Brevet FR2825101A1 — publié le 20021129

particulier de la crasse causée par la pollution atmosphérique. La présente invention concerne de nouvelles molécules d'acides nuclélques et leur application thérapeutique en ophtalmologie. La cataracte est une pathologie extrêmement fréquente, survenant inexorablement avec l'âge. Elle correspond à une opacification du cristallin dont la pathogénie demeure inconnue. Ses répercutions sur les fonctions visuelles sont majeures. Le seul traitement effficace est chirurgical: Il consiste en une ablation du cristallin avec conservation de son enveloppe, c'est-à-dire le sac capsulaire dans lequel sera placé l'implant cristallinien. Malgré son efficacité, le traitement chirurgical se complique constam ment chez l'enfant et dans environ la mo itié des cas chez l' ad u lte, de l'apparition d'une cataracte secondaire dite opacification capsulaire postérieure (PCO) responsable d'une nouvelle baisse d'acuité visuelle dont le seul traitement consiste actuellement à réaliser, à l'aide d'un laser YAG, un orifice central dans la capsule postérieure opacifiée. Cette ouverture est cependant susceptible de provoquer des complications graves pouvant entraner une cécité. Ces complications fonctionnelles ont également des répercutions économiques et à titre d'exemple, le coût du laser YAG dans cette indication a été chiffrée en 1993 aux USA à 250 millions de dollars. La cataracte secondaire correspond à une opacification de la capsule du cristallin due à la prolifération et à la migration de cellules épithéliales cristalliniennes résiduelies laissées en place dans le sac capsulaire à la fin de l'intervention chirurgicale malgré tout le soin apporté à celle-ci. Plusieurs approches ont été proposoes pour tenter de diminuer I'incidence de la cataracte secondaire. Des méthodes chirurgicales mécaniques telles qu'un nettoyage précautionneux des cellules épithéliales résiduelles ont été proposées. Plusieurs études utilisant différentes géométries d'implants intra- oculaires et différents blo-matériaux faisant un barrage physique pour éviter la migration des cellules épithéliales résiduelles de la périphérie vers le centre du cristallin ont été également conduites. L'utilisation d'un anneau placé en périphérie du sac capsulaire visant également à empêcher cette migration centripète des cellules a également été envisagée. Des agents pharmacologiques tels que des anti-métabolites ou des toxines liées à des anticorps monoclonaux dirigés contre les cellules épithéliales du cristallin ont également fait l'objet d'études expérimentales. A l'heure actuelle, la prévention de la cataracte secondaire n'est pas résolue car les différentes stratogies ne sont qu'incomplètement efficaces ou sont toxiques pour les tissus oculaires environnants. Afin de prévenir cette cataracte secondaire, Malecaze et al. (Adenovirusmediated suicide gene transduction: feasibility in lens epithelium and in prevention of posterior capsule opacification in rabbits, Human gene therapy, 1999, 10:2365-2372) et Couderc et al, (Retrovirus-mediated transfer of the suicide gene into lens epithelial cells in vitro and in an experimental model of posterior capsule opacification) Curr. Eye Res., 1999. 19: p. 472-482) ont proposé d'inhiber la prolifération des cellules épithéliales cristalliniennes résiduelles par transfert de gène suicide in vivo associé à l'administration de ganciclovir à haute dose. L'efficacité d'une telle stratogie a été appréciée sur un modèle expérimental de cataracte secondaire chez le lapin. Pour cela, les cellules cristalliniennes résiduelles à la fin de l'intervention chirurgicale ont été modifiées par le gène codant la thymidine-kinase du virus Herpes Simplex 1 en utilisant comme vecteur l'adénovirus qui est laissé en place à la fin de l'intervention dans le sac capsulaire. Les lapins traités n'ont pas développé de cataracte secondaire, mais une légère toxicité cornéenne a été observée. Le traitement n'était pas totalement efficace comme on l'exige d'une telle intervention. On observait qu'un quart des animaux traités développaient une cataracte secondaire d'au moins de grade lil (voir Maleceze et al. Human gene therapy, 1999, 2365-2372). En outre une importante réaction inflammatoire a été observée. Il n'existe à ce jour aucun traitement préventif de la PCO. Il serait donc souhaitable de disposer d'un traitement préventif efficace de la PCO, ne produisant pas d'inflammation ou de toxicité. Il serait notamment souhaitable de tuer les cellules cristalliniennes restantes mais sans endommager les cellules endothéliales corncennes, ni les structures oculaires adjacentes. Or les demandeurs ont découvert avec étonnement que si i'on utilisait une construction génique comprenant une séquence d'acides nuclélques codant un inducteur de mort des cellules cristalliniennes, sous un contrôle transcriptionnel spécifique des celluies du cristallin, on atteignait tout ou partie des objectifs ci-dessus. C'est pourquoi la présente demande a pour objet une molécule d'acides nucléiques (de gène, d'ADNc ou d'ARN), notamment d'ADN, comprenant une séquence codant un inducteur de mort des cellules cristalliniennes, de préférence par apoptose, sous un contrôle transcriptionnel spécifique des cellules du cristallin. Cette approche thérapeutique constitue l'invention. La séquence (de gène, d'ADNc ou d'ARN) codant l'inducteur de mort des cellules cristalliniennes pourra coder par exemple une protéine capable d'induire la mort des cellules cristalliniennes par nécrose (gène codant la granzyme par exemple) ou une protéine toxique pour les cellules cristalliniennes, et coder de préférence une protéine impliquée dans la régulation de l'apoptose. La séquence d'acides nucléiques codant un réqulateur d'apoptose peut correspondre par exemple à un gène suppresseur de tumeur comme p53, à un gène codant FLICE (appelé encore caspase 8), TRAIL ou BAX, ou à un gène codant une protéine impliquée dans la réqulation de l'apoptose. La présente demande a particulièrement pour objet une molécule d'acides nucléiques ci-dessus caractérisée en ce que la séquence de ladite molécule (gène, ADNc ou ARN) codant un inducteur de mort des cellules cristalliniennes est une séquence codant un inducteur d'apoptose, ou codant un composé impliqué dans le processus d'apoptose. A titre d'exemple, ces séquences peuvent coder toutes les protéines impliquées dans l'apoptose selon différentes voies, par exemple les trois voies actue llement con n ues de l' ind uctio n de l 'a poptose. La première voie est la voie initiée par la liaison de facteurs de croissance, réqulée par les protéines de la famille Bc1-2, et qui aboutit soit au relargage de cytochrome C à partir des mitochondries activant l'apaf-1 et activant la cascade des caspases soit à l'activation de la voie AI F. La deuxième voie est la voie faisant intervenir des récepteurs membranaires de mort cellulaire comme TNF ou fas qui va, par l'intermédiaire de molécules adaptatrices recruter et activer les caspases. La troisième voie est initiée par une altération de l'ADN. Elle semble réquiée en partie par des protéines comme P53 et ATM. On peut utiliser notamment les molécules d'acides nuclélques dont la séquence code p53, BAX, FLICE (appelé encore caspase 8) TRAIL ou 1 5 TRAIL-R. Dans des conditions préférentielles de mise en _uvre de l'invention, on préfère BAX et p53. De man ière généra le, le contrôle tra nscription nel spécifiq ue de l'expression des gènes dans des cellules du cristallin peut être effectué à l'aide d'un promoteur d'un gène codant une protéine ou un élément biochimique spécifique du cristallin. Le contrôle transcriptionnel spécifique de l'expression des gènes dans des cellules du cristallin peut être effectué par exemple par mise en _uvre de promoteurs de gènes codant des protéines spécifiques du cristallin comme la famille des protéines "Major Intrinsic Protein (MIP) of the lens" (exemple MP26), ou la protéine LEP503 mais sera réalisé de préférence grâce - à des promoteurs spécifiques des cellules cristalliniennes tels que les promoteurs des différentes familles de cristallines "B, ou d. On utilise préférentiellement une molécule d'acides nuclélques ci dessus caractérisée en ce que le contrôle transcriptionnel spécifique des cellules du cristallin est effectué par le promoteur de l'A cristallin, le promoteur de la Dcristalline, le promoteur de MIP (MP26), le promoteur de LEP503 ou le promoteur d7un élément biochimique spécifique des cellules épithéliales du cristallin et tout particulièrement le promoteur de l'ocA cristalline ou le promoteur de la Dcristalline qui sont très spécifiques du cristallin. Dans des conditions préférentielles de mise en _uvre de I'invention, la molécule d'acides nuclélques et notamment d'ADN est portée par un vecteur. Le vecteur peut être par exemple un vecteur synthétique qui véhiculera la molécule d'acides nuclélques selon l'invention soit sous forme d'ADN soit sous forme d'ARN, ou un vecteur viral. A titre de vecteur viral, on peut utiliser un vecteur dérivé soit d'un virus de la famille des rétrovirus du genre oncoviridae (souche Moloney) utilisé avantageusement en suspension virale concentrée, soit d'un virus du genre ientiviridae. Le vecteur viral peut aussi être dérivé du virus adénovirus associé (MV) ou d'un virus de la familie des adénovirus. On peut utiliser la totalité d'un vecteur viral ou simplement un fragment de celui-ci dans la mesure o il permet au gène codant une protéine induisant la mort cellulaire de pénétrer dans les cellules cristalliniennes à détruire. Le vecteur mis en _uvre est préférentiellement un vecteur épisomique, ne s'intégrant donc pas dans le génome de ses cellules cibles. Le vecteur est avantageusement tronqué de ses parties inflammatoires s'il en possède eVou de toute autre partie pouvant induire des effets secondaires non désirés. L'adénovirus est particulièrement de sérotype 5. On préfère de tels adénovirus doublement tronqués (E1-E3). Le vecteur mis en _uvre est avantageusement capable d'infecter % des cellules cristalliniennes cibles. Des vecteurs objets de la présente invention peuvent par exemple être préparés comme suit: On réalise une construction plasmidique d'acides nucléiques, de préférence d'ADN, comportant une séquence d'acides nucléiques codant un inducteur de mort des cellules cristalliniennes sous un contrôle transcriptionnel spécifique des cellules du cristallin pour obtenir la molécule d'acides nucléiques attendue que l'on isole. Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre du procédé cidessus décrit, on réalise une construction plasmidique d'ADN comportant une séquence codant une protéine inductrice d'apoptose (tel que p53), sous un contrôle transcriptionnel spécifique aux cellules du cristallin (par exemple mettant en _uvre un promoteur spécifique aux cellules cristalliniennes, notamment le promoteur de l'ocAcristalline ou le promoteur de la Dcristalline), le gène codant la protéine inductrice d'apoptose étant de préférence suivi d'une séquence de polyadénylation. La molécule d'ADN ci-dessus décrite peut alors être insérée dans un vecteur tel un vecteur dérivé d'un adénovirus pour obtenir le vecteur attendu que l'on isole. A titre illustratif, I'ADN plasmidique obtenu ci-dessus peut être linéarisé puis cotransfecté dans des cellules transcomplémentantes 293, avec de l'ADN viral codant le bras long du génome d'un vecteur tel un adénovirus (de préférence le génome entier tronqué d'un ITR et de ses gènes E1 et E3). La recombinaison entre ces deux ADNs dans des cellules hôtes adaptées, (comme des cellules 293) va conduire à la génération de particules virales codant la construction d'intérêt. Les vecteurs désirés, en l'espèce des particules virales, peuvent alors être sélectionnés à partir des cellules hôtes transfectées. Les vecteurs-particules virales peuvent alors être sous-clonés (pour être purifiés) puis amplifiées par infection de cellules hôtes adaptées, (par exemple à nouveau des cellules 293). Les molécules d'acides nuclélques, notamment d'ADN et les vecteurs objet de la présente invention possèdent de très intéressantes propriétés pharmacologiques. Ils sont en particulier capables de provoquer la mort notamment "naturelle" des cellules cristalliniennes restant après le traitement chirurgical de la cataracte, mais sans endommager les cellules endothéliales oculaires et sans effets secondaires non désirés tel que l'inflammation, en particulier pour les molécules d'ADN codant une molécule impliquée dans la réqulation de l'apoptose comme un inducteur de la mort cellulaire par apoptose. De surcro^t, les vecteurs objet de la présente invention permeffent le développement des techniques chirurgicales de restauration de I'accommodation de la presbytie par une chirurgie du cristallin. Ces techniques consistent essentiellement à mettre en place un implant accommodatif qui permet de corriger optiquement la presbytie par un déplacement antéro- postérieur de l' imp la nt crista lli n ien o u à restau rer l'accommod ation en remplaçant l'intérieur du cristallin par une substance autorisant la déformation du cristallin lors de la contraction du muscle ciliaire. Ces deux techniques sont jusqu'à présent limitées par la perte de l'élasticité du sac capsulaire par fibrose et la survenue d'une cataracte secondaire liée à la présence de cellules épithéliales résiduelles dans le sac capsulaire. Les molécules d'acides nucléiques et vecteurs de l'invention sont notamment capables d'induire la mort des cellules cristalliniennes par nécrose (gène codant la granzyme par exemple), par toxicité pour les cellules . cristalliniennes, et de préférence par apoptose. Ces propriétés sont illustrées ci-après dans la partie expérimentale. Elles justifient l'utilisation des molécules d'acides nuclélques et des vecteurs ci-dessus décrits à titre de médicament. C'est pourquoi l'invention a aussi pour objet les molécules d'acides nuclélques et les vecteurs ci-dessus décrits, pour leur utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique du corps humain ou animal, c'est-à dire à titre de médicament. Les médicaments selon la présente invention trouvent leur emploi par exemple dans le traitement préventif de l'apparition de la cataracte secondaire lors de l'intervention chirurgicale de la cataracte ou dans l'amélioration de certains traitements chirurgicaux correctifs de la vision, tel que le traitement chirurgical de la presbytie. La dose usuelle, variable selon le sujet traité, peut être, par exemple, de 106 à 105 vecteurs viraux, notamment de 108 à 1044 adénovirus vecteurs selon l'invention par voie injectable chez l'homme du vecteur de I'exemple 1, pendant ou après l'intervention chirurgicale de la cataracte. L' invention a auss i pour objet les compositions pharmaceutiq ues qui renferment au moins une molécule d'acides nuclélques ou vecteur précité, à titre de principe actif, associé ou non à des dispositifs physiques ou chimiques de diffusion, tels que blomatrices, liposomes, nanoparticules ou dispositifs à libération prolongée. Dans ces compositions, le principe actif est avantageusement présent à des doses pharmacologiquement efficaces; les compositions précitées renferment notamment une dose efficace d'au moins un principe actif 1 0 ci-dessus. A titre de médicaments, les vecteurs peuvent être incorporés dans des compositions pharmaceutiques destinces à la voie parentérale ou locale. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être, par exemple, semi liquides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme par exemple les préparations injectables ou utilisables in situ durant l'intervention chirurgicale, ou les préparations à usage local telles que les collyres ou gels ophtalmiques; elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Elles sont en principe stériles dans la mesure o elles sont destinces à être injectées. Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que les véhicules aqueux ou non, les divers agents mouillants, dispersants ou émuisifiants, les conservateurs. La présente invention a encore pour objet un procédé de préparation d'une composition ci-dessus décrite, caractérisé en ce que l'on mélange, selon des méthodes connues en elles-mêmes, le ou les principes actifs avec des excipients acceptables, notamment pharmaceutiquement acceptables. Quel que soit le principe actif utilisé, il pourra être soit laissé en place dans le sac capsulaire en fin d'intervention chirurgicale, soit administré dans l'_il après l'intervention chirurgicale, soit relargué à partir de l'implant cristallinien, soit relargué à partir d'anneaux ou de dispositifs de diffusion, dégradables ou non-dégradables, préalablement recouverts du vecteur, et placés en périphérie du sac capsulaire. L'invention a enfin pour objet l'utilisation d'une molécule d'acides nuclélques ou d'un vecteur ci-dessus pour l'obtention d'un médicament destiné à une utilisation préventive de l'apparition de la cataracte secondaire lors de I'intervention chirurgicale de la cataracte. Elle a également pour objet une méthode de traitement préventif de l'apparition de la cataracte secondaire lors de l'intervention chirurgicale destinée à corriger la presbytie ou tout autre affection, lors d'une chirurgie intraoculaire cristallinienne. On administre alors dans l'_il, ou directement dans le sac capsulaire, une dose pharmacologiquement efficace de la molécule d'acides nucléiques ci-dessus décrite. Les conditions préférentielles de mise en oeuvre des molécules d'acides nucléiques et des vecteurs ci-dessus décrits s'appliquent également aux autres objets de l'invention visés ci-dessus. La figure 1 représente la carte de restriction de Quantum P53 La figure 2 représente la carte de restriction de Quantum BAX La figure 3 représente la carte de restriction de Quantum FLICE La figure 4 représente la carte de restriction de Quantum,BGAL Les exemples qui suivent illustrent ia présente invention. Tous les enzymes de restriction, la taq polymérase, I'enzyme de Kleenow, la T4DNA ligase, la transcriptese reverse ont été achetés à la société Roche (Roche - Bochringer, Meylan, France). Les oligonucléotides utilisés pour les réactions de PCR ont été achetés à la société GENSET (Genset Oligos, Paris, France). Exemple 1: Vecteur adénoviral comprenant le gène codant p53 et dont l'expression est spécifique des cellules ocAcristallines Préparation 1: Plasmide codant p53 et dont l'expression est spécifique des cellules cristalliniennes. Stade A: Préparation d'ADN codant la galactosidase sous le contrôle transcriptionnel du promoteur de l'aAcristalline (pAdFRGAL) On a synthétisé un premier vecteur codant la galactosidese sous la dépendance du promoteur aAcristalline appelé pAdFRGAL. On soumet pRSVGALIX (Legal Lasalle, Sciences, 1993, 12: 988 990) à une dIgestion par Xba1 et Avril. On purifie sur gel d'électrophorèse d'agarose la bande de 9128 pdb. On obtient un fragment F1. On amplifie par PCR l'ADN correspondant au promoteur de l'aAcristalline décrit par Chepelinsky et al. dans Mol. Cell Biol. 1987. La PCR est réalisse en utilisant les amorces: aA366 5' GCTCTAGATATCAGATTCTCTGGAGGmCGG 3' et aA366 rev 5' TTCGMGGATCCCCGMGGCTGGCAGTGAGTC 3' de Genset et déterminées à partir de la séquence publiée par Chepelinsky et al. (Mol. Cell Biol.1987). On obtient un ADNc de 433 pdb. Cet ADN est digéré par Xba1et Avril. On obtient un fragment F2. On procède à la ligation des fragments F1 et F2 à 4 C pendant 16 heures en présence de T4DNA ligase. On transforme alors des bactéries DH5a avec le produit de ligation. On obtient le vecteur plasmidique pAdFRGAL de 9561 pdb. Stade B: Préparation d'ADN codant le gène p53 On a tout d'abord synthétisé un premier vecteur codant p53 sous la dépendance du promoteur aAcristalline appelé pAdFRp53. Puis à partir des éléments géniques de ce vecteur, on a construit le vecteur Quantump53. 1ère étape: Synthèse du vecteur appelé pAdFRp53 codant le gène p53 On soumet le vecteur pCDNA3p53 dérivé du vecteur pCITEP53 publié par Hegi et al., Cancer Res., 2000, 60: 3019-3024 à une digestion par Xba1et BamH1. On purifie sur gel d'électrophorèse d'agarose la bande de 1160 pdb. On obtient un fragment F3. 2ème étape: Construction du vecteur pAdFRp53 On soumet pAdFRGAL obtenu au Stade A ci-dessus à une digestion par Avril et Bc11. On purifie sur gel d'électrophorèse d'agarose la bande de 8091 pdb. On obtient un fragment F4. On procède à la ligation des fragments F3 et F4 à 4 C pendant 16 heures en présence de T4DNA ligase. On transforme alors des bactéries DH5a avec le produit de ligation. On obtient le vecteur plasmidique pAdFRp53 de 9301 pdb. Stade C Plasmide QuantumP53 Le vecteur plasmidique pAdFRp53 est digéré par Kpn1 et EcoRV. La bande de 3544 pdb est purifiée par gel d'électrophorèse et geneclean. On obtient un fragment F5. On soumet le vecteur Adenoquest, pQBI-AdBN Quantum- Biotechnologies (France) à une digestion par EcoRV et Kpn1. On obtient un fragment F6. On procède à la ligation des fragments F5 et F6 pendant 3 heures à 20 C, puis pendant 16 heures à 4 C en présence de T4DNA ligase. On transforme alors des bactéries DH5a avec le produit de ligation. On obtient le vecteu r plasm id iq ue Qua ntu m P53 de 8994 pd b. Dans cet exemple, l'ADN a été extrait et purifié par utilisation du kit de maxiprep commercialisé par QUIAGEN (France). La concentration de l'ADN obtenu a été déterminée par mesure de la DO de la solution plasmidique. Une carte de restriction a été réalisée. Les séquences de jonctions avec le vecteur Quantum et la totalité de la séquence du promoteur et du gène codant la p53 ont été vérifiées par sequençage. Préparation 2: Vecteur adénoviral Quantump53 On incorpore l'ADN codant le gène p53 sous le contrôle transcriptionnel du promoteur de l'xAcristalline, dans le vecteur adénoviral choisi. Stade A: Préparation de molécules d'ADN. g de molécules d'ADN QuantumP53 préparées au Stade C ci dessus sont linéarisées par digestion avec l'enzyme de restriction Asp700. Après digestion, I'ADN plasmidique est purifié par deux extractions au phénol chloroforme et une précipitation à l'éthanol. Les particules virales sont obtenues par co-transfection de cellules QBI293A (75.000 cellules, ensemencées la veille, par bo^te de pétri de diamètre 6) à l'aide de 5,ug de Quantump53 et de 10 ug d'ADN viral QBI Viral DNA (Adénovirus type 5, AdCMVLacZAE16E3) commercialisé par Quantum Appligène), par la méthode au phosphate de calclum avec les produits commercialisés par Quantum-Appligène. Les cellules QBI293A sont des cellules transcomplémentantes de rein embryonnaires humaines synthétisant E1A et E1B commercialiséss par Quantum-Appligène (Q.Biogène, lilkirch, France). Elles sont cultivées dans du milieu de Eag le mod ifié selon Dulbecco (DM EM) supplémenté de 2 mM glutamine et de 10 % de sérum de veau f_tal (SVF). Elles sont maintenues en culture pendant 3 à 4 mois maximum 24 heures après transfection, les cellules sont traitées à la trypsine et ensemencées dans 6 puits de 3,5 cm de diamètre. 5 heures après, les cellules sont recouvertes de milieu de culture contenant 1,25 /O d'agarose. 1 ml de milieu de Eagle modifié selon Dulbecco (DMEM) Sesplaque est rajouté aux cultures cellulaires tous les 5 jours. Les plages de Iyse apparaissent entre 10 et 21 jours après la transfection. Stade B: Constitution du stock viral: Les plages sont récupérées comme des carottes d'agarose et sont mises à éluer 24 heures dans 0,5 ml de DMEM 5 %. Ces suspensions virales subissent 4 cycles de congélation - décongélation à -80 C/+37 C. On infecte alors avec 200,ul de solution virale, des puits de bo^tes de 24 puits (2 puits/plage) contenant des cellules 293A à 60 % de confluence (10000 cellules/puits) dans 0,8 ml de DMEM, 5 % SVF. 20 plages de Iyse sont testées au minimum par construction. Le contenu des puits est prélevé quand toutes les cellules ont montré un CPE (complete cytopathic effect). Ces suspensions virales subissent 4 cycles de congélation-décongélation à -80 C/+37 C. Stade C: Sélection des clones Quantump53 Chaque clone a été testé pour l'expression du gène inséré dans le 1 5 vecteur. Le vecteur sauvage avec lequel on fait la recombinaison porte le gène galactosidese sous le contrôle du promoteur RSV. Les virus Quantum p53 sont identifiés par rapport aux vecteurs sauvages RSV,Bgal par un test d'expression de la,Bgalactosidase. On infecte des cellules cristalliniennes à l'aide des différentes suspensions virales correspondant aux différents clones viraux. 48 heures après, les cellules infectées sont testées pour l'activité,Bgalactosidese. Les cellules sont lavées 2 fois avec du tampon phosphate (PBS) puis fixées pendant 5 mn avec une solution 1% formaldahyde, 0,1 % glutaraldéhyde dans du PBS. Après deux lavages au PBS elles sont colorces avec une solution de Xgal (5 bromo-4 chloro-3-indolyl--D-galactoside commercialisé par Sigma Chemical, Saint Quentin Fallavier, France). En utilisant un microscope à contraste de phase, au grossissement 20, des champs cellulaires sont évalués. On évalue la présence des cellules qui expriment la,Bgalactosidase par rapport au nombre total de cellules. Si les cellules expriment la galactosidase, c'est qu'elles sont infectées par le virus non recombinant. Ces clones de particules virales sont éliminés. Les autres clones de particules virales sont utilisés pour l'infection de cellules cristalliniennes. Les cellules infectées sont Iysoes 24 heures après infection et on réalise un western blot sur les extraits protélques issus des cellules infectées à I'aide d'un anticorps anti-p53 (Pharmingen, France). Les suspensions virales sélectionnces comme étant celles correspondant à la construction d'intérêt sont testées par une analyse de l'ADN viral. On infecte une bo^'te de 10 cm de diamètre à 60 % de confluence de cellules cristalliniennes par 200,ul de suspension virale issue des particules virales sélectionnées après western blot. L'ADN viral des cellules infectées est extrait puis purifié par extraction au phénol/chloroforme et précipitation à l'éthanol. Le culot d'ADN viral est repris par 100 ul d'eau contenant 20 ug de Rnase. Puis une cartographie de restriction et une analyse par réaction de polymérisation en chane ( PCR) sont réalisées. Les particules virales constituant le clone sélectionné sont sous clonées par 3 clonages successifs en plages de Iyse. On obtient les particules de d'adénovirus vecteurs Quantump53 attendues. Exemple 2: Vecteur adénoviral comprenant le gène codant BAX On a préparéun plasmide comprenant le promoteur aA cristallin et une séquence de polyadénylation, qui a été utilisé pour y insérer différents gènes inducteurs de mort cellulaire. Stade A: Plasmide comprenant une séquence de polyadénylation On digère un vecteur Adenoquest, pQBI-AdBN commercialisé par la société Quantum-Biotechnologies (France) par Bgill et Xhol (fragment 7) . On digère un vecteur PUT EMCV ZEO ( Douin et al. Cancer Gene Ther., 2000, 12: 1545-1553) par les enzymes Sal1 et Bgill. On purifie sur gel d'électrophorèse d'agarose la bande de 141 pdb (fragment 8). On procède à la ligation des fragments 7 et 8 à 4 C pendant 16 heures en présence de T4DNA ligase. On transforme des bactéries DH5Oc avec le produit de ligation. On obtient le vecteur plasmidique Quantum PolyA de 5591 pdb. Quantum poly A est digéré par EcoRV et Hindill (fragment 9). Stade B: On amplifie par PCR de l'ADN correspondant au promoteur de l'aAcristalline. La PCR est réalisée en utilisant l'ADN 366alphaApromoter CAT précédemment décrit, en utilisant les amorces aA366 5' GCTCTAGATATCAGATTCTCTGGAGG l l l CGG 3' et aA366 rev 5' TTCGMGGATCCCCGMGGCTGGCAGTGAGTC 3' de la société Genset et déterminées à partir de la séquence publise par Chepelinsky et al. (Mol. Cell Biol. 1987). On obtient un ADNc de 433 pdb. Cet ADN est digéré par EcoRV et Hindill (fragment 10). On procède à la ligation des fragments 9 et 10 pendant 3 heures à C puis pendant 16 heures à 4 C en présence de T4DNA ligase. On transforme des bactéries DH5a avec le produit de ligation. On obtient le vecteur plasmidique Quantum aA366 - PolyA de 6024 pdb. Stade C: Préparation de l'adénovirus vecteur codant BAX Le vecteur de 6024 pdb du stade B est digéré par Hindill et traité par la phosphatase alcaline (fragment 11). On amplifie par PCR l'ADNc humain correspondant à BAX à partir du vecteur publice par Oltvai et al. (Cell, 1993, 74: 609-619) avec les amorces 'CCCMGCTTATGGACGGGTCCGGGGAGCAGC 3'et ' CCCMGCTTCAGCCCATCTTCTTCCAG 3'. On obtient un fragment de 590 pdb qui est digéré par Hindill (fragment 12) . On procède à la ligation des fragments 11 et 12 à 4 C pendant 16 heures en présence de T4DNA ligase. On transforme des bactéries DH5O avec le produit de ligation. On obtient un vecteur plasmidique Quantum ocA366 BAX de 6604 pdb. Dans cet exemple, l'ADN a été extrait et purifié par utilisation du kit de maxiprep commercialisé par QUIAGEN (France). La concentration de l'ADN obtenue a été déterminée par mesure de la DO de la solution plasmidique. Une carte de restriction a été réalisée. On obtient les particules virales correspondant à cette construction Quantum aA366 BAX comme indiqué aux stades A, B et C de la préparation 2 de l'exemple 1. Exemple 3: Vecteur adénoviral comprenant le gène codant FLICE Le vecteur de Quantum aA366 - PolyA de 6024 pdb l'exemple 2 est digéré par Hindill et traité par la phosphatase alcaline (fragment 13) . On amplifie par PCR l'ADNc humain correspondant à FLICE à partir de la séquence publiée dans J. Mol. Biol, 1997, 272, 17255-17257, par Hu et al, avec les amorces ' CCCMGCTTGGATCCATGGACTTCAGCAG 3' et ' CCCMGCTTCCTCMTCAGMGGGMGAC 3' On obtient un fragment de 1439 pb qui est digéré par Hindill (fragment 14). On procède à la ligation des fragments 13 et 14 à 4 C pendant 16 heures en présence de T4DNA ligase. On transforme des bactéries DH5a avec le produit de lipation. On obtient le vecteur plasmidique Quantum aA366 FLICE de 7463 pdb. Dans cet exemple, l'ADN a été extrait et purifié par utilisation du kit de maxiprep commercialisé par QUIAGEN (France). La concentration de l'ADN obtenue a été déterminée par mesure de la DO de la solution plasmidique. Une carte de restriction a été réalisoe. On obtient les particules virales Quantum aA366 FLICE, correspondant à cette construction comme indiqué aux stades A, B et C de la préparation 2 de l'exemple 1. Exemple 4: Préparations ophtalmiques injectables On a préparé des ampoules injectables répondant à la formule Adénovirus p53 de l'exemple 13.109 Unités Formant Plage excipient: tampon salin pour préparations injectables q.s. pour une ampoule terminée à 200 pI. Exemple 5: Préparations opUtalmiques injectables On a préparé des ampoules répondant à la formule Adénovirus p53 Iyophilisés de l'exemple 1 3.109Unités FormantPlage Ampoule d'excipient: Tampon salin pour préparations injectables 200 ul. ETUDE PHARMACOLOGIQUE Préparation des lapins: Phacoémuisification Préalablement à l'opération de phacoémuisification, les lapins sont traités par des collyres antiinflammatoires de diclofénac 0,1 % et de dexaméthasone. Cés deux types de collyre sont administrés dans les heures qui précèdent l'intervention chirurgicale. Des collyres mydriatiques (atropine à 1%, chlorhydrate de p hénylé ph rine à 2, 5 % et tropicamide à 1 %) sont ad m in istrés à 3 rep rises dans I'heure qui précède la chirurgie. Les lapins sont anesthésiés en utilisant de la kétamine (60 mg/kg voie intramusculaire). La chirurgie débute par une incision cornéenne de 3 mm. Un produit visqueux (Viscost@) est ensuite injecté dans la chambre antérieure. Un capsulorhexis de 4mm est ensuite réalisé et après hydrodissection, une phacosmuisification est effectuée en utilisant comme liquide d'infusion une solution salée (BSS) contenant de l'Héparine (100 Ul/ml). Un nettoyage des masses périphériques résiduelles est réalisé à l'aide d'une pièce à main d'irrigation-aspiration. L'incision corncenne est ensuite suturce. Après l'opération, des collyres anti-inflammatoires (diclofénac et Chibrocadron) et des collyres mydriatiques (Néosynéphrine et Mydriaticum) sont administrés 4 fois/jour. Expérimentation 1: Effet préventif sur la cataracte secondaire de l'administration du vecteur QuantumP53 préparé à l'exemple 1 chez le lapin A la fin de la phacoémuisification et après suture de l'incision cornsenne, 100 pI de la suspension virale testée (5 109 virus/ml) sont injectés dans la chambre antérieure en regard du sac capsulaire à travers l'incision à l'aide d'une aiguille (30 gauje). L'évaluation de la cataracte secondaire après l'intervention est réalisée en double insu par deux examinateurs. Ces examens sont fait deux jours après la chirurgie puis toutes les semaines durant le premier mois après la chirurgie. L'opacification capsulaire est évaluée après dilatation pupiliaire en utilisant une lampe à fente biomicroscopique et un microscope opératoire. On a considéré l'aire de la surface opacifiée en utilisant des scores d'opacification capsulaire selon la méthode d'Odrich. L'échelle de scores varie de 0 à 4, 0: pas d'opacification, 1: opacification intéressant moins d'un cadran, 2: moins de deux cadrans, 3: moins de trois cadrans, * 4: opacification intéressant les 4 cadrans avec ou sans opacification centrale. Résultats Les 5 lapins qui ont reçu en fin de phacosmuisification un adénovirus témoin sans gène inducteur de mort cellulaire ont développé une cataracte secondaire de score 4 en un mois. Par contre, les 6 lapins opérés ayant reçu en fin de phacoémuisification l'adénovirus QuantumP53 n'ont pas développé de cataracte secondaire. Afin de mettre en évidence la tolérance du traitement, le degré d'inflammation post-opératoire a été apprécié cliniquement à l'aide d'une lampe à fente en étudiant la résction fibrineuse, le tyndall de l'humeur aqueuse. Un examen biomicroscopique de la cornée a été également réalisé. Aucune inflammation oculaire, atteintes des structures adjacentes, ni toxicité corncenne n'a été décelée chez les 6 lapins traités par l'adénovirus QuantumP53. Expérimentation 2: Spécificité pour les cellules cristalliniennes après infection de cellules de lapins in vitro Préparation A: Construction du vecteur Quantum0GAL Le vecteur plasmidique pAdFRGAL préparé au stade A de la préparation 1 de l'exemple 1 est linéarisé par digestion par Kpn1 puis une digestion partielle par EcoRV est réalisoe. La bande de 3804 pb est purifise par gel d'électrophorèse et geneclean. On obtient un fragment F15. On soumet le vecteur Adenoquest, pQBI-AdBN Quantum- Biotechnologies (France) à une digestion par EcoRV et Kpn1. On obtient un fragment F16. On procède à la ligation des fragments F15 et F16 pendant 3 heures à 20 C, puis pendant 16 heures à 4 C en présence de T4DNA ligase. On transforme alors des bactéries DH5a avec le produit de ligation. On obtient des particules virales Quantum0GAL que l'on teste dans les expérimentations 2,3, et 4. Préparation B: Cultures cellulaires: Des cellules de cristallin de lapins, sont cultivées dans du milieu Hamster formula 12 (HAM/F12) supplémenté de 20 % de SVF (Life technologies, Inc. Cergy Pontoise, France) et 10 mg/ml de glutamine, 50,ug/ml de gentamycine et 25,ug/ml d'amphotéricine (Sigma Chemical, Saint Quentin Fallavier, France). Les cellules issues de blopsies sont passoes au 1/3 et ne sont gardées en culture qu'au maximum deux mois (10 passages). Différentes lignces cellulaires dont des cellules d'épithéllum pigmentaire humain, des fibroblastes humains de différentes origines et des cellules tumorales humaines ont été cultivées dans ces mêmes milieux de culture. Les cellules épithéliales cristalliniennes préparces ci- dessus et les cellules des différentes lignces sont ensemencées à la densité de cellules tbo'^te de 6 cm de diamètre la veille de l'infection. Les cellules sont alors infectées avec 108 particules virales (100,ul), soit de virus contrôle pRSVGALIX, soit de vecteur viral Quantum3GAL obtenu selon le mode de préparation présenté ci-dessus, dans 2 ml de milieu de culture sans SVF. L'adénovirus contrôle des infections virales est le vecteur pRSVGALIX (Legal Lasalle, Sciences, 1993, 12(259): 988-990) car il permet une expression de la galactosidase de façon constitutive quelle que soit l'origine de la cellule infectée. En effet, I'ADNc codant la galactosidase est sous le contrôle transcriptionnel du promoteur du virus de sarcome de Roux (RSV). Les cellules sont incubées pendant 1 heure sous agitation à 37 C, puis 3 ml de milieu 10 % SVF sont rejoutés. 48 heures après, les cellules sont testées pour l'activité galactosidase. Les cellules sont lavéss 2 fois avec du PBS puis fixées pendant mn avec une solution 1 % formaldéhyde, 0,1 % glutaraldéhyde dans du PBS. Après deux lavages au PBS elles sont colorées avec une solution de Xgal (5 bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside)(Sigma Chemical, Saint Quentin Fallavier, France). En utilisant un microscope à contraste de phase, on compte le pourcentage de cellules qui expriment la galactosidese par rapport au nombre total de cellules. Résultats: % des cellules cristalliniennes infectées expriment la galactosidese après avoir été infectées avec le virus pRSVGALIX contrôle. 100 % des cellules cristalliniennes expriment la galactosidase après infection par le vecteur Quantum0GAL. Aucune cellule autre que les cellules cristalliniennes n'exprime la betagalactosidese après infection par Quantuml3gal. La construction Quantum0GAL est donc spécifique des cellules cristalliniennes. Expérimentation 3: Spécificité pour les cellules cristalliniennes après infection de cellules humaines in vitro On a déposé des cornées humaines issues d'organoculture et des capsules obtenues à partir de capsulorhexis humains dans des bo^'tes de culture contenant 500,ul de milieu HAM/F12 20 % SVF. Les suspensions virales, soit de virus contrôle RSV0gal, soit de vecteur viral Quantum0GAL (100,ul) ont été déposées selon le cas dans la concavité des cornées et à la surface des capsules pendant 4 heures. Les cornées et les capsules sont alors replacées dans leurs récipients d'origine et immergées dans le milieu de culture HAMF12 20 % SVF. Ces prélèvements sont testés pour l'expression de la galactosidese 48 heures après et selon la méthodologie décrite précédemment. % des cellules cristalliniennes ou de cornse infectées expriment la galactosidese après avoir été infectées avec le virus pRSVGALIX contrôle. Les cellules de cornée (organoculture) n'expriment pas la Bgalactosidese après avoir été infectées par Quantum0GAL. 100 % des cellules cristalliniennes (cellules de capsulorhexis) expriment la [3galactosidase après infection par le vecteur QuantumGAL. Expérimentation 4: Spécificité pour les cellules cristaLliniennes après infection de cellules de lapins in vivo A la fin de la phacoémuisification et après suture de l'incision cornéenne, une injection intra oculaire d'une suspension virale pRSVGALIX ou QuantumGAL est réalisée à travers l'incision. Deux jours après la chirurgie, les globes oculaires sont disséqués à l'aide d'un microscope opératoire et colorés avec X-GAL pour détecter l'activité galactosidase. des ceNuIes chstaRlnlennes ou de cornice inductees exphment la pgalosidase aprds avow ate lies svec le virus pRSVALlX country. Les capsules de cornde n'expdment pas la pgalaosidase apes avolr eta incomes par OuantumpOAL. 100 des cellules cristalliniennes exprlment pgsossse apes Ceylon par voyeur OuanmpOAL. La neumdre expdme pas 6galactosase. REVENDICATIONS 1. Une molécule d'acides nuclélques (gène, ADNc ou ARN) comprenant une séquence codant un inducteur de mort des cellules cristalliniennes, sous un contrôle transcriptionnel spécifique des cellules du cristallin. 2. Une molécule d'acides nacléiques selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle code un inducteur de mort des cellules cristalliniennes choisi parmi les protéines induisant la mort cellulaire et les protéines impliquées dans l'induction de cette mort cellulaire. 3. Une molécule d'acides nuclélques selon la revendication 1 caractérisée en ce que la séquence de ladite molécule codant un inducteur de mort des cellules cristalliniennes est une séquence codant un inducteur d'apoptose, ou codant un composé impliqué dans le processus d'apoptose. 4. Une molécule d'acides nuclélques selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que la molécule d'acides nuclélques codant un inducteur de mort des cellules cristalliniennes est choisie parmi les séquences codant p53, BAX, FLICE (appelé encore caspase 8) TRAIL et TRAIL-R. 5. Une molécule d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que le contrôle transcriptionnel spécifique des cellules du cristallin est effectué à l'aide d'un promoteur d'un gène codant une protéine ou un élément blochimique spécifique du cristallin. 6. Une molécuie d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que le contrôle transcriptionnel spécifique des cellules du cristallin est effectué par le promoteur de l'ocA cristalline, le promoteur de la Dcristalline, le promoteur de MIP (MP26), ie promoteur de LEP503 ou le promoteur d'un élément biochimique spécifique des cellules épithéliales du cristallin. 7. Un vecteur comprenant une molécule d'acides nucléiques telle que définie à l'une des revendications 1 à 6. 8. Un vecteur selon la revendication 7 caractérisé en ce que le vecteur est du genre adénovirus. 9. Un vecteur selon l'une des revendications 7 et 8 caractérisé en ce que le vecteur est délété de ses parties inflammatoires s'il en possède, ou de toute partie pouvant induire des effets secondaires non désirés. 10. Procédé de préparation d'une molécule d'acides nucléiques telle que définie à l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on réalise une construction plasmidique d'ADN comportant une séquence codant un inducteur de mort des cellules cristalliniennes sous un contrôle transcriptionnel spécifique des cellules du cristallin pour obtenir la molécule d'acides nuclélques attendue que l'on isole. 11. Procédé de préparation d'un vecteur tel que défini à l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que une molécule d'acides nuclélques telle que définie à l'une des revendications 1 à 6 est insérce dans un vecteur tel un adénovirus pour obtenir le vecteur attendu que l'on isole. 12. Une molécule d'acides nuclélques telle que définie à l'une des revendications 1 à 6 ou un vecteur tel que défini à l'une des revendications 7 à 9, pour son utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique du corps humain ou animal. 13. Une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle renferme à titre de principe actif l'un au moins des composés (molécule d'acides nucléiques ou vecteur) tels que définis à l'une des revendications 1 à 9, ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable. 14. Une composition pharmaceutique selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'on utilise une molécule d'acides nuclélques ou vecteur, tels que définis à l'une des revendications 1 à 9, associé à un dispositif de