Brevet FR2843405A1 — publié le 20040213

La présente invention est relative au contrôle de l'origine géographique des bois de chêne. L'origine du bois de chêne a une influence importante sur ses qualités technologiques et son adaptation à différentes utilisations. Par exemple, le bois de chêne utilisé en tonnellerie pour le façonnage des barriques -exerce une influence importante sur les qualités organoleptiques des vins. Différentes études ont montré un rôle prépondérant de l'origine géographique des bois sur leurs caractéristiques physico-chimiques, responsables de cette influence. De même, l'origine géographique des chênes utilisés en menuiserie ou en ébénisterie peut avoir une influence importante sur les qualités des produits finis obtenus. Il est donc souhaitable de disposer de tests permettant de contrôler cette origine géographique. De nombreuses études antérieures, associant de nombreux laboratoires de différents pays européens, parmi lesquels celui des Inventeurs, ont permis d'effectuer une analyse génétique de l'ADN chloroplastique des chênes blancs répartis sur l'ensemble du continent européen, et de mettre en évidence une structuration géographique très importante des différents variants mis en évidence (PETIT RJ et al. Forest Ecology and Management 156,5-26, 2002a ; DUMOLINLAPEGUE S et al. Genetics 146,1475-1487, 1997), et notamment une forte différenciation entre les variants issus d'Europe de l'Est (Roumanie, Pologne, Ukraine) et ceux issus d'autres localisations. Ces observations ont permis d'envisager l'utilisation des techniques de typage génétique basées sur la détection de polymorphismes de l'ADN chloroplastique, pour contrôler la provenance géographique de lots de bois. Toutefois, les analyses effectuées dans le cadre des études précédemment citées ont été mises en #uvre à partir de matériel végétal (glands, feuilles, ou bourgeons), recueilli et conservé en vue de ces analyses, dans des conditions permettant d'éviter la dégradation de l'ADN. En revanche, dans le cas de bois destiné à être utilisé comme matière première, les conditions de récolte, de traitement et de stockage ne sont pas conçues pour permettre la conservation de l'ADN. Il a ainsi été observé sur des échantillons de bois que l'ADN chloroplastique était présent en faible quantité, et en outre très dégradé. Des -travaux précédents (DUMO'LTN-LAPEGUE et al., Mol. Ecol., 8,2137-2140, 1999) ont permis de montrer qu'il était possible, moyennant une adaptation des protocoles utilisés, d'extraire et d'amplifier de l'ADN chloroplastique de bois de chêne, et de détecter des polymorphismes localisés dans une région non-codante de l'ADN chloroplastique localisée dans l'espaceur intergénique trnD-trnT (DT). Aucune association de ces polymorphismes avec l'origine géographique des bois analysés n'est rapportée dans cette publication. Les Inventeurs ont entrepris de rechercher des polymorphismes détectables sur de l'ADN chloroplastique extrait à partir d'échantillons de bois, et pouvant être corrélés à l'origine géographique de ces échantillons. Ils ont ainsi identifié une combinaison de polymorphismes permettant de différencier les haplotypes mis en évidence dans le cadre des études précédemment citées. Ces polymorphismes sont localisés dans 2 régions du génome chloroplastique : l'intron du gène trnL(UAA) ; la séquence complète de cet intron est accessible sur GENBANK sous le numéro Z48753 ; contient un indel de 13 pb, décrit par FERRIS et al. (Mol. Ecol., 2,337-344 1993) ; cet indel est localisé entre les positions 111 et 125 de la séquence SEQ ID NO:1 ; ce marqueur polymorphique sera dénommé ci-après TFA ; l'espaceur intergénique trnD(GUC)-trnT(GGU) ; dans cette région, les polymorphismes sélectionnés par les Inventeurs sont les suivants : - une substitution C/G ; est localisée en position 135 de la séquence SEQ ID NO:2 ; ce marqueur polymorphique sera dénommé ci-après DTA ; - une séquence microsatellite (A)n dans laquelle n varie de 9 à 12 ; séquence débute à la position 221 de la séquence SEQ ID NO:2 ; ce marqueur polymorphique sera dénommé ci-après DTB ; 2 polymorphismes DTA et DTB ont été précédemment décrits par DUMOLIN-LAPEGUE et al. (1999, précité) ; - un indel de 5 pb, de séquence cttaa, localisé entre les positions 80 et 86 de la séquence SEQ ID NO:3 ; ce marqueur polymorphique sera dénommé ci-après DTC ; - une substitution TG/TT/AG, en positions 138 et 139 de la séquence SEQ ID NO: 3 ; ce marqueur polymorphique sera dénommé ci-après DTD ; 2 polymorphismes DTC et DTD ont été identifiés par les Inventeurs. A chacun des haplotypes a à i correspond une combinaison spécifique d'allèles des marqueurs TFA, DTA, DTB, DTC et DTD, comme le montre le Tableau I ci-dessous. TableauI Fragment Mutations , , # HaPlotyPe SEQ ID NO:1 TFA (insertion13 bases)- - - +SEQ ID NO:2 DTA (substitution) C G C C C C C C C SEO Nô:2 DTB microsatellite A n 10 10 11 11 12 10 9 11 10 SEQ ID N0:3 DTC insertion CTTAA - + + + + + + + + SEO Nô:3 DTD (substitution) TG TG TT TT TT TG AG TG TG La présente invention a pour objet l'utilisation d'une combinaison des marqueurs polymorphes mentionnés cidessus pour déterminer, à partir d'un échantillon de bois de chêne sessile ou pédonculé, l'haplotype de l'arbre dont est issu ledit bois. En particulier, la présente invention a pour objet un procédé pour déterminer l'haplotype de l'arbre dont est issu un échantillon de bois de chêne, caractérisé en ce qu'il comprend l'amplification, à partir de l'ADN extrait dudit échantillon, de fragments comprenant les marqueurs polymorphes TFA, DTA, DTB, DTC et DTD définis ci-dessus, et la détermination de la forme allélique de chacun desdits marqueurs présente dans le produit d'amplification. Cette détermination s'effectue par des méthodes classiques, connues en elles-mêmes de l'homme du métier ; selon le marqueur concerné, la distinction entre les allèles peut notamment s'effectuer par détermination de la taille des produits d'amplification, ou par détermination de la taille des fragments de digestion desdits produits d'amplification par une endonucléase de restriction appropriée (PCR-RFLP). Par exemple, les différents allèles de TFA ou de DTB peuvent être directement différenciés par la taille du produit d'amplification obtenu à l'aide d amorces encadrant ledit polymorphisme ; ceux de DTA peuvent être différenciés par la taille des fragments obtenus après digestion par TaqI ; ceux de DTC et DTD peuvent être différenciés par la taille des fragments obtenus après digestion par MseI. Un premier mode de mise en #uvre du procédé conforme à l'invention comprend l'amplification de trois fragments d'ADN : - un fragment TF42 comprenant le marqueur TFA ; - un fragment DT12b comprenant les marqueurs DTA et DTB - un fragment DT72 comprenant les marqueurs DTC et DTD. Ce mode de mise en #uvre peut être utilisé notamment pour l'analyse d'échantillons de bois frais bien conservé. Un second mode de mise en #uvre du procédé conforme à l'invention, qui peut être avantageusement utilisé dans les cas d'échantillons de bois sec ou moins bien conservé comprend l'amplification de cinq fragments d'ADN : - un fragment TF42 comprenant le marqueur TFA ; - un fragment DT13 comprenant le marqueur DTA ; - un fragment DT14 comprenant le marqueur DTB ; - un fragment DT73 comprenant le marqueur DTC ; - un fragment DT74 comprenant le marqueur DTD. La présente invention a également pour objet des combinaisons d'amorces d'amplification permettant la mise en #uvre du procédé conforme à l'invention. Ces amorces d'amplification peuvent être obtenues à partir des séquences encadrant les marqueurs à amplifier. Par exemple : - des amorces convenant pour l'amplification de TFA peuvent être obtenues à partir du fragment SEQ ID NO:1 ; - des amorces convenant pour l'amplification de DTA et DTB peuvent être obtenues à partir du fragment SEQ ID NO:2 ; dans ce cadre, des amorces convenant plus particulièrement pour l'amplification de DTA peuvent être obtenues à partir du fragment SEQ ID NO:4, et des amorces convenant plus particulièrement pour l'amplification de DTB peuvent être obtenues à partir du fragment SEQ ID NO:5 ; - des amorces convenant pour l'amplification de DTC et DTD peuvent être obtenues à partir du fragment SEQ ID NO:3; dans ce cadre, des amorces convenant plus particulièrement pour l'amplification de DTC peuvent être obtenues à partir du fragment SEQ ID NO: 6, et des amorces convenant plus particulièrement pour l'amplification de DTD peuvent être obtenues à partir du fragment SEQ ID NO:7. Une combinaison d'amorces utilisable dans le cadre du premier mode de mise en #uvre du procédé conforme à l'invention comprend : une paire d'amorces (TF42) permettant l'amplification de TFA : TF42u TAATGACGACCCGAATCTTTA (SEQ ID NO : 14) TF421 ACAACAACTCTTTCGATTTTT (SEQ ID NO :15) ; une paire d'amorces (DT12b) permettant l'amplification de DTA et DTB : DT12bu GAGACCAGAAAGGGTAATGAA (SEQ ID NO : 16) DT12bl TTTCAATAACTTGTTGATCC (SEQ ID NO : 17) ; une paire d'amorces (DT72) permettant l'amplification de DTC et DTD : DT72u GCGTTGCTATTTAGTAAATCC (SEQ ID NO : 18) DT721 GTGGACCATTCAGGAACGAGA (SEQ ID NO :19) . Une combinaison d'amorces utilisable dans le cadre du second mode de mise en #uvre du procédé conforme à l'invention comprend : une paire d'amorces (TF42) permettant l'amplification de TFA : TF42u TAATGACGACCCGAATCTTTA (SEQ ID NO : 14) TF421 ACAACAACTCTTTCGATTTTT (SEQ ID NO :15) ; une paire d'amorces (DT13) permettant l'amplification de DTA : DT13u GAGACCAGAAAGGGTAATGAA (SEQ ID NO : 16) DT131 GAATCAATGAATGAAAGTGGA (SEQ ID NO :20) ; une paire d'amorces (DT14) permettant l'amplification de DTB : DT14u fiTATCTTACACfiAACTCG1 (SEQ TD NO .21 ) DT141 CCCTCTTCCCAGATTTCCAGA (SEQ ID NO :22) ; une paire d'amorces (DT73) permettant l'amplification de DTC : DT73u GCGTTGCTATTTAGTAAATCC (SEQ ID NO : 18) DT731 AGAGTAAACTAGTGATTATGG (SEQ ID NO :23) ; une paire d'amorces (DT74) permettant l'amplification de DTD : DT74u CCATAATCACTAGTTTACTCT (SEQ ID NO : 24) DT741 GTGGACCATTCAGGAACGAGA (SEQ ID NO : 19). Les Inventeurs ont également identifié une combinaison de polymorphismes permettant de subdiviser les haplotypes caractérisés par l'étude des cinq polymorphismes TFA, DTA, DTB, DTC et DTD présentés dans la première partie du brevet. Ces nouveaux polymorphismes sont localisés dans 3 régions du génome chloroplastique : 1) l'espaceur intergénique trnD(GUC)-trnT(GGU) ; dans cette région, les polymorphismes sélectionnés par les Inventeurs sont les suivants : - une séquence microsatellite (A) n dans laquelle n varie de 8 à 12 ; séquence débute à la position 65 de la séquence SEQ ID NO:8 ; ce marqueur polymorphique sera dénommé ci-après DTE ; - une séquence microsatellite (A)n dans laquelle n varie de 8 à 11 ; séquence débute à la position 99 de la séquence SEQ ID NO:9 ; ce marqueur polymorphique sera dénommé ci-après uDTF ; 2) l'espaceur intergénique trnC(GCA)-trnD(GUC) ; dans cette région, les polymorphismes sélectionnés par les Inventeurs sont les suivants : - une séquence microsatellite (T)n dans laquelle n varie de 11 à 12 ; séquence débute à la position 24 de la séquence SEQ ID N0:10 ; ce marqueur polymorphique sera dénommé ci-après uCDA ; - une séquence microsatellite (A)n dans laquelle n varie de 8 à 9 ; séquence débute à la position 49 de la séquence SEQ ID NO:11 : ce marqueur polymorphique sers. dénommé ci-après CDB ; 3) l'intron trnK (UUU); dans cette région, les polymorphismes sélectionnés par les Inventeurs sont les suivants : - une séquence microsatellite (T)n dans laquelle n varie de 10 à 11 ; séquence débute à la position 44 de la séquence SEQ ID NO:12 ; ce marqueur polymorphique sera dénommé ci-après uKKA ; - une séquence microsatellite (T)n dans laquelle n varie de 8 à 9 ; séquence débute à la position 68 de la séquence SEQ ID NO:13 ; ce marqueur polymorphique sera dénommé ci-après uKKB ; A chacun des haplotypes a à i correspond une combinaison spécifique d'allèles des marqueurs TFA, DTA, DTB, DTC et DTD. Les polymorphismes uDTE, DTF, uCDA, CDB, uKKA et KKB permettent de redéfinir les haplotypes a à i mais aussi de subdiviser l'haplotype f en quatre nouveaux haplotypes fl, f2, f3, f4 et de subdiviser l'haplotype h en deux nouveaux haplotypes hl, h2. A chacun des 13 nouveaux haplotypes a à i correspond une combinaison spécifique d'allèles des marqueurs uDTE, DTF, uCDA, uCDB, uKKA et uKKB, comme le montre le Tableau II ci-dessous Tableau II Fragment Mutations Haplotype a b c d e f1 f2 f3 f4 g h1 h2 SEQ ID NO:8 DTE (A)n 10 11 10 10 10 11 12 8 9 11 8 8 SEQ ID NO:9 DTF (A) n 11 10 9 9 9 10 10 9 9 10 8 8 SEQ ID NO:10 CDA (T) n 12 11 12 12 12 11 11 12 11 11 12 11 SEQ Il NO: 11 pCDB (A) 9 9 8 8 8 9 9 9 9 9 9 9 ,'1 SEQ ID NO:12 KKA (T) n 10 10 10 10 10 10 10 11 10 10 11 11 SEQ ID NO: 13 KKB (T)n 8 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 Le mode de mise en #uvre du second procédé, en outre du premier, conforme à l'invention comprend l'amplification de six fragments d'ADN : - un fragment uDT3 comprenant le marqueur uDTE ; la séquence de ce fragment est accessible sur GENBANK sous le numéro AJ489838 [SEQ ID NO : 8 ; (A)n = 11). - un fragment uDT4 comprenant le marqueur DTF ; la séquence de ce fragment est accessible sur GENBANK sous le numéro AJ489839 [SEQ ID NO : 9 ; (A)n = 9]. - un fragment uCD4 comprenant le marqueur uCDA ; la séquence de ce fragment est accessible sur GENBANK sous le numéro AJ489832 [SEQ ID NO : 10 ; (T)n = 12]. - un fragment uCD5 comprenant le marqueur uCDB ; la séquence de ce fragment est accessible sur GENBANK sous le numéro AJ489833 [SEQ ID NO : 11 ; (A)n = 8]. - un fragment uKK3 comprenant le marqueur uKKA ; la séquence de ce fragment est accessible sur GENBANK sous le numéro AJ489844 [SEQ ID NO : 12 ; (T)n = 10]. - un fragment uKK4 comprenant le marqueur KKB ; la séquence de ce fragment est accessible sur GENBANK sous le numéro AJ489845 [SEQ ID NO : 13 ; (T)n = 9]. Ce mode de mise en #uvre peut être utilisé pour l'analyse d'échantillons de bois frais et de bois sec. La présente invention a également pour objet des combinaisons d'amorces d'amplification permettant la mise en #uvre du procédé conforme à l'invention. Ces amorces d'amplification peuvent être obtenues à partir des séquences encadrant les marqueurs à amplifier. Par exemple : - des amorces convenant pour l'amplification de uDTE peuvent être obtenues à partir du fragment SEQ ID NO:7 ; - des amorces convenant pour l'amplification de uDTF peuvent être obtenues à partir du fragment SEQ ID NO:8 ; - des amorces convenant pour l'amplification de PCDA peuvent être obtenues à partir du fragment SEQ 3D NO: 9 ; - des amorces convenant pour l'amplification de CDB peuvent être obtenues à partir du fragment SEQ ID N0:10 ; - des amorces convenant pour l'amplification de uKKA peuvent être obtenues à partir du fragment SEQ ID N0:11 ; - des amorces convenant pour l'amplification de pKKB peuvent être obtenues à partir du fragment SEQ ID NO:12 ; Une combinaison d'amorces utilisable dans le cadre du mode de mise en #uvre du procédé conforme à l'invention comprend : une paire d'amorces (DT3) permettant l'amplification de DTE : pDT3u TGTTAGTAATCCTTTCGTTT (SEQ ID NO : 25) pDT31 AGGTATAAAGTCTAAGGTAA (SEQ ID NO :26) ; une paire d'amorces (DT4) permettant l'amplification de uDTF : uDT4u GATAATATAAAGAGTCAAAT (SEQ ID NO : 27) pDT41 CCGAAAGGTCCTATACCTCG (SEQ ID N0:28) ; une paire d'amorces (CD4) permettant l'amplification de CDA : uCD4u TTATTTGTTTTTGGTTTCACC (SEQ ID N0:29) pCD41 TTTCCCATAGAGAGTCTGTAT (SEQ ID NO:30) ; une paire d'amorces (CD5) permettant l'amplification de CDB : uCD5u CCCCCGGATCTCTGTCAACTG (SEQ ID N0:31) pCD51 TAATAAACGAGAATCACATAA (SEQ ID N0:32) ; une paire d'amorces (KK3) permettant l'amplification de uKKA : uKK3u TTAGATCGGGTAATCGTTCAA (SEQ ID N0:33) UKK31 AAGTGAATAAATGGATAGAGC (SEQ ID NO:34) ; une paire d'amorces (KK4) permettant l'amplification de uKKB : pKK4u TTGTTTACCTATAATTGGAGC (SEQ ID N0:35) pKK41 TAGCGGATCGGTTCAAAACTT (SEQ ID N0:36). La présente invention permet de caractériser et de différencier les 5 haplotypes trouvés en France, et également de les différencier de façon exclusive des haplotypes trouvés en Europe de l'Est. Il est ainsi possible de tester la correspondance du type chloroplastique d'un échantillon de bois de chêne avec celui de la provenance annoncée, par consultation des informations disponibles sur la répartition des différents haplotypes de chênes européens, et le cas échéant en complétant ces informations par des analyses complémentaires de détermination des haplotypes présents dans la région, forêt ou parcelle d'où est supposé provenir le lot de bois à tester. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non limitatifs de mise en #uvre du procédé conforme à l'invention. EXEMPLE 1 : DETERMINATION DE L'HAPLOTYPE D'ECHANTILLONS DE BOIS Méthodes générales Les analyses sont effectuées en laboratoire stérile, en prenant les précautions usuelles pour éviter toute contamination par de l'ADN étranger. A réception, les échantillons sont dépoussiérés, chaque échantillon est rangé dans un sachet en plastique, éventuellement en présence d'un agent dessicateur (SILICAGEL) s'il est très humide, et conservé à température ambiante jusqu'à l'extraction et l'analyse de l'ADN. Extraction de l'ADN L'extraction d'ADN est réalisée avec le kit DNEASY PLANT MINIKIT de QIAGEN en utilisant le protocole de base préconisé par le fabricant. Amplification de l'ADN 2,5 L d'ADN ,extrait sont ajoutés au mélange d1amplification suivant (volume final 25 L): 4 L MgCl2 ( 6, 5 mM) 1 L dNTP (0,4 mM) 2,5 L de chacune des amorces (1 uM) 7,125 uL H20 0,75 L BSA (0,66 mg/mL) 2,5 uL de tampon PCR GENEAMP 10X (PERKIN-ELMER) 0,125 L AMPLITAQ GOLD (PERKIN-ELMER) Les conditions de PCR sont les suivantes : - 5 minutes à 94 C - 60 cycles (45 secondes à 94 C + 45 secondes à la température d'hybridation correspondant à la paire d'amorces utilisée + 1 minute à 72 C) - 10 minutes à 72 C Digestion de l'ADN La digestion par TaqI ou MseI est effectuée selon le protocole suivant : * Digestion par TaqI 5 L de produit d'amplification par PCR sont ajoutés au mélange suivant : 3 uL de tampon lOx (spécifiquement fourni avec l'enzyme) 21,8 L d'H2O 0,2 uL de TaqI (10 U/uL) La digestion est effectuée pendant 3 heures à 65 C. * Digestion par MseI 5 L de produit d'amplification par PCR sont ajoutés au mélange suivant : 3 L de tampon 2 (spécifiquement fourni avec l'enzyme) 0,15 L de BSA 21, 45 uL d' H20 0,4 L de MseI (4U/uL) La digestion est effectuée pendant une nuit à 37 C. I- Echantillons de bois frais Les amorces suivantes sont utilisées : TF42 TF42u TAATGACGACCCGAATCTTTA (SEQ ID NO : 14) TF421 ACAACAACTCTTTCGATTTTT (SEQ ID NO : 15) DT12b DT12bu GAGACCAGAAAGGGTAATGAA (SEQ ID NO : 16) DT12bl TTTCAATAACTTGTTGATCC (SEQ ID NO : 17) DT72 DT72u GCGTTGCTATTTAGTAAATCC (SEQ ID NO : 18) DT721 GTGGACCATTCAGGAACGAGA (SEQ ID NO : 19) La paire d'amorces DT12b permet l'amplification d'un fragment d'ADN comprenant les marqueurs DTA et DTB. La paire d'amorces DT72 permet l'amplification d'un fragment d'ADN comprenant les marqueurs DTC et DTD. Les températures d'hybridation pour chaque paire d'amorces sont : TF42 45 C DT12b 50 C DT72 50 C Le produit d'amplification par DT12b a une longueur de 172 à 175 pb selon l'haplotype concerné, le produit d'amplification par DT72 a une longueur de 108 ou 113 pb selon l'haplotype concerné, et le produit d'amplification par TF42 a une longueur de 70 ou 83 pb selon l'haplotype concerné. Le produit d'amplification DT12b est digéré par TaqI ; le produit d'amplification DT72 est digéré par MseI. Les produits de digestion, ainsi que le produit d'amplification TF42 sont analysés sur gel d'acrylamide à 8 %. Les fragments sont visualisés sous éclairage UV, après traitement du gel au bromure d'éthydium. Les fragments sont classés selon leur taille relative qui définit le niveau du fragment. Le niveau 1 correspond au fragment le plus long ; les niveaux 2,3, etc, correspondent aux fragments plus courts, classés par taille décroissante. Chaque haplotype est caractérisé par une combinaison de niveaux de fragments, comme le montre le Tableau III ci-après. Tableau III Niveau fragment Niveau fragment DT72 Niveau Haplotype DTl2b digéré par digéré par MseI fragment TaqI digéré par MseI TF42 a 2 2 2 b 5 1 2 c 3 3 2 d 3 3 1 e 4 3 2 f 2 1 2 g 1 1 2 h 3 1 2 i 6 1 2 II- Echantillons de bois sec Les amorces suivantes sont utilisées : TF42 TF42u TAATGACGACCCGAATCTTTA (SEQ ID NO : 14) TF421 ACAACAACTCTTTCGATTTTT (SEQ ID NO :15) DT13 DTl3u GAGACCAGAAAGGGTAATGAA (SEQ ID NO : 16) DT131 GAATCAATGAATGAAAGTGGA (SEQ ID NO : 20) DT14 DTl4u TTATCTTACACTAAGCTCGGA (SEQ ID NO : 21) DT141 CCCTCTTCCCAGATTTCCAGA (SEQ ID NO : 22) DT73 DT73u GCGTTGCTATTTAGTAAATCC (SEQ ID NO : 18) DT731 AGAGTAAACTAGTGATTATGG (SEQ ID NO : 23) DT74 DT74u CCATAATCACTAGTTTACTCT (SEQ ID NO : 24) DT741 GTGGACCATTCAGGAACGAGA (SEQ ID NO : 19) Les températures d'hybridation pour chaque paire d'amorces sont : TF42 45 C DT13 50 C DT14 50 C DT73 45 C DT74 45 C L'une des amorces DT14 est marquée (fluorochrome IRD800) pour pouvoir être visualisée sur gel de séquençage. Le produit d'amplification par DT13 a une longueur de 53 pb, le produit d'amplification par DT14 a une longueur de 63 à 66 pb selon l'haplotype concerné, le produit d'amplification par DT73 a une longueur de 64 ou 69 pb selon l'haplotype concerné, le produit d'amplification par DT74 a une longueur de 65 pb, et le produit d'amplification par TF42 a une longueur de 69 ou 83 pb selon l'haplotype concerné. Le produit d'amplification DT13 est digéré par TaqI ; les produits d'amplification DT73 et DT74 sont digérés par MseI. Les produits de digestion de DT13, DT73, DT74, ainsi que le produit d'amplification TF42 sont analysés sur gel d'acrylamide à 8 %. Les fragments sont visualisés sous éclairage UV, après traitement du gel au bromure d'éthydium. Le produit d'amplification DT14 est analysé sur gel d'acrylamide dénaturant. Les résultats sont illustrés par la Figure 2. Le niveau des fragments est défini comme décrit en I ci-dessus. Chaque haplotype est caractérisé par une combinaison de niveaux de fragments, illustrée par le Tableau IV ci-après. Tableau IV Niveau du Niveau du Niveau du Niveau du fragment fragment fragment Niveau du Haplotype fragment DT13 DT74 DT73 fragment DT14 digéré par digéré par digéré par TF42 TaqI MseI MseI a 1 1 1 2 2 b 1 2 1 1 2 c 2 1 2 1 2 d 2 1 2 1 1 e 3 1 2 1 2 f 1 1 1 1 2 g 0 1 1 1 2 h 2 1 1 1 2 i 4 1 1 1 2 Q. alba 3 1 1 1 2 III- Subdivision des haplotypes De nouveaux polymorphismes, en outre des premiers, sont analysés grâce aux amorces suivantes: DT3 uDT3u TGTTAGTAATCCTTTCGTTT (SEQ ID NO : 25) pDT31 AGGTATAAAGTCTAAGGTAA (SEQ ID NO : 26) pDT4 uDT4u GATAATATAAAGAGTCAAAT (SEQ ID NO : 27) uDT41 CCGAAAGGTCCTATACCTCG (SEQ ID N0:28) CD4 pCD4u TTATTTGTTTTTGGTTTCACC (SEQ ID N0:29) uCD41 TTTCCCATAGAGAGTCTGTAT (SEQ ID N0:30) CD5 uCD5u CCCCCGGATCTCTGTCAACTG (SEQ ID N0:31) uCD51 TAATAAACGAGAATCACATAA (SEQ ID N0:32) KK5 pKK3u TTAGATCGGGTAATCGTTCAA (SEQ ID N0:33) pKK31 AAGTGAATAAATGGATAGAGC (SEQ ID N0:34) pKK4 uKK4u TTGTTTACCTATAATTGGAGC (SEQ ID N0:35) pKK41 TAGCGGATCGGTTCAAAACTT (SEQ ID N0:36) Une amorce de chaque paire est marquée (fluorochrome IRD800) pour pouvoir être visualisée sur gel de séquençage. La paire d'amorces pDT3 permet l'amplification d'un fragment d'ADN comprenant le marqueur DTE. La paire d'amorces uDT4 permet l'amplification d'un fragment dTADN comprenant le marqueur DTF. La paire d'amorces uCD4 permet l'amplification d'un fragment d'ADN comprenant le marqueur uCDA. La paire d'amorces uCD5 permet l'amplification d'un fragment d'ADN comprenant le marqueur uCDB. La paire d'amorces KK3 permet l'amplification d'un fragment d'ADN comprenant le marqueur KKA. La paire d'amorces uKK4 permet l'amplification d'un fragment d'ADN comprenant le marqueur uKKB. Les températures d'hybridation pour chaque paire d'amorces sont : uDT3 46 C uDT4 44 C uCD4 45 C ucd5 45 C uKK3 50 C uKK4 50 C Le produit d'amplification par uDT3 a une longueur de 123 à 127 pb selon l'haplotype concerné ; le produit d'amplification par uDT4 a une longueur de 146 à 149 pb selon l'haplotype concerné ; le produit d'amplification par CD4 a une longueur de 96 ou 97 pb selon l'haplotype concerné ; le produit d'amplification par CD5 a une longueur de 77 ou 78 pb selon l'haplotype concerné ; le produit d'amplification par uKK3 a une longueur de 99 ou 100 pb selon l'haplotype concerné et le produit d'amplification par uKK4 a une longueur de 113 ou 114 pb selon l'haplotype concerné. Les produits d'amplification uDT3, uDT4, CD4, uCD5, KK3 et uKK4 sont analysés directement sur gel d'acrylamide dénaturant. Les fragments sont classés selon leur taille relative, qui définit le niveau du fragment. Le niveau 1 correspond au fragment le plus long ; les niveaux 2,3, etc, correspondent aux fragments plus courts, classés par taille décroissante. Les résultats sont illustrés par la Figure 3. Chaque haplotype est caractérisé par une combinaison de niveaux de fragments, comme 1-e montre le Tableau V ci-après. Tableau V Niveau Niveau Niveau Niveau Niveau Niveau Haplotype fragment fragment fragment fragment fragment fragment DT3 JJLDT4 CD4 CD5 KK3 LKK4 a 3 1 1 1 2 1 b 2 2 2 1 2 2 c 3 3 1 2 2 2 d 3 3 1 2 2 2 e 3 3 1 2 2 2 fl 2 2 2 1 2 2 f2 1 2 2 1 2 2 f3 5 3 1 1 2 2 f4 4 3 2 1 1 2 g 2 2 2 1 2 2 hl 5 4 1 1 2 2 h2 5 4 2 1 1 2 h3 5 4 1 1 1 2 EXEMPLE 2 : TEST DE CONFORMITE D'UN LOT DE BOIS AVEC UNE ORIGINE GEOGRAPHIQUE SUPPOSEE On veut tester l'hypothèse Ho = le lot de bois provient de l'origine géographique annoncée. Le nombre total d'échantillons (S) de bois dans le lot est appelé N. Pour chaque haplotype i identifié dans le lot, on note p (i) la fréquence de cet haplotype dans la région annoncée comme origine géographique. Si p(i) 0,05 (on a affaire à un haplotype très rare dans la région annoncée), on calcule la probabilité P(i) d'échantillonner l'haplotype i au moins une fois sur N échantillons de bois : p(i) = 1 - L 1-h ii l N Si p(i) 0,05 (on a affaire à un haplotype assez fréquent dans la région annoncée), on considère alors que la probabilité de rencontrer l'haplotype i dans l'échantillon, est égale à 1. P(i) = 1 On mesure ensuite la conformité du lot de bois avec l'origine annoncée. La probabilité P de trouver la combinaison d'haplotypes dans l'échantillon devient : P = produit des P(i) Si p # S, on rejette l'hypothèse de conformité avec l'origine annoncée (Ho), avec un risque d'erreur [alpha] # S (= risque de déclarer non conforme le lot alors qu'il provient bien de l'origine annoncée). Si p # S, on ne rejette pas l'hypothèse de conformité avec l'origine annoncée (Ho). REVENDICATIONS 1) Utilisation d'une combinaison de marqueurs sélectionnés parmi le groupe constitué de : un marqueur polymorphique dénommé TFA, constitué par un indel de 13 pb localisé entre les positions 111 et 125 de la séquence SEQ ID NO : 1 ; un marqueur polymorphique dénommé DTA, constitué par une substitution C/G localisée en position 135 de la séquence SEQ ID NO : 2 ; un marqueur polymorphique dénommé DTB, constitué par une séquence microsatellite (A)n dans laquelle n varie de 9 à 12, débutant à la position 221 de la séquence SEQ ID NO : 2 ; - un marqueur polymorphique dénommé DTC, constitué par un indel de 5 pb, de séquence cttaa, localisé entre les positions 80 et 86 de la séquence SEQ ID NO : 3 ; un marqueur polymorphique dénommé DTD, constitué par une substitution TG/TT/AG, en positions 138 et 139 de la séquence SEQ ID NO : 3 ; pour déterminer, à partir d'un échantillon de bois de chêne, l'haplotype de l'arbre dont est issu ledit bois. 2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'elle met en outre en #uvre une combinaison de marqueurs choisis parmi : - un marqueur polymorphe dénommé uDTE, constitué par une séquence microsatellite (A)n dans laquelle n varie de 8 à 12 ; cette séquence débute à la position 65 de la séquence SEQ ID NO : 8 ; - un marqueur polymorphe dénommé uDTF, constitué par une séquence microsatellite (A)n dans laquelle n varie de 8 à 11 ; cette séquence débute à la position 99 de la séquence SEQ ID NO : 9 ; - un marqueur polymorphe dénommé CDA, constitué par une séquence microsatellite (T) n dans laquelle n varie de 11 à 12 ; séquence débute à la position 24 de la séquence SEQ ID NO : 10 ; - un marqueur polymorphe dénommé CDB, constitué par une séquence microsatellite (A)n dans laquelle n varie de 8 à 9 ; séquence débute à la position 49 de la séquence SEQ ID NO : 11 ; - un marqueur polymorphe dénommé uKKA, constitué par une séquence microsatellite (T) n dans laquelle n varie de 10 à 11 ; cette séquence débute à la position 44 de la séquence SEQ ID NO :12 ; - un marqueur polymorphe dénommé KKB, constitué par une séquence microsatellite (T) n dans laquelle n varie de 8 à 9 ; séquence débute à la position 68 de la séquence SEQ ID NO : 13 ; pour déterminer, à partir d'un échantillon de bois de chêne, l'haplotype de l'arbre dont est issu ledit bois. 3) Procédé pour déterminer l'haplotype de l'arbre dont est issu un échantillon de bois de chêne, caractérisé en ce qu'il comprend l'amplification, à partir de l'ADN extrait dudit échantillon, de trois fragments d'ADN constitués par : - un fragment comprenant le marqueur TFA, - un fragment comprenant les marqueur DTA et DTB, - et un fragment comprenant les marqueurs DTC et DTD ; et la détermination de la forme allélique de chacun desdits marqueurs présents dans le produit d'amplification. 4) Procédé pour déterminer l'haplotype de l'arbre dont est issu un échantillon de bois de chêne, caractérisé en ce qu'il comprend l'amplification, à partir de l'ADN extrait dudit échantillon, de cinq fragments d'ADN constitués par : - un fragment comprenant le marqueur TFA, - un fragment comprenant le marqueur DTA, - un fragment comprenant le marqueur DTB, - un fragment comprenant le marqueur DTC, - et un fragment comprenant le marqueur DTD ; et la détermination de la forme allélique de chacun desdits marqueurs présents dans le produit d'amplification. 5) Procédé selon une quelconque des revendications 3 ou 4 caractérisé en qu'il comprend en outre l'amplification de six fragments d'ADN constitués par : - un fragment comprenant le marqueur DTE, - un fragment comprenant le marqueur uDTF , - un fragment comprenant le marqueur CDA,K - un fragment comprenant le marqueur uCDB , - un fragment comprenant le marqueur KKA, - et un fragment comprenant le marqueur uKKB ; et la détermination de la forme allélique de chacun desdits marqueurs présents dans le produit d'amplification. 6) Combinaison d'amorces pour la mise en #uvre d'un procédé selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle comprend : - une paire d'amorces permettant l'amplification de TFA, obtenues à partir des régions de la séquence SEQ ID NO :1 encadrant une séquence contenant ledit marqueur ; - une paire d'amorces permettant l'amplification de DTA et DTB, obtenues à partir des régions de la séquence SEQ ID NO :2 encadrant une séquence contenant ledit marqueur ; - une paire d'amorces permettant l'amplification de DTC et DTD, obtenues à partir des régions de la séquence SEQ ID NO :3 encadrant une séquence contenant ledit marqueur . 7) Combinaison d'amorces selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle comprend : la paire d'amorces TF42 permettant l'amplification de TFA ; - la paire d'amorces DT12b permettant l'amplification de DTA et DTB ; la paire d'amorces DT72 permettant l'amplification de DTC et DTD . 8) Combinaison d'amorces pour la mise en #uvre d'un procédé selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle comprend : - une paire d'amorces permettant l'amplification de TFA, obtenues à partir des régions de la séquence SEQ ID NO :1 encadrant une séquence contenant ledit marqueur ; - une paire d'amorces permettant l'amplification de DTA, obtenues à partir des régions de la séquence SEQ ID NO :4 encadrant une séquence contenant ledit marqueur ; - une paire d'amorces permettant l'amplification de DTB, obtenues à partir des régions de la séquence SEQ ID NO :5 encadrant une séquence contenant ledit marqueur ; - une paire d'amorces permettant l'amplification de DTC, obtenues à partir des régions de la séquence SEQ ID NO :6 encadrant une séquence contenant ledit marqueur ; - une paire d'amorces permettant l'amplification de DTD, obtenues à partir des régions de la séquence SEQ ID NO :7 encadrant une séquence contenant ledit marqueur . 9) Combinaison d'amorces selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle comprend : la paire d'amorces TF42 permettant l'amplification de TFA ; la paire d'amorces DT13 permettant l'amplification de DTA ; la paire d'amorces DT14 permettant l'amplification de DTB ; la paire d'amorces DT73 permettant l'amplification de DTC; la paire d'amorces DT74 permettant l'amplification de DTD . 10) Combinaison d'amorces pour la mise en #uvre d'un procédé selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend une combinaison d'amorces selon une quelconque des revendications 6 à 9 et : - une paire d'amorces permettant l'amplification de uDTE, obtenues à partir des régions de la séquence SEQ ID NO :8 encadrant une séquence contenant ledit marqueur ; - une paire d'amorces permettant l'amplification de DTF, obtenues à partir des régions de la séquence SEQ ID NO :9 encadrant une séquence contenant ledit marqueur ; - une paire d'amorces permettant l'amplification de uCDA, obtenues à partir des régions de la séquence SEQ ID NO : 10 encadrant une séquence contenant ledit marqueur ; - une paire d'amorces permettant l'amplification de CDB, obtenues à partir des régions de la séquence SEQ ID NO : 11 encadrant une séquence contenant ledit marqueur ; - une paire d'amorces permettant l'amplification de KKA, obtenues à partir des régions de la séquence SEQ ID NO : 12 encadrant une séquence contenant ledit marqueur . - une paire d'amorces permettant l'amplification de KKB, obtenues à partir des régions de la séquence SEQ ID NO : 13 encadrant une séquence contenant ledit marqueur . 11) Combinaison d'amorces selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend : la paire d'amorces uDT3 permettant l'amplification de uDTE ; la paire d'amorces uDT4 permettant l'amplification de KTF ; la paire d'amorces uCD4 permettant l'amplification de CDA ; la paire d'amorces CD5 permettant l'amplification de CDB; la paire d'amorces uKK3 permettant l'amplification de KKA; la paire d'amorces uKK4 permettant l'amplification de KKB.