Brevet FR2825102A1 — publié le 20021129

diffusion. La présente invention concerne de nouveaux polynucléotides comportant des polymorphismes de type SNP dans la séquence nucléotidique du gène IFNa-14, de nouveaux polypoptides ainsi que leurs utilisations thérapeutiques. ART ANTERIEUR La séquence nucléotidique du gène interféron alpha 14 (IFNa-14) de 1784 nucléotides correspond à une séquence nucléotidique composée des 658 premiers nucléotides du clone HTG sous le numéro d'accès AL353732 suivie de 1126 nucléotides de la séquence nucléotidique accessible dans la GenBank sous le numéro d'accès X02959. La séquence X02959 est décrite dans les publications suivantes: - Gooddel D.V. et al.; "The structure of eight distinct cloned human leukocyte interferon cDNAs"; Nature 290 (5801); 20-26 (1981). - Lawn RM. Et al.; "DNA sequence of two closely linked human leukocyte interferon genes"; Science 212 (4499); 1159-1162 (1981). - Olopade O. I. et al.; "Mapping of the shortest region of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with human neopiasia"; Genomics 14: 437-443; 1992. Les interférons alpha humains (I FNa) sont con nus pour leurs effets antiprolifératifs cellulaires et leurs implications dans les réponses anti virales et anti-parasitaires. Les IFN sont aussi connus pour inhiber l'expression de plusieurs autres cytokines au niveau des cellules hématopoTétiques souches, ainsi que pour inhiber la prolifération cellulaire de certaines tumeurs. Les IFNa sont également connus pour rébuire l'expression des récepteurs de l'EGF dans les carcinomes rénaux, pour inhiber l'expression de certains gènes mitochondriaux, pour inhiber la prolifération des fibroblastes, des monocytes et des Iymphocytes B et pour bloquer la synthèse des anticorps par les Iymphocytes B. Les IFN sont également connus pour induire l'expression d'antigènes spécifiques de tumeurs à la surface de cellules tumorales et également pour induire la transcription des gènes placés sous le contrôle de régions promotrices de type ISRE (Interferon-Stimulatod Response Element) en agissant sur les facteurs de transcription spécifiques de ces ISRE. Il a été observé par ailleurs une immunisation dirigée contre les INFo chez des patients atteints de certaines formes de pathologies auto- immunes ou d'infections virales généralisées ainsi que dans certains cancers. Il est connu que les IFNo sont impliqués dans différents dérèglements eVou maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les Iymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas lices au système immunitaire comme, par exemple, I'obésité, les maladies infectieuses en particulier les infections virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites uicératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, I'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, I'astUme, les scléroses multiples, I'ostéoporose, le psoriasis, I'arthrite rdumatode, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie. Les IFN sont particulièrement utilisés pour le traitement des hépatites chroniques B et C, des leucémies telles que la leucémie à tricholeucocytes et la leucémie myéloYde chronique, des myélomes multiples, des Iymphomes folliculaires, de tumeurs carcinodes, de mélanomes malins, de carcinomes rénaux métastasés ainsi que des tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA. Les IFNoc sont reconnus par la FDA (Food and Drug Administration) pour le traitement des verrues génitales ou vénériennes. Toutefois, les IFNa présentent de nombreux effets secondaires lorsqu'ils sont employés dans des compositions pharmaceutiques, tels que des résctions d'hypersensibilité aiguë (urticaire, broncho-constriction, choc anaphylactique, etc.), des arythmies cardiaques, des hypotensions artérielles, des crises d'épilepsie, des troubles des fonctions thyrodiennes ou des syndromes pseudo-grippaux (fièvres, sueurs, myalgies). La demanderesse a trouvé de nouveaux polypeptides et nouveaux polynucléotides analogues à l'lFNa-14, pouvant avoir une fonctionnalité différente de l'lFNoc-14 naturelle. Ces nouveaux polypoptides et polynucléotides peuvent notamment étre utilisés pour traiter ou prévenir les dérèglements ou maladies mentionnés précédemment et éviter tout ou partie des inconvénients qui leurs sont liés. L'INVENTION L'invention a pour premier objet de nouveaux polynucléotides qui diffèrent de la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence de l'lFNoc 14, en ce qu'ils comportent un ou plusieurs polymorphismes de type SNP (Single Nucleotide Polymorphism) fonctionnels. La séquence nucléotidique ID SEQ N 1 du gène IFNa-14 humain sauvage de référence est composée de 1784 nucléotides et comporte une séquence codante de 570 nucléotides, du nucléotide 936 (codon start) au nucléotide 1505 (codon stop). La demanderesse a ainsi identifié trois polymorphismes de type SNP fonctionnel codants dans la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence de l'lFNoc-14. Ces trois polymorphismes sont présentés ci-dessous: 1) Le nucléotide guanine (g) en position 1318 de la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 du gène sauvage de référence IFNa-14 est muté en adénine (a). Ce polymorphisme de type SNP est appelé ci-après g1318a. 2) Le nucléotide cytosine (c) en position 1423 de la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 du gène sauvage de référence IFNa-14 est muté en thymine (t). Ce polymorphisme de type SNP est appelé ci-après c1423t. 3) Le nucléotide cytosine (c) en position 1456 de la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 du gène sauvage de référence IFNoc-14 est muté en thymine (t). Ce polymorphisme de type SNP est appelé ci-après c1456t. Ces polymorphismes de type SNP fonctionnel (au sens de la présente invention) ont été chacun identifiés par la demanderesse sur la base du procédé de détermination décrit dans sa demande de brevet FR 00 22894, intitulée "Procédé de détermination d'un ou plusieurs polymorphisme(s) fonctionnel(s) dans la séquence nucléotidique d'un gène candidat fonctionnel présélectionné et ses applications" et déposée le 6 décembre 2000, citée ici à titre de référence. Le procédé décrit dans cette demande de brevet permet l'identification d'un (ou plusieurs) polymorphisme(s) de type SNP fonctionnel(s) prcexistant(s) dans au moins un individu constitutif d'une population aléatoire d'individus. Dans le cadre de la présente invention, un fragment de la séquence nucléotidique du gène IFNc-14, comprenant, par exemple, la séquence codante, a été isolé chez des individus dans une population d'individus choisis de manière aléatoire. Un séquençage de ces fragments a ensuite été réalisé sur certains de ces échantillons présentant un profil hétéroduplex (c'est à dire un profil différent de celui de la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence IFNc-14) après analyse par DHPLC ("Denaturing-High Performance Liquid Chromatography"; Chromatographie liquide haute performance en condition dénaturante). On a alors comparé les fragments ainsi séquencés à la séquence nucléotidique du fragment du gène IFNrx-14 sauvage de référence et identifier les polymorphismes de type SNP conforme à l'invention. Ainsi ces polymorphismes de type SNP fonctionnels sont naturels et chacun d'entre eux est présent chez certains individus de la population mond iale. Le gène IFNu-14 sauvage de référence code pour une protéine immature de 189 acides aminés, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, qui sera convertit en protéine mature de 166 acides aminés, par clivage du peptide signal qui comprend les 23 premiers acides aminés. Chacun des polymorphismes de type SNP de l'invention g1318a, c1423t et c1456t entrarnent des modifications de la protéine codée par la séquence nucléotidique du gène IFNcc-14 au niveau de la séquence d'acides aminés. Ces modifications dans la séquence d'acides aminés sont les suivantes: 1) Le polymorphisme de type SNP g1318a entrane une mutation de l'acide aminé glycine (G) en position 128 dans la protéine immature du gène IFNa-14, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, en acide glutamique (E) et en position 105 de la protéine mature. Dans la description de la présente invention, on appellera indifféremment G105E et G128E la mutation codée par le polymorphisme de type SNP de l'invention selon que l'on se réfère respectivement à la protéine mature ou à la protéine immature. 2) Le polymorphisme de type SNP c1423t entrane une mutation de l'acide aminé alanine (A) en position 163 dans la protéine immature du gène IFNoc14, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, en valine (V) et en position 140 de la protéine mature. Dans la description de la présente invention, on appellera indifféremment A140V et A163V la mutation codée par le polymorphisme de type SNP de l'invention selon que l'on se réfère respectivement à la protéine mature ou à la protéine immature. 3) Le polymorphisme de type SNP c1456t entrane une mutation de l'acide aminé sérine (S) en position 174 dans la protéine immature du gène IFNoc14, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, en phénylalanine (F) et en position 151 de la protéine mature. Dans la description de la présente invention, on appellera indifféremment S151F et S174F la mutation codée par le polymorphisme de type SNP de l'invention selon que l'on se réfère respectivement à la protéine mature ou à la protéine immature. Les polymorphismes de type SNP de l'invention entranent des modifications de la conformation spatiale des polypeptides conformes à l'invention par rapport au polypeptide codé par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence IFNoc-14. Ces modifications peuvent être observoes par modélisation moléculaire bioinformatique, selon des méthodes bien connues de l'homme du métier mettant en _uvre, par exemple, les outils de modélisation de novo (par exemple, SEQ FOLD/MS I), d'homologie (par exemple, MODELER/MSI), de minimisation des champs de force (par exemple, DISCOVER, DELPHI/MSI) eVou de dynamique moléculaire (par exemple, CFF/MSI). Des exemples de telles modélisations sont donnés ci-après dans la partie expérimentale. 1) La modélisation bio-informatique permet d'observer que la mutation G105E sur la protéine mutée mature entrane une déformation locale de la boucle dite "CD", qui relie les hélices C et D. La mutation G105E provoque l'apparition d'un pont hydrogène, entre l'atome d'oxygène du groupement carbonyle du résidu acide glutamique et l'atome d'azote du squelette peptidique du résidu isoleucine 54, qui participe à la rigidification de la boucle"CD". La modélisation bio-informatique permet ainsi de prévoir que la présence de l'acide aminé acide glutamique en position 105 entrane une modification significative de la structure et de la fonction de la protéine IFNa-14 naturelle. 2) La modélisation blo-informatique permet d'observer que la mutation A140V sur la protéine mutée mature entrane une modification de la structure tridimensionnelle de la fin de l'hélice D avec un déplacement du résidu proline 138. Les chanes latérales des résidus aspartate 32, tyrosine 130, Iysine 134 et sérine 137 changent également de conformations. De plus, la mutation A140V entrane aussi la formation d'un pont salin (D32-K134) avec une rigidification de la structure de la protéine IFN-14 mutée. La modélisation bio-informatique permet ainsi de prévoir que la présence de l'acide aminé valine en position 140 entraîne une modification significative de la structure et de la fonction de la protéine IFNoc-14 naturelle. 3) La modélisation blo-informatique permet d'observer que la mutation S151F sur la protéine mutée mature entrane une forte perturbation de l'hélice E. En effet, le résidu phénylalanine 151, qui possède un encombrement stérique plus important que le résidu sérine 151, provoque un réarrangement des acides aminés environnants. De plus, le cycle aromatique phénylalanine 151 augmente l'effet d u phénomène d'empilement pi (pi-stacking) avec les résid us environ nants (Phe43, Tyr123) d'o une rigidification de l'hélice E dans cette zone. Ainsi, la protéine mutée possède une conformation tridimensionnelle différente de la protéine IFNoc-14 naturelle. Par ailleurs, la modification de structure tridimensionnelle provoqué par la mutation S147F doit très certainement influer sur l'affinité de I'lFNcc-14 vis à vis de son récepteur. La modélisation blo-informatique permet ainsi de prévoir que la présence de l'acide aminé phénylalanine en position 151 entrane une modification significative de la structure et de la fonction de la protéine IFNrx-14 naturelle. Un génotypage des polyoucléotides conformes à l'invention peut également être effectué de façon à déterminer la fréquence allélique de ces polynucléotides dans une population. Un exemple de génotypage est donné, ci après, d a ns la pa rtie expé ri me nta le. La détermination de la fonctionnalité des polypeptides de I'invention peut également être effectuce par un test de leur activité blologique. A cet égard, on peut mesurer, par exemple, I'effet anti-prolifératif sur la lignée cellulaire de Daudi en présence de polypeptides conformes à l'invention en comparaison avec la protéine IFNx-14 naturelle. L'invention a aussi pour objet l'utilisation de polynucléotides et de polypeptides conformes à l'invention ainsi que de molécules thérapeutiques obtenues eVou identifices à partir de ces polynucléotides et polypeptides, notamment pour la prévention et le traitement de certains dérèglements eVou maladies humaines. La Figure 1 représente la modélisation de la protéine codée conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP G105E et de la protéine IFN-14 naturelle. La Figure 2 représente la modélisation de la partie supérieure de chacune des protéines représentées sur la Figure 1. Le ruban noir des Figures 1 et 2 représente la structure de la protéine l'lFNoc-14 naturelle. Le ruhan blanc des Figures 1 et 2 représente la structure de la protéine l'lFNcc-14 mutée (G105E). La Figure 3 représente la modélisation de la protéine codée conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP A140V et de la protéine l'IFN-14 naturelle. La Figure 4 représente la modélisation de la partie inférieure de chacune des protéines représentéss sur la Figure 3. Le ruban noir des Figures 3 et 4 représente la structure de la protéine l'IFN-14 naturelle. Le ruban blanc des Figures 3 et 4 représente la structure de la protéine l'lFNa-14 mutée (A140V). La Figure 5 représente la modélisation de la protéine codée conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP S151F et de la protéine l'lFNcc-14 naturelle. La Figure 6 représente la modélisation de la partie centrale de chacune des protéines représentées sur la Figure 5. Le ruban noir des Figures 5 et 6 représente la structure de la protéine l'lFNoc-14 naturelle. Le ruban blanc des Figures 5 et 6 représente la structure de la protéine l'IFN-14 mutée (S151F). La Figure 7 représente le résultat du génotypage du polymorphisme de type SNP g1318a dans une population d'individus. Sur cette figure, les abscisses représentent la valeur mp du filtre Tamra (ddTTP)et les ordonnées représentent la valeur mp du filtre R-110 (ddCTP). En haut à droite, le groupe hétérozygote CT contient 2 individus. En haut à gauche, le groupe homozygote CC contient 235 individus. En bas à gauche, le groupe d'individus contient 7 blancs et 2 individus non génotypés. La Figure 8 représente le résultat du génotypage du polymorphisme de type SNP c1423t dans une population d'individus. Sur cette figure, les abscisses représentent la valeur mp du filtre Tamra (ddATP)et les ordonnées représentent la valeur mp du filtre R-110 (ddGTP). En haut à droite, le groupe hétérozygote AG contient 4 individus. En haut à gauche, le groupe homozygote GG contient 232 individus. En bas à gauche, le groupe d'individus contient 7 blancs et 3 individus non génotypés. La Figure 9 représente le résultat du génotypage du polymorphisme de type SNP c1456t dans une population d'individus. Sur cette figure, les abscisses représentent la valeur mp du filtre Tamra (ddGTP)et les ordonnées représentent la valeur mp du filtre R-110 (ddATP). En haut à droite, le groupe hétérozygote AG contient 1 individu. En haut à gauche, le groupe homozygote GG contient 238 individus. En bas à gauche, le groupe d'individus contient 7 blancs. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Définitions On entend par "séquence nucléotidique du gène sauvage de référence", la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 du gène IFNx-14 humain. La séquence nucléotidique ID SEQ N 1 du gène IFNx-14 de 1784 nucléotides correspond à une séquence nucléotidique composée des 658 premiers nucléotides du clone HTG sous le numéro d'accès AL353732 suivie de 1126 nucléotides de la séquence nucléotidique accessible dans la GenBank sous le numéro d'accès X02959. On entend par"lFNa-14 naturelle" la protéine mature codée par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence. La protéine immature de l'lFNcc-14 naturelle correspond à la séquence peptidique ID SEQ N 2. On entend par "polynucléotide", un polyribonucléotide ou un polydésoxyribonucléotide qui peut être un ADN ou un ARN modifié ou non. Le terme polynucléotide inclut, par exemple, un ADN simple brin ou double brin, un ADN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brins, un ARN simple brin ou double brin et un ARN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brins. Le terme polynucléotide peut aussi comprendre un ARN eVou un ADN comprenant une ou plusieurs régions trip le brins. On entend également par polyn ucléotide les AD Ns et ARNs contenant une ou plusieurs bases modifices de façon à avoir un squelette modifié pour la stabilité ou pour d'autres raisons. On entend par base modifice, par exemple, les bases inhabituelles telles que l'inosine. On entend par "polypeptide", un peptide, un oligopeptide, un oligomère ou une protéine comprenant au moins deux acides aminés joints l'un à l'autre par une liaison peptidique normale ou modifiée, comme dans le cas des peptides isostères, par exemple. Un polypeptide peut être composé d'autres acides aminés que les acides aminés codés par les gènes humains. Un polypeptide peut également être composé d'acides aminés modifiés par des processus naturels, tel que le processus de maturation post-traductionnel ou par des procédés chimiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. De telles modifications sont bien détaillées dans la littérature. Ces modifications peuvent appara^tre n'importe o dans le polypeptide: dans le squelette peptidique, dans la chane d'acides aminés ou encore aux extrémités carboxy- ou amino-terminales. Un polypeptide peut être ramifié suite à une ubiquitination ou être cyclique avec ou sans ramification. Ce type de modifications peut être le résultat de processus de post-translation naturel ou synthétique, qui sont bien connus de l'homme du métier. On entend, par exemple, par modifications d'un polypoptide, I'acétylation, I'acylation, I'ADP-ribosylation, I'amidation, la fixation covalente de flavine, la fixation covalente d'un hème, la fixation covalente d'un nucléotide ou d'un dérivé nucléotidique, la fixation covalente d'un lipidé ou d'un dérivé lipidique, la fixation covalente d'un phosphatidylinositol, la réticulation covalente ou non-covalente, la cyclisation, la formation de pont disulfure, la déméthylation, la formation de cystéine, la formation de pyroglutamate, la formylation, la gamma-carboxylation, la glycosylation, la formation d'ancre au GPl, l'hydroxylation, l'iodisation, la méthylation, la myristoylation, l'oxydation, le processus protéolytique, la phosphorylation, la prénylation, la racémisation, la sénéloylation, la sulfatation, l'addition d'acides aminés telle que l'arginylation ou l'ubiquitination. De telles modifications sont bien détaillées dans la littérature: PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, New York, 1993, POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983, Seiffer et al. "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182:626-646 et Rattan et al. "Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62. On entend par "polynucléotide isolé" ou "polypeptide isolé" un polynucléotide ou un polypeptide tel que défini précédemment qui est isolé du corps humain ou autrement produit par un procédé technique. On entend par "identité", la mesure d'identité d'une séquence nucléotidique ou polypeptidique. L'identité est un terme bien connu de l'homme du métier et de la littérature. Voir COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., Ed., Oxford University Press, New York, 1998; BIOCOMPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECT, Smith, D.W., Ed., Academic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M. and Griffin H.G., Ed, Humana Press, New Jersey, 1994; et SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987. Les méthodes communément employées pour déterminer I'identité et la similarité entre deux séquences sont également bien décrites dans la littérature. Voir GUIDE TO HUGE COMPUTER, Martin J. Bishop, Ed, Academic Press, San Diepo, 1994, et Carillo H. and Lipton D., Siam J Applied Math (1988) 48:1073. Un polynucléotide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95 % avec la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 est un polynucléotide qui comporte au plus 5 points de mutation sur 100 nucléotides, par rapport à ladite séquence. Ces points de mutation peuvent être une (ou plusieurs) substitution(s), addition(s) et/ou délétion(s) d'un (ou plusieurs) nucléotide(s). De même, un polypeptide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95 % avec la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 est un polypeptide qui comporte au plus 5 points de mutation sur 100 acides aminés, par rapport à ladite séquence. Ces points de mutation peuvent être une (ou plusieurs) substitution(s), addition(s) eVou délétion(s) d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s). Les polynucléotides et les polypeptides conformes à l'invention qui ne sont pas totalement identique avec respectivement la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 ou la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, étant entendu que ces séquences comportent au moins l'un des polymorphismes de type SNP de l'invention, sont considérés comme des variants de ces sequences. Habituellement un polynucléotide conforme à l'invention possède la même, ou pratiquement la même activité biologique que la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 comportant au moins l'un des polymorphismes de type SNP de l'invention. De même, habituellement un polypeptide conforme à l'invention possède la même, ou pratiquement la même activité biologique que la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 comportant au moins l'un des polymorphismes de type SNP de l'invention. Un variant, selon l'invention, peut être obtenu, par exemple, par mutagenèse dirigée ou par synthèse directe. On entend par "polymorphisme de type SNP", toute variation naturelle d'une base dans une séquence nucléotidique. Un polymorphisme de type SNP, sur une séquence nucléotidique, peut être codant, silencieux, ou non codant. Un polymorphisme de type SNP codant est un polymorphisme compris dans la séquence codante d'une séquence nucléotidique qui entrane une modification d'un acide aminé dans la séquence d'acides aminés codée par cette séquence nucléotidique. Dans ce cas, le terme polymorphisme de type SNP s'applique également, par extension, à une mutation dans une séquence d'acides aminés. Un polymorphisme de type SNP silencieux est un polymorphisme compris dans la séquence codante d'une séquence nucléotidique qui n'entrane pas une modification d'un acide aminé dans la séquence d'acides aminés codée par cette séquence nucléotidique. Un polymorphisme de type SNP non codant est un polymorphisme compris dans la séquence non codante d'une séquence nucléotidique. Ce polymorphisme peut notamment se trouver dans un intron, une zone d'épissage, une séquence promotrice de transcription ou un site enhancer. On entend par "polymorphisme de type SNP fonctionnel", un polymorphisme de type SNP, tel que défini précédemment, qui est compris dans une séquence nucléotidique ou une séquence d'acides aminés, ayant une fonctionnalité. On entend par "fonctionnalité", I'activité blologique d'un polypeptide ou d'un polynucléotide codant pour ce polypoptide. La fonctionnalité d'un polypeptide ou d'un polynucléotide conforme à l'invention peut consister en une conservation, une augmentation, une diminution ou une suppression de l'activité biologique du polypeptide codé par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence ou de cette dernière séquence nucléotidique. La fonctionnalité d'un polypeptide ou d'un polynucléotide conforme à l'invention peut également consister en un changement de la nature de l'activité biologique du polypeptide codé par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence ou de cette dernière séquence nucléotidique. L'activité biologique peut, notamment, être liée à l'affinité ou à l'absence d'affinité d'un polypeptide conforme à l'invention vis-à-vis d'un récepteur. Polvnucléotide La présente invention a pour premier objet un polynucléotide isolé comprenant: a) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité, préférentiellement au moins 90 % d'identité, plus préférentiellement au moins 95 % d'identité et encore plus préférentiellement au moins 99 % d'identité avec la séquence ID SEQ N 1 ou sa séquence codante (du nucléotide 936 au nucléotide 1505), étant entendu que cette séquence nucléotidique comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - g1318a, - c1423t, - c1456t; ou b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique sous a). 11 est entendu, au sens de la présente invention, que la numérotationcorrespondant au positionnement des polymorphismes de type SNP g1318a, c1423t et c1456t est relative à la numérotation de la séquence nucléotidique ID SEQ N 1. La présente invention concerne également un polynucléotide isolé comprenant: a) la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 ou sa séquence codante, étant entendu que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - g1318a, - c1423t, - c1456t; ou b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique sous a). Préférentiellement, le polynucléotide de l'invention consiste en la séquence ID SEQ N 1 ou sa séquence codante, étant entendu que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - g1318a, - c1423t, - c1456t. Selon l'invention, le polynucléotide défini précédemment comporte préférentiellement un seul polymorphisme de type SNP choisi dans le groupe constitué par: - g1318a, - c1423t, et - c1456t. La présente invention a aussi pour objet un polynucléotide isolé codant pour un polypeptide comprenant: a) la séquence d'acides aminés iD SEQ N 2, ou b) la séquence d'acides aminés comprenant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - G 128E, - A163V, - S174F. Il est entendu, au sens de la présente invention, que la numérotation correspondant au positionnement des polymorphismes de type SNP G128E, A163V et S174F est relative à la numérotation de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2. Selon un objet préféré de l'invention, le polypeptide défini précédemment comporte un seul polymorphisme de type SNP tel que défini ci dessus. Préférentiellement un polynucléotide conforme à l'invention est composé d'une molécule d'ADN ou d'ARN. Un polynucléotide conforme à l'invention peut être obtenu par les méthodes standards de synthèse d'ADN ou d'ARN. Ce polynucléotide peut également être obtenu par mutagenèse dirigée à partir de la séquence nacléotidique du gène IFNoc-14 en modifiant l'un au moins des nucléotides g, c et c par respectivement les nucléotides a, t et t en position 1318,1423 et 1456 sur la séquence nucléotidique ID SEQ N 1. Les procédés de mutagenèse dirigée qui peuvent ainsi être mis en _uvre sont bien connus de l'homme du métier. On peut notamment évoquer la publication de TA Kunkel en 1985 dans "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 82:488. Un polynucléotide isolé peut également comprendre, par exemple, des séquences nucléotidiques codant pour des séquences d'acides aminés pre-, pro- ou pre-pro-protéine ou des séquences d'acides aminés marqueurs, comme l'hexa-histidine peptide. Un polynucléotide de l'invention peut également être associé à des séquences nucléotidiques codant pour d'autres protéines ou fragments de protéines en vue d'obtenir des protéines de fusion ou à des fins de purification. Un polynucléotide conforme à l'invention peut également comprendre des séquences nucléotidiques comme les séquences 5' eVou 3' non-codantes, telles que, par exemple, des séquences transcrites ou non, des séquences traduites ou non, des séquences signal d'épissage, des séquences polyadényléss, des séquences de liaison avec des ribosomes ou encore des séquences qui stabilisent l'ARNm. On définit comme séquence nucléotidique complémentaire à la séquence nucléotidique un polynucléotide qui peut être hybridé avec cette séquence nucléotidique, dans des conditions stringentes. On entend généralement, mais pas nécessairement, par "conditions stringentes d'hybridation" les conditions chimiques qui permettent une hybridation lorsque les séquences nucléotidiques ont une identité d'au moins 80 %, de préférence supérieure ou égale à 90 %, encore plus préférentiellement supérieure ou égale à 95 % et tout particulièrement supérieure ou égale à 97 %. Les conditions stringentes peuvent être obtenues selon les méthodes bien connues de l'homme du métier et, par exemple, par une incubation des polynucléotides, à 42 C, dans une solution comprenant 50 % de formamide, 5xSSC (150 Mm de NaCI, 15 mM de trisodium citrate), 50 Mm de sodium phosphate (pH = 7,6), 5x Solution Denhardt, 10 % de dextran sulfate et g d'ADN de sperme de saumon dénaturé, suivi d'un lavage des filtres à 0,1x SSC, à 65 C. Dans le cadre de l'invention, lorsque les conditions stringentes d'hybridation permettent une hybridation des séquences nucléotidiques ayant une identité égale à 100 %, on considère que la séquence nucléotidique est strictement complémentaire à la séquence nucléotidique sous a), telle que décrite plus haut. Il est bien entendu au sens de la présente invention que la séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence nucléotidique comportant l'un au moins des polymorphismes de type SNP conforme à l'invention en anti-sens. Ainsi, par exemple, si la séquence nucléotidique comporte le polymorphisme de type SNP g1318a, sa séquence nucléotidique complémentaire comporte toujours le nucléotide thymine (t) en position 1318. Identification, hvbridation eVou amplification d'un polvnucléotide comportant le polymorphisme de tvpe SNP La présente invention a aussi pour objet l'utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide défini précédemment, pour identifier, hybrider eVou amplifier tout ou partie d'un polynucléotide consistant en la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 ou sa séquence codante (du nucléotide 936 au nucléotide 1505), étant entendu que chacune de ce séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - g1318a, - c1423t, - c1456t. Génotvpage et détermination de la fréquence du polvmorphisme de type SNP La présente invention a également pour objet l'utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide conforme à l'invention comme outil de génotypage. La présente invention a. aussi pour objet un procédé de détermination de la fréquence du polymorphisme de type SNP d'un polynucléotide conforme à l'invention dans lequel on procède à un génotypage chez un individu ou dans une population d'individus. Au sens de l'i nvention, on défin it le génotypage com me u n procédé de détermination du génotype d'un individu ou d'une population d'individus. On entend par "population d'individus", un groupe d'individus déterminés de façon aléatoire ou non. Ces individus peuvent être des humains, des animaux, des micro-organismes ou des plantes. Les individus peuvent étre choisis selon leur ethnie ou selon leur phénotype, notamment ceux qui sont atteints par les dérèglements et/ou maladies suivantes: les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les Iymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, I'obésité, les maladies infectieuses comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites uicératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, I'anémie chez les patients dialysés, les allergies, I'asthme, les scléroses multiples, I'ostéoporose, le psoriasis, I'arthrite rhumatode, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie. Un polymorphisme de type SNP fonctionnel conforme à l'invention est préférentiellement génotypé dans une population d'individus. Il existe de multiples technologies de pouvant être mises en oeuvre pour génotyper des polymorphismes de type SNP génotypage (voir * notamment Kwok Pharmacogenomics, 2000, vol 1, pp 95-100. "High- throughput genotyping assay approaches"). Ces technologies sont basées sur l'un des quatre principes suivants: hybridation d'oligonucléotides spécifiques d'allèles, élongation d'un oligonucléotide par des didésoxynucléotides en présence ou non de désoxynucléotides, ligation d'oligonucléotides spécifiques d'allèles ou clivage d'oligonucléotides spécifiques d'allèles. Chacune de ces technologies peut être couplé à un système de détection tel que la mesure de la fluorescence directe ou polarisoe, ou la spectrométrie de masse. Le génotypage peut notamment être effectué par un miniséquençage avec des ddNTPs chauds (2 ddNTPs différents marqués par des fluorophores différents) et froids (2 ddNTPs non marqués), en liaison avec un lecteur de fluorescence polarisé. Le protocole de miniséquençage avec lecture de fluorescence polarisée (Technologie FP-TDI ou Fluorescence Polarization Template-direct Dye-Terminator Incorporation) est bien connu de I'homme du métier. Il peut être réalisé sur un produit obtenu après amplification par résction de polymérisation en charne (PCR) de l'ADN de chaque individu. Ce produit PCR est choisi pour couvrir la région génique du polynucléotide contenant le polymorphisme de type SNP étudié. Après la dernière étape dans le thermocycleur de la PCR, la plaque est alors placée sur un lecteur de fluorescence polarisée pour la lecture des bases marquées en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifique des fluorophores. Les valeurs d'intensité des bases marquées sont reportées sur un graphe. Les amorces respectivement sens et antisens pour l'amplification PC R. dans le cas d u polymorphisme de type SN P de l'invention, peuvent facilement être choisis par l'homme du métier selon la position des polymorphismes de type SNP conforme à l'invention. Par exemple, les séquences nucléotidiques sens et antisens pour l'amplification PCR peuvent être respectivement ID SEQ N 3 et ID SEQ N 4. Ces séquences nucléotidiques permettent d'amplifier un fragment d'une longueur de 677 nucléotides, du nucléotide 889 au nucléotide 1565 dans la séquence nucléotidique ID SEQ N 1. Une analyse statistique de la fréquence de chaque allèle (fréquence allélique) codé par le gène comportant le SNP dans la population d'individus est alors effectuée, ce qui permet de déterminer l'importance de leur impact et leur répartition dans les différents sous-groupes et notamment, le cas échéant, les diverses etUnies qui constituent cette population d'individus. Les données de génotypage sont analysoes pour estimer les fréquences de distributions des diKérents allèles observés dans les populations étudiées. Les calcuis de fréquences alléliques peuvent être réalisés à l'aide de logiciels tels SAS-suite (SAS) ou SPLUS (MathSoft). La comparaison des distributions alléliques du polymorphisme de type SNP de l'invention au travers des différentes ethnies de la population d'individus peut être réalisée au moyen des logiciels ARLEQUIN et SAS-suiteO. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention pour la recherche d'une variation dans la séquence nucléotidique du gène IFNa-14 chez un individu. Vecteur d'expression et cellule hôte La présente invention a aussi pour objet un vecteur recombinant comprenant au moins un polynucléotide conforme à l'invention. De nombreux systèmes d'expression peuvent être utilisés, comme, par exemple, les chromosomes, les épisomes, les virus dérivés. Plus particulièrement, les vecteurs recombinants utilisés peuvent être dérivés de plasm ides bactériens, de transposons, d 'épisome de levu re, d'éléments d'insertion, d'éléments chromosomiques de levures, de virus tels que les baculovirus, les papillonna virus comme SV40, les vaccinia virus, les adénovirus, les fox pox virus, les pseudorabies virus, les rétrovirus. Ces vecteurs recombinants peuvent également être des dérivés de cosmides ou de phagemides. La séquence nucléotidique peut être insérée dans le vecteur recombinant d'expression par les méthodes bien connues de I'homme du métier, telles que, par exemple, celles qui sont décrites dans MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (supra) Sambrook et al Le vecteur recombinant peut comprendre des séquences nucléotidiques de contrôle de la régulation de l'expression du polynucléotide ainsi que des séquences nucléotidiques permettant l'expression et la transcription d'un polynucléotide de l'invention et la traduction d'un polypeptide de l'invention, ces séquences étant choisies en fonction des cellules hôtes mises en _uvre. Ainsi, par exemple, un signal de sécrétion approprié peut être intégré dans le vecteur recombinant pour que le polypeptide, codé par le polynucléotide de l'invention, soit dirigé vers la lumière du réticulum endoplasmique, vers l'espace périplasmique, sur la membrane ou vers l'environnement extracellulaire. La présente invention a aussi pour objet une cellule hôte comprenant un vecteur recombinant conforme à l'invention. L'introduction du vecteur recombinant dans une cellule hôte peut être effectuée selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que celles décrites dans BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al., 1986 et MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, telles que la transfection par calclum phosphate, le transfection par DEAE dextran, la transvection, la microinjection, la transfection par lipides cationiques, I'électroporation, la transbuction ou l'infection. Les cellules hôtes peuvent être, par exemple, des cellules bactériennes telles que les cellules de streptocoque, de staphylocoque, d'E. coli ou de Bacillus subtilis, des cellules de champignons telles que les cellules de levure et les cellules d'Aspergillus, de Streptomyces, des cellules d'insectes telles que les cellules de Drosophilia S2 et de Spodoplera Sf9, des cellules animales, telles que les cellules CHO, COS, HeLa, C127, BHK, HEK 293 et des cellules humaines du sujet à traiter ou encore des cellules végétales. Les cellules hôtes peuvent être utilisoes, par exemple, pour exprimer un polypeptide de l'invention ou en tant que produit actif dans des compositions pharmaceutiques, comme on le verra ci-après. Polvpeptide La présente invention a aussi pour objet un polypeptide isolé comprenant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 % d'identité, préférentiellement au moins 90 % d'identité, plus préférentiellement au moins % d'identité et encore plus préférentiellement au moins 99 % d'identité avec: a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ou avec: b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - G128E, - A163V, - S174F. Le polypoptide de l'invention peut également comprendre: a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - G128E, - A163V, - S174F. Le polypeptide de l'invention peut tout particulièrement consister en: a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - G128E, - A163V, - S174F. Préférentiellement, un polypoptide conforme à l'invention comporte un seul polymorphisme de type SNP choisi dans le groupe constitué par: - G128E, - A163V, et - S174F. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un polypeptide ci-dessus décrit, dans lequel une cellule hôte définie précédemment est cultivée et ledit polypeptide est isolé du milieu de culture. Le polypeptide peut être purifié à partir des cellules hôtes, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la précipitation à I'aide d'agents chaotropiques comme les sels, en particulier le sulfete d'ammonium, I'éthanol l'acétone ou l'acide trichloroacétique, I'extraction à I'acide; la chromatographie échangeuse d'ions; la chromatographie par phosphocellulose; la chromatographie par interaction hydrophobe; la chromatographie d'affinité; la chromatographie hydroxylapatite ou les chromatographies d'exclusion. On entend par "milieu de culture", le milieu dans lequel on isole ou purifie le polypoptide de l'invention. Ce milieu peut être constitué par le milieu extracellulaire et/ou le Iysat cellulaire. Des techniques biens connues de l'homme du métier permettent également à ce dernier de redonner la conformation active au polypeptide, si la conformation dud it polypeptide a été altérée lors de l'isolation ou de la purification. Anticorps La présente invention a aussi pour objet un procédé d'obtention d'un anticorps immunospécifique. On entend par "anticorps", les anticorps monoclonaux, polyclonaux, chimériques, simple charne, humanisés ainsi que les fragments Fab, incluant les produits d'un Fab ou d'une banque d'expression d'immunoplobulines. Un anticorps immunospécifique peut être obtenu par immunisation d'un animal avec un polypeptide conforme à l'invention. L'invention concerne aussi un anticorps immunospécifique pour un polypeptide conforme à l'invention, tel que défini précédemment. Un polypeptide selon l'invention, un de ses fragments, un analogue, un de ses variants ou une cellule exprimant ce polypeptide peuvent aussi être utilisés pour produire des anticorps immunospécifiques. Le terme "immunospécifique" signifie que l'anticorps possède une meilleure affinité pour le polypeptide de l'invention que pour d'autres polypeptides connus de l'art antérieur. Les anticorps immunospécifiques peuvent être obtenus par administration d'un polypeptide de l'invention, d'un de ses fragments, d'un analogue ou d'un fragment épitopique ou d'une cellule exprimant ce polynucléotide chez un mammifère, de préférence non humain, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier. Pour la préparation d'anticorps monoclonaux, on peut utiliser des méthodes usuelles de production d'anticorps, à partir de lignées cellulaires, telles que la technique des hybridomes (Kohier et al., Nature (1975) 256:495 497), la technique des triomes, la technique des hybridomes de cellules B humaines (Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4:72) et la technique des hybridomes EBV (Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, 1985). Les techniques de production d'anticorps simple-chane telles que décrites, par exemple, dans le brevet US N 4,946, 778 peuvent être également utilisées. Des an ima ux transgén iq ues comme les sou ris, pa r exemp le, peuvent être également utilisés pour produire des anticorps humanisés. Agents interagissant avec le polvpeptide de l'invention La présente invention a également pour objet un procédé d'identification d'un agent activateur ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, comprenant: a) la mise en présence de cellules hôtes, telles que définies ci-dessus avec un agent à tester, et b) la détermination de l'effet activateur, ou inhibiteur, généré par l'agent à tester. Un polypeptide conforme à l'invention peut ainsi être employé pour un procédé de criblage de composés qui rentrent en interaction avec celui ci. Ces composés peuvent être des agents activateurs (agonistes) ou inhibiteurs (antagonistes) de l'activité intrinsèque d'un polypoptide selon l'invention. Ces composés peuvent également être des ligands ou des substrats d'un polypeptide de l'invention. Voir Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (2), Chapter 5 (1991). En général, pour mettre en place un tel procédé, il est d'abord souhaitable de produire des cellules hôtes appropriées qui expriment un polypeptide conforme à l'invention. De telles cellules peuvent être, par exemple, des cell ules de mamm ifères, de levures, d'insectes com me Drosophilia ou de bactéries comme E. coli. Ces cellules ou des extraits de membrane de ces cellules, sont alors mises en présence des composés à tester. On peut ainsi observer la capacité de liaison des composés à tester avec le polypeptide de l'invention, mais également l'inhibition ou I'activation de la réponse fonctionnelle. L'étape b) du procédé ci-dessus peut être mise en _uvre en utilisant un agent à tester marqué directement ou indirectement. Elle peut aussi comprendre un test de compétition, en utilisant un agent marqué ou non et un agent compétiteur marqué. On peut également déterminer si un agent à tester conduit à la génération d'un signal d'activation ou d'inhibition sur des cellules exprimant le polypeptide de l'invention, en utilisant des moyens de détection appropriés, suivant le signal à détecter. De tels agents activateurs ou inhibiteurs peuvent être des polynucléotides, et dans certains cas des oligonucléotides ou des polypeptides, comme des protéines ou des anticorps, par exemple. La présente invention a aussi pour objet une méthode pour l'identification d'un agent activé ou inhibé par un polypeptide conforme à l'invention, comprenant: a) la mise en présence de cellules hôtes obtenues comme décrit ci-dessus avec un agent à tester, et b) la déterm ination de l'effet activateur ou i n h ibiteu r, gé néré pa r led it polypeptide sur l'agent à tester. Un agent activé ou inhibé par le polypeptide de l'invention est un agent qui répond, respectivement, par une activation ou une inhibition en présence de ce polypeptide. Les agents activés ou inhibés, directement ou indirectement, par le polypeptide de l'invention peuvent consister en des polypeptides comme, par exemple, des récepteurs membranaires ou nucléaires, des kinases et plus préférentiellement des tyrosines kinases, des facteurs de transcription ou des polynucléotides. Détection de maladies La présente invention a aussi pour objet un procédé de détection de l'expression eVou de l'activité d'un polypeptide conforme à l'invention, comprenant: a) la détection de la présence ou de l'absence d'un polynucléotide selon l'invention dans le génome du sujet, eVou b) la détermination de la concentration d'un polypeptide selon l'invention chez un sujet. La détection d'un polynucléotide eVou la détermination de la concentration d'un polypeptide selon l'invention peut permettre de savoir si un sujet est atteint ou risque d'être atteint ou, au contraire, présente une résistance partielle au développement d'une maladie, d'une indisposition ou d'un dérèglement tels que définis précédemment, relatifs à l'expression d'un polypeptide de l'invention. La détection du polynucléotide, dans l'étape a) du procédé de détection mentionné ci-dessus, peut être réalisé à partir d'échantillons biologiques du sujet à étudier, tels que des cellules, du sang, de l'urine, de la salive, ou à partir d'une biopsie ou d'une autopsie du sujet à étudier. L'ADN génomique peut être utilisé directement pour la détection ou après à une amplification par PCR, par exemple. L'ARN ou l'ADNc peuvent également étre utilisés de façon similaire. Il est ensuite possible de comparer la séquence hucléotidique d'un polynucléotide conforme à l'invention avec la séquence nucléotidique détectée dans le génome du sujet. La comparaison des séquences nucléotidiques peut être effectuée par séquençage par des méthodes d'hybridation de l'ADN, par différence de mobilité des fragments d'ADN sur gel d'électrophorèse avec ou sans agents dénaturants ou par différence de températures de fusion. Voir Myers et al. , Science (1985) 230:1242. De telles modifications dans la structure de la séquence nucléotidique en un point précis peuvent également être révélées par des essais de protection aux nucléases, telles que l'ARNase et la nuclésse S1 ou encore par des agents chimiques de clivage. Voir Cotton et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1985) 85:4397-4401. Des sondes oligonucléotidiques comprenant un fragment d'un polynucléotide de l'invention peuvent également être utilisées pour conduire le criblage. De nombreuses méthodes bien connues de l'homme du métier peuvent être utilisées pour déterminer l'expression d'un polynucléotide de l'invention et pour identifier la variabilité génétique de ce polynucléotide. Voir Chee et al., Science (1996), Vol 274, pp 610-613. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention pour effectuer un diagnostic génétique d'une maladie ou d'une résistance à une maladie liée à la présence, chez un ou plusieurs individus de la population humaine, de l'allèle mutant codé par un polymorphisme de type SNP fonctionnel conforme à l'invention. Ces maladies peuvent être des dérèglements eVou des maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les Iymphomes, les myclomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, I'obésité, les maladies infectieuses en particulier virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites uicératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, I'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, I'asthme, les scléroses multiples, I'ostéoporose, le psoriasis, I'arthrite rhumatode, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie. La détermination de la concentration de polypeptide selon l'invention, dans l'étape b), peut également aider au diagnostic d'une maladie, d'une indisposition ou un dérèglement ou, au contraire, la résistance à une maladie, une indisposition ou un dérèglement chez un sujet en prélevant un échantillon dérivé de ce sujet. L'augmentation ou la diminution de l'expression du polypeptide peut étre mesurée en quantifiant le niveau d'ARN codant pour ce polypeptide, suivant les méthodes bien connues de l'homme du métier, par exemple, par PCR, RT-PCR, protection à l'ARNase, Northern blot, et autres méthodes d'hybridation. Il est également possible de déterminer la concentration en polypeptides de l'invention présents dans un échantillon biologique du sujet par des méthodes bien connues, par exemple, par radioimmunoessai, tests de liaisons compétitives, Western blot et tests ELISA. Consécutivement à l'étape b), on peut comparer la concentration déterminée en polypeptide conforme à l'invention avec la concentration en protéine IFN-14 naturelle habituellement rencontrée chez un sujet. L'homme du métier peut identifier le seuil au-dessus ou en dessous duquel appara'^t la sensibilité ou, au contraire, la résistance à la maladie, I'indisposition ou le dérèglement évoqué ci-dessus, à l'aide des publications de l'art antérieur ou par des tests ou des essais conventionnels, comme ceux qui sont mentionnés précédemment. Médicaments et traitements des maladies La présente invention a aussi pour objet un médicament renfermant, à titre de principe actif, un polypoptide conforme à l'invention. L'invention concerne encore l'utilisation d'un polypeptide conforme à l'invention, pour la fabrication d'un médicament destinée à la prévention ou au traitement de différents dérèglements eVou maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les Iymphomes, les myclomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, I'obésité, les maladies infectieuses en particulier virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, I'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, I'asthme, les scléroses multiples, I'ostéoporose, le psoriasis, I'arthrite rhumatode, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie. Préférentiellement, un polypeptide conforme à l'invention peut être utilisé pour la fabrication d'un médicament destinée à la prévention ou au traitement de différents dérèglements et/ou maladies humaines, tels que les hépatites chroniques B et C, les leucémies telles que la leucémie à tricholeucocytes et la leucémie myélode chronique, les myélomes multiples, des Iymphomes folliculaires, les tumeurs carcinodes, les mélanomes malins, les carcinomes rénaux métestasés, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ainsi que les tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA. Certains des composés permettant d'obtenir le polypeptide conforme à l'invention ainsi que les composés obtenus ou identifiés par ou à partir de ce polypeptide peuvent également être utilisés pour le traitement thérapeutique du corps humain, c'est-à-dire à titre de médicament. C'est pourquoi la présente invention a aussi pour objet un médicament contenant, à titre de principe actif un polynucléotide conforme à I'invention, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte définie précédemment, un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur eVou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention. L'invention concerne encore l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention, d'un vecteur recombinant défini précédemment, d'une cellule hôte définie précédemment, d'un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur eVou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, pour la fabrication d'un médicament destinée à la prévention ou au traitement de différents dérèglements eVou maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les Iymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas lices au système immunitaire comme, par exemple, I'obésité, les maladies infectieuses en particulier virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites uicératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, I'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, I'asthme, les scléroses multiples, I'ostéoporose, le psoriasis, I'arthrite rdumatode, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie. Préférentiellement, un polynucléotide conforme à l'invention, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte définie précédemment, un anticorps défini précédemment eVou un agent activateur eVou inKibiteur d'un polypoptide conforme à l'invention peuvent être utilisés pour la fabrication d'un médicament destinée à la préventiori ou au traitement de différents dérèglements eVou maladies humaines, tels que les hépatites chroniques B et C, les leucémies telles que la leucémie à tricholeucocytes et la leucémie myélode chronique, les myélomes multiples, des Iymphomes folliculaires, les tumeurs carcinodes, les mélanomes malins, les carcinomes rénaux métestasés, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ainsi que les tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA. Le dosage d'un polypeptide et des autres composés de l'invention, utiles en tant que principe actif, dépend du choix du composé, de l'indication thérapeutique, du mode d'administration, de la nature de la formulation, de la nature du sujet et du jugement du médecin. Lorsqu'il est utilisé comme principe actif, un polypeptide conforme à l'invention est généralement administré à des doses comprises entre 1 et 100 g/kg du sujet, par jour et selon le mode d'administration. L'invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique qui renferment au moins un composé précité, tel qu'un polypeptide conforme à l'invention, un polynucléotide conforme à l'invention, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte définie précédemment, un anticorps défini précédemment eVou un agent activateur eVou inhibiteur d'un polypoptide conforme à l'invention, à titre de principe actif, ainsi qu'un excipient pharmaceutiq uement acceptable. Dans ces compositions pharmaceutiques, le principe actif est avantageusement présent à des doses physiologiquement efficaces. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisoes en médecine humaine, comme par exemple les comprimés simples ou dragolfiés, les gélules, les granulés, les caramels, les suppositoires et de préférence les préparations injectables et les poudres pour injectables. Ces formes pharmaceutiques peuvent être préparées selon les méthodes usuelles. Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, I'amidon, le dextrose, le glycérol, I'éthanol, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émuisifiants, les conservateurs. Le ou les principes actifs conforme à l'invention peuvent être employés seul ou en combinaison avec d'autres composés, tels que des composés thérapeutiques tels que d'autres IFNs alpha, voire d'autres cytokines comme l'interleukine, par exemple. Les différentes formulations des compositions pharmaceutiques sont adaptées suivant le mode d'administration. Les compositions pharmaceutiques peuvent être administrées par les différentes voies d'administration connues de l'homme du métier. L'invention a également pour objet une composition de diagnostic qui renferment au moins un composé précité, tel qu'un polypeptide conforme à l'invention, un polynucléotide conforme à l'invention, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte définie précédemment, un anticorps défini précédemment eVou un agent activateur eVou inLibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, à titre de principe actif, ainsi qu'un excipient approprié pharmaceutiq uement acceptable. Les excipients appropriés utilisés dans la composition de diagnostic sont généralement des tampons et des conservateurs. La présente invention a également pour objet l'utilisation: a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent activateur défini précédemment eVou b) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide selon l'invention, eVou c) d'un polynucléotide selon l'invention, eVou d) d'une cellule hôte du sujet à traiter, définie précédemment, pour préparer un médicament destiné à augmenter l'expression ou l'activité chez un sujet, d'un polypeptide conforme à l'invention. Ainsi, pour traiter un sujet qui a besoin d'une augmentation de I'expression ou de l'activité d'un polypeptide de l'invention, plusieurs méthodes sont possibles. Il est possible d'administrer au sujet une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide de l'invention eVou d'un agent activateur et/ou activé tels que définis précédemment, éventuellement en combinaison, avec un excipient pharmaceutiquement acceptable. 11 est également possible d'augmenter la production endogène d'un polypeptide de l'invention par administration au sujet d'un polynucléotide selon l'invention. Par exemple, ce polynucléotide peut être inséré dans un vecteur rétroviral d'expression. Un tel vecteur peut être isolé à partir de cellules ayant été infectées par un vecteur de plasmide rétroviral contenant de l'ARN codant pour le polypeptide de l'invention, de telle façon pour que les cellules transduites produisent des particules virales infectieuses contenant le gène d'intérêt. Voir Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, Chapter 20, in Human Molecular Genetics, Strachan and Read, BIOS Scientifics PublisLers Ltd (1996). 11 est également possible d'administrer au sujet des cellules hôtes lui appartenant, ces cellules hôtes ayant été prélevées et modifiées, au préalable, de façon à exprimer le polypeptide de l'invention, comme décrit précédemment. La présente invention concerne également l'utilisation a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent inhibiteur défini précédemment, eVou b) d'une quantité thérapeutiquement effficace d'un anticorps immunospécifique défini précédemment, eVou c) d'un polynucléotide permeffant d'inhiber l'expression d'un polynucléotide conforme à l'invention, pour préparer un médicament destiné à diminuer l'expression ou l'activité, chez un sujet, d'un polypeptide conforme à l'invention. Ainsi, il est possible d'administrer au sujet une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent inhibiteur eVou d'un anticorps tels que définis précédemment, éventuellement en combinaison, avec un excipient pharmaceutiq uement acceptable. Il est également possible de diminuer la production endogène d'un polypeptide de l'invention par administration au sujet d'un polynucléotide complémentaire conforme à l'invention permettant d'inhiber l'expression d'un polynucléotide de l'invention. AUTRES POLYMORPHISMES DE TYPE SNP La demanderesse a également identifié deux polymorphismes de type SNP silencieux c1298a et g1397a dans la séquence codante de la séquence nucléotidique ID SEQ N 1, qui n'entranent pas de modification dans la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 de la protéine immature du gène IFNcc14 (alanine (A) en position 121 pour le polymorphisme de type SNP c1298a et leucine (L) en position 154 pour le polymorphisme de type SNP g 1397a). La demanderesse a aussi identifié 6 polymorphismes de type SNP dans la séquence non codante de la séquence nucléotidique ID SEQ N 1. Ces polymorphismes sont les suivants: g451c, c542t, c742g, c804t, a875g et g1512a. Les lettres a, t, c et g pour les polymorphismes de type SNP mentionnés précédemment signifient respectivement adénine, thymine, cytosine et guanine. Sauf indication contraire, les numérotations cidessus font référence au positionnement des polymorphismes de type SNP mentionnés précédemment sur la séquence nucléotidique ID SEQ N 1. PARTIE EXPERIMENTALE Exemple 1: Modélisation d'une protéine codée par un polynocléotide de séquence nucléotidique comportant un polymorphisme de tYpe SNP q1318a. c1423t ou c1456t et de la protéine codée par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence Dans une première étape la structure tridimensionnelle de IFN- 14 a été construite à partir de celle de IFNoc-2 dont la structure est disponible dans la base de données PDB (code 1 ITF) et ce en utilisant le logiciel Modeler (MSI, San Diego, CA). Le fragment polypeptidique mature a ensuite été modifié de façon à reproduire la mutation G105E, A140V ou S151 F. Un millier d'étapes de minimisations moléculaires ont été conduites sur ce fragment muté en utilisant les programmes AMBER et DISCOVER (MSI: Molecular Simulations Inc.). Deux suites de calcuis de dynamiques moléculaires ont ensuite été effectuées avec le même programme et les mêmes champs de forces. Dans chaque cas, 50000 étapes ont été calculées à 300 K, terminées par 300 étapes d'équilibration. Le résultat de cette modélisation est visualisé sur les Figures 1, 2, 3, 4, 5 et 6. Exemple 2: Génotypaqe des polymorphismes de type SNP g1318a, c1423t et c1456t dans une population d'individus Le génotypage de SNPs est basé sur le principe du miniséquençage dont le produit est détecté par une lecture de fluorescence polarisée. La technique consiste en un miniséquençage fluorescent (Technologie FP-TDI ou Fluorescence Polarization Templatedirect Dye terminator Incorporation). Le miniséquençage consiste à allonger un oligonucléotide amorce, placé juste en amont du site du polymorphisme de type SNP, par des didéoxynucléotides fluoromarqués à l'aide d'une enzyme polymérase. Le produit résultant de cet allongement est directement analysé par une lecture de fluorescence polarisée. Le génotypage requiert 5 étapes: 1) Amplification par PCR 2) Purification du produit de PCR par digestion enzymatique 3) Elongation de l'oligonucléotide amorce 4) Lecture ) Interprétation de la lecture Les étapes de génotypage 1 et 2 sont réalisses de manière identique pour chacun des polymorphismes de type SNP g1318a, c1423t et c1 456t Les étapes 3, 4 et 5 sont spécifiques à chacun de ces polymorphismes. 1) L'amplification PCR de la séquence nucléotidique du gène IFNcc-14 est effectuée à partir de d'ADN génomique provenant de 239 individus d'origine ethniques diverses. Ces ADNs génomiques ont été fournis par l'lnstitut Coriell aux Etats-Unis. Les 239 individus se répartissent comme suit: POPULATION DESCRIPTION NOMBRE D'INDIVIDUS 1 Afro Américain 50 2 Amérindien du Sud Ouest 5 3 Sud Américain (Andes) 10 4 Caribéen 10 Caucasien 50 6 Chinois 10 7 Grec 8 8 Ibérien 10 9 Italien 10 Japonais 10 11 Mexicain 10 12 Moyen-Orient 20 13 Individus du Pacifique 7 14 I ndo-Pakistanais 9 Sud Américain 10 16 Asie du Sud 10 L'ADN génomique issu de chacun des individus constitue un échantillon. L'amplification PCR est réalisée à partir des amorces suivantes: IDSEQN 3etlDSEQN 4. Ces séquences nucléotidiques permettent d'amplifier un fragment d'une longueur de 677 nucléotides, du nucléotide 889 au nucléotide 1565 dans la séquence nucléotidique ID SEQ N 1. Le volume réactionnel total mis en _uvre pour l'âmplification PCR est de 5 pI par échantillon. Ce volume résctionnel est composé par les réactifs indiqués dans le tableau suivant: Fourn isseur Référence Réactif Conc. Vol. par Conc. initiale tube ( Ill) finale Life Technologie Livré avec Taq Tampon (X) 10 0,5 1 Life Technologie Livré avec Taq MgSO4 (mM) 50 O,2 2 AP Biotech 27-2035-03 dNTPs (mM) 10 0,1 0,2 Sur demande Amorce F ( M) 10 0, 1 0,2 ID SEQ N 3 Sur demande Amorce R (,uM) 10 0,1 0,2 ID SEQ N 4 Life Technologie 1 1304-029 Taq platinium 5U/ lli 0,02 0,1 U/ réaction H2O Qsp 5,ul 1,98 ADN 2,5 ng/ ul 5 ngl (échantillon) réaction Volume total 5 pl Ces réactifs sont distribués dans une plaque PCR noire à 384 puits fournie par ABGene (ref:TF-0384-k). La plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 (Tetrad de MJ Rescarch) et subit l'incubation suivante: Cycles de PCR: 1 min à 94 C, suivi de 36 cycles composés de 3 étapes (15 sec. à 94 C, 30 sec. à 56 C, 1 min. à 68 C). 2) L'amplifiat PCR est ensuite purifié à l'aide de deux enzymes: la phosphatase alcaline de crevette (ou Shrimp Alkaline Phosphatese SAP) et I'exonucléase I (Exo I). La première de ces enzymes permet la déphosphorylation des dNTPs non incorporés au cours de l'amplification PCR, tandis que la seconde élimine les résidus simple brin d'ADN, en particulier les amorces non utilisées au cours de la PCR. Cette digestion se fait par addition dans chaque puits de la plaque PCR d'un mélange réactionnel de 5,ul par échantillon. Ce mélange réactionnel est composé des réactifs suivants: Fourn isseur Référence Réactif Conc. Vol. par Conc. initiale tube ( ul) finale AP Biotech E70092X SAP 1 U/,ul O,5 réaction AP Biotech 070073Z Exo I 10 U/,ul O,1 réaction AP Biotech Fourni Tampon 10 0, 5 1 avec SAP SAP (X) H2O Qsp 5,ul 3,9 PCR 5,ul amplifiat Vol total 10,ul Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante: Digestion SAP-EXO:45 min à 37 C, 15 min à 80 C. L'étape d'élongation ou de miniséquençage est ensuite réalisoe sur ce produit de PCR digéré, par addition d'un mélange réactionnel de 5 uL par échantillon préparé. Le miniséquençage 3) et les étapes de lecture 4) et d'interprétation de lecture 5) sont spécifiques à chaque polymorphisme de type SNP g1318a, c1423t et c1456t. Toutes ces étapes sont décrites ci-après pour chacun de ces polymorphismes. 3.1) Polymorphisme de type SNP g1318a L'étape d'élongation ou de miniséquençage est ensuite réalisée comme indiqué dans le tableau suivant: Fourn isseu r Référence Réactif Conc Vo' par Conc. Propre Tampon Elongation 5 1 1 préparation (X) L.fe Amorce Miniseq Technologies Sur demande ( uM) 10 0,5 1 AP Biotech 27-2051 ddNTPs? ( juM) 2,5 025 0,125 (61,71,81)-01 2 non marqués de chaque de chaque e Ne 47Z/5 ddNTPsz ( I3M c chaque 0,25 de chaque AP Biotech E79000Z Thermo- sequenase 3,2 U/ pl 0,125 réaction H20 Qsp 5 p1 3,125 PCR digérée 10 pl Vol total 15 pl Le tampon élongation: Le tampon élongation 5X est composé de Tris-HCI pH 9 à 250 mM, de KCI à 250 mM, de NaCI à 25 mM, de MgCI2 à 10 mM et de glycérol à 40 %. 2 ddNTPs: Pour les ddNTPs, un mélange des 4 bases est réalisé en fonction du polymorphisme étudié. Seulement les 2 bases d'intérêts TIC) composant le polymorphisme de type SNP fonctionnel portent un marquage, soit en Tamra, soit en R110. Le mélange de ddNTPs est composé de: - 2,5 IJM de ddATP non marqué, - 2,5 IJM de ddGTP non marqué, - 2,5,uM de ddTTP (1,875 M de ddTTP non marqué et 0,625 IJM de ddTTP marqué au Tamra), - 2,5,uM de ddCTP (1,875,uM de ddCTP non marqué et 0,625 IJM de ddCTP marqué au R110). Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placce dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit I'incubation suivante: Cycles d'élongation: 1 min. à 93 C, suivi de 35 cycles composés de 2 étapes (10 sec. à 93 C, 30 sec. à 55 C). Après la dernière étape dans le thermocycleur, la plaque est directement placée sur un lecteur de fluorescence polarisée de type Analyst HT de LJL Biosystems Inc.. La plaque est lue à l'aide du logiciel Criterion HostO en utilisant deux méthodes. La première permet de lire la base marquse en Tamra en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 550-10 nm, émission 580-10 nm) et la seconde permet de lire la base marquée en R110 en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 49010 nm, émission 520 nm). Dans les deux cas, un miroir double dichroque (R110/Tamra) est utilisé et les autres paramètres de lecture sont: Zheight: 1,5 mm Attenuator: out Temps d'intégration: 100,000,usec. Raw data units: counts/sec Switch polarization: by well Plate seffling time: O msec PMT setup: Smart Read (+), sensitivity 2 Dynamic polarizer: emission Static polarizer: S Un fichier résultat est alors obtenu contenant les valeurs calculées de mP (milliPolarization) pour le filtre Tamra et celle pour le filtre R110. Ces valeurs de mP sont calculées à partir des valeurs d'intensité obtenues sur le plan parallèle(//) et sur le plan perpendiculaire (l) d'après la formule suivante: mP =1000(//- gl)l(ll + gl). Dans ce calcul, la valeur l est pondérée d'un facteur g. Celui-ci est un paramètre machine qui doit être déterminé préalablement expérimentalement. 4.1) et 5.1) Interprétation de la lecture et détermination des génotypes. Les valeurs de mP sont reportées sur un graphe à l'aide du logiciel Excel de Microsoft Inc., eVou du logiciel Allele Caller développé par LJL Biosystems Inc.. En abscisse est indiquée la valeur de mP de la base marquée au Tamra, en ordonnée est indiquée la valeur de mP de la base marquée au R110. Une forte valeur de mP indique que la base marquée avec ce fluorophore est incorporée et, inversement, une faible valeur de mP révèle l'absence d'incorporation de cette base. On obtient jusqu'à trois groupes homogènes de séquences nucléotidiques ayant des génotypes différents, comme indiqué dans la Figure 7. L'utilisation du logiciel Allele Caller permet, une fois le repérage des différents groupes réalisé, d'extraire directement le génotype défini pour chaque individu sous forme d'un tableau. Les séquences des deux amorces de miniséquençage nocessaires pour le génotypage ont été déterminées de façon a être placées en amont du site du polymorphisme de type SNP. Le produit de PCR qui comporte le polymorphisme de type SNP étant un produit d'ADN double brin, le génotypage peut donc se faire soit sur le brin sens soit sur le brin antisens. Les amorces sélectionnées sont fabriquées par Life Technologies Inc. Les amorces du miniséquençage sont les suivantes: 1 5 Amorce sens: (A): ctgtgtgatacaggaggffg Amorce antisens: (B): tcaggggagtctcffccacc Le miniséquençage du polymorphisme de type SNP g1318a a d'abord été validé sur 16 échantillons, puis génotypé sur l'ensemble de la population d'individus composée de 239 individus et 7 blancs. Conditions de miniséquençage testées: Condition N 1: Amorce sens + ddGTPR110 + ddATP-Tamra Condition NQ 2: Amorce sens + ddATP-R110 + ddGTP-Tamra Condition N 3: Amorce antisens + ddCTP-R110 + ddTTP-Tamra Condition N 4: Amorce antisens + ddTTP-R110 + ddCTP-Tamra Ces 4 conditions ont été testées et la condition N 3 a été retenue pour le génotypage. Résultats du miniséquençage pour le polymorphisme de tvoe SNP g1318a Après la réalisation compiète du processus de génotypage, la détermination des génotypes des individus de la population d'individus pour la SNP fonctionnel étudié ici a été réalisée à l'aide du graphe représenté à la Figure 7. Ce génotype est en théorie soit homozygote CC, soit hétérozygote CT, soit homozygote TT chez les individus testés. En réalité et comme montré ci-dessous, le génotype homozygote TT n'est pas détecté dans la population d'individus. Les résultats des contrôles, de la répartition des génotypes déterminés dans la population d'individus et le calcul des différentes fréquences alléliques pour ce polymorphisme de type SNP fonctionnel sont présentés dans les tableaux suivants: Nombre d'individus Nombre de blanc Pourcentage de testés | génotypés testés | validés réussite 239 1 237 7 1 7 99,2 * È À '0, t C]n c _ Z u' o 0 t 0 03 0 0 0 o, C=M O) O O C o O O O N O O O O O O o O O O O Z o 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Cl -= O O O O O O O O- 0 0 0 0- 0 0 O O O' Z O O O O O O O O O O O O O O O O O IL O O O' O O. O- O O O O O O O O- O O N N N N N N N _Z o 0 0 0 0 o3 0 0 0 0 N _ O O N n È È 7 2] 4, Dans ie tableau cidessus, - N représente le nombre d'individus, - % rep résente le pourcentage d 'i nd ivid us dans la sous-population spécifiq ue, - la fréquence allélique représente le pourcentage de l'allèle muté dans la sous population spécifique, - 95 % IC représente l'intervalle minimal et maximal de confiance à 95 %. Il faut préciser que l'allèle c lu en antisens correspond à l'allèle g lu en sens, soit à la présence d'un G en position 128 de la séquence de la protéine immature de l'lFNoc-14 et donc que l'allèle t lu en antisens correspond à l'allèle a lu en sens correspondant à un E pour cette position dans la séquence de la protéine correspondante. En examinant ces résultats par population, on constate que les 2 individus hétérozygotes CT sont issus des sous-populations caucasienne et mexicaine de la population d'individus. 3.2) Polymorphisme de type SNP c1423t L'étape d'élongation ou de miniséquençage est réalisée comme indiqué dans le tableau suivant: Fou rn s Seu r Réactif Co nc Vol. par Conc. Propre Tampon Elongation 5 1 1 préparation (X) Amorce Miniséq Technologies Sur demande ( IM) 10 0,5 1 C ou D AP Biotech 27-2051 ddNTPs (,uM) 2,5 025 0,125 (61,71,81)-01 2 non marques de chaque de chaque NEN Nel 472/5 2 marqués 5 0,25 0 125 et Nel 492/5 Tamra et R110 de c, aq de chaque AP Biotech E79000Z Thermo-sequenase 3,2 U/ pl 0, 125 ré0a4tiUo/n H20 Qsp 5,u1 3,125 PCR digérée 10,ul Vol total 15 pl Le tampon élongation: Le tampon élongation 5X est composé de Tris-HCI pH 9 à 250 mM, de KCI à 250 mM, de NaCI à 25 mM, de MgCI2 à 10 mM et de glycérol à 40 %. 2 ddNTPs: Pour les ddNTPs, un mélange des 4 bases est réalisé en fonction du polymorphisme étudié. Seulement les 2 bases d'intérêts Adenine/ Guanine>) composant le polymorphisme de type SNP fonctionnel portent un marquage, soit en Tamra, soit en R110. Le mélange de ddNTPs est composé de: - 2,5 M de ddCTP non marqué, - 2,5 M de ddTTP non marqué, 1 0 - 2,5 M de ddATP (1,875 llM de ddATP non marqué et 0,625 M de ddATP marqué au Tamra), - 2,5 M de ddGTP (1,875 M de ddGTP non marqué et 0,6251JM de ddGTP marqué au R110). Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placoe dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Rescarch) et subit I'incubation suivante: Cycles d'élongation: 1 min. à 93 C, SUiVi de 35 cycles composés de 2 étapes (10 sec. à 93 C, 30 sec. à 55 C). Après la dernière étape dans le thermocycleur, la plaque est directementplacée sur un lecteur de fluorescence polarisée de type Analyst HT de LJL Biosystems inc.. La plaque est lue à l'aide du logiciel Criterion Host en utilisant deux méthodes. La première permet de lire la base marquée en Tamra en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 550-10 nm, émission 580-10 nm) et la seconde permet de lire la base marquce en R110 en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 49010 nm, émission 520 nm). Dans les deux cas, un miroir double dichroque (R110/Tamra) est utilisé et les autres paramètres de lecture sont: Zheight: 1,5 mm Attenuator: out Temps d'intégration: 100,000,usec. Raw data units: counts/sec Switch polarization: by well Plate settling time: O msec PMT setup: Smart Read (+), sensitivity 2 Dynamic polarizer: emission Static polarizer: S Un fichier résultat est alors obtenu contenant les valeurs calculées de mP pour le filtre Tamra et celle pour le filtre R110. Ces valeurs de mP sont calculées à partir des valeurs d'intensité obtenues sur le plan parallèle(//) et sur le plan perpendiculaire (l) d'après la formule suivante: mP =1000(//- gl)l(ll + gl). Dans ce calcul, la valeur l est pondérée d'un facteur g. Celui-ci est un paramètre machine qui doit être déterminé préalablement expérimentalement. 4.2) et 5.2) Interprétation de la lecture et détermination des génotypes. Les valeurs de mP sont reportées sur un graphe à l'aide du logiciel Excel de Microsoft Inc., eVou du logiciel Allele CallerO développé par LJL Biosystems Inc.. En abscisse est indiquce la valeur de mP de la base marquée au Tamra, en ordonnée est indiquée la valeur de mP de la base marquée au R110. Une forte valeur de mP indique que la base marquée avec ce fluorophore est incorporée et, inversement, une faible valeur de mP révèle l'absence d'incorporation de cette base. On obtient jusqu'à trois groupes homogènes de séquences nucléotidiques ayant des génotypes différents, comme indiqué dans la Figure 8. L'utilisation du logiciel Allele CallerO permet, une fois le repérage des différents groupes réalisé, d'extraire directement le génotype défini pour chaque individu sous forme d'un tableau. Les séquences des deux amorces de miniséquençage nécessaires pour le génotypage ont été déterminées de façon a être placées en amont du site du polymorphisme de type SNP. Le produit de PCR qui comporte le polymorphisme de type SNP étant un produit d'ADN double brin, le génotypage peut donc se faire soit sur le brin sens soit sur le brin antisens. Les amorces sélectionnées sont fabriquées par Life Technologies Inc. Les amorces du miniséquençage sont les suivantes: Amorce sens: (C): gaagaaatacagcccttgtg Amorce antisens: (D): ctgctctgacaacctcccag Le miniséquençage du polymorphisme de type SNP c1423t a d'abord été validé sur 16 échantillons, puis génotypé sur l'ensemble de la population d'individus composée de 239 individus et 7 blancs. Conditions de miniséquençage testées: Condition N 1: Amorce sens + ddCTPR110 + ddTTP-Tamra Condition N 2: Amorce sens + ddTTP-R110 + ddCTP-Tamra Condition N 3: Amorce antisens + ddGTP-R110 + ddATP-Tamra Condition N 4: Amorce antisens + ddATP-R110 + ddGTP-Tamra Ces 4 conditions ont été testées et la condition N 3 a été retenue pour le génotypage. Résultats du miniséquençage pour le polvmorphisme de tvpe SNP c1423t Après la réalisation complète du processus de génotypage, la détermination des génotypes des individ us de la population d'individ us pour la SNP fonctionnel étudié ici a été réalisoe à l'aide du graphe représenté à la Figure 8. Ce génotype est en théorie soit homozygote GG, soit hétérozygote GA, soit homozygote M chez les individus testés. En réalité et comme montré ci-dessous, le génotype homozygote M n'est pas détecté dans la population d'individus. Les résultats des contrôles, de la répartition des génotypes déterminés dans la population d'individus et le calcul des différentes fréquences alléliques pour ce polymorphisme de type SNP fonctionnel sont présentés dans les tableaux suivants: Nom bre d'individus Nom bre de blanc Pourcentage de | testés | génotypés testés | validés réussite 239 1 236 7 1 7 98,3 l r n 1: Z to o, so 0 to C=M 0 0 ta9 a: O O O O O _- O O O O O o- = z 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 of at O O O O' O O O O O O O On O O O O O z 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEL o = A t:= IL o o O ô o ô ô o O ô ô ô ô ô ô ô "o) 0 N N N N N N N (1 N O) CO N _ _ Z 1M O O O O O O 1 O O N È. =.m.: :) L _m == Dans le tableau ci-dessus, - N représente le nombre d'individus, - % rep résente le pou rcentage d ' ind ivid us da ns la sous-pop u lation spécifiq ue, - la fréquence allélique représente le pourcentage de l'allèle muté dans la sous population spécifique, - 95 % IC représente l'intervalle minimal et maximal de confiance à 95 %. Il faut préciser que l'allèle g lu en antisens correspond à l'allèle c lu en sens, soit à la présence d'un A en position 163 de la séquence protéique immature IFNoc-14 et donc que l'allèle a lu en antisens correspond à l'allèle t lu en sens correspondant à un V pour cette position dans la séquence de la protéine correspondante. En examinant ces résultats par population, on constate que les 4 individus hétérozygotes GA sont issus des sous-populations afro- américaine, caucasienne et ibérienne de la population d'individus. 3.3) Polymorphisme de type SNP c1456t L'étape d'élongation ou de miniséquençage est réalisée comme indiqué dans le tableau suivant: Frn cce Rr'e Réactif in '' aio Vol. par Conc. Propre Tampon Elongation 5 1 1 préparation (X) Life Amorce Miniseq Tecinologies Sur demande E ou F 10 0,5 1 AP Biotech 27-2051 ddNTPs ( M) 2, 5 025 0,125 (61,71,81)-01 2 non marques de chaque de chaque i NEN ct N 492/S ddNTPsj ( IM) de Àuo 0 25 0,125 AP Biotech E79000Z Thermo- sequenase 3,2 Ul pl I 0,125 réaction _ H20 Qsp 5 p1 3,125 PCR digérée 10, ul Vol total 15 pl I Le tampon élongation: Le tampon élongation 5X est composé de Tris-HCI pH 9 à 250 mM, de KCI à 250 mM, de NaCI à 25 mM, de MgCI2 à 10 mM et de glycérol à 40 %. 2 ddNTPs: Pour les ddNTPs, un mélange des 4 bases est réalisé en fonction du polymorphisme étudié. Seulement les 2 bases d'intérêts Adenine/Guanine) composant le polymorphisme de type SNP fonctionnel portent un marquage, soit en Tamra, soit en R110. Le mélange de ddNTPs est composé de: - 2,5 IJM de ddCTP non marqué, - 2,5,uM de ddTTP non marqué, - 2,5 IJM de ddATP (1,875 M de ddATP non marqué et 0,625,uM de ddATP marqué au Tamra), - 2,5 IJM de ddGTP (1,875,uM de ddGTP non marqué et 0,625 IJM de ddGTP marqué au R110). Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Ressarch) et subit I'incubation suivante: Cycles d'élongation: 1 min. à 93 C, SUiVi de 35 cycles composés de 2 étapes (10 sec. à 93 C, 30 sec. à 55 C). Après la dernière étape dans le thermocycleur, la plaque est directement placée sur un lecteur de fluorescence polarisée de type AnalystO HT de LJL Biosystems Inc.. La plaque est lue à l'aide du logiciel Criterion Host en utilisant deux méthodes. La première permet de lire la base marquée en Tamra en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 550-10 nm, émission 580-10 nm) et la seconde permet de lire la base marquée en R110 en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 490-10 nm, émission 520 nm). Dans les deux cas, un miroir double dichroque (R110/Tamra) est utilisé et les autres paramètres de lecture sont: Z-height: 1,5 mm Attenuator: out Temps d'intégration: 100,000,usec. Raw data units: counts/sec Switch polarization: by well Plate settling time: O msec PMT setup: Smart Read (+), sensitivity 2 Dynamic polarizer: emission Static polarizer: S Un fichier résultat est alors obtenu contenant les valeurs calculées de mP pour le filtre Tamra et celle pour le filtre R110. Ces valeurs de mP sont calculées à partir des valeurs d'intensité obtenues sur le plan parallèle(//) et sur le plan perpendiculaire (L) d'après la formule suivante: mP =1000(// - gL)I(II + gL). Dans ce calcul, la valeur L est pondérée d'un facteur g. Celui-ci est un paramètre machine qui doit être déterminé préalablement expérimentalement. 4.3) et5.3) Interprétation de la lecture et détermination des génotypes. Les valeurs de mP sont reportées sur un graphe à l'aide du logiciel Excel de Microsoft Inc., eVou du logiciel Allele Caller développé par LJL Biosystems Inc.. En abscisse est indiquée la valeur de mP de la base marquée au Tamra, en ordonnée est indiquée la valeur de mP de la base marquée au R110. Une forte valeur de mP indique que la base marquée avec ce fluorophore est incorporce et, inversement, une faible valeur de mP révèle l'absence d'incorporation de cette base. On obtient jusqu'à trois groupes homogènes de séquences nucléotidiques ayant des génotypes différents, comme indiqué dans la Figure 9. L'utilisation du logiciel Allele CallerO permet, une fois le repérage des différents groupes réalisé, d'extraire directement le génotype défini pour chaque individu sous forme d'un tableau. Les séquences des deux amorces de miniséquençage nécessaires pour le génotypage ont été déterminées de façon a être placées en amont du site du polymorphisme de type SNP. Le produit de PCR qui comporte le polymorphisme de type SNP étant un produit d'ADN double brin, le génotypage peut donc se faire soit sur le brin sens soit sur le brin antisens. Les amorces sélectionnées sont fabriquées par Life Technologies Inc. Les amorces du miniséquençage sont les suivantes: 1 5 Amorce sens: (E): cagagcagasatcatgagat Amorce antisens: (F): agmgttgaaaaagagagg Le miniséquençage du polymorphisme de type SNP c1456t a d'abord été validé sur 16 échantillons, puis génotypé sur l'ensemble de la population d'individus composée de 239 individus et 7 blancs. Conditions de miniséquençage testées: Condition N 1: Amorce sens + ddCTPR110 + ddTTP-Tamra Condition-N 2: Amorce sens + ddTTP-R110 + ddCTP-Tamra Condition N 3: Amorce antisens + ddGTP-R110 + ddATP-Tamra Condition N 4: Amorce antisens + ddTATP-R110 + ddGTP-Tamra Ces 4 conditions ont été testées et la condition N 3 a été retenue pour le génotypage. Résultats du miniséquençage pour le polymorphisme de type SNP c1456t Après la réalisation complète du processus de génotypage, la détermination des génotypes des individus de la population d'individus pour la SNP fonctionnel étudié ici a été réalisée à l'aide du graphe représenté à la Figure 9. Ce génotype est en théorie soit homozygote GG, soit hétérozygote GA, soit homozygote M chez les individus testés. En réalité et comme montré ci-dessous, le génotype homozypote M n'est pas détecté dans la population d'individus. Les résultats des contrôles, de la répartition des génotypes déterminés dans la population d'individus et le calcul des différentes fréquences alléliques pour ce polymorphisme de type SNP fonctionnel sont présentés dans les tableaux suivants: N om bre d' i nd ivid us Nom bre de bla n c Pou rcentage de testés | génotypés testés | validés réussite 239 1 239 7 1 7 100 -o o o o o o o o o o o o o I o I o o _ C go o o o ô o o - o o o' o o o Z u o 0 u 0 oo O O 0 h 0) 0 0 -m o o o o o o o o o o ^ o o ô o o o ô o3 __ _ _ __ _ ___ I C, Z o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o C 10 o o o o o o o o o o- o o o- o o o Z o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o oO o o o oO o o o oO ô ô ô J 1 z jo, I o 0 0 o 0 0 - 0 o i: c c O.m.= L\: ô. Dans le tableau ci-dessus, - N représente le nombre d'individus, - % représente le pourcentage d'ind ivid us dans la so us-popu lation spécifiq ue, - la fréquence allélique représente le pourcentage de l'allèle muté dans la sous population spécifique, - 95 % IC représente l'intervalle minimal et maximal de confiance à 95 /O. Il faut préciser que l'allèle g lu en antisens correspond à l'allèle c lu en sens, soit à la présence d'un S en position 174 de la séquence de la protéine immature de l'IFNa-14 et donc que l'allèle a lu en antisens correspond à l'allèle t lu en sens correspondant à un F pour cette position dans la séquence de la protéine correspondante. En examinant ces résultats par population, on constate que le seul individu hétérozygote GA est issu de la sous-population afro-américaine de la population d'individus. Exemple 3: Etude de la fonctior bioloaique de l'lFNo-14 G105E comparée à celle de l'lFNoc-14 naturelle a) Clonage des IFNoc-14 naturelle et mutée (G105E) dans le vecteur d'expression eukaryote pPicZ-topo: Les séquences nucléctidiques codant pour la protéine IFNx-14, naturelle et mutée sont amplifiées par PCR. Les amorces PCR permettant une telle amplification sont: - Amorce sens: TGTMTCTGTCTCAAACCCACAGC - Amorce antisens: TCMTCCTTCCTCCTTMTCTT I I I TG Les produits PCR sont insérés dans le vecteur d'expression eukaryote pPicZoc-TOPO sous le contrôle du promoteur. hybride AOX1 inductible par le méthanol (TOPO_-cloning; Invitrogen Corp.). Ce vecteur permet l'expression hétérologue de protéines eucaryotes dans la levure Pichia pastoris. Après vérification de la séquence nucléotidique de la région du vecteur codant pour les protéines recombinantes, le vecteur est linéarisé par I'enzyme de restriction Pme1, la souche de levure P pastoris (Invitrogen) est transformée avec ces vecteurs d'expression recombinants. b) Expression hétéroloque chez P. pasforis et purification des protéines IFNoc-14 naturelle et mutée G105E: Deux pré-cultures saturantes de 50 ml de milieu BMGY (2% Peptone, 1% extrait de levure, 1,34% YNB, 1% Glycérol, 100 mM phosphate de Potessium, 0,4 mglLitre biotine pH 6,8) contenant un clone codant pour l'lFNoc 14 naturelle ou celui codant pour l'lFNcr-14 G105E, ont été réalisées pendant 24 heures à 30 C à une agitation de 200 rotations par minute (rpm). Lorsque la culture atteint une densité cellulaire correspondant à une densité optique de 5,0 mesurer a une longueur d'onde de 600 nm, celle-ci est utilisée pour ensemencer, au 1/5, 200 ml de milieu BMMY (2% Peptone, 1 % extraite de levure, 1,34% YNB, 0,5% Méthanol, 100 mM phosphate de Potessium, 0,4 mglLitre biotine pH 6,8). L'expression de la protéine est alors induite par le méthanol à une concentration finale de 0,5%, pendant 2 à 5 jours à 30 C, avec une agitation de la culture à 200 rpm. Grâce à la présence de la séquence poptide signal "facteur alpha" (alpha factor), en amont de la séquence codante, les protéines sont secrétées par les levures dans le milieu de culture. Le facteur alpha est naturellement clivé lors de l'adressage. La suspension est centrifugé et le surnageant renfermant la protéine est purifiée par HPLC. Dans la première étape de purification, une gel filtration permet de récupérer la protéine dans un tampon de 50 mM Tris-NaCI pH 8,0. La présence de la protéine dans les fractions collectées est vérifise, d'une part par électrophorèse de type SDS PAGE et d'autre part par immuno-détection par un anticorps spécifique dirigé contre la protéine IFNoc-14. A ce stade, la protéine d'intérêt est pure à hauteur de 80%. La dernière étape de la purification consiste en une séparation des protéines sur colonne de chromatographie d'échange d'ions. Les fractions contenant la protéine de fusion sont injectées sur une colonne échangeuse d'anions (ResourceQ 6,0 mL, Pharmacia) préalablement équilibrée en tampon Tris 50 mM pH 8. L'élution des protéines est réalisse par le passage d'un gradient entre 0 et 1 M NaCI dans le tampon Tris 50 mM pH 8. La pureté de la protéine d'intérêt est estimée sur gel SDS/PAGE et les concentrations en protéine ont été mesurces par dosage BCA (acide bicinchoninique et sulfate de cuivre, Sigma). Les protéines IFNa-14 naturelle et IFNoc-14 mutée purifices sont utilisés lors des tests fonctionnels qui consistent en une mesure de l'activité anti-proliférative de ces deux formes de lilFNoc-14 sur la croissance de la lignée cellulaire de type Daudi. c) Evaluation de la capacité de l'lFNoc-14 naturelle et mutée G105E à induire l'anti-prolifération des cellules de Iymphoblastes humains de la Iignée cellulaire Daudi Burkitt's Ces tests sont effectués sur deux types d'lFNoc-14 différents, à savoir: I'lFNcc-14 naturelle et l'lFNx-14 G105E. Des cellules (Iymphoblastes humains de la lignée cellulaire Daudi Burkitt's, ci-après appelé "cellules de Daudi") préalablement cultivées dans du milieu RPMI 1640 (supplémenté avec % de Sérum de Veau F_tal et 2 mM de L-Glutamine) sont ensemencées en plaque 96 puits à la densité cellulaire de 2.105 cellules/ puits. Dans chaque puits, on met les cellules de Daudi en contact avec des concentrations croissante de: soit de l'IFN-14 naturelle soit de l'lFNcc14 mutée. Les concentrations en IFNcc-14 étudiés (naturelle ou mutée) sont comprises entre 0,003 pM et 600 nM (concentrations finales dans le puits). Pour chaque concentration en chacun des IFNx-14 testés (naturelle ou mutée), on met en ouvre 4 puits. Les cellules Daudi sont ensuite cultivées pendant 66 heures à 37 C sous une atmosphère d'air comprenant 5% de CO2 Après les 66 heures de croissance, I'effet anti-prolifératif de chaque IFNcc-14 est estimé par le nombre de cellules vivantes présentant encore une activité déshydrogénase mitochondriale. L'activité de la déshydrogénase peut être détectée en présence de 12 mM de MTT (sel de tétrezolium), incubé 4 heures à 37 C, par le suivi de la densité optique à 550 nm correspondant à la formation de cristaux de formazan issus du clivage du MTT. L'activité d'anti-proliférative de l'lFNoc-14 naturelle ou mutée (G105E) est basée sur les mesures de l'IC 50, correspondant à la concentration en IFNcc-14, en picomolaires (pm), inhibant 50 % de la croissance cellulaire. Deux expériences similaires ont été effectuées à quelques jours d'intervalle. Les IC 50, pour chaque expérience, sont mentionnés dans le 1 5 tableau suivant: Expérience I 50 | Rapport I Rapport Standardisé | _ 1 I Sauvage Mutée | O,108 1 0,086 1 O,80 1 O,8 2 0,29 1 0,22 1 O,76 Le Rapport correspond à la valeur de l'IC50 de la protéine mutée sur la valeur de la protéine naturelle. Le Rapport Standardisé correspond à la moyenne des rapports de chaque expérience en tenant compte des écarts type et des erreurs d'expérimentation. Ainsi, I'activité anti-proliférative cellulaire de l'IFN-14 mutée G105E est légèrement plus forte que celle de l'lFNoc-14 naturelle tout en restant dans le même ordre de grandeur. Exemple 4: Etude de la fonction biologique de l'lFNoc-14 S151F comparce à celle de l'lFNx-14 naturelle a) Clonage des IFN-14 naturelle et mutée (S151F) dans le vecteur d'expression eukaryote pPicZa-topo: Les séquences nucléotidiques codant pour la protéine IFN-14, naturelle et mutée sont amplifices par PCR. Les amorces PCR permettant une telle amplification sont: - Amorce sens: TGTMTCTGTCTCMACCCACAGC - Amorce antisens: TCMTCCl1CCTCCTTMTCl1TTTTG Les produits PCR sont insérés dans le vecteur d'expression eukaryote pPicZTOPO sous le contrôle du promoteur hybride AOX1 inductible par le méthanol (TOPO_-cloning; Invitrogen Corp.). Ce vecteur permet l'expression hétérologue de protéines eucaryotes dans la levure Pichia pastoris. Après vérification de la séquence nucléotidique de la région du vecteur codant pour les protéines recombinantes, le vecteur est linéarisé par l'enzyme de restriction Pme1, la souche de levure P. pastoris (Invitrogen) est transformée avec ces vecteurs d'expression recombinants. b) _ Expression hétéroloque chez P pastor/s et purification des protéines IFNoc-14 naturelle et mutée S151F. Deux pré-cultures saturantes de 50 ml de milieu BMGY (2% Peptone, 1% extrait de levure, 1,34% YNB, 1% Glycérol, 100 mM phosphate de Potessium, 0,4 mg/Litre biotine pH 6,8) contenant un clone codant pour l'lFNx 14 naturelle ou celui codant pour l'lFNc-14 S151F, ont été réalisées pendant 24 heures à 30 C à une agitation de 200 rotations par minute (rpm). Lorsque la culture atteint une densité cellulaire correspondant à une densité optique de 5,0 mesurer a une longueur d'onde de 600 nm, celle-ci est utilisée pour ensemencer, au 1/5, 200 ml de milieu BMMY (2% Peptone, 1% extraite de levure, 1,34% YNB, 0,5% Méthanol, 100 mM phosphate de Potessium, 0,4 mg/Litre biotine pH 6,8). L'expression de la protéine est alors induite par le méthanol à une concentration finale de 0,5%, pendant 2 à 5 jours à 30 C, avec une agitation de la culture à 200 rpm. Grâce à la présence de la séquence peptide signal "facteur alpha" (alpha factor), en amont de la séquence codante, les protéines sont secrétées par les levures dans le milieu de culture. Le facteur alpha est naturellement clivé lors de l'adressage. La suspension est centrifugé et le surnageant renfermant la protéine est purifiée par HPLC. Dans la première étape de purification, une gel filtration permet de récupérer la protéine dans un tampon de 50 mM Tris-NaCI pH 8,0. La présence de la protéine dans les fractions collectées est vérifiée, d'une part par électrophorèse de type SDS PAGE et d'autre part par immuno-détection par un anticorps spécifique dirigé contre la protéine IFN-14. A ce stade, la protéine d'intérêt est pure à hauteur de 80%. La dernière étape de la purification consiste en une séparation des protéines sur colonne de chromatographie d'échange d'ions. Les fractions contenant la protéine de fusion sont injectées sur une colonne échangeuse d'anions (ResourceQ 6,0 mL, Pharmacia) préalablement équiiibrée en tampon Tris 50 mM pH 8. L'élution des protéines est réalisée par le passage d'un gradient entre O et 1 M NaCI dans le tampon Tris 50 mM pH 8. La pureté de la protéine d'intérêt est estimée sur gel SDS/PAGE et les concentrations en protéine ont été mesurées par dosage BCA (acide bicinchoninique et sulfate de cuivre, Sigma). Les proteines IFNor-14 naturelle et IFN-14 mutée purifiées sont utilisés lors des tests fonctionnels qui consistent en une mesure de l'activité anti-proliférative de ces deux formes de l'lFNoc-14 sur la croissance de la lignée cellulaire de type Daudi. c) Evaluation de la capacité de l'lFNx-14 naturelle et mutée S151F à induire l'anti-prolifération des cellules de Ivmphoblastes humains de la Iignée cellulaire Daudi Burkitt's Ces tests sont effectués sur deux types d'lFNcc-14 différents, à savoir: I'lFNoc-14 naturelle et l'lFNoc-14 S151F. Des cellules (Iymphoblastes humains de la lignée cellulaire Daudi Burkitt's) préalablement cultivées dans du milieu RPMI 1640 (supplémenté avec 10% de Sérum de Veau F_tal et 2 mM de L-Glutamine) sont ensemencées en plaque 96 puits à ia densité cellulaire de 2 105 cellules/ puits. Dans chaque puits, on met les cellules de Daudi en contact avec des concentrations croissante de: soit de l'lFNoc-14 naturelle soit de l'lFNoc-14 mutée. Les concentrations en IFNcc-14 étudiés (naturelle ou mutée) sont comprises entre 0,003 pM et 600 nM (concentrations finales dans le puits). Pour chaque concentration en chacun des IFNa-14 testés (naturelle ou mutée), on met en _uvre 4 puits. Les cellules Daudi sont ensuite cultivoes pendant 66 heures à 37 C sous une atmosphère d'aire comprenant 5% de CO2 Après les 66 heures de croissance, I'effet anti-prolifératif de chaque IFNcc-14 est estimé par le nombre de cellules vivantes présentant encore une activité des déshydrogénases mitochondriales. L'activité de ces déshydrogénases peut être détectée en présence de 12 mM de MTT (incubé 4 heures à 37 C), par le suivi de la densité optique à 550 nm correspondant à la formation de cristaux de formazan issus du clivage du sel de tétrazolium MTT. L'activité anti-proliférative de l'lFNoc-14 naturelle ou mutée (S151F) est basée sur les mesures de l'IC 5O, correspondant à la concentration en IFNx-14, en picomolaires (pm), inhibant 50 % de la croissance cellulaire. Deux expériences similaires ont été effectuces à quelques jours d 'i nterva l le. Les IC 50, pour chaque expérience, sont mentionnés dans le tableau suivant: Expérience 50 Rapport Rapport Standardisé Sauvage Mutée 0,108 O,096 O,9 1,1 O,29 O,350 1,2 Le Rapport correspond à la valeur de l'IC50 de la protéine mutée sur la valeur de ia protéine naturelle. Le Rapport Standardisé correspond à la moyenne des rapports de chaque expérience en tenant compte des écarts type et des erreurs d'expérimentation. Ainsi, I'activité anti-proliférative cellulaire de lilFNa-14 mutée S151F est légèrement moins forte que celle de l'lFNa-14 naturelle tout en restant dans le même ordre de grandeur. REVENDICATIONS 1. Polynucléotide isolé comprenant: a) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence ID SEQ N 1 ou sa séquence codante, étant entendu que cette séquence nucléotidique comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - g1318a, - c1423t, - c1456t; ou b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique sous a). 2. Polynucléotide isolé comprenant: a) la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 ou sa séquence codante, étant entendu que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - g1318a, - c1423t, - c1456t; ou b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique sous a). 3. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce qu'il consiste en la séquence ID SEQ N 1 ou sa séquence codante, étant entendu que chacune des séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - g1318a, - c1423t, - c1456t. 4. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique a) comporte un seul polymorphisme de type SNP choisi dans le groupe constitué par: g1318a, c1423t, et c1456t. 5. Polynucléotide isolé, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide comprenant: a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) la séquence d'acides aminés comprenant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, étant enteridu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - G 128E, - A163V, - S174F. 6. Polynucléotide selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide comportant un seul polymorphisme de type SNP choisi dans le groupe constitué par: - G128E, - A163V, et - S174F. 7. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est composé d'une moiécule d'ADN ou d'ARN. 8. Utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour identifier, hybrider eVou amplifier tout ou partie d'un polynucléotide consistant en la séquence ID SEQ N 1 ou sa séquence codante, étant entendu que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - g1318a, - c1423t, - c1456t. 9. Utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comme outil de génotypage. 10. Procédé de détermination de la fréquence du polymorphisme de type SNP d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel on procède à un génotypage chez un individu ou dans une population d'individus. 11. Procédé de détermination selon la revendication 1 0, dans lequel le génotypage est effectué par miniséquençage. 1 2. Procédé de détermination selon la revendication 11, dans lequel le miniséquençage est réalisé sur un produit PCR obtenu avec les amorces sens et antisens correspondant respectivement aux séquences nucléotidique ID SEQ N 3 et ID SEQ N 4. 13. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour la recherche d'une variation de séquence dans la séquence nucléotidique du gène IFN-14 chez un individu. 14. Vecteur recombinant comprenant un polynucléotide selon I'une quelconque des revendications 1 à 7. 15. Cellule hôte comprenant un vecteur recombinant selon la revendication 14. 16. Procédé de préparation d'un polypeptide, caractérisé en ce qu'une cellule hôte selon la revendication 15 est cultivée et ledit polypeptide est isolé du milieu de culture. 17. Polypeptide isolé comprenant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 % d'identité avec: a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - G 1 28E, - A163V, - S1 74F. 18. Polypeptide selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend: a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - G128E, - A163V, - S174F. 19. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 18, caractérisé en ce qu'il consiste en: a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - G128E, - A163V, - S174F. 20. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte un seul polymorphisme de type SNP choisi dans le groupe constitué par: - G 128E, - A163V, et; - S174F. 21. Procédé d'obtention d'un anticorps immunospécifique, caractérisé en ce qu'il est obtenu par immunisation d'un animal avec un polypoptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20. 22. Anticorps immunospécifique pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20. 23. Procédé d'identification d'un agent activateur ou inhibiteur d'un polypaptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, comprenant: a) la mise en présence de cellules hôtes selon la revendication 15 avec un agent à tester, et b) la détermination de l'effet activateur ou inhibiteur généré par l'agent à tester. 24. Méthode pour l'identification d'un agent activé ou inhibé par un polypaptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, comprenant: a) la mise en présence de cellules hôtes selon la revendication 15 avec un agent à tester, et b) la détermination de l'effet activateur ou inhibiteur généré par un polypeptide sur l'agent à tester. 25. Procédé de détection de l'expression et/ou de l'activité d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 7 à 20, comprenant: a) la détection de la présence ou de l'absence d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 dans le génome du sujet, eVou b) la détermination de la concentration d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, dans un échantillon biologique du sujet. 26. Médicament comprenant à titre de principe actif au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20. 27. Utilisation d'un polypoptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou le traitement de l'une des maladies choisies dans le groupe constitué par les différents cancers comme les carcinomes, les mélanomes, les Iymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme l'obésité, les maladies infectieuses en particulier virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, I'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, I'asthme, les scléroses multiples, I'ostéoporose, le psoriasis, I'artUrite rhumatorde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie. 28. Utilisation d'un polypeptide selon la revendication 27, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou le traitement de l'une des maladies choisies dans le groupe constitué par les hépatites chroniques B et C, les leucémies telles que la leucémie à tricholeucocytes et la leucémie myélode chronique, les myélomes multiples, des Iymphomes folliculaires, les tumeurs carcinodes, les mélanomes malins, les carcinomes rénaux métastesés, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ainsi que les tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA. 29. Médicament comprenant à titre de principe actif au moins un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, un vecteur recombinant selon la revendication 14, une cellule hôte selon la revendication eVou un anticorps selon la revendication 22. 30. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, d'un vecteur recombinant selon la revendication 14, d'une cellule hôte selon la revendication 15 eVou d'un anticorps selon la revendication 22, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou le traitement de l'une des maladies choisies dans le groupe constitué par les différents cancers comme les carcinomes, les mélanomes, les Iymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme l'obésité, les maladies infectieuses en particulier virales comme les hapatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, I'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, I'asthme, les scléroses muitiples, I'ostéoporose, le psoriasis, I'arthrite rhumatorde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie. 31. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, d'un vecteur recombinant selon la revendication 14, d'une cellule hôte selon la revendication 15 eVou d'un anticorps selon la revendication 22, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou le traitement de l'une des maladies choisies dans le groupe constitué par les hépatites chroniques B et C, les leucémies telles que la leucémie à tricholeucocytes et la leucémie myélode chronique, les myélomes multiples, des Iymphomes folliculaires, les tumeurs carcinodes, les mélanomes malins, les carcinomes rénaux métastasés, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ainsi que les tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA. 32. Composition pharmaceutique renfermant à titre de principe actif au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, un vecteur recombinant selon la revendication 14, une cellule hôte selon la revendication 15 et/ou un anticorps selon la revendication 22, ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable. 33. Composition de diagnostic renfermant à titre de principe actif au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, un vecteur recombinant selon la revendication 14, une cellule hôte selon la revendication eVou un anticorps selon la revendication 22, ainsi qu'un excipient approprié pharmaceutiquement acceptable. 34. Utilisation: a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, eVou b) d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, eVou c) d'une cellule hôte selon la revendication 15, cette cellule provenant du sujet à traiter, pour préparer un médicament destiné à augmenter l'expression ou l'activité chez un sujet, d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20. 35. Utilisation: a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un anticorps selon la revendication 22, eVou b) d'un polynucléotide permettant d'inLiber l'expression d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour préparer un médicament destiné à diminuer l'expression ou l'activité chez un sujet d'un polypeptide selon l'une quelconque des