Brevet FR2829904A1 — publié le 20030328

La présente invention concerne l'amélioration des plantes, et plus particulièrement l'obtention de plantes sous-accumulant le nitrate. Le nitrate est indispensable à la plante qui l'utilise comme source d'azote pour synthétiser les acides aminés essentiels. Les racines des plantes absorbent le nitrate présent naturellement dans le sol ou apporté sous forme d'engrais. Le nitrate une fois absorbé peut être transporté par le xylème jusqu'aux parties aériennes de la plante. Schématiquement, l'incorporation de l'azote dans les molécules d'acides aminés à partir de l'ion nitrate fait intervenir trois étapes principales. Une première étape catalysée par la nitrate-réductase permet de réduire le nitrate en nitrite. Une seconde étape est catalysée par la nitrite-réductase qui réduit l'ion nitrite en ion ammonium. Enfin l'ion ammonium va réagir avec l'acide glutamique pour former la glutamine qui participe à la biosynthèse des acides aminés. Ces réactions ont principalement lieu dans les parties aériennes de la plante, au cours de la phase lumineuse de la photosynthèse qui fournit les électrons nécessaires aux réactions de réduction. L'absorption et l'assimilation du nitrate varient selon la longueur et l'intensité de la période de jour puisque ces étapes dépendent directement de l'efficacité de la photosynthèse. Le nitrate qui n'est pas utilisé est stocké dans des compartiments subcellulaires, comme par exemple la vacuole. D'un point de vue alimentaire, une forte teneur en nitrate dans les plantes dont les feuilles, les racines ou les bulbes sont consommées, a fortiori lorsque ces fruits ou légumes sont consommés crus, n'est pas recommandée. Des études ont montré qu'une ingestion importante de nitrates pouvait accentuer la méthémoglobinémie (ou maladie bleue) du nourrisson et favoriser l'apparition de certains cancers. En effet, les nitrates ingérés sont transformés en nitrites dans le tube digestif par les bactéries présentes. En milieu acide, par exemple dans l'estomac, les nitrites peuvent réagir avec les amines ou les amides pour former des nitrosamines cancérigènes. Etant donné les risques potentiels liés à la surconsommation de nitrates, des normes ont été édictées, par exemple pour les salades, les teneurs réglementaires en nitrates sont de 2500 ppm en été et 4500 ppm en hiver. Ces taux limites de nitrates sont assez régulièrement dépassés, notamment en période hivernale ou dans les pays avec un faible taux d'ensoleillement. Pour pallier cette trop forte accumulation de nitrates, il est possible de jouer sur l'apport exogène de nitrates en diminuant les quantités d'engrais apportées, en optimisant les périodes d'amendement, en améliorant la conversion du nitrate dans le sol. D'autre part, il est possible de diminuer la teneur en nitrate dans les plantes en jouant sur l'efficacité de l'absorption, de la conversion du nitrate dans la plante ou en sélectionnant des variétés sous-accumulant naturellement le nitrate. Par exemple, afin de diminuer les teneurs en nitrate, il a été proposé de modifier l'activité des enzymes impliquées dans la voie d'assimilation des nitrates, telles que la nitrate réductase. Une autre voie de diminution de l'accumulation de nitrate consiste à convertir le nitrate dans la plante après récolte. Par exemple, la Demande EP 0577222 propose une méthode pour diminuer rapidement et significativement la teneur en nitrate dans les plantes par un traitement au C02. La présente invention propose maintenant une nouvelle approche pour obtenir des plantes sous-accumulant le nitrate. Les Inventeurs ont maintenant constaté qu'il était possible de moduler l'accumulation du nitrate dans les plantes en intervenant sur des canaux anioniques, et en particulier des canaux chlore, de la membrane chloroplastique. La présente invention propose donc une nouvelle approche pour obtenir des plantes sous-accumulant le nitrate. On entend par canal ionique , toute protéine possédant au moins une région transmembranaire permettant le passage des ions. Les canaux chlore, également dénommés canaux chlorure , ou canaux CLC constituent une famille comprenant un domaine contenant 10 ou 12 hélices transmembranaires (pfam 00654). Le premier membre de la famille des CLC qui a été isolé est le canal CLC-0. Ce canal a été obtenu par JENTSCH et al. (Nature, 348,510-514, 1990) et provient de l'organe électrique du poisson torpille. Ultérieurement, d'autres canaux CLC ont été mis en évidence chez des mammifères, principalement chez l'homme,-le rat et la souris, et d'autres animaux tels que le xénope (Xenopus laevis. ), le poisson téléostéen Oreochromis mossambicus, le nématode Caenorhabditis elegans, etc. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, un seul gène (ScCLC) a été détecté. Les données de séquençage systématique indiquent la présence d'homologues de gènes CLC dans beaucoup de génomes procaryotes (JENTSCH et al., Eur. J. Physiol., 437,783-795, 1999 et MADUKE et al., J. Gen. Physiol., 114,713-722, 1999). Chez les végétaux, plusieurs canaux anioniques de la famille des CLC ont été identifiés à ce jour, deux canaux ont été identifiés chez le tabac (LURIN et al., Plant Cell, 8,701-711, 1996 ; LURIN, Thèse de l'Université Paris VI, Pierre et Marie Curie, France, 1998), un chez la pomme de terre (CZEMPINSKI et al., J. Exp. Bot. 50,955-966, 1999), sept chez la plante modèle Arabidopsis thaliana dont le génome entier a été séquencé : AtCLC-a,-b,-c et-d (HECHENBERGER et al., J. Biol. Chem., 271,33632-33638, 1996) ; AtCLC-g (GEELEN et al., Plant J., 21,259-269, 2000) ; AtCLC-e (AF 366367, GenBank, 15 mai 2001) et AtCLC-f (AF 3666368, GenBank, 15 mai 2001) ont été identifiés par les Inventeurs). Les canaux anioniques chez les végétaux sont principalement situés sur la membrane plasmique et le tonoplaste (BARBIER-BRYGOO et al., Biochim. Biophys. Acta., 1465,199-218, 2000 ; HEDRICH et BECKER, Plant. Mol. Biol., 26,1637-1650, 1994 ; TYERMAN, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 43,351-373, 1992) et également sur les membranes des mitochondries et des plastes (BORECKY et al., J. Biol. Chem., 272,19282-19289, 1997 ; NEUHAUS et WAGNER, Biochim. Biophys. Acta., 1465,307-323, 2000). L'intervention des canaux anioniques dans différentes fonctions physiologiques de la plante a été proposée : - dans la croissance et le développement via des voies de signalisation hormonales, - dans des réponses à des stress biotiques et abiotiques, dans les-réponses aux micro-organismes pathogènes, - dans la nutrition minérale. Cependant, l'implication des canaux anioniques n'a été clairement démontrée que dans quelques réponses comme dans l'ouverture et la fermeture des stomates et dans la régulation de l'élongation de l'hypocotyle. Dans les réponses aux stress biotiques et abiotiques, les canaux anioniques interviendraient très en amont des déclenchements des réponses aux stress (JABS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4800-4805, 1997 ; CAZALE et al., Plant Physiol., 116, 659-669,1998). Il apparaît clairement que les canaux anioniques ont un rôle important dans la physiologie de la plante, mais que dans de nombreux cas, les données accumulées ne permettent pas encore d'associer un rôle physiologique définitif aux activités de type canal caractérisées ou d'associer un canal particulier aux différents processus impliquant des transports d'anions. Chez Arabidopsis, la plupart des 7 gènes codant les canaux AtCLC-a à-g se situent sur le chromosome V, sauf les gènes AtCLC-b,-e et-f localisés respectivement sur les chromosomes III, IV et I. Les cinq canaux végétaux AtCLC-a,-b,-c,-d, et - g sont proches des canaux anioniques animaux intracellulaires de type CLC-6 et CLC-7. Les deux autres membres de la famille AtCLC-e et AtCLC-f forment une autre sous-famille avec les CLC bactériens. Les gènes CLC végétaux sont exprimés dans toute la plante bien que des différences entre organes aient été mises en évidence. Par exemple, AtCLC-a s'exprime de manière préférentielle dans les feuilles, AtCLC-b dans les racines, AtCLC-d dans les feuilles et les racines (HECHENBERGER et al., 1996, publication précitée). La fonction dans les plantes des protéines AtCLC commence seulement à être élucidée. AtCLC-c et AtCLC-d sont capables de complémenter le mutant gefl de levure pour les phénotypes de déficience respiratoire et de sensibilité au pH dans le cas d'AtCLC-d, et uniquement pour la sensibilité au pH pour AtCLC-c (GAXIOLA et-al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95,4046-4050, 1998 ; HECHENBERGER et al., 1996, publication précitée). Cependant, aucune corrélation n'a pu être établie entre la fonction complémentée chez la levure, et la fonction réelle de ces protéines dans la plante. S'appuyant sur la localisation dans le Golgi de ScCLC chez la levure, une activité dans les endomembranes des protéines AtCLC-c et AtCLC-d a été suggérée. GEELEN et al. (2000, publication précitée) ont montré que les plantes clca-1 comportant une mutation dans le gène codant le canal anionique tonoplastique AtCLC-a sousaccumulaient le nitrate, et présentaient également une hypersensibilité au chlorate. Le chlorate peut rentrer via les transporteurs de nitrate dans la cellule, où il va être transformé par la nitrate réductase en chlorite, un composé toxique. Il apparaît probable que chez des plantes sauvages le chlorate et le chlorite sont accumulés dans la vacuole via la protéine AtCLC-a. Chez les plantes mutantes coca-1, l'absence de la protéine AtCLC-a est à l'origine d'une accumulation du chlorate et du chlorite dans le cytoplasme, d'où l'hypersensibilité observée. Les Inventeurs ont maintenant constaté que l'inactivation du gène AtCLC-e codant pour le canal chlore AtCLC-e provoquait une sous-accumulation du nitrate chez les plantes mutantes. Ainsi, chez un mutant d'Arabidopsis dénommé clé-1, dans lequel le gène AtCLC-e a été inactivé par l'insertion d'ADN-T, on observe une sous-accumulation de nitrate d'environ 56% par rapport aux plantes sauvages. Ce mutant présente également un taux de malate 1,5 fois supérieur à celui des plantes sauvages, et une plus grande sensibilité à l'acide salicylique. En revanche, au niveau de la morphologie des organes floraux et végétatifs, ainsi qu'au niveau du développement, son phénotype n'apparaît pas différent de celui des plantes sauvages. En outre, contrairement au mutant clca-l, il ne présente pas d'hypersensibilité au chlorate. Le canal AtCLC-e est codé par une seule copie du gène AtCLC-e localisée sur le chromosome IV. Il se compose de 6 exons. L'ADNc d'AtCLC-e. référencé dans la présente invention par la séquence SEQ ID NO : 1 est composé d'une région 5'non traduite de 30 paires de bases, suivie d'une phase ouverte de lecture de 2127 pb codant une protéine de 709 acides aminés ayant une masse moléculaire calculée de 75,4 kDa. La séquence de cette protéine est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 4. La région 3'non traduite est composée de 360 pb et aucun signal potentiel de polyadénylation n'a été trouvé dans cette région. Les Inventeurs ont en outre étudié la localisation subcellulaire du canal AtCLC-e, et ont mis en évidence un adressage chloroplastique de cette protéine. La présente invention a pour objet un procédé pour diminuer l'accumulation du nitrate dans une plante, caractérisé en ce que l'on inhibe un canal chlore chloroplastique, et en particulier le canal CLC-e, de ladite plante. On définit ici comme canal CLC-e , non seulement la protéine AtCLC-e codée par le gène AtCLC-e d'Arabidopsis thaliana mais également tout canal chlore chloroplastique codé par un gène homologue d'une autre plante. Des gènes homologues d'AtCLC-e peuvent être identifiés et clonés, selon des méthodes classiques, à partir de banques d'ADNc ou d'ADN gnomique de la plante souhaitée, à l'aide d'oligonucléotides choisis à partir de la séquence d'ADNc GenBank AF 366367, qui est également représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1, ou de la portion codante de cette séquence d'ADNc, représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 2. Il sera également possible de récupérer des gènes homologues des gènes AtCLC-e dans les banques EST ou dans les banques génomiques des plantes d'intérêts, les oligonucléotides correspondant pourront être utilisés. On choisira de préférence des oligonucléotides spécifiques d'AtCLC-e, qui peuvent facilement être identifiés en comparant la séquence de ce gène avec les séquences des gènes codant les autres canaux CLC d'Arabidopsis thaliana, également disponibles sur les bases de données de séquence. La fonction du gène cloné à partir de la plante choisie pourra être contrôlée par complémentation d'un mutant d'Arabidopsis thaliana dans lequel le gène AtCLC-e est inactivé, par exemple en vérifiant que l'expression du gène cloné dans ce mutant restaure l'accumulation du nitrate. Par inhibition du canal CLC-e , on entend toute altération de ce canal pouvant aller d'une simple diminution de son activité jusqu'à l'inactivation totale. Cette inhibition peut être obtenue de différentes manières, par exemple : - par mutation du gène CLC-e ; cette mutation peut être une délétion de tout ou partie du gène, une insertion d'une séquence exogène (ce qui inclut le remplacement de la séquence du gène sauvage par un gène muté), une mutation ponctuelle, ou une combinaison de ces différentes mutations. Selon l'étendue et la localisation des portions du gène concernées, on peut aboutir à l'inactivation totale du gène, à une diminution du niveau d'expression de la protéine CLC-e (si la mutation est localisée au niveau des séquences de contrôle de l'expression), ou à la production d'un canal CLC-e inactif ou à activité réduite, par exemple du fait d'une mutation touchant une région transmembranaire, ou la séquence d'adressage vers le chloroplaste. - par inhibition de la transcription ou de la traduction du gène CLC-e, conduisant à la diminution de la quantité de protéine synthétisée, ou à l'absence de synthèse de la protéine. - par inhibition de l'activité de la protéine CLC-e, par exemple par un effecteur chimique absorbé par la plante. La mutation du gène CLC-e peut être effectuée par différentes méthodes connues en elles-mêmes de l'homme du métier ; on peut par exemple effectuer une mutagenèse dirigée, en mettant en oeuvre des techniques classiques, telles que les techniques de recombinaison homologue, pour cibler la portion du gène CLC-e que l'on souhaite inactiver. Avantageusement, on pourra-également utiliser des méthodes comprenant une étape de mutagenèse aléatoire, par exemple par insertion d'ADN-T, et une étape de criblage ciblé permettant la détection des mutants du gène CLC-e. D'autres techniques de mutagenèse aléatoire et de criblage utilisables pour la mise en oeuvre de la présente invention sont par exemple décrites par LI et al. (Plant J., 27,235-242, 2001), ou par McCALLUM et al. (Nature Biotech., 18,455-457, 2000). La mutagenèse du gène CLC-e permet notamment d'obtenir des plantes exprimant un canal inactif, par exemple du fait d'une altération ou d'une délétion de la séquence d'adressage vers le chloroplaste. L'inhibition de la transcription ou de la traduction du gène CLC-e peut être obtenue par des techniques classiques, par exemple par co-suppression, ou suppression antisens, à l'aide de constructions d'ADN recombinant produisant dans les cellules des transcrits sens ou antisens dérivés de l'ADNc de la protéine CLC-e. Des techniques utilisables sont par exemple décrites dans l'article de revue de MATZKE et al. (Curr. Opin. Genet. Dev., 11 (2), 221-227, 2001) ainsi que dans les publications qui y sont référencées. La mutation du gène CLC-e ou l'inhibition de sa transcription ou de sa traduction, peuvent être mises en oeuvre, conformément à l'invention, en utilisant des polynucléotides dérivés de la séquence dudit gène. La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation d'au moins un polynucléotide comprenant tout ou partie de la séquence d'un gène CLC-e, ou de son complémentaire, pour diminuer l'accumulation du nitrate dans une plante. Avantageusement, on utilisera un polynucléotide comprenant tout ou partie de la séquence de l'ADNc d'un canal CLC-e, ou de son complémentaire, ou au moins un polynucléotide représentant un fragment d'au moins 20, de préférence au moins 50, et de manière tout à fait préférée au moins 100 bases consécutives de ladite séquence. On peut également utiliser, pour la mise en oeuvre de la présente invention, des polynucléotides dont la séquence n'est pas complètement identique à ou complémentaire de celle du gène CLC-e de ladite plante ou d'un fragment de celui-ci. Dans ce cas, on choisira de préférence des polynucléotides possédant au moins 80%, avantageusement au moins 90%, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité avec le polynucléotide SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, ou SEQ ID NO : 3, ou avec le fragment souhaité de celui ci, ou leurs complémentaires. La taille dudit polynucléotide sera choisie en fonction de l'utilisation envisagée. Par exemple, pour le criblage de mutants du gène CLC-e, on peut utiliser des polynucléotides à partir de 20 bases. Pour la suppression antisens, on préférera des polynucléotides plus longs, comprenant généralement au moins 50, et de préférence au moins 100 bases, afin de permettre une hybridation stable avec l'ARNm de CLC-e. On peut notamment utiliser, pour la mise en oeuvre de la présente invention, les polynucléotides de séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, ou SEQ ID NO : 3, ou leurs fragments, ainsi que les polynucléotides possédant au moins 70%, de préférence au moins 80%, avantageusement au moins 90%, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité avec le polynucléotide SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, ou SEQ ID NO : 3, ou avec le fragment souhaité de celui-ci. De même, on peut utiliser, dans le cadre de la mise en oeuvre de la présente invention, les polynucléotides de séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, ou SEQ ID NO : 3, ou leurs fragments, pour obtenir l'inhibition du canal CLC-e chez des plantes d'autres espèces qu'Arabidopsis thaliana, afin de diminuer l'accumulation du nitrate chez lesdites plantes. La présente invention a plus particulièrement pour objet un procédé d'obtention d'une plante sousaccumulant le nitrate, caractérisé en ce qu'il comprend : - la transformation d'une cellule hôte végétale avec au moins une copie d'un polynucléotide choisi parmi : a) les polynucléotides de séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, ou SEQ ID NO : 3, ou leurs fragments d'au moins 50, de préférence au moins 100 bases ; ou bien b) les polynucléotides dont la séquence possède au moins 70%, de préférence au moins 80%, avantageusement au moins 90%, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité avec l'un des polynucléotides a) ci-dessus ; - la régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte obtenue à l'étape précédente. Pour la mise en oeuvre de la présente invention, le polynucléotide utilisé est inséré, dans l'orientation sens, ou dans l'orientation antisens, selon la stratégie choisie, dans une cassette d'expression, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Avantageusement ladite cassette d'expression comprend également un terminateur de transcription. L'invention englobe également les cassettes d'expression ainsi obtenues. Parmi les promoteurs de transcription pouvant être utilisés, on peut citer notamment les promoteurs constitutifs, les promoteurs inductibles, ainsi que les promoteurs tissu-spécifiques. Un promoteur constitutif permet une expression forte du transcrit dans l'ensemble des tissus de la plante régénérée et sera actif dans la plupart des conditions environnementales, et dans l'ensemble des étapes de transformations et de différentiations cellulaires. Par exemple, des promoteurs constitutifs fréquemment utilisés sont : - le promoteur 35S, ou avantageusement le promoteur double 35S (pd35S) du CaMV, - le promoteur de l'actine. Alternativement, il peut être intéressant d'utiliser un promoteur de transcription inductible capable d'être contrôlée par les conditions environnementales ou le stade de développement comme par exemple les promoteurs phénylalanine ammonia-lyase (PAL), de chitinases, de la nopaline synthase (nos) ou du gène vspB (US 5 670 349). A titre d'exemples non limitatifs, on citera notamment les promoteurs figurant sur la liste présentée dans le tableau 3 du brevet US 5 670 349. Une autre catégorie de promoteurs pouvant avantageusement être utilisée pour réaliser le procédé objet de l'invention regroupe les promoteurs tissu-spécifiques ; par exemple, il peut s'agir des promoteurs de gènes s'exprimant spécifiquement dans les feuilles, tels que par exemple le promoteur du gène de la sous-unité de la RUBISCO codée par le génome nucléaire. Le terminateur de transcription est placé à l'extrémité 3'de la séquence à transcrire. Il peut provenir du même gène que la séquence promotrice ou d'un gène différent. Parmi les terminateurs de transcription pouvant être utilisés, on peut citer par exemple : - le terminateur polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), ou - le terminateur polyA NOS, qui correspond à la région en 3'non-codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline. De préférence, ladite cassette d'expression comprend également un marqueur de sélection permettant de sélectionner les cellules végétales transformées. De nombreux marqueurs de sélection sont connus de l'homme du métier ; on citera en particulier ceux qui confèrent une résistance à une ou plusieurs toxines, comme par exemple une résistance à des antibiotiques comme l'ampicilline, la spectinomycine, la kanamycine, ou des résistances à des herbicides tels que le BASTA' La transformation des cellules végétales peut être contrôlée par d'autres techniques bien connues de l'homme du métier comme les Southern, Northern et Western blots. A titre d'exemple, une cassette d'expression conforme à l'invention peut comprendre : - le promoteur fort constitutif 35S de la mosaïque du chou-fleur, un polynucléotide sens codant le canal anionique AtCLC-e de séquence SEQ ID NO : 1 ou un polynucléotide antisens correspondant au brin complémentaire de l'ARNm transcrit à partir de la séquence codant le canal anionique AtCLC-e et référencé dans la présente invention par la séquence SEQ ID NO : 2 - le terminateur Nos correspondant à la région en 3'non-codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline. Pour transformer la cellule-hôte, on peut introduire la cassette d'expression dans un vecteur d'expression adapté pour transformer les cellules végétales. Les vecteurs d'expression ainsi obtenus font également partie de l'objet de l'invention. A titre d'exemple non-limitatif de vecteurs utilisables pour l'obtention de vecteurs d'expression conformes à l'invention, on citera les vecteurs binaires, bien connus de l'homme du métier. La transformation peut ainsi être effectuée par l'intermédiaire d'un hôte bactérien tel qu'Agrobacterium tumefaciens, ou encore Agrobacterium rhizogenes. De manière préférentielle, la transformation des cellules végétales est réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extrachromosomique inducteur de tumeurs Ti d'Agrobacterium tumefaciens, en utilisant un système binaire. Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans un de ces vecteurs, la région d'ADN-T a été éliminée par délétion, à l'exception des bords droit et gauche, un gène marqueur étant inséré entre eux pour permettre la sélection dans les cellules de plantes. L'autre partenaire du système binaire est un plasmide Ti auxiliaire, plasmide modifié qui n'a plus d'ADN-T mais contient toujours les gènes de virulence vir nécessaires à la transformation de la cellule végétale. Ce plasmide est maintenu dans Agrobacterium. D'autres méthodes de transformation utilisables sont par exemple : - la transformation de protoplastes végétaux, notamment après incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylèneglycol en-présence de cations divalents (Ca 2+) ; - la transformation par électroporation ; - la transformation par utilisation d'un canon à particules permettant la projection, à très grande vitesse, de particules métalliques recouvertes des séquences d'ADN d'intérêt, délivrant ainsi les séquences à l'intérieur du noyau cellulaire ; - la transformation par micro-injection cytoplasmique ou nucléaire. Les cellules transformées par les constructions objets de la présente invention sont ensuite sélectionnées par exemple sur la base de leur résistance aux antibiotiques, notamment la résistance à la kanamycine. Les cellules transgéniques sont ensuite cultivées, de manière classique, sur un milieu approprié permettant la régénération de plantes entières. Le principe de régénération in vitro à partir de cellules végétales est bien connu de l'homme de métier. Les plantes sont régénérées à partir de cals obtenus après culture de cellules d'anthères, de grains de pollen, d'embryons ou de protoplastes. Les cellules sont cultivées sur des milieux nutritifs gélosés adaptés à chaque type cellulaire en conditions stériles dans des boîtes de Pétri ou des tubes de cultures en chambre climatique dans des conditions environnementales favorables (température et luminosité adaptées). Dans le cas des protoplastes, la paroi cellulaire peut se reformer sous l'effet de conditions osmotiques appropriées. Dans le cas de graines ou d'embryons, un milieu favorable à la germination ou à l'initiation de cals est employé. Pour les explants, le milieu employé doit permettre la régénération. Après repiquage, les vitroplants sont transplantés en serre. L'invention englobe également les cellules hôte, notamment les cellules végétales ainsi que les végétaux transformés par des constructions d'ADN recombinant définies ci-dessus. La présente invention a également pour objet toute plante sous-accumulant le nitrate, susceptible d'être obtenue par inhibition du canal chloroplastique CLC-e conformément à l'invention. Bien entendu, ceci englobe les descendants, obtenus par semis ou par multiplication végétative, des plantes directement obtenues par le procédé de l'invention. Par plante sous-accumulant le nitrate on définit ici toute plante chez laquelle le taux de nitrate mesuré dans les plantules ou dans les feuilles est inférieur au taux moyen de nitrates mesuré dans les plantules ou dans les feuilles des plantes de type sauvage de la même espèce, cultivées dans les mêmes conditions. Avantageusement, le taux de nitrate dans les plantules ou dans les feuilles d'une plante conforme à l'invention est au moins inférieur de 20%, de préférence au moins inférieur de 40%, et de manière tout à fait préférée au moins inférieur de 50% au taux moyen de nitrates des plantes de type sauvage de la même espèce. Pour la détermination du taux de nitrate, l'homme du métier pourra utiliser le moyen de mesure du nitrate qu'il jugera opportun. A titre indicatif, les inventeurs ont mesuré le taux de nitrate dans les plantules par électrophorèse capillaire (Waters), technique séparative permettant de doser précisément les anions dans des échantillons de faible volume. L'électrophorèse capillaire mesure le taux de rétention des anions sur le tampon chromate. Les temps de rétention et les surfaces des pics sont convertis en concentration par rapport à une courbe étalon. Une autre technique permettant d'effectuer un dosage colorimétrique des teneurs en nitrate est basée sur la réduction enzymatique du nitrate en nitrite (BARTHES et al., Plant Physiol. Biochem., 33,173-183, 1995). De manière préférée, des plantes sous-accumulant le nitrate conformes à l'invention appartiennent à des espèces consommées dans l'alimentation humaine ou animale. Ces espèces peuvent appartenir à différentes familles, telle que les crucifères, les solanacées, les chenopodiacées, les composées, les cucurbitacées, les rosacées, des ombellifères, etc. L'invention comprend également les cellules et tissus végétaux, ainsi que les organes ou parties de plantes, y compris feuilles, tiges, racines, fleurs, fruits, et/ou graines avec une teneur réduite en nitrate, obtenues à partir d'une plante conforme à l'invention. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la production et la caractérisation de plantes transgéniques exprimant une séquence codant pour un canal CLC-e, en orientation sens ou antisens. EXEMPLE 1 : TRANSFORMATION DES PLANTES PAR AGROBACTERIUM TUMEFACIENS 1 Les plasmides d'expression Un vecteur binaire pSR3 a été utilisé pour produire des plantes transgéniques. Les plantes transgéniques surexprimant des constructions d'AtCLC-e en orientation sens et antisens sous le contrôle du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur, ont été produites avec le plasmide pSR3. D'autres plasmides ont été utilisés pour les expériences de complémentation du mutant clce-1. Le plasmide pSR3 contient le gène de résistance à l'ampicilline pour la sélection en Escherichia coli, à la spectinomycine pour la sélection des agrobactéries et à la kanamycine pour la sélection des plantes transformées. Ce plasmide est représenté sur la Figure 1. 2. Transformation par électroporation des agrobactéries a. Préparation des agrobactéries électro-compétentes Deux fioles erlenmeyer contenant 300 ml de LB avec antibiotiques (SAMBROOK et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd edition : New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) sont inoculées avec 200 jul d'une préculture saturée et sont mises en agitation à 30 C jusqu'à atteindre une DO à 600 nm de 0,5 à 0,6 (16 h à 18 h). Les étapes suivantes sont réalisées à 4 C en conditions semistériles. Les bactéries sont refroidies pendant 15 à 30 min sur la glace, puis récoltées grâce à une centrifugation de 15 min à 4000 rpm (Sorval, rotor JA10) à 4 C. Le culot est repris par 250 ml d'eau 1 mM Hepes. Le culot obtenu après une centrifugation de 10 min à 5000 rpm (rotor JA-10) à 4 C, est repris dans 25 ml d'eau Hepes 1 mM. Le mélange est centrifugé 10 min à 7000 rpm (JA-20) puis repris dans 25 ml d'eau Hepes 1 mM, puis à nouveau centrifugé dans les mêmes conditions et repris par 25 ml de glycérol 10%, puis par 500 jul de glycérol 10%. La suspension de bactéries est ensuite séparée en fractions aliquotes de 40 ul et conservées à-80 C. b. Electroporation des agrobactéries 40 u. l de bactéries compétentes, préparées comme décrit ci-dessus, sont mis à décongeler sur la glace. Après ajout de 60 ptl de glycérol 10% et de quelques dizaines de ng de plasmide à transférer, elles sont transvasées dans une cuve à électroporation refroidie et électroporées dans les conditions suivantes : 2500 V, 40 F, 192 Q. Rapidement 900 pal de milieu SOC (SAMBROOK et al., 1989, publication précitée) sont ajoutés aux bactéries électroporées, qui sont incubées lh30 à 30 C avec agitation, puis étalées sur milieu YEP contenant les antibiotiques de sélection. 3. Transformation des plantes d'Arabidopsis 200 ml de milieu YEP contenant des antibiotiques sont inoculés avec 2 ml d'une préculture effectuée à partir d'une colonie isolée d'agrobactéries contenant le plasmide d'intérêt, puis mis en agitation pendant 48 h à 300C jusqu'à ce que la suspension atteigne une DO de 0,8 à 1 à 260 nm. Les bactéries sont récoltées après une centrifugation de 10 min à 5000 rpm (JA14) à température ambiante. Le culot est repris délicatement dans 300 ml de saccharose 1%, puis transféré dans un pot magenta, dans lequel sont ajoutés 150 gl de Si. lwet L-77 (Lehle seeds), un détergent qui va permettre de préparer les tissus végétaux à la transformation. Les plantes d'Arabidopsis d'écotype Columbia d'environ un mois, au stade boutons floraux (environ 30 plantes par transformation), sont incubées 2 min dans la solution précédente sans faire le vide. Les plantes transformées sont ensuite placées sous cloche, couchées pour la nuit. Le lendemain, les plantes sont à nouveau placées en position verticale, puis les plantes sont mises à la serre afin de produire des graines à partir desquelles seront sélectionnés les tranformants primaires. EXEMPLE 2 : TRANSFORMATION PAR BOMBARDEMENT 1 Fixation de l'ADN aux billes d'or Pour chaque construction plasmidique contenant la séquence sens ou antisens AtCLC-e, trois bombardements sont réalisés. Le transfert de l'ADN dans les cellules de feuille se fait à l'aide de particules d'or. Les billes d'or (Biorad, 1,6 ju. m) préparées comme indiqué par le fournisseur, sont passées au vortex pendant 10 min. La fixation de l'ADN sur les billes est réalisée de la manière suivante : à 25 l de billes d'or (60 mg/ml) sont ajoutés, tout en agitant au vortex, 2,5 l de plasmides d'intérêt (1 g/l) préparés à l'aide du kit Qiagen (QIAprep Spin Miniprep), 25 JLL de CaCl2 2,5 M et 10 fJ. l de spermidine 0,1 M. Le mélange est ensuite soumis au vortex pendant 3 min puis les billes sont rassemblées dans un culot grâce à une incubation d'l min et une centrifugation de 2 s à vitesse maximale dans une centrifugeuse de paillasse. Le culot de billes est lavé avec 70 ul d'éthanol 70%, puis avec 70 l d'éthanol absolu, puis repris en tapotant à l'aide du doigt sur le tube et en agitant avec un vortex à faible vitesse dans 60 p. l d'éthanol absolu. Pour chaque bombardement, 20 l de la solution de billes, associées à l'ADN sont déposés sur des macrocarriers (Bio-Rad) et mis à sécher avant bombardement. 2. Bombardement Les bombardements sont effectués avec un appareil PSD-1000/He (Bio-Rad) en utilisant les paramètres suivants : vide 28 inches Hg, distance de bombardement 6 cm, pression d'hélium 1350 psi. Les feuilles utilisées sont issues de plantules d'Arabidopsis (écotype Columbia) âgées d'environ un mois et cultivées in vitro sur milieu ABIS solide dans des bcites de Pétri (8 cm de diamètre) positionnées horizontalement. Juste avant le bombardement, les feuilles sont prélevées par incision au niveau du pétiole et sont transférées, faces adaxiales vers le haut, au centre d'une nouvelle boîte d'ABIS solide (milieu laissé séché deux 2 jours), sur une surface d'environ 2 cm2. Les pétioles sont enfoncés dans la gélose. Composition du milieu ABIS Composition Concentration finale Macroéléments K2HPO43H2O + KH2PO4 2,5 mM ; pH 6 KNO3 5mM MgS047H20 2 mM Ca (N03) 2H20 1 mM FeEDTA 50 ism Microéléments (Murashige et Skoog, 1962) H3BO3 100 pM KI 5pM MnS044H20 100 pM ZnS04 7H2O 30 ! -lM Na2MoO4 5H20 1 pM CuSO4 5H2O 0, 1 PM CoCI26H2O 0,1 (JM MES 1 mM Saccharose 10 g/L Bacto agar7 g/L PH ajusté à 6,1 avec du KOH 0,5M avant autoclavage EXEMPLE 3 : SELECTION DE PLANTES TRANSGENIQUES Les transformants primaires hémizygotes ont été sélectionnés parmi les graines produites par les plantes transformées (TO) sur kanamycine (100 mg/l) pour les constructions réalisées dans le plasmide pSR3. Le plasmide pFP101 contient la GFP sous le contrôle du promoteur spécifique de la graine, les transformants primaires correspondant aux graines fluorescentes ont été sélectionnés sous la loupe binoculaire à épifluorescence. Pour chaque construction, le tableau 1 récapitule les différentes étapes de sélection qui ont été réalisées afin d'isoler des plantes transgéniques homozygotes et simple copie, ainsi que le nombre de plantes sélectionnées à chaque génération. Pour chaque transformation, plusieurs transformants primaires (graines Tl) ont été sélectionnés et mis en culture à la serre pour autofécondation. Parmi les plantes hémizygotes sélectionnées en Tl, celles dont la descendance (graines T2) présentait une ségrégation sur kanamycine (75% résistantes-à la Kanamycine, 25% sensibles à la kanamycine) ont été sélectionnées. Pour chaque plante Tl sélectionnée, 10 plantes T2 ont été mises à la serre, autofécondées afin d'obtenir les graines T3 et de sélectionner les plantes T2 homozygotes pour l'insertion porteuses de graines T3 toutes résistantes à la kanamycine. Pour chaque plante homozygote, cinq plantes ont été mises à la serre, afin de produire un stock de graines pour les analyses phénotypiques. Il est important de sélectionner plusieurs plantes pour chaque construction car notamment en fonction du lieu d'intégration du transgène dans le génome celui-ci pourra être plus ou moins bien exprimé. Pour la transformation contrôle réalisée avec le plasmide pSR3, nous avons sélectionné 4 plantes T3 indépendantes homozygotes pour l'insertion (Tableau I). En ce qui concerne les plantes transformées par la construction pSR3AtCLCe-S pour produire des plantes transgéniques surexprimant AtCLC-e en orientation sens et par la construction pSR3AtCLC-eAS pour produire des plantes transgéniques surexprimant une forme antisens d'AtCLC-e, nous avons respectivement sélectionné 7 et 5 plantes T3 homozygotes indépendantes Le bilan de cette sélection est illustré par le Tableau I. Les plantes homozygotes ne comportant qu'une copie du transgène sont sélectionnées grâce au gène marqueur de résistance à la kanamycine. m : allèle mutant, contenant une insertion, + : allèle sauvage. Les boîtes grises correspondent aux plantes sélectionnées à chaque étape. Kana5 sensible à la kanamycine, Kanar : résistant à la kanamycine. Construction pSR3 pSR3AtCLC-eS pSR3AtCLC-eAS (contrôle) Sélection parmi iesgrainesït des transformants primaires résistants à la 37/10000 51/6000 19/6000 kanamycine Taux detransformation 0,37% 0,85% 0,32% Sélection des plantes T1 dont la 5/37 9/51 10/19 descendance (T2) montre une ségrégation (54, 71, 72, 75, 81) (9, 19, 23, 31, 34, 39, 41, 46,47) (2,3, 7,9, 10, 15, 17, 18, 19, sur kanamycine: 3/4 Karf, 1/4 Kans 20) Transfert à la serre de 10 plantes TZ résistantes à la kanamycine par plane T1 sélectionnée Sélection ection des plantesT2 dont la 5 plantes retenues 8 plantes retenues 5 plantes retenues descendance (T3) montre 100% de indépendantes indépendantes indépendantes résistance à la kanamycine, donc 54-10, 71-7, 19-8, 31-4,34-5, 2-2, 3-7 homozygotes pour l'insertion 72-3,75-5 39-1, 41-9, 7-6,9-6 81-2 46-6,46-10, 47-4 19-4 Transfert à la serre de 5 plantes T3 par plante T2 sélectionnée Production de graines 4 plantes indépendantes 7 plantes indépendantes 5 plantes Analyse moléculaire et phénotypique 54-10-5, 71-7-2, 19-8-4, 31-4-2, 34-5-2, indépendantes sur la descendance (T4) d'une plante 75-5-2 81-2-5 39-1-5, 41-9-2,46-10-4, 2-2-5, 3-7-1, 7-6-3, T3 sur les 5 mises à la serre 47-4-4 9-6-3, 19-4-3 Homozygotes pour l'insertion AtCLC-e en Tableau 1. Génotype n1"1+ 1 Autofécondation , S' ! p !'. ; ! t.'..-. i.'.. 25% +/+ I Autofécondation 50% m/+ 25% m/m 25% +/+ ou . OQm Autofécondation qc'm'ynn EXEMPLE 4 : COMPLEMENTATION DE LA MUTATION clce Afin de démontrer la liaison entre le phénotype mutant et l'insertion de l'ADN-T dans le gène AtCLC-e, la complémentation des plantes homozygotes mutantes clce-l ayant subi deux back-cross à l'aide d'une construction exprimant l'ADNc d'AtCLC-e sous le contrôle du promoteur fort 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur a été effectuée. Des agrobactéries ASE recombinantes ont été obtenues par électroporation et ont été utilisées pour la transformation d'environ 30 plantes mutantes clce-1 au stade boutons floraux selon la technique de transformation basée sur l'utilisation du Silwet comme détergent. Des plantes contrôles ont été produites suite à la transformation de plantules homozygotes mutantes clé-2 avec des agrobactéries contenant le plasmide vide. EXEMPLE 5 : ANALYSE PHENOTYPIQUES DES TRANSFORMANTS 1. Dosage des anions internes de plantules par éléctrophorèse capillaire 100 mg de plantules entières de 14 jours cultivées in vitro sur milieu ABIS ou une masse équivalente de racines et de parties aériennes séparément sont récoltés dans un tube eppendorf (1,5 ml), broyés avec un piston et dilués au 1/10 avec de l'eau. Les échantillons sont ensuite congelés, décongelés et agités au vortex. Cette étape est effectuée trois fois, puis les échantillons sont centrifugés, le surnageant est filtré puis dilué 10 fois. Le dosage de différents anions inorganiques et organiques est effectué par électrophorèse capillaire (Waters), une technique séparative permettant un dosage précis des anions dans des échantillons de faible volume. La solution à doser est injectée à l'extrémité d'un capillaire de grande taille (60 cm) mais de faible diamètre (60 um) en utilisant la force de gravité pour effectuer un"siphonage". Les paramètres de hauteur et de durée sont constants et permettent d'injecter un volume de solution toujours identique. Une tension de 20000 Volts est ensuite imposée à travers le capillaire, provoquant la migration des charges selon leur signe dans un sens ou dans l'autre. Les anions migrent à travers un tampon spécial composé de chromate (4,6 mM), absorbant la lumière à 254 nm, et d'OFM (Osmotique Flow Inverser) qui est un agent tensioactif cationique. La force de migration des ions liée à leur charge, est contrecarrée par la présence dans le capillaire d'un flux en sens opposé nommé' d'un flux en sens opposé nommé flux électroosmotique (FEO) dû aux charges négatives tapissant la paroi interne du capillaire de verre. L'OFM, fortement positif, permet de neutraliser ces charges et d'inverser ainsi le sens du flux électroosmotique, ce qui accélère de façon considérable la vitesse de migration des anions sans modifier la qualité de la séparation. La mesure proprement dite s'effectue à l'autre extrémité du capillaire. On enregistre la diminution d'absorption du chromate lors du passage des anions devant la fenêtre de lecture. Le temps de rétention et l'ordre de passage de chacun des ions sont bien caractérisés. Une gamme étalon permet de transformer les surfaces des pics en concentrations. L'anion bromure est utilisé comme étalon temporel. 2. Dosage colorimétrique rapide du nitrate interne de plantules par réduction enzymatique La technique de dosage du nitrate par réduction enzymatique selon (BATHES et al., 1995, publication précitée) permet un dosage colorimétrique simple et rapide. Les plantules sont préparées comme pour les dosages par électrophorèse capillaire et à 15 ul de solution à doser sont ajoutés 100 ul d'une solution contenant la nitrate réductase (0, 15 U/ml ; Aspergillus/Bonringer) et un mélange d'EDTA 0,84 mM, de K2HP04+KH2P04 83,7 mM, pH 7,4 et de NADPH 0,28 mM. Le mélange est incubé à 37 C pendant 30 minutes, temps au cours duquel le nitrate est réduit en nitrite. La réaction est arrêtée avec 10 ul d'une solution 1,5 M ZnS04. Le dosage colorimétrique du nitrite est réalisé par l'ajout de 200 pi de solution DC (sulfanylamide 0,5% ; HCL 0,75 N ; N-naphyl-ethylène-diamine-dichlorohydrate 0,01%). Après 5 minutes, la coloration rose proportionnelle à la concentration de nitrite peut être lue à une DO de 550 nm. Une courbe de référence à laquelle on se réfère pour le dosage de chaque échantillon est réalisée en mesurant la DO pour des concentrations de nitrate connues. Ces réactions sont effectuées dans des plaques Elisa pour une lecture plus facile au spectrophotométre. Les résultats sont généralement ramenés au poids de matière fraîche. REVENDICATIONS 1) Procédé pour diminuer l'accumulation du nitrate dans une plante, caractérisé en ce que l'on inhibe le canal chlore chloroplastique CLC-e de ladite plante. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'inhibition du canal CLC-e est obtenue par une méthode choisie parmi la mutation du gène CLC-e, l'inhibition de la transcription ou de la traduction dudit gène, ou l'inhibition de l'activité de la protéine CLC-e. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'inhibition du canal CLC-e est obtenue par l'expression dans ladite plante d'au moins un polynucléotide choisi parmi : a) les polynucléotides comprenant tout ou partie de la séquence d'un gène CLC-e, ou de son complémentaire ; b) les polynucléotides possédant au moins 70% d'identité avec un polynucléotide défini en a) ci-dessus. 4) Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que le polynucléotide comprenant tout ou partie de la séquence d'un gène CLC-e est choisi parmi les polynucléotides de séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, ou SEQ ID NO : 3, et leurs fragments d'au moins 20 bases consécutives. 5) Procédé d'obtention d'une plante sousaccumulant le nitrate, caractérisé en ce qu'il comprend : - la transformation d'une cellule hôte végétale avec au moins une copie d'un polynucléotide tel que défini dans une quelconque des revendications 3 ou 4 ; - la régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte obtenue à l'étape précédente. 6) Utilisation d'un polynucléotide tel que défini dans une quelconque des revendications 3 ou 4 pour diminuer l'accumulation du nitrate dans une plante. 7) Cassette d'expression comprenant un polynucléotide tel que défini dans une quelconque des revendications 3 ou 4 sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. 8) Vecteur d'acide nucléique comprenant une cassette d'expression selon la revendication 7. 9) Cellule végétale transformée par une cassette d'expression selon la revendication 7. 10) Plante sous accumulant le nitrate, susceptible d'être obtenue par un procédé selon une quelconque des revendications 1 à 5. 11) Plante selon la revendication 10, caractérisée en ce que le taux de nitrate dans les plantules ou dans les feuilles de ladite plante est au moins inférieur de 20% au taux moyen de nitrates des plantes de type sauvage de la même espèce. 12) Plante selon une quelconque des revendications 10 ou 11, caractérisée en ce qu'elle appartient à une famille choisie parmi les crucifères, les solanacées, les chenopodiacées, les composées, les cucurbitacées, les rosacées, et les ombellifères.