Brevet FR2839726A1 — publié le 20031121

L'invention concerne une méthode de mesure du processus de recombinaison non-homologue de l'ADN ou Non-Homologous End Joining (NHEJ) dans des cellules de mammifère, des molécules d'ADN double-brin hybrides et des cellules modifiées pour la mise en #uvre de cette méthode, ainsi que leur utilisation pour le criblage de médicaments anti-cancéreux ou anti-rétroviraux. Au cours de la vie somatique et de la transmission de l'information génétique, l'ADN subit des lésions programmées, spontanées, environnementales ou induites, dont la réparation est nécessaire pour le maintien de l'intégrité du matériel génétique et la survie cellulaire. Ces lésions, de nature très diverses, sont, pour la plupart, réparées fidèlement ; toutefois, les défauts de réparation et les anomalies de la recombinaison conduisent à des mutations et des réarrangements du génome qui peuvent être à l'origine des évènements d'initiation de la cancérogenèse et de prédispositions génétiques à des pathologies diverses. Les radiations ionisantes sont à l'origine de différentes lésions de l'ADN, parmi lesquelles les cassures double-chaîne (CDC) sont connues comme étant responsables des effets biologiques radio-induits les plus toxiques (mutations, instabilité chromosomique, etc. ). Les CDC peuvent également se produire à la suite d'arrêts de la fourche de réplication, notamment générés par certaines drogues utilisées en chimiothérapie. Les cassures double-chaîne peuvent être réparées par des processus de recombinaison qui sont principalement de deux types : # La recombinaison homologue, qui permet de réparer les CDC en utilisant des séquences homologues intactes d'une molécule donneuse (chromosome homologue, chromatide s#ur, séquence homologue sur un plasmide) ; une homologie de plusieurs dizaines de bases est nécessaire entre les deux partenaires de la recombinaison. # La recombinaison par religature des extrémités ou recombinaison non-homologue (Non-Homologous End Joining, NHEJ), qui ne nécessite pas de fortes homologies entre les séquences des deux extrémités de la CDC. Chez les mammifères, la réparation des CDC s'effectue principalement par le processus de recombinaison non-homologue ou processus NHEJ qui re-ligature les extrémités cassées. Outre leur participation au maintien de l'intégrité du génome, les processus de recombinaison non-homologue peuvent aussi être impliqués dans des phénomènes biologiques ayant des effets moins favorables pour la cellule : - les cellules délétées ou défectives pour les protéines cellulaires impliquées dans le processus NHEJ présentent une sensibilité accrue aux radiations ionisantes ; en conséquence, pour optimiser les traitements radio- et chimiothérapeutiques, notamment anti-cancéreux, l'utilisation d'inhibiteurs du processus NHEJ pourrait augmenter l'efficacité desdits traitements et donc diminuer les doses utilisées aussi bien en radiothérapie qu'en chimiothérapie. Ceci pourrait permettre de diminuer les risques secondaires associés au traitement lui-même et d'améliorer le confort du malade. - les protéines impliquées dans le processus NHEJ participent également au maintien des télomères, essentiel dans les cellules en réplication active telles que les cellules tumorales. L'inhibition de cette voie pourrait également sensibiliser les cellules proliférantes à des stress génotoxiques. - enfin, la machinerie cellulaire du processus NHEJ serait impliquée dans l'intégration des rétrovirus dans le génome cellulaire, puisque le génome viral s'intègre, après cassure double-brin de l'ADN cellulaire. Les protéines impliquées dans le processus NHEJ constituent de nouvelles cibles pharmacologiques représentant une solution supplémentaire dans le cadre des multithérapies. Des inhibiteurs du processus NHEJ constitueraient une voie efficace dans le traitement contre les rétrovirus comme le VIH, par exemple en inhibant le phénomène d'intégration du virus. Toutefois, l'isolement de tels inhibiteurs du processus NHEJ implique de disposer d'outils simples, sensibles et spécifiques, adaptés à l'analyse quantitative rapide des évènements de recombinaison non-homologue dans une cellule de mammifère ; de tels outils doivent permettre, non seulement d'analyser les processus de recombinaison ou de réparation mis en jeu, mais aussi de mesurer leur efficacité. Il existe aujourd'hui différentes méthodes d'analyse de la réparation des cassures double-chaîne : Certaines se font directement sur les cellules après irradiation, soit par évaluation de la survie cellulaire, soit par analyse de l'ADN par électrophorèse en champ pulsé. Ces méthodes sont approximatives car elles ne permettent pas d'analyser précisément les processus de recombinaison (homologue ou non-homologue) impliqués dans la réparation et des études supplémentaires, au niveau moléculaire, sont nécessaires pour identifier la nature de ces processus. D'autres méthodes, plus précises, utilisent un substrat qui est un fragment d'ADN extrachromosomique (plasmidique) ou intrachromosomique comprenant des marqueurs génétiques. Certains substrats possèdent un ou plusieurs sites de coupure I-Sce I. I-Sce 1 est une enzyme de restriction particulière de la catégorie des méganucléases ; elle est codée par un intron de la mitochondrie de la levure Saccharomyces cerevisiae, sa spécificité et sa précision sont importantes, grâce à son site de reconnaissance qui excède 12 pb pour atteindre 18 pb ou plus et est asymétrique. L'insertion du site I-Sce I assure donc une coupure unique dans le génome des cellules de mammifère et en fait un outil idéal pour l'étude de la réparation des CDC ; sites I-Sce I permettent de provoquer une CDC dirigée à l'intérieur de la cellule, et les marqueurs génétiques d'identifier le mode de réparation de l'ADN mis enjeu. 1) Les méthodes qui utilisent un substrat plasmidique comprennent essentiellement : la transfection transitoire de cellules de mammifère par des plasmides préalablement linéarisés et l'analyse (PCR, Southern-Blot, séquençage) de la réparation de cet ADN plasmidique (efficacité et fidélité), après extraction et amplification dans des bactéries (Smith et al; N.A.R., 2001,29 (23), 4783-4792 ; Escarceller et al., J. Mol. Biol., 1998,279, 375-385). Ces méthodes ne permettent pas de mesurer la réparation dans un contexte chromosomique mais dans un contexte plasmidique, ce qui modifie énormément les contraintes et est générateur d'artefacts ; beaucoup d'évènements peuvent être générés par la transfection elle-même et le nombre de copies par cellule est difficilement contrôlable. En outre, le passage en bactéries peut également affecter les résultats ; par exemple, des cellules mutantes pour le gène KU (défaut de réparation des cassures double-chaîne et sensibilité aux radiations), analysées par cette méthode, ne montrent pas de diminution de l'efficacité de réparation mais seulement une diminution de sa fidélité. En outre, ces méthodes présentent l'inconvénient d'être longues, difficilement automatisables et peu sensibles ; elles ne permettent pas de détecter de différences dans la réparation, inférieures à un facteur 10. 2) Les méthodes qui utilisent un substrat chromosomique comprennent essentiellement : l'intégration dans le génome de cellules de mammifère d'un site I-Sce 1 placé dans un gène de résistance à une drogue, la coupure double-brin dirigée du substrat et l'analyse de la réparation de l'ADN, soit par l'acquisition de la résistance à la drogue (système sélectif : Lukacsovich et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 5649 , Liang et al., P. N. A. S., 1998,95, 5172-), soit par analyse directe de l'ADN (système non-sélectif : Liang et al., précité ; et al., Mol. Cell. Biol., 1999, ,8353- 8360, Lin et al., Genetics, 2001,158, 1665-1674). De manière plus précise : - Lukacsovich et al. (précité) décrivent un système sélectif comprenant un gène de la thymidine kinase (tk), interrompu par un site I-Sce I, intégré de façon stable, en un seul exemplaire dans le génome de fibroblastes tk-. L'enzyme ISce 1 est introduite par électroporation, soit seule pour identifier des phénomènes de recombinaison non-homologue, soit accompagnée de constructions servant de substrat pour une recombinaison homologue : pTARG (qui possède le gène tk avec une interruption par introduction d'une séquence inversée de 104 paires de bases) ou pAL2 (porteur du gène tk sauvage). Les phénomènes de réparation (homologues ou nonhomologues) sont analysés par PCR et Southern blot. Cette méthode qui repose sur l'acquisition de la résistance à la drogue ne permet d'analyser que la réparation non-homologue infidèle (perte du site IScel pour récupérer le cadre de lecture du gène de résistance) et non pas l'efficacité de la réparation non-homologue, dans la mesure où les évènements fidèles ou infidèles qui ne restaurent pas le cadre de lecture ouvert ne sont pas révélés. En outre, cette méthode est longue (plusieurs semaines pour comptabiliser les clones recombinants résistants à l'antibiotique), coûteuse en culture cellulaire, et difficilement automatisable. - Liang et al. (précité) décrivent un système sélectif comprenant un gène marqueur hygR entouré de deux gènes de la néomycine (néo) en répétition directe, intégré de façon stable, en un seul exemplaire, dans le génome de cellules de mammifère : le premier en 5' (S2neo) contient un site I-Sce 1 et possède un site NcoI muté, le second en 3' (3'néo) est un fragment tronqué de 0,7 kb du gène néo sauvage, mais possède une séquence comprenant le site NcoI fonctionnel, qui peut servir à réparer S2néo. La cellule qui possède ce substrat est résistante à l'hygromycine mais pas au G418. Après introduction de l'enzyme I-Sce 1 dans les cellules, la réparation des CDC, qui peut se faire par différents mécanismes de recombinaison homologue [par conversion génique, associée ou non à un crossing over, ou bien par appariement de l'ADN simple-brin ou SSA (Single-Strand Annealing) ], est mesurée par la fréquence des clones recombinants néo+ (néo+hyg ou néo+hyg+). Cette méthode qui repose sur l'acquisition de la résistance à la drogue ne permet pas d'analyser la NHEJ mais uniquement la recombinaison homologue. - Liang et al., précité, décrivent également un système non sélectif pour identifier les évènements homologues et non-homologues (NHEJ) ; dans ce système non sélectif, des cellules contenant le substrat chromosomique précédent, cultivées en milieu non sélectif, sont électroporées avec un plasmide d'expression du gène I-Sce 1 . Puis, 0,4 et 24 h plus tard, le gène néo est amplifié par PCR et les produits amplifiés sont digérés avec les enzymes Nco 1 et/ou I-Sce 1 et les réparations homologues (Nco I+ / I-Sce I-) ou non-homologues infidèles (Nco I- / I-Sce I-) sont identifiées par Southern-Blot. Cette méthode, qui repose sur l'analyse de l'ADN, est moins longue que la précédente, mais elle ne permet d'analyser que la réparation non-homologue infidèle (perte du site I-SceI pour récupérer le cadre de lecture du gène de résistance) et non pas l'efficacité de la réparation non-homologue. Il apparaît donc qu'on ne dispose à l'heure actuelle, d'aucune méthode d'analyse de la réparation des cassures CDC par recombinaison, qui soit spécifique du processus NHEJ et permette en outre une analyse qualitative et quantitative de ce mécanisme (efficacité et fidélité). Or, compte tenu des implications médicales du processus NHEJ et en particulier de l'intérêt de trouver des inhibiteurs de ce processus, il existe un réel besoin de disposer d'une méthode spécifique, rapide, sensible et simple à mettre en #uvre, permettant d'analyser qualitativement et quantitativement la recombinaison non-homologue (NHEJ) dans les cellules de mammifère. C'est la raison pour laquelle les Inventeurs ont mis au point un substrat qui permet effectivement d'identifier spécifiquement le processus NHEJ et d'en mesurer l'efficacité et la fidélité dans les cellules de mammifère. La présente invention a ainsi pour objet une molécule d'ADN double-brin hybride isolée, destinée à être utilisée comme substrat de recombinaison non-homologue, caractérisée en ce qu'elle comprend : - un seul promoteur unidirectionnel et au moins deux gènes rapporteurs différents, respectivement A et C dans le sens de la transcription ; le seul gène rapporteur sous le contrôle dudit promoteur étant le gène rapporteur A, et - deux sites de coupure double-brin dirigée identiques, le premier site de coupure étant situé entre le promoteur et le gène rapporteur A et le second site de coupure étant situé en amont du gène rapporteur C ou dans celui-ci. Dans le processus NHEJ, aucune homologie de séquence n'est nécessaire pour la réparation de la CDC. Aussi lorsqu'il y a deux CDC, la religature des deux extrémités de la double chaîne d'ADN peut donc aboutir à trois types d'événements, à savoir : (i) la reconstitution de la molécule initiale, (ii) la délétion simple du fragment d'ADN compris entre les deux sites de coupure et (iii) l'inversion du fragment d'ADN. En outre, la réparation peut-être fidèle ou infidèle : elle est fidèle lorsque les deux extrémités de la cassure double-chaîne sont religaturés sans modification de séquence, dans le cas contraire (substitution, insertion, délétion d'un ou de plusieurs nucléotides), elle est infidèle. Selon un mode de réalisation avantageux de la molécule d'ADN double-brin hybride selon l'invention, elle comprend également un troisième gène rapporteur B situé entre le gène rapporteur A et le second site de coupure double-brin dirigée, lequel gène rapporteur B est inversé par rapport au sens de la transcription dudit promoteur. La molécule d'ADN double-brin selon l'invention ou substrat de recombinaison non-homologue, comprend donc essentiellement trois éléments qui sont nécessaires et suffisants pour évaluer le type de réparation mis enjeu (délétion si 2 gènes rapporteurs A et C ;délétion ou inversion si 3 gènes rapporteurs A, B, C), ainsi que l'efficacité et la fidélité de cette réparation, à savoir : - un promoteur, - au moins deux gènes rapporteurs différents A et C ; préférence trois gènes (A, B et C), et - deux sites de coupure double-brin dirigée identiques, en orientation directe ou inverse. Au sens de la présente invention, les sites de coupure double-brin dirigée sont des sites de coupure d'une enzyme de restriction telle qu'une enzyme de restriction à site rare ou une méganucléase ; enzymes de restriction sont définies sur le site http://www.meganucléase.com. Le substrat de recombinaison non-homologue selon l'invention permet de mesurer rapidement (révélation 24 à 72 heures après cassure) la réparation, qu'elle soit fidèle ou infidèle. L'utilisation du substrat permet aussi de cribler de nouvelles molécules inhibitrices des protéines impliquées dans le processus de réparation d'ADN non-homologue ou Non-Homologous End Joining (NHEJ). La construction du substrat est telle qu'après coupure double-brin avec une endonucléase (enzyme de restriction) puis réparation, seul un des trois gènes rapporteurs (A, B ou C) est placé sous le contrôle du promoteur et s'exprime : - le gène rapporteur A s'exprime s'il n'y a pas de coupure ou si la réparation conduit à la reconstitution de la molécule initiale ; le gène B qui est inversé et le gène C ne s'expriment pas , - le gène rapporteur C s'exprime si la réparation conduit à la délétion simple du fragment d'ADN compris entre les deux sites de coupure ; la délétion des gènes A et B place le gène C immédiatement derrière le promoteur, et - le gène rapporteur B, lorsqu'il est présent, s'exprime si la réparation conduit à l'inversion du fragment d'ADN compris entre les deux sites de coupure ; l'inversion place le gène B immédiatement derrière le promoteur, le gène A qui est inversé et le gène C qui est éloigné ne s'expriment pas. Selon le produit (A, B ou C) détecté par des moyens appropriés notamment des anticorps spécifiques des produits A, B ou C, on en déduit le mécanisme, l'efficacité et la fidélité de la réparation. La détection spécifique permet aussi bien d'identifier que de quantifier l'événement. Selon un autre mode de réalisation avantageux de la molécule d'ADN double-brin selon l'invention, le premier site de coupure double-brin dirigée est situé entre le promoteur et le gène rapporteur A et le second site de coupure double-brin dirigée est situé entre les gènes rapporteurs B et C. En effet, les sites de coupure double-brin dirigée peuvent se trouver dans des séquences codantes ou non codantes. Cependant, lorsque ces sites de coupure double-brin dirigée sont placés dans des régions codantes (dans l'un des gènes rapporteurs), il est nécessaire que la réparation reconstitue un gène rapporteur fonctionnel ou au contraire inhibe un gène (sélection négative ou positive). Dans ce cas, on ne peut mesurer que des évènements fidèles ou que des évènements infidèles (selon que l'on procède à une sélection positive ou négative). En revanche, lorsque les sites de coupure sont placés dans des régions non codantes, l'ensemble des évènements est pris en compte et le rapport entre fidélité et mutagenèse peut être mesuré. En effet, certains traitements peuvent affecter non pas l'efficacité mais la fidélité du mécanisme de réparation. En outre, l'expression du gène rapporteur n'est pas conditionnée par l'événement de recombinaison, laissant ainsi le choix (fidélité ou mutagenèse) au mécanisme de réparation. Ainsi, si le site de coupure est dans une région non codante, on peut avantageusement mesurer la fidélité de la réparation sans pression de sélection. Cette disposition, qui présente l'avantage particulier de découpler efficacité et fidélité de réparation, est donc préférée. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de la molécule d'ADN double-brin selon l'invention, lesdits sites de coupure double-brin dirigée sont dans la même orientation (orientation directe). Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de la molécule d'ADN double-brin selon l'invention, lesdits sites sont en orientation opposée (orientation inverse). Selon une disposition avantageuse des modes de réalisation précédents, lesdits sites sont des sites de coupure d'une enzyme de restriction sélectionnée dans le groupe constitué par les enzymes de restriction à site rare et les méganucléases ; de préférence, ladite enzyme de restriction à site rare possède un site asymétrique (non-palindromique) et ladite méganucléase est I-Sce I. En effet, selon l'orientation des sites de coupure asymétrique, le substrat permet en plus de différencier directement les évènements fidèles ou infidèles. Par exemple, I-Sce I reconnaît un site de 18 pb et lorsqu'elle clive ce site, elle laisse 4 nucléotides sortants. Mais à l'inverse des enzymes de restriction classiques, le site ISce 1 n'est pas palindromique. Ainsi, si les deux sites de coupure sont en orientation directe, les nucléotides sortants produits sont parfaitement complémentaires et la réparation peut être fidèle ou infidèle. Si les deux sites sont en orientation inverse, les nucléotides sortants ne sont pas complémentaires et la réparation doit obligatoirement modifier les extrémités pour effectuer la ligature ; elle doit être obligatoirement infidèle. Dans cette orientation, les évènements sont donc une mesure directe de la réparation infidèle. Les deux constructions donnent donc des informations complémentaires. En outre, la possibilité d'avoir un substrat avec les deux types d'orientation présente l'avantage supplémentaire de pouvoir différencier directement les évènements fidèles ou infidèles sans avoir à séquencer les molécules recombinantes. Ainsi, deux substrats comprenant deux sites I-Sce I respectivement en orientation directe et inverse et deux gènes rapporteurs A et C ou un seul substrat comprenant deux sites 1-6'ce I en orientation directe ou inverse et trois gènes rapporteurs A, B et C, permettent avantageusement de mesurer l'efficacité et la fidélité de la recombinaison non-homologue, 48 h après coupure double-brin dirigée et réparation ; - Le substrat comprenant deux sites I-Sce I en orientation directe mesure : (i) la somme des réparations fidèles et infidèles, par l'expression de C qui résulte de la délétion du fragment interne et, dans le cas de trois gènes rapporteurs différents, (ii) la réparation nécessairement infidèle, par l'expression de B qui résulte de l'inversion du fragment interne, et - Le substrat avec les deux sites I-Sce I en orientation inverse mesure : (iii) la réparation nécessairement infidèle, par l'expression de C qui résulte de la délétion du fragment interne et, dans le cas de trois gènes rapporteurs différents, (iv) la somme des réparations fidèles et infidèles, par l'expression de B qui résulte de l'inversion du fragment interne. # L'efficacité globale de la recombinaison non-homologue est mesurée, soit par la proportion de cellules exprimant l'un des gènes rapporteurs B ou C dans la population cellulaire totale (cellules B+ + cellules C+, cas d'un seul substrat A, B, C), soit par la somme de la proportion de cellules exprimant le gène rapporteur C dans la population cellulaire totale (ou dans la population de cellules transfectées, si l'efficacité de transfection varie en fonction du substrat), obtenue avec chacun des substrats (orientation directe et orientation inverse). # La fidélité de la recombinaison non-homologue peut-être mesurée par la comparaison de la proportion de cellules exprimant le gène rapporteur C, obtenue avec le substrat en orientation directe et celui en orientation inverse. En outre, les remaniements importants de l'ADN peuvent être mesurés avec les deux types de substrats, 5 jours après la coupure de l'ADN (temps nécessaire au renouvellement (turn-over) des protéines), par la proportion de cellules exprimant le gène rapporteur C, et éventuellement B dans l'ensemble des cellules ayant subi une réparation notable (cellules n'exprimant aucun des gènes rapporteurs). Comme promoteur, on peut utiliser tout promoteur qui est actif dans des cellules de mammifère. A titre d'exemple non-limitatif, on peut citer : le promoteur précoce du cytomégalovirus (CMV), le promoteur de l'antigène T du virus SV40, de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex ou de la phosphoglycérate kinase, le fragment LTR des rétrovirus et les promoteurs inductibles comme celui de la métallothionine ou ceux du type Tet on/off. Les promoteurs de type LTR sont particulièrement intéressants, puisqu'ils sont capables de fonctionner à distance. Comme gène rapporteur, on peut utiliser tout gène dont l'expression est détectable par des moyens simples et sensibles (fluorescence, luminescence, techniques immunoenzymatiques (ELISA) ou radioimmunologiques (RIA)). A titre d'exemple non-limitatif on peut citer les gènes codant pour des antigènes de surface comme par exemple CD4, CD8 ou les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) comme les antigènes H2 du CMH de classe I de la souris (H2-K, H-2D, H2-L), des protéines à fluorescence intrinsèque comme la GFP (Green Fluorescent Protein) et leurs différents variants de couleur (YFP pour Yellow Fluorescent Protein, RFP pour Red Fluorescent Protein ou BFP pour Blue Fluorescent Protein), le gène LacZ (P-galactosidase) et les gènes de résistance aux antibiotiques (néomycine, hygromycine, puromycine, blasticidine, zéocine). Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de la molécule d'ADN double-brin selon l'invention, elle comprend également une cassette d'expression d'un marqueur de sélection tel qu'un marqueur métabolique ou un gène de résistance à un antibiotique (néomycine, hygromycine, puromycine, blasticidine, zéocine), utile pour la sélection de cellules modifiées ayant intégré une copie de ladite molécule d'ADN double-brin dans leur génome. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de la molécule d'ADN double-brin selon l'invention, lesdits gènes rapporteurs A, B, C sont sélectionnés dans le groupe constitué par les antigènes H2, CD4 et CD8. La présente invention a également pour objet un vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'ADN double-brin, telle que définie ci-dessus. De nombreux vecteurs où l'on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Selon un mode de réalisation avantageux du vecteur selon l'invention, il est sélectionné dans le groupe constitué par les plasmides, les vecteurs viraux intégratifs tels que l'AAV, les rétrovirus et les lentivirus, et les vecteurs de recombinaison homologue. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO: 2 correspondant respectivement aux plasmides dénommés pSH-Del et pSH-Iv. Ces plasmides comprennent le promoteur CMV, deux sites 1-6'ce I respectivement en orientation directe ou inverse et les séquences codantes des antigènes H2-K (orientation 5'-3'), CD8 (orientation 3'-5') et CD4 (orientation 5'-3'), liées de façon fonctionnelle à un signal de polyadénylation. La présente invention a également pour objet, une cellule modifiée comprenant une molécule d'ADN double-brin ou un vecteur tels que définis ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux de la cellule modifiée selon l'invention, elle est modifiée par intégration génomique d'une copie de ladite molécule d'ADN double-brin. De préférence, la cellule modifiée telle que définie ci-dessus est une cellule de mammifère. La présente invention a également pour objet un mammifère nonhumain recombinant, comprenant une molécule d'ADN double-brin telle que définie ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux de la cellule modifiée ou du mammifère non-humain recombinant tels que définis ci-dessus, ils comprennent également une cassette d'expression d'une enzyme de restriction sélectionnée dans le groupe constitué par les enzymes de restriction à site rare et les méganucléases. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite enzyme de restriction à site rare possède un site de coupure asymétrique (nonpalindromique). Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite enzyme de restriction est la méganucléase I-Sce I. La présente invention a également pour objet une méthode de mesure du processus de recombinaison non-homologue (NHEJ) dans des cellules de mammifères, caractérisée ne ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : ai) la culture de cellules de mammifère modifiées comprenant une molécule d'ADN double-brin hybride telle que définie ci-dessus, lesdites cellules étant avantageusement modifiées soit à l'aide d'ADN nu, soit à l'aide d'un vecteur contenant ladite molécule d'ADN double-brin, conformément aux méthodes exposées ci-dessus, b1) la coupure de l'ADN desdites cellules, au niveau desdits sites de coupure double-brin de ladite ou desdites molécule (s) double-brin hybride(s), par un moyen approprié, ci) l'analyse de l'expression des gènes rapporteurs A, et C, et éventuellement B, dans lesdites cellules par un moyen approprié, et dl) la mesure de l'efficacité et de la fidélité de la réparation de l'ADN desdites cellules par détermination de la proportion de cellules exprimant le gène rapporteur C et éventuellement le gène rapporteur B. La présente invention a également pour objet une méthode de criblage de modulateurs du processus de recombinaison non-homologue (NHEJ) dans des cellules de mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : a2) la culture de cellules de mammifère modifiées telles que définies ci-dessus, b2) le traitement desdites cellules modifiées par au moins une substance à tester, ci) la coupure de l'ADN desdites cellules, au niveau desdits sites de coupure double-brin de ladite ou desdites molécule(s) d'ADN double-brin hybride(s), par un moyen approprié, d2) l'analyse de l'expression des gènes rapporteurs A et C et éventuellement B dans lesdites cellules traitées ou non-traitées, par un moyen approprié, et e2) la mesure de l'activité de ladite substance sur l'efficacité et la fidélité de la réparation de l'ADN par comparaison, entre les cellules traitées et nontraitées, de la proportion de cellules exprimant le gène rapporteur C et éventuellement le gène rapporteur B. Selon un mode de mise en #uvre avantageux des méthodes précédentes, elles comprennent la mise en #uvre, en parallèle, de deux types de cellules modifiées comprenant une molécule d'ADN double-brin hybride incluant deux gènes rapporteurs A et C et deux sites de coupure double-brin dirigée, respectivement en orientation directe et inverse. Selon un autre mode de mise en #uvre avantageux des méthodes précédentes, les dites cellules modifiées à l'étape a1 ou a2 comprennent une molécule d'ADN double-brin hybride incluant trois gènes rapporteurs A, B et C et deux sites de coupure double-brin dirigée en orientation directe ou inverse. Selon encore un autre mode de mise en #uvre avantageux des méthodes précédentes, ladite coupure double brin dirigée de l'ADN à l'étape bi ou C2, est réalisée par une enzyme de restriction sélectionnée dans le groupe constitué par les enzymes de restriction à site rare et les méganucléases ; préférence, ladite enzyme de restriction à site rare possède un site asymétrique et ladite méganucléase est I-Sce 1 ; de manière préférée ladite enzyme de restriction est introduite dans lesdites cellules modifiées par un vecteur approprié, tel que défini ci-dessus. Avantageusement, l'analyse de l'expression des gènes rapporteurs A et C et éventuellement B à l'étape ci ou d2 est effectuée en cytométrie de flux ou par une méthode immunoenzymatique (ELISA), soit directement, soit à l'aide d'anticorps spécifiques desdits gènes rapporteurs, couplés à un marqueur approprié. La présente invention a également pour objet un kit de mesure du processus de recombinaison non-homologue (NHEJ) dans des cellules de mammifère, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une molécule d'ADN double-brin ou une cellule de mammifère modifiée telles que définies ci-dessus. La présente invention a également pour objet l'utilisation du procédé de criblage tel que défini ci-dessus, pour la sélection de médicaments anti-cancéreux ou anti-rétroviraux. La présente invention a également pour objet un modulateur du processus de recombinaison non-homologue (NHEJ), caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé de criblage tel que défini ci-dessus. La présente invention a également pour objet un médicament comprenant un modulateur tel que défini ci-dessus. La présente invention a également pour objet l'utilisation du modulateur tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un médicament anti-cancéreux ou anti-rétroviral. Les avantages de la méthode de mesure du processus de recombinaison non-homologue (NHEJ) telle que définie ci-dessus sont les suivants : - spécificité Du fait de la structure particulière du substrat de recombinaison, les cellules de mammifère modifiées contenant une copie chromosomique de ce substrat qui sont mises en #uvre dans la méthode selon l'invention, permettent de mesurer spécifiquement le processus de recombinaison non-homologue (NHEJ) dans un contexte chromosomique. En outre, cette méthode prend en compte les événements fidèles ou infidèles puisque les coupures dans la présente invention peuvent se faire dans des régions non-codantes. - sensibilité L'utilisation d'un seul substrat comprenant trois gènes rapporteurs différents ou de deux substrats comprenant des sites de coupure en orientation directe et inverse et deux gènes rapporteurs différents, lesquels gènes rapporteurs sont sous le contrôle transcriptionnel d'un seul promoteur, permet une détection sensible de l'ensemble des événements de recombinaison non-homologue (réparation fidèle ou infidèle par délétion ou par inversion). - simplicité L'analyse de l'expression des trois transgènes dans les cellules de mammifère modifiées est effectuée très facilement (FACS, ELISA), à l'aide d'anticorps commerciaux et permet de mesurer directement le processus de recombinaison non-homologue (NHEJ). Contrairement, aux méthodes de l'art antérieur telles que décrites ci-dessus, les résultats sont interprétables sans avoir à séquencer les molécules recombinantes. - rapidité A la différence des méthodes de l'art antérieur précédemment citées elle est rapide puisque les résultats sont obtenus en 24 h à 72 h. En raison de ces différents avantages, la méthode selon l'invention est facilement automatisable ; cellules transformées par la séquence d'ADN hybride ou substrat selon l'invention sont ensemencées dans chaque puits d'une plaque de culture (plaques à 96 puits), puis elles sont infectées par un vecteur d'expression codant pour un enzyme de restriction à site rare non-palindromique ou une méganucléase (I-Sce I). Après incubation avec un anticorps commercial spécifique de chaque transgène (seul ou en mélange), on mesure l'expression du gène rapporteur, directement, dans chaque puits (cytométrie de flux, ELISA). En outre, si les gènes rapporteurs codent pour un antigène de surface, il n'est pas nécessaire de lyser les cellules, ce qui facilite l'automatisation. Par comparaison, l'automatisation est beaucoup plus compliquée à mettre en #uvre avec les procédés de l'art antérieur. Par exemple, dans le cas d'un procédé utilisant des substrats plasmidiques (épisomiques), il faut ensemencer les cellules dans les plaques, transfecter chaque puits, extraire les plasmides de chaque puits, puis les utiliser pour transformer des bactéries (un clone par puits). Ces différents avantages permettent d'envisager le criblage à grande échelle de molécules pharmacologiques capables d'inhiber le processus de recombinaison non-homologue (molécules anti-NHEJ). Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre du substrat de recombinaison non-homologue (NHEJ) et du procédé de criblage objets de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre la stratégie de clonage des sites I-Sce I dans les substrats plasmidiques de recombinaison non-homologue pSH-Del (SEQ ID NO: 1) et pSH-Iv (SEQ ID NO: 2) : - panneau supérieur et central : un premier oligonucléotide (1LO, SEQ ID NO: 3) contenant de 5' en 3', un premier site Nhe I, un site Xba I, un site I-Sce I (orientation 5'-3') et un second site Nhe I et un deuxième oligonucléotide (1 UP, SEQ ID NO : 4) complémentaire du précédent, sont hybridés et clonés dans les deux orientation au site Nhe I du plasmide pdDNA6/V5-His. Les plasmides obtenus contiennent respectivement un fragment Il incluant un site I-Sce I en orientation 3'-5' (pSH-Iv) et un fragment Il incluant un site I-Sce I en orientation 5'-3' (pSH-Del). - panneau~inférieur: un fragment de 119 pb a été amplifié par PCR à l'aide des amorces P1(SEQ ID NO: 5) et P2 (SEQ ID NO: 6), puis un fragment de 30 pb contenant les sites Cla I, Sce I et Xba I, obtenu par hybridation des oligonucléotides 2LO (SEQ ID NO: 7) et 2 UP (SEQ ID NO: 8) a été inséré au site Nde I du fragment de 119 pb pour donner le fragment I2. Ce fragment a été cloné au site BstE II des plasmides précédents pour donner les plasmides pSH-Iv et pSH-Del contenant 2 sites I-Sce I respectivement en orientation inverse et directe. - la figure 2 illustre la structure d'un substrat plasmidique de recombinaison non-homologue (NHEJ) de séquence SEQ ID NO: 1 (pSH-Del) ou SEQ ID NO: 2 (pSH-Iv), après linéarisation au niveau du site Sca I: ces plasmides dérivent du plasmide pcDNA6/V5-His (INVITROGEN) portant les gènes de résistance à l'ampicilline (ampR) et à la blasticidine (blastiR), par insertion des fragments suivants respectivement au site Nhe I, BamH I, Xho I, BstE II et BstB I du site de clonage multiple situé entre le promoteur hCMV et le signal de polyadénylation du gène BGH : un fragment Il contenant un site I-Sce I en orientation 5'-3' ou 3'-5', un fragment A contenant la séquence codante de l'antigène H2-Kdde souris (orientation 5'-3') immédiatemment suivie du signal de polyadénylation du virus SV40, un fragment B contenant la séquence codante de l'antigène CD8 de souris (orientation 3'- 5') immédiatemment suivie du signal de polyadénylation du gène tk du virus de l'Herpès simplex, un fragment I2 contenant un site I-Sce I en orientation 5'-3' et un fragment C contenant la séquence codante de l'antigène CD4 de souris (orientation 5'- 3'). Les distances entre les fragments sont indiquées en nombre de pb, les grandes flèches en gras indiquent l'orientation des séquences codantes et les petites flèches indiquent la position et l'orientation des amorces 1 et 2 (SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO:8) utilisées pour l'analyse des clones de cellules de mammifère modifiées ayant intégré au moins une copie du substrat de recombinaison. - la figure 3 illustre la mesure du processsus de recombinaison nonhomologue (NHEJ) dans des cellules de mammifères modifiées contenant le substrat de recombinaison non-homologue conforme à l'invention (cellules H2+CD4-CD8-) : l'expression des antigènes H2, CD4 et CD8 est analysée par cytométrie de flux ou par ELISA, environ 48 h à 72 h après la transfection d'un vecteur d'expression de l'enzyme I-Sce I ; l'efficacité globale de la réparation non-homologue de l'ADN dans des cellules de mammifère est mesurée par le pourcentage de cellules exprimant CD8 ou CD4 (CD4+ + CD8+), et ce pour les deux types de substrats. La fidélité de la recombinaison peut être mesurée par la différence entre la proportion de cellules CD4+ obtenue avec le substrat en orientation directe et celui en orientation inverse. Les flèches verticales indiquent la position des sites I-Sce I et les flèches horizontales, l'orientation des séquences codantes des antigènes H2 (5'-3'), CD8 (3'-5') et CD4 (5'- 3'), relativement au promoteur hCMV (P) ; les flèches en trait plein représentent les antigènes qui sont exprimés et les flèches en pointillés représentent les antigènes qui ne sont pas exprimés. Exemple 1 : de substrats de recombinaison non-homologue selon l'invention (figures 1 et 2) 1 ) Matériel et méthodes Les constructions ont été réalisées en utilisant les protocoles classiques de préparation, de clonage et d'analyse de l'ADN tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc. Library of Congress, USA). Le plasmide pcDNA6/V5-HisC (INVITROGEN) qui contient : (i) le promoteur du cytomégalovirus humain (hCMV) lié à un site multiple de clonage, pour l'insertion des séquences d'intérêt, et au signal de polyadénylation de l'hormone de croissance bovine (BGH), (ii) le gène de la résistance à la blasticidine sous le contrôle du promoteur EM-7, pour la sélection de cellules de mammifère modifiées ayant intégré les séquences d'intérêt dans leur génome et (iii) le gène de résistance à l'ampicilline, pour la sélection des clones recombinants ayant inséré un fragment d'ADN dans le site multiple de clonage du plasmide, a été utilisé pour construire deux substrats plasmidiques de recombinaison non-homologue dénommés respectivement pSH-Del et pSH-Iv. Ces plasmides qui contiennent le promoteur hCMV, deux sites I-Sce 1 en orientation directe (pSH-Del, figure 1) ou inverse (pSH-Iv, figure 1) et les antigènes H2Kd, CD8 et CD4 de souris, ont été construits par clonages successifs de 5 fragments (A, I2, I1, B et C dans l'ordre du clonage), respectivement aux sites BamH I, BstE II, Nhe I, Xho 1 et BstB 1 du plasmide pcDNA6/V5-HisC (figure 2). De manière plus précise, les 5 fragments ont été obtenus de la façon suivante: - fragment I1 Ce fragment Nhe I d'environ 50 pb de séquence non-codante, contenant un site I-Sce I entre les positions 7 et 24 (vecteur pSH-Iv) ou entre les positions 30 et 47 (pSH-Del), a été obtenu par hybridation des oligonucléotides 1LO (SEQ ID NO: 3, figure 1) et 1UP (SEQ ID NO: 4, figure 1). - fragment A Ce fragment BamH I d'environ 1,5 kb issu du plasmide pKC-Kd.wt (Lalanne et al., N. A.R., 1983, 11, 1567-1577), contient la séquence codante (positions 26 à 1132 de la séquence Genbank J00402) et un fragment de séquence 3' non-codante de l'antigène H2-Kd, ainsi que les séquence de l'intron de l'antigène t et du signal de polyadénylation du virus SV40. -fragment B Ce fragment a été obtenu de la façon suivante : (i) le fragment Xba ISal I de 800 pb du plasmide pSMLyt2aMMCL/2 (décrit dans Turner et al. Cell, 1990, 60,755-765, fourni par le Dr. D. Littman), contenant la séquence codante de l'antigène CD8 de souris mutée en positions 691 et 697 (Cys227Ala et Cys229Ala) et (ii) le fragment Sca I-Hind III de 570 pb du plasmide pTK-Hygro (Genbank U02428, fourni par CLONTECH), contenant 60 pb de séquence 3' et le signal de polyadénylation du gène de la thymidine kinase (TkpA), ont été insérés successivement entre les sites Xba I et Xho I et les sites BamH I et Hind III du plasmide pcDNA3 (INVITROGEN), puis le fragment BamH I-Hind III du plasmide ainsi obtenu contenant les séquences CD8 et TkpA, a été réparé par la polymérase de Klenow. De manière alternative, le fragment contenant la séquence codante de l'antigène CD8 (positions 13 à 756 de la séquence Genbank M12825) peut-être amplifié par PCR à partir d'ADNc de lymphocytes T CD8+, à l'aide d'amorces correspondant aux extrémités 5' et 3' de ladite séquence codante. - fragment I2 Ce fragment BstE II d'environ 150 pb de séquence non-codante issue du gène de résistance à l'hygromycine (positions 3057 à 2938 du plasmide pDR2 de séquence Genbank U02428), contenant un site I-Sce I situé entre les positions 71 et 88, a été obtenu de la façon suivante : un fragment de 119 pb a été amplifié par PCR à l'aide des amorces P1 (SEQ ID NO: 5) et P2 (Seq ID NO: 6), puis un fragment de 30 pb contenant les sites Cla I, Sce I et Xba I, obtenu par hybridation des oligonucléotides 2LO (SEQ ID NO: 7, figure 1) et 2 UP (SEQ ID NO: 8, figure 1) a été inséré au site Nde I du fragment de 119 pb. - fragment C Ce fragment, contenant une partie de la séquence codante (domaines extracellulaire, transmembranaire et un fragment du domaine cytoplasmique) et de la séquence 3' non-codante de l'antigène CD4, a été obtenu par digestion du plasmide pMV7L3T4-Tl (décrit dans Turner et al., précité, et fourni par le Dr. D. Littman) par EcoR I et Hind III, puis réparation, par la polymérase de Klenow, du fragment de 1500 pb ainsi obtenu ; de manière alternative, ledit fragment peut-être amplifié par PCR à partir d'ADNc de lymphocytes T CD4+, à l'aide d'amorces correspondant aux extrémités 5' et 3' de la séquence codante de l'antigène CD4 (positions 170 et 1439 de la séquence Genbank X04836). Les fragments obtenus ont été insérés successivement aux sites de clonage suivants du plasmide pcDNA6/V5-HisC (figures 1 et 2): - le fragment A a été cloné en orientation 5'-3', au site BamH I (figure 2), - le fragment 12 a été en orientation 5'-3', au site BstE II (figure 1), - le fragment Il a été cloné dans les 2 orientations (orientation 5'-3' pour pSH-Del et orientation 3'-5' pour pSh-Iv), au site Nhe I (figure 1), - le fragment B a été cloné en orientation 3'-5'au site Xho I, préalablement réparé par la polymérase de Klenow (figure 2) et - le fragment C a été cloné en orientation 5'-3' au site BstB I, préalablement réparé par la polymérase de Klenow (figure 2). Les plasmides obtenus, contenant deux sites I-Sce I en orientation directe ou en orientation inverse, sont dénommés respectivement pSH-Del et pSH-Iv. 2) Résultats La figure 2 illustre la structure générale des substrat plasmidiques pSH-Del et pSH-Iv présentant respectivement les séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2, après linéarisation au niveau du site Sca I. Ces substrats, dérivés du vecteur pcDNA6/V5-HisC, comprennent successivement : - le promoteur hCMV (issu du vecteur pcDNA6/V5-HisC), - un site I-Sce I, en orientation 5'-3' ou 3'-5', dans une séquence noncodante d'environ 150 pb, et situé environ 75 pb en aval de la fin de la séquence du promoteur hCMV, - la séquence de l'antigène H2Kd liée au signal de polyadénylation de SV40 (en orientation 5'-3') ;l'ATG et le codon stop étant situés environ 200 pb et 1290 pb en aval de la fin de la séquence du promoteur hCMV, - la séquence de l'antigène CD8 liée au signal de polyadénylation du gène tk (en orientation 3'-5') ; l'ATG et le codon stop étant situés environ 3170 pb et 2380 pb en aval de la fin de la séquence du promoteur hCMV, - un site 1-6'ce I, en orientation 5'-3', dans une séquence non-codante d'environ 150pb, et situé environ 3190 pb en aval de la fin de la séquence du promoteur hCMV, - la séquence de l'antigène CD4 (en orientation 5'-3') liée au signal de polyadénylation du gène BGH (issue du vecteur pcDNA6/V5-HisC) ; et le codon stop étant situés environ 3490 pb et 4865 pb en aval de la fin de la séquence du promoteur hCMV, - et tous les autres éléments constitutifs du vecteur pcDNA6 situés en amont du promoteur hCMV et en aval du signal de polyadénylation du gène BGH, notamment le gène de résistance à la blasticidine permettant de sélectionner des cellules eucaryotes ayant intégré une copie du substrat de recombinaison. La carte du plasmide pSH-Del (SEQ ID NO: 1) est présentée dans le Tableau ci-dessous ; les séquences en italique correspondent à celles du plasmide pcDNA6 et les séquences en gras à celles qui ont été insérées, les positions des amorces utiles pour la PCR sont également indiquées et les amorces permettant la détection des évènements de recombinaison non-homologue sont soulignées. Tableau I: carte du plasmide pSH-Del position séquence amorce 1-310 Fin du gène amp 680-1267 Promoteur CMV OFA-7 (742-764) amorce 1 (871-848) CMV-1 (971-995) Seql (1228-1246) 1369-1386 Site I-Sce 1421-1465 5'non-codante d'H2 1466-2553 Séquence codante d'H2 H2K-int (1617-1597) H2K-end (2490-2467) 2554-2613 3' non-codante d'H2 2614-2790 Intron de l'Ag t SV40 2791-3035 polyA de SV40 3036-3090 Polylinker 3091-3659 polyA tk PolyA-tk (3623-3643) 3733-4476 Séquence codante de CD8 CD8-int (4279-4298) 4602-4620 Site I-Sce I 4697-4829 5' non-codante de CD4 4830-6101 Séquence codante de CD4 CD4-int (5026-5005) CD4-end (5649-5625) 6102-6107 3' non-codante de CD4 6308-6535 polyA BGH 7045-7340 ori SV40 7362-7440 EM7 7463-7861 gène de la blasticidine 9350-9906 début du gène de amorce 2 (9341-9365) l'ampicilline Exemple 2 : Construction d'une lignée de cellules de mammifère modifiée par intégration d'une copie du substrat selon l'invention 1) Matériels et méthodes a) Sélection de clones stables Les cellules de hamster (lignée CHO-K1, ATCC n CCL-61) sont cultivées dans du milieu DMEM (GIBCO) contenant 10 % de sérum de veau foetal (GIBCO), à 37 C , en présence de 5 % CO2. 106 cellules ont été électroporées (1000 V, 25F) avec 0,1 ug des plasmides substrats tels que décrits à l'exemple 1 préalablement linéarisés au niveau du site Sca I. Les cellules ont été ensuite ensemencées dans des boîtes de Pétri (100 mm de diamètre) contenant 10 ml de milieu DMEM tel que défini ci-dessus. 48 h après l'électroporation, de la blasticidine a été ajoutée dans le milieu de culture (5 g/ml), et les clones résistants ont été prélevées après 10 jours de culture en milieu sélectif. b) analyse des clones b1) analyse des antigènes exprimés La présence de l'antigène H2-Kd et l'absence d'antigène CD4 sont analysées par cytométrie de flux (FACS), pour chaque clone sélectionné. De manière plus précise, les cellules sont décollées en présence de PBS contenant 50 mM d'EDTA, rincées avec du PBS, puis incubées simultanément avec un anticorps anti-H2-Kd couplée à la phycoérythrine (clone SF1.1, BD PHARMINGEN) et un anticorps anti-CD4 couplé à l'isothiocyanate de fluorescéine (RM-5, BD PHARMINGEN), en suivant les recommandations du fournisseur. Les cellules sont analysées en cytométrie de flux et les clones exprimant l'antigène H2-Kdmais pas l'antigène CD4 et l'antigène CD8 (clones H2+CD4-CD8-) sont conservés. b2) analyse de l'ADN génomique L'ADN génomique de chaque clone est extrait par les techniques classiques, selon les protocoles décrits dans Current Protocols in Molecular Biology, précité. La présence d'au moins une copie complète d'un substrat dans le génome des clones est analysée par PCR à l'aide d'une amorce sens complémentaire du gène de l'ampicilline (amorce 2 de séquence SEQ ID NO: 9 correspondant aux positions 9341-9345 de pSH-Del, figure 2) et d'une amorce anti-sens complémentaire du promoteur CMV (amorce 1 de séquence SEQ ID NO: 10 correspondant aux positions 871-848 de pSH-Del, figure 1). Les résultats sont confirmés en Southem blot, à l'aide d'une sonde marquée correspondant au gène de la blasticidine. 2) Résultats Des clones stables exprimant l'antigène H2-Kd mais pas l'antigène CD4 et l'antigène CD8 (clones H2+CD4- CD8-) ont été isolés après transfection de pSH-Iv (11clones) et pSH-Del (8 clones). Parmi ces clones, 5 au moins contiennent une copie unique du substrat intégrée dans leur génome. Exemple 3 : Criblage de molécules modulant la recombinaison non-homologue (NHEJ) selon le procédé de l'invention (figure 3). 1) Matériels et méthodes a) Traitement des cellules de mammifère modifiées selon l'invention par la molécule à tester. Des cellules de mammifère modifiées obtenues à l'exemple 2 (105 à 106 cellules H2+CD4-CD8-) sont cultivées en milieu DMEM contenant 10 % de sérum de veau foetal et 5 g/ml de blasticidine, puis la molécule à tester est ajoutée dans le milieu de culture. b) Induction de la cassure double brinpar l'enzyme I-Sce I L'enzyme I-Sce I est introduite dans les cellules préalablement traitées par la molécule tester, à l'aide d'un vecteur d'expression plasmidique tel que décrit dans Rouet et al., P. N.A.S., 1994,91, 6064-6068 ou d'un vecteur rétroviral dérivé du plasmide pTRIPdelta, décrit dans Zennou et al., Cell, 2000,101, 173-185, selon les protocoles classiques connus de l'Homme du métier. De préférence, les cellules sont infectées par le vecteur rétroviral qui permet de réaliser une coupure double-brin dans 100 % des cellules. c) analyse de l'expression des différents antigènes 3 jours après l'introduction du vecteur d'expression dans les cellules modifiées traitées par la molécule à tester, les cellules sont décollées en présence de PBS contenant 50 mM d'EDTA, rincées avec du PBS, puis l'expression des différents antigènes est analysée par l'une des techniques suivantes : ci) fluorométrie (cytométrie de flux ou microscopie de fluorescence) Les cellules sont incubées simultanément avec : anticorps anti- H2Kd (clone SF1.1, BD PHARMINGEN) puis un anticorps secondaire (anticorps d'âne anti-IgG de souris) couplé à la cyanine (715-176-150, JACKSON, INTERCHIM), un anticorps anti-CD4 couplé à l'isothiocyanate de fluorescéine (RM- 4-5, BD PHARMINGEN) et un anticorps anti-CD8 couplé à la phycoérythrine (53- 6. 7, PHARMINGEN), en suivant les recommandations du fournisseur. Le pourcentage de cellules exprimant H2, CD8, CD4 ou bien aucun de ces antigènes est analysée en cytométrie de flux ou par comptage des cellules observées en microscopie de fluorescence. C2) ELISA Les cellules sont incubées dans des plaques à 96 puits recouvertes d'anticorps anti-CD4 ou anti-CD8 polyclonal de lapin puis lysées en présence d'un tampon approprié. Les plaques sont lavées, puis les complexes antigène-anticorps formés sont révélées en présence d'un anticorps monoclonal de rat couplé à la phosphatase alcaline ou fluorescent. Le pourcentage de cellules exprimant CD8ou CD4 est analysée à l'aide d'un lecteur ELISA. d) mesure de la recombinaison non-homologue (NHEJ) dans les cellules traitées ou non traitées L'efficacité globale de la réparation non-homologue de l'ADN dans des cellules de mammifère est mesurée par le pourcentage de cellules exprimant CD8 ou CD4 (CD4+ + CD8), et ce pour les deux types de substrats. La fidélité de la recombinaison peut être mesurée par la différence entre les pourcentages de cellules CD4+ obtenus avec les substrats en orientation directe (pSH-Del) et inverse (pSH-Iv). La comparaison des valeurs obtenues dans les cellules traitées ou non traitées permet de déterminer si la molécule à tester module l'efficacité et/ou la fidélité de la recombinaison non-homologue de type NHEJ. 2) Résultats Des clones stables exprimant l'antigène H2-Kdmais pas l'antigène CD4 et l'antigène CD8 (clones H2+CD4- CD8-) isolés après transfection de pSH-Iv et pSH-Del ont été transfectés de façon transitoire par un plasmide d'expression de l'enzyme I-Sce I (efficacité de 20 %). A différents temps après la transfection, les pourcentages de cellules exprimant les antigènes CD4 et CD8dans la population cellulaire totale ont été déterminés par analyse en cytométrie de flux. Les résultats obtenus avec les substrats chromosomiques de recombinaison contenant deux sites ISce I, respectivement en orientation directe (pSH-Del) et inverse (pSH-Iv), sont présentés dans les tableaux II et III ci-dessous. Tableau II Temps CD4+ CD8+ CD4-H2- 24 h 2 0 0 48 h 2,5 0 0,7 72 h 3,5 0 1,5 14j 7 - 7 Tableau III Temps CD4+ CD8+ CD4-H2- 24 h 1 0 - 48 h 3,5 0 0,7 72 h 3,8 0 1,5 9 j 4,3 - - Dans les conditions de transfection utilisées (efficacité de 20 %), on observe la présence de cellules CD4+ résultant de la réparation de l'ADN par délétion mais pas de cellules CD8+ résultant de la réparation de l'ADN par inversion. On observe également une augmentation croissante avec le temps, des cellules H2-CD4- CDS- résultant d'un remaniement important de l'ADN. L'utilisation simultanée des deux substrats permet à la fois de mesurer l'efficacité globale de la recombinaison non-homologue par le pourcentage de CD4+ obtenu avec pSH-Del, et la fidélité de cette recombinaison par comparaison avec les pourcentages de CD4+ obtenus avec pSH-Iv qui mesure la réparation nécessairement infidèle de l'ADN. Ces résultats démontrent que les substrats pSH-Del et pSH-Iv permettent de mesurer l'efficacité et la fidélité de la recombinaison non-homologue dans des cellules de mammifère. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 ) Molécule d'ADN double-brin hybride isolée, destinée à être utilisée comme substrat de recombinaison non-homologue, caractérisée en ce qu'elle comprend : - un seul promoteur unidirectionnel et au moins deux gènes rapporteurs différents, respectivement A et C dans le sens de la transcription ; le seul gène sous le contrôle dudit promoteur étant le gène rapporteur A, et - deux sites de coupure double-brin dirigée identiques, le premier site de coupure étant situé entre le promoteur et le gène rapporteur A et le second site de coupure étant situé en amont du gène rapporteur C ou dans celui-ci. 2 ) Molécule d'ADN double-brin selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend également un troisième gène rapporteur B situé entre le gène rapporteur A et le second site de coupure double-brin dirigée, lequel gène rapporteur B est inversé par rapport au sens de la transcription dudit promoteur. 3) Molécule d'ADN double brin selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que lesdits sites de coupure double-brin dirigée sont dans la même orientation. 4) Molécule d'ADN double brin selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que lesdits sites de coupure double-brin dirigée sont en orientation opposée. 5 ) Molécule d'ADN double-brin selon l'une quelconque des revendications 2 à 4 , caractérisée en ce que le second site de coupure double-brin dirigée est situé entre les gènes rapporteurs B et C. 6 ) Molécule d'ADN double-brin selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que lesdits sites de coupure double-brin dirigée sont des sites de coupure d'une enzyme de restriction sélectionnée dans le groupe constitué par les enzymes de restriction à site rare et les méganucléases. 7 ) Molécule d'ADN double-brin selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite enzyme de restriction à site rare possède un site asymétrique. 8 ) Molécule d'ADN double-brin selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite méganucléase est 1-6'ce I. 9 ) Molécule d'ADN double-brin selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend également une cassette d'ex- pression d'un marqueur de sélection. 10 ) Molécule d'ADN double-brin selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, caractérisée en ce que lesdits gènes rapporteurs A, B, C sont sélectionnés dans le groupe constitué par les antigènes H2, CD4 et CD8. 11 ) Vecteur caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'ADN double brin selon l'une quelconque des revendications 1 à 10. 12 ) Vecteur selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les plasmides, les vecteurs viraux intégratifs tels que l'AAV, les rétrovirus et les lentivirus, et les vecteurs de recombinaison homologue. 13 ) Vecteur selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO: 2. 14 ) Cellule modifiée par une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou un vecteur selon l'une quelconque des revendications 11 à 13. 15 ) Cellule selon la revendication 14, modifiée par intégration génomique d'une copie de ladite molécule d'ADN double-brin. 16 ) Cellule de mammifère modifiée selon la revendication 14 ou la revendication 15. 17 ) Mammifère non-humain recombinant, comprenant une molécule d'ADN double brin selon l'une quelconque des revendications 1 à 10. 18 ) Cellule modifiée selon l'une quelconque des revendications 14 à 16 ou mammifère non-humain recombinant selon la revendication 17, caractérisés en ce qu'ils comprennent également une cassette d'expression d'une enzyme de restriction telle que définie à l'une quelconque des revendications 6 à 8. 19 ) Méthode de mesure du processus de recombinaison non- homologue (NHEJ) dans des cellules de mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : ai) la culture de cellules de mammifère modifiées par au moins une molécule d'ADN double-brin hybride selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ; lesdites cellules étant avantageusement modifiées conformément aux revendications 14 à 16 et 18, bi) la coupure de l'ADN desdites cellules, au niveau desdits sites de coupure double-brin de ladite ou desdites molécule(s) d'ADN double-brin hybride(s), par un moyen approprié, ci) l'analyse de l'expression des gènes rapporteurs A, C et éventuellement B dans lesdites cellules par un moyen approprié, et dl) la mesure de l'efficacité et de la fidélité de la réparation de l'ADN dans lesdites cellules par détermination de la proportion de cellules exprimant le gène rapporteur C et éventuellement le gène rapporteur B. 20 ) Méthode de criblage de modulateurs du processus de recombinaison non-homologue (NHEJ) dans des cellules de mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : a2) la culture de cellules de mammifère modifiées par au moins une molécule d'ADN double-brin hybride selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ; lesdites cellules étant avantageusement modifiées conformément aux revendications 14 à 16 et 18, b2) le traitement des cellules par au moins une substance à tester, c2) la coupure de l'ADN desdites cellules, au niveau desdits sites de coupure double-brin de ladite ou desdites molécule(s) d'ADN double-brin hybride(s), par un moyen approprié, d2) l'analyse de l'expression des gènes rapporteurs A, C et éventuellement B dans lesdites cellules traitées ou non-traitées, par un moyen approprié, et e2) la mesure de l'activité de ladite substance sur l'efficacité et la fidélité de la réparation de l'ADN par comparaison, entre les cellules traitées et non- traitées, de la proportion de cellules exprimant le gène rapporteur C et éventuellement le gène rapporteur B. 21 ) Méthode selon la revendication 19 ou la revendication 20, caractérisée en ce que ladite coupure double-brin dirigée de l'ADN à l'étape b1 ou C2 est réalisée par une enzyme de restriction telle que définie à l'une quelconque des revendications 6 à 8. 22 ) Méthode selon la revendication 19 ou la revendication 20, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en #uvre, en parallèle, de deux types de cellules modifiées comprenant une molécule d'ADN double-brin hybride incluant deux gènes rapporteurs A et C et deux sites de coupure double-brin dirigée, respectivement en orientation directe et inverse. 23 ) Méthode selon la revendication 19 ou la revendication 20, caractérisée en ce que les dites cellules modifiées à l'étape a1 ou a2 comprennent une molécule d'ADN double-brin hybride incluant trois gènes rapporteurs A, B et C et deux sites de coupure double-brin dirigée en orientation directe ou inverse. 24 ) Kit de mesure du processus de recombinaison non-homologue dans des cellules de mammifère, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une molécule d'ADN double brin selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou des cellules de mammifère modifiées selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, et 18. 25 ) Utilisation du procédé selon la revendication 20, pour le criblage de médicaments anti-cancéreux ou anti-rétroviraux.