Brevet FR2822706A1 — publié le 20021004

La présente invention concerne l'utilisation d'antagonistes de récepteurs de glutamate dans le traitement de la dégénérescence rétinienne, en particulier dans le traitement de la rétinite pigmentaire. Elle concerne en outre un procédé de traitement d'un patient souffrant de dégénérescence rétinienne, notamment de rétinite pigmentaire, comprenant l'administration d'un antagoniste de glutamate audit patient. Ces dernières années, la compréhension des mutations et des événements cellulaires conduisant à la perte cellulaire dans la rétinite pigmentaire (RP) a augmenté considérablement. La plupart des mutations identifiées affectent des gènes exprimés dans les photorécepteurs des bâtonnets, comprenant la rhodopsine, des sous-unités de la phosphodiestérase, le canal commandé par le GMPc (guanosine monophosphate cyclique). Une voie commune de la mort, c'est-à-dire l'apoptose, des récepteurs des bâtonnets a été démontrée dans plusieurs modèles animaux. Cependant, les mécanismes rattachant ces mutations à l'apoptose restent obscurs. Les connaissances les plus étendues sur la dégénérescence cellulaire des photorécepteurs des bâtonnets proviennent d'études effectuées sur la souris rd, un modèle animal de la rétinite pigmentaire qui a été découvert il y a plus de 70 ans. Le rétablissement de cônes et de bâtonnets au moyen d'un agent bloquant les canaux Ca2+ de type L a suggéré que la mort cellulaire des photorécepteurs pouvait résulter d'un influx accru de Ca2+. Un influx accru de Ca2+ dans les photorécepteurs peut en effet déclencher une libération de glutamate, la concentration du transmetteur augmentant jusqu'à un taux connu comme provoquant un endommagement excitotoxique dans les neurones glutaminergiques du cerveau et de la rétine. Pour mieux évaluer cette hypothèse de l'excitotoxicité du glutamate sur les neurones post-synaptiques, on a administré quotidiennement à une souris rd de la NBQX (6-nitro-7-sulfamylbenzoquinoxaline-2, 3-dione), un antagoniste des récepteurs de glutamate de type kaïnate/AMPA (acide a-amino-3- hydroxy-5-méthylisoxazolepropionique)/, tandis qu'on n'a injecté que du véhicule à des souris rd témoins. RÉTABLISSEMENT DE NEURONES POST-SYNAPTIQUES : Après une injection quotidienne de NBQX du 3e jour au 22e jour, on compare des coupes dans de la paraffine, colorées à l'hématoxyline, provenant d'animaux traités, à des coupes provenant de souris rdtémoins auxquelles avait été injecté le véhicule seul. Dans la couche nucléaire interne, les noyaux cellulaires sont 1,14 fois plus nombreux dans les coupes de rétine des souris rd traitées (218, 11 + 4, 66 e. t. m. (erreur type de la moyenne), n = 18) que dans celles des souris témoins (190, 95 3, 888 e. t. m., n = 20). Cette différence est statistiquement significative (P RÉTABLISSEMENT DE PHOTORÉCEPTEURS DE BÂTONNETS : Lorsqu'on examine la couche nucléaire externe provenant d'animaux traités et de souris rdtémoins, on peut voir que les noyaux cellulaires sont en plus grand nombre chez les animaux traités. La détermination quantitative montre qu'ils sont 65 fois plus nombreux dans les coupes de rétine de souris ru traitées au NBQX (51, 55 1, 372 e. t. m., n = 18) que dans celles des souris rdtémoins (19, 40 + 0, 950 e. t. m., n = 20). La différence est là encore statistiquement significative (P Lorsque les bâtonnets sont comptés à l'aide d'une technique stéréologique permettant un échantillonnage impartial, ils se révèlent être 3, 31 fois plus nombreux chez les souris rd traitées au NBQX (86 566 : 5 590 e. t. m., n = 8) que chez les souris ru témoins (26 094 : 3 086 e. t. m., n = 8) (P RÉTABLISSEMENT FONCTIONNEL : Pour déterminer si le rétablissement cellulaire induit par NBQX pouvait améliorer les fonctions visuelles chez des souris rd, on enregistre des électrorétinogrammes (ERG) chez des animaux traités et des animaux témoins, 22 jours après la naissance. À cet âge, les signaux d'ERG sont habituellement absents chez les souris rdtémoins. Dans nos essais, un signal mesurable n'est obtenu que chez une souris non traitée (8,5 % des 12 animaux au total). En revanche, des signaux d'ERG sont enregistrés chez 8 (66,7 %) des 12 souris rd traitées au NBQX. Les amplitudes des ondes a et b sont 3//V et 5 UV chez les souris témoins, 8, 5 : 0, 690 /V (e. t. m., n = 12) et 1, 45 : 0, 987 /V (e. t. m., n = 12) chez les souris rdtraitées. L'analyse statistique de ces valeurs, effectuée avec le test non paramétrique de Mann-Whitney, montre une différence significative entre le groupe traité et le groupe non traité (P DISCUSSION La présente neuroprotection induite par NBQX suggère que les neurones rétiniens internes dégénèrent par excitotoxicité. Il est en effet connu que la NBQX supprime l'endommagement excitotoxique dans le système nerveux central par inactivation de récepteurs de glutamate sensibles à l'AMPA et/ou au kaïnate, et ces récepteurs sont exprimés dans la plupart des neurones rétiniens internes, des cellules OFF bipolaires, des cellules horizontales, des cellules amacrines et des ganglions cellulaires. Ces neurones s'avèrent classiquement être sensibles à l'endommagement excitotoxique à la fois in vivo après injection intraoculaire d'agonistes de récepteurs de glutamate ou, in vitro, par incubation de ces agonistes. Nos résultats sur des souris rd au 22e jour après la naissance indiquent que ces endommagements de neurones post-synaptiques se produisent plus tôt qu'il était attendu. Ils peuvent même expliquer la maturation défectueuse de la couche plexiforme externe, où des photorécepteurs établissent normalement leurs connexions aux neurones postsynaptiques et où la première lésion ultrastructurale décelable a été constatée chez la souris rd Dans les photorécepteurs, le glutamate induit un courant qui n'est pas bloqué par l'antagoniste de récepteurs NBQX ; le courant est en fait engendré par un transporteur couplé à des canaux CI. Il a été également rapporté dans l'état de la technique que le glutamate activait les récepteurs métabotropiques modulant les flux de Ca2+. Ces données pharmacologiques indiquent que le rétablissement de bâtonnets induit par NBQX ne peut pas être attribué à un effet direct de NBQX sur les photorécepteurs. Ils suggèrent au contraire que la suppression de l'excitation et de l'excitotoxicité post-synaptique par le glutamate peut ralentir la dégénérescence des photorécepteurs. Ce qui précède suggère que la neuroprotection par le diltiazem, un bloquant des canaux calciques, rapportée antérieurement, puisse en fait résulter en partie d'une réduction de la libération de glutamate. Le diltiazem limiterait l'excitotoxicité du glutamate par réduction de la libération de glutamate dépendant de Ca2+ au niveau des sites pré-synaptiques au lieu de bloquer les récepteurs post-synaptiques de glutamate. Même si l'hypothèse excitotoxique ne peut pas expliquer toute la dégénérescence des photorécepteurs, étant donné le rétablissement constaté, provoqué à la fois par NBQX et le diltiazem, elle ouvre néanmoins une nouvelle voie pour tenter de ralentir le processus de dégénérescence. MATÉRIELS ET MÉTHODES ANIMAUX ET TRAITEMENT MÉDICAMENTEUX Toutes les expériences sont effectuées conformément à la Notification ARVO pour l'Emploi d'Animaux dans la Recherche Ophtalmique et sur la Vision. Elles sont effectuées sur des souris C3H/He/] homozygotes pour la mutation rd, obtenues auprès de Janvier Animal Suppliers (Le Genest St. Isle, France), maintenues en cycles d'éclairement-obscurité de 12 heures. Du 3e au 21 e jour après la naissance, des souris C3H ont reçu des injections intrapéritonéales de 60 pu de solution soit de NBQX, soit de véhicule (TocrisCookson, Bristol, GB). NBQX est dissous dans une solution de glucose à 5 %, pH 8, 5 et injecté par voie intrapéritonéale à une concentration finale de 7, 5 mM entre le 3'et le 71 jour après la naissance et de 15 mM entre le 8e et le 21 e jour après la naissance. Ces injections représentent des doses allant de 30 mg/kg à 60 mg/kg, qui se situent dans la plage de l'efficacité pharma- cologique. ÉLECTROPHYSIOLOGIE Après une période d'adaptation à l'obscurité pendant 24 heures, les animaux sont anesthésiés par une injection intrapéritonéale (23 pl/g) d'éto- midate (0,2 mg/mi) et de midazolan (1,25 mg/ml), sous faible éclairement rouge. On les introduit dans une cage de Faraday, en leur immobilisant la tête dans un système de contention en forme d'U. On dilate la pupille par une application de tropicamide à 0,5 % et on anesthésie localement la cornée par une application locale de proparacaine à 0,5 %. Les paupières supérieure et inférieure sont rétractées en exophtalmie et maintiennent l'oeil ouvert. On insère une électrode de référence en acier inoxydable sous la peau de la tête de l'animal. On mesure ensuite l'ERG à l'aide d'une mèche en coton imprégnée de sérum physiologique, placée au sommet de la cornée et reliée à une électrode Ag : AgCl. Les réponses sont amplifiées et filtrées (filtres à basse fréquence de coupure de 0,1 Hz et haute fréquence de coupure de 1 000 Hz) à l'aide d'un amplificateur Universal (Gould, Texas, USA). Elles sont numérisées au moyen d'une carte Labmaster d'acquisition de données (Scientific Solutions, Solon, Ohio, USA) montée sur un ordinateur personnel IBMcompatible. Une ampoule au xénon de 150 W (Müller Instruments, Moosinning, RFA) fournit le stimulus lumineux de 2,9 log cd/m2, tel que mesuré au moyen d'un luxmètre au niveau des yeux. La durée du stimulus lumineux (300 ms) est définie par un obturateur commandé par ordinateur. On mesure les ERG sur un oeil par souris et l'expérimentateur ignore quelle souris a reçu des injections témoins ou des injections de NBQX. IMMUNOMARQUAGE ET COMPTAGE DE BÂTONNETS Les animaux sont sacrifiés au moyen d'une dose excessive de pentobarbital immédiatement après les enregistrements d'ERG. On retire les cupules optiques et on les fixe pendant 2 heures dans du formaldéhyde à 4 % avec une solution de chlorure de sodium tamponnée au phosphate (STP) à pH 7,4. On sépare les rétines des cupules optiques postérieures. Elles sont rincées dans de la STP, perméabilisées pendant 5 minutes dans de la STP contenant 0,1 % de Triton X-100, puis mises à incuber pendant 20 minutes dans du tampon de blocage (STP contenant 0, 1 % d'albumine de sérum bovin, 0, 1 % de Tween 20 et 0, 1 % d'azoture de sodium. On les met ensuite à incuber pendant 1 heure avec un anticorps anti-bâtonnet rho-4D2 (10 ug/mi) qui colore spécifiquement les photorécepteurs de bâtonnets, on les lave et on les immerge pendant 1 heure dans de l'antisérum de chèvre anti-lgG de souris couplé au rouge Texas (Jackson laboratories, West Grove, PA, USA). Après les avoir bien lavées, on monte à plat les rétines dans une solution à 50 % de STPglycérol (1 : 1), les photorécepteurs tournés vers le haut, et on les examine à l'aide d'un microscope à épifluorescence Nikon Optiphot 2. On évalue les bâtonnets immunomarqués en utilisant une méthode stéréologique permettant un échantillonnage impartial (Mohand, 1998). On choisit 120 champs de 8 000, um2 sur toute la surface de la rétine, en utilisant un encodeur à étages et un procédé aléatoire systématique. Les champs sont examinés au moyen d'une caméra à affichage graphique en couleurs Sony Trinitron et numérisés à l'aide du logiciel Automator pour Windows, fourni par Biocom (Lyon, France). Dans chaque champ, on compte les cellules dans deux grilles rectangulaires impartiales de 900/vm engendrées par le logiciel. On évalue ensuite pour toute la surface rétinienne (9, 7 mm2 au 22e jour après la naissance) le nombre total de bâtonnets dans toute la rétine, qui est obtenu à l'aide d'un système d'analyse d'image (Optiscan, Apple Computer, Cupertino, CA, USA). ÉTUDES HISTOMORPHOLOGIQUES Le 22e jour après la naissance, les animaux sont sacrifiés par une dose excessive de pentobarbital. L'énucléation est pratiquée aisément et les yeux sont fixés dans du formaldéhyde à 10 % et traités pour l'inclusion dans de la paraffine. On prépare des coupes transversales (4 m d'épaisseur) dans la paraffine, comprenant le nerf optique, et on les colore à l'hématoxylinephloxine-safran. On utilise pour l'analyse des coupes incluant le nerf optique et la rétine jusqu'à l'orra serrati. Des images des coupes observées sous un grossissement de 40 x (microscope NIKON UFXDX) sont prises au moyen d'une caméra CCD (à couplage de charges) et numérisées sur un écran d'ordinateur (Macintosh LCIICi, Apple) à l'aide de la carte Optiscan. On obtient de même une image d'une cellule de Neubauer (carré de 50 um de côté) et on la superpose sur les images de rétine en utilisant le logiciel Optilab (Graftek, Voisins Le Bretonnaux, France). En tenant compte des études morphologiques précédentes dans ce modèle, montrant que la perte cellulaire est beaucoup plus rapide dans la rétine postérieure (Carter-Dawson), on choisit la rétine péripapillaire, car elle manifeste la plus faible variabilité en ce qui concerne épaisseur de la rétine et nombre de photorécepteurs. Cette zone est analysée quantitativement sur une longueur de 125 um sur les deux côtés horizontaux et à 50 pom du nerf optique. On évalue les paramètres suivants : nombres de noyaux cellulaires dans les couches nucléaires interne et externe (INL, ONL). ANALYSE STATISTIQUE Pour des comparaisons de souris rd témoins et de souris rd traitées au NBQX, on effectue une analyse de différences en utilisant la méthode paramétrique du test de Student pour des séries non appariées pour une variable : c'est-à-dire les nombres de cellules nucléaires internes et de photorécepteurs par coupe et le nombre de bâtonnets immunomarqués par rétine. On utilise le test non paramétrique de Mann-Whitney pour les comparaisons d'amplitudes d'ondes a et b sur l'EPG chez les souris ri témoins et les souris rd traitées. Toutes les données sont exprimées par la moyenne : erreur type de la moyenne (e. t. m.). REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un antagoniste de récepteurs du glutamate dans la fabrication d'un médicament destiné au traitement de la dégénérescence rétinienne. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit antagoniste de récepteurs de glutamate est un antagoniste de récepteurs de glutamate de type AMPA/kaïnate, en particulier un antagoniste de récepteurs AMPA et en particulier également un antagoniste de récepteurs kaïnate. 3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite dégénérescence rétinienne est choisie parmi la rétinite pigmentaire et la dégénérescence de photorécepteurs. 4. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit antagoniste de récepteurs de glutamate est la NBQX (6-nitro-7-sulfamoylbenzo- quinoxaline-2, 3-dione). 5. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné à l'application oculaire locale, l'administration systémique et en particulier l'administration intravitréenne. 6. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite dégénérescence signifie la dégénérescence des photorécepteurs.