Brevet FR2827867A1 — publié le 20030131

UTILISATION DE FRAGMENTS PEPTIDIQUES DE LA SOUS-UNITE a-1 DES CANAUX CALCIQUES, COMPORTANT LE CAS ECHEANT DES MUTATIONS, POUR LE CRIBLAGE DE MOLECULES D'INTERET THERAPEUTIQUE. La présente invention a pour objet l'utilisation de fragments peptidiques de la sousunité a-1 des canaux calciques de mammifères, de séquences dérivées par mutation desdits fragments, ou encore de cellules transformés par des séquences codant pour lesdits fragment ou séquences dérivées, pour le criblage de molécules d'intérêt thérapeutique. L'importance de la boucle I-II dans la régulation de l'activité du canal est connu depuis 1994, date à laquelle le site d'ancrage de la sous-unité P auxiliaire fut identifié (Pragnell M. et al., (1994), Calcium channel beta-subunit binds to a conserved motif in the I-II cytoplasmic linker of the alpha 1-subunit Nature 368,67-70 : ). Cette sous-unité ss produit un nombre impressionnant de modifications fonctionnelles des canaux calciques. La boucle cytoplasmique I-II de la sous-unité a-1 des canaux calcium haut-seuils dépendants du potentiel relie entre elles le premier et le second des quatre domaines hydrophobes. Elle joue un rôle essentiel dans 1) la régulation de l'activité du canal (propriétés d'activation et d'inactivation), 2) le niveau d'expression membranaire du canal (contrôle du niveau de rétention au sein du réticulum endoplasmique), 3) la régulation par les protéines exogènes (site de fixation du complexe Gpy des protéines G) et 4) la régulation par les sousunité ss des canaux calciques (site d'ancrage de la sous-unité ss et premier site de régulation). D'après les résultats expérimentaux obtenus par les Inventeurs, il apparaît particulièrement intéressant d'utiliser la boucle I-II des canaux calciques pour la. compréhension des rôles cellulaires de ces canaux calciques, pour l'inactivation neuronale, ou encore comme une cible pharmacologique pour la modulation de l'activité des canaux calciques. En effet l'invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs du fait que l'expression exogène de la boucle I-II, lorsqu'elle est couplée à un segment transmembranaire, inhibe de manière substantielle l'expression membranaire de canaux calciques natifs. Ce résultat permet de réduire l'expression de canaux calciques dans un tissu donné afin d'appréhender la fonction cellulaire de ces canaux. Les Inventeurs ont démontré que la boucle I-II est une boucle moléculaire organisatrice. Elle est couplée à d'autres boucles cytoplasmiques du canal calcique (séquences amino et carboxy-tenninales, boucles II-III et III-IV). Ces interactions intra-moléculaires ont pour fonction le contrôle de l'inactivation. Par exemple, l'interaction entre boucle I-II et boucle III-IV du canal calcium de type P/Q a joué un rôle primordial dans le contrôle de la cinétique d'inactivation du canal. De façon spectaculaire, ces interactions sont partiellement ou totalement interrompues par l'interaction de la boucle I-II avec la sous-unité ss. En d'autres termes, la sous-unité ss des canaux calcium entre en compétition avec les interactions intramoléculaires de la boucle 1-11. Avec de tels résultats, on peut s'attendre à ce que le complexe Gpy, qui lui aussi se fixe sur la boucle I-II, puisse aussi entrer en compétition avec ces interactions moléculaires. Ce serait par le biais de ces compétitions que le complexe Gssy provoquerait la régulation du canal calcique (diminution de l'amplitude du courant calcique et ralentissement de la cinétique d'activation). Ainsi, un des principaux buts de la présente invention est de développer un test de criblage visant à identifier des molécules capables de perturber les interactions intramoléculaires et l'activité ionique de la sous-unité al des canaux calciques à hauts-seuils, lesdites molécules étant susceptibles d'être utilisées notamment dans le cadre du traitement de l'ischémie cérébrale ou de la neurodégénérescence La présente invention a pour objet l'utilisation : - de fragments peptidiques de la sous-unité al des canaux calciques de mammifères, lesdits fragments correspondant à la boucle I-II et/ou à la boucle III-IV de ladite sous-unité al, ou correspondant à une séquence peptidique dérivée de cette boucle I-II ou IH-IV, notamment par substitution, et/ou délétion, et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ou correspondant à une partie peptidique de ladite boucle I-II, ou III-IV, ou d'une séquence dérivée de cette dernière, notamment à une partie peptidique d'au moins environ 5 acides aminés, ladite séquence dérivée et ladite partie de la boucle I-II ayant la propriété de ladite boucle I-II de se lier à la sous-unité fui et à la boucle III-IV desdits canaux calciques, ladite séquence dérivée et ladite partie de la boucle III-IV ayant la propriété de ladite boucle III-IV de se lier à ladite boucle I-II, - ou de séquences peptidiques mutées, dérivées par mutation d'un ou plusieurs acides aminés desdits fragments peptidiques susmentionnés de la boucle 1-II de la sous-unité al des canaux calciques dans la mesure où la ou les mutations en question affectent des acides aminés essentiels dans le cadre de l'expression des canaux calciques à la surface membranaire, et/ou de séquences peptidiques dérivées par mutation d'un ou plusieurs acides aminés desdits fragments peptidiques susmentionnés de la boucle III-IV de la sous-unité al des canaux calciques, dans la mesure où la ou les mutations en question affectent des acides aminés essentiels dans le cadre de l'inactivation des canaux calciques, - ou de cellules transformées par des séquences nucléotidiques codant pour les fragments peptidiques susmentionnés de la boucle I-II et/ou de la boucle III-IV de la sousunité al des canaux calciques, ou codant pour les séquences peptidiques mutées susmentionnées, pour la mise en oeuvre de procédés de criblage : - de molécules restaurant le nombre de canaux calciques à la normale dans les membranes cellulaires où ce nombre a anormalement diminué, à savoir du criblage de molécules P like susceptibles d'être utilisées dans le cadre du traitement de pathologies liées à une diminution anormale du nombre de canaux calciques telles que l'épilepsie, ou les dégénérescences neuronales, - et/ou de molécules augmentant le nombre de canaux calciques dans les membranes cellulaires, à savoir du criblage de molécules ss like susceptibles d'être utilisées dans le cadre du traitement de pathologies contre lesquelles une augmentation du nombre de canaux calciques à la membrane plasmique aurait un effet bénéfique, telle que la maladie de Parkinson, les diabètes insulino-dépendants, ou le syndrome myasthénique de Lambert- Eaton,, - et/ou de molécules restaurant le nombre de canaux calciques à la normale dans les membranes cellulaires où ce nombre a anormalement augmenté, à savoir du criblage de molécules susceptibles d'être utilisées dans le cadre du traitement de pathologies liées à une augmentation anormale du nombre de canaux calciques telle que l'hypertrophie cardiaque, - et/ou de molécules réduisant le nombre de canaux calciques dans les membranes cellulaires, à savoir du criblage de molécules susceptibles d'être utilisées dans le cadre du traitement de pathologies contre lesquelles une diminution du nombre de canaux calciques à la membrane plasmique aurait un effet bénéfique, telle que l'épilepsie, l'hypertension, l'angine de poitrine, ou l'ischémie cérébrale, - et/ou de molécules régulant l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs, à savoir du criblage de molécules susceptibles d'être utilisées dans le cadre de la stimulation ou de l'inhibition de la communication neuronale, notamment dans le cadre du traitement de pathologies contre lesquelles une régulation de l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs aurait un effet bénéfique, telles que les épilepsies, les ataxies, les migraines, la maladie de Parkinson, ou les ischémies cérébrales. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de fragments peptidiques correspondant à la boucle I-II de la sous-unité al, ou à une séquence peptidique dérivée, ou à une partie de cette boucle I-II, ou de cellules transformées par des séquences nucléotidiques codant pour lesdits fragments, tels que définis ci-dessus, pour la mise en oeuvre de procédés de criblage : - de molécules restaurant le nombre de canaux calciques à la normale dans les membranes cellulaires où ce nombre a anormalement diminué, telles que définies ci-dessus, - et/ou de molécules augmentant le nombre de canaux calciques dans les membranes cellulaires, telles que définies dans la revendication 1. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée : - de la séquence peptidique correspondant à la boucle I-II de la sous-unité Cav2. 1 des canaux calciques de cellules neuronales de lapin, ladite séquence correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 suivante : SGEFAKERERVENRRAFLKLRRQQQIERELNGYMEWISKAEEVILAEDETDVEQRHPF DGALRRATIKKSKTDLLHPEEAEDQLADIASVGSPFARASIKSAKLENSSFFHKKERR MRFYIRRMVKTQ - ou de la séquence peptidique correspondant à la boucle I-II de la sous-unité Cav2. 1 des canaux calciques de cellules neuronales humaines, ladite séquence correspondant à la séquence SEQ ID NO : 4 suivante : SGEFAKERERVENRRAFLKLRRQQQIERELNGYMEWISKAEEVILAEDETDGEQRHPF DGALRRTTIKKSKTDLLNPEEAEDQLADIASVGSPFARASIKSAKLENSTFFHKKERR MRFYIRRMVKTQ - ou de cellules transformées avec les séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 3 suivantes codant respectivement pour les séquences peptidiques SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 4 susmentionnées : SEQIDN 1 : tcaggggagtttgccaaagaaagggagcgggtggagaaccggcgcgcattcctgaagctgcggcggcagcagcagattgaacgc gagctcaacgggtacatggagtggatctcaaaagcagaagaggtgatcctcgcagaggacgagaccgacgtggagcagagacatc cctttgatggagctctgcggagagccactatcaagaagagcaagacggacctgctccacccagaggaggcggaggatcagctggcc gacatcgcctccgtggggtctccctttgcccgagccagcattaaaagtgccaagctggagaactcgagttttttccacaaaaaagagag gagaatgcgtttctacatccgtcgcatggtcaaaactcag SEQ ID N03 tcagggg agtttgccaa agaaagggaa cgggtggaga accggcgggc ttttctgaag ctgaggcggc aacaacagat tgaacgtgag ctcaatgggt acatggaatg gatctcaaaa gcagaagagg tgatcctcgc cgaggatgaa actgacgggg agcagaggca tccctttgat ggagctctgc ggagaaccac cataaagaaa agcaagacag atttgctcaa ccccgaagag gctgaggatc agctggctga tatagcctct gtgggttctc ccttcgcccg agccagcatt aaaagtgcca agctggagaa ctcgaccttt tttcacaaaa aggagaggag gatgcgtttc tacatccgcc gcatggtcaa aactcag De préférence, dans le cas de l'utilisation susmentionnée de fragments peptidiques de la sous-unité al ayant une taille supérieure à environs 5 acides aminés, lesdits fragments sont fusionnés du côté N-terminal à une séquence peptidique transmembranaire, à savoir une séquence peptidique ayant pour effet de maintenir lesdits fragments peptidiques dans la membrane cellulaire, telle que la séquence transmembranaire de la chaîne a du récepteur CD8 humain contenue dans la séquence SEQ ID NO : 5 suivante : LDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHR En variante, l'invention concerne également l'utilisation susmentionnée de cellules transformées avec une séquence nucléotidique recombinante exogène codant pour une séquence peptidique transmembranaire telle que définie ci-dessus, cette dernière séquence étant située en amont de la séquence codant pour le fragment peptidique susmentionné de la sous-unité al. L'invention a également pour objet tout procédé de criblage de molécules restaurant le nombre de canaux calciques à la normale dans les membranes cellulaires où ce nombre a anormalement diminué, telles que définies ci-dessus, et/ou de molécules augmentant le nombre de canaux calciques dans les membranes cellulaires, telles que définies ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mise en présence de fragments peptidiques de la sous-unité al tels que définis cidessus, avec des cellules exprimant des canaux calciques pendant un temps suffisant pour que le nombre de canaux calciques diminue de manière significative à la surface desdites cellules, puis avec des molécules à tester, - ou mise en présence de cellules transformées à l'aide de séquences nucléotidiques codant pour des fragments peptidiques de la sous-unité al tels que définis ci-dessus, réduisant ainsi le nombre de canaux calciques à la surface desdites cellules, avec des molécules à tester, - détection d'une éventuelle augmentation du nombre de canaux calciques à la surface des cellules transformées témoignant de l'effet des molécules testées d'augmentation du nombre de canaux calciques à la surface des membranes cellulaire, notamment par mesures électrophysiologiques, ou à l'aide de sondes fluorescentes ou radioactives. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de séquences peptidiques dérivées par mutation d'un ou plusieurs acides aminés des fragments peptidiques de la boucle I-II de la sous-unité al des canaux calciques, la ou les mutations en question affectant des acides aminés essentiels dans le cadre de l'expression des canaux calciques à la surface membranaire, dans la mesure où leur mutation a pour effet d'augmenter ou de diminuer l'expression à la surface de la membrane plasmique des canaux calciques, pour la mise en oeuvre de procédés de criblage : - de molécules restaurant le nombre de canaux calciques à la normale dans les membranes cellulaires où ce nombre a anormalement diminué, telles que définies ci-dessus, - et/ou de molécules augmentant le nombre de canaux calciques dans les membranes cellulaires, telles que définies ci-dessus, - et/ou de molécules restaurant le nombre de canaux calciques à la normale dans les membranes cellulaires où ce nombre a anormalement augmenté, telles que définies ci-dessus, - et/ou de molécules réduisant le nombre de canaux calciques dans les membranes cellulaires, telles que définies dans la revendication 1. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de séquences peptidiques comportant une ou plusieurs mutations ayant pour effet d'augmenter l'expression à la surface de la membrane plasmique des canaux calciques, lesdites séquences peptidiques étant dérivées par mutation d'un au moins des acides aminés situés aux positions 383,395, 396,398, 427, et 428 de la sous-unité Cav2.1 des canaux calciques de cellules neuronales de lapin, ou humaines, à savoir des séquences peptidiques correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 4, dans laquelle l'un au moins de Q en position 24, W en position 36, 1 en position 37, K en position 39, K en position 68, et K en position 69, est substitué par un acide aminé naturel ou non, notamment par une alanine. L'invention concerne plus particulièrement encore l'utilisation susmentionnée de séquences peptidiques comportant une ou plusieurs mutations ayant pour effet de diminuer l'expression à la surface de la membrane plasmique des canaux calciques, lesdites séquences peptidiques étant dérivées par mutation d'un au moins des acides aminés situés aux positions 387,422, et 423 de la sous-unité Cav2. 1 des canaux calciques de cellules neuronales de lapin, ou aux positions équivalentes de la sous-unité Cav2.1 humaine, à savoir des séquences peptidiques correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 4, dans laquelle l'un au moins de R en position 28, R en position 63, et R en position 64, est substitué par un acide aminé naturel ou non, notamment par. une alanine. L'invention concerne également tout procédé de criblage : - de molécules restaurant le nombre de canaux calciques à la normale dans les membranes cellulaires où ce nombre a anormalement diminué, telles que définies ci-dessus, - et/ou de molécules augmentant le nombre de canaux calciques dans les membranes cellulaires, telles que définies ci-dessus, - et/ou de molécules restaurant le nombre de canaux calciques à la normale dans les membranes cellulaires où ce nombre a anormalement augmenté, telles que définies dans la revendication 1, - et/ou de molécules réduisant le nombre de canaux calciques dans les membranes cellulaires, telles que définies ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mise en présence de séquences peptidiques dérivées de la boucle I-II de la sous-unité al tels que définies ci-dessus, avec des molécules à tester déjà sélectionnées pour leur capacité à se lier spécifiquement aux séquences peptidiques non mutées correspondant auxdites boucles I-II, - sélection des molécules susmentionnées se liant spécifiquement aux boucles 1- II et ne se liant pas aux séquences peptidiques dérivées susmentionnées, notamment par l'utilisation de la technique de Biacore (O'Shannessy DJ et al. (1992) Immobilization chemistries suitable for use in the Biacore surface plasmon resonance detector Anal Biochem. 205,132- 136) basée sur un principe physique et optique d'interaction moléculaire, - le cas échéant, mise en présence des molécules sélectionnées à l'étape précédente avec des cellules exprimant des canaux calciques, et observation de l'éventuel effet des molécules sélectionnées sur l'augmentation ou la diminution du nombre de canaux calciques à la surface desdites cellules, notamment par mesures éléctrophysiologiques, ou à l'aide de sondes fluorescentes ou radioactives. L'invention a également pour objet l'utilisation susmentionnée de séquences peptidiques dérivées par mutation d'un ou plusieurs acides aminés des fragments peptidiques de la boucle I-II de la sous-unité al des canaux calciques, la ou les mutations en question affectant des acides aminés essentiels dans le cadre de l'inactivation des canaux calciques présents à la surface membranaire, dans la mesure où leur mutation a pour effet de moduler l'activité des canaux calciques, pour la mise en oeuvre de procédés de criblage de molécules régulant l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs, telles que définies ci-dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de séquences peptidiques comportant une ou plusieurs mutations ayant pour effet d'inactiver les canaux calciques, lesdites séquences peptidiques étant dérivées par mutation d'un au moins des acides aminés situés aux positions 387 et 388 de la sous-unité Cav2.1 des canaux calciques de cellules neuronales de lapin, ou humaines, à savoir des séquences peptidiques correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 4, dans laquelle l'un au moins de R en position 28, et E en position 29, est substitué par un acide aminé naturel ou non, notamment R28 est substitué par une alanine ou par E, et E29 est substitué par une alanine. L'invention concerne également tout procédé de criblage de molécules régulant l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs, telles que définies ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mise en présence de séquences peptidiques dérivées de la boucle I-II de la sous-unité al tels que définies ci-dessus, avec des molécules à tester déjà sélectionnées pour leur capacité à se lier spécifiquement aux séquences peptidiques non mutées correspondant auxdites boucles I -II, - sélection des molécules susmentionnées se liant spécifiquement aux boucles I-II et ne se liant pas aux séquences peptidiques dérivées susmentionnées, notamment par la technique Biacore susmentionnée, - le cas échéant, mise en présence des molécules sélectionnées à l'étape précédente avec des cellules exprimant des canaux calciques, et observation de l'éventuel effet des molécules sélectionnées sur la régulation de l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs desdites cellules, notamment par mesures électrophysiologiques. L'invention a également pour objet l'utilisation susmentionnée de fragments peptidiques correspondant à la boucle III-EV de la sous-unité al, ou à une séquence peptidique dérivée, ou à une partie de cette boucle III-IV, ou de cellules transformées par des séquences nucléotidiques codant pour lesdits fragments, tels que définis ci-dessus, pour la mise en oeuvre de procédés de criblage de molécules régulant l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs, telles que définies ci-dessus. L'invention a plus particulièrement l'utilisation susmentionnée : - de la séquence peptidique correspondant à la boucle III-IV de la sous-unité Cav2. 1 des canaux calciques de cellules neuronales humaines ou de lapin, ladite séquence correspondant à la séquence SEQ ID NO : 7 suivante : ITFQEQGDKMMEEYSLEKNERACIDFAISAKPLTRHMPQNKQSFQYRMWQFVVSP - ou des cellules transformées avec la séquence nucléotidique codant pour la boucle III-IV de la sous-unité Cav2.1 des canaux calciques de cellules neuronales humaines, ladite séquence correspondant à la séquence SEQ ID NO : 6 suivante : at caccttccag gagcaagggg acaagatgat ggaggaatac agcctggaga aaaatgagag ggcctgcatt gatttcgcca tcagcgccaa gccgctgacc cgacacatgc cgcagaacaa gcagagcttc cagtaccgca tgtggcagtt cgtggtgtct ccg - ou de cellules transformées avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO : 8 codant respectivement pour les séquences peptidiques SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 9 susmentionnées codant pour la boucle III-IV de la sous-unité Cav2. 1 des canaux calciques de cellules neuronales de lapin, ladite séquence correspondant à la séquence SEQ ID NO : 8 suivante : atcacct tccaggagca gggcgacaag atgatggagg agtacagctt ggagaaaaac gagagggcct gcatcgactt cgccatcagt gccaagccgc tgaccaggca catgccccag aacaagcaga gcttccagta ccgcatgtgg cagttcgtgg tgtccccg De préférence dans le cas de l'utilisation de fragments peptidiques de la sous-unité al ayant une taille supérieure à environ 5 acides aminés, lesdits fragments sont fusionnés ou non du côté N-terminal à une séquence peptidique transmembranaire, à savoir une séquence peptidique ayant pour effet de maintenir lesdits fragments peptidiques dans la membrane cellulaire, telle que la séquence transmembranaire de la chaîne a du récepteur CD8 humain contenue dans la séquence SEQ ID NO : 5 suivante : LDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHR En variante, l'invention concerne également l'utilisation susmentionnée de cellules transformées avec une séquence nucléotidique recombinante exogène codant pour une séquence peptidique transmembranaire telle que définie ci-dessus, cette dernière séquence étant située en amont de la séquence codant pour le fragment peptidique susmentionné de la sous-unité ex 1. L'invention a également pour objet tout procédé de criblage de molécules régulant l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs, telles que définies ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mise en présence de fragments peptidiques de la sous-unité al tels que ci-dessus, avec des cellules exprimant des canaux calciques pendant un temps suffisant pour que l'état d'inactivation des canaux soit modifié, puis avec des molécules à tester, - ou mise en présence de cellules transformées à l'aide de séquences nucléotidiques codant pour des fragments peptidiques de la sous-unité al tels que définis ci-dessus, avec des molécules à tester, - détection de l'effet des molécules testées sur l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs, notamment par mesures électrophysiologiques. L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée de séquences peptidiques dérivées par mutation d'un ou plusieurs acides aminés des fragments peptidiques de la boucle III-IV de la sous-unité al des canaux calciques, la ou les mutations en question affectant des acides aminés essentiels dans le cadre de l'inactivation des canaux calciques présents à la surface membranaire, dans la mesure où leur mutation a pour effet'de moduler l'activité des canaux calciques, pour la mise en oeuvre de procédés de criblage de molécules régulant l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs, telles que définies ci-dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de séquences peptidiques comportant une ou plusieurs mutations ayant pour effet d'inactiver les canaux calciques, lesdites séquences peptidiques étant dérivées par mutation d'un au moins des acides aminés de la séquence peptidique correspondant à la séquence SEQ ID NO : 7. L'invention concerne également tout procédé de criblage de molécules régulant l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs, telles que définies ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mise en présence de séquences peptidiques dérivées de la boucle III-IV de la sousunité al tels que définies ci-dessus, avec des molécules à tester déjà sélectionner pour leur capacité à se lier spécifiquement aux séquences peptidiques non mutées correspondant auxdites boucles III-IV, - sélection des molécules susmentionnées se liant spécifiquement aux boucles III-IV et ne se liant pas aux séquences peptidiques dérivées susmentionnées, notamment selon la technique Biacore susmentionnée, - le cas échéant, mise en présence des molécules sélectionnées à l'étape précédente avec des cellules exprimant des canaux calciques, et observation de l'éventuel effet des molécules sélectionnées sur la régulation de l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs desdites cellules, notamment par mesures électrophysiologiques. L'invention a également pour objet les séquences peptidiques suivantes : - les séquences SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 4 dans lesquelles l'un au moins de Q en position 24, W en position 36, 1 en position 37, K en position 39, K en position 68, et K en position 69, est substitué par un acide aminé naturel ou non, notamment par une alanine, - les séquences SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 4 dans lesquelles l'un au moins de R en position 28, R en position 63, et R en position 64, est substitué par un acide aminé naturel ou non, notamment par une alanine, - les séquences SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 4 dans lesquelles l'un au moins de R en position 28, et E en position 29, est substitué par un acide aminé naturel ou non, notamment R28 est substitué par une alanine ou par E, et E29 est substitué par une alanine. L'invention sera davantage illustrée à l'aide des résultats expérimentaux qui suivent : 1- Démonstration de la diminution du nombre de canaux calciques à la surface membranaire des cellules chromaffines bovins et des cellules granulaires du cervelet de rat. Les résultats des Inventeurs démontrent que l'expression de la boucle I-II de la sousunité Cav2.1 dans les cellules chromaffines de bovins ou les cellules granulaires de cervelet induit une diminution notable des canaux calciques haut-seuils à la surface membranaire de ces cellules. Les mesures effectuées montrent que plus de 50% du courant calcique haut-seuil est diminué dans ces cellules suite à l'expression de cette séquence. L'expression de la boucle I-II du canal Cav2. 1 est induite suite à une méthode de transfection cellulaire (grâce à un agent de transfection : lipofectamine, fugène, etc...). Afin d'avoir la capacité de fixer les sous-unités ss endogènes à ces cellules, nous avons constaté que la capacité de cette séquence I-II à réduire l'expression à la membrane plasmique des canaux calciques haut-seuils endogènes est facilitée par son couplage à un segment transmembranaire. Les Inventeurs ont utilisé pour leurs expériences le segment transmembranaire de la chaine a du récepteur CD8 humain, couplé à la partie amino-terminale de la boucle 1-11. Afin de faciliter la détection des cellules transfectées, la partie carboxy-terminale de la boucle I-II a été couplée à la protéine GFP (Green Fluorescent Protein) qui possède la propriété de fluorescence verte (facilement détectable en microscopie à fluorescence). La figure 1A illustre la construction utilisée pour ces expériences. En figure 1B, est illustrée la séquence en acide-aminés de la séquence transmembranaire de la chaine a du récepteur CD8. Séquence transmembranaire de la chaîne cr du récepteur CD8 humain (contenu dans) : LDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHR il-Démonstration de l'importance des acides aminés Arg 387 et Glu 388 de la séquence Cav2. 1 de lapin dans l'inactivation de ce canal. Les résultats expérimentaux obtenus démontrent que les acides aminés de la boucle I-II du canal calcique Cav2. 1 interviennent dans l'inactivation de ce canal. Deux modes de participation sont possibles : 1-En absence de sous-unité ss, ces deux acides aminés sont impliqués dans une interaction moléculaire avec la boucle III-IV de la sous-unité Cava. l (Figures 2 et 3). Si ces interactions sont interrompues, soit par mutagenèse des acides aminés Arg 387 ou Glu 388 (Figure 4), soit en exprimant la boucle III-IV (qui peut alors entrer en compétition avec l'interaction naturelle entre les boucles I-II et III-IV du canal Ca, 2. 1, Figure 5), l'inactivation du canal calcique est facilitée. Une inactivation facilitée représente, soit une transition accélérée de l'état ouvert du canal vers son état inactivé, soit une diminution du nombre de canaux activables à un potentiel membranaire donné de la cellule. Les méthodologies permettant la mesure des courants calciques et l'analyse de l'inactivation sont données en annexe D. 2-En présence de sous-unité P (la configuration normale du canal à la membrane plasmique), la charge électrique portée par les chaînes radicales de ces acides aminés (charge + pour Arg 387 et charge-pour Glu 388) joue un rôle dans l'inactivation de ce canal. Les résultats démontrent que dans ces deux cas de figures, ces acides aminés peuvent être prises comme cible d'une intervention pharmacologique directe pour moduler l'inactivation des canaux calciques. La présence de ces acides aminés dans la plupart des canaux calciques neuronaux (Cav2. 1, Cav2. 2 et Cava. 3), et chez la plupart des espèces, y compris chez l'homme suggère fortement que ces acides aminés interviennent également dans l'inactivation de ces canaux. Figure 2 : Fixation de la boucle I-II de Cav2. 1 sur différentes boucles intracellulaires. Une fixation de 1-11 est évidente sur la boucle III-IV de Cav2. 1. Cette boucle III-IV a été exprimée et purifiée comme une protéine de fusion GST (Glutathion-S-Tranferase). La protéine I-II du canal a été traduite in vitro et marquée par un acide aminé radioactif (S- methionine) pour suivre sa fixation sur la protéine de fusion GST-III-IV. Figure 3 : Représentation schématique démontrant les interactions intramoléculaires entre les différentes boucles du canal Cav2. 1. La flèche verte illustre l'interaction entre la boucle I-II et la boucle III-IV de ce eanal. PM = membrane plasmique. Figure 4 : Démonstration de la perte de fixation de la boucle I-II du canal Cav2.1 sur la protéine de fusion GST-III-IV suite à la mutation des acides aminés Arg 387 ou Glu 388. Ces deux acides aminés sont donc indispensables à la fixation de la boucle I-Il sur la boucle III-IV en absence de la sous-unités ss du canal calcium. Figure 5 : L'expression de la boucle III-IV accélère la cinétique d'inactivation du canal Cav2.1. Cette accélération est similaire si la boucle III-IV exprimée est associée à la membrane plasmique (gauche, via un couplage en position amino-tenninale avec la chaîne a du récepteur CD8 humain) ou est libre dans le cytoplasme (droite, injection d'un peptide représentant les 40 acides aminés carboxy-terminal de la boucle III-IV). 111- Démonstration de l'importance de plusieurs acides aminés de la boucle III de la séquence Cav2. 1 de lapin dans la rétention de ce canal au niveau du réticulum endoplasmique. Les résultats de mutagenèse de la boucle I-II de la sous-unité Cav2. 1 et de l'expression dans l'ovocyte de Xénope des mutants correspondants démontrent qu'un certain nombre d'acide aminés de la boucle I-II peuvent être choisies comme cible pour augmenter l'adressage membranaire des canaux calciques haut-seuils. Nous pouvons classer ces acides aminés en deux catégories : (i) les acides aminés dont la fonction est indépendante de la sousunité ss des canaux calciques et dont la mutation induit une augmentation d'expression des canaux calciques à la surface de la membrane, et (ii) les acides aminés dont la mutation seule ne contribue pas à une expression de surface facilitée du canal Cav2. 1 lorsqu'il est exprimé seul, mais plutôt à une facilitation de l'action des sous-unités ss. L'action desdites sous-unités P étant justement de faciliter l'expression des canaux calciques haut-seuils, l'expression à la surface cellulaire de l'ensemble du complexe Cav2. 1/p est également facilitée par la mutagenèse de ces résidus. L'importance des acides aminés p-indépendant est démontrée dans la figure 6, alors que celle des résidus ss-dépendants est illustrée en figure 7. La figure 8 récapitule la position des acides aminés de la boucle I-II dont la mutation peut faciliter l'expression des canaux calciques Figure 6 : Expression de sous-unités Cav2. 1 mutés augmentant l'expression du canal (en absence de sous-unité ss) Mesure en densité de courants à la surface de la membrane plasmique des ovocytes de Xénopes. Voir annexe A ci-après pour la méthodologie d'expression et d'enregistrement des courants électriques. Figure 7 : Expression de sous-unités Cav2. 1 mutés facilitant l'action de stimulation d'expression de la surface membranaire des canaux calciques par la sous-unité ss. Voir annexe D pour la méthodologie d'expression et d'enregistrement des courants électriques. Ci-après sont représentées les positions des acides aminés dont la mutation favorise l'expression à la surface de la membrane plasmique du canal Cav2. 1. En gras, acides aminés p-indépendant, et souligné, les acides aminés ss-dépendants. SGEFAKERERVENRRAFLKLRRQQQIERELNGYMEWISKAEEVILAEDETDVEQRHP FDGALRRATIKKSKTDLLHPEEAEDQLADIASVGSPFARASIKSAKLENSSFFHKKERR 1 427 + 428 (double mutation) MRFYIRRMVKTQ On peut aussi identifier la position des acides aminés dont la mutation entraîne une diminution de l'expression à la surface des cellules. Cette information est donnée à titre d'exemple ci-après. Position des acides aminés dont la mutation entraîne une diminution notable d'expression du canal Cav2. 1 à la membrane (en présence et absence de sous-unité ss). SGEFAKERERVENRRAFLKLRRQQQIERELNGYMEWISKAEEVILAEDETDVEQRHP 387 FDGALRRA TIKKSKTDLLHPEEAEDQLADIASVGSPF ARASIKSAKLENSSFFHKKERR MRFYIRRMVKTQ Afin d'étendre la validité de nos résultats, nous avons aligné la séquence de la boucle I-II du canal Cay2. 1 de lapin à celle de la séquence I-II du canal Cay2. 1 humain. Les positions des acides aminés essentiels à l'ensemble des fonctions citées sont indiquées en gras ci-après. Alignement des séquences de Cay2. 1 de lapin et humain. En gras, acide aminés essentiels. Souligné : les acides aminés différents entre les deux séquences. Cav2.1 humain SGEFAKERERVENRRAFLKLRRQQQIERELNGYMEWISKAEEVIL Cav2. 1 lapin SGEFAKERERVENRRAFLKLRRQQQIERELNGYMEWISKAEEVIL AEDETDGEQRHPFDGALRRTTIKKSKTDLLNPEEAEDQLADIASVGSPFARASIKS AEDETDVEQRHPFDGALRRATIKKSKTDLLHPEEAEDQLADIASVGSPFARASIKS AKLENSTFFHKKERRMRFYIRRMVKTQ AKLENSSFFHKKERRMRFYIRRMVKTQ Annexe A Expression du canal Cav2. 1 dans l'ovocyte de Xénope, mesure électrophysiologique des courants calciques et analyse des propriétés d'inactivation du canal calcique. Expression Les ovocytes de Xénopes sont prélevés aux stades V et VI à partir d'ovaires de grenouille Xenopus laevis d'afrique du sud et maintenus en solution saline classique (milieu de Barth). Les cellules sont traitées à la collagenase type IA (2 mg/ml) pendant deux heures et les membranes folliculaires sont éliminées manuellement. Les ovocytes sont maintenus en milieu DNOM (defined nutrient oocyte medium) durant 2 jours avant injection de cRNA codant pour le canal Cav2.1. L'injection de ce cRNA codant pour le canal sauvage ou muté est effectué à une concentration de 0. 3 Jlg/lll. Dans les cas de coinjection d'autres cRNA (exemple : CD8-III-IV, III-IV, etc...), ces cRNA sont injectés à une concentration de 0.1 tg/tl. Les injections de peptide III-IV sont effectuées à une concentration finale intracellulaire de 10 u. M. Dans tous les cas de figure, le volume d'injection n'excède pas 50 nl par ovocyte. Suite aux injections de cRNA, les cellules sont conservées à 16 C en milieu DNOM pendant au minimum 4-5 jours avant de poursuivre avec les enregistrements électrophysiologiques. Mesures électrophysiologiques Nous avons appliqué la technique de voltage-clamp à deux electrodes pour les enregistrements de courants Ba2+ (le Ba2+ est plus perméable que le Ca2+ au travers des canaux calcium à haut-seuils et facilite nos analyses). Les entregistrements sont effectués avec un amplificateur GeneClamp de chez Axon Instruments (Poster City, CA). Le milieu d'enregistrement extracellulaire contient (en mM) : Ba (OH) 2 40, NaOH 50, KCI 3, HEPES 5, acide niflumique 1, pH 7.4 avec l'acide methane sulfonique. Les électrodes sont remplies avec (en mM) KCI 140, EGTA 10 et HEPES 10 (pH 7.2 avec du KOH) et ont des résistances électriques comprises entre 0.5 et 1 Mil. Les enregistrements de courant électriques sont filtrés on-line à 2 kHz, le courant de fuite est soustrait par un protocole P/6, et échantillonné à 5-10 kHz. Les données sont analysées avec le suite de logiciels pCLAMP version 6.03 (Axon Instruments). Analyse des propriétés d'inactivation du canal Cav2. 1 Afin d'établir des courbes d'inactivation en fonction du potentiel membranaire de cellule, les ovocytes sont depolarisés pendant au moins 30 secondes à une valeur de potentiel donnée (entre-100 et 10 mV ; potentiel de maintien), puis le courant calcique est déclenché par une dépolarisation cellulaire à +20 mV. Cette procédure est répétée plusieurs fois pour des valeurs de potentiel de maintien croissant (de 10 mV en 10 mV). L'amplitude maximale des courants Ba2+ ainsi obtenues pour chaque dépolarisation à +20 mV est comparée à l'amplitude du courant maximal obtenu par une dépolarisation à partir du potentiel de-100 mV vers +20 mV (valeur référence correspondant à 0% d'inactivation des canaux). L'inactivation des canaux calciques est aussi déclenchée par une dépolarisation maintenue à +20 mV (à partir d'une valeur de maintien de-100 mV). Le décours cinétique décroissant du courant illustre le processus d'inactivation des canaux calciques qui est déclenché par la dépolarisation à +20 mV. Pour comparer les différences en cinétiques d'inactivation, nous avons choisit le temps nécessaire à la demi-inactivation des canaux calciques comme valeur de référence. REVENDICATIONS 1. Utilisation : - de fragments peptidiques de la sous-unité al des canaux calciques de mammifères, lesdits fragments correspondant à la boucle I-II et/ou à la boucle III-IV de ladite sous-unité al, ou correspondant à une séquence peptidique dérivée de cette boucle I-II ou III-IV, notamment par substitution, et/ou délétion, et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ou correspondant à une partie peptidique de ladite boucle I-II, ou III-IV, ou d'une séquence dérivée de cette dernière, notamment à une partie peptidique d'au moins environ 5 acides aminés, ladite séquence dérivée et ladite partie de la boucle I-II ayant la propriété de ladite boucle I-II de se lier à la sous-unité ss et à la boucle III-IV desdits canaux calciques, ladite séquence dérivée et ladite partie de la boucle III-IV ayant la propriété de ladite boucle III-IV de se lier à ladite boucle I-II, - ou de séquences peptidiques mutées, dérivées par mutation d'un ou plusieurs acides aminés desdits fragments peptidiques susmentionnés de la boucle I-II de la sous-unité al des canaux calciques dans la mesure où la ou les mutations en question affectent des acides aminés essentiels dans le cadre de l'expression des canaux calciques à la surface membranaire, et/ou de séquences peptidiques dérivées par mutation d'un ou plusieurs acides aminés desdits fragments peptidiques susmentionnés de la boucle III-IV de la sous-unité al des canaux calciques, dans la mesure où la ou les mutations en question affectent des acides aminés essentiels dans le cadre de l'inactivation des canaux calciques, - ou de cellules transformées par des séquences nucléotidiques codant pour les fragments peptidiques susmentionnés de la boucle I-H et/ou de la boucle III-IV de la sousunité al des canaux calciques, ou codant pour les séquences peptidiques mutées susmentionnées, pour la mise en oeuvre de procédés de criblage : - de molécules restaurant le nombre de canaux calciques à la normale dans les membranes cellulaires où ce nombre a anormalement diminué, à savoir du criblage de molécules ss like susceptibles d'être utilisées dans le cadre du traitement de pathologies liées à une diminution anormale du nombre de canaux calciques telles que l'épilepsie, ou les dégénérescences neuronales, - et/ou de molécules augmentant le nombre de canaux calciques dans les membranes cellulaires, à savoir du criblage de molécules ss like susceptibles d'être utilisées dans le cadre du traitement de pathologies contre lesquelles une augmentation du nombre de canaux calciques à la membrane plasmique aurait un effet bénéfique, telle que la maladie de Parkinson, les diabètes insulino-dépendants, ou le syndrome myasthénique de Lambert- Eaton,, - et/ou de molécules restaurant le nombre de canaux calciques à la normale dans les membranes cellulaires où ce nombre a anormalement augmenté, à savoir du criblage de molécules susceptibles d'être utilisées dans le cadre du traitement de pathologies liées à une augmentation anormale du nombre de canaux calciques telle que l'hypertrophie cardiaque, - et/ou de molécules réduisant le nombre de canaux calciques dans les membranes cellulaires, à savoir du criblage de molécules susceptibles d'être utilisées dans le cadre du traitement de pathologies contre lesquelles une diminution du nombre de canaux calciques à la membrane plasmique aurait un effet bénéfique, telle que l'épilepsie, l'hypertension, l'angine de poitrine, ou l'ischémie cérébrale, - et/ou de molécules régulant l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs, à savoir du criblage de molécules susceptibles d'être utilisées dans le cadre de la stimulation ou de l'inhibition de la communication neuronale, notamment dans le cadre du traitement de pathologies contre lesquelles une régulation de l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs aurait un effet bénéfique, telles que les épilepsies, les ataxies, les migraines, la maladie de Parkinson, ou les ischémies cérébrales. 2. Utilisation selon la revendication 1 de fragments peptidiques correspondant à la boucle I-II de la sous-unité al, ou à une séquence peptidique dérivée, ou à une partie de cette boucle I-II, ou de cellules transformées par des séquences nucléotidiques codant pour lesdits fragments, tels que définis dans la revendication 1, pour la mise en oeuvre de procédés de criblage : - de molécules restaurant le nombre de canaux calciques à la normale dans les membranes cellulaires où ce nombre a anormalement diminué, telles que définies dans la revendication 1, - et/ou de molécules augmentant le nombre de canaux calciques dans les membranes cellulaires, telles que définies dans la revendication 1. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2 : - de la séquence peptidique correspondant à la boucle I-II de la sous-unité Cav2.1 des canaux calciques de cellules neuronales de lapin, ladite séquence correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 suivante : SGEFAKERERVENRRAFLKLRRQQQIERELNGYMEWISKAEEVILAEDETDVEQRHPF DGALRRATIKKSKTDLLHPEEAEDQLADIASVGSPFARASIKSAKLENSSFFHKKERR MRFYIRRMVKTQ - ou de la séquence peptidique correspondant à la boucle I-II de la sous-unité Cav2. 1 des canaux calciques de cellules neuronales humaines, ladite séquence correspondant à la séquence SEQ ID NO : 4 suivante : SGEFAKERERVENRRAFLKLRRQQQIERELNGYMEWISKAEEVILAEDETDGEQRHPF DGALRRTTIKKSKTDLLNPEEAEDQLADIASVGSPFARASIKSAKLENSTFFHKKERR MRFYIRRMVKTQ - ou de cellules transformées avec les séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 3 suivantes codant respectivement pour les séquences peptidiques SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 4 susmentionnées : SEQ ID N'l : tcaggggagtttgccaaagaaagggagcgggtggagaaccggcgcgcattcctgaagctgcggcggcagcagcagattgaacgc gagctcaacgggtacatggagtggatctcaaaagcagaagaggtgatcctcgcagaggacgagaccgacgtggagcagagacatc cctttgatggagctctgcggagagccactatcaagaagagcaagacggacctgctccacccagaggaggcggaggatcagctggcc gacatcgcctccgtggggtctccctttgcccgagccagcattaaaagtgccaagctggagaactcgagttttttccacaaaaaagagag gagaatgcgtttctacatccgtcgcatggtcaaaactcag SEQ ID N03 tcagggg agtttgccaa agaaagggaa cgggtggaga accggcgggc ttttctgaag ctgaggcggc aacaacagat tgaacgtgag ctcaatgggt acatggaatg gatctcaaaa gcagaagagg tgatcctcgc cgaggatgaa actgacgggg agcagaggca tccctttgat ggagctctgc ggagaaccac cataaagaaa agcaagacag atttgctcaa ccccgaagag gctgaggatc agctggctga tatagcctct gtgggttctc ccttcgcccg agccagcatt aaaagtgcca agctggagaa ctcgaccttt tttcacaaaa aggagaggag gatgcgtttc tacatccgcc gcatggtcaa aactcag 4. Utilisation de fragments peptidiques de la sous-unité al selon l'une des revendications 1 à 3, lesdits fragments étant fusionnés du côté N-terminal à une séquence peptidique transmembranaire, à savoir une séquence peptidique ayant pour effet de maintenir lesdits fragments peptidiques dans la membrane cellulaire, telle que la séquence transmembranaire de la chaîne a du récepteur CD8 humain contenue dans la séquence SEQ ID NO : 5 suivante : LDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHR ou de cellules transformées avec une séquence nucléotidique recombinante exogène codant pour une séquence peptidique transmembranaire telle que définie ci-dessus, cette dernière séquence étant située en amont de la séquence codant pour le fragment peptidique susmentionné de la sous-unité al. 5. Procédé de criblage de molécules restaurant le nombre de canaux calciques à la normale dans les membranes cellulaires où ce nombre a anormalement diminué, telles que définies dans la revendication 1, et/ou de molécules augmentant le nombre de canaux calciques dans les membranes cellulaires, telles que définies dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mise en présence de fragments peptidiques de la sous-unité al tels que définis dans l'une des revendications 2 à 4, avec des cellules exprimant des canaux calciques pendant un temps suffisant pour que le nombre de canaux calciques diminue de manière significative à la surface desdites cellules, puis avec des molécules à tester, - ou mise en présence de cellules transformées à l'aide de séquences nucléotidiques codant pour des fragments peptidiques de la sous-unité al tels que définis dans l'une des revendications 2 à 4, réduisant ainsi le nombre de canaux calciques à la surface desdites cellules, avec des molécules à tester, - détection d'une éventuelle augmentation du nombre de canaux calciques à la surface des cellules transformées témoignant de l'effet des molécules testées d'augmentation du nombre de canaux calciques à la surface des membranes cellulaire. 6. Utilisation selon la revendication 1 de séquences peptidiques dérivées par mutation d'un ou plusieurs acides aminés des fragments peptidiques de la boucle I-II de la sous-unité al des canaux calciques, la ou les mutations en question affectant des acides aminés essentiels dans le cadre de l'expression des canaux calciques à la surface membranaire, dans la mesure où leur mutation a pour effet d'augmenter ou de diminuer l'expression à la surface de la membrane plasmique des canaux calciques, pour la mise en oeuvre de procédés de criblage : - de molécules restaurant le nombre de canaux calciques à la normale dans les membranes cellulaires où ce nombre a anormalement diminué, telles que définies dans la revendication 1, - et/ou de molécules augmentant le nombre de canaux calciques dans les membranes cellulaires, telles que définies dans la revendication 1, - et/ou de molécules restaurant le nombre de canaux calciques à la normale dans les membranes cellulaires où ce nombre a anormalement augmenté, telles que définies dans la revendication 1, - et/ou de molécules réduisant le nombre de canaux calciques dans les membranes cellulaires, telles que définies dans la revendication 1. 7. Utilisation selon la revendication 6 de séquences peptidiques comportant une ou plusieurs mutations ayant pour effet d'augmenter l'expression à la surface de la membrane plasmique des canaux calciques, lesdites séquences peptidiques étant dérivées par mutation d'un au moins des acides aminés situés aux positions 383,395, 396,398, 427, et 428 de la sous-unité Cav2. 1 des canaux calciques de cellules neuronales de lapin, ou humaines, à savoir des séquences peptidiques correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 4, dans laquelle l'un au moins de Q en position 24, W en position 36, 1 en position 37, K en position 39, K en position 68, et K en position 69, est substitué par un acide aminé naturel ou non, notamment par une alanine. 8. Utilisation selon la revendication 6 de séquences peptidiques comportant une ou plusieurs mutations ayant pour effet de diminuer l'expression à la surface de la membrane plasmique des canaux calciques, lesdites séquences peptidiques étant dérivées par mutation d'un au moins des acides aminés situés aux positions 387,422, et 423 de la sous-unité Cav2.1 des canaux calciques de cellules neuronales de lapin, ou humaines, à savoir des séquences peptidiques correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 4, dans laquelle l'un au moins de R en position 28, R en position 63, et R en position 64, est substitué par un acide aminé naturel ou non, notamment par une alanine. 9. Procédé de criblage : - de molécules restaurant le nombre de canaux calciques à la normale dans les membranes cellulaires où ce nombre a anormalement diminué, telles que définies dans la revendication 1, - et/ou de molécules augmentant le nombre de canaux calciques dans les membranes cellulaires, telles que définies dans la revendication 1, - et/ou de molécules restaurant le nombre de canaux calciques à la normale dans les membranes cellulaires où ce nombre a anormalement augmenté, telles que définies dans la revendication 1, - et/ou de molécules réduisant le nombre de canaux calciques dans les membranes cellulaires, telles que définies dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mise en présence de séquences peptidiques dérivées de la boucle I-II de la sous-unité al tels que définies dans la revendication 1, 6 ou 7, avec des molécules à tester déjà sélectionnées pour leur capacité à se lier spécifiquement aux séquences peptidiques non mutées correspondant auxdites boucles I-II, - sélection des molécules susmentionnées se liant spécifiquement aux boucles I-II et ne se liant pas aux séquences peptidiques dérivées susmentionnées, - le cas échéant, mise en présence des molécules sélectionnées à l'étape précédente avec des cellules exprimant des canaux calciques, et observation de l'éventuel effet des molécules sélectionnées sur l'augmentation ou la diminution du nombre de canaux calciques à la surface desdites cellules. 10. Utilisation selon la revendication 1 de séquences peptidiques dérivées par mutation d'un ou plusieurs acides aminés des fragments peptidiques de la boucle I-II de la sous-unité a 1 des canaux calciques, la ou les mutations en question affectant des acides aminés essentiels dans le cadre de l'activité des canaux calciques à la surface membranaire, dans la mesure où leur mutation a pour effet de moduler l'activité des canaux calciques, pour la mise en oeuvre de procédés de criblage de molécules régulant l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs, telles que définies dans la revendication 1. 11. Utilisation selon la revendication 10 de séquences peptidiques comportant une ou plusieurs mutations ayant pour effet d'inactiver les canaux calciques, lesdites séquences peptidiques étant dérivées par mutation d'un au moins des acides aminés situés aux positions 387 et 388 de la sous-unité Cav2.1 des canaux calciques de cellules neuronales de lapin, ou humaines, à savoir des séquences peptidiques correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 4, dans laquelle l'un au moins de R en position 28, et E en position 29, est substitué par un acide aminé naturel ou non, notamment R28 est substitué par une alanine ou par E et E29 est substitué par une alanine. 12. Procédé de criblage de molécules régulant l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs, telles que définies dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mise en présence de séquences peptidiques dérivées de la boucle I-II de la sous-unité al tels que définies dans la revendication 10 ou 11, avec des molécules à tester déjà sélectionnées pour leur capacité à se lier spécifiquement aux séquences peptidiques non mutées correspondant auxdites boucles I-II, - sélection des molécules susmentionnées se liant spécifiquement aux boucles I-II et ne se liant pas aux séquences peptidiques dérivées susmentionnées, - le cas échéant, mise en présence des molécules sélectionnées à l'étape précédente avec des cellules exprimant des canaux calciques, et observation de l'éventuel effet des molécules sélectionnées sur la régulation de l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs desdites cellules. 13. Utilisation selon la revendication 1 de fragments peptidiques correspondant à la boucle III-IV de la sous-unité al, ou à une séquence peptidique dérivée, ou à une partie de cette boucle III-IV, ou de cellules transformées par des séquences nucléotidiques codant pour lesdits fragments, tels que définis dans la revendication 1, pour la mise en oeuvre de procédés de criblage de molécules régulant l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs, telles que définies dans la revendication 1. 14. Utilisation selon la revendication 1 ou 13 : - de la séquence peptidique correspondant à la boucle III-IV de la sous-unité Cav2.1 des canaux calciques de cellules neuronales humaines ou de lapin, ladite séquence correspondant à la séquence SEQ ID NO : 7 suivante : ITFQEQGDKMMEEYSLEKNERACIDFAISAKPLTRHMPQNKQSFQYRMWQFVVSP - ou des cellules transformées avec la séquence nucléotidique codant pour la boucle III-IV de la sous-unité Cav2.1 des canaux calciques de cellules neuronales humaines, ladite séquence correspondant à la séquence SEQ ID NO : 6 suivante : at caccttccag gagcaagggg acaagatgat ggaggaatac agcctggaga aaaatgagag ggcctgcatt gatttcgcca tcagcgccaa gccgctgacc cgacacatgc cgcagaacaa gcagagcttc cagtaccgca tgtggcagtt cgtggtgtct ccg - ou de cellules transformées avec la séquence nucléotidique codant pour la boucle IIIIV de la sous-unité Cav2.1 des canaux calciques de cellules neuronales de lapin, ladite séquence correspondant à la séquence SEQ ID ? 8 suivante : atcacct tccaggagca gggcgacaag atgatggagg agtacagctt ggagaaaaac gagagggcct gcatcgactt cgccatcagt gccaagccgc tgaccaggca catgccccag aacaagcaga gcttccagta ccgcatgtgg cagttcgtgg tgtccccg 15. Utilisation de fragments peptidiques de la sous-unité ocl selon l'une des revendications 1,13 et 14, lesdits fragments étant fusionnés du côté N-terminal à une séquence peptidique transmembranaire, à savoir une séquence peptidique ayant pour effet de maintenir lesdits fragments peptidiques dans la membrane cellulaire, telle que la séquence transmembranaire de la chaîne a du récepteur CD8 humain contenue dans la séquence SEQ ID NO : 5 suivante : LDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHR ou de cellules transformées avec une séquence nucléotidique recombinante exogène codant pour une séquence peptidique transmembranaire telle que définie ci-dessus, cette dernière séquence étant située en amont de la séquence codant pour le fragment peptidique susmentionné de la sous-unité 0'. 1. 16. Procédé de criblage de molécules régulant l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs, telles que définies dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mise en présence de fragments peptidiques de la sous-unité al tels que définis dans l'une des revendications 13 à 15, avec des cellules exprimant des canaux calciques pendant un temps suffisant pour que l'état d'inactivation des canaux soit modifié, puis avec des molécules à tester, - ou mise en présence de cellules transformées à l'aide de séquences nucléotidiques codant pour des fragments peptidiques de la sous-unité al tels que définis dans l'une des revendications 13 à 15, avec des molécules à tester, - détection de l'effet des molécules testées sur l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs. 17. Utilisation selon la revendication 1 de séquences peptidiques dérivées par mutation d'un ou plusieurs acides aminés des fragments peptidiques de la boucle III-IV de la sous-unité cd des canaux calciques, la ou les mutations en question affectant des acides aminés essentiels dans le cadre de l'activation des canaux calciques à la surface membranaire, dans la mesure où leur mutation a pour effet d'activer ou d'inactiver les canaux calciques, pour la mise en oeuvre de procédés de criblage de molécules régulant l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs, telles que définies dans la revendication 1. 18. Utilisation selon la revendication 17 de séquences peptidiques comportant une ou plusieurs mutations ayant pour effet d'inactiver les canaux calciques, lesdites séquences peptidiques étant dérivées par mutation d'un au moins des acides aminés de la séquence peptidique correspondant à la séquence SEQ ID NO : 7. 19. Procédé de criblage de molécules régulant l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs, telles que définies dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mise en présence de séquences peptidiques dérivées de la boucle III-IV de la sousunité al tels que définies dans la revendication 17 ou 18, avec des molécules à tester déjà sélectionner pour leur capacité à se lier spécifiquement aux séquences peptidiques non mutées correspondant auxdites boucles 111-IV, - sélection des molécules susmentionnées se liant spécifiquement aux boucles III-IV et ne se liant pas aux séquences peptidiques dérivées susmentionnées, - le cas échéant, mise en présence des molécules sélectionnées à l'étape précédente avec des cellules exprimant des canaux calciques, et observation de l'éventuel effet des molécules sélectionnées sur la régulation de l'état d'inactivation des canaux calciques neuronaux impliqués dans la libération des neurotransmetteurs desdites cellules. 20. Séquences peptidiques choisies parmi : - les séquences SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 4 dans lesquelles l'un au moins de Q en position 24, W en position 36, I en position 37, K en position 39, K en position 68, et K en position 69, est substitué par un acide aminé naturel ou non, notamment par une alanine, - les séquences SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 4 dans lesquelles l'un au moins de R en position 28, R en position 63, et R en position 64, est substitué par un acide aminé naturel ou non, notamment par une alanine, - les séquences SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 4 dans lesquelles l'un au moins de R en position 28, et E en position 29, est substitué par un acide aminé naturel ou non, notamment R28 est substitué par une alanine ou par E, et E29 est substitué par une alanine.