Brevet FR2827289A1 — publié le 20030117

La présente invention concerne un nouveau dérivé. d'acide hydroxybisphosphonique présentant d'intéressantes propriétés utiles en thérapeutique, et plus particulièrement l'acide phénylacétique bisphosphonique et ses sels, un procédé pour sa préparation et son application en thérapeutique, notamment pour le traitement des tumeurs cancéreuses et des maladies virales ou inflammatoires hépatiques. De nombreux dérivés d'acide diphosphonique ont été décrits dans la littérature ainsi que leurs propriétés utiles dans divers domaines d'application. En ce qui concerne les applications des dérivés d'acide diphosphonique en thérapeutique, on sait que divers dérivés ont des propriétés utiles dans le traitement de l'inflammation, de l'ostéoporose, ou de certaines métastases osseuses. Ainsi par exemple, l'acide didronique est bien connu depuis des années comme principe actif de médicament pour le traitement des maladies osseuses telles que l'ostéoporose, et plus particulièrement l'etidronate disodique, décrit dans le brevet FR 8.441 M. Une structure dérivée est décrite par exemple dans le brevet US 4.705. 651 relatif à l'acide alendronique possédant des propriétés d'inhibition de la perte osseuse, permettant son utilisation également dans le traitement de l'ostéoporose. Une autre structure dérivée, l'acide ibandronique présentant des propriétés anti-inflammatoires, est décrite dans le brevet GB 2.312. 165. Des dérivés d'acide alcane-1, l-diphosphonique résultant du couplage d'un acide diphosphonique avec un acide aminé, et présentant une activité antitumorale et d'inhibition de la résorption osseuse, ont été décrits dans la demande de brevet WO 97.49711. D'autres dérivés d'acide diphosphonique, comportant un substituant phényle en position 1, sont connus pour leur activité anti-inflammatoire comme dans le brevet US 4.473. 560 relatif à des dérivés à activité anti-inflammatoire, notamment anti-arthritique, ou dans la demande de brevet WO 97.04785 décrivant des diphosphonates substitués par un groupe phénolique présentant des propriétés anti-néoplasiques. On a aussi décrit dans le brevet EP 537. Q08 des diphosphonates comportant un groupe lipophile utiles pour la préparation d'un médicament inhibiteur de protéine prényl transférase susceptible de bloquer la transformation néoplasique provoquée par des oncogènes ras. Cependant, la résistance acquise aux médicaments est une importante difficulté rencontrée aujourd'hui dans le traitement du cancer et la plupart des cancers chez l'homme sont résistants aux effets des chimiothérapies. La demanderesse a découvert de manière surprenante qu'un nouveau dérivé d'acide bisphosphonique, se caractérisant par la présence d'un groupe hydroxy et d'un groupe phénylène en position 1, présente des propriétés spécifiques le différenciant de manière significative des diphosphonates connus. Aussi l'invention a pour objet un nouveau dérivé d'acide bisphosphonique, constitué par l'acide phénylacétique bisphosphonique et ses sels de formule (I) ci-après : dans laquelle Ri et R2, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un atome de métal alcalin ou alcalinoterreux. L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant l'acide phénylacétique bisphosphonique de formule (I) ci-dessus ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, en combinaison le cas échéant avec un ou plusieurs excipients et supports pharmacologiquement acceptables. L'invention a plus-particulièrement pour objet l'acide phénylacétique bisphosphonique, ou un de ses sels, pour le traitement des tumeurs cancéreuses, ainsi que son utilisation pour la préparation d'un médicament pour le traitement des tumeurs cancéreuses, des maladies impliquant une angiogénèse pathologique et des maladies virales ou inflammatoires hépatiques. L'invention a encore pour objet un procédé de préparation de l'acide phénylacétique bisphosphoniquee de formule (I) cidessus. Dans la formule (I) ci-dessus. Ri et/ou R2 représentent de préférence l'hydrogène ou un atome de sodium, de calcium ou de potassium. L'acide phénylacétique bisphosphonique représenté par la formule (I) ci-dessus, se distingue des autres dérivés d'acide diphosphonique, et même des dérivés comportant un groupe phényle en position 1, par une intéressante activité antiangiogénique, anti-inflammatoire et antivirale hépatique, et une absence de toxicité. On sait en effet que certains dérivés de phénylacétate, par exemple le phénylacétate de sodium, ont des propriétés cytostatiques et des expérimentations ont montré qu'ils peuvent bloquer la prolifération de cellules tumorales, mais les études cliniques ont mis en évidence des effets secondaires importants lorsqu'on les utilise isolément ou en association avec d'autres médicaments. Les dérivés de diphosphonates sont surtout utilisés dans le traitement de l'ostéoporose, et des études ont montré qu'ils peuvent inhiber la croissance de cellules tumorales, in vitro et in vivo, permettant ainsi d'envisager de les utiliser pour le traitement de métastases osseuses. Au contraire, l'acide phénylacétique bisphosphonique exerce une activité spécifique, exempte d'effet secondaire et de toxicité, même dans le cas d'un traitement prolongé dans le temps. Plus particulièrement, les études et essais pharma- cologiques-et cliniques ont montré que l'acide phénylacétique bisphosphonique exerce des effets antitumoraux, anti-angio- géniques et pro-apoptotiques, et qu'il est actif à la. fois in vivo et in vitro sur la prolifération de nombreuses cellules tumorales. In vitro, on a constaté que l'acide phénylacétique bisphosphonique a des effets d'inhibition de la prolifération de deux lignées cellulaires de cancer du sein, représentatives de deux types de cancer du sein (tumeur hormonosensible non métastatique et tumeur hormonoindépendante métastatique) même à faible dose, en interrompant le cycle cellulaire et en induisant une apoptose des cellules tumorales. In vivo, l'acide phénylacétique bisphosphonique bloque irréversiblement la prolifération de cellules MCF7-ras et la croissance de tumeurs mammaires dès les cinq à six premières semaines de traitement, et cet effet se prolonge sans apparition d'effet toxique, même lorsque le traitement est prolongé pendant une longue période. Les résultats in vivo et in vitro démontrent ainsi l'effet proapoptotique et antiangiogénique de l'acide phénylacétique bisphosphonique. Ces essais sont explicités dans les exemples ci-après. De plus, les études effectuées ont mis en évidence une action de l'acide phénylacétique bisphosphonique sur les lésions inflammatoires hépatiques induites par des virus. Ces résultats montrent que l'acide phénylacétique bisphosphonique et ses sels pharmaceutiquement acceptables peuvent être utilisés efficacement dans le traitement de certains cancers et plus particulièrement le cancer du sein, ainsi que dans le traitement des maladies inflammatoires du foie, telles que les hépatites aiguës ou chroniques, par exemple les hépatites virales ou toxiques. L'activité antiangiogénique s'avère également utile dans le traitement des angiogénèses pathologiques, par exemple des rétinopathies du diabète, de la polyarthrite rhumatoïde et de la dégénérescence maculaire liée à l'âge. Le médicament à base d'acide phénylacétique bisphosphonique suivant la présente-invention peut être administré par les voies usuelles, par exemple par voie orale, paren- térale ou transdermique, au moyen des formes d'administration classiques telles que comprimés, capsules, gélules ou solutés injectables, comprenant les excipients et supports couramment utilisés dans la préparation des médicaments. La dose de phénylacétate bisphosphonate est adaptée à la forme d'administration. La posologie est choisie par le praticien en fonction de l'affection à traiter et de la situation du patient, et pourra être généralement comprise entre 1 et 200 mg/kg. Conformément à la présente invention, l'acide phénylacétique bisphosphonique peut être préparé par un procédé analogue à la méthode de préparation de dérivés hydroxydiphosphoniques décrite dans le brevet FR 2.669. 348 et par Y. Leroux et al., Phosphorus, Sulfur and Silicon, 63,181 (1991). Le procédé consiste, dans une première étape, à faire réagir un chlorure d'acide sur un mélange de diméthylphosphite et de triméthylphosphite, puis dans une deuxième étape, à hydrolyser les fonctions esters formées dans la première étape, par hydrolyse acide, suivie si nécessaire par une salification. Le chlorure d'acide utilisé dans la première étape est le chlorure de phénylacétyle (C6Hs-CHz-COC1) et la réaction est effectuée de préférence dans un solvant tel que le chloroforme à une température inférieure à 25 C, par exemple à température ambiante ou à une température voisine de 0 C, sous atmosphère neutre, par exemple sous atmosphère d'azote. L'hydrolyse des fonctions esters, dans la deuxième étape, peut être réalisée par dissolution du produit obtenu dans la première étape dans de l'acide chlorhydrique concentré, en excès, et chauffage à reflux pendant 5 à 15 heures environ. L'acide phénylacétique bisphosphonique ainsi préparé est obtenu avec un excellent rendement, supérieur à 95 %. L'exemple de préparation ci-après illustre l'invention sans en limiter la portée. Exemple 1 A un mélange de triméthylphosphite (0,01 mole) et de diméthylphosphite (0,01 mole) dans 5 ml de chloroforme, on ajoute goutte à goutte une solution de chlorure de phénylacétyle dans 5 ml de chloroforme à froid (0 C), en maintenant le mélange réactionnel sous agitation sous atmosphère d'azote sec. Le mélange est ensuite porté à 80 Oc pendant environ 8 heures. Après refroidissement, le mélange est lavé et précipité à l'éther éthylique. Le solide blanc recueilli par filtration est l'ester de bisphosphonate (1-hydroxy-1-phényléthylidène- 1,1-bisphosphonate tétraméthyl ester). Rendement : 97 % Point de fusion F = 120 C RMN p31 (CDClg) : 8 = 20,53 ppm RMN Hl (TMS, CDC13) : 8 = 3, 8 ppm ; 8t (CH2) = 3, 4 ppm (3JHccp : 13,5 Hz) ; 8m (ph) = 7,3 ppm. L'ester de bisphosphonate obtenu comme indiqué ci-dessus est redissous dans un large excès d'acide chlorhydrique concentré et porté à reflux pendant 15 heures. La solution aqueuse est lavée à l'éther, puis elle est évaporée sous vide sur Rotavapor. On obtient ainsi l'acide correspondant. L'acide est purifié et reprécipité à l'éther et au mélange benzène/éther. Le précipité blanc est recueilli par filtration pour obtenir l'acide 1-hydroxy-1-phényléthylidène- 1,1-bisphosphonique. Rendement : 98 % RMN p31 (D20) : 8 = 19,53 ppm RMN H' (DsO) : 8t (cH2) = 3, 4 ppm (Jnccp : 13, 5 Hz) ; 5ph : = 3, 4 ppm. Exemple 2 Etude in vitro L'étude de l'effet du phénylacétate bisphosphonate de sodium sur la croissance et la viabilité cellulaire a été effectuée de la manière suivante. Des cellules MCF7-ras sont ensemencées à raison de 20.000 cellules par puits, dans des plaques de 24 puits. Après 24 heures d'incubation, le milieu (DMEM avec 10% de sérum de veau foetal) est remplacé par un même milieu additionné de différentes concentrations de phénylacétate bisphosphonate (2 mM, 4 mM, 6 mM, 87 mM et 10 mM). Les cellules sont incubées pendant 1 à 4 jours à 37 C. La viabilité cellulaire est vérifiée par le test du bleu trypan. On constate alors que le phénylacétate biphosphonate est cytostatique pendant les trois premiers jours de culture à des concentrations inférieures à 6 mM. Aux concentrations plus élevées (8 et 10 mM) une légère toxicité (10%) est observée, qui devient importante (50-60%) au quatrième jour de culture. Afin de vérifier la réversibilité de l'effet du phénylacétate bisphosphonate, des cellules MCF7-ras ont été traitées avec des concentrations croissantes de phénylacétate bisphosphonate pendant 10 jours, en changeant le milieu tous les deux jours. Puis les cellules sont réparties en deux lots. Au premier lot on ajoute le milieu de culture DMEM complémenté avec 10% de sérum de veau foetal, et au deuxième lot on ajoute le même milieu avec 10 mM de phénylacétate bisphosphonate, en changeant le milieu tous les deux jours. Au 15ème jour on ajoute de la thimidine tritiée pendant 4 heures et la radioactivité de la suspension est déterminée au moyen d'un compteur à scintillation liquide bêta (Beckman). On observe alors une inhibition de la prolifération cellulaire partiellement réversible à la dose de 2 mM et irréversible au-delà de 4 mM. Activité proapoptotique Afin de déterminer la nature, de la toxicité du phénylacétate bisphosphonate de sodium, des cellules MCF7 et MCF7-ras sont ensemencées, puis lavées au bout de 24 heures et ensemencées pendant 3 heures dans du milieu DMEM additionné de 10% de sérum de veau foetal. Un lot est additionné de phénylacétate bisphosphonate (10 mM) tandis que l'autre lot n'en contient pas. L'apoptose est déterminée par le test de l'Annexine V conjuguée à l'anticorps FITC. L'iodure de propidium est utilisé pour distinguer l'apoptose précoce (marquage positif pour l'Annexine V et négatif pour l'iodure de propidium) de l'apoptose tardive (marquage positif pour l'Annexine V et l'iodure de propidium). On constate qu'au bout de 4 heures de traitement avec le phénylacétate biphosphonate, le pourcentage de cellules en apoptose précoce est presque identique pour les deux types cellulaires, tandis que celui des cellules en apoptose tardive est plus important pour les cellules MCF7-ras (22% et 53% respectivement). L'apoptose des cellules est confirmée par la méthode de la dégradation de l'ADN. A cet effet les cellules MCF7 et MCF7-ras sont ensemencées à raison de 5x10s cellules dans des flacons T25. Après 24 heures, les cellules sont lavées puis ensemencées dans du milieu de DMEM additionné de 10% de sérum de veau foetal, avec phénylacétate bisphosphonate (10 mM) pour un lot et sans phénylacétate bisphosphonate pour l'autre lot. Après 96 heures, l'extrait cellulaire contenant l'ADN fragmenté est incubé avec 0, 5 mg/ml de RNase A à 370C pendant une heure puis avec 0,5 mg/ml de protéinase K pendant une heure à 37 C. Après l'incubation, l'ADN fragmenté est précipité par l'isopropanol puis dissous dans 10 mM de Tris- HCI (pH 8) 1 ml d'EDTA, 5% de glycérol et 0, 05% de bleu de bromophénol. L'ADN fragmenté séparé par électrophorèse sur gel d'agarose à 1% est marqué par le bromure d'éthidium et photographié en UV. On observe alors une nette dégradation de l'ADN des cellules MCF7 et MCF7-ras dans le cas du lot contenant 10 mM de phénylacétate bisphosphonate. Ces résultats montrent que l'acide phénylacétique bisphosphonique inhibe la prolifération et induit l'apoptose des cellules MCF7 et MCF7-ras. Exemple 3 Etude in vivo L'effet antitumoral du phénylacétate bisphosphonate de sodium est vérifié chez la souris. L'inoculation de 4x106 cellules MCF7-ras chez des souris nude femelles athymiques est effectuée par voie sous-cutanée dans un volume de 0,1 ml de DMEM et induit 70% de prise de tumeurs après trois semaines. Le traitement par le phénylacétate biphosphonate a 3 commencé quand les tumeurs avaient un volume moyen de 550 mm3. Les animaux sont répartis en deux lots, l'un avec phénylacétate bisphosphonate, l'autre sans. Le phénylacétate bisphosphonate est injecté par voie sous-cutanée et péritumorale, deux fois par semaine, pendant 5 semaines, en utilisant des doses de 80 mg/kg (5 cas) et 160 mg/kg (6 cas). En fin de traitement, on observe une inhibition de la croissance des tumeurs qui est irréversible et dépendante de la dose. Après l'arrêt du traitement, la croissance des tumeurs est bloquée pendant au moins trois semaines pour les souris traitées avec une dose de 160 mg/kg tandis que la croissance reprend dans le cas des souris traitées avec une dose de 80 mg/kg. L'examen immunohistologique des tumeurs montre que la diminution de la prolifération cellulaire est liée à l'induction de l'apoptose, à une forte diminution de l'angiogénèse de la tumeur et à l'induction de la fibrose dans la tumeur. Effet pro-apoptotique De plus, l'effet proapoptotique du-phénylacétate bisphosphonate est confirmé par la technique du marquage par anticorps. Le marquage de cellules apoptotiques est effectué par l'anticorps M30 qui reconnaît le site spécifique des capsases sur les filaments de cytokératine 18 produits par les cellules épithéliales. Ces filaments s'agrègent rapidement dans les cellules en apoptose précoce, par hyperphosphorylation des cytokératines. Ce marquage cytoplasmique permet d'observer des structures granulaires à l'intérieur du cytoplasme, qui correspondent aux cellules en apoptose tardive. Ces structures granulaires sont observées dans les tumeurs traitées avec une forte dose (160 mg/kg) de phénylacétate bisphosphonate. On constate aussi une augmentation du marquage avec l'anticorps anticytokératine 18 en fonction de la concentration. L'apoptose précoce peut ainsi être distinguée de l'apoptose tardive par la présence des structures granulaires dans le cytoplasme. Ceci confirme que le traitement des tumeurs par le phénylacétate bisphosphonate à une dose de 80 mg/kg provoque une apoptose alors que le traitement à la dose de 160 mg/kg provoque une aponécrose, phase intermédiaire entre l'apoptose et la nécrose. Effet anti-angiogénique L'effet anti-angiogénique a été vérifié par la technique de la lectine GSL1. En utilisant la lectine GSL1 on détermine l'angiogénèse, identifiée par le marquage des cellules endothéliales en rouge avec l'anticorps anti-GSL1. On constate que cette angiogénèse est inhibée par le traitement des tumeurs par le phénylacétate bisphosphonate. Cet effet est partiel à la dose de 80 mg/kg er total à 160 mg/kg Ces essais démontrent que l'acide phénylacétique bisphosphonique présente un effet antiangiogénique très important, ainsi qu'un effet antitumoral et proapoptotique. Ces résultats confirment que l'acide phénylacétique bisphosphonique constitue un principe actif potentiel de médicament pour le traitement des tumeurs cancéreuses, en particulier le cancer du sein. Exemple 4 Effet sur les cellules inflammatoires hépatiques L'étude est effectuée sur des souris nude développant une hépatite aiguë. Les souris sont réparties en deux lots, l'un étant traité par le phénylacétate bisphosphonate de sodium, l'autre pas. Les souris traitées reçoivent le phénylacétate bisphosphonate à raison de 80 mg/kg ou 160 mg/kg par voie sous-cutanée, deux fois par semaine pendant 5 semaines. Puis les animaux sont sacrifiés et le foie est prélevé et analysé histologiquement après HES (méthode de la coloration par Hematoxilline Eosine, ou Hemalun). L'examen au microscope optique montre une atteinte très importante des foies de souris non traitées par rapport au foie des souris traitées. On observe en particulier des zones nécrotiques dues à une hépatite chronique, ainsi qu'une accumulation de liquides dans les hépatocytes (stéatose) associée à une inflammation des cellules lymphocytaires. Cette atteinte hépatique provoque la nécrose des tissus hépatiques, se traduisant par la formation d'une zone fibreuse. Au contraire, chez les souris traitées par le phénylacétate bisphosphonate, dans 4 cas sur 5, on n'observe aucun signe de toxicité hépatique. REVENDICATIONS 1. Dérivé d'acide diphosphonique, caractérisé en ce qu'il est constitué par l'acide phénylacétique bisphosphonique, ou un de ses sels, de formule (I) ci-après : dans laquelle Ri et R2, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un atome de métal alcalin ou alcalinterreux. 2. Dérivé d'acide diphosphonique selon la revendication 1, caractérisé en ce que Rl et/ou R2 représentent l'hydrogène ou un atome de sodium, de calcium ou de potassium. 3. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend l'acide phénylacétique bisphosphonique ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, en combinaison le cas échéant avec un ou plusieurs excipients et supports pharmacologiquement acceptables. 4. Composition pharmaceutique pour le traitement des tumeurs cancéreuses, caractérisée en ce qu'elle comprend l'acide phénylacétique bisphosphonique ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, en combinaison le cas échéant avec un ou plusieurs excipients et supports pharmacologiquement acceptables. 5. Composition pharmaceutique pour le traitement des maladies virales ou inflammatoires hépatiques, caractérisée en ce qu'elle comprend l'acide phénylacétique bisphosphonique ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, en combinaison le cas échéant avec un ou plusieurs excipients et supports pharmacologiquement acceptables. 6. Utilisation de l'acide phénylacétique bisphosphonique ou d'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, pour la préparation d'un médicament pour le traitement des tumeurs cancéreuses. 7. Utilisation de l'acide phénylacétique bisphosphonique ou d'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, pour la préparation d'un médicament pour le traitement des maladies virales ou inflammatoires hépatiques. 8. Utilisation de l'acide phénylacétique bisphosphonique ou d'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, pour la préparation d'un médicament pour le traitement des maladies impliquant une angiogénèse pathologique. 9. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement du cancer du sein. 10. Procédé de préparation de l'acide phénylacétique bisphosphonique suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste, dans une première étape, à faire réagir un chlorure d'acide sur un mélange de diméthylphosphite et de triméthylphosphite, puis dans une deuxième étape, à hydrolyser par hydrolyse acide les fonctions esters formées dans la première étape, suivie si nécessaire par une salification. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le chlorure d'acide utilisé dans la première étape est le chlorure de phénylacétyle (C6Hs-CH2-COC1). 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisé en ce que la réaction de la première étape est effectuée dans le chloroforme à une température inférieure à 25 C. 13. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'hydrolyse est réalisée par dissolution dans l'acide chlorhydrique concentré, à chaud.