Brevet FR2836918A1 — publié le 20030912

L'invention concerne un procédé de mesure de l'expression de plusieurs gènes d'un échantillon biologique utilisant une technique PCR, notamment de gènes de résistance à une drogue antitumorale. Les traitements anticancéreux se soldent encore trop souvent par des échecs, liés à la fois à des phénomènes de résistance tumorale aux médicaments ou aux radiations ionisantes, mais aussi à leur toxicité vis-à-vis des tissus sains. Les phénomènes de résistance tumorale peuvent préexister aux traitements mais ils sont le plus souvent acquis en cours de traitement. Ils sont à l'origine d'un échappement de la tumeur ou des métastases malgré l'application successive de plusieurs lignes thérapeutiques. Les carcinomes colorectaux sont les tumeurs les plus fréquentes, tous sexes confondus, représentant 25 000 nouveaux cas par an en France, dont la moitié mourront de progression de la maladie, essentiellement sous forme de métastases. Les succès thérapeutiquement limités s'expliquent en partie par le fait que les seuls critères anatomo-cliniques classiques ne rendent pas assez compte de l'importante hétérogénéité évolutive de ces tumeurs et sont de faibles indicateurs de la réponse thérapeutique. Exposé de manière réductrice, on peut dire qu'il est difficile aujourd'hui d'évaluer a priori la réponse d'un patient au traitement auquel il va être soumis. Le choix d'un traitement est donc fait par le médecin en fonction de données aujourd'hui insuffisamment pertinentes. Puis, en fonction de l'évolution de la tumeur, une ou plusieurs autres voies thérapeutiques seront éventuellement choisies. Dans le cas de chimiorésistance, il y a perte de temps ; la tumeur progresse et rend le pronostic plus défavorable. Cependant, l'évolution des connaissances en biologie du cancer, ainsi que les progrès technologiques réalisés à ce jour, permettent d'envisager une meilleure définition moléculaire et fonctionnelle des tumeurs solides aboutissant à une classification plus objective. Associée aux données cliniques et anatomopathologiques, approches analytique et statistique devraient contribuer à évaluer la sensibilité aux drogues anticancéreuses et à : - sélectionner les patients selon la sensibilité potentielle de leur tumeur aux médicaments anticancéreux, - éviter les inconvénients des surtraitements et les effets iatrogènes qui peuvent en découler, - orienter précocement vers l'innovation thérapeutique les patients porteurs de tumeurs d'emblée insensibles aux traitements conventionnels ou à haut risque potentiel évolutif De nombreuses études rapportées dans la littérature internationale ont eu pour objet la caractérisation des mécanismes impliqués dans la résistance tumorale à la chimiothérapie et leur classification : - résistance membranaire extrusion active de la molécule par une glycoprotéine membranaire - résistance nucléaire hyperexpression ou au contraire, inhibition d'expression de la cible du médicament - résistance métabolique augmentation du catabolisme intracellulaire du médicament. Si un certain nombre des mécanismes en cause sont connus, leur rôle réel et respectif en clinique est beaucoup plus difficile à déterminer. De plus, ces mécanismes de résistance sont très souvent associés. Cette situation est liée en grande partie aux difficultés rencontrées pour se rapprocher des conditions réelles, c'est-à-dire in vivo. Les approches se limitent le plus souvent à l'analyse d'un nombre restreint de gènes et les études cliniques de corrélation d'expression de gène de résistance et de phénotype de résistance font encore défaut. La situation actuelle est la suivante : - Beaucoup de nouveaux médicaments sont maintenant à la disposition des cancérologues, sans connaître à l'avance leur efficacité et leur toxicité individuelles et les meilleures modalités d'administration. - Malgré les nombreuses tentatives de caractérisation des mécanismes impliqués dans la résistance tumorale, il reste encore impossible de savoir lesquels interviennent et de pouvoir prédire une éventuelle résistance avant l'instauration d'un traitement : mécanisme membranaire, nucléaire, métabolique, combinant les trois ? - Les retombées cliniques restent actuellement pratiquement nulles et on ne connaît pas la place respective de ces différents prédicteurs en l'absence d'analyse multivariée. Jusqu'à présent un patient porteur de cancer est le plus souvent traité par une association de médicaments déterminé de façon empirique d'après des essais thérapeutiques contrôlés. Le pourcentage statistique de réponse des cancers est ainsi en général inférieur à 50%. De plus, il est maintenant reconnu que l'état métabolique des cellules cibles diffère pour chaque patient et chaque tumeur. L'état de sensibilité ou de résistance cellulaire tumorale à un médicament est lié en général à l'activité résultante de plusieurs protéines agissant de concert. Ainsi, en l'absence d'une cartographie métabolique de la tumeur à traiter, il existe un risque d'administrer un ou des médicaments non adapté et de se heurter à un échec thérapeutique. Actuellement certains laboratoires ont envisagé de quantifier par exemple une activité enzymatique pertinente afin de guider le praticien pour le choix du traitement. Ces dosages sont en règle générale limités à l'activité d'un seul facteur, du fait de quantités limités de prélèvement et de la multiplicité des protocoles de dosage et donc les retombés en clinique sont à ce jours inexistantes. Malgré ces difficultés, il est souhaitable de réaliser un dosage quantitatif de plusieurs marqueurs de résistances pour obtenir une appréciation plus raisonnée du traitement à appliquer et donc de l'individualiser. Leur quantification simultanée permettrait d'éviter une inefficacité thérapeutique et des toxicités inutiles et dangereuses. En absence d'un protocole simple général et sensible de dosage de marqueurs de résistance aux anticancéreux avec des méthodes biochimiques, on peut considérer que la quantification des ARN messagers codant pour ces protéines est le plus souvent le reflet direct de la présence et de l'activité de celle-ci. Or, les techniques de quantification utilisées jusqu'à présent ne sont pas suffisamment appropriées pour cette mesure simultanée et rapide. On rappelle que différentes techniques de"Réaction de Polymérisation en Chaîne" (PCR) existent pour évaluer l'expression d'un gène. La PCR est basée sur des cycles répétés de dénaturation de doubles brins d'ADN, suivie par le couplage d'amorces avec la matrice d'ADN après dénaturation, et l'élongation de l'amorce en présence d'ADN polymérase (Mullis et al., brevets US 4 683 195,4 683 202,4 800 159). La PCR nécessite le choix de paires d'amorces encadrant la séquence à amplifier. Les amorces oligonucléotidiques utilisées pour la PCR sont telles qu'elles se couplent en deux points de l'ADN, une amorce avec un brin, l'autre amorce avec le brin complémentaire, l'élongation de la chaîne s'effectuant entre ces deux amorces. Une première amorce dite"anti-sens"est capable de se coupler à une région d'un brin anti-sens du gène étudié, et une seconde amorce"sens"est capable de se coupler à une région du brin sens du gène étudié. L'amplification PCR se traduit par une production exponentielle de fragments d'ADN obtenus à chaque cycle à partir des amorces. Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions. Parmi les méthodes existant pour quantifier l'expression des gènes étudiés, les méthodes RT-PCR (réaction de polymérisation en chaîne avec transcription inverse), décrites par exemple dans le brevet EP 1 050 587, sont souvent préférées. La RT-PCR implique successivement la synthèse d'un ADNc à partir d'un ARN par transcription inverse, puis la réplication de l'ADNc nouvellement synthétisé par un processus d'amplification PCR faisant intervenir des amorces. Typiquement, on distingue trois types de protocole : - la RT-PCR non couplée, dans laquelle la transcription inverse est réalisée comme une étape indépendante, l'échantillon d'ADNc obtenu étant ensuite séparément utilisé pour une amplification PCR avec une ADN polymérase thermostable telle que la Taq ADN polymérase ; - la RT-PCR couplée, avec une enzyme de polymérisation, selon laquelle une polymérase unique est utilisée à la fois pour la formation à la fois de l'ADNc à partir de l'ARN, et l'amplification de l'ADN ; - la RT PCR couplée avec au moins deux enzymes de polymérisation, selon laquelle au moins deux polymérases séparées sont utilisées pour la synthèse initiale d'ADNc et l'amplification qui suit. La RT PCR couplée avec une enzyme utilise l'activité transcriptase inverse d'ADN polymérases telles que la Taq ADN polymérase, tandis que la RT-PCR couplée à au moins deux enzymes utilise une transcriptase inverse rétrovirale ou bactérienne telle que l'AMV-RT, la MMLV-RT, ! a HIV-RT, et une ADN polymérase thermostable telle que la Taq ADN polymérase. L'intérêt d'une RT-PCR couplée est de limiter le nombre de manipulations et de réactifs utilisés, d'où une amplification plus rapide et un besoin d'échantillon plus faible. Par exemple le document WO 99/54510 décrit un procédé de mesure de l'expression d'au moins un gène faisant intervenir par une réaction RT-PCR la détermination d'une courbe standard pour chaque gène d'intérêt à l'aide d'un couple d'amorces pour chaque gène. Un essai est effectué pour chaque gène séparément, en comparaison avec la courbe standard pour ledit gène. Le document WO 00/50061 utilise la RT-PCR pour évaluer l'expression d'un gène associé à un phénotype tumoral, utilisant des amorces spécifiques d'une région du gène. Le document US 5 804 383 concerne également une méthode faisant intervenir une amplification RT-PCR, pour évaluer l'expression de séquences d'ADN mutés. Cette méthode est destinée spécifiquement à l'évaluation de l'expression d'allèles spécifiques durant le développement foetal ou impliquées dans des mutations cancéreuses. Le document US 5 830 656 décrit une méthode de détection de la présence ou de l'absence d'un niveau réduit d'ARNm transcrit d'un gène suppresseur tumoral. Le procédé comprend l'isolation de l'ARNm de l'échantillon tissulaire, l'amplification de cet ARNm par une RT-PCR utilisant des amorces spécifiques du gène, et la détection de la présence ou de l'absence des produits d'amplification pour déterminer si le gène est présent ou absent dans l'échantillon. L'art antérieur décrit donc des techniques de PCR quantitatives en temps réel (RT-PCR) qui permettent d'évaluer des modifications physiologiques quantitatives d'expression d'un gène du fait de la sensibilité de cette technique. Toutefois, Les quantifications telles qu'elles sont pratiquées habituellement par rétrotranscription des ARN messagers suivies d'une amplification et d'une quantification des produits obtenus posent plusieurs problèmes : - Ces méthodes font appels pour chaque marqueur de résistance à un protocole d'amplification particulier par couple d'amorce. - On doit utiliser un standard particulier par molécule à quantifier. - Les standards étant des molécules différentes, il est impossible d'affirmer que le nombre de cible pour une dilution donnée serait exactement le même pour chaque standard de chaque marqueur, ainsi des comparaisons relatives de plusieurs marqueurs peuvent être très largement faussées. - Les molécules standards doivent être proches en taille des produits amplifiés pour être multipliées avec des cinétiques équivalentes. - Pour des raisons pratiques de sensibilité de détection, la quantité de produit PCR est souvent estimée dans des conditions ou l'amplification n'est plus proportionnelle à la quantité initiale de cible. Ces pratiques altèrent le résultat de la quantification. - II est nécessaire de faire une multitude de dilution des échantillons afin de centrer les résultats dans la fenêtre de lecture pour permettre une comparaison avec l'amplification de la molécule standard dans les mêmes conditions. - La procédure d'amplification ajoutée à l'analyse des résultats est longue. En effet elle est de l'ordre d'une journée minimum pour l'estimation d'un seul marqueur. De plus, l'homogénéité du produit amplifié et quantifié est rarement contrôlée. L'invention vise à palier les inconvénients de l'art antérieur en proposant une technique efficace et rapide permettant de mesurer de manière quantitative et dans un même essai l'expression de plusieurs gènes d'un échantillon cellulaire. L'invention vise également à détecter en quelques heures l'inefficacité ou l'efficacité d'une voie thérapeutique. L'invention vise également un gain de temps important dans le traitement de nombreux patients souffrant, en particulier, d'affections tumorales. A cet effet l'invention concerne selon un premier aspect une séquence amorce composite standard d'acide nucléique de formule générale : Xl-...-Xp-... X (n-l)-Xn-INT-Yl-...-Yp-...-Y (n-l)-Yn Dans laquelle : - XI est une amorce matrice sens d'un premier gène d'intérêt - Xp est une amorce matrice sens d'un pième gène d'intérêt - Xn est une amorce matrice sens d'un nième gène d'intérêt - INT est une séquence intercalaire - YI est une amorce matrice antisens du premier gène d'intérêt - Yp est une amorce matrice antisens du pième gène d'intérêt - Yn est une amorce matrice antisens du nième gène d'intérêt avec n entier 2 : 2 et de préférence inférieur à 10, ladite séquence amorce composite étant apte à servir de matrice d'amplification PCR, l'amplification par tout couple amorce (Xp, Yp) capable de s'hybrider avec le couple amorce matrice (Xp, Yp) et d'amplifier ladite séquence amorce composite conduisant à un produit d'amplification (Xp-... Xn-INT-Yl-...-Yp) sensiblement de même taille quelque soit p, ladite séquence étant destinée à la mesure de l'expression simultanée d'au moins deux de ces gènes d'intérêt. L'invention concerne également les variants de ladite séquence amorce composite. Les variants ont une séquence nucléotidique différente de la séquence Par variants de ladite séquence amorce composite on inclut les séquences nucléotidiques dont au moins la séquence d'une amorce Xp, Yp et/ou de l'ADN intercalaire INT diffère des séquences indiquées dans la liste des séquences annexée, tout en permettant d'obtenir l'amplification souhaitée. En particulier on entendra, pour chaque couple (Xp, Yp) et pour la séquence INT : - A) une séquence nucléotidiqus comportant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % d'identité avec la séquence nucléotidique correspondante annexée - B) une séquence nucléotidique s'hybridant dans des conditions de forte stringence avec la séquence nucléotidique correspondante - C) une séquence nucléotidique complémentaire correspondant à une séquence telle que définie en a) ou b) - D) une séquence nucléotidique de fragment représentatif d'une séquence telle que définie en a), b), ou c) - E) une séquence nucléotidique modifiée d'une séquence telle que définie en a), b), c), ou d). Il doit être compris que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié. On entend ainsi également désigner les acides nucléiques obtenus par synthèse chimique. Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. On entend désigner par"meilleur alignement"ou"alignement optimal", l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981, Ad. App. Math. 2 : 482), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970, J. Mol. Biol. 48 : 443), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Afin d'obtenir l'alignement optimal, on utilise de préférence le programme BLAST, avec la matrice BLOSUM 62. On peut également utiliser les matrices PAM ou PAM250. Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale dans laquelle la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 85 % ou 90 %, de façon plus préférée 95 % voire 98 %, après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique et/ou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % ou 98 %, d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence. Il s'agit de préférence de séquences dont les séquences complémentaires sont susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec les séquences de référence. De préférence, les conditions d'hybridation spécifiques ou de forte stringence seront telles qu'elles assurent au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % d'identité après alignement optimal entre l'une des deux séquences et la séquence complémentaire de l'autre. Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes. L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7, 5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0, 15 M NaCI + 0, 015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i. e. : 42 C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20 C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20 C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60 C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al., (1989, Molecular cloning : a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor). Par le terme matrice on entend que l'amorce standard composite sert de matrice d'amplification PCR en présence d'au moins un couple amorce d'amplification (Xp, Yp), pour conduire à un produit d'amplification (Xp-... Xn-INT-Yl-...-Yp). Ainsi les amorces sens Xp et les amorces antisens Yp utilisées pour la construction de l'amorce composite matrice standard, sont à considérer comme des fragments formant matrice pour l'amplification de l'amorce composite matrice standard. Par le terme gène d'intérêt on désigne un gène dont on cherche à quantifier le niveau d'expression. Par le terme sensiblement simultanée on entend que la quantification de l'expression de ces gènes d'intérêt est obtenue dans un même essai à partir d'un même échantillon biologique et dans les mêmes conditions de PCR. Selon un mode de réalisation l'amorce composite standard est un ADN mono ou bicaténaire. La taille des séquences amorces matrices XI,... Xn, Yl,.. Yn est sensiblement identique entre les amorces matrices. La taille des séquences amorces matrices XI,... Xn, YI,... Yn est typiquement comprise entre 5 et 50 bases, avantageusement 10 à 20 bases, et la taille de la séquence INT intercalaire est comprise typiquement entre 50 et 1000 bases, avantageusement 200 à 500 bases. Selon une réalisation la séquence intercalaire correspond à SEQ ID N'l. Les gènes d'intérêt sont choisis typiquement parmi les gènes de résistance aux produits anticancéreux. Selon une réalisation n=5 avec : - XI amorce sens de la Thymidilate Syntase (TS), de séquence SEQ ID N 2 - X2 amorce sens de la la dihydropyrimidine déshydrogénase (DPD), de séquence SEQ ID N 3 - X3 amorce sens de la Thymidine kinase (TK), de séquence SEQ ID N 4 - X4 amorce sens de la dihydofolate Réductase (DHFR), de séquence SEQ ID N05 - X5 amorce sens de la folypolyglutamate synthase (FPGS), de séquence SEQ ID N06 - INT séquence intercalaire de séquence SEQ ID ? 7 - Yl amorce antisens de la Thymidilate Syntase, de séquence SEQ ID N 8 - Y2 amorce antisens de la la dihydropyrimidine déshydrogénase, de séquence SEQ ID N9 - Y3 amorce antisens de la Thymidine kinase, de séquence SEQ ID NO 10 - Y4 amorce antisens de la dihydofolate Réductase, de séquence SEQ ID NO Il - Y5 amorce antisens de la folypolyglutamate synthase, de séquence SEQ ID NO 12 Selon une réalisation n=3 avec : - XI amorce sens de la Topoisomérase 1, de séquence SEQ ID NO 13 - X2 amorce sens de la Topoisomérase 2 beta de séquence SEQ ID N 14 - X3 amorce sens de la Topoisomérase 2 alpha de séquence SEQ ID ? 15 - INT séquence intercalaire de séquence SEQ ID ? 7 - YI amorce antisens de la Topoisomérase 1, de séquence SEQ ID N 16 - Y2 amorce antisens de la Topoisomérase 2 beta de séquence SEQ ID ? 17 - Y3 amorce antisens de la Topoisomérase 2 alpha de séquence SEQ ID ? 18 Selon une réalisation n=5 avec : - XI amorce sens de la protéine MRP1 de séquence SEQ ID ? 19 - X2 amorce sens de la protéine MRP2, de séquence SEQ ID ? 20 - X3 amorce sens de la protéine MDR1, de séquence SEQ ID N 21 - X4 amorce sens de la protéine MXR, de séquence SEQ ID N 22 - X5 amorce sens du récepteur EGF, de séquence SEQ ID N 23 - INT séquence intercalaire de séquence SEQ ID ? 7 - Yl amorce antisens de la protéine MRP1 de séquence SEQ ID N 24 - Y2 amorce antisens de la protéine MRP2 de séquence SEQ ID ? 25 - Y3 amorce antisens de la protéine MDR1 de séquence SEQ ID N026 - Y4 amorce antisens de la protéine MXR de séquence SEQ ID ? 27 - Y5 amorce antisens du récepteur EGF de séquence SEQ ID N28 Selon un autre aspect l'invention concerne un vecteur de clonage comprenant une séquence amorce composite telle que mentionnée ci-dessus. Selon un autre aspect l'invention concerne une cellule hôte transformée par un tel vecteur. Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou être des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs sont préparés par des méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards, telle que la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, ou des méthodes chimiques. Les vecteurs selon l'invention sont par exemple des vecteurs d'origine plasmidique ou virale. Ils sont utiles pour transformer des cellules hôtes afin de cloner les séquences nucléotidiques selon l'invention. L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes, par exemple les cellules bactériennes mais également les cellules de levure ou les cellules animales, en particulier les cellules de mammifères. Selon un autre aspect l'invention concerne un procédé de préparation d'une amorce composite standard comprenant successivement les étapes : - A) préparation de la séquence intercalaire INT d'ADN double brin - B) préparation d'une séquence Xn-INT-Yl, par amplification PCR de la séquence intercalaire INT à l'aide : 0 d'une première amorce amont mixte sens Xn-Tup, Tup étant complémentaire de la séquence terminale amont de la séquence intercalaire INT 0 et d'une première amorce aval mixte antisens Tdn-Yl, Tdn étant une séquence complémentaire de la séquence terminale aval de la séquence intercalaire - C) préparation d'une séquence X (n-l) -Xn-INT-YI-Y2, par amplification de la séquence Xn-INT-Yl, à l'aide d'une deuxième amorce amont mixte sens X (n- l)-Xn et d'une deuxième amorce aval mixte (Y1-Y2) - D) préparation d'une séquence X (n-2)-X -X (n-l) -Xn-INT-YI-Y2-Y3, par amplification de la séquence X (n-l) -Xn-INT-YI-Y2, à l'aide d'une amorce amont mixte sens X (n-2)-X (n-l) et d'une deuxième amorce aval mixte Y2-Y3 - répétition de l'étape d) pour chaque amorce composite successivement jusqu'à obtenir l'amorce composite standard XI-X2-...-X (n-l)-Xn- INT-YI-Y2-...- Y (n-l)-Yn. Par amorce amont on entend une amorce située par rapport à la séquence intercalaire du côté des amorces sens (X) de l'amorce standard composite, par opposition à aval située du côté des amorces antisens (Y). Selon un autre aspect l'invention concerne un procédé de mesure de l'expression de plusieurs gènes d'intérêt d'un échantillon biologique utilisant une technique PCR, comprenant les étapes : - a) préparation d'un échantillon biologique à tester comportant l'extraction des acides nucléiques représentatifs de l'expression d'au moins deux desdits gènes d'intérêt - b) mise en présence d'une amorce standard composite spécifique telles que décrite précédemment, avec lesdits acides nucléiques représentatifs - c) Amplification compétitive desdits acides nucléiques représentatifs et de ladite amorce standard composite, en présence d'au moins deux des couples d'amorces marqués (XI, Yl), (X2, Y2),..., (Xn, Yn), dans des conditions permettant l'amplification dans le même essai des couples d'amorces testés de manière quantitiativement sensiblement égale - d) mise en évidence et quantification des produits d'amplification de façon à en déduire sensiblement simultanément et quantitativement l'expression d'au moins deux des n gènes d'intérêt dans l'échantillon biologique. Selon une réalisation la quantification fait intervenir une comparaison de l'amplification de l'amorce standard composite à l'issue de l'étape c) par rapport à cette amplification en l'absence, ou en présence d'une quantité connue, desdits acides nucléiques représentatifs. Les couples d'amorces sont typiquementmarqués par un marqueur radioactif ou non radioactif La PCR est de préférence une RT PCR, lesdits acides nucléiques représentatifs étant les ADNc obtenus à partir des ARNm représentatifs de l'expression desdits gènes d'intérêt. L'amplification de l'amorce standard composite par les couples amorces (XI, Yl), (X2, Y2),..., (Xn, Yn) conduit respectivement aux amplicons (Xl-...-Xn- INT-Y1), (X2-... -Xn-INT-YI-Y2),..., (Xn-INT-Yl-... -Yn), la taille des amplicons étant sensiblement identique entre eux. Selon une réalisation l'échantillon à tester est issu de cellules tumorales, les gènes d'intérêt dont on mesure l'expression étant des gènes de résistance à une drogue destinée à lutter contre ces cellules tumorales. Selon une variante les gènes d'intérêt sont les gènes de la Thymidilate Synthase (TS), la dihydropyrimidine déshydrogénase (DPD), la Thymidine kinase (TK), la dihydofolate Réductase (DHFR), la folypolyglutamate synthase (FPGS). La drogue anti-tumorale est le 5 fluorouracile. Selon une variante les gènes d'intérêt sont les gènes de la topoisomérase 1, la topoisomérase 2 alpha et 2 beta. Selon une variante les gènes d'intérêt sont les gènes de la MRP1, MRP2, MDR1, MXR, de l'EGF. Selon un autre aspect l'invention concerne un kit ou nécessaire pour la détection et/ou la quantification de l'expression de plusieurs gènes d'intérêt comprenant une amorce composite standard telle que décrite précédemment et des réactifs nécessaires à l'amplification de cette amorce composite. D'autres aspects et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description qui suit, en référence aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 représente une amorce composite standard selon un premier mode de réalisation de l'invention - la figure 2 représente une amorce composite standard selon un deuxième mode de réalisation de l'invention - la figure 3 représente une amorce composite standard selon un troisième mode de réalisation de l'invention - la figure 4 représente la courbe standard obtenue pour l'enzyme DPD en utilisant l'amorce composite standard selon l'invention, pour un individu témoin non résistant au 5-fluorouracile - la figure 5 illustre le taux anormalement faible de DPD chez un individu résistant au 5-fluorouracile - la figure 6a illustre les étapes de construction successive du standard composite selon le premier mode de réalisation, à l'aide des couples d'amorces chevauchantes, la taille des amplicons augmentant à chaque nouveau couple d'amorces sens et antisens ; la figure 6b représente illustre le détail pour l'étape 1 de construction de la figure 6a - la figure 7 représente l'amplification du standard composite par les différents couples d'amorces dans le premier mode de réalisation - les figures 8a et 8b illustre la détermination d'une droite étalon d'un standard composite sur Light Cycler - les figures 9a à 9e illustrent la détermination des droites étalons de tous les couples d'amorces dans le premier mode de réalisation. On décrit maintenant de manière plus détaillée des modes de réalisation de l'invention, la mesure fiable et rapide de l'expression de plusieurs gènes nécessitant de répondre aux contraintes suivantes : - Très petite quantité de tissus disponible. - Méthode sensible et fiable exigée. - Protocole standard identique requis pour l'ensemble des marqueurs. - Rapidité de l'analyse pour une généralisation de la méthode. - Contrôle de l'homogénéité du produit amplifié et quantifié par la caractérisation postPCR d'une courbe de fusion. Sur ces bases, dans le cadre des traitements par des médicaments anticancéreux, la méthodologie développée par les inventeurs permet de quantifier plusieurs gènes d'intérêt qui sont des marqueurs de résistance de plusieurs ARNm dans les mêmes conditions d'amplification par PCR capillaire en présence de SYBRgreen avec lecture de la fluorescence en temps réel. Ainsi pour le 5-Fluorouracile, les marqueurs enzymatiques reconnus et retenus pour constituer un standard commun sont les suivants : la Thymidilate synthase (TS), la Dihydropyrimidine déshydrogénase (DPD), la Thymidine kinase (TK), la Dihydrofolate réductase (DHFR) et la Folylpolyglutamate synthétase (FPGS). Pour les marqueurs de résistance au CPT11 la Topoisomérase 1 et les topoisomérases II alpha et béta ont été retenues. Pour les marqueurs de résistances membranaires un standard commun a été développé pour MRPl, MRP2, MDRI, MIXR et le récepteur à l'EGF (EGFR). On rappelle que la présente invention utilise différentes techniques conventionnelles appropriées expliquées dans la littérature, par exemple dans Sambrook, Fritsch et Maniatis"Molecular cloning : a laboratory manual (1982), et les principales notions suivantes. Un ADNc est défini comme une copie d'ADN ou ADN complémentaire, et est le produit de la transcription inverse d'un ARNm transcrit. La RT-PCR conduit à la production d'ADNc qui sont complémentaires des ARNm. Le terme oligonucléotide est défini comme une molécule comprenant au moins deux désoxyribonucléotides, de préférence plus de trois. Le terme amorce est utilisé pour désigner un oligonucléotide, soit existant naturellement, soit produit synthétiquement, qui est capable d'agir en tant que point d'initiation de la synthèse d'un produit d'élongation de l'amorce qui est complémentaire d'un brin d'acide nucléique, en présence de nucléotides et d'agents induisant l'élongation tels que l'ADN polymérase, et une température et un pH appropriés. L'amorce peut être soit simple brin soit double brin et doit être suffisamment longue pour générer la synthèse du produit d'élongation désiré en présence de l'agent inducteur. Par le terme"acide nucléique cible"ou"séquence cible"on désigne une séquence d'acide nucléique dont on cherche à détecter la présence, pouvant être simple ou double brin. Si elle est double brin elle peut être dénaturée en simple brin pour être détectée en utilisant les méthodes décrites dans ce document. Par le terme"amplification"on désigne l'augmentation du nombre de copies d'un acide nucléique particulier cible, les dites copies étant appelées des amplicons ou produits d'amplification. Le terme"amorce"fait référence à une molécule d'acide nucléique qui comprend une extrémité 3'qui est soit bloquée et ne peut se lier de façon covalente à des acides nucléiques, soit non bloquée et possède un groupe chimique à l'extrémité 3'qui permettra l'élongation d'une chaîne d'acide nucléique tel que catalysée par une ADN polymérase ou une transcriptase inverse. Le terme amorce composite signifie une amorce comprenant elle-même plusieurs séquences amorces alignées bout à bout, obtenue après jointure de ces séquences successives. On désigne par amorce composite standard l'amorce obtenue par les inventeurs de formule générale Xl-X2-...-X (n-l)-Xn- INT-Y1-Y2-...-Y (n-l)- Yn, sachant que d'autres amorces composites décrites en détail plus loin sont également obtenues. Par"ADN polymérase"on entend des enzymes capables d'incorporer des nucléotides à l'extrémité hydroxyle 3'd'un acide nucléique dans la direction 5'vers 3', de manière à synthétiser une séquence d'acide nucléique. Parmi les ADN polymérases, on peut notamment utiliser l'ADN polymérase I, le fragment protéolytique de l'ADN polymérase I d'E. Coli ( fragment de Klenow ), la Taq polymérase, la T7 polymérase, la polymérase Bst, la T4 polymérase, la T5 polymérase, etc. On désigne par"transcriptase inverse"une enzyme qui catalyse la synthèse d'un ADN complémentaire d'un brin matrice d'ARN en présence de la matrice d'ARN, d'une amorce oligo-désoxynucléotide, et de quatre désoxynucleotides triphosphate, dATP, dGTP, dCTP, dTTP. La réaction est initiée par une liaison non covalente d'une amorce oligo-désoxynucléotide à l'extrémité 3'd'un ARNm, suivie d'une étape d'addition de désoxynucléotides appropriées, selon l'appariement de base avec la séquence nucléotidique de l'ARN m, à l'extrémité 3'de la chaîne en cours d'élongation. Dans le cadre de la présente invention, les gènes d'intérêt choisis, autrement désignés gènes marqueurs ou cibles, sont notamment de deux types : - spécifiques dans le cas des médicaments très largement utilisés dans les tumeurs digestives comme le 5-Fluorouracile et le CPT11. - généraux dans le cas des mécanismes membranaires de résistance. 1-Condition de PCR capillaire. Le programme d'amplification par PCR capillaire avec lecture de fluorescence en temps réel, réalisé sur un appareil Light Cycler (Roche), déterminé pour l'ensemble des standards et donc des ARNm codant pour les marqueurs considérés est le suivant : Dénaturation lOmn 95 Amplification N cycles de 15sec 95 11 sec 55 22sec 72 Fusion Osec 95 30sec 65 Puis d'un gradient de température de 0. 1'/sec jusqu'à 95 Et un refroidissement à 400 pendant 1 mn. 2-Recherche des couples d'amorces remplissant les conditions requises En premier lieu, des amorces spécifiques optimales de chaque marqueur de résistance pertinent ont été sélectionnées. Les amorces permettent l'amplification de fragment d'ADNc ou de standard de taille similaire dans les mêmes conditions de PCR capillaire. Le standard composite est construit par association en escalier des amorces autour d'un fragment d'ADN unique afin d'obtenir des produits d'amplification dont la taille est voisine et équivalente à celle obtenue avec les ARN sauvages rétrotranscrits. Pour chacune de ces enzymes des couples d'amorces compatibles avec la PCR capillaire permettant dans la mesure du possible l'amplification de fragments d'ADN entre 200 et 500pb pour conserver un temps d'élongation de 22sec, pour une température d'hybridation optimale de 55 C et ne produisant pas dans le cadre de dimères d'amorces ou d'amplification non spécifique. La construction et l'amplification du standard matrice composite seront détaillées plus loin pour plusieurs modes de réalisation. Chaque couple d'amorces matrices sélectionné est testé en PCR capillaire en présence de SYBRgreen avec une lecture de fluorescence en temps réel avec le programme de PCR commun fixé au départ sur un produit de rétrotranscription provenant de cellules en culture contenant les ARNm concernés. Les amorces matrices suivantes ont été sélectionnées pour la quantification des marqueurs de résistance au 5-Fluorouracile. (H=séquence humaine, U=amorce sens matrice, D=amorce antisens matrice) TKI H U SEQ aaa gca cag agt tga tga gac TK1 H D SEQ aag tag cag agc cga cac ac TS H D SEQ gt gtg cgc aat cat gta cgt gag TS H U SEQ cat ttt ggg gca gaa tac aga gat DHFR H D SEQ gca gta agc cga ggt cac ac DHFR H U SEQ agtcagcgagcaggttctca DPD H U SEQ tcagaagagctgtccaactaat DPD H D SEQ gaatacctcagtagcaaattgc FPGS H U SEQ ID N 6 gtc ttc ctc caa gag aag gt FPGS H D SEQ gac acc ttg ctt aaa gat gc Les amorces matrices suivantes ont été sélectionnées pour la quantification des marqueurs de résistance au CPT11. (H=séquence humaine, U=amorce sens matrice, D=amorce antisens matrice) topo 1 H U SEQ ID ? 13 gag caa gga aga gaa act ga topo 1 H D SEQ ID N 16 ccg gat ctt gtc cac aca Topo 2 H U SEQ ID N 124 tct tct caa act cag aca atg a beta Topo 2 H D SEQ ID N 17 caa tag gct dgaa gca agt taa t beta topo 2 H U SEQ ID N 15 atg act tca tca aca agg aac t alpha topo 2 H D SEQIDN 18 cattgtaaagatgtatcgtgga alpha Les amorces suivantes ont été sélectionnées pour la quantification des marqueurs de résistance membranaire.. (H=séquence humaine, U=amorce sens, D=amorce antisens). EGFR H U SEQ cgc tgc tggctg cgc tct g EGFR H D SEQ agc cac ctc ctg gat ggt c MDR H U SEQ gag gaa gac atg acc agg ta MDR H D SEQ ctg tcg cat tat agc atg aa MRPI H U SEQ ID N019 agg tca cca cgt act tga ac MRP I H D SEQ cat cga tga tct ctc ct MXR H D SEQ tat gag tgg ctt atc ctg ct MXR H U SEQ ID N022 ctt tgg gat act ttg aat ca MRP 2 H U SEQ ID N 20 caa tac agc aga caa tgg tg MRP 2 H D SEQ aaa tgc tga aaa gat cag ga 3-Construction des standards composites a-Principe général Pour une résistance donnée, après sélection des amorces d'amplification correspondantes, l'amorce standard composite ADN est construite par association séquentielle des séquences oligonucléotidiques grâce à des oligonucléotides composites et autour d'un polynucléotide de 259pb, provenant du clone de récepteur Via de rat dont la séquence SEQ ID N'l est annexée. La séquence utilisée désignée séquence intercalaire INT est soulignée. Cette séquence intercalaire INT est la même pour les trois exemple suivants. b-Exemple 1 : construction du standard de résistance au 5-Fluorouracile Les oligonucléotides composites utilisés pour la construction sont obtenus à partir des amorces sens matrices (ou up) suivantes, avec en correspondance avec la formule générale exposée précédemment : VI a up = Tup, FPGS=X5, DHFR=X4, TK=X3, DPD=X2, TS=XI, VI a down = Tdn : FPGS-Vlaup (Tnup) 5'gtc ttc ctc caa gag aag gtg agg gaa gga agg aca ga 3' DHFR-FPGS up 5'agt cag cga gca ggt tct cag tct tcc tcc aag aga agg t 3' TK-DHFRup (P) 5'aaa gca cag agt tga tga gac agt cag cga gca ggt tct ca 3' DPD-TK up 5'tca gaa gag ctg tcc aac taa taa agc aca gag ttg atg aga c 3' TS-DPD up 5'cat ttt ggg gca gaa tac aga gat tca gaa gag ctg tcc aac taa t 3' Les oligonucléotides composites utilisés pour la construction sont obtenus à partir des amorces matrices antisens (ou down) suivantes : TS-Vla down 5'gat gtg cgc aat cat tga cgt gag cag ctc ctc att gcg tac 3' DPD-TS down 5'gaa tac ctc agt agc aaa ttg cga tgt gcg caa tca tgt acg tga g 3' TK-DPD down 5'aag tag cag agc cga cac acg aat acc tca gta gca aat tgc 3' DHFR-TK down (V) 5'gca gta agc cga ggt cac aca agt agc aga gcc gac aca c 3' FPGS-DHFR down 5'gac acc ttg ctt aaa gat gcg cag taa gcc gag gtc aca c 3' L'ensemble des oligonucléotides est agencé pour former la structure représentée figure 1, ou standard composite ADN bicaténaire [TS-DPD-TK-DHFR-FPGS-INT-TS-DPDTK-DHFR-FPGS]. La construction se fait selon les étapes suivantes (cf figure 6a) : - Etape 1 : amplification par PCR, en présence de l'amorce sens amont mixte FPGS-VI a up, et de l'amorce antisens aval mixte TS-VI a down, de la séquence intercalaire. Après duplication de l'ADN monocaténaire intercalaire INT désigné ADN X sur la figure 1 (dans une autre réalisation on part directement de l'ADN INT bicaténaire), les deux brins de l'ADN intercalaire INT s'écartent : à l'extrémité 5', la séquence VI a up de l'amorce sens FPGS-VI a up s'hybride avec le brin complémentaire de la séquence teminale grisée qui est strictement identique à VI a up. A l'extrémité 3', la séquence VI a down de l'amorce antisens TS-VI a down s'hybride avec la séquence grisée. Il en résulte que la séquence intercalaire est alors prolongée du côté sens par la séquence amorce sens FPGS, et du côté antisens par la séquence amorce antisens TS, pour former un ADN bicaténaire désigné premier composite de séquence : amorce sens FPGS-séquence INT-amorce antisens TS, c'est à dire sous la forme X5-INT-Yl. - Etape 2 : amplification par PCR, en présence de l'amorce sens DHFR-FPGS up, et de l'amorce antisens TS-VI a down, du premier composite obtenu à l'étape 1 : (cf figure 6). A l'extrémité sens, l'amorce DHFR-FPGS up s'hybride avec l'amorce sens du premier composite (amorce sens FPGS-séquence INT-amorce antisens TS). A l'extrémité antisens l'amorce antisens DPD-TS down s'hybride avec le brin complémentaire de la séquence terminale TS down du premier composite. Cette étape de construction séquentielle est répétée pour chaque couple d'amorce sensamorce antisens jusqu'à l'obtention du standard composite [TS-DPD-TK-DHFR- FPGS-INT-TS-DPD-TK-DHFR-FPGS]. La figure 6b illustre les étapes de construction successive du standard à l'aide des couples d'amorces chevauchantes, la taille des amplicons augmentant à chaque nouveau couple d'amorces sens et antisens c-Exemple 2 : construction du standard de résistance au CPT11 Les oligonucléotides composites utilisés pour la construction sont les suivants. Amorces matrices sens (ou up) : Topo II alpha - VIa up 5'atg act tca aca agg aac tga ggg aag gaa gga cag a 3' Topo II beta-Topo Il alpha up 5'tct tct caa act cag aca atg aat gac ttc aac aag gaa ct 3' Topol-Topo II beta up 5'gag caa gga aga gaa act gat ctt ctc aaa ctc aga caa tga3' Amorces matrices antisens (down) : Topo 1 - VIa down 5'ccg gat ctt gtc cac aca cag ctc ctc att gcg tac 3' Topo II beta - Topo 1 down 5'caa tag gct gaa gca agt taa tcc gga tct tgt cca cac a 3' Topo II alpha-Topo II beta down 5'cat tgt aaa gat gta tcg tgg aca ata ggc tga agc aag tta at 3' L'ensemble des oligonucléotides est agencé pour former la structure représentée figure 2 : [TOPO 1-TOP02Beta-TOP02AIpha-INT-TOPO 1-TOP02Beta-TOP02Alpha]. d-Exemple 3 : construction du standard de résistance membranaire Les oligonucléotides composites utilisés pour la construction sont les suivants. Amorces matrices sens (up) : EGFR-Vla up 5'cgc tgc tgg ctg cgc tct gaa ggg aag gaa gga cag a 3' MXR-EGFR up 5'cet tgg gat act ttg aat cac gct gct ggc tgc gct ctg 3' MDR-MXR up 5'gag gaa gac atg acc agg tac ctt ggg ata ctt tga atc a 3' MRP2-MDR up 5'caa tac agc aga caa tgg tgg agg aag aca tga cca ggt a 3' MRPl-MRP2up 5'AGG tca cca cgt act tga acc aat cac gca gac aat ggt g 3' Amorces antisens (down) : MRPl-Vladown 5'cat cga tga tga tct ctc ctc agc tcc tca ttg cgt ac 3' MRP2-MRP 1 down 5'aaa tgc tga aaa gat cag gac atc gat gat gat ctc tcc t 3' MDR-MRP2 down 5'ctg tcg cat tat agc atg aaa aat gct gaa aag atc agg a 3' MXR-MRP down 5'tat gag tgg ctt atc ctg ctc tgt cgc att ata gca tga a 3' EGFR-MXR down 5'agc cac ctc ctg gat ggt cta tga gtg gct tat cet gct 3' L'ensemble des oligonucléotides est agencé pour former la structure représentée figure 3. 4. Mesure de l'expression des gènes d'intérêt. 4.1 Construction des courbes standard pour chaque gène d'intérêt. Le principe expérimental correspond à l'association séquentielle des différentes amorces matrices dans l'ordre établi par PCR de manière que la taille des produits d'amplification soit équivalente. L'amplification de l'amorce standard composite par les couples amorces (XI, Y1), (X2, Y2),..., (Xn, Yn) conduit respectivement aux amorces composites ou ampli cons (XI-... -Xn-INT-YI), (X2-... -Xn-INT-YI-Y2),..., (Xn-INT-YI-... -Yn), la taille des amplicons étant sensiblement identique entre eux. Dans le cas des gènes TS, DPD, TK, DHFR, FPGS, on obtient les amplicons A1=TS-DPD-TK-DHFR-FPGSINT-TS, A2=DPD-TK-DHFR-FPGS-INT-TS-DPD, A3=TK-DHFR-FPGS-INT-TSDPD-TK, A4=DHFR-FPGS-INT-TS-DPD-TK-DHFR, A5=FPGS-INT-TS-DPD-TK- DHFR comme indiqué figure 1 en bas. La taille des couples d'amorces sens et antisens TS (24pb), DPD (22pb), TK (21pb), DHFR (20pb), FPGS (20pb) étant sensiblement identique, en tout cas très proche, la taille des amplicons Al (390pb), A2 (388pb), A3 (386pb), A4 (385pb), A5 (385pb), est sensiblement identique. La migration des amplicons sur un gel de séparation est donc très proche. Les amplicons obtenus par PCR sont liés par T-cloning (technique rappelée notamment dans le brevet US 5 824 704) dans le vecteur PCEM-T Easy (Promégabrevet par exemple US 4 766 072) qui présente l'avantage de posséder un gène de résistance pour l'ampicilline et des promoteurs d'ARN polymérase en sens et antisens du fragment inséré afin de pouvoir synthétiser in vitro un ARN complémentaire si nécessaire. Le produit de liaison est utilisé pour transformer des cellules JM109 et les bactéries sont sélectionnées sur LB Agar ampicilline. Un clone est sélectionné, amplifié et le plasmide est extrait puis purifié. L'ADN est quantifié par densité optique à 260nm et par fluorescence puis conservé à-20 C. La caractérisation finale de chaque construction est effectuée par séquençage d'ADN. Chaque standard commun composite est utilisé en gamme de concentration de 10 OOOfg à Ifg lors d'une quantification par PCR capillaire dans les conditions préconisées par Roche dans le kit Faststart DNA master SYBRgreenI. La figure 7 (amplification de 0.5 ng de standard composite par les différents couples d'amorces) permet de vérifier que l'amplification du standard composite est la même quelque soit le couple d'amorce utilisé. La figure 8a indique comment fixer la ligne de base en début de phase exponentielle où l'amplification par PCR est proportionnelle à la quantité de standard composite. La figure 8b exprime la corrélation des points obtenus sur la ligne de base D en fonction des concentrations d'ADN de départ, le rendement étant R=10 (1/pente)-1. Les figures 9a à 9e, qui déterminent les droites étalons pour les couples d'amorces respectivement TK, DPD, FPGS, TS, DHFR, permettent de vérifier que l'efficacité et le rendement sont sensiblement identiques pour tous les couples d'amorces quelque soit la concentration de l'amorce standard composite. Plus précisément la méthode de construction des standards composites a été la suivante dans une réalisation préférée, illustrée par la figure 6. Etape 1 PCR1 1 l D'ADN Via (lOng/1) lOng 2p1 des amorces de l'étape 1 (5pmol/ l chaque) 10pmol 22fll H2û programme PCR : 2. 5min 94 C Equilibré à 80 C Ajouter 251il mix 5 ; J tampon 10X 2X 2. 5 l MgCl2 50mM 5mM 0. 5 l Taq (5u/I. d, Eurobio) 1 unité 2î dNTPs 10mM (Sigma) 0.4mM 15 lH2O Programme PCR 30s 94 C 1 1 min 550C 20 cycles 1. 5min 72 C Analyse du produit d'amplification par électrophorèse sur gel d'agarose à bas point de fusion 0.8% (LMP Agarose Eurobio) en tampon Tris borate EDTA (TBE) Extraction du produit d'amplification et utilisation pour la PCR suivante Etape 2 PCR2 1 tu 1 du produit obtenu précédemment 21. 11 amorces de l'étape 2 (5pmol/u l chaque) lOpmol 22ul H20 + 25 l mix S joli tampon 10X 2X 2. 51 MgC12 50mM 5mM 0. 5 l Taq (5u/ l, Eurobio) 1 unité 2 l dNTPs 10mM (Sigma) 0. 4mM 15 l H2O Le programme, l'analyse et l'extraction du produit d'amplification sont réalisés dans les mêmes conditions que dans la première étape. Les amplifications successives des différentes étapes sont réalisées afin d'obtenir le standard composite final Le clonage du standard à l'aide des différents couples d'amorce suit le mode opératoire suivant (clonage standard pGEM#-T easy vector system II (Promega)) : - Analyse du produit d'amplification par électrophorèse sur gel d'agarose à bas point de fusion 0.8% (LMP Agarose Eurobio) en tampon Tris borate EDTA (TBE) en présence de BET. Découpe du gel et extraction de l'ADN par QIAEX II (Qiagen) et reprise dans 20 l d'eau stérile 3'dA extension zu standard purifié 1 gel tampon 10X IX 0. 5 l MgC12 50mM 0. 2mM 1 l dATP 2mM 0. 2mM 1 gel Taq (5u/l, Eurobio) 5 unités 4. 5 l H20 Ligation dans PGEM-T 2 l produit de 3'dA extension 25 ng 5 l tampon 2X IX 1 l pGEM-T (50ng/ l, Promega) 50 ng 1 l T4 DNA ligase (3u/jl) 3 unités lu III H20 - Transformation de 50ul de bactéries compétentes JM109 avec 2 et 5111 de produit de ligation. - Culture des bactéries sur un milieu solide LuriaBroth agarose contenant lOOug/ml d'ampicilline et IPTG (lmM)/X-gal (lOOg/ml) - Incubation à 37 durant 12 h - Sélection des clones par PCR sur un aliquot de chaque colonie - Amplification des colonies positives dans du milieu liquide LuriaBroth contenant 100 g/ml d'ampicilline à 37 durant 16h sous agitation. -Préparation du plasmide recombinant par la méthode Qiagen (QIApep Spin mini prep kit) - Vérification du plasmide par analyse électrophorétique, et séquencage selon la méthode de Sanger dans un séquenceur capillaire. - Quantification du plasmide par densité optique à 260nm, et conservation du plasmide recombinant dans 10 mM Tris. HCI, pH 8,5. à-20 C - Vérification par PCR que chaque couple d'amorce pour chaque gène amplifie l'ADN recombinant composite obtenu dans les mêmes conditions et génère un fragment d'ADN avec une température de fusion unique et de la taille attendue. 4.2 Niveau témoin Pour exemple à partir de 500ul de sang total, les ARN totaux sont extraits, hybridés avec des nucléotides héxamériques au hasard puis rétrotranscrits par la MMLV. Un quantifiable des ARNm de la G3PDH ou gène de référence est effectué par rapport à une quantité connue de G3PDH. On rappelle que la détection d'un ADN par PCR quantitative ou d'un ARNm par PCR-RT fait intervenir l'utilisation d'un contrôle interne qui est co-amplifié avec la séquence cible ADN ou ARNm. La séquence contrôle est amplifiée de manière compétitive avec la séquence cible dans l'échantillon analysé. Ainsi, pendant l'amplification PCR, la séquence contrôle donnera des produits d'amplification de taille différente des produits d'amplification de la séquence cible. La séparation par des procédures de séparation standard de ces acides nucléiques de différentes tailles peut alors être obtenue à l'aide de techniques de séparation par taille appropriées telles que par une méthode d'électrophorèse sur gel d'agarose. La proportion entre la séquence cible et la séquence contrôle est ainsi calculée : l'intensité de la bande est rapportée au log du nombre de copies de la séquence cible de l'échantillon. 4.3 Quantification de l'expression des gènes d'intérêt. Pour quantifier le niveau d'expression des gènes d'intérêt de l'échantillon biologique, on procède typiquement de la manière suivante, en prenant l'exemple des gènes d'intérêt TS-DPD-TK-DHFR-FPGS : Etape 1 : on prépare l'échantillon biologique, par exemple un extrait cellulaire dont on extrait les ARNm ensuite rétrotranscrits par RT-PCR en ADNc de manière à obtenir un échantillon de test. Selon une réalisation on sélectionne avant la RT-PCR les ARNm d'intérêt parmi les ARNm totaux extraits. Etape 2 : on ajoute à l'échantillon de test l'amorce standard composite ADN bicaténaire [TS-DPD-TK-DHFR-FPGS-INT-TS-DPD-TK-DHFR-FPGS]. Etape 3 : on effectue, à l'aide des réactifs et dans les conditions d'amplification appropriés, l'amplification de l'ADN de l'échantillon de test, en présence des couples d'amorces sens et antisens TS, DPD, TK, DHFR, FPGS. L'amplification est donc compétitive entre les ADNc TS, DPD, TK, DHFR, FPGS obtenus par transcription inverse et l'amorce standard composite. Pendant cette amplifiction, l'amplification du standard composite avec le couples d'amorces des gènes TS, DPD, TK, DHFR, FPGS conduit respectivement aux amplicons Al à A5. Une fois l'amplification terminée on détermine à l'aide des courbes standards de chaque amplicon Al à A5, la quantité d'acide nucléique de chacun des gènes d'intérêt, donc quasiment simultanément pour les cinq gènes. La figure 8 présente la migration simultanée dans cinq puits de gel différents, chaque amplicon étant marqué avec un marqueur différent des autres amplicons. Le niveau de fluorescence permet de déduire le niveau d'expression du gène correspondant pour chaque amplicon, sachant que pour chaque amplicon Al,..., A5, un niveau de fluorescence mesuré correspond à une concentration donnée en amplicon après un nombre de cycles d'amplification donné. On en déduit la quantité de chaque amplicon A1,..., A5 issu de l'échantillon de test, que l'on compare à un niveau témoin correspondant à la quantité de chaque amplicon A1,..., A5 en présence d'une quantité connue d'ADNc extrait de l'échantillon biologique. Puisque la taille des fragments à amplifier, la température d'hybridation des différentes amorces sont les mêmes, un seul programme de PCR est systématiquement utilisé. f-Exploitation des résultats. La quantification obtenue permet de normaliser les échantillons soit de témoigner du rendement d'extraction des ARN et de l'efficacité de la rétrotranscription pour chaque échantillon. Deux échantillons sont analysés : un témoin (3) g, et un patient (109) ayant fait une toxicité grave au 5-Fluorouracile. Les deux échantillons sont quantifiés pour les marqueurs au 5-Fluorouracile à l'aide du standard composite correspondant puis normalisés par rapport à la G3PDH. Pour exemple, la courbe standard obtenue pour la DPD avec le standard commun au 5-Fluorouracile est représentée figure 4. Après normalisation des résultats obtenus par la G3PHD seule la quantité de DPD est notablement altérée comme cela est montré dans la figure suivante 5. Les résultats indiquent clairement que le patient 109 ayant fait une toxicité à un traitement au 5-Fluorouracile montre un taux faible de DPD relatif à la G3PDH. Ce déficit visualisé rétrospectivement par la méthode développée aurait été très utile en prospectif au praticien. La description qui précède met en valeur les nombreux avantages de l'invention, notamment : - l'amélioration des techniques de pharmacocinétique de médicaments cytostatiques, et plus particulièrement de pharmacogénétique. L'invention permet en particulier, en s'appuyant sur l'étude des variations individuelles du métabolisme de certains médicaments sur les individus, notamment du 5-fluorouracile, d'adapter les doses aux patients afin d'améliorer l'efficacité et de réduire la toxicité des traitements - une meilleure adaptation du traitement à la tumeur, en permettant de quantifier l'expression des gènes impliqués dans les mécanismes de résistance et d'aider à choisir les médicaments en fonction, en s'appuyant sur l'étude des phénomènes de résistance des cellules tumorales aux médicaments anticancéreux - l'amélioration du traitement : - de différents types de résistance multidrogue, dans les lymphomes non hodgkiniens et les carcinomes rénaux, associés aux gènes MDR, MRP et REGF - de la résistance acquise des cellules tumorales digestives aux médicaments anticancéreux, et notamment : - la résistance aux 5-fluoro-uracile impliquant les protéines : thymidylate synthétase (TS), dyhydropyrimidine déhydrogénase (DPD), folylpolyglutamate synthétase (FPGS), thymidine kinase (TK), thymidine phosphorylase (TP), - la résistance à l'irinotecan associée à l'expression des gènes de la topoisomérase 1 (TOPOI) On a décrit comme marqueur fluorescent le SYBR Green. D'autres marqueurs tels que le YO-PRO-1, thiazole orange, Hex. pico green, edans, fluorescein, FAM, or TET sont utilisables. En outre, on a décrit des exemples de réalisation utilisant la RT PCR qui est la méthode préférée. Toutefois d'autres méthodes PCR peuvent également être utilisées permettant d'amplifier un ADN ou un ARN. Il existe actuellement de nombreux procédés permettant cette amplification, rappelés dans le document US 6 180 341, par exemple : - les techniques dites"NASBA" (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) (Compton, 1991) et 3SR : les acides nucléiques peuvent être préparés pour l'amplification par une extraction au phénol-chloroforme, une dénaturation par la chaleur de l'échantillon clinique, un traitement avec un tampon de lyse et des colonnes pour l'isolation de l'ADN et de l'ARN, ou par extraction de l'ARN au chlorure de guanidine. Ces techniques d'amplification impliquent le réchauffage d'une sonde de séquences cibles spécifiques. Après la polymérisation, les hybrides ADN-ARN sont digérés avec une RNaseH, tandis que les molécules d'ADN double brin sont à nouveau dénaturées par la chaleur. L'ADN simple brin est transformé en ADN double brin par l'addition d'une seconde amorce spécifique, suivie d'une polymérisation. Les molécules d'ADN double brin sont alors transcrites en copies multiples par une polymérase telle que la T7 ou la SP6. Dans un cycle de réaction isothermique, les ARN sont transcrits de manière reverse en ADN double brin, et sont transcrits à nouveau avec une polymérase telle que la T7 ou la SP6. Les produits résultants qu'ils soient partiels ou complets, indiquent les séquences spécifiques cibles. - les techniques"TAS" (Transcription Based Amplification system) (Guatelli et al., 1999). - les techniques"LCR" (Ligase Chain Reaction) (Landegren et al., 1988) notamment décrites dans le document EP 320 308 : la LCR est une méthode selon laquelle l'amplification d'une cible est obtenue avec seulement une ADN ligase. Dans la réaction, quatre sondes sont hybridées par paires adjacentes entre elles sur chaque brin de l'ADN cible. L'espace entre les sondes est fermé par une ADN ligase de manière que deux nouveaux brins d'ADN soient produits. Le document WO 93/02215 utilise une amplification LCR faisant intervenir deux sondes LCR supplémentaires. Ces sondes s'hybrident à la partie unique d'un ADN contrôle. - la technique SDA (Strand Displacement Amplification, ou Techniques d'Amplification et Déplacement de Brain, décrite par Walker et al. en 1992), notamment décrite dans les documents US 5,270, 184, US 5,455, 166, US 5,624, 825, W00061816 : cette technique permet l'amplification isothermique d'acides nucléiques impliquant des cycles successifs de déplacement de brin et de synthèse. - la technique CPR (Cycling Probe Reaction), décrite par Duck et al. en 1990 : une sonde ayant des séquences 3'et 5'd'ADN non spécifiques, et une séquence intermédiaire d'ARN spécifique, est hybridée avec un ADN présent dans l'échantillon ; lors de l'hybridation la réaction est traitée avec une RNaseH, et les produits de la sonde sont identifiés comme produits distinctifs libérés après la digestion, la matrice originale est réchauffée pour un autre cycle avec sonde et la réaction est répétée. - la technique TMA (Transcription Mediated Amplification). la technique RCR (Repair Chain Reaction), décrite par Segev en 1992 : cette technique implique le réchauffage de plusieurs sondes autour d'une région cible pour l'amplification, suivi d'une réaction de réparation dans laquelle seulement deux des quatre bases sont présentes, les deux autres bases pouvant être ajoutées pour une détection facile en tant que dérivées biotinylés. la technique d'amplification à la Qss réplicase, décrite par Miele et al. en 1983, perfectionnée notamment par Chu et al. en 1986, Lizerdi et al. en 1988 puis par Burg et al. ainsi que par Stone et al. en 1996, également décrite dans le document PCT/US 97/00880 : dans cette méthode une séquence répliquante d'ARN comprenant une région complémentaire de celle de la cible est ajoutée à l'échantillon en présence d'ARN polymérase, la polymérase recopie la séquence répliquante qui peut alors être détectée. la technique ssRNA (Amplification d'Acide Nucléique impliquant la synthèse cyclique d'un ARN simple brin), décrite dans le document EP 329, 822 : l'ARN simple brin est une première matrice pour une première amorce oligonucléotidique, qui est étendue par des transcriptases inverses (ADN polymérase ARN dépendante). L'ARN est alors enlevé du duplex ADN-ARN résultant, par l'action d'une ribonucléase H. Le ssDNA résultant est une seconde matrice pour une seconde amorce qui est étendue par une ADN polymérase conduisant à un ADN double brin (dsDNA), ayant une séquence identique à celle de l'ARN d'origine, entre les amorces et ayant en plus, à une extrémité, une séquence promoteur. Cette séquence promoteur peut être utilisée par un ARN polymérase approprié pour construire des multiples copies ARN de l'ADN. Ces copies peuvent être réintroduites dans le cycle d'une forte amplification. Du fait de la nature cyclique de ce procédé, la séquence de départ peut être aussi bien un ADN qu'un ARN la technique ssDNA, décrite dans le document WO 89/06700. Bibliographie 1-0mura K, Morishita M, Kawakami K, Kanehira E, Ishida Y, Watanabe Y. Quantification of thymidylate synthase gene expression in human gastrointestinal carcinoma tissues using competitive PCR. Hepatogastroenterology. 1999 Mar-Apr ; 46 (26) : 985-90. 2-Houze TA, Larsson L, Larsson PA, Hansson G, Asea A, Gustavsson B. Rapid detection of thymidylate synthase gene expression levels by semi-quantitative competitive reverse transcriptase polymerase chain reaction followed by quantitative digital image analysis. TumourBiol. 1996 ; 17 (5) : 306-19. 3-Maddens S, Tiberghien P, Contassot E, Certoux JM, Chalmers D, Otto E, Herve P, Ferrand C. Development of a competitive PCR method for in vitro and in vivo quantification of herpes simplex virus thymidine kinase and neomycin resistanceexpressing cells used in a clinical trial. J Hematother Stem Cell Res. 2000 Apr ; 9 (2) : 225-36. 4-Rots MG, Willey JC, Jansen G, Van Zantwijk CH, Noordhuis P, DeMuth JP, Kuiper E, Veerman AJ, Pieters R, Peters GJ. mRNA expression levels of methotrexate resistance-related proteins in childhood leukemia as determined by a standardized competitive template-based RT-PCR method. 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Clin Cancer Res. 2000 Apr ; 6 (4) : 1322-7. 16-Johnson MR, Wang K, Smith JB, Heslin MJ, Diasio RB. Related Articles Quantitation of dihydropyrimidine dehydrogenase expression by real-time reverse transcription polymerase chain reaction. Anal Biochem. 2000 Feb 15 ; 278 (2) : 175-84. REVENDICATIONS 1. Séquence amorce composite standard d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle est de formule générale : Xl-...-Xp-... X (n-l)-Xn-INT-Yl-...-Yp-...-Y (n-l)-Yn Dans laquelle : - XI est une amorce matrice sens d'un premier gène d'intérêt - Xp est une amorce matrice sens d'un pième gène d'intérêt - Xn est une amorce matrice sens d'un nième gène d'intérêt - INT est une séquence intercalaire - YI est une amorce matrice antisens du premier gène d'intérêt - Yp est une amorce matrice antisens du pième gène d'intérêt - Yn est une amorce matrice antisens du nième gène d'intérêt Avec n entier 22 et de préférence inférieur à 10, et variants de ladite séquence amorce composite, ladite séquence amorce composite étant apte à servir de matrice d'amplification PCR, l'amplification par tout couple amorce (Xp, Yp) capable de s'hybrider avec le couple amorce matrice (Xp, Yp) et d'amplifier ladite séquence amorce composite conduisant à un produit d'amplification (Xp-... Xn-INT-Yl-...-Yp) sensiblement de même taille quelque soit p, ladite séquence étant destinée à la mesure de l'expression simultanée d'au moins deux de ces gènes d'intérêt. 2. Amorce composite standard selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un ADN mono ou bicaténaire. 3. Amorce composite standard selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que la taille des séquences amorces matrices sens XI,... Xn, et des amorces matrices antisens YI,... Yn est sensiblement identique. 4. Amorce composite standard selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que la taille des séquences matrices amorces sens XI,... Xn, et des amorces matrices antisens YI,... Yn est comprise entre 5 et 50 bases, avantageusement 10 à 20 bases, et la taille de la séquence INT intercalaire est comprise entre 50 et 1000 bases, avantageusement 200 à 500 bases. 5. Amorce composite standard selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que la séquence intercalaire correspond à SEQ ID N'l. 6. Amorce composite standard selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que les gènes d'intérêt sont choisis parmi les gènes de résistance aux produits anticancéreux. 7. Amorce composite standard selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que n=5 avec : - XI amorce matrice sens de la Thymidilate Syntase (TS), de séquence SEQ ID N02 - X2 amorce matrice sens de la dihydropyrimidine déshydrogénase (DPD), de séquence SEQ ID ? 3 - X3 amorce matrice sens de la Thymidine kinase (TK), de séquence SEQ ID N04 - X4 amorce matrice sens de la dihydofolate Réductase (DHFR), de séquence SEQ ID N05 - X5 amorce matrice sens de la folypolyglutamate synthase (FPGS), de séquence SEQ ID N06 INT séquence intercalaire de séquence SEQ ID N 7 - YI amorce matrice antisens de la Thymidilate Syntase, de séquence SEQ ID N08 - Y2 amorce matrice antisens de la dihydropyrimidine déshydrogénase, de séquence SEQ ID N 9 - Y3 amorce matrice antisens de la Thymidine kinase, de séquence SEQ ID NO 1 0 Y4 amorce matrice antisens de la dihydofolate Réductase, de séquence SEQ ID N'l 1 - Y5 amorce matrice antisens de la folypolyglutamate synthase, de séquence SEQ ID NO 12 SEQ ID N'l 2 8. Amorce composite standard selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que n=3 avec : - XI amorce matrice sens de la Topoisomérase 1, de séquence SEQ ID ? 13 - X2 amorce matrice sens de la Topoisomérase 2 beta de séquence SEQ ID ? 14 - X3 amorce matrice sens de la Topoisomérase 2 alpha de séquence SEQ ID N015 - INT séquence intercalaire de séquence SEQ ID ? 7 - YI amorce matrice antisens de la Topoisomérase 1, de séquence SEQ ID ? 16 - Y2 amorce matrice antisens de la Topoisomérase 2 beta de séquence SEQ ID ? 17 - Y3 amorce matrice antisens de la Topoisomérase 2 alpha de séquence SEQ ID N018 9. Amorce composite standard selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que n=5 avec : - XI amorce matrice sens de la protéine MRP1 de séquence SEQ ID N 19 - X2 amorce matrice sens de la protéine MRP2, de séquence SEQ ID ? 20 - X3 amorce matrice sens de la protéine MDR1, de séquence SEQ ID ? 21 - X4 amorce matrice sens de la protéine MXR, de séquence SEQ ID ? 22 - X5 amorce matrice sens du récepteur EGF, de séquence SEQ ID N 23 - INT séquence intercalaire de séquence SEQ ID N7 - Yl amorce matrice antisens de la protéine MRP1 de séquence SEQ ID N 24 - Y2 amorce matrice antisens de la protéine MRP2 de séquence SEQ ID N 25 - Y3 amorce matrice antisens de la protéine MDR1 de séquence SEQ ID N 26 - Y 4 amorce matrice antisens de la protéine MXR de séquence SEQ ID N 27 - Y5 amorce matrice antisens du récepteur EGF de séquence SEQ ID N 28 10. Vecteur de clonage caractérisé en ce qu'il comprend une séquence amorce standard composite selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 11. Cellule hôte caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur selon la revendication 10. 12. Procédé de préparation d'une amorce composite selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'il comprend successivement les étapes : - A) préparation de la séquence intercalaire double brin - B) préparation d'une séquence Xn-INT-Y1, par amplification PCR de la séquence intercalaire INT à l'aide : 0 d'une première amorce amont mixte sens Xn-Tup, Tup étant complémentaire de la séquence terminale amont de la séquence intercalaire INT 0 et d'une première amorce aval mixte antisens Tdn-Yl, Tdn étant une séquence complémentaire de la séquence terminale aval de la séquence intercalaire - C) préparation d'une séquence X (n-l) -Xn-INT-YI-Y2, par amplification de la séquence Xn-INT-Yl, à l'aide d'une deuxième amorce amont mixte sens X (n- l)-Xn et d'une deuxième amorce aval mixte Y1-Y2 - D) préparation d'une séquence X (n-2)-X (n-l)-Xn-INT-Yl-Y2-Y3, par amplification de la séquence X (n-l)-Xn-INT-Yl-Y2, à l'aide d'une amorce amont mixte sens X (n-2)-X (n-l) et d'une deuxième amorce aval mixteY2-Y3 - répétition de l'étape d) pour chaque amorce composite successivement jusqu'à obtenir l'amorce composite standard XI-X2-...-X (n-l)-Xn- INT-Y1-Y2-...- Y (n-l)-Yn. 13. Procédé de mesure de l'expression de plusieurs gènes d'intérêt d'un échantillon biologique utilisant une technique PCR, comprenant les étapes : - a) préparation d'un échantillon biologique à tester comportant l'extraction des acides nucléiques représentatifs de l'expression d'au moins deux desdits gènes d'intérêt - b) mise en présence d'une amorce standard composite spécifique selon l'une quelconque des revendication 1 à 9, avec lesdits acides nucléiques représentatifs - c) amplification compétitive desdits acides nucléiques représentatifs et de ladite amorce standard composite, en présence d'au moins deux des couples d'amorces marqués (Xl, Yl), (X2, Y2),... (Xn, Yn), dans des conditions permettant l'amplification dans le même essai des couples d'amorces testés de manière quantitiativement sensiblement égale - d) mise en évidence et quantification des produits d'amplification de façon à en déduire simultanément et quantitativement l'expression d'au moins deux des n gènes d'intérêt dans l'échantillon biologique. 14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la quantification fait intervenir une comparaison de l'amplification de l'amorce standard composite à l'issue de l'étape c) par rapport à cette amplification en l'absence ou en présence d'une quantité connue desdits acides nucléiques. 15. Procédé selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que les couples d'amorces sont marqués par un marqueur radioactif ou non radioactif. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendication 13 à 15, caractérisé en ce que la PCR est une RT PCR, lesdits acides nucléiques étant les ADNc obtenus à partir des ARNm représentatifs de l'expression desdits gènes d'intérêt. 17. Procédé selon la revendication l'une quelconque des revendication 13 à 16, caractérisé en ce que l'amplification de l'amorce standard matrice composite par les couples amorces (XI, Yl), (X2, Y2),..., (Xn, Yn) conduit respectivement aux amplicons (Xl-...-Xn-INT-Yl), (X2-...-Xn-INT-Yl-Y2),..., (Xn-INT-Yl-...-Yn), la taille des amplicons étant sensiblement identique entre eux. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendication 13 à 17, caractérisé en ce que l'échantillon à tester est issu de cellules tumorales, les gènes d'intérêt dont on mesure l'expression étant des gènes de résistance à une drogue destinée à lutter contre ces cellules tumorales. 19. Procédé selon l'une quelconque des revendication 13 à 18, caractérisé en ce que les gènes d'intérêt sont les gènes de la Thymidilate Synthase (TS), la dihydropyrimidine déshydrogénase (DPD), la Thymidine kinase (TK), la dihydofolate Réductase (DHFR), la folypolyglutamate synthase (FPGS). 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que la drogue antitumorale est le 5 fluorouracile. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendication 13 à 17, caractérisé en ce que les gènes d'intérêt sont les gènes de la topoisomérase 1, la topoisomérase 2 alpha et 2 beta. 22. Procédé selon l'une quelconque des revendication 13 à 17, caractérisé en ce que les gènes d'intérêt sont les gènes de la MRP1, MRP2, MDR1, MXR, de l'EGF. 23. Kit ou nécessaire pour la détection et/ou la quantification de l'expression de plusieurs gènes d'intérêt caractérisé en ce qu'il comprend une amorce composite standard selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 et des réactifs nécessaires à l'amplification de cette amorce composite.