Brevet FR2841259A1 — publié le 20031226

La présente invention est relative à un nouveau gène de l'acétyl- cholinestérase responsable de la résistance aux insecticides, notamment chez les moustiques, aux produits de ce gène (ADNc, protéine) et à leurs applications, notam- ment pour le criblage de nouveaux insecticides et la détection génétique de la résis- tance aux organophosphorés et aux carbamates dans les populations de moustiques. L'acétylcholinestérase (AChE, E.C. 3. 1.1.7) est une enzyme essen- tielle qui hydrolyse l'acétylcholine dans les synapses, mettant ainsi fin aux transmis- sions cholinergiques au niveau des jonctions neuronales ou neuromusculaires. L'inhi- bition de l'AChE empêche la désactivation du signal synaptique, conduisant ainsi à une perte de contrôle de la transmission cholinergique. La biologie de l'acétyl- cholinestérase a été très étudiée chez les invertébrés, et en particulier les insectes, car cette enzyme est la cible des principales classes de pesticides utilisés, les organo- phosphorés et les carbamates. Cependant, l'utilisation massive de pesticides au cours des dernières décennies a provoqué l'émergence d'espèces résistantes. Parmi les méca- nismes de résistance, la sélection de mutations rendant l'AChE insensible aux insecticides a été observée dans de nombreux cas (Pour une revue, voir Fournier et al., Comp. Biochem. Physiol., 1994,108, 19-31). Afin de déterminer avec précision, la nature de l'AChE cible des insecticides, ainsi que les mutations responsables de la résistance à ces derniers, les gènes codant pour des AChE (gènes ace) ont été isolés chez différentes espèces d'arthropodes (insectes et arachnides). Le premier gène ace a été identifié chez la drosophile (Drosophila melanogaster), par génétique inverse (Hall et al., EMBO J., 1986,5, 2949-2954). La preuve que ce gène était impliqué dans la résistance aux insecticides a été fournie par la mise en évidence de substitutions d'acides aminés dans l'AChE de drosophiles résis- tantes, conférant l'insensibilité aux insecticides cholinergiques (Mutéro et al., P. N.A.S., 1994,91, 5922-5926). Les études chez D. melanogaster semblaient donc indiquer la présence d'un seul gène ace chez les insectes, codant pour l'AChE cible des insecticides cholinergiques. Toutefois, à l'exception du gène ace d'un autre insecte, Musca domestica (Williamson et al., 1992, In Multidisciplinary approaches to cholinesterase functions, Eds Schafferman A. & Velan B., Plenum Press, New-York, pp 83-86 ; 2 , 1 Walsh et al., Biochem. J., 2001,359, 175-181 ; Kozaki et al., Insect. Biochem. Mol. Biol., 2001,31, 991-997), l'étude des gènes ace isolés chez d'autres insectes ou bien chez des arachnides, par homologie avec celui de la drosophile, indiquent qu'ils ne sont pas impliqués dans la résistance aux insecticides. En effet, aucune mutation dans la séquence en acides aminés de l'AChE codée par le gène ace d'Aphis gossypii, de Nephotettix cincticeps et de Boophilus microplus n'est observée entre les individus résistants et sensibles (Menozzi et al., Thèse de Doctorat de l'université Paul sabatier, Toulouse, 2000 ; Tomita et al., Insect Biochem. Mol. Biol., 200,30, 325-333 ; Baxter et al., Insect Biochem. Mol. Biol ;, 1998,28, 581-589 ; Hernandez et al., J ; Entomol., 1999,36, 764-770), et une ségrégation indépendante est observée entre le gène ace de Culex pipiens et C. tritaeniorynchus et la résistance aux insecticides (Malcolm et al., Insect. Mol. Biol., 1998, 7, 107-120 ; Mori et al., Insect Mol. Biol., 2001, 10, 197-203). En ce qui concerne les autres gènes ace isolés chez d'autres insectes, leur rôle dans la résistance aux insecticides n'a pas été étudié (Lucilia cuprina : Chen et al., Insect. Biochem. Mol. Biol., 2001, 31, 805-816 ; Schizaphis graminum : Gao et al., Insect. Biochem. Mol. Biol., 2001,31, 1095-1104) ou aucune forme d'AChE insensible aux insecticides n'a été décrite (Aedes aegypti, Anopheles gambiae et Anopheles stephensi : Anthony et al., FEBS letters, 1995,368, 461-465 ; Malcolm et al., In Molecular Insect Science, Eds Hageborn et al., Plenum Press, New-York, pp 57- 65). Deux hypothèses ont été émises pour expliquer la différence dans la résistance aux insecticides, observée entre Drosophila melanogaster ou Musca domestica et les autres insectes ou les arachnides qui ont été étudiés : la présence d'un "gène modificateur" responsable de modifications post-transcriptionnelles ou posttraductionnelles de l'AChE, conduisant à des formes d'AChE possédant des activités catalytiques différentes, et la présence d'un deuxième gène ace. Toutefois, aucune étude n'a permis de vérifier ces hypothèses et par conséquent de déterminer la nature du gène et celle de la cible (AChE) impliqués dans la résistance aux insecticides chez les insectes autres que Drosophila melanogaster et Musca domestica ou bien chez les arachnides: - La mise en évidence, chez C. pipiens, de deux formes d'AChE possédant des activités catalytiques distinctes supporte les deux hypothèses et l'analyse biochimique de ces AChE n'a pas permis de déterminer la nature de l'AChE impliquée dans la résistance aux insecticides (Bourguet et al., J. Neurochemistry, 1996, 67, 2115-2123). - Un deuxième gène ace a été isolé chez les arachnides, toutefois ce gène n'est pas impliqué dans la résistance aux insecticides (Hemandez et al., Baxter et al., précités). - Un deuxième gène ace n'a pu être isolé chez les insectes malgré de nombreuses tentatives dans différentes espèces (Menozzi et al., Tomita et al., Mori et al., précités ; Severson et al., J. Hered., 1997, 88, 520-524). Il ressort de ce qui précède que la nature du gène et de la cible (AChE) impliqués dans la résistance aux organophosphorés et aux carbamates n'ont pas été identifiés chez la plupart des insectes et chez les arachnides, notamment chez ceux où ils ont été recherchés ; on peut citer les plus importants dans les domaines de la santé humaine ou animale et de l'agriculture comme les vecteurs de pathogènes et les nuisibles, notamment de nombreux moustiques comme Culex pipiens, Aedes aegypti, Anopheles gambiae, Anopheles albimanus, Anopheles stephensi, et des ravageurs des cultures comme Aphis gossypii, Nephotettix cincticeps et Leptinotarsa decemlineata. Les Inventeurs ont identifié un nouveau locus du gène ace dans le génome d'Anopheles gambiae et de 15 espèces différentes de moustiques et ils ont montré que ce nouveau locus, non-homologue au locus précédemment décrit chez D. melanogaster, était impliqué dans la résistance aux insecticides chez les moustiques. Ce nouveau gène représente un outil de diagnostic pour la détection génétique de la résistance aux insecticides (organophosphorés, carbamates) dans les populations de moustiques. L'AChE codée par ce gène représente une cible pour le criblage de nouvelles molécules actives sur les populations de moustiques résistants aux insecticides actuellement utilisés. La présente invention a, en conséquence, pour objet une protéine, caractérisée en ce qu'elle comprend une région catalytique centrale qui présente une séquence en acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence SEQ 4 ' ID NO: 1 et les séquences présentant au moins 60 % d'identité ou 70 % de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 1, à l'exclusion de la séquence NCBI AAK0973 correspondant à l'acétylcholinestérase de Schizaphis graminum. La protéine selon l'invention représente une nouvelle acétyl- cholinestérase d'insecte, dénommée ci-après AchEl, responsable de la résistance aux organophosphorés et aux carbamates, au moins chez les moustiques, notamment chez C. pipiens ; le locus codant pour ladite AchEl est dénommée ci-après ace-1 ; ace-2 représente le second locus ace, qui n'est pas impliqué dans la résistance aux insectici- des chez les moustiques. L'unique gène ace présent dans Drosophila melanogaster, qui est homologue à ace-2, est donc également dénommé ace-2. Conformément à l'invention, ladite région catalytique centrale contient le domaine catalytique de l'AChE et correspond à celle située entre les positions 70 et 593 de la séquence de l'AChE1d'Anopheles gambiae (SEQ ID NO: 3, 643 acides aminés) ; elle correspond à celle située respectivement entre les positions 100 et 629 de la séquence d'AChEl de Schizaphis graminum (NCBI AAK0973), 60 et 582 de la séquence de l'AChElde Culex pipiens (SEQ ID NO: 7), 34 et 593 de la séquence d'AChE2 $ Anophèles gambiae (figure 1, SEQ ID NO : et 41 et 601 de la séquence d'AChE2 de Drosophila melanogaster (NCBI AAF54915). Cette région centrale qui contient le domaine catalytique est conservée chez les vertébrés et les invertébrés alors que les extrémités N- et C-terminales présentent une forte variabilité entre les différentes espèces. Conformément à l'invention, l'identité d'une séquence par rapport à une séquence de référence (SEQ ID NO: 1) s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques, lorsque les séquences correspondant à la région catalytique telle que définie ci-dessus sont alignées, de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % d'identité avec la séquence de référence SEQ ID NO: 1 est définie, dans la présente invention comme une protéine dont la séquence correspondant à la région catalytique centrale telle que définie ci-dessus peut inclure jusqu'à 100-X altérations pour 100 acides aminés de la séquence SEQ ID NO: 1. Au sens de la présente invention, le terme altération inclut les délétions, les substitutions ou les insertions consécu- 5 ' tives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. Cette définition s'applique, par analogie, aux molécules d'acide nucléique. La similarité d'une séquence par rapport à la séquence de référence SEQ ID NO 1 s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques ou qui différent par des substitutions conservatives, lorsque les séquences correspondant à la région catalytique centrale telle que définie ci-dessus sont alignées de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. Au sens de la présente invention, on entend par substitution conservative, la substitution d'un acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques similaires (taille, charge ou polarité), qui généralement ne modifie pas les propriétés fonctionnelles de la protéine. Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 1 est définie, dans la présente invention comme une protéine dont la séquence correspondant à la région catalytique centrale telle que définie ci-dessus peut inclure jusqu'à 100-X altérations nonconservatives pour 100 acides aminés de la séquence de référence. Au sens de la présente invention, le terme altérations non-conservatives inclut les délétions, les substitutions non-conservatives ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence SEQ ID NO: 1. La comparaison de l'AChEl selon l'invention avec les AChE d'insecte disponibles sur les bases de données, par alignement des séquences correspondant à la région centrale telle que définie ci-dessus, à l'aide du logiciel BLAST (http://www.ncbi.nlm.mh.gov/gorf/bl2.htmL paramètres par défaut, filtre inactivé) montre que : - les séquences d'AChEl et d'AChE2 d'insecte présentent 36-39% d'identité (53-57% similarité) entre elles. - les séquences d'AChEl d'insecte présentent 65-97% d'identité (79- 98% similarité) entre elles, - les séquences d'AChE2 d'insecte présentent 58-99% d'identité (73- 99% similarité) entre elles, En outre, l'analyse phylogénétique des AChE des différentes espèces animales montre que les séquences protéiques d'AChEl forment un groupe autonome significatif (bootstrap 795/1000), et que les AChEl d'insecte forment un sous-groupe distinct significatif (bootstrap 856/1000). L'AChEl selon l'invention comprend des motifs caractéristiques des AChE (figure 1) situés aux positions suivantes, respectivement dans la séquence SEQ ID NO: 3 et dans la séquence de référence de Torpedo marmorata (SWISSPROT P07962) : un motif canonique du type FGESAG autour de la sérine en position 266 (200), qui est caractéristique du site actif des AchE, un site de liaison à la choline (résidu Tryptophane en position 151 (84)), trois résidus de la triade catalytique (résidus sérine, acide glutamique et histidine, respectivement en positions 266 (200), 392 (327) et 506 (440 , six résidus cystéine potentiellement impliqués dans des ponts disulfures conservés (C134(67)-CI61(94); C320(254)-C333(265); C468(401)'C589(Sll)) des résidus aromatiques bordant la gorge du site actif (10 résidus) et un résidu phénylalanine en position 355 (290) mais pas en position 353 (288), qui distingue les AChE d'invertébrés de celles de vertébrés. Elle possède également un peptide C-terminal hydrophobe correspondant à un signal d'addition d'un glycolipide, indiquant le clivage posttraductionnel d'un fragment C-terminal et l'addition d'une résidu d'ancrage glycolipidique comme chez Drosophila ; le résidu cystéine dans la séquence C-terminale précédant le site potentiel de clivage du peptide hydrophobe pourrait être impliqué dans une liaison disulfure intermoléculaire, liant les deux sous-unités catalytiques du dimère d'AChE. L'AChEl selon l'invention se distingue de l'AChE de Drosophila (AChE2) par l'absence d'une insertion hydrophile de 31acides aminés entre les résidus situés aux positions 174 et 175 de la séquence SEQ ID NO: 3 (figure 1) ; cette insertion hydrophile pourrait être caractéristique de l'AChE2, au moins chez les diptères. L'invention englobe les AChEld'insecte sensibles ou résistantes aux organophosphorés et aux carbamates. Au sens de la présente invention on entend par "AChE sensible", une AChE dont l'activité acétylcholinestérase est inhibée en présence d'organophosphorés ou de carbamates. Au sens de la présente invention on entend par "AChE résistante", une AChE dont l'activité n'est pas inhibée par des concentrations en organophosphorés ou en carbamates qui inhibent 100 % de l'activité de "l'AChE sensible" correspondante issue d'un individu de la même espèce ; cette "AChE résistante" diffère de la précédente par la présence d'une ou plusieurs mutations dans sa séquence en acides aminés (substitutions d'acides aminés) qui modifient sa sensibilité aux inhibiteurs de l'acétylcholinestérase ; parmi ces mutations on peut citer les suivantes F78S, I129V, G227A, F288Y, les acides aminés étant numérotés en référence à la séquence de l'AChE de Torpedo marmorata (SWISSPROT P07962). L'activité acétylcholinestérase et les paramètres catalytiques des AChE sont mesurés par les techniques enzymatique classiques telles que celles décrites dans Bourguet et al., précité. Les protéines selon l'invention incluent toute protéine naturelle, synthétique, semi-synthétique ou recombinante de n'importe quel organisme procaryote ou eucaryote, comprenant ou consistant en une séquence d'acides aminés d'une protéine AChEl telle que définie ci-dessus. Elles incluent notamment les protéines naturelles isolées chez n'importe qu'elle espèce d'insecte, ainsi que les protéines recombinantes produites dans un système d'expression approprié. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite AChEl, elle correspond à celle d'un insecte qui appartient à l'ordre des diptères (Diptera) ; de manière préférée, ledit insecte est choisi dans la famille des Culicidae, parmi les genres Culex, Aedes et Anopheles. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite AChEl est constituée par les séquences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 7, correspondant à la séquence complète de l'AChElde respectivement deux souches d'Anopheles gambiae et une souche de Culex pipiens, sensibles aux organophosphorés et aux carbamates. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite région centrale catalytique de l'AChEl comprend une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 8 à 21 représentant un fragment d'environ 91 acides aminés (fragment K, figure 1), correspondant à celui situé entre les positions 445 et 535 de la séquence SEQ ID NO: 3. La présente invention a également pour objet un peptide, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment d'au moins 7 acides aminés de la protéine AChEl, telle que définie ci-dessus ; ces fragments sont particulièrement utiles pour la production d'anticorps reconnaissant spécifiquement la protéine ACHE 1. La présente invention a également pour objet des anticorps, caracté- risés en ce qu'ils sont dirigés contre la protéine AChEl ou un fragment de celle-ci, tels que définis ci-dessus. Conformément à l'invention, lesdits anticorps sont soit des anticorps monoclonaux, soit des anticorps polyclonaux. Ces anticorps peuvent être obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, comprenant notamment l'immunisation d'un animal avec une protéine ou un peptide conforme à l'invention, afin de lui faire produire des anticorps dirigés contre ladite protéine ou ledit peptide. La présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique isolée, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : - les séquences codant pour une protéine AChEl telle que définie cidessus (ADNc et fragment d'ADN génomique correspondants au gène ace-1), et - les séquences complémentaires des précédentes, sens ou anti-sens. - les fragments d'au moins 8 pb, de préférence de 15 pb à 500 pb des séquences précédentes. L'invention englobe, les séquences des allèles du gène ace-1 issues de n'importe quel insecte, ainsi que les séquences des mutants naturels (allèles sensibles et résistants) ou artificiels du gène ace-1 codant pour une protéine AChEl sensible ou résistante, telle que définie ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite séquence codant pour une protéine AChEl est sélectionnée dans le groupe constitué par: a) les séquences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 6 qui correspondent à l'ADNc de la protéine AChEl de séquence en acides aminés, respectivement SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 7, telles que définie ci-dessus, et b) les séquences SEQ ID NO: 22 et SEQ ID NO: 23 qui correspondent au gène ace-1 d'Anophèles gambiae codant les AChEl en a), lequel gène présente une organisation exon-intron comprenant au moins 7 exons (Tableau I). Tableau 1 : Organisation Intron-Exon du gène ace-1 Site 5' Site 3' Position Séquence Position Séquence Intron 1 nd nd 1179 ttcag/ACGCA Intron 2 1315 CTCGG/gtaag 1400 ggcag/ACGCG Intron 3 1938 CTACG/gtagg 2017 gtcag/CTGGG Intron 4 2214 CTAAG/gtacg 2301 tccag/AGCAC Intron 5 3009 ACCGG/gtaag 3075 tacag/CAATC Intron 6 3248 TACCT/gtaag 3355 aacag/CGAAC Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit fragment est sélectionné dans le groupe constitué par les amorces de séquence SEQ ID NO: 39 à 50 et les fragments de séquences SEQ ID NO: 24 à 38. Les molécules d'acide nucléique selon l'invention sont obtenues par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL,2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). Par exemple, elles peuvent être obtenues par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RTPCR, par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue, ou bien par synthèse chimique totale ou partielle. Les molécules d'acides nucléiques telles que définies ci-dessus peuvent être utilisées comme sondes ou comme amorces pour isoler le gène ace-1 d'autres espèces ou des allèles de ce gène, notamment par criblage d'une banque d'ADN génomique ou d'ADNc, ainsi que pour détecter/amplifier des molécules d'acide nucléique (ARNm ou ADN génomique) codant une protéine AChE 1 telle que définie ci-dessus. Ces différentes molécules d'acides nucléiques permettent de mettre en évidence le gène ace-1, des variants alléliques de ce gène, une altération fonctionnelle de ce gène ace-1 (changement substantiel de la sensibilité aux insecticides) résultant d'une mutation (insertion, délétion ou substitution) d'un ou plusieurs nucléotides au niveau dudit gène. La présente invention a également pour objet une méthode de détection d'insectes porteurs d'une résistance aux insecticides de la classe des organophosphorés et des carbamates, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la préparation d'un échantillon d'acides nucléiques à partir d'insectes à tester, et - la détection par tout moyen approprié de la présence, dans ledit échantillon d'acides nucléiques, d'une mutation dans le gène ace-1 tel que défini cidessus. Ladite détection est réalisée par les techniques classiques qui sont connues en elles mêmes, par exemple : (i) par amplification d'une région dudit gène ace-1 susceptible de contenir une mutation, puis détection de ladite mutation par séquençage ou par digestion par une enzyme de restriction appropriée, du produit de PCR obtenu, ou bien (ii) par hybridation avec une sonde marquée spécifique d'une région dudit gène ace-1 susceptible de contenir une mutation, puis détection directe des mésappariements et/ou digestion par une enzyme de restriction appropriée. De préférence un fragment d'environ 320 pb (fragment K) est amplifié à l'aide des amorces SEQ ID NO: 39 et SEQ ID NO: 40. Par exemple, chez les moustiques on obtient un fragment de séquence SEQ ID NO: 24 à 38 qui présente des mutations entre les moustiques sensibles et résistants aux insecticides. Par exemple, chez C. pipiens on observe 3 substitutions dans la séquence des individus résistants dont l'une introduit un site EcoRI. L'analyse du profil de restriction après amplification PCR du fragment K et digestion des produits obtenus par EcoRl (analyse RFLP), permet de détecter rapidement le génotype ace-1 dans une population de C.pipiens ; la présence d'un seul fragment correspond aux homozygotes résistants (RR), la présence de 2 fragments d'environ 106 pb et 214 pb correspond aux individus homozygotes sensibles (SS) et la présence de 3 fragments de 106 pb, 214 pb et 320 pb correspond aux individus hétérozygotes résistants (RS). La présente invention a également pour objet un réactif de détection d'insectes porteurs d'une résistance aux organophosphorés et aux carbamates, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par : les molécules d'acide nucléique et leurs fragments tels que définis ci-dessus (sondes , amorces) et les anticorps tels que définis ci-dessus. La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend un insert sélectionné dans le groupe constitué par les molécules d'acides nucléiques codant une protéine AChEl et leurs fragments tels que définis ci-dessus. De préférence, ledit vecteur recombinant est un vecteur d'expression dans lequel ladite molécule d'acide nucléique ou l'un de ses fragments sont placés sous le contrôle d'éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés. Ces vecteurs sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes. De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ;le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser des vecteurs viraux comme les baculovirus ou non-viraux comme des plasmides. Pour exprimer l'AChEl, l'ADNc d'ace-1peut être placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif comme le promoteur de l'actine 5C, dans un vecteur approprié et ledit vecteur recombinant est introduit dans des cellules d'insecte telles que des cellules de drosophile (cellules de Schneider S2). La présente invention a également pour objet des cellules procaryotes ou eucaryotes, modifiées par un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus ; de préférence ces cellules sont des cellules d'insectes. Les vecteurs recombinants et les cellules modifiées telles que définies ci-dessus, sont utiles notamment pour la production des protéines et des peptides AChElselon l'invention. La présente invention a également pour objet un animal invertébré transgénique, caractérisé en ce qu'il contient des cellules modifiées par au moins une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus ; de préférence ledit animal est un insecte. Les animaux transgéniques et les cellules modifiées telles que définis ci-dessus, sont utiles notamment pour le criblage de substances insecticides. La présente invention a également pour objet une méthode de criblage d'une substance insecticide, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) la mise en contact de la substance à tester avec une protéine AChEl sélectionnée parmi : la protéine AChEl isolée selon l'invention, un extrait de cellules modifiées ou un échantillon biologique d'un animal transgénique contenant ladite protéine AChEl, tels que définis ci-dessus, en présence d'acétylcholine ou de l'un de ses dérivés, b) la mesure par tout moyen approprié, de l'activité acétylcholinestérase du mélange obtenu en a), et c) la sélection des substances capables d'inhiber ladite activité. La présente invention a également pour objet une méthode de criblage d'une substance insecticide, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la mise en contact d'un animal transgénique tel que défini ci-dessus, avec la substance à tester, et - la mesure de la survie de l'animal. Avantageusement, lesdites méthodes de criblages mettent en oeuvre des AChEl résistantes aux organophosphorés ou aux carbamates ou bien des cellules ou des animaux transgéniques les contenant. La présente invention a également pour objet un réactif de criblage de substances insecticides, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les protéines ACHE 1, les vecteurs recombinants, les cellules modifiées et les animaux transgéniques tels que définis ci-dessus. Des substances insecticides capables d'inhiber l'activité acétylcholinestérase des protéines AChEl résistantes aux insecticides de la classe des organophosphorés et des carbamates couramment utilisés ont des applications : en santé humaine et animale, pour lutter contre les vecteurs de pathogènes (par exemple Aedes aegypti, vecteur d'arboviroses comme la dengue et la fièvre jaune, Culex pipiens vecteur du virus WestNile, Anopheles gambiae vecteur africain de l'agent du paludisme, etc) et dans le domaine de l'agriculture, pour lutter contre les insectes nuisibles qui dévastent les récoltes(par exemple le doryphore (Leptinotarsa decemlineata) qui s'attaque aux pommes-de-terre, les pucerons ravageurs comme Aphis gossypii et Myzus persicae, etc.). L'invention a en outre pour objet une trousse de détection et/ou de criblage pour la mise en #uvre des méthodes telles que définies ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle inclut au moins un réactif tel que défini ci-dessus. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre du gène ace-1 et de ses produits (ADNc, protéine) selon la présente invention ainsi qu'au tableau résumant les séquences de la Demande et aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre l'alignement des séquences en acides aminés des protéines AChEl d'Anophèles gambiae, Schizaphis graminum, An. stephensi, Aedes aegypti, Drosophila melanogaster, Lucilia ,cuprina, Musca domestica et Culex pipiens. Par convention, les acides aminés sont numérotés en référence à la séquence de l'AChE du poisson torpille (Torpedo marmorata; SWISSPROT P07962). Les séquences N- et C- terminales ne sont pas représentées en raison de leur variabilité. Les acides aminés conservés entre AChEl et AChE2 sont indiqués en gris. Les acides aminés spécifiques d'AChE2 sont indiqués en noir. Les 3 résidus représentant la triade catalytique (S200, E327 et H440) sont encadrés. Le site de liaison à la choline (Ws4) est souligné. Les cercles représentent la position des 14 résidus aromatiques bordant la gorge du site actif dans l'AChE de Torpedo, dont 10 sont présents dans toutes les AChEl et AChE2 (cercles pleins), les autres n'étant pas conservés (cercles vides). Trois liaisons disulfures intramoléculaires entre des résidus cystéines sont indiquées. La flèche horizontale indique la position du fragment K (amplifié à l'aide des amorces PdirAGSG et PrevAGSG). La région hypervariable d'AChE2 qui est absente dans AChE est entourée. - la figure 2 illustre la détection génétique des moustiques résistants aux organophosphorés et aux carbamates par PCR-RFLP : . la figure 2 A représente la comparaison de la séquence en acides aminés du fragment K de différentes espèces de moustiques : Pip (Culex pipiens), Ae alb (Aedes albopictus), Ae aeg (Aedes aegypti), An alb (Anopheles albimanus), An gamb (Anopheles gambiae), An fun (Anopheles funestus), An nil (Anopheles nili), An sac (Anopheles sacharovi), An pse (Anopheles pseudopunctipennis). Les acides ami- nés variants sont grisés. Les séquences suivantes sont identiques: An. darlingi et An. albimanus; An. sundaicus, An. gambiae et An. arbiensis ; An. moucheti, An. funestus et An. minimus; An. stephensi et An. saccharovi. . la figure 2B illustre la comparaison des séquences nucléotidiques correspondant au fragment K des souches sensibles (S-LAB) et résistantes (SR). Les nucléotides variants sont grisés (t # c en position 3 ; a# g en position 84 : lesite.EcoRl (gaattc) situé autour de cette position, utilisé pour l'analyse PCR-RFLP, est présent uniquement dans la souche S-LAB ; c# t en position 173). La figure 2C illustre les profils de restriction obtenus après électrophorèse en gel d'agarose des produits de digestion par EcoRI, du fragment K amplifié par PCR. La souche homozygote sensible S-LAB présente un profil caractérisé par 2 bandes (214 pb et 106 pb), la souche homozygote résistante présente un profil caractérisé par une seul bande de 320 pb et les moustiques résistants issus du croisement en retour présentent un profil hétérozygote caractérisé par 3 bandes (320 pb, 214 pb et 106 pb). - la figure 3 illustre l'arbre phylogénétique des protéines AChE. L'analyse phylogénétique a été réalisée à partir de 47 séquences de protéines AChE de 35 espèces différentes provenant de la base de données ESTHER fhttp://www.ensam.inra.fr/cgi-bin/ace/index). Les séquences ont été alignées et un arbre a été construit comme décrit à l'exemple 1. Seuls les n#uds correspondant à des valeurs de "bootstrap" > 50% (c'est à dire des scores supérieurs à 500) sont indiqués. L'échelle représente une divergence de 10 %. Agam: An. gambiae ; Aeg : Aedes aegypti ; Aste : Anopheles stephensi; Cpip : Culex pipiens; Dmel: Drosophila melanogaster: Lcup: Lucilia cuprina: Mdom : Musca domestica: Ldec : Leptinotarsa decemlineata; Amel: Apis mellifera : Nephotettix cincticeps ; Schizaphis graminum ; Rapp: Rhipicephalus appendiculatus ; Bmic: Boophilus microplus; Bdec: Boophilus decoloratus; Hsap: Homo sapiens ; Btau: Bos taurus ; Fcat : Felix catus ; Ocun : Oryctolagus cuniculus ; Rnor : Rattus norvegicus ; Mmus: Mus musculus ; Ggal: Gallus gallus; Drer : Danio reno ; Eele : Electrophorus electricus ; Tamr: Torpedo marmorata ; Tcal : Torpedo californica ; Bfas: Bungarus fasciatus ; Mglu : Myxine glutinosa ; Bflo: Branchiostoma floridae ; Blan : Branchiostoma lanceolatum ; Cint : Ciona intestinalis ; Csav: Ciona savignyi ; Celé: Caenorhabditis elegans ; Cbrig : Caenorhabditis briggsae ; Dviv: Dictyocaulus viviparus; Lopa : Loligo opalescens. - la figure 4 illustre le cladogramme des protéines AChEl et AChE2. Les séquences des protéines AChEl et AChE2 ont été traitées comme à la figure 1. La séquence Bmic a été ajoutée comme séquence externe pour définir l'origine de l'arbre. Les cadres marqués d'une astérisque représentent les protéines codées par un gène qui ségrège avec la résistance aux insecticides. Les cadres vides représentent les protéines codées par un gène qui ne ségrègue pas avec la résistance aux insecticides. L'échelle correspond à une divergence de 10 %. Tableau II: Liste des séquences Numéro Séquence d'identification SEQ ID NO: 1 fragment de la région centrale de la protéine AChEl Anopheles gambiae (positions 70 à 593 de la SEQ ID NO: 3). SEQ ID NO:2 ADNc AChEl Anophèles gambiae SEQ ID NO: 3 Protéine AChEl Anopheles gambiae SEQ ID NO: 4 ADNc AChE 1 Anopheles gambiae (souche KISUMU) SEQ ID NO: 5 Protéine AChEl Anophèles gambiae (souche KISUMU) SEQ ID NO: 6 ADNc AChEl Culex pipiens (souche S-LAB) SEQ ID NO: 7 Protéine AChEl Culex pipiens (souche S-LAB) SEQ ID NO: 8 fragment peptidique K AChE 1 Culex pipiens SEQ ID NO: 9 fragment peptidique K AChEl Aedes aegypti SEQ ID NO: 10 fragment peptidique K AChEl Aedes albopictus SEQ ID NO: 11 fragment peptidique K peptidique ACHE Anophèles darlingi SEQ ID NO: 12 fragment peptidique K AChEl An. sundaicus SEQ ID NO: 13 fragment peptidique K ACHE An. minimus SEQ ID NO: 14 fragment peptidique K AChEl An. moucheti SEQ ID NO: 15 fragment peptidique K AChEl An. arabiensis SEQ ID NO: 16 fragment peptidique K AChE 1 An. funestus SEQ ID NO: 17 fragment peptidique K AChEl An. pseudopunctipennis SEQ ID NO: 18 fragment peptidique K AChEl An. sacharovi SEQ ID NO: 19 fragment peptidique K ACHE 1 An. stephensi SEQ ID NO: 20 fragment peptidique K AChEl An. albimanus SEQ ID NO: 21 fragment peptidique K AChEl An. nili SEQ ID NO: 22 gène ace-1 An. gambiae SEQ ID NO: 23 gène ace-1 An. gambiae KISUMU SEQ ID NO: 24 fragment nucléotidique K AChEl C. pipiens (souche S-LAB) SEQ ID NO: 25 fragment nucléotidique K AChEl C. pipiens (souche SR) SEQ ID NO: 26 fragment nucléotidique K AChEl Aedes aegypti SEQ ID NO: 27 fragment nucléotidique K AChEl Aedes albopictus SEQ ID NO: 28 fragment nucléotidique K AChEl Anopheles darlingi SEQ ID NO: 29 fragment nucléotidique K AChE 1 An. sundaicus SEQ ID NO: 30 fragment nucléotidique K AChEl An. minimus SEQ ID NO: 31 fragment nucléotidique K AChEl An. moucheti SEQ ID NO: 32 fragment nucléotidique K AChE An. arabiensis SEQ ID NO: 33 fragment nucléotidique K AChEl An. funestus SEQ ID NO: 34 fragment nucléotidique K AChEl An. pseudopunctipennis SEQ ID NO: 35 fragment nucléotidique K AChEl An. sacharovi SEQ ID NO: 36 fragment nucléotidique K AChEl An. stephensi SEQ ID NO: 37 fragment nucléotidique K AChE 1 An. albimanus SEQ ID NO: 38 fragment nucléotidique K AChE 1 An. nili SEQ ID NO: 39 amorce PkdirAGSG SEQ ID NO: 40 amorce PkrevAGSG SEQ ID NO: 41 amorce PbdirAGSG SEQ ID NO: 42 amorce PbrevAGSG SEQ ID NO: 43 amorce culex-bdirl SEQ ID NO: 44 amorce culex-krevl SEQ ID NO: 45 amorce AGI-Adir SEQ ID NO: 46 amorce AG1-Arev SEQ ID NO: 47 amorce AGI-Bdir SEQ ID NO: 48 amorce AGI-Brev SEQ ID NO: 49 amorce AGI-Cdir SEQ ID NO: 50 amorce AG 1 -Crev SEQ ID NO: 51 Protéine AChEl Ciona intestinalis SEQ ID NO: 52 Protéine AChEl Ciona savignyi SEQ ID NO: 53 Protéine AChE2 Anopheles gambiae EXEMPLE 1 : et méthodes a) Souches et croisements Cinq souches de C. pipiens ont été utilisées : une souche standard sensible aux insecticides (Georghiou et al., 1966, Bull. Wld. Hlth Org., 35, 691-708), SA1, SA4 et EDIT qui possèdent une seule AChE sensible aux insecticides, et SR qui est homozygote pour une AChE insensible aux insecticides (Berticat et al., Genet. Res., 2002,79, 41-47). Les souches possédant une AChE sensible et insensible sont dénommées respectivement S et R. b) Nomenclature des gènes ace et numérotation des séquences d'acides aminés ace-1 représente le locus codant pour une AChE cholinergique responsable de la résistance aux organophosphorés et aux carbamates chez C. pipiens (AChEl), précédemment dénommé Ace.l (Raymond et al., Genetica, 2001,112/113, 287-296). ace-2 représente le second locus ace, qui n'est pas impliqué dans la résistance aux insecticides chez C. pipiens (précédemment dénommé Ace.2), dont la fonction est inconnue chez C. pipiens. L'unique gène ace présent dans Drosophila melanogaster, qui est homologue à ace-2, est donc dénommé de même. Dans les analyses qui suivent, les positions des résidus d'acides aminés sont indiquées en référence à la séquence de l'AChE du poisson torpille [Torpédo marmorata; GENBANK P07962], selon la nomenclature recommandée par Massoulié et al., 1992, In Multidisciplinary approaches to cholinesterase functions, eds, Schafferman, A. & Velan, B. (Plenum Press New York), p 285-288]. c) Analyse de la transmission du gène ace-1 Les femelles étant indiquées en premier, des croisements FI (S X R) et des croisements en retour (FI X S-LAB et S-LAB X FI) ont été obtenus par croisement en masse d'adultes. Quelques larves issues des croisements en retour ont été traitées avec une dose de carbamate (propoxur, 4mg/L) qui tue 100 % des larves sensibles. La liaison entre ace-1 et la résistance au propoxur a été étudiée par RFLP chez les larves survivantes, à partir d'un produit PCR de 320 pb permettant d'identifier les allèles S et R. Les expériences ont été réalisées de façon indépendante, avec S SAl, S = SA4 et S = EDIT. d) Analyse des séquences et assemblage des gènes Toutes les analyses de séquences ont été effectuées à partir des séquences brutes d'Anophèles gambiae disponibles sur le serveur INFOBIOGEN (http://www.infobiogen.fr) et des outils disponibles sur le site (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast). Les séquences génomiques codant une AChE ont été identifiées à l'aide des logiciels TBLASTN et BLAST (Altschul et al., J. Biol. Mol., 1990,215, 403-410). Les séquences génomiques identifiées ont été assemblées à l'aide du logiciel ABI Prism Auto-Assembler (v2.1, PERKIN ELMER). Les séquences ont été vérifiées et corrigées à l'aide du logiciel Ensembl Trace Server (http: // trace.ensembl.org/). Deux concaténations de respectivement 5195 et 6975 paires de bases, codant respectivement pour AChEl et AChE2 ont été assemblées à partir de respectivement 64 et 74 séquences indépendantes (redondance moyenne de 10,5 et 6,5). Les exons et les séquences protéiques ont été identifiés à l'aide d'une combinaison entre les logiciels FGENESH (http://www.sanger.uk) et BLASTX (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Les séquences génomiques d'AChE d'ascidies ont été assemblées à partir de séquences brutes déposées dans les bases de données du NCBI (Ciona savignyi) et du Doe Joint Institute (Ciona intestinalis, http://www.jgi.doe.gov/programs/ciona/ciona mainage.html). Les recherches dans les bases de données de Drosophila ont été effectuées à l'aide de Flybase (http://www.fruitfly.org/). e) Comparaisons de séquences Les séquences des protéines AChEl et AChE2 6.' Anophèles gambiae déduites des séquences génomiques et les séquences peptidiques déduites de fragments PCR de C. pipiens et A. aegypti ont été alignées avec celles des AChE connues, à l'aide du logiciel ClustalW, en utilisant une matrice BLOSUM et des paramètres par défaut (Thompson et al., N. A.R., 1994, 22, 4673-4680). Un arbre phylogénétique a été construit en utilisant l'algorithme du plus proche voisin (neighbour-joining algorithm) de la version DDBJ de Clustal W (http://hypernig.nig.ac.jp/homology/ex) clustalw-e.shtml). L'analyse de type Bootstrap (1000 comptages et 111 valeurs d'entrée) a été utilisée pour évaluer les degrés de confiance pour la topologie de l'arbre. La construction des arbres a été réali- sée à l'aide du logiciel Treeview (vl.6.6). f) Numéros d'accession Les numéros des séquences (numéros d'accession dans les bases de données ou les numéros d'identification dans la liste de séquences) ayant servi à l'analyse génétique sont les suivants. - Craniata : Homo sapiens : NP~00046 ; Bos taurus : P23795 ; Felix catus : 06763 ; Oryctolagus cuniculus : Q29499 ; Rattus norvegicus : P36136 ; Mus musculus : P21836 ; Gallus gallus: CAC37792 ; Danio reno: Q9DDE3 ; Electrophorus electricus : 6730113 ; Torpedo marmorata : P07692 ; Torpedo californica : P04058 ; Bungarus fasciatus : Q92035 ; Myxine glutinosa : Q92081. - Cephalocordés : Branchiostoma floridae : 076998 et 076999 ; Branchiostoma lanceolatum : Q95000 et Q95001. - Urocordés : Ciona intestinalis : SEQ ID NO : 51 ; Ciona savignyi : SEQ ID NO : 52. - Nématodes : Caenorhabditis elegans (1 à 4) : P38433,061371, 061459 et 061372; Caenorhabditis briggsae (1 à 4) Q27459, 061378Q9NDG9 et Q9NDG8 ; Dictyocaulus viviparus : Q9GPLO. - Insectes : Anopheles gambiae (1 et 2) : SEQ ID NO:3 et SEQ ID NO: 53 ; Aedes aegypti (1 et 2) : SEQ ID NO: 9 et AAB3500 ; An. stephensi : P56161 ; Culex pipiens : SEQ ID NO: 7 (ace-1) et Esther data base pour ace-2 ; Drosophila melanogaster :P07140 ; Lucilia cuprina : P91954 ; Musca domestica : AAK69132.1 ; Leptinotarsa decemlineata : Q27677 ; Apis mellifera : AAG43568 ;Nephotettix cincticeps : AF145235~1 ; Schizaphisgraminum : Q9BMJ1. - Arachnides : Rhipicephalus appendiculatus : 062563 ; Boophilus microplus (1 et 2) : 045210 et 061864 ; Boophilus decoloratus : 061987 ; - Mollusques : Loligo opalescens : 097110. g) Clonage du fragment K et génotypage d'ace-1 chez Culex pipiens L'ADN de moustique a été extrait comme décrit dans Rogers et al., [Plant Molecular Biology manual, 1988, eds. Gelvin, S.B.Schilperoot, R.A. (Kluwer Académie Publishers, Boston), VolA6, pl-10]. Les oligonucléotides PkdirAGSG ( 5'ATMGWGTTYGAGTACACSGAYTGG-3', SEQ ID NO: 39) et PkrevAGSG (5'GGCAAARTTKGWCCAGTATCKCAT-3', SEQ ID NO: 40) amplifient un fragment de 320 pb (fragment K) à partir de l'ADN génomique de plusieurs moustiques. 30 cycles d'amplification PCR ont été réalisés dans les conditions suivantes : 94 C pendant 30s, 50 C pendant 30s à et 72 C pendant 30s. Les séquences ont été déterminées directement sur les produits PCR sur un séquenceur ABI prism 310, à l'aide du kit Big Dye Terminator. Le génotypage d'ace-1 chez Culex est réalisé dans les conditions suivantes : Les fragments K obtenus comme décrit précédemment sont digérés par EcoRI et le produit de digestion est séparé par électrophorèse sur un gel d'agarose à 2%. Les profils de restriction montrent : 1 bande (320 pb) chez les moustiques homozygotes résistants RR, 2 bandes (106 pb et 214 pb) chez les moustiques homozygotes SS et 3 bandes (103 pb, 214 pb et 320 pb) chez les moustiques hétérozygotes RS. h) Clonage de l'ADNc d'ace-1 chez les individus sensibles et résistants L'ADNc du gène ace-1 de Culex pipiens à été obtenu à partir de l'ARN extrait d'individus de la souche sensible de référence S-LAB, au tout premier stade de développement larvaire L1. La transcription inverse a été réalisée avec un oligonucléotide 18T et la SuperScripIIRNaseH (IN VITROGEN), selon les conditions recommandées par le fabricant. Deux fragments d'ADNc ont été amplifiés par PCR à l'aide d'oligonucléotides dégénérés obtenus à partir de l'alignement des séquences des gènes ace-1 d'Anophèles Gambiae et de Schizaphis graminum : - un fragment b (193pb) a été amplifié à l'aide du couple d'amorces PbdirAGSG (5'GGYGCKACMATGTGGAAYCC3', SEQ ID NO: 41) et PbrevAGSG (5'ACCAMRATCACGTTYTCYTCCGAC3', SEQ ID NO: 42). - un fragment k (320pb) a été amplifié à l'aide du couple d'amorces PkdirAGSG (5'ATMGWGTTYGAGTACACSGAYTGG3', SEQ ID NO: 39) et PkrevAGSG (5'GGCAAARTTKGWCCAGTATCKCAT3', SEQ ID NO: 40). Les fragments b et k ainsi obtenus ont ensuite été clonés et séquences, selon les techniques classiques connues en elles-mêmes de l'Homme du métier, telles que décrites dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. A USUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). Un fragment d'ADNc de plus grande taille a été amplifié par PCR, à l'aide d'amorces spécifiques de Culex pipiens déduites des séquences des fragments b et k précédemment obtenues. A savoir : - un fragment CulexA (1127 pb) a été amplifié par PCR à l'aide du couple d'amorces amorces : culex-bdirl (5'TACATCAACGTGGTCGTGCCACG3', SEQ ID NO: 43) et culex-krevl (5'GTCACGGTTGCTGTTCGGG3', SEQ ID NO: 44). Le fragment Culex A de 1127 pb ainsi obtenu a ensuite été cloné et séquence, comme ci-dessus. Les extrémités des ADNc ont été amplifiées par la technique RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), à l'aide d'un kit commercial (du kit Gene Racer (IN VITROGEN) selon les conditions indiquées dans le manuel d'utilisation. Ensuite elles ont été clonées puis séquencées, comme ci-dessus. i) Clonage du gène ace-1 chez les individus sensibles et résistants La séquence de l'ADN génomique de la souche A.Gambiae KISUMU (souche sensible de référence de l'Afrique de l'Ouest) a été obtenue à partir de moustiques homozygotes. De manière plus précise, l'ADN de moustique a été extrait comme décrit dans Rogers et al., [Plant Molecular Biology manual, 1988, eds. Gelvin, S.B.l Schilperoot, R.A. (Kluwer Académie Publishers, Boston), VoIA6, pl-10]. 3 fragments chevauchants (A, B et C) ont été amplifiés dans les conditions suivantes : 94 C pendant 30s, 50 C pendant 30s à et 72 C pendant 30s (30 cycles), à l'aide d'amorces synthétisées à partir de la séquence du gène ace-1. A savoir : - le fragment A (1130pb) a été amplifié à l'aide du couple d'amorces AGI-Adir (5'CGACGCCACCTTCACA3', SEQ ID NO: 45) et AGI-Arev (5'GATGGCCCGCTGGAACAGAT3', SEQ ID NO: 46), - le fragment B (1167pb) a été amplifié à l'aide du couple d'amorces AGI-Bdir (5'GGGTGCGGGACAACATTCAC3', SEQ ID NO: 47) et AGI-Brev (5'CCCCGACCGACGAAGGA3', SEQ ID NO: 48), et - le fragment C (876pb) a été amplifié à l'aide du couple d'amorces AGI-Cdir (5'AGATGGTGGGCGACTATCAC3', SEQ ID NO: 49) et AGI-Crev (5'CTCGTCCGCCACCACTTGTT3', SEQ ID NO: 50). Les séquences des fragments A, B et C ont été déterminées directement sur les produits PCR, à l'aide d'oligonucléotides internes, inclus dans ces fragments, en utilisant le kit Big Dye Terminator et un séquenceur ABI prism 310. EXEMPLE 2 : en évidence de 2 gènes ace chez Anopheles gambiae Des gènes homologues des gènes d'acétylcholinestérases humaines et de drosophiles ont été recherchés à partir de fragments de séquences déposées dans les bases de données, en utilisant le logiciel TBLASTN. Deux groupes de fragments distincts codant pour une AChE très similaire à celle de la drosophile ont été identifiés. Deux gènes de respectivement 6975 pb (ace-1) et 5195 pb (ace-2) ont été reconstruits à partir de fragments chevauchants de chaque groupe. L'analyse des gènes à l'aide des logiciels FGENESH et BLASTX montre que les gènes ace-1 et ace-2 sont constitués respectivement d'au moins 7 et 8 exons codant pour des protéines d'environ 534 et 569 acides aminés, dénommées respectivement AChEl et AChE2. Toutefois, cette analyse n'a pas permis de déterminer avec certitude la séquence des extrémités 5' et 3' de l'ADNc et les séquences NH2 et COOH des protéines correspondantes, qui ne sont pas conservées entre les différentes AChE. L'analyse des séquences en acides aminés confirme que les protéines AChEl et d'AChE2 sont très homologues à l'AChE de Drosophila (BLASTP : P ment été retrouvés dans les deux séquences (AChEl et AChE2): le site de liaison à la choline (résidu Tryptophane en position 84, W84), les trois résidus de la triade cataly- tique (résidus sérine, acide glutamique et histidine, respectivement en positions 200, 327 et 440 : S200, E327 et H440), les six résidus cystéine potentiellement impliqués dans des ponts disulfures conservés (C67-C94; C254-C265; C402-C521), et des résidus aromati- ques bordant la gorge du site actif (10 et 11 résidus , respectivement pour AChE1 et AChE2). Dans les deux séquences, on observe la présence d'un résidu phénylalanine en position 290 (F290) mais pas en position 288 ; caractéristique commune aux AChE d'invertébrés est responsable d'une plus large spécificité de subs- trat des AChE d'invertébrés, par rapport à celles de vertébrés. L'analyse des séquences C-terminales des AChE de diptère montre la présence d'un peptide hydrophobe correspondant à un signal d'addition d'un glyco- lipide, indiquant le clivage post-traductionnel d'un fragment C-terminal et l'addition d'une résidu d'ancrage glycolipidique comme chez Drosophila et d'autres espèces de moustiques. Dans toutes les séquences on observe également la présence d'un résidu cystéine dans la séquence C-terminale précédant le site potentiel de clivage du peptide hydrophobe. Ce résidu cystéine pourrait être impliqué dans une liaison disulfure intermoléculaire, liant les deux sous-unités catalytiques du dimère d'AChE. Les protéines AChEl et AChE2 d'An. gambiae présentent 53 % de similarité entre elles et montrent respectivement : 76 % et 55 % de similarité avec l'AChE de Schizaphis graminum (numéro d'accession NCBI AAK09373 ou GENBANK 12958609), 53 % et 98 % de similarité avec l'AChE d'An. stephensi (GENBANK 2494391), 54 % et 95 % de similarité avec l'AChE d'Aedes aegypti (GENBANK 2133626), 52 % et 83 % de similarité avec l'AChE de Drosophila (GENBANK 17136862). La différence majeure entre AChEl et AChE2 réside dans une insertion de 31 acides aminés dans la séquence d'AChE2 (figure 1). Cette séquence, dénommée "insertion hydrophilique" dans l'AChE de Drosophila, est absente dans les AChEs de vertébrés et de nématodes et pourrait être caractéristique de l'AChE2, au moins chez les diptères. Ces résultats démontrent la présence de deux gènes ace dans le génome $ Anophèles gambiae, l'un codant pour AChE qui est apparentée à l'AChE de Schizaphis graminum, et l'autre pour AChE2 qui est apparentée à l'AChE de Drosophila et aux AChEs connues de moustiques. La présence d'autres gènes ace chez An. gambiae est très improbable dans la mesure où des recherches complémentaires dans les bases de données du génome d'An gambiae, en utilisant des paramètres moins stringents, ont détecté uniquement des séquences codant pour des alpha-estérases (EC 3.1.1) et des carboxylestérases (EC 3.1.1.1). EXEMPLE 3: Mise en évidence d'un unique gène ace chez Drosophila melanogaster La présence d'un gène homologue du gène ace-1 a été recherchée dans le génome de Drosophila. Les recherches TBLASTN ont permis de détecter le gène ace précédemment identifié, homologue du gène ace-2 d'Anopheles gambiae mais n'ont pas permis de détecter d'autres séquences homologues du gène ace-l. Des recherches à l'aide de paramètres moins stringents ont permis de détecter uniquement des alpha et des carboxylestérases. Ces résultats démontrent que le génome de la drosophile contient un unique gène ace (ace-2). EXEMPLE 4 : en évidence d'au moins deux gènes ace chez les autres espè- ces de moustiques La présence du gène ace-1 dans le génome d'autres espèces de moustiques a été analysée par PCR à l'aide d'oligonucléotides dégénérés (PdirAGSG et PrevAGSG, SEQ ID NO: 39 et 40) permettant d'amplifier un fragment exonique (fragment K, d'environ 320 pb figure 1), correspondant à des séquences conservées entre les séquences d'AChEl d'An. gambiae et Schizaphis graminum mais divergentes entre les séquences d'AChElet AChE2 d'An. gambiae. La séquence des produits PCR obtenus à partir de l'ADN génomique de différentes espèces de moustiques, montre un pourcentage d'identité très élevé entre les séquences d'Anopheles, Culex et Aedes. En outre, la plupart des substitutions sont silencieuses puisque les séquences en acides aminés déduites de ces séquences nucléotidiques ne diffèrent entre elles que part 5 à 6 acides aminés (Figure 2A). Le fragment K a également été amplifié par RT-PCR à partir de l'ARNm de C. pipiens, indiquant que le gène ace-1 est exprimé sous forme d'ARNm ; ce résultat est en accord avec l'existence, chez C. pipiens, de deux AChEs possédant des propriétés catalytiques distinctes. EXEMPLE 5 : Analyse de la liaison entre le gène ace-1 et la résistance aux insecticides Afin d'analyser la liaison entre le gène ace-1 et la résistance aux insecticides, le fragment K amplifié à partir de l'ADN génomique de C. pipiens résis- tants (souche R), a été séquence. La comparaison des séquences du fragment K entre les souches S et R montre des différences au niveau de 3 nucléotides (substitutions silencieuses, Figure 2B). L'une de ces substitutions affecte un site EcoRI, ce qui permet de différencier facilement le locus ace-1 des souches S et R par PCR-RFLP : les profils de restriction montrent 1 bande (320 pb) chez les individus homozygotes résistants, 2 bandes (106 pb et 214 pb) chez les moustiques homozygotes SS et 3 bandes (103 pb, 214 pb et 320 pb) chez les moustiques hétérozygotes RS (figure 2C). La liaison entre le gène ace-1 et la résistance au propoxur a été étudiée, en triple, de la façon suivante : des larves de croisement en retour (S x R) x S ont été traitées par une dose létale pour les individus sensibles et le génotype d'ace-1 a été analysé chez les survivants, par PCR-RFLP. Les résultats montrent que l'exposition au propoxur tue 50 % des larves dans tous les croisements en retour, c'est à dire tous les individus sensibles. Toutes les larves survivantes (100 pour chaque croisement en retour, 300 au total) montrent un profil hétérozygote en RFLP, indiquant qu'elles possèdent toutes une copie du gène ace-1 de la souche R. Ces résultats démontrent que le gène ace-1 est lié de façon très étroite avec la résistance aux insecticides (moins de 1 % de recombinaison avec un degré de confiance de 0,05). EXEMPLE 6 : Analyse de la phylogénie des gènes ace-1 et ace-2. Des arbres phylogénénétiques ont été construits à partir des séquences des régions conservées des AChE d'An gambiae (SEQ ID NO: 1 et fragment 34- 393 de la séquence SEQ ID NO: 53, figure 1), des fragments K de C. pipiens et Aedes aegypti (SEQ ID NO: 8 et 9) et de 33 séquences d'AChE disponibles dans GENBANK, à l'aide de la méthode du plus proche voisin (neighbour-joining method), comme décrit dans le matériels et méthodes. La figure 3 illustre l'hétérogénéité du nombre de gènes ace au cours de l'évolution du règne animal. Chez les cordés, les céphalocordés possèdent au moins deux gènes ace alors que les urocordés n'en possèdent qu'un seul, comme déduit de l'analyse de leur génome. Chez les arthropodes, les diptères possèdent, soit un seul gène ace (Drosophila du sous-ordre des brachycères) ou deux gènes ace (moustiques du sous-ordre des nématocères). La topologie de l'arbre montre que ces deux gènes ace se sont dupliqués très précocement au cours de l'évolution, probablement avant la séparation entre les protostomes et les deutérostomes. Ces résultats sont supportés par le fait que les AChE de mollusques, de nématodes et d'arthropodes se ramifient à partir des séquences des cordés (craniatia, céphalocordés et urocordés). Les résultats montrent que les arthropodes et les nématodes possèdent une AChE apparentée. Ces résultats indiquent que les gènes ace-1 et ace-2 identifiés chez les insectes proviennent d'un événement de duplication très ancien et que l'absence du gène ace-l, au moins chez certaines espèces du sous-ordre des brachycères (Drosophila ) résulte de la perte d'un gène ace plutôt que d'une duplication récente du gène ace chez les nématocères. Ces résultats suggèrent également que les extrapolations faites à partir d'études chez D. melanogaster sont à considérer avec réserve dans la mesure où la situation de Drosophila n'est ni représentative des diptères ni de l'ensemble de la classe des insectes. EXEMPLE 7 : Détermination de la séquence complète de l'ADNc d'ace-1 L'ADNc d'ace-1 a été cloné à partir d'une souche d'Anopheles gambiae de l'Afrique de l'Ouest (souche KISUMU) et d'une souche de Culex pipiens (souche S-LAB) sensibles aux insecticides de la classe des organophosphorés et des carbamates, comme décrit dans le matériels et méthodes La séquence complète de l'ADNc correspond respectivement aux séquences SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 6 et qui codent pour une protéine de respectivement 643 et 702 acides aminés (SEQ ID NO:5et SEQ ID NO: 7). EXEMPLE 8 : Détermination de la séquence complète du gène ace-1 La séquence complète du gène ace-1 a été déterminée à partir de l'ADN génomique d'une souche d'Anophèles gambiae de l'Afrique de l'Ouest (souche KISUMU), comme décrit dans le matériels et méthodes. La séquence complète du gène ace-1 correspond à la séquence SEQ ID NO: 23 qui présente une organisation intron-exon comprenant au moins 7 exons (Tableau I). Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en #uvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 ) Acétylcholinestérase d'insecte, caractérisée en ce qu'elle comprend une région catalytique centrale qui présente une séquence en en acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence SEQ ID NO: 1 et les séquences présentant au moins 60 % d'identité ou 70 % de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 1, à l'exclusion de l'acétylcholinestérase de séquence NCBI AAK0973. 2 ) Acétylcholinestérase selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle correspond à celle d'un insecte de la famille des Culicidae, choisi parmi les genres Culex, Aedes et Anopheles. 3 ) Acétylcholinestérase selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 7. 4 ) Acétylcholinestérase selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite région catalytique centrale comprend une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 8 à 21. 5 ) Peptide, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment d'au moins 7 acides aminés de l'acétylcholinestérase selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 6 ) Molécule d'acide nucléique isolée, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : - les séquences codant pour une acétylcholinestérase selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 (ADNc et gène ace-1), - les séquences complémentaires des séquences précédentes, sens ou anti-sens, et - les fragments d'au moins 8 pb, de préférence de 15 pb à 500 pb des séquences précédentes. 7 ) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par les ADNc de séquence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4 et SEQ ID NO: 6 et les ADN génomiques de séquence SEQ ID NO : et SEQ ID NO : 23.8 ) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par les amorces de séquence SEQ ID NO: 39 à 50 et les fragments de séquence SEQ ID NO: 24 à 38. 9 ) Méthode de . détection d'insectes porteurs d'une résistance aux insecticides de la classe des organophosphorés et des carbamates, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la préparation d'un échantillon d'acides nucléiques à partir d'insec- tes à tester, et - la détection par tout moyen approprié, de la présence dans ledit échantillon d'acides nucléiques, d'une mutation dans le gène ace-1 tel que défini à la revendication 6 ou à la revendication 7. 10 ) Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite détection comprend : - l'amplification d'un fragment d'environ 320 pb à l'aide du couple d'amorces SEQ ID NO: 39 et 40, - la digestion dudit fragment à l'aide d'une enzyme de restriction appropriée, et - l'analyse du profil de restriction obtenu. 11 ) Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite enzyme de restriction est EcoRJ. 12 ) Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend un insert sélectionné dans le groupe constitué par les molécules d'acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 6 à 8. 13 ) Cellules, caractérisées en ce qu'elles sont modifiées par un vecteur recombinant selon la revendication 12. 14 ) Anticorps, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre l'acétylcholinestérase selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou le peptide selon la revendication 5. 15 ) Réactif de détection d'insectes porteurs d'une résistance aux insecticides de la classe des organophosphorés et des carbamates, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les molécules d'acides nucléiques et leurs fragments selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 et les anticorps selon la revendication 14. 16 ) Animal invertébré transgénique, caractérisé en ce qu'il contient des cellules transformées par au moins une molécule d'acide nucléique selon la revendication 6 ou la revendication 7. 17 ) Méthode de criblage d'une substance insecticide, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) la mise en contact de la substance à tester avec une acétylcholinestérase selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, un extrait de cellules modifiées telles que définies à la revendication 13 ou un échantillon biologique d'un animal transgénique tel que défini à la revendication 16, en présence d'acétylcholine ou de l'un de ses dérivés, et b) la mesure par tout moyen approprié, de l'activité acétylcholinestérase du mélange obtenu en a), et c) la sélection des substances capables d'inhiber ladite activité. 18 ) Méthode de criblage de substances insecticides, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la mise en contact d'une substance à tester avec un animal transgénique selon la revendication 16, et - la mesure de la survie de l'animal. 19 ) Réactif de criblage de substances insecticides, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les acétylcholinestérases selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, les vecteurs recombinants selon la revendication 12, les cellules modifiées selon la revendication 13 et les animaux transgéniques selon la revendication 16. 20 ) Trousse de détection et/ou de criblage, caractérisée en ce qu'elle inclut au moins un réactif selon la revendication 15 ou la revendication 19.