Brevet FR2841902A1 — publié le 20040109

PEPTIDES LINEAIRES CATIONIQUES AYANT DES PROPRIETES ANTIBACTERIENNES ET/OU ANTIFONGIQUES. La présente invention concerne le domaine du traitement des infections bactériennes et fongiques chez l'homme, l'animal ou les plantes. Elle vise plus particulièrement des peptides et les compositions les contenant pour prévenir et/ou traiter des infections par des agents pathogènes comme les bactéries et champignons. De nombreux micro-organismes pathogènes et responsables de sévères infections chez l'homme et l'animal présentent des résistances aux antibiotiques couramment utilisés en clinique. Le développement croissant des résistances microbiennes est un problème majeur de santé publique. Aussi, depuis quelques années, un intérêt considérable s'est développé pour l'identification de nouvelles molécules et particulièrement pour l'étude de peptides courts (15 à 30 acides aminés) possédant des activités antibactériennes et antifongiques et ayant un mode d'action différent des antibiotiques usuellement utilisés. De nombreux peptides dérivent de protéines humaines, animales et végétales connues comme possédant des propriétés antimicrobiennes tandis que d'autres sont générés de façon synthétique sur la base d'études physicochimiques. Le peptide 14 mer linéaire de séquence KLAKLAKKLAKLAK a été décrit dans la littérature comme un peptide non hémolytique ayant une activité antibactérienne (Javadpour MM, Juban MM, Lo WC, Bishop SM, Alberty JB, Cowell SM, Becker CL, McLaughlin ML. De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity. J Med Chem. 1996 Aug 2; 39 (16):3107-13) . Les études restreintes menées avec ce peptide ont montré une activité sur trois souches de bactéries (E. coli, P. aeruginosa et S. aureus) pendant un temps d'incubation court de 4 heures. Des résultats avec des temps d'incubation plus longs n'ont jamais été décrits. La Demanderesse a réalisé des études in vitro des propriétés antibactériennes de ce peptide dans les conditions standard d'évaluation (incubation de 18 heures) qui n'ont montré aucune activité biologique aux concentrations décrites dans la littérature. Il a par contre maintenant été mis en évidence, que de façon inattendue, le motif KLAKLAK était capable de conférer des propriétés antibactériennes et/ou antifongiques à des peptides comprenant ce motif et une séquence peptidique n'ayant pas de propriété antibactérienne et/ou ant i f ong i que . La présente invention a donc pour objet un peptide, avantageusement linéaire et cationique, comprenant ou consistant en : - une première séquence peptidique de formule (KLAKLAK), où K est l'acide aminé Lysine, L est l'acide aminé Leucine et A est l'acide aminé Alanine, et - une seconde séquence peptidique de formule (B), où B est un peptide de 4 à 15 acides aminés chargé positivement à pH neutre, comprenant ou consistant en au moins un motif peptidique de formule ssXXss, où (3 est un acide aminé basique et X est n'importe quel acide aminé, et dans lequel, ladite première séquence peptidique est répétée n fois et ladite seconde séquence peptidique est répétée m fois, n et m étant des nombres entiers compris entre 1 et 5. n est de préférence un nombre entier compris entre 1 et 3. Avantageusement m est supérieur à 1 et les secondes séquences peptidiques (B) sont identiques ou différentes. Les peptides de l'invention peuvent donc comprendre plusieurs secondes séquences peptidiques (B) identiques ou différentes et donc plusieurs motifs peptidiques de formule ssXXss, identiques ou différents, dans chacune des secondes séquences peptidiques (B). Les peptides de l'invention sont avantageusement linéaires. Ils répondent donc à la formule générale (I) suivante : (KLAKLAK)n(B)m, dans laquelle les première(s) et seconde(s) séquences peptidiques sont : - alternées, ou - regroupées à l'une et/ou l'autre des extrémités N et C terminales d'une ou desdites première(s) ou seconde(s) séquences peptidiques. De préférence, dans les peptides de l'invention, la ou les premières séquences peptidiques sont regroupées à l'une et/ou l'autre des extrémités N et C terminales de la ou des seconde(s) séquence(s) peptidique (s) . Préférentiellement, lesdites première(s) et seconde(s) séquences peptidiques sont liées par des liaisons covalentes, avantageusement peptidiques. Dans le motif peptidique de formule ssXXss, ss est un acide aminé basique de préférence choisi dans le groupe comprenant l'arginine (R) et la lysine (K) et X est de préférence choisi dans le groupe comprenant la leucine (L), la glycine (G) et l'histidine (H). A titre d'exemple spécifique de la seconde séquence peptidique entrant dans la composition des peptides selon l'invention, on peut citer les séquences suivantes : - SEQ ID NO.1 : VKRGLKL - SEQ ID NO.2 : KHLKKHLKKHLK - SEQ ID NO.3 : GKRKKKGKLGKKRDP Ces secondes séquences peptidiques peuvent être associées à une première séquence peptidique répétée deux fois : KLAKLAKKLAKLAK (SEQ ID N0.4) de façon à générer des peptides linéaires cationiques ayant une activité antibactérienne et/ou antifongique après 18 heures d'incubation avec les micro-organismes. Les peptides de l'invention peuvent être préparés par synthèse chimique ou par génie génétique dans une cellule procaryote comme une bactérie, dans une cellule eucaryote comme une levure, une cellule CHO, une cellule NSO, chez un animal transgénique, par exemple dans le lait de lapin, de chèvre, de brebis, etc... transgéniques ou dans une plante transgénique comme, par exemple, dans des plants de tabac, etc.... L'invention concerne aussi des équivalents fonctionnels des peptides définis ci-dessus, tels que des peptides comprenant des modifications issues de processus post-traductionnels comme la glycosylation ou de modifications chimiques telles que le couplage avec des lipides, sucres, séquences de nucléotides dès lors que ces modifications ne modifient pas l'activité antibactérienne et/ou antifongique desdits peptides conformément aux tests donnés dans la partie expérimentale ci-après. Les équivalents fonctionnels comprennent aussi des peptides dont un ou plusieurs acides aminés sont des acides aminés de conformation D. L'invention couvre également les rétropeptides et les rétro-inverso-peptides. L'invention a aussi pour objet l'utilisation des dits peptides chez l'homme, l'animal ou les plantes pour prévenir et/ou traiter une infection bactérienne et/ou fongique. La présente invention concerne donc une composition pharmaceutique, cosmétique ou agroalimentaire comprenant comme principe actif au moins un peptide tel que défini précédemment associé dans ladite composition avec un ou plusieurs véhicules, diluants ou excipients pharmaceutiquement acceptables. Les peptides de l'invention présentent une faible toxicité et de plus, ces peptides sont non hémolytiques. Les véhicules, diluants et excipients sont choisis en fonction du type d'application de la composition à titre pharmaceutique, cosmétique ou agronomique. Ainsi, l'invention a encore pour objet l'utilisation d'un peptide tel que défini précédemment pour la préparation d'une composition pharmaceutique, cosmétique, dermatologique ou agroalimentaire à visée antibactérienne et/ou antifongique. Les peptides de l'invention possèdent une activité antibactérienne contre une large variété de microorganismes, incluant une activité contre des bactéries à gram négatif, à gram positif, des champignons filamenteux et levures alors que les secondes et premières séquences prises isolement n'ont pas d'activité dans les conditions d'évaluation choisies. Les compositions de l'invention sont utiles tant à titre préventif que curatif. L'administration de composition pharmaceutique selon l'invention peut être réalisée par l'un quelconque des modes d'administration acceptés pour les agents thérapeutiques. Ces procédés comprennent l'administration systémique, topique ou encore centrale, par exemple par voie chirurgicale intracrânienne ou encore l'administration intra-oculaire. On peut citer aussi l'implantation souscutanée d'implants biodégradable. L'administration orale peut se faire au moyen de comprimés, gélules, capsules molles, y compris les formulations à libération différée ou prolongée, pilules, poudres, granules, élixirs, teintures, suspensions, sirops et émulsions. Cette forme de présentation est plus particulièrement adaptée au passage de la barrière intestinale et à l'utilisation la plus commune des composés antibactériens et/ou antifongiques. L'administration parentérale de composés antibactériens et/ou antifongiques se fait généralement par injection intramusculaire ou intraveineuse par perfusion. Les compositions injectables peuvent être préparées sous des formes classiques, soit en suspension ou solution liquide soit sous forme solide convenant à une dissolution extemporanée dans un liquide adéquat, y compris les formulations à libération différée ou prolongée comme l'inclusion des peptides dans des micro ou nano particules biodégradables de formulation lipidique ou de formulation de dextran ou encore de PLGA ou équivalents. Cette forme de présentation est plus particulièrement adaptée au passage de la barrière hémato-encéphalique et à l'utilisation hospitalière des composés antibactériens et/ou antifongiques. Une possibilité pour l'administration parentérale utilise l'implantation d'un système à libération lente ou libération prolongée qui assure le maintien d'un niveau constant de dose. Une autre possibilité consiste à fixer par adsorption ou autre les peptides de l'invention sur un support, comme un cathéter, une prothèse ou une colle biologique. Pour l'administration intranasale, on peut utiliser des véhicules intranasaux convenables. D'autres préparations topiques habituelles comprennent les crèmes, les onguents, les lotions, les gels et les sprays aérosols. Ces derniers sont plus particulièrement adaptés pour le traitement des infections broncho-pulmonaires bactériennes et/ou fongiques. L'utilisation des peptides de l'invention dans des compositions cosmétiques est utile à titre essentiellement préventif consistant à inclure lesdits peptides dans les crèmes, les vernis à ongle, les produits d'hygiène des organes génitaux, les pâtes de dentifrices, les solutions d'hygiène buccales ou à les inclure dans des micro-particules à diffusion lente, en phase aqueuse, incluses par exemple dans des couches-culottes, des cotonstiges, des pansements, des cotons à démaquiller, des serviettes hygiéniques ou encore des litières pour animaux. En fonction du mode d'administration, les composés peuvent être sous forme solide, semi-solide ou liquide. Pour les compositions solides, tels que comprimés, pilules, poudres ou granulés à l'état libre ou inclus dans des gélules, le principe actif peut être combiné avec : - des diluants, par exemple le lactose, le dextrose, le sucrose, le mannitol, le sorbitol, la cellulose et/ou la glycine ; - des lubrifiants, par exemple la silice, le talc, l'acide stéarique, son sel de magnésium ou de calcium et/ou le polyéthylèneglycol ; - des liants, par exemple le silicate de magnésium et d'aluminium, la pâte d'amidon, la gélatine, la gomme adragante, la méthylcellulose, la carboxyméthylcellulose sodique et/ou la polyvinylpyrrolidone ; le cas échéant, - des désintégrants, par exemple l'amidon, l'agar, l'acide alginique ou son sel de sodium, ou des mélanges effervescents ; et/ou - des absorbants, colorants, aromatisants et édulcorants. Les excipients peuvent être par exemple du mannitol, lactose, amidon, stéarate de magnésium, saccharine sodique, talc, cellulose, glucose, sucrose, carbonate de magnésium et analogues de qualité pharmaceutique. Pour les compositions semi-solides, telles que suppositoires, l'excipient peut, par exemple, être une émulsion ou suspension grasse, ou à base de polyalkylèneglycol, tel que le polypropylène-glycol. Les compositions liquides, en particulier injectables ou à inclure dans une capsule molle, peuvent être préparées par exemple par dissolution, dispersion, etc. du principe actif dans un solvant pharmaceutiquement pur tel que, par exemple, l'eau, le sérum physiologique, le dextrose aqueux, le glycérol, l'éthanol, une huile et analogues. Les peptides selon l'invention peuvent également être administrés sous la forme de systèmes de libération du type liposomes, tels que sous la forme de petites vésicules unilamellaires, de grandes vésicules unilamellaires et de vésicules multilamellaires. Les liposomes peuvent être formés à partir d'une diversité de phospholipides, contenant du cholestérol, de la stéarylamine ou des phosphatidylcholines. Dans une forme d'exécution, un film de composants liquides peut être hydraté avec une solution aqueuse du médicament pour former une couche lipidique encapsulant le médicament. Les compositions selon l'invention peuvent être stérilisées et/ou contenir des adjuvants et substances auxiliaires non toxiques tels que des agents de conservation, de stabilisation, de mouillage ou d'émulsification, des agents favorisant la dissolution, des sels pour régler la pression osmotique et/ou des tampons. En outre, elles peuvent également contenir d'autres substances présentant un intérêt thérapeutique. Les compositions sont préparées, respectivement, par des procédés classiques de mélange, granulation ou enrobage et elles contiennent d'environ 0,1 à 75%, de préférence d'environ 1 à 50 %, de principe actif. Les peptides selon l'invention peuvent être également couplés avec des polymères solubles tels que des supports de médicament ciblables. De tels polymères peuvent comprendre la polyvinylpyrrolidone, le copolymère pyrane, le polyhydroxypropyl-méthacrylamide-phénol, le polyhydroxy- éthyl-aspanamide-phénol ou le poly(oxyde d'éthylène)polylysine substitué par des résidus palmitoyle, le dextran. En outre, les composés selon la présente invention peuvent être couplés à une classe de polymères biodégradables utiles pour réaliser une libération maîtrisée d'un médicament, par exemple, le poly(acide lactique), la poly(epsilon-caprolactone), le poly(acide hydroxybutyrique), les polyorthoesters, les polyacétals, les polydihydropyranes, les polycyanoacrylates et les copolymères d'hydrogel séquences réticulés ou amphipatiques. La posologie pour l'administration des peptides selon l'invention est choisie en fonction de nombreux facteurs y compris le type, l'espèce, l'âge, le poids, le sexe et l'état médical du sujet ; la gravité de l'état à traiter ; la voie d'administration ; l'état des fonctions rénale et hépatique du sujet et la nature du composé particulier, ou sel, employé. Un médecin ou vétérinaire normalement expérimenté déterminera facilement, et prescrira, la quantité efficace pour prévenir, contrarier ou stopper le progrès de l'état médical à traiter. Une composition selon l'invention peut contenir de 0,1 à 99%, de préférence 1 à 70% de principe actif. A titre d'exemples, les posologies orales des peptides selon l'invention seront comprises entre environ 0,5 et 1 mg/jour par voie orale et, de préférence fournies sous la forme de comprimés contenant 0,5,1, 2,5,5, 10, 15,25, 50,100, 250,500 et 1.000 mg de principe actif. Les concentrations plasmatiques efficaces de peptides seront obtenues à partir d'une posologie allant de 0,002 mg à 50 mg par kg de poids corporel et par jour. Les peptides de l'invention peuvent être administrés sous la forme de doses quotidiennes uniques, ou en deux, trois ou quatre doses par jour. L'invention envisage non seulement l'administration des peptides décrits précédemment mais également l'utilisation des séquences polynuclucléotidiques codant ces peptides pour transformer des hôtes, et notamment des cellules animales, végétales ou des procaryotes. Ces séquences sont utilisées conformément aux techniques du génie génétique décrit dans la littérature. En conséquence, l'invention a également pour objet un polynucléotide codant un peptide décrit précédemment, une molécule d'acide nucléique, ADN ou ARN, comme un vecteur, comprenant ledit polynucléotide, et un hôte, par exemple une cellule animale ou végétale ou encore un procaryote comprenant ladite molécule d'acide nucléique, ainsi que les compositions notamment pharmaceutiques les contenant. A titre d'exemples de tels polynucléotides, qui peuvent être utilisés pour transformer des cellules végétales ou animales ou encore des procaryotes, on peut citer : - la séquence 5' GTT AAA CGT GGT TTG AAA TTG AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA 3' (SEQ ID N0.5) codant le peptide VKRGLKLKLAKLAKKLAKLAK (SEQ ID NO. 6), - la séquence 5' AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA AAA CAT TTG AAA AAA CAT TTG AAA AAA CAT TTG AAA 3' (SEQ ID N0.7) codant le peptide KLAKLAKKLAKLAKKHLKKHLKKHLK (SEQ ID NO. 8). - la séquence 5' AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA GGT AAA CGT AAA AAA AAA GGT AAA TTG GGT AAA AAA CGT GAT CCT 3' (SEQ ID N0.9) codant le peptide KLAKLAKKLAKLAKGKRKKKGKLGKKRDP (SEQ ID NO. 10). L'invention s'intéresse donc aussi aux applications agronomiques des peptides décrits précédemment pour rendre des plantes résistantes aux bactéries et champignons phyto-pathogènes et réduire ainsi l'utilisation à titre préventif ou curatif de pesticides chimiques toxiques pour l'environnement. L'application directe sur la plante d'une quantité efficace de peptides antibactériens et/ou antifongique ou d'une composition en contenant représente une première forme de mise en #uvre de l'application agronomique. Une deuxième forme de mise en #uvre de cette application est basée sur des techniques de transgénèse consistant à incorporer de façon stable dans l'ADN d'une cellule végétale, une séquence polynucléotidique codant pour un ou plusieurs peptides antibactériens et/ou antifongiques ci-dessus. Les cellules végétales ainsi transformées permettent de régénérer une plante transmettant le caractère de résistance aux infections bactériennes et/ou fongiques à sa descendance. A titre d'exemples de plantes, on peut citer le riz, le maïs, le colza, la betterave, le blé, le tabac, la tomate, la pomme de terre, etc.... Les acides aminés des séquences peptidiques sont généralement représentés par leur code à une lettre, mais ils peuvent être aussi représentés par leur code à trois lettres selon la nomenclature ci-dessous . A Ala Alanine C Cys Cystéine D Asp Acide Aspartique E Glu Acide Glutamique F Phe Phénylalanine G Gly Glycine H His Histidine I Ile Isoleucine K Lys Lysine L Leu Leucine M Met Méthionine N Asn Asparagine P Pro Proline Q Gln Glutamine R Arg Arginine S Ser Sérine T Thr Thréonine V Val Valine W Trp Tryptophane Y Tyr Tyrosine D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent, donnés à titre illustratif, et dans lesquels il sera fait référence aux dessins en annexe où : - la figure 1 rapporte la cinétique de l'activité bactéricide du peptide No. 1 de séquence SEQ ID NO.6 sur E. coli. - la figure 2 rapporte la cinétique de l'activité bactéricide du peptide No. 2 de séquence SEQ ID NO.8 sur E. coli. - la figure 3 rapporte la cinétique de l'activité bactéricide du peptide No. 2 de séquence SEQ ID NO.8 sur P. aeruginosa. - La figure 4 rapporte l'étude de l'activité hémolytique des peptides No. 1, No. 2 et No. 3 respectivement de séquences SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.10 sur les érythrocytes humains. - La figure 5 rapporte la stabilité du peptide No. 2 (SEQ ID N0.8) dans le plasma humain. MATERIEL. 1) Peptides linéaires. No. 1 : VKRGLKLKLAKLAKKLAKLAK (SEQ ID NO.6) No. 2 : KLAKLAKKLAKLAKKHLKKHLKKHLK (SEQ ID NO.8) No. 3 : KLAKLAKKLAKLAKGKRKKKGKLGKKRDP (SEQ ID NO.10) 2) Bactéries, champignons filamenteux et levures. Les souches utilisées et référencées dans les divers résultats sont issues des banques de collections de l'ATCC (American Type Culture Collection) et de l'Institut Pasteur. 3) Cellules. Hématies humaines issues de sang total provenant de l'Etablissement Français du Sang (EFS) et conservées à +4 C. 4) Préparation des peptides. Les synthèses peptidiques ont été réalisées selon les techniques connues de l'homme de métier. Les peptides sont solubles dans l'eau. RESULTATS. I - Evaluation de l'activité antimicrobienne des peptides. A - Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) et de la concentration minimale bactéricide (CMB) en milieu liquide. Les CMI sont déterminées par la méthode de microdilution en milieu liquide (NCCLS M7A5) pour l'ensemble des espèces bactériennes en plaque de polystyrène 96 puits. Le milieu de culture est le bouillon de Muëller-Hinton (MHB) (pH 7,2 - 7,4) avec des suppléments selon l'espèce bactérienne étudiée : - MHB seul pour les souches non exigeantes, - MHB + 3% sang lysé de cheval pour les Streptocoques, Listeria et Neisseria, - MHB + Hémine 15 mg/1 + NAD 15 mg/1 + Extrait de levure 5 g/1 pour Haemophilus. L'inoculum bactérien est réalisé à partir de ré-isolement effectué sur : - Gélose CLED : souches non exigeantes, - Gélose au sang + 5% sang de cheval : Streptocoques, Listeria, Bacillus, - Gélose Chocolat : Haemophilus, Neisseria. L'inoculum final est à # 5x105 UFC/ml (Unités formant colonies). 50 l d'inoculum bactérien sont distribués par puits contenant un volume égal de la solution de peptides dilué de demi en demi dans le milieu de culture adéquat selon l'espèce bactérienne (0,5 à 512 ug/ml). Les cultures ont été incubées à 35 C en air ambiant pendant 16 à 20 heures (20 à 24H pour les streptocoques). La CMI exprimée en ug/ml est la première concentration ne présentant pas de croissance bactérienne. La détermination des CMB est réalisée après incubation et lecture des plaques de CMI : Un volume de 3pl de chaque concentration d'antibiotique est déposé sur des géloses : - MH : pour les souches non exigeantes, - MH + 5% sang de mouton : pour les Streptocoques, Listeria, Bacillus, Neisseria, - HTM : pour les Haemophilus. Les géloses sont incubées 18H à 35 C en atmosphère : en air ambiant : pour les souches non exigeantes, - avec 5-6% de CO2 : pour les Streptocoques, Listeria, Haemophilus, Neisseria, La CMB est la plus faible concentration d'antibiotique qui inhibe toute croissance bactérienne sur la gélose de repiquage ( Le tableau 1 ci-dessous rapporte l'activité des peptides contre les bactéries. Les résultats montrent clairement que le peptide No. 2 est plus actif que le peptide No. 1. Le peptide No. 3 n'est pas actif. Les CMB sont très proches des CMI : le rapport CMB/CMI est souvent égal à 2, rarement supérieur à 4 ce qui traduit une activité bactéricide des peptides No. 1 et No 2. Tableau 1 BACTÉRIES N Peptide 1 Peptide 2 Peptide 3 ATCC CMI CMB CMI CMB CMI CMB Bactérie Gram-negatif Acinetobacter 19606 8 16 2 2 nt nt baumanii Citrobacter 8090 16 16 8 8 nt nt f reundi i Enterobacter 13048 256 256 16 16 nt nt aerogenes Enterobacter 23355 16 16 2 2 nt nt cloacae Escherichia coli 25922 16 16 2 2 nt nt Escherichia coli 35218 8 8 2 2 64 nt Haemophilus 49247 64 64 32 32 nt nt influenzae Klebsiella 13883 >512 >512 32 32 nt nt pneumoniae Listeria 19115 128 128 2 2 nt nt monocytogenes Neisseria sica 9913 4 128 0,5 0,5 nt nt Proteus vulgaris 13315 128 256 4 4 nt nt Pseudomonas 27853 512 >512 8 8 64 nt aeruginosa Salmonella 14028 8 8 4 4 nt nt typhimurium Serratia 8100 >512 >512 >512 >512 nt nt marcescens Shigella flexneri 12022 16 32 2 2 nt nt Shigella sonnei 25931 4 4 2 2 nt nt Bactérie Gram-positif Bacillus cereus 11778 128 128 8 8 nt nt Bacillus subtilis 6633 8 8 8 8 nt nt Enterococcus 19433 >512 >512 64 128 nt nt faecalis Enterococcus 29212 >512 >512 32 32 64 nt faecalis Enterococcus 35667 128 >512 16 32 nt nt faecium Micrococcus luteus 9341 4 4 4 4 nt nt Staphylococcus 14154 64 128 32 64 nt nt aureus Staphylococcus 25923 64 64 16 32 64 nt aureus Staphylococcus 12228 4 4 2 2 nt nt epidermidis Streptococcus 13813 128 128 8 8 nt nt agalactiae Streptococcus 6303 64 64 32 128 >500 nt pneumoniae Streptococcus 49619 128 256 16 256 nt nt pneumoniae Streptococcus 19615 64 64 8 8 nt nt pyogenes nt : non testé B- Etude cinétique de l'activité antibactérienne. Une colonie isolée de la bactérie E. coli ATCC 25922 ou P. Aeruginosa ATCC 27853 est mise en suspension dans 3 à 5ml de milieu de culture Mueller-Hinton (MH) et incubée à 37 C pendant une nuit sous agitation. A partir de cette culture de nuit, une culture en phase exponentielle de croissance de la souche est réalisée ; le milieu MH est ensemencé au 1/50è avec la culture de nuit et incubé 2 heures à 37 C sous agitation. La concentration bactérienne est ajustée à 1-2x106 ufc/ml (Unités formant colonies) dans le milieu MH. 1x105-1x106 ufc sont incubées à 37 C en présence ou non de peptides (x ug/ml) pendant un temps croissant ( 30 min, lheure, 3 heures et 6 heures) dans un volume final de 10 ml de MH. Le nombre d'ufc à ces différents temps d'incubation est évalué en étalant 500 l de la suspension bactérienne sur une boite de gélose MH qui est incubée à 37 C pendant 18 heures. La figure 1 rapporte l'étude de l'activité bactéricide du peptide NO. 1 sur E. coli, la figure 2 rapporte l'étude de l'activité bactéricide du peptide NO. 2 sur E. coli et la figure 3 rapporte l'étude de l'activité bactéricide du peptide NO. 2 sur P. aeruginosa. Les résultats montrent que le peptide No. 1 est bactéricide. On observe une diminution du nombre de bactéries survivantes supérieure à 3 Log après 6 heures d'incubation avec la concentration 64 ug/ml correspondant à 4 fois la CMI décrite dans le tableau 1. Les résultats des figures 2 et 3 montrent que le peptide No. 2 a une forte activité bactéricide sur E. coli (Fig. 2) et P. aeruginosa (Fig. 3). Dès 30 minutes d'incubation des bactéries E. coli, on observe une forte diminution du nombre de bactéries survivantes dans la suspension. Une diminution de 5 Log est observée à la concentration de 2 pg/ml correspondant à la CMI décrite dans le tableau 1. Pour les concentrations plus élevées, aucune bactéries survivantes n'ont pu être détectées après 30 minutes d'incubation. L'activité bactéricide du peptide No. 2 sur P. aeruginosa est montrée sur la figure 3 par l'absence totale de bactéries survivantes après 30 minutes d'incubation avec la concentration 8pg/ml qui correspond à la CMI décrite dans le tableau 1. C - Etude de l'influence des protéines sériques humaines sur l'activité antibactérienne des peptides. Une colonie isolée de la bactérie E. oli ATCC 25922 ou P. aeruginosa ATCC 27853 est mise en suspension dans 3 à 5ml de milieu de culture Mueller-Hinton (MH) et incubée à 37 C pendant une nuit sous agitation. A partir de cette culture de nuit, une culture en phase exponentielle de croissance de la souche est réalisée ; le milieu MH est ensemencé au 1/50è avec la culture de nuit et incubé 2 heures à 37 C sous agitation. La concentration bactérienne est ajustée à - 5x105 ufc/ml (unités formant colonies) dans le milieu MH contenant 0,10, 25 ou 50% de sérum humain. 50 pl d'inoculum bactérien sont distribués par puits (plaque de polystyrène 96 puits) contenant un volume égal de la solution de peptides dilué de demi en demi dans le milieu MH additionné de 0,10, 25 ou 50% de sérum humain (concentration en peptides de 0. 5 à 512 ug/ml). La CMI est déterminée comme la concentration la plus faible qui provoque l'absence de croissance des bactéries (absence de turbidité) après 18 heures de culture dans une étuve à 37 C. La CMI est exprimée en g/ml (mg/1). Le tableau 2 ci-dessous rapporte les CMI des peptides No. 1 et No. 2 évaluées en absence et en présence de sérum humain. Tableau 2 Escherichia coli Pseudomonas Sérum aeruginosa humain ATCC 25922 aeruginosa ATCC 27853 0 8 - 32 64-256 Peptide No. 1 10 8 - 32 128 25 2 64 - 128 50 4 32 - 128 0 1 1 - 2 Peptide No. 2 10 1 2 25 1 16 50 1 - 2 16 L'activité antibactérienne contre P. aeruginosa du peptide No. 1 n'est pas modifiée en présence de sérum. L'activité du peptide No.1 contre E. coli augmente en présence de 25% et 50% de sérum humain dans le milieu de culture. Les concentrations croissantes de sérum humain n'ont pas d'effet sur l'activité antibactérienne du peptide 2 contre E. coli. L'activité du peptide No.2 envers P. aeruginosa est diminuée en présence de 25 et 50% de sérum humain. D - Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) en milieu liquide pour les champignons filamenteux et les levures. Concentrations en peptide testées : de 0,2ug/ml à 100pg/ml. Le tableau 3 ci dessous rapporte l'activité des peptides contre les champignons. Tableau 3 Séquence C. neoformans C. albicans A. Fumigatu CMI (ug/ml) Cn52D ATCC 90028 s 2001/143.02 No. 1 12,5 AND* AND No. 2 1,56 AND AND No. 3 1,56 AND AND * AND : Activité Non Détectée à lOOug/ml Les résultats montrent que les 3 peptides testés sont actifs sur Cryptococcus neoformans. II - Evaluation de l'activité hémolytique des peptides. 1x106 érythrocytes humains sont incubés pendant 30 minutes avec des concentrations croissantes de peptides (de 0 à 500ug/ml) dans un volume final de 150ul. L'activité hémolytique est évaluée par mesure de l'absorbance (Abs) à la longueur d'onde 414nm (Absorbance de l'hémoglobine) des surnageants cellulaires. L'absorbance du surnageant après incubation des érythrocytes dans l'eau correspond à 100% (Abs100) d'hémolyse et l'absorbance du surnageant après incubation des érythrocytes dans le PBS correspond à 0% d'hémolyse (Abso). L'activité hémolytique des peptides exprimée en pourcentage correspond à (Abspeptide - Abso) Abs100 X 100. La figure 4 rapporte l'étude de l'activité hémolytique des peptides No. 1, No. 2 et No. 3 sur les érythrocytes humains. Les peptides ne montrent pas d'activité hémolytique. III - Evaluation de la stabilité des peptides. Un volume de 3,9 ml de plasma humain est ajouté à 100 l de peptide No. 2 à 2 mM. La stabilité est réalisée à 37 C. Après 0, 0.5, 1,2, 4 et 6 heures, 3x200 l sont prélevés et ajoutés à 10 l de standard interne (peptide No. 1) à 500uM dans de l'eau, auxquels 800 l d'acide trifluoroacétique (TFA) 0,1% dans de l'eau sont additionnés. Un volume de 1 ml de ce mélange est déposé sur la résine C2(EC) préalablement équilibrée avec 1 ml de TFA 0,1% dans de l'eau, 1 ml de TFA 0. 1% dans de l'acétonitrile et 1 ml de TFA 0,1% dans de l'eau. Après deux lavages avec 1 ml de TFA 0,1% dans de l'eau, l'élution du peptide et de ces métabolites se fait par 1 ml de TFA 0,1% dans du méthanol. Celui-ci est ensuite séché sous flux d'air et repris dans 200 ul de TFA 0. 1% dans de l'eau. Un volume de 100 l est analysé par HPLC sur une colonne Luna C18 (2), 3 , 4.6 x 100mm (Phenomenex) avec du TFA 0,1% dans de l' eau comme solvant A et du TFA 0.1% dans de l'acétonitrile comme solvant B. Un gradient de 15-45% de B en 12 minutes est utilisé pour l'élut ion avec un débit de 1.2 ml/min et la détection est réalisée à 214 nm. La figure 5 rapporte l'étude de la stabilité du peptide 2 dans trois lots de plasma humain issus de groupes sanguins différents : A+ (A) ; B+ (B) et O+ (C) . (*:peptide No. 2, A et A : métabolites Deux principaux métabolites sont générés par clivage du peptide No. 2. Le peptide No. 2 est dégradé au maximum à 41% après 6 heures d'incubation dans le plasma humain. Quel que soit le groupe sanguin dont est issu le plasma, il n'y a pas de différence significative dans la dégradation du peptide. REVENDICATIONS 1) Un peptide comprenant ou consistant en : - une première séquence peptidique de formule (KLAKLAK), où K est l'acide aminé Lysine, L est l'acide aminé Leucine et A est l'acide aminé Alanine, et - une seconde séquence peptidique de formule (B), où B est un peptide de 4 à 15 acides aminés chargé positivement à pH neutre, comprenant ou consistant en au moins un motif peptidique de formule ssXXss, où (3 est un acide aminé basique et X est n'importe quel acide aminé, et dans lequel, ladite première séquence peptidique est répétée n fois et ladite seconde séquence peptidique est répétée m fois, n et m étant des nombres entiers compris entre 1 et 5. 2) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que n est un nombre entier compris entre 1 et 3. 3) Peptide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que m est supérieur à 1 et en ce que les secondes séquences peptidiques (B) sont identiques ou différentes. 4) Peptide selon la revendication 3, caractérisé en ce que les motifs peptidiques de formule ssXXss sont identiques ou différents, dans chacune des secondes séquences peptidiques (B). 5) Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les première(s) et seconde(s) séquences peptidiques sont : - alternées, ou - regroupées à l'une et/ou l'autre des extrémités N et C terminales d'une ou desdites première(s) ou seconde(s) séquences peptidiques. 6) Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la ou les premières séquences peptidiques sont regroupées à l'une et/ou l'autre des extrémités N et C terminale de la ou des seconde(s) séquence(s) peptidique(s). 7) Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites première(s) et seconde(s) séquences peptidiques sont liées par des liaisons covalentes, avantageusement peptidiques. 8) Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que dans le motif peptidique de formule ssXXss, ss est un acide aminé basique de préférence choisi dans le groupe comprenant l'arginine (R) et la lysine (K) et X est choisi dans le groupe comprenant la leucine (L), la glycine (G) et l'histidine (H). 9) Composition pharmaceutique, cosmétique, agroalimentaire ou agronomique comprenant comme agent actif au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 10) Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle est utile pour prévenir et/ou traiter une infection bactérienne et/ou fongique, chez l'homme, l'animal ou les plantes. 11) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il code pour un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 12) Molécule d'acide nucléique, comme un vecteur, comprenant au moins un polynucléotide selon la revendication 11. 13) Hôte, comme une cellule animale ou végétale ou encore un procaryote, comprenant une molécule d'acide nucléique selon la revendication 12. 14) Une plante générée à partir d'une cellule végétale selon la revendication 13.