Brevet FR2836482A1 — publié le 20030829

La présente invention concerne un procédé et une installation pour l'obtention de cellules vivantes desséchées, ainsi que les cellules vivantes desséchées obtenues par la mise en oeuvre de ce procédé. On sait qu'il existe actuellement un besoin important en cellules vivantes desséchées, par exemple dans les domaines de l'immunothérapie cellulaire ou dans les domaines nécessitant un stockage de cellules desséchées vivantes. On sait de plus que les procédés connus actuels pour dessécher les cellules vivantes mettent en oeuvre des méthodes de lyophilisation associées à une congélation préalable. Ces procédés connus obligent à soumettre les cellules à de très basses températures, entraînant une forte mortalité desdites cellules par éclatement dû à la congélation de leurs éléments liquides. Pour abaisser la mortalité, on peut utiliser des cryoprotecteurs, tel que le glycérol. Cependant, des cellules vivantes additionnées de tels cryoprotecteurs peuvent devenir inaptes aux applications envisagées. Enfin, ces procédés connus nécessitent de conserver et de transporter les cellules vivantes desséchées à de très basses températures contrôlées, ce qui les rend particulièrement coûteux à mettre en oeuvre. La présente invention a pour objet de remédier à ces inconvénients en permettant de traiter les cellules vivantes à partir de la température ambiante et de les conserver à cette même température qui correspond à leur viabilité maximale, par la mise en oeuvre de moyens moins coûteux, aussi bien en ce qui concerne l'investissement que les coûts d'exploitation. A cette fin, selon l'invention, le procédé d'obtention de cellules vivantes desséchées est remarquable en ce qu'il comporte la suite des étapes suivantes : a-on commence par refroidir lesdites cellules vivantes depuis la tempéra- ture ambiante jusqu'à l'apparition du phénomène de surfusion ; b-puis, on soumet lesdites cellules vivantes ainsi refroidies à l'action du vide pour en obtenir la congélation, la mise sous vide desdites cellules vivantes étant accompagnée d'une adsorption des vapeurs liquides qu'elles contiennent et ladite congélation étant poursuivie jusqu'à ce que la température négative desdites cellules atteigne une valeur au moins deux fois inférieure à celle du palier de surfusion apparaissant pendant ladite étape b ; c-après quoi, on réchauffe lesdites cellules maintenues sous vide et sous adsorption jusqu'à une température voisine de la température ambiante ; et d-finalement, on arrête ladite adsorption et on met lesdites cellules à la pression atmosphérique. Ainsi, conformément à la présente invention, dans l'étape b du procédé, la congélation des cellules vivantes est obtenue par le vide--et non pas par une machine frigorifique--, l'évaporation des liquides de cellesci apportant les frigories permettant de refroidir et de congeler les cellules, tandis que l'adsorption continue la dessiccation de ces dernières. Par suite, la congélation desdites cellules consomme une partie des liquides qu'elles contiennent, de l'ordre de 10 à 12%, ce qui diminue d'autant le volume de glace formé dans les cellules. Il en résulte que celles-ci sont protégées contre l'éclatement de leur membrane. Si les cellules se trouvent dans un milieu liquide ou semi-pâteux, le changement de consistance du milieu, solidifié avant lesdites cellules, apporte à celles-ci un soutien rigide de leur structure, leur permettant de résister à la pression osmotique et de passer sans dommage le palier de surfusion. On remarquera que, lors d'une opération de congélation d'un mi- lieu comportant plusieurs composés et des cellules, il peut apparaître plusieurs paliers de surfusion, chaque palier étant une phase à température relativement constante correspondant à une transformation progressive d'un liquide en solide. Au début d'un palier, on observe généralement un changement de consistance à la surface du liquide. Le palier apparaissant le premier pendant la congélation est le plus important et c'est celui qui est considéré par la présente invention. Les cellules vivantes contenant un grand nombre de composés, leur (premier) palier est toujours situé en dessous de OIC. La congélation des cellules à la fin de l'étape b ne soulève aucune difficulté particulière car, à ce stade du processus, toutes les structures cellulaires sont rigidifiées. On notera qu'une telle congélation par le vide est particulièrement avantageuse, puisque ce sont les cellules à congeler qui apportent les frigories nécessaires à cet effet, ce qui permet, d'une part, d'abaisser la consommation énergétique et, d'autre part, d'éliminer une partie du liquide des cellules, favorisant ainsi la dessiccation effectuée par l'adsorption, simultanément à la congélation. En revanche, il est avantageux que le refroidissement effectué à l'étape a soit obtenu par une machine frigorifique. En effet, si ce refroidissement est assuré par un froid d'origine mécanique, il se fera sans dommage pour les cellules. Au contraire, si ce refroidissement était obtenu par le vide, il apparaîtrait deux phénomènes défavorables, à savoir : - l'ébullition des liquides des cellules, pouvant entraîner la destruction des cellules les plus fragiles ; et - la sortie des liquides hors des cellules, engendrant une pression osmoti- que importante qui peut modifier l'organisation de cellules, jusqu'à les tuer. Par ailleurs, afin d'accélérer l'établissement du vide au début de l'étape b, il est préférable que, pendant le refroidissement de l'étape a, lesdites cellules soient soumises à une dépression, dont la valeur de la pression est supérieure à celle du vide prévu à l'étape b. Dans une forme avantageuse de mise en oeuvre, l'étape de réchauffement c est subdivisée en : - une première sous-étape c1, consécutive à l'étape b, pendant laquelle le réchauffement est intensif pour obtenir une remontée de la température desdites cellules jusqu'à une valeur positive significative, inférieure à ladite température ambiante ; et - une seconde sous-étape c2, consécutive à la sous-étape cl, pendant laquelle la température desdites cellules croît progressivement de ladite valeur positive significative jusqu'à ladite température ambiante. La présente invention concerne également une installation pour la mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, cette instal- lation comportant : - une enceinte à vide, dans laquelle sont disposées lesdites cellules ; - une machine frigorifique, apte à refroidir ladite enceinte à vide ; - une machine thermique, apte à chauffer ladite enceinte à vide ; - une machine à vide, apte à faire le vide dans ladite enceinte à vide ; et - des moyens d'adsorption de gaz par adsorbant solide reliés, d'un côté, à ladite enceinte à vide et, de l'autre, à ladite machine à vide. De préférence, notamment pour réaliser commodément l'étape a du procédé, l'installation de l'invention comporte une liaison commandable reliant ladite machine à vide à ladite enceinte à vide et disposée en parallèle sur lesdits moyens d'adsorption de gaz. L'installation conforme à la présente invention peut comporter une plaque thermique, qui est disposée dans ladite enceinte à vide et sur laquelle reposent lesdites cellules, ainsi que des moyens de commutation permettant de relier ladite plaque thermique, soit à ladite machine frigorifi- que, soit à ladite machine thermique. Elle peut de plus comporter des moyens pour récupérer la chaleur engendrée par lesdits moyens d'adsorption. On comprendra aisément que la présente invention concerne de plus des cellules vivantes desséchées obtenues par l'action combinée d'une congélation par le vide et d'une adsorption par adsorbant solide, telle que décrite ci-dessus. Les figures du dessin annexé feront bien comprendre comment l'invention peut être réalisée. Sur ces figures, des références identiques désignent des éléments semblables. La figure 1 montre le schéma synoptique d'un exemple de réalisation pour l'installation de dessèchement de cellules conforme à la présente invention. La figure 2 représente des diagrammes temporels, illustrant schématiquement le fonctionnement de l'installation de la figure 1. L'exemple de réalisation d'installation, conforme à l'invention et représenté schématiquement sur la figure 1, comporte une enceinte à vide 1 à l'intérieur de laquelle est disposée une plaque thermique 2 supportant un récipient 3 qui contient des cellules vivantes 4 à dessécher, lesdites cellules se trouvant par exemple dans un milieu aqueux. La plaque thermique 2 comporte deux liaisons 5 et 6, entre lesquelles peut circuler un fluide thermique apte à la traverser pour lui communiquer sa température. De façon connue, la plaque thermique 2 peut comporter un serpentin interne (non représenté) aux extrémités opposées duquel sont reliées lesdites liaisons 5 et 6, aptes à servir d'entrée (sortie) et de sortie (entrée) pour ledit fluide thermique traversant la plaque 2. Chacune des deux liaisons 5 et 6 est reliée à une vanne à trois voies 7 ou 8, respectivement. Grâce à une telle disposition, la plaque thermique 2 peut être soit refroidie par un fluide de refroidissement provenant d'un échangeur ther- mique 9, soit réchauffée par un fluide de réchauffement provenant d'un échangeur thermique 10. Le fluide de refroidissement de l'échangeur thermique 9 est refroidi par une machine frigorifique 11. Ladite enceinte à vide 1 est reliée à un système de pompe à vide 12, par une conduite 13 sur laquelle est disposée une vanne 14. En parallèle sur la portion de conduite 13 comportant la vanne 14, est disposé au moins un réacteur 15 à adsorption réversible solide/gaz contenant un adsorbant solide 16, tel que la zéolithe. A chacune de ses extrémités, ledit réacteur 15 est pourvu d'une vanne 17 ou 18, commandant la communication avec la conduite 13. Le fluide de réchauffement de l'échangeur thermique 10 est réchauffé, grâce à des vannes à trois voies 19 et 20, soit par une machine thermique 21, par exemple une chaudière, soit par la chaleur engendrée par l'adsorbant 16 du réacteur 15. L'installation schématique de la figure 1 comporte de plus une vanne 22 de mise à l'air libre de l'enceinte à vide 1 et un dispositif de commande 23 recevant la température des cellules 4 mesurée par un appareil de mesure de température 24 (par exemple un thermocouple) et la pression à l'intérieur de l'enceinte 1 mesurée par un appareil de mesure de pression 25. De façon semblable et non représentée, l'installation de l'in- vention peut comporter un autre appareil mesurant la température de la plaque thermique 2 et l'adressant audit dispositif de commande 23. Par ses sorties 26, le dispositif 23 commande, de façon non représentée pour des raisons de clarté du dessin, le fonctionnement des dispositifs 11, 12 et 21, ainsi que l'ouverture et la fermeture des vannes 7,8, 14,17, 18, 19, 20 et 22. Un exemple de fonctionnement de l'installation de la figure 1 est décrit ci-après à l'aide des diagrammes de la figure 2. Cette dernière figure montre schématiquement, en fonction du temps t : - la variation de la température 0 (en C) des cellules vivantes 4, illustrée par la courbe 30 en trait plein ; - la variation de la température T (en 0 C) de la plaque thermique 2, illus- trée par la courbe 31 en trait mixte ; et - la variation de la pression P (en millibar = 102 Pascal) à l'intérieur de l'enceinte 1, illustrée par la courbe 32 en pointillés. Dans cet exemple de fonctionnement, on suppose que, antérieurement à un instant initial to, le récipient 3 contenant les cellules vivantes 4 repose sur la plaque thermique 2, à l'intérieur de l'enceinte à vide 1 et que toutes les vannes 7,8, 14,17, 18,19, 20 et 22 sont fermées. De plus, comme indiqué sur la figure 2, cet exemple de fonctionnement comporte quatre étapes successives, respectivement référencées a, b, c1 +c2 et d. A l'instant to, auquel commence l'étape a, le dispositif de commande 23 bascule les vannes 7,8 sur l'échangeur 9 et ouvre la vanne 14, de sorte qu'il en résulte que, simultanément : - la plaque thermique 2 est refroidie par la machine frigorifique 11 (courbe 31), par l'intermédiaire de l'échangeur thermique 9, et elle- même refroidit les cellules vivantes 4 (courbe 30). En fonction de la na- ture de ces dernières, la température de la plaque thermique 2 est ré- gulée entre-5 C et-10 C, aux alentours du point eutectique desdites cellules 4 ; et - un vide partiel est créé dans l'enceinte à vide 1 par la pompe à vide 12. Ce vide partiel peut, par exemple, être de l'ordre de 50. 102 Pa (50 mil- liars). Ainsi, pendant l'étape a, on refroidit progressivement lesdites cel- lules 4 sans les figer, leur structure restant souple et fragile. Cette étape a --dont la durée est par exemple d'une demi-heure--cesse à l'instant t1, auquel le thermocouple 24 détecte la pointe de température négative 33 correspondant à la surfusion desdites cellules 4 et qui marque le début de l'étape b suivante. En recevant du thermocouple 24 l'information de détection de la pointe de surfusion 33, le dispositif de commande 23 ferme les vannes 7, 8 et 14, ouvre les vannes 17 et 18 et contrôle la pompe à vide 12 pour parfaire le vide dans l'enceinte 1 (courbe 32), par exemple à une valeur de l'ordre de 0, 5. 102 Pa (0, 5 millibar). Il résulte de ces actions du dispositif de commande 23 que : - la machine frigorifique 11 est isolée de l'enceinte 1 et ne refroidit plus la plaque thermique 2, qui reste cependant à une faible température, par exemple de l'ordre de 0 C ; - sous l'action du vide, les liquides contenus dans les cellules vivantes s'évaporent, ce qui engendre des frigories permettant de refroidir ces dernières jusqu'à leur congélation. Aussi, la température desdites cellu- les 4, après la pointe de surfusion 33 et la remontée au palier de surfu- sion 34--dont la température est désignée par 8p-- continue de décroî- tre (courbe 30) ; et - les vapeurs liquides émises par lesdites cellules sont adsorbées par l'ad- sorbant solide 16. Dans cette étape b, lesdites cellules 4 sont donc à la fois conge- lées--donc rigidifiées--et desséchées. Ladite étape b cesse à l'instant t2, auquel la température des cellules congelées 4 atteint une température de congélation Of, nettement inférieure à la température 8p du palier 34. Par exemple, si la température Op est égale à -5OC, la température Of est égale à au moins-10 C et, de préférence, à au moins-20 C. Cette température Of est détectée et transmise au dispositif de commande 23 par le thermocouple 24. Tout comme l'étape a, l'étape b peut avoir une durée de l'ordre de la demi-heure. A l'instant t2 où les cellules ont atteint la température Of, instant qui marque le début d'une sous-étape de réchauffement c1, le dispositif de commande 23 bascule les vannes 7 et 8 sur l'échangeur 10 et actionne les vannes 19 et 20 de façon que, en fonction de la température désirée pour la plaque thermique 2, soit l'échangeur 10, soit la chaudière 21 récupère la chaleur développée par l'adsorbant solide 16 dans le réacteur 15. Par suite, la température de la plaque thermique 2 (courbe 31) et celle des cellules 4 (courbe 30) croissent, la température de la plaque thermique 2 étant éventuellement régulée à une valeur constante, par exemple égale à 50 C. A la fin de la sous-étape c1, à l'instant t3, la température des cellules 4 a atteint une température positive significative Os inférieure à la température ambiante. La sous-étape c1 peut avoir une durée de l'ordre de 5 à 10 heures. Pendant toute la durée de cette sous- étape c1, les cellules sont maintenues sous vide (par exemple 0, 5. 102 Pa) et sont en relation avec le réacteur d'adsorption 15. A l'instant t3 commence la seconde sous-étape de réchauffement c2, dont la durée est également de l'ordre de 5 à 10 heures. Pendant cette sous-étape, la température de la plaque thermique 2 (courbe 31) est abaissée, puis régulée au voisinage de la température ambiante, de sorte que la température des cellules 4 croît (courbe 30), depuis la température Os, jusqu'à cette température régulée. Pendant cette sous-étape c2, les cellules 4 restent maintenues sous vide et en communication avec le réacteur 16. A la fin de la sous-étape c2, à l'instant t4, les vannes 17 à 20 sont fermées et l'enceinte 1 est mise à la pression atmosphérique par ouverture de la vanne 22. Les cellules vivantes desséchées peuvent alors être sorties de l'enceinte 1 (étape d). Dans l'installation, conforme à la présente invention et illustrée schématiquement sur la figure 1, on n'a représenté qu'un seul réacteur 15 à des fins de simplification explicative. Il va de soi, cependant, que cette installation peut comporter des moyens d'adsorption plus complexes, composés d'une pluralité de réacteurs montés fonctionnellement en parallèle et/ou en série. REVENDICATIONS 1. Procédé pour le traitement de cellules vivantes à partir de la température ambiante, permettant la conservation des cellules ainsi traitées à ladite température ambiante, caractérisé en ce qu'il comporte la suite des étapes suivantes : a-on commence par refroidir lesdites cellules vivantes (4) depuis la tempé- rature ambiante jusqu'à l'apparition du phénomène de surfusion (33) ; b-puis, on soumet lesdites cellules vivantes (4) ainsi refroidies à l'action du vide pour en obtenir la congélation, la mise sous vide desdites cellu- les vivantes étant accompagnée d'une adsorption des vapeurs liquides qu'elles contiennent et ladite congélation étant poursuivie jusqu'à ce que la température négative desdites cellules atteigne une valeur (8f) au moins deux fois inférieure à celle (8p) du palier de surfusion (34) appa- raissant pendant ladite étape b ; c-après quoi, on réchauffe lesdites cellules maintenues sous vide et sous adsorption jusqu'à une température voisine de la température ambiante ; et d-finalement, on arrête ladite adsorption et on met lesdites cellules à la pression atmosphérique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le refroidissement effectué à l'étape a est obtenu par l'action d'une machine frigorifique. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que, pendant le refroidissement de l'étape a, lesdites cellules sont soumises à une dépression. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite étape de réchauffement c est subdivisée en : - une première sous-étape cl, consécutive à l'étape b, pendant laquelle le réchauffement est intensif pour obtenir une remontée de la température desdites cellules jusqu'à une valeur positive significative (8s), inférieure à ladite température ambiante ; et - une seconde sous-étape c2, consécutive à la sous-étape c1, pendant laquelle la température desdites cellules croît progressivement de ladite valeur positive significative (wus) jusqu'à ladite température ambiante. 5. Installation pour la mise en oeuvre du procédé spécifié sous l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comporte : - une enceinte à vide (1), dans laquelle sont disposées lesdites cellules (4) ; - une machine frigorifique (11), apte à refroidir ladite enceinte à vide (1) ; - une machine thermique (21), apte à chauffer ladite enceinte à vide (1) ; - une machine à vide (12), apte à faire le vide dans ladite enceinte à vide (1) ; et - des moyens (15) d'adsorption de gaz par adsorbant solide (16) reliés, d'un côté, à ladite enceinte à vide (1) et, de l'autre, à ladite machine à vide (12). 6. Installation selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comporte une liaison commandable (13,14) reliant ladite machine à vide (12) à ladite enceinte à vide (1) et disposée en parallèle sur lesdits moyens d'adsorption de gaz (15). 7. Installation selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce qu'elle comporte une plaque thermique (2), qui est disposée dans ladite enceinte à vide (1) et sur laquelle reposent lesdites cel- lules (4), ainsi que des moyens de commutation (7,8) permettant de relier ladite plaque thermique (2), soit à ladite machine frigorifique (11), soit à ladite machine thermique (21). 8. Installation selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisée en ce qu'elle comporte des moyens (19,20) pour récupérer la chaleur engendrée par lesdits moyens d'adsorption (15). 9. Cellules conservables à la température ambiante, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par l'action combinée d'une congélation par le vide et d'une adsorption par adsorbant solide, telle que spécifiée sous l'une quelconque des revendications 1 à 4.