Brevet FR2828497A1 — publié le 20030214

La présente invention se rapporte au domaine de l'analyse de l'activité biologique des composés inhibiteurs de l'acétylcholinestérase, et plus particulièrement sur les effets non spécifiques des composés inhibiteurs de l'acétylcholinestérase sur d'autres cibles cellulaires que cette enzyme. ART ANTERIEUR L'acétylcholinestérase, aussi désignée AChE, est une enzyme classée selon la nomenclature internationale en E. C. 3.1. 1.7. L'AChE hydrolyse le neurotransmetteur acétylcholine qui contrôle la contraction du muscle dans le système nerveux périphérique et joue également un rôle crucial dans la transmission synaptique dans le système nerveux central. De plus, l'AChE aurait également un rôle non-enzymatique dans la croissance des neurites et leur différenciation. L'inhibition de l'activité AChE conduit à une perte de motilité. De nombreux composés pesticides, tels que les composés organophosphorés et carbamates sont des inhibiteurs de l'acétylcholinesterase (AChE). La propriété d'inhibition de l'AChE est utilisée afin de bloquer la transmission des signaux neuronaux aux niveaux des synapses cholinergiques et des jonctions neuromusculaires, ce qui a pour effet de paralyser l'organisme cible, plus spécifiquement les insectes et les parasites considérés comme nuisibles dans l'agriculture. Certains inhibiteurs de l'acétylcholinestérase sont également utilisés comme principes actifs de médicaments utilisés en thérapie humaine, notamment dans le traitement des maladies neuro-dégénératives, telle que la maladie d'Alzheimer, ou encore pour traiter d'autres pathologies telles que la myasthénie gravis ou encore certaines maladies auto-immunes. Il est généralement admis que les différents composés inhibiteurs de l'AChE actuellement commercialisés possèdent de nombreux effets non spécifiques indésirables, qui peuvent être extrêmement délétères pour les hommes ou les animaux mis en contact avec de tels composés. Parmi les effets délétères indésirables, on peut citer particulièrement leur pouvoir tératogène et plus généralement des dysfonctionnements au niveau du système nerveux central. Il existe donc un besoin dans l'état de la technique pour un modèle expérimental in vivo permettant de tester les effets non spécifiques indésirables de composés inhibiteurs de l'AChE d'intérêt industriel, notamment des composés utilisés comme principes actifs de compositions pesticides, insecticides ou encore de compositions pharmaceutiques, afin de sélectionner, parmi ces composés, ceux pour lesquels les effets non spécifiques de l'AChE sont inexistants ou tout au moins le plus réduits possible. La mise au point d'un tel modèle expérimental in vivo serait de nature à permettre la commercialisation de composés inhibiteurs de l'AChE dont la mise en oeuvre est plus sûre et n'entraîne pas d'effets indésirables sur la santé de l'utilisateur. La toxicité des inhibiteurs des cholinestérases a déjà été testée sur les poissons embryons et adultes, en particulier pour les composés utilisés comme pesticides. Par exemple, HANNEMAN et al. (1992) a étudié l'activité du diisopropylfluorophosphate sur le poisson-zèbre et a montré que ce composé altérait la somitogénèse. Toutefois, le modèle expérimental in vivo utilisé par HANNEMAN et al. (1992) ne permet pas de discriminer les effets spécifiques du DFP sur l'AChE des éventuels effets non spécifiques sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'AChE. Des moyens permettant la mise en oeuvre d'un procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'AChE sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que cette enzyme sont fournis pour la première fois par la présente invention. SOMMAIRE DE L'INVENTION L'invention a pour objet l'utilisation d'un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio, dans le génome duquel au moins une copie du gène codant l'acetylcholinestérase a été inactivée, dans un procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acetylcholinestérase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acetylcholinestérase. Pour tous les procédés de criblage in vivo détaillés dans la présente description, des embryons de poisson-zèbre ou des poisson-zèbres adultes sont mis en contact avec des composés inhibiteurs de l'acétylcholinestérase dont on recherche les effets potentiellement délétères non spécifiques de leur action sur l'acétylcholinestérase. En d'autres termes, les procédés selon l'invention ne peuvent en aucun cas être assimilés à des procédés de traitement de nature thérapeutique ou chirurgicale, compte tenu des objectifs poursuivis. Dans tous les cas, les embryons de poissons ou les poissons adultes utilisés pour le mise en oeuvre des divers procédés de criblage selon l'invention ne sont pas élevés dans l'attente de leur mort naturelle. Ils sont systématiquement sacrifiés, à plus ou moins longue échéance après leur utilisation dans un procédé de criblage, et la plupart du temps immédiatement à la fin du procédé. De plus, comme on le verra, certaines étapes des procédé de criblage décrits impliquent nécessairement le sacrifice du poisson ou de l'embryon de poisson, notamment à des fins de caractérisation histologique. L'invention est également relative à des procédés de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'AChE. Elle concerne aussi un procédé d'obtention d'un poisson de l'espèce Danio rerio, dans lequel au moins une copie du gène codant l'acétylcholinestérase est inactivée, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) mettre en contact des poissons mâles de l'espèce Danio rerio, dont les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont fonctionnelles, avec un composé mutagène, de préférence l'éthyl-nitroso-urée ; b) croiser les poissons mâles obtenus à l'étape a) avec un poisson femelle Danio rerio sauvage dont les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont fonctionnelles, afin dobtenir des descendants de génération F1 ; c) croiser entre eux des mâles et des femelles de la génération F1 afin d'obtenir des descendants de la génération F2 ; d) croiser entre eux des mâles et des femelles de la génération F2 afin d'obtenir des descendants de la génération F3 dont certains d'entre eux possèdent les deux copies du gène codant l'acétylcholiestérase inactivées. L'invention a également trait à un procédé d'obtention d'un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio à partir des poissons obtenus selon le procédé ci-dessus. Elle est également relative à des poissons et des embryons de poissons de l'espèce Danio rerio dont au moins une copie du gène codant l'AChE est inactivée. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : représentation schématique d'un criblage pour des mutations homozygotes létales. L'ENU a été utilisé pour muter les spermatogonies du mâle en GO qui a été croisé avec une femelle sauvage. Dans la génération F1 produite chaque poisson possède une combinaison unique de mutations. Les F1 sont croisés deux à deux et forment des familles F2. Les croisements entre individus F2 permettent d'obtenir des homozygotes mutants en F3. Plusieurs mutations peuvent être isolées à partir d'une même famille F2. Figure 2 : La perte d'activité AChE est liée à la mutation AChE -/- in vitro. - ab : L'activité AChE peut être détectée in vivo dans le SNC (comme dans les ganglions tri-jumeaux tg) et dans les muscles (h heart) et les somites. - cA - Dans les embryons -/- on ne détecte plus aucune activité. e) L'activité spécifique AChE d'embryons a été mesurée à plusieurs stades de développement. Ces embryons sont issus de croisements de couples d'hétérozygotes. des embryons sont immobiles et on ne détecte aucune activité AChE dans les extraits de ces embryons. f) Des poissons adultes ont été génotypés par étude de leur descendance. L'activité spécifique des hétérozygotes (+/-) correspond à la moitié de celle des poissons sauvages (+/+). Figure 3 : Alignement de 41 séquences d'acides aminés d'acétylcholinestérase. La ligne supérieure représente la séquence en acides aminés de l'acétylcholinestérase du mutant AChE selon l'invention, pour lequel l'acide aminé sérine (S) en position 226 est remplacé par l'acide aminé asparagine (N). La deuxième ligne représente la séquence en acides aminés de l'acétylcholinestérase du poisson Danio rerio sauvage. Figure 4 : Les embryons mutants sont capables d'exprimer un mini-gène codant pour la forme sauvage d'AChE. Les embryons issus d'une ponte de parents AChE +/-ont été injectés avec la forme sauvage, pC-AChE, ou la forme mutante, pC-S226N, et un plasmide codant pour la GFP. L'activité AChE a été détectée à 24 heures dans les embryons exprimant la GFP. L'absence d'activité selon le profil normal permet d'identifier le génotype des embryons (Figure 4A). Chez les mutants, l'AChE sauvage recombinante est exprimée dans de nombreuses cellules de types variés (Figure 4B) alors qu'aucune activité n'est détectée après injection de pC-S226N (figure 4C). Figure 5 : Le mouvement des embryons AChE -/- est altéré à 48 heures. A) La tête des embryons sauvages ou mutants est immobilisée dans de l'agarose et les mouvements de la queue sont enregistrés sous lumière stroboscopique. Après une stimulation latérale avec une aiguille, les embryons sauvages répondent par des mouvements amples et rapides qui durent plusieurs secondes. Dans les mêmes conditions, les mutants AChE ne présentent qu'un faible mouvement (tremblement) du bout de la queue et s'immobilisent rapidement en position contractée. B) Comparaison d'un embryon sauvage au repos et d'un embryon mutant AChE en état de crampe. Figure 6 : Les fibres musculaires sont altérés dans les embryons mutants AChE-/-. En microscopie photonique, en lumière polarisée, on observe une forte biréfringence dans les muscles de l'embryon sauvage (Figure 6 A) mais une biréfringence qui est très diminuée dans les mutants (Figure 6 B). En microscopie électronique, les myofibrilles sont présentes mais envahies par un sarcoplasme fortement vacuolisé dans le mutant (Figure 6 D) ? L'enveloppe nucléaire est distendue et fortement vacuolisée. La figure 7 illustre la carte du plasmide pc-ACHE, dérivé du vecteur pcDNA3, dans lequel est inséré une copie fonctionnelle du gène de l'AChE du poisson Danio rerio. La figure 8 illustre la carte du plasmide pc-5226N, dérivé du vecteur pcDNA3, dans lequel est inséré une copie du gène inactivé de l'AChE selon l'invention. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Par une technique de mutagenèse chimique de poissons de l'espèce Danio rerio (poisson-zèbre) suivie de la caractérisation des mutants ainsi produits, le demandeur a obtenu de manière reproductible des poissons de l'espèce Danio rerio, dans le génome desquels une copie du gène codant l'acétylcholinestérase a été inactivée. A partir des mutants hétérozygotes comprenant une seule copie inactivée du gène de l'AChE, le demandeur a obtenu de manière reproductible des embryons de poissons de l'espèce Danio rerio homozygote comprenant les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sous forme inactivée. L'activité acétylcholinestérase est indétectable chez ces mutants homozygotes. De manière tout à fait surprenante, l'inactivation des deux copies du gène acétylcholinestérase n'empêche pas la production d'embryons viables jusqu'à 9 jours L'obtention de manière reproductible par le demandeur de poisson Danio rerio partiellement ou totalement dépourvu d'activité catalytique acétylcholinestérase a permis la mise au point de procédés de criblage de composés inhibiteurs de l'AChE afin de déterminer si les composés ainsi criblés possédaient des effets non spécifiques sur d'autres cibles cellulaires que l'AChE, et en particulier des effets non spécifiques délétères sur le développement des embryons, et encore plus spécifiquement sur le développement du système nerveux central ou du système nerveux périphérique. Un premier objet de l'invention consiste donc en l'utilisation d'un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio dans le génome duquel au moins une copie du gène codant l'acétylcholinestérase a été inactivée, dans un procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase. Il est ainsi fourni pour la première fois selon l'invention des poissons de l'espèce Danio rerio dans le génome desquels une copie du gène codant l'AChE a été inactivée, et qui peuvent être obtenus de manière reproductible par l'homme du métier. Il est aussi fourni selon l'invention des embryons de poissons de l'espèce Danio rerio dans le génome desquels les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont inactivées. Procédés reproductibles d'obtention de poissons de l'espèce Danio rerio mutés sur le gène de l'AChE. Procédé d'obtention par mutagenèse chimique. Un procédé reproductible d'obtention d'un poisson de l'espèce Danio rerio mutée dans le gène codant l'AChE est décrit en détail à l'exemple 1 et est illustré par la figure 1. Brièvement, un mâle sauvage dont les spermatogonies ont été traités par un agent mutagène chimique est croisé avec une femelle sauvage. De préférence, l'agent mutagène chimique est l'éthyl-nitroso-urée (ENU) qui est connu pour induire des mutations ponctuelles nombreuses dans toutes les cellules du mâle et notamment les gamètes. Les descendants de la génération F1 sont croisés deux à deux afin d'obtenir des descendants de génération F2 qui portent les mutations du génome paternel et les mutations du génome maternel, avec une combinaison unique dans chaque poisson, en fonction de la ségrégation des chromosomes et des recombinaisons au cours de la méiose. Puis, les frères et soeurs de la génération F2 sont croisés entre eux afin d'obtenir des descendants de génération F3. Les descendants de génération F3 sont, pour un quart de la population, des mutants homozygotes pour une mutation donnée qui sont produits à chaque fois que l'on a croisé un mâle et une femelle ayant reçu la même mutation. Les mutants de la génération F3 ont ensuite été sélectionnés successivement selon deux critères, un critère phénotypique et un critère biochimique. Le critère phénotypique consiste en l'observation des caractéristiques de mobilité des embryons, plus spécifiquement le test qualitatif du réflexe de fuite dans lequel les embryons sont stimulés mécaniquement à la jonction tête-tronc, puis les altérations du mouvement détectées après 48 heures de développement. L'utilisation d'enregistrements vidéo permet d'identifier précisément la séquence du mouvement réflexe après stimulation tactile chez les embryons et les jeunes larves. Le critère biochimique consiste en la détection de l'activité acétylcholinestérase chez les embryons, qui peut être réalisée selon la technique de KARNOVSKY et al. (1964), qui consiste en une technique de coloration à la fois simple et rapide. Les embryons peuvent être observés sous loupe binoculaire sans autre préparation, la présence d'une coloration brune étant révélatrice de l'activité catalytique acétylcholinestérase. Sur la totalité de la population d'embryons de la génération F3, vingt lignées présentaient un phénotype d'altération de la mobilité et ont ensuite été testées sur le critère biochimique d'activité de l'acétylcholinestérase. Sur les vingt lignées testées, une seule lignée ne présentait aucune activité cholinestérasique pour environ un quart des embryons de la génération F3, dans cinq pontes de couples hétérozygotes indépendants. Après amplification et séquençage du gène de l'acétylcholinestérase chez ces embryons, une mutation ponctuelle correspondant à la substitution d'un nucléotide dans le cadre ouvert de lecture du gène et conduisant à la production d'une acétylcholinestérase catalytiquement inactive a été caractérisée. L'application des critères de sélection phénotypique et biochimique ci- dessus, après mutagenèse chimique, permet donc l'obtention reproductible de poissons de l'espèce Danio rerio dans le génome duquel une copie du gène codant l'acétylcholinestérase a été inactivée. De plus, le croisement de poissons hétérozygotes pour une mutation dans le gène de l'acétylcholinestérase permet d'obtenir directement des descendants dont un quart de ceux-ci sont homozygotes pour la mutation. Inactivation du gène codant l'acétylcholinestérase par des oligonucléotides antisens. Un second procédé d'inactivation du gène codant l'acétylcholinestérase consiste en l'utilisation d'un polynucléotide antisens possédant une séquence complémentaire de l'ARN messager constituant le produit d'expression du gène de l'acétylcholinestérase du poisson Danio rerio. La séquence nucléotidique d'un oligonucléotide antisens selon l'invention peut être aisément déterminée par l'homme du métier à partir de la séquence nucléotidique du gène de l'acétylcholinestérase du poisson Danio rerio, dont le clonage est décrit par BERTRAND et al. (2001). Pour la construction de polynucléotides antisens et leur utilisation pour inhiber l'expression d'un gène donné, l'homme du métier pourra se référer av avantageusement aux articles de SCZAKIEL et al. (1995) et de ROSS ! et al. (1991) ainsi qu'au contenu des demandes PCT NOWO 94/23 026, WO 95/04141, WO 92/18 522 ainsi qu'à la demande de brevet européen n EP 0 572 287. Les poynucléotides antisens doivent avoir une longueur et une température de fusion suffisantes pour permettre la formation d'un duplex intracellulaire ayant une stabilité suffisante pour inhiber l'expression de l'ARNm dans le duplex. Préférentiellement, un polynucléotide antisens utilisé selon l'invention pour inactiver le gène codant l'acétylcholinestérase du poisson Danio rerio, est un ADN antisens de type morpholino tel que décrit notamment dans les brevets US N'5, 142,047 et 5,185, 444. De manière tout à fait préférée, un ADN antisens utilisable selon l'invention est l'ADN de type morpholino possédant la séquence SEQ ID N'l. Selon l'invention, une copie du gène codant l'acétylcholinestérase du poisson de l'espèce Danio rerio est inactivée lorsque l'activité catalytique acétylcholinestérase retrouvée dans les tissus du poisson est réduite d'environ 50%, par rapport à l'activité catalytique retrouvée chez le poisson Danio rerio sauvage. Ainsi, l'inactivation d'une copie du gène codant l'AChE peut consister en une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions de nucléotides dans la séquence nucléotidique du cadre ouvert de lecture du gène, conduisant à la production d'un polypeptide modifié ou tronqué ne possédant plus l'activité catalytique de l'acétylcholinestérase, c'est-à-dire d'un polypeptide incapable d'hydrolyser l'acétylcholine. Selon un autre aspect, une copie du gène codant l'AChE est inactivée lorsqu'une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions de nucléotides ont été artificiellement induites dans la séquence régulatrice en amont du gène de l'AChE ou encore dans les séquences introniques, en particulier lorsque les mutations sont localisées dans des séquences introniques impliquées dans le processus d'épissage du pré-ARN messager. Il a été montré selon l'invention que l'inactivation d'une seule copie du gène codant l'AChE conduisait à la production de 50% de l'acétylcholinestérase normalement produite chez le poisson sauvage possédant les deux copies fonctionnelles du gène. Il a été également montré que les embryons de poissons Danio rerio dans lesquels les deux copies du gène de l'AChE ont été inactivées ne produisent plus d'acétylcholinestérase sous une forme catalytiquement active. Selon un mode particulièrement préféré de l'utilisation d'un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio dans un procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase, les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase ont été inactivées. Par activité biologique d'un composé inhibiteur sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'AChE, on entend essentiellement les effets non spécifiques des composés inhibiteurs, qui ne sont pas dus à une interaction entre ce composé et l'acétylcholinestérase, du moins sous sa forme active. Il s'agit donc d'un criblage in vivo de l'activité biologique non spécifique de l'acétylcholinestérase des composés inhibiteurs, ce qui implique nécessairement que d'autres cibles cellulaires que l'acétylcholinestérase, en particulier d'autres protéines impliquées dans diverses voies métaboliques soit la cible des inhibiteurs d'AChE testés. De préférence, les composés inhibiteurs de l'AChE testés sont des composés pesticides ou insecticides ainsi que des composés d'intérêt thérapeutique utiles pour le traitement de certaines maladies du système nerveux comme la maladie d'Alzheimer ou la myasthenia gravis.. Selon un autre mode de réalisation préféré, les composés inhibiteurs sont des composés organophosphorés. Selon un autre mode de réalisation préféré, les composés inhibiteurs sont des composés possédant au moins un groupement carbamate. Des exemples illustratifs de tels composés sont par exemple l'ésérine, le diisopropylfluorophosphate (DFP), le chlorpyrifos commercialisé par la Société DURSBAN, le dibromure de 1, 5-bis- (4-allylbimthylammoniumphenyl) - pentan-3-one (BW 284c51) ou physostigmine. D'autres inhibiteurs utilisables selon l'invention sont décrits notamment sur le site Web ESTHER consacré aux cholinestérases (adresse : http : //www. ensam. inra. fr/ cholinesterase) et plus particulièrement dans la partie spécifiquement consacrée aux composés inhibiteurs (adresse : http : //www. ensam. inra. fr/cholinesterase/ chem/ Inhibitors/index. html ) ou encore dans l'article de CHATONNET et al. (1999). Procédés de criblage selon l'invention Afin de détecter l'activité biologique non spécifique de l'acétylcholinestérase de composés inhibiteurs de l'AChE, un premier procédé de criblage in vivo selon l'invention permet de comparer le développement d'un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio totalement déficient en acétylcholinestérase catalytiquement active, selon que cet embryon est mis en contact ou non avec le composé inhibiteur à tester. Ainsi, l'invention est relative à un procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio, dans le génome duquel les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase ont été inactivées, avec le composé inhibiteur à tester ; b) comparer les caractéristiques de développement de l'embryon de l'étape a) avec les caractéristiques de développement d'un embryon témoin identique, qui n'a pas été mis en présence du composé inhibiteur. Selon le procédé de criblage in vivo ci-dessus, les différences observées dans les caractéristiques de développement de l'embryon selon qu'il est mis ou non en contact avec le composé inhibiteur de l'AChE à tester, si elles existent, sont significatives d'une activité du composé inhibiteur testé qui est non spécifique de l'acétylcholinestérase. Un tel composé inhibiteur de l'AChE est donc fortement susceptible de provoquer des effets délétères indésirables pour l'utilisateur. Selon un second procédé de criblage in vivo conforme à l'invention, il est réalisé une comparaison des caractéristiques de développement respectivement d'un embryon de l'espèce Danio rerio dans le génome duquel une copie du gène codant l'AChE a été inactivée et d'un embryon de l'espèce Danio rerio dont les deux copies du gène codant l'AChE sont fonctionnelles, les deux types d'embryon étant mis en contact avec le composé inhibiteur à tester. Les embryons dont une copie du gène codant l'AChE est inactivée sont viables et donnent naissance à des poissons adultes. Aussi, les tests peuvent aussi être réalisés à des stades ultérieurs du développement, par exemple au stade poisson adulte. Ainsi, l'invention est également relative à un procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio, dans le génome duquel une copie du gène codant l'acétylcholinestérase a été inactivée, avec le composé inhibiteur à tester ; b) mettre en contact un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio dont les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont fonctionnelles avec le composé inhibiteur à tester. c) comparer les caractéristiques de développement de l'embryon de l'étape a) avec celles de l'embryon de l'étape b). Selon le procédé ci-dessus, des différences dans les caractéristiques de développement des deux types d'embryons sont significatives d'une activité biologique du composé inhibiteur de l'AChE, qui est non spécifique de l'acétylcholinestérase. Ainsi, des composés inhibiteurs testés pour lesquels des différences dans les caractéristiques de développement sont observées sont susceptibles de provoquer des effets délétères indésirables sur la santé de l'utilisateur. De préférence, les caractéristiques de développement comparées dans les procédés de criblage in vivo selon l'invention incluent la mobilité des embryons, en particulier les caractéristiques de mobilité du réflexe de fuite après stimulation mécanique à la jonction tête-tronc, qui peuvent être le cas échéant analysées à l'aide d'enregistrements vidéo permettant d'identifier précisément la séquence du mouvement réflexe après stimulation tactile chez les embryons et les gènes larves. Les caractéristiques de développement de l'embryon qui sont comparées dans les procédés de criblage in vivo ci-dessus incluent aussi l'observation du développement morphologique de ces embryons, comprenant les battements du coeur, la circulation du sang, la morphologie des cellules sanguines, le développement des nageoires, la forme de la tête, la taille des yeux, le développement de la mâchoire et du squelette pharyngé, l'ouverture de la bouche (observation de la structure des arches branchiales), la formation de la vessie natatoire, la pigmentation en particulier au niveau des cellules pigmentaires dérivées des crêtes neurales. Les caractéristiques de développement comparées dans les procédés de criblage in vivo ci-dessus incluent aussi l'observation du développement du système nerveux central et du système nerveux périphérique, le développement du cerveau postérieur, en particulier la fermeture du tube neural, et en général tous les problèmes de différenciation des structures du système nerveux central et du système nerveux périphérique. Les caractéristiques de développement comparées incluent aussi le développement musculaire tel que le développement des somites, notamment les somites terminaux de la queue. Selon l'invention, on privilégie la détection des caractéristiques de développement directement visibles par l'observation des embryons au moyen d'une loupe binoculaire ou d'un microscope, le cas échéant associé à un dispositif de capture et d'enregistrement vidéo. Dans tous les cas, les poissons mis en oeuvre dans un procédé de criblage selon l'invention sont sacrifiés à plus ou moins long terme après le test, et préférentiellement immédiatement après la fin du test. Toutefois, des caractéristiques de développement impliquant le sacrifice et l'étude histologique de l'embryon peuvent être également comparées selon l'invention. De telles caractéristiques de développement incluent notamment les caractéristiques de développement neuromusculaires, telles que la désorganisation des fibres musculaires, qui peut être mise en évidence notamment sur des coupes histologiques, selon des techniques bien connues de l'homme du métier. D'autres caractéristiques de développement qui peuvent être comparées dans un procédé de criblage in vivo tel que défini ci-dessus incluent la détection de l'expression ou du niveau d'expression de gènes d'intérêt, par exemple des gènes impliqués dans les caractéristiques de développement citées ci-dessus. Selon l'invention, la détermination des caractéristiques de développement de l'embryon est réalisée de préférence à des intervalles de temps prédéterminés, à partir de l'instant de fécondation de l'oeuf. Selon une telle caractéristique, les différences de caractéristiques de développement selon le type d'embryon ou selon le traitement de l'embryon peuvent être suivies de manière continue dans le temps. Il a été montré selon l'invention que des embryons homozygotes comprenant les deux copies inactivées du gène de l'AChE étaient viables jusqu'à 9 jours après fécondation de l'oeuf. Chez les embryons homozygotes comportant les deux copies inactivées du gène de l'AChE, la réponse réflexe à une stimulation tactique devient très faible au temps 48 heures de fécondation de l'oeuf. Il est observé une contraction unilatérale, du côté opposé à la stimulation, qui est suivie d'une période brève de battements alternatifs droite/gauche, limitée à la partie terminale de la queue. Au temps 3 jours après fécondation de l' oeuf, la plupart des embryons homozygotes sont immobiles et adaptent une posture cambrée avec la queue pointant dorsalement en suivant l'axe de l'embryon. Au vu de ce qui précède, les procédés de criblage selon l'invention peuvent en outre être caractérisées en ce que la détermination des caractéristiques de développement de l'embryon est réalisée jusqu'au temps 48 heures suivant la fécondation de l'oeuf. Les procédés de criblage in vivo définis ci-dessus ont été mis en oeuvre, à titre illustratif, avec deux composés inhibiteurs de l'AChE, respectivement l'ésérine et le diisopropylfluorophosphate (DFP). Pour l'ésérine, la mise en contact des embryons sauvages avec une solution à 10-3 molaire d'ésérine bloque complètement la mobilité des deux types d'embryon au temps 18 heures après fécondation de l'oeuf. Un tel blocage de la mobilité n'est pas observé chez les embryons homozygotes pour une mutation sur le gène de l'AChE, ce qui est significatif d'une action de l'ésérine non spécifique de l'AChE, qui agirait en conséquence également sur d'autres cibles cellulaires que cette enzyme. De même, le DFP est connu pour altérer le développement des somites au temps 24 heures après fécondation de l'~uf, comme cela est décrit par HANNEMAN et al. (1992). En revanche, aucune altération dans la formation des somites n'a été observée chez les embryons homozygotes pour une mutation sur le gène de l'AChE, ce qui est significatif d'une activité non spécifique du DFP sur d'autres cibles cellulaires que l'AChE elle-même. Ainsi, la mise en oeuvre des procédés de criblage in vivo de l'invention pour tester deux composés inhibiteurs de l'AChE a permis de mettre en évidence des effets non spécifiques de l'AChE, qui pourraient être fortement délétères pour l'utilisateur. Selon un autre aspect de l'invention, les poissons de l'espèce Danio rerio de la génération F2, qui possèdent une seule copie inactivée du gène codant l'AchE, ou encore la partie de la population de poissons de la génération F3 qui possèdent une seule copie inactivée de gène, qui se développent jusqu'au stade adulte, peuvent être utilisés dans des procédés de criblage des effets non spécifiques de composés inhibiteurs de l'AchE liés à des surdosages. Ces poissons hétérozygotes pour l'inactivation du gène de l'AChE ont une activité de l'AChE quantitativement égale à 50% de l'activité ACHE retrouvée chez les poissons sauvages et peuvent être utilisés pour tester les effets non spécifiques d'inhibiteurs de l'AChE qui sont détectés pour de fortes doses d'inhibiteur. L'invention a aussi pour objet un procédé de criblage in vivo de l'effet non spécifique de surdosage d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase, sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un poisson adulte de l'espèce Danio rerio, dans le génome duquel une seule copie du gène codant l'acétylcholinestérase a été inactivée, avec le composé inhibiteur a tester, par exemple avec une série de concentrations croissantes du composé inhibiteur à tester, b) comparer les caractéristiques du poisson traité conformément à l'étape a) avec les caractéristiques d'un poisson adulte de l'espèce Danio rerio, dans le génome duquel les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont fonctionnelles et qui a été mis en contact avec le composé inhibiteur, par exemple avec une série de concentrations croissantes du composé inhibiteur à tester. Le procédé de criblage ci-dessus permet de mettre en évidence, in vivo, les effets non spécifiques de l'acétylcholinestérase, liés à un surdosage d'un composé inhibiteur, notamment d'un composé inhibiteur pesticide ou d'un composé inhibiteur d'intérêt thérapeutique. Les caractéristiques du poisson adulte étudiées sont choisies parmi les caractéristiques morphologiques et les caractéristiques de mobilité, notamment. Les effets délétères du surdosage peuvent également être mis en évidence par détection de l'expression ou du niveau d'expression de gènes d'intérêt. Les effets délétères du surdosage peuvent être aussi mis en évidence en évaluant le taux, par exemple le pourcentage, de mortalité observé chez les poissons (+/-) ou (+/+) traités par le composé inhibiteur. Procédé d'obtention d'un poisson ou d'un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio muté sur le gène de l'AChE. Un autre objet de l'invention consiste en un procédé d'obtention d'un poisson de l'espèce Danio rerio, ou d'un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio susceptible d'être utilisé pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylch 01 inestérase. L'invention a aussi pour objet un procédé d'obtention d'un poisson de l'espèce Danio rerio dans lequel au moins une copie du gène codant l'actétylcholinestérase est inactivée, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) mettre en contact des poissons mâles de l'espèce Danio rerio, dont les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont fonctionnelles, avec un composé mutagène, de préférence l'éthyl-nitroso-urée ; b) croiser les poissons mâles obtenus à l'étape a) avec un poisson femelle Danio rerio sauvage dont les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont fonctionnelles, afin dobtenir des descendants de génération F1 ; c) croiser entre eux des mâles et des femelles de la génération F1 afin d'obtenir des descendants de la génération F2 ; d) croiser entre eux des mâles et des femelles de la génération F2 afin d'obtenir des descendants de la génération F3 dont certains d'entre eux possèdent les deux copies du gène codant l'acétylcholiestérase inactivées. La description générale des différentes étapes du procédé ci-dessus a été déjà exposée précédemment par la présente description. La description détaillée d'un procédé d'obtention d'un poisson d'espèce Danio rerio tel que défini ci-dessus est aussi décrit en détail à l'exemple 1. L'invention est également relative à un procédé d'obtention d'un embryon de l'espèce Danio rerio dont au moins une copie du gène codant l'acétylcholinestérase est inactivée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) croiser entre eux un poisson mâle et un poisson femelle obtenus par le procédé ci-dessus ; b) récupérer les oeufs fécondés. De manière surprenante, il a été montré selon l'invention qu'une mutation sur les deux copies du gène de l'AChE conduit à l'obtention d'embryons viables jusqu'à 9 jours, mais qui présente rapidement des déficits dans la transmission des signaux neuronaux. Le développement du poisson-zèbre est extrêmement rapide. Au temps 24 heures après fécondation, un plan de base d'un poisson est mis en place. Au temps 6 jours après la fécondation, la plupart des organes sont complètement différenciés. Après le temps 6 jours, la larve complètement différenciée ne fait plus que grandir en taille. La viabilité des embryons homozygotes pour une mutation dans le gène de l'AChE est essentielle si l'on veut les utiliser dans un procédé de criblage in vivo de composés inhibiteurs de l'AChE incluant une étape d'étude ou de comparaison des caractéristiques de développement de celuici. En outre, il était essentiel, en vue de détecter les activités non spécifiques de l'AChE de composés inhibiteurs d'acétylcholinestérase, d'obtenir un modèle animal dans lequel l'absence d'activité catalytique AChE n'était pas compensée par l'activité d'autres enzymes, ce qui aurait été de nature à masquer totalement les effets non spécifiques des inhibiteurs de l'acétylcholinestérase. Un autre objet de l'invention consiste en un poisson de l'espèce Danio rerio dont une copie du gène codant l'acétylcholinestérase est inactivée, susceptible d'être obtenu par le procédé ci-dessus. Elle est également relative à un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio dont au moins une copie du gène codant l'acétylcholinestérase est inactivée, susceptible d'être obtenu par le procédé ci-dessus. Selon un mode de réalisation préféré de l'embryon de poisson Danio rerio ci-dessus, cet embryon est caractérisé en ce que les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont inactivées. Selon l'invention, il a été obtenu des poissons de l'espèce Danio rerio dont l'inactivation du gène de l'AChE a été provoquée par la substitution d'un nucléotide dans le cadre ouvert de lecture du gène, résultant en la production d'une AChE catalytiquement inactive dont le résidu d'acide aminé sérine en position 226 a été remplacé par un résidu d'acide aminé asparagine. En conséquence, l'invention est également relative à un poisson ou un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio caractérisé en ce qu'une copie du gène de l'acétyl cholinestérase ou les deux copies de ce gène comportent la substitution d'un nucléotide résultant en la production d'une acétylcholinestérase catalytiquement inactive dont l'acide aminé sérine en position 226 de la séquence de l'enzyme est remplacé par l'acide aminé asparagine. L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants : EXEMPLES : EXEMPLE 1 : Obtention de poissons Danio rerio mutés sur le gène de l'AChE. 1.1 Mutagenèse à l'ENU La technique de criblage précédemment utilisée par le groupe de NÜSSLEIN-VOLHARDT, est basée sur le croisement d'un mâle traité à l'ENU avec une femelle sauvage (figure 1). L'agent chimique mutagène ENU induit des mutations ponctuelles nombreuses dans toutes les cellules du mâle et notamment dans les gamètes. Dans le large stock F1, tous les individus sont porteurs de plusieurs mutations. Le croisement de F1, deux à deux permettent de définir un couple fondateur et d'obtenir une famille F2. Dans celle-ci les individus portent les mutations du génome paternel et les mutations maternelles, avec une combinaison unique dans chaque poisson, en fonction de la ségrégation des chromosomes et des recombinaisons au cours de la méïose. En recroisant les frères et surs F2, les mutants homozygotes (1/4 des embryons) apparaissent en F3 à chaque fois que l'on aura croisé un mâle t une femelle ayant reçu la même mutation (figure 1). A partir d'une même famille issue d'un couple fondateur plusieurs mutations récessives différentes pourront être isolées et donneront des phénotypes nouveaux dans les homozygotes F3. Pour maintenir le stock des mutants, les adultes hétérozygotes mutants sont croisés à chaque génération avec des poissons sauvages de la même souche (lignée ABO) afin d'éviter les problèmes liés aux croisements consanguins sur trois générations au cours du criblage. Dans le produit de ces croisements, les hétérozygotes sont identifiés à nouveau par croisement entre frères et soeurs comme dans la F3. Les croisements présentent l'avantage de maintenir un fond génétique constant chez les mutants et identique à la souche sauvage. Critères de sélection des mutants Le mouvement de nage des embryons et des larves (embryon de plus de 3 jours) a été étudié en détail. L'embryon montre des contractions spontanées dès 17-18h de développement. A partir de 24 heures il répond à un stimulus par un mouvement réflexe sporadique qui devient coordonné vers 48 heures et permet la fuite (FELSENFELD et al., 1990 ; GRANATO et al. 1990). L'élaboration de ces mouvements suit la mise en place du système nerveux central et périphérique (Saint-Amant et Drapeau, 2000). La stimulation des neurones sensoriels, les cellules de Mauthner, qui déclenche un signal qui se propage le long du réseau des faisceaux dorsaux. La stimulation du côté ipsilatéral est inhibée simultanément ce qui permet une contraction unilatérale éloignant le poisson de la source de stimulation. Dès 72 heures, la larve nage librement et peut se diriger vers une cible. Pour sélectionner les mutants, la mobilité est étudiée de façon qualitative par le test du réflexe de fuite dans lequel les embryons sont stimulés mécaniquement à la jonction tête-tronc. Les altérations du mouvement peuvent ainsi être détectées après 48 heures de développement. L'utilisation d'enregistrements vidéo permet d'identifier précisément la séquence du mouvement réflexe après stimulation tactile chez les embryons et les jeunes larves. Pour compléter ce criblage, les animaux présentant une nécrose localisée ou générale du tube neural ont été retenus. Ce critère permet de sélectionner les mutants dans lesquels les neurones, n'ayant pas atteint leur cible, dégénèrent. Ces observations ont été réalisées sous la loupe binoculaire. 105 familles ont été créées et 56 lignées mutantes ont été retenues pour l'analyse. Les mutants ont été caractérisés, à 48 heures et à 72 heures de développement, sur le plan morphologique, sur leur aptitude à bouger et à répondre au test tactile et ont été classés en 4 groupes. La première famille contient les mutants immobiles, la seconde les mutants ayant une mobilité réduite. Les mutants de ces deux groupes peuvent présenter ou non des défauts morphologiques. Les embryons présentant des nécroses du tube neural sont classés dans le troisième groupe, et les lignées restantes ayant un phénotype mal défini constituent le dernier groupe. Dans les quatre groupes phénotypiques, des tests de complémentations (intra-famille ou avec des mutants du criblage de Tübingen) ont permis d'identifier des allèles différents pour un même gène. 1.2 Détection de l'activité AChE dans les mutants, une technique simple et rapide de criblage. Les mutants déficients en activité AChE ont été retenus. Dans les embryons la coloration de l'activité AChE par la technique de karnovsky est simple, rapide et les embryons colorés peuvent être observés sous loupe binoculaire sans autre préparation. Nous avons testé 20 lignées parmi les 35 entretenues couramment au laboratoire. Pour chaque lignée mutante, la moitié d'une ponte, issue de parents hétérozygotes a été utilisée pour détecter l'activité AChE à 24 heures de développement et l'autre moitié élevée pour vérifier le phénotype de mobilité des mutants à 48 heures et 72 heures. Parmi les 20 lignées testées, 15 présentaient un phénotype normal de localisation et d'intensité du marquage de l'activité cholinestérasique. Dans une lignée, classée dans le groupe phénotypique des mutants immobiles, aucune activité cholinestérasique n'a été détectée pour environ 1/4 des embryons dans 5 pontes de couples hétérozygotes indépendants. Cette lignée a été baptisée AChE. EXEMPLE 2 : Détection de l'activité enzymatique acétylcholinestérase chez le mutant AChE. A. MATERIE ET METHODES La détection de l'AChE est réalisée après fixation pendant 6 à 8 heures. Les embryons sont incubés 4 à 6 heures dans une solution dont les concentrations finales sont : 60 mM sodium acétate pH 6.4, 5 mM sodium citrate, 4.7 mM CuS04,0. 5 mM K3 (Fe (CN) 6) et 1.7 mM acétylthyiocholine. Les embryons sont ensuite rincés dans du PBST (PBS, 0.1 % Tween 20). B. RESULTATS B1. Origine de l'absence d'activité. Déficit d'activité dans les embryons-/-et les adutes +/-. Les premières observations montrent que des mutants AChE sont immobiles à partir de 3 jours et qu'ils meurent au gème jour environ. Les mutants possédant une mutation récessive létale, la lignée est entretenue à partir des individus hétérozygotes que l'on croise entre eux pour obtenir des embryons mutants homozygotes. Pour confirmer la relation entre l'absence d'activité AChE mise en évidence à 24 heures et le phénotype d'immobilité observé plus tardivement dans les embryons, nous avons mesuré l'activité cholinestérasique dans des extraits protéiques in vitro. Des extraits protéiques ont été préparés à partir d'embryons d'une ponte de parents AChE +/-. Les embryons ont été triés selon leur phénotype de mobilité à 3 et 4 jours. Pour les deux phénotypes l'activité globale est mesurée à partir d'un extrait de 10 embryons, et l'expérience répétée dans 4 pontes indépendantes. Les résultats présentés dans la figure 2 montrent qu'aucune activité AChE n'est détectée dans les embryons immobiles alors qu'elle est présente dans les embryons mobiles. Parmi les embryons mobiles, composés d'1/3 d'embryons sauvages et de 2/3 d'hétérozygotes, aucune distinction de phénotype n'est visible. En parallèle, la direction de l'activité AChE dans les embryons entiers immobiles confirme l'absence de marquage précédemment observé. Le taux d'activité AChE dans les adultes sauvages ou hétérozygotes a ensuite été étudié. Pour distinguer leur génotype nous avons utilisé un test de croisement et observé leur descendance F1 ; seuls les couples hétérozygotes produisent des embryons immobiles-/-. Si les embryons F1 ont tous un phénotype sauvage, au moins un des deux parents est sauvage. Ensuite, pour chaque individu testé, l'activité spécifique de l'AChE a été mesurée dans un extrait protéique normalisé par rapport à la concentration protéique totale. L'AChE a été ainsi quantifiée pour 10 poissons. Parmi ceux-ci, deux couples contenaient au moins un parent sauvage d'après le résultat des croisements. D'après l'activité spécifique AChE mesurée nous avons défini deux classes. La comparaison avec le résultat des croisements nous a permis de déduire que les adultes hétérozygotes possédaient moitié moins d'activité AChE que les adultes sauvages. L'activité moyenne pour les 8 adultes +/-et les 2 adultes +/+ identifiés est indiquée sur la figure 2B. Ces résultats relient clairement l'absence d'activité AChE avec le phénotype d'immobilité dans les embryons mutants-/-. La transmission mendélienne du caractère présence ou absence d'activité AChE indique qu'un locus unique est à l'origine du phénotype. EXEMPLE 3 : Expression de l'ARNm de l'acétylcholinestérase chez les mutants AChE A. MATERIEL ET METHODES Une sonde ARN antisens est réalisée à partir de l'ADNc codant avec incorporation de nucléotide UTP couplés à la digoxigenin (DIG). Les embryons sont fixés durant 12-16 heures dans la paraformaldéhyde 4%, rincés dans le PBST. Les embryons sont ensuite préincubés 1 heure à 65 C dans le tampon HYB puis on ajoute lui de sonde à 450 ui de tampon HYB et on incube les embryons durant la nuit. Rinçages à 65 C : 2x30'50% formamide-50% 2xSSC-0. 1 % Tween 20TM 1x15'2XSSC-0. 1% Tween 20TM 2x30'0. 2Xssc-0. % Tween 20TM Puis on incube les embryons dans la solution de blocage pendant 3-4 heures à température ambiante et on incube les embryons durant la nuit avec les anticorps anti-DIG dilués 1/4000. On rince les embryons 6 fois 15 minutes dans le PBST puis 2 fois 5 minutes dans le tampon de coloration et on révèle avec du NBT (3.5 pi/ml) et du BCIP (3. 5 pllml) dans le tampon de coloration. Tampon HYB : 50% formamide, 5XSSC, 500 mg/ml Yeast RNA, 0.1% Tween 20TM, 9 mM acide citrique. Tampon blocage anticorps : 1 x PBS, 0. 1% Tween 20TM, 0, 2% BSA, 1% DMSO. Tampon de coloration : 100 mM Tris pH9, 5, 50 mM MgCI2, 100 mM NaCI, 0. 1% Tween 20. B. RESULTATS Les expériences d'hybridation in situ au stade 12 somites et à 24 heures ne montrent aucune différence de marquage des ARNm de l'AChE entre les embryons. Ceux-ci, observés sous loupe binoculaire ou au microscope, présentent un profil d'expression sauvage dans les différents tissus. Pour vérifier l'intégrité des transcrits (forme sauvage ou tronquée), il a été réalisé des transcriptions inverses avec un oligo-dT sur les ARNm extraits d'embryons immobiles (30 embryons âgés de 3 jours) et les PCRs suivantes à l'aide d'oligonucléotides couvrant toute la séquence de l'ADNc. Ces expériences ont montré que la totalité de i'ARNm AChE est présent dans les embryons mutants immobiles. Le déficit d'activité dans les embryons AChE-/-ne semble pas dû à un défaut de régulation de la transcription, ni à une coupure ou à une instabilité des ARNm de l'AChE. EXEMPLE 4 : Caractérisation de la mutation sur les mutants AChE Clonage de MDNc d'acéfylcholinestérase dans les mutanfs Le produit des trois expériences de RT-PCRs indépendantes ont été séquencés et la séquence protéique déduite comparée à la séquence sauvage. La seule variation identifiée correspond à la sérine 226 de la protéine sauvage qui est transformée en asparagine. Nous avons donc vérifié, in vitro et in vivo, si la mutation S226N pouvait expliquer le phénotype du mutant AChE. La sérine 226 est conservée dans toutes les cholinestérases de vertébrés et d'invertébrés. L'alignement de 250 séquences de protéines du bloc C, y compris les cholinestérases, des carboxylestérases et des protéines d'adhésion cellulaire (électrotactines), a révélé l'extrême conservation de la sérine 226. Un alignement de 41 de ces séquences est présenté à la figure 3. Dans la structure 3D de la sous-unité d'AChE la chaîne latérale de la sérine 226 pointe vers la sérine 200 du site actif. La mutation S226N modifie l'encombrement stérique mais aussi la polarité de la chaîne latérale. D'après un modèle informatique en trois dimensions, N226 pourrait établir une liaison hydrogène avec le glutamate 327 du site actif et entraîner ainsi la perte de l'activité. Jusqu'à présent aucune étude de mutagenèse n'a impliqué le résidu 226 dans l'activité de l'enzyme. Il serait intéressant de remplacer la sérine polaire par un résidu non polaire de taille équivalente telle que la leucine pour vérifier l'implication des liaisons hydrogènes dans la perte de l'activité catalytique. EXEMPLE 5 : Expression d'une AChE active chez les mutants AChE A. MATERIELS ET METHODES Les cartes des plasmides utilisés sont représentés respectivement dans les figures 7 et 8. Le gène de l'AChE digéré aux sites Scal et Xhal a été introduit dans les sites EcoRV et Xbal du vecteur pcDNA3 (Invitrogen). Les sites EcorV et Scal ne sont plus fonctionnels. L'expression est dirigée par le promoteur du CMV. B. RESULTATS L'acétylcholinestérase sauvage recombinante peut être produite dans les embryons mutants. Pour vérifier la capacité des embryons AChE -1- à produire l'AChE, nous avons comparé l'activité de l'AChE sauvage ou mutante après injection des constructions pC-AChE et pC-S226N. Ces plasmides ont été co-injectés avec un plasmide codant pour la GFP dans les embryons d'une ponte de parents AChE hétérozygotes. La coloration de l'activité cholinestérasique à 24 heures permet d'une part, d'identifier le génotype des embryons (absence ou présence d'AChE endogène normale), et d'autre part de vérifier l'expression des constructions. Dans les embryons homozygotes-/-injectés avec i'AChE sauvage on détecte l'activité de l'enzyme dans de nombreux tissus (figure 4A). L'AChE wt est alors exprimée notamment dans les motoneurones, les neurones sensoriels et des fibres musculaires des mutants. Par contre, aucune activité n'a pu être visualisée dans les embryons injectés avec la construction S226N (figure 4B). Ce résultat indique que les embryons mutants sont capables d'exprimer la protéine d'AChE. L'expression d'enzyme sauvage dans les embryons mutants ne permet pas de restaurer le mouvement probablement en raison du faible nombre de cellules exprimant l'enzyme. Le clonage du gène de l'AChE du mutant et son expression in vitro et in vivo ont confirmé l'origine du phénotype immobile comme étant un déficit spécifique en activité cholinestérasique, lié à la mutation de la sérine 226 en asparagine. Le phénotype des embryons homozygotes mutants a alors été analysé plus en détail. EXEMPLE 6 : Caractérisation du phénotype du mutant AChE 6. 1 Tétanie musculaire et paralysie progressive du tronc Les mouvements des embryons, d'une ponte de parents hétérozygotes, ont été observés à différents stades sous loupe binoculaire. Nous avons noté une altération caractéristique du mouvement dans 22, 7% + 3,2 des embryons à 48 heures (n = 1346 embryons, sur 6 pontes indépendantes). A 17 heures, tous les embryons sont soumis à des contractions involontaires. Après 24 heures les embryons sont capables de mouvements réflexes brefs après stimulation et, une différence de comportement est visible à partir de 26 heures de développement. Lorsque les embryons sont soumis à une stimulation lactile, par exemple au cours du retrait du chorion, la réponse des embryons sauvages consiste en un ou deux battements de queue puis un retour à l'état relâché alors que les embryons mutants restent contractés à la suite du dernier battement et se relâchent plus lentement. De plus, es contractions des embryons mutants ne sont jamais aussi amples que celles des embryons sauvages. Ce phénotype devient clairement visible à partir de 30 heures et s'accentue progressivement : les battements sont remplacés par des crampes tétaniques prolongées qui sont suivies d'une période d'inactivité complète (paralysie) même sous stimulation. A 48 heures un embryon sauvage soumis à une stimulation tactile, au niveau de la jonction entre la tête et le tronc, est capable d'élaborer un mouvement coordonné de fuite par contraction violente du tronc du côté opposé à la stimulation. La vidéo-microscopie au ralenti, sur des embryons sauvages immobilisés par la tête et le tronc antérieur, permet d'observer cette contraction latérale réflexe, suivie d'une période de nage (figure 5A). Dans les embryons homozygotes AChE, la réponse est très faible : une contraction unilatérale, du côté opposé à la stimulation, est suivie d'une période brève de battements alternatifs droite/gauche, limitée à la partie terminale de la queue (figure 5A). La réponse diminue au cours du temps et à 3 jours la plupart des embryons AChE -/- sont immobiles et adoptent une posture cambrée avec la queue pointant dorsalement en suivant l'axe de l'embryon (figure 5B). Dans les embryons mutants, comme dans les embryons sauvages traités aux inhibiteurs des cholinestérases (voir résultats, 2ème partie), le déficit en activité AChE entraîne probablement une augmentation de la concentration d'ACh aux synapses et provoque, à court terme, des contractions tétaniques suivies de périodes d'immobilité. A long terme, on observe une paralysie complète des embryons. 6.2 Description morphologique. Les embryons mutants de 24 heures ont à première vue un aspect normal. Le coeur bat et le sang circule normalement. Aucune différence morphologique n'a été notée pour les cellules sanguines dans les embryons sauvages ou mutants à 5 jours de développement. Les nageoires se développent de façon normale jusqu'à 3 jours cependant chez les mutants elles s'atrophient ensuite progressivement. De façon générale, à l'exception des contractions tétaniques, les embryons homozygotes mutants présentent un phénotype sauvage jusqu'à environ 2 jours où les muscles commencent à dégénérer. Les résultats présentés à la Figure 6 montrent, en microscopie photonique, que la biréfringence des muscles est très diminuée chez les mutants ache-/- (Figure 6 B), par rapport aux poissons sauvages (Figure 6A). De plus, en microscopie électronique, on peut observer que, chez les mutants, les myofibrilles sont envahies par un sarcoplasme fortement vacuolisé et que l'enveloppe nucléaire est distendue et est fortement vacuolisée (Figure 6 D). EXEMPLE 7 : Inactivation du gène de l'AChE à l'aide d'ARN antisens Les oligonucléotides de type morpholino sont commercialisés par la Société GENETOOLS LLC. Ils ont été resuspendus en solution et injectés à une concentration de 1 mM comme décrit par Nasevicius et EKKER (2001). La séquence de l'oligonucléotide antisens MO-ache est 5'- CTGAGGTCTTCATGGCTTCTTTTCA-3' (SEQ ID n01) et celle de l'oligonucléotide témoin, MO-co est 5'CCATATCGGAGTATACGATCTCCAT-3' (SEQ ID N 2). EXEMPLE 8 Procédés de criblage in vivo de l'activité non spécifique de composés inhibiteurs de l'AChE. L'absence de BchE chez le poisson zèbre rend le modèle du mutant AChE tout à fait unique et particulièrement utile pour tester les effets des inhibiteurs des cholinestérases. Notamment il serait possible d'étudier le pouvoir tératogénique des composés organophosphorés et carbamates commerciaux utilisés comme insecticides et pesticides. Par cette approche, il est aussi possible de détecter d'autres cibles éventuelles des drogues anticholinestérasiques utilisées en thérapie humaine dans le traitement des maladies de neuro-dégénérescence du type de la maladie d'Alzheimer. Les tests de toxicité peuvent être effectués par simple bain des embryons et l'analyse du phénotype réalisé sous loupe binoculaire. Tout phénotype anormal induit dans les embryons AChE pourra être attribué à des effets non spécifiques des inhibiteurs puisque ces embryons n'ont pas d'activité AChE. 8.1 Mise en oeuvre d'un procédé de criblage selon l'invention avec l'ésérine L'effet de l'ésérine sur les embryons d'une ponte de parents hétérozygotes mutants a été testé. A une concentration de 10-3 M, tous les embryons présentent le même phénotype : ils sont totalement immobiles et meurent à 4-5 jours de développement. Ce résultat montre que les effets de l'ésérine ne sont pas restreints à l'inhibition de l'AChE dans les embryons. Par exemple, in vitro, l'ésérine est capable de se lier au récepteur de l'acétylcholine sur deux sites d'affinité distincte. La liaison de l'ésérine sur le site de haute affinité (50 uM) permet une activation du récepteur et l'ouverture du canal, alors que la fixation sur le site de faible affinité (Kd de l'ordre du mM) agit comme un bloquant en se fixant sur le récepteur activé par l'Ach (OKONJO et al., 1991). L'immobilité complète des embryons AChE -/- en présence de fortes concentrations d'ésérine est donc un effet non spécifique de l'inhibition de l'AChE, probablement par désensibilisation et inactivation du récepteur. 8.2 Mise en oeuvre d'un procédé de criblage selon l'invention avec le DFP. Chez les embryons de poissons Danio rerio sauvages, le DFP induit de graves altérations dans le développement des somites. En revanche, chez les mutants AChE, aucune altération détectable dans le développement des somites n'a été observée. Ces résultats montrent que les effets délétères du DFP ne sont pas spécifiques de son action inhibitrice sur l'AChE et que les effets indésirables du DFP se produisent sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase. Des tests d'intoxication chronique peuvent être effectués, de façon identique, sur des poissons adultes hétérozygotes qui possèdent deux fois moins d'activité AChE que les poissons sauvages. Chez les adultes l'étude détaillée des différents tissus pourra révéler les effets périphériques des inhibiteurs. REFERENCES : BERTRAND C, (2001, The Journal of Biological Chemistry, vol. 276 (1) : 464-474. CHATONNET, A. HOTELIER T. et COUSIN, X. (1999) Kinetic parameters of cholinesterase interactions with organophosphates : retrieval and comparison tools available through ESTHER data base. ESTerases, alpha/beta Hydrolase Enzymes and Relatives. Chem. Biol. Interact 120,567-76. DREWS, U. (1975) Cholinesterase in embryonic Development. Prog. 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Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase ont été inactivées. 3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que les composés inhibiteurs sont des composés pesticides ou insecticides. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que les composés inhibiteurs sont des composés organophosphorés ou des composés possédant au moins un groupement carbamate. 5. Procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio, dans le génome duquel les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase ont été inactivées, avec le composé inhibiteur à tester ; b) comparer les caractéristiques de développement de l'embryon de l'étape a) avec les caractéristiques de développement d'un embryon témoin identique, qui n'a pas été mis en présence du composé inhibiteur ; 6. Procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acetylcholinesterase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio, dans le génome duquel une copie du gène codant acétylcholinestérase a été inactivée, avec le composé inhibiteur à tester ; b) mettre en contact un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio dont les deux copies du gène codant acétylcholinestérase sont fonctionnelles avec le composé inhibiteur à tester. c) comparer les caractéristiques de développement de l'embryon de l'étape a) avec celles de l'embryon de l'étape b). 7. Procédé de criblage selon l'une des revendications 5 à 6, caractérisé en ce que les caractéristiques de développement incluent le degré de mobilité, le développement des somites, les battements du coeur, la circulation du sang, la morphologie des cellules sanguines, le développement des nageoires, la forme de la tête, la taile des yeux, le développement de la mâchoire et du squelette pharyngé, l'ouverture de la bouche (observation de la structure des arches branchiales), la formation de la vessie natatoir, la pigmentation en particulier au niveau des cellules pigmentaires dérivées des crêtes neurales, le développement du système nerveux central et du système nerveux périphérique, le développement du cerveau postérieur, en paticulier la fermeture du tube neural, et en général tous les problèmes de différenciation des structures du système nerveux central et du système nerveux périphérique, ainsi que les caractéristiques du développement musculaire tel que le développement des somites, notamment des somites terminaux de la queue. 8. Procédé de criblage selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que la détermination des caractéristiques de développement de l'embryon est réalisée à des intervalles de temps prédéterminés, à partir de l'instant de fécondation de l'oeuf. 9. Procédé de criblage selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que la détermination des caractéristiques de développement de l'embryon est réalisée jusqu'au temps 48 heures suivant l'instant de fécondation de l'oeuf. 10. Procédé de criblage in vivo de l'effet non spécifique de surdosage d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase, sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un poisson adulte de l'espèce Danio rerio, dans le génome duquel une seule copie du gène codant l'acétylcholinestérase a été inactivée, avec le composé inhibiteur a tester ; b) comparer les caractéristiques du poisson traité conformément à l'étape a) avec les caractéristiques d'un poisson adulte de l'espèce Danio rerio, dans le génome duquel les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont fonctionnelles et qui a été mis en contact avec le composé inhibiteur. 11. Procédé de criblage selon l'une des revendications 5 à 10, caractérisé en ce que les caractéristiques de développement de l'embryon ou les caractéristiques du poisson adulte incluent la détection de l'expression ou du niveau d'expression de gènes d'intérêt. 12. Procédé d'obtention d'un poisson de l'espèce Danio rerio, dans lequel au moins une copie du gène codant acétylcholinestérase est inactivée, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) mettre en contact des poissons mâles de l'espèce Danio rerio, dont les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont fonctionnelles, avec un composé mutagène, de préférence l'éthyl-nitroso-urée ; b) croiser les poissons mâles obtenus à l'étape a) avec un poisson femelle Danio rerio sauvage dont les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont fonctionnelles, afin dobtenir des descendants de génération F1 ; c) croiser entre eux des mâles et des femelles de la génération F1 afin d'obtenir des descendants de la génération F2 ; d) croiser entre eux des mâles et des femelles de la génération F2 afin d'obtenir des descendants de la génération F3 dont certains d'entre eux possèdent les deux copies du gène codant l'acétylcholiestérase inactivées. 13. Procédé d'obtention d'un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio dont au moins une copie du gène codant acétylcholinestérase est inactivée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) croiser entre eux un poisson mâle et un poisson femelle obtenus par le procédé selon la revendication 12 ; b) récupérer les oeufs fécondés. 14. Poisson de l'espèce Danio rerio dont une copie du gène codant l'acteylcholineterase est inactivée, susceptible d'être obtenu par le procédé selon la revendication 12. 15. Embryon de poisson de l'espèce Danio rerio dont au moins une copie du gène codant acétylcholinestérase est inactivée, susceptible d'être obtenu par le procédé selon la revendication 13. 16. Embryon selon la revendication 15, caractérisé en ce que les deux copies du gène codant acétylcholinestérase sont inactivées. 17. Poisson selon la revendication 14 ou embryon selon l'une des revendications 15 ou 16, caractérisé en ce qu'une copie du gène codant acétylcholinestérase ou les deux copies de ce gène comporte la substitution d'un nucléotide résultant en la production d'une acetylcholinesterase catalytiquement inactive dont le résidu d'acide aminé Sérine en position 226 de la séquence de l'enzyme est remplacé par un résidu d'acide aminé Asparagine.