Brevet FR2822238A1 — publié le 20020920

La présente invention a pour objet une méthode et une trousse pour le suivi des maladies neurodégénératives. L'invention trouve notamment application dans le domaine médical et dans le domaine immunologique. Malgré les immenses progrès médicaux de ces cinquante dernières années, un certain nombre de maladies, anciennement connues ou d'apparition récente, restent à proprement parler incurables, malgré un coût important pour la Santé Publique. Citons en particulier les affections neuro-dégénératives, comme la maladie de Parkinson, la Sclérose en Plaques (SEP), la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), la maladie d'Alzheimer, les maladies autoimmunes, les hépatites, les rhumatismes dégénératifs et inflammatoires dont la polyarthrite rhumatoïde (PR). Dans ces maladies, le diagnostic nosologique est posé, certains mécanismes et étapes du processus lésionnel sont connus, des traitements symptomatiques sont opposés, souvent très chers, mais les résultats ne sont pas à la hauteur des espérances. La Sclérose en Plaques est une pathologie démyélinisante multiloculaire du système nerveux central affectant la substance blanche du cerveau et de la moelle épinière, très lourdement invalidante, d'évolution insidieuse et imprévisible. En France, la SEP touche 1 individu sur 1000 en pleine maturité (40 à 60 cas pour 100 000 habitants), soit 50 000 français, et il faut compter 2000 nouveaux cas chaque année. Dans le monde, on recense 2 millions de cas. La maladie débute chez l'adulte jeune, entre 15 et 50 ans (20 et 40 ans surtout). Son incidence est deux fois plus grande chez la femme que chez l'homme. La SEP comprend trois grandes formes cliniques distinctes : rémittente, progressive et rémittente progressive. La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) ou Maladie de Charcot est une affection neurologique d'évolution rapide, d'étiologie inconnue. Elle est caractérisée par une atteinte dégénérative des motoneurones du cerveau, du tronc cérébral et de la corne antérieure de la moelle épinière, tandis que les neurones sensitifs ne sont pas touchés et que les fonctions intellectuelles restent intactes, laissant les patients pleinement conscients de la progression de leur maladie et de la détérioration de leurs capacités fonctionnelles. La prévalence de la SLA est égale à celle de la SEP. Elle est 5 fois supérieure à celle de la maladie de Huntington. Chaque année, meurent plus de malades atteints de SLA que de SEP ou de maladie de Huntington. La SLA survient le plus souvent entre 45 et 70 ans, atteignant 1, 5 à 2 fois plus les hommes que les femmes. Elle concerne des sujets de plus en plus jeunes : il existe des cas à début précoce avant 40 ans. Son incidence, c'est-à-dire le nombre de nouveaux cas chaque année, a tendance à augmenter dans le monde pour une raison inconnue. En France, il y aurait 5 à 10 000 personnes atteintes, et il apparaît environ 1100 nouveaux cas chaque année. L'évolution de cette maladie est dramatique, toujours mortelle. Elle se fait vers une aggravation progressive, avec installation d'un état grabataire et d'une insuffisance respiratoire par atteinte de la musculature intercostale et diaphragmatique, menant rapidement au décès (en 3 à 5 ans). La SLA comprend une hétérogénéité clinique évolutive qui laisse à penser à une hétérogénéité biologique. La polyarthrite rhumatoïde (PR), anciennement appelée polyarthrite chronique évolutive, est une maladie inflammatoire polyarticulaire chronique responsable de dégâts ostéocartilagineux entraînant une impotence fonctionnelle douloureuse par déformation et ankylose. C'est donc une maladie potentiellement sévère qui cause un handicap important chez plus de la moitié des patients, 10 ans après le début des symptômes, et réduit de plusieurs années leur espérance de vie. Sa prévalence en France serait d'environ 1 % : c'est le rhumatisme inflammatoire chronique le plus fréquent. Il touche 7000 nouveaux individus par an, atteignant plus souvent la femme encore jeune. La Spondylarthrite (SPR) est une affection rhumatismale chronique se manifestant par une atteinte au niveau lombo-sacré entraînant une ankylose progressive. Cette affection immunologique et inflammatoire est liée à une surexpression de l'antigène d'histocompatibilité B27 (retrouvé dans 90% des cas). L'importance de ces maladies tant au niveau du nombre de personnes touchées qu'au niveau de coût pour la santé publique, n'est donc pas négligeable. A ce jour, il n'existe pas de test biologique pour évaluer le stade et/ou prévoir l'évolution de ces maladies. Seul un examen clinique, éventuellement complété par des examens complémentaires, permet de poser le diagnostic de ces maladies. Il existe donc un réel besoin de pouvoir disposer d'un test diagnostique évolutif spécifique, susceptible de pallier aux insuffisances de la clinique. Le Demandeur a mis en évidence que l'occurrence des maladies neurodégénératives était associée à des modifications antigéniques, intégrées par les cellules immunocompétentes, se traduisant par la production d'anticorps circulants d'isotypie A et/ou M. Ces anticorps sont dirigés contre les antigènes indiqués dans le Tableau 1 ci-après, montrant les modifications antigéniques et les facteurs bactériens participant à la chronicité de ces maladies : Tableau 1 Antigènes Origine Isotypie de l'anticorps Acides gras (acides palmitique, composés endogènes oléique, myristique) liés par liaison amide Farnésyl Cystéine M Phosphatidylinositol Acétylcholine Acide Azélaïque composé endogène modifié (liaison M amide) Résidu produit très réactif sur Malondialdéhyde des constituants M endogènes NO-Cystéine constituants endogènes NO-Tyrosine modifiés Par #NO et NO-Tryptophane EOR (espèces M NO-Histidine oxygénées réactives) NO2-Tyrosine NO-Phénylalanine NO-Arginine NO-Asparagine NO-Méthionine NO-Créatine NO-Serum Albumin Bovine antigènes bactériens 3 (lag3) Hafnia alvei Aou M antigènes bactériens 5 (Ig5) Pseudomonas Aou M aeruginosa antigènes bactériens 12 (Ig12) Morganella morganii A ou M antigènes bactériens 13 (Ig 13) Proteus mirabilis A ou M antigènes bactériens 16 (Ig 16) Pseudomonas putida A ou M antigènes bactériens 17 (lg17) Citrobacter diversus A ou M antigènes bactériens 19 (Ig 19) Klebsiella A ou M pneumoniae La détection de ces anticorps peut donc rentrer dans le cadre d'un diagnostic général des maladies neurodégénératives, et dans le suivi de ces maladies. Un tel procédé de détection de ces anticorps dans un fluide biologique peut comprendre les étapes suivantes : - mise en contact dudit fluide avec chacun des antigènes suivants : Pal, Ole, Myr, Pl, MAD, Ach, FarCys, Aze, NO-Cys, NO-Tyr, NO-Trp, NO-His, NO2-Tyr, NO-Phe, NO-Arg, NO-Asn, NO-Met, NO-Cr, NO-SAB, Ig3, lag5, g12, g13Jg16, Ig17Jg19 et - mise en évidence des complexes éventuellement formés entre lesdits antigènes et les anticorps correspondants. Comme cela est indiqué dans le Tableau 1, lorsqu'on détecte la présence d'un anticorps dirigé contre un antigène bactérien"Ig", cet anticorps peut être d'isotypie A et/ou d'isotypie M. Les antigènes non-bactériens autre que la sérum albumin bovine éventuellement nitrosylée sont avantageusement conjugués. Par"antigène conjugué"on entend au sens de la présente invention un antigène (tel que Pal, FarCys, NO-Cys, etc.) couplé à une molécule porteuse, de préférence la sérum albumin bovine, soit directement soit par l'intermédiaire de glutaraldéhyde ou d'anhydride glutarique. Un tel couplage est réalisé de manière bien connue de l'homme du métier, par exemple comme décrit dans Boullerne et al., 1995, 1996 ; Geffard et al., 1998. Les antigènes bactériens sont obtenus par sonication de cultures des bactéries indiquées dans le Tableau 1. Le fluide biologique peut être, en particulier : un sérum, un plasma, du sang total, de !'urins, un liquide cérébrospinal. Le procédé mis en oeuvre peut être avantageusement du type "sandwich". Les complexes éventuellement formés peuvent être mis en évidence à l'aide d'un anticorps anti-immunoglobuline A ou M humaine, couplé à un marqueur, par exemple un marqueur fluorescent, le système biotine/streptavidine, un élément (radio) isotopique ou une enzyme. Le procédé conforme à l'invention est avantageusement mis en oeuvre à l'aide d'un support solide convenable. Comme support solide, on peut utiliser tout dispositif adapté à la manipulation de suspensions cellulaires et préférentiellement des tubes, des supports magnétiques particulaires ou des plaques rigides ou souples de microtitration en polyéthylène, polystyrène, chlorure de polyvinyle ou nitrocellulose comportant des micropuits. Lorsqu'on utilise une plaque de microtitration préactivée ayant des terminaisons NH2, il n'est pas nécessaire de"coupler"les antigènes à une molécule porteuse. L'expression"un anticorps couplé à un élément (radio) isotopique"signifie que l'anticorps porte, soit sur un élément propre de sa structure, par exemple les résidus de tyrosine constitutifs, soit sur un radical approprié qui lui a été fixé, un isotope radioactif permettant de le doser par comptage de la radioactivité qui lui est associée. Lorsque l'anticorps est couplé à une enzyme celle-ci, associée à l'emploi de réactifs appropriés, permet une mesure quantitative de cet anticorps. Le substrat et les réactifs sont choisis de sorte que le produit final de la réaction ou de la séquence des réactions provoquées par l'enzyme et mettant en oeuvre ces substances soit : - ou bien une substance colorée ou fluorescente qui diffuse dans le milieu liquide environnant les cellules et qui fait l'objet de la mesure finale spectrophotométrique ou fluorimétrique, respectivement, - ou bien une substance colorée insoluble qui se dépose sur les cellules et les parois sur lesquelles elles sont fixées et qui peut faire l'objet, soit d'une mesure photométrique par réflexion, soit d'une évaluation à l'oeil éventuellement par rapport à une gamme de teintes étalonnées. Lorsque l'on utilise un élément radio-isotopique, comme par exemple l'iode 125, la radioactivité associée à l'échantillon est comptée dans un compteur gamma selon toute modalité appropriée. Lorsque l'on utilise une enzyme, l'apparition d'un produit coloré ou fluorescent est obtenue en ajoutant au support solide une solution contenant le substrat de l'enzyme et un ou plusieurs réactifs auxiliaires permettant d'obtenir finalement comme produit de réaction, soit un produit coloré soluble dans le milieu, soit un produit coloré insoluble, soit un produit fluorescent soluble, comme cela a été expliqué précédemment. On mesure ensuite le signal lumineux provenant des échantillons ainsi traités, à l'aide de l'appareillage adapté à chaque cas : photomètre en transmission ou en réflexion ou fluorimètre respectivement. Lorsque le support solide est une plaque de microtitration, la lecture du signal lumineux peut être effectuée séquentiellement dans tous les puits d'une même plaque par l'emploi de lecteurs automatisés d'usage courant dans les laboratoires de biologie. On peut utiliser comme enzyme la phosphatase alcaline, dont les substrats préférentiels sont le paranitrophénylphosphate pour une lecture finale spectrophotométrique ou le méthyl-4- umbelliférylphosphate pour une lecture fluorométrique ou le bromo- 5-chloro-4-indolyl-3-phosphate pour obtenir un produit de réaction coloré insoluble. On peut de même utiliser comme enzyme la ss- galactosidase dont les substrats préférentiels seront alors l'orthon itrophényl-ss-D-galactopyranoside. Préférentiellement, on peut coupler, de manière conventionnelle, les anticorps anti-kg à la peroxydase. Les réactifs utilisés pour révéler la peroxydase conjuguée aux anticorps anti-kg contiennent de l'eau oxygénée, substrat de l'enzyme, et un chromogène approprié par exemple de l'orthophénylènediamine, la diamino-3, 3' benzidine ou la TMB (3, 3', 5, 5'-tétraméthylbenzidine) pour obtenir un produit final de réaction insoluble, ou bien l'acide parahydroxyphénylpropionique pour obtenir un produit de réaction fluorescent soluble dans le milieu. La réaction colorimétrique est arrêtée avec de l'acide sulfurique. Un autre mode préférentiel de réalisation de l'invention est l'utilisation d'anticorps anti-immunoglobuline couplés à t'acétykhotinestérase. L'acétylcholinestérase est couplée à l'anticorps en utilisant préférentiellement un procédé dérivé de celui décrit dans le brevet français ? 2 550 799 ou un procédé qui comporte schématiquement la préparation de fragments de l'anticorps par une technique connue, la modification de l'enzyme par réaction avec un agent hétérobifonctionnel approprié et enfin le couplage des produits ainsi obtenus. La révélation de l'activité enzymatique est réalisée de préférence selon la technique bien connue qui emploie l'acétylthiocholine comme substrat de l'enzyme et le réactif d'Ellman, ou acide dithio-5, 5' nitro-2 benzoïque comme chromogène, selon toute variante adaptée au cas examiné, par exemple celle décrite dans Anal. Chem. 57 (1985) 1170- 1173. Les chromogènes cités sont utilisés tels quels ou sous forme de sels soluble dans l'eau. L'invention a également pour objet une trousse pour la mise en oeuvre du procédé décrit ci-dessus. Cette trousse comprend avantageusement : - chacun des antigènes suivants : Pal, Ole, Myr, Pl, MAD, Ach, FarCys, Aze, NO-Cys, NO-Tyr, NO-Trp, NO-His, NO2-Tyr, NO-Phe, NO- Arg, NO-Asn, NO-Met, NO-Cr, NO-SAB, Ig3, Ig5, Ig12, Ig13, Ig16, Ig17 et ! g19 ; - éventuellement au moins un anticorps anti-immunoglobuline humaine, d'isotypie A et/ou M tel que défini précédemment. Cette trousse peut également comprendre un support solide convenable. Ce test permet notamment : - d'établir un diagnostic précoce de la maladie, en particulier chez les personnes à risque, et donc de ne pas prendre de retard dans le traitement de la maladie ; - de suivre l'évolution de la maladie, et donc de pouvoir adapter le traitement en conséquence. La détection des anticorps dirigés contre les antigènes suivants : Pl, Ach, Aze, NO-Cys, NO-Tyr, NO-Trp, NO2-Tyr, NO-Asn, NO-Met, Ig5 (anticorps d'isotypie A), ! g12 (anticorps d'isotypie A et d'isotypie M), Ig13 (anticorps d'isotypie A), Ig16 (anticorps d'isotypie A), tag17 (anticorps d'isotypie M) et g19 (anticorps d'isotypie A), permet en particulier d'établir le diagnostic de la SEP. La quantification des anticorps dirigés contre les antigènes suivants : NO2-Tyr, NO-Tyr, Ach et Ig16 (anticorps d'isotypie A), permet de discriminer les formes particulières de la SEP (progressive, rémittente, rémittente progressive). De même, la détection des anticorps dirigés contre les antigènes suivants : Ole, Pl, MAD, Aze, NO-Cys, FarCys, Ig3 (anticorps d'isotypie A et d'isotypie M), Ig5 (anticorps d'isotypie A), Ig12 (anticorps d'isotypie A et d'isotypie M), Ig13 (anticorps d'isotypie A et d'isotypie M), g16 (anticorps d'isotypie A et d'isotypie M), Ig17 (anticorps d'isotypie A et d'isotypie M), permet d'établir le diagnostic de la SLA et, en fonction du titre en anticorps, de différencier les 3 classes de cette maladie. La détection des anticorps dirigés contre les antigènes suivants : Pal, Ole, Myr, Pl, MAD, FarCys, Aze, NO-Cys, NO-Phe, Ig3 (anticorps d'isotypie A et d'isotypie M), g5 (anticorps d'isotypie A et d'isotypie M), Ig12 (anticorps d'isotypie A et d'isotypie Mt Ig 13 (anticorps d'isotypie M) et ! g19 (anticorps d'isotypie A), permet d'établir le diagnostic de la PR. Dans la description et les revendications, on utilise les abréviations suivantes : SAB : sérum albumine bovine G : résidu de glutaraldéhyde AG : résidu d'anhydride glutarique PBS : tampon phosphate salé OPD : ortho-phénylènediamine H202 : eau oxygénée H2SO4: acide sulfurique PI : phosphatidylinositol CaCI2 : chlorure de calcium NaCI : chlorure de sodium DO : densité optique SAH : sérum albumine humaine SAH-EA : sérum albumine humaine sur laquelle est accrochée de l'éthylènediamine Ig : immunoglobuline Ach : acéty ! chotine Ole : acide oléique Pa ! : acide palmitique Myr : acide myristique FarCys : Farnésyl cystéine MDA : malondialdéhyde (néo-épitope résultant de la lipoperoxydation) (avec R = protéine) NO-Cys : NO-cystéine (néoépitope dû à la nitrosylation de la cystéine) NO-Trp : NO-tryptophane (néoépitope dû à la nitrosylation du tryptophane) NO-Asn : NO-asparagine (néoépitope dû à la nitrosylation de l'asparagine) NO-Tyr : NO-tyrosine (néoépitope dû à la nitrosylation de la tyrosine) NO2-Tyr : NO2-tyrosine (néoépitope dû à la formation de peroxynitrite : NO+0) NO-His : NO-histidine (néoépitope dû à la nitrosylation de !'histidin) NO-Phe : NO-phénylalanine (néoépitope dû à la nitrosylation de la phénylalanine) NO-Met : NO-méthionine (néoépitope dû à la nitrosylation de la méthionine) NO-Arg : NO-arginine (néoépitope dû à la nitrosylation de l'arginine) NO-Cr : NO-créatine (néoépitope dû à la nitrosylation de la créatine) L'invention sera mieux comprise à l'aide des sections et exemples ci-après, donnés à titre purement illustratif. SECTION 1 : DOSAGE DES ANTICORPS ANTI-NO-CYSTEINE On utilise une plaque de microtitration ! viaxisorp (R) commercia ! isée par la Société MERCK-EUROLAB (POLYLABO), comportant 96 puits. On place par puits 10 ug/ml de solution de conjugué NO-Cystéine-G-SAB (préparé selon la méthode décrite dans Boullerne et al., 1995,1996 et Geffard et al., 1998) dans du tampon carbonate à pH 9,6 (blancs de réaction : SAB-G), pendant une nuit à + 4 C sous agitation, en évitant l'exposition de la plaque à la lumière. On verse ensuite dans les puits du tampon PBS contenant du Tween (B), 10% glycerol et 1 g/) de SAB, afin de saturer la surface des puits en protéine, ce qui obtenu après 1 h à 37 C. On rince trois fois au PBS. On ajoute ensuite le sérum à doser, dilué au 1/1000e dans du tampon PBS contenant du Tween&commat;, 10 % glycérol et 1 g/l de SAB-G, et on incube pendant 2 heures à 37 C. On ajoute enfin dans les puits une solution au 1/5000e, dans du tampon PBS contenant du Tween (B) et 1 gll de SAB, d'anticorps anti- IgM humaines (commercialisé par Sanofi Pasteur sous la référence 75061) marqués à la peroxydase, et on incube pendant 1 heure à 37 C. On rince la plaque trois fois au PBS contenant du Tween (b. On vide les puits par retournement de la plaque. On ajoute dans chaque puits du réactif de révélation (pour 20 ml de tampon citrate phosphate, on ajoute 10 u # de H2 (substrat de l'enzyme) et 0,5 ml d'OPD à 4 %) et on laisse la coloration se faire à l'obscurité pendant 10 mn. On arrête la réaction avec 50 ul d'H2SO4 4N, et on lit la DO à 492 nm. Les résultats sont ensuite exprimés par rapport à une population de témoins de la façon suivante : Titre en anticorps = (DO sérum-DOmoy, témoins)/DOmoy. témoins. SECTION 2 : DOSAGE DES ANTICORPS ANTI-PHOSPHATIDYLINOSITOL On utilise une plaque de microtitration Maxisorp#. On place par puits 20 g/ml de solution de coating (Faiderbe et al., 1990 ; Brochet et al., 1991), préparée à partir de 20 ml de tampon phosphate 10-2M + CaCI2 10-3M, pH 7, saturée en chloroforme, auquel on a ajouté 40 u ! de la solution mère de phosphatidylinositol (commercialisé par SIGMA, référence P-5766) avec une seringue Hamilton et 100 l d'un mélange hexane/chloroforme (84/16) pour faire passer le Pl en solution (blancs de réaction : SAB). On passe les puits au vortex jusqu'à l'obtention d'un précipité blanc, puis on laisse la plaque une nuit à 37 C sous agitation, on la sèche à l'étuve pendant au moins 30 mn, et on rince trois fois au PBS. On ajoute ensuite le sérum à doser, obtenu de la manière suivante : la veille du dosage, on prépare une pré-dilution du sérum (1/10e) dans du tampon PBS contenant 27 g/l de NaCl et on agite à 4 C pendant la nuit. On centrifuge ensuite 15 mn à 10 000 tr/mn. A partir du surnageant, on dilue au 1/50e (dilution finale au 1/500e dans du tampon PBS salé contenant 10 % de glycérol et 1 g/l de SAH-EA). On ajoute enfin dans les puits une solution au 1/5000, dans du tampon PBS contenant du Tween&commat; et 1 g/1 de SAB, d'anticorps antiIgM humaines (SANOFI-PASTEUR, référence 75061) marqués à la peroxydase, et on incube pendant 2 heures à 37 C. On rince la plaque trois fois au PBS contenant du Tween&commat;. On vide les puits par retournement de la plaque. On ajoute dans chaque puits du réactif de révélation (pour 20 ml de tampon citrate phosphate, on ajoute 20 u de du dz et 1 ml d'OPD à 4 %) et on laisse la coloration se faire à l'obscurité pendant 10 mn. On arrête la réaction avec 50 u ! d'HSO 4N, et on lit la DO à 492 nm. Les résultats sont ensuite exprimés par rapport à une population de témoins de la façon suivante : Titre en anticorps = (DO sérum-DOmoy. témoins)/DOmoy. témoins. SECTION 3 : DOSAGE DES ANTICORPS ANTI-ACETYLCHOLINE On utilise une plaque de microtitration Maxisorp. On place par puits 10 ug/m ! de solution de conjugué Choline-AG-SAB (préparé selon la méthode décrite dans Souan et al., 1986) dans du tampon carbonate à pH 9, 6 (blancs de réaction : SAB), pendant une nuit à + 4 C sous agitation. On verse ensuite dans les puits du tampon PBS contenant du Tween&commat;, 10% glycérol et 1 g/ ! de SAB-AG, afin de saturer la surface des puits en protéine, ce qui obtenu après 1h à 37 C. On rince trois fois au PBS. On ajoute ensuite le sérum à doser, dilué au 1/1000e dans du tampon PBS contenant du Tween&commat; et 1 g/i de SAB-AG, et on incube pendant 2 heures à 37 C. On rince la plaque trois fois au PBS contenant du Tween&commat;. On ajoute enfin dans les puits une solution au 1/10 OVO", dans du tampon PBS contenant du Tween&commat; et 1 g/ ! de SAB, d'anticorps antiIgM humaines (SANOFI-PASTEUR, référence 75061) marqués à la peroxydase, et on incube pendant 1 heure à 37 C. On rince la plaque trois fois au PBS contenant du Tween&commat;. On vide les puits par retournement de la plaque. On ajoute dans chaque puits du réactif de révélation (pour 20 ml de tampon citrate phosphate, on ajoute 10 ul de H et 0,5 ml d'OPD à 4 %) et on laisse la coloration se faire à l'obscurité pendant 10 mn. On arrête la réaction avec 50 u) d'H2SO4 4N, et on lit la DO à 492 nm. Les résultats sont ensuite exprimés par rapport à une population de témoins de la façon suivante : Titre en anticorps = (DO sérum-DOmoy. témoins)/DOmoy. témoins. SECTION 4 : DOSAGE DES ANTICORPS ANTI-ACIDE AZELAIQUE On utilise une plaque de microtitration Maxisorp. On place par puits 10 ug/ml de solution de conjugué Aze-SAB (préparé selon la méthode décrite dans Daverat et al., 1989) dans du tampon carbonate à pH 9, 6 (blancs de réaction : SAB), pendant une nuit à + 4 C sous agitation. On verse ensuite dans les puits du tampon PBS contenant du Tweeng, 10% glycérol et 1 g/1 de SAH-EA, afin de saturer la surface des puits en protéine, ce qui obtenu après 1 h à 37 C. On rince trois fois au PBS. On ajoute ensuite le sérum à doser, dilué au 1/500e dans du tampon PBS contenant du Tween#, 10 % glycérol et 1 g/l de SAH-EA, et on incube pendant 2 heures à 37 C. On rince la plaque trois fois au PBS contenant du Tween&commat;. On ajoute enfin dans les puits une solution au 1/10 000e, dans du tampon PBS contenant du Tween (R) et 1 g/I de SAB, d'anticorps anti- IgM humaines (SANOFI-PASTEUR, référence 75061) marqués à la peroxydase, et on incube pendant 1 heure à 37 C. On rince la plaque trois fois au PBS contenant du Tween&commat;. On vide les puits par retournement de la plaque. On ajoute dans chaque puits du réactif de révélation (pour 20 ml de tampon citrate phosphate, on ajoute 10 u de H, O, et 0, 5 ml d'OPD à 4 %) et on laisse la coloration se faire à l'obscurité pendant 10 mn. On arrête la réaction avec 50 pt d'H2SO4 4N, et on lit la DO à 492 nm. Les résultats sont ensuite exprimés par rapport à une population de témoins de la façon suivante : Titre en anticorps = (DO sérum-DOmoy. témoins)/DOmoy. témoins. SECTION 5 : DOSAGE DES ANTICORPS ANTI-FARNESOL-CYSTEINE On utilise une plaque de microtitration Maxisorp#. On place par puits 20 g/ml de solution de conjugué FarCys-SAB (préparé par activation de FarCys au chloroformiate d'éthyle puis couplage à la SAB selon la technique indiquée pour les acides gras dans la Section 7 ci-après) dans du tampon carbonate à pH 9,6 (blancs de réaction : SAB), pendant une nuit à + 4 C sous agitation. On rince trois fois au PBS. On verse ensuite dans les puits du tampon PBS contenant 27 g/l de NaCl et 2 g/t de SAB délipidée, afin de saturer la surface des puits en protéine, ce qui obtenu après 1 h à 37 C. On rince trois fois au PBS. On ajoute ensuite le sérum à doser, dilué au 1/250e dans du tampon PBS contenant 27 g/l de NaCl et 2 g/l de SAB délipidée, et on incube pendant 2 heures à 37 C. On rince trois fois au PBS. On ajoute enfin dans les puits une solution au 1/5000e, dans du tampon PBS contenant du Tween (B) et 1 g/l de SAB, d'anticorps antiIgM humaines (SANOFI-PASTEUR, référence 75061) marqués à la peroxydase, et on incube pendant 1 heure à 37 C. On rince la plaque trois fois au PBS contenant du Tween (B). On vide les puits par retournement de la plaque. On ajoute dans chaque puits du réactif de révélation (pour 20 ml de tampon citrate phosphate, on ajoute 20 ul de H et 1 ml d'OPD à 4 %) et on laisse la coloration se faire à l'obscurité pendant 10 mn. On arrête la réaction avec 50 ul d'H2SO, 4N, et on lit la DO à 492 nm. Les résultats sont ensuite exprimés par rapport à une population de témoins de la façon suivante : Titre en anticorps = (DO sérum-DOmoy. témoins)/DOmoy. témoins. SECTION 6 : DOSAGE DES ANTICORPS ANTI-DA On utilise une plaque de microtitration Maxisorp&commat;. On place par puits 80 ug/m) de solution de conjugué MDA-SAB (préparé selon la méthode décrite dans Amara et al., 1995) dans du tampon carbonate à pH 9, 6 (blancs de réaction : SAB), pendant une nuit à + 4 C sous agitation. On verse ensuite dans les puits du tampon PBS contenant du Tween (D, 10% glycéroi et 5 g/ ! de SAB, afin de saturer la surface des puits en protéine, ce qui obtenu après 1 h à 37 C. On rince trois fois au PBS. On ajoute ensuite le sérum à doser, dilué au 1/1000e dans du tampon PBS contenant du Tween&commat; et 5 g/ ! de SAB, et on incube pendant 2 heures à 37 C. On rince trois fois au PBS. On ajoute enfin dans les puits une solution au 1/5000e, dans du tampon PBS contenant du Tween (B) et 5 g/ ! de SAB, d'anticorps antiIgM humaines (SANOFI-PASTEUR, référence 75061) marqués à la peroxydase, et on incube pendant 1 heure à 37 C. On rince la plaque trois fois au PBS contenant du Tween&commat;. On vide les puits par retournement de la plaque. On ajoute dans chaque puits du réactif de révélation (pour 20 ml de tampon citrate phosphate, on ajoute 10 ! JI de H202 et 0, 5 ml d'OPD à 4 %) et on laisse la coloration se faire à l'obscurité pendant 10 mn. On arrête la réaction avec 50 ul d'H2SO4 4N, et on lit la DO à 492 nm. Les résultats sont ensuite exprimés par rapport à une population de témoins de la façon suivante : Titre en anticorps = (DO sérum-DOmoy. témoins)/DOmoy. témoins. SECTION 7 : DOSAGE DES ANTICORPS ANTI-ACIDE GRAS On utilise une plaque de microtitration Maxisorp (R). On place par puits 50 ug/m ! de solution de conjugué Ole-BSA, Pal-BSA ou Myr-BSA (préparés selon la méthode décrite dans Maneta et al., 1987 ; Amara et al., 1994 a et b, Constans et al., 1995 ; Boullerne et al., 1996) dans du tampon carbonate contenant du CaC l2 10-3M, pH 9,6 (blancs de réaction : SAB délipidée), pendant une nuit à + 4 C sous agitation. On rince trois fois au PBS contenant du CaCI2 10-3M. On ajoute ensuite le sérum à doser, dilué au 1/1000e dans du tampon PBS contenant du CaCl2 10-3M et 1 g/l de SAB délipidée, et on incube pendant 2 heures à 37 C. On rince trois fois au PBS contenant du CaCI2 10'M. On ajoute enfin dans les puits une solution au 1/5000e, dans du tampon PBS contenant contenant du CaCI2 10-3M et 1 g/i de SAB délipidée, d'anticorps anti-im humaines (SANOFI-PASTEUR, référence 75061) marqués à la peroxydase, et on incube pendant 1 heure à 37 C. On rince la plaque trois fois au PBS contenant du Tweeng. On vide les puits par retournement de la plaque. On ajoute dans chaque puits du réactif de révélation (pour 20 ml de tampon citrate phosphate, on ajoute 10 l de H2O2 et 0,5 ml d'OPD à 4 %) et on laisse la coloration se faire à l'obscurité pendant 10 mn. On arrête la réaction avec 50 l d'H2SO4 4N, et on lit la DO à 492 nm. Les résultats sont ensuite exprimés par rapport à une population de témoins de la façon suivante : Titre en anticorps = (DO sérum - DOmoy. témoins)/DOmoy. témoins. SECTION 8 : DOSAGE DES ANTICORPS ANTI-ANTIGENS BACTERIENS On utilise une plaque de microtitration Maxisorp. On place par puits 34 g/ml de Iysat d'antigène bactérien, obtenu par sonication d'une culture de la bactérie correspondante (cf. Tableau 1), dans du tampon carbonate à pH 9, 6 (blancs de réaction : SAB), pendant une nuit à + 4 C sous agitation. On verse ensuite dans les puits du tampon PBS contenant 5 g/1 de SAB, afin de saturer la surface des puits en protéine, ce qui obtenu après 1h à 37 C. On rince trois fois au PBS contenant du Tween&commat;. On ajoute ensuite le sérum à doser, dilué au 1/500e dans du tampon PBS contenant du Tween (S) et 2,5 g/l de SAB, et on incube pendant 2 heures à 37 C. On rince trois fois au PBS contenant du Tween&commat;. On ajoute enfin dans les puits une solution au 1/5000e, dans du tampon PBS contenant du Tween et 2,5 g/I de SAB, d'anticorps anti- IgA ou anti-IgM humaines (SANOFI-PASTEUR, références 75041 et 75061) marqués à la peroxydase, et on incube pendant 1 heure à 37 C. On rince la plaque trois fois au PBS contenant du Tween#. On vide les puits par retournement de la plaque. On ajoute dans chaque puits du réactif de révélation (pour 20 ml de tampon citrate phosphate, on ajoute 10 l de H2O2 et 0,5 ml d'OPD à 4 %) et on laisse la coloration se faire à l'obscurité pendant 10 mn. On arrête la réaction avec 50 u) d'H2SO4 4N, et on lit la DO à 492 nm. Les résultats sont ensuite exprimés par rapport à une population de témoins de la façon suivante : Titre en anticorps = (DO sérum-DOmoy. témoins)/DOmoy. témoins. EXEMPLE 1 : QUANTIFICATION D'ANTICORPS CIRCULANTS DANS LA SEP Le Tableau 1 ci-après rassemble les résultats des tests immunoenzymatiques effectués sur un grand nombre de sujets selon la méthode décrite dans les sections qui précèdent. Tableau 1 conjugué n : SEP/Témoinp Pal 755/238 0, 0095 Myr 730/234 0, 0302 Ole 1399/226 0,0115 FarCys 718/235 0001 Aze 1459/232 NOCys 1314/234 NOTyr 279/135 0001 NO2Tyr 251/126 0, 0067 NOTrp 288/148 0001 NOMet 218/101 0, 0022 NOHis 266/147 0001 NOPhe 243/116 0001 NOAsn 180/101 0, 0092 NOArg 177/81 0, 0033 NOSAB 264/135 0, 6784 NOCr 108/46 0, 0718 MDA 670/206 0001 Ach 731/229 0, 0001 Pl 1387/209 Ig3 * 658/219 0001 Ig5 * 670/222 0010 I 670/218 0, 0040 Ig5 * 670/222 0, 0524 # 670/221 0, 2023 # 670/222 0, 9243 # 299/95 0, 9785 # 657/226 0001 # 669/222 0, 0009 # 669/225 0, 0909 # 669/223 0, 9913 # 669/220 0, 1731 # 668/222 0, 0133 # 299/97 0, 7493 * anticorps d'isotypie M ** anticorps d'isotypie A Une réponse anticorps statistiquement significative a été trouvée en faveur de la SEP pour 23 conjugués sur 33. A titre d'exemple, la spécificité de la réponse anti-NO-Cys vis-à-vis de la SEP a été confrontée à celle des affections neurodégénératives contrôles dans lesquelles des processus radicalaires ont été trouvés impliqués : Sclérose Latérale Amyotrophique, épilepsies et maladie de Parkinson. Les résultats ont montré une différence significative de cette réponse entre les différentes pathologies en faveur de la SEP. Le Tableau 2 ci-dessous montre la relation entre les différentes formes de SEP (P : progressive ; R : rémittente ; RP : rémittente progressive ; TEM : témoins) à partir de 16 conjugués significatifs. Tableau 2 conjugué n : SEPP/TEM p 1 n : SEP R/TEM p 1 n : SEP RP/TEM p1 n : SEPP/R/RP p2 Aze 259/232 0,0032 164/232 0,0046 111/232 0, 4149 259/164/111 0,0343 NOCys 240/234 0,0078 152/234 111/234 0,0073 240/152/111 0,0046 NOTyr 36/135 0,0762 53/135 40/135 36/53/40 0,0494 NO2Tyr 39/126 0,3829 59/126 0,0096 40/126 0,0311 39/59/40 0,0409 NOTrp 38/148 0,5177 54/148 39/148 0,0899 38/54/39 0,0006 NOMet 36/101 0,8718 49/101 0,0005 39/101 0,9574 36/49/39 0,0393 NOAsn 25/101 0,5167 49/101 0,0065 34/101 0,6982 25/49/34 0,0380 Ach 117/229 0,5938 112/229 71/229 0,1375 117/112/71 pl 253/209 161/209 109/209 0,1040 253/161/109 0,0117 in12* 110/221 0,1162 107/221 0,0412 68/221 0, 4858 110/107/68 0,0290 Ig17* 110/222 0,0002 107/222 0, 4582 68/222 0,2827 110/107/68 0,0123 log5** 109/222 0,0549 107/222 0,9743 68/222 0,0016 109/107/68 0,0406 in16** 109/225 0,2218 107/225 0,0067 68/225 0,2997 109/107/68 0,0491 Ig12** 109/223 0,1433 107/223 0,0312 68/223 0,2231 109/107/68 0,0185 Ig13** 109/220 0,6407 107/220 0,0001 68/220 0,1543 109/107/68 0,0124 tag19** 50/97 0, 2028 73/97 0, 0173 42/97 0, 8779 50/73/42 0, 0151 1 test de Mann-Whitney 2 test de Kruskal-Wallis * anticorps d'isotypie M ** anticorps d'isotypie A La figure 1 montre la répartition des données pour chaque forme de SEP et les témoins. antigène NO2Tyr NOTrp Ach ! 1 p 2 0,0409 0,0006 Chaque conjugué discrimine, de manière particulière, les formes cliniques de SEP : Les anticorps anti-N02-Tyr sont particulièrement pertinents pour discriminer les formes progressive et rémittente-progressive (p de Mann-Whitney entre ces deux échantillons = 0,0167). On note des valeurs faibles pour les SEP progressives. Les anticorps anti-NO-Trp sont de bons indicateurs pour discriminer les formes progressive et rémittente (p de Mann-Whitney Les anticorps anti-Ach sont pertinents pour discriminer la forme rémittente des deux autres formes (p de Mann-Whitney Les anticorps anti-lg16 d'isotypie A sont pertinents pour discriminer les formes progressive et rémittente (p de Mann-Whitney Ces anticorps circulants permettent de discriminer les formes de SEP et surtout le passage d'une forme évolutive à une autre (forme rémittente/forme progressive). Cette évolution n'est identifiable par aucune autre approche clinique ou exploratoire actuellement. EXEMPLE 2 : QUANTIFICATION D'ANTICORPS CIRCULANTS DANS LA SLA Les Figures 2 à 4 mettent en évidence les 3 classes de SLA : la classe 1, constituée par 39% des sérums testés (118 au total), est caractérisée par des valeurs fortes pour les antigènes suivants : FarCys, Ig3, Ig5, Ig16, Ig12, Ig13 et dans une moindre mesure g17 (pour toutes ces Ig, les anticorps détectés sont d'isotypie A)-cf. Figure 2 ; la classe 2, constituée par 34 % des sérums testés, est caractérisée par des valeurs faibles pour l'ensemble des 21 antigènes (avec les médianes Ces profils biologiques sont à rattacher à des types évolutifs différents de la SLA. De plus, 80% des patients testés restent dans le même groupe d'origine au cours de l'évolution clinique de leur maladie. EXEMPLE 3 : QUANTIFICATION DES ANTICORPS CIRCULANTS DANS LA PR Dans la PR (tous stades et évolutions confondus), les anticorps significatifs sont les anticorps dirigés contre les acides gras, l'acide azélaïque, le farnésyl-cystéine, le malondialdéhyde, le phosphatidylinositol, NO-cystéine, NO-phénylalanine et les immunoglobulines Ig3 (anticorps d'isotypie A et M), Ig5 (anticorps d'isotypie A et M), ! g12 (anticorps d'isotypie A et M), ! g13 (anticorps d'isotypie M), ! g17 (anticorps d'isotypie M) et g19 (anticorps d'isotypie A), comme le montre le Tableau 3 ci-après : Tableau 3 Conjugué n TEM n PR p Pal 238 251 Myr 234 251 0001 Ole 226 251 0001 FarCys 235 250 0,0005 Aze 232 251 0001 MDA 206 239 Ach 229 251 0,9593 Pl 209 251 NOCys 234 251 0001 NOTyr 135 86 0, 1471 NO2Tyr 126 98 0, 7411 NOTrp 148 88 0, 2906 NOMet 101840, 2822 NOHis 147 100 0,6778 NOPhe 116 86 0, 0376 NOAsn 101 86 0, 7968 NOArg 81 86 0,8052 NOSAB 135 100 NS NOCr 46 77 0, 2909 Ig3* 219 248 Ig5* 222 251 0, 0002 Ig16* 218 251 0,0772 dgl2* 221 251 dgl3* 221 251 0,0003 dgl7* 222 251 0, 0005 # 95 133 0,8907 Ig3** 226 248 0001 Ig5** 222 251 0,0009 Ig16** 225 251 0,2308 Ig12** 223 251 0,0140 Ig13** 220 251 0,0967 Ig17** 222 251 0,2993 Ig19** 97 133 0,0363 * anticorps d'isotypie M ** anticorps d'isotypie A ll apparaît donc que les titres en anticorps circulants d'isotypie M sont une aide au suivi des malades atteints de PR. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 'AMARA A., CHAUGIER C. and GEFFARD M. Autoantibodies directed against conjugated fatty acids in sera of HIV-1 infected patients. AIDS, (1994 a) 8, 711-713. 'AMARA A., CHAUGIER C., RAGNAUD J.-M. and GEFFARD M. Circulating autoantibodies directed against conjugated fatty acids in sera of HIV-1 infected patients. Clinical and Experimental Immunology, (1994 b) 96, 379-383. 'AMARA A., CONSTANS J., CHAUGIER C., SEBBAN A., DUBOURG L, PEUCHANT E., PELLEGRIN J. L, LENG B., CONRI C. and GEFFARD M. Autoantibodies to malondialdehyde-modified epitope in connective tissue diseases and vasculitides. Clinical and Exp. Immunol., (1995) 101, 1-6. 'BOULLERNE A., PETRY K. G., MEYNARD M. and GEFFARD M. Indirect evidence for NO involvement in multiple sclerosis by characterization of circulating antibodies directed against conjugated Snitrosocysteine. J. of Neuroimmunol., (1995) 60. 117-124. o BOULLERNE A. I., PETRY K. G. and GEFFARD M. 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'FAIDERBE S., CHAGNAUD J. L., WAFFLART J. and GEFFARD M. Autoanticorps dirigés contre un phospholipide membranaire dans les sérums de malades porteurs de tumeurs malignes. CRAS, (1990) 310, 49-52. e GEFFARD M., BODET D., CLAUDEPIERRE P., METZGER J. M. et SIBILIA J. Anticorps sériques circulants dirigés contre des antigènes modifiés par le NO dans les affections neurologiques et rhumatismales. Immunoanal. Biol. Spéc., (1998) 209-217. 'MANETA-PEYRET L., DAVERAT P., GEFFARD M., CASSAGNE C. and ORGOGOZO J. M. Natura) série anti-fatty acid antibodies in multiple sclerosis. Neurosc. Letters, (1987) 80, 235-239. e SOUAN M. L., GEFFARD M., LEBRUN-GRANDIE P. and ORGOGOZO J. M. Detection of anti-acetylcholine antibodies in myasthenic patients. Neurosc. Letters, (1986) 64, 23-28. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection des anticorps associés à l'occurrence ou l'évolution d'une maladie neurodégénérative dans un fluide biologique, qui comprend les étapes suivantes : - mise en contact dudit fluide avec chacun des antigènes suivants : Pal, Ole, Myr, Pl, MAD, Ach, FarCys, Aze, NO-Cys, NO-Tyr, NO-Trp, NO-His, NO2-Tyr, NO-Phe, NO-Arg, NO-Asn, NO-Met, NO-Cr, NO-SAB, Ig3, Ig5, Ig12, Ig13, Ig16, Ig17, Ig19, et - mise en évidence des complexes éventuellement formés entre lesdits antigènes et les anticorps correspondants. 2. Procédé de détection des anticorps associés à l'occurrence ou l'évolution d'une maladie neurodégénérative dans un fluide biologique, qui comprend les étapes suivantes : - mise en contact dudit fluide avec chacun des antigènes suivants : Pl, Ach, Aze, NO-Cys, NO-Tyr, NO-Trp, NO2-Tyr, NO-Asn, NO-Met, Ig5, Ig12, Ig13, Ig16, Ig17 et dgl9, et - mise en évidence des complexes éventuellement formés entre lesdits antigènes et les anticorps correspondants. 3. Procédé de détection des anticorps associés à l'occurrence ou l'évolution d'une maladie neurodégénérative dans un fluide biologique, qui comprend les étapes suivantes : - mise en contact dudit fluide avec chacun des antigènes suivants : Ole, Pl, MAD, Aze, NO-Cys, FarCys, log3, ig5, Ig12, fig13, Ig16 et dgl7, et - mise en évidence des complexes éventuellement formés entre lesdits antigènes et les anticorps correspondants. 4. Procédé de détection des anticorps associés à l'occurrence ou l'évolution d'une maladie neurodégénérative dans un fluide biologique, qui comprend les étapes suivantes : - mise en contact dudit fluide avec chacun des antigènes suivants : Pal, Ole, Myr, Pl, MAD, FarCys, Aze, NO-Cys, NO-Phe, log3, log5, Ig12, Ig13, Ig17 et Ig19, et - mise en évidence des complexes éventuellement formés entre lesdits antigènes et les anticorps correspondants. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel les antigènes non-bactériens autres que NO-SAB sont couplés à une molécule porteuse, de préférence la sérum albumin bovine. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel le complexe éventuellement formé est mis en évidence à l'aide d'un anticorps anti-immunoglobuline humaine d'isotypie M ou, le cas échéant, d'isotypie A, ledit anticorps étant marqué de préférence par une enzyme. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel l'enzyme est la peroxydase. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, qui est mis en oeuvre à l'aide d'un support solide, de préférence une plaque de microtitration. 9. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la maladie dégénérative est la sclérose en plaques, la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Parkinson, la polyarthrite rhumatoïde ou la spondylarthrite. 10. Trousse pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, qui comprend chacun des antigènes suivants : Pal, Ole, Myr, Pl, MAD, Ach, FarCys, Aze, NO-Cys, NO-Tyr, NO-Trp, NO-His, NO2-Tyr, Ig3, Ig5, Ig12, Ig13, Ig16, Ig17 et dgl9. 11. Trousse pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 2, qui comprend chacun des antigènes suivants : Pl, Ach, Aze, NO-Cys, NO-Tyr, NO-Trp, NO2-Tyr, NO-Asn, NO-Met, Ig5, dgl2, dgl3, ! g16, Ig17 et Ig19. 12. Trousse pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 3, qui comprend chacun des antigènes suivants : Ole, Pl, MAD, Aze, NO-Cys, FarCys, Ig3, Ig5, dgl2, dgl3, Ig16 et fig17. 13. Trousse pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 4, qui comprend chacun des antigènes suivants : Pal, Ole, Myr, Pl, MAD, FarCys, Aze, NO-Cys, NO-Phe, lag3, log5, dgl2, dgl3, Ig17ettg19. 14. Trousse selon l'une des revendications 10 à 13, dans laquelle les antigènes non-bactériens autres que NO-SAB sont couplés à une molécule porteuse, de préférence la sérum albumin bovine. 15. Trousse selon l'une des revendications 10 à 14, qui comprend également au moins un anticorps anti-immunoglobuline humaine d'isotypie M et/ou au moins un anticorps antiimmunoglobulin humaine d'isotypie A.