Brevet FR2827478A1 — publié le 20030124

La présente invention se rapporte à un procédé de préparation d'une poudre à base de nacre, à une protéine isolée de ladite poudre et à leurs utilisations en chirurgie osseuse et dans diverses pathologies ostéoarticulaires. Les situations cliniques répondant au besoin de comblement tissulaire ou d'aide à la re-cicatrisation du tissu osseux sont nombreuses. Ainsi en pathologie traumatique, les pertes de substances surviennent dans un contexte de mauvais revêtement cutané, d'infection locale et de nécrose. La solution la plus souvent proposée est d'apporter une couverture bien vascularisée dans les jours qui suivent le traumatisme. Les pertes de substance osseuse sont, en général, comblées ultérieurement en utilisant les sites de prélèvement autologue (péroné, crête tibiale, crête iliaque), les banques de tissu, et des biomatériaux osseux comme adjuvants. En cancérologie, les problèmes vasculaires et infectieux sont rarement présents et le comblement osseux se fait plus facilement avec des matériaux de substitution. Il en est de même dans le traitement de certaines malformations congénitales et dans le traitement chirurgical de la pathologie rachidienne. En chirurgie reconstructrice de la face, les implants osseux sont utilisés pour reconstruire la mandibule et les implants dentaires sont indispensables. Les progrès spectaculaires survenus depuis 20 ans en matière de prothèses articulaires et de techniques de reconstruction osseuse ont fondamentalement modifié le traitement des pathologies ostéoarticulaires. Initialement, la résolution des problèmes liés aux contraintes mécaniques a semblé prédominant, et les études biomécaniques fondamentales se sont développées. Rapidement, les chirurgiens se sont rendus compte qu'un grand nombre de complications postopératoires tardives était lié à une intolérance mécanique ou chimique entre le tissu biologique et les matériaux utilisés. Ainsi est née la notion de biocompatibilité, c'est à dire la capacité d'un matériau à entraîner une réponse adaptée de l'hôte. Un matériau biocompatible ne doit pas provoquer de réactions inflammatoires, ne doit être ni toxique, ni immunogène, ni carcinogène. De plus, un tel matériau doit résister aux fluides agressifs, donc être physiquement et chimiquement stable in vivo. Pour améliorer la biocompatibilité des matériaux de substitution, on a introduit des produits inducteurs, comme les hormones de croissance et des enzymes. Toutefois, le faible nombre de zones donneuses de l'organisme, les difficultés sérologiques d'utilisation des allogreffes et les insuffisances des biomatériaux existants réduisent les champs d'applications médicales et ont conduit à rechercher des biomatériaux capable d'apporter des facteurs inducteurs de la reformation de l'os. De nombreuses recherches dans ce sens ont permis d'aboutir à la mise au point de biomatériaux qui peuvent être soit ostéoconducteurs (permettant l'ostéoformation à partir d'une trame poreuse), soit ostéoinducteurs (contenant des substances susceptibles d'aider à la formation osseuse dans des zones non osseuses). La nacre a ainsi été proposée comme matériau de substitution et/ou de régénération osseuse, en particulier en chirurgie orthopédique (demande de brevet français n 2 715 568 et WO 94/17838) mais aussi dans la fabrication d'implants dentaires (demande de brevet français n 2 647 334). Certains auteurs ont montré que la nacre exerçait à distance des effets ostéoconducteurs et ostéogènes sur des cellules osseuses in vitro (Lopez et al., (1992), Tissu and Cell, 24,667-679) ; ces auteurs ont également suggéré que ces effets pourraient être dus à des substances actives existant dans la nacre et que ces substances pourraient être des analogues des BMP (. Bone Morphogenetic Proteins), protéines actives sur la formation de l'os, qui ont été isolées de la fraction insoluble de la matrice de l'os (Urist et al., (1979), Proc. Natl. Acad. Sci., 76,1828-1832). Ces mêmes auteurs décrivent dans la demande internationale WO 9724133 un mélange de protéines hydrosolubles qu'ils ont isolé à partir de la partie nacrée de l'huître Pinctada maxima ; ce mélange présente des activités biologiques de stimulation de la prolifération cellulaire, en particulier des ostéoblastes, des chondrocytes, des kératinocytes et des fibroblastes. Toutefois, aucune protéine n'a été isolée ni caractérisée. En outre, à la différence des biomatériaux artificiels, la nacre est totalement biocompatible. Aussi les inventeurs se sont donnés pour but de préparer une poudre à base de nacre issue de coquilles de mollusques aquatiques et d'isoler à partir de ladite poudre une protéine qui soit ostéoconductrice. En conséquence, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une poudre à base de nacre, comprenant le lavage des coquilles dans des conditions classiques aptes à décoller la matière organique fixée sur la coquille (algues, ascidies etc. ), et caractérisé en ce qu'il comprend un lavage d'au moins 48h par une solution basique à pH environ égal à 14, suivi d'au moins un lavage par une solution acide à 1% et à pH égal à 1,18 avec entre chaque lavage un rinçage à 1'eau distillée, de manière à retourner à pH neutre, puis un séchage et un broyage dans des conditions qui permettent d'obtenir des particules comprises entre 0,5 et 5 pm. Les coquilles utilisées sont des coquilles de mollusques aquatiques, notamment d'huîtres de l'étang de Thau, connues sous le nom scientifique de Crassostrea Gigas. Dans un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, les étapes de traitement chimique peuvent être réalisées sous un léger bullage, pour assurer une bonne diffusion des produits. Par ailleurs, l'étape de lavage peut être réalisée par un contre-courant d'eau. Dans un autre mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, la solution basique est une solution de potasse. Selon un autre mode préféré de réalisation du procédé selon l'invention la solution d'acide est une solution d'acide sulfamique. Dans un mode préféré de réalisation, la granulométrie finale de la poudre obtenue est d'environ 1 pm. Dans une variante du procédé selon l'invention, la poudre obtenue peut être compactée sous une pression comprise entre 10 et 12 tonnes par cm2. Ce procédé simple et peu coûteux permet d'enrichir les coquilles en nacre, par dissolution de la partie calcique. A partir d'une teneur initiale en nacre de l'ordre de 1% on arrive à une teneur finale comprise entre 5 % et 10 %. La présente invention a également pour objet une protéine, caractérisée en ce qu'elle est isolée de la poudre à base de nacre obtenue par le procédé selon l'invention. La présente invention concerne également les séquences nucléotidiques codant pour une telle protéine. Il doit être entendu que de telles protéines, obtenues d'une autre source ou par synthèse in vivo, par des organes ou des tissus isolés ou par des cellules en culture sont également comprises dans l'invention, de même que les protéines obtenues par synthèse chimique et génie génétique. La poudre à base de nacre obtenue par le procédé selon l'invention, les protéines isolées de ladite poudre, sont utiles à titre d'implant ou de médicaments, notamment pour faciliter la régénération des tissus osseux ou cartilagineux. En conséquence, ces produits peuvent, en particulier, être utilisés en chirurgie orthopédique, pour réaliser notamment des greffes osseuses dans le cas de pertes de substances osseuses, ou des comblements périprothétiques (par exemple, dans le cadre de la chirurgie prothétique de la hanche, ou de la stabilisation des moyens de fixation du rachis). Ces produits peuvent, par ailleurs, se révéler fort utiles dans le cadre de la chirurgie réparatrice et/ou esthétique, en permettant de réaliser une modélisation du volume et des contours de certains os. Enfin, on peut très sérieusement envisager l'utilisation desdits produits en dermatologie, notamment comme moyen de ponçage, ou pour leur action cicatrisante. Lesdits produits peuvent, bien entendu, entrer dans des compositions pharmaceutiques pouvant se présenter sous différentes formes : solutions, suspensions, lyophilisats, poudres, gels, pâtes, colles, revêtements, enduits. Comme indiqué précédemment, ces compositions pharmaceutiques peuvent être, en particulier, utilisées comme matériaux de comblement destiné à restaurer le squelette, dans le cas de perte et/ou de défaut de substance osseuse, qu'ils soient d'ordre traumatologique, esthétique ou pathologique. Dans ce cas, les matériaux de comblement peuvent, en outre, contenir un support solide biocompatible. L'invention sera, à présent, plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent et qui ne doivent pas être considérés comme limitant l'invention. Exemple 1 : Préparation de la poudre de nacre et extraction de la protéine. 1) Mode opératoire 1000g de coquilles d'huîtres de l'étang de Thau préalablement lavées à l'eau sous pression dans un tambour rotatif sont renettoyées avec un jet d'eau sous pression. Elles sont laissées pendant 48 heures dans une solution aqueuse de potasse à 30 g/l puis rincées par un contre-courant d'eau jusqu'à neutralisation à pH 7. Après le rinçage, les coquilles sont traitées pendant 48 heures par une solution aqueuse d'acide sulfamique à 100 g/l, lavées dans les conditions décrites précédemment, puis traitées pendant 48 heures avec une solution aqueuse d'acide sulfamique à 50 g/l. Les coquilles sont de nouveau lavées à l'eau dans les conditions déjà décrites et soumises à un dernier traitement pendant 48 heures par une solution aqueuse d'acide sulfamique à loo g/l. Finalement, les coquilles sont séchées dans une étuve thermostatée à 60 C 14 heures puis broyées. Le prébroyage et le broyage sont réalisés avec deux types de broyeurs distincts, pour obtenir en final des particules de granulométrie aussi proche que possible du micromètre. Afin d'éviter toute pollution du produit final, les broyeurs devront être parfaitement nettoyés. On obtient 10 g de poudre contenant environ 30% de nacre. La poudre est ensuite compactée dans un moule en acier présentant une résistance mécanique de 150 MPA, et sous une pression 2 comprise entre 10 et 12 tonnes par cm' Afin d'isoler la protéine, 20g de poudre de nacre sont ensuite mis en suspension dans 100ml d'eau distillée et placés dans un bain à ultrasons pendant 2h. Après filtration, la solution est lyophilisée, puis on effectue une électrophorèse pour isoler la protéine ostéoconductrice. On obtient environ 500pg de ladite protéine. Exemple 2 : Etude in vivo chez le rat 1. Mode opératoire L'étude est réalisée chez des rats Wistar de sexe féminin répartis en trois groupes de dix rats. Chez chaque rat, on excise un segment ostéopériosté de cubitus de 1,5 cm de long. Les animaux du groupe témoin ne reçoivent pas de matériau de comblement ; les animaux du groupe (I) reçoivent le matériau de comblement, sous forme de dépôt, et les animaux du groupe (II) reçoivent le matériau de comblement préalablement chauffé à 2000C pendant 12 heures. Les résultats ont été analysés sur des documents radiologiques et anatomo-pathologiques à J+2,1 mois, 2 mois et 3 mois après l'opération. La quantité de tissu non résorbé sert de marqueur de la qualité de la résorption. La quantité d'os néoformé, mesurée à J+2 et à 3 mois sert de marqueur qualitatif de la repousse osseuse. 2. Résultats al résultats radiographiques Dans le groupe témoin aucune ostéoconduction n'apparaît, confirmant qu'en l'absence d'effet ostéoconducteur, l'organisme n'est pas capable de combler spontanément une perte de substance osseuse. Dans le groupe (I) on observe un comblement de la perte de substance osseuse par un os néoformé, avec résorption du biomatériau en 3 mois en moyenne. Dans le groupe (II), l'ossification est plus lente et surtout la résorption est moindre. Chez 5 animaux sur 10, le comblement de la perte de substance a été complet, alors que dans les autres cas l'ossification semblait moins efficace, laissant un aspect effiloché du cal osseux de part et d'autre de la perte de substance. Ainsi le groupe (II) qui a reçu le biomatériau chauffé, ne montre pas de potentiel d'ostéoformation aussi net que le groupe (I). Ces résultats montrent que l'agent responsable de l'ostéoconduction est essentiellement protéique ou peptidique. hl Résu2tats anatomo-patho2ogiques Dans le groupe (I), on constate que l'os néoformé est situé au contact direct du biomatériau, sans interposition fibreuse. La résorption osseuse au contact du biomatériau se fait par des cellules de type ostéoclaste, que l'on retrouve au contact du biomatériau. Le produit se dégrade lentement, par effritement, car on retrouve de nombreux granules au contact du front d'ossification. Dans le groupe (II), la réaction fibreuse est plus importante. On ne retrouve pas de signes d'ostéoformation, mais des plages de tissu fibreux interposées entre le biomatériau et l'os néoformé. L'ostéoformation est réduite. Exemple 3 : Etude in vivo chez le lapin 1) Mode opératoire L'étude est réalisée sur 30 lapins répartis en trois groupes de 10. Sur chaque lapin, on effectue, sous anesthésie générale, une résection tibia-péroné de 2cm. Les animaux du groupe témoin ne reçoivent pas de matériau de comblement. Les animaux du groupe (A) reçoivent le matériau de comblement. Les animaux du groupe (B) reçoivent le matériau de comblement préalablement chauffé. Chez les deux derniers groupes, le matériau de comblement est mis en place sous forme de blocs compacts juxtaposés. Un fixateur externe est, par ailleurs, mis en place par quatre broches reliées par des tiges. 2) Résultats al résultats radiographiques La surveillance des lapins est effectuée mensuellement, par clichés mammographiques. On n'observe aucune restauration de la structure osseuse auprès du groupe témoin. La résection de 2cm de tibia est incompatible avec une quelconque possibilité de restauration de la continuité osseuse. Dans le groupe (A), on observe dès le premier mois une apparition d'un cal osseux. Après deux mois, la fusion osseuse est complète chez 9 lapins. Dans le groupe (B), 2 lapins ont obtenu une fusion osseuse tardive à 3 mois. Tous les autres cas se sont soldés par l'apparition d'une pseudarthrose, sans visualisation d'un cal osseux. b) résultats anatomo-pathologiques Ces résultats sont obtenus après sacrifice des lapins du groupe (A). Examen à un mois : on note la présence d'un"cal"osseux, et de travées osseuses abondantes de type immature (de type os primaire), le matériel exogène est aussi présent sous la forme d'amas compacts de taille très variable, entourés d'une fibrose discrètement inflammatoire. Examen à deux mois : l'aspect général est le même. On note une maturation débutante des travées osseuses, le matériel exogène est toujours présent, parfois inclus dans les structures osseuses et parfois latéralisé. L'os présent ne se constitue cependant pas en une masse unique. Examen à trois mois : l'aspect général est le même. On observe la maturation progressive de l'os avec"médularisation"des structures osseuses présentes qui montrent une cavité centrale de type médullaire avec sur certains plans de coupe une apparition de précurseurs hématopoïétiques. On note la persistance du matériel exogène, toujours cerclé d'un assez large liseré fibreux discrètement inflammatoire et non évolutif par rapport aux dates antérieures. L'os constitué se présente souvent comme des masses d'os séparés par le matériel exogène. Examen à cinq mois : on note une évolution architecturale franche de matériel osseux et la présence d'une nette "corticalisation"de l'os présent qui montre un aspect d'os secondaire et une cavité médullaire franche ; le matériel exogène est toujours présent et généralement englobé (mais parfois exclus) dans l'os constitué. Les résultats de ces divers exemples montrent très clairement que les produits selon l'invention, obtenus en utilisant comme matière première un mélange constitué essentiellement de coquilles d'huîtres et de nacre, constituent un biomatériau capable de résister mécaniquement à certaines contraintes, et apportent un facteur inducteur de la reformation de l'os. En particulier, la protéine isolée selon la présente invention possède un effet ostéoconducteur, des potentialités d'ostéoconduction, et répond parfaitement au critère de biocompatibilité. Bien que l'invention ait été décrite à propos d'une forme de réalisation particulière, il est bien entendu qu'elle n'y est nullement limitée et qu'on peut y apporter diverses modifications, sans pour autant s'éloigner du cadre et de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de poudre à base de nacre, comprenant le lavage des coquilles dans des conditions classiques aptes à décoller la matière organique fixée sur la coquille (algues, ascidies etc. ), et caractérisé en ce qu'il comprend un lavage, pendant au moins 48h, par une solution basique à pH environ égal à 14, suivi d'au moins un lavage par une solution acide à 1% ayant un pH de 1,18, avec entre chaque lavage un rinçage à l'eau distillée de manière à retourner à pH neutre, un séchage et un broyage dans des conditions qui permettent d'obtenir des particules comprises entre 0,5 et 5 pm. 2. Procédé de préparation selon la revendication 1 caractérisé en ce que la solution basique est une solution de potasse. 3. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la solution d'acide est une solution d'acide sulfamique. 4. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la granulométrie finale de la poudre obtenue est d'environ 1 pm. 5. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la poudre obtenue est compactée sous une pression comprise entre 10 et 12 tonnes par cm2. 6. Poudre à base de nacre obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 7. Protéine caractérisée en ce qu'elle est obtenue à partir de la poudre à base de nacre selon la revendication 6, ceci par un procédé consistant à isoler cette protéine de cette poudre à base de nacre. 8. Utilisation de la poudre à base de nacre selon la revendication 6 pour la préparation d'un médicament destiné à faciliter la régénération des tissus osseux ou cartilagineux. 9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que la poudre à base de nacre est préalablement compactée. 10. Utilisation d'une protéine selon la revendication 7 pour la préparation d'un médicament destiné à faciliter la régénération des tissus osseux, fibreux ou cartilagineux. 11. Utilisation d'une protéine selon la revendication 7 pour la préparation d'un médicament destiné à faciliter la cicatrisation des tissus osseux, fibreux ou cartilagineux. 12. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine selon la revendication 7. 13. Composition pharmaceutique selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un support biocompatible.