Brevet FR2832161A1 — publié le 20030516

aqueux est comprise entre 0,01 % et 20 %, de préférence entre 0,1 % et 10 %. 1 2832161 La présente invention concerne un milieu de culture solide pour micro organismes et cellules eucaryotes ainsi que son procédé d'obtention. De nos jours l'ensemble des milieux de culture solides contient une base gélifiante communément appelée Agar-Agar. En raison des propriétés intrinsèques s des milieux gélosés, ceux-ci trouvent de nombreuses applications dans des domaines aussi divers que la recherche fondamentale en biologie moléculaire, le génie génétique, les méthodes d'identification de micro-organismes, ainsi que la conservation de ceux-ci pour le maintien des collections. Cependant, I'obtention de colonies à identifier prennent plusieurs jours quand, bien souvent, comme dans le cas d'échantillons médicaux, le temps est compté. En ce qui concerne les collections de micro-organismes, I'appauvrissement rapide du milieu entrane la nécessité d'un repiquage systématique fréquent. Aussi, un des buts de la présente invention est-il de fournir un nouveau milieu de culture solide, dans lequel la blodisponibilité des substrats est optimale. Ce but, ainsi que d'autres qui appara^'tront par la suite, est obtenu par un milieu de culture solide, caractérisé par le fait qu'il comprend, comme base gélifiante, un polysaccharide ayant une unité de reproduction qui possède une chane latérale et est constitué par six sucres neutres, dont le glucose et le galactose, et un sucre acide, des substituants pyruvates et acétates étant présents, une solution dans l'eau ou une solution saline à une concentration en ce polysaccharide supérieure ou égale à 2g/1 formant un gel élastique et transparent. De préférence, ce polysaccharide est synthétisé par un Rhizobium déposé sous le N 1-1809 auprès de la CNCM. Avantageusement, le milieu de culture comprend de 2,2 à 6 % en poids de ce polysaccharide par rapport au poids total de ce milieu. De préférence, ce milieu de culture solide comprend aussi 0,5 M de chlorure de sodium (NaCI) Ainsi qu'il a été dit précédemment, la présente invention concerne aussi un procédé pour obtenir ce milieu de culture, selon lequel: a) On mélange des milieux nutritionnels connus sous forme de poudre; b) On ajoute à ce mélange de 2,2 à 6 % en poids du polysaccharide ci-dessus sous forme de poudre; c) On met en solution le mélange ainsi obtenu par adjonction d'eau en quantité suffisante afin de satisfaire aux recommandations pour le milieu considéré; d) On stérilise la solution issue de l'étape c); et, e) On coule dans des récipients ad hoc le produit stérilisé encore chaud. Avantageusement, à l'issue de l'étape e), on laisse reposer pendant 24 h à s température ambiante. De préférence, on ajoute, si nécessaire, à la solution issue de l'étape c) 0,5 M de chlorure de sodium (NaCI). L'exemple de réalisation qui suit et qui ne présente aucun caractère limitatif, permettra à l'homme de métier de mieux comprendre la présente invention et notamment ses nombreux avantages. On réalise un milieu de culture selon la présente invention à partir de la composition d'un milieu connu tel que celui dénommé Luria Bertani qui est commercialisée par la société Difco sous la référence 0446-17-3, complémenté d'un mélange c_ur/cervelle commercialisée par la société OXOID sous la référence CM 225, dont la base gélifiante est de l'Agar- Agar; mais on remplace celle-ci par un polysaccharide du genre comprenant une unité de reproduction qui possède une chane latérale et est constitué par six sucres neutres, dont le glucose et le galactose, et un sucre acide, des substituants pyruvates et acétates étant présents; une solution dans l'eau ou une solution saline en ce polysaccharide à une concentration supérieure ou égale à 2g/l forme un gel élastique et transparent. Un tel polysaccharide est d'ailleurs décrit dans la demande de brevet français publiée sous le N 2 759 377. Pour rénliser ce milieu, on mélange les milieux nutritionnels sous forme de poudre puis on ajoute le polysaccharide sous forme de poudre dans une proportion comprise entre 2,2 et 6 % en poids. Puis on solubilise les poudres par adjonction d'eau en quantité suffisante afin de satisfaire aux recommandations pour le milieu considéré. On soumet l'ensemble à une stérilisation par exemple à 110 C pendant mn ou 121 C pendant 15 mn, à l'autoclave. Les différentes poudres n'ont pas besoin d'être parfaitement solubiliséss avant l'étape de stérilisation, le polysaccharide se dissolvant au cours de la stérilisation: on obtient ainsi un milieu de culture selon la présente invention dénommé par la suite " milieu invention ". On a aussi préparé un milieu traditionnel contenant de l'Agar-Agar comme seule base gélifiante, qui constitue le milieu témoin, et un milieu, dit milieu mixte, 3 2832161 comportant un mélange d'Agar-Agar et de polysaccharide comme base gélifiante. Dans le tableau 1 ci-dessous on a regroupé les compositions de ces trois milieux de culture. Tableau 1 Composition Milieu Témoin Milieu invention Milieu mixte Concentration Concentration Concentration en gA en g/i en g/l Tryptones 10 10 10 NaCI 10 10 10 Extrait de levure C_ur de cervelle 5 5 5 Glucose 2 2 2 Agar-Agar 22 1 Polysaccharide 22 22 Les milieux ci-dessus sont coulés après stérilisation dans des bo^tes de pétri rondes d'une surface totale de 5 800 mm2. Après séchage et une journée entière de maturation, on ensemence chacun de ces milieux par le dépôt de 2,ul d'un 0 inoculum de chacun des micro-organismes suivants: Pseudomonas aeruginosa, BacilJs subtilis, et Staphylococcus epidermidis, ceux-ci étant en phase exponentielle de croissance. Après acquisition numérique des bo^'tes de pétri sur lesquelles se développent les colonies, les photos sont imprimées puis les colonies sont découpées. Sachant que le papier est d'une densité de 80g/m2, la mesure du poids que représentent les disques permet d'estimer la surface de la colonie. Ainsi, malgré la forme atypique des colonies des microorganismes, une estimation précise de la surface des colonies est réalisoe. Le suivi de la croissance de celles-ci a été effectué sur une durée de 65 heures. Les résultats obtenus sont présentés sous forme de courbes, objets des figures cijointes: - la figure 1 représente les courbes de croissance de Pseudomonas aeruginosa sur chacun des trois milieux de croissance ci-dessus; - la figure 2 représente les courbes de croissance de Bacilis subtilis sur chacun des trois milieux de croissance ci-dessus; et, - la figure 3 représente les courbes de croissance de Staphylococcus epidermidis sur chacun des trois milieux de croissance ci-dessus. Le milieu de culture selon la présente invention permet donc d'augmenter de façon très significative la taille des colonies de micro-organismes. Ainsi, de par cette augmentation de taille, il est possible d'identifier précocement les micro organismes présents sur les bo^tes. On a également réalisé des essais comparatifs avec les mêmes micro 0 organismes que ci-dessus, mais avec des proportions différentes de polysaccharide, en ajoutant ou non 1g/l d'Agar-Agar ou 0,5 M de chlorure de sodium (NaCI). On a regroupé les résultats dans les tableaux 2 et 3 ciaprès. Tableau 2 Surface des colonies en mm2 après 63,5 heures de culture Bacilus subtilis Pseudomonas Staphylococcus acruginosa epidermidis Agar 72 115 29 Polysaccharide 798 1381 374 Polysaccharide 22 gil + NaCI 755 1326 46 Polysaccharide 22 g/l + Agar 93 1201 25 Polysaccharide 30 gil 206 2121 239 Polysaccharide 30 gil + Agar 109 1379 38 Polysaccharide 40 gil 179 2111 179 Polysaccharide 40 gil + Agar 67 2197 34 2832161 Tableau 3 Ratio surface témoin/surface essai Bacilus subtilis Pseudomonas Staphylococcus 1 aeruginosa epidermidis Agar 11 12 13 Polysaccharide Poiysaccharide 22 g/l 11 12 2 Polysaccharide 22 gil + Agar 10 Polysaccharide 30 g/l 18 Polysaccharide 30 g/l + Agar 12 1 Polysaccharide 40 g/l 18 Polysaccharide 40 g/l + Agar 19 1 s 11 appara^t de ces différents essais que la concentration croissante en polysaccharide ou l'ajout d'Agar-Agar à 1g/l tendent à atténuer l'écart entre le témoin et le milieu comprenant le polysaccharide à 22g/l. ll appara^'t néanmoins que l'utilisation du polysaccharide favorise une rapide colonisation de la surface du milieu de culture quelle que soit sa concentration par rapport au milieu témoin. 0 11 n'échappera pas à l'homme du métier que, avantageusement, ce nouveau milieu de culture, de par l'utilisation du polysaccharide décrit dans le document FR 2 759 377-A, favorise une biodisponibilité optimale des substrats en facilitant la diffusion des matières dans la matrice du milieu de culture. Les micro-organismes en culture sur ce gel accèdent ainsi facilement aux substrats carboné et azoté, et aux facteurs de croissance: de ce fait, ils poursuivent leur croissance, alors que le milieu ne contenant que de l'Agar-Agar stoppe la croissance par épuisement des nutriments à la périphérie de la colonie. L'accessibilité au substrat et à l'eau, qui résulte de l'aptitude du polysaccharide décrit dans le document FR-2 759 377-A à capter les liquides, permet de diminuer de façon importante l'affinité entre les cellules de micro organismes et la surface du milieu gélosé. Cet abaissement de la tension entre les micro-organismes permet un étalement plus aisé des colonies et, par suite, une colonisation plus rapide de la surface, d'o la créstion de bio-films. L'augmentation de la vitesse de croissance des micro-organismes permet ainsi la détection et l'identification précoce de micro-organismes pathogènes ou s non lors d'analyses médicales et donc de définir un traitement ciblé plus précoce. De plus, il est possible d'obtenir des colonies de micro-organismes génétiquement modifiés de tailles nettement supérieures à celles obtenues sur les milieux de culture habituellement utilisés. En effet, sur ces derniers, du fait de la fragilité et du petit nombre de telles souches et de l'épuisement rapide des lo nutriments à la périphérie des microorganismes, les colonies obtenues sont difficilement détectables. De même, le milieu de culture, objet de la présente invention, est particulièrement adapté à la conservation de collections de microorganismes. En effet, sur des milieux de culture classiques, les microorganismes se mettent rapidement sous forme résistante du fait de 1'épuisement des nutriments facilement disponibles. Il est donc nécessaire de faire des repiquages fréquents des colonies en culture pour conserver les souches sous forme végétative. Avec le milieu de culture selon la présente invention, I'augmentation de la disponibilité des nutriments fait que les micro-organismes cultivés sur ce gel restent sous forme végétative beaucoup plus longtemps, permettant d'espacer considérablement les repiquages de colonies. De plus, le polysaccharide utilisé pour fabriquer le milieu de culture a une capacité de rétention de liquide considérable, ce qui permet d'éviter la formation de condensation sur le couvercle de la bo^'te de Pétri au cours de l'incubation. Ainsi, I'observation des colonies en culture en est facilitée et ceci d'autant plus que le milieu contenant le polymère est transparent. En outre, les risques de contamination sont diminués, puisqu'il n'est plus nocessaire d'ouvrir la bo^'te et de retirer la condensation avant observation. Il va sans dire que l'utilisation de ce milieu est particulièrement adaptée pour les tests d'identification des modes respiratoires des microorganismes, c'est-à dire: - aérobie stricte; - aérobie, anaérobie facultatif; ou, - anaérobie stricte. Par exemple, I' inoculation de Saccharomyces cerevisae (m icro-organisme aérobie anaérobie facultatif) et de Botrytis (micro-organisme aérobie stricte) sur un milieu à base viande/foie contenant le polysaccharide décrit dans le document FR 2759377-A, permet de vérifier les caractères respiratoires de ces micro organismes avec un délai d'incubation plus court que sur un milieu de culture s habituel. Par ailleurs, certains micro-organismes, sur milieu de culture contenant le polysaccharide décrit dans le document FR-2 759 377-A, forment des colonies de formes et/ou couleurs caractéristiques. Ainsi, les tests d'identification sont facilités par une observation macroscopique préalable. La taxonomie de l'espèce étudiée 0 est par conséquent plus aisée. Enfin, la nature polysaccharidique de la molécule décrite dans le document FR-2 759 377-A et notamment la présence d'une molécule de pyruvate, d'acétate, de glucose et de galactose dans sa structure, fait de ce polysaccharide contenu dans le milieu de culture objet de la présente invention un substrat carboné utilisable par des micro- organismes posséJant les enzymes d'hydrolyse de ce substrat. p 8 2832161 REVENDICATIONS 1- Milieu de culture solide, caractérisé par le fait qu'il comprend, comme base gélifiante 2,2 à 6 % en poids, par rapport au poids total dudit milieu, d'un polysaccharide ayant une unité de reproduction qui possède une chane latérale et est constitué pa.r six sucres neutres, dont le glucose et le galactose, et un sucre acide, des substituants pyruvates et acétates étant présents, une solution dans l'eau ou une solution saline à une concentration en ce polysaccharide supérieure ou égale à 2g/l formant un gel élastique et transparent. 2- Milieu de culture selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le polysaccharide est synthétisé par un Rhizobium déposé sous le N 1- 1809 auprès de la CNCM. 3- Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé par le fait qu'il comprend aussi 0,5 M de chlorure de sodium. 4- Procédé d'obtention d'un milieu de culture solide pour les micro organismes et les cellules eucaryotes selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) On mélange des milieux sous forme de poudre; b) On ajoute à ce mélange de 2,2 à 6% en poids d'un polysaccharide ayant une unité de reproduction qui possède une chane latérale et est constitué par six sucres neutres, dont le glucose et le galactose, et un sucre acide, des substituants pyruvates et acétates étant présents, une solution dans l'eau ou une solution saline à une concentration en ce polysaccharide supérieure ou égale à 2 g/l formant un gel élastique et transparent. c) On met en solution le mélange ainsi obtenu; d) On stérilise à 110 C pendant 10 minutes; et, e) On coule dans des récipients ad hoc le produit stérilisé encore chaud. - Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que, à 1'issue de l'étape e), on laisse reposer pendant 24h à température ambiante. 6- Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'on ajoute à