Brevet FR2823221A1 — publié le 20021011

Cette invention concerne des méthodes et des compositions pour la détection et le traitement des maladies dégénératives de la rétine. En particu- lier, l'invention concerne une protéine qui protège de la dégénérescence des cônes rétiniens, des molécules d'acides nucléiques codant pour une telle protéine, des anticorps reconnaissant la protéine et des méthodes pour le diagnostic des maladies dégénératives de la rétine. Les photorécepteurs constituent une sous-série spécialisée de neurones de la rétine, responsables de la vision. Les photorécepteurs sont constitués par des bâtonnets et des cônes, qui sont les cellules photosensibles de la rétine. Chaque cône et chaque bâtonnet élabore un cil vibratile spécialisé, dit segment externe, qui contient la machinerie de la phototransduction. Les bâtonnets contiennent un pigment visuel spécifique absorbant la lumière, la rhodopsine. Il existe trois classes de cônes chez l'homme, caractérisés par l'expression de pigments visuels distincts : les pigments des cônes bleus, des cônes verts et des cônes rouges. Chaque type de protéine pigmentaire visuelle a son maximum d'absorption lumineuse à une longueur d'onde particulière. La rhodopsine des bâtonnets est le pigment de la vision photopique (en lumière faible), alors que les pigments des cônes sont responsables de la vision photopique (en lumière vive). Les pigments rouges, bleus et verts sont également à la base de la vision des couleurs chez l'homme. Les pigments visuels dans les bâtonnets et les cônes réagissent à la lumière et génèrent un potentiel d'action, dans les cellules de sortie, les neurones bipolaires des bâtonnets, qui sont ensuite relayés par les neurones des ganglions de la rétine pour produire un stimulus visuel dans le cortex visuel. Chez l'homme, plusieurs maladies de la rétine mettent en jeu une dégénérescence progressive et en fin de compte la mort des photorécepteurs, conduisant inexorablement à une cécité. La dégénérescence des photorécepteurs, comme dans les dystrophies rétiniennes congénitales (par exemple la rétinite pigmentaire), la dégénérescence maculaire sénile, et autres maculopathies, ou le décollement de la rétine se caractérisent toujours par une atrophie progressive et une perte de fonction des segments extérieurs des photorécepteurs. En outre, la mort des photorécepteurs ou la perte de la fonction des photorécepteurs aboutissent à une désafférentiation partielle des neurones rétiniens de second ordre (cellules horizontales et cellules bipolaires des bâtonnets) chez les patients atteints de dystrophies de la rétine, avec ainsi diminution de l'efficacité globale de la propagation du signal électrique généré par les photorécepteurs. Les modifications de l'épithélium pigmentaire et glial secondaire consécutives à la dégénérescence des photorécepteurs conduisent à des modifications vasculaires aboutissant à une ischémie et une gliose. Des facteurs trophiques capables de sauver les photorécepteurs d'une mort cellulaire et/ou de restaurer la fonction de photorécepteurs en dysfonctionnement (atrophiques ou dystrophiques) pourraient représenter des thérapies utiles pour le traitement de telles pathologies. Ces pathologies évoluent par perte successive des deux classes de photorécepteurs. Les bâtonnets disparaissent d'abord directement sous l'effet de lésions génétiques ou environnementales ou d'origine inconnue, avec en résultat une héméralopie et une réduction du champ visuel suivies inéluctablement de la perte des cônes aboutissant à la cécité totale. Les cônes disparaissent donc de façon indirecte, car ils n'expriment pas la lésion primaire. Aucun des gènes associés à la dystrophie de la rétine n'a encore été identifié. L'identification de tels gènes rendrait possible le diagnostic de la maladie et l'identification de thérapies efficaces. L'invention concerne sur un plan général un nouveau gène, le"Rod- derived Cone Survival Factor" (Rdcsft) ou facteur de survie des cônes dérivé des bâtonnets. Dans un premier aspect, l'invention fournit (t) un ADN isolé comprenant la séquence nucléotidique représentée dans SEQ ID ? : 1. Les acides nucléiques sensiblement similaires à l'acide nucléique ayant la séquence nucléotidique représentée dans SEQ ID NO : 1 entrent également dans le champ de la présente invention. Dans un mode de réalisation préféré, l'ADN isolé prend la forme d'une molécule vecteur comprenant l'ADN représenté dans SEQ ID NO : 1. Dans un second aspect, l'invention fournit un polypeptide isolé ayant la séquence d'aminoacides représentée dans SEQ ID NI : 2. Un tel peptide, ou des fragments de celui-ci, est présent dans les yeux de patients souffrant de dystrophies de la rétine à un taux très inférieur à son taux dans les yeux d'individus ne souffrant pas de dystrophie de la rétine. Les fragments du polypeptide isolé ayant la séquence d'aminoacides représentée dans SEQ ID NO : 2 comprendront les polypeptides comprenant environ de 5 à 10 amino- acides, de préférence d'environ 10 à environ 20 aminoacides, plus préférablement d'environ 20 à environ 100 aminoacides et le plus préférablement d'environ 20 à environ 50 aminoacides. Cet aspect de l'invention fournit un nouveau polypeptide provenant de mammifères, et en particulier provenant de souris, ainsi que des fragments utiles sur un plan biologique, diagnostique et thérapeutique, des variantes et des dérivés du polypeptide, des variantes et dérivés des fragments et des analogues des produits précédents. Un troisième aspect de la présente invention concerne une méthode pour le diagnostic de la dystrophie rétinienne chez l'homme, méthode incluant la détection d'une diminution, dans les yeux d'un homme, de la transcription de l'ARN messager transcrit à partir de l'ADN codant pour le Rdcsfl, une telle diminution de la transcription étant le diagnostic d'une dystrophie rétinienne chez cet homme ou un vieillissement pathologique (ARMD). Un autre mode de réalisation de l'aspect analytique de l'invention fournit une méthode pour le diagnostic de la dystrophie rétinienne chez l'homme nécessitant la mesure de la quantité d'un polypeptide Rdcsfl ou de ses fragments dans les yeux d'un homme suspect d'être atteint de dystrophie rétinienne, la présence d'une quantité de polypeptide ou de ses fragments en diminution par rapport à la quantité de polypeptide ou de ses fragments dans les yeux d'un individu ne souffrant pas de dystrophie rétinienne constituant un diagnostic de dystrophie rétinienne chez cet homme. Dans un mode de réalisation de cet aspect de l'invention, sont fournis des polynucléotides antisens qui régulent la transcription du gène Rdcsfl ; dans un autre mode de réalisation, un ARN double brin pouvant réguler la transcription du gène Rdcsfl est fourni. Un autre aspect de l'invention fournit un procédé pour la production des polypeptides, fragments de polypeptides, variantes et dérivés, fragments des variantes et dérivés et analogues des précédents. Dans un mode de réalisation préféré de cet aspect de l'invention sont fournies des méthodes de production des polypeptides Rdcsfl de souris susmentionnés comprenant la culture de cellules hôtes dans lesquelles a été incorporé un vecteur d'expression contenant un polynucléotide exogène codant pour Rdcsfl, dans des conditions suffisantes pour l'expression de polypeptides Rdcsfl chez l'hôte et ensuite la récupération du polypeptide exprimé. Selon un autre aspect de l'invention, sont fournis des produits, des compositions, des procédés et des méthodes utilisant les polypeptides et les polynucléotides susmentionnés pour, notamment, des objectifs de recherche, et des objectifs biologiques, cliniques et thérapeutiques. Certains autres modes de réalisation préférés de cet aspect de l'invention concernent un anticorps ou un fragment d'anticorps se liant spécifiquement à un polypeptide comprenant la séquence d'aminoacides représentée dans SEQ ID NO : 2, c'est à dire Rdcsfl. Dans certains modes de réalisation particulièrement préférés à cet égard, les anticorps sont très sélectifs pour les polypeptides Rdcsfl ou des portions de polypeptides Rdcsfl de mammifères et en particulier de souris. Un autre aspect concerne un anticorps ou un fragment d'anticorps se liant à un fragment ou à une portion de la séquence d'aminoacides représentée dans SEQ ID NO : 2. Un autre aspect est relatif à des méthodes de traitement chez un sujet d'une maladie médiée par, ou associée à, une modification de l'expression du gène Rdcsfl, par exemple une diminution de la présence du polypeptide Rdcsfl dans les yeux, par l'administration au sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une protéine Rdcsfl telle que représentée dans SEQ ID NO : 2 ou d'un fragment ou d'une portion de cette protéine. Des méthodes pour le diagnostic d'une maladie ou d'un état associé à une diminution de l'expression du gène Rdcsfl ou une diminution de la présence du polypeptide Rdcsfl chez un sujet, comprenant l'utilisation d'un anticorps se liant à un polypeptide ayant la séquence des aminoacides représentée dans SEQ ID NO : 2 ou à un fragment ou à une portion de celui-ci, dans un dosage immunologique font également partie de l'invention. Selon encore un autre aspect, l'invention concerne des cellules que l'on peut propager in vitro, de préférence des cellules de vertébrés, capables de produire en culture un polypeptide comprenant la séquence d'aminoacides représentée dans SEQ ID ? : 2 ou des fragments de celle-ci, ces cellules contenant des séquences d'ADN contrôlant la transcription, différentes des séquences de contrôle de la transcription de Rdcsfl de la souris, les séquences de contrôle de la transcription contrôlant la transcription de l'ADN codant pour un polypeptide ayant la séquence d'aminoacides selon SEQ ID ? : 2 ou des fragments de celui-ci. Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet une méthode pour la production de polypeptides Rdcsfl comprenant la culture d'une cellule hôte dans laquelle est incorporée un vecteur d'expression contenant un polynucléotide exogène codant pour Rdcsfl, dans des conditions suffisantes pour l'expression de polypeptides Rdcsfl dans la cellule hôte avec ainsi production du polypeptide exprimé, et la récupération du polypeptide exprimé. Selon encore un autre aspect, la présente invention concerne des méthodes et des kits d'analyse comprenant les composants nécessaires pour détecter une expression anormale, par exemple sub-normale, des polynucléotides ou des polypeptides Rdcsfl ou leurs fragments dans des échantillons de tissus corporels prélevés chez un patient, de tels kits comprenant par exemple des anticorps se liant à Rdcsfl ou des sondes oligonucléotides qui s'hybrident avec les polynucléotides de l'invention. Dans un mode de réalisation préféré, de tels kits contiennent également des instructions détaillant les procédures d'utilisation des composants du kit. Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide Rdcsfl ou d'un de ses fragments, du nucléotide codant pour Rdcsfl ou un de ses fragments, ou d'un anticorps se fixant à Rdcsfl ou à un de ses fragments dans la fabrication d'un médicament pour le traitement d'une dystrophie rétinienne. Un autre aspect concerne des compositions pharmaceutiques comprenant un polypeptide Rdcsfl ou un de ses fragments, un nucléotide codant pour Rdcsfl ou un de ses fragments, pour le traitement de la dystrophie rétinienne. Selon un autre aspect, l'invention concerne des méthodes pour l'identification de molécules pouvant se lier à Rdcsfl et/ou moduler l'activité de Rdcsfl ou de molécules pouvant se lier à des séquences d'acides nucléiques qui modulent la transcription ou la traduction de Rdcsfl. De telles méthodes sont décrites dans, par exemple, les brevets US no 5 541 070,5 567 317,5 593 853, 5 670 326, 5 679 582, 5 856 083, 5 858 657, 5 866 341, 5 876 946, 5 989 814, 6 010 861, 6 020 141, 6 030 779 et 6 043 024, Les molécules identifiées par de telles méthodes entrent également dans le champ de la présente invention. Selon encore un autre de ses aspects, l'invention concerne des méthodes pour l'introduction d'acides nucléiques de l'invention dans un ou plusieurs tissus d'un sujet nécessitant un traitement ayant pour résultat le fait qu'une ou plusieurs protéines codées par les acides nucléiques sont exprimées et/ou sécrétées par les cellules du tissu. Selon un autre de ses aspects, l'invention fournit une méthode donnant des cellules de photorécepteurs destinées à être implantées, dans laquelle les cellules de photorécepteurs sont cultivées avec Rdcsf1. D'autres objets, caractéristiques, avantages, aspects de la présente invention apparaîtront à l'homme de l'art au vu de la description suivante. Il faut comprendre, cependant, que la description et les exemples spécifiques qui suivent, tout en indiquant les modes de réalisation préférés de l'invention, ne sont présentés qu'à titre d'illustration. L'homme de l'art observera facilement que l'on peut imaginer diverses modifications et variantes entrant dans le champ d'application de l'invention décrite, à la lecture de la description qui suit et à la lecture des autres parties de la présente description. - La figure 1 est une représentation de l'ADNc codant pour le Rdcsfl de la souris (SEQ ID M" : 1). - La figure 2 est une représentation de la séquence des aminoacides codée par SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 2). - La figure 3 est une représentation des amorces pour GST-Rdcsfl. Pour la mise en pratique de la présente invention, on utilise de nombreuses techniques classiques en biologie moléculaire, en microbiologie et en génie génétique. Ces techniques sont bien connues et sont expliquées, par exemple, dans Current Protocols in Molecular Biology, Volumes 1, Il et ttt, 1997 (F. M. Ausubel, éd. ) ; Sambrook et coti., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 21"édition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ; DNA Cloning : A Practical Approach, Volumes 1 et Il, 1985 (D. N. Glover, éd. ) ; Oligonucleotid Synthesis, 1984 (M. L. Gait, éd.) ; Nucleic Acid Hybridization, 1985 (Hames et Higgins) ; Transcription and Translation, 1984 (Hames et Higgins, éd.) ; Animal Cell Culture, 1986 (R. i. Freshney, éd.) ; Immobilized Ce Ils and Enzymes, 1986 (IRL Press) ; Perbal, 1984, A Pratical Guide to Molecular Cloning ; la série, Methods in Enzymology (Academic Press, Ine.) ; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller et M. P. Calos, éds., Cold Spring Harbor Laboratory) ; et Methods in Enzymology Vol. 154 et Col. 155 (Wu et Grossmann, et Wu, éd. respectivement). Telle qu'elle est utilisée ici, l'expression"gène exprimé différentiellement"désigne (a) un gène contenant au moins une des séquences d'ADN décrites ici (par exemple celle présentée dans la figure 1, SEQ ID ? : 1) ; (b) toute séquence d'ADN codant pour la séquence des aminoacides codée par les séquences d'ADN décrites ici (par exemple celle représentée dans la figure 2, SEQ ID NO : 2) ; ou (c) toute séquence d'ADN sensiblement similaire aux séquences de codage décrites ici. Dans son sens le plus large, l'expression"sensiblement similaire", quand elle est utilisée ici en référence à une séquence nucléotidique, désigne une séquence de nucléotides correspondant à une séquence de nucléotides de référence, la séquence correspondante codant pour un polypeptide ayant sensiblement la même structure et la même fonction que le polypeptide codé par la séquence nucléotidique de référence, par exemple ce polypeptide ne présentant de modifications qu'au niveau d'aminoacides n'ayant pas d'influence sur sa fonction. Il est souhaitable que la séquence nucléotidique sensiblement similaire code pour le polypeptide codé par la séquence nucléotidique de référence. Il est souhaitable que le pourcentage d'identité entre la séquence nucléotidique sensiblement similaire et la séquence nucléotidique de référence soit d'au moins 90 %, plus préférablement d'au moins 95 %, encore plus préférablement d'au moins 99 %. Les comparaisons de séquences sont réalisées en utilisant l'algorithme d'alignement des séquences de SmithWaterman (se reporter par exemple à Waterman, M. S. Introduction to Computational Biology : Maps, sequences and genomes. Chapman a Hall. Londres : 1995. ISBN 0412-993910 ou à http ://www-hto. usc. edu/ software/seqain/index. htmt). Le programme locals version 1. 16 est utilisé avec les paramètres suivants :"match" : 1,"mismatch penalty" : 0, 33, "open-gap penalty" : 2,"extended-gap penalty" : 2. Une séquence nucleotidique"sensiblement similaire"à la séquence nucléotidique de référence s'hybride avec la séquence nucléotidique de référence dans dodécylsulfate de sodium (SDS) à 7 %, NaPO4 0, 5M, EDTA 1 mM à 50 C avec lavage dans 2 x SSC, SDS à 0, 1 % à SO'C, de façon plus souhaitable dans dodécylsulfate de sodium (SDS) à 7 %, NaP04 0, 5M, EDTA 1 mM à 50 C avec lavage dans 1 x SSC, SDS à 0, 1 % à 50 C, de façon encore plus désirable dans dodécylsulfate de sodium (SDS) à 7 %, NaPO4 0, SM, EDTA A 1 mM à 50 C avec lavage dans 0, 5 x SSC, SDS à 0, 1 % à 50 C, de préférence dans dodécylsulfate de sodium (SDS) à 7 %, NAPS4 0, 5M, EDTA 1mM à 50 C avec lavage dans 0, 1 x SSC, SDS à 0, 1 % à 50 C, plus préférablement dans dodécylsulfate de sodium (SDS) à 7 %, NaPO4 O, SM, EDTA lmM à 50 C avec lavage dans 0, lx SSC, SDS à 0, 1 % à 6SoC, et code encore pour un produit de gène fonctionnellement équivalent. Les gènes exprimés différentiellement décrits ici sont exprimés dans des tissus oculaires et en particulier sont produits par les cellules de bâtonnets, mais chez un homme souffrant d'une dystrophie rétinienne telle qu'une rétinite pigmentaire, une dégénérescence maculaire sénile, un syndrome de BardetBiedel, un syndrome de Bassen-Kornzweig, une maladie de Best, un choroïdérémie, une atrophie gyrée, une amourose congénitale, un syndrome de Refsum, une maladie de Stargardt et un syndrome d'Usher, ils sont produits en quantités inférieures à celles produites dans les tissus correspondants d'un homme ne souffrant pas de dystrophie rétinienne. L'ARN messager transcrit à partir des gènes exprimé différentiellement et la protéine traduite à partir d'un tel ARNm, sont présents dans les tissus des bâtonnets et/ou associés à de tels tissus en une quantité d'au moins environ deux fois moins, de préférence d'au moins environ cinq fois moins, plus préférablement d'au moins environ dix fois moins, le plus préférablement d'au moins environ 100 fois moins que dans les tissus correspondants chez l'homme ne souffrant pas de dystrophie rétinienne. Une telle diminution de la transcription de l'ARNm de Rdcsfl est dite ici "transcription diminuée". L'expression"cellule hôte", telle qu'elle est utilisée ici, se rapporte à une cellule procaryote ou eucaryote contenant un ADN hétérologue ayant été introduit dans la cellule par un moyen quelconque, par exemple par électroporation, par précipitation de phosphate de calcium, par microinjection, par transformation, par infection virale et analogue. Le terme"hétérologue"tel qu'il est utilisé ici signifie"d'origine naturelle différente"ou représente un état non naturel. Par exemple, si une cellule hôte est transformée par un ADN ou un gène provenant d'un autre organisme, en particulier d'une autre espèce, ce gène est hétérologue par rapport à cette cellule hôte et également par rapport aux descendants de la cellule hôte qui portent ce gène. De même, hétérologue se rapporte à une séquence nucléotidique provenant du même type de cellule originale, naturelle, ou introduite dans ce même type, mais présente à l'état non naturel, par exemple avec un numéro de copie différent ou contrôlée par des éléments régulateurs différents. Une molécule vecteur est une molécule d'acide nucléique dans laquelle on peut insérer l'acide nucléique hétérologue que l'on introduira ensuite dans une cellule hôte appropriée. Les vecteurs ont de préférence une ou plusieurs origines de réplication et un ou plusieurs sites dans lesquels on peut insérer l'ADN recombiné. Les vecteurs contiennent souvent des moyens commodes de tri permettant de distinguer les cellules avec vecteurs de celles sans vecteurs ; par exemple ils codent pour des gènes de résistance à des médicaments. Les vecteurs courants sont notamment les plasmides, les génomes de virus et (surtout dans les levures et bactéries) les"chromosomes artificiels". Les"plasmides"sont désignés ici en général par un p minuscule précédé et/ou suivi par des lettres en majuscule et/ou des nombres, conformément aux conventions de dénomination standards, bien connues de l'homme de l'art. Les plasmides de départ décrits ici sont commerciaux, disponibles au public sans restriction, ou peuvent être construits à partir de plasmides disponibles par application en routine de procédures publiées, bien connues. Beaucoup de plasmides et autres vecteurs de clonage et d'expression que l'on peut utiliser conformément à la présente invention sont bien connus et l'homme de l'art peut se les procurer facilement. Par ailleurs, l'homme de l'art peut construire facilementautant de plasmides utiles dans l'invention qu'il le souhaite. Les propriétés, construction et utilisation de tels plasmides, ainsi que d'autres vecteurs, dans la présente invention apparaîtront de façon manifeste à l'homme de l'art au vu de la présente description. Le terme"isolé"signifie que la matière a été retirée de son environnement d'origine (par exemple l'environnement naturel s'il s'agit d'une matière naturelle). Par exemple, un polynucléotide ou un polypeptide naturellement présent chez un animal vivant n'est pas isolé, mais le même polynucléotide ou polypeptide, séparé de certaines matières avec lesquelles il coexiste, ou de toutes ces matières, dans le système naturel, est isolé, même si ensuite il est réintroduit dans le système naturel. De tels polynucléotides peuvent faire partie d'un vecteur et/ou de tels polynucléotides ou polypeptides peuvent faire partie d'une composition et encore être isolés en ce sens qu'un tel vecteur ou composition ne font pas partie de leur environnement naturel. Telle qu'elle est utilisée ici l'expression"séquence de contrôle de la transcription"se rapporte à des séquences d'ADN telles que les séquences d'initiateurs, les séquences d'amplificateurs, et les séquences de promoteurs, qui induisent, répriment ou contrôlent d'une autre façon la transcription des séquences d'acides nucléiques codant pour des protéines auxquelles elles ont été reliées de façon opérationnelle. Telle qu'elle est utilisée ici, l'expression"séquences de contrôle de la transcription de Rdssfl"désigne toutes les séquences de contrôle de la transcription que l'on trouve normalement associées à un gène Rdcsfl de mammifère et en particulier au gène Rdcsfl de la souris tel qu'il se trouve dans le génome de la souris. Telle qu'elle est utilisée ici, l'expression"séquence de contrôle de la transcription non humaine"désigne une séquence de contrôle de la transcription absente dans le génome humain. Les termes"polypeptide","polypeptides"et"protéine (s)" sont utilisés ici de façon interchangeable. Telle qu'elle est utilisée ici, l'expression"dérivé chimique"d'un polypeptide de l'invention désigne un polypeptide de l'invention contenant des fragments chimiques additionnels ne faisant normalement pas partie de la molécule. Ces fragments peuvent améliorer la solubilité de la molécule, son absorption, sa demi-vie biologique, etc. Ces fragments peuvent aussi diminuer la toxicité de la molécule, éliminer ou atténuer un effet secondaire indésirable, etc. Les fragments capables d'opérer de tels effets sont décrits, par exemple, dans l'ouvrage Pharmaceutical Sciences de Remington, 16eue édition, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980). L'invention inclut des molécules d'acides nucléiques, de préférence des molécules d'ADN, telles que (1) un ADN isolé comprenant une séquence nucléotidique telle que représentée dans SEQ ID ? : 1, (2) des ADN isolés comprenant des séquences d'acides nucléiques qui s'hybrident dans des conditions très rigoureuses avec un ADN isolé tel que représenté dans la SEQ ID ? : 1, et (3) des séquences d'acides nucléiques qui s'hybrident avec (1) ou (2) ci-dessus. De telles conditions d'hybridation peuvent être très rigoureuses ou moins rigoureuses, comme décrit ci-dessus. Dans les cas où les molécules d'acide nucléique sont des désoxyoligonucléotides ("oligo"), des conditions très rigoureuses peuvent être constituées, par exemple, par un lavage dans 6 x SSC/pyrophosphate de sodium à 0,05 % à 37 C (pour des oligos à 14 bases), à 48 C (pour des oligos à 17 bases), à 55 C (pour des oligos à 20 bases) et à 60 C (pour des oligos à 23 bases). Les plages appropriées de ces conditions rigoureuses pour des acides nucléiques de diverses compositions sont décrites dans Krause et Aaronson (1991) Methods in Enzymology, 200 : 546-556 en plus de Maniatis et coli., cité ci-dessus. Ces molécules d'acide nucléique peuvent agir en tant que molécules antisens du gène cible, utiles, par exemple, dans la régulation du gène cible et/ou en tant qu'amorces antisens dans les réactions d'amplification des séquences d'acides nucléiques du gène cible. En outre, on peut utiliser de telles séquences comme élément de séquences de triples hélices et/ou de ribozymes, également utiles pour la régulation du gène cible. En outre, encore, de telles molécules peuvent être utilisées comme composants de méthodes de diagnostic en permettant de détecter la présence d'un allèle de Rdcsfl à l'origine de la maladie. L'invention englobe également (a) des vecteurs contenant une quelconque des séquences de codage précédentes (c'est à dire sens) et/ou de leurs compléments (c'est à dire antisens) ; (b) les vecteurs d'expression contenant une quelconque des séquences de codage précédentes associées de façon opérationnelle avec un élément régulateur qui dirige l'expression des séquences de codage : et (c) des cellules d'hôtes modifiées génétiquement contenant une quelconque des séquences de codage précédentes associées de façon opérationnelle avec un élément régulateur qui dirige l'expression des séquences de codage dans la celle hôte. Telle qu'elle est utilisée ici l'expression "éléments régulateurs"englobe, sans limitation, les promoteurs inductibles et non inductibles, les amplificateurs, les opérateurs et autres éléments, connus de l'homme de l'art, qui commandent et régulent l'expression. L'invention inclut des fragments d'une quelconque des séquences d'acides nucléiques décrites ici. Les fragments du gène Rdcsfl ayant une longueur complète peuvent être utilisés comme sonde d'hybridation pour une banque d'ADNc pour isoler le gène ayant une longueur complète et pour isoler d'autres gènes dont une partie importante de la séquence est similaire au gène Rdcsfl et présente une activité biologique similaire. Les sondes de ce type ont de préférence au moins environ 30 bases et peuvent contenir, par exemple, d'environ 30 à environ 50 bases, d'environ 50 à environ 100 bases, d'environ 100 à environ 200 bases ou plus de 200 bases (par exemple 300). La sonde peut aussi être utilisée pour identifier un clone d'ADNc correspondant à un produit de transcription de longueur complète et un clone ou des clones génomiques contenant le gène Rdcsfl complet et incluant des régions de régulation et du promoteur, des exons et des introns. Un exemple de criblage comprend l'isolement de la région de codage du gène Rdcsfl par utilisation de la séquence d'ADN connue pour synthétiser une sonde oligonucléotique ou un amorçage aléatoire de la séquence isolée représentée dans la figure 1. Les oligonucléotides marqués ayant une séquence complémentaire de cette du gène de la présente invention sont utilisés pour effectuer un criblage dans une banque d'ADNc humaine, ADN génomique, pour déterminer les clones individuels de la banque qui s'hybrident avec la sonde. Outre les séquences de gènes décrites ci-dessus, on peut identifier des orthologues de telles séquences, pouvant par exemple être présentes chez d'autres espèces, et on peut les isoler facilement, sans trop d'expérimentations, par des techniques de biologie moléculaire bien connues de l'homme de l'art. En outre, il peut exister des gènes en d'autres loci génétiques dans le génome qui codent pour des protéines ayant une très grande homologie (homologues) pour un ou plusieurs domaines de tels produits de gènes. Ces gènes peuvent aussi être identifiés par des techniques similaires. Par exemple, la séquence de gène exprimé isolée peut être marquée et utilisée pour le criblage d'une banque d'ADNc construite à partir d'ARNm obtenus à partir de l'organisme concerné. Les conditions d'hybridation seront moins rigoureuses si la banque d'ADNc provient d'un organisme différent du type d'organisme dont la séquence marquée provient. Selon une autre possibilité, on peut utiliser le fragment marqué pour le criblage d'une banque génomique dérivée de l'organisme concerné, à nouveau, en utilisant des conditions appropriées peu rigoureuses. De telles conditions peu rigoureuses sont bien connues de l'homme de l'art et varient, de façon prévisible, avec la phylogénie des organismes particuliers d'où proviennent la banque et les séquences marquées. Pour toutes informations concernant ces conditions, consulter, par exemple, Sambrook et coll. cité ci-dessus. Par ailleurs, on peut isoler une séquence du type gène exprimé, antérieurement inconnue, en réalisant une amplification en chaîne par polymérase (PCR) au moyen de deux pools d'amorces oligonucléotidiques dégénérées conçues sur la base des séquences des aminoacides dans le gène intéressant. La matrice pour la réaction peut être l'ADNc obtenu par transcription inverse de l'ARNm préparé à partir de lignées cellulaires ou de tissus humains ou non humains connus pour exprimer un homologue ou des variants d'épissage, ou suspects d'en exprimer. Le produit de la PCR peut être sous-cloné et séquencé pour s'assurer que les séquences amplifiées représentent les séquences d'une séquence d'acides nucléiques analogue au gène exprimé. Le fragment de la PCR peut ensuite être utilisé pour isoler un clone d'ADNc de longueur complète par diverses méthodes. Par exemple, le fragment amplifié peut être marqué et utilisé pour le criblage d'une banque d'ADNc de bactériophages. Le fragment marqué peut aussi être utilisé pour le criblage d'une banque génomique. La technologie de la PCR peut aussi être utilisée pour isoler des séquences d'ADNc de longueur complète. Par exemple, l'ARN peut être isolé, par des procédures standards, à partir d'une source cellulaire ou tissulaire appropriée. Une réaction de transcription inverse peut être réalisée sur l'ARN en utilisant une amorce oligonucléotidique spécifique pour la plupart des extrémités 5'du fragment amplifié pour l'amorçage de la synthèse du premier brin. L'hybride ARN/ADN formé peut ensuite être terminé par une"queue"à l'aide de guanines en utilisant une réaction de transférase terminale standard, l'hybride peut être digéré par une ARNaseH et la synthèse du second brin peut ensuite être amorcée avec une amorce poly-C. Ainsi on peut facilement isoler des séquences d'ADNc en amont du fragment amplifié. Pour une revue des stratégies de clonage pouvant être utilisées, se reporter, par exemple, à Sambrook et coli. 1989, cité ci-dessus. Dans les cas où le gène exprimé différentiellement identifié est le gène normal, ou gène de type sauvage, ce gène peut être utilisé pour isoler des allèles mutants du gène. Un tel isolement est préférable dans les processus et désordres connus pour avoir, ou suspects d'avoir, une base génétique. Les allèles mutants peuvent être isolés des individus connus pour avoir, ou suspects d'avoir, un génotype contribuant aux symptômes de la maladie. Les allèles mutants et les produits des allèles mutants peuvent ensuite être utilisés dans les systèmes d'analyses diagnostiques décrits ci-dessous. On peut isoler un ADNc du gène mutant, par exemple, en utilisant une RT-PCR, technique bien connue de l'homme de l'art. Dans ce cas, on peut synthétiser le premier brin d'ADNc en hybridant un oligonucléotide oligo-dT (ou des hexamères aléatoires) avec un ARNm isolé du tissu connu pour être, ou suspect d'être, exprimé chez un individu suspect d'être porteur de l'allèle mutant, et en allongeant le nouveau brin avec une transcriptase inverse. Le second brin de l'ADNc est ensuite synthétisé en utilisant un oligonucléotide qui s'hybride spécifiquement sur l'extrémité 5'du gène normal (ou par tout autre moyen). En utilisant ces deux amorces, on amplifie ensuite le produit par PCR, on le clone dans un vecteur approprié, et on le soumet à une analyse de la séquence d'ADN par les méthodes bien connues de l'homme de l'art. En comparant la séquence d'ADN du gène mutant à celle du gène normal, on peut identifier la ou les mutations responsables de la perte ou de l'altération de la fonction du produit du gène mutant. On peut aussi construire une banque génomique ou banque d'ADNc, et faire un criblage en utilisant un ADN ou un ARN provenant d'un tissu connu pour exprimer, ou suspect d'exprimer, le gène concerné chez un individu suspect d'être porteur de l'allèle mutant. Le gène normal, ou un de ses fragments appropriés, peut ensuite être marqué et utilisé comme sonde pour identifier l'allèle mutant correspondant dans la banque. Le clone contenant ce gène peut ensuite être purifié par les méthodes utilisées en routine dans la technique et soumis à une analyse de séquence comme décrit ci-dessus. De plus, on peut construire une banque d'expression en utilisant un ADN isolé d'un tissu, ou un ADNc synthétisé par un tissu connu pour exprimer, ou suspect d'exprimer, le gène concerné chez un individu suspect d'être porteur de l'allèle mutant. De cette façon, les produits de gène fabriqués par le tissu suspect d'être mutant peuvent être exprimés et criblés en utilisant les techniques de criblage par anticorps standards en association avec des anticorps dirigés contre le produit de gène normal comme décrit cidessous. (Pour les techniques de criblage, se reporter, par exemple à Harlow, E. et Lane, éd., 1988, "Antibodies : A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor. ) Dans les cas où la mutation aboutit à l'expression d'un produit de gène ayant une fonction altérée (par exemple par suite d'une mutation faux-sens), une série polyclonale d'anticorps réagira de façon croisée avec le produit de gène mutant. Les clones de la banque détectés par leur réaction avec de tels anticorps marqués peuvent être purifiés et soumis à une analyse de séquence comme décrit ci-dessus. Les produits de gène exprimés différentiellement incluent les protéines codées par la séquence nucléotidique présentée dans SEQ ID NO : 1, en particulier, un polypeptide identique à la séquence d'aminoacides présentée dans SEQ ID ? : 2, ou un polypeptide la contenant, ou ses fragments. En outre, les produits de gène exprimés peuvent inclure des protéines qui représentent des produits de gène équivalents sur un plan fonctionnel. Un tel produit de gène équivalent peut contenir des délétions, additions ou substitutions de restes d'aminoacides dans la séquence des aminoacides codée par les séquences des gènes exprimés différentiellement décrites, ci-dessus, mais dont le résultat est une modification silencieuse, produisant ainsi un produit de gène exprimé différentiellement équivalent sur un plan fonctionnel (polymorphismes). Pour remplacer des aminoacides, on peut choisir des aminoacides dont les restes ont une polarité, une charge, une solubilité, une hydrophobie, une hydrophilie et/ou une nature amphipathique similaire ou procéder par comparaison avec la séquence des aminoacides d'autres espèces. Par exemple, les aminoacides non polaires (hydrophobes) incluent l'alanine, la leu cine, l'isoleucine, la valine, la proline, la phénylalanine, le tryptophanne et la méthionine ; les aminoacides neutres polaires incluent la glycine, la sérine, la thréonine, la cystéine, la tyrosine, l'asparagine et la glutamine ; les aminoacides chargés positivement (basiques) incluent l'arginine, la lysine et l'histidine ; et les aminoacides chargés négativement (acides) incluent l'acide aspartique et l'acide glutamique. L'expression"équivalent sur un plan fonctionnel"telle qu'elle est utilisée ici peut se rapporter à une protéine ou à un polypeptide capable de présenter une activité sensiblement similaire in vivo ou in vitro à celle des produits de gènes endogènes exprimés différentiellement codés par les séquences de gène exprimées différentiellement décrites ci-dessus. L'expression"équivalent sur un plan fonctionnel"peut aussi se rapporter à des protéines ou des polypeptides capables d'interagir avec d'autres molécules cellulaires ou extracellulaires comme le ferait la portion correspondante du produit de gène exprimé différentiellement endogène. Par exemple, un peptide"équivalent sur un plan fonctionnel"serait capable, dans un dosage immunologique, de diminuer la fixation d'un anticorps au peptide correspondant (c'est à dire la séquence d'aminoacides peptidiques qui a été modifiée pour obtenir le peptide"équivalent sur un plan fonctionnel") à la protéine endogène, ou à la protéine endogène elle-même, si l'anticorps est dirigé contre le peptide correspondant à la protéine endogène. Une concentration équimolaire du peptide équivalent sur un plan fonctionnel diminuera la fixation susmentionnée du peptide correspondant d'au moins environ 5 %, de préférence entre environ 5 % et 10 %, plus préférablement entre environ 10 % et 25 %, encore plus préférablement entre environ 25 % et 50 % et le plus préférablement entre environ 40 % et 50 %. Les produits de gène exprimés différentiellement peuvent être produits par génie génétique en utilisant les techniques bien connues de l'homme de l'art. Ainsi, des méthodes pour la préparation de polypeptides et de peptides de gènes exprimés différentiellement de l'invention par expression d'acide nucléique codant pour des séquences de gènes exprimées différentiellement sont décrites ici. Des méthodes, bien connues de l'homme de l'art, peuvent être utilisées pour construire des vecteurs d'expression contenant des séquences de codage de protéines de gènes exprimés et les signaux de contrôle de transcription/traduction appropriés. Ces méthodes incluent, par exemple, des techniques de génie génétique in vitro, des techniques de synthèse et la recombinaison in vivo/recombinaison génétique. Se reporter, par exemple, aux techniques décrites dans Sambrook et coll., 1989, cité ci-dessus et Ausubel et coll., 1989, cité ci-dessus. On peut aussi synthétiser chimiquement l'ARN ou l'ADNc capable de coder pour des séquences de protéines du gène exprimé en utilisant par exemple des synthétiseurs. Se reporter, par exemple, aux techniques décrites dans"Oligonucleotide Synthesis", 1984, Gait, M.). éd., IRL Press, Oxford. Divers systèmes hôte-vecteur d'expression peuvent être utilisés pour exprimer les séquences de codage des gènes exprimés différentiellement de l'invention. De tels systèmes hôte-expression représentent des véhicules par lesquels les séquences de codage intéressantes peuvent être produites et ensuite purifiées, mais aussi représentent des cellules qui peuvent, quand elles sont transformées ou transfectées par les séquences de codage nucléotidiques appropriées, exprimer la protéine du gène exprimé différentiellement de l'invention in situ. Ceux-ci incluent, mais sans aucune limitation, des micro- organismes tels que des bactéries (par exemple E. colt, B. subtils) transformées par des vecteurs d'expression d'ADN de bactériophage recombiné, d'ADN de plasmide ou d'ADN de cosmide contenant les séquences de codage de la protéine du gène exprimé différentiellement ; des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) transfonmées par des vecteurs d'expression de levures recombinées contenant les séquences de codage de la protéine du gène exprimé différentiellement ; des systèmes cellulaires d'insectes infectés par des vecteurs d'expression de virus recombinés (par exemple de baculoviru) contenant les séquences de codage de la protéine du gène exprimé différentellement ; des systèmes cellulaires de plantes infectés par des vecteurs d'expression de virus recombinés (par exemple le virus de la mosaïque du chou-fleur, CaMV, le virus de la mosaïque du tabac, TMV) ou transformés par des vecteurs de transformation de plasmide recombinés (par exemple plasmide Ti) contenant les séquences de codage de la protéine du gène exprimé différentiellement ; ou des systèmes de cellules de mammifères (par exemple COS, CHO, BHK, 293, 3T3) hébergeant des cassettes d'expression recombinées contenant des promoteurs dérivés du génome de cellules de mammifères (par exemple le promoteur métallothionéine) ou de virus de mammifères (par exemple le promoteur tardif d'adénovirus, le promoteur 7, 5K du virus de la vaccine, le promoteur précoce du gène du cytomégalovirus). On peut également réaliser l'expression de Rdcsfl par une cellule à partir d'un gène Rdcsfl natif pour la cellule. Des méthodes pour une telle expression sont détaillées dans, par exemple, les brevets US 5 641 670 ; 5 733 761-5 968 502 et 5 994 127. On peut implanter des cellules ayant été induites pour exprimer Rdcsfl par les méthodes selon un quelconque des brevets US 5 641 670 ; 5 733 761 ; 5 968 502 et 5 994 127 dans un tissu désiré chez un animal vivant pour augmenter la concentration locale de Rdcsfl dans le tissu. Dans des systèmes bactériens, on peut de façon avantageuse choisir plusieurs vecteurs d'expression en fonction de l'utilisation envisagée pour la protéine du gène exprimé différentiellement à exprimer. Par exemple, si on veut produire une grande quantité d'une telle protéine, pour produire des anticorps ou pour le criblage de banques de peptides, il peut être souhaitable d'avoir des vecteurs qui dirigent l'expression de niveaux élevés de produits de protéine de fusion faciles à purifier. De tels vecteurs incluent, sans limitation, le vecteur d'expression de E. cpUR278 (Ruther et coli., 1986, EMBO 1. 2 : 1791), dans lequel la séquence de codage de la protéine du gène exprimé différentiellement peut être ligaturée individuellement dans le vecteur dans le cadre de lecture avec la région de codage lac Z de telle façon qu'une protéine de fusion soit produite ; les vecteurs piN (Inouye SE Inouye, 1985, Mucleic Acids Res. 13 : 3101-3109 ; Van Heeke se Schuster, 1989, J. Bíol. Chem. 264 : 5503-5509) et analogues. Les vecteurs PGEX peuvent aussi être utilisés pour exprimer des polypeptides étrangers en tant que protéines de fusion avec une glutathione S-transférase (GST). En général, de telles protéines de fusion sont solubles et peuvent être facilement purifiées à partir des cellules Iysées par adsorption sur des perles glutathion-aséphagarose puis par élution en présence de glutathion libre. Les vecteurs PGEX sont construits de telle façon qu'ils incluent les sites de clivage de la thrombine ou de la protéase du facteur Xa si bien que la protéine du gène cible clonée peut être libérée par le fragment GST par utilisation de ces endopeptidases. Les régions promoteur peuvent être choisies à partir de n'importe quel gène voulu en utilisant des vecteurs contenant une unité de transcription reporteur ne possédant pas de région promoteur, telles qu'une unité de transcription de chloramphénicol acétyltransférase ("cat") ou de luciférase, en aval du ou des sites de restriction pour l'introduction d'un fragment promoteur candidat ; c'est à dire d'un fragment pouvant contenir un promoteur. Comme on le sait bien, l'introduction dans le vecteur d'un fragment contenant un promoteur au site de restriction en amont du gène de cat ou de luciférase engendre la production d'une activité CAT ou luciférase, que l'on peut détecter par des analyses standards de CAT ou par luminométrie. Les vecteurs appropriés à cette fin sont bien connus et on peut se les procurer facilement. pKK232-8, -pCM7 et pGL3 (Promega, Eh 751, Genebank Ass n u47295) sont trois vecteurs de ce type. Ainsi, les promoteurs pour l'expression des polynucléotides de la présente invention incluent non seulement les promoteurs bien connus et facilement disponibles, mais aussi les promoteurs que l'on peut obtenir facilement par la technique précédente, en utilisant une analyse de gène reporteur. Parmi les promoteurs bactériens connus, appropriés pour l'expression des polynucléotides et polypeptides conformément à la présente invention, il existe les promoteurs lad et lacZ dE col les promoteurs T3 et T7, le promoteur T5tac, les promoteurs lambda PR, PL et le promoteur trp. Parmi les promoteurs d'eucaryotes connus appropriés dans cette optique, il existe le promoteur précoce immédiat CMV, le promoteur de thymidine kinase HSV, les promoteurs précoce et tardif SV40, les promoteurs des LTR rétroviraux, tels que ceux du virus du sarcome de Rous ("RSV") et les promoteurs de métallothionéine, tels que le promoteur de la métallothionéine 1 de souris. Dans un système d'insecte, le virus de la polyhédrose nucléaire d'Autographa a/ifor ica (AcNPV) est un des systèmes d'insectes pouvant être utilisés en tant que vecteur pour exprimer des gènes étrangers. Le virus se développe dans des cellules de Spodoptera frugiperda La séquence codant pour le gène exprimé différentiellement peut être clonée individuellement dans des régions non essentielles (par exemple le gène de la polyhédrine) du virus et placée sous le contrôle d'un promoteur AcNPV (par exemple le promoteur de la polyhédrine). L'insertion réussie de la séquence de codage du gène exprimé différentiellement aboutit à une inactivation du gène de la poly-hédrine et à la production d'un virus recombiné non occlus (c'est à dire d'un virus ne possédant pas l'enveloppe protéinée codée par le gène de la polyhédrine). Ces virus recombinés sont ensuite utilisés pour infecter des cellules de Spodoptera frugiperda dans lesquelles le gène introduit s'exprime (par exemple se reporter à Smith et coll., 1983, 46 : 584, brevet US no 4215 051). Dans les cellules hôtes de mammifères, on peut utiliser plusieurs systèmes d'expression à base de virus. Dans les cas où on utilise un adénovirus comme vecteur d'expression, on peut ligaturer la séquence de codage du gène exprimé différentiellement à un complexe de contrôle de la transcription/traduction de l'adénovirus, par exemple le promoteur tardif et la séquence de tête tripartite. Ce gène chimère peut ensuite être introduit dans le génome de l'adéno- virus par recombinaison in vitro ou in vivo. L'insertion dans une région non essentielle du génome du virus (par exemple la région El ou E3) donnera un virus recombiné viable et capable d'exprimer la protéine du gène exprimé différentiellement dans des hôtes infectés (par exemple, se reporter à Logan se Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 81 : 3655-3659). Des signaux d'initiation spécifiques peuvent aussi être nécessaires pour une traduction effective des séquences de codage du gène exprimé différentiellement intro- duites. Ces signaux incluent le codon d'initiation ATG et les séquences adjacentes. Dans les cas où un gène exprimé différentiellement complet, avec son propre codon d'initiation et ses propres séquences adjacentes, est introduit dans le vecteur d'expression approprié, des signaux supplémentaires de contrôle de la traduction peuvent ne pas être nécessaires. Cependant, dans les cas où seule une partie de la séquence de codage du gène exprimé différentellement est introduite, il faut fournir des signaux exogènes de contrôle de la traduction et notamment, peut-être, le codon d'initiation ATG. En outre, le codon d'initiation doit être en phase avec le cadre de lecture de la séquence de codage voulue pour garantir la traduction de la totalité de l'insert. Ces signaux exogènes de contrôle de la traduction (séquence de Kozack) et les codons d'initiation peuvent avoir diverses origines, aussi bien naturelles que synthétiques. L'efficacité de l'expression peut être améliorée par inclusion d'éléments amplifiant la transcription, de terminateurs de la transcription, etc., appropriés (se reporter à Bittner et coli., 1987, Methods in Enzymol, 153 : 516-544). Le choix de vecteurs et promoteurs appropriés pour l'expression dans une cellule hôte est une procédure bien connue et les techniques requises pour la construction du vecteur d'expression, pour son introduction dans l'hôte et pour l'expression dans l'hôte sont des techniques de routine pour l'homme de l'art. En général, les vecteurs d'expression recombinés contiendront des origines de réplication, un promoteur provenant d'un gène à forte expression pour diriger la transcription selon une séquence structurale en amont, et un marqueur sélectionnable pour permettre l'isolement des cellules contenant le vecteur après exposition au vecteur. En plus, on peut choisir une souche de cellule hôte qui module l'expression des séquences introduites ou qui modifie et traite le produit du gène comme on le souhaite, de façon spécifique. De telles modifications (par exemple une glycosylation) et traitements (par exemple un clivage) des produits protéinés peuvent être importants pour la fonction de la protéine. Des cellules hôtes différentes ont des mécanismes spécifiques et caractéristiques pour le traitement et la modification des protéines après la traduction. On peut choisir des lignées cellulaires ou des systèmes d'hôtes de telle façon que l'on soit sûr que la protéine étrangère exprimée soit modifiée et traitée correctement. Pour cela, on peut utiliser des cellules hôtes eucaryotes qui possèdent la machinerie cellulaire pour traiter correctement le transcrit primaire, pour glycosyler et phosphoryle le produit du gène. De telles cellules hôtes de mammifères incluent, sans limitation, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, etc. Pour la production, pendant une longue durée et avec un haut rendement, de protéines recombinées, on préfère que l'expression soit stable. On peut par exemple obtenir par modification génétique des lignées cellulaires qui expriment de façon stable la protéine exprimée différentiellement. Plutôt que d'utiliser des vecteurs d'expression contenant des origines de réplication virales, on peut transformer les cellules hôtes avec un ADN contrôlé par des éléments de contrôle de l'expression appropriés (par exemple promoteur, amplificateur, séquences, terminateurs de transcription, sites de polyadénylation, etc. ) et un marqueur sélectionnable. Après l'introduction de l'ADN étranger, on peut laisser les cellules génétiquement modifiées se développer pendant 1 à 2 jours dans un milieu enrichi, puis les mettre dans un milieu sélectif. Le marqueur sélectionnable dans le plasmide recombiné confère une résistance à la sélection et permet aux cellules d'intégrer de façon stable le plasmide dans leurs chromosomes et de croître en formant des foyers que l'on peut à leur tour cloner et développer en lignées cellulaires. Cette méthode peut être utilisée avantageusement pour obtenir des lignées cellulaires modifiées génétiquement qui expriment la protéine exprimée différentellement. De telles lignées cellulaires modifiées génétiquement peuvent être particulièrement utiles dans le criblage et l'évaluation de composés qui affectent l'activité endogène de la protéine exprimée différentiellement. Ces lignées cellulaires stables peuvent être utilisées comme moyen de thérapie cellulaire directement ou après encapsulation. On peut utiliser plusieurs systèmes de sélection, incluant, mais sans limitation, les gènes de la thymidine kinase de l'herpès simplex virus (Wigier et coli.. 1977, Cell 11 : 223), de l'hypoxanthine-guanine phosphoribosyl- transférase (Szybaiska Szybalski, 1962. Proc. Matl Acad. Sc ! USA 48 : 2026) et de l'adénine phosphoribosyltransférase (Lowy et coll., 1980, Cell 22 : 817) que l'on peut employer dans les cellules tk, hgprt ou aprt-, respectivement. De même, on peut utiliser la résistance aux antimétabolites comme base de sélection pour les gènes dhfr, qui confère une résistance au méthotrexate (Wigler et coli., 1980, Proc. Natl. Acad. SA USA 77 : 3567 ; O'Hare et coil., 1981, Proc. Natl Acad. Sei. USA 78 : 1527) ; gpt, qui confère une résistance à l'acide mycophénolique (Mulligan se Berg, 1981, Proc. roc. Acad. Sei. USA 78 : 2072) ; neo, qui confère une résistance à l'aminoglycoside G-418 (Colberre-Garapin et coll., 1981,). Mol Riol 150 : 1) ; et hygro, qui confère une résistance à l'hygromycine (Santerre et coli., 1984, Gene 30 : 147). Un autre système de protéines de fusion permet de purifier facilement des protéines de fusion non dénaturées exprimées dans des lignées de cellules humaines (Janknecht et coll., 1991, Proc. Natl Acad. Sei. USA 88 : 8972- 8976). Dans ce système le gène intéressant est sous-cloné dans un plasmide de recombinaison de vaccine de telle façon que le cadre de lecture ouvert du gène soit fusionné, avec traduction, à une étiquette amino-terminale constituée par six restes histidine. Les extraits de cellules infectées par le virus de la vaccine recombiné sont introduits dans des colonnes Ni2+ acide nitriloacétique-agarose et les protéines marquées par l'histidine sont éluées sélectivement par des tampons contenant de l'imidazole. Quand on l'utilise comme composant dans des systèmes de dosage tels que ceux décrits ci-dessous, la protéine exprimée différentiellement peut être marquée, directement ou indirectement, pour faciliter la détection d'un complexe formé entre la protéine exprimée différentiellement et une substance test. On peut utiliser un système de marquage approprié quelconque et notamment, mais sans limitation, des radioisotopes tels que Il 2 5 ; des systèmes de marquage enzymatiques qui génèrent un signal calorimétrique ou de la lumière détectable quand ils sont exposés au substrat ; et des marqueurs fluorescents. Quand on utilise la technologie du génie génétique pour produire la protéine exprimée différentiellement pour de tels systèmes de dosage, il peut être avantageux de construire des protéines de fusion pouvant faciliter le marquage, l'immobilisation et/ou la détection. Le marquage indirect met en jeu l'utilisation d'une protéine, telle qu'un anticorps marqué, qui se fixe spécifiquement à un produit de gène exprimé différentiellement. De tels anticorps incluent, mais sans limitation, des anti- corps polyclonaux, monoclonaux, chimères, monocaténaires, des fragments Fab et des fragments produits par une banque d'expression de Fab. Dans un autre mode de réalisation, des acides nucléiques comprenant une séquence codant pour une protéine Rdcsfl ou un de ses dérivés fonctionnels sont administrés pour favoriser la fonction des cônes, par le biais de la thérapie génique. La thérapie génique désigne la thérapie mise en oeuvre par administration d'un acide nucléique à un sujet. Dans ce mode de réalisation de l'invention, l'acide nucléique produit sa protéine codée laquelle produit un effet thérapeutique en favorisant la fonction des cônes. On peut utiliser dans la présente invention n'importe quelle méthode de thérapie génique disponible dans la technique. Des exemples de méthodes sont décrits ci-dessous. Dans un aspect préféré, le traitement comprend un acide nucléique Rdcsfl qui fait partie d'un vecteur d'expression qui exprime une protéine Rdcsfl ou un fragment de cette protéine ou une protéine chimère de celle-ci dans un hôte particulier. En particulier, un tel acide nucléique a un promoteur lié de façon opérationnelle à la région de codage de Rdcsfl, ledit promoteur étant inductible ou constitutif et, éventuellement, étant spécifique du tissu. Dans un autre mode de réalisation particulier, on utilise une molécule d'acide nucléique dans laquelle les séquences de codage de Rdcsf1 et les autres séquences désirées sont flanquées de régions qui favorisent une recombinaison homologue à un site désiré dans le génome, ce qui fournit une expression intrachromosomale de l'acide nucléique Rdcsfl (Koller et Smithies, 1989, Proc. Natl Acad. Sel USA 86 : 8932-8935 ; Zijlstra et coli., 1989, Nature 342 : 435-438). L'administration de l'acide nucléique à un patient peut être directe, auquel cas le patient est directement exposé à l'acide nucléique ou au vecteur transportant l'acide nucléique, ou indirecte, auquel cas, les cellules sont d'abord transformées par l'acide nucléique in vitro, puis transplantées chez le patient. Ces deux approches sont connues, respectivement, sous les noms de thérapie génique in vivo et ex vivo. Dans un mode de réalisation spécifique, l'acide nucléique est administré directement in vivo où il est exprimé pour produire le produit codé. Pour cela on peut utiliser une quelconque des nombreuses méthodes connues dans la technique, par exemple en le construisant pour en faire un élément d'un vecteur d'expression d'un acide nucléique approprié et en l'administrant de telle façon qu'il devienne intracellulaire, par exemple par infection en utilisant un rétrovirus défectueux ou atténué ou un autre vecteur viral (adénovirus, virus associé à un adénovirus et lentivirus) (se reporter, par exemple, au brevet US no 4 980 286 et à d'autres cités ci-dessous), ou par injection directe de l'ADN nu, ou par utilisation d'un bombardement par micro- particules (par exemple fusil de gène ; Biolistic, Dupont), ou par enrobage par des lipides ou des récepteurs de la surface cellulaire ou d'agents transfectants, par encapsulation dans des liposomes, des microparticles ou des microcapsules, ou par administration sous forme liée à un peptide dont on sait qu'il pénètre dans le noyau, par administration sous forme liée à un ligande intervenant dans une endocytose médiée par un récepteur (se reporter par exemple, aux brevets US 5 166 320 ; 5 728 399 ; 5 874 297 et 6 030 954, (qui peuvent être utilisés pour cibler des types de cellules exprimant spécifiquement les récepteurs), etc. Dans un autre mode de réalisation, on peut former un complexe acide nucléique-ligande dans lequel le ligande comprend un peptide viral fusogène pour détruire les endosomes, ce qui permet à l'acide nucléique de ne pas être dégradé par les lysosomes. Dans encore un autre mode de réalisation, l'acide nucléique peut être ciblé in vivo de façon à être capté spécifiquement par la cellule et à participer à l'expression, par ciblage d'un récepteur spécifique (se reporter, par exemple, aux publications PCT WO 92/06180 ; WO92/ 22635 ; WO92/20316 ; WO93/14188 et WO93/20221). Selon une autre possibilité, l'acide nucléique peut être introduit dans la cellule et incorporé dans l'ADN de la cellule hôte pour participer à l'expression, par recombinaison homologue (se reporter, par exemple, aux brevets US 5413 923 ; 5 416 260et5574205età Zijlstra et coll., 1989, Nature 342 : 435-438). Dans un mode de réalisation spécifique, on utilise un vecteur viral contenant l'acide nucléique Rdcsfl. Par exemple, on peut utiliser un vecteur rétroviral (se reporter par exemple, aux brevets US 5 219 740 ; 5 604 090 et 5 834 182). Ces vecteurs rétroviraux ont été modifiés pour supprimer des séquences rétrovirales non nécessaires pour l'encapsidation du génome viral et son intégration dans l'ADN de la cellule hôte. L'acide nucléique Rdcsfl à utiliser dans la thérapie génique est cloné dans le vecteur, ce qui facilite la délivrance du gène au patient. Les adénovirus sont d'autres vecteurs viraux pouvant être utilisés en thérapie génique. Les adénovirus sont des véhicules particulièrement intéressants pour la délivrance de gènes aux épithéliums respiratoires. Les adénovirus infectent naturellement les épithéliums respiratoires et sont légèrement pathogènes. Le foie, le système nerveux central, les cellules endothéliales et les muscles sont d'autres cibles des systèmes de délivrance à base d'adénovirus. Les adénovirus ont l'avantage d'être capables d'infecter des cellules quiescentes. Des méthodes de mise en oeuvre d'une thérapie génique à base d'adénovirus sont décrites dans, par exemple, les brevets US 5 824 544 ; 5 868 040 ; 5 871 722 ; 5 880 102 ; 5 882 877 ; 5 885 808 ; 5 932 210 ; 5 981 225 ; 5 994 106 ; 5 994 132 i 5 994 134 ; 6001 557 et 6033843. L'utilisation des virus associés aux adénovirus (AAV) a également été proposée en thérapie génique. Les virus associés aux adénovirus sont des véhicules particulièrement intéressants pour la délivrance de gènes à la rétine. Des méthodes pour la production et l'utilisation d'AAV sont décrites, par exemple, dans les brevets US 5 173 414 ; 5 252 479 ; 5 552 311 ; 5 658 785 ; 5 763 416 ; 5 773 289 : 5 843 742 ; 5 869040 ; 5942 496 et 5948675. Une autre approche de thérapie génique met en jeu le transfert d'un gène à des cellules en culture tissulaire par des méthodes telles que l'électroporation, la lipofection, la transfection médiée par le phosphate de calcium ou l'infection virale. En général, la méthode de transfert inclut le transfert d'un marqueur sélectionnable aux cellules. Les cellules sont ensuite soumises à une sélection pour isoler celles qui ont capté et exprimé le gène transféré. Ces cellules sont ensuite administrées à un patient directement ou après encapsulation. Dans ce mode de réalisation, les acides nucléiques sont introduits dans une cellule avant administration in vivo de la cellule recombinée finale. Une telle introduction peut se faire par une quelconque des méthodes connues dans la technique incluant, mais sans limitation, la transfection, l'électroporation, la microinjection, l'infection par un vecteur viral ou de bactériophage contenant les séquences de l'acide nucléique, la fusion de cellules, le transfert de gène médié par chromosome, le transfert de gène médié par microcellule, la fusion de sphéropiastes, etc. Beaucoup de techniques d'introduction de gènes étrangers dans les cellules sont connues de l'homme de l'art et elles peuvent être utilisées conformément à la présente invention sous réserve qu'elles ne nuisent pas aux fonctions de développement et aux fonctions physiologiques nécessaires des cellules réceptrices. La technique doit permettre un transfert stable de l'acide nucléique dans la cellule de telle façon que l'acide nucléique puisse être exprimé par la cellule et qu'il soit de préférence hérité et exprimé par la descendance de la cellule. Les cellules recombinées résultantes peuvent être délivrées à un patient par diverses méthodes connues dans la technique. Dans un mode de réalisation préféré, on injecte des cellules épithéliales, par exemple par voie sous-cutanée. Dans un autre mode de réalisation, on peut appliquer des cellules cutanées recombinées sous la forme d'une greffe de peau sur le patient. Les cellules de sang recombinées (par exemple cellules hématopoïétiques souches ou embryonnaires) sont administrées de préférence par voie intraveineuse. La quantité de cellules à utiliser dépend de l'effet désiré, de l'état du patient, etc., et peut être déterminée par l'homme de Fart. Les cellules dans lesquelles on peut introduire un acide nucléique dans le but de réaliser une thérapie génique englobent tous les types de cellules existants, désirés, et incluent, mais sans limitation, les cellules épithéliales, les cellules endothéliales, les kératinocytes, les fibroblastes, les cellules musculaires, les hépatocytes, les cellules sanguines comme les lymphocytes T, les lymphocytes B, les monocytes, les macrophages, les neutrophiles, les éosinophiles, les mégacaryoctes, les granulocytes ; diverses cellules souches ou embryonnaires, en particulier des cellules hématopoïétiques souches ou embryonnaires, par exemple celles obtenues à partir de la moelle osseuse, du sang périphérique, du sang du cordon ombilical, de foie foetal, etc. Dans un mode de réalisation préféré, la cellule utilisée en thérapie génique est autologue pour le patient. Dans un mode de réalisation dans lequel on utilise des cellules recombi- nées en thérapie génique, on introduit un acide nucléique Rdcsfl dans les cellules de telle façon qu'il puisse être exprimé par les cellules ou leur descendance et on administre ensuite les cellules recombinées in vivo pour avoir un effet thérapeutique. Dans un mode de réalisation spécifique, on utilise des cellules souches ou embryonnaires. Toute cellule souche et/ou embryonnaire pouvant être isolée et maintenue in vitro peut potentiellement être utilisée conformément à ce mode de réalisation de la présente invention. De telles cellules souches incluent, mais sans limitation, les cellules souches hématopoïé- tiques (HSC), les cellules souches des tissus épithéliaux comme la peau et la muqueuse tapissant l'intestin, les cellules embryonnaires des muscles du coeur, les cellules hépatiques souches (se reporter par exemple à WO 94/08598) et les cellules nerveuses souches (temple et Anderson, 1982, Cell 71 : 973-985). Les cellules souches épithéliales (ESC) ou les kératinocytes peuvent être extraits de tissus tels que la peau et la muqueuse tapissant l'intestin par des procédures connues (Rheinwald, 1980, Math. CeIlBio. 21 A : 229). Dans un tissu épithélial stratifié comme la peau, le renouvellement se produit par mitose des cellules souches dans la couche germinale, la couche la plus proche de la membrane basale. Les cellules souches dans la muqueuse tapissant l'intestin font que ce tissu se renouvelle rapidement. Les ESC ou les kératinocytes tirés de la peau ou de la muqueuse tapissant l'intestin chez un patient ou un donneur peuvent être cultivés en culture tissulaire (Pittelkow et Scott, 1986, Maya C ! iníc Proc."61 : 771). Si les ESC proviennent d'un donneur, on peut aussi utiliser une méthode pour la suppression de la réactivité du greffon contre l'hôte (par exemple une irradiation, l'administration d'un médicament ou d'un anticorps pour favoriser une immunosuppression modérée). Cellules souches de la rétine (Tropepe et coil., 2000, Science, 287 : 2032). Pour ce qui concerne les cellules hématopoïétiques souches (HSC), on peut utiliser toute technique d'isolement, de propagation et de maintien in vitro des HSC dans ce mode de réalisation de l'invention. Les techniques grâce auxquelles ces opérations peuvent être accomplies incluent (a) l'isolement et l'établissement de cultures de HSC provenant de cellules de moelle osseuse isolées chez l'hôte futur, ou chez un donneur, ou (b) l'utilisation de cultures anciennes de HSC établies depuis longtemps, pouvant être allogéniques ou xénogéniques. On utilise de préférence des HSC non autologues associées à une méthode de suppression des réactions immunitaires du futur patient/hôte contre le greffon. Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, on peut obtenir des cellules de moelle osseuse humaine par prélèvement dans la partie postérieure de l'os iliaque, par aspiration à l'aiguille (se reporter, par exemple à Kodo et coli., 1984, J. Clin. Invest. 73 : 1377- 1384). Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, les HSC peuvent être très enrichies ou sous une forme pratiquement pure. L'enrichissement peut être accompli avant, pendant ou après une culture de longue durée, et peut être réalisé par toute technique connue de l'homme de l'art. Les cultures de cellules de moelle osseuse à long terme peuvent être établies et maintenues par utilisation, par exemple, de variantes des techniques de culture de cellules de Dexter (Dexter et coli., 1977, J. Cell Physio, 91 : 335) ou par des techniques de culture de Witlock-Witte (Witiock et Witte, 1982, Proc. M ? cj USA 79 : 3608-3612). Dans un mode de réalisation spécifique, l'acide nucléique à utiliser dans la thérapie génique comprend un promoteur inductible lié de façon opérationnelle à la région de codage, de telle façon que l'expression de l'acide nucléique soit contrôlable en présence ou en l'absence d'un inducteur de transcription approprié. On décrit ici des méthodes pour la production d'anticorps capables de reconnaître spécifiquement un ou plusieurs épitopes de gènes exprimés différentiellement. De tels anticorps sont notamment, de façon non limitative, des anticorps polyclonaux, des anticorps monoclonaux (mAb), des anticorps chimères ou humanisés, des anticorps monocaténaires, des fragments Fab, des fragments F (ab') 2, des fragments produits par une banque d'expression de Fab, des anticorps anti-idiotypiques (anti- ! d), et des fragments de fixation aux épi- topes d'un quelconque des produits précédents. De tels anticorps peuvent être utilisés par exemple dans la détection d'une empreinte, d'un gène cible dans un échantillon biologique ou, selon une autre possibilité, en tant que méthode pour l'inhibition d'une activité anormale d'un gène cible. Ainsi, on peut utiliser de tels anticorps comme partie de méthodes de traitement de maladies et/ou on peut les utiliser comme parties de techniques de diagnostic, dans lesquelles on teste les patients pour rechercher des taux anormaux de Rdcsfl ou la présence de formes anormales de Rdcsfl. Pour cela on prélève des échantillons d'humeur aqueuse ou de vitré par des méthodes bien connues de l'homme de l'art (par exemple Forster, R. K., Abbott RL, Gelender, H. (1990) Management of infectious endophthalmitis Ophthalmology87, 313-319). Pour la production d'anticorps dirigés contre un gène exprimé différentiellement, on peut immuniser divers animaux hôtes par injection par une protéine exprimée différentiellement ou par une fraction de celle-ci ou par immunisation par un ADN. De tels animaux hôtes sont notamment, de façon non limitative, des lapins, des souris, des rats, pour en citer quelques uns. On peut utiliser divers adjuvants pour augmenter la réponse immunologique, selon l'espèce de l'hôte, et ceux-ci sont notamment, de façon non limitative, des adjuvants de Freund (complet et incomplet), des gels minéraux comme l'hydroxyde d'aluminium, des substances tensioactives comme la Iysolécithine, des polyols pluroniques, des polyanions, des peptides, des émulsions dans l'huile, l'hémocyanine de patelle, le dinitriphénol et des adjuvants potentiellement utiles chez l'homme comme le BCG (bacille de Calmette-Guérin) et Corynebacterfum parvum. Les anticorps polyclonaux sont des populations hétérogènes de molécules d'anticorps provenant de sérums d'animaux immunisés par un antigène, tel qu'un produit de gène cible, ou un de ses dérivés fonctionnels antigéniques. Pour la production des anticorps polyclonaux, on peut immuniser des animaux hôtes comme ceux cités ci-dessus en injectant un produit de gène exprimé différentiellement additionné d'adjuvants comme cités ci-dessus également. On peut obtenir des anticorps monoclonaux, qui sont des populations homogènes d'anticorps dirigés contre un antigène particulier, par toute technique permettant la production de molécules d'anticorps par des lignées cellu- laires continues en culture. Celles-ci sont notamment, de façon non limitative, la technique d'hybridome de Kohler et Milstein, (1975, Nature 256 : 495- 497 ; et brevet US no 4 376 110), la technique d'hybridome de lymph- , y 4 : 72 ; Cole et cytes B humains (Kosbor et coil., 1983, Immunology Todi coli., 1983,/r. M ? cj USA 80 : 2026-2030) et la technique d'hybridome-du virus d'Epstein-Barr (EBV) (Cole et coll., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pages 77- 96). De tels anticorps peuvent appartenir à n'importe quelle classe d'immunoglobuline et notamment IgG, IgM, IgE, IgA, IgD et à toutes leurs sous-classes. Les hybridomes produisant les mAb de cette invention peuvent être cultivés in et in vivo. La production de concentrations élevées de mAb in vivo fait que l'on préfère actuellement cette méthode de production. En outre, on peut utiliser des techniques développées pour la production "d'anticorps chimères" (Morrison et coli. 1984, Proc. Natl. AcaJ /. USA 81 : 6851-6855 ; Neuberger et coli., 1984, Nature, 312 : 604-608 ; Takeda et coll., 1985, Nature, 314 : 452-454) par épissage des gènes d'une molécule d'anticorps de souris ayant une spécificité d'antigène appropriée avec des gènes d'une molécule d'anticorps humain ayant une activité biologique appropriée. Un anticorps chimère est une molécule contenant des fragments différents provenant d'espèces animales différentes ; il peut s'agir aussi d'une molécule ayant une région variable ou hypervariable provenant d'un mAb de souris et une région constante dérivée d'une immunoglobuline humaine. Selon une autre possibilité, on peut adapter les techniques décrites pour la production d'anticorps monocaténaires (brevet US no 4 946 778 ; Bird, 1988, Science 242 : 423-426 ; Huston et coli., 1988,/r. M ? c Sci. USA 85 : 5879-5883 ; et Ward et coll., 1989, Nature 334 : 544- 546) pour qu'elles produisent des anticorps monocaténaires de gènes exprimés différentiellement. Les anticorps monocaténaires sont formés en reliant les fragments chaîne lourde et chaîne légère de la région Fv par un pont aminoacide, ce qui donne un polypeptide monocaténaire. Plus préférablement, on peut adapter les techniques utilisées pour la production"d'anticorps humanisés"à la production d'anticorps aux polypeptides, aux fragments, aux dérivés et aux équivalents fonctionnels de la présente invention. De telles techniques sont décrites dans le brevet US no 5 932 448, 5 693 762, 5 693 761, 5 585 089, 5 530 101, 5 910 771, 5 569 825,5 625 126,5 633 425,5 789 650,5 545 580,5 661 016 et 5 770 429 p Les fragments d'anticorps qui reconnaissent des épitopes spécifiques peuvent être créés par des techniques connues. Par exemple, de tels fragments sont notamment, de façon non limitative, des fragments F (ab') 2 qui peuvent être produits par digestion de la molécule d'anticorps par la pepsine et les fragments Fab qui peuvent être produits par réduction des ponts disulfures des fragments F (ab') 2. On peut aussi construire des banques d'expression de Fab (Huse et coll., 1989, Science, 2 46 : 1275-1281) pour permettre une identification rapide et aisée des fragments Fab monoclonaux ayant la spécificité désirée. On préfère en particulier, pour la facilité de détection, les analyses sandwich, dont il existe plusieurs versions, que l'on entend toutes englober dans la présente invention. Par exemple, dans une analyse directe type, un anticorps non marqué est immobilisé sur un substrat solide et l'échantillon à tester est mis en contact avec la molécule fixée. Après une durée d'incubation appropriée, pendant une période suffisante pour permettre la formation d'un complexe binaire anticorps-antigène, on ajoute un second anticorps, marqué par une molécule reporteur capable d'induire un signal détectable et on met à incuber, en prévoyant un temps suffisant pour qu'il se forme un complexe ternaire anticorps-antigène-anticorps marqué. On élimine toutes les matières n'ayant pas réagi par lavage et on détermine la présence de l'antigène par l'observation d'un signal ou bien on peut le quantifier par comparaison à un échantillon témoin contenant des quantités d'antigène connues. Les variantes de l'analyse directe sont notamment l'analyse simultanée dans laquelle on ajoute simultanément l'échantillon et l'anticorps à l'anticorps lié, ou l'analyse inversée dans laquelle on combine d'abord l'anticorps marqué et l'échantillon à tester, on les met à incuber et on les ajoute à l'anticorps fixé sur une surface, non marqué. Ces techniques sont bien connues de l'homme de l'art et on peut facilement imaginer des variantes mineures. Telle qu'elle est utilisée ici, l'expression"analyse sandwich"englobe toutes les variantes de la technique de base à deux sites. Pour les dosages immunologiques de la présente invention, il existe une seule restriction : les anticorps non marqués et marqués doivent être des anticorps spécifiques de Rdcsfl. Les molécules reporteurs les plus couramment utilisées dans ce type d'analyse sont des enzymes, des molécules fluorophores ou des molécules contenant des radionucléides. Dans le cas d'un dosage immunoenzymatique, un enzyme est conjugué au second anticorps, en général au moyen du glutaraldéhyde ou d'un periodate. Comme on l'observera immédiatement, cependant, il existe une large gamme de techniques de ligature différentes, bien connues du technicien expérimenté. Les enzymes utilisées couramment sont notamment la peroxydase de raifort, la glucose oxydase, la p-galactosidase et la phosphatase alcaline. Les substrats à utiliser avec les enzymes spécifiques sont en général choisis de telle façon qu'ils produisent, par hydrolyse par l'enzyme correspondante, une variation de couleur décelable. Par exemple, le p-nitrophénylphosphate convient dans le cas où on utilise des conjugués de phosphatase alcaline ; pour les conjugués de peroxydase, on utilise couramment la 1, 2-phénylènediamine ou la toluidine. Il est également possible d'utiliser des substrats fluorogéniques, qui donnent un produit fluorescent plutôt que les substrats chromogènes cités ci-dessus. On ajoute ensuite une solution contenant le substrat approprié au complexe tertiaire anticorps-Rdcsfl-anticorps marqué. Le substrat réagit avec l'enzyme liée au second anticorps, donnant ainsi un signal visuel qualitatif, que l'on peut quantifier, en général par spectrophotométrie, pour évaluer la quantité de Rdcsfl présente dans l'échantillon de sérum. Selon une autre possibilité, on peut coupler chimiquement des composés fluorescents, comme de la fluorescéine ou de la rhodamine, à des anticorps sans modifier leur capacité à se fixer. Quand il est activé par illumination par une lumière ayant une longueur d'onde particulière, l'anticorps marqué par le fluorochrome absorbe de l'énergie lumineuse, ce qui induit un état d'excitabilité dans la molécule aboutissant à une émission lumineuse, d'une longueur d'onde caractéristique. L'émission apparaît sous la forme d'une couleur caractéristique, que l'on détecte visuellement à l'aide d'un microscope optique. Les techniques d'immunofluorescence et d'immuno-essais enzymatiques sont toutes deux des techniques bien établies et sont particulièrement préférées pour la présente méthode. Cependant, d'autres molécules reporteurs, comme des molécules à radioisotope, des molécules chimio- luminescentes ou bioluminescentes peuvent aussi être utilisées. Le technicien expérimenté comprendra facilement comment on peut modifier la procédure pour l'adapter à l'utilisation envisagée. Cette invention concerne également l'utilisation des polynucléotides de la présente invention en tant que réactifs de diagnostic. La détection d'une forme mutée du gène caractérisée par le polynucléotide de SEQ ID ? : 1, associée à un dysfonctionnement fournira un outil de diagnostic qui peut venir compléter le diagnostic d'une maladie ou la suspicion d'une maladie, ou qui peut définir un tel diagnostic, la maladie se traduisant par une sous-expression, une sur-expression ou une altération, dans l'espace ou le temps, de l'expression du gène. Les individus porteurs de mutations dans le gène pourront être détectés, au niveau de l'ADN, par diverses techniques. On peut extraire les acides nucléiques nécessaires au diagnostic des cellules du sujet, par exemple de son sang, de ses urines, de sa salive, d'une biopsie cellulaire ou de matières d'autopsie. On peut utiliser l'ADN génomique directement pour la détection ou l'amplifier de façon enzymatique en utilisant une PCR ou d'autres techniques d'amplification avant l'analyse. On peut aussi utiliser de l'ARN ou de l'ADNc de façon similaire. On peut détecter des délétions et des insertions par une modification de la taille du produit amplifié par rapport à celle du génotype normal. On peut identifier des mutations ponctuelles par hybridation d'ADN amplifié avec des séquences nucléotidiques marquées. On peut distinguer des séquences parfaitement appariées à des duplex non appariés par digestion par une RNase ou par des différences dans les températures de fusion. Les différences entre les séquences d'ADN peuvent aussi être décelées par des modifications de la mobilité électrophorétique des fragments d'ADN dans des gels, avec ou sans agents dénaturants (SSCP), ou par séquençage direct de l'ADN (par exemple, Myers et coli., Science (1985) 230 : 1242). On peut aussi mettre en évidence des modifications de séquence en des localisations particulières par des analyses avec protection vis- à-vis d'une nucléase, comme la méthode avec protection vis-à-vis de la RNase et S 1 ou la méthode de clivage chimique (se reporter à Cotton et coll., Proc. Natl Acad. Sei. USA (1985) 85 : 4397-4401). Dans un autre mode de réalisation, on peut construire une grille de sondes oligonucléotidiques comprenant la séquence nucléotidique de Rdcsfl ou ses fragments pour effectuer un criblage efficace de, par exemple, mutations génétiques. Les méthodes de la technologie des grilles sont bien connues et ont un domaine d'application très général ; on peut les utiliser pour traiter diverses questions en génétique moléculaire et notamment l'expression des gènes, les liaisons génétiques, et la variabilité génétique (se reporter par exemple à M. Chee et coli., Science, Vol. 274, pages 610-613 (1996)). Les analyses de diagnostic offrent un procédé pour le diagnostic d'une maladie ou la détermination d'une susceptibilité à cette maladie par détection d'une mutation dans le gène Rdcsfl par les méthodes décrites. En outre, de telles maladies peuvent être diagnostiquées par des méthodes comprenant la détermination, dans un échantillon obtenu chez un sujet, d'une expression anormale de Rdcsfl. L'expression peut être mesurée au niveau de l'ARN par une quelconque des méthodes bien connues dans la technique de la quantification des polynucléotides comme, par exemple, les méthodes de l'amplification des acides nucléiques, par exemple la PCR, la RT-PCR, la protection à RNase, la méthode du Northern Biot et autres méthodes d'hybridation. Les techniques d'analyse que l'on peut utiliser pour déterminer les taux d'une protéine, par exemple du polypeptide de la présente invention, dans un échantillon obtenu chez un hôte sont bien connues de l'homme de l'art. De telles méthodes d'analyse sont notamment les dosages radioimmunologiques, les analyses par fixation compétitive, l'analyse de Western Biot et les analyses ELISA. Ainsi, selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne un kit de diagnostic comprenant : - un polynucléotide de la présente invention, de préférence la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 ou un de ses fragments ; - une séquence nucléotidique complémentaire de celle de (a) ; - un polypeptide de la présente invention, de préférence le polypeptide SEQ ID ? : 2 ou un de ses fragments ; ou - un anticorps à un polypeptide de la présente invention, de préférence au polypeptide SEQ ID ? : 2. On notera que dans un kit quelconque de ce type, (a), (b), (c) ou (d) peut comprendre un composant substantiel. Un tel kit sera utile dans le diagnostic d'une maladie ou d'une susceptibilité à une maladie, en particulier à une rétinite pigmentaire, une dégénérescence macula ire sénile, un syndrome de Bardet-Biedel, un syndrome de Bassen-Kornzweig, une maladie de Best, un choroïdérémie, une atrophie gyrée, une amourose congénitale, un syndrome de Refsum, une maladie de Stargardt et un syndrome d'Usher. Les séquences nucléotidiques de la présente invention sont également précieuses pour la localisation des chromosomes. La localisation des chromosomes peut être obtenue par PCR sur un ADN préparé à partir d'un panel de lignées cellulaires hybrides (souris-hamster). La localisation chromosomique du gène humain peut être déduite de la localisation du gène de souris par synténie (McCarthy et coll. (1997), Genomeresearcb, 7, 1153). La séquence est ciblée spécifiquement vers une localisation particulière d'un chromosome individuel, notamment un chromosome de souris ou d'homme, et peut s'hybrider avec cette localisation. La cartographie des séquences pertinentes des chromosomes selon la présente invention est une première étape importante dans la corrélation de ces séquences avec la maladie associée au gène. Quand une séquence a été cartographiée et que son emplacement précis sur le chromosome est connu, on peut corréler la position physique de la séquence sur le chromosome avec les données de la carte génétique. On peut trouver de telles données par exemple, dans V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (données pouvant être obtenues on-line auprès de la bibliothèque médicale de l'Université ohns Hopkins, RetNet). La relation entre les gènes et les maladies qui ont été localisées dans la même zone du chromosome est ensuite identifiée par une analyse des liaisons (co-transmission héréditaire de gènes physiquement adjacents). Les différences d'ADNc ou de séquence génomique entre des individus malades et sains peuvent également être déterminées. Si on observe une mutation chez certains individus atteints ou chez tous les individus atteints, mais jamais chez des individus normaux, il est alors probable que la mutation soit l'agent causal de la maladie. Un autre mode de réalisation de l'invention concerne l'administration d'une composition pharmaceutique, en association avec un support pharmaceutiquement acceptable, pour un des effets thérapeutiques décrits ci-dessus. De telles compositions pharmaceutiques peuvent consister en Rdcsfl, en produits mimétiques ou en agonistes. Les compositions peuvent être administrées seules ou en association avec au moins un autre agent, tel qu'un agent stabilisant, qui peut être administré dans un support pharmaceutique biocompatible stérile, et notamment, mais de façon non limitative, dans un soluté salin, un soluté salin tamponné, du dextrose ou de l'eau. Les compositions peuvent être administrées au patient seules, ou en association avec d'autres agents, médicaments ou hormones. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être administrées par plusieurs voies d'administration : par exemple se reporter à "Transcleral delivery of bioreactive protein to the choroid and retina" d'Ambati et coli. (2000) Investigative Ophthalmology and Visual Science, 41, 1186. La formulation de préparations ophtalmiques pour la voie topique, et notamment de solutions, suspensions et pommades ophtalmiques est bien connue de l'homme de l'art (se reporter à Parmaceutical Sciences de Remington 18ème édition, chapitre 86, pages 1581-1592, Mack Publishing Company, 1990). D'autres modes d'administration existent, et notamment des injections intracamérales (qui peuvent être pratiquées directement dans la chambre antérieure ou directement dans la chambre du corps vitré), des injections sous-conjonctivales et des injections rétrobulbaires et les méthodes et moyens pour la production de préparations ophtalmiques pour de tels modes d'administration sont également bien connus. Tel qu'il est utilisé dans cette demande, le terme"extraoculaire"se rapporte à la surface oculaire et à l'espace (extérieur) entre le globe oculaire et la paupière. Le cul-de-sac oculoconjonctival, la surface conjonctivale et la surface de la cornée constituent des exemples de régions extraoculaires. Cette localisation est extérieure à tous les tissus oculaires et il n'est pas nécessaire de faire appel à une procédure invasive pour accéder à cette région. Les exemples de systèmes extraoculaires incluent les inserts et les gouttes, gels ou pommades appliqués"localement"et que l'on peut utiliser pour délivrer une matière thérapeutique dans ces régions. Les dispositifs extraoculaires s'enlèvent en général facilement, et même le patient peut les retirer. Les brevets suivants décrivent des systèmes extraoculaires pouvant être utilisés pour administrer des médicaments dans les régions extraoculaires. Higuchi et coli. décrivent dans les brevets US ne 3 981 303,3 986 510 et 3 995 635 un insert oculaire biodégradable contenant un médicament. L'insert peut être fabriqué sous différentes formes s'adaptant dans le cul-desac du globe oculaire, espace extraoculaire entre le globe oculaire et la paupière. Plusieurs polymères biocompatibles courants sont décrits comme appropriés à une utilisation dans la fabrication de ce dispositif. Ces polymères sont notamment l'alginate de zinc, l'acide polylactique, l'alcool polyvinylique, des polyanhydrides et l'acide polyglycolique. Les brevets décrivent aussi des dispositifs revêtus de membranes qui réduisent la perméation du médicament et des chambres creuses contenant la formulation de médicament. Le brevet US ne 4 217 898 de Theeuwes, décrit des réservoirs microporeux utilisés pour contrôler la délivrance des médicaments. Ces dispositifs sont placés de façon extraoculaire dans le cul-de-sac oculaire. Les copolymères chlorure de polyvinyle-acétate de polyvinyl font partie des systèmes polymères intéressants. Kaufman décrit dans les brevets US no 4 865 846 et 4 882 150 un système de délivrance de médicaments ophtalmiques contenant au moins une matière biodégradable ou un support de pommade pour le sac conjonctival. Le brevet décrit des systèmes de polymères comme le poly- (lactid) le poly (glycolide), l'alcool polyvinylique et le collagène réticulé, en tant que systèmes de délivrance appropriés. Dans l'utilisation décrite dans la présente invention du produit protéique Rdcsfl pour le traitement d'une maladie ou d'une lésion rétinienne, il est également avantageux qu'une formulation ophtalmique appliquée localement inclut un agent pour favoriser la pénétration ou le transport de l'agent thérapeutique dans oeil. De tels agents sont connus dans la technique. Par exemple, Ke et coli., brevet US ne 5 221 696, décrivent l'utilisation de matières pour favoriser la pénétration de préparations ophtalmiques dans la cornée. Les systèmes intraoculaires sont des systèmes appropriés à une utilisation dans un compartiment tissulaire dans, entre ou autour des couches de tissu de l'oeil lui-même. Ces localisations incluent les espaces sous-conjonctivaux (sous la muqueuse oculaire adjacente au globe oculaire), orbitaux (derrière le globe oculaire) et intracaméraux (dans les chambres du globe oculaire elles-même). Contrairement au cas des systèmes extraoculaires, pour accéder à ces régions, il faut avoir recours à une procédure invasive consistant en une injection ou une implantation. Les brevets suivants décrivent des dispositifs intraoculaires. Wong, brevet US no 4 853 224, décrit des médicaments encapsulés à introduire dans la chambre de l'eil. Les polymères utilisés dans ce système incluent des polyesters et polyéthers. Lee, brevet U. S. no 4 863 457, décrit un dispositif biodégradable implanté chirurgicalement dans loeil pour une libération prolongée d'agents thérapeutiques. Le dispositif est conçu pour être implanté chirurgicalement sous la conjonctive (muqueuse du globe oculaire). Krezancaki, brevet US no 4 188 373, décrit un véhicule pharmaceutique se gélifiant à la température du corps humain. Ce véhicule est une suspension aqueuse du médicament et de gommes ou de dérivés synthétiques dérivés de cellulose. Haslam et coli. décrivent dans les brevets US no 4 474 751 et 4 474 752, un système polymère-médicament, liquide à la température ambiante et gélifié à la température du corps. Les polymères appropriés utilisés dans ce système incluent le polyéthylèneglycol et le polypropylèneglycol. Davis et coll. décrivent dans le brevet no 5 384 333 un polymère injectable biodégradable pour la délivrance de médicaments qui permet une libération prolongée du médicament. La composition médicamenteuse est constituée par un principe pharmaceutiquement actif dans une matrice de polymère biodégradable, la matrice de polymère étant solide à des températures dans la plage 200 à 37OC et étant fluide aux températures dans la plage de 38 à 52 C. Le polymère utilisé pour la délivrance de médicaments ne se limite pas à la délivrance de formulations de médicaments solubles ou liquides. Par exemple, ce polymère peut servir de matrice pour stabiliser et retenir à leur site d'injection des microsphères, des liposomes contenant des médicaments ou d'autres médicaments liés à des particules. Un véhicule particulièrement approprié à une injection intraoculaire est constitué par l'eau distillée stérile dans laquelle le produit protéiné Rdcsfl est formulé sous la forme d'une solution isotonique stérile, avec les conservateurs appropriés. Une autre préparation ophtalmique peut mettre en jeu la formulation du produit protéiné Rdcsfl avec un agent, par exemple des microsphères ou des liposomes injectables, permettant une libération lente ou prolongée de la protéine qui peut alors être délivrée sous la forme d'une injection retard. Parmi les autres moyens appropriés pour l'introduction intraoculaire du produit protéiné Rdcsfl, il existe des dispositifs de délivrance de médicaments implantables, ou contenant le produit protéiné Rdcsfl. Les préparations ophtalmiques de la présente invention, en particulier les préparations topiques, peuvent inclure d'autres composants, par exemple des conservateurs, des agents pour la tonicité, des cosolvants, des agents humidifiants, des agents complexant, des agents tampons, des antimicrobiens, des antioxydants et des tensioactifs acceptables sur un plan ophtalmique, tous bien connus de l'homme de l'art. Par exemple, les agents augmentant la tonicité appropriés sont notamment des halogénures de métaux alcalins (de préférence le chlorure de sodium ou de potassium), le mannitol, le sorbitol et analogues. L'agent augmentant la tonicité est ajouté de façon avantageuse en quantité suffisante pour que la formulation à instiller dans l'oil soit hypotonique ou sensiblement isotonique. Les conservateurs appropriés sont notamment, de façon non limitative, le chlorure de benzalconium, le thimérosal, l'alcool phénéthylique, le méthylparaben, le propylparaben, la chlorhexidin, l'acide sorbique et analogue. On peut aussi utiliser le peroxyde d'hydrogène comme conservateur. Les cosolvants appropriés sont notamment, de façon non limitative, la glycérine, le propylène glycol et le polyéthylèneglycol. Les agents complexant appropriés incluent la cafféine, la polyvinylpyrrolidone, ta p-cyctodextrine ou l'hydroxypropyl-, 8-cyclodextrine. Les tensioactifs ou agents mouillants appropriés sont notamment, de façon non limitative, les esters de sorbitane, les polysorbates tels que le polysorbate 80, la trométhamine, la lécithine, le cholestérol, le tyloxapol et analogues. Les tampons peuvent être des tampons classiques comme le borate, le citrate, le phosphate, le bicarbonate ou Tris-HCI. Les composants de la formulation sont présents à des concentrations acceptables pour le site extraoculaire ou intraoculaire d'administration. Par exemple, les tampons sont utilisés pour maintenir la composition à un pH physiologique ou à un pH légèrement inférieur, typiquement dans un intervalle de pH d'environ 5 à environ 8. Les autres composants de la formulation peuvent être notamment des matières prolongeant le temps de séjour de l'agent thérapeutique administré de façon extraoculaire, au niveau de de façon à augmenter le plus possible le temps de contact et à favoriser l'absorption. Les matières appropriées incluent les polymères ou les matières formant un gel qui augmentent la viscosité de la préparation ophtalmique. Le chitosan est une matière particulièrement appropriée pour le contrôle de la vitesse de libération oculaire dans les formulations de médicaments ophtalmiques à libération prolongée (se reporter au brevet US no 5 422 116, Yen et coil.). On peut évaluer la capacité des formulations de la présente invention à libérer de façon contrôlée (par exemple par délivrance prolongée) un agent ophtalmique dans l'oeil par diverses procédures connues de l'homme de l'art, par exemple comme celles décrites dans Journal of Controlled Release, 6 : 367-373,1987, ainsi que par leurs variantes. Outre les principes actifs, ces compositions pharmaceutiques peuvent contenir des supports appropriés pharmaceutiquement acceptables comprenant des excipients et des agents auxiliaires qui facilitent la transformation des composés actifs en préparations pouvant être utilisées pharmaceutiquement. On peut consulter pour d'autres détails sur les techniques de la formulation et de l'administration la dernière édition de l'ouvrage Pharmaceutical Sciences de Remington, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980). Les compositions pharmaceutiques pour une administration orale peuvent être formulées en utilisant des supports pharmaceutiquement acceptables bien connus dans la technique, en doses appropriées pour une administration orale. De tels supports permettent de formuler les compositions pharmaceutiques sous la forme de comprimés, de pilules, de dragées, de gélules, de liquides, de gels, de sirops, de bouillies, de suspensions et analogues, pour qu'elles soient ingérées par le patient. Les préparations pharmaceutiques pour une utilisation orale peuvent être obtenues en combinant les composés actifs avec un excipient solide, en broyant éventuellement le mélange obtenu et en transformant le mélange de granulés, après addition des additifs appropriés, si on le désire, pour obtenir des comprimés ou des noyaux de dragées. Les excipients appropriés sont des charges à base d'hydrate de carbone ou de protéines, comme des sucres et notamment du lactose, du saccharose, du mannitol ou du sorbitol ; de l'amidon de maïs, de froment, de riz, de pomme de terre et d'autres végétaux ; de la cellulose comme de la méthylcellulose, de l'hydroxypropylméthylcellulose ou de la carboxyméthylcellulose sodique ; des gommes et notamment de la gomme arabique et adragante ; et des protéines comme de la gélatine et du collagène. Si on le souhaite, on peut ajouter des agents de délitement ou de solubilisation, comme de la polyvinylpyrrolidone réticulée, de la gélose, de l'acide alginique ou un de ses sels comme de l'alginate de sodium. Les noyaux de dragées peuvent être utilisés en association avec des enrobages appropriés comme des solutions de sucre concentrées, pouvant également contenir de la gomme arabique, du talc, de la polyvinylpyrrolidone, un gel de carbopoi, du polyéthylèneglycol et/ou du dioxyde de titane, des solutions de laques et des solvants ou des mélanges de solvants organiques appropriés. On peut ajouter des colorants ou des pigments aux comprimés ou aux enrobages des dragées pour leur identification ou pour caractériser la quantité de principe actif, c'est à dire le dosage. Les préparations pharmaceutiques que l'on peut utiliser par voie orale incluent les gélules en gélatine, fermées par emboîtement, aussi bien que les capsules molles, fermées hermétiquement, en gélatine, avec un enrobage, par exemple de glycérol ou sorbitol. Les gélules à emboîtement peuvent contenir des principes actifs mélangés à une charge ou des liants, comme du lactose ou des amidons, des lubrifiants, comme du talc ou du stéarate de magnésium et éventuellement, des stabilisants. Dans les capsules molles, les principes actifs peuvent être dissous ou mis en suspension dans des liquides appropriés comme des huiles grasses, liquides, ou du polyéthylèneglycol liquide avec ou sans stabilisants. Les formulations pharmaceutiques appropriées à une administration parentérale peuvent être formulées en solutions aqueuses, de préférence dans des tampons physiologiquement compatibles comme une solution de Hank, une solution de Ringer ou un soluté salin tamponné physiologiquement compatible. Les suspensions aqueuses injectables peuvent contenir des substan- ces augmentant la viscosité de la suspension, par exemple de la carboxyméthylcellulose sodique, du sorbitol ou du dextrane. En outre, on peut préparer des suspensions de principes actifs sous la forme de suspensions huileuses injectables appropriées. Les solvants ou véhicules lipophiles appropriés incluent les huiles grasses comme l'huile de sésame ou les esters d'acides gras synthétiques comme l'oléate d'éthyle ou des triglycérides ou des liposomes. On peut aussi utiliser des polymères aminés polycationiques non lipidiques pour la délivrance du principe actif. Eventuellement, la suspension peut aussi contenir des stabilisants ou des agents appropriés qui augmentent la solubilité des composés et permettent la préparation de solutions très concentrées. Pour une administration topique ou nasale, on utilise dans la formulation des agents pénétrants appropriés à la barrière particulière à traverser. De tels agents pénétrants sont connus, sur un plan général, de l'homme de l'art. Les compositions pharmaceutiques de la présente invention peuvent être fabriquées selon des méthodes connues de l'homme de l'art, par exemple au moyen de procédés de mélange, de dissolution, de granulation, de dragéification, de lévigation, d'émulsification, de piégeage ou de lyophilisation classiques. Les compositions pharmaceutiques peuvent aussi être fournies sous la forme d'un sel et peuvent être associées à plusieurs acides et notamment, de façon non limitative, aux acides chlorhydrique, sulfurique, acétique, lactique, tartrique, malique, succinique, etc. Les sels ont tendance à être plus solubles dans les solvants aqueux et les autres solvants protoniques que les formes basiques libres correspondantes. Dans d'autres cas, la préparation préférée peut être une poudre lyophilisée qui peut contenir un des produits suivants ou tous : histidine 1-50 mM, saccharose 0, 1 % à 2 % et mannitol 2 à 7 %, dans un intervalle de pH de 4,5 à 5,5, combinée au tampon avant emploi. Les compositions pharmaceutiques ayant été préparées, on les place dans un conditionnement approprié, étiqueté pour le traitement d'une pathologie indiquée. Pour l'administration de Rdcsfl, ces étiquettes mentionneront la quantité de produit à administrer et la fréquence et la méthode d'administration. Les compositions pharmaceutiques utiles dans l'invention incluent les compositions dans lesquelles les principes actifs sont contenus en une quantité efficace pour atteindre l'objectif fixé. L'homme de l'art dispose de toutes les compétences lui permettant de déterminer la dose efficace. Pour un composé, on peut estimer d'abord la dose thérapeutique efficace en effectuant des essais en cultures cellulaires, par exemple de cellules néoplasiques, ou des essais sur des modèles expérimentaux chez l'animal, en général la souris, le lapin, le chien ou le cochon. On peut également utiliser le modèle animal pour déterminer l'intervalle de doses approprié et la voie d'administration. De telles informations peuvent ensuite être utilisées pour déterminer les doses utiles et les voies d'administration chez l'homme. On entend par dose thérapeutique efficace la quantité de principe actif, par exemple de Rdcsfl ou de ses fragments, d'anticorps à Rdcsfl, d'agonistes, qui améliore les symptômes ou la pathologie. On peut déterminer l'efficacité thérapeutique et la toxicité par des procédures pharmaceutiques standards dans des cultures cellulaires ou chez des animaux d'expérience, par exemple la DE50 (dose thérapeutiquement efficace dans 50 % de la population) et la DL50 (dose létale pour 50 % de la population). Le rapport de doses entre les effets toxiques et thérapeutiques est l'indice thérapeutique et il peut être exprimé par le rapport DL50/DE50. Les compositions pharmaceutiques dont les indices thérapeutiques sont élevés sont préférables. Les données obtenues à partir des essais en cultures de cellules et des expérimentations animales sont utilisées dans la définition d'un intervalle posologique pour l'utilisation chez l'homme. La dose contenue dans de telles compositions se situe de préférence dans une plage donnant des concentrations circulantes incluant la DL50 et n'entraînant pas de toxicité, ou en entraînant peu. La dose varie dans cette plage selon la forme pharmaceutique utilisée, la sensibilité du patient et la voie d'administration. La dose exacte sera déterminée par le médecin praticien, en fonction de facteurs liés au sujet auquel le traitement est destiné. La posologie et l'administration sont ajustées de telle façon que l'on obtienne des taux de principe actif suffisants, ou pour maintenir l'effet désiré. Les facteurs à prendre en compte sont notamment la gravité de la pathologie, l'état général de santé du sujet, son âge, son poids et son sexe, son alimentation, le moment et la fréquence de l'administration, le ou les médicaments associés, les sensibilités aux médicaments, et la tolérance et la réponse au traitement. Les compositions pharmaceutiques à longue durée d'action peuvent être administrées tous les 3 ou 4 jours, chaque semaine ou une fois tous les quinze jours en fonction de la demi-vie et de la vitesse d'élimination de la formulation concernée. Les doses normales peuvent varier de 0,1 à 100 000 microgrammes, jusqu'à une dose totale d'environ 1 g, selon la voie d'administration. On trouve dans la littérature des conseils pour des posologies et des méthodes de délivrance particulières et les médecins praticiens disposent, sur un plan général, de ces informations. L'homme de l'art utilisera pour les nucléotides des formulations différentes de celles pour les protéines ou leurs inhibiteurs. De même, la délivrance des polynucléotides ou des polypeptides sera spécifique et fonction notamment des cellules, des conditions, des localisations particulières, etc. Des formulations pharmaceutiques appropriées à l'administration orale de protéines sont décrites, par exemple, dans les brevets US 5 008 114 ; 5505 962 ; 5641 515 ; 5681811 ; 5 700486 ; 5 766633 ; 5 792 451 ; 5 853 748 ; 5972 387 ; 5976 569et6051 561. Les exemples suivants illustrent la présente invention, mais n'en limitent nullement la portée. EXEMPLES CLONAGE D'EXPRESSION 1) PURIFICATION DE L'ARN TOTAL DE RÉTINES DE SOURIS NORMALES ÂGÉES DE CINQ SEMAINES : On a construit une banque d'ADNc en utilisant des rétines de souris C57BL/6&commat;N âgées de 5 semaines, en suivant, sur un plan général, la méthode de Glissin et coli. (1974), Biochemistry, 13, 2633-2637. En bref, après sacrifice, les animaux ont été énucléés et leurs yeux ont d'abord été placés dans un soluté salin tamponné au phosphate (PBS) supplémenté par 0,1 % de pyrocarbonate de diéthyle (DEPC). On a disséqué rapidement la rétine neurale (en ne conservant pas dans cette préparation tissulaire l'épithélium pigmenté de la rétine). Rapidement après chaque dissection, on a homogénéisé les tissus dans du chlorure de guanidinium (GC) 6M frais. On a introduit 10 rétines dans 2, 4 ml de GC dans des tubes stériles de 4 mi et on a totalement détruit les tissus par homogénéisation intense pendant 1 minute à la température ambiante. PURIFICATION DE L'ARN MESSAGER (ARNm) À PARTIR DES RÉTINES DE SOURIS NORMALES ÂGÉES DE CINQ SEMAINES On a isolé l'ARN messager sur des perles poreuses enrobées d'oligo-dT (Oligotex, Qiagen) dans des conditions de stringence selon la méthode de Kuribayashi et coli., (1988) Nuclek Acids Res. Symposium series, 19, 61- 64. En bref, on mélange 100-150 7g d'ARN total de rétine de souris avec 15 vil de perles oligo-dT dans un tampon de liaison [Tris 10 mM pH 7, 5 ; NaCl 0,3 M, EDTA 0,1 M ; dodécylsulfate de sodium (SDS) 0,5 % masse/volume] et on met à incuber 6 minutes à 65 C dans un bécher d'eau de 0, 5 1, puis on refroidit progressivement jusqu'à la température ambiante en environ 3 à 4 heures et on centrifuge à la température ambiante pour récupérer les perles de gélose. On les lave ensuite deux fois en les mettant à incuber pendant 10 minutes dans 0,4 ml de (Tris 0,1 M pH 7,5 ; NaCl 0,1 M, EDTA 0,1 M ; SDS 0,5 % masse/volume). On élue l'ARN lié (ARNm) en deux étapes avec 50 pi d'eau sans ARNase tiédie à 70 C, on le fait précipiter avec 1 Oui d'acétate de sodium pH 5,2 et 0, 25 ml d'éthanol et on met à incuber pendant 12 heures à-70C. On recueille l'ARNm par centrifugation (1 heure à 15 000 tours par minute, puis deux lavages avec de l'éthanol à 70 %) et on le remet en suspension dans 20 I d'eau sans ARNase. On a mesuré la concentration d'ARNm à 260 nm et vérifié l'absence de contaminations par ARNr par électrophorèse sur gel dans les conditions de dénaturation indiquées ci-dessus. SYNTHÈSE DE L'ADNc : Elle a été réalisée selon la méthode d'Okayama et Berg, (1982), Mol CpA ? 2, 161-170. La synthèse du premier brin a été amorcée par 2, 5 Jig d'un oligonucléotide lieur Not ! (5'TGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGACAA (T) 18 3', SEQ ID ? 7) avec une incubation pendant 2 heures avec 50 unités de transcriptase inverse du virus de la leucémie murine Moloney (M-MLV) modifié (Superscript Il, Life Technology) dans les conditions recommandées par le fournisseur. Pour la synthèse du second brin, le mélange réactionnel a été mis à incuber pendant 4 heures à 14 C avec 4 unités de ARNaseH et 100 unités de ADN polymérase 1 dans un tampon SS [Tris 40 mM pH 7,2 ; chlorure de potassium 82 mM ; chlorure de magnésium 4,4 mM ; DTT 3 mM ; 5 uglml de sérumalbumine bovine (BSA)] sous un volume final de 0,25 ml. On a ligaturé des lieurs EcoRI (5'OH AATTCGGCACGAGG 3'-OH-3'-OH GCCGTGCTCC5'-P04, SEQ ID N"8-SEQ ID ? 9) aux deux extrémités de l'ADNc double brin en 14 heures à 16 C en utilisant 40 unités de T4 DNA ligase (Promega, Madison, Etats-Unis) sous un volume total de 20 ut dans les conditions recommandées par le fournisseur. Les produits de cette réaction sont un dscDNA ayant un demi-site EcoRI en 5'et un demi-site Nod en 3'que l'on peut orienter dans le vecteur de clonage. LIGATURE DE dscDNA DANS pcDNA3 : Elle a été réalisée selon Maniatis T. (1992), Molecular cloning : a laboratory manual, 2"'édition, en utilisant 10 pg de plasmide pcDNA3 (Invitrogen) préparé par coupure avec EcoRI et Notl (Promega, Madison, Etats-Unis) dans les conditions recommandées par le fournisseur. PROPAGATION DES CLONES RECOMBINÉS : Elle a été réalisées, sur un plan général, conformément à la méthode de Birnboim et coll. (1979), ivucleic Acids, Res.,, 7, 1513-1523. En bref, pour obtenir des pools de 100 clones primaires, nous avons légèrement modifié le protocole de transformation XL1 Gold (Strategene) (fourni par Stratagene) comme suit. Après une incubation dans un milieu de croissance, on a porté le mélange réactionnel de la transformation à 20 % (v/v) de glycérol et 8 % (v/v) de sérum albumine de cheval (HAS, Life Technologies). HAS et le glycérol empêchent la mort après des cycles de congélationdécongélation. On a réalisé un titrage sur plaques de gélose (1 00 pg/ml d'ampicilline) en déposant des volumes croissants de chaque mélange réactionnel de transformation pour calculer le volume donnant 100 colonies, le mélange réactionnel de transformation étant conservé à-80"C. On a purifié les plasmides recombinés de la banque par 96 à la fois. Pour préparer 96 pools de 100 clones, on a mis sur des plaques de gélose le volume calculé correspondant à 100 clones et on a procédé à la culture pendant 20 heures à 37 C. On a purifié l'ADN directement à partir des colonies récupérées des plaques de gélose. On a conservé un stock de chaque culture avec 23 % de glycérol à-80 C. On a purifié l'ADN avec Qiawell ultra (Qiagen) en suivant le protocole recommandé par le fournisseur. On a obtenu, typiquement, 10 g de plasmide purifié et on a mesuré la concentration de chaque préparation en utilisant la densité optique à 260 nm. Pour subdiviser les pools de 100 choisis en pools de 10, on a mis sur plaque de gélose 50 pi d'une dilution à 1/250 000 du stock avec glycérol du pool original, avec 100 ugli d'ampicilline. Après 16 heures de croissance à 37OC, on a répliqué 160 colonies individuelles sur 16 plaques de gélose (10 par plaque) et on les a cultivées 16 heures à 37 C. On a recueilli les 10 colonies de chaque plaque et on les a cultivées dans un milieu liquide (Luria Broth (LB), 100 pg/ml d'ampicilline pendant 3 heures à 37C. On a conservé un stock de ces cultures à 30 % de glycérol à-80"C. On a préparé l'ADN du plasmide comme ci-dessus. Pour diviser des sous-pools de 10 en clones individuels, on a mis sur plaque de gélose 50, ) d'une dilution à 1/250 000 du stock avec glycérol des sous-pools de 10 avec 100 g/ml d'ampicilline. Après 16 heures de croissance à 37OC, on a repiqué 16 colonies individuelles et on les a cultivées 16 heures dans 2 ml de LB avec 100 g/ml d'ampicilline. On a conservé un stock de ces cultures à 30 % de glycérol à-80 C. On a préparé l'ADN du plasmide comme ci-dessus. TRANSFECTION TRANSITOIRE DANS DES CELLULES COS-1 : Elle a été réalisée par la méthode de Chen et Okayama, (1987) High efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol. Cell 7, 2745-2752. CULTURES RÉTINIENNES D'EMBRYONS DE POULETS : Le protocole a été adapté de celui d'Adler et Hatlee [ (1989) Science, 243, 391]. Des rétines d'embryons de poulets (6 jours in ovo) ont été dissociées et mises en culture monocouche. Dans ces conditions de culture, en l'absence de signaux de différenciation, les cônes représentent 60-80 % des cellules. Nous avons produit chez des lapins des anticorps polyclonaux dirigés contre la visinine (marqueur de cônes du poulet. Numéro d'enregistrement Genbank M84729) et nous avons vérifié que la proportion de cônes dans notre culture est de 60-80 %. L'environnement simple de notre modèle (milieu défini chimiquement, absence de contacts de cellule à cellule), ajouté à la facilité et la rapidité de la méthode, en fait un système très adapté à l'étude des facteurs trophiques impliqués dans la survie des cônes. En bref, on dissèque des rétines d'embryons provenant d'un groupe témoin de progéniteurs au bout de 6 jours de développement in ovo, on dissocie les cellules et on les met en culture sur plaques à faible densité (105 cellules /cm2). Pendant 10 jours, on suit la viabilité des cellules (60-80 % de cônes) en utilisant un test LIVE/DEAD (Molecular probes, Eugene, USA), test quantifiant les cellules vivantes et mortes. Le nombre de cellules vivantes diminue jusqu'à 8 % du nombre initial au bout de 7 jours de culture dans un milieu défini chimiquement. Quand ce test est réalisé en présence d'un milieu conditionné provenant de cellules COS 1 transfectées par des pools de clones de la banque, le nombre des cellules vivantes est déterminé au bout de sept jours in vitro. Les progéniteurs de poulet (label rouge souche 657) étaient maintenus dans un compartiment séparé, pour cette expérimentation, dans une installation de production d'oeufs à couver située à 25 km du laboratoire. Les oeufs fertilisés, obtenus naturellement, étaient recueillis toutes les semaines et maintenus à 17OC (leur zéro biologique) dans le laboratoire après leur obtention. Quotidiennement, 5 oeufs sont mis à incuber pendant 24 heures à 20 C puis 136 heures à 37 C avec inversion de l'inclinaison des oeufs de temps en temps, dans une chambre humidifiée. Le jour de la culture, la surface des oeufs est lavée par du Mucocit-A, puis brisée et les embryons de poulet sont transférés dans du PBS. On vérifie que chaque embryon en est au 29"niveau du stade de développement par comparaison visuelle à l'échelle de Hamburger et Hamilton (1951), dans (Essential Development Biology, Stern et Holland éditeurs). On choisit deux embryons, on prélève leurs yeux et on transfère ceux-ci dans un milieu indépendant de C02 (Life technologies). On prélève les rétines et on les transfère dans un tampon de Ringer, puis on les lave deux fois. On découpe les rétines en petits morceaux et on les traite 20 minutes à 37 C par une solution de trypsine (0,25 % P/V). On stoppe la réaction par addition d'un milieu de culture (M199, Life technologies) supplémenté par 10 % de FCS inactivé. On traite la suspension cellulaire pendant quelques minutes dans 25/il d'ADNase (1 mg/ml, Sigma). On lave ensuite la suspension de cellules deux fois dans un milieu de culture défini chimiquement [CDCM, volumes égaux de DMEM et de milieu M199 (Life technologies) et AB avec des suppléments (5 g/ml d'isnuline, 5 g/ml de transferrine ; progestérone 64 nM ; putrescine 0,1 mM ; 5 ng/ml de sélénium ; taurine 3 mM ; cytidine 5'-diphosphoéthanolamine 2, 7 uM ; cytidine 5'-diphosphocholine 5, 2 lis ; 0, 2 pg/ml d'hydrocortisone ; 3, 3', 5- triiodo-L-thyronine 30 nM ; pyruvate de sodium 1 mM), prostaglandine D2 0, 3/iM ; 0,1 mg/ml l d'acide linoléique] pour éliminer le FCS. On a mesuré la concentration des cellules colorées par du bleu de trypan à l'aide d'une cellule de Mallassez et on a porté les cellules à deux concentrations (5,6 et 1,12 105 cellules/ml) correspondant aux deux densités de culture sur plaques (2 et 4 105 cellules/cm2). On a décongelé les milieux conditionnés de cellules Cos-1 transfectées sur de la glace et on a transféré 50/il sur deux plaques noires de cultures tissulaires à 96 puits traitées (Corning Star), revêtues d'une solution de 100 pg/ml de poly-L-lysine (Sigma) conformément au plan : PREMIÈRE ÉTAPE DU CRIBLAGE 1 1 1 1 2C 2 2 2 3 3P C 3 3 4 4 4 C 4 5 5 5 5 6 C 6 6 6 7 7 C 7 7 8 8 8 8 C 9 9 9 9 10 C 10 10 10 11 11 11 C 11 12 12 12 12 C 13 13 13 13 14 14 C 14 14 15 15 15 C 15 16 16 16 16 17 C 17 17 17 18 18 C 18 18 19 19 19 19 P 20 20 20 C 20 Dans ce tableau les chiffres désignent le numéros de pools de 100 clones, C désigne le milieu conditionné de cellules Cos-1 transfectées par le vecteur vide (pcDNA3) et P un témoin positif (milieu conditionné transfecté par pcDNA-GDNF de souris). SECONDE ET TROISIÈME ÉTAPES DU CRIBLAGE x.(y).01 x.(y).01 x.(y).01 x.(y).01 x.(y).02 C x. (y). 02 x. (y). 02 x. (y). 02 x. (y). 03 x. (y). 03 p C x. (y). 03 x. (y). 03 x. (y). 04 x. (y). 04 x. (y). 04 C x. (y). 04 x. (y). 05 x. (y). 05 x. (y). OS x. (y). 05 x. (y). 06 C x. (y). 06 x. (y). 06 x. (y). 06 x. (y). 07 x. (y). 07 C x. (y). 07 x. (y). 07 x. (y). 08 x. (y). 08 x. (y). 08 x. (y). 08 C x. (y). 09 x.(y).09 x.(y).09 x.(y).09 x.(y).10 C x.(y).10 x.(y).10 x.(y).10 x. (y). 11 x. (y). 11 x. (y). l1 C x. (y). 11 x. (y). 12 x. (y). 12 x. (y). 12 x. (y). 2 C x. (y). 13 x. (y). 13 x. (y). 13 x. (y). 3 x. (y). 14 x. (y). 14 C x.(y).14 x.(y).14 x.(y).15 x.(y).15 x.(y).15 C x.(y).15 x. (y). 16 x. (y). 16 x. (y). 16 x. (y). 16 x. (y) C x.(y) x.(y) x.(y) C57 C57 C C57 C57 C3H C3H C3H OH P 0 0 0 C 0 Dans ce tableau x (seconde étape) et y (troisième étape) représentent le numéro de pools sélectionnés respectivement dans la première et la seconde étape. 01 à 16 représentent les sous-pools utilisés. x (y) représente le pool parental dont sont issus les 16 pools. C est tel que défini dans la première étape. P a été modifié et est pCMVScript-CNTF dans la seconde étape et progressivement pcDNA-939. 09. 08 dans la troisième étape. 0 représente les cellules de cône de poulet dans le milieu CDCM seul. C57 et C3H sont les milieux conditionnés provenant d'explants de rétines préparées comme décrit dans"préparation de milieux conditionnés à partir d'explants de rétines de souris"à partir de rétines de souris respectivement C57BL/6&commat;N et C3H/He&commat;N âgées de 5 semaines. *On a ajouté 50 pl de suspensions de cellules correspondant aux deux densités (2 et 4 105 cellules/cm2) dans les puits des deux plaques à 96 puits remplis de milieux conditionnés à l'aide d'une pipette motorisée à 8 canaux (Biohit) de façon à minimiser les erreurs expérimentales. On a mis les cellules à incuber pendant 7 jours à 37 C dans 5 % de C02. PRÉPARATION DE MILIEUX CONDITIONNÉS À PARTIR D'EXPLANTS DE RÉTINES DE SOURIS La seconde et la troisième étapes du criblage incluaient des témoins positifs selon une variante de la méthode de Mohand-Saïd et colI. (1998). On a sacrifié des souris C57BL/6&commat;N (type sauvage) et C3H/He&commat;N (roda âgées de 5 semaines et on les a énucléées. On a disséqué deux rétines et on les a mises à incuber pendant 24 heures à 37 C dans 5 % de C02 dans 1, 5 mi de CDCM dans des plaques à 12 puits. On a récupéré les milieux conditionnés et on les a concentrés d'un facteur 40 par ultrafiltration sur un Vivaspin (Sartorius, point de coupure 10 kDa). On a congelé les milieux conditionnés dans de l'azote liquide et on les a conservés, divisés en fractions aliquotes, à-20 C avant emploi. Le jour de leur utilisation, on a décongelé les milieux conditionnés sur de la glace, on les a dilués 10 fois dans du CDCM et on les a stérilisés par filtration sur un filtre 0, 22 um (Acrodisk 13, Gelman Sciences). TEST FONCTIONNEL, TEST lIVE/DEAD : Le test fonctionnel est fondé sur le nombre de cellules rétiniennes de poulet vivantes au bout de 7 jours d'incubation in vitro. On a utilisé le kit de test LIVE/DEAD (Molecular probes, Eugene, Etats-Unis), qui se fonde sur l'utilisation de deux colorants fluorogènes (Calcein AM et dimère d'éthidium) qui colorent les cellules vivantes et mortes respectivement. Une cellule vivante met en jeu une activité métabolique (ici une activité estérasique) qui convertit le substrat (Calcein AM) en son dérivé fluorescent qui émet à 520 nm. La perméabilité membranaire d'une cellule morte est altérée, ce qui permet la coloration de l'ADN du noyau par le dimère d'éthidium qui émet à 635 nm. Une cellule est vivante si elle émet à 520 nm après excitation à 485 nm ou morte si elle émet à 635 nm après excitation à 520 nm. Grâce à une microscopie à épifluorescence, il est possible de visualiser séparément les deux types de cellules fluorescentes. Au bout de 7 jours in vitro, les cellules sont mises à incuber pendant 30 minutes à la température ambiante dans l'obscurité avec Calcein-AM 2, 7, uM et Ethidium dimer 0,3 mM. ACQUISITION DES IMAGES : En bref, l'acquisition des images consiste en une autofocalisation dans chaque puits, un comptage automatique des cellules dans les deux fluorescences, suivi du traitement des données brutes à l'aide d'un logiciel spécialisé, par exemple Metamorph (Universal Imaging Corporation, West Chester, Etats, Unis), de façon à obtenir des images numérisées de chaque puits de la plaque. Nous avons utilisé un microscope inversé (Nikon TE 200) équipé d'une lampe épifluorescente au mercure à deux filtres d'excitation à 485 et 520 nm et deux filtres d'émission à 520 et 635 nm, d'un objectif (x 10), d'une platine motorisée commandée par ordinateur (Multicontrol 2000, Martzauzer) et d'une caméra à dispositif à transfert de charge (CCD) (Cohu). Pour enregistrer la plaque, on la positionne sur la platine motorisée, on fait le point manuellement sur le premier puits et ce plan est enregistré (origine z). Le seuil de l'image morte et vivante est fixé dans le premier puits. Le centre du premier puits est ajusté au moyen de la lumière blanche par alignement manuel du fond du premier puits sur le fond de l'image sur l'écran de l'ordinateur, puis par alignement de l'extrême droite du premier puits sur la droite de l'image sur l'écran de l'ordinateur, puis par enregistrement des deux positions. Le centre du premier puits est calculé et donne la position du centre de chaque puits de la plaque. Nous avons noté au cours de la mise au point du procédé que les cellules sont légèrement plus denses sur les bords du puits et nous avons exclu les bords des acquisitions. Il est important que l'image de chaque puits soit parfaitement centrée pour éviter tout résultat trompeur. Quand l'ajustement est réalisé, un premier balayage de la plaque enregistre les cellules mortes. La densité des cellules mortes est moins variable dans ces conditions. L'application exécute une autofocalisation en prenant des images en différents plans focaux et en choisissant la plus brillante. Cette position z est mémorisée et la platine exécute des mouvements programmés selon les axes x et y ; elle prend au total 4 images qui, quand elles sont reconstituées en une image, représentent les 2/3 de la surface du puits. Un fichier d'images des plans focaux est mémorisé pour contrôle. La platine exécute une autofocalisation et quatre acquisitions pour chaque puits de la plaque en commençant aux puits Al jusqu'à A12, puis B12 jusqu'à Bl, CI jusqu'à Cl 2, etc. A la fin, la platine se déplace pour sortir de la plaque et surexposer le dernier puits (HO. Le balayage des cellules mortes dure 30 minutes. Le second balayage (cellules vivantes) est exécuté après changement du filtre. Le second balayage utilise les positions z enregistrées pour chaque puits dans la lecture des cellules mortes. Quatre images sont prises dans chaque puits, comme pour les cellules mortes. A la fin de ce second balayage (22 minutes), les images reconstituées pour les cellules mortes et vivantes sont mémorisées dans un fichier qui se voit attribuer automatiquement un nom avec la date du jour. Les nombres de cellules (mortes et vivantes) sont comptés automatiquement avec des paramètres morphométriques (moyens) prédéfinis et affichés sur l'écran de l'ordinateur pour que l'on puisse vérifier si l'expérience est correcte. Il est important de vérifier quotidiennement que le nombre de cellules vivantes n'est pas trop élevé. Nous avons observé que, si elles sont cultivées à une densité trop importante, les cellules de la rétine du poulet survivent plus longtemps, sans doute en produisant leur propre facteur de survie. Nous avons testé les cellules en l'absence de cet effet. Avant balayage de la seconde plaque (même expérience avec une densité de cellules double), nous ajoutons un il à la fin du nom du fichier des enregistrements de la première plaque. Les images de chaque expérience sont mémorisées sur un CD-rom. Nous avons produit une banque de plus de 250 CD-rom. COMPTAGE DES CELLULES ET SÉLECTION DES POOLS : Nous avons déterminé le nombre des cellules (mortes et vivantes) en utilisant les images de chaque expérience stockées sur CD-rom. Nous avons d'abord chargé le fichier des enregistrements d'une expérience dans l'ordinateur (comptage en différé) et l'avons ouvert avec le logiciel Metamorph. Dans une première étape, les images correspondant aux 14 puits C (milieux conditionnés provenant de cellules Cos-1 transfectées par le vecteur vide) sont ouvertes. Après ajustement du seuil de l'image, on utilise la commande Integrated Morphometry Analysis pour mesurer la distribution des surfaces entre 10 et 250 de l'objet (nombre de cellules vivantes pour chaque surface totale) pour ces puits témoins. La distribution suit une courbe gaussienne, le nombre maximal d'objets correspondant à une cellule isolée. Cette valeur standard (SV) est ensuite utilisée pour calculer la valeur de la surface au-dessus de laquelle un objet sera compté comme étant deux cellules (seuil de coupure d'un objet standard, SOC) grâce à notre fonction empirique : SOC = 29/20, 74 SV. La valeur SOC de chaque plaque individuelle est utilisée pour compter le nombre de cellules vivantes de la plaque. Ces nombres sont ensuite transférés dans un tableau Excel. Pour la première étape de criblage, nous avons porté sur un graphe une valeur pour chaque pool en l'exprimant sous la forme d'une différence relative (augmentation ou diminution des nombres de cellules vivantes) par rapport à la moyenne des 14 puits témoins l'écart type. Pour éliminer les variations provenant des différences de position dans la plaque, nous avons calculé la moyenne des différences relatives trouvées individuellement pour les 80 puits correspondant aux positions dans lesquelles les pools ont été testées et les 14 puits témoins pour 200 plaques indépendantes. En moyenne, les différences observées sont dues uniquement aux différences de position et les nombres de cellules ont été corrigés par ce coefficient. Pour différencier de façon plus rigoureuse les pools à sélectionner, nous avons considéré sur le graphe comme des témoins toutes les valeurs des différences relatives ne dépassant pas 1,3 mais dépassant 0,4. Ainsi, tous les pools dont la différence relative par rapport aux 14 puits correspondant au vecteur vide sont dans l'intervalle de 0,4 à 1,3 sont considérés comme n'ayant pas d'effet et sont utilisés comme témoins. Après correction, les différences relatives par rapport aux témoins des deux plaques ont été multipliées et le résultat trié par différence relative décroissante. Nous avons encore vérifié les pools en haut de cette liste en inspectant visuellement le graphe correspondant aux 20 pools de l'expérience (pour les deux plaques) et les images des cellules mortes et vivantes pour ne pas sélectionner de pools faussement positifs. Pour la seconde et la troisième étapes, le criblage des sous-pools des plaques comprend un témoin supplémentaire. Nous avons préparé des milieux conditionnés à partir d'explants de rétines d'animaux âgés de 5 semaines. Nous avons sélectionné des expériences où des effets positifs avaient été enregistrés pour des explants de rétine prélevés sur des souris C57BL/6&commat;N et nous avons rejeté les autres. Les résultats ont été exprimés par la différence trouvée par rapport aux 14 puits témoins, sans nouveau calcul pour les témoins. Les différences relatives par rapport aux témoins des deux plaques ont été multipliées et les résultats ont été triés par différence relative décroissante pour les 16 sous-pools. L'ADNc isolé a été séquencé en utilisant une amorce T7 (S'GTAATA- CGACTCACTATAGGGC 3', SEQ ID NO 10) sur un séquenceur capillaire (CEQ2000, Beckman Coulter). La séquence de l'ADN a été comparée aux bases de données en utitisantun"Basic Locat Atignment Search Tool" (BLAST). ANALYSE PAR RT-PCR EN TEMPS RÉEL DE L'EXPRESSION DE RDCSF1 : L'expression rétinienne de Rdcsfl par des souris C57BL/6&commat;N et C3H/ He&commat;N âgées de 5 semaines a été étudiée par RT-PCR en temps réel sur un dispositif Lightcycler (Roche) avec un kit de PCR Sybergreen. Les ADNc ont été produits par amorçage avec un oligonucléotide hexamère aléatoire (pdN6, Amersham), une transcriptase inverse M-MLV (superscript 11, Life Technologies) et un ARN total de rétine de souris préparé comme dans 1). L'ADNc a été normalisé en utilisant un messager ubiquitaire Glucose-6- phosphate déshydrogénase (G6PDH). On a amplifié 0, 2 pl de la synthèse du premier brin de l'ADNc (équivalent à 10 ng DARN total) avec 2 M des oligonucléotides de SEQ ID N : 3 et SEQ ID N : 4 en triple sous un volume total de 25 pu en utilisant le programme suivant : 30 secondes à 95 C et 35 cycles d'une séquence (1 seconde à 95'Cil 18 secondes à 55OC, 10 secondes à 72OC). L'analyse (figure 3) montre que l'expression de Rdcsfl diminue après dégénérescence des bâtonnets chez la souris rdl (C3H/He&commat;N). Les produits ont été contrôlés par électrophorèse sur gel d'agarose. Des résultats similaires ont été obtenus avec une autre paire d'amorces spécifiques de Rdcsfl. Comme témoin positif, on a contrôlé l'expression de l'arrestine des bâtonnets (n M24086) dans les mêmes conditions avec les amorces (5' CTATTACGTCAAGCCTGTAGCC 3', SEQ ID N"11 et 5'CATCCTCA- TCTTTCTTCCCTTC 3', SEQ ID N"12). On a pu obtenir la confirmation que Rdcsfl est le facteur protecteur des cônes en ajoutant une quantité appropriée de Rdcsfl 1 à un expiant rétinien de souris rV (C3H/He&commat;N) âgées de 5 semaines. On peut déterminer la quantité appropriée par quelques expériences de titrage initiales. La comparaison avec des témoins appropriés après 7 jours montre que le taux de survie des cônes est augmenté. FACTEUR SPÉCIFIQUE DES BÂTONNETS L'analyse par RT-PCR en temps réel, effectuée dans des conditions standards, de l'expression de l'arrestine des bâtonnets (témoin) et de Rdcsfl dans des explants rétiniens de souris C57BL/6&commat;N âgées de 5 semaines et de souris (C3H/He&commat;N) âgées de 5 semaines, en utilisant comme amorces : SEQ ID No : 3 : 5'TCTATGTGTCCCAGGACCCTACAG 3' SEQ ID NO : 4 : 5 TTTATGCACAAGTAGTACCAGGACAG 3' a démontré que Rdcsfl ne s'exprime qu'en présence de bâtonnets (CSF1 obtenu à partir de bâtonnets ou Rod-derivedCSFl). PRODUCTION D'ANTICORPS POLYCLONAUX : Les anticorps polyclonaux ont été préparés en injectant une protéine de fusion de gluthathion-S-transférase purifiée (GST-Rdcsfl) à des lapins. La cassette du produit de fusion pGST-Rdcsfl a été préparée par amplification avec les oligonucléotides de SEQ ID N : 5 et de SEQ ID N : 6 en utilisant pcDNA-Rdcsfl comme matrice dans des conditions standards. Le cadre ouvert de lecture (ORF) de Rdcsfl a été cloné dans le cadre dans pGex2TK (Pharmacia) entre les sites de restriction BamHI et EcoRI et transformé dans E. coli [BL21 (DE3) pLysS, Promega] par une procédure standard. On a cultivé une colonie unique dans 3 litres de milieu liquide LB avec 100, ug/ml d'ampicilline à 30 C, on a induit la production de la protéine par addition de 1 7g/ml d'isopropylthio-p-D-galactoside (IPTG) et on a poursuivi pendant 5 heures à 30oc. Les cellules ont été recueillies, Iysées par sonification et purifiées sur glutathion sépharose en utilisant un protocole standard. On a élué la protéine de fusion avec du glutathion réduit 10 mM à la température ambiante. On a dialysé la protéine éluée dans du PBS avant de l'injecter à des lapins. La pureté de la protéine a été contrôlée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Deux lapins ont été immunisés par injection intradermique, en 80 sites, de 100, tug de GST-Rdcsfl purifiée. On a prélevé le sérum au bout de 8 semaines. REVENDICATIONS 1. ADN isolé comprenant une séquence nucléotidique représentée dans SEQ ID NI : 1. 2. Cellule hôte comprenant un ADN isolé selon la revendication 1. 3. Molécule vecteur comprenant au moins un fragment d'un ADN isolé selon la revendication 1. 4. Molécule vecteur selon la revendication 3 comprenant des séquences de contrôle de la transcription. 5. Polypeptide isolé comprenant la séquence d'aminoacides représentée dans SEQ ID NI : 2. 6. Polypeptide isolé constitué par la séquence d'aminoacides représentée dans SEQ ID NI : 2. 7. ADN isolé comprenant une séquence nucléotidique codant pour le polypeptide selon la revendication 6. 8. ADN isolé comprenant une séquence nucléotidique d'environ 30 à environ 50 nucléotides qui s'hybride dans des conditions de forte stringence avec l'ADN isolé selon la revendication 1. 9. Cellule hôte comprenant une molécule vecteur selon la revendication 3. 10. Cellule hôte de vertébré qui peut être propagée in vitro et qui est capable, par culture, de produire un polypeptide selon la revendication 5, ladite cellule comprenant au moins une séquence de contrôle de la transcription qui n'est pas une séquence de contrôle de la transcription humaine, où une ou plusieurs des dites séquences de contrôle de la transcription contrôlent la transcription d'un ADN codant pour un polypeptide selon la revendication 5. 11. Cellule de vertébré selon la revendication 10, dans laquelle une ou plusieurs desdites séquences d'ADN contrôlant la transcription sont des séquences de contrôle de la transcription non-humaines. 12. Méthode pour le diagnostic d'une dystrophie rétinienne chez l'homme comprenant la détection d'une diminution de la transcription de l'ARN messager transcrit à partir de l'ADN selon la revendication 7 dans l'oeil d'un homme, ladite diminution de transcription constituant un diagnostic de ladite atteinte de l'homme par une dystrophie rétinienne. 13. Méthode selon la revendication 12, dans laquelle ledit ADN a la séquence nucléotidique représentée dans SEQ ID NO : 1. 14. Méthode pour le diagnostic d'une dystrophie rétinienne chez l'homme comprenant la mesure de la quantité d'un polypeptide comprenant le polypeptide selon la revendication 5, ou ses fragments, dans les cellules des bâtonnets d'un homme, dans laquelle la présence d'une quantité dudit polypeptide ou de ses fragments en diminution par rapport à la quantité dudit polypeptide ou de ses fragments dans le tissu oculaire normal, constitue un diagnostic d'une dystrophie rétinienne chez ledit homme. 15. Méthode selon la revendication 14, dans laquelle ladite étape de détection comprend la mise en contact dudit tissu avec un anticorps qui se lie spécifiquement à un polypeptide qui comprend la séquence d'aminoacides représentée dans SEQ ID ? : 2 ou un de ses fragments et la détection de la fixation spécifique dudit anticorps avec un polypeptide dans ledit tissu, la détection de la fixation spécifique à un polypeptide indiquant la présence d'un polypeptide comprenant la séquence des aminoacides représentée dans SEQ ID NO : 2 ou un de ses fragments. 16. Anticorps purifié ou un de ses fragments, qui se lie spécifiquement à un polypeptide comprenant la séquence des aminoacides représentée dans SEQ ID NO : 2 ou un fragment d'un polypeptide comprenant la séquence des aminoacides représentée dans SEQ ID NO : 2. 17. Fragment d'anticorps selon la revendication 16, qui est un fragment Fab ou F (ab') 2. 18. Anticorps selon la revendication 16, qui est un anticorps polyclonal. 19. Anticorps selon la revendication 16, qui est un anticorps monoclonal. 20. Méthode pour la production de polypeptides Rdcsfl de souris selon l'une des revendications 5 à 6, comprenant la culture d'une cellule hôte dans laquelle a été incorporé un vecteur d'expression contenant un polynucléotide exogène codant pour le Rdcsfl de souris, dans des conditions suffisantes pour l'expression de polypeptides Rdcsfl de souris dans la cellule hôte, avec ainsi production d'un polypeptide exprimé ; et la récupération du polypeptide produit par ladite cellule. 21. Molécule d'ADN isolée ayant une séquence nucléotidique complémentaire de la séquence nucléotidique de l'ADN isolé selon la revendication 1.