Brevet FR2842199A1 — publié le 20040116

La présente invention est relative à une protéine recombinante modi- fiée dérivée de PBP2x de Streptococcus pneumoniae, dénommée mini-PBP2x, ainsi qu'à ses applications pour la sélection et l'identification d'antibiotiques actifs sur les souches de S. pneumoniae résistantes aux p-lactamines. La résistance aux antibiotiques représente un problème majeur en thérapie anti-infectieuse. Depuis plusieurs années, on observe l'apparition d'un nombre croissant de souches de bactéries très résistantes aux composés de la famille des ss- lactamines (pénicillines et céphalosporines..), qui représentent les antibiotiques les plus utilisés dans le monde entier depuis plus de 60 ans ; actuellement, 21 % des isolats cliniques Streptococcus pneumoniae, un des pathogènes majeurs des voies respiratoires supérieures sont très résistants aux p-lactamines (Concentration minimale inhibitrice (CMI) > 2 g/ml ; Doem et al., Antimicrob. Agents Chemother, 2001,45, 1721-1729). Les p-lactamines ont pour cible les PBPs (Penicillin Binding Proteins), des protéines membranaires qui catalysent des étapes essentielles de la synthèse du peptidoglycane de la paroi bactérienne. Chaque espèce de bactérie possède plusieurs PBPs, dont le poids moléculaire varie entre 30 kDa et 100 kDa. Les PBPs de haut poids moléculaire comprennent un domaine cytoplasmique court, un seul domaine transmembranaire et un grand domaine péri- plasmique et sont divisées en classe A (possédant à la fois l'activité transpeptidase et glycosyltransférase (pontage) et en classe B (possédant un domaine N-terminal de fonction inconnue et un domaine où se localise l'activité transpeptidase), qui sont facilement identifiables grâce à des motifs d'acides aminés conservés pour chaque classe de PBP. Les PBPs de faible poids moléculaire possèdent essentiellement une activité carboxypeptidase. Des études biochimiques indiquent que seules les PBPs de haut poids moléculaire sont des enzymes multifonctionnelles essentielles à la survie des bactéries ; en revanche les PBPs de faible poids moléculaire ne sont pas essentielles et régulent uniquement le degré de pontage de la paroi bactérienne. Le mode d'action des P-lactamines repose sur l'analogie de struc- ture entre le cycle des P-lactamines et le D-alanyl-D-alanine de l'extrémité C- terminale des peptides du peptidoglycane ; lesp-lactamines sont des pseudo-substrats de la transpeptidase capables d'acyler le résidu sérine du site actif de cette trans- peptidase, qui est ensuite déacylé très lentement, perturbant ainsi la synthèse du pepti- doglycane. Les mécanismes de résistance aux p-lactamines chez les bactéries à Gram+ comprennent essentiellement : la production de p-lactamases qui hydrolysent le cycle des p-lactamines avant qu'elles n'atteignent leur cible (PBPs), l'altération de la perméabilité membranaire et la modification des PBPs. Streptococcus pneumoniae a développé une résistance aux ss- lactamines en modifiant ses PBPs ; combinaison de mutations ponctuelles dans les gènes PBP et d'évènements de recombinaison homologue de ces gènes avec ceux des souches de streptocoques apparentées (S. mitis, S. oralis) résulte dans la production de PBPs possédant une faible affinité pour les P-lactamines. Parmi les PBPs de S. pneumoniae, la protéine PBP2x qui est essen- tielle pour la survie de S. pneumoniae et constitue le premier facteur de résistance aux p-lactamines (Hakenbeck et al., J. Bacteriol., 1998,180, 1831-1840), représente la cible majeure pour l'identification de nouveaux antibiotiques actifs sur les souches de S. pneumoniae, résistantes aux ss-lactamines. La PBP2x est une protéine de 750 acides aminés comprenant une région cytoplasmique (positions 1 à 18), une région transmembranaire (positions 19 à 48), un domaine ne liant pas les pénicillines (non penicillin-binding domain ou n-PB, positions 49-265), un domaine de liaison aux pénicillines/domaine transpeptidase (positions 266 à 615) et un domaine C-terminal (616-750). L'analyse structure-fonction de la PBP2x a permis de préciser les mécanismes moléculaires de la résistance de la PBP2x aux P-lactamines (Mouz et al., P. N.A.S., 1998, 95, 13403-13406 ; J. Biol. Chem., 1999, 274, 19175-19180). La structure tridimensionnelle de la PBP2x a été déterminée à partir d'une PBP2x comprenant une délétion des régions cytoplasmiques et transmembra- naires, dénommée PBP2x* ; structure a été déterminée avec une résolution de respectivement 3,5,2,4 et 3,2 , pour une souche de S. pneumoniae sensible aux ss- lactamines (Souche R6 : Pares et al., Nature Struct. Biol., 1996,3, 284-289 ; Gordon et al., J. Mol. Biol., 2000,299, 477-485) et pour un isolat clinique résistant (Dessen et al., J. Biol. Chem., 2001,276, 45106-45112 ; numéros d'accession dans la base de données PROTEIN DATA BANK (http://www.rcsb.org/), respectivement 1PMD, 1QME et 1K25). La structure tridimensionnelle d'un complexe entre une PBP2x* d'une souche sensible (souche R6) et une p-lactamine (céfuroxime) a également été déter- minée avec une résolution de 2,8 (numéro d'accession 1QMF dans la base de données PROTEIN DATA BANK et Gordon et al., J. Mol. Biol., 2000,299, 477- 485). Toutefois, les données actuellement disponibles n'ont pas permis d'identifier de nouvelles molécules antibiotiques actives sur les souches de S. pneumoniae résistantes aux p-lactamines, notamment en raison de la difficulté d'obte- nir des cristaux ayant un bon pouvoir diffractant (2,5 ) pour la PBP2x native (type sauvage, sensible aux P-lactamines), les complexes PBP2x-inhibiteurs et les variants de PBP2x résistants aux p-lactamines. En effet, l'analyse des cristaux de PBP2x qui diffractent à 2,4 (1QME, Gordon et al., J. Mol. Biol., 2000,299, 477-485) a montré qu'ils contenaient une forme de PBP2x partiellement protéolysée au niveau de la liaison peptidique entre les résidus en position 182 et 183, obtenue dans des conditions expérimentales non- reproductibles, résultant de l'exposition de la protéine PBP2x à 25 C pendant plusieurs mois, lors du processus de cristallisation. Les Inventeurs ont recherché, en choisissant comme modèle la PBP2x d'une souche de S. pneumoniae, sensible à la pénicilline (souche R6) dont la structure tridimensionnelle est connue, s'il était possible d'obtenir des PBP2x plus cristallisables de façon reproductible, et douées d'un meilleur pouvoir de diffraction. Ils ont ainsi constaté que des délétions supplémentaires dans la région correspondant au domaine n-PB (positions 50 à 265 de PBP2x) qui ne modifient pas les propriétés enzymatiques de PBP2x (liaison aux p-lactamines et acti- vité transpeptidase), permettaient d'obtenir facilement des cristaux ayant une meilleure qualité de diffraction. L'approche envisagée est applicable à n'importe quelle PBP2x issue d'une souche de S. pneumoniae sensible ou résistante aux P-lactamines. Cette mini-protéine représente un outil parfaitement adapté à la sélection et à l'identification de nouveaux antibiotiques, actifs sur les souches de S. pneumoniae résistantes aux p-Iactamines. En conséquence, la présente invention a pour objet une protéine dérivée d'une PBP2x de Streptococcus pneumoniae, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une concaténation des fragments correspondant respectivement aux acides aminés situés entre les positions 74 à 90,186 à 199, 218 à 228 et 257-750, en référence à la séquence de la protéine PBP2x de la souche R6 (SWISSPROT P14677 ou GENBANK 18266817), chacun desdits fragments étant précédé d'un fragment peptidique de 1 à 7 acides aminés. La protéine selon l'invention est dénommée ci-après mini-protéine PBP2x ou mini-PBP2x ; comprend donc la délétion des acides aminés situés respectivement entre les positions 1 à 73,91 à 185,200 à 217 et 229 à 256, telles que définies ci-dessus et l'insertion, en lieu et place desdites délétions, d'un fragment peptidique de 1 à 7 acides aminés. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite protéine mini- PBP2x, ledit fragment peptidique de 1 à 7 acides aminés comprend des acides aminés de la séquence de ladite protéine PBP2x de Streptococcus pneumoniae correspondant à ceux situés entre les positions-1 à-7, relativement aux résidus en position 74,186, 218 et 257 et/ou entre les positions +1 à +7, relativement aux résidus en position 90, 199 et 228 tels que définis ci-dessus. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite protéine mini-PBP2x, ledit fragment peptidique de 1 à 7 acides aminés comprend des acides aminés dont le volume de la chaîne latérale est petit, comme l'alanine (A), la sérine (S), la glycine (G) ou la thréonine (T). Au sens de la présente invention, ladite protéine PBP2x de S. pneumoniae est définie par les caractéristiques suivantes : # elle est codée par le gène dénommé pbpX correspondant à celui situé dans le génome de la souche R6 de S. pneumoniae, entre les positions 2263 et 4515du locus présentant le numéro d'accession NCBI AE008411 ou GENBANK 15457852. # elle comprend les motifs en acides aminés suivants (code à une lettre), propres aux PBPs de classe B. : Ml: RGXhX(D/S)RSGXXXA M2 : (R/K)XXPXG M3 : (G/Y) hEXXXDXXL M4 : hXX(S/T)hDXXXQ M5 : T(G/S)EhhXXXXSPXh(D/N) M6 : hEP(A/G)SXXK M7: hXXSXNh M8 : K (T/S)G, dans lesquels les acides aminés en gras sont strictement conservés dans les séquences de PBPs de classe B ; représente une alternative, par exemple D/S représente un acide aspartique ou une sérine ; X représente n'importe quel acide aminé ; h représente un acide aminé hydrophobe et les autres lettres représentent les acides aminés le plus fréquemment rencontrés à cette position, et # sa séquence présente sur sa totalité, au moins 30% d'identité, de préférence au moins 50 % d'identité ou au moins 85 % de similarité avec la séquence de la souche R6 (SWISSPROT P 14677). L'identité d'une séquence par rapport à une séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques, lorsque les deux séquences sont alignées, de manière à obtenir le maximum de corres- pondance entre elles. Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % d'identité avec une séquence de référence est définie, dans la présente invention comme une protéine dont la séquence peut inclure jusqu'à 100-X altérations pour 100 acides aminés de la séquence de référence, tout en conservant les propriétés fonction- nelles de ladite protéine de référence. Au sens de la présente invention, le terme alté- ration inclut les délétions, les substitutions ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. La similarité d'une séquence par rapport à une séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques ou qui différent par des substitutions conservatives, lorsque les deux séquences sont alignées de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. Au sens de la présente invention, on entend par substitution conservative, la substitution d'un acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques similaires (taille, charge ou polarité), qui généralement ne modifie pas les propriétés fonctionnelles de la protéine. Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % de similarité avec une séquence de référence est définie, dans la présente inven- tion comme une protéine dont la séquence peut inclure jusqu'à 100-X altérations non- conservatives pour 100 acides aminés de la séquence de référence. Au sens de la pré- sente invention, le terme altérations non-conservatives inclut les délétions, les substi- tutions non-conservatives ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. La présente invention englobe les mini-PBP2x dérivées d'une PBP2x de n'importe quelle souche de S. pneumoniae, sensible ou résistante aux p- lactamines, notamment d'isolats cliniques résistants aux P-lactamines. A titre d'exemple non-limitatif on peut citer la souche C 506 résistante aux P-lactamines qui est décrite dans l'article aux noms de Laible et al. (Mol. Microbiol., 1989,3, 1337- 1348). Selon un mode de réalisation avantageux de ladite protéine mini- PBP2x, elle est dérivée d'une souche de Streptococcus pneumoniae résistante aux p- lactamines. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite protéine mini-PBP2x, elle est constituée par la concaténation des fragments, tels que définis ci- dessus, de la PBP2x de la souche R6 de Streptococcus pneumoniae sensible aux ss- lactamines (SWISSPROT P14677) et elle présente la séquence SEQ ID NO: 1. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite protéine mini-PBP2x, elle comprend une substitution d'au moins un résidu méthionine par un résidu sélénométhionine. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite protéine mini-PBP2x, elle est associée à un ligand, notamment sous forme d'un complexe mini- PBP2x/ligand. Conformément à l'invention ledit ligand est constitué par une molécule organique, notamment une protéine telle qu'un anticorps, ou une molécule inorganique ; ledit ligand est notamment un substrat tel qu'un pseudo-substrat, capable de se lier à ladite protéine mini-PBP2x par l'intermédiaire de son site actif et d'inhiber l'activité de ladite mini-PBP2x. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de ladite protéine mini-PBP2x, elle est sous la forme d'un cristal. Conformément à l'invention, ledit cristal est constitué par une mini- PBP2x sous forme libre ou associée à un ligand tel que défini ci-dessus. Conformément à l'invention, les conditions de cristallisation de la mini-PBP2x sont déterminées par la technique de la goutte suspendue. Par exemple, des cristaux de mini-PBP2x sont obtenus dans les conditions suivantes : mini-PBP2x (12 mg/ml), Hepes sodique 100 mM, pH 7,5,2 % V/V PEG 400,2M sulfate d'ammo- nium, à la température de 8 C. Les mini-PBP2x constituées de fragments de PBP2x de souches de S. pneumoniae résistantes aux ss-lactamines sont utiles pour le criblage et l'identifica- tion de nouveaux antibiotiques ; les mini-PBP2x constituées de fragments de PBP2x de souches de S. pneumoniae sensibles, notamment la mini-PBP2x de séquence SEQ ID NO: 1 sont utiles comme contrôle, dans le criblage et l'identification d'antibiotiques. La présente invention a également pour objet un peptide, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment d'au moins 7 acides aminés de la protéine mini-PBP2x, telle que définie ci-dessus, lequel peptide inclut au moins un résidu choisi parmi ceux situés aux positions 74,90, 186, 199, 218, 228, et 257, tels que défi- nis ci-dessus ; un tel peptide est particulièrement utile pour la production d'anticorps reconnaissant spécifiquement la mini-PBP2x. La présente invention a également pour objet des anticorps, caracté- risés en ce qu'ils sont dirigés contre un peptide tel que défini ci-dessus. Conformément à l'invention, lesdits anticorps sont soit des anticorps monoclonaux, soit des anticorps polyclonaux. Ces anticorps peuvent être obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, comprenant notamment l'immunisation d'un animal avec une protéine ou un peptide conforme à l'invention, afin de lui faire produire des anti- corps dirigés contre ladite protéine ou ledit peptide. De tels anticorps sont utiles notamment pour immobiliser la mini- PBP2x sur un support solide ou bien pour la co-cristalliser sous forme de complexes anticorps-mini-PBP2x. La présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique isolée, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences codant pour une mini-PBP2x telle que définie ci-dessus et les séquences complémentaires des précédentes, sens ou anti-sens. L'invention a également pour objet des amorces destinées à amplifier spécifiquement les séquences codant pour une PBP2x, caractérisées en ce qu'elles sont sélectionnées dans le groupe constitué par la paire de séquence SEQ ID NO: 2-3. L'invention a également pour objet des sondes et des amorces, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence d'environ 10 à 30 nucléotides correspondant à celle située à la jonction des fragments peptidiques de 1 à 7 acides aminés et des fragments de la PBP2x ; sondes et ces amorces permettent de détec- ter/amplifier spécifiquement lesdites molécules d'acide nucléique codant une mini- PBP2x. Selon un mode de réalisation avantageux desdites sondes et desdites amorces, elles présentent une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 4 à 9. Les molécules d'acide nucléique selon l'invention sont obtenues par des méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library ofCongress, USA). Les séquences codant pour PBP2x peuvent être obtenues par ampli- fication d'une séquence nucléique par PCR ou RT-PCR ou bien par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue. Par exemple, elles sont amplifiées par PCR à l'aide d'une paire d'amorces appropriée comme la paire de séquences SEQ ID NO: 2-3. Les molécules d'acides nucléiques dérivées, codant pour une mini- PBP2x, sont obtenues par les méthodes classiques, permettant d'introduire des muta- tions dans une séquence d'acide nucléique, connues en elles-mêmes, suivant les proto- coles standards précités. Par exemple, la séquence codant pour la mini-PBP2x peut- être obtenue par mutagenèse dirigée selon la méthode de Kunkel et al., (P.N.A.S., 1985,82, 488-492), en utilisant les amorces SEQ ID NO: 4 à 7, puis amplification PCR à l'aide des amorces SEQ ID NO: 8 et 9, telles que définies ci-dessus. La présente invention a également pour objet un vecteur recombi- nant, caractérisé en ce qu'il comprend un insert sélectionné dans le groupe constitué par les molécules d'acides nucléiques codant une mini-PBP2x et leurs fragments tels que définis ci-dessus. De préférence, ledit vecteur recombinant est un vecteur d'expression dans lequel ladite molécule d'acide nucléique ou l'un de ses fragments sont placés sous le contrôle d'éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés. En outre, ledit vecteur peut comprendre séquences (étiquettes ou tag) fusionnées en phase avec l'extrémité 5' et/ou 3' dudit insert, utiles pour l'immobilisation, et/ou la détection et/ou la purification de la protéine exprimée à partir dudit vecteur. De manière préférée, ledit vecteur d'expression est un vecteur proca- ryote. Ces vecteurs sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes. La présente invention a également pour objet des cellules transfor- mées par un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdites cellules sont des cellules procaryotes. Les vecteurs recombinants et les cellules transformées tels que défi- nis ci-dessus, sont utiles notamment pour la production de la mini-PBP2x et des peptides dérivés, tels que définis ci-dessus. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une mini- PBP2x telle que définie ci-dessus pour le criblage et l'identification d'antibiotiques. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit criblage est réalisé par un procédé comprenant au moins les étapes suivantes : ai) la mise en contact d'une mini-PBP2x telle que définie ci-dessus avec une substance à tester, bi) la détection par tout moyen approprié de la liaison de ladite molécule à tester avec la mini-PBP2x et/ou de l'inhibition de l'activité de ladite mini- PBP2x résultant de cette liaison, et Ci) la sélection des substances actives capables de se lier à la mini- PBP2x et/ou d'inhiber l'activité de ladite mini-PBP2x, utilisables comme antibiotiques. La liaison de ladite molécule à tester avec la mini-PBP2x peut être mesurée par des tests de liaison classiques permettant de détecter les molécules capables de se lier de façon covalente au niveau de la sérine active (S337, en référence à la séquence de PBP2x de la souche R6), notamment à l'aide d'un ligand préalablement marqué avec un chromophore ou avec un fluorophore comme une céphalosporine couplée à un chrompophore (nitrocefin) ou bien par mesure de la décroissance de la fluorescence intrinsèque de ladite mini-PBP2x, comme décrit dans l'article aux noms de Jamin et al., Biochem. J., 1993, 292, 735-741. L'inhibition de l'activité enzymatique de la mini-PBP2x peut-être déterminée, soit par mesure de l'inhibition de l'hydrolyse des substrats thiolesters, soit par mesure de l'efficacité d'acylation de la sérine active, par les techniques classiques comme décrit dans l'article aux noms de Zhao et al., J. Bacteriol., 1997,179, 4901- 4908. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite identification est réalisée par un procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a2) la préparation de cristaux à partir d'une mini-PBP2x telle que définie ci-dessus, b2) la détermination de la structure tridimensionnelle de ladite mini- PBP2x à partir du cristal obtenu en a2), et C2) l'identification de substances actives capables de se lier à la mini- PBP2x et/ou d'inhiber l'activité de ladite mini-PBP2x, utilisables comme antibiotiques. Conformément à l'invention : - le cristal est préparé à partir d'une mini-PBP2x libre dérivée d'une PBP2x d'une souche de S. pneumoniae, sensible ou résistante aux P-lactamines, ou bien de complexes mini-PBP2x/ligand, par la technique de la goutte suspendue. - la structure tridimensionnelle de la mini-PBP2x est déterminée par les techniques classiques connues en elles mêmes comme la résonance magnétique nucléaire et la diffraction aux rayons X. - les inhibiteurs de PBP2x sont identifiés par modélisation de la structure de la mini-PBP2x libre ou des complexes mini-PBP2x-ligand. Avantageusement : - la mini-PBP2x selon l'étape a2) est soumise à un traitement préalable comprenant une étape de dénaturation par la température ou par un agent chimique, en présence ou en l'absence de ligands, suivie d'une étape de renaturation dans des conditions appropriées, - la mini-PBP2x selon l'étape a1) ou a2) est constituée par la conca- ténation des fragments, tels que définis ci-dessus, d'une PBP2x d'une souche de S. pneumoniae résistante aux p-lactamines, et - la détection effectuée à l'étape bi) ou la détermination et l'identifi- cation effectuées respectivement aux étapes b2) et c2) sont réalisées par comparaison avec une mini-PBP2x constituée par la concaténation des fragments, tels que définis ci-dessus, d'une PBP2x d'une souche de S. pneumoniae sensible aux P-lactamines. L'invention a également pour objet une trousse pour la mise en #uvre des procédés tels que définis ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle inclut au moins une protéine, un peptide, un anticorps, un vecteur, une cellule, une sonde ou une amorce, tels que définis ci-dessus. La mini-PBP2x selon l'invention qui peut-être produite en grande quantité sous une forme fonctionnelle soluble, et facilement cristallisable, et ce pour l'ensemble des PBP2x, présente les avantages suivants : - elle est adaptée au criblage systématique de nouvelles molécules antibiotiques par des tests fonctionnels (criblage à haut débit), - elle est adaptée à l'étude structure-fonction des variants de PBP2x résistants aux P-lactamines et à la conception rationnelle de nouvelles molécules anti- biotiques (modélisation moléculaire ou drug design). Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre de la mini-PBP2x objet de la présente invention ainsi qu'au Tableau 1 résumant les séquences de la Demande et au dessin annexé, dans lequel : - la figure 1 illustre la séquence en acides aminés d'une mini-PBP2x (SEQ ID NO: 1), issue de la PBP2x de la souche R6 de S. pneumoniae sensible aux ss- lactamines (SWISSPROT P14677) ; les acides aminés de PBP2x qui ont été délétés dans la mini-PBP-2x sont remplacés par un trait d'union et ceux des fragments pepti- diques qui ont été insérés sont représentés en italique ; les motifs propres aux PBPs de classe B sont soulignés. Tableau 1 : Liste des séquences Numéro d'identification Séquence SEQ ID NO: 1 Mini-PBP2x dérivée de PBP2x de la souche R6 (SWISSPROT P14677) SEQ ID NO: 2 amorce 5'ICNter SEQ ID NO: 3 amorce 3'ICCter SEQ ID NO: 4 oligonucléotide mini 1 SEQ ID NO: 5 oligonucléotide mini 2 SEQ ID NO: 6 oligonucléotide mini 3 SEQ ID NO: 7 oligonucléotide mini 4 SEQ ID NO: 8 oligonucléotide mini2x Ndel SEQ ID NO: 9 oligonucléotide mini2x XhoI Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1: PRODUCTION D'UNE MINI-PBP2x RECOMBINANTE 1) Construction d'un vecteur d'expression d'une mini-PBP2x a) Matériels et méthodes Un vecteur d'expression d'une mini-PBP2x a été construit à partir du plasmide pGEX-S-PBP2x*-fl (Mouz et al., J. Biol. Chem., 1999,274, 19175- 19180) contenant la séquence codant pour la PBP2x* de la souche R6 de S. pneumoniae sensible aux P-lactamines (fragment 49-750 de la PBP2x de la séquence en acides aminés GENBANK PI 4677, correspondant à la séquence nucléotidique GENBANK X16367). Les délétions des acides aminés situées entre les positions 49 à 73, 94 à 183,200 à 217 et 230 à 256 et l'insertion en lieu et place desdites délétions, respectivement des fragments de liaison Gly-Ser-Gly, Gly-Gly, Gly et Gly-Gly-Gly a été réalisée par mutagenèse dirigée, selon la méthode de Kunkel et al. (P. N.A.S., 1985,82, 488-492), en utilisant les protocoles tels que décrits dans Mouz et al., J. Biol. Chem., 1999, 274, 19175-19180). De manière plus précise, le phagemide dénommé pGEX-S-PBP2x*-fl est transformé en simple brin puis utilisé comme matrice pour les étapes de mutagénèse (délétions et insertions). Les étapes de mutagénèse ont été réalisées en deux étapes, la première avec les oligonucléotides Mini 1 (SEQ ID NO: 4) et Mini 3 (SEQ ID NO: 6) et la deuxième avec les oligonucléotides Mini 2 (SEQ ID NO: 5) et Mini 4 (SEQ ID NO: 7): - Mini 1 :5'-CATAAATAGTCCCACGTTTGGCCCCGGATCCACGCGGAACCAG-3', cet oligo- nucléotide permet la délétion de la séquence nucléotidique correspondant aux acides aminés situés entre les positions 49 et 73 de PBP2x et l'insertion en lieu et place de ladite délétion d'un fragment de liaison correspondant à un peptide Gly-Ser-Gly. - Mini 2: 5'-GTTTGGGTAACTACGATTGGGACCTCCAGAGGTTGCATCCTCAGCAATCGG-3', cet oligonucléotide permet la délétion de la séquence nucléotidique correspondant aux acides aminés situés entre les positions 94 et 183 de PBP2x et l'insertion en lieu et place de ladite délétion d'un fragment de liaison correspondant à un peptide Gly-Gly. - Mini 3: 5'-GTTCAAGGAACTCTCCATTCCACCGCCGATAAAACTAGAAGCAAATTG-3', cet oligonucléotide permet la délétion de la séquence nucléotidique correspondant aux acides aminés situés entre les positions 200 et 217 de PBP2x et l'insertion en lieu et place de ladite délétion d'un fragment de liaison correspondant à un peptide Gly. - Mini 4: 5'-TGTATAAACATCCTTACCGTCCCCACCTCCCCCTGCAAGAATACTGTTC-3', cet oligonucléotide permet la délétion de la séquence nucléotidique correspondant aux acides aminés situés entre les positions 230 et 256 de PBP2x et l'insertion en lieu et place de ladite délétion d'un fragment de liaison correspondant à un peptide Gly-Gly- Gly. Le plasmide ainsi obtenu, dénommé pGEX-S-mini-PBP2x-fl, a été utilisé comme matrice pour amplifier par PCR le fragment d'ADN correspondant à la mini-PBP2x et introduire à ses extrémités les sites de restriction Ndel et Xho I, pour le clonage dans le vecteur commercial pET30b (NOVAGEN). Les oligonucléotides utili- sés pour l'amplification PCR sont les suivants : - oligo Mini2x NdeI (SEQ ID NO: 8) : 5'-CCGCATATGGCCAAACGTGGGACTATTTAT-3' - oligo Mini2x XhoI (SEQ ID NO: 9) : 5'-GGCTCGAGTTAGTCTCCTAAAGTTAATGTAAT-3' La séquence nucléotidique de la mini-PBP2x, dans le vecteur d'expression ainsi obtenu, dénommé pET30b-mini-PBP2x, a été confirmée par séquençage automatique. b) Résultats La séquence peptidique déduite de la séquence nucléotique obtenue par séquençage automatique présente la séquence SEQ ID NO: 1 (figure 1), corres- pondant à celle attendue pour une mini-PBP2x. La mini-PBP2x est constituée par la succession des fragments correspondant respectivement aux acides aminés situés entre les positions 74 à 93, 184 à 199, 218 à 229 et 257-750 de la PBP2x (numéro d'accession SWISSPROT P14677), chaque fragment étant précédé respectivement du fragment de liaison GSG, GG, G et GGG. 2) Production et purification de mini-PBP2x a) Matériels et méthodes La mini-PBP2x est produite dans E. coli, à partir du vecteur d'expres- sion tel que décrit à l'exemple 1.1, puis elle est purifiée par chromatographie, succes- sivement sur colonne de Q-Sepharose, Resource Q et Superdex 200. Le produit obtenu est analysé par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et par spectro- métrie de masse (Electrospray ionization-mass spectrometry, ESI-MS). De manière plus précise, 2 litres de culture de la souche d'E.coli BL21 (DE 3) transformée par le plasmide pET30b-mini-PBP2x sont induits à une densité optique de 1 (600 nm), pendant 15 h à 16 C. Après centrifugation, le culot de bactéries est lavé par 500 ml de tampon A (Tris HCI, 20 mM, pH, 8,0, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA) contenant des inhibiteurs de protéases, puis il est resuspendu dans 50 ml du même tampon. Après sonication (6 min sur un lit de glace/éthanol), les 50 ml de lysat bactérien sont centrifugés à 40000 g, à + 4 C, pendant 20 min, et le surnageant obtenu est déposé sur une colonne échangeuse d'ions de 20 ml (Q-Sépharose, AMERSHAM-PHARMACIA), préalablement équilibrée avec le tampon A. Un gradient linéaire de sodium est réalisé avec le tampon B (Tris HCI, 20 mM, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA). La protéine mini-PBP2x est éluée à partir de 38 % de Tampon B. Les fractions éluées sont analysées en Western blot, à l'aide d'anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre la PBP2x*, puis elles sont regroupées. Le pool de fractions contenant la mini-PBP2x est dilué 10 fois dans du Tampon A sans NaCI puis déposé sur une colonne Resource Q de 6 ml (AMERSHAM-PHARMACIA) préala- blement équilibrée avec le tampon A. Un gradient linéaire de sodium est réalisé avec le tampon. La protéine mini-PBP2x est éluée à partir de 55 % de tampon B. Les fractions correspondant au pic d'élution sont analysées en SDS-PAGE 15 %. Les fractions les plus pures sont regroupées et le pool obtenu est concentré jusqu'à un volume de 2 à 4 ml, puis déposé sur une colonne de chromatatographie sur gel (Superdex 200,16/60, AMERSHAM-PHARMACIA), préalablement équilibrée dans un tampon 10 mM Hepes, pH 7,5,100 mM NaCl, 1 mM EDTA. La mini-PBP2x est éluée en un pic symétrique à un volume d'élution correspondant à une masse appa- rente de 60 kDa. b) Résultats La préparation de protéine mini-PBP2x ainsi obtenue présente un degré de pureté supérieur à 95 %. Le rendement final en protéine mini-PBP2x purifiée est de 10 à 15 mg/litre de culture, en fonction des préparations. La purification par chromatographie sur gel montre la présence d'un pic d'élution symétrique qui atteste de l'homogénéité de la protéine en terme d'oligo- mérisation. Le volume d'élution correspond à une protéine monomérique. La protéine mini-PBP2x présente une excellente solubilité car elle peut-être concentrée jusqu'à 15 mg/ml sans qu'elle ne précipite. L'analyse en spectrométrie de masse montre la présence d'une protéine homogène, qui présente une masse moléculaire de 59465 Da correspondant à . celle calculée à partir de la séquence en acides aminés. EXEMPLE 2 : DES PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES ET ENZYMATIQUES DE LA MINI-PBP2x 1) Matériels et méthodes Les propriétés physico-chimiques et enzymatiques de la mini-PBP- 2x purifiée obtenue à l'exemple 1, ont été mesurées de manière analogue à celles des variants de PBP2x, comme décrit dans Mouz et al. ( P. N.A.S, 1998,95, 13403- 13406). De manière plus précise : a) Poids moléculaire Le poids moléculaire a été déterminé par ESI-MS (Electrospray ioni- zation-mass spectrometry). b) Point isolélectrique Le point isolélectrique théorique a été déterminé à partir de la composition en acides aminés de la mini-PBP2x. c) Coefficient d'extinction Le coefficient d'extinction molaire a été déterminé, expérimentale- ment par mesure de l'inhibition de la mini-PBP2x par la céfotaxime ou de façon théorique à partir de la séquence en acides aminés. d) Cinétique d'acylation L'efficacité d'acylation de la mini-PBP2x par les p-lactamines, qui est définie par la valeur k2/K où K = k-1/k selon l'équation 1 (Eql), a été déterminée, en présence de céfotaxime (antibiotique de 3ième génération) ; l'interaction des PBP (Enzyme E) avec les p-lactamines (I) est représentée par l'équation Eql, dans laquelle El, El* et P représentent respectivement, le complexe de Michaëlis-Menten, le complexe covalent acyl-enzyme et le produit (P-lactamine dégradée): ki k2 k3 E + I EI # EI* # E + P (Eql). k-. e) Cinétique d'hydrolyse L'activité transpeptidase (activité d'hydrolyse) de la mini-PBP2x, définie par la valeur kcat/Km, a été déterminée en présence de deux analogues de substrats de PBP2x [N-benzoyl-D-alanylmercaptoacetic thiolester (S2d) et carboxy- méthyl-benzoylaminothioacetate thiolester (S2a) ], synthétisés selon le protocole décrit dans Adam et al. (Biochem. J., 1990, 270, 525-529). 2) Résultats Les caractéristiques physico-chimiques de la mini-PBP2x sont présentées dans le Tableau II ci-dessous. Tableau II : Paramètres physico-chimiques de la mini-PBP2x Paramètre Mini-PBP2x Poids moléculaire (daltons) 59465 5 Point isoélectrique théorique 4,5 Coefficient d'extinction à 280 nM 52830 50 (mole-1cm-1L-1) Les paramètres cinétiques de la mini-PBP2x sont présentés dans le Tableau ni ci-dessous, par comparaison avec ceux de la PBP2x* (Jamin et al., Biochem. J., 1993, 292, 735-741; Mouz et al., P. N.A.S., 1998, 95, 13403-13406). Tableau III : Paramètres cinétiques comparés de mini-PBP2x et de PBP2x* Paramètres' Mini-PBP2x PBP2x*2 PBP2x*' k2/K 146100 ~ 9000 162000 400 209000 ~ 1800 (céfotaxime) kcat/Km (S2a) 76 3 610 150 139 8 kcat/Km (S2d) 2890 ~ 400 5000 ~ 1400 2500 200 1 exprimés en M-1.s-1, 2Jamin et al., Biochem.J., 1993, 292, 735-741,3Mouz et al., P.N.A.S., 1998, 95, 13403-13406 L'analyse des paramètres cinétiques des variants de PBP2x montre que, par comparaison à la PBP2x* qui est délétée uniquement des domaines cyto- plasmiques et transmembranaires de PBP2x (résidus 1 à 48), la mini-PBP2x qui présente des délétions supplémentaires dans le domaine n-PB (non penicillin -binding domain), possède des propriétés enzymatiques (liaison aux P-lactamines et activité transpeptidase) équivalentes à celles de la PBP2x*. EXEMPLE 3 : D'UNE MINI-PBP-2x 1) Matériels et méthodes La mini-PBP2x est purifiée comme décrit à l'exemple 1. Les condi- tions de cristallisation de la mini-PBP-2x, obtenues par la méthode de la goutte suspendue sont les suivantes : mini-PBP2x (12 mg/ml), Hepes sodique 100 mM, pH 7,5, 2 % V/V PEG 400, 2M sulfate d'ammonium, à la température de 8 C. 2) Résultats Les cristaux apparaissent après quelques semaines ; ils présentent une forme de bi-pyramide hexagonale avec un longueur de l'ordre de 150 m. EXEMPLE 4 : DES PROPRIETES DE DIFFRACTION D'UNE MINI-PBP2x 1) Matériels et méthodes Les données de diffraction ont été enregistrées à l'ESRF (European Synchrotron Radiation Facility, Grenoble , France). De manière plus précise, les cristaux ont été plongés dans le tampon de cristallisation tel que décrit à l'exemple 3, additionné d'éthylène-glycol (10 % V/V) avant d'être refroidis rapidement dans l'azote liquide. Les données de diffraction ont été enregistrées sur la ligne de lumière ID14- EH2 et traitées à l'aide des programmes MOSFLM et SCALA, de la suite CCP4 (Acta Crystallograph. Sect. D, 1994,54, 905-921). 2) Résultats Les cristaux qui diffractent jusqu'à 2,5 A, présentent une maille élémentaire hexagonale (a=b=136,4 , c= 142,8 ) et appartiennent au groupe d'espace P61/P65, avec deux molécules dans l'unité asymétrique. Les résultats d'un jeu complet de diffraction collecté à l'ESRF sont présentés dans le Tableau IV ci-dessous, par comparaison avec les données précédemment obtenues avec la PBP2x* soluble (Dessen et al., J. Biol. Chem., 2001,48, 45106-45112 ; Gordon et al., J. Mol. Biol., 2000, 299, 477-485). Tableau IV : Données cristallographiques comparées de Mini-PBP2x et de PBP2x* Données Mini-PBP2x PBP2x* PBP2x* cristallographiques (Dessen et al.) (Gordon et al.) Dimensions ( ) a = b =136,4, a= b= 146,56, a = b = 129,9 c=142,8 c= 132,61 c =139,86 Groupe d'espace P61/P65 P32 P41212 Résolution minimale (A ) 2,5 3,2 2,4 nbre de réflexions uniques 51815 52413 42234 Rsym (%) 10 (29,6)* 11,1 (36,7)* 6,3 (36,8)* #/## 2,3 10,2 (3,1) * Redondance 4,0 3,2 7 Complétion (%) 99,9 96,1 (97,8) * 99,7 (93,5) * * valeur correspondante dans la dernière couche de diffraction. Le Tableau IV montre que les données de diffraction de mini- PBP2x se réduisent à 51815 réflexions uniques avec un Rsym de 10 % (30 % dans la dernière couche de diffraction : 2,64 à 2,5 ), avec un degré de complétion de 99,9 %. Une analyse plus fine des données obtenues avec la mini-PBP2x, en fonction de la résolution, est présentée dans le tableau V ci-dessous ; les données les plus significatives sont indiquées en gras. Tableau V : statistique des données de diffraction de la mini-PBP2x en fonction de la résolution Dmin Rfac2 Rfull3 Rcum4 Av-I5 #6 #/# Nmea7 1 Nref8 7,91 0,069 0,070 0,069 39616 5195,0 7,6 4938 1556 5,59 0,085 0,080 0,077 18912 2986,4 6,3 10812 3027 4,56 0,092 0,075 0,085 26060 4275,6 6,1 14633 3889 3,95 0,087 0,056 0,086 26842 4120,7 6,5 18118 4617 3,54 0,084 0,063 0,085 16584 2210,7 7,5 20977 5210 3,23 0,094 0,067 0,086 9999 1434,4 7,0 23488 5776 2,99 0,125 0,105 0,089 5454 996,0 5,5 25470 6242 2. 80 0,165 0,136 0,092 3227 771,4 4,2 27395 6710 2,64 0,223 0,179 0,096 2006 648,9 3,1 29137 7145 2,5 0,296 0,220 0,100 1378 594,1 2,3 30891 7580 1 : résolution minimale (A), 2 : de confiance dans la tranche, 3 : de confiance pour les réflexions complètes sur un film , 4 : facteur de confiance cumulé, 5 : moyenne des intensités , 6 : écart type des intensités, 7 : de réflexions mesurées, 8 : de réflexions uniques dans la tranche de résolution. Les données présentées dans les Tableaux IV et V ci-dessus montrent que la mini-PBP2x permet d'obtenir des cristaux ayant un bon pouvoir diffractant (2,5 ). EXEMPLE 5 : DE MOLECULES ANTIBIOTIQUES A L'AIDE D'UNE MINI-PBP2X Le criblage d'inhibiteurs d'une mini-PBP2x, utilisables comme antibiotiques, est réalisée par des tests de liaison ou par des tests d'inhibition de l'acti- vité enzymatique (activité d'hydrolyse) de la mini-PBP2x, en présence de la molécule à tester. 1) Test de liaison à la mini-PBP2x Il a été montré que la fluorescence intrinsèque de la PBP2x décroît lors de la liaison, au niveau du site actif, d'inhibiteurs tels que les p-lactamines (Jamin et al., Biochem. J. 292,735-741). En conséquence, des inhibiteurs de la mini-PBP2x utilisables comme antibiotiques, sont criblés de manière analogue. De manière plus précise, la mini-PBP2x, préparée comme décrit à l'exemple 1, est répartie dans les puits d'une plaque (2 à 500 l de mini-PBP2x dans du tampon 10 mM phosphate, pH 7), puis les molécules à tester sont ajoutées et les plaques sont incubées à une température comprise entre 5 C et 40 C, pendant une durée comprise entre 30 s et 1 h. La variation de fluorescence de la mini-PBP2x, en présence ou en l'absence de molécule à tester, est mesurée dans une fenêtre de longueur d'onde comprise entre 305 et 360 nm, après excitation à une longueur d'onde de 280 nm ; mesure est effectuée soit en continu, soit après différents temps d'incubation compris entre 30 s et lh. Les molécules capables de se lier au niveau du site actif de la mini-PBP2x, correspondant à celles pour lesquelles on observe une diminution de la fluorescence intrinsèque de la mini-PBP2x, sont sélec- tionnées. 2) Test d'inhibition de l'activité enzymatique de la mini-PBP2x L'hydrolyse de pseudo-substrats de type thioester [N-benzoyl-D- alanylmercaptoacetic thiolester (S2d) et carboxyméthyl-benzoylaminothioacetate thiolester (S2a) ] est mesurée avec la mini-PBP2x, seule ou en présence de molécule à tester, en suivant les protocoles tels que décrits dans Zhao et al., précité. Les molécules capables d'inhiber l'activité d'hydrolyse de la mini-PBP2x sont sélection- nées. REVENDICATIONS 1 ) Protéine dérivée d'une PBP2x de Streptococcus pneumoniae, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une concaténation des fragments correspondant respectivement aux acides aminés situés entre les positions 74 à 90, 186 à 199,218 à 228 et 257-750, en référence à la séquence de la protéine PBP2x de la souche R6 (SWISSPROT P14677 ou GENBANK 18266817), chacun desdits frag- ments étant précédé d'un fragment peptidique de 1 à 7 acides aminés. 2 ) Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit fragment peptidique comprend des acides aminés de ladite protéine PBP2x de Streptococcus pneumoniae situés entre les positions -1 à-7, relativement aux résidus en position 74,186, 218 et 257 et/ou entre les positions +1 à +7, relativement aux résidus en position 90,199 et 228, tels que définis à la revendication 1. 3 ) Protéine selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractéri- sée en ce que ledit fragment peptidique comprend des acides aminés choisis parmi l'alanine (A), la sérine (S), la glycine (G) et la thréonine (T). 4 ) Protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caracté- risée en ce qu'elle est dérivée d'une souche de S. pneumoniae résistante aux ss- lactamines. 5 ) Protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, carac- térisée en ce qu'elle présente la séquence SEQ ID NO: 1. 6 ) Protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, carac- térisée en ce qu'elle comprend une substitution d'au moins un résidu méthionine par un résidu sélénométhionine. 7 ) Protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, carac- térisée en ce qu'elle est associée à un ligand. 8 ) Protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, carac- térisée en ce qu'elle est sous la forme d'un cristal. 9 ) Peptide, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment d'au moins 7 acides aminés de la protéine mini-PBP2x, selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 6, lequel peptide inclut au moins un résidu choisi parmi ceux situés aux positions 74,90, 186,199, 218,228, et 257 tels que définis à la revendication 1. 10 ) Anticorps, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre un peptide selon la revendication 9. Il') Molécule d'acide nucléique isolée, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences codant pour une mini-PBP2x selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et les séquences complémentaires des précédentes, sens ou anti-sens. 12 ) Paire d'amorces, caractérisée en ce qu'elle présente la séquence SEQ ID NO: 2-3. 13 ) Sondes et amorces, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence d'environ 10 à 30 nucléotides correspondant à celle située à la jonction des fragments peptidiques de 1 à 7 acides aminés et des fragments de la PBP2x tels que définis à la revendication 1. 14 ) Amorces selon la revendication 13, caractérisées en ce qu'elles présentent une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 4 à 9. 15 ) Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend un insert sélectionné dans le groupe constitué par les molécules d'acides nucléiques codant une mini-PBP2x selon la revendication 11. 16 ) Vecteur d'expression selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il est constitué par un vecteur procaryote. 17 ) Cellules transformées par un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16. 18 ) Cellules selon la revendication 17, caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules procaryotes. 19 ) Utilisation d'une mini-PBP2x selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour le criblage d'antibiotiques. 20 ) Procédé de criblage d'antibiotiques, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : ai) la mise en contact d'une mini-PBP2x selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 avec une substance à tester, b1) la détection par tout moyen approprié de la liaison de ladite molécule à tester avec la mini-PBP2x et/ou de l'inhibition de l'activité de ladite mini- PBP2x résultant de cette liaison, et CI) la sélection et l'identification des substances actives capables de se lier à la mini-PBP2x et/ou d'inhiber l'activité de ladite mini-PBP2x, utilisables comme antibiotiques. 21 ) Procédé d'identification d'antibiotiques, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : a2) la préparation de cristaux à partir d'une mini-PBP2x selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, b2) la détermination de la structure tridimensionnelle de ladite mini- PBP2x à partir du cristal obtenu en a2), et C2) l'identification de substances actives capables de se lier à la mini- PBP2x et/ou d'inhiber l'activité de ladite mini-PBP2x, utilisables comme antibiotiques. 22 ) Trousse de criblage pour la mise en #uvre du procédé selon la revendication 20 ou la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle inclut au moins une protéine, un peptide, un anticorps, un vecteur, une cellule, une sonde ou une amorce, selon l'une quelconque des revendications 1 à 18.