Brevet FR2844598A1 — publié le 20040319

METHODE DE DIAGNOSTIC D'UN RHABDOMYOSARCOME ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES POUR LE TRAITEMENT ET/OU LA PREVENTION D'UN RHABDOMYOSARCOME La présente invention concerne un marqueur spécifique des cellules issues de rhabdomyosarcome embryonnaire (RMSe) et de rhabdomyosarcome alvéolaire (RMSa) ainsi que des méthodes et des compositions pharmaceutiques mettant en #uvre ce marqueur dans le diagnostic, le traitement et/ou la prévention de ces pathologies. Le rhabdomyosarcome est une tumeur des parties molles à différenciation musculaire striée, peu fréquente (son incidence est estimée à 1/125000) et qui concerne principalement des enfants puisque, dans 70% des cas, les rhabdomyosarcomes (RMS) surviennent lors de la première décennie. Ces tumeurs sont la conséquence d'une perturbation dans la croissance ou la différenciation des cellules d'origine musculaire au cours du développement. La localisation primitive est variable (tête et cou, tractus urogénital, membres, tronc). Il s'agit d'une pathologie à forte évolution métastatique (métastases pulmonaires, osseuses et médullaires) puisque 15 à 30% des patients présentent déjà des métastases à la première consultation. Deux types majeurs histologiquement différents de RMS sont décrits. Le rhabdomyosarcome embryonnaire (RMSe) qui représente les 2/3 de ces pathologies et concerne les sujets jeunes et le rhabdomyosarcome alvéolaire (RMSa) concernant les sujets plus âgés. Des critères cytogénétiques différents sont retrouvés dans ces deux types de RMS. En particulier, les RMSe présentent une perte de l'hétérozygotie du locus 11p15, région contenant de nombreux gènes impliqués dans l'oncogenèse. Dans la majorité des RMSa, il existe une translocation réciproque 2-13 ou 1-3 conduisant à l'apparition d'une protéine chimérique Pax3-FKHR ou Pax7-FKHR ayant une activité transcriptionelle accrue. D'autres altérations génétiques ont été rapportées dans les rhabdomyosarcomes comme des mutations du gène p53, des gènes H- et N-ras ainsi que des amplifications des gènes N-myc et c-MET (Merlino et Helman, 1999, Oncogene, vol. 18, pages 5340-5348 ; et al., 1998, Bull Cancer, vol. 85, pages 1015-1042 ; Womerand Pressey, 2000, Curr. Opin. Oncol., vol. 12 pages 337-344). L'état de la technique connaît des méthodes d'identification des RMSa décrites dans le brevet US 5,605,278 basées sur la présence d'un transcrit de fusion spécifique d'une translocation, ce transcrit correspondant à un marqueur spécifique des RMSa. Le diagnostic positif d'un RMSe, quant à lui, est actuellement basé sur une étude anatomo-pathologique et immunohistochimique lourde combinant l'utilisation de différents anticorps. A ce jour, aucun marqueur spécifique des RMSe n'a été décrit dans l'état de la technique. La stratégie thérapeutique appliquée aux RMSe et aux RMSa dépend de la localisation de la tumeur et de l'existence ou non de métastases. L'identification d'un marqueur spécifique d'un RMS présente donc un intérêt majeur à la fois dans le domaine du diagnostic et du traitement de ces pathologies. Par marqueur spécifique d'un RMS , on entend une substance ou un composé qui permet de distinguer un RMSe ou un RMSa d'autres pathologies et notamment des ostéosarcomes et des tumeurs de Ewings. La R-cadhérine appartient à une superfamille de glycoprotéines transmembranaires réalisant des interactions cellule-cellule homophiliques dépendantes du calcium que sont les cadhérines. La partie extracellulaire des cadhérines est composée de cinq domaines (EC) homologues d'environ 110 acides aminés. La partie cytoplasmique, très conservée, interagit avec différentes protéines cytoplasmiques dont les caténines (a-, p-, y- et pl20 caténines), elles-mêmes reliées aux filaments d'actine (voir figure 1) (Kemler, 1993, Trends Genet., vol. 9, pages 317-321). Les cadhérines réalisent ainsi, au niveau des sites d'adhésion, des ponts transmembranaires entre le cytosquelette de deux cellules voisines. Néanmoins, ces structures ne sont pas figées car elles sont en perpétuel remodelage. De plus, l'établissement des contacts intercellulaires conduit à la mise en place d'une signalisation intracellulaire permettant une réponse cellulaire adaptée, en terme de régulation de la croissance et du cycle cellulaire, de migration, de forme ou de différenciation (Fukata et Kaibuchi, 2001, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., vol. 2, pages 887-897). Les cellules musculaires squelettiques expriment les cadhérines N, R, M et 11 à différents moments du développement embryonnaire. La N-cadhérine est exprimée tout au long du développement musculaire squelettique et est requise à différentes étapes de ce processus (Charrasse et al., 2002, J. Cell Biol., vol. 158, pages 953-965 ; George et al., 1997, Dev. Biol., vol. 185, pages 14-24 ; Knudsen, 1990, Curr. Opin. Cell Biol., vol. 2, pages 902- 906 ; Knudsen et al., 1990, Exp. Cell Res., vol. 188, pages 175-184 ; Linask et al., 1998, Dev. Biol., vol. 202, pages 85-102). La M-cadhérine est exprimée plus tardivement et participerait à la fusion des myoblastes en myotubes, précurseurs de la fibre musculaire (Zeschnigk et al., 1995, J. Cell Sci., vol. 108, pages 2973-2981). La R-cadhérine et la cadhérine-11 sont exprimées au cours des étapes précoces du développement musculaire (Inuzuka et al., 1991, Development, vol. 113, pages 959-967 ; Kimura et al., 1995, Dev. Biol., vol. 169, pages 347-358 ; et al., 1997, Dev. Biol., vol. 187, pages 55-70). Ces deux cadhérines ne sont plus exprimées après la formation des myotubes. En effet, les différentes études publiées montrent une expression de la R-cadhérine au cours du développement uniquement sauf pour le cerveau où cette protéine a été retrouvée chez l'adulte (Inuzuka et al., 1991, Neuron, vol. 7, pages 69-79 ; Mutsunami et Takeichi, 1995, Dev. Biol., vol. 172, pages 466-478 ; et al., 1997, Histochem. Cell. Biol., vol. 108, pages 35-43 ; Stoykova et al., 1997, Development, vol. 124, pages 3765- 3777 ; Ganzler et Redies, 1995, J. Neurosci., vol. 15, pages 4157-4172 ; et al., 2001, Neuroscience, vol. 106, pages 505-533 ; et al., 2001, Anat. Embryol., vol. 204, pages 485-491 ; Gerhardt et al., 2000, Glia, vol. 31, pages 131-143 ; Inoue et al., 2001, Development, vol. 128, pages 561-569 ; et al., 2001, J. Neurobiol., vol. 15, pages 255-264). En outre, l'expression de la R-cadhérine dans le muscle strié, le rein et le pancréas n'a été décrite qu'au cours du développement (Rosenberg et al., 1997, Dev. Biol., vol. 187, pages 55-70 ; et al., 1998, J. Am. Soc. Nephrol., vol. 9, pages 1234-1241 ; et al., 2002, Mol. Cell. Biol., vol. 22, pages 1474-1487 ; Sjodin et al., 1995, Exp. Cell Res., vol. 221, pages 413-425). La formation et la déformation des jonctions adhérentes cadhérines-dépendantes intervient à différentes étapes du développement d'un organisme (transition épithélium-mésenchyme) ainsi qu'au cours des mécanismes de transformation cellulaire et plus particulièrement lors de la perte d'inhibition de contact et de la formation de métastases. Une des particularités du rhabdomyosarcome réside dans sa forte agressivité. En effet, 15 à 30% des patients présentent des métastases lors du premier examen. La Demanderesse a donc recherché le profil d'expression des cadhérines N, R, M et 11 dans différentes lignées de rhabdomyosarcomes. Ces travaux ont permis à la Demanderesse de mettre en évidence, de façon surprenante, l'expression de la protéine R-cadhérine spécifiquement dans les lignées de RMSe. Cependant, afin de confirmer ces résultats, une étude similaire à celle sur les lignées de RMS a été réalisée sur des biopsies de RMS. Les résultats obtenus montrent que la R-cadhérine est présente aussi bien dans les RMSe que dans les RMSa. Les lignées initialement utilisées ont dû perdre l'expression de la R-cadhérine lors de leur mise en culture ou au cours des passages successifs. Les résultats obtenus sur les biopsies sont plus fiables et plus probants que ceux obtenus sur lignées cellulaires, les biopsies étant plus proches du in vivo que les lignées. La présente invention fournit donc, pour la première fois, un marqueur spécifique des RMS qu'est la Rcadhérine. La présente invention concerne une méthode de diagnostic d'un rhabdomyosarcome à partir d'un échantillon d'un individu consistant à mettre en évidence, in vitro, l'expression de la R-cadhérine dans ledit échantillon. On entend, dans le cadre de l'invention, par individu , un homme, une femme ou un animal, jeunes ou adultes, sains ou susceptibles d'être atteints ou atteints d'un rhabdomyosarcome embryonnaire ou d'un rhabdomyosarcome alvéolaire ou de toute autre pathologie. Avantageusement, la méthode de diagnostic d'un rhabdomyosarcome objet de la présente invention consiste à mettre en contact in vitro un échantillon d'un individu, après un éventuel traitement, avec un moyen pour détecter et/ou mesurer la R-cadhérine exprimée. Les rhabdomyosarcomes embryonnaire ou alvéolaire affectant les parties molles à différenciation musculaire striée, l'échantillon d'un individu susceptible d'être utilisé dans le cadre de l'invention peut être une cellule, un ensemble de cellules ou un tissu extraits à partir d'un individu. Plus particulièrement, le tissu extrait peut être un tissu suspecté pour porter la pathologie et, à titre d'exemple et de façon non exhaustive, un muscle strié. La (ou les) cellule(s) et le tissu peuvent être mis en culture avant que l'on ne détermine le niveau d'expression de la Rcadhérine dans ces derniers. Les éventuels traitements que peut subir l' échantillon avant la détection de l' expression de la Rcadhérine sont, par exemple, les traitements visant à extraire dudit échantillon les ARN messagers et/ou les protéines et ce, afin que la détection de l'expression de la R-cadhérine soit effectuée sur ces ARN messagers ou protéines extraites. La détermination de l'expression de la Rcadhérine peut être mise en #uvre par différentes techniques connues de l'homme du métier. Dans une première forme de mise en #uvre de l'invention, l'expression de la R-cadhérine pourra être détectée via la mise en évidence de l'ARN messager de la R- cadhérine. Cet ARN messager pourra être mis en évidence à l'aide des techniques de cytogénétique moléculaire (RT-PCR) en utilisant des amorces capables d'amplifier spécifiquement la R-cadhérine. De façon avantageuse, les amorces capables d'amplifier spécifiquement la R-cadhérine sont les suivantes : - amorce sens 5'-CCGACCAGCCCCCCATGGAG-3' (SEQ ID No : 1 dans la liste de séquences en annexe) et - amorce antisens 5'-CCTGGCTTGGAGCCCTCGTCC-3' (SEQ ID No : 2 dans la liste de séquences en annexe). De façon alternative, la mise en évidence de l'ARN messager de la R-cadhérine peut être réalisée grâce à une sonde spécifique de cet ARN messager. Plus particulièrement, cette sonde spécifique de l'ARN messager de la R-cadhérine peut être un ARN ou un ADN simple brin capable de s'hybrider sous fortes conditions de stringence avec l'ARN messager de la R-cadhérine. L'homme du métier connaît différentes techniques afin de mettre en évidence la structure double-brin résultant de cette hybridation, comme, à titre d'exemple et de façon non exhaustive, en utilisant une sonde spécifique de l'ARN messager de la Rcadhérine marquée. Dans une seconde forme de mise en #uvre de l'invention, l'expression de la R-cadhérine pourra être détectée via la mise en évidence de la protéine correspondant à la R-cadhérine. Cette mise en évidence pourra se faire au moyen d'anticorps spécifiques de cette protéine, par exemple, par la technique de Western Blot . On peut également envisager de mettre en évidence l'expression de la R-cadhérine sur l'échantillon cellulaire ou tissulaire issu d'un individu par une technique immunohistochimique simple mettant en #uvre un anticorps dirigé contre la R-cadhérine. Cette mise en #uvre ne nécessite aucun traitement préalable dudit échantillon tel que ceux définis ci-dessus. Dans le cadre de la présente invention, on entend par méthode de diagnostic d'un rhabdomyosarcome aussi bien une méthode de diagnostic du rhabdomyosarcome embryonnaire qu'une méthode de diagnostic du rhabdomyosarcome alvéolaire. La présente invention envisage également l'utilisation du marqueur spécifique d'un rhabdomyosarcome pour cibler in vivo les foyers tumoraux de RMSe et/ou de RMSa (tumeur initiale et éventuelles métastases). La méthode de ciblage in vivo des foyers tumoraux consiste à administrer à un individu au moins un anticorps dirigé contre le domaine extracellulaire de la R-cadhérine radiomarqué (radio-immunociblage) ou photomarqué (immunophotomarquage). Un tel anticorps est capable de cibler les régions exprimant la R-cadhérine. Ces différentes formes de mise en #uvre de l'invention ne sont données qu'à titre d'exemple et de façon non exhaustive. L'homme du métier sera capable d'utiliser, dans le cadre de la présente invention, toute technique permettant de mettre en évidence l'expression d'une protéine particulière ou la présence d'ARN messagers particuliers et ce, de façon spécifique. L'invention concerne aussi un kit de diagnostic d'un rhabdomyosarcome embryonnaire et/ou alvéolaire caractérisé en ce qu'il comprend au moins un moyen pour détecter l'expression de la R-cadhérine. De façon avantageuse, ce moyen est choisi parmi le groupe constitué par un anticorps spécifique de la R-cadhérine, des amorces pour la RT-PCR capables d'amplifier spécifiquement la Rcadhérine, le couple d'amorces suivant : amorce sens 5'CCGACCAGCCCCCCATGGAG-3' et amorce antisens 5'CCTGGCTTGGAGCCCTCGTCC-3' (respectivement SEQ ID No : 1 et No : 2 dans la liste de séquences en annexe) et une sonde capable de s'hybrider spécifiquement à l'ARN messager de la R-cadhérine. De plus, l'identification d'un marqueur spécifique d'un rhabdomyosarcome permet également d'envisager son utilisation dans une méthode de traitement spécifique et ciblée du rhabdomyosarcome embryonnaire et/ou du rhabdomyosarcome alvéolaire. Ainsi, la présente invention envisage une composition pharmaceutique pour le traitement d'un rhabdomyosarcome comprenant une molécule active dans le traitement d'un rhabdomyosarcome associée à un vecteur capable d'adresser ladite molécule active aux cellules exprimant la R-cadhérine. Une telle composition pharmaceutique peut, bien entendu, comprendre également un ou plusieurs excipients ou adjuvants appropriés. Le vecteur capable d'adresser la molécule active aux cellules exprimant la R-cadhérine est, de façon préférée, un anticorps dirigé contre le domaine extracellulaire de la R-cadhérine. La présente invention met en #uvre des anticorps dirigés contre la R-cadhérine notamment dans le cadre des méthodes de diagnostic d'un rhabdomyosarcome mettant en évidence la protéine R-cadhérine. Certains des anticorps utilisés dans le cadre de la présente invention doivent être, plus précisément, dirigés contre le domaine extracellulaire de la R-cadhérine, par exemple, dans le cadre des compositions pharmaceutiques utiles pour le traitement du rhabdomyosarcome embryonnaire et/ou du rhabdomyosarcome alvéolaire. L'homme du métier peut utiliser tout anticorps dirigé contre la R-cadhérine connu dans l'état de la technique dans le cadre de la présente invention. De plus, l'homme du métier est également capable de générer de tels anticorps puisqu'il connaît différentes techniques standards lui permettant de produire des anticorps monoclonaux ou polyclonaux qui lient de façon spécifique la R-cadhérine et, plus particulièrement, le domaine extracellulaire de la R-cadhérine. Une molécule active dans le traitement d'un rhabdomyosarcome susceptible d'être utilisée dans la composition thérapeutique objet de la présente invention est choisie parmi les anti-cancéreux, les radioéléments, les colorants fluorescents, les toxines, les ARN antisens et les siARN (pour small interference ARN) spécifiques de la R-cadhérine. Le vecteur capable d'adresser la molécule active aux cellules exprimant la R-cadhérine et la molécule active peuvent être associés l'un à l'autre de façon directe ou indirecte au moyen d'une liaison chimique telle qu'une liaison hydrophobe ou ionique. Comme la R-cadhérine est également exprimée dans le cerveau adulte, l'homme du métier sera particulièrement vigilant au fait que la molécule active dans le traitement d'un rhabdomyosarcome associée à un vecteur capable d'adresser cette molécule active aux cellules exprimant la R-cadhérine ne doit pas être capable de franchir la barrière hémato-encéphalique. La présente invention envisage également une méthode de prévention d'un rhabdomyosarcome visant à empêcher l'expression de la R-cadhérine dans le muscle squelettique. Par conséquent, la présente invention concerne une composition pharmaceutique pour la prévention d'un rhabdomyosarcome comprenant une molécule empêchant l'expression de la R-cadhérine associée à un vecteur capable d'adresser ladite molécule aux cellules musculaires squelettiques. Une telle composition pharmaceutique peut, bien entendu, comprendre également un ou plusieurs excipients ou adjuvants appropriés. Dans le cadre de la présente invention, on entend par molécule empêchant l'expression de la R-cadhérine , toute molécule capable de bloquer ou de diminuer l'expression de la R-cadhérine. Toute molécule capable d'empêcher l'expression de la R-cadhérine est utilisable dans le cadre de la présente invention. A titre d'exemple et de façon non exhaustive, ladite molécule peut être un ARN antisens ou un siARN (pour small interference ARN) spécifique de la R-cadhérine. De plus, tout vecteur capable d'adresser spécifiquement une molécule aux cellules musculaires squelettiques est utilisable dans le cadre de l'invention. Ce vecteur peut être un anticorps spécifique d'une protéine membranaire présente à la surface des cellules musculaires squelettiques. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et qui concernent l'étude de l'expression des cadhérines dans des lignées cellulaires et dans des biopsies et l'étude de la diminution de l'expression de la R-cadhérine dans des lignées cellulaires issues de rhabdomyosarcome. Ces exemples sont donnés à titre illustratif et ne sauraient être interprétés comme limitant la portée de l'invention. Ces exemples font référence : - à la figure 2 qui présente l'étude de l'expression de la R-cadhérine dans différentes cellules par RT-PCR (Figure 2, partie A) et la visualisation et la quantification de l'expression de la protéine R-cadhérine dans différentes cellules (Figure 2, partie B). - à la figure 3 qui présente la quantification de l'expression de la protéine R-cadhérine dans différentes biopsies. - à la figure 4 qui présente l'effet sur la prolifération cellulaire de la diminution de l'expression de la R-cadhérine. Des cellules de la lignée cellulaire RD exprimant le vecteur contrôle pEGFP seul ou avec le vecteur pSUPER exprimant un siARN spécifique de la R-cadhérine sont mises à incuber avec 10 M de bromodéoxyuridine (BrdU) pendant 3 heures avant d'être fixées 4 jours après la transfection. Un marquage de l'ADN et de l'incorporation de BrdU dans les cellules est réalisé. Les valeurs représentent le pourcentage de cellules exprimant la GFP et marquées positivement au BrdU. Les résultats présentés sont représentatifs de deux expériences indépendantes. Exemple 1 : Etude de l'expression des cadhérines dans des lignées cellulaires issues de rhabdomyosarcomes humains. I. Matériel et méthodes. 1.1. Cellules utilisées. Les cellules utilisées comme contrôle sont : - des myoblastes de souris C2C12, - des myoblastes de rat L6, et - des myoblastes humains issus de muscle strié paravertébral (Origine : Banque de tissus pour la recherche, AFM-BTR). Les cellules de RMSe utilisées sont : - la lignée RD (Origine ATCC, CCL-136), - la lignée A-204 (Origine ATCC, HTB-82), - la lignée A-673 (Origine ATCC, CRL-1598), - la lignée CT-10 P8T (Origine T. Triche, Childrens Hospital, Los Angeles, USA), et - la lignée TTC-442 P8T (Origine T. Triche, Childrens Hospital, Los Angeles, USA) Les cellules de RMSa utilisées sont : - la lignée Rh30 (P. Houghton, St. Jude Childrens Hospital, Memphis, USA), - la lignée Rh28 (P. Houghton, St. Jude Childrens Hospital, Memphis, USA), - la lignée JR/C (J. Garvin, Medical University of South Carolina, Charleston, USA). Les lignées épithéliales utilisées sont : - la lignée MCF7 (adénocarcinome de la glande mammaire), - la lignée FT44 (foie tumoral humain isolé en milieu hospitalier), - la lignée Caco-2 (tumeur colorectale), la lignée SW48 (adénocarcinome colorectal, adénome précoce), - la lignée SW480 (adénocarcinome colorectal), et la lignée SW620 (métastase de type nodule lymphoïde issue de la tumeur dont est dérivée la lignée SW480) . 1.2. RT-PCR quantitative. Les ARNs sont extraits par la méthode de Chomczynski and Sacchi (1987, Anal. Biochem., vol. 162, pages 156-159) et leur qualité est contrôlée en gel d'agarose non dénaturant. L'ADNc est obtenu par reverse transcription (Superscript II GIBCO) en utilisant l'oligo dT (Perkin Elmer). La réaction PCR contient 1 l de mélange Master SYBR Green I (Light cycler Roche) (Taq DNA polymerase FastStart, tampon, deoxynucleotide trisphosphate mix, and SYBR Green I dye), 3 mM MgCl2 , 0.5 M de chaque amorce et 2 1 d'ADNc dilué. Les amorces utilisées pour amplifier la R-cadhérine sont : - amorce sens 5'-CCGACCAGCCCCCCATGGAG-3' (SEQ ID No : 1 dans la liste de séquences en annexe) et - amorce antisens 5'-CCTGGCTTGGAGCCCTCGTCC-3' (SEQ ID No : 2 dans la liste de séquences en annexe) . Une courbe standard de concentration est établie par série de dilutions d'ADNc de R-cadhérine. Les données sont normalisées en utilisant la GAPDH comme index du contenu d'ADNc après réverse transcription. Les échantillons sont d'abord dénaturés à 95 C pendant 8 min, puis 45 cycles sont effectués : dénaturation à 95 C pendant 3s, hybridation à 61-62 C pendant 8-10 s, et élongation à 72 C pendant 10-12 s. Le taux de transition de température est de 20 C/s. La fluorescence est mesurée à la fin de chaque étape d'extension. Après amplification, les produits sont chauffés à 95 C, refroidis et maintenus à 70 C pendant 20 s, puis doucement (0,3 C/s) chauffés à 95 C pour déterminer la spécificité des produits de PCR. Cette spécificité est confirmée par visualisation des produits de PCR en gel d'agarose et par séquençage. 1.3. Western blot. Les extraits cellulaires sont lysés dans un tampon froid contenant 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 120 mM NaCl, 20 mM NaF, 1 mM EDTA, 6 mM EGTA, 15 mM sodium PPi, 15 mM p-nitrophenyl phosphate, 1 mM benzamidine, 0,1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 0,5 mM sodium orthovanadate, 1% NP-40 et un mélange inhibiteur de protéases (Protease inhibitor mixture, Sigma). Les lysats sont centrifugés à 14,000 rpm pendant 10 min à 4 C. Le surnageant est récupéré et utilisé. La concentration des protéines est déterminée avec le kit "BCA protein assay" (Pierce). Pour le Western Blot, 20 g de protéines sont chargées sur un gel d'acrylamide 8% (Laemmli gel) et transférées sur une membrane PVDF. La R-cadhérine est révélée par un anticorps monoclonal dilué 1:200 (MRCD5 généreusement donné par Dr. Takaishi). II. Résultats. Les inventeurs ont donc recherché le profil d'expression des cadhérines N, R, M et 11 dans 8 lignées de rhabdomyosarcomes. Trois lignées normales ont été prises comme contrôle. Des lignées tumorales d'origine épithéliale ont aussi été testées. Deux approches expérimentales ont été utilisées : la RT-PCR quantitative et le western-blot (pour la N et la R-cadhérine uniquement). Les résultats obtenus montrent une diminution globale du niveau d'ARNm des cadhérines N, M et 11 dans les rhabdomyoblastes (résultats non montrés). L'expression de la R-cadhérine a été spécifiquement détectée dans les RMSe (Figure 2 partie A). La protéine R-cadhérine a été aussi spécifiquement détectée dans les cellules issues de RMSe (Figure 2 partie B). Exemple 2 : Etude de l'expression des cadhérines dans des biopsies de rhabdomyosarcomes humains. I. Matériel et méthodes. En utilisant la technique de RT-PCR quantitative telle que décrite au point 1.1 de l'exemple 1, l'expression de la R-cadhérine a été étudiées dans des biopsies de rhabdomyosarcomes embryonnaires et de rhabdomyosarcomes alvéolaires. Pour réaliser cette étude, des myoblastes humains normaux issus de muscle strié paravertébral (banque de tissus pour la recherche, AFM-BTR), des myoblastes normaux de souris C2C12 et des myoblastes normaux de rat L6 ont été utilisés comme contrôle. L'ARN total a été extrait de 9 biopsies de rhabdomyosarcomes embryonnaires et de 9 biopsies de rhabdomyosarcomes alvéolaires. II. Résultats. Les résultats obtenus montrent la présence de la R-cadhérine dans les biopsies de RMSe et de RMSa (Figure 3). Il est probable que les lignées cellulaires issues de RMSa utilisées dans l'exemple 1 ont dû perdre l'expression de la R-cadhérine lors de leur mise en culture ou au cours des passages successifs. Les biopsies ne subissant aucune mise en culture, elles sont représentatives des phénomènes du i n vivo. Exemple 3 : Etude de l'effet sur la prolifération cellulaire de la diminution de l'expression de la Rcadhérine. I. Matériel et méthodes. Des constructions siARN spécifiques de la Rcadhérine ont été réalisées en utilisant le vecteur pSUPER à expression contrôlée par la polymérase III (Brummelkamp et al., 2002, Science, vol. 296, pages 550-553) gracieusement obtenu auprès de R. Agami (The Netherlands Cancer Institute, Plesmanlaan, Pays-Bas). Pour supprimer l'expression endogène de la R-cadhérine, l'oligonucléotide de formule : GATCCCCTGACATCCCCATCCGGTACttcaagagaGTACCGGATGGGGATGTC ATTTTTGGAAA (SEQ ID No. 3 dans le listage de séquences en annexe) a été inséré dans le vecteur pSUPER. Les lettres en gras correspondent aux oligonucléotides 611-629 de la séquence de l'ADNc codant la R-cadhérine humaine (NM- 001794). Les cellules RD (point 1.1 de l'exemple 1) ont été transfectées deux fois avec la construction pSUPER et pEGFP en utilisant la lipofectamine dans les conditions décrites par le fournisseur (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Quatre jours après la première transfection, les cellules sont mises à incuber en présence de 10 M de Bromodéoxyuridine (BrdU) pendant 3 heures avant d'être fixées. Un marquage de l'ADN et de l'incorporation de BrdU dans les cellules a été effectué. Le pourcentage des cellules exprimant la GFP et positivement marquées au BrdU a été calculé pour deux expériences indépendantes. II. Résultats. De façon à analyser l'implication directe de la R-cadhérine dans la prolifération des rhabdomyosarcomes, la technique utilisant un siARN spécifique de la R-cadhérine a été utilisée pour inhiber l'expression de la R-cadhérine dans la lignée cellulaire RD (point 1.1 de l'exemple 1). Des expériences préliminaires ont été mises en #uvre de façon à déterminer les conditions opératoires adéquates (concentration en plasmide pSUPER à utiliser et durée entre la transfection et la fixation des cellules) pour obtenir une diminution de l'expression de la Rcadhérine. L'inhibition de l'expression de la R-cadhérine a été suivie par la technique de Western blot. L'analyse au densitomètre de ces différents tests a montré que le niveau de la protéine R-cadhérine a diminué progressivement de par l'utilisation des siARN et qu'un maximum d'inhibition (80%) a été obtenu après 4 jours entre la transfection et la fixation des cellules. L'expression de la N-cadhérine et de la tubuline n'a pas varié au cours des expériences prouvant la spécificité de la technique utilisée. Afin de déterminer si la diminution de l'expression de la R-cadhérine affecte la prolifération des cellules RD, l'analyse de l'incorporation de BrdU a été analysée dans des cellules RD exprimant des ARN inhibant l'expression de la R-cadhérine. Comme montré sur la figure 4, la diminution de l'expression de la R-cadhérine diminue la prolifération cellulaire de cellules RD comme montré par l'étude de l'incorporation de BrdU 4 jours après la transfection. La quantification de ces résultats montre que l'incorporation de BrdU réduit de 52% à 12% la prolifération cellulaire. REVENDICATIONS 1. Méthode de diagnostic d'un rhabdomyosarcome à partir d'un échantillon d'un individu consistant à mettre en évidence, in vitro, l'expression de la R-cadhérine dans ledit échantillon. 2. Méthode de diagnostic selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle consiste à mettre en contact in vitro un échantillon d'un individu, après un éventuel traitement, avec un moyen pour détecter et/ou mesurer la Rcadhérine exprimée. 3. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit échantillon est une cellule, un ensemble de cellules ou un tissu. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'expression de la R-cadhérine est détectée via la mise en évidence de l'ARN messager de la R-cadhérine. 5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit ARN messager est mis en évidence à l'aide des techniques de cytogénétique moléculaire (RT-PCR) en utilisant des amorces capables d'amplifier spécifiquement la R-cadhérine. 6. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit ARN messager est mis en évidence à l'aide d'une sonde spécifique de cet ARN messager. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'expression de la R-cadhérine est détectée via la mise en évidence de la protéine correspondant à la R-cadhérine au moyen d'anticorps spécifiques de cette protéine. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ledit rhabdomyosarcome est un rhabdomyosarcome embryonnaire. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ledit rhabdomyosarcome est un rhabdomyosarcome alvéolaire. 10. Kit de diagnostic d'un rhabdomyosarcome embryonnaire et/ou alvéolaire caractérisé en ce qu'il comprend au moins un moyen pour détecter l'expression de Rcadhérine choisi parmi le groupe constitué par les anticorps spécifiques de la R-cadhérine, des amorces pour la RT-PCR capables d'amplifier spécifiquement la Rcadhérine, le couple d'amorces suivant : amorce sens 5'CCGACCAGCCCCCCATGGAG-3' et amorce antisens 5'CCTGGCTTGGAGCCCTCGTCC-3' (respectivement SEQ ID No : 1 et No : 2 dans la liste de séquences en annexe) et les sondes capables de s'hybrider spécifiquement à l'ARN messager de la R-cadhérine. 11. Composition pharmaceutique pour le traitement d'un rhabdomyosarcome comprenant une molécule active dans le traitement du rhabdomyosarcome choisie parmi les anticancéreux, les radioéléments, les colorants fluorescents, les toxines, les ARN antisens et les siARN (pour small interference ARN) spécifiques de la R-cadhérine et associée à un vecteur capable d'adresser ladite molécule active aux cellules exprimant la R-cadhérine qui est un anticorps dirigé contre le domaine extracellulaire de la Rcadhérine. 12. Composition pharmaceutique pour la prévention du rhabdomyosarcome embryonnaire et/ou du rhabdomyosarcome alvéolaire comprenant une molécule empêchant l'expression de la R-cadhérine choisie parmi un ARN antisens et un siARN (pour small interference ARN) spécifique de la Rcadhérine et associée à un vecteur capable d'adresser ladite molécule aux cellules musculaires squelettiques qui est un anticorps spécifique d'une protéine membranaire présente à la surface des cellules musculaires squelettiques.