Brevet FR2841985A1 — publié le 20040109

DETECTION D'UNE RECONNAISSANCE MOLECULAIRE PAR ELECTROCHIMILUMINESCENCE SUR POLYMERE CONDUCTEUR DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à un procédé de détection d'une reconnaissance moléculaire par électrochimiluminescence sur un polymère conducteur à conduction électronique. Elle permet de manière générale la détection quantitative et qualitative d'une reconnaissance moléculaire entre une première molécule fixée sur un support et une deuxième molécule recherchée dans un échantillon. Elle concerne le domaine au sens large des capteurs et biopuces, en particulier ceux ou celles comprenant au moins un film polymère conducteur électronique tel que le polypyrrole et leurs dérivés. Cette invention est relative à la détection par chimiluminescence électrogénérée ou électrochimiluminescence (ECL) via un relais présentant des propriétés d'oxydo-réduction, appelé dans la présente relais rédox . Selon l'invention, la reconnaissance moléculaire peut être définie comme une interaction spécifique entre deux molécules plus ou moins complexes, conduisant à une liaison ou assemblage des deux molécules suffisamment stable pour que les molécules puissent être détectées lorsqu'elles sont liées. Il peut s'agir par exemple d'une hybridation d'acides nucléiques (ADN et/ou ARN), d'une réaction de reconnaissance de type antigène/anticorps, d'une interaction de type protéine/protéine, d'une interaction sucre/protéine, d'une interaction de type enzyme/substrat, d'une interaction de type ADN double brin/protéine, etc. Le procédé de la présente invention trouve par exemple une application dans la détection dans le domaine des"Biopuces"au sens large c'est-à-dire des puces à acides nucléiques et des puces à protéines ou tous systèmes y compris multiparamétriques pour l'étude de la reconnaissance sonde-cible de substrats biologiques. Il s'agit par exemple de la détection d'hybridation d'acides nucléiques sur support solide, en milieu aqueux ou à l'air, par exemple dans le cadre d'un criblage ("screening") ou d'une détection d'hybridation sur une biopuce. Le procédé de la présente invention peut être appliqué à toutes finalités de marquage sur des surfaces de polymères conducteurs à conduction électronique par un système électrochimiluminescent. Dans la présente description, les références entre crochets [] renvoient à la liste de référence annexée. Etat de la technique Les biocapteurs miniaturisés ou biopuces sont actuellement l'objet d'enjeux économiques majeurs. Cet attrait s'explique par leur capacité de pouvoir réaliser des milliers d'analyses en parallèle ainsi que par leur vaste champ d'application touchant à la fois le domaine du diagnostic médical, du contrôle environnemental et agro-alimentaire, ainsi que celui de la pharmacologie. Ces systèmes sont constitués de molécules sondes, généralement de molécules biologiques telles que des fragments d'ADN, ou plus généralement des fragments d'oligonucléotides (ou ODN), immobilisées sur de très petites surfaces. Ces sondes, de par leur capacité de reconnaître spécifiquement des entités biologiques données, appelées molécules cibles, comme des brins d'ADN ou d'ODN complémentaires, confèrent au biocapteur une sélectivité de reconnaissance. La sensibilité de ces biocapteurs dépend en partie de la technique mise en oeuvre pour révéler le phénomène de reconnaissance molécules sondes/molécules cibles. De nombreux outils ont été développés pour détecter ces reconnaissances moléculaires. Certaines techniques utilisent des marqueurs fluorescents qui offrent une grande sensibilité de détection. Cependant, ces techniques nécessitent une excitation laser des fluorophores greffés sur les biomolécules cibles qui peut s'accompagner également par une fluorescence résiduelle parasite provenant de l'illumination du support et des biomolécules. D'autres techniques utilisent des marqueurs électrochimiluminescents tels que le luminol et ses dérivés ou les composés organométalliques tel que le complexe Ru(2,2'-bipyridine) , Ru (bpy) " [1] et [2]. Malheureusement dans le cas du luminol et de ses dérivés, l'êlectrochimiluminescence (ECL) conduit à une destruction irréversible de la molécule de luminol ou de ses dérivés. L'émission de lumière correspond alors à un flash, son intensité diminuant rapidement dans le temps. Pour les marqueurs type Ru (bpy) , l'émission de luminescence ne s'accompagne pas de la destruction du luminophore, le complexe Ru(bpy)32+ étant régénéré, mais sont utilisation ne peut malheureusement pas se faire sur tout type de support. L'électrochimiluminescence du Ru(bpy)32+ est induite par la désactivation du complexe à l'état excité Ru(bpy) 3 *. Ce complexe peut-être formé suivant une première voie par la réaction d'annihilation, réaction (3) ci- dessous, entre le Ru (bpy) 33+ et le Ru (bpy) 32+ ; chacune de ces deux espèces étant électrogénérée à partir du complexe Ru(bpy)32+, respectivement par oxydation, décrite par la réaction (1) ci-dessous, et réduction, décrite par la réaction (2) ci-dessous, de ce dernier en appliquant alternativement, à une fréquence de l'ordre de 0,2 Hz, un potentiel de +1,3 V et-1,3 V (vs Ag/AgCl). Cette réaction d'annihilation (3) conduit à la formation du complexe à l'état excité Ru(bpy)32+* qui lors de sa désactivation, réaction (4), émet sous forme de flash une lumière centrée à 610 nm en redonnant le complexe initial Ru(bpy)32+. Cette première voie ne concerne pas le procédé de la présente invention. Il est également possible, suivant une deuxième voie, à partir du complexe Ru(bpy)32+ d'observer une émission permanente à 610 nm par électrochimiluminescence en appliquant un potentiel constant de +1,3 V (vs Ag/AgCl). Dans ce cas, la présence d'un co-substrat, appelé aussi substrat sacrificiel, est alors requise. Ce composé qui peut- être une amine aliphatique type tripropylamine (Pr3N), comme le décrit le document [1], génère un agent réducteur PrsN-CH'-CHs-CHs, comme le décrit la réaction (6) ci-dessous, qui peut soit réagir avec le complexe Ru(bpy)33+ pour former l'état excité Ru(bpy) *, selon la réaction (7) ci-dessous, ou réduire l'espèce Ru(bpy)3 en Ru(bpy)3+, selon la réaction (8) cidessous, pour conduire au Ru(bpy)zo selon la réaction (3) ci-dessus. Comme précédemment, le complexe Ru(bpy)3 n'est pas épuisé mais régénéré lors de l'électrochimiluminescence par contre le co-substrat est irréversiblement consommé. C'est pourquoi par rapport au luminol ou ses dérivés les composés Ru(bpy) sont des candidats plus attractifs en tant que marqueurs pour une détection par électrochimuluminescence. Malheureusement, les potentiels de lecture du signal émis pour les marqueurs électrochimiluminescents tels que les complexes de ruthénium sont trop élevés pour pouvoir être utilisés sur des films de polymères conducteurs tels que ceux utilisés pour la fabrication de la pluspart des capteurs et biopuces, par exemple tels que le polypyrrole dans les systèmes MICAM (marque déposée). En effet, ces potentiels conduisent à une suroxydation du film de polymère conducteur qui perd alors ses propriétés de conductivité électronique rendant le transfert électronique support/sonde insuffisant pour permettre une détection par ECL. Foster et coll. [3] ont élaboré un capteur à base 21 de Ru (bpy) 32+ pour la détection d'ions oxalate. Dans ce cas, le complexe Ru (bpy) 32+ est immobilisé par un lien covalent dans une matrice poly (4-vinylpyridine). Le principe de la détection des oxalates repose sur la génération électrochimique de Ru(bpy)33+ qui réagit ensuite avec l'analyte CsC'pour conduire au complexe à l'état excité Ru(bpy)32+*. Ce dernier émet ensuite à 610 nm lors de sa désactivation suivant la réaction (4) ci-dessus. R. Blanchard et coll. [4] ont également développé un capteur pour la détection d'ions oxalates en piégeant électrostatiquement un dérivé du complexe Ru(bpy) 32+ dans une matrice polymère conducteur électronique. Le complexe de ruthénium sous sa forme sulfonique RuBPS (acide tris (4, 7-diphenyl-1, 10phénantrolinedisulfonique) ruthénium II) est inséré en tant que contre-ion dopant dans la matrice polymère (polyMPP) lors de son électrosynthèse via l'oxydation électrochimique de monomères 1-méthyl-3- (pyrrol-1- ylmethyl) pyridinium chlorure (MPP). En imposant à ce film RuBPS/polyMPP en présence d'ions oxalate, un potentiel de 1,250 V vs Ag/AgCl, une réponse lumineuse par électrochimiluminescence est alors détectée. Cependant ces auteurs notent une faible stabilité dans le temps du film RuBPS/PMPP résultant d'une solubilisation de ce polymère. En outre ils soulignent également la possibilité d'émission d'électrochimiluminescence du RuBPS à l'interface de l'électrode conséquence de son exclusion par diffusion de la matrice PMPP. Dans cet exemple, la sonde d'électrochimiluminescence est piégée électrostatiquement à la surface de l'électrode. Cette méthode d'immobilisation pose donc un problème en terme de stabilité puisque les complexes de ruthénium peuvent être exclus de la matrice polymère par simple diffusion. De plus, comme le montrent des études réalisées à partir de polypyrroles solubles fonctionnalisés par des complexes polypyridyle de ruthénium II [5], on peut envisager dans le cas de l'insertion des complexes Ru(bpy) 3 dans une matrice polymère type polypyrrole, un effet de quenching de l'état excité Ru(bpy)32+* induit par son confinement dans la matrice polymère. On peut donc penser que 21 l'immobilisation du complexe Ru (bpy) 32+ par un lien électrostatique ou covalent dans un polymère est peu favorable à son emploi comme marqueur en vue d'une détection par électrochimiluminescence. Xu et coll. [6-7] ont adopté une autre démarche où cette fois-ci la molécule cible est marquée par la sonde d'électrochimiluminescence. Cette dernière n'est donc plus insérée à l'électrode via une matrice polymère comme précédemment. Ces auteurs, pour contourner le problème précité de suroxydation du film de polymère conducteur, ont appliqué cette détection par électrochimiluminescence à un biocapteur à ADN constitué de simples brins d'ADN immobilisés sur une électrode recouverte par un film d'alcanebisphosphonate d'aluminium. Le phénomène d'hybridation entre ces fragments d'ADN immobilisés et des brins complémentaires en solution a été mis en évidence via électrochimiluminescence de complexes Ru(bpy)32+ soit insérés comme intercalant ou greffés préalablement sur les brins complémentaires. Il existe donc un réel besoin d'une méthode alternative de détection d'une reconnaissance moléculaire par électrochimiluminescence, qui puisse facilement être mise en oeuvre, même sur des capteurs et biopuces telles que les systèmes MICAM (marque déposée), et qui ne présente pas les inconvénients des techniques de l'art antérieur, et notamment, qui ne s'accompagne pas d'une destruction irréversible du marqueur électrochimiluminescent et surtout du film de polymère conducteur. EXPOSÉ DE L'INVENTION La présente invention a précisément pour but de fournir une telle méthode alternative et de résoudre les problèmes précités de l'art antérieur en fournissant un procédé de détection d'une reconnaissance moléculaire entre une molécule sonde fixée sur un support et une molécule cible recherchée dans un échantillon à tester, ledit procédé permettant en outre une détection qualitative et quantitative précise et sensible de la molécule cible lorsqu'elle est présente dans un échantillon. Ledit procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes : a) mettre en présence un support test comprenant une surface comportant un film polymère conducteur électronique sur lequel est fixée une molécule sonde, b) marquer avant ou après l'étape c) la molécule cible avec un marqueur électrochimiluminescent, c) mettre en contact la molécule cible avec le support test dans des conditions physiques et chimiques permettant la reconnaissance moléculaire et l'assemblage spécifique entre la molécule sonde et la molécule cible, d) rincer le support test de manière à supprimer l'excès de marqueur électrochimiluminescent tout en préservant l'assemblage spécifique entre la molécule sonde et la molécule cible de l'étape c), et e) soumettre le support test rincé obtenu à l'étape d) à une lecture du signal d'électrochimiluminescence déclenchée par un transfert électronique entre le marqueur de la cible et le support en présence d'un relais rédox. La détection d'une chimiluminescence à l'étape e) révèle un assemblage par reconnaissance moléculaire au sens précité entre la molécule sonde fixée sur le support et la molécule cible recherchée, et donc la présence de la molécule cible dans l'échantillon testé. Dans le procédé de la présente invention, la détection de la reconnaissance entre la molécule sonde et la molécule cible marquée est basée sur la chimiluminescence électrogénérée, ou électrochimiluminescence (ECL). Il s'agit d'une détection optique permettant de s'affranchir des inconvénients des procédés de l'art antérieur tout en conservant la sensibilité des détecteurs optiques. En effet, le déclenchement électrique de la chimiluminescence ne concerne que le marqueur chimiluminescent et non pas le support test ou les biomolécules. En outre, ce nouveau mode de détection appliqué aux biopuces permet d'effectuer des mesures quantitatives de la reconnaissance molécules sondes/molécules cibles contrairement à la détection par fluorescence. De plus, l'excitation par une impulsion électrique conforme à la présente invention permet un contrôle spatial et une mise en oeuvre rapide et aisée tout en s'affranchissant d'un appareillage coûteux d'excitation laser utilisé dans l'art antérieur. La présente invention trouve donc notamment une application dans le domaine des biopuces, où le support sur lequel est déposé le film conducteur conformément à la présente invention forme la biopuce. Selon l'invention, le support peut être un quelconque des supports utilisés par l'homme du métier pour la fabrication de biopuces. A titre d'exemples non limitatifs, peuvent être utilisés un support en métal tel que Au, Pt, etc. ; un support constitué d'un matériau semi-conducteur ; un support verre/ITO ; un support en verre ou quartz métallisé ; un support plastique/ITO ; un support en plastique métallisé ; un support en carbone vitreux ; ou un support formé par dépôt d'un matériau conducteur sérigraphié sur un substrat isolant ou sur un des supports précités. Selon la présente invention, le film polymère conducteur électronique peut être un film de polymère conducteur tel que ceux utilisés par l'homme du métier pour la fabrication de biopuces sur lesquelles sont greffées des sondes. Par exemple le polymère peut être un polymère conducteur tel que ceux décrits dans les Techniques de l'Ingénieur -A3140-sous la dénomination polymères conducteurs intrinsèques : il s'agit de polymères formés de molécules porteuses de liaisons conjuguées (oligomères ou réseaux réticulés) et éventuellement dopés par des dopants donneurs ou accepteurs d'électrons tels que les poly(acétylène), le poly(nitrure de soufre), le polyphénylène, le polypyrrole, le poly(sulfure de phénylène), le polythiophène, le polyaniline etc. A titre d'exemple non limitatif, il peut s'agir d'un film de polypyrrole ; de poly(3,4-éthylènedioxythiophène) (PEDOT) ou de leur dérivés. Selon la présente invention, le film polymère conducteur peut être déposé sur le support en utilisant les techniques classiques connues de l'homme du métier, par exemple l'électrodéposition ou l'électropolymêrisation ou le dépôt par centrifugation ("spin coating") ou encore le jet d'encre. Selon l'invention, le film polymère conducteur peut être élaboré à partir de simples monomères de type pyrrole ou d'oligomères pré-synthétisés comme des oligothiophènes, ainsi qu'à partir de systèmes moléculaires plus complexes comme des unités complexantes de métaux de transition tels que les phénantrolines, la phénylpyridine, etc., portant des unités électropolymérisables ce qui conduit lors de l'élaboration du polymère à un réseau conjugué. Selon l'invention, la molécule sonde peut être par exemple de l'ADN simple ou double brin, un oligonucléotide, un anticorps, une protéine, un sucre ou un enzyme, ainsi que toute molécule ou biomolécule permettant une reconnaissance spécifique et un assemblage tels que définis ci-dessus. Selon l'invention, la fixation de la molécule sonde sur le film polymère conducteur peut se faire par les méthodes classiques de chimie utilisées pour fixer des sondes sur une biopuce. La liaison entre le film et la sonde peut être d'adsorption, électrostatique, chimique obtenue par auto-assemblage, silanisation, ou par toute méthode chimique, électrochimique, photochimique, etc. connue de l'homme du métier pour le dépôt de la molécule sonde par exemple fonctionnalisée par un groupement apportant la propriété d'autoassemblage, d'ancrage, de couplage, ou polymérisable chimiquement, électrochimiquement, photochimiquement ou électrophotochimiquement par photosensibilisation. Selon l'invention, liaison entre le film polymère conducteur électronique déposé sur le support et la sonde peut être obtenue en une étape par exemple par le procédé MICAM (marque déposée). Les documents FR-A-2 787 581, FR-A-2 787 582 et US 5 810 989 décrivent par exemple des techniques de dépôt de film et de fixation de molécules sondes utilisables dans la présente invention. Il s'agit par exemple d'électro-copolymérisation sur un support, par exemple sur un substrat de silice, de monomères précurseurs du polymère conducteur, tel que le pyrrole, avec des monomères, par exemple de pyrrole, fonctionnalisés par une molécule sonde selon la présente invention, par exemple des oligonucléotides. Dans ces techniques, on exploite l'adhésion du film conducteur de polypyrrole sur le substrat de façon à y réaliser la fixation des molécules sondes de reconnaissance. Selon l'invention, la sonde peut aussi être fixée sur le film après son dépôt sur le support par exemple par post-fonctionnalisation du film, par exemple de polypyrrole (Ppy), déposé par exemple par électrogreffage sur le support, par un système de reconnaissance par affinité, par exemple un système avidine/biotine ou des systèmes équivalents, ou des dérivés de ces systèmes. Ceci conduit par exemple aux structures support (S)-film conducteur-molécule sonde suivantes : S-PPy-ADN ; S-PPy-biotine/avidine/biotineADN ; S-PPy-biotine/avidine-protéine ; S-PPybiotine/avidine/biotine-anticorps, utilisables selon la présente invention. Ces structures sont par exemple utilisables sur un support (S) d'or (Au) ou de silice, ou sur tout support précité permettant le greffage du polymère conducteur. Cette fixation peut se faire par exemple avec adressage des sondes. Il s'agit par exemple d'un adressage photochimique, d'un adressage mécanique, par exemple par micropipetage à l'aide d'un robot disperseur, ou d'un adressage électrochimique. Ces techniques de fixation de sondes sur un film polymère sont connues de l'homme du métier. L'adressage présente l'avantage qu'il permet ensuite des analyses multiparamétriques. L'ancrage de la molécule sonde peut se faire par simple couplage entre deux fonctions chimiques réactives, par exemple type ester activé et une amine, l'une de ces fonctions étant portée par la molécule sonde et l'autre ancrée sur le film. Le couplage chimique sonde/film peut être empêché en bloquant la réactivité de la fonction chimique portée par le film. L'empêchement peut être levé, débloqué , en rendant à nouveau la fonction réactive, ceci grâce par exemple à une activation électrochimique ou photochimique. A l'issue, le couplage de la molécule sonde sur le film est à nouveau possible. Selon l'invention, le marquage de la cible par le marqueur électrochimiluminescent peut être antérieur ou postérieur à l'étape c) de mise en contact de la molécule cible avec le support test. En d'autres termes, le marquage de la molécule cible peut être effectué soit sur l'échantillon à tester avant sa mise en contact avec le support test, c'est à dire avant que l'assemblage molécule sonde/molécule cible se fasse, soit sur le support test après l'étape c) de mise en contact de la molécule cible avec le support test, c'est à dire, lorsque l'assemblage molécule sonde/molécule cible s'est fait. L'homme du métier saura adapter le procédé de la présente invention par exemple suivant le type de molécules sonde/cible mises en jeu. Selon l'invention, le marqueur peut être un des marqueurs électrochimiluminescents connus de l'homme du métier. Il peut s'agir au sens large d'un marqueur ayant des propriétés d'électrochimiluminescence dont le potentiel de déclenchement de l'ECL en présence du cosubstrat, se situe dans un domaine de potentiel où le film polymère conducteur présente un effet de suroxydation. Cette suroxydation se manifeste par une dégradation notable des propriétés de conductivités électroniques du film polymère conducteur. Avantageusement, le marqueur électrochimiluminescent peut être un complexe organométallique. Il peut être choisi par exemple dans le groupe comprenant les complexes d'osmium et de ruthénium avec des ligands identiques ou différents de bi ou terpyridine et/ou de phénantroline et leurs dérivés ; un cryptate d'europium ou des esters d'acridinium. Dans ce cas, le marquage de la cible peut se faire par liaison entre la cible et le complexe métallique. Elle peut être directe par couplage chimique, comme par exemple entre le complexe métallique portant une fonction ester activé et la molécule cible possédant une fonction terminale amine NH2, ou par le biais d'un couplage par affinité de type biotine/avidine, par exemple ADNcible-biotine/avidine- métal. Des protocoles de marquage de la cible utilisables dans la présente invention sont décrits par exemple dans les documents [1] et [2]. Dans le procédé de la présente invention, le relais rédox a pour but, dans l'étape e), de pouvoir déclencher l'électrochimiluminescence du marqueur à un potentiel inférieur à celui appliqué en l'absence de relais rédox par transfert des électrons du marqueur vers le film polymère déposé sur le support. Il agit comme un relais rédox entre le marqueur et le film, et abaisse le potentiel de lecture de l'électrochimiluminescence. Ainsi, le potentiel de lecture de l'électrochimiluminescence étant inférieur à celui qui devrait être utilisé pour le marquer seul, le film polymère conduceur est préservé de la suroxydation et donc de la dégradation notable de ses propriétés de conductivités électroniques. Ce relais rédox peut être en solution, ou immobilisé, par exemple par greffage, sur le support avec le film ou avec l'assemblage résultant de la reconnaissance moléculaire entre la sonde et la cible, par exemple sous la forme d'intercalant possédant des propriétés redox ou comportant des groupements redox. L'homme du métier saura adapter le procédé de la présente invention en fonction des molécules cibles et sondes en jeu. A titre d'exemples non limitatifs, il peut être choisi parmi : un groupement métallocène, par exemple un ferrocène ou un diferrocène ; des complexes de métaux de transition tel qu'un complexe de cobalt, ou d'autres métaux de transition ; un groupement de la famille de la phénothiazine, du méthylviologène et de leurs dérivés respectifs ; ou des intercalants de l'ADN possédant des propriétés rédox ou comportant des groupements rédox des amines aromatiques ou hétérocycles, etc. Dans certains cas, par exemple pour les complexes du ruthénium, la lecture du signal d'électrochimiluminescence déclenchée par un transfert électronique indirect entre le marqueur de la cible et le support via un relais rédox peut devoir être réalisée en présence d'un substrat sacrificiel. Ce composé peut-être par exemple un de ceux décrits dans le document [1], par exemple une amine aliphatique telle que la tripropylamine (Pr3N) qui génère un agent réducteur PrsN-CH'-CHB-CHg, selon la réaction (6) ci- dessus, qui peut soit réagir avec le complexe Ru(bpy) 33+ pour former l'état excité Ru(bpy) 32+*, selon la réaction (7) ci-dessus, ou réduire l'espèce Ru(bpy) en Ru(bpy) 3+, selon la réaction (8) ci-dessus, pour conduire au Ru(bpy)* selon la réaction (3) ci-dessus. Ainsi, le complexe Ru(bpy) 32+ n'est pas épuisé mais régénéré lors de l'électrochimiluminescence par contre le substrat sacrificiel est irréversiblement consommé. La figure 1 est une représentation schématique d'un transfert électronique entre la molécule cible marquée et le support via le relais rédox et le film conducteur électronique lors d'une lecture d'électrochimiluminescence conformément au procédé de la présente invention. Sur cette figure, su représente le support, f le film conducteur électronique, li la liaison film conducteur électronique/molécule sonde, S la molécule sonde, C la molécule cible, m le marqueur, t la liaison entre la molécule cible et le marqueur, le transfert d'électrons, le relais (M) e' rédox (ox = oxydant ; réd = réducteur) permettant le transfert électronique, et hv l'électroluminescence. La présence d'une éventuelle molécule sacrificielle n'est pas représentée. L'étape finale de lecture d'électrochimiluminescence peut être réalisée au moyen d'un luminomètre qui mesure l'intensité de luminescence émise, par exemple à 610 nm pour les complexes du ruthénium. L'intensité de luminescence émise est proportionnelle à la concentration de molécules cibles assemblées aux molécules sondes. Dans le procédé de la présente invention, la détection directe, c'est à dire sans relais rédox, est impossible ou très difficile. En effet, comme illustré dans la partie art antérieur ci-dessus, le potentiel de déclenchement de l'ECL sans relais rédox est incompatible avec les propriétés de conduction électronique du film de polymère tel que le pyrrole car situé dans un domaine de potentiel où le pyrrole est dans un état de suroxydation avancée et donc joue le rôle d'une couche quasi-passivante rendant le transfert électronique direct support/sonde insuffisant pour permettre la détection de l'ECL. Le potentiel de lecture de l'ECL dans le procédé de la présente invention est abaissé, ce qui préserve le film de polymère de sa suroxydation, et permet la lecture de l'ECL. Dans le procédé de la présente invention, le transfert électronique du support vers le marqueur électrochimiluminescent en présence du relais rédox peut donc s'effectuer au travers d'un film polymère conducteur électronique ce qui n'est pas le cas dans les systèmes développés par Xu et coll. [6-7]. En effet pour ces systèmes de l'art antérieur, l'ancrage du groupement électrochimiluminescent sur le support est réalisé par l'intermédiaire respectivement d'alcane bisphosphonate d'aluminium et d'aminohexane, couches qui sont non-conductrices. Dans la présente invention, l'immobilisation du marqueur électrochimiluminescent est réalisée spécifiquement sur l'analyte cible contrairement aux procédés où le complexe est immobilisé dans une matrice polymère sur l'électrode [3,4]. L'emploi d'un relais rédox selon la présente invention favorise et rend possible le transfert électronique support/film conducteur électronique/marqueur et donc les performances de ce mode de détection par électrochimiluminescence. De plus, dans le procédé de la présente invention, le support peut présenter une double fonction active permettant (i) l'immobilisation électro-contrôlée de l'objet biologique au sein du film conducteur électronique et (ii) l'activation en tant que"déclencheur"du processus d'électrochimiluminescence du marqueur électrochimiluminescent en présence du relais ce qui permet son application à un système multiparamétrique (analyse en parallèle, ou"multi-array") de type biopuce basée sur la technologie développée depuis plusieurs années utilisant un réseau d'électrodes de type MICAM (marque déposée). Chaque plot composant une biopuce de type MICAM reconnaissant de manière spécifique une molécule particulière, par exemple une séquence d'ADN, les différentes molécules, par exemple différentes séquences d'ADN, présentes dans un échantillon donné peuvent être détectées simultanément lors de l'analyse. Pour l'application de la présente invention, il suffit d'appliquer, soit de manière séquentielle, soit en parallèle, à chacun des plots d'une telle biopuce, le potentiel de déclenchement de l'êlectrochimiluminescence du marqueur en présence du relais rédox. Ainsi, par exemple pour de l'ADN, à partir des plots qui présentent une luminescence, il est possible d'identifier les séquences d'ADN présentes dans l'analyte. Le support présente une double fonction active permettant (i) l'immobilisation électrocontrôlée de l'objet biologique sonde, dans cet exemple l'ADN, et (ii) l'activation en tant que déclencheur de l'électrochimiluminescence. La présente invention permet donc pour la première fois la mise en oeuvre d'un procédé d'électrochimiluminescence sur un système analyse en parallèle ("multi-array") dans lequel le support d'immobilisation est aussi celui qui permet le déclenchement de la chimiluminescence. L'application de la présente invention à un système multiparamétrique permet en outre une lecture multiparamétrique et/ou en parallèle que n'offre pas les dispositifs de positionnement successifs de l'art antérieur. De plus, le procédé de la présente invention permet d'effectuer des analyses quantitatives directes tout en éliminant les problèmes de bruit de fond inhérents aux mesures par fluorescence. Enfin, dans la présente invention, l'immobilisation du marqueur est réalisée spécifiquement sur la molécule cible contrairement aux procédés de l'art antérieur faisant intervenir des intercalants électrochimiluminescents dans le cas de biocapteurs à ADN. D'autres caractéristiques et avantages apparaîtront encore à l'homme du métier dans les exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif en référence à la figure annexée. Brève description de la figure La figure 1 est une représentation schématique du mécanisme réactionnel de la présente invention. Exemples Exemple 1 : ÉLECTROCHIMILUMINESCENCE du complexe Ru(bpy)32+ en solution sur une électrode de platine recouverte ou non d'un film de polypyrrole. Les inventeurs entrepris l'étude de l'électrochimiluminescence à partir du complexe trisbipyridine de ruthénium (Ru(bpy) ) en solution. Cette expérience a été réalisée à partir d'une solution 1 mM en Ru(bpy)32+ + 50 mM de tripropylamine (TPA) + LiCl04 0,1 M en milieu mixte CH3CH/H20 (50 : 50 en volume) ou CH3CN pur sur une électrode de platine recouverte ou non d'un film de polypyrrole. Sur l'électrode nue, comme attendu, l'émission lumineuse orange débute à partir d'une tension seuil de 0,8 V dont l'intensité croît jusqu'à 1,0 V pour se stabiliser dans la zone de potentiel exploré jusqu'à 1,2 V. Dans les mêmes conditions, mais en utilisant une électrode de platine recouverte d'un film homogène de polypyrrole d'épaisseur 0,08 um (20 mC/cm2), aucune émission lumineuse est détectée jusqu'à un potentiel de 1,2 V. Exemple 2 : ÉLECTROCHIMILUMINESCENCE du Pu(bpy)32+ en solution en présence de N-méthylphénothiazine ou de Nbutylphénothiazine sulfonate de sodium sur une électrode de platine recouvert par un film de polypyrrole. Comme pour l'exemple 1, l'électrochimiluminescence est étudiée à partir du complexe Ru(bpy) 32+ en solution et d'une électrode de platine recouverte par un film de polypyrrole (20 mC/cm2). Si à la solution précédente (1 mM en Ru(bpy) 3 + 50 mM de tripropylamine (TPA) + LiCl04 0,1 M dans CH3CN/H20), on ajoute 2 mM de Nméthylphénothiazine, il est alors possible d'observer une émission luminescence orange centrée à 610 nm 21 typique d'électrochimiluminescence du Ru (bpy) sur cette électrode recouverte du film de polypyrrole en appliquant seulement qu'un potentiel de 0,65 V. Cette émission est constante tant que cette valeur de potentiel est imposée. Par contre si le potentiel est porté à 1 V, c'est à dire au potentiel où se produit la suroxydation du polypyrrole, cette émission disparaît presque instantanément et irréversiblement. Ainsi la présence d'un relais rédox conformément à la présente invention, par exemple la Nméthylphénothiazine dans cet exemple, permet d'abaisser le potentiel de déclenchement de l'électrochimiluminescence du complexe Ru(bpy)32+ dans un domaine de potentiel où la matrice formant le film polymère de polypyrrole n'est pas suroxydée, c'est à dire dans un domaine où elle conserve ses propriétés de conductivité électronique et. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES [1] Fahnrich K. A., Pravda M. and Guibault G. G.,"Recent applications of electrogenerated chemiluescence in chemical analysis"Talanta 2001, 54(4), 531-559. [2] Lee W. -Y., Mikrochirn. Acta 127 (1997) 19. [3] Forster R. J. and Hogan C. F., Anal. Chem. 72 (2000) 5576. [4] Blanchard R. M., Martin A. F., Nieman T. A., Guerrero D. J. and Ferraris J. 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Procédé de détection d'une reconnaissance moléculaire entre une molécule sonde fixée sur un support et une molécule cible recherchée dans un échantillon à tester, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) mettre en présence un support test comprenant une surface comportant un film polymère conducteur sur lequel est fixée une molécule sonde, b) marquer avant ou après l'étape c) la molécule cible avec un marqueur électrochimiluminescent, c) mettre en contact la molécule cible avec le support test dans des conditions physiques et chimiques permettant la reconnaissance moléculaire et l'assemblage spécifique entre la molécule sonde et la molécule cible, d) rincer le support test de manière à supprimer l'excès de marqueur électrochimiluminescent tout en préservant l'assemblage spécifique entre la molécule sonde et la molécule cible de l'étape c), et e) soumettre le support test rincé obtenu à l'étape d) à une lecture du signal d'électrochimiluminescence déclenchée par transfert électronique indirect entre le marqueur de la cible et le support via un relais rédox. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le film polymère conducteur est un film de polypyrrole, de poly(3,4-éthylènedioxythiophène) ou de leur dérivés. 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la molécule sonde est choisie parmi de l'ADN simple ou double brin, un anticorps, une protéine ou un enzyme. 4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le marqueur électrochimiluminescent est un complexe organométallique dont le potentiel de déclenchement de l'électrochimiluminescence se situe dans un domaine de potentiel où le film polymère conducteur électronique présente un effet de suroxydation. 5. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le marqueur électrochimiluminescent est choisi dans le groupe comprenant les complexes d'osmium et de ruthénium avec des ligands identiques ou différents de bi ou terpyridine et/ou de phénantroline et leurs dérivés ; un cryptate d'europium ou des esters d'acridinium. 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, dans lequel la lecture du signal d'électrochimiluminescence déclenchée par transfert électronique entre le marqueur de la cible et le support via un relais rédox est réalisée en présence d'un substrat sacrificiel. 7. Procédé selon la revendication 1, dans lequel, le relais rédox est choisi parmi un groupement métallocène tel que le ferrocène ou le diferrocène ; des complexes de métaux de transition tels qu'un complexe de cobalt ; un groupement de la famille de la phénothiazine, du méthylviologène et de leurs dérivés respectifs ; ou des intercalants de l'ADN possédant des propriétés rédox ou comportant des groupements rédox ; ainsi que des amines aromatiques ou hétérocycles. 8. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le relais rédox est en solution ; greffé au film conducteur à conduction électronique ou à la molécule sonde ; ou sous la forme d'intercalant de la molécule sonde possédant des propriétés rédox ou comportant des groupements rédox. 9. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le film polymère conducteur est un film de polypyrrole, le marqueur électrochimiluminescent est un complexe de ruthénium, le relais rédox est une N-méthylphénothiazine, et dans lequel la lecture du signal d'électrochimiluminescence rendue possible par transfert électronique entre le marqueur de la cible et le support via le relais rédox est réalisée en présence d'une amine aliphatique telle que la tripropylamine. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel le support est un support multiparamétrique. 11. Utilisation d'un procédé selon la revendication 1, pour réaliser une analyse quantitative ou qualitative d'une molécule cible présente dans un échantillon. 12. Utilisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans un système d'analyse multiparamétrique et/ou en parallèle.