits des gènes nécessaires pour la résistance dans le sérum et la virulence in vivo. La méthode de l'invention pour identifier un gène acquis pour la prolifération in vivo d'un microorganisme pathogène est caractérisée en ce qu'elle comprend: * l'utilisation d'une souche du microorganisme pathogène, * la génération de mutants d'inactivation dans les gènes codant pour les facteurs de virulence, * la détermination de la virulence de ces mutants sur un modèle expérimental d'infection et de leur effet sur la colonisation entérique chez un modèle de souris axénique, et * la sélection des gènes bactériens essentiels pour la résistance au sérum in vitro, et essentiels chez l'hôte pour la dissémination sérique. Le microorganisme pathogène est notamment une souche EXPEC de E.coli. Les mutants d'inactivation des gènes de virulence mis en oeuvre dans cette méthode entrent dans le cadre de l'invention. L'invention vise en outre les acides nucléiques ainsi identifiés, responsables de la dissémination par voie sanguine, mais n'affectant pas de manière significative la colonisation intestinale ou mucosale de bactéries pathogènes telles que E.coli, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Yersinia pestis, Serratia marcescens, Haemophilus influenzae, Pasteurella multocida, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Acetinobacter, Moraxella catarrhalis, Burkholderia pseudomallei, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Bacteroides fragilis, Clostridium acetobutylicum Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Enterococcus. L'invention vise en particulier les acides nucléiques isolés ou purifiés, caractérisés en ce qu'ils répondent à l'une des séquences de nucléotides SEQ ID N016-30. Elle vise également les ADNc et les ARNs correspondant à ces acides nucléiques. L'invention vise également les vecteurs comprenant au moins un acide nucléique tel que défini ci-dessus, ainsi que les cellules hôtes contenant au moins un tel vecteur sous le contrôle d'un promoteur approprié. Les produits d'expression des acides nucléiques définis ci-dessus sont également visés par l'invention. Il s'agit plus spécialement de polypeptides et peptides isolés ou purifiés, codés par des acides nucléiques tels que définis plus haut. L'invention vise en particulier les polypeptides et peptides isolés ou purifiés répondant à l'une des séquences d'acides aminés SEQ ID N01-15. Les anticorps capables de se lier spécifiquement aux peptides ci-dessus font également partie de l'invention. Ces acides nucléiques et peptides ou polypeptides constituent des cibles pour identifier des composés à effet inhibiteur spécifique sur la dissémination systémique d'une infection bactérienne, et non sur la colonisation des muqueuses ou, pour les entérobactéries, sur la colonisation intestinale, ce qui permet de préserver la flore commensale et d'éviter la sélection de résistance aux composés. L'invention vise ainsi une méthode pour inhiber la prolifération d'un microorganisme pathogène dans le sérum, comprenant l'utilisation d'une quantité efficace d'un composé capable d'inhiber l'activité ou de réduire la quantité d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus, ou d'un composé capable d'inhiber l'activité d'un polypeptide ou d'un peptide tel que défini ci-dessus. Elle vise également une méthode de criblage de composés susceptibles d'inhiber l'expression de ces acides nucléiques ou des polypeptides et peptides correspondants comprenant leur mise en contact avec le composé à tester, la mise en évidence de l'effet éventuel du composé sur leur activité, et la sélection des composés actifs. Elle vise également une méthode de criblage de composés susceptibles d'inhiber l'activité biochimique et/ou enzymatique des polypeptides et peptides exprimés par lesdits acides nucléiques. Les composés ainsi sélectionnés sont utilisés, conformément à l'invention, pour fabriquer des médicaments pour inhiber une infection bactérienne, notamment une infection extra-intestinale dans le cas des entérobactéries. L'invention fournit ainsi une nouvelle stratégie et de nouveaux moyens pour prévenir ou traiter une dissémination bactérienne systémique, une bactérémie et une septicémie. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés dans les exemples qui suivent, en se référant aux figures 1 et 2, qui représentent, respectivement, - la figure 1, la croissance de S26 et du mutant pg23 en sérum, et - la figure 2, la croissance de S26 et du mutant pg23 en sérum décomplémenté. Exemple du gène correspondant à la séquence 23: 1-Inactivation des gènes d'intérêt La stratégie générale basée sur un système de recombinaison, consiste à interrompre un gène par recombinaison allélique avec un gène de sélection (un gène de résistance à un antibiotique dans le cas présent) porté par un fragment d'ADN linéaire. Dans un premier temps, on introduit dans la bactérie (par exemple E.coli) un plasmide de façon à apporter en trans les protéines qui vont induire la recombinaison. Le plasmide portant un gène de résistance à l'ampicilline, est thermosensible (300C), ce qui permettra facilement son élimination après utilisation dans la bactérie. Le plasmide est introduit dans la bactérie par électroporation. Après électroporation, les bactéries résistantes à l'ampicilline seront celles qui auront intégré le plasmide et seront sélectionnées. Cette étape est entièrement réalisée à 300C, température permissive pour le plasmide. Synthèse du fragment de PCR spécifique du gène cible (pg23) A partir d'un plasmide matrice portant le gène de sélection (résistance au chloramphénicol), une PCR est réalisée en utilisant des amorces pg23Pl et pg23P2, respectivement, de séquences SEQ ID N031 et SEQ ID N032, composées de deux parties: en 3': 20 pb homologues au gène de sélection (résistance au chloramphénicol): Pl ou P2 en 5': 40 pb homologues au gène cible (pg23): Hl ou H2 pg23Pl: 5' TCGTGCAGGCCAACCTGCACAACAGAGTGATTTGATTAACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 3' Hi Pl Pg23P2: 5' CAGGGTGCTGGCGCTCACCATTTCCGGAGACAGCTTAGACACATATGAATATCCTCCTTA 3' H2 P2 On obtient ainsi un fragment d'ADN constitué du gène de sélection (CAT: Chloramphénicol Acétyl Transférase) flanqué des régions homologues au gène cible Hl et H2. Etape d'inactivation du gène cible La bactérie contenant le plasmide est mise en culture dans du milieu LB à 300C sous agitation, en présence d'ampicilline 100 mM et de L-arabinose 1 mM de façon à induire le système de recombinaison. Lorsque les bactéries sont en phase exponentielle de croissance (DOEoonm=0,5), la culture est arrêtée, les bactéries sont récoltées et rendues électrocompétentes. Par électroporation, le produit de PCR spécifique du gène cible (pg23) est introduit dans la bactérie. Les bactéries sont ensuite mises en culture dans un milieu riche (milieu SOC) non sélectif à 370C sous agitation pendant 2 heures, puis étalées sur milieu sélectif LB agar. Après 18 heures à 370C, seules auront poussé les bactéries ayant intégré le gène de résistance à l'antibiotique. Vérification de l'insertion de la cassette de résistance Afin de vérifier l'insertion de la cassette de résistance, des réactions de PCR sont réalisées directement à partir de colonies. Trois couples d'amorces sont utilisés: un couple dont les amorces FR1 et FR2 encadrent le gène cible, et deux couples utilisant une amorce située à l'intérieur de la cassette de résistance, l'autre amorce étant localisée soit en amont soit en aval du gène cible. Isolement des bactéries mutées et élimination du plasmide Les colonies ainsi vérifiées par PCR sont réisolées successivement sur milieu sélectif, deux fois sur milieu non sélectif et une dernière fois sur milieu sélectif à 370C. Enfin les bactéries sélectionnées sont testées pour la sensibilité à l'ampicilline qui témoigne de l'absence du plasmide. Trois clones sont ainsi choisis pour chaque type de mutant. 2-Test du mutant vis-à-vis de la résistance à l'activité bactéricide du sérum Le sérum utilisé est d'origine humaine. Lors de chaque expérimentation, la croissance a également été réalisée pour la souche sauvage (S26 isolat clinique de E. coli particulièrement résistant au sérum et virulent chez la souris) et une souche ECOR4 dépourvue de capsule et de lipopolysaccharide (LPS). Les croissances ont été réalisées en triplicate et dans deux sérums différents. Les croissances ont été menées parallèlement en sérum complémenté et décomplémenté (30 min à 560C) de façon à vérifier que l'effet observé était d uniquement à l'action lytique du complément. A partir d'une préculture de deux heures en milieu minimum référencé RPMI, les bactéries sont mises en présence de sérum 100%, à un inoculum de départ de 104ufc/ml. Des numérations sont ensuite effectuées aux temps 0, 1 et 4 heures en étalant différentes dilutions sur milieu LB agar en présence ou non d'antibiotique. Après 18 heures à 370C, les bactéries sont comptées et une courbe de croissance est réalisée à partir des résultats obtenus. Ces résultats sont donnés sur les figures 1 et 2. Dans cet exemple, le mutant Apg23 présente une sensibilité importante au sérum: on observe en effet une différence avec la souche sauvage de plus de 2 log à 1 heure et de plus de 4 log à 4 heures. D'autre part les résultats obtenus en sérum décomplémenté et avec la souche ECOR4 en sérum indiquent que l'effet observé est bien d à l'action bactéricide du complément. 3-Etude de la virulence dans un modèle animal de souris Préparation de 1'inoculum Les bactéries sauvages et mutées sont isolées à partir de la souche conservée à -80WC sur boîte LB agar avec ou sans antibiotique et incubées à 37 OC pendant 18 heures. Une préculture est réalisée sur milieu liquide. A partir d'une dilution au 1/10ème dans 10 ml de LB, la culture est reconduite à 370C sous agitation pendant 2 heures. Après 2 heures de culture, la DO600nm est mesurée et différentes dilutions sont réalisées dans de l'eau physiologique de façon à obtenir l'inoculum désiré. Pour la souche sauvage S26, la DL50 correspond à un inoculum de 5. 105 ufc/souris et la DL100 à un inoculum de 1.106 ufc/souris. Test de virulence Les souris (Balb/c âgées de 6 semaines) reçoivent une injection par voie intrapéritonéale et la solution bactérienne injectée représente un volume de 100 gl. Cinq souris sont utilisées par dose. Pour S26Apg23, 4 inoculums ont été testés et le taux de survie a été mesuré au bout de 24 et 48 heures après l'injection. Lors de chaque expérimentation, l'étude a été réalisée en parallèle avec la souche sauvage dont la DL50 =5 105. Le mutant S26Apg23 injecté à une dose égale à 10 fois la DL1oo ne provoque aucune mortalité, la mutation du gène pg23 chez la souche E. col! Kl S26 est donc responsable d'une diminution importante de la virulence. 4-Etude de la colonisation intestinale dans un modèle animal de souris axénilues L'intégralité de l'expérimentation est réalisée dans un environnement stérile, avec des instruments stériles, sous isolateur et les souris reçoivent une alimentation stérile. Les souris Il s'agit de souris femelles, axéniques, de lignée C3H/He J, âgées de 6 à 8 semaines. Quatre animaux sont utilisés par souche bactérienne. Préparation de 1'inoculum Les bactéries sauvages et mutées sont isolées à partir de la souche conservée à -800C sur boîte LB agar avec ou sans antibiotique et incubées à 37 OC pendant 18 heures. Après culture de la souche en milieu liquide, différentes dilutions sont réalisées dans de l'eau physiologique de façon à obtenir un inoculum de 107 ufc/ml. Test de colonisation L'inoculation bactérienne se fait par voie orale. Pendant les 24 heures précédant l'inoculation, les souris sont privées d'eau. On leur donne ensuite à boire une solution bactérienne à 107 ufc/ml pendant 4 heures. Le volume de boisson est mesuré à 0 et 4 heures, et en moyenne une souris absorbe 5 ml de cette solution bactérienne. Les feces sont ensuite prélevés à différents temps, une numération bactérienne est réalisée en reprenant les feces dans de l'eau physiologique et en étalant différentes dilutions sur boîte LB agar avec et sans antibiotique. UFC/mq feces temps en heures S26wt S26Apg23 4 6,85E+05 1,65E+05 1,86E+06 2,84E+06 118 8,34E+06 7,94E+06 456 4,14E+06 6,64E+06 Pour la souche sauvage S26, de même que pour le mutant S26Apg23, une colonisation au niveau de l'intestin s'est installée de manière stable. Aucune différence n'est constatée entre la souche sauvage et le mutant Apg23. La colonisation est confirmée le dernier jour par le prélèvement de l'intestin et la numération bactérienne après broyage de cet organe. Clonage et expression du polypeptide sélectionné L'acide nucléique codant le polypeptide est cloné dans un vecteur d'expression procaryote tel que le pET-14b avec un tag N-terminal poly-his selon les méthodes classiques de clonage. Le plasmide recombinant est ensuite utilisé pour transformer la souche de E.coli BL21. Les cellules transformées sont sélectionnées en présence d'ampicilline et les colonies sont isolées. Elles sont ensuite cultivées en présence d'IPTG pour induire l'expression de la protéine. Les clones produisant la protéine sont mis en culture et les protéines totales extraites par la lyse des cellules. La protéine recombinante est purifiée par colonne d'affinité pour le tag Histidine selon le protocole du fabricant. La protéine ainsi obtenue est purifiée et utilisée in vitro pour mesurer son activité enzymatique. 284221 0 m - 13 REVENDICATIONS 1/ Méthode pour identifier un gène requis pour la prolifération in vivo d'un microorganisme pathogène, comprenant - l'utilisation d'une souche du microorganismes pathogène, - la génération de mutants d'inactivation dans les gènes codant pour ces facteurs, - la détermination de la virulence de ces mutants sur modèle expérimental d'infection, et de leur effet sur la colonisation entérique chez un modèle de souris axénique, et - la sélection des gènes bactériens essentiels pour la résistance au sérum in vitro, et essentiels chez l'hôte pour la dissémination sérique. 2/ Méthode selon la revendication 1, caractérisée par l'utilisation d'une souche EXPEC de E.coli. 3/ Acides nucléiques isolés ou purifiés, caractérisés en ce qu'ils répondent à l'une des séquences de nucléotides SEQ ID N016-30. 4/ Les ADNc des acides nucléiques selon la revendication 3. / Les ARNs des acides nucléiques selon la revendication 3. 6/ Acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisés en ce qu'ils correspondent aux acides nucléiques d'organismes pathogènes comprenant E.coli, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Yersinia pestis, Serratia marcescens, Haemophilus influenzae, Pasteurella multocida, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Acetinobacter, Moraxella catarrhalis, Burkholderia pseudomallei, Neisseria meningitidis,. Neisseria gonorrhoeae, Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Bacteroides fragilis, Clostridium acetobutylicum, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Enterococcus. 7/ Acides nucléiques selon la revendication 6, caractérisés en ce qu'ils correspondent à des acides nucléiques de E.coli. 8/ Vecteurs comprenant au moins un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 3 à 7. 9/ Cellules hôtes contenant au moins un vecteur selon la revendication 8. / Les produits d'expression des acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 3 à 7. 11/ Peptides isolés ou purifiés caractérisés en ce qu'ils répondent à l'une des séquences d'acides aminés SEQ ID N01-15. 12/ Les anticorps capables de se lier spécifiquement aux peptides selon la revendication 10 ou 11. 13/ Méthode pour inhiber in vitro la prolifération d'un microorganisme pathogène dans le sérum, comprenant l'utilisation d'une quantité efficace d'un composé capable d'inhiber l'activité ou de réduire la quantité d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, ou d'inhiber l'activité d'un peptide ou d'un polypeptide selon la revendication 10 ou 11. 14/ Méthode de criblage de composés susceptibles d'inhiber l'expression des acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, ou des polypeptides ou peptides selon la revendication 10 ou 11, comprenant la mise en contact avec le composé à tester, la mise en évidence de l'effet éventuel du composé sur leur activité et la sélection des composés actifs. / Méthode de criblage de composés susceptibles d'inhiber l'activité biochimique et/ou enzymatique des polypeptides et peptides exprimés par lesdits acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 3 à 7.