Brevet FR2828690A1 — publié le 20030221

La présente invention concerne un procédé de préparation d'organismes utilisables dans un biocapteur, capable de détecter plusieurs signaux physiques ou substances chimiques ainsi que le biocapteur obtenu par un tel procédé. La présence de facteurs stressants, que ce soit des signaux physiques, tels que des ondes acoustiques, une pression hydrostatique, des contraintes mécaniques, thermiques, des champs électriques ou magnétiques pulsés ou continus, des ondes électromagnétiques, des rayonnements ionisants, ou des substances chimiques ou minérales se traduit, au niveau de l'organisme stressé, par l'expression de gènes de stress spécifiques des facteurs présents. Pour permettre une analyse à la fois qualitative et quantitative de ces facteurs, les biologistes ont développé une approche génétique, consistant à associer, au sein d'un organisme, à un gène de stress un ou plusieurs gènes rapporteurs codant pour une ou plusieurs protéines émettant un signal mesurable. Diverses techniques de luminescence génétiquement contrôlée ont été développées de manière à détecter des polluants et divers produits chimiques délétères. Ainsi, l'utilisation de gènes de bioluminescence de type luciférase de l'opéron luxABCDE de l'espèce Vibrio Fischeri fusionnés à des promoteurs de gènes de stress chez Escherichia Coli en vue de détecter des substances toxiques a été décrite par Oren Ben-Israel, Haggit Ben-Israel et Shimon Ulitzur dans Applied and Environmental Microbiology, Nov. 1998, p. 4346-4352 Des souches différentes de la bactérie E. Coli portant des gènes rapporteurs de bioluminescence fusionnés à différents promoteurs ont été exposés à des produits chimiques toxiques variés. La bioluminescence a permis la caractérisation et l'identification des toxiques sur la base de leurs signatures spécifiques. Ce système peut aussi être adapté à l'identification de mélanges simples d'agents toxiques, quand les signatures biologiques des composés individuels sont connues. En effet, la plupart des toxiques t activent certains promoteurs avec un profil caractéristique, ce qui permet d'identifier des substances par comparaison avec un profil type. Toutefois, au niveau de ces techniques, l'association de gènes de stress ou de réponse chimiotactique et de gènes de bioluminescence est, par nature, monoparamétrique et ne permet, de ce fait, la détection ou la caractérisation que d'une seule grandeur à la fois. Pour procéder à la mesure de plusieurs grandeurs, il est nécessaire d'utiliser plusieurs souches bactériennes, chaque souche étant le siège d'une association (gène de stress/gène de bioluminescence) donnée. De plus, des décroissances de bioluminescence à hautes concentrations d'agents stressants ont été observées avec les fusions lux. Ces décroissances sont dues, notamment, à l'inactivation des protéines de bioluminescence par certaines des substances toxiques que l'on cherche à caractériser. Les luciférases présentent, également, un caractère instable. Les émissions lumineuses subissent des variations d'intensité et de longueur d'onde variable en fonction du pH. De plus, l'exposition des luciférases bactériennes à des températures supérieures à 35 C, et à des concentrations en excès de certains ions métalliques, d'aldéhydes ou d'agents réagissant avec les groupes sulfhydryles inhibe leur activité. Enfin, l'expression nécessaire des cinq gènes de l'opéron luxABCDE de Vibrio fischeri entraîne des cinétiques d'induction de la bioluminescence relativement lentes et rend ainsi difficile le suivi in vivo et en temps réel d'expressions génétiques par cette technique. Le but de cette invention est de remédier à ces inconvénients en proposant un procédé de préparation d'organismes utilisables dans un biocapteur capable de détecter, d'identifier et quantifier simultanément des signaux physiques et des substances chimiques différents, en utilisant une seule souche bactérienne. La présente invention a également pour but un procédé de réalisation de biocapteur, émettant un signal stable suite à la sollicitation par un facteur stressant. Un autre but de l'invention est de fabriquer un biocapteur, présentant une expression plus caractéristique du gène de stress ou de chimiotactisme et une extinction plus rapide du signal lumineux d'émission lors de l'arrêt de ou des contraintes stressantes ou inductrices d'une réponse chimiotactique. Un des buts de l'invention est d'obtenir un biocapteur dont le fonctionnement ne doit pas être perturbé par une surproduction de protéines, susceptibles d'induire une réponse de stress endogène, voire de conduire à la mort de l'organisme recombiné. Pour ce faire, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'organismes utilisables dans un biocapteur, permettant le suivi en temps réel de signatures spécifiques de stress ou de chimiotactisme. Ce procédé comporte une étape d'insertion, au sein d'une même souche bactérienne, de gènes rapporteurs, codant pour des protéines fluorescentes décalées en longueur d'onde, au niveau des loci de gènes de stress ou de chimiotactisme. Les gènes de fluorescence, codant pour les protéines fluorescentes, seront préférentiellement des gènes de type gfp (Green Fluorescent Proteins), et plus précisément des gènes gfp mutés codant pour des protéines recombinantes émettant une lumière de longueur d'onde spécifique. Afin de disposer d'un biocapteur fonctionnant en bimode, en l'occurrence, en mode fluorescent et mode bioluminescent, le procédé de réalisation pourra comporter une étape d'insertion d'un gène, codant pour une protéine bioluminescente, au niveau du locus considéré ou dans un plasmide, l'ensemble protéine bioluminescente-protéine fluorescente formant ensuite un complexe autonome, ne nécessitant pas d'apport lumineux extérieur. De préférence, ce gène code pour la protéine Aequorine. Ce procédé pourra comporter une étape de polyadénylation, au niveau de la terminaison 3'de l'ARNm du gène de stress ou de chimiotactisme, ou une étape de polyadénylation au niveau de la terminaison 3'de l'ARNm bicistronique codant pour la protéine de stress ou de chimiotactisme et pour la protéine GFP associée, cette polyadénylation étant constituée de 5 à 15 bases adénine (A). Enfin, ce procédé de réalisation comportera, de préférence, une étape d'adjonction de terminaisons polypeptidiques aux protéines de stress ou de chimiotactisme ou aux protéines codées par les gènes rapporteurs associés, permettant ainsi une meilleure réversibilité du biocapteur après disparition des contraintes de stress ou de chimiotactisme. Les modifications génétiques sus-citées pourront être réalisées chez Escherichia Coli, ou chez tout autre organisme procaryote. Le biocapteur réalisé pourra être soumis à un apprentissage de type pavlovien si le signal physique ou la substance chimique à détecter sont de nature non stressante ou non inductrice d'une réponse chimiotactique ; ledit apprentissage consistant à associer le signal physique ou la substance chimique non stressante à un signal physique ou à une substance chimique stressante ou inductrice d'une réponse chimiotactique, pendant une durée convenable. Le biocapteur réalisé par le procédé selon l'invention présente l'avantage de détecter et de caractériser des signaux physiques différents et des substances chimiques différentes. En effet, après création des associations gène de stress ou de chimiotactisme x1/gène rapporteur de fluorescence Y1 au sein d'une même bactérie, on peut soumettre celle-ci à des signaux physiques ou à des substances chimiques tels qu'ils induisent l'expression des gènes rapporteurs associés et l émission d'une fluorescence de longueur d'onde. L'une des caractéristiques de l'invention étant le fait que les gènes rapporteurs Yi sont des gènes codant pour des protéines fluorescentes présentant des spectres d'émission de fluorescence décalés en longueur d'onde. La mesure des intensités Ii correspondant à l'expression des gènes Y1 codant pour les protéines fluorescentes permet d'obtenir une signature caractéristique du signal physique appliqué ou de la substance chimique introduite dans l'environnement du capteur. De plus, il est possible d'analyser la réponse synergique du biocapteur à deux ou plusieurs substances chimiques différentes présentes simultanément dans le milieu, de manière à identifier chacune de ces substances. Il est en effet possible d'extraire une signature spécifique des produits en mélange et de séparer par traitement statistique et informatique les signatures spécifiques de chacun des produits ou des contraintes physiques différents. Ce type de biocapteur présente également l'avantage de présenter plusieurs associations gènes X1/Yi au sein d'un même organisme. Le signal physique et la substance chimique stressante induisent donc l'émission d'un spectre lumineux comprenant des longueurs d'onde différentes, et qui peut être mesuré et enregistré de manière simple et directe. On n'est donc plus obligé de faire appel à des bactéries différentes pour caractériser le signal physique ou la substance chimique. Le procédé de l'invention permet donc de réaliser des capteurs microbiens multiparamétriques, intégrant dans la même bactérie le suivi parallèle de plusieurs gènes de stress et/ou de réponse chimio-tactique. Un autre avantage réside aussi dans le fait que le nouveau type de biocapteur permet une expression plus caractéristique du gène de stress ou de chimiotactisme et une extinction plus rapide du signal en l'absence de condition stressante ou inductrice d'une réponse chimio-tactique. En effet, la polyadénylation en 3'de l'ARNm codant pour la protéine de stress ou de chimiotactisme, entraîne une déstabilisation de ce dernier. Les ARNm porteurs de cette polyadénylation sont principalement dégradés chez les bactéries dans des structures appelées dégradosomes. De même, une extinction plus nette du signal de stress, lors de l'arrêt des contraintes stressantes peut être obtenue en déstabilisant les protéines codées par les gènes rapporteurs de fluorescence, par l'ajout de séquences C-terminales d'acides aminés de type convenable, réduisant la demi-vie des protéines synthétisées. Enfin, un des avantages de cette invention est d'éviter la sur-expression des gènes de stress et/ou de chimiotactisme, du fait de l'utilisation de plasmides dans la construction de la bactérie. Or, le procédé de l'invention ne fait pas appel à de tels plasmides mais consiste à modifier le génome des bactéries par recombinaison homologue des fragments porteurs des gènes de stress ou chimio-tactiques associés aux gènes rapporteurs au niveau des loci des gènes de stress ou chimiotactique considérés. Afin de réaliser le biocapteur multiparamétrique selon l'invention, nous avons procédé à des mesures fluorimétriques quantitatives in-vivo. Pour cela, le gène codant pour la Green Fluorescent Protein (GFP) de la méduse Aequoria victoria a été cloné et utilisé comme gène rapporteur. Des variants décalés en longueurs d'onde d'émission par mutations permettent le suivi en parallèle de plusieurs gènes de stress et/ou de réponse chimio-tactique. Les techniques de fluorescence présentent une très grande sensibilité, liée essentiellement à la sensibilité propre des photodétecteurs utilisés. En effet, la fluorescence produit des photons aisément quantifiables même à très faibles niveaux. De plus, l'excitation des protéines fluorescentes induit l'émission de spectres lumineux pouvant être étudiés grâce à un analyseur optique. La GFP de type sauvage est très stable sous forme fluorescente mature, ce qui la rend inutilisable pour le suivi en temps réel d'expressions géniques transitoires. De manière à rendre la GFP plus sensible à l'action de protéases endogènes, des protéines modifiées ont été construites par addition de courtes séquences peptidiques en C-terminal de la GFP. La protéine mutante GFPmut3. l a servi de base pour la construction de ces nouvelles protéines instables, utilisables pour le suivi en temps réel d'expressions géniques transitoires chez les bactéries. Le gène gfp (mut3. 1) a été modifié de telle façon que les terminaisons peptidiques déstabilisantes soient positionnées en C-terminal de la protéine. Pour la réalisation de notre invention, quatre protéines déstabilisées ont été sélectionnées. Ces quatre protéines GFP (ASV), GFP (AAV), GFP (LVA) et GFP (LAA) présentent respectivement les extensions C-terminales RPAANDENYAASY, RPAANDENYAAAM, RPAANDENYALXA et RPAANDENYALAA. Chez Escherichia Coli, les demi-vies des protéines GFP (ASV), GFP (AAV), GFP (LVA)-GFP (LAA) sont respectivement de 110,60 et 40 minutes environ. La préparation d'organismes utilisables dans un biocapteur selon l'invention s'effectue de la manière indiquée ci-dessus. Afin de rendre cette description plus lisible, seule l'association (gène de stress ou de chimiotactisme/gène de fluorescence gfp) est ici explicitée. 1) Procédure d'insertion du gène de stress et/ou de chimiotactisme avec un des gènes de fluorescence gfp. Après avoir extrait l'ADN génomique de la souche bactérienne voulue, on obtient au moyen d'un enzyme de restriction convenable E un fragment d'ADN noté F, contenant le gène de stress gstress, par exemple le gène uspA, ou le gène de chimiotactisme gchim. Le clivage obtenu est vérifié sur un gel approprié Gl. On procède alors à l'amplification par Polymerase Chain Reaction (PCR) du gène de stress ou du gène de chimiotactisme obtenu par clivage. La réaction d'amplification met en oeuvre deux amorces Al et A spécifiques et complémentaires des extrémités 5'et 3'd'une fraction d'ADN, présente sur le brin F, et contenant le gène gstress ou gchim en entier, ainsi que l'ADN polymérase et les dNTP. On obtient ainsi un fragment d'ADN, noté F', de taille supérieure à celle de F, et contenant le gène gstress ou gchim et les sites nécessaires aux manipulations génétiques ultérieures. On clive ensuite par un enzyme de restriction convenable ER2 les gènes gfp... gfp, notamment ceux du type gfp (LAA), gfp (AAV), gfp (ASV) et gfp (LVA) présents respectivement dans les plasmides P (LAA), P (AAV), P (ASV) et P (LVA). L'enzYme ER2 est inactivé. Les clivages respectifs, obtenus au moyen de ER2, sont ensuite vérifiés sur un gel approprié Gl. Le fragment F'contenant le gène gstress ou gchim est alors clivé au moyen d'un enzyme convenable Erzen obtient deux fragments F\ et F2 de longueurs inégales. Le fragment fez renferme la zone de l'amorce A, le promoteur du gène gstress ou gchim, et la séquence codant pour la protéine de stress ou chimiotactique. Le fragment F2 renferme le site de terminaison et la zone de l'amorce A2 complémentée. L'enzyme ER3 est inactivé et le clivage obtenu au moyen de ER3 est contrôlé sur un gel approprié G2. On positionne ensuite l'adaptateur Ad (ER3/ER2) entre les fragments fil et F2 et on procède à la ligation de cet adaptateur entre lesdits fragments au moyen d'une ADN-ligase. L'adaptateur constitué de deux amorces associées tête-bêche présente des bouts collants identiques à ceux engendrés par le clivage dû à l'enzyme de restriction ER2. On obtient un fragment F''. On contrôle la ligation sur un gel G2. On clive le fragment F'' au moyen de l'enzyme ER2 et on inactive thermiquement l'enzyme ER2. On obtient deux fragments F'1 et F'2 de longueurs inégales. Le fragment F'1 renferme la zone de l'amorce A, le promoteur du gène gstress ou gchim, la séquence codant pour la protéine de stress ou chimio-tactique et une fraction clivée de l'adaptateur. Le fragment F'2 renferme la seconde fraction clivée de l'adaptateur, le site de terminaison et la zone de l'amorce A2 complémentée. On contrôle le clivage obtenu sur un gel G2. L'étape explicitée ci-dessus sera commune à l'ensemble des procédures alternatives décrites ultérieurement. Ensuite, on mélange les fragments de types F'1 et F'2 avec les fragments F (gfp) porteurs notamment des gènes gfp (LAA), gfp (AAV), gfp (ASV) et gfp (LVA) pris séparément. On notera que chaque fragment porteur du gène gfp ne renferme qu'un seul gène gfp d'un type déterminé. On procède alors à la ligation des fragments F'i, F (gfp) et F'2 au moyen d'une ADN-ligase. On contrôle la ligation des fragments F'/F (gfp)/F'2 sur un gel Gi, puis on découpe le fragment de gel G contenant l'ADN correspondant aux fragments F'/F (gfp)/F'2. On procède ensuite à l'extraction de l'ADN à partir du fragment de gel Gdécoupé, en utilisant une procédure adaptée. On procède alors à l'amplification par PCR des fragments d'ADN F'/F (gfp) /F'2 récupérés précédemment au moyen des amorces Al et A2. On contrôle l'amplification sur un gel G1. On vérifie que l'insertion du fragment F (gfp) est correcte en procédant à une double réaction PCR consistant à amplifier la partie amont F'i/F (gfp) au moyen des amorces Al et A3, cette dernière étant spécifique de la zone amont de la partie du gène gfp codant pour la protéine GFP, et à amplifier la partie aval F (gfp)/F'2 au moyen des amorces A4 et A, l'amorce A4 étant spécifique de la zone aval de la partie du gène gfp codant pour la protéine GFP. Le résultat de la réaction est contrôlé sur un gel Gl. On transforme alors les bactéries compétentes de la souche S, avec les produits de la réaction d'amplification précédente, par une procédure courante et on isole les bactéries sur gélose Ge, ou les organismes sur un milieu convenable. On applique un stress aux bactéries ou aux organismes, et on vérifie qu'il y a apparition de fluorescence. On met en culture sur un milieu liquide L les colonies bactériennes isolées et fluorescentes et on procède à l'extraction de l'ADN génomique des bactéries isolées. On contrôle par les mêmes procédures PCR que précédemment que l'on a bien les bons fragments attendus et que les fragments F'i/F (gfp) IF'2 se sont bien recombinés au niveau du locus génomique de gstress ou de gchim. Dans l'affirmative, les bactéries sont réputées être transformées et utilisables dans un biocapteur. Les bactéries sélectionnées sont ensuite transférées dans une minicuve ou fixés à un substrat convenable. La minicuve est ensuite positionnée dans un faisceau lumineux produit par la diode électroluminescente associée au filtre d'excitation. Lorsque le signal ou la substance chimique à détecter sont mis en présence du biocapteur, la fluorescence qui en résulte est mesurée au moyen d'un ou plusieurs photodétecteurs, associés au filtre d'émission. Les signaux électriques délivrés par les photodétecteurs sont pris en compte par un dispositif électronique d'amplification et de filtrage, suivi par un convertisseur analogique/numérique CAN et un microcalculateur CAL. Celui-ci est mis en oeuvre par un logiciel d'exploitation et de traitements statistiques des signaux numérisés. Un exemple concret de ces étapes figure en annexe sous l'intitulé procédure A, qui présente, de manière explicite, l'insertion du gène uspA avec un des gènes gfp comprenant l'étape de clivage du gène uspA par l'enzyme de restriction AflIII, l'étape de positionnement de l'adaptateur (AflIII/HindIII) dans le gène uspA, l'étape de caractérisation par PCR de la fusion uspA/gfp. Afin de réaliser un biocapteur multiparamétrique, il est bien entendu que l'opération d'insertion sera à réitérer autant de fois que d'associations gène de stress ou de chimiotactisme/gène rapporteur voulues, attendu que chaque gène rapporteur de fluorescence associé à un gène de stress ou de chimiotactisme donné émettra une lumière de longueur d'onde donnée. 2) Procédure de positionnement par PCR d'une séquence codant pour des terminaisons déstabilisantes au niveau C-terminal de la protéine de stress et/ou de chimiotactisme. Une première variante de l'invention consiste à utiliser une autre procédure, permettant de réduire la demi-vie des protéines synthétisées, et permettant une expression plus nette du gène gstress ou du gène gchim, ainsi qu'une meilleure extinction du signal lumineux d'émission lors de l'arrêt des contraintes stressantes ou inductrices d'une réponse chimiotactique. Pour cela, les gènes gstress ou gchim, contenus au niveau du fragment Fi,, sont alors modifiés par réaction d'amplification PCR qui fait appel à l'amorce Ai et à une amorce Ag qui code pour une séquence terminale d'acides aminés, par exemple, du type ASV ou AAV ou LVA, A représentant l'alanine, S la sérine, L la leucine et V la valine. Le fragment FI, est donc transformé en un fragment légèrement plus long F''1 que le fragment F'1. Le contrôle de la réaction d'amplification est ensuite fait sur un gel Gl. On clive le fragment F''1 au moyen de l'enzyme ER2 et on inactive thermiquement l'enzyme Erzen obtient deux fragments FI 1 Il et FI''2 de longueurs inégales. Le fragment FI'', renferme la zone de l'amorce Al, le promoteur du gène gstress ou gchim, la séquence codant pour la protéine de stress ou chimio-tactique, la zone de l'amorce As et une fraction clivée par ER2 de ladite amorce As. Le fragment Fui'', renferme la seconde fraction clivée de l'amorce Ag. On contrôle le clivage obtenu sur un gel 82. On mélange les fragments de types FI,, FI'', et FI'', avec les fragments F (gfp) porteurs des gènes gfp mutés. On procède alors à la ligation des fragments Fi'',, F (gfp) et F'2 au moyen d'une ADN-ligase. On contrôle la ligation des fragments F'''1/F(gfp)/F'2 sur un gel 81, puis on découpe le fragment de gel 81 correspondant aux fragments F'" JF (gfp) IF'2. On procède ensuite à l'extraction de l'ADN à partir du fragment de gel G découpé en utilisant une procédure adaptée. La suite des étapes, pour accéder à une bactérie réputée transformée est similaire aux étapes spécifiées dans la procédure précédente. Un exemple de positionnement par PCR d'une séquence codant pour des terminaisons ASV, AAV ou LVA au niveau C-terminal de la protéine UspA est explicité en annexe, sous l'intitulé procédure B. 3) Procédure d'insertion des gènes fluorescents gfp au niveau du promoteur seul du gène de stress et/ou de chimiotactisme. Une seconde variante de l'invention consiste également à réduire la demi-vie des protéines synthétisées et permet une expression plus nette du gène gstress ou du gène gchim, ainsi qu'une meilleure extinction du signal lumineux d'émission lors de l'arrêt des contraintes stressantes, ou inductrices d'une réponse chimio-tactique. Cette variante consiste à associer directement les gènes rapporteurs fluorescents, de type gfp, au promoteur seul du gène gstress ou du gène gchim. Pour ce faire, on utilise les fragments d'ADN issus de la première procédure et on amplifie par PCR le promoteur du gène gstress ou du gène gchim au moyen de l'amorce Ai et d'une nouvelle amorce Ag, qui comprend des sites de clivage convenables, par exemple, SphI et HindIII correspondant aux enzymes de restriction ER4 et ER2' On obtient ainsi des fragments d'ADN, appelés F (prom) comprenant le site de l'amorce, le promoteur du gène gstress ou du gène gchim, le site Shine-Dalgarno de fixation au ribosome et le site de l'amorce Ag. En parallèle, on procède au clivage de fragments d'ADN issus de la première procédure au moyen de l'enzyme de restriction ER2 de façon à obtenir des fragments comprenant la zone de polylinker 5'MCS (Multiple Cloning Site), le site synthétique de fixation au ribosome RBSII, la zone codant pour l'une des protéines correspondant à l'un des gènes gfp, le polylinker 3'MCS, la terminaison du fragment issu de la première procédure et la zone de fixation de l'amorce A2. Ces fragments sont clivés par l'enzyme ER4 de façon à éliminer la partie 5'MCS-RBSII. Les fragments Fprom sont alors clivés au moyen de l'enzyme ER4 au niveau du site de l'amorce Ag. On mélange les fragments de types Fprom avec les fragments F (gfp) porteurs des gènes gfp pris séparément. On procède alors à la ligation des fragments F (prom) avec les fragments F (gfp) au moyen d'une ADN-ligase. On contrôle la ligation des fragments F (prom)/ (Fgfp) sur un gel Gl, puis on découpe le fragment de gel G contenant l'ADN correspondant aux fragments F (prom)/ (Fgfp). On procède ensuite à l'extraction de l'ADN à partir du fragment de gel G, découpé en utilisant une procédure adaptée. On procède alors à l'amplification par PCR des fragments d'ADN F (prom)/F (gfp) récupérés précédemment au moyen des amorces Al et A2. On contrôle l'amplification sur un gel Gl. On procède ensuite aux opérations de contrôle déjà définies précédemment. L'ensemble de ces étapes est explicité au niveau de l'annexe, sous l'intitulé procédure C, donnant un exemple de fusion promoteur uspA/gfp (mut3. 1, ASV, AAV, LVA). Un exemple d'insertion d'un gène gfp au niveau du promoteur uspA est explicité en annexe sous l'intitulé Procédure C. Pour contrôler et corriger les dispersions entre biocapteurs et pour permettre un contrôle de la biomasse active dans chaque capteur et de sa viabilité, il est possible d'associer, comme gène rapporteur un gène gfp, codant pour une protéine GFP de longueur d'onde convenable, à un gène constitutif ou à un promoteur d'expression constante tout au long de la vie de l'organisme. Cette valeur de fluorescence sert de référence dans les mesures de niveaux de fluorescence induite par des contraintes stressantes ou chimiotactiques. De plus, ce dispositif permet d'indiquer en fin de période d'activité du biocapteur s'il est nécessaire de le remplacer ou pas. Cette association peut être obtenue par l'une des procédures décrites précédemment. 4) Procédure de polyadénylation des ARN messagers codés par les gènes modifiés. Une troisième variante de l'invention consiste à déstabiliser les ARN messagers codant pour les gènes modifiés précédemment par l'adjonction en terminaison 3'des ARN messagers transcrits, d'une polyadénylation constituée de 5 à 15 bases adénine consécutives, destinée à déstabiliser les ARN messagers transcrits in vivo chez les bactéries. Cette déstabilisation des ARN messagers a pour objectif de permettre de réduire la demi-vie de ces ARN et de permettre un retour à l'état initial du biocapteur bactérien mettant en oeuvre ces techniques. L'ensemble des procédures décrites ci-dessus permet d'obtenir un biocapteur, qui revient rapidement à son état initial après application d'une contrainte stressante ou chimiotactique. Les déstabilisations des protéines GFP et des ARN ont pour but de faire décroître plus rapidement le signal de fluorescence consécutif à l'arrêt de la contrainte stressante ou chimio-tactique. La déstabilisation des protéines de stress ou chimio-tactiques a pour objectif de déréguler le rétrocontrôle génétique de manière à faire produire de manière plus importante la protéine, et par là même, la protéine fluorescente GFP associée, tout en évitant une sur-expression potentiellement dommageable pour les organismes. 5) Procédure de réalisation d'un dispositif couplé de bioluminescence et de fluorescence associé. Un autre type de réalisation de l'invention consiste à réaliser un dispositif couplé de bioluminescence et de fluorescence en utilisant comme générateur de lumière in vivo la protéine bio-luminescente Aequorine, en présence d'une faible concentration de calcium et de Coelenthérazine. Ladite protéine bioluminescente Aequorine est codée par un gène porté par un plasmide convenable ou intégré dans le génome de l'organisme. Il est à noter que l'Aequorine et la GFP font partie d'un complexe luminescent chez la méduse Aequoria victoria. Il est à noter également que l'Aequorine et la GFP utilisées doivent provenir de la même espèce et être compatibles entre elles. L'utilisation de la bioluminescence engendrée par la protéine Aequorine synthétisée in vivo par l'organisme permet, du fait de l'association directe de l'Aequorine et de la GFP au niveau d'une zone d'accrochage médiane existant chez cette dernière, un transfert d'énergie lumineuse efficace entre l'Aequorine activée par le calcium en présence de Coelenthérazine et la GFP avec restitution d'une émission lumineuse particulièrement puissante. En suivi multiparamétrique par fluorescence uniquement, le couplage de l'Aequorine avec les GFP sécrétées in vivo par les organismes permet, en l'absence d'activation par la Coelenthérazine et le calcium, de stabiliser les GFP en évitant leur association en dimères GFP-GFP. Ces dimérisations sont préjudiciables aux mesures du fait de la modification des spectres d'excitation correspondants. Cette association permettrait une meilleure conformation après synthèse de la protéine GFP. 6) Procédure de réalisation de capteur à apprentissage de type pavlovien. Le capteur, objet de l'invention, peut être soumis à un apprentissage de type pavlovien si le signal physique ou la substance chimique à détecter sont de nature non stressante, ou non inductrice d'une réponse chimio-tactique. L'apprentissage se déroule dans les conditions suivantes : on applique au capteur (sensible à un signal stressant Sabs, ou inducteur d'une réponse chimiotactique, appelé facteur absolu en terminologie pavlovienne), le signal non stressant Scond'ou non inducteur d'une réponse chimiotactique, appelé facteur conditionnant en terminologie pavlovienne ; les signaux Sabs et Scond sont appliqués au capteur pendant une durée T convenable ; l'opération est reprise N fois, N étant un nombre convenablement choisi ; entre deux applications successives de durée T le capteur est laissé au repos pendant une durée t convenable. L'apprentissage est réussi quand l'application du signal Scond seul déclenche dans le capteur une réaction R', de caractéristiques voisines de celles de la réaction R, obtenue lorsque le signal Sabs seul est appliqué. Pour le capteur objet de l'invention, l'apprentissage peut être mis en oeuvre avec l'une quelconque des procédures décrites précédemment. Les substances non stressantes peuvent appartenir par exemple à la catégorie des nutriments tels que glucides, lipides, sels minéraux ou à la catégorie des micronutriments ou à la catégorie des oligo-éléments. Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de métier à ce procédé de réalisation de biocapteur, qui vient uniquement à titre d'exemple non limitatif, sans sortir du cadre de protection défini par les revendications annexées. PROCEDURE A 1) Extraction de l'ADN Génomique des souches d'Escherichia coli 2) Digestion de l'ADN Génomique d'E. Coli par l'enzyme de restriction Pst, et obtention d'un fragment d'ADN génomique de 5,2 kb de taille contenant le gène uspA 3) Contrôle sur gel d'agarose à 1 % du clivage Pst 1 4) Amplification par PCR du gène uspA grâce aux deux primers spécifiques : Primer 1 uspA : 5'-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3' (up) Primer 2 uspA : 5'-ACGCAGACCGTAGGCCAGAT-3' (down) 5) Contrôle sur gel d'agarose à 1% de l'amplification d'un fragment de 885 pb contenant le gène uspA 6) Extraction des quatre ADN Plasmidiques porteurs des gènes gfp (mut 3.1, ASV, AAV, LVA) 7) Digestion des quatre ADN plasmidiques par l'enzyme de restriction Hind ni au niveau des polylinkers des plasmides déstabilisés, inactivation de l'enzyme Hind III 8) Contrôle sur gel d'agarose 1% des clivages Hindis - gap (mut3.1, ASV, AAV, LVA)-3'-MCS 9) Digestion de la zone de clivage du gène uspA par l'enzyme de restriction Afl III et obtention de deux fragments de 789 et 96 pb, et inactivation de l'enzyme Afl in 10) Contrôle sur gel d'agarose 3% du clivage Afl m 11) Introduction des adaptateurs Afl m/Hind ni, et ligation des deux fragments précédents, plus adaptateur Adaptateur Afl m/Hind m : 5'-CGTGTAAGCTTA-3' 3'-ATTCGAATGCAC-5' 12) Contrôle sur gel d'agarose à 3% de la ligation précédente (fragment de 893 pb) 13) Clivage par l'enzyme de restriction Hind m du produit de ligation précédent, puis inactivation de l'enzyme 14) Contrôle de l'apparition de deux fragments de tailles respectives 793 et 100 pb sur gel d'agarose à 1% 15) Mélange des fragments clivés par Hind III, 5'-MCS-gfp (mut3.1, ASV, AAV, LVA)-3'MCS, avec le produit du clivage précédent, et ligation 16) Visualisation de l'insertion sur gel d'agarose à 1 % 17) Extraction sur gel d'agarose de l'ADN des bandes d'intérêt 18) Amplification par PCR des fragments présentant les fusion uspA : : gfp (mut3.1, ASV, AAV et LVA), grâce aux deux primers uspA présentés précédemment 19) Contrôle sur gel d'agarose à 1% 20) Validation de l'insertion correcte des gènes gfp (mut3.1, ASV, AAV, LVA) par PCR, avec amplification des parties Amont et Aval des fusions, grâce aux primers uspA précédents et gfp suivants : Primer 1 g) : 5'-GGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAG-3' Primer 2 gfp : 5'-CATCACCATCTAATTCAACAAG-3' 21) Visualisation sur gel d'agarose à 1% des produits d'amplification précédents 22) Transformation des bactéries Escherichia coli compétentes avec 10 ng des produits d'amplification uspA : : gfp (mut3.1, ASV, AAV, LVA) 23) Isolements sur gélose LB 24) Visualisation de l'apparition d'une fluorescence suite à l'instauration d'un stress, pour chacune des colonies isolées 25) Criblage par PCR de l'ADN des bactéries transformées fluorescentes, isolées, et mise en évidence sur gel d'agarose des produits d'amplification Amont et Aval, selon la même méthode que précédemment 26) Confirmation des transformations pour les quatre types de gènes gfp (mut3.1, ASV, AAV, LVA), et pour les diverses souches considérées 27) Congélation à-80 C et lyophilisation des souches transformées pour utilisation ultérieure SEQUENCE DU GENE uspA t - 342 ÇTÇ JCCGATACGCTGCCAA'I'CKA TAACACC AGGTCCTGGA GAAACCGCTT TTGTGGTGAC-283 //Position du Primer 1 - 282 CAACATACGA GCGGCTCTAT AGATAGTGTA GGAGATCAGE TTGTTTTTTT TÇCAGAAGGT -223 - 222 TAACCACTAT CAATATATTC ATGTCGAAAA TTTGTTTATC TAACGAGTAA GCAAGGCGGA -163 - > Début de transcription - 162 JTTGEJCGGATC ATCCGGGTCG CTAKKEBT ? !) jAGGAT G'i'CTTAACAC GAA TCTTTACGGC-103 - 35-10 Ou2 Promoteur uspA Liaison FadR - 102 TGGGTTAGCC CCGCGCACGT AGTTCGCAGG ACGCGGGTGA GCTAACGGCA CAAGAAACGC -43 - 42 T & GCTGGCCAGTCATCGACa) ACTTTATGG & JKEEKTAACA CT PM GCT TAT AAA 12 Oui SD met ala tyr lys Liaison FadR Début UspA 13 CAC ATT CTC ATC GCG GTC GAC CTC TCC CCG GAA AGC AAA GTT CTG GTA 60 his ile leu ile ala val asp leu ser pro glu ser lys val leu val 61 GAG AAA GCA GTC TCT ATG GCT CGC CCC TAC AAT GCG AAA GTT TCT CTG 108 glu lys ala val ser met ala arg pro tyr asn ala lys val ser leu 109 ATC CAC GTA GAT GTA AAC TAC TCT GAC CTA TAC ACC GGG CTT ATT GAT 156 ile his val asp val asn tyr ser asp leu tyr thr gly leu lle asp 157 GTG AAT CTG GGT GAT ATG CAG AAA CGC ATC TCT GAA GAG ACA CAT CAT 204 val asn leu gly asp met glu lys arg ile ser glu glu thr his his 205 GCA CTG ACC GAG CTT TCC ACT AAT GCA GGC TAC CCA ATC ACT GAA ACC 252 ala leu thr glu leu ser thr asn ala gly tyr pro Ile thr glu thr 253 CTG AGC GGC AGC GGC GAC CTG GGC CAG GTT CTG GTC GAT GCA ATC AAG 300 leu ser gly ser gly asp leu gly glu val leu val asp ala ile lys 301 AAA TAC GAT ATG GAT TTG GTG GTT TGT GGT CAC CAC CAG GAC TTC TGG 348 lys tyr asp met asp leu val val cys gly his his glu asp phe trp 349 AGC AAA CTG ATG TCT TCC GCA CGT CAG CTG ATC AAC ACC GTT CAC GTT 396 ser lys leu met ser ser ala arg gln leu ile asn thr val his val 397 GAT ATG CTG ATT GTT CCG CTC GCG GAC GAA GAA GAA p'BTCTTCCCTCTACG 448 asp met leu ile val pro leu ala asp glu glu glu end Zone de Fin UspA 449 ACGTGTTCCT G ACUCCCGC TAT j MHCU'n] TTGCTTT TTGGCGCGCC TTGTTACCTG 508 clivage Term. Rhô-indépendante 509 ATCAGCGTAA ACACCTT JATCTGGCC'1'ACGGTCTUCG ACG CM. TC & AM. TCCCÇAGÇCAA 568 Position du Primer 2 Il Zone non amplifiée 569 TACAACATTT ARCAÇCATC TATTTTCCATCATTAGTGTG ATCATCTDGT TATTTTCTGT 628 629 TGTAATAGTGTATTAATCTA TTÇ & CC6ÇAT CT 688 629 TGTAATAGTG TATTAATCTA TTCACCGCAT CAATATTAAG AATCTCTGAC AGATGTAAAC 688 Primers : Primer 1 5'-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3' (de-339 à-520) Primer 2 5'-ACGCAGACCGTAGGCCAGAT-3' (de +526 à +545) Amplification par PCR de la zone allant de-339 à +545 (885 pb) Oui et Ou2 : Fixation du dimère FadR SD : Shine-Dalgarno (fixation au ribosome) Références : Chen J. and Griffits MLW., 1998 PCR différenciation of Escherichia coli from other Gram-négative bacteria using primers derived from the nucleotide sequences flanking the gene encoding the universal stress protein. Letters in Applied Microbiology (1998), 27, pg. 369-371 Nystrom T. and Neidhardt F. C., 1992 Cloning, mapping and nucleotide sequencing of a gene encoding a universal stress protein in Escherichia coli. Molecular Microbiology (1992), 6, pg. 3187-3198 Farewell A., Diez A. A., Di Russo C. C. and Nystrm T., 1996 Role of the Escherichia coli FadR Regulator in Stasis Survival and Growth PhaseDependent Expression of the uspA, fad, and fab genes. Journal ofBacteriology (1996), 178 (22), pg. 6443-6450 - 342 CTC GATACUCTGCCAA. TCKBT TAACACC AGGTCCTGGA GAAACCGCTTTrTrTMAC-283 //Position du Primer 1 2828690 - 282 CAACATACGA GCGGCTCTAT AGATAGTGTA GGAGATCAGG TTGTTTTTTT TCCAGAAGGT-223 - 222 TAACCACTAT CAATATATTC ATGTCGAAAA TTTGTTTATC TAACGAGTAA GCAAGGCGGA-163 - > Début de transcription - 162 TTGACGGATC ATCCGGGTCG CTATAAGGTA jKGGATGG'i'C'i"l'AACKCTl GAA TCTTTACGGC-103 - 35-10 Ou2 Promoteur uspA Liaison FadR - 102 TGGGTTAGCC CCGCGCACGT AGTTCGCAGG ACGCGGGTGA GCTAACGGCA CAAGAAACGC-43 - 42 T JAHCTGUCCAGTCATCBKCB) ACTTTATGGA BESTAACA CT Tq SCT TAT AAA 12 Oui SD met ala tyr lys Liaison FadR Début UspA 13 CAC ATT CTC ATC GCG GTC GAC CTC TCC CCG GAA AGC AAA GTT CTG GTA 60 his ile leu ile ala val asp leu ser pro glu ser lys val leu val 61 GAG AAA GCA GTC TCT ATG GCT CGC CCC TAC AAT GCG AAA GTT TCT CTG 108 glu lys ala val ser met ala arg pro tyr asn ala lys val ser leu 109 ATC CAC GTA GAT GTA AAC TAC TCT GAC CTA TAC ACC GGG CTT ATT GAT 156 ile his val asp val asn tyr ser asp leu tyr thr gly leu lle asp 157 GTG AAT CTG GGT GAT ATG CAG AAA CGC ATC TCT GAA GAG ACA CAT CAT 204 val asn leu gly asp met glu lys arg ile ser glu glu thr his his 205 GCA CTG ACC GAG CTT TCC ACT AAT GCA GGC TAC CCA ATC ACT GAA ACC 252 ala leu thr glu leu ser thr asn ala gly tyr pro lle thr glu thr 253 CTG AGC GGC AGC GGC GAC CTG GGC CAG GTT CTG GTC GAT GCA ATC AAG 300 leu ser gly ser gly asp leu gly gln val leu val asp ala ile lys 301 AAA TAC GAT ATG GAT TTG GTG GTT TGT GGT CAC CAC CAG GAC TTC TGG 348 lys tyr asp met asp leu val val cys gly his his gln asp phe trp 349 AGC AAA CTG ATG TCT TCC GCA CGT CAG CTG ATC AAC ACC GTT CAC GTT 396 ser lys leu met ser ser ala arg gln leu ile asn thr val his val 397 GAT ATG CTG ATT GTT CCG CTC GCG GAC GAA GAA GAA CTTCCCTCTACG 448 CCC-T 448 asp met leu ile val pro leu ala asp glu glu glu end Fin UspA 449 (ACSTS'TCCT G AACGCCCGCATATSCSGSCGT TTGCTTT TTGGCGCGCC TTGTTACCTG 508 Term. Rho-indépendante Clivage Afl III AJCRYGT avec R = A ou G et Y = C ou T (Clivages possibles : AICACGT 1 AICATGT. A/CGCGT et AICGTG Unique clivage Afl III de-342 à 688 : S'-B N pETC'TTC-3' &verbar;~ z ~J 3'-nxxq SK-5' 509 ATCAGCETAA ACACCTT) ATCTGGCCTACHGTCTBCBT ACG CAATCAAAAT CCCCAGCCAA 568 Position du Primer 2//Zone non amplifiée 569 TACAACATTT AACACCATCA TATTTTCCAT CATTAGTGTG ATCATCTGGT TATTTTCTGT 628 629TGTAATAGTG.TATTAATCTA,TTÇAÇCGCATÇAATATTAAS.. AATÇTCTGAC AGATGTAAAC 688 629 TGTAATAGTG TATTAATCTA TTCACCGCAT CAATATTAAG AATCTCTGAC AGATGTAAAC 688 Figure Figure Clivage unique Awl 111 du gène uspA Taille des fragments : Fragment non clivé de -339 à +545/Taille de 885 pb Fragment de-339 à +449/Taille de 789 pb Fragment de +450 à +545/Taille de 96 pb Légende : Primer 1 uspA : 5'-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3' (de-339 à-520) Primer 2 uspA : 5'-ACGCAGACCGTAGGCCAGAT-3' (de +526 à +545) (amplification par PCR de la zone allant de-339 à +545/fragment de 885 pb) Ou 1 et 0u2 : Fixation du dimère FadR SD : Shine-Dalgarno (fixation au ribosome) Références : Documentations techniques des sociétés CLONTECH, PROMEGA, MBI Fermentas et BioLabs Inc. - 342 CTC JCCGATACSCTGCCAATCA TAACACC AGGTCCTGGA GAAACCGCTT TTGTGGTGAC-283 //Position du Primer 1- 2828690 - 282 CAACATACGA GCGGCTCTAT AGATAGTGTA GGAGATCAGG TTGTTTTTTT TCCAGAAGGT-223 - 222 TAACCACTAT CAATATATTC ATGTCGAAAA TTTGTTTATC TAACGAGTAA GCAAGGCGGA -163 - > Début de transcription - 162 TTGACGGATC ATCCGGGTCG CTATRRGGTA AUHATGSTUTTAACECT GAA TCTTTACGGC-103 - 35-10 Ou2 Promoteur uspA Liaison FadR - 102 TGGGTTAGCC CCGCGCACGT AGTTCGCAGG ACGCGGGTGA GCTAACGGCA CAAGAAACGC -43 - 42 T) AGCTSGCCAHTCM'CBKCBj ACTTTATGG & jBSeKTAACA CT Tq GCT TAT... 12 OU1 SD met ala tyr... Liaison FadR Début UspA Protéine UspA 397... ATG CTG ATT GTT CCG CTC GCG GAC GAA GAA GAA CTTCCCTCTACG 448 CTCTACG 448 ... met leu ile val pro leu ala asp glu glu glu end Fin UspA 449 (ACGTG'TCCT G JAACHCCCGCATATGCEHGCUTT TTGCTTT TTGSCGCGCC TTGTTACCTG 508 Term. Rhô-indépendante Clivage Afl III AICRYGT avec R = A ou G et Y = C ou T (Clivages possibles : AICACGT, AICATGT, AJCGCGT et AICGTGT) Unique clivage Afl III de-342 à 688 : S'-CBN iCSTS'TTq-S' 3'-iGCr'BCXC ! jSCSj-5' Positionnement d'un Adaptateur Afl III 1 Kind III (Associant un clivage Afl III A) CRYGT avec R = A ou G et Y = C ou T, et un clivage Hind III type AJAGCTT) Structure de l'Adaptateur 1 5'-CGTGTAAGCTTA-3' 3'-ATTCGAATGCAC-5' Clivage Hind III introduit 1 5'-jCBTB'nSj jKBCr'T ! !}...-3' 31-... IKT-'ZCM-51 509 ATCRGCGTA & ACACCTT RTCTBGCCTACGGTCTSCGT] ACG ATCAARAT CCCCAGCCR & 568 position du Primer 2//Zone non amplifiée Figure Positionnement d'un adaptateur Ai) ! ! !/Hind ! ! I dans] e gène uspA Légende : Primer 1 uspA : 5'-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3' (de -339 à -520) Primer 2 uspA : 5'-ACGCAGACCGTAGGCCAGAT-3 1 (de +526 à +545) (amplification par PCR de la zone allant de-339 à +545/fragment de 885 pb) Ou 1 et 0u2 : Fixation du dimère FadR SD : Shine-Daigamo (fixation au ribosome) Références : Documentations techniques des sociétés CLONTECH, PROMEGA, MBI Fennentas et BioLabs Ine. CARACTERISATION DE LA FUSION uspA : : gfp (mut3. 1, ASV, AAV, LVA) ... 1. Amplification par PCR du gene uspA - 342 CTÇ JCCGATACGCTGCCAATCAST TAACACC AGGTCCTGGA GAAACCGCTT TTGTGGTGAC-283 //Position du Primer 1 - 282 CAACATACGA GCGGCTCTAT AGATAGTGTA GGAGATCAGG TTGTTTTTTT TCCAGAAGGT-223 - 222 TAACCACTAT CAATATATTC ATGTCGAAAA TTTGTTTATC TAACGAGTAA GCAAGGCGGA-163 - > Début de transcription - 162 TTGACGGATC ATCCGGGTCG CTATAAGGTA ( & EGATHGTCt"l'AACAC GAA TCTTTACGGC-103 - 35-10 Ou2 Promoteur uspA Liaison FadR - 102 TGGGTTAGCC CCGCGCACGT AGTTCGCAGG ACGCGGGTGA GCTAACGGCA CAAGAAACGC-43 - 42 T ( & GCTGUCCAGTCATC (. ! AC ACTTTATGGA JKBBEEJTAACA CT p ! TGj GCT TAT... 12 Oui SD met ala tyr Liaison FadR Début UspA 397... ATG CTG ATT GTT CCG CTC GCG GAC GAA GAA GAA/TÄÄ ! TCTTCCCTCTACG 448 met leu ile val pro leu ala asp glu glu glu end Zone de Fin UspA 449 ACGTGTTCCT G AACUCCCGCATATU (NGmT TTGCTTT TTGGCGCGCC TTGTTACCTG 508 clivage Term. Rhô-indépendante 509 ATCAGCGTAA ACACCTT (ATCTGGCCTACHHTCTHCGT) ACG CAATCAAAAT ÇCCÇAG... 568 Position du Primer 2//Zone non amplifiée Primers : Primer 1 uspA 5'-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3' (de-339 à-520) Primer 2 uspA 5'-ACGCAGACCGTAGGCCAGAT-3' (de +526 à +545) Amplification par PCR de la zone allant de-339 à +545 (885 pb) 2. Amplification par PCR du gene uspA fusionné au gène gfp - 342 CTC JCCGM'ACSCTSCCAKTCKB' TAACACC AGGTCCTGGA GAAACCGCTT TTGTGGTGAC -283 //Position du Primer l - 282 CAACATACGA GCGGCTCTAT AGATAGTGTA GGAGATCAGG TTGTTTTTTT TCCAGAAGGT-223 - 222 TAACCACTAT CAATATATTC ATGTCGAAAA TTTGTTTATC TAACGAGTAA GCAAGGCGGA -163 - > Début de transcription - 1. 62 TTGACGGATC ATCCGGGTCG CTATAAGGTA JAHGATUGTCTTAACACT GAA TCTTTACGGC-103 - 35-10 Ou2 Promoteur uspA Liaison FadR - 102 TGGGTTAGCC CCGCGCACGT AGTTCGCAGG ACGCGGGTGA GCTAACGGCA CAAGAAACGC-43 - 42 T pMSCl'GHCCAGTCATCUACA ACTTTATGGA JBSSETAACA CT M GCT TAT... 12 Oui SD met ala tyr Liaison FadR Début UspA 397... ATG CTG ATT GTT CCG CTC GCG GAC GAA GAA GAA jTKEp'CTTCCCTC... 448 met leu ile val pro leu ala asp glu glu glu end Fin UspA Zone d'intégration de l'insert gfp (mut3. 1, ASV, AAV ou LVA) (clivage 5'-MCS à 3'-MCS) 449... GTTCCT G TTGCTTT TTGGCGCGCC TTGTTACCTG 508 Term. Rhô-indépendante 509 ATCAGCGTAA ACACCTT jATC'i'UUCCTACGUTCTECET) ACS CAATCAAAAT CCCCAG... 568 Position du Primer 2//Zone non amplifiée Primers : Primer 1 uspA 5'-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3' (de-339 à-520) Primer 2 uspA 5'-ACGCAGACCGTAGGCCAGAT-3' (de +526 à +545) Amplification par PCR de la zone allant de-339 à +545 (uspA) (885 pb + taille de l'insert) 3. Validation par PCR de l'insertion du gène gfp (Partie Amont) dz - 342 CTC JCCHATACGCTGCCAATCAGT) TAACACC AGGTCCTGSA GAAACCGCTT TTGTGGTGAC-283 //Position du Primer 1 (uspA) - 282 CAACATACGA GCGGCTCTAT AGATAGTGTA GGAGATCAGG TTGTTTTTTT TCCAGAAGGT -223 - 222 TAACCACTAT CAATATATTC ATGTCGAAAA TTTGTTTATC TAACGAGTAA GCAAGGCGGA-163 - 162 TTGACGGATC ATCCGGGTCG CTATAAGGTA jAtJUATGGTCTTAACACT GAA TCTTTACGGC-103 - 35-10 Ou2 - 102 TGGGTTAGCC CCGCGCACGT AGTTCGCAGG ACGCGGGTGA GCTAACGGCA CAAGAAACGC-43 - 42 T AGCTHGCCAGTCATCCACaj ACTTTATGGA TAACA CT JKTB) GCT TAT... 12 Oui SD met ala tyr 397... ATG CTG ATT GTT CCG CTC GCG GAC GAA GAA GAA MMTCTTCCCTCT... 448 met leu ile val pro leu ala asp glu glu glu end Fin UspA Zone d'intégration de l'insert gfp (mut3. 1, ASV, AAV ou LVA) (clivage 5'-MCS à 3'-MCS) ... B'-MCSfgfp)-RBSII-jKTqCGTAAAS GASAAGAACT TTTCACTSCA GTTGTCCCAA Début Gfp (mut3. 1, AAV, ASV, LVA) TT pTTE'rl'HKATTAGATUHTHETBj TTAA...-3'gfp (mut3. 1, AAV, ASV, LVA) 3'-GAACAACTTAATCTACCACTAC-5' Primer 2 GFP-N Clontech (367-346) Primers : Primer 1 uspA 5'-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3' (de-339 à-520) Primer 2 gfp 5'-CATCACCATCTAATTCAACAAG-3' (de +367 à +346) (GFP-N Primer Clontech &num;6476-1/2, 5 microgrammes) Amplification par PCR de la zone allant de-339 (uspA) à 367 (gfp) 4. Validation par PCR de l'insertion du gène gfp (Partie Aval) Zone d'intégration de l'insert gfp (mut3. 1, ASV, AAV ou LVA) (clivage 5'-MCS à 3'-MCS) ... CAT GTCC'ITCT'i'ëACTTTHTASEKE) CTGCTGGGATTA CACATGGCAT GGATGAACTA //Primer 1 GFP-C Clontech (957-979) TACAAATAAGCT - 3'MCS (gfp).., 449... TGTTCCT G pACGCCCG =ffiU TTGCTTT TTGGCGCGCC TTGTTACCTG 508 Term. Rhô-indépendante 509 ATCAGCGTAA ACACCTT TCTHHCCTACGGTCTGCe ACG CAATCAaAAT CCCC... 568 Position du Primer 2//Zone non amplifiée Primers : Primer gfp 5'-GGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAG-3' (de 957 A 979) (GFP-C Primer Clontech &num;6477-1/2, 5 microgrammes) Primer 2 uspA 5'-ACGCAGACCGTAGGCCAGAT-3' (de +526 à +545) Amplification par PCR de la zone allant de 957 (gfp) a +545 (uspA) Références : Chen J. and Griffits M. W., 1998 PCR différenciation of Escherichia coli from other Gram-negative bacteria using primers derived from the nucleotide sequences flanking the gene encoding the universal stress protein. Letters in Applied Microbiology (1998), 27, pg. 369-371 Nystrm T. and Neidhardt F. C., 1992 Cloning, mapping and nucleotide sequencing of a gene encoding a universal stress protein in Escherichia coli. Molecular Microbiology (1992), 6, pg. 3187-3198 Farewell A., Diez A. A., Di Russo C. C. and Nystrom T., 1996 Role of the Escherichia coli FadR Regulator in Stasis Survival and Growth Phase-Dependent Expression ofthe uspA, fad, and fab genes. Journal of Bacteriology (1996), 178 (22), pg. 6443-6450 Documentation technique de la société CLONTECH PROCEDURE 1) Extraction de l'ADN Génomique des souches d'Escherichia coli 2) Digestion de l'ADN Génomique d'E. Coli par l'enzyme de restriction PstI, et obtention d'un fragment d'ADN génomique de 5,2 kb de taille contenant le gène uspA 3) Contrôle sur gel d'agarose à 1% du clivage Pst I 4) Amplification par PCR du gène uspA grâce aux deux primers spécifiques : Primer 1 uspA : 5'-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3' Primer 2 uspA : 5'-ACGCAGACCGTAGGCCAGAT-3' 5) Contrôle sur gel d'agarose à 1% de l'amplification d'un fragment de 885 pb contenant le gène uspA. 6) Digestion de la zone de clivage du gène uspA par l'enzyme de restriction Afl m et obtention de deux fragments de 789 et 96 pb, et inactivation de l'enzyme Afl m. 7) Contrôle sur gel d'agarose 1 % du clivage Afl m 8) Introduction des adaptateurs Afl m/Hind m, et ligation des deux fragments précédents, plus adaptateur Adaptateur Afl d/Hind m : 5'-CGTGTAAGCTTA-3' 3'- ATTCGAATGCAC - 5' 9) Contrôle sur gel d'agarose 1% de la ligation précédente (fragment de 893 pb) 10) Clivage par l'enzyme de restriction Hind m du produit de ligation précédent, puis inactivation de l'enzyme. 11) Contrôle de l'apparition de deux fragments de tailles respectives 793 et 100 pb sur gel d'agarose à 1%. 12) Modification par PCR du gène uspA et amplification à l'aide de primers spécifiques codant pour les tails ASV, AAV, et LVA. Les primers utilisés sont les suivants : Primer 1 uspA : 5'-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3' (idem précédemment) Primer 3 uspA (ASV) : 5 1 - CTCTCAAGCTTATTAAACTGATGCAGCGTAGTTTTCGTCG TTTGCTGCAGGCCTTTCTTCTTCGTCCGCGAGCGGA-3' Primer 4 uspA (AAV) : 5'- CTCTCAAGCTTATTAAACTGCTGCAGCGTAGTTTTCGTCG TTTGCTGCAGGCCTTTCTTCTTCGTCCGCGAGCGGA-3' Primer 5 uspA (LVA) : 5'-CTCTCAAGCTTATTAASCTACTAAAGCGTAGTTTTCGTCG TTTGCTGCAGGCCTTTCTTCTTCGTCCGCGAGCGGA-3' 13) Contrôle sur gel d'agarose à 1% de l'amplification des trois fragments de 825 pb contenant le gène uspA et les séquences codant pour les tails ASV, AAV, et LVA respectivement 14) Digestion des 3 ADN précédents par l'enzyme de restriction Hind m en partie terminale des séquences, et obtention dans chaque cas d'un fragment de 815 pb, puis inactivation de l'enzyme Hind m 15) Extraction des quatre ADN Plasmidiques porteurs des gènes gfp (ASV, AAV, LVA) 16) Digestion des quatre ADN plasmidiques par l'enzyme de restriction Hind m au niveau des polylinkers des plasmides déstabilisés, inactivation de l'enzyme Hind m. 17) Contrôle sur gel d'agarose 1% des clivages 5'-MCS-gfp (ASV, AAV, LVA)-3'-MCS 18) Mélange des fragments clivés par Hind m, 5'-MCS-gfp (ASV, AAV, LVA)-3'MCS, avec les produits des clivages précédents (étapes 10,14, et 16), et ligation. 19) Visualisation des différentes bandes obtenues sur gel d'agarose à 1 %. 20) Extraction sur gel d'agarose de l'ADN des bandes d'intérêt contenant le gène uspA modifié, les séquences codant pour les tails ASV, AAV ou LVA, les gènes gfp (ASV), gfp (AAV) ou gfp (LVA), et la terminaison rho-indépendante du gène uspA. 21) Amplification par PCR des fragments présentant les fusion uspA (ASV) : : gfp (ASV), uspA (AAV) : : gfp (AAV), uspA (LVA) : : gfp (LVA), grâce aux deux primers uspA (1 et 2) de l'étape 4). 22) Contrôle sur gel d'agarose à 1% 23) Validation de l'insertion correcte des gènes gfp (ASV, AAV, LVA) par PCR, avec amplification des parties Amont et Aval des fusions (Amplifications PI uspA-P2 gfp et Pl gfp-P2 uspA), grâce aux primers uspA et gfp suivants : Primer 1 uspA : 5'-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3' Primer 2 uspA : 5'-ACGCAGACCGTAGGCCAGAT-3' Primer 1 gfp : 5'-GGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAG-3' Primer 2 gfp : 5'-CATCACCATCTAATTCAACAAG-3' 24) Visualisation sur gel d'agarose à 1% des produits d'amplification précédents 25) Transformation des bactéries Escherichia coli compétentes avec 10 ng des produits d'amplification uspA (ASV) : : gfp (ASV), uspA (AAV) : : gfp (AAV), et uspA (LVA) : : gfp (LVA). 26) Isolements sur gélose LB 27) Visualisation de l'apparition d'une fluorescence suite à l'instauration d'un stress, pour chacune des colonies isolées 28) Criblage par PCR de l'ADN des bactéries transformées fluorescentes, isolées, et mise en évidence sur gel d'agarose des produits d'amplification Amont et Aval, selon la même méthode que précédemment 29) Confirmation des transformations pour les trois modifications, uspA (ASV) : : gfp (ASV), uspA (AAV) : : gfp (AAV), et uspA (LVA) : : gfp (LVA), et pour les diverses souches considérées 30) Congélation à-80 C et lyophilisation des souches transformées pour utilisation ultérieure N. B. Les étapes 1) à 11) sont communes avec la procédure A - 342 CTC ICCGA.rT & C3CTGCCA & 'i'CAU'l'j TAACACC AGGTCCTGGA GAAACCGCTT TTGTGGTGAC-283 //Position du Primer 1 - 282 CAACATACGA GCGGCTCTAT AGATAGTGTA GGAGATCAGG TTGTTTTTTT TCCAGAAGGT-223 - 222 TAACCACTAT CAATATATTC ATGTCGAAAA TTTGTTTATC TAACGAGTAA GCAAGGCGGA-163 - > Début de transcription - 162 TTGACGGATC ATCCGGGTCG CTATAAGGTA GSATHHTl'C'TAACACll GAA TCTTTACGGC-103 - 35-10 Ou2 Promoteur uspA Liaison FadR - 102 TGGGTTAGCC CCGCGCACGT AGTTCGCAGG ACGCGGGTGA GCTAACGGCA CAAGAAACGC -43 - 42 T) & GCTGSCCAGTC'ATCHACA) ACTTTATGGA JKBSSTAACA CT jKTa GCT TAT AAA 12 Oui SD met ala tyr... Liaison FadR Début UspA 397 GAT ATG CTG ATT GTrr CCG CTU GAC GAA Uqâ M ; ZRCTTCCCTCTACG 448 ... met leu ile val pro leu ala asp glu glu glu end Il Zone non Fin UspA Positionnement du Primer 3 uspA (ASV) : 3'-A GGC GAG CGC CTG CTT CTT CTT TCC GGA CGT CGT Fin uspA arg pro ala ala R P A A StuI TTG CTG CTT TTG ATG CGA CGT AGT CAA ATTATTCGRACTCTC-5' asn asp glu asn tyr ala ala ser val HindIII N D E N Y A A S V 449 ACGTGTTCCT G AACGCCCHCATATùfCGGUCETT TTGÇTTT. TTGGÇGCGCC TTGTTACCTG 508 amplifiée Tenn. Rhô-indépendante amplifiée Term. 509 ATCAGCGTAA ACACCTT ATCTGGCCTACGGTCTGCGT ACG CAATCAAAAT CCCCAGCCAA 568 569 TACAACATTT AACACCATCA TATTTTCCAT CATTAGTGTG ATCATCTGGT TATTTTCTGT 628 629 TGTAATAGTG TATTAATCTA TTCACCGCAT CAATATTAAG AATCTCTGAC AGATGTAAAC 688 Figure Positionnement par PCR d'une séquence RPAANDENYAASV en C-terminal de la proteine UspA Légende : Primer 1 uspA : 5'-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3' Primer 3 uspA (ASV) : 5'-CTCTCAAGCTTATTAAACTGATGCAGCGTAGTTTTCGTC GTTTGCTGCAGGCCTTTCTTCTTCGTCCGCGAGCGGA-3' (amplification par PCR d'un fragment de 825 pb) Oui et Ou2 : Fixation du dimère FadR SD : Shine-Dalgamo (fixation au nbosome) Références : Andersen J. B., Sternberg C., Poulsen L. K, Bjorn S. P, Givskov M. and Molin S., 1998 New Unstable Variants of Green Fluorescent Protein for studies of Transient Gene Expression in Bacteria. Applied and Environmental Microbiology (1998), 64 (6), pg. 2240-2246 Nystrom T. and Neidhardt F. C., 1992 Cloning, mapping and nucleotide sequencing of a gene encoding a universal stress protein in Escherichia coli. Molecular Microbiology (1992), 6, pg. 3187-3198 Farewell A., Diez AA, Di Russe C. C. and Nystrom T., 1996 Role of the Escherichia coli FadR Regulator in Stasis Survival and Growth Phase-Dependent Expression pfthe uspA, fad, and fab genes. Journal of Bacteriology (1996), 178 (22), pg. 6443-6450 Primer 1 uspA : (Amont) 5'-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3' Primer 3 uspA (ASV) : (Aval) 5'-CTCTCAAGCTTATTA AAC TGA TGC AGC GTA GTT TTC GTC GTT TGC TGC AGG CCT TTCTTCTTCGTCCGCGAGCGGA-3' HindIII val ser ala ala tyr asn glu asp asn ala ala pro arg Primer 4 uspA (AAV) : (Aval) 5'-CTCTCAAGCTTATTA AAC TSC TSC AGC GTA GTT TTC GTC GTT TSC TSC AGG CCT TTCTTCTTCGTCCGCGAGCGGA-3' HindIII val ala ala ala tyr asn glu asp asn ala ala pro arg Fin t1spA v A à à y N E D m A a p R VAAATTNEDHAAPR Stul Primer 5 uspA (LVA) : (Aval) 5'-CTCTCAAGCTTATTA AGC TAC TAA AGC GTA GTT TTC GTC GTT TGC TGC AGG CCT TTCTTCTTCGTCCGCGAGCGGA-3' HindIII ala val leu ala tyr asn glu asp asn ala ala pro arg Fin t1spA A V L A Y N E : D N A A P R Stul Sites de restriction : HindIII : AIAGCTT Stul ou AatI : AGGICCT Figure Primers utilises dans e positionnement par PCR de séquences RPAANDENYA-ASV,-AAV ou-LVA en C-terminal de la proteine UspA Références : Andersen J. B., Sternberg C Poulsen L. ! C, Bjorn S. P Givskov M. and Molin S., 1998 New Unstable Variants of Green Fluorescent Protein for studies of Transient Gene Expression in Bacteria. Applied and Environmental Microbiology (1998), 64 (6), pg. 2240-2246 Nystrom T. and Neidhardt F. C., 1992 Cloning, mapping and nucleotide sequencing of a gene encoding a universal stress protein in Escherichia coli. Molecular Microbiology (1992), 6, pg. 3187-3198 Procédure C. CARACTERISATION DE LA FUSION Promoteur uspA : : gfp (mut3. 1, ASV, AAV, LVA) 1. Amplification par PCR du promoteur uspA avec introduction de sites de clivage Sphl et HindIII - 342 ÇTÇ pCGATACGCTGCCAATCAGTj TAACACC AGGTCCTGGA GAAACCGCTT TTGTGGTGAC-283 //Position du Primer l - 282 CAACATACGA GCGGCTCTAT AGATAGTGTA GGAGATCAGG TTGTTTTTTT TCCAGAAGGT-223 - 222 TAACCACTAT CAATATATTC ATGTCGAAAA TTTGTTTATC TAACGAGTAA GCAAGGCGGA-163 - > Début de transcription - 162 TTGACGGATC ATCCGGGTCG CTATAAGGTA jAijGATGG'i'CTTAACACT') GAA TCTTTACGGC-103 - 35-10 Ou2 Promoteur uspA Liaison FadR - 102 TGGGTTAGCC CCGCGCACGT AGTTCGCAGG ACGCGGGTGA GCTAACGGCA CAAGAAACGC-43 - 42 T JAGCTHGCCAGTCATCEKGA) ACTTTATGGA JAGGAGJTAACA CT ATU GCT'TAT AAK) 12 Oui SD met ala tyr lys Liaison FadR 1 A f Début UspA Mutation SphI(CT- > GC, G- > C) 13 JCAC ATT CTC ATC UCU BTC S & C CTC TCCj CCG GAA AGC AAA GTT CTG GTA 60 his ile leu ile ala val asp leu ser pro glu ser lys val leu... //Zone non amplifiée Positionnement du Primer 6 uspA : 3'-ATTGT CG TAC GGA ATA TTT 1 A 1 met tyr lys Sph : r (GCATGI C) GTG TAA GAG TAG CGC CAG CTG GAG AGG ATTATTCGAACTCTC- 5' his ile leu ile ala val asp leu ser Bindlll (AJAGCTT) Primer 1 uspA : (Amont) 5'-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3' Primer 6 uspA : (Aval) 5'-CTCTCAAGCTTATTA GGA GAG GTC GAC CGC GAT GAG AAT GTG TTT ATA AGG CAT GCTGTTA-3' ser leu asp val ala ile leu ile his lys tyr met &verbar;A &verbar; i A 0 Ili SphI EiIICU2 : 1 Sphl 2. Promoteur uspA amplifié-Sites de clivage - 342 CTÇ JCCHATACHCTGCC & A'1'C & GT) TAACACC AGGTCCTGGA GAAACCGCTT TTGTGGTGAC-283 //Position du Primer 1 -282 CAACATACGA GCGGCTCTAT AGATAGTGTA GGAGATCAGG TTGTTTTTTT TCCAGAAGGT-223 - 222 TAACCACTAT CAATATATTC ATGTCGAAAA TTTGTTTATC TAACGAGTAA GCAAGGCGGA -153 - > Début de transcription - 162 TTGACGGATC ATCCGGGTCG CTATAAGGTA UHATUHTCTTAACKCT SAA TCTTTACGGG-103 - 35-10 Ou2 Promoteur uspA Liaison FadR - 102 TGGGTTAGCC CCGCGCACGT AGTTCGCAGG ACGCGGGTGA GCTAACGGCA CAAGAAACGC-43 - 42 T j & UCTHHCCMTCATCBKCA ACTTTATGGA & HSA1'AACA GC A'1'U CCT TAT AA 12 Oui SD met ala tyr lys Liaison FadR Début UspA ils Clivage SphI (GCATGIC) 13 JC & C ATi''CTC ATC GCG GTC BAC C'l'C'TCC"T. BKTKKSCTTHAGAGj his ile leu ile ala val asp leu ser 1 Ar. Positionnement du Primer 6 (uspA) cH vage HindIII (A 1 AGCTT) 3. Liaison promoteur uspA 1 gfp (AA V, ASV, LVA) - 342 CTÇ ICCGATACGCTGCCMTCKB TAACACC AGGTCCTGGA GAAACCGCTT TTGTGGTGAC-283 //Position du Primer 1 - 282 CAACATACGA GCGGCTCTAT AGATAGTGTA GGAGATCAGG TTGTTTTTTT TCCAGAAGGT-223 - 222 TAACCACTAT CAATATATTC ATGTCGAAAA TTTGTTTATC TAACGAGTAA GCAAGGCGGA -1. 63 - > Début de transcription - 162 TTGACGGATC ATCCGGGTCG CTATAAGGTA GGATGGTCTTAACC'T) GAA TCTTTACGGC-103 - 35-10 Ou2 Promoteur uspA Liaison FadR - 102 TGGGTTAGCC CCGCGCACGT AGTTCGCAGG ACGCGGGTGA GCTAACGGCA CAAGAAACGC-43 - 42 T JAGCTU, (IUCAGT ACTTTATGGA GGAGjTAACA GC ArG CCT TAT AAAj 12 Oui SD met ala tyr lys Liaison FadR Début UspA 1^1 Clivage SphI (GCATGJC) 13 3 CAC ATT CTC ATC GCG GTG GAC CTC TCC TAATAAUCTTUAGA his ile leu ile ala val asp leu ser Positionnement du Primer 6 (uspA) Clivage HindIII (A 1 AGCTT) B'-MCS des Plasmides pGFP (mut 3. 1, AAV, ASV, LVA) : Lac Z- > se-ATGACCATCATTACGCCAAGCTT GCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCTAGAAT'ltAAAHASH & N )'* ! ! ( !"-jgj ; jHindIII SphI BamHI - > GFP (AAV, ASV, LVA, mut3. 1) AAATTAAGCATGCGT-3' I Spahi 3'-MCS des Plasmides pGFP (AAV, ASV, LVA) : GFP (mut 3. 1, AAV, ASV. LVA) Stop 5'-TAAGCTTAATTAGCTGACCTACTAGTCGGCCGTACGGGCCC-3' Ili HindIII Figure Caractérisation de la fusion Promoteur uspA : : gfp (mut3. 1. ASV, AAV, LVA) Légende : Primer 1 uspA : 5'-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3' Primer 6 uspA : 5'-CTCTCAAGCTTATTAGGAGAGGTCGACCGCGATGAGAATGTGTTTATAAGGCATGCTGTTA-3' OuI et Ou2 : Fixation du dimère FadR SD : Shine-Dalgarno (fixation au ribosome) Références : Nystrm T. and Neidhardt F. C., 1992 Cloning, mapping and nucleotide sequencing of a gene encoding a universal stress protein in Escherichia coli. Molecular Microbiology (1992), 6, pg. 3187-3198 Farewell A., Diez Aj, Di Russo C. C. and Nystrom T.. 1996 Role of the Escherichia coli FadR Regulator in Stasis Survival and Growth Phase-Dependent Expression ofthe uspA, fad, and fab genes. JoumatofBactenobgy (] 996),) 78 (22). pg. 6443-6450 Van DykT. K, Smulski R, Reed T. R., Belkin S., Vollmer A. C. and LaRossa RA. 1995 Responses to Toxicants of an Escherichia coli Strain Canying a uspA' : : lux Genetic Fusion and an E. coli Strain Carrying a grpE' : : lux Fusion Are Similar. Applied and Environmental Mjcrobiology (1995). 61 (11). pg. 4124-4]27 REVENDICATIONS 1. - Procédé de préparation d'organismes utilisables dans un biocapteur permettant le suivi en temps réel de signatures spécifiques de stress ou de chimiotactisme, caractérisé en ce que ce procédé comporte une étape d'insertion, au sein d'une même souche bactérienne, de gènes rapporteurs codant pour des protéines fluorescentes décalées en longueur d'onde, au niveau des loci de gènes de stress ou de chimiotactisme, chaque locus donné étant porteur d'une seule association (gène de stress ou de chimiotactisme/gène de fluorescence). 2.-Procédé de préparation d'organismes utilisables dans un biocapteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que les gènes rapporteurs de fluorescence sont des gènes du type Green Fluorescent Protein (GFP). 3.-Procédé de préparation d'organismes utilisables dans un biocapteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que les gènes gfp sont des gènes mutés codant pour des protéines recombinantes émettant une lumière de longueur d'onde spécifique. 4.-Procédé de préparation d'organismes utilisables dans un biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte une étape d'insertion d'un gène codant pour une protéine bioluminescente, de manière à réaliser un biocapteur couplé de bioluminescence et de fluorescence associé. 5.-Procédé de préparation d'organismes utilisables dans un biocapteur selon la revendication 4, caractérisé en ce que le gène de bioluminescence inséré code pour la protéine Aequorine. 6.-Procédé de préparation d'organismes utilisables dans un biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de polyadénylation au niveau de la terminaison 3'de l'ARNm du gène de stress ou de chimiotactisme ou une étape de polyadénylation au niveau de la terminaison 3'de l'ARNm bicistronique codant pour la protéine de stress ou de chimiotactisme et pour la protéine GFP associée. 7.-Procédé de préparation d'organismes utilisables dans un biocapteur selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape de polyadénylation consiste en l'introduction de 5 à 15 bases Adénine consécutives permettant la dégradation rapide des ARN messagers au niveau des dégradosomes bactériens. 8.-Procédé de préparation d'organismes utilisables dans un biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte une étape d'adjonction de terminaisons polypeptidiques aux gènes codant pour la protéine de stress ou de chimiotactisme. 9.-Procédé de préparation d'organismes utilisables dans un biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'organisme utilisé est une bactérie d'espèce Escherichia Coli. 10.-Procédé de préparation d'organismes utilisables dans un biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le biocapteur est soumis à un apprentissage de type pavlovien si le signal physique ou la substance chimique à détecter sont de nature non stressante ou non inductrice d'une réponse chimiotactique, ledit apprentissage consistant à associer le signal physique ou la substance chimique non stressante à un signal physique ou à une substance chimique stressante ou inductrice d'une réponse chimiotactique pendant une durée convenable. 11.-Biocapteur utilisant des organismes modifiés par le procédé de l'une quelconque des revendications précédentes et permettant d'identifier et de quantifier par une mesure physique directe une substance chimique ou un signal physique ou inducteur d'une réponse chimiotactique.