Brevet FR2841564A1 — publié le 20040102

ACIDE NUCLEIQUE ISOLE DU 5'NTR DU GENE FGF-1 HUMAIN PRESENTANT UNE ACTIVITE IRES L'invention concerne un acide nucléique isolé présentant une activité IRES (internai ribosome entry site), ladite séquence nucléotidique provenant de l'extrémité 5' non traduite (5'NTR) du gène FGF-1 humain. L'invention a également pour objet une cassette d'expression d'au moins une molécule d'intérêt dans une cellule eucaryote, ladite cassette comprenant l'IRES de FGF-1 et permettant @rimer plusieurs molécules à partir d'un même ARNm. La cassette peut être introduite directement ou sous forme de vecteur dans une cellules hôte de sorte que les vecteurs recombinants et les cellules hôte transfectées par ledit vecteur ou la cassette font également partie de l' invention. La régulation de l'expression génique intervient à plusieurs niveaux, la transcription, la maturation, la stabilité de l'ARNm mais aussi la traduction. La traduction d'un ARNm est sujette à des régulations strictes et se révèle une étape clef dans la régulation de l'expression génique. Par exemple, une augmentation de la traduction du proto-oncogène c-myc est associée au syndrome de Bloom (20). Ce contrôle traductionnel aberrant pourrait contribuer au risque accru que courent ces patients de développer des cancers. Les régulations au niveau de la traduction mettent en jeu de nombreuses protéines et s 'exercent principalement via les régions 5' et 3' non traduites (NTR) sans exclure, cependant, certain éléments structuraux de la partie codante des ARNm. L'étape d'initiation de la traduction est, elle aussi, soumise à des régulations. L'initiation classique de la traduction se fait par reconnaissance de la coiffe (ou CAP) situé à l'extrémité 5' du transcrit. Cette structure permet la fixation des facteurs d'initiation de la traduction. Dans cette étape, c'est le complexe eIF4F qui joue le rôle d'adaptateur entre la coiffe et la petite sous-unité du ribosome 40S. Ce complexe est constitué de trois facteurs, respectivement eIF4E ( Cap binding protein ), eIF4A (une hélicase à ARN ) et eIF4G qui joue un rôle de pont, entre les autres facteurs d'initiation de la traduction, l'ARNm et la petite sous unité 40S. Cette dernière, une fois recrutée, va scanner l'ARNm jusqu'à rencontrer un codon d'initiation de la traduction (canonique ou non). Après quoi, il y aura association de la sous-unité 60S avec la 40S et début de la traduction du cadre de lecture jusqu'à un codon stop, ou le ribosome se dissocie. Certains ARNm messagers sont dépourvus de coiffe et ne peuvent donc pas être traduits par le mécanisme décrit par Marylin Kozak. C'est le cas des ARN picornaviraux (14), où l'on a mis en évidence un autre système d'initiation de la traduction, mettant enjeu un site d'entrée interne des ribosomes ou IRES au niveau de la région 5' non traduite (5'NTR). Ce site permet aux ribosomes de se lier directement à l'intérieur de l'ARNm, et cela par un mécanisme encore mal compris. Depuis des IRES ont été identifiées dans l'ARN d'autres groupes de virus comme les flavivirus , les pestivirus, les tobamovirus et les rétrovirus (19). L'implication de protéines cellulaires pour la traduction de ces ARN viraux, a motivé la recherche de ce mécanisme d'entrée interne au niveau de transcrits d'origine cellulaire. En 1991, un tel site a été caractérisé dans l'ARNm de la BIP (Immunoglobulin heavy-chain binding protein) (8) et plus récemment dans celui du facteur de croissance fibroblastique FGF-2 (18), du proto-oncogène c-myc (12), du facteur de croissance PDGF pour Platelet Derived Growth Factor (2) et du VEGF Vascular Endothelial Growth Factor (6). L'ARNm du FGF-2 est pourvu d'un long 5'NTR d'environ 500 nucléotides dans lequel ont été mis en évidence des initiations alternatives de la traduction au niveau de codons non canoniques CUG (1), ce qui aboutit à la formation de cinq isoformes du FGF-2. On a également localisé un site d'entrée interne des ribosomes situé entre les nucléotides 154 et 318 (données non publiées). L'ARNm du VEGF est lui aussi pourvu d'une longue séquence non traduite dans la quelle a été mis en évidence, très récemment, la présence d'une initiation alternative au niveau d'un codon non canonique CUG. Dans ce 5'NTR, la présence de deux IRES a été démontrée, l'un est situé en amont du CUG et l'autre précède le codon d'initiation classique AUG (6). Étonnamment, ces deux facteurs de croissance ont leur croissance contrôlée au niveau traductionnel par des IRES, qui ont une activité dans l'angiogénèse. Ces deux facteurs sont induits lors du processus de néovascularisation d'une tumeur en développement. Il existe un troisième facteur angiogénique majeur, le FGF-1 dont la traduction de l'ARNm n'a pas été étudiée à ce jour. Or, les Demandeurs ont découvert que l'initiation de la traduction de l'ARNm de FGF- 1 mettait en jeu un site d'entrée interne situé dans la région 5' non traduite. En outre, ils ont constaté que le transcrit A de FGF-1 en particulier, présentait de manière inattendue une activité IRES in vivo (muscle de souris) meilleure que les autres IRES d'ARN cellulaires testés jusqu'ici. La structure génomique (11) du FGF-1 comporte 3 exons contenant la séquence codante (fig. n 1). Ces derniers subissent un épissage qui aboutit à la formation d'un cadre de lecture unique. L'exon 3 contient l'extrémité 3'NTR qui est pourvu d'un site de polyadénylation. Il existe quatre promoteurs différents pour le gène humain du FGF-1, qui une fois activés, aboutissent à la formation de quatre transcrits primaires différents. Suite à la maturation, la seule différence entre ces quatre transcrits se situe au niveau de leur 5'NTR respectif (fig. n 2). L'exon 1 est pourvu d'un site accepteur d'épissage où vient se lier un des 4 exons non codant (A, B, C, D) suite à l'activation de leur promoteur respectif . Les transcrits A et B sont les transcrits majoritaires qui sont principalement exprimés au niveau du cerveau, du rein et de la rétine (fig. n 2). Ces deux transcrits ont respectivement des 5'NTR de 435 et 147 nucléotides. Les transcrits C et D sont des transcrits mineurs exprimés très faiblement in vivo (11). Néanmoins, ils sont présents dans des lignées dérivées de glioblastome et peuvent être induits dans des fibroblastes ou des cellules musculaires lisses d'origine vasculaire lorsqu'elles sont soumises à une privation au sérum ou un traitement au PMA (phorbol 12-myristate 13-acétate). Ces deux transcrits ont respectivement des 5'NTR de 149 et 92 nucléotides. L'existence de ces quatre variants d'ARNm codant pour le FGF-1 est commune à l'homme, la souris (9), le b#uf (16). La comparaison des séquences de ces 5' NTR humain a montré un bonne homologie avec ceux du b#uf et de la souris (9). En effet, l'alignement des séquences des 5'NTR du FGF-1 de ces divers organismes (9,11,16) a montré une bonne conservation de ces séquences non codantes, avec près de 70% de similitude pour le 5'NTR A. Une telle conservation dans les séquences de zones non traduites permet d'envisager une fonction importante de ces 5'NTR, régions habituellement soumises à une pression de sélection relativement faible et donc à une évolution rapide. L'activité IRES des 5'NTR de chacun des transcrits A, B, C et D du FGF-1 humain et murin est démontrée dans la suite de la description (exemple 1 Bl). Pour l'essentiel, la présence d'IRES est recherchée en transfectant des cellules Cos-7 avec des vecteurs CAT-I-NuCAT, contenant les 5'NTR du FGF-1 puis en soumettant les cellules transfectées à un western-blot. L'expression de la protéine NuCAT est observée en présence des transcrits A, B, C et D et témoigne de l'activité IRES de ces 4 transcrits (analyse qualitative). Du fait de la forte homologie des séquences des 5' NTR humain avec ceux du b#uf et en particulier de la souris (9), on en déduit la présence de sites IRES également dans le FGF-1 murin et bovin. L'activité IRES in vitro des 5'NTR de chacun des transcrits du FGF-1 humain est également étudiée en fonction du type et de l'état cellulaire (analyse quantitative) (exemple 1B1). Pour ce faire, l'activité IRES est mesurée au moyen de vecteurs bicistroniques codant pour des gènes rapporteurs (en pratique les gènes LucF/LucR) dans différentes lignées. Le calcul du rapport LucF/LucR informe sur la capacité d'entrée interne de la séquence 5' NTR et définit l'activité IRES de cette séquence. Parmi les différents résultats, on observe une très bonne activité IRES du transcrit A dans les cellules Hela et Sk-Hep-1 plus importante que celle de l'IRES du FGF-2. Les Demandeurs ont par ailleurs comparé, in vitro, sur des cellules humaines, l'activité IRES de la structure des 5'NTR humains (transcrits A et B) à celle des 5' NTR murins (exemple 1 B2). Les transfections ont été réalisées dans les cellules Cos-7, SK-Hep-1 et Saos-2, pour effectuer une comparaison directe avec les séquences humaines. Les expériences ont montré que les profils d'activité IRES des variants A et B humain et murin étaient similaires. L'invention consiste non seulement à avoir démontré pour la première fois l'activité IRES des 5'NTR du FGF-1, mais également, comme il sera démontré par la suite, à avoir caractérisé les sites IRES dans les différents transcrits A, B, C et D du FGF-1 humain (Exemple 2). Plus particulièrement, le Demandeur a réussi à identifier la plus petite séquence de chacun des transcrits A, B, C, D ayant une activité IRES, tant in vitro que in vivo. Pour ce faire, différentes séquences nucléotidiques continues issues de l'ARN messager de FGF-1 ont été sous clonées dans un vecteur bicistronique codant pour des gènes rapporteurs luciférase. Différentes lignées cellulaires de mammifères et humaines (in vitro) ont été transfectées ainsi que le muscle de souris (in vivo) a été transduit par ces vecteurs. L'activité IRES du FGF-1 humain et par homologie, du FGF-1 murin, est donc divulguée pour la première fois dans la présente demande. Cette activité a été démontrée pour chaque transcrit A, B, C, D de même que pour certains fragments des 5'NTR de ces transcrits. Dans la suite de la description et dans les revendications, par l'expression séquence homologue on désigne une séquence identique à au moins 60%, avantageusement 95% à une séquence donnée, l'homologie résultant dans ce cas de la variabilité d'une espèce à une autre, en particulier de la souris à l'homme. Dès lors, l'invention concerne tout d'abord un acide nucléique isolé présentant une activité IRES qui se caractérise en ce qu'il contient une séquence identique ou homologue à la séquence SEQ ID 1 située entre les nucléotides 1 et 435 du 5'NTR du transcrit A de l'ARNm du FGF-1 humain et dénommé ci-après A. Cette séquence correspond à la totalité de la séquence du 5'NTR du transcrit A. Comme déjà dit, le Demandeur a réussi en outre à identifier, sur le transcrit A, des séquences nucléotidiques de taille inférieure à la séquence SEQ ID 1, présentant une activité IRES, ce qui suggère donc que le site IRES serait compris dans ces séquences. Ainsi, l'invention a également pour objet : - un acide nucléique isolé présentant une activité IRES comprenant une séquence identique à la séquence SEQ ID 2, située entre les nucléotides 1 et 399 de la séquence SEQ ID 1 et dénommé ci-après A2, - un acide nucléique isolé présentant une activité IRES comprenant une séquence identique ou homologue à la séquence SEQ ID 3, située entre les nucléotides 38 et 435 de la séquence SEQ ID 1 et dénommé ci-après A3, - un acide nucléique isolé présentant une activité IRES comprenant une séquence identique ou homologue à la séquence SEQ ID 4, située entre les nucléotides 122 et 399 de la séquence SEQ ID 1 et dénommé ci-après A6, - un acide nucléique isolé présentant une activité IRES comprenant une séquence identique ou homologue à la séquence SEQ ID 5, située entre les nucléotides 215 et 399 de la séquence SEQ ID 1 et dénommé ci-après A7, - un acide nucléique isolé présentant une activité IRES comprenant une séquence identique ou homologue à la séquence SEQ ID 6, située entre les nucléotides 270 et 399 de la séquence SEQ ID 1 et dénommé ci-après A9. Ce dernier acide nucléique constitue le plus petit fragment du transcrit A du FGF-1 humain présentant une activité IRES. Pour une séquence de taille inférieure, de l'ordre de 100 nucléotides, on n'obtient pas une activité IRES significative, du moins dans des cellules d'adénocarcinome humain. Comme déjà dit, le Demandeur a démontré que l'extrémité 5' NTR du transcrit B du FGF-1 humain présentait une activité IRES importante, en particulier dans les myoblastes. En conséquence, l'invention concerne également un acide nucléique isolé présentant une activité IRES qui se caractérise en ce qu'il contient une séquence identique ou homologue à la séquence SEQ ID 7 située entre les nucléotides 1 et 147 du 5'NTR du transcrit B de l'ARNm du FGF-1 humain et dénommé ci-après B. En d'autres termes, la séquence SEQ ID 7 correspond à la totalité de la séquence du 5'NTR du transcrit B, le Demandeur ayant démontré que la délétion des nucléotides 111 à 147 inactivait complètement l'IRES. On peut donc considérer que la totalité de la séquence est nécessaire pour une activité IRES satisfaisante, tout au moins sur des cellules d'adénocarcinome humain (voir exemple 2). Le Demandeur a également démontré que l'extrémité 5' NTR du transcrit C du FGF-1 humain et un de ses sous fragments présentait une activité IRES importante. En conséquence l'invention a également pour objet un acide nucléique isolé présentant une activité IRES qui se caractérise en ce qu'il contient une séquence identique ou homologue à la séquence SEQ ID 8 située entre les nucléotides 1 et 149 du 5'NTR du transcrit C de l'ARNm du FGF-1 humain et dénommé ci-après C. Cette séquence correspond à la totalité de la séquence du 5'NTR du transcrit C. Le site IRES ayant été identifié par le Demandeur entre les nucléotides 1 et 113 de la séquence SEQ ID 8, l'invention concerne également un acide nucléique isolé présentant une activité IRES qui se caractérise en ce qu'il contient une séquence identique ou homologue à la séquence SEQ ID 9 située entre les nucléotides 1 et 113 de la séquence SEQ ID 8 et qui correspond à la séquence la plus petite présentant une activité IRES, du moins dans les cellules d'adénocarcinome humain. Par ailleurs, le Demandeur a démontré que l'extrémité 5' NTR du transcrit D du FGF- 1 humain présentait une activité IRES significative, en particulier sur les myoblastes. En conséquence, l'invention concerne également un acide nucléique isolé ou recombinant présentant une activité IRES qui se caractérise en ce qu'il contient une séquence identique ou homologue à la séquence SEQ ID 10 située entre les nucléotides 1 et 92 du 5'NTR du transcrit D de l'ARNm du FGF-1 humain et dénommé ci-après D. La séquence SEQ ID 10 correspond à la totalité de la séquence du 5'NTR du transcrit D. L'activité IRES des FGF-1 humain et murin en fait des candidats potentiels à la réalisation de cassettes permettant d'exprimer un ou plusieurs gènes d'intérêt dans des cellules eucaryotes, à partir d'un même ARNm sous le contrôle d'un seul promoteur. Dans la suite de la description et dans les revendications, par l'expression gène d'intérêt , on désigne des acides nucléiques codant pour des polypeptides tels que protéines d'intérêt thérapeutique, antigènes, anti-angiogènes, pro-angiogènes, suppresseurs de tumeurs ou encore des gènes destinés à compenser une anomalie génétique du type mutation etc. Dès lors et selon un autre aspect, l'invention concerne une cassette d'expression d'au moins un gène d'intérêt dans une cellule eucaryote, ladite cassette se caractérisant en ce qu' elle contient au moins un acide nucléique tel que précédemment décrit. Comme il sera vu par la suite, les cassettes comprenant un seul gène pourront être utilisées soit pour la production de molécules d'intérêt in vitro, soit en thérapie génique. Il est également possible de créer une cassette bicistronique résultant de l'insertion de l'une des séquences d'acides nucléiques précitées entre deux gènes d'intérêt, l'expression du second gène étant coordonnée à celle de premier gène. Plus précisément, le premier gène (premier cistron) fournit le niveau de traduction capdépendante tandis que le second gène (deuxième cistron) est exprimé proportionnellement à l'activité d'entrée interne des ribosomes au niveau des différents 5'NTR du FGF-1 Ce principe peut s'étendre à la coexpression de 3,4 ou plusieurs molécules dans la mesure où celles-ci sont séparées par une séquence IRES telle que définie précédemment, conduisant à l'élaboration de cassettes multicistroniques. Bien entendu, la cassette multicistronique de l'invention comprend des IRES du FGF-1 tels qu'ils sont caractérisés dans la présente demande, associés ou non avec d'autres IRES tels que, par exemple, ceux identifiés sur la BIP (Immunoglobulin heavy-chain binding protein), le facteur de croissance fibroblastique FGF-2, le proto-oncogène c-myc, le facteur de croissance PDGF Platelet Derived Growth Factor et le VEGF Vascular Endothelial Growth Factor . Dès lors et dans un mode de réalisation particulier, la cassette d'expression contient au moins deux gènes d'intérêt séparés par un acide nucléique tel que précédemment décrit, le premier gène (premier cistron) fournissant le niveau de traduction capdépendante tandis que le second gène (deuxième cistron) est exprimé proportionnellement à l'activité du site IRES présent dans ledit acide nucléique. De manière connue, la cassette contient en outre un promoteur permettant de contrôler l'expression du ou des gènes. La principale application des cassettes d'expression multicistronique relève de la thérapie génique dans la mesure où de telles cassettes permettent d'exprimer le produit du ou des nucléotides ou les gènes qu'elles contiennent, à partir d'un même ARNm in vivo. Ces cassettes peuvent en outre permettre d'exprimer différents types de molécules d'intérêt industriel telles que récepteurs, enzymes.... La thérapie génique peut être envisagée selon deux techniques distinctes, parfaitement connues de l'homme du métier. La première technique consiste à introduire, in vivo, directement dans l'organisme hôte (humain ou animal), une composition pharmaceutique contenant la cassette nue contenue dans un ADN double brin, ladite composition pharmaceutique faisant partie de la présente invention. Dans le cas de l'utilisation de la cassette nue, celle-ci est couplée, dans la composition pharmaceutique, à tout composé capable de favoriser la pénétration de la cassette dans les cellules, en particulier le PEI et ses dérivés, les liposomes et dérivés... Les vecteurs recombinants contenus dans la composition pharmaceutique, dans lesquels sont insérés les cassettes d'expression font également partie de l'invention. Ainsi, les cassettes d'expression peuvent être insérées dans des vecteurs plasmidiques ou viraux tels que rétrovirus, lentivirus, adénovirus et AAV. La seconde technique de thérapie génique consiste à prélever une cellule de l'organisme hôte, puis in vitro, à introduire la cassette nue ou insérée dans un vecteur dans la cellule, la cellule modifiée étant ensuite réintroduite dans l'organisme hôte. De la sorte, le produit de la cassette peut être exprimé dans le corps du patient. Comme déjà dit, lorsque la cassette d'expression ne contient qu'une molécule d'intérêt, on peut utiliser cette cassette pour la production in vitro de ladite molécule à partir de cultures cellulaires. De même que précédemment, la cassette peut se présenter sous forme nue ou insérée dans un vecteur. La cassette ou le vecteur sont alors introduits dans une cellule hôte par technique de transfection, bien connue de l'homme du métier. De telles techniques peuvent être par exemple des techniques physiques (électroporation), des techniques chimiques, vecteurs synthétiques, précipitation au phosphate de calcium ou encore d'autres méthodes telles que la fusion de cellules, conjugaison, etc. En conséquence, l'invention concerne également une cellule hôte recombinante, qui se caractérise en ce qu'elle comprend la cassette d'expression ou un vecteur recombinant tel que précédemment, décrit Les cellules hôte recombinantes de l'invention sont en particulier, mais de façon non limitative : 911 cellules de rétinoblaste embryonnaire humain, pas de n ATCC lignée de Génétt C2/7 cellules de myoblaste murin ; de n ATCC lignée de Généth CHQ5B cellules de myoblaste embryonnaire humain C2C12 Lignée issue de myoblaste murin 91031101 Cos-7 CV-1 transformées par l'antigène T du virus SV-40 CRL-1654 Hela Cellules épithéliales de carcinome utérin humain CCL-2 L929 Tissus connectif de souris immunodéprimé CCL-1 NIH-3T3 Cellules fibroblatiques embryonnaires murines CRL1658 Saos-2 Cellules épithéliales d'ostéosarcome humain (p53 -/-). HTB-85 SK-Hep-1 Adénocarcinome de foie humain. HTB-52 SK-N-AS Cellules de neuroblastome humain 94092302 SK-N-BE Cellules de neuroblastome humain 95011815 En pratique la production du peptide est obtenue par transfection, in vitro, de la cellule hôte mise en culture par la cassette nue ou insérée dans un vecteur. L'analyse de l'expression du peptide est réalisée à partir d'extraits cellulaires préparés à partir des cellules transfectées. En fonction de la nature de peptide d'intérêt, son niveau d'expression sera analysé par différentes techniques de détection (dosage enzymatique, détection imunologique...). Dans un but d'utilisation industrielle des molécules d'intérêts, celles-ci pourront être purifiées. Pour d'autres utilisations, les cellules génétiquement modifiées par la cassette d'expression seront utilisées pour produire les molécules d'intérêt (thérapie génique ex vivo, criblages pharmacologiques). La cassette d'expression réalisée à partir des séquences IRES faisant l'objet de la présente invention peuvent également être insérées dans les cellules (#uf) d'un animal pour créer un animal transgénique. Dès lors, l'invention concerne également un animal transgénique qui se caractérise en ce que ses cellules comprennent la cassette nue ou insérée dans un vecteur, tels que précédemment décrits. En pratique, l'animal est obtenu par introduction de la cassette ou du vecteur dans les cellules au stade embryonnaire. Ce type de technologie est parfaitement connue de l'homme du métier. L'invention ressort bien des exemples ci après, à l'appui des figures annexées. Figure 1 : le gène du facteur de croissance fibroblastique 1 : Organisation du gène humain du FGF-1. Les exons 1, 2 et 3 constituent les 3 exons codant; 1 'épissage des exons non codant -lA, 1 B, 1C,1D au niveau de l'exon 1 générera les ARNm A, B, C, D respectivement. Le point de départ de transcription du transcrit A est précédé des séquences canoniques CCAAT et TATA. Figure 2 : des 4 transcrits A, B,C,D codant pour le FGF-1 : les transcrits A et B sont majoritaires et exprimés au niveau du rein, du cerveau et de la rétine. Les transcrits C et D sont minoritaires et exprimés dans les fibroblastes et les Cellules Musculaires Lisses Vasculaires (CMLV) après induction au sérum ou au PMA. Ils sont également exprimés dans les cellules dérivés de cancer de la prostate (PC3), des poumons, ou des cellules dérivées de glioblastomes Figure 3 : Stratégie d 'étude des IRES : Principe des vecteurs bicistroniques : premier cistron de 1 'ARNm bicistronique fournit le niveau de traduction cap- dépendante, le second est exprimé proportionnellement à l'activité d 'entrée interne au niveau des 5 'NTR du FGF-1. Le calcul du rapport protéine Y/ protéine X définit l'activité IRES de la séquence situé entre les deux cistrons. Figure 4 : Western Blot consécutif des transfections des vecteurs CAT-I-NuCAT dans les cellules Cos-7 : des bandes correspondant à CAT fournit le niveau de traduction cap-dépendant. L'intensité des bandes NuCAT correspond à l'activité IRES du 5 'NTR considéré. N.T. : extrait de cellules non transfectées; FGF-2 : vecteur contenant le 5 'NTR du FGF-2. A, B, C, D, : contenant respectivement les 5 'NTR A, B, C, D du FGF-1 humain ; 1: isoformes de haut poids moléculaires issus de l'initiation alternative de la traduction dans le 5 'NTR du FGF-2 au niveau de codon d 'initiation CUG. Figure 5 : ARNm bicistroniques LucR- I-LucF et Comparaison de l'activité IRES des 5 'NTR du FGF-1 humain dans différents types cellulaires Figure 5A : Représentation schématique de l'ARNm bicistronique LucR-I-LucF. On a placé en 3 ' de LucR une structure en tige boucle pour limiter le phénomène ré- initiation non spécifique de la traduction au niveau du second cistron LucF. Figure 5B : Diagramme des activités IRES des 5 'NTR du FGF-1 humain dans différents types cellulaires. Les valeurs en ordonnée sont obtenus en calculant le rapport des activités LucF/LucR et sont exprimés en unité arbitraire. Figure 6 : du gène et des transcrits du FGF-1 murin. Figure 6 A: Structure génique du FGF-1 murin. Les exons 1, 2, et 3 constituent les 3 exons codant ; l'épissage des exons non codants -1A et -1B au niveau de 1 'exon 1 génère les ARNm A et B du FGF-1. Figure 6B : Schéma des transcrits A et B du FGF-1 murin. Les transcrits ont en commun le cadre de lecture et la zone 3 'NTR, et diffèrent par leur extrémité 5 'NTR. Figure 7 : Comparaison entre les 5 'NTR humain et murin du FGF-lFigure 7A : Alignement des séquences des 5 'NTR A du FGF-1 murin (mFGF-1) et humain (h- FGF-1). Figure 7B : des activités IRES des 5 'NTR A et B du FGF-1 humain (hFGFl) et murin (mFGFl) dans différents types cellulaires. Les valeurs en ordonnées sont obtenus en calculant le rapport des activités LucF/LucR et sont exprimés en unité arbitraire. Figure 8 Diagramme des activités IRES de différents sous fragments de 5 'NTR du FGF-1 humain dans des cellules d'adénocarcinome humain SK-Hep-1. Les valeurs en ordonnée sont obtenues en calculant le rapport des activités LucF/LucR et sont exprimés en unité arbitraire. Ont ainsi été testés 7 séquences nucléotidiques du fragment A (A, A2, A3, A6, A7, A9, Al 1), 2 séquences nucléotidiques des fragments B et C, respectivement (B, B2) et (C, C2) et la séquence nucléotidique du fragment D. Figure 9 Diagramme des activités IRES de différents sous fragments de 5 'NTR du FGF-1 humain dans des lignées 911 (rétinoblastes embryonnaires (figure 9A)) des myoblastes (figure 9B) et des myoblastes différenciés en myotubes (figure 9C). Les valeurs en ordonnée sont obtenues en calculant le rapport des activités LucF/LucR et sont exprimés en unité arbitraire. Ont ainsi été testés 5 séquences nucléotidiques du fragment A (A, A2, A6, A7, A9), la séquence nucléotidique du fragment B, y compris celle du fragment B2 pour la figure 9A, la séquence nucléotidique du fragment C, y compris celle du fragment C2 pour la figure 9A et la séquence nucléotidique du fragment D. Figure 10 : comparant l'activité IRES du transcrit A de FGF-1 humain, in vivo (injection intramusculaire chez la souris), au regard d'IRES d'EMCV, VEGF, FGF2, Bip et PDGF. Figure 11 : Diagramme comparant l'activité IRES du transcrit A de FGF-1 humain et de ses sous fragments A2, A6, A7 et A9, in vivo, au regard de l'IRES d'EMCV. Figure 12 : Diagramme comparant l'activité IRES du transcrit A de FGF-1 humain et de son sous fragments Al 1, du transcrit B de FGF-1humain et de ses sous fragments B2 et B3, du transcrit C de FGF-1 humain et de ses fragments C2 et C3, au regard de l'IRES d'EMCV EXEMPLE 1 : IRES DES 4 TRANSCRITS A, B, C ET D DE FGF-1 HUMAIN ET MURIN ex vivo A/ Matériel et méthodes Extraction d'ARNm : Les extractions d'ARN ont été réalisées, pour tous les types cellulaires, sur des boîtes de 10cm de diamètre, à confluence. Chaque boîte est lavée 2 fois avec du PBS stérile, puis traitée avec lml de la solution de lyse RNAble (Eurobio). Par la suite les ARN totaux subissent un traitement chloroforme, une précipitation isopropanol et un lavage éthanol 80%. Après séchage , ils sont repris dans 50 l d'eau et dosés à 260 nm. Reverse Transcription : Les réactions de reverse transcription ont été réalisées selon le protocole superscript II (GIBCO BRL) en utilisant, pour tous les types cellulaires, 2 g des extraits d'ARN totaux par réaction. Pour la synthèse des cDNA du FGF-1 humain, on a utilisé les amorces hexamères dégénérées. Pour les cDNA de souris, on a utilisé l'amorce 3' spécifique de FGF-1 souris. Oligonucléotides : Ils sont présentés dans le sens 5' vers 3', les sites de clonage SpeI et NcoI sont soulignés dans les amorce 3' et 5' respectivement. L'amorce 3' est commune à l'ensemble des 5'NTR d'un même organisme, du fait de son appariement au niveau de l'ATG de l'exonl. Amorce FGF-1 humain Amorce 3' : CTGCTGAGCCATGGCTGAAGGG Amorce 5' A : ACAACTAGTGGGCATACCAGTGTCAGCTGCA ; B :CTAACTAGTAGAGAGCCGGGCTACTCTGAGAA; C:ACAACTAGTCCAGGCAGTGGGGCCGGCTGGCCAGACTCTTGGGGGATT CCTTAG ; D :ACAACTAGTAGAGAGAGAGAAAAAATACT GTTGGCAGCAGCACAATG Amorce FGF-1 souris Amorce 3's : ACCACCGCTGCTTGCTGCCGAGCCATGGCTGAA Amorce 5' sA : CTCTACTAGTGTCCTTTAGTGCCAGCTAGCCTTACA sB:TCTCCAACTAGTAGAGCTGCAGAAATCCTGAGG PCR : Les PCR ont été réalisées avec la TAQ polymérase platinum (Gibco BRL) pour ses capacités à amplifier de l'ADN riche en GC et sa très bonne spécificité. On a utilisé pour chaque PCR 3 l des ADNc réalisés ci-dessus. Pour les PCR visant à amplifier les 5'NTR C et D, on a ajouté 50 ng d'un fragment de plasmide portant une partie de ces différents 5'NTR fournis par I-M Chiu (11). Les amplifications des transcrits A et B murins ont été réalisé de la même manière. Les amplifications sont réalisés selon la méthode de Touch Down PCR . Le 5'NTR A a été amplifié avec l'amorce 5' A et l'amorce 3', dans les conditions suivantes : 94 C 5 min, puis 3 cycles 94 C 30sec/76 C 2min, puis 3 cycles 94 C 30sec/74 C 2min puis 25 cycles 94 C 30sec/ 72 C 2 min, enfin 72 C 5 min. Le 5' NTR B a été amplifié dans les conditions suivantes : 94 C 5 min, puis 3 cycles 94 C 30sec/68 C 2min, puis 3cycles 94 C 30sec/66 C lmin/68 C 1min puis 25 cycles 94 C 30sec/ 64 C lmin/68 C 1min, enfin 68 C 5 min, en utilisant les amorce 3' et 5' B. De la même manière les 5'NTR C, D, et les 5'NTR A et B murins ont été amplifiés, avec leurs amorces correspondantes, dans des conditions similaires au 5'NTR B avec des températures d'hybridation de 70 C, 70 C, 68 C et 66 C respectivement. Culture cellulaire. : Leslignées cellulaires ont été obtenues à l' American Type Culture Collection (ATCC) ou l' European Collection of Cell Cultures (ECACC) et ont été cultivées selon leur instructions. Nom Origine N ATCC ou ECACC C2C12 Lignée issue de myoblaste murin 91031101 Cos-7 CV-1 transformées par l'antigène T du virus SV-40 CRL-1654 Hela Cellules épithéliales de carcinome utérin humain CCL-2 L929 Tissus connectif de souris immunodéprimé CCL-1 NIH-3T3 Cellules fibroblatiques embryonnaires murines CRL1658 Saos-2 Cellules épithéliales d'ostéosarcome humain (p53 -/-). HTB-85 SK-Hep-1 Adénocarcinome de foie humain. HTB-52 SK-N-AS Cellules de neuroblastome humain 94092302 SK-N-BE Cellules de neuroblastome humain 95011815 Construction des plasmides : L'insertion des différents 5'NTR du FGF-1 dans les vecteurs bicistroniques a été réalisée en utilisant les sites SpeI et NcoI situés dans les amorces PCR 5' et 3' respectivement. L'obtention des différents plasmides s'est faite par les techniques classiques de biologie moléculaire, à savoir : ligation, transformation, sélection des clones positifs, séquençage et préparation de solution concentrée à 1 g/ l. Transfections : L'ensemble des transfections a été réalisé avec le réactif FUGENE 6 selon le protocole fourni par Boeringher-Roche, à raison de 2.5 l par g d'ADN plasmidique. Les transfections pour les dosages luciférase sont réalisées dans des boîtes de 12 puits avec 80 000 cellules et 1 g de plasmide par puit. Les transfections réalisées pour les Western Blot se font avec 2 g d'ADN plasmidique dans des boîtes de 5 cm de diamètre ensemencées avec 200 000 cellules Cos-7. Dosage luciférase : L'activité de LucR et LucF a été mesurée en utilisant le système dual luciférase reporter assay (Promega). Les cellules transfectées, platées dans des boîtes de 12 puits, sont rincées 2 fois au PBS. Puis elles sont décollées et homogénéisées dans 100 g du tampon de lyse fourni avec le Kit, 48 heures après la transfection. Les signaux chimioluminescents de LucF et LucR sont mesurés dans un luminomêtre (Berthold) équipé d'injecteurs automatiques. Western Blot : 48 heures après transfection, les cellules Cos-7 sont lavées deux fois avec du PBS, et sont récoltées dans 1 ml de PBS. Après une centrifugation de 2 min à 2000g, le culot est resuspendu dans une solution à 1% SDS contenant des inhibiteurs de protéases, puis lysé par ultrason. Les protéines sont dosées, avec le réactif BCA (Pierce), en spectrophotométrie à 595 nm. 20 g des protéines de chaque extrait cellulaire sont utilisés pour le Western Blot. En résumé, les lysats cellulaires sont chauffés à 95 c pendant 2 minutes dans une solution de SDS 1%, DTT 0.1M, et tampon de dépot, puis les protéines sont séparées sur un gel de polyacrylamide 12. 5% et transférées sur membrane de nitrocellulose. Les protéines CAT et NuCAT sont immunodétectées par un anticorps polyclonal de lapin anti-CAT préparé au laboratoire (dilution 1/10000). Après leur fixation, on détecte les anticorps anti-IgG de lapin couplé à la peroxydase grâce au réactif de chimioluminescence (Amersham). B/ Résultats B1/Présence de sites IRES dans les différents 5'NTR du FGF-1humain Clonage de l'ADNc des 5'NTR du FGF-1 humain : La première étape a consisté à cloner les différents 5'NTR du FGF-1 humain. Pour ce faire, les ARN totaux ont été extraits des lignées cellulaires humaines présentes au laboratoire. Après reverse transcription, des PCR visant à amplifier les séquences des différents 5'NTR du FGF-1 ont été réalisées. Après amplification, la présence du fragment attendu informe sur l'existence de chaque transcrit dans le type cellulaire testé. L'amplification des différents 5'NTR du FGF-1 humain a été observée à partir des ADNc issus des cellules SK-Hep-1, SK-N-BE et SK-N-AS. L'ADNc des cellules SK-Hep-1, plus abondant, a permis le clonage dans les vecteurs bicistroniques. Vecteurs bicistroniques : La stratégie des vecteurs bicistroniques utilisée pour démontrer l'existence des IRES (14) a été appliquée pour tester l'activité IRES des différents 5'NTR du FGF-1 dans différents types cellulaires (fig n 3). Ces constructions permettent d'exprimer, à partir d'un même ARNm, deux gènes rapporteurs différents. Les différents 5'NTR du FGF-1 ont été introduits entre ces 2 gènes rapporteurs. Le premier cistron fournit le niveau de traduction capdépendante. Le deuxième cistron est exprimé proportionnellement à l'activité d'entrée interne des ribosomes au niveau des différents 5'NTR du FGF-i Bl.lTest de l'activité IRES des 5'NTR du FGF-1dans les cellules Cos-7 Vecteurs bicistroniques CAT-I-NuCAT : Des vecteurs bicistroniques CAT-I-NuCAT ont été tout d'abord utilisés et ce, pour déterminer de manière qualitative, par Western Blot, l'activité d'entrée interne des différents 5'NTR du FGF-1. En effet, ces vecteurs sont pourvus de l'ADNc de la chloramphénicol acétyl transférase (ou CAT) en premier cistron et de celui d'une protéine de fusion Nucléoline-CAT (NuCAT) en deuxième cistron (fig.n 4). De par la différence de poids moléculaire entre ces deux protéines, on les séparera facilement sur gel de polyacrylamide en condition dénaturante. On visualisera facilement les protéines CAT et NuCAT, par l'utilisation d'anticorps dirigé contre la zone C-terminale de CAT, après transfert sur membrane. L'évaluation du rapport entre le deuxième et le premier cistron informe sur la capacité d'entrée interne de la séquence insérée et défini son activité IRES. Résultats : Les différents vecteurs CAT-I-NuCAT, contenant les 5'NTR du FGF-1, ont été transfectés dans les cellules Cos-7. Le Western Blot consécutif à ces transfections est présenté fig n 4. On observe au niveau de la bande CAT (premier cistron), des variations dues à des différences d'efficacité de transfections. Néanmoins, l'expression de la protéine NuCAT est observée en présence des transcrits A, B et C. Ces résultats suggèrent une forte activité IRES du variant B du FGF-1, puis une bonne activité du variant A (si on la rapporte à l'efficacité de transfection qui est moindre dans ce cas). L'activité des 5'NTR C et D est beaucoup plus faible. La surexposition du film informe aussi sur l'absence d'initiation alternative du FGF-1 au niveau des quatre 5'NTR. Ce phénomène, décrit et observé pour le FGF-2 (1), aboutit à la formation d'isoformes de poids moléculaire supérieur (fig. n 4 ; flèche bleue). Ce résultat est en accord avec la séquence publiée par Chiu et al., qui décrivait la présence d'un codon stop dans l'exon 1, quelques bases avant l'AUG duFGF-l(ll). La présence d'une activité IRES pour les variants A, B,C a motivé la comparaison quantitative de l'activité IRES de ces différents transcrits dans des types cellulaires différents. Pour cette étude, le western blot n'étant pas un technique appropriée, d'autres vecteurs bicistroniques codant pour des gènes rapporteurs luciférase ont été utilisés. B.1.2 Comparaison des activités IRES des 5'NTR du FGF-1 dans différents types cellulaires Vecteurs bicistroniques LucR-I-LucF : Les vecteurs bicistroniques LucR-I-LucF(4) expriment deux luciférases, qui utilisent des substrats différents. La luciférase Rénillia (LucR) est le premier cistron et la luciférease Firefly (LucF) est le second cistron (fig. 5A). LucF rend compte de l'activité d'entrée interne et est dosable de manière très sensible, comme LucR. En 3' du gène LucR, on a placé une structure en tige boucle très stable (AG= -40 kCal/mol) permettant de limiter les phénomènes de réinitiation non spécifiques observés lors de l'introduction de courtes séquences dans l'espace intercistronique (figure n 5A). L'utilisation d'un tel système, basé sur la haute sensibilité des gènes rapporteurs, autorise une quantification rapide, précise et concomitante de l'activité de chaque rapporteur. Le calcul du rapport LucF/LucR informe sur la capacité d'entrée interne de la séquence 5' NTR et définit l'activité IRES de cette séquence. L'activité IRES entre les différents types cellulaires est calibrée, au laboratoire, en utilisant le vecteur RHL(4), qui contient une structure en tige boucle mais pas d'IRES entre les deux cistrons. Ce vecteur permet de déterminer la valeur de d'initiation non spécifique du deuxième cistron et de s'affranchir des variations d'efficacité de transfections entre les types cellulaires. Résultats : Pour étudier la variation d'activité des IRES en fonction du type cellulaire, nous avons choisi différentes lignées en fonction de l'expression des quatre types de transcrits du FGF-1, et des résultats connus pour l'IRES du FGF-2. Nous avons choisi les cellules Cos-7 (déjà utilisé avec le vecteur CAT-I-NuCAT), une lignée ou l'on a pu amplifier les quatre 5'NTR du FGF-1 ( les cellules SK-Hep- 1) et une lignée ou l'amplification n'a pas fonctionné ( les cellules Hela ). Les cellules Saos-2, dérivées d'un ostéosarcomes p53-/-, sont le dernier modèle choisi pour cette étude car l'IRES du FGF-2 y est très active (4). Les résultats de transfections avec les vecteurs LucR-I-LucF, dans les cellules Cos-7, Hela , SK-Hep- 1 et Saos-2 sont présentés figure 5 B. Il apparaît clairement, comme observé figure n 4, que les 5'NTR A, B et C ont une activité IRES. En revanche, l'activité du 5'NTR D est très faible, tout du moins dans les types cellulaires testés. L'activité des 5'NTR A, B et C est cependant très variable. D'une manière générale, c'est le 5'NTR A qui est le plus actif, avec des valeurs variant de 5. 5 à 12. 7. Son activité, dans les cellules Hela et Sk-Hep-1, est plus importante que celle de l'IRES du FGF-2. En revanche, l'IRES du variant A fonctionne moins bien que celle du FGF-2 dans les cellules Cos-7 et Saos-2 (bien que les valeurs enregistrées dans ces types cellulaires soient les plus élevées). Le variant B du FGF-1 est plus actif que le A dans les cellules Cos-7(10 unités), et son activité est modeste dans les cellules Saos-2. Dans les autres types cellulaires testés, le 5'NTR B n'a aucune activité. Quant au variant C, il présente une activité moyenne dans les SK-Hep-1 et les Saos-2 (5. 8 et 7. 5 respectivement). C'est malgré tout dans ce dernier type cellulaire ou le 5'NTR C est le plus actif. Son activité dans les cellules Cos-7 et Hela est extrêmement basse. On pourra de plus ajouter que les informations obtenues, dans les cellules Cos-7 avec les vecteurs CAT-I-NuCAT sont corrélables avec les valeurs obtenues avec les vecteurs LucR-I-LucF. B2/ Entrée interne des ribosomes dans les différents 5'NTR du FGF-1 murin On retrouve une structure génique identique à celle de l'humain chez la souris (fig.n 6A), le b#uf, le porc et le poulet. L'alignement des séquences des 5'NTR du FGF-1 de ces divers organismes (9,11,16) a montré une bonne conservation de ces séquences non codantes. Cette conservation se vérifie tout particulièrement entre la souris et l'homme, avec près de 70% de similitude pour le 5'NTR A( figure n 7 A). L'hypothèse d'une conservation du mécanisme des IRES de la souris à l'homme a été envisagée, nous avons donc réalisé une étude comparative des variants A et B du FGF-1 humain et murin. Pour ce faire, nous avons amplifié par RT-PCR et cloné les 5'NTR A et B du FGF-1 murin (fig.n 6B) à partir d'ADNc de lignées cellulaires murines. Puis nous avons utilisé la même stratégie d'étude : construction de vecteurs bicistroniques LucR-ILucF, et transfection dans les types cellulaires utilisés pour l'étude des homologues humain. Clonage de l'ADNc des 5'NTR A et B du FGF-1murin : Nous avons utilisé la même stratégie de clonage, par RT-PCR, que pour les 5'NTR humain. Les mêmes problèmes d'amplification ont été rencontrés et ont abouti à l'utilisation d'enzymes et de conditions de stringence identique. Les 5' NTR murins ont été amplifiés et reclonés, à partir d'ADNc de cellules L929. Comparaison de l'activité d'entrée interne des 5'NTR A et B du FGF-1 murin et humain dans des cellules humaines : Les transfections ont été réalisées dans les cellules Cos-7, SK-Hep-1 et Saos-2, pour effectuer une comparaison directe avec les séquences humaines. Les résultats consécutifs aux dosages luciférases, sont présentés figure n 7B . Les profils d'activité IRES du variant A humain et murin sont similaires. Ils ont des valeurs du même ordre de grandeur et semblent être régulés de la même manière en fonction du type cellulaire, à l'exception des cellules Saos-2. En effet, l'activité IRES du variant A murin est plus importante dans ces cellules et se rapproche de la valeur observée pour l'IRES du FGF-2. On retrouve également des valeurs d'entrée interne du même ordre de grandeur pour les 5'NTR B humain et murin. De plus la meilleure activité IRES est observée dans les cellules Cos-7, pour la construction contenant le 5'NTR B du FGF-1 humain : c'est aussi le cas avec l'homologue murin. EXEMPLE 2 : CARACTERISATION DES IRES DES 4 TRANSCRITS A, B, C et D DE FGF-1HUMAIN ex vivo Exemple 2A : dans les cellules d'adénocarcinome humain (SK-Hep-1) La caractérisation des IRES des 4 transcrits consiste à déterminer quelle est la plus petite séquence nucléotidique de chacun des fragments A à D présentant une activité IRES satisfaisante, ce qui permet de localiser de manière relativement précise le site IRES de chacun des transcrits. Cette expérience est conduite sur des cellules d'adénocarcinome humain (SK-Hep-1). Ont ainsi été testés : - la totalité du 5'NTR du transcrit A (A), - 6 séquences nucléotidiques correspondant à des fragments continus du 5'NTR du transcrit A (A2, A3, A6, A7, A9, Al 1), - la totalité du 5'NTR du transcrit B (B), 1 séquence nucléotidique correspondant à un fragment continu du 5'NTR du transcrit B (B2) - la totalité du 5 'NTR du transcrit C (C), 1 séquence nucléotidique correspondant à un fragment continu du 5'NTR du transcrit C (C2), - la totalité du 5'NTR du transcrit D (D). Les séquences nucléotidiques à tester sont des séquences continues issues de l'ARN messager et ont été sous clonées dans un vecteur bicistronique selon un mode opératoire identique à celui décrit dans l'exemple 1. Le vecteur bicistronique code pour deux luciférase, la luciférase de renilla (LucR, premier cistron) et la luciférase de luciole ou firefly (LucF, deuxième cistron). Les séquences nucléotidiques à tester ont donc été insérées entre les deux gènes luciférase, de façon à quantifier, en mesurant l'activité LucF, leur capacité à générer une initiation de la traduction par entrée interne des ribosomes. La valeur de l'activité LucF est rapportée à la valeur d'activité de LucR qui est, elle, proportionnelle à la quantité d'ARNm. Pour exprimer les valeurs d'activité d'IRES en unités arbitraires (UA), le rapport LucF/LucR est luimême rapporté à la valeur d'un contrôle négatif (vecteur bicistronique sans IRES) qui représente le niveau de "fuite". L'activité luciférase LucR et LucF a été mesurée 48h après transfection sur les extraits cellulaires d'adénocarcinome humain (SK-Hep-1).. Les résultats sont représentés sur la figure 8. IRES FGF-1A : comme le montre la Figure 8, le 5'NTR A de l'ARNm du FGF-1 (nucléotides 1 à 435) permet l'entrée interne des ribosome avec une efficacité de 9 UA environ (Fig. 8, construction A), ce qui vient donc confirmer les résultats de l'exemple 1. L'analyse de différents segments de cette 5'NTR permet de conclure que l'activité d'entrée interne ne requiert pas les nt 1 à 270, ni les nt 399 à 435. Sur la base de cette cartographie, on peut conclure que l'IRES minimum du FGF-IA comprend les nucléotides 215 à 399 (construction A9). Il faut remarquer qu'un élément indispensable mais pas nécessairement suffisant se trouve entre les nt 270 et 304. IRES FGF-1B : la figure 8 indique que la 5'NTR B de l'ARNm du FGF-1 (nt 1 à 147) possède une activité d'IRES relativement faible de l'ordre de 3 UA, ce qui vient donc confirmer les résultats de l'exemple 1. La 5'NTR complète est nécessaire à cette activité : notamment la délétion des nt 111 à 147 inactive complètement l'IRES (Fig. 8, construction B2). Ce segment de 36 nt, qui est commun à toutes les 5'NTR du FGF-1 car situé en 3' du site d'épissage accepteur commun aux quatre processus d'épissage alternatif, est donc inopérant dans le cas de l'IRES du FGF-1 A mais indispensable à l'activité de l'IRES du FGF-1B. D'autres exemples indiqueront que l'IRES du FGF-1 B a une activité supérieure dans d'autres types cellulaires. IRES FGF-1C: la Figure 8 indique que la 5'NTR C de l'ARNm du FGF-1 (149 nt) possède une activité d'IRES équivalente à celle de l'IRES FGF-1 A (10 UA), ce qui vient donc confirmer les résultats de l'exemple 1 . De manière intéressante, la délétion des nt 113 à 149 (correspondant à la zone commune aux 4 NTRs de l'ARNm FGF-1) engendre une augmentation de l'activité de l'IRES (17 UA): on peut donc conclure que l'IRES minimum du FGF 1-C comprend les nt 1 à 113. IRES FGF-1D: la Figure 8 indique que la 5'NTR D de l'ARNm du FGF-1 ne possède aucune activité d'IRES dans les cellules SK-Hep-1. Cependant, d'autres exemples montreront que ce fragment possède une activité IRES dans d'autres types cellulaires, notamment les myoblastes C2/7 Exemple 2B : caractérisation dans les cellules 911 (cellules de rétinoblastes embryonnaires hymens) et dans les cellules C2/7 (cellules de myoblastes murins) On répète l'exemple 2 A avec l'ensemble des séquences à l'exception des fragments A3 et A11. Les cellules de rétinoblastes embryonnaires et les myoblastes sont ensemencés un à deux jours avant la transfection en plaque 24 puits. L'ensemble des transfections des cellules de rétinoblastes et de myoblastes a été réalisé avec le réactif Lipofectamine selon le protocole fourni par Life Technologies, à raison de 3 ul par g d'ADN plasmidique par puits. Les cellules sont lysées, 48 h post transfection, par 100 III de tampon de lyse (Dual Luciferase, Promega). Les activités luciférases (Rénilla et Firefly) sont mesurées sur 20 l de lysat cellulaire (Mediator PliL, Luminomètre) pendant 10s après 50 III d'adjonction de réactif (Dual Luciferase, Promega). Les résultats sont représentés sur les figures 9A et 9B. L'hairpin est une séquence de référence de structure en tige boucle, ne contenant pas d'IRES. Comme le montre la figure 9A, le 5'NTR du transcrit A ainsi que les fragments A2, A6, A7 et A9 présentent une activité IRES satisfaisante. Il en est de même concernant les 5'NTR des transcrits B , C et D dans les myoblastes alors que ces mêmes séquence présentaient une activité moindre dans les cellules d'adénocarcinome humain (SK-Hep-1) (voir exemple 2A) Exemple 2C : dans les cellules myoblastes C2/7 différenciées ensuite en myotubes) On répète l'exemple 2 A avec les transcrits A, A9, B, C, D et on compare cette activité avec celle d'EMCV. Les cellules de myoblastes sont ensemencées un à deux jours avant la transfection en plaque 12 puits. Les transfections, réalisées sur les fragments contenant l'hairpin, EMCV, A, A9, B, C, ou D ; sont faites en duplicate comme décrit ci-dessus. Les cellules sont lysées, 24 h post transfection (figure 9C en hachuré) ou 9 jours posttransfection (figure 9C en pointillé). Pendant les 9 jours d'incubation, les cellules de myoblastes sont mises en différenciation en myotubes dans un mileu DMEM additionné de 5% de sérum de cheval. Comme le montre la figure 9C, l'activité de l'IRES du transcrit A du FGF-1, du fragment A9 et du transcrit B de FGF-lpossède une activité plus élevée dans les myotubes que dans les myoblastes. Le transcrit C et D du FGF-1 possède une activité comparable dans les myoblastes et les myotubes. Il est très intéressant de noter que l'activité dans les myotubes versus myoblastes de l'IRES du transcrit A du FGF-1 (ratio = 8,47), du fragment A9 (ratio = 11,63) et du transcrit B de FGF-1 (ratio = 18,27) est très supérieure à celle d'EMCV (ratio = 6,44). EXEMPLE 3 : ACTIVITE DES 5'NTR DES TRANSCRITS A, B C et D DU FGF-1 HUMAIN in vivo Les expériences sont réalisées selon le protocole suivant. Les animaux utilisés sont des souris femelles sevrées d'environ 6 semaines. La souche utilisée est la Balb/C (IFFA CREDO). Les souris sont anesthésiées par un mélange de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (lOmg/kg) par voie intrapéritonéale. La durée de l'anesthésie est de 20 minutes. L'ADN est amplifié et purifié par maxipréparation en absence d'endotoxine (Endofree, Qiagen). Après précipitation, l'ADN est repris dans une solution de NaCl 150 mM (Sigma) à une concentration d'environ 50 g dans 30 (il. L'ADN est injecté dans le tibia antérieur gauche en utilisant une seringue Hamilton. La patte, préalablement rasée, est enduite de gel conducteur. On applique les deux électrodes de part et d'autre de la patte pour réaliser l'electrotransfert. En règle générale, on délivre 8 impulsions électriques de 20 milli secondes à une fréquence de 2Hz., le voltage étant de 200V/cm. Ces expériences sont réalisées sur des groupes de trois animaux par plasmide. Une semaine plus tard, les animaux sont sacrifiés par injection par voie intrapéritonéale de O,lml de pentobarbital sodique à 6 puis par dislocation cervicale. Le tibia antérieur est prélevé et congelé dans l'azote liquide. Les muscles sont ensuite broyés dans 500 l de tampon de lyse additionné d'un cocktail inhibiteur de protéines à 16,7 l/ml. Les lysats musculaires sont décongelés pendant 5 minutes à 37 C, vortexés et centrifugés à 4 C pendant 5 minutes à 15000 G. Les activités luciférase (Renilla et Firefly) sont mesurées sur 20 III de lysat musculaire (Mediators PhL, Luminomètre) pendant 10 s après 50 III d'adjonction de réactif (Dual Luciférase, Promega). Le muscle contrôle est soit un muscle où 30 III de NaCl 150 mM ont été injectés puis electroporés soit un muscle qui n'a rien subi. EXEMPLE 3A : comparaison de l'activité IRES du transcrit A de FGF-1humain au regard d'IRES connus Cet exemple vise à comparer, in vivo, dans le muscle de souris, l'activité IRES du transcrit A du FGF-1 humain par rapport à d'autres IRES tels que celui de EMCV, VEGF, FGF2, Bip et PDGF. Comme le montre la figure 10, L'activité de l'IRES de FGF-1A est équivalente à celle d'EMCV et supérieure aux IRES de VEGF, FGF-2, Bip et PDGF. EXEMPLE 3 B : de l'activité IRES du transcrit A de FGF-1 humain et de ses sous fragments A, A2, A6, A7 et A9, in vivo, au regard de l'IRES d'EMCV Comme le montre la figure 11L'IRES du FGF-1A et ceux qui sont modifiés, A2, A6 et A7, possède une activité d'IRES similaire à celle de l'IRES d'EMCV, alors que l'IRES minimum du FGF-1A (construction A9) a une activité légèrement supérieure. EXEMPLE 3C : de l'activité IRES du transcrit A de FGF-1 humain et de son sous fragments Al 1, du transcrit B de FGF-1 humain et de ses sous fragments B2 et B3, du transcrit C de FGF-1 humain et de ses fragments C2 et C3, au regard de l'IRES d'EMCV Comme le montre la figure 12, l'IRES du FGF-1B et FGF-1C possède une activité similaire à celle d'EMCV. L'IRES minimum du FGF-1B (fragments B3) et de FGF- 1C (fragment C2) ont une activité très supérieure à celle d'EMCV. Le fragment Al 1 ne possède aucune activité, ceci confirme que l'IRES minimum du FGF-1 A est le fragment A9 (exemple 3B). BIBLIOGRAPHIE 1. Arnaud, E., C. Touriol, C. Boutonnet, M. C. Gensac, S. Vagner, H. Prats, and A. C. Prats. 1999. A new 34-kilodalton isoform of human fibroblast growth factor 2 is cap dependently synthesized by using a non- AUG start codon and behaves as a survival factor. Mol Cell Biol 19:505- 14. 2. Bernstein, J., O. Sella, S. Y. Le, and O. Elroy-Stein. 1997. 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REVENDICATIONS 1/ Acide nucléique isolé présentant une activité IRES caractérisé en ce qu'il contient une séquence identique ou homologue à celle des transcrits A, B, C et D de FGF1 correspondant respectivement aux séquences SEQ ID 1 (A), SEQ ID7 (B), SEQ ID8 (C) et SEQ ID 10 (D). 2/ Acide nucléique isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient une séquence identique ou homologue à la séquence SEQ ID 2 (A2). 3/ Acide nucléique isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient une séquence identique ou homologue à la séquence SEQ ID 3 (A3). 4/ Acide nucléique isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient une séquence identique ou homologue à la séquence SEQ ID 4 (A6). 5/ Acide nucléique isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient une séquence identique ou homologue à la séquence SEQ ID 5 (A7). 6/ Acide nucléique isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient une séquence identique ou homologue à la séquence SEQ ID 6 (A9). 7/ Acide nucléique isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient une séquence identique ou homologue à la séquence SEQ ID 9 (C2). 8/ Cassette d'expression d'au moins un gène d'intérêt dans une cellule eucaryote, ladite cassette se caractérisant en ce qu'elle contient au moins un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7. 9/ Cassette d'expression selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle contient au moins deux gènes d'intérêt. 10/ Vecteur d'expression recombinant caractérisé en ce qu'il comprend la cassette d'expression objet de la revendication 8. 11/ Vecteur d'expression selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur plasmidique ou viral choisi dans le groupe comprenant les rétrovirus, les lentivirus et les adénovirus. 12/ Composition pharmaceutique comprenant la cassette d'expression objet de la revendication 8 ou un vecteur recombinant objet de la revendication 10. 13/ Cellule hôte recombinante caractérisée en ce qu'elle comprend la cassette d'expression objet de la revendication 8 ou un vecteur recombinant objet de la revendication 10. 14/ Animal transgénique caractérisé en ce qu'il comprend la cassette d'expression objet de la revendication 8 ou un vecteur recombinant objet de la revendication 10. DEPOSANTS : 1/ GENETHON III 2/ INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE MANDATAIRE : CABINET LAURENT ET CHARRAS