Brevet FR2830323A1 — publié le 20030404

Solution aqueuse éclaircissante de tissus La présente invention concerne une solution utilisée pour l'analyse de tissus biologiques et, en particulier, une solution aqueuse éclaircissante rendant des tissus biologiques transparents. Dans un certain nombre de sciences telles que la biologie cellulaire, la neurobiologie, la biologie moléculaire, la physiologie, l'immunologie, la biologie des signaux et la biologie du développement, pour examiner au microscope des structures biologiques ou non biologiques planes ou tridimensionnelles, il est nécessaire non seulement de disposer d'un microscope confocal permettant d'obtenir des images avec une haute résolution, mais également d'apporter un soin particulier à la préparation des échantillons, à l'enregistrement des images microscopiques et au traitement des images de manière à ce que les instruments optiques puissent être utilisés pour examiner certains échantillons, tissus ou cellules biologiques, capables d'émettre un rayonnement fluorescent. Lors de la préparation des échantillons, et en particulier lors du montage et de la fixation de ceux-ci, il est nécessaire de préserver l'intégrité des échantillons ayant une structure tridimensionnelle. D'une manière générale, la microscopie par transmission de lumière est communément utilisée dans à peu près n'importe quel laboratoire biologique pour l'examen de structures cellulaires. Des tissus biologiques sont habituellement colorés avec des colorants, avant que l'on puisse les examiner au microscope. Pour rendre visibles les structures internes colorées, les tissus sont souvent examinés sous forme de coupes minces. Pour augmenter la transparence des tissus, la plupart des échan- tillons colorés sont rendus transparents (éclaircis) par déshydratation et extraction de lipides. Par exemple, on utilise souvent le xylène pour éclaircir, c'est-à-dire rendre transparents, des coupes paraffiniques après déshydratation à l'alcool. Les structures internes colorées peuvent alors être visualisées avec une grande netteté. L'extraction par des solvants nécessite toutefois beaucoup de temps et entraîne souvent des déformations morphologiques qui doivent parfois être évitées. Par exemple des cryocoupes, ou coupes à congélation, c'est-à-dire des coupes obtenues à partir de tissus congelés, appropriées pour un diagnostic rapide, ne sont généralement pas bien fixées. Ces coupes tissulaires sont normalement immergées ou incluses directement dans des liquides de montage aqueux à base de glycérol, sans qu'une étape d'éclaircissement ait lieu, afin d'éviter la destruction de la morphologie fragile. Les images de microscopie obtenues souffrent alors d'un manque de clarté ou de transparence. Par ailleurs, pendant les étapes d'observation, de balayage et de reconstruction des images de tissus biologiques, l'épaisseur reconstruite ne dépasse pas 100 à 200 micromètres en raison de la transparence insuffisante des échantillons de tissus. Par conséquent, la présente invention propose une solution aqueuse "éclaircissante" permettant de rendre des tissus biologiques transparents sans les endommager et sans nécessiter une étape de déshydratation. Les figures lA à 1C montrent qu'un cerveau d'insecte ayant une épaisseur d'environ 500 m, qui est normalement opaque dans du sérum physiologique (Fig. 1A) et semi-opaque dans du sérum physiologique contenant 80 % de glycérol (Fig. 1B), est complètement transparent dans la solution éclaircissante de la présente invention (Fig. 1C). L'invention a pour but de proposer une solution aqueuse éclaircissante permettant de rendre transparentes des coupes de tissus biologiques sans les endommager et sans altérer leur morphologie. Elle a également pour but de proposer un procédé de traitement de tissus biologiques avec la solution éclaircissante de la présente invention permettant d'obtenir, par microscopie à lumière fluorescente et à lumière non fluorescente, des images avec une meilleure résolution. La présente invention a pour objet une solution aqueuse éclaircissante permettant de rendre des tissus biologiques transparents sans étape de déshydratation, comprenant, dans un milieu aqueux approprié, un ou plusieurs composés choisis parmi le diméthylsulfoxyde, l'acide diatrizoïque (acide diacétamido-3,5-triiodo-2,4,6-benzoïque), l'acide éthylènediaminotetraacétique, la glucamine, le P-nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate, le diatrizoate de sodium et des dérivés de polyoxyalkylènes (commercialisés sous la dénomination Tween 20 et utilisés en tant qu'agents émulsionnants et détergents). L'invention a encore pour objet un procédé d'augmentation de la transparence de tissus biologiques comprenant le traitement d'un échantillon de tissu biologique avec une telle solution éclaircissante de manière à obtenir un échantillon de tissu biologique clair et transparent. Enfin, l'invention a pour objet un procédé d'examen d'échantillons de tissus biologiques, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes suivantes : - traitement d'un tissu biologique avec une solution aqueuse éclaircissante décrite ci-dessus, et - examen au microscope de l'échantillon ainsi traité de manière à obtenir une image de la structure interne de l'échantillon. Les Figures 1 A à 1 C illustrent l'évaluation de la transparence de divers tissus. Des tissus cérébraux d'une épaisseur d'environ 500 m sont prélevés sur des cafards femelles adultes de l'espèce Diploptera punctata. Figure (A) : Le cerveau est opaque lorsqu'il est incubé dans du sérum physiologique. Figure (B) : Le cerveau est semi-transparent dans du sérum physiologique contenant 80 % de glycérol. Figure (C) : Le cerveau devient complètement transparent dans la solution aqueuse éclaircissante de la présente invention. Les Figures 2A et 2B montrent l'effet d'une bonne transparence des tissus sur les images obtenues par microscopie confocale. On fait au microscope confocal une série d'images de glomérules d'antennes de cafards D. punctata distantes les unes des autres de 50 m dans la direction Z. Figure (A) : Les glomérules internes ne sont plus visibles à une profondeur de 100 m en dessus de la surface du tissu lorsque celui-ci baigne dans du sérum physiologique contenant 80 % de glycérol. Figure (B) : L'image des glomérules reste limpide même à une profondeur de 200 m lorsque ceux-ci sont dans la solution aqueuse éclaircissante de la présente invention. La Figure 3 montre une carte tri-dimensionnelle de neuropiles de cerveaux de cafards Diploptera punctata adultes femelles. La Figure 4 montre une image de microscopie de corps pédonculés d'un cerveau de criquet observé par microscopie à transmission de lumière. La Figure 5 montre des images haute résolution obtenues par microscopie confocale de fibroblastes humains baignant dans la solution aqueuse éclaircissante de a présente invention. La Figure 6 montre une reconstruction, en trois dimensions, d'un grain de pollen ayant un diamètre d'environ 100 m. La distance de chaque structure par rapport à la surface est indiquée par un gradient de couleur. La présente invention concerne une solution aqueuse éclaircissante permettant de rendre des tissus biologiques transparents. La solution aqueuse éclaircissante de la présente invention comprend, dans un milieu aqueux approprié, un ou plusieurs composés choisis parmi le diméthylsulfoxyde, l'acide diatrizoïque, l'acide éthylènediaminotetraacétique, la glucamine, le phosphate dinucléotide adénine ss-nicotainamide, le diatrizoate de sodium et des dérivés de polyoxyalkylènes, commercialisés sous la dénomination commerciale Tween 20 et utilisés en tant qu'agents émulsionnants et détergents. Le pH de la solution ci-dessus est tamponné à une valeur comprise entre 5 et 10. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la solution aqueuse éclaircissante comprend un excès de diatrizoate de sodium et d'acide diatrizoïque. Un autre mode de réalisation concerne une solution aqueuse éclaircissante comprenant un excès de diméthylsulfoxyde. Les tissus biologiques englobent des structures biologiques telles que des cellules animales ou végétales, des organismes biologiques et des composés et éléments biologiques. On peut obtenir la transparence des échantillons en incubant directement les tissus, préalablement fixés ou non fixé, dans la solution aqueuse éclaircissante de la présente invention. La transparence des tissus biologiques s'améliore au bout d'un certain temps d'incubation. Lorsqu'une structure interne particulière est marquée par immunofluorescence ou avec un colorant classique, le fait que rendre transparent le milieu au-dessus et en dessous de l'élément marqué améliore la qualité des images obtenues et augmente la sensibilité de détection. Ainsi, la transparence obtenue grâce à la solution aqueuse éclaircissante de la présente invention permet d'améliorer la qualité de l'observation et de la détection de structures cellulaires fluorescentes ou non-fluorescentes par des méthodes de détection optiques telles que la microscopie confocale, la microscopie de fluorescence, la microscopie classique par transmission de lumière, la microscopie pour dissection, l'examen à l'oeil nu, la cytométrie à flux, la spectrophotométrie, la détection de fluorescence sur plaque et la détection de fluorescence sur plaquette etc. La transparence que l'on obtient grâce à la solution éclaircissante de la présente invention améliore la qualité de l'observation et la sensibilité de détection de structures cellulaires fluorescentes et non-fluorescentes. La microscopie confocale permet d'éliminer, dans un échantillon épais fluorescent, le bruit de fluorescence dû à la fluorescence du milieu en dehors du plan focal, et permet d'enregistrer les coordonnées X, Y et Z d'objets qui peuvent ensuite être reconstruits et analysés en trois dimensions. L'opacité de tissus biologiques ayant une épaisseur supérieure à 100 m, c'est-à-dire comportant environ 5 à 10 couches de cellules, empêche normalement une excitation efficace et un signal suffisam- ment fort pour une détection de fluorescence. D'autre part, des méthodes classiques impliquant une série de déshydrations à l'alcool et un éclaircissement par du salicylate de méthyle s'accompagnent souvent de la diffusion des fluorochromes de marquage. L'éclaircissement et l'immersion des tissus marqués avec des colorants fluorescents dans la solution éclaircissante permettent de surmonter complètement ces problèmes. Par exemple, les glomérules d'un lobe d'antenne d'un insecte, immergés dans du sérum physiologique contenant 80 % de glycérol ne peuvent être observés par microscopie confocale que jusqu'à une profondeur maximale de 100 m (Fig. 2A). Par contre, lorsque l'échantillon est rendu limpide par immersion dans la solution aqueuse éclaircissante de la présente invention, les structures internes situées à une profondeur supérieure à 200 m sont toujours visibles (Fig. 2B). Par ailleurs, le céramide-NBD fluorescent, qui est une sonde fluorescente membranaire utilisée pour le marquage de n'importe quelle structure lipidique dans des tissus biologiques, se trouvera progressivement dissous dans le mélange sérum physiologique-glycérol. Ceci se traduit par le fait que des détails de structures fines marquées ne sont plus visibles. Au contraire, de tels détails restent clairement visibles lorsque le même tissu est immergé dans la solution aqueuse éclaircissante de la présente invention. La présente invention est illustrée plus en détail à l'aide des exemples suivants : Exemple 1 Microscopie de tissus épais marqués avec des sondes fluorescentes On utilise pour cet exemple un cerveau d'insecte ayant une épaisseur supérieure à 500 m, c'est-à-dire un cerveau d'un cafard de l'espèce Diploptera punctata. Les structures neuropilaires et les corps neuronaux du cerveau sont marqués avec la sonde lipophile membranaire NBD-C6-céramide et avec de l'iodure de propidium, une sonde d'ADN. Après fixation appropriée dans du para-formaldéhyde à 4 %, les noyaux à l'intérieur du cerveau sont digérés par une solution d'ARNase à 50 g/ml et on colore avec de l'iodure de propidium à 20 g/ml dans du tampon phosphate physiologique. Ensuite, après un bref rinçage dans du tampon phosphate physiologique, on colore les membranes avec 0,453 mM de NBD-C6-céramide dans du DMSO. Le cerveau est rendu transparent par immersion directe, pendant 1 heure, dans la solution éclaircissante de la présente invention. Pour éviter la compression des échantillons par la lamelle de recouvrement, on les place dans des anneaux d'espacement ayant une épaisseur d'environ 600 l et on les examine par microscopie confocale. Les structures fluorescentes peuvent alors être observées directement dans la totalité du cerveau au moyen d'un microscope de fluorescence usuel ou par microscopie confocale. La Figure 3 montre un cerveau de cafard en trois dimensions contenant l'ensemble des neuropiles internes reconstruits à partir d'images numériques de 168 coupes optiques confocales. Ceci n'aurait pas été possible si le tissu cérébral n'avait pas été suffisamment transparent pour permettre la pénétration de la lumière laser et la détection de la fluorescence. La solution aqueuse éclaircissante de la présente invention permet non seulement de rendre transparent des tissus entiers, mais peut également être utilisée pour des coupes de tissus telles que des cryocoupes et des coupes obtenues à l'aide d'un vibratome. Exemple 2 Microscopie de tissus épais marqués avec des colorants non fluorescents On utilise pour cet exemple des cerveaux de criquets de l'espèce Acheta domesticus. On fixe les cerveaux pendant 2 heures sur de la glace dans du tampon phosphate physiologique contenant 4 % de formaldéhyde (360 mOsMparkg H20,pH 7,4). On les lave ensuite 3 fois avec du tampon phosphate physiologique refroidi par la glace, chaque lavage ayant une durée de 10 minutes. On rend les tissus perméables en les incubant pendant 16 heures à 4 C dans du tampon phosphate physiologique contenant 1 % de Triton X-100. Après lavage avec du tampon phosphate physiologique, on visualise l'activité NADPH-diaphorase insensible à la fixation en incubant les tissus pendant 2 heures à 27 C dans 100 l de Tris-HCl (50 mM, pH 7,4) contenant 1 % de Triton X-100, 1 mM de ss-NADPH et 0,5 mM de NBT. Du bleu de formazan précipite et indique ainsi les sites où la NADPH diaphorase a été active. On élimine la précipitation non spécifique en lavant abondamment les tissus pendant 72 heures dans du tampon TrisHCl contenant 1 % de Triton X-100. Après élimination des tissus environnants, on rend transparent les cerveaux entiers ayant une épaisseur supérieure à 600 m, en incubant directement pendant 1 heure dans la solution aqueuse éclaircissante de la présente invention. Afin d'éviter la compression par la lamelle de recouvrement, les échantillons sont placés dans des anneaux espaceurs montés dans la même solution aqueuse éclaircissante, on examine visuellement et on les photographie à travers un microscope de dissection ou à l'aide d'un microscope Zeiss Axiophot (Carl Zeiss, Jena, Allemagne) équipé d'un système optique Nomarski. La Figure 4 montre qu'une forte activité NADPH-diaphorase mise en évidence par précipitation de formazan se situe au niveau des corps pédonculés. Les corps pédonculés internes sont bien visibles car les cerveaux a été rendu transparent par incubation dans la solution éclaircissante de la présente invention. Cette méthode peut également être utilisée pour rendre visibles des structures dans des cryocoupes et des coupes tissulaires obtenues par à l'aide d'un vibratome. Exemple 3 Microscopie de cellules individualisées marquées avec des sondes fluorecentes ou non fluorescentes Des cellules indivudualisées fixées sur plaque peuvent être directement rendues transparentes et montées dans la solution aqueuse éclaircissante de la présente invention. La nature aqueuse de la solution éclaircissante permet de l'utiliser directement pour l'analyse de cellules individualisées marquées par immunofluorescence ou par d'autres composés fluorochromes. La Figure 5 montre qu'une bonne transparence améliore sensiblement la résolution et la sensibilité de détection en microscopie confocale. L'efficacité d'excitation et la sensibilité de détection de l'émission sont nettement augmentées grâce à la transparence améliorée. Par conséquent, on peut utiliser une ouverture plus faible pour éliminer le bruit de fluorescence en dehors du plan focal. Cette méthode peut également être utilisée pour visualiser des cellules individualisées marquées avec un colorant non fluorescent à l'aide d'un microscope usuel. Elle est également efficace pour des tissus présentant une certaine autofluorescence tels que des mutants de Drosophila exprimant des protéines à fluorescence verte ou des tissus végétaux. La Figure 6 montre une reconstruction en trois dimensions d'un grain de pollen autofluorescent ayant un diamètre d'environ 100 m. La morphologie de surface avec un code de profondeur est rendue grâce à un empilement de plans de confocalisation correspondant à des coupes optiques distantes de 5 m les unes des autres. Bien que la présente invention ait été décrite en référence à des modes de réalisation préférés, on comprendra que l'invention n'est pas limitée à des détails de ces modes de réalisation. Différentes substitutions et variations ont été suggérées dans la description et l'homme du métier pourra en imaginer d'autres. Par conséquent, toutes ces modifications et substitutions font partie de la présente invention. REVENDICATIONS 1. Solution aqueuse éclaircissante permettant d'augmenter la transparence de tissus biologiques, caractérisée par le fait qu'elle comprend, dans un milieu aqueux approprié, un ou plusieurs composés choisis parmi le diméthylsulfoxyde, l'acide diatrizoïque, l'acide éthylènediaminotetraacétique, la glucamine, le p-nicotinamide-adénine-dinucléotide- phosphate, le diatrizoate de sodium et des dérivés de polyoxyalkylènes. 2. Solution aqueuse éclaircissante selon la revendication 1, caractérisée par le fait que lesdits tissus biologiques englobent des cellules animales et végétales. 3. Solution aqueuse éclaircissante selon la revendication 1, caractérisée par le fait que lesdits tissus biologiques englobent des organismes biologiques. 4. Solution aqueuse éclaircissante selon la revendication 1, caractérisée par le fait que les tissus biologiques englobent des composés et éléments biologiques. 5. Solution aqueuse éclaircissante selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle est tamponnée à un pH compris entre 5 et 10. 6. Solution aqueuse éclaircissante selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle comprend en outre un excès de diatrizoate de sodium et d'acide diatrizoïque. 7. Solution aqueuse éclaircissante selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle comprend en outre un excès de diméthylsulfoxyde. 8. Procédé d'augmentation de la transparence de tissus biologiques caractérisé par le fait qu'il comprend le traitement d'un échantillon de tissu biologique avec une solution éclaircissante selon l'une quelconque des revendications précédentes, de manière à obtenir un échantillon de tissu biologique clair et transparent. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'échantillon est examiné par microscopie confocale. 10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'échantillon est examiné à l'aide d'un microscope à transmission de lumière. 11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'échantillon est examiné à l'aide d'un cytomètre à flux. 12. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'échantillon est observé directement à l'oeil nu ou à l'aide d'un microscope pour dissection. 13. Procédé d'examen d'échantillons de tissus biologiques, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes suivantes : - traitement d'un tissu biologique avec une solution aqueuse éclaircissante selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, et - examen au microscope de l'échantillon ainsi traité de manière à obtenir une image de la structure interne de l'échantillon. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé par le fait que l'on examine l'échantillon par microscopie confocale. 15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé par le fait que l'on examine l'échantillon par microscopie à transmission de lumière.