Brevet FR2841248A1 — publié le 20031226

La présente invention concerne un gène suppresseur de formation de boutons floraux qui est utile pour conférer des propriétés de floraison précoce à une plante vivace, un vecteur recombiné qui comprend un ADN codant le gène ci-dessus ou un ADN antisens du gène, un transformant qui comprend le vecteur recombiné, des graines obtenues à partir du transformant, un procédé pour conférer à une plante des propriétés de floraison précoce et un procédé pour produire une plante à floraison précoce. Contrairement aux plantes herbacées, les plantes ligneuses ont besoin de beaucoup de temps pour passer de la floraison à la fructification, c'est-à-dire que ces plantes ont de longues périodes juvéniles. De ce fait, il est long d'améliorer par culture un arbre fruitier vivace comme le pommier (Malus) qui appartient à la famille des rosacées. Par exemple, une période de 7 à 8 ans après la plantation des graines est nécessaire au pommier pour fructifier. Dans la culture des arbres fruitiers, quand un gène utile du point de vue agricole, comme un gène de résistance à des maladies d'une espèce sauvage, est introduit dans un cultivar, environ 10 opérations de croisement sont nécessaires statistiquement pour obtenir une lignée de bonne qualité. Ainsi, le caractère juvénile, qui est une caractéristique propre aux plantes ligneuses, est un facteur significatif qui entrave l'efficacité des croisements. On a tenté d'utiliser des moyens conventionnels pour raccourcir la période de culture d'un arbre fruitier, comme la floraison et la fructification précoces, l'utilisation de variétés naines et le dressage de branches portant des fruits. Cependant, aucun de ces procédés n'a eu un effet marquant (Pinero, M. et al., Plant Physiol. 1998,117: 1-8 ; Levy, Y. Y. et al., Plant Cell 1998, 10: 1973-1989). D'autre part, au cours des dernières années, plusieurs gènes régulant la formation des boutons floraux ont été isolés de la plante Arabidopsis thaliana (Arabette des dames) qui constitue un modèle pour les dicotylédones (Ohshima, S. et al., Mol. Gen. Genet. 1997,254(2): 186- 194 ; Bradley, D. et al., Science 1997,275(5296): 80-83). Le mécanisme moléculaire de la formation des boutons floraux est en cours d'élucidation. Par exemple, on sait que le gène TERMINAL FLOWER (TFL1) est capable de supprimer la formation des boutons floraux (gène de floraison tardive) (demande de brevet international publiée n WO 97/10339). Dans Arabidopsis thaliana, on a montré expérimentalement que la surexpression de ce gène provoque une floraison tardive, et que la suppression de l'expression de ce gène provoque une floraison précoce (Ratcliffe, O.J. et al., Development 1999,126: 1109-1120 ; Liljergren, SJ. et al., Plant Cell 1999,11: 1007-1018). Cependant, on connaît aussi des gènes ayant une séquence similaire à TFL1 mais présentant un effet inverse. Ainsi, l'élucidation des gènes et des mécanismes impliqués dans la floraison est délicate (Weigel, D. et al., Nature 1995,377: 495-500 ; Mandel, M. A. et al., Nature 1995,377: 522-524). En outre, on ne connaît actuellement aucun gène et aucune protéine impliqués dans la formation des boutons floraux chez les rosacées qui incluent le genre Malus. Par ailleurs, dans le domaine de l'agriculture, aucune tentative visant par exemple à conférer des propriétés de floraison précoce à des cultures vivaces par régulation de gènes qui suppriment la formation des boutons floraux n'a été décrite. La présente invention a pour but d'isoler un gène lié à la formation des boutons floraux dans des plantes vivaces et de fournir une plante ayant des propriétés de floraison précoce par transformation d'une plante au moyen de ce gène ou d'un ADN antisens de ce gène. La demanderesse a réussi à cloner un gène analogue à TERMINAL FLOWER 1 à partir d'un pommier, à la suite d'études approfondies pour atteindre les buts ci-dessus. Plus précisément, la présente invention est basée sur le fait que l'on a confirmé que le gène ci-dessus a bien une activité pour supprimer la formation des boutons floraux dans Arabidopsis thaliana et Malus domestica et qu'il est possible de produire une plante régénérée ayant des propriétés de floraison précoce en transformant des cellules végétales avec un ADN vecteur dans lequel est incorporé un ADN antisens du gène ci-dessus, en amenant les cellules à former un cal, en amenant le cal à se développer et à se redifférencier en une plante puis en greffant la plante à un porte-greffe. La présente invention concerne également une protéine comprenant une séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO: 2 figurant en annexe. La présente invention concerne aussi une protéine isolée comprenant une séquence d'acides aminés ayant une délétion, substitution ou addition d'un ou plusieurs acides aminés dans une séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO: 2 et ayant une activité de suppression de la formation de boutons floraux. En outre, la présente invention concerne un acide nucléique isolé ou un fragment de celui-ci qui comprend une séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 1, ou qui est capable de s'hybrider dans des conditions stringentes à un ADN comprenant une séquence complémentaire d'au moins une partie de la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 1 et qui code une protéine ayant une activité de suppression de la formation de boutons floraux. La présente invention concerne également un acide nucléique antisens qui comprend une séquence complémentaire de la séquence nucléotidique de l'acide nucléique isolé ci-dessus ou de son fragment. Par ailleurs, la présente invention concerne un vecteur recombiné qui comprend au moins une partie de l'acide nucléique isolé ci-dessus ou de son fragment, ou au moins une partie de l'acide nucléique antisens ci-dessus. En outre, la présente invention concerne un transformant qui comprend le vecteur recombiné ci-dessus. Ce transformant peut être une plante ou une cellule végétale, de préférence encore une plante vivace ou une cellule d'une telle plante. La plante vivace utilisée de préférence dans la présente invention comprend un arbre fruitier vivace. Le transformant peut avoir des propriétés de floraison précoce. La présente invention concerne aussi une graine qui est obtenue à partir du transformant ci-dessus. Par ailleurs, la présente invention concerne un procédé pour conférer à une plante des propriétés de floraison précoce qui comprend la suppression de l'expression ou de l'activité d'un gène MdTFL endogène dans une plante. En outre, la présente invention concerne un procédé pour réguler l'époque de floraison d'une plante qui comprend l'introduction de l'acide nucléique isolé ci-dessus ou de son fragment ou de l'acide nucléique antisens ci-dessus dans une plante. En outre, la présente invention concerne un procédé pour produire une plante à floraison précoce qui comprend les étapes de construction d'un vecteur recombiné comprenant l'acide nucléique isolé ci-dessus ou son fragment ou l'acide nucléique antisens ci-dessus, la transformation d'une plante hôte avec le vecteur recombiné et la régénération d'une plante à partir du transformant obtenu. Dans les procédés ci-dessus, la plante est de préférence une plante vivace, en particulier un arbre fruitier vivace. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui suit et se réfère aux dessins annexés, donnés uniquement à titre d'exemple, et dans lesquels : La figure 1 est une photographie montrant le gène MdTFL dans un pommier non transformé, détecté par transfert de Southern. Chaque lettre en tête des pistes représente une enzyme de restriction : B,BamHI; E, EcoRI ; H, HindIII; N, NcoI ; Xb, XbaI ; et Xh, XhoI. La figure 2 est une photographie d'une électrophorèse montrant l'expression du gène MdTFL dans différents tissus de pommiers non transformés détectée par transfert de Northern. La figure 3 est une photographie d'une électrophorèse montrant l'expression du gène MdTFL en fonction du temps dans des apex de pousses d'un pommier non transformé, détectée par transfert de Northern. Les figures 4A et 4B montrent les vecteurs binaires pSMDTFL12.1.2+ et pSMDTFL5.1-, respectivement, qui sont utilisés pour la transformation d'Arabidopsis thaliana et de pommiers selon la présente invention. Les figures 5A et 5B sont des photographies montrant la croissance d'Arabidopsis thaliana transformée dans laquelle MdTFL sens a été introduit (lignées T-S10-6 et T-S21-1, respectivement). La figure 5C est une photographie montrant la croissance d'Arabidopsis de type sauvage à titre de témoin. Les photographies des figures 5A à 5C ont été prises 35 jours après l'ensemencement. Les figures 6A à 6F montrent des transformants de pommiers à floraison précoce. Les figures 6A et 6B montrent la lignée 705-1 8 mois et 12 mois après le greffage, respectivement. "f' sur la figure 6A désigne une fleur et "sg" désigne un site greffé. La figure 6C montre la lignée 705-4 11 mois après le greffage. La figure 6D est une photographie montrant une comparaison morphologique de feuilles provenant de chaque lignée (lignées 303-3 et 705-1, et type sauvage). La figure 6E montre des boutons floraux formés à l'extrémité d'une pousse au stade de la croissance. La figure 6F est une photographie montrant une vue agrandie de la photographie de la figure 6E où la flèche désigne un bouton floral différencié. Les figures 7A à 7C sont des photographies montrant la floraison de pommiers de type sauvage et de pommiers transformés dans lesquels le gène MdTFL antisens a été introduit. Les figures 7D à 7F sont des photographies montrant la fructification d'un pommier de type sauvage et de pommiers transformés dans lesquels est introduit le gène MdTFL antisens. Les figures 8A à 8C sont des photographies montrant l'aptitude à la germination du pollen des lignées de pommiers transformées 705-3 et 705-4 à floraison précoce, et d'un pommier de type sauvage, respectivement. La figure 9 est une photographie d'une électrophorèse montrant l'expression du transgène (MdTFL antisens) dans les feuilles d'un pommier de type sauvage (témoin) et de pommiers transformés (lignées 303-1, 303-2,303-3, 303-4, 705-1, 705-2,705-3 et 705-4), détectée par transfert de Northern. La demanderesse a isolé un gène lié à la floraison, le gène analogue à TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) tel qu'il est décrit ci-dessous. Pour isoler un gène codant une protéine homologue de TFL1 dérivée d'une plante appartenant à la famille des rosacées, en particulier au genre Malus, la demanderesse a d'abord obtenu un fragment de gène par une réaction en chaîne par polymérase (PCR) au moyen d'amorces dégénérées qui ont été conçues sur la base de séquences d'acides aminés hautement conservées parmi les protéines analogues à TFL1 dérivées d'autres plantes et au moyen d'une matrice d'ADNc dérivée de l'apex de pousse d'un pommier. Puis, la demanderesse a amplifié l'ADNc de longueur intégrale par une réaction en chaîne par polymérase à amplification rapide d'extrémités d'ADNc (RACE-PCR) pour obtenir un gène analogue à TFL1. De plus, le gène a une certaine homologie (approximativement 75 %) avec le gène TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) d'Arabidopsis thaliana. Pour les rosacées, comme le gène a été isolé pour la première fois à partir d'un pommier (Malus domestica), il est appelé MdTFL (Malus domestica TFL1). De plus, la présente demanderesse a confirmé que le gène a une activité pour supprimer la formation des boutons floraux dans Malus domestica. Selon la présente invention, l'époque de la floraison d'une plante dans laquelle est introduit le gène MdTFL est régulée par le fait que l'expression de ce gène MdTFL est favorisée ou supprimée. Le gène MdTFL est impliqué dans la suppression de la formation des boutons floraux chez les rosacées. Ainsi, une plante transformée pour supprimer l'expression du gène MdTFL endogène ou l'activité de la protéine MdTFL endogène présentera une floraison précoce par inhibition de l'activité de suppression de la formation des boutons floraux. Comme technique pour supprimer l'expression génique, on connaît par exemple un procédé antisens qui introduit l'ADN antisens d'un gène, et l'interférence d'ARN. Plus précisément, dans le procédé antisens, l'expression d'un gène cible est supprimée par liaison spécifique de la séquence antisens à une séquence du gène cible. La séquence antisens inhibe l'expression d'un gène cible en bloquant la traduction ou la transcription par le fait qu'elle se lie à l'ARNm cellulaire ou à l'ADN génomique. L'interférence d'ARN utilise un phénomène selon lequel, quand un ARN double brin est présent dans une cellule, un ARNm endogène qui est complémentaire de la séquence de l'ARN double brin est dégradé et détruit, de sorte que l'expression génique est supprimée spécifiquement dans la cellule (Hannon, GJ., Nature 2002,418: 244-251 ; Elbashir, SM. et al., Nature 2001,411: 494-498 ; McCaffrey, AP. et al., Nature 2002,418: 38-39). Il existe aussi une autre technique qui utilise la cosuppression. La cosuppression est un phénomène qui apparaît dans une plante par exemple quand un gène est introduit dans une plante par ligature du gène en aval d'un promoteur qui provoque une expression constante et forte dans une orientation sens, ce qui supprime l'expression du gène introduit et du gène endogène (Montgomery, MK et Fire, A (1998), Trends Genet., 14,255-8). Selon la présente invention, une plante présentant des propriétés de floraison précoce est produite par introduction du gène MdTFL ou d'un ADN antisens du gène régulé par un promoteur fort dans une plante, ce qui supprime l'expression du gène MdTFL endogène, et inhibe l'activité de suppression de la formation des boutons floraux. Par ailleurs, l'introduction du gène MdTFL dans une direction sens dans une plante conduit normalement à une expression accrue du gène MdTFL. Dans un cas de ce type, l'activité de suppression de la formation des boutons floraux est stimulée et la plante présente une floraison tardive. Une telle plante est utile pour étudier le mécanisme de suppression de la formation des boutons floraux. A titre d'alternative, ainsi que cela est bien connu dans la technique, un anticorps dirigé contre la protéine MdTFL peut être utile pour supprimer l'activité de la protéine MdTFL. L'isolement du gène MdTFL, la production de la protéine MdTFL, la préparation d'un vecteur recombiné et la production d'un transformant seront décrits ci-dessous en détail. 1. Isolement et identification du gène MdTFL (1) Préparation d'ARNm et d'une banque d'ADNc Le gène MdTFL peut être obtenu par un procédé connu quelconque avec l'ARNm purifié provenant de l'ARN extrait du tissu d'une plante rosacée. Les exemples de procédés connus comprennent la RACEPCR, la RT-PCR et le criblage d'une banque d'ADNc. Le gène MdTFL est exprimé principalement dans les feuilles, les apex des pousses et les calices. Ainsi, la source d'ARNm peut être par exemple une partie ou un tissu d'une plante comme les feuilles ou les apex de pousses de rosacées. De plus, il est possible aussi d'utiliser des tissus de plantes rosacées comme l'épiderme, le phloème, le parenchyme, le xylème, le faisceau fibrovasculaire, le tissu palissadique ou le tissu spongieux, cultivés dans des conditions stériles dans un milieu, comme le milieu MS (milieu de Murashige et Skoog) ou des cellules de culture de tissus (par exemple un cal). Les exemples de plantes qui peuvent être utilisées comme source pour l'isolement d'un gène selon la présente invention ne sont pas limités spécifiquement à condition que ce soient des plantes appartenant à la famille des rosacées. Ce peut être par exemple : Le genre Malus : Malus domestica, Malus baccata var. mandschurica, Malus sieboldii, Malus prunifolia var. ringo ASAMI Le genre Rosa : Rosa hybrida Le genre Prunus : Prunus persica, Prunus avium, Prunus amygdalus Le genre Pyrus : Pyrus pyrifolia, Pyrus communis Le genre Fragaria : Fragaria ananassa Le genre Cydonia : Cydonia oblonga Le genre Rubus : Rubus palmatus L'ARNm peut être préparé par exemple par une technique conventionnelle quelconque après congélation de l'apex d'une pousse d'une plante rosacée dans l'azote liquide. Par exemple, la plante congelée est broyée dans un mortier puis une fraction d'ARN brut est extraite et préparée à partir du produit broyé résultant, par un procédé au chlorure de césium, ou un procédé au bromure de cétyltriméthylacétyle (CTAB). Ensuite, à partir de la fraction d'ARN brut, l'ARN poly(A)+ (ARNm) peut être obtenu par un procédé à colonne d'affinité avec, comme support, de l'oligo dT-cellulose, ou un procédé utilisant des particules de latex à oligodT immobilisé. En utilisant comme matrice l'ARNm ainsi obtenu, un ADNc simple brin est synthétisé avec oligodT 20 et la transcriptase inverse au moyen d'un kit du commerce (par exemple kit de synthèse d'ADNc (STRATAGENE)). Puis, un ADNc double brin est synthétisé à partir de l'ADNc simple brin. Ensuite, un adaptateur approprié ou une cassette appropriée (par exemple cassette EcoRI produite par TAKARA) est ajouté à l'ADNc double brin ainsi obtenu, de sorte qu'il est possible de préparer une banque d'ADNc, par exemple comme matrice pour la RACE-PCR. Comme kit pour mettre en oeuvre le procédé RACE-PCR, il est possible par exemple d'utiliser 3'-Full RACE Core Set (TAKARA) ou 5'-Full RACE Core Set (TAKARA). (2) Préparation de fragments du gène MdTFL Un exemple de procédé pour cloner le gène MdTFL comprend la clarification de régions d'ADN inconnues par RACE-PCR au moyen de fragments du gène, puis l'amplification de l'ADNc de longueur intégrale par PCR et ensuite le clonage du produit amplifié contenant le gène dans un vecteur approprié. Les fragments de MdTFL peuvent être obtenus par PCR au moyen d'amorces dégénérées conçues à partir d'une séquence consensus de TFL1 provenant de Arabidopsis thaliana (numéro d'ordre GenBank : U77674) et CENTRORADIALIS provenant de Antirrhinum majas (gène CEN : numéro d'ordre Genbank : S81193). Dans la PCR, un exemple d'ADN matrice qui peut être utilisé selon la présente invention est un ADN génomique provenant d'une plante rosacée ou la banque d'ADNc obtenue en (1) ci-dessus. De plus, les exemples d'amorces dégénérées comprennent une amorce sens de séquence 5'- AAT/CGGICAT/CGAA/GT/CTITTT/CCC-3' (SEQ ID NO: 3) et une amorce antisens de séquence 5'-CG/TT/CTGIGCA/GTTA/GAAA/GAAIAC-3' (SEQ ID NO: 4). Dans la séquence, "I" désigne l'inosine. Cependant, les amorces selon la présente invention ne sont pas limitées à ces séquences. L'homme du métier peut concevoir des amorces appropriées sur la base de la séquence consensus ci-dessus. (3) Isolement du gène MdTFL Deux amorces sens spécifiques de gène et deux amorces antisens spécifiques de gène sont conçues respectivement pour une région appropriée dans le fragment de MdTFL obtenu en (2) ci-dessus. Pour élucider une séquence inconnue en 5' du gène, deux amorces antisens et deux amorces cassettes sont utilisées, et pour élucider une séquence inconnue en 3' du gène, deux amorces sens et deux amorces cassettes sont utilisées pour réaliser une RACE-PCR. A titre de résultat, un fragment d'ADN contenant le côté amont 5' ou le côté aval 3' du gène MdTFL est obtenu. Pour la 5'-RACE, l'amorce est conçue pour être une séquence spécifique d'environ 20 pb en 3' du fragment de gène obtenu en (2) ci-dessus. Pour la 3'-RACE, l'amorce est conçue pour être une séquence spécifique d'environ 20 pb en 5' du fragment de gène obtenu en (2) ci-dessus. Ensuite, une amorce ayant une séquence amont 5' spécifique et une amorce ayant une séquence aval 3' spécifique sont préparées. Une PCR est réalisée au moyen de ces amorces, de sorte que l'ADNc de MdTFL peut être amplifié. Les amorces sont conçues sous forme d'une séquence spécifique d'environ 20 pb dans la région amont 5' obtenue dans la 5'RACE, et sous forme d'une séquence spécifique dans la région aval en 3' (à l'exclusion de poly A) obtenue dans la 3'-RACE. Comme matrice pour la PCR, il est possible d'utiliser la banque d'ADNc obtenue en (1) ci-dessus. Après que le gène MdTFL obtenu en (3) ci-dessus a été ligaturé par exemple au vecteur plasmidique pBluescript ayant une extrémité T ajoutée à son site EcoRV, Escherichia coli est transformé avec le vecteur de sorte que le gène peut être cloné. Des exemples spécifiques de vecteurs qui peuvent être utilisés ici comprennent pUC18, pUC119 et pBR322, en plus du plasmide pBluescript. Normalement, un produit de PCR a tendance à avoir de l'adénine (A) à son extrémité. De ce fait, le produit de PCR d'un gène peut être cloné aisément par clivage d'un vecteur avec une enzyme de restriction, comme EcoRV, qui produit des extrémités franches, puis addition d'une extrémité thymine (T) au vecteur (procédé de clonage TA). La ligature du produit de PCR du gène à un plasmide pBluescript traité pour ajouter une extrémité T peut être réalisée normalement par une réaction au moyen par exemple d'un kit de ligature (TAKARA), généralement à 16 C pendant 1 h. La transformation de Escherichia coli peut être réalisée par tout procédé connu. Quand pBluescript est utilisé comme vecteur, le transformant résultant devient résistant à l'ampicilline et, en même temps, l'insertion d'un gène étranger dans une région codant la p-galactosidase provoque la suppression de l'activité p-galactosidase. Ainsi, il apparaît des colonies blanches, résistantes à l'ampicilline, qui ne peuvent pas hydrolyser X-GAL et qui peuvent être sélectionnées comme transformants (sélection par les couleurs bleu-blanc). De cette manière, un transformant ayant le plasmide pBMDTFL 12 dans lequel le gène MdTFL est incorporé dans un vecteur plasmidique pBluescript peut être obtenu. Par exemple, quand le gène est introduit dans Escherichia coli JM109, il est possible d'obtenir le transformant Escherichia coliJM109 (pBMDTFL 12). En outre, un micro-organisme transformé comme Escherichia coli ayant le plasmide pBMDTFL 12 ci-dessus est cultivé, puis un moyen connu, comme le procédé au SDS et à l'alcali, est employé, de sorte qu'une grande quantité de plasmide pBMDTFL 12 dans lequel est incorporé le gène MdTFL peut être obtenue. (4) Analyse génétique Toute la séquence nucléotidique de MdTFL est déterminée au moyen du vecteur plasmidique pBMDTFL 12 obtenu en (3) ci-dessus. La séquence nucléotidique peut être déterminée par une technique connue quelconque, comme le procédé de modification chimique de Maxam- Gilbert ou le procédé de terminaison de chaîne aux didésoxynucléotides. Normalement, une séquence nucléotidique est déterminée au moyen d'un séquenceur d'ADN automatique (par exemple le séquenceur d'ADN SQ- 5500 fabriqué par Hitachi, Ltd.). SEQ ID NO: 1 présente à titre d'exemple la séquence nucléotidique du gène MdTFL de la présente invention, et SEQ ID NO: 2 présente à titre d'exemple une séquence d'acides aminés d'une protéine codée par le gène MdTFL (appelée par la suite protéine MdTFL"). Cependant, des variétés végétales différentes peuvent différer en ce qui concerne leurs séquences d'acides aminés dans une certaine mesure. De plus, même si des plantes appartiennent à la même variété, leurs séquences d'acides aminés sont différentes car les acides aminés peuvent être modifiés par exemple par des mutations. Ainsi, la présente invention inclut aussi une protéine comprenant une séquence d'acides aminés ayant une délétion, une substitution ou une addition d'un ou plusieurs acides aminés (par exemple 1 à 10 acides aminés, de préférence 1 à 8, de préférence encore 1 à 3 acides aminés) dans une séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO: 2, et ayant une activité de suppression de la formation de boutons floraux. Par exemple, la protéine MdTFL de la présente invention englobe une séquence d'acides aminés comprenant une séquence d'acides aminés ayant une délétion de 1 à 10, de préférence de 1 à 5 acides aminés, une addition de 1 à 10, de préférence de 1 à 5 acides aminés ou une substitution de 1 à 10, de préférence de 1 à 5 acides aminés par d'autres acides aminés. Une telle protéine ayant une mutation peut être préparée au moyen d'un procédé approprié et peut être sélectionnée pour son activité de suppression de la formation de boutons floraux. En outre, la protéine selon la présente invention englobe un fragment peptidique de la protéine décrite ci-dessus. Un tel fragment peptidique peut être utile par exemple pour produire un anticorps ou un fragment d'anticorps dirigé contre la protéine de la présente invention. Le terme "activité de suppression de la formation de boutons floraux" selon la présente invention désigne l'aptitude à provoquer une floraison tardive en supprimant la formation de boutons floraux. Cette activité peut être confirmée par l'introduction du gène dont on suppose qu'il présente cette activité dans un modèle végétal, comme Arabidopsis thaliana, ou le tabac, puis examen de l'époque de la floraison. En outre, le gène MdTFL selon la présente invention englobe aussi un gène capable de s'hybrider dans des conditions stringentes à une séquence complémentaire d'au moins une partie d'une séquence d'ADN comprenant la séquence nucléotidique du gène MdTFL ci-dessus, et qui code une protéine ayant une activité supprimant la formation des boutons floraux. Dans la présente invention, les termes "gène" et "acide nucléique" sont parfois utilisés de manière interchangeable. Les conditions stringentes sont des conditions dans lesquelles des hybrides spécifiques sont formés tandis que des hybrides non spécifiques ne se forment pas. Par exemple, un ADN ayant une grande homologie (homologie de 76 % ou plus, de préférence de 80 % ou plus) avec un certain acide nucléique s'hybride à l'acide nucléique dans de telles conditions. Plus spécifiquement, un exemple de telles conditions comprend une concentration de sodium de 300 à 2000 mM, de préférence 600 à 900 mM et une température de 40 à 75 C, de préférence de 65 C. Par exemple, dans des conditions d'hybridation incluant une concentration de sodium de 500 mM et une température de 65 C, quand l'hybridation de l'ADN à tester avec un certain acide nucléique est confirmée par des techniques standards, comme le transfert de Southern ou l'hybridation par transfert en taches ("dot-blot"), on peut dire que l'ADN est capable de s'hybrider à l'acide nucléique dans des conditions stringentes. Le terme "une partie de séquence" utilisé ici désigne une séquence nucléotidique d'ADN contenant une partie de la séquence nucléotidique du gène MdTFL ci-dessus, et codant une protéine ayant une activité supprimant la formation des boutons floraux. De plus, la présente invention englobe un fragment du gène de la présente invention décrit ci-dessus. Un tel fragment peut ne pas être limité spécifiquement, à condition que ce soit au moins une partie du gène de la présente invention. Le fragment peut être utilisé par exemple pour préparer une sonde ou une amorce du gène de la présente invention. Lorsque la séquence nucléotidique du gène MdTFL de la présente invention est déterminée, le gène MdTFL peut être obtenu par synthèse chimique, PCR avec l'ADNc ou l'ADN génomique du gène comme matrice, ou hybridation avec, comme sonde, un fragment d'ADN contenant la séquence nucléotidique. La séquence nucléotidique du gène MdTFL de la présente invention et la séquence d'acides aminés de MdTFL ont été déposées auprès de DDBJ sous le n d'ordre AB052994. (5) Analyse du nombre de copies du gène MdTFL et site d'expression dans du tissu végétal Le nombre de copies du gène MdTFL dans une plante rosacée peut être confirmé par extraction de l'ADN des cellules ou de tissus végétaux, selon des procédés standards, puis exposition de l'ADN à une analyse de Southern. En analysant le nombre de copies du gène MdTFL et les sites d'expression de cette manière, il est possible d'étudier les caractéristiques d'un gène analogue à TFL1 ayant tendance à former une famille de gènes. De plus, l'expression du gène MdTFL dans des tissus végétaux peut être confirmée par analyse de l'expression d'ARNm ou par analyse de l'expression de la protéine dans chaque tissu d'une plante rosacée. Des exemples spécifiques de procédés pour confirmer l'expression du gène MdTFL selon la présente invention comprennent la RT-PCR et l'analyse de Northern. Des exemples de procédés pour confirmer l'expression de la protéine MdTFL comprennent l'analyse de Western avec un anticorps dirigé contre la protéine MdTFL. L'identification de la configuration de l'expression du gène MdTFL permet d'élucider les caractéristiques du gène MdTFL, de sorte qu'elle est utile pour élucider les fonctions du gène MdTFL. 2. Production de la protéine MdTFL La protéine MdTFL selon la présente invention peut être produite à partir de cellules ou de tissus des plantes rosacées décrites ci-dessus par tout procédé connu dans ce domaine pour purifier les protéines. De plus, la protéine MdTFL peut aussi être produite par un procédé de synthèse peptidique chimique connu dans ce domaine, comme le procédé de synthèse en phase solide. En outre, la protéine MdTFL de la présente invention peut aussi être produite par culture d'un transformant obtenu par transformation avec un ADN codant la protéine MdTFL et récupération de la protéine à partir de la culture résultante. Un tel procédé pour produire une protéine par génie génétique est bien connu dans la technique, et est décrit en détail ci-dessous. (1) Préparation d'un vecteur Un vecteur recombiné pour la transformation peut être obtenu par ligature du gène MdTFL à un vecteur approprié. Il est possible d'obtenir un transformant en introduisant le vecteur recombiné dans un hôte de manière que le gène MdTFL puisse être exprimé dans l'hôte. Comme vecteur, on utilise un phage ou un plasmide capable de réplication autonome dans un hôte. Les exemples d'ADN plasmidiques comprennent un plasmide dérivé de Escherichia coli (par exemple pBR322, pUC18 et pUC19), un plasmide dérivé de Bacillus subtilis (par exemple pUB110 et pTP5), et un plasmide dérivé de la levure (par exemple YEpl3, YEp24 et YCp50). Des exemples d'ADN phagiques comprennent les phages (par exemple #gt10, Igtll et #ZAP). En outre, il est possible aussi d'utiliser des vecteurs viraux animaux comme des rétrovirus ou des virus de la vaccine, et des vecteurs viraux d'insectes comme les baculovirus. Un exemple de procédé employé pour insérer le gène MdTFL dans un vecteur met en jeu le clivage d'ADN purifié avec une enzyme de restriction appropriée puis l'insertion du produit clivé dans un site de restriction ou un site de clonage multiple d'un vecteur approprié pour ligation au vecteur. Il est nécessaire que le gène MdTFL soit incorporé dans un vecteur de manière que la fonction du gène soit exercée. Ainsi, en plus d'un promoteur et du gène MdTFL, des éléments cis comme un stimulateur, un signal d'épissage, un signal d'addition de poly A, un marqueur de sélection et une séquence de fixation ribosomique (séquence de Shine-Dalgarno (SD)) peuvent être ligaturés à un vecteur recombiné si nécessaire. Des exemples de marqueurs de sélection comprennent un gène de dihydrofolate réductase, un gène de résistance à l'ampicilline et un gène de résistance à la néomycine. Il est possible d'utiliser non seulement un vecteur capable de réplication autonome dans deux ou plusieurs types de micro-organismes hôtes comme Escherichia coli ou la levure mais aussi différents vecteurs navettes. De tels vecteurs peuvent aussi être clivés avec l'enzyme de restriction ci-dessus pour obtenir un vecteur linéaire. Pour ligaturer un fragment d'ADN à un vecteur linéaire, il est possible d'utiliser une ADN ligase connue quelconque. Le fragment d'ADN et le vecteur linéaire sont ligaturés l'un à l'autre après hybridation, de sorte qu'il en résulte un vecteur recombiné. (2) Transformation L'hôte à utiliser pour la transformation n'est pas limité spécifiquement à condition qu'il puisse exprimer le gène MdTFL. Il peut s'agir par exemple d'une bactérie (Escherichia coli, Bacillus subtilis), d'une levure, de cellules végétales, de cellules animales (cellules COS, cellules CHO), et de cellules d'insectes. Quand des bactéries sont utilisées comme hôtes, de préférence un vecteur recombiné est capable de réplication autonome dans l'hôte bactérien et comprend un promoteur, une séquence de fixation ribosomique, le gène MdTFL et une séquence de terminaison de la transcription. De plus, un gène qui régule un promoteur peut être inclus. Un exemple d'hôte Escherichia coli est Escherichia coli DH5[alpha] et un exemple d'hôte Bacillus est Bacillus subtilis. Il est possible d'utiliser tout promoteur capable d'expression dans un hôte comme Escherichia coli. Par exemple, il est possible d'utiliser un promoteur dérivé de Escherichia coli ou d'un phage, comme le promoteur trp, le promoteur lac, le promoteur PL ou le promoteur PR. Par exemple, il est possible aussi d'utiliser le promoteur tac qui est conçu et modifié artificiellement. Des exemples de procédés pour introduire un vecteur recombiné dans des bactéries ne sont pas limités spécifiquement à condition que ce soient des procédés permettant d'introduire un ADN dans des bactéries, et ces procédés comprennent un procédé utilisant les ions calcium et l'électroporation. Quand une levure est utilisée comme hôte, on peut utiliser généralement Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe. Dans ce cas, le promoteur à utiliser n'est pas limité spécifiquement à condition qu'il puisse être exprimé dans une levure. Ce peut être par exemple le promoteur GAL1, le promoteur GAL10, le promoteur de protéine de choc thermique, le promoteur GAP ou le promoteur ADH. Les exemples de procédés pour introduire un vecteur recombiné dans une levure ne sont pas limités particulièrement à condition que ce soient des procédés permettant d'introduire de l'ADN dans une levure, et ce peut être par exemple l'électroporation, un procédé utilisant des sphéroplastes ou un procédé utilisant l'acétate de lithium. Quand des cellules animales sont utilisées comme hôtes, des exemples de cellules animales utilisées comprennent les cellules de singe COS-7, Vero, les cellules ovariennes de hamster chinois (cellules CHO), les cellules L de souris, les cellules GH3 de rat et cellules FL humaines. Comme promoteur, il est possible d'utiliser le promoteur SRa, le promoteur SV40 ou le promoteur CMV, par exemple. De plus, il est possible aussi d'utiliser un promoteur précoce du cytomégalovirus humain. Les exemples de procédés pour introduire un vecteur recombiné dans des cellules animales comprennent l'électroporation, le procédé au phosphate de calcium et la lipofection. Quand des cellules d'insectes sont utilisées comme hôtes, il est possible d'utiliser par exemple des cellules Sf9. Les exemples de procédés pour introduire un vecteur recombiné dans des cellules d'insectes comprennent le procédé au phosphate de calcium, la lipofection et l'électroporation. (3) Production de la protéine MdTFL Selon la présente invention, la protéine MdTFL peut être obtenue par culture du transformant ci-dessus portant le gène MdTFL et récupération de la protéine à partir de la culture. Le terme "culture" désigne le surnageant de culture, les cellules cultivées, la souche bactérienne cultivée ou les cellules ou bactéries lysées. Le transformant selon la présente invention est cultivé dans un milieu de culture selon des procédés employés normalement pour cultiver des hôtes. Comme milieu de culture pour la culture des transformants obtenus avec des micro-organismes hôtes comme Escherichia coli ou la levure, il est possible d'utiliser un milieu naturel ou synthétique à condition qu'il contienne une source de carbone, une source d'azote, des sels inorganiques ou autres qui sont assimilables par les micro-organismes, et qu'il permette une culture efficace des transformants. Des exemples de sources de carbone utilisées ici comprennent les glucides comme le glucose, le fructose, le saccharose ou l'amidon, les acides organiques comme l'acide acétique ou l'acide propionique et les alcools comme l'éthanol ou le propanol. Les exemples de sources d'azote comprennent l'ammoniac, le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, l'acétate d'ammonium et le phosphate d'ammonium, les sels d'ammonium d'acides organiques, la peptone, l'extrait de viande, la liqueur de trempage du maïs et d'autres composés azotés. Des exemples de substances inorganiques qui sont utilisées ici comprennent le phosphate primaire de potassium, le phosphate secondaire de potassium, le phosphate de magnésium, le sulfate de magnésium, le chlorure de sodium, le sulfate ferreux, le sulfate de manganèse, le sulfate de cuivre et le carbonate de calcium. La culture est normalement réalisée dans des conditions de culture agitée ou de culture sous aération et agitation, dans des conditions aérobies à approximativement 37 C pendant environ 5 à 30 jours. Pendant la culture, le pH est maintenu au voisinage du pH neutre. Le pH est ajusté avec un acide inorganique ou organique, une solution alcaline ou analogue. Pendant la culture, des antibiotiques comme l'ampicilline ou la tétracycline peuvent être ajoutés au milieu, si nécessaire. Quand un micro-organisme transformé avec un vecteur d'expression contenant un promoteur inductible est cultivé, un inducteur peut être ajouté au milieu, si nécessaire. Par exemple, quand un microorganisme transformé avec un vecteur d'expression contenant le promoteur lac est cultivé, il est possible d'ajouter comme inducteur l'isopropyl-p-D-thiogalactoside (IPTG), et quand un micro-organisme transformé avec un vecteur d'expression contenant le promoteur trp est cultivé, il est possible d'ajouter de l'acide indolacétique (IAA) au milieu. Comme milieu de culture pour cultiver les transformants obtenus avec des cellules animales comme hôtes, on emploie généralement le milieu RPMI1640, le milieu DMEM ou un milieu additionné de sérum foetal de veau. La culture est normalement réalisée en présence de 5 % de CO2, à 37 C pendant environ 1 à 30 jours. Pendant la culture, des antibiotiques comme la kanamycine ou la pénicilline peuvent être ajoutés dans le milieu de culture si nécessaire. Après la culture, quand la protéine MdTFL est produite dans des souches bactériennes ou dans des cellules, la protéine est extraite par lyse des souches ou des cellules. De plus, quand la protéine MdTFL est sécrétée par les souches bactériennes ou les cellules, le milieu de culture peut être utilisé intact, ou bien le milieu de culture peut être soumis à une centrifugation pour retirer les souches ou les cellules. Ensuite, la protéine MdTFL peut être isolée et purifiée à partir de la culture ci-dessus au moyen d'un procédé biologique seul, ou par une combinaison appropriée de moyens généralement employés pour l'isolement et la purification des protéines, comme la précipitation au sulfate d'ammonium, la chromatographie sur gel, la chromatographie d'échange d'ions ou la chromatographie d'affinité. Le fait que la protéine MdTFL soit obtenue peut être confirmé par électrophorèse en gel de SDS-polyacrylamide. 3. Préparation d'un vecteur recombiné et production d'une plante transformée Le gène MdTFL ou l'ADN antisens du gène MdTFL obtenu comme décrit dans la section ci-dessus "1. Isolement et identification du gène MdTFL" est introduit dans des plantes hôtes, de sorte que l'expression du gène MdTFL est stimulée ou supprimée, et que l'époque de formation des boutons floraux peut être régulée. Par exemple, il est possible de produire une plante transformée ayant des propriétés de floraison précoce en supprimant l'expression du gène MdTFL dans la plante hôte. D'autre part, il est possible de produire une plante transformée ayant des propriétés de floraison tardive en stimulant l'expression du gène MdTFL. Comme décrit ci-dessus, une plante transformée dans laquelle l'expression du gène MdTFL est régulée peut être utilisée pour étudier la formation des boutons floraux et les propriétés de floraison d'une plante. Le terme "propriétés de floraison précoce" selon la présente invention désigne la période qui s'étend de la germination ou de la greffe d'une plante à la première floraison, qui est plus courte que celle d'une plante témoin (non transformée). De plus, le terme "propriétés de floraison tardive" désigne la période qui s'étend de la germination ou du greffage d'une plante à la première floraison, qui est plus longue que celle d'une plante témoin. (1) Plante hôte pour la transformation Les plantes hôtes selon la présente invention désignent des plantes quelconques parmi les suivantes : des cellules végétales cultivées, des plantes cultivées entières, des organes végétaux (par exemple feuilles, pétales floraux, tiges, racines, porte-greffes et graines) ou des tissus végétaux (épiderme, phloème, parenchyme, xylème et faisceau fibrovasculaire). De préférence, une plante qui peut être utilisée comme plante hôte peut être une plante ou arbre vivace, quand on prend en considération l'objectif de la présente invention qui consiste à conférer des propriétés de floraison précoce à des espèces végétales ayant de longues périodes juvéniles, en plus du modèle végétal constitué par Arabidopsis thaliana. Le terme "plante vivace" ne désigne pas une plante dont la vie se termine en une année, comme le riz ou le blé, mais désigne une plante qui peut pousser pendant plusieurs années (5 à 10 ans ou plus). Une plante vivace peut être par exemple une plante portant des fruits (arbres fruitiers). Une telle plante fruitière vivace comprend une plante appartenant à la famille des rosacées (pommier, pêcher, poirier, cerisier), une plante appartenant à la famille des Ebenaceae (plaqueminier), une plante appartenant à la famille des Vitaceae (vigne), une plante appartenant à la famille des Rutaceae (plante appartenant aux genres Poncirus, Fortunella, Citrus), une plante appartenant à la famille des Ericaceae (myrtilles, airelles), une plante appartenant à la famille des Juglandaceae (noyer), une plante appartenant à la famille des Fagaceae (châtaignier). Sont inclus comme arbres, par exemple les plantes appartenant à la famille des Taxodiaceae (cryptomères), à la famille des Pinaceae (Pinus densiflora, Pinus thunbergii) et à la famille des Cupressaceae (cyprès japonais). (2) Vecteur recombiné Un vecteur recombiné contenant le gène MdTFL ou l'ADN antisens du gène peut être obtenu par ligature (insertion) du gène ou de l'ADN antisens dans un vecteur approprié. Les exemples de vecteurs pour l'insertion du gène MdTFL ou de l'ADN antisens du gène ne sont pas limités spécifiquement à condition qu'ils soient capables de réplication dans des plantes hôtes, et ils comprennent un ADN plasmidique, un ADN phagique et un système de vecteur binaire. Les exemples d'ADN plasmidiques comprennent un plasmide dérivé de Escherichia coli (par exemple pBR322, pUC18 et pUC19), et un plasmide dérivé de Bacillus subtilis (par exemple PBU110 et pTP5). Les exemples d'ADN phagiques comprennent les phages # (par exemple #gt10, #gt11 et #ZAP). De plus, quand la transformation est réalisée au moyen d'une agrobactérie (qui sera décrite plus précisément dans la suite), il est possible d'utiliser un système de vecteur binaire (par exemple pBI121, pGA482 et pSMAK251). Le gène MdTFL peut être obtenu de la manière décrite dans la section ci-dessus "1. Isolement et identification du gène MdTFL". De plus, comme ADN antisens du gène MdTFL, il est possible de citer à titre d'exemple un ADN comprenant une séquence complémentaire de la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 1. Cependant, l'ADN antisens utilisé dans la présente invention n'est pas nécessairement une séquence totalement complémentaire de la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 1, à condition qu'il puisse supprimer l'expression du gène MdTFL endogène quand il est introduit dans une plante hôte. De ce fait, un ADN qui comprend une séquence complémentaire d'un ADN capable de s'hybrider dans des conditions stringentes à un ADN comprenant une séquence complémentaire d'au moins une partie de la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 1 peut aussi être utilisé comme ADN antisens dans la présente invention. De plus, un acide nucléique antisens peut constituer une partie d'une séquence complémentaire de la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 1 à condition qu'il puisse supprimer ou inhiber l'expression (traduction ou transcription) du gène MdTFL endogène quand il est introduit dans une plante hôte. Des conditions stringentes et un procédé pour synthétiser de l'ADN sont tels que décrits dans la section "1. Isolement et identification du gène MdTFL". Par exemple, un procédé employé pour insérer le gène MdTFL ou l'ADN antisens du gène dans un vecteur recombiné met en jeu le clivage d'ADN purifié avec une enzyme de restriction appropriée, la ligature d'un lieur approprié si nécessaire puis l'insertion de l'ADN clivé dans un site de restriction ou dans un site de clonage multiple d'un ADN vecteur approprié pour la ligature au vecteur. Le gène MdTFL ou l'ADN antisens du gène devrait être incorporé dans un vecteur pour qu'il puisse exercer sa fonction. Ainsi, une cassette d'expression est ligaturée dans le vecteur. La cassette d'expression comprend (i) une séquence promotrice qui peut diriger la transcription de l'ADN dans des cellules végétales, (ii) le gène MdTFL ou l'ADN antisens du gène ligaturé en aval de la séquence promotrice, et (iii) une séquence terminatrice contenant une séquence nécessaire pour la terminaison de la transcription et la polyadénylation, et ajoutée en aval du gène ou de l'ADN antisens. Il est possible également de ligaturer à la cassette d'expression, en plus d'un promoteur, une séquence d'ADN pour favoriser encore la transcription, par exemple des éléments cis, comme une séquence simulatrice, un signal d'épissage, un signal d'addition de poly A, un marqueur de sélection, une séquence de fixation ribosomique (séquence SD). Le promoteur à utiliser n'est pas limité spécifiquement à condition qu'il soit actif dans une plante. Par exemple, il est possible aussi d'utiliser un promoteur destiné à l'expression permanente, comme le promoteur 35S ou un promoteur inductible. De plus, il est possible aussi de ligaturer un terminateur pour terminer la transcription en aval du gène MdTFL ou de l'ADN antisens du gène, si nécessaire. Un tel terminateur comprend un terminateur dérivé du virus de la mosaïque du chou fleur et un terminateur du gène de nopaline synthase. Cependant, le terminateur à utiliser n'est pas limité à ceux-ci, à condition qu'il soit connu comme étant actif dans une plante. De plus, il est préférable de ligaturer un gène marqueur de sélection efficace à un vecteur recombiné pour sélectionner efficacement les plantes transformées d'intérêt. Les exemples de marqueurs de sélection utilisés dans ce but comprennent un gène de résistance à la kanamycine (NTP II), un gène d'hygromycine phosphinothricine acétyltransférase (htp) qui confère à une plante une résistance à l'antibiotique hygromycine, et un gène de phosphinothricine acétyltransférace (bar) qui confère à une plante une résistance au bialaphos. (3) Production d'un transformant La plante transformée selon la présente invention peut être obtenue par introduction du vecteur recombiné décrit en (2) ci-dessus dans une plante hôte de manière que le gène MdTFL ou l'ADN antisens du gène ligaturé au vecteur puisse fonctionner. Le vecteur recombiné ci-dessus peut être introduit dans une plante hôte par différents procédés connus. Par exemple, il est possible d'employer un procédé d'introduction indirect utilisant des agrobactéries et un procédé d'introduction direct représenté par l'électroporation, un procédé utilisant le polyéthylèneglycol, un procédé à canon de particules. Parmi ces procédés, le procédé utilisant des agrobactéries est très efficace pour les dicotylédones incluant les plantes rosacées, car le procédé permet une transformation stable. Quand le procédé aux agrobactéries est employé, un vecteur recombiné construit est introduit dans des souches d'Agrobacterium appropriées, comme Agrobacterium tumefaciens C58, LBA4404, EHA101, C58C1RifR, EHA105 ou Agrobacterium rhizogenes LBA9402 au moyen d'un procédé incluant un procédé de congélation et décongélation, ou l'électroporation. Ensuite, la souche est amenée à infecter des lamelles cultivées dans des conditions aseptiques selon un procédé conventionnel comme le procédé d'immersion florale, ou un procédé à disques foliaires, de sorte qu'il est possible d'obtenir des plantes transformées. De plus, les exemples de procédés d'infection à agrobactéries comprennent un procédé utilisant un vecteur intermédiaire et un vecteur binaire. Dans la présente invention, il est possible d'introduire un gène au moyen de l'un quelconque de ces procédés d'infection. Quand le procédé au canon de particules est employé, il est possible d'utiliser directement une plante, un organe végétal ou un tissu végétal, ou bien de l'utiliser après en avoir préparé des coupes, ou après en avoir préparé des protoplastes. Les échantillons ainsi préparés peuvent être traités au moyen d'un système de transfert de gène (par exemple canon à particules PDS-1000, Bio-Rad). Les conditions de traitement peuvent varier en fonction du type de plante ou d'échantillon, mais, normalement, on applique une pression d'approximativement 3103 x 103 à 13790 x 103 Pa (450 à 2000 psi) à une distance d'environ 4 à 12 cm du sujet. Quand des cellules végétales cultivées sont utilisées comme hôtes, la transformation est réalisée par introduction de vecteurs recombinés dans les cellules cultivées par le procédé au canon de particules ou le procédé d'électroporation. En termes d'efficacité et de facilité de manipulation, la production d'une plante transformée par le procédé d'infection à agrobactéries au moyen d'un système de vecteur binaire va être décrit spécifiquement ci-dessous à titre d'exemple préféré selon la présente invention. Quand un gène est introduit par le procédé d'infection à agrobactéries, une étape d'infection d'une plante hôte avec des agrobactéries comportant un plasmide contenant un gène cible est nécessaire. Quand cette étape est mise en #uvre par le procédé d'immersion florale, les plantes hôtes à transformer sont cultivées, et les boutons floraux des plantes hôtes sont plongés directement dans une suspension de souches d'Agrobacterium comportant des plasmides contenant le gène MdTFL ou l'ADN antisens du gène. Les pots sont transférés sur un plateau, recouverts puis laissés au repos pendant une nuit à l'humidité. Les couvercles sont retirés le jour suivant et les plantes sont cultivées encore, ce qui permet de récolter les graines. Ensuite, pour sélectionner une plante ayant le transgène (transformant), des graines issues de différentes lignées sont inoculées à du milieu gélosé MS additionné d'antibiotiques appropriés. Les plantes qui ont poussé sur le milieu sont transplantées dans des pots pour être cultivées encore. Ainsi, il est possible d'obtenir des graines de plantes transformées dans lesquelles le gène MdTFL ou l'ADN antisens du gène selon la présente invention a été introduit. D'autre part, le procédé aux disques foliaires est employé de préférence pour l'infection avec des agrobactéries quand des plantes vivaces sont utilisées comme hôtes, car il est possible de produire directement un grand nombre de transformants par ce procédé. Spécifiquement, des disques foliaires recueillis sur des feuilles stériles cultivées dans des conditions stériles de plantes du genre Malus sont plongés dans une culture, par exemple, de Agrobacterium tumefaciens EHA101 (pSMDTFL, voir l'exemple 4), cultivés dans du milieu de régénération et amenés à former des cals et à croître. Comme milieu de régénération, il possible d'utiliser par exemple un milieu connu comme un milieu MS additionné d'hormone végétale. Puis, des cals sont sélectionnés au moyen d'un milieu de sélection. Comme milieu de sélection pour sélectionner les transformants, il est possible d'utiliser le milieu de régénération ci-dessus qui est additionné en outre de kanamycine à raison de 25 à 100 ug/mL, ou comme milieu pour stériliser les agrobactéries, il est possible d'utiliser le même milieu de régénération qui est additionné d'un agent antimicrobien comme le céfotaxime à raison de 200 à 500 ug/mL. Les cals, les pousses, les racines chevelues ou d'autres tissus résultant de la transformation peuvent être utilisés pour la culture de cellules, la culture de tissus ou la culture d'organes. A titre d'alternative, ces tissus ou cellules peuvent être amenés à régénérer des plantes par un procédé standard connu pour la culture de tissus végétaux par administration d'une hormone végétale (par exemple auxine, cytokinine, acide abscisique et gibbérelline) à une concentration appropriée. De plus, l'acclimatation des plantes transformées est réalisée par transplantation des plantes transformées dans un milieu d'enracinement pour les plantes pour former leurs propres racines, puis transplantation des plantes en pots remplis de sol. A titre d'alternative, une naturalisation est réalisée par greffage des plantes à des porte-greffes appropriés. Ainsi, il est possible de réaliser un transfert de la culture au niveau du laboratoire à la culture au niveau de la serre. Il est possible de confirmer l'introduction du gène MdTFL ou de l'ADN antisens du gène dans une plante par PCR, hybridation de Southern ou hybridation de Northern. Par exemple, l'ADN est préparé à partir des plantes transformées, puis des amorces spécifiques d'ADN sont conçues et une PCR est ensuite réalisée au moyen d'un procédé conventionnel. Ensuite, la transformation peut être confirmée en soumettant les produits amplifiés à une électrophorèse en gel d'agarose, une électrophorèse en gel de polyacrylamide ou une électrophorèse capillaire, à une coloration des produits avec un colorant approprié, comme le bromure d'éthidium et le SYBR Green, puis à une détection du produit amplifié sous forme d'une bande unique. En outre, il est possible aussi de détecter les produits amplifiés en réalisant une PCR avec des amorces marquées avec un marqueur approprié, par exemple un colorant fluorescent. De plus, il est possible aussi d'utiliser d'autres procédés qui mettent en jeu la liaison des produits amplifiés à une phase solide, comme une microplaque, puis la confirmation des produits amplifiés par fluorescence ou réaction enzymatique. (4) Analyse de l'expression du gène MdTFL dans une plante transformée L'analyse du niveau d'expression et du site d'expression du gène MdTFL dans une plante transformée dans laquelle le gène MdTFL ou l'ADN antisens du gène a été introduit peut être réalisée en extrayant l'ARNm de ces cellules ou de ces tissus par un procédé connu quelconque, puis détection de l'ARNm du gène MdTFL par un procédé RT-PCR ou par analyse de Northern. La plante transformée présentant une expression accrue du gène MdTFL peut être utilisée pour étudier la formation des boutons floraux et la floraison des plantes. De plus, la plante transformée présentant une expression supprimée du gène MdTFL est très intéressante en agriculture car elle présente des propriétés de floraison précoce. 4. Plante à floraison précoce La plante transformée produite selon la section ci-dessus "3. Préparation d'un vecteur recombiné et production d'une plante transformée" ayant une expression supprimée du gène MdTFL présente des propriétés de floraison précoce. D'autre part, les plantes transformées manifestant l'expression accrue du gène présentent des propriétés de floraison tardive. A titre d'alternative, il est possible d'obtenir une plante à laquelle sont conférées des propriétés de floraison précoce en supprimant l'expression ou l'activité d'un gène MdTFL endogène dans une plante. De ce fait, un procédé pour produire une plante à floraison précoce n'est pas limité aux procédés décrits en détails ici. Un tel procédé peut être compris aisément par l'homme du métier. L'évaluation de l'époque de floraison d'une plante y compris la plante transformée décrite ci-dessus (par exemple ayant des propriétés de floraison précoce ou des propriétés de floraison tardive) peut être réalisée en cultivant, dans des conditions similaires, une plante à tester (par exemple une plante transformée dans laquelle a été introduit le gène MdTFL ou l'ADN antisens du gène) et une plante témoin (par exemple une plante non transformée) et en comparant leurs époques de floraison. Par exemple, dans le cas de la plante modèle Arabidopsis thaliana, les plantes transformées sont plantées dans des pots additionnés d'un sol contenant de la vermiculite et la perlite, amenées à croître à 20 à 25 C puis examinées en ce qui concerne leurs époques de floraison. Dans le cas de plantes vivaces, les pousses transformées avec le système de culture aseptique ci-dessus sont greffées pour l'acclimatation, et les plantes sont transférées en serre puis examinées en ce qui concerne leurs époques de floraison. De plus, en utilisant les processus ci-dessus pour la différenciation et l'induction d'une plante à partir de cellules infectées, des tissus (par exemple des racines, des pousses et des feuilles) ou des organes (par exemple le point végétatif et le pollen) de plantes transformées sont cultivés. Ainsi, sans phase reproductive (graine), il est possible de reproduire des plantes transformées. De telles techniques et de tels processus sont connus de l'homme du métier et des procédés généraux de culture de tissus sont décrits dans différents manuels spécialisés. La graine obtenue à partir de la plante transformée ainsi produite, selon la présente invention, germe et se développe normalement, et présente des propriétés de floraison précoce. Ceci confirme le fait que le gène MdTFL ou l'ADN antisens du gène introduit est conservé dans la génération suivante, de sorte que les propriétés de floraison précoce sont transmises de manière stable à la descendance. De ce fait, selon la présente invention, il est possible d'obtenir des plantes pratiques et utiles présentant des propriétés de floraison précoce. Selon la présente invention, il est fourni une plante ayant un gène qui supprime la formation des boutons floraux ou un ADN antisens de ce gène. La plante transformée comportant l'ADN antisens obtenue selon la présente invention a des propriétés de floraison précoce et des propriétés de fructification précoce, sans provoquer de malformation, de sorte qu'elle est utile en agriculture. La présente invention est illustrée plus précisément par les exemples non limitatifs suivants : Exemple 1 : ISOLEMENT DU GENE MdTFL (1) Pommiers employés dans les expériences suivantes On a utilisé des pommiers Jonathan (Malus domestica cv. Jonathan) de 15 à 16 ans greffés à des porte-greffes Maruba. (2) Préparation d'ARN poly (A)+ Avant et après le stade d'initiation florale (différenciation des boutons floraux) c'est-à-dire de juillet à septembre, les apex des pousses de la plante de (1) ci-dessus ont été recueillis, puis l'ARN total a été préparé par le procédé au CTAB. Spécifiquement, 3 g d'apex de pousses de pommier congelés ont été broyés en une poudre, mis en suspension dans 3 mL de solution 2 x CTAB (2 % de CTAB, 0,1 M Tris-HCI, pH 9,5, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCI, 1 % de 2-propanol), puis incubés à 65 C pendant 10 min. La solution a été soumise deux fois à une extraction avec du chloroforme-isoamyle, additionnée de 1/4 de volume de chlorure de lithium 10 M puis laissée au repos à -20 C pendant 2 h pour obtenir de l'ARN précipité. Ensuite, une centrifugation a été réalisée à 12000 x g pendant 10 min à 4 C pour recueillir l'ARN précipité. L'ARN total obtenu a été dissous dans TE (Tris-HCI 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM), puis soumis à un traitement au phénol saturé de TE, à un traitement au phénol-chloroforme, puis à une précipitation à l'éthanol, pour obtenir l'ARN total purifié. L'ARN total obtenu a été dissous dans de l'eau stérilisée puis soumis à un procédé de mesure de l'absorbance et à un procédé d'électrophorèse en gel d'agarose dénaturé au formaldéhyde pour confirmer qu'un ARN total de haute qualité avait été préparé. 140 ug de l'ARN total ci-dessus ont été dissous dans 235 l d'eau stérilisée. 35 pl d'oligotex (dT) 30 (TOYOBO) ont été ajoutés à la solution, la solution a été chauffée à 70 C pendant 10 min puis rapidement refroidie dans la glace. 17,5 pl de NaCI 5M ont été ajoutés à la solution, la solution a été agitée puis chauffée à 37 C pendant 10 min. Ensuite, la solution a été centrifugée à 12000 x g pendant 5 min à 25 C, puis le surnageant à été jeté. 500 pl de tampon de lavage (Tris-HCI 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, NaCI 0,5 M, SDS 0,1 %) ont été ajoutés à la solution, après quoi la solution a été centrifugée de nouveau à 12000 x g pendant 5 min à 25 C. Après addition de 100 l d'eau distillée au précipité et chauffage de la solution à 65 C pendant 5 min, la solution a été centrifugée à 12000 x g pendant 10 min à 25 C. Le surnageant a été conservé puis 100 pl d'eau distillée ont été ajoutés de nouveau au précipité. La solution a été chauffée à 65 C pendant 5 min puis centrifugée à 12000 x g pendant 10 min à 25 C. Le surnageant a été recueilli puis ajouté au surnageant obtenu dans la première étape. Ensuite, une précipitation à l'éthanol a été réalisée pour obtenir 3,0 g d'ARN poly (A)+. (3) Synthèse d'une banque d'ADNc De l'ADNc simple brin a été synthétisé au moyen d'un kit de synthèse d'ADNc (Amersham) avec 3,0 g de l'ARN poly (A)+ obtenu en (2) ci-dessus. Dans cette réaction, oligo (dT) 25 a été utilisé comme amorce. Une solution de l'ARN et des amorces a été préparée avec la composition suivante : ARN 30 l (3 g) Amorce 3 pl Total 33 l Le mélange ci-dessus a été chauffé à 70 C pendant 5 min. Puis, le mélange a été placé sur la glace pendant 1 min après quoi les réactifs suivants ont été ajoutés au mélange : Solution d'ARN/amorce 33 l 5 x tampon pour synthèse 1er brin 12 l Acide phosphorique 3 l HPRI (inhibiteur de RNase placentaire 3 l humaine) Mélange de NTP pour 1er brin 6 l Total 57 l 3 l (20 unités/NI) de transcriptase inverse ont été ajoutés à la solution ci-dessus, puis la solution a été incubée à 42 C pendant 2 h, pour synthétiser un ADNc simple brin. Ensuite, les réactifs suivants ont été ajoutés à la solution réactionnelle de l'ADNc simple brin résultant. Solution réactionnelle d'ADNc simple brin 60 l 2,5 x tampon pour synthèse 2ème brin 120 l 0,8 unité/pl RNase H 3 l 3,5 unités/NI ADN polymérase I 20 l Eau distillée stérile 97 l Total 200 l La solution réactionnelle ci-dessus a été incubée à 12 C pendant 1 h, 22 C pendant 1 h puis 70 C pendant 10 min, de sorte que de l'ADNc double brin a été synthétisé. L'ADNc double brin synthétisé a été incubé avec 6 unités de T4 polymérase à 37 C pendant 10 min pour obtenir un ADNc ayant des extrémités franches. Après extraction au phénol/chloroforme et précipitation à l'éthanol, le culot résultant a été dissous dans 20 pl de tampon TE. 3 l de solution d'ADNc (1,0 g) ont été mélangés avec 1 l (100 pmol) d'adaptateur EcoRI, 4 l de solution de kit de ligature II et 8 l de solution de kit de ligature I (TAKARA), après quoi la solution a été incubée à 4 C pendant 12 h pour ajouter des extrémités EcoRI à l'ADNc. Après phosphorylation des extrémités EcoRI, 4,0 l (500 g) de la solution d'ADNc ayant des extrémités EcoRI, 1,0 l de cassette EcoRI (TAKARA), 5 pl de solution de kit de ligature II et 10 l de solution de kit de ligature I (TAKARA) ont été mélangés, après quoi la solution a été incubée à 4 C pendant 12 h pour ajouter une cassette EcoRI à l'ADNc double brin, pour préparer ainsi une banque d'ADNc pour le clonage par RACE-PCR. (4) Préparation d'amorces Des amorces ont été synthétisées sur la base des séquences d'acides aminés hautement conservées parmi la protéine TFL1 de Arabidopsis thaliana et la protéine CENTRORADIALIS (CEN) de Antirrhinum majas. Spécifiquement, une amorce 5'-ATTGTGACTGACATCCCAGGC-3' (SEQ ID NO: 6) a été synthétisée sous forme d'amorce sens 5' sur la base de IVTDIPG (SEQ ID NO: 5) à l'extrémité N-terminale, la séquence commune des protéines analogues à TFL des deux plantes. De plus, une amorce dégénérée 5'-CG/TT/CTGIGCA/GTTA/GAAA/GAAIAC-3' (SEQ ID NO: 4) a été synthétisée sous forme d'amorce antisens 3' sur la base de VYFNAQRE (SEQ ID NO: 7) à l'extrémité C-terminale. Dans la séquence ci-dessus, "I" désigne l'inosine. (5) Amplification du fragment de gène MdTFL du pommier par RT-PCR Une PCR a été réalisée en utilisant comme matrice l'ADNc double brin synthétisé en (2) ci-dessus, et comme amorces l'amorce sens et l'amorce antisens préparées en (3) ci-dessus. La composition de la solution réactionnelle de PCR est montrée ci-dessous : Solution d'ADNc 1 l Eau distillée stérile 17,5 l 10 x tampon de PCR 2,5 l 2,5 mM mélange de dNTP 2 l 10 M amorce sens 1 l 10 M amorce antisens 1 l 5 U/ l Taq polymérase 0,25 l Total 25,25 l La solution réactionnelle ci-dessus a été bien mélangée puis chauffée à 95 C pendant 10 min. Puis la PCR a été réalisée en 40 cycles, chaque cycle consistant en les conditions suivantes : dénaturation thermique à 94 C pendant 1 min, hybridation à 50 C pendant 1 min et réaction d'élongation à 72 C pendant 2 min. Le produit de PCR résultant a été soumis à une électrophorèse en gel d'agarose à 1,5 %. Il en est résulté la confirmation d'une seule bande de 235 pb. Le produit de PCR a été ligaturé à pBluescript SKII (+) (STRATAGENE) qui avait été clivé avec EcoRV et additionné d'une extrémité thymine (T) pour construire un plasmide recombiné. Le plasmide recombiné a été utilisé pour transformer la souche de Escherichia coli DH5a. Une colonie unique a été cultivée dans du milieu LB, des plasmides ont été purifiés puis analysés au moyen d'un séquenceur d'ADN fluorescent automatique (Hitachi, Ltd. SQ5500) utilisant le kit de séquençage cyclique à Thermo Sequenase prémélangé (Amersham). La détermination des séquences nucléotidiques d'une pluralité de produits de PCR a révélé qu'ils avaient tous une séquence identique et qu'ils présentaient une homologie d'approximativement 75 % avec TFL1 d'Arabidopsis thaliana. De ce fait, on a considéré que les fragments de gène constituaient des parties du gène homologue de TFL du pommier. (6) Isolement du gène MdTFL du pommier Le gène MdTFL de longueur intégrale a été isolé par RACE-PCR avec la banque d'ADNc préparée en (3) ci-dessus et le fragment de gène préparé en (5) ci-dessus. Spécifiquement, dans le fragment de gène obtenu en (5) ci-dessus, deux amorces sens (R1S et R2S) (SEQ ID NO: 8 et 9, respectivement) ayant des séquences d'ADN spécifiques pour le gène, les deux amorces antisens (R1A et R2A) (SEQ ID NO: 10 et 11, respectivement) ayant des séquences d'ADN spécifiques ont été conçues. Des 5' RACE-PCR et 3' RACE-PCR ont été réalisés avec ces quatre amorces et des amorces cassettes (Cl et C2) (SEQ ID NO: 12 et 13 respectivement) (TAKARA). Dans la 5' RACE, la première PCR a été réalisée avec la banque d'ADNc comme matrice et Cl et R2A comme amorces, et la seconde PCR a été réalisée avec le produit de PCR obtenu à partir de la première PCR comme matrice et C2 et R2A comme amorces. D'autre part, dans la 3' RACE, la première PCR a été réalisée avec la banque d'ADNc comme matrice et Cl et RIS comme amorces, et la seconde PCR a été réalisée avec le produit de PCR obtenu à partir de la première PCR comme matrice et C2 et R2S comme amorces. La composition réactionnelle de PCR est la suivante : Solution d'ADNc produit de PCR de la 1ère 1 NI PCR Eau distillée stérile 17,5 l 10 x tampon de PCR 2,5 l 2,5 mM mélange de dNTP 2 l 10 M amorce cassette 1 l 10 M amorce spécifique 1 l 5 U/ l LA Taq polymérase 0,25 l Total 25,25 l La solution réactionnelle a été bien mélangée, les première et seconde réactions de PCR ont été conduites l'une et l'autre pendant 30 cycles, chaque cycle consistant en les conditions suivantes : dénaturation thermique à 94 C pendant 30 s, hybridation et extension à 62 C pendant 4 min. Un produit d'amplification de 550 pb a été obtenu à partir de la 5' RACE-PCR, et un produit d'amplification de 450 pb a été obtenu à partir de la 3' RACE-PCR. Par le procédé décrit en (5) ci-dessus, chaque fragment de gène a été cloné puis les séquences nucléotidiques ont été déterminées. On a montré qu'un site d'initiation de la traduction ATG était présent dans un fragment de 550 pb du côté amont 5' du gène, et qu'une séquence poly A était présente dans un fragment de 450 pb du côté aval en 3'. Ainsi, les amorces spécifiques (2S et 2A) (SEQ ID NO: 14 et 15 respectivement) ont été conçues dans chacun de ces fragments de gène, puis le gène MdTFL de longueur intégrale a été amplifié par LA-PCR. La réaction de PCR a été réalisée pendant 25 cycles, chaque cycle consistant en les conditions suivantes : dénaturation thermique à 94 C pendant 1 min, hybridation à 50 C pendant 1 min et réaction d'élongation à 72 C pendant 2 min. Par les processus mentionnés ci-dessus, on a obtenu 650 pb de fragment de gène amplifié. Ensuite, le fragment de gène a été cloné par le procédé décrit en (5) ci-dessus, pour obtenir quatre plasmides recombinés, pBMDTFL1, pBMDTFL2, pBMDTFL5 et pBMDTFL12, respectivement. La composition réactionnelle pour la PCR est la suivante : Solution d'ADNc 1 l Eau distillée stérile 17,5 l 10 x tampon de PCR 2,5 l 2,5 mM mélange de dNTP 2 l 10 M amorce sens 1 NI 10 M amorce antisens 1 l 5 U/ l LA Taq polymérase 0,25 l Total 25,25 l (7) Détermination de la séquence nucléotidique La séquence nucléotidique totale de l'ADNc obtenu a été déterminée avec les plasmides pBMDTFLl, pBMDTFL2, pBMDTFL5 et pBMDTFL12. Les plasmides ont été préparés à partir de cellules de Escherichia coli cultivées par un procédé au SDS et à l'alcali. La séquence nucléotidique a été déterminée par un procédé similaire à celui utilisé en (5) ci-dessus. Le résultat montrait que tout ADNc dans les plasmides pBMDTFLl, pBMDTFL2, pBMDTFL5 et pBMDTFL12 comprenait des nucléotides de 656 pb (SEQ ID NO: 1), et seulement un cadre de lecture ouvert codant une protéine supposée comprenant 172 résidus d'acides aminés était présent dans les nucléotides. Exemple 2 : ANALYSE DU GENE MDTFL PAR TRANSFERT DE SOUTHERN (1) Préparation d'ADN génomique L'ADN génomique a été préparé par un procédé au CTAB à partir des feuilles d'un pommier "Jonathan". Spécifiquement, 3 g de feuilles de pommier ont été congelés dans l'azote liquide puis broyés rapidement dans un mortier pour obtenir une poudre. Pour retirer les sucres, un tampon d'extraction (polyéthylèneglycol 6000 10 %, sorbitol 0,35 M, Tris-HCI 0,1 M pH 7,5, 2-mercaptoéthanol 1 %) a été ajouté et bien mélangé dans un tube de 50 mL. Ensuite, une centrifugation a été réalisée à 12000 x g pendant 5 min à la température ambiante. Le surnageant a été jeté puis 9 mL d'un tampon de lyse (sorbitol 0,35 M, Tris-HCI 0,1 M pH 7,5, 2-mercaptoéthanol 1 %) et 1 mL de sarcosine à 10 % ont été ajoutés au culot, qui a ensuite été agité doucement à la température ambiante pendant 10 min. Ensuite, 10 mL de 2 x CTAB (CTAB 2 %, Tris-HCI 0,1 M pH 9,5, EDTA 20 mM, NaCI 1,4 M, 2-mercaptoéthanol 1 %) ont été ajoutés, après quoi la solution a été secouée doucement à 56 C pendant 20 min. Après que la solution de CTAB ci-dessus a été traitée deux fois avec du chloroforme/isoamyle, une quantité équivalente de 2-propanol a été ajoutée pour obtenir un précipité blanc. La fibre d'ADN a été recueillie par enroulement sur une baguette en verre, dissoute dans 5 mL de solution 1 M de NaCI puis soumise à un traitement de digestion à la RNase (10 mg/mL) à 56 C pendant 2 à 3 h. Ensuite, la solution résultante, après la digestion, a été soumise à une précipitation à l'éthanol puis dissoute dans 1 mL de TE pour obtenir l'ADN génomique. (2) Hybridation 10 g de l'ADN génomique obtenu en (1) ci-dessus ont été digérés avec BamHI, EcoRI, HindIII, NcoI, XbaI et XhoI, et le produit de digestion a été soumis à une électrophorèse en gel d'agarose à 0,8 %. Après la migration, les fragments d'ADN ont été transférés sur une membrane en Nylon. La membrane a été plongée dans une solution de préhybridation (hydrogénophosphate de disodium 0,5 M pH 7,2, SDS 7 %, EDTA 1 mM) à 65 C pendant 30 min pour réaliser une préhybridation. Ensuite, une hybridation a été réalisée avec une sonde qui avait été marquée avec la digoxigénine (DIG) par PCR au moyen d'un kit de détection de luminescence DIG et du gène MdTFL comme matrice. Spécifiquement, l'hybridation a été réalisée par immersion de la membrane dans une solution tampon pour l'hybridation (hydrogénophosphate de disodium 0,5 M pH 7,2, SDS 7 %, EDTA 1 mM) contenant la sonde de PCR marquée à 65 C pendant 16 h. Puis, la membrane a été lavée trois fois dans du tampon phosphate (hydrogénophosphate de disodium 40 mM pH 7,2, SDS 7 %, EDTA 1 mM) à 65 C pendant 20 min, pour réaliser une réaction d'anticorps pour la détection. Après la réaction, un autoradiogramme a été réalisé et une bande s'hybridant à la sonde a été observée. Les résultats sont présentés sur la figure 1. Parmi les enzymes de restriction utilisées pour la digestion de l'ADN, les sites de clivages de NcoI, XbaI et XhoI n'étaient pas présents dans la sonde, et des bandes mineures ont été observées aussi, en plus des bandes majeures, ce qui suggère la présence d'un autre gène ayant une homologie relativement élevée avec le gène MdTFL cible. Exemple 3 : ANALYSE DU GENE MDTFL PAR TRANSFERT DE NORTHERN (1) Préparation de l'ARN L'ARN total a été préparé par le procédé décrit dans l'exemple 1 (2) ci-dessus à partir d'organes de pommier incluant les calices, les pétales floraux, les étamines, les pistils, les apex des pousses, les feuilles, les cotylédons, les tiges et les racines. De plus, des apex de pousses et des boutons floraux des pommiers ont été recueillis de juin à avril de l'année suivante à des intervalles prédéterminés, après quoi les ARN totaux des apex des pousses et des boutons floraux recueillis à chaque fois ont été préparés. (2) Hybridation 10 g de l'ARN total obtenu en (1) ci-dessus ont été soumis à une dénaturation avec le formaldéhyde, à une électrophorèse en gel d'agarose à 1,2 % puis transférés sur une membrane en Nylon. La membrane a été plongée dans une solution de préhybridation (5 x SSC, 10 x solution de Denhardt, Na2PO4 10 mM (pH 6,5), SDS 0,5 %, formamide 50 %, ADN de sperme de saumon 10 mg/mL) à 65 C pendant 1 h pour réaliser une préhybridation. Ensuite, une hybridation a été réalisée avec une sonde d'ARN qui avait été marquée avec la digoxigénine (DIG) par une réaction de transcription inverse in vitro au moyen d'un kit de marquage d'ARN avec DIG et au moyen du gène MdTFL (SEQ ID NO: 1) comme matrice. Spécifiquement, l'hybridation a été réalisée par immersion de la membrane dans un tampon d'hybridation contenant une sonde d'ARN marquée avec DIG à 65 C pendant 16 h. Puis, la membrane a été lavée deux fois dans 2 x SSC contenant 0,1 % de SDS à la température ambiante pendant 15 min, puis lavée deux fois dans 0,2 x SSC contenant 0,1 % de SDS à 65 C pendant 15 min. Après une réaction d'anticorps pour la détection, un autoradiogramme a été formé pour examiner les bandes qui s'hybrident à la sonde. Les résultats sont montrés sur les figures 2 et 3. L'expression du gène MdTFL a été observée parmi les organes suivants des pommiers : calices, feuilles et apex des pousses (figure 2). De plus, concernant la configuration d'expression pendant différentes saisons observée pour les apex des pousses et les boutons floraux des pommiers, une forte expression a été observée pendant la seconde moitié de juin qui précède immédiatement le stade d'initiation florale. Ensuite, on a observé une tendance à une diminution progressive des niveaux d'expression (figure 3). Exemple 4 : TRANSFERT DU GENE A UNE PLANTE (TRANSFORMATION) (1) Construction d'un plasmide pour des plantes pBMDTFL12 (1 g) obtenu dans l'exemple 1 ci-dessus où le gène MdTFL avait été introduit dans une orientation sens a été clivé dans du tampon L (Tris-HCI 10 mM (pH 7,5), MgCI2 10 mM, dithiothréitol 1 mM) à 37 C avec KpnI (3 unités), puis clivé dans du tampon K (Tris-HCI 20 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, dithiothréitol 1 mM, NaCI 100 mM) à 30 C avec BamHI (3 unités) pendant 2 h à chaque fois pour obtenir un fragment d'ADN d'approximativement 650 pb contenant le gène MdTFL. D'autre part, le vecteur plasmidique pUC119 a été clivé avec des enzymes de restriction similaires, et ligaturé au gène au moyen d'un kit de ligature pour construire pUMDTFL12. 1+. Le pUMDTFL12. 1+ obtenu a été utilisé pour transformer Escherichia coli DH5[alpha]. Le transformant résultant a été cultivé, puis pUMDTFL12 a été purifié à partir du milieu de culture. Ensuite, pUMDTFL12. 1+ (10 g) a été clivé dans du tampon M (Tris-HCI 10 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, dithiothréitol 1 mM, NaCI 50 mM) avec XbaI (30 Unités) et Sad (30 unités) à 37 C pendant 12 h pour obtenir approximativement 650 pb de fragment d'ADN contenant le gène MdTFL. D'autre part, le vecteur binaire pSMAK251 (10 g) portant l'ADN promoteur de CaMV 35S a été traité de la même manière que dans les processus ci-dessus avec XbaI (30 unités) et Sad (30 unités) pour retirer la région GUS. Le fragment d'ADN d'approximativement 650 pb ci-dessus, contenant MdTFL, et pSMAK251 ont été ligaturés avec un kit de ligature (TAKARA) à 4 C pendant 16 h. Le produit de ligature ainsi obtenu a été utilisé pour transformer Escherichia coli de la même manière que dans les processus ci-dessus. Le transformant ainsi obtenu a été cultivé, puis pSMDTFL12.1.2+ a été purifié à partir de la culture. La liaison de pSMDTFL12.1.2+ dans une orientation sens a été confirmée par clivage avec Sad (figure 4 A). Ensuite, pour préparer un vecteur binaire portant le gène MdTFL dans une orientation antisens, un processus a été mis en #uvre de la même manière que ci-dessus avec le plasmide pBMDTFL5 où le gène MdTFL avait été introduit dans une orientation antisens pour obtenir pSMDTFL5.1-. pSMDTFL5.1- a été clivé avec Sad de sorte que la liaison dans une orientation antisens a été confirmée (figure 4B). (2) Préparation d'Agrobacterium contenant les plasmides pSMDTFL12.1.2+ et pSMDTFL5.1- Les plasmides pSMDTFL12.1.2+ et pSMDTFL5.1- pour les plantes obtenues en (1) ci-dessus ont été introduits dans la souche Agrobacterium tumefaciens EHA101 (E. E. Hood et al., The hypervirulence of Agrobacterium tumefaciens A281 is encoded in a région of a TiBo542 outside of T-DNA, J. Bacteriol. 168 (1986) 1291-1301) par un procédé de congélation et de décongélation. Spécifiquement, des souches d'Agrobacterium ont été cultivées à 28 C pendant une nuit dans 500 mL de milieu #B (Bactotryptone 2 %, extrait de bactolevure 0,5 %, MgS04 1,0 %, pH 7,2). Quand la densité optique à 650 nm (D. O. 650) a atteint 1,0, les cellules ont été recueillies puis centrifugées à 6000 x g pendant 5 min. Le culot a été lavé avec 100 mL de milieu LB, centrifugé d'une manière similaire au processus ci-dessus, après quoi le culot a été remis en suspension dans 25 ml de milieu LB. 200 pl de la suspension ont été versés respectivement dans des tubes de 1,5 mL, puis les suspensions ont été conservées à -80 C, de sorte que l'on a obtenu des cellules compétentes. 200 pl de cellules compétentes, 5 g de plasmide pSMDTFL12. 1.2+ ou pSMDTFL5.1- purifié et 100 pl de milieu LB ont été mélangés. La solution a été laissée au repos dans l'azote liquide pendant 5 min. Après incubation de la solution à 37 C pendant 25 min, 15 mL de milieu LB ont été ajoutés. La suspension de souche d'Agrobacterium transformée ainsi obtenue a été laissée au repos à 28 C pendant une nuit dans un incubateur. La suspension a été centrifugée à 6000 x g pendant 5 min pour recueillir les cellules. Le culot a été mis en suspension dans 300 l de milieu LB, puis 100 l de la suspension d'Agrobacterium ci-dessus ont été appliqués sur une boîte de gélose LB contenant des antibiotiques (100 pg/mL de spectinomycine (Dénomination commerciale japonaise : Trobicine), 50 pg/mL de streptomycine). La suspension a été cultivée à 28 C pendant 2 jours de sorte que l'on a obtenu respectivement des souches d'Agrobacterium dans lesquelles le plasmide pSMDTFL12.1+ était introduit et des souches d'Agrobacterium dans lesquelles le plasmide pSMDTFL5.1- était introduit. (3) Infection d'Arabidopsis thaliana avec des souches d'Agrobacterium Arabidopsis thaliana a été infecté avec des souches d'Agrobacterium par un procédé d'immersion florale. Spécifiquement, les zygotes des souches d'Agrobacterium transformées obtenues en (2) ci-dessus ont été cultivés dans du milieu #B (10 mL) contenant 100 pg/mL de spectinomycine à 28 C jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm atteigne 0,8. Le milieu de culture a été centrifugé pour retirer le milieu, puis une solution de saccharose à 5 % a été ajoutée et mise en suspension pour que la densité optique à 600 nm soit égale à 0,8. Ensuite, Silwet 77 (Nippon Unicar Co., Ltd.) a été ajouté à une concentration finale de 0,02 % à 0,05 % (v/v), pour préparer une solution de traitement. Par ailleurs, environ 20 plants d'Arabidopsis (Columbia) ont été cultivés pendant 3 semaines dans des pots de 7 cm contenant du sol dans lequel des quantités égales de perlite et de vermiculite avaient été incorporées. Puis, une souche d'Agrobacterium a été utilisée pour infecter les plantes par immersion des bourgeons d'Arabidopsis après la formation de tiges florales dans la solution de traitement d'Agrobacterium ci-dessus qui contenait le plasmide pSMDTFL12. 1.2+ ou pSMDTFL5.1- pendant 3 s. Les pots ont été transférés sur un plateau, recouverts de coupelles pendant 1 jour pour maintenir l'humidité. Les plantes ont été cultivées intactes pour obtenir des graines. Les graines ont été stérilisées avec une solution aqueuse d'hypochlorite de sodium à 2,5 % contenant 0,05 % de Tween 20, puis inoculées à de la gélose préparée par addition de 25 mg/mL de kanamycine à du milieu 1/2 MS pour la sélection. Les plants d'Arabidopsis qui avaient poussé sur le milieu de sélection ont été transférés dans des pots, pour obtenir des transformants d'Arabidopsis Les graines ont ensuite été inoculées à du milieu de sélection d'une manière similaire pour obtenir leur descendance. (4) Infection de feuilles de pommier avec des agrobactéries Une lignée de culture tissulaire de pommier (Malus domestica) var. "Ohrin" a été sous-cultivée dans du milieu MS contenant 1 mg/mL de 6-benzylaminopurine, 0,1 mg/mL d'acide 3-indolacétique et de vitamine B5 par litre de milieu. Au bout d'environ 1 mois, on a recueilli les feuilles qui s'étaient développées. Des coupes d'approximativement 5 mm x 10 mm ont été préparées à partir des feuilles et cultivées pendant 1 nuit à 28 C. Puis, une solution d'Agrobacterium contenant pSMDTFL5.1- a été ajoutée aux coupes foliaires pour que les souches d'Agrobacterium les infectent pendant 30 min. Ensuite, les coupes foliaires ont été transférées sur du milieu MS puis cocultivées pendant 1 semaine. (5) Sélection de cellules transformées et régénération en une plante Après la coculture, les coupes foliaires ont été transférées dans du milieu de sélection (le milieu MS ci-dessus additionné de 3,38 mg/mL de 6-benzylaminopurine, 0,93 mg/mL d'acétate d'a-naphtyle, 500 pg/mL de céfotaxime et 25 pg/mL de kanamycine), cultivées à l'obscurité à 25 C pendant 2 semaines puis cultivées avec un cycle de 16 h à la lumière et de 8 h à l'obscurité. Environ 1 à 2 mois plus tard, des bourgeons adventifs résistants à la kanamycine formés sur des cals ont été obtenus comme transformants. Les bourgeons adventifs obtenus ont été sous-cultivés puis les feuilles qui s'étaient développées ont été recueillies. L'ADN a été extrait des feuilles puis la présence du transgène MdTFL a été confirmée par PCR. Spécifiquement, une PCR a été réalisée en utilisant comme matrice l'ADN ci-dessus et comme amorces l'amorce sens (2S) et l'amorce antisens (2A) préparées en (6) ci-dessus. La réaction de PCR a été réalisée pendant 40 cycles, chaque cycle consistant en les conditions suivantes : dénaturation thermique à 94 C pendant 1 min, hybridation à 50 C pendant 1 min et réaction d'extension à 72 C pendant 2 min. La composition de la solution de réaction de PCR était la suivante : Solution d'ADN 1 NI Eau distillée stérile 17,5 l 10 x tampon PCR 2,5 l 2,5 mM mélange de dNTP 2 l 10 M amorce sens 1 l 10 M amorce antisens 1 l 5 U/ l Taq polymérase 0,25 l Total 25,25 l (6) Naturalisation d'un transformant Après que le transfert de gène a été confirmé par PCR au moyen d'amorces spécifiques, la naturalisation des plantes individuelles dans lesquelles le gène MdTFL avait été introduit en (4) ci-dessus a été réalisée par greffage de bourgeons cultivés sur des porte-greffes. Les pommiers recombinés ainsi obtenus ont été transférés dans une serre isolée puis cultivés pour l'évaluation des traits. Exemple 5 : ANALYSE MORPHOLOGIQUE DES PLANTES TRANSFORMEES (1) Analyse morphologique de transformants d'Arabidopsis dans lesquels avait été introduite la version sens et antisens du gène MdTFL 31 lignées d'Arabidopsis dans lesquelles la version sens du gène MdTFL avait été introduite ont été obtenues et 6 lignées d'Arabidopsis dans lesquelles la version antisens du gène MdTFL avait été introduite ont été obtenues (génération Tl). De plus, la descendance de chaque lignée a été obtenue (génération T2). Une floraison tardive a été observée pour 6 lignées parmi 31 lignées de transformants d'Arabidopsis dans lesquels le gène sens pSMDTFL12. 1.2+ avait été introduit. De plus, la génération T2 a été obtenue à partir de ces 6 lignées, puis cultivée dans des conditions de journées prolongées (16 h à la lumière et 8 h à l'obscurité), de sorte que l'époque de la floraison a été surveillée (figure 5 et tableau 1). Tableau 1 : Epoque de floraison, feuilles en rosettes et génération T2 de transformants d'Arabidopsisayant la version sens du gène MdTFL Lignée de Jours nécessaires nombre de nombre de Transformant pour la floraison feuilles descendants (Tl) en rosette obtenus (T2) à la floraison Témoin 30,3 1,6 8,0 1,0 10 T-S6 39,4 5,1 11,8 3,6 5 T-S10 59,0 15,6 15,6 ~ 4,3 5 T-Sll 45,4 6,0 11,8 2,3 5 T-S21 44,7 ~ 6,9 18,0 4,3 3 T-S22 47,0 0 23,0 4,6 3 T-S28 53,0 6,0 21,5 1,5 2 Tandis que la plante témoin, Arabidopsis thaliana de type sauvage, fleurissait en 30 jours en moyenne, la floraison des transformant a été retardée d'approximativement 9 à 29 jours. (2) Analyse morphologique de transformants de pommiers dans lesquels la version antisens du gène MdTFL a été introduite Dix transformants de pommiers de 3 lignées dans lesquelles la version antisens du gène MdTFL avait été introduite (lignées 303-1, 303-2,303-3, 303-4,614-1, 614-2,705-1, 705-2,705-3 et 705-4) ont été obtenus. Parmi ces transformants, une floraison précoce a été observée 8 à 15 mois après le greffage pour les lignées 303-1,303-4, 705-1,705-2, 705-3 et 705-4 (figure 6 et tableau 2). Tableau 2 : époque de la floraison et aptitude à la germination du pollen de transformants de pommiers ayant la version antisens du gène MdTFL Lignée Expression Mois Aptitude Epoque de du transgène à la germination greffage (année, mois) Témoin Aucune- - 1997.8 303-1 +++ 11 Non testé 2000.6 303-2 +± - 2000.6 303-3 +± - 2000.6 303-4 +++ 11 Non testé 2000.6 705-1 +++ 8 + 2000.4 705-2 ++ 15 + 2000.4 705-3 + 11 + 2000.6 705-4 + 11 + 2000.6 614-1 Non testé- - 2001.6 614-2 Non testé- - 2001.6 614-3 Non testé - - 2001.6 Dans le tableau 2, "lignée" signifie lignée de transformant, "mois" signifie mois nécessaires après le greffage pour la floraison, et "aptitude à la germination" signifie l'aptitude à la germination du pollen. "+++", "++" et "+" dans la colonne "expression du transgène" indiquent une expression relativement forte, une expression modérée et une expression détectée, respectivement. Les non-transformants, des pommiers Orin de 6 ans, cultivés à titre de témoins, n'ont pas fleuri même après 61 mois. D'autre part, la lignée 705-1 a fleuri 8 mois après la greffe (figure 6A). Une comparaison avec des pommiers non transformants a révélé que le nombre de fleurs des lignées à floraison précoce (transformants) tendait à être aussi bas que 1 ou 2 par bouquet floral en moyenne, mais on a observé que les fleurs étaient des organes floraux normaux (figures 7B et C). Concernant la forme des feuilles, la lignée 303 tendait à présenter des aspects en dent de scie dans bien des cas, dans une certaine mesure, tandis qu'il n'y avait pas de différence significative quand on a comparé la lignée 705 et le pommier Ohrin témoin (figure 6D). La fécondité du pollen des lignées à floraison précoce a été examinée par croisement et par un test de germination sur un milieu gélosé. Le croisement de variétés compatibles avec des lignées à floraison précoce a conduit à une fructification. De plus, le croisement des pollens de lignées à floraison précoce avec des variétés générales a conduit aussi à une fructification, de sorte que la présence d'une fécondité a été confirmée (figures 7D à F). Les pollens de toutes les lignées testées étaient capables de germer (figure 8). Exemple 6 : EXPRESSION DU GENE MDTFL DANS DES TRANSFORMANTS DE POMMIERS L'ARN total a été extrait des feuilles de transformants dans lesquels le gène MdTFL avait été introduit, après quoi une analyse par transfert de Northern a été réalisée selon l'exemple 3 ci-dessus. La sonde utilisée était une sonde d'ARN sens préparée avec le gène MdTFL de longueur intégrale comme matrice. Les bandes ont été détectées avec LAS1000 (FUJI FILM). Les lignées de pommiers transformants obtenues contenaient un vecteur introduit dans lequel le gène MdTFL avait été ligaturé dans une orientation antisens en aval du promoteur 35S. Il a été confirmé par analyse par transfert de Northern que l'ARN antisens était surexprimé dans toutes les lignées testées (figure 9). On a observé une expression relativement importante d'ARNm antisens dans les lignées 303-1,303-4 et 705-1, et ces lignées fleurissaient précocement pendant une période aussi courte que 8 à 11 mois après le greffage (voir le tableau 2). REVENDICATIONS 1. Protéine isolée, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO: 2. 2. Protéine isolée, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence d'acides aminés ayant une délétion, une substitution ou une addition d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO: 2, et ayant une activité de suppression de la formation de boutons floraux. 3. Acide nucléique isolé ou fragment de celui-ci, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 1, ou en ce qu'il est capable de s'hybrider dans des conditions stringentes à un ADN comprenant une séquence complémentaire d'au mois une partie de la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 1 et qui code une protéine ayant une activité de suppression de la formation de boutons floraux. 4. Acide nucléique antisens, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence complémentaire de la séquence nucléotidique de l'acide nucléique isolé ou de son fragment selon la revendication 3. 5. Vecteur recombiné, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une partie de l'acide nucléique isolé ou de son fragment selon la revendication 3. 6. Vecteur recombiné, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une partie de l'acide nucléique antisens selon la revendication 4. 7. Transformant, caractérisé en ce qu'il comprend le vecteur recombiné selon l'une quelconque des revendications 5 et 6. 8. Transformant selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une plante ou d'une cellule végétale. 9. Transformant selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il a des propriétés de floraison précoce. 10. Transformant selon l'une quelconque des revendications 8 et 9, caractérisé en ce que la plante est une plante vivace. 11. Transformant selon la revendication 10 caractérisé en ce que la plante vivace est un arbre fruitier vivace. 12. Graine, caractérisée en ce qu'elle est obtenue à partir d'un transformant qui comprend le vecteur recombiné selon l'une quelconque des revendications 5 et 6. 13. Procédé pour conférer à une plante des propriétés de floraison précoce, caractérisé en ce qu'il comprend la suppression de l'expression ou de l'activité d'un gène MdTFL endogène dans une plante. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la plante est une plante vivace. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la plante vivace est un arbre fruitier vivace. 16. Procédé pour réguler l'époque de floraison d'une plante, caractérisé en ce qu'il comprend l'introduction dans une plante de l'acide nucléique isolé ou de son fragment selon la revendication 3 ou de l'acide nucléique antisens selon la revendication 4. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que la plante est une plante vivace. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la plante vivace est un arbre fruitier vivace. 19. Procédé pour produire une plante à floraison précoce, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de construction d'un vecteur recombiné comprenant l'acide nucléique isolé ou son fragment selon la revendication 3 ou l'acide nucléique antisens selon la revendication 4, la transformation d'une plante hôte avec le vecteur recombiné et la régénération d'une plante à partir du transformant obtenu. 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que la plante est une plante vivace. 21. Procédé suivant la revendication 20, caractérisé en ce que la plante vivace est un arbre fruitier vivace.