Brevet FR2836925A1 — publié le 20030912

La présente invention est relative à un procédé de criblage de molécules actives dans la prévention et le traitement des complications inflammatoires de l'athérosclérose, aux produits inhibant la prolifération. la migration et l'activité des cellules NK. T CD3*NK. L1'produisant de l'IL-4, ainsi qu'à leurs applications. L'athérosclérose est une lésion de la couche interne (intima) des artères. De manière plus précise. la lésion élémentaire d'athérosclérose ou plaque simple consiste en un épaississement localisé de l'intima artérielle. formé d'un amoncellement de tissu fibreux dur (sclérose) enchâssant un centre mou constitué de lipides modifiés ou oxydés (athérome ou coeur lipidique de la plaque) et de lipoprotéines (LDL ou cien. lipopi-otein). Chez l'homme, l'athérosclérose est la cause dominante des obstruc- tions qui touchent les artères de gros et de moyen calibre dans la grande circulation. Les maladies résultant de l'athérosclérose consistent en une ischémie ou insuffisance d'apport sanguin à l'organe irrigué par l'artère obstruée. Se manifestant essentiellement chez les personnes âgées de plus de 40 ans et avec une fréquence accrue à mesure qu'elles vieillissent, l'athérosclérose est avec le cancer, une des causes premières de maladie et de mort dans les pays occidentaux. L'athérosclérose est considérée comme une maladie inflammatoire chronique impliquant des réponses immunitaires à la fois humorales et cellulaires. résultant d'interactions multiples et complexes entre des lipoprotéines modifiées. essentiellement des LDL oxydées. des monocytes/macrophages et des cellules T. avec les composants de la paroi artérielle. Cette maladie résulte d'interactions complexes entres des facteurs génétiques et environnementaux (alimentation. infections...). Le rôle des facteurs alimentaires et des gènes de transporteurs de lipides (gène ApoE). dans le développement de l'athérosclérose. a été démontré dans z : l des modèles animaux, respectivement chez le lapin ou chez la souris C57BL/6. soumis à une alimentation riche en cholestérol et chez la souris Knock-out déficiente en apoE ou souris apoEo (Plump et al.. Cell. 1992. 71, 343-353 ; Zhang et al., Science. 1992. 258. 468-471). Ces animaux qui présentent des lésions sévères (induites ou spontanées) d'athérosclérose constituent des modèles utiles pour l'étude et le traitement de l'athérosclérose. Il a également été suggéré qu'une inflammation chronique comme celle résultant d'une infection virale ou bactérienne pourrait contribuer au développement ou à l'aggravation des lésions d'athérosclérose. tc En effet, des études. essentiellement épidémiologiques. montrent uniquement la présence de microorganismes tels que ('hlttiiiyclici pneunionicie et le cytomégalovirus dans les lésions d'athérosclérose d'individus présentant une e insuffisance cardiaque (Mendall et al.. J. Infect., 1995. 30, 121-128 ; Melnick et al., Eur. Heart. J., 1993. 14. 30-38 ; Chiu et al.. Circulation, 1997. 96, 2144-2148, ainsi qu'une augmentation de l'incidence de maladie coronarienne chez les patients c présentant une infection dans laquelle le microorganisme n'est pas localisé au niveau de la paroi artérielle, notamment lors d'infections par Helicobacter pylori, d'infections dentaires ou bien de bronchites (Mendall et au. ber Heart. 1.. 1994,71, 437-439 ; Mattila, Clin. Infect. Dis.. 1995. 20, 588-592 ; Jousilahti et al.. Lancet, 1996, 348. 567- 572). Ainsi. il a été proposé que des endotoxines telles que les lipopolysaccharides de la paroi des bactéries Gram-négatives (LPS). associées à des lipoprotéines pourraient être incorporées dans la paroi des artères et provoquer une inflammation locale (Memon et al.. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 2000, 20, 1536- 1542 : Kalayoglu et al.. Inf. Immunity. 1998. 66. 5067-5072). Il a également été proposé que l'oxygène réactif généré en réponse à l'infection par un microorganism tel que C'hlciniy, tliti pneiiiiionicie pourrait augmenter l'oxydation des LDL (Memon et c 1 al.. précité ; Kalayogu et al.. J. Infect. Dis.. 1999. 180, 780-790). Toutefois. l'étude de ces infections n'a pas permis de mettre en évidence de rôle dans le développement ou l'aggravation de l'athérosclérose. pour ces microorganismes et/ou pour l'inflammation qu'ils provoquent. La réponse immunitaire associée à l'athérosclérose a été étudiée dans le modèle de souris apoEo Ainsi, des épi topes oxydation-spécifiques ont été mis en évidence dans les lésions d'athérosclérose et une quantité importante d'auto-anticorps dirigés contre la malondialdéhyde (MAD)-lysine ont été détectés dans le plasma des c souris apoEo (Palinski et al.. Arterioscler. Thromb.. 1994, 14. 605-616. L'analyse immunohistochimique des lésions d'athérosclérose présentes chez ces souris révèle la présence de macrophages et de lymphocytes T' :'parmi ces lymphocytes T, certains Z--1 1 expriment la chaîne a du récepteur de l'IL-2 (CD25) indiquant une activation récente (Zhou et al., Am. J. Pathol.. 1996, 149, 359-366). Il a également été montré qu'une alimentation riche en cholestérol pouvait influencer la participation des cellules T dans l'athérosclérose. En effet. des cellules du type Th 1 productrices d'IFN-y, présentes dans les lésions précoces, sont remplacées par des cellules du type Th2 produisant de l'IL-4 et de ! L-1. lors d'une hypercholestérolémie induite par une alimentation riche en cholestérol (Zhou et al., J. Clin. Invest.. 1998, 101. 1717-1725). Toutefois. ces études de la réponse immunitaire associée à l'athérosclérose. n'ont pas permis de déterminer le rôle de l'inflammation chronique dans le développement ou l'aggravation de l'athérosclérose. Ce rôle a été démontré récemment dans un modèle de lapins hypocholestérolémiques traités par des injections répétées de lipopolysaccharides de la paroi des bactéries Gram-négatives (LPS) ; chez les lapins traités par le LPS. qui mime l'activation du système immunitaire induite par l'infection par un microorganisme. on observe une aggravation des lésions d'athérosclérose, par rapport aux sujets non-traités (Lehr et al.. Circulation, 2001. 104.914-920). Dans cet article, les auteurs proposent. pour prévenir et/ou traiter les lésions d'athérosclérose, d'inhiber le complément et/ou des macrophages qui sont les principaux effecteurs de la réponse immunitaire. induits par cette infection. Toutefois, le rôle de ces effecteurs dans l'aggravation des lésions d'athérosclérose n'a pas été démontré. Afin. de traiter plus efficacement l'athérosclérose chez l'homme, il existe un réel besoin de disposer de nouveaux modèles in vivo et in vitro adaptés au criblage et à la sélection de molécules actives. aptes à prévenir ou à traiter spécifiquement les complications inflammatoires de l'athérosclérose, utilisables en complément des médicaments hypocholestérolémiants. Les cellules NKT sont constituées par une population de lymphocytes T présentant des caractéristiques communes avec les cellules tueuses naturelles (cellules NK). (Pour une revue, voir Godfrey et al.. Immunology Today, 2000,21, 573-583). Ces cellules sont caractérisées par un biais dans l'utilisation des gènes du récepteur T (TcR). une restriction par la molécule CDId et une production élevée de cytokines notamment d'IL-4. d'IFN-y et de TNF-a. Chez la souris, elles sont définies par l'expression simultanée du marqueur NK 1. 1 et des chaînes ci et ss du TcR (cellules NKI. I+ cpTcR) : toutefois cette définition englobe des cellules phénotypiquement et fonctionnellement différentes. Le rôle exact de ces cellules est mal connu ; il a été suggéré que ces cellules pourraient jouer un rôle protecteur dans les maladie autoimmunes, le rejet de greffe, et le cancer, ainsi qu'un rôle régulateur dans la réponse immunitaire à certaines infections. En utilisant les souris apoEo. les Inventeurs ont mis au point un modèle d'étude qui leur a permis d'identifier une sous-population de lymphocytes NKT participant de manière cruciale à l'aggravation des lésions d'athérosclérose ZDC induites par une inflammation chronique. En conséquence, la présente invention a pour objet un procédé de criblage de molécules aptes à prévenir et/ou à traiter l'athérosclérose chez l'homme, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement : - la mesure de l'effet de la molécule à tester sur l'activité de cellules NKT CD3'NK 1. 1"'" produisant de l'IL-4. et - la sélection des molécules aptes à inhiber ladite activité. Au sens de la présente invention. on entend par"activité des cellules NKT CD3+NKl. l + produisant de l'IL-4", la prolifération, la migration ou bien l'activité biologique de ces cellules comme la production d'IL-4 ; l'inhibition de cette z : l activité est mesurée par l'inhibition de la prolifération, l'inhibition de la migration ou bien l'inhibition de l'activité biologique de ces cellules, notamment de la production Z-1 d'IL-4. En effet. les Inventeurs ont trouvé, de manière inattendue, que la sous-population de cellules NKT CD') +NKI. I' produisant de l'IL-4 (cellules NKTCD3NK !. IIL-4) était associée. de façon étroite. à l'aggravation des lésions d'athérosclérose induites par une inflammation chronique. En conséquence. les cellules NKT CD') SKI. I+ produisant de l'IL-4 représentent une cible adaptée au criblage de molécules capables d'inhiber l'activité de ces cellules ; de telles molécules sont aptes à prévenir et/ou à traiter l'athérosclérose chez l'Homme, et en particulier à agir spécifiquement sur la composante c inflammatoire de cette pathologie, notamment chez les individus infectés de façon chronique par un microorganism. Conformément au procédé de l'invention. ladite molécule à cribler est, soit préalablement adiiiinistrée iii i, ii, o et ladite mesure de l'inhibition des cellules NKT CD3NK1. 1+ produisant de l'IL-4 est réalisée in vh' o ou ex vivo. à partir d'un échantillon biologique contenant lesdites cellules. soit l'ensemble des étapes de z : l criblage est réalisé ex rh'i'' r/' à partir d'un échantillon biologique contenant lesdites cellules. Conformément au procédé de l'invention. lesdites cellules NKT CD3+NK 1. 1 + produisant de l'IL-4 sont issues d'un mammifère humain ou nonhumain : de préférence elles sont issues du sang périphérique, du foie, de la rate, du thymus ou d'une lésion d'athérosclérose de l'homme ou de la souris. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé. lesdites cellules NKT CD3+NK 1. 1 + produisant de l'IL-4 sont issues de souris homozygotes déficientes en ApoE (souris apoEo : Zhang et al.. précité ; Plump et al.. précité). Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre. lesdites souris homozygotes déficientes en ApoE ont été préalablement traitées par des administrations répétées de lipopolysaccharides de la paroi de bactéries Gramnégatives (LPS) : chez ces souris. on observe une augmentation de la taille des lésions d'athérosclérose, associée à une augmentation très importante de la proportion de cellules NKT CD3+NK 1. 1 + produisant de l'IL-4, dans le sang. la rate. le thymus et les lésions d'athérosclérose. Conformément au procédé de l'invention. ladite mesure est réalisée indifféremment, à partir d'une population de lymphocytes isolés, ou bien à partir de la fraction purifiée de 1) mphocytes CD3+NK 1. 1-. lesquel1es sont préparées par des techniques classiques, telles que celles décrites dans Current Protoco ! s in Immuno ! ogy (John E. ('o/ en elles-mêmes sont connues de l'Homme du métier, notamment celles décrites dans CM/T/P/'/'cc.'As'/'/// ? ? w.)/ (T. précité. Par exemple : - l'inhibition de la prolifération est mesurée par l'analyse comparative, par toute technique appropriée comme la cytométrie de flux ou l'incorporation de 3H-thymidine. de la proportion ou du nombre de cellules C03+NK 1. 1 +IL-4-'-. en présence. ou en l'absence de la molécule à tester. - l'inhibition de la migration est mesurée par l'analyse comparative. par toute technique appropriée comme la cytométrie de flux. de la proportion ou du nombre de cellules CD3"NKI. I'IL-4". à partir de lymphocytes issus d'une lésion d'athérosclérose d'un sujet traité ou non par la molécule à tester, - l'inhibition de la production d'IL-4 est mesurée par l'analyse comparative, par toute technique appropriée comme la cytométrie de flux. de la proportion ou du nombre de cellules C03+NK1. 1 +IL-4+. à partir d'une population de lymphocytes isolés ou de cellules CD') +NKI. I+ purifiées. ou bien par dosage 1 c comparatif de l'IL-4 produite par des cellules CD-') +NKI. I+ purifiées, par toute technique appropriée comme la cytométrie de flux ou les tests ELISA. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé. ladite mesure est réalisée par l'analyse comparative en cytométrie de flux, de la proportion de cellules triplement marquées, à l'aide d'anticorps respectivement antiCD3.-NKI. I. et-1L-4. couplés à des tluorochromes différents. Selon une disposition avantageuse des modes de mise en oeuvre 1 précédents, il comprend au moins les étapes suivantes : al) induction d'une lésion d'athérosclérose chez des souris homozygotes déficientes en ApoE (souris apoEo -1-). par administration répétée de LPS. b,) mesure de l'effet d'une molécule à tester sur l'activité de cellules NKT CD') +NKI. I+ produisant de l'IL-4 par analyse comparée, par tout moyen approprié. à partir d'un échantillon biologique desdites souris, du nombre ou de la appropri 1 Zr proportion de cellules CD3+NKI. I+ produisant de j'IL-4. avant et après la mise en contact (administration rh' Selon une autre disposition avantageuse des modes de mise en oeuvre précédents, il comprend au moins les étapes'suivantes : a2) mise en culture de lymphocytes et éventuellement stimulation desdits lymphocytes en présence d'une substance appropriée telle que la bréfeldine A, b2) mise en contact desdits lymphocytes avec une molécule à tester, C2) mesure de l'effet de ladite molécule à tester sur l'activité de cellules NK. T CD3T\'KI. t" produisant de)'IL-4 par analyse comparée, par tout moyen approprié. de la proportion ou du nombre de cellules CD)-NKI. I-' produisant de l'IL- 4, en l'absence et en présence de ladite molécule à tester. et d2) sélection des molécules aptes à inhiber ladite activité. Avantageusement. l'analyse comparée (étape b, ou C2) est réalisée en cytométrie de flux. par triple marquage à l'aide d'anticorps respectivement anti-C03, NK1. 1. et-IL-4 couplés à des t1uorochromes différents. Avantageusement. lesdits lymphocytes à l'étape a2) sont des lymphocytes CD3+NKLI+ isolés et purifiés. par les techniques classiques telles que définies ci-dessus. Le procédé de criblage selon l'invention présente les avantages ln > suivants : - il est spécifique : la cible qui est utilisée (cellules NKT CD3+NKI. I+ IL-4-) est associée de façon étroite à l'aggravation des lésions d'athérosclérose induite par une inflammation chronique, - il est simple : test in vitro à partir de lymphocytes de souris et analyse en cytométrie de flux ou par ELISA - il est rapide : il peut être réalisé en 18 heures. et - il est facile à mettre en oeuvre : les souris apoEo et les anticorps anti-CD3.-NKI. I et-IL-4 couplés à un tluorochrome sont disponibles dans le commerce. Du fait des avantages précédents, ce procédé est parfaitement adapté à l'analyse simultanée d'un grand nombre de molécules. La présente invention à également pour objet. l'utilisation d'au moins une molécule obtenue par le procédé de criblage tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir et/ou traiter l'athérosclérose. La présente invention a également pour objet un produit contenant au moins une molécule telle que définie-ci-dessus et un principe actif hypocholestérolémiant. en tant que préparation combinée pour une utilisation simultanée. séparée ou étalée dans le temps, dans la prévention et/ou le traitement de l'athérosclérose. Une telle association permet avantageusement de prévenir et/ou de traiter l'aggravation des lésions d'athérosclérose induites par une inflammation chronique, notamment lors d'infection par un microorganism Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre l'analyse en ELISA, de l'effet de l'administration c répétée de LPS sur la réponse en auto-anticorps anti-LDL oxydées ; les densités optiques (DO) correspondant aux immunoglobulines anti-LDL oxydées totales (Ig totales) et aux différents isotypes de ces immunoglobulines sont présentées chez les souris apoEo traitées de façon répétée par le LPS (LPS). par comparaison avec les souris apoEo non-traitées (PBS). Les valeurs correspondent aux moyennes + s. e. m.. *** P - la figure 2 illustre l'analyse en cytométrie de flux. des cytokines produites par les cellules T du sang des différents groupes de souris apoEo (LPS. LPSI et PBS). effectuée dans les conditions telles que décrites à l'exemple 1. 6. Les panneaux A, B et C représentent l'analyse comparative des pourcentages de cellules ZD productrices des cytokines suivantes : (A) cellules IL-4 positives (IL-4+) dans la population de cellules CD3 et NK 1. 1 +. (B) cellules IFN-y positives (IFN-y) dans la population de cellules CD3* et CD4 et (C) cellules TNF-a positives (TNF-a') dans la population de cellules CD3- et CD8+. 1, 2, 3. 4 correspondent aux valeurs obtenues 24 h après chaque injection de LPS (groupe LPS) ou de PBS (groupe PBS). Le groupe LPSI a reçu une seule injection de LPS. Les valeurs correspondent aux moyennes + s. e. m.. *** P - la figure 3 illustre l'analyse en cytométrie de flux des cellules T productrices de cytokines. dans le foie, la rate et le thymus des différents groupes de souris apoEo (LPS. LPSI et PBS). A la fin de l'expérimentation. les organes sont prélevés et les cellules T sont purifiées comme décrit à l'exemple 1.5. Les panneaux A et B représentent l'analyse comparative des pourcentages de cellules productrices des cytokines suivantes : (A) cellules IL-4 positives (IL4+) dans la population de cellules CD-'i+ et NKI I, (B) cellules IFN-&gamma; positives dans la population de cellules CD') et C04+. Les valeurs correspondent aux moyennes-s. e. m.. *** P - la figure 4 illustre l'analyse immunohistochimique des lésions d'athérosclérose chez les souris apoEo traitées de façon répétée par le LPS (groupe LPS) ou non-traitées (groupe PBS). Les coupes de coeur sont analysées avec des c anticorps dirigés contre tes molécules suivantes : NKI. 1 (A), IL-4 (B). double marquage NKI. l/IL-4 (C) et TNF-a (D). grossissement x 400. ZD z - la figure 5 illustre l'anahse immunohistochimique des lésions d'athérosclérose dans l'intima et l'adventice du sinus aortique des souris apoEo traitées de façon répétée par le LPS (groupe LPS). Les coupes sont analysées avec des Z7 1 anticorps dirigés contre les molécules suivantes : CD69 (A). IgG de souris (B) et IgM de souris (C). La flèche indique une brèche dans la media. amenant les composants de la lésion d'athérosclérose en contact direct avec l'adventice. grossissement x 400. EXEMPLE 1 : Matériels et Méthodes. 1) Modèle animal Les souris mâles déficientes en ApoE (apoEo). de fond génétique C57BL/6 (laboratoire JACKSON) sont élevées dans des conditions de température contrôlées. avec des alternances de périodes de lumière et d'obscurité. Elles sont nourries avec un aliment standard (UAR) et ont de l'eau à volonté. A l'âge de 10 semaines, des souris mâles apoEo ont été divisées au z hasard en trois groupes (4 individus par groupe). Le premier groupe (groupe LPS) a tr--c reçu 10 injections successives d'une dose de 50 g de LPS d'E coli (SIGMA), à intervalle d'une semaine par voie intrapéritonéale. Le second groupe (groupe LPS1) a reçu une seule injection de LPS à la même dose. Le dernier groupe (groupe PBS) a reçu 10 injections successives d'un volume équivalent de PBS, à intervalle d'une semaine, par ! a même voie. Les doses de LPS utilisées sont considérées comme non hépato-toxiques (Ishika\\a et aL Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol., 1990, 69, 111-114). La réponse immunitaire des souris apoE0 a été comparée à celle de deux groupes de souris C57BL/6 de type sauvage (5 animaux par groupe) ; le premier ID 1 Z--c groupe ayant reçu une seule injection de LPS et le second une seule injection de PBS, dans les conditions précédentes. 24 h après le traitement, un prélèvement de sang a été effectué sur les souris dans les conditions suivantes : la nourriture a été retirée des cages à 9 h le c matin. et 8 h plus tard. un échantillon de sang a été prélevé dans le sinus rétro-orbital, sous anesthésie à l'isot1uorane. A la fin de l'expérimentation, les animaux ont été sacrifiés par exsanguination par ponction cardiaque. puis du PBS a été perfusé par voie trans-cardiaque et le coeur. le foie. la rate et le thymus ont été prélevés. 2) Dosage des lipides plasmatiques La concentration plasmatique de cholestérol et de triglycérides est déterminée par une technique enzymatique à l'aide d'un kit commercial 1 (BOEHRINGER MANNHEIM). selon les instructions du fabricant. analyse des lésions aortiques Dans les modèles murins d'étude de l'athérosclérose, il a été montré qu'il existe une corrélation élevée entre le degré d'athérosclérose au niveau de la racine aortique et au niveau de la totalité de l'arbre aortique (Tangirala et al., J. Lipid Res.. 1995. 36. 2320-2328). Par conséquent. les lésions aortiques des souris ont été analysées au niveau de la racine aortique. selon la méthode décrite dans Paigen et al., Atherosclerosis. 1987. 68. 231-240. De manière plus précise, les coeurs et les aortes proximales ont été prélevées et fixées. Les coeurs ont été coupés directement. parallèlement à la partie saillante mince de la valve aortique, et les portions supérieures ont été incluses dans t'OCT (TISSUE-TEK) (mélange de glycols solubles dans l'eau et de résines) et congelées. Des coupes de 10 0, uM ont été réalisées au travers du sinus aortique. Pour chaque animât. 28 coupes ont été colorées avec du Oilred O pour mettre en évidence les lipides, puis elles ont été contre-colorées à l'hématoxyline. Les zones de dépôts lipidiques des coupes transversales ont été analysées par planimétrie à l'aide d'un programme d'ordinateur. L'analyse statistique a été réalisée sur 5 lésions distinctes de chaque animal, séparées de 120 uM. La première coupe analysée chez chaque animal correspond à l'origine du sinus aortique. Les coupes intermédiaires ont été utilisées pour l'analyse immunohistochimique. 4) Mise en évidence des anticorps anti-LDL oxvdées. Les LDL humaines sont isolées selon le protocole décrit dans Pang et al.. J ; Clin. Invest.. 1996. 97. 2204-2212. Les LDL humaines oxydées (oxLDL) sont préparées en incubant les LDL humaines (1 mg/ml) avec 5 u'nol/L de CuS04, dans du c PBS, une nuit à 37OC. Avant chaque test. des plaques de microtitration à 96 puits sont fraîchement recouvertes. toute la nuit à 4 C. avec 100 ni de LDL oxydées (5 lg/ml dans PBS). Les puits sont bloqués 2 h à température ambiante. avec 1 % de BSA dans du PBS. Deux échantillons de 100 nul de sérum de chaque groupe de souris tel que ZD défini à l'exemple 1. 1. dilués au 1/40 dans du PBS. sont ajoutés dans des puits et les plaques sont incubées 2 h à température ambiante. Après 3 lavages dans du PBS contenant 0. 1 % de T\\een 20, un anticorps de chèvre anti-IgM. IgGI. IgG2a, IgG2b. IgG3 et IgA de souris, conjugué à la phosphatase alcaline (BECKMAN-COULTER). dilué au 1/1000 est ajouté dans chaque puits et les plaques sont incubées 2 h à température ambiante. Après un lavage des plaques dans du PBS contenant 0. 1 % de Tween 20, du substrat p-nitrophényl phosphate est ajouté dans chaque puits et l'activité phosphatase alcaline est déterminée par mesure de la densité optique à 405 nm. 5) Préparation des cellules Les cellules du sang périphérique, de la rate et du thymus de chaque animal sacrifié. comme décrit à l'exemple 1. 1. sont isolées par centrifugation de densité et lavées 3 fois dans du PBS. Les lymphocytes hépatiques sont isolés selon la méthode décrite dans Osman et al., Eur. J. Immunol.. 2000. 30, 1919-1928. De manière plus précise, le foie est prélevé, coupé en deux. puis un des morceaux est passé au travers d'un filtre en métal de 200 gauge. Les cellules ainsi obtenues sont mises en suspension dans du milieu RPMI contenant 5 % de sérum de veau foetal (FCS) inactivé, puis elles sont lavées dans le même milieu et les lymphocytes sont isolés par centrifugation dans un gradient de Percoll (35 % de Percoll contenant 100 UI/ml d'héparine, SIGMA). Les lymphocytes purifiés sont lavés trois fois avant d'être mis en culture. 6) Analyse des cytokines par cvtométrie de flux Les cellules purifiées comme décrit à l'exemple 1. 5, sont incubées toute la nuit à 37 C. en présence de 5 % de CO2 et de bréfeldine A (2/-1g/ml. SIGMA). c Après le traitement, les cellules sont récoltées et incubées 30 min à 25 C. en présence d'anticorps monoclonaux conjugués à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC). à la phycoérythrine (PE). au Chrome-Cy (CyC) ou au PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein), dirigés respectivement contre les molécules CD4, CD8. CD3 et NK 1. 1 (PHARMINGEN). Puis. les cellules sont lavées deux fois avec du PBS et incubées 15 min à 25 C. dans 200 pLI de solution de fixation (2 % paraformaldéhyde dans du PBS). Après la fixation, les cellules sont lavées 2 fois avec du PBS. incubées 10 min dans une solution de perméabilisation (0. 005 % Saponine (SIGMA). 0, 5 % FCS dans PBS) * fuL, et centrifugées pendant 5 min à 400 (Après la centrifugation. le surnageant est éliminé et les cellules sont incubées 30 min à 20 C. avec 25 pu d'anticorps anti-IFN-y. anti-TNF-o. ou anti-IL-4 (PHARMI1'JGEN), dilué dans le tampon de perméabilisation. Après le marquage. les cellules sont lavées deux fois avec du PBS puis remises en suspension dans 500 ni de PBS. pour l'analyse en cytométrie de flux. Le témoin positif de la production de cytokines est constitué par des cellules issues de souris traitées avec du LPS comme décrit à l'exemple 1. 1 ou non traitées. stimulées avec un iiiélan,-, e de PMA (Phoi-bol 4celcite. 10 n (y/ml) et d'ionomycine (500 ng/ml) puis incubées une nuit en présence de bréfeldine A (2 Lg/ml). Le témoin négatif est constitué par des cellules issues de souris nonc traitées avec du LPS comme décrit à l'exemple 1. 1. incubées en présence d'anticorps non-relevants de même isotype ; dans ces conditions moins de 0.03 % des cellules sont fluorescentes. L'acquisition des données est réalisée dans différentes fenêtres de taille et de granulométrie. sur au moins 25000 lymphocytes vivants, de façon à tai Zr déterminer les proportions des différentes cellules positives. 7) Analvse immunohistochimique L'analyse immunohistochimique est réalisée sur les coupes de sinus aortiques. Les coupes de tissus sont pré-traitées à l'acétone et incubées 45 min à 37 C ; en présence de 2 % de gélatine. dans une enceinte humidifiée. Les coupes sont ensuite c rincées avec 0. 1 % de Triton X-100 dans PBS. incubées avec un anticorps approprié, puis rincées trois fois avec le même tampon. Tous les anticorps sont utilisés à des dilutions optimales. préalablement déterminées sur des coupes de rate. Pour détecter respectivement du TNF-ci.. des cellules NK ou NK-T. des lymphocytes B et T et les cellules NK activées. des IgM et des Egg. les anticorps suivants ont été utilisés aux c dilutions indiquées : anti-TNF-a (BD PHARMINGEN. 1/50). anti-NKM (BD PHARMINGEN. 1/30). anti-CD69 (BD PHARMINGEN. 1/30). anti-IgM de souris (SIGMA. 1/200) et anti-IgG de souris (SIGMA. 1/800). Le témoin négatif est effectué à l'aide d'un anticorps monoclonal non-relevant de même isotype. 8) Analvse statistique Les résultats sont exprimés par la moyenne r erreur standard à la moyenne (s. e. m.). Les analyses statistiques sont effectuées à l'aide du test ANOVA. Les différences sont considérées significatives si P EXEMPLE 2 : Effet de l'administration répétée de LPS sur la taille des lésions d'athérosclérose et le métabolisme lipidique, chez les souris apoEo. Des souris apoEo ont été traitées par du LPS comme décrit à l'exemple 1. 1. puis les lésions d'athérosclérose aortiques et les lipides plasmatiques ont été analysés dans les conditions décrites aux exemples 1. 2 et 1. 3. Les résultats observés sont les suivants : - à l'âge de 20 semaines, les souris apoEo présentent des plaques fibro-lipidiques au niveau de l'aorte. constituées par un noyau riche en lipide. entouré d'une enveloppe fibreuse. - chez les souris traitées une fois par le LPS (groupe LPS 1), on c observe des lésions de 174. 900 73. ! 00 jm'. équivalentes à celles des souris apoEo non-traitées (groupe PBS. ! 20, 300 22. 600). mr), - en revanche, chez les souris traitées plusieurs fois par du LPS. on 2 observe des lésions de 219. 1002 : 22. 600 lm2. correspondant à une augmentation de z : l 83 % (P Ces résultats indiquent que les injections répétées de LPS favorisent l'athérogénèse. c La concentration de lipides plasmatiques chez les souris apoEo traitées par le LPS. ou non-traitées. exprimée par la moyenne =t s. e. m.. est présentée dans le Tableau 1 ci-dessous : Tableau 1 Souris Cholesterol Triglycerides (mg/dL) (mg/dL) LPS 319 ~ 12 89 ~ 10 # LPS1 403=52 143 46 PBS 39653 396=53 r En revanche, aucune différence significative n'est observée entre les souris apoEo traitées une seule fois par le LPS (groupe LPS 1) et les souris témoins non-traitées (groupe PBS). 1 EXEMPLE 3 : Effet de l'administration répétée de LPS sur la réponse en autoanticorps anti-LDL oxydées chez les souris apoEo. Des souris apoEo ont été traitées par du LPS comme décrit à l'exemple 1. L puis les auto-anticorps plasmatiques anti-LDL oxydées ont été titrés comme décrit à l'exemple 1.4. Les résultats présentés à la figure L montrent que le titre des autoc anticorps anti-LDL oxydées plasmatiques est augmenté de façon significative chez les souris apoEo traitées de façon répétée par le LPS. par rapport aux souris apoEo non- traitées ; cette augmentation concerne les IgM. les différents isotypes d'IgG et les IgA. Chez les souris apoEo traitées une seule fois par le LPS. on observe également une augmentation significative mais néanmoins plus faible du titre de ces mêmes auto-anticorps plasmatiques. Ces résultats indiquent. soit l'implication de lymphocytes T auxiliaires dans l'activation des lymphocytes B spécifiques des LDL oxydées. soit l'activation polyclonale de lymphocytes B, induite par le LPS. EXEMPLE 4 : Analyse er-vivo des cytokines produites par des populations de lymphocytes du sang, du foie, de la rate ou du thymus des souris apoEo traitées n par le LPS ou non-traitées. 1) Lymphocytes du sang périphérique (figure 2) Afin d'identifier des lymphocytes pouvant être impliqués dans la réponse en auto-anticorps anti-LDL oxydées. observée chez les souris apoEo traitées de façon répétée par le LPS. des triples marquages des cellules du sang périphérique ont été réalisés à l'aide des combinaisons suivantes de marqueurs : CD3/NK 1. 1/IL-4 ; CD3/CD4/IFN-y et CD3/CD8/TNF-a. dans les conditions décrites à l'exemple 1. 6. Dans le groupe de souris traitées de façon répétée par le LPS (groupe LPS). les proportions de lymphocytes CD4. CD8 et NK 1. 1 sont c 1 respectivement de (moyenne, intervalle) : 35,2 (27-43) %, 23 (16-25.5) % et 5. 7 (2. 9- 8. 1) %. Chez les souris témoins non-traitées (groupe PBS) les valeurs correspondantes sont respectivement de 35. 2 (27-43) % pour les CD4. 23 (16-25. 5) % pour les CD8 et 3,3 (0.9-3,3) % pour les NKI. I. Les pourcentages de lymphocytes producteurs de cytokines chez les souris apoEo traitées de façon répétée ou non-répétée par le LPS (groupes LPS et c LPSI). par rapport aux souris apoEo non-traitées (groupe PBS) sont présentés dans le Tableau II ci-dessous : Tableau Il Souris CD3+NK 1.1+IL-4+ CD3+NK1.1+IFN&gamma;+ CD3+NK1.1+TNF&alpha;+ LPS 62 ~ 3,1 23 ~ 3,2 33 ~ 2, 8 LPS1 32 3 8 2. 2 62, 5 PBS 15 ~ 2,5 6 ~ 2 6 ~ 1, 6 Les cytokines produites par ces différentes populations de lymphocytes sont présentées à la figure 2. Les résultats observés sont les suivants : - d'une manière générale (figures 2A. B et C et Tableau II). on observe une augmentation du nombre de lymphocytes producteurs de cytokines chez 1 1 les souris du groupe LPS. par rapport aux souris apoEo non-traitées (groupe PBS) ou zz, aux souris C57BL/6 traitées par du LPS. - la figure 2A montre une augmentation importante des cellules productrices d'IL-4 au cours du temps. chez les souris du groupe LPS. Cette c augmentation est également observée, dans une moindre mesure, dans le groupe de souris LPS 1 et le groupe de souris PBS. Dans le groupe de souris LPS, la majorité des cellules productrices d'IL-4 sont des cellules CD')'et NKI. I+. En revanche, la proportion de cellules CDC'-et NKI. I+ productrices d'IFN-y est comparable dans les groupes de souris LPS et PBS. - ! es figures 28 et 2C montrent une augmentation. chez les souris du groupe LPS. du nombre de cellules produisant respectivement de l'IFN-y et du TNF-a. Le phénotype de ces cellules est le suivant : CD3CD4*IFN-'/ (figure 2B). CD3"CD8TNF-a (Figure 2C) et CD3+CD8"IFN-f. - des cellules productrices d'IL-6 ou d'IL-10 n'ont été détectées dans aucun des groupes de souris. 2) lymphocytes du foie. de la rate et du tln mus (figure 3) Le profil des cytokines produites par les lymphocytes du foie. de la rate et du thymus est comparable à celui observé dans les lymphocytes du sang périphérique. De manière générale. on observe une augmentation plus importante Zr, c des cellules productrices de cytokines chez les souris apoEo traitées par le LPS, par rapport aux souris témoins (souris apoEo non-traitées (groupe PBS) et souris C57BL/6 traitées par le LPS). Comme dans le sang périphérique. l'augmentation la plus z, c importante concerne les cellules CD3+NKI. I- produisant de l'IL-4 (figure 3A). tD Cependant, des cellules productrices d'IFN-y et de TNF-a sont également détectées dans tous les tissus testés et leur phénotype respectivement C03+CO-1-+ (Figure 3B) et CD') +CD8+, correspond à celui observé dans le sang. L'ensemble de ces résultats démontre une augmentation de la z : l production de cytokines pro-inftammatoires et de'la réponse cellulaire T dépendante suite à l'injection de LPS chez les souris apoEo susceptibles à l'athérosclérose. l'augmentation la plus importante concernant les cellules CD)-NKI. I+ produisant de l'IL-4. EXEMPLE 5 : Analyse de la production de cytokines, dépendante des lymphocytes T, dans les lésions d'athérosclérose. La production de cytokines. dépendante des lymphocytes T. dans les 1 1 lésions d'athérosclérose. a été analysée dans les conditions décrites à l'exemple 1.7. Les résultats sont illustrés par les figures 4 et 5. La figure 4 montre une augmentation des cellules NK 1. 1 + (figure 4A) et une augmentation de la production d'IL-4 (figure 4B) dans les lésions d'athérosclérose des souris apoEo traitées par le LPS. par comparaison avec les souris apoEo non-traitées (groupe PBS). La figure 4C montre que les deux anticorps colocalisent. indiquant que les cellules NK 1. 1 sont les cellules majoritairement impliquées dans la production d'IL-4. La figure 4D montre également que les lymphocytes producteurs de TNF-a sont plus abondants dans les lésions des souris du groupe LPS. En revanche les cellules CD4+ productrices d'IFN-y sont plus abondantes dans les lésions d'athérosclérose des souris apoEo non-traitées (groupe PBS). c L'expression du CD69. un marqueur d'une activation lymphocytaire récente a été analysée sur les coupes de sinus aortiques des souris traitées de façon répétée par le LPS (groupe LPS) et des souris non-traitées (groupe PBS). La figure 5A montre que les athéromes des souris du groupe LPS présentent une accumulation de c lymphocytes T activés au niveau de l'intima, qui n'est pas détectée chez les souris nontraitées (groupe PBS). La figure 5A montre également que l'adventice des souris apoEo traitées de façon répétée par le LPS. présente également une accumulation de lymphocytes T exprimant le marqueur C069. Les figures 5B et 5C montrent que les souris du groupe LPS présentent également une accumulation d'une quantité importante IgG et d'IgM. au niveau de l'intima et de l'adventice. Dans l'adventice, ces ZD immunoglobulines se présentent sous forme d'agrégats ressemblant à des structures de 1't, c follicules lymphoïdes. indiquant une réponse humorale tardive. Les titres élevés en auto anticorps anti-LDL oxydées. détectés dans le sérum des souris du groupe LPS. c pourraient être impliqués dans le développement de lésions d'athérosclérose plus avancées dans ce groupe de souris. Ainsi que cela ressort de ce qui précède. l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite : elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée. de la présente invention. REVENDICATIONS 1 ) Procédé de criblage de molécules aptes à prévenir et/ou à traiter l'athérosclérose chez l'homme, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement : - la mesure ex vivolin vitro de l'effet de la molécule à tester sur l'activité de cellules NKT CD3NK1. 1 produisant de l'IL-4, à partir d'un échantillon biologique contenant lesdites cellules, et - la sélection des molécules aptes à inhiber ladite activité. 2 ) Procédé de criblage selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites cellules NKT CD3+NK1. 1+ produisant de l'IL-4 sont issues de souris homozygotes déficientes en ApoE. 0 3 ) Procédé de criblage selon la revendication 2, caractérisé en ce que lesdites souris homozygotes déficientes en ApoE ont été préalablement traitées par des administrations répétées de lipopolysaccharides de la paroi de bactéries Gramnégatives. 4 ) Procédé de criblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite mesure est réalisée par l'analyse comparative en cytométrie de flux, de la proportion de cellules triplement marquées, à l'aide d'anticorps respectivement anti-CD3,-NK1. 1, et-IL-4, couplés à des fluorochromes différents. 5 ) Procédé de criblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : al) induction d'une lésion d'athérosclérose chez des souris homozygotes déficientes en ApoE, par administration répétée de LPS, bl) mesure de l'effet d'une molécule à tester sur l'activité de cellules NKT CD3K1. 1+ produisant de l'IL-4 par analyse comparée, par tout moyen approprié, à partir d'un échantillon biologique desdites souris, de la proportion de cellules CD3+NK1. l + produisant de l'IL-4, avant et après la mise en contact avec ladite molécule à tester, et cl) sélection des molécules aptes à inhiber ladite activité. 6 ) Procédé de criblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : a2) mise en culture de lymphocytes, et éventuellement stimulation desdits lymphocytes en présence d'une substance appropriée, b2) mise en contact desdits lymphocytes avec une molécule à tester, ci) mesure de l'effet de ladite molécule à tester sur l'activité de cellules NKT CD3+NK1.1+ produisant de l'IL-4, par analyse comparée, par tout moyen approprié, de la proportion de cellules CD3+NK1. 1+ produisant de l'IL-4, en l'absence et en présence de ladite molécule à tester, et d2) sélection des molécules aptes à inhiber ladite activité.