Brevet FR2835531A1 — publié le 20030808

PROCEDE POUR LA FABRICATION D'AMIDES EN PRESENCE D'UNE NITRILE HYDRATASE D'ORIGINE MICROBIOLOGIQUE ET NOUVEAU MICROORGANISM. L'invention a tout d'abord pour objet un procédé de production d'amides obtenues par hydratation d'un nitrile en présence d'une nitrile hydratase d'origine microbiologique. Plus précisément, l'invention concerne un procédé de fabrication d'amides en présence d'une nitrile hydratase produite par une bactérie appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans. Elle se rapporte ensuite à un procédé de culture de bactéries appartenant à l'espèce / ! oococcM 'i'ncon. ?. L'invention concerne enfin une souche bactérienne spécifique appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans. Le document FR-A-2 294 999 décrit un procédé de préparation d'un amide par hydrolyse du nitrile correspondant consistant à soumettre le nitrile en solution aqueuse à l'action de bactéries présentant une activité nitrile hydratasique. En tant que bactérie à activité nitrile hydratasique, est notamment décrit le genre Brevibactérium, tel que défini au sens de Bergey et plus particulièrement la souche R312. Le document EP-188 316 décrit un procédé de fabrication d'amides en présence d'une nitrile hydratase d'origine microbiologique, en particulier d'acrylamide, à partir d'un mononitrile contenant de deux à six atomes de carbone. En tant que microorganismes, sont spécifiquement décrits les bactéries appartenant au genre Rhodococcus ou au genre Microbactérium. Cependant, le procédé tel que décrit dans ce document ne reste efficace que pour l'hydratation de nitriles aliphatiques inférieurs, l'activité sur les nitriles aromatiques restant très faible (voir exemple 2). Pour résoudre ce problème, le document EP-A-307 926 décrit une souche spécifique appartenant au genre Rhodococcus, plus précisément la souche Rhodococcus rhodochrous J-l (FERM BP-1478) qui, en présence d'ions cobalt, hydrate les nitriles. La concentration en CoCl-ôHO des milieux de culture est de 10 mg/1. Le brevet EP-A-362829 présente une méthode de production de cellules de la bactérie Rhodoccocus rhodochrous permettant d'obtenir une activité nitrile hydratasique élevée en additionnant de l'urée, ou un dérivé, au milieu de culture de la bac, %. de la bactérie. La culture des bactéries est de façon systématique commencée en présence d'ion cobalt et d'urée, ou de ses dérivés. En conséquence, la bactérie AoococcM oJc'c/OM J-7 décrite dans les deux documents précités, de par son activité élevée, est devenue, pour l'homme du métier, la bactérie de référence en matière d'activité nitrile hydratasique. Le document GB-A-2 290 295 décrit également l'utilisation d'une souche de Rhodococcus rhodochrous déposée auprès de la collection nationale russe de microorganismes sous le numéro VKM Ac-1515D. Cette souche est utilisée comme source de nitrile hydratase, pour la fabrication biologique d'amides et ce, en l'absence d'inducteur ce qui amène à penser que l'activité nitrile hydratasique de cette bactérie est constitutive. YOON & al. décrit dans le document Int J Syst. Evol. Microbiol. 2000 Nov., 50 Pt, 6 : 2173-80, une nouvelle souche bactérienne désignée"PDB9T"ayant donné lieu à l'identification d'une nouvelle espèce, à savoir l'espèce pyridinovorans appartenant au genre Rhodococcus. La souche PDB9 a été déposée auprès de la collection coréenne des cultures sous le numéro KCTC 0647 BP de même qu'auprès du centre coréen de culture de microorganisme sous le numéro KCCM 80005. La séquence partielle de l'ARN 16S ribosomal est en outre disponible dans la banque de gènes GENBANK sous le numéro d'accession AF 173005. Le document YOON indique que Rhodococcus pyridinovorans est apte à dégrader la pyridine. Or, le Demandeur a découvert que, de manière tout à fait surprenante, Rhodococcus pyridinovorans présentait une activité nitrile hydratase élevée, en faisant un microorganisme avantageusement utilisable dans un procédé de fabrication biologique d'amides. En conséquence, l'invention concerne un procédé de fabrication d'amides consistant à hydrater un nitrile en une amide correspondante, en présence d'une nitrile hydratase d'origine microbiologique caractérisé en ce que ladite nitrile hydratase est produite par une bactérie appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans. Même si les bactéries d'espèce pyridinovorans appartiennent au même genre Rhodococcus que les bactéries d'espèce rhodochrous, lesquelles présentent une activité nitrile hydratase élevée, il n'était pas pour autant évident que pyridinovorans soit également douée d'une activité nitrile hydratase élevée. En effet, à ce jour, seule l'espèce rhodochrous a permis un développement industriel pour la production d'amides tels que l'acrylamide. Les autres espèces majeures du genre Rhodoccocus comme erythropolis ou equi ne présentent que des activités marginales notamment pour la production d'acrylamide. En outre, le Demandeur a démontré que l'activité nitrile hydratasique pouvait être améliorée en appliquant des conditions de culture spécifiques, en particulier en employant des concentrations et/ou des temps d'ajouts d'une source de carbone, d'un ion métallique et d'un inducteur sélectif. Ainsi et selon une première caractéristique, les bactéries de l'invention sont cultivées dans un milieu contenant des ions cobalt (Co et/ou Co). Le cobalt peut être ajouté sous forme de sels de cobalt ou de composés organiques. Il peut être ajouté en 1 fois ou en continu, en début ou en cours de culture, de préférence séquentiellement. En pratique, les concentrations finales en cobalt (base Col2- 6H2O) sont comprises entre 10 et 40 mg/L et préférentiellement entre 15 et 30 mg/L. Pour améliorer davantage l'activité, les bactéries sont cultivées en présence également d'un inducteur choisi dans le groupe des amides ou des nitriles. La plupart des amides (y compris l'urée et ses dérivés) peuvent être utilisés comme inducteur de l'activité nitrile-hydratasique. Ces inducteurs peuvent être ajoutés seuls ou en mélange, en 1 fois, séquentiellement ou en continu, en début ou en cours de culture. En pratique, l'inducteur est choisi dans le groupe comprenant crotonamide, urée, propionamide, acétamide, n-butyramide, isobutyramide, n-valéramide, ncapronamide, méthacrylamide et cyclohexanecarboxamide. Certains inducteurs de type nitrile peuvent également être utilisés, comme par exemple : acétonitrile, propionitril, isobutyronitrile. On utilisera de préférence un inducteur peu onéreux qui n'est pas ou peu métabolisé (urée ou ses dérivés). En pratique, les concentrations finales en urée ou ses dérivés sont comprises entre 5 et 50 g/L, préférentiellement supérieures à 10 g/L. En d'autres termes, le Demandeur a démontré que l'activité nitrile hydratase des bactéries de l'invention était améliorée dans des conditions standards de cultures (CoCI2-6H2O > 10 mg/1 ; urée préférentiellement > 10 g/l) distinctes de celles utilisées pour Rhodococcus rhodochrous J-l (CoC12-6H2O : 10mg/l ; urée : 7,5 g/l) [Optimum culture conditions for the production of cobalt-containing nitrile hydratase by Rhodococcus rhodochrous JI, Appl. Microbiol. Biotechnol. (1991) 34 : 783-788]. La concentration en source de carbone influence également l'obtention d'une activité nitrile-hydratasique satisfaisante. En pratique, on utilise des sources de C à des concentrations nominales variant de 5 à 50 g/L, de préférence de 12 à 30 g/L, ajoutées seules ou en mélange, en 1 fois, séquentiellement ou en continu, en début ou en cours de culture. De façon non limitative, on citera en tant que source de carbone le D-Glucose, le Pyruvate, le D-Sorbitol... En pratique, des quantités pré-déterminées d'urée, de cobalt et d'une source de carbone sont ajoutées au milieu basal. La culture est menée à une température comprise entre 15 et 50 oC, préférentiellement autour de 28 C, à un pH compris entre 6 et 9 durant au minimum 96 heures (jusqu'à 200 heures). Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie utilisée est la souche MW3 appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans et déposée le 24 janvier 2002 à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes), Institut Pasteur, 25 rue du Dr. ROUX, PARIS, France, sous le numéro CNCM 1-2772, et les mutants de cette souche. Les mutants de la souche ci-dessus entrent en effet dans le cadre de l'invention dès lors qu'ils présentent une activité nitrile hydratase. Dans un mode de réalisation avantageux, le microorganisme peut être immobilisé en utilisant des méthodes et des procédures connues de l'homme du métier. Ces méthodes comprennent, par exemple, les immobilisations par inclusion sur gel (polyacrylamide, extraits d'algues, alginates...) ainsi que les immobilisations sur support par adsorption ou par liaisons covalente (supports d'origine minérale (alumine, brique, verre, argile...) ou organique (résines échangeuses, collagène, cellulose...). Selon une autre caractéristique, les substrats sur lesquels agissent Rhodococcus pyridcnovorans peuvent aussi bien être des nitriles aliphatiques que les nitriles aromatiques. On citera à titre d'exemple sans toutefois limiter l'invention, des composés tels que l'acétonitrile, le propionitrile, le méthacrylonitrile, l'acrylonitrile, le benzonitrile, la 3-cyanopyridine, le 3-hydroxy isovaleronitrile, le 3-hydroxypropionitrile, le 2-hydroxy 4methylthiobutyronitrile... On notera que la production d'amide obtenues par hydratation d'un nitrile en présence de la nitrile hydratase produite par le microorganisme de la présente demande peut se faire aussi bien par le biais de procédés continus que discontinus (appelés" batch "). L'invention se rapporte aussi à un procédé de culture de bactéries appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans. Selon une première caractéristique, le milieu de culture contient des ions cobalt Co2+ et/ou Co3+ dans des concentrations comprises entre 10 et 40 mg/L (base CoCI2-6H2O), préférentiellement entre 15 et 30 mg/L. Selon un mode de réalisation avantageux, le milieu contient en outre de l'urée ou ses dérivés dans des concentrations finales comprises entre 5 et 50 g/L, préférentiellement supérieures à 10 g/L. Selon une forme de réalisation préférée, le milieu contient en outre une source de carbone dont les concentrations nominales varient entre 5 et 50 g/L, de préférence entre 12 et 30 g/L. L'invention concerne également la souche MW3 appartenant à Rhodococcus pyridinovorans déposée le 24 janvier 2002 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-2772 et les mutants de cette souche. L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants. 1/Caractérisation de la souche MW3 a/Milieudeculture Milieu basal : K2HPO4 0.5 g KH. PO, 0.5 g MgS04, 7ho 0. 5 g Extrait de levure 1.0 g Tryptone de caseine 7.5 g Eau déionisée q. s. p. 1 litre (pH 7.2) Ion métallique Co : 10 mg/L (CoCl2-6H2O) Inducteur Urée : 7,5 g/L Source de carbone D-Glucose monohydrate 10 g/L b/PropriétésdeMW3 Type de colonie : gram + colonies pigmentées en rose Caractère biochimique : oxydase- catalase + nitrate réductase + nitrite réductaseMétabolisme respiratoire : aérobie stricte ci Identification Méthode utilisée : - Amplification du gène rrs codant l'ARNr 16S - Séquençage du gène rrs L'analyse de la séquence d'ARNr 16S de MW3 montre un pourcentage d'homologie égal à 100% avec la séquence de l'ARNr 16S de la souche PDB9 accessible dans la banque GENBANK sous le numéro AF173005. L'homologie étant de 100%, on en conclut que MW3 appartient à Rhodococcus py'dinovorans. 2/Activité nitrile hydratase de MW3 Descriptif des mesures de l'activite nitrile-hydratasique effectuées : Définitions - Activité spécifique : gmol d'amide produit. min-t. mg-t de poids sec bactérien. Activité relative : activité exprimée en pourcent correspondant à l'activité spécifique ou totale obtenue rapportée à l'activité spécifique ou totale de référence (100%). - Activité totale : umol d'amide produit. min-'. g-'de milieu de culture. Test d'activité à 200C . Solution réactionnelle de 100g contenant : - 50g de tampon phosphate lOOmM - 49g de solution aqueuse de nitrile respectivement : . x grammes de nitrile correspondant à la quantité nécessaire à l'obtention de la concentration finale recherchée . 49-x g d'eau déionisée La réaction est déclenchée en rajoutant 1 g de suspension cellulaire (contenant une quantité prédéterminée de cellules centrifugées 10 min à 10000 g). Prélèvement de 4 mL après différents temps d'incubation et arrêt de la réaction avec 30 nul d'acide sulfurique concentré. Dosage par chromatographie phase liquide de l'amide formé. 3/EXEMPLES A/EXEMPLE1 Test activité effectué dans des conditions standards optimales utilisées pour Rhodococcus rhodochrous Y/ [Optimum culture conditions for the production of cobalt-containing nitrile hydratase by Rhodococcus rhodochrous J1, Appl. Microbiol. Biotechnol. (1991) 34 : 783-788]. Conditions de culture : CoClHO : 10mg/1 ; urée : 7,5 g/1 ; glucose : 10 g/L ; substrat : acrylonitrile 50 mM Bactérie Formation d'amide1 MW3 10 Rhodococcus rhodochrous J1 100* @ : Activité spécifique relative (%) * : sur la base des résultats du brevet EP 362829 (AS = 497 ; ex 2, tab 1) On constate que, dans des conditions standards décrites comme optimales pour Jl, MW3 présente une activité nitrile hydratasique modérée. B/EXEMPLE 2 : Variation des conditions de culture de MW3 en fonction des concentrations et/ou des temps d'ajout du cobalt. Conditions de culture : CoCI2-6H2O : variable ; urée : 7,5 g/l ; glucose : 10 g/L ; substrat : acrylonitrile 50 mM Concentration en Temps d'ajout Formation CoCL2-6H20 d'amide1 10 mg/L (standard) T=O 100 20 mg/L T=O 345 30mg/L T=0 128 2x10 mg/L T=0et24h 396 @ : Activité spécifique relative (%) En multipliant par 2 la concentration en cobalt et en fractionnant son ajout, l'activité de MW3 peut de façon surprenante être multipliée par 4. C/EXEMPLE 3 : Variation des conditions de culture de MW3 en fonction des concentrations et/ou des temps d'ajout de l'inducteur (l'urée). Conditions de culture : CoC12-6H2O : 10 mg/1 ; urée : variable ; glucose : 10 g/L ; substrat : acrylonitrile 50 mM Concentration en Temps d'ajout Formation urée d'amide' 7, 5 g/L (standard) T=0 100 7,5 g/L T = 12h 110 15g/L T=24h 260 15 g/L T = 36h 240 2 x 7, 5 g/L T = 24h et 48h 250 2 x 7, 5 g/L T = 12h et 36h 250 2 x 15 g/L T = 24h et 48h 290 1 : Activité spécifique relative (%) De façon surprenante, lorsque l'ajout d'urée n'intervient qu'après le début de culture de MW3 (au moins 12 heures) et que la quantité utilisée est augmentée, l'activité nitrile hydratasique de la bactérie est surmultipliée. DI EXEMPLE 4 : Variation des conditions de culture de MW3 en fonction des concentrations et/ou des temps d'ajout de la source de carbone (le glucose). Conditions de culture : CoCI2-6H2O : 10mg/l ; urée : 7,5 g/l ; glucose : variable ; substrat : acrylonitrile 50 mM Concentration en Temps d'ajout Formation glucose d'amide 1 10 g/L T=O 100 15g/L T=0 140 20g/L T=0 190 2 x 10 g/L T = 0 et 24h 200 3#10 g/L T=0,24 et 48h 220 @ : Activité totale relative (%) De façon surprenante, lorsque la quantité en source de carbone est augmentée et que son ajout est fractionné après le début de culture de MW3, l'activité nitrile hydratasique de la bactérie est amplifiée. E/EXEMPLE 5 : Variation du substrat (nitrile) utilisé lors du test d'activité. Conditions de culture : CoClHO : 10mg/1 ; urée : 7,5 g/1 ; glucose : 10 g/L ; substrat : variable Substrat (50mM) Formation d'amide1 Acrylonitrile 100 Méthacrylonitrile 79 Cyanopyridine 33 Benzonitrile 53 Propionitrile 69 Acétonitrile 109 @ : Activité spécifique relative (%) MW3 présente une activité nitrile hydratasique sur une grande variété de substrats aussi bien aliphatiques, aromatiques ou insaturés. FI EXEMPLE 6 : Mesures d'activité spécifique (substrat : acrylonitrile 377 mM). Test 1 Test 2 Test 3 CoC12-6H20 20 mg/L 20 mg/L 20 mglL Temps d'ajout T=O T = 0 et 24h T=O Urree2 x 7, 5 g/L2 x 7, 5 g/L2 x 7, 5 g/L Temps d'ajout T = 0 et 24h T = 24 et 48h T = 0 et 24h Glucose2xlOg/L16 g/L2x10 g/L Temps d'ajout T = 0 et 24h T=O T = 0 et 24h Durée de culture 168h 168h 120h Concentration de 9 g/L 8, 1 g/L 6,2 g/L cellules Formation d'amide Activité Spécifique 340 220 250 Activité Totale 3060 1760 1550 Remarque : Lorsque l'ajout d'urée est effectué en totalité à T = 0, l'activité totale obtenue était nettement plus faible que celles constatées pour les tests présentés dans le tableau ci-dessus (inférieure à 1000). G/EXEMPLE 7 : immobilisation 140 g d'une suspension cellulaire de MW-3 (contenant 15% p/p de cellules sèches dans du tampon phosphate 50 mM pH 7,0) obtenue par fermentation sur milieu nutritif tel que décrit par l'exemple 6 (test 1), est immobilisée dans un gel de polyacrylamide selon un procédé bien connu de l'homme de l'art. Le gel ainsi obtenu est broyé dans un moulin afin d'obtenir après tamisage des particules de taille homogène comprise entre 500 et 1500 um. Ces particules sont lavées dans le tampon phosphate pH 7,0 puis stockés dans ce même tampon. H/EXEMPLE 8 : essai de bioconversion n01 On prend 120 g de gel égoutté obtenu selon l'exemple 7 et ayant une activité totale de 15000 U sont ajoutés à 2,895 kg d'eau déionisée contenant 148 ppm d'acrylate de sodium, pH 8,0. Le mélange est maintenu, sous une agitation de 200 rpm, à 12 C les 12 premières heures puis à 20 C les 12 heures suivantes. 2624 ml d'acrylonitrile sont ajoutés à un débit constant de 164 ml/h pendant 16 h, le pH étant régulé par addition de soude 50 mM. Après une durée totale de 24 h de bioconversion, on obtient une solution finale présentant une concentration de 56,4% en acrylamide et avec un résidu d'acrylonitrile Il EXEJ\1PLE 9 : essai de bioconversion n 2 20 g de MW-3 immobilisé et égoutté comme décrit dans l'exemple 7 sont ajoutés à 811 g d'eau déionisée contenant 148 ppm d'acrylate de sodium, pH 8.0. La température du mélange étant maintenue à 20 C sous une agitation de 200 rpm. 189 ml de méthacrylonitrile sont ajoutés à un débit constant pendant 24 h. Après une durée totale de 30 h de bioconversion, 19, 1% de methacrylamide contenant moins de 100 ppm de methacrylonitrile sont obtenus. Le produit est séparé du catalyseur par filtration sur 0.2 u. m, puis cristallisé avec un rendement de 46%. J/EXEMPLE 10 : essai de bioconversion n 3 3 g d'une suspension de cellules libres de MW-3 (310 mg de cellules sèches dans 0.85% NaCl) sont ajoutés à 687 g d'eau déionisée contenant 148 ppm d'acrylate de sodium, pH 8,0. Ce mélange étant maintenu à 20 C sous une agitation de 200 rpm, 389 ml d'acrylonitrile sont ajoutés à un débit constant durant 16 h. Après une durée totale de bioconversion de 24 h, une solution de 42% d'acrylamide contenant moins de 50 ppm d'acrylonitrile résiduel est obtenue. Les cellules sont séparées du produit final par filtration sur 0. 2 am. REVENDICATIONS 1/Procédé de fabrication d'amides consistant à hydrater un nitrile en une amide correspondante, en présence d'une nitrile-hydratase d'origine microbiologique, caractérisé en ce que ladite nitrile hydratase est produite par une bactérie appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans. 2/Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les bactéries sont cultivées en présence d'ions cobalt. 3/Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les concentrations finales en cobalt (base CoCLrôHO) sont comprises entre 10 et 40 mg/L, préférentiellement entre 15 et 30 mg/L. 4/Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les bactéries sont cultivées en présence d'urée ou de ses dérivés. 5/Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les concentrations finales en urée ou ses dérivées sont comprises entre 5 et 50 g/L, préférentiellement supérieures à 10 g/L. 6/Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que des bactéries sont cultivées en présence d'une source de carbone dont les concentrations nominales varient entre 5 et 50 g/L, de préférence entre 12 et 30 g/L. 7/Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la bactérie utilisée est la souche MW3 déposée le 24 janvier 2002 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-2772 et les mutants de cette souche. 8/Procédé de culture de bactéries appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans, caractérisé en ce que le milieu contient des ions cobalt dans des concentrations comprises entre 10 et 40 mg/L (base CoClHO), préférentiellement entre 15 et 30 mg/L. 9/Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le milieu contient de l'urée ou ses dérivés dans des concentrations finales comprises entre 5 et 50 g/L, préférentiellement supérieures à 10 g/L. 10/Procédé selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que le milieu contient une source de carbone dont les concentrations nominales varient entre 5 et 50 g/L, de préférence entre 12 et 30 g/L. 11/Souche MW3 appartenant à Rhodococcus pyridinovorans déposée le 24 janvier 2002 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-2772 et les mutants de cette souche. DEPOSANT : S. N. F. MANDATAIRE : CABINrZLAURENT & CHARRAS