Brevet FR2836919A1 — publié le 20030912

L'invention concerne un complexe protéine-protéine impliqué dans la prédisposition aux cancers du sein et de l'ovaire. Plus particulièrement cette interaction protéine-protéine présente des applications pour le criblage de molécules ayant une activité thérapeutique dans le traitement et la prévention du cancer, ainsi que des applications diagnostiques. Le cancer du sein est une affection très fréquente, qui touche près de 10 % des femmes du monde occidental. Il existe deux formes de ce cancer : une forme sporadique majoritaire et une forme familiale concernant 5 à 10 % des cas. Dans les familles prédisposées, la transmission du risque se fait selon un mode autosomal dominant (Ford D. et al., 1998), et les tumeurs mammaires sont fréquemment associées à d'autres cancers, notamment le cancer de l'ovaire. L'étude de familles prédisposées a permis d'identifier deux gènes majeurs de prédisposition au cancer du sein : BRCA1 (Breast Cancer 1), localisé en 17q21 (Miki Y. et al., 1994) et BRCA2, localisé en 13q12-13 (Wooster R. et al., 1995). La majorité des cas familiaux de cancers du sein et/ou de l'ovaire sont liés à des mutations du gène BRCA1 (Ford D. et al., 1998). Le gène BRCA1 s'étend sur près de 81 kb (Smith T. M. et al., 1996) et code pour un transcrit ubiquitaire de 7,8 kb traduit en une protéine de 1 863 acides aminés. Le gène BRCA1 est très conservé, son homologue murin code pour une protéine de 1812 acides aminés identique pour 58 % à la protéine BRCA1 humaine (Bennett L. M. et al., 1995). La fonction de la protéine BRCA1 est encore mal connue et l'étude de sa localisation cellulaire a fait l'objet de controverses. D'après les études les plus récentes, BRCA1 est une protéine nucléaire de 220 kDa (Scully R. et al., 1997a). La forme raccourcie par épissage de l'exon 11, exon qui contient deux séquences codant pour des signaux de localisation nucléaire, est, elle, une protéine cytoplasmique de 110 kDa. Malgré la grande taille de cette protéine, seuls deux domaines remarquables ont été mis en évidence : un domaine en doigts de zinc à l'extrémité amino-terminale (Miki Y. et al., 1994), et un domaine BRCT (BRCA1 C-terminus) à l'extrémité carboxy-terminale (Koonin E. V. et al., 1996 ; Callebaut 1. et Mornon J. P., 1997 ; Bork P. et al., 1997). Les données actuelles sur la fonction de la protéine BRCA1 suggèrent un rôle dans différents mécanismes biologiques : 1) une fréquente perte d'hétérozygotie concernant l'allèle sauvage BRCA1 a été mise en évidence dans les tumeurs mammaires (Smith A. A. et al., 1992), suggérant que BRCA1 puisse agir comme un suppresseur de tumeur ; 2) la protéine BRCA 1 semble jouer un rôle essentiel au cours du développement embryonnaire et de la différenciation de la glande mammaire chez la souris (Hakem R. et al., 1995), et aussi chez l'homme (Magdinier F. et al., 1999) ; 3) BRCA1 serait un transactivateur de la transcription (Chapman M. S. et Verma I. M., 1996 ; Monteiro A. N. A. et al., 1996) et serait associée à l'ARN po ! ymérase)) (Scut ! y R. et al., 1997b) ; 4) BRCA1 serait impliquée dans les voies de réparation de l'ADN (Scully R. et al., 1997c ; Hakem R. et al., 1997 ; Ouchi T. et al., 1998) et le contrôle du cycle cellulaire (Larson J. S. et al., 1997) ; 5) Enfin, plusieurs protéines connues ont été identifiées comme étant des partenaires de BRCAL, dont BARD1 (Wu L. C. et al., 1996), p53 (Zhang H. et al., 1998a), c-Myc (Wang Q. et al., 1998), Rad 51 (Scully R. et al., 1997a), BRCA2 (Chen J. et al., 1998), CtlP (Yu X. et al., 1998), l'ARN hélicase A au sein du complexe ARN polymérase Il holoenzyme (Anderson S. F. et al., 1998), le complexe histone déacétylase (Yarden R. et al., 1999), ou la protéine BACH1 (Cantor S. B. et al., 2001) ; leurs régions d'interaction sont réparties sur l'ensemble de la protéine BRCA 1. En 1996, une recherche de similitudes de séquence entre la protéine BRCA1 et les protéines connues des banques de données a permis de mettre en évidence une région d'intérêt située à l'extrémité C-terminale de la protéine BRCA1 : le domaine BRCT (BRCA1 C-terminal) (Koonin E. V. et al., 1996). Une étude plus approfondie de cette région par la technique "Hydrophobic Cluster Analysis" (HCA) (Callebaut 1. et Mornon J. P., 1997) a permis de caractériser le domaine BRCT. Il est constitué par la duplication d'un module d'une centaine d'acides aminés comportant des séquences très conservées. Ce module BRCT est retrouvé au sein d'une quarantaine de protéines présentes dans diverses espèces (Bork P. et al., 1997). Parmi les protéines à BRCT dont la fonction est caractérisée, la plupart sont impliquées dans les mécanismes de réparation de l'ADN et de contrôle du cycle cellulaire. Dans certaines de ces protéines, le module BRCT semble jouer un rôle majeur dans la médiation d'interactions protéiques (complexes XRCCA/ADN ligase IV (Critchlow S. E. et al., 1997), XRCC1/ADN ligase ! i ! (Nash R. et al., 1997) et XRCC1/PARP (Masson M. et al., 1998)). Il serait aussi responsable de l'homodimérisation de la protéine XRCC1 (Zhang X. et al., 1998b). Dans la protéine BRCAL, le domaine BRCT est particulièrement bien conservé : l'identité de séquence avec la forme murine est de 72 % pour cette région contre seulement 58 % pour la protéine totale (Bennett L. M. et al., 1995), et sa structure globulaire est conservée. La majorité des mutations germinales délétères, ne permettent pas la synthèse de cette région de BRCA 1. De plus, un grand nombre de mutations faux-sens affectent directement ce domaine. Cette partie C-terminale semble par ailleurs essentielle à la fonction normale de la protéine : sa suppression conduit à retirer à BRCA1 sa capacité à inhiber la croissance des cellules cancéreuses, ainsi que sa fonction de transactivateur de la transcription. Enfin, des partenaires protéiques de BRCA1 interagissant spécifiquement avec son extrémité C-terminale contenant le domaine BRCT ont déjà pu être identifiés : BRCA2, CTIP, l'ARN hélicase A et le complexe histone déacétylase, la protéine BACH1. Pour identifier des protéines qui interagissent avec le tandem formé des deux modules BRCT de Brca1, les inventeurs ont réalisé un essai de co-sédimentation dans un Iysat de fibroblastes murins, avec une protéine de fusion à la GST contenant les acides aminés 1583 à 1812 de Brca1 murin, nommée GST-BRCT. L'analyse des complexes protéiques de cosédimentation a montré qu'une bande majeure de 210 kDa était visible uniquement dans l'échantillon GST-BRCT. Les inventeurs ont montré que le tandem des deux domaines BRCT était nécessaire et suffisant à la formation de ce complexe. De plus, les inventeurs ont montré que la formation de ce complexe était conservée dans les cellules humaines, en utilisant une protéine de fusion GST-BRCThumain dans des expériences de cosédimentation similaires à celles citées ci-dessus. Les travaux des inventeurs portant sur le rôle fonctionnel de BRCA1 ont ainsi permis de mettre en lumière une nouvelle interaction protéineprotéine impliquant d'une part la protéine BRCA1 et plus particulièrement le domaine BRCT situé à l'extrémité carboxy-terminale de celle-ci et, d'autre part, une protéine connue, l'acétyl-Coenzyme A-carboxylase, forme a (ACC-a). La protéine BRCA1 et le gène codant pour cette protéine sont notamment décrits dans les demandes de brevet EP 699 754 et EP 705 902. La séquence SEQ ID n 13 correspond à l'ADNc du gène Brca1 murin (Genebank : MMU31625), SEQ ID n 14 à la séquence d'acides aminés de Brca1 murine, SEQ ID n015 correspond à l'ADNc du gène BRCA1 humain (Genebank : HSU14680), et SEQ ID n016 à la séquence d'acides aminés de BRCA1 humaine. L'ACC-a est une protéine cytoplasmique de 265 kDa dont l'activité enzymatique joue un rôle clef dans la voie de synthèse des acides gras à chaîne longue. L'ADNc de ACC-a humain (SEQ ID n017) a été cloné en 1995 par Abu-Elheiga et al. Sa séquence est très conservée chez l'homme, le rat, le poulet et la levure, en particulier au niveau des sites de liaison à la biotine, à l'ATP et au coenzyme A. La séquence protéique de ACC-a humaine est indiquée par SEQ ID n 18. Des expériences de co-immunoprécipitation, avec un anticorps anti-Brca1, sur des Iysats cellulaires Bosc transfectés par la forme sauvage de la protéine Brca 1 murine ou sa forme épissée A11 ont été réalisées. Elles ont permis de confirmer que les deux formes de la protéine murine s'associent à l'ACC-a in vivo. De la même façon, la protéine BRCA1 entière humaine coprécipite avec l'ACC-a endogène de cellules Bosc transfectées. Un anticorps polyclonal dirigé contre les extrémités aminoterminale (MDEPSPLAQPLELNQ) (SEQ ID n 1) et carboxy-terminale (AEVIRILSTMDSPST) (SEQ ID n 2) de la protéine ACC-a humaine a été préparé chez le lapin et immunopurifié contre ces deux séquences peptidiques. Des expériences de coimmunoprécipitation avec cet anticorps anti-ACC-a, appelé L3J74, sur des Iysats de cellules épithéliales mammaires humaines HBL 100, ont montré in vivo, dans des conditions physiologiques, l'existence du complexe endogène BRCA1/ACC-a. Afin de préciser le domaine d'interaction de l'ACC-a sur BRCAL, différentes protéines de fusion GST-BRCT ont été préparées et testées par cosédimentation sur des Iysats de fibroblastes murins NIH3T3, et ont permis de montrer qu'une forme plus longue du domaine BRCT murin (résidus 1512-1812 de SEQ ID n014), comme le domaine BRCT complet testé en premier lieu (résidus 1583-1812 de SEQ ID n 14), interagissent avec l'ACC-a. En revanche, des protéines de fusion à la GST contenant, soit le module BRCT A seul, soit le module BRCT B seul, sont incapables de s'associer à l'ACC-a. Une protéine de fusion à la GST exprimant les 220 résidus amino-terminaux de la protéine Brca1 murine a permis de confirmer la spécificité de l'interaction de l'ACC-a avec l'extrémité carboxy-terminale de BRCA 1. De nombreuses mutations familiales prédisposant au cancer du sein ont été localisées au niveau de la région carboxy-terminale de BRCA 1. Afin de mesurer l'incidence de telles mutations sur l'interaction ACC-a/BRCAl, des protéines de fusion ont été préparées et testées en co-sédimentation. Les premières mutations choisies dans la protéine BRCA1 humaine, R1835X et Y1853X, sont situées dans le domaine BRCT le plus distal. Elles introduisent un codon stop empêchant la synthèse des 29 et 11 derniers acides aminés respectivement de la protéine humaine qui présente donc un domaine BRCT incomplet. La protéine de fusion à la GST contenant la mutation W1777X, qui mime la mutation germinale humaine R1835X sur la protéine murine, abolit également l'interaction de Brca 1 murine avec l'ACC-a. De façon similaire, les mutations A1708E, P1749R, et M1775R, créant une substitution d'acide aminé dans le domaine BRCT A, dans la séquence de liaison des deux domaines BRCT et dans le domaine BRCT B respectivement, annihilent la liaison de BRCA1 humaine à l'ACC-a. Compte tenu du rôle important de l'extrémité C-terminale de la protéine BRCA1 dans la prédisposition au cancer du sein, l'interaction BRCA1/ACC-a peut être mise à profit de façon avantageuse pour la mise au point de molécules à visée thérapeutique. L'invention a donc pour objet un complexe moléculaire comprenant : - un premier polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés 1640 à 1863 de la protéine BRCA1 humaine ou une même séquence d'acides aminés de la protéine BRCA1 chez une autre espèce animale, et - un deuxième polypeptide comprenant un fragment de la protéine ACC-a capable de lier ledit premier polypeptide. La région définie par les résidus d'acides aminés 1640 à 1863 de la protéine BRCA1 humaine est appelée"domaine minimal de BRCA1". Préférentiellement, ladite même séquence d'acides aminés de la protéine BRCA1 chez une autre espèce animale est une séquence d'un mammifère non humain, et notamment la séquence d'acides aminés 1583- 1812 de la protéine BRCA1 murine. Par"protéine ACC-a", on entend la protéine ACC-a humaine ou la protéine correspondante d'une espèce animale, notamment d'un mammifère non humain, en particulier la souris. Un fragment de la protéine ACC-a capable de lier le domaine minimal de BRCA1 humaine ou le domaine correspondant d'une espèce animale, ou un polypeptide comprenant ledit domaine, constitue un"domaine minimal de la protéine ACC-a". L'identification du domaine minimal de la protéine ACC-a relève du travail de routine de l'homme du métier. Ce domaine peut-être identifié par des techniques classiques telles que la production de formes tronquées de la protéine ACC-a et des expériences de coimmunoprécipitation, par exemple en présence du domaine d'acides aminés 1640 à 1863 de la protéine BRCA1 humaine. Un domaine minimal de la protéine ACC-a inclut notamment la protéine ACC-a entière. L'invention a également pour objet une méthode de criblage de molécules capables de moduler l'interaction entre BRCA1 et ACC-a, c'est à dire empêcher ou favoriser la formation du complexe, ou encore dissocier, en tout ou partie, le complexe formé. L'invention concerne donc une méthode de criblage, notamment in vitro, de molécules utiles pour la prévention ou le traitement du cancer du sein et/ou de l'ovaire dans laquelle les molécules sont testées pour leur capacité à moduler l'interaction entre les protéines BRCA1 et ACC-a. Une méthode de criblage selon la présente invention comprend : a) la mise en contact, dans un ordre quelconque, de deux partenaires ou trois partenaires différents sélectionnés parmi le groupe constitué d'un premier polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés 1640 à 1863 de la protéine BRCA1 humaine ou une même séquence d'acides aminés de la protéine BRCAL, un deuxième polypeptide comprenant un fragment de la protéine ACC-a capable de lier ledit premier polypeptide et une molécule candidate ; b) l'incubation desdits partenaires pendant un temps suffisant pour permettre leur éventuelle interaction ; c) dans le cas où seuls deux partenaires différents ont été sélectionnés à l'étape a), l'ajout du troisième partenaire sélectionné dans ledit groupe et l'incubation pendant un temps suffisant pour permettre une éventuelle interaction ; d) la détermination de la capacité de la molécule candidate à moduler l'interaction entre BRCA1 et ACC-a. Une telle méthode permet plus particulièrement d'identifier des molécules capables de moduler l'interaction entre BRCA1 et ACC-a. La détermination de la capacité de la molécule candidate à moduler l'interaction entre BRCA1 et ACC-a peut être réalisée à l'aide de moyens de séparation et/ou de détection appropriés, biens connus de l'homme de l'art. On pourra par exemple quantifier le nombre de complexes formés en présence de concentrations croissantes de la molécule candidate. Ceci peut notamment être mis en oeuvre à l'aide de techniques classiques d'analyse telles que la chromatographie, l'électrophorèse, le marquage immunologique éventuellement en association avec des marqueurs détectables tels que des marqueurs fluorescents, isotopiques, ou chromogéniques. On pourra par exemple se référer à Current Protocols in Molecular Biology, Edited by F. M. Ausubel et al. (John Wiley and Sons). Selon cette méthode, un polypeptide comprenant le domaine minimal de BRCAL, un polypeptide comprenant le domaine minimal de ACC-a et au moins une molécule candidate peuvent être mis en contact et incubés pendant un temps suffisant pour permettre leur interaction, dont éventuellement la formation ou la dissociation du complexe BRCA1/ACC-a. Selon un autre aspect, au moins une molécule candidate et un polypeptide comprenant le domaine minimal de BRCA1 ou de ACC-a sont mis en contact et incubés pendant un temps suffisant pour permettre leur éventuelle interaction. Le domaine minimal de BRCA1 ou de ACC-a manquant est ensuite ajouté et l'ensemble est incubé pendant un temps suffisant pour permettre l'interaction de l'ensemble des éléments, dont éventuellement la formation du complexe BRCA1/ACC-a. Selon une autre variante encore, un polypeptide comprenant le domaine minimal de BRCA1 et un polypeptide comprenant le domaine minimal de ACC-a sont préincubés de manière à permettre la formation du complexe BRCA1/ACC-a avant l'ajout d'au moins une molécule candidate et l'incubation de l'ensemble pendant un temps suffisant pour permettre leur interaction et éventuellement la dissociation du complexe BRCA1/ACC-a. Un mode de réalisation préféré de cette méthode comprend les étapes suivantes : a) la mise en présence d'un premier polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés 1640 à 1863 de la protéine BRCA1 humaine ou une même séquence d'acides aminés de la protéine BRCA1 avec un deuxième polypeptide comprenant un fragment de la protéine ACC-a capable de lier ledit premier polypeptide, un des polypeptides au moins étant marqué de manière détectable ; b) l'addition d'une molécule candidate capable de moduler l'interaction ; c) l'incubation desdits polypeptides en présence de la molécule candidate dans des conditions et pour une période de temps suffisante pour que la liaison entre lesdits polypeptides ait lieu ; d) la quantification du nombre de molécules marquées liées en présence de concentrations croissantes de la molécule candidate. Parmi ces molécules, certaines sont des agonistes, d'autres des antagonistes de l'interaction BRCA 1/ACC-a. La présente invention propose donc une méthode de criblage de molécules capables de moduler l'interaction entre BRCA1 et ACC-a, caractérisée en ce que ladite molécule est un antagoniste de l'interaction BRCA1/ACC-a. Selon un autre aspect, la présente invention propose une méthode de criblage de molécules capables de moduler l'interaction entre BRCA1 et ACC-a, caractérisée en ce que ladite molécule est un agoniste de l'interaction BRCAI/ACC-a. Par"antagoniste", on entend une molécule dont l'action s'oppose à la formation ou au maintien du complexe BRCA1/ACC-a. En d'autres termes, les molécules antagonistes selon l'invention incluent par exemples des inhibiteurs capables d'empêcher ou de limiter l'interaction entre BRCA1 et ACC-a ou des molécules capables de dissocier le complexe lorsque celui-ci est formé. Par"agoniste", on entend une molécule dont l'action concourt à, ou accroît la formation du complexe BRCA 1/ACC-a. Selon un autre aspect, la présente invention concerne une méthode d'identification ex vivo de molécules constituant des ligands endogènes du complexe BRCA1/ACC-a. Le terme ligand possède le sens commun de molécule capable d'interagir avec le complexe BRCA1/ACC-a. Plus particulièrement, un ligand peut constituer un effecteur de l'activité biologique du complexe BRCA1/ACC-a. Dans ce sens, un récepteur cellulaire du complexe BRCA1/ACC-a constitue un exemple de ligand endogène pour le complexe. L'identification de ligands du complexe peut être réalisée par les méthodes classiques bien connues de l'homme de l'art, telles que l'immunoprécipitation, la méthode de double hybride, l'immunohistochimie. De manière préférentielle, la méthode d'identification selon l'invention comprend : a) la mise en contact du complexe BRCA1/ACC-a avec un échantillon biologique dans des conditions permettant la formation d'interactions entre le complexe et d'éventuels ligands ; b) la détection d'interactions entre le complexe BRCA1/ACC-a et lesdits ligands ; et c) l'identification des ligands interagissant avec le complexe. Le complexe BRCA1/ACC-a mis au contact de l'échantillon biologique peut être avantageusement être marqué à l'aide de marqueurs détectables, tels que des marqueurs fluorescents ou par un radioisotopique. Les molécules candidates ou ligands des méthodes de criblage ou d'identification décrites ci-dessus incluent des composés peptidiques, des peptidomimétiques ou d'autres composés organiques. Ces molécules peuvent être endogènes, naturelles ou synthétiques ou encore être des mélanges de composés. Les molécules candidates peuvent être structurellement définies ou non, comme c'est le cas généralement lorsqu'il s'agit d'extraits. Par"peptidomimétiques", on entend ici une molécule organique qui mime certaines propriétés des peptides, par exemple leur spécificité de liaison et/ou leur activité physiologique. Des peptidomimétiques sont généralement obtenus par modification de la structure d'un peptide. Ces modifications tendent notamment à améliorer la résistance à la dégradation enzymatique, la biodisponibilité du composé ou encore ses propriétés pharmacocinétiques. Dans le cadre de la présente invention, des anticorps ou des aptamères constituent des exemples de molécules candidates. Les aptamères constituent une classe de molécules qui représentent une alternative aux anticorps en terme de reconnaissance moléculaire. Les aptamères sont des séquences d'oligonucléotides ayant la capacité de reconnaître virtuellement n'importe quelle classe de molécules cibles avec une haute affinité et spécificité. De tels ligands peuvent être isolés par un criblage appelé SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) d'une banque de séquences aléatoires, comme décrit dans Tuerk et Gold (1990). La banque de séquence aléatoire peut être obtenue par synthèse d'ADN par chimie combinatoire. Dans une telle banque, chaque membre est un oligomère linéaire, éventuellement chimiquement modifié, correspondant à une séquence unique. Les possibles modifications, applications et avantages de cette classe de molécules ont fait l'objet d'une revue par Jayasena (1999). Des molécules candidates ainsi identifiées, capables de moduler l'interaction entre BRCA1 et ACC-a ou de constituer un ligand du complexe, peuvent être utilisées pour le traitement et/ou la prévention de cancers du sein et/ou de l'ovaire, notamment des formes familiales du cancer du sein et/ou de l'ovaire. L'invention a également pour objet une méthode de diagnostic in vitro d'une prédisposition au cancer du sein et/ou de l'ovaire, comprenant la détermination d'une modification de l'interaction BRCA1/ACC-a chez un sujet par rapport à une population témoin, la modification de l'interaction BRCA1/ACC-a étant associée à une variation du risque de développer un cancer du sein et/ou de l'ovaire. Par"modification de l'interaction BRCA1/ACC-a", on entend notamment l'absence ou la présence de complexe BRCA1/ACC-a détectable chez ledit sujet, ou encore une différence quantitative ou qualitative du complexe BRCA1/ACC-a par rapport à une population témoin. La présence du complexe BRCA1/ACC-a pourra par exemple être détectée par une méthode telle que la co-immunoprécipitation, par exemple à l'aide de l'anticorps D16 (Santa Cruz Biotechnology, California, USA) dirigé contre BRCAL, et d'un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre les extrémités amino-terminale (MEDPSPLAQPLELNQ) et carboxy-terminale (AEVIRILSTMDSPST) de la protéine ACC-a humaine. Par"différence quantitative", on entend une variation de la quantité de complexes BRCA1/ACC-a détectable. Par"différence qualitative", on entend notamment une variation susceptible de modifier l'activité biologique du complexe, comme par exemple une stabilité accrue ou décrue, ou une modification de la spécificité de liaison du complexe. Selon un autre aspect, l'invention concerne un anticorps anti- ACC-a humaine, dirigés contre les peptides de séquence SEQ ID n 1 et SEQ ID n 2 de la protéine ACC-a humaine. Un tel anticorps est particulièrement utile pour détecter la présence d'un complexe BRCA 1/ACC-a, par immunoprécipitation par exemple. L'utilisation d'un tel anticorps anti-ACC-a peut également permettre la localisation cellulaire de la protéine ACC-a ainsi que la localisation du complexe ACC-a-BRCAl dans les même cellules, par technique immunochimique ou par immunofluorescence par exemple. Une application diagnostic peut comprendre l'observation au microscope de cellules afin de détecter l'existence de ce complexe et la localisation attendue de ce complexe. La présente invention propose donc également une méthode de détection ex vivo d'un complexe BRCA1/ACC-a comprenant la mise en contact d'un anticorps selon l'invention avec un échantillon biologique dans des conditions permettant l'immunoprécipitation d'ACC-a, et la détection de BRCA1 dans le précipité, la présence de BRCA1 dans le précipité étant indicatrice de la formation d'un complexe BRCA1/ACC-a. La présente invention vise également des anticorps dirigés contre le complexe moléculaire BRCA1/ACC-a, caractérisés en ce qu'ils n'interagissent pas avec les protéines BRCA1 ou ACC-a seules. La sélectivité de tels anticorps vis à vis du complexe BRCA1/ACC-a peut notamment être obtenue en produisant des anticorps reconnaissant le complexe BRCA1/ACC- a, par immunisation chez l'animal par exemple, et en réalisant une étape de sélection négative, c'est à dire en éliminant les anticorps produits ayant une réactivité croisée avec la protéine BRCAL isolée et la protéine ACC-a isolée. Une telle sélection négative peut être réalisée par chromatographie d'immunoaffinité. Il peut s'agir d'anticorps poly-ou monoclonaux ou de leurs fragments, d'anticorps chimériques, notamment humanisés ou immunoconjugués. Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre une protéine selon les modes opératoires usuels. Selon un mode de réalisation de l'invention, on peut utiliser comme antigène un complexe peptidique approprié, tel qu'un complexe associant le domaine minimal de BRCA1 et de ACC-a, pouvant être couplé par l'intermédiaire d'un résidu réactif à une protéine (telle que l'hémocyanine de patelle KLH) ou un autre peptide. Des lapins sont immunisés avec l'équivalent de 1 mg de l'antigène peptidique selon la procédure décrite par Benoit et a/. (1982). A des intervalles de quatre semaines, les animaux sont traités par des injections de 200 ug d'antigène et saignés 10 à 14 jours plus tard. Après la troisième injection, l'anti-sérum est examiné pour déterminer sa capacité à se lier au peptide antigène radiomarqué à l'iode, préparé par la méthode chloramine-T et est ensuite purifié par une chromatographie sur colonne échangeuse d'ion carboxyméthyl cellulose (CMC). Les molécules d'anticorps sont ensuite recueillies dans les mammifères et isolées jusqu'à la concentration souhaitée par les méthodes bien connues de l'homme de l'art, par exemple, en utilisant DEAE Sephadex pour obtenir la fraction IgG. Afin d'augmenter la spécificité du sérum polyclonal, les anticorps peuvent être purifiés par une chromatographie d'immuno-affinité en utilisant des polypeptides immunisants en phase solide. L'anticorps est mis en contact avec le polypeptide immunisant en phase solide pendant une durée suffisante de façon à faire immuno-réagir le polypeptide avec la molécule d'anticorps afin de former un complexe immunologique en phase solide. Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Köhler et Milstein (1975). Les anticorps ou fragments d'anticorps de l'invention peuvent être par exemple des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab et F (ab') 2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués. Les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux, peuvent notamment être utilisés pour la détection ex vivo par immunochimie du complexe BRCA1/ACC-a, par exemple par immunofluorescence, marquage à for, immunoperoxydase, notamment dans les méthodes de criblage décrites ci-dessus. Les exemples suivants illustrent l'invention : PROCEDURE EXPERIMENTALE - Constructions plasmidiques - Vecteurs d'expression eucaryotes : Les plasmides pUHD 10,3 exprimant soit Brca1 de type sauvage, soit la forme AU, ont été préparés comme décrit dans Bachelier, R et al. (2000). Le plasmide pcDNA3ss-BRCA 1 wt exprimant la forme humaine de BRCA1 a été précédemment décrite (6). -Vecteurs d'expression dans les bactéries Le plasmide pGEX-BRCT a été obtenu par amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) des nucléotides 4747 à 5436 de Brca1 en utilisant l'ADNc de Brca1 murin cloné en tant que matrice, et les amorces suivantes : 5'-GCGAA TTCACA TCTTCAGAAGAAAGAGC-3' (SEO ID n 3) et 5'-GCGTCGACTTAATCATTGGAGTCTTGTGG-3' (SEQ ID n'4). Le produit de réaction de polymérisation en chaîne de 0,7 kb a été cloné dans les sites EcoRI/Sall de pGEX-4T-1 (Amersham Pharmacia Biotech). Des constructions plus courtes avec les premier ou second modules du tandem BRCT ont été obtenues avec les amorces suivantes 5'- GCGAATTCACATCTTCAGAAGAAAGAGC-3' (SEQ ID n 5) et 5'- GCGTCGACTCAGCCCTTGAAGAGCTTTTCC-3' (SEQ ID n 6) pour la construction pGEX-BRCT A, 5'-GCGAATTCCGGGAAAAGCTCTTCAAGG-3' (SEQ ID nO 7) et 5'-GCGTCGACTTAATCATTGGAGTCTTGTGG-3' (SEQ ID n 8) pour la construction pGEX-BRCT B. Une forme plus longue pGEX-BRCT L contenant les nucléotides 4534 à 5436 de Brca 1 a également été préparée en utilisant les amorces suivantes : 5'-GCGAATTCGAAGGAACCCCATACCTG-3' (SEQ ID n 9) et 5'-GCGTCGACTTAATCATTGGAGTCTTGTGG-3' (SEQ ID n 10). Un mutant pGEX-BRCT (M) a été produit avec les mêmes amorces que celles utilisées pour GST-BRCT de type sauvage en utilisant un ADNc Brca1 ayant la mutation non-sens 1777X, en tant que matrice. Le plasmide pGEXBRCTh exprimant la forme humaine du tandem BRCT a été obtenu par amplification des nucléotides 4917 à 5592 en utilisant l'ADNc de BRCA1 inséré dans pCDNA3ss, et les amorces suivantes : 5'- GCGGATCCACAGCTTCAACAGAAAGGG-3' (SEQ ID n"11) et 5'GCGTCGACTCAGTAGTGGCTGTGGGG-3' (SEQ ID nO 12). Des mutants pGEX-BRCTh ont été produits avec les mêmes amorces que celles utilisées pour GST-BRCTh de type sauvage en utilisant un ADNc BRCA1 ayant la mutation non-sens R1835X ou Y1853 X, ou les mutations faux-sens A1708E, P1749R, ou M1775R, en tant que matrice. - Culture cellulaire : Les cellules ont été cultivées dans un milieu DMEM additionné de 10 % de sérum foetal de veau. Les cellules MCF7 ont été cultivées dans le même milieu avec 5 mg/ml d'insuline. Pour le radiomarquage, les cellules ont été cultivées pendant une heure dans un milieu DMEM sans méthionine, puis pendant trois heures dans un milieu DMEM sans méthionine contenant 250 uCi de méthionine marquée au [35S]. Pour la transfection, la méthode standard de précipitation au phosphate de calcium a été utilisée (Gibco BRL) avec 5 ug d'ADN plasmidique total. Des cellules ont été récoltées 48 heures après la transfection. - Essais de co-sédimentation avec GST : Les protéines de fusion avec GST ont été synthétisées dans Escherichia coli, souche JM 109 (Promega) transformées avec pGEX-4T-1, pGEX-BRCT, pGEX-BRCT A, pGEX-BRCT B, pGEX-BRCT L, pGEX-BRCT M ou pGEX-BRCTh ainsi que les formes mutées de BRCTh (A1708E, P1749R, M1775R, R1835X et Y1853X). Elles ont été purifiées par chromatographie d'affinité sur Glutathione-Sepharose. L'essai de liaison par co-sédimentation a été réalisé in vitro en incubant des Iysats cellulaires, en présence de protéines GST non recombinantes ou de protéines de fusion-GST et de billes Glutathione-Sepharose. 10 ug de GST ou GST-fusion ont été utilisés dans chaque essai de liaison. Les complexes protéiques ont été soigneusement lavés (50 mM Tris HCI pH 7,6, 100 mKCI, 0,05% Tween 20,1 mM DTT, 0, 2 mM PMSF) pour éliminer les interactions protéiques non spécifiques et libérés par un chauffage à 100 C dans un tampon de charge 5X SDS-PAGE et 100 mM DTT. Les protéines ont été analysées par SDS-PAGE et visualisées par autoradiographie, coloration à l'argent (Bio-Rad SilverStain) ou coloration au Bleu de Comassie selon la nature du lysat utilisé. - Préparation des extraits cellulaires totaux : Les cellules ont été Iysées de manière douce par choc thermique (azote/37 C) dans le tampon suivant : 25 mM Tris HCI pH 7,6, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,2 mM PMSF, 10 pg/ml de leupeptine, pepstatine A et aprotinine. - Immunoprécipitation et analyse en Western Blot : Les immunoprécipitations de protéines endogènes ou surexprimées in vivo ont été réalisées dans un tampon de lyse avec 1 pg d'anticorps spécifique (anti-BRCA1 OP92, Oncogene Research Products ; antiBrca1 D16, Santa Cruz Biotechnology ; anti-ACC-a L3J74) et la protéine Gsépharose pendant deux heures à 4 C. Après précipitation, les billes ont été lavées à trois reprises avec le tampon de lyse et les protéines ont été éluées par chauffage pendant cinq minutes dans le tampon de charge SDS. Les protéines ont été séparées sur des gels de polyacrylamide de 6 à 10 % contenant du SDS (SDS-PAGE) et chargées sur des membranes de poly (difluorure de vinylidène) (PVDF) (Immobilon-P, Millipore). Les membranes ont été saturées dans du TBS contenant 0,05 % de Tween 20 et 5 % de poudre de lait. Les incubations avec les anticorps primaires et secondaires ont été réalisées dans du TBS contenant 0,05 % de Tween 20 et 2 % de poudre de lait, et les protéines ont été détectées par chimioluminescence (ECL, Amersham Pharmacia Biotech ou Super Signal West Dura Extended, Pierce). - Fractionnement subcellulaire : La fraction cytosolique a été obtenue après incubation des cellules pendant 10 minutes sur de la glace dans un tampon RYMO (10 mM Tris HCI pH 7,6, 1 mM MgCi2, 0,5 mM de CaCI2, 0, 25M saccharose, 0,6 % NP40), et centrifugation (2 000 rpm, 5 minutes). Le culot nucléaire a ensuite été clarifié pendant 10 minutes sur de la glace dans un tampon RIPA (137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 25 mM Tris pH 8,1 % NP 40) et centrifugé à 13 000 rpm pendant cinq minutes pour éliminer les matières insolubles. Toutes les fractions ont été ajustées à 150 mM NaCI, 25 mM Tris pH 7,6 et des inhibiteurs de protéase ont été ajoutés (2 mM PMSF, 10 pg/ml de leupeptine, pepstatine A et aprotinine). Des fractions ont été testées pour leur concentration en protéines par la méthode de Bradford (Bio-Rad Protein Assay), et soumises à des analyses par Western Blot avec des anticorps dirigés contre la ss-tubuline (KMX-1, Roche Molecular Biochemical) ou p300 (N-15, Santa Cruz Biotechnology). - Séquençage peptidique par spectrométrie de masse - digestion sur gel : La protéine de 210 kDa d'intérêt colorée au Bleu de Comassie a été excisée du gel SDS-PAGE puis lavée avec 50 mM de tampon d'acétate d'ammonium, pH 7 pendant une heure. Le surnageant a été jeté et la tranche de gel lavée dans une solution 50/50 % (v/v) d'acétonitrile/25 mM d'acétate d'ammonium, pH 7,5 pendant une heure et enfin avec de l'eau pure avant déshydratation complète dans une centrifugeuse sous vide. Les pièces de gel ont été réhydratées avec une quantité minimale d'une solution de trypsine porcine modifiée (PROMEGA Madison, Wl, USA) contenant 0, 25 ug de protéase. Si nécessaire, du tampon supplémentaire a été ajouté jusqu'à ce que la pièce de gel ait été complètement réhydratée. La digestion a eu lieu à 37 C pendant quatre heures. - Spectrométrie de masse : SM-MALDI i Les spectres de masse des produits de digestion tryptique ont été obtenus sur un spectromètre de masse MALDI-TOF Voyager Elite X1 (Perspective Biosystems), équipé d'une extraction différée. L'instrument a été utilisé en mode reflectron. 1 ! JI du produit de digestion a été déposé directement sur le support d'échantillon et mélangé avec 1 pI d'une solution saturée d'acide 2,5-dihydrobenzoïque. Une liste de masses de peptides a été obtenue pour chaque produit de digestion protéique. Ce profil de masses peptidiques a ensuite été traité avec un logiciel approprié dans le but d'identifier les protéines (MS- FIT : http : //prospector. ucsf. edu/ucsfhtmI3. 2/msfit. htm, ou PROFOUND : http ://129. 85.19. 192/prowicgi/ProFound. ex). Les peptides tryptiques de la protéine de 210 kDa ont été identifiés à partir de la carte de masse des fragments tryptiques. Les produits de digestion tryptiques ont été extraits à deux reprises avec une solution à 50/50 % (v/v) d'acétronitrile/25 mM d'acétate d'ammonium pH 7,5. La solution de digestion et les extraits ont été rassemblés, séchés dans une centrifugeuse sous vide et dessalés avec ZipTip C18 (Millipore, Bedford, Ma, USA) avant analyse SM/SM. - SM/SM-nanospray : Un instrument Q-TOF (Micromass, Manchester, Royaume Uni) a été utilisé avec une source ionique Z-Spray fonctionnant en mode"nanospray". Environ 3 à 5 pl de chaque échantillon dessalé ont été introduits dans une aiguille (aiguille de prélèvement moyenne, PROTAN Inc., Odense, Danemark) pour la réalisation des expérimentations SM/SM. Le voltage capillaire a été réglé à un voltage moyen de 1 000 volts et le cône échantillon à 50 volts. Du glufibrinopeptide a été utilisé pour calibrer l'instrument pour le mode SM/SM. Les spectres SM/SM ont été transformés en utilisant MaxEnt3 (MassLynx, Micromass Ltd), et les séquences d'acides aminés ont été analysées à l'aide de PepSeq (BioLynx, Micromass Ltd). Les séquences d'acides aminés, les fragments de séquences ou les fragments ioniques peptidiques qui ont pu être déterminés ont été utilisés pour cribler des banques de protéines et d'EST à l'aide des logiciels appropriés : Pepfrag (http ://prowl1. rockefeller. edu/prowl/pepfragch. html), Scan (http : //dna. standford. edu/scan) ou BLAST pour les recherches d'homologies (http : //www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/blast). - Séquençage peptidique par dégradation desman L'essai de co-sédimentation préparatif a été réalisé à partir de 5. 107 cellules NIH3T3 et séparé par SDS-PAGE suivi d'une coloration au noir amido. Dans ces conditions, la bande d'intérêt contenait une quantité suffisante de protéines (25 pmoles correspondant à 5 pg de la protéine 210 kDa) pour être analysée par séquençage peptidique. La tranche de gel de polyacrylamide correspondant à la bande de 210 kDa a été excisée et incubée avec une solution de 0,05 M Tris HCI pH 8,6/0, 03 % SDS contenant 0,4 ug d'endolysine à 35 C pendant 18 heures. Les peptides endolytiques ont été séparés par HPLC sur une colonne DEAE-C18 avec un gradient acétonitrile/TFA à 0,1%. Le séquençage des peptides isolés a été réalisé conformément à la dégradation d'Edman sur un séquenceur Procise d'Applied Biosystems. Les séquences d'acides aminés ont servi à cribler la banque de données protéique pour la recherche d'homologies : BLAST (http : //www. ncbi. nim. nih. gov/blast/blast), ExPASy (http : //www. expasy. org/toolsl). RESULTATS : - Essais de co-sédimentation avec GST et isolement de la protéine cytoplasmique interagissant avec Brca 1 : Pour identifier des protéines qui interagissent avec le tandem formé des deux modules BRCT de Brca1, les inventeurs ont réalisé un essai de co-sédimentation avec GST à l'aide de la lignée cellulaire de fibroblastes murins NIH3T3. Une protéine de fusion à la GST contenant les acides aminés 1583 à 1812 de Brca1 murin, nommée GST-BRCT, a été construite, exprimée dans Escherichia coli, et purifiée sur des billes de glutathione-sepharose. Des Iysats de cellules entières ont été préparés à partir de 7. 106 cellules NIH3T3 marquées à la 35S méthionine. Les Iysats ont été pré-purifiés à l'aide de billes de glutathione-Sépharose. Ils ont été ensuite mis en contact avec soit des billes de glutathione seules, soit des billes de glutathione additionnées de GST, soit des billes de glutathione additionnées de GST-BRCT. Après plusieurs lavages, les complexes de co-sédimentation ont été séparés par SDS-PAGE et visualisés par auto-radiographie. Une bande majeure de 210 kDa était visible uniquement dans l'échantillon GST-BRCT. Pour déterminer la localisation subcellulaire de la protéine interagissant avec le tandem BRCT, des cellules NIH3T3 ont été séparées en fractions nucléaire et cytoplasmique. Un essai de cosédimentation réalisé sur ces deux fractions a été analysé par SDS-PAGE suivi d'une coloration par l'argent. Les résultats ont montré que la protéine d'interaction était majoritairement cytoplasmique. Le bon fractionnement de ces cellules a été contrôlé à l'aide d'anticorps dirigés contre p300 nucléaire et la ss-tubuline cytoplasmique. - ACC-a identifiée comme étant la protéine interagissant avec Brca 1 : Pour identifier la protéine qui interagit avec le tandem BRCT de Brca1, un essai de co-sédimentation préparatif a été réalisé à partir de 5. 107 cellules NIH3T3 (représentant approximativement 10 essais de cosédimentation analytique avec GST, décrits ci-dessus) et séparés par SDSPAGE. Dans ces conditions, la bande de 210 kDa pouvait être détectée par coloration au Bleu de Coomassie. Ceci indique que cette bande contient une quantité suffisante de protéines pour être analysée par spectrométrie de masse. Des tranches de gel de polyacrylamide correspondant à la bande de 210 kDa ont été excisées. La protéine a été digérée en plusieurs peptides de façon enzymatique par la trypsine, puis le mélange a été analysé par MALDISM en utilisant le mode reflectron. Les masses mono-isotopiques de peptides provenant de la digestion protéolytique ont été comparées aux masses d'une banque de données peptidique, calculée à partir de la banque de donnée protéique nr de NCBI avec des tolérances de masse de 0,2 Da et avec des restes de méthionine partiellement oxydés (valeurs m/z listées dans des programmes profound et sm-fit (voir procédure experimental) : 920.47, 931.52, 938.49, 948.51, 1034.51, 1045.62, 1065. 63, 1084.51, 1087.66, 1092.59, 1097.66, 1165.73, 1179.76, 1199.73, 1232.77, 1235.68, 1267.70, 1300.64, 1308.75, 1322.72, 1365.71, 1438.79, 1493.77, 1571.72, 1791.77). Les autres paramètres étaient les suivants : domaine de variation de la masse protéique de 100-300 kDa ; cystéines non modifiées, maximum de trois sites de clivage non pris en compte. La protéine arrivant en tête était l'acétyl-CoA carboxylase de Rattus norvegicus (EC 6.4. 1.2 ; swiss prot code d'accès P 11497) avec 16 peptides possibles sur les 25 peptides listés avait une probabilité proche de 1 (9. 9e-1) et se distinguait nettement du candidat venant en deuxième position trouvé lors de la recherche (protéine KIAA 1286 d'homo sapiens ; probabilité de 4.0e-3). Ce résultat a été confirmé par des expérimentations sm/sm sur des ions m/z 634.32, 720.36 et 786.33 correspondant aux ions doublement chargés de peptides 1266.7, 1438.79 et 1570.7 Da réalisés avec un Q-TOF. Les séquences peptidiques déduites des ions b et y ont été utilisées pour 14 1419 cribler le programme BLAST. Les séquences 1409VEVGTEVTDYR1419, 1435EASFEYLQNEGER1447 et la séquence partielle du peptide 1438.79 (DFTVASP) ont montré 100 % d'homologie avec l'acétyl-CoA carboxylase de Rattus norvegicus et confirmé les résultats précédents. Pour confirmer l'identité de la protéine interagissant avec BRCT, un microséquençage du peptide a également été réalisé. Un essai de co- sédimentation préparatif du GST utilisant 5. 107 cellules NIH3T3 a été réalisé pour obtenir 25 pmoles de protéine destinés à être digérés et séquencés. Une tranche de gel de polyacrylamide contenant 5 ug de la bande de 210 kDa d'intérêt (approximativement 25 pmoles) a été excisée. La protéine a été digérée enzymatiquement en peptides par l'endolysine, puis les peptides ont été séparés par chromatographie sur DEAE-C18 et séquencés. Les séquences KAAEEVGYP ET 2267KDLVEWLEK2275 ont été obtenues. Comme attendu, elles ont montré 100 % d'homologie avec l'acétyl-CoA carboxylase de Rattus norvegicus (EC 6.4. 1.2 ; swiss prot numéro d'accès P 11497). Deux formes majeures d'ACC d'origine animale ont été décrites jusqu'à présent : l'ACC-a de 265 kDa et l'ACC-ss de 280 kDa. Les 5 séquences peptidiques obtenues ici présentent 100 % d'homologie avec l'ACC-a du rat. Le gène ACC-a murin n'a pas été cloné. Néanmoins, la séquence codante du gène a est bien conservée chez les différentes espèces. Ainsi, la séquence d'ADNc de l'ACC-a de rat (Lopez-Casillas et al., 1988) est hautement similaire (90 %) à la séquence de l'ACC-a humaine (Abu-Elheiga L. et al., 1995). Le site de liaison à la biotine hautement conservé et les sites de liaison putatifs à l'ATP et au coenzyme A sont identiques chez l'homme, le rat et la levure. - ACC- se lie au tandem de modules BRCT dans les cellules épithéliales de glande mammaire : Les inventeurs ont démontré que le tandem BRCT de Brca1 se liait à l'ACC-a endogène dans des fibroblastes murins. Etant donné que le gène BRCA1 est associé à une forme familiale du cancer du sein, les inventeurs ont recherché l'interaction entre le tandem BRCT et ACC-a dans la glande mammaire. Les essais de co-sédimentation GST ont été réalisés avec quatre lignées cellulaires épithéliales murines mammaires, à savoir Be4a, 13G2, Tac-2 et J3B1, et les protéines liées ont été détectées à l'aide de peroxydase couplée à la streptavidine. La capacité du tandem BRCT à lier l'ACC-a est conservée dans toutes ces lignées cellulaires. Un essai a été réalisé pour examiner si le tandem BRCT de BRCA1 murin pouvait également s'associer avec la forme humaine de l'ACC-a présente dans la glande mammaire. A cet effet, ils ont réalisé un essai de co- sédimentation avec deux lignées cellulaires d'épithélium mammaire humain (HBL 100 et MCF 7). Une étude par Western Blot, à l'aide de peroxydase couplée à la streptavidine, a montré que la capacité du tandem BRCT murin à lier l'ACC-a était conservée dans les cellules épithéliales mammaires humaine. Les séquences des deux domaines BRCT de BRCA1 murin partagent 75 % et 58 % d'identité avec ceux de la protéine BRCA1 humaine, respectivement (Callebaut 1. et Mornon J. P., 1997). De plus, la séquence d'ADNc de l'ACC-a de rat (Lopez-Casillas et al., 1988) est hautement similaire (90 %) avec la séquence d'ACC-a humaine (Abu-Elheiga L. et al., 1995). Les résultats représentés ici indiquent que le tandem murin BRCT se lie aussi bien à la forme ACC-a humaine qu'à la forme murine. En conséquence, pour caractériser davantage cette interaction, les inventeurs ont recherché la capacité du tandem BRCT humain à lier les formes murines et humaines de l'ACC-a. Des essais de co-sédimentation ont été réalisés sur les lignées cellulaires de fibroblastes NIH3T3 murin et la lignée épithéliale mammaire humaine HBL 100. Les résultats démontent que l'interaction entre le tandem BRCT humain et l'ACC-a est maintenue dans les espèces murine et humaine. Ensemble, ces données démontrent une interaction protéineprotéine bien conservée entre le tandem BRCT de BRCA1 et la protéine ACCa dans les espèces murines et humaines. - interagit spécifiquement avec l'intégralité du tandem des modules BRCT de Brca 1 : De façon à cartographier le domaine d'interaction de ACC-a sur le tandem BRCT de Brca 1, des essais de co-sédimentation avec six protéines de fusion distinctes ont été réalisés. Les complexes protéiques de cosédimentation ont été résolus par SDS-PAGE et visualisés par Western-Biot. La protéine ACC contenant la biotine a été détectée en utilisant de la peroxydase couplée à la streptavidine, la streptavidine ayant une haute affinité pour la biotine est ainsi une sonde très sensible pour détecter l'ACC-a (Witters, L. A et al., 1994). Les résultats montrent que le fragment GST-BRCT L contenant les résidus 1512-1812 de Brca1, de même que GST-BRCT, interagissent avec ACC-a. Toutefois, le fragment GST-BRCT A auquel manquent les séquences du domaine B de BRCT est incapable de s'associer avec l'ACC-a. De même, le fragment GST-BRCT B auquel manquent les séquences du domaine BRCT A ne lie pas ACC-a. GST-Brca1 N contenant les 220 résidus N-terminaux de Brca1, de même que GST tout seul, n'ont pas été capables de capturer ACC-a, ce qui démontre la spécificité de l'interaction entre ACC-a et la région carboxy-terminale de Brca 1. De nombreuses mutations familiales ont été retrouvées dans le segment carboxy terminal de BRCA 1. L'une d'entre elles, R 1835X, localisée dans le domaine distal de BRCT, introduit un codon non-sens qui supprime les 29 derniers acides aminés de Brca1 et rompt ainsi le second domaine BRCT. Pour déterminer si cette mutation pouvait abolir l'interaction du tandem BRCT avec ACC-a, la mutation W1777X qui mime la mutation humaine R1835X a été introduite sur l'ADNc murin de Brca1 et un essai de co-sédimentation a été réalisé avec le tandem muté (GST-BRCT M). La mutation germinale abolit l'interaction avec ACC-a. L'effet de cette mutation a par ailleurs été confirmé par introduction de la mutation R1835X dans l'ADNc humain de BRCA 1. La protéine de fusion GST-BRCTh tronquée correspondante ne lie pas l'ACC-a. L'étude d'autres mutations familiales telles que les mutations A1708E, P1749R, ou M1775R, qui créent une substitution d'acide aminé dans le domaine BRCT A, dans la séquence de liaison des deux domaines BRCT ou dans le domaine BRCT B respectivement, ou encore la mutation non sens Y1853X qui conduit à un domaine BRCT B tronqué, montre que ces mutations abolissent également la liaison de BRCA1 à l'ACC-a. L'ensemble de ces données indique que la séquence minimale BRCA1 requise pour l'association avec ACC-a correspond précisément au tandem des domaines BRCT, ce qui signifie que les deux motifs BRCT sont impliqués dans l'interaction avec ACC-a. BRCA 1 sa forme courte Brcal-, Jll s'associent in vivo à l'ACC-a : Afin de déterminer si la protéine BRCA1 peut interagir avec ACC-a in vivo, des expériences de co-immunoprécipitation ont été réalisées avec des Iysats de cellules Bosc transfectées. A cet effet, les cellules Bosc ont été transfectées avec des plasmides d'expression codant pour Brca 1 de longueur totale ou la forme courte Brca1-A11. Les Iysats préparés à partir de ces cellules transfectées ont été immunoprécipités avec l'anticorps D16 (Santa Cruz Biotechnology) dirigé contre BRCA1 et chaque immuno-précipité a été fractionné par SDS-PAGE. La présence de l'ACC-a endogène dans ces immuno-précipités a alors été déterminée par Western blot à l'aide de peroxydase couplée à la streptavidine. L'ACC-a endogène a été coimmunoprécipitée à partir de cellules exprimant Brcal et de cellules exprimant la forme courte Brca 1- 11. Pour étudier plus avant si la forme humaine de BRCA1 pouvait s'associer avec l'ACC-a endogène, des cellules Bosc ont été transfectées avec un plasmide exprimant la protéine BRCA 1. Des Iysats ont été immunoprécipités avec l'anticorps OP92 (Oncogene Research Products) dirigé contre BRCA1 et la présence d'ACC-a endogène dans les coimmunoprécipités a été analysée par Western Blot à l'aide de peroxydase couplée à la streptavidine. Comme attendu, BRCA1 humain coprécipite avec l'ACC-a endogène. Parce que BRCA1 est majoritairement une protéine nucléaire, les résultats obtenus dans les essais de co-sédimentation et les résultats concernant la localisation cytoplasmique de ACC-a soulèvent la question de la signification physiologique de l'interaction entre BRCA1 et ACC-a. Les inventeurs ont réexaminé la localisation sub-cellulaire de BRCA1 et de l'isoforme murine Brca1-A11 exprimé de façon transitoire dans des cellules Bosc. A cet effet, des techniques de fractionnement ont été utilisées pour étudier la localisation sub-cellulaire de BRCA1 et de la forme Brca1-A11 murine (Bachelier, R et al., 2000). Après fractionnement cellulaire, des extraits nucléaires et cytoplasmiques des cellules transfectées ont été séparés par SDS-PAGE et soumis à une analyse par Western Blot. Comme attendu, la protéine BRCA1 humaine endogène a été détectée majoritairement dans la fraction nucléaire tandis que BRCA1 exprimée de façon ectopique était majoritairement cytoplasmique. Ces résultats sont en accord avec les observations précédentes (Bachelier, R et al., 2000). En outre, l'isoforme Brca1-A11 murine exogène était majoritairement présente dans la fraction cytoplasmique. Pris ensemble, ces résultats indiquent que l'ACC-a qui est localisée dans le cytoplasme lie les protéines BRCA1 de longueur totale et la forme courte BRCAl-All exprimées de façon ectopique, via le tandem des domaines BRCT présents à la fois dans les formes humaines et murines. Aucun anticorps dirigé contre la forme humaine d'ACC-a n'étant disponible sur le marché, les inventeurs ont préparé, chez le lapin un anticorps polyclonal dirigé contre les extrémités amino-terminale (MEDPSPLAQPLELNQ, SEQ ID n 1) et carboxy-terminale (AEVIRILSTMDSPST, SEO ID n02) de la protéine ACC-a humaine. Cet anticorps a ensuite été immunopurifié contre ces deux deux séquences peptidiques. La spécificité de cet anticorps anti-ACC-a appelé L3J74, a été testée par technique de Western Blot dans plusieurs lignées cellulaires (lignées humaines : HBL100, MCF7, BT20, Bosc, HCC1937 ; lignée murine : NIH3T3) et plusieurs Iysats tissulaires (sein, ovaire, pancréas), dans des conditions expérimentales permettant de distinguer clairement les formes a et ss de l'ACC. Les résultats ont montré que L3J74 était spécifique de la forme a d'ACC, et que son affinité pour la forme humaine était très supérieure à celle observée pour la forme murine de la protéine. Cet anticorps a été ensuite testé par technique d'immunoprécipitation sur différents Iysats cellulaires (HBL 100, Bosc, NIH3T3). Deux cents nanogrammes de cet anticorps permettent, dans un Iysat de 5 x 106 cellules, l'immunoprécipitation d'ACC-a. Dans le but de montrer que la protéine ACC-a s'associe à BRCA 1 in vivo, dans des conditions physiologiques, des expériences de coimunopréciptation ont été menées sur des cellules épithéliales de glande mammaire humaines de lignée cellulaire HBL100. L'immunoprécipitation de BRCAI résulte en la coprécipitation d'ACC-a. Réciproquement, l'immunoprécipitation d'ACC-a avec l'anticorps L3J74 résulte en la coprécipitation de BRCA 1. Ces résultats montrent clairement que BRCA1 et ACC-a forment in vivo un complexe endogène. BIBLIOGRAPHIE Abu-Elheiga L. et al. (1995). Human acetyl-CoA carboxylase : characterization, molecular cloning, and evidence for two isoforms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 : 4011-4015. Anderson S. F. et al. (1998). BRCA1 protein is linked to the RNA polymerase 11 holoenzyme complex via RNA helicase A. Nat. Genet. 19 : 254-256. Bachelier, R. et al. (2000) Int J Cancer, 88,519-524. Bennett L. M. et al (1995) Genomics, 29,576-581. Benoit et al., (1982) PNAS USA, 79,917-921. 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Complexe moléculaire comprenant : - un premier polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés 1640 à 1863 de la protéine BRCA1 humaine ou une même séquence d'acides aminés de la protéine BRCA1 chez une autre espèce animale, et - un deuxième polypeptide comprenant un fragment de la protéine ACC-a capable de lier ledit premier polypeptide. 2. Méthode de criblage in vitro de molécules utiles pour la prévention ou le traitement du cancer du sein et/ou de l'ovaire dans laquelle les molécules sont testées pour leur capacité à moduler l'interaction entre les protéines BRCA1 et ACC-a. 3. Méthode de criblage selon la revendication 2, comprenant : a) la mise en contact, dans un ordre quelconque, de deux partenaires ou trois partenaires différents sélectionnés parmi le groupe constitué d'un premier polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés 1640 à 1863 de la protéine BRCA1 humaine ou une même séquence d'acides aminés de la protéine BRCAL, un deuxième polypeptide comprenant un fragment de la protéine ACC-a capable de lier ledit premier polypeptide et une molécule candidate ; b) l'incubation desdits partenaires pendant un temps suffisant pour permettre leur éventuelle interaction ; c) dans le cas où seuls deux partenaires différents ont été sélectionnés à l'étape a), l'ajout du troisième partenaire sélectionné dans ledit groupe et l'incubation pendant un temps suffisant pour permettre une éventuelle interaction ; d) la détermination de la capacité de la molécule candidate à moduler l'interaction entre BRCA1 et ACC-a. 4. Méthode de criblage selon la revendication 2 ou 3, comprenant : a) la mise en présence d'un premier polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés 1640 à 1863 de la protéine BRCA1 humaine ou une même séquence d'acides aminés de la protéine BRCA1 avec un deuxième polypeptide comprenant un fragment de la protéine ACC-a capable de lier ledit premier polypeptide, un des polypeptides au moins étant marqué de manière détectable ; b) l'addition d'une molécule candidate capable de moduler l'interaction ; c) l'incubation desdits polypeptides en présence de la molécule candidate dans des conditions et pour une période de temps suffisante pour que la liaison entre lesdits polypeptides ait lieu ; d) la quantification du nombre de molécules marquées liées en présence de concentrations croissantes de la molécule candidate. 5. Méthode de criblage selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que ladite molécule capable de moduler l'interaction BRCA1/ACC-a est un agoniste. 6. Méthode de criblage selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que ladite molécule capable de moduler l'interaction BRCA1/ACC-a est un antagoniste. 7. Méthode d'identification ex vivo de molécules constituant des ligands endogènes du complexe BRCA1/ACC-a comprenant : a) la mise en contact du complexe BRCA1/ACC-a avec un échantillon biologique dans des conditions permettant la formation d'interactions entre le complexe et d'éventuels ligands ; b) la détection d'interactions entre le complexe BRCA1/ACC-a et lesdits ligands ; et c) l'identification des ligands interagissant avec le complexe. 8. Méthode de diagnostic in vitro d'une prédisposition au cancer du sein et/ou de l'ovaire, comprenant la détermination d'une modification de l'interaction BRCA1/ACC-a chez un sujet par rapport à une population témoin, la modification de l'interaction BRCA1/ACC-a étant associée à une variation du risque de développer un cancer du sein et/ou de l'ovaire. 9. Anticorps dirigé contre complexe moléculaire BRCA1/ACC-a, caractérisé en ce qu'il n'interagit pas avec les protéines BRCA1 ou ACC-a seules.