Brevet FR2824912A1 — publié le 20021122

DESCPTION Cette invention appartient au domaine de la virologie pour ce qui concerne la protéine mDBP, qui provient du virus dpstein-Barr. Son utilisation comme méthode de diagnostic concerne la biologie médicale. Le virus d'Epstein-Barr est responsable de plusieurs pathologies graves, au rang desquelles la mononucléose infectieuse (MNI), le lymphome de Burkitt (BL), et le cancer du rhino-pharynx (NPC), avec7 en fréquences moindres, d'autres cancers. Ces maladies, responsables d'une mortalité élevée, dans les zones d'endémie, doivent étre diagnostiquées le plus précocement possible. Le diagnostic au laboratoire, fait appel à deux catogories de techniques: 1. Mise en évidence et visualisation des protéines ou des ADN viraux. Les protéines: peuvent étre détectées après fixation sur lame, de tissus ou de cultures cellulaires, contenant l'EBV La révélation fait appel à l'immunohistochimie, à l'immunocytochimie. La réaction, est mise en évidence, par réaction enzymatique, par chimiluminescence' fluorescence, marquage isotopique. Les ADN et ARN viraux sont recherchés par: - Hybridation in situ Polymerase Chain Reaction (PCR) 2. Méthodes indirectes immunologiques Ici sont regroupées les méthodes sérologiques. Celles ci recherchent dans le sérum les anticorps anti-EBV des différentes classes: IgM, IgA, IgG. Ces anticorps sont dirigés contre les antigènes viraux: latents précoces immédiats précoces tardifs On compte parmi ces méthodes: l'inhibition de l'activité enzymatique, I'immunoblott, et les techniques Elisa. ! i Les antigènes de l'EBV les plus utilisés sont ceux du cycle précoce de la réplication du virus. On trouve parmi ceux-ci: la DNAase, la DNApolymerase, la protéine accessoire EA-D, la ribonacleotide reductase RR, la thymidine kinase TK, et la protéine mDBP (ou BALF2). 3. En pratique: Les principales méthodes de diagnostic disponibles, sont basées sur l'immunologie. Cette invention concerne la protéine mDBP (major DNA Binding Protein) provenant du virus d'Epstein- Barr (EBV), ainsi que son utilisation dans le diagnostic sérologique du cancer du rhino-pharynx. Cette protéine mDBP fait partie des antigènes viraux précoces, qui apparaissent lors de la réplication virale dans la cellule. Son caractère antigénique permet d'utiliser cette protéine en réaction avec le sérum des patients, et de doser les anticorps dirigés contre elle. Ce titre d'anticorps anti mDBP, caractéristique du cancer du rhinopharynx, perrnet de déterminer si le patient est atteint par ce cancer, et, dans l'affirmative, quel est le stade de sa maladie. Le kit Elisa est préparé sur plaques de titration en polystyrène, à partir de solutions de la protéine mDBP. La protéine mDBP est obtenue pure par le procédé suivant: La production de la protéine commence par le clonage du gène BALF2, suivi de sa ligation dans un plasmide, puis la transfection d'une bactérie, qui est cultivée, puis recueillie, et lysée, pour obtenir fnalement une solution contenant la protéine. La solution est soumise à différentes étapes de purifcation, qui conduisent à un pool protélque pur. 1 / La fabrication du kit Elisa de diagnostic. La méthode choisie pour la sérologie est la méthode Elisa, en cupules sur plaque de titration en polystyrène. Le titrage des anticorps se fait en ajoutant le sérum du patient dans une série de cupules, contenant des quantités croissantes de protéine. Le kit est constitué d'une plaque de titration en polystyrène à 96 cupules (8 cupules x 12 cupules). A partir du pool de protéine pure, une solution en protéine est préparée, de concentration 1,0 microgramme/ml. Des fractions de cette solution sont déposées dans les puits de façon à avoir sur chaque rangée de 8 cupules des quantités de protéine mDBP au iSond des cupules de 1 - 0.5 - 0.25 - 0.125 - 0.064 - 0.032 - 0.016 - 0.008 microgrammes respectivement. Après l'ajout de la solution protéique, les plaques sont laissées à sécher, de façon que la protéine adhère et se lie au fond des cupules. Le kit est alors prêt pour sa commercialisation et son utilisation. Ce dispositif de kit de diagnostic Elisa est caractérisé en ce que la protéine mDBP donne avec les anticorps présents dans le sérum des patients une précipitation, dont l'intensité sera lue par un lecteur optique. La dilution de la protéine réagissant encore avec le sérum permet de quantifier le taux d'anticorps présents dans le sérum. 2/ La protéine mDBP La protéine mDBP possède un poids moléculaire de 135 kiloDaltons. Elle est codée par le gène BALF2 du virus dpstein-Barr, et est constituce de 1128 acides aminés. (Voir séquence en acides aminés: fgure 01). 3/ Procédé d'obtention d'un pool de protéine mDBP pure - Clonage du gène BALF2. Le gène BALF2, (voir figure 02), qui code cette protéine, est séparé de l'ADN viral par digestion par les enzymes EcoRI et BamHI. Après séparation par électrophorèse en gel d'agarose, le gène est inséré par ligation dans le plasmide pKK 223-3. - Production de la protéine par culture bactérienne, suivie d'une extraction. Le plasmide est transtecté dans la bactérie Escherichia coli souche BL21, par choc thermique. Après régénération, les bactéries transformées sont cultivées en bouillon nutritif à 37 C, pendant 5 à 8 heures, (en présence d'un antibiotique, ampicilline, 30 à 80 2 5 microgrammes/ml, pour éviter toute contamination), pui s recueil li es par centrifugati on. La nature du plasmide impose une induction par l'isopropyl-bêta-Dthiogalactopyranoside (IPTG). Cette induction est faite à une concentration comprise entre 0,1 et 1,3 mM, pendant la phase exponentielle de croissance. Le culot bactérien, est remis en suspension dans un tampon de formule: [Tris pH 7,5: 20 mM; MgCl2: 10 mM; CaCl2: 2 mM; DiThioThreitol (DTT): 0,5 mM]. Le pH de ce tampon a pour valeur: 7,5. Les bactéries sont lysées par ultrasons. Le milieu est ensuite soumis à l'action de la DNAase (20 à 80 microgrammes/ml, à 10 C, pendant 1 heure), pour éliminer l'ADN, qui retiendrait la protéine. Puis centrifugé, pour garder une solution protéique débarrassée des débris cellulaires. Purification de la protéine La purification intervient sur cette solution. Le processus se compose de trois étapes. La première étape est une précipitation fractionnée par aj out de sulLate d'ammonium, à une concentration de 40%. Le précipité obtenu par centrifugation contient la protéine, et est redissout dans du tampon. Cette solution est dialysée pour éliminer le NaCl contenu dans le tampon. Les deuxième et troisième étapes suivantes sont des chromatographies en colonnes: - chromatographie ionique sur résine de sulfopropyl sepharose - chromatographie d'affnité sur DNA cellulose. La deuxième étape voit la rétention de la protéine par liaison ionique avec une résine de sulfopropyl sepharose. La protéine fixée est éluce par le tampon à une concentration de 250 rnM en NaCl. La fraction recueillie en sortie de colonne est dialysée pour éliminer le NaCl. La troisième étape fait passer la fraction précédente sur une colonne de DNA monobrin fixé sur un substrat de cellulose. La protéine est retenue par affinité sur le DNA, et ensuite détachée par un tampon avec une concentration de 500 rnM en NaCl. La fraction recueillie en sortie de colonne est dialysée pour éliminer le NaCl. Un pool de protéine mDBP est constitué à partir de plusieurs processus de culture extraction-purification. Ce pool sera utilisé pour la fabrication du kit de diagnostic. Toutes les étapes, depuis l'obtention d'un culot bactérien, après culture, jusqu'au pool final, sont réalisées à la température de + 4 C, pour préserver l'intogrité de la protéine, (exception faite de l'action de la DNAase, à 10 C). Lors des étapes de purification, des antiprotéases sont ajoutées au tampon pour éviter la dégradation de la protéine, par les enzymes d'origine bactérienne. Le cocktail d'antiprotéases a pour formule: [PMSF 1 mM; popstatine 20 microM; paPMSF 20 microM; leupeptine 10 microM; TLCK 270 microM; benzamidine 10 mM; aprotinine 1 microM]. Pour toutes les étapes de purifications, le tampon utilisé a pour formule: [Tris pH 7,5: 20 mM; NaCl: 50 mM; EDTA: 1 mM; DiThioThreitol (DTT): 0,5 mM; glycérol: 10%]. Le pH de ce tampon a pour valeur: 7,5. Seul du NaCl supplémentaire peut être ajouté à ce tampon pour obtenir une concentration de 250 mM (2è étape de purifcation), et 500 mM (3è étape de purification). Cette protéine présente un intérêt pour le diagnostic du NPC, car la plupart des méthodes commercialisées à ce jour, ont un efficacité limitée dans la détection de ce cancer, et son pronostic. Il a été montré que l'utilisation de mDBP permet la détection des malades à un taux de 80% et plus, ces résultats n'étant pas atteints avec les autres méthodes. Le kit Elisa est un procédé très simple d'utilisation, rapide, et fiable. Il est économique, facile à fabriquer, ne nécessitant que peu de place. Un technicien biologiste peut le mettre en oeuvre sans difficulté, car il s'agit d'une technique classique dans les laboratoires d'analyses de biologie médicale. Sa réalisation ne lO nécessite aucun appareillage particulier, si ce n'est un lecteur optique. Son interprétation se fait sans problème par un médecin biologiste. C'est d'autre part une technique facilement exportable vers les pays touchés par ce cancer, par son faible poids, et encombrement. Les pays concernés sont principalement des pays en voie lS de développement: Chine, Maghreb, régions arctiques. Le faible coût du kit est un avantage pour ces pays à faible revenu. YE!YBICATIONS 1) Dispositif de 'Kit -ilisam les ptopriétes atir.iques de la porcine lVBr pruvenall du Irks d'pstein-Parrj Ae-stiné pins particl31ièremnt all diagnostic serolniniue, cancer Ala ino-ptarymjx, caraciensé er ce q-.] compren] Lll-.e paque cornporta ji p1LieuTs.arjes de cu1es, et que dars chaque rangée5 la protéire End)RP est iiée dans le fond de.-haque cuDu1e eri qualtités léterrl.irles de 1 - 0.5 - 0.25 - 0.125 - 0.064 - 0.032 - 0. 016 - O.OOO respectiYement. 2) Protine ml)BP eartérisée en ce qu'elle possède un psids molèculaire de 1-S Lio-naltons5 et en ce qu'elle est codée par Iç gèr;e BA1F2 du virus d'Epstein-Barr5 et est constituse de 1128 acides aminés 3J Procédé d'obteition d'une protéine BP prov-enant du vius d'Epsein-Barr (:I5B caractfisé en ce qu'il Qnsiste sucCessivement: cloner le gène BALF2 réaliser la ligation du gène dans un plasmide réaliser la -trarisfiecc d'-.e bactérie, qui sera cultivée puis rucillie et lyée po oblenir ue soluion con1:enant ladite proléine, la; -^Iu-ion, étRr. YP^gli o'm,e à i^lP.+5 ét5 Ae nurii.. 4N ié-S 2 ne es. inscré par ligatio-n, da-s le -v7eceur p]as-f-fi.idiqUe -p223-3. N Procèdé seloi-l l'une quelcorlqu.e des rcvendicatviiO précedenies 3 à 4' car=.ctéiisé eri ce lie ie piasmide est transfect.é dans la bactérie E:scherichia coij souche BLI E: ar choc 1;herm:ie, :v pll7S alps regçrerTior' les baeries transformes sont culivees er bou.lion nutritif; à 7 durahi à 7neures en ptéence u'n ah-tibiil-qiie aTnpiilline5 perrneiTahi u,EY-itet ltJUt.é C;-;5lninsi{,N, puis recieiSie$ par centri-lugation. 6,) Pock selon lame cueleoqlle des re.endications précédentes à 5, caractnsé en ce Me la nature d 1 nas.mide; impose une inAllet7r.n par llicri7rrrpy:1-bêta-l)-tnloglact>r>arr}side; Jajce a la concentration de O71 à 1 mM peridot la phase eonentelle de croissce. 7) Proceed selon l'une qTúeleonque des revendications cédentes à 6, caractérisé en ce que la 1Diomasse bactrienne es': d.ispersce aans un tanipon e formule (Ins 7jS, IvigCl, CaC127 1}iThioThrtol (DTT' ps en c que les lactes sort lysces p ua$o.s et en ee que le milieu e: enui4e sumis à i'actic' de la {iNAase, d!u-ne crleitiûn de 2 à G mi.rogrammesJml, à IO0C, durant une à trois heures, pour éliminer l'Al)N qui retiendrad la proteine. 8) Procédé selon lune quelconque des revendicarions précédenes 3 à 7, caractérisé en ce que la nurification le la rroteinc, est réalisée sel on les ge sucessives uivantes -ne precipqtaon fitachonce par aJout de suLai^ d'amnoriunn à une concena.-on = 1: 40%, le pré-cipité obtenu par centrifilgation contient ladte protéine et est dissolt dans du tampon, puis la sol-utian es; dialysoe pOu1 eliliner 1e sulLate d'aTrlonum., venant du precipi - une çhromatographie iorique sur résine de sulfiopropyl sepharose urie chro...atsgraphie d'affinité sur DNA ccilu1ose C 9) Procédé selcn la reveication 8 caracténsé en ce que la deuxième étape oit la réÉeri-tion cle 1u proléine p'a1 1iaison i- niq-ue a-Yec une résine d s-u1optopyl sep1narose el: en ce ciiJe 1n n.rotP7ne fxP P él'gg,' le tl.l.? à._.P corfeT,nn r3 9.St) n3.M e7l N.l' 1 Nn-' -nt par la suiie éliminé par dialyse de 1a fraction recucillie en so.ie ue colo.e. 10J Prvcèdé selon la reYerlclication ou la reYendicatiorl 9 enfactelisé er1 Ce que k troisieme etapé ait passer ia firafion oDtfnlf à la ellieme stapC' sur lUme co30nne de DYA mF,,tn 1X S'1 ii Sa' 4- f PlllF-s i --, -que la F-téi-ie YVt i-elue pa' -4=i-1iAté vi le DI;A etcusuite déraç= par untarnpon ave une conc.ention de 506M en}617 la fraction rceucillie en so*ie de ecloir^e étantdialysée pour élimineFle Na C1. 11) Procédé selon la reYe-ication 3, et les re,endication 1O, caractrisé par les condirionstec-iaiquessuivanes - CCllpuSiiiOl1 talo pour les trois Tapes de p.ilication iTris pal 7; NaCl; ERRATA; DiJhii1Th].TT)' ycé-rol)i O(,i pnvant ee ajtlté Abut hteniT l.es conPr,trati^, necessaires de 20 on 500 mM à l'élutorl Retapes 2 et 3 respectimeri) - presence n'antipFotéases tout an long de la purification (P; pepsatine; phi; leupeptine; TO; benzaidi,e' aprotirine) - touters If s etapes de Firlation éta réàlisées à ±C 12, rr-ucéué sedan 3'une que3con.lue dies revendications -rcecUen.es 3 à 3 l, caramels Eli ce qu'= pi de ?roteine ml)13P est fonstitué à pa{tir de plllsieurs rnrcessus de ullre-