Brevet FR2842424A1 — publié le 20040123

Utilisation du NAD ou de l'un de ses analogues, substrat des mono-ADP- ribosyl transferases, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies liées aux récepteurs purinergiques. La présente invention est relative à l'utilisation du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) ou d'au moins un de ses analogues, substrat des mono-ADP-ribosyl transférases (ART) dans la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité d'au moins un récepteur purinergique, avantageusement de type P2X ou P2Y, ledit médicament étant particulièrement destiné au traitement des pathologies dans lesquelles les récepteurs purinergiques participent au processus physiopathologique ou des pathologies liées à une dérégulation de l'activité des récepteurs purinergiques. L'analyse du génome de nombreuses espèces ne cesse de révéler de nouvelles protéines capables de lier les purines naturelles que sont l'adénosine, l'adénosine triphosphate (ATP) ou le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) et qui interviennent dans la communication cellulaire par des actions pharmacologiques spécifiques. Il s'agit en particulier des récepteurs purinergiques de type P1, principalement sensibles à l'adénosine, ou P2, principalement sensibles à l'ATP, et des adénosine diphosphate-ribosyl transférases (ADP-ribosyl transférases) qui ont une activité enzymatique qui leur permet de transférer un groupement ADP-ribose du NAD sur des protéines cibles. Il est connu que l'ATP, outre son rôle de co-facteur enzymatique et son rôle dans la formation de liaisons phosphates, est aussi un messager extracellulaire impliqué dans de nombreux processus biologiques, produisant ces effets via une famille particulière de récepteurs purinergiques présents à la surface des cellules de nombreux tissus, les récepteurs P2. Les récepteurs P2 existent sous la forme de deux familles distinctes, les récepteurs P2X dont il est connu sept isoformes (P2Xi.7) et qui sont des canaux ioniques qui sont constitués après activation par la formation d'homo- ou d'hétéro-polymères dans les membranes, et les récepteurs P2Y, protéines à sept domaines transmembranaires, qui sont couplés aux protéines G et dont il est connu 11 isoformes (P2Y1-11) Les récepteurs P2, du fait de leur présence dans de nombreux tissus, sont impliqués dans une grande variété de fonctions biologiques et ainsi potentiellement impliqués dans de nombreuses pathologies comme par exemple et sans limitation, les maladies neurologiques et neurodégénératives, les maladies cardiovasculaires et l'ischémie, les maladies inflammatoires systémiques, le cancer ou encore les maladies autoimmunes comme le diabète. On peut à cet égard se référer à la revue de G. Burnstock et M. Williams (The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2000, 295 :862-869). Les récepteurs P2X et P2Y sont décrits dans les systèmes nerveux central et périphérique sur lesquels on sait que l'ATP produit des effets aussi bien sédatifs qu'excitants. Ils sont aussi décrits dans le système auditif. Il en est de même dans le système oculaire où les récepteurs P2X et P2Y seraient impliqués dans la régulation des flux sanguins rétiniens et de la pression intraoculaire qui peut être réduite par l'utilisation d'analogues de l'ATP via les récepteurs P2. A l'inverse, une activation du récepteur P2Y2 entraîne une augmentation des sécrétions oculaires, ce qui permet d'envisager l'utilisation d'activateur de ces récepteurs P2 pour le traitement des pathologies liées à la sécheresse oculaire. Au niveau rétinien, l'augmentation de l'activité des récepteurs P2Y2 serait impliquée dans les décollements de la rétine. Des antagonistes des récepteurs P2X sont décrits comme de potentiels agents anti-épileptiques. Il a été montré que des souris déficientes en récepteur P2X3 présentent une perception de la douleur fortement diminuée. Dans cet ordre d'idée, des antagonistes des récepteurs P2 présentent des propriétés analgésiques. L'implication des récepteurs P2 est aussi décrite dans les phénomènes d'homéostasie cellulaire, dans les processus de neuroviabilité et de neurorégénération ainsi que dans les pathologies neurodégénératives, dans les pathologies de l'incontinence urinaire (P2X), dans le psoriasis (P2X), dans la sclérodermie (P2X), l'infertilité masculine (P2X) ou encore dans les carcinomes cellulaires basaux. Des souris déficientes en récepteurs P2Y1 présentent une résistance accrue aux thromboses. Des antagonistes des récepteurs P2Y sont connus comme présentant une activité anti-thrombique. Il est également évoqué que la modulation de l'activité des récepteurs P2 (X et Y) pourrait être un traitement potentiel de l'ostéoporose, de l'arthrite rhumatoïde, de la périodontite ou encore de l'ostéopénie. L'augmentation des sécrétions dans le colon et les canaux biliaires et pancréatiques, de même que la sécrétion de l'insuline par le pancréas sont décrites comme liées à une modification de l'activité des récepteurs P2Y. L'implication des récepteurs purinergiques est aussi décrite dans les maladies inflammatoires systémiques telles le lupus ou la polyarthrite, les maladies inflammatoires du colon, le cancer et les maladies autoimmunes comme le diabète. L'implication des récepteurs P2X dans l'apoptose cellulaire est bien décrite. L'activation des récepteurs P2 déclenche l'apoptose pour faciliter l'embryogenèse, mais également pour éliminer des tissus les cellules cancéreuses ou infectées. L'activation du récepteur P2X via l'ATP, induit une cytolyse des macrophages infectés, ce qui représente une voie potentielle de traitement des pathologies infectieuses, comme cela est par exemple décrit pour le traitement de la tuberculose (Stober C. B. et al., The Journal of Immunology, 2001, 166 : 6276-6286). On comprend de ce qui précède l'importance des récepteurs purinergiques, particulièrement des récepteurs P2, (P2X et P2Y), et de la modulation de leur activité dans les mécanismes biologiques. Cependant, il apparaît que peu de modulateurs (agonistes ou antagonistes) de l'activité des récepteurs P2 ont été décrits, n'offrant ainsi qu'un nombre restreint d'agents potentiellement utilisables dans la voie de la modulation de l'activité des récepteurs purinergiques pour le traitement desdites pathologies (voir le document G. Burnstock et M. Williams, précédemment cité). Il reste donc un réel besoin pour de nouveaux modulateurs de l'activité des récepteurs purinergiques. C'est un des buts de la présente invention que de fournir de tels modulateurs. Par ailleurs, parmi les ADP-ribosyl transférases, les monoADP-ribosyl transférases (ART) sont connues depuis longtemps car elles correspondent aux toxines de nombreuses bactéries pathogènes comme Corynebacterium diphteriae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bordetella petrussis, Clostridium botulinum, Vibrio cholerae ou encore certaines salmonelles (Schmitt et al., Emerging Infectious Diseases, 5 : 224, 1999) , Ce n'est que récemment que l'existence d'ART a été décrite chez les vertébrés. On en connaît aujourd'hui au moins 5 isôformes (Haa g et Koch-Nolte, J. Biol Regul. Homeost. Agents, 1998,12 ; 53. Okazaki et Moss, Ann. Rev. Nutr. 1999,19 : 485). Chez l'Homme, la .souris ou le rat, ces protéines sont en majorité des protéines membranaires glypiées, ancrées dans la membrane par un groupement phosphatidyl innositol (GPI anchored). Elles sont donc présentes à la surface des cellules mais peuvent être relarguées dans certaines conditions grâce, en particulier, à l'intervention de métalloprotéases (Kahl et al., J. Immunol., 2000,165 : 4463-4469). On sait encore peu de choses sur le rôle de ces ART. Elles sont capables de fixer un groupement ADP-ribose à partir du NAD sur les arginines, les cystéines, les asparagines ou les acides glutamiques de protéines cibles. Chez certaines souches de souris, cela peut aussi conduire à une inhibition de la migration cellulaire par ADP-ribosylation des intégrines et à un blocage des interactions cellulaires. Chez l'homme, l'activité des ART1 dans la peau semble conduire à une ADP-ribosylation de facteurs de croissances comme le facteur de croissance fibroblastique (FGF) et de son récepteur, modifiant ainsi l'homéostasie du tissu. D'une manière plus générale, des déficits dans l'expression des ART ont été décrits, chez le rat et chez la souris, comme des facteurs de prédisposition au diabète et aux maladies auto-immunes, ce qui confirme leur intervention vraisemblable dans la régulation de l'immunité naturelle et acquise. Récemment, le sous-type ART2. 2 a été décrit comme sélectivement présent dans les lymphocytes T matures de souris (Koch-Nolte et al., J.Immunol., 1999, 163 :6014) Le NAD est connu pour ces propriétés antagonistes des narcotiques et son utilisation comme produit dissuasif dans le traitement de l'alcoolisme. A ce jour aucun lien n'a été établi entre les ART, leur activité d'ADP-ribosylation et les récepteurs purinergiques, particulièrement ceux de type P2. Or de manière surprenante, les inventeurs viennent maintenant de démontrer que l'utilisation de NAD ou de ses analogues, substrat des ART, peut entraîner un effet pharmacologique lié à la modulation de l'activité des récepteurs purinergiques, particulièrement ceux de type P2. II a été démontré que le NAD, via une ART, particulièrement le sous-type ART2. 2, induit rapidement l'apoptose des lymphocytes T naïfs chez la souris (Adriouch et al., J. Immunol., 2001, 167: 196-203). Les inventeurs ont maintenant démontré qu'un analogue du NAD, l'éthéno-NAD, qui ne diffère du NAD que par une modification du groupement adénosine, mais qui demeure un substrat efficace des ART, particulièrement le sous-type ART2. 2, n'induit pas l'apoptose des lymphocytes T naïfs chez la souris. Cela suggère donc l'existence d'un effecteur secondaire sensible à l'adénosine et non à ses analogues, dont la modulation de l'activité conduit au déclenchement de l'apoptose induite par le NAD via les ART. Les inventeurs ont de manière surprenante découvert que cet effecteur est un récepteur purinergique de type P2X7. L'utilisation d'inhibiteurs des récepteurs P2X7 bloque en effet l'apoptose ART-dependante induite par le NAD. De plus les inventeurs ont démontré que cet effet pharmacologique du NAD sur les lymphocytes T via les récepteurs purinergiques s'exerce à des concentrations cent fois inférieures à celles requises pour induire le même phénomène, via une activation directe par l'ATP des récepteurs purinergiques. Cela démontre qu'il est possible de moduler l'activité des récepteurs purinergiques par une ADP-ribosylation induite par le NAD ou ses analogues, substrat des ART, et qu'ainsi il doit être possible de moduler les effets pharmacologiques dépendants desdits récepteurs et ce à des concentrations plus faibles que celles nécessaires pour obtenir des effets identiques avec les ligands libres spécifiques des récepteurs purinergiques. C'est cette découverte qui est à la base de la présente invention. En effet, cela ouvre une nouvelle voie de modulation de l'activité des récepteurs purinergiques et en conséquence de nouvelles voies dans le traitement des pathologies liées à une dérégulation de l'activité des récepteurs purinergiques. Ainsi, l'invention a pour objet l'utilisation du NAD ou d'au moins un de ses analogues, substrat des mono-ADP-ribosyl transférases (ART) dans la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité d'au moins un récepteur purinergique, avantageusement de type P2X ou P2Y. Par modulation de l'activité d'au moins un récepteur purinergique on entend une activation ou une stimulation ou une diminution ou une inhibition de l'activité dudit récepteur. Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le médicament est destiné au traitement des pathologies liées à une dérégulation de l'activité d'au moins un récepteur purinergique, particulièrement un récepteur de type P2X ou P2Y. Par pathologies liées à une dérégulation de l'activité d'au moins un récepteur purinergique, on entend les pathologies liées soit à l'apparition, l'augmentation, la diminution ou la disparition de l'activité dudit récepteur. Par analogues du NAD substrats des ART on entend selon l'invention, des molécules sur lesquelles ont été introduites des modifications du groupement nicotinamide, des modifications de la liaison 5'-5' pyrophosphate, des modifications du groupement ribose de la partie ADP du NAD, des modifications du groupement adénine ou une combinaison de ces différentes modifications. A titre d'exemple d'analogues du NAD connus utilisables selon l'invention on peut citer l'éthéno-NAD, le nicotinamide hypoxanthine dinucléotide (NHD) ou le nicotinamide guanosine dinucléotide (NGD). Les travaux de Kim et al., (EMBO Journal, Vol. 20, N 22, pp 6347-6358, 2001)montrent que dans les cellules embryonnaires humaines de rein, le récepteur P2X7 est associé à 11 autres protéines, dont certaines pourraient avoir un rôle régulateur du récepteur P2X7. Ainsi, la modulation de l'activité des récepteurs purinergiques par une ADP-ribosylation induite par le NAD ou ses analogues, substrat des ART, peut se faire soit par ADP-ribosylation directe des récepteurs purinergiques, soit par ADP-ribosylation d'autres facteurs protéiques environnants qui eux-mêmes interviendraient alors sur les récepteurs purinergiques. Les différentes ART ainsi que les différents récepteurs purinergiques ont des distributions ubiquitaires dans l'organisme. Plusieurs ART et plusieurs récepteurs purinergiques peuvent être présents sur une même cellule. Cependant ni toutes les ART, ni tous les récepteurs purinergiques ne sont présents sur tous les types cellulaires. Ainsi, il peut exister à la surface des cellules des couples ART/récepteurs purinergiques spécifiques d'un type cellulaire considéré. Dès lors il est envisageable d'utiliser des analogues du NAD spécifiques d'une ART particulière, elle-même impliquée dans un couple ART/récepteurs purinergiques spécifique d'un type cellulaire donné, pour moduler spécifiquement l'activité dudit récepteur purinergique. Les nombreuses fonctions biologiques dans lesquelles les récepteurs purinergiques sont impliqués, permettent d'envisager l'utilisation du NAD ou d'au moins un de ses analogues, substrat des mono-ADP-ribosyl transférases (ART) dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies des systèmes nerveux central et périphérique, comme les troubles neurologiques ou les pathologies neurodégénératives, particulièrement en intervenant sur les processus de neuroviabilité et de neurorégénération, au traitement des pathologies du système cardiovasculaire, particulièrement les thromboses comme agent antithrombique, au traitement des pathologies du système auditif, au traitement des pathologies du système oculaire particulièrement celles liées à la régulation des flux sanguins rétiniens et de la pression intraoculaire ou encore celles liées à la sécheresse oculaire par une augmentation des sécrétions oculaires ou encore le traitement des décollements de la rétine, au traitement de la douleur par exemple comme analgésiques, au traitement des pathologies inflammatoires systémiques comme l'arthrite rhumatoïde, le lupus ou encore la polyarthrite, au traitement des pathologies du système gastrointestinal comme les pathologies inflammatoires du colon ou les pathologies nécessitant une modulation des sécrétions dans le colon ou les canaux biliaires, au traitement des pathologies autoimmunes comme le diabète, par exemple par la stimulation de la sécrétion de l'insuline par le pancréas, au traitement du cancer et des carcinomes cellulaires basaux, au traitement de l'épilepsie, au traitement de l'incontinence urinaire, du psoriasis, de la sclérodermie, de l'infertilité masculine, de l'ostéoporose, de la périodontite ou encore de l'ostéopénie, au traitement des pathologies infectieuses. L'invention a aussi pour objet un procédé d'évaluation de l'effet modulateur d'une mono-ADP-ribosyl transférase présente à la surface d'une cellule, sur un récepteur purinergique présent à la surface de la même cellule, caractérisé en ce que dans une première étape on met en contact ladite cellule avec un composé connu comme substrat de ladite mono-ADPribosyl transférase, et que dans une deuxième étape on évalue par tout moyen approprié le niveau d'activité dudit récepteur purinergique dans lesdites cellules par rapport au niveau d'activité du même récepteur dans des cellules témoins, placées dans les mêmes conditions expérimentales. L'invention a également pour objet un procédé d'évaluation de l'effet d'un composé, substrat d'une mono-ADP-ribosyl transférase, sur les récepteurs purinergiques, caractérisé en ce que dans une première étape on met en contact ledit composé avec des cellules porteuses de ladite monoADP-ribosyl transférase et d'au moins un récepteur purinergique et que dans une deuxième étape on évalue par tout moyen approprié le niveau d'activité du récepteur purinergique dans lesdites cellules par rapport au niveau d'activité du même récepteur dans des cellules témoins placées dans les mêmes conditions expérimentales. Dans les procédés selon l'invention, les cellules témoins sont des cellules qui, dans les mêmes conditions expérimentales, soit n'ont été mises en contact avec aucun composé substrat des mono-ADP-ribosyl transférases, susceptible d'induire un effet sur les récepteurs purinergiques, soit ont été mises en contact avec un composé substrat des mono-ADPribosyl transférases, connu pour avoir un effet sur les récepteurs purinergiques. De même, les moyens appropriés pour évaluer le niveau d'activité du récepteur purinergique sont ceux que connaît l'homme du métier dans la mesure où il sait évaluer, indépendamment de tout effet dû à une mono-ADP-ribosyl transférase, l'activité du récepteur purinergique. On peut citer à titre d'exemple la détection d'un marqueur de ladite activité du récepteur purinergique par des anticorps spécifiques dudit marqueur, l'induction de flux calciques, l'activation de protéines G, la synthèse d'AMP-cyclique, l'ouverture d'un canal ionique détectable en électrophysiologie, l'induction d'une perméabilité à des molécules comme le YOPRO-1 ou le bromure d'éthidium, l'expression des phosphatidyl serines détectable par l'annexine-V, l'apoptose mesurée par l'analyse de la fragmentation de l'ADN, la sécrétion de cytokines, sans que cette liste soit limitative . Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'Invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : La Figure 1 représente les résultats des expériences réalisées en vue de démontrer l'implication des ART2 dans l'apoptose des cellules T. - Les Figures 2 et 3 représentent les résultats des expériences réalisées en vue de montrer les effets d'un analogue du NAD sur les cellules T. - La Figure 4 représente les résultats des expériences réalisées en vue de montrer les effets du NAD et de l'ATP sur la formation de pores membranaires dans les cellules de ganglions lymphatiques. - La Figure 5 représente les résultats des expériences réalisées en vue de montrer que l'apoptose des lymphocytes T, induite par le NAD, passe par l'activation du récepteur P2X7. - Les Figures 6 et 7 représentent les résultats des expériences réalisées en vue de montrer que l'apoptose des lymphocytes T, induite par le NAD, requiert la présence d'une ART2. - La Figure 8 représente les résultats des expériences réalisées en vue de montrer que l'apoptose cellulaire induite par le NAD requiert la présence simultanée d'une ART2 et du récepteur P2X7. Les exemples suivants sont illustratifs de l'invention et ne la limitent aucunement. EXEMPLE 1 : Matériel et Méthodes 1. Produits L'adénosine triphosphate (ATP), le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), l'éthéno-NAD, le nicotinamide hypoxanthine dinucléotide (NHD), le nicotinamide guanosine dinucléotide (NGD), l'ATP oxydé (oATP), benzoyl-benzoyl ATP (bzATP) sont vendus par la société SIGMA ; le YOPROYellow (ou YOPRO-1) est vendu par la société Molecular Probes. La molécule KN62, l'acide pyridoxal-phosphate-6-azophenyl- 2',4'-disulfonic (PPADS) ou la suramine sont vendus par la société SIGMA. Le milieu RPMI est vendu par la société INVITROGEN. 2. Cellules, anticorps et analyse par immunofluorescence : L'anticorps monoclonal spécifique de l'ART2-2, NIKA102, (IgG2a de rat) a été produit selon la méthode décrite par Koch-Nolte F. et al., (J. Immunology, 1999, 163 : 6014). Les suspensions de cellules individualisées issues de thymus, de rate ou de ganglion lymphatique ont été analysées par cytométrie de flux à l'aide d'un FACScan (Becton Dickinson) selon la méthode décrite par KochNolte F. et al , (J. Immunology, 1999, 163 : 6014). Lorsque nécessaire, la déplétion en cellule B a été réalisée par la technique de séparation cellulaire à l'aide d'anticorps anti-souris de chèvre (IgG) immobilisées sur billes magnétiques Dynabead (Dynal, Hambourg, Germany). L'anticorps monoclonal de souris 1 G4 (IgG2a) spécifique de l'éthéno-adénosine a été produit selon la méthode décrite par Young and Santella (Carcinogenesis, 1988,9 : 589) Les autres anticorps monoclonaux utilisés dans les essais d'immunofluorescence, anti-CD3e (145-2C11), anti-CD4 (GK1. 5), anti-CD8 (53-6. 72) proviennent de la société CALTAG. La biotine, la phycoérythrine (PE) et la fluorescéine isothiocyanate (FITC) proviennent de la société Pharmigen (BectonDickinson/Pharmigen). L'anticorps GK1.5 (anti-CD4) a été marqué avec l'indocarbocyanine Cy3TM selon la méthode décrite par Koch-Nolte F. et al., (J. Immunology, 1999, 163 : 6014). 3. Exposition des phosphatidylsérines et formation des pores membranaires : Les cellules apoptotiques et nécrotiques ont été marquées avec le conjugué annexine-V-FITC ou de l'iodure de propidium, tel que décrit dans Koch-Nolte F. étal., (J. Immunology, 1999,163 : 6014). Après traitement au NAD ou à l'ATP à 37 C, les cellules ont été lavées en milieu RPMI additionnée de 2 mM de CaCl2, puis marquées dans le même milieu pendant 20 minutes sur de la glace avec du conjugué annexine-V-FITC (1 g/ml) et de l'iodure de propidium (10 g/ml), ou des IgG anti-souris PE-conjuguées. L'exposition des phosphatidylsérines à la surface cellulaire, signe précoce de l'apoptose détectable grâce à l'annexine-V, est alors mesurée par cytométrie de flux avec le conjugué annexine-V-FITC. Pour les essais de formation de pores perméables au YOPRO-1, les cellules ont d'abord été incubées en présence des nucléotides dans du milieu RPMI à 37 C. Le YOPRO-1 (concentration finale de 10 g/ml) est ajouté dans les 2 dernières minutes de l'incubation. Les cellules sont placées sur la glace et lavées avec du milieu réfrigéré à la température de la glace puis contrecolorées pendant 20 minutes à 4 C avec du conjugué annexine-V-FITC (1 g/ml), de l'iodure de propidium (10 g/ml) ou des IgG anti-souris PE-conjuguées. La coloration des cellules au bromure d'éthidium (1 g/ml) est réalisée dans du milieu RPMI en présence des nucléotides à 37 C. Les cellules ont ensuite été lavées et contrecolorées au conjugué annexine-V-FITC pendant 20 minutes sur de la glace. La formation de pores perméables est ensuite mesurée par la mesure de l'incorporation de YOPRO-1 et du bromure d'éthidium en cytométrie de flux. 4. Protection des cellules contre l'apoptose par préincubation avec des anticorps, de l'éthéno-NAD ou des antagonistes P2X7 : Les cellules ont été préincubées soit 30 minutes sur de la glace dans du milieu RPMI contenant des anticorps anti-ART2 spécifiques (à 3 g/ml), soit pendant 45 minutes à 37 C en milieu complet (RPMI additionné de 10 % de sérum de veau foetal, de pyruvate, de glutamate)), contenant 10- 50 M d'éthéno-NAD ou encore pendant 2 heures à 37 C en milieu complet contenant des antagonistes P2X7 aux concentrations indiquées. Les cellules ont ensuite été incubées en milieu RPMI contenant du NAD, de l'ATP pendant 30 minutes à 37 C et soumises à une coloration avec de l'annexine-V, de l'iodure de propidium, du YOPRO-1 ou des anticorps fluorescents selon la méthode décrite précédemment. EXEMPLE 2 : des cellules T est induite au travers de l'ADP-ribosylation des protéines cellulaires de surface catalysée par les ART2 : L'incubation des cellules T de ganglions lymphatiques en présence de NAD exogène (10 M) induit rapidement l'exposition de phosphatidylsérines, un signe précoce de l'apoptose (Figure 1A, encart central). A l'inverse, l'ADP-ribose, qui peut être généré à partir du NAD par les NAD-glycohydrolases, n'induit pas l'apoptose, même à des concentrations 100 fois supérieures (1 mM) (Figure 1A, encart droit). L'exposition de phosphatidylsérines induite par le NAD peut être prévenue par pré-incubation des cellules avec un mélange d'anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine de surface ADP-ribosyltransferase ART2. 2 (Figure 1 B, encart droit). Cela indique que l'ADP-ribosylation NAD-dépendante d'autres protéines de la surface cellulaire, catalysée par l'ART2.2, déclenche l'apoptose des cellules T. EXEMPLE 3 : L'éthéno-ADP-ribosylation des protéines de surface prévient l'apoptose NAD induite : L'analogue du NAD, l'éthéno-NAD est un substrat efficace des ecto-ART2. 2 et l'éthéno-ADP-ribosylation des protéines de surface peut être facilement suivie par cytométrie de flux avec l'anticorps anti-éthéno-adénosine 1 G4 (Figure 2A, encart central). L'incubation des cellules T avec de l'éthénoNAD n'induit pas l'apoptose (Figure 2B, encart central), malgré une incorporation efficace d'éthéno-ADP-ribose dans les protéines de la surface cellulaire. Cela suggère que l'ADP-ribosylation, mais non l'éthéno-ADPribosylation d'un même effecteur secondaire, peut déclencher l'apoptose. Cela est démontré par un traitement préventif des cellules avec de l'éthéno-NAD, qui prévient l'induction de l'apoptose par un traitement subséquent des cellules avec du NAD (Figure 2C). La préincubation avec de l'éthéno-NAD protège les cellules de l'exposition des phosphatidylsérines induite par le NAD et de l'apoptose. EXEMPLE 4 : nicotinamide hypoxanthine dinucléotide (NHD) et le nicotinamide guanosine dinucléotide (NGD) préviennent l'apoptose NAD induite : Le nicotinamide hypoxanthine dinucléoide (NHD) et le nicotinamide guanosine dinucléotide (NGD) sont des analogues structuraux du NAD. L'incubation des cellules T avec des concentrations croissantes de NHD (Figure 3A) ou de NGD (Figure 3B) pendant 30 minutes à 37 C n'induit pas l'apoptose. Cependant, la préincubation des mêmes cellules avec des concentrations croissantes de NHD (Figure 3A) ou de NGD (Figure 3B) pendant 15 minutes, suivi d'une incubation avec 30 M de NAD pendant 30 minutes, prévient l'exposition des phosphatidylsérines induite par le NAD et l'apoptose. Ces observations démontrent, comme dans le cas de l'éthéno-NAD, que le NGD et le NHD sont de substrats des ART. Comme l'éthéno-NAD, les NHD et le NGD ne sont pas des analogues agonistes du NAD mais des antagonistes qui inhibent son activité. Elles démontrent également qu'une modification du groupement adénosine du NAD est compatible avec le maintien de la propriété de substrat des ART mais prévient la capacité d'induire un signal apoptotique. EXEMPLE 5 : traitement des cellules T déclenche la formation de pores membranaires perméables au YOPRO-1, colorant de l'ADN : Le NAD et l'éthéno-NAD ne différent que par le groupement adénosine. La découverte que l'ADP-ribosylation, mais pas l'éthéno-ADPribosylation, induit l'apoptose indique qu'un effecteur secondaire essentiel de l'apoptose NAD-induite doit être sensible à une différence dans le groupement adénosine. Le récepteur P2X7 est décrit comme impliqué dans la formation de pores membranaires, induite par l'ATP, qui peut être facilement suivie par la capture de colorant de l'ADN tels que le bromure d'éthidium ou le YOPRO-1. Les résultats présentés à la Figure 4A montrent que l'incubation de cellules de ganglions lymphatiques avec soit de l'ATP exogène, soit du NAD, résulte en une coloration des cellules par le bromure d'éthidium ou le YOPRO-1. La capture du colorant de l'ADN suit rapidement l'exposition des phosphatidylsérines et est complète après 30 à 45 minutes d'exposition au NAD (Figure 4B). EXEMPLE 6 : prétraitement des cellules T prévient l'apoptose NAD-induite : Les résultats présentés à la Figure 5A, obtenus par cytométrie de flux montrent qu'une préincubation des cellules avec de l'o-ATP, qui se fixe irréversiblement au récepteur P2X7 et bloque sa capacité à induire la formation de pores membranaires, bloque l'apoptose NAD-induite des cellules T. De manière similaire, d'autres antagonistes des récepteurs P2X7 comme le KN62, le PPADS ou la suramine bloquent l'induction de l'apoptose NADinduite des cellules T (Figure 5B). Ces résultats suggèrent que l'apoptose induite par le NAD passe par l'activation du récepteur P2X7. EXEMPLE 7 : induite par le NAD, mais pas celle induite par l'ATP, requiert la présence d'une ART2 : Les résultats présentés dans la Figure 6 montrent que des cellules T déficientes en ART2~(W Ohlrogge, et al., T cells of ART2 knockout mice can not ADP-ribosylate cell surface proteins and are less sensitive to NAD-mediated supression of proliferation, Immunobiol., 2000,203, 181) (Figure 6B), ayant perdu la capacité d'ADP-ribosylation des protéines cellulaires de surface, sont aussi sensibles à l'apoptose ATP-induite que des cellules T de souris normales non déficientes (Figure 6A) ayant conservé la capacité d'ADP-ribosylation des protéines cellulaires de surface. Au contraire, les cellules T ART2-déficientes sont totalement résistantes à l'apoptose NAD induites. Cela confirme l'existence d'un effet du NAD sur le récepteur P2X7 via une ADP-ribosylation directe du récepteur ou via une ADPribosylation de protéines de la surface cellulaire agissant sur le récepteur. Le fait que le NAD n'affecte pas directement le récepteur P2X7 est confirmé par le fait qu'un pré-traitement des cellules avec de l'éthéno-NAD (eNAD) (Figure 7B) bloque l'apoptose NAD-induite mais pas l'apoptose ATPinduite (bzATP). Cet effet est à comparer à celui obtenu sans prétraitement à l'éthéno-NAD (Figure 7A). EXEMPLE 8 : Effet-dose de l'ATP et du NAD sur l'apoptose induite : Les résultats présentés dans les Figures 6 et 7 montrent des différences dans la coloration à l'annexine-V induite par le NAD ou par l'ATP. La réponse à l'ATP montre un effet de seuil : en dessous de 50 M, l'ATP n'induit pas l'apoptose alors que celle-ci est induite par des doses d'ATP de 100 M et plus. Au contraire, le NAD induit immédiatement la coloration des cellules à l'annexine-V à une concentration aussi basse que 1 M. EXEMPLE 9 : Seules les cellules transfectées par l'ART2 et le récepteur P2X7 sont sensibles à l'apoptose induite par le NAD : 1. Clonage du P2X7 et de L'ART2.2 : Les ADNc de lymphocytes T purifiés provenant de la souris BALB/c ont été préparés puis amplifiés par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en utilisant des amorces nucléotidiques spécifiques du gène codant pour le P2X7 de souris décrites par ailleurs (Chessell, I. P. et al., 1998. Cloning and functional characterisation of the mouse P2X7 receptor., FEBS Lett., 439 : 26). L'enzyme utilisée dans cette réaction de PCR est une polymérase de fidélité supérieure (High fidelity Platinium Taq polymerase, Invitrogen). Le produit de la réaction de PCR a ensuite été cloné dans le vecteur commercial pCRBlunt-Topo (Invitrogen) en utilisant les recommandations du fabricant. La séquence nucléotidique du gène ainsi inséré dans ce vecteur a ensuite été vérifiée par séquençage (Génome Express, Montreuil, France). Le gène a ensuite été sous-cloné dans le vecteur d'expression pCDNA6/V5-HisB (Invitrogen) en utilisant les techniques standards de clonage. Le clonage du gène codant pour l'ART2.2 a été décrit en détail dans la publication de Koch-Nolte, F., et al., 1999. A new monoclonal antibody detects a developmentally regulated mouse ecto-ADPribosyltransferase on T cells: subset distribution, inbred strain variation, and modulation upon T cell activation. J. Immunol., 163 : 6014) 2. Transfection et expression dans les cellules HEK293 : Les transfections ont été réalisées en combinant 1 g de l'un ou l'autre des vecteurs codant pour le gène d'intérêt avec le réactif de transfection FuGENE 6 (ROCHE) en respectant les recommandations du fournisseur. Les cellules utilisées dans ces expériences sont des cellules HEK293 qui proviennent de l'American Type Cell collection (ATCC nb : CRL- 1573). Ces cellules ont été transfectées puis sélectionnées par la généticine 600 g/ml ou la blasticidine 6 g/ml (Invitrogen) pendant une semaine avant d'être analysées pour leurs sensibilités au NAD et à l'ATP. Les cellules HEK293 transfectées par les deux gènes ont d'abord été transfectées par le gène codant par le P2X7, sélectionnées pendant une semaine par la blasticidine 6 g/ml avant d'être transfectées par le gène codant pour l'ART2.2 puis sélectionnées par la généticine 600 g/ml et enfin analysées pour leurs sensibilités au NAD et à l'ATP. 3. Analyse de la sensibilité à l'apoptose induite par le NAD ou l'ATP Les cellules HEK293 transfectées ont été préalablement décollées des flasques de culture par traitement à la trypsine, puis incubées à 37 C pendant 1 heure dans du milieu de culture complet (DMEM/F12, Invitrogen). Ces cellules ont été ensuite traitées par de l'ATP ou du NAD à la concentration indiquée pendant 30 min à 37 C avant d'être lavées puis marquées par l'annexine-V-FITC (BD Biosciences) et l'iodure de propidium (BD Biosciences) comme décrit dans les exemples précédents. Les cellules ainsi traitées ont ensuite été analysées en cytomètrie de flux. Les résultats présentés sur la Figure 8A, montrent que les cellules HEK293 non transfectées sont résistantes à l'apoptose induite par le NAD ou l'ATP, même à de fortes concentrations. La Figure 8B montre que les cellules HEK293 transfectées par le récepteur P2X7 sont sensibles à l'apoptose induite par l'ATP mais pas à celle induite par le NAD. La Figure 8C révèle que seule les cellules double transfectées par les gènes codant pour l'ART2 et le récepteur P2X7 sont sensibles à l'apoptose induite par le NAD. Les résultats présentés dans les exemples précédents démontrent qu'il existe une voie de modulation de l'activité des récepteurs purinergiques, très puissante, via l'ADP-ribosylation induite par le NAD, soit directement sur les récepteurs soit au travers de l'ADP-ribosylation de protéines membranaires qui agiraient alors sur les récepteurs et leur activité. 1. Utilisation du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) ou d'au moins un de ses analogues, substrat des mono-ADP-ribosyl transférases (ART) dans la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité d'au moins un récepteur purinergique. 2. Utilisation selon la revendication 1, dans la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité d'au moins un récepteur purinergique de type P2X ou P2Y. 3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans la préparation d'un médicament destiné à activer ou stimuler ou diminuer ou inhiber l'activité d'au moins un récepteur purinergique. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies liées à une dérégulation de l'activité d'au moins un récepteur purinergique. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies des systèmes nerveux central et périphérique, comme les troubles neurologiques ou les pathologies neurodégénératives, particulièrement en intervenant sur les processus de neuroviabilité et de neurorégénération, au traitement des pathologies du système cardiovasculaire, particulièrement les thromboses comme agent antithrombique, au traitement des pathologies du système auditif, au traitement des pathologies du système oculaire particulièrement celles liées à la régulation des flux sanguins rétiniens et de la pression intraoculaire ou encore celles liées à la sécheresse oculaire par une augmentation des sécrétions oculaires ou encore le traitement des décollements de la rétine, au traitement de la douleur par exemple comme analgésiques, au traitement des pathologies inflammatoires systémiques comme l'arthrite rhumatoïde, le lupus ou encore la polyarthrite, au traitement des pathologies du système gastrointestinal comme les pathologies inflammatoires du colon ou les pathologies nécessitant une modulation des sécrétions dans le colon ou les canaux biliaires, au traitement des pathologies autoimmunes comme le diabète, par exemple par la stimulation de la sécrétion de l'insuline par le pancréas, au traitement du cancer et des carcinomes cellulaires basaux, au traitement de l'épilepsie, au traitement de l'incontinence urinaire, du psoriasis, de la sclérodermie, de l'infertilité masculine, de l'ostéoporose, de la périodontite ou encore de l'ostéopénie, au traitement des pathologies infectieuses. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'analogue du NAD, substrat d'au moins une des ART, est choisi parmi des molécules sur lesquelles ont été introduites des modifications du groupement nicotinamide, des modifications de la liaison 5'-5' pyrophosphate, des modifications du groupement ribose de la partie adénosine diphosphate (ADP) du NAD, des modifications du groupement adénine ou une combinaison de ces différentes modifications. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'analogue du NAD, substrat d'au moins une des ART, est choisi parmi l'éthéno-NAD, le nicotinamide hypoxanthine dinucléotide (NHD) ou le nicotinamide guanosine dinucléotide (NGD). 8. Procédé d'évaluation de l'effet modulateur d'une monoADP-ribosyl transférase présente à la surface d'une cellule, sur un récepteur purinergique présent à la surface de la même cellule, caractérisé en ce que dans une première étape on met en contact ladite cellule avec un composé connu comme substrat de ladite mono-ADP-ribosyl transférase, et que dans une deuxième étape on évalue par tout moyen approprié le niveau d'activité dudit récepteur purinergique dans lesdites cellules par rapport au niveau d'activité du même récepteur dans des cellules témoins, placées dans les mêmes conditions expérimentales. 9. Procédé d'évaluation de l'effet d'un composé, substrat d'une mono-ADP-ribosyl transférase (ART), sur les récepteurs purinergiques, caractérisé en ce que dans une première étape on met en contact ledit composé avec des cellules porteuses d'au moins ladite mono-ADP-ribosyl transférase (ART) et d'au moins un récepteur purinergique et que dans une deuxième étape on évalue par tout moyen approprié le niveau d'activité du récepteur purinergique dans lesdites cellules par rapport au niveau d'activité du même récepteur dans des cellules témoins placées dans les mêmes conditions expérimentales.