Brevet FR2828691A1 — publié le 20030221

La présente invention concerne un procédé pour exprimer un récepteur membranaire fonctionnel au moyen d'un baculovirus bourgeonnant, plus précisément un procédé pour exprimer un récepteur membranaire fonctionnel où une protéine interagissante et un récepteur membranaire sont co-exprimés dans un baculovirus bourgeonnant libéré par un hôte, un baculovirus bourgeonnant correspondant, un procédé pour analyser une interaction entre un récepteur membranaire et un ligand dans un tel baculovirus bourgeonnant, un procédé pour sélectionner une substance qui favorise ou inhibe une interaction entre un récepteur membranaire et un ligand dans un baculovirus bourgeonnant et une substance ainsi sélectionnée. Un système d'expression de baculovirus permet un haut niveau d'expression d'un gène d'intérêt par recombinaison du gène dans des cellules Sf9 au moyen d'un promoteur d'un gène de polyédrine de baculovirus. Une polyédrine est exprimée dans le noyau des cellules Sf9 à un haut niveau sous forme de corps d'inclusion qui constitue la forme des virus à l'état latent dans la cellule. Un système d'expression de baculovirus dans lequel un gène recombiné est introduit dans un virus à polyédrine et les protéines exprimées sont purifiées présente de nombreux avantages par rapport aux systèmes constitués par Escherichia coli ou la levure, car les protéines exprimées qui comportent de nombreuses régions hydrophobes comme les protéines membranaires s'agglomèrent relativement difficilement et les protéines exprimées subissent une modification post-transcriptionnelle qui est nécessaire pour leurs fonctions, comme l'addition de chaînes glucidiques et la coordination d'ions métalliques, si bien que le système d'expression de baculovirus est souvent utilisé comme système d'expression de récepteurs membranaires (Tate CG, Grisshammer R., Trends in Biotechnology 1996,14, p. 426-430, Heterologous expression of G protein-coupled receptors ; et Grisshammer R, Tate CG, Quarterly Reviews of Biophysics 1995,28, p. 315-422, Overexpresssion of intégral membrane proteins for structural studies). Le baculovirus a un autre cycle vital en plus de celui au cours duquel le baculovirus est un virus à polyédrine recouvert de polyédrine et présent dans le noyau. Pour proliférer et réaliser une infection, le baculovirus devient un virus bourgeonnant qui rompt la membrane des cellules Sf9 et qui est libéré à l'extérieur de la cellule. Loisel et al. ont décrit l'expression dans le virus à polyédrine ci-dessus d'un récepteur à sept passages membranaires recombiné sur la membrane cellulaire et son obtention à partir de l'enveloppe du baculovirus bourgeonnant (Loisel TP, Ansanay H, St-Onge S, Gay B, Boulanger P, Strosberg AD, Marullo S, Bouvier M., Nat. Biotechnol. novembre 1997 ; 15(12) : 1300-4., Recovery of homogeneous and functional beta 2-adrenergic receptors from extracellular baculovirus particles). Il a été indiqué également que, tandis que la plupart des récepteurs à sept passages membranaires exprimés dans une cellule hôte comportent une structure à chaîne glucidique qui n'est pas fonctionnelle, seuls les récepteurs fonctionnels sont récupérés à partir de l'enveloppe virale. Il a été décrit aussi qu'un groupe de protéines qui sont présentes dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE) ou dans la membrane de l'appareil de Golgi et qui sont impliquées dans la régulation intracellulaire du cholestérol par rétroaction, comme SREBP 2 (protéine liant des éléments régulateurs de stérols), la HMG-CoA (hydroxyméthylglytaryle coenzyme A) réductase, SCAP (protéine activant le clivage de SREBP), S1P (protéase de site 1) sont exprimées sur l'enveloppe virale en conservant leurs fonctions (Ishihara, G., Shirai, H., Yamaguchi, M., Fukuda, R., Hamakubo, T., et Kodama, T., Atherosclerosis, 151, p. 290,2000, Expression of cholestérol regulatory proteins on extracellular baculoviruses). Par ailleurs, les récepteurs couplés à des protéines G (GPCR) sont importants comme cible pour le développement de médicaments, et environ 700 récepteurs sont décrits dans des bases de données génomiques (Venter JG, Adams MD, Myers EW, et al., Science 291, p. 1304-1351,2001, The séquence of the human genome). Le mécanisme de la transduction de signaux hormonaux a également été étudié (Tate CG, Grisshammer R., Trends in Biotechnology 1996, p. 426-430, Heterologous expression of G protein-coupled receptors). Un GPCR a sept domaines transmembranaires et est couplé à une protéine G hétérotrimérique. Le type de sous-unité a d'une protéine G qui est liée (couplée) lors de la fixation d'un ligand au récepteur dépend du type de récepteur. Par exemple, dans le cas du récepteur de leucotriène B4, il s'agit d'une protéine G de classe Gi ou Gq (Igarashi T., Yokomizo T., Tsutsumi 0., Taketani Y., Shimizu T. et Izumi T., Eur. J. Biochem., 259, p. 419-425,1999, Characterization of the leukotriene B4 receptor in porcine leukocytes séparation and reconstitution with heterotrimeric GTPbinding proteins). On sait que, dans le cas du récepteur d'adrénaline, une protéine G de type Gs est couplée. Selon Loisel et al., la protéine Gs de cellules Sf9 est exprimée et couplée pour former un complexe sur un virus bourgeonnant (Loisel TP., Ansanay H., St-Onge S., Gay B., Boulanger P., Strosberg AD., Marullo S., Bouvier M., Nat Biotechnol. 1997, novembre 15 (12), p. 1300-1304, Recovery of homogeneous and functional beta 2adrenergic receptors from extracellular baculovirus particles). Différentes isoformes de protéines G sont exprimées dans des cellules Sf9 de même que dans des cellules de mammifères, mais en des quantités qui diffèrent en fonction du type de protéine G (Leopoldt D., Harteneck C., Nurnberg R., Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol, 356, p.216-224, 1997, G Proteins endogenously expressed in Sf9 cells : interactions with mammalian histamine receptors). Comme la protéine Gs est présente de manière relativement abondante dans les cellules Sf9, le récepteur d'adrénaline exprimé dans le virus peut être couplé avec la protéine Gs issue de cellules d'insectes de sorte qu'un récepteur membranaire fonctionnel est exprimé dans le système de Loisel et al. Cependant, dans le cas d'un récepteur comme le récepteur de leucotriène B4 qui est couplé à une autre isoforme de Ga comme Gi, qui est relativement rare dans les cellules Sf9, il est difficile d'obtenir un récepteur fonctionnel à haute affinité, s'il est exprimé. La présente invention a pour but de résoudre les problèmes évoqués précédemment en développant une technique pour exprimer un récepteur membranaire fonctionnel au moyen d'un baculovirus et d'un système d'expression de cellules d'insectes. Ce but est atteint grâce à la préparation d'un virus qui exprime un récepteur et des sous-unités de protéine G et à la reconstitution de la protéine sur un virus bourgeonnant, pour obtenir un récepteur à haute affinité. En effet, dans le cas d'une protéine G comme Gi qui est rare dans les cellules Sf9, en infectant des cellules d'insectes avec un virus contenant des gènes de chacune des sous-unités a, ss, et y et avec un virus recombiné exprimant le récepteur, le récepteur exprimé peut former un complexe avec une protéine G hétérotrimérique qui est intégrée dans le virus bourgeonnant et peut avoir une activité de liaison à haute affinité. Il existe un problème du fait que, comme un récepteur à faible affinité est exprimé en abondance dans la fraction membranaire de cellules Sf9 qui expriment un complexe de récepteur et de protéine G par co-infection, il est difficile de mesurer seulement l'activité d'un récepteur à haute affinité. Cependant, on a constaté de manière inattendue qu'il est possible de mesurer l'activité de liaison à haute affinité en utilisant un complexe de récepteur et de protéine G qui est exprimé sur un baculovirus bourgeonnant. Ainsi, la présente invention concerne un procédé pour exprimer un récepteur membranaire fonctionnel qui comprend les étapes de culture d'un hôte infecté avec au moins un type de baculovirus recombiné qui contient un gène codant une protéine interagissante et un gène codant un récepteur membranaire qui interagit avec ladite protéine interagissante pour remplir sa fonction, et de co-expression de ladite protéine interagissante et dudit récepteur membranaire dans un baculovirus bourgeonnant libéré par ledit hôte. De préférence, on cultive un hôte infecté avec au moins un type de baculovirus recombiné qui contient un gène codant une protéine interagissante et au moins un type de baculovirus recombiné qui contient un gène codant un récepteur membranaire qui interagit avec ladite protéine interagissante pour remplir sa fonction, et ladite protéine interagissante et ledit récepteur membranaire sont co-exprimés dans un baculovirus bourgeonnant libéré par ledit hôte. La présente invention concerne aussi un procédé pour préparer un récepteur membranaire physiologiquement actif qui comprend les étapes de culture d'un hôte infecté avec au moins un type de baculovirus recombiné qui contient un gène codant une protéine interagissante et un gène codant un récepteur membranaire qui interagit avec ladite protéine interagissante pour remplir sa fonction, et de récupération d'un baculovirus bourgeonnant libéré par ledit hôte. De préférence, on cultive un hôte infecté avec au moins un type de baculovirus recombiné qui contient un gène codant une protéine interagissante et au moins un type de baculovirus recombiné qui contient un gène codant un récepteur membranaire qui interagit avec ladite protéine interagissante pour remplir sa fonction, et on recueille un baculovirus bourgeonnant libéré par ledit hôte. De préférence, la protéine interagissante est une protéine couplée. De manière particulièrement préférable, la protéine interagissante est une protéine G, et le récepteur membranaire est un récepteur couplé à une protéine G. De préférence, l'hôte est une cellule d'insecte ou une larve d'insecte. La présente invention concerne également un baculovirus bourgeonnant qui est libéré par un hôte infecté avec au moins un type de baculovirus recombiné qui contient un gène codant une protéine interagissante et un gène codant à un récepteur membranaire qui interagit avec ladite protéine interagissante pour remplir sa fonction. De préférence, la protéine interagissante est une protéine couplée. De manière particulièrement préférable, la protéine interagissante est une protéine G et le récepteur membranaire est un récepteur membranaire couplé à une protéine G. De préférence, l'hôte est une cellule d'insecte ou une larve d'insecte. La présente invention concerne également un procédé pour analyser une interaction entre un récepteur membranaire dans un baculovirus bourgeonnant et un ligand, au moyen d'un baculovirus bourgeonnant du type évoqué ci-dessus. La présente invention concerne également un procédé pour sélectionner une substance qui favorise ou inhibe une interaction entre un récepteur membranaire dans un baculovirus bourgeonnant et un ligand, où une interaction entre un récepteur membranaire dans le baculovirus bourgeonnant et un ligand est analysée en présence d'une substance test au moyen du baculovirus bourgeonnant évoqué ci-dessus. Enfin, la présente invention concerne aussi une substance qui favorise ou inhibe une interaction entre un récepteur membrane et un ligand, qui est obtenue au moyen du procédé de sélection ci-dessus. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui suit et se réfère aux dessins annexés, dans lesquels : la figure 1 montre le résultat d'une analyse ELISA utilisant un antisérum anti-BLTl dans la fraction VB ; la figure 2 montre le résultat d'une analyse ELISA utilisant un anticorps anti-histamine dans la fraction VB ; la figure 3 montre l'évolution au cours du temps de l'expression de BLT1 (ELISA avec un antisérum anti-BLTl) ; la figure 4 montre une comparaison de la quantité de BLT1 exprimée (ELISA avec anticorps anti-BLTl) ; la figure 5 montre une comparaison des activités de liaison du récepteur de leucotriène B4 (LTB4) ; la figure 6 montre l'expression de BLT1 sur un virus bourgeonnant dans le cas d'une co-infection avec différents virus recombinés exprimant des sous-unités de protéine G (ELISA avec antisérum anti-BLTl) ; la figure 7 montre la liaison de [3H] LTB4 à des fractions VB dans le cas d'une co-infection avec des virus recombinés exprimant HisBLT1 et différentes sous-unités de protéine G ; etla figure 8 montre l'activité de liaison de [3H] LTB4 dans un virus bourgeonnant qui co-exprime BLT-1 et différentes protéines G. Le procédé pour exprimer un récepteur membranaire fonctionnel selon la présente invention est caractérisé en ce qu'un hôte infecté avec au moins un type de baculovirus recombiné qui contient un gène codant une protéine interagissante et un gène codant un récepteur membranaire qui interagit avec ladite protéine interagissante pour remplir sa fonction est cultivé et ladite protéine interagissante et ledit récepteur membranaire sont co-exprimés dans un baculovirus bourgeonnant libéré par ledit hôte. Dans la présente invention, deux types de protéines sont co-exprimés ainsi qu'on l'a mentionné ci-dessus. Les gènes codant chacun de ces deux types de protéines peuvent être contenus dans le même baculovirus recombiné ou dans des baculovirus différents. Selon la présente invention, il est possible de préparer un récepteur membranaire ayant une activité physiologique en cultivant un hôte infecté avec un baculovirus recombiné contenant des gènes codant ces deux types de protéines et en recueillant un baculovirus bourgeonnant libéré par l'hôte. Le terme "lié à la membrane" dans le présent contexte se rapporte au sens large à une protéine présente sur une membrane cellulaire ou sur la membrane plasmique d'organelles intracellulaires comme le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi. Le terme "récepteur" désigne au sens large une protéine pouvant interagir avec un ligand. De préférence, une telle protéine est capable de transmettre à l'intérieur d'une cellule les informations résultant de cette interaction avec un ligand. Les récepteurs membranaires comprennent les récepteurs à sept passages membranaires pour des hormones, des substances odorantes, des substances gustatives, des photons et analogues, les récepteurs de LDL, les récepteurs piégeurs, les récepteurs à un passage membranaire pour les hormones de croissance, l'insuline, le TNFa, l'acide glutamique et analogues, les récepteurs à canaux ioniques comme GABA, l'acétylcholine et la ryanodine, les récepteurs de cellules T et les récepteurs de Fc. Ces protéines peuvent former un complexe. Parmi ces protéines, le récepteur membranaire utilisé dans la présente invention est une protéine dont la fonction consiste à interagir avec une protéine interagissante. Les combinaisons de récepteur membranaire et de protéine interagissante ne sont pas limitées spécifiquement. Il peut s'agir par exemple d'une combinaison d'un récepteur couplé à une protéine G et d'une protéine G, d'une combinaison d'un récepteur de cellule T (chaînes a, ss, y, 8)/complexes CD3 (chaînes y, 8, e, ) et d'une thyrosine kinase de la famille Src, comme la protéine Fyn, d'une combinaison d'un récepteur de cellule B et d'une thyrosine kinase de la famille Src comme les protéines Lyn, Syk, blk et Ick, et d'une combinaison d'un récepteur de Fcy ou d'un récepteur de Fc# et d'une thyrosine kinase de la famille Src comme les protéines Syk, Csk et Lyn. L'interaction de récepteurs couplés à des protéines G peut être par exemple le couplage de protéines G trimériques avec des récepteurs, l'interaction de récepteurs d'adrénaline ss2 avec la p-arrestine ou la kinase de récepteur couplé à une protéine G (GRK), l'interaction de récepteurs de glutamate métabotropes (mglu) avec des protéines Homer, et l'interaction de récepteurs d'adrénaline ss2 avec des facteurs d'échange de Na+, H+ (Heuss, C. et Gerber, U. G-protein-independent Signaling by G-proteincoupled Receptors. Trends Neurosci. (2000) 23, 469-475). D'autres exemples d'interactions de récepteurs couplés à des protéines G comprennent l'interaction de protéines G ou de leurs récepteurs de couplage avec un groupe de protéines (Hepler, J. R. Emerging Roles for RGS Proteins in Cell Signalling. TiPS (1999) 20,376- 382) qui ont un domaine RGS qui réalise un couplage avec des sous-unités Ga appelées protéines RGS (régulateurs de signaux des protéines G), comme la liaison de récepteurs de glutamate métabotropes (mglu) avec RGS4, et la liaison de récepteurs d'interleukine 8B avec RGS12. Les protéines G peuvent être par exemple des protéines G trimériques. Les sous-unités a des protéines G comprennent celles de la classe Gs, comme Gsa et Golfa, celles de la classe Gi comme Gil[alpha], Gi2a, Gi3a, G01[alpha], G02a, Gt1[alpha], Gt2a et Ggusta, de la classe Gq comme Gqa, Glla, G14a, G15[alpha] et G16a, et de la classe G12 comme G12[alpha] et G13a. Des exemples de sous-unités p et y qui forment des trimères avec ces sous-unités a comprennent les sous-unités ss1 à ss5 et ylàyll, respectivement. On donne dans la suite des exemples de récepteurs couplés à des protéines G en indiquant entre parenthèses leurs ligands respectifs : (1) Des exemples de récepteurs couplés à des protéines G analogues au récepteur de rhodopsine/p-adrénaline comprennent BLT1 (leucotriène B4), ETA et ETB (endosérine), AT1 (angiotensine), EDG (sphingosine phosphate), CCR et CXCR (chimiokine), [alpha]1, [alpha]2, ss1, ss2 et ss3 (norépinéphrine), M1, M2 et M3 (acétylcholine), 5-HT1A (sérotonine), NK-1 (substance P), Yi (neuropeptide Y), Bi et B2 (bradyquinine), VIA (vasopressine), CB1 et CB2 (anandamide), Dl, D2 et D3 (dopamine), les récepteurs des substances odorantes, MT1, MT2 et MT3 (mélatonine) et les photorécepteurs. (2) Des exemples de récepteurs couplés à des protéines G analogues au récepteur de glucagon/VIP (peptide intestinal vasoactif)/calcitonine comprennent les récepteurs de calcitonine (calcitonine), VIP1, VIP2 (peptide intestinal vasoactif), CRF1 (facteur libérant de la corticotropine) et les récepteurs PTH (hormone parathyroïdienne). (3) Des exemples de récepteurs couplés à des protéines G analogues aux récepteurs de neurotransmetteur/calcium métabolique comprennent mglul, mglu2 (acide glutamique), GABAB (acide y-amino- butyrique) et les récepteurs des substances gustatives (Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G proteincoupled receptors. Endocrine Reviews (2000) 21,90-113) (1998 Receptor and Ion Channel Nomenclature Supplément, Trends in Pharmacological Science, 1998). Selon la présente invention, on emploie au moins un type de baculovirus recombiné contenant un gène codant la protéine mentionnée ci-dessus qui doit être exprimée. Les baculovirus qui infectent les insectes et qui provoquent des maladies sont des virus à enveloppe contenant un ADN double brin cyclique et auxquels les insectes tels que les lépidoptères, les hyménoptères et les diptères sont sensibles. Parmi les baculovirus, les virus de la polyédrose nucléaire (NPV) constituent un groupe qui produit une grande quantité de corps d'inclusion appelés polyèdres dans le noyau des cellules infectées. Les polyèdres sont constitués par des protéines de type polyédrine ayant une masse moléculaire de 31 kDa, sont produits en grande quantité au stade tardif de l'infection et contiennent de nombreuses particules virales. Comme les polyèdres sont essentiels pour la survie des virus mais ne sont pas nécessaires à leur prolifération, les virus peuvent provoquer une infection et proliférer et même si un gène étranger à exprimer est inséré à la place d'un gène de polyédrine. Selon la présente invention, on peut utiliser par exemple comme baculovirus un vecteur viral comme Autographa californica NPV (AcNPV) de la sous-famille Phytometra et Bombyx mori NPV (BmNPV) du ver à soie. Les hôtes de AcNPV (cellules infectées et établies) peuvent être par exemple des cellules de Spodoptera frugiperda (cellules Sf) et les hôtes de BmNPV (cellules infectées et établies) peuvent être par exemple des cellules BmN4. On préfère les vecteurs de la lignée AcNPV car les cellules Sf présentent une plus grande vitesse de prolifération que les cellules BmN4, et car AcNPV présente un caractère infectieux à l'égard des cellules hépatiques humaines et des néphrocytes f#taux humains. Des lignées cellulaires Sf9 et Sf21 de Spodoptera Frugiperda ont été établies comme hôtes à partir du tissu ovarien de larves de S. frugiperda et sont disponibles par exemple auprès de Invitrogen, Pharmingen (San Diego, CA) ou ATCC. En outre, il est possible aussi d'utiliser comme hôte une large d'insecte vivante. Il est possible de mettre en #uvre au moyen de techniques standards un procédé pour construire un virus recombiné utilisé selon la présente invention, par exemple en suivant les étapes suivantes. Tout d'abord, on construit un vecteur de transfert recombiné en insérant un gène d'une protéine à exprimer dans le vecteur de transfert. En général, la taille du vecteur de transfert est de plusieurs kb à environ 10 kb, une taille d'environ 3 kb correspondant à un squelette dérivé d'un plasmide, qui contient un gène de résistance à un antibiotique (par exemple l'ampicilline) et un signal pour initier la réplication de l'ADN dans des bactéries. Outre ce squelette, un vecteur de transfert contient généralement plusieurs kb de chacune des régions 5' et 3' d'un gène de polyédrine, de sorte que, quand on réalise la transfection de la manière décrite ci-dessous, il se produit souvent entre ces séquences une recombinaison homologue entre le gène d'intérêt et le gène de polyédrine. De préférence, le vecteur de transfert contient un promoteur pour l'expression d'un gène d'une protéine, qui peut être par exemple un promoteur de gène de polyédrine, un promoteur de gène plO ou un promoteur de gène de capside. Les types de vecteurs de transfert ne sont pas limités spécifiquement et les vecteurs de transfert de la lignée AcNPV comprennent par exemple pEVmXIV2, pAcSGl, pVL1392/1393, pAcMP2/3, pAcJP1, pAcUW21, pAcDZ1, pBlueBacIII, pAcUW51, pAcAB3, pAc360, pBlueBacHis, pVT-Bac33, pAcUW1 et pAcUW42/43 ; et les vecteurs de transfert de la lignée BmNPV comprennent par exemple pBK283, pBK5, pBB30, pBE1, pBE2, pBK3, pBK52, pBKblue, pBKblue2, pBF (qui sont tous disponibles par exemple auprès de FUNAKOSHI, Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd). Puis, pour préparer des virus recombinés, on mélange les vecteurs de transfert recombinés mentionnés ci-dessus avec des virus, puis on les transfère dans des cellules cultivées destinées à être utilisées comme hôtes, ou bien encore on les transfère dans des cellules cultivées destinées à être utilisées comme hôtes qui ont été préalablement infectés avec des virus de manière à entraîner une recombinaison homologue entre les vecteurs de transfert recombinés et les ADN génomiques viraux, pour construire des virus recombinés. Les cellules cultivées utilisées comme hôtes sont les hôtes mentionnés ci-dessus, et elles comprennent généralement des cellules d'insectes (par exemple cellules Sf9 ou cellules BmN). Les conditions de culture sont déterminées de manière appropriée par l'homme du métier. Quand on utilise des cellules Sf9, on réalise de préférence la culture à environ 28 C dans un milieu contenant 10 % de sérum foetal de veau. Il est possible de purifier les virus recombinés ainsi construits par des techniques standards comme la purification sur plages. Les virus recombinés ainsi préparés peuvent être distingués aisément des virus non recombinés du fait qu'ils ne forment pas de polyèdres car le gène de la protéine polyédrine du virus de la polyédrose nucléaire a été remplacé par l'ADN étranger. Dans le procédé selon la présente invention, il est possible de recueillir la protéine d'intérêt en amenant le baculovirus recombiné mentionné ci-dessus à infecter l'hôte approprié décrit ci-dessus (cellules cultivées, par exemple des lignées cellulaires Sf9 et Sf21 de Spodoptera Frugiperda ou larves d'insectes) et en recueillant les virus bourgeonnants (VB) extracellulaires à partir du surnageant de culture grâce à des moyens de séparation comme la centrifugation, au bout d'un certain temps (72 h). Il est possible de réaliser une infection avec un seul type de baculovirus recombiné ou de réaliser une co-infection avec deux ou plusieurs types de baculovirus recombinés. Il est possible de recueillir les baculovirus bourgeonnants extracellulaires, par exemple de la manière décrite ci-dessous. Tout d'abord, on centrifuge à 500 à 1 000 g une solution de cellules infectées cultivées et on recueille le surnageant contenant les baculovirus bourgeonnants extracellulaires. On centrifuge ce surnageant à environ 30 000 à 50 000 g et on isole le précipité contenant les baculovirus bourgeonnants extracellulaires que l'on met en suspension dans un tampon approprié. On applique cette suspension de virus à des gradients de concentration appropriés (par exemple gradient de saccharose) puis on centrifuge à 100 000 g pour le fractionnement. Enfin, on peut choisir les fractions contenant les protéines voulues parmi les fractions obtenues. Quand on obtient les protéines exprimées sous forme de protéines solubilisées, on recueille des virus bourgeonnants extracellulaires par centrifugation, par exemple à 40 000 g, à partir de la solution de culture des cellules infectées. On met le culot en suspension dans un tampon approprié, on traite avec un agent de dissolution comme la lysophosphatidylcholine, et on centrifuge à 30 000 tr/min pour séparer la suspension en un surnageant et un précipité. On recueille la protéine solubilisée d'intérêt dans le surnageant. La protéine exprimée recueillie par le procédé de la présente invention décrit ci-dessus est caractérisée en ce qu'elle est recueillie sous sa forme active. De préférence, on recueille sous sa forme active par le procédé de la présente invention au moins 50 % ou plus, de préférence 60 % ou plus, de préférence encore 70 % ou plus, de préférence encore 80 % ou plus, de préférence encore 90 % ou plus, et de manière particulièrement préférable 95 % ou plus de la protéine. Une telle forme active d'une protéine membranaire ne pouvait pas être récupérée avec un rendement élevé par les procédés conventionnels. La présente invention concerne en outre un procédé pour analyser une interaction entre un récepteur membranaire dans un baculovirus bourgeonnant et un ligand, au moyen du baculovirus bourgeonnant libéré par un hôte infecté avec au moins un type de baculovirus recombiné qui contient un gène codant une protéine interagissante et un gène codant un récepteur membranaire qui interagit avec ladite protéine interagissante pour remplir sa fonction. Les procédés pour mesurer une interaction entre un récepteur membranaire et un ligand ne sont pas limités spécifiquement, et ils peuvent être choisis de manière appropriée par l'homme du métier. Par exemple, il est possible de mesurer l'aptitude à lier un ligand au moyen d'un ligand radiomarqué. Spécifiquement, on ajoute un baculovirus bourgeonnant contenant un récepteur membranaire à un tampon (par exemple une solution tampon appropriée pour la liaison) contenant un ligand marqué par exemple avec [3H]. On détermine judicieusement les conditions réactionnelles en fonction du type de combinaison d'un récepteur et d'un ligand. Après la réaction, on filtre la solution réactionnelle et on l'adsorbe sur un support en phase solide tel qu'un filtre approprié pour arrêter la réaction. On lave et sèche le support en phase solide de sorte que seuls les complexes sont immobilisés sur celui-ci. On mesure la radioactivité du support en phase solide au moyen d'un compteur de scintillation, pour mesurer l'interaction (c'est-à-dire l'aptitude à lier un ligand) entre un récepteur membranaire et un ligand. La présente invention concerne en outre un procédé pour sélectionner une substance qui favorise ou inhibe une interaction entre un récepteur membranaire dans un baculovirus bourgeonnant et un ligand, où une interaction entre un récepteur membranaire dans le baculovirus bourgeonnant et un ligand est analysée en présence d'une substance test au moyen du baculovirus bourgeonnant libéré par un hôte infecté avec au moins un type de baculovirus recombiné qui contient un gène codant une protéine interagissante et un gène codant un récepteur membranaire qui interagit avec ladite protéine interagissante pour remplir sa fonction. Les substances tests qu'il s'agit de sélectionner comprennent par exemple les peptides, les polypeptides, les composés synthétiques, les produits obtenus à partir de micro-organismes par fermentation, les extraits d'organismes (incluant les tissus végétaux ou animaux, les micro-organismes et les cellules) ou leurs banques. Les exemples de banques comprennent une banque de composés synthétiques (par exemple une banque combinatoire) et une banque peptidique (par exemple banque combinatoire). Les substances chimiques qu'il s'agit de sélectionner peuvent être des substances naturelles ou synthétiques. Il est possible de tester individuellement une substance chimique constituant un candidat unique ou un mélange de substances chimiques constituant des candidats (y compris des banques). De plus, il est possible de sélectionner un mélange fractionné tel qu'un extrait cellulaire, puis de le soumettre à un fractionnement répété pour isoler une substance ayant l'activité voulue. Ces substances tests sont de préférence celles dont on prévoit qu'elles favorisent ou inhibent une interaction entre un récepteur membranaire et un ligand. Le procédé de sélection selon la présente invention permet de sélectionner un inhibiteur ou un agent activant pour un récepteur membranaire. La présente invention concerne aussi une substance qui est obtenue par le procédé de sélection de la présente invention et qui favorise ou inhibe une interaction entre un récepteur membranaire et un ligand. La présente invention est illustrée plus précisément au moyen des exemples non limitatifs suivants. Exemple 1 : Préparation d'un baculovirus recombiné qui exprime un récepteur couplé à une protéine G BLT1 est un récepteur pour le leucotriène B4 (LTB4) produit à partir de l'acide arachidonique (Serhan, C. N., Haeggstrom, J. Z. et Leslie, C. C. Lipid Mediator Networks in Cell Signaling : Update and Impact of Cytokines (1996) FASEB J. 10, 1147-1158). BLT1 est un récepteur couplé à une protéine G présent sur la membrane cellulaire, qui permet la transduction intracellulaire d'un signal en se liant spécifiquement à LTB4 (Yokomizo, T., Masuda, K., Kato, K., Toda, A., Izumi, T. et Shimizu, T. Leukotriene B4 receptor. Cloning and Intracellular Signaling (2000) Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 161, S51-S55). (1) Culture et infection de cellules et collecte de baculovirus bourgeonnants On a sous-cloné un cadre de lecture ouvert d'ADNc de BLT1 humain (Yokomizo, T., Izumi, T., Chang, K., Takuwa, Y. et Shimizu, T. A G-protein-coupled Receptor for Leukotriene B4 that mediates Chemotaxis (1997) Nature 387, 620-624) dans un vecteur pBlueBac4.5TM (Invitrogen, Carlsbad, CA) ou pBlueBacHis2A, pour produire respectivement pBlueBac-BLT1 et pBluBac-His-BLT1. On a sous-cultivé des cellules Sf9 (Invitrogen) dans un milieu complet (milieu de Grace complété (GIBCO BRL) contenant 10 % de sérum foetal de veau (Sigma), 100 unités/ml de pénicilline et 100 pg/ml de streptomycine) sur une boîte de 10 cm à 27 C. On a réalisé une culture à grande échelle dans un récipient rotatif de 1L (Wheaton) contenant un milieu complet additionné de 0,001 % de Pluronic F-68 (GIBCO BRL). Pour préparer un baculovirus recombiné, on a co-infecté les cellules Sf9 avec l'ADN de Bac-N-Blue (issu de ApMNPV) et pBlueBac-BLT1 ou pBluBac-His-BLT1 selon les indications (Bac-N-BlueTM Transfection Kit, Invitrogen). (2) Analyse par ELISA de l'expression du récepteur dans un baculovirus bourgeonnant On a cultivé des cellules Sf9 dans un volume de 500 ml dans un récipient rotatif de IL (Wheaton) à une concentration de 2 x 106 cellules/ml. On a infecté les cellules avec les virus recombinés produits en (1) ci-dessus à une multiplicité d'infections (MOI) de 5, après quoi, on a utilisé pour une expérience subséquente la solution de culture 72 h après l'infection. On a centrifugé la solution de culture à 1 000 x g pendant 10 min et on l'a séparée en un précipité et un surnageant. On a mis le précipité en suspension dans un tampon de lyse de cellules (TrisHCI 20 mM pH 7,4, saccharose 0,25 M, MgCl2 10 mM, EDTA 1 mM, PMSF 0,5 mM, DTT 2 mM), on l'a soumis à une sonication puis on l'a centrifugé à 10 000 x g pendant 30 min. On a soumis le surnageant à une ultracentrifugation à 100 000 x g pendant 1 h puis on a mis le précipité résultant en suspension dans du tampon phosphate (PBS), pour obtenir une fraction de membrane cellulaire. On a centrifugé à 10 000 x g pendant 15 min le surnageant résultant de la centrifugation à 1 000 x g, puis on a centrifugé le surnageant à 45 000 x g pendant 30 min. Ensuite, on a mis le précipité en suspension dans PBS et on a centrifugé à 45 000 x g pendant 30 min. On a mis le précipité en suspension dans PBS pour obtenir des fractions de virus bourgeonnants (fractions de VB). On a confirmé la quantité d'expression de BLT1 dans les fractions VB par ELISA en utilisant des antisérums anti-BLTl (Cayman) qui reconnaissent l'extrémité C-terminale du récepteur (figure 1). On a ainsi confirmé la liaison d'anticorps dirigés contre les récepteurs exprimés dans les fractions VB avec une quantité de protéine virale de 100 ng ou plus, par rapport au cas où les cellules étaient infectées avec un baculovirus de type sauvage. En outre, dans le cas où on a réalisé une analyse ELISA avec des anticorps anti-marqueur His pour les fractions VB de récepteurs exprimés contenant un marqueur His fusionné à l'extrémité N-terminale, on a obtenu des résultats similaires (figure 2). On a recueilli toutes les 24 h de 0 à 96 h la solution de culture de cellules Sf9 infectées avec le virus recombiné. On a centrifugé à 10 000 x g pendant 10 min les fractions de membrane cellulaire et les surnageants après une centrifugation à 1 000 x g pendant 10 min, pour préparer des surnageants (fractions de surnageant). Puis, on a confirmé l'évolution au cours du temps de la quantité d'expression du récepteur (figure 3). En utilisant 1 g de fraction de membrane cellulaire et 200 pl de fraction de surnageant à chaque point dans le temps, on a réalisé une analyse ELISA avec des antisérums anti-BLTl. Ainsi, les fractions de membrane cellulaire commençaient à manifester l'expression du récepteur 48 h après le début de la culture, et les fractions de surnageant commençaient à manifester l'expression du récepteur 72 h après le début de la culture. Ces résultats suggèrent que le virus contenant le récepteur est exprimé dans la solution de culture à partir de 72 h après le début de la culture. On a comparé la quantité d'expression du récepteur de la fraction VB et la quantité d'expression du récepteur de la fraction de membrane cellulaire au moyen d'une analyse ELISA avec des antisérums anti-BLTl (figure 4). Avec une quantité de protéine de 1 g dans chaque cas, la quantité d'expression du récepteur dans la fraction VB était égale à environ la moitié de la quantité d'expression de récepteur dans la fraction de membrane cellulaire. (3) Analyse de l'activité de liaison de ligands à des récepteurs dans des baculovirus bourgeonnants On a confirmé l'activité de liaison de ligands dans la fraction VB et dans la fraction de membrane cellulaire au moyen d'une expérience de liaison de [3H] LTB4 à chaque échantillon (figure 5). On a réalisé l'expérience de liaison de [3H]LTB4 en ajoutant la fraction VB exprimant BLT1 ou la fraction de membrane cellulaire exprimant BLT1 à un tampon de liaison contenant [3H] LTB4 (Tris-HCI 50 mM pH 7,4, MgCl2 10 mM, NaCI 10 mM, 0,1 % de BSA sans acide gras) pour préparer 200 l d'une solution réactionnelle que l'on a laissée au repos pendant 1 h à la température ambiante. Puis, on a filtré cette solution sur un filtre de microfibres de verre GF/C (Whatman) pour réaliser une adsorption pour arrêter la réaction. Ensuite, on a lavé le filtre trois fois avec 2 ml de tampon de liaison glacé, et on l'a séché. Puis, on a mesuré la radioactivité au moyen d'un compteur de scintillation. On a calculé la liaison non spécifique en ajoutant 10 M de LTB4 à la solution réactionnelle. La quantité de liaison de [3H]LTB4 à la fraction VB exprimant BLT1 ou exprimant BLT1 marqué avec His était approximativement 3 à 4 fois supérieure à la quantité de liaison de chaque fraction de membrane cellulaire de Sf9 exprimant le récepteur. Ce résultat indique que des récepteurs capables de lier des ligands étaient exprimés en plus grande quantité dans les fractions VB que dans les fractions de membrane cellulaire. Exemple 2 : Co-expression d'un récepteur couplé à une protéine G et d'une protéine G dans des baculovirus bourgeonnants BLT1 est couplé dans des cellules avec des protéines G analogues à Gi ou analogues à Gq, puis LTB4 est lié spécifiquement, de sorte que les protéines G couplées sont activées (Gaudreau, R., Gouill, C. L., Metaoui, S., Lemire, S., Stankova, J. et Rola-Pleszczynski, M. Signalling through the leukotriene B4 receptor involves both ai and al6, but not aq or [alpha]11 G protein subunits (1998) Biochem J. 335, 15-18). Il a été décrit que les protéines G exprimées dans des cellules Sf9 sont principalement des protéines G analogues à Gs et analogues à Gq et que la quantité d'expression de protéines G analogue à Gi est faible (Obosi, L., Schuette, D. G., Europe-Finner, N., Beadle, D. J., Hen, R., King, L. A. et Bermudez, I. Functional characterization of the Drosophila 5-HTdrol and 5HTdro2B serotonin receptors in insect cells : activation of a Gas-like protein by 5HTdro1 but lack of coupling to inhibitory G proteins by 5-HTdro2B. (1996) FEBS Lett. 381, 233-236). (1) Comparaison de la quantité d'expression des récepteurs dans la coexpression de protéines G On a infecté 200 ml de cellules Sf9 à une concentration de 2 x 106 cellules/ml, à une multiplicité d'infections (MOI) de 2 par virus, avec des virus recombinés exprimant des sous-unités [alpha], ss et y de protéines G de rat (Gail, Gss1, Gy2) et avec des virus recombinés exprimant BLT1 marqué avec His. 72 h plus tard, on a préparé des fractions VB, puis on a confirmé l'expression de récepteurs par une analyse ELISA avec des antisérums anti-BLTl (figure 6). La quantité d'expression des récepteurs dans les fractions VB était la plus élevée dans les cellules infectées avec les virus recombinés exprimant le récepteur seulement, suivie par les cellules infectées avec les virus recombinés exprimant Gail et avec les récepteurs recombinés exprimant le récepteur, puis celles infectées avec les virus recombinés exprimant Gss1 et Gy2 et les virus recombinés exprimant le récepteur, et enfin celles infectées avec les virus recombinés exprimant Gail, Gss1 et Gss2 et les virus recombinés exprimant le récepteur, dans l'ordre décroissant. Ces résultats suggèrent que la quantité d'expression de récepteurs diminuait quand le nombre de types de virus infectants augmentait dans le cas d'une co-infection avec des virus recombinés exprimant le récepteur et des protéines G, à une multiplicité d'infections (MOI) de 2. De plus, l'infection avec des virus recombinés exprimant des protéines G (Gail, Gss1, Gy) seulement conduisait à un bas niveau de liaison d'anticorps qui est équivalent à celui d'une infection avec des baculovirus de type sauvage. (2) Comparaison de l'aptitude à lier des ligands dans la co-expression de protéines G On a infecté 200 ml de cellules Sf9 à une concentration de 2 x 106 cellules/ml, à une multiplicité d'infections (MOI) de 2 par virus, avec des virus recombinés exprimant des sous-unités [alpha], ss et y de protéine G de rat (Gail, Gss1, Gy2) et avec des virus recombinés exprimant BLT1 marqué avec His. 72 h plus tard, on a préparé des fractions VB, puis on a confirmé l'effet de la co-expression de protéines G sur l'aptitude à lier des ligands au moyen d'une expérience de liaison de ligands analogue à l'exemple 1 (3) (figure 7). L'aptitude à lier [3H] LTB4 0,25 nM à 0,3,1 ou 3 g de fraction VB était la plus élevée dans les cellules co-infectées avec des virus recombinés exprimant BLT1 marqué avec His et avec des virus recombinés exprimant les sous-unités [alpha], ss et y de protéine G de rat (Gail, Gss1, Gy2), suivie par celles co-infectées avec des virus recombinés exprimant le récepteur et Gail, et celles co-infectées avec des virus recombinés exprimant le récepteur et Gss1, Gy2, dans l'ordre décroissant. De plus, l'activité de liaison de ligands des cellules co-infectées avec les virus recombinés exprimant le récepteur et Gss1, Gy2 était la même que celle des cellules co-infectées avec les virus recombinés exprimant le récepteur seulement. Ces résultats confirmaient que la co-expression de sous-unités de protéine G conduit à une augmentation de l'activité de liaison des ligands des récepteurs et que la co-expression des sous-unités a et {3 de protéine G conduit à la plus grande activité de liaison des ligands. L'activité de liaison de [3H]LTB4 à une concentration allant de 0 à 2 nM à 0,3 g de fraction VB exprimant le récepteur a été confirmée (figure 8). La co-expression des récepteurs et des sous-unités [alpha], ss et y de protéine G conduisait à une aptitude à la liaison accrue à une faible concentration de ligand, par rapport à l'expression de récepteurs seulement. Ces résultats suggèrent que la co-expression de récepteurs et de sous-unités [alpha], ss et y de protéine G dans la fraction VB a pour effet que les récepteurs exprimés se lient aux ligands à haute affinité. La présente invention permet l'expression d'un récepteur lié à la membrane qui fonctionne en formant un complexe, comme le récepteur GPCR et le récepteur des cellules T. Le récepteur lié à la membrane peut être utilisé pour sélectionner une substance qui inhibe ou favorise la liaison ou la transduction de signaux. REVENDICATIONS 1. Procédé pour exprimer un récepteur membranaire fonctionnel caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de culture d'un hôte infecté avec au moins un type de baculovirus recombiné qui contient un gène codant une protéine interagissante et un gène codant un récepteur membranaire qui interagit avec ladite protéine interagissante pour remplir sa fonction, et de co-expression de ladite protéine interagissante et dudit récepteur membranaire dans un baculovirus bourgeonnant libéré par ledit hôte. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de culture d'un hôte infecté avec au moins un type de baculovirus recombiné qui contient un gène codant une protéine interagissante et au moins un type de baculovirus recombiné qui contient un gène codant un récepteur membranaire qui interagit avec ladite protéine interagissante pour remplir sa fonction, et de co-expression de ladite protéine interagissante et dudit récepteur membranaire dans un baculovirus bourgeonnant libéré par ledit hôte. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéine interagissante est une protéine couplée. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéine interagissante est une protéine G et le récepteur membranaire est un récepteur couplé à une protéine G. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'hôte est une cellule d'insecte ou une larve d'insecte. 6. Procédé pour préparer un récepteur membranaire physiologiquement actif, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de culture d'un hôte infecté avec au moins un type de baculovirus recombiné qui contient un gène codant une protéine interagissante et un gène codant un récepteur membranaire qui interagit avec ladite protéine interagissante pour remplir sa fonction, et de récupération d'un baculovirus bourgeonnant libéré par ledit hôte. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de culture d'un hôte infecté avec au moins un type de baculovirus recombiné qui contient un gène codant une protéine interagissante et au moins un type de baculovirus recombiné qui contient un gène codant un récepteur membranaire qui interagit avec ladite protéine interagissante pour remplir sa fonction, et de récupération d'un baculovirus bourgeonnant libéré par ledit hôte. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 et 7, caractérisé en ce que la protéine interagissante est une protéine couplée. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que la protéine interagissante est une protéine G et le récepteur membranaire est un récepteur couplé à une protéine G. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que l'hôte est une cellule d'insecte ou une larve d'insecte. 11. Baculovirus bourgeonnant, caractérisé en ce qu'il est libéré par un hôte infecté avec au moins un type de baculovirus recombiné qui contient un gène codant une protéine interagissante et un gène codant un récepteur membranaire qui interagit avec ladite protéine interagissante pour remplir sa fonction. 12. Baculovirus bourgeonnant selon la revendication 11, caractérisé en ce que la protéine interagissante est une protéine couplée. 13. Baculovirus bourgeonnant selon l'une quelconque des revendications 11 et 12, caractérisé en ce que la protéine interagissante est une protéine G et le récepteur membranaire est un récepteur membranaire couplé à une protéine G. 14. Baculovirus bourgeonnant selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que l'hôte est une cellule d'insecte ou une larve d'insecte. 15. Procédé pour analyser une interaction entre un récepteur membranaire dans un baculovirus bourgeonnant et un ligand, caractérisé en ce qu'un baculovirus bourgeonnant selon l'une quelconque des revendications 11 à 14 est utilisé. 16. Procédé pour sélectionner une substance qui favorise ou inhibe une interaction entre un récepteur membranaire dans un baculovirus bourgeonnant et un ligand, caractérisé en ce qu'une interaction entre un récepteur membranaire dans le baculovirus bourgeonnant et un ligand est analysée en présence d'une substance test au moyen d'un baculovirus bourgeonnant selon l'une quelconque des revendications 11 à 14. 17. Substance qui favorise ou inhibe une interaction entre un récepteur membranaire et un ligand, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé selon la revendication 16.