Brevet FR2830762A1 — publié le 20030418

La présente invention concerne une nouvelle utilisation de protéines dites"CRMPs" (Co ! ! apsin Response Mediator Proteins) pour le diagnostic et la thérapie de pathologies liées à un dysfonctionnement du système immunitaire. Les CRMPs sont des molécules de signalisation intracellulaire jusqu'ici reconnues comme spécifiques du système nerveux. Ces protéines sont plus précisément impliquées dans le contrôle du développement neuronal et la guidance axonale. A ce jour, cinq protéines de cette famille sont identifiées, CRMP1, CRMP2, CRMP3, CRMP4 et CRMP5. De manière inattendue, les inventeurs ont mis en évidence la présence des CRMPs 1,2 et 4 à des taux élevés dans les lymphocytes T chez des patients atteints de pathologies dysimmunes. En l'occurrence, il apparaît que la présence de ces protéines y est accrue lorsqu'elle est associée à une anomalie de mort ou de prolifération des lymphocytes. Par ailleurs, les inventeurs ont également observé une translocation nucléaire très augmentée de la CRMP2 des lymphocytes infectés par HTLV-1 et les rendant probablement hyperprolifératifs, ou de lymphocytes T de patients présentant une déficience immune liée au système Fas-Fas ligand. Cette translocation correspondrait à une forme très phosphorylée de CRMP2, plus particulièrement reconnue par son anticorps spécifique. Enfin, comme il ressort des exemples ci-après, la présence de ces protéines a été également caractérisée dans des cellules épithéliales thymiques dès le stade embryonnaire. Cette découverte de CRMPs dans les cellules épithéliales immatures est un des rares exemples de protéine de signalisation intracellulaire dans le thymus. Par ailleurs, la disparition des CRMPs dans le thymus adulte et leur induction dans les cellules T après stimulation du TCR indique une relation avec le "réarrangement" du récepteur des cellules T, TCR, et l'éducation des thymocytes. En conséquence, l'ensemble de ces nouvelles données témoigne de l'intervention des protéines CRMPs dans une voie de signalisation qui conduit à la prolifération, la mort, la maturation et l'éducation des lymphocytes et donc de leur implication dans la régulation de la réponse immunitaire. Ces observations sont d'autant plus inattendues que, jusqu'à ce jour, les CRMPS n'étaient considérées sur un plan thérapeutique que comme des cibles potentielles pour traiter des pathologies du système nerveux central (SNC). Il est clair que cette découverte ouvre de nouvelles perspectives thérapeutiques. Il est désormais envisageable d'agir sur la prolifération ou la mort de cellules T et/ou d'agir sur les cellules du thymus et l'autoimmunité via une intervention au niveau des protéines CRMPs dans les lymphocytes. En l'occurrence, la présente invention a précisément pour objet d'utiliser les CRMPs comme cibles pour le traitement, le pronostic et/ou le diagnostic de pathologies liées à un dysfonctionnement du système immunitaire et notamment de la prolifération des cellules T. En particulier, elle concerne l'utilisation d'au moins une protéine de la famille des CRMPs, fragment polypeptidique ou dérivé biologiquement actif de celle-ci, d'une séquence ou fragment de séquence nucléotidique codant pour ladite protéine, d'une séquence anti-sens capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence nucléotidiquement codant pour ladite protéine ou un anticorps dirigé contre ladite protéine ou une séquence peptidique capable d'agir avec ladite protéine, ou des composés pharmaceutiques capables de contrôler l'expression de ladite protéine, et/ou de leurs partenaires et/ou de leurs interactions, pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter des pathologies liées à un dysfonctionnement du système immunitaire. Plus précisément, la présente invention vise l'utilisation d'au moins une protéine de la famille CRMPs, fragment polypeptidique ou dérivé biologiquement actif de celle-ci, d'une séquence ou fragment de séquence nucléotidique codant pour ladite protéine, d'une séquence anti-sens capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence nucléotidiquement codant pour ladite protéine ou un anticorps dirigé contre ladite protéine pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les maladies auto-immunes, les leucémies T et lymphomes, les atteintes neuro-inflammatoires associées à l'infection par le rétrovirus HTLV-1, la paraparésie spastique tropicale, le neurosida, les pathologies de type herpès, rougeole, virus d'Epstein-Barr et les maladies à prions ; les atteintes dysimmunes liées à la mutation de Fas et Fasl ; et les atteintes neuro-inflammatoires associées à une activation des lymphocytes. Ainsi, une altération des CRMPs, comme par exemple une modification de la phosphorylation de CRMP2, est susceptible de conduire à une hyperprolifération ou à une mort cellulaire. De même, une stimulation des CRMPs semble constituer un moyen efficace pour restaurer une signalisation déficiente et améliorer la survie Iymphocytaire comme dans le cas de l'infection par VIH. Enfin, un contrôle de l'hyperexpression de CRMP semble déterminant pour réduire la prolifération de lymphocytes rendus"hyper" prolifératifs comme dans le cas d'une infection par HTLV-1 ou une mutation de Fas. Cette inhibition pourrait aussi améliorer les processus autoimmuns qui impliquent des lymphocytes T reconnaissant des déterminants du soi (autoréactifs), et les atteintes du SNC liées à l'invasion du SNC par ces lymphocytes T (TSP/HAM liée à HTLV-1, encéphalite liée à la rougeole, sclérose en plaques). Les pathologies plus particulièrement concernées par une augmentation de l'expression des CRMPs dans les cellules T sont : - les leucémies T et lymphomes et les atteintes neuroinflammatoires associées à l'infection par le rétrovirus HTLV1, paraparésie spastique tropicale ou myélopathie associée à HTLV-1-TSP/HAM et le neurosida ; - les pathologies de type herpès, rougeole, virus d'Epstein-Barr et maladies à prions ; - les atteintes dysimmunes liées à la mutation de Fas et Fasl ; et - les atteintes neuro-inflammatoires associées à une activation des lymphocytes T (scléroses en plaques). Il est également envisageable de traiter des maladies autoimmunes (et notamment celles liées à Fas), en agissant via les protéines CRMPs et leurs différents partenaires biologiques, sur la maturation des lymphocytes T au niveau du thymus. A titre représentatif de ces pathologies auto-immunes, on peut plus particulièrement citer l'arthrite rhumatoïde, la myasthénie, le lupus érythémateux, l'asthme, la sclérose en plaques, la leucémie T de l'adulte, lymphomes (c'est-à-dire la prolifération maligne des cellules T), ou tout trouble immun impliquant une reconnaissance immune et la cible des cellules en soi ou des tissus et résultant dans une ou plusieurs réponses inflammatoires. La sclérose en plaques est la plus fréquente des maladies auto-immunes. Les protéines CRMPs plus particulièrement considérées selon l'invention sont les protéines CRMP1, CRMP2, CRMP3, CRMP4 et CRMP5. La présente invention concerne de manière préférentielle l'utilisation d'au moins une protéine CRMP choisie parmi les séquences d'acides aminés des protéines humaines CRMP1, CRMP2, CRMP3, CRMP4 et CRMP5 qui sont représentées en figure 8. Selon la présente invention : - La protéine CRMP1 fait notamment référence à une protéine comprenant la séquence d'acides aminés représentée en figure 8 ainsi que tous fragments polypeptidiques ou dérivés correspondants. - La protéine CRMP2 fait notamment référence à une protéine comprenant la séquence d'acides aminés représentée en figure 8 ainsi que tous fragments polypeptides ou dérivés correspondants. - La protéine CRMP3 fait notamment référence à une protéine comprenant la séquence d'acides aminés représentée en figure 8 ainsi que tous fragments polypeptides ou dérivés correspondants. - La protéine CRMP4 fait notamment référence à une protéine comprenant la séquence d'acides aminés représentée en figure 8 ainsi que tous fragments polypeptides ou dérivés correspondants. - La protéine CRMP5 fait notamment référence à une protéine comprenant la séquence d'acides aminés représentée en figure 8 ainsi que tous fragments polypeptides ou dérivés correspondants. Les polypeptides dérivés font référence à toute variante polypeptidique des protéines ci-dessus ou toute autre molécule résultant d'une modification génétique et/ou de nature chimique de l'une des séquences précisées précédemment, c'est-à-dire obtenue par mutation, délétion, addition, substitution et/ou toute modification chimique d'un unique ou d'un nombre limité d'acides aminés, de même que toute séquence isoforme, ladite séquence dérivée, modifiée ou isomorphe ayant conservée au moins l'une des propriétés la rendant biologiquement active. Sont également concernées les différentes formes de protéines considérées susceptibles d'être reconnues par leurs anticorps respectifs. Il peut ainsi s'agir de leurs formes dimériques, phosphorylées et/ou tronquées. En figure 5, il est ainsi démontré par Western Biot à l'aide d'un anticorps spécifique la présence d'une forme particulière de CRMP2 phosphorylée dans les lymphocytes T hyperprolifératifs (C91 PL), comparés aux lymphocytes contrôles (Jurkat). Sont plus particulièrement préférées dans le cadre de la présente invention à titre de cibles thérapeutiques, les protéines CRMP2 et CRMP5. La protéine CRMP5 semble notamment constituer une cible particulièrement intéressante pour le diagnostic et/ou le traitement des pathologies de type maladies à prions. De la même manière, l'invention couvre l'utilisation de toute séquence d'acides nucléiques isolés codant pour l'une des protéines CRMP1, CRMP2, CRMP3, CRMP4 et CRMP5, ou fragments nucléotidiques ou séquences dérivant de l'une des séquences, du fait de la dégénérescence du code génétique ou du fait de mutation, de délétion, ou d'insertion d'au moins un nucléotide, lesdites séquences dérivées ayant une activité biologique pratiquement identique à celle de la protéine considérée. Les différentes séquences nucléotidiques ou peptidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences d'ADN ou d'ARN, obtenues par criblage de banques de séquences au moyen de sondes élaborées sur la base des séquences d'origine. De telles banques peuvent être préparées par des techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme de l'art. Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage des bandes. Ces séquences nucléotidiques permettent la réalisation de sondes nucléotidiques capables de s'hybrider fortement et spécifiquement avec une séquence d'acides nucléiques, d'un ADN génomique ou d'un ARN messager codant pour un peptide selon l'invention ou un fragment biologiquement actif de celui-ci. Les conditions d'hybridation appropriées correspondent aux conditions de température et de force ionique usuellement utilisées par l'homme du métier (Sambrook et aL, 1989), de préférence à des conditions de température comprises entre (Tm-5 C) et (Tm-30 C), m étant la température théorique de fusion définie comme étant la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent. Ces deux variantes d'utilisation sont intéressantes lorsque l'on cherche à accroître la quantité en au moins l'une des CRMPs. En l'occurrence, on peut également envisager d'utiliser un composé ou un mélange de composés d'origine synthétique ou naturelle qui active ou inhibe l'expression ou l'action de ces CRMPs. A titre illustratif de ce type de composés, on peut plus particulièrement citer les molécules susceptibles de se comporter comme un partenaire biologique des CRMPs, en utilisant par exemple les CRMPs comme molécule de signalisation intracellulaire. A titre illustratif de ce type de composés, on peut notamment citer la protéine Prp. Les inventeurs ont ainsi mis en évidence une interaction de la CRMP5 avec la protéine prion PrP. Vraisemblablement, la modulation de l'expression des CRMPs dans les lymphocytes par l'intermédiaire de la protéine PrP interviendrait dans le processus de dégénérescence au niveau du transfert de l'information pathogène du système immunitaire vers le système nerveux central. Cet aspect de l'invention est illustré, par l'exemple 4 ci-après. L'approche thérapeutique à considérer consisterait donc à bloquer l'interaction entre PrP et la protéine CRMP, et notamment CRMP5. L'utilisation de séquences anti-sens ou d'anticorps anti-CRMP1, CRMP2, CRMP3, CRMP4 et/ou CRMP5 est pour sa part privilégiée lorsque l'on cherche à bloquer l'expression de la protéine CRMP considérée. Les séquences nucléotidiques codant pour les protéines CRMP1, CRMP2, CRMP3, CRMP4 ou CRMP5 sont utiles pour la production de séquences anti-sens capables de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acides nucléiques incluant l'ARN messager qui peut être utilisé en thérapie génique. L'invention couvre donc également l'utilisation de séquences antisens capables d'inhiber au moins partiellement la production des protéines CRMPs identifiées ci-dessus. L'invention vise également l'utilisation d'anticorps mono-ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués obtenus à partir d'une CRMP choisies parmi les protéines CRMP1, CRMP2, CRMP3, CRMP4 ou CRMP5, dérivés ou fragments polypeptidiques biologiquement actifs de CRMPs. Les anticorps polyclonaux ont été obtenus selon le protocole décrit dans les exemples. Ces anticorps peuvent toutefois être également obtenus à l'aide de méthodes conventionnelles. A titre représentatif des séquences utilisées pour produire ces anticorps, on peut particulièrement citer ceux représentés en figure 8. Il s'agit de : - peptide 6 (CMRP1) : SEO ID nO 22 ; - peptide 3 (CMRP2) : : SEO ID nO 23 ; - peptide 4 (CMRP2) : : SEQ ID nO 24 ; - peptide 7 (CRMP4) : : SEO ID nO 25 ; - peptide 8 (CRMP3) : : SEO ID nO 26 ; - peptide 5 (CRMP5) : : SEO ID nO 27 ; - peptide 9 (CRMP2 C-terminal) : SEQ ID n 28. L'anti-pep4 est plus spécifique de CRMP2, ce qui est particulièrement avantageux compte tenu de la forte homologie entre les protéines CRMPs qui rend difficile la production d'anticorps spécifiques. Le peptide comprend une sérine qui est un site de phosphorylation potentiel et qui, vraisemblablement, facilite la détection de la forme phosphorylée. L'anti-pep 9 (CRMP2 C-terminal) est également spécifique d'une partie de la protéine CRMP2 qui est tronquée dans certaines circonstances pathologiques. L'anti-pep5 est spécifique de CRMP5 et permet donc avantageusement de différencier CRMP5 des autres CRMPs. Les anticorps peuvent être des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab et F (ab') 2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués. Dans cette même perspective, on peut également envisager d'intervenir dans la cascade de signalisation en mettant en oeuvre un composé ou mélange de composés d'origine synthétique ou naturelle capable d'inhiber l'action desdites protéines et plus particulièrement de bloquer l'interaction soit entre deux d'entre elles, soit entre l'une d'entre elles et ses partenaires biologiques naturels. Les inventeurs ont ainsi mis en évidence que les CRMPs qui sont donc des molécules de signalisation intracellulaire réagissaient avec la protéine prion PrP, impliquée vraisemblablement dans la signalisation membranaire. En l'occurrence, un second aspect de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant précisément à titre de principe actif un composé ou mélange de composés, d'origine synthétique ou naturelle capable de cibler au moins une protéine CRMP et/ou d'inhiber l'interaction naturelle d'au moins une protéine CRMP et/ou un dimère de CRMP avec la protéine prion PrP. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la protéine CRMP considérée est la CRMP5. Au sens de l'invention, le composé ou mélange de composés agit plus particulièrement en bloquant l'interaction entre les deux protéines considérées. Conviennent tout particulièrement à ce titre les composés dits aptamères. II s'agit de molécules qui possèdent la faculté de se lier à d'autres molécules avec une grande affinité et spécificité. A titre représentatif de ce type de composés, on peut plus particulièrement proposer les aptamères peptidiques. Les pathologies susceptibles d'être traitées selon cette variante sont les maladies à prion, sporadique, acquise ou génétique ou, de manière plus générale, toute maladie impliquant la PrP dans la signalisation cellulaire. En ce qui concerne les composés possédant une activité stimulatrice ou inhibitrice vis-à-vis des protéines CRMPs, ils peuvent être sélectionnés à l'aide d'une méthode de screening dans laquelle le composé à tester est mis en contact avec une protéine CRMP et l'interaction entre les deux protéines déterminées. Selon un mode préféré de l'invention, le patient est un humain, de préférence un adulte, mais la méthode de traitement revendiquée peut également être appliquée à des mammifères ou autres vertébrés. Les modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux des compositions selon l'invention peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient, comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, les effets secondaires constatés, etc. Préférentiellement, les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être administrées par voie systémique, de préférence par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale. L'invention vise également une méthode pour le pronostic et/ou diagnostic de maladies auto-immunes, de lymphomes, leucémie de l'adulte, maladies neuro-inflammatoires liées à une infection virale et/ou de maladies à prions, caractérisée en ce que l'on met en évidence dans des lymphocytes prélevés chez un individu, la présence d'au moins une protéine CRMP dont l'expression, la séquence ou la localisation est modifiée par rapport à des lymphocytes contrôles obtenus chez des sujets sains. L'évaluation de l'expression des protéines CRMPs peut être effectuée par différentes techniques bien connues de l'homme de l'art. L'ARN codant pour les protéines peut être détecté et quantifié à l'aide de sondes nucléotidiques spécifiques. Les produits des gènes codants pour les protéines CRMPs peuvent être également dosés à l'aide d'anticorps correspondants tels que définis ci-dessus et localisés dans la cellule. Alternativement, la présence des anticorps anti-CRMP peut être déterminée à l'aide des protéines CRMPs ou de leurs fragments épitopiques qui peuvent être marqués de manière à ce que les complexes formés entre la protéines et lesdits anticorps soient ensuite facilement détectables dans des échantillons biologiques. De manière plus générale, il est possible d'envisager également la mise en oeuvre des protéines CRMPs comme appâts pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans des extraits biologiques, de type lipidique ou biopsies, de patients atteints de maladies autoimmunes, neuroinflammatoires, lymphomes ou leucémies T. En l'occurrence, l'invention vise également à protéger l'utilisation d'au moins une protéine CRMP à titre d'outil de diagnostic pour détecter, identifier et/ou doser au moins un partenaire biologique d'une protéine CRMP dans des extraits biologiques de patients atteints de maladies autoimmunes, neuroinflammatoires, lymphomes ou leucémies T. Les exemples et figures ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif de la présente invention. FIGURES : Figure 1 : Comparaison par analyse RT-PCR du niveau d'expression des ARNm codant CRMP-4,-2 et-1 dans des lymphocytes et cellules mononucléées, contrôles ou issues de patients atteints de pathologies dysimmunes. Le niveau d'expression des ARNm des CRMP est normalisé par rapport au niveau d'expression du gène-ubiquitaire GAPDH. Les résultats sont exprimés en valeur relative comme un rapport de pixels entre l'amplicon de chaque CRMP et l'amplicon de G3PDH. Figure 2 : Profil électrophorétique des protéines CRMP1,2 et 4 dans une lignée Iymphocytaire Jurkat comparée à une lignée de cellule nerveuse Dev. Figure 3 : Détection immunocytochimique de la location subcellulaire de la protéine CRMP2 dans des cellules mononucléées sanguines (PBL) de patients contrôle ou infectés par HTLV-1 ou présentant une déficience immune liée au système Fas/Fas ligand, ou infectés par le VIH. Figures 4 : caractérisation de la présence nucléaire reconnue par l'anti CRMP-2 (peptide 4) dans les lymphocytes T hyperprolifératifs. Figures 4a : examen après immunodétection de CRMP-2 et contrecoloration par l'intercalant de l'ADN Dapi dans les cellules Jurkat T (contrôles) et les cellules C 8166 (T infectés par HTLV-1 non productrices de virus). Figures 4b : examen de l'immunodétection de CRMP-2 en microscopie confocale dans les cellules CEM (lignée T contrôle) et les cellules C91 Pl (lignée infectée par HTLV-1). Figure 5 : Démonstration par Western Blot à l'aide de l'anticorps spécifique anti-CRMP2 (peptide 4) de la présence d'une forme particulière de CMRP2 phosphorylée dans les lymphocytes T hyperprolifératifs (C91PL) comparé aux lymphocytes contrôles (Jurkat). Figure 6 : Analyse immunohistochimique de l'expression des protéines CRMP5 et CRMP2 au niveau du thymus humain foetal (A, B, C) et dans un thymome (D, E, F). Figure 7 : Caractérisation par essais double-hybride par conjugaison de l'interaction entre les protéines PrP bovine et CRMP5 humaine. Figure 8 : Séquences en acides aminés des protéines humaines CRMP1, CRMP2, CRMP3, CRMP4 et CRMP5. Sont également présents sur cette figure les séquences des peptides choisis pour produire des anticorps spécifiquement dirigés contre les CRMPs. MATERIELS ET METHODES 1. Cellules et Culture cellulaire e Cellules du SI : Les lymphocytes T sont soit des lymphocytes établis en lignées (IL-2 indépendante), soit des lymphocytes en culture primaire et dont la croissance nécessite la présence d'IL-2. Ces lymphocytes sont cultivés (37 C, 5% CO2) en suspension dans un milieu salin supplémenté : soit en SVF (10%) dans le cas des lignées Iymphocytaires, soit en sérum humain de type AB (SAB 10%) et en IL-2 dans le cas des cultures primaires de lymphocytes T. Des lymphocytes périphériques (PBL pour peripheral blood lymphocytes) ont également été fraîchement isolés à partir du sang de patients ou de sujets contrôle, séparés sur un gradient de Ficoll et récupérés après une phase d'adhésion des monocytes/macrophages. . Traitements des lymphocytes T : Pour certaines expériences, les PBL fraîchement isolés ont été traités par des anticorps agonistes CD3 (10 g/mt) qui miment l'activation des lymphocytes par un antigène via le récepteur T (TCR) ou par la Phytohémagglutinine (PHA-10 p.ig/ml) (C. Malus). 2. Examen des transcripts (ARNm) par la méthode de RT-PCR (reverse transcription et polymerase chain reaction). Isolement des ARN totaux : Cette expérience se fait systématiquement à 40C pour éviter une dégradation des ARN par les Rnases. Les extractions d'ARN ont été effectuées à partir de cultures cellulaires ou de lymphocytes fraîchement isolés auxquels une solution de RNAzol est rajoutée (2 ml pour 106 cellules). Le RNAzol contient le phénol et l'isothiocyanate de guanidium et lyse les cellules. La séparation de phase est effectuée à l'aide de chloroforme (400 pI pour 2 ml de RNAzol). Après homogénéisation (vortex) puis 5 min de repos, l'échantillon est centrifugé au repos (5 minutes) puis centrifugé à 12000 rpm pendant 30 minutes à 4 C. Les ARN présents dans la phase aqueuse (volume mesuré) sont précipités une première fois par addition d'un volume identique d'isopropanol (15 min à 4 C puis centrifugation (12000 rpm pendant 15 minutes à 4 C). Une deuxième précipitation est réalisée en ajoutant au culot un volume d'acétate de sodium 0,3 M pH 5,2 ainsi que trois volumes d'éthanol absolu à -20 C. Le précipité est recueilli par centrifugation (12000 rpm, 15 minutes, 4 C). L'élimination des sels s'effectue par ajout au culot de 800 ! d'éthanol 80% à -20 C suivie d'une centrifugation. Après élimination de toute trace d'éthanol, le culot est dissout dans 100 ! d'eau distillée et stocké à-80 C. Le dosage des ARN se fait par mesure de la densité optique au spectrophotomètre à 260 et 280 nm (1 unité de DO à 260 nm = 40 jag d'ARN). Le rapport des DO obtenues à 260 nm et à 280 nm doit être proche de 2, indice d'une bonne extraction d'ARN sans trace de protéines. # La transcription inverse : La transcription inverse (RT pour reverse transcription) est l'étape préliminaire à la polymérisation itérative qui utilise une ADN polymérase incapable de polymériser de l'ADN à partir d'ARN. La RT s'effectue grâce à une transcriptase inverse la Rtase du virus MuLV et est initiée par une amorce qui permet l'élongation et la synthèse d'un brin d'ADN complémentaire de l'ARN par l'enzyme. Dans une perspective d'étude comparative des produits d'amplification de différents ARNm, l'utilisation des amorces non-spécifiques (oligodT) s'est révélée plus adaptée, offrant la possibilité de mener les diverses PCR spécifiques à partir d'un même échantillon de RT. 500 ng d'ARN totaux dilués dans 7 lui d'eau (qsp) sont incubés 10 minutes à 70 C pour permettre la dénaturation des structures secondaires puis les tubes sont plongés immédiatement dans la glace pour éviter toute renaturation. A ces 70 p. ! d'ARN totaux sont alors ajoutés 1 pI d'aligodT (100 ng/ti) et 12 l de milieu "d'incubation" contenant 0,5 nM de dNTP, 4 ; J de tampon RT, 40 U de RNAsine (inhibiteur de Rnases), 10 mM de dithiotréitol ou DTT (dénaturant), 1 ut de MuLV-Rtase (200 U/jJ). Le mélange réactionnel est incubé 90 minutes à 42 C. Les produits de RT sont ensuite dilués au 10/10eue dans de l'eau distillée et stocké à-20 C. e La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) : La polymérisation itérative (PCR pour polymerase chain reaction) est une technique qui consiste à répéter des cycles de polymérisation d'un segment d'un ADN d'intérêt. La première étape de chaque cycle est une étape de dénaturation effectuée à 95 C. La deuxième étape est une étape d'hybridation ou accrochage avec des amorces spécifiques du segment qui encadrent la région à amplifier à une température à laquelle 50% des ADN sont sous forme double brin et les 50% restant sous la forme simple brin (Tm). La troisième étape est l'étape d'élongation à 72 C, température optimale pour l'activité de l'ADN polymérase ADN dépendante thermostable, la Taq polymérase. Les paramètres qui doivent être prioritairement pris en compte pour optimiser la PCR sont le choix des amorces (réalisés par le logiciel Primer3 et validés par comparaison avec les séquences humaines indexées, Blast), la température d'hybridation ou Tm, la concentration en MgC) 2 et ie nombre de cycles. Toutes ces conditions ont été mises au point avant de réaliser les PCR et sont résumées dans le tableau suivant : Amorces pour la RT-PCR Tm [MgCl2] Nombre Sonde pour le Southem-blot de cycles CRMP-4 Sens : gcaagtgtaggaaggcacgct Anti-sens : ggcagctctggaacgtgaaga Sonde : cctcagccttgttcttcacg 62 C 2mM 28 SEQ ID N 1 SEQ ID N02 SEQ ID N03 CRMP-2 Sens : tcacatcagaactcctgtgg Anti-sens : catgagtggaggaactttc Sonde : ccatcaccacccttgtctct 620C 3mM 22 SEQ ID N04 SEQ ID ? 5 SEQ ID N06 CRMP-1 Sens : tcatgctgaatccacctcgg Anti-sens : cctctgaggcagttgacgg Sonde : gacatcgccaaggactgact 62 C 3 mM 26 SEQ ID N07 SEQ ID ? 8 SEQ ID N09 CRMP-3 Sens : gccgcccctaccagagacc Anti-sens : gtgcagcgacagccagat Sonde : cggagaaaacctcatcgt 62 C 3 mM 30 SEQ ID ? 10 SEQ ID N 11 SEQ ID N012 CRMP-5 Sens : ctgggagagaggagtggttg Anti-sens : gaagtctcctccctggacct Sonde : gttttgtggccgttaccagt 62 C 3 mM 28 SEQ ID N 13 SEQ ID N 14 SEQ ID N 15 Actine Sens : ggacttcgagcaagagatgg Anti-sens : acatctgctggaaggtggac Sonde : aagtactccgtgtgtggatcgg 62 C 3 mM 25 SEQ ID ? 16 SEQ ID ? 17 SEQ ID ? 18 G3PDH Sens : ggctctccagaacatcatcc Anti-sens : ggagattcagtgtggtgg Sonde : gacatcaagaaggtggtgaagcag 62 C 3 mM 23 SEQ ID N 19 SEQ ID N020 SEQ ID N021 Chaque échantillon de PCR contient 10 pLI de RT diluée au 1/10ème et 40 j, t de Mix (5 pI de tampon PCR 1X, 2 ou 3 pI de MgCI2, 4x1 pI de dNTP, 1 loi de chaque amorce (sens et anti-sens), 0, 4 pI de Taq polymérase, qsp 50 ! -LI d'eau distillée. La PCR comprend une première étape de dénaturation de 5 min à 95 C puis un nombre de cycles déterminé pour chaque couple d'amorces (Cf. tableau) (1 min à 95 C, 1 min 15 à 62 C, 1 min 30 à 72 C). La PCR se termine par une étape d'élongation de 15 min à 72 C. les produits de PCR sont stockés à-20 C. . Visualisation des RT-PCR : Southern-blot : Elle est réalisée après la séparation des produits d'amplification par électrophorèse puis transfert sur membrane et hybridation avec une sonde interne radiomarquée. La migration des différents produits de PCR se fait par dépôt de 10 ; J de chaque échantillon sur un gel de 1, 5% d'agarose dans un tampon TBE (Tris-Borate-EDTA) 0, 5X contenant du Bromure d'éthidium (0, 5 lig/ml au final) et application de 100 V. Une fois la migration effectuée, les ADNc sont transférés selon une méthode d'électrotransfert semi-sec sur membrane de nylon en tampon TBE 0, 5X. Après transfert (15V-45 min), l'ADN est fixé sur la membrane par une solution de NaOH (0, 4N-2 min) puis neutralisé (SSC 6X-10 min). La sonde interne, spécifique du fragment d'ADN amplifié par PCR (Cf. tableau) est radiomarquée en 5'par une terminale kinase (T4 Kinase) avec du y32P-ATP. 2 j. ! 1 sont incubés 10 min à 37 C avec 5 J de tampon forward, 1 pLI de T4 kinase, 2 pI de y32P-ATP et 15 ; J d'eau distillée. La kination est arrêtée à 4 C. la sonde radiomarquée est ensuite purifiée sur une colonne d'exclusion (Bio-Rad Laboratories) qui retient les nucléotides libres. Les membranes de transfert sont préhybridées 30 min à 420C par incubation dans le milieu d'hybridation (SSC 6X, Denhardt 2X, tampon phosphate 25 mM, disodium éthylène diamine tétra-acétate ou EDTA 25 mM, SDS 0, 1%, ADN de sperme de saumon 250 fg/ml) afin de saturer tous les sites non spécifiques. L'hybridation s'effectue pendant 30 min à 42 C avec la sonde interne. Les membranes sont ensuite lavées à 42 C dans des milieux de stringence croissante : dans du SSC6X/0, 1% SDS 10 min, SSC 2X/SDS 0,1% 20 min et SSC 0, 5X/0, 1% SDS 10 min. Les membranes radiomarquées et scellées sous feuillet plastique sont ensuite placées dans une cassette d'autoradiographie munie d'un écran amplificateur. La visualisation des bandes d'ADNc radiomarquées se fait par lecture au Phosphorimager et la quantification par utilisation d'un logiciel informatique (Image Quant). 3. immunodétection des protéines CRMP. . Les anticorps anti-peptides : Des anticorps polyclonaux antipeptides spécifiques des 5 CRMP ont été préparés après sélection d'un immunogène situé dans une zone non homologue pour les autres CRMP et injection à un lapin. La spécificité de chaque sérum pour une protéine CRMP donnée a été contrôlée par Western-blot sur les protéines CRMP recombinantes. Les sérums de chacun de ces lapins prélevés avant leur immunisation (sérums pré-immuns) sont négatifs en Western-blot sur les protéines recombinantes obtenues dans Ecolitranes formées ou cellules Hela transfectées et sont utilisés comme contrôle. On a au préalable déterminé les dilutions optimum pour leur utilisation en Western-blot ou en immunocytochimie. -o Western-blot : Cette technique consiste en la séparation électrophorétique des protéines puis transfert sur membrane qui permet la visualisation d'une protéine d'intérêt après la fixation d'un anticorps spécifique révélé par un anticorps secondaire couplé à la peroxydase. Les Western-blot sont réalisés sur extraits protéiques de Iysats de cellules immunes ou nerveuses en culture ou fraîchement isolées. Les cellules sont en général Iysées dans un tampon sans détergent (20 mM Tris-HCI, 10% sucrose, 1 mM d'EDTA, 5 mM d'EGTA et un cocktail d'anti-protéases (Complete TM 1X) et parfois en tampon RIPA (Tris-HCI10 mM pH 7,2, 150 mM de NaCI, 1% de Triton 100X, 0,1% de SDS, 1 mM d'EDTA, 1% de sodium désoxycholate, Complete 1X). L'homogénéisation des Iysats cellulaires est ensuite complétée par une sonication à 80Hz. Après un dosage protéique, une solution de 1 ou 2 jg/) J de protéines est conservée à -20oC. L'échantillon de dépôt (40 zu finaux de protéines) est dénaturé par l'addition d'un tampon réducteur (Tris-Hcl 0, 0625 M pH 6, 8, SDS 1%, giycérot 10%, dithiothréitot DTT 0, H\/), bteu de bromophénol) et chauffage (5 min à 95 C). La séparation des protéines est réalisée sur gel d'acrylamide-SDS (10%-0, 1%, respectivement). Après migration sous 100V, les protéines sont électrotransférées sur une membrane de nitrocellulose par transfert discontinu utilisant 3 tampons : Tampon 1 (0, 3M Tris base, 20% Méthanol) ; Tampon 2 (25 mM Tris base, 20% Méthanol) ; Tampon 3 (25 mM Tris base, 40 mM EACA, 20% Méthanol) permettant un meilleur transfert de toutes les protéines, quel que soit leur poids moléculaire. Les membranes sont incubées 5 min dans une solution de Rouge Ponceau-acide trichloroacétique qui permet de fixer et visualiser les protéines. Les membranes sont ensuite saturées pendant 1 h à température ambiante dans une solution de Tampon phosphate (PBS)Tween 20 0, 1% - lait écrémé 5%. L'immunodétection des CRMP avec les sérums polyclonaux de lapin anti-CRMP dilués en PBS-Tween 20 0, 1%lait 1% (CRMP-4 : 1/100 ; CRMP-2 : 1/500 ; CRMP-1 : 1/500 ; CRMP-3 : 1/500 ; CRMP-5 : 1/200) ou pré-immun (1/200) est réalisée à 4 C-une nuit. Les blots sont alors rincés (3x5 min) en PBS-Tween 20 0, 1%-lait 1% puis incubés 1 h avec un anticorps secondaire spécifique des IgG de lapin et couplé à la peroxydase (1/50000e-1h-température ambiante). Après 3 rinçages (5 min) en PBS-Tween 20 0, 1%-lait 1%, le blot est révélé en chambre noire grâce à un kit d'électrochimioluminescence (Covalab) et après impression sur film photographique. Lors d'une expérience, les échantillons ont été traités par une phosphatase pendant 1 h à 370C avant leur séparation sur un gel d'acrylamide-SDS : 2 pI de phosphatase alcaline CIP (Calf intestine phosphatase à 20 unités/jJ) sont ajoutés à 20 jJ d'échantillon protéique et à 2 j. tl de tampon permettant l'activité de l'enzyme. e Immunocytochimie (ICC) : La détection des CRMP a été réalisée à l'échelle cellulaire par immunocytochimie. Les lymphocytes, cellules non adhérentes, sont étalés par centrifugation (cytospin-600 rpm-5 min) alors que les cellules nerveuses Dev sont cultivées sur des lames de Permanox (Labteck). Une fixation des cellules par l'acétone (-20 C, 5 min) a pour but de fixer les protéines et de perméabiliser les cellules à l'entrée des anticorps réactionnels. Ces conditions ont permis la détection des CRMP 1, 2, 3, 4 et 5. Le blocage des sites non spécifiques se fait avec une solution de BSA 0, 1% (30 minutes à température ambiante). Un premier contact des cellules fixées sur lames est effectué avec l'anticorps primaire (anti-CRMP produits chez le lapin dilués en PBS pH 7, 4) (1h-37 C en chambre humide). Après 3 lavages en tampon phosphate (PBS pH 7, 4, 5 min), l'anticorps secondaire spécifique des IgG de lapin est mis en contact (1h-température ambiante) et rincé 3 fois en PBS 5 min. La contrecoloration des noyaux se fait ensuite par une incubation en solution de Dapi (intercalant nucléique-0, 025 jug/mi-lmin). Les) ames sont montées en glycérol tamponné pH 7, 4. Les résultats de ces analyses sont représentés en sur les figures 2-8. EXEMPLE 1 : Evaluation de l'expression des CRMP 1, 2 et 4 dans les lymphocytes et cellules mononucléées, contrôles ou issues de patients atteints de pathologies dysimmunes. e ARNm (par rapport à GAPDH) Une première évaluation est réalisée en titrant les ARNm correspondants. Les résultats sont présentés de manière détaillée en figure 1 et résumés dans le tableau 1 ci-après. Profil comparatif, en considérant tous les échantillons pour une même CRMP : TABLEAU 1 CRMP2 CRMP4 CRMPI Lignées T control + 0 0 Lymphocytes T/HTLV-1++ +++ +++ Lympho. patients "eontrol" + 0 + Lympho. patients défie. Apopt. 0 +/++ Patients VIH ++ ++ ++ L'analyse précédente est complétée par détection des protéines CRMP1, 2 et 4 dans des lymphocytes T et des cellules nerveuses par Western Biot sur Iysat cellulaire (Dev : cellules nerveuses ; Jurkat : lignée Iymphocytaire T) en tampon non détergent et en utilisant les anticorps polyclonaux antipeptide spécifiques de chaque CRMP. Les résultats sont présentés en figure 2. On note que les anti CRMP-1, -2 et -4 détectent plusieurs isoformes partagées par les lymphocytes T et les cellules nerveuses. EXEMPLE 2 : Détection immunocytochimique de la localisation subcellulaire de la protéine CRMP2 dans des cellules mononucléées sanguines (PBL) de patients contrôles ou infectés par le HTLV-1 ou présentant une déficience immune liée au système Fas/Fas ligand ou infectés par le VIH. L'anticorps anti CRMP-2 a été au préalable préparé et isolé selon le protocole décrit au point 3 du préambule matériels et méthode . Les résultats sont illustrés en figure 3. On note que : - la localisation de CRMP-2 est essentiellement cytoplasmique dans des lymphocytes (PBL) isolés d'un sujet contrôle ou d'un sujet infecté par VIH-1 ; elle peut aussi être nucléaire dans les lymphocytes isolés de patients infectés par HTLV-1 ou dans les PBL d'un patient dysimmun (déficience Fas) ; - CRMP-2 est plus exprimée dans les lymphocytes des patients comparés à ceux du sujet contrôle cultivés en IL2, donc préactivés. Par examen après immunodétection de CRMP-2 et contrecoloration par l'intercalant de l'ADN Dapi, on note que l'expression est majoritairement nucléaire dans les lymphocytes T chroniquement infectés par HTLV-1 et hyperprolifératifs. Quant à l'examen de l'immunodétection de CRMP-2 en microscopie confocale, il révèle une présence nucléaire très faible dans les lymphocytes T contrôle et majoritaire dans les lymphocytes T chroniquement infectés par HTLV-1 (figure 4). En conclusion, L'expression de CRMP2 est augmentée dans les noyaux des lymphocytes prolifératifs. En revanche chez les patients infectés par le VIH, CRMP2 reste cytoplasmique. Chez les patients dysimmuns (déficients en Fas), la localisation est nucléaire dans quelques cellules. Les figures 3 et 4 rendent compte des résultats obtenus. De même, la présence nucléaire d'une protéine reconnue par ce même anticorps a été vérifiée dans les lymphocytes T hyperprolifératifs par Western Blot sur des fractionnements cellulaires enrichis en noyaux. EXEMPLE 3 : Caractérisation par immunohistochimie de l'expression des protéines CRMP5 et CRMP2 au niveau du thymus. Les protéines ont été caractérisées à l'aide de leurs anticorps respectifs. Les cellules analysées sont des cellules de thymus normal de foetus humain et dans un thymome chez un patient adulte. A titre témoin, la même immunohistochimie a été réalisée sur du thymus humain d'un embryon de 6 semaines. Le thymus est surgelé et coupé au cryostat (15 sum). Les coupes sont fixées pendant 15 minutes dans l'acétone. L'immunohistochimie est réalisée dans les mêmes conditions que sur du cerveau. Cette analyse révèle une expression de CRMP2 et CRMP5 dans les cellules épithéliales thymiques normale au stade embryonnaire. L'expression disparaît chez l'adulte normal et peut être induite dans le cas de pathologie tumorale (thymome). EXEMPLE 4 : Caractérisation de l'interaction entre les protéines PrP bovine et CRMP5 humaine. L'interaction entre les protéines PrP bovine et CRMP5 humaine a été caractérisée par essais double-hybride par conjugaisons. Les ADNc codant pour ces deux protéines (complètes ou différentes formes dérivées) ont été clones dans un vecteur"d'appât"et un vecteur"de proie". Le vecteur d'appât pEG202 (Gyuris et al, 1993, Cell 75, 791-803), comporte le gène codant pour le marqueur HIS3, une origine de réplication 2 j et dirige l'expression de protéines fusionnées au domaine de liaison à l'ADN de la protéine LexA (1-202), sous le contrôle du promoteur constitutif ADHp. En ce qui concerne le vecteur de proie, pJG 4-5 (US 5,580, 736), il comporte le gène codant pour le marqueur TRP1, une origine de réplication 2 microns et dirige l'expression de protéines fusionnées à une séquence de localisation nucléaire (NLS), au domaine activateur de transcription B42 et à l'épitope HA, sous le contrôle du promoteur inductible GALp. Par commodité, la fusion NLS-B42-HA est ici désignée"Act". La souche EGY42 (MAT) (Golemis et al, 1992, Mol. Cell. Biol. 12, 3006-3014) a été co-transformée avec le vecteur plasmidique pSH18-34 (US 5,695, 941) comportant le gène marqueur URA3 et huit opérateurs LexA placés en amont du gène rapporteur lacez et différents vecteurs d'appâts dirigeant l'expression de LexA, LexA-PrP, LexA-PrPm (mutations sur PrP restant à déterminer), LexA-PrPtr (troncation de PrP restant à déterminer), LexA-MAX (contrôle négatif) et LexA-CRMP5. La souche EGY48 (MAT a) a été transformée avec différents vecteurs de proie dirigeant l'expression de Act, Act-PrP, Act-BaxATM (contrôle négatif) et Act-CRMP5. Ces différentes souches ont été conjuguées de façon à créer une matrice d'interaction. Cette matrice a été répliquée sur milieu indicateur (mura', His-, Trip-, Galactose/X-gal) permettant d'exprimer les appâts et les proies, de sélectionner les exconjuguants diploïdes et de révéler les phénotypes d'interaction (couleur bleue, révélant une activité ss-galactosidase observée lorsque le gène rapporteur lac est transcrit). La figure 7 rend compte des résultats obtenus. Les constructions testées sont les suivantes : PrP : protéine PrP bovine (AA 22-237), PrPm : protéine PrP bovine (AA 22-237) contenant diverses mutations restant à déterminer, PrPtr : protéine PrP bovine (AA-22- ?), tronquée vers le milieu de sa séquence (la position du codon stop reste à déterminer), MAX : contrôle négatif d'interaction CRMP 5 : protéine CRMP 5 humaine complète. BAXATM : contrôle négatif d'interaction. L'interaction entre les protéines PrP (différentes constructions détaillées ci-dessous) et la protéine CRMP5 est détectée lorsque les protéines PrP sont exprimées en tant qu'appâts et la protéine CRMP5 est exprimée en tant que proie. LexA-CRMP5 et Act-Prp ne donnent pas de phénotype d'interaction. Les contrôles négatifs (LexA-MAX et Act-BaxATM ainsi que LexA et Act) ne donnent aucun phénotype d'interaction avec les protéines PrP et CRMP. L'homodimérisation de CRMP5 fournit le contrôle positif d'interaction de cette matrice. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'au moins une protéine de la famille CRMPs, fragment polypeptidique ou dérivé biologiquement actif de celle-ci, d'une séquence ou fragment de séquence nucléotidique codant pour ladite protéine, d'une séquence anti-sens capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence nucléotidiquement codant pour ladite protéine ou un anticorps dirigé contre ladite protéine, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des pathologies liées à un dysfonctionnement du système immunitaire. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la pathologie est choisie parmi les maladies auto-immunes, les leucémies T et lymphomes, les atteintes neuro-inflammatoires associées à l'infection par le rétrovirus HTLV-1, la paraparésie spastique tropicale, le neurosida, les pathologies de type herpès, rougeole, virus d'Epstein-Barr et les maladies à prions ; les atteintes dysimmunes liées à la mutation de Fas et Fasl ; et les atteintes neuro-inflammatoires associées à une activation des lymphocytes T. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la protéine CRMP est choisie parmi les protéines CRMP1, CRMP2, CRMP3, CRMP4 et CRMP5. 4. Utilisation selon la revendication 1 ou 2 d'une séquence d'acides nucléiques isolés codant pour l'une des protéines CRMP1, CRMP2, CRMP3, CRMP4 et CRMP5, ou fragments nucléotidiques ou séquences dérivant de l'une des séquences, du fait de la dégénérescence du code génétique ou du fait de mutation, de délétion, ou d'insertion d'au moins un nucléotide, avec lesdites séquences dérivées codant pour une protéine ayant une activité biologique pratiquement identique à la protéine CRMP considérée. 5. Utilisation selon la revendication 1 ou 2 d'une séquence anti-sens capable de s'hybrider avec une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine choisie parmi les protéines CRMP1, CRMP2, CRMP3, CRMP4 et CRMP5. 6. Utilisation selon la revendication 1 ou 2 d'anticorps mono-ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués obtenus à partir d'une CRMPs choisie parmi les protéines CRMP1, CRMP2, CRMP3, CRMP4 et CRMP5, dérivés ou fragments polypeptidiques biologiquement actifs de CRMPs. 7. Méthode pour le pronostic et/ou diagnostic de maladies autoimmunes, de maladies neuro-inflammatoires associées à une infection virale, de maladies à prions, de lymphomes et/ou de leucémie T de l'adulte, caractérisée en ce que l'on met en évidence dans des lymphocytes prélevés chez un individu, la présence d'au moins une protéine CRMP dont l'expression, la séquence ou la localisation est modifiée par rapport à des lymphocytes contrôles sains. 8. Méthode pour détecter, identifier et/ou doser un partenaire biologique d'une protéine CRMP dans un extrait biologique de"patients atteints de maladies autoimmunes, neuroinflammatoires, lymphomes ou leucémies T.", caractérisé en ce que l'on utilise à titre d'outil de diagnostic au moins une protéine de CRMP.