Brevet FR2827045A1 — publié le 20030110

Méthodes et Compositions pour la sélection et le développement de nouveaux agents pharmacologiques ou de nouveaux médicaments. La présente invention concerne des méthodes et compositions pour la sélection et le développement de nouveaux agents pharmacologiques ou de nouveaux médicaments possédant des propriétés ou des mécanismes d'action originaux. La présente invention décrit notamment la caractérisation et l'identification du rôle fonctionnel de plusieurs éléments constitutifs du système nerveux central, jouant un rôle dans le métabolisme ou le transport de l'acide xanthurénique (XA) ou impliqués dans la réception et/ou la transduction du signal médié par cette substance. Ces cibles sont de nouveaux outils pour la définition et la sélection de nouvelles substances chimiques de synthèse, interférant avec ces cibles et modulant les fonctions de XA pour en tirer des profits sur le plan pharmacologique ou médicamenteux. Le domaine d'application de l'invention est, en premier lieu, le traitement d'affections et de maladies neurologiques ou mentales. L'industrie pharmaceutique est à la recherche continuelle de nouvelles substances naturelles, présentes dans le cerveau, et dont le rôle fonctionnel est important pour la régulation et le contrôle de l'activité psychologique, psychoaffective, mentale, cognitive ou neurologique. La découverte de nouveaux mécanismes dans le domaine de la neurotransmission et de nouvelles cibles participant à ces mécanismes dans le système nerveux sont autant d'outils précieux pour la sélection de nouveaux médicaments dans des indications variées qui seront décrites plus loin. La présente invention décrit pour la première fois le rôle important d'une substance naturelle, l'acide xanthurénique, dans les phénomènes de neurotransmission au niveau central. Ce nouveau système de neurotransmission comporte un système métabolique de synthèse et d'élimination du transmetteur, des transporteurs, des récepteurs et des signaux intracellulaires allumés suite à la stimulation de ces récepteurs. Ces éléments constituent des "cibles" pouvant être modulées par des médicaments potentiels et utilisables pour l'identification, la sélection ou la caractérisation de composés biologiquement actifs. D'autre part, l'invention décrit également différents rôles fonctionnels de l'acide xanthurénique dans le cerveau (interférences avec d'autres neutransmetteurs, rôle dans certains protocoles comportementaux ou neuropharmacologiques) permettant d'envisager des domaines d'applications pharmacologiques et thérapeutiques nouveaux pour cette molécule, ses dérivés ou, plus généralement, les substances naturelles ou de synthèse fixées par les cibles décrites précédemment. Depuis le début des années 1980, le catabolisme du tryptophane a progressivement occupé un rôle de plus en plus important dans les recherches des causes et des traitements de désordres majeurs au niveau du système nerveux central (Orv. Hetil 1992 Jul 19 ; 133 (29) : 1803-1807). Ce sont essentiellement des produits comme l'acide quinolinique et l'acide kynurénique, métabolites du tryptophane, qui ont focalisé l'attention pour leurs profils pharmacologiques. Un déséquilibre dans la formation de ces métabolites, une synthèse ou une dégradation chroniquement altérées, pourraient être responsables de troubles fonctionnels du système nerveux central et des pathologies qui en résulteraient. S'agissant du XA, autre métabolite du tryptophane, différentes études ont rapporté des effets ponctuels du XA. Ainsi, un effet analgésique a été mentionné pour le XA (50 à 600 mg/kg i. p. ) chez le rat Sprague-Dawley, par utilisation des tests de la plaque chaude et du tail flick (Pharmacol Res. 1998 oct ; 38 (4) : 243-250). D'autre part, chez l'animal, l'injection intrapéritonéale de XA a prolongé le temps de latence d'apparition des crises d'épilepsie induites par les injections intracérébroventriculaires d'acide quinolinique, de strychnine ou de pentylènetétrazole. Il semblerait que l'excrétion accrue de XA réponde à un processus de compensation chez les patients manifestant différents stades d'épisodes convulsifs (J. Neural. Transm. 1983 ; 56 (2-3) : 177-185 ; Clin. Endocrinol (Oxf) 1997 Dec ; 47 (6) : 667-677). Après ingestion de tryptophane (5g), l'excrétion urinaire (24h) de XA est nettement augmentée chez les patients déprimés (Psychopharmacology (Berl) 1981 ; 75 (4) : 346-349 ; Acta Psychiatr Belg 1979 Nov-Dec ; 79 (6) 638-646). D'autres résultats montrent cependant que l'injection ICV de XA, ne modifie pas le tracé EEG chez le rat (Okayama Igakkai Zasshi 104 (5-6) : 471-482 1992), que l'injection, chez la souris, de XA n'induit pas de comportement de head twitches (Psychopharmacology (Berl) 1977 Mar 16 ; 51 (3) : 305-309), que le XA ne bloque pas les dépolarisations induites les acides aminés excitateurs (Brain Res. 1986 Aug. 20 ; 380 (2) : 297-302) et que le XA induit l'augmentation de l'expression d'une protéine chaperone du réticulum endoplasmique (Grp 94) et de calreticulin, provoquant une anomalie de conformation de certaines protéines. Les concentrations d'acide xanthurénique nécessaires pour induire ces problèmes en culture de cellules seraient de l'ordre de plusieurs millimolaires (H. Malina ; Biochemical and biophysical Research Communications, 265,600-605 (1999)). Toutefois, à ce jour, le rôle du XA demeure non caractérisé, son mode d'action et son rôle physiologique restent inconnus, l'existence d'un récepteur éventuel n'a pas été démontrée, et aucune stratégie thérapeutique basée sur cette molécule n'a été entreprise. La présente invention résulte de la description, la caractérisation et l'identification du rôle fonctionnel de plusieurs éléments constitutifs du système nerveux central, jouant un rôle dans le métabolisme ou le transport de l'acide xanthurénique (XA) ou impliqués dans la réception et/ou la transduction du signal médié par cette substance. Ces cibles sont de nouveaux outils pour la définition et la sélection de nouvelles substances chimiques de synthèse, interférant avec ces cibles et modulant les fonctions de XA pour en tirer des profits sur le plan pharmacologique ou médicamenteux. L'invention démontre plus particulièrement le rôle du XA dans le système nerveux central et son implication, en tant que neuro-transmetteur, dans de multiples mécanismes physio-pathologiques. L'invention montre notamment : - l'existence et les caractéristiques de la libération extracellulaire du XA dans le cortex, - l'existence d'un site de liaison de haute affinité pour cette substance dans le cerveau, modulé par les dérivés adényliques (adénosine, ADP, ATP), les ions cuivre et zinc, et l'acide kynurénique et ses dérivés, - l'existence d'interrelations fonctionnelles in vivo entre le XA et la dopamine cérébrale, - l'induction d'effets électrophysiologiques par le XA en quantités micromolaires sur certaines conductances ioniques membranaires de cellules exprimant les récepteurs XA, - la capacité d'agonistes synthétiques de XA d'induire un effet électrophysiologique du type de XA sur les cellules NCB-20 et, en particulier, de moduler la dopamine cérébrale in vivo, - la capacité d'antagonistes du XA, tels le NCS-486, d'antagoniser les effets électrophysiologiques induits par le XA ou ses agonistes, et en particulier d'inhiber l'activité dopaminergique du XA in vivo, et - les effets neuropharmacologiques in vivo spécifiques du XA, en application locale ou en administration systémique, qui induit sédation, anxiolyse, des effets dopaminergiques (exploitables dans plusieurs domaines tels que addiction aux drogues, maladie de parkinson, schizophrénie, troubles de l'humeur, etc. ), des effets antidépresseurs et des effets bénéfiques sur la mémoire et sur les interactions sociales. La présente demande démontre ainsi que le XA, pour lequel aucun rôle fonctionnel n'était connu jusqu'a présent dans le CNS, possède des propriétés largement en faveur d'un rôle de neurotransmetteur/neuromodulateur. Ce nouveau système de neurotransmission/neuromodulation représente un éventail de cibles potentielles (enzymes de synthèse et de dégradation de XA, sites récepteurs, sites de transport, sites de libération) pour des ligands ou composés, de synthèse ou d'origine naturelle, modulant l'activité de XA et représentant, de ce fait, des médicaments potentiels dans plusieurs domaines de la thérapeutique neurologique et mentale. La présente demande a donc pour objet l'utilisation d'un composé modulant l'activité de l'acide xanthurénique pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies du système nerveux. L'invention concerne également une méthode de traitement de pathologies du système nerveux, notamment central, comprenant l'administration à un sujet d'un composé modulant l'activité de l'acide xanthurénique. Un aspect particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé modulant spécifiquement l'activité de l'acide xanthurénique pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies du système nerveux, et dans une méthode de traitement correspondante. Le composé est dit spécifique lorsqu'il module d'abord l'activité du XA (e. g., son transport, son métabolisme ou l'activité du/des récepteurs XA) sans affecter directement, en première intention, de façon significative l'activité d'autres systèmes de neurotransmission/neuromodulation centrale. Bien entendu, la modulation du système XA central entraîne des répercussions et des adaptations dans d'autres systèmes, en particulier le système dopaminergique ou GABAergique, mais pas de manière substantielle dans le système sérotoninergique. Des composés spécifiques particuliers selon l'invention sont des composés capables de lier préférentiellement un récepteur XA sans lier, de manière spécifique ou substantielle, un récepteur sérotoninergique. Selon des variantes préférées de mise en oeuvre, l'invention a plus particulièrement pour objet : - l'utilisation d'un composé modulant l'activité de l'acide xanthurénique pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de l'anxiété, ainsi qu'une méthode de traitement correspondante ; - l'utilisation d'un composé modulant l'activité de l'acide xanthurénique pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de la dépression, ainsi qu'une méthode de traitement correspondante ; l'utilisation d'un composé modulant l'activité de l'acide xanthurénique pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de troubles de la mémoire ou des interactions sociales, ainsi qu'une méthode de traitement correspondante ; - l'utilisation d'un composé modulant l'activité de l'acide xanthurénique pour la préparation d'un médicament sédatif et/ou hypnotique, ainsi qu'une méthode de traitement correspondante ; - l'utilisation d'un composé modulant l'activité de l'acide xanthurénique pour la préparation d'un médicament destiné à moduler l'action dopaminergique, ainsi qu'une méthode de traitement correspondante ; Dans le contexte de l'invention, le terme traitement désigne le traitement préventif, curatif, palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, amélioration de la durée de vie, amélioration de la qualité de vie, ralentissement de la progression de la maladie), etc. Le traitement peut en outre être réalisé en combinaison avec d'autres agents ou traitements, notamment adressant les événements tardifs de la pathologie ou d'autres principes actifs. Comme indiqué ci-dessus, les composés utilisés sont préférentiellement des modulateurs spécifiques de l'activité XA. L'invention a aussi pour objet un procédé pour moduler les effets dopaminergiques du XA comprenant l'administration à un sujet d'un composé modulant l'activité de l'acide xanthurénique. L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un composé modulant l'activité de l'acide xanthurénique pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de maladies neurodégénératives, notamment de la maladie de Parkinson, d'Alzheimer ou de l'ALS, ou de maladies mentales, telles que la schizophrénie, ou encore de la dépendance à certaines drogues, notamment aux opiacées. L'invention concerne également un procédé pour moduler l'activité XA in vivo, comprenant l'administration à un sujet d'une quantité efficace d'un composé synthétique modulant l'activité XA. Dans le contexte de la présente demande, le terme modulation désigne soit une stimulation, soit une inhibition de l'activité XA. La stimulation peut être obtenue par l'utilisation de composés mimant l'activité de XA ou stimulant la quantité ou l'efficacité de XA. L'inhibition peut être partielle (e. g., une réduction de l'activité). Elle peut être obtenue en diminuant la quantité de XA présente ou en inhibant la capacité de XA à produire un effet biologique, ou en bloquant ou inhibant l'effet biologique induit par XA. De ce fait, au sens de la présente demande, le terme activité de l'acide xanthurénique désigne notamment la synthèse de ce composé, son transport, sa libération, son interaction avec un récepteur ou avec un partenaire, sa dégradation, un signal ou une voie métabolique activée ou régulée par XA, etc., c'est-à-dire l'activité du système utilisant le XA comme médiateur. Le composé modulant l'activité du XA peut donc être un agent modulant la synthèse du XA, un agent modulant le transport ou la libération du XA, un agoniste du XA, un antagoniste du XA, etc. Il peut s'agir également d'un composé modulant l'activité du site récepteur XA en agissant sur un site régulateur ou allostérique de ce récepteur. Selon un premier mode particulier de réalisation, le composé utilisé est un composé modulant la synthèse ou la régulation du XA. Un tel composé peut agir sur l'activité ou l'expression d'enzymes impliqués dans la biosynthèse de cette molécule ou de ses précurseurs, en particulier en particulier un composé modulant l'activité de la kynurénine 3-hydroxylase. Cet enzyme participe à la régulation de la production de XA, et sa modulation par des composés permet de moduler l'activité du XA, au sens de la présente demande. Des composés modulant l'activité ou l'expression de cet enzyme sont par exemple des molécules antisens, des inhibiteurs transcriptionnels, des ribozymes ou aptazymes, des anticorps anti-protéine, des composés chimiques ou peptidiques capables d'inhiber l'activité de l'enzyme, etc. Selon un autre mode particulier, le composé utilisé est un composé modulant la liaison de XA à un récepteur membranaire (e. g., un agoniste ou un antagoniste). Un agoniste est un composé présentant une affinité pour le site de liaison du XA, et produisant un signal analogue à celui produit par le XA. Un antagoniste est un composé présentant une affinité pour le site de liaison du XA, et empêchant la liaison et la production d'un signal par le XA ou un agoniste du XA. De tels composés peuvent être des analogues de XA, des anticorps anti-XA, des composés de synthèse, etc. De tels composés peuvent être identifiés, synthétisés, ou caractérisés par des méthodes décrites ci-après. Un autre composé utilisable selon l'invention est un composé modulant le transport du XA ou sa libération. De tels composés permettent, en réduisant ou en facilitant la libération de XA, de moduler localement l'activité du XA, au sens de l'invention. A cet égard, l'methanol module la libération de XA dans certaines régions du cerveau chez l'animal. D'autres molécules de synthèse, ayant dans certains cas des analogies structurales avec XA, peuvent interférer avec son transport vésiculaires ou via des transporteurs de la membrane plasmique. Un autre composé utilisable selon l'invention est un composé modulant la synthèse, le transport ou l'activité du récepteur du XA. De tels composés permettent, en réduisant ou en facilitant l'exposition de récepteurs XA, de moduler localement l'activité de cette molécule. Les composés modulant l'activité du XA selon l'invention peuvent être de nature et d'origine variées. Il peut s'agir des produits inorganiques ou organiques et notamment d'un polypeptide (ou une protéine ou un peptide), d'un acide nucléique, d'un lipide, d'un polysaccharide, d'un composé chimique ou biologique, etc. Le composé peut être d'origine naturelle ou synthétique et issu notamment d'une banque combinatoire. Les composés ou compositions selon l'invention peuvent être administrés de différentes manières et sous différentes formes. Ainsi, ils peuvent être injectés par voie systémique ou orale, de préférence systémique, comme par exemple par voie intraveineuse, intra-musculaire, sous-cutanée, trans-dermique, intra-artérielle, intracérébrale, intra-péritonéale, intracérébrovasculaire, etc. Pour les injections, les composés sont généralement conditionnés sous forme de suspensions liquides, qui peuvent être injectées au moyen de seringues ou de perfusions, par exemple. A cet égard, les composés sont généralement dissous dans des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Ainsi, les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. Des agents ou véhicules utilisables dans des formulations liquides et/ou injectables sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales, l'acacia, etc. Les composés peuvent également être administrés sous forme de gels, huiles, comprimés, suppositoires, poudres, gélules, capsules, etc., éventuellement au moyen de formes galéniques ou de dispositifs assurant une libération prolongée et/ou retardée. Pour ce type de formulation, on utilise avantageusement un agent tel que la cellulose, des carbonates ou des amidons. Il est entendu que le débit et/ou la dose injectée peuvent être adaptés par l'homme du métier en fonction du patient, de la pathologie, du mode d'administration, etc. Typiquement, les composés sont administrés à des doses pouvant varier entre 0.1 jjg et 1000 mg/kg de poids corporel, plus généralement de 0,01 à 500 mg/kg, typiquement entre 1 et 200 mg/kg. En outre, des injections répétées peuvent être réalisées, le cas échéant. D'autre part, pour des traitements chroniques, des systèmes retard ou prolongés peuvent être avantageux. A titre indicatif, les résultats présentés dans les exemples montrent que le XA exerce un effet sédatif lorsqu'il est administré chez l'animal à des doses supérieures à environ 50 mg/kg. Les doses préférées pour obtenir un effet anxiolytique chez l'animal sont des doses inférieures à 50 mg/mg. Un effet anti-dépresseur est avantageusement obtenu chez l'animal à des doses comprises entre 100 et 200 mg/kg. L'invention concerne également des méthodes pour identifier, sélectionner ou caractériser des composés biologiquement actifs, notamment de composés actifs sur le système nerveux, lesdites méthodes étant basées sur la modulation de l'activité du XA. Les méthodes de l'invention peuvent comprendre des tests de liaison in vitro, des tests de liaison en système cellulaire (ou sur des préparations membranaires, naturelles ou synthétiques) ou des tests fonctionnels en système cellulaire ou artificiels. Selon un mode particulier, une méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés selon l'invention comprend la mise en contact d'un composé test avec une cellule (ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique) exprimant une molécule cible impliquée dans l'activité de à l'acide xanthurénique, et la mise en évidence d'une liaison du composé test à ladite molécule. La molécule cible peut être le récepteur du XA, une enzyme de synthèse du XA, un transporteur du XA, etc., ou tout fragment de ceux-ci. Dans un exemple particulier, la molécule cible est le récepteur au XA ou un fragment de celui-ci, notamment un fragment conservant la capacité de liaison au XA, comme par exemple un fragment extracellulaire. Dans un autre mode de réalisation, la molécule cible est une enzyme de biosynthèse ou de régulation du XA, comme par exemple la kynurénine 3-hydroxylase. Une cible moléculaire préférée est représentée par le récepteur au XA ou des fragments de celui-ci. La liaison du composé test à la molécule cible peut être mise en évidence par exemple en utilisant un composé test marqué ou en utilisant un ligand marqué de la cible moléculaire (par exemple un ligand marqué du récepteur XA ou un anticorps marqué spécifique d'une enzyme de synthèse du XA ou d'un transporteur du XA), le déplacement de la liaison du ligand marqué reflétant la liaison du composé test. Le ligand marqué peut être tout produit liant la molécule cible (anticorps, agoniste ou antagoniste, fragment ou dérivé d'un ligand endogène, etc. ). Le ligand peut être marqué par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par incorporation d'un élément radioactif, fluorescent, luminescent, enzymatique, colorimétrique, etc. Dans un mode de réalisation particulier, le ligand est un anticorps marqué, spécifique de la cible moléculaire considérée. L'anticorps peut être polyclonal ou monoclonal. Il peut également s'agir d'un fragment ou dérivé d'anticorps, comme par exemple des fragments Fab, Fab'2, CDR, etc. Les anticorps peuvent être produits de manière conventionnelle, par immunisation la cible moléculaire (ou une partie immunogène de celle-ci), et récupération du sérum (polyclonal) ou des cellules de la rate (pour fabriquer des hybridomes par fusion avec une lignée appropriée), comme décrit par exemple dans Vaitukaitis et al. (J Clin Endocrinol Metab. 1971,33 (6), 988-91) ou dans Harlow et al. (Antibodies : A laboratory Manual, CSH Press, 1988). Les fragments Fab ou F (ab') 2 peuvent être produits par exemple selon Riechmann et al., 1988, Nature 332,323-327. Dans un autre mode de réalisation particulier, la cible moléculaire est le récepteur du XA et le ligand est un ligand endogène, un agoniste ou un antagoniste du récepteur, marqué. Dans un mode de mise en oeuvre spécifique, on utilise du XA marqué, notamment radiomarqué, en particulier tritié. Selon un mode particulier, la méthode comprend donc la mise en contact d'un composé test avec une cellule (ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique) exprimant un récepteur à l'acide xanthurénique et la mise en évidence d'une liaison du composé test au récepteur. Selon un autre mode particulier, la méthode comprend la mise en contact d'un composé test avec une cellule (ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique) exprimant une molécule cible impliquée dans l'activité de l'acide xanthurénique, en présence d'un ligand marqué de ladite cible, et la mise en évidence d'une liaison du composé test par détermination du déplacement de la liaison du ligand marqué. Dans une autre variante, le procédé de l'invention comprend la mise en contact d'un composé test avec une cellule exprimant une molécule cible impliquée dans l'activité de l'acide xanthurénique (en particulier le récepteur de l'acide xanthurénique), et la mise en évidence d'un effet biologique ou pharmacologique caractéristique d'une liaison du composé test à ladite molécule cible. L'effet biologique ou pharmacologique peut être l'expression d'une ou plusieurs protéines cellulaires, l'expression d'un récepteur, l'activation d'un gène, l'internalisation du récepteur, l'apparition d'un courant électrique, d'un flux ou d'un influx d'ions, etc. La mise en évidence de cet effet peut être réalisée par tous moyens appropriés, comme la mesure de l'expression d'un gène rapporteur, la mesure de l'expression membranaire d'un récepteur, le dosage des ions ou d'un courant électrique, etc. Classiquement, l'effet du composé test est comparé à l'effet déterminé en l'absence dudit composé. En outre, l'effet du composé test peut être déterminé en présence d'un ligand du récepteur XA, par exemple du XA lui-même, notamment lorsqu'une activité de modulation ou d'inhibition de XA est recherchée. Selon une variante particulière, le procédé de l'invention comprend donc la mise en contact d'un composé test avec une cellule exprimant un récepteur à l'acide xanthurénique, en présence d'un ligand dudit récepteur, la mesure d'un effet biologique ou pharmacologique caractéristique d'une liaison au récepteur XA et la comparaison de l'effet mesuré à celui obtenu en l'absence de composé test. Un tel procédé est particulièrement adapté à la recherche, la sélection, la caractérisation ou l'amélioration de composés inhibant l'activité de XA. Les cellules utilisées dans les tests peuvent être tout cellule exprimant une molécule cible impliquée dans l'activité du XA, notamment un récepteur XA. Il peut s'agir de cellules exprimant naturellement cette molécule (e. g., ce récepteur), ou de cellules modifiées génétiquement ou traitées pour surexprimer ladite molécule (e. g., ledit récepteur). Il s'agit, dans un mode préféré de l'invention, de cellules de mammifères (cellules nerveuses, hépatocytes, fibroblastes, cellules endothéliales, musculaires, etc. ). De manière encore plus préférée, ces cellules sont des cellules humaines. Il peut également s'agir de cultures primaires ou de lignées établies. Dans un autre mode de mise en oeuvre, il est possible également d'utiliser des cellules procaryotes (bactéries), des cellules de levure (Saccharomyces, Kluyveromyces, etc. ), des cellules végétales, etc. Dans un mode préféré, on utilise des cellules d'origine nerveuse ou synaptique, notamment des neurones, des cellules gliales, des astrocytes, du matériel d'origine synaptique (membranes, synaptosomes, synaptoneurosomes), etc. Ces cellules peuvent être isolées, cultivées et caractérisées selon des techniques connues, décrites dans les exemples. La présente demande montre, pour la première fois, l'existence d'un récepteur de haute affinité pour le XA exprimé dans différentes populations cellulaires ou régions du cerveau. Ce récepteur présente les caractéristiques pharmacologiques suivantes : - expression dans le cerveau - Kd du récepteur synaptique pour le XA inférieur ou égal à environ 300 nM à 1300 nM, - récepteur modulé par les dérivés adényliques (adénosine, ADP, ATP) - récepteur modulé par les ions cuivre et zinc - récepteur modulé par l'acide kynurénique, - l'activation du récepteur par le XA induit un courant électrique - le récepteur est exprimé par les cellules NCB-20. Par ailleurs, des indications électrophysiologiques et biochimiques laissent prévoir un récepteur couplé à des G protéines, sans que cela ait été formellement démontré. La caractérisation de ce récepteur, son identification et la description de procédés permettant de mesurer la liaison de molécules sur ce récepteur permettent, selon la présente demande, de mettre en évidence de nouveaux composés biologiquement actifs, capables de moduler l'activité du XA. La démonstration du rôle pharmacologique de XA souligne l'importance de la mise à disposition de tels composés actifs. Dans un mode particulier, Pour la mise en oeuvre des procédés ci-dessus, on utilise une préparation membranaire exprimant un récepteur du XA. La préparation membranaire peut être, avantageusement, d'origine naturelle, c'est- à-dire produite à partir d'une cellule exprimant le récepteur. On peut produire des préparations membranaires par lyse mécanique, chimique, physique, électrique, etc., et notamment par traitement avec des détergents, ultrasons, congélation/décongélation, etc., comme illustré dans les exemples. Cette préparation membranaire se caractérise essentiellement par la présence de fragments de membrane, comprenant une bicouche lipidique dans laquelle tout ou partie du récepteur XA est présente. Ces préparations membranaires sont généralement dépourvues de cellule intacte. En outre, elles peuvent être enrichies en débris membranaires par des traitements appropriés (centrifugation, etc. ). On peut également utiliser une préparation membranaire d'origine synthétique, comme par exemple un liposom dans lequel tout ou partie du récepteur XA a été introduit, ou une membrane supportée. Pour les tests de liaison ou fonctionnels ci-dessus, les composés peuvent être mis au contact des cellules (ou des préparations membranaires) à différents moments, selon leur (s) effet (s), leur concentration ou la nature des cellules et pour des périodes variées, qui peuvent être ajustées par l'homme du métier. Le test peut être effectué sur tout support approprié et notamment sur une plaque, une lame, une boîte, dans un tube ou une flasque. Généralement, la mise en contact est réalisée dans une plaque multi-puits ce qui permet de conduire, en parallèle, des essais nombreux et variés. Parmi les supports typiques on trouve des plaques de microtitration et plus particulièrement des plaques 96 ou 384 puits (ou plus), faciles à manipuler. Selon le support et la nature du composé test, des quantités variables de cellules peuvent être utilisées lors de la mise en oeuvre des méthodes décrites. De manière classique, 102 à 106 cellules sont mises en contact avec un type de composé test, dans un milieu de culture approprié, et de manière préférentielle entre 103 et 105 cellules. Lorsqu'une préparation membranaire est utilisée, on applique généralement 0,01 à 50 mg de protéine par essai, plus préférentiellement deO, 05 à 2 mg de protéine par essai. Les essais peuvent être réalisés dans tout type de milieu approprié, comme par exemple des solutions salines, des tampons, etc. On peut citer notamment des tampons Tris, Pipes, Hepes, etc. La température est, typiquement, proche de la température ambiante. Le pH du milieu est avantageusement compris entre 5,5 et 8, plus préférentiellement entre 7 et 8. Il est entendu que ces paramètres peuvent être ajusté par l'homme du métier, suivant les indications fournies dans les exemples. La quantité (ou la concentration) de composé test peut également être ajustée par l'utilisateur selon le type de composé (sa toxicité, sa capacité de pénétration cellulaire, etc.), la longueur de la période d'incubation, etc. Généralement, les cellules (ou membranes) sont exposées à des quantités de composés test qui varient de 1 nM à 1 mM. Il est bien sûr possible de tester d'autres concentrations sans dévier de la présente invention. Chaque composé peut, de plus, être testé, en parallèle, à différentes concentrations et sur différentes périodes. Par ailleurs, des adjuvants et/ou vecteurs et/ou produits facilitant la pénétration des composés dans les cellules tels que des liposomes, des lipides cationiques, des polymères, des peptides issus de virus, etc., peuvent, en outre, être utilisés, si nécessaire. Le contact peut être maintenu pendant une période comprise entre 1 minute et plusieurs heures, selon la nature de la molécule cible. Lorsque la molécule cible est le récepteur XA, le contact est maintenu typiquement pendant moins de 1 heure environ. Lorsque la molécule cible est une molécule intracellulaire, le contact peut être maintenu plus longtemps. Dans une autre variante, l'invention est basée sur des tests de liaison in vitro entre le XA et un composé test ou entre un composé test et une molécule cible (par exemple tout ou une partie du récepteur XA). Selon ces modes de mise en oeuvre, le procédé pour la sélection, l'identification ou la caractérisation de composés actifs comprend : - la mise en contact d'un composé test avec une molécule cible impliquée dans l'activité du XA, par exemple une enzyme de synthèse ou de régulation, un transporteur, un récepteur, ou un fragment de ceux-ci, et - la détermination de la liaison éventuelle dudit composé test sur ladite molécule. La liaison du composé test peut être mise en évidence de différentes manières, comme par exemple par migration sur gel ou électrophorèse des complexes formés. D'autres méthodes basées sur la luminescence ou utilisant la technique FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) bien connue de l'homme du métier ou la technique SPA ( Scintillation Proximity Assay))), peuvent être mises en oeuvre, dans le cadre de la présente invention, pour déterminer la liaison éventuelle du composé test sur la molécule cible. Lorsque la cible est un récepteur, la mesure de la liaison peut être effectuée en présence d'un ligand marqué, par détermination de la déplacement du ligand par le composé test. La présente invention peut être appliquée à tout type de composé test. Ainsi, le composé test peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée ou en mélange avec d'autres produits. Le composé peut être défini en termes de structure et/ou de composition ou ne pas être défini. Le composé peut, par exemple, être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de structure indéfinie, un mélange de produits connus et caractérisés ou une composition indéfinie comprenant un ou plusieurs produits. De telles compositions indéfinies peuvent être, par exemple, des échantillons de tissus, des fluides biologiques, des surnageants cellulaires, des préparations végétales, etc. Les composés test peuvent être des produits inorganiques ou organiques et notamment un polypeptide (ou une protéine ou un peptide), un acide nucléique, un lipide, un polysaccharide, un composé chimique ou biologique tel qu'un facteur nucléaire, un cofacteur ou tout mélange ou dérivé de ces derniers. Le composé peut être d'origine naturelle ou synthétique et inclure une banque combinatoire, un clone ou une banque de clones d'acides nucléiques exprimant un ou plusieurs polypeptide (s) liant l'ADN, etc. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de production d'un composé actif, notamment sur le système nerveux, le procédé comprenant : - la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'activité de XA in vitro ou ex vivo, et - la synthèse dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de production d'un modulateur de XA, le procédé comprenant : - la mise en contact d'un composé avec une molécule cible impliquée dans l'activation du XA, - la détermination d'un effet du composé sur la molécule cible, ledit effet indiquant que le composé est un modulateur de XA, et - la synthèse dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de production d'un médicament comprenant un composé actif, notamment sur le système nerveux, le procédé comprenant : - la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'activité de XA in vitro ou ex vivo, et - le mélange dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci avec un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de production d'un médicament comprenant un composé modulateur de XA, le procédé comprenant : - la mise en contact d'un composé avec une molécule cible impliquée dans l'activation du XA, - la détermination d'un effet du composé sur la molécule cible, ledit effet indiquant que le composé est un modulateur de XA, et - le mélange dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci avec un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. Dans le contexte de l'invention, le terme analogue structural désigne toute molécule obtenue par modélisation moléculaire ou variation structurale à partir d'un composé test. D'autres avantages et aspects de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LEGENDE DES FIGURES Figure 1 : Concentration extracellulaire de XA au niveau du Cortex prefrontal (CPF) Figure 2A et 2B : Libération de XA dans le CPF après stimulation électrique du VTA (figure 2A = 100 pA ; figure 2B = 200 uA). Dopamine = triangles noirs ; XA = carrés noirs Figure 3 : Libération de XA induite par 100 mM KCI dans la sonde pendant 5 min. Figure 4 : Libération de XA induite par la présence de 50 uM de veratridine dans la sonde pendant 20 minutes. Figure 5 : Libération de XA dans le CPF sous stimulation électrique (barres blanches). La même expérience, reproduite en l'absence d'ions calcium et en présence d'EGTA, ne montre plus de libération accrue de XA sous stimulation électrique (barres noires). Figure 6 : Libération de XA dans le CPF après stimulation électrique du VTA (barres blanches, libération de base = 21 pmol/5 min). Même expérience mais en présence de 2.0 uM de TTX dans le liquide de dialyse (barres noires, libération de base = 7 pmol/5 min). En présence de TTX, il n'existe plus de libération induite de XA. Figure 7 : Répartition de XA dans le cerveau de rat dans les conditions physiologiques. Concentrations selon un code couleur arbitraire. Abréviations : CxPrFr : cortex prefrontal ; CxFR : cortex frontal ; CxPar : cortex pariétal ; CxOcc : cortex occipital ; C : cervelet ; GP : globus pallidus ; CP : caudé putamen ; n. Acc : noyau accumbens ; TO : tubercules olfactifs ; BO : bulbes olfactifs ; S : septum ; Hb : habenula ; Hi : hippocampe ; Th : thalamus ; Hy : hypothalamus ; SN : substance noire (A9) ; VTA : aire tegmentale ventrale (ait) ; Rad : noyau raphé dorsal ; Ram : noyau raphé médian ; LC : locus coeruleus (A6) ; MO : médulla oblongata. Figure 8 : Effet du pH sur la liaison de l'AX sur son (ses) site (s) de liaison Figure 9 : Etude de la linéarité du binding spécifique en fonction de la concentration en protéine. Figure 10 : Détermination de la constante d'association Kon Figure 11 : Détermination de la constante de dissociation Koff Figure 12 : Courbe de saturation des sites membranaires de XA. Détermination du Kd et du Bmax. Figure 13 : Inhibition compétitive de la fixation de XA radioactif par XA non marqué. Détermination des IC 50 pour l'acide xanthurénique Figure 14 : Influence d'ions métalliques sur la liaison de l'acide xanthurénique à son (ses) site (s) de liaison Figure 15 : Effet de la variation du pH sur la liaison de l'AX à son (ses) site (s) de liaison en présence d'ions cuivre. Figure 16 : Etude de la linéarité du binding spécifique en fonction de la concentration protéique en présence d'ions cuivre Figure 17 : Effet/dose du Cuivre (cru2+) sur la liaison de l'AX à son (ses) site (s) de liaison Figure 18 : Mesure de la courbe de saturation et des paramètres Kd et Bmax en présence d'ions cuivre. Figure 19 : Inhibition compétitive de XA marqué par XA non radioactif. Détermination des IC 50 pour l'acide xanthurénique. Figure 20 : Dose/effet du XA sur la réponse dopaminergique après injection locale dans le CPF. Figure 21 : Evolution des taux de dopamine, DOPAC et HVA dans le CPF après application locale de 20 uM de XA. Figure 22 : Effets de la présence de l'antagoniste NCS-486 sur la libération extracellulaire de dopamine après application locale de 20 uM de XA dans le CPF. Figure 23 : Stratégie expérimentale dans les expériences de patch-clamp. Figure 24 : Effet de l'acide xanthurénique sur les cellules NCB-20. A. Traces types enregistrées à partir d'un fragment de membrane en conditions contrôle et pendant l'application de l'acide xanthurenique à une concentration de 20 uM. Le fragment de membrane était stimulé par une rampe de potentiel comme indiqué par le protocole illustré par la trace du bas. En présence de l'acide xanthurénique un grand courant sortant se développe aux potentiels positifs. La trace a été numérisée à une fréquence de 2 kHz. B. Evolution du courant sortant moyen mesuré à un potentiel de 95 mV. En présence de l'acide Xanthurénique ce courant est augmenté de manière considérable. C. Relation courant-potentiel du courant active en présence de l'acide xanthurénique (après soustraction du courant obtenu en condition contrôle). La courbe en trait continu est l'ajustement du modèle de Boltzmann à ce courant. FIGURE 25. Pharmacologie de la réponse à l'acide xanthurénique. Le courant membranaire mesuré aux potentiels de-80 et 80 mV est représenté en fonction du temps d'enregistrement. La période d'application des ligands du récepteur du xanthurénate est matérialisé par les traits pleins : en haut et en bas respectivement pour le NCS-482 et le NCS-486 seuls et au milieu pour le mélange des deux aux concentrations indiquées. Le NCS-486 seul ne change pas l'amplitude du courant. Figure 26 : Activation d'une conductance chlorure par le récepteur de l'acide xanthurénique. L'agoniste utilisé dans cette expérience est le NCS-482 à une concentration de 20 uM. La réponse se développe en deux phases (a et b). Le nature du courant dans ces deux phases est différentes comme le montre le potentiel d'inversion du courant obtenu dans chacune des deux phases (diagrammes du bas). Figure 27 : Activité locomotrice spontanée des animaux traités par des doses croissantes de XA. Le temps est mesuré en minutes. Figure 28 : Mesure de la réactivité globale de l'animal dans le test de l'open field. Le XA à la dose de 37,5 mg/kg (dose non sédative) favorise le déplacement de l'animal au centre du champ ouvert éclairé par rapport aux animaux contrôles. Figure 29 : Effet/dose du XA dans le test de Porsolt (test de la nage). La durée d'immobilité décroit avec l'augmentation de la dose de XA. Les rats traités à l'imipramine 30 mg/kg servent de réferences positives. Figure 30 : Dans l'open field, une dose de XA de 50 mg/kg induit une augmentation de la durée des interactions sociales par rapport à l'animal non traité. Ce résultat est également en faveur d'un effet anxiolytique du XA. Figure 31 : Effet de XA sur les processus de mémorisation dans le test de reconnaissance d'objets. SECTION EXPERIMENTAL 1. MISE EN EVIDENCE ET PROPRIETES DE LA LIBERATION EXTRACELLULAIRE D'ACIDE XANTHURENIQUE (XA) IN VIVO DANS LE CORTEX PREFRONTAL DU RAT. En combinant la stimulation électrique de l'aire tegmentaire ventrale (ale) et la microdialyse in vivo du cortex préfrontal chez le rat, une libération extracellulaire de XA a pu être mis en évidence. Cette libération peut-être reproduite par dépolarisation locale a l'aide de fortes concentrations d'ions potassium ou de quantités micromolaires de veratridine. La libération de XA est calcium-dépendante et est bloquée par la tétrodotoxine qui empêche la dépolarisation neuronale locale. Le XA est donc libéré dans cette région du cerveau au moins, selon des caractéristiques identiques à celles des autres neurotransmetteurs connus, c'est à dire selon un mécanisme exocytotique induit par la dépolarisation neuronale. Matériels et Méthodes . Animaux Des rats males Wistar pesant 350 à 400 g ont été utilisés pour les expériences. Les animaux sont placés en cage individuelle de plastique et soumis à un cycle lumière/obscurité de 7 heures/19 heures et 19 heures/7 heures. L'accès à la nourriture et à l'eau est libre. Les interventions sur les animaux ont été menées dans la stricte application des règles de la directive européenne du 24 novembre 1986 (86/609/EEC). . Procédure Chirurgicale Les expériences ont été réalisées à l'aide de canule en !, avec une extrémité de 4 mm. La membrane de dialyse (500 um) est en polycarbonate-polyether avec un seuil d'arrêt de 20 Kda. La membrane de dialyse est insérée dans le cortex préfrontal (CPF) tandis qu'une des extrémités de l'électrode de stimulation bipolaire est placée dans CPF et l'autre dans le VTA. L'intervention est réalisée sous anesthésie à la kétamine. . Protocole de Microdialyse Les expériences sont réalisées chez l'animal conscient, 24 à 72 heures après l'intervention chirurgicale. La composition du milieu de perfusion est la suivante : 147 mM NaCI, 1. 2 mM CaCI2, 1. 2 mM MgCb. et 4. 0 mM KCI, pH 6. 5. Dans le cas des stimulations à fortes concentrations de potassium, les ions sodium sont diminués de la même valeur. Dans le cas des stimulations en l'absence d'ions calcium, 2.0 mM EGTA sont rajoutés dans le milieu de dialyse. Les dialysas sont collectés à une vitesse de 2 ul/min, toutes les 5 minutes et sont immédiatement stockés dans l'azote liquide jusqu'à l'analyse. . Analyse de la dopamine et de l'acide xanthurénique Ces deux composés sont quantifiés par chromatographie HPLC avec détection électrochimique. Le système chromatographique consiste en une colonne 25 cm X 4.6 mm Hypersyl C18, maintenue à température constante. La phase mobile est un tampon 0.05 M NaH2P04 + 0.1 mM EDTA et 6% méthanol. L'identification des pics s'effectue par comparaison avec les temps de rétention mesurés avec des solutions standards de calibration. . Protocole de stimulation électrique Le VTA a été stimulé pendant une période de 10 minutes, avec des trains de 30 impulsions de durée 0.5 msec pendant 100 millisec, d'intensité 100 ou de 200 uA et à une fréquence de 25 Hz. . Détermination des rendements in vitro Ces déterminations sont destinées à estimer le passage de la dopamine et de XA au travers de la membrane de dialyse pendant les expériences in vivo. Les rendements de dialyse in vitro ont respectivement été d'environ 28% et d'environ 15% pour respectivement XA et la dopamine pour une vitesse de dialyse de 1 u)/min à température ambiante. Résultats Détermination des concentrations de XA dans le milieu extracellulaire du CPF Ces études ont été réalisées en déterminant les taux variables de XA dialysés à différents rendements de dialyse. Les divers rendements de dialyse ont été modifiés par le changement graduel de la vitesse du liquide de dialyse (respectivement 1,2, 3 et 4 ui/minute) et détermination à chaque fois de la concentration de XA. Par extrapolation à vitesse zéro, on a un rendement de 100 % et une valeur de la concentration de XA dans le liquide de dialyse égal à sa concentration dans le milieu extracellulaire. L'expérience, menée sur 3 différents rats, a donné une valeur de XA = 6. 1 pmol/ul de liquide de dialyse ou de milieu extracellulaire cérébral. Ce qui donne une valeur moyenne de 6. 1 uM de XA dans le milieu extracellulaire du CPF (figure 1). . Libération de XA dans le CPF après stimulation électrique. Dans deux séries d'expériences, les stimulations électriques ont été de 100 ou 200 uA, pendant 10 minutes. Après insertion de la sonde et une heure de dialyse, la ligne de base à été établie par dialyse durant la deuxième heure (16 à 18 pmol/5 min). Une stimulation à 100 ou 200 uA à donné le même résultat, indiquant que la totalité du compartiment libérable dans nos conditions, avait été libéré. Par rapport à une ligne de base arbitrairement fixée à 100%, la libération électriquement induite de XA atteint 539% alors que la libération de dopamine atteint 655%. La libération s'installe dés la stimulation, atteint un maximum après environ 5 minutes de stimulation, puis revient à la ligne de base, même si la stimulation se poursuit. Une cinétique plus précise ne peu être décrite, compte tenu des conditions de dialyse (prélèvements toutes les 5 minutes). Les résultats sont présentés sur la figure 2. Libération de XA dans le CPF après dépolarisation locale par de fortes concentrations d'ions potassium ou par 50 uM de veratrine. La libération de XA dans l'espace extracellulaire du CPF à été également testée après dépolarisation locale par de fortes concentrations d'ions potassium placés dans la sonde de dialyse (100 mM de KCI pendant 5 minutes). Avant stimulation, la libération de base était d'environ 92 pmol/20 min. Après la dépolarisation, la libération de XA augmente progressivement pour atteindre 250% du niveau de base après 40 minutes. Puis, le niveau de base se rétablit progressivement et rejoint les niveaux antérieurs 80 minutes après la dépolarisation (figure 3). Dans le cas de la veratrine, celle-ci a été placée dans la sonde à la concentration de 50 uM pendant 20 minutes. Le niveau XA de base (avant la dépolarisation) était d'environ 96 pmol/20 minutes. Après application de la veratrine, un pic de XA est rapidement libéré, atteignant environ 600% du niveau de base au bout de 20 minutes, puis le niveau de base antérieur est progressivement rétabli en 60 minutes environ (figure 4). La libération de XA induite dans le CPF par la stimulation électrique est un phénomène calcium-dépendent Dans ces études, un groupe de rat est soumis à une stimulation électrique dans le VTA et on mesure la libération de XA dans le cortex frontal. La ligne de base est à 19 pmol/5 min et après stimulation électrique, la libération est à 70-75 pmol de XA pour 5 min de dialyse. La même expérience est refaite, mais dans ce cas le milieu de dialyse ne contient pas d'ions calcium,, mais 2.0 mM EGTA. Dans ces conditions, la libération de base de XA est de 10 pmol/5 min et la stimulation électrique ne produit aucun accroissement de la libération de XA (figure 5). La libération de XA dans le CPF après stimulation électrique est inhibée par la tétrodotoxine, bloqueur des canaux sodiques sodium-dépendant. L'étude est réalisée sur des rats témoins chez lesquels on mesure la libération de XA dans le CPF après stimulation électrique. Les mêmes expériences sont ensuite répétées, mais en plaçant 2.0 de tétrodotoxine dans la sonde de dialyse pendant 10 minutes. Dans ces dernières conditions, la libération de XA induite par la stimulation électrique est complètement bloquée (figure 6). 2. DISTRIBUTION HETEROGENE DE XA DANS LE CERVEAU DE RAT APRES ADMINISTRATION PERIPHERIQUE. Méthodes : Les rats sont injectés par voie i. p. avec 50 mg/kg de XA puis sacrifiés 30 minutes après par irradiation aux micro-ondes. Le cerveau est disséqué et le XA est dosé dans 20 régions différentes du cerveau. Résultats : Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous (ng/g de cerveau). Structures Concentrations Après Augmentation cérébrales physiologiques injection Cortex préfrontal 146 90 1297 351 9fois (**) Cortex frontal 50 1448 ~ 165 30 (***) Cortex pariétal 416 23 2565 692 6 (*) Cortex temporal110 60 995 360 9 (*) Caudé-Putamen 48 ~4 595 ~ 294 12 (*) Amygdales 297 : 1204+180"4 (*) Substance noire, 397 73 1307 351 3 (*) VTA L'accumulation de XA est surtout importante dans le cortex frontal et préfrontal (CPF), dans le cortex temporal et pariétal, dans les amygdales, les noyaux dopaminergiques et dans le striatum. Parmi les structures cérébrales étudiées, les régions ne présentant pas d'accumulation significative d'acide xanthurénique sont les suivantes : Cortex occipital, cortex cingulaire, cortex entorhinal, cortex rétroslénial, bulbes olfactifs, pons, hippocampe, médulla oblongata, cervelet, thalamus, noyau accumbens, septum, globus pallidus et hypothalamus. 3. CONCENTRATIONS PHYSIOLOGIQUES DE XA DANS DIVERSES REGIONS DU CERVEAU DE RAT. Méthodes : Les animaux sont sacrifiés par irradiation aux micro-ondes, les cerveaux sont rapidement disséqués sur une plaque de verre. De nombreuses structures cérébrales et divers noyaux sont isolés et conservés dans l'azote liquide jusqu'à l'analyse. Après pesée de chaque structure, les tissus sont homogénéisés dans 10 volumes d'acide perchlorique (w/v) et centrifugés. Les surnageants sont analysés par HPLC avec détection électrochimique. La limite de détection est de 0.05 nmoles/g de poids frais. Résultats : Les résultats sont présentés sur la Figure 7. Ils montrent une concentration hétérogène, particulièrement élevée dans le cervelet et le bulbe olfactif. 4. IDENTIFICATION ET CARACTERISATION DES SITES DE FIXATION POUR L'ACIDE XANTHURENIQUE DANS LE CERVEAU DE RAT. Protocole de préparation des membranes synaptiques : Les membranes synaptiques ont été préparées selon le protocole décrit ci-après. 10) Prélèvement rapide de deux cerveaux entiers de rats mâles Wistar (décapitation) et pesée des cerveaux. 2 ) Homogénéisation des cerveaux dans 10 x le poids en volume de solution S : S = sucrose 0.32 M KH2P04 10 mM pH 6. 0 EDTA 1 mM 30) Centrifugation à 915 g à 4 C pendant 10 minutes (Du Pont Instruments, Sorvall RC-5B) et récupération du surnageant. 4 ) Centrifugation à 18200 g à 40C pendant 20 minutes (Du Pont Instruments, Sorvall RC-5B). 5 ) Prélèvement du culot et éclatement des synaptosomes dans 70 x le poids en volume d'eau distillée à 0 C. Polytroner 30 secondes à vitesse maximale. 6 ) Partage dans des tubes de centrifugation Beckman selon le volume et centrifugation à 51000 g à 40C (Beckman, ultracentrifugeuse L8-70M) pendant 20 minutes. 7 ) Lavage des culots dans le tampon KH2PO4 50 mM pH 6.0 à 0 C 8 ) Partage dans des tubes de centrifugation Beckman selon le volume et centrifugation à 51000 g à 4 C (Beckman, ultracentrifugeuse L8-70M) pendant 20 minutes. 9 ) Récupération et congélation des culots à -800C. Partie 1 : ETUDE DES CARACTERISTIQUES PHARMACOLOGIQUES DU SITE DE LIAISON DE L'ACIDE XANTHURENIQUE SANS IONS Protocole de liaison Protocole classique : Le binding est réalisé dans du tampon Pipes 50 mM pH 7,4 à OOC (sur glace) en présence de membranes synaptiques (quantité protéique variant de 0.1 à 0.3 mg par tube), d'acide xanthurénique tritié ([3H]-AX en concentration variable selon le type d'expérience) et soit du tampon (pour la détermination de la liaison totale : LT) soit de l'acide xanthurénique"froid"non tritié (Sigma) à 2 mM (pour la détermination de la liaison non spécifique : LNS). La soustraction entre liaison totale et liaison non spécifique donne la liaison spécifique : LS. Le temps d'incubation est de 25 min. La filtration qui permet la séparation du [3H]-AX libre du [3H]-AX fixé à son (ses) site (s) de binding s'effectue par aspiration rapide du milieu d'incubation à travers des filtres en fibres de verre (GF/B) whatman qui sont ensuite lavés de façon successive 2 fois par du tampon Pipes 50 mM pH 7,4 froid (en tout 3x3 ml). Les filtres sont placés dans des fioles de comptage et on y ajoute 5 ml de Rotiszint&commat; (Roth). Le comptage s'effectue dans un compteur à scintillation liquide (Beckman LS6000sc). Protocole pour la détermination de l'effet pH : Le binding est réalisé selon le modèle classique : Le milieu d'incubation est préparé à partir de tampon Pipes 50 mM à différents pH (pH étudiés : 5,5 ; 6,0 ; 6, 5 ; 7,0 ; 7,5 ; 8,0). La concentration en acide xanthurénique tritié ([3H]-AX) est de 200 nM et pour l'étude de la liaison non spécifique on utilise une concentration de 2 mM d'acide xanthurénique non tritié (AX). La soustraction entre liaison totale et liaison non spécifique donne la liaison spécifique qui varie en fonction du pH. Les résultats présentés dans la Figure 8 montrent que le pH optimum de binding de l'acide xanthurénique est de 7,4-7, 5. Mesure de la zone de proportionnalité en fonction des protéines Le binding est réalisé selon le modèle classique : Le milieu d'incubation est préparé à partir de tampon Pipes 50 mM pH 7,4 (pH optimum). On fait varier la quantité protéique (0.04 mg à 0.5 mg par tube). La concentration en acide xanthurénique tritié ([3H]-AX) est de 200 nM et pour l'étude de la liaison non spécifique on utilise une concentration de 2 mM d'acide xanthurénique non tritié (AX). La soustraction entre liaison totale et liaison non spécifique donne la liaison spécifique qui varie en fonction de la quantité protéique : jusqu'à une quantité protéique de 0.5 mg par tube on reste dans la zone de proportionnalité. Les résultats sont présentés sur la Figure 9. Pour les expériences ultérieures, on travaillera entre 0.15 à 0.3 mg de protéines par tube. Mesure des constantes cinétique du bindinq ** Constante du taux d'association ou (ki ou kon) : Le binding est réalisé selon le modèle classique : Le milieu d'incubation est préparé à partir de tampon Pipes 50 mM pH 7,4 (pH optimum). La concentration en acide xanthurénique tritié ([3H]-AX) est de 200 nM et pour l'étude de la liaison non spécifique on utilise une concentration de 2 mM d'acide xanthurénique non tritié (AX). La préparation membranaire synaptique est ajoutée dans chaque tube et on procède à la filtration rapide aux différents temps étudiés ; les temps d'incubation varient de 1 minute à 40 minutes. La soustraction entre liaison totale et liaison non spécifique donne la liaison spécifique qui augmente en fonction du temps pour atteindre un équilibre : l'équilibre est atteint aux alentours de 10-15 minutes. L'analvse au logiciel Graohoad Prism de l'équation de rassnciatinn exnonentie) ! e donne une constante du taux observé Kob exprimé en min-1 qui n'est pas le même que le kon. La valeur du kob est de 0.53 0. 16 min-1 (Figure 10). Equation utilisée pour le calcul du kon : kon = kob-koff en M 1 min- [radlollgand] ** Constante du taux de dissociation ou (k-1 ou koff) : Le binding est réalisé selon le modèle classique : Le milieu d'incubation est préparé à partir de tampon Pipes 50 mM pH 7,4 (pH optimum). On procède à une incubation de la préparation membranaire synaptique avec l'acide xanthurénique tritié (200 nM) pendant 25 minutes (liaison totale) puis on y ajoute l'acide xanthurénique non radiomarqué (2 mM) que l'on laisse incuber pendant différents temps pour observer la dissociation et on procède à la filtration rapide ; les temps d'incubation varient de 1 minute à 45 minutes. Initialement ! e [H]-AX est iié à son site de binding, l'équilibre est atteint puis plus on incube pendant des temps prolongés avec l'AX non radiomarqué plus il y a une diminution du binding qui traduit la dissociation du complexe site de binding- [H]-AX. La dissociation est rapide et l'analyse au logiciel Graphpad Prism de l'équation de la dissociation exponentielle donne la constante du taux de dissociation koff exprimé en min-1. La valeur du koff est de 0.33 ~ 0. 07 min-1 (Figure 11). **Ces deux constantes permettent d'extrapoler de façon approximative une valeur pour le Kd = koff/kon = 330 nM. Expérience de saturation, mesure réelle du Kd et Bmax Le binding est réalisé dans du tampon Pipes 50 mM pH 7,4 à 0 C (sur glace) en présence de membranes synaptiques (quantité protéique variant de 0.1 à 0.3 mg par tube), d'acide xanthurénique tritié et soit du tampon (pour la détermination de la liaison totale) soit de l'acide xanthurénique non radiomarqué à 2 mM (pour la détermination de la liaison non spécifique). Le temps d'incubation est de 25 min. puis on procède à la filtration. On fait varier la concentration en acide xanthurénique tritié de façon croissante afin d'arriver à une occupation des sites de liaison maximale (plateau de saturation). On réalise la même chose en présence d'un excès d'acide xanthurénique non radiomarqué afin de déterminer la liaison non spécifique du [3H]-AX. Ainsi en soustrayant la liaison totale de la liaison non spécifique on obtient la liaison spécifique de l'acide xanthurénique à son (ou ses) site (s) de binding. L'analyse au logiciel Graphpad Prism permet de déterminer l'affinité de l'acide xanthurénique pour son (ou ses) site (s) de liaison : le Kd est de 743 nom : t 250 nM. De même le logiciel Graphpad Prism permet de déterminer le nombre de sites de liaison présents sur une préparation de membranes d'origine synaptique obtenues à partir de cerveaux entiers de rat : le Bmax est de 6.9 pmol/mg de protéines 1. 2 pmol/mg de protéines (Figure 12). Expérience de compétition, mesure d'une CI50 (concentration inhibitrice 50) Le binding est réalisé dans du tampon Pipes 50 mM pH 7,4 à 0 C (dans la glace) en présence de membranes synaptiques (quantité protéique variant de 0.1 à 0.3 mg par tube), d'acide xanthurénique tritié (200 nM) et soit du tampon (pour la détermination de la liaison totale), soit de l'acide xanthurénique non radiomarqué à 2 mM (pour la détermination de la liaison non spécifique) et soit des concentrations variables d'une molécule non radiomarquée. Si la molécule reconnaît le site de liaison du [3H]-AX de façon réversible alors les 2 ligands vont entrer en compétition et on obtiendra une courbe de déplacement du [3H]-AX en fonction de la concentration de la molécule compétitrice. Le temps d'incubation est de 20-25 min. puis on procède à la filtration. L'analyse au logiciel Graphpad Prism permet de déterminer la CI50 qui représente la concentration de la molécule qui bloque 50 % du binding de l'acide xanthurénique. Lorsque l'on effectue une expérience de compétition entre le [3H]-AX et l'AX non radiomarqué, on obtient une courbe de déplacement dont l'analyse au logiciel Graphpad Prism nous donne un modèle de liaison à deux sites, une CI50 à 300 nM et une CI50 à 57 uM. Selon ce protocole, on peut effectuer des expérience de compétition avec des molécules de synthèse et ainsi identifier ou caractériser des agonistes ou antagonistes, en particulier ayant une meilleure affinité pour le récepteur de l'acide xanthurénique que l'AX lui-même. Pour cela avant de procéder à une expérience de compétition classique pour déterminer une C150, on effectue d'abord un"screening"c'est à dire que l'on teste à une concentration relativement basse (10 pM) les molécules sur le déplacement de 200 nM de [3H]-AX (en gardant comme contrôle l'AX non radiomarqué) et l'on regarde si cette concentration déplace de façon identique ou meilleure cette même concentration en AX non radiomarqué. Si oui, on détermine la CI 50. L'étude du déplacement du [H]-AX par des métabolites du tryptophane (Lkynurénine, 30H-DL-kynurenine, 5 hydroxy-L-tryptophane, acide picolinique, acide 3 hydroxy anthranilique) dont l'acide xanthurénique fait parti a également été réalisée en screening à 200 uM. Aucun des composés ne déplace de façon significative l'acide xanthurénique. Par contre le screening réalisé sur l'acide kynurénique révèle qu'il n'y a pas de déplacement du [3H]-AX de son (ses) site (s) de liaison mais une potentialisation de cette liaison. En effet on obtient une liaison de l'acide xanthurénique tritié supérieure à ce que l'on obtient dans les conditions normales de binding. Effet des ions sur la liaison de l'acide xanthurénique à son (ses) sites de liaison L'étude de l'influence d'ions sur la liaison de l'acide xanthurénique à son (ses) site (s) de liaison est réalisé dans un tampon Tris Maléate 50 mM pH 6.5 à OOC (dans la glace) en présence de membranes synaptiques (quantité protéique variant de 0.1 à 0.3 mg par tube), d'acide xanthurénique tritié (200 nM) et soit du tampon (pour la détermination de la liaison totale), soit de l'acide xanthurénique non radiomarqué à 2 mM (pour la détermination de la liaison non spécifique) et une concentration de 1 mM en ions. Le temps d'incubation est de 25 minutes. Les ions suivants ont été testés : CU2+ (CuCb) ; Zn2+ (ZnC) 2) ; Mg (MgCis) ; Mn2+ (MnCI2) ; Cd2+ (CdCI2) ; Sn2+ (SnCI2), Fe (FeCI3). Les courbes ECso pour les différents ions (Figure 14) donnent la préférence aux ions cuivriques : ceux-ci possèdent un ECso d'environ 100, uM alors que les ions zinc possèdent un ECso d'environ 500 uM. Une concentration de 100-200 uM en ions cuivriques représente approximativement les concentrations endogènes cérébrales. D'autre part, au cours de nos recherches sur l'existence de ligands endogènes cérébraux pouvant jouer un rôle au niveau du site de binding XA ou au niveau d'un site modulateur de ce récepteur, nous avons constaté que l'adénine et ses dérivés [adénosine, adénosine diphosphate (ADP) ou adénosine triphosphate (ATP)] présentaient une affinité significative pour le site xanthurénique et inhibaient la fixation de XA tritié. Il est très probable que ces dérivés jouent un rôle important dans la modulation de l'activité du site XA au niveau cérébral. Ces molécules peuvent représenter des modèles pour la réalisation de ligands analogues structuraux pouvant interférer avec les sites XA pour la confection d'outils thérapeutiques ou pharmacologiques. Partie 2 : ETUDE DES CARACTERISTIQUES PHARMACOLOGIQUE S DU SITE DE LIAISON DE L'ACIDE XANTHURENIQUE EN PRESENCE D'IONS CUIVRE (cru2+) Protocole de Bindinq classique (protocole établi à partir des études du pH, de la proportionnalité, des constantes cinétique et de la saturation) Le binding est réalisé dans du tampon Tris Maléate 50 mM pH 6.5 à température ambiante en présence de membranes synaptiques (quantité protéique variant de 0.1 à 0.25 mg par tube), d'acide xanthurénique tritié ( [H]-AX en concentration variable selon le type d'expérience), 200 uM de CuCI2 et soit du tampon (pour la détermination de la liaison totale : LT) soit de l'acide xanthurénique"froid"non tritié (Sigma) à 2 mM (pour la détermination de la liaison non spécifique : LNS). La soustraction entre liaison totale et liaison non spécifique donne la liaison spécifique : LS. Le temps d'incubation est de 25 min. La filtration qui permet la séparation du [3H]-AX libre du jH]-AX fixé à son (ses) site (s) de binding s'effectue par aspiration rapide du milieu d'incubation à travers des filtres en fibres de verre (GF/B) Whatman qui sont ensuite lavés de façon successive 2 fois par du tampon Tris Maléate 50 mM pH 6.5 à température ambiante (en tout 3x3 ml). Les filtres sont placés dans des fioles de comptage et on y ajoute 5 ml de Rotiszint (Roth). Le comptage s'effectue dans un compteur à scintillation liquide (Beckman LS6000sc). Effet pH : Le binding est réalisé selon le modèle classique : Le milieu d'incubation est préparé à partir de tampon Tris Maléate 50 mM à température ambiante à différents pH (pH étudiés : 5,5 ; 6,0 ; 6,5 ; 7,0 ; 7, 5 ; 8,0). La concentration en acide xanthurénique tritié ([3H]-AX) est de 200 nM (+ 20 uM d'acide xanthurénique) et pour l'étude de la liaison non spécifique on utilise une concentration de 2 mM d'acide xanthurénique non tritié (AX). Le milieu d'incubation contient 200 uM de CuCI2. La soustraction entre liaison totale et liaison non spécifique donne la liaison spécifique qui varie en fonction du pH (Figure 15) : le pH optimum de binding de l'acide xanthurénique est de 6,4-6, 5. Mesure de la zone de proportionnalité en fonction des protéines : Le binding est réalisé selon le modèle classique : Le milieu d'incubation est préparé à partir de tampon Tris Maléate 50 mM pH 6.5 à température ambiante (pH optimum). On fait varier la quantité protéique (0.07 mg à 0.4 mg par tube). La concentration en acide xanthurénique tritié ([3H]-AX) est de 200 nM et pour l'étude de la liaison non spécifique on utilise une concentration de 2 mM d'acide xanthurénique non tritié (AX). Le milieu d'incubation contient 200 pM de CuC. La soustraction entre liaison totale et liaison non spécifique donne la liaison spécifique qui varie en fonction de la quantité protéique : jusqu'à une quantité protéique de 0.25 mg par tube on reste dans la zone de proportionnalité (Figure 16). Pour les expériences ultérieures, on travaillera entre 0.10 à 0.25 mg de protéines par tube. Mesure de l'effet dose du cuivre sur le binding de l'acide xanthurénique Le binding est réalisé selon le modèle classique : Le milieu d'incubation est préparé à partir de tampon Tris Maléate 50 mM pH 6.5 à température ambiante (pH optimum). On fait varier la concentration en cuivre (CuCI2) de 3. 10-7 M à 3. 10-4 M. La concentration en acide xanthurénique tritié ( [H]-AX) est de 400 nM (et 20 pM d'acide xanthurénique) et pour l'étude de la liaison non spécifique on utilise une concentration de 2 mM d'acide xanthurénique non tritié (AX). On obtient une courbe effet dose dont l'analyse au logiciel Graphpad Prism nous donne une EC50 (concentration efficace 50) à 33. 4 uM avec un coefficient de Hill de 1.8 (Figure 17). Expérience de saturation, mesure réelle du Kd et Bmax Le binding est réalisé dans du tampon Tris Maléate 50 mM pH 6.5 à température ambiante en présence de membranes synaptiques (quantité protéique variant de 0.10 à 0.25 mg par tube), d'acide xanthurénique tritié et soit du tampon (pour la détermination de la liaison totale) soit de l'acide xanthurénique non radiomarqué à 2 mM (pour la détermination de la liaison non spécifique). Le temps d'incubation est de 25 min. puis on procède à la filtration. On fait varier la concentration en acide xanthurénique tritié de façon croissante afin d'arriver à une occupation des sites de liaison maximale (plateau de saturation). On réalise la même chose en présence d'un excès d'acide xanthurénique non radiomarqué afin de déterminer la liaison non spécifique du [H]-AX. Ainsi en soustrayant la liaison totale de la liaison non spécifique on obtient la liaison spécifique de l'acide xanthurénique à son (ou ses) site (s) de binding. L'analyse au logiciel Graphpad Prism permet de déterminer l'affinité de l'acide xanthurénique pour son (ou ses) site (s) de liaison : le Kd est de 7. 56 uM + 0. 8, uM. De même le logiciel Graphpad Prism permet de déterminer le nombre de sites de liaison présents sur une préparation de membranes d'origine synaptique obtenues à partir de cerveaux entiers de rat : le Bmax est de 581.8 pmol/mg de protéines 33 pmol/mg de protéines (Figure 18). Expérience de compétition, mesure d'une CI50 (concentration inhibitrice 50) Le binding est réalisé dans du tampon Tris Maléate 50 mM pH 6.5 à température ambiante en présence de membranes synaptiques (quantité protéique variant de 0.1 à 0.3 mg par tube), d'acide xanthurénique tritié (200 nM) et soit du tampon (pour la détermination de la liaison totale), soit des concentrations variables d'AX non radiomarqué (10-3 M à 10-10 M). L'analyse au logiciel Graphpad Prism permet de déterminer la CI50 qui représente la concentration de la molécule qui bloque 50 % du binding de l'acide xanthurénique. L'expérience de compétition entre le [3H]-AX et l'AX non radiomarqué, permet d'obtenir une courbe de déplacement dont l'analyse au logiciel Graphpad Prism nous donne un modèle de liaison à deux sites, une CI50 à 1 uM et une Cet50 à 114 utv) (Figure 19). . Etude de la distribution régionale des sites de liaison de XA dans le cerveau de rat par autoradiographie quantitative suivie d'analyse d'images. Méthode : trois cerveaux de rat males Wistar adultes sont rapidement extraits après décapitation de l'animal et congelés dans de l'isopentane maintenu à 0 C par de la carboglace. Les divers cerveaux sont ensuite sectionnés à l'aide d'un cryostat en coupes de 20 um d'épaisseur. Ces coupes sont étalées sur des lamelles de verre qui sont ensuite rapidement séchées à l'air froid. Les lamelles, assemblées sur un cadre, sont ensuite incubées pendant 10 minutes dans un tampon PIPES 50 mM, pH 7.4, maintenu à 0 C par de la glace. Les lamelles sont ensuite trempées pendant 20 minutes dans le même tampon, contenant en plus 200 nM de XA radioactif. Après trois bref lavages de chacun 10 secondes dans le tampon PIPES dépourvu de ligand radioactif, les coupes sont séchées par un courant d'air froid. Elles sont ensuite exposées à l'obscurité contre un film sensible au tritium. Après 2 mois d'exposition dans des cassettes hermétiques, les films dont développés et les niveaux de gris sont numérisés et comparés à une échelle de radioactivité tritium arbitraire, calibrée en Curie par gramme d'équivalent tissu (Amersham). Les résultats, qui représentent à un facteur près, la répartition des densités des récepteurs XA dans les diverses régions du cerveau de rat, sont données dans le tableau ci-joint. Distribution régionale des sites de liaison du [3H] Xanthurénate. (Coupes sériées de 20 um de cerveau de Rat Wistar). Structure cérébrale Valeur densitométrique intégrée nCi/g t SD (n=3) Noyau caudé partie latérale 195 t 3. 1 1942. 6 t 30.3 252.0 t 4.0 fmol/mg Substance noire compacte 126 t 2. 0 806. 5 t 13. 8 104. 6t 1. 8 (Ag) Noyau interpédonculaire 127t 4. 3 822. 9 t 17.3 106. 8 t 2.2 Noyau amygdale centrale 194 t 4.3 1921. 3 t 42.9 249. 4 t 5.6 Hippocampe dorsal 203 t 9. 8 2068 t 41. 1 268. 5 t 5.3 Hippocampe ventral 128 t 2. 1 847. 5 t 16. 9 110. 0 t 2.2 Noyau thalamus médiodorsal 172 t 3. 5 1568. 8 t 39. 3 203. 7 t 5.1 Noyau thalamus median post. 180 t 7. 5 1701 t 69. 9 220. 9 t 9.0 Hypothalamus dorsomédian 180 t 6. 3 1700 t 73.2 220. 7 t 9.5 Aire tegmenta) e ventra) e (Aie) 119t 7. 5 691. 8 t 43. 6 89. 8 t 5.6 Noyau accumnbens latéral 193 t 10 1904. 9 t 99.0 247. 3 t 12.8 Noyau raphé dorsal (B7) 121 t 10 724. 5 t 59. 8 94. 1 t 7.7 Noyau raphé médian (Bg) 110 t 2. 0 544. 2 t 16. 9 70. 6 t 2.2 Lobules cérébelleux 180t 3. 5 1740. 9 t 58. 5 226. 0 t 7.6 Cortex pariétal 184 t 1.4 1757.3 t 23.3 228.2 t 3.0 Cortex temporal 115 t 7. 7 634. 4 t 52. 3 82. 4 t 6.8 Cortex cingulaire partie ant. 180 t 5.2 1691. 8 t 49.5 219. 7 t 6.4 Cortex préfrontal 180 t 11. 5 1691. 8 t 108.2 219. 7 t 14.0 Gris périaqueducal 125 t 5. 65 724. 5 t 40. 0 94. 1 t 5.2 Cortex pynforme 186 t 7. 7 1798. 3t 91. 7 233.5 t 11.9 Bulbes olfactifs 181 t 7. 0 1703 t 81. 5 221. 2 t 10.6 Medulla oblongata 149 t 4. 9 1249. 1 t 50. 7 162. 2 t 6.6 Globus pallidus 163 t 7. 7 1413. 2 t 67. 2 183. 5 t 8.7 Noyau septum latéral 175 t 6.1 1609 t 55. 7 208. 9 t 7.2 Noyau septum médian 14714. 9 1150 t 116. 3 149. 4 t 15.1 Cortex occipital 152 t 51 1232 t 291. 7 160. 0 t 37.8 5. ETUDE DE LA MODULATION PAR LE XA DE L'ACTIVITE DOPAMINERGIQUE NIGRO-STRIEE ET MESO-CORTICO- LIMBIQUE. Matériels et Méthodes Animaux : Rats males adultes Wistar pesant 250 à 275 g, hebergés par deux dans des cages plastiques avec une illumination standard de 7h à 19 heures et ayant un accès) libre à l'eau et à la nourriture. Les études sur ces animaux ont été menées en accord avec les réglements du Conseil des Communautés Européennes du 24 novembre 1986 (86/609/EEC). . Produits chimiques : XA ; 6-OHDA hydrobromide ; 2,4, 5- trihydroxyphenylethylamine et desipramine ont été obtenus chez Sigma). Le NCS-486 à été fabriqué par le Laboratoire de Pharmacochimie du CNRS, Strasbourg. Protocole chirurgical : Une canule en !, avec une extrémité de 4 mm, (CMA 12, Carnegie, Suéde) a été utilisée pour les expériences, . La membrane de dialyse, de diamètre 500 um, est constituée de polycarbonate-polyether avec un seuil d'arrêt à 20 Kda. Le guide de sonde est implanté dans le CPF sous repaire stéréotaxique, les animaux étant anesthésiés par du chlorhydrate de kétamine (150 mg/kg/i. p.) Lésions à la 6-hydroxydopamine des noyaux dopaminergiques A9 et A10 Les animaux sont anesthésiés à la Kétamine (100 mg/kg i. p. ). La 6-OHDA est dissoute dans du sérum physiologique contenant 0.01% d'acide ascorbique à la concentration de 4 ug/ul. Un ul sont injectés en deux minutes, sous repaires stéreotaxiques, à l'aide d'une seringue de Hamilton dans A9/A10. Après injections, on attend la diffusion de la toxine pendant une minute. Les neurones noradrénergiques sont protégés par l'injection préalable à l'animal de desipramine 25 mg/kg i. p., 45 minutes avant la 6-OHDA. 4 semaines après, les rats sont administrés par 1 mg/kg d'apomorphine en injection sous-cutanée et le nombre de tours controlatéraux effectués 15 minutes après l'injection, sont enregistrés. Les rats lésés ont effectué 130 45 tours/15 minutes. Six semaines après l'injection locale de 6-OHDA dans les nayaux dopaminergiques A9/A10 droits, les rats présentant une bonne altération fonctionnelle ont été sélectionnés et implantés pour des études en microdialyse. Protocole de microdialyse Les expériences ont été réalisées sur des rats conscients lésés et non lésés, 24 à 48 heures après l'intervention chirurgicale (mise en place du guide de microdialyse). La composition du milieu de microdialyse est : NaCI 147 mM ; CaCI2 1,2 mM ; MgCI2 1,2 mM ; KCI 4,0 mM, pH 6,5. La vitesse de dialyse est de 1 1-11/min (pompe CMA 100, Carnegie). Les dialysas sont collectés toutes les 20 minutes et immédiatement stockés dans l'azote liquide jusqu'à l'analyse. . Analyse de la dopamine, DOPAC et HVA dans les liquides de microdialyse Ces composés sont analysés par HPLC avec détection électrochimique. Le système chromatographique consiste en une colonne 25 cm X 4.6 mm C18 maintenu à une température constante de 30 C. La phase mobile est constituée de NaH2PO4 50 mM contenant 0.1 mM EDTA et du méthanol 6%, le pH de la solution étant réglé à 4.85. . Rendements in vitro Le rendement in vitro pour le dialyse de la dopamine a été préalablement mesuré à 16% à la température du laboratoire et pour une vitesse de dialyse de 11-11/min. . Histologie Après les expériences, le placement correct de la sonde est toujours vérifié par examen histologique post-mortem du cerveau de l'animal, après fixation dans du paraformaldéhyde. . Analyses statistiques Les analyses de microdialyse ont été évaluées statistiquement par un ANOVA suivi d'un test de comparaison multiples de Newman-Keuls. RESULTATS Effet 1 dose du XA infusé localement dans le CPF sur la modification des concentrations extracellulaires de dopamine. Les concentrations de XA retrodialysées ont été respectivement de 1 uM (cercles noirs), de 5 uM (carrés noirs) et de 20 uM (triangles noirs). L'application de XA se fait pendant une dialyse de 20 minutes. Les résultats sont exprimés en pourcentage de la libération moyenne de base pour la dopamine (8 fractions de 20 min avant la stimulation par le XA), Figure 20. La plus faible concentration en XA (lut) ne modifie pas la libération de dopamine. Par contre, la concentration de 5 uM (environ 1. 5 uM de XA dans le tissu cérébral selon les données du rendement in vitro) fait augmenter la libération extracellulaire de dopamine d'environ 250%. La dose de 20 uM (environ 6 uM dans le tissu) fait augmenter la dopamine à 400-450%. Effets de l'application locale de 20 uM de XA dans le CPF sur les taux de dopamine, DOPAC et HVA. Les résultats sont exprimés en pourcentage de dopamine libéré par rapport à la ligne de base (8 x 20 min de dialyse avant l'injection du XA), Figure 21. Les carrés noirs représentent la dopamine, les cercles noirs représentent le DOPAC et les carrés blancs représentent l'HVA. Dans ce cas, l'augmentation de dopamine est, comme précédement, de 400-450% du niveau basal après 20 minutes, mais les taux de DOPAC et d'HVA baissent légèrement au bout de 100 à 120 minutes. . Effets de l'application locale de 20 pM de XA dans le CPF sur la libération extracellulaire de dopamine, en présence ou en absence de 20 uM de NCS-486. Les résultats sont exprimés en pourcentage de la libération basale de dopamine (moyenne de 8 x 20 minutes fractions de dialysas avant le traitement avec XA (Figure 22). Application de 20 uM de XA pendant 20 minutes (cercles noirs), ou coinfusion de XA 20 uM + NCS 486 20 uM (carré blancs) ou application de 20 uM de NCS-486 seul (triangles blancs). On peut observer que le traitement avec NCS-486 seul ou NCS-486 + XA ne modifient pas la libération de dopamine, par contre XA seul augmente cette libération de 300% environ, 40 minutes environ après la stimulation. 6. ETUDES ELECTROPHYSIOLOGIQUES Enregistrements électrophysiologiques Les cellules de la lignée neuronale NCB-20 étaient enregistrées grâce à la technique du patch-clamp (Hamill et al., 1981) dans sa configuration dite cellule attachée. Les milieux d'enregistrements étaient conçus tel que seule l'activité des canaux cationiques aspécifiques et des canaux à chlorure se trouvant dans le fragment de membrane sous la pipette, pouvait être enregistrée de manière isolée. Les courants spécifiques calciques, sodiques et potassiques étaient minimisés par substitution de la majorité des cations du milieu pipette, par un cation imperméant la N-methyl-D-glucamine (NMDG) ou blocage par du TEA (Tétra-Ethyl-Amonium). La substitution des cations perméants dans la pipette par la NMDG permettait aussi d'avoir les courants cationiques aspécifiques essentiellement dans le sens sortant la composante entrante étant minimisée. En outre, dans certaines expériences l'activité des canaux à chlorure était enregistrée uniquement dans le sens entrant grâce au remplacement des ions chlorure du milieu pipette par du TCA (acide trichloracétique). Le contrôle du potentiel de membrane cellulaire à une valeur proche de zéro mV se faisait en utilisant un milieu extracellulaire KCI. Ainsi le potentiel du fragment de membrane enregistré correspond à l'opposé du potentiel imposé dans la pipette d'enregistrement. Dans ces conditions les solutions d'enregistrement avaient la composition suivante : (en mM) : NMDG/Cl (ou TCA) 140, KCI 2, Mg) 2 1, HEPES 10, TEA/CI 15, pour le milieu pipette et NaCI, KCI 141, CaCz 0.5, HEPES 10, EGTA 5, pour le bain, le pH était ajusté dans les deux cas à 7.4 avec respectivement du TRIS base et KOH. Les produits chimiques provenaient de chez Sigma (Saint Quentin Fallavier, France). Après réalisation d'un'gigaseal'avec des pipettes d'une résistance comprise entre 4 et 7 MO, les courants ioniques étaient mesurés grâce à un amplificateur de patch-clamp (EPC-7 amplifier, List-Medical, Darmstadt, RFA ou Axopatch B200, Axon Instruments, CA). L'acquisition du signal se faisait ensuite (Fréquence d'acquisition de 1 à 5 kHz) à l'aide d'une carte interface (Scientific Instruments, OH) et du logiciel pClamp 6 (Axons Instruments, CA). Les produits étaient dilués à la concentration voulue dans le milieu extracellulaire. L'application se faisait par gravité à travers un système de perfusion multivoies chacune d'elles ayant un diamètre interne de 300 um.. Le changement de solution s'opérait en plaçant après ouverture du robinet la voie correspondante en face de la cellule enregistrée. Résultats Les cellules NCB-20 expriment un site de liaison qui reconnaît spécifiquement l'acide xanthurénique. Le but de ces expériences fonctionnelles était de détecter tout phénomène membranaire électrogénique pouvant être activé par le (s) récepteur (s) de l'acide xanthurénique. Certains arguments laissaient à penser que ce récepteur est couplé aux protéines G et donc qu'un effet membranaire passerait par un relais intracellulaire. Nous avons en conséquence prospecté une éventuelle action sur les perméabilités cationiques et chlorures dont l'activation dépend à la fois du potentiel de membrane et de facteurs cytosoliques (essentiellement l'ion calcium et les protéines kinases ; Evans and Marty, 1987 ; Taleb et al., 1988 ; Leech et al., 1996). Ces deux types de canaux ioniques ont donc été enregistrés de manière isolée (voir méthodes) et selon la mise en jeu de l'une ou l'autre des deux perméabilités. Le potentiel d'inversion de la réponse serait compris entre-49. 5 ou- 11.8 mV respectivement pour une réponse cationique (cations monovalents) ou chlorure. Dans ces conditions tout changement au niveau des facteurs cytoplasmiques sera révélé par les paramètres de la relation courant potentiel (Figure 23). Les cellules étaient enregistrées en cellule-attachée. Le courant traversant les canaux insérés dans la membrane sous la pipette était enregistré de manière isolée. Le potentiel de la membrane cellulaire était imposé à 0 mV par une concentration de KCI dans le bain équivalente à celle du milieu cytoplasmique. Dans ces conditions le potentiel du fragment de membrane sous la pipette est opposé à celui de la pipette. Effet de l'acide xanthurénique sur l'activation du courant cationique Le fragment de membrane enregistré était périodiquement stimulé (fréquence 0.2 Hz) par une rampe de potentiel de-70 à 100 mV (voir protocole dans la Fig. 24 A, trace du bas). Dans les conditions contrôles utilisant un milieu pipette pauvre en ion chlorure (substitués par du TCA), le courant enregistré était stable et avait une amplitude de-0. 4 : t 0. 1 et 8.6 0. 2 pA (n = 30) aux potentiels respectifs de-70 et 100 mV. Ce courant s'inversait à un potentiel de-48. 3 3. 5 mV (n = 3). Cette valeur proche du potentiel d'inversion des cations monovalents (-49.5 mV, si on estime que la concentration intracellulaire des ions K+ et Na+ est respectivement de 140 et 2 mM) montre dans ces conditions d'enregistrement, qu'il y a une perméabilité basale sélective aux cations. La relation courant potentiel présentait une forte rectification sortante (Fig. 24A et C), en accord avec la distribution asymétrique des cations de part et d'autre du fragment de membrane enregistré. En présence de l'acide xanthurénique à une concentration de 1 à 20 uM après un délai (de 1 à 4 min) dépendant de la concentration de l'agoniste, l'amplitude du courant cationique est augmentée (de 10 à 40 %) avec une cinétique lente sur lequel peut se greffer des courants transitoires de grande amplitude. Dans le cas de la fig. 24, l'augmentation de l'amplitude du courant au pique du transitoire et au potentiel de 100 mV était d'un facteur 5. En moyenne, pour une concentration de 20 uM de l'agoniste, l'amplitude du courant est augmentée d'un facteur 5.0 1. 7 (n=3). La relation l-V du courant spécifiquement active en présence de l'acide xanthurénique (après soustraction du courant obtenu en conditions contrôle) a des caractéristiques similaires à celle du courant contrôle (Fig. 24C). En particulier, le potentiel d'inversion était quasiment identique à celui du contrôle et avait d'une valeur moyenne de-51. 6 2. 1 (n=3). Ceci est vrai à la fois pour le courant lent et pour le courant transitoire. Cette valeur du potentiel d'inversion est voisine du potentiel d'équilibre des cations monovalents ce qui suggère que l'acide xanthurénique peut induire dans ces conditions, l'activation d'un courant de nature cationique. Le fait que ce courant soit enregistré au niveau d'un fragment de membrane physiquement isolé du reste de la cellule où l'agoniste est appliqué, montre que l'activation de ces canaux cationiques passe par un relais intracellulaire intermédiaire entre le récepteur et le canal. Pour répondre à la question si ces canaux cationiques laissent passer aussi les cations divalents, en particulier le calcium, nous avons réalisé le même type d'expérience que précédemment mais avec un milieu pipette contenant essentiellement des ion Ba2+ (l'ensemble des cations monovalent est remplacé par du Ba2+ à l'exception de 2 mM d'ions K+ et 15 mM d'ions TEA+). Dans ces conditions aussi on observe en présence de l'acide xanthurénique, l'activation d'un courant dont le potentiel d'inversion avait cette fois ci une valeur moyenne de 2.6 2.5 mV (n=7). La substitution des cations monovalents par ! e Ba a déplacé) e potentiel d'inversion de la réponse d'environ 54 mV. Dans le cas où les ions Ba2+ ne participeraient pas au courant activé par l'agoniste, le potentiel d'inversion attendu aurait une valeur de-53. 5 mV. La différence observée témoigne du passage des ions Ba2+ à travers les canaux cationiques. Effet de l'acide xanthurénique sur l'activation d'un courant chlorure Sur un certain nombre de réponses en particulier celles qui ne présentent pas de courant transitoire, on a observé cependant une évolution du potentiel d'inversion du courant induit par l'agoniste. Ainsi dans le cas illustré dans la Fig. 25, le début de la réponse avait un potentiel d'inversion de-16. 5 mV qui témoigne de la contamination du courant cationique par un autre courant dont le potentiel d'équilibre a une valeur plus dépolarisée. Dans une deuxième phase de la réponse le potentiel a évolué vers une valeur encore plus dépolarisée-4. 2 mV. le courant qui s'est rajouté a un potentiel d'inversion compatible avec un mouvement d'ions chlorure dans nos conditions expérimentales. Pharmacologie de la réponse à l'acide xanthurénique Le NCS-482 appliqué à une concentration de 10 à 20 uM à la cellule NCB-20, induit une réponse quasi-identique à celle de l'acide xanthurénique (Fig. 25 et 26). Ce résultat, montre que le NCS-482, une molécule capable de déplacer la liaison de l'acide xanthurénique, a des propriétés d'agoniste sur le récepteur du Xanthurénate. Le NCS-486 qui déplace aussi la liaison de l'acide xanthurénique, n'a aucune action quand il est appliqué seul (20uM) par contre sa présence réduit l'amplitude de la réponse induite par l'agoniste (Fig. 26). Ce qui lui confère des propriétés antagonistes sur le récepteur du xanthurénate. 7. NEUROPHARMACOLOGIE DE L'ACIDE XANTHURENIQUE (XA) EVALUATION COMPORTEMENTALE CHEZ LE RAT. 1) Mesure de l'activité locomotrice par cellules infra-rouges : Les doses étudiées ont été les suivantes : 12.5, 25,37. 5,50, 100 et 200 mg/kg (i. p.) (Figure 27). Ce test a mis en évidence une diminution de l'activité motrice, et ceci à des doses de XA supérieures ou égales à 50 mg/kg. L'intensité de la sédation observée a été proportionnelle à la quantité de produit injectée. 2) Mesure de la réactivité globale de l'animal par le test open field . Ce test a confirmé l'absence de sédation à la dose de 37.5 mg/kg, dose à laquelle l'exploration du centre de la cage était significativement augmentée, ceci pouvant être interprété comme un effet anxiolytique potentiel (Figure 28). Cette tendance à été confirmée par un test évaluant les interactions sociales entre deux congénères (Ramos et al. Behav Brain Res 85199757 - 69). La dose de 50 mg/kg a montré un effet significatif de l'augmentation de la durée des interactions sociales de l'animal traité par rapport à son congénère témoin non traité. A la dose de 100 mg/kg, la sédation significative induite par le produit a perturbé cette évaluation. 3) Mise en evidence d'un effet de type antidépresseur par le test de Porsolt. Les doses utilisées ont été les suivantes : 50,100, 150 et 200 mg/kg i. p. Ce test a été validé par l'imipramine 30 mg/kg. Le test utilisé est le test de Porsolt et al. Eur. J Pharmacol 47 (1978) 379-391. Les doses de 100,150, 200 mg/kg ont montré une diminution statistiquement significative des durées cumulées d'immobilité indiquant un effet similaire à celui obtenu par l'imipramine (Figures 29 et 30). 4) Mise en évidence d'un effet de l'ac xanthurénique sur les processus de mémorisation par le test de reconnaissance d'objets. Ennaceur et Delacour ; Behav Brain Res 31 (1988) 47-59. Les doses utilisées ont été les suivantes : 37.5 et 75 mg/kg i. p. Les résultats obtenus (Figure 31) ont montré une augmentation significative de l'indice de reconnaissance des objets par les animaux traités par rapport aux contrôles. L'augmentation de cet indice peut être interprétée comme un apport bénéfique du produit favorisant la mémoire à court terme. * 5) Effets de l'ac. xanthurénique après injections intracérébrales. Le produit a été injecté par voie intra-cérébroventriculaire (i. c. v) d'une part, et dans des structures cérébrales définies d'autre part : aire tegmentale ventrale (A10), substance noire (A9) ou noyau accumbens. Pour les doses de 2,4, 10,50 pg/rat de XA, des stéréotypies proportionnelles à la dose injectée ont été observées. Après disparition des stéréotypies (30 minutes 15), la ré-injection du XA a conduit aux mêmes observations. 6) Etude des potentialités antagonistes du NCS-486 sur des animaux dont les voies nigrostriatale et mésocorticolimbique ont été lésées de manière unilatérale par des injections intracérébrales (VTA ; SNc) d'un neurotoxique (6-OHDA) après protection des neurones noradrénergiques par prétraitement à la désipramine. L'injection d'une dose non sédative de XA (25 mg/kg i. p. ) n'antagonise pas les rotations contralatérales induites par l'injection d'apomorphine (0.05, 0.1 mg/kg s. c.) La recherche d'une potentialisation des rotations ipsilatérales induites par l'amphétamine et l'antagonisme éventuel du NCS-486 sur les rotations ipsilatérales induites par 25 mg/kg i. p. de xanthurénate est en cours. 7) Analyse électroencéphalographique (EEG) de la sédation induite par l'injection (i. p. ) d'ac. xanthurénique. Les doses étudiées se sont réparties entre 50 et 500 mg/kg (i. p). L'analyse E. E. G détaillée n'avait pas mis en évidence de tracé de type épileptique ou de type sommeil lent profond . Seule une réduction de l'amplitude des ondes EEG a été observée. Cette sédation était accompagnée d'une baisse significative de la température corporelle proportionnelle à la dose de produit injectée (-0. 5 à-2 C). EN CONCLUSION, les tests neuropharmacologiques que nous avons menés chez le rat après traitement à l'acide xanthurénique soit par voie périphérique, soit par voie locale, ont montré : Le XA possède un effet sédatif chez l'animal, avec un effet/dose très démonstratif. Cet effet sédatif est corroboré par plusieurs tests. Dans l'open field ou on observe le comportement spontané de l'animal, nous avons pu remarquer que le XA possédait un effet anxiolytique à des doses non sédatives et qu'il favorisait les interactions sociales. Certains tests visant à explorer un effet antidépresseur du XA ont montré que celui-ci potentialisait l'humeur de l'animal, suivant un effet/dose. Des tests mnésiques démontrent que le XA favorise la mémoire à court terme. Enfin, cette substance possède un fort pouvoir dopaminergique objectivé par l'induction de stéréotypies. Ces stéréotypies sont bloquées par l'antagoniste NCS-486 à fortes doses. L'examen EEG ne montre pas d'effets épileptiques du XA ou d'effet inducteur sur le sommeil lent profond, par contre on observe une diminution de l'amplitude du tracé et une hypothermie, ces deux phénomènes pouvant être corrélés à la sédation. REVENDICATIONS 1. Méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés, comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un composé test avec une cellule ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique exprimant une molécule cible impliquée dans l'activité de l'acide xanthurénique, et la mise en évidence d'une liaison du composé test à ladite molécule. 2. Méthode selon la revendication 1, comprenant la mise en contact d'un composé test avec une cellule (ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique) exprimant une molécule cible impliquée dans l'activité de l'acide xanthurénique, en présence d'un ligand marqué de ladite cible, et la mise en évidence d'une liaison du composé test par détermination du déplacement de la liaison du ligand marqué. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la molécule cible est le récepteur du XA, une enzyme de synthèse du XA, un transporteur du XA ou un fragment de ceux-ci. 4. Méthode selon la revendication 3, comprenant la mise en contact d'un composé test avec une cellule (ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique) exprimant un récepteur à l'acide xanthurénique et la mise en évidence d'une liaison du composé test au récepteur. 5. Méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés, comprenant la mise en contact d'un composé test avec une cellule exprimant une molécule cible impliquée dans l'activité de l'acide xanthurénique, et la mise en évidence d'un effet biologique ou pharmacologique caractéristique d'une liaison du composé test à ladite molécule cible. 6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'effet biologique ou pharmacologique mesuré est l'expression d'une ou plusieurs protéines cellulaires, l'expression d'un récepteur, l'activation d'un gène, l'internalisation du récepteur, l'apparition d'un courant électrique, d'un flux ou d'un influx d'ions. 7. Méthode selon la revendication 5 ou 6, comprenant la mise en contact d'un composé test avec une cellule exprimant un récepteur à l'acide xanthurénique, en présence d'un ligand dudit récepteur, la mesure d'un effet biologique ou pharmacologique caractéristique d'une liaison au récepteur XA et la comparaison de l'effet mesuré à celui obtenu en l'absence de composé test. 8. Méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés, comprenant : - la mise en contact d'un composé test avec une molécule cible impliquée dans l'activité du XA, par exemple une enzyme de synthèse ou de régulation, un transporteur, un récepteur, ou un fragment de ceux-ci, et - la détermination de la liaison éventuelle dudit composé test sur ladite molécule. 9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que la liaison du composé test est mise en évidence par migration sur gel, électrophorèse, FRET SPA ou par détermination du déplacement d'un ligand marqué par le composé test. 10. Procédé de production d'un composé actif, notamment sur le système nerveux, le procédé comprenant : - la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'activité de XA in vitro ou ex vivo, et - la synthèse dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci. 11. Procédé de production d'un modulateur de XA, le procédé comprenant : - la mise en contact d'un composé avec une molécule cible impliquée dans l'activation du XA, - la détermination d'un effet du composé sur la molécule cible, ledit effet indiquant que le composé est un modulateur de XA, et - la synthèse dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci. 12. Procédé de production d'un médicament comprenant un composé actif, notamment sur le système nerveux, le procédé comprenant : - la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'activité de XA in vitro ou ex vivo, et - le mélange dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci avec un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. 13. Procédé de production d'un médicament comprenant un composé modulateur de XA, le procédé comprenant : - la mise en contact d'un composé avec une molécule cible impliquée dans l'activation du XA, - la détermination d'un effet du composé sur la molécule cible, ledit effet indiquant que le composé est un modulateur de XA, et - le mélange dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci avec un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. 14. Utilisation d'un composé modulant l'activité de l'acide xanthurénique pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies du système nerveux. 15. Utilisation selon la revendication 14, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de l'anxiété. 16. Utilisation selon la revendication 14, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de la dépression. 17. Utilisation selon la revendication 14, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de troubles de la mémoire ou des interactions sociales. 18. Utilisation selon la revendication 14, pour la préparation d'un médicament sédatif et/ou hypnotique. 19. Utilisation selon la revendication 14, pour la préparation d'un médicament destiné à moduler l'action dopaminergique. 20. Utilisation d'un composé modulant l'activité de l'acide xanthurénique pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de maladies neurodégénératives, notamment de la maladie de Parkinson, d'Alzheimer ou de l'ALS, ou de maladies mentales, telles que la schizophrénie, ou encore de la dépendance à certaines drogues, notamment aux opiacées.