Brevet FR2822847A1 — publié le 20021004

DESCRIPTION La présente invention concerne un milieu de détection spécifique de Staphylococcus aureus et/ou de discrimination des Staphylococcus à coagulase positive par rapport aux Staphylococcus à coagulase négative permettant l'isolement des bactéries du genre staphylocoque et l'identification de l'espèce Staphylococcus aureus, qui utilisent au moins un substrat enzymatique. Elle concerne également un procédé d'identification, et éventuellement de dénombrement, des Staphylococcus aureus qui utilise un tel milieu. En 1999, le genre Staphylococcus regroupe quarante-trois (43) espèces et sousespèces, dont dix-sept (17) ont été retrouvées chez l'homme. La plupart de ces espèces sont des pathogènes opportunistes chez l'homme présentant un risque élevé en cas de blessure cutanée par un traumatisme ou par implantation directe d'un produit médical. D'ailleurs, l'espèce Staphylococcus aureus est une bactérie qui se retrouve souvent chez des patients qui doivent recevoir des soins hospitaliers faisant intervenir des appareils tels que seringues, cathéters. Il y a donc un grand intérêt de détecter la présence de cette bactérie pathogène, de plus en plus impliquée dans les maladies nosocomiales. Parmi les staphylocoques, Staphylococcus aureus est incontestablement l'espèce la plus virulente, puisqu'elle produit un nombre important de toxines et d'enzymes extracellulaires. Elle peut être à l'origine de pathologies nombreuses et variées, allant du simple panaris, jusqu'aux infections les plus sévères comme les septicémies, endocardites, pneumopathies, infections ostéoarticulaires, dont le pronostic peut être très réservé. En outre, seules cinq (5) espèces : Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus et Staphylococcus hominis représentent au moins 1% des souches pathogènes isolées dans des centres cliniques et, à elles cinq, plus de 98% des souches de staphylocoques les plus fréquemment rencontrées. Les autres espèces sont rarement rencontrées et peu pathogènes. En bactériologie, il est classique d'opposer l'espèce Staphylococcus aureus, caractérisée par la production d'une coagulase, aux autres espèces dites à coagulase négative. Les méthodes traditionnelles pour différencier Staphylococcus aureus de Staphylococcus non aureus reposent sur la recherche de la coagulase libre, de la DNase et sur l'obtention d'une agglutination sur latex visant à mettre en évidence la présence du facteur d'affinité pour le fibrinogène, de la protéine A et d'antigènes capsulaires. Il faut savoir que d'autres espèces de staphylocoques, potentiellement pathogènes, sont capables d'exprimer une coagulase. Les espèces à coagulase positive sont les suivantes : Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus delphinis, Staphylococcus lutrae et Staphylococcus schleiferi. Il existe des techniques de culture sur milieux sélectifs pour permettre d'évaluer la présence de Staphylococcus aureus. Il s'agit des milieux suivants : 'Le milieu hypersalé de Chapman (à 75 % de NACI) est généralement sélectif pour Staphylococcus aureus et les staphylocoques qui hydrolysent le Mannitol. Ces bactéries font virer le milieu de rouge au jaune. Certains micro-organismes et les entérocoques du groupe D, en particulier, peuvent produire la même réaction sur le milieu ; il est donc nécessaire alors de vérifier la catalase (négative pour les streptocoques). * Le milieu de Baird Parker (contenant du Tellurite de potassium et du Chlorure de lithium comme agents sélectifs) est utilisé pour isoler et dénombrer les staphylocoques à coagulase positive dans les produits alimentaires et permet de mettre en évidence l'activité de la coagulase. Sur ce milieu les colonies de Staphylococcus aureus, et d'autres espèces à coagulase positive apparaissent avec un centre noir entouré d'un halo opaque. D'autres micro-organismes peuvent se développer sur ce milieu. Il s'agit principalement des groupes suivants : M Cocci Gram + : des genres Enterococcus et Listera, * Bacille Gram- : des genres Proteus et Pseudomonas. En fait, la révélation des Staphylococcus aureus, qui utilise la technique du milieu hyper salé de Chapman, manque de sensibilité (pouvoir de mettre en évidence l'espèce recherchée lorsque celle-ci est présente en faible quantité dans un échantillon biologique à tester) et surtout de spécificité (pouvoir de détecter l'espèce recherchée dans l'échantillon biologique à tester contenant d'autres espèces). De même, la révélation des Staphylococcus aureus, qui utilise la technique du milieu Baird-Parker, manque de sensibilité et de spécificité. Ainsi, certaines souches n'appartenant pas à l'espèce Staphylococcus aureus, en particulier Staphylococcus schleifer et Staphylococcus saprophyticus, peuvent également donner des colonies entourées d'une auréole d'éclaircissement. Il peut arriver aussi que certaines souches de Staphylococcus aureus n'expriment pas l'activité enzymatique recherchée ou ne se développent pas sur le milieu, car ils peuvent être présents en trop faible quantité dans les échantillons biologiques et/ou inhibées par les composants trop sélectifs du milieu. On comprend donc que cette révélation avec les milieux Baird-Parker et Chapman, ne donnent qu'un diagnostic présomptif et nécessitent d'autres tests de confirmation. Or, les manipulations supplémentaires, nécessaires à l'identification de Staphylococcus aureus, augmentent la durée et le coût des analyses. Elles nécessitent une multitude de réactifs et l'intervention d'un personnel qualifié. Il est également possible d'utiliser des substrats à base de glucoside, ce qui permet de détecter, selon la configuration des molécules utilisées, soit une activité a-glucosidase, soit une activité ss-glucosidase. L'utilisation d'a-glucosides pour l'identification des différentes espèces de staphylocoques est déjà connue. Cependant, l'étude de l'acidification de ces sucres par les différentes espèces de staphylocoques ne permet pas actuellement une identification simple de Staphylococcus aureus, car elle est soit trop peu spécifique (dans le cas du Maltose, du Turanose, du Saccharose, du Tréhalose par exemple), soit trop peu sensible (dans le cas du Méthyl-a-glucoside, du Raffinose, du Turanose par exemple) (Bascomb S. and Manafi M. 1998. Use of enzyme tests in characterization and identification of aerobic and facultatively anaerobic Gram positive cocci. Clin. Microbiolol. Rev. 11 : 318-340.) (Kloos WE. et al. 1982. Identification of Staphylococcus Species with the API Staph-IDENT. System. J. Clin. Microbiol. 16 (3) : 509-516.). Cet état de fait n'a pas tendance à pousser les chercheurs à travailler sur ce type d'activité a-glucosidase. Par contre, des publications récentes font état de l'intérêt de travailler avec l'activité ss-glucosidase. C'est par exemple le cas du brevet EP-B-0. 741. 797, qui décrit un procédé de différentiation sur un milieu de culture sélectif de bactéries de genre Staphylococcus des autres bactéries par l'utilisation de deux substrats chromogéniques à base d'indoxyl permettant de détecter l'activité phosphatase des staphylocoques et l'activité ss-glucosidase des autres genres de bactéries. Par rapport à la détection de staphylocoques sur un milieu gélifié, selon ce brevet, permettant seulement la différenciation de staphylocoques de bactéries d'autres genres, notre invention permet donc de distinguer les Staphylococcus aureus des autres bactéries du genre Staphylococcus. Dans un article : Evaluation of CHROMagar Staph. aureus, a new chromogenic medium, for isolation and presumptive identification of Staphylococcus aureus from human clinical specimens. de Gaillot 0. et al. 2000. J. Clin. Microbiol. 38, 4, 1587-1591, on décrit et évalue un milieu de culture chromogénique CHROMagar (marque déposée) Staph. aureus permettant l'isolement des staphylocoques et l'identification de Staphylococcus aureus à l'aide de substrats chromogéniques qui procurent une coloration mauve de cette dernière espèce. Les autres espèces du même genre sont alors détectées par la coloration bleue ou incolore, en théorie. On utilise essentiellement les activités ss-glucosidase, ssglucuronidase, ss-galactosidase et phosphatase, ainsi qu'un inhibiteur, la Déféroxamine, qui permet la différenciation de Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis. Une demande de brevet a d'ailleurs été déposée sur ce sujet, WO-A-00/53799. Cette demande de brevet propose un milieu de détection de Staphylococcus aureus qui couple au moins les deux agents chromogènes suivants : '5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl phosphate, activité phosphatase, et * 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl glucoside, activité ss-glucosidase, déjà décrits dans la demande de brevet EP-B-0. 741. 797, décrite plus haut. En fait, ce nouveau document ajoute aux chromogènes simplement et essentiellement un inhibiteur de croissance, appelé Déféroxamine. Ce dernier permet de mieux discriminer les Staphylococcus aureus des Staphylococcus epidermidis. Or la Déféroxamine est déjà bien connue comme inhibiteur de croissance des Staphylococcus epidermidis mais pas pour les autres espèces de staphylocoque (Lindsay J. A., Aravena-roman M. A., Riley T. V.- Identification of Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus hominis from blood cultures by testing susceptibility to desferrioxamine-European J. of Clin. Microbiol. et Inf. Diseases-1993, vol. 12, pages 127-131). Par rapport au milieu CHROMagar (marque déposée) Staph. aureus, notre milieu permet une différentiation plus aisée des Staphylococcus aureus des Staphylococcus epidermidis, les deux espèces produisant des colonies de la même couleur sur le milieu CHROMagar (marque déposée). Ceci est dû au manque de spécificité des substrats de phosphatase qui sont positifs pour les Staphylococcus aureus et les Staphylococcus epidermidis et au fait que l'inhibition de ces derniers par la Déféroxamine n'est que partielle. Il faut noter que selon notre invention, en détectant uniquement l'activité a-glucosidase, on peut déjà séparer Staphylococcus aureus de Staphylococcus epidermidis et Staphylococcus saprophyticus qui sont trois des principales espèces de staphylocoques isolées en clinique. En fait et contre toute attente, les inventeurs ont démontré que des substrats à base d'a-glucoside pouvaient permettre une identification sensible et spécifique de Staphylococcus aureus. En fait, par le choix de conditions opérationnelles et/ou de substrats particuliers d'a-glucosidase et/ou de coupler au moins un deuxième substrat enzymatique permettant de définir un milieu réactionnel, il est possible de : discriminer entre les principales espèces de staphylocoques à coagulase positive les plus fréquemment isolées (Staphylococcus aureus et Staphylococcus intermedius essentiellement) et les staphylocoques à coagulase négative les plus présents (Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus essentiellement), et/ou identifier spécifiquement des Staphylococcus aureus. Par exemple, un gain de spécificité et dans l'aspect pratique de l'invention est apporté par l'adjonction d'au moins un deuxième substrat enzymatique. Ainsi, ce gain est obtenu par la détection, d'une part, d'une activité a-glucosidase, activité fortement exprimée par les Staphylococcus aureus et très faiblement par les autres espèces de staphylocoque, et d'autre part, d'une activité ss-glucuronidase et/ou ss-galactosidase et/ou ss-glucosidase exprimée (s) par la plupart des staphylocoques mais pas par les Staphylococcus aureus en fonction des substrats utilisés. Cette deuxième activité permet de mieux différencier les Staphylococcus aureus des autres espèces du genre Staphylococcus. A cet effet, la présente invention concerne un milieu de détection de Staphylococcus aureus et/ou de Staphylocoques à coagulase positive, qui comporte un milieu de culture de Staphylococcus aureus et au moins un substrat enzymatique permettant de mettre en évidence une activité a-glucosidase. Le substrat enzymatique permettant de mettre en évidence une activité a-glucosidase est un agent chromogène. L'agent chromogène permettant de mettre en évidence une activité a-glucosidase est à base d'Indoxyle. Ce milieu utilise comme agents) chromogène (s) : * 6-Bromo-3-indoxyl-a-D-glucoside, '5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-a-D-glucoside, * 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl-a-D-glucoside, et/ou '6-Chloro-3-indoxyl-a-D-glucoside. Selon un mode de réalisation, le milieu utilise au moins deux substrats enzymatiques différents, préférentiellement deux agents chromogènes, l'un permettant de mettre en évidence une activité a-glucosidase et l'autre permettant de détecter une activité osidase (ss- glucosidase et/ou ss-glucuronidase et/ou p-galactosidase) et/ou estérase (estérasellipase et/ou phosphatase et/ou sulfatase) et/ou peptidase et/ou coagulase. De plus, le milieu utilise deux agents chromogènes, choisis parmi les couples suivants : * 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl-a-D-glucoside associé au 5-Bromo-6-chloro- 3-indoxyl-ss-D-galactoside, ou * 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl-a-D-glucoside associé au 6-Chloro-3-indoxyl- ss-D-glucuronide, ou '6-Chloro-3-indoxyl-a-D-glucoside associé au 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl- ss-D-glucuronide, ou * 6-Chloro-3-indoxyl-a-D-glucoside associé au 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl- p-D-glucoside. Préférentiellement, le milieu utilise au moins un inhibiteur qui privilégie la croissance des bactéries du genre Staphylococcus, tel que Chlorure de lithium (LiCI), Azide de sodium (NaN3), Colistine, Amphotéricine, Aztréonam, Colimicine, Chlorure de sodium acul) et Déféroxamine. La présente invention concerne également une méthode d'identification de bactérie (s) de l'espèce Staphylococcus aureus dans un échantillon, contenant au moins une espèce de bactérie, qui comprend les étapes suivantes : * inoculer un milieu, tel que décrit ci-dessus, avec tout ou partie de l'échantillon, et 'incuber le milieu inoculé pour produire des colonies bactériennes de taille suffisante pour observer la coloration de chaque agent chromogène, ayant réagi, utilisé dans ledit milieu. Cette méthode peut permettre en outre le dénombrement de bactérie (s) de l'espèce Staphylococcus aureus dans l'échantillon, dans ce cas, on effectue une troisième étape qui consiste à énumérer les colonies identifiées par une coloration en relation avec les bactéries de l'espèce Staphylococcus aureus. Expérience 1 : Evaluation de différents substrats d'a-glucosidase constitués par des différents marqueurs chromogéniques à base de dérivés d'Indoxyl : Les milieux ci-après ont été préparés dans une base contenant : e 11 gramme par litre (g/1) de peptone, e 0, 65 g/l de tampon TRIS, et e 14 gll d'agar, en combinaison avec les substrats chromogéniques d'a-glucosidase décrits dans le tableau 1 suivant : Substrat chromogénique Abréviation utilisée 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-a-D-glucoside 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl- &alpha;-D-glucoside 6-Chloro-3-indoxyl-a-D-glucoside Rose-a-GLU 6-Bromo-3-mdoxyl-a-D-glucoside Red A a-GLU 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl-&alpha;-D-glucoside Green A a-GLU Tableau 1 : Abréviations des substrats chromogéniques d'a-glucosidase utilisés Les substrats de l'a-glucosidase sont solubilisés dans le Diméthylsulfoxide à une concentration de 200 girl. Un volume suffisant est ajouté aux quatre milieux en surfusion pour obtenir une concentration finale en substrat à 100 mg/1. Des micro-organismes issus de la collection interne de bioMérieux ont été ensemencés sur chacun des milieux par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 MacFarland. Néanmoins, des résultats obtenus avec des micro-organismes issus de collections disponibles au public, ATCC ou NCTC par exemple, donneraient des résultats identiques. Les boîtes ont été incubées à 378C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après un temps d'incubation de 24 et 48 heures. La coloration ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées. Dans le tableau 2 ci-dessous, comme dans les tableaux qui suivront, C représente la coloration des colonies après incubation, 1 représente l'Intensité de cette coloration, le symbole - est synonyme d'une absence de couleur ou d'intensité, enfin TI définit les temps d'incubation. A noter que l'intensité de la coloration est une échelle arbitraire mais qui est commune à l'ensemble des échantillons biologiques et des milieux testés. Cette échelle est valable pour cette expérience ainsi que pour toutes les expériences qui suivront. Elle peut être définie de la manière suivante : * 0 correspond à une absence d'activité, * 0, 1 correspond à la présence d'une trace de coloration, * 0, 5 correspond à la présence d'une coloration très pâle, * 1 correspond à la présence d'une coloration nette de faible intensité, '1, 5 correspond à la présence d'une coloration intermédiaire aux colorations 1 et 2, 2 correspond à la présence d'une coloration franche d'intensité moyenne, * 2, 5 correspond à la présence d'une coloration intermédiaire aux colorations 2 et 3, * 3 correspond à la présence d'une coloration intense, * 3, 5 correspond à la présence d'une coloration intermédiaire aux colorations 3 et 4, * 4 correspond à la présence d'une coloration très intense. Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous : Milieu X-a-GLU Rose-a- Red "A" a- Green "A" aGLU GLU GLU Souches TI C 1 C 1 C 1 C 1 S. aureus 24h turquoise 1,5 rose 2 rose 2 vert 1,5 070 48 h turquoise 1,5 rose 2 rose 2,5 vert 2,5 S. aureus 24h turquoise 2 rose 1,5 rose 2 vert 2 276 48 h turquoise 2 rose 1,5 rose 2 vert 2 S. aureus 24h turquoise 1 rose 1 rose 0,5 vert 1,5 004 48 h turquoise 2 rose 1 rose 2,5 vert 2 S. intermedius 24 h turquoise 0, 5-0-0 vert 1,5 075 48 h turquoise 2 rose 0,5 rose 1,5 vert 1,5 S. saprophyticus 24h-0-0-0-0 064 48 h turquoise 0, 5-0-0-0 S. epidermidis 24h-0-0-0-0 009 48h turquoise 1 - 0 - 0 - 0 S. 24 h turquoise 0. 5-0-0-0 008 48 h turquoise 1. 5 rosé 0. 5 rosé 2. 5 vert l Tableau 2 : Evaluation de différents substrats d'a-glucosidase constitués par différents marqueurs chromogéniques à base de dérivés d'Indoxyl Pour le substrat 5-Bromo-4-chloro-3- (tiret d'union insécable) indoxyl-a-D- glucoside, on obtient un écart d'intensité de coloration entre les souches de staphylocoques à 24 heures, qui permet d'identifier les Staphylococcus aureus et de les distinguer des autres espèces du genre Staphylococcus. A 48 heures, un doute peu exister entre Staphylococcus aureus et Staphylococcus xylosus. Pour les trois autres substrats, la durée d'incubation n'a pas d'influence, en ce sens que l'écart d'intensité de coloration, à 24 heures comme à 48 heures, permet l'identification des Staphylococcus aureus et leur distinction par rapport aux autres espèces du genre Staphylococcus. On remarque toutefois que les écarts d'intensité entre les souches de Staphylococcus aureus et les souches de Staphylococcus xylosus (à coagulase négative) sont plus significatifs avec les trois substrats 6-Chloro-3-indoxyl-a-D-glucoside, 6-Bromo-3indoxyl-a-D-glucoside et 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl-a-D-glucoside qui donne un meilleur contraste entre la couleur du marqueur et celle du milieu et sont plus spécifiques que le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-a-D-glucoside. Expérience 2 : Différentiation des Staphylococcus aureus par rapport aux espèces du même genre par la détection directe de l'activité a-glucosidase et d'une autre activité osidase dans un milieu gélifié : Les milieux ci-après ont été préparés dans une base contenant : * 11 gramme par litre (g/l) de peptone, * 0,65 g/l de tampon TRIS, et # 14 g/l d'agar, associée à une combinaison de deux substrats chromogéniques dont l'un permet de détecter une activité a-glucosidase. Ces substrats complexes sont présentés dans le tableau 3 qui suit : Abréviation Substrat &alpha;-glucosidase Substrat associé (activité détectée) 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl- 6-Chloro-3-indoxyl-ss-DA N-methyl-&alpha;-D-glucoside glucuronide (ss-glucuronidase) B 5-Bromo-4-chloro-3-mdoxyl-6-Chloro-3-indoxyl-p-DN-methyl-q-D-glucoside galactoside (p-galactosidase) C 6-Chloro-3-indeoxyl-&alpha;-D- 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-ss-Dglucosideglucoside (P-glucosidase) D 6-Chloro-3-indoxyl-a-D-5-Bromo-4-chloro-3-mdoxyl-p-Dglucoside glucuronide (p-glucuronidase) Tableau 3 : Abréviation de différentes combinaisons de substrats chromogéniques d'a-glucosidase et de substrats chromogéniques spécifiques d'autres activités enzymatiques Une solution mère de chaque substrat d'a-glucosidase à 200 g/l est préparée dans le Diméthylsulfoxide. Un volume suffisant est ajouté aux quatre milieux en surfusion pour obtenir une concentration finale pour chaque substrat d'a-glucosidase de 100 mg/1. En même temps, un volume suffisant de substrat de chacune des autres activités osidases, décrites ci-dessus, est ajouté aux quatre milieux à une concentration comprise entre 50 et 200 mg/1 selon le substrat. Des micro-organismes issus de la collection interne de bioMérieux ont été ensemencés sur chacun des milieux par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 MacFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 et 48 heures d'incubation. La coloration ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées. Les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous : Milieu A B C D Souches TI C l C l C 1 C 1 S. aureus 24h vert 1,5 vert 1,5 rose 1,5 rose 2 070 48 h vert 1,5 vert 1,5 rose 3 rose 3 S. aureus 24h vert 2 vert 2 rose 1,5 rose 1,5 276 48 h vert 3 vert 3 rose 3,5 rose 2 S. aureus 24h vert 1,5 vert 1,5 rose 1,5 rose 1,5 004 48 h vert 1,5 vert 1,5 rose 2 rose 2 S. intermedius 24 h vert 0,5 gris 0,5 rose 0,5 rose 0 075 48 h vert 1,5 mauve 2 rose 1,5 rose 1,5 S. haemolyticus 24h-0-0 rose 0,5 rose 0,5 131 48h-0-0 rose 0,5 rose 0,5 S. saprophyticus 24 h - 0 rose 2 - 0 - 0 064 48 h-0 rose 2,5 rose 0,5 rose 0,5 S. epidermidis 24 h - 0 - 0 - 0 - 0 009 48 h-rose 0,5 rose 0, 5 S. xylosus 24 h rose 1,5 mauve 0,5 turquoise 3 turquoise 1,5 008 48 h mauve 3,5 mauve 1, 5 turquoise 3 turquoise 2,5 Tableau 4 : Evaluation de différents combinaisons de substrats Les résultats ci-dessus montrent qu'il est possible de distinguer les Staphylococcus aureus des autres espèces, les plus fréquemment rencontrées (Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, etc. ) après 24 heures d'incubation avec tous les couples de substrats chromogéniques testés. Chaque couple A, B, C et D de substrats étudié par la gamme de couleurs et/ou par l'intensité de couleur permet de distinguer les différentes espèces de staphylocoques. D'une part, la différence de coloration permet de repérer Staphylococcus xylosus sans ambiguïté, et d'autre part les niveaux d'intensité de la couleur les plus forts, obtenus pour les Staphylococcus aureus, permettent de les différencier des autres espèces du même genre ayant la même coloration. Seule l'espèce Staphylococcus intermedius peut poser problème à 48 heures avec le couple de substrat A, néanmoins il n'y a aucune ambiguïté à 24 heures d'incubation, ce qui est plus intéressant car plus la durée d'identification est courte plus le milieu est performant. il s'agit d'une espèces de staphylocoque à coagulase positive qui n'est pas distinguée de Staphylococcus aureus par la plupart des méthodes d'identification notamment sur les milieux Chapman, Baird Parker et CHROMagar (marque déposée) Staph aureus. Expérience 3 : Etude comparative d'un de nos milieux contenant un mélange de substrats décrit à l'Expérience 2 vis-à-vis de milieux disponibles dans le commerce : Les milieux de culture suivants, révélateurs de la présence de Staphylococcus aureus dans un prélèvement biologique peuvent être obtenus chez les sociétés suivantes : * milieu CHROMagar Staph aureus (référence TA600) auprès de la société CHROMagar située à Paris en France, et 'milieux Chapman (référence 43311) et Baird Parker (référence 43521) auprès de la société bioMérieux située à Marcy l'Etoile en France. Les abréviations des milieux présentés dans le tableau 5 ci-dessous sont les suivantes : * A correspond au milieu contenant le mélange A décrit à l'Expérience 2, * B correspond au milieu CHROMagar Staph aureus utilisé pour isoler les staphylocoques et identifier l'espèce Staphylococcus aureus par une coloration rose des colonies, les autres espèces de staphylocoques donnent une couleur turquoise ou incolore, * C correspond au milieu Chapman utilisé pour isoler Staphylococcus aureus et les staphylocoques qui hydrolysent le mannitol, ces bactéries font virer l'indicateur coloré, présent dans le milieu, du rouge au jaune, et 'D correspond au milieu Baird Parker utilisé pour isoler et caractériser Staphylococcus aureus qui produit en 24 heures des colonies caractéristiques à centre noir entouré d'une zone d'éclaircissement, dit halo, correspondant à la détection d'une coagulase. Dans les milieux décrits ci-dessus ont été testées trente-six (36) souches appartenant à douze (12) espèces de staphylocoques, les plus fréquemment rencontrées en analyse clinique. Ces micro-organismes issus de la collection interne de bioMérieux ont été ensemencés sur chacun des milieux par isolement en trois cadrants à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 et 48 heures d'incubation. La coloration des colonies sur notre milieu et le milieu chromogénique CHROMagar Staph aureus ont été notées selon le procédé et l'échelle décrit dans l'exemple 1. Pour la lecture du milieu Chapman, le symbole - correspond à une absence de virage de l'indicateur coloré, la gélose reste rouge autour des colonies (souches mannitol-) et le symbole + correspond à un virage de l'indicateur coloré, la gélose devient jaune autour des colonies (souche mannitol +). Pour la lecture du milieu Baird Parker, le symbole - correspond à une absence de halo d'éclaircissement autour des colonies (souche coagulase-) et le symbole + correspond à la présence d'un halo d'éclaircissement autour desdites colonies (souche coagulase +). Dans le tableau 5 ci-dessous, la coloration correspond à la coloration des colonies après incubation, les initiales C. M. représente la coloration du milieu Chapman autour des colonies après incubation, le terme Halo représente la zone d'éclaircissement du milieu Baird Parker autour des colonies après incubation, enfin le symbole if représente le nombre de souches par espèces identifiées, selon le milieu, par la coloration spécifique ou le halo. Milieu A B C D Souches TI Coloratio n Cotoratio n C. M. no Halo nO n n S. aureus 24h vert 9 rose 9 + 9 + 3 (9) 48 h vert 9 rose 9 + 9 + 5 S. intermedius 24 h vert 2 rose 2--+ 2 (2) 48 h vert 2 rose 2--+ 2 S. haemolyticus 24h----+ 2 (3) 48 h-+ 2-S. saprophyticus 24 h - - turquoise 3 + 1 (3) 48 h - - turquoise 3 + 1 S. epidermidis 24 h - - rose 4 (5) 48 h--rose 4---S. hominis 24h--turquoise 1 (2) 48h--turquoise 1 S. warneri 24h----+ 1 (2) 48h----+ 1 S. schleiferi 24h--rose 2--+ 2 (2) 48 h - - rose 2 - - + 2 S. cohnii 24 h rose 1 turquoise 1 + 2 (2) 48 h rose 1 turquoise 2 + 2 S. xylosus 24 h rose 2 turquoise 2 + 1 (2) 48 h mauve 2 turquoise 2 + 2 S. capitis 24 h - - - - + 1 - - (2) 48 h - - - - + 2 - S. hyicus 24 h rose 2 (2) 48 h - - mauve 2 - - + 2 Tableau 5 : Comparaison d'un milieu selon l'invention avec les milieux disponibles dans le commerce. Sur le milieu, selon l'invention, et sur les milieux CHROMagar Staph aureus et Chapman toutes les souches de Staphylococcus aureus ont été identifiées. De plus, les souches de Staphylococcus intermedius, espèce à coagulase positive, sont identifiées sur notre milieu, selon l'invention, comme sur le milieux CHROMagar Staph aureus et Baird-Parker. Les résultats montrent aussi qu'aucun faux positif n'a été identifié sur le milieu selon l'invention et sur le milieu Baird Parker. On note également que sur le milieu CHROMagar Staph aureus et sur le milieu hypersalé Chapman (à 75 % de NaCl), il n'est pas possible de distinguer les Staphylococcus aureus de certaines espèces à coagulase négative. Il est donc nécessaire de réaliser des tests complémentaires visant à mettre en évidence la présence de ces Staphylococcus aureus. Cette expérience met en évidence la spécificité et la fiabilité du procédé selon l'invention. Divers : Les substrats chromogènes suivants, révélateur de l'a-glucosidase, peuvent être obtenus auprès des sociétés suivantes : '5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-a-D-glucoside auprès de BIOSYNTH située à Staad en Suisse sous la référence B-7230, * 6-Chloro-3-indoxyl-a-D-glucoside auprès de BIOSYNTH précédemment évoquée et porte la référence C-5015, et '6-Bromo-3-indoxyl-a-D-glucoside, dont la synthèse est décrite dans le brevet nO WO 99/50438 de la société Inalco. En ce qui concerne le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl-a-D-glucoside, il peut être synthétisé de la manière suivante : Le 5-Bromo-4-chloro-l-méthyl-indol-3-yl-a-D-glucoside, formule ci-dessous : est obtenu à partir du 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl acétate ou du 5-Bromo-4-chloro-indolyl- 1, 3-diacétate. Etape 1 : Synthèse du 5-Bromo-4-chloro-N-méthyl-3-indolyl-acétate 3mmol de l'un ou l'autre ester ci-dessus sont dissoutes dans 35 ml de Diéthyl ester anhydre et méthylés sur l'Azote 1 par addition d'un excès de complexe Diazométhane-Trifluorure de Bore dans l'éther. La phase organique est extraite avec de l'acide Chlorydrique IM, lavée à l'eau et séchée (Na2S04)'Le solvant est éliminé et le résidu séché sous vide en présence de Pentoxide de Phosphore pour obtenir 0,62g de produit. Etape 2 : Synthèse du 5-Bromo-4-chloro-l-méthyl-3-indolyl-a-D-glucoside A. L'ester d'acétate N-méthylé obtenu ci-dessus (0,6g, 2mmol) est dissous dans de l'Acétate d'Ethyl anhydre et hydrolysé par addition d'un excès d'Ammoniaque méthanolique sous atmosphère d'Argon. Après 16 heures à température ambiante, le solvant et l'excès d'ammoniaque sont éliminé par évaporation sous pression réduite, le résidu solide est directement glycosilé sans purification supplémentaire. B. Le 5-Bromo-4-chloro-l-méthyl-indol-3-yl est repris dans du Dichlorométhane et traité à 0 C avec une solution de Glucose penta-acétate dans du Dichlorométhane (1,45g, 5mmo !/20ml), puis par du Chlorure d'Etain (2mmol) dissous dans du Dichlorométhane, sous agitation. La réaction est poursuivie pendant une nuit et le produit isolé par agitation avec de l'acide Chlorydrique glacial 1M. Après élimination des sels d'Etain, la phase organique est filtrée sur papier PHASE-SEP et séchée sur MgSO4. En CCM, deux spots sont détectés sous UV. Après une première séparation sur une colonne de gel de Silice avec du Dichlorométhane-Acétate d'Etyl comme éluant, les deux composés sont séparément déacétylés en présence d'une solution méthanolique de Méthoxide de Sodium pour donner des mélanges d'a et p-glucoside. C. La forme a apparaît prédominante, le p-glucoside résiduel peut être éliminé par dissolution dans l'eau chaude, refroidie à 37 C et incubée en présence de ss-glucosidase. La solution est filtrée et les pigments d'indigo sont extraits à l'Ether. La solution aqueuse résiduelle est évaporée sous pression réduite puis lyophilisée pour obtenir l'a-glucoside (120 mg). Le substrat chromogène 6-chloro-3-indoxyl-P-D-glucuronide, révélateur de la ss-glucuronidase, peut être obtenu auprès de BIOSYNTH toujours située à Staad en Suisse sous la référence C-5050. Le substrat chromogène 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-ss-D-glucuronide, également révélateur de la ss-glucuronidase, peut être obtenu auprès de BIOSYNTH sous la référence B-7400. Le substrat chromogène 6-Chloro-3-indoxyl-ss-D-galactoside, révélateur de la ss-galactosidase, peut être obtenu auprès de BIOSYNTH sous la référence C-5000. Le substrat chromogène 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-ss-D-glucoside, révélateur de la ss-glucosidase, peut être obtenu auprès de BIOSYNTH sous la référence B-7250. REVENDICATIONS 1. Milieu de détection de Staphylococcus aureus et/ou de Staphylocoques à coagulase positive, qui comporte un milieu de culture de Staphylococcus aureus et au moins un substrat enzymatique permettant de mettre en évidence une activité a-glucosidase. 2. Milieu, selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le substrat enzymatique permettant de mettre en évidence une activité a-glucosidase est un agent chromogène. 3. Milieu, selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'agent chromogène permettant de mettre en évidence une activité a-glucosidase est à base d'Indoxyle. 4. Milieu, selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé par le fait qu'il utilise comme agent (s) chromogène (s) : * 6-Bromo-3-indoxyl-a-D-glucoside, * 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-a-D-glucoside, * 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl-a-D-glucoside, et/ou '6-Chloro-3-indoxyl-a-D-glucoside. 5. Milieu, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il utilise au moins deux substrats enzymatiques différents, préférentiellement deux agents chromogènes, l'un permettant de mettre en évidence une activité agiucosidase et l'autre permettant de détecter une activité osidase (ss-glucosidase et/ou p-glucuronidase et/ou ss- galactosidase) et/ou estérase (estérase/lipase et/ou phosphatase et/ou sulfatase) et/ou peptidase et/ou coagulase 6. Milieu, selon la revendication 5, caractérisé par le fait qu'il utilise deux agents chromogènes, choisis parmi les couples suivants : * 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyI-N-méfhyI-a-D-glucoside associé au 5-Bromo-6-chloro- 3-indoxyl-ss-D-galactoside, ou * 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl-a-D-glucoside associé au 6-Chloro-3-indoxyl- ss-D-glucuronide, ou '6-Chloro-3-indoxyl-a-D-glucoside associé au 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl- ss-D-glucuronide, ou '6-Chloro-3-indoxyl-a-D-glucoside associé au 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl- ss-D-glucoside, 7. Milieu, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait qu'il utilise au moins un inhibiteur qui privilégie la croissance des bactéries du genre Staphylococcus, tel que Chlorure de lithium (LiCI), Azide de sodium (NaN3), Colistine, Amphotéricine, Aztréonam, Colimicine, Chlorure de sodium (NaCI) et Déféroxamine. 8. Méthode d'identification de bactérie (s) de l'espèce Staphylococcus aureus dans . un échantillon, contenant au moins une espèce de bactérie, qui comprend les étapes suivantes : 'inoculer un milieu, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, avec tout ou partie de l'échantillon, et * incuber le milieu inoculé pour produire des colonies bactériennes de taille suffisante pour observer la coloration de chaque agent chromogène, ayant réagi, utilisé dans ledit milieu. 9. Méthode, selon la revendication 8, permettant en outre le dénombrement de bactérie (s) de l'espèce Staphylococcus aureus dans l'échantillon caractérisée en ce que l'on effectue une troisième étape qui consiste à énumérer les colonies identifiées par une coloration en relation avec les bactéries du genre Staphylococcus aureus.