Brevet FR2845604A1 — publié le 20040416

COMPOSITION PHARMACEUTIQUE COMPRENANT UN RECEPTEUR 5-HT4D100A, ET SES APPLICATIONS THERAPEUTIQUES. La présente invention appartient au domaine des pathologies liées à des défaillances dans la synthèse intracellulaire d'adénosine-monophosphate cyclique (AMPc), et en particulier à l'utilisation de compositions pharmaceutiques utiles dans la prévention et/ou le traitement de pathologies liées à une défaillance dans la synthèse d'AMPc, en particulier de pathologies neurodégénératives et de pathologies respiratoires. Parmi les maladies neurodégénératives ayant une incidence importante dans la santé humaine, on connaît, notamment, la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, ou la chorée de Huntington. La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui se traduit par des difficultés de déclenchement du mouvement volontaire. Cette maladie est due à la dégénérescence des neurones dopaminergiques situés dans la substance noire. La maladie d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative progressive du cerveau qui entraîne la sénilité et la démence. L'accumulation de la protéine beta-amyloïde est à l'origine de l'apparition des premiers symptômes de cette maladie. La Chorée de Huntington qui se caractérise par un trouble du mouvement associé à une démence progressive est due à l'altération des neurones du striatum. La plupart des maladies neurodégénératives ne sont diagnostiquées qu'à l'apparition des symptômes, à un moment où la dégénérescence neuronale est déjà très avancée, les traitements sont et seront pour longtemps symptomatiques. Dans le cas de la maladie de Parkinson, les traitements consistent à administrer de la L-dopa, un précurseur de la dopamine, afin d'augmenter sa synthèse dans les neurones encore en vie. Ces traitements ont des effets indésirables (dyskinésies) qui surviennent après quelques années. Dans les cas les plus sévères on peut utiliser la mise en place chirurgicale d'un appareillage de stimulation à haute fréquence du noyau subtalamique. Dans le cas de la maladie d'Alzheimer, les traitements pharmacologiques sont en cours selon trois approches qui agissent sur le système cholinergique. Administrer des précurseurs de l'acétylcholine, telle la lécithine-choline. Administrer des médicaments majorant la libération de l'acétylcholine comme l'hydergine, administrer des inhibiteurs de la cholinestérase tels que la tacrine et la velnacrine, cependant les bénéfices cliniques demeurent en général modestes avec beaucoup d'effets indésirables. Les traitements de la chorée d'Huntington mettent en #uvre des médicaments qui réduisent l'activité dopaminergique. Leurs principaux effets indésirables sont l'agitation et le parkinsonisme. Aucun de ces traitements donne satisfaction d'un point de vue thérapeutique car, en aucun cas, ces processus ne peuvent être reversés par les traitements actuels mentionnés ci-dessus. Les traitements existants qui sont uniquement symptomatiques n'empêchent en aucun cas la dégénérescence neuronale, ils ont uniquement pour but de stimuler davantage les quelques neurones en survie provisoire. L'issue par ces traitements est de toute façon fatale, seule la prolongation de quelques fonctions neuronales renforcées est envisageable par les traitements actuels. Ainsi, pour pallier ces inconvénients, la demanderesse a mis au point une nouvelle composition thérapeutique capable d'accroître localement la concentration intracellulaire d'un composé protecteur : l'AMPc. Dans le cadre de pathologies neurodégénératives, grâce à son effet neuroprotecteur, l'AMPc peut sauver de la mort des neurones en cours de dégénérescence. Il évite ainsi la mort programmée du neurone et permet par conséquent de maintenir et/ou de recouvrer partiellement ou totalement son activité. De ce fait, la maladie sera traitée à ses origines. Les régions du cerveau concernées sont celles où les neurones dégénèrent. On connaît que, outre les maladies neurodégénératives ci-dessus mentionnées, d'autres pathologies, comme les maladies respiratoires, et notamment l'asthme et la mucoviscidose, sont liées à une anomalie dans la synthèse d'AMPc. Il est aujourd'hui reconnu que l'asthme est une maladie inflammatoire d'où l'importance des médicaments anti-inflammatoires dans le traitement quotidien de l'asthme et pour guérir les crises aiguës. De nombreuses recherches fondamentales dans ce domaine ont démontré que les processus d'inflammation peuvent être régulés par l'AMPc via l'inhibition des phosphodiestérases afin d'augmenter la concentration intracellulaire d'AMPc (Trifilieff,A. et al. J.Pharmacol.Exp.Ther. (2002) 301 : 241-248) ou via l'activation des récepteurs béta2 adrénergiques couplés positivement à l'adénylate cyclase (Aksoy MO. J Allergy Clin. immunol.(2002) 109:491-497 ; Gao H. et al. Chin. Med. J (2001) 114: 1317-1319). Dans ces deux études, il a été clairement démontré que l'augmentation de la concentration intracellulaire en AMPc conduit à des effets bénéfiques dans le traitement de l'asthme. L'AMPc est considéré comme un bronchodilatateur pour diminuer la réponse inflammatoire dans le cas de l'asthme mais aussi le cas de la mucoviscidose où l'on sait que le gène de la protéine cystic fibrosis transmembrane conductance regulator ou (CFTR) code pour une protéine dont l'une des fonctions est d'être un canal chlore régulé par l'AMPc, (Andersson C. et al. Clin Sci (2002) 103 : 417-424;J. Gen. Physiol. (2002) 120 : 407-418 ; Bebok Z. J. Biol. Chem. (2002) in press). L'augmentation locale de la concentration d'AMPc est obtenue, dans le cadre de la présente invention, au moyen d'une composition pharmaceutique induisant une augmentation locale et spécifique de l'expression, dans un tissu ciblé, d'un récepteur 5-HT4 muté, de telle manière qu'il est activé par un ligand synthétique mais pas par son ligand naturel Ledit récepteur est ensuite activé seulement par des ligands spécifiques synthétiques pour induire localement la synthèse de l'AMPc protecteur des cellules et notamment des cellules neuronales et des cellules épithéliales. On connaît le cas des neurones dopaminergiques de la substance noire, dans le cas de la maladie de Parkinson par exemple (Jellinger, K. (1990) Adv Neurol 53 : 1-16). Plusieurs effets bénéfiques de la production d'AMPc par le récepteur 5-HT4-D100A dans les neurones dopaminergiques sont attendus : l'augmentation de la survie neuronale 2) la stimulation de la transcription codant pour la tyrosine hydroxylase (donc une augmentation de la synthèse de dopamine) 3) la stimulation de dopamine 4) un effet anti-inflammatoire. Dans le cas de la maladie d'Alzheimer, une augmentation locale d'AMPc favoriserait la sécrétion de la forme soluble du précurseur de la protéine bêta amyloïde, forme non amyloïdogénique (Robert, S. J., Zugaza, J. L., Fischmeister, R., Gardier, A. M., and Lezoualc'h, F. (2001) J Biol Chem. 276 : Dans le cas de la Chorée de Huntington une augmentation locale d'AMPc sauverait ainsi les neurones du putamen de la mort programmée (Mantamadiotis, T., Lemberger, T., Bleckmann, S. C., Kern, H., Kretz, 0., Martin Villalba, A., Tronche, F., Kellendonk, C., Gau, D., Kapfhammer, J., Otto, C., Schmid, W., and Schutz, G. (2002) Nat Genet 31 : 47-54. ). La composition pharmaceutique de l'invention, ouvre aussi la voie à une nouvelle forme de thérapie génique pour le traitement des maladies nécessitant une régulation de la concentration intracellulaire d'AMPc en utilisant un récepteur couplé aux protéines Galpha s' un RASSL 5-HT4 muté, comme moyen de régulation de la concentration intracellulaire d'AMPc. Des compositions pharmaceutiques comprenant lesdits récepteurs mutés silencieux 5-HT4-D100A constituent des outils qui modulent les voies de transduction et permettent, de ce fait, de corriger des pathologies liées à la survie cellulaire, notamment neuronales, dépendant de la concentration intracellulaire d'AMPc. L'effet neuroprotecteur de l'AMPc sur les neurones du système nerveux central, permet de mettre en #uvre une nouvelle forme de thérapie génique comprenant l'expression du récepteur muté, producteur d'AMPc, dans les régions du cerveau où les neurones dégénèrent. Dans les trois exemples de maladies neurodégénératives ci-dessus mentionnés, l'augmentation de la concentration intracellulaire en AMPc peut réduire fortement la dégénérescence neuronale (Jellinger, K. (1990) Adv Neurol 53 : 1-16 ; Robert, S. J., Zugaza, J. L., Fischmeister, R., Gardier, A. M., and Lezoualc'h, F. (2001) J.Biol.Chem. 276: 44881-44888 ; Mantamadiotis, T., Lemberger, T., Bleckmann, S. C., Kern, H., Kretz, O., Martin Villalba, A., Tronche, F., Kellendonk, C., Gau, D., Kapfhammer, J., Otto, C., Schmid, W., and Schutz, G. (2002) Nat.Genet. 31 : 47-54) Les compositions pharmaceutiques objet de la présente invention ont pour but de reverser les processus cellulaires qui, une fois enclenchés, conduisent au développement des maladies neurodégénératives. Cette nouvelle composition thérapeutique comprend un récepteur qui, avantageusement, a été rendu silencieux à son ligand endogène, par une simple mutation, mais qui reste toujours activable uniquement par des ligands exogènes. L'intérêt de ces récepteurs appelés RASSL Receptor Activated Solely by Synthetic Ligands a été pour la première fois mentionné par Conklin en 1998 (Coward P. et al. (1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 352-35). Les exemples de récepteurs qui par une ou plusieurs mutations deviennent totalement silencieux en présence de leur agoniste naturel tout en gardant la faculté d'être stimulés par des agonistes synthétiques sont encore très rares. Le seul exemple connu à ce jour est le récepteur kappa des opiacés, couplé négativement à l'adénylate cyclase. Ainsi, l'expression de ce récepteur exprimé dans le c#ur, a la capacité de moduler le rythme cardiaque en diminuant, dans ce cas, la concentration intracellulaire d'AMPc (Redfern C.H. et al.(2000) Proc. Natl.Acad.Sci. USA 97 : Dans le cadre de la présente invention on entend par : - Agoniste: toute molécule capable d'engendrer par sa liaison à ses récepteurs, une réponse biologique semblable à un médiateur endogène. - Antagoniste : toute molécule capable de bloquer l'action des agonistes. Agoniste inverse : Un agoniste capable d'engendrer une réponse biologique inverse à celle des agonistes normaux. La présente invention met en oeuvre un récepteur silencieux particulier, un récepteur 5-HT4 dans lequel l'acide aspartique D100 occupant la position 100 a été muté en Alanine (5-HT4D100A). Ce récepteur muté ne répond plus à la sérotonine qui est son ligand endogène, mais reste toujours activable par des composés spécifiques de ce récepteur qui traversent très bien la barrière hématoencéphalique. Ce type de "RASSL" que la demanderesse a obtenu pour le récepteur 5-HT4 par une simple mutation est unique. En effet, le 5-HT4-D100A est le premier "RASSL" qui devient totalement non activable par son ligand endogène, ce qui n'est pas le cas du récepteur kappa aux opiacés (Coward P. et al. (1998)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 95 : 352-35). Le récepteur 5-HT4-D100A est totalement stimulé par un très grand nombre de drogues totalement différentes du point de leur structure et de leur bio stabilité. Certains composés hautement sélectifs du récepteur 5-HT4, qui font partie de la classe des arylcétones se comportent comme des agonistes partiels du récepteur natif et deviennent des agonistes totaux du récepteur muté 5-HT4-D100A. Ils présentent également l'avantage d'être très hydrophobes et de passer très facilement la barrière hémato-encéphalique. Plus précisément, la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant une séquence d'ADN (acide déxoxyribonucléique double brin) codant pour un récepteur muté 5-HT4-D100A pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou la prévention d'une pathologie provoquée par un disfonctionnement dans la synthèse d'AMPc. A titre d'exemple, parmi les ADN qui peuvent être utilisés dans la composition thérapeutique de l'invention, on peut citer l'ADN dont la séquence est identifié par la SEQ ID No. : 1 dans la liste de séquences en annexe. Cette séquence est la forme mutée d'un récepteur 5-HT4 sauvage, (dont la séquence est identifiée sous le numéro SEQ ID N 3 dans la liste de séquences en annexe et dont le N accession dans la base de séquences GENBANK est Y09586) où le codon GAC en position 297-300 codant pour l'acide aspartique a été remplacé par le codon GCT codant pour l'alanine. Ce type de récepteur est incapable de se lier à la 5-HT lorsque l'aspartateloo, du domaine transmembranaire III, hautement conservé au cours de l'évolution, est muté en alanine. L'aspartate situé dans la poche de liaison du récepteur constitue un ancrage indispensable à la sérotonine pour que celle-ci se lie sur le récepteur. Le récepteur reste, par contre, totalement activable par de nombreux agonistes synthétiques et spécifiques du récepteur 5-HT4 comme les dérivés benzimidazolones (BIMU- 8), les dérivés benzamines (cisapride, renzapride) et benzoates (Ml 10302, ML 10375) ou les dérivés arylcétones (RS 66333) (Bockaert, J., Fagni, L., and Dumuis, A. (1997) in Handbook of expérimental pharmacology: Serotoninergic neurons and 5-HT receptors in the CNS (Baumgarten, H. G., and Gôthert, M., eds) Vol. 129 : 439-465,Spinger-Verlag, Berlin Heidelberg New York). Ces molécules ont une structure très volumineuse et l'aspartate100 n' est pas utile à leur liaison sur le récepteur. Dans le cadre de la présente invention, on entend par récepteur silencieux 5-HT4, tout récepteur 5-HT4 silencieux fonctionnel, c'est à dire qui présente la mutation du résidu aspartique du domaine transmembranaire III du récepteur sauvage correspondant en alanine et conserve sa capacité de liaison pour des ligands synthétiques. Ainsi, la composition pharmaceutique peut comprendre toute séquence d'ADNc codant pour des récepteurs 5-HT4D100A, de quelque espèce que ce soit, notamment humains, murins ou de rat, ayant une identité d'au moins 90% avec ladite séquence SEQ ID No : 1, et dans lesquelles la mutation GCT/GAC, ci-dessus décrite, a été introduite. Il peut s'agir du récepteur identifié par la séquence SEQ ID No : 1 dans la liste de séquences en annexe mais, également, la préparation pharmaceutique de l'invention peut comprendre des séquences d'ADNc codant pour des récepteurs 5-HT4D100A tronqués qui conservent leur capacité de liaison pour leurs ligands synthétiques et notamment des récepteurs 5-HT4-D100A dans lesquels le domaine C-terminal est absent, ou encore des récepteurs 5-HT4-D100A présentant une ou plusieurs mutations ponctuelles. Avantageusement ces derniers récepteurs tronqués ou mutés sont exprimés de manière constitutive. De tels récepteurs mutés silencieux 5-HT4-D100A peuvent être obtenus par mutagenèse dirigée (Mialet. J et al. Br.J.Pharmacol. (2000) 130:527-38; Joubert L. et al. J.Biol.Chem. (2002) 277 : 25502-25511). Af in d'exprimer ce récepteur muté 5-HT4-D100A, dans les régions du cerveau où les neurones dégénèrent on peut envisager l'utilisation de vecteurs de transfert, tels que des vecteurs non-viraux ou viraux contenant la séquence d'ADNc codant pour ledit récepteur muté 5-HT4-D100A. Parmi les vecteurs viraux, on peut citer, les vecteurs du type adénovirus (Eur. cytokine Netw 2002; 13 (3) : 324-30, les vecteurs issus des virus associés aux adénovirus de type 2 (AAV) (J Virol 2002 Jan;76(2):791- 801) (Curr.Opin.Mol.Ther. 2002:4 (4):349-58) , des vecteurs lentivirus avec différents pseudo-types (Mol.Ther.(2002) 6(3):349 ; (Curr.Opin.Mol.Ther. (2002) 4 (4) :349-58 ; (Basic.Res. Cardiol. (2002) 97 (5) : 348-58), des vecteurs issus des virus de l'immunodéficience féline (J.Virol. (2002) ;76(19) :9624- 34) ou encore des vecteurs issus du Foamy virus (FV) (Mol. Ther. (2002) 6 (3) :321) . Ces vecteurs viraux sont débarrassés de tout effet pathogène et toxique. Ils sont particulièrement efficaces pour transfecter les neurones et l'expression des protéines est très stable. Ces vecteurs sont utilisés avec des promoteurs adéquats, en fonction du tissu cible. Pour les cellules neuronale de la substance noire ou neurones dopaminergiques, il s'agit du promoteur du transporteur de la dopamine. Pour la transfection ciblée d'autres tissus, de promoteurs spécifiques peuvent être utilisés, par exemple pour des vecteurs de type VIH et une transfection ciblée dans les neurones on peut utiliser les promoteurs décrits dans : 272 : (1996) ; PNAS 93 : 11382 (1996) ; J. Virol. 71: 6641 (1997) ; Hum. Gene Ther. 11 : 179(2000) ; Nature Biotech. 19: 446 (2001) ; Hum. Gene Ther. 13 : (2002) Pour la transfection des cellules de l'épithélium des voies aériennes avec des vecteurs viraux de type VIH, des promoteurs adéquats sont indiqués dans les publications suivantes : Hum. Gene Ther. 8 : (1997) ; J. Virol. 75 : (2001). D'autres exemples de promoteurs que l'on peut utiliser dans le cadre de la présente invention sont également ceux cités dans : Blood 95 : 2499(2000) et dans Gene Ther. 7 : 20(2000). Pour exemple, selon un mode particulier de mise en oeuvre, dans la composition thérapeutique de l'invention, le plasmide contient le génome complet du AAV (psub201) et le plasmide d'empaquetage (pAAV/Ad). Le vecteur PAAV-CAG-5-HT4-DlooA-HA est construit dans une cassette contenant un promoteur fort (P-actine/enhancer cytomégalovirus ou promoteur CAG) selon le protocole décrit par Kapplit et al. (Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., and During, M. J. (1994) Nat Genet 8 (2), 148-54. ). Selon un autre mode de réalisation, les compositions pharmaceutiques destinées à la préparation d'un médicament pour le traitement d'une maladie respiratoire comprendront l'ADN du récepteur 5-HT4-D100A introduit dans un vecteur recombinant du virus associé aux adénovirus (AAV) ou du lentivirus placé derrière une cassette contenant un promoteur fort CMV et un promoteur spécifique du tissu dans lequel on souhaite exprimer ledit récepteur, à titre d'exemple d'un tel promoteur, on peut citer celui de la Cytokératine K18 (Lusky M. et al. J Virol (1999);73:8308-19) Avantageusement, la composition pharmaceutique de l'invention sera administrée par injection. En particulier, les patients seront injectés avec les particules virales comprenant l'acide nucléique codant pour le récepteur 5-HT4D100A, sous contrôle stéréotaxique, pour le traitement des maladies neurodégénératives cette injection pourra être effectuée au niveau des zones du cerveau en injections successives, pouvant aller de 2 à 10, de préférence de 3 à 5, espacées de 24 h chacune. Des agonistes synthétiques du récepteur 5-HT4 seront ensuite administrés aux temps définis précédemment. Ces composés traversent la barrière hématoencéphalique, sont très actifs et présentent une grande bio stabilité in vivo. Une augmentation de la concentration intracellulaire d'AMPc peut être obtenue par une activation du récepteur muté 5-HT4-D100A, exprimé spécifiquement, au moyen de la composition pharmaceutique de l'invention, dans les neurones dopaminergiques de la substance noire, dans les neurones d'hippocampe ou les neurones du striatum selon les protocoles décrits dans les exemples ci-après. Cette activation du récepteur muté 5-HT4-D100A, peut-être effectuée, par exemple, avec des agonistes synthétiques, dont on peut citer, à titre d'exemple, les composés BIMU8 et RS 66333, lors de l'apparition des premiers signes cliniques de la maladie. On pourra utiliser également d'autres agonistes du récepteur 5-HT4-D100A ne se fixant pas sur le récepteur natif. Un autre objet de l'invention, concerne un procédé de criblage de ligands du récepteur 5HT4 muté. Un tel procédé de criblage est mis en #uvre, par exemple in vitro , il comprend la mise en contact dudit récepteur avec ledit composé chimique, dans des conditions permettant leur liaison, suivie de la détection de cette liaison. Il peut s'agir du récepteur isolé, purifié ou partiellement purifié, comprenant le fragment de la séquence du récepteur contenant la mutation D100, fixé sur des supports solides, selon des techniques bien connues de l' homme du métier, par exemple et de manière non-limitative, on peut citer des tests par compétition, des tests au moyen de biocapteurs ou encore au moyen de fragments membranaires extraits de cellules exprimant ledit récepteur. Un tel procédé de criblage peut également être mis en #uvre in vivo , sur des cellules isolées génétiquement modifiées pour exprimer ledit récepteur 5HT4D100A. Ce procédé comprend alors la mise en contact de cellules génétiquement modifiées exprimant ledit récepteur muté 5-HT4D100A avec ledit composé chimique, dans des conditions permettant leur liaison et la détection de l'activité dudit récepteur. Ce dernier procédé de criblage est particulièrement adapté pour l'identification de composés agonistes du récepteur 5-HT4D100A. Dans ce mode de réalisation particulier, l'on met en contact des cellules isolées, génétiquement modifiées pour exprimer le récepteur 5-HT4D100A avec ledit composé chimique à tester, dans des conditions permettant l'activation dudit récepteur et l'on détecte une éventuelle augmentation de l'activité dudit récepteur. De même, ce procédé de criblage est particulièrement adapté pour l'identification de composés antagonistes du récepteur 5-HT4D100A. Dans ce mode de réalisation particulier, on met en contact des cellules isolées, génétiquement modifiées pour exprimer ledit récepteur 5-HT4D100A avec ledit composé chimique à tester, dans des conditions permettant l'activation dudit récepteur et l'on détecte une éventuelle diminution de l'activité dudit récepteur. Enfin l'invention a également pour objet un support solide sur lequel est fixé un récepteur 5-HT4D100A selon l'invention ou un fragment fonctionnel de celuici. Selon un mode particulier de mise en oeuvre, sur le support solide de l'invention est fixé un récepteur 5-HT4D100A dont la séquence polypeptidique est identifiée en annexe sous le numéro SEQ ID No : 2. Selon un mode de réalisation préféré, le récepteur est fixé sur ledit support solide par des liaisons covalentes ou non covalentes. De préférence, le support solide selon l'invention est choisi parmi le groupe de supports comprenant les supports inorganiques tels que le métal, le verre, le silicium et les supports organiques à base de polymères ou de co-polymères tels que le polystyrène, le polyéthylène, le polycarbonate, la polyacrylamide, le nylon ou le latex. L'invention concerne aussi une cellule génétiquement modifiée par transfection avec un vecteur d'expression comportant la séquence d'un ADN comprenant un ADN codant pour le récepteur 5-HT4D100A. De préférence, la cellule selon l'invention est choisie parmi des cellules neuronales et/ou épithéliales. L'invention concerne également un modèle animal non-humain comprenant des cellules génétiquement modifiées pour exprimer le récepteur 5-HT4D100A. Avantageusement, lesdites cellules expriment le récepteur de manière constitutive. L'invention concerne également un procédé d'identification de composés actifs pour traiter ou prévenir une maladie liée à une défaillance dans la synthèse d'AMPc, du type mettant en oeuvre un modèle animal non-humain comprenant des cellules génétiquement modifiées pour exprimer le récepteur muté récepteur 5HT4D100A, dans lequel: a) on administre à un animal non-humain mutant dont les cellules ont été génétiquement modifiées pour exprimer le récepteur muté 5-HT4D100A ledit composé chimique, dans des conditions permettant la liaison dudit composé au récepteur muté et b) on détermine par tout moyen approprié l'action dudit composé sur la synthèse d'AMPc. L'invention se rapporte également à une méthode de traitement thérapeutique d'un patient atteint d'une pathologie affectant la synthèse d'AMPc, tel qu'une pathologie neurodégénérative, ou une pathologie respiratoire, notamment l'asthme ou la mucoviscidose comprenant d'abord l'administration audit patient, de la composition thérapeutique de l'invention, pour induire une surexpression du récepteur muté silencieux 5-HT4-D100A dans les tissus dudit patient, en particulier dans le tissu neuronal pour les pathologies neurodégénératives ou dans le tissu épithélial pour les pathologies respiratoires. Une fois que cette surexpression a été obtenue, on stimule éventuellement ces récepteurs endogènes par les agonistes synthétiques dudit récepteur. De tels agonistes 5-HT4 (le métoclopramide ou Primperanm, le cisapride ou Prépulside# et le Tégazérode-HTF919 ou Zelmac) sont commercialisés ou utilisés en clinique pour augmenter le transit gastrointestinal, sans que l'on ait observé de problèmes centraux. Les agonistes 5-HT4 auraient également un effet pro-mnésique, ce qui n'est pas nécessairement un désavantage dans le cas d'une pathologie de la personne âgée. Avantageusement, d'autres ligands synthétiques, qui seraient agonistes du récepteur muté et antagonistes du récepteur natif, pourraient être utilisés. Des ligands présentant ces propriétés seraient particulièrement utiles, car ces propriétés permettront de limiter l'apparition éventuelle d'effets centraux indésirables. Aussi, des ligands synthétiques qui seraient agonistes partiels du récepteur 5-HT4 natif, et agonistes totaux du récepteur 5-HT4-D100A pourraient être utilisés, lors de la phase d'activation du récepteur, en vue d'obtenir une augmentation de la synthèse d'AMPc. De manière surprenante, l'expression du récepteur muté selon la technique exposée est un phénomène relativement stable qui ne demande pas beaucoup d'injections dans les régions ciblées sous contrôle stéréotaxique. Il est possible, en utilisant lesdits récepteurs, d'induire une augmentation de la concentration intracellulaire et une synthèse d'AMPc totalement contrôlable en intensité et dans le temps, puisqu'ils ne répondent plus à leur ligand endogène mais seulement à des ligands exogènes spécifiques. La demanderesse a prouvé que des tels récepteurs, ayant une mutation ponctuelle, par exemple 5-HT4A258L ou obtenus par troncation du domaine C-terminal sont constitutivement actifs et ont une aptitude naturelle à stimuler l'adénylate cyclase en absence de tout agoniste (Claeysen et al. Mol.Pharm. 58 : 136-144) (2000) ; Claeysen et al EMBO reports 21:61-67 (2001). L'invention sera mieux comprise à l'aide des travaux expérimentaux conduits par la Demanderesse dans le cadre de la présente invention ainsi que des figures jointes en annexe dans lesquelles : - Les figures 1A à 1D montrent que les agonistes ayant une similitude de structure avec la sérotonine sont incapables de stimuler le récepteur RASSL D100 (3 , 32) A. - les figures 1A et 1B montrent les courbes doseréponse pour les récepteurs sauvages et mutés D100(3,32)A exposés à des dérivés tryptaminiques (5MeOT, 5CT, HTF919 et 5-HT). La production d'AMPc est mesurée dans les cellules COS-7 exprimant de manière transitoire, soit le récepteur natif 5-HT4a, soit le récepteur muté D100(3,32)A, à des niveaux de 1500 230 et 1450 160 fmol/mg protéine respectivement. La production d'AMPc est mesurée durant 15 minutes et est exprimée en tant que pourcentage de formation d'AMPc par rapport à des cellules contrôles (Cellules transfectées avec le vecteur sans l' ADN codant pour le récepteur). Dans les cellules contrôle les pourcentages de conversion de [3H]ATP en [3H]AMPc est égale à 0,120,04%. Les données représentent les valeurs moyennes de quatre expériences réalisées par triplicata. - La Figure 1C illustre les tests de liaison par compétition, effectués pour la 5-HT en présence de 0,24 nM de [3H] GR113808 . Les expériences ont été effectuées sur des membranes (8 g protéine) extraites de cellules COS-7 exprimant des niveaux similaires de récepteurs sauvages (WT) ou mutés D100A (3500 fmol/mg protéine) . - La figure 1D illustre la représentation Scatchard des expériences de saturation de la liaison du composé [3H]GR113808 (0,048 à 0,51 nM) sur les récepteurs 5-HT4a et 5-HT4D100(3,32)A exprimées dans des cellules COS- 7. le composé RS 1000235 (10 M) a été utilisé pour déterminer la liaison non-spécifique. - Les Figures 2A et 2B montrent que la mutation du résidu conservé D100(3,32) en alanine (A) n' empêche pas la réponse, ni la liaison, d'un agoniste synthétique du récepteur 5-HT4-R, le composé BIMU 8. - la Figure 2A illustre les effets d'une gamme de concentrations du composé BIMU 8 sur les niveaux intracellulaires d'AMPc qui ont été mesurés dans des cellules COS-7 exprimant les récepteurs 5-HT4(a) ou D100A à des niveaux équivalents (1350 60 et 1580 110 fmol/mg protéine respectivement). - La Figure 2B illustre la compétition du composé BIMU 8 avec le composé [3H]GR113808. Les conditions sont identiques à celles utilisées pour les expériences de la figure 2A). Les Figures 3A et 3B montrent que la mutation D100(3,22)A conduit à des changements de propriétés des ligands, un antagoniste sur récepteur sauvage devient en agoniste sur le récepteur muté. - les Figures 3A et 3B montrent les activités des composés ML10375 (A) et GR113808 (B), deux antagonistes puissants et spécifiques du récepteur 5-HT4(a). Ces deux ligands ont été testés dans des cellules COS-7 exprimant le récepteur sauvage 5-HT4(a) (2700 320 fmol/mg de protéine) ou le récepteur muté (2500 280 fmol/mg de protéine). - la Figure 3C montre l'accumulation d'AMPc mesurée dans des cellules COS-7 exprimant de manière transitoire les récepteurs sauvages et mutés D100(3,32)A à des densités similaires à celles utilisées en absence (Figure 3A) et en présence (Figure 3B) de 3x10-8 M BIMU 8. La capacité du composé ML 10375 (10-5 M) pour inhiber l'accumulation de l'AMPc induite par le BIMU 8 a été testée sur les mêmes cellules COS-7. - La figure 4 est un schéma représentant les effets, dans les neurones, de l'AMPc induit après utilisation du récepteur silencieux (RASSL) comme outil de thérapie génique, en particulier pour le traitement de la maladie de Parkinson. TRAVAUX EXPERIMENTAUX 1- Construction de l'ADN du récepteur muté m5HT4a. Le récepteur mutant a été généré en échangeant le résidu endogène, acide aspartique (D) par le résidu alanine (A) dans la séquence ADNc du 5-HT-4(a)R par mutagenèse dirigée grâce à l'utilisation d'un Kit commercial (Quick Change Site-Directed Mutagenesis) de la société Stratagene. L'amorce sens utilisée était: D100A - 5'-ACC TCT CTG GCT GTC CTA CTC ACC-3' 2- Culture cellulaire et transfection Les ADNc, sous-clonés dans le plasmide pRK5, ont été introduits dans des cellules COS-7 par électroporation. Les cellules ont été trypsinisées, centrifugées et remises en suspension dans du tampon suivant (50 mM KZHP04 , 20 mM CH3Co2K, 2 0 mM KOH, 26,7 mM MgS04 ; pH 7,4) avec 25-2000 ng d'ADNc du récepteur identifié par la SEQ ID No. : 1 dans la liste de séquences en annexe. La quantité totale d'ADN a été maintenue constante à 15 g par transfection avec le vecteur pRK5 vide, comme entraîneur. Après 15 minutes à température ambiante, 300 l de la suspension cellulaire (107 cellules) ont été transférés à une cuvette d'électroporation de 0,4 cm (Bio-Rad, Ivry sur Seine, France) et les cellules ont reçu un choc électrique au moyen d'un appareil de pulsation de gènes (réglé à 1000 pF , 580 V). Les cellules ont été ensuite diluées dans du milieu d'Eagle modifié selon Dulbecco (DMEM, 106 cellules/ml) contenant 10% de sérum de veau f#tal décomplémenté et filtré (dSVF) et placées dans des boîtes de Pétri pour culture de cellules (15cm de diamètre) ou dans des plaques de 12 puits, à la densité souhaitée. 3- Détermination de la production d'AMP cyclique (AMPc) dans les cellules intactes. Après six heures de transfection, le milieu dans lequel se trouvent les cellules a été remplacé par du DMEM sans dSVF contenant de l'adénine tritiée (2 uCi/ml) afin de marquer le pool d'ATP, et incubé durant la nuit. Le taux d'AMPc formé a été mesuré selon la méthode décrite préalablement (Dumuis A. Bouhelal R., Sebben M., Cory R. and Bockaert J. (1998) Mol.Pharmacol.34: 880- 887) . 4- Préparation des membranes et essai de liaison du ligand radiomarqué. Les membranes ont été préparées à partir de cellules transfectées de manière transitoire, déposées dans des boîtes de pétri pour culture de 15 cm de diamètre, contenant du DMEM et 10% dSVF, ceci durant six heures et ensuite elles sont incubées pendant 20 heures dans du DMEM sans dSVF. Les cellules ont été lavées deux fois dans du PBS, grattées avec une spatule en caoutchouc, remises dans du PBS et centrifugées à 4 C (200 g durant 4 minutes). Le culot a été remis en suspension dans du tampon contenant 10 mM HEPES (pH 7,4), 5 mM EGTA, lmM EDTA et 0,32 M de sucrose et homogénéisé avec un poter en verreTeflon à 4 C. L'homogénat a été centrifugé à 20. 000 g, 20 minutes et le culot membranaire a été remis en suspension dans 50 mM de tampon HEPES (pH 7,4 à raison de 5mg/ml de protéine) et conservé à -80 C jusqu'à son utilisation. Des expériences de saturation ont été effectuées en utilisant un ligand spécifique radiomarqué au tritium, 3[H]GR113808 à des concentrations allant de 0,048 nM à 1 nM. Les densités du récepteur 5-HT4 ont été estimées avec du 3[H]GR113808 à des concentrations de saturation (0,5 nM) selon décrit préalablement (Ansanay,H., Sebben,M.,Bockaert,J. and Dumuis A. (1996) Eur.J.Pharmacol. 298 :165-174). La liaison non-spécifique a été définie en utilisant soit La 5-HT (5x10-5 M) soit le composé RS 100235 (10-7 M) . Les concentrations de protéines ont été déterminées en utilisant un essai de quantification de protéines commercial (Bio-Rad). 5- Analyse des données Les expériences de compétition et de saturation ont été analysées par des calculs de régression nonlinéaires en utilisant le programme d'ordinateur LIGAND (Munson P. J., and Rodbard, D. (1980) Anal.Biochem.l07: 220-39). Les expériences de saturation ont été également analysées selon la représentation de Scatchard. Les valeurs d' IC50 nécessaires pour le déplacement de 50% de la liaison du, 3[H] GR113808 ont été convertis en valeurs Kd selon l'équation Kd=IC,0/1+S/KDs (Cheng,Y ., and Prussof,W.H. (1973) Biochem.Pharmacol.22 (23) ,3099-108) où S est la concentration de 3 [H] GR113808 et K la constante d' équilibre de 3 [H] GR113808 . En utilisant un programme Kaleidagraph, les courbes dose/réponses ont été calibrées selon l'équation : Y= ( (Ymax-Ymin) /1 + (x/EC)1*) ) +ymin où EC50 (ou EC50inv) est la concentration de l'agoniste (ou de l'agoniste inverse), qui induit la moitié de la réponse maximale. ymax et ymin correspondent respectivement aux réponses maximales et minimales et nH est le coefficient de Hill. Les différences statistiques ont été examinées avec le programme Star-View Student (Abacus Concepts, Berkeley, Californie) avec les tests t. Composés GR 113308 1[2-méthylsulfonylamino)éthyll-4- pipéridinyl 1-méthyl-indole-3-carboxylate HTF 919 5-méthoxy-indole-3-carboxyaldhéhyde 4pentyl-iminosemicarbazone BIMU Endo- N-(8-méthyl-8-azabicyclo[3.2.1]oct- 3-yl)-2-oxo-3-isopropyl-2,3-dihydro-lH benzimidazole-1-carboxamise. (S)-Zacopride (S)-N-(l- azabicyclo [2.2.2]oct-3-yl)-4amino-5-cholro-2-méthoxy-benzamide monohydrochloride Cisapride Cis N- [1- [3- (4-fluorophenoxy)propyl] -3- méthoxy-4-piperidinyl]-4-amino-5-chloro- 2-méthoxy-benzamide Metoclopramide N-(2-diméthylamino)éthyl)-4-amino-5cholro-2-méthoxy-benzamide Renzapride () endo-N-(l-azabicyclo [3.3.1] non-4yl)-4-amino-5-chloro-2-méthoxy-benzamide monohydrochloride SB 204070 (1-butyl-4-pipéridinyl)méthyl 8-amino-7chloro-1,4-benzodioxane-5-carboxylate ML 10302 2-(l-pipéridinyl)éthyl 4-amino-5-chloro- 2-méthoxy-benzoate ML 10735 2-(cis-3,5-diméthyl-1-pipéridinyl)éthyl4amino-5-chloro-2-méthoxybenzoate RS 67333 1-(4-amino-5-chloro-2-méthoxy-phényl)-3- (1-butyl-4-pipéridinyl)-1-propanone RS 100350 N-[2-[4-[3-(8-amino-7-chloro-l,4- benzodioxan-5-yl)-3-oxo-propyl]lpiperidinyl]éthyl]-4-méthoxybenzenesulfonamide RS 124523 1-(4-amino-5-chloro-2-méthoxy-phényl)-3- [1- [3-4-fluorophényl)propyl] -4- pipéridinyl]-1-propanone RS 47431 1-(4-amino-5-chloro-2-méthoxy-phényl)3- [1-[3-(3,4-diméthoxyphényl)propyll-4- pipéridinyl]-1-propanone RS 100235 1-(8-amino-7-vhloro-1,4-benzodioxan-5yl) -3- [1- [3-3,4-diméthoxyphényl)propyl] - 4-pipéridinyl]-1-propanone RESULTATS ET DISCUSSION Les résultats ci-dessus illustrent pour la première fois l'activation d'un récepteur 5-HT4, connu pour son insensibilité à son ligand endogène (Mialet J. et al British journal of Pharmacol (2000) 130 :527- 538), par des agonistes synthétiques non-amine primaires. Sur la base des travaux de Strader concernant les récepteurs (3-adrénergiques et d'autres récepteurs d'amines biogéniques (Straders,C., Fong,T.T. Tota, M., Underwood,D. and Dixon,R. (1994) Annu.Rev.Biochem. 63,101-132), il a été observé que l'interaction clé entre ces récepteurs et le ligand se fait au niveau du résidu acide aspartique du TM III, hautement conservé dans toute la famille de récepteurs aux amines biogéniques. Dans le cas du récepteur 5-HT4 il s'agit de l'aspartate, en position 100 dans le TM-III (Dloo (3 . 32 ) . Ce résidu semble intervenir dans une interaction ionique entre son groupe carboxylate chargé négativement et l'azote chargé positivement de l'amine protonée du neurotransmetteur (5-HT et dérivés tryptamines). La Demanderesse a maintenant prouvé que la mutation du D100(3.32) en alanine dans le récepteur 5-HT4 non stimulable par la 5-HT ne l'est également pas par d'autres tryptamines dont la structure est très proche de celle de la 5-HT (5-CT ou 5-MeOT) ou par un dérivé carbazimidamide indole substitué (HTF-919) (Buchheit KH, Gamse,R, Giger,R, Hoyer, D, Klein,F, Kloppner, E., Pfannkuche,H.J. and Mattes H. J.Med.Chem. (1995) 38(13):2326-30), (Figures 1A, 1B). Des mutations d'une large série d'autres résidus, hautement conservés, dans la famille des récepteurs aux amines biogéniques impliqués dans la poche de liaison de la 5-HT (S197(5,43), W275(6,48) et F275(6,51)) ont également été réalisées. Toutefois, aucune de ces mutations n'a conduit à supprimer complètement les réponses aussi bien de la 5-HT que des autres dérivés tryptamines. Les récepteurs mutés F275A, le W2722A et le S197A, ont seulement une affinité réduite de 50 à 5000 fois pour la 5-HT et ses dérivés, sans changement dans le maximum de stimulation (données non-montrées). A l'inverse, la mutation du résidu D100(3,32) hautement conservé, dans le récepteur 5-HT4 n'affecte que très modestement la liaison du ligand spécifique radiomarqué 3[H]GR113808 lorsque cet acide aminé est muté en alanine(Kd= 0,17 0,008 nM et 0,38 0,09 nM respectivement, dans le récepteur natif et muté Dloo (3 .32) A, (Figure 1D) . En utilisant le ligand 3[H]GR113808, la Demanderesse a vérifié que le ligand 5-HT est incapable de se lier au récepteur muté D100(3.32)A (Figure 1C). La liaison de 3[H]GR113808 maintenue sur le récepteur muté a été la première observation qui indiquait que la présence d'un azote basique dans le cycle aromatique de la chaîne latérale, associée à une augmentation de la distance entre ledit azote basique et le noyau aromatique supprimait la nécessité de la présence du groupe carboxylique du D100(3.32) pour la liaison avec son ligand. Ceci a été confirmé lorsque la Demanderesse a procédé au criblage de la plupart des agonistes nontryptaminiques du récepteur 5-HT4 pour leur capacité à activer le récepteur 5-HT4D100A. Il a été démontré que le composé BIMU 8, appartenant à la classe des azabicycloalyl benzymidazolones (Dumuis A, Sebben M, Monferini E, Nicola M, Turconi M, Ladinsky H, Bockaert J. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.(1991)343:245-51) très structurallement différent de la 5-HT, est un très bon agoniste des récepteurs 5-HT4 Comme le montre la figure 2, ce composé demeure complètement actif, avec la même efficacité, sur le récepteur mutant D100A que sur le récepteur 5-HT4 sauvage. Les valeurs EC50 pour la stimulation de l'AMPc ont été respectivement de 4 1,5 nM et de 1 0,5 nM pour le récepteur sauvage et muté,(Figure 2A). L'affinité du composé BIMU 8 pour le récepteur 5HT4 est également meilleure sur le récepteur mutant D100A que sur le récepteur sauvage. Les valeurs de Kd pour le composé BIMU 8, mesurées par compétition avec le ligand radiomarqué 3[H]GR 113808 sont respectivement, de 30 11 nM et de 6, 5 3 nM pour le récepteur sauvage et le mutant (D100A) (Figure 2B) . D'une manière similaire, les benzamides portant la substitution 2-méthoxy-4-amino-5-chloro, tel que les composés Renzapride, S-zacopride ou cisapride, se montrent équivalents du point de vue de leur efficacité sur le récepteur sauvage et sur le récepteur muté (D100(3,32)A (Tableau I) avec des affinités nanomolaires, seule une faible diminution de leur affinité pour le récepteur muté D100A est observée. Le tableau I ci-dessous montre l'efficacité des ligands du récepteur 5-HT4 sur le récepteur sauvage et le récepteur 5-HT4 muté Dloo (3 , 32 ) A. TABLEAU I Drogues 5-HT4(a) 5-HT4-RD100A ( M) % delaréponse % de la réponse 5-HT BIMU8 .. BIMU8 o"T f 5-HT 100 ""on.-. "ï Bimu 8 90 10 100 :n:ifC5:\:';;::>:': rir≥o i1;;:}:i>:':;:;:,,:t,r:,:;::'::;;rca:, ,5-met ::t: H'rF9 imJh 5-Meot 90 10 HTF919 eJ >:::;;; Cisapride #N#O# Renzapride 85 8 100 @ ##NH# S-Zacopride 100 5 100 5 H2N#OMe Cisapride 100 10 100 10 ML 10302 57 9 100 6 SB 204070 20 3 100 5 RS 100350 17 5 70 10 RS67333 -a>fV RS 124523 21 6 75 5 H2N#OMe N-Bu-n RS 67333 28 6 85 12 RS 47431 30 ~ 5 100 ~ 7 V ",,/,'/,',,,,',',',"///;>0'; GR 113808 10 9 78 10 GR113808 ##N ML 10375 Cl#O#N# ML 10375 5 ~ 4 80 15 Eï::;[@iht:ft!1Jjj: :t::t: Les mesures d'efficacité ont été déterminées dans des expériences d'accumulation d'AMPc dans des cellules COS-7 exprimant de manière transitoire, soit les récepteurs 5-HT4a, soit le récepteur muté D100A à la même densité de récepteurs (environ 2500fmol/mg de protéine). Pour le récepteur sauvage les résultats sont exprimés en pourcentage de l'accumulation d'AMPc induit par la 5-HT. Pour le récepteur muté 5-HT4-D1 (3, 32)A, les résultats sont exprimés en pourcentage de l'accumulation d'AMPc induit par le composé BIMU8. Ces données suggèrent que le récepteur muté D100(3,32)A peut être autant activé que le récepteur sauvage si le composé peut se lier au récepteur. Les niveaux d'expression des récepteurs sauvages et mutés ne sont pas significativement différents. Par contre, le récepteur mutant W272(6,51)A présentait un niveau d'expression anormalement bas. Le niveau d'expression maximal de protéine était de 600 fmol/mg de protéine quelle que soit la quantité d'ADN transfecté (Roth B. L., Shoham, M. Choudhary,M.S., Khan,N. Mol.Pharmacol.(1997) 52 :259-66). Deux médicaments sont antagonistes du récepteur sauvage , alors qu'ils sont agonistes du récepteur muté (D100(3,32)A). Les dérivés du benzoate portant la substitution 2-méthoxy-4-amino-5-chloro- (tel que ML10302) (Langlois,M., Zhang,L., Yang, D., Brémont,B., Shen,S., Manara,L. and Croci,T. (1994) Bioorg.Med.Chem.Lett. 4 : 1433-1436) et les arylcétones correspondantes (tels que RS67333, RS124523, RS1000350, RS47431) (Clark,R.D.(1998) In 5-HT4 receptors in the brain and periphery. (Eglen,R.M., ed pp.1-48, Springer), sont des agonistes partiels des récepteurs 5-HT4sauvages. Comme il est montré sur le tableau I, ils sont plus efficaces sur les récepteurs mutés D100(3,32)A que sur le récepteur sauvage. De manière tout à fait intéressante, un autre dérivé benzoate, connu pour être un antagoniste hautement spécifique du ligand 5-HT4 (ML 10375) (Yang,D, Soulier,JL., Sicsic,S., Mathe-Allainmat,M., Brémont,B., Croci, T., Cardamone,R., Aureggi,G. and Langlois,M. J.Med.Chem.(1997) 40 :608-21) ou un agoniste inverse du récepteur 5-HT4 (Blondel,0., Gastineau,M., Langlois,M., Fischmeister, R. Br.J.Pharmacol. (1998)125:595-7.19), s'avère être un agoniste total du récepteur 5-HT4 muté D100(3,32)A (ECso = 1 0, 6 nM) , (Figures 3A et 3C) . Ces résultats ont conduit la Demanderesse à cribler les propriétés d'agonistes putatifs d'une série d'antagonistes du récepteur 5-HT4. Il a été trouvé que l'antagoniste 3[H]GR 113808 qui est l'antagoniste radiomarqué le plus habituellement utilisé (Figure 3C) pour les études sur le récepteur 5-HT4 (Grossman,C.J., Kilpatrick,G.J., Bunce,K.T. Br.J.Pharmacol. (1993) 109:618-24) est un puissant et efficace agoniste (EC50 = 0,17 0,04 nM) vis-à-vis du récepteur muté D100(3,32)A (Figure 3B) . Les résultats ci-dessus montrent que le récepteur 5-HT4 muté D100(3,32)A est un récepteur de type RASSL, unique sur la base de plusieurs caractéristiques : 1) Il est généré par une mutation unique. 2) Il est complètement insensible à son unique agoniste naturel endogène : 5-HT. 3) Il peut être stimulé par une longue série d'agonistes synthétiques de différentes classes chimiques. 4) Nombre de ces ligands synthétiques présentent une affinité nanomolaire pour le RASSL 5-HT4 et certains parmi eux sont disponibles pour une administration par voie orale, comme le Cisapride. Le Cisapride ou PrépulsideTM a été utilisé pendant de nombreuses années pour le traitement de la dyspepsie et principalement le reflux gastro-#sophagique chez l'enfant. Ce composé a été retiré du marché à cause de quelques arythmies provoquées via l'activation des canaux potassiques (K+) (Kii, Y., Ito,T. J.Cardiovasc.Pharmacol. (1997) 29:670-5). D'autres benzamides sont toujours en développement et seront certainement disponibles pour leur administration chez l'homme. De manière intéressante, il a été démontré que le composé RS 67333 est un autre agoniste puissant du RASSL 5-HT4. Ce composé possède en outre, une grande faculté à traverser la barrière hématoencéphalique. 5) Des composés (ML 10375 et GR 113808) sont des antagonistes hautement spécifiques du récepteur natif et deviennent des agonistes du récepteur RASSL 5-HT4. Le composé GR 113808 traverse également la barrière hématoencéphalique ce qui le rend particulièrement intéressant pour une utilisation putative du récepteur in vivo. Ainsi, avec ces composés (ML 10375 et GR 113808), il est possible de maintenir silencieux les récepteurs natifs tout en activant le récepteur RASSL 5-HT4, y compris lorsqu'ils sont exprimés par ingénierie génétique chez les souris. Par comparaison avec les récepteurs bétaadrénergiques RASSL couplés à des protéines G préalablement décrits, le récepteur RASSL 5-HT4 présente l'avantage d'être stimulé par des composés synthétiques d'une bien plus haute affinité : nM pour le récepteur RASSL 5-HT4 alors que l'affinité n'est que M pour le récepteur RASSL béta2-adrenergique (Small KM, Brown KM, Forbes SL, Liggett SB. J. Biol . Chem. (2001) 276(34):31596-601). Les analyses structurales des ligands du récepteur 5-HT4, utilisés dans cette étude, sont en accord avec un rapport récent sur la cartographie comparative des sites de liaison du récepteur 5-HT4 (Lopez-Rodriguez, M.L., Murcia,M., Benhamu,B., Viso, A., Campillo,M. and Pardo,L. Bioorg.Med.Chem.Lett. (2001) 11(21):2807-11.22). Les caractéristiques structurales qui définissent les ligands du récepteur 5-HT4 sont constituées une partie aromatique, d'un carbonyle coplanaire, d'une fonction carboxylique ou cétone et d'un atome d'azote basique. Le substituant de l'azote basique doit être volumineux (comme dans tous les médicaments actifs pour le récepteur RASSL 5-HT4 décrit) afin de se stabiliser dans une poche hydrophobe du récepteur, sans nécessiter la présence du groupement carboxylate de l'aspartate D100. La taille du substituant, jusqu'à un certain degré, améliore la sélectivité et l'affinité du ligand pour son récepteur. Une des hypothèses de la demanderesse est que l'azote basique de ces médicaments interagit avec ladite poche hydrophobe avec une charge négative, mais pas avec l'aspartate D1003,32. Ce résidu Asp est, par contre, nécessaire pour la liaison avec l'amine protonée présente dans les dérivés tryptamines proche de la 5-HT. Ces composés sont donc inactifs sur le récepteur RASSL 5-HT4 décrit. On peut donc supposer que l'interaction de l'azoté basique n'est pas essentielle. L'affinité des ligands ayant des substituants volumineux pour le récepteur RASSL 5-HT4 (Structures dans le tableau 1) dépendra des interactions entre leur cycle hydrophobe et la poche hydrophobe définie par les résidus aromatiques hautement conservés des TMVI et VII (W6,48, F6,51 et Y7,43) (16, 23, 24).s Ce récepteur RASSL 5-HT4 constitue par conséquent un modèle très utile pour déterminer les effets physiologiques de l'expression d'un récepteur couplé aux protéines Gs et pour contrôler, par exemple dans des modèles de souris transgéniques la transduction du signal liée aux protéines Gs in vivo (Scearce-Levie,K., Coward, P., Redfern,C.H., Conklin,B.R. Methods Enzymol. (2002) 232-48. Lorsque ledit récepteur est exprimé, il est fonctionnellement silencieux jusqu'au moment de l'administration du ligand synthétique. Un tel récepteur est particulièrement utile pour réguler des nombreuses réponses physiologiques qui nécessitent l'activation de la voie couplée à Gs. A titre d'exemple, on peut proposer l'expression d'un récepteur RASSL 5-HT4 dans le coeur d'une souris, qui n'exprime pas de récepteur 5-HT4, contrairement au c#ur humain (Kaumann,A.J., Lynham,J.A., Brown,A.M. Naunyn. Schmiedebergs. Arch. Pharmacol. (1996) 353(5):592-5). Ce modèle permettrait de tester l'activation chronique ou aiguë de la voie Gs, en absence de stimulation d'autres cibles périphériques, en incluant des tissus vasculaires. Au niveau central, le récepteur RASSL 5-HT4, exprimé dans la substance noire pourra être stimulé et la production d'AMPc dans des neurones dopaminergiques conduira à leur survie et à leur protection lorsqu' ils seront traités par une drogue neurotoxique, le MPP+(1méthyl-4-phénylpyridinium) le métabolite actif du MPTP (1-méthyl-4-phényl-1, 2,3, 6-tétrahysropyridine). Il est connu que la production d'AMPc in vivo, permet une telle protection. De telles expériences fournissent une base pour une thérapie génique de la maladie de Parkinson. REVENDICATIONS 1) Utilisation d'un ADNc codant pour un récepteur 5- HT4-DlooA, dans lequel le codon codant l' aspartate10o, du domaine transmembranaire III du récepteur sauvage correspondant, est muté pour coder une alanine, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou la prévention d'une pathologie provoquée par un disfonctionnement dans la synthèse d'AMPc. 2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence de l'ADNc du récepteur 5-HT4-D100A muté est la séquence identifiée sous le numéro SEQ ID No. : 1 dans la liste de séquences en annexe. 3) Utilisation selon les revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite pathologie provoquée par un disfonctionnement dans la synthèse d'AMPc est une maladie neurodégénérative, de préférence, la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer ou la Chorée de Hungtington. 4) Utilisation selon les revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite pathologie provoquée par un disfonctionnement dans la synthèse d'AMPc est une maladie respiratoire, de préférence l'asthme ou la mucoviscidose. 5) Utilisation selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite séquence d'acide nucléique est insérée dans un vecteur de transfert viral ou nonviral. 6) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le vecteur viral est adapté pour le transfert de la séquence nucléotidique dans une cellule, et qu'il comprend les éléments de régulation nécessaires pour l'expression dudit récepteur pour permettre l'expression ciblée et fonctionnelle de celui-ci. 7) Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que le vecteur de transfert est un vecteur viral choisi parmi le groupe des vecteurs comprenant des vecteurs issus des virus associés aux adénovirus de type 2, des vecteurs issus du lentivirus avec différents pseudotypes, des vecteurs issus des virus de l'immunodéficience féline et des vecteurs issus du Foamy virus . 8) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce ledit vecteur de transfert est un plasmide comportant le génome complet du vecteur associé aux adénovirus (AAV) (psub201) et le plasmide d'empaquetage (pAAV/Ad). 9) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit vecteur est le vecteur PAAV- promoteur- 5 -HT4-D 100 A-HA construit dans une cassette contenant un promoteur fort. 10) Utilisation selon les revendications 6 à 9, caractérisée en ce que ledit vecteur comprend un promoteur, choisi parmi groupe comprenant le promoteur fi actine/enhancer cytomégalovirus (ou promoteur CAG) et le promoteur du transporteur de la dopamine.