Brevet FR2844519A1 — publié le 20040319

La présente invention est relative à une protéine recombinante chimérique, un ADN codant ladite protéine recombinante chimérique, ainsi que l'utilisation de cette protéine recombinante chimérique pour le diagnostic in vitro des maladies en relation avec un virus. Le diagnostic précoce de la présence d'un virus dans l'organisme est essentiel afin, d'une part, d'éviter la propagation du virus par les malades qui ne connaissent pas encore leur séropositivité, et d'autre part, de proposer à ces patients un traitement adapté pour reculer la date d'apparition des symptômes. Dans le cas du SIDA (syndrome d'immunodéficience acquise), conséquence de l'infection par les rétrovirus HIV-1 (human immunodeficiency virus-1) ou HIV-2 (human immunodeficiency virus-2), la primo infection est suivie d'une période asymptomatique, d'une durée variable avant que la maladie n'évolue chez la plupart des patients en SIDA, caractérisé par l'apparition d'infections à germes opportunistes, de tumeurs et de manifestations neurologiques, et le diagnostic précoce de la présence du virus HIV dans l'organisme doit être effectué que le patient ait initialement été infecté par HIV-1ou par HIV-2. La plupart des tests de diagnostic commercialisés est basé sur une réaction antigène-anticorps dirigée contre certaines protéines virales, telles que les protéines transmembranaires de l'enveloppe virale. Dans le cas d'HIV-1, les protéines de l'enveloppe sont dérivées du gène env, qui code une glycoprotéine précurseur d'un poids moléculaire de 160 000 daltons, dénommée gp 160. La gp 160 est ensuite clivée en deux protéines virales de l'enveloppe, la gp 120 et la gp 41. Dans le cas d'HIV-2, la glycoprotéine précurseur est la gpl40, clivée en gp36 et gp105/110. Ainsi, dans l'article scientifique de Vallari et al (Journal of microbiology, pages 3657-3661,1998), on retrouve la description d'un kit de diagnostic permettant de détecter la présence de virus HIV-1 groupe M, HIV-1 groupe 0 et HIV-2, par l'utilisation de trois protéines recombinantes, dérivées des régions env de virus HIV-1groupe M, HIV-1groupe 0 et HIV-2. D'une façon comparable, dans l'article scientifique de Shin et al (Biochemistry and molecular biology international, volume 43, n 4, pages 713-721, 1997), sont décrits des peptides multi-antigéniques pour détecter des infections aux virus HIV-1 ou HIV-2. Toutefois, dans de tels tests de diagnostic de plusieurs souches virales, il est nécessaire lors de l'analyse de sera par la technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay), de fixer sur le support plusieurs protéines recombinantes ayant des caractéristiques d'adsorption (ou coating) individuelles différentes, induisant des problèmes notamment lors de l'étape de révélation. De plus, la multiplicité des protéines recombinantes engendre des coûts de fabrication importants. Afin d'éviter ces problèmes de différences de coating entre les différentes protéines recombinantes, d'autres tests de diagnostic utilisent préférentiellement des protéines recombinantes chimériques, porteuse de plusieurs épitopes dirigés contre des protéines virales différentes. Ainsi, le brevet EP-B-0 577 894 décrit la construction d'une protéine recombinante chimérique utilisée pour le diagnostic du SIDA. Cette protéine est porteuse des épitopes dirigés contre les protéines virales dérivées du gène gag de HIV-2 et contre la protéine gpl20 d'HIV-1. Toutefois, cette protéine recombinante ne permet pas la détection simultanée des patients infectés par les virus HIV-1 de groupe M et 0, ce qui peut induire des risques de faux négatifs (patient détecté séronégatif alors qu'il est porteur du virus), faux négatifs dont les conséquences peuvent être dramatiques. De plus, cette protéine recombinante n'est pas porteuse de l'épitope dirigé contre la gp41, qui est pourtant l'épitope immunodominant majeur, ce qui augmente, là encore, le risque d'apparition de faux négatif. De même, dans l'article scientifique de Han et al (Biochemistry and molecular biology international, vol 46 n 3, 1998), il est décrit une protéine recombinante présentant un épitope dirigé contre la gp41 d'HIV-1, et un épitope dirigé contre la gp36 d'HIV-2, ces deux épitopes étant liés par un peptide de liaison afin de permettre l'accessibilité à chacun des épitopes. Toutefois, cette protéine recombinante ne permet pas la détection simultanée des patients infectés par les virus HIV-1 de groupe M et 0, ce qui peut induire, là encore, des risques de faux négatifs. La présente invention se propose de résoudre l'ensemble des inconvénients de l'état de la technique, en proposant une protéine recombinante chimérique, facile à purifier et à synthétiser, présentant une forte immunoréactivité vis-à-vis de sera de patients susceptibles d'être infectés par un ou plusieurs virus. Les définitions suivantes permettront de mieux comprendre l'invention. Par ADN recombinant, on entend un séquence nucléotidique construit artificiellement et obtenu par génie génétique. A titre indicatif, ledit ADN recombinant peut être inséré dans un organisme hôte d'expression, tel que notamment une bactérie, par un vecteur d'expression, notamment un plasmide bactérien ou un bactériophage. Par fragment nucléotidique. on entend une succession d'au moins trois acides nucléotidiques codant au moins un acide aminé. Par site de coupure, on entend un site permettant la séparation de deux fragments nucléotidiques par l'action d'au moins un moyen de coupure, tel que notamment une enzyme de restriction qui est capable, au niveau de site de coupure correspondant à une séquence nucléotidique spécifique de générer pour chaque brin deux extrémités, l'une ayant un groupement 3'-OH, l'autre un groupement 5'-P. Par protéine recombinante chimérique, on entend une protéine construite artificiellement et obtenue par génie génétique. A titre indicatif, ladite protéine recombinante chimérique peut être produite par un organisme hôte d'expression modifiée génétiquement par insertion de la séquence nucléotidique codant ladite protéine recombinante chimérique par un vecteur d'expression. Par région épitopique, on entend une région peptidique qui va interagir de façon stéréospécifique avec la région peptidique paratopique de l'anticorps dirigé contre le microorganisme, tel que notamment le virus, présent dans le sérum du patient. Les régions épitopiques les plus immunogéniques sont dites immunodominantes. Par région de liaison, on entend une région assurant une meilleure accessibilité des régions paratopiques des différents anticorps présents dans le sérum des patients vis à vis des régions épitopiques d'intérêt correspondantes de la protéine recombinante chimérique. Par région de fixation, on entend une région permettant de fixer ladite protéine recombinante chimérique vis-à-vis : # d'un support, de manière direct et/ou indirect, et/ou # d'une molécule de détection, Le support peut être composé de matériaux, tels que : * le verre, un matériau peu onéreux, inerte et mécaniquement stable , * les polymères : plaques de microtitration... * les métaux : colonne de métal chelate de chromatographie d'affinité, * les particules magnétiques, telles que décrites dans les demandes de brevet WO-A- 97/34909, WO-A-97/45202, WO-A-98/47000 et WO-A-99/35500 déposées par la demanderesse. Le support peut alors être utilisé comme support d'analyse, notamment lors d'un ELISA (Enzym Linked ImmunoSorbent Assay), pour des étapes de purification lors d'une chromatographie d'affinité, pour des étapes de lavage lorsque ladite protéine recombinante chimérique, fixée sur une particule magnétique est retenue par aimantation dans un lieu prédéterminé. Par molécule de détection, on entend une molécule associée à un marqueur permettant de générer directement ou indirectement un signal détectable. Ces marqueurs peuvent être notamment radioactifs, enzymatiques, fluorescents. La fixation de la protéine recombinante chimérique sur ledit support ou ladite molécule de détection peut impliquer des ligands capables de réagir avec un anti-ligand. On peut citer à titre d'exemples les couples ligand/anti-ligand suivants : # biotine/streptavidine, # haptène/anticorps, # antigène/anticorps, # peptide/anticorps, # sucre/lectine, Ainsi, l'invention concerne un ADN recombinant codant une protéine recombinante chimérique comprenant : # au moins deux premiers fragments nucléotidiques codant chacun une région épitopique d'au moins un microorganisme, # au moins un deuxième fragment nucléotidique codant une région de liaison, et # au moins un troisième fragment nucléotidique codant une région de fixation. Selon un mode préférée de l'invention, le deuxième fragment nucléotidique comprend au moins un site de coupure. Selon un mode préféré, l'ADN recombinant tel que décrit précédemment est caractérisé en ce que chaque fragment nucléotidique comprend au moins un troisième fragment nucléotidique codant une région de fixation. L'invention concerne également un ADN recombinant codant une protéine recombinante chimérique comprenant : # au moins deux premiers fragments nucléotidiques codant chacun une région épitopique d'au moins un microorganisme, # au moins un deuxième fragment nucléotidique codant chacun une région de liaison, ledit deuxième fragment nucléotidique comprenant en outre au moins un site de coupure. Selon un mode préféré de l'invention, ledit deuxième fragment nucléotidique a pour séquence au moins l'une quelconque des séquences suivantes, prises seules ou en combinaison : SEQ ID N 11, SEQ ID N 13, SEQ ID N 15, SEQ ID N 17, SEQ ID N 19, ou SEQ ID N 20. Selon un mode préféré de l'invention, ledit microorganisme est un virus, préférentiellement le virus HIV-1 ou le virus HIV-2. Selon un autre mode préféré de l'invention, le virus HIV-1 est de groupe M ou de groupe O. Selon un mode préféré de l'invention, les premiers fragments nucléotidiques codent au moins deux régions immunodominantes comprises parmi tout ou partie de la glycoprotéine gp 120 d'HIV-l, de la glycoprotéine gp 41 d'HIV-1 de groupe M, de la glycoprotéine gp 41 d'HIV-1de groupe 0 ou de la glycoprotéine gp 36 d'HIV-2. Préférentiellement, les premiers fragments nucléotidiques ont pour séquence l'une quelconque des séquences SEQ ID N 3, SEQ ID N 5, SEQ ID N 7 ou SEQ ID N 9. Selon un autre mode préféré de l'invention, ledit troisième fragment nucléotidique a pour séquence l'une quelconque des séquences SEQ ID N 21, SEQ ID N 23, ou SEQ ID N 25. L'invention concerne également une protéine recombinante chimérique codée par un ADN recombinant tel que décrit ci-dessus comprenant # au moins deux régions épitopiques d'au moins un microorganisme, # au moins une région de liaison, et # au moins une région de fixation. Selon un mode préféré de l'invention, la région de liaison est un peptide comprenant au moins une glycine et/ou au moins une sérine. Préférentiellement, ladite région de liaison a pour séquence l'une quelconque des séquences SEQ ID N 12, SEQ ID N 14, SEQ ID N 16 ou SEQ ID N 18. Selon un autre mode préféré de l'invention, ladite région de fixation est un peptide situé à l'une quelconque des extrémités N ou C terminales de ladite protéine recombinante chimérique. Préférentiellement, ladite région de fixation est une région riche en histidines et ses dérivés, tel qu'une région contenant une densité d'histidines, supérieure ou égale à 25%, et préférentiellement supérieure ou égale à 33%. Encore plus préférentiellement, la région de fixation comporte au moins quatre histidines et préférentiellement six histidines adjacentes. Selon un autre mode préféré de l'invention, ladite région de fixation est un peptide comprenant au moins une lysine. Préférentiellement, ladite région de fixation a pour séquence SEQ ID N 22, 24 ou 26. L'invention concerne également un vecteur d'expression comprenant un ADN recombinant tel que décrit ci dessus. L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un ADN recombinant et/ou d'au moins une protéine recombinante chimérique tels que décrit ci dessus pour le diagnostic in vitro. Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention. Exemple 1 : d'une protéine chimérique recombinante permettant la reconnaissance d'anticorps anti HIV-1 groupe 0 et M et HIV-2. La séquence nucléotidique SEQ ID N 1 a été conçue pour coder une protéine recombinante selon l'invention, et clonée dans un vecteur d'expression. Elle correspond à la séquence suivante : SEQ ID N 1 : ATG AGG GGA TCC AGA ATC CTA GCT GTG GAA AGA TAC CTA AAG GAT CAA CAG CTC CTA GGG ATT TGG GGT TGC TCT GGA AAA CTC ATT TGC ACC ACT GCT GTG AGC TCC GGT TCA GGC GCT ATA GAG AAG TAC CTA CAG GAC CAG GCG CGG CTA AAT TCA TGG GGA TGT GCG TTT AGA CAA GTC TGC TCG AGC GGT TCT GGA GGA GGA GAT ATG AGG GAC AAT TGG AGA AGT GAA TTA TAT AAA TAT AAA GTA GTA AAA ATT GAA CCA TTA GGA GTA GCA CCC ACC AAG TCT GCA GGC CGT CTG CTT GCT CTG GAA ACC CTG CTT CAG AAC CAA CAG CTG CTT TCT CTG TGG GGT TGC AAA GGT AAG CTG GTT TGC TAC ACC TCT GTT AAA GCT TCC CAC CAT CAC CAT CAC CAT TGA TCT AGA La protéine recombinante chimérique codée par la séquence SEQ ID N 1, comprend 137 acides aminés, pour une masse moléculaire de 15191,5 Da. Sa séquence en acides aminés est la suivante : SEQ ID N 2 : MRGS RILAVERYLK DQQLLGIWGC SGKLICTTAV SSGSG AIEKYLQDQA RLNSWGCAFR QVC SSGS GGGDMRDNWR SELYKYKVVK IEPLGVAPTK SAG RLLALETLLQ NQQLLSLWG CKGKLVCYTS V KAS HHHHHH. La présence de MRGS et la séquence ATG AGG GGA TCC correspondante est introduite par la technique de clonage utilisée dans le vecteur d'expression pMR. La séquence d'intérêt est introduite dans le vecteur pMR entre le site de restriction BamHI en 5' et le site XbaI en 3', ce qui conduit à la fusion de la séquence MRGS en Nterminal de la protéine d'intérêt. Seul le codon d'initiation ATG et par conséquent l'acide aminé Met est vraiment indispensable dans cette séquence. Les régions épitopiques sont indiquées en gras, la région de fixation en italique et les régions de liaisons en non gras non italique. Cette protéine recombinante chimérique comprend : a) plusieurs régions épitopiques (indiquées en gras dans la SEQ ID n 2) permettant : ' la reconnaissance des anticorps anti-HIV-1(groupe M ; gp41), : La séquence SEQ ID N 3 est issue de la souche virale HIV-1 groupe M (clone de référence HXB2) et correspond à la séquence suivante : SEQ ID N 3 : AGA ATC CTA GCT GTG GAA AGA TAC CTA AAG GAT CAA CAG CTC CTA GGG ATT TGG GGT TGC TCT GGA AAA CTC ATT TGC ACC ACT GCT GTG, Cette séquence est amplifié par PCR (polymerase chain reaction) par l'utilisation d'amorces d'amplification spécifiques (amorce sense 5' AGT CGG ATC CAG AAT CCT AGC TGT GGA A 3' et amorce antisense 5' GCC TGA TCC GGA GCT CAC AGC AGT GGT GCA AAT 3' ;17 cycles de PCR sont réalisés avec à chaque cycle une étape de dénaturation à 94 C pendant 1 minute (min), une étape d'hybridation à 52 C pendant 1 min et une étape d'élongation 72 C pendant 20 secondes. Le fragment nucléotidique obtenu code pour le peptide correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID N 4 : RILAVERYLK DQQLLGIWGC SGKLICTTAV. * la reconnaissance des anticorps anti-HIV-11 (groupe O ; gp41) : La séquence SEQ ID N 5 correspond à une séquence ADN artificielle, conçue à partir de la séquence en acide aminé de la souche virale HIV-1 groupe 0 [clone ANT70]. Cette portion synthétique a été conçu en sélectionnant des codons dont l'utilisation est favorable à l'expression de gène chez E. coli. La séquence est la suivante : SEQ ID N 5 : CGT CTG CTT GCT CTG GAA ACC CTG CTT CAG AAC CAA CAG CTG CTT TCT CTG TGG GGT TGC AAA GGT AAG CTG GTT TGC TAC ACC TCT GTT. Cette séquence est construite par PCR par l'utilisation de 3 oligonucléotides (un oligonucléotide sens 5' AAG TCT GCA GGC CGT CTG CTT GCT CTG GAA ACC CTG CTT CAG AAC CAA CAG CTG CTT TCT 3' et deux oligonucléotides antisens 5' GCT ATC TAG ATC AAT GGT GAT GGT GAT GGT GGG AAG CTT TAA CAG AGG TGT AGC AAA C 3' et 5' AAC AGA GGT GTA GCA AAC CAG CTT ACC TTT GCA ACC CCA CAG AGA AAG CAG CTG TTG GTT 3' ; 17 cycles de PCR sont réalisés avec à chaque cycle une étape de dénaturation à 9 C pendant 1 min, une étape d'hybridation à 50 C pendant 1 min et une étape d'élongation 68 C pendant 20 secondes). Ce fragment nucléotidique code pour le peptide correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID N 6 : RLLALETLLQ NQQLLSLWGC KGKLVCYTSV . ' la reconnaissance des anticorps anti-HIV-2 (gp36) : La séquence SEQ ID N 7 est issue de la souche virale HIV-2 (clone de référence ROD) et correspond à la séquence suivante : SEQ ID N 7 : GCT ATA GAG AAG TAC CTA CAG GAC CAG GCG CGG CTA AAT TCA TGG GGA TGT GCG TTT AGA CAA GTC TGC Cette séquence est amplifiée par PCR par l'utilisation d'amorces d'amplification spécifiques (amorce sense 5' CTG TGA GCT CCG GTT CAG GCG CTA TAG AGA AGT ACC TA 3' et amorce antisense 5' AGA ACC GCT CGA GCA GAC TTG TCT AAA CGC 3' ; 17 cycles de PCR sont réalisés avec à chaque cycle une étape de dénaturation à 94 C pendant 1 min, une étape d'hybridation à 52 C pendant 1 min et une étape d'élongation 72 C pendant 20 secondes). Ce fragment nucléotidique code pour le peptide correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID N 8 : AIEKYLQDQA RLNSWGCAFR QVC. # la reconnaissance des anticorps anti-HIV-1(groupe M ; gp120) : La séquence SEQ ID N 9 est issue de la souche virale HIV-1 groupe M (clone de référence HXB2) et correspond à la séquence suivante : SEQ ID N 9 : GGA GGA GGA GAT ATG AGG GAC AAT TGG AGA AGT GAA TTA TAT AAA TAT AAA GTA GTA AAA ATT GAA CCA TTA GGA GTA GCA CCC ACC AAG. Cette séquence est amplifié par PCR par l'utilisation d'amorces d'amplification spécifiques (amorce sense 5' GTC TGC TCG AGC GGT TCT GGA GGA GGA GAT ATG AGG 3' et amorce antisens 5' ACG TCC TGC AGA CTT GGT GGG TGC TAC TCC 3' ; 17 cycles de PCR sont réalisés comprenant à chaque cycle une étape de dénaturation à 94 C pendant 1min, une étape d'hybridation à 52 C pendant 1 min et une étape d'élongation à 72 C pendant 20 secondes). Ce fragment nucléotidique code pour le peptide correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID N 10 : GGGDMRDNWR SELYKYKWK IEPLGVAPTK b) des régions de liaisons, entre chacune des régions épitopiques citées précédemment, permettant : # au niveau nucléotidique l'introduction de six sites de coupure par des enzymes de restriction pouvant être utilisés pour modifier, retirer ou ajouter un domaine épitopique, et # au niveau protéique, l'obtention de régions d'espacement, flexibles, assurant une meilleure accessibilité des anticorps potentiels à chacun des domaines. Ainsi, la séquence nucléotidique SEQ ID N 11 : G AGC TCC GGT TCA GGC permet l'obtention d'un site de coupure par l'enzyme Sac 1 (indiqué en gras), le G indiqué en italique, étant la dernière base de la séquence nucléotidique codant le peptide permettant la reconnaissance des anticorps anti HIV-1, groupe M. Cette séquence code la région flexible correspondant au peptide de séquence SEQ ID N 12 : SSG SG. La séquence nucléotidique SEQ ID N 13 : C TCG AGC GGT TCT permet l'obtention d'un site de coupure par l'enzyme Xho 1 (indiqué en gras), le C indiqué en italique, étant la dernière base de la séquence nucléotidique codant le peptide permettant la reconnaissance des anticorps anti HIV-2. Cette séquence code la région flexible correspondant au peptide de séquence SEQ ID N 14 : SSGS. La séquence nucléotidique SEQ ID N 15 : TCT GCA GGC permet l'obtention d'un site de coupure par l'enzyme Pst 1 (indiqué en gras). Cette séquence code la région flexible correspondant au peptide de séquence SEQ ID N 16 : SAG La séquence nucléotidique SEQ ID N 17 : AAA GCT TCC permet l'obtention d'un site de coupure par l'enzyme Hind III (indiqué en gras). Cette séquence code la région flexible correspondant au peptide de séquence SEQ ID N 18 : KAS. Les séquences SEQ ID N 19 : ATG AGG GGA TCC et SEQ ID N 20 TGA TCT AGA permettent respectivement d'obtenir un site de coupure par l'enzyme BamHl (indiqué en gras) et un site de coupure par l'enzyme Xbal permettant l'insertion ou l'extraction de la totalité de la séquence codant la protéine recombinante selon l'invention dans un plasmide. c) une région de fixation et permettant la purification de la protéine recombinante chimérique : une séquence hexahistidine est ajoutée en C-terminal afin de faciliter ultérieurement l'étape de purification de la protéine recombinante chimérique. Ce peptide, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N 21 : CAC CAT CAC CAT CAC CAT, correspond à la séquence SEQ ID N 22 : HHHHHH. A titre indicatif, cette région de fixation particulière, comprenant une succession d'histidine, permet notamment la fixation orientée de la protéine recombinante sur un support constitué de silice ou d'oxydes métalliques, tel que décrit dans le brevet FR-B- 98/04879. L'ordre des séquences codant les différentes régions épitopiques immunodominantes de la protéine recombinante chimérique peut être éventuellement modifié. La longueur des régions de liaison peut également être modifiée pour améliorer l'accessibilité d'un épitope. Certains épitopes peuvent être présentés plusieurs fois au sein de la protéine recombinante chimérique. Les épitopes peuvent également présenter des variations par rapport aux séquences décrites dans l'exemple ci dessus selon le sous type ou le clone HIV qu'ils représentent. Exemple 2 : et purification de la protéine recombinante chimérique de l'exemple 1 La première étape consiste à insérer la séquence SEQ ID N 1 (exemple 1), dans un vecteur d'expression (pMR) puis à transformer une bactérie E. coli (souche BL21) avec la construction plasmidique obtenue selon un protocole classique de clonage connu de l'homme du métier. Les bactéries transformées sont sélectionnées grâce à leur résistance à l'ampicilline portée par le vecteur pMR. Un clone de bactérie recombinante est alors sélectionné pour ensemencer une préculture de 40 ml de milieu 2x YT (tryptone 16 g/1 ; yeast extract 10 g/1 ; NaCl 5 g/1, pH 7,0) contenant 100 g/ml ampicilline. Après 15 à 18h d'incubation à 37 C sous agitation à 250 rpm, cette préculture est utilisée pour ensemencer 1 litre de milieu 2xYT contenant 2 % glucose et 100 g/ml ampicilline. Cette culture est incubée à 37 C sous agitation à 250 rpm. Lorsque la D06oo nm a atteint 0,7-0,9, de l'IPTG (isopropyl-P-D- thiogalactoside, Eurogentec) est ajouté à 0,5 mM final dans le milieu de culture et la culture est poursuivie pendant 4 h. L'IPTG permet d'induire l'expression de la protéine chimérique recombinante SEQ ID N 2 qui s'accumule dans les bactéries sous forme de corps d'inclusion. Après 4 h d'induction, la culture est centrifugée à 6000 rpm pendant 30 min à 4 C et le culot de bactéries est congelé à -80 C. Afin d'extraire la protéine recombinante des corps d'inclusion, les bactéries décongelées sont lysées. Pour cela, les culots de bactéries correspondant à une culture d'un litre sont repris dans 100 ml de tampon de lyse (PBS IX contenant des inhibiteurs de protéases : lysozyme : 1 mg/ml ; benzonase : 2,5 unités par ml (Novagen#) et Mg2+ : 1 mM) en vortexant jusqu'à obtenir une suspension homogène. Cette solution est incubée 1 heure à température ambiante sous agitation. La solution est ensuite centrifugée 30 min à 4 C à 10000 g. Le culot obtenu contient les corps d'inclusion. Ce culot est mis en suspension dans 50 ml de tampon de solubilisation (bicarbonate de sodium : 40 mM ; NaCl : 300 mM ; SDS : 1% ; p-mercaptoethanol : 20 mM, pH 9,6) contenant des inhibiteurs de protéases (complete EDTA-free, Roche). La solution ainsi obtenue est incubée 16 à 18 h sous agitation entre 18 et 25 C. Elle est ensuite diluée au quart avec un tampon PBS 2X contenant 8 mM d'imidazole et des inhibiteurs de protéases (complete EDTA-free, Roche) à pH 8,0. Une centrifugation à 10 000 g pendant 30 min à 20 C permet d'obtenir un surnageant limpide, qui est filtré sur filtre 0,45 Il et purifié par chromatographie d'affinité sur une colonne de chélation de métaux (matrice nickelnitrilotriacetic acid (Ni-NTA, Qiagen). Les 200 ml d'échantillon sont déposés (1 ml/min) à 18-25 C sur une colonne de 8 ml de gel Ni-NTA équilibrée en tampon Al (PBS 2X, urée 4 M, imidazole 6 mM, pH 7,8 contenant P-mercaptoethanol 5 mM) ou A2 (PBS 2X, SDS 0. 25 %, imidazole 6 mM, pH 7,8 contenant p-mercaptoethanol 5 mM). La colonne est ensuite lavée en tampon Al ou A2, jusqu'à obtention en sortie de colonne d'une DO280nm=0. L'élution de la protéine recombinante est obtenue par application d'un tampon B1(PBS 2X, urée 4M, imidazole 100 mM, pH 7,5, contenant P-mercaptoethanol 5 mM) ou B2 (PBS 2X, SDS 0. 25%, imidazole 100 mM, pH 7,5, contenant P-mercaptoethanol 5 mM). Des quantités de l'ordre de 50 mg de protéine recombinante purifiée peuvent être obtenues à partir d'un litre de culture. La protéine recombinante ainsi purifiée est soumise à un traitement dénaturant par addition de SDS (1500 molécules par molécule de protéine recombinante), DTT 5 mM, bicarbonate de sodium 50 mM au pH 9,6 et chauffage 30 min à 37 C. La stockiométrie molécules de SDS/ molécules de protéine recombinante peut être modifiée (idéalement diminuée si la durée ou température de chauffage est augmentée). Par exemple, des résultats similaires sont obtenus par addition de 250 molécules de SDS/molécule de protéine recombinante, DTT 5 mM, bicarbonate de sodium 50 mM au pH 9. 6 et chauffage 2 heures à 40 C. La protéine ainsi dénaturée est stabilisée par addition de Polyethylène glycol (MW 3350 en particulier) pour une stockiométrie de 10 molécules de PEG par molécule de protéine puis dialysée à 4 C pendant 18à 24 heures contre un tampon bicarbonate de sodium 50mM, EDTA ImM, SDS 0,01%, PEG 1 mg/1, pH 9,6. Exemple 3 : et validation de la protéine recombinante chimérique dans un test VIDAS@ (bioMérieux) Cette validation est réalisée en test VIDAS@ par l'utilisation d'une solution de protéine chimérique recombinante obtenue selon les exemples 1 et 2 et ayant subit le traitement dénaturant décrit dans l' exemple 2. Le principe du test VIDAS est le suivant : cône constitue le support solide qui sert également de système de pipetage pour les réactifs présents dans la barrette. La protéine recombinante est fixée sur le cône. Après une étape de dilution, l'échantillon est aspiré et refoulé plusieurs fois à l'intérieur du cône. Ceci permet aux IgG anti-VIH de l'échantillon de se lier à la protéine recombinante. Les composants non liés sont éliminés par lavage. Un anticorps anti-IgG humaines conjugué à la phosphatase alcaline (PAL) est alors incubé dans le cône où il se fixe aux IgG anti-VIH. Des étapes de lavage éliminent le conjugué non fixé. Pendant la dernière étape de révélation, le substrat de la PAL, le 4-méthyl-ombelliferyl phosphate, est hydrolysé en 4-méthyl-ombelliferone dont la fluorescence émise à 450 nm est mesurée. L'intensité de la fluorescence est mesurée par le système optique du Vidas et est proportionnelle à la présence d'IgG anti-VIH présents dans l'échantillon. Les résultats sont analysés automatiquement par le VIDAS@ et exprimés en RFV (Relative Fluorescent Value). Dans cet exemple, une solution de protéine recombinante obtenue selon les exemples 1 et 2, (1,2 g dans un millilitre de tampon bicarbonate de sodium 50 mM, SDS 0,01%, pH 9,6-9,8) est incubée avec les cônes VIDAS 18 à 24 h à température ambiante (120 l/cône). Les cônes sont ensuite incubés dans un tampon de passivation (330 ni/cône de tampon HIV Duo contenant 3 % de sérum de veau) pendant 18 à 24 h à température ambiante Des solutions tests (Etablissement Français du Sang, France), de sérologie HIV connue, (28 l de sérum, de statut HIV connu, dilué dans 300 l de tampon PBS 1 X, NaCl 8,76 g/1, tween 20 2,5 % (v/v), lait écrémé en poudre 2,5 g/1, albumine 20 g/1, et 3 % (v/v) sérum de veau, pH 6,1) sont alors mis en contact avec les cônes présentant les protéines recombinantes de l'exemple 1, pendant 13 min et 20 secondes (80 cycles de pipettage/refoulement de 10 secondes). Une étape de lavage est ensuite effectuée en tampon Tris 24,23 g/1, acide maléique 23,22 g/1, tween 20 0,05% (v/v), NaOH 6 g/1, NaCl 8,77 g/1, pH 6,1. Une solution d'anticorps anti-Fc humain conjugué à la PAL (P5F2F7) et dilué au 1/5000ème est incubée au contact du cône pendant 5 min (avec 30 cycles de pipettage /refoulement de 10 secondes chacun). Une dernière étape de lavage est réalisé en tampon HIV Duo, avant l'étape finale de révélation. Les résultats obtenus, sont exprimés en RFV (Relative Fluorescent Value). Les valeurs RFV supérieures ou égales à 250 sont arbitrairement considérées comme provenant d'un sérum HIV séro positifs. Les valeurs inférieures sont négatives. Les résultats obtenus avec la protéine recombinante obtenue selon les exemples 1 et 2, sont tous en accord avec la sérologie HIV, préalablement déterminée par le test VIDAS HIV Duo# (bioMérieux). L'utilisation d'une telle protéine recombinante en test VIDAS@ permet bien de déterminer la sérologie HIV des échantillons. Tableau 1 - Validation expérimentale de la protéine recombinante obtenue selon les exemples 1 et 2 Solution calibrateur / sera Références sérum RFV (relative fluorescent value) Sera HIV1-M positifs 9991574 9820 9991504 9346 9991544 9621 9991524 9735 9991500 9914 Sera HIV1-O positifs 48 786 Sera HIV 2 positifs 7312A 9174 JS8-1002 0008 8475 JS8-1002 0009 9532 JS8-1002 0010 9472 JS8-1002 0013 9526 JS8-1002 0014 9695 JS8-1002 0016 9872 JS8-1002 0017 9090 JS8-1002 0018 9241 JS8-1002 0020 9391 Sera HIV séronégatifs 203 139 222 171 262 105 263 84 280 182 285 86 287 127 291 173 g10653 193 g12290 122 g13461 170 g13818 192 g13830 106 p03512 176 Exemple 4 : Constructiond'une protéine recombinante biotinylée Une séquence consensus de biotinylation in vivo dans E.coli telle que décrite par Schatz, (Bio/technology, vol. 11, 1993) peut être fusionnée à la SEQ ID n 2 L'addition de la séquence SEQ ID N 23 : 5' CTG CAC CAT ATC CTG GAA GCC CAG AAA ATG GAA TGG CAC CCG CAC, codant le peptide de séquence SEQ ID N 24 : LHHILEAQKM EWHPH, permet la biotinylation de la protéine recombinante obtenue selon les exemples 1 et 2 afin d'utiliser une protéine avidine conjuguée à une enzyme pour la phase de révélation dans un test EIA. Les conditions d'expression et purification décrites dans l'exemples 2 restent valides avec quelques modifications. Les bactéries transformées avec le plasmide recombinant peuvent être de type BL21 ou AVB101 (Avidity, LLC). Le milieu de culture utilisé pour l'expression peut être de type : 2x YT (tryptone 16 g/1 ; yeast extract 10 g/1 ; NaCl 5 g/1, pH 7,0) contenant 100 ug/ml ampicilline et supplémenté par 12 g par ml de biotine. Exemple 5 : Evaluation et validation de la protéine recombinante chimérique biotinylée in vivo dans un test VIDAS de type sandwich. Cette validation est selon un protocole VIDAS décrit dans l'exemple 3 et modifié comme suit : la protéine chimérique recombinante obtenue selon l'exemple 1 est fixée sur la phase solide (cône VIDAS) comme décrit dans l'exemple 3. Après incubation de l'échantillon dilué avec le cône puis lavage, les Ig G anti HIV liées aux cônes sont incubées avec la protéine chimérique recombinante obtenue selon l'exemple 4. Après lavage, les protéines recombinantes biotynylées fixées sur le cône réagissent avec un solution de streptavidine conjugué à la PAL. L'étape finale de révélation est conforme à la description de l'exemple 3. Les résultats sont présentés dans le tableau 2. Les valeurs RFV supérieures ou égales à 250 sont arbitrairement considérées comme positives. L'utilisation d'une telle protéine recombinante en test VIDAS@ permet bien de déterminer la sérologie HIV des échantillons. Tableau 2 - Validation expérimentale de la protéine recombinante obtenue selon les exemples 4 et 5 Solution calibrateur / sera Références sérum RFV Séra HIV négatifs CTS 8 195 g06976 214 g31377 170 Sera HIV 1 M positifs 9991574 4708 9991504 1395 Sera HIV 2 positif JS8-1002 0008 2562 JS8-1002 0009 3754 Exemple 6 : Amélioration de la sensibilité de la protéine recombinante chimérique Afin d'augmenter encore la sensibilité de reconnaissance des anticorps anti-HIV de la protéine recombinante obtenue selon l'invention de nouveaux épitopes caractéristiques de certains sous-types HIV peuvent être ajoutés ou un des épitopes décrit peut être dupliqué dans la séquence de la protéine chimérique. Exemple 7 : Addition d'une séquence hexalysine à la protéine recombinante pour faciliter le couplage d'une enzyme ou de biotine, notamment sur la fonction ssaminé de la lysine. Une séquence codant pour six lysines peut être fusionnée en 3' de la SEQ ID n 2. L'addition de la séquence ADN SEQ ID n 25: AAG AAA AAG AAA AAG AAA, codant pour le peptide de séquence SEQ ID n 26 : KKKKKK, permet le couplage orienté d'enzyme ou biotine en C-terminal de la protéine chimérique. Le couplage de cette protéine recombinante à la phosphatase alcaline en particulier permet l'utilisation de la protéine couplée dans un format sandwich de révélation des anticorps anti-HIV. 1. ADN recombinant codant une protéine recombinante chimérique comprenant # au moins deux premiers fragments nucléotidiques codant chacun une région épitopique d'au moins un microorganisme, # au moins un deuxième fragment nucléotidique codant une région de liaison, et # au moins un troisième fragment nucléotidique codant une région de fixation. 2. ADN recombinant, selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit deuxième fragment nucléotidique comprend au moins un site de coupure. 3. ADN recombinant, selon la revendication 2, caractérisé en ce que chaque fragment nucléotidique comprend au moins un troisième fragment nucléotidique codant une région de fixation. 4. ADN recombinant codant une protéine recombinante chimérique comprenant # au moins deux premiers fragments nucléotidiques codant chacun une région épitopique d'au moins un microorganisme, # au moins un deuxième fragment nucléotidique codant une région de liaison, ledit deuxième fragment nucléotidique comprenant en outre au moins un site de coupure. 5. ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que ledit deuxième fragment nucléotidique a pour séquence au moins l'une quelconque des séquences suivantes, prises seules ou en combinaison, SEQ ID N 11 SEQ ID N 13, SEQ ID N 15, SEQ ID N 17, SEQ ID N 19, ou SEQ ID N 20. 6. ADN, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit microorganisme est un virus, préférentiellement le virus HIV-1 ou le virus HIV-2. 7. ADN, selon la revendication 6, caractérisé en ce que le virus HIV-1 est de groupe M ou de groupe 0 8. ADN, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que les premiers fragments nucléotidiques codent au moins deux régions immunodominantes comprises parmi tout ou partie de la glycoprotéine gp 120 d'HIV-1, de la glycoprotéine gp 41 d'HIV-1 de groupe M, de la glycoprotéine gp 41 d'HIV-1de groupe 0 ou de la glycoprotéine gp 36 d'HIV-2. 9. ADN, selon la revendication 8, caractérisé en ce que chaque premier fragment nucléotidique a pour séquence l'une quelconque des séquences SEQ ID N 3, SEQ ID N 5, SEQ ID N 7 ou SEQ ID N 9. 10. ADN, selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ledit troisième fragment nucléotidique a pour séquence l'une quelconque des séquences SEQ ID N 21, SEQ ID N 23 ou SEQ ID N 25. 11. Protéine recombinante chimérique codée par un ADN recombinant, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, comprenant # au moins deux régions épitopiques d'au moins un microorganisme, # au moins une région de liaison, et # au moins une région de fixation. 12. Protéine, selon la revendication 11, caractérisée en ce que ladite région de liaison est un peptide comprenant au moins une glycine et/ou au moins une sérine. 13. Protéine, selon la revendication 12, caractérisée en ce que ladite région de liaison a pour séquence l'une quelconque des séquences SEQ ID N 12, SEQ ID N 14, SEQ ID N 16 ou SEQ ID N 18. 14. Protéine, selon la revendication 11 à 13, caractérisée en ce que ladite région de fixation est un peptide situé à l'une quelconque des extrémités N ou C- terminales de ladite protéine recombinante chimérique. 15. Protéine, selon la revendication 11 à 14, caractérisée en ce que ladite région de fixation est une région riche en histidines et ses dérivés, tel qu'une région contenant une densité d'histidines, supérieure ou égale à 25%, et préférentiellement supérieure ou égale à 33%. 16. Protéine selon la revendication 15 caractérisée en ce que la région de fixation comporte au moins quatre histidines et préférentiellement six histidines adj acentes. 17. Protéine selon la revendication 11 à 16 caractérisée en ce que ladite région de fixation est un peptide comprenant au moins une lysine. 18. Protéine selon la revendication 17 caractérisée en ce que ladite région de fixation a pour séquence SEQ ID N 22, 24 ou 26. 19. Vecteur d'expression comprenant un ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 10. 20. Utilisation d'au moins un ADN selon l'une quelconque des revendications 1 ou 10 et/ou d'au moins une protéine recombinante chimérique selon l'une quelconque des revendications 11à 18pour le diagnostic in vitro.