Brevet FR2844513A1 — publié le 20040319

La présente invention concerne des anticorps monoclonaux chimériques humanisés ou humains qui sont produits dans des lignées cellulaires sélectionnées, lesdits anticorps présentant une forte affinité pour le récepteur CD16 des cellules effectrices du système immunitaire mais également la propriété d'induire la sécrétion de cytokines et d'interleukines, qui peuvent moduler l'activité ADCC des cellules effectrices. L'immunothérapie au moyen d'anticorps monoclonaux est en passe de devenir un des aspects les plus importants de la médecine. En revanche, les résultats obtenus lors d'essais cliniques apparaissent contrastés. En effet, il peut s'avérer que l'anticorps monoclonal ne soit pas suffisamment efficace. De nombreux essais cliniques sont arrêtés pour diverses causes telles que le manque d'efficacité et des effets secondaires incompatibles avec une utilisation en thérapie clinique. Ces deux aspects sont étroitement liés sachant que des anticorps peu actifs sont administrés à forte dose pour compenser et obtenir une réponse thérapeutique. L'administration de forte dose induit non seulement des effets secondaires mais est économiquement peu viable. Ces problèmes sont majeurs dans le développement industriel des anticorps monoclonaux chimériques humanisés ou humains. A titre d'exemple, la société Protein Design Labs a suspendu les essais cliniques en phase I/II du Remitogen, qui est un anticorps anti-HLA-DR pouvant être utilisé pour traiter les cancers de cellules MHC de classe II positives, notamment les leucémies des cellules B et T. Aujourd'hui, la recherche est orientée sur le fragment Fcy de l'immunoglobuline afin d'améliorer les propriétés fonctionnelles des anticorps. A terme, cela devrait permettre l'obtention d'anticorps qui interagissent et activent les récepteurs des cellules effectrices (monocytes macrophage, lymphocyte T et B, cellules NK et dendritiques). La fixation d'un anticorps sur son ligand peut induire une activation de certaines cellules effectrices via leurs récepteurs Fc, ce qui est l'objectif de la présente invention. Nous avons trouvé qu'une des conséquences de l'activation des cellules est non seulement l'induction de propriétés fonctionnelles, comme l'ADCC ou l'activation du complément, mais aussi la production de cytokines. Ces cytokines, produites au site d'activation des effecteurs, peuvent exercer différentes activités biologiques. Ainsi, il apparaît nécessaire de tester les propriétés des anticorps candidats à induire la production de ces facteurs modulant la réponse immunitaire. En effet, on a trouvé que l'activation des récepteurs des cellules effectrices produit des réponses très différentes conduisant à la libération d'une ou plusieurs cytokines. Ces cytokines sont responsables de l'activation ou de l'inhibition de certains composants du système immunitaire selon le cas. Il peut s'avérer par exemple q'un même anticorps dirigé contre un antigène donné soit complètement inefficace lors qu'il est produit dans des lignées de myélome de souris, alors qu'il se montre très efficace lors qu'il est produit dans d'autres lignées cellulaires. Par exemple, nous démontrons ici que la fixation d'un anticorps sur son ligand peut induire une activation de la cellule Jurkat transfectée CD 16 avec comme conséquence la sécrétion d'IL2. Une forte corrélation est observée entre la sécrétion d'IL2 par Jurkat CD 16 et l'activité ADCC médiée par le CD 16 des cellules effectrices. Nous avions montré dans notre demande WO 01/77181 (LFB) l'importance de sélectionner des lignées cellulaires permettant de produire des anticorps présentant une forte activité ADCC du type FcyRIII (CD16). Nous avions trouvé que la modification de la glycosylation du fragment constant des anticorps conduisait à améliorer l'activité ADCC dans des lignées de myélomes de rat telle que YB2/0. Les structures glycanniques étant de type biantennées, avec des chaînes courtes, une faible sialylation, des mannoses et GIcNAc du point d'attache terminaux non intercalaires, et une faible fucosylation. Or, dans le cadre de la présente invention, nous avons découvert que l'avantage de présenter une forte affinité pour le CD 16 peut encore être renforcé par des tests supplémentaires visant à choisir les anticorps qui induisent la production de cytokines.. Les deux caractéristiques précitées se complémentent. En effet, la production de cytokine induite par les anticorps sélectionnés par le procédé de l'invention pourrait renforcer activité cytotoxique des anticorps. Le mécanisme d'action d'une telle activation tient probablement à une régulation positive autocrine des cellules effectrices. On peut postuler que les anticorps se lient au CD16 provoquant une activité cytotoxique mais également induisent la production d'IFN gamma qui au final peut conduire à augmenter encore davantage l'activité cytotoxique. L'invention propose donc des anticorps qui présentent une activité jusqu'à 100 fois supérieure aux anticorps disponibles en thérapie. En particulier, l'invention apporte un anti-HLD-DR et un anti-CD20 significativement plus efficace que leur homologue respectif tel que le Remitogen# et le Rutixan. La présente invention marque un tournant majeur dans le développement des anticorps à visée clinique en apportant une nouvelle génération dont les ED50 (expliciter) sont bien inférieures à celles des anticorps actuellement utilisés. Description Ainsi, l'invention se rapporte à un anticorps monoclonal chimérique humanisés ou humain produit dans une lignée cellulaire sélectionnée pour ses propriétés de glycosylation du fragment Fc d'un anticorps, ou dont la structure glycannique a été modifiée ex vivo, ledit anticorps présentant un taux ADCC de type FcyRIII (CD 16) supérieur à 60 %, 70%, 80 % ou de préférence supérieur à 90 % comparé au même anticorps produit dans une lignée CHO ou à un anticorps homologue disponible dans le commerce, caractérisé en ce qu'il présente une capacité à induire un taux de production d'au moins une cytokine par une cellule effectrice du système immunitaire exprimant le récepteur CD16 supérieur à 60 %, 100 % ou de préférence supérieur à 200 % comparé au même anticorps produit dans une lignée CHO ou à un anticorps homologue disponible dans le commerce. De préférence, cet anticorps présente un taux ADCC supérieure à 100 % à une concentration de lOng/ml comparé au même anticorps produit dans une lignée CHO ou à un anticorps homologue disponible dans le commerce et un taux de production d'au moins une cytokine par une cellule effectrice du système immunitaire exprimant le récepteur CD 16 supérieur à 1000 % à une concentration delOng/ml comparé au même anticorps produit dans une lignée CHO ou à un anticorps homologue disponible dans le commerce. Lesdites cytokines libérées sont des interleukines, des interférons et des facteurs de nécrose tissulaire (TNF). Ainsi, l'anticorps est sélectionné pour sa capacité d'induire la sécrétion d'au moins une cytokine choisie parmi IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10,... TNFa, TGFss, IP10 et IFNy par les cellules effectrices du système immunitaire exprimant le récepteur CD16. De préférence, l'anticorps sélectionné a la capacité d'induire la sécrétion d' IFNy par les cellules effectrices du système immunitaire exprimant le récepteur CD 16. Le taux d' IFNy sécrété reflète la qualité de l'anticorps fixé par le récepteur CD 16 quant à son intégrité (fonction Fc) et à sa capacité (site antigénique) de liaison à l'antigène. En outre, la sécrétion d' IFNy contribue à renforcer l'active l'activité cytotoxique des cellules effectrices. Les cellules effectrices peuvent exprimer un CD 16 endogène ou être transformées. On entend par cellule transformée, une cellule modifiée génétiquement de sorte à exprimer un récepteur, en particulier le récepteur CD 16. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps de l'invention est capable d'induire la sécrétion d'au moins une cytokine par une cellule leucocytaire, en particulier de la famille des NK (natural killer) ou par des cellules du groupe monocytes-macrophages. De préférence, on utilise pour la sélection des anticorps une lignée Jurkat transfectée avec un vecteur d'expression codant pour le récepteur CD16 comme cellule effectrice. Cette lignée est particulièrement avantageuse car elle est immortalisée c'est à dire qu'elle se développe indéfiniment dans des milieux cultures et qu'elle permet d'obtenir des résultats reproductibles de par sa stabilité d'expression du CD16. En outre, l'anticorps peut être sélectionné après avoir été purifié et/ou modifié ex vivo par modification de la structure glycannique du fragment Fc. La sélection peut se faire sur des anticorps produits par des cellules couramment utilisées pour la production d'anticorps thérapeutiques, telles que les lignées de myélomes de rat, en particulier YB2/0 et ses dérivés, les cellules lymphoblastoïdes humaines, les cellules d'insectes et les cellules de myélomes murines. La sélection peut également être appliquée à l'évaluation d'anticorps produits par des plantes transgéniques ou de mammifères transgéniques. A cet effet, la production dans CHO sert de référence (CHO étant employée pour la production d'anticorps médicament) pour comparer et sélectionner les systèmes de production conduisant aux anticorps selon l'invention. Une autre alternative consiste à effectuer la comparaison avec les anticorps disponibles dans le commerce, en particulier les anticorps en cours de développement, les anticorps ayant obtenus une AMM ou encore des anticorps dont les essais cliniques ont été arrêtés et qui se sont révélés peu efficaces et/ou produisant des effets secondaires indésirables aux doses administrées. En effet, comme indiqué précédemment, les anticorps modifiés de l'invention sont jusqu'à 100 fois plus efficaces pour activer l'ADCC des cellules effectrices du système immunitaires, ce qui implique des doses d'administration inférieures à celles pratiquées par les anticorps mentionnés précédemment. L'anticorps de l'invention peut être produit dans des lignées cellulaires du type myélome de rat, notamment YB 2/0. Il peut être dirigé contre un antigène normal non ubiquitaire (exemple, l'anticorps est de spécificité anti- Rhésus du globule rouge humain), ou un antigène d'une cellule pathologique ou d'un organisme pathogène pour l'homme, en particulier contre un antigène d'une cellule cancéreuse. Par Dans un aspect préféré, l'anticorps est un anti-HLA-DR. Cet anticorps présente un taux ADCC supérieure à 100 % à une concentration de 10 ng/ml et un taux de production d'IL-2 par une cellule effectrice du système immunitaire exprimant le récepteur CD16 supérieur jusqu'à 1000 % à une concentration de 10 ng/ml comparé au même anticorps exprimé dans la lignée CHO, lignée d'expression du Remitogen#. L'anti-HLA-DR de l'invention peut être produit dans une lignée de myélome de rat, notamment YB2/0. Dans un autre aspect préféré, l'anticorps de l'invention est un anti-CD20. Cet anticorps présente un taux ADCC supérieure à 100 % à une concentration de 10 ng/ml et un taux de production d'IL-2 par la cellule Jurkat CD16 supérieur jusqu'à 1000 % à une concentration del Ong/ml comparé au Rituxan@. L'anti-CD20 de l'invention peut être produit dans une lignée de myélome de rat, notamment YB2/0. D'autres anticorps peuvent être sélectionnés parmi les anti Ep-CAM, anti HER2, anti CD52, anti HER1, anti GD3, anti CA125, anti GD, anti GD2, anti CD-23 et anti ProteinC ; anti-KIR3DL2, anti-CD38, anti-CD30, anti-CD33, anti-CD44, des anti- idiotypes spécifiques d'inhibiteurs par exemple de facteurs de coagulation, les antiviral : HBV, HCV et RSV. Dans un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un anticorps décrit ci-dessus pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des cancers et des infections par des agents pathogènes. Plus particulièrement, l'invention vise l'utilisation d'un anticorps Anti-HLA-DR ou anti-CD20 décrit plus haut pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des cancers des cellules MHCII positives, notamment les lymphomes de cellules B, les leucémies aiguës de cellules B, le lymphome de Burkitt, le lymphome de Hodgkin, les leucémies myéloïdes, les lymphomes et leucémies de cellules T, les lymphomes non hodgkinien et les leucémies myéloïdes chroniques. Dans un aspect préféré de l'invention, l'anticorps peut dans un premier temps être sélectionné pour son affinité au récepteur CD 16 puis testé et sélectionné tel que décrit ci-dessus pour ses propriétés à induire la production d'une cytokine, notamment l'IL-2, par les cellules Jurkat CD16 ou d'IFNy par les cellules effectrices exprimant le CD 16. De tels anticorps possédant cette double propriété d'induire l'ADCC via le CD 16 et d'induire la production de l'IL-2 conduise à une stimulation très importante de l'activité cytotoxique des cellules effectrices. Par exemple, cet anticorps peut être un anticorps listé ci-dessous produit dans toute lignée cellulaire et sélectionnée par les tests mentionnés ci-dessus. Il s'agit d'anticorps de seconde génération plus efficace que leur homologue disponible actuellement (voir tableau 1 ci-après). Tableau 1 Nom et marque Société cible indication commerciale de l'anticorps Edrecolomab Centocor anti Ep-CAM colorectal cancer PANOREX Rituximab Idec anti CD20 B cell lymphoma RITUXAN Licensié à thrombocytopenia purpura Genentech/ Hoffman la roche Trastuzumab Genentech anti HER2 ovarian cancer HERCEPTIN Licensié à Hoffman la roche/Immunogen Palivizumab Medimmune RSV SYNAGIS Licensié à Abott Alemtuzumab BTG anti CD52 leukemia CAMPATH Licensié à Schering ibritumomab IDEC anti CD20 NHL tiuxetan Licensié à Schering ZEVALIN Cetuximab Merck /BMS / anti HER1 cancers IMC-C225 Imclone Bevacizumab Genentech/ anti VEGF cancers AVASTIN Hoffman la roche Epratuzumab Immumedics/ anti CD22 cancers: Amgen non hogkin lymphoma Hu M195Mab Protein Design ND cancers Labs MDX-210 Immuno-Designed ND cancers Molécules BEC2 Imclone anti GD3 cancers Mitumomab Oregovomab Altarex anti CA125 Ovarian cancer OVAREX Ecromeximab Kyowa-Hakko anti GD malignant melanoma KW-2971 ABX-EGF Abgenix EGF cancers MDX010 Medarex ND Cancers XTL 002 XTL ND anti-viral : HCV biopharmaceuticals H11 SCFV viventia biotech ND cancers 4B5 viventia biotech anti GD2 Cancers XTL 001 XTL ND anti-viral : HBV biopharmaceuticals MDX-070 MEDAREX Anti-PSMA Prostate cancer TNX-901 TANOX anti CD-23 IDEC-114 IDEC inhibition non-Hodgkin lymphoma ProteinC L'invention porte également sur l'utilisation d'un anticorps décrit ci-dessus pour la fabrication d'un médicament destiné à induire l'expression de TNF, IFNy, IP10 et IL-6 par les cellules effectrices naturelles du système immunitaire, ledit médicament étant utile notamment pour le traitement du cancer et des infections. Exemple 1 : Anti-HLA-DR 1. 1 TEST ADCC CD16 L'anticorps anti-HLA DR chimérique a été exprimé dans la cellule YB2/0 et dans CHO. Les anticorps chimériques anti-HLA-DR sont capables d'induire une activité cytotoxique de la cellule RAJI, exprimant à sa surface des antigènes HLA-DR. Pour ce faire, la même séquence codant pour une IgGl spécifique de l'antigène HLA-DR est transfectée dans CHO et YB2/0. Les anticorps sont incubés avec les cellules RAJI (cibles) et les cellules Natural Killer (NK) humaines. L'activité cytotoxique des anticorps sur la cellule Raji (ADCC) a été évaluée après 16h d'incubation (voir figure 1). Les deux anticorps anti-HLA-DR exprimés par YB2/0 (carré) ou CHO (triangle) induisent une lyse de la cellule Raji par ADCC. L'anticorps exprimé dans YB2/0 s'avère plus cytotoxique que CHO surtout dans des conditions de faibles quantités d'effecteurs. 1. 2 TEST IL-2 La même séquence codant pour une IgGl spécifique de l'antigène HLA-DR est transfectée dans CHO et YB2/0. Les anticorps sont incubées avec les cellules RAJI (cible) et les cellules Jurkat CD16 (effecteurs) portant l'acide aminé phénylalanine (F) en position 158. La quantité de cytokines (IL2) sécrétée par Jurkat CD16 est mesurée par ELISA (voir figure 2). Les anticorps anti-HLA DR induisent une forte sécrétion d'IL2 (cytokine). Comparativement, la sécrétion et donc le degré d'activation est supérieur lorsque l'anticorps est exprimé dans YB2/0 (carré) par rapport à CHO (triangle) à toutes les concentrations étudiées. REVENDICATIONS 1. Anticorps monoclonal chimérique ou humain produit dans une lignée cellulaire sélectionnée pour ses propriétés de glycosylation du fragment Fc d'un anticorps, ou dont la structure glycannique a été modifiée ex vivo, ledit anticorps étant caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes: - test et sélection des anticorps présentant un taux ADCC de type FcyRIII (CD16) supérieur à 100% à une concentration de l Ong/ml comparé au même anticorps produit dans une lignée CHO; - test et sélection desdits anticorps présentant une capacité à induire un taux de production d'au moins une cytokine par la cellule Jurkat CD 16 ou une cellule effectrice du système immunitaire exprimant le récepteur CD16 supérieur à 60 %, 100 % ou de préférence supérieur à 200 % à une concentration de lOng/ml comparé au même anticorps produit dans une lignée CHO. 2. Anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cytokines libérées sont des interleukines. 3. Anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cytokines libérées sont des interférons. 4. Anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cytokines libérées sont des facteurs de nécrose tissulaire (TNF). 5. Anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'anticorps sélectionné a la capacité d'induire la sécrétion d'au moins une cytokine choisie parmi IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, TNFa , TGFss, IP10 et IFN[gamma] par les cellules effectrices exprimant le récepteur CD 16. 6. Anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce que la cellule effectrice est une cellule Jurkat exprimant le récepteur CD16 ou une cellule leucocytaire, en particulier de la famille des NK (natural killer) ou des cellules du groupe monocytesmacrophages. 7. Anticorps produit dans une lignée cellulaire du type myélome de rat, notamment YB 2/0, ledit anticorps étant caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes: - test et sélection des anticorps présentant un taux ADCC de type FcyRIII (CD16) supérieur à 100% à une concentration de lOng/ml comparé au même anticorps produit dans une lignée CHO; - test et sélection desdits anticorps présentant une capacité à induire un taux de production d'au moins une cytokine par la cellule Jurkat CD 16 ou une cellule effectrice du système immunitaire exprimant le récepteur CD 16 supérieur à 60 %, 100 % ou de préférence supérieur à 200 % à une concentration de lOng/ml comparé au même anticorps produit dans une lignée CHO. 8. Anticorps selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est dirigé contre un antigène d'une cellule pathologique ou d'un organisme pathogène pour l'homme, en particulier contre un antigène d'une cellule cancéreuse. 9. Anticorps selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est de spécificité antiRhésus du globule rouge humain. 10. Anticorps selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est un anti-HLA-DR. 11. Anticorps anti-HLA-DR selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il présente un taux ADCC supérieure à 100 % à une concentration de 10 ng/ml et un taux de production d'IL-2 par une cellule effectrice du système immunitaire exprimant le récepteur CD 16 supérieur jusqu'à 1000 % à une concentration de 10 ng/ml comparé au même anticorps exprimé dans la lignée CHO, lignée d'expression du Remitogen@. 12. Anticorps selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est un anti-CD20. 13. Anticorps anti-CD20 selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il présente un taux ADCC supérieure à 100 % à une concentration de 10 ng/ml et un taux de production d'IL-2 par une cellule effectrice du système immunitaire exprimant le récepteur CD 16 supérieur jusqu'à 1000 % à une concentration de 10 ng/ml comparé au Rituxan#. 14. Anticorps selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi les anti Ep-CAM, anti HER2, anti CD52, anti HER1, anti GD3, anti CA125, anti GD, anti GD2, anti CD-23 et anti ProteinC ; anti-viral : HCV et RSV, anti-KIR3DL2, anti-CD38, anti-CD30, anti-CD33, anti-CD44, des anti-idiotypes spécifiques d'inhibiteurs par exemple de facteurs de coagulation. 15. Utilisation d'un anticorps selon l'une des revendications 1 à 14 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des cancers et des infections par des agents pathogènes. 16. Utilisation d'un anticorps selon l'une des revendications 1 à 14 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des cancers des cellules MHC de classe II positives, notamment les lymphomes de cellules B, les leucémies aiguës de cellules B, le lymphome de Burkitt, le lymphome de Hodgkin, les leucémies myéloïdes, les lymphomes et leucémies de cellules T, les lymphomes non hodgkinien et les leucémies myéloïdes chroniques. 17. Utilisation d'un anticorps selon l'une des revendications 1 à 14 pour la fabrication d'un médicament destiné à renforcer l'activité cytotoxique par ADCC, ledit médicament étant utile pour le traitement du cancer et des infections. 18. Utilisation d'un anticorps selon l'une des revendications 1 à 14 pour la fabrication d'un médicament destiné à induire l'expression de TNF, IFN[gamma], IP10 et IL-6 par les cellules effectrices naturelles du système immunitaire, ledit médicament étant utile pour le traitement du cancer et des infections.