Brevet FR2822234A1 — publié le 20020920

DESCRIPTION La présente invention concerne le domaine de la biochimie ou de la biologie moléculaire et plus particulièrement celui des méthodes d'analyses de structures tridimensionnelles de substances biochimiques (ou similaires) seules ou en interaction éventuelle avec des agents extérieurs. Elle a pour objet un procédé de détermination locale de paramètres structuraux de telles substances, reposant sur l'utilisation du couplage excitonique comme sonde hyper-sensible de l'ouverture ou de la déformation de ces substances marquées par deux marqueurs ou chromophores. Elle a également comme objet différentes utilisations du procédé, par exemple, pour détecter des modifications structurales de substances telles que l'ADN, l'ARN... Les substances qui peuvent être employées dans ces analyses ne se limitent toutefois pas à ces cas et peuvent être très variées incluant notamment des molécules chimiques (études stéréochimiques, étude de catalyseurs, de complexants, de macromolécules...), des protéines, des molécules biologiquement ou pharmacologiquement actives... L'invention est particulièrement adaptée pour la réalisation d'études structurales portant sur des substances telles que notamment les acides nucléiques, les oligonucléotides ou les phospholipides. Une tâche courante dans la recherche en chimie ou en biochimie consiste à déterminer les structures dans l'espace adoptées par les molécules étudiées ainsi que l'étude des effets que peuvent avoir certaines interactions desdites molécules avec leur environnement (variation de la température, du pH, nature du solvant, ajout de réactifs...). Ainsi, par exemple, il peut être très utile de connaître le mode d'interaction d'une protéine spécifique avec une séquence nucléique cible donnée, notamment pour en comprendre les mécanismes d'action et favoriser ou inhiber lesdites interactions, par exemple pour la réalisation d'un médicament bien précis. Pour réaliser cette tâche, il existe actuellement un procédé utilisant des molécules dites balises (molecular beacons en anglais). Ces molécules, dont le mode de fonctionnement précis sera décrit plus en détail ultérieurement, présentent une structure dite tigeboucle constituée par une séquence de nucléotides (A, T, C, G) formant, d'une part la boucle, et dont les deux extrémités formant la tige sont appariées par complémentarité des bases (A-T, T-A, G-C et C-G) formant la séquence. L'une des extrémités de la tige porte un fluorophore et l'autre un groupement d'inhibition ou d'extinction (quencher en anglais) dudit fluorophore. La séquence de la tige maintient le fluorophore et le groupement extincteur proches l'un de l'autre de sorte que la fluorescence du fluorophore est éteinte par le groupement d'extinction. La séquence de la boucle est complémentaire de celle de la cible. Ainsi, lorsque ladite molécule, qui agit comme une sonde, localise sa cible, ladite boucle s'hybride avec ladite cible. Ceci entraîne à son tour une ouverture de la tige et par conséquent, l'éloignement du fluorophore du voisinage du groupement d'exctinction, permettant ainsi à la fluorescence d'apparaître et d'être mesurée de manière quantitative. En effet, la fluorescence observée est (du moins en théorie) directement proportionnelle à la quantité de séquence cible présente dans l'échantillon. Des expériences effectuées par le passé ont montré que grâce à cette structure boucle/tige, les balises moléculaires présentent une spécificité plus élevée pour leurs cibles que les sondes oligonucléotidiques linéaires connues (Tyagi et al., 1998.). L'utilisation de balises multicolores et la détection simultanée de différentes cibles dans le même échantillon ont également été rendues possible avec la technique susvisée. Toutefois, la mise en oeuvre de procédés faisant intervenir de telles balises moléculaires présente certaines difficultés, en particulier dans l'analyse finale des résultats. Ces difficultés peuvent notamment résulter de l'interaction des protéines avec le fluorophore, par exemple, avec la rhodamine 6G habituellement utilisée. En effet, ces interactions ont pour effet de diminuer de manière importante la fluorescence de celle-ci. Une substitution de la rhodamine 6G par d'autres fluorophores comme la tétraméthylrhodamine ou la fluorescéine n'a pas permis de résoudre les problèmes rencontrés. Avec le procédé connu, il est par conséquent souvent impossible de tirer des conclusions quant aux modifications structurales résultant des interactions examinées, par exemple d'une protéine sur la séquence nucléique étudiée. De plus, les balises moléculaires et les techniques connues qui les font intervenir, présentent plusieurs autres inconvénients : - elles sont limitées aux acides nucléiques en tige-boucle dont la tige présente un nombre limité de paires de bases, - elles nécessitent la mise en oeuvre de la spectroscopie de fluorescence, relativement complexe, coûteuse et conduisant souvent à des artéfacts. En effet, la fluorescence est extrêmement sensible à l'environnement. De ce fait, un agent extérieur agissant sur une séquence nucléique donnée peut modifier la fluorescence du fluorophore en interagissant avec celui-ci. Il en résulte que l'augmentation de fluorescence suite à l'éloignement de l'inhibiteur peut être compensée par la diminution de fluorescence résultant de l'interaction de l'agent extérieur avec le fluorophore, ce qui peut conduire à des conclusions erronées. - elles ne permettent de détecter facilement que les transition du type tout ou wien entre une tige ouverte ou fermée . Par contre, une ouverture ou une déformation partielle de la tige n'entraînera qu'un écartement réduit des fluorophores et donc, qu'une faible variation de fluorescence qui sera difficilement détectable. La présente invention a pour but de pallier au moins certains des inconvénients précités. A cette fin, elle a pour objet un procédé de détermination locale de paramètres structuraux d'une molécule ou de deux molécules destinées à interagir structurallement, en particulier de molécules biochimiques ou pharmacologiques, caractérisé en ce qu'il consiste à : - mesurer au moins une variation du couplage excitonique existant entre deux marqueurs présents sur une même molécule dont on cherche à déterminer lesdits paramètres structuraux ou entre deux marqueurs présents sur deux molécules distinctes destinées à interagir structurallement et dont on cherche à déterminer les paramètres structuraux, la ou les mesures du couplage excitonique étant réalisées lorsque la ou les molécules passent d'un premier état physico-chimique dans lequel les marqueurs ont une orientation et un éloignement définis à au moins un second état différent dans lequel l'orientation et l'éloignement diffèrent de ceux du premier état, au moins un desdits premier ou second états présentant un éloignement desdits marqueurs supérieur à 1 nm et au moins un desdits premier ou second états présentant un éloignement desdits marqueurs inférieur à 1 nm, puis, - déduire les paramètres recherchés à partir des mesures précédemment effectuées. Elle a également pour objet différentes utilisations du procédé, notamment pour l'analyse de modifications structurales locales de molécules spécifiques telles que l'ADN, l'ARN... Les inventeurs ont découvert de manière inattendue et surprenante, lors d'études en parallèle des spectres d'absorption desdites molécules balises, la présence de modifications importantes des spectres d'absorption des chromophores sous l'effet de l'ajout d'une protéine. Ce point a été à l'origine de la mise en évidence du couplage excitonique dans différentes molécules, en particulier dans les séquences nucléiques doublement marquées. L'objet de la présente invention constitue un outil supplémentaire par rapport aux produits existant sur le marché. Il confère également des potentialités nouvelles pour l'utilisation des balises moléculaires susmentionnées. L'invention sera mieux comprise grâce à la description ciaprès, qui se rapporte à un mode de réalisation préféré, donné à titre d'exemple non limitatif, et expliqué avec référence aux dessins schématiques annexés, dans lesquels : la figure 1 est un schéma simplifié du mécanisme de fonctionnement d'un procédé connu de l'état de la technique utilisant des balises moléculaires, la figure 2 représente des exemples de structures de tigesboucles utilisées dans le cadre de l'invention, la figure 3 représente des exemples de spectres d'absorption utilisés dans la présente invention, la figure 4 représente une courbe illustrant la dépendance du couplage excitonique de la température, la figure 5 représente des exemples de tracés de spectres d'absorption d'échantillons additionnés d'un exemple d'intercalant et d'une protéine utilisés dans le cadre de la présente invention, et la figure 6 représente des exemples de tracés de spectres d'absorption d'échantillons additionnés d'un exemple de protéine utilisée dans le cadre de la présente invention. Comme expliqué dans la partie introductive, des constructions nucléiques, appelées molecular beacons (balises moléculaires) ont déjà été mises au point pour rapporter la présence de séquence nucléiques spécifiques et pour mettre en évidence certaines modifications de structures. Ces constructions correspondent à des séquences en tige-boucle dont les extrémités couramment désignées par les positions dites 5' et 3' dans le vocabulaire spécifique aux séquences nucléiques sont occupées par un fluorophore et un groupement inhibiteur non fluorescent, par exemple un inhibiteur connu sous le nom de dabcyl et de formule Le fonctionnement de ces molécules balises est schématiquement représenté à la figure 1. Lorsque la tige 1 est fermée, le fluorophore 2 représenté par un cercle blanc est proche du groupement inhibiteur 3 schématisé par un cercle noir. Il en résulte que la fluorescence du fluorophore 2 est fortement éteinte. A l'inverse, lorsque la boucle l'de cette construction s'hybride avec une séquence complémentaire (cible 4), il en résulte une ouverture de la tige 1 qui éloigne le fluorophore 2 du groupement inhibiteur 3. Il s'en suit une restauration de la fluorescence dudit fluorophore 2. Les constructions du type tige 1/boucle 1'précitées ont été mises au point pour reporter la présence de séquences nucléiques spécifiques in vitro et in vivo. Pour cela, on utilise des balises moléculaires dont la boucle l' présente une séquence complémentaire de la séquence nucléique (cible 4) dont on souhaite mettre en évidence la présence. Il est à noter que dans les balises moléculaires, la tige 1 doit être préférentiellement constituée d'environ 5 à 7 paires de bases. Cette limite vient du fait qu'en absence de séquence complémentaire à la boucle l', la tige 1 doit être suffisamment stable, donc suffisamment longue, pour maintenir le fluorophore 2 à proximité du groupement inhibiteur 3, c'est-à-dire à une distance d'environ quelques angström ou dixièmes de nanomètres. A l'inverse, lors de la mise en présence de la séquence complémentaire (cible 4) de la boucle 1', la tige 1 doit être suffisamment courte pour ne pas constituer un frein pour l'hybridation de la séquence de ladite boucle l'avec sa séquence complémentaire de la cible 4. Le procédé selon l'invention a également été mis en oeuvre pour des substrats protéiques d'enzymes. Ces substrats constitués par de petits peptides ont été marqués en deux endroits par deux sondes de fluorescence. En présence de l'enzyme de clivage, le peptide se rompt et fait disparaître le signal de fluorescence. Cette technique permet dans ce cas de mettre en évidence, la présence de la protéase. Conformément à la présente invention, le procédé de détermination locale de paramètres structuraux d'une molécule ou de deux molécules destinées à interagir structurallement, en particulier de molécules biochimiques ou pharmacologiques, caractérisé en ce qu'il consiste à : - mesurer au moins une variation du couplage excitonique existant entre deux marqueurs présents sur une même molécule dont on cherche à déterminer lesdits paramètres structuraux ou entre deux marqueurs présents sur deux molécules distinctes destinées à interagir structurallement et dont on cherche à déterminer les paramètres structuraux, la ou les mesures du couplage excitonique étant réalisées lorsque la ou les molécules passent d'un premier état physico-chimique dans lequel les marqueurs ont une orientation et un éloignement définis à au moins un second état différent dans lequel l'orientation et l'éloignement diffèrent de ceux du premier état, au moins un desdits premier ou second états présentant un éloignement desdits marqueurs supérieur à 1 nm et au moins un desdits premier ou second états présentant un éloignement desdits marqueurs inférieur à 1 nm, puis, - déduire les paramètres recherchés à partir des mesures précédemment effectuées. Dans un premier mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : - marquer localement une même molécule, au niveau de la portion d'espace pour laquelle on veut déterminer les paramètres structuraux de ladite molécule, par deux marqueurs proches, - établir un premier spectre d'absorption de la molécule ainsi marquée et qui se trouve dans un premier état physico-chimique donné, - modifier ledit premier état physico-chimique précité pour faire passer la molécule marquée dans un second état physico-chimique donné différent dudit premier état en créant ainsi une variation du couplage excitonique existant entre les deux marqueurs, - établir un second spectre d'absorption de la molécule marquée se trouvant dans ledit second état physico-chimique, - comparer les premier et second spectres précédemment obtenus, et - en déduire les paramètres recherchés. Dans une seconde variante, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : - marquer localement deux molécules distinctes, au niveau de la portion d'espace pour laquelle on veut déterminer les paramètres structuraux de l'une ou l'autre molécule, - établir un premier spectre d'absorption de l'une des deux molécules seule ainsi marquée et qui se trouve dans un premier état physico-chimique donné, - modifier ledit premier état physico-chimique précité pour faire passer la molécule marquée dont on a obtenu le premier spectre dans un second état physico-chimique donné différent dudit premier état en créant ainsi une variation du couplage excitonique existant entre les deux marqueurs, - établir un second spectre d'absorption de la molécule marquée se trouvant dans ledit second état physico-chimique, - comparer les premier et second spectres précédemment obtenus, et - en déduire les paramètres recherchés. Le principe théorique de base du procédé selon l'invention est schématiquement le suivant. Si on appelle A et B, deux marqueurs présents sur la même molécule ou sur deux molécules différentes destinées à interagir, le procédé selon l'invention consiste essentiellement à mesurer la différence en nombre d'ondes Av enke les maxima d'absorbance des marqueurs A et B dans l'exciton et la différence en nombre d'ondes Avo entre les maxima d'absorbance des marqueurs A et B lorsqu'ils ne sont pas en interaction. A partir de ces mesures, la distance R entre les deux marqueurs A et B est calculée préférentiellement d'après la formule : où n est l'indice de réfraction du solvant, h la constante de Planck, c la vitesse de la lumière, Eo la permittivité du vide et, et g les modules respectifs des dipoles de transition des marqueurs A et B. Le facteur d'orientation Kdépend de l'angle entre les dipoles de transition des marqueurs A et B ainsi que des angles entre ces dipoles et le vecteur rayon qui connecte les deux dipoles. Ce facteur d'orientation se déduit généralement de manière qualitative en comparant les déplacements des spectres des marqueurs A et B entre l'exciton et la situation où lesdits marqueurs A et B ne sont pas en interaction. Dans la plupart des cas analysés par les inventeurs, une géométrie de type H a été observée, ce qui correspond au cas où K = 1. Selon une caractéristique avantageuse, le passage du premier état physico-chimique au second état physico-chimique est obtenu en modifiant la température de la ou des molécules marquées. Le procédé selon l'invention peut donc être caractérisé en ce que l'on augmente la température de la ou des molécules marquées, en particulier, en ce que l'on fait passer la température de la ou des molécules marquées de la température ambiante à une température supérieure à celle du point de fusion de la ou desdites molécules marquées. Sans qu'il s'agisse d'une quelconque limitation, la présente invention concerne plus particulièrement les acides nucléiques (ADN ou ARN) présentant une région en forme de double brin au niveau de ses extrémités dites extrémités 5' et 3' . Cet exemple non limitatif particulièrement intéressant sera utilisé dans la suite pour décrire plus en détail le fonctionnement de la présente invention. En effet, si l'on marque chacune des extrémités précitées par des marqueurs ou chromophores, ceux-ci vont se trouver très proches, c'est- à-dire à quelques dixièmes de nanomètres (angström) l'un de l'autre. Les inventeurs ont découvert de manière complètement surprenante et inattendue la présence d'un couplage excitonique entre les deux chromophores qui conduit à une modification importante du spectre d'absorption de ces chromophores. Cette modification spectrale est extrêmement sensible à la proximité et à l'orientation des chromophores. Il en résulte que le procédé selon l'invention dont une étape consiste à faire varier l'orientation et la distance entre les extrémités 5'et 3', par exemple en les séparant ne fût-ce que de quelques angström, entraîne une disparition du spectre d'absorption de l'exciton au profit des spectres de chacune des espèces séparées. La présente invention permet, par exemple, de mettre sélectivement en évidence un éloignement des extrémités 5'et 3'd'un acide nucléique présentant une séquence double brin à son extrémité. Cet éloignement qui se traduit par la disparition du spectre d'absorption de l'exciton permet de détecter avec une grande sensibilité une ouverture (même partielle) ou une déformation du double brin, localisée au niveau de l'extrémité de l'acide nucléique. Le procédé de la présente invention permet donc de mettre en évidence par la simple réalisation de spectres d'absorption, l'action d'un agent extérieur (température, protéine, autre acide nucléique...) sur l'extrémité de l'acide nucléique dans la mesure où ce dernier agit sur la distance existant entre les marqueurs judicieusement disposés au niveau de la portion d'espace dans laquelle se produit le changement de structure. Lorsque deux chromophores sont présents aux extrémités 5'et 3'd'une séquence double brin, ils sont de fait très proches dans l'espace (typiquement entre 5 et 10 angström, soit 0,5 à 1 nm) et capables d'interagir entre eux. Il peut alors y avoir une interaction entre les moments de transition des deux chromophores, ce qui entraîne un transfert rapide de l'excitation électronique d'un chromophore à l'autre. Ce phénomène est appelé couplage excitonique. Il en résulte une délocalisation de l'excitation sur les deux sondes. De ce fait, les propriétés spectrales (en spectroscopie d'absorption) ne correspondent plus à celles des sondes individuelles mais constituent une signature spécifique de l'exciton. Ce couplage a été mis en évidence par les inventeurs sur les séquences tige-boucle dont les structures sont données en figure 2. Selon une autre caractéristique de l'invention, les marqueurs sont des chromophores absorbant dans la gamme de longueurs d'ondes comprise entre 300 nm et 800 nm. De manière préférée, au moins un des chromophores est un groupement dabcyl. De manière particulièrement préférée, au moins un des chromophores est choisi dans le groupe formé par la tétraméthylrhodamine, la 5-carboxytétraméthylrhodamine, la 6-carboxytétraméthylrhodamine, la 5- (et-6)-carboxytétraméthylrhodamine, l'ester succinimidylique de la 5- carboxytétraméthylrhodamine, l'ester succinimidylique de la 6carboxytétraméthylrhodamine, l'ester succinimidylique de la 5- (et-6)carboxytétraméthylrhodamine, la rhodamine X, le sel de triéthylammonium de la 5-carboxy-X-rhodamine, la 6-carboxy-X-rhodamine, l'ester succinimidylique de la 5-carboxy-X-rhodamine, l'ester succinimidylique de la 6-carboxy-X-rhodamine, l'ester succinimidylique de la 5- (et-6)-carboxyX-rhodamine, la tétraéthylrhodamine, l'hydroxyde d'éthanaminium-N- (9- (4- (chlorosulfonyl)-2-sulfbphényl)-6- (diéthylamino)-3H-xanthène-3ylidène)-N-éthyle, la rhodamine 110, la rhodamine 123, la rhodamine phalloidine, l'hydrochlorure de l'ester succinimidylique de la 5- (et-6) carboxyrhodamine 110, l'ester succinimidylique du trifluoroacétamide de la 5- (et-6) carboxyrhodamine 110, l'hydrochlorure de l'ester succinimidylique de l'acide 5- (et-6) amino-hexanoïque-carboxyrhodamine 110, la sulforhodamine 101, la sulforhodamine B, la sulforhodamine G, la 5- isothiocyanato-tétraméthylrhodamine (isomère G), la 6-isothiocyanatotétraméthylrhodamine (Isomère R), la 5- (et-6)-isothiocyanato- tétraméthylrhodamine, le 9- (2, 3,6, 7,12, 13,16, 17-octahydro- 1H, 5H, 11H, 15H-xanthèno (2,3, 4-ij : 5, 6, 7-i'j')-diquinolizin-18-ium, le sel interne de 9- (2 (ou 4)- (chlorosulfbnyl)-4 (ou 2)-sulfophényl)- (2,3, 6,7, 12,13, 16, 17-octahydro-lH, 5H, llH, 15H-xanthèno (2,3, 4-ij : 5,6, 7i'j')-diquinolizin-18-ium, le sel interne de 9-[2 (ou 4) -[[[6-[2, 5-dioxo-l- pyrrolidinyl) oxy]-6-oxohéxyl] amino] sulfbnyl]-4 (ou 2)-sulfbphényl]- 2,3, 6,7, 12,13, 16, 17-octahydro-lH, 5H, IIH, 15H-xanthèno (2,3, 4-ij : 5,6, 7i'j')-diquinolizin-18-ium, la 5- (et-6)-isothiocyanato-rhodamine-X, la rhodamine 6G, le chlorure de la rhodamine 6G, l'hydrochlorure de la 6carboxyrhodamine 6G, l'hydrochlorure de la 5-carboxyrhodamine 6G, l'ester succinimidylique de la 5-carboxyrhodamine 6G, l'ester succinimidylique de la 6-carboxyrhodamine 6G et l'ester succinimidylique de la 5- (et-6)-carboxyrhodamine 6G. Selon une variante, les chromophores sont choisis dans le groupe formé par la fluorescéine, la 5-carboxyfluorescéine, la 6- carboxyfluorescéine, la 5- (et-6)-carboxyfluorescéine, l'ester succinimidylique de la 5-carboxyfluorescéine, l'ester succinimidylique de la 6-carboxyfluorescéine, l'ester succinimidylique de la 5- (et-6)carboxyfluorescéine, la 5- (4, 6-dichlorotriazinyl) aminofluorescéine, l'ester succinimidylique de l'acide 6- (fluorescéine-5-carboxamido) hexanoïque, l'ester succinimidylique de l'acide 6- (fluorescéine-5- (et-6)-carboxamido) hexanoïque, l'ester succinimidylique de la fluorescéine-5-EX, la 5isothiocyanato-fluorescéine, la 6-isothiocyanato-fluorescéine, la 2', 7'- difluorofluorescéine, la 5-carboxy-2', 7'-difluorofluorescéine, l'ester-5- succinimidylique de la 2', 7'-difluorofluorescéine, l'ester-6-succinimidylique de la 2', 7'-difluorofluorescéine, la 5- (et-6)-isothiocyanato-2', 7'difluorofluorescéine, la 5- (et-6)-carboxynaphthofluorescéine, l'ester succinimidylique de la 5- (et-6)-carboxynaphthofluorescéine, l'ester succinimidylique du N, O-bis-trifluoroacétamide de la 5- (et 6-) carboxylrhodamine 110 et l'hydrochlorure de l'acide 5- (et 6-) carboxylique du 3'-hydroxy-6'-aminofluorane. Selon une autre variante, au moins un des chromophores est choisi dans le groupe formé par l'acide 4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique, l'acide 4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3pentanoïque, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl- 4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-pentanoïque, l'acide 4, 4-difluoro-5, 7diphényl-4-bora-3 a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5, 7-diphényl-4-bora-3a, 4a-diaza-sindacène-3-propionique, l'acide 4, 4-difluor-1, 3, 5, 7-tétraméthyl-4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène-8-propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluor-1, 3, 5, 7-tétraméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-8propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5- (2-thiényl)-4bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5- (2-pyrrolyl)-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3propionique, l'acide 4, 4-difluoro-5-styryl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5-styryl-4bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5- (4-phényl-1, 3-butadiényl)-4-bora-3a, 4a-diaza-sindacène-3-propionique, l'acide 6- ( (4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4adiaza-s-indacène-3-propionyl) amino) hexanoïque, l'ester succinimidylique de l'acide 6- ( (4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3propionyl) amino) hexanoïque, l'acide 4, 4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-sindacène-3, 5-dipropionique, l'ester succinimidylique de l'acide 6- ( ( (4- (4, 4difluoro-5- (2-thiényl)-4-bora-3a, 4a-diaza--indacène-3yl) phénoxy) acétyl) amino) hexanoïque, l'ester succinimidylique de l'acide 6- ( (4, 4-difluoro-l, 3-diméthyl-5- (4-méthoxyphényl)-4-bora-3a, 4a-diaza-sindacène-2-propionyl) amino) hexanoïque, le sel sodé de l'ester sulfosuccinimidylique de l'acide 4, 4-difluor-5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4adiaza-s-indacène-3-propionique, le sel de triéthylammonium de l'ester succinimidylique de l'acide N- (4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl- 4-bora-3a, 4adiaza-s-indacène-3-propionyl) cystéique, l'acide 2, 6-dibromo-4, 4-difluoro- 5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 2, 6-dibromo-4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique et l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5-phényl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique. Les molécules de ce dernier groupe font partie de la famille de composés connue sous la dénomination commerciale bodipy (marque déposée) de la société MOLECULAR PROBES INC. Toutes les formules développées des composés précités sont données à la fin de la présente description. Enfin, selon une autre caractéristique au moins un des chromophores est choisi dans le groupe formé par la 3, 3, 3', 3'-tétraméthylindodicarbocyanine 5 (CY5), la 3, 3, 3', 3'-tétraméthyl-indodicarbocyanine 3 (CY3) ou la 3, 3, 3', 3'-tétraméthyl-4, 5-benzindodicarbocyanine 5 (CY5. 5). Les structures de ces composés sont données ci-après. CY5 CY3 CY5.5 A titre indicatif, les sélections de couples suivants se sont révélés particulièrement avantageux et ont été utilisés de manière préférée en tant que marqueurs (chromophores) : - rhodamine 6G, dabcyl, - tétraméthylrhodamine, dabcyl, - tétraméthylrhodamine, tétraméthylrhodamine, - fluorescéine, tétraméthylrhodamine, - fluorescéine, Cy5 L'effet du couplage excitonique sur les spectres d'absorption est montré dans la figure 3 qui représente une mise en évidence du couplage excitonique. Sur cette figure 3, les spectres d'absorption obtenus pour un échantillon de TAR (abréviation de transactivation response region) doublement marqué par la tétraméthylrhodamine (TMR) ont été représentés pour une température de 20 C (traits mixtes) et de 60 C (tirets). Le spectre d'absorption d'un mélange équimolaire composé de TARm simplement marqué en 3'par la tétraméthylrhodamine (TMR) et de TARm simplement marqué en 5'par le même chromophore a également été représenté en traits pleins sur cette figure. On note sur cette figure une diminution importante du pic à 521 nm (dû à la présence du couplage excitonique) et l'augmentation du pic à 558 nm (caractéristique du chromophore isolé) lorsque la température des échantillons passe de 20 C à 60 C. Lorsqu'on chauffe à 60 C la séquence doublement marquée, il y a fusion de la séquence double brin en brins individuels qui restaure un spectre d'absorption tout à fait superposable au spectre obtenu avec le mélange équimoléculaire des brins distincts simplement marqués et dans lequel le pic à 521 nm a disparu. Ce comportement spectral est tout à fait caractéristique d'un couplage excitonique. Dans ce cas particulier, ce couplage a une géométrie de type H, c'est-à-dire que les moments de transition des deux chromophores sont parallèles et les vecteurs distances qui relient les deux moments forment des angles droits avec ceux-ci. Un couplage excitonique a pu être observé avec l'ensemble des couples de chromophores qui ont été étudiés. L'existence du couplage excitonique ne dépend pas de la nature des chromophores, de leur positions respectives en 5'et en 3', de la séquence double brin à laquelle ils sont attachés ou de la nature ARN ou ADN du double brin. Par contre, l'importance du couplage et par conséquent, la modification du spectre d'absorption, dépend essentiellement de la distance entre les marqueurs des sondes. La dépendance en fonction de la distance est très importante puisque l'effet est inversement proportionnel à la distance au cube. Des simulations effectuées sur les systèmes étudiés par les inventeurs montrent que le décalage spectral dû à l'exciton devient imperceptible pour des distances entre chromophores au-delà d'environ 10 angström (1,0 nm). Cette distance reste très courte à l'échelle moléculaire et permet donc de détecter une ouverture d'un nombre très réduit de paires de bases, au niveau des extrémités du double brin. En outre, en se fondant sur le décalage spectral entre les chromophores couplés et les chromophores isolés, on peut déduire la distance entre les chromophores. L'intérêt du couplage excitonique peut être illustré dans plusieurs exemples. Ainsi, on peut suivre la fusion par chauffage du double brin en suivant la disparition du signal de l'exciton. Dans le cas de TARm doublement marquée par de la tétraméthylrhodamine, la disparition du couplage en suivant la diminution du pic à 521 nm et l'augmentation du pic à 558 nm a été étudiée. En parallèle, l'hypochromisme, qui constitue un moyen bien connu pour suivre la fusion de tout acide nucléique, a été également suivi à 260 nm. La figure 4 illustre les résultats obtenus pour les différentes longueurs d'ondes analysée et permet en outre de visualiser la dépendance du couplage excitonique de la température. Les variations d'absorbance en fonction de la température de TARm doublement marquée à la tétraméthylrhodamine ont ainsi été enregistrées à 260 nm (triangles), 521 nm (cercles) et 558 nm (carrés), respectivement. On voit que les courbes à 521 et 558 nm sont superposables entre elles et parallèles à la courbe réalisée à 260 nm. On note cependant un décalage de 2 à 4 C entre les courbes de l'exciton et la courbe à 260 nm, suggérant que l'extrémité de la tige est moins stable que l'ensemble de la tige. Le couplage excitonique peut également être utilisé pour détecter une hybridation entre une séquence et sa séquence complémentaire. Dans ce cas, l'appariement entre une séquence doublement marquée et sa séquence complémentaire non marquée se traduit par un éloignement des sondes et une perte du signal de l'exciton. Une alternative consiste à utiliser une séquence marquée en 5' par un chromophore et sa séquence complémentaire marquée en 3'par un chromophore. L'hybridation des deux séquences se traduit par l'apparition d'un couplage excitonique. Dans un autre mode de réalisation, le procédé conforme à la présente invention est caractérisé en ce que le passage du premier état physico-chimique au second état physico-chimique est obtenu en ajoutant à la ou aux molécules marquées une substance agissant sur la structure spatiale propre à la ou aux molécules marquées, en particulier sur l'éloignement existant entre les deux marqueurs. Selon une caractéristique avantageuse, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que les espèces atomiques ou moléculaires constituant la substance ajoutée s'intercalent au moins partiellement entre les deux marqueurs proches situés sur la ou les molécules marquées de façon à écarter un marqueur de l'autre. De manière préférée, la substance ajoutée est choisie dans le groupe formé par les dimères de cyanines. Le couplage excitonique a, par exemple, été examiné en fonction de l'ajout d'un intercalant de l'ADN ou d'une protéine (figure 5). Le spectre d'absorption de TARm doublement marquée par de la tétraméthylrhodamine y a été enregistré en absence (trait plein) et en présence (pointillés) d'un exemple de substance ajoutée préférée de formule tétraiodure de 2, 2'-[1, 3 propanediylbis[ (diméthylimino) -3, 1propandiyl-1 (4H)-pyridinyl-4-ylidèneméthylidyne]] bis [3-méthyl]benzoxazolium. Cette substance est également connue sous la dénomination POPO (marque déposée de la société MOLECULAR PROBES INC. ) et a été ajouté à l'échantillon de TARm selon un rapport molaire de 12 : 1. Comme on peut le constater d'après la figure 5, la fixation de l'intercalant au double brin induit un décalage du spectre de l'exciton et une variation du rapport des pics, montrant ainsi que l'exciton est sensible à la déformation du double brin induite par l'intercalant. L'effet de l'addition de la protéine de la nucléocapside du virus de l'immunodéficience humaine (HIV) à la séquence TARm doublement marquée par de la tétraméthylrhodamine est également rapportée à la figure 5. Cette protéine est connue pour déstabiliser les structures en tigeboucle sans toutefois les ouvrir complètement. L'action déstabilisante de la protéine ajoutée à raison d'un rapport molaire d'une partie pour cinq nucléotides se manifeste par une variation du rapport des pics et par la restitution d'un spectre proche de celui obtenu après chauffage de l'oligonucléotide. Selon une autre variante, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que les espèces atomiques ou moléculaires constituant la substance ajoutée agissent sur la ou les molécules marquées de façon à rapprocher les marqueurs l'un de l'autre. Par exemple, le procédé peut être caractérisé en ce que la substance ajoutée est choisie dans le groupe formé par les protéines. Comme évoqué ci-dessus, le procédé peut être caractérisé en ce que les molécules marquées sont deux brins complémentaires séparés constitués chacun d'une séquence d'acides nucléiques marqués chacun par un marqueur et que la substance ajoutée est une protéine ou un agent physico-chimique favorisant l'hybridation des deux brins complémentaires. La figure 6 illustre l'effet de la protéine de la nucléocapside du virus de l'immunodéficience humaine sur un mélange d'une séquence TAR marquée en 3'par de la fluorescéine (TAR fluo) et de sa séquence complémentaire marquée en 5'par de la tétraméthylrhodamine (TAR comp. TMR). La protéine favorise l'hybridation des deux brins complémentaires, ce qui génère la formation d'un couplage excitonique entre la fluorescéine et la tétraméthylrhodamine. Comme on peut le voir sur la figure 6 précitée, le couplage excitonique représenté en traits pleins se traduit par une baisse d'absorbance du pic de la tétraméthylrhodamine et une augmentation d'absorbance du pic de la fluorescéine par rapport au spectres des espèces non hybridées (traits pointillés). De manière générale, le procédé selon l'invention peut être caractérisé en ce que les paramètres structuraux déterminés localement sont la distance entre les deux marqueurs portés par la ou les molécules marquées et l'orientation angulaire de l'un des deux marqueurs portés par la ou les molécules marquées par rapport à l'autre. La présente invention concerne également l'utilisation du procédé pour l'analyse de modifications structurales locales de molécules, d'ADN, en particulier d'ADN humain, d'ARN et en particulier d'ARN humain. Dans une autre application l'utilisation du procédé selon l'invention est prévue pour détecter une hybridation entre une séquence et sa séquence complémentaire. L'effet de l'addition de la protéine de la nucléocapside du virus de l'immunodéficience humaine (HIV) à un mélange équimolaire de la séquence TAR marquée en 3'par un groupement dabcyl et de séquence complémentaire marquée en 5'par un groupement tétraméthylrhodamine est également rapportée sur la figure 6. L'addition de la protéine au mélange d'oligonucléotides induit l'apparition d'un couplage excitonique qui démontre l'hybridation entre les deux séquences sous l'effet de la protéine. Par rapport aux balises moléculaires connues et aux techniques qui les font intervenir, la présente invention présente donc plusieurs caractères distinctifs et innovants qui permettent de pallier au moins certains des désavantages présents dans les procédés de l'art antérieur. En effet, le procédé conforme à la présente invention n'est pas limité aux acides nucléiques en tige-boucle et peut être appliqué à n'importe molécule en particulier à n'importe quelle séquence nucléique, à condition que celle-ci présente une structure permettant de fixer deux marqueurs de manière suffisamment proche à l'endroit qui doit être examiné. De manière préférée, les molécules dont on veut déterminer les paramètres structuraux à l'aide du procédé selon la présente invention sont des nucléotides ou des phospholipides. Le procédé selon l'invention ne nécessite pas la présence d'un groupement inhibiteur de fluorescence. On peut en fait utiliser n'importe quel couple de chromophores, ce qui augmente grandement la flexibilité du procédé selon l'invention. Il utilise la spectroscopie d'absorption et non la spectroscopie de fluorescence. La spectroscopie d'absorption est de mise en oeuvre plus simple, présente moins d'artéfacts et est moins coûteuse que la spectroscopie de fluorescence. Il permet aussi bien de détecter facilement les ouvertures partielles ou les déformations minimes des substances analysées que des modifications structurales plus importantes. De plus, la technique de spectrométrie d'absorption est peu sensible à l'environnement et les signaux détectés ont peu de chances de contenir des contributions provenant de la perturbation de l'échantillon par un agent extérieur. Les formules développées des chromophores utilisées dans le cadre de la présente invention sont données ci-après. En ce qui concerne des molécules issues de la famille des rhodamines on a : Tétraméthylrhodamine (TAMRA ou TMR) 5-carboxytétraméthylrhodamine (5-TAMRA) 6-carboxytétraméthylrhodamine (6-TAMRA) 5- (et-6)-carboxytétraméthylrhodamine (5 (6)-TAMRA) Ester succinimidylique de la 5-carboxytétraméthylrhodamine (5-TAMRA, SE) Ester succinimidylique de la 6-carboxytétraméthylrhodamine (6-TAMRA, SE) Ester succinimidylique de la 5-(et-6)-carboxytétraméthylrhodamine (5 (6)-TAMRA, SE) Rhodamine X Sel de triéthylammonium de la 5-carboxy-X-rhodamine (5-ROX) 6-carboxy-X-rhodamine (6-ROX) Ester succinimidylique de la 5-carboxy-X-rhodamine (5-ROX, SE) Ester succinimidylique de la 6-carboxy-X-rhodamine (6-ROX, SE) Ester succinimidylique de la 5- (et-6)-carboxy-X-rhodamine (5 (6)ROX, SE) Tétraéthylrhodamine (rhodamine B) Hydroxyde d'éthanaminium, N- (9- (4-chlorosulfonyl)-2-sulfophényl)- 6- (diéthytamino)-3H-xanthène-3-y ! idène)-N-éthyle (chlorure de sulfonyl de la Lissamine rhodamine B) Rhodamine 110 (R1100 Rhodamine 123 (R123) Rhodamine phalloidine Hydrochlorure de l'ester succinimidylique de la 5- (et-6) carboxyrhodamine 110 (Rhodamine Gréent (5 (6)-CR 110, SE) Ester succinimidylique du trifluoroacétamide de la 5- (et-6) carboxyrhodamine 110 (Rhodamine GreenTM) (5 (6)-CR110TFA, SE) 0 0 Il Il 0ff) 3 3 0 0 0 6-1 f M-O-C 1 I I Il 0 Hydrochlorure de l'ester succinimidylique de l'acide 5- (et-6) aminohexanoïque-carboxyrhodamine 110) (Rhodamine GreenTm-X) Sulforhodamine 101 Sulforhodamine B Sulforhodamine G 5-isothiocyanato-tétraméthylrhodamine (5-TRITC ; isomère G) 6-isothiocyanato-tétraméthylrhodamine (6-TRITC ; isomère R) 5- (et-6)-isothiocyanato-tétraméthylrhodamine (5 (6)-TRITC) 9- (2, 3, 6, 7, 12, 13, 16, 17-octahydro-lH, 5H, IlH, 15H-xanthèno (2, 3, 4ij : 5, 6, 7-i'j') -diquinolizin-18-ium (Texas Red) Sel interne de 9- (2 4)-(chlorosulfonyl)-4 (ou 2)-sulfophényl)- 2,3, 6,7, 12,13, 16, 17-octahydro-lH, 5H, 11H, 15H-xanthèno (2,3, 4- ij : 5,6, 7-i'j')-diquinolizin-18-ium (chlorure de sulfonyle du Texas Red&commat;) Sel interne de 9- [2 (ou 4)-[[[6-[2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]-6- oxohéxyl]amino]sulfonyl]-4-(ou 2)-sulfophényl]-2, 3,6, 7,12, 13,16, 17- octahydro-lH, 5H, 11H, 15H-xanthèno (2,3, 4-ij : 5,6, 7-i'j')-diquinolizin- 18-ium (ester succinimidylique du Texas Red-X) 5-(et-6)-isothiocyanato-rhodamine-X (5 (6)-XRITC) Rhodamine 6G Chlorure de la rhodamine 6G Hydrochlorure de la 6-carboxyrhodamine 6G (6-CR 6G) Hydrochlorure de la 5-carboxyrhodamine 6G (5-CR 6G) Ester succinimidylique de la 5-carboxyrhodamine 6G (5-CR 6G, SE) Ester succinimidylique de la 6-carboxyrhodamine 6G (6-CR 6G, SE) Ester succinimidylique de la 5- (et-6)-carboxyrhodamine 6G (5 (6)-CR 6G, SE) En ce qui concerne des molécules issues de la famille des bodipy on a : Acide 4, 4-difluor-5, 7-diméthyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacène- 3- propionique (BODIPY&commat; FL) Ester succinimidylique de l'acide 4,4-difluoro-5, 7-diméthyl- 4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène- 3-propionique (BODIPY# FL, SE) Acide 4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacène- 3- pentanoïque (BODIPY&commat; FL Cs) Ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluor-5, 7-diméthyl- 4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène-3-pentanoïque (BODIPY&commat; FL Cg, SE) Acide 4, 4-difluoro-5, 7-diphényl- 4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène- 3propionique (BODIPY&commat; 530/550) Ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluor-5, 7-diphényl- 4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique (BODIPY&commat; 530/550, SE) Acide 4, 4-difluor-1, 3, 5, 7-tétraméthyl- 4-bora-3a, 4a-diaza-sindacène-8-propionique (BODIPY (E) 493/503 C3) Ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluor-1, 3, 5, 7-tétraméthyl- 4bora-3a, 4a-diaza-s-indacène- 8-propionique (BODIPY&commat; 493/503, SE) Ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5- (2-thiényl) -4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique (BODIPY&commat; 558/568, SE) Ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5- (2-pyrrolyl)-4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène- 3-propionique (BODIPY 576/589, SE) Acide 4, 4-difluoro-5-styryl-4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène-3propionique (BODIPY (g) 564/570) Ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5-styryl-4-bora- 3a, 4adiaza-s-indacène-3-propionique (BODIPY (R) 564/570, SE) Ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5- (4-phényl-1, 3- butadiényl)-4-bora-3a, 4a- diaza-s-indacène-3-propionique (BODIPY# 581/591, SE) Acide 6- ( (4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza--mdacène- 3-propionyl) amino) hexanoïque (BODIPY&commat; FL-X) Ester succinimidylique de l'acide 6-((4,4-difluoro-5,7-diméthyl- 4- bora-3a, 4a-diaza-s-indacène- 3-propionyl) amino) hexanoïque (BODIPY&commat; FL-X, SE) Acide 4, 4-difluoro-4-bora-3a, 4a- diaza-s-indacène-3, 5-dipropionique (BODIPY&commat; 500/510) Ester succinimidylique de l'acide 6- ( ( (4- (4, 4-difluoro-5- (2- thiényl)-4- bora-3a, 4a-diaza- s-indacène-3-yl) phénoxy) acétyl) amino) hexanoïque (BODIPY&commat; TR-X, SE) Ester succinimidylique de l'acide 6-((4,4-difluoro-1,3-diméthyl- 5-(4- méthoxyphényl)-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-2-propionyl) amino) hexanoïque (BODIPY&commat; TMR-X, SE) Sel sodé de l'ester sulfosuccinimidylique de l'acide 4, 4-difluor-5, 7diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène- 3-propionique (BODIPY (B) FL, SSE) Sel de triéthylammonium de l'ester succinimidylique de l'acide N- (4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl- 4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène- 3propionyl) cystéique (BODIPY&commat; FL, CASE) Acide 2, 6-dibromo-4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza- sindacène-3-propionique (BODIPY&commat; FL Br2) Ester succinimidylique de l'acide 2,6-dibromo-4, 4-difluor-5, 7diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza- s-indacène-3-propionique (BODIPY# FL Br2, SE) Ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5-phényl-4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique (BODIPY&commat; R6G, SE) En ce qui concerne des molécules issues de la famille des fluorescéines on a : Fluorescéine 3'-6'-dihydroxyspiro [isobenzofuran-l (3H), 9'- [9H] xanthèn]-3-one 5-carboxyfluorescéine (5-FAM) 6-carboxyfluorescéine (6-FAM) 5- (et-6) -carboxyfluorescéine (5 (6)-FAM) Ester succinimidylique de la 5-carboxyfluorescéine, (5-FAM, SE) Ester succinimidylique de la 6-carboxyfluorescéine, (6-FAM, SE) Ester succinimidylique de la 5- (et-6) -carboxyfluorescéine (5 (6)-FAM, SE) 5-(4,6-dichlorotriazinyl)aminofluorescéine (5-DTAF) Ester succinimidylique de l'acide 6-(fluorescéine-5-carboxamido) hexanoïque (5-SFX) Ester succinimidylique de l'acide 6-(fluorescéine-5-(et-6)- carboxamido) hexanoïque (5 (6)-SFX) Ester succinimidylique de la fluorescéine-5-EX 5-isothiocyanato-fluorescéine (FITC Isomère I) 6-isothiocyanato-fluorescéine (FITC Isomère II) 2', 7'-difluorofluorescéine (Vert Oregon 488-Oregon Green 488) 5-carboxy-2', 7'-difluorofluorescéine Ester-5-succinimidylique de la 2', 7' -difluorofluorescéine Ester-6-succinimidylique de la 2', 7'-difluorofluorescéine 5- (et-6)-isothiocyanato-2', 7'-difluorofluorescéine (F2FITC) 5- (et-6)-carboxynaphthofluorescéine Ester succinimidylique de la 5-(et-60-carboxynaphthofluorescéine Ester succinimidylique du N, O-bis-trifluoroacétamide de la 5- (et-6) carboxylrhodamine 110 (Rhodol GreenTM) (5 (6)-CRF 492 TFA, SE) Hydrochlorure de l'acide 5- (et-6) carboxylique du 3'-hydroxy-6'aminofluorane (Rhodol GreenTM) (5 (6)-CRF 492) Bien entendu, l'invention n'est pas limitée au mode de réalisation décrit et représenté aux dessins annexés. Des modifications restent possibles, notamment du point de vue de la constitution des divers éléments ou par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour autant du domaine de protection de l'invention. De même, les inventeurs ne sont pas liés par les théories scientifiques qu'ils exposent ou auxquelles ils se réfèrent dans la présente description, en particulier pour l'explication scientifique des résultats obtenus. REVENDICATIONS 1. Procédé de détermination locale de paramètres structuraux d'une molécule ou de deux molécules destinées à interagir structurallement, en particulier de molécules biochimiques ou pharmacologiques, caractérisé en ce qu'il consiste à : - mesurer au moins une variation du couplage excitonique existant entre deux marqueurs présents sur une même molécule dont on cherche à déterminer lesdits paramètres structuraux ou entre deux marqueurs présents sur deux molécules distinctes destinées à interagir structurallement et dont on cherche à déterminer les paramètres structuraux, la ou les mesures du couplage excitonique étant réalisées lorsque la ou les molécules passent d'un premier état physico-chimique dans lequel les marqueurs ont une orientation et un éloignement définis à au moins un second état différent dans lequel l'orientation et l'éloignement diffèrent de ceux du premier état, au moins un desdits premier ou second états présentant un éloignement desdits marqueurs supérieur à 1 nm et au moins un desdits premier ou second états présentant un éloignement desdits marqueurs inférieur à 1 nm, puis, - déduire les paramètres recherchés à partir des mesures précédemment effectuées. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : - marquer localement une même molécule, au niveau de la portion d'espace pour laquelle on veut déterminer les paramètres structuraux de ladite molécule, par deux marqueurs proches, - établir un premier spectre d'absorption de la molécule ainsi marquée et qui se trouve dans un premier état physico-chimique donné, - modifier ledit premier état physico-chimique précité pour faire passer la molécule marquée dans un second état physico-chimique donné différent dudit premier état en créant ainsi une variation du couplage excitonique existant entre les deux marqueurs, - établir un second spectre d'absorption de la molécule marquée se trouvant dans ledit second état physico-chimique, - comparer les premier et second spectres précédemment obtenus, et - en déduire les paramètres recherchés. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : - marquer localement deux molécules distinctes, au niveau de la portion d'espace pour laquelle on veut déterminer les paramètres structuraux de l'une ou l'autre molécule, - établir un premier spectre d'absorption de l'une des deux molécules seule ainsi marquée et qui se trouve dans un premier état physicochimique donné, - modifier ledit premier état physico-chimique précité pour faire passer la molécule marquée dont on a obtenu le premier spectre dans un second état physico-chimique donné différent dudit premier état en créant ainsi une variation du couplage excitonique existant entre les deux marqueurs, 1 - établir un second spectre d'absorption de la molécule marquée se trouvant dans ledit second état physico-chimique, - comparer les premier et second spectres précédemment obtenus, et - en déduire les paramètres recherchés. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le passage du premier état physico-chimique au second état physico-chimique est obtenu en modifiant la température de la ou des molécules marquées. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on augmente la température de la ou des molécules marquées. 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que l'on fait passer la température de la ou des molécules marquées de la température ambiante à une température supérieure à celle du point de fusion de la ou desdites molécules marquées. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le passage du premier état physico-chimique au second état physico-chimique est obtenu en ajoutant à la ou aux molécules marquées une substance agissant sur la structure spatiale propre à la ou aux molécules marquées, en particulier sur l'éloignement existant entre les deux marqueurs. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les espèces atomiques ou moléculaires constituant la substance ajoutée s'intercalent au moins partiellement entre les deux marqueurs proches situés sur la ou les molécules marquées de façon à écarter un marqueur de l'autre. 9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que la substance ajoutée est choisie dans le groupe formé par les dimères de cyanines. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que la substance ajoutée est le tétraiodure de 2, 2'- [1, 3 propanediylbis [ (diméthylimino)-3, 1-propandiyl-l (4H)-pyridinyl-4ylidèneméthylidyne]] bis [3-méthyl]-benzoxazolium. 11. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les espèces atomiques ou moléculaires constituant la substance ajoutée agissent sur la ou les molécules marquées de façon à rapprocher les marqueurs l'un de l'autre. 12. Procédé selon la revendication 7 ou 11, caractérisé en ce que la substance ajoutée est choisie dans le groupe formé par les protéines. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 ou 11 et 12, caractérisé en ce que les molécules marquées sont deux brins complémentaires séparés constitués chacun d'une séquence d'acides nucléiques marqués chacun par un marqueur et que la substance ajoutée est une protéine ou un agent physico-chimique favorisant l'hybridation des deux brins complémentaires. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que les paramètres structuraux déterminés localement sont la distance entre les deux marqueurs portés par la ou les molécules marquées et l'orientation angulaire de l'un des deux marqueurs portés par la ou les molécules marquées par rapport à l'autre. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que les marqueurs sont des chromophores absorbant dans la gamme de longueurs d'ondes comprise entre 300 nm et 800 nm. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'au moins un des chromophores est un groupement dabcyl. 17. Procédé selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce qu'au moins un des chromophores est choisi dans le groupe formé par la tétraméthylrhodamine, la 5-carboxytétraméthylrhodamine, la 6carboxytétraméthylrhodamine, la 5- (et-6)-carboxytétraméthylrhodamine, l'ester succinimidylique de la 5-carboxytétraméthylrhodamine, l'ester succinimidylique de la 6-carboxytétraméthylrhodamine, l'ester succinimidylique de la 5- (et-6)-carboxytétraméthylrhodamine, la rhodamine X, le sel de triéthylammonium de la 5-carboxy-X-rhodamine, la 6-carboxy- X-rhodamine, l'ester succinimidylique de la 5-carboxy-X-rhodamine, l'ester succinimidylique de la 6-carboxy-X-rhodamine, l'ester succinimidylique de la 5- (et-6)-carboxy-X-rhodamine, la tétraéthylrhodamine, l'hydroxyde d'éthanaminium-N- (9- (4- (chlorosulfbnyl)-2-sulfbphényl)-6- (diéthylamino)- 3H-xanthène-3-ylidène)-N-éthyle, la rhodamine 110, la rhodamine 123, la rhodamine phalloidine, l'hydrochlorure de l'ester succinimidylique de la 5- (et-6) carboxyrhodamine 110, l'ester succinimidylique du trifluoroacétamide de la 5- (et-6) carboxyrhodamine 110, l'hydrochlorure de l'ester succinimidylique de l'acide 5- (et-6) amino-hexanoïque-carboxyrhodamine 110, la sulforhodamine 101, la sulforhodamine B, la sulforhodamine G, la 5-isothiocyanato-tétraméthylrhodamine (isomère G), la 6-isothiocyanatotétraméthylrhodamine (Isomère R), la 5-(et-6)-isothiocyanatotétraméthylrhodamine, le 9- (2, 3,6, 7,12, 13,16, 17-octahydro- 1H, 5H, 11H, 15H-xanthèno (2,3, 4-ij : 5,6, 7-i'j')-diquinolizin-18-ium, le sel interne de 9- (2 (ou 4)- (chlorosulfbnyl)-4 (ou 2)-sulfbphényl)- (2, 3, 6, 7, 12, 13, 16, 17-octahydro-lH, 5H, l IH, 15H-xanthèno (2, 3, 4-ij : 5, 6, 7i'j')-diquinolizin-18-ium, le sel interne de 9-[2 (ou 4)-[[[6-[2, 5-dioxo-1pyrrolidinyl) oxy]-6-oxohéxyl] amino] sulfbnyl]-4 (ou 2)-sulfophényl]- 2, 3, 6, 7, 12, 13, 16, 17-octahydro-lH, 5H, 1 IH, 15H-xanthèno (2, 3, 4-ij : 5, 6, 7i'j')-diquinolizin-18-ium, la 5- (et-6)-isothiocyanato-rhodamine-X, la rhodamine 6G, le chlorure de la rhodamine 6G, l'hydrochlorure de la 6carboxyrhodamine 6G, l'hydrochlorure de la 5-carboxyrhodamine 6G, l'ester succinimidylique de la 5-carboxyrhodamine 6G, l'ester succinimidylique de la 6-carboxyrhodamine 6G et l'ester succinimidylique de la 5- (et-6)carboxyrhodamine 6G 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisé en ce qu'au moins un des chromophores est choisi dans le groupe formé par la fluorescéine, la 5-carboxyfluorescéine, la 6carboxyfluorescéine, la 5- (et-6)-carboxyfluorescéine, l'ester succinimidylique de la 5-carboxyfluorescéine, l'ester succinimidylique de la 6-carboxyfluorescéine, l'ester succinimidylique de la 5- (et-6)carboxyfluorescéine, la 5- (4, 6-dichlorotriazinyl) aminofluorescéine, l'ester succinimidylique de l'acide 6- (fluorescéine-5-carboxamido) hexanoïque, l'ester succinimidylique de l'acide 6- (fluorescéine-5- (et-6)-carboxamido) hexanoïque, l'ester succinimidylique de la fluorescéine-5-EX, la 5- isothiocyanato-fluorescéine, la 6-isothiocyanato-fluorescéine, la 2', 7'difluorofluorescéine, la 5-carboxy-2', 7'-difluorofluorescéine, l'ester-5succinimidylique de la 2', 7'-difluorofluorescéine, l'ester-6-succinimidylique de la 2', 7'-difluorofluorescéine, la 5- (et-6)-isothiocyanato-2', 7'difluorofluorescéine, la 5- (et-6)-carboxynaphthofluorescéine, l'ester succinimidylique de la 5- (et-6)-carboxynaphthofluorescéine, l'ester succinimidylique du V, 19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisé en ce qu'au moins un des chromophores est choisi dans le groupe formé par l'acide 4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-sindacène-3-propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5, 7diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique, l'acide 4, 4-difluoro- 5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-pentanoïque, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluor-5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-sindacène-3-pentanoïque, l'acide 4, 4-difluor-5, 7-diphényl-4-bora-3a, 4adiaza-s-indacène-3-propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4difluor- 7-diphényl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique, l'acide 4, 4-difluor-1, 3, 5, 7-tétraméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-8propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluor-1, 3, 5, 7tétraméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-8-propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5- (2-thiényl) -4-bora-3a, 4a-diaza-sindacène-3-propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5- (2-pyrrolyl)-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique, l'acide 4, 4difluoro-5-styryl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5-styryl-4-bora-3a, 4a-diaza-sindacène-3-propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5- (4-phényl-1, 3-butadiényl)-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique, l'acide 6- ( (4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3propionyl) amino) hexanoïque, l'ester succinimidylique de l'acide 6- ( (4, 4difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3propionyl) amino) hexanoïque, l'acide 4, 4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-sindacène-3, 5-dipropionique, l'ester succinimidylique de l'acide 6- ( ( (4- (4, 4difluoro-5- (2-thiényl)-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3yl) phénoxy) acétyl) amino) hexanoïque, l'ester succinimidylique de l'acide 6- ( (4, 4-difluoro-1, 3-diméthyl-5- (4-méthoxyphényl)-4-bora-3 a, 4a-diaza-s- indacène-2-propionyl) amino) hexanoïque, le sel sodé de l'ester sulfosuccinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4adiaza-s-indacène-3-propionique, le sel de triéthylammonium de l'ester succinimidylique de l'acide N- (4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl- 4-bora-3a, 4adiaza-s-indacène-3-propionyl) cystéique, l'acide 2, 6-dibromo-4, 4-difluoro- 5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 2, 6-dibromo-4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique et l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5-phényl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique. 20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 19, caractérisé en ce qu'au moins un des chromophores est choisi dans le groupe formé par la 3,3, 3', 3'-tétraméthyl-indodicarbocyanine 5, la 3,3, 3', 3'tétraméthyl-indodicarbocyanine 3 ou la 3,3, 3', 3'-tétraméthyl-4, 5benzindodicarbocyanine 5. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que la ou les molécules dont on veut déterminer les paramètres structuraux sont des nucléotides. 22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que la ou les molécules dont on veut déterminer les paramètres structuraux sont des phospholipides. 23. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, pour l'analyse de modifications structurales locales de molécules. 24. Utilisation selon la revendication 23 pour l'analyse de modifications structurales locales d'ADN, en particulier d'ADN humain. 25. Utilisation selon la revendication 23 pour l'analyse de modifications structurales locales d'ARN, en particulier d'ARN humain. 26. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 23 à 25 pour détecter une hybridation entre une séquence et sa séquence complémentaire.