Brevet FR2842518A1 — publié le 20040123

Dérivés de saccharides et d'itols possédant un groupement O-alkyle ou un groupement O-alkyle et un groupement O-n-butanoyle. Applications comme médicaments dans les pathologies prolifératives tumorales ou bénignes. La présente invention concerne des dérivés de saccharides et d'itols possédant un groupement O-alkyle ou un groupement O-alkyle et un groupement O-n-butanoyle et leurs applications comme médicaments dans les pathologies prolifératives tumorales ou bénignes. Il est connu que l'acide butyrique et ses sels ont une action antiproliférative sur certains types de tumeurs (Prasad, K. N. & al., 1980, Life Sciences, 27, 1351; Fisckhoff & al., Leukemia, 1990, 4, 302 ; Samid, D. & al., Cancer Res., 1992,52, 1988). Toutefois, l'élimination rapide de ces substances par l'organisme, ainsi que la nécessité de maintenir des concentrations plasmatiques élevées (Daniel, P. & al., Clin.Chim.Acta, 1989, 81, 255), imposent des contraintes sérieuses qui limitent considérablement l'utilisation de ces drogues en cancérologie. Ces produits présentant cependant un intérêt potentiel indéniable en thérapeutique anticancéreuse, diverses stratégies ont été développées dans le but de modifier leur pharmacocinétique, et en particulier d'allonger leur durée de vie plasmatique. Parmi ces stratégies, il a été proposé de préparer des dérivés d'esters butyriques des oses (glucose, mannose) et du glycérol (Pieri & al., Brevet FR 871294,1987; brevet FR 8809092,1988). Dans cette optique, l'ester butyrique était conçu comme le précurseur du principe actif (l'acide butyrique), la désestérification ayant lieu dans divers compartiments, en particulier au niveau intracellulaire, la plupart des cellules possédant des estérases cytosoliques très actives. Il est connu également que la membrane cellulaire, de par son caractère hydrophobe, est peu perméable aux molécules chargées, comme les acides organiques ou les protéines (Singer, S.J., Nicolson, G. L. 1972, Science, 175, 720 ; Bretscher, M., 1985, Sci. Am., 253,100 ; Petty, H. R., 1993, in Molecular Biology of Membranes : Structure and Functions, Plenum Press, N.Y. ; P. L. 1993, in The Membranes of Cells, Academic Press, San Diego) et que la présence d'une chaîne lipophile facilite le passage transmembranaire des substances chargées, même volumineuses, comme les protéines (Kabanov, A. V. & al. 1989, Prot. Eng., 3, 39). Il est enfin connu que certains dérivés de chaînes alkyle peuvent agir sur l'activité de canaux ioniques membranaires (Becaert, T. & al. 1996, Boll. Chim. Farm. 135, 204) dont certains jouent un rôle dans le contrôle de la prolifération cellulaire (Vaur, S. & al., 1998, J. Cell Physiol., 177, 402; Wiecha, J. & al. 1998, J. Vase. Res., 35,363). Un des buts de la présente invention est de fournir la synthèse de nouveaux dérivés de saccharides et d'itols possédant un groupement O-alkyle et repondant à la formule générale 1 et ou encore possédant un groupement O-alkyle et un groupement O- n-butanoyle et répondant à la formule générale II, cette dernière représentant un sous- ensembles des composés de type 1 : II dans lesquelles Su représente un dérivé saccharidique cyclique ou non, protégé ou non, choisi par exemple parmi hexose, pentose, désoxyhexose, ou encore un dérivé d'itol, cyclique ou non, protégé ou non correspondant par exemple au glycérol, dans lesquelles R représente une chaîne n-alkyle ou n-alkényle ayant 1 à 18 atomes de carbone, dans lesquelles P représente un groupe d'atomes liés à l'atome d'oxygène du groupement hydroxyle et formant, via celui-ci, et avec Su, une fonction éther, P étant choisi de préférence parmi les groupements benzyle ou trityle, ou encore formant une fonction ester, P étant choisi de préférence parmi les groupements acétyle et benzoyle, ou encore formant un acétal de type dioxolane, de préférence isopropylidène ou benzylidène, dans lesquels i représente le nombre de sites hydroxylés ne portant pas R comme défini précédemment, ces groupements hydroxylés pouvant être tous (j=0) ou en partie libres (0 Les composés de type 1 conformes à l'invention, autres que les glycosides d'alkyle, peuvent être préparés selon la méthode de la littérature (F. CHELLE, G. RONCO, P. VILLA, Brevet FR 87 05277, PCT/FR8800128, W08808000). Les glycosides d'alkyle de formule générale 1 sont préparés avec la configuration ss-D ou a- L, selon le schéma 1, Su(OH)i Schéma 1. Synthèse des glycosides d'alkyle de type I dans lequel, le carbone C-2 de l'hexose ou du désoxyhexose Su(OH)i est lié à R' = OH et à R" = H ou à R' = H et à R" = OH, et dans lequel ROH représente un n-alcanol ayant 1 à 18 atomes de carbone : - en faisant réagir à température ambiante et sous agitation un équivalent d'hexose ou de désoxyhexose avec cinq à dix équivalents de n-alcanol en présence de préférence de un à deux équivalents de chlorure d'acétyle. Après dix à vingt heures de réaction, on porte le mélange à 0 C, on ajoute un volume équivalent à 5 à 10 fois le volume du n-alcanol initialement introduit, d'un solvant apolaire et l'on recueille, par filtration, le glycoside d'alkyle pur, de configuration ss-D ou a-L. Le solvant apolaire peut être un alcane linéaire ou ramifié choisi de préférence parmi le pentane, l'hexane ou l'heptane ou encore un éther cyclique ou acyclique et de préférence l'éther éthylique ou un mélange éther éthylique-hexane. Ce procédé présente l'avantage de se distinguer de la méthode de TAKEO (K. TAKEO, M. NAKAGEN, Y. TERRAMOTO, Carbohydrate Research, 1990, 201, 261) en ce que ROH est un n-alcanol ayant 1 à 18 atomes de carbone, au lieu de l'alcool allylique et que les produits sont obtenus purs avec la configuration (3-D ou a-L, sans neutralisation par une base (NaHC03), ni lavage à l'eau, ni extraction au toluène, suivie de l'évaporation et recristallisation dans l'éthanol. Les composés de type II sont préparés à partir des composés de type I, à l'exclusion des glycosides d'alkyle, par greffage régiosélectif du groupement O-n- butanoyle selon le schéma 2 , Schéma 2. Synthèse des composés de type II On fait réagir à température ambiante et sous agitation un équivalent de composé de type 1 dans un solvant apolaire, avec un équivalent de chlorure de n-butanoyle en présence de 1,1 équivalents d'une base faible minérale ou organique ; solvant apolaire peut être un alcane cyclique, acyclique, ramifié ou non, ou encore un hydrocarbure aromatique ou un mélange des deux ou mieux le toluène ; base faible peut être soit minérale choisie par exemple parmi les carbonates alcalino-terreux ou les carbonates et hydrogénocarbonates alcalins, soit organique choisie par exemple parmi les amines cycliques ou acycliques et de préférence la triéthylamine. Après consommation des réactifs, la solution est filtrée et le solvant évaporé sous pression réduite et le produit de type II obtenu, est purifié par solubilisation sélective, ou recristallisation ou chromatographie sur silice neutre. Lorsque les produits de type II sont obtenus à partir des hexoses et des pentitols, la réaction selon le schéma 2 est réalisée sur les composés de type 1 possédant le groupement protecteur isopropylidène. Pour obtenir ensuite les composés de type II totalement déprotégés (j = 0) on procède à une désacétalisation acidocatalysée dans un solvant hydroxylé choisi par exemple parmi l'eau ou un alcanol choisi de préférence parmi méthanol ou éthanol, ou un mélange eau-alcanol, ou un mélange eau-solvant apolaire choisi de préférence parmi dioxane ou THF. La désacétalisation peut être réalisée : - soit en milieu homogène en présence d'un acide minéral choisi de préférence parmi H2SO4 ou HCl ou en présence d'un acide organique choisi de préférence parmi HOTs, CH3COOH ou CF3COOH, suivie de la neutralisation éventuelle par une base faible puis lavage, évaporation du solvant et purification, - soit en milieu hétérogène en présence de résine acide choisie, de préférence parmi les DOWEX ou les AMBERLYST H+, suivie de la filtration, évaporation du solvant et purification. La purification peut être réalisée par solubilisation sélective, recristallisation ou chromatographie sur silice neutre. Un autre but de la présente invention est l'utilisation, des dérivés de saccharides et d'itols possédant un groupement O-alkyle et répondant la formule générale 1 ou encore possédant un groupement O-n-butanoyle et un groupement O-alkyle et répondant à la formule générale II, cette dernière représentant un sous-ensembles des composés de type 1 : avec Su, R, P, i et j comme défini précédemment et conformes à la présente invention, comme composés pour la préparation d'additifs alimentaires ou de médicaments, utilisable notamment en cancérologie et dans le traitement des pathologies prolifératives tumorales ou bénignes ou encore la préparation d'agents potentialisateurs permettant d'améliorer l'efficacité de la photochimiothérapie antitumorale. Les médicaments ainsi préparés pourront être inclus dans les prothèses artérielles. A titre d'exemples et sans que cela soit considéré comme limitatif, on décrit ci- après la synthèse de quelques dérivés conformes à l'invention ainsi qu'une étude toxicologique et des tests antiprolifératifs sur des lignées cellulaires malignes et non malignes. Exemple 1. Préparation des 1-0-alkyl-D,L-glycérols la-c (type I). On fait réagir 26,4 g (0,20 mol) de 1,2-0-isopropylidène-D,L-glycérol (solkétal) avec 0,22 mol de bromure d'alkyle en présence de 28 g (0,5 mol) de KOH en poudre dans 300 mL du mélange toluène-DMSO 80 :20 à température ambiante pendant 24h. Après filtration, lavage avec une solution aqueuse de NH4C1 à 20%, la phase organique est évaporée sous pression réduite et les dérivés O-alkylés sont isolés à l'état pur par chromatographie sur silice neutre (éluant hexane-acétone 95 :5 Tableau 1. n-alkyle Rendement (%) p-H2+ n-C8HI7 95 0/ n-C12H25 96 p n-C16H33 94 RMN @C ; 71,7 (C-1), 74,7 (C-2), 66,8 (C-3), 109,2 (CMe2), 25,3,26,2 (CMe2), 71,7 (C-a), 22,5,31,7 (C-(3, C-w-1), 13,9 (C-co). Les dérivés 0-alkylés sont ensuite désacétalisés dans eau-éthanol 95 GL avec 1 g de résine Amberlyst 15H+ par gramme d'acétal, à 50 C pendant 4h. Après filtration, évaporation du solvant, les composés la-c sont isolés à l'état pur par chromatographie sur silice neutre (éluant hexane-acétone 80 :20 Tableau 2. n-alkyle Rendement (%) F ( C) O-CH2+m2-CgHI, la 95 10 OH rc-C12H25lb 96 48 OH n-Cl6Hss lc 94 49 Exemple 2. Préparation des 1-0-alkyl-2,3-0-isopropylidène-D,L-xylitols 2a-c et des 1-O-alkyl-D,L-xylitols 3a-c (type I). On fait réagir 23,2 g (0,10 mol) de 2,3:4,5-di-0-isopropylidène-D,L-xylitol avec 0,11 mol de bromure d'alkyle en présence de 14 g (0,25 mol) de KOH en poudre dans 300 mL du mélange toluène-DMSO 80 :20 à température ambiante pendant 24h. Après filtration, lavage avec une solution aqueuse de NH4C1 à 20%, la phase organique est évaporée sous pression réduite et les dérivés 0-alkylés sont isolés à l'état pur par chromatographie sur silice neutre (éluant hexane-acétone 95 :5 Tableau 3. n-alkyle Rendement (%) F ( C) CO-C'H"+1 n-C8H17 95 Liquide \o n-C,2H25 Liquide o n-C12H25 95 Liquide tx -C16H33 93 41-46 0 -- I Les dérivés O-alkylés sont ensuite désacétalisés dans eau-éthanol 95 GL avec 2 g de résine Amberlyst 15H* par gramme de diacétal, à 50 C. Après disparition du diacétal, filtration et évaporation du solvant, les composés 2a-c et 3a-c sont isolés à l'état pur par chromatographie sur silice neutre (gradient hexane-acétone 80 :20 v/v à 20:80 v/v). Exemple 3. Préparation des a-L-fucopyranosides d'alkyle 4a-b, des ss-Dgalactopyranosides d'alkyle 5a-b et des ss-D-glucopyranosides d'alkyle 6a-b (type I). On fait réagir à température ambiante et sous agitation 0,10 mol de L-fucose avec 9 équivalents d'alcanol n-CnH2n+1OH en présence de 2 équivalents de CH3COC1 sous agitation pendant 20h. On porte ensuite le mélange à 0 C et on ajoute 50 mL d'éther éthylique. On sépare par filtration les dérivés glycosidiques purs cristallisés de configuration a-L pour le fucose. Les dérivés (3-D-galactopyranosides d'alkyle 5a-b et (3-D-glucopyranosides d'alkyle 6a-b ont été préparés par la méthode de Schmidt en passant par le peracétate. On obtient les dérivés de configuration (3 du galactose et du glucose par purification chromatographique. Tableau 4. Trouvé Calculé n-alkyle Rdt F ( C) MM # -, . (%) C H C H o O-CnH2n+l n-CgH17 4a 75 126 276 60,76 10,12 60,80 10,20 CH3 HO OH n-C12H254b 70 90 332 65,13 10,98 65,02 10,91 oH n~CgHI, 5a 80 98 292 57,56 9,63 57,51 9,65 H(y#oo-cHt H n-C lz H Zs 5b 88 55 348 62,12 10,49 62,04 10,41 OH oH n~CgHI., 6a 85 69 292 57,48 9,65 57,51 9,65 ,!#00-C,Hi n-Cl2H25 348 62,15 10,67 62,04 10,41 fH / n-C12H256b 84 80 348 62,15 10,67 62,04 10,41 HO gjH | OH RMN 4b (C5D5N). 13C :100,9 (C-1) ; 73,5 (C-4) ; 71,5 (C-3) ; 70,4 (C-2) ;68,4 (C-a ; 67,3 (C-5) ; 30,3 - 23,1 (CH2) ; 17,4 (C-6) ; 14,4 (CH3). RMN 5a (DMSO). 13C :104,3 (C-1 ; 75,9 (C-5) ; 74,3 (C-3) ; 71,4 (C-2) ; 69,3 (C-a) ; 69,0 (C-4) ; 61,2 (C-6) ; 32,1-22,9 (CH2)n ; 14,8 (CH3). RMN 6b (DMSO). 13C : 103,7 (C-1 ; 77,6 (C-3 et C-5) ; (C-2) ; 70,9 (C-4) ; 69,4 (C-a) ; 61,9 (C-6) ; 32,1 - 22,9 (CH2)n ; 14,8 (CH3). Exemple 4. Préparation des 1-0-alkyl-3-0-n-butanoyl-D,L-glycérols Butla-c (type II). On fait réagir sous agitation, à température ambiante, 1,10 mol de composé la-c avec 10,7 g (0,1mol) de chlorure de n-butanoyle en présence de 11,1g (0,11 mol) de triéthylamine dans 150 mL de toluène anhydre. Après lOh de réaction, la solution est filtrée et le toluène est évaporé sous pression réduite. Les produits Butla-c sont isolés à l'état pur par chromatographie sur silice neutre (éluant hexane-acétone 90:10 v/v). Tableau 5. n-alkyle F ( C) MM O-CnH+1 n-CSH17 Butla Liquide 274 OH n-C12H25 Butlb Liquide 330 O-CO-C3H7 n-C16H33 Butlc 32-36 386 Exemple 5. Préparation des 1-0-alkyl-5-0-n-butanoyl-2,3-0-isopropylidène-D,L- xylitols But2a-c et des 1-0-alkyl-5-0-n-butanoyl-D,L-xylitols But3a-c (type II). On fait réagir sous agitation, à température ambiante, 0,10 mol de composés 2ac avec 10,7 g (0,1mol) de chlorure de n-butanoyle en présence de 11,1g (0,11 mol) de triéthylamine dans 150 mL de toluène anhydre. Après 15h de réaction, la solution est filtrée et le toluène est évaporé sous pression réduite. Les produits But2a-c sont isolés à l'état pur par chromatographie sur silice neutre (éluant hexane-acétone 90:10 v/v). Tableau 6. n-alkyle Rdt (%) F ( C) MM O-CnH2n+l n-CsH17 But2a 90 Liquide 374 0 /o# n-C12H25 But2b 92 Liquide 430 OH O-CO-C 3 H n-C16H33 But2c 89 Liquide 486 Une fraction de produits But2a-c est désacétalisée dans eau-éthanol 95 GL avec 2 g de résine Amberlyst 15H+ par gramme d'acétal But2a-c, à 50 C. Après disparition de l'acétal, filtration et évaporation du solvant, les composés But3a-c sont isolés à l'état pur par chromatographie sur silice neutre (hexane-acétone 60 :40 Tableau 7. n-alkyle Rdt (%) F ( C) MM O-C"H+1 n-C8H1 But3a 75 Liquide 334 OH Ho n-C12H25 But3b 78 Liquide 390 oH n-C16H33 But3c 74 Liquide 446 O-CO-C3H Exemple 6. Etude de la toxicité aiguë chez la Souris Protocole animal La toxicité par administration unique chez la Souris standard (5 mâles et 5 femelles EOPS par dose à tester ; semaines d'âge ; de 20 5 g, souris OF1 de IFFA CREDO) a été conduite conformément aux prescriptions de la ligne directrice n 401 del'OCDE, sur une période d'observation de 14 jours. La souris n'est pas rationnée en aliment ni en eau. Les animaux sont pesés à l'entrée en étude, puis au 7ième et au 14ième jour. Le gain moyen de poids quotidien ou GMQ, permettant de juger de l'état de forme métabolique générale, est calculé pour les périodes Jo à J7 et J7 à J14, en divisant le gain de poids de la souris sur la période par le nombre de jours d'observation. Préparation des produits Les produits testés sont : la-c, 2a-c, 3a-c, But2a-c, But3a-c, 4a, b et 5a,b. Ces produits mis en solution dans un solvant atoxique testé sur un lot d'animaux témoins (sérum physiologique-DMSO 60 :40 ou DMSO pur), ou injectés sans solvant pour ceux qui se présentaient à l'état liquide ou sirupeux, ont été administrés par voie intrapéritonéale (I.P.) et par voie orale (per os, P.O.). Résultats expérimentaux La mortalité observée à 1g.kg-1 par administration I.P. et à 3 g/kg-1 par administration P. O. est reportée dans le tableau 8. D'une façon générale, la mortalité est faible aux doses testées et le gain moyen quotidien (GMQ) des survivants en particulier entre le 8ième et le 14ième jour est proche de celui observé avec le témoin. Tableau 8. Toxicité aiguë chez la Souris et Gain Moyen Quotidien (GMQ) des survivants entre J8 à J14 Voie intrapéritonéale (I.P.), 1 g.kg-1 sur 14 jours Voie orale (P. O.), 3 g.kg' sur 14 jours % mortalité GMQ (g.j-1) % mortalité GMQ (g.j-1) Produit F M F+M F M F M F+M F M Témoin* 0 0 0 0,940,20 0,980,20 0 0 0 0,910,12 0,970,20 DMSO 0 0 0 0,880,20 0,900,18 la 40 20 30 0,900,17 0,960,22 lb 40 20 30 0,820,29 0,930,34 2b 0 0 0 0,970,31 0,950,26 3a 0 20 10 0,940,31 0,930,25 3b 20 20 20 0,970,24 0,970,20 4b 0 20 10 0,910,22 0,940,17 5b 0 0 0 0,920,19 0,980,26 Butla 20 20 20 0,960,09 0,990,24 20 0 10 0,910,10 0,970,27 Butlb 0 20 10 0,970,23 0,960,19 0 0 0 0,940,14 0,890,08 Butlc 0 0 0 0,940,24 1,040,26 0 0 0 0,950,21 0,920,17 But2a 20 20 20 0,950,15 0,910,17 60 60 60* 0,900,28 0,970,41 But2b 0 0 0 0,910,18 0,980,22 0 0 0 0,970,20 1,020,24 But2c 0 0 0 0,950,12 0,940,28 0 0 0 0,910,06 0,980,22 But3a 0 0 0 0,900,08 0,940,20 0 0 0 0,900,10 0,910,30 But3b 20 40 30 0,920,14 0,920,28 0 0 0 0,940,20 0,940,08 But3c 40 40 40 0,850,21 0,910,34 40 40 40 0,750,29 0,860,21 * DL50 = 2,700,559 g.kg-'chez la femelle et 2,70,55 g.kg' chez le mâle Exemple 7. Contrôle d'inocuité dermatologique chez le Lapin Albinos. L'étude a pour but de déterminer chez le Lapin albinos les propriétés irritantes et/ou le degré de corrosion provoqué par un produit lors de son application cutanée unique. Protocole général L'irritation et/ou la corrosion dermiques consécutives à l'application cutanée d'un produit sur le dos du Lapin sont évaluées par cotation des réactions observées, selon un barème déterminé (ci-dessous). L'expérimentation conduit au calcul de l'indice d'irritation primaire cutané. Indice d'irritation Classe 0. 00 0. 50 2. 00 5. 00 Le protocole mis en #uvre, conforme aux prescriptions de la Ligne Directrice N 404 de l'OCDE (12 mai 1981) et au Journal Officiel de la République Française (21 février 1982), permet d'évaluer complètement le caractère réversible ou irréversible des effets observés. L'étude est menée dans l'esprit des Bonnes Pratiques de Laboratoire. Préparation des animaux et des produits Les Lapins ELCO albinos sont utilisés, 3 animaux de chaque sexe par produit. Leur poids est compris entre 1,5 et 1,7 kg au début de l'essai, qui commence par une acclimatation de 3 jours. Les animaux sont stabulés en cage aux dimensions normalisées. Les excréments sont éliminés automatiquement. Les cages sont placées en animalerie climatisée (18-20 C), maintenue à une hygrométrie comprise entre 45 et 65 % d'humidité relative. L'air est filtré de manière absolue et renouvelé 10 fois par heure. Le cycle nycthéméral semi-artificiel est de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. L'aliment entretien UAR (référencé ISO 9002) est utilisé. L'eau de ville est distribuée à volonté. Le produit utilisé est appliqué sur la région cutanée dorsale. Pour ce faire, la veille de l'application, la région dorsale de chaque lapin est soigneusement rasée sur 2 zones de 14 cm sur 5 cm symétriques par rapport à l'axe vertébral. Le flanc gauche de chacun des animaux est laissé intact, alors que le flanc droit est scarifié au vaccinostyle, par trois traits de 2,5 cm de long et espacés de 0,5 cm. Les surfaces adjacentes de la peau non traitée de chaque animal servent de contrôle pour l'essai. La substance à tester est déposée sur un carré de gaze, qui sont maintenus en place et protégés par des compresses stériles et un pansement non occlusif. Résultats expérimentaux Après 24 heures de contact et 72 heures de contact respectivement, sont évaluées les lésions éventuelles pouvant être apparues sur les zones scarifiées ou non de chacun des animaux des deux sexes, selon un barème portant sur 5 niveaux d'érythèmes et 5 niveaux d'oedèmes. L'indice d'irritation primaire cutanée (I.I.C) est calculé en additionnant les scores d'oedèmes et d'érythèmes pour 3 lapins, pour les 2 zones test. Le total de ces deux chiffres est divisé par 12 (2 temps d'observation x 2 zones x 3 lapins). Les résultats, reportés dans le tableau 9 montrent que les produits sont classés NON IRRITANTS à LEGEREMENT IRRITANTS. Tableau 9. Contrôle d'inocuité dermatologique chez le Lapin Albinos. Ib lc 2b 3b But-lb But-lc But-2b But-3b Indice d'irritation cutanée 0 0,16 1,25 0,08 0,16 0,33 1,75 0,33 (IIC) Lapine Classification Lapine N.I. N.I . L.I. N.I. N.I. N.I. L.I. N.I. Indice d'irritation cutanée 0 0,25 1,00 0 0 0,16 1,17 0 (IIC) Lapin Classification Lapin N.I. N.I. L.I. N.I. N.I. N.I. L.I. N.I. Dessèchement de la peau ± + +± ++ (appréciation visuelle) Cicatrisation rapide +++ - +± ++± ++ (appréciation visuelle) a Différence non significative avec la base correspondante b Le protocole mis en #uvre est conforme aux prescriptions de la ligne directrice n 404 de l'OCDED du 12 mai 1981. Le calcul de l'indice d'irritation primaire cutané est réalisé dans les conditions prévues par le JO du 21 02 1982. c Rappel des classifications ; 0,00 0,50 2,00 5,00 Exemple 8. Effet antiprolifératif de divers composés vis-à-vis de lignées cancéreuses et d'une lignée de kératinocytes humains avec les produits de type II: Lignées cancéreuses : - Lignée HT1080 (fibrosarcome humain ; lignée établie en 1972 à partir d'une tumeur osseuse humaine), - Lignée EMT6 (tumeur vésicale murine ; lignée fournie par le Pr J. D.Chapman, Fox Chase Cancer Institute, Philadelphie, USA). Kératinocytes humains : - Lignée NCTC 2544 (Perry, V. P., Sandford, K.K., Hyatt, G. W., Earle, W. R. Establishment of epithelial cells from human skin. J.Natl.Cancer Inst. (1957) 18 : 707-717.La figure annexée (Figure 1) illustre l'effet de divers dérivés O-n-butanoyle-O-alkyle de type II, à la concentration de 10-4 M, sur la prolifération des cellules HT1080, en comparaison avec le butyrate de sodium(BuNa) à la même concentration (expérience - type) ; influence de la longueur de la chaîne alkyle( conditions expérimentales : 48h de traitement par les produits en milieu DMEM supplémenté à 5% de sérum de veau foetal). L'examen de la Figure 1 (en annexe) permet de faire plusieurs constatations : 1/ Le butyrate de sodium, à la concentration de 10 M, n'a aucun effet antiprolifératif . Ce résultat est déjà connu, les butyrates n'étant efficaces qu'au delà de 10-3 M , soit une concentration dix fois supérieure. La concentration de 10-4 M a été choisie au vu d'expériences préliminaires montrant une efficacité notable des composés revendiqués, à cette concentration, alors que les butyrates sont sans effet notable (résultats non présentés). On peut donc affirmer que les composés butlb, but2b et but3b sont au moins de 5 à 10 fois plus efficaces que le butyrate de sodium, composé déjà utilisé dans le traitement de certaines tumeurs.. 2/ Pour un même substrat (1,2 ou 3), la longueur de la chaîne alkyle greffée est très critique en ce qui concerne l'effet antiprolifératif. Ainsi, une chaîne à 8 atomes de carbone est pratiquement dépourvue de toute efficacité, quel que soit l'itol considéré (butla, but2a, but3a). L'efficacité maximale est obtenue avec une chaîne à 12 atomes de carbone (butlb, but2b, but3b), et décroît au delà (butlc, but2c). Cette observation suggère fortement que les composés étudiés peuvent, par une insertion à un niveau précis dans la membrane cellulaire, dépendant de la longueur de la chaîne alkyle, altérer des processus membranaires spécifiques. En effet, un simple effet facilitateur de la chaîne alkyle sur la pénétration cellulaire ne devrait pas faire apparaître un tel effet "critique" de la longueur de chaîne. Ces observations nous amènent à reconsidérer les mécanismes d'action potentiels. Ainsi, il semble que dans cette zone de concentration, les caractérististiques de la chaîne O-alkyle soient beaucoup plus importantes que la présence du groupement O-n-butanoyle (le butyrate lui-même n'ayant aucun effet à cette concentration, d'autres mécanismes doivent être envisagés). De ces observations ont découlé de nouvelles expériences, réalisées avec les composés de type 1 correspondants, c'est-à-dire les composés 0-alkyle dépourvus de groupement 0-butanoyle. La Figure 2 (en annexe) montre quelques exemples des résultats obtenus, toujours sur la lignée cancéreuse humaine HT1080. La figure 2 annexée (Figure 2) illustre l'Effet de divers dérivés de type 1 sur la prolifération des cellules HT1080, en comparaison avec le butyrate de sodium (BuNa) etavec les dérivés correspondants de type II (concentration : 10-4 M, durée de traitement 48h). On peut ainsi constater que les trois dérivés testés de type 1 ci-dessus, c'est à dire les dérivés O-alkyle dépourvus de butyrate sont au moins aussi actifs que leurs analogues de type II, ce qui confirme que l'effet antiprolifératif n'est pas lié à la présence du groupement butanoyle. A partir de cette constatation, des expériences ont été effectuées avec les dérivés O- alkyle de type I, en faisant varier de façon plus large la nature du substrat (ose ou itol). D'après les résultats présentés dans la Figure 3 (en annexe) , nous avons pu conclure que, pour une même longueur de la chaîne alkyle (C12), l'ordre d'efficacité est le suivant : a-L-Fucose > (3-D-Glucose > (3-D-Galactose et (3-D-Galactose = D, L-Xylitol = D,L-Glycérol La figure 3 annexée (Figure 3) illustre l'effet de divers dérivés de type I avec une chaîne en C12, sur la viabilité des cellules tumorales humaines HT1080. (concentration : 10-4 M, durée de traitement : 48h). Pour les dérivés 0-alkyle les plus actifs (chaîne en C12), la nature de l'ose n'est donc pas sans importance. La Figure 4 (en annexe) montre un exemple, en microscopie optique à contraste de phase, de l'effet cytotoxique puissant du dérivé fucose possédant une chaîne alkyle en C12 (4b). La figure 4 annexée (Figure 4) illustre l'examen en microscopie en contraste de phase de cultures de cellules cancéreuses humaines (lignée HT1080) témoins ou traitées pendant 48h par le dérivé O-alkyle du fucose (4b) à différentes concentrations. A : témoins (non traités) ; B : 10-5 M ; C : 510-5 M ; D :10-4 M. Enfin, la Figure 5 (en annexe) montre un exemple d'expérience réalisée avec le produit 4b, mettant en évidence la dose-dépendance ainsi que la dépendance de l'effet cytotoxique vis à vis du temps de traitement, pour une même concentration. .La figure 5 annexée (Figure 5) illustre l'effet cytotoxique du produit 4b sur les cellules tumorales humaines HT1080, en fonction de la concentration (10-5 M à 10-4 M) et du temps de traitement (1 à 4 jours : J1 à J4). JO = contrôles (100%). Exemple 9. Effets des composés de type 1 et II sur la viabilité de la lignée tumorale EMT6 (cancer vésical murin). La figure 6 (en annexe) ne présente qu'une partie des résultats obtenus. La figure 6 annexée (Figure 6) illustre l'effet de dérivés de type I sur la prolifération des cellules EMT6, en comparaison avec le butyrate de sodium (BuNa) et avec les dérivés O-n-butanoyle-O-alkyle (type II) correspondants (butlb, but2b, but3b), à la concentration de 10-4M (durée de traitement : 48h). On voit que, globalement, les résultats concernant ces composés sont assez voisins de ceux obtenus pour la lignée HT1080. On remarque cependant une plus grande sensibilité aux dérivés 0-alkyle (type I), ce qui suggère que l'efficacité des produits peut varier en foncion de la lignée tumorale étudiée et peut-être en fonction des différences de composition et de caractéristiques physiques des membranes en fonction du type cellulaire considéré. Les différences d'efficacité concernant la longueur de la chaîne alkyle ont été également retrouvées. Exemple 10. Effets des composés de type II sur la lignée de kératinocytes humain NCTC 2544. Les Figures 7 et 8 (en annexe) présentent une partie des résultats obtenus avec la lignée (non tumorale) de kératinocytes humains NCTC 2544, considérée comme assez représentative de la couche proliférative (stratum basale) de l'épiderme. On peut constater que, globalement, les résultats vont dans le même sens que ceux présentés pour les lignées tumorales, mais avec de légères différences, en particulier une efficacité maximale pour le but2b, ce qui confirme l'existence de différences de sensibilité en fonction du type cellulaire. On retrouve également des différences importantes en fonction de la longueur de la chaîne alkyle (C8, C12 ou C16). Enfin, l'efficacité des dérivés O-alkyle (Figure 8 ; annexe) est à peu près équivalente à celle des dérivés 0n-butanoyle-O-alkyle (Figure 7 ; annexe). La figure 7 annexée (Figure 7) illustre l'effet de divers dérivés de type II sur la viabilité des kératinocytes humains NCTC 2544 en culture (concentration : 10-4 M, durée de traitement : 48h). (butla, but3a et but2a : chaîne alkyle en C8 ; butlb, but3b et but2b : C12 ; butlc, but3c et but2c : C16). La figure annexée (Figure 8) illustre l'effet de quelques dérivés de type II à chaîne alkyle en C12 (butlb, but3b, but2b), comparé à celui de dérivés de type I correspondants (Ib, 3b et 2b). (concentrations 10-4M, durée du traitement : 48h). Exemple 11. Potentialisation de l'effet photocytotoxique du Photofrin IIR par le produit de type I, 4b. Cet exemple concerne la photochimiothérapie des tumeurs (PCT). Cette méthode, en plein développement, est basée sur la génération photosensibilisée d'espèces activées de l'oxygène, entraînant la destruction des cellules tumorales et de la vascularisation de la tumeur (Dougherty, T.J. 1989, Oncology, 3, 67 ; Dougherty, T. J., 1993, Photochem.Photobiol. 58, 895 ; Pass, H.I. & al., 1993, J. Natl. Cancer. Inst., 85 , 443). L'intérêt majeur de cette méthode est la sélectivité, dans la mesure où seule la zone illuminée, c'est-à-dire la tumeur (illuminée par voie extérieure pour les tumeurs cutanées, ou bien par voie endoscopique pour les tumeurs des organes creux) est concernée par l'effet photocytotoxique. Malgré ses avantages, la PCT se heurte encore à certains obstacles : peu vascularisées (l'efficacité du traitement dépend de la concentration en oxygène des tissus : Chapman, J. D. & al. 1991, Radiat. Res., 126, 73), ou certains cas de résistance d'origines diverses (ré-excrétion du photosensibilisateur etc..). Pour pallier ces problèmes, des stratégies de potentialisation associant un photosensibilisateur avec une molécule non-photosensibilisatrice augmentant la réponse cellulaire, ont été développées (Biade , S. & al., 1993, Photochem. Photobiol., 57, 371; Biade, S. & al., 1993, Cell Pharmacol., 1, 37; Berg, K. & al., 1998, Biochim. Biophys. Acta, 1370, 317). Dans cet exemple, nous présentons des résultats montrant une potentialisation de l'effet photocytotoxique du Photofrin IIR, photosensibilisateur déjà employé en thérapeutique humaine (phase III) et l'un des dérivés de type 1 décrits précédemment, le dérivé du L-fucose, 4b. Les cellules tumorales HT1080 ont été prétraitées durant 48h par 4b à des doses non cytotoxiques (10-6 et 5 10-6M). Selon la figure 9, nous montrons qu'un prétraitement de 48h avec l'un des dérivés 0alkyle précédemment décrits, le 4b, à des concentrations n'ayant pas d'effet cytotoxique propre (10-6 et 5x10-6M), potentialise d'un facteur voisin de 2 l'effet photocytotoxique du Photofrin IIR, photosensibilisateur déjà employé en thérapeutique humaine pour la photochimiothérapie de diverses tumeurs ((Dougherty, T.J. 1989, Oncology, 3, 67). La figure 9 annexée (Figure 9) illustre la potentialisation de l'effet photocytotoxique du Photofrin IIR (IPSEN Biotech) par des concentrations non cytotoxiques du composé de type I, 4b. Les cellules HT1080 sont prétraitées durant 48h par de faibles concentrations de 4b (10-6 ou 5 10-6 M) n'affectant pas la viabilité cellulaires. Le Photofrin Il* est ensuite ajouté (concentration finale dans le mileu de culture : 1 g/mL ') et l'incubation prolongée durant 24h. Les cellules sont ensuite lavées, puis subissent une dose d'illumination de 0,3J.cm2 dans l'UVA (table Vilber Lourmat TFL 35).(T témoin ; FI = 4b seul ; P2 = Photofrin IIR seul ; P2F1 = 4b + Photofrin IIR). La Figure 10 (en annexe) , montre l'aspect, en microscopie optique à contraste de phase, des cellules ainsi traitées (pour une concentration en 4b de 10-6 M). La figure 10 annexée (Figure 10) illustre l'examen en microscopie optique des cellules HT1080 prétraitées durant 48h avec F1 à 10-6 M puis par le Photofrin IIR à 1 g.mL-1 durant 24h. A :Photofrin II seul, pas d'illumination ; B : 4b seul, pas d'illumination (on note qu'il n'y a à cette concentration aucun effet de 4b sur les cellules) ; C : Photofrin II seul, UVA 0,3 J.cm2; D : Photofrin II +4b, UVA 0,3 J.cm2. On observe, en comparant D (Photofrin II + 4b) et C (Photofrin II seul), une nette accentuation des dommages cellulaires après illumination. L'aspect des cellules endommagées évoque un processus d'apoptose (rétraction des coprs cellulaires, réfringence, nombreux débris très denses). Exemple 12. Effets curatif de composés de type II sur le psoriasis Le composé 3-0-n-butanoyl-1-0-n-hexadécylglycérol (Butlc) a été testé en milieu hospitalier sur un malade de sexe masculin atteint de psoriasis sévère. Le produit a été appliqué en solution de 0,1 % (m/m) dans l'oléate d'éthyle. Il a été vérifié préalablement sur 100 sujets sains que l'application sur le bras droit de cette solution et sur le bras gauche de l'oléate d'éthyle seul pendant trois mois n'a suscité aucune réaction cutanée. Le test d'allergénéïté a été effectué sur le Lapin et n'a révélé aucune réaction. Au vu de ce résultat, le malade a été traité en appliquant quotidiennement la solution précédente aux jambes du patient pendant deux mois et demi. La figure 11a (en annexe) montre l'état du patient avant le traitement et la figure llb (en annexe) montre la disparition des lésions initialement présentes sur ce même patient quinze jours après la fin du traitement. Aucune récidive n'a été constatée dans les six mois suivants. Les f igures 1 la et 11b annexées (Figure 1 la et Figure 11 b) (a et b). illustre l'effet du produit Butlc en application quotidienne pendant deux mois et demi sur un patient atteint de psoriasis aigu. (Figure 11a) Patient avant traitement. (Figure Ilb) Patient quinze jours après lafin du traitement. Revendications : 1- Nouveaux dérivés de saccharides et d'itols possédant un groupement O-alkyle et répondant à la formule générale 1 1 dans laquelle Su représente un dérivé saccharidique cyclique ou non, protégé ou non, ou encore un dérivé d'itol, cyclique ou non, protégé ou non, dans laquelle R représente une chaîne n-alkyle ou n-alkényle ayant 1 à 18 atomes de carbone, dans lesquelles P représente un groupe d'atomes liés à l'atome d'oxygène du groupement hydroxyle et formant, via celui-ci, et avec Sub, une fonction éther, ou encore formant une fonction ester, ou encore formant un acétal de type dioxolane, dans lesquels i représente le nombre de sites hydroxylés ne portant pas R comme défini précédemment, ces groupements hydroxylés pouvant être tous (j=0) ou en partie libres (0 2- Nouveaux dérivés de saccharides et d'itols selon la revendication 1 possédant un groupement O-alkyle et un groupement O-n-butanoyle répondant à la formule générale II dans laquelle Su représente un dérivé saccharidique cyclique ou non, protégé ou non, ou encore un dérivé d'itol, cyclique ou non, protégé ou non, dans laquelle R représente une chaîne n-alkyle ou n-alkényle ayant 1 à 18 atomes de carbone, dans laquelle P représente un groupe d'atomes liés à l'atome d'oxygène du groupement hydroxyle et formant, via celui-ci, et avec Sub, une fonction éther, ou encore formant une fonction ester, ou encore formant un acétal de type dioxolane, dans lesquels i représente le nombre de sites hydroxylés ne portant pas R comme défini précédemment, ces groupements hydroxylés pouvant être tous (j=0) ou en partie libres (0 3 - Composés, dérivés de saccharides et d'itols selon les revendications 1 et 2, dans lesquels le substrat Sub est choisi par exemple parmi hexose, pentose, désoxyhexose, ou encore un dérivé d'itol, cyclique ou non, protégé ou non correspondant par exemple au glycérol. 4- Composés, dérivés de saccharides et d'itols selon les revendications 1 et 2, dans lesquels P est choisi de préférence parmi les groupements benzyle ou trityle, acétyle, benzoyle, ou encore forme un acétal de type dioxolane, de préférence isopropylidène ou benzylidène. 5- 1-0-n-octyl-D,L-glycérol 6- l-(9-n-dodécyl-D,L-glycérol 7- 1-0-n-hexadécyl-D,L-glycérol 8- 2,3-O-isopropylidène-1-O-n-octyl-D,L-xylitols et 1-0-octyl-D,L-xylitol 9- 1-O-n-dodécyl-2,3-O-isopropylidène-D,L-xylitols et 1-D-octyl-D,L-xylitol 10- 1-O-n-hexadécyl-2,3-O-isopropylidène-D,L-xylitols et 1-0-octyl-D,L-xylitol 11- a-L-fucopyranoside d'octyle 12- a-L-fucopyranoside de dodécyle 13- a-L-fucopyranoside d'hexadécyle 14- (3-D-galactopyranoside d'octyle 15- (3-D-galactopyranoside de dodécyle 16- P-D-galactopyranoside d'hexadécyle 17- P-D-glucopyranoside d'octyle 18- P-D-glucopyranoside de dodécyle 19- P-D-glucopyranoside d'hexadécyle 20- 3-O-n-butanoyl-1-O-n-octyl-D,L-glycérol 21- 3-O-n-butanoyl-1-O-n-dodécyle-D,L-glycérol 22- 3-0-n-butanoyl-1-0-n-hexadécyle-D,L-glycérol 23- 5-O-n-butanoyl-2,3-O-isopropylidène-1-O-n-octyl-D,L-xylitol et 5-0-n-butanoyl-1- O-n-octyl-D,L-xylitol 24- 5-0-n-butanoyl-1-0-n-dodécyl-2,3-0-isopropylidène-D,L-xylitol et 1-0-n-dodécyl- 5-O-n-butanoyl-D,L-xylitol 25- 5-0-n-butanoyl-1-0-n-hexadécyl-2,3-0-isopropylidène-D,L-xylitol et 1-O-n- hexadécyl-5-O-n-butanoyl-D, L-xylitol 26- Utilisation de l'un des composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 25 pour la préparation de médicaments à visée anticancéreuse par voie locale (tumeurs cutanées) ou générale. 27- Utilisation de l'un des composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 25 pour la préparation de médicaments à visée antiproliférative dans les tumeurs bénignes, en particulier les tumeurs cutanées bénignes. 28- Utilisation de l'un des composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 25 pour la préparation de médicaments à visée antiproliférative dans les pathologies prolifératives non tumorales, en particulier le psoriasis. 29- Utilisation de l'un des composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 25 pour la préparation d'agents potentialisateurs permettant d'améliorer l'efficacité de la photochimiothérapie antitumorale. 30- Utilisation de l'un des composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 25 pour la préparation de médicaments inclus dans les prothèses artérielles, notamment dans le but de réduire la prolifération cellulaire.