Brevet FR2833016A1 — publié le 20030606

L'invention concerne de nouvelles biomasses bactériennes, leur protocole d'obtention, et leur utilisation pour la bactérisation de sols et de résidus de cultures L'invention concerne de nouvelles biomasses bactériennes, leur protocole d'obtention, et leur utilisation pour la bactérisation de sols et de résidus de cultures. La bactérisation des sols arables consiste à apporter, par voies (micro) biologiques aux sols et aux cultures agronomiques, une partie des éléments nutritifs, notamment l'azote diatomique provenant de l'atmosphère, nécessaires pour l'obtention de rendements économiques et durables. Traditionnellement, la bactérisation a surtout été synonyme d'utilisation d'inocula de souches Rhizobium pour le pelliculage des semences d'espèces Leguminosea comme le soja, la luzerne et le trèfle rouge. Il a également été proposé d'utiliser des endomycorrhizes, des acétobacters diazotrophes endophytes, des rhizobactéries PGPB (Plant Growth Promoting Bacteria) des micro-algues et des cyanobactéries, ou encore des bactéries diazotrophes non-symbiotiques en association avec des résidus de cultures. L'utilisation de bactéries en agronomie, et plus particulièrement en production céréalière, s'est heurtée toutefois au problème de leur non persistance, une fois réintroduites dans les sols. De ce fait, elles ne peuvent pas assurer la réalisation de l'effet agronomique recherché, à savoir l'augmentation et la stabilité des rendements en grains, leurs teneurs en protéines, et/ou la réduction des niveaux d'intrants, notamment l'azote minéral. Il s'ensuit que les biomasses bactériennes proposées à ce jour ne permettent pas une exploitation satisfaisante des composés issus de la dégradation in situ (i. e. au champ) des résidus de cultures agronomiques, notamment les résidus de la culture céréalière intensive, y compris celle du maïs-grain. Les composés solubles et assimilables issus de la dégradation in situ des résidus de cultures céréalières sont mal valorisés par l'ensemble de la microflore du sol, et plus particulièrement sa composante diazotrophe et non-symbiotique dite azotobactérienne. Ce manque de valorisation explique en bonne partie la réalisation de trois phénomènes, parfois nuisibles, bien connus ; (1) la présence continuelle de quantités agronomiques de résidus pailleux à la surface des sols au moment des travaux aratoires, (2) une immobilisation de l'azote par les microorganismes non-diazotrophes du sol entraînant une faim d'azote chez la culture en place, et, paradoxalement, (3) une baisse appréciable des teneurs en carbone (soluble, labile et total) et des biomasses microbiotiques. Un autre problème rencontré avec les bactéries est lié à leur isolement et leur production en masse traditionnellement effectués par dilution en série d'une suspension de sol et la mise en culture d'un aliquote d'une nième dilution de cet aliquote sur un milieu gélosé riche. Les souches ainsi isolées, une fois suffisamment caractérisées, servent par la suite à ensemencer des fermenteurs bioindustriels conventionnels. La capacité des inocula ainsi produits à augmenter durablement l'activité in situ des organismes concernés, la diazotrophie dans un sol arable amendé avec des résidus de culture par exemple, est de ce fait aujourd'hui très faible et/ou aléatoire. Le recours à divers supports poreux, solides ou organiques, afin de protéger ces bactéries une fois ré (introduites) dans les sols, ne semble pas avoir pu permettre une plus grande efficacité de ce type d'inoculation. L'étude de ces problèmes par les inventeurs les a conduits à mettre au point des conditions d'isolement de bactéries du sol à l'aide de protocoles et de milieux d'isolement, ou rétention, in vitro, capables d'assurer l'entretien et la survie des souches bactériennes les plus capables de persistance active en milieux édaphiques, et une bactérisation satisfaisante des sols une fois (ré) introduites, grâce à leurs propriétés de persistance in situ. Historiquement, on peut relever trois approches à l'obtention de souches bactériennes d'origine édaphique (c'est-à-dire de sols arables) en principe les mieux adaptées à la persistance active in situ une fois réintroduites : a. l'isolement sur matrices abiotiques : avec utilisation de milieux à caractères édaphiques (i. e. gels siliciques avec ou sans extraits de terre), sans pour autant faire l'intégration des principales composantes (siliciques, humiques, carbonés, et hydrologique) de ces milieux ; b. la pré-incubation sur supports abiotiques : il s'agit d'une pré-incubation en milieu édaphique, ou au sein d'une fraction plus ou moins fine de celui-ci, de cellules bactériennes déjà isolées et cultivées conventionnellement ; c. la culture en milieux appauvris : on procède à un appauvrissement volontaire, notamment en carbone, des milieux de culture de cellules bactériennes isolées conventionnellement. La solution apportée par l'invention intègre ces 3 approches, et plus particulièrement l'approche a), au sein du protocole d'obtention défini ci-après, qui conduit à l'obtention des souches et biomasses bactériennes constitutives, en termes d'adaptation, de persistance et d'activité in situ, et cela au-delà d'un simple conditionnement a posteriori des bactéries déjà isolées et/ou cultivées selon les approches a), b) et/ou c) dites plus conventionnelles. De plus, l'invention prend en compte le processus de formation des biofilms en milieu aqueux. A cet égard, les inventeurs ont considéré que la zone édaphique la plus conséquente pour les bactéries du sol correspond à la zone hydratée (biofilm) adjacente aux complexes argilo-humique (CAH) du sol, et que la formation et le fonctionnement de celle-ci est probablement sujette aux mêmes mécanismes que ceux impliqués dans la formation et le fonctionnement de biofilms au sens large. Selon Characklis (1990) et Characklis et Marshall (1990) l'accumulation d'un biofilm à la surface d'une matrice, biotique ou abiotique, est le résultat de huit processus physicochimiques et biologiques distincts : 1. Conditionnement de la matrice 2. Transport des cellules bactériennes (planctoniques) vers la matrice 3. Adsorption d'une portion de ces cellules 4. Désorption d'une portion de ces cellules 5. Adsorption irréversible de cellules complémentaires 6. Croissance des cellules bactériennes constituant le biofilm aux dépens de la phase aqueuse surnageant 7. Attachement de cellules et de particules en suspension dans la phase aqueuse 8. Libération de cellules constituant le biofilm par voie de déplacement volumétrique, érosion, usure, etc. La réalisation de ces processus permet en principe la formation d'un biofilm à deux phases (solide et liquide), et plus précisément à cinq compartiments : 1. Un substrat matriciel (gels siliciques ou agar par exemple) 2. Le biofilm de base contenant l'essentiel des cellules bactériennes 3. Le biofilm de surface contenant pour l'essentiel les cellules complémentaires 4. La phase liquide surnageante 5. La phase aqueuse ultime Or, il s'avère que le biofilm en tant que tel est surtout constitué par les compartiments 2,3 et 4. Selon le modèle édaphique le plus reconnu (Davies et al. 1998 ; Gordienko 1990 ; Pochon et Tchan 1948 ; Pochon et De Barjac 1958), la microflore bactérienne est elle aussi constituée d'essentiellement trois composantes, la composante autochtone la plus rustique et oligotrophe, la composante zymogène plutôt copiotrophe associée à cette composante autochtone, et enfin la composante, très marginale mais facilement isolable, essentiellement zymogène et très copiotrophe. L'invention repose sur un rapprochement conceptuel original entre les descriptions des biofilms au sens large et la zone hydratée adjointe aux CAHs des sols. Elle a alors pour but de fournir un procédé d'obtention de biomasses bactériennes essentiellement formées de souches persistantes et actives une fois réintroduites dans un sol cible d'origine, caractérisées par l'intégration de caractéristiques APC (agro-pédoclimatique), notamment en interagissant avec les CAHs et ISL (interface sollignocellulosique) d'une zone édaphique identifiable. Elle vise aussi les biomasses bactériennes et les nouvelles souches de ces biomasses possédant les caractéristiques métabolo-physiologiques couramment recherchées, comme la diazotrophie, l'activité fongi-statique et/ou phytosanitaire, la production et la sécrétion de régulateurs de croissance, le catabolisme de xénobiotiques, etc). L'invention vise en outre l'utilisation de ces biomasses bactériennes et souches pour la bactérisation de sols et de résidus de cultures, en particulier de cultures céréalières. Le procédé d'obtention in vitro de biomasses bactériennes d'origine édaphique est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : - mise en contact d'une suspension aqueuse de sol avec un substrat matriciel, de manière à former une zone hydratée, ou biofilm, à la surface du substrat, analogue à celle adjointe au CAH du sol, abritant pour l'essentiel la composante bactérienne autochtone du sol, afin de retenir, à la surface du substrat matriciel, l'essentiel de la microflore bactérienne endogène aux milieux édaphiques d'origine. - maturation du biofilm avec établissement de conditions oligotrophiques permettant aux cellules les plus constitutives du biofilm édaphique qui ont colonisé le substrat matriciel, de migrer vers la phase liquide surnageant ledit substrat, et progressivement à la dominer, - récupération et culture des souches bactériennes les plus prolifiques en milieux de cultures liquides riches, à caractère autochtone, rustiques et persistantes in situ, cultivables en milieux liquides et donc aptes à être produites industriellement. On utilise dans ce procédé un substrat matriciel inorganique et abiotique, en milieu aqueux, favorisant la production d'exopolysaccharides (EPS) et des autres composantes du glycocalyx bactérien, ainsi que l'organisation en réseau d'un nombre suffisant de cellules capables d'initier les premières étapes de formation d'un biofilm à la surface du substrat. Des matériaux appropriés en tant que substrats comprennent le gel de silice, l'agar, le polystyrène, l'argile, le verre poreux ou encore la vermiculit. L'eau de la suspension aqueuse renferme des composés présents dans les proportions relatives caractéristiques du sol cible d'origine, à savoir des substances humiques et fulviques, des composés carbonés et notamment des mono-, oligo-et polysaccharides, d'origine végétale, animale, et bactério-fongique, des éléments nutritifs. La maturation du biofilm est réalisée en alternant une phase où le biofilm formé sur la surface abiotique n'est pas en présence d'une phase liquide surnageant, avec une phase liquide comprenant l'ensemble des cellules bactériennes surnageant la phase solide. Cette maturation résulte en principe de la migration des bactéries autochtones vers la phase liquide (Pochon et Tchan, ci-dessus) du biofilm formé sur le substrat matriciel. Le déplacement volumétrique n'a lieu qu'au cours et après vieillissement (maturation) du biofilm (c'est-à-dire du biofilm à la surface du substrat matriciel). Cette maturation permet la libération, dans la phase aqueuse surnageant le substrat matriciel, des cellules bactériennes les plus constitutives de ce biofilm. La maturation du biofilm peut être facilitée/augmentée si la phase liquide surnageant est périodiquement asséchée, ou du moins retirée, de façon à favoriser la croissance des biomasses bactériennes constituant le biofilm, qui sont pour la plupart aérobiques. Elle est ensuite restaurée en ajoutant de l'eau aseptique. Cette addition peut être réalisée par exemple par microfiltration. L'invention permet ainsi de réconcilier la diversité microbiologique (surtout bactérienne) des sols avec la pureté microbiologique des biomasses devant être produites en bioprocédés conventionnels, ce qui n'a jamais véritablement été tenté jusqu'à présent. L'isolement de souches bactériennes est en effet surtout réalisé à l'aide de milieux de cultures relativement riches et selon des caractères métaboliques (eg. résistance à certains antibiotiques, diazotrophie in vitro, activités spécifiques de certaines enzymes, etc. ) et/ou génomiques (eg. à l'aide de sondes oligo-nucléotidiques spécifiques de certains opérons d'intérêt agronomique ou industriel) facilement identifiables, mais qui n'ont fondamentalement peu, ou rien à voir avec l'adaptation et la persistance active de ces cellules bactériennes autochtones plutôt que zymogènes une fois (ré) introduites dans divers milieux édaphiques. Le protocole d'obtention de biomasses bactériennes de l'invention favorise ainsi la dominance microbiologique de souches bactériennes à caractères édaphiques, et assure néanmoins que celles-ci demeurent aussi suffisamment copiotrophes (i. e. capables de croître en milieux riches) pour être produites en quantités industrielles par voies de bioprocédés conventionnels. Tout au contraire, des bactéries obtenues selon des procédés n'intégrant pas les dispositions qui précèdent au sein d'un même protocole sont inefficaces. Il en est ainsi : des biomasses bactériennes 1) obtenues de surfaces biotiques mais sans la présence d'un biofilm ou d'un complément humique, et/ou des biomasses bactériennes 2) obtenues de surfaces abiotiques selon le protocole en question, mais a) avec un complément humique non-calqué sur celui du sol cible et/ou b) avec un substrat carboné apporté en quantité supérieure aux concentrations normalement présentes dans le sol, et/ou des biomasses bactériennes 3) obtenues de surfaces abiotiques non conditionnées (i. e. sans le développement d'une pellicule hydratée ou biofilm). Pour illustrer cette démonstration, une série d'inocula témoins n'intégrant pas au moins l'une des notions envisagées ci-dessus a été produite, à savoir notion 1 : adhérence à des surfaces inorganiques et abiotiques ; notion 2 : croissance oligotrophique à partir de compléments glucidiques et humiques ; notion 3 : expression de caractères benthiques et planctoniques, la comparaison directe des effets obtenus avec les biomasses de l'invention et avec ces témoins permet d'interférer que l'intégration des 3 notions (1,2, 3) évoquées ci-dessus est possible pour obtenir les résultats recherchés et constituent un moyen d'identification des biomasses de l'invention comme exposé dans les exemples. Selon un mode de réalisation préféré du procédé de l'invention d'isolement progressif de biomasses bactériennes rustiques et persistantes in situ, on a avantageusement recours aux étapes suivantes : a)-rétention immédiate et temporaire de l'essentiel de la microflore bactérienne endogène aux milieux édaphiques d'origine : Afin de rendre cette étape de rétention moins draconienne en termes d'élimination et de pertes des souches moins copiotrophes, on procède à une pré-incubation du substrat matriciel avec la suspension de sol renfermant les bactéries. Le substrat matriciel est inorganique et abiotique, tel que gel de silice, argile, polystyrène, verre poreux, vermiculite, agar. La surface du substrat est conditionnée par mise en contact avec un milieu de rétention essentiellement calqué sur les caractéristiques du sol cible d'origine. Ces caractéristiques comprennent, non-exclusivement : (1) les teneurs en substances humiques et fulviques et leurs constitutions en termes des divers composés phénoliques et benzoïques, (2) les teneurs en composés carbonés, et notamment les mono-, oligo-et polysaccharides de provenance végétale, animale et/ou bactério-fongique, (3) la granulométrie de la partie minérale du sol, et surtout la plus fine, ou du moins à l'exclusion des agrégats supérieurs à 5 mm de diamètre, (4) les teneurs immédiates en éléments nutritifs (azote, phosphore, soufre, etc. ) capables d'influencer le développement bactérien à court terme. Cette pré-incubation en présence d'eau des milieux de rétention permet la formation de manière satisfaisante d'une pellicule hydratée ou biofilm à la surface des substrats matriciels solides. Les souches bactériennes, qui progressivement viennent à dominer à la surface de ces substrats et au sein de ces biofilms, sont ainsi plus spécifiquement adaptées aux APC sur lesquels la constitution de ces biofilms a été calquée et sont donc aussi plus aptes à persister activement une fois réintroduites dans ces APC. b)-dominance progressive des souches bactériennes recherchées, diazotrophes et/ou fongistatiques par exemple, sur ces milieux de rétention spécifiques et caractéristiques des milieux édaphiques d'origine : Les milieux de culture, ou de rétention, deviennent de facto la source des éventuelles biomasses bactériennes candidates. Les cellules bactériennes étant de bonnes productrices d'exo-polysaccharides (EPS) servant à la formation de biofilms à la surface du substrat, elles peuvent aussi être amenées à dominer la phase liquide restaurée à sa surface. En effet, les biofilms ainsi formés peuvent en ce sens maturer. C'est pendant ce processus de maturation que la multiplication de cellules du biofilm permet de déplacer graduellement les cellules bactériennes vers la surface du biofilm, par voie d'un processus appelé déplacement volumétrique (Characklis 90 et Characklis et Marshall 90 ci-dessus). Ces cellules se retrouvent donc éventuellement libres dans la phase liquide surnageant à la surface du biofilm. Dans la mesure où cette phase liquide et le substrat du biofilm sont quasi dépourvus d'azote minéral assimilable, les cellules concernées seront pour la plupart azotobactériennes. c)-isolement, par dominance micro-biologique, des souches bactériennes recherchées les plus prolifiques en milieux de cultures liquides riches et plus conventionnels : Les biomasses et souches de l'invention, bien que relativement plus oligotrophes que des souches plus conventionnelles, doivent néanmoins rester cultivables en milieux riches conventionnels, tels qu'on les utilise au cours de bio-procédés industriels. Cependant, et puisque les aliquotes provenant des phases liquides surnageant les milieux d'obtention de ces souches ne sont pas nécessairement d'une pureté microbiologique absolue, il existe un risque que les souches candidates recherchées qu'ils contiennent soient déplacées (i. e. dominées en nombre) par des contaminations plus copiotrophes et contraires au but recherché. Pour éviter autant que possible de telles contaminations, on restaure le milieu de culture avec un aliquote contenant à 90% environ des cellules provenant de la phase surnageant les milieux d'obtention et seulement 10% environ de cellules effectivement pré-incubées afin de favoriser, éventuellement, la dominance de cellules plutôt oligotrophes. Suite au troisième, voire quatrième, cycle de pré-incubation, un aliquote de 1 pour 1000 environ de cette dernière pré-culture sera transféré vers à un milieu liquide riche conventionnel, avec azote, les cellules qui contiennent cet aliquote pourront alors être produites en masse et de façon conventionnelle. Il est recommandé de procéder à un suivi et contrôle de la pureté de ces biomasses et souches en plus d'une série de profils génomiques non-fonctionnels de type RAPD, et plus fonctionnels selon l'expression particulière de certains mécanismes les plus importants en terme d'adéquation édaphique (eg. alg, mue, eps, pob, rhl, etc. ). Les inocula prototypes candidats sont formulés et conditionnés pour leur utilisation au champ. Des formulations liquides et solides permettent non-seulement d'assurer un délai de conservation satisfaisant d'un minimum de 6 mois, soit à 4 C, soit à température ambiante (i. e. de 18 à 27 C), mais aussi d'assurer encore plus une pré-adaptation des cellules bactériennes déjà sélectionnées selon la présente invention. L'invention vise également les biomasses bactériennes isolées, caractérisées en ce qu'elles comportent, comme souches dominantes, des souches bactériennes GRAM négatif, à caractère édaphique, autochtones, oligotrophes, en majeure partie aérobiques, présentant des caractéristiques métabolo-physiologiques de diazotrophie, activité font-statique et/ou phytosanitaire. Avantageusement ces biomasses bactériennes sont capables de croître aisément en milieux liquides, ce qui permet de les produire en quantités industrielles par voie de bioprocédés conventionnels. Comme illustré par les exemples donnés ci-après, ces biomasses sont caractérisées par les phénotypes suivants exprimés in vitro et/ou in situ : par rapport à des témoins isolés selon tout ou partie des protocoles conventionnels 1), 2) et 3) rappelés ci-dessus, elles sont plus mucoïdes que ces témoins, plus enkystées et de manière plus durable, moins copiotrophes que lesdits témoins, et produisent des facteurs d'auto-induction (FAI) selon des taux plus élevés que les témoins, par exemple de l'octanoyl homosérine lactone. Par rapport auxdits témoins, elles sont capables de maintenir la teneur en azote minéral des sols reconstitués en microcosmes selon une fraction granulométrique > 3mm, sur une période de plus de 28 jours d'incubation. Des biomasses bactériennes préférées de l'invention sont des Azobacteriaceae, des Pseudomonaceae, ou des Rhizobiaceae. La caractérisation génomique et moléculaire des souches isolées montre qu'elles renferment et expriment un fragment génomique analogue à des fragments caractéristiques de aIgD et aigU responsables de la production d'EPS, ainsi que des fragments caractéristiques de pobA et pobR responsables de la production de PHBH, trouvés chez bon nombre d'azoto bacteriaceae, Pseudomonaceae et Rhizobiaceae. Les biomasses bactériennes obtenues sont particulièrement appropriées pour la bactérisation microbiologique de sols et de résidus de cultures, en particulier de résidus de cultures céréaliers, y compris ceux du maïs-grain. Grâce à la persistance de leur activité in situ une fois (ré) introduites dans le sol, durant la période de mise en culture des cultures agronomiques concernées, elles peuvent utiliser les résidus en voie de décomposition comme substrats énergétiques et stucturels. L'invention vise donc leur utilisation pour une telle bactérisation en les introduisant in situ, à proximité desdits résidus, de manière à exploiter le carbone soluble libéré par suite de leur dégradation. A cet effet, des inoculas préparés à partir des biomasses bactériennes et souches isolées sont avantageusement pulvérisés sur les résidus de culture, notamment au moment de leur enfouissement dans les sols. On utilise par exemple des taux d'inoculation de 100. 000 à 1 million de cellules viables/g de résidus, ou encore lg/tonne de résidus. Au niveau édapho-agronomique, on observe in situ ou en microcosmes, une plus grande persistance in situ et dans le temps de l'activité de la nitrogénase, dans le cas de biomasses azotabactériennes capables de diazotrophie, une augmentation de l'accumulation de l'azote minéral, notamment sous forme ammoniacal, une augmentation des biomasses végétales, du rapport entre les parties végétatives et racinaires, un retard initial de la dégradation des résidus de culture attribuable à l'activité fongi-statique des bactéries (ré) introduites. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent, avec référence aux figures 1 à 8, qui représentent, respectivement : - les figures 1A et 1B, les bandes PCR produites par des amorces AIgU y selon le type de matrices utilisées ; - la figure 2, les bandes produites par RAPD, selon une série de six amorces (nlO) caractéristiques des souches de type Azotobacteraceae candidates, comparées à une souche d'A. chroococcum 76.112 témoin, - la figure 3, les teneurs en azote minéral mesurées, sur des microcosmes et des microparcelles inoculés avec divers témoins et des souches candidates, - la figure 4, le rapport, en fonction du temps d'incubation entre l'activité de la réduction de l'acétylène en présence de résidus de culture inoculés selon l'invention ou avec des témoins, et non inoculés, - la figure 5, les teneurs en azote minéral de 2 séries de microcosmes traités selon l'invention ou par des témoins, avec addition de composés para-humiques ; - la figure 6, l'effet d'un antibiotique sur le traitement de résidus de culture selon l'invention et par des témoins, - les figures 7A et 7B, la décomposition de résidus de culture en fonction du temps d'incubation (laboratoire et au champ) ; - les figures 8A et 8B, l'effet de la granulométrie de sols reconstitués en microcosmes sur les propriétés des bactéries, et - les figures 9A à 9E, les effets de biomasses de l'invention par rapport à des témoins. Exemple 1 : Isolement de souches candidates de type Azotobacteraceae. . sols utilisés pour les prélèvements On rapporte les résultats obtenus sur 2 sites (Terrefort et Groies) dont les caractères APC sont les suivants : Tableau la : Analyses physico-chimiques des sols F4 et 19 ( Terrefort ) sur le domaine expérimental de l'Inra-Toulouse Parcelle F4 I9 Granulométrie Argile 230 260 Limon fin 242 227 Limon grossier 139 165 Sable fin 167 207 Sable grossier 222 141 Carbone organique 8. 5 9.2 Matières organique 14.6 15.8 Azote organique 1.07 1.13 pH eau 5.9 6.6 CaCO 0 0 P20s 0.11 0.06 Ca échangeable 1.91 2.75 Na échangeable 0.014 0.015 Mg échangeable 0.173 0.187 K échangeable 0.183 0.134 Humidité à 105 C 24 28 Tableau l. b : Caractéristiques édaphique des sols Groies à proximité de Poitiers (86) TERRES... e Séchantes . Principalement au nord du département CARACTÈRES Couleur brune Argile limoneuse Substrat : calcaire PROPRIÉTÉS 'Sol calcaire, peu profond, caillouteux (calcaires) * Sol sain Réserve en eau faible (opportunité de l'irrigation) * Fertilité bonne à moyenne VARIANTE : Grosse groie ou argilo-calcaire * Sol profond, plus argileux 'bonne réserve en eau . protocole d'isolement On met en contact une suspension sol/eau avec un substrat matriciel d'agar ou de gel silicique. Le biofilm qui se forme au contact du substrat matriciel répond aux caractéristiques du sol cible d'origine, en ce qui concerne notamment (1) les teneurs en substances humiques et fulviques et leur constitution en termes des divers composés phénoliques et benzoïques, (2) les teneurs en composés carbonés, et notamment les mono-, oligo-et polysaccharides de provenance végétale, animale et/ou bactério-fongique, (3) la granulométrie de la partie minérale du sol, et surtout la plus fine, ou du moins à l'exclusion des agrégats supérieurs à 5 mm de diamètre, (4) les teneurs immédiates en éléments nutritifs (azote, phosphore, soufre, etc. ) capables d'influencer le développement bactérien à court terme. Pour obtenir la maturation du biofilm, on restaure périodiquement la phase liquide, à savoir par exemple une fois par semaine, afin d'éviter l'assèchement du biofilm et d'attendre suffisamment longtemps entre deux restaurations (e. g. environ sept jours), de manière à laisser le temps aux cellules azotobactériennes les plus constitutives du biofilm ainsi formé de migrer par déplacement volumétrique vers la surface du biofilm. Afin d'éviter la dominance de cellules azotobactériennes copiotrophes aux dépens des cellules azotobactériennes recherchées, qui sont plutôt oligo-ou méso-trophes, plus autochtones et persistantes une fois (ré) introduites, mais aussi donc facilement dominées en milieux in vitro riches, il faut éviter de charger les gels et les phases liquides qui les surnagent avec des substrats carbonés, notamment des sucres simples tel que le glucose, et/ou des éléments nutritifs minéraux. On utilise de préférence de l'eau distillée aseptique (en particulier par micro-filtration). Il faut aussi éviter de rompre ou de perturber excessivement le biofilm au moment de la restauration en utilisant un jet d'eau trop brusque ou dirigé au moment de la restauration de la phase liquide. En général, il est suffisant d'utiliser 1 ml d'eau sur gels contenus dans des boîtes de Pétri de 10 mm de diamètre et 5 ml pour les boîtes de 33 mm de diamètre. Après environ sept jours d'incubation à 22-27 C, la dernière restauration, soit généralement la troisième, des aliquotes de ces phases liquides serviront à ensemencer une série de milieux de cultures liquides conventionnels. Pour l'isolement des souches candidates recherchées, on procède avantageusement comme suit : on place un aliquote de 1 ml dans 1000 mL de milieu liquide glucosé (avec sels de Winogradsky comprenant ceux provenant d'un extrait de terre à hauteur de 10% p/v) sans azote minéral et/ou assimilable, et on laisse pré-incuber 1 à 2 jours à 22-27 C. Ce transfert est effectué à partir de la culture ainsi obtenue encore deux à trois fois, mais en n'utilisant que 100 micro-litres (1/10 de mL) de cette culture de Rang 1 et 9/10 de mL d'un nouvel aliquote provenant directement de la phase liquide surnageant le milieu d'obtention d'origine. On réduit la probabilité, sans pour autant l'éliminer, de voir une biomasse candidate plutôt moins oligotrophe prendre le dessus, en terme de nombre de cellules par mL de milieu de culture, sur les biomasses candidates encore plus oligotrophes, persistantes et actives in situ. - identité des organismes Les bactéries ont été isolées sur des milieux sélectifs dépourvus d'azote minéral et/ou organique assurant ainsi la dominance de ces organismes diazotrophes aux dépens des autres organismes hétérotrophes du sol. Les organismes ainsi retenus sont Gram négatifs, aérobiques, diazotrophes et en forme de bâtonnets d'environ 1 à 3 microns. On sait que A. chroococcum est reconnue comme étant la plus adaptée aux conditions de vie édaphique. Cette souche a donc été retenue comme référence pour les souches de l'invention. En effet, les observations macro-et microscopique des souches de l'invention sont en accord avec les descriptions d'Azotobacter chroococcum Beijerinckii 1901 de l'ATCC, de la DMS et de l'Institut Pasteur. Une caractérisation génomique et moléculaire de ces souches a donc été établie à partir de mécanismes connus chez Azotobacter. - propriétés biologiques des organismes Les bactéries de type Azotobacteracea obtenues avec la technologie de l'invention sont capables de fixer de l'azote diatomique et d'utiliser les substrats carbonés provenant de la décomposition des résidus de culture au champ, et notamment ceux provenant de la décomposition des pailles de céréales et de maïs. En principe, certains écotypes azotobactériens sont aussi capables d'établir des associations rhizosphériques et de promouvoir ainsi la croissance de la plante, mais ne sont pas pour autant virulentes. Elles ne sont pas non plus, et cela contrairement à certaines Acetobacter, endophytes. Les bactéries de type Azotobacteraceae sont généralement trouvées dans les sols, elles sont Gram négatives, et ont un mode de croissance et de développement conventionnel et hétérotrophe. Dans des conditions de stress hydrique ou autre, elles peuvent s'enkyster à l'aide de capsules d'exopolysaccharrides (EPS) et plus particulièrement d'alginate. En ce sens, cette production d'EPS est primordiale pour la survie et la rusticité en milieu édaphique de ces bactéries ; la caractérisation plus ou moins fine de ce mécanisme servira donc à l'identification de ces organismes comme décrit ci-après. Ces bactéries sont responsables de la fixation d'azote diatomique dans les sols par voie non symbiotique. Elles sont aérobiques, contrairement aux Clostridium, et sont généralement reconnues comme ne pouvant, selon les circonstances, fixer par diazotrophie que quelques kg, voire quelques dizaines de kg d'azote par hectare et par an. Or, ces taux de fixation biologique sont surtout limités par la (non) disponibilité des substrats carbonés suite à la (non) persistance des souches diazotrophes (ré) introduites dans des sols particuliers. On notera que, conformément à l'invention, ces taux globaux par hectare peuvent être au moins triplés, voire quintuplés. Il a en effet été démontré à l'aide de données expérimentales obtenues en laboratoire, en serre, en chambre de culture et en parcelles expérimentales au champ que l'invention permet effectivement une plus grande efficacité relative des souches azotobactériennes isolées, une fois celles-ci (ré) introduites dans leur agro-pédo-climat (APC) d'origine. - méthodes d'analyse . établissement de l'identité des organismes L'identité des organismes a été établie en fonction de leur adaptation aux APC. Les résultats rapportés ci-après concernent les 2 APC à partir desquels les souches ont été isolées, et dans lesquels elles seront ré-introduites sous la forme d'inocula bactérien : un dans la région Toulousaine (31) (Terrefbrt ou TF31 , voir Tableau l. a) et l'autre dans la région de Poitiers (86) (Groies ou GR86 , voir Tableau l. b). Aux fins de caractérisation, on a utilisé des oligonucléotides capables d'amorcer la polymérisation de segments conservés d'un gène reconnu comme essentiel à la synthèse d'exo-polysaccharides (EPS), notamment l'alginate, nécessaire à la survie des bactéries dans les sols. . Oligonucléotides utilisés pour la caractérisation fonctionnelle de segments AlgU et AlgD des souches Azotobacteraceae candidates. On a choisi les deux régions considérées comme les plus conservées des segments génomiques aIgU et algD déjà rapportés comme appartenant aux genres Pseudomonas et Azotobacter (information sur Genebank concernant le segment AVU11240. AlgD Azobacter vinelandii ATCC 9046 Campos et al. Journal J. Bacteriol. 178 (7), 1793-1799 (1996)). Sept séries d'amorces oligonucléotidiques ont été élaborées à partir de ces régions pour servir à amplifier par voie de PCR des portions de quelques centaines de bases de ces gènes facilement repérables par électrophorèse : Pour AI t, gD > Amorce AlgDl : TGG GCT ATG TMG GTG CAG T Amorce AlgD2 : ACSACCACGGTGTGGCGAA > Amorce AlgD3 : GGT GTA CTT GAT CAT CTC GGC Pour AIgU > Amorce AlgUI : TGG TYG QRC GRG TRC AGC G > Amorce AlgU2 : ACG RTA KGC TYY GAT GAA > Amorce AlgU3 : TTY TAT ACM TGG CTG TAT C > Amorce AlgU4 : GAC CCY ACS GTY CCM AC Les résultats obtenus sont donnés sur les figures 1A et 1B qui représentent : A. Les bandes PCR produites par les amorces AIgU 1/2 selon le type de matrices utilisées. L'expression des bandes PCR-AlgU dénote selon toute vraisemblance des segments de masses différentes et donc caractéristiques des souches candidates TF31 et R86, respectivement ; B. La mise en évidence de la différence entre les bandes PCR AIgU 1/2 pour les souches candidates TF31 et GR86. Les amorces Algal et U2 se révèlent les plus discriminantes, permettant d'obtenir de façon reproductible des produits PCR caractéristiques des deux souches candidates retenues, et cela vis-à-vis de la souche utilisée comme témoin, Azotobacter chroococcum 76.116 de la CNCM de l'Institut Pasteur (voir figure 1). . contrôle de la pureté microbiologique de la souche candidate et de la préparation La technique dite RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) est la plus généralement utilisée pour obtenir rapidement un profil génétique d'un organisme bactérien. Un choix d'amorces oligonucléotidiques servant à amplifier par PCR des segments d'ADN, a priori disposés aléatoirement au sein du génome de l'organisme, peut donc servir d'outil d'AQCQ (Assurance Qualité, Contrôle Qualité) au cours de la production et du déploiement expérimental d'organismes bactériens. Ce choix est dicté par (i) l'apparition d'une bande PCR , dans un premier temps, (ii) la ré-apparition systématique de cette bande au cours de PCR successives, et (iii) le rapport qu'établira cette communauté de bandes entre les diverses souches que l'on cherche à distinguer les unes des autres. Les souches candidates ayant été caractérisées comme étant de type Azotobacteraceae et probablement des écotypes d'A. chroococcum Berjerinckii, Gram négatifs, aérobiques, diazotrophes, en forme de bâtonnets, parfois ovoïdes, et de dimension de 1 à 3 microns selon le stade de développement de la culture et la composition du milieu, il s'agissait surtout de distinguer les diverses souches candidates TF31 et GR86, d'une souche de culture type, notamment A. chroococcum Berjerinkcii 76.116 de la CNCM de l'Institut Pasteur. A partir de deux séries de neuf amorces aléatoires composées chacune de dix bases nucléiques (voir Tableau 2), six amorces ont été choisies selon les trois critères de choix mentionnés plus haut (Voir Burucoa et al. 1999). Tableau 2 : Synopsis de l'ensemble des amorces (décamères) essayés dans le cadre de l'analyse par RAPD des trois souches et biomasses azotobactériennes, y compris la souche de référence Azotobacter chroococcum 76.116 de la CNCM de l'Institut Pasteur. Production de Bandes PCR-RAPD Séquence Azotobacter souches Souches Décamère Oligonucléotidiques chroococcum candidates candidates TF31 GR86 Vtl-3 TCGTAGCCAA ?-- ?-Vt2-4a TCACGATGGA ?--** Vt3-4c TCT CGA TGC A ?---Vt4-5a CTG TTG CTA C ?---- ?---Vt5-8 TGG TCA CTG A ?---Vt6-10b GGA AGT AGT G ?---- ?---Vt7-lla ACCTCGAGCA ?-- ?-Vt8-12b CGG CCC CTG T ? **** **** Vt9-13 ATTGCGTCCA ?-- ?-Azrl GGC CCGATC G ?-- ?-Azr2 TACCCCGAGG ?- ?Azr3 TGC GGC TCA G ? *** *** Azr4 TCCCAGCGCG ?- ?Azr5 GCA TGC ACG G * ** ** Azr6 GCC AGTCCCG ? ** ?Azr7 GCTGCCCGAG ? ?- ?Azr8 GTG CGA CCA C ? ** ** Azr9 TTC GGC GCG A * ** ** Notes ? : amorce utilisée mais aucune bande PCR - : amorce abandonnée en raison de l'absence de bande PCR. * : bande PCR réalisée ** : bande PCR non-réalisée Les résultats obtenus sont rapportés sur la figure 2, qui représente les bandes produites par RAPD. Les six amorces, qui sont des décamères, ont permis de s'assurer que les souches candidates étaient effectivement apparentées à A. chroococcum 1901/76.116 de l'Institut Pasteur (voir les bandes a2 et a5 sur la Figure 2), tout en se distinguant de celles-ci (voir les bandes al, a3, a4 et a6 sur la Figure 2). Ce profil PCR-RAPD permet aussi de distinguer entre les souches candidates TF31 et GR86, ce qui vient corroborer l'analyse plus fonctionnelle de ces deux souches en fonction des segments de gènes alg (voir Figure 1). Les résultats obtenus sont rapportés sur la figure 2, qui représente les bandes produites par RAPD, selon une série de six amorces (ni 0) caractéristiques des souches de type Azotobacteraceae candidates, comparées à une souche d'A. chroococcum 76.112 témoin. Identification de biomasses de l'invention par rapport à des témoins On rappelle que, de manière générale, le protocole de rétention in vitro de biomasses bactériennes à caractères édaphiques les mieux adaptées à la survie, la persistance et l'activité au cours de la périodes de mise en culture des cultures agronomiques concernés intègre les trois (3) notions suivantes au sein du protocole, à savoir : * Notion 1 : Adhérence à des surfaces inorganiques et abiotiques * Notion 2 : Croissance oligotrophique à partir de compléments glucidiques et humiques 'Notion 3 : Expression de caractères benthiques et planctoniques Ces biomasses peuvent être en effet repérées et distinguées par rapport à une gamme de biomasses témoins produites plus ou moins conventionnellement (traditionnellement) et/ou selon une variante du dit protocole n'intégrant que deux, voire une seule, desdites notions. Plus précisément, une série d'essais en microcosmes, voire en micro-parcelles incorporant un ou plusieurs des témoins inoculés (azb et/ou Azb) listés ci-dessous, et la biomasse candidate (AZB) peut mettre en évidence, a posteriori, la mise en oeuvre du dit protocole ; Intégration des Notions Biomasses candidates Numéro du témoin dans les Bactériennes Retenues exemples 1,2, 3 AZB Na 2, 3 Témoin Azb Type 1 TRI 1, 3 Témoin Azb Type IITM2 1, 2 Témoin Azb Type lll TM3 1 Témoin azb 1 TM4 2 Témoin azb 2 TM5 3 Témoin azb 3 TM6 * TM l - Témoin Azb Type 1 : Ces biomasses sont isolées de gels agar ou autres surfaces matricielles organiques et biotiques conventionnels sur lesquels un extrait de terre calqué sur la situation édaphique du sol d'origine/cible. De par la présence d'un substrat matriciel relativement riche, elles sont donc en principe surtout à caractère oligotrophe et contraires au principe de la persistance active tel que visé par l'invention ; . TM2 - Témoin Azb Type II : Ces biomasses sont isolées en présence de gels siliciques en alternant les phases liquides et solides par assèchement graduel de l'apport d'eau distillée à la surface des gels n'ayant pas reçu d'extrait de terre, ou encore ayant reçu un extrait de terre (i. e. complément glucido-humique calqué sur le sol cible) d'un sol d'origine différent de celui du sol cible. * TM3-Témoin Azb Type III : Comme avec les témoins Azb de Type 1, ces biomasses sont isolées de gels, mais siliciques et/ou inorganiques et abiotiques, sur lesquels un extrait de terre est calqué sur la situation édaphique du sol d'origine/cible. Un extrait de terre est apporté à la surface du gel silicique (i. e. installation d'une première, et dernière phase liquide), mais celle-ci n'est pas restaurée une fois asséchée. . TM4 - Témoin azb 1 : Ces biomasses bactériennes candidates sont obtenues selon le protocole de Pochon (1954), Pochon et Tchan (1948), Pochon et al. (1958) et Sasson (1967). Cependant, et selon la présente définition, ces biomasses sont obtenues sans l'imprégnation des gels siliciques, et/ou autres surfaces matricielles inorganiques et abiotiques, avec un quelconque extrait de terre. * TM5 - Témoin azb 2 : Ces biomasses sont obtenues par voie de protocoles d'obtention à caractères édaphiques mais strictement en ce qui concerne le complément glucidique et humique du sol d'origine/cible ; ce complément ( extrait de terre ) est soit apporté à la surface d'une surface matricielle organique/biotique (eg. gel agar) ou dans un milieu de culture liquide riche et plus ou moins conventionnel. * TM6-Témoin azb 3 : Ces biomasses sont déjà répertoriées dans les diverses collections bactériennes (ATCC, UTEX, Institut Pasteur, DMZM, etc. ) et ont été isolées conventionnellement, ou du moins sans considération particulière cherchant à reproduire in vitro, au cours de leur isolement, le caractère édaphique, au sens de la présente invention. Il est aussi possible de distinguer deux type de Témoins azb 3 ; (a) d'une part les Témoins azb 3 endogènes (azb3a), c'est-à-dire ces biomasses bactériennes obtenues de façon conventionnelle, mais directement à partir d'un échantillon du sol d'origine/cible, et (b) d'autre part les Témoins azb 3 exogènes (azb3b), c'est-à-dire ces biomasses bactériennes déjà répertoriées dans les collections. Représentation Graphique de l'Effet AZB par rapport aux Inocula Témoins On a représenté graphiquement la réalisation de cet effet AZB en ordonnant les rapports des résultats agronomiques obtenus soit en microcosmes, soit en serre, soit en micro-parcelles aux champs suivants (voir Figure 9A et B) : 'Rapports AZB/Témoins Azb (I, II et III) versus Rapport AZB/Témoins Azb (1,2 et 3) * Rapports AZB/Témoins Azb (1, II et III) versus Rapport AZB en condition favorables/défavorables à l'expression du l'effet AZB provenant de la mise en oeuvre de l'invention. Cette présentation permet de mettre en évidence l'efficacité des biomasses bactériennes obtenues selon l'invention par rapport à leurs divers inocula témoins. Cette représentation permet aussi de facilement identifier les préparations inoculantes relativement efficaces pouvant servir de souches candidates à la fabrication d'inocula destinés à la commercialisation. A titre d'exemple, 3 jeux de données expérimentales ont été rapportés et sont illustrés respectivement par les figures 9C, 9D et 9E : * Figure 9C : (a) Efficacité relative de diverses préparations inoculantes provenant de biomasses azotobactériennes isolées de deux types de sols (F4 et 19) ; 'Figure 9D : (b) Efficacité relative de diverses préparations inoculantes provenant de biomasses azotobactériennes isolées de deux types de sols (F4 et 19) selon les résultats obtenus au cours d'incubation en microcosmes avec et sans des agrégats de sols intacts ; * Figure 9E : (c) Efficacité relative de diverses préparations inoculantes obtenues et essayées au cours d'une série d'essais expérimentaux (Exp 17,18, 19,20 et 21). Les efficacités relatives AZB/témoins supérieures à 1.00 dénotent des préparations inoculantes plus efficaces que les préparations conventionnelles. Cette amélioration de l'efficacité est nécessairement attribuable à la mise en oeuvre de l'invention. Données expérimentales comprenant des témoins Azb conventionnels et des témoins Azb de Type l : . Teneurs en azote/kg de sol On indique dans le tableau 3 ci-dessous, les teneurs en azote minéral (Nm) des sols en microcosmes incubés en présence de 1% p/p de résidus de culture de maïs inoculés avec des préparations bactériennes selon l'invention (AZB) et leurs témoins TM6 et TMI (i. e. des témoins internes). Tableau 3 ----------- mg Nm/kg sol---Essais 1 Témoin TM6 Témoin TM1 AZB AZB/TMI AZB/TI\t6 Val 2 54 57 71 1.25 1.31 Val 3 58 62 64 1.03 1.10 Val 4 57 55 71 1.29 1.25 Val 5 62 62 62 1.00 1.00 Val 6 60 62 63 1.02 1.05 Moyenne 59 62 68 1.10 1. 16 1 Phase II : de janvier 98 à décembre 1999 2 Témoin Azb Type I . accumulation de l'azote minéral (Nm) par kg de sol selon les conditions de rétention sur milieux tels qu'utilisés dans l'invention. De façon générale, le protocole d'isolement de l'invention favorise la rétention in vitro à la surface de matières abiotiques conditionnées de façon à abriter des biofilms propices à l'évolution de souches (azoto) bactériennes à caractères édaphiques. L'une des principales caractéristiques de ces biomasses bactériennes édaphiques ainsi retenues est en principe leur oligotrophie qui est associée à leur plus grande rusticité et efficacité in situ. Pour mettre en évidence cette oligotrophie rustique, quelquefois appelée zymogénie, l'expérimentation résumée dans le tableau 4 ci-dessous a été effectuée : Tableau 4 Accumulation de l'azote minéral (Nm) par kg de sol selon les conditions de rétention sur des milieux de l'invention. Les conditions d'obtention des biomasses (azoto) bactériennes en italique annulent l'efficacité du protocole de l'invention, en instaurant des conditions de rétention trop riches en substrats carbonés. Pré-incubation Présence de glucose Par rapport Des sols sur les milieux de azb, témoin Avec cellulose rétention conventionnel mg Nm/kg sol3 oui oui 1. 02 26 (3) non oui 0. 99 26 (l) oui non 1. 14 29 (2) non non 1.38 36 (2) 3 Microcosmes de 25 g de sol Terrefort reconstitué sur 28 jours d'incubation à 22 C Données expérimentales témoins Azb de Type II (TM2) : . Efficacité du protocole de l'invention pour favoriser l'obtention de biomasses (azoto) bactériennes selon la nature édaphique du sol d'origine et cible . Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 5 ci-dessous : On donne sur la figure 3, les teneurs en azote minéral (Nm) /kg de sol en inoculant divers témoins et des souches candidates, en microcomes et sur des microparcelles. Tableau 5 Biomasse Nature édaphique Nature édaphique Rapport AZB/Azb Tvpe II (TM2) candidates du sol d'origine du sol cible Première série Deuxième série Témoin T :'I12 Argilo-limoneux Arglle 1. 52 1. 07 TMHMKn TAf2 Limon Argile 0. 75 0.89 Témoin trin Sableux Argile 0.63 1. 31 AZB Argile Argile 2.02 2.81 On a procédé à la pré-incubation de deux séries d'un même sol à partir duquel on souhaite isoler selon le protocole de l'invention les bactéries AZB candidates avec et sans 2% P/V de cellulose. En principe cette pré-incubation aurait dû favoriser la prolifération des bactéries plutôt zymogéniques et les moins oligotrophes et les rendre ainsi plus facilement, ou du moins plus probablement, isolables vu leur plus grand nombre. Dans de telles conditions, les souches obtenues par voie du protocole de l'invention ( AZB ) devraient être peu ou pas plus efficaces que les biomasses azobactériennes conventionnelles (Azb). De plus, on a ajouté une solution à 1% de glucose suffisante pour anéantir les conditions oligotrophiques en principe présentes sur les milieux de rétention selon l'invention. Trois témoins négatifs annulant l'action des souches candidates ont pu être instaurés au moment de la rétention des biomasses (azoto) bactériennes les plus oligotrophes et rustiques (voir tableau). A noter que seule l'absence complète de substrats carbonés apportés permet d'obtenir selon le protocole décrit ci-dessus des biomasses (azoto) bactériennes AZB véritablement plus efficaces que les biomasses azotobactériennes azb isolées de façon plus conventionelle. Cette expérimentation met parfaitement en évidence les rôles de l'oligotrophie au cours de la rétention de biomasses (azoto) bactériennes les plus rustiques et efficaces une fois réintroduites dans les zones édaphiques en tant qu'inocula. Il faut rappeler que cette condition d'obtention qu'est l'oligotrophie est nécessaire mais non suffisante pour assurer l'isolement des souches bactériennes les plus édaphiques. En effet, la rusticité et la résistance au stress nutritionnel ne correspond pas exclusivement aux seules bactéries du sol, mais restent néanmoins ici primordiales compte tenu de la recrudescence des conditions oligotrophes en zones édaphiques. Autres données expérimentales : . Etude de l'augmentation de la teneur des microcosmes en mg d'azote minéral (Nm) par kg de sol reconstitué, et de la persistance de l'activité de la nitrogénase dans le temps mesurée selon le rapport de l'activité de la réduction de l'acétylène (ARA) au temps t2 et au temps tl. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 6 ci-dessous : Tableau 6 Essai 1 Essai 2 Essai 3 Microcosme Nm ARA3 NmARA* NmARA Résidus de culture 28 3.87 10.8 22 60 1.6 Résidus de culture avec témoin TM5 29 4.42 14.8 45 66 2.1 Résidus de culture avec AZB 40 6.67 15.3 112 72 2.7 . Teneurs en azote minéral (Nm) des sols en microcosmes incubés en présence de 1 % p/p de résidus de culture de maïs inoculés avec des préparations bactériennes AZB et leurs témoins azb et Azb (i. e. témoins internes ) 3 t2 = 26 h après début d'incubation des microcosmes ; tl = 22 h 4 t2 = 72 h après début d'incubation des microcosmes ; tl = 24 h 5 t2 = 66 h après début d'incubation des microcosmes ; tl = 16h Les résultats sont résumés dans le tableau 7 ci-dessous Tableau 7 ---- mg Nm/kg sol---Essais Phase 16 témoin TM6 témoin TMI AZB AZB/TM] AZB TM6 II9 51 Na 56 Na 1.10 III 46 Na 61 Na 1. 33 IV 53 na 54 Na 1.02 Eal 53 na 54 Na 1.02 Ea2 51 na 56 Na 1. 10 Ea3F4 51 na 56 Na 1.10 Ea319 52 na 55 Na 1.06 Ea4 49 na 58 Na 1. 18 ea4bis 52 na 55 Na 1.06 Ea4tris 53 na 54 Na 1.02 Moyenne 51 na 56 Na 1.10 Essais Phase II Témoin TM6 témoin TM1 AZB AZB/TM ! AZB-TM6 Val 2 54 57 71 1.25 1.31 Val 3 58 62 64 1.03 1.10 Val 4 57 55 71 1.29 1.25 Val 5 62 62 62 1.00 1.00 Val 6 60 62 63 1.02 1. 05 Moyenne 59 62 68 1. 10 1.16 6 Phase 1 : de septembre 96 à décembre 97 7 Phase Il : de janvier 98 à décembre 99 La figure 5 donne les teneurs en azote minéral (mg Nm/kg sol) de deux séries de microcosmes en parallèles, avec et sans l'apport de l'équivalent d'une cinquantaine d'unités d'azote minéral par hectare, selon le type d'inocula (azoto) bactériens utilisés (azb-inocula témoin conventionnel constitué de souches azotobactériennes isolées conventionnellement ; gels siliciques (GS) conditionnés selon l'invention plus diverses substances para-humiques (SpH 1,2 et 3), un polycondensat de catéchol (PC) et une SpH). . Cinétique de dégradation des résidus de culture au champ sur un période de 5 mois (d'octobre 2000 à mars 2001) sur sol de type Terres rouge de châtaigniers, Domaine expérimental Inra, Lusignan (86). On rapporte dans le tableau 8 ci-dessous les résultats obtenus : Tableau 8 Inocula selon Coefficient de g résidus restant par rapport l'invention et dégradation8 Coefficient R2 aux témoins non-inoculés (t témoins-ka x 10-2 = 5 mois) Témoin TM6 37 0. 93 1. 47 Témoin TM2 41 0.97 1. 11 AZB 47 0. 91 0. 91 8 Selon la cinétique de dégradation dRC = A x e-kt, où dRC représente la quantité de résidus de culture dégradés au temps t, et A la quantité de résidus au temps 0, soit 4. 00 g de matière sèche. . Bactérisation selon l'invention des résidus de culture (RC)-effet d'une mouture plus fine sur l'utilisation des substrats provenant de leur dégradation et en principe utilisables par les biomasses (azoto) bactériennes ainsi apportées à la surface de ces résidus. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 9 ci-dessous Tableau 9 -------------------------- mg Nm/kg Sol--------Inocula Mouture Fine des RC Mouture Grossière des RC Témoin TM6 58 52 Témoin TM1 52 48 AZB 82 55 On observera que le mouture plus grossière (3 mm) de ces même résidus ne permet vraisemblablement pas aux biomasses AZB de contribuer à l'augmentation relative des teneurs en azote minérale (Nm) des microcosmes par rapport aux témoins inoculés TM6 (i. e. biomasse azotobactérienne isolée conventionnellement) et TM1 (i. e. biomasse azotobactérienne isolée selon une variante inefficace de l'invention. . Augmentation de la biomasse : les résultats obtenus sont rapportés dans les tableaux 10, 11 et 12 ci-après : A) Augmentation de la production de biomasse végétale (aérienne) par les espèces Lolium multiflorum et Triticum aestivum selon le mode de culture en pot (serre) au cours de l'incubation de résidus de cultures céréalières (pailles de blé) sur une période de 28 à 56 jours (Essai 5) avec et sans les divers inocula de l'invention et leurs témoins TM6 et TM1. Tableau 10 mq de biomasse Mode de culture en pot Essai1a Essai2a Essai3b Essai4b Essai5b Résidus de culture 9.1 7.1 33 37 35 Résidus de culture avec témoin TM6 8.7 5.9 39 32 37 Résidus de culture avec témoin TM1 na 8.1 39 32 37 Résidus de culture avec témoin TM2 na na 39 32 37 Résidus de culture avec AZB 10.0 8.7 40 41 39 Note : a ; g de biomasse Lohum multiflorum par pot b ; mg de biomasse Triticum aestivum par plantule B) Pourcentage (%) d'augmentation des rendements en grains (Rdt à 15% humidité) et des PMG (Poids de mille grains) au cours d'essais agronomiques au champ (campagne 1999-2000 à Toulouse 31 sur sol Terrefort, et campagne 2000-2001 à Lusignan sur sol Terre rouge de châtaignier) par rapport aux témoins non-inoculés jumelés à TM6, TM1 et AZB. Tableau 11 Rdt 15% hum PMG Mode de culture au champ Toulouse Lusignan Toulouse Lusignan Résidus de culture avec témoin TM6 4% 0. 73% 5% 0. 08% Résidus de culture avec témoin TM1/2a 13 % 0. 86% 4% 0. 02% Résidus de culture avec AZB 20% 1. 47% 6% 0. 94% Note : a ; Témoins TMI pour Toulouse, TM2 pour Lusignan C) Coïncidence des augmentations de rendements et de PMG au cours des essais agronomiques au champ de la campagne 2001-2001 à Lusignan sur sol Terre rouge de châtaigner et les divers indices de valorisation des résidus de culture obtenus de façon parallèle sur ces même parcelles. Tableau 12 Mode de culture au champ Rdta PMGb -ktC dRCd dRCe Résidus de culture avec témoin TM6 63 0. 08% 41 2.10 0.70 Résidus de culture avec témoin TM2 71 0. 02% 37 2.02 0.81 Résidus de culture avec AZB 126 0.94% 47 2.42 1.19 Note : a ; augmentation des rendements en kg grain/ha à 15% humidité b ; poids mille grains de blé par rapport aux témoins non-inoculés jumelés aux témoins TM2/6 et AZB c ; coefficient de degradation x 104 selon dRC = A*ed ; dégradation des résidus de culture (4,00 g à tO) sur 164 jours e ; degradation des résidus de culture par rapport aux témoins non-inoculés jumelés aux témoms TM2/6 et AZB . Augmentation du rapport biomasses végétales/biomasses macitaires attribuables à l'action rhizosphérique des bactéries (ré) introduites. Le tableau 13 ci-après donne les résultats obtenus concernant l'augmentation du rapport entre les parties végétatives (aériennes) et racinaires (Index Végétatif, IV) des plantules cultivés sur sols incubés en présence de résidus de culture céréalières (pailles de blé) traités et non-traités avec les inocula selon l'invention et leurs témoins TM6 et TM2. Traitement des résidus de culture---rapport végétation/racines (Index Végétatif)-----------Essai 1 Essai 2 Essai 3 Moyenne Témoins TM6 0.85 na na 0.85 Témoin TM2 na na na TF31 (AZB TF31) 0.90 na na 0.90 Témoin TM6 1.02 0.90 1.03 0.98 (0.03) 9 Témoin TM2 na 1.03 1.09 1.06 (0.04) GR86 (AZB GF86) 1.05 0.92 1.36 1. 11 (0. 09) 9 (écartype) . Retard de l'effet de l'immobilisation de l'azote comparé à celui obtenu sur des résidus de culture témoins traités avec un antibiotique. On étudie l'effet du traitement des résidus de culture céréalière (pailles de blé) avec un antibiotique (ampicilline) à un taux agronomique (de 1000 kg/10 Mg de résidus/hectare (soit environ 1000 Mg de sol)). Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 14 ci-dessous. Tableau 14 Mode de culture en pot Essai 1Essai 2Essai 3Moyenne Résidus de culture 33 37 35 35 (2) 10 Résidus de culture avec antibiotique"37 39 38 38 (1) Résidus de culture avec AZB 40 41 39 40 (1) '" (écart type) Ampicilline L'effet observé est attribuable au retard inculqué aux bactéries impliquées dans la dégradation des résidus de culture, et donc accessoirement à l'immobilisation de l'azote minéral assimilable du sol. Cette atténuation de l'immobilisation de l'azote assimilable permet une plus grande croissance végétale des plantules testés en place ; cette augmentation de la croissance végétative est analogue à celle observée en présence de résidus de culture traités selon l'invention. Ce traitement peut donc aussi être conçu comme une bonne alternative (micro) biologique à un éventuel traitement aux antibiotiques des résidus de cultures. La figure 6 donne une représentation graphique de trois expérimentations VB9 avec l'utilisation de l'ampicilline comme témoin antibiotique. On observera que l'ampicilline est plus favorable à la croissance végétative que les témoins inoculés azb et Azb, tandis que AZB est plus favorable que l'ampicilline. . Dégradation des résidus de culture On étudie la décomposition en microcosmes au laboratoire et au champ, en sachets de nylon, des résidus de culture céréalières traités selon l'invention par rapport à leurs témoins jumelés non inoculés. Les résultats obtenus sont donnés sur les figures 7A ET 7B. . effet de la granulométrie des sols On rapporte sur les figures 8A et SB les résultats concernant l'étude de l'efficacité relative des biomasses (azoto) bactériennes de l'invention pour maintenir la teneur en azote minéral de sols reconstitués en microcosmes selon la fraction granulométrique ( > 3 mm en (A), et moins de 1 mm en (B)) de ces fractions. On notera que seules les biomasses AZB sont efficaces et que cette efficacité par rapport aux témoins inoculés (azb et Azb) et non inoculés (témoin), n'est plus observée lorsque les biomasses évoluent au sein de la fraction 1 mm. Références Bibliographiques Burucoa, C. ; V. Lhomme et J. L. Fauchere. 1999. Performance criteria of DNA fingerprinting methods for typing of Heliobacter pylori isolates : experimental results and meta-analysis. J. Clin. Microbiol. 37 (12) : 4071-4080. Characklis, W. G. 1990. Biofilm processes. In :"Biofilms" (Characklis et Marshall, eds.), John Wiley and Sons, NY, NY. Characklis, W. G. et K. C. Marshall. 1990. Biofilm : a basis for an interdisciplinary approach. In :"Biofilms" (Characklis et Marshall, eds. ), John Wiley and Sons, NY, NY. Davies, L. ; H-C. Flemming et P. A. Wilderer. 1998. Microorganisms and their roel in soil. In :"Bioremediation : principals and practice, Vol. I"-Fundamentals and Applications (S. K. Sikdar et R. L. Irvine, eds.). Technomic Publ. Inc., Lancaster (UK), Basel (CH). Gordienko, S. 1990. Conceptual model of the functional structure of autochtonous component in soil microbial organisms communities. Ekologia 9 (4) : 429-439. Pochon, J. et Y-T. Tchan. 1948. Précis de microbiologie du sol : principes, techniques, place dans les cycles geo-biologiques. Masson et Cie., eds, Paris. Pochon, J. 1954. Manuel technique d'analyse microbiologique du sol. Masson et Cie. Eds., Paris. Pochon, J. et H. DeBarjac. 1958. Traité de microbiologie du sol : application agronomiques. Dunod, Paris. Sasson, A. 1967. Recherches éco-physiologiques sur la flore bactérienne de sols de régions arides du Maroc. Thèse doctorale, Faculté des Sciences de Paris, soutenue le 26 juin 1967. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention in vitro de biomasses bactériennes d'origine édaphique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : - mise en contact d'une suspension aqueuse de sol avec un substrat matriciel, de manière à former une zone hydratée, ou biofilm, à la surface du substrat, analogue à celle adjointe au CAH du sol, abritant pour l'essentiel la composante bactérienne autochtone du sol, afin de retenir à la surface du substrat matriciel, l'essentiel de la microflore bactérienne endogène aux milieux édaphiques d'origine. - maturation du biofilm avec établissement de conditions oligotrophiques permettant aux cellules les plus constitutives du biofilm édaphique qui ont colonisé le substrat matriciel, de migrer vers la phase liquide surnageant le substrat matriciel, et progressivement à la dominer, - récupération et culture des souches bactériennes les plus prolifiques en milieux de cultures liquides riches, à caractère autochtone, rustiques et persistantes in situ, cultivables en milieux liquides, et donc aptes à être produites industriellement. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat matriciel est un substrat matriciel inorganique et abiotique, en milieu aqueux. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'eau de la suspension aqueuse renferme des composés présents dans les proportions relatives caractéristiques du sol cible d'origine, à savoir des substances humiques et fulviques, des composés carbonés et notamment des mono-, oligo-et polysaccharides, d'origine végétale, animale, et bactériofongique, des éléments nutritifs. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la maturation du biofilm est réalisée en alternant une phase où le biofilm formé sur la surface abiotique n'est pas en présence d'une phase liquide surnageant, avec une phase liquide comprenant l'ensemble des cellules bactériennes surnageant la phase solide. 5. Biomasses bactériennes isolées, caractérisées en ce qu'elles comportent, comme souches dominantes, des souches bactériennes Gram négatif à caractère édaphique, autochtones, oligotrophes, en majeure partie aérobiques. 6. Biomasses selon la revendication 5, caractérisé par les phénotypes suivants exprimés in vitro et in situ par rapport à des biomasses bactériennes témoins obtenues de surfaces biotiques, mais sans la présence d'un biofilm ou d'un complément humique et/ou obtenues de surfaces abiotiques, mais a) avec un complément humique non-calqué sur celui du sol cible et/ou b) avec un substrat carboné apporté en quantité supérieure aux concentrations normalement présentes dans le sol, et/ou obtenues de surfaces abiotiques non conditionnées, lesdites biomasses bactériennes sont plus mucoïdes que ces témoins, plus enkystées et de manière plus durable, moins copiotrophes que lesdits témoins, et produisent des facteurs d'auto-induction selon des taux plus élevés que les témoins, par exemple de l'octanoyl homosérine lactone. 7. Biomasses bactériennes selon la revendication 6, caractérisées en ce que, par rapport auxdits témoins, elles sont capables de maintenir la teneur en azote minéral des sols reconstitués en microcosmes sur une période plus de 28 jours d'incubation d'Azobacteriaceae, des Pseudomonaceae, ou des Rhizobiaceae. 8. Biomasses bactériennes selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisées en ce qu'il s'agit d'Azobacteriaceae, de Pseudomonaceae, ou de Rhizobiaceae. 9. Souches bactériennes isolées à partir des biomasses bactériennes selon l'une quelconque des revendications 5 à 8. 10. Souches bactériennes selon la revendication 9, en ce qu'il s'agit de d'écotypes de A. chroococcum Berjerinkcii. 11. Application des biomasses bactériennes selon l'une quelconque des revendications 5 à 8 et des souches bactériennes selon la revendication 9 ou 10, à la bactérisation microbiologique de sols et de résidus de cultures, en particulier de résidus de cultures céréalières, y compris ceux du maïs-grain. 12. Application selon la revendication 11, caractérisée par inoculation desdites biomasses bactériennes et souches par pulvérisation de formulations les contenant sur les résidus de culture.