Brevet FR2825103A1 — publié le 20021129

revendications La présente invention se rapporte à de nouveaux vecteurs utilisables à la fois pour créer des banques d'ADN génomiques et en tant que vecteurs pour la réalisation de réactions de recombinaison homologue dans des cellules hôtes, permettant notamment d'améliorer la sélection desdits événements de recombinaison homologue et de diminuer le temps d'obtention du vecteur final pour effectuer la réaction de recombinaison homologue. L'invention a également pour objet un procèdé mettant en ceuvre ces vecteurs. Ces nouveaux vecteurs et le procèdé les utilisant sont spécialement adaptés pour la recombinaison homologue dans des cellules souches de mammifères. L'obtention de souris porteuses de modifications génétiques programmées par l'expérimentateur a entièrement modifié l'étude de quasiment tous les aspects de la biologie de cet animal et de ces différents systémes (immunitaire, nerveux, hématopoïetique, etc.). En outre, ces méthodes de modification du patrimoine génétique de la souris permettent la création de modèles murins de maladies génétiques humaines qui sont précieux pour l'étude de leur physiopathologie et éventuellement la mise au point de thérapeutiques approprices. Cela a été rendu possible grâce à la rencontre heureuse de deux approches très différentes: l'une a abouti à l'isolement in vitro de cellules souches embryonnaires (cellules ES) et l'autre a permis d'identifier, chez les cellules d'eucaryotes supérieurs, les conditions nécessaires au processus de recombinaison homologue entre un ADN exogène connu et la séquence homologue dans le chromosome. La recombinaison homologue dans les cellules ES: création de mutations nulles (souris knock-out) Des études effectuces dans les années 1980 (Smithies et Capecchi par exemple) ont démontré que les cellules embryonnaires souches (ES) possèdent l'appareil enzymatique nécessaire à la recombinaison homologue (RH) entre une séquence d'ADN exogène et la séquence homologue présente dans le génome de la souris, même s'il s'agit d'un événement rare comparativement à l'intégration aléatoire de ce même fragment d'ADN (Smithies et al., 1985; Wong and Capecchi, 1986). En dépit de cette rare fréquence d'apparition, la technique de recombinaison homologue a pu être étendu à l'étude de nombreux gènes (Jackson laboratory) grâce à différentes astuces de sélection et de criblage. Le Knock-in: l'autre aspect de la recombinaison homoloeue. Une variante intéressante des vecteurs de ciblage pour l'obtention de mutations nulles résulte de l'introduction, en phase avec la séquence codante du gène cible, d'un ADNc d'intérét. Après la recombinaison homologue, l'ADNc inséré dans le gène cible est 1 0 exprimé sous le contrôle du promoteur endogène. Le choix de l'ADNc dépend du projet et du but recherché. Par exemple, il peut s'agir de la séquence codante d'un gène rapporteur comme la p-galactosidase. L' expression de cette protéine mime alors l'expression du gène ciblé, ce qui permet de déterminer son profil d'expression (Li et al., 1997) et/ou de suivre le devenir des cellules exprimant le 1 5 gène ciblé (Schneider-Maunoury et al., 1993; Tajbakhsh et al., 1996). Des mutations nulles aux mutations subtiles Si les mutations nulles (knock-out) représentent un instrument d'analyse génétique très puissant, il est clair que d'autres types de mutations plus fines (mutations ponctuelles, petites délétions ou insertions) sont très utiles pour affiner les modèles d'études. Lorsque des allèles mutés sont créés, il est particulièrement nécessaire d'éliminer les séquences de sélection qui pourraient interférer avec la régulation de l'expression du gène cible ou de gènes adjacents (Fiering et al., 1999). Plusieurs stratégies peuvent êtres utilisés pour créer des mutations "propres" (Moore et al., 1998, Cohen-Tannoudji et Babinet, 1998) comme le "Plug and socket" (Detloffet al., 1994), le " hit and run" (Hasty et al., 1991) ou le système de recombinases Cre/loxP ou FLP/FRT(Kilby et al., 1993). La stratégie des recombinases (Cre/loxP, FRT/FLP...) repose sur l' utilisation d' une protéine, la recombinase, et de séquences cibles. Dans le système Cre/loxP, la protéine Cre est une recombinase, identifiée chez le bactériophage P1, qui agit lorsqu'elle reconna^t dans un segment d'ADN, une séquence de 34 pb appelée loxP (Sauer and Henderson, 1988). Après l'excision par la Cre du fragment se trouvant entre les deux séquences loxP, l'allèle muté porte un site loxP. Aucune indication d'une interférence de ce site avec l'expression génétique n'a pu être mis en évidence. La mutagénèse conditionnelle La stratégie Cre/loxP (ou FRT/FLP, qui est similaire) permet l'apparition conditionnelle d'une mutation chez l'animal en cours de développement ou chez l'adulte (Cohen-Tannoudji et Babinet, 1998; Gu et al., 1994).Il s'agit dans un premier temps de créer des souris porteuses d'un allèle flanqué de deux séquences loxP encadrant une partie essentielle d'un gène d'intérét sans pour autant altérer son fonctionnement, en les plaçant par exemple dans dés introns (gène " floxé "). On accouple une souris ainsi produite avec une autre souris transgénique exprimant la recombinase dans un type cellulaire particulier. Cette stratégie est potentiellement très efficace, car elle permet non seulement de contourner le probléme de la létalité embryonnaire qui se produit lorsque toutes les cellules de l'embryon portent la mutation, mais aussi d'examiner l'effet de cette mutation dans n'importe quel tissu pourvu quel'on dispose d'une lignée de souris transgéniques exprimant la protéine Cre dans le tissu en question (Xu et al., l999; Shibata et al., 1997; Kulkarni et al., l999; Tsien et al., 1996; Harada et al., l999). Un raffinement supplémentaire consiste à contrôler l'induction de la mutation, non seulement dans l'espace mais également dans le temps grâce à des systèmes inductibles. Dans cette optique, la protéine Cre est exprimée sous la forme d'une protéine de fusion avec un domaine de fixation à un ligand. Cette protéine de fusion ne présente pas d'activité Cre. En revanche, en présence du ligand approprié, un changement de conformation permet la restauration de l'activité de Cre. Ainsi chez les souris transgéniques portant les deux allèles du gène d'intérêt " floxés "et exprimant la protéine Cre fusion (récepteur au ligand associé à la protéine) dans un tissu particulier (Shibata et al., l 997), l'administration du ligand approprié provoquera l'induction de la mutation nulle dans ce type de tissu au moment voulu. Il est également possible de contrôler l'expression de la recombinase en utilisant des systèmes qui permettent d'induire ou de réprimer la transcription d'un gène rapporteur. Le système le plus docomenté utilise les propriétés du couple opérateur/répresseur de l'opéron bactérien tétracycline (tet) (Baron U. et al, l 999) Toutes ces techniques prometteuses présentent cependant deux inconvénients majeurs, la construction de vecteurs complexes et le temps indispensable pour réaliser et analyser ces modèles murins. Ainsi, on estime qu'aujourd'hui, le temps d'obtention d'une souris knockin ou knock-out conditionnel est d'environ 15 à 18 mois. En moyenne, il faut en effet environ 8 à 9 mois pour cloner, cartographier, et construire le vecteur cible, 1 à 2 mois pour la culture de cellules ES et enfin 6 à 8 mois d'animalerie et de croisement. L'objet de la présente invention est de réduire les délais de manipulations de biologie moléculaire qui devraient, par l'utilisation des vecteurs et/ou procédés selon l'invention, pouvoir être menées en 3 mois au lieu de 8 ou9 mois. Ce gain de temps est significatif tout en présentant un risque plus faible de non-réussite grâce à l'élimination des étapes de sous-clonages et à la diminution du nombre d'étapes de clonage, grâce à l'utilisation des vecteurs selon l'invention. I1 est estimé que l'utilisation de ces vecteurs permet de descendre en dessous de la barre des 12 mois pour produire un modèle murin. L'objectif de la présente invention est de fournir un nouveau vecteur de base, adapté à la création d'une banque d'ADN génomique, ledit vecteur étant également adapté pour pouvoir étre transformé de façon directe (sans sous-clonage) afin d'effectuer les réactions de recombinaison homologue dans l'hôte cible. L'invention divulgue ainsi un procédé permettant d'accélérer la fabrication des vecteurs utilisés pour la mise en _uvre de la recombinaison homologue, dans tout organisme, et de prétérence dans des cellules eucaryotes, notamment des cellules souches ES issues d'organismes pluricellulaires. Ainsi, dans un premier aspect, la présente invention a pour objet un vecteur de clonage adapté pour la création d'une banque d'ADN génomique, caractérisé en ce qu'il présente une cassette comprenant: - un polylinker permettant l'intégration d'un fragment d'ADN génomique, ledit polylinker étant fianqué de sites rares de restriction, et que ladite cassette est flanquée de sites très rares de restrictions. Un élément est " flanqué de sites de restriction " lorsqu'un site de restriction au moins est présent à chaque extrémité de l'élément. Dans un mode de réalisation préférée, ladite cassette comprend également au moins un gène de sélection négative. Le vecteur selon l'invention est parfaitement adapté pour la création de banque d'ADN génomique, et perrnet notamment le clonage de fragments d'ADN de taille moyenne voire de grande taille. L'homme du métier sait ce que signifie qu'un vecteur est adapté à la création d'une banque d'ADN, notamment génomique, c'est-à-dire qu'il permet d'insérer et d'obtenir la stabilité des séquences d'ADN insérées, notamment pour ce qui est du maintien du vecteur dans la cellule hôte, en particulier lors de la réplication, et pour lequel on observe un taux faible d'événements de recombinaison du fragment d'ADN avec lui-méme et/ou perte de séquences d'ADN exogène. Des exemples de vecteurs utilisables sont donnés ci- après. Par " fragments de taille moyenne ", on entend notamment des fragments d'une taille supérieure à l 5 kilobases (kb), de prétérence comprise entre l 5 kb et 75 kb, de prétérence comprise entre environ 17 kb et environ 50 kb, de préférence comprise entre environ 20 kb et environ 30-35 kb. Par " sites rares de restriction ", on entend des sites de restriction dont la fréquence de coupure est supérieure à l0 kb, de prétérence lS kb, de façon plus préférée 20 kb dans le génome humain. Parmi les enzymes rares, on peut notamment citer PmeI, SgrAI, RsrII, ClaI, NotI, PacI, Sril, NheI, FseI, NsI. Un site de restriction est dit " très rare " lorsque sa fréquence de coupure dans le génome humain est supérieure à l00, de prétérence 200 kb (par exemple AscI). Parmi les sites de restriction très rares utilisables, on peut citer les " Homing endonucleases ". Ces euzymes sont des protéines codées par des gènes possédant des introns s'auto-épissant. Ces euzymes effectuent des coupures site-spécifiques dans de l'ADN double brin, et reconnaissent généralement des sites de l 8-20 bases ou plus. On note en particulier I-PpoI,, I-CeuI, PI-PsI, I-SceI, PI-SceI. Par ailleurs, ainsi qu'il sera vu, le vecteur de clonage selon la présente invention, et en particulier lorsqu'il présente au moins un gène de sélection négative, est également particulièrement adapté pour la recombinaison homologue dans des cellules de mammifères, notamment les cellules souches murines, de lapin, porcines, bovines, humaines. Dans un cas particulier, le vecteur selon l'invention présente, dans son polylinker pour le clonage de l'ADN exogène, un maximum de 4, de préLérence 3, de prétérence deux sites de restrictions. Il est particulièrement avantageux de réduire le nombre de sites de restrictions situés dans le polylinker utilisé pour l'insertion du fragment d'ADN exogène, ou situés dans le squelette du vecteur, afin de pouvoir util i ser l es enzymes de restri ction correspond antes ap rès cl o nage du fragment d'ADN exogène, pour vérifier notamment la nature dudit fragment, voire son orientation, ainsi que la nature, l'orientation et l'emplacement exact des modifications introduites dans le fragment d'ADN exogène. Ainsi, il est possible que le polylinker ne présente qu'un seul site de restriction. Il existe aujourd'hui différents types de vecteurs permettant la construction de banques d'ADN. On peut notamment citer les cosmides ou les chromosomes artificiels. Ces derniers, qui peuvent être adaptés aux bactéries (BAC), aux levures (YAC) ou aux cellules mammifères (MAC) permettent l'intégration stable de fragments d'ADN pouvant aller jusqu'à 200 kb ou plus. Les cosmides ont une capacité plus limitée (environ 20 à 40 kb), mais qui est toutefois plus importante que les plasmides classiques, par exemple ceux dérivés de pBlueScript qui ne peuvent recevoir au maximum qu'environ 14-lS kb. Les chromosomes artificiels de bactéries sont des vecteurs particulièrement attractifs, car ils peuvent être utilisés dans des hôtes faciles à manipuler (notamment lE;scherichia coli), et assurent un maintien stable des fragments d'ADN introduits. Ainsi, dans un cas particulier de l'invention, le vecteur est dérivé d'un cosmide, ou d'un vecteur de chromosome artificiel, de préférence de bactérie. Par " vecteur dérivé d'un autre vecteur ", on entend que le vecteur final possède globalement le même squelette (notamment les origines de réplication...) que le vecteur de départ dont il est dérivé (vecteur parent). Il est important de noter que ceci signifie également que, de préférence, les éléments intergéniques sont conservés. Les modifications apportées dans le vecteur de base sont de telles sortes que l'hôte de réplication du vecteur reste le méme, et ne modifient pas les propriétés fondamentales du vecteur (nombre de copies, taille de l'insert, stabilité. ..). Il est à noter que l'on peut envisager de modifier le gène de sélection du vecteur dérivé par rapport au vecteur parent, pour autant que les propriétés de réception d'ADN exogène du vecteur dérivé ne soient pas altérées par rapport au vecteur parent. On choisit de prétérence un vecteur dérivé du corps du vecteur de chromosome artificiel de bactérie pBeloBAC11, bien connu de 1'homme du métier, dont la séquence peut notamment étre obtenue dans GenBank sous le numéro d'accession U5 1 1 13. Le vecteur selon l'invention est préférentiellement basé sur le squelette de pBeloBACll, digéré par SalI, et religué. Ainsi, le vecteur selon l'invention est dépourvu des séquences cosN, loxP, et lacZ, initialement présentes dans pBeloBAC11. Une telle modification permet en effet de supprimer certaines séquences d'origine bactérienne (lacZ), ou utiles dans la levure (cosN), ou pouvant interférer ultérieurement avec une recombinaseûtile pour le procédé selon l'invention (loxP). La suppression des éléments d'origine bactérienne ou de levure est en effet avantageuse pour améliorer la fréquence des événements de recombinaison dans les cellules de mammifères. Le maintien du site loxP pourrait s'avérer génant pour l'utilisation ultérieure d'une recombinase Cre sur les vecteurs 1 5 obtenus. Dans un cas particulier de l'invention, on a supprimé, dans le vecteur selon l'invention, au moins un site de restriction choisi parmi les sites présents 1, 2 ou 3 fois dans le squelette du vecteur parent. L'absence d'au moins un des sites de restrictions précités dans le squelette du vecteur selon l'invention permet notamment d'utiliser ce site pour l'étude des fragments intogrés dans ledit vecteur, ou pour introduire par procédé enzymatique les gènes de sélection modifiant le fragment d'ADN exogène avant son utilisation pour la recombinaison homologue proprement dite. La modification du squelette du vecteur pour supprimer les sites précités peut étre effectuée par mutagenèse dirigée, afin que l'enzyme de restriction correspondante ne coupe plus le squelette du vecteur. D'une façon préférée, et notamment lorsque le vecteur selon l'invention est dérivé du vecteur pBeloBAC11, on a supprimé, dans son squelette au moins un site de restriction choisi parmi ApaI, BstEII, SacII, Sf I, SpeI, SphI, StuI, XhoI, BssI, EcoRI, EcoRV, KpnI, NdeI, NotI, NruI, PvuI, SgrAI, XbaI, PstI, SalI et SmaI. Ainsi que précisé plus haut, il peut être avantageux de supprimer le maximum de ces sites de restriction, c'est-à-dire au minimum 2 de ces sites, au mieux 3, 4 ou 5, dans le meilleur des cas, de n'en garder aucun. Dans un cas particulier, le squelette du vecteur selon l'invention ne possède plus le site BstEII. Dans un mode de réalisation particulier, la cassette du vecteur selon l'invention présente un site très rare de restriction à l'une de ses extrémités et deux sites très rares de restriction à l'autre extrémité, l'un de ces deux sites étant de prétérence identique au site situé à la première extrémité de la cassette. La présence de ces sites permet soit de linéariser le vecteur selon l'invention (utilisation du site présent à une seule extrémité de la cassette), soit d'exciser l'insert intégré dans le vecteur (utilisation du site situé aux deux extrémités de la 1 0 cassette). Dans un cas particulier et prétéré, le polylinker du vecteur selon l'invention permettant l'intégration de l'ADN exogène est flanqué de plusieurs (notamment un nombre égal ou supérieur à 2, 3, ou 4) sites rares de restrictions choisis notamment parmi PmeI, SgrAI, RsrII, ClaI, NotI, PacI, Srfl, NheI, FseI. Le vecteur selon l'invention contient ainsi au moins un gène de sélection négative. On peut notamment choisir des gènes suicides, c'est-à-dire qui codent pour des produits capables de transformer une substance inactive en substance cytotoxique. On cite notamment les gènes de la thymidine kinase du virus HSV-1, utilisable avec le ganciclovir ou l'acyclovir, le gène DTA, codant pour le fragment A de la toxine diphtérique, décrit dans Yagi et al., (1990, PNAS, 87, 9918-22), toxique par sa seule présence. I1 existe aujourd'hui plusieurs gènes suicides à la disposition de l'homme du métier, pouvant étre utilisés comme marqueurs de sélection négative. On peut aussi citer le cytochrome p450 de rat et la cyclophosphophamide (Wei et al., 1994, Human Gene Ther. 5, 969-978), la purine nucleoside phosphorylase d'Escherichia coli (E. coli) et la 6-methylpurine deoxyribonucleoside (Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1, 223-8), la guanine phosphoribosyl transterase d'E. coli et la 6-thioxanthine (Mzoz et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 589-595), les cytosine deaminase (CDase) ou uracil phosphoribosyl transLérase (UPRTase) qui peuvent être utilisées avec la 5-fluorocytosine (5-FC). Le gène de sélection négative est ainsi situé à une extrémité du polylinker utilisé pour le clonage du fragment d'ADN génomique, mais le vecteur selon l'invention contient de préLérence deux gènes de sélection négative (éventuellement identiques), chacun étant situé de part et d'autre dudit polylinker. D'une façon prétérée, le vecteur de clonage selon l'invention contient deux copies du méme gène de sélection négative, flanquant le polylinker utilisé pour le clonage du fragment d'ADN génomique, lui-même flanqué de sites rares de restriction (figure l). On obtient donc une construction ainsi faite (de 5' vers 3'): - au moins un site très rare de restriction, - un marqueur de sélection négative, une cassette SRl possédant au moins un (de préférence plusieurs) site(s) rare(s) de restriction, - le polylinker présentant un nombre réduit -de sites de restriction, - une cassette SR2 contenant au moins un (de prétérence plusieurs) site(s) rare(s) de restriction, de préférence différent(s) du (des) site(s) de la première cassette, - un marqueur de sélection négative, éventuellement identique au premier 1 5 marqueur, - au moins un site très rare de restriction, de prétérence deux sites très rares de restriction, l'un étant de prétérence identique au premier site mentionné ci-dessus, l'autre différent. La présence de plusieurs sites très rares de restriction permet en effet de linéariser le vecteur de clonage selon l'invention ou d'isoler l'insert situé entre deux sites très rares de restriction. Il est à noter que, de préférence, les sites rares de restriction contenus dans une des cassettes sont tous différents de ceux contenus dans l'autre cassette. Ceci permet en effet de linéariser le vecteur selon l'invention après clonage du fragment d'ADN génomique, et, dans la mesure o il est intéressant, pour des événements de recombinaison homologue dans les cellules mammifères, de disposer d'un bras long d'homologie et d'un bras court d'homologie, de pouvoir utiliser l'exonucléase III afin de réduire l'un des deux bras. Il est à noter que les cassettes SRI et SR2 peuvent aussi contenir des sites de restriction moins rares, tels notamment SacI, SwaI, SphI ou SalI. Le vecteur selon l'invention permet donc la construction d'une banque d'ADN génomique de l'organisme dans lequel on désire effectuer la recombinaison homologue. De préLérence, cette banque est composée de fragments de taille moyenne, afin de pouvoir effectuer les modifications nécessaires à la recombinaison homologue directement dans le vecteur ayant servi à la construction de la banque, sans qu'il soit nécessaire de sous-cloner le fragment d'ADN génomique portant le locus cible, après son identification dans la banque. Il est toutefois important de noter que la taille des fragments dans la banque peut être proportionnelle à la taille du génome de l'organisme cible, dans la mesure o il est intéressant (notamment pour des raisons pratiques de manipulation) de limiter le nombre de clones présents dans la banque. Ainsi, pour un génome tel que celui de la souris, on choisit de fabriquer une banque de fragments d'une taille moyenne égale à 20-30 kb. La présente invention concerne donc également une banque d'ADN génomique de fragments de taille moyenne, fabriquée dans un vecteur selon l'invention. L'homme du métier connait les différents moyens de fabriquer une banque d'ADN génomique dans un vecteur approprié, notamment par digestion partielle de l'ADN génomique. Le vecteur selon l'invention a de plus été optimisé afin qu'il soit parfaitement adapté à un procédé de mise en _uvre de recombinaison ciblée dans le génome d'un organisme cible, à partir d'une banque de fragments génomiques qui y sont clonés. Ainsi, on peut introduire les éléments modifiant le fragment portant le locus cible identifié dans la banque d'ADN génomique directement dans le vecteur le portant et effectuer la réaction de recombinaison homologue dans l'hôte cible, sans avoir besoin de sous-cloner le locus cible. En effet, le fait que le vecteur selon l'invention porte un gène de sélection négative permet de sél ecti onner plu s faci l ement l es événement s de recomb in ai son homologue. Après sélection du clone portant le locus cible dans la banque d'ADN génomique, on peut introduire le ou les fragments d'ADN qui seront utilisés pour modifier le gène cible in vzvo (par exemple les gènes de sélection positive ou sites de reconnaissance de la recombinase Cre). Ces fragments d'ADN peuvent étre introduits dans le vecteur par clonage classique (utilisation de sites enzymatiques) ou par recombinaison homologue dans les bactéries, ou encore par l'utilisation de transposons ou par toute autre technique adaptée. L'utilisation de transposons est préférée, car elle permet de réduire le temps nécessaire à l'obtention du locus modifié, puisqu'il n'est pas besoin d'étudier préalablement la cartographie dudit locus. Ainsi, la présente invention a également pour objet un procédé pour effectuer une recombinaison ciblée dans un organisme, à partir d'une banque d'ADN génomique dans un vecteur selon l'invention comprenant: a) l'incubation d'un vecteur de ladite banque génomique avec au moins un fragment d'ADN comprenant au moins un transposon, ledit kansposon comprenant - un gène de sélection positive, éventuellement un gène de sélection négative et/ou un gène marqueur, lesdits gènes de sélection étant éventuellement encadrés par les sites d' action I d'une recombinase site-spécifique I, et de façon optionnelle - au moins un site d' action II d'une recombinase site-spécifique II différente de la première recombinase I, ledit site d'action II n'étant pas situé entre lesdits sites d'action I de la première recombinase I, en présence d'une enzyme ayant une activité de transposase pour l e(s)d it( s) transpo son(s), de tell e sorte qu e l e(s)dit(s) tran spo son(s) est (sont) transféré(s) dans ledit fragment génomique, b) l'introduction dudit vecteur, éventuellement linéarisé, portant ledit fragment génomique dans lequel est (sont) inséré(s) le(s)dit(s) transposons dans une cellule hôte cible issue dudit organisme, c) la sélection des événements de recombinaison homologue dans ladite cellule cible par l'utilisation du (des) gène(s) de sélection positive porté(s) par le(s)dit(s) transposon(s) , et éventuellement du gène de sélection négative porté par ledit vecteur de clonage. De préLérence, ledit fragment génomique modifié est un fragment de taille moyenne. Le procédé selon l'invention permet l'intégration ciblée, et la recombinaison homologue dans un organisme cible, de préférence un organisme mammifère, de façon plus préférée des cellules de rongeurs (notamment murines), de lapins, porcines, ovines, bovines, voire humaines. Afin de vérifier les loci d'intégration des transposons dans les fragrnents génomiques portés par les vecteurs selon l'invention, on peut notamment utiliser les enzymes de restriction coupant aux sites rares dans les cassettes SR1 et SR2. On utilise aussi éventuellement ces euzymes pour linéariser le vecteur, et former les petit et long bras d'homologie grâce à l'action ciblée de l'exonucléase III. Le procédé selon l'invention est avantageusement complété en faisant suivre l'étape c) d'une étape d): d) l a soumi s si on des cellul es transformées par recomb inai son homo lo gue et sélectionnées dans l'étape c) à l'action de la recombinase I, afin d'éliminer le(s) gène(s) de sélection positive et éventuellement négative porté(s) par le(s) transposon(s). De façon préférée, l'organisme cible est donc un organisme pluricellulaire, et ladite cellule cible issue dudit organisme est une cellule souche. Dans un cas préféré, on induit la délétion d'un fragment génomique et/ou l'insertion d'un fragment exogène dans ledit organisme après l'étape c) ou éventuellement l'étape d) par la mise en contact des cellules sélectionnées dans l'étape c) ou dérivées desdites cellules avec la recombinase II. Ceci permet ainsi d'obtenir une inactivation conditionnelle du gène que l'on a ciblé, notamment lorsque la construction a été réalisée de telle façon que les sites loxP se retrouvent dans des introns du gène que l'on désire inactiver. Cette inactivation conditionnelle est effectuée in viro, ainsi que décrit dans l'introduction. La présente invention concerne également un kit comprenant: - un vecteur de clonage selon l'invention, - au moins un fragment d'ADN comprenant au moins un transposon, ledit transposon comprenant un gène de sélectionpositive, et éventuellement un gène de sélection négative et/ou un gène marqueur, le(s)dit(s) gène(s) de sélection étant éventuellement, et de façon prétérée, encadré(s) par les sites d'action I d'une recombinase site-spécifique I. De façon optionnelle, ledit transposon comprend également un gène de sélection négative ou un gène marqueur situé à côté du gène de sélection positive, situé ou non entre les sites d'action I de ladite recombinase site-spécifique I lorsque celle-ci est présente. Le transposon utilisable pour la présente invention peut être de toute sorte, notamment le transposon Tn5. Le transposon Tn5 est choisi de préférence pour son intégration unidirectionnelle dans l'ADN cible (de 5' vers 3'), pour une utilisation directe avec une transposase sans avoir à rajouter de cofacteurs et pour sa commercialisation en kit. Pour contourner le probléme d'instabilité, s'il se présente, l'utilisation de différents types de transposons (par exemple Tn5, TnlO, Tn7) peut étre envisagée (Brune et al., 1999; Chatterjee and Coren, 1997; Goryshin et al. , 2000; Goryshin and Reznikoff, 1998; Stellwagen and Craig, 1997; Westphal and Leder, 1997; Yang et al., 1997). Certains gènes de sélection négative utilisables pour la mise en _uvre de la présente invention ont été cités plus haut. Parmi les gènes marqueurs utilisables, on peut citer le gène lacZ, ou les gènes codant pour des protéines fluorescentes (FP). Les gènes de sélection positive sont bien connus de l'homme du métier et sont préférentiellement des gènes de résistance à un antibiotique, tel les gènes de résistance à la kanamycine, qui permet également la résistance à la néomycine dans les cellules mammifères, résistance à l'hygromycine, à la zéocine, à la blasticidine... De façon optionnelle, le transposon comprend également au moins un site d'action II d'une recombinase site-spécifique II différente de la première recombinase I, le(s)dit(s) site(s) d'action II n'étant pas situé(s) entre lesdits sites d' action I de la première recombinase I. De fac, on préférée, le kit selon l 'invention comprend deux fragments d'ADN, chacun comprenant un transposon, chaque transposon portant un gène de sélection positive différent, et éventuellement un gène de sélection négative, le gène de sélection négative étant alors de prétérence identique pour les deux transposons, lesdits gènes de sélection positive et négative étant de préférence encadrés par les sites d'action d'une recombinase I. Dans un mode de mise en _uvre prétérée de l'invention, chaque transposon comprend une séquence correspondant à un site d'action d'une recombinase II différente de la première recombinase I. Ainsi, dans un cas préféré, ladite recombinase I est la recombinase FLP, ladite recombinase II étant la recombinase Cre. Il est alors avantageux que l'un des transposons contiennent les séquences FRT natives reconnues par la recombinase FLP, l'autre transposon contenant alors les séquences FRT* mutées, telles que décrites par Schalke et Bode (1994). Afin de mettre en _uvre le procédé selon l'invention, décrit plus haut, pour faciliter les événements de recombinaison ciblée, il est avantageux que le kit selon l'invention comprenne également une enzyme ayant une activité de transposase pour le(s)dit(s) transposon(s), ainsi que les instructions de mise en ceuvre pour l'insertion du(des)dit(s) transposon(s) dans le fragment génomique situé dans ledit vecteur de clonage. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1: carte schématique d'un vecteur modifié selon 1'invention. SR1 et SR2: cassettes présentant les sites de restriction rares. PL: polylinker pour le clonage des fragments génomiques. DTA: gène de la sous-unité A de la toxine diphtérique. Figure 2: description de l 'insertion de deux transposons dans un fragment d'ADN dans le vecteur selon l'invention. DTA: gène du fragment A de la toxine diphtérique, présent dans le vecteur selon l'invention. SR1 et SR2, cassettes contenant au moins un site de restriction rare. Site très rare: site notamment d'Homing endonucléase. Kana: gène de résistance à la kanamycine en bactéries, à la néomycine dans les cellules encaryotes. Zeocin: gène de résistance à la zéocine. TK: gène de la thymidine kinase du HSV1. FRT: sites de reconnaissance de la recombinase FLP. FRT*: sites mutés de reconnaissance de la reombinase FLP. LoxP: sites de reconnaissance de la recombinase Cre. OE/S: séquences permettant de déterminer le locus d'intégration du transposon. Figure 3: Schéma de la recombinaison homologue d'un vecteur selon l'invention après intégration de transposons dans un locus génomique. Les boites noires 1, 2, 3, 4 représentent les exons du gène cible. Les autres sigles ont la signification précédente. L'événement de recombinaison homologue est sélectionné par la résistance à la néomycine (présence du gène kanamycine) et à la Zéocine, et l'absence des gènes DTA du vecteur (sélection négative). Fiaure 4: Action de la recombinase FLP dans les cellules sélectionnées pour la recombinaison homologue pour obtenir un locus final knock-out conditionnel en supprimant les séquences d'ADN exogènes (gènes de résistance). Figure S: Action de la recombinase Cre sur les cellules sélectionnées pour la recombinaison homologue pour obtenir un locus final knock-out, et production d'une protéine trouquée. Fiaure 6: Action de la recombinase Cre in vivo dans l'animal transgénique dérivant des cellules ayant été soumises à la recombinase FLP pour obtenir un locus final knock-out, et production d'une protéine trouquée de manière conditionnelle. Figure 7: carte du plasmide pBeloBAC11, utilisé en tant que vecteur parent pour certains vecteurs selon l'invention. EXEMPLES Exemple 1: La première étape consiste à créer une banque de mini-BAC (entre 20 et 30 kb) adaptée à la construction de tou s les types de vecteurs de recomb inai son homologue. Cette banque est produite à partir d'ADN génomique de souris 129 sv et d'un vecteur pBeloBacl 1 modifié (figure 1). Des gènes de sélection négatifs sont rajoutés de part et d'autre du poly-linker de pBeloBAC. Les fragments d'ADN génomique dits grand bras et petit bras d'homologie du vecteur de recombinaison homologue (Thomas et Capecchi, 1987; Hasty et al., 1991; Thomas et al., 1992) proviennent de cette banque. Des techniques standard de sélection comme la PCR et le Southern blot sont utilisées pour sélectionner le mini-BAC contenant la partie à modifier du gène d'étude. Des transposons sont insérés dans le mini-BAC afin d'introduire des gènes de sélection procaryotes, encaryotes, et des sites d'action des recombinases. Ces transposons portent également des séquences spécifiques pouvant servir aux séquençages, aux tests PCR et aux digestions enzymatiques (Figure 2). Le vecteur de recombinaison homologue est électroporé dans des cellules ES, l'événement de recombinaison homologue est sélectionné en présence de Zéocine, de G418 (Yagi et al., 1990) (Figure 3). L'obtention de la mutation dite propre dans ces cellules ES recombinées est obtenue par l'action de la recombinase FLP en présence de gancyclovir (Hasty and Bradley, 1993) (action d'élimination des cellules ES contenant le gène de la thymidine kinase TK). Construction de la bangue de BAC Le génome de la souris est formé d'environ 3 milliards de paires de bases. Pour couvrir de façon satisfaisant ce génome, il est essentiel d'avoir une bonne représentation de sa diversité au sein de la banque de départ. Un modèle statistique a été élaboré dans ce but. I1 se base sur l'équation mathématique suivante: N = -LO In ( (l-p)/(L-1)3 Cette équation prend en compte les éléments suivants: - L: taille du fragment inséré dans le mini-BAC - N: nombre de clones composant la banque - p: pourcentage de réussite du criblage de la banque - 1: taille du locus cible devant être présent dans le mini-BAC L: Longueur minimum insécable d'intérêt - LO: longueur du génome La taille du fragment génomique est choisie entre 20 et 30 kb (moyenne à 25 kb). Cette taille permet une manipulation facilitée des BAC tout en n'augmentant pas trop le nombre de clones devant composer la banque de BAC. La première étape consiste à sélectionner le ou les mini-BACs positifs pour la région du gène d'intérêt (locus cible). Ce travail est réalisé par analyse de la totalité de la banque en associant des techniques simples de sélection par PCR et par Southern blot. En moyenne, 150 PCR sont nécessaires pour réaliser ce travail (test des superpools puis des pools et enf n identification des clones positifs) . Parmi les BAC détectés positifs, il convient de choisir celui qui contient le gène d'intérêt dans une position adéquate. En effet, il est essentiel que les sites d'insertion visés pour 1'intégration des transposons ne soit pas trop proche des extrémités. Le petit bras d'homologie doit avoir une taille minimale d'environ 3,5 Kb pour autoriser la construction du vecteur témoin positif et du vecteur fnal de recombinaison homologue. Ce choix se fait par simple prof1 enzymatique suivi d'une détection des fragments cibles. Intégration des transposons Dans le mini-BAC choisi, deux transposons (Tn5) sont intégrés aléatoirement, porteur chacun de gènes de résistances différents (Yang et al., 1997). Chacun possède des séquences spécifiques permettant de remplir sa mission d'insertion (OE de deux fois 19 Pb). Les insertions et la caractérisation du site d' insertion de chaque transposon se fait successivement. Le transposon I correspond à la cassette exogène classique d'un vecteur de recombinaison homologue (Figure 2) contenant le gène de sélection positive (Néo) et négatif (TK) encadré de sites d' action d'une recombinase ou non, de gènes marqueurs (lacZ par exemple) ou non... Il est a noté que ce gène de sélection positif est également utilisé comme gène de sélection de l'intégration du transposon dans le mini-BAC (promoteur mixte eucaryote-procaryote). Pour l'inactivation classique d'un gène, le transposon 1 est introduit dans une région indispensable à l'expression du gène (exon 1 par exemple). Sinon il sera introduit dans un intron pour permettre une inactivation conditionnelle ultérieure. Le transposon 2 apporte un deuxième gène de sélection négative (TK) et un gène de sélection positive à la zéocine, encadré de sites d'action d'une recombinase. Ce transposon permet d'introduire une pression de sélection sur l'intégration d'un site loxP (additionné ou non d'autre séquence) utilisé par la recombinase Cre. De nombreux problèmes lors de l'événement de recombinaison homologue ont été mentionnés pour les modèles animaux d' inactivation conditionnelle de gène. En effet, il n'est pas rare d'avoir une intégration homologue de la partie se trouvant sous la pression de sélection au G418 (ncomycine) mais de perdre à chaque fois la séquence loxP (34 pb) présente en amont ou en aval. L'introduction du deuxième gène de sélection (zéocine) au niveau de cette séquence loxP augmente les chances d'obtenir des cellules ES ayant intégré de façon homologue les deux transposons et donc les deux séquences loxP d'intérêt. Les transposons sont conçus afin de pouvoir déterminer leur position relative ainsi que leur position par rapport aux extrémités de l'insert du mini-BAC (site de restriction (S1, S2, S3, S4), séquences spécifiques pour amorces de PCR (OE)...). Sélection de l'événement de recombinaison homologue A ce stade, de nombreux antibiotiques sont utilisés en association. L'intégration des deux séquences loxP se fait sous la pression de sélection au G418 et à la zéocine. La sélection de l'événement de recombinaison homologue est facilitée par la sélection négative DTA au deux extrémités de la construction. " NettoYage " des cellules ES recombinées: obtention d'une mutation dite " propre " Pour produire un modèle murin le plus proche possible de la réalité, il est nécessaire d'enlever les gènes utilisés pour les sélections des événements d'intégration des transposons dans le mini-BAC et dé l'événement d'intégration du transgène dans les cellules ES (Figure 4). Dans cette optique, il est intéressant d'utiliser des séquences reconnues par la recombinase FLP, les sites FRT mutés ou non. Le principe est le suivant: deux sites FRT vont permettre à la FLP d'exciser 1 5 les séquences se trouvant entre ces deux sites. Il ne reste alors plus qu'un des deux sites FRT. Un site FRT muté ne peut agir qu'avec un autre site FRT muté (Schlake and Bode, 1994). De cette manière, il nous est possible d'exciser les gènes de sélection de l'insertion des deux transposons. Il ne reste alors plus que les séquences permettant l'insertion des transposons (OE), les deux séquences loxP et deux séquences FRTs (mutées ou non). Ces séquences (OE, loxP, FRT) se retrouvent sur deux sites d'insertion et représentent chacun 150pb (voir figure 4). Les cellules ES recombinées dites propres sont micro-injectées dans des blastocystes pour donner un modèle murin. REFERENCES Araki, et al. (1995). Proc Natl Acad Sci U S A 92, 160-4. Austin, et al. (1981). Cell 25, 729-36. 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Vecteur de clonage adapté pour la création d'une banque d'ADN génomique, caractérisé en ce qu'il présente une cassette comprenant - un polylinker permettant l'intégration d'un fragment d'ADN génomique, ledit polylinker étant flanqué de sites rares de restriction et que ladite cassette est flanquée de sites très rares de restrictions. 2. Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite cassette comprend également au moins un gène de sélection négative. 3. Vecteur selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce ledit polylinker permettant l'intégration d'un fragment d'ADN génomique présente un maximum de 4 sites de restrictions. 4. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est dérivé d'un cosmide, ou d'un vecteur de chromosome artificiel, de préférence de 1 5 bactérie. S. Vecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est dérivé du vecteur pBeloBAC 1 1. 6. Vecteur selon la revendication 4 ou S. caractérisé en ce qu'au moins un site de restriction choisi parmi les sites présents 1, 2 ou 3 fois dans le squelette du vecteur parent en est absent. 7. Vecteur selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que son squelette ne présente plus au moins un site choisi parmi ApaI, BstEII, SacII, S)iI, SpeI, SphI, StuI, XhoI, BssHII, EcoRI, EcoRV, KpnI, NdeI, NotI, NruI, PvuI, SgrAI, XbaI, PstI, SalI et SmaI. 8. Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce que son squelette ne présente plus de site BstEII. 9. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ladite cassette présente un site très rare de restriction à l'une des ses extrémités et deux sites très rares de restriction à l'autre extrémité, l'un de ces deux sites étant identique au site situé à l'autre extrémité de la cassette. 10. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ledit polylinker est flanqué de plusieurs (nombre supérieur à 3) sites rares de restrictions choisis notamment parmi PmeI, SgrAI, RsrII, ClaI, NoI, PacI, Srfl, NheI. 11. Vecteur de clonage selon l'une des revendications 2 à 10, caractérisé en ce que ladite cassette comprend deux copies du méme gène de sélection négative, flanquant ledit polylinker et sites rares de restriction. 12. Procédé pour effectuer une recombinaison ciblée dans un organisme, à partir d'une banque d'ADN génomique dans un vecteur selon l'une des revendications 1 à 11 comprenant: a) l'incubation d'un vecteur de ladite banque génomique avec au moins un fragment d'ADN comprenant au moins un transposon, ledit transposon comprenant - un gène de sélection positive, - éventuellement un gène de sélection négative et/ou un gène marqueur, lesdits gènes de sélection étant éventuellement encadrés par les sites d'action I d'une recombinase site-spécifique I, - et de facon optionnelle au moins un site d'action II d'une recombinase site-spécifique II différente de la première recombinase I, ledit site d'action II n'étant pas situé entre lesdits sites d'action I de la première recombinase I, en présence d'une enzyme ayant une activité de transposase pour l e(s)dit(s) transpo son(s), d e tell e sorte que l e(s) dit(s) transpo son(s) est (sont) transféré(s) dans ledit fragment génomique, b) l'introduction dudit vecteur, éventuellement linéarisé, portant ledit fragment génomique dans lequel est (sont) inséré(s) le(s)dit(s) transposons dans une cellule hôte cible issue dudit organisme, c) l a sél ection des événements de recombinai so n ho mol ogue d an s l adi te cellule cible par l'utilisation du (des) gène(s) de sélection positive porté(s) par le(s) dit(s) transposon(s), et éventuellement du gène de sélection négative porté par ledit vecteur de clonage. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que 1'étape c) est suivie d'une étape d): d) la soumission des cellules transformées par recombinaison homologue et sélectionnées dans l'étape c) à l'action de la recombinase I, afin d'éliminer le(s) gène(s) de sélection positive et éventuellement négative porté(s) par le(s) transposon(s). 14. Procédé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que l'organisme cible est un organisme pluricellulaire, et que ladite cellule cible issue dudit organisme est une cellule souche. 15.Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit organisme appartient au genre des rongeurs, notamment à l'espèce murine. 16. Procédé selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que l'on induit la délétion d'un fragment génomique dans ledit organisme après l'étape c) ou éventuellement l'étape d) par la mise en contact des cellules sélectionnées dans l'étape c) ou dérivées desdites cellules avec la recombinase II. 17. Kit comprenant: - un vecteur de clonage selon l'une des revendications 1 à 11, - au moins un fragment d'ADN comprenant au moins un transposon, ledit transposon comprenant un gène de sélection positive, éventuellement un gène de sélection négative et/ou un gène marqueur, éventuellement encadrés par les sites d'action I d'une recombinase site-spécifique I, optionnellement au moins un site d'action II d'une recombinase site spécifique II différente de la première recombinase I, ledit site d'action II n'étant pas situé entre lesdits sites d'action I de la première recombinase I. 18. Kit selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprenant un ou deux fragments d'ADN, chacun comprenant un transposon, chaque transposon portant un gène de sélection positive différent, et éventuellement un gène de sélection négative, de préférence identique pour les deux transposons, lesdits gènes de sélection positive et négative étant encadrés par les sites d'action d'une recombinase I. 19. Kit selon la revendication 18, caractérisé en ce que chaque transposon comprend une séquence correspondant à un site d'action d'une recombinase II différente de la première recombinase I. i 20. Kit selon l'une des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que ladite recombinase I est la recombinase FLP, ladite recombinase II étant la recombinase Cre. 21. Kit selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisé en ce qu'il comprend une enzyme ayant une activité de transposase pour le(s)dit(s) transposon(s). 22. Kit selon l'une des revendications 17 à 21 pour la mise en _uvre d'un procédé selon l'une des revendications 12 à 16. 23. Banque d'ADN génomique, caractérisée en ce que les fragments d'ADN génomique sont clonés dans un vecteur selon l'une des revendications 1 à 11.