Brevet FR2828106A1 — publié le 20030207

flore intestinale ou encore pour traiter l'encéphalopathie hépatique. UTILISATION D'UNE OMP D'ENTEROBACTERIE DE FAIBLE MASSE MOLECULAIRE COMME PORTEUR ET/OU ADJUVANT L'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins un peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire ou une construction nucléique codant pour ledit peptide, tout comme l'utilisation d'un tel peptide ou d'une telle construction nucléique pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers. La vaccination est un moyen effficace de prévenir ou de réduire les infections viral es ou b act ériennes. Le succès des campagnes de vaccinati on dans c es d om aines a permis d'étendre le concept de vaccin jusqu'alors utilisé dans le domaine de l'infectiologie aux domaines du cancer et des maladies auto-immunes. La mise au point de vaccins parfaitement définis et dépourvus d'effets secondaires marqués, nécessite l'emploi d'antigènes vaccinants de faible masse moléculaire, tels que des peptides ou des oligosaccharides. Ces antigènes de faible mas se, mai s aus si certains antigènes de mass e molécul aire sup éri eure tel. s que l es polysaccharides de la paroi bactérienne, ne peuvent induire seuls une réponse immunitaire durable et intense. Il est indispensable de lier ces antigènes, par voie chimique ou par génie génétique, à des protéines porteuses. Les protéines porteuses, actuellement utilisées, sont de deux types: - les anatoxines tétanique et diphtérique: l'emploi trop fréquent de ces protéines s porteuses risque d'aller à l'encontre d'une réponse intense contre l'haptène et risque de po ser des probl èm es d' immunotoxi co lo gie, - les extraits de protéines membranaires bactériennes telles que les OMPC de Neisseria meningitidis (Vella et al., Infect. Immun., 60, 49774983, 1992), TraT d'Escherichia coli (Croft et al., J. Immunol., 146, 793798, 1991) ou PorB de Neisseria meningitidis (Fusco et al., J. Infect. Dis., 175, 364-372, 1997). L'OmpA de KleLsiella pnenmoniae, protéine majeure de la membrane externe baptisée P40, présente une activité de protéine porteuse, par voie systémique, pour des antigènes sous-unitaires peptidiques (brevets WO 95/27787 et WO 96/14415; Haeuw et al., Eur. J. Biochem., 255, 446-454, 1998; Plotnicky-Gilquin et al., J. Virol., 73, 5637 s 5645, 1999) et polysaccharidiques (brevet WO 97/41888; Rauly et al., Infect. Immun., 67, 5547-5551, 1999). De plus, les antigènes possèdent généralement une faible immunogénicité et il est néces s aire de l es mél anger à des adj uvants. On recherche donc constamment de nouveaux adjuvants. Ainsi, il existe aujourd'hui un grand besoin de disposer d'un composé qui, associé à une molécule, notamment un antigène ou haptène, soit capable de générer une réponse immunitaire dirigée contre ladite molécule. Un tel composé pourrait en particulier être utilisé pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à induire une protection immunitaire antivirale, antibactérienne, antifongique ou antiparasitaire, ou antitumorale. Il existe donc aujourd'hui un besoin de disposer de protéine porteuse et/ou adjuvante capable de générer une réponse immunitaire. Ceci est justement l'objet de la présente invention. De manière surprenante, il a été mis en évidence qu'un peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire, répond à ces besoins. La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'un peptide provenant d'une Omp d'entérob actéri e de faib l e mas se mol écul aire en tant que protéine porteu se et/ou adjuvante pour augmenter l'immunogénicité d'un antigène associé de manière covalente, soit conjugué de manière chimique soit fusionné. Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme "peptide" également les polypeptides et par le terme " Omp " (pour " Outer Membrane Protein "), les protéines de la membrane externe. Par peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire, on entend désigner en particulier tout peptide de séquence d'acides aminés compris dans la séquence d'acides aminés d'une protéine Omp d'entérobactérie qui, lorsqu'il est associé à un antigène ou haptène spécifique d'un agent infectieux ou d'une cellule tumorale, est capable de générer ou accro^tre une réponse immunitaire dirigée contre ledit agent infectieux ou ladite cellule tumorale. L'invention a pour objet une composition pharrnaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins un peptide s provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire ou une construction nucléique codant pour ledit peptide. Dans la présente invention, une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire est définie comme une Omp présentant une masse moléculaire comprise enke 15 et 25 kDa. Ces Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire sont 0 notamment celles dénommées OMPs pour "small outer-membrane proteins". C es Omp d' entérob actéri es d e faib le m as s e mol écul aire, qu ' ell es soi ent constitutives de ladite entérobactérie ou exprimées par un bactériophage qui lui est associé, constituent une famille de protéines de membrane externe de bactérie gram négative et sont généralement impliquées dans l'adhésion desdites entérobactéries aux cellules de l'hôte qu'elles infectent, notamment dans l'adhésion aux cellules épithéliales de mammifères, dans la résistance au sérum etlou dans la virulence de l'entérobactérie (Mescsas et al., J. of Bact., 177(3), 799- 804, 1995; Heffernan et al., J. of Bact., 174 (1), 84-91, 1992). De manière également préférée, lesdites Omp d'entérobactéries de faible masse moléculaire sont des protéines dont la séquence comprend un nombre de résidus d'acides aminés compris entre 165 et 210 (séquence signal comprise). De manière également préférée, lesdites Omp d'entérobactéries de faible masse moléculaire comprennent un fragment consensus de séquence G[X]N[X] KYRYE (SEQ ID N 5) dont le premier résidu d'acide aminé "G" est situé à une position comprise 2s entre les positions 40 à 60 de la séquence de 1'Omp de faible poids moléculaire, et/ou un fragment consensus de séquence YAQ (de préférence GYAQK (SEQ ID N 21) ou YAQS (SEQ ID N 22)) dont le résidu d'acide aminé "Y" est situé à une position comprise entre les positions 30 à 38 de la séquence de l'Omp de faible poids moléculaire. Par peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire, on entend notamment un peptide choisi parmi: - une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire telle que définie ci avant; un peptide présentant après alignement optimal au moins 80 %, de préférence %, 90 %, 95 % et 99 % d'homologie avec une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire telle que définie ci-avant; - un peptide d'au moins 5 acides aminés consécutifs d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire telle que définie ci-avant et présentant une activité immunogénique; et - un épitope T helper d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire 0 telle que définie ci-avant. Dans un mode de réalisation préPéré, l'Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire est choisie parmi l'OmpK17 de Klebsiella pneumoniae, l'OmpX de Escherichia coli, l'OmpX de Enterobacter clocue, Rck et PagC de Salmonella typhimurium et Rck de Salmonella enteritidis, Ail de Yersinia enterocolitica et Yersinia pseudotuberculosis, Omp4 de Serratia marcescens, IalB de Bartonella bacilliformis et Lom du bactériophage lambda. Dans un mode de réalisation particulièrement prétéré, l'Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire est choisie parmi l'OmpK17 de Klebsiella pneumonine décrite par Climent et al. (Res. Microbiol. 148, 133-143, 1997) et clonée à partir de la souche KleLsiella pneumoniae 52145 (O1:K2). Le précurseur de l'OmpK17 possède 170 acides aminés (SEQ ID N 2). Ce dernier contient une séquence signal N-terminale de 24 résidus, et la protéine mature possède donc 146 acides aminés. L'OmpK17 de Klabsiella pneumoniae est également dénommée dans la présente invention "P18". Dans un autre mode de réalisation particulièrement préféré, l'Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire est choisie parmi l'OmpX de Escherichia coli. L'OmpX possède 171 acides aminés (SEQ ID N 4). Dans un autre mode de réalisation particulièrement préféré, l'Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire est choisie parmi le groupe suivant: - l'OmpX de Enterobacter clocoe de séquence SEQ ID N 6 (Stoorvogel et al., J. of Bact., 173 (1), 156-160, 1991; GenBank sous le numéro d'accession A39189); s - Rck de Salmo 'ella enteriditis de séquence SEQ ID N 7 (Aneda et al., Infect Immun 2001, 69 (4), 2612-20, 2001; GenBank sous le numéro d'accessionBAB20575); - Rck de Salmonella typhimurium de séquence SEQ ID N 8 (Cirillo et al., Infect. Immun., 64 (6), 2019-23, 1996; Heffernan et al., J. of Bact., 174 (1), 8491, 1992; GenBank sous le numéro d'accession A43309); - PagC de Salmonella phimurlum de séquence SEQ ID N 9 (Pukkinen et al., J. of Bact. , 173 (1), 86-93, 1991; GenBank sous le numéro d'accession A39185); - Ail de Yersinia enterocolitica de séquence SEQ ID N 10 (Miller et al., J. of Bact., 172 (2), 1062-1069, 1990; GenBank sous le numéro d'accession A35123); 0 - Ail de Yersinia pseuJotuberculosis de séquence SEQ ID N 11 (Yang et al., Infec. Immun., 64 (7), 2483-2489, 1996; GenBank sous le numéro d'accession AAB36601); - Omp4 de Serratia marcescens de séquence SEQ ID N 12 (Guasch et al., Microbiol., 141 (Pt 10), 2535-2542, 1995; GenBank sous le numéro d'accession CAA85513); - IalB de Bartonella bacilliformis de séquence SEQ ID N 13 (Mitchell et al., Infec. Immun., 63 (4), 1552-1562, 1995; GenBank sous le numéro d'accession AAA87327); et - Lom du bactériophage lambda de séquence SEQ ID N 14 (Pacheco et al., FEMS Microbiol. Letter, 156 (1), 129-132, 1997; Sanger et al., J. Mol. Biol., 25,162 (4), 729 73, 1982; GenBank sous le numéro d'accession P03701). L'Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire peut 8tre obtenue par un procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie. Les procédés d'exkaction de protéines de membrane bactériennes sont connus de l 'homme de l' art et ne seront pas développés dans la présente description. On peut citer par exemple, mais sans s'y limiter le procédé d'extraction décrit par Haeuw J.F. et al. (Eur. J. Biochem, 255, 446-454, 1998). L' Omp d'entérobactérie de faible masse mol éculaire peut également eke obtenue par voie recombinante. Les méthodes de préparation de protéines recombinantes sont aujourd'hui bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas développées dans la présente description, on pourra néanmoins se rétérer à la méthode décrite dans les exemples. Parmi les cellules utilisables pour la production de ces protéines recombinantes, il faut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins P.O. et Lee S.C., Recent advances in heterologous gene expression in E. coli. Curr. Op. Biotechnology 4:520-525, 1993), mais également les cellules de levure (Buclolz R.G., Yeast Systems for the Expression of Heterologous Gene Products. Curr. Op. Biotechnology 4:538-542, 1993), de même que l es cellul es animal es, en parti culi er les cultures d e cellul es de mammi fère (Edward s C.P. et Aruffo A., Current applications of COS cell based transient expression systems. Curr. Op. Biotechnology 4:558-563, 1993) mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre par exemple des baculovirus 0 (Luckow V.A., Baculovirus systems for the expression of human gene products. Curr. Op. Biotechnology 4:564-572, 1993). Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire comprend: a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID N 2, SEQ ID N 4, SEQ ID N 6, SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 10, SEQ ID N 11, SEQ ID N 12, SEQ ID N 13 ou SEQ ID N 14, de préférence la séquence SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 4; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant après alignement optimal une homologie d'au moins 80 %, de prétérence 85 %, 90 %, 95 % et 99 % avec une des séquences telle que définie en a); ou c) la séquence d'acides aminés d'un fragrnent d'au moins 5 acides aminés d'une séquence telle que définie en a). Par séquence d'acide nocléique ou d'acides aminés présentant une homologie d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés déterminée, on entend désigner une séquence qui après alignement optimal avec ladite séquence déterminée comprend un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec ladite séquence déterminée. Par "pourcentage d'identité" entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement stati stique et l es di fférences entre l es deux séquences étant rép arti es au has ard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par "fenêtre de comparaison" pour identifer et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 0 48:443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Soltware Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P). Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenétre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de rétérence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenétre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, "BLAST 2 sequences", disponible sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, les paramètres utilisés étant ceux donnés par déLaut (en particulier pour les paramètres "open gap penaltie>>: 5, et "extension gap penaltie": 2; la matrice choisie étant par exemple la matrice "BLOSUM 62" proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme. Parmi lesdites séquences présentant une homologie d'au moins 80 % avec la séquence Omp de référence, on préfère les séquences de, ou codant pour des, peptides capables d'induire une réponse immunitaire dirigée spécifiquement contre l'antigène ou haptène qui lui est associée, telle que l'induction d'une réponse immunitaire mesurée au s moyen des techniques standards décrites dans les exemples ci-après. La présente invention concerne aussi une composition selon l'invention, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique comprend une construction nucléique codant pour ledit peptide provenant d'une Omp dentérobactérie de faible masse moléculaire ou une cellule hôte transformée capable d'exprimer ledit peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire. L' invention a également pour objet la composition selon l 'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend en outre, un antigène, immunogène ou haptène. Par " immunogène, antigène ou haptène spécifique d'un agent infectieux ou d'une cellule tumorale ", on entend désigner en particulier tout composé exprimé par un agent infectieux, tel qu'un virus, une bactérie, une levure, un champignon ou un parasite, par une cellule tumorale, ou un de leurs analogues structuraux, qui seul ou en association avec un adjuvant ou porteur est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique dudit agent infectieux ou de ladite cellule tumorale. On entend également désigner par "immunogène, antigène ou haptène" dans la présente description un composé présentant une analogie structurale avec ledit antigène ou haptène capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit antigène ou haptène dans un organisme préalablement immunisé avec ledit composé analogue. Ledit antigène ou haptène peut notamment étre choisi parmi les protéines, les glycopeptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques et les lipides. Dans une forme de réalisation de l'invention, ledit antigène, immunogène ou haptène dérive d'un virus, d'une bactérie, d'un parasite ou d'un champignon. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un peptide dérivé de microorganisme responsable de pathologies des voies aériennes choisi parmi le VRS, le para influeuza virus (PIV), l'influenza virus, les hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques, haemophilus influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les méningocoques. Dans un mode de réalisation encore plus préféré de l'invention ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un fragment de la protéine G du virus s respiratoire syncytial. L'antigène, immunogène ou haptène est associé ou spécifique d'une cellule tumorale. Parmi les cancers dont les tumeurs expriment un antigène tumoral associé pouvant étre prévenus ou traités par les utilisations selon la présente invention, on peut 0 citer en particulier, mais sans s'y limiter: le cancer du sein, du poumon, du côlon, et le carcinome gastrique (Kawashima et al., Cancer Res. 59:431 -5, 1999); le mésothéliome, l'ostéosarcome, les cancers du cerveau (Xie et al., J. Natl. Cancer. Inst. 91:169-75, 1999); 5. le mélanome (Zheuten et al., Bratilsl. Lek. Listy 99:426-34, 1998); l'adénome cystique du pancréas (Hammel et al., Eur. J. gastroenterol. Hepatol. :345-8, 1998); le cancer colorectal (Ogura et al., Anticancer Res. 18:3669-75, 1998); le carcinome des cellules rénales (Jantzer et al., Cancer Res. 58:3078-86, 1998); et À le cancer de l'ovaire et du cervix (Sonoda et al., Cancer. 77:1501-9, 1996). La présente invention a aussi pour objet une composition selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène est couplé ou mélangé au peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire. L'invention comprend également l'utilisation selon l'invention, caractérisée en 2s ce que ledit antigène ou haptène est couplé par liaison covalente, notamment par couplage chimique, avec ledit peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans ledit peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire, ou l'un de ses fragments, et/ou dans ledit antigène ou haptène pour faciliter le couplage chimique, de prétérence, ledit élément de liaison introduit est un acide aminé. Selon l'invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs éléments de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre ledit peptide s provenant d'une Omp d' entérobactéri e de faib le mass e mol éculaire, et l ed it immunogène, antigène ou haptène. Le couplage covalent entre le peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire et ledit immunogène, antigène ou haptène selon l'invention peuvent être réalisés à l'extrémité N- ou C- terminale dudit poptide. Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage seront déterminés en 0 fonction de l'extrémité dudit peptide choisie pour effectuer le couplage et de la nature dudit immunogène, antigène ou haptène à coupler. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que le couplage entre ledit immunogène, antigène ou haptène et ledit peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire est réalisé par recombinaison génétique, lorsque ledit immunogène, antigène ou haptène est de nature peptidique. Les conjugués issus d'un couplage entre l'immunogène, antigène ou haptène et ledit peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire, peuvent êhe préparés par recombinaison génétique. La protéine chimérique ou hybride (le conjugué) peut être produite par des techniques d'ADN recombinant par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour ledit peptide provenant d'une Omp d' entérob actéri e de faibl e mas se molécul aire, d'une séquence cod ant p our l ed it immunogène, antigène ou haptène de nature protéique. Les procédés de synthèse des molécules hybrides englobent les méthodes utilisces en génie génétique pour construire des polynucléotides hybrides codant pour les séquences polypeptidiques recherchées. On pourra, par exemple, se rétérer avantageusement à la technique d'obtention de gènes codant pour des protéines de fusion décrite par D.V. Gooddel (Gene expression technology, Methods in Enzymology, vol. 185, 3-187, 1990). Ainsi, la présente invention concerne aussi une composition pharmaceutique qui comprend une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride, ou qui comprend un vecteur contenant une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride ou une cellule hôte transformée contenant ladite construction nucléique capable d'exprimer ladite protéine hybride. Les compositions selon l'invention peuvent contenir en outre un adjuvant. Ce dernier peut notamment être choisi parmi le MPL-A (" MonoPhosphoryl Lipid A "), le Quil-A (adjuvant dérivé de saponine), 1'ISCOM (" ImmunoStimulating COMplex "), le Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC), les CpG (oligodésoxynucléotides contenant un motif spécifique centré sur un dinucléotide CpG), la Leif (antigène protélque dérivé de Leishmania capable de stimuler les cellules PBMC et présentatrices d'antigène, et de produire une réaction cytokine de type Th-l), la CT (Toxine Cholérique), la LT ("heat Labil Toxin") et les versions détoxifiées de la CT ou la LT. Dans un mode de réalisation prétéré de l'invention, la composition pharmaceutique selon l'invention ne contient pas d'adjuvant autre que le poptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire. Dans un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention contient en outre un détergent. Les compositions selon l'invention peuvent contenir en outre un détergent, et notamment tout type de tensioactif pharmaceutiquement acceptable, permettant notamrnent, le cas échéant, de solubiliser l'Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire. On pourra plus particulièrement utiliser des tensioactifs anioniques, cationiques, non-ioniques ou amphotères, préférentiellement acceptables chez l'hornme. On utilise préférentiellement les détergents Zwittergent 3-12 et l'octylglucopyrannoside et encore plus prétérentiellement le Zwittergent 3-14. 2s Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la composition selon l'invention ne contient pas de détergent. Au sens de la présente invention, le milieu pharmaceutiquement acceptable est le milieu dans lequel les composés de l'invention sont administrés, prétérentiellement un milieu injectable chez l'homme. I1 peut étre constitué d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et/ou de glycérol. L'invention comprend égalernent une composition selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme perrnettant diaméliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité; ainsi, elle peut étre véhiculée sous forme de liposomes, virosomes, nanosphères, microsphères ou microcapsules. L'utilisation d'un poptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire telle que définie ci-dessus comme porteur et/ou adjuvant dans un vaccin constitue un autre objet de l'invention. L'invention concerne encore l'utilisation d'un peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire telle que définie ci- dessus pour la 0 préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers. L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire telle que définie ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroitre une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale. Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Légendes des figures: Figure 1: Analyse de la P18 recombinante produite dans BL-21 DE3 par SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie ou Western blot à l'aide d'un anticorps anti-6 histidines couplé à la peroxydase. Lignes 1 et 5: corps d'inclusion des bactéries transformées avec pET 24d 2s OmpK17. Lignes 3 et 7: corps d'inclusion des bactéries transformoes avec pET 24d. Lignes 2 et 6: fraction soluble des bactéries transformées avec pET 24d OmpK1 7. Lignes 4 et 8: fraction soluble des bactéries transformées avec pET 24d. Fiure 2: Immunogénicité du conjugué Pl8-AII (Angiotensine II) administré par voie sous-cutanée en absence d'adjuvant. Les résultats sont exprimés en log0 du titre, le titre étant déterminé comme l'inverse de la dernière dilution donnant une DO > 0,2 (DO pour DensitéOptique). Fieure 3: Analyse de la OmpX recombinante produite dans BL-21 DE3 par gel SDS PAGE et coloration au bleu de Coomassie. s Ligne 1: solution initiale. Ligne 2: solution initiale filtrée. Ligne 3: fraction non retenue. Ligne 4: pool OmpX purifiée. Exemple 1: Extracffon et purifcation d'une Omp d'entérobacterie de faible masse moléculare L'Omp d'entérobacterie de faible masse moléculaire est purifiée à partir d'un extrait membranaire de Klabsiella p 'eumoniae. 1. Préparation de fractions membranaires de Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumonine, souche I-145, est cultivoe sur milieu chimiquement défini. Après centrifugation et lavage, la biomasse est resuspendue dans un tampon Tris HC1 10 mM pH 7 contenant 150 mM NaCl et 10 mM MgCl2, à raison de 5 g de cellules sèches pour 100 ml de tampon, et l'ensemble est homogénéisé (homogénéisateur à palettes IKA RW 10R, 1 h 30 à température ambiante) avant addition de DNAse (5 g/ml). Après une nouvelle homogénéisation (30 min à température ambiante), les bactéries sont broyées par sonication dans la glace (sonicateur Vibra Cell, 3 x 10 min. puissance 8, 50 % de cycle actif), puis traitées au lysozyme (0,5 mg/ml) pendant 1 h à température ambiante sous agitation (homogéncisateur à palettes IKA RW 10R). Le surnageant issu d'une première centrifugation (10 000 g, 10 min. + 4 C) est centrifugé de nouveau à plus haute vitesse: 30 000 g, 45 min. + 4 C. Les culots sont resuspendus dans une solution de NaCl à 0,9 %, et la solution est placée sous agitation (agitateur magnétique) pendant une nuit à + 4 C. Après deux nouvelles centrifugations réalisées dans les conditions précédemment décrites (10 000 g puis 30 000 g), le culot est repris dans l'eau. Après un nouveau cycle d'agitation-centrifugation, le culot est resuspendu dans l'eau, et la suspension obtenue est congelée puis lyophilisée. 2. Purification de l'Omp d'entérobacterie de faible masse moléculaire L'Omp d'entérobacterie de faible masse moléculaire, ci-après dénornmée P 18 est extraite des fractions membranaires par traitement à l'aide d'une solution contenant un détergent. Le Iyophilisat est solubilisé dans une solution d'acétate de sodium 0,2 M pH 2,5 contenant 0,2 M CaCI2, 20 % (v/v) éthanol et 2 % (p/v) cétrimide à raison de 100 ml s de solution / g de Iyophilisat. Le mélange est placé sous agitation (agitateur magnétique) pendant une nuit à température ambiante. Après centrifugation à 15 000 g pendant 20 min à + 4 C, les protéines du surnageant sont précipitées à l'éthanol: deux précipitations successives avec centrifugation intermédiaire (10 000 g, 10min, + 4 C) sont réalisées, 20 à 50 % puis 50 à 80 %. Les culots 80 % sont remis en suspension dans 0 1 % (p/v) Zwittergent 3-14. Après agitation (agitateur magnétique) pendant 3 heures à température ambiante, le pH est ajusté à 6,5 à 1'aide de NaOH 1N. Une centrifugation du mélange (10 000 g, 10 min. + 4 C) permet d'obtenir une fraction enrichie en protéines de la membrane externe. La protéine P18 est ensuite purifiée à 1'aide de deux étapes chromatographiques successives. La solution est dans un premier temps dialysée contre un tampon triéthylammonium formate 40 mM pH 3,1 contenant 0,1 % (p/v) Zwittergent 3-14 (TEAF/Zw). La première étape de purification est une chromatographie d'échange de cations: celle-ci est réalisée sur support Mono-S ou Source S (Amersham Pharmacia Biotech). L'élution des protéines est réalisce à l'aide d'un gradient linéaire de NaCI dans le tampon TEAF/Zw. Après analyse des fractions par él ectrophorès e, l es fractions contenant la P18 sont rassemblées, puis le mélange est dialysé contre un tampon Tris HC120 mM pH 8 contenant 0,1 % (p/v) Zwittergent 314 (Tris/Zw). La seconde étape de purification est une chromatographie d ' échange d' anions réalisée sur support Mono Q ou Source Q (Amersham Pharmacia Biotech). L'élution des protéines est réalisée à 2s 1'aide d'un gradient linéaire de NaCI dans le tampon Tris/Zw. Après analyse des fractions par électrophorèse, les fractions contenant la P18 sont rassemblées puis concentrées par ultrafiltration (seuil de coupure 10 kda). Cette purification par chromatographie peut être réalisée avec succès directement à partir des fractions membranaires totales. Exemple 2: Caractérisation de la P18 1. Cartocraphie peptidique et séquençage de peptides issus de la P 18 La protéipe P18 est hydrolysée à 1'aide de l'endoprotéinase Lys-C: 100 1lg de protéine sont hydrolysés dans un tarnpon Tris-HCl 25 mM pH 8 contenant 1 mM EDTA pendant une nuit à 37 C (rapport Endo Lys-C/Pl8 = 1/50). Les peptides libérés sont purifiés par HPLC phase reverse sur colonne Vydac C18 (250 x 4,6 rnm). L'élution des s peptides est réalisce à l'aide d'un gradient linéaire d'acétonitrile. Deux pics majeurs sont isolés, puis lyophilisés avant d'être analysés par spectrométrie de masse et séquençage N-terminal. Les masses moléculaires et séquences N-terminales déterminées sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous: Tableau 1: Masse moléculaire et séquences N- terminales de la protéine P18 0 hydrolysée Pic A Pic B Masse molèculaire 10598,36 Da 5515,1 Da Séquence N- terminale ATSTVTGXYAa WDMSDYGFSY (10 acides aminés) SEQ ID N 15 SEQ ID N 16 a X: résidu non déterminé b: ES-MS pour " ElectroSpray-Mass Spectrometry 2. Clonage et séquençage du gène exprimant la protéine P18 Les séquences déterminces étant identiques à deux segments de la séquence de l'OmpK17 (Climent et al., Res. Microbiol. 148, 133-143, 1997), les oligonucléotides 'ggctagcaataaaattgcacgtctttcag 3' (SEQ ID N 17) et 5' cctcgaggaagcggtaacccacgccagc 3'(SEQ ID N 18) ont été utilisés pour amplifier le gène codant pour cette OMP: du DNA génomique à été isolé de la souche I-145 de KleLsiella pnemonine, cultivée comme décrit sous " exemple 1 " à l'aide d'un kit " Quiagen genomic tip system " (Qui agen, Courtaboeuf, France). Une réaction de polymérase en chaîne (P CR) a été effectuée à l'aide d'un kit " Expand high fidelity PCR system " selon les instructions du fournisseur (Roche Molecular Biochemicals, Meylan, France) . Le produit de PCR a été cloné dans le vecteur pGEM-T Easy (Promega, Charbonnières, France) et séquencé à 2s l'aide d'oligonucléotides appropriés. L'insert a été isolé par digestion avec les enzymes de restriction Nhe I et X7o I et électrophorèse en gel agarose et recloné dans le vecteur d'expression procariotique pET 24d (Novagen, Madison, VVI) . La construction pET 24d OmpK17 ou le vecteur vide pET 24d (contrôle) ont été introduits par transformation dans la souche de E. coli BL-21 DE3 (Novagen). Les bactéries ont été cultivées dans du milieu LB contenant 50 1lg par ml de kanamycine jusqu'à densité optique de 0,6 à 600 nm et l 'expression de la protéine recombinante induite par l j addition d' IPTG (concentration final e 1 mM) pour 4 h. Les b actéri es ont été lys ées par soni cati on d ans du s tampon 25 mM Tris-HC1 pH 7,4, 1,15 mM EDTA contenant 1 mg/ml de lysozyme et les fractions solubles séparées des corps d'inclusion par centrifugation à 10 000 g pour 15 min. Des aliquotes des fractions solubles ou des corps d'inclusions correspondant à 20 111 de cultures ont été repris dans du tampon 0,05 M Tris-HC1 pH 6,8, 0,1 M dithiothreitol, 2 /O SDS, 0,1% bromophénol blue, 20 % glycérol, dénaturés 5 min à 0 95 C et analysés par SDS-PAGE (figure 1). La protéine OmpK17 est purifiée par chromatographie échangeuse d'ions. Après extraction, OmpK17 est reprise dans un tampon Tris 25 mM, 6 M urée, pH 8,5. La protéine est purifiée sur une colonne QHP sépharose, et est éluce à 110 mM NaCI, pH 8,5. Exemple 3: Couplage du peptide Angiotensine II La protéine P18 est dialysée contre un tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7 contenant 0,1 % (p/v) Zwittergent 3-14 pendant une nuit à + 4 C. La concentration en protéine est ensuite ajustée à 2 mg/ml à l'aide d'un tampon carbonate de sodium 0,1 M pH 9 contenant 0,1 % (p/v) Zwittergent 314. Le peptide Angiotensine II (AII), en solution à 1 mg/ml en tampon carbonate 0,1 M pH 9 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14, est additionné à la protéine afin d'obtenir un rapport AII/P18 = 1/4. Le couplage débute par l'addition de glutaraldéhyde à la concentration finale de 0,0185 %. Le mélange est placé sous agitation (agitateur basculant) à + 4 C. Une nouvelle addition de glut araldéhyde es t réal i sée après 96 heures. Le coupl age est stopp é, après 2 4 heures 2s d'agitation, par addition de Lysine 1 M: concentration finale = 3 mM. Le conjugué est dialysé contre un tampon PBS pendant une nuit à + 4 C, puis est filtré sur filtre 0,22 1lm et conservé à- 20 C ou lyophilisé. Exemple 4: Immunogénicité du coujugué P18-AII Des groupes de 5 souris (OF1) reçoivent par voie sous-cutanée à J0, J7 et J14, 15 g de peptide AII en présence d'adjuvant de Freund, ou 15 g de conjugué P18-AII en absence d'adjuvant. Le sang est prélevé à J21, J28, J35 et J42 et la réponse IgG anti AII est déterminée par ELISA. A cet effet, des microplaques de titration sont sensibilisées avec un conjugué BSA-AII à la concentration de 5 1lg/ml. Après saturation, les sérums de souris sont déposés et dilués: lére dilution testée = 1/lOO6me, puiS dilutions sérielles de raison 2. La réaction antigène/anticorps est mise en évidence à l'aide s d'anticorps secondaires anti-IgG de souris conjugués à une enzyme, puis par ajout du substrat de l'enzyme. Les résultats sont exprimés en logo du titre, le titre étant déterminé comme l'inverse de la dernière dilution donnant une DO > 0,2. Les résultats présentés dans la figure 2 montrent que la protéine P 18 est capable d'induire, en absence d'adjuvant, une réponse anticorps contre un peptide qui lui est associé, ce même poptide étant incapable de générer une telle réponse méme lorsqu'il est injecté en présence d'un adjuvant puissant comme l'adjuvant de Freund. Ces résultats mettent en évidence les propriétés de porteur et d'adjuvant de la protéine P18. Exemple 5: Clonage et séquençage du gène exprimant la protéine PX d'E. Coli De la méme manière que pour l'OmpK17, le clonage et le séquençage ont été réalisés en utilisant le DNA génomique de la souche E. coli XL1 blue (Stratagène). Les oligonucléotides 5' cctcgaggaagcggtaaccaacaccggc 3' (SEQ ID N l9) et 5' gggctagcaataaaaaaatt gcatgtctttc 3' (SEQ ID N 20) ont été utilisés pour amplifier le gène codant pour cette OmpX. La protéine OmpX est purifiée par chromatographie d'affinité sur une colonne nickel (IMAC). Après extraction, OmpX est reprise dans un tampon Tris 25 mM, 6 M urée, NaC10,5 M, imidazole 1,25 mM, pH 8,5. Elle est chargée sur la colonne IMAC préalablement équilibrce avec le tampon Tris 25 mM, 6 M urée, NaC1 0,5 M, imidazole 1,25 mM, pH 8,5. Après lavage de la colonne avec ce méme tampon, OmpX est éluée à 2s 500 mM imidazole, pH 8,5. i Jl REVE ND I CATI ON S 1/ Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins un peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire ou une construction nucléique codant pour ledit poptide. 2/ Composition selon la revendication 1, dans laquelle l'Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire est caractérisce en ce qu'elle présente une masse moléculaire comprise entre 15 et 25 kDa. 0 3/ Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire est choisi parmi: - une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire; - un peptide présentant après alignement optimal 80 % d'homologie avec une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire; - un peptide d'au moins 5 acides aminés consécutifs d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire et présentant une activité immunogénique; et - un épitope T helper d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire. 4/ Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire est choisi parmi un peptide provenant d'une protéine OmpK17 de Kletsiella pnenmoniae, OmpX de Escherichia coli, OmpX de Enterobacter clocue, Rck et PagC de Salmonella typhimurium et Rck de Salmonella enteritidis, Ail de Yersinia enterocolitica et Yersinia pseudotuberculosis, PagC de Salmonella typhimurium, Omp4 de Serratia marcescens, IalB de Bartonella bacilliformis et Lom du bactériophage lambda. / Composition selon l'une quelcorique des revendications 1 à 4, caractérisce en ce que le peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire comprend: a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID N 2 ou 4; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant après alignement optimal une homologie d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID N 2 ou 4; ou c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 5 acides aminés d'une séquence telle que définie en a). 6/ Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle contient en outre un antigène, immunogène ou haptène. s 7/ Composition selon la revendication 6, caractérisce en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène est choisi parmi les protéines, les peptides, les glycopeptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques et les lipides. 8/ Composition selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène dérive d'un virus, d'une bactérie, d'un parasite ou d'un champignon. 9/ Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un peptide dérivé de micro organisme responsable de pathologies des voies aériennes choisi parmi le VRS, le para influenza virus (PIV), l'influenza virus, les hantavirus, les streptocoques, les pnenmocoques, haemophilus influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les méningocoques. / Composition selon la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un fragment de la protéine G du virus respiratoire syncytial. 111 Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'antigène, immunogène ou haptène est associé ou spécifique d'une cellule tumorale. 121 Composition selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène est associé, par mélange ou par couplage, au 2s peptide provenant d'une Omp d'entérobacterie de faible masse moléculaire. 131 Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce que le couplage entre ledit antigène, immunogène ou haptène et ledit peptide provenant d'une Omp d'entérobacterie de faible masse moléculaire est réalisé par recombinaison génétique. 14/ Composition selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique contient en outre un adjuvant, préférentiellement choisi dans le groupe d'adjuvant comprenant le MPL-A, le Quil-A, 1'ISCOM, le Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC), les CpG, la Leif, la CT, la LT et les versions détoxifiées de la CT ou la LT. / Composition selon l'une des revendications l à 13, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique ne contient pas d'adjuvant autre que le poptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire. 161 Composition selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que ladite composition contient en outre un détergent. 17/ Composition selon la revendication 16, caractérisée en ce que ledit détergent est choisi parmi les tensioactifs anioniques, cationiques, nonioniques ou 0 amphotères, et préférentiellement parmi le Zwittergent 3-12, l'octylglucopyrannoside et le Zwittergent 3-14. 181 Composition selon l'une des revendications l à 15, caractérisce en ce que ladite composition ne contient pas de détergent. 191 Composition selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisée en ce que i5 ledit milieu pharmaceutiquement acceptable est constitué d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose etlou de glycérol. 201 Composition selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité etlou son immunogénicité. 211 Utilisation d'un peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire telle que définie dans l'une des revendications 1 à 4 ou d'une construction nucléique codant pour ledit poptide comme porteur etlou adjuvant pour la préparation d'un vaccin. 221 Utilisation d'un poptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire telle que définie dans l'une des revendications l à 4 ou d'une construction nucléique codant pour ledit poptide pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales' bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers. 231 Utilisation d'un peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire telle que définie dans l'une des revendications 1 à 4 ou d'une construction nucléique codant pour ledit peptide pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer on accrotre une réponse imrounitaire contre un agent *infectieux ou une cellule tumorale.