Brevet FR2823223A1 — publié le 20021011

La présente invention se rapporte à de nouvelles biostructures pouvant en particulier servir de biocapteurs, notamment un support permettant de présenter des acides nucléiques et de détecter à la fois la présence d'acides nucléiques dans un échantillon, mais aussi l'interaction entre protéines et lesdits acides nucléiques, ainsi que la liaison entre un ligand et une protéine liée à un acide nucléique. Le développement des biocapteurs à ADN, encore appelé puces à ADN, s'est accru de manière considérable au cours des dernières années. L'impact de tels biocapteurs s'est principalement orienté dans le séquençage, la cartographie d'expression de gènes, le diagnostique (détection, dommage, mutation...) et l'analyse des interactions ADN-ligand (hybridation...). L'essentiel des capteurs employés utilise des techniques d'immobilisation de molécules d'acide nucléique simple brin ou ADNsb, l'analyse étant réalisée grâce à des systèmes de transduction optique, électrochimique ou piezzo-acoustique. L'extrême importance physiologique des membranes biologiques comme siège de nombreuses réactions chimiques et métaboliques fut à l'origine d'un engouement pour le développement de modèles lipidiques sur des surfaces inorganiques. Le design de telles structures bio-compatibles et bio-fonctionnelles sur des substrats solides a permis le développement de modèles concernant des domaines interdisciplinaires qui ont conduit à l'essor de nombreux axes de recherche scientifiques ainsi que d'applications pratiques. Les principales applications ont ainsi concerné : la fabrication de matrice pour l'immobilisation d'enzymes, de récepteurs cellulaires ou d'hormones dans des environnements non dénaturants, te design d'interface permettant de capter des cellules afin d'étudier les effets de molécules pharmaceutiques sur le devenir cellulaire, l'auto-assemblage de membranes très résistantes pour le développement de biocapteurs. Les méthodes analytiques appliquées à l'analyse des interactions biomoléculaires ADN-ADN, telles qu'elles sont représentées au coeur des dispositifs puce à ADN, sont essentiellement basées sur la fixation d'un ADN simple brin (ADNsb) au sein d'une aire délimitée sur un substrat. Les principales techniques pour produire des ADN fixés de manière covalente sur le substrat sont la synthèse in situ de ADNsb sur le support, l'assemblage de ADNsb modifiés chimiquement pour permettre le greffage sur le support ou la microdéposition sur une matrice adsorbante (Boncheva et al., 1999, Berner et al., 2000, WittungStafshede P. et al., 2000). Or dans le développement de biocapteurs, la disposition de biomolécules aux interfaces joue un rôle crucial. Pour obtenir des surfaces hautement sensibles, il est important de présenter des molécules réceptrices de façon à ce que le ligand correspondant puisse interagir sans restrictions stériques. Cependant, dans ces différentes approches, les moyens mis en oeuvre pour réaliser ces matrices d'ADN génèrent des artefacts (erreurs de synthèses in situ ou de fonctionnalisation des oligonucléotides) à l'origine d'adsorptions non spécifiques, ainsi une partie des travaux actuels porte sur les moyens de circonvenir à ces différentes limitations (Steel et al., 2000). Une autre limitation de ces systèmes est inhérente au mode de présentation des ADNsb. Le fort compactage des molécules sur la surface conduit à l'apparition de contraintes stériques qui affectent l'efficacité d'hybridation de la puce. Si l'immobilisation de ADNsb sur une surface est l'alternative jusqu'alors la plus communément employée, elle constitue également celle qui contraint la géométrie du dispositif se traduisant par une perte totale de flexibilité et de modularité de l'assemblage. L'une des caractéristiques de la présente invention est de proposer un nouveau mode de présentation d'acides nucléiques à la surface d'un substrat. Le mode de présentation des acides nucléiques selon l'invention présente l'originalité de permettre une mobilité des acides nucléiques, et ainsi de pouvoir détecter tout changement dans l'état desdits acides nucléiques par la détection d'une transition entre deux états présentant des niveaux d'organisation distincts. Ainsi, la présente invention a pour objet une cellule pour la présentation d'un acide nucléique comprenant : - un support substantiellement plan à l'échelle atomique, - une protéine III présentant une structure tridimensionnelle univoque (organisation spatiale stable et définie), un acide nucléique IV lié à ladite protéine III, l'ensemble acide nucléique-protéine étant mobile latéralement par rapport audit support, de telle sorte que l'hybridation d'un acide nucléique cible audit acide nucléique IV ou le changement de conformation dudit acide nucléique IV soit détectable ou détectée par la réorganisation géométrique de l'ensemble acide nucléique-protéine. Dans un cas préféré de la présente invention, ladite protéine III est choisie dans le groupe constitué des protéines ayant un centre rédox et des protéines présentant une propriété d'absorption optique anisotrope. La protéine III sera décrite plus en détail plus bas. Par cellule , on entend un sous-ensemble délimité latéralement de la surface se caractérisant par une homogénéité structurale et pouvant être reproduit en de nombreux exemplaires identiques ou variants sur le support inorganique. Une cellule peut en particulier être utilisée pour la détection d'un type spécifique d'acide nucléique (comme cela sera vu plus loin), différent de l'acide nucléique détecté par l'utilisation d'une autre cellule. Il est entendu que la présente invention se rapporte également à un support, présentant une pluralité de cellules selon la présente invention. Dans la présente demande, on pourra utiliser le terme Flotteur pour désigner l'ensemble constitué de la protéine mobile par rapport au support, reliée à l'oligonucléotide. L'oligonucléotide lié au Flotteur pourra être appelé Amorce dans la présente demande. On pourra aussi utiliser les abréviations suivantes dans la présente demande : DMPC : Dimyristoyl phosphatidyl choline DOGS : 1, 2 dioleoyl-sn-glycero-3 [ (N (5-amino-l-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl] DOPC : Dioleoyl phosphatidyl choline DPDPB : 1, 4-Di- [3'- (2'-pyridyIdithio) propionamido] butane DPPC : Dipalmitoyl phosphatidyl choline ADNdb : ADN double brin DTT : Di thiothreitol Hb5 (His) 4 : protéine de fusion cytochrome b5 humain-histidine 4 Hb5 (His) 4mut24 : mutant cystéine (position 24) de Hb5 (His) 4 IMAC : Chromatographie d'affinité par ion métallique OG : octyl glucopyranoside OM : octadecyl mercaptan RPS : résonance de plasmon de surface RU : unité de réponse SAM : monocouche auto-assemblée (Self assemblage monolayer) ADNsb : ADN simple brin Il est intéressant que l'oligonucléotide ne soit pas directement en contact avec le support, ce qui permet une présentation améliorée aux acides nucléiques cibles ou autres éléments interagissant et modifiant la conformation de l'amorce. Dans un cas particulier, l'ensemble protéine-acide nucléique est mobile par rapport au support, du fait que la protéine soit elle-même mobile dans une couche lipidique elle-même fixée sur le support. On utilise de préférence une bicouche lipidique. En bref, cet assemblage est constitué d'une membrane lipidique reconstituée sur une surface plane de nature inorganique. On parle alors de membrane lipidique supportée. Un tel modèle possède des propriétés voisines des membranes biologiques en terme de compacité des éléments la constituant, de compartimentation, de fluidité des éléments constitutifs de ces modèles ainsi que de la plupart des molécules incorporées ou en interaction avec ce modèle (Heyse et al., 1998, Marchai et al., 1998). Cette propriété de dynamique membranaire est à l'origine de la mobilité latérale des structures proposées et de la réorganisation permettant la formation de domaine et de transduction de signal. De plus, on peut moduler à façon la composition moléculaire de cet édifice lipidique afin de modifier ses propriétés intrinsèques ou d'introduire de nouvelles potentialités. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une cellule pour la présentation d'un acide nucléique comprenant : un support substantiellement plan à l'échelle atomique, sur lequel est fixé - une monocouche hydrophobe 1, sur laquelle est présente une monocouche II comprenant des phospholipides, - une molécule de pontage présentant une extrémité hydrophobe de nature à interagir avec la monocouche II, et une extrémité chimiquement fonctionnalisée de façon à former une liaison stable avec une protéine III, une protéine III présentant une structure tridimensionnelle univoque, ladite protéine III étant mobile latéralement dans ladite couche II, un acide nucléique IV relié de manière univoque à ladite protéine III, de préférence par un bras moléculaire. Le fait que la protéine soit mobile dans la couche II (feuillet lipidique) assure une dynamique latérale c'est à dire une la possibilité pour l'ensemble flotteur + amorce de diffuser librement en deux dimensions en absence de contrainte géométrique supplémentaire qui serait imposée par l'interaction de l'amorce avec d'autres acides nucléiques. La fluidité membranaire permet la réorganisation et le contact de molécules indispensable pour l'auto-assemblage en superstructures. De surcroît, dans certains modes de réalisation, l'assemblage supramoléculaire ainsi réalisé est caractérisé par une forte modularité : chaque étape de réalisation ou de déstructuration de cet ensemble peut être réalisée de façon réversible par action contrôlée des solutés présents dans une phase aqueuse ou de l'action de conditions thermiques ou d'environnement électrostatique.. De façon à utiliser les propriétés très particulières de ces biostructures, le greffage d'acide nucléique simple brin sur la protéine a été effectué. De cette façon, les oligonucléotides sont greffés sur des blocs de nature protéique flottants sur la monocouche lipidique supérieure du modèle membranaire. Cette disposition offre les avantages suivant : - Mobilité latérale de l'ancre protéique flottante et par conséquent du ADNsb greffé. Suppression des interactions non spécifiques des ADNsb sur le support plan du fait d'un recouvrement lipidique approprié. - Contrôle de la densité des ADNsb présents à la surface du biocapteur (grande modularité) Dans certains modes de réalisation, réversibilité des différentes interactions supramoléculaires par procédures de traitements aqueux (permettant la régénération du biocapteur). Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui pourront être employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides naturels ou synthétiques, définissant un fragment ou une région d'un acide nucléique et pouvant correspondre aussi bien à un ADN ou un ARN simple, double ou triple brins. Ainsi, les séquences nucléiques selon l'invention englobent également les PNA (Peptid Nucleic Acid), ou analogues. Les liaisons entre les différentes bases peuvent être des liaisons phosphodiester classiques, ou des liaisons modifiées, telles les phosphorothioates, méthylphosphonates. Les oligonucléotides peuvent également être chimériques, c'est-à-dire présentant des liaisons et/ou bases différentes. Le terme englobe ainsi tout variant d'une séquence d'acide nucléique présentant une propriété de reconnaissance par hybridation. De préférence, l'acide nucléique lié à la protéine dans la cellule selon l'invention est un acide nucléique simple brin. Sa taille n'est pas un paramètre déterminant selon la présente invention, et peut être choisie aisément en utilisant les connaissances générales de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique est relié à ladite protéine par une liaison réversible. Cette liaison réversible peut d'ailleurs être covalente. Ainsi, il est possible de relier l'acide nucléique à la protéine de telle sorte que des liaisons disulfures soient impliquées, qui peuvent toutefois être réversées en présence d'agents appropriés, ou dans des conditions particulières. Ainsi, la liaison réversible peut-elle, dans ce cas particulier, être considérée comme un liaison pouvant être cassée facilement. Dans un mode de réalisation, l'acide nucléique est relié à ladite protéine par une liaison covalente. Une telle liaison est connue de l'homme du métier et peut notamment être réalisée en utilisant des bases modifiées dans l'oligonuclétide permettant le couplage à un bras chimique fonctionnalisé pour pouvoir être couplé à spécifiquement à la protéine du flotteur. Par ailleurs, la nature du greffage peut être de deux sortes : on peut effectuer un greffage connexe de façon à accoler intimement la molécule d'acide nucléique à la protéine ou un greffage par l'intermédiaire d'un bras moléculaire espaceur de façon à offrir une plus grande liberté confbrmationnelle de l'ADN vis à vis du flotteur. On utilise alors de façon préférée un bras espaceur attaché de manière univoque dans ladite protéine. En effet, ainsi qu'il sera développé plus loin, il est intéressant que la géométrie du flotteur soit parfaitement définie. Ainsi, il est préférable que le bras espaceur soit relié à la protéine à un site précis de celle-ci. Dans le mode de réalisation dans lequel on accole l'acide nucléique à la protéine, ledit bras espaceur peut alors être complexe métallique tel le cis-platine, le trans-platine, l'europium ou un autre métal de transition impliquant des ligands provenant de la structure même de l'acide nucléique et un ou des ligands provenant de la structure même de la protéine III du flotteur. Lorsque le bras espaceur est plus long, permettant une plus grande flexibilité de l'acide nucléique, on choisit de préférence un bras espaceur reliant une fonction thiol-ou amino-introduite sur l'acide nucléique, notamment par l'intermédiaire d'une base modifiée (le choix de la base pouvant être quelconque, c'est-à-dire que l'on peut choisir une base en 3', en 5'ou à l'intérieur de l'oligonucléotide, cette alternative pouvant présenter certains avantages, notamment d'offrir un degré de liberté supérieur à l'oligonucléotide), à une autre fonctionnalité présente, de préférence de manière unique, sur la protéine. De préférence, cette seconde fonction est également une fonction thiol, portée par exemple par une cystéine. Il existe toutefois d'autres types de greffages d'un acide nucléique à une protéine. On peut notamment le greffer sur une arginine dans la protéine. Il est toutefois préférable, pour respecter un principe de l'invention, que le couplage de l'acide nucléique à la protéine soit spécifique, parfaitement défini et univoque au niveau moléculaire. Ainsi, on exclut en général tout type de greffage aléatoire de l'acide nucléique sur la protéine pouvant faire naître une ambiguïté ou une hétérogénéité dans la structure des flotteurs selon la présente invention. Ainsi, de façon préférée, l'acide nucléique IV est relié à ladite protéine III par l'intermédiaire d'un composé choisi parmi : un bras espaceur reliant deux résidus identiques ou différents chimiquement réactifs de l'acide nucléique IV et de la protéine III, choisis dans le groupe constitué des thiols, des amines, des amides et des arginines. un complexe métallique tel le cis-platine, le trans-platine, l'europium, un complexe de nickel, de cuivre, ou de ruthenium coordonné d'une part à un résidu ou un groupe de résidus aminés de ladite protéine III et d'autre part à une ou plusieurs bases naturelles ou modifiées de l'acide nucléique IV, un complexe protéique covalent ou non covalent impliquant l'acide nucléque IV. La protéine dans la cellule selon la présent invention présente une géométrie détectable de façon univoque, c'est à dire une organisation spatiale stable et définie. Ceci signifie notamment que sa conformation dans la cellule selon la présente invention est identique quelle que soit la protéine observée, lorsque la cellule selon l'invention présente plusieurs flotteurs identiques. Ceci signifie également que la mise en présence de la cellule et d'acides nucléiques extérieurs capables d'interagir avec les amorces de façon univoque conduira à une organisation hautement répétitive au niveau spatial des flotteurs au sein de la cellule. En particulier les acides nucléiques externes pourront conduire à l'association de flotteurs en groupes organisés et ces groupes de flotteurs pourront grâce à leur mobilité latérale interagir entre eux de manière non covalente de façon à former au sein de chaque cellule un réseau de flotteurs hautement organisé au niveau bidimensionnel. Les propriétés (physique, électrique, optique, quantique) de ce réseau hautement organisé différeront alors des propriétés dynamiques de flotteurs désorganisés au sein de la cellule en absence d'interaction avec l'acide nucléique externe. De préférence, la protéine du flotteur sera choisie de façon à ce que les variations de l'organisation spatiale des flotteurs les uns par rapport aux autres conduise à un signal détectable par un procédé quelconque en particulier électrique, optique ou de résonance. Des protéines présentant cette propriété seront choisies préférentiellement dans le groupe constitué des protéines ayant un centre redox et/ou une propriété d'absorption optique anisotrope et/ou de fluorescence intrinsèque. On cite notamment les cytochromes et de façon plus préférée le cytochrome b5 humain, de levure, ou de toute autre origine, les flavodoxines, les ferridoxines, les azurines et autres protéines à cuivre bleu, les protéines multihémiques de la classe des cytochrome c bactériens qui possèdent à la fois un centre rédox et les propriété d'absorption optique anisotrope. Parmi les protéines fluorescentes on citera préférentiellement la protéine fluorescente verte (GFP) et ses analogues obtenus par mutagenèse ou évolution dirigée. Dans un cas préféré de mise en oeuvre, ladite protéine est hydrosoluble. Elle peut également avoir subi des modifications, dont certaines sont indiquées ci-après, pour autant que ces modifications conduisent à une protéine de structure tridimensionnelle stable et définie répondant aux critères tels que définis selon la présente invention. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, ladite protéine a subi une modification ayant permis l'introduction d'un site unique, dans ladite protéine, pour effectuer ladite liaison avec ledit acide nucléique. Le fait qu'un site unique soit introduit dans la protéine selon l'invention pour le greffage de l'acide nucléique permet ainsi de favoriser fortement l'unicité, la spécificité et la définition univoque de la liaison protéine-acide nucléique. Dans un cas particulier, ladite modification consiste en une mutation de ladite protéine pour ne laisser subsister ou n'introduire qu'un unique acide aminé prédéterminé. La mutation peut être introduite par mutation de l'acide nucléique codant pour la protéine, c'est la méthode la plus simple qui sera favorisée par l'homme du métier. Le site unique de greffage de l'acide nucléique sera alors cet unique acide aminé prédéterminé. En fonction de la séquence de la protéine que l'on a choisie pour mettre en oeuvre l'invention, il est en effet à la portée de l'homme du métier de déterminer les acides aminés à modifier, afin de n'en laisser subsister qu'un seul, ou d'en introduire un qui n'est pas présent dans la protéine native. Ainsi, et pour illustrer ce fait, lorsque la protéine que l'on utilise est un cytochrome b5, il est possible d'introduire une cystéine dans la protéine, dans la mesure où cet acide aminé est absent de la protéine native. Il est d'ailleurs toujours très intéressant de modifier la protéine de telle sorte qu'elle ne présente qu'une seule cystéine, ou pour le moins qu'elle présente une unique cystéine libre (non impliquée dans une liaison disulfure avec une autre cystéine). Il est également préférable, pour la bonne mise en oeuvre du procédé selon l'invention que la modification dans la protéine soit de telle sorte que cela facilite le greffage de l'acide nucléique, c'est-à-dire, que l'acide aminé utilisé pour ledit greffage soit situé à la périphérie (en surface) de ladite protéine. Il est à la portée de l'homme du métier, en fonction de la protéine choisie, de déterminer le meilleur emplacement pour l'introduction de la modification dans la protéine. Dans le cytochrome b5, on a ainsi exemplifié l'introduction de la cystéine par mutation de la sérine 24. Toutefois, des emplacements alternatifs auraient pu aisément être choisis. Ainsi d'après la structure tridimentionnelle d'un cytochrome b5 de mammifère autre que humain (ex. rat ou bovin), il est tout à fait possible de sélectionner les acides aminés à modifier de façon à n'introduire qu'une seule cystéine dans la séquence de la protéine. Par exemple, la représentation en trois dimensions permettra de cibler les acides aminés les plus périphériques de la protéine, c'est à dire ceux favorisant une meilleure réactivité avec l'acide nucléique modifié. De plus, il pourrait être d'un intérêt crucial de lier le ADNsb au voisinage du centre redox de la protéine : une mutation de la glycine 47 permettrait d'obtenir une telle connexion. Une des caractéristiques importantes de la présente invention est que la protéine III est mobile par rapport à la couche II de la cellule selon l'invention. Ceci assure aussi la mobilité de l'acide nucléique IV relié à la protéine III dans la cellule, par rapport au support selon l'invention. La mobilité de la protéine dans la couche II peut être obtenue de différentes façons, notamment lorsque ladite protéine présente une queue hydrophobe lui permettant d'être ancrée dans la couche II. Les séquences des queues hydrophobes sont connues dans la littérature, et il est à la portée de l'homme du métier de choisir une telle séquence et de modifier la protéine choisie par génie génétique afin d'introduire une telle séquence d'ancrage. Il est alors avantageux de choisir une queue hydrophobe qui soit courte, afin qu'elle s'ancre uniquement dans la couche II, sans pénétrer dans la couche I. Ceci permet notamment d'améliorer la mobilité de la protéine dans la couche II, en réduisant les phénomènes de frottement pouvant être observés si la queue hydrophobe est trop importante. L'optimisation de ces éléments reste à la portée de l'homme du métier. Dans un cas préféré, toutefois, ladite protéine est reliée à un phospholipide de la couche II, et dans un cas particulier à un phospholipide artificiel introduit de préférence en faible proportion (c'est-à-dire en proportion inférieure à 10 %, de préférence inférieure à 5 %, de façon plus préférée environ 2 %). En effet, la mobilité de la protéine par rapport à la couche II est alors similaire à la mobilité des phospholipides dans ladite couche. Une telle mobilité est en général plus importante que lorsque la protéine présente une queue hydrophobe. Ceci permet d'améliorer les performances de la cellule selon l'invention, ainsi qu'il sera vu. L'homme du métier a plusieurs méthodes à sa disposition, pour réaliser une liaison protéine-phospholipide. On peut notamment citer, parmi les liaisons covalentes, l'acylation, la farnésylation, l'utilisation d'une séquence d'ancrage GPI (glycosylphosphatidylinositol) ou l'incorporation d'un phospholipide ou d'un acide gras à un résidu spécifique de la protéine III par un procédé artificiel quelconque. Il peut toutefois être préférable d'avoir une liaison réversible, c'est à dire pouvant être rompue en présence de réactifs ou dans des conditions particulières, mais stable dans les conditions ou en présence des réactifs usuels de travail (hybridation d'acides nucléiques, étude de liaison entre éléments biologiques...). De façon générale, l'homme du métier peut utiliser toutes les méthodes connues permettant de relier une protéine à un liposome par exemple, dans la mesure où les liposomes sont généralement constitués de phospholipides. Ainsi, on peut notamment utiliser un bras capable de lier un chélate métallique d'un côté et un acide aminé de l'autre, en utilisant, dans la couche II, un phospholipide modifié, ledit phospholipide présentant une zone de fixation d'un chélate. Ainsi, un phospholipide préféré selon l'invention est le DOGS ou 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3 (N (5-amino-l-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl)]. Ce phospholipide est un phospholipide synthétique possédant un résidu iminodiacétate complexant un cation divalent nickel. Afin de favoriser la mobilité de la protéine dans la couche II, il est intéressant de choisir les phospholipides de ladite couche II afin qu'ils présentent des queues hydrophobes choisies de telle sorte que ladite couche n'est pas à l'état cristallin, mais à l'état fluide à température d'utilisation. Ces propriétés de fluidité d'une couche de phospholipides sont connues de l'homme du métier, et il existe notamment des diagrammes permettant de choisir la longueur de chaîne et l'insaturation pour obtenir la fluidité à la température d'utilisation (Gulik-Krzywicki et al., 1967). Cette température d'utilisation dépend évidemment de l'usage que l'on désire faire du capteur. Ainsi, lorsque l'on recherche une hybridation, la température d'utilisation peut être différente de celle utilisée lorsque l'on étudie la liaison d'une protéine à un acide nucléique. D'autre part, la transition entre des états fluide et gel peut être stratégique dans le cadre d'une technique de détection basée sur l'imagerie des superstructures comme la microscopie à force atomique (AFM). En fonction de la température d'utilisation, l'homme du métier recherchera les phospholipides les plus adaptés pour la couche II. En règle générale, et afin de simplifier et d'améliorer les potentialités du biocapteur, on recherche la fluidité de la couche II à température ambiante. Ainsi, on choisit de façon préférée des phospholipides présentant des queues hydrophobes ayant une longueur de chaîne supérieure ou égale à 14 atomes de carbone, ladite chaîne présentant éventuellement des insaturations, de telle sorte que ladite couche II est à l'état fluide à température d'utilisation. Il est intéressant de noter, par exemple, que des éléments en C14 sont généralement fluides à une température supérieure à 23 oC, alors que les C 6 ne le sont qu'à partir de 37OC, et les C18 au dessus de 50-55OC. Toutefois, l'utilisation de queues en CI 8, mais présentant des insaturations, permet de diminuer la température de transition de phase (état cristallin-état fluide). Néanmoins, pour certaines applications ou modes de détection, il pourra être préféré que la couche II ne soit pas fluide à température ambiante mais seulement à des températures plus élevées. En particulier ce mode sera préféré si l'on désire mémoriser l'état d'organisation des flotteurs, en utilisant l'abaissement de température pour figer la structure après une phase d'organisation à plus haute température. Ceci sera en particulier le cas si la technique de détection (microscopie de champs proche par exemple), ou les conditions d'analyse (déshydratation par exemple) risque d'altérer la structure. Les phospholipides non modifiés de la couche II ne présentent pas de caractéristiques particulières outre les propriétés de mobilité déjà décrites, toutefois, il est préférable qu'ils présentent des têtes polaires, choisies dans le groupe constitué des têtes polaires neutres ne portant pas de charges, neutres globalement portant des charges opposées (zwitterioniques), ou portant une charge globale négative. Le choix de la charge portée par les phospholipides peut s'avérer intéressant, notamment pour réduire les phénomènes d'absorption non spécifique des acides nucléiques tests sur la couche, qui sont diminués lorsque la charge des têtes de phospholipides est négative. L'utilisation de têtes neutres (soit non chargées soit portant plusieurs charges opposées) est aussi envisagée. La couche II est assemblée sur la couche I, de façon classique, par les interactions existant entre deux éléments hydrophobes dans un milieu aqueux. On peut donc parler de couche auto-assemblée. Néanmoins, dans certain cas un catalyseur adapté appelé agent fusogène sera utilisé pour faciliter cette fusion. Ainsi de tels agents comme les cations Ca++, le polymère d'éthylène glycol (PEG), les détergents seront utilisés selon des protocoles connus de l'homme du métier. La couche I, quant à elle, comprend des éléments hydrophobes, présentant une longueur de chaîne d'environ 2 à 2,5 nm, par exemple comprise entre 12 et 20 atomes de carbone, de préférence entre 14 et 18 atomes de carbones. Il convient en effet de disposer d'une couche 1 qui soit particulièrement homogène. Par ailleurs, la longueur des chaînes des éléments de la couche 1 est préférentiellement suffisamment longue pour que la réunion des deux couches 1 et II forment une véritable bicouche. Les éléments de la couche 1 sont linéaires ou ramifiés et portent de façon optionnelle des insaturations. Il est important que cette couche 1 soit homogène, dans la mesure où elle sert de support pour le dépôt de la couche II. La couche 1 est reliée au support de la cellule selon l'invention de façon covalente, ou par des liaisons non-covalente fortes. Ce mode de liaison au support ne présente pas une grande importance pour la mise en oeuvre de l'invention. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, ladite couche 1 comprend des phospholipides liés audit support par l'intermédiaire de leurs têtes polaires. Dans un autre mode de réalisation, ladite couche 1 comprend des éléments hydrophobes liés audit support par l'intermédiaire d'une liaison covalente, par exemple une liaison alkyl-thiol ou une liaison alkyl-siloxanne, en fonction de la nature du support. Il peut être avantageux de disposer d'une liaison support-couche 1 qui soit covalente, afin de permettre une réutilisation facilitée de la cellule selon l'invention. En effet, lorsque l'acide nucléique est lié à la protéine, et la protéine est liée à la couche II par des liaisons réversibles, on peut facilement régénérer la cellule par action des éléments (ou des conditions) permettant la ruptures des liaisons acide nucléique-protéine et protéine-couche II, et supprimer la couche II par action d'un détergent approprié. On conçoit ainsi aisément qu'une liaison covalente non réversible entre la couche I et le support permette de reconstruire une cellule. Il est évident que si la couche 1 est liée au support par une liaison réversible, on peut recommencer à préparer la cellule, mais avec une étape supplémentaire. La réutilisation du support peut s'avérer très intéressante, dans la mesure où celui-ci doit posséder une quasi planéité au niveau atomique, et par ailleurs peut inclure tout ou partie du système de détection de l'état des cellules, ce qui peut poser certaines contraintes de fabrication et augmenter les coûts de production de la cellule selon l'invention. Ainsi, dans un mode de réalisation préférée, la planéité dudit support est telle que la différence de hauteur entre deux zones distantes de moins de 100 run est inférieure ou égale à 10 nm, de préférence inférieure ou égale à 3 nm, de façon plus préférée inférieure ou égale à 2 nm. On peut choisir différents matériaux pour fabriquer la base de la cellule selon l'invention, notamment un matériau choisi dans le groupe constitué du verre recouvert d'une couche d'or, du mica clivé, du silicium ou de tout autre matériau monocristallin. Le silicium monocristallin est un matériau très intéressant, dans la mesure où il est effectivement plan à l'échelle atomique, et qu'il peut aisément subir des microgravures, et des modifications chimiques variées, ce qui permet de fabriquer un support présentant une pluralité de cellules selon l'invention. Par ailleurs, le silicium présente des propriétés conductrices ou optiques qui peuvent s'avérer très intéressantes pour ce qui est de la détection des événements biologiques ayant lieu sur la cellule selon l'invention. Ainsi qu'il sera développé, la cellule selon l'invention peut comprendre plusieurs protéines identiques ou différentes, liées à des acides nucléiques identiques ou différents. Lorsque l'on utilise des amorces différentes, un acide nucléique cible complémentaire de deux Amorces, sera capable de lier les deux Flotteurs correspondants ce qui accentuera son interaction avec le support et amorcera un changement d'organisation spatiale des flotteurs au sein de la cellule. Ainsi, lorsque les liaisons acide nucléique IV-protéine III et protéine IIIcouche II sont réversibles, il est possible, par l'intermédiaire d'agents compétiteurs de l'interaction Flotteur-Support (Histidine, Imidazole, EDTA), de facilement différencier des degrés d'hybridation. Par ailleurs, l'aspect de réorganisation bidimentionnelles des nano-objets Flotteur et Amorce sur la surface plane membranaire, obtenu par la fluidité de la couche II, s'inscrit dans le domaine de l'auto-organisation de molécules biologiques et des phénomènes physico-chimiques qui découlent de ces mouvements collectifs. Ainsi à partir d'une répartition aléatoire des blocs proteine-acide nucléique, il est clair que l'action d'un effecteur (ex : molécule cible) engendrera une restructuration radicale en deux dimensions. Lorsque l'on utilise en particulier une cellule dans laquelle sont présentes deux (ou plus) amorces différentes, la présence dans l'échantillon cible d'un acide nucléique pouvant s'hybrider à ces différentes amorces et permettant le pontage desdits blocs doit conduire à un processus d'élongation (organisation monodimensionnelle) à la surface de la cellule. On passe donc, et c'est un des intérêts majeurs de l'invention, d'un système plus ou moins désordonné (aléatoire, ou avec un équilibre instable) à un système hautement ordonné, sous l'effet de la présence de l'acide nucléique cible dans l'échantillon testé. Par ailleurs cette organisation est extrêmement sensible à la conformation géométrique de l'acide nucléique et donc à tout facteur (mésappariement, fixation de protéines, agent chimiques) susceptible d'interagir avec la conformation ou la structure de l'acide nucléique. De même, lorsque l'on étudie la liaison d'une protéine ou d'un ligand quelconque à un acide nucléique (simple brin ou double brin) lié à la protéine ancrée dans la couche II, ou lorsque l'on étudie la liaison d'une molécule effectrice sur une protéine (du type facteur de transcription) liée à un acide nucléique, sur une cellule selon l'invention, on observe alors (du fait de l'arrivée de ces éléments), une modification de la structure (par exemple courbure de l'acide nucléique) et de l'équilibre du système qui peuvent alors être aisément observés par diverses méthodes capables de détecter le changement d'organisation de la cellule, et notamment par l'intermédiaire d'un système optique (absorbance, fluorescence), électrique, électronique, à résonance de plasmon de surface, de transfert d'énergie, de radiomarquage, de diffraction (optique, électronique, de rayons X, de neutron) ou de microscopie (optique directe ou fluorescence, électronique, champ proche, force atomique). Ce changement de phase désordre-ordre observé lorsqu'un événement se produit à l'échelle atomique ne peut être aisément détecté que lorsque la protéine sur la cellule selon l'invention possède ce qui a été nommé une géométrie détectable de façon univoque , et que l'acide nucléique y est attaché de manière univoque. Le principe de l'invention est donc la mobilité de la protéine ancrée dans la couche II, permettant une réorganisation du système et le fait que l'unité protéineacide nucléique soit univoque et non aléatoire, ce qui permet de détecter ladite réorganisation. Il est également envisagé que la présence d'une seule molécule d'acide nucléique cible dans l'échantillon testé permettra d'induire une réorganisation qui pourra alors être détectée. Un exemple de la réalisation d'un tel procédé serait de pré-organiser la cellule par un acide nucléique de même nature que celui à détecter mais présentant d'une part une plus faible affinité pour l'amorce que l'acide nucléique à tester (base modifiée, mésappariement), d'autre part dont la géométrie (taille, courbure) serait différente de l'acide nucléique à tester. L'échange d'un seul acide nucléique (molécule compétitrice externe) au sein d'une cellule pré-organisée conduira alors à un défaut structural local. Il est connu de l'homme du métier qu'un défaut unique au sein d'un réseau cristallin déstabilise l'ensemble du réseau. Si la taille de cellule est choisie de manière adaptée, il est raisonnable d'espérer que cet événement unique changera la stabilité de l'organisation de la cellule. Un tel changement de stabilité peut être testé en appliquant progressivement un facteur extérieur (chimique, température, potentiel électrique...) déstabilisateur jusqu'à désorganisation de la cellule. Ce principe ouvre la possibilité de détecter des événements moléculaires uniques et correspond à la sensibilité maximum théorique d'un détecteur. Cette sensibilité est un énorme avantage par rapport aux autres systèmes existant et largement répandus, qui demandent la présence d'un nombre important de molécules d'acides nucléiques dans l'échantillon pour être détectées. Par ailleurs un tel détecteur associé à une protéine réceptrice choisie de manière adéquate pour voir son interaction avec l'ADN modulée peut être à l'origine de détecteur moléculaire pour une variété infinie de molécules d'intérêt (notamment protéines, médicament, polluants). Il est également important de noter que l'on ne détecte pas l'hybridation en tant que telle, mais plutôt les changements induits dans la cellule selon l'invention. Ainsi, ceci implique que la cellule selon l'invention (ou le support présentant une pluralité de cellules) peut être utilisé pour la détection d'une cible dans un échantillon, sans qu'il soit nécessaire de marquer ou de manipuler outre mesure ledit échantillon. Ceci est encore un avantage important, puisque l'on peut ainsi détecter la présence d'ARNm sans avoir à le transformer d'abord en ADNc. Il faut noter que la conformation géométrique des ADNsb et ADNdb est si différente qu'elle se traduit par des propriétés physico-chimiques très distinctes. Ainsi, après hybridation, on peut détecter notamment cet effet par un changement dans la conductivité électronique de la cellule selon l'invention. Ceci est particulièrement facile lorsque la protéine selon l'invention possède également un centre rédox. On peut également détecter l'hybridation par résonance de plasmon de surface, ou par une méthode optique, qui est facilitée par la présence d'une protéine présentant une absorption optique anisotrope. Afin d'effectuer la détection simultanée de plusieurs cibles, l'invention concerne donc également un support présentant une pluralité de cellules selon l'invention. Les différentes cellules peuvent être séparées les une des autres par microgravure sur le support, ou par la présence entre deux cellules d'une couche hydrophobe constituée d'éléments ayant une longueur de chaîne différente (de préférence inférieure) de la longueur de chaînes des éléments de la couche I, par exemple inférieure ou égale à 5 atomes de carbone ( differential patterning Cheng et al., 2000). Ces éléments possédant une chaîne à bas nombre de carbones peuvent être déposés sur le support en utilisant les techniques de masquage communes en micro-électronique. Le support selon l'invention est avantageusement complété par la mise en place d'un système permettant la mesure du courant, de l'impédance ou du potentiel, permettant la détection des événements se passant sur chacune des cellules. Une autre alternative favorisée est que le support comporte une surface alternant des zones conductrices et réfléchissantes et des zones non conductrices et transparentes. Un tel réseau comportant des zones transparentes de taille nettement inférieure à la longueur d'onde de la lumière visible a été décrit comme ayant une fonction de transmission lumineuse en fonction de la longueur d'onde en forme de peigne (Ebbesen et al., 1998). Les propriétés de transmission optique d'une telle structure doivent être altéré par l'état des cellules voisines, ce qui fourni un moyen de lecture possible. On peut aussi envisager que le support selon l'invention comporte entre chaque cellule un dispositif optique intégré (couple laser-photodiode par exemple) capable de mesurer l'absorbance d'une cellule dans deux directions croisées et d'en déduire son état d'organisation (anisotropie) ou de désorganisation (isotropie). On peut envisager aussi préférentiellement une lecture de l'état d'organisation de chaque cellule par un dispositif de balayage optique laser sensible au changement de polarisation de la lumière. Un tel dispositif capable de lire des cellules de taille submicronique est couramment utilisé au niveau grand public dans les lecteurs de minidisque et les lecteurs de CDRom réinscriptibles. Dans un tel cas la variation de polarisation de la lumière réfléchie normalement assurée dans les disques magnéto-optiques par une réorganisation du réseau cristallin d'un sel de Terres Rares (europium, et autres composés de la même série de transition de la table de Mendeléeiv) par un champ magnétique et un chauffage laser, le serait dans le système décrit dans l'invention par la variation d'organisation spatiale dans la cellule de la protéine et ou de son cofacteur qui sont des objets optiquement actifs en terme de polarisation, d'ellipticité (absorption différentielle de lumière polarisée) et d'absorption optique. L'invention concerne aussi un procédé d'identification de la présence d'un acide nucléique test dans un échantillon, comprenant les étapes de : a) mettre ledit échantillon en contact avec une cellule selon l'invention, dans des conditions permettant l'hybridation dudit acide nucléique test à un acide nucléique relié à une protéine de ladite cellule, b) détecter l'hybridation dudit acide nucléique test audit acide nucléique relié à ladite protéine. La détection peut être effectuée par tout moyen cité ci-dessus. Si l'on a marqué l'échantillon test, la détection peut être effectuée en fonction dudit marquage. Toutefois, il peut être préféré de détecter la présence de l'acide nucléique cible par changement de conformation du système. Ainsi, la cellule selon l'invention permet la détection sans qu'il ait été besoin de marquer l'échantillon test. L'invention concerne aussi un procédé d'identification de la liaison d'une protéine à un acide nucléique et/ou de son activité sur la conformation dudit acide nucléique, comprenant les étapes de : a) mettre en contact ladite protéine avec un acide nucléique relié à une protéine, dans une cellule selon l'invention, b) détecter la liaison de ladite protéine audit acide nucléique et/ou son activité sur la conformation dudit acide nucléique. Ledit acide nucléique peut être simple brin, double brin ou triplex, lorsque l'on a déjà fixé un acide nucléique sur un des acides nucléiques (amorces) de la cellule. Il est clair que le choix de certaines bases pour l'amorce peut mener à la formation d'un acide nucléique triplex, ladite formation étant alors considérée, au sens de l'invention comme une hybridation. La détection peut encore être effectuée de plusieurs manière, et notamment par changement de conformation du système. L'invention concerne également un procédé d'identification de la liaison d'un ligand à une protéine attachée à un acide nucléique fixé à une protéine dans une cellule selon l'invention, comprenant les étapes de : a) mettre en contact ledit ligand avec ladite protéine, b) détecter la liaison dudit ligand à ladite protéine. Parmi les ligands et protéines envisagées, on effectue notamment les études pour identifier des molécules effectrices se liant sur des récepteurs nucléaires ou des facteurs de transcription. La liaison peut être directe ou indirecte, et impliquer par exemple la liaison du ligand à un récepteur qui va alors se fixer à une protéine ou un complexe protéique déjà associé à l'ADN de la cellule. La liaison du ligand à la protéine peut être observée notamment par changement de conformation du système. De façon générale, l'invention se rapporte à un procédé d'identification de la liaison d'un composé à un acide nucléique et/ou de son activité sur la conformation dudit acide nucléique, comprenant les étapes de : a) mettre en contact ledit composé avec un acide nucléique relié à une protéine, dans une cellule selon l'invention, b) détecter la liaison dudir composé audit acide nucléique et/ou son activité sur la conformation dudit acide nucléique. De même que précédemment, ledit acide nucléique peut être simple brin, double brin ou triplex, lorsque l'on a déjà fixé un acide nucléique sur un des acides nucléiques de la cellule. La liaison est détectée notamment par changement de conformation du système, ainsi qu'il a été expliqué plus haut. La détection de la géométrie ou de la perturbation de la géométrie des ensembles Flotteur-Amorce-Cible peut être avantageusement effectuée grâce à l'apport de technologies de microscopies de force atomique en environnement liquide. Ainsi, les applications potentielles de ce type de caractérisation portent sur l'étude de l'impact de l'interaction de toutes molécules ou macromolécules avec les acides nucléiques (régulation, facteurs de transcription, drogues, médicaments, notamment pour chimiothérapie...). Dans un cas particulier, le dispositif selon l'invention offre une contiguïté moléculaire et supramoléculaire impliquant une membrane lipidique, des protéines rédox et des acides nucléiques. Cet assemblage de biomolécules électro-et optoactives au sein de microsystèmes issu de la microélectronique peut s'avérer potentiellement de fort impact dans des domaines de transductions électroniques (conducteurs, semi-conducteurs, circuits biomoléculaires) et optiques non linéaires (anisotropie). De fait, l'ADN double brin, à la différence du ADNsb, possède des propriétés de transfert d'électron selon un processus de conduction électronique par recouvrement des orbitales Pi. De plus, la réaction d'hybridation entre deux molécules de ADNsb est très spécifique. Les systèmes actuels développés dans le cadre des composants électroniques à l'échelle du nanomètre se heurtent à différents problèmes dont : l'interconnexion des nano-objets entre eux la connexion des nanostructures à des électrodes macroscopiques. L'utilisation de processus de reconnaissance moléculaire et d'autoassemblages de molécules au sein de structures supramoléculaires, tels qu'envisagés au sein de la cellule selon la présente invention, pourraient permettre de circonvenir à ces difficultés. En effet, la cellule selon l'invention présente une architecture biomoléculaire originale qui se positionne dans le domaine des nano-bioingénieries, c'est à dire du développement de nouveaux types de nanostructures possédant des propriétés de : forte modularité, - haut degré d'organisation à l'échelle moléculaire, - transferts électroniques vectoriels, couplage avec des messagers chimiques. L'ADN possède les propriétés de reconnaissance moléculaire, mécanique pour être intégré dans des microcircuits. Cependant les propriétés électroniques intrinsèques de cette macromolécule semblent insuffisantes pour être utilisé directement (Braun et al., 1998). Un des axes de recherche les plus prometteurs dans l'utilisation de potentiel de transport de charges électriques le long du duplex d'ADN est représenté par l'utilisation de processus électrocatalytiques (Boon et al., 2000). Un tel dispositif de transduction du signal peut tout à fait être intégré dans le dispositif selon l'invention grâce à l'utilisation de molécules rédox additionnelles. Cependant, dans un dispositif préféré selon l'invention, la présence des Flotteurs composés de protéines rédox possédant des groupes électroactifs et/ou des potentiels d'oxydoréduction différents et modulables permet d'assurer un environnement électronique dense en terme de recouvrement des orbitales électroniques. En fonction de la périodicité et de l'organisation bidimentionnelle de ces macromolécules rédox (considérées alors comme des centres relais), une telle structure pourrait être à l'origine, d'un dopage électronique des ADN, à des sauts d'électrons entre protéines ou à des processus de transfert d'énergie. Ainsi, une cellule selon l'invention peut avoir d'autres modes d'utilisation que les simples procédés de détection qui ont été cités ci-dessus. L'invention concerne également un procédé de préparation d'une cellule selon l'invention comprenant l'étape de : mise en place, sur un support substantiellement plan à l'échelle atomique, d'une protéine III présentant une structure tridimensionnelle univoque (organisation spatiale stable et définie), liée à un acide nucléique IV, de telle sorte que l'ensemble acide nucléique-protéine soit mobile latéralement par rapport audit support, afin que l'hybridation d'un acide nucléique cible audit acide nucléique IV ou le changement de conformation dudit acide nucléique IV soit détectable par la réorganisation géométrique de l'ensemble acide nucléiqueprotéine. L'invention concerne également un procédé de préparation d'une cellule selon l'invention comprenant les étapes de : - fixation d'une monocouche hydrophobe 1 sur un support substantiellement plan à l'échelle atomique, - assemblage sur ladite monocouche 1 d'une monocouche II comprenant des phospholipides, - mise en place d'une protéine III présentant une structure tridimensionnelle univoque, ladite protéine III étant mobile latéralement dans ladite couche II, par l'intermédiaire d'une molécule de pontage présentant une extrémité hydrophobe de nature à interagir avec la monocouche II, et une extrémité chimiquement fonctionnalisée de façon à former une liaison stable avec une protéine III, ladite protéine III étant reliée de manière univoque à un acide nucléique IV, de préférence par un bras moléculaire. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Construction de la bicouche hybride et caractérisation par analyse résonance de plasmon de surface. A : le signal enregistré correspond à la ligne de base du support métallique recouvert d'une monocouche dense d'OM dans l'environnement du tampon de travail (classiquement tampon phosphate, 50mM, pH7.5). B : La variation de signal correspond à l'injection dans le circuit fluidique d'une solution vésiculaire mixte DMPC-DOGS fabriquée dans l'eau. L'augmentation du signal correspond à une cinétique de fusion des vésicules sur le support de façon à obtenir une monocouche lipidique compacte. Ainsi, après 20- 40min d'injection, le retour au tampon de travail permet d'estimer la quantité de lipides assemblés à 1700 +/-300RU. Cette valeur, selon les différents modes de calibrage proposé par BIAcore, correspond à celui d'une hémimembrane lipidique. C : Une procédure de traitement de la membrane par une solution de soude 20mM permet d'éliminer l'excédant de lipides adsorbés sur la structure. D : Contrôle de l'homogénéité de la membrane lipidique par injection de protéine hydrosoluble (ex. Cytochrome c, BSA...). Figure 2 : Mise en évidence d'une association spécifique de Hb5 (His) 4 sur la bicouche hybride fonctionnalisée par des cations nickel chélateur Caractérisation par RPS A : Trois injections successives (représentées par des flèches) de la forme cytochrome b5 poly-histidines sont effectuées au voisinage de la bicouche lipidique fonctionnalisée. Classiquement la solution protéique, de concentration égale à 1 uM dans du tampon phosphate 50mM, pH7, est injectée sous un flux de 10) il/min pendant 180 secondes. Les différentes injections conduisent à une saturation progressive de la surface. Le maximum de recouvrement est de l'ordre de 650 +/- 50 RU soit un taux de recouvrement surfacique de 7pmole. cm-2. B : Afin de montrer la grande spécificité de l'interaction, des injections d'une solution d'histidine Img/ml dans du tampon phosphate 50mM sont effectuées (ex : Quatre injections symbolisées par les flèches). L'injection d'un agent compétiteur de la chélation entre le segment poly histidine de Hb5 (His) 4 et la membrane. Chaque injection (flux lOul/min pendant 120 secondes) est accompagnée d'une baisse de signal c'est à dire de la quantité de protéines en interaction avec la membrane. Ainsi la régénération complète de la structure est obtenue après quelques minutes de temps de contact. Figure 3 : Schéma du biocapteur membranaire, construction/régénération de l'assemblage supramoléculaire Construction : Une surface inorganique (ex : or) est fonctionnalisée par une monocouche dense d'octadecyl mercaptan. Cette surface est propice à la fusion de vésicules lipidiques (liposomes) jusqu'à l'obtention d'une monocouche dense de phospholipides au dessus du support. La présence de 10% (mol/mol) de phospholipides modifiés permet l'ancrage de cytochromes b5 de façon à l'obtention d'une monocouche dense de protéines. Régénération : Des injections d'agents compétiteurs de l'affinité par ions métalliques comme une solution d'histidine (Img/ml) permettent le décrochage de l'intégralité de Hb5 (His) 4 interagissant de façon spécifique avec le support. De la même manière l'hémimembrane lipidique reconstituée sur le support inorganique fonctionnalisé peut être régénéré grâce à l'utilisation d'une solution de détergent comme l'octyl glucoside ou OG (40mM dans H20). Ainsi l'intégralité des phases de construction et de déstructuration peut être réalisée de façon contrôlée par l'emploi de solution aqueuse préservant l'intégrité des molécules biologiques. Figure 4 : Caractérisation du complexe b5-cis-Pt-ADNsb, Gel SDS de Polyacrylamide (15%) de Hb5 (His) 4 platiné et couplé avec un oligonucléotide de séquence CTATCATTTGCTTACTATTC (SEQ ID NI 13) Fig. 4. A : Autoradiogramme d'un gel dans lequel a été injecté le Hb5 (His) 4cisPt (puits 1) ; l'oligonucléotide radiomarqué au 32p (puits 2) et le complexe b5cis-Pt-ADNsb (puits 3) permet de mettre en évidence l'apparition d'un signal de radioactivité supplémentaire dans le puits 3 par rapport au puits 2. Fig. 4. B : Utilisation d'un gel de polyacrylamide (15%) en conditions dénaturantes (SDS). Caractérisation croisée du complexe b5-cis-Pt-ADNsb : ledit complexe injecté en piste 3 présente une bande qui permet de confirmer l'existence d'une population dont le poids moléculaire est proche de 20000 Dalton soit le poids moléculaire théorique. Puits (1) : b5 platiné avec cis-Pt[ (NH3) 2 (H2O) 2] 2+. Puits (2) : ADN 20 mère radiomarqué (ADN*). Puits (3) : b5 platiné lié à l'ADN* 20-mère Figure 5 : Caractérisation spectrale du complexe Hb5 (His) 4CTATCATTTGCTTACTATTC via un pontage cis-Pt [ (NH3) 2 (H20) 2] Deux procédures de reconstitutions du complexe Hb5 (his) 4-cisPt-ADNsb sont caractérisés par spectrophotomètrie dans une fenêtre 240-600nm. Le cytochrome b5 possède un maximum d'absorption à 412nm alors que le ADNsb a un maximum à 260nm. Le profil spectral de deux échantillons ainsi que la quantification relative de chaque espèce grâce aux coefficients d'extinction molaire permet de mettre en évidence : spectre rouge : une fraction molaire Hb5 (His) 4/ADNsb=3/1 spectre bleu : une fraction molaire Hb5 (His) 4/ADNsb=l/l La procédure permettant la caractérisation représentée par le spectre d'absorption bleu permet d'obtenir un couplage équimolaire. Figure 6 : Détermination des température de fusion du 20-mer ADN et du 20mer ADN ponté avec Hb5 (His) 4 platiné. Les déterminations des températures de fusion ont été effectuées par mesures spectrales d'hyperchromicité après fusion du brin complémentaire à haute température (80 C). Une décroissance par pallier de 10C pennet de suivre spectralement l'évolution du ADNdb. . Les résultats d'absorption en fonction de la température pour le ADNsb libre permet d'obtenir une courbe dont le point d'inflexion correspond à la température de fusion. La Tm pour le ADNsb est évaluée à 45OC. . La même caractérisation sur le ADNsb couplé à Hb5 (His) 4 donne un profil modifié dont la Tm a été estimée à 23OC. Figure 7 : Séparation des espèces protéiques et du complexe cytochrome b5ADNsb via un pont DPDPB par chromatographie. Caractérisation par spectrophotomètrie 240-450nm Les différentes populations issues de l'incubation (4H à 30 C) de ADNsbDPDPB avec Hb5 (His) 4mut24 sont chargées sur colonne DEAE. Les différentes espèces sont ensuite éluées par l'intermédiaire d'une solution de tampon phosphate 25mM et d'un gradient croissant de NaCl. Le cytochrome b5 possède un maximum d'absorption à 412nm alors que le ADNsb a un maximum à 260nm. Le gradient de NaCI permet l'élution graduelle de toutes les populations : ' [NaCl] La quantification molaire des espèces isolée après séparation sur DEAE est représentée sous la forme d'histogramme : . les populations 1 et 2 de Hb5 (His) 4mut24 caractérisées en figure 7 ne présentent aucune composante ADNsb mesurée à 260nm. Ces deux populations correspondent à la forme monomèrique (n'ayant pas réagit au cours de l'incubation) et à la forme dimérique (résultant d'un pont cystine entre deux protéines). . La population 3 présente un complexe équimolaire Hb5 (his) 4mut24- ADNsb. Figure 9 : Détection par résonance de plasmon de surface de la cinétique d'association d'un ADNsb complémentaire du ADNsb amorce en interaction avec le biocapteur A partir d'un signal b5-Wl voisin de 250RU, différentes injections de ADNsb ont été effectuées, à une densité de b5-ADNsb égale à 1 pmol. cm-2 : Ainsi le brin ADNsb complémentaire de Wl a été injecté au voisinage du biocapteur (lul/min pendant 10min) pour deux concentrations en NaCI. A une concentration de NaCl 150mM, un signal d'hybridation est observée dans une gamme de complexation correspondant à 100% des assemblages b5ADNsb en interaction avec la membrane. Le même oligonucléotide injecté à faible concentration en NaCI (25mM) montre une hybridation très restreinte vis à vis du biocapteur. FigurelO : Schéma de l'assemblage comme biocapteur à ADNLa flèche représente le flux de biomolécules de l'échantillon test. Figure 11 : Schéma de l'assemblage comme nanostructures douées de propriétés dynamiques et conformationnelles Un jeu de différents blocs Flottant peut être présenté à la surface du biocapteur, l'injection d'un oligonucléotide potentiellement s'hybridant sur une partie des blocs Flottant doit permettre un pontage inter-bloc. Le caractère de mobilité latérale des éléments doit favoriser ce processus jusqu'à l'obtention de phénomènes de réorganisation supramoléculaires à la surface de la cellule. Les exemples qui suivent se rapportent à un cas particulier de l'invention, mais ne doivent pas être considérés comme limitant l'invention. EXEMPLES Exemple 1 : Réalisation de la bicouche hybride 1.1) Fonctionnalisation du support Le support solide utilisé est constitué d'une lame de verre recouverte d'un film d'or commercialisé par la société BIAcore sous le nom de puce JI. De tels supports ont été également fabriqués par les inventeurs. Ils consistent en l'utilisation de lamelles de verre planées (épaisseur 0. 4mm, 22*10mm, Prolabo) subissant successivement une vaporisation de 2.6nm de chrome puis une vaporisation de 48nm d'or sous un vide de 2. 1 06mm de Hg. On procède ensuite à un recouvrement de l'interface métallique par autoassemblage de molécules d'octadécyl mercaptan ou OM de chez Aldrich. La solution d'OM est utilisée à ImM dans un mélange éthanol/eau 4/1 (v/v). Après deux heures d'incubation, les lames sont lavées au chloroforme, au méthanol puis à l'eau et sont séchées sous flux d'azote. Le résultat est la reconstitution sur l'or d'une monocouche dense hautement organisée conférant au support de très fortes propriétés hydrophobes. Ce premier assemblage a été caractérisé de nombreuses fois dans la littérature. Des mesures d'angle de contact permettent de vérifier en routine la compacité de la monocouche ainsi reconstituée. 1.2) Fabrication des vésicules lipidiques 1. 2. 1) Méthode sonication/extrusion La méthode utilisée pour préparer les liposomes est basée sur une double procédure sonication/extrusion. Les phospholipides dimyristoyl et/ou dipalmitoyl phosphatidyl choline de chez Sigma constituants principaux des vésicules sont solubilisés dans une solution organique de chloroforme. Un film lipidique est ensuite déposé dans des tubes en verre à scintillation par évaporation du chloroforme sous flux d'azote. Ce film est re-suspendu dans une solution aqueuse (d'eau ultra pure ou tamponnée) à une concentration finale de ImM. Cette mixture est ensuite soniquée : - dans un bain à ultrason (Transsonic 310 de chez Fisher-Scientific) à puissance maximale pendant 20min, puis par un désintégrateur ultrasonique (Vibra-Cell de chez Bioblock) par pulses de 2min, avec 50% de cycle actif pour une puissance de sortie de 4. La procédure est stoppée lorsque la solution est devenue translucide, c'est à dire classiquement après 6 à 10 min de temps cumulés de sonication. La dernière étape de fabrication consiste en l'extrusion à travers une membrane de polycarbonate (Avestin, diamètre de 19mm et de diamètre de pore 50nm ou 10Onm) dans un appareil Liposofaste basic, Avestin, Inc. 1. 2.2) Méthode vortex/extrusion Une seconde procédure est utilisée dans le cas de l'utilisation de molécules sensibles aux perturbations ultrasoniques comme les chaînes hydrocarbonées de certains phospholipides présentant des poly-insaturations (ex : 1, 2 dioleoyl-snglycero-3[ (N (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl] ou DOGS de chez Aventi Polar Lipids, Dioleoyl phosphatidyl choline ou DOPC de chez Sigma). Dans ce cas, une procédure identique à 1. 2. 1 de solubilisation dans CECI3 puis de construction d'un film lipidique sur verre est appliquée. La procédure diffère ensuite par resuspension des phospholipides en solution aqueuse à ImM par une étape de vortex, 5min à la vitesse maximale. Cette étape est suivie d'une phase d'extrusion à travers une membrane de polycarbonate de diamètre de pore 50nm dans un appareil Liposofaste de chez AVESTIN. 1.3) Reconstitution de la monocouche lipidique Le support hydrophobe servant de matrice pour générer la monocouche lipidique, subit une procédure de traitement comme suit : afin d'améliorer la mouillabilité de la structure, une solution d'éthanol/eau (1/1 vol) est injectée sur le support et est suivie d'étapes de rinçage à l'eau et à des solution tamponnées. Afin de nettoyer l'interface, l'injection d'une solution de détergent, l'octyl glucopyranoside de chez Sigma, de concentration 40mM. Immédiatement après, les vésicules lipidiques confectionnées sont injectées au contact de la surface métallique fonctionnalisée. Spontanément, selon un processus de fusion de liposomes établi par Kalb et al. (1992), les vésicules fusionnent au contact de la monocouche hydrophobe d'OM. Après 30 à 60min, ce processus conduit à la formation d'une monocouche lipidique recouvrant totalement la monocouche d'OM. L'assemblage moléculaire ainsi obtenu présente un substrat de nature métallique recouvert de façon covalente d'un premier feuillet alkylé sur lequel est assemblé un feuillet fluide et dynamique de molécules amphiphiles. Les expériences de caractérisation utilisent la technologie BIAcore par l'intermédiaire des appareils BIAcore 1000 et BIAcore X. Les résultats de fusion de liposomes sont obtenus sous la forme d'un sensorgramme (figure 1). A l'injection des vésicules, une phase d'association avec le support est observée conduisant à un plateau après 20-30 de temps de contact. A l'arrêt de l'injection et donc au retour du tampon de travail, une première quantité de matériel lipidique est évaluée. Une procédure de nettoyage de la surface à l'hydroxyde de sodium 20mM permet d'éliminer toutes les vésicules imparfaitement fusionnées à la surface du biocapteur. Classiquement le signal obtenu est compris entre 1400 et 2000 RU, ce qui est conforme avec les résultats disponibles dans la littérature et les mode de calibrage fournis par le fabriquant. Une injection de protéines solubles au voisinage de cette membrane supportée permet de valider l'absence de défaut de la monocouche lipidique supérieure. L'introduction dans les liposomes de phospholipides synthétiques DOGS à raison de 10% mol/mol confère à cette monocouche des propriétés de complexation de capteur de protéinesTagHis. Exemple 2 : Construction, expression et purification des protéines de fusion 2.1) Les protéines hydrosolubles avec un Tag histidine La protéine initiale utilisée dans le cadre de cet exemple est une hémoprotéine membranaire : le cytochrome b5 humain ou de levure. C'est une protéine bitopique possédant un grand domaine hydrosoluble globulaire contenant l'hème et un petit domaine hydrophobe permettant l'ancrage aux membranes microsomales. Toutes les séquences nucléotidiques et en acides aminés sont regroupées dans la liste de séquences. La séquence en acides aminés des formes humaine et de levure sont dénommées comme suit : Séquence en acides aminés du cytochrome b5 humain membranaire (SEQ ID ? 1) 1 MLAEQSDEAV KYYTLEEIQK HNHSKSTWLI LHHKVYDLTK FLEEHPGGEE VLREQAGGDA 61 TENFEDVGHS TDAREMSKTF IIGELHPDDR PKLNKPPETL ITTIDSSSSW WTNWVIPAIS 121 AVAVALMYRL YMAED Séquence en acides aminés du cytochrome b5 de levure membranaire (SEQ ID NO 2) 1 MPKVYSYQEV AEHNGPQNFW IIIDDKVYDV SQFKDEHPGG DEIIMDLGGQ DATESFVDIG 61 HSDEALRLLK GLYIGDVDKT SERVSVEKVS TSENQSKGSG TLVVILAILM LGVAYYLLNE Le premier travail de modification des séquences du cytochrome b5 a consisté en l'ablation du coté carboxy terminal des acides aminés impliqués dans l'insertion membranaire pour les remplacer par quatre histidines. Cette protéine chimère ou fusion est obtenue par clonage de la séquence nucléotidique par polymerase chain reaction (PCR). Le kit de clonage utilisé est le TOPO TA cloning&commat; de chez Invitrogen. La séquence ADN codante pour la protéine chimère est introduite dans un vecteur 8 pCR&commat;2. 1-TOPO'. L'ensemble a été amplifié dans les cellules Vial of One Shot. La séquence ADN codante a ensuite été transférée dans le vecteur d'expression PUHE25-2 (clonage Spahi pour l'ATG et Bam HI pour le stop). La modification en base pour Hb5 est donc la suivante : Séquence nucléotidique de Hb5 membranaire (SEQ ID NO 3) 1 ATGGCAGAGC AGTCGGACGA GGCCGTGAAG TACTACACCC TAGAGGAGAT TCAGAAGCAC 61 AACCACAGCA AGAGCACCTG GCTGATCCTG CACCACAAGG TGTACGATTT GACCAAATTT 121 CTGGAAGAGC ATCCTGGTGG GGAAGAAGTT TTAAGGGAAC AAGCTGGAGG TGACGCTACT 181 GAGAACTTTG AGGATGTCGG GCACTCTACA GATGCCAGGG AAATGTCCAA AACATTCATC 241 ATTGGGGAGC TCCATCCAGA TGACAGACCA AAGTTAAACA AGCCTCCGGA AACTCTTATC 301 ACTACTATTG ATTCTAGTTC CAGTTGGTGG ACCAACTGGG TGATCCCTGC CATCTCTGCA 361 GTGGCCGTCG CCTTGATGTA TCGCCTATAC ATGGCAGAGG ACTGA Séquence nucléotidique de Hb5 soluble tag histidine rHb5- (His) 41 (SEO ID NO 4) 1 ATGGCAGAGC AGTCGGACGA GGCCGTGAAG TACTACACCC TAGAGGAGAT TCAGAAGCAC 61 AACCACAGCA AGAGCACCTG GCTGATCCTG CACCACAAGG TGTACGATTT GACCAAATTT 121 CTGGAAGAGC ATCCTGGTGG GGAAGAAGTT TTAAGGGAAC AAGCTGGAGG TGACGCTACT 181 GAGAACTTTG AGGATGTCGG GCACTCTACA GATGCCAGGG AAATGTCCAG AACATTCATC 241 ATTGGGGAGC TCCATCCAGA TGACAGACCA AAGTTAAACA AGCCTCCGGA AACTCTTATC 301 ACTACTATTG ATTCTAGTTC CAGTAACGGA CATCACCACC ATTAA Séquence en acides aminés de rHb5- (His) 41 (SEQ ID NO 5) 1 MLAEQSDEAV KYYTLEEIQK HNHSKSTWLI LHHKVYDLTK FLEEHPGGEE VLREQAGGDA 61 TENFEDVGHS TDAREMSRTF IIGELHPDDR PKLNKPPETL ITTIDSSSSN GHHHH 2. 2) La protéine hydrosoluble Tag histidine mutée Ser24-Cys La protéine chimère obtenue précédemment est ensuite mutée afin de faire apparaître à la périphérie de la protéine un groupement thiol par l'intermédiaire d'un résidu cystéine. Cette modification est réalisée grâce à une mutagenèse dirigée sur la sérine n024 de Hb5 (His) 4. Le kit de mutagenèse utilisé est le QuikChange site-directed Mutagenesis Kit de chez Stratagene. L'action de la ADN plu polymérase permet de reconstituer le vecteur d'expression et la séquence à muter. Des bactéries épicurian XLI-blue supercompétentes sont transformées par ce plasmide. Plusieurs localisations différentes de la mutation ont été essayées et il est exemplifié en particulier la position 24 soit une modification du résidu sérine en cystéine. La mutation a été vérifiée par séquençage au laboratoire (ABI séquenceur) : Séquence nucléotidioue de Hb5- (His) 4mut24 (SEQ ID NO 6) 1 ATGGCAGAGC AGTCGGACGA GGCCGTGAAG TACTACACCC TAGAGGAGAT TCAGAAGCAC 61 AACCACTGCA AGAGCACCTG GCTGATCCTG CACCACAAGG TGTACGATTT GACCAAATTT 121 CTGGAAGAGC ATCCTGGTGG GGAAGAAGTT TTAAGGGAAC AAGCTGGAGG TGACGCTACT 181 GAGAACTTTG AGGATGTCGG GCACTCTACA GATGCCAGGG AAATGTCCAG AACATTCATC 241 ATTGGGGAGC TCCATCCAGA TGACAGACCA AAGTTAAACA AGCCTCCGGA AACTCTTATC 301 ACTACTATTG ATTCTAGTTC CAGTAACGGA CATCACCACC ATTAA Séquence en acides aminés de Hb5- (His) 4 mut24 (SEQ ID NO 7) 1 MLAEQSDEAV KYYTLEEIQK HNHCKSTWLI LHHKVYDLTK FLEEHPGGEE VLREQAGGDA 61 TENFEDVGHS TDAREMSRTF IIGELHPDDR PKLNKPPETL ITTIDSSSSN GHHHH 2. 3) Expression des protéines chez Escliericiiia Coli La souche d'expression bactérienne est XL 1-lue. Une préculture (6h à 37 C dans 50ml de milieu) d'un clone dans un milieu Luria-Bertami (LB) en présence d'un marqueur de sélection, l'ampicilline, a permis d'ensemencer à raison de 1/1O0ème un litre de milieu Terrifie Broth supplémenté avec 10Omgll d'ampicilline. La culture est placée à température ambiante sous agitation pendant 48h puis la surexpression de protéine est induite par ajout d'Isopropyl ss-D-ThioGalacto Pyranoside (IPTG) à raison de 0. 5mM final. 2.4) Purification des protéines Les bactéries sont centrifugées après 24-48h d'induction et sont congelées. Un cycle congélation/décongélation est suivi d'une étape de lyse/fractionnement (lysozyme, acide cholique et desintégrateur ultrasonique). La procédure de purification par chromatographie par ion métallique (IMAC) est définie comme suit : Un gel d'agarose fonctionnalisé par de l'acide iminodiacétique (Sigma) est préalablement chargé (flux lml/min) en Nickel par chargement d'une solution de Chlorure de Nickel 50mM solubilisé dans un tampon acétate, pH5.4. la colonne est lavée par ce même tampon au même flux puis nous procédons à un remplacement de l'acétate par un tampon phosphate sodium, 50mM, pH 7. Le fractionnement cellulaire est directement injecté sur colonne de gel d'agarose à 5ml/min. Spécifiquement les protéines chimères sont retenues sur la colonne selon la technique IMAC. La colonne subit une phase de lavage au tampon phosphate de concentration croissante 50 à 250mM, pH7 jusqu'à ce que la solution passante ne présente plus de spectre d'absorption dans l'ultraviolet (240-300nm). L'échantillon protéique est élué lors de pulses d'histines en solution de concentration lmg/ml dans le tampon phosphate 50mM, pH 7. Des expériences similaires ont été réalisées sur la forme levure du cytochrome b5. Ainsi il est possible d'obtenir plusieurs protéines chimères mutantes humaines et levure de fort degré de pureté et à raison de plusieurs milligrammes de protéine. Exemple 3 : Réalisation de l'ancrage protéique flottant La structure de bicouche hybride présentée paragraphe 1. 3 a été fonctionnalisée dans le but de conférer au modèle des propriétés d'affinités par ions métalliques. Pour ce faire, un phospholipide synthétique possédant un résidu iminodiacétate complexant un cation divalent nickel a été choisi. Il s'agit du DOGS ou 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3 (N (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl)] de chez Avanti polar Lipid, Inc. Il a été démontré qu'une telle molécule permet l'interaction de protéines possédant un domaine poly-histidine dans leur séquence primaire. Dans le but d'introduire ces phospholipides synthétiques dans le modèle membranaire, nous avons fabriqué des vésicules lipidiques composées d'une mixture de lipides à hauteur de 10% (mol/mol) de lipide modifié. Ces liposomes mixtes ont le même comportement vis à vis du support hydrophobe que ceux composés d'une seule espèce de phospholipides. Les résultats de fusion par RPS conduisent à des valeurs comparables en terme de cinétique de fusion et de recouvrement (résultats non présentés). Une méthode pour adresser des protéines solubles de manière stable et spécifique à des supports membranaires est d'utiliser le couplage entre un cation divalent métallique chélateur présent à la surface de la membrane et des résidus histidines. Il a été démontré que le cytochrome b5 dont le domaine membranaire a été délaité au profit d'un segment Tag Histidine conserve une affinité pour les membranes biologiques présentant des cations divalents chélateurs. Différentes formes de cytochrome b5 avec un domaine TagHis ont été produites (paragraphe 2.1). L'immobilisation des cytochromes b5 sur la bicouche hybride par approche IMAC a été caractérisée par RPS (Figure 2). Pour évaluer la capacité de fixation de la membrane, de multiples injections protéiques ont été effectuées dans son environnement. Les concentrations protéiques sont comprises classiquement entre 0.5 et 2, uM et conduisent à une cinétique de saturation du biocapteur. Pour la forme Hb5 (His) 4, un signal de chargement maximal de 650RU, qui correspond à environ 75% de recouvrement optimal sur un tel modèle membranaire (figure la), a été obtenu. Pour démontrer l'interaction spécifique de ces protéines avec le biocapteur, on a procédé à de multiples injections d'un agent compétiteur des coordinations histidine-Ni2+. Une solution d'histidine à Img/ml injectée à la surface du biocapteur entraîne une forte décroissance du signal, c'est à dire de la quantité de cytochrome b5 fixé sur la membrane (figure 2b). De cette façon on peut compétiter l'interaction spécifique et revenir à la ligne de base du signal. Cette procédure, utilisant une solution aqueuse non dénaturante pour les biomolécules, permet ainsi une régénération complète de la surface de la monocouche lipidique. Les résultats présentés en figure 2 confirme le fort potentiel du biocapteur en terme de capture protéique avec un haut niveau de compacité. Ils permettent de souligner l'extrême contrôle des auteurs sur les différentes phases de construction de cet assemblage supramoléculaire car, en modulant les pulses d'injections protéiques ou d'agent compétiteurs, il est possible de fixer précisément la quantité de protéine à la surface. Cette grande modularité peut être synthétisée par la figure 3. Exemple 4 : Greffage Protéine-ADNsb par complexe Cis-Pt Les complexes de platine, en particulier les cis-diamminedichloroplatine (cis- [PtCl2 (NH3) 2] sont des agents qui se fixent covalemment sur l'ADN. De plus ces molécules, par substitution de leur ligand labile chloro, peuvent ponter d'une part une base d'un ADN et d'autre part un résidu nucléophile d'un acide aminé d'une protéine. 4.1) Matériels Le CM- [PtCl2 (NH3) 2] et le M- [PtCl2 (NH3) 2] sont fournis par Johnson Matthey (Londres, Royaume Unis). Cis-[Pt (NH3) 2 (H20) 2]2+ et trans- [Pt (NH3) 2 (H20) 2] 2+ sont préparés en dissolvant une suspension de cis- [Pt (N03) 2 (NH3) 2] et de trans-[Pt(NO3) 2 (NH3) 2] dans l'eau, respectivement formé par la réactino du cis-[PtCI2 (NH3) 2] et du tran- [PtC12 (NH3) 2] avec du nitrate d'argent. L'ADN-20mer, son brin complémentaire et son brin complémentaire biotynilé proviennent de chez Eurogentec. La séquence de l'ADN-20mer, 5'CTATCATTTGCTTACTATTC 3' (SEQ ID NO 13) est choisi de sorte à ne posséder qu'une seule guanine car l'azote N7 est le principal site de platination des ADN (Lepre et al., 1990). 4.2) Formation du pontage ADN-b5 via un pontage platine Les réactions de platination sont réalisées premièrement sur l'ADN ou sur le cytochrome b5 (Hb5 (His) 4 and Hb5 (His) 4mut24) mais le rendement de pontage ADN-b5 est supérieur lorsque le cytochrome b5 est platiné le premier. La platination du ADNsb (500 uM) par un équivalent de complexe de platine dans 70mM NaCI04 conduit à la formation du cis-or o- [Pt (NH3) 2 (H20)] 2+ monoadduit lié à la guanine. Le site de platination est déterminé après traitement de l'oligonucléotide modifié avec de la piperidine-DMS dans des conditions de séquençage MaxamGilbert"suivies d'un traitement par le NaCN. L'absence de réactivité de la guanine N7-platinée avec le dimethylsulfate (DMS) permet de conclure à la protection de cette dernière vis à vis du DMS et donc de sa platination effective (Comess et al., 1990). Le Cytochrome b5 (100-200 u. M) est incubé en présence de 5 équivalents of complexes de platine dans de l'eau non tamponnée (pH5) pendant 5 heures à 25OC. Le cytochrome b5 est ensuite incubé (90 uM) avec 1.5 équivalent d'ADN dans de l'eau non tamponnée (pH5) pendant 50 heures à 25Oc. Les complexes ADN-b5 sont séparés des molécules d'ADN non complexées en utilisant un gel d'agarose fonctionnalisé par des groupements Ni2+/acide iminodiacetique (Sigma). L'élution de la protéine est effectuée par injection d'immidazole (IM). L'excès d'ADN n'est pas retenue sur la colonne. Les complexes ADN-b5 couplé par pont platine sont également purifiés des formes non réactives d'ADN en utilisant des sphères magnétiques recouvertes de streptavidine de Promega selon une modification de la procédure décrite par Promega : 0.5 nmole d'ADN total (complexé ou non) de la mixture de complexation est chauffée à 45 C pendant 10 min dans l'eau puis est confronté à son brin complémentaire biotinylé dans 0.075M NaCl, 0.0075M citrate pH7. 2 à 2. 5 C. La mixture (500 l) est ajoutée à 0. 6mg sphères magnétiques complexées à de la streptavidine, lavées préalablement et équilibrées dans le même tampon à 2. 5 C. Le complexe de platine ADNsb-b5 ne sont pas retenus sur les sphères et le ADNsb non complexé est élué entre 30-40 C dans 0. 015M NaCI and 0.0015M citrate pH7.2. Ces étapes de purification sont suivies d'une part d'une détection de radioactivité du ADNsb marqué au P32 en position 5' (auparavant radiomarqué par action de la polynucleotide kinase grâce au [y32p] ATP) et d'autre part, d'une étude spectral sur une fenêtre d'absorbance comprenant 413nm pour le b5 (e = 100 ZOOM''. cm-l) et 260nm pour le ADNsb (e = 180 500 M-l. cm-1). Ce dernier est corrigé de la composante d'absorbance de Hb5 à cette longueur d'onde (soit 1/5 de son absorbance à 413 nm). Cependant, on précise que ces deux dernières procédures ne permettent pas la séparation du complexe de platine" ADNsb-b5 du cytochrome b5 non complexé. Les complexes de platine cis-[Pt (NH3) 2 (H20) 2] 2+ and trans- [Pt (NH3) 2 (H20) 2] 2+ sont capables de coupler le cytochrome b5 avec le ADNsb- 20mer. Le site de platination sur l'oligonucléotide ADN se produit au niveau de N7 d'une guanine unique. Les complexes macromoléculaires"ADN-b5"sont caractérisés par des analyses de gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes, de quantification spectrophotmètriques et détermination de température de fusion avec un ADNsb libre complémentaire. L'étude électrophorètique sur 15% PAGE-SDS de la mixture composée du ADNsb radiomarqué en 5', de Hb5 [His] 4 et du cis ou trans-[Pt (NH3) 2 (H20) 2] 2+ a été réalisée. Après migration des échantillons, la radioactivité du ADNsb* est associée à la bande de migration de Hb5 [His] 4 (révélée par une coloration au bleu de coomassie) démontrant qu'une liaison covalente a été formée entre le ADNsb- 20mer et le cytochrome b5 (Figure 4). Le complexe ADN-pt-b5 a été caractérisé par analyse spectrale dans le but de déterminer la stoechiométrie de la réaction entre le cytochrome b5 et le ADNsb-20mer. Les conditions expérimentales ont permis la formation d'un complexe equimoléculaire comme l'indique l'absorbance respective du cytochrome b5 à 413nm et du ADNsb-20mer à 260 nm (Figure 5). 4. 3) Détermination de la température de fusion Les températures de fusion du ADNsb-20 mer et du ADNsb-20mer couplé au b5 par un pont cis-[Pt (NH3) 2 (H20) 2] 2+ ont été déterminées dans 0. 1 M NaCI04 pH4 avec leur ADNsb complémentaires. Les températures de fusion ont été mesurées sur un spectrophotomètre Uvikon 941 (Kontron). 0.2 nmole de ADNsb-20mer (ou complexe"ADNsb-b5Pt ) ont été incubées avec un ADNsb ayant une séquence complémentaire à une concentration finale de 0. 5M dans 0.025M NaCI04 pH4.4. L'échantillon de duplex est chauffée à 80 C (ADN-20mer) ou 65 C ( ADN-Pt-b5 ), la température subit une décroissance de l C/min jusqu'à 2. 5 C et l'absorbance est mesurée à 260nm. Les échantillons sont chauffés de 2. 5 C à 60 C à l C/min et leur absorbance est suivie à 260nm, dans le but de vérifier que les courbes obtenues lors du refroidissement et du chauffage sont superposables (profils réversibles). Les Tm ont été déterminées en utilisant un logiciel Kontron. La température de fusion du duplex contenant le ADNsb-20mer décroît de 22 C (de 45 C à 23OC) lorsqu'il est couplé avec le cytochrome b5 (figure 6). Aucune différence n'a été observée entre le complexe comportant Hb5 (His) 4 et le mutant cystéine : la cystéine en position 24 ne semble pas être, pour le complexe cis Pt, plus réactive que les autres sites nucléophiles présents à la périphérie du cytochrome b5. Quoiqu'il en soit les réactions de platination ne se produisent pas sur l'étiquette 4 histidines en position carboxy terminal, auquel cas le complexe ainsi formé ne serait pas capable d'être purifié sur colonne d'agarose-iminodiacetate ou d'interagir fortement avec la cellule. Des expérience de caractérisation en masse (électrospray, Maldi-TOF) des différents complexes sont en cours de réalisation. Exemple 5 : Greffage Protéine-ADNsb par bras espaceur 5.1) Fonctionnalisation de ADNsb par DPDPB Une seconde alternative a été explorée concernant le greffage d'un acide nucléique avec le cytochrome b5. Dans l'optique d'une présentation optimale de l'ADN couplé à la surface du biocapteur membranaire, les inventeurs ont choisi d'utiliser non pas un couplage direct mais préférentiellement une complexation par l'intermédiaire d'un bras espaceur. La molécule assurant le pontage intermoléculaire est le 1, 4-Di- [3'- (2'-pyridyldithio) propionamido] butane ou DPDPB. Cette molécule permet une liaison de type covalente entre deux molécules possédant des fonctions thiols et assure un espace intermoléculaire de 1,6 nm. Pour réaliser un tel assemblage supramoléculaire, une fonction thiol a été créée à la fois sur un oligonucléotide et sur le cytochrome b5. Les oligonucléotides modifiés sont de qualité HPLC et sont produits par Eurogentec. Les différents oligonucléotides modifiés sont les suivants : 0 ! igotiuc ! eotide n Wl (SEQ ID NI 8) 5'GCT-AGC-TGC-ATA-GAT-CTC-TAC-C-SH 3' La modification thiol est réalisée à l'extrémité 3'du 22mer. Oligonucléotide n W2 (SEQ ID N 9) 5'GCT-AGC-TGC-ATA-GAT-CTC-TAC-C 3' La modification thiol est réalisée en intra chaîne sur une thymine placée en position 11 du 22mer. Les différents oligonucléotides non modifiés impliqués dans l'exemplification sont les suivants : Oligonucléotide n W3 (SEQ ID NI 10) 5'-GGT-AGA-GAT-CTA-TGC-AGC-TAG-G-3' W3 est le 22mer complémentaire de Wl. Oligonucléotide nOW4 (SEQ ID NO 11) 5'-GCA-GCT-AGC-GGT-AGA-GAT-CT-3' W4 possède une séquence complémentaire des 9 premières bases de Wl (coté 5') et des 11 premières bases de Wl (coté 3'). De cette façon W4 possède la particularité de pouvoir ponter deux oligonucléotides Wl. Oligonucléotide noW5 (SEQ ID NO 12) 5'-GCT-AGC-TGC-ATA-GAT-CTC-TAC-C-3' W5 correspond à la séquence aléatoire en base de Wl. La procédure de couplage DPDPB-W1 est la suivante : afin de prévenir toute dimérisation des Wl par liaison disulfide, les oligonucléotides sont traités par un agent réducteur de DiThioThréitol (DTT) à raison d'une fraction molaire 1/5. La mixture est incubée à 30 C pendant 15min. La solution mère de DPDPB est solubilisée dans le Diméthyl sulfoxyde (DMSO) à raison de 10mg/mI. Un ajout de DPDPB à raison de 1 mole de Wl pour 500 à 5000 moles de DPDPB est effectué en présence du DTT résiduel pendant un temps d'incubation de 2 à 4 heures à 30 C. L'échantillon Wl est ensuite fixé spécifiquement sur colonne DEAE échangeuse d'ions, les réactifs sont éliminés et l'oligonucléotide est élué par addition d'une solution de NaCI 1. 5M. Le taux de modification peut être calculé par dosage au DTT de l'agent de cross-linking (réticulation). Cette réduction entraîne le départ du second groupe thiopyridine de l'agent de pontage dont la quantification peut être obtenue spectralement à 341nm. La procédure décrire permet d'atteindre 100% de complexe. 5.2) Greffage cytochrome b5-Wl via le bras espaceur Afin de réaliser un greffage contrôlé et réversible sur le cytochrome b5, les inventeurs ont procédé à une mutagenèse dirigée de Hb5 (His) 4 comme décrit au paragraphe 2.2 conduisant à la protéine Hb5 (His) 4 mutant24. La mutation serine cystéine permet d'introduire spécifiquement un groupement thiol en périphérie de la protéine. Afin de prévenir une dimérisation des protéines, la solution est traitée au DTT (Xmol b5/DTT=1/5) pendant 30 min à 30oc. L'échantillon est ensuite chargée sur colonne de chromatographie de gel d'exclusion (G25) de façon à éliminer le DTT et est immédiatement injecté à la solution d'oligonucléotides modifiés (Xmol b5/Wl=l/2) pendant 4H à 30 C. L'excès d'oligonucléotide est éliminé par rétention des protéines sur un gel iminodiacétate-Ni2+. L'élution des protéines est obtenue par des pulses d'une solution histidine Img/ml, comme indiqué lors de l'étape de purification des protéines HisTag, . L'analyse spectrale sur une fenêtre [240-500] nm permet de mettre en évidence le couplage effectif de Hb5 (His) 4 mut24 avec Wl (figure 7). Au regard des coefficients d'absorption molaire des deux macromolécules, les taux de complexation varie de 35 à 65%. Afin de n'utiliser ultérieurement qu'une population équimoléculaire Hb5/Wl, une étape supplémentaire de purification est réalisée sur DEAE. Une élution effectuée sous un gradient de concentration de NaCI permet d'isoler les différentes espèces reconstituées au cours du couplage (Hb5 monomèrique et dimérique, Hb5-espaceur-WI). Ainsi à partir de la population initiale, l'intégralité des espèce sont séparées par gradient croissant de NaCl (figure 7) : Spectre a) monomère de Hb5 (His) 4 mut 24 Spectre b) dimère de Hb5 (His) 4 mut 24 Spectre c) Complexe équimolaire b5-Wl. Selon cette procédure, la population b5-Wl est isolée et peut être confrontée à la membrane hybride. Exemple 6 : Réalisation de l'assemblage supramoléculaire b5-cis Pt-ADNsb et b5-DPDPB-ADNsb Le greffage des différents complexes sur la bicouche hybride a été caractérisé par résonance plasmon de surface. Au sein d'un appareil BIAcore. Des expériences à base de radioactivité et de marquage de fluorescence sont en cours de développement au laboratoire. Les expériences de couplage de l'assemblage moléculaire sur le modèle lipidique grâce au complexe chélateur nickel par résonance de plasmon de surface ont permis de montrer la formation d'un complexe stable. Les niveaux de compacité obtenus avec l'assemblage semblent en revanche inférieurs à ceux obtenus avec la protéine non modifiée par l'oligonucléotide. L'augmentation des charges négatives apportées par Wl peut être à l'origine de répulsions entre blocs supramoléculaires et ainsi conduire à un recouvrement moindre. Les valeurs de recouvrement ont été évaluées entre 200 et 250RU. On a vérifié à l'instar de Hb5 (His) 4, que les structures sont en interactions spécifiques avec le support et que l'action d'agents compétiteur de la chélation comme une solution d'histidine lmg/ml permet une régénération complète de la structure. (données non montrées mais présentant le même comportement que celles faisant l'objet de la figure 2). Exemple 7 : Potentiel du biocapteur et détection d'hybridation Afin d'évaluer le potentiel du biocapteur membranaire en terme de spécificité et de sensibilité, différents tests ont été effectués. Dans un premier temps, il a été indispensable de vérifier l'absence d'interactions non spécifiques d'oligonucléotides avec le biocapteur. Pour ce faire différentes injections de W4 ont été effectuées. W4 représente une séquence aléatoire à partir des bases constitutives de Wl, l'étude de l'évolution du signal à permis de montrer que W4 n'interagit pas à la surface du biocapteur c'est à dire la structure lipidique et l'assemblage supramoléculaire b5-Wl ; et ceci quel que soit le moyen de pontage (cis-Pt ou DPDPB) Dans un second temps, différentes injections de W3 ont été effectuées à différentes concentrations salines. Ainsi on a clairement démontré que les injections de W3, la séquence complémentaire de Wl, en présence d'une forte concentration de NaCI étaient accompagnées d'une cinétique d'association ou hybridation. En revanche, pour des concentrations en NaCI inférieur ou égale à 20mM, le même oligonucléotide n'interagit pas ou peu avec le biocapteur. Ces résultats démontrent la possibilité de détecter des états d'hybridation entre deux ADNsb à la surface du biocapteur. Les résultats d'hybridation montrent une valeur seuil d'environ 30 à 35RU. Or d'après les différents modes de calibrage, la valeur attendue pour une hybridation complète à partir d'un signal de bloc b5-Wl de 250RU, est de 70RU. Cependant les mesures de Tm effectuées sur Wl montrent clairement une température de transition de phase proche de la température ambiante, c'est à dire la température de mesure au sein de l'appareil BIAcore. A cette température seulement 50% de l'hybridation est attendue. La valeur mesurée avec notre dispositif est donc proche d'une hybridation optimale preuve d'une très favorable accessibilité des molécules cibles présentées par les biocapteur. Les dimensions de la cellule de travail au sein du dispositif BIAcore sont de 2 l'ordre du Imm. Cependant la surface réellement sondée par l'onde évanescente ne représente que 0. 224mm2. Considérant le calibrage 1000RU 0. 224ng/ 0. 224mm2, 250 RU d'assemblage moléculaire correspondent à O. 1ng soit 5immole = Q 3. 109 molécules. Le biocapteur membranaire permet une hybridation moléculaire n d'environ 109 molécules. De plus, Le biocapteur présenté ne requiert que la capture d'un ADNsb complémentaire sans que l'utilisation d'une sonde marquée ne soit nécessaire. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Bemey et al. (2000) Sensors and Actuators B 68, 100-108 Boncheva et al. (1999) Langmuir 15,4317-4320 Boon et al. (2000) Nature Biotechnology 18,1096-1100 Braun et al. (1998) Nature 391,775-778 Cheng et al. (2000) Reviews in molecular biotechnology 74, 159-174 (pI8) Comess et al. (1990) Biochemistry, 29,2102-2110 Ebbesen et al. (1998) Nature 391, 667-669 (pI8) Gulik-Krzywicki et al., (1967), J Mol Biol. ; 27 (2) : 303-22 Heyse et al. (1998) Biochemistry 37,507-522 Kalb et al. (1992) Biochim. Biophys. Acta 1103 : 307-316 Lepre et al. (1990) Nucleic Acids Molec. 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Cellule selon l'une des revendications 1 ou 2, comprenant : un support substantiellement plan à l'échelle atomique, sur lequel est fixé - une monocouche hydrophobe 1, sur laquelle est présente une monocouche II comprenant des phospholipides, - une molécule de pontage présentant une extrémité hydrophobe de nature à interagir avec la monocouche II, et une extrémité chimiquement fonctionnalisée de façon à former une liaison stable avec une protéine III, une protéine III présentant une structure tridimensionnelle univoque, ladite protéine III étant mobile latéralement dans ladite couche II, un acide nucléique IV relié de manière univoque à ladite protéine III, de préférence par un bras moléculaire. 4. Cellule selon l'une des revendication 1 à 3, caractérisée en ce que l'acide nucléique est relié à ladite protéine par une liaison covalente. 5. Cellule selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'acide nucléique est relié à ladite protéine par une liaison réversible. 6. Cellule selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'acide nucléique IV est relié à ladite protéine III par l'intermédiaire d'un composé choisi parmi : un bras espaceur reliant deux résidus identiques ou différents chimiquement réactifs de l'acide nucléique IV et de la protéine III, choisis dans le groupe constitué des thiols, des amines, des amides et des arginines. un complexe métallique tel le cis-platine, le trans-platine, l'europium, un complexe de nickel, de cuivre, ou de ruthenium coordonné d'une part à un résidu ou un groupe de résidus aminés de ladite protéine III et d'autre part à une ou plusieurs bases naturelles ou modifiées de l'acide nucléique IV, un complexe protéique covalent ou non covalent impliquant l'acide nucléque IV. 7. Cellule selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite protéine III a subi une modification introduisant un site unique permettant d'effectuer ladite liaison ledit acide nucléique IV de manière univoque. 8. Cellule selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite modification consiste en une mutation de ladite protéine pour ne laisser subsister ou n'introduire qu'un unique acide aminé prédéterminé. 9. Cellule selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit acide aminé prédéterminée est une cystéine. 10. Cellule selon l'une des revendications 3 à 9, caractérisée en ce que ladite protéine est reliée à un phospholipide de la couche II. 11. Cellule selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite liaison est une liaison covalente, par exemple par acylation, famesylation, par une séquence d'ancrage GPI (glycosylphosphatidylinositol) ou par l'accrochage d'un phospholipide à un résidu spécifique de la protéine III par un procédé artificiel quelconque. 12. Cellule selon la revendication 10 ou 11, caractérisée en ce que ladite liaison est une liaison réversible, par exemple par l'intermédiaire d'un bras capable de lier un chélate métallique d'un côté et un acide aminé ou un groupe d'acides aminés de l'autre. 13. Cellule selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisée en ce que ladite protéine est liée à un phospholipide modifié de la couche II, ledit phospholipide présentant une zone de fixation d'un chélate. 14. Cellule selon l'une des revendications 3 à 9, caractérisée en ce que ladite protéine présente une queue hydrophobe lui permettant d'être ancrée dans la couche II. 15. Cellule selon l'une des revendications 3 à 14, caractérisée en ce que les phospholipides de la couche II présentent des queues hydrophobes choisies de telle sorte que ladite couche n'est pas à l'état cristallin, mais à l'état fluide à température d'utilisation. 16. Cellule selon la revendication 15, caractérisée en ce que lesdites queues hydrophobes présentent une longueur de chaîne supérieure ou égale à 14 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant présenter des insaturations, de telle sorte que ladite couche II est à l'état fluide à température d'utilisation. 17. Cellule selon l'une des revendications 3 à 16, caractérisée en ce que lesdits phospholipides de la couche II présentent des têtes polaires, choisies dans le groupe constitué des têtes polaires neutres ne portant pas de charges, neutres globalement portant des charges opposées (zwitterioniques), ou portant une charge globale négative. 18. Cellule selon l'une des revendications 3 à 17, caractérisée en ce que ladite couche 1 comprend des éléments hydrophobes, présentant une longueur de chaîne d'environ 2 à 2,5 nm, par exemple comprise entre 12 et 20 atomes de carbone, de préférence entre 14 et 18 atomes de carbones. 19. Cellule selon l'une des revendications 3 à 18, caractérisée en ce que ladite couche 1 comprend des phospholipides liés audit support par l'intermédiaire de leurs têtes polaires. 20. Cellule selon l'une des revendications 3 à 18, caractérisée en ce que ladite couche 1 comprend des éléments hydrophobes liés audit support par l'intermédiaire d'une liaison covalente, par exemple une liaison alkyl-thiol ou une liaison alkyl-siloxanne. 21. Cellule selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisée en ce que la planéité dudit support est telle que la différence de hauteur entre deux zones distantes de moins de 100 nm est inférieure ou égale à 10 nm, de préférence inférieure ou égale à 3 nm, de façon plus préférée inférieure ou égale à 2 nm. 22. Cellule selon l'une des revendications 1 à 21, caractérisée en ce que ledit support est constituée d'un matériau choisi dans le groupe constitué du verre recouvert d'une couche d'or, du mica clivé, du silicium ou de tout autre matériau monocristallin. 23. Cellule selon l'une des revendications 1 à 22, caractérisée en ce qu'elle comprend plusieurs protéines identiques ou différentes, liées à des acides nucléiques identiques ou différents. 24. Support pour la détection d'acides nucléiques présentant une pluralité de cellules selon l'une des revendications 1 à 23. 25. Support selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il comporte un système permettant la mesure de courant, d'impédance ou de potentiel. 26. Support selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il comporte entre chaque cellule un dispositif optique intégré capable de mesurer l'absorbance d'une cellule dans deux directions croisées et d'en déduire son état d'organisation (anisotropie) ou de désorganisation (isotropie). 27. Support selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il comporte une surface alternant des zones conductrices et réfléchissantes et des zones non conductrices et transparentes. 28. Procédé d'identification de la présence d'un acide nucléique test dans un échantillon, comprenant les étapes de : a) mettre ledit échantillon en contact avec une cellule selon l'une des revendications 1 à 23, dans des conditions permettant l'hybridation dudit acide nucléique test à un acide nucléique relié à une protéine de ladite cellule, b) détecter l'hybridation dudit acide nucléique test audit acide nucléique relié à ladite protéine. 29. Procédé d'identification de la liaison d'une protéine à un acide nucléique et/ou de son activité sur la conformation dudit acide nucléique, comprenant les étapes de : a) mettre en contact ladite protéine avec un acide nucléique relié à une protéine, dans une cellule selon l'une des revendications 1 à 23, b) détecter la liaison de ladite protéine audit acide nucléique et/ou son activité sur la conformation dudit acide nucléique. 30. Procédé d'identification de la liaison d'un ligand à une protéine attaché à un acide nucléique fixé à une protéine dans une cellule selon l'une des revendications 1 à 23, comprenant les étapes de : a) mettre en contact ledit ligand avec ladite protéine, b) détecter la liaison dudit ligand à ladite protéine. 31. Procédé d'identification de la liaison d'un composé à un acide nucléique et/ou de son activité sur la conformation dudit acide nucléique, comprenant les étapes de : a) mettre en contact ledit composé avec un acide nucléique relié à une protéine, dans une cellule selon l'une des revendications 1 à 23, b) détecter la liaison dudit composé audit acide nucléique et/ou son activité sur la conformation dudit acide nucléique. 32. Procédé d'identification selon l'une des revendications 28 à 31, caractérisé en ce que la détection s'effectue par l'intermédiaire d'un système optique (absorbance, fluorescence), électrique, électronique, à résonance de plasmon de surface, de transfert d'énergie, de radiomarquage, de diffraction (optique, électronique, de rayons X, de neutron) ou de microscopie (optique directe ou fluorescence, électronique, champ proche, force atomique).