Brevet FR2832162A1 — publié le 20030516

la solution issue de l'étape c) 0,5 M de chlorure de sodium (NaCI). La présente invention est relative à un procédé de formation d'une couche de polymères d'épaisseur homo gène à la surface d' un support so li de, au support solide obtenu en mettant en _uvre ce procédé, ainsi quà ses applications. Il existe actuellement un grand intérêt pour les outils d'analyse S multiparamétriques connus sous le nom de puces à ADN. Ces outils sont dédiés à l'analyse de macromolécules biologiques telles que par exemple les molécules d'acide nucléique et les protéines. Ils permettent, par l'intermédiaire d'une couche de polymères liée à au moins une surface d'un support solide, de fixer, par l'intermédiaire de fonctions l O spécifiques, ces macromolécules biologiques. Les molécules ainsi immobilisées peuvent ensuite être soumises à différentes techniques d'analyse qualitatives et quantitatives o peuvent également servir de sondes, dans le but de fixer d'autres molécules biologiques d'intérêt, notamment dans le cas de l'hybridation de brins complémentaires d'ADN. l Actuellement, les dépôts de polymères, et en particulier de polymères conducteurs associés à des fonctions spécifiques (biologiques ou chimiques) dans le but de fixer des macromolécules biologiques sont réalisés de différentes manières, incluant les dépôts par voie chimique ou électrochimique. - Les couches de polymères des systèmes actuellement disponibles sur le marché sont plus ou moins épaisses en fonctions des applications recherchées. Les dépôts de polymères associés à la fixation d'éléments biologiques. sont décrits comme la succession de maillons d'une chaîne formée par un ou plusieurs monomères différents; certains de ces différents monomères étant eux mêmes porteurs d'éléments biologiques. A titre d'illustration, ce genre de construction peut être schématiquement représenté par la structure suivante: = { u dans laquelle A et B représentent les monomères du polymère et EB représente un élément biologique directement porté par les monomères A et/ou B. Dans le cas particulier des polymères conducteurs, la polymérisation est réalisée de façon électrochimique. Au cours du processus de polymérisation, la chaîne de polymère conducteur se développe en insérant successivement les différents monomères. Statistiquement, les monomères porteurs d'éléments biologiques se fixent de taçon aléatoire à la chaîne, au cours de son élongation. La longueur de la chaîne n'étant pas régulée, l'élongation de celle-ci se poursuit jusqu'à l'arrêt du processus de polymérisation, provoqué, le plus souvent, en fonction du temps, en diminnant le l O potentiel de dépôt ou bien encore par l'épuisement des monomères. Cette technique ne permet pas de contrô ler faci lement la lo ngueur de s chaînes et co nduit, par cons équent, à l'obtention de couches de polymères hétérogène en terme d'épaisseur. Par ailleurs, lorsque la polymérisation est réalisée de façon chimique, par exemple au moyen d'un oxydant chimique que l'on mélange aux monomères' au inoment de l'emploi, pour initier le processus de polymérisation (polymérisation oxydative). Dans ce cas c'est uniquement le temps pendant lequel on laisse en contact les différents monomères et l'oxydant chimique ou la quantité de m ono mères initi al e ment présents qui permet de faire varier la lo ngueur fmale des chaines de polymères. Cette technique de polymérisation ne permet donc pas non plus de maîtriser facilement l'épaisseur finale de la couche de polymères formée, ni la quantité d'éléments biologiques éventuellement fixés sur les chaînes ainsi constituées. Par ailleurs, l'accessibilité des éléments biologiques étant meilleure à la surface des couches de polymères qu'au sein même de cette couche, de nombreux chercheurs se sont employés à diminuer les épaisseurs des couches de polymères, jusqu'à réaliser des dépôts rapides (temps de dépôts court, en général inférieur à 1 seconde). Ces dépôts rapides nécessitent une grande maîtrise des paramètres mis en jeux au cours de la préparation de la couche de polymères (temps de polymérisation, potentiel de dépôt dans le cas particulier des dépôts électrochimiques, nettoyage des surfaces, etc...). Les dépôts rapides, bien que permettant de conduire à des couches de polymères de faible épaisseur, sont donc délicats à mettre en _uvre et nécessitent des conditions de réalisation très précises. D'autre part, lorsque l'on so uhaite pol yméri ser plusieurs sites simultanément, les conditions de dépôts font qu'il est extrêmement difficile de réaliser des épaisseurs de dépôt uniformes sur tous les sites. En effet, les conditions physico- chimiques de la surface du site à polymériser influe sur le démarrage du dépôt, ce qui a pour conséquence, une inhomogénéité dans 1'épaisseur des différentes couches de polymères obtenues sur Les différents sites à polymériser. Ceci est typiquement le cas lo rs de l'élaboration des biopuces de type MICAM tel les que décrites par exemple dans la demande de brevet FR-A-2 781 886 ainsi que dans 1'article de M.P. Caillat, Sensors and Actuators B-Chimie, 1999, 61, 154-162. C'est donc afin de remédier à l'ensemble de ces inconvénients et de pourvoir à un procédé permettant d'obtenir des supports solides dont au moins une des surfaces est recouverte par une couche polymérique homogène et de faible épaisseur, que les Inventeurs ont mis au point ce qui fait l'objet de la présente invention. Les Inventeurs ont notamment mis en évidence, de façon surprenante et inattendue, qu'il était possible de préparer de tels supports en utilisant un mélange de différents monomères, ledit mélange étant constitué à au moins 50 % par des monomères comportant une fonction chimique apte à bloquer la réaction de polymérisation. La présente invention a donc pour premier objet un procédé de tormation d'une couche polymérique d'épaisseur homogène sur au moins une partie de l'une des surfaces d'un support solide, caractérisé par le fait que ladite couche polymérique est obtenue par copolymérisation d'une solution de monomères reniermant des monomères porteurs d'une fonction apte à bloquer la réaction de copolymérisation, et dans laquelle le nombre de monomères porteurs de ladite fonction représente au moins 50 /0 du nombre total de monomères présents au sein de ladite solution. Les Inventeurs ont en effet démontré que le procédé conforme l'Invention permet d'autoréguler le dépôt des monomères et par-là même, I'élongation des chames de polymères, en bloquant successivement l'élongation des chaînes en cours de polymérisation. Ceci permet de diminuer fortement la vitesse de l'élongation des chaînes et d'obtenir des conditions de dépôts des sites que l'on souhaite recouvrir plus souples. De façon surprenante, ce procédé permet désormais d'obtenir des couches de polymères de faible épaisseur et remarquablement homogènes. De plus, lorsque l'on désire réaliser la polymérisation de plusieurs sites simultanément, par exemple dans le cas des biopuces possédant plusieurs milliers de sites différents, le démarrage de la polymérisation peut être différent entre deux sites du fait des conditions physico- chimiques des surfaces. Dans ce cas, le procédé conforme à l' invention permet de freiner la cro issance de la couche par blocage successif des chaînes au cours de leur élongation et de réduire l'écart dû au démarrage ditléré entre deux sites au fur et à mesure de la croissance du dépôt initial. Au fmal, l'écart d'épaisseur entre les différents sites est réduit, la biopuce présente des épaisseurs de polymères uniformes sur chacun de ses différents sites. Le procédé conforme à l'Invention permet également de limiter et de matriser la quantité d'éléments biologiques fixés sur une chaîne de polymères. Selon une forme de réalisation avantageuse de l'invention le nombre de monomères porteurs de ladite fonction représente de préférence au moins 60 %, et encore plus préférentiellement 60 à 95 % du nombre total de monomères présents dans ladite solution. Le procédé co nforme à l'Invention permet de co ntrôler la croissance de la couche de polymères dont l'épaisseur est alors plus homogène. Plus précisément, le procédé conforme à l' Invention permet de dim inuer la vitesse d'obtention de la couche de polymère jusqu'à un facteur 10 environ. L'écart type (E) de la mesure d'épaisseur (effectuée sur des couches de polymères dont l'épaisseur peut varier entre quelques nanomètres et quelques dizaine de nanomètres) peut être calculé selon l'équation suivante: E = - (Xj - X",)' dans laquelle n représente le nombre de mesure Xj représente la valeur en Angstrom de l'épaisseur au point de mesure et Xm représente la valeur moyenne de l'épaisseur. Cet écart type E passe de 90 pour une couche polymérique obtenue en mettant uniquement en ceuvre des monomères non fonctionnalisés à 9 seulement si 1'on utilise un mélange de monomères renfermant 85 % environ de monomères fonctionnalisés par une fonction apte à bloquer la réaction de copolymérisation par rapport au nombre total de monomères. Selon l' Invention, la nature même des monomères n'est pas critique. Les monomères pouvant être utilisés selon le procédé conforme à 1'invention sont en fait choisis en fonction du type d'application envisagée et notamment en fonction du type de macromolécules que l'on souhaite fixer. Ces monomères peuvent notamment être choisis parmi les pyrroles, les anilines, les thiophènes et les azulènes. La réaction de copolymérisation peut être déclenchée, en fonction de la nature des monomères, soit par un oxydant chimique, soit par un signal électrique (électropolymérisation) dans le cas des monomères conducteurs. Parmi les oxydant chimiques, on peut notamment citer le chlorure lerrique, le chlorure cuivrique, le chlorure de molybdène (V) et le trichlorure de ruthénium. Selon une forme de réalisation préférée de l'lnvention, lesdits monomères sont choisis parmi les monomères pyrrole et la réaction de copolymérisation est une réaction d'électropolymérisation. Parmi les fonctions aptes à bloquer la réaction de copolymérisation, on peut notamment citer les fonctions aldéhyde, nitrile, ester, alkyle et aryle. De manière avantageuse, ladite fonction est de préférence choisie parmi les fonctions permettant d'assurer l'accrochage d'un élément blologique ou biochimique contenant par exemple une fonction amine, tel que par exemple un brin d'ADN une biotine, une streptavidine ou un anticorps. A titre d'exemple, et lorsque le monomère est un pyrrole porteur d'une fonction aldéhyde, l'accrochage de l'élément biologique pourra se faire directement sur la fonction apte à bloquer la réaction de polymérisation, et ce selon la réaction suivante: N- H H H H dans laquelle R représente un élément biologique ou biochimique. On obtiendra ainsi un support solide comportant une couche polymérique dans laquelle l'élément biologique ou biochimique sera fixé en bout de chame selon la formule suivante: H S N-R dans laquelle R représente un élément biologique ou biochimique et S coTespond à la surface d'un support solide. Ce procédé permet donc également d'obtenir des supports solides dans lesquels la couche de polymères est particulièrement homogène et qui présentent 1'avantage supplémentaire de comporter des éléments biologiques ou biochimiques très accessibles. Cette accessibilité est notamment intéressante dans le cas o l'on souhaite réaliser des réactions d'hybridation de brins d'ADN. Les supports solides utilisables conformément à l'invention sont de préférence choisis parmi les supports métalliques, tels que les supports en or, les supports en vere ou en matériau plastique. L'Invention a donc également pour objet le support solide obtenu en mettant en ceuvre le procédé décrit ci-dessus. Ce support solide comporte, sur au moins une partie de l'une de ses surfaces, une couche de polymère dont l'épaisseur est de préférence comprise entre environ quelques nanomètres et quelques dizaines de nanomètres. L'invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un support so l ide conforme à l' invention pour l'isolement, la séparation, et/ou l'analyse d'éléments biologiques et biochimiques. Ainsi, I'Invention trouve une application dans la réalisation de puces biologiques de type MICAM améliorées mais aussi de puces biologiques dont le support solide est en ver e ou en matériau plastique. Outre les dispositions qui précèdent, I'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre. qui se rétère à un exemple de mesure de la vitesse de formation d'une couche de polypyr ole à la surface d'un support solide en fonction du rapport pyrrole/pyrrole porteur d'une fonction aldéhyde, à un exemple de mesure de l'épaisseur et de l'homogénéité d'une couche polymérique à la surface d'un support solide en fonction du rapport pyrrole/pyrrole porteur d'une fonction aldéhyde ainsi qu'aux fgures annexées dans lesquelles: - la figure I représente la vitesse de formation de la couche de polymère (en pourcentage de la vitesse initiale) en fonction du pourcentage de monomère pyrrole-2-carboxaldéhyde; - la figure 2 représente l'écart type E de la mesure d'épaisseur en fonction du pourcentage décroissant de pyrrole-2-carboxaldéhyde présent dans chaque solution de monomères. EXEMPLE 1: Mesure de la vitesse de formation d'une couche de polymère de type polypyrrole en fonction du pourcentage de monomères pyrrole-2- carboxaldéhyde présent au sein d'un mélange de monomères pyrrole/pyrrole2- carboxaldéhyde. 1) Matériel et méthode On prépare 9 solutions de monomères pyrrole/pyrrole-2 carboxaldéhyde (Aldrich) comprenant de 10 à 90 % de monomères pyrrole-2 carboxaldéhyde par raDport au nombre total de monomères pyrrole/pyrrole-2 carboxaldéhyde (à une concentration de 1 molaire dans 1'acétonitrile). Deux solutions de monomères (à une concentration de 1 molaire dans l'acétonitrile) constituées respectivement uniquement de monomères pyrrole ou de monomères pyrrole-2-carboxaldéhyde ont été également préparées. Les dépôts des différentes solutions de monomères ainsi préparées sont effectués sur des plots en or ayant tous la même dimension. Le potentiel de dépôt est fixé à 1,1 V (électrode au calomel saturée). Pour chaque solution, le dépôt est réalisé jusqu'à obtenir une charge de 5 mC. Le temps nécessaire pour atteindre cette charge est relevé. Le courant moyen du dépôt est calculé en divisant la charge totale par le temps du dépôt. La réaction de polymérisation est initiée par voie électrochimique. L'électrolyte support utilisé est du LiC104 aqueux à O,1 M. La vitesse de formation de la couche polymérique est donnée par le courant moyen du dépôt. 2) Résultats En comparant entre eux les différents courants moyens obtenus, et en fixant à 100 % la vitesse maximale obtenue, on obtient une courbe représentant la vitesse de formation de la couche de polymère en fonction du pourcentage de monomères pyrrole-2-carboxaldéhyde présent dans chaque solution de monomères (5gure 1). Ces résultats montrent qu'une solution de monomères pyrrole renfermant au moins 50 % en nombre de monomères pyrrole-2-carboxaldéhyde, conduit à une diminution d'environ 10 % de la vitesse de formation de la couche de polymère. Lorsque le pourcentage de monomères pyrrole-2-carboxaldéhyde est compris entre 60 et 70 %. EXENIPLE 2: Mesure de l'homogénéité d'une couche de polymère de type polypyrrole en fonction du pourcentage de monomères pyrrole-2carboxaldéhyde présent au sein d'un mélange de monomères pyrrole/pyrrole-2carboxaldéhyde. 1) Matériel et méthode On prépare 4 solutions de monomères pyrrole/pyrrole-2- carboxaldéhyde (Aldrich) comprenant de 46 à 86 % (46 %; 66 %; 78 % et 86 %) de monomères pyrrole-2-carboxaldéhyde par rapport au nombre total de monomères pyrrole/pyrrole-2-carboxaldéhyde (à une concentration de 1 molaire dans I'acétonitrile). Deux solutions de monomères (à une concentration de 1 molaire dans l'acétonitrile) constituées respectivement uniquement de monomères pyrrole ou de monomères pyrrole-2-carboxaldéhyde ont été également préparées. Les dépôts des différentes solutions de monomères ainsi préparées sont effectués selon la méthode décrite ci-dessus 1'exemple 1. Pour chaque solution, le dépôt est réalisé jusqu'à obtenir une charge de 15 mC. L'épaisseur et l'homogénéité du dépôt sont ensuite mesurées à l'aide d'un interféromètre optique de marque NANOSPEC(. L'indice de réfraction de la couche est fixé arbitrairement à 1,7. Chaque dépôt est mesuré en 5 points. L'homogéncité du dépôt est caractérisce par l'écart type (E) des mesures d'épaisseurs obtenues. Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 2 qui représente l'écart type E de la mesure d'épaisseur en fonction du pourcentage décroissant de pyrrole-2-carboxaldéhyde présent dans chaque solution de monomères. Ces résultats montrent que l'écart type E est diminué d'un facteur de 2 environ lorsque le mélange de monomères utilisé renferme, conformément à l'invention. 66 /0 de monomères porteurs d'une fonction apte à bloquer la réaction de copolymérisation. Ces résultats montrent également que l'écart type E passe d'environ 95 à seulement 9 environ 1orsque le pourcentage de monomères pyrrole-2-carboxaldéhyde passe de O % à 85 %. Ces résultats sont significatifs de la très bonne homogénéité de la couche polymérique obtenue en mettant en _uvre le procédé conforme à la présente invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de formation d'une couche polymérique d'épaisseur homogène sur au moins une partie de l'une des surfaces d'un support solide, caractérisé par le fait que ladite couche polymérique est obtenue par copolymérisation cl'une solution de monomères renfermant des monomères porteurs d'une fonction apte à bloquer la réaction de copolymérisation et dans laquelle le nombre de monomères porteurs de ladite fonction représente au moins 50 % du nombre total de monomères présents au sein de ladite solution. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le nombre de monomères porteurs de ladite fonction représente au moins 60 % du nombre total de monomères présents dans ladite solution. 3. Procédé selon la revendication 2' caractérisé par le fait que le nombre de monomères porteurs de ladite fonction représente de 60 à 95 % du nombre total de monomères présents dans ladite solution. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les monomères sont choisis parmi les pyrroles, les anilines, les thiophènes et les azulenes. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que les monomères sont choisis parmi les pyrroles et que la réaction de copolymérisation est une réaction d'électropolymérisation. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les fonctions aptes à bloquer la réaction de copolymérisation sont choisies parmi les fonctions aldéhyde, nitrile, ester, alkyle et aryle. 7. Support solide caractérisé par le fait qu'il est obtenu selon le procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications I à 6. S. Utilisation d'au moins un support solide tel que défini à la revendication 7, pour 1'isolement, la séparation, et/ou 1'analyse d'éléments biologiques et biochimiques. 9. Utilisation d'au moins un support solide tel que défini à la