Brevet FR2845692A1 — publié le 20040416

On connaît différents virus de type herpès qui se distinguent par leur génome ainsi que par leurs caractéristiques biologiques. Une sous famille de ces virus correspond aux alpha herpès virus parmi lesquels on peut nommer les virus herpès simplex humain de type 1 et de type 2 (HSV-1 et HSV-2), le virus de la maladie d'Aujeszky ou Pseudorabies virus (PRV) et l'herpès virus bovin de type 1 (BHV-1). Tous ces virus présentent la particularité d'être neurotropes et d'avoir un cycle de réplication très bref et un large spectre d'hôte. L'infection par ces virus provoque des lésions de l'épiderme, se situant en règle générale au niveau des muqueuses, suivies d'une propagation du virus au système nerveux pouvant y entraîner des inflammations aiguës, ainsi que des infections latentes. Parmi les alpha herpès virus entraînant les ravages les plus importants, on peut citer le virus PRV qui est un agent pathogène d'une importance économique majeure en production porcine tant par le coût direct des pathologies induites que par celui des moyens de lutte mis en #uvre. Ce virus est largement présent dans la plupart des régions de forte production porcine (Europe, Amérique du Nord, Asie). Il existe actuellement plusieurs vaccins contre le virus PRV qui représentent un marché important à l'échelle mondiale. Une telle vaccination n'est cependant pas sans inconvénients compte tenu en particulier du coût entraîné par la nécessité de vacciner une large proportion des animaux d'un troupeau et les problèmes pratiques liés à cette nécessité qui rendent cette opération particulièrement incommode, ce d'autant plus qu'il est en général nécessaire de faire plusieurs injections. Le coût et les contraintes de cette opération peuvent en limiter l'usage et par là même également l'efficacité. Des stratégies d'éradication du virus sont également utilisées avec des résultats variables mais toujours fragiles. Par suite, la conception d'un procédé permettant d'engendrer des lignées de porcs transgéniques constitutivement résistants au virus PRV aurait un intérêt économique considérable. L'invention a pour objet de proposer un tel procédé. Celui-ci a pu être conçu grâce à des recherches préalables effectuées sur un modèle souris, qui tout comme le porc est sensible à certains alpha herpès virus et en particulier aux virus HSV1et PRV. Il est connu que les alpha herpès virus se lient aux cellules d'abord grâce à l'interaction d'une glycoprotéine virale gC, entrant dans la constitution de la membrane du virion et de l'héparane sulfate présent à la surface des cellules, alors que la fusion ultérieure entre l'enveloppe du virion et la membrane cellulaire fait, quant à elle, intervenir d'autres glycoprotéines (gB, gD, gH et gL). De nombreux travaux ont porté sur l'étude de récepteurs potentiels des alpha herpès virus présents à la surface des cellules de mammifères hôtes ayant une capacité de fixation de la particule virale et pouvant éventuellement neutraliser ainsi son pouvoir infectieux. Quatre récepteurs humains des alpha herpès virus ont été identifiés à ce jour à savoir : - le HVEM ou HveA qui est un médiateur d'entrée des virus HVS1et HVS2 mais pas du virus PRV (Montgomery, R. I., Warner, M. S., Lum B. J., and Spear, P. G. (1996). Herpes simplex virus-1entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell 87, 427-436). - trois membres de la superfamille des immunoglobulines (HveB ou nec- tin-2 ; HveC ou nectin-1et HveD) (Cocchi, F., Menotti, L., Mirandola, P., Lopez, M., and Campadelli-Fiume, G. (1998). The ectodomain of a novel member of the immunoglobulin subfamily related to the poliovirus receptor has the attribute of a bona fide receptor for herpes simplex virus types 1 and 2 in human cells. J. VIrol. 72,9992-10002 ; Geraghty, R. J., Krummenacher, C., Eisenberg, R. J., Cohen G. H., and Spear, P. G. (1998) Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor related protein 1 and poliovirus receptor. Science 280,1618- 1620 ; Shukla, D., Liu, J., Blaiklock, P., Shworak, N. W., Bai, X., Esko, J. D., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Rosenberg, R. D., and Spear, P. G. (1999). A novel role for 3-0-sulfate heparan sulfate in herpes simplex virus entry. Cell 99, 13-22 ; Warner, M. S., Martinez, W., Geraghty, R. J., Montgomery, R. I., Witbeck, J. C., Xu, R., Eisenberg, R ; J., Cohen, G. H., and Spear, P. G. (1998). A cell surface protein with herpesvirus entry activity (HveB) confers susceptibility to infection by herpes simplex virus type 2, mutants of herpes simplex virus type 1 ans pseudorabies virus. Virology 246,179-189. Selon les publications Spear, P. G. (1993). Entry of alphaherpesviruses into cells. Semin. Virol. 4, 167-180 ; Campadelli-Fiume, G., Arsenakis, M., Farabegoli, F., and Roizman, B. (1988). Entry of herpes simplex virus 1 in BJ cells that constitutively express viral glycoprotein D is by endocytosis and results in dégradation of the virus. J. Virol. 62,159- 167, il a été suggéré que, outre la liaison initiale avec l'héparane sulfate, c'est l'interaction de la glycoprotéine gD de l'alpha herpès virus avec un récepteur présent à la surface de la cellule qui permet l'entrée du virus sous une forme infectieuse et que dans certains types de cellules, les virus HSV-1, PRV et BHV-1 peuvent utiliser un récepteur commun de la glycoprotéine gD pour entrer dans la cellule. Il a été montré que la protéine gD des virus HSV1et HSV2 est ainsi un ligand fort de la protéine HVEM exprimée par l'homme et de celle exprimée par la souris, ainsi que de la protéine HveC ou nectin-1exprimée par l'homme. La protéine gD du virus PRV n'est pas en revanche un ligand de la protéine HVEM mais constitue un ligand fort de la protéine HveC exprimée par le porc, y compris des formes tronquées de celle-ci. (Milne, R. S. B., Connolly, S. A., Krummenacher, C., Eisenberg, R. J., and Cohen, G. H. (2001). Porcine HveC, a member of the highly conserved HveC/nectin 1 family, is a functional alphaherpesvirus receptor. Virology 281, 315-328.). Ces capacités de liaison à la glycoprotéine virale gD sont plus particulièrement attribuées au domaine V pour HveC et aux deux premiers domaines riches en cystéine ( CRD ) pour HVEM (StructureBased Analysis of the Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Binding Site Present on Herpesvirus Entry Mediator HevA (HVEM). Connolly SA, Land- sburg DJ, Carfi A, Wiley DC, Eisenberg RJ, Cohen GH ; Jvirol 2002, Nov 1 ; 76 (21) : 10894-10904). A partir de ces connaissances préalables, il est proposé conformément à l'invention un procédé pour produire un mammifère appartenant à une espèce non humaine rendu résistant à une infection par un alpha herpès virus donné par transgénèse germinale, caractérisé en ce que l'on introduit par insertion ou recombinaison homologue dans le génome des cellules constituant la lignée germinale du mammifère ou de l'un de ces ancêtres un transgène codant pour une protéine chimérique constituée d'une part du domaine extracellulaire d'un récepteur cellulaire potentiel de l'alpha herpès virus visé ou de l'une de ses parties et d'autre part du fragment cristallisable d'une immunoglobuline, notamment d'une immunoglobuline de type gamma, dans un système d'expression approprié. Selon l'invention, le récepteur de l'alpha herpès virus visé et/ou l'immunoglobuline appartiennent de préférence à l'espèce homologue. Le récepteur utilisé est une protéine membranaire dont une glycoprotéine virale de surface, telle gD, est un ligand fort, telle que HveC chez le porc pour le virus PRV ou HVEM chez la souris pour le virus HSV- 1. On pourra également n'utiliser qu'une partie du récepteur telle que le domaine V pour HveC ou les deux premiers domaines riches en cystéine pour HVEM, ou même, le cas échéant des formes mutées de ces parties, sélectionnées pour leur capacité de liaison avec le virus. La première étape du procédé conforme à l'invention correspond donc à la préparation du transgène qui peut être effectuée en mettant en oeuvre des méthodes bien connues des spécialistes et abondamment décrites dans la littérature constituant à cloner : 1. d'une part, soit l'ADN complémentaire de l'ARN transcrit pour le gène du récepteur cellulaire choisi, à partir d'une préparation d'ARN extraite d'un prélèvement de tissu pris sur un mammifère, soit la région chro- mosomique (ensemble des exons et introns) constituant le gène de ce récepteur à partir d'une préparation d'ADN génomique extraite égale- ment d'un prélèvement de tissu réalisé sur un mammifère, soit une construction chimérique constituée pour partie de l'ADNc et du frag- ment génomique correspondant ( minigène ). On utilisera seulement la partie correspondant au domaine extracellulaire de ce récepteur, ou dans une autre version du procédé, uniquement la partie montrée res- ponsable de ses capacités de fixation aux glycoprotéines virales de surface du virion au sein de ce domaine extracellulaire, 2. d'autre part, soit l'ADNc complémentaire de l'ARN transcrit pour l'un des gènes de chaîne lourde pour la classe et la sous-classe d'immunoglobuline choisie (par exemple Gl), à partir d'une préparation d'ARN extraite d'un prélèvement de tissu pris sur un mammifère, soit la région chromosomique (ensemble des exons et introns) constituant ce gène de chaîne lourde à partir d'une préparation d'ADN génomique extraite également d'un prélèvement de tissu réalisé sur un mammi- fère, soit une construction chimérique constituée pour partie de l'ADNc et du fragment génomique correspondant ( minigène ). La construc- tion réalisée retiendra avantageusement les régions codant pour les domaines Hinge CH2 et CH3 uniquement de la chaîne lourde d'immunoglobuline choisie (fraction cristallisable). Un exemple d'une telle construction pour l'immunoglobuline humaine Glest décrit dans la publication CTLA-4 Is a Second Receptor for the B Cell Activation Antigen B7. By Peter S. Linsley, William Brady, Mark Urnes, Laura S. Grosmaire, Nitin K. Damle, and Jeffrey A. Ledbetter ; J. Exp. Med. # The Rockefeller University Press ; volume 174, Septem- bre 1991, 561-569. Les opérations de clonage seront réalisées à partir des connaissances préalables existantes relatives aux gènes utilisés, à savoir leur séquence, leur localisation chromosomique, ceci si possible dans l'espèce homologue, sinon en se basant sur les séquences existantes pour ce gène chez d'autres mammifères. Ces opérations pourront être réalisées par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) précédée d'une étape de transcription reverse pour l'ADN complémentaire ou recherche de clones génomiques susceptibles de s'hybrider avec une sonde spécifique, de produire un amplicon PCR spécifique du gène recherché. Cette construction sera réalisée de façon à joindre l'ADN codant pour le domaine extracellulaire du récepteur ou l'une de ses parties en 5' de l'ADN codant pour le fragment cristallisable de la chaîne lourde d'immunoglobuline terminé par un codon stop en respectant le cadre de lecture original des deux gènes, et éventuellement la nature et l'efficacité des jonctions introns-extrons s'ils ont été inclus, de façon à assurer, au final, l'expression d'une protéine chimérique constituée pour sa partie amino terminale du polypeptide correspondant au domaine extracellulaire du récepteur cellulaire ou à l'une de ses sous parties (domaine V notamment pour HveC) et pour sa partie carboxi terminale des domaines Hinge CH2, CH3 de la chaîne lourde d'immunoglobuline. Cette construction sera réalisée dans un vecteur d'expression permettant une expression forte de la protéine chimérique dans un ou plusieurs compartiments biologiques de l'hôte où elle permettra la protection des cellules de manière à rendre l'hôte globalement résistant à l'infection initiale ou à son développement. Le procédé consistera notamment à utiliser des systèmes d'expression actifs soit de façon cons- titutive dans l'ensemble des cellules, soit dans les tissus épithéliaux et/ou dans les tissus du système nerveux. Le vecteur d'expression pourra comprendre une région promotrice, un signal de terminaison, des éléments stimulateurs de la transcription, des séquences isolatrices du contexte chromatinien, d'autres unités de transcription, tous éléments susceptibles d'assurer l'expression souhaitée. Le procédé consistera avantageusement en l'emploi de systèmes d'expression constitués à partir de séquences régulatrices clonées chez l'espèce homologue, ou pour l'application à des animaux de rente chez d'autres animaux d'élevage habituellement consommés par l'homme. La seconde étape du procédé conforme à l'invention consiste à introduire le transgène ainsi obtenu dans le génome des cellules constituant la lignée germinale du mammifère hôte visé par insertion ou recombinaison homologue, là encore par une méthode bien connue des spécialistes de sorte que ce transgène s'intègre dans le patrimoine génétique de ce mammifère. On pourra notamment utiliser à cette fin la micro injection pronucléaire ou le transfert nucléaire de cellules transformées en culture. L'invention concerne également un mammifère appartenant à une espèce non humaine rendu résistant par transgénèse germinale à une infection par un alpha herpès virus par l'effet de l'expression d'une protéine chimérique constituée d'une part du domaine extracellulaire d'un récepteur de l'alpha herpès virus ou de l'une de ses parties de préférence de l'espèce homologue, et d'autre part du fragment cristallisable d'une immunoglobuline, notamment d'une immunoglobuline de type gamma de préférence de l'espèce homologue. L'invention concerne également le descendant d'un tel mammifère, ayant hérité par descendance du transgénèse inséré dans le génome de la lignée germinale de l'un de ses parents. Selon l'invention, le récepteur spécifique de l'alpha herpès virus peut avantageusement être la nectin-1 ou HveC, l'alpha herpès virus le virus PRV et le mammifère appartenir à l'espèce porcine. Il est essentiel conformément à l'invention que l'opération de transgénèse soit une transgénèse germinale de façon que les descendants du mammifère soient eux aussi susceptibles d'exprimer la protéine chimérique. Plusieurs exemples de séquences de protéines chimériques conformes à l'invention sont jointes en annexe. Il s'agit de séquences en acides aminés exprimées selon le code à une lettre en usage. Elles comprennent le peptide signal à l'extrémité amino terminale qui sera processé lors de la maturation. Elles sont terminées par un codon stop figure ici par *. Une protéine chimérique conforme à ce modèle est également décrite dans le document JP-2001-328430 dans le cadre d'une autre application. La faisabilité du procédé conforme à l'invention a été confirmée par des résultats expérimentaux obtenus dans le cadre de l'analyse in vivo de la résistance au virus herpes simplex humain de type 1 (HSV-1) de souris transgéniques. Selon ces tests on a introduit par transgénèse germinale dans l'ADN de ces souris un transgène codant pour une protéine chimérique constituée du domaine extracellulaire du récepteur murin HVEM de ce virus et de la portion cristallisable Fc de l'immunoglobuline IgG-1 humaine. Le domaine extracellulaire murin HveM a été cloné par RT PCR à partir d'une préparation d'ARN extraite de cellules de rate stimulées par la concavaline A, obtenues sur des souris de souche BALB/c. Les amorces utilisées pour la réaction RT PCR étaient 5'TAACTCGAGCTCTTGGCCTGAAGTTTC-3'et5'-TTAAGGATCCGAGGAGCAGGTGGTGTCT-3'. L'ADNc a été inséré dans les sites de restriction Xhol et BamHl d'un plasmide portant la séquence du fragment cristallisable de l'immunoglobuline Gl humaine (comme décrit dans la publication Nakagawa I., Murakami, M., Ijima, K., Chikuma, S., Saito, I., Kanegae, Y., Ishikura, H., Yoshiki, T., Okamoto, H., Kitabatake, A., and Uede, T. (1998). Persistent and secondary adenovirus-mediated hepatic gene expression using adenovirus vector containing CTLA4IgG. Human Gene Therapy 9, 1739-1745), sous le contrôle du promoteur CAG (promoteur de la ss actin) connu pour permettre une expression constitutive élevée dans tout type de cellule (Niwa, H., Yamamura, K., and Miyazaki, J. (1991). Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108,193-200). On a créé par micro injection du fragment Pmel/Sall de ce plasmide, contenant le facteur de stimulation de la transcription du gène viral CMV IE, le promoteur du gène Beta actin de la poule, la séquence de la protéine HVEMIg et le signal de polyadénylation 3' du locus Beta globin de lapin, dans les pronucléi d'embryons fécondés (souris FI C57 BL/6 X SJL) trois lignées A, B, C de souris transgéniques chacune issue d'un fondateur indépendant exprimant cette protéine chimérique HVEM Ig. La présence de la protéine HVEMIg a été détectée comme bande spécifique révélée par l'anticorps anti-HVEMIg de l'espèce lapine par immunoélectrophorèse dans le sérum des trois lignées de souris transgéniques, avec un titre en moyenne plus faible pour les souris de la lignée B. La construction effectuée est représentée schématiquement sur la figure 1. La concentration en protéine chimérique HVEMIg du sérum des souris des trois lignées transgéniques A B C est représentée sur les tableaux 1, 2,3 et 4 joints en annexe. Les souris transgéniques de trois lignées se sont développées normalement et on n'a pas constaté de différences entre les poids de ces souris et ceux de leurs homologues non transgéniques de la même portée. Pour déterminer si les souris transgéniques exprimant la protéine chimérique HVEMIg étaient effectivement protégées contre le virus HSV-1, on a inoculé par voie intraveineuse et une dose de 109 ufc correspondant à dix fois la dose létale (10 DL 50) de virus, des souris transgéniques et des souris non transgéniques de contrôle de la même portée. La DL 50 a été déterminée initialement chez la lignée de souris la moins sensible des deux ayant servi à la production des animaux transgéniques hybrides. Selon les figures 2,3, et 4 on a dénombré les souris transgéniques Tg respectivement des lignées A B et C et les souris non transgéniques non Tg demeurées vivantes jusqu'à 14 jours après l'infection. On a ainsi pu constater que toutes les lignées de souris transgéniques étaient résistantes au virus HSV-1. Plus précisément toutes les souris transgéniques des lignées A et C ont survécu à l'inoculation par le virus et sont restées en bonne santé pendant plusieurs mois après l'essai (tableaux 1 et 4). Seule une souris transgénique de la lignée B, est décédée après l'inoculation par le virus tandis que les six autres ont survécu (ta- bleau 3), mais la lignée B est celle pour laquelle les taux sériques mesurés en HVEMIg étaient les plus faibles. En revanche, six des sept souris non transgéniques des mêmes portées que les souris transgéniques de la lignée A, 13 des 14 souris non transgéniques des mêmes portées que les souris transgéniques de la lignée B et six des sept souris non transgéniques des mêmes portées que les souris transgéniques de la lignée C ont développé des symptômes tels qu'une paralysie et sont décédées dans les 14 jours qui ont suivi l'inoculation par le virus HSV-1. On a recherché l'expression du LAT du virus HSV-1 dans les ganglions trigéminaux des souris survivantes après l'inoculation par la méthode décrite dans les publications. - Spivak, J. G., and Fraser, N. W. (1987). Detection of herpes virus type 1 transcripts during latent infections in mice. J. Virol., 61,3841-3847. - Stevens, J. G., and Cook, M. L. (1971). Latent herpes simplex virus in spinal ganglia of mice. Science 173,843-845. On a ainsi mis en #uvre la méthode de RT-PCR de façon à détecter l'expression du LAT. Celle-ci a été observée chez les souris non transgéniques ayant développé des symptômes et chez une seule souris transgénique de la lignée B n'ayant pas présenté de symptômes, mais n'a en revanche pas été observée chez toutes les autres souris transgéniques testées ni chez les souris non transgéniques survivantes n'ayant pas développé de symptômes. Dans le cadre de cette étude on a également effectué un essai de contrôle dans le but de déterminer si les souris transgéniques exprimant la protéine chimérique HVEMIg étaient protégées contre le virus PRV ce alors que le récepteur HVEM n'est pas un récepteur de la glycoprotéine gD du virus PRV. A cet effet, on a inoculé par voie intraveineuse et par une dose correspondant à 10 fois la dose létale (10 LD 50) de virus PRV, des souris transgéniques de la lignée A et des souris non transgéniques de la même portée (tableau 2 et figure 5). On a ainsi pu constater qu'à l'exception d'une souris transgénique qui a survécu pendant 10 jours toutes les souris sont décédées dans les cinq jours suivant l'inoculation par le virus PRV. Par suite les souris transgéniques exprimant la protéine chimérique HVEMIg ne se sont pas révélées protégées contre le virus PRV. Dans le cadre de cette étude, on a également cherché à déterminer si la résistance des souris transgéniques à l'inoculation par le virus HSV-1 ayant pu être constatée in vivo s'accompagnait en parallèle d'une résistance des cellules de ces souris une fois isolées. A cet effet on a inoculé des cultures de fibroblastes embryonnaires de souris transgéniques ou de souris non transgéniques par le virus HSV-1. On a ensuite dénombré les plages de lyse provoquées par le virus dans la culture cellulaire 5 jours après l'inoculation, et constaté que le nombre de ces plages était nettement plus important dans le cas des fibroblastes de souris non transgéniques que dans le cas de fibroblastes de souris transgéniques. On a parallèlement effectué un test similaire pour le virus PRV en inoculant des cultures de fibroblastes embryonnaires issus de souris transgéniques ou de souris non transgéniques par le virus PRV, sans constater de différences notables entre le nombre de plages de lyse observé chez les souris transgéniques et chez les souris non transgéniques. Ces résultats sont de nature à prouver que la protéine chimérique HVEMIg exprimée par les fibroblastes des souris transgéniques intervient dans l'inhibition de l'adsorption du virus HSV-1 par ces fibroblastes embryonnaires. Dans un test complémentaire dont les résultats sont illustrés sur le tableau 5 on a recherché si la protéine chimérique HVEMIg présente dans le sérum de souris transgéniques pouvait inhiber la contamination de cultures cellulaires par les virus HSV-1ou PRV. Dans ce but, on a recueilli du sérum de souris transgéniques de la lignée C et incubé avec un inoculât de ce sérum le virus HSV-1 ou le virus PRV avant de le mettre en contact avec des cultures de cellules Vero. On a ainsi pu établir que le sérum de souris transgéniques de la lignée C peut protéger des cellules Vero d'une contamination par le virus HSV-1mais pas d'une contamination par le virus PRV. Un test de contrôle effectué avec du sérum de souris non transgéniques n'a au contraire pas permis de constater d'activité antivirale. On a par ailleurs constaté que le sérum des souris transgéniques de la lignée C ne présente plus d'activité antivirale après qu'il ait été mis en contact avec un sérum polyclonal anti-HVEMIg produit par hyperimmunisation sur lapin pendant 30 minutes à température ambiante. L'ensemble de ces résultats démontre que l'activité antivirale constatée provient de la protéine chimérique HVEMIg présente dans le sérum des souris transgéniques, mais sont également sans doute associés à l'expression de cette protéine chimérique à la surface des cellules de l'hôte telles les fibroblastes embryonnaires évalués dans ces tests. TABLEAU 1 Résistance des souris transgéniques de la lignée A à une inoculation par le virus HSV-1 Essai Numéro de Sexe HVEMIg (ug/ml) Symptô- Jour de la l'animal mes mort I Al M 14.8 A2 M 10.0 A3 M 11.6 A4 F 7.6 A5 F 8.3 A6 F 10.0 A7 F 24.6 A8 F 8.5 A9 F 7.9 A10 F 7.3 LI M 1.5 L2 M 1.1 L3 M 1.6 + 4 L4 M 0.8 + 14 L5 M 1.6 + L6 F 0.6 + 5 II A11 M 10.1 A12 M 15.9 A13 M 10.5 A14 M 9.3 A15 F 7.3 A16 F 14.0 A17 F 15.4 A18 F 14. 9 L7 M 0.4 + 4 L8 M 0.5 + L9 F 0.5 + TABLEAU 2 Sensibilité des souris transgéniques de la lignée A à une inoculation par le virus PRV Numéro de Sexe HVEMIg (ug/ ml) Symptô- Jour de la l'animal mes mort A19 M 41.2 + 4 A20 F 19.4 + 10 A21 F 29.6 + 5 A22 F 24.2 + 5 A23 F 20.2 + 5 C57BL/6 M NT + 4 C57BL/6 M NT + 4 C57BL/6 M NT + 5 C57BL/6 M NT + 5 C57BL/6 M NT + 5 TABLEAU 3 Résistance des souris transgéniques de la lignée B à une inoculation par le virus HSV-1 Essai Numéro de Sexe HVEMIg Symptô- Jour de RT-PCR l'animal ( g/ml) mes la mort I B1 M 8.5 - B2 M 7.8 - B3 M 7.7 - B4 F 8.1 + 11 L1 M 0.4 + 6 L2 M 0.7 + 6 L3 M 0.5 + 5 L4 M 0.7 + 7 L5 F 0.3 + 5 II B5 M 5.0 - + B6 M 6.2 - B7 F 4.4 - L6 M 0.6 L7 M 0.6 + 10 L8 M 0.5 + 7 L9 M 0.6 + + L10 F 0.4 + 7 L11 F 0.5 + 5 L12 F 0.5 + 5 L13 F 0.5 + 5 L14 F 0. 4 + 6 TABLEAU 4 Résistance des souris transgéniques de la lignée C à une inoculation par le virus HSV-1 Essai Numéro de Sexe HVEMIg Symptô- Jour de RT-PCR l'animal ( g/ml) mes la mort C1 M 20.4 - C2 M 14.2 - C3 F 19.3 - C4 F 18.5 - C5 F 24.3 - C6 F 21.8 - C7 F 24.0 - C8 F 20.6 - L1 M 1.3 - L2 M 0.9 + + L3 M 1.6 + 6 L4 F 1.3 + 5 L5 F 1.4 + 5 L6 F 1.5 + 6 L7 F 1. 6 + 5 TABLEAU 5 Neutralisation du virus HVS-1par la protéine chimérique HVEMlg dans le sérum de souris transgéniques de la lignée C. Inoculation de virus HSV1sur cellules VERO, après incubation avec des concentrations variables de ce sérum Nombre de plages de lyse observées Serum (HVEMIg ug/ ml) HSV-1 PRV (20. 4) 0 108.0 8.8 (2. 04) 0- (0. 20) 1.7 1.6 - (0. 02) 34.7 16.2 - (0. 20) + anti HVEMlg 30. 3 6. 9 Contrôle 44.0 0 107. 3 2. 9 REVENDICATIONS 1 ) Procédé pour produire un mammifère appartenant à une espèce non humaine rendu résistant à une infection par un alpha herpès virus par transgénèse germinale, caractérisé en ce que l'on introduit par insertion ou recombinaison homologue dans le génome des cellules constituant la lignée germinale du mammifère, un transgène codant pour une protéine chimérique constituée d'une part du domaine extracellulaire d'un récepteur cellulaire de l'alpha herpès virus visé ou de l'une de ses parties et d'autre part du fragment cristallisable d'une immunoglobuline, dans un système d'expression approprié. 2 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'immunoglobuline est une immunoglobuline de type gamma. 3 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le récepteur de l'alpha herpès virus visé et/ ou l'immunoglobuline appartiennent à l'espèce homologue. 4 ) Mammifère appartenant à une espèce non humaine, caractérisé en ce qu' il a été rendu résistant par transgénèse germinale à une infection par un alpha herpès virus par l'effet de l'expression d'une protéine chimérique constituée d'une part du domaine extracellulaire d'un récepteur de l'alpha herpès virus visé ou de l'une de ses parties, de préférence de l'espèce homologue, et d'autre part du fragment cristallisable d'une immunoglobuline, notamment d'une immunoglobuline de type gamma, de préférence de l'espèce homologue. 5 ) Mammifère selon la revendication 4, caractérisé en ce que le récepteur spécifique de l'alpha herpès virus est la nectin-1ou HveC. 6 ) Mammifère selon la revendication 5, caractérisé en ce que le récepteur spécifique de l'alpha herpès virus est le domaine V de la nectin-1ou HveC. 7 ) Mammifère selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce qu' il appartient à l'espèce porcine et que l'alpha herpès virus est le virus PRV. 8 ) Mammifère selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce qu' il renferme dans le génome de ses cellules, un transgène codant pour une protéine chimérique constituée d'une part du domaine extra cellulaire d'un récepteur cellulaire de l'a-herpès virus visé ou de l'une de ses parties, et d'autre part du fragment cristallisable d'une immuno globuline, dans un système d'expression approprié, ce transgène ayant été inséré dans le génome de la lignée germinale de l'un de ses parents.