Brevet FR2832422A1 — publié le 20030523

L'invention concerne la détermination d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine modifiée, l'élaboration de vecteurs en permettant l'expression, et les applications des vecteurs obtenus et des protéines ainsi exprimées. Une protéine modifiée selon l'invention est une protéine, dite d'intérêt, c'est-à-dire une protéine, ou une partie de cette protéine, que l'on cherche à isoler par exemple en diagnostic, à véhiculer par exemple en thérapie, dans la séquence peptidique de laquelle sont rapportées par intercalation et/ou ajout, au moins deux successions de résidus d'acides aminés : une succession d'au moins six résidus lysine et une succession d'au moins six résidus histidine. Dans la suite de la description, on utilisera indifféremment les termes succession et tag pour représenter un groupe de résidus d'acides aminés. Dans les exemples qui suivront la protéine d'intérêt est la glycoprotéine de la capside de VIH-1, p24, mais les objets de l'invention n'y sont bien entendu pas limités. Selon le document WO-A-98/59241, les auteurs de la présente invention ont démontré que la modification de la séquence peptidique de la protéine p24 de capside du VIH-1, par insertion d'un tag de six résidus lysine, permet d'augmenter considérablement le rendement de couplage de la protéine sur le copolymère AMVE67. On a ainsi pu atteindre une immobilisation de 50 molécules de protéine modifiée par chaîne de copolymère. L'immobilisation de protéines trouve des applications dans un grand nombre de domaines. Par exemple, en chimiothérapie, l'immobilisation de protéines thérapeutiques permet d'augmenter leur temps de vie dans le sang par limitation des dégradations protéolytiques (Monfardini et al., 1998), mais aussi de cibler passivement des cellules tumorales grâce à l'hyperperméabilité de ces cellules (Duncan et aL, 1999). En thérapie génique, on utilise des ligands spécifiques de récepteurs cellulaires et qui sont couplés à des polymères cationiques, pour vectoriser des gènes, permettant un ciblage efficace des cellules à transfecter (Varga et al., 2000). On sait par ailleurs que le rendement de purification d'une protéine par chromatographie d'affinité pour les ions métalliques immobilisés (IMAC) est fortement élevé quand la protéine est modifiée par apport d'un tag d'au moins six résidus histidine. Mais, pour la plupart des applications, il est essentiel de conserver l'activité biologique de la protéine, après purification et immobilisation. Aussi, l'enjeu de l'invention a résidé dans l'obtention d'une protéine modifiée qui, à la fois, soit efficacement purifiable par chromatographie telle que la technique IMAC, soit facilement immobilisable sur un polymère, et possède au moins toutes les propriétés biologiques de la protéine native, pour lesquelles la protéine modifiée est utilisée et trouve une application. Ainsi, un premier objet de l'invention est une séquence nucléotidique codant pour une protéine d'intérêt modifiée, comprenant au moins un gène codant pour ladite protéine d'intérêt, un fragment nucléotidique, dit polyK, codant pour une succession d'au moins six résidus lysine, et un fragment nucléotidique, dit polyH, codant pour une succession d'au moins six résidus histidine. Selon la protéine considérée, et en particulier en fonction de localisation de son ou ses sites d'activité, dans sa séquence peptidique, les tags respectivement de résidus histidine et lysine devront être apportés dans l'une et/ou l'autre des extrémités N-et C-terminales, ou pourront être intercalés entre les épitopes situés dans ladite séquence. Avantageusement : les deux tags au moins sont insérés dans, ou ajoutés à, soit l'extrémité N-terminale, soit l'extrémité C-terminale de la protéine ; dans cette configuration, les deux tags peuvent être contigus ou séparés par un espaceur ; ou un des deux tags est inséré dans, ou ajouté à, l'extrémité N-terminale, et l'autre est inséré dans, ou ajouté à, l'extrémité C-terminale de la protéine. A cet effet, une séquence nucléotidique de l'invention est choisie parmi les séquences telles que définies précédemment et présentant en outre les caractéristiques suivantes : - les séquences nucléotidiques dans lesquelles, par rapport audit gène codant pour la protéine d'intérêt, au moins l'un des deux fragments nucléotidiques, polyK ou polyH, est situé sur l'extrémité 5'de la séquence ; - les séquences nucléotidiques dans lesquelles, par rapport audit gène codant pour la protéine d'intérêt, les deux fragments nucléotidiques, polyK ou polyH, sont situé sur l'extrémité 5'de la séquence ; dans cette configuration, soit le fragment nucléotidique polyK est situé entre le fragment nucléotidique polyH et le gène, soit le fragment nucléotidique polyH est situé entre le fragment nucléotidique polyK et le gène ; - les séquences nucléotidiques dans lesquelles, par rapport audit gène codant pour la protéine d'intérêt, au moins l'un des deux fragments nucléotidiques, poly ou poly, est situé sur l'extrémité 5'de la séquence, et l'autre des deux fragments nucléotidiques, polyH ou polyK, est situé sur l'extrémité 3' ; dans cette configuration, soit le fragment nucléotidique polyK est sur l'extrémité 3', et le fragment nucléotidique polyH est sur l'extrémité 5', soit le fragment nucléotidique polyH est sur l'extrémité 3', et le fragment nucléotidique polyK est sur l'extrémité 5' ; - les séquences nucléotidiques dans lesquelles, par rapport au gène, les deux fragments nucléotidiques, poly et polyH, sont situés sur l'extrémité 3'de la séquence ; dans cette configuration, soit le fragment nucléotidique polyK est situé entre le fragment nucléotidique polyH et le gène, soit le fragment nucléotidique polyH est situé entre le fragment nucléotidique polyK et le gène ; - les séquences nucléotidiques, telles que définies ci-dessus et dans lesquelles, entre le gène et au moins l'un des deux fragments polyK et polyH et/ou entre les deux fragments polyK et poly, est intercalé au moins un fragment nucléotidique codant pour un bras espaceur. Une séquence nucléotidique préférée est une séquence dans laquelle le fragment polyK code pour une succession de six résidus lysine, et/ou le fragment polyH code pour une succession de six résidus histidine. Un bras espaceur est avantageusement choisi parmi les séquences nucléotidiques comprenant au moins l'une quelconque des SEQ ID NO : 5 à 8. Les séquences SEQ ID NO : 9-12 illustrent les séquences peptidiques codées par les séquences nucléotidiques des bras espaceurs SEQ ID NO : 5 à 8. Comme cela sera illustré dans les exemples, dans une application particulière de la détection du VIH-1, la protéine d'intérêt est la p24 de VIH-1, identifiée par SEQ ID NO : 13, et la protéine modifiée a une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 14 à 20. Avant d'exposer les autres objets de l'invention et d'en décrire en détails les caractéristiques et avantages, une définition de certains termes employés dans la description et les revendications est ci-après donnée pour que l'invention et donc l'étendue de la protection soient clairement délimitées. Une succession ou tag de résidus d'acides aminés est une courte séquence d'acides aminés qui est rapportée dans la séquence peptidique de la protéine native ou originale, en un lieu privilégié, pour permettre à cette succession ou tag d'être exposée de façon pertinente, tout en conservant, voire améliorant, les propriétés biologiques de la protéine native ou originale. En particulier selon l'invention, la présentation du tag de résidus histidine doit être favorable par rapport à une affinité de ce tag pour des ions métalliques, tels qu'utilisés dans la technique de purification dite IMAC (chromatographie par affinité pour ions métalliques immobilisés), celle du tag de résidus lysine doit être favorable par rapport à sa fixation sur une phase d'immobilisation via une interaction covalente entre le tag et des fonctions réactives présentes sur ou dans ladite phase. Par intercalation ou insertion d'un tag, on comprend que le tag est introduit à l'intérieur de la séquence peptidique de la protéine d'intérêt, entre deux acides aminés. Par ajout d'un tag, on comprend que le tag, on entend que le tag est rabouté à la séquence peptidique de la protéine d'intérêt, en l'extrémité N-ou C-terminale de ladite séquence. En pratique, les protéines modifiées recombinantes obtenues selon l'invention, comporteront souvent des acides aminés qui s'intercaleront entre les tags, et/ou entre les tags et la séquence peptidique de la protéine native ou originale, sans pour autant avoir d'incidence sur la spécificité des tags et sur l'activité biologique de la protéine. Les résidus d'acides aminés appartenant à un tag selon l'invention sont choisis parmi les acides aminés naturels et les acides aminés chimiquement modifiés. La modification chimique apportée à l'acide aminé naturel doit préserver, voire développer, la spécificité du tag vis-à-vis de son rôle dans la fixation. A titre d'exemple, on peut citer le remplacement d'un acide aminé L, par l'acide aminé D correspondant et inversement ; une modification de la chaîne latérale de l'acide aminé : dans le cas de la lysine, il peut s'agir d'une acétylation du groupe aminé de la chaîne latérale ; une modification des liaisons peptidiques du tag, telles que des liaisons carba, rétro, inverso, rétroinverso, réduites, méthylène-oxy. La phase d'immobilisation sur laquelle la fixation de la protéine modifiée est favorisée par l'intermédiaire du tag de résidus lysine peut être un polymère, articulaire ou linéaire, et notamment choisi parmi les homopolymères tels que la polylysin, la polytyrosine ; parmi les copolymères tels que les copolymères d'anhydride maléique, les copolymères de N-vinylpyrrolidone, les polysaccharides naturels ou synthétiques, les polynucléotides et les copolymères d'acides aminés comme les enzymes. Des polymères avantageux sont le copolymère N-vinyl-pyrrolidone 1 N-acryloxysuccinimide, le poly-6-aminoglucose, la peroxydase de raifort (HRP) et la phosphatase alcaline. La phase d'immobilisation comporte des fonctions réactives qui vont interagir par covalence avec le tag lysine. Ces fonctions réactives sont choisies parmi les fonctions ester, acide, halogénocarbonyle, sulfhydrile, disulfure, époxyde, halogénocarbonyle et aldéhyde. La phase d'immobilisation peut être fixée, directement ou indirectement, sur un support solide, par adsorption passive ou par covalence. Ce support solide peut se présenter sous toutes formes appropriées telles qu'une plaque, un cône, une bille, la bille étant éventuellement radioactive, fluorescente, magnétique et/ou conductrice, une barrette, un tube de verre, un puits, une feuille, une puce ou analogues. Le matériau du support est de préférence choisi parmi les polystyrènes, les copolymères styrène-butadiène, les copolymères styrène-butadiène en mélange avec des polystyrènes, des polypropylènes, des polycarbonates, des copolymères polystyrène-acrylonitrile, des copolymères styrène- méthylméthacrylate de méthyle, parmi les fibres synthétiques et naturelles, parmi les polysaccharides et les dérivés de la cellulose, le verre, le silicium et leurs dérivés. La synthèse d'une séquence nucléotidique selon l'invention est aisément réalisable par des techniques de routine que l'homme du métier sait mettre en oeuvre. Un autre objet de l'invention est un système d'expression, tel qu'un vecteur permettant l'expression d'une séquence nucléotidique de l'invention. Lorsque la protéine d'intérêt est la p24 de capside du VIH-1, un vecteur approprié présente une séquence nucléotidique choisie par SEQ ID Nos : 1 à 4, de préférence la séquence nucléotidique est SEQ ID NO : 1 ou 3. L'invention concerne aussi un kit de vecteurs pour l'expression d'au moins deux séquences nucléotidiques différentes, de l'invention. Un kit avantageux comprend des vecteurs codant pour l'expression au moins de deux séquences nucléotidiques dans lesquelles, par rapport audit gène codant pour la protéine d'intérêt, les deux fragments nucléotidiques, polyK ou polyH, sont situé sur l'extrémité 5'de la séquence ; ou de deux séquences nucléotidiques dans lesquelles, par rapport audit gène codant pour la protéine d'intérêt, au moins l'un des deux fragments nucléotidiques, polyK ou polyH, est situé sur l'extrémité 5'de la séquence, et l'autre des deux fragments nucléotidiques, polyH ou polyK, est situé sur l'extrémité 3' ; ou bien de deux séquences nucléotidiques dans lesquelles, par rapport au gène, les deux fragments nucléotidiques, polyK et polyH, sont situés sur l'extrémité 3'de la séquence. Un autre kit avantageux comprend des vecteurs codant pour l'expression au moins d'une séquence nucléotidique dans laquelle, par rapport audit gène codant pour la protéine d'intérêt, les deux fragments nucléotidiques, polyK ou polyH, sont situé sur l'extrémité 5'de la séquence ; d'une séquence nucléotidique dans laquelle, par rapport audit gène codant pour la protéine d'intérêt, au moins l'un des deux fragments nucléotidiques, polyK ou polyH, est situé sur l'extrémité 5'de la séquence, et l'autre des deux fragments nucléotidiques, polyH ou polyK, est situé sur l'extrémité 3' ; et d'une séquence y nucléotidique dans laquelle, par rapport au gène, les deux fragments nucléotidiques, polyK et polyH, sont situés sur l'extrémité 3'de la séquence. Un autre objet de l'invention est une cellule hôte comprenant au moins un vecteur de l'invention, dans laquelle s'exprime au moins une séquence nucléotidique telle que définie précédemment. Cette facilité d'obtention et d'expression dans un vecteur par exemple, d'une séquence nucléotidique, a conduit les auteurs à mettre au point un procédé simple d'obtention d'une protéine d'intérêt modifiée, purifiée et immobilisée. Ce procédé comprend les étapes suivantes : on dispose d'au moins une séquence nucléotidique de l'invention ; on exprime la séquence nucléotidique, au moins, dans un système d'expression approprié ; on purifie la protéine au moins, modifiée ainsi obtenue, par chromatographie par affinité aux ions métalliques ; on immobilise la protéine au moins, modifiée, purifiée. Les auteurs ont également défini un procédé simple d'obtention d'une protéine d'intérêt modifiée, purifiée et immobilisée, et qui conserve les propriétés biologiques de la protéine d'intérêt native, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : on dispose d'au moins un kit de vecteurs tels que définis précédemment, en particulier au moins l'un des kits avantageux ; on exprime les séquences nucléotidiques, dans un système d'expression approprié ; on purifie les protéines modifiées ainsi obtenues, par chromatographie par affinité aux ions métalliques ; on immobilise les protéines, modifiées, purifiées ; on teste l'activité biologique des protéines, modifiées, immobilisées ; et on sélectionne la protéine modifiée, immobilisée, présentant la meilleure activité biologique. Selon une variante du procédé de l'invention, celui-ci peut en outre comprendre les étapes suivantes : Après l'étape de purification, on peut sélectionner la ou les protéines pour lesquelles le rendement de purification est le plus élevé, et/ou Après l'étape d'immobilisation, on peut sélectionner la ou les protéines pour lesquelles le rendement d'immobilisation est le plus élevé. Les caractéristiques et avantages des différents objets de l'invention sont ci-après illustrés, à l'appui des Exemples 1 à 6 et des Figures 1 à 6, selon lesquelles : La Figure 1 illustre la protéine native p24 et les différentes protéines modifiées, telles qu'obtenues et utilisées selon la présente invention. La Figure 2 illustre l'analyse sur gel de polyacrylamide de l'expression et de la purification des protéines recombinantes ; Figure 2A montre le taux d'expression des différentes protéines avant et après induction à l'IPTG, ; Figure 2B montre le taux de pureté des différentes protéines après purification par chélation métallique pour les ions Zn2+ ; Figure 2C montre la reconnaissance des protéines purifiées par un anticorps polyclonal après transfert par Western Blot sur membrane de nitrocellulose. La Figure 3 illustre les caractéristiques physico-chimiques des sept protéines recombinantes décrites en Figure 1, et plus particulièrement le nombre d'acides aminés les constituant et leur masse moléculaire déterminée par spectrométrie de masse et comparée à la masse moléculaire théorique. La Figure 4 représente un histogramme montrant l'efficacité de couplage en pourcentage des sept protéines recombinantes sur le polymère d'AMVE67. La Figure 5 illustre la comparaison des réactivités biologiques des conjugués RH24K-AMVE67 et RK24H-AMVE67 en phase de capture d'anticorps monoclonaux en fonction de la position de l'épitope reconnu par l'anticorps. La Figure 6 illustre la structure des vecteurs d'expression pMK permettant d'obtenir des protéines modifiées selon l'invention. La Figure 6A schématise la structure d'un vecteur, et la Figure 6B montre quatre configurations de vecteurs permettant d'obtenir les protéines modifiées suivantes : RH24K, R24KH, RK24H et RHK24. Exemple 1 : Ensemble de constructions permettant l'obtention de protéines doublement taggées Schématiquement, les vecteurs permettant l'expression des protéines recombinantes taggées ont été générés à partir du vecteur d'expression pMR24 obtenu par ligation du fragment Ncol-Xbal du pMH24 (Cheynet et al, 1993) contenant le gène de la p24 avec le fragment Ncol-Xbal du pMR-T7 (WO-98/45449, Arnaud et al, 1997) contenant l'ensemble des séquences régulant la réplication du plasmide ainsi que les éléments permettant l'expression du gène inséré. Des adaptateurs oligonucléotidiques adéquats amenant les informations codantes relatives aux tags lysine et/ou histidine ont été insérés entre Cial et Ncol en 5'et Smal et Xbal en 3', pour obtenir une séquence nucléotidique selon l'invention. La portion du gène de la p24 codant pour le polypeptide commençant à l'acide aminé 3 (valine) et se terminant à l'acide aminé 224 (proline) est conservée dans toutes les constructions. Les sept séquences nucléotidiques insérées ont été conçues comme suit : toutes possèdent une séquence nucléotidique codant pour une succession (ou tag) de 6 résidus histidine, devant permettre une purification efficace de la protéine par affinité pour les ions métalliques (IMAC pour chromatographie par affinité sur ions métalliques immobilisés), et cinq d'entre elles présentent une séquence codant pour une succession (ou tag) de six lysines, afin de permettre un couplage covalent de la protéine sur le polymère. Les protéines modifiées recombinantes obtenues sont les suivantes : - RH24 codée par le plasmide pRH24, possède un tag de 6 résidus histidine en position N-terminale, illustrée par SEQ ID NO : 14 - R24H, codée par le plasmide pRH24 et pR24H, présente un tag de 6 résidus histidine en position C-terminale, illustrée par SEQ ID NO : 15 ; - RH24K, codée par le plasmide pRH24K, présente un tag de 6 résidus histidine en position N-terminale et un tag de 6 résidus lysine en position C-terminale, illustrée par SEQ ID NO : 16 ; - RK24H, codée par le plasmide pRK24H, présente un tag de 6 résidus histidine en position C-terminale et un tag de 6 résidus lysine en position N-terminale, illustrée par SEQ ID NO : 17 ; - R24KH, codée par le plasmide pR24KH, présente un tag de 6 résidus histidine et un tag de 6 résidus lysine ; tous deux sont en position C-terminale et sont contigüs, illustrée par SEQ ID NO : 18 ; - R24KsH, codée par le plasmide pR24KsH, présente un tag de 6 résidus lysine et un tag de 6 résidus histidine ; tous deux sont en position C-terminale et sont séparés par une séquence espaceur, illustrée par SEO ID NO : 19 ; - RHsK24, codée par le plasmide pRHsK24, présente un tag de 6 résidus histidine et un tag de 6 résidus lysine ; tous deux sont en position N-terminale et sont séparés par une séquence espaceur, illustrée par SEQ ID NO : 20 ; La séquence espaceur des protéines recombinantes R24KsH et RHsK24 est représentée par s et est constituée par une succession de quatre résidus glycine et un résidu sérine, qui peut être répétée plusieurs fois. La Figure 1A décrit la séquence peptidique de la protéine p24 native de capside du VIH-1, isolée de la souche HXB2. Le fragment peptidique 3-224 représente la séquence conservée dans toutes les protéines recombinantes. La Figure 1 B illustre la structure des sept protéines recombinantes, ci-dessus, la séquence peptidique conservée étant représentée par une boîte blanche, le tag de 6 résidus histidine étant représenté par une boîte grise, le tag de 6 résidus lysine étant représenté par une boîte noire ; les résidus d'acide aminé précisément indiqués sont des acides aminés spécifiques, hors des trois boîtes précédentes et de la séquence espaceur, pouvant varier d'une protéine recombinante à une autre. Exemple 2 : Obtention de protéines recombinantes taggées He et Kr, Des bactéries compétentes E. coli souche XL 1 ont été transformées par les sept plasmides obtenus à l'Exemple 1, et l'induction de l'expression des protéines est réalisée par addition d'isopropyl-ss-D- thiogalactopyranoside (IPTG), comme précédemment décrit (Cheynet et al, 1993, Arnaud et al, 1997). Les protéines sont extraites, après sonication du culot bactérien, en tampon 50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 10 mM MgCI2, 100 mM NaCI en présence d'anti-protéases (leupeptine 10 ug/pl et aprotinine 1,25 pg/pl), puis purifiées par IMAC. Les purifications ont été réalisées sur un gel de Sépharose activé avec des ions zinc. Les protéines recombinantes comprenant un tag de 6 résidus histidine sont chélatées par les ions métalliques. Le système chromatographique utilisé est une FPLC (Äkta Explorer, Pharmacia Biotech). La boucle de chargement est de 2 ml. Les purifications se font par injection de protéine diluée au 1/2 dans le tampon de lavage qui est un tampon phosphate 67 mM - NaCI 0, 5 M pH7,8. Les protéines d'intérêt sont éluées spécifiquement à pH 4,7 environ par élaboration d'un gradient de pH à l'aide de tampons acétate d'ammonium pH 6,0 et pH 3,0. Les différentes fractions de purification sont collectées. 10 pl de chacune de ces fractions sont déposés sur papier Whatman 3MM Chr puis colorés au bleu de Coomassie. Les fractions (protéines non retenues-protéine purifiée) sont ensuite mises à migrer sur gels d'acrylamide 12% après réduction au ss-Me et chauffage 10 minutes à 95 C, puis colorées au bleu de Coomassie. Les fractions les plus concentrées en protéine d'intérêt sont alors rassemblées puis dialysées en cassette de dialyse Slide-A-Lyzer MWCO 10000 PIERCE 1 heure puis 1 nuit à +4 C contre un tampon Phosphate 50 mM pH 7,8. Les concentrations en protéines sont alors définies par un dosage colorimétrique Bradford Coomassie Plus Assay (PIERCE). Les extraits protéiques bactériens et les protéines purifiées sont mis à migrer sur gels d'acrylamide 12% après réduction au ss-mercapto-éthanol et chauffage 10 minutes à 95 C, puis colorés au bleu de Coomassie. Pour les protéines purifiées, un gel réalisé en parallèle est transféré par Western Blot sur membrane de nitrocellulose (Hybond C extra, Amersham Life Science). Les sites non spécifiques de la membrane sont ensuite saturés en tampon Tris salin (TBS pour Tris Buffer Salin) Tween 0, 1% additionné de 5% de lait. Après 3 lavages en TBS-T, la membrane est mise à incuber 2 heures à température ambiante en présence de l'anticorps polyclonal de lapin biotinylé anti-p24 dilué me au 1/10 000 en tampon TBS-T + 5% lait. Après 3 lavages en TBS-T, la membrane est mise à incuber 1 heure à température ambiante en présence de streptavidine-peroxydase (Jackson ImmunoResearch) à 0,5 g/) diluée au ème 1/3 000 en tampon TBS-T + 5% lait. Trois lavages en TBS-T sont réalisés avant la révélation par chimiluminescence ECL + (Amersham Pharmacia Biotech, RPN2132). Une autoradiographie de 15 secondes en chambre noire est réalisée sur film Kodak Biomax MR. La Figure 2 illustre l'analyse sur gel de polyacrylamide de l'expression et de la purification des protéines recombinantes comme suit. La Figure 2A présente le résultat d'une analyse sur gel d'acrylamide 12% coloré au bleu de Coomassie des fractions non induites (-) et induites (+) à l'IPTG 1 mM pendant 3 heures à 37 C des sept protéines recombinantes, avec un dépôt de 5 ul/puits d'échantillon brut. La protéine produite est indiquée par une flèche ( > ). La Figure 2B présente le résultat de l'analyse sur gel d'acrylamide 12% coloré au bleu de Coomassie des sept protéines recombinantes, après 2+ leur purification par chélation pour les ions métalliques Zn, avec un dépôt de 3 ug/puits. La Figure 2C représente le résultat du transfert des protéines sur membrane de Nitrocellulose par Western Blot après migration sur gel d'acrylamide 12%. La reconnaissance est effectuée par un anticorps polyclonal de lapin biotinylé dilué au 1/10000ème et révélation par chimiluminescence ECL+, après exposition du film d'autoradiographie pendant 15 secondes. Le dépôt était de 0, 127 ug/puits. L'analyse de l'expression (Figure 2A) montre que, pour 6 des 7 protéines attendues, les protéines d'intérêts représentent environ 20 à 30% des protéines totales produites par la bactérie E coli après induction (+), indépendamment de l'introduction du tag Lys-6 (par comparaison de RH24K et RH24, de RK24H et R24H) et des positions respectives des tags His-6 et Lys-6 (par comparaison de RH24K, RK24H, R24KH et R24KsH). La protéine RHsK24 présente quant à elle, un faible niveau d'expression, avec moins de 5% de la quantité des protéines totales. Au final, on obtient des quantités similaires des protéines recombinantes RH24, R24H, RH24K, RK24H, R24KH et R24KsH, à savoir entre 2 et 5 mg par gramme de biomasse pour une condition de culture et d'extraction donnée, et seulement 0,4 mg de RHsK24, en accord avec son faible niveau d'expression. On observe qu'en optimisant les conditions de cultures telles que le volume de culture et l'étape d'extraction, des rendements de 9 à 16 mg par gramme de biomasse ont pu être obtenus pour la RH24 et la RH24K. Le résultat de l'étape de purification des protéines est représentée sur la Figure 2B, et on observe que la pureté sur gel après coloration au bleu de Coomassie est supérieure à 95%. Une reconnaissance sur membrane de nitrocellulose par un anticorps polyclonal de lapin anti-p24 fait apparaître selon la Figure 2C que les protéines obtenues correspondent bien à celles attendues. Elles migrent à une taille de 27 kDa environ, ce qui est en accord avec la valeur attendue. Certaines protéines présentent de faibles bandes supplémentaires de masse inférieure et de très faible intensité. Exemple 3 : Caractérisation des protéines recombinantes Les protéines purifiées sont ensuite plus précisément caractérisées par spectrométrie de masse couplée à une chromatographie liquide (LC/ESI/MS). Les analyses ont été réalisées sur un spectromètre de masse simple quadripôle API 100, des pompes 140B et un détecteur 785A (Perkin Elmer). Les chromatographies liquides en phase inverse ont été réalisées sur une colonne C4 (Vydac Ref 214PT5115, taille des particules 5 um). Les tampons d'élution sont pour le solvant A : acide formique dans de l'eau 0,1% (v/v) et pour le solvant 8 : acide formique dans une solution eau 1 acétonitrile (5 : 95 v/v). Un gradient de 40 à 60% de B a été utilisé. Pour chaque protéine recombinante, sont indiqués, sur la Figure 3, le nombre d'acides aminés, les masses moléculaires (MM) théoriques (a) déterminées grâce à l'utilisation du logiciel Mac Vector Version 6.5. 3 et les masses moléculaires expérimentales (b) déterminée par spectrométrie de masse couplée à une chromatographie liquide (LC/ESI/MS). Les résultats montrent que les masses moléculaires déterminées par spectrométrie de masses sont conformes à celles attendues pour les protéines RH24, RH24K, RK24H et RHsK24, et que donc les protéines utilisées correspondent à celles déduites de la traduction du gène modifié. Les protéines R24KsH R24KH R24H présentent respectivement un défaut de masse de 119,121 et 123 Da, correspondant probablement à la perte de l'isoleucine carboxy-terminale. Ceci n'affecte aucun des deux tags. Exemple 4 : Obtention de conjugués protéines-polymère L'efficacité de couplage de ces protéines diversement taggées sur des copolymères d'anhydride maléique a été testée. L'immobilisation covalente de protéines sur des polymères se fait par l'établissement d'une liaison amide covalente entre les groupements anhydride du polymère et les amines primaires présentes sur les chaînes latérales des résidus lysine comme illustré dans le schéma ci-dessous. Cependant, le polymère n'étant pas hydrosoluble, il est nécessaire de le dissoudre dans du DMSO (diméthylsulfoxyde) anhydre préalablement à la réaction de couplage réalisée en milieu aqueux à 95%. Conditions opératoires : Tampons de couplage : Phosphate 50 mM pH 7,8, Polymère : peser 2 mg de copolymère AMVE 67 000 (Polysciences INC lot N'427393) et dissoudre doucement dans 2 ml de DMSO anhydre. Protéine : décongeler doucement dans la glace, la quantité requise pour le couplage Protocole de couplage : 100 ou 36 ug de protéines 5 1-11 de polymère à 1 g/t en DMSO (7, 46. 1 moles) qsp 105 1-11 tampon phosphate 50 mM pH 7, 8 La réaction de couplage covalent est réalisée spontanément par incubation pendant 3 heures à 37 C sur agitateur thermique. Les conjugués sont ensuite caractérisés comme suit. Les échantillons sont filtrés dans des tubes Ultrafree Millex HV 0,45 um (Millipore) puis analysés par chromatographie d'exclusion stérique sur colonne Shodex Protein KW 803. Le système chromatographique est une HPLC Kontron comprenant une pompe 422, un injecteur automatique 465 et une DAD (Diode Array Detector). L'élution est réalisée en tampon phosphate 0,1 M pH 6,8 + 0,5% SDS (m/m) avec un flux de 0,5 ml/min. La détection est réalisée par mesure de l'absorbance à 280 (à la concentration utilisée, le polymère n'absorbe pas). Le ratio de l'air du pic correspondant à la protéine couplée au polymère versus la somme des deux pics correspondants aux protéines coupées et non coupées (c'est-à-dire la quantité totale des protéines impliquées dans la réaction) donne la valeur du rendement de couplage (Y). (Aire du pic de conjugué protéine/polymère) 280 nm x 100 (Aire du pic de conjugué protéine/polymère) 280 nm + (Aire du pic de protéine libre) 280 nm Le nombre de protéines par chaîne de polymère est défini par la relation suivante : N = n. Y/n' ou n et n'représentent respectivement le nombre de moles de protéines et le nombre de chaînes de polymère dans le milieu réactionnel. Les données de la Figure 4 illustrent les rendement de couplage en pourcentage des sept protéines recombinantes RH24, R24H, RH24K, RK24H, R24KH, R24KsH et RHsK24 dérivées de la protéine de capside p24 du VIH-1 sur le copolymère d'AMVE67 en tampon phosphate 50 mM pH 7,8. Les concentrations utilisées sont les suivantes [protéines] = 0, 95 g/l (3, 56. 10-9 mol), [AMVE67] = 0, 048 g/l (7, 46. 10-11 mol). Q représente les protéines ne contenant qu'un tag de 6 résidus histidine, lm représente les protéines avec un tag de 6 résidus histidine opposé au tag de 6 résidus lysine,. représente les protéines avec des tags de 6 résidus histidine et 6 résidus lysine contigus. Les expériences ont été réalisées 3 fois, les valeurs indiquées correspondent à la moyenne plus un écart type. En l'absence de résidus lysine, les rendements de couplage sont compris entre 10 et 30%. Ils sont supérieurs à 95% lorsque le tag de 6 résidus lysine est présent sur la protéine. La présence d'un tag de 6 résidus lysine permet donc d'améliorer considérablement l'efficacité de couplage (par comparaison de RK24H, R24KH, R24KsH, RHsK24 avec RH24 et R24H), indépendamment de sa position N-ou C-terminale (comparaison de RK24H avec RH24K, RHsK24 avec R24KsH), en opposition ou adjacent au tag de 6 résidus histidine (comparaison de RH24K et RK24H avec R24KH, R24KsH, RHsK24). Exemple 5 : Bioréactivité des protéines ainsi couplées L'amélioration du rendement de couplage des protéines Lys-6 sur le copolymère AMVE67 suggère que la réaction de couplage est régiosélective, à savoir qu'elle implique le tag de résidus lysine. On a évalué la réactivité biologique des conjugués en fonction de la position N-ou C-terminale du tag et de la position N-ou C-terminale de l'épitope reconnu par l'anticorps monoclonal. Deux protéines ont été retenues pour cette étude, RH24K et RK24H, présentant respectivement un tag de six résidus lysine en position C-terminale et N-terminale, et opposé au tag de six résidus histidine. Le protocole d'ELISA a été réalisé comme suit : 100 pl/puits de conjugué protéines-polymère dilué à 0,25 ug/ml en tampon PBS sont immobilisés en fond de microplaque 96 puits (Nunc Immunoa Plate Maxisorpa surface) par incubation d'une nuit à température ambiante. Les sites non spécifiques sont alors saturés pendant 2 heures à 37 C par 200 ul/puits d'une solution de PBS-1 % RégilaitTm (plv). Les puits sont alors lavés 3 fois en PBStween 0, 05%. Les anticorps monoclonaux dilués à la dilution appropriée en tampon PBS-tween 0,05%-0, 2% Régulait sont alors incubés pendant 1 heure à 37 C. Après 3 lavages en PBS-tween 0,05%, le conjugué anti-souris marqué à la peroxydase (Jackson ImmunoResearch) dilué au 1/2 000 en PBS-tween 0, 05%-l% RégilaitTm est incubé 1 heure à 37 C. Trois lavages en PBS-tween 0, 05% sont réalisés avant la révélation au cours de laquelle 100 pl d'une solution contenant une pastille d'OPD 30 mg diluée dans 10 mi de tampon substrat OPD (Sanofi pasteur) sont incubés 10 min à l'obscurité à température ambiante. La réaction est alors bloquée par addition de 100 uj/puits de H2S04 1 N, puis les valeur d'absorbance sont lues au spectrophotomètre à 492 nm. Les données de la Figure 5 sont comme suit : Le Tableau indique le signal obtenu en ELISA en coating de conjugué protéine-polymère a Protéines RH24K et RK24H couplées au polymère AMVE67. b Position de l'épitope reconnue par l'anticorps monoclonal. c La détection a été réalisée en utilisant un anticorps monoclonal. d Ratio déterminé à partir de la DO de l'échantillon testé (DOET) et de la DO du conjugué de référence RH24K-AMVE67 (DORef). Les résultats montrent que le signal ELISA est meilleur lorsque le tag se trouve en position opposé à l'épitope reconnu par un anticorps monoclonal. Ainsi, 1"anticorps monoclonal reconnaissant un épitope localisé en position N-terminale (AcM 15F8) présente un signal 1,3 fois plus élevé pour une protéine immobilisée via sa région C-terminale (RH24K) que pour une protéine immobilisée via sa région N-terminale (RK24H). Inversement, un anticorps reconnaissant un épitope localisé en position C-terminale présente un signal 8,3 fois (AcM 23A5) et 2,25 fois (AcM 3D8) plus élevé lorsque la protéine est immobilisée via sa région N-terminale (RK24H) que lorsque celleci est immobilisée via sa région C-terminale (RH24K). Exemple 6 : préparation d'un kit de vecteurs d'expression de protéines modifiées Compte tenu des capacités d'expression, de purification et de couplage orienté présentées par les différentes protéines doublement taggées, dérivées du modèle p24, on a réalisé des vecteurs d'expression permettant l'insertion d'un gène d'intérêt pour lequel les trois propriétés seraient requises. Ces vecteurs combinent des séquences codant pour un tag de six résidus histidine permettant une purification efficace par chélation pour les ions métalliques et un tag de six résidus lysine pour une immobilisation covalente orientée. En fonction de l'application et/ou de restrictions imposées par la position du site actif de la protéine, les vecteurs d'expression proposés présentent différentes combinaisons possibles. Le vecteur pMK81 dérive du vecteur d'expression pH24K par clivage avec Ncol et Smal, puis par ligation à la séquence du polyKinker Ncol- Smal. Le vecteur pMK81 contient en 5'une trame de lecture codant pour un tag His-6, des sites de clonages uniques pour l'insertion de gènes codant pour des protéines d'intérêt, et en 3'une trame de lecture codant pour un tag Lys-6. Sa taille est de 4935 bp. Le vecteur pMK82 dérive du vecteur d'expression p24KH par clivage avec Ncol et Smal, puis par ligation à la séquence du polyKinker NcolSmal. Le vecteur pMK82 contient en 5'un codon initiateur de la traduction, des sites de clonages uniques pour l'insertion de gènes codant pour des protéines d'intérêt, et en 3'une trame de lecture codant pour un tag double Lys-6 His-6. Sa taille est de 4921 bp. Le vecteur pMK83 dérive du vecteur d'expression pK24H par clivage avec Ncol et Xhol, puis par ligation à la séquence du polyKinker Ncol- Xhol. Durant la construction, le site Xhol a éliminé. Les oligonucléotides double brin ont été obtenus par hybridation de chaque brin en tampon 50 mM NaCI, 6 mM Tris/HCI, pH 7.5, 8 mM MgCI2), par chauffage 5 minutes à 65 C, et refroidissement lent à température ambiante. Le vecteur pMK83 contient en 5' une trame de lecture codant pour un tag Lys-6, des sites de clonages uniques pour l'insertion de gènes codant pour des protéines d'intérêt, et en 3'une trame de lecture codant pour un tag His-6. Sa taille est de 4945 bp. Le vecteur pMK84 dérive du vecteur d'expression pHK24 par clivage avec Ncol et Smal, puis par ligation à la séquence du polyKinker NcolSmal. Le vecteur pMK84 contient en 5'une trame de lecture codant pour un tag double His-6 Lys-6, des sites de clonages uniques pour l'insertion de genes codant pour des protéines d'intérêt, et en 3'un codon terminateur de la traduction. Sa taille est de 4951 bp. Les caractéristiques des vecteurs représentés sur la Figure 6 sont comme suit : La Figure 6A représente la structure des vecteurs d'expression pMK. Ptac, promoteur tac (boite noire) ; RBS1-MC-RBS2, minicistron flanqué par 2 sites de fixation des ribosomes (RBS) (flèche blanche), MCS, site de clonage multiple (boite grise) ; rrnB T1 T2, terminateurs de transcription forts (boite en pointillés) ; bla, gène conférant la résistance à l'ampicilline (flèche noire) ; pMB1 ori/M13 ori, origines de réplication (boite blanche fine) ; laclq, gène codant pour le répresseur laclq (flèche hachurée). Les sites de restriction Clal et Xbal flanquant le MCS sont soulignés. La Figure 6B représente les séquences des vecteurs d'expression pMK81, pMK82, pMK83 et pMK84 entourant le minicistron (RBS1 et RBS2 soulignés, la courte trame de lecture ouverte en petit caractères), les codons d'initiation et de terminaison (caractère gras) et les sites de restriction du site de clonage multiple. Les séquences en acides aminés correspondant aux régions amino-et carboxy-terminales des protéines recombinantes, incluant les tags sont indiquées. BIBLIOGRAPHIE Monfardini C. and F. M. Veronese. 1998 Stabilization of Substances in Circulation (review) Bioconjugate Chem. 9 : 418-450. Duncan R. 1999 Polymer conjugates for tumour targeting and intracytoplasmic delivery. The EPR effect as a common gateway ? Pharmaceutical Science & Technology Today 2 (11) : 441-449. Varga C. M., Wickham T. J., and D. A. Lauffenburger. 2000 Receptor-mediated targeting of gene delivery vectors : Insights from molecular mechanisms for improved vehicle design (Review). 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Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce que, par rapport au gène, au moins l'un des deux fragments nucléotidiques, polyK ou polyH, est situé sur l'extrémité 5'de la séquence. 3. Séquence nucléotidique selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'autre des deux fragments nucléotidiques, polyH ou polyK, est situé sur l'extrémité 5'. 4. Séquence nucléotidique selon la revendication 3, caractérisée en ce que le fragment nucléotidique poly est situé entre le fragment nucléotidique polyH et le gène. 5. Séquence nucléotidique selon la revendication 3, caractérisée en ce que le fragment nucléotidique polyH est situé entre le fragment nucléotidique polyK et le gène. 6. Séquence nucléotidique selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'autre des deux fragments nucléotidiques, polyH ou poly, est situé sur l'extrémité 3'. 7. Séquence nucléotidique selon la revendication 6, caractérisée en ce que le fragment nucléotidique poly est situé sur l'extrémité 5'et le fragment nucléotidique polyH est situé sur l'extrémité 3'. 8. Séquence nucléotidique selon la revendication 6, caractérisée en ce que le fragment nucléotidique polyH est situé sur l'extrémité 5'et le fragment nucléotidique polyK est situé sur l'extrémité 3'. 9. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce que par rapport au gène, les deux fragments nucléotidiques, polyK et polyH, sont situés sur l'extrémité 3'de la séquence. 10. Séquence nucléotidique selon la revendication 9, caractérisée en ce que le fragment nucléotidique polyK est situé entre le fragment nucléotidique polyH et le gène. 11. Séquence nucléotidique selon la revendication 9, caractérisée en ce que le fragment nucléotidique polyH est situé entre le fragment nucléotidique polyK et le gène. 12. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce que la succession d'au moins six résidus lysine et la succession d'au moins six résidus hisitidine sont contiguës. 13. Séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que, entre le gène et au moins l'un des deux fragments polyK et polyH et/ou entre les deux fragments polyK et polyH, est intercalé au moins un fragment nucléotidique codant pour un bras espaceur. 14. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce que le fragment polyK code pour une succession de six résidus lysine, et/ou le fragment polyH code pour une succession de six résidus histidine. 15. Séquence nucléotidique selon la revendication 13, caractérisée en ce que le bras espaceur est choisi parmi les séquences nucléotidiques comprenant au moins l'une quelconque des SEQ ID NO : 5 à 8. 16. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt est la glycoprotéine p24 de VIH-1, identifiée par SEQ ID NO : 13. 17. Séquence nucléotidique selon la revendication 16, caractérisée en ce que la protéine modifiée a une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 14 à 20. 18. Vecteur pour l'expression d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 17. 19. Vecteur selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il présente une séquence nucléotidique choisie par SEQ ID Nos : 1 à 4. 20. Kit de vecteurs pour l'expression d'au moins deux séquences nucléotidiques différentes, selon l'une quelconque des revendications 1 à 17. 21. Kit selon la revendication 20, pour l'expression au moins de deux séquences nucléotidiques selon la revendication 3, de deux séquences nucléotidiques selon la revendication 6 ou de deux séquences selon la revendication 9. 22. Kit selon la revendication 20, pour l'expression au moins d'une séquence selon la revendication 3, d'une séquence selon la revendication 6 et d'une séquence selon la revendication 9. 23. Cellule hôte comprenant au moins un vecteur selon la revendication 18 ou 19. 24. Procédé d'obtention d'une protéine d'intérêt modifiée, purifiée et immobilisée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : on dispose d'au moins une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 ; on exprime la séquence nucléotidique, au moins, dans un système d'expression approprié ; on purifie la protéine au moins, modifiée ainsi obtenue, par chromatographie par affinité aux ions métalliques ; on immobilise la protéine au moins, modifiée, purifiée. 25. Procédé d'obtention d'une protéine d'intérêt modifiée, purifiée et immobilisée, et conservant les propriétés biologiques de la protéine d'intérêt native, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : on dispose d'au moins un kit de séquences nucléotidiques selon l'une quelconque des revendications 20 à 22, on exprime les séquences nucléotidiques, dans un système d'expression approprié ; on purifie les protéines modifiées ainsi obtenues, par chromatographie par affinité aux ions métalliques ; on immobilise les protéines, modifiées, purifiées ; on teste l'activité biologique des protéines, modifiées, immobilisées ; et on sélectionne la protéine modifiée, immobilisée, présentant la meilleure activité biologique. 26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins l'une des étapes suivantes : après l'étape de purification, on sélectionne la ou les protéines pour lesquelles le rendement de purification est le plus élevé, et/ou après l'étape d'immobilisation, on sélectionne la ou les protéines pour lesquelles le rendement d'immobilisation est le plus élevé.