Brevet FR2826869A1 — publié le 20030110

PRODUITS APTES A TRAITER LES CANCERS DE L'OVAIRE ET A EN PREVENIR LES RECHUTES. La présente invention est relative à des produits aptes à traiter les cancers de l'ovaire et à en prévenir les rechutes. Les cancers de l'ovaire représentent la première cause de mortalité par cancer gynécologique et se placent au quatrième rang des causes de décès par cancer chez la femme et leur incidence ne fait que progresser (de l'ordre de 4 % par an). La gravité de ces cancers est liée en particulier à leur découverte tardive et à leur capacité à développer une forte chimiorésistance au cours des cycles de chimiothérapie, ce qui fait que le taux de mortalité suite à ce cancer a peu évolué durant ces quinze dernières années. En France, le taux d'incidence du cancer de l'ovaire est estimé à 11,1/100. 000 et s'accroît avec l'âge. L'étiologie des cancers de l'ovaire est peu connue ; la majorité de ces cancers est due à une transformation maligne de l'épithélium ovarien (cancers épithéliaux). Ils présentent des propriétés particulières de croissance : ils peuvent se présenter à la fois sous forme de tumeurs solides envahissant l'ovaire, de sphéroïdes multicellulaires en suspension dans un liquide d'ascite dans la cavité péritonéale ou sous forme de nodules disséminés sur le péritoine. La dissémination se réalise également par voie lymphatique ou sanguine, provoquant l'apparition de métastases ganglionnaires, pulmonaires ou hépatiques. Leur thérapie usuelle associe la chirurgie et une chimiothérapie basée essentiellement sur les sels de platine, tels que le cisplatine (cis-dichlorodiamino-platine (II) ou CDDP) ou le carboplatine (diaminecyclobutane-dicarboxyloplatine ou CBDCA), analogue du cisplatine, dont l'équivalence de dose a été établie (rapport CBDCA/CDDP de 4). Les différentes polychimiothérapies utilisant l'un des dérivés du platine ont constitué un progrès majeur dans le traitement de ces tumeurs. Aussi bien le cisplatine que le carboplatine sont administrés à des doses allant, selon le produit et selon les cas, de 100 à 650 mg/m2 par mois, sous la forme de perfusions en 1 à 24 heures (Poulain et al., Int. J. Cancer, 1998,78, 454-463, M. Marone et al., Clin. Cancer Res., 1998,4, 517-524, J. R. Liu et al., Gynecol. Oncol., 1998,70, 398-403, J. K. Taylor et al., Oncogene, 1999,18, 4495-4504, et J. K. Taylor et al., Nature Biotechnol., 1999,17, 1097-1100). Dans les polychimiothérapies, les principaux médicaments actuellement utilisés sont outre les dérivés du platine, les agents alkylants, tels que le méphalan, le chlorambucil, le cyclophosphamide ou le thiotepa, les anthracyclines, telles que l'adriamycin ou les taxanes. Les associations de polychimiothérapie suivantes sont de préférence préconisées : CDDP 100 mg/m2-cyclophosphamide 600 mg/m paclitaxel-carboplatine, cisplatine-carboplatine ou cisplatine 100 mg/m-cyclophosphamide 300 mg/m2-carboplatine 300 mg/m. L'exérèse, aussi complète que possible, conditionne l'efficacité des traitements adjuvants. Elle est classiquement suivie de 4 à 6 cures de chimiothérapie, espacées de 28 jours, comprenant principalement, en association ou non, les produits précités et notamment des sels de platine, du cyclophosphamide et de l'adriamycine. La radiothérapie peut également intervenir, en particulier au niveau de zones massivement atteintes. Les carcinomes ovariens sont généralement sensibles à la chimiothérapie de première ligne mais paradoxalement la survie des patientes reste courte, du fait de l'acquisition de la chimiorésistance au cours des traitements, dans la très grande majorité des cas. Les mécanismes de résistance sont notamment décrit dans Poulain et al., 1998 (précité) ; ils concernent plus précisément : - l'altération de l'incorporation intracellulaire du CDDP, par diminution de l'incorporation intracellulaire de platine ou par élévation des taux intracellulaires de composés soufrés (glutathion, thiorédoxine), - les modifications des systèmes de réparation de l'ADN, - des altérations mitochondriales ou - des altérations dans l'expression de gènes impliqués dans le contrôle du cycle et/ou de la régulation de l'apoptose. En particulier, le rôle des gènes homologues de la famille Bel-2 dans le cycle cellulaire et le contrôle de l'apoptose est mis en avant pour expliquer une partie des mécanismes de chimiorésistance : . la surexpression de Bcl-2 est corrélée à la chimiorésistance de divers types de tumeurs, dont les cancers de l'ovaire. . la protéine Bcl-x, présente deux isoformes issues d'un épissage alternatif : Bcl-xL, qui a une fonction anti-apoptotique, similaire à celle de Bcl-2 et Bcl-xS (Brevet US 5,834, 309), qui a une fonction pro-apoptotique. . l'acquisition de la résistance au cisplatine, associée à la capacité des cellules traitées à progresser dans le cycle cellulaire au-delà de la phase G 1 : le défaut observé dans la régulation du cycle cellulaire pourrait intervenir au niveau de l'inhibiteur de cdk p21 CIPI/WAFI. En effet, le cisplatine exerce son effet cytotoxique en induisant une mort cellulaire par apoptose, résultant d'un dommage létal de l'ADN ; de plus, ce médicament interrompt la progression cellulaire et conduit ainsi à une accumulation des cellules dans des phases spécifiques du cycle, généralement avant l'apoptose. On observe un dysfonctionnement du métabolisme de la p53 nucléaire de l'inhibiteur de cdk p21 dans les cellules résistantes au cisplatine. Une diminution de la sensibilité à la chimiothérapie est liée à l'altération des taux de Bcl-2, Bax ou Bcl-x, qui interviennent dans le mécanisme de l'apoptose (M. Marone et al., Clin. Cancer Res., 1998,4, 517-524). Le gène Bcl-2 (pour B cells lymphomas) a été découvert grâce à son expression constitutive dans certains lymphomes folliculaires humains du fait d'une translocation t (14,18) (q32, q32) le plaçant à proximité du promoteur fort du gène des immunoglobulines. La protéine Bcl-2 protège la cellule contre l'apoptose induite par une large gamme de stimuli. Elle est exprimée dans la membrane externe mitochondriale, le réticulum endoplasmique, et l'enveloppe nucléaire. Les protéines de la famille Bcl-2 présentent une homologie de structure plus ou moins étendue, parfois même restreinte à deux domaines particuliers BH1 et BH2, impliqués dans la dimérisation de ces protéines, qui constitue un élément essentiel de la régulation de leur activité : ces protéines peuvent avoir des rôles opposés, puisque certaines interviennent dans l'induction de l'apoptose (Bax, Bcl-xS, Bad, Bak, Bik), alors que d'autres (Bcl-2, Bcl-xL, Mcll, Bfll, Al) sont impliquées dans sa répression. Leur homo-ou dimérisation permet un déplacement d'équilibre d'une situation de survie et de croissance cellulaire vers une induction de la mort cellulaire programmée (J. R. Liu et al., Gynecol. Oncol., 1998,70, 398-403 ; J. K. Taylor et al., Nature Biotechnol., 1999,17, 1097-1100). La résistance à l'apoptose, qui joue un rôle important dans les tumeurs qui sont réfractaires à une chimiothérapie, est régulée par le rapport protéines anti-apoptotiques/protéines pro-apoptotiques. J. K. Taylor et al., Nature Biotechnol., (précité), émettent l'hypothèse qu'en manipulant les taux de ces différentes protéines, les cellules peuvent devenir sensibles à l'apoptose, en réponse aux agents anti-tumoraux. Ils montrent en particu- lier qu'en modifiant le rapport Bcl-xL/Bcl-xS dans la cellule, en utilisant un oligo- nucléotide anti-sens, on peut obtenir une sensibilisation des cellules à l'apoptose. Compte tenu du fait qu'une surexpression de Bcl-xL est associée à une diminution de l'apoptose dans les tumeurs, à une résistance aux agents anticancéreux et à une évolution clinique défavorable, ils émettent l'hypothèse qu'une intervention pharmacologique qui diminue les taux de Bcl-xL et augmente les taux de Bcl-xS pourrait constituer une chimiothérapie alternative intéressante. Dans ce contexte, l'utilisation des membres de cette famille a été préconisée à des fins thérapeutiques. Il a été proposé, pour augmenter l'expression de Bcl-xS, d'inhiber l'utilisation du site d'épissage 5'dans l'exon II de l'ARN bcl-xl, de manière à rediriger la machinerie d'épissage, à l'aide d'oligonucléotides antisens (J. K. Taylor et al., Nature Biotechnol., 1999, précité) : des cellules A549 (lignées de cellules carcinomes de poumons humains), transfectées par de la lipofectine (contrôle), l'oligonucléotide ISIS 22783 (Brevet US 6,172, 216) en présence de lipofectine ou un oligonucléotide contrôle en présence de lipofectine montrent que 1 Le traitement des cellules avec l'oligonucléotide ISIS 22783, qui cible l'exon 1 du transcrit Bcl-xL et est capable de modifier le rapport Bcl-xS/Bcl-xL de 17 % à 293 % sans réduire la quantité d'ARN Bcl-x totale dans les cellules A549, entraîne une augmentation d'un facteur 2 de l'apoptose, après traitement avec du cisplatine. Toutefois, ce document J. K. Taylor et al. ne permet pas de conclure : . à l'effet de Bcl-xS ; en effet, il est notamment précisé dans cet article que compte tenu d'autres essais, dans lesquels on obtenait la même stimulation de l'apoptose, uniquement par diminution de la Bcl-xL, il semblerait que la diminu- tion du taux de Bcl-xL a un effet plus significatif sur l'induction de l'apoptose que l'augmentation de l'expression de Bcl-xS et . au rôle de Bcl-xS dans les tumeurs ovariennes ; en effet, aucune des cellules mises en oeuvre dans ce document ne provient de tumeurs ovariennes. D'autres traitements ont également été proposés : - J. S. Han et al., Springer Semin. Immunopathol., 1998,19, 279-288 préconisent d'utiliser un vecteur viral (adénovirus) exprimant le gène bel-xS, qui diffuse uniquement à des distances limitées dans les tumeurs solides et qui est un inhibiteur fonctionnel de Bcl-2 et de Bcl-xL. L'utilisation d'un tel vecteur est particulièrement recommandée, du fait de ses propriétés de faible diffusion, dans le traitement des cancers qui induisent une dissémination dans une cavité : vessie, cancer ovarien (cavité péritonéale). - A. P. Simoes-Wust et al., Int. J. cancer, 2000,87, 582-590 décrivent un traitement anti-sens bcl-xl pour induire l'apoptose dans les cancers du sein (carcinomes). L'oligonucléotide utilisé est le 2'-O-méthoxy-éthoxy nucléotide 4259 qui cible les nucléotides 687-706 de l'ARNm bel-xL, une séquence qui ne se retrouve pas dans le transcrit pro-apoptotique bcl-xS. Un tel oligonucléotide présente plusieurs avantages : il est spécifique de bcl-xl, les modifications aux extrémités 5'et 3'par des résidus 2'-MOE lui permettant de présenter une affinité significativement augmentée pour sa cible et une stabilité dans le sérum. Le traitement de cellules MCF7 avec cet oligonucléotide 4259 à une concentration de 600 nM pendant 20 heures diminue les taux d'ARNm bel-xi et de protéine correspondante de 80 % et de 50 %, respectivement. Ce type de traitement est préconisé exclusivement dans les cancers du sein, dans la mesure où l'expression de Bcl-2 et de Bcl-xL (membres anti-apoptotiques de la famille) est souvent augmentée dans les cancers primaires du sein. En ce qui concerne le protocole mis en oeuvre, il est précisé que l'oligonucléotide est administré sous la forme d'un complexe avec la lipofectine. - P. J. Beale et al., Br. J. Cancer, 2000,82, 2, 436-440Dans cet article, les Auteurs ont cherché à déterminer si les taux des protéines de la famille Bcl- 2 sont corrélés avec la sensibilité ou la résistance au traitement avec les dérivés du platine, dans des tumeurs ovariennes (carcinomes). Ils considèrent en particulier que : (1) la surexpression de la protéine Bcl-2 dans les tumeurs ovariennes confère une sensibilité au cisplatine, plutôt qu'une résistance ; (2) on n'observe aucune corrélation significative lorsque l'on compare la sensibilité au cisplatine in vitro aux taux de Bax, Bcl-xL ou Bak ; (3) l'introduction de Bax, dans des lignées résistantes au cisplatine ou de Bcl-xL dans des lignées sensibles n'entraîne pas de modifications significatives de la chimiosensibilité. D'autres traitements pour pallier le phénomène de chimiorésistance, préconisent de potentialiser la cytotoxicité du cisplatine et du carboplatine dans les cancers de l'ovaire, ce qui permet de récupérer une sensibilité au traitement : . par l'amphotéricine B (Poulain et al., Cancer Chemother. Pharma- col., 1997,40, 385-390) ; toutefois, l'association cisplatine-AmB est trop néphro- toxique pour une utilisation clinique, alors que l'association carboplatine-AmB ne présente pas une telle néphrotoxicité. D'autres modulateurs, tels que les méthylxanthines, sont préconisés, en association à l'AmB, pour atténuer la néphrotoxicité de l'association cisplatine-AmB ou . par le gène cipl-wafl (Lincet et al., Cancer Letters, 2000,161, 17- 26). Toutefois, les différents traitements préconisés dans l'art antérieur, pour les cancers de l'ovaire, ne permettent pas d'éviter la chimio-résistance observée ni d'éliminer les récidives ou rechutes à long terme. En conséquence, la Demanderesse s'est donnée pour but de pourvoir à un traitement plus adapté et qui réponde mieux aux besoins de la pratique que les traitements proposés dans l'art antérieur, notamment en ce qu'il évite les récidives ou rechutes à long terme. La présente invention a pour objet des produits contenant (1) un vecteur d'acide nucléique non viral comprenant au moins une polyéthylène imine (PEI) de poids moléculaire inférieur à 25 kDa, (2) une séquence d'acide nucléique comprenant le gène bcl-xS ou un fragment fonctionnel de celui-ci et (3) au moins un agent anti-tumoral actif sur le cancer de l'ovaire, comme préparation combinée pour une utilisation séquentielle dans le traitement des cancers de l'ovaire, la séquence d'acide nucléique associée audit vecteur d'acide nucléique non viral étant administrée après le composé anti-tumoral. Une telle combinaison séquentielle permet, de manière inattendue, de résoudre à la fois le problème de la chimiorésistance et le problème des récidives ou rechutes à long terme. Conformément à l'invention : - le vecteur non viral est de préférence sélectionné dans le groupe constitué par les PEI linéaires de poids moléculaire Des PEI linéaires utilisables comme vecteur non viral sont notamment décrites dans O. Boussif et al., (PNAS, 1995,92, 7297-7301), L. Poulain et al., (Cancer Gene Ther., 2000,7, 4,644-652), le Brevet américain 6,013, 240 au nom de Rhone-Poulenc Rorer, J. S. Rémy et al., (Adv. Drug Delivery Rev., 1998,30, 85-95), S. Ferrari et al., (Gene Ther, 1997,4, 1100-1106), D. Goula et al., (Gene Ther., 1998,5, 1291-1295), F. Labat-Moleur et al., (Gene Ther., 1996,3, 1010-1017). Des thio-dérivés de PEI d'environ 25 kDa, conjugués au peptide de liaison aux intégrines (PEI-RGD) sont décrits dans P. Erbacher et al., (Gene Ther., 1999,6, 138-145) ; des PEI galactosylées sont décrites dans M. A. Zanta et al., (Bioconjugate Chem., 1997,8, 839-844) ; et le couplage de ligands membranaires aux PEI est décrit dans R. Kircheis et al., (Gene Ther., 1997,4, 409-418) - l'agent anti-tumoral actif sur le cancer de l'ovaire est de préférence sélectionné dans le groupe constitué par les dérivés du platine, les taxanes, les inhibiteurs des topoisomérases 1 et 2 et les associations de ces différents produits ; lesdits agents anti-tumoraux sont éventuellement associés à d'autres agents anti-cancéreux et/ou à de l'amphotéricine B ou des dérivés de la caféine. Le plasmide Bc1-xS combiné avec l'agent antitumoral augmente de manière significative la mort des cellules cancéreuses de telle sorte que les rechutes ou récidives sont significativement diminuées. Lesdits produits sont avantageusement combinés dans le cadre d'une utilisation séquentielle dans le traitement des cancers de l'ovaire. En effet, l'ordre d'administration des produits est essentiel : la séquence nucléique vectorisée doit impérativement être administrée après le composé antitumoral. La combinaison d'une séquence d'acide nucléique vectorisée (Bcl- xS associée à une PEI, telle que définie ci-dessus) et d'au moins un agent anti- tumoral, administrés dans l'ordre indiqué, présente les avantages suivants : - potentialisation de l'activité de l'agent antitumoral, ce qui permet de diminuer les doses de l'agent antitumoral - élimination de l'effet de chimiorésistance à l'agent antitumoral et rétablissement d'un niveau de sensibilité des cellules à l'agent antitumoral, tout à fait satisfaisant et - élimination des récidives ou rechutes à long terme. De manière plus précise, la combinaison séquentielle agent antitumoral et notamment cisplatine puis gène bcl-xS vectorisé par un vecteur non viral à base de PEI de poids moléculaire inférieur ou égal à 25 kDa, permet de détruire un nombre suffisant de cellules tumorales par apoptose, pour éviter les récidives, ce que l'on ne peut obtenir avec le gène Bcl-xS seul, ni avec l'agent antitumoral seul. Les complexes PEI/ADN seront préférentiellement administrés par voie intra-péritonéale, bien que la voie intraveineuse reste possible. Les complexes sont préparés de préférence dans une solution de glucose 5 % en utilisant un rapport N/P de 5 comme détaillé dans Poulain et al., Cancer Gene Ther. ; 2000,7, 4,644-652. Trois injections à 12 heures d'intervalle sont préférentiellement envisagées. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1A illustre les modifications, induites par une exposition à 5 ptg/ml de CDDP, du cycle cellulaire des lignées cellulaires tumorales ovariennes sensibles IGROV1 et OAW42. - la figure 1B illustre le temps de récupération d'un état de prolifération normal des lignées cellulaires tumorales ovariennes sensibles IGROVI et OAW42, après une exposition à 5 ug/ml de CDDP. - la figure 2 est un histogramme présentant l'évolution de la réponse de la lignée cellulaire sensible IGROV1 dans le temps, après une exposition à 5 ig/ml de CDDP. - la figure 3A illustre les modifications, induites par une exposition à 5 tg/ml de CDDP, du cycle cellulaire des lignées cellulaires résistantes IGROVI-RIO et SKOV3. - la figure 3B illustre le temps de récupération d'un état de prolifération normal des lignées cellulaires IGROV1 et OAW42, IGROV1-R10 et SKOV3, après une exposition à 5 g/ml de CDDP. - la figure 4 illustre l'évolution de la réponse de la lignée cellulaire résistante SKOV3 dans le temps, après une exposition à 5 ug/ml de CDDP. - la figure 5 illustre les modifications, induites par une exposition à 20 g/ml de CDDP, du cycle cellulaire des lignées cellulaires sensibles IGROV1 et OAW42 (A) et des lignées cellulaires résistantes IGROVI-R10 et SKOV3 (B). - la figure 6A illustre l'expression basale de bcl-xL et bcl-xS dans les lignées cellulaires IGROVI (OVI) et OAW42 (OA) et les lignées cellulaires IGROV1-R10 (OVR) et SKOV3 (SK). - la figure 6B illustre la présence des protéines BCI-XL et Bcl-xs dans les lignées cellulaires IGROV1 (OVl) et OAW42 (OA) et les lignées cellulaires IGROV1-RlO (OVR) et SKOV3 (SK) évaluée par Western blot. - la figure 7A illustre l'expression de bcl-xL et bcl-xS dans le cytoplasme de cellules tumorales ovariennes mise en évidence par immunohistochimie. - la figure 7B illustre l'expression des protéines Bcl-xL et Bcl-xS dans des échantillons de tumeurs ovariennes, évaluées par Western blot. - la figure 8A illustre les modifications de l'expression de bcl-x dans les lignées cellulaires IGROV1, OAW42 et IGROV1-R10 et SKOV3,6h après une exposition à 5 et 20 ug/ml de CDDP. - la figure 8B illustre les modifications du taux des protéines Bcl-xL et Bcl-xS dans les lignées cellulaires IGROV1, OAW42 et IGROV1-R10 et SKOV3, 24h après une exposition à 5,20 et 100 fJ-g/mI de CDDP. - les figures 9 et 10 illustrent l'efficacité d'un protocole combinatoire alliant chimiothérapie (avec différentes concentrations de CDDP) puis transfert non viral de gène bcl-x pour surmonter la chimiorésistance des cancers de l'ovaire ; ces figures illustrent le nombre de cellules viables (ordonnées) après transfection des cellules SKOV3 avec un plasmide Bcl-xS, 24 h après exposition au CDDP 5/lg/ml. - la figure lIA illustre les résultats obtenus avec un protocole combinatoire dans lequel des cellules SKOV3 sont transfectées par bol-xi puis exposée à 5/lg/ml de CDDP, pendant 2 h. - la figure lIB illustre l'efficacité d'un protocole combinatoire dans lequel des cellules SKOV3 sont exposées à 5/lg/ml de CDDP pendant 2 h, puis transfectées par bc1-xS. - la figure 12 illustre les résultats obtenus avec un protocole dans lequel le transfert de gène précède de 24 h l'exposition au cisplatine (un effet protecteur peut être observé après exposition à 5/lg/ml de CDDP seul). Dans ce cas, la transfection de Bcl-xS n'augmente pas la cytotoxicité du CDDP et protège même les cellules vis-à-vis de cet agent. Ces résultats montrent bien l'importance de l'ordre d'administration des produits. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1 : Matériels et méthodes Lignées cellulaires Les lignées IGROVI (Bénard et al., Cancer Res., 1985,45, 4970- 4979), OAW42 (Wilson et al., J : A//. CcT., 1984, 72, 513-521) et SKOV3 (Fogh et al., A/. Cc-T., 1977, 59, 221-226) sont des lignées établies à partir d'adénocarcinome humain de l'ovaire. La lignée IGROV1-RIO, obtenue par traitements successifs de la lignée IGROV1 par des doses croissantes de cisplatine, présente une résistance au cisplatine 10 fois supérieure à celle de la lignée parentale (Poulain et al., Int. J. Cancer, 1998,78, 454-463), comme le démontrent les résultats du test XTT. Les lignées IGROV1 et SKOV3 sont cultivées dans du milieu RPMI 1640 (GIBCO-BRL) contenant 10% de sérum de veau foetal (GIBCO-BRL), 2 mM de L-glutamine (GIBCO-BRL), 33 mM de bicarbonate de sodium et 20 mM d'Hepes. La lignée OAW42 est cultivée dans du milieu DMEM (GIBCO-BRL) contenant 10 % de sérum de veau fcetal, 2 mM de L-glutamine (GIBCO-BRL), 1 mM de pyruvate de sodium et 20 UVI d'insuline bovine (GIBCO-BRL). Les cellules sont cultivées à 37 C dans une atmosphère humide, en présence de 5 % de C02 et divisées deux fois par semaine par trypsination. Les cellules IGROV1, d'aspect polygonal (caractéristique des cellules épithéliales), poussent en monocouche et sont capables, une fois la confluence atteinte, de former des dômes libérés dans le milieu et de réadhérer sur un nouveau support. Ces cellules sont tumorigènes chez la souris nude. La courbe de croissance de la lignée IGROV1 présente une phase de latence suivie d'une phase exponentielle avant d'atteindre un plateau après 6 jours de culture. En début de phase exponentielle la population de cellules en suspension représente 1/5 de la population totale alors qu'à la fin de cette phase elle représente 1/10 de la population totale. Le temps de doublement des cellules est de 27h. Les cellules OAW42 (Wilson et al., 1984, précité) présentent un aspect similaire à celui des cellules IGROV1, bien que de plus grande taille, mais ne présentent pas les mêmes caractéristiques de croissance. En effet, leur temps de doublement est de l'ordre de 40h, et la confluence provoque un arrêt de croissance et une dégénérescence progressive de la culture en absence de repiquage. La lignée SKOV3 est issue d'un adénocarcinome ovarien humain (Fogh et al., 1977, précité). Ces cellules, qui ne poussent qu'en monocouche et supportent difficilement la confluence, présentent un aspect fibroblastique. Leur courbe de croissance montre qu'elles ont un temps de doublement de 26 h. Traitement avec le cisplatine Le cisplatine [cis-diamino-dichloro-platine II (CDDP)] fourni par Roger-Bellon (CisplatyF) est dilué à 1 mg/ml dans de l'eau distillée stérile et conservé à-20 C. Les cellules en phase exponentielle de croissance sont traitées pendant 2 heures à 37 C avec différentes concentrations de CDDP dans du milieu sans sérum. Après traitement, les cellules sont rincées et incubées dans du milieu de culture. Test au XTT Les cellules sont ensemencées sur une plaque à 96 puits (104 cellules/puits) puis 2 jours plus tard, pendant la phase exponentielle de croissance, les cellules sont traitées avec des doses croissantes de CDDP. La cytotoxicité du cisplatine est mesurée par le test de coloration au XTT-PMS, qui mesure la viabilité cellulaire, 6 jours après l'exposition au CDDP, en utilisant le protocole décrit par Scudiero et al., Cancer Res., 1988,48, 4827-4833. RT-PCR 1 ig d'ARN total, extrait à l'aide du kit RNAeasy (QIAGEN) sont rétro-transcrits en ADNc, en présence de 200 UI de transcriptase inverse (Superscript II, GIBCO-BRL), en suivant les instructions du fabricant. L'ADNc obtenu est amplifié à l'aide des amorces 5'-CGCAGAAGGGGTCCTGGTGA-3'et 5'CAGCTCCTTCTTCTGCTCCGGGGT-3', comme décrit dans Maronne et al. précité. La réaction de PCR est réalisée en présence de 2 mM MgCl2, 250 mM dNTP, 10 pmoles de chacune des amorces et 5 UI de Taq polymérase (EUROBIO) dans les conditions suivantes : dénaturation à 94 C pendant 40 sec, hybridation à 58 C pendant 60 sec et extension à 72 C pendant 40 sec (30 cycles), à l'aide d'un thermocycleur AmplitronR (BIOBLOCK). Après électrophorèse des produits obtenus en gel d'agarose à 2 %, deux fragments distincts, correspondant respectivement à Bcl-xS et Bcl-xL sont observés. Le fragment correspondant à la forme longue est beaucoup plus abondant que celui correspondant à la forme courte. Immunoblotting Après 6 heures de traitement avec le CDDP, les cellules ou les broyats de tumeurs congelées sont lysés pendant 30 min sur de la glace, dans un tampon contenant 150 mM NaCI, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 % Triton X-100,4 mM PMSF, 2 mM aprotinine et 5 mM EDTA. Les lysats sont clarifiés par centrifugation à 10000 g pendant 15 min à 4 C et la concentration en protéine est mesurée par le test de Bradford (BIO-RAD). Une fraction d'extrait cellulaire (100 ig de protéines) est séparée par électrophorèse en gel de 10% polyacrylamide-SDS, transférée sur une membrane de nitrocellulose par électrotransfert, 30 minutes à 500 mA dans du Trisglycine-méthanol (Hybond, AMERSHAM). La membrane est incubée toute la nuit à 4 C dans un tampon T-TBS (132 mM NaCI, 20 mM Tris-cl pH 7,6 et 0,1 % Tween 20) contenant 5 % de poudre de lait écrémé. La membrane est incubée, l h à température ambiante, avec l'anticorps primaire (anti-Bcl-x, L/S 651186 E, PHARMINGEN) dilué au 1/1000 dans le tampon T-TBS contenant 5 % de poudre de lait écrémé. Après 3 lavages avec le tampon T-TBS, la membrane est incubée, 1 h à température ambiante, avec l'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase (anticorps NA 934, AMERSHAM) dilué au 1/5000 dans le même tampon que l'anticorps primaire. Après, 4 lavages avec le tampon T-TBS et un lavage à l'eau, l'immuno- réaction est révélée par chimioluminescence (kit ECL, AMERSHAM). Des marqueurs colorés de faible poids moléculaire (BIORAD) servent de référence. Immunohistochimie Une fois les coupes de 4 am réalisées dans les blocs de paraffine, elles sont étalées sur lames polysilanisées de façon à favoriser l'adhérence du tissu sur la lame lors des différentes étapes qui suivent. Les lames peuvent être stockées entre deux papiers cartonnés à l'abri de l'air et de la lumière jusqu'à utilisation. Les lames sont ensuite déparaffinées par passages successifs de 5 minutes dans 3 bains de toluène, puis dans des bains d'alcool à 100 (x2), 95 , 70 et 50 . Elles sont ensuite incubées dans un bain de TBS-H202 1 % durant 10 min, avant de subir 3 passages de 4'15"au micro-onde 750W dans du tampon citrate 10mMpH6. Après blocage de l'activité peroxydase endogène par incubation dans une solution de peroxyde d'hydrogène à 1 % dans du PBS, les coupes sont transférées dans du tampon PBS. Après une pré-incubation de 20 min dans du tampon TBS contenant 20 % de sérum de chèvre, les lames sont incubées, 1 h à température ambiante, avec l'anticorps primaire anti-Bcl-x (anticorps S18, SANTA-CRUZ) dilué au 1/500 dans du tampon PBS contenant 0,5 % de sérum albumine bovine (BSA). Après des lavages extensifs, les complexes immuns sont amplifiés à l'aide du kit HRP duet (DAKO), en suivant les instructions du fabricant. Enfin, l'activité immunoperoxydase est révélée par incubation, 5 min à température ambiante, dans une solution de DAB (10 mg/ml, SIGMA) dans un tampon 50 mM Tris-HCI, pH 7,6, 0,03 % H202. Les lames sont rapidement contre-colorées à l'hématoxyline. Protocole de transfection du plasmide La transfection est effectuée comme décrit dans Poulain et al., Cancer Gene Ther., 2000, 7, 4, 644-652. Exemple 2 : Efficacité de la chimiothérapie sur des lignées cellulaires tumorales ovariennes (IGROV1, OAW42). Les cellules tumorales ovariennes IGROVI et OAW42 décrites à l'exemple 1 sont exposées 2 h à différentes concentrations de CDDP. Les modifications de leur cycle cellulaire et le temps de récupération d'un état de prolifération normal sont observés. On constate l'élongation de la phase S et l'accumulation des cellules dans les phases G2-M (figure 1A). Les principales différences concernent l'induction de l'apoptose et la survie à long terme des cellules traitées. Alors que les cellules hautement sensibles (OAW42) sont accumulées en phase S et entrent massivement en apoptose dès 48 h après l'exposition à 5 j-t-g/ml de CDDP, les cellules moins sensibles (IGROV1) n'entrent pas en apoptose avant 72 h à 96 h après l'exposition à 5 u. g/ml de CDDP. Cependant, dans les deux cas, la quasi-totalité des cellules meurt après 4 jours ; un très faible nombre de cellules sont alors maintenues dans un état quiescent pour plusieurs semaines, avant de récupérer un modèle de croissance normal et la régénération d'une population apte à proliférer. Le délai avant de récupérer un état de prolifération est de 2 à 4 semaines pour les cellules IGROV1 et est de 8 semaines pour les cellules OAW42 (figure 1B). Après 4 semaines, l'effet de l'exposition à 5) g/ml de CDDP n'est plus visible sur les histogrammes des cellules IGROV1 (figure 2). Quand les cellules sensibles sont exposées à 20 p. g/ml de CDDP, un fort blocage en phase GO-G 1 est observé et les cellules entrent massivement en apop- tose après 24 h à 48 h (figure 5A). Dans cette situation, aucune récidive n'intervient, la population tumorale ovarienne est totalement éliminée. Exemple 3 : Chimiorésistance de lignées cellulaires tumorales ovariennes (SKOV3, IGROV1-R10) Les cellules tumorales ovariennes SKOV3 et IGROV1-R10 décrites à l'exemple sont exposées 2 h à différentes concentrations de CDDP. Les modifications de leur cycle cellulaire et le temps de récupération d'un état de prolifération normal sont observés. On constate un ralentissement de la progression du cycle cellulaire, l'accumulation des cellules en phase G2-M et l'induction de l'apoptose (figure 3A). Chaque événement semble intervenir d'une façon très accélérée en comparaison des cellules sensibles. Ainsi, malgré une mort cellulaire massive, le délai avant la réapparition de cellules aptes à proliférer est quasi éliminé, et la réapparition intervient entre environ 5 et 7 jours pour les cellules SKOV3, et entre 8 et 12 jours pour les cellules IGROV1-RIO (figure 3B). Après ce temps, les histogrammes ne présentent plus de trace d'exposition à S llg/ml de CDDP (figure 4). Quand les cellules tumorales ovariennes résistantes sont exposées à 20/lglml de CDDP, elles sont capables de progresser dans le cycle cellulaire (figure 5B). Les cellules IGROV1-R10 s'accumulent en phase G2-M, ce qui n'est pas le cas des cellules SKOV3. La plupart des cellules subissent alors une apoptose après 48 h, mais une faible population d'entre elles restent capables de ré-engager un nouveau cycle cellulaire et de re-coloniser un flacon de culture en environ 4 à 5 semaines. Exemple 4 : Expression basale de bcl-x dans les lignées tumorales ovariennes. Par RT-PCR, l'ARNm de bcl-x a été mis en évidence dans toutes les lignées cellulaires étudiées, mais seulement sous sa forme longue (forme L) (figure 6A). Une analyse par Western blot démontre en effet que 2 à 3 bandes d'environ 30 kDa, correspondant à la protéine Bcl-xL, sont présentes dans toutes les lignées cellulaires étudiées, alors que la protéine Bcl-xS reste indétectable (figure 6B). Le niveau de la protéine Bcl-xL est assez similaire dans les lignées cellulaires IGROV1, IGROV1-R10 et SKOV3, mais est visiblement inférieur dans la lignée cellulaire OAW42. L'expression de Bcl-x a été également évaluée par histochimie sur un panel de 60 spécimens de tumeurs ovariennes. 90% d'entre elles expriment Bcl-x dans le cytoplasme des cellules tumorales (figure 7A). Le Western blot réalisé sur ces échantillons n'a mis en évidence que la forme longue de la protéine, Bcl-xL (figure 7B). Exemple 5 : Modifications de l'expression de bcl-x après une exposition au cispla- tine des différentes lignées cellulaires tumorales ovariennes sensibles et résis- tantes. Les cellules sont exposées 2 h à différentes concentrations de CDDP puis les modifications d'expression de l'ARNm de bcl-x sont étudiées. En réponse à une exposition à 20 g/ml de CDDP, le niveau d'ARNm est diminué dès 6 h après exposition au CDDP dans les lignées cellulaires OAW42 et IGROV1, alors qu'il est maintenu à un niveau élevé dans les lignées cellulaires SKOV3 et IGROV1-R10 (figure 8A). Les mêmes résultats ont été observés au niveau de la protéine 24 h après l'exposition (figure 8B). En réponse à une exposition à 5 ptg/ml de CDDP, le niveau de l'ARNm de bcl-x et le niveau de protéine restent stables dans les lignées cellulaires IGROV1, IGROVI-RIO et SKOV3,6 h et 24 h, respectivement, après l'exposition. Dans le cas de la lignée cellulaire OAW42, le niveau d'ARNm reste stable 6 h après exposition mais le niveau de protéine est largement réduit 24 h après exposition. Exemple 6 : Niveau d'expression de Bcl-x et sensibilité au CDDP. Le niveau d'expression de la protéine Bcl-x est similaire dans les cellules IGROV1, IGROVI-RIO et SKOV3, mais sensiblement inférieur dans les cellules OAW42, ces dernières étant également les plus sensibles au CDDP (cf exemple 1, figure 5A). Aussi, ont été étudiées les modifications d'expression de Bcl-x, en réponse au CDDP dans les différentes lignées cellulaire tumorales ovariennes. Le CDDP est capable d'induire une répression de l'expression de Bcl-x dans les lignées cellulaires sensibles (IGROV1, OAW42) mais pas dans les lignées cellulaires résistantes (IGROVI-RIO, SKOV3). Néanmoins cette répression peut être observée seulement dans des conditions où une apoptose massive et précoce est observée : IGROV1 exposées à 20 J. g/ml de CDDP et OAW42 exposée à 5 ou 20 jn. g/ml de CDDP et dans lesquelles aucune récidive n'est observable. La corrélation entre les variations de l'ARN de bcl-x et le niveau de protéine après une exposition au CDDP suggère que le niveau de protéine est principalement contrôlé au niveau de l'ARN. Exemple 7 : Efficacité in vitro de la combinaison d'un agent antitumoral (CDDP) et du transfert non viral d'un gène impliqué dans l'induction de l'apoptose (belx) pour surmonter la chimiorésistance des cancers de l'ovaire. A. Exposition à l'agent antitumoral après transfection (figure 11A). Dans ce sens, le protocole combinatoire n'est pas efficace. B. Transfection après exposition à l'agent antitumoral. Des cellules tumorales ovariennes SKOV3 (figures 9,10 et 11B), résistantes au CDDP, sont exposées 2 heures à différentes concentrations de CDDP. Environ 24 h après cette exposition, les cellules sont transfectées par le vecteur non viral PEI (22kDa) porteur du gène bcl-xS. La viabilité des cellules exposées à ce protocole combinatoire est alors observée au cours du temps par comparaison avec des cellules n'ayant subi aucun traitement, des cellules exposées au CDDP ou des cellules transfectées. Les résultats sont présentés dans les figures 9 et 10 ci-dessous. Les cellules exposées à 5 p-g/ml de CDDP ou transfectées ont une viabilité réduite par rapport au témoin 72 h après le début du traitement mais récupèrent progressivement un état de prolifération normal entre 72 h et 168 h. Les cellules subissant le protocole combinatoire présentent une viabilité largement réduite 72 h après l'exposition à 5 fg/ml de CDDP par rapport aux autres cellules exposées au CDDP seul ou seulement transfectées ; cette viabilité réduite persiste jusqu'à 168 h. Les cellules exposées à 20 tg/ml de CDDP ou transfectées par bcl-x après une exposition à 20 ug/ml de CDDP ont une viabilité largement réduite 72 h après le traitement et cet effet persiste jusqu'à 168 h après le traitement. Cependant, le protocole combinatoire permet d'anéantir totalement la population et, contrairement à la seule exposition à 20 Ilglml de CDDP, aucune récidive n'est possible, les cellules étant dans un état incapable d'évoluer vers la prolifération. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATONS 1 ) Produits contenant (1) un vecteur d'acide nucléique non viral comprenant au moins une polyéthylène imine (PEI) de poids moléculaire inférieur à 25 kDa, (2) une séquence d'acide nucléique comprenant le gène bcl-xS ou un fragment fonctionnel de celui-ci et (3) au moins un agent anti-tumoral actif sur le cancer de l'ovaire, comme préparation combinée pour une utilisation séquentielle dans le traitement des cancers de l'ovaire, la séquence d'acide nucléique associée audit vecteur d'acide nucléique non viral étant administrée après le composé anti-tumoral. 2 ) Produits selon la revendication 1, caractérisés en ce que le vecteur non viral est de préférence sélectionné dans le groupe constitué par les PEI linéaire 3 ) Produits selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que lesdites PEI sont associées à du polyéthylène glycol (PEG) ou de l'acide folique. 4 ) Produits selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce que l'agent anti-tumoral actif sur le cancer de l'ovaire est de préférence sélectionné dans le groupe constitué par les dérivés du platine, les taxanes, les inhibiteurs des topoisomérases 1 et 2 et les associations de ces différents produits. 5 ) Produits selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que lesdits agents anti-tumoraux sont associés à d'autres agents anticancéreux et/ou à de l'amphotéricine B ou des dérivés de la caféine.