Brevet FR2829153A1 — publié le 20030307

La présente invention se rapporte à un procédé d'identification de composés pouvant se lier à une glycosyltransférase bactérienne, au site de transglycosylation. L'invention se rapporte aussi aux composés obtenus par un tel procédé, et à leurs utilisations. Le peptidoglycane est un polymère synthétisé par la bactérie et indispensable à sa survie. Les enzymes impliquées dans la synthèse et l'organisation de ce peptidoglycane bactérien, propre au monde procaryote, constituent ainsi des cibles potentielles très intéressantes pour la recherche de nouveaux antibiotiques. Parmi celles-ci les PBP (Penicillin Binding Proteins, protéines liant la pénicilline), qui font partie des étapes membranaires, font l'objet de nombreux travaux. Cet intérêt est lié principalement à la présence d'une activité transpeptidase qui est inhibée par les pénicillines (van Heijenoort, J. 1996, p. 1025-1034. In Neidhardt et al. (ted.), Escherichia coli and Salmonella, 2nd 00. : cellular and molecular biology, ASM Press, Washington, D. C.). Les plus étudiées sont les PBP de classe A qui sont des protéines modulaires possédant deux activités enzymatiques : l'activité transpeptidase (représentée par une séquence d'environ 340 amino-acides) et une activité glycosyltransférase (environ 300 amino-acides dans la région N-terminale). Cette activité glycosyltransférase est encore peu connue, tant par la difficulté à suivre la réaction enzymatique que par l'absence totale de données cristallographiques. On connaît cependant un inhibiteur de cette activité, la moénomycine dont le mécanisme exact d'action reste à élucider (Wasielewski et al, 1965, Antimicrob. Agents and Chem., 743-748). Il est important de noter qu'à ce jour, aucune PBP de classe A n'a été entièrement cristallisée. A côté de ces PBP bi-fonctionnelles cohabitent deux systèmes monofonctionnels : d'une part, les PBP mono-fonctionnelles, qui possèdent uniquement une activité transpeptidase : Une de ces PBP a été récemment cristallisée (Gordon et al, 2000,. Mol. Biol., 299, 477-485). - d'autre part, des enzymes possédant la seule activité glycosyltransférase, dénommées MgtA (Di Berardino et al, 1996, FEBS Lett., 392, 184-188) Il est important de pouvoir disposer de nouveaux inhibiteurs de l'activité glycosyltransférase, qui pourraient ainsi être utilisés en tant que nouveaux agents antibiotiques. La présente invention concerne donc un nouveau procédé d'identification, détection et/ou criblage de composés se liant au site de transglycosylation d'une glycosyl transférase, ce procédé étant simple à mettre en oeuvre, et ladite glycosyl transférase étant soit une protéine PBP de classe A, soit une protéine de type MgtA, sensible à la moénomycine (par exemple une MgtA de staphylocoque et de streptocoque, tel S. aureus ou S. pneumoniae). Le procédé selon l'invention permet également de pratiquer un criblage à haut débit, c'est-à-dire de pouvoir tester aisément plusieurs composés en même temps. Ce procédé permet donc un gain de temps et une économie substantielle pour la détection de nouveaux partenaires de liaison de la glycosyl transférase, et un mode de réalisation est schématisé en figure 1. Dans un premier mode de réalisation, l'invention concerne un procédé d'identification et/ou de criblage et/ou de sélection d'un composé se liant au site de transglycosylation d'une glycosyl transférase recombinante, comprenant les étapes consistant à : a) mettre ledit composé en contact avec ladite protéine recombinante, avant, après, ou de façon concomitante à la mise en contact de ladite protéine recombinante avec un inhibiteur de l'activité de transglycosylation, ledit inhibiteur étant marqué par un marqueur générant un signal direct ou indirect, b) étudier ledit signal lié à ladite protéine recombinante, la liaison dudit composé au site de transglycosylation étant déduite de la différence de signal obtenu dans l'étape b) par rapport au signal obtenu en l'absence dudit composé. Dans un mode de réalisation préférée, ladite glycosyl transférase recombinante est une PBP de classe A, de façon plus préférée la PBPlb de Escherichia coli. Cette protéine est la principale responsable de l'activité glycosyltransférase indispensable à la synthèse de la paroi bactérienne. Par ailleurs, elle possède une importante homologie avec les PBP de classe A observées chez les autres bactéries. Ainsi, on utilise préférentiellement la PBPlb correspondant à SEQ ID N'2, SEQ ID NO 1 représentant une protéine de fusion construite pour la production d'une PBPlb recombinante. La méthode peut toutefois être adaptée en utilisant toute PBP de classe A, provenant d'un micro-organisme possédant un peptidoglycane, qu'il soit Gram + ou Gram-. On utilise de préférence des PBP de classe A provenant de micro-organismes pathogènes pour l'homme, par exemple S. aureus, S. pneumoniae, M leprae, L. pneumophilia, M catarrhalis, C. jeikeium, H. influenzas, P. aerugnosa... Ainsi, on détecte la liaison au site de transglycosylation par compétition avec l'inhibiteur employé. Ce procédé permet d'obtenir des composés spécifiques de l'activité de transglycosylation, qui présentent aussi une probabilité élevée d'inhiber cette activité. L'intérêt de l'utilisation d'une protéine recombinante permet également de diminuer les risques de liaison des différents composés testés pouvant arriver si l'on utilise une protéine préparée directement à partir de la membrane bactérienne, la préparation ainsi obtenue pouvant contenir alors des protéines contaminantes. Dans un mode de réalisation particulier, ledit inhibiteur est la moénomycine. Il est toutefois important de noter que l'on pourrait également utiliser des analogues de la moénomycine, comme ceux décrits dans la demande WO 99/26956, ou tout autre composé inhibant l'activité de transglycosylation. Dans un mode préféré de réalisation, ladite protéine recombinante est fixée à un support solide. Ce support peut notamment être une colonne ou une surface plane. De préférence, le support solide selon l'invention consiste en des billes, portant un groupement capable de fixer la protéine recombinante, tel que des ions Cuivre ou un résidu Glutathion. En effet, l'utilisation de billes permet la mise en contact en solution de la protéine avec les inhibiteurs et les composés à tester, ce qui permet en général d'améliorer les capacités de liaison, par rapport à une surface plane (bidimensionnel). Dans un mode de réalisation particulier, ladite protéine recombinante a été modifiée par génie génétique, afin de présenter une modification permettant sa liaison audit support. De telles modifications sont connues de l'homme du métier, et comprennent notamment l'ajout de résidus Histidine à l'extrémité N-ou Cterminale de la protéine, ce qui permet une liaison avec un chélate métallique (Cuivre, par exemple). On peut aussi utiliser les systèmes basés sur le glutathion. Dans un mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, ledit marqueur est un marqueur radioactif ou fluorescent. Ainsi, on peut utiliser tout type de marquage radioactif, notamment par incorporation de composés radioactifs (de façon préférée 3H) dans la structure de l'inhibiteur. L'utilisation de tritium est en effet préférée, lorsque l'inhibiteur marqué utilisé dans le procédé selon l'invention est une molécule organique. Toutefois, on peut aussi envisager l'incorporation de 13C OU 14 C dans le squelette dudit inhibiteur. Ainsi, on peut utiliser un précurseur marqué au 14C (glucose, propionate...), lors de la synthèse de l'inhibiteur, lorsque celui-ci est préparé par fermentation. Lorsqu'il est préparé par synthèse chimique, on utilise de éléments déjà marqués. On peut aussi marquer ledit inhibiteur avec un marqueur fluorescent ou d'une autre nature, soit que le signal émis soit détecté directement, soit qu'il ne le soit qu'en cas de contact (ou proximité) entre la protéine et l'inhibiteur (détection indirecte). Ainsi, on peut marquer à la fois l'inhibiteur et la protéine par des composés fluorescent, la liaison entre les deux entités étant alors déterminée par quenching , ou par d'autres méthodes (par exemple SPA (Scintillation Proximity Assay) ou FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, la PBP 1 b est fixée sur des billes SPA (Amersham) qui renferment un scintillant. On met en contact ces billes-PBP avec l'inhibiteur potentiel et la moénomycine marquée. Si la PBP fixe l'inhibiteur on ne voit pas de signal. Si la PBP fixe la Moénomycine marquée la proximité du radioélément et de la bille déclenche l'émission d'un signal (émission de photons par le scintillant contenu dans la bille SPA). Dans un mode de réalisation, on peut déduire le signal lié à ladite protéine recombinante par mesure du signal non lié à la protéine, en fonction du signal total de départ. En effet, connaissant la quantité d'inhibiteur ajouté dans le procédé selon l'invention, on connaît la quantité de signal initial. Il est alors possible, après passage de l'inhibiteur sur la protéine, et les différents lavages, de déterminer la quantité d'inhibiteur non lié, et d'en déduire ainsi la quantité d'inhibiteur lié à la protéine. Il s'agit ici d'une méthode indirecte. Toutefois, le mode de réalisation dans lequel on mesure directement la quantité d'inhibiteur lié à la protéine est préféré. L'invention se rapporte également à un procédé d'identification d'un produit ayant une activité antibactérienne, comportant les étapes de : a) mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, b) modification du produit sélectionné à l'étape a) notamment par greffage de résidus sur le squelette chimique, c) test du produit modifié dans l'étape b) dans des procédés in vitro et/ou in vivo, sur des modèles pertinents de mesure d'activité antibiotique, d) identification du produit permettant d'obtenir une activité antibiotique supérieure à l'activité obtenue pour le produit sélectionné à l'étape a). En effet, le développement d'un médicament est souvent effectué sur le principe suivant : - criblage de composés ayant une activité voulue par une méthode appropriée, sélection des composés répondant au cahier des charges (ici, liaison au site d'activité de transglycosylation de la glycosyl transférase), détermination de la structure (notamment la séquence (éventuellement tertiaire) s'il s'agit de peptides, formule et squelette s'il s'agit de composés chimiques) des composés sélectionnés, - optimisation des composés sélectionnés, par modification de la structure (par exemple par le changement de la conformation stéroéochimique (par exemple passage de L en D des acides aminés dans un peptide), ajout de substituants sur les squelettes peptidiques ou chimiques, notamment par greffage de résidus sur le squelette, modification des peptides (voir notamment Gante "Peptidomimetics", dans Angewandte Chemie-Intemational Edition Engl. 1994,33. 1699-1720), - passage et criblage des composés ainsi obtenus sur des modèles appropriés qui sont souvent des modèles plus proches de la pathologie étudiée. A ce stade, on utilise notamment souvent des modèles animaux, en général chez les rongeurs (souris, rats...) ou chez des chiens, voire des primates. Les modèles in vitro sont facilement mis en oeuvre par l'homme du métier. On ajoute, à un milieu de culture pour les bactéries cibles, les composés sélectionnés par les procédés selon l'invention (avec éventuellement les modifications de structure apportées), à des concentrations variables, et on étudie la survie des bactéries par toute méthode appropriée, notamment en les étalant sur des milieux solides et en comptant les colonies formées. Les modèles animaux qui peuvent être utilisés sont bien connus de l'homme du métier. On utilise par exemple, des modèles basés sur des souris immunodéprimées (par exemple scid/scid), que l'on infecte avec des bactéries, ce qui mène au développement d'une infection. On étudie l'efficacité des composés sélectionnés par la méthode selon l'invention par la résolution de l'infection. L'invention se rapporte également à un composé pouvant se lier au site de transglycolsylation d'une glycosyl transférase et possédant de préférence une activité antibiotique, pouvant être obtenu par un procédé selon l'invention, ou directement obtenu par l'un desdits procédés. Un tel composé selon l'invention peut être un composé ayant une structure chimique (du type petite molécule organique), un lipide, un sucre, une protéine, un peptide, un composé hybride protéine-lipide, protéine-sucre, peptide-lipide, ou peptide-sucre, une protéine ou un peptide sur lequel on a ajouté des ramifications chimiques. Parmi les composés organiques envisagés, ils peuvent contenir un ou plusieurs cycles, aromatique (s) ou non, ainsi que plusieurs résidus de toute sorte (notamment alkyle inférieur, c'est-à-dire présentant entre 1 à 6 atomes de carbones). Toutefois, le composé selon l'invention n'est pas la moénomycine, ni les composés de WO 99/26956. L'invention se rapporte également à un composé selon l'invention, à titre de médicament, en tant que tel ou avec un excipient pharmaceutiquement acceptable, ainsi qu'à l'utilisation desdits composés pour la préparation d'un médicament destiné à traiter les infections bactériennes. L'invention se rapporte ainsi en particulier à l'utilisation de composés pouvant être ou étant obtenus par le procédé selon l'invention et possédant des capacités de liaison au site de transglycosylation d'une glycosyl transférase et/ou d'inhibition de cette activité, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter des infections bactériennes. De préférence, le composé préféré possède de plus une activité antibiotique, pouvant facilement être testée sur modèles animaux ou in vitro, sur milieux de cultures. Ledit composé n'est pas la moénomycine et se comporte comme un compétiteur de ce produit dans le procédé selon la présente invention. Un inhibiteur intéressant du site de glycosyltransférase est la moénomycine, et dans un mode de réalisation préférée de l'invention, on utilise ce composé après tritiation, ceci permettant une mise en oeuvre favorisée de l'invention, dans la mesure où cette modification ne modifie pas radicalement les propriétés de la moénomycine, et permet une détection aisée, notammment par SPA. Le nombre de liaisons saturées ayant un effet sur le caractère plus ou moins lipophile de la molécule et donc probablement sur le rapport signal/bruit de fond observé lors du test (augmentation du collage avec la lipophilie), il peut être intéressant de chercher à limiter le nombre de liaisons saturées. Une hydrogénation en présence de catalyseur de Wilkinson permet d'atteindre ce but avec de l'hydrogène mais donne des résultats décevants avec du tritium. Ainsi, un procédé alternatif a été développé, consistant en une tritiation en milieu hétérogène, de préférence en mesurant la quantité de tritium absorbé et en arrêtant la réaction à environ deux moles de tritium par mole de moénomycine. Ainsi, on effectue une tritiation contrôlée de la moénomycine. Le mélange obtenu est ensuite avantageusement séparé par chromatographie de façon à grouper les produits d'activité spécifique identique (donc selon le nombre de doubles liaisons saturées au tritium). Ainsi, l'invention se rapporte également à un procédé de préparation de moénomycine tritiée, comprenant une étape de fixation de tritium sur une ou plusieurs doubles liaisons de la chaîne latérale de la moénomycine (figure 2). Ce procédé est réalisé de préférence en milieu hétérogène, en présence d'un catalyseur, notamment le palladium. De préférence, ledit catalyseur est du palladium sur charbon, de préférence le palladium à environ 12-25 % sur charbon, de façon plus préférée à environ 18 % sur charbon. De façon préférée, on dissout la moénomycine dans un solvant organique, et de préférence dans l'éthanol ou le méthanol. Le choix du solvant adapté pour la moénomycine est à la portée de l'homme du métier. En présence du catalyseur, on pressurise avec du tritium, et on ramène à une température inférieure à environ 45-50 C, de préférence inférieure à environ 30 C, de façon plus préférée à température ambiante, soit environ 20 C. On agite à température ambiante, pour faire baisser la pression, puis on filtre le milieu réactionnel, que l'on concentre sous vide, avant de reprendre le résidu. On agite ainsi le temps nécessaire à l'intégration d'une à deux moles de tritium par mole de moénomycine. Ce temps dépend de la température et peut être déterminé par l'homme du métier, mais on indique que le temps nécessaire est d'environ 15 minutes lorsque l'on travaille à 20 C. La filtration du milieu est effectuée après élimination de l'excès de tritium. On peut ensuite analyser le mélange, par exemple par HPLC, et le purifier sur une colonne préparative, selon des protocoles connus de l'homme du métier. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir de façon reproductible des lots de moénomycine tritiée, et de contrôler la quantité de tritium incorporée, en fonction de la quantité de tritium apportée, Ainsi, le procédé selon l'invention permet d'obtenir une moénomycine marquée au tritium, de telle sorte que le tritium ne sature qu'un nombre limité (une ou deux) de doubles liaisons, ce qui permet de conserver les caractéristiques et propriétés de la moénomycine. De plus, la séparation par chromatographie (HPLC) des produits mono et di saturés permet de travailler avec des lots d'activité spécifique reproductible. Ce point peut s'avérer important pour juger de la qualité de l'effet compétiteur des produits que l'on teste dans le procédé selon l'invention. il convient en effet de disposer de lots parfaitement identifiés et aux propriétés bien définies. Notons que l'on peut mettre en oeuvre toute autre méthode de séparation des produits. L'invention se rapporte également à de la moénomycine tritiée, pouvant éventuellement être ou directement obtenue par le procédé de tritiation selon l'invention, le tritium étant incorporé de préférence par saturation d'une double liaison dans sa chaîne latérale, et/ou étant synthétisée par fermentation en présence de précurseurs radioactifs. L'invention utilise également une glycosyl transférase recombinante. Cette protéine membranaire est préparée de préférence de telle sorte qu'elle puisse être solubilisée. Ainsi, l'invention se rapporte à un procédé de préparation d'une glycosyl transférase recombinante à partir d'un vecteur comprenant le gène de ladite glycosyl transférase, comprenant les étapes de : a) fermentation d'une cellule dans laquelle est introduit ledit vecteur, dans des conditions permettant la production de la glycosyl transférase recombinante b) purification de ladite glycosyl transférase recombinante, en présence d'un détergent de préférence non ionique. De préférence, ce procédé est appliqué pour la préparation d'une PBP de classe A, et notamment la PBPlb de E. coli, principale responsable de l'activité glycosyltransférase indispensable à la synthèse de la paroi bactérienne. De préférence, le vecteur introduit dans la cellule bactérienne contient le gène de la PBP, à l'extrémité duquel on a inséré, par des méthodes connues de biologie moléculaire, une queue polyhistidine. Ceci permet la liaison de la protéine recombinante avec les billes de type SPA lorsque l'on met en oeuvre le procédé selon l'invention. On obtient ainsi une protéine présentant une séquence proche de SEQ ID NO 1, qui est indiquée en illustration, les acides aminés 1-23 correspondant à la queue polyhistidine, les acides aminés 24-822 correspondant à la PBP d'E. coli (SEQ ID NO 2). La fermentation est effectuée selon les méthodes habituelles. Selon que l'on utilise un promoteur particulier, on peut induire la production (voire la surproduction) de protéine, ce qui peut également être effectué en variant la température de fermentation. Tout ceci est bien connu de l'homme du métier. La protéine PBP est une protéine membranaire hydrophobe. Il est donc nécessaire de la purifier en présence de détergent. Ce point doit être vérifié, alors que les méthodes de purification utilisées sont quant à elles bien connues de l'homme du métier. On travaille de préférence en présence d'un détergent non ionique, le détergent préféré étant le NOG (N-Octyl Glucopyranoside). On peut également choisir un autre détergent non ionique, comme l'Hecameg, le Triton X- 100, le tétraéthylène glycol mono-octyl éther ou le Nonidet P-40. Notons que le détergent est utilisé dans toutes les étapes de la purification. La mise en oeuvre du procédé selon l'invention s'effectue aussi de préférence en présence d'un détergent non ionique, et plus particulièrement du détergent utilisé lors de la purification, c'est-à-dire le NOG. Ceci permet d'observer une bonne activité enzymatique. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : représentation schématique du procédé selon l'invention. Les billes SPA portant des groupements cuivre sont représentées par des ovales, avec le site de fixation de l'extrémité poly-histidine (His) de la protéine PBPlb de E. coli. En présence d'un inhibiteur, la moénomycine marquée ([3H]-Moénomycine) ne peut se lier au site de transglycosylation de la protéine. En l'absence de l'inhibiteur, la liaison s'effectue et un signal est émis. Figure 2 : représentation de la tritiation de la moénomycine par saturation d'une double liaison sur la chaîne latérale. T : tritium, Ca : catalyseur. Les exemples ci-dessous illustrent une mise en oeuvre de l'invention, mais ne doivent pas être considérés comme limitant l'invention. EXEMPLES Exemple 1 : Réactifs et matériels Billes PVT Copper His-Tag AMERSHAM : 200g/100 ul/puits PBPlb E.Coli purifiée 0,860 mg/ml ; PM=89 kDa ; 8.31 ! JM ; 5 pmoles/10 1/puits. Moénomycine : PM=1580 Da ; 200 pmoles/1 O ! Jll puits pour suivre le niveau non spécifique. Inhibiteur : Dilution en DMSO ; 10 l/puits. 3H-Moénomycine : 8,5 MBq/ml ; 8,9 M ; 12,5 pmoles/ 100ul/puits. Trizma hydrochloride SIGMA Acide Maléique MERCK MgCl2 MERCK NOG SIGMA (n-octyl -D glucopyranoside) NaCl MERCK Tampon 1 : Tris,maléate 10 mM ; MgCl210 mM ; NaCl 0, 2 M ; NOG l % ; pH 7, 2 PBS lOx GIBCO BRL Tween 20 ACROS Tampon 2 : PBS Ix ; Tween 20 0,5 % BSA CALBIOCHEM Tampon 3 : PBS2x ; BSA 2% Compteur de radioactivité WALLAC Microbéta 1450 Exemple 2 : Protocole 2. 1 Fixation de la PBPlb sur les billes Prélever la quantité voulue de billes après avoir bien agité la solution. Diluer au 1/5 en eau Milli-Q. Diluer une nouvelle fois au 1/2 en tampon 3 Préparer la solution de PBP 1 b en diluant dans le tampon 1. Dans un tube vacutainer, mélanger (100 l de billes + 10 ul de solution de PBP 1 b) par le nombre de puits à faire Incuber 30 mn à 37 C à 250 tours/minute. 2.2. Compétition on 3H-traceur / Inhibiteur Préparer la Moénomycine radioinerte pour la détermination du niveau de liaison non spécifique : Solution mère à 1,58 mg/ml, soit 1 mM en tampon 2 (conserver à-80 C) Diluer cette solution mère au 1/10 puis au 1/5 en tampon 2. Préparer la 3H-Moénomycine : Solution mère à 8,9 M. Prélever le volume nécessaire pour avoir une solution à 125 nM finale. Evaporer sous un flux d'azote. reprendre par le volume final de tampon 2. Préparer les inhibiteurs : Les dilutions sont faites en DMSO. Les concentrations initiales sont telles que l'inhibiteur est à la bonne concentration finale en déposant 10111/puits. Dans une plaque 96 puits translucide Greiner, déposer : 10 ul de Moéno radioinerte dans les puits niveau de liaison non spécifique. 10 ut d'inhibiteur dans les puits tests 100 ui1 de 3H-Moéno dans tous les puits. 10 ul de DMSO dans les puits sans protéine, niveau de liaison maximum, niveau de liaison non spécifique. Faire 2 lavages des billes/PBPlb en PBS lx ; Tween20 0, 5% pour éliminer la PBPlb non fixée. Entre chaque lavage/aspiration, centrifuger 5 mn à 1 OOOG à température ambiante. Après la dernière centrifugation reprendre les billes/PBPlb par (110 ul tampon 2) x nombre de puits à faire. Déposer 110 ul de billes/PBP 1 b par puits. Couvrir la plaque d'un film plastique autocollant. Incuber 1 nuit à 4 C sans agitation. Des incubations de 24 h, 48 h et même 72 h à 4 C ne donnent pas de résultats significativement différents Comptage Compter sans lavage ni centrifugation sur un compteur de radioactivité. Exemple 3 : Calculs Calculer le pourcentage d'inhibition de fixation de la 3H-Moénomycine avec chaque concentration d'inhibiteur par rapport à la fixation maximale (puits niveau de liaison maximum). Tracer une courbe % inhibition = f ( [inhibiteur]) pour déterminer l'IC50. Exemple 4 : Bilan des concentrations [initiale] pmoles/puit [finale] Billes 2 mg/ml 200100 1 0. 9 mg/ml PBPlb 500 nM 5 pmoles/10 1 &num;24 nM H-Moénomycine 125 nM 12, 5 pmoles/100 Jll 57nM Inhibiteurs : 1mM ~10 nmoles/10 l ~ 45 M Exemple 5 : test à haut débit L'utilisation du procédé selon l'invention a permis de tester environ 500 000 composés en 5 jours, et d'en sélectionner environ 1000. Ainsi, le procédé est rapide, à haut débit, et relativement discriminatif. Exemple 6 : Tritiation de la moénomvcine Dans un ballon à tritiation de lem3 on introduit : 6mg de moénomycine soit-lOumol. 300 l de méthanol. 2mg de catalyseur Palladium à 18% sur charbon (Degussa type E10N/D). On place sur le banc, piège, vide et pressurise avec du tritium. Après retour à 20 on agite durant 15mn de façon à obtenir une chute de pression de 3 400mBar soit environ 20mol de tritium (volume total du tritium 1 cm\ Après récupération de l'excès de tritium, le milieu réactionnel est filtré, concentré sous vide et le résidu est repris par 100cm3 d'éthanol et compté. On obtient : l, lCi (théorie pour 20Jlmol de tritium : 1, 2Ci). Le produit est analysé en HPLC dans les conditions suivantes : Colonne Symmetry C8 5Jl3. 9x150mm Solvant : Acetonitrile/eau/TFA : 55/45/0, 1, Débit : lcm/mn Détection : UV 220nm et radioactivité. La composition du mélange est la suivante : produit inchangé : 24% (en UV), mono saturé : 29%, di saturé : 28% (complément à 100% en radioactivité : produits polysaturés). Purification sur colonne préparative ; Colonne Symmetry C8 7u, 7. 8x300mm. Solvant : Acetonitrile/eau/TFA : 55/45/0. 1. Débit : 4cm3/mn. Détection : UV 220nm et radioactivité. Caractéristiques de deux lots : Lot A : Activité totale : 6,56GBq (177mCi) Activité Spécifique : 1,9TBq/mmol (-2T/mole) Activité volumique : 37MBq/cm3 (Ethanol à 5% d'eau). Stockage : -80 C sous gaz inerte. Lot B : Activité totale : 8,28GBq (223mCi). Activité Spécifique : 4, 92TBq/mmol (-4. 5T/mole). Activité volumique : 37MBq Icm3 (Ethanol à 5% d'eau). Stockage : -80 C sous gaz inerte. Revendications 1. Procédé d'identification d'un composé se liant au site de transglycosylation d'une glycosyl transférase recombinante, comprenant les étapes consistant à : a) mettre ledit composé en contact avec ladite protéine recombinante, avant, après ou de façon concomitante à la mise en contact de ladite protéine recombinante avec un inhibiteur de l'activité de transglycosylation, ledit inhibiteur étant marqué par un marqueur générant un signal direct ou indirect, b) étudier ledit signal lié à ladite protéine recombinante, la liaison dudit composé au site de transglycosylation étant déduite de la différence de signal obtenu dans l'étape b) par rapport au signal obtenu en l'absence dudit composé. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit inhibiteur est la moénomycine. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite protéine recombinante est fixée à un support solide, de préférence des billes, notamment portant des groupements cuivre. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit marqueur est un marqueur radioactif ou fluorescent. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit signal est mesuré de façon directe. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit signal est mesuré de façon indirecte, par exemple par SPA (Scintillation Proximity Assay) ou FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on déduit le signal lié à ladite protéine recombinante par mesure du signal non lié à la protéine, en fonction du signal total de départ. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit inhibiteur est tritié. 9. Procédé d'identification d'un produit ayant une activité antibactérienne, comportant les étapes de : a) mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 8, b) modification du produit sélectionné à l'étape a) notamment par greffage de résidus sur le squelette chimique, c) test du produit modifié dans l'étape b) dans des procédés in vitro et/ou in vivo, sur des modèles pertinents de mesure d'activité antibiotique, d) identification du produit permettant d'obtenir une activité antibiotique supérieure à l'activité obtenue pour le produit sélectionné à l'étape a). 10. Utilisation d'un composé pouvant se lier au site de transglycolsylation d'une glycosyl transférase et possédant éventuellement une activité antibiotique, identifié par un procédé selon l'une des revendications 1 à 9, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'infections bactériennes. 11. Procédé de préparation d'une glycosyl transférase recombinante, utilisable pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 9, à partir d'un vecteur comprenant le gène de ladite glycosyl transférase, comprenant les étapes de : a) fermentation d'une cellule dans laquelle est introduite ledit vecteur, dans des conditions permettant la production de la glycosyl transférase recombinante b) purification de ladite glycosyl transférase recombinante, en présence d'un détergent de préférence non ionique.