Brevet FR2827303A1 — publié le 20030117

PROCEDE D'OBTENTION D'UNE PREPARATION TITREE D'ALGUES ET LES PREPARATIONS TITREES EN RESULTANT La présente invention se rapporte au domaine de la chimie et plus particulièrement à celui de la chimie végétale. Elle a plus précisément pour objet un nouveau procédé d'obtention d'une préparation à base d'algues titrée en principes actifs assurant la fixation du calcium par les cellules osseuses. Elle a spécifiquement pour objet un procédé d'obtention de poudres ou d'extraits de l'algue Padina pavonica, titrés en principes actifs par l'intermédiaire d'un coefficient d'équivalence avec l'estradiol, qui consiste à doser l'extrait ou la poudre de Padina pavonica à l'aide d'une méthode dans laquelle on cultive des ostéoblastes dans un milieu de culture riche en ions calcium, on analyse le calcium fixé par les cellules de la matrice extracellulairc en présence ou en l'absence d'agents antagonistes de la fixation du calcium et on exprime les résultats soit en unités arbitraires ou internationales par rapport à un étalon de référence, soit par référence avec l'activité connue de doses déterminées d'estradiol ou de tout autre agent favorisant la fixation du calcium. Plus précisément le procédé selon l'invention consiste à préparer une suspension d'une lignée cellulaire osseuse humaine ou animale en ajustant la densité cellulaire déterminée par turbidimétrie ou par comptage à une valeur de référence, à laisser incuber pendant un à trois jours à 37 C en présence de gaz carbonique et de milieu de culture complet (MCC), à additionner des puits d'un agent inhibiteur de la fixation du calcium ou d'une hormone calciotrope, et de l'extrait à titrer, à éliminer les surnageants de culture, à rincer les puits avec un milieu de rinçage sans calcium ni magnésium (P.B.S. par exemple) de façon à éliminer du milieu de culture, le calcium non fixé, à éliminer les fractions surnageantes, et à ajuster le volume de la dispersion avec un volume déterminé d'acide minéral comme l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique ou l'acide perchlorique ou de tout autre produit susceptible de détruire la matrice extra cellulaire élaborée par les cellules en culture. Pour finir on ajuste le mélange et on dose le calcium, par exemple selon la norme AFNOR n NT-690. 005. Le dosage du calcium constitue un indicateur d'activité facile à déterminer. La fixation du calcium par les ostéoblastes ou les cellules d'une lignée cellulaire est sous la dépendance d'agents calciotropes activant la fixation du calcium (estradiol, vitamines D3, calcitonine) ou d'agents délétères sur la fixation du calcium comme les inhibiteurs des canaux calciques (vérapamil, cinchonine ou diltiazem), les cytokines pro-inflammatoires : prostaglandines, interleukines, PAF... Les extraits ou les poudres de l'algue Padina pavonica présentent une activité de stimulation de l'activité biologique (synthèse des protéines et des glycoaminoglycanes) mais aussi interviennent pour restaurer des fonctions physiologiques comme la fixation du calcium par les cellules ostéogéniques. Pour cela, on dose le calcium fixé par une lignée cellulaire déterminée, comme par exemple la lignée cellulaire UMR 106 ou la lignée G 292, en présence ou non d'agents délétères comme les inhibiteurs des canaux calciques et les agents pro-inflammatoires comme IL 1. Les ostéoblastes normaux donnent de bons résultats, leur disponibilité pose problème. La préparation à analyser est testée en parallèle sur la même lignée cellulaire, en présence ou non de ces mêmes agents délétères. On compare la quantité de calcium fixée par rapport à celle obtenue avec l'agent oalciotropo et avec celles obtenues en présence d'agents inhibiteurs de la fixation du calcium. En effet, on a constaté que les molécules actives de l'algue Padina pavonica (MAPP) conservaient leur propriété d'amélioration de la fixation du calcium par les cellules osseuses, même en présence d'inhibiteur des canaux calciques ou d'agent inflammatoire comme l'interleukine IL-1. Ceci indique que l'extrait de Padina pavonica possède un ou plusieurs principes actifs dont le mode d'action est différent de celui des substances connues qui ne sont pas susceptibles d'améliorer la fixation du calcium en présence d'inhibiteur calcique. La difficulté de la situation vient du fait que l'algue présente une activité très variable selon la saison, la croissancc, le stade de développement de la plante, la profondeur, la luminosité et que le technicien ou le consommateur final désire disposer d'un produit à activité constante. Il faut donc produire un extrait dans des conditions telles qu'il soit possible de s'affranchir des variations en principes actifs chez le végétal, et les problèmes qui se posent sont : quelle doit être l'activité de l'extrait et comment obtenir un produit de titre toujours constant ? La présente invention a pour but de résoudre le problème technique exposé ci-dessus. La récolte de plantes, leur traitement et la fabrication d'extrait stabilisé requièrent le dosage de l'activité dans les matières traitées. La collecte de la plante doit se faire alors que la teneur en principe actif est optimale et il faut en déterminer le moment. La conservation des plantes avant leur traitement, l'extraction du brut, la fabrication de l'extrait nécessitent de disposer d'une méthode analytique permettant de quantifier l'activité de la matière. Habituellement la production d'un extrait fait appel au dosage chimique de la molécule active. Quand l'activité est apportée par une famille de molécules, il devient difficile ou impossible de se rapporter à un dosage chimique. La difficulté du problème vient du fait que les molécules peuvent exister sous forme d'isomères ou de tautomères, les uns actifs, les autres inactifs. Si l'isomérie est supportée par des groupements fonctionnels, il est possible de doser les groupements fonctionnels et ceux-ci supportent la totalité et l'exclusivité de l'activité des principes actifs. On illustrera le propos en citant le dosage des anthraquinones du séné, des alcaloïdes, etc. Dans le cas des hétérosides cardiotoniques de la digitale, il a été observé maintes fois des anomalies de corrélation entre l'analyse chimique et l'activité biologique, du fait de la multiplicité des principes actifs de niveau d'activité inégal. Si l'isomérie est supportée essentiellement par des élément structuraux, l'analyse sera plus délicate et devra faire appel à la mise en valeur d'éléments structuraux caractéristiques par spectrophotométrie, ou faire appel à des réactions caractéristiques comme la coloration des fonctions susceptibles d'être représentatives de la famille moléculaire recherchée. Par exemple, dans le cas d'une isomérie cis-trans, il faut fonctionnaliser la double liaison en fixant une fonction réactionnelle. Sur cette fonction, il sera possible de fixer un groupement chromophore, par une réaction de couplage (isothiocyanate de fluorescéine par exemple). Il est aussi possible de faire usage de la spectrométrie de masse mais il faut rappeler que cette technique est destructive. Il n'est donc pas possible de vérifier à nouveau l'activité de la fraction isolée. Pour de nombreuses substances, on a pour habitude de doser l'activité par voie biologique, par exemple pour la pénicilline, de nombreuses vitamines comme la vitamine A, la vitamine E, les anticorps, les antigènes, certaines hormones comme l'insuline, le FSH, les GH, les cytokines comme l'interféron, le TNF... Cette technique s'applique essentiellement aux dosages qui seraient impossibles par voie chimique. Le cas des vitamines A et E illustre bien le propos puisqu'elles existent sous forme de nombreux isomères. Le problème devient encore plus complexe quand on s'adresse à des substances sans groupement chromophore facilement détectable et dont la structure n'est pas connue. Dans ce cas, le dosage de l'activité biologique semble la méthode exclusive ou en tout cas la méthode de choix. Parmi les méthodes de dosage d'activité, on trouve des méthodes s'appliquant aux substances modifiant une activité biologique des cellules procaryotes ou eucaryotes. Le dosage de l'activité biologique pose le problème de la stabilité des cellules normales ou des lignées cellulaires. En outre, le signal analysé peut varier selon des critères opératoires impossibles à préciser dans bien des cas. Lors de l'usage de ces méthodologies, les auteurs sont confrontés à la variabilité de la réponse des cellules. Il faut donc étalonner la réponse de la souche par rapport à un système de référence. Ce système ne donne pas de bonne réponse dans le cas qui importe, car il se trouve que la Padine est la seule plante connue susceptible d'induire une réponse sur la fixation du calcium en présence d'un inhibiteur calcique (Inh-Ca) et en présence d'un agent inflammatoire comme l'IL-1. Toutes les autres substances testées à ce jour ne peuvent restaurer la fixation du calcium en présence d'inhibiteur calcique (Inh-Ca). Après de nombreuses difficultés techniques, les Demandeurs sont parvenus à mettre au point une méthode de dosage efficace et reproductible. La matière à tester est dosée sur culture cellulaire. On analyse le calcium fixé par les cellules osseuses. Pour ce faire, on dose le calcium fixé par une lignée cellulaire ostéoblastique. A titre non limitatif, on citera UMR 106, G292, en présence ou non d'agents délétères comme les InhCa et l'IL-1. La préparation à analyser sera testée elle aussi, sur la même lignée cellulaire en présence ou non d'agents comme Inh-Ca et IL-1. Dans les mêmes conditions, on dose le calcium fixé par la même lignée cellulaire en présence d'estradiol et on constitue un barème d'étalonnage exprimé en poids d'estradiol. Ce barème d' étalonnage s' échelonne de 10-3 à 10-10mol d' estradiol ou plus fréquemment entre 10-7 et 10-9 mol d'estradiol. De cette façon, on peut établir une corrélation entre l'activité de l'extrait de Padine et une quantité active d'estradiol. On doit souligner que cette comparaison se fait entre l'activité de l'estradiol directement sur la culture cellulaire avec l'actif extrait de la Padine en présence d'agents délétères comme un Inh-Ca ou l'IL-1. Donc il ne s'agit pas vraiment d'une comparaison pondérale et on propose d'exprimer le résultat en Unité d'Activité (UA). Une unité d'activité est définie comme la quantité d'extrait susceptible d'accroître de 50% la quantité de calcium fixé par 400 000 cellules cultivées 48 H en présence d'ing d' interleukine 1 par puits de 1 ml. L'IL-1 peut être remplacée par un autre agent inhibiteur de la fixation du calcium à une dose équiactive. Les extraits de Padine ont été décrits, notamment dans la demande de brevet européen EP 0. 655.250. On procède à l'épuisement de l'algue après séchage, par un solvant hydrocarboné tel que le cyclohexane ou l'acétone, séparation de la matière végétale, filtration puis évaporation à sec du produit d'extraction. Une quantité exactement pesée d'extrait sec est ensuite dissoute dans l'éthanol. La détermination de son activité fait l'objet de la présente invention. Concrètement, le procédé selon l'invention consiste à préparer une suspension de culture de la lignée cellulaire humaine G292 (ECAC n 901-l 10522) en ajustant la densité cellulaire à 400 000 cellules par ml de milieu de culture complet (MCC), supplémenté par 10 % de sérum de veau foetal. On répartit la suspension cellulaire à raison de 1 ml par puits sur des plaques de 24 puits. On laisse incuber sous atmosphère de C02 pendant une nuit à 37 C. On sépare les surnageants puis on dilue par une nouvelle addition de MCC. On prépare une fraction aliquote d'IL-1 et on ajoute 5 l de solution d'interleukine IL-1, soit 1 ng par puits dans les puits pour les cellules qui reçoivent seulement un traitement inhibiteur par IL-1. Pour chaque essai de solution à titrer, on ajoute 5 l de solution d'extrait de Padina. On laisse ensuite incuber pendant le temps nécessaire pour la réalisation de l'essai, habituellement de 24 à 72 h, et de préférence pendant 48h. On élimine ensuite les @ et on rince les culots cellulaires à trois reprises avec du tampon PBS sans calcium et sans magnésium, préalablement chauffé à la température de 37 C, de manière à éliminer tout le calcium en solution apporté par le milieu de culture. Après les purifications habituelles, on mélange avec un acide et on dose le calcium selon la méthode définie par la norme AFNOR n NF-T-90. 005. Les dosages de calcium sont seulement des indicateurs d'activité et peuvent s'exprimer en unités arbitraires. Ils n'ont de valeur absolue que si les valeurs obtenues sont comparées avec celles provenant de cellules non traitées ou subissant un traitement de référence (IL-1 estradiol, inhibiteur calcique par exemple). EXEMPLE I Fixation du calcium par la lignée d'ostéoblastes G 292 comparée avec l'estradiol, la vitamine D3 et l'extrait de Padina (EPP) en présence ou non d'interleukine 1 Témoins IL-1 E2 E2 / IL-1 EPP EPP+ IL-1 D3 D3 + IL-1 Ostéoblastes 1,000 0,200 1,843 0,200 2,659 2,785 1,215 0,125 G292 1,000 0,070 2,648 0,070 0,000 2,458 1,540 0,070 La figure 1 schématise les résultats obtenus dans ces conditions. Les cellules traitées uniquement par de l'interleukine IL-1 présentent un niveau d'activité largement inférieur à celui des cellules témoins. Les cellules traitées par IL-1 et l'extrait de padine ont une activité voisine de celle du témoin. EXEMPLE II Etalonnage de l'extrait de Padine avec l'estradiol en présence d'IL-1 Moyenne Ecart-type 50% Témoin 1,194 0,182 DE=0,755 IL-1 0,315 0,002 100 ng EPP+ IL-1 0,663 0,016 200 ng EPP + IL-1 0,671 0,129 500 ng EPP + IL-1 1,139 0,196 1000 ng EPP + IL-1 1,153 0,216 Estr + IL-1 0,357 0,013 Est 10-9 0,706 0,102 Est 10-8 1,115 0,167 Est 10-' 1,151 0,137 DE = Dose efficace La figure 2 schématise les résultats obtenus. 240 ng EPP =10-9 M Estradiol = 272 g /L soit 272 ng /ml. La dose de 240 ng d'extrait de Padine correspond à l'activité de 10-9M d'estradiol sur la fixation du calcium (240 ng d'extrait de Padine = 272 g/l d'estradiol, soit 272 ng /ml). On peut aussi dire que 240 ng d'extrait ont un titre d'une unité EXEMPLE III Etalonnage de l'extrait de Padine (EPP) et de l'estradiol sur la fixation du calcium par rapport à l'effet d'un inhibiteur calcique comme le Verapamil Moyenne Ecart-type 50% Témoin 1,194 0,182 DE=0,789 Verap 10 g 0,383 0,018 100 ng EPP + Verap 0,907 0,081 200 ng EPP + Verap. 1,189 0,345 500 ng EPP + Verap. 1,222 0,173 1000 ng EPP + Verap. 1,249 0,140 Est + Verap 0,373 0,023 Est 10-9 0,706 0,102 DE = Dose efficace Est 10-8 1,115 0,167 Est 10-7 1,151 0,137 La figure 3 schématise les résultats obtenus. Verap. = Verapamil et Est. = Estradiol EXEMPLE IV Etalonnage de l'extrait de Padine par rapport à l'estradiol et à un inhibiteur calcique : la cinchonine Moyenne Ecart-type 50% Témoin 1,194 0,182 DE = 0,627 Cinchonine 10 g 0,059 0,003 100 ng EPP + Cinchonine. 0,981 0,272 EPP = Extrait de Padine 200 ng EPP + Cinchonine. 1,163 0,147 Est. = Estradiol 500 ng EPP + Cinchonine. 1,100 0,246 1000 ng EPP + Cinchonine. 1,123 0,194 Estr + Cinchonine. 0,357 0,013 Est 10-9 0,706 0,051 Est 10-8 1,115 0,084 Est 10-7 1,151 0,068 DE = Dose efficace EXEMPLE V Variation de densité osseuse de la colonne lombaire au cours d'une année Temps Moyenne Témoin Variation Moyenne des sujets traités N = 8 avec 200 mg d'EPP, N = 8 0 0,000 0,000 3 mois -0 ,230 0,515 6 mois -0,520 1,355 9 mois-0,725 1,510 12 mois -0,845 1,725 La figure 4 schématise les résultats obtenus. Les données sur l'activité sont comparées en utilisant des tests statistiques de comparaison de deux moyennes et de deux écarts-type (test de Student). Les résultats sont tous statistiquement significatifs. @ Les exemples 1 à 5 montrent la concordance des résultats obtenus par le procédé selon l'invention avec les résultats obtenus par voie biologique et les essais en clinique humaine. Les quelques différences constatées (240 ng pour 272 ng/ml d'estradiol) sont principalement dues à l'incertitude des mesures nécessaires pour l'évaluation d'un procédé biologique. On peut donc considérer que les extraits biologiques de Padina pavonica ont une activité comparable à celle de l'estradiol, mais qu'en aucun cas elle n'est affectée par la présence d'interleukine ou d'inhibiteur des canaux calciques comme le Verapamil ou le Diltiazem à la différence des agents de fixation du calcium déjà connus comme l'estradiol, la vitamine D et la calcitonine. REVENDICATIONS Procédé d'étalonnage d'un extrait d'algue ou d'une poudre d'algue titré en principes actifs assurant la fixation du calcium par les cellules osseuses par référence avec l'activité connue de doses déterminées d'un agent favorisant la fixation du calcium, caractérisé en ce qu'on met en culture dans une plaque à puits une lignée de cellules osseuses humaines ou animales dans un milieu de culture complet, on assure le développement complet de cette culture en présence d'un extrait ou de poudre de l'algue Padina pavonica, on analyse la quantité de calcium fixée par les cellules dans la matrice extra cellulaire, en présence ou en l'absence d'agents antagonistes de la fixation du calcium et on exprime les résultats soit en unités arbitraires soit en quantité d'estradiol, contenues dans l'extrait ou la poudre d'algue Padina pavonica. Procédé d'étalonnage selon la revendication 1 dans lequel on met en culture une suspension d'une lignée cellulaire humaine ou animale et on ajuste la densité cellulaire déterminée par turbidimétrie ou par comptage à une valeur de référence. Procédé d'étalonnage selon la revendication 1 ou la revendication 2 dans lequel on ajoute dans chaque puits du milieu de culture complet (MCC) puis une dispersion d' agent inhibiteur de la fixation du calcium, on additionne le milieu d'un volume déterminé de solution d'extrait d'algues à tester et laisse incuber à 37 C le milieu sous atmosphère de gaz carbonique pendant un à trois jours. Procédé d'étalonnage selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel on sépare du milieu incubé les fractions surnageantes, rince les cellules avec un milieu dépourvu de calcium et de magnésium, ajuste le volume avec un volume déterminé d'un agent susceptible de détruire la matrice extracellulaire élaborée par les cellules, et notamment d'un acide minéral, et on dose le calcium fixé par les cellules. Procédé d'étalonnage selon d'une des revendications 1 à 4 dans lequel on utilise comme principe actif de référence une hormone calciotrope comme par exemple l'estradiol. Procédé d'étalonnage selon l'une des revendications 1 à 4 dans lequel l'agent antagoniste de la fixation du calcium est un agent pro-inflammatoire comme l'interleukine IL -1. Procédé d'étalonnage selon l'une des revendications 1 à 4 dans lequel l'inhibiteur de la fixation du calcium est un agent qui bloque les canaux calciques comme le Vérapamil ou la Cinchonine. Les extraits titrés ou les poudres titrées d'algue Padina pavonica, étalonnés selon le procédé de la revendication 1. Les extraits ou les poudres d'algue Padina pavonica selon la revendication 8, titrant environ 240 ng de principe actif et manifestant une activité de fixation du calcium sensiblement comparable à celle d'une préparation d'un agent calciotrope comme l'estradiol à la dose de 272 ng/ml.