Brevet FR2822477A1 — publié le 20020927

L'invention a trait à une méthode de génotypage rapide, sans extraction chimique préalable de l'ADN. Le génotypage d'individus consiste en l'analyse de leur génotype, et comprend notamment la détermination de polymorphismes. Aujourd'hui de nombreux polymorphismes de l'ADN, répartis sur l'ensemble du génome, ont été identifiés. Ces mutations, fonctionnelles ou non, traduisant la diversité de chaque individu, sont recensées dans des banques de données accessibles, par exemple auprès du National Center for Biotechnology Information, et dans lesquelles les généticiens puisent pour localiser des gènes de maladies. Il s'agit le plus fréquemment de polymorphismes nucléotidiques ( single nucleotide polymorphisms , SNP). Ces analyses génotypiques peuvent être mises à profit pour évaluer le risque qu'un individu développe une maladie (Lathrop et al, 2000) ou pour adapter les protocoles thérapeutiques au profil génotypique d'un patient (Amouyel, 2000). Les études de génotypage sont généralement réalisées sur de l'ADN génomique extrait, par exemple à partir de leucocytes sanguins, par des procédés classiques d'extraction de l'ADN. L'article Amant et ai, 1997, qui rapporte une analyse des polymorphismes du gène ACE (enzyme de conversion de l'angiotensine), fait ainsi référence à des protocoles de préparation de l'ADN en routine (Marcadet et al, 1987). Ces procédés d'extraction des acides nucléiques ont toutefois l'inconvénient d'être relativement longs à réaliser (entre 24 et 48 heures généralement). En outre, ils mettent généralement en oeuvre des protéases, dont le coût n'est pas négligeable. Or, il serait avantageux que des résultats de génotypage puissent être obtenus très rapidement, et à un coût raisonnable, par exemple à des fins de diagnostic ou pour adapter le traitement au patient dont le génotype a été identifié. Les auteurs de la présente invention ont maintenant mis au point une méthode de génotypage qui résout ce problème simplement. Conformément à l'invention, l'acide nucléique qui sert à l'identification du génotype n'a pas subi d'extraction chimique. En particulier aucune extraction au phénol, au chloroforme, à l'éther ou à l'isobutanol n'est réalisée. Par extraction chimique , on entend toute étape basée sur l'utilisation de la solubilité différentielle des molécules (acide nucléique et contaminants) entre deux phases non miscibles, ou sur l'utilisation de la réactivité différentielle de ces molécules vis à vis d'un agent chimique. Au sens de l'invention, le terme extraction comprend donc la précipitation classique des acides nucléiques en présence d'un agent de précipitation de type éthanol ou isopropanol par exemple. En fait, les auteurs de l'invention ont supprimé ces étapes usuelles d'extraction, et les ont remplacées par un simple chauffage suivi d'une centrifugation. La présente invention a donc pour objet une méthode de génotypage d'un acide nucléique sans étape d'extraction chimique, comprenant : ta mise en présence d'une préparation cellulaire avec un agent détergent, qui permet la lyse des cellules ; le chauffage de la préparation obtenue, puis sa centrifugation ; le surnageant récupéré, qui comprend des acides nucléiques, étant enfin soumis à une analyse génotypique. Aucune étape d'extraction chimique, ni de chromatographie ou autre traitement des préparations cellulaires n'est nécessaire. De manière notable, et contrairement à la plupart des procédés classiques d'extraction, la méthode de l'invention ne nécessite pas d'ajout de protéases, ce qui permet de réduire encore le temps de préparation de l'ADN et diminue le coût global de la méthode. La préparation cellulaire servant de matériel de départ peut être par exemple un échantillon de sang total, ou une préparation de leucocytes sanguins. Il peut également s'agir de tissus, tels que des biopsies tissulaires mais aussi des frottis, notamment endo-bucaux. Les agents détergents utilisables sont bien connus de l'homme du métier. On peut par exemple citer le SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) ou le sarcosyl. Conformément à la présente invention, la préparation d'acide nucléique est incubée à une température d'environ 70 à 100oC, de préférence 85-95OC, de préférence encore 90OC. Un temps d'incubation de l'ordre de 30 minutes à 1 heure convient, par exemple 40 minutes environ. De manière avantageuse, on peut effectuer une incubation de la préparation à 90 C pendant 40 minutes. Les conditions de la centrifugation qui suit sont adaptées pour précipiter les contaminants (tels que des débris cellulaires) sous la forme d'un culot et laisser l'acide nucléique dans le surnageant. Une centrifugation de l'ordre de 5 à 15 minutes (de préférence 10 minutes) entre approximativement 4000 et 7000g (de préférence 5600g environ) convient particulièrement. Le surnageant récupéré, qui comprend les acides nucléiques, peut être directement analysé. Ces acides nucléiques sont essentiellement formés par de l'ADN génomique. L'analyse génotypique est réalisée selon les méthodes connues de l'homme du métier. Une détermination d'allèles peut être par exemple réalisée après amplification (de préférence du type PCR, amplification en chaîne par une polymérase) de la région d'ADN dans laquelle existe un polymorphisme d'intérêt. Pour cela, on peut créer dans une amorce de PCR un site de clivage pour une enzyme de restriction, n'existant pas chez les individus porteurs d'un des allèles. On peut également utiliser une technique d'hybridation utilisant des sondes oligonucléotidiques spécifiques des allèles. Les produits d'amplification peuvent ensuite être séparés dans une matrice, par exemple par électrophorèse sur un gel d'agarose, le polymorphisme d'intérêt étant ensuite aisément détecté selon les techniques standards. Une analyse génotypique des SNP par spectrométrie de masse peut également être réalisée (Sauer et al, 2000). Elle repose sur la méthode d'extension d'amorces qui génère des produits ayant une masse spécifique pour chaque allèle. Les allèles se distinguent par leur différence de masse, facile à interpréter automatiquement par ordinateur. L'analyse génotypique peut également être réalisée en mettant en oeuvre un séquençage, de préférence automatique. La méthode de l'invention s'avère non seulement très rapide, mais est aussi d'une grande sensibilité. Elle est donc particulièrement adaptée pour toute application clinique qui nécessiterait la détermination fiable et rapide du génotype d'un patient. La méthode de l'invention peut par exemple être mise à profit pour identifier les allèles D du gène ACE, en relation avec un risque de resténose après la pose d'une endoprothèse vasculaire. Elle peut également être utile pour déterminer des mutations dans des cellules tumorales, par des analyses réalisées sur des prélèvements de cellules tumorales, au cours d'une intervention chirurgicale. La détermination de ces mutations peut alors orienter le geste du chirurgien, selon l'origine du cancer ainsi identifiée. La méthode de l'invention revêt en outre un aspect pratique et commercial intéressant : peu coûteuse, elle peut être mise en oeuvre sur des prélèvements cellulaires de sujets dont il n'est pas nécessaire de stocker l'ADN. Parmi les exemples non limitatifs d'applications, on peut citer notamment le génotypage d'allèles du gène APOE, à des fins de pronostic du risque de développer la maladie d'Alzheimer (FR 2 716 894). L'exemple suivant illustre l'invention sans en limiter la portée. EXEMPLE : Génotypage ACE Un génotypage pour le gène ACE codant pour l'enzyme de conversion de l'angiotensine a été réalisé sur 345 patients ayant subi des implantations de stent coronarien, dans les 12 à 24 heures précédant l'analyse. 15 u ! de sang total prélevés sur anti-coagulant EDTA ont été mélangés, à 60 u ! de Lauryl sarcosyl à 0,5% dans du tampon de lyse de globules rouges (Tris HCI 7,7mM, MgC ! 2, 6H20 5mM, NaCI10 mM, pH 7,6). Les échantillons ont ensuite été incubés 40 minutes à 90oC, puis centrifugés 10 minutes à 5600g. Une fraction de 5 ut de surnageant a été utilisée pour l'amplification et déterminer le génotype ACE. Cette analyse a été réalisée selon le protocole décrit dans l'article d'Amant et al, 1997. Brièvement, le fragment ACE contenant le polymorphisme recherché (ID) a été amplifié au moyen d'un thermocycleur d'ADN de PerkinElmer, à l'aide de l'ADN polymérase de Thermus aquaticus (Amersham). Le polymorphisme ACE a été détecté comme décrit précédemment dans l'article de Tiret et al, 1992, à l'exception de l'addition de DMSO pour augmenter l'amplification de l'allèle ACE 1 (Fogarty et al, 1994 ; Shanmugam et al, 1993). Les produits de réaction ont été analysés par électrophorèse sur un gel d'agarose pour l'identification allélique. Les patients ont été également génotypés avec un système à trois amorces (Hamon et al, 1995), pour confirmation. Les produits d'amplification ont été déposés sur des gels d'électrophorèse (agarose NuSieve à 4% FMC Bioproducts). Pour plus de détails concernant la technique de détection des polymorphismes de l'ACE, l'homme du métier pourra se reporter utilement à la description de la demande WO 90/0345, et plus généralement aux principes décrits dans les brevets US 4,683, 202 et US 4,683, 195. Pour tous les patients, on a vérifié les résultats de la détermination rapide du génotype en utilisation les techniques classiques d'extraction de l'ADN mettant en oeuvre notamment une extraction au phénol et une précipitation à l'isopropanol (Amant et al, 1997, et Marcadet et al, 1987). La méthode de génotypage rapide a permis d'obtenir des résultats en 4 heures environ seulement. 16,5% des patients avaient le génotype Il, 50% le génotype ID et 33, 5% le génotype DD. En comparaison avec la méthode conventionnelle de génotypage, le test de détection rapide des porteurs DD présentait une sensibilité de 100%, une spécificité de 98,7%, une valeur prédictive positive de 97,4% et une valeur prédictive négative de 100%. Les patients présentant un génotype DD pour l'ACE ont un risque plus élevé de resténose après l'implantation de l'endoprothèse. Rapidement génotypés, ces patients pourront bénéficier d'une thérapie préventive dans les meilleurs délais. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Amant et al, 1997, Circulation, 96 (3), pp 56-60 Amouyel, 2000, Biofutur, no 206, pp 86-88 Fogarty et al, 1994, Lancet, no 343, p. 851 Hamon et al, 1995, Circulation, no 92, pp 296-299 Lathorp et al, 2000, Biofutur, no 206, pp 82-85 Marcadet et al, 1987, Histocompatibility Testing, New York, NY : Springer-Verlag, pp 553-560 Sauer et al, 2000, Nucleic Acids Research, 28 (5) : E13 et 28 (3) : E100 Shanmugam et al, 1993, Methods Appl., vol. 3, pp 120-121 Tiret et al, 1992, Am. J. Hum. Genet. vol. 51, pp 197-205 REVENDICATIONS 1. Méthode de génotypage d'un acide nucléique sans étape d'extraction chimique ni d'ajout de protéases, comprenant ta mise en présence d'une préparation cellulaire avec un agent détergent, qui permet la lyse des cellules ; te chauffage de la préparation obtenue, puis sa centrifugation ; te surnageant récupéré, qui comprend des acides nucléiques, étant enfin soumis à une analyse génotypique. 2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle le chauffage de la préparation est réalisé à une température de 70 à 100oC, de préférence à 90 C environ. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le chauffage de la préparation est réalisé pendant une durée de 30 minutes à 1 heure, de préférence pendant 40 minutes environ. 4. Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle la centrifugation est réalisée entre approximativement 4000 et 7000g, de préférence 5600g environ. 5. Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle la préparation cellulaire consiste en un échantillon de sang total. 6. Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle ladite analyse génotypique consiste en la détermination des allèles D du gène ACE codant pour l'enzyme de conversion de l'angiotensine. 7. Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle ladite analyse génotypique comprend l'amplification d'une région d'ADN où il existe un polymorphisme d'intérêt, la séparation des produits d'amplification dans une matrice, et la détection dudit polymorphisme.