Brevet FR2832716A1 — publié le 20030530

PROTÉINE DE FUSION AYANT AUGMENTÉ L'ACTIVITÉ IN VIVO DE L'ÉRYTHROPOÏÉTINE DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne une protéine de fusion ayant augmenté l'activité in vivo de l'érythropoïétine (EPO, ci-dessous) qui est un nouveau médicament pour le traitement de l'anémie. Spécifiquement, la présente invention concerne la protéine de fusion ayant grandement augmenté l'activité et le temps de demi-vie in vivo de l'érythropoïétine par la fusion d'une molécule d'EPO avec un certain peptide qui présente une activité d'élongation du temps de demi-vie et qui dérive du corps humain. ART ANTÉRIEUR L'EPO, une glycoprotéine ayant un poids moléculaire de 30 000 à 34 000, est un facteur qui stimule la production et la différentiation des globules rouges. Cette protéine agit en se liant à des récepteurs sur des cellules précurseurs des érythrocytes, ce qui résulte en une augmentation de la concentration en ions calcium dans une cellule, en une augmentation de la biosynthèse d'ADN, et en une stimulation de la formation d'hémoglobine et de ses analogues. Cette EPO peut être utilisée pour le traitement de l'anémie provoquée par une insuffisance rénale, de l'anémie du nourrisson prématuré, de l'anémie due à l'hyperthyroïdie, de l'anémie due à la malnutrition, etc. L'utilisation clinique d'EPO humaine recombinante est en augmentation. Cependant, une telle utilisation peut avoir des inconvénients et des coûts élevés car elle devrait être administrée en moyenne trois fois par semaine à cause de son court temps de demi-vie. Ainsi, si l'activité in vivo de l'EPO est maintenue pendant longtemps, la fréquence d'administration de l'EPO pourra être sensiblement diminuée. L'efficacité de l'EPO est proportionnelle à son temps de demi-vie in vivo. On sait que le temps de demi-vie in vivo de l'EPO est en corrélation avec le contenu en acide sialique situé sur l'extrémité des chaînes de sucres de l'EPO. Donc, l'efficacité de l'EPO dépend fortement de la présence de chaînes de sucres. Étant donné que les formes des sucres apparaissent différemment selon le type de cellules où l'EPO est exprimée, les mêmes glycoprotéines peuvent avoir une structure sucre différente si elles sont exprimées dans des cellules différentes. Bien qu'il ait été récemment démontré qu'une bactérie peut lier les chaînes de sucres, on sait que des bactéries typiques, par exemple E. Coli, ne le font pas. Les protéines exprimées dans E. Coli ne contiennent pas les chaînes de sucres et donc, l'EPO dérivée de E. Coli, qui ne contient pas les chaînes de sucres, présente une activité in vitro positive, mais pas d'activité in vivo. C'est parce que l'EPO déglycosylée est rapidement éliminée du corps humain et a un temps de demi-vie très court. En conclusion, les chaînes de sucres jouent un rôle très important dans l'activité de l'EPO. De nombreuses études ont été menées afin d'accroître l'activité de l'EPO. La principale approche est la substitution d'acides aminés de l'EPO par mutagenèse sur le gène de l'EPO. Par exemple, la demande de brevet PCT/US94/09257, déposée par Amgen et intitulée "Analogues de l'érythropoïétine", décrit un procédé pour accroître le temps de demi-vie in vivo de l'EPO en augmentant les teneurs en sucres par mutagenèse. De même, une tentative pour augmenter le temps de demi-vie in vivo de l'EPO a été effectuée par la formation de dimères d'EPO (voir A.J. Sytkowski et al., J.B.C. vol. 274, n 35, pp 24773-24778). D'autre part, un autre procédé connu consiste à augmenter l'activité in vivo de l'EPO en fusionnant de nouveaux acides aminés, des peptides ou des fragments de protéines avec des molécules d'EPO sur le mode du génie génétique, et en augmentant la teneur en sucres, c'est-à-dire la teneur en acide sialique de l'EPO. Cependant, tous les acides aminés, les peptides ou les fragments de protéines hétérogènes ne peuvent pas être utilisés dans ce but. Dans la plupart des cas, de telles modifications peuvent résulter en une baisse ou une perte de l'activité inhérente à la protéine et peuvent causer un problème d'antigénicité lors d'une utilisation in vivo. Bien que cela ne soit pas en relation avec l'EPO, des protéines de fusion ou des protéines chimériques ont été étudiées, par exemple, pour l'hormone stimulant le follicule qui est une sorte d'hormone sexuelle (voir Furuhashi et al., 1995, Mol. K(3co/). Cependant, les procédés n'ont pas été appliqués dans l'industrie car les modifications de protéines utilisant un procédé de génie génétique comportent de nombreux risques. En fait, dans la plupart des cas, la protéine cible ne peut pas être obtenue facilement sans savoir-faire professionnel, et au contraire, l'activité inhérente à la protéine peut être diminuée ou perdue par l'addition ou la substitution de nouveaux acides aminés. DESCRIPTION DE L'INVENTION Les présents Inventeurs ont étudié de manière étendue de nouveaux procédés pour augmenter in vivo l'activité de l'EPO en fusionnant de nouveaux acides aminés, des peptides ou des fragments de protéines avec la molécule d'EPO, afin de ce fait d'en accroître la teneur en sucres. En résultat de cela, les présents Inventeurs ont découvert qu'une protéine de fusion de l'EPO, obtenue en fusionnant un peptide carboxy-terminal (CTP, ci-dessous) de la thrombopoïétine (TPO, ci-dessous), une protéine qui existe déjà dans le corps humain, avec l'extrémité carboxy-terminale de l'EPO, a fortement augmenté le temps de demi-vie in vivo grâce à de nombreux acides aminés qui augmentent le site de glycosylation sans perte de l'activité inhérente à l'EPO, et ne provoquant pas d'antigénicité lorsqu'on l'applique au corps humain. Ensuite, les inventeurs ont effectué la présente invention. Donc, l'objet de la présente invention est de fournir une protéine de fusion ayant augmenté l'activité in vivo de l'EPO humaine et contenant le CTP de la TPO fusionné à l'EPO humaine à l' extrémité carboxy-terminale de celle-ci. Un autre objet de la présente invention est de fournir un acide nucléique codant la protéine de fusion, un vecteur recombinant contenant l'acide nucléique, et une lignée cellulaire hôte transformée par le vecteur recombinant. Encore un autre objet de la présente invention est de fournir un procédé de préparation de la protéine de fusion ayant augmenté l'activité in vivo de l'EPO humaine en cultivant la lignée cellulaire transformée. D'abord, la présente invention concerne la protéine de fusion ayant augmenté l'activité in vivo de l'EPO humaine et contenant le CTP de la TPO fusionné avec l'EPO humaine sur l' extrémité carboxy-terminale de celle-ci. Le CTP comprend de préférence la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 qui correspond aux acides aminés des positions 176 à 353 (LTP, ci-dessous), ou des parties de celle-ci, en particulier la séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 2 qui correspond aux acides aminés des positions 337 à 353 (STP, ci-dessous). En particulier, la protéine de fusion, selon la présente invention, peut comprendre la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 3 ou 4. Deuxièmement, la présente invention concerne un acide nucléique codant la protéine de fusion, un vecteur recombinant contenant l'acide nucléique, et une lignée cellulaire hôte, de préférence une cellule CHO (ovaire de hamster chinois), transformée avec le vecteur recombinant. Troisièmement, la présente invention concerne un procédé de préparation de la protéine de fusion ayant augmenté l'activité in vivo de l'EPO humaine par la culture de la lignée cellulaire transformée. La présente invention sera expliquée ci-dessous plus en détail. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES Les figures la et lb représentent les séquences nucléotidiques et d'acides aminés des peptides carboxy-terminaux (LTP, STP) de la TPO ; Les figures 2aa et 2ab représentent les séquences nucléotidiques et d'acides aminés de ELTP, qui est une protéine de fusion de l'EPO et du peptide LTP, et la Figure 2b représente les séquences nucléotidiques et d'acides aminés de ESTP, qui est une protéine de fusion de l'EPO et du peptide STP ; Les figures 3a et 3b sont des schémas montrant les procédures de préparation des vecteurs d'expression, pADNc-ELTP et pADNc-ESTP ; La figure 4 est une photo d'électrophorèse de ELTP et ESTP exprimées et ; La figure 5 est un graphique montrant les résultats pharmacocinétiques de l'EPO, de ELTP et de ESTP. MEILLEUR MODE DE RÉALISATION DE L'INVENTION La présente invention comprend les étapes de préparation et le clonage d'un gène de ia protéine de fusion désirée, la construction d'un vecteur d'expression contenant le gène désiré, la transformation d'une cellule animale, l'expression, la purification et le test biologique. (1) Préparation du gène L'ADNc de l'EPO peut être obtenu en pratiquant une technique conventionnelle de PCR (PCR PreMix Kit of Bioneer Co. ) en utilisant les amorces complémentaires des extrémités de l'ADNc de l'EPO (EPI et EP2) provenant de la bibliothèque d'ADNc de foie de foetus humain (Invitrogen Co. ). L'ADNc de la TPO peut être obtenu en utilisant les amorces complémentaires des extrémités de l'ADNc de la TPO (Tl et T2) selon la même méthode. EPI : ATGGGGGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGG (SEQ ID NO : 5) EP2 : GTCCCCTGTCCTGCAGGCCT (SEQ ID NO : 6) T1 : ATGGATCTGACTGAATTGCTCCTC (SEQ m NO : 7) T2 : TTACCCTTCCTGAGACAGATTCTGGGA (SEQ ID NO : 8) L'ADNc de l'EPO et l'ADNc de la TPO, obtenus par PCR, sont respectivement clonés avec pGEM-T (Promega Co. ), un vecteur de clonage. Le pGEM-EPO et pGEMTPO sont ensuite séquences et utilisés comme matrices pour les procédures suivantes. LTP, un gène du CTP de la TPO, utilisé dans la présente invention, peut être obtenu en effectuant une PCR utilisant pGEM-TPO comme matrice, ainsi que les amorces EL1 et T2. EL1:GAGGCCTGCAGGACAGGGGACGCCCCACCCACCACAGCTGTCC (SEQ ID NO : 9) L'amorce EL1 contient un gène étendu à la position de l'enzyme de restriction StuI, lequel est situé près de l'extrémité 3' de l'EPO, et une partie de l'extrémité 5' du gène LTP (acides aminés des positions 176 à 353 de la TPO) en même temps. D'autre part, la PCR est effectuée en utilisant pGEM-EPO comme matrice et les amorces EPIet EP2 pour donner le gène EPO seulement. Les gènes EPO et LTP ainsi obtenus sont traités respectivement avec l'enzyme de restriction StuI. Ensuite, les fragments des gènes EPO et LTP sont ligaturés et le produit de la ligature est utilisé comme matrice dans la procédure de PCR utilisant les amorces EP11 et L2 pour donner un fragment de gène ELTP ayant environ 1113 pb. EP11 : TAAGCTTATGGGGGTGCACGAATGT (SEQ ID NO : 10) L2 : TGGATTCTTACCCTTCCTGAGACAGATTC (SEQ ID NO : 11) Ce gène est cloné avec un vecteur de clonage de pGEM-T puis séquence (pGEMELTP, Figure 3a). De plus, le gène STP utilisé dans la présente invention peut être obtenu par la procédure de PCR de synthèse et d'auto-amorçage. Les fragments de gènes synthétisés sont les suivants : ES1, S2 et S3, et L2 ci-dessus. ES1 : AGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACCCTCTTCTAA (SEQ NO:12) S2 : GTGGGTGTAGGATGTGTTTAGAAGAGG (SEQ ID NO : 13) S3: TACACCCACTCCCAGAATCTGTCTC (SEQ ID NO :14) lui (50 pmoles/ul) de chacun des quatre fragments de gène est prélevé et la PCR est effectuée en utilisant le système haute-fidélité Taq de BM Co. Le fragment de gène d'environ 50 pb (gène STP) est identifié dans un gel d'agarose à 1%. Ce gène code pour les 17 acides aminés (acides aminés des positions 337 à 353) de l'extrémité carboxy-terminale de la TPO (figure 1). La PCR est effectuée en utilisant pGEM-EPO comme matrice, et les amorces EP11et EP2 pour donner le gène EPO seulement. Ce gène EPO et le gène STP sont utilisés comme matrices en même temps et les amorces EP 11 et L2 sont utilisées dans une PCR utilisant le système Taq haute-fidélité de BM Co. pour donner le gène de fusion désiré, le gène ESTP, d'environ 630 pb. Ce gène est cloné avec pGEM-T, un vecteur de clonage, puis séquence (pGEM-ESTP, figure 3b) @ (2) Construction du vecteur d'expression Le vecteur d'Invitrogen Co. pADNc3. 1 est utilisé comme vecteur d'expression. Le vecteur pADNc3. 1 est traité avec les enzymes de restriction HindIII et BamHI pour faire un vecteur linéaire, et pGEM-ELTP et pGEM-ESTP sont aussi traités respectivement avec les mêmes enzymes de restriction HindIII et BamHI. Les gènes digérés pADNc3.1, ELTP et ESTP sont isolés grâce au kit d'extraction Qiagen sur un gel d'agarose. Après chaque ligature des gènes, le produit de ligature est introduit dans E. Coli NM522. Des plasmides sont isolés des colonies qui se sont formées à partir de la culture de E. Coli transformée sur plaque de LB-ampicilline toute une nuit, et sont traités avec des enzymes de restriction HindIII et BamHI. Les colonies ayant le gène ELTP ou ESTP sont ensuite criblées par électrophorèse sur gel d'agarose à 1%. Ces plasmides sont désignés respectivement pADNc-ELTP et pADNc-ESTP (figures 3a et 3b). (3) Transformation de cellules CHO et expression Les cellules CHO (DG44) sont cultivées à une confluence de 40 à 80% (1 à 4 x 105 cellules/ boîte de 60 mm) dans une boîte de culture cellulaire de 60 mm. 3 l de réactif de superfection (BM Co. ) et 97 l de milieu de culture cellulaire (a-MEM avec milieu, sans sérum, sans antibiotiques) sont bien mélangés, et on y ajoute pADNc-ELTP (= 0,1 ug/ul, environ 2 g) et le vecteur pLTRdhfr26 (ATCC37295, 0,2 g) contenant le gène dhfr. Le mélange est laissé pour réaction à température ambiante pendant 5 à 10 minutes, puis est ajouté aux cellules préparées plus haut. Au bout d'un jour, le milieu est rafraîchi avec un milieu contenant G418 à une quantité de 500 g/ml (a-MEM sans milieu, 10% FBS). Le milieu est alors rafraîchi avec un milieu G418 contenant 500 g/ml de G418 pendant 7 à 10 jours, au cours desquels les cellules sans le gène de résistance au G418 et les cellules de contrôle négatif sont complètement éliminées. Des cellules sélectionnées dans le milieu G418 sont cultivées de manière suffisante et une protéine exprimée de ELTP est identifiée grâce au kit d'ELISA EPO de BM Co. La même opération est appliquée au vecteur d'expression ESTP, puis une protéine de fusion ESTP exprimée est également identifiée de la même manière. @ (4) Purification des protéines ELTP et ESTP exprimées On prépare de la résine d'affinité pour l'isolement et la purification en utilisant l'anticorps monoclonal anti-EPO (R&D Co. ) de la manière suivante : 0,3 g de Sépharose 4B, activée par CNBr, est gonflée pendant 20 minutes dans 1 mM de HCI, et la résine est transférée dans une colonne et lavée avec 1mM de HCl. La résine est lavée avec 4 ml de solution tampon de couplage (0,1 M NaHC03, 0,5 M NaCl, pH 8,3), immédiatement mélangée avec l'anticorps monoclonal anti-EPO (500 g/tube) contenu dans 4 ml de tampon de couplage, et est laissée réagir pendant 2 heures à température ambiante en agitant le tube. Rafraîchie avec un tampon de blocage (0,2 M de glycine, pH 8,0), la résine est laissée réagir pendant deux heures à température ambiante en agitant le tube. Puis, la résine est lavée avec, dans l'ordre, 6,5 ml de tampon de couplage, 6,5 ml de tampon acétate (0,1 M d'acide acétique, 0,5 M de NaCl, pH 4) et 6,5 ml de tampon de couplage. On prépare une colonne en utilisant la résine ainsi obtenue et on effectue la purification comme décrit ci-dessous. Les cellules sont cultivées dans un milieu sans sérum pendant un jour, et le milieu est concentré à environ 5 fois avec Centriprep (Millipore MWCO 10 000). Ce concentré est chargé dans une colonne équilibrée à l'avance avec du PBS à un débit de 20 ml/h, et lavé à nouveau au PBS. Le tampon d'élution (0,1 M de glycine, pH 2,8) est appliqué à la colonne et l'éluat est immédiatement titré avec 1 M de Tris à un pH de 7,5. La pureté est au moins de 97% lorsqu'elle est analysée par SDS-PAGE et par la coloration à l'argent (figure 4). (5) Mesure de l'activité par une méthode de test biologique Dans le test biologique utilisant des cellules de rate de souris traitées à la phénylhydrazine, les ELTP et ESTP, qui sont exprimées et purifiées de manière adéquate, présentent une plus grande activité que l'EPO. Cela démontre que les extrémités carboxy-terminales fusionnées dans ELTP et ESTP ne peuvent pas inhiber l'activité de l'EPO elle-même. (6) Expériences pharmacocinétiques Des expériences pharmacocinétiques sont effectuées sur des souris afin de déterminer si les ELTP et ESTP préparées ont prolongé de fait le temps de demi-vie in vivo. La substance candidate est administrée par voie intraveineuse à 4 souris à une quantité de 20 unités par souris. Afin de déterminer la concentration dans le sang au cours du temps, on prélève du sang aux souris à un intervalle de 30 minutes et on mesure les concentrations grâce au kit EIA de Boerhinger Mannheim Co. Dans les expériences pharmacocinétiques sur des souris, les substances candidates, ELTP et ESTP, présentent un bien plus long temps de demi-vie que l'EPO de contrôle (figure 5). La présente invention sera expliquée de manière bien plus spécifique dans les exemples qui suivent. Cependant, on doit comprendre que les exemples qui suivent ont pour but d'illustrer la présente invention et en aucune manière d'en limiter la portée. Exemple 1 : du gène L'ADNc de l'EPO a été obtenu en effectuant la PCR conventionnelle (Kit de PCR PreMix de Bioneer Co. ), utilisant les amorces EPI et EP2 qui sont complémentaires aux extrémités de l'ADNc de l'EPO, à une quantité de 50 pmoles, respectivement, à partir de la bibliothèque d'ADNc de cellules de foie foetal humain (Invitrogen Co. ). L'ADNc de la TPO a été obtenu en utilisant les amorces Tl et T2, complémentaires aux extrémités de l'ADNc de l'EPO, selon la même méthode. Au total 30 cycles de PCR ont été effectués avec le système haute fidélité Taq de BM Co. à 52 C pendant 40 secondes pour l'appariement, puis à 72 C pendant 55 secondes, et à 94 C pendant 20 secondes pour donner l'ADNc de l'EPO et l'ADNc de la TPO. Ils ont été respectivement clonés avec pGEM-T (Promega Co. ), un vecteur de clonage. C'est-à-dire que les produits des PCR ont été élués à partir de gel d'agarose à 1% et ligaturés dans pGEM-T, qui a alors été introduit dans E. Coli NM522. La E. Coli transformée a été laissée en culture pendant la nuit sur une plaque de LB-Ampicilline contenant Xgal/EPTG. Des plasmides ont été purifiés à partir des colonies blanches et traités avec les enzymes de restriction, SacI et SacII, pour cribler les colonies contenant respectivement les ADNc. Les vecteurs obtenus à ce stade ont été désignés pGEM-EPO et pGEM-TPO, et ont été alors séquences et utilisés comme matrices pour les procédures suivantes. LTP, le gène du CTP de l'EPO utilisé dans la présente invention, a été obtenu en effectuant un total de 30 cycles de PCR en utilisant le système de haute fidélité Taq de BM Co., et en utilisant pGEM-TPO comme matrice et les amorces EL1 et T2 (50 pmoles), à 50 C pendant 40 secondes pour l'appariement, à 72 C pendant 45 secondes, et à 94 C pendant 20 secondes. L'amorce EL1 contient un gène de la position de l'enzyme de restriction StuI, qui est située près de l'extrémité 3' de l'EPO, vers l'extrémité 3', et une partie de l'extrémité 5' du gène LTP en même temps. Un fragment de gène d'environ 534 pb a été identifié sur gel d'agarose à 1% (gène LTP). Ce gène code pour les 178 acides aminés de l'extrémité carboxy-terminale de la TPO (acides aminés des positions 176 à 353) (figure 1). D'autre part, la PCR a été effectuée en utilisant pGEM-EPO comme matrice et les amorces EP1et EP2 pour donner le gène EPO seulement. Les gènes EPO et LTP ainsi obtenus ont été respectivement traités avec l'enzyme de restriction StuI. Ensuite, des fragments de gènes de l'EPO et de LTP ont été purifiés avec le kit d'extraction Qiagen et ligaturés avec une ligase. Le produit de la ligature des gènes EPO et LTP a été utilisé comme matrice dans un processus de 30 cycles de PCR en utilisant les amorces EP11 et L2 (50 pmoles) et le système haute fidélité Taq de BM Co. à 55 C pendant 40 secondes pour l'appariement, à 72 C pendant 60 secondes, et à 94 C pendant 20 secondes pour donner le gène de fusion ELTP souhaité, ayant environ 1113 pb. Ce gène a été cloné avec un vecteur de clonage de pGEM-T de la même manière que précédemment, puis séquence (pGEM-ELTP, figure 3a). Le gène STP a été obtenu par un procédé de PCR de synthèse et d'auto-amorce. Les fragments d'ADN synthétisés étaient ES1, S2, S3 et L2. On a prélevé 1 l (50 pmo1es/1l1) de chacun des 4 fragments d'ADN et un total de 15 cycles de PCR a été effectué en utilisant le système haute fidélité Taq de BM Co. à 55 C pendant 40 secondes pour l'appariement, à 72 C pendant 40 secondes et à 94 C pendant 20 secondes. Un fragment de gène d'environ 50 pb a été identifié sur gel d'agarose à 1% (gène STP). Ce gène code pour les 17 acides aminés de la région carboxy-terminale de la TPO (acides aminés des positions 337 à 353)(figure 1). Une PCR a été effectuée en utilisant pGEM-EPO comme matrice et les amorces EP11 et EP2 de la même manière que ci-dessus pour donner le gène EPO seulement. Ce gèrie EPO et le gène STP ont été utilisés comme matrices en même temps, et les amorces EP11et L2 ont été utilisées dans une PCR de 30 cycles en utilisant le système haute fidélité Taq de BM Co. à 58 C pendant 40 secondes pour l'appariement, à 72 C pendant 50 secondes et à 94 C pendant 20 secondes pour donner le gène de fusion souhaité, le gène ESTP, d'environ 630 pb. Ce gène a été cloné avec pGEM-T, un vecteur de clonage, puis séquence (pGEM-ESTP, figure 3b). Exemple 2: Construction des vecteurs d'expression pADNc-ELTP et pADNc-ESTP On a utilisé le vecteur pADNc3.1 d'Invitrogen Co. comme vecteur d'expression. Les gènes ELTP et ESTP qui sont clonés avec le vecteur pGEM-T contiennent respectivement à leurs extrémités les sites de reconnaissance HindIII et BamHI. pADNc3.1, pGEM-ELTP et pGEM-ESTP ont été respectivement traités avec les enzymes de restriction HindIII et BamHI. Les gènes rendus linéaires pADNc3.1, ELTP et ESTP ont été isolés sur gel d'agarose avec le kit d'extraction Qiagen. Après ligature de pADNc3. 1 avec ELTP ou ESTP, le produit de ligature a été introduit dans E. Coli NM522. Des plasmides ont été isolés à partir des colonies qui s'étaient formées par la culture de la E. Coli transformée, pendant la nuit sur plaque de LB-ampicilline, et ont été traités avec des enzymes de restriction HindIII et BamHI. Les colonies contenant les gènes ELTP ou ESTP ont été alors criblées par électrophorèse sur gel d'agarose à 1%. Ces plasmides ont été désignés respectivement pADNc-ELTP et pADNc-ESTP (figure 3). Exemple 3 : des cellules CHO et expression Des cellules CHO (DG 44) ont été cultivées à une confluence de 40 à 80% (1 à 4 x 105 cellules/ boîte de 60 mm) dans une boîte de culture cellulaire de 60 mm. On a bien mélangé 3 l de réactif de superfection (BM Co. ) et 97 l de milieu de culture cellulaire (a-MEM avec milieu, sans sérum, sans antibiotiques), et le plasmide pADNc-ELTP (= 0,1 .tg/.t1, environ 2 zig) et le vecteur pLTRdhfr26 (ATCC37295, 0,2 g) contenant le gène dhfr y ont été ajoutés. Le mélange a été laissé réagir pendant 5 à 10 minutes à température ambiante, puis ajouté aux cellules préparées ci-dessus. Au bout d'un jour, le milieu a été rafraîchi avec un milieu contenant G418 à une quantité de 500 g/ml (a-MEM sans milieu, 10 % FBS). Le milieu a été ensuite rafraîchi avec un milieu G418 contenant 500 g/ml de G418 pendant 7 à 10 jours, au cours desquels les cellules sans gène de résistance au G418 et les cellules de contrôle négatif ont été complètement éliminées. Des cellules choisies dans le milieu G418 ont été suffisamment cultivées et une protéine ELTP exprimée a été identifiée grâce au kit d'ELISA EPO de BM Co. Le même procédé à été appliqué à pADNc-ESTP. Exemple 4 : Purification de protéines de fusion exprimées Une résine d'affinité pour l'isolement et la purification a été préparée en utilisant l'anticorps monoclonal anti-EPO (R&D Systems Co) de la manière suivante : 0,3 g de sépharose 4B, activée par CNBr, a été gonflé pendant 20 minutes dans 1 mM de HCI, et la résine a été transférée dans une colonne et lavée avec 1 mM de HCl, La résine a été lavée avec 4 ml de tampon de couplage (0,1 M de NaHC03, 0,5 M de NaCl, pH 8,3), immédiatement mélangée avec l'anticorps monoclonal (500 g/tube) contenu dans 4 ml de tampon de couplage dans un tube, et laissée réagir pendant 2 heures à température ambiante en agitant le tube. Rafraîchie avec un tampon de blocage (0,2 M de glycine, pH 8,0), la résine a été laissée réagir à température ambiante pendant deux heures en agitant le tube. Puis, la résine a été lavée avec, dans l'ordre, 6,5 ml de tampon de couplage, 6,5 ml de tampon acétate (0,1 M d'acide acétique, 0,5 M de NaCl, pH 4), et 6,5 ml de tampon de couplage. On a préparé une colonne en utilisant la résine ainsi obtenue et la purification a été effectuée comme décrit cidessous. Des cellules ont été cultivées dans un milieu sans sérum pendant un jour, et le milieu a été concentré à environ 5 fois en utilisant Centriprep (Millipore, MWCO 10,000). Ce concentré a été chargé dans une colonne équilibrée à l'avance avec du PBS à un débit de 20 ml/h, et lavé à nouveau au PBS. Le tampon d'élution (0,1 M de glycine, pH 2,8) a été appliqué à la colonne et l'éluat a été immédiatement titré avec 1 M de Tris de pH 7,5. Les résultats SDS-PAGE de ELTP et ESTP purifiées sont représentés dans la figure 4. La pureté était au moins de 97% lors de l'analyse par SDS-PAGE et à la coloration à l'argent. Exemple 5 : Mesure de l'activité par la méthode de test biologique On a injecté de la phénylhydrazine à une souris une fois par jour pendant deux jours à une dose de 60 mg/kg. Après trois jours, la rate hypertrophiée a été séparée et moulue avec un homogénéisateur afin d'obtenir des cellules de rate. Les cellules de rate ont été diluées à 6 x 106 cellules/ml et 100 l de la solution cellulaire ont été introduits dans chacun des puits d'une plaque de 96 puits. 0 à 500 mU/ml d'EPO authentique et 100 mU/ml de la protéine de fusion exprimée ont été ajoutés à chaque puits, et la plaque a été laissée pendant 22 heures à 37 C dans un incubateur à CO2. 50 (il de diméthyl 3[H]-thymidine (20 Ci/ml) ont été ajoutés à chaque puits, et laissés réagir encore deux heures dans le même incubateur, et la solution de réaction a alors été absorbée sur un filtre de verre (Nunc 1-73164) par puits. Les filtres ont été lavés trois fois dans une solution saline physiologique et le degré de radioactivité de chaque filtre a été mesuré avec un compteur ss. Les activités des protéines de fusion ELTP et ESTP sont apparues identiques ou supérieures à celles de l'EPO authentique, ce qui a démontré que les extrémités carboxy-terminales fusionnées dans EPO n'ont pas inhibé l'activité de l'EPO elle-même. Exemple 6 : Expériencespharmacocinétiques Des expériences pharmacocinétiques ont été effectuées sur des souris afin de déterminer si la substance candidate préparée a vraiment prolongé le temps de demi-vie in vivo. La protéine de fusion, purifiée selon le procédé de l'exemple 5, a été administrée par voie intraveineuse à 4 souris dans une quantité de 20 unités/souris. Afin de déterminer la concentration dans le sang au cours du temps, du sang a été prélevé des souris à un intervalle de 30 minutes et les concentrations ont été mesurées avec le kit EIA de Boerhinger Mannheim Co. Les résultats sont représentés dans la figure 5. Comme on peut le voir sur la figure 5, ELTP et ESTP présentent un temps de demi-vie respectivement 3 fois plus long que l'EPO de contrôle (le temps de demi-vie de l'EPO était de 22 minutes, celui de ELTP de 60 minutes, et celui de ESTP de 57 minutes). APPLICATION INDUSTRIELLE Les protéines de fusion selon la présente invention ont fortement augmenté le temps de demi-vie in vivo de l'EPO grâce à la présence d'acides aminés qui amplifient les chaînes de sucres sans influencer l'activité inhérente à l'EPO. De plus, les protéines de fusion ne causent pas de problèmes d'antigénicité lorsqu'on les utilise sur le corps humain, étant donné que le peptide fusionné, LTP ou STP, est un peptide déjà existant dans le corps humain. REVENDICATIONS 1. Protéine de fusion dans laquelle un peptide carboxy-terminal (CTP) de la thrombopoïétine (TPO) est fusionné avec l'extrémité carboxy-terminale de l'érythropoïétine humaine (EPO). 2. Protéine de fusion selon la revendication 1, dans laquelle le peptide carboxy-terminal comprend les acides aminés des positions 176 à 353 de la TPO, dont la séquence est décrite dans SEQ ID NO : 1, ou des parties de celle-ci. 3. Protéine de fusion selon la revendication 2, dans laquelle le peptide carboxy-terminal comprend les acides aminés des positions 337 à 353 de la TPO, dont la séquence est décrite dans SEQ ID NO : 2. 4. Acide nucléique codant pour la protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 5. Procédé de préparation d'une protéine de fusion ayant augmenté l'activité in vivo de l'EPO humaine comprenant la culture d'une lignée cellulaire hôte transformée avec le vecteur recombinant contenant l'acide nucléique selon la revendication 4.