Brevet FR2829154A1 — publié le 20030307

Nouveau procédé de détection d'une mutation en phase de lecture dans une séquence codante et appareil pour sa mise en oeuvre La présente invention concerne un nouveau procédé de détection d'une mutation en phase de lecture dans une séquence codante d'au moins un brin d'acide nucléique, de préférence de l'ADN, contenu dans un échantillon, ce procédé comprenant au moins des étapes d'amplification par PCR du ou des brin (s) d'acide nucléique contenu (s) dans l'échantillon, les produits d'amplification incorporant au moins un composé fluorescent, de séparation des produits d'amplification par électrophorèse, - d'excitation de la fluorescence par faisceau laser et - de transformation du signal de référence en un graphe dans lequel au moins une partie des pics correspond à la taille, exprimée en nombre de bases nucléotidiques, d'un produit d'amplification, ainsi qu'un appareil pour la mise en oeuvre d'un tel procédé. La détection de mutation sur des fragments d'ADN est une préoccupation constante depuis de nombreuses années. Ainsi, le brevet EP-A-0. 648.844 décrit un procédé d'analyse de fragments d'ADN par séquençage des bases des fragments en vue d'obtenir, par comparaison des graphes, une information relative à la présence ou à l'absence de mutation. La nécessité d'obtenir dans ce procédé au moins quatre courbes, chaque courbe correspondant à la distribution d'un type de nucléotide (ATGC) dans le fragment est une méthode longue et fastidieuse. Un autre procédé pour déterminer l'existence d'une mutation est décrit dans le brevet WO 97/17464. Ce procédé nécessite de disposer dans l'échantillon de la séquence type sauvage et de la séquence mutée pour pouvoir comparer les deux pics obtenus. Par ailleurs, l'étape de séparation des produits d'amplification s'effectue par électrophorèse sur gel, ce qui limite la précision de la résolution à plus ou moins deux bases de telle sorte que des faux positifs peuvent apparaître. Un but de la présente invention est de proposer un nouveau procédé de détection de mutation par analyse de taille de fragment, ce procédé permettant d'éliminer de manière sûre les faux positifs. Un autre but de la présente invention est de proposer un procédé permettant de détecter des mutants sans connaissance de la taille exacte du fragment de brin sauvage ou de référence dont une mutation est recherchée. Un autre but de la présente invention est de proposer un procédé du type précité permettant une mise en oeuvre rapide dans le cadre d'analyse de routine pour la détection de mutations multiples ou de mutations dont la localisation est connue mais dont la nature est variable d'un patient à un autre. Un autre but de la présente invention est de proposer un procédé du type précité dont la mise en oeuvre permet de J confirmer, à un moindre coût, l'intérêt d'une prescription médicamenteuse. A cet effet, l'invention a pour objet un procédé de détection d'une mutation (délétion ou insertion) en phase de lecture dans une séquence codante d'au moins un brin d'acide nucléique, de préférence de l'ADN, contenu dans un échantillon, ce procédé comprenant au moins des étapes d'amplification par PCR du ou des brin (s) d'acide nucléique contenu (s) dans l'échantillon, les produits d'amplification incorporant au moins un composé fluorescent, - de séparation des produits d'amplification par électrophorèse, - d'excitation de la fluorescence par faisceau laser et - de transformation du signal de référence en un graphe dans lequel au moins une partie des pics correspond à la taille exprimée en nombre de bases nucléotidiques d'un produit d'amplification, caractérisé en ce qu'on sépare les produits d'amplification par électrophorèse capillaire, en ce qu'on détermine à partir du graphe le nombre N de pics, en ce que si le nombre N de pics est supérieur ou égal à 2, on détermine la différence D de taille entre deux produits d'amplification correspondant respectivement à un pic et en ce que si la différence D est un multiple de 3, on confirme la présence d'au moins un brin d'acide nucléique mutant dans l'échantillon, la mutation respectant le cadre de lecture de l'ADN et correspondant soit à une insertion soit à une délétion. L'invention a encore pour objet un appareil pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection d'une mutation en phase de lecture du type précité, cet appareil comprenant des moyens de séparation des produits d'amplification par électrophorèse, des moyens d'excitation de la fluorescence par faisceau laser et des moyens d'analyse du signal de fluorescence en vue de la transformation du signal de fluorescence en un graphe dans lequel chaque sommet de pic correspond à la taille exprimée en nombre de bases nucléotidiques d'un produit d'amplification, caractérisé en ce que les moyens de séparation des produits d'amplification sont des moyens de séparation par électrophorèse capillaire et en ce que les moyens d'analyse incluent des premiers moyens de calcul du nombre de pics et des seconds moyens de calcul et d'analyse de l'écart entre deux pics, ces seconds moyens de calcul étant activables lorsque le nombre de pics est supérieur à 1. L'invention a encore pour objet une utilisation d'un procédé de détection d'une mutation en phase de lecture dans l'exon 11 du gène KIT d'un échantillon mis en oeuvre en tant qu'agent de détermination de l'administration du médicament Glivec (marque déposée) (Imatinib) ou d'un autre inhibiteur de l'activité de c-kit pour le traitement de tumeurs stromales gastro-intestinales ou de sarcomes ou de carcinomes. L'invention sera bien comprise à la lecture de la description suivante d'exemples de réalisation, en référence aux dessins annexés dans lesquels : la figure 1 représente un graphe obtenu à partir de l'analyse de taille de fragment d'acide nucléique d'un échantillon dans lequel aucune mutation n'est présente et la figure 2 représente un graphe obtenu à partir de l'analyse d'un échantillon dans lequel le brin sauvage et le brin mutant sont présents, la mutation correspondant à une délétion de six paires de bases. Il est à noter que pour chaque graphe ci-dessus l'abscisse correspond au nombre de bases nucléotidiques et l'ordonnée à l'intensité du signal de fluorescent. Comme mentionné ci-dessus, le procédé de détection d'une mutation par analyse de taille de fragment est plus particulièrement destiné à être mis en oeuvre dans le cadre d'analyses de routine en vue de détecter rapidement la présence d'un brin d'acide nucléique mutant dans un échantillon sans avoir besoin de connaître la localisation exacte de cette mutation. Dans l'exemple qui suit, ce procédé est mis en oeuvre en vue de la détection de délétion ou d'insertion de l'exon 11 du gène KIT dans des échantillons de tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) fixes et incluses en paraffine. Bien évidemment, le procédé de détection peut s'appliquer à tout autre type de gène. Dans cette pathologie, les mutations sont des délétions de 3 à 54 paires de bases localisées sur un segment d'environ 150 paires de bases. Les mutations de l'exon 11 de KIT dans les GIST sont présentes dans environ 50 % des formes malignes et sont un facteur de mauvais pronostic. Les GIST métastasées sont actuellement incurables. Parallèlement, un nouveau médicament, le Glivec (marque déposée) (Imatinib) a été développé par la Société Novartis pour le traitement de telles tumeurs. Or, il a été rapporté que la présence de ces mutations est associée à 80 % de bonnes réponses au Glivec (marque déposée) alors que seulement % des patients non mutés répondent à ce traitement. La mise en évidence de cette mutation a donc un intérêt clinique évident. L'ADN extrait d'un prélèvement tumoral contient souvent des fragments de séquence de référence connus. S'il existe une mutation d'un gène d'intérêt, cette mutation peut être difficile à détecter puis à caractériser car elle peut exister à l'état hétérozygote au sein des cellules tumorales et le stroma tumoral peut contenir beaucoup de cellules non tumorales donc non mutées. Toutefois, le procédé objet de l'invention permet la détection de brins mutants y compris dans le cas où les brins mutants sont présents en faible quantité dans l'échantillon. L'ADN tumoral est généralement obtenu à partir d'échantillon L'échantillon est ici constitué d'ADN humain extrait d'une tumeur gastro-intestinale ou d'un sarcome d'autre localisation, la séquence codante cible d'acide nucléique dont la mutation est recherchée étant constituée par l'exon 11 du gène KIT. L'analyse d'un tel échantillon de matériel biologique nécessite une première étape d'extraction des acides nucléiques. Il existe de nombreuses techniques d'extraction qui permettent d'obtenir des acides nucléiques dont le degré de pureté est très variable. Ainsi, à titre d'exemple, pour l'échantillon d'ADN tumoral obtenu cidessus, huit sections de 4 pm ont été soumises à une digestion de protéinase K pendant 3 heures dans un tampon à pH 8 et l'ADN a été purifié sur des colonnes d'affinité (DGenos, France), conformément aux instructions du fabricant. L'élution d'ADN a été réalisée avec 80 ml d'eau distillée. Cette technique de purification est plus particulièrement décrite dans le brevet FR-A-2.733. 754. Cette étape d'extraction est suivie d'une étape d'amplification par PCR (Polymérase Chain Reaction) ou réaction en chaîne par polymérase du ou des brins d'acide nucléique contenus dans l'échantillon. Au cours de cette étape d'amplification, on incorpore au moins un composé fluorescent. Ainsi, généralement, on réalise la PCR au moyen d'amorces oligonucléotidiques et de désoxynucléotides triphosphates (dNTP) pour l'amplification, lesdites amorces étant aptes à s'hybrider avec chacun des deux brins de la séquence cible dont une mutation est recherchée. Les amorces et/ou les dNTP contiennent au moins un composé fluorescent incorporé. Dans l'exemple ci-dessous, les composés fluorescents ont été incorporés aux amorces. L'amplification par PCR de l'exon 11 du gène KIT est ainsi réalisée avec des amorces localisées dans l'intron en amont (kit-11A : 5'-CAGGTAACCATTTAT-3') ou en aval (kit-11B : 5'- TCATTGTTTCAGGTGGAAC-3'et kit-11D : 5'- GTTATGTGTACCCAAAAAGG-3') de l'exon 11. Les amorces non modifiées kit-11A, kit-11B et kit-11D, ainsi que le kit 11-A marqué en 5'avec FAM, qui constitue un composé fluorescent, sont disponibles auprès de la Société Eurogentec (Herstal, Belgique). Pour chaque amplification, 4 pl de l'échantillon d'ADN dans un total de mélange de réaction de PCR de 50 jul ont été soumis à 40 cycles d'amplification par PCR en utilisant une Taq polymérase portant la référence Quantum Taq DNA polymerase (Appligene) dans un thermocycler Perkin Elmer (Gene Amp PCR xx 2400, Perkin Elmer, Norwalk, CT). Les concentrations respectives de chaque produit à l'intérieur du mélange de réaction PCR sont dNTP : 0,04 mM, amorces : 0,2 mM, formamide : 5 %, Taq ADN polymerase : 50 U/ml, tampon de Taq ADN polymerase (Appligene) : x 1. Chaque cycle PCR a été constitué d'une dénaturation pendant 1 minute à 92 C, d'un appariement pendant 30 secondes à 500C et d'une élongation pendant 45 secondes à 72 C. Pour chaque amplification par PCR, une étape initiale de 2 minutes à 940C et une période finale de 7 minutes à 720C ont été observées. Les produits d'amplification ainsi obtenus sont séparés par électrophorèse. De manière caractéristique à l'invention, l'électrophorèse est une électrophorèse capillaire réalisée au moyen de dispositifs connus tels que l'analyseur génétique ABI Prism 310 (Applied Biosystems) et ce conformément aux instructions du fabricant. Pour détecter et déterminer la taille des fragments, des témoins de marquage ont été ajoutés à l'échantillon. Sur le graphe obtenu après électrophorèse, ces éléments de marquage apparaissent généralement sous forme d'une courbe d'une couleur différente. Dans les graphes représentés aux figures 1 et 2, les pics correspondant aux éléments de marquage portent la référence TM. ..... Dans les produits d'identification obtenus, les produits détectés seront ceux incorporant un composé fluorescent introduit par l'intermédiaire de l'amorce 5'FAM-kit A, FAM correspondant à un composé fluorescent. Il est à noter que, en tant que composé fluorescent, de nombreux produits peuvent être utilisés et sont aujourd'hui disponibles sur le marché. Ainsi, à titre d'exemple, l'étape de séparation des produits par électrophorèse capillaire peut s'effectuer comme suit : à 1 pl de chaque échantillon ont été ajoutés 23 pl de formamide et 0,5 pl de marqueur de taille de référence GeneScan 500 Tamra de taille standard (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). L'échantillon ainsi obtenu est analysé dans un analyseur ABI Prism 310 (Applied Biosystems). Les courbes de fluorescence sont ensuite analysées avec un logiciel GeneScan (Applied Biosystems). Pour chaque échantillon, la PCR a été faite avec les amorces kit-llD et kit-llA marquée avec FAM. Les graphes obtenus peuvent être ainsi conformes, en fonction de l'échantillon, aux graphes représentés aux figures 1 et 2. Conformément au procédé, on détermine alors à partir du graphe le nombre N de pics, au moins une partie des pics correspondant à la taille exprimée en nombre de bases nucléotidiques d'un produit d'amplification. Le logiciel permet en effet d'introduire une échelle indiquant pour chaque pic la taille du fragment concerné. Si le nombre de pic est supérieur ou égal à 2, comme l'illustre la figure 2, on détermine la différence D de taille entre deux produits d'amplification correspondant respectivement à un pic et si la différence D obtenue est un multiple de 3, on confirme la présence d'au moins un brin d'acide nucléique mutant dans l'échantillon, la mutation respectant le cadre de lecture de l'ADN et correspondant soit à une insertion soit à une délétion. Ainsi, dans l'exemple représenté à la figure 2, on constate l'existence de deux pics, la différence D est égale à ce qui confirme la présence d'un brin mutant. La mutation correspond à une insertion de bases. La détermination du nombre de pics peut s'effectuer suivant divers procédés. Ainsi, on peut déterminer visuellement le nombre de pics et calculer mentalement la différence D et la nature de cette différence. Il est également possible d'effectuer les opérations précitées au moyen d'un logiciel approprié. Pour ce faire, dans un premier, on détermine par calcul le nombre de pics en comparant les valeurs des ordonnées des points de mesure du graphe par série d'au moins trois points de mesure successifs et en sélectionnant les points dont l'ordonnée est d'une part supérieure à une valeur seuil, d'autre part supérieure à l'ordonnée du point de mesure immédiatement en amont et du point de mesure immédiatement en aval et en ce que, dans un second temps, si le nombre de points sélectionné est supérieur ou égal à deux, on détermine par calcul, à partir des abscisses des points sélectionnés, la différence D et sa nature. Ainsi, la comparaison des valeurs des ordonnées permet de déterminer les points de mesure du graphe correspondant à chaque sommet de pic. Par la suite, il suffit, à partir des abscisses de chaque point sélectionné, de calculer la différence entre deux abscisses et de vérifier que cette différence est un multiple de 3. Toutes ces opérations peuvent être faites au moyen d'un appareil du type précité dans lequel les moyens d'analyse du signal de fluorescence en vue de la transformation du signal de fluorescence en un graphe sont complétés de manière à inclure des premiers moyens de calcul du nombre de pics et des seconds moyens de calcul et d'analyse de l'écart entre deux pics, ces seconds moyens de calcul étant activables lorsque le nombre de pics est supérieur à 1. Ainsi, les premiers moyens de calcul incluent des moyens de comparaison des valeurs des ordonnées des points du graphe par série d'au moins trois points de mesure successifs et J w des moyens de sélection des points dont l'ordonnée est d'une part supérieure à une valeur seuil, d'autre part supérieure à l'ordonnée du point de mesure immédiatement en amont et à celle du point de mesure immédiatement en aval. Les seconds moyens de calcul comportent quant à eux des moyens de calcul de la différence des abscisses de points de mesure sélectionnés par les premiers moyens de calcul, des moyens de division du résultat obtenu et des moyens de comparaison du reste de la division avec une valeur nulle pour confirmer si la comparaison est positive, c'est-à-dire si le reste est égal à zéro, la présence d'un brin d'acide nucléique mutant dans l'échantillon. Par ailleurs, grâce à un tel procédé, si le nombre de pics est égal à 1, on compare alors la taille du produit d'amplification correspondant au pic visualisé avec la taille déduite de la séquence connue de référence correspondant au brin sauvage d'acide nucléique dont une mutation est recherchée (taille égale à 270 paires de bases dans l'exemple présenté). Si la comparaison révèle une identité des tailles, on confirme l'absence de brin d'acide nucléique mutant dans l'échantillon. Il est donc possible, grâce à ce procédé, et dans le cas où la taille exacte de la séquence de référence est connue, de conclure à l'absence de mutant dans l'échantillon. Contrairement à ce qui est décrit pour d'autres procédés (tels le WO 97/17464), il n'est pas nécessaire, ici, de disposer du graphe d'un échantillon de référence. Dans les cas exceptionnels où un seul pic est détecté mais ne correspond pas à la taille de la séquence référence ou dans le cas où deux pics sont détectés mais la différence entre leur deux tailles n'est pas un multiple de 3, il convient alors de refaire la PCR après contrôle de l'ensemble des conditions de travail. En outre, si le nombre de pics est égal à 0, on soumet à nouveau l'échantillon à l'ensemble des étapes du procédé. 1 Dans ce cas, la PCR réalisée n'est pas strictement identique à la PCR mentionnée ci-dessus. En effet, pour ces échantillons, une première PCR est effectuée avec les amorces kit-11A non marquée et kit-11B. Les produits de PCR sont ensuite purifiés avec une colonne (Qiaquick purification PCR kit, Qiagen, Courtaboeuf, France). Les produits sont repris dans un volume final de 30 pl. Une seconde PCR est pratiquée avec 4 pl de ces produits en présence des amorces kit-11A marquée par FAM et kit-11D. Les produits d'amplification sont analysés sur l'ABI Prism 310 : . Si plus d'un pic est détecté et que la différence entre la taille des deux pics est un multiple de 3, on peut conclure à la présence d'un mutant au sein de l'échantillon analysé ; . Si un seul pic est détecté et que la taille de ce pic est de 270 nucléotides, qui correspondent à la séquence à brin sauvage de l'exon 11, on peut conclure à l'absence de mutation ; . Si aucun pic n'est détecté, on peut conclure que l'ADN n'est pas analysable par cette technique. Il peut alors être utile de refaire une extraction. . Dans des cas exceptionnels, un seul pic est détecté mais sa taille est anormale ou deux pics sont détectés mais la différence entre leur deux tailles n'est pas un multiple de trois. Dans ces cas, les deux PCR doivent être refaites après contrôle de l'ensemble des conditions de travail. Bien évidemment, une fois que le procédé précité a permis la mise en évidence de la présence d'un brin mutant dans l'échantillon, il peut alors être procédé à un séquençage de ce brin de manière à déterminer la nature exacte de la mutation détectée. Le procédé décrit ci-dessus permet de traiter en un temps court un grand nombre d'échantillons. Ce qui permet, pour tous les échantillons dans lesquels une absence de mutation a été détectée, d'éviter toute opération de séquençage complet des fragments d'acide nucléique contenus dans ces échantillons. De la même manière, dans le cas d'échantillons où la présence d'un brin mutant a été détectée, il n'est pas nécessaire de procéder à un séquençage complet, en particulier dans le cas où ce procédé est mis en oeuvre pour confirmer l'intérêt d'une prescription thérapeutique, en particulier dans le cas du médicament décrit ci-dessus où le seul fait de connaître l'existence d'une mutation de l'exon 11 du gène KIT permet de confirmer l'efficacité de ce médicament. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection d'une mutation en phase de lecture dans une séquence codante d'au moins un brin d'acide nucléique, de préférence de l'ADN, contenu dans un échantillon, ce procédé comprenant au moins des étapes d'amplification par PCR du ou des brin (s) d'acide nucléique contenu (s) dans l'échantillon, les produits d'amplification incorporant au moins un composé fluorescent, de séparation des produits d'amplification par électrophorèse, - d'excitation de la fluorescence par faisceau laser et - de transformation du signal de référence en un graphe dans lequel au moins une partie des pics correspond à la taille exprimée en nombre de bases nucléotidiques d'un produit d'amplification, caractérisé en ce qu'on sépare les produits d'amplification par électrophorèse capillaire, en ce qu'on détermine à partir du graphe le nombre N de pics, en ce que si le nombre N de pics est supérieur ou égal à 2, on détermine la différence D de taille entre deux produits d'amplification correspondant respectivement à un pic et en ce que si la différence D est un multiple de 3, on confirme la présence d'au moins un brin d'acide nucléique mutant dans l'échantillon, la mutation respectant le cadre de lecture de l'ADN et correspondant soit à une insertion soit à une délétion. 2. Procédé de détection selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on détermine visuellement le nombre de pics. 3. Procédé de détection selon la revendication 1, caractérisé en ce que, dans un premier temps, on détermine par calcul le nombre de pics en comparant les valeurs des ordonnées des points de mesure du graphe par série d'au moins trois points de mesure successifs et en sélectionnant les points dont l'ordonnée est d'une part supérieure à une valeur seuil, d'autre part supérieure à l'ordonnée du point de mesure immédiatement en amont et du point de mesure immédiatement en aval et en ce que, dans un second temps, si le nombre de points sélectionné est supérieur ou égal à deux, on détermine par calcul, à partir des abscisses des points sélectionnés, la différence D et sa nature. 4. Procédé de détection selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que si N est égal à 1, on compare la taille du produit d'amplification correspondant au pic visualisé avec la taille déduite de la séquence connue de référence correspondant au brin sauvage d'acide nucléique dont une mutation est recherchée et en ce que, si la comparaison révèle une identité des tailles, on confirme l'absence de brin d'acide nucléique mutant dans l'échantillon. 5 Procédé de détection selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que si N est égal à 0, on soumet à nouveau l'échantillon à l'ensemble des étapes du procédé. 6. Procédé de détection selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on réalise la PCR au moyen d'amorces oligonucléotidiques et de désoxynucléotides triphosphates (dNTP) pour l'amplification, lesdites amorces étant aptes à s'hybrider avec chacun des deux brins de la séquence cible dont une mutation est recherchée et en ce qu'on incorpore dans les amorces et/ou les dNTP au moins un composé fluorescent. 7 Procédé de détection selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'échantillon est constitué d'ADN humain extrait d'une tumeur gastro-intestinale ou d'un sarcome d'autre localisation, la séquence codante cible d'acide nucléique dont la mutation est recherchée étant constituée par l'exon 11 du gène KIT. 8 Appareil pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection d'une mutation en phase de lecture conforme à l'une des revendications 1 à 7, cet appareil comprenant des moyens de séparation des produits d'amplification par électrophorèse, des moyens d'excitation de la fluorescence par faisceau laser et des moyens d'analyse du signal de fluorescence en vue de la transformation du signal de fluorescence en un graphe dans lequel chaque sommet de pic correspond à la taille exprimée en nombre de base nucléotidique d'un produit d'amplification, caractérisé en ce que les moyens de séparation des produits d'amplification sont des moyens de séparation par électrophorèse capillaire et en ce que les moyens d'analyse incluent des premiers moyens de calcul du nombre de pics et des seconds moyens de calcul et d'analyse de l'écart entre deux pics, ces seconds moyens de calcul étant activables lorsque le nombre de pics est supérieur à 1. 9. Appareil selon la revendication 8, caractérisé en ce que les premiers moyens de calcul incluent des moyens de comparaison des valeurs des ordonnées des points du graphe par série d'au moins trois points de mesure successifs et des moyens de sélection des points dont l'ordonnée est d'une part supérieure à une valeur seuil, d'autre part supérieure à l'ordonnée du point de mesure immédiatement en amont et à celle du point de mesure immédiatement en aval. 10. Appareil selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisé en ce que les seconds moyens de calcul comportent des moyens de calcul de la différence des abscisses de points de mesure sélectionnés par les premiers moyens de calcul, des moyens de division du résultat obtenu et des moyens de comparaison du reste de la division avec une valeur nulle pour confirmer si la comparaison est positive, la présence d'un brin d'acide nucléique mutant dans l'échantillon. 11. Utilisation d'un procédé de détection d'une délétion ou insertion en phase de lecture dans l'exon 11 du gène KIT d'un échantillon conforme à l'une des revendications 1 à 7 mis en oeuvre en tant qu'agent de détermination de l'administration du médicament Glivec (marque déposée) (Imatinib) ou d'un autre inhibiteur de l'activité de c-kit pour le traitement de tumeurs stromales gastro-intestinales ou de sarcomes ou de carcinomes.