Brevet FR2834466A1 — publié le 20030711

"Nouveaux moyens pour l'hébergement de cellules et leurs applications" L'invention vise de nouveaux moyens pour l'hébergement de cellules et leurs applications notamment pour l'élaboration d'implants ou d'organes bioartificiels ou de systèmes de culture cellulaire in vitro. On sait que l'utilisation de pancréas bioartificiels a été proposée pour le traitement du diabète. Actuellement, ce traitement implique l'injection sous-cutanée d'insuline, habituellement plusieurs fois par jour afin de réguler la glycémie. Ce système ne permet pas de maintenir une glycémie constante au cours de la journée et peut provoquer des épisodes d'hypoglycémie sévère chez le patient diabétique. Pour pouvoir mieux suppléer les fonctions du pancréas déficient, on a proposé d'implanter chez le patient des îlots de Langerhans immunoprotégés par une membrane semi-perméable (Mikos 1994, Reach 1999, Colton 1995). L'objectif est de permettre aux îlots de recevoir le signal, à savoir la concentration en glucose dans le sang, et d'y répondre par une synthèse et une sécrétion d'insuline permettant d'assurer la régulation de la glycémie. Ces îlots doivent fonctionner comme au sein d'un pancréas sain. Cependant, dans le cas d'une implantation d'un pancréas bioartificiel dans la cavité péritonéale ou en sous-cutané, les échanges entre les îlots immobilisés et le sang sont purement diffusifs. De plus, l'approvisionnement en oxygène, nécessaire à la survie et au bon fonctionnement des cellules, se fait aussi de façon diffusive. Les géométries de pancréas bioartificiels à ce jour se heurtent toutes à un problème de changement d'échelle, qui se traduit par la nécrcse des îlots de Langerhans. Cette nécrose résulte d'une part de distances trop élevées pour la diffusion de l'oxygène, et d'autre part d'une densité d'îlots trop grande visant à réduire le volume global de l'organe bioartificiel. L'utilisation de microcapsules, en alginate notamment, a également été envisagée car le rapport volume/surface d'échanges est optimisé. Néanmoins, lors de l'implantation dans la cavité péritonéale se pose le problème de l'ancrage de ces éléments, et celui de leur récupération en cas de problème. La macroencapsulation dans des fibres creuses semi-perméables permet de surmonter cet écueil, et offre de plus une résistance mécanique accrue. Dans ce cas, cependant, le changement d'échelle pour une transposition a l'homme a échoué jusqu'à présent. Il semble difficile de proposer une géométrie suffisamment compacte pour héberger le nombre d'îlots requis pour une suppléance efficace. Les transferts de masse par diffusion apparaissent limités, notamment en ce qui concerne l'oxygène, et imposent une néovascularisation à la surface externe de la barrière immunitaire. D'autres équipes ont proposé d'utiliser une géométrie plane, facilement extractible du lieu d'implantation, pour minimiser les trajets diffusifs. On citera notamment les travaux des compagnies Islet Sheet Medical (Antanavich 2000) et Baxter avec le produit Théracyte@ (Rafael 1997). Le système Théracyte consiste en une chambre de diffusion très fine équipée de 2 membranes superposées : une membrane externe avec des pores favorisant la formation de néovaisseaux et une membrane interne avec des pores permettant l'immunoprotection des îlots. Les distances de diffusion sont donc très courtes en raison du volume interne très faible, il est cependant très difficile de placer dans cette chambre des îlots de Langerhans dont le diamètre moyen est de 200 m. Le volume d'un îlot étant d'environ 4.10-3 l, on peut placer environ 10 000 îlots dans cette chambre, sous une densité maximale. Avec une densité optimisée, de l'ordre de 30%, on peut placer environ 3000 îlots nécessaires à la suppléance du pancréas d'un rat diabétique. Islet Sheet Medical propose d'héberger les îlots dans un sandwich de 3 couches d'alginate. L'épaisseur totale du film est de 400 m environ, ce qui assure ici aussi une très faible distance de diffusion. La densité des îlots dans le gel est au mieux de 35%. On retrouve donc le même type de dimension que celles évoquées ci-dessus. Les travaux des inventeurs ont montré qu'en utilisant de nouvelles géométries de structure d'hébergement d'îlots de Langerhans, on pouvait surmonter les limites évoquées ci-dessus en rapport avec des implants de pancréas artificiels. De plus, ces géométries se sont révélées applicables à d'autres types d'implants ou d'organes bioartificiels. L'invention a donc pour but l'utilisation de telles structures pour héberger des cellules, en particulier des types cellulaires déficients dans des pathologies données. Elle vise également la mise à profit des propriétés de ces structures pour réaliser des implants ou des systèmes bioartificiels ou des systèmes de cultures cellulaires in vitro. Les structures utilisées selon l'invention pour héberger des cellules sont caractérisées en ce qu'il s'agit de membranes sensiblement planes, en un matériau biocompatible, possédant une pluralité de canaux longitudinaux séparés, hébergeant des cellules. Ces membranes seront désignées ci-après par l'expression "membranes polycreuses". Des membranes appropriées correspondent en particulier à celles faisant l'objet du brevet FR 2 641 709 au nom de la Lyonnaise des Eaux. La répartition et le maintien des cellules au sein de chaque canal sont obtenus par la présence d'un gel biocompatible. Comme gels appropriés, on citera les alginates, les collagènes, ou encore l'agarose. Après remplissage par le gel, on obture les canaux. On utilisera avec avantage une colle réticulable aux UV telle que celle décrite dans la demande FR 00 14 969 du 20 novembre 2000 au nom d'Aquasource. Dans sa définition la plus générale, cette colle est à base d'un adhésif synthétique réticulable /polymérisable sous rayonnement ultraviolet. Une quantité précisément dosée d'adhésif est introduite dans les extrémités des canaux aux fins de durcissement. Les différentes caractéristiques géométriques de la membrane sont ajustées en fonction du cahier des charges pour, d'une part, assurer le bon fonctionnement des cellules hébergées et, d'autre part, permettre une récupération aisée du dispositif implanté. La géométrie polycreuse (longueur, largeur et épaisseur de la membrane) peut être adaptée en fonction des besoins et de l'application visée chez l'homme ou chez l'animal. La forme des canaux, de section circulaire à l'origine, peut être modifiée pour assurer l'hébergement d'un nombre suffisant d'îlots ou de cellules avec une densité optimale. La densité du gel lui-même dépend de la solution finale recherchée. Les couches filtrantes de la membrane (interne et/ou externe) sont ajustables pour assurer les besoins en terme de transfert de matière de glucose, d'insuline et d'oxygène, mais aussi pour assurer l'immuno-protection des îlots. Différents matériaux polymères peuvent être envisagés, en fonction des propriétés mécaniques et de la biocompatibilité recherchée. Selon la forme de canal souhaité, on adaptera la géométrie de la filière utilisée pour produire la membrane. Si le canal est de section circulaire, son diamètre est choisi pour permettre l'hébergement d'un type cellulaire donné. Par exemple, dans le cas des îlots de Langerhans, ce diamètre peut varier de 200 um à 1 mm environ. Le canal peut aussi avoir une section de forme oblongue, afin de placer plusieurs îlots en parallèle sur une même couche, tout en minimisant les trajets diffusifs pour les substances d'intérêt, par exemple, glucose, insuline, oxygène dans le cas desdits îlots. Ces structures s'avèrent particulièrement adaptées pour l'hébergement de cellules primaires allogéniques ou xénogéniques, ou issues de lignées, à protéger du milieu environnant. On citera en particulier les îlots de Langerhans, mais également les hépatocytes, les cellules rénales, de la thyroïde, de la parathyroïde ou des glandes surrénales. L'implantation de ces structures chez l'homme ou chez l'animal permet la survie à long terme des cellules qu'elles contiennent. L'invention vise donc l'utilisation desdites membranes pour l'élaboration d'implants ou d'organes bioartificiels. En ce qui concerne par exemple le cas des îlots de Langerhans, on observe une régulation adéquate de la glycémie et on ne se heurte pas aux problèmes rencontrés par les autres systèmes de l'art antérieur. L'invention vise également l'utilisation de ces membranes polycreuses dans des applications extracorporelles. De telles applications revêtent un grand intérêt notamment pour réaliser un foie bioartificiel, avec perfusion de sang ou de plasma dans la membrane renfermant les hépatocytes en culture, et réadministration du sang ou du plasma traité au patient. L'invention vise aussi l'utilisation desdites membranes polycreuses pour l'élaboration de systèmes de cultures cellulaires. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans la description qui suit en se référant aux figures 1 à 3 qui représentent respectivement : - la figure 1 une membrane polycreuse plane à canaux de section circulaire, renfermant une rangée de cellules, - la figure 2, une autre membrane polycreuse telle qu'utilisée selon l'invention, comportant des canaux de section oblongue, et 2 rangées de cellules dans chaque canal, et - la figure 3, une membrane polycreuse avec une surface externe ondulée. Utilisation d'une membrane polycreuse Cette membrane est avantageusement fabriquée selon le procédé décrit dans le brevet FR 2 641 709 précité. Les caractéristiques de la membrane sont modulées en fonction des besoins, notamment en termes de : - Matériau : tout type de polymère biocompatible : polysulfone, polyethersulfone, PEVA, PVA, cellulose modifiée, - Homogénéité : la structure peut être homogène ou disposer d'un support très poreux et d'une fine couche filtrante qui définira le seuil de coupure. La couche filtrante peut être interne ou externe. En particulier, il peut s'agir d'une couche externe très poreuse, avec des diamètres de pore supérieurs à 0,8 um, afin de favoriser la néovascularisation autour de l'implant. - Épaisseur : l'épaisseur de la membrane doit être suffisamment faible pour favoriser les transferts diffusifs, tout en assurant une bonne tenue mécanique. Cette épaisseur, ajoutée au diamètre du canal définira l'épaisseur totale de l'implant ou de l'organe bioartificiel. - Seuil de coupure : les substances nutritives ainsi que les espèces sécrétées par les cellules immobilisées à l'intérieur des canaux doivent traverser librement la membrane. Les immunoglobulines doivent en revanche être retenues : en conséquence, le seuil de coupure peut varier entre 20 kDa et 150 kDa. - Forme externe : la face externe de la membrane peut être lisse ou présenter des caractéristiques permettant d'accroître sa rugosité. Par exemple, la face externe peut être ondulée pour favoriser la formation de néovaisseaux qui réduiront les trajets diffusifs entre le sang et les cellules immobilisées (Fig. 3) . Ces structures présentent des avantages par rapport aux dispositifs évoqués précédemment : 1. Géométrie originale par elle-même : bien que la géométrie soit plane, elle est totalement différente des dispositifs antérieurs évoqués plus haut. 2. Ajustement de la densité d'îlots facilité par le remplissage suivant une seule dimension (axe du canal). Ce paramètre étant primordial pour la survie des îlots à long terme, le remplissage canal par canal permet d'assurer une très bonne homogénéité sur l'ensemble du dispositif plan. 3. Excellente tenue mécanique de l'ensemble assurée par la structure même de la membrane, d'où l'absence de risque de diminution du volume interne, ou de délaminage des différentes couches de gel, tels qu'observés avec des structures de l'art antérieur. 4. Surface externe favorisant la formation de néovaisseaux. En fonction des données de la littérature, la taille des pores externes de la membrane peut être adaptée pour optimiser la néovascularisation. Il est également possible d'accroître la rugosité du matériau, et même, à l'aide d'une filière adaptée, de créer une surface externe ondulée. 5. Possibilité d'utiliser certains canaux pour un apport nutritionnel ou en oxygène. Des exemples de structures de membranes polycreuses sont illustrées par les figures 1 à 3. La figure 1 correspond à une membrane polycreuse plane 1 comportant des canaux 2 de section circulaire, contenant chacun une rangée de cellules 3 dans un gel 4. La figure 2 montre une membrane avec des canaux de section oblongue 5 contenant deux rangées de cellules 6 et 7 dans chaque canal, ce qui permet de disposer de la densité cellulaire souhaitée, adaptée à certains types de culture. La figure 3 illustre une structure avec une surface externe 8 ondulée, ce qui permet de favoriser la néovascularisation. Application à l'hébergement d'îlots de Langerhans Suppléance d'un pancréas chez le rat. Pour environ 3000 îlots de diamètre 200 um, sous une densité de l'ordre de 30%, on utilise un volume interne global de 42 l. Par exemple, avec un diamètre interne de canal de 300 um, on a utilisé une longueur totale de canaux de 60 cm, soit par exemple 20canaux de 3 cm de long. Avec une distance intercanal de 300 um, les dimensions globales de la structure sont alors : Longueur = 3 cm, largeur = 1,2 cm l'épaisseur de l'implant étant par exemple de 500 um, ce qui correspond à un volume total de 180 mm3. Certains canaux peuvent également être dépourvus de cellules et être utilisés pour des apports nutritifs ou un apport d'oxygène. La densité des cellules peut être modulée en fonction du volume de gel biocompatible introduit dans les canaux. Ce paramètre est primordial pour assurer une bonne oxygénation des cellules. Pancréas bioartificiel La structure obtenue comme indiquée ci-dessus est implantée dans la cavité péritonéale ou en sous cutané. Du fait de ses dimensions, elle est facilement extractible. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Mikos AG, Papadaki MG, Kouvroukoglou S, Ishaug SL, Thomson RC. Mini-review : islet transplantation to create a bioartificial pancreas. Biotechnol. Bioeng. 1994 ; Reach G. Perspectives dans le traitement du diabète insulinodépendant : réflexions sur cinq révolutions. Encycl Méd Chir 1999. Colton CK.Implantable biohybrid artificial organs. Cell Transplant. 1995;4(4)415-36 Antanavich RD, Dorian R. Retrievable bioartificial implants having dimensions allowing rapid diffusion of oxygen and rapid biological response to physiological change, processes for their manufacture, and methods for their use. US Patent 2000, US006165225A. Rafael E, Tibell A, Arner P. Microdialysis for in vivo évaluation of permeability of immunoisolation devices. Transplant. Proc. 1997;29:2134-2135. REVENDICATIONS 1. Utilisation pour l'hébergement de cellules de membranes sensiblement planes, en un matériau biocompatible, possédant une pluralité de canaux longitudinaux séparés. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la répartition et le maintien des cellules au sein de chaque canal sont assurés par un gel biocompatible, tel qu'un alginate, un collagène ou de l'agarose. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les canaux sont obturés à l'aide d'une colle. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'un ou plusieurs canaux sont dépourvus de cellules et sont utilises pour des apports nutritifs ou des apports en oxygène. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes pour l'hébergement d'îlots de Langerhans. 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée par l'utilisation de canaux de section circulaire, ayant un diamètre de 200 m à 1 mm, ou de forme oblongue. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes pour l'élaboration d'implants ou d'organes bioartificiels. 8. Utilisation selon la revendication 7, pour l'élaboration d'un pancréas artificiel. 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour l'élaboration de systèmes de cultures cellulaires in vitro. 10. Structures d'hébergement de cellules, caractérisées en ce qu'elles comprennent des membranes renfermant des cellules, telles qu'utilisées dans l'une quelconque des revendications 1 à 6.