Brevet FR2831821A1 — publié le 20030509

MARQUEUR BIOLOGIQUE DES ETATS DE STRESS, PROCEDE D'EVALUATION QUANTITATIVE DE PRESENCE DE CE MARQUEUR, ET SON UTILISATION POUR LA PREVENTION DU STRESS L'invention concerne un marqueur biologique (ou bio-marqueur) révélateur des états de stress, un procédé d'évaluation quantitative de la présence de ce marqueur biologique des états de stress, ainsi que l'utilisation d'un tel marqueur préparé sous une forme conditionnée pour prévenir les états de stress. La notion d'états de stress couvre l'ensemble des réactions métaboliques et/ou comportementales, provoquées dans l'organisme dans son entier par de nombreux facteurs d'agression exogènes, tels que : maladies inflammatoires, interventions chirurgicales, chocs traumatiques, rayonnements solaires, électromagnétiques ou ionisants, tabagisme, pollution, allergies, efforts prolongés, émotions, froid, etc. Le type de perturbation engendrée dans l'organisme, permet de distinguer différents types ou états de stress : d'ordre chimique, microbiologique, biochimique, physiologique, psychique, biophysique, ou pharmacologique. Il est bien établi que, sous l'effet de certains des facteurs cités, l'organisme produit des agents oxydants générant un stress dit oxydatif. Ces agents se présentent sous la forme d'espèces réactives de l'oxygène (ROS, initiales de reactive oxygen species en dénomination anglaise). Par exemple, en cas d'effort prolongé, la demande en oxygène, et par conséquent sa consommation, augmente ce qui induit à la fois un état d'hypoxie et une surproduction d'agents ROS. La production des agents ROS est alors liée à des mécanismes biochimiques endogènes normaux. En particulier, dans la chaîne respiratoire, 2 à 4% de l'oxygène impliqué sont incomplètement réduits et donnent naissance à des agents ROS. Les agents ROS sont des radicaux libres, des atomes ou molécules instables et réactives, présentant habituellement un ou plusieurs électrons célibataires. Leur origine est à la fois exogène et endogène au niveau des mitochondries. Les principaux agents ROS sont : l'oxygène singulet (0-), l'anion superoxyde, le peroxyde d'hydrogène, le radical hydroxyle, le monoxyde d'azote, ou les hydroperoxy radicaux (produits lors de la peroxydation des lipides membranaires, principalement ceux constitués d'acides gras polyinsaturés). Sur le plan biochimique, le stress oxydatif conduit à : - la peroxydation lipidique, ciblée sur les membranes cellulaires et mitochondriales ; les acides gras poly-insaturés (PUFA) sont attaqués et libèrent de l'éthane (co-3 PUFA) et du pentane (cl-6 PUFA) ; - l'oxydation protéique des protéines mitochondriales, qui conduit à des dysfonctionnements de la chaîne respiratoire et à une baisse de la production énergétique des cellules ; ou - l'oxydation de l'ADN mitochondrial (ADNmt) qui conduit à des mutations entraînant également le dysfonctionnement des mitochondries. Or l'oxydation est le principal responsable du vieillissement cellulaire et des maladies dues à l'âge (cancers, troubles cardiovasculaires, baisse des fonctions immunitaires, dysfonctionnement cérébral comme la maladie d'Alzheimer, ou la cataracte). Ceci est corroboré par le fait que les antioxydants alimentaires (acide ascorbique, tocophérol et caroténoïdes des fruits et végétaux) participent à la prévention contre l'apparition de ces maladies dégénératives. L'éthane et le pentane constituent des bio-marqueurs connus des états de stress oxydatifs. Comme indiqué ci-dessus, le stress oxydatif provoque des désordres métaboliques dont la peroxydation lipidique qui induit la formation d'éthane et de pentane. Ces produits sont des substances volatiles qui sont ensuite éliminées dans l'air expiré. Le pentane semble plus significatif que l'éthane in vivo car les lipides de structure-6 PUFA sont prédominants au niveau membranaire, par rapport aux co-3 PUFA. La concentration mesurée en éthane/pentane dans l'air expiré est proportionnelle à l'état de stress oxydatif. Cependant, il est important de disposer d'un marqueur quantitatif des états de stress, en particulier du stress oxydatif. Le but de l'invention est donc de proposer un nouveau bio- marqueur des états de stress, qui soit hautement significatif et puisse permettre de mesurer quantitativement des niveaux de stress. Pour ce faire, il a été détecté, de manière surprenante, que l'air de fin d'expiration d'une personne, dit air alvéolaire, contient des composants fluorés lorsque cette personne a subi différents états de stress. Plus précisément, la présente invention a pour objet un produit de composés fluorés utilisé comme bio-marqueur des états de stress, en particulier de composés à base de chloroalcanes fluorés (appelés également CFC ou fréons). Plus particulièrement, ce produit est obtenu à partir d'un fluide biologique, c'est-à-dire d'une matière liquide ou gazeuse produite par le corps humain, par fractionnement et concentration sur des portions finales de prélèvements de ce fluide. Le fluide peut être par exemple l'air expulsé, le sang ou l'urine. Préférentiellement, le produit selon l'invention est contenu dans une fraction d'air alvéolaire obtenue par concentration d'air expulsé par le corps humain. Le bio-marqueur est à base de l'un au moins des composants choisis parmi le trichloro-trifluro-éthane, le tétrachloro-hexafluoro- butane et le trichloro-monofluoro-méthane. Etant le plus abondant, le trichlortrifluoro-éthane est choisi de préférence. L'invention a également pour objet un procédé d'évaluation quantitative de présence de ce marqueur, consistant à prélever et concentrer l'échantillon de matière, à analyser le produit concentré par désorption thermique, chromatographie en phase gazeuse couplée à une spectrométrie de masse afin d'identifier la présence de CFC, en particulier du C2CI3F3, puis par étalonnage du pic chromatographique de ce bio-marqueur. Une détermination quantitative d'un niveau de stress pour chaque état de stress peut alors être effectuée par étalonnage, en liaison directe avec l'évaluation quantitative de la présence du bio-marqueur selon l'invention. Le résultat de cette détermination peut servir de base intermédiaire à des fins ultérieures de diagnostic médical (inflammation, etc..). L'invention concerne également l'utilisation de composés fluorés limitant les pertes en fluor et donc en dérivés fluorés, préparés comme médicament ou apport alimentaire, pour servir d'agent de prévention du stress, selon une formule adaptée en principe actif. De tels composés fluorés peuvent être des fluorures de sodium (par exemple le monofluorophosphate), les CFC, les acides aminés fluorés et dérivés (par exemple le fluorure d'amine), etc. L'administration de ces composés peut se faire sous des formes de conditionnement variées : comprimé, composé ancillaire d'un dispositif médical, tel que patch ou pansement, ou bien encore comme additif d'une formule liquide dans un dispositif iono-phorétique pour l'administration percutanée. D'autres caractéristiques et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui suit, relative à des exemples de mise en oeuvre de l'invention pour différents états de stress en référence aux figures annexées, qui représentent respectivement : - la figure 1, deux chromatogrammes d'air alvéolaire prélevé sur une personne, respectivement, au repos et après 15 minutes de marche rapide ; - la figure 2, un chromatogramme d'air alvéolaire prélevé sur une personne, 5 minutes après un effort sportif intensif effectué pendant une heure ; - la figure 3, un chromatogramme d'air alvéolaire prélevé sur la même personne, 6 heures après cet effort sportif intensif ; - la figure 4, deux chromatogrammes d'air alvéolaire prélevé sur un fumeur occasionnel, respectivement, au repos et 5 minutes après avoir fumé ; et - la figure 5, deux chromatogrammes superposés d'air alvéolaire prélevé, respectivement, sur un fumeur occasionnel 5 minutes après qu'il a fumé, et sur un fumeur chronique au repos. Le dispositif de prélèvement d'air expiré utilisé pour effectuer les mesures exposées ci-après est du type décrit dans la demande de brevet publiée sous le numéro FR 2 800 465, déposée au nom de la demanderesse et incorporée par référence. Ce dispositif permet de prélever et de concentrer spécifiquement l'air de fin d'expiration, dit air alvéolaire, qui représente une fraction riche en bio-marqueurs présents dans l'air pulmonaire, avec une haute sensibilité et une haute reproductibilité du prélèvement. Des protocoles communs, concernant les conditions mise sous stress et de prélèvement d'air, ont été respectés dans les différents exemples ci-après exposés, afin de vérifier la reproductibilité des résultats. Les prélèvements se présentent sous forme de cartouche remplie de deux couches d'adsorbant. Les analyses des différents prélèvements sont réalisées par désorption thermique, suivie d'une chromatographie en phase gazeuse avec détection par spectrométrie de masse. La famille chimique des chloroalcanes fluorés, encore appelée CFC (initiales de Chloro-Fluoro-Carbones) ou fréons, ont ainsi été mesurés comme bio-marqueurs du stress dans l'air alvéolaire expiré. Dans les exemples qui suivent, le tri-chloro-trifluoro-éthane C20F3, est plus particulièrement mis en évidence. La structure chimique de ce bio-marqueur a été déterminée par la spectrométrie de masse couplée à la chromatographie gazeuse. Les exemples d'augmentation de la production et de l'élimination du bio-marqueur selon l'invention qui sont illustrés, sont provoqués par différents types de stress. En référence à la figure 1, un effort modéré est provoqué pour illustrer le stress physiologique. Les deux chromatogrammes représentés, C1 et C2, correspondent à l'analyse chromatographique de l'air alvéolaire prélevé sur une personne, respectivement, au repos (courbe Cl) et après 15 minutes de marche rapide (courbe partielle C2). L'intensité 1 de signal est représentée en fonction du temps t. Les unités sont arbitraires. Les deux chromatogrammes sont légèrement décalés pour améliorer la visibilité de la figure. Les pics P1 correspondent à la présence de CzOgFs, les pics P2 à la présence d'isoprène, et les pics P3 à celle de dichlorométhane. La différence d'intensité des pics P1 illustre bien la sensibilité du C2CI3F3 en tant que bio-marqueur du stress de type physiologique. Les figures 2 et 3 illustrent le cas d'un effort avec essoufflement intense de la personne, provoqué par la pratique du tennis pendant une heure, toujours pour illustrer le stress physiologique. Sur la figure 2, le chromatogramme C3 d'air alvéolaire est prélevé sur la personne, 5 minutes après l'effort sportif. L'amplitude élevée du pic P1 traduit le niveau de stress subi par l'organisme du fumeur. Les pics P4 à P12 correspondent, respectivement, au cyclohexane (P4), à l'hexane (P5), au chloroforme (P6), au méthylcyclohexane (P7), au triméthylhexane (P8), à l'heptane (P9), au tétrachloroéthylène (P10), au benzène (P11) et à l'éthyléther (P12). Sur la figure 3, soit 6 heures après l'effort sportif intensif, le pic P1 du chromatogramme C4 est sensiblement diminué, ce qui illustre encore la fonction de bio-marqueur de stress dédiée au trichlorotrifluoroéthane CsCtgFs. Les figures 4 et 5 illustrent également la sensibilité du C2CbF3 comme révélateur du stress de type chimique. Sur la figure 4, les deux chromatogrammes, C5 (reporté partiellement) et C6, représentent l'air alvéolaire prélevé sur un fumeur occasionnel, respectivement, au repos et 5 minutes après avoir fumé. Les pics P1 correspondent encore à la présence de C2CbF3, les pics P2 à la présence d'isoprène, et les pics P3 à celle de dichlorométhane. D'autres pics sont identifiés : le pic P6 correspond au chloroforme et le pic P12 à l'éthyléther. Sur la figure 5, les deux chromatogrammes, courbes C6 et C7 superposées, représentent l'air alvéolaire prélevé, respectivement, sur le fumeur occasionnel 5 minutes après avoir fumé comme sur la figure précédente, et, pour comparaison, sur un fumeur chronique au repos, n'ayant pas fumé au moins pendant l'heure qui a précédé le prélèvement. Sur cette figure, les pics P5 (hexane) et P6 (chloroforme) de l'heptane ont également été indiqués. La comparaison des pics P1 sur les deux chromogrammes montre bien que le bio-marqueur selon l'invention, le C2ChF3, est bien révélateur d'un état de stress passager et non d'un état chronique. Un étalonnage de la quantité de C2CI3F3 est effectué par rapport au dichlorométhane, présent dans l'air alvéolaire et qui varie peu, sous la forme du rapport F suivant, entre les intensités des signaux des pics de chromatographie : signal du pic chromatographique du biomarqueur signal du pic chromatographique du dichlorométhane Un tel étalonnage F est rapporté dans le tableau ci-après, pour différents exemples d'états de stress pris à partir d'un état de repos et en général 5 minutes après l'arrêt (sauf indication contraire) de diverses causes du stress, à savoir : le stress physiologique par la pratique de sports (violent et modéré), le stress biochimique dû au tabagisme, le stress psychique par la pratique intense d'un jeu vidéo rapide, et le stress biophysique par une exposition aux rayonnements électromagnétiques pulsés d'un écran d'ordinateur. Les mesures étalonnées F du bio-marqueur, prises au repos (Fo) et après soumission aux différents stress dans les conditions indiquées, sont résumées dans le tableau suivant : TYPE DE STRESS Fo CONDITION F DE SOUMISSION Physique modéré 0,37 20 minutes de vélo d'appartement 0,48 Physique modéré 0,13 15 minutes de marche à pied 3,14 rapide Physique violent 0,21 1 heure de tennis 7,87 6 heures après l'effort 0,59 biochimique 0,13 Consommation d'une cigarette 12,5 psychique 0,37 30 minutes de pratique intense 5,00 d'un jeu vidéo rapide biophysique 0,21 30 minutes d'exposition au 0,88 rayonnement électromagnétique d'un écran d'ordinateur 15 minutes après l'exposition 0,44 90 minutes après l'exposition 0,21 Ainsi, quel que soit le type de stress, il est possible de quantifier, à partir des valeurs obtenues, des niveaux de stress pour chaque type de stress. L'invention n'est pas limitée aux exemples décrits et représentés. Par exemple, le produit de composés fluorés peut être utilisé à des fins non seulement prophylactiques mais également curatives du stress selon un dosage déterminé. Par ailleurs, l'utilisation des composés fluorés pour servir d'agent de prévention peut être étendue aux composés fluorés endogènes et aux composés aptes à les mobiliser. REVENDICATIONS 1. Produit de composés à base de chloroalcanes fluorés utilisés comme bio-marqueur des états de stress. 2. Produit à base de chloroalcanes fluorés selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'un fluide biologique produit par le corps humain, par fractionnement et concentration sur des portions finales de prélèvements de cette matière. 3. Produit à base de chloroalcanes fluorés selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est contenu dans une fraction d'air alvéolaire obtenue par concentration d'air expulsé par le corps humain. 4. Produit selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est à base de l'un au moins des composants choisis parmi le trichloro-trifluro-éthane, le tétrachloro-hexafluoro- butane et le trichloro-monofluoro-méthane. 5. Procédé d'évaluation quantitative de la présence du produit selon l'une quelconque des revendications précédentes, en tant que biomarqueur des états de stress, consistant à prélever et concentrer l'échantillon de matière, à analyser le produit concentré par désorption thermique, chromatographie en phase gazeuse couplée à une spectrométrie de masse afin d'identifier la présence de CFC, puis à étalonner le pic chromatographique de ce bio-marqueur. 6. Procédé d'évaluation selon la revendication 5, dans lequel une détermination quantitative d'un niveau de stress pour chaque état de stress est ensuite effectuée par étalonnage. 7. Utilisation de composés à base de sels de fluor, d'acides aminés fluorés et fou de chloroalcanes fluorés dans la préparation de médicament ou d'apport alimentaire, en tant qu'agent de prévention du stress. 8. Conditionnement de composés fluorés en vue de l'utilisation selon la revendication précédente, choisi parmi une forme de comprimé, de composé ancillaire d'un dispositif médical, et d'additif d'une formule liquide dans un dispositif iono-phorétique pour une administration percutanée.