Brevet FR2821623A1 — publié le 20020906

La présente invention a trait à un procédé de culture d'acariens en vue de la production d'extraits allergéniques d'acariens, ainsi qu'à des formulations nutritives destinces à être mises en _uvre dans ces procédés. - Différentes espèces d'acariens sont utilisées pour préparer des extraits allergéniques mis en _uvre dans des formulations d'allergologie pour servir, par exemple, de tests d'allergologie in vivo ou in vitro, ou encore de préparations désensibilisantes administrées aux patients. Parmi ces acariens on trouve notamment les espèces suivantes: Derma tophagoi des pteronyssinus, Derma topLagoi des farinae, Blomia kulagini ou tropicalis, PyroglypLus africanus, et EuroglypLus maynsi, qui sont des acariens domestiques qui se nourrissent principalement de squames humaines. On utilise classiquement, pour produire ces acariens, des milieux de culture contenant des squames humaines convenablement traitées et autoalavées en vue de l' inactivation des virus, bactéries et des agents transmissibles non conventionnels tels que les prions. Les acariens ainsi produits permettent d'obtenir, par extraction, des extraits allergéniques d'une grande qualité et pratiquement dépourvus d'allergènes d'autre origine susceptibles d'entraîner des réactions croisoes pouvant mettre des tests en défaut ou susceptibles d'induire des allergies. D'autres procédés de culture d'acariens sont connus, mettant en _uvre des milieux nutritifs à base de protéines telles que des _ufs de crevettes ou de la poudre de foie de porc. Ces milieux permettent d'obtenir des productions satisfaisantes, mais comportent des substances non acariennes, notamment d'origine animale, pouvant être allergisantes et/ou à potentiel infectieux. Bien que les procédés d' inactivation utilisés pour traiter les squames humaines destinées à la culture d'acariens soient d'une efficacité extrêmement élevée et que des contaminations d' agents infectieux conventionnels ou non soient hautement improbables, il est néanmoins souhaitable d'uti-liser, pour cultiver les acariens,-des milieux nutritifs d'origine non humaine et non animale et dépourvus d'éléments susceptibles d'être allergéniques. La présente invention se propose donc de fournir un procédé de culture et de production d'acariens, et notamment des acariens des espèces précitées, limitant au maximum le risque de présence d'agents infectieux d'origine animale ou humaine. Un autre objectif de l' invention est de fournir un tel procédé qui permette un rendement important en acarlens. Un autre objectif encore de l' invention est d'améliorer éventuellement l'antigénicité des acariens destinés à être utilisés ou extraits pour former les formulations finales. Un autre objectif encore de l' invention est de permettre déliminer facilement une grande partie du milieu de culture. L'invention a pour objet un procédé de culture et de production d'acariens, et notamment d'acariens appartenant à l'une au moins des espèces suivantes: 3 0 Derma tophagoi des p teronyssinu s, Derma tophagoi des farina e, Blomia kulagini ou tropicalis, PyroglypLus africanus, et EuroglypLus maynei, caractérisée en ce que l'on cultive les acariens sur milieu dépourvu d'éléments ou de protéines humaines ou animales et comprenant, en quantités efficaces, une pluralité d'acides aminés sous forme particulaire avec une granulométrie inférieure à 250 m, ou sous forme lyophilisée. La granulométrie recherchée d'acides aminés peut être obtenue par un broyage des acides aminés, individuellement ou en mélange. De façon équivalente les acides aminés peuvent être obtenus par dissolution des acides aminés, puis lyophilisation. Dans ce cas on préfère que - la lyophilisation aboutisse à des particules de taille inférieure à 250 m. Bien entendu, dans le milieu selon l' invention, certains seulement des acides peuvent avoir été broyés et/ou lyophilisés, notamment en fonction de leurs caractéristiques physiques, par exemple leur solubilité, et, le cas échéant, certains acides peuvent être ajoutés tels quels dans le mélange. L' invention repose sur la découverte que, si l'on utilise tels quels (sans broyage et/ou sans solubilisation-lyophilisation et/ou sans adjonction de sels) les acides aminés disponibles commercialement, les acariens se cultivent extrêmement mal et les rendements sont très faibles. De façon surprenante, les mélanges d'acides aminés ayant les caractéristiques définies dans l'invention aboutissent à des rendements comparables voire supérieurs aux rendements classiques utilisant des squames humaines. Les mélanges d'acides aminés comportent, de préférence, la majorité ou la totalité des acides aminés constitutifs naturels des protéines. Par majorité on entend au moins 50%, par exemple 60 à 80%, des vingt acides aminés constitutifs naturels des protéines ou d'acides aminés équivalents assimilables. On peut cependant, également, ajouter des acides aminés non constitutifs, ou remplacer certains des acides aminés par des acides aminés non constitutifs de protéines. Dans un mode de réalisation particulier, on peut avantageusement mettre en _uvre un mélange d'acides aminés se rapprochant de la composition de la kératine ou de la couche cornée. Cependant, dans des variantes de l' invention, on peut également utiliser des mélanges d'acides aminés se rapprochant de la-composition des _uis de crevettes ou du soja. Dans d'autres formulations on peut s'éloigner de cette distribution. Les proportions respectives des acides aminés peuvent se rapprocher des proportions quantitatives des acides aminés dans des substances telles que la kératine, ou la couche cornée, les _ufs de crevettes ou le soja, mais une identité de distribution en proportion n'est nullement exigée, dès lors que les acides aminés individuels sont présents en quantité suffisante. Le milieu nutritif qui comporte le mélange d'acides aminés du procédé selon l'invention peut également comporter d'autres éléments usuels de milieux nutritifs pour acariens, destinés soit à apporter un complément nutritif, soit à donner au milieu une texture propre au développement et à la multiplication des acariens, ainsi que des sels. Ainsi on préfère incorporer, dans le milieu de culture, des germes de blé et/ou de la levure, notamment de la levure de boulangerie, et/ou de la cyanocobalamine et/ou de la d-biotine. Le milieu peut encore comporter d'autres vitamines. Les germes de blé sont de préférence chauffés pour supprimer tout risque d'allergénicité. Dans le procédé selon l' invention, le milieu de culture, contenant le mélange d'acides aminés, est amené à un degré d'humidité convenable, usuel pour les acariens que l' on cultive, et maintenu à la température habituelle convenable. Les durses de culture peuvent être, par exemple, de trois mois et l'on préfèrera des durées classiques de 2 à 5 mois. L' invention a également pour objet les milieux de culture contenant les mélanges d'acides aminés selon l' invention. L'invention a encore pour -objet les procédés de préparations d' extraits ou de formulations d' allergènes obtenus à partir des acariens cultivés par le procédé selon l' invention. D'autres avantages et caractéristiques de l' invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif. Des cultures ont été conduites simultanément sur milieux acides aminés selon les exemples 1 et 3 et sur squames humaines selon l'exemple 2. Exemple 1: Cet exemple décrit un procédé de culture dans un milieu contenant une préparation commerciale d'acides aminés. On prépare un milieu de culture contenant des germes de blé, de la cyanocobalamine, de la levure de boulangerie et de la D-biotine. Les germes de blé sont autoalavés à 121 C pendant ' puis broyés et tamisés sur un tamis de 250 m. La cyanocobalamine est broyée et tamisoe sur un tamis de 250 m de porosité. La levure de boulangerie est chauffée à 122 C pendant 2 à 3', puis entre 100 et 135 C pendant 12" dans un tambour dont la vitesse de rotation est de 5 tours par minute, puis chauffée à 100 C pendant 15'. La préparation commerciale d'acides aminés a été obtenue auprès de la société Frésénius-Kabi France S.A. Sa composition est la suivante, qsp 1 L d'eau PPI: - L-alanine 3,8 g - Larginine 4,2 g - acide L-aspartique 5,2 g - L-cystéine chlorhydrate monohydratée exprimé en L-cystéine/L-cystine 1,7 g - acide L- glutamique 11,5 g - glyaine 2,7 g - L-histidine 3,1 g - Lisoleucine 5,0 g - L-leucine 6,7 g - Chlorhydrate de L-Lysine, exprimé en L-lysine 5,0 g - L-méthionine 2,4 g - L-phénylalanine 7,0 g - L-proline 10,3 g - L- sérine 9,6 g L-thréanine 3,8 g - L-tryptophane 1,3 g - L-tyrosine 0,6 g - L-valine 5,5 g - Chlorure de calcium dihydraté 0,44 g - Sulfate de magnésium hoptahydraté 0,493 g - Hydroxyde de sodium 2,6 g - Hydroxide de potassium 0,70 g - Chlorure de potassium 0,078 g La solution est lyophilisce et le lyophilisat récolté est tamisé sur un tamis vibrant de 250 m de porosité. Le milieu proprement dit est préparé de la facon suivante: Pour 600 g de milieu: On pèse 252 g de germes de blé tamisé, 252 g de levures tamisées, 90 g de la solution d'acides aminés lyophilisée et tamisce, 5,4 g de cyanocobalamine tamisée et 0,6 g de D- biotine, l'ensemble étant homogéncisé dans un homogéncisateur puis tamisé sur un tamis de 400 m de porosité. Le milieu est conditionné en flacons bouchés identifiés et peut être conservé en chambre froide à température comprise entre +2 C et +8 C. La culture proprement dite est effectuée de la façon suivante: Les milieux préparés sont ensemencés avec- un échantillon de cultures d'ensemencement classique de Dermatophagoides pteronisynus. La culture s'effectue en flacons à une température de 25 C, à un dogré humidité de 75. Les prélèvements sont effectués à des époques différentes. Les milieux récoltés sont ensuite lyophilisés et extraits à 5% en solution de bicarbonate d'ammonium 4 g/l pendant 24 heures à +4 C, puis centrifugés à 3000 tour par min. pendant 15 min. à +4 C. Le surnageant est récolté puis filtré sur filtre Millex HV de 0,45 m de porosité (Millipore). Dans les extraits obtenus on dose l'activité allergénique totale (par Rast-inhibition), les protéines (par la technique de Lowry et/ou la technique de Bradiord), et les allergènes majeurs Der p 1 et Der p 2 (à l' aide des kits de dosage usuels). Le résultat du Rast-inhibition est exprimé en IR/ml(IR: indice de réactivité), les extraits étant dosés en comparai son avec un ext rait de référence dont l'activité est de 100 IR/ml. Exemple 2: Le milieu de l'exemple 2 est identique à celui de l'exemple 1 à la différence que la solution commerciale lyophilisée dacides aminés est remplacée par une préparation de squames humaines. Ces squames sont autoclavées dans des sachets à 134 C pendant 18'. Les squames sont ensuite déposces dans des plateaux en inox mis dans une étuve à 37 C pendant 1 à 2 semaines. Les squames sont ensuite broyées et tamiséss avec des tamis de 500 et 250 m. La poudre de squames recucillie est ensuite traitée à l'acétone et laissce à décanter 24 heures. Le surnageant est éliminé. On procède ensuite à une dernière opération de lavage en acétone. On recusille le culot que lon réparti en couches minces sur des plateaux et que l'on recouvre d'une feuille d'aluminium perforée. Cette substance est séchée sous hotte puis finalement tamisse avec un tamis vibrant de 250 m. Au lieu des 90 g de mélange d'acides aminés, le milieu de culture de cet exemple comprend 90 g de la préparation de squames humaines précitée. Exemple 3: Le milieu de culture comprend les germes de blé, la cyanocobalamine et la levure conformément aux exemples 1 et 2. On prépare un mélange d'acides aminés de la façon suivante: Dans un récipient on verse 10 litres d'eau distillée stérile et on solubilise les acides aminés su1vants: - Lalanine 17,2 g - L-arginine 26,4 g - L-cystéine chlorhydrate monohydratée 4,4 g - glycine 49,6 g - L-histidine 5,2 g - L-isoleucine 13,2 g chlorhydrate de L-Lysine 20,0 g - L-méthionine 8,0 g - L-proline 8,8 g L-sérine 44,0 g - L-thréonine 13,6 g - L-valine 13,6 g - L-tryptophane 1, 3 g - L-phénylalanine 20,8 g - L-lencine 34,8 g - acide L-glutamique 64,4 g - acide L-aspartique 9,7 g La solution est ensuite lyophilisée et le lyophilisat récolté est tamisé sur un tamis vibrant de 250 m. On broie séparément 6,5 g d'acide aspartique et 4,0 g de tyrosine. Pour préparer le milieu on ajoute aux 252 g de germes de blé, 252 g de levures, 5,4 g de cyanocabalamine et 0,6 g de D-biotine, 79,5 g du mélange lyophilisé précité, 6,5 g dacide aspartique broyé et 4,0 g de tyrosine broyée. L'ensemble est homogéncisé puis tamisé sur 400 m. Après ensemencement la culture est effectuce comme dans l'exemple 1 et 2. Les résultats comparatifs des exemples 1 à 3 figurent dans le tableau 1 pour un premier cycle de culture, après 3 mois, et dans les tableaux 2 et 3 pour un second cycle de culture (les acariens cultivés sur un milieu donné sont ré-ensemencés sur le même milieu), après 2,5 mois et 3 mois, respectivement: TABLEAU 1 Activité allergénique totale, taux protélques, de Der p 1 et de Der p 2 dans les extraits au 1/20ème de Dermatophagoides pteronyssinus cultivé sur différents milieux après trois mois de culture. Milieu contenant Acides Squames humaines Acides aminés -(exemple 2) aminés (exemple 1) (exemple 3) Activité allergénique 263 284 573 totale (IR/ml) Taux protéique(g/ml; 537 544 217 technique de Bradford) Taux protéique 5689 6446 5538 (g/ml; technique de Lowry) Der p 1 (g/ml) 187, 5 231,5 69,0 Der p 2 (g/ml) 2,0 2,5 10,0 Tableau 2 Activité allergénique totale, taux protéique, de Der p 1 et de Der p 2 dans les extraits au 1/20ème de Dermatophagoides pteronyssinus cultivé pour un second cycle sur différents milieux après deux mois et demi de culture. Milieu contenant Acides Squames humaines Acides aminés (exemple 2) aminés (exemple 1) (exemple 3) Activité allergénique 617 713 195 totale (IR/ml) Taux protéique(g/ml; 328 371 75 technique de Bradford) Der p 1 (g/ml) 83, 0 138,0 8,5 |Der p 2 (g/ml) | 19,5 1 19,5 1 3,0 | Tableau 3 Activité allergénique totale, taux protélque, de Der p 1 et de Der p 2 dans les extraits au 1/20ème de Dermatophagoides pteronyssinus cultivé pour un second cycle sur différents milieux après trois mois de culture. Milieu contenant Acides Squames humaines Acides aminés (exemple 2) aminés (exemple 1) (exemple 3) Activité allergénique 631 486 192 totale (IR/ml) Taux protélque(llg/ml; 363 411 110 technique de Bradford) Der p 1 (g/ml) 206,0 267,5 23,0 Der p 2 (g/ml) 14,0 4,5 5,0 On voit que si la culture sur acides aminés suivant l'exemple 3 donne de bons résultats lors d'un premier cycle de culture, elle donne de mauvais résultats sur un second cycle de culture. Cet exemple n'est donc pas adapté à la culture en routine des acariens. En revanche, la culture sur acides aminés suivant 1' exemple 1 semble bien adaptée, puisque non seulement les résultats sont satisfaisants après deux cycles de culture, mais encore ils sont très proches des résultats obtenus avec les squames humaines, qui constituent lalimentation naturelle des acariens dont il est ici question. La relative faiblesse des résultats obtenus lors du premier essai est certainement imputable à un temps de culture trop important (une récolte à deux mois et demi aurait donné certainement de meilleurs résultats). REVENDI CATIONS 1. Milieu de culture et de production d'acariens, et notamment d'acariens appartenant à l'une au moins des espèces suivantes: Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Blomia kulagini ou tropicalis, PyroglypLus africanus, et EuroglypLus maynei, caractérisé en ce qu'il est dépourvu d'éléments ou de protéines humaines ou animales et qu'il comprend, en quantités efficaces, une pluralité d'acides aminés sous forme particulaire avec une granulométrie inférieure à 250 m ou sous forme lyophilisée. 2. Milieu selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend des acides aminés obtenus par un broyage d'acides aminés. 3. Milieu selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il comprend également des acides aminés lyophilisés et/ou tels quels du commerce. 4. Milieu selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend des acides aminés lyophilisés et des acides aminés tels quels du commerce. 5. Milieu selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il contient des sels. 6. Milieu selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le mélange d'acides aminés comporte au moins 50% des acides aminés constitutifs naturels des protéines ou leurs équivalents. 7. Milieu selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que le mélange d'acides aminés reproduit le spectre des acides aminés constitutifs de la kératine ou de la couche cornée. S. Milieu selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le mélange d'acides aminés reproduit le spectre des acides aminés présents dans les _ufs de crevettes ou dans le soga. 9. Milieu selon l'une des revendications 7 et caractérisé en ce que les proportions respectives des acides aminés sont proches des proportions quantitatives des acides aminés et des sels dans des substances telles que la kératine ou la couche cornce ou les _ufs de crevettes ou le soja. 10. Milieu selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte également d'autres éléments usuels de milieux nutritifs pour acariens, destinés à apporter un complément nutritif, et/ou à donner au milieu une texture propre au développement et à la multiplication des acariens. 11. Milieu selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comporte en outre, des germes de blé et/ou de la levure, notamment de la levure de boulangerie, et/ou de la cyanocobalamine et/ou de la d-biotine. 12. Milieu selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il peut contenir du soja. 13. Milieu selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comporte au moins 50% des acides aminés suivants: - L-alanine - L-arginine - Acide L-aspartique - L-cystéine/cystine - Acide L-glutamique - glyaine - L-histidine - L-isoleucine - L-leucine - LLysine - L-méthionine - L-phénylalanine - L-proline - L-sérine - Lthréonine - L-tryptophane - L-tyrosine - L-valine 14. Milieu selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend les acides aminés dans les proportions suivant-es, pour un total de 93,711 g: - L-alanine 3,8 g L-arginine 4,2 g - acide L-aspartique 5,2 g - L-cystéine chlorhydrate monohydratée exprimé en L-cystéine/L-cystine 1,7 g - acide L- glutamique 11,5 g - glycine 2,7 g - L-histidine 3,1 g - L-isoleucine 5,0 g L-leucine 6,7 g - Chlorhydrate de L-lysine, exprimé en L-lysine 5,0 g L-méthionine 2,4 g - L-phénylalanine 7,0 g - L-proline 10,3 g - L- sérine 9,6 g - L-throonine 3,8 g - L-tryptophane 1,3 g - L-tyrosine 0,6 g L-valine 5,5 g - Chlorure de calcium dihydraté 0,44 g - Sulfate de magnésium heptahydraté 0,493 g - Hydroxyde de sodium 2,6 g - Hydroxide de potassium 0,70 g - Chlorure de potassium 0,078 g 15. Procédé de culture et de production d'acariens, et notamment d'acariens appartenant à l'une au moins des espèces suivantes: Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Blomia kulagini ou tropicalis, PyroglypLus africarus, et EuroglypLus maynei, caractérisé en ce que l'on cultive les acariens sur un milieu selon l'une quelcouque des revendications 1 à 14. 16. Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce que le milieu de culture, contenant le mélange d'acides aminés, est amené à- un degré d'humidité convenable, usuel pour les acariens que l' on cultive, et maintenu à la température habituelle convenable. 17. Procédé selon l'une des revendications 15 et 16 caractérisé en ce que l'on effectue la culture entre 2 et mois. 18. Procédé d'obtention d'une préparation dallergènes caractérisé en ce que l'on réalise une extraction des allergènes de la culture selon l'une des revendications 15 à 17.