Brevet FR2844524A1 — publié le 20040319

La présente invention se rapporte au domaine de la purification des cellules épithéliales contenues dans l'urine humaine ou animale, en particulier à des fins diagnostiques ou thérapeutiques. Du bassinet jusqu'au début de l'urètre, la paroi de l'arbre urinaire est 5 tapissée par un épithélium stratifié de transition. Dans la vessie, cet épithélium est composé d'environ sept couches de cellules. Les plus profondes sont cylindriques, tandis que les cellules intermédiaires sont de formes variées. La surface est recouverte de cellules transitionnelles, aussi appelées urothéliales. Les cellules transitionnelles ou urothéliales sont des 10 éléments normaux du sédiment urinaire. L'exfoliation des cellules épithéliales, spécifiquement des cellules urothéliales, dans les urines constitue un processus physiologique normal chez l'homme ou l'animal. Cette exfoliation est le résultat du renouvellement normal de l'épithélium. Toutefois, on observe une augmentation de l'exfoliation dans certaines pathologies, y compris des pathologies provoquant une augmentation de la mortalité cellulaire et des pathologies affaiblissant le lien entre les cellules et la membrane basale de l'épithélium. Ainsi, au cours des différents processus pathologiques affectant 20 l'homme ou l'animal, des cellules dérivant du revêtement épithélial de l'arbre urinaire, aussi appelées cellules urothéliales, desquament dans le flux urinaire. L'examen et la caractérisation de ces cellules exfoliées, à partir d'une analyse d'urine, permet de réaliser le diagnostic d'une pathologie dont l'individu duquel provient ces cellules peut être affecté. Les principales techniques couramment utilisées pour la caractérisation et la détection de cellules urothéliales pathologiques, en particulier des cellules urothéliales malignes, sont notamment les suivantes: - analyse des caractéristiques morphologiques des cellules, par cytologie urinaire; - détection d'antigènes spécifiques des cellules urothéliales, telles que l'antigène du cancer de la vessie (" Bladder tumor antigen ", ou BTA), les cytokératines, les produits de dégradation du fibrinogène ou encore l'antigène NMP-22; - analyse des anomalies chromosomiques massives, notamment par cytométrie en flux, fluorescence in situ (FISH) ou encore des techniques du type Quanticyt ; - détection des remaniements de régions chromosomiques, par 5 exemple par amplification et analyse de séquences répétées (marqueurs microsatellites); - analyse du nombre de copies ou de l'expression de gènes impliqués dans la cancérogenèse constituant des gènes marqueurs, tels que la télomérase ou la survivine. Afin d'améliorer la sensibilité et la spécificité des divers tests de diagnostic réalisés à partir des cellules épithéliales présentes dans l'urine, il existe un besoin dans l'état de la technique pour des procédés permettant d'enrichir les échantillons d'urine de départ en cellules épithéliales et éliminer simultanément les nombreux autres constituants de l'urine susceptibles 15 d'affecter la spécificité ou la sensibilité du diagnostic, voire dans certains cas de rendre ce diagnostic impossible. Outre les cellules épithéliales, l'urine peut contenir également d'autres composants, cellulaires ou non cellulaires, en particulier des cellules nucléées comme les leucocytes et le cas échéant également des spermatozodes, des cellules anucléées comme les 20 hématies, le cas échéant des microorganismes d'origine bactérienne ou fongique, ou encore des composants non cellulaires, en particulier de nombreux cristaux,de taille et de nature chimique variées. En particulier, on observe que la présence de nombreux leucocytes et hématies dans l'urine provoque l'obtention de résultats faussement positifs 25 ou faussement négatifs lors de la mise en oeuvre des divers tests de diagnostic énumérés ci-dessus. Pour les techniques de diagnostic nécessitant une préparation de l'ADN contenu dans les cellules épithéliales, par exemple en vue d'une analyse des allèles de différents marqueurs ADN contenus dans le génome 30 des cellules épithéliales urinaires, on a proposé de séparer les cellules humaines des organismes contaminants, principalement des microorganismes contenus dans l'urine, avant de procéder à l'étape d'extraction d'ADN. Notamment, l'équipe de VAN DER HEL et al. a réalisé des travaux visant à déterminer les conditions optimales de spécificité et de sensibilité d'une amplification PCR à partir d'ADN isolé d'urine congelée (VAN DER HEL et al., 2002, Analytical Biochemistry, vol.304:206-211). Ces auteurs ont notamment testé l'avantage technique éventuel que pourrait constituer une étape de séparation des cellules épithéliales des 5 autres constituants de l'urine, préalablement à l'extraction puis à l'amplification de l'ADN. Dans ce but, cette équipe a réalisé une séparation des cellules épithéliales à partir d'échantillons d'urine congelée comportant (i) une première étape de centrifugation de l'urine, (ii) une remise en suspension du culot solide ainsi obtenu, (iii) une première filtration par 10 centrifugation du culot remis en suspension à travers un filtre de Nylon de 40 pm de taille de pore, (iv) une remise en suspension du sédiment contenu dans le filtrat, (v) une filtration par centrifugation du sédiment remis en suspension à travers un filtre de Nylon d'une taille de pore de 11 pm, puis (vi) une lyse directe des cellules retenues à la surface du filtre en vue 15 d'extraire l'ADN dont l'analyse par amplification est recherchée. Toutefois, ces auteurs ont observé que, d'une part, il n'existe aucune corrélation entre le degré de contamination bactérienne des échantillons de départ et le succès de l'amplification par PCR de l'ADN extrait des cellules urinaires et que, d'autre part, la décontamination bactérienne des 20 échantillons par le procédé de filtration ci-dessus n'apporte pas de différence significative dans les résultats finals d'amplification de l'ADN. Ces mêmes auteurs concluent que l'allongement de la durée du procédé, du fait de l'étape de décontamination bactérienne préalable à l'extraction de l'ADN, est injustifiée compte tenu de l'absence de corrélation apparente entre la qualité 25 de l'amplification de l'ADN et le degré de contamination bactérienne. De manière surprenante, on a montré selon l'invention qu'une séparation des cellules épithéliales contenues dans un échantillon d'urine humaine ou animale par microfiltration de cet échantillon d'urine sur une membrane filtrante ayant un diamètre moyen de pore de 11 pm, puis 30 récupération des cellules retenues sur la surface de ladite membrane filtrante par une solution contenant de la trypsine permettait l'obtention d'une suspension cellulaire contenant majoritairement des cellules épithéliales, lesdites cellules épithéliales ayant de plus conservé leur intégrité physique, ce qui les rend aptes à être utilisées directement pour la mise en oeuvre des divers tests diagnostic de type cytologique, immunologique, de type cytométrie de flux ou encore de type génétique mentionnés précédemment. L'invention a pour objet un procédé de séparation des cellules épithéliales à partir d'un échantillon d'urine humaine ou animale contenant ces cellules, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) microfiltration de l'échantillon d'urine sur une membrane filtrante ayant un diamètre moyen de pore de 11 pm, afin d'obtenir un rétentat de microfiltration contenant majoritairement des cellules épithéliales, b) récupération des cellules du rétentat de microfiltration, par traitement de 10 la membrane filtrante par une solution contenant de la trypsine. On a montré selon l'invention que le procédé ci-dessus permettait l'obtention d'une suspension purifiée contenant majoritairement des cellules épithéliales, du fait de l'élimination d'une grande partie des constituants cellulaires et non cellulaires indésirables initialement contenus dans l'urine, 15 respectivement les leucocytes, les microorganismes bactériens ou fongiques, les hématies, les cristaux de diverses natures ainsi que des filaments ou du mucus, ces différents composants indésirables étant retrouvés respectivement dans 75%, 30%, 54%, 21% et 23% des échantillons de départ testés. En particulier, on a montré selon l'invention que le procédé de séparation des cellules épithéliales à partir d'un échantillon d'urine cidessus permet d'éliminer totalement les leucocytes initialement présents dans 80% des échantillons testés. De plus, dans environ 90% des échantillons testés, moins de 10% des leucocytes initialement présents dans l'urine sont 25 retrouvés. Le terme " diamètre moyen de pore " est, au fin de la présente description, synonyme de " taille de maille " d'une membrane filtrante, ces expressions étant utilisées respectivement selon que la membrane filtrante comprend une surface poreuse ou que la membrane filtrante comprend un 30 tamis. Selon le procédé ci-dessus, l'échantillon d'urine animale est préférentiellement un échantillon d'urine de mammifère. L'échantillon d'urine traité selon le procédé de l'invention peut être un échantillon d'urine fraîchement collecté, le cas échéant maintenu au froid, par exemple à 40C, 35 pendant une durée allant de quelques minutes à quelques heures, par exemple 48 heures. L'échantillon d'urine peut également provenir d'une urine collectée à un moment quelconque, puis conservée sous forme congelée, par exemple à une température inférieure à - 200C, puis décongelée peu de temps avant son utilisation. L'échantillon d'urine susceptible d'être traité 5 selon le procédé ci-dessus peut également provenir d'un prélèvement d'urine prélevée sur l'homme ou l'animal par endoscopie ou avec un cathéter. Dans tous les cas, l'échantillon d'urine n'a subi aucune étape de séparation de ses différents constituants cellulaires ou non cellulaires, préalable à son traitement par le procédé de l'invention. Le cas échéant, l'échantillon d'urine peut être dilué avec un milieu permettant de conserver une bonne viabilité des cellules épithéliales, ou à tout le moins de conserver une excellente intégrité physique de ces cellules, comme par exemple un milieu de Hank's. Tout milieu de culture de cellules de mammifères peut également être utilisé. De préférence, l'étape b) de récupération des cellules du rétentat de microfiltration obtenu à l'étape a) est réalisée par traitement de la membrane de microfiltration avec une solution contenant une concentration de trypsine permettant le détachement des cellules du rétentat à partir de la surface de la membrane filtrante sans affecter significativement la viabilité des cellules 20 épithéliales, ou à tout le moins sans affecter notablement l'intégrité physique de ces cellules, c'est-à-dire en conservant autant que possible intacte la membrane cellulaire. Les concentrations appropriées de trypsine peuvent être facilement déterminées par l'homme du métier, au vu des nombreuses publications scientifiques décrivant l'utilisation de trypsine pour détacher des 25 cellules adhérentes en culture, à partir d'un support de culture, par exemple à partir de la surface d'une boîte de Pétri ou à partir des puits de microplaques pour culture cellulaire. Avantageusement, on utilise une solution tampon contenant une concentration finale de 0,25% de trypsine. Avantageusement, la trypsine est ajoutée à un milieu permettant de conserver une bonne viabilité des cellules épithéliales, ou à tout le moins une bonne intégrité physique de ces cellules, comme par exemple un milieu de Hank's, en l'absence de calcium ou de magnésium. L'efficacité de la séparation des cellules épithéliales des autres 35 constituants de l'urine avec le procédé selon l'invention peut être encore améliorée en réalisant un cycle additionnel de séparation comprenant une seconde étape de microfiltration des cellules du rétentat issu de la première étape de microfiltration, afin d'éliminer de manière plus complète les différents autres constituants indésirables. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, ledit procédé comprend les étapes additionnelles suivantes: c) microfiltration d'une suspension des cellules obtenues à l'étape b) du procédé sur une membrane filtrante ayant un diamètre moyen de pore de 11 pm, afin d'obtenir un rétentat de microfiltration contenant 10 majoritairement des cellules épithéliales; d) récupération des cellules du rétentat de microfiltration par traitement de la membrane filtrante par une solution contenant de la trypsine. Les conditions opératoires du second cycle facultatif de microfiltration définies ci-dessus sont de préférence identiques à celles utilisées pour la 15 première étape de microfiltration puis récupération des cellules du rétentat. On a montré selon l'invention que l'utilisation d'une solution contenant de la trypsine pour récupérer les cellules épithéliales présentes dans le rétentat de microfiltration permet d'atteindre un haut rendement en cellules épithéliales, puisque, lorsque le procédé est réalisé avec une étape de 20 récupération des cellules en l'absence de trypsine, seul de 0% à au maximum 60% des cellules obtenues avec le procédé de l'invention sont récupérées. De plus, le procédé de séparation des cellules épithéliales urinaires de l'invention entraîne une perte cellulaire réduite, laquelle est au plus égale à 25 10% des cellules épithéliales contenues initialement dans les échantillons, pour 60% des échantillons testés. Comme indiqué précédemment, les échantillons urinaires contiennent des cristaux divers, ce qui a été observé dans 21% des échantillons testés. Certains des cristaux présents dans l'urine ont une taille supérieure à 11 Pm 30 et sont donc retenus par la membrane filtrante au cours de l'étape a) de microfiltration. Lorsqu'ils sont présents en grandes quantités, ces cristaux, principalement des cristaux d'urates, peuvent provoquer un colmatage, au moins partiel, de la membrane filtrante, de nature à réduire considérablement les caractéristiques de séparation de l'étape de microfiltration. Ce problème 35 technique peut être surmonté en réalisant l'étape a) de microfiltration en présence d'une solution tampon susceptible de dissoudre les cristaux d'urates. De préférence, on alternera, au cours de l'étape a) de microfiltration, le passage de l'échantillon d'urine et le passage de ladite solution tampon, afin de dissoudre périodiquement les cristaux d'urates 5 susceptibles d'être retenus à la surface de la membrane filtrante, afin d'en éviter le colmatage. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier du procédé ci-dessus, ledit procédé est caractérisé en ce que l'étape a) de microfiltration comprend un ou plusieurs cycles de microfiltration puis lavage du rétentat, chaque cycle 10 comprenant les étapes suivantes: ai) microfiltration d'un échantillon d'urine sur une membrane filtrante ayant un diamètre moyen de pore de 11 pm, a2) lavage du rétentat obtenu à l'étape ai) par addition d'une solution tampon susceptible de dissoudre les cristaux d'urates éventuellement 15 présents dans le rétentat de microfiltration. Avantageusement, pour dissoudre les cristaux d'urates, on utilise une solution de tampon TBS (25 mM Tris, 140 mM NaCI, 3 mM KCI, pH 7,4). Le nombre de cycles d'étapes ai) de microfiltration puis d'étape a2) de lavage du rétentat est variable. Le nombre de cycles est ajusté en 20 fonction de la quantité et de la taille des cristaux retenus à la surface de la membrane filtration, ainsi que du volume de l'échantillon d'urine à microfiltrer. En général, le nombre de cycles d'étape ai) de microfiltration puis a2) de lavage est de préférence de 1 à 10 et de manière tout à fait préférée de 1 à 5. Plus le nombre de cycles est élevé, plus le risque de perte des cellules 25 est important. De manière tout à fait préférée, la membrane filtrante est choisie dans un matériau qui ne favorise pas l'adhérence des cellules à sa surface. Une membrane filtrante préférée selon l'invention est un filtre de Nylon d'une taille de pore de 1i1 pm, tels que les filtres de Nylon d'une taille de pore de 1i1 pm 30 commercialisés par la Société Millipore. De préférence, l'étape a) de microfiltration est réalisée par aspiration du filtrat. Le demandeur a en effet observé que la réalisation de l'étape a) de microfiltration par centrifugation conduisait à des résultats médiocres. En 35 particulier, lorsque l'échantillon d'urine de départ contient des cristaux d'urates susceptibles d'être retenus par la membrane filtrante, un colmatage du filtre est observé, sans possibilité de dissoudre lesdits cristaux d'urates en cours de centrifugation. Avantageusement, l'aspiration du filtrat au cours de l'étape a) de 5 microfiltration est réalisée à l'aide d'un dispositif classique de trompe à vide. Toutefois, tout autre dispositif visant à créer une dépression du côté de la membrane filtrante o est recueilli le filtrat de microfiltration peut également être utilisé. La combinaison des caractéristiques techniques du procédé de 10 séparation selon l'invention le rend particulièrement apte à être intégré dans un procédé dans lequel est recherchée l'obtention d'une quantité suffisante d'ADN de cellules épithéliales, par exemple en vue de réaliser des tests génétiques, tout en minimisant la présence simultanée d'ADN contaminant bactérien ou fongique ou encore d'ADN contaminant provenant d'autres 15 cellules nucléées présentes initialement dans les échantillons d'urine, principalement de l'ADN contaminant provenant des leucocytes. En effet, la grande sélectivité du procédé de séparation selon l'invention pour les cellules épithéliales, avec élimination d'une grande partie, et dans certains cas de la totalité, des leucocytes initialement présents dans 20 les échantillons, rend possible la préparation de suspensions cellulaires contenant une proportion réduite d'ADN humain provenant d'autres cellules que les cellules épithéliales. De même, la majorité, et le plus souvent la totalité, des microorganismes bactériens ou fongiques éventuellement présents dans 25 certains échantillons urinaires sont éliminés dans le filtrat de microfiltration. En outre, de nombreux facteurs inhibiteurs des diverses réactions nécessaires à la réalisation de tests génétiques, telle que l'amplification PCR, sont également éliminés dans le filtrat de microfiltration. Il s'agit notamment des hématies, le cas échéant des spermatozodes, des 30 microorganismes et des divers cristaux présents initialement dans l'urine. Enfin, le maintien de l'intégrité des cellules épithéliales séparées selon le procédé de l'invention permet la récupération d'une quantité maximale d'ADN originaire des cellules épithéliales, et ceci de manière contrôlée, c'està-dire exclusivement après la réalisation d'une étape additionnelle de lyse 35 des cellules. Un tel résultat ne pourrait pas être atteint avec un procédé dans lequel l'étape de lyse des cellules serait réalisée in situ, c'est-à-dire à même la membrane filtrante, sans l'étape b) préalable de récupération des cellules à l'aide de la trypsine, du fait de la perte inévitable d'une grande partie de l'ADN contenu initialement dans les cellules retenues à la surface de la membrane filtrante. En conséquence, un autre objet de l'invention est un procédé à haut rendement d'extraction de l'ADN contenu dans les cellules épithéliales présentes dans un échantillon d'urine humaine ou animale, comprenant les étapes suivantes: a) séparation des cellules épithéliales des autres constituants de l'urine par mise en oeuvre du procédé de séparation tel que défini ci-dessus; b) lyse des cellules séparées à l'étape a), puis extraction de l'ADN libéré à partir des cellules lysées. L'étape b) de lyse des cellules séparées, puis d'extraction de l'ADN 15 peut être réalisée par l'homme du métier par toute technique conventionnelle. Notamment, l'étape de lyse est réalisée avec une solution tampon de lyse classique, puis extraction de l'ADN, par exemple dans un volume adapté d'éthanol absolu. L'homme du métier pourra avantageusement se référer 20 pour la mise en oeuvre de l'étape b) du procédé ci-dessus, à l'article de VAN DER HEL et al. (2002), précité. Les résultats expérimentaux présentés dans les exemples montrent les avantages techniques conférés par la mise en oeuvre du procédé de séparation des cellules épithéliales urinaires de l'invention en tant qu'étape 25 préalable à une utilisation de l'ADN provenant des cellules épithéliales dans une analyse génétique d'allélotypage de patients. La sélectivité et la spécificité de l'étape d'allélotypage sont accrues, par rapport à celles des procédés connus, du fait de la grande qualité d'ADN de départ, qui est essentiellement constitué d'ADN originaire des cellules épithéliales et qui 30 contient une proportion réduite d'ADN contaminant indésirable, et du fait que l'ADN de départ contient une quantité réduite d'inhibiteurs de la réaction d'amplification PCR qui sont contenus initialement dans les échantillons d'urine. De plus, dans la plupart des essais, le procédé de l'invention permet l'obtention d'une grande quantité d'ADN de départ, ce qui est également de nature à accroître la sélectivité et la spécificité de l'étape d'allélotypage, par rapport aux procédés antérieurs. Selon encore un autre aspect, l'invention est relative à un procédé d'allélotypage d'un ADN contenu dans les cellules épithéliales présentes 5 dans un échantillon d'urine humaine ou animale, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) extraction de l'ADN contenu dans lesdites cellules épithéliales selon le procédé d'extraction tel que défini ci-dessus; b) utilisation de l'ADN extrait à l'étape a) dans un test d'allélotypage 10 d'ADN. L'étape b) peut comprendre les étapes suivantes: bl) Amplification de l'ADN extrait à l'étape a) à l'aide d'au moins une amorce nucléotidique hybridant spécifiquement avec un fragment d'ADN génomique contenant un marqueur génétique polymorphe; b2) caractérisation de l'allèle dudit marqueur génétique polymorphe à partir de l'ADN amplifié à l'étape bl), par exemple par séquençage dudit ADN amplifié. L'étape b) d'utilisation de l'ADN dans un test d'allélotypage peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier. Pour réaliser 20 l'étape b) du procédé, l'homme du métier se référera avantageusement à l'article de SCHNEIDER et al. (2000, Cancer Research, vol.60:4617-4622). L'invention est également relative à un procédé d'analyse des cellules épithéliales contenues dans un échantillon d'urine humaine ou animale, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) séparation des cellules épithéliales des autres constituants de l'urine par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à ; b) analyse des caractéristiques des cellules épithéliales séparées à l'étape a) par un test de diagnostic in vitro cytologique, immunologique, 30 génétique ou par cytométrie de flux. La présente invention est en outré illustrée, sans pour autant être limitée, par la figure et les exemples suivants. Figure unique La figure 1 illustre les résultats d'allélotypage de l'ADN contenu respectivement dans les leucocytes du sang (ligne supérieure), les cellules présentes dans le rétentat de microfiltration (ligne médiane) et les cellules présentes dans le filtrat de microfiltration (ligne inférieure). L'analyse d'allélotypage a été réalisée pour trois marqueurs distincts, respectivement le marqueur TP53, le marqueur D45243 et le marqueur THO décrits dans Schneider et al. (2000, précité). DA représente la valeur du déséquilibre allélique par rapport à un ADN témoin et est calculé comme décrit dans l'article de SCHNEIDER et al. 10 (2000, précité). ò Sur la ligne supérieure sont représentés, pour chacun des marqueurs, les résultats d'allélotypage, obtenus avec de l'ADN témoin extrait à partir des leucocytes circulants du sang. Sur la ligne médiane sont représentés, pour chacun des 15 marqueurs, les résultats d'allélotypage, obtenus avec de l'ADN extrait à partir des cellules contenues dans le rétentat de microfiltration, après mise en oeuvre du procédé de l'invention. Sur la ligne inférieure sont représentés, pour chacun des marqueurs, les résultats d'allélotypage obtenus avec de l'ADN 20 extrait à partir des cellules retrouvées dans le filtrat de microfiltration, après mise en oeuvre du procédé de l'invention. EXEMPLES A. Matériel et méthodes utilisés dans les Exemples 25 A.1. Patients et échantillons La mise au point du procédé de tamisage sélectif des urines, sa faisabilité ainsi que l'impact de la filtration sur le résultat d'un test de détection de cellules tumorales ont été évalués sur des échantillons provenant de 48 patients atteints de tumeur de la vessie et suivis à l'aide du 30 test d'allélotypage (microsatellites). Les patients concernés sont inclus dans le Protocole Hospitalier de Recherche Clinique 1997 (Pr P. OUDET et Pr D. JACQMIN. Tous les patients inclus dans l'étude ont signé un accord de consentement pour participer à celle-ci. Les échantillons d'urines (volume 50 à 150ml) sont reccueillis par miction naturelle et conservés à 40C jusqu'au traitement. Le temps s'écoulant entre la miction et le traitement de l'urine varie de 12 à 48 heures. A.2. Filtration de l'urine Les urines sont directement passées sur un filtre de nylon de pores de 11 pm de diamètre et déposé sur un support de filtration. Le passage de l'urine sur le filtre est facilité par l'utilisation d'une trompe à vide. Après le passage de l'urine, le filtre est rincé avec 5ml de PBS (tampon Phosphate). Le filtrat est récupéré dans des tubes qui sont centrifugés. Les culots 10 résultants sont conservés à -20'C après examen microscopique des éléments présents dans les filtrats. A.3. récupération des cellules urotheliales presentes sur le filtre: Le filtre est récupéré et lavé pendant 5 mn dans 20ml de 15 PBS/Trypsine. L'action de la trypsine est arrêtée par l'addition de 20ml de PBS (effet de dilution). Le filtre est alors retiré de cette solution de lavage et les cellules ainsi détachées et en suspension dans la solution de lavage sont centrifugées. Dix plI du culot cellulaire sont prélevés pour observation au microscope. Le reste du culot est congelé à -80'C. 20 A.4. Procedure de filtration en cas de presence d'urates: Lorsque les urines contiennent des cristaux d'urates (visibles à l'oeil nu, cristaux de couleur rose en quantité très importante; risquant de colmater le filtre), l'urine est filtrée par petits volumes en alternance avec du 25 TBS (tampon Tris Borate qui a la propriété de dissolution des urates). A.5. Test d'allélotypage: L'ADN des cellules filtrées à partir des urines est extrait, en même temps que l'ADN provenant des leucocytes sanguins et qui constitue 30 l'échantillon témoin pour le test d'allélotypage. Le testd'allélotypage est décrit dans l'étude Schneider et al. L'ADN a été extrait à partir des échantillons sanguins et urinaires d'un même patient. L'urine a préalablement été filtrée. L'ADN des cellules sur le filtre et des cellules dans le filtrat a été extrait. Des PCR ont été réalisées à 35 l'aide de 3 marqueurs différents en utilisant comme matrice les ADN extraits à partir des leucocytes du sang (ADN témoin, ligne du haut), des cellules récupérées sur le filtre (ligne du milieu) et des cellules dans le filtrat (ligne du bas). Les 2 pics correspondant aux 2 allèles sont notés par leur hauteur relative. Le déséquilibre allélique (DA) est calculé par rapport à l'ADN témoin (Schneider et ai). B. Résultats Exemple 1: Evaluation de la perte de cellules épithéliales La technique de filtration à l'étude est basée sur l'utilisation d'un filtre 10 de nylon dont le maillage est de 11 pm. Cette taille de pores permet la rétention d'éléments dont la taille excède 11 pm et l'élimination d'éléments de taille inférieure à 11 pm. Cette filtration différentielle doit aboutir en l'occurrence à la séparation des cellules épithéliales, dont le diamètre est supérieur généralement à 20p.m, des leucocytes qui présentent une taille 15 d'environ 10pm. Le filtre est placé sur un support à filtration sur lequel est branché une trompe à vide ce qui permet d'appliquer une force entraînant l'urine et les éléments à éliminer. Du fait de l'application de cette force, certaines cellules passent tout de même dans les pores ou sont plaquées fortement sur le filtre, ce qui génère des pertes. 1.1 Optimisation de la récupération des cellules adhérentes au filtre après filtration: Des tests préliminaires avaient montré qu'après filtration, un pourcentage important de cellules adhèrent au filtre. Un lavage du filtre à 25 l'aide de trypsine permet une restitution importante des cellules après filtration. L'action de la trypsine a été évaluée grâce à l'expérience suivante: après la filtration d'urines, nous avons coupé le filtre en deux. Une moitié a été lavée dans la trypsine, les cellules sont récupérées par centrifugation puis comptées. L'autre moitié a été lavée dans du PBS (cellules centrifugées 30 et comptées). Les résultats de l'analyse du taux de récupération des cellules à la fin du procédé sont présentés dans le Tableau 1 ci-dessous. Tableau 1: Evaluation de la restitution des cellules grâce à la trvpsine moitié du % de cellules moitié du filtre filtre restituées lavée à la en l'absence de trypsine lavée au PBS trypsine Patient 1 70000 cellules 5000 7% Patient 2 60000 15000 25% Patient 3 500 0 0% Patient 4 50000 30000 60% La variabilité observée dans cette expérience est liée au profil cellulaire des urines, très différent d'un patient à l'autre: les facteurs pouvant contribuer à cette variabilité sont le nombre initial de cellules, la taille des cellules, leur état, la présence d'agrégats, etc. Dans tous les cas de figure, le lavage du 10 filtre à l'aide de trypsine permet une restitution importante du matériel. 1.2 Evaluation de la perte de cellules par passage au travers du filtre Après filtration, nous évaluons la proportion de cellules perdues dans le filtrat. Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous. 2844524 15 Tableau 2: Evaluation de la perte de cellules Pertes Nombre d'échantillons observées concernés % ou moins 29/48 (60%) % 9/48 (19%) % 9/48 (19%) plus de 50% 1/48 (2%) Exemple 2: Influence de la filtration sur le rendement d'extraction d'ADN Des pertes d'ADN peuvent être observées suite aux pertes de cellules décrites ci-dessus. Après filtration, les cellules sont centrifugées et l'ADN est 10 extrait et quantifié. Sur les 48 échantillons d'urines, 3 ont été écartés de l'étude pour ADN insuffisant. La quantité trop faible d'ADN était due dans ces 3 cas à un nombre initial de cellules très faible et non à une perte de cellules pendant la filtration. Exemple 3: Influence de la filtration sur la qualité de l'ADN La filtration des urines permet l'élimination d'un milieu de composition chimique très variable d'un patient à l'autre et chargé d'inhibiteurs potentiels de PCR. Des éléments tels que les érythrocytes, les germes, des cristaux de différente nature, des spermatozodes sont également éliminés très 20 efficacement. Ces molécules ou éléments autre que les cellules épithéliales, s'ils ne sont pas éliminés peuvent aussi modifier la quantification de l'ADN. Exemple 4: Elimination des leucocytes et impact sur le résultat de l'amplification par PCR réalisée au cours d'une analyse d'allélotypage 25 sur de l'ADN de cellules épithéliales provenant d'échantillons d'urine humaine. La présence d'un nombre significatif de leucocytes dans les urines, suite à des situations inflammatoires ou des infections aboutit à une baisse de sensibilité du test d'allélotypage. En effet, leur ADN n'étant pas remanié, ils sont susceptibles de négativer le signal de perte allélique (puisque le déséquilibre allélique observé est la résultante d'une population de cellules). Le maillage de Il pm permet l'élimination sélective des leucocytes, étant donné leur taille inférieure à 11 pm. Parmi les 48 échantillons testés, 35 c'est à dire 73% contenaient des leucocytes. Le rapport final après filtration entre cellules épithéliales et leucocytes a été évalué: - pour 28/35 (80%) des culots cellulaires, la totalité des leucocytes a été 10 éliminée. - pour 3/35 (8,5%) des culots cellulaires, un rapport leucocytes/cellules épithéliales de 25% a été observé. - pour 4/35 (11,5%) des culots cellulaires, un rapport leucocytes/cellules épithéliales de 50% a été observé. Si l'on considère l'élimination des leucocytes par rapport au nombre de leucocytes initialement présents dans l'urine, les efficacités suivantes sont observées: - nombre d'urines dans lesquels il reste moins de 10% des leucocytes initiaux: 33/37 (89%) - nombre d'urines dans lesquels il reste 25% des leucocytes initiaux: 2/37 (5,5%) - nombre d'urines dans lesquels il reste 50% des leucocytes initiaux: 2/37 (5,5%). Dans le cas o les urines sont suffisamment riches en cellules 25 épithéliales, il est possible de procéder à une seconde filtration si l'élimination des leucocytes n'est pas suffisante. Dans ce cas, la seconde filtration permet l'élimination totale des leucocytes. L'élimination des leucocytes de l'urine est primordiale pour la sensibilité du test (voir protocole). La filtration permet donc d'éliminer des 30 cellules dont le génome n'est pas remanié et qui aurait pour effet de "diluer" le signal de déséquilibre allélique donné par les cellules tumorales. Pour évaluer ce point, nous avons extrait l'ADN des cellules retenues par le filtre (potentiellement tumorales) ainsi que l'ADN des cellules éliminées par la filtration. Les remaniements ont été évalués par PCR. Les résultats sont 35 présentés sur la Figure 1, ainsi que dans le Tableau 3 ci-dessous. TABLEAU 3: Analyse des déséquilibres alléliques détectées dans les cellules retenues sur le filtre en comparaison avec les cellules présentes dans le filtrat % DA cellules % DA cellules Composition du filtrat retenues retenues sur le filtre dans filtrat (proportion C. épithéliales /leucocytes) Patient A D4S243** 15 12,2 > 90% de leucocytes ACTBP2* 50 18 MJD52** 7 4,5 Patient B MJD52** 3 16 30% de leucocytes THO* 26 6,9 70% d'épithéliales D17S654* 23 13,5 Patient C THO* 26 9,7 > 90% de leucocytes ACTBP2** 11,4 13,5 TP53* 27 9 Patient D D9S171** 10,7 7,5 > 90% de leucocytes IFNA** 18 8 D17S654* 26 30 TP53** 14,2 5,7 Patient E D4S243* 27 4 > 90% de leucocytes ACTBP2* 29 5 D9S162* 34 8 D9S747* 29 12,5 MJD52* 21 1,4 PatientF D9S171** 13 2 >90% deleucocytes TP53* 20 9 D17S654** 3,8 3 * Valeurs de DA considérées comme significatives. ** marqueurs non remaniés, utilisés comme contrôles (but: montrer que la filtration d'induit pas de signal faussement positif dans le filtrat). Comme le montre les résultats de la Figure 1, la filtration a permis de retenir spécifiquement sur le filtre des cellules épithéliales, dont le génome est remanié (déséquilibre allélique de 27, 29, et 34% pour les marqueurs 1, 2 et 3, respectivement). Dans le filtrat, les déséquilibres sont nettement diminués (4, 5 et 8%). Nous avons évalué cette sélectivité de filtration dans 15 les échantillons de 6 patients dont les urines contenaient des leucocytes (Tableau 3). Dans la plupart des cas, les déséquilibres alléliques sont nettement plus faibles dans le filtrat par rapport au filtre, indiquant que la procédure mise au point conduit à une augmentation nette de la sensibilité du test. Des exceptions sont retrouvées dans le cas du patient B (marqueurs MJDJ2), et du patient D (marqueur D17S564). Pour le patient B, les 5 déséquilibres retrouvés dans le filtrat sont expliqués par le fait qu'un nombre significatif de cellules épithéliales ont été perdues lors de la filtration (voir composition du filtrat, Tableau 3). Ce phénomène n'est visible que pour certains marqueurs, indiquant certainement la perte sélective de certaines cellules épithéliales, perte néanmoins contre-balancée par le nombre de 10 marqueurs testés. L'étude sur des marqueurs non remaniés (**) montre qu'il n'y a pas induction de signal faussement positif lié à la filtration. Exemple 5: Adaptabilité de la technique à des urines de composition très diverses et ajustement de la procédure en cas de présence de 15 cristaux d'urates. La composition des urines est extrêmement variable d'un patient à l'autre. Les composants majeurs en plus des cellules épithéliales et des leucocytes sont: - des hématies, présentes dans 26/48 (54%) des échantillons, 20 des germes, présents dans 14/48 (30%) des échantillons, - des filaments ou du mucus dans 11/48 (23%) des échantillons, - des cristaux de différentes natures, dans 10/48 (21 %) des échantillons. La filtration permet l'élimination efficace des hématies, des germes et de la plupart de cristaux. Lorsque des cristaux d'urates sont présents lesquels, par 25 conséquent, colmatent le filtre et empêchent le passage des urines, une procédure particulière est mise en place du fait de leur abondance élevée et. Dans ce cas, les urines sont filtrées en présence de tampon TBS, qui a pour propriété de dissoudre les cristaux d'urates. En présence d'une quantité significative de mucus ou de filaments, la 30 filtration est un peu plus lente et peut être à l'origine d'une mauvaise efficacité d'élimination des leucocytes (observée dans 2 échantillons sur 48). REVENDICATIONS 1. Procédé de séparation des cellules épithéliales à partir d'un échantillon d'urine humaine ou animale contenant ces cellules, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) microfiltration de l'échantillon d'urine sur une membrane filtrante ayant un diamètre moyen de pore de Il pm, afin d'obtenir un rétentat de microfiltration contenant majoritairement des cellules épithéliales, b) récupération des cellules du rétentat de microfiltration, par traitement de 10 la membrane filtrante par une solution contenant de la trypsine. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes additionnelles suivantes: c) microfiltration d'une suspension des cellules obtenues à l'étape b) du 15 procédé sur une membrane filtrante ayant un diamètre moyen de pore de 1i1 pm, afin d'obtenir un rétentat de microfiltration contenant majoritairement des cellules épithéliales; d) récupération des cellules du rétentat de microfiltration par traitement de la membrane filtrante par une solution contenant de la trypsine. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'étape a) de microfiltration comprend un ou plusieurs cycles de microfiltration puis lavage du rétentat, chaque cycle comprenant les étapes suivantes: ai) microfiltration d'un échantillon d'urine sur une membrane filtrante 25 ayant un diamètre moyen de pore de 11 pm, a2) lavage du rétentat obtenu à l'étape ai) par addition d'une solution tampon susceptible de dissoudre les cristaux d'urates éventuellement présents dans le rétentat de microfiltration. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la membrane filtrante est un filtre de nylon. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape a) de microfiltration est réalisée par aspiration du filtrat. 35 6. Procédé à haut rendement d'extraction de l'ADN contenu dans les cellules épithéliales présentes dans un échantillon d'urine humaine ou animale, comprenant les étapes suivantes: a) séparation des cellules épithéliales des autres constituants de l'urine par mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 5, b) lyse des cellules séparées à l'étape a), puis extraction de l'ADN libéré à partir des cellules lysées. 7. Procédé d'allélotypage d'un ADN contenu dans les cellules épithéliales 10 présentes dans un échantillon d'urine humaine ou animale, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) extraction de l'ADN contenu dans lesdites cellules épithéliales selon le procédé de la revendication 6, b) utilisation de l'ADN extrait à l'étape a) dans un test d'allélotypage 15 d'ADN. 8. Procédé d'analyse des cellules épithéliales contenues dans un échantillon d'urine humaine ou animale caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) séparation des cellules épithéliales des autres constituants de l'urine par mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 5; b) analyse des caractéristiques des cellules épithéliales séparées à l'étape a) par un test diagnostic in vitro cytologique, immunologique, génétique ou par cytométrie de flux.