Brevet FR2826279A1 — publié le 20021227

La présente invention est relative au domaine des compositions vaccinales. Plus particulièrement l'invention est relative au domaine des adjuvants pour composition vaccinale. Par adjuvant vaccinal, on entend un produit qui, ajouté dans un vaccin, permet d'accroître ou de modifier la réponse du système immunitaire d'un organisme vis à vis de l'administration d'un antigène. En particulier, il peut s'agir d'une augmentation de la réponse humorale ou de la réponse cellulaire, ou des deux simultanément. L'action d'un adjuvant vaccinal peut également être, non pas une augmentation de la réponse qui se produirait en l'absence d'adjuvant, mais une orientation différente de la réponse produite : par exemple, orientation vers une réponse cellulaire plutôt qu'une réponse humorale, production de certaines cytokines plutôt que d'autres, production de certains types ou sous-types d'anticorps plutôt que d'autres, stimulation de certaines cellules plutôt que d'autres. L'action d'un adjuvant peut également être de provoquer une réponse plus rapide que celle qui se produirait sans adjuvant, ou encore de conduire à une sorte d'immunisation prolongée dans le temps. On connaît, dans l'art antérieur, de nombreux adjuvants pour composition vaccinale ; cependant, à ce jour, peu ont été approuvés par les autorités pharmaceutiques pour la fabrication de vaccins, la plupart des vaccins présents sur le marché étant adjuvés par ce que l'on appelle des gels d'aluminium, qui sont essentiellement, soit de l'hydroxide d'aluminium, soit du phosphate d'aluminium. Cependant, de tels adjuvants ne permettent pas toujours d'obtenir les résultats d'immunisation souhaités, suivant l'antigène et/ou la voie d'administration choisis. Il est donc souhaitable de pouvoir disposer de nouveaux adjuvants. A cette fin, la présente invention a pour objet une composition vaccinale comprenant au moins un antigène, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un composé de type hydrotalcite. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'antigène est un antigène sous-unitaire. Selon un autre mode de réalisation, l'antigène est une fraction d'ADN codant pour un antigène vaccinal. L'invention a également pour objet un adjuvant vaccinal comprenant au moins un composé de type hydrotalcite. Selon un mode particulier de réalisation, l'adjuvant vaccinal selon l'invention comprend le composé ayant la formule Mg6Alz (OH) 16 (C03). 4H20 qui a subi une décarbonatation. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un adjuvant vaccinal comprenant au moins un composé de type hydrotalcite pour la fabrication d'un médicament susceptible d'induire une réponse de type TH2 vis-à-vis d'un antigène. Les composés de type hydrotalcite au sens de la présente invention sont des composés que l'on appelle aussi Hydroxydes doubles lamellaires ou LDH (pour layered double hydroxide ) ; ils constituent une famille de composés ioniques lamellaires, contenant des anions échangeables. Ces composés ont des feuillets d'hydroxyle chargé positivement, entre lesquels sont intercalés des anions et des molécules d'eau. Leur formule générale est la suivante : Dans laquelle MI, est un cation métallique divalent (Mg2+, Zn 2+, Mn 2+,.....), MIll est un cation métallique trivalent, Zest un anion interfoliaire avec m étant un entier supérieur ou égal à 1, et x variant entre 0,2 et 0,3. Ces composés sont ainsi appelés en raison de leur structure analogue à celle de l'hydrotalcite minérale naturelle dont la formule est la suivante : Les cations métalliques divalents MIl sont choisis parmi notamment : le magnésium (Mg), le chrome (Cr), le manganèse (Mn), le fer (Fe), le nickel (Ni), le cobalt (Co), le cuivre (Cu), le zinc (Zn), le Calcium (Ca). On a obtenu de particulièrement bons résultats avec le magnésium. Les cations métalliques trivalents MIII sont choisis parmi notamment : l'aluminium (AI), le chrome (Cr), le manganèse (Mn), le fer (Fe), le nickel (Ni), le cobalt (Co), le gallium (Ga). Un cation convenant particulièrement bien est l'aluminium. Il est également possible que les 2 membres du couple cation divalent/cation trivalent proviennent du même métal, par exemple le fer avec Fe2+/Fe3+ ou encore le manganèse avec Mn/Mn. Les anions situés entre les feuillets peuvent être des halogénures, des oxoanions, des iso-ou hétéroanions, des anions complexes ou des anions organiques. Il peut notamment s'agir de fluorures, de chlorures, de bromures, de carbonates, de nitrates, de sulfates ou encore de Croc-. Un anion convenant particulièrement bien est le Carbonate col-. La valeur de n qui traduit l'état d'hydratation de la molécule utilisée est strictement supérieure à 0. La valeur de m qui traduit la charge de l'anion est une valeur entière, qui peut notamment être 1, 2,3, 4,5 ou 6. Ces composés sont appelés selon la nature des cations métalliques des feuillets ; on a, par exemple les composés suivants : - Fhydrotalcite (Mg-Al) : JACCOHO - la pyroaurite (Mg-Fe) : Mg6Fe2C03 (OH) 16. 4H2O - la stichtite (Mg-Cr) : Mg6Cr2C03 (OH) 16. 4H20 - la takovite (Ni-Al) : Ni6Al2C03 (OH) 16. 4H20 - la reevesite (Ni-Fe) : Ni6Fe2C03 (OH) 16. 4H20 - la comblainite (Ni-Co) : Ni6C02C03 (OH) 16. 4H20 De nombreux autres composés sont possibles, en faisant varier la nature des cations métalliques, leurs proportions respectives (il est même possible d'avoir plus de 2 types de cations notamment Mg/Zn/AI), la nature des anions interfoliaires, ou encore l'état d'hydratation. Ces composés sont généralement des composés disponibles commercialement. Il est également possible de les préparer spécifiquement grâce à des méthodes connues dites de chimie douce . Il est par exemple possible de fabriquer le Zl16Ah (OH) 16 (C03). 4H2O à partir d'un mélange de ZnCIz et de A1C13 en proportion 3/1. La solution obtenue est mélangée goutte à goutte avec une solution de soude concentrée, le pH restant constant autour de 7. Le précipité obtenu est centrifugé puis lavé plusieurs fois avec de l'eau ultrafiltrée. De même, on peut préparer Zn6Fe2 (OH) 16 (C03). 4H20, à partir cette fois, non pas de AlClg mais de Fed3. De tels composés ont été largement décrits dans la littérature pour leurs applications comme échangeurs d'ions, catalyseurs, adsorbants, conducteurs d'ions... Cependant, ils n'ont jamais été décrits ni suggérés comme ayant une capacité à stimuler une réponse immunitaire, leur permettant d'être utilisés comme adjuvant vaccinal. Selon l'invention, les composés de type hydrotalcite sont utilisés en association avec des antigènes à des fins d'immunisation. Les antigènes utilisés peuvent être de nature variée ; il peut s'agir de substances capables d'induire directement une réponse immunitaire de la part de l'organisme auquel elles sont administrées : antigènes protéiques, peptidiques, polysaccharidiques, lipopeptidiques, portions ou totalité de virus ou de bactéries... ; ou encore il peut s'agir de fractions d'ADN capables d'être exprimées dans l'organisme auquel elles sont administrées, et donc de conduire indirectement à une stimulation du système immunitaire qui réagira contre le produit d'expression de cette traction d'ADN administrée. L'association des composés selon l'invention avec les antigènes d'immunisation peut être d'un type tel que celle se produisant lors de l'utilisation classique d'une suspension d'aluminium. Cette association est obtenue par simple mélange des composés de type hydrotalcite et des antigènes d'intérêt, dans des proportions qui peuvent varier selon la nature de l'antigène et selon la nature du composé de type hydrotalcite. La composition vaccinale selon l'invention peut, outre l'antigène ou les antigènes d'intérêt et les composés de type hydrotalcite, comprendre également toute autre substance habituellement comprise dans un vaccin, et notamment un stabilisant, un conservateur, un ou d'autres adjuvants... Une telle composition vaccinale peut être administrée par toutes les voies habituellement utilisées, et selon tous les protocoles d'administration recommandés par les différents organismes de santé. Les exemples qui suivent illustrent différents modes de réalisation de la présente invention. Exemple 1 : Compositions vaccinales comprenant au moins un antigène contre le tétanos. On dispose de composé de type hydrotalcite Mg/AI de formule : Mg6Al2C03 (OH) 16. 4H2O provenant de Süd Chemie que l'on décarbonate par calcination. On dispose également d'une suspension de phosphate d'aluminium. On prépare des doses de 0,5 ml de compositions vaccinales ayant les formulations suivantes : - composé de type hydrotalcite ou suspension d'aluminium classique : 0, 3g/l (exprimé en poids d'aluminium) - anatoxine diphtérique : 30 LF/ml - anatoxine tétanique : 10 LF/ml - merthiolate : 40 l1g ! dose L'activité adjuvante des composés de type hydrotalcite vis-à-vis de l'antigène du tétanos est appréciée grâce à un test effectué chez la souris, vis-à-vis d'une dose létale de toxine tétanique administrée par voie sous-cutanée. Lors de ce test, l'activité antitétanique est déterminée en comparant la dose nécessaire pour protéger 50% des animaux (DE50) des effets de la toxine, à celle d'un vaccin de référence étalonné en UI/ml. Brièvement, le test est réalisé de la manière suivante : Pour chaque test, on dispose de 316 souris permettant de tester 3 formulations vaccinales ; les souris sont réparties de la façon suivante : - souris pour vaccination : 16 souris par dose à raison de 4 doses souris témoins de l'épreuve : 10 souris souris pour vérification de la DLso : 10 souris par dose à raison de 5 doses Les souris reçoivent par voie sous-cutanée 0,5ml d'une des dilutions des compositions vaccinales à tester ou du vaccin de référence. 28 jours après cette immunisation, les souris sont éprouvées par une solution d'épreuve de toxine tétanique. On dénombre 4 jours après l'épreuve, les souris survivantes, et on détermine : -la DE50 du vaccin de référence et des vaccins à titrer, - l'activité relative du vaccin par rapport au vaccin de référence, - le nombre de DLo contenu dans la dose d'épreuve. L'activité (en UI/dose) est ensuite déterminée à partir de l'activité relative et du titre en UI du vaccin de référence. Les résultats obtenus pour les différentes compositions vaccinales testées sont les suivants : Mg/Al/C03 décarbonaté : 45 et 57 - Al/P04 : 41 Ces résultats permettent de voir que lorsque l'adjuvant utilisé est un composé de type hydrotalcite Mg/Al/C03 décarbonaté, l'activité antitétanique est du même ordre que lorsque l'adjuvant utilisé est une suspension de phosphate d'aluminium. Exemple 2 : Compositions vaccinales comprenant l'antigène p24 On prépare des compositions vaccinales comprenant l'antigène p24 qui est un antigène susceptible d'entrer dans la composition d'un vaccin contre le SIDA. Cet antigène p24 a été décrit dans la publication suivante : Diagnostic value of HIV-Ag testing and anti-p24 titers in HIV carriers and AIDS patients. Roumeliotou A, Nestoridou E, Economidou I, Psarra E, Sidiri E, Choremi E, Kallinikos G, Papaevangelou G, AIDS 1988 Feb ; 2 (l) : 64 ; il est présent à une concentration de 6,7 g/l dans une solution de Phosphate de sodium 100mM et de Chlorure de sodium 5OmM, à pH 7,4. On dispose pour la préparation des compositions vaccinales, des matériaux suivants : de l'hydroxide d'aluminium (Reheis) en suspension aqueuse à 10,02 g/l, - du phosphate d'aluminium (Superfos) en suspension aqueuse à 4,4 g/l, - de l'hydrotalcite Mg/Al/COs (Sud Chemie) en tampon Hepes à 6 g/l, - du composé de type hydrotalcite Mg/Fe/COs (Süd Chemie) en tampon Hepes à 6 g/1, - de l'hydrotalcite Mg/Al/C03 (Süd Chemie) décarbonaté par chauffage, en tampon Hepes dégazéifié, à une concentration de 6g/1, stocké sous argon à 4 C. Chacune des suspensions des matériaux cités ci-dessus est diluée à 3, 7g/1 par du tampon PBS (= 0, 012 g/1 Na2HP042H2O, 0, 06 g/l KHP04, 9g/l NaCl). A 1, 3ml des échantillons de solution qui en résultent, on ajoute 0, 3 ml de p24 dilué à 0, 134 g/l en tampon PBS, de manière à obtenir 1, 6ml d'une suspension comprenant 0, 04 mg de p24 et 4, 8mg d'adjuvant minéral. On obtient ainsi des doses de 0,2ml contenant 5ag de p24 et 0,6mg d'adjuvant minéral. Le protocole de l'étude est le suivant : on prépare les compositions vaccinales le jour-même de leur administration aux souris. Pour chaque composition vaccinale testée, on immunise 6 souris. Les souris sont immunisées à JI et à J21, par administration en sous-cutané d'une dose de 200ul de la composition vaccinale à tester. Des prélèvements sanguins sont effectués à J14 et à J35, et les souris sont sacrifiées à J37. Les dosages effectués sont les suivants : - dosage des IgG 1 et IgG2a sériques spécifiques de la p24 par ELISA - Dosage par ELISA de la production en IL5 et en IFNy dans les surnageants des cellules spléniques qui sont stimulées pendant 5 jours in vitro avec de la p24 recombinante à raison de lOug/ml, - Dosage par ELISPOT de la fréquence de cellules produisant de l'IFNy après stimulation des cellules spléniques par un peptide CTL de la p24 et par de l'IL2 pendant 7 jours (avec un contrôle effectué au moyen d'une stimulation par un peptide HA), test de lymphoprolifération après stimulation à la p24 recombinante à raison de 5ug/ml pendant 5 jours. Les résultats des différents groupes d'animaux sont représentés : - sur la Figure 1 pour ce qui concerne les titres en IgG1 à J14, sur la Figure 2 pour ce qui concerne les titres en IgG2a à J14, - sur la Figure 3 pour ce qui concerne les titres en IgG1 à J35, - sur la Figure 4 pour ce qui concerne les titres en IgG2a à J35, - sur la Figure 5 pour ce qui concerne la production d'IFNy dans le surnageant des cellules spléniques, - sur la Figure 6 pour ce qui concerne la production d'IL5 dans le surnageant des cellules spléniques, - sur la Figure 7 pour ce qui concerne le dénombrement des cellules productrices d'IFNy - sur la Figure 8 pour ce qui concerne la réponse en prolifération après restimulation à la p24 recombinante. Les groupes de souris sont référencées en relation avec la composition vaccinale testée. - le groupe 1 n'a reçu que de la p24 ; - le groupe 2 a reçu p24 + AIOOH - le groupe 3 a reçu p24 + AI P04 - le groupe 4 a reçu p24 + Mg/AI/C03 - le groupe 5 a reçu p24 + Mg/Fe IC03 - le groupe 6 a reçu p24 + Mg/AI/C03 décarbonaté. Ces résultats montrent que les compositions selon l'invention, qui contiennent des composés de type hydrotalcite, conduisent à des résultats proches de ceux obtenus avec de l'hydroxide d'aluminium. La forte augmentation de la production d'immunoglobulines de type IgG2a montrent que les composés selon l'invention sont susceptibles d'induire une réponse immunitaire de type TH2. Exemple 3 Composition vaccinale pour une immunisation ADN On prépare des compositions vaccinales comprenant, non plus un antigène direct comme dans le cas des 2 exemples précédents, mais un plasmide codant pour un antigène, notamment le plasmide VR-1012 HA codant pour l'hémagglutinine (HA) du virus de la grippe, en l'occurrence la souche A/PR8/34, HINI) A cette fin, on dispose d'hydrotalcite Mg/AI/C03 et conservé à une concentration de 5g/1 en tampon Hepes 50 mM Les compositions vaccinales comprenant différentes concentrations d'hydrotalcite et d'ADN sont préparées par injection rapide de l'hydrotalcite dans l'ADN, homogénéisation par aspiration/refoulement 3 fois, puis mélange au Vortex légèrement. Chacune des compositions vaccinales est administrée à un groupe de 6 souris, qui reçoivent une 1ère administration à JO, une seconde administration à J21, de manière bilatérale par voie i. m. dans le muscle tibialis antérieur à raison de 50ill par muscle pour chacune des injections. Des prélèvements sanguins ont été réalisés au niveau du sinus retro-orbital à JO, J21 et J35 pour l'étude de la réponse humorale. Les souris ont été sacrifiées à J35 pour le test d'immunité cellulaire. Les souris sont réparties dans des groupes A à H en fonction de la composition vaccinale administrée : Groupe A : 0. 1 ug de VR-HA Groupe B : : 1 jog de VR-HA Groupe C : 10 gag de VR-HA Groupe D : : 50 lug de VR-HA Groupe E : 0. 1 jug de VR-HA + 0. 5 ug Hydrotalcite Groupe F : 1 jug de VR-HA + 5 Jlg Hydrotalcite Groupe G 10 ug de VR-HA + 50 ug Hydrotalcite Groupe H : 50 ug de VR-HA + 250 Jlg Hydrotalcite ANALYSE Les IgG totales anti-HA ont été dosées individuellement pour les groupes A à H. On a évalué par ELISPOT le nombre de cellules sécrétrices d'IFN-y après stimulation ex vivo avec un peptide présenté par le MHC de classe 1 spécifique de HA pour chaque souris des groupes A à H. La méthode d'analyse de la réponse cellulaire est présentée brièvement ci-après : Un anticorps spécifique de la cytokine à détecter (réf 18181D Pharmingen pour l'anti-IFNy) a été incubé toute la nuit à 4 C dans des plaques à 96 puits comportant un fond en nitrocellulose. Les plaques ont ensuite été saturées avec du milieu de culture durant 1 h à 37 C. Les splénocytes ont été stimulés in vitro par les peptides présentés par le MHC de classe 1 de la protéine HA (IYSTVASSLVL) du virus de la grippe ou de la protéine gag (contrôle négatif, AMQMLKETI) de HIV. Les peptides ont été utilisés à la seule concentration finale de 20 g/ml. Des contrôles, négatif avec du milieu et positif avec de la ConA (10 g/ml final), ont aussi été inclus. 3x105 cellules spléniques ont été déposées dans chaque puits en triplicats en présence d'IL-2 murine à 20U/ml final (Boehringer) et incubées 18h à 37 C. Un anticorps anti-IFN-y biotinylé (réf 18112D Pharmingen) a ensuite été ajouté et le complexe a été révélé par de la streptavidine-peroxidase (réf 7100-05 Southern biotech). Les spots ont été comptés à l'aide d'un lecteur Microvision. Les résultats obtenus sont illustrés sur la Figure 9. En ce qui concerne la réponse humorale, les tests ont été effectués de la manière décrite ciaprès. Les sérums des souris prélevés avant immunisation et après la 2ème injection (J35) ont été analysés par ELISA pour doser la présence d'IgG contre la souche de virus grippal A/PR8/34 (virus inactivé aux rayons ultra-violets et formol, adsorbé à 100 ng/puits). Un sérum de souris hyperimmun anti-A/PR8/34 dirigé contre l'antigène HA (appelé Te SouI/A/PR8/34) a été utilisé comme standard. Chaque sérum (standard ou échantillon) a été déposé en simplicat à des dilutions successives de raison 2 sur 12 cupules (ELISA réalisé robotiquement, Robot ZYMARK). Le conjugué anti-IgG de souris (Jackson, réf 115-036- 062) a été utilisé au 1/30000. Expression des résultats : Les titres IgG des sérums échantillons ont été calculés par rapport au sérum standard avec la méthode de calcul CodUnit. Ils sont exprimés en logio. Le titre IgG arithmétique du sérum standard grippe a été fixé à 41636 Unités Arbitraires (UA)/ml. Les résultats obtenus sont illustrés sur la Figure 10 Ces résultats montrent clairement l'effet adjuvant du composé selon l'invention, à la fois vis-à-vis de la réponse CD8 mesurée par ELISPOT IFN-y, mais aussi vis-à-vis de la production d'immunoglobulines, et notamment d'immunoglobulines spécifiques de l'antigène administré. REVENDICATIONS 1. Composition vaccinale comprenant au moins un antigène caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un composé de type hydrotalcite. 2. Composition selon la revendication l, caractérisée en ce que l'antigène est un antigène sous-unitaire. 3. Composition vaccinale selon la revendication l, caractérisée en ce que l'antigène est une fraction d'ADN codant pour un antigène vaccinal. 4. Adjuvant vaccinal comprenant au moins un composé de type hydrotalcite. 5. Adjuvant vaccinal selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend le composé ayant la formule suivante : Mg6Al2C03 (OH) 16. 4H20 qui a subi une décarbonatation. 6. Utilisation d'un adjuvant vaccinal selon une des revendications 4 à 5, pour la fabrication d'un médicament susceptible d'induire une réponse de type TH2 vis-à-vis d'un antigène.