Brevet FR2836928A1 — publié le 20030912

METHODE D'IDENTIFICATION D'ANIMAUX SUSCEPTIBLES DE PRESENTER DE BONNES QUALITES DE PRODUCTION LAITIERE, PAR ANALYSE DU POLYMORPHISME DES GENES PIT-1 ET KAPPACASEINE La présente invention concerne les domaines de l'exploitation laitière et de l'élevage. Plus particulièrement, cette invention concerne des méthodes et des kits pour déterminer le potentiel de production laitière chez un animal, à partir de l'analyse du polymorphisme de ses gènes Pit-1 et K-caséine. Actuellement, la sélection d'un trait particulier chez un animal est lente et onéreuse. Cette sélection est basée, d'une part, sur l'observation dudit animal, par différents types de mesure, tels que son poids, sa taille, sa couleur, etc., et, d'autre part, sur l'étude de sa généalogie. Cette sélection peut se faire sur plusieurs générations, par des croisements entre animaux qui présentent le même trait recherché, en espérant que ce trait sera dominant dans la génération suivante. Ce type de sélection présente plusieurs inconvénients, du fait de sa longueur mais aussi car il nécessite le jugement d'un éleveur expert dans le domaine. Le jugement de l'éleveur est basé sur des observations et des hypothèses, et il comporte donc une certaine part de subjectivité, liée notamment à son degré d'expérience. De plus, un trait sélectionné de cette façon, à une génération donnée, ne sera pas nécessairement transmis à la génération suivante. Pour surmonter les inconvénients mentionnés ci-dessus, de nouvelles méthodes sont en cours de développement, sur la base des progrès scientifiques réalisés dans le domaine de la génétique. Une approche particulièrement prometteuse consiste à étudier des gènes à effets individuels importants, et leur association éventuelle avec certains traits recherchés chez les animaux. De tels gènes peuvent ensuite être utilisés comme marqueurs moléculaires pour sélectionner les traits en question chez un animal. Cette méthode nécessite donc tout d'abord d'identifier des gènes à effets individuels importants ou des marqueurs génétiques associés aux traits recherchés. Le succès de cette approche est conditionné par la mise en évidence d'une corrélation entre le trait phénotypique recherché et un certain polymorphisme du gène en question. Dans le domaine de la production laitière, plusieurs gènes ont été identifiés pour leur influence sur la production de lait, soit en termes de quantité produite (par exemple, gènes de l'axe somatotrope), soit en termes de qualité du lait (par exemple, gènes associés aux variations protéiques). Plusieurs gènes associés aux propriétés lactodynamographiques du lait ont ainsi identifiés dont notamment le gène de la kappa-caséine (voir article de revue de Formaggioni et al., 1999). En particulier, l'influence du polymorphisme du gène de la K-caséine sur les traits de la production laitière de vaches Holstein a été largement démontrée dans la littérature (Van Eenennaam et Medrano, 1991 ; Bovenhuis et al., 1992 ; Mao et al., 1992 ; Ron et al., 1994). L'allèle B de ce gène est associé à une qualité lactodynamographique du lait favorable à la production fromagère, qui permet d'obtenir plus de fromage, un caillé plus ferme et un temps de formation du caillé plus court (Martinet et Houdebine, 1993). L'influence de différents gènes de l'axe somatotrope sur la production laitière a aussi été décrite. Par exemple, l'apport d'hormone de croissance est connu pour stimuler la production laitière (voir article de Chilliard et al, 2001). Un autre gène de l'axe somatotrope, le gène Pit-1, a également été identifié comme ayant de l'influence sur la quantité de lait produite. Dans la demande de brevet PCT WO 98/03677, déposée le 22 juillet 1996, les inventeurs ont démontré que l'allèle A du gène Pit-1 était associé à des traits de production laitière avantageux, tandis que l'allèle B était plutôt associé à une meilleure production de viande. Ces deux allèles diffèrent par la substitution en position 1178 d'une adénine (allèle A) par une guanine (allèle B). L'invention a pour but de fournir une méthode d'identification d'un mammifère qui possède un génotype indicatif de traits de production laitière avantageux, qui soit indicative de potentialités élevées de production laitière et de production de protéines du lait chez ledit mammifère, et soit plus performante que les méthodes connues de l'état de la technique. Dans la suite du texte, les différents allèles du gène de la K-caséine seront désignés de la même façon que dans la littérature scientifique antérieure, tels qu'ils sont décrits dans le tableau 4 de l'article de Formaggioni et al., supra. Des exemples de méthodes pour mettre en évidence les allèles A et B du gène de la K-caséine sont décrits dans les exemples 1 et 2 cidessous, par analyse du polymorphisme de taille des fragments de restriction (Restriction Fragment Length Polymorphism, ou RFLP) et par détection allèle-spécifique, respectivement. Les allèles A et B du gène Pit-1 sont ceux décrits dans la demande de brevet PCT WO 98/03677. Les inventeurs ont par ailleurs mis en évidence un autre polymorphisme dans le gène Pit-1, au niveau de l'exon 2 (exemple 5). Les allèles C et T correspondant diffèrent par la substitution d'une adénine (allèle C) par une guanine (allèle T) dans le codon de la Sérine 65. Cette mutation, bien que silencieuse, peut servir de marqueur moléculaire associé à des traits de production laitière. En effet, les inventeurs ont observé que dans 97,8% des taureaux testés (sur un échantillon de plus de 500 taureaux Holstein), le génotype AA pour l'exon 6 est associé au génotype TT pour l'exon 2, tandis que les génotypes BB pour l'exon 6 et CC pour l'exon 2 sont corrélés. L'association entre le génotype observé pour cette mutation et les performances de production laitière est du même ordre que pour l'exon 6. Le gène Pit-1 et le gène kappa-caséine n'appartiennent pas à la même chaîne métabolique. Ils n'ont donc a priori aucune raison d'interagir. Néanmoins, les inventeurs ont mis au point une méthode d'identification d'un mammifère qui possède un génotype indicatif de traits de production laitière avantageux, dans laquelle on utilise à titre de marqueurs génétiques à la fois le gène Pit-1 et le gène de la kappacaséine. Ils ont montré que cette méthode est plus performante que les méthodes connues de l'état de la technique, basées sur l'utilisation du marqueur Pit-1 seul ou du marqueur kappa-caséine seul. L'invention porte en premier lieu sur une méthode d'identification d'un mammifère qui possède un génotype indicatif de traits de production laitière avantageux, comprenant les étapes suivantes : a) obtention d'un échantillon biologique comprenant de l'ADN dudit mammifère, b) analyse du polymorphisme des gènes Pit-1 et K-caséine dudit mammifère, dans laquelle la présence simultanée de l'allèle A et/ou T du gène de Pit-1 et de l'allèle B du gène de la K-caséine est indicative de potentialités élevées de production laitière et de production de protéines du lait chez ledit mammifère. Dans une mise en oeuvre préférée de cette méthode, le mammifère est un bovin. Les inventeurs ont en effet démontré, par une étude statistique détaillée dans l'exemple 6 ci-dessous, que des animaux génotypés AAp, t-i et BBK-case, ne présentaient des performances de production laitière bien supérieures à celles des bovins génotypés BBp, t-, AAK-caseine. En effet, comme cela est résumé notamment dans le tableau 3, les vaches testées AAp, t-i et BBK-caséine produisent environ 237 kg de lait de plus en moyenne, sur la base d'une lactation de 305 jours, que celles testées BBp, t-i et AAK- caseine. Cet effet est supérieur à la somme des effets observés pour les deux gènes individuellement (46,3 kg pour Pit-1 et 72,2 pour la K-caséine). De même, un effet très important de l'association des deux allèles favorables est observé sur la production des protéines, lequel effet est supérieur à la somme des effets individuels des deux gènes. Les résultats présentés à l'exemple 7, obtenus sur un échantillon plus réduit d'animaux, montrent que l'analyse du polymorphisme du gène de Pit-1 peut être réalisée également au niveau de l'exon 2, auquel cas c'est la présence simultanée de l'allèle T du gène de Pit-1 et de l'allèle B du gène de la K-caséine qui est indicative de potentialités élevées de production laitière et de production de protéines du lait chez l'animal testé. Des résultats publiés par Chilliard et al. (2001) montrent que l'administration d'une quantité importante d'hormone de croissance ne modifie pas significativement les taux de protéines dans le lait. Comme Pit- 1 et l'hormone de croissance appartiennent au même axe métabolique, les résultats de Chilliard et al. suggèrent que Pit-1 n'exerce pas un effet direct sur le taux de protéines produites par la glande mammaire. La quantité totale de protéines exprimée en kg pour une lactation complète peut toutefois être modifiée suite à une modification du volume de lait produit. Dans les méthodes de l'invention, la présence de l'allèle B de la Kcaséine est en outre indicative d'une qualité lactodynamographique du lait favorable à la production fromagère. Le première étape des méthodes de l'invention, c'est-à-dire l'obtention d'un échantillon biologique comprenant de l'ADN de l'animal à tester, peut être effectuée suivant n'importe quelle technique connue de l'homme du métier, par exemple à partir d'une biopsie, d'un prélèvement sanguin ou de tout autre échantilon biologique. De façon préférée, cette étape est effectuée à partir de cellules provenant des follicules pileux obtenus par arrachement de quelques poils à l'animal. Dans l'étape b) des méthodes de l'invention, l'analyse du polymorphisme du gène de la K-caséine peut être réalisée par analyse du polymorphisme de taille des fragments de restriction (RFLP), en amplifiant un fragment comportant le nucléotide 5345 de la séquence décrite par Alexander et al., 1988 (qui correspond à A dans l'allèle A et C dans l'allèle B) du gène K-caséine et en digérant le produit de cette amplification par l'enzyme de restriction Hinfl. Comme décrit dans l'exemple 1 ci-dessous, un tel fragment peut être amplifié en utilisant les amorces : 5'-ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3' (SEQ ID No : 1) et 5'-GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3' (SEQ ID No : 2). De façon alternative et préférée, l'étape b) est effectuée pour le gène K-caséine par amplification et/ou détection allèle-spécifique. L'exemple 2 illustre la technique de détection allèle-spécifique, mise en oeuvre avec les amorces et les sondes suivantes : Amorce Kappa F : CCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAG (SEQ ID No : 3), Amorce Kappa R : TCTCAGGTGGGCTCTCAATAACTT (SEQ ID No : 4), Sonde Kappa Vic : TACTCTAGAAGATTCTC (SEQ ID No : 5), Sonde Kappa Fam : TACTCTAGAAGCTTCTC (SEQ ID No : 6). De même, dans les méthodes de l'invention, l'étape b) peut être effectuée pour le gène Pit-1 par analyse du polymorphisme de taille des fragments de restriction (RFLP), en amplifiant un fragment comportant le nucléotide 1178 du gène Pit-1 et en digérant le produit de cette amplification par l'enzyme de restriction Hinfl, comme présenté dans l'exemple 3 ci-dessous. Pour cela, les amorces suvantes peuvent être utilisées : 5'-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3' (SEQ ID No : 7) 5'-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3' (SEQ ID No : 8) L'étape b) des méthodes de l'invention peut également être effectuée, pour le gène Pit-1, par amplification et/ou détection allèlespécifique. Les exemples 4 et 5 ci-dessous illustrent la technique d'amplification allèle-spécifique de fragments du gène Pit-1, respectivement dans les exons 6 et 2, avec les amorces suivantes : - pour une amplification allèle-pécifique au niveau de l'exon 6 : 5'- CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATG -3' (SEO ID No : 9), spécifique de l'allèle B, 5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATA-3' (SEQ ID No : 10), spécifique de l'allèle A, et 5'- AGATAGAGGGAAAGATATAGTGAAAGGGACAG -3' (SEQ ID No : 11) comme amorce inverse. - pour une amplification allèle-pécifique au niveau de l'exon 2 : 5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT C-3' (SEQ ID No : 12), spécifique de l'allèle C, 5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT T -3' (SEQ ID No : 13), spécifique de l'allèle T, et 5'-CA ACA GGA CTT CAT TAT TCT GTT CCT CAT TAT TCT GTT CCT T - 3' (SEQ ID No : 14) comme amorce inverse. Le polymorphisme du gène Pit-1 peut également être déterminé par détection allèle-spécifique d'un fragment amplifié de ce gène, par exemple au niveau de l'exon 6, en utilisant les sondes et les amorces suivantes : Amorce PIT-1 F : CATTCGAGATGCTCCTTAGAAATAGTAA (SEQ ID No : 15), Amorce PIT-1 R : GTTTTGTAACCGAAGGCAGAGAGA (SEQ ID No : 16), Sonde PtT-HvtGB FAM : AACTCTGATTTAGGCTTG (pour allèle A) (SEQ ID No : 17), et Sonde PIT-1MGB VIC : AACTCTGATTCAGGCTT (pour allèle B) (SEQ ID No : 18). Bien entendu, les conditions expérimentales décrites dans les exemples 1 à 5 sont indiquées à titre d'illustration seulement, et peuvent être modifiées par l'homme du métier. Ceci est le cas notamment pour les réactifs et les conditions de température utilisés pour effectuer les réactions d'amplification, mais aussi pour la séquence des amorces. En effet, il est facile, connaissant la position du polymorphisme que l'on cherche à détecter, de déterminer d'autres amorces ou sondes utilisables pour amplifier le fragment concerné et identifier l'allèle en question. Cette détermination d'amorces peut être faite à la lecture de la séquence entourant le lieu du polymorphisme, et le cas échéant, à l'aide de logiciels du type du logiciel GeneScan &commat; (Applied Biosystems). De plus, d'autres techniques peuvent être utilisées pour déterminer le polymorphisme des gènes considérés, comme par exemple les techniques connues sous les acronymes anglais SSCP (single-stranded conformation polymorphism), DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) et CFLP (cleavage fragment length polymorphism), lesquelles sont décrites par exemple dans Sambrook et al. (Molecular Cloning-A laboratory manual Third Edition-Cold Spring Harbor Laboratory Press. L'invention porte également sur un kit pour l'identification chez un bovin d'un génotype indicatif de traits de production laitière avantageux, comportant des oligonucléotides pour amplifier un fragment comportant le nucléotide 1178 du gène Pit-1, des oligonucléotides pour amplifier un fragment comportant le nucléotide 5345 du gène K-caséine, et l'enzyme de restriction Hinfl. Un tel kit peut par exemple contenir, pour amplifier un fragment comportant le nucléotide 1178 du gène Pit-1, les amorces 5'-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3' (SEQ ID No : 7) et 5'-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3' (SEQ ID No : 8), et, pour amplifier un fragment comportant le nucléotide 5345~du gène K-caséine, les amorces 5'-ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3' (SEQ ID No : 1) et 5'-GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3' (SEQ ID No : 2). Un autre objet de la présente invention est un kit pour l'identification chez un bovin d'un génotype indicatif de traits de production laitière avantageux, comportant des oligonucléotides pour effectuer une amplification et/ou une détection allèle-spécifique d'un fragment du gène Pit-1, et des oligonucléotides pour effectuer une amplification et/ou une détection allèle-spécifique d'un fragment du gène K-caséine. Dans une réalisation préférée d'un tel kit, les oligonucléotides pour l'amplification allèle-spécifique d'un fragment du gène Pit-1 sont les amorces : 5'- CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATG -3' (SEO ID No : 9), spécifique de l'allèle B, 5'- CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATA -3' (SEO ID No : 10), spécifique de l'allèle A, et 5'- AGATAGAGGGAAAGATATAGTGAAAGGGACAG -3' (SEO ID No : 11) comme amorce invel se. Dans une réalisation alternative d'un tel kit, les oligonucléotides pour l'amplification allèle-spécifique d'un fragment du gène Pit-1 ciblent l'exon 2 et sont les amorces : 5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT C-3' (SEQ ID No : 12), spécifique de l'allèle C, 5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT T-3' (SEQ ID No : 13), spécifique de l'allèle T, et 5'-CA ACA GGA CTT CAT TAT TCT GTT CCT CAT TAT TCT GTT CCT T -3' (SEQ ID No : 14) comme amorce inverse. Dans une autre réalisation préférée d'un kit de l'invention, les oligonucléotides pour la détection allèle-spécifique d'un fragment du gène de la K-caséine sont les amorces et sondes suivantes : Amorce Kappa F : CCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAG (SEQ ID No : 3) Amorce Kappa R : TCTCAGGTGGGCTCTCAATAACTT (SEQ ID No : 4) Sonde Kappa Vic : TACTCTAGAAGATTCTC (SEQ ID No : 5) Sonde Kappa Fam : TACTCTAGAAGCTTCTC (SEQ ID No : 6), et les oligonucléotides pour la détection allèle-spécifique d'un fragment du gène Pit-1 sont les amorces et sondes suivantes : Amorce PIT-1 F : CATTCGAGATGCTCCTTAGAAATAGTAA (SEQ ID No : 15), Amorce PIT-1 R : GTTTTGTAACCGAAGGCAGAGAGA (SEQ ID No : 16), Sonde PIT-1 MGB FAM : AACTCTGATTTAGGCTTG (pour allèle A) (SEQ ID No : 17), et Sonde PIT-1 MGB VIC. AACTCTGATTCAGGCTT (pour allèle B) (SEQ ID No : 18). Bien entendu, l'homme du métier pourra utiliser d'autres séquences nucléotidiques, que ce soit pour l'amplification des fragments des gènes de la K-caséine et de PIT-1 ou pour leur détection. De même, l'homme du métier pourra modifier le marquage des sondes utilisées, sans pour cela sortir du cadre de b présente invention. La présente invention porte aussi sur un marqueur génétique pour déterminer chez un bovin ses capacités de production laitière ou de viande, caractérisé en ce qu'une adénine en position 195 du gène Pit-1 est caractéristique d'une bonne production laitière et une guanine en position 195 du gène Pit-1 est caractéristique d'une bonne production de viande. Les exemples et figures présentés ci-après, à titre non limitatif, illustrent et précisent certains aspects de la présente invention. Légende des figures : La figure 1 montre le résultat de l'amplification allèle-spécifique de l'exon 6 du gène Pit-1, à partir d'ADN génomique d'un animal homozygote AA (échantillon 1), d'un animal homozygote BB (échantillon 2), et d'un animal hétérozygote AB (échantillon 3). La figure 2 montre les amorces utilisées pour effectuer un amplification allèle-spécifique appliquée au niveau de l'exon 2 du gène Pit-1. La séquence du gène est représentée en italique. La figure 3 montre le résultat de l'amplification allèle-spécifique de l'exon 2 du gène Pit-1, à partir d'ADN génomique d'animal homozygote CC (échantillon 1), d'animal homozygote TT (échantillon 2), et d'animal hétérozygote CT (échantillon 3). Exemple 1 : Mise en évidence par analyse RFLP des allèles A et B pour la kappa-caséine Le mélange réactionnel est composé d'H20, de tampon 10x, de 2mM de MgCI2, de 20 pmol d'amorces, de 0,2mM de dNTPs, de 100ng/25 l d'ADN et de 0, 6U/25il de polymérase [Goldstar DNA Polymerase, EUROGENTEC]. Le cycle de la réaction PCR est constitué d'une première phase de dénaturation de 3 min. à 96 C suivie de 40 cycles de 1 min. à 94 C, 1 min. à 66 C et de 1 min. à 72 C. La phase d'extension terminale a lieu à 720C pendant 10 min. Le produit PCR est ensuite incubé avec 20 U de l'enzyme Hinfl pendant 2 heures à 37 C. A la fin de l'incubation, 2 l de solution STOP (50% glycérol, 20 mM EDTA, 0.25% Bleu de Bromophénol) sont ajoutés et le mélange est séparé par électrophorèse dans un gel d'agarose 2%. Amorces : 5'-ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3' 5'-GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3' L'allèle appelé arbitrairement A dans la littérature scientifique est coupé par l'enzyme Hinfl et l'allèle B n'est pas digéré par l'enzyme Hinfl. Exemple 2 : Mise en évidence par détection allèle-spécifique des allèles A et B pour la kappa-caséine Le mélange réactionnel est composé par le Taq Man Universal PCR master mix (Applied biosystems Inc), en présence des amorces et sondes : Amorce Kappa F 2,5 pl Amorce Kappa R 900 nM Sonde Kappa Fam 200 nM Sonde Kappa Vic 200 nM, dans un volume complété à 5 ! JI par de l'eau. L'amplification est mesurée en temps réel, en utilisant une machine Applied Biosystems, modèle 7900HT. Le cycle de la réaction PCR est constitué d'une première phase de un cycle à 50 C pendant 2 minutes suivis de 1 cycle de 10 min à 95 C suivis de 40 cycles de 15 sec à 95 C et de 1 min à 60 C. La lecture des résultats se fait automatiquement sur l'appareil. Amorces utilisées : Primer F : CCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAG, (SEQ ID No : 3) et Primer R : TCTCAGGTGGGCTCTCAATAACTT. (SEQ ID No : 4) Sondes : Sonde Vic : TACTCTAGAAGATTCTC, (SEQ ID No : 5) et Sonde Fam : TACTCTAGAAGCTTCTC (SEQ ID No : 6). L'allèle appelé arbitrairement A dans la littérature est celui avec le nucléotide A en position 5345 et l'allèle B celui avec le nucléotide C en position 5345. Exemple 3 : Mise en évidence par analyse RFLP des allèles A et B pour le qène Pit-1 L'analyse du polymorphisme du gène Pit-1 au niveau du nucléotide 1178 a été réalisée par RFLP, en utilisant les amorces suivantes : 5'-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3' (SEQ ID No : 7), et 5'-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3' (SEQ ID No : 8). L'amplification par PCR a été réalisée dans des conditions sensiblement identiques à celles présentées dans l'exemple 1. Le produit de cette amplification est un fragment de 451 paires de base. L'incubation de ce fragment avec l'enzyme de restriction Hinf1 permet de distinguer deux allèles : l'allèle A n'est pas coupé par Hinf1 et l'allèle B comprend un site de restriction Hinf1, ce qui génère deux fragments, de 244 et 207 paires de bases. Exemple 4 : Mise en évidence par amplification allèle-spécifique des allèles A et B de l'exon 6 du gène de Pit-1 Cette méthode repose sur l'utilisation, en PCR, de deux amorces pour lesquelles le nucléotide situé en position 3'terminale est différent. Cette différence est responsable de la spécificité des amorces vis-à-vis d'un des deux allèles du gène. Cette méthode utilise donc des amorces spécifiques de chaque allèle, et ne nécessite pas l'utilisation d'enzyme de restriction. Des réactions d'amplification sont réalisées en solution H20, tampon 10x, 3 mM MgCI2, 20 mole/50 pi d'amorce spécifique (A ou B), 400/lM dNTP, 100 ng/50 d'ADN, et 1, 2 U/50 ut de polymérase [Goldstar DNA Polymerase, EUROGENTEC]. La réaction PCR comporte une première étape de dénaturation à 96 C pendant 3 minutes, suivie d'environ 35 cycles comportant 1 min. à 95 C, 1 min. à 65, 2 C et, 1 min. à 72 C. La dernière étape est réalisée à 72 C pendant 10 min. Les amorces utilisées dans cette méthode sont les suivantes : 5'- CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATG -3' (SEQ ID No : 9), spécifique de l'allèle B, 5'- CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCA T A -3' (SEO ID No : 10), spécifique de l'allèle A, et 5'- AGATAGAGGGAAAGATATAGTGAAAGGGACAG -3' (SEO ID No : 11) comme amorce inverse. Après la réaction d'amplification, les produits obtenus sont révélés sur gel d'agarose, comme montré à la figure 1. Dans cette expérience, chaque échantillon est mis en présence soit de l'amorce A, soit de l'amorce B. Le fragment PCR amplifié de 320 pb est soit présent uniquement dans le tube A (l'animal est dès lors de génotype AA), soit il n'est présent que dans le tube B (l'animal est homozygote BB) soit il est présent dans les deux tubes (l'animal est hétérozygote AB). Exemple 5 : Mise en évidence par amplification allèle-spécifique des allèles C et T pour l'exon 2 du gène de Pit-1 Un second site polymorphe a été mis en évidence par la méthode de Single Strand Conformational Polymoprhism (SSCP), au niveau du gène Pit-1. Le séquençage de la partie polymorphe du gène a permis d'identifier la mutation responsable.'1 s'agit d'une transition A- G au niveau du codon 65 de la sérine du domaine de transactivation de la protéine. L'acide aminé n'est pas modifié par cette mutation. Les deux allèles qui résultent de cette mutation entraînent l'existence de trois profils polymorphes en SSCP. L'étude de ce point de mutation sur l'échantillon de bovins Holstein nécessite la mise au point d'une méthode d'analyse rapide et facile à mettre en oeuvre, ce qui n'est pas le cas de la méthode de SSCP. Une réaction de PCR allèle-spécifique a donc été mise au point pour étudier cette mutation. L'une des amorces, appelée Pit C, est spécifique de l'allèle C. L'autre, appelée Pit T, est spécifique de l'allèle T. L'amorce Pit R, quant à elle, est utilisée comme amorce inverse. Pour augmenter la spécificité de la réaction, une mutation supplémentaire a été introduite au niveau de la 3eme base en amont de l'extrémité 3'-OH des deux amorces spécifiques (figure 2). Pit-C : 5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT C-3' (SEQ ID No : 12), Pit-T : 5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT T-3' (SEQ ID No : 13), et Pit-R : 5'-CA ACA GGA CTT CAT TAT TCT GTT CCT CAT TAT TCT GTT CCT T-3' (SEQ ID No : 14). Exemple 6 : Combinaison de l'effet du gène de Pit-1 (exon 6) avec celui du gène de la K-caséine Le génotype pour le gène de la K-caséine a été déterminé pour un échantillon de 1100 taureaux Holstein au point de mutation au niveau du nucléotide 5345 de Alexander et al., 1988, qui différentie le variant B du variant A. Les fréquences des génotypes AA, AB et BB sont les suivantes : 75%, 23% et 2% respectivement, ce qui correspond à 86,5% d'allèle A et 13,5% d'allèle B. Elles suivent la loi de Hardy-Weinberg. Ces fréquences sont similaires à celles obtenues par Van Eenennaam et Medrano (1991) à partir de 1152 vaches Holstein (82% de A et 18% de B) et par Ron et al. (1994) à partir de 119 taureaux Holstein (78,6% de AA, 20,5% de AB et 0,9% de BB). Le tableau ci-après (Tableau 1) reprend les résultats de l'étude statistique d'association entre le polymorphisme du gène K-caséine et les traits de production laitière obtenus dans le cas de cette étude, en comparaison de ceux obtenus par Van Eenennaam et al. (1991) et Ron et al. (1994). Van Eenennaam Ron et a/. 1100 taureaux et al. (1991) (1994) Holstein Caractères de production a a a Lait, Kg-146, 0-139, 3-72, 2 Matière grasse, Kg-2, 0-0, 28-4, 2 Protéines, Kg-7, 0-2, 21-2, 5 Matière grasse, %-0, 044-0, 044-0, 02 Protéines, %-0, 022-0, 022-0, 001 ! ao ! eau l : ! aateau comparant reprenant) es resuttats obtenus sur l'échantillon de 1100 taureaux Holstein Semex Alliance (Canada) et par Van Eenennaam et al. (1991), Ron et al. (1994). a : effet sur les traits de production de la substitution d'un allèle B par un allèle A du gène Kcaséine. Dans le cas des trois études, l'allèle B a un effet positif sur les quantités de lait, matière grasse et protéines produites sans modifier les pourcentages de matière grasse et de protéines. La comparaison de l'amplitude des effets montre que globalement, ceux-ci peuvent être considérés comme similaires. Les différences observées peuvent être dues à l'échantillon utilisé, au modèle statistique utilisé et/ou à l'échantillon ECHANTILLON Les effets de substitution allélique des différents gènes étudiés ont été calculés à partir d'un total de 2 397 037 lactations de 1 094 443 filles de 1100 taureaux Holstein canadiens. Les données officielles de lactation proviennent du"Canadian Dairy Network". Le tableau 2 reprend les valeurs moyennes, d'écart-types, de maximum et de minimum calculés pour les quantités de lait, de matières grasses et de protéines produits sur base d'une lactation de 305 jours. Les écart-types relativement élevés et les minimum-maximum qui reprennent une échelle de valeurs étendues montrent la diversité de cet échantillon en termes de performances de production laitière. Ces valeurs sont caractéristiques d'un échantillon non sélectionné, comprenant des bovins performants et d'autres qui le sont moins. Caractère de Moyenne Ecart-type Minimum Maximum production (en Kg) Lait 8110, 9 1778,1 1049,0 22135,0 Matière grasse 300,7 68,3 37,0 971,0 Protéines 261,1 55,6 32,0 705,0 Tableau 2 : Valeurs moyennes, écart-types, minimum et maximum calculés pour différents paramètres de production des descendantes des 1100 taureaux Holstein (Semex) calculées sur base d'une lactation de 305 jours. MODÈLE GÉNÉTIQUE Les probabilités alléliques ont été introduites dans une version simplifiée du modèle animal canadien : y=Xh+Tt+Qr+Zp+Z*a+e avec : y = vecteur des productions de lactation à 305 jours (lait, matière grasse ou protéines) h = vecteur des effets fixes troupeau-année-saison (octobre à février et mars à septembre)-parité (première ou supérieure) t = vecteur des effets fixes lactation (1 à 6 ou plus) - classes d'âge-mois de lactation. r = vecteur des 2 coefficients de régression sur les probabilités alléliques transformées p = vecteur des effets aléatoires environnement permanent a = vecteur des effets aléatoires polygéniques e = vecteur des effets aléatoires résiduels X, T, Z et Z* = matrices d'incidence liant h, t, p et a à y, et Q = matrice des variables de régression avec 2 colonnes, 1 pour chaque probabilité allélique (Pit 1, K-caséine). Les composantes de la variance employées sont celles utilisées au Canada. Il s'agit d'une héritabilité de 0,33 et d'une répétabilité de 0,54. Les équations ont été résolues avec l'aide du"preconditioned conjugate gradient'car la convergence a été très lente. Un nombre d'itérations supérieur à 300 a été typiquement nécessaire. La différence entre les deux coefficients est proportionnelle à 2 x l'effet de substitution allélique. Celui-ci est obtenu par un calcul tenant compte de la transformation arcsinus des variables de régression. Les résultats pour les taux de matière grasse et de protéine sont obtenus indirectement en tenant compte des moyennes de la population : avec : L = moyenne de lait dans la population AL = effet sur le lait c% = moyenne sur le taux du composant du lait (matière grasse ou protéine) AC= effet sur le composant (en quantité) AC% = effet sur le composant (en taux) Résultats Le tableau 3 montre les effets additifs estimés dans le cas de 1100 taureaux Holstein canadiens sur les traits de la production laitière. Pit-1 AAP, t-lBBK-caseineK-caséine (exon6) BBPit-1AAK-caséine Caractères de production a1 a2 a3 Lait, Kg 46,3 -72,2 237 Matière grasse, Kg 1, 5-4, 2 11,4 Protéines, Kg 1,9 -2,5 8,8 Matière grasse, % -0, 0002 -0, 02 Protéines, % 0, 004 -0, 001 - Tableau 3 : effets additifs estimés dans le cas de 1100 taureaux Holstein canadiens sur les traits de la production laitière. a : effet sur les traits de production de la substitution d'un allèle B par un allèle A du gène Pit-1. a2 : effet sur les traits de production de la substitution d'un allèle B par un allèle A du gène K-caséine. a3 : effet sur les traits de production de la substitution d'un allèle B par un allèle A du gène Pit-1 et de la substitution d'un allèle A par un allèle B du gène K-caséine. Une sélection des meilleurs allèles des gènes Pit-1 (allèle A) et Kcaséine (allèle B) pourrait donc conduire à une augmentation importante des quantités de lait, matière grasse et protéines du lait, sans pour cela modifier le pourcentage de protéines et de matière grasse dans le lait. Exemple 7 : Combinaison de l'effet de Pit-1 (exon 2) avec celui de K-caséine Le modèle animal et le modèle statistique sont identiques à ceux décrits dans l'exemple précédent. Le tableau 4 résume les résultats observés : TTp, t-lBBK-caséme Pit-1 K-caséine versus (exon2) CCPit-1AAK-caséine Caractères de production c a a Lait, Kg 17, 11-21, 41 77, 04 Matière grasse, Kg 1, 57-1, 21 5,56 Protéines, Kg 1, 18-0, 14 2, 64 Matière grasse, % 0, 015-0, 01Protéines, % 0,011 -0,001 - Tableau 4 : effets additifs estimés dans le cas de 1100 taureaux Holstein canadiens sur les traits de la production laitière. a 1 : effet sur les traits de production de la substitution d'un allèle C par un allèle T du gène Pit-1. a2 : effet sur les traits de production de la substitution d'un allèle B par un allèle A du gène K-caséine. a3 : effet sur les traits de production de la substitution d'un allèle C par un allèle T du gène Pit-1 et de la substitution d'un allèle A par un allèle B du gène K-caséine. On voit donc qu'en utilisant simultanément, suivant l'invention, l'allèle T du gène Pit-1 et l'allèle B du gène kappa-caséine, on obtient une augmentation importante des quantités de lait, matière grasse et protéines du lait sans pour cela modifier le pourcentage de protéines et de matières grasses dans le lait. Bibliographie (1) Alexander et al. (1988) Eur. J. Biochem., 178 (2), 395-401). Accession number : X14908, X14326 (2) Bovenhuis S., Van Arendonk J., Korver S. (1992). Association between milk protein polymorphisms and milk traits. J. Dairy Sci., 75 : 2549-2559. (3) Chilliard et al, Biotechnology in Animal Husbandry, Renaville R. & Burny A. (eds), Kluwer academic publishing, pages 65-97 (mai 2001)). (4) Formaggioni et al. (1999) Milk protein polymorphism : detection and diffusion of the genetic varaiants in bos genus. Annali della Facoltà di Medicina Veterinaria Vol. XIX (5) Mao I., Buttanozi L. G., Aleandri R. (1992). Effetcs of polymorphic milk protein genes on milk yield and composition traits in Holstein cattle. Acta Agric. Scand., Sect. A, Animal Sci., 42 : 1-7. (6) Martinet et Houdebine (1993) Biologie de la lactation Editions Inserm, Inra Editions 587 pages. (7) Ron M., Yoffe O., Ezra E., Medrano J. F., Weller (1994). Determination of effects of milk protein genotype on production traits of Israeli Holsteins. J. Dairy Sci., 77 : 1106-1113. (8) Sambrook et al. (Molecular Cloning-A laboratory manual Third Edition-Cola Spring Harbor Laboratory Press. (9) Van Eenennaam A., Medrano J. F. (1991). Milk protein polymorphisms in California dairy cattle. J. Dairy Sci., 74 : 1730- 1742. (10) EP 96 401 634.9, déposée le 22 juillet 1996. REVENDICATIONS 1. Méthode d'identification d'un mammifère qui possède un génotype indicatif de traits de production laitière avantageux, comprenant les étapes suivantes : a) obtention d'un échantillon biologique comprenant de l'ADN dudit mammifère, b) analyse du polymorphisme des gènes Pit-1 et K-caséine dudit mammifère, dans laquelle la présence simultanée de l'allèle A et/ou de l'allèle T de Pit-1 et de l'allèle B de la K-caséine est indicative de potentialités élevées de production laitière et de production de protéines du lait chez ledit mammifère. 2. Méthode d'identification selon la revendication 1, dans laquelle le mammifère est un bovin. 3. Méthode d'identification selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la présence de l'allèle B de la K-caséine est en outre indicative d'une qualité lactodynamographique du lait favorable à la production fromagère. 4. Méthode d'identification selon les revendications 1 à 3, dans laquelle l'étape a) est effectuée à partir de cellules de follicules pileux de l'animal. 5. Méthode d'identification selon les revendications 1 à 4, dans laquelle l'étape b) est effectuée pour le gène K-caséine par analyse du polymorphisme de taille des fragments de restriction (RFLP), en amplifiant un fragment comportant le nucléotide 5345 du gène K-caséine et en digérant le produit de cette amplification par l'enzyme de restriction Hinfl. 6. Méthode d'identification selon la revendication 5, dans laquelle le fragment du gène K-caséine comportant le nucléotide 5345 est amplifié avec les amorces : 5'-ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3' (SEQ ID No : 1) et 5'-GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3' (SEQ ID No : 2) 7. Méthode d'identification selon les revendications 1 à 4, dans laquelle l'étape b) est effectuée pour le gène K-caséine par amplification et/ou détection allèle spécifique. 8. Méthode d'identification selon la revendication 7, dans laquelle l'amplification allèle-spécifique du gène K-caséine est effectuée avec les amorces 5'- CCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAG -3' (SEO ID No : 3) et 5'- TCTCAGGTGGGCTCTCAA T AACTT -3' (SEO ID No : 4), et les sondes Vic : 5'- TACTCTAGAAGATTCTC -3' (SEO ID No : 5) et Fam : 5'- TACTCTAGAAGCTTCTC -3' (SEO ID No : 6) 9. Méthode d'identification selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle l'étape b) est effectuée pour le gène Pi-1 par analyse du polymorphisme de taille des fragments de restriction (RFLP), en amplifiant un fragment comportant le nucléotide 1178 du gène Pit-1 et en digérant le produit de cette amplification par l'enzyme de restriction Hinfl. 10. Méthode d'identification selon la revendication 9, dans laquelle le fragment du gène Pit-1 comportant le nucléotide 1178 est amplifié avec les amorces 5'-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3' (SEQ ID No : 7) 5'-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3' (SEQ ID No : 8) 11. Méthode d'identification selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle l'étape b) est effectuée pour le gène Pit-1 par amplification et/ou détection allèle-spécifique. 12. Méthode d'identification selon la revendication 11, dans laquelle l'amplification allèle-spécifique du gène Pit-1 est effectuée au niveau de l'exon 6, avec les amorces 5'- CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCA TG -3' (SEO ID No : 9), spécifique de l'allèle B, 5'- CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATA -3' (SEQ ID No : 10), spécifique de l'allèle A, et 5'-AGATAGAGGGAAAGATATAGTGAAAGGGACAG -3' (SEQ ID No : 11) comme amorce inverse. 13. Méthode d'identification selon la revendication 11, dans laquelle l'amplification allèle-spécifique du gène Pit-1 est effectuée au niveau de l'exon 2, avec les amorces 5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT C -3' (SEO ID No : 12), spécifique de l'allèle C, 5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT T -3' (SEQ ID No : 13), spécifique de l'allèle T, et 5'-CA ACA GGA CTT CAT TAT TCT GTT CCT CAT TAT TCT GTT CCT T -3' (SEQ ID No : 14) comme amorce inverse. 14. Méthode d'identification selon la revendication 11, dans laquelle la détection allèle-spécifique du gène Pit-1 est effectuée au niveau de l'exon 6, avec les amorces suivantes : Amorce PIT-1 F : CATTCGAGATGCTCCTTAGAAATAGTAA (SEQ ID No : 15), Amorce PIT-1 R : GTTTTGTAACCGAAGGCAGAGAGA (SEQ ID No : 16), Sonde PIT-1 MGB FAM : AACTCTGATTTAGGCTTG (pour allèle A) (SEQ ID No : 17), et Sonde PIT-1 MGB VIC : AACTCTGATTCAGGCTT (pour allèle B) (SEQ ID No : 18). 15. Kit pour l'identification chez un bovin d'un génotype indicatif de traits de production laitière avantageux, comportant des oligonucléotides pour amplifier un fragment comportant le nucléotide 1178 du gène Pit-1, des oligonucléotides pour amplifier un fragment comportant le nucléotide 5345 du gène K-caséine, et l'enzyme de restriction Hinfl. 16. Kit selon la revendication 15, dans lequel les oligonucléotides pour amplifier un fragment comportant le nucléotide 1178 du gène Pit-1 sont les amorces : 5'-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3' (SEO ID No : 7) et 5'-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3' (SEO ID No : 8), et les oligonucléotides pour amplifier un fragment comportant le nucléotide 5345 du gène K-caséine sont les amorces 5'-ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3' (SEQ ID No : 1) et 5'-GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3' (SEO ID No : 2). 17. Kit pour l'identification chez un bovin d'un génotype indicatif de traits de production laitière avantageux, comportant des oligonucléotides pour effectuer une amplification et/ou détection allèle-spécifique d'un fragment du gène Pit-1, et des oligonucléotides pour effectuer une amplification et/ou détection allèle-spécifique d'un fragment du gène K-caséine. 18. Kit selon la revendication 17, dans lequel les oligonucléotides pour l'amplification allèle-spécifique d'un fragment du gène Pit-1 sont les amorces 5'- CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATG -3' (SEO ID No : 9), spécifique de l'allèle B, 5'- CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATA -3' (SEO ID No : 10), spécifique de l'allèle A, et 5'- AGATAGAGGGAAAGATATAGTGAAAGGGACAG -3' (SEO ID No : 11) comme amorce inverse. 19. Kit selon la revendication 17, dans lequel les oligonucléotides pour l'amplification allèle-spécifique d'un fragment du gène Pit-1 sont les amorces 5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT C-3' (SEQ ID No : 12), spécifique de l'allèle C, 5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT T-3' (SEQ ID No : 13), spécifique de l'allèle T, et 5'-CA ACA GGA CTT CAT TAT TCT GTT CCT CAT TAT TCT GTT CCT T -3' (SEQ ID No : 14) comme amorce inverse. 20. Kit selon la revendication 17, dans lequel les oligonucléotides pour la détection allèle-spécifique d'un fragment du gène Pit-1 sont les amorces : Amorce PIT-1 F : CATTCGAGATGCTCCTTAGAAATAGTAA (SEQ ID No : 15), Amorce PIT-1 R : GTTTTGTAACCGAAGGCAGAGAGA (SEQ ID No : 16), et les sondes : Sonde PIT -1 MGB F AM : AACTCTGATTTAGGCTTG (pour allèle A) (SEQ ID No : 17), et Sonde PIT-1MGB VIC : AACTCTGATTCAGGCTT (pour allèle B) (SEQ ID No : 18). 21. Kit selon la revendication 17, dans lequel les oligonucléotides pour la détection allèle-spécifique d'un fragment du gène K-caséine sont les amorces 5'- CCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAG -3' (SEO ID No : 3) et 5'- TCTCAGGTGGGCTCTCAATAACTT -3' (SEO ID No : 4), et les sondes Vic : 5'- TACTCTAGAAGATTCTC -3' (SEO ID No : 5) et Fam : 5'- TACTCTAGAAGCTTCTC -3' (SEO ID No : 6) 22. Marqueur génétique pour déterminer chez un bovin ses capacités de production laitière ou de viande, caractérisé en ce qu'une adénine en position 195 du gène Pit-1 est caractéristique d'une bonne production laitière et une guanine en position 195 du gène Pit-1 est caractéristique d'une bonne production de viande.