Brevet FR2826019A1 — publié le 20021220

La présente invention concerne un milieu de culture chromogène destiné à mettre en évidence les entérocoques. Dans le domaine clinique, la détection des entérocoques s'avère extrêmement importante, en raison de l'apparition de souches résistantes aux antibiotiques, notamment à la vancomycine, l'antibiotique le plus utilisé pour traiter les infections. Ces infections nosocomiales peuvent ainsi mettre en danger la vie des patients atteints. Il est donc important de disposer d'un test fiable et rapide permettant de détecter les contaminations par ces bactéries, lequel test devant être à la fois sensible et spécifique. Les entérocoques croissent de façon générale dans des gammes de température de 100 à 45OC, la croissance optimale étant autour de 35 C, sur milieu non sélectif (agar à base de sang ou agar chocolat). Toutefois, un tel milieu permet également la croissance d'autres bactéries et ne permet pas de distinguer effectivement les entérocoques. Il existe aujourd'hui certains milieux de culture pour la détection des entérocoques, notamment le milieu MacConkey Agar, sans Cristal Violet, vendu par Difco. Le Cristal Violet est un composé inhibant la croissance des bactéries Gram positives, dont on considère qu'il inhibe la croissance des entérocoques et des staphylocoques (rappelons que les entérocoques sont des coques à Gram positif, se présentant de manière isolée ou en paires ou en courtes chaînes). Ce milieu contient également d'autres inhibiteurs de croissance, tels des sels biliaires. Ces autres inhibiteurs sont efficaces pour inhiber la croissance de bactéries Gram positives, mais pas des entérocoques. En effet, les bactéries entérocoques peuvent également croître dans des milieux contenant des sels biliaires, les colonies ne se dissolvant pas après exposition à la bile. On peut aussi faire croître les bactéries dans un milieu contenant une concentration de 6,5% en NaCI. De ces constatations, on peut conclure que le Cristal Violet est un inhibiteur de croissance des entérocoques, dès 1 mg/ml. Cette hypothèse est renforcée par le fait que parmi les différents milieux MacConkey, celui utilisé pour détecter les entérocoques ne contient pas de Cristal Violet, mais contient des sels biliaires. Toutefois, ce milieu permet aussi la croissance des staphylocoques. Il convient de noter que la méthode la plus couramment utilisée pour la détection des entérocoques consiste en une technique de filtration sur un milieu sélectif (tel que le milieu m-Enterococcus agar = milieu de Slanetz et Bartley ou le milieu acide oxolinique-esculine-azide = milieu OAA) suivie d'une confirmation par culture sur une gélose bile-esculine incubée 48 heures à 44 C. L'effet sélectif peut être renforcé en incubant le milieu de Slanetz et Bartley à 41 C. Le plus souvent, l'identification complète n'est pas réalisée et seule la recherche de la catalase est effectuée afin d'éliminer certaines souches de staphylocoques capables de se développer sur les milieux utilisés. Il convient donc de disposer d'un milieu permettant la détection des entérocoques qui permette également de les différentier des staphylocoques, qui poussent en général sur les milieux de culture des entérocoques. Dans le cadre de la présente invention, il a été montré qu'il est possible d'ajuster la concentration de Cristal Violet de telle manière que celui-ci garde son rôle d'inhibition de croissance pour la plupart des bactéries Gram positives, et notamment des staphylocoques, tout en permettant la croissance des entérocoques. Ainsi, les milieux de l'art antérieur (notamment le milieu MacConkey Agar vendu par les laboratoires Difco) utilisent généralement une concentration de Cristal Violet égale à 1 mg/l. Dans le cadre de la présente invention, il a été montré que l'ajout de Cristal Violet à une concentration de 0,1 jusqu'à environ 1,5 mg/l permet de maintenir la croissance des entérocoques, notamment lorsque le milieu ne contient pas d'autres inhibiteurs de croissance pour bactéries Gram positives. Ce résultat, et notamment le fait que la concentration en Cristal Violet puisse être supérieure à 1 mg/l dans certaines conditions tout en permettant la croissance des entérocoques, ne pouvait être prévu à la lumière des connaissances décrites dans l'art antérieur. Ainsi, la présente invention a pour objet un milieu de culture pour la détection et/ou la discrimination des entérocoques, caractérisé en ce qu'il comporte, dans un milieu de culture pour entérocoques, du Cristal Violet à une concentration permettant la croissance des entérocoques et l'inhibition de croissance de la plupart des bactéries Gram positives. De préférence, ladite concentration est supérieure à 0,1 mg/l, de façon plus préférée, supérieure à 0,25 mg/l. Ainsi, l'on observe une inhibition de croissance d'une quantité importante de bactéries Gram positives après ajout de Cristal Violet à une concentration aussi basse que 0,1 mg/l. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite concentration est inférieure à 1,5 mg/l, de façon plus préférée inférieure à 1 mg/l. Lorsque la concentration en Cristal Violet est à environ 1 mg/l ou supérieure à cette valeur, il convient alors de réduire, voire de supprimer les autres inhibiteurs de bactéries Gram positives, notamment les sels biliaires. Il est à la portée de l'homme du métier que d'ajuster les concentrations en inhibiteurs en fonction de la concentration en Cristal Violet ajouté dans le milieu selon l'invention. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la concentration en Cristal Violet est inférieure à 0,8 mg/l, de façon plus préférée, inférieure à 0,7 mg/l. A de telles concentrations, on peut rajouter éventuellement d'autres inhibiteurs de bactéries Gram positives. L'homme du métier sait ce que signifie le terme milieu de culture pour entérocoques , c'est-à-dire un milieu de culture contenant les nutriments nécessaires pour permettre la croissance de ces bactéries. On cite notamment de la peptone de caséine, de soja, de viande, de l'extrait de levure ou de boeuf, du dextrose... De façon préféré, le milieu selon l'invention comprend en outre au moins un agent chromogène, substrat d'une enzyme de fermentation des sucres, ladite enzyme étant, de préférence, une glucosidase, notamment la ss-glucosidase ou une galactosidase, notamment la ss-galactosidase. Le fait que l'on puisse ajouter un agent chromogène est tout à fait inattendu, dans la mesure où le Cristal Violet colore déjà les milieux selon l'invention, ce qui dissuade donc de rajouter un élément apportant une couleur, tel un agent chromogène. De préférence, ledit agent chromogène libère, par hydrolyse, un chromophore précipitable choisi parmi les dérivés indoxyle, halogéno-indoxyle (bromo-indoxyle, chloro-indoxyle, fluoro-indoxyle, iodo-indoxyle, dichloro- indoxyle, chloro-bromo-indoxyle, tri-chloro-indoxyle), méthyl-indoxyle, ou hydroxy-quinoline, en particulier les dérivés suivants : 6-chloro-indoxyle, 5-bromoindoxyle, 3-bromo-indoxyle, 6-fluoro-indoxyle, 5-iodo-indoxyle, 4,6-dichloroindoxyle, 6, 7-dichloro-indoxyle, 5-bromo-4-chloro-indoxyle, 5-bromo-6-chloroindoxyle, 4,6, 7-trichloro-indoxyle, N-méthyl-indoxyle ou 8-hydroxy-quinoline. De préférence, ledit agent chromogène substrat de la ss-glucosidase est un indoxyl-glucoside, notamment le 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-ss-glucoside et/ou ledit agent chromogène substrat de la ss-galactosidase est un indoxyl-galactoside, en particulier le 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl-ss-galactoside. Afin de mieux permettre la détection des entérocoques, on peut également rajouter, dans le milieu de culture selon l'invention, des inhibiteurs de croissance pour les bactéries Gram négatives, tels l'acide nalidixique ou la colistine. Afin de détecter les entérocoques atypiques résistants à certains antibiotiques, et responsables en grande partie des infections nosocomiales, on peut aussi rajouter lesdits antibiotiques dans les milieux selon l'invention. On rajoutera ainsi de la vancomycine à une concentration d'environ 6 mg/1. Notons que l'on peut détecter la proportion de bactéries résistantes dans un échantillon en effectuant un étalement sur une boîte sans antibiotiques et une boîte les comprenant et en comparant le nombre de colonies identifiées comme entérocoques sur chaque boîte. L'invention se rapporte également à l'utilisation d'un milieu de culture selon l'invention pour la détection et/ou la discrimination des entérocoques, ainsi qu'à un procédé de détection et/ou discrimination des entérocoques dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : a. inoculer un milieu de culture selon l'invention avec ledit échantillon ou un inoculum dérivé de l'échantillon, b. détecter la présence d'entérocoques sur ledit milieu de culture. On détecte la présence des entérocoques par la croissance des colonies sur le milieu, et l'on est aidé par leur coloration après libération du chromophore à partir du chromogène substrat de l'enzyme. On choisit de préférence un chromophore ayant une longueur d'onde différente de la longueur d'onde du Cristal Violet, afin de l'identifier plus facilement. Toutefois, le milieu selon l'invention permet également l'utilisation et la détection de chromophores ayant une longueur d'onde proche de la longueur d'onde du Cristal Violet. D'une façon générale, l'invention se rapporte aussi à un milieu de culture pour la détection de bactéries Gram positives ou Gram négatives, comprenant, outre des facteurs de croissance pour lesdites bactéries Gram positives ou Gram négatives, un agent chromogène et du Cristal Violet, le Cristal Violet étant présent à une concentration permettant la croissance desdites bactéries que l'on cherche à détecter et l'inhibition différentielle de croissance des bactéries Gram positives, ladite concentration étant comprise de préférence entre 0,1 et 1,5 mg/l. L'invention concerne aussi l'utilisation du Cristal Violet en tant qu'agent inhibiteur sélectif de croissance pour la préparation d'un milieu de culture pour la détection de bactéries Gram positives ou Gram négatives, contenant en outre un agent chromogène. L'invention a donc démontré que l'on peut ajouter un colorant dans un milieu chromogène, tout en gardant les propriétés du chromogène. Le chromogène est choisi de telle sorte que le chromophore libéré possède une longueur d'onde différente de celle du Cristal Violet ou du colorant utilisé dans le milieu chromogène. EXEMPLES Exemple 1 Un milieu préféré pour la mise en oeuvre de l'invention comprend (pour un litre) : - Agar 15 g - Extrait de levure et peptones 9 g - NaCl 5 g - Acide Nalidixique 50 mg - Colistine 5 mg - Cristal Violet 0,5 mg - 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-p-glucoside 50 mg Exemple 2 L'étalement de bactéries sur le milieu selon l'invention a donné les résultats suivants (24 heures d'incubation à 37 C). Croissance Couleur Entérocoques + bleu-mauve Staphylocoques L'utilisation du milieu selon l'invention permet donc de détecter les entérocoques, et de les discriminer des staphylocoques. Revendications 1. Milieu de culture pour la détection et/ou la discrimination des entérocoques, caractérisé en ce qu'il comporte, dans un milieu de culture pour entérocoques, du Cristal Violet à une concentration permettant la croissance des entérocoques et l'inhibition de croissance de la majorité des bactéries Gram positives, ladite concentration étant comprise entre 0,1 et 1,5 mg/l. 2. Milieu de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un agent chromogène, substrat d'une enzyme de fermentation des sucres. 3. Milieu selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite enzyme est une glucosidase, notamment la ss-glucosidase ou une galactosidase, notamment la ss- galactosidase. 4. Milieu de culture selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que ledit agent chromogène libère, par hydrolyse, un chromophore précipitable choisi parmi les dérivés indoxyle, halogéno-indoxyle (bromo-indoxyle, chloro-indoxyle, fluoro- indoxyle, iodo-indoxyle, dichloro-indoxyle, chloro-bromo-indoxyle, tri-chloro- indoxyle), méthyl-indoxyle, ou hydroxy-quinoline, en particulier les dérivés suivants : 6-chloro-indoxyle, 5-bromo-indoxyle, 3-bromo-indoxyle, 6-fluorindoxyle, 5-iodo-indoxyle, 4, 6-dichloro-indoxyle, 6, 7-dichloro-indoxyle, 5bromo-4-chloro-indoxyle, 5-bromo-6-chloro-indoxyle, 4, 6, 7-trichloro-indoxyle, N-méthyl-indoxyle ou 8-hydroxy-quinoline. 5. Milieu de culture selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que ledit substrat de la ss-glucosidase est un indoxyl-glucoside, et/ou ledit substrat de la ss-galactosidase est un indoxyl-galactoside. 6. Milieu de culture selon la revendication 5, caractérisé en ce que le substrat de la P-glucosidase est le 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-ss-glucoside et/ou le substrat de la ss-galactosidase est le 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl-ss-galactoside. 7. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il contient également des inhibiteurs de croissance pour les bactéries Gram négatives. 8. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend (pour un litre) : - Agar 15 g - Extrait de levure et peptones 9 g - NaCI 5g - Acide Nalidixique 50 mg - Colistine 5 mg - Cristal Violet 0,5 mg - 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-p-glucoside 50 mg 9. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 8, contenant en outre des antibiotiques. 10. Utilisation d'un milieu de culture tel que défini dans l'une des revendications 1 à 9 pour la détection et/ou la discrimination des entérocoques. 11. Procédé de détection et/ou discrimination des entérocoques dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : a. inoculer un milieu de culture tel que défini dans l'une des revendications 1 à 9 avec ledit échantillon ou un inoculum dérivé de l'échantillon, b. détecter la présence d'entérocoques sur ledit milieu de culture. 12. Milieu de culture pour la détection de bactéries Gram positives ou Gram négatives, comprenant, outre des facteurs de croissance pour lesdites bactéries Gram positives ou Gram négatives, un agent chromogène et du Cristal Violet, à une concentration permettant la croissance desdites bactéries que l'on cherche à détecter et l'inhibition différentielle de croissance des bactéries Gram positives, ladite concentration étant comprise entre 0,1 et 1,5 mg/1. 13. Utilisation du Cristal Violet en tant qu'agent inhibiteur sélectif de croissance pour la préparation d'un milieu de culture pour la détection de bactéries Gram positives ou Gram négatives, contenant en outre un agent chromogène.