Brevet FR2834519A1 — publié le 20030711

La présente invention concerne notamment une séquence nucléotidique promoteur et ses variants, capable de commander l'expression d'un gène d'intérêt spécifiquement dans le phloème, une construction nucléotidique comprenant une telle séquence, un procédé d'obtention d'une plante transformée productrice d'une substance destinée à éliminer des pathogènes. Le phloème est responsable du transport à partir d'organes sources de photoassimilats ainsi que d'autres molécules telles que des ARN, des peptides signal, ou d'autres molécules impliquées dans différents mécanismes physiologiques ou de développement (Oparka et Turgeon, 1999, Ruiz-Medrano et al., 2001). Un certain nombre d'insectes piqueurs suceurs, bien connus de l'homme du métier, notamment des homoptères tels que les familles Aphididae (pucerons), les Aleyrodidae (aleurodes), les Cicadellidae (ciccadelles), se nourrissent spécifiquement à partir des cellules conductrices du phloème, avec pour conséquence d'endommager les plantes en leur transmettant des virus pathogènes. D'autres dégâts induits par les insectes piqueurs suceurs résultent du prélèvement de sève élaborée, qui prive la plante de nutriments et d'eau, conduisant à des pertes de vigueur et à un flétrissement, à l'excrétion par l'insecte de composés phytotoxiques présents dans sa salive, ou à l'obstruction des tubes criblés suites aux piqûres, entraînant des effets physiologiques défavorables. La colonisation systémique de plantes, notamment par des phytovirus et des phytoplasmes, se fait par l'intermédiaire du phloème. De tels agents pathogènes sont responsables de dégâts importants, tels que des réductions de croissance, des déformations d'organes, des dépérissements. On connaît déjà des techniques de lutte contre les insectes piqueurs suceurs, notamment des traitements chimiques ou des méthodes de lutte biologique. Toutefois certains de ces traitements ne sont pas suffisants pour lutter contre ces insectes et/ou contre des agents transmis par ces insectes (virus, phytoplasmes...) . Une autre stratégie de défense consiste à faire exprimer spécifiquement dans le phloème des gènes d'intérêt capables de lutter contre de tels ravageurs ou pathogènes, tels que des gènes codant pour des toxines actives contre ces ravageurs ou pathogènes. On connaît déjà des séquences nucléotidiques issues de virus de plantes utilisables pour contrôler l'expression de transgènes dans des plantes (Mushegian et Sheperd, 1995). En particulier, plusieurs promoteurs capables d'induire des niveaux d'expression élevés d'un gène dans des plantes transgéniques ont été isolés de virus de plantes à ADN. On citera en particulier des promoteurs issus de virus tels que le Cauliflower mosaic caulimovirus (Odell et al., 1985), le Figword mosaic caulimovirus (Sanger et al., 1990), le Cassava vein mosaic caulimovirus (Verdaguer et al., 1996), le Mirabilis mosaic caulimovirus (Nrisingha et al., 1999), le Commelina yellow mottle badnavirus (Medberry et al., 1992), le Rice tungro bacilliform badnavirus (Bhattacharyya-Pakrasi et al., 1993) le Sugarcane bacilliform badnavirus (Schenk et al., 1999), le Banana streak badnavirus (Schenk et al., 2001), le Maize streak geminivirus (Matzithulela et al., 2000). L'activité de tels promoteurs viraux dans les plantes transgéniques, lorsqu'elle est observée, est souvent associée, mais non exclusivement, à des cellules du phloème. De tels promoteurs viraux sont particulièrement intéressants car, contrairement à de nombreux promoteurs de plantes, ils répondent rarement à des signaux métaboliques ou physiologiques, ce qui conduit à un profil d'expression de ces promoteurs qui est stable durant la vie de la plante. Toutefois il existe toujours le besoin d'améliorer encore les traitements actuels, et notamment : - d'obtenir un niveau d'expression du transgène d'intérêt plus élevé qu'avec les promoteurs connus, - de cibler encore davantage l'expression du transgène dans le phloème, - de pouvoir utiliser un même promoteur pour un large spectre de plantes. On recherche tout particulièrement en effet : - des promoteurs viraux présentant une forte activité générale dans l'ensemble du phloème, aérien et souterrain, notamment une activité dans la racine, la tige, la feuille, les organes floraux : certains promoteurs de l'art antérieur ont en effet une action limitée au phloème de certains organes, par exemple foliaire, ce qui limite le spectre d'insectes nuisibles cibles ; - des promoteurs utilisables chez plusieurs espèces, à la fois des dicotylédones (solanacées, cucurbitacées, brassicacées), et des monocotylédones. On recherche en particulier des promoteurs capables de commander l'expression de molécules de défense contre des agents pathogènes (virus, phytoplasmes...) ou contre des ravageurs (insectes piqueurs-suceurs), telles que des molécules insecticides, des peptides antimicrobiens, pour obtenir des plantes résistantes aux insectes piqueurs suceurs et/ou aux pathogènes qu'ils véhiculent. En outre, on recherche des promoteurs viraux dont l'expression n'est pas altérée par des virus apparentés aux virus à partir desquels sont obtenus ces promoteurs. En effet, il peut arriver que l'expression d'un promoteur viral soit modulée durant le cycle d'infection virale, par des facteurs viraux, en particulier par des virus apparentés au virus à partir duquel est obtenu ce promoteur, au niveau de la transcription (Hong et al., 1996) ou au niveau de la traduction (Maiti et al., 1998). Une telle activation n'est pas souhaitée en terme de contrôle de l'expression du transgène dans la plante transgénique hôte. Par ailleurs, compte tenu de la forte variabilité de spécificité d'expression et de niveau d'activité des promoteurs viraux chez les plantes, y compris dans une famille de virus donnée, il n'est pas du tout évident pour un homme du métier de prévoir l'efficacité d'un promoteur donné dans un tissu donné. Une telle détermination nécessite la mise au point de protocoles appropriés pour des promoteurs candidats judicieusement choisis. L'invention vise à pallier les inconvénients précités de l'art antérieur et a pour objet selon un premier aspect une séquence nucléotidique promoteur, capable de commander l'expression d'un gène d'intérêt spécifiquement au niveau du phloème. Cette séquence promoteur comprend la séquence nucléotidique correspondant à SEQ ID N 1. Cette séquence promoteur dite pWDV est issue du Wheat dwarf virus. La gamme d'hôte du WDV est large, incluant notamment le blé, l'orge, l'avoine, et une large variété de graminées. Le WDV est décrit notamment par Bendahmane et al. 1995. Le terme "transgène" ou gène d'intérêt fait référence à un gène introduit et exprimé dans des cellules d'une plante transgénique régénérée exprimant le caractère codé par ce transgène. Les séquences promoteur selon l'invention sont aptes à contrôler le niveau d'expression d'un transgène dans le phloème. On rappelle qu'un promoteur est une séquence nucléotidique qui est capable de moduler ou contrôler le niveau de transcription d'un gène sous le contrôle de ce promoteur, et qui permet (ou fournit un site pour) la liaison de l'ARN polymérase lors de la transcription. La position d'un promoteur est définie par rapport au site du début de la transcription. On connaît des séquences promoteurs consensus retrouvées chez les promoteurs de plantes, en particulier une boîte TATA située environ 19 à 27 bases en amont de ce site et une boîte CAAT située environ 70 à 80 bases en amont de ce site. On rappelle également que l'on connaît des séquences nucléotidiques, ne faisant pas partie du promoteur, et susceptibles de moduler l'expression d'un gène d'intérêt, en particulier : -des séquences leaders et des séquences enhancers, qui interviennent à un niveau posttranscriptionnel ou traductionnel (notamment stabilisation d'ARN et effet sur la transcription dans les ribosomes), par exemple le leader EMCV (Elroy-Stein et al, 1989) et le leader TMV (Gallie et al., 1989). -des boîtes de régulation intervenant à un niveau transcriptionnel, capables de commander au moins partiellement l'activité d'un promoteur ; ces dernières boites de régulation peuvent être inductibles par un facteur physiologique ou de l'environnement de la plante. Par promoteur, ou activité promoteur, spécifique du phloème, on entend que le promoteur est capable de commander l'expression du gène d'intérêt spécifiquement au niveau du phloème (et plus précisément dans la totalité ou la quasi totalité du phloème), à un niveau suffisant pour conférer la propriété insecticide ou antimicrobienne. On utilisera indifféremment l'expression dans le phloème, ou au niveau du phloème. Le niveau suffisant d'expression s'apprécie en terme d'efficacité par exemple insecticide par rapport au niveau en absence dudit promoteur. Typiquement, l'expression du gène d'intérêt dans le phloème obtenue grâce au promoteur selon l'invention est typiquement 2 à 10 fois plus forte que l'expression de ce gène dans d'autres tissus. Ceci n'exclut pas que cette expression soit également stimulée dans d'autres tissus végétaux, xylème notamment, mais on cible avant tout une expression au moins dans le phloème (au moins dans l'essentiel du phloème) pour atteindre l'effet souhaité. Les inventeurs ont démontré la spécificité vasculaire de l'expression obtenue grâce au promoteur selon l'invention, plus précisément dans les différents types cellulaires du phloème, i.e parenchyme phloémien, cellules compagnes et cellules des tubes criblés, cette expression étant détectable à l'aide de tests histochimiques. On obtient de manière très avantageuse une forte activité dans le phloème, l'activité étant confirmée dans les organes souterrains et aériens, en particulier la racine, la tige, la feuille, les organes floraux. L'invention concerne également une séquence nucléotidique promoteur, choisie parmi : a) une séquence nucléotidique comportant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N 1 b) une séquence nucléotidique complémentaire de la SEQ ID N 1 ou d'une séquence définie en a) c) un fragment représentatif d'une séquence définie en a), ou b) d) une séquence nucléotidique comprenant une séquence telle que définie en a), b), ouc) e) une séquence nucléotidique modifiée d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b), c) ou d), ladite séquence promoteur étant capable de commander l'expression d'un gène d'intérêt spécifiquement dans le phloème. Selon un mode de réalisation préféré, le gène d'intérêt code un insecticide, en particulier un insecticide contre les insectes piqueurs suceurs, notamment les Homoptères. Selon un mode de réalisation le gène d'intérêt code un peptide ou un polypeptide toxique vis-à-vis de parasites des organes aériens et/ou racinaires des plantes. Selon un mode de réalisation le gène d'intérêt code une substance anti-microbienne (désignée indifféremment anti-pathogène) en particulier antibactérienne. Les principaux pathogènes vasculaires sont connus de l'homme du métier. Selon un mode de réalisation le gène d'intérêt code un éliciteur de la résistance des plantes à des parasites ou des ravageurs. Selon un mode de réalisation le gène d'intérêt code une élicitine. De nombreuses élicitines sont connues de l'homme du métier et décrites par exemple dans Picard et al. (2000). Les élicitines sont des protéines généralement de faible poids moléculaire qui induisent une réaction de défense de la plante, telle que la réponse hypersensible ou la résistance systémique acquise (Yu, 1995). Selon une réalisation, on utilisera une élicitine de type cryptogéine ; certaines cryptogéines étant nécrotiques, l'homme du métier prendra soin le cas échéant d'assurer la transgénèse en utilisant des boîtes de régulation appropriées. Selon une autre réalisation le gène d'intérêt code l'oligandrine, notamment de Pythium oligandrum, un mycopathogène utilisé en lutte biologique, cette élicitine étant non toxique pour la plante (Picard et al, 2000). Selon un mode de réalisation le gène d'intérêt code un peptide à effet répulsif, en particulier contre les insectes effectuant une première piqûre de gouttage. Selon un mode de réalisation le gène d'intérêt code une substance active contre des insectes vecteurs de transmission de pathogènes, en particulier de pathogènes responsables de maladies virales ou parasitaires. Selon un mode de réalisation le gène d'intérêt code une lectine toxique vis-à-vis d'insectes piqueurs suceurs ou d'agents pathogènes, notamment une lectine, par exemple la lectine de perce neige GNA. D'autres gènes d'intérêt sont utilisables, notamment : -un gène d'inhibiteur de protéases pour les insectes piqueurs suceurs (notamment sérine ou cystéine protéases), -un gène de toxine issue de Bacillus thuringiensis, efficace contre certains pucerons, telle qu'une protéine CAMB décrite dans le document US 6 150 156, -un gène de lipoxydase dont la toxicité contre des insectes piqueurs suceurs est décrite dans le brevet US 5 604 121. Par "séquence nucléotidique homologue", on entend toute séquence nucléotidique qui diffère de la séquence SEQ ID N 1 par substitution, délétion, et/ou insertion d'un nucléotide ou d'un nombre réduit de nucléotides, à des positions telles que ces séquences nucléotidiques homologues possèdent une activité promoteur telle que décrite précédemment. De préférence, une telle séquence nucléotidique homologue est identique à au moins 80 % de la séquence SEQ ID N 1, de préférence au moins 85, 90,92, 95,98%. Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques, on entend désigner un pourcentage de nucléotides identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé à l'aide d'algorithmes mathématiques. D'une manière préférée, non limitative, on peut citer différents algorithmes rappelés dans Altschul et al (1998) notamment les algorithmes présentés dans Altschul et al (1990), Karlin et Altschul (1993) . On pourra utiliser par exemple les programmes : -BLAST, notamment BLASTN, BLAST2 (Tatusova et al., 1999), gapped BLAST (Altschul et al., 1997), ou -FASTA (Altschul et al., 1990). De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement à la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID N 1, dans des conditions stringentes. Les paramètres définissant les conditions de stringence appropriées (par exemple une solution 6xSSC) sont connus de l'homme du métier, notamment décrits dans Ausubel et al. (1995). Par fragment nucléotidique , on entend tout fragment de la séquence SEQ ID N 1 ou des séquences nucléotidiques homologues de la séquence SEQ ID N 1, qui conduisent à une activité promoteur spécifique du phloème telle que définie précédemment. Ces fragments nucléotidiques présentent au moins 15 nucléotides, de préférence au moins 30,75, 150,300 nucléotides consécutifs de la séquence dont ils sont issus. Ces fragments ont une activité promoteur spécifique du phloème, et de préférence d'au moins 20,30, 50, 80, 90%, voire plus de 100%, de l'activité promoteur spécifique du phloème obtenue avec SEQ ID N 1. Pour tester cette activité promoteur spécifique du phloème des fragments, l'homme du métier dispose notamment de la méthode présentée dans les exemples détaillés décrits ci-après. Parmi les fragments représentatifs on peut notamment utiliser les éléments fonctionnels (boîtes de régulation) de ce promoteur qui après transgénèse confèrent la spécificité d'expression dans le phloème. Par séquence nucléotidique modifiée, on entend toute séquence nucléotidique obtenue par mutagénèse selon des techniques appropriées, et comportant des modifications par rapport aux séquences normales. Des variants du promoteur selon l'invention peuvent êtres ainsi préparées selon les techniques appropriées telles que la mutagenèse dirigée site spécifique, par exemple décrite dans Upender et al. (1995). On peut par exemple obtenir des promoteurs mutés par délétions et cribler des mutants actifs pour identifier les séquences nécessaires à l'activité phloème spécifique. Les fragments représentatifs selon l'invention peuvent également être des sondes ou amorces, qui peuvent être utilisées dans des procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquences nucléiques. Ces procédés peuvent faire intervenir des techniques connues de l'homme du métier, y compris les techniques d'amplification du type PCR (polymerase chain reaction) utilisant des amorces nucléotidiques correspondant à des portions de la séquence SEQ ID N 1. Une sonde ou amorce se définit, au sens de l'invention, comme étant un fragment d'acide nucléique simple brin ou un fragment double brin dénaturé comprenant au moins 10 bases, de préférence au moins 15,30 bases, et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique cible. De telles sondes seront en particulier utilisables dans des programmes de sélection assistée par marqueur, par exemple pour suivre l'introgression du promoteur dans la plante transformée. L'invention concerne également une séquence nucléotidique telle que décrite précédemment, comprenant une association de boîtes de régulation, représentative du promoteur, capable de conférer l'activité phloème spécifique. Grâce à l'invention, l'on peut commander ' l'expression d'un gène d'intérêt spécifiquement dans le phloème d'une plante transformée, par transfert d'une construction nucléotidique comprenant au moins : - la séquence promoteur SEQ ID N 1 ou une séquence promoteur définie en a) à e) - un gène d'intérêt dont l'expression est commandée par cette séquence promoteur. L'invention concerne donc selon un autre aspect une construction nucléotidique (indifféremment désignée cassette d'expression dans ce texte) comprenant une séquence promoteur selon l'invention (une séquence comprenant SEQ ID N 1, ou une séquence promoteur définie en a) à e)), liée de manière opérationnelle à au moins un gène d'intérêt. La préparation d'une telle construction ADN peut être réalisée de différentes manières appropriées par l'homme du métier. Brièvement, le gène d'intérêt peut être cloné en aval du promoteur en utilisant des enzymes de restriction pour assurer son insertion dans une orientation appropriée au regard du promoteur de manière qu'il soit exprimé. Une fois cet ADN d'intérêt lié opérationnellement au promoteur, la construction ainsi formée peut être clonée dans un plasmide ou autre vecteur. La séquence promoteur contrôle la transcription du gène d'intérêt en un ARN messager fonctionnel. La construction nucléotidique préparée comprend typiquement également une région de terminaison de la transcription. Selon une réalisation on utilise pour une telle construction au moins une des séquences suivantes : - une séquence dite séquence en boucle, conservée chez les geminivirus, repérée nt 163 à nt 208 sur la séquence SEQ ID N 1, cette région étant nécessaire à la réplication de l'ADN du promoteur pWDV, - des éléments agissant en cis nécessaires à la réplication du WDV (Kammann et al., 1991), - un signal pour la transcription (Hofer et al., 1992), comprenant le début de transcription pour les gènes VIet C 1-1, - des éléments caractéristiques de promoteurs eucaryotes, identifiés sur le brin positif de la région LIR de WDV, tels que la boîte CAAT en position 114 et 115, - la boîte GATA, pour la liaison de facteurs 2-ASF (Lam et al., 1989), repérée sur le brin complémentaire de la région LIR du WDV, en position 341. Dans ce document, on utilise l'expression un gène d'intérêt ; cette expression fait référence à au moins un gène d'intérêt, ceci dans le cas où l'on utilise plusieurs gènes d'intérêt susceptibles d'être commandés par un même promoteur selon l'invention. Par exemple selon une réalisation dans laquelle le promoteur WDV est utilisé en orientation sens et en orientation antisens, on pourra utiliser une construction nucléotidique comprenant un promoteur selon l'invention, entouré de chaque côté par un gène d'intérêt ; cette construction pourra commander l'expression des deux gènes d'intérêt. On comprend en outre que l'on peut transférer une construction nucléotidique comprenant non seulement un promoteur lié opérationnellement à un gène d'intérêt, mais aussi au moins une séquence capable de modifier l'activité du promoteur, en particulier une séquence enhancer et/ou une séquence leader. Selon une réalisation, on cherchera à obtenir une expression spécifique du phloème, et inductible (par exemple en réponse à une attaque de pathogènes ou de ravageurs, à un stress hydrique, à un stress salin). La seule séquence promoteur SEQ ID N 1 n'est pas inductible en réponse à des pathogènes notamment à des insectes piqueurs suceurs. Toutefois, l'on peut obtenir une plante transformée à l'aide d'une construction inductible comprenant : - une construction comprenant un promoteur selon l'invention associé à un gène d'intérêt, - et une boîte de régulation connue pour être inductible, de manière que cette boîte inductible commande l'activité du promoteur qui lui même commande l'expression du gêne d'intérêt. De telles boîtes inductibles sont connues notamment du document US 5 981 843 qui les nomme élément de régulation de la transcription inductible par des pathogènes . L'invention concerne ainsi selon un autre aspect de telles constructions inductibles. Selon un autre aspect l'invention concerne un vecteur de clonage et/ou d'expression comprenant une construction nucléotidique telle que décrite précédemment. Selon un autre aspect l'invention concerne une cellule hôte transformée avec les séquences nucléiques décrites ci-dessus. Selon un autre aspect l'invention concerne les cellules végétales transformées par un vecteur tel que défini précédemment, à l'aide d'un hôte cellulaire susceptible d'infecter lesdites cellules végétales en permettant l'intégration dans le génome de ces dernières, des séquences nucléotidiques promoteur initialement contenues dans le génome du vecteur utlisé. Le terme transformation fait référence à une manipulation génétique de cellules végétales susceptibles d'être transformées telles que des cellules de cals, d'embryons, des cellules en suspension dans des cultures (cultures issues par exemple de cals, d'embryons, de tissus de feuilles, d'inflorescences jeunes, d'anthères). Une plante transgénique peut être obtenue par différentes techniques connues de l'homme du métier incluant, de manière non limitative, le transfert d'ADN médié par Agrobacterium tumefaciens, en utilisant un vecteur d'ADN-T désarmé, ou des méthodes de transfert direct telles que les méthodes de transformation de protoplastes ou les méthodes biolistiques. Ces techniques sont en particulier développées pour l'introduction d'ADN dans les monocots ainsi que des dicots, ainsi que les techniques pour cultiver et régénérer des plantes entières à partir des tissus ainsi transformés. Ces techniques sont connues de l'homme du métier et les plus fréquemment utilisées pour la transformation de monocotylédones ou de dicotylédones sont par exemple décrites dans les références Hansen et Wright (1999), Komari et al. (1998). Les techniques et les agents pour sélectionner les cellules végétales et/ou les tissus végétaux incorporant des séquences nucléotidiques marqueurs associées au gène d'intérêt sont également bien connues de l'homme de métier, et comprennent, de manière non exclusive, l'utilisation de gènes marqueurs tels que des gènes conférant des résistances à un antibiotique ou à des herbicides, ou de systèmes de sélection positive, cités par exemple dans Gelvin 1998, en particulier le système basé sur une sélection sur mannose, en présence du gène de sélection de la MPI (Mannose-6phosphate isomérase) (Hansen et Wright, 1999), ou de systèmes de sélection couplés à l'élimination des gènes marqueurs après sélection (Ebinuma et al., 1997). Enfin, les plantes transformées peuvent également être sélectionnées par criblage PCR en l'absence de gènes marqueurs de sélection (McGarvey et Kaper, 1991). Les techniques de génie génétique pour la transformation génétique de cellules ou de tissus végétaux seront utilisées pour le transfert d'une cassette d'expression comprenant le promoteur WDV, ou un promoteur chimérique comprenant la séquence du promoteur du WDV, fusionné à une séquence hétérologue codante, codant pour un gène d'intérêt et des séquences de terminaison de transcription. Les cassettes d'expression seront transférées dans les tissus ou les cellules végétales en utilisant les méthodes de transformation précédemment décrites. La cassette d'expression sera portée par un plasmide de transformation, tel que bien connu par l'homme du métier, et rappelé notamment dans le document Hellens et al. (2000). Selon un autre aspect l'invention concerne un procédé d'obtention d'une plante exprimant au moins un gène d'intérêt exprimé spécifiquement dans le phloème comprenant l'introduction d'une construction nucléotidique comprenant une séquence nucléotidique promoteur telle que décrite précédemment, dans au moins une cellule de plante, puis la culture de la cellule ainsi transformée de manière à régénérer une plante contenant dans son génome ladite casstte d'expression. Selon une réalisation le procédé comprend en outre l'identification et la sélection des cellules transformées capables de régénérer des plantes dont le phloème surexprime ledit gène d'intérêt par rapport à une plante non transformée. L'invention concerne également les tissus ou parties de plantes, plantes, ou graines contenant les séquences d'acide nucléique promoteur selon l'invention. Le terme "tissu de plante" fait référence à n'importe quel tissu d'une plante, dans une plante ou dans une culture. Ce terme inclut des plantes entières, des cellules de plantes, des organes de plantes, des graines de plantes, des protoplastes, des cals, des cultures de cellules et toutes autres cellules de plantes organisées en tant qu'unité fonctionnelle et/ou structurelle. Des parties de plantes régénérées telles que des fleurs, des graines, des feuilles, des tiges, des fruits, du pollen, des tubercules et analogues sont également dans le cadre de l'invention. L'invention inclut des plantes transgéniques fertiles obtenues ainsi que leur descendance et le produit de cette descendance. Les plantes transgéniques hybrides, obtenues par le croisement d'au moins une plante selon l'invention avec une autre, font aussi partie de l'invention. Les plantes transgéniques selon l'invention comprennent notamment une plante transgénique TO ou RO, c'est-à-dire la première plante générée à partir de cellules de plantes transformées, la plante transgénique Tl ou RI c'est-à-dire la première génération de descendance, et les plantes de la descendance de générations suivantes obtenues qui comprennent et expriment l'ADN recombinant. Pour confirmer la présence de la construction nucléotidique, et en particulier du promoteur selon l'invention, dans les plantes régénérées, on peut utiliser un grand nombre de techniques appropriées, par exemple l'analyse PCR ou des techniques d'hybridation Southern blot, pour déterminer la structure de l'ADN recombinant, la détection de l'ARN transcrit à partir de l'ADN du gène d'intérêt exprimé dans des cellules du phloème de plantes transformées, à l'aide de techniques Northem blot ou d'amplification RT-PCR, des techniques de repérage de la production de protéines codées par le gène d'intérêt, telles que l'électrophorèse de protéines sur gel, des techniques Western blot. Selon un autre aspect, l'invention concerne les plantes transformées choisies parmi les espèces : Riz ; Maïs ; Blé ; Orge ; Sorgho ; Tomate ; Tabac ; Piment ; Pomme de Terre ; Pommier ; Poirier ; Coton ; Citronnier ; Espèces cultivées du genre brassica ; Courgette ; Concombre ; Melon ; Laitue ; Chicorée. Selon des réalisations préférées, on obtient une expression forte dans des espèces de monocotylédones, en particulier dans le blé, le maïs, le riz, et dans des espèces de dicotylédones, en particulier Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Cucumis melo. Comme on l'a décrit, selon une réalisation préférée, le gène d'intérêt est un gène codant pour une protéine apte à lutter contre les insectes piqueurs suceurs. De nombreuses applications s'inscrivent dans le cadre de l'invention, le gène d'intérêt pouvant être par exemple un gène de résistance à un stress notamment un stress hydrique ou un stress salin. Selon un autre aspect l'invention concerne donc, de manière plus globale, l'utilisation d'un acide nucléique promoteur tel que décrit précédemment pour l'obtention d'une plante exprimant dans le phloème un gène d'intérêt tel que décrit précédemment. D'autres avantages de l'invention apparaîtront lors de la description détaillée qui suit. La description détaillée s'appuiera sur les figures suivantes : - La figure 1.A représente l'organisation du génome du WDV-F. Quatre ORFs sont présentés tels que fléchés : V1 et V2 (protéine de capside) sur le brin positif, et Cl- 1, CI-2 sur le brin complémentaire. Cl-2 correspond à un épissage alternatif du transcrit sens-complémentaire. La région intergénique large (LIR) de 403 bp, comprenant la structure en forme de boucle avec l'oligonucléotide TAATATTAC conservé entre tous les géminivirus, et la région intergénique étroite (SIR) sont indiquées. La numérotation de séquences débute au nucléotide A (base 8 du nonamère conservé). - La figure 1.B représente schématiquement le WDV LIR. La séquence invariante en boucle, avec le nonanucléotide (ligne brisée), flanquée de séquences répétées inversée (flèches courtes), le début des deux protéines virales (flèches grises épaisses), les sites de transcription divergentes (flèches noires épaisses), les régions A-T (boîtes étroites vides) et la position des nucléotides, incluant le site d'initiation (+1), sont présentés. - La figure 2 représente la structure schématique des gènes chimériques utilisés pour la transformation de plantes. Les différents promoteurs (boîtes vides), l'enhancer de traduction #' (boîte étroite), le début de transcription (flèches courtes), la région codante uidA (boîtes grises), les régions de terminaisons (boîtes gris clair) sont présentées. La signification des abréviations est la suivante : - sRbc3' : petite sous-unité de la Rubisco région 3' - NOS-ter : terminateur du gène de la nopaline synthase - GUS : région codante du gène de la P-glucuronidase - p35S dupl. CaMV : promoteur de l'ARN 35S du Cauliflower mosaic virus (CaMV) avec la duplication de la région enhancer - pAtSUC2 ::GUS : promoteur du gène SUC2 - pAtAHA3 ::GUS : promoteur du gène AHA3 - WDV-LIR : large région intergénique du WDV - BD et BG : bordures droite et gauche de l'ADN-T. Les dimensions des promoteurs ne sont pas à l'échelle. - La figure 3 représente une construction avec un gène d'intérêt de lectine GNA. npt II : néomycine phosphotransférase. BD et BG : bordures droite et gauche de l'ADN-T. 35S ter et p35s : terminateur et promoteur de l'ARN 35S du CaMV. Lectine : gna On décrit maintenant de manière détaillée un mode de réalisation de l'invention. Construction des plasmides. La région intergénique large (LIR) de la souche F du wheat dwarf virus (WDV) (Bendahmane et al., 1995 ; numérod'accession : X82104) a été amplifiée par PCR (25 cycles, lmn 94 C, lmn 57 C, lmn 72 C) en utilisant les amorces suivantes: GCGGTACCGGTAGTGAACAGAAGTCCGGC 3' (appariement en position 2512- 2532) amorce qui crée un site Kpnl (bases soulignées) et 5'CGCAAGCTTGGGCTCCCACGCACTTCC-3' (appariement en position 147-164) amorce qui crée un site HindIII site (bases soulignées). Cette région, dénommée pWDV, est localisée entre les codons d'initiation de traduction du gène CI du WDV présent sur le brin négatif, et du gène VI, codant pour la protéine de mouvement, localisé sur le brin positif (Fig lA). Brièvement, pSDl comprend un gène modifié uidA, obtenu en plaçant la région codante de la p-glucuronidase sous le contrôle de traduction du leader TMV #' (Gallie et al., 1987). Ce vecteur a été construit par insertion d'un fragment HindIII-EcoRI Q'::GUS, dans Bluescript KS+ (Stratagène), le fragment étant obtenu par insertion du fragment HindIII et Ncol de pBS Q' C (Dinant et al., 1993) dans PRAJ275 (Jefferson et al., 1987) coupé par HindIII et Ncol. Le plasmide résultant contient une fusion transcriptionnelle pWDV :: #'::GUS. Après vérification du promoteur de fusion par séquençage, ce fragment a été coupé par Kpnl, rempli en utilisant un traitement au fragment de Klenow, et/Xbal puis lié dans PKYLX71-35S-2 (Maiti et al., 1993), linéarisé par EcoRl, rempli en utilisant un traitement de Klenow, et par Xbal, en substituant le promoteur 35S, et en introduisant le construit en amont de la région terminateur de la petite sous unité du gène de la Rubisco du pois (Fig. 1). Le plasmide recombinant pSD3 possède une fusion transcriptionnelle du promoteur WDV et du gène GUS (pWDV ::GUS) (Fig. 2), et a été ensuite soumis à une électroporation dans une souche d'Agrobacterium désarmé C58pGV2260 (Deblaere et al., 1985) pour la transformation de plantes. D'autres constructions GUS ont été utilisées pour la transformation de plantes (Fig. 2). Une fusion transcriptionnelle du promoteur constitutif CaMV 35S et du gène GUS (p35S ::GUS), a été obtenue par ligation (Kay et al., 1987), introduite dans les sites correspondants de pBI101 (Jefferson et al., 1987). Deux promoteurs spécifiques du phloème ont été utilisés comme contrôle spécifique dans ces expériences. Le vecteur binaire 3P3. 1 (De Witt et al., 1991) a été utilisé pour l'expression de la fusion transcriptionnelle du promoteur du gène AtAHA3 avec la région codant GUS (pAHA3 : :GUS). Le plasmide pET101SUC2 (Truernit et Sauer, 1995) a été utilisé pour l'expression de la fusion traductionnelle du promoteur AtSUC2 avec la région codant GUS (pSUC2 ::GUS). Transformation des plantes. Plusieurs espèces ont été transformées avec les différentes constructions dans Arabidopsis thaliana, écotype WS, Nicotiana tabacum XHFD8 (Bourgin, 1978), Nicotiana benthamiana, Cucumis melo. Les différentes constructions ont été introduites dans Nicotiana tabacum, N. benthamiana par coculture de disques foliaires en présence d'Agrobacterium tumefaciens en utilisant un protocole de transformation in planta standard (Dinant et al., 1998), dans Arabidopsis thaliana par infiltration de plantes adultes (Bechtold et al., 1993), et dans le melon par coculture d'explant selon un protocole également approprié. Les trois premières espèces (N. tabacum, N. benthamiana, A. thaliana) ont été également transformées avec trois autres constructions utilisées comme contrôle d'activité GUS : trois constructions présentent dans leur ADN-T un marqueur de sélection (résistance à la kanamycine) et le gène rapporteur GUS sous contrôle d'un promoteur constitutif, le promoteur 35S du CaMV, ou deux promoteurs phloèmespécifiques contrôlant l'expression dans les cellules compagnes, celui du gène AtSUC2 (Truernit et Sauer, 1995) et celui du gène AtAHA3 (DeWitt et al., 1991). Le vecteur pKYLX-35S2 (Maiti et al., 1993), utilisé pour le clonage de pWDV, a été utilisé directement pour la transformation des plantes, comme témoin négatif d'activité GUS (pas de gène rapporteur GUS dans cette construction). Localisation histochimique et quantification de l'expression GUS. La quantification de l'activité GUS par fluorimétrie a été réalisée en suivant le protocole décrit par Jefferson et al. (1987), sur des extraits de plante en présence de 1 mM MUG, 50 mM NaP04, 10 mM Na2EDTA, et 10 mM DTT, et après ajustement de la quantité d'échantillon à 30 g de protéines, après dosage des protéines par un test de Bradford (1976). Pour des tests histochimiques, l'activité GUS, de petits fragments de tige, de feuille, de racine, de transformants primaires de la génération FI, ont été incubés à 37 C pendant 4 à 12 heures dans un tampon de réaction contenant 1 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3 indolyle glucuronide (X-gluc), 100 mM Potassium Phosphate pH 7,0.1 % (vol/vol) Triton XI 00, et en présence de 3 mM de Potassium ferrocyanure, 3 mM Potassium ferricyanure. Ces conditions ont été utilisées pour limiter la diffusion de produits intermédiaires de réaction de GUS (Guivarc'h et al., 1996). Les sections de tissus faites à la main ont été clarifiées dans de l'éthanol 70 %. Les sections colorées ont été visualisées à l'aide d'un microscope LEICA. Pour les observations cytologiques, après les colorations GUS et un éclaircissement dans de l'éthanol 70 %, les tissus ont été fixés dans du 1 % glutaraldéhyde avant la déshydratation dans une série de solutions d'éthanols et avec placées avec du méthacrylate Historésine 2-hydroxyethyl (LEICA). Les sections (8-10 m) ont été observées avec un microscope (LEICA). Les activités moyennes obtenues ont été comparées à celles obtenues par d'autres promoteurs phloème-spécifiques, en particulier les promoteurs des gènes d'Arabidopsis thaliana AtAHA3 et AtSUC2. (DeWitt et al., 1991, Truernit et Sauer, 1995). Agroinoculation et analyse des plantes infectées par TYLCV ou WDV. Les plantes N. benthamiana et N. tabacum ont été agroinoculées par des souches S de TYLCV (Kheyr-Pour et al., 1991), ou des souches F de WDV, telles que décrit (Bendahmane et al., 1995) en utilisant des souches d'Agrobacterium tumefaciens présentant des plasmides avec des génomes partiellement redondants en TYLCV-S ou WDV-F. Les agrobactéries ont été inoculées sur des plantes N. benthamiana et N. tabacum totalement développées, au niveau de la tige principale totalement décapitée. Les symptômes ont été enregistrés après une semaine. L'agroinoculation des disques foliaires a été réalisée in vitro ; après incubation pendant 48 heures des disques foliaires sur des plaques MS avec des agrobactéries portant les génomes TYLCV-S ou WDV-F, les disques ont été transférés sur des plaques fraîches MS avec de l'Augmentin (lg/1). L'activité GUS a été mesurée 10 à 15 jours après l'agroinoculation. L'infection a été confirmée, soit par des techniques sur membrane de nylon (Hybond N, Amersham), soit par des techniques Southern Blot, utilisant des sondes spécifiques TYLCV ou WDV marquées avec du P32. Les principaux résultats obtenus ont été les suivants. Cassettes d'expression du gène. La région LIR du promoteur WDV a été amplifiée par PCR comme décrit précédemment. Des éléments caractéristiques de promoteurs eucaryotes ont été identifiés sur le brin positif de la région LIR de WDV, tels que la boîte CAAT. Une boîte GATA, pour la liaison de facteurs 2-ASF (Lam and Chua 1989), a été repérée sur le brin complémentaire de la région LIR du WDV. Le codon d'initiation de la transcription du gène WDV VI n'était pas avec un contexte favorable pour la traduction (Joshi et al., 1997). Ainsi, un enhancer de la transcription, la séquence #' du leader TMV (Gallie et al., 1987) a été introduit entre le promoteur WDV VIet la région codante du gène de la P-glucuronidase (Fig. 1). Les construits GUS ont été transférés dans Agrobacterium tumefaciens pour la transformation des plantes. Analyse de l'activité GUS dans des plantes transgéniques FO. L'activité promoteur de ces différentes constructions GUS a été évaluée sur des plantes dicotylédones transformées de manière stable. Les construits GUS ont été transférés dans des espèces modèles, telles que A. thaliana et N. benthamiana, ainsi que dans des espèces cultivées N. tabacum ou Cucumis melo (Tableau 1). Des transformants primaires résistants à la kanamycine ont été systématiquement testés pour leur activité GUS par des colorations histochimiques à l'aide de X-Gluc. L'activité GUS a été testée en premier sur des organes aériens, c'est-à-dire les fragments de feuilles ou de tiges, et confirmée à différentes étapes de la croissance, soit in vitro sur les plantules ou en serres sur des plantes totalement développées. Après transfert de la construction pWDV : :GUS, au total, 31,14, 19 et 3 plantes transgéniques avec une activité GUS détectable, ont été obtenues avec N tabacum, N. benthamiana, A. thaliana et C. melo, respectivement. Cela représente 50 à 100 % des transformants ayant une activité GUS détectable (Tableau 1). Ce pourcentage n'a pas varié significativement entre les quatre construits. L'activité GUS a été confirmée sur des plantes transgéniques FI obtenue après auto-fertilisation des transformants primaires N. tabacum, N. benthamiana, A. thaliana. Spécificité tissulaire du promoteur WDV dans les plantes transgéniques Afin de déterminer la spécificité tissulaire de différents construits GUS, des colorations histochimiques ont été réalisées sur différents organes de plantes transgéniques FO présentant une forte activité GUS. Dans les plantes transgéniques pWDV : :GUS, l'activité GUS a été trouvée dans les nervures des feuilles, à la fois les nervures médianes et latérales, et dans les tissus vasculaires des tiges (Tableau 2). L'activité GUS a été également repérée dans les tissus vasculaires de tous les organes testés, incluant les racines, les fleurs, les siliques (Arabidopsis). En coupe transversale de tiges et de pétioles, le phloème était coloré, en particulier le phloème interne et externe d'espèces de Nicotiana et de Cucumis melo. Contrairement aux construits pAHA3::GUS et pSUC2::GUS, le construit pWDV ::GUS entraîne une expression dans le parenchyme phloémien. Aucune coloration n'est observée dans l'épiderme, le cortex. En plus de l'expression dans le phloème, les plantes transgéniques qui expriment le plus haut niveau d'activité GUS du construit pWDV : :GUS, présentent une coloration dans les cellules du parenchyme du xylème, jamais observée dans les lignées pAHA3 : :GUS et pSUC2 ::GUS. Une telle coloration est cependant moins prononcée que la coloration observée dans les tissus du phloème. L'activité GUS dirigée par les construits pAHA3 ::GUS et pSUC2 ::GUS a été observée dans le tissu phloémien de feuilles et de tiges. Les plantes transgéniques obtenues avec le construit p35S : :GUS ont été utilisées comme contrôle et présentent une activité GUS dans tous les tissus (Odell et al., 1985). Une différence importante entre les trois promoteurs spécifiques du phloème est la reproductibilité de l'activité GUS dans le cylindre central racinaire des plantes transgéniques avec la fusion pWDV : :GUS. L'essentiel de l'activité a été retrouvée dans les cellules du tissus phloémien racinaire, avec une activité plus faible dans certains cas, dans les cellules du tissu xylémien. Dans les plantes transgéniques utilisant les deux construits pAHA3 : :GUS et pSUC2 : :GUS, une telle activité n'est pas observée systématiquement dans les racines des transformants ni in vitro, ni dans les plantes développées en serre (Tableau 2). Lorsqu'il a été observé, le signal a été faible, et irrégulier le long du cylindre central racinaire. On obtient ainsi avec pWDV : :GUS une expression générale dans le phloème. En outre, les comparaisons ont été effectuées entre plantes cultivées dans les mêmes conditions, et échantillonnées sur des organes identiques ou à des phases identiques, et sur des positions identiques dans l'organe. L'activité GUS issue du construit pWDV ::GUS a été comparée avec celle obtenue avec les trois autres construits. Au moins quatre mesures indépendantes ont été effectuées pour chaque transformant. Les plantes transgéniques ont été échantillonnées à différentes phases du développement, sur des plantes cultivées, soit in vitro, soit en serre. Les activités moyennes sont présentées sur le Tableau 3. Les variations maximales d'activité GUS ont été observées sur des lignées transgéniques de Nicotiana tabacum. Bien que les activités des construits pWDV ::GUS, pAHA3 ::GUS et pSUC ::GUS soient à des niveaux similaires sur des plantes de tabac, l'activité obtenue avec le construit p35S : :GUS est supérieure. Les différences d'activité, notamment entre les construits pWDV : :GUS et p35S : :GUS, ne sont pas aussi importantes dans les lignées transgéniques de N. benthamiana (Tableau 3). Comme observées dans les plantes de tabac, les activités GUS issues des construits pWDV ::GUS, pAHA3 : :GUS et pSUC2 ::GUS, ont atteint des niveaux semblables dans les plantes de N. benthamiana. Par ailleurs, aucune transactivation n'a été observée du fait de l'infection par des geminivirus, dans des plantes Nicotiana transgéniques portant le promoteur WDV VI. Afin de déterminer si le promoteur WDV VI pouvait être transactivé durant l'infection lors de l'intégration dans le génome de la plante, des plantes transgéniques Nicotiana benthamiana présentant une activité GUS issue du construit pWDV : :GUS, ont été inoculées avec du TYLCV ou le WDV VI. Les plantes transgéniques, ainsi que les plantes contrôles non transformées, présentent 100 % d'infection suivant l'inoculation par TYLCV. Les N. benthamiana infectées présentent les symtômes typiques d'une infection par le virus. Toutefois, une infection par TYLCV n'induit aucune modification significative de l'activité GUS détectée dans une plante in planta dans les lignées transgéniques testées. Grâce aux travaux réalisés, les inventeurs ont ainsi réussi à obtenir les principaux résultats suivants : - le promoteur WDV VIprésente une activité phloème spécifique, - l'activité promoteur WDV VI est essentiellement limitée aux cellules du phloème, incluant les cellules compagnes et les cellules du parenchyme phloémien, l'expression éventuellement rencontrée dans le xylème étant faible comparée à celle observée dans le phloème, - le promoteur WDV VI conduit à une accumulation de l'activité GUS dans les parties aériennes de la plante ainsi que dans les racines, alors que les promoteurs des gènes AtSUC2 et AtAHA3 ne conduisent pas à une expression reproductible souhaitée dans les racines, - une infection virale de plantes transformées obtenues, ne conduit pas à une modification non souhaitée de l'expression du promoteur WDV VI, et le niveau de la transcription des gènes issue de l'activité promoteur WDV VIest comparable à celui de gènes connus s'exprimant dans le phloème tels que des gènes du métabolisme des sucres. De plus, afin de vérifier le niveau d'expression non seulement de gènes marqueurs, mais aussi de gènes codant pour des toxines insecticides, les inventeurs ont obtenu une construction avec une lectine. Plus précisément, les inventeurs ont réalisé une construction comportant le gène de la lectine GNA (Galanthus nivalis agglutinine) sous le contrôle du promoteur WDV VI. La GNA est une lectine à mannose présentant une activité délétère pour certains pucerons comme le puceron du cotonnier Aphis Gossypii (non publié, Rahbé Y), le puceron vert du pêcher Myzus persicae (Sauvion et al., 1996, Hilder et al., 1995, Gatehouse et al. 1996), le puceron de la pomme de terre Aulacorthum solani (Down et al., 1996), le puceron vert et rose du pois Acyrthosiphon pisum (Rahbé et al., 1995). Ce vecteur P3G (figure 3) a été introduit via Agrobacterium dans Arabidopsis thaliana et le melon (Cucumis melo). Les premiers résultats obtenus démontrent une expression phloème spécifique et un niveau d'expression de lectine suffisant pour lutter contre les pucerons testés. Espèce Construit FO FO Plantes GUS + transgéniques (1) Plantes transgéniques (2) N.tabacum pWDV::GUS 62 31 pSUC2 ::GUS 15 12 pAHA3 ::GUS 13 11 p35S ::GUS 13 13 N. benthamiana pWDV::GUS 19 14 pSUC2 ::GUS 29 18 pAHA3 ::GUS 29 19 p35S::GUS 26 20 A. thaliana pWDV::GUS 26 19 pSUC2::GUS 2 2 C.melo pWDV::GUS 6 3 activité GUS: UF/mn/30 g de protéines totales TABLEAU 1 : de l'activité GUS dans les plantes transgéniques FO obtenues avec des promoteurs GUS. Les plantes transgéniques exprimant pWDV : :GUS, pSUC2 : :GUS, ou pAHA3 ::GUS, ont été testées pour l'activité GUS par fluorimétrie. L'activité GUS a été confirmée dans les plantes transgéniques par histochimie réalisée sur des tiges et les fragments de feuilles. (1) : nombre de plantes transgéniques résistant à la kanamycine obtenue après transformation et régénération du milieu sélectif à la kanamycine. (2) : nombre de plantes transgéniques résistant à la kanamycine présentant une activité GUS significative. Tissus Construit de fusion promoteur-GUS pWDV ::GUS pSUC2 ::GUS pAHA3 ::GUS Tige: Phloème extérieur + + + Phloème intérieur + + + Phloème parenchyme +Cellules compagnes + + + Cortex - - Medullaire parenchyme- Xylème parenchyme +/Feuille : Mesophylle Epiderme - - Trichome ... Phloème + + + Racine du tissus vasculaire extrémité de la racine + nd nd cylindre central + a a TABLEAU 2 : Spécificité tissulaire du promoteur WDV et d'autres promoteurs Localisation histochimique de l'activité GUS dans des plantes transgéniques exprimant pWDV ::GUS, pSUC2 ::GUS ou pAHA3 ::GUS, et présentant une activité GUS significative. L'analyse histochimique a été réalisée dans des conditions redox afin d'empêcher la diffusion de substrat GUS. Arabidopsis thaliana n'ont pas de phloème externe. a : activité GUS non reproductible. nd : déterminé. Espèces Construit Activité GUS (UF/mn/30 g protéines totales) GUS max GUS moyen activité (1) activité (2) N. tabacum pWDV ::GUS 39 32 pSUC2 ::GUS 11 9 pAHA3::GUS 83 50 P35S ::GUS 574 468 N. benthamiana pWDV ::GUS 100 82 pSUC2::GUS 72 30 pAHA3::GUS 36 26 p35S::GUS 189 154 TABLEAU 3 : du promoteur WDV comparée à celle d'autres promoteurs dans des espèces Nicotiana Activité fluorimétrique dans les plantes transgéniques exprimant pWDV ::GUS, pSUC2 ::GUS, pAHA3 ::GUS. Les plantes transgéniques exprimant les constructions pWDV ::GUS, pAtSUC2 ::GUS, pAtAHA3 ::GUS, ont été testées pour leur activité GUS par fluorimétrie, et mesurées à partir d'une solution à 30 g de protéines solubles totales. (1) : Activité moyenne GUS détectée dans les plantes transgéniques de la lignée présentant le plus haut niveau de l'activité GUS (2) : Activité GUS moyenne détectée dans les plantes transgéniques des trois lignées présentant le plus haut niveau d'activité GUS. Références Altschul et al., 1990, Basic local alignment search tool, J. Mol, Biol., 215 (3) : 403-410. Altschul et al., 1997, Gapped BLAST and PSI-BLAST : a new generation of database search programs, Nucleic Acids Research 25 (17) :3389-3402. Altschul et al., 1998, Fundamentals of database searching (review), Bioinformatics : A trends Guide, 5 :7-9 Ausubel et al., 1995, eds. Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, N. Y. ). Bechtold, N., Ellis, J. and Pelletier, G. 1993. In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Acad. Sci. Paris. Sciences de la Vie. 316 : 1194-1199. Bendahmane, M., Schalk, H. 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Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi : a) une séquence nucléotidique comportant au moins 80% d'identité avec SEQIDN 1, b) une séquence nucléotidique complémentaire de la SEQ ID N 1ou d'une séquence définie en a), c) un fragment représentatif d'une séquence définie en a), ou b), d) une séquence nucléotidique comprenant une séquence telle que définie en a), b), ou c), e) une séquence nucléotidique modifiée d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b), c) ou d), ladite séquence étant capable de commander l'expression d'un gène d'intérêt spécifiquement dans le phloème. 3. Construction nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique promoteur selon la revendication 1 ou 2, liée de manière opérationnelle audit gène d'intérêt. 4. Construction nucléotidique selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit gène d'intérêt code un insecticide, en particulier un insecticide contre les insectes piqueurs suceurs, notamment les Homoptères. 5. Construction nucléotidique selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit gène d'intérêt code un peptide ou un polypeptide toxique vis-à-vis de parasites des organes souterrains et/ou aériens des plantes. 6. Construction nucléotidique selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit gène d'intérêt code un éliciteur de résistance des plantes à des parasites ou à des ravageurs. 7. Construction nucléotidique selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit gène d'intérêt code une élicitine, notamment de type cryptogéine ou oligandrine. 8. Construction nucléotidique selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit gène d'intérêt code une lectine, utilisée pour la protection contre les insectes piqueurs suceurs ou des agents pathogènes. 9. Vecteur de clonage et/ou d'expression caractérisé en ce qu'il comprend une construction nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 3 à 8. 10. Procédé d'obtention d'une plante exprimant au moins un gène d'intérêt spécifiquement dans le phloème caractérisé en ce qu'il comprend l'introduction d'une construction nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 3 à 8 dans au moins une cellule de plante, puis la culture de la ou des cellules ainsi transformées de manière à régénérer une plante contenant dans son génome ladite construction nucléotidique. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le gène d'intérêt code un insecticide, en particulier un insecticide contre les insectes piqueurs suceurs, notamment les Homoptères. 12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le gène d'intérêt code un peptide ou un polypeptide toxique vis-à-vis de parasites des racines des plantes. 13. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le gène d'intérêt code un éliciteur de résistance des plantes à des parasites ou à des ravageurs. 14. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que le gène d'intérêt code une élicitine, notamment la cryptogéine ou l'oligandrine. 15. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que le gène d'intérêt code une lectine. 16. Plante ou partie de plante obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 15. 17. Plante ou partie de plante selon la revendication 16 présentant une augmentation de l'expression d'une toxine contre les insectes piqueurs suceurs par rapport à une plante non transformée. 18. Plante selon la revendication 16 ou 17 caractérisée en ce que la cassette d'expression est intégrée de manière stable dans le génome de la cellule. 19. Plante ou partie de plante selon l'une quelconque des revendications 16 à 18 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une mono ou une dicotylédone, choisie notamment parmi les espèces suivantes : Riz ; Maïs ; Blé ; Orge ; Sorgho ; Tomate ; Tabac ; Piment ; Pomme de Terre ;Pommier ; Poirier ; Coton ; Citronnier ; Espèces cultivées du genre brassica ; Courgette ; Concombre ; Melon ; Laitue ; Chicorée. 20. Cellule de plante transformée par un vecteur selon la revendication 9.