Brevet FR2831959A1 — publié le 20030509

METHODE D'ANALYSE DE LA CONFORMATION D'UN PEPTIDE PRESENTANT UNE AFFINITE POUR DES SUBSTANCES CIBLES ET SON UTILISATION POUR L'ETUDE DE SUBSTANCE CIBLES COMME DES LIPOPROTEINES. L'invention s'intéresse au domaine de l'analyse de la conformation d'un peptide présentant une affinité pour des substances cibles mettant en oeuvre une mesure du transfert d'énergie entre des fluorophores. L'invention se rapporte plus particulièrement à l'analyse de la conformation d'un peptide comprenant la région de fixation au récepteur des LDL du domaine N-terminal de l'apolipoprotéine E lorsqu'il est mis en contact avec des lipoprotéines. L'invention concerne aussi une méthode d'analyse de substances cibles, plus particulièrement de lipoprotéines, comprenant l'analyse de la configuration ouverte ou fermée d'un peptide, notamment un peptide issu de l'extrémité N-terminale de l'apolipoprotéine E. L'invention se rapporte plus particulièrement à une méthode d'analyse des lipoprotéines contenues dans le plasma de sujets normaux et hyperlipidémiques. L'athérogénèse est une maladie plurifactorielle et les dyslipoprotéinémies représentent un des facteurs de risque bien identifié (Lusis AJ., Nature, 2000,407 : 233-41). Les résultats d'une méta-analyse récente d'études épidémiologiques prospectives ont démontré que la triglycéridémie à jeun constituait un facteur de risque cardiovasculaire indépendant (Austin MA., Am. J. Cardiol. 1999,83 : 13F-16F ; Austin MA, Hokanson JE, Edwards KL., Am. J. Cardiol. 1998,81 : 7B-12B ; Hokanson JE, Austin MA., J. Cardiovasc Risk. 1996,3 : 213-9). Actuellement le diagnostic biologique des hyperlipidémies repose sur les dosages plasmatiques du cholestérol total, des triglycérides et du cholestérol-HDL, le dosage du cholestérol-LDL étant obtenu par calcul par la formule de Friedewald. L'hypertriglycéridémie correspond à la présence en excès dans le plasma de lipoprotéines riches en triglycérides (LRT) (LRT : chylomicrons et/ou VLDL). Ce sont des lipoprotéines légères (d La présente invention a précisément pour objet de remédier à cet inconvénient en offrant une méthode simple et performante pour caractériser finement les sous-classes de taille des lipoprotéines. On connaît de l'art antérieur que la conformation de l'apolipoprotéine E à la surface des particules lipoprotéiques riches en triglycérides (VLDL) détermine leur affinité pour le récepteur des LDL encore appelé récepteur apo B/E (Dergunov AD. Et al., Biochim. Biophys. Acta. 2000, 1484 : 29-40 ; Dergunov AD. Et al., Biochim. Biophys. Acta. 2000 Feb 24,1484 (1) : 14-28). En particulier chez les sujets hypertriglycéridèmiques il existe deux conformations identifiées de l'apolipoprotéine E présentes à la surface des VLDL, l'une accessible à l'action de la thrombine et à la reconnaissance par le récepteur LDL (apoB/E), l'autre inaccessible à ces deux facteurs (Bradley WA. et al., J. Biol. Chem. 1984,259 : 14728-35 ; Gianturco SH. Et al., J. Biol. Chem. 1983,258 : 4526-33). Il a été rapporté que la région de fixation au récepteur des LDL se situe à proximité des résidus 130 à 150 à l'intérieur du domaine N-terminal de 22 kDa de l'apolipoprotéine E. La technique FRET (transfert d'énergie de fluorescence) a été utilisée pour montrer que la reconnaissance par le récepteur de ce domaine se manifeste lors de l'association de l'apo E aux lipides et s'accompagne d'un changement de conformation de la protéine (Fisher CA. et al., J. Biol. Chem., 2000 Oct. 27,275 (43) : 33601-6). La présente invention se rapporte à une méthode d'étude des lipoprotéines de sujets normaux et hyperlipidémiques, basée sur les propriétés physico-chimiques d'un peptide constitué par ou comprenant l'extrémité Nterminale d'une apolipoprotéine E, qui, lorsqu'il est incubé en présence de lipoprotéines, peut conduire à la formation de particules et présente un pouvoir d'association différentielle avec les différentes sous-classes de lipoprotéines. La méthode de l'invention permet également d'établir la conformation ouverte ou fermée du peptide au sein de certaines sous-classes de lipoprotéines (Clement-Collin V. et al., Eur. J. Biochem. 1999 Sep, 264 (2) : 358-68 ; Fisher CA. et al., E. J. Biol Chem. 2000,275 : 33601-6 ; Fisher CA, Ryan RO., E. J. Lipid Res. 1999 Jan, 40 (1) : 93-9). Les inventeurs ont en effet maintenant mis en évidence que cette structure du peptide à la surface de ces particules est en relation directe avec leur reconnaissance par le LDL récepteur qui est responsable de leur catabolisme. Si le peptide adopte une structure repliée à la surface des particules lipoprotéiques, ces particules ne sont pas reconnues par le LDL récepteur, si sa structure est étendue, elles sont reconnues. Cette information permet ainsi de juger de la capacité de ces lipoprotéines à être métabolisées. La présente invention se rapporte donc à une méthode d'analyse de la conformation d'un peptide présentant une affinité pour des substances cibles. Cette méthode permet de caractériser la conformation ouverte ou fermée du peptide associé à ces substances cibles par mesure du transfert d'énergie entre des fluorophores présents sur le dit peptide. On entend par fluorophore, une molécule capable d'absorber de l'énergie lumineuse (lumière d'excitation) et de la restituer rapidement sous forme de lumière fluorecente (lumière d'émission). En raison de l'absorption d'une partie de l'énergie par d'autres molécules du milieu (phénomène de quenching), l'énergie de la lumière réémise est plus faible que celle qui a été absorbée, ce qui se traduit par une augmentation de la longueur d'onde. Le déplacement du spectre d'émission vers des longueurs d'ondes plus élevées, décrit par la loi de Stokes, est essentiel pour la séparation et la détection de la lumière de fluorescence. Il existe un grand choix de fluorophores, chacun pouvant être caractérisé par ses spectres d'excitation et d'émission, qui peuvent être greffés directement ou indirectement sur le peptide purifié. Il peut aussi s'agir de résidus d'acide aminé naturellement présents ou introduits dans le peptide et capable de transférer de l'énergie. Ainsi, le peptide comprend au moins un premier fluorophore donneur, qui lorsqu'il est exposé à une lumière d'excitation pourra transférer son énergie à un second fluorophore accepteur qui pourra lui-même ré-émettre à une longueur d'onde plus longue. Ceci a condition que le peptide soit replié de manière compacte de manière à permettre ce transfert d'énergie. L'invention se rapporte plus particulièrement à l'analyse de la conformation d'un peptide comprenant la région de fixation au récepteur des LDL à l'intérieur du domaine Nterminal de l'apolipoprotéine E lorsqu'il est mis en contact avec des lipoprotéines par mesure du transfert d'énergie entre des fluorophores présents sur ledit peptide. De préférence, l'invention se rapporte à l'apolipoprotéine E humaine, mais toute apolipoprotéine E de mammifère est susceptible d'être mise en oeuvre dans l'invention dès lors qu'elle présente les mêmes caractéristiques de structure pour la mesure du transfert d'énergie de l'apolipoprotéine E humaine. La séquence du domaine N-terminal de 22 kDa de l'apolipoprotéine E de l'apolipoprotéine humaine est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le No. SEQ ID NO. 1. L'invention se rapporte donc à un peptide comprenant la séquence comprise entre les résidus 130 à 150 de la séquence SEQ ID NO. 1, qui se situe à l'intérieur du domaine N-terminal de 22 kDa de l'apolipoprotéine E. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à un peptide comprenant ou constitué par la séquence en acides aminés située entre les résidus 1 à 191 de la séquence SEQ ID NO. 1. Le peptide mis en oeuvre dans le cadre de l'invention comprend avantageusement en position 112, l'unique cystéine de l'apolipoprotéine E. Cette cystéine permet de greffer un fluorophore accepteur sur le peptide. A titre d'exemple préféré le fluorophore greffé sur la cystéine en position 112 est le fluorophore AEDANS. Les autresfluorophores du peptide sontavantageusement constitués par les tryptophanes en positions 20,24, 36 et 39. Ainsi, la conformation ouverte ou fermée du peptide est analysée par émission de fluorescence de l'AEDANS (fluorophore accepteur) à 500 nm, en exposant le peptide à une lumière dont la longueur d'onde d'excitation (295 nm) est celle du tryptophane (fluorophore donneur). En effet, si la structure du peptide est repliée, les fluorphores sont distants de moins de 25 angstroem, et l'on peut mesurer un transfert d'énergie du tryptophane vers l'AEDANS. Le domaine amino-terminal de l'apo E3 humaine situé entre les acides aminés aux poistion 1 et 191 (apo E3 (1- 191)) a été crystallisé en 1988 (Aggerbeck L. P. et al., J. Mol. Biol., 1988,202 : 179-181). La structure tri-dimensionnelle de ce fragment d'apo E3 humaine n'a été établie par diffraction des rayons X que 3 années plus-tard par la même équipe (Wilson, C., Science, 1991,252 : 1817-1822). En absence de lipides, le domaine amino-terminal de l'apoE3 adopte une structure de type globulaire de type four helix bundle)) c'est à dire composée de quatre hélices amphipatiques de types alpha qui se regroupent sous la forme d'un faisceau de quatre hélices alpha orientées tête-bêche et qui délimite une zone hydrophobe à l'intérieur des quatre hélices en faisceau. Ces quatre hélices alpha sont relativement plus longues que celles habituellement observées dans les protéines de type globulaire ou membranaire. L'hélice 1 s'étend des résidus 24 à 42, l'hélice 2 s'étend des résidus 54 à 81, l'hélice 3 s'étend des résidus 87 à 122 et l'hélice 4 s'étend des résidus 130 à 164. De plus, une courte hélice allant des résidus 44 à 53 unit l'hélice alpha 1 et l'hélice alpha 2. Les résidus 1 à 22 et 167 à 191 apparaissent comme désordonnés (non-structuré) dans le cristal et il n'a pas été possible pour l'instant de déterminer précisément leur position. Un modèle a été proposé par Raussens et al. (Raussens V. et al., J. Biol. Chem., 1998,273 : 25825-25830) afin de décrire le changement de conformation (l'ouverture des quatre hélices) du domaine amino-terminal de l'apo E3 humaine en présence de lipides. Ce modèle d'ouverture du domaine aminoterminal de l'apo E3 humaine en présence de lipides a été confirmé en 1999 par Ryan et Fischer (Fisher CA., et RO. Ryan, J. Lipid Res., 1999,40 : 93-99). La méthode de l'invention permet d'établir la conformation ouverte ou fermée du peptide au sein des sousclasses de lipoprotéines contenu dans un échantillon : Chylomicron, VLDL, LDL, HDL. L'invention a aussi pour objet une méthode d'analyse de substances cibles comprenant la détermination de la conformation d'un peptide lié aux dites substances cibles par mesure du transfert d'énergie entre des fluorophores présents sur ledit peptide. Cette méthode d'analyse de substances cibles comprend : i) la mise en contact des dites substances cibles avec un peptide comprenant des fluorophores aptes à réaliser un transfert d'énergie, ledit peptide étant capable de se présenter sous une forme ouverte ou une forme repliée selon le type de substances cibles auxquels il est associé, ii) la séparation de chaque type de substances cibles associés au peptide, iii) l'exposition des substances cibles associées au peptide, séparées à l'étape (ii), à une lumière dont la longueur permet le transfert d'énergie entre les fluorophores présents sur ledit peptide, iv) la détection de la fluorescence émise à une autre longueur. A L'étape (iii) de la méthode ci-dessus, on expose les substances cibles à une lumière dont la longueur d'onde excite au moins un fluorophore donneur, de façon à ce que si le peptide présente une conformation repliée un transfert d'énergie ait lieu et entraîne l'émission de fluorescence par au moins un second fluorophore accepteur qui sera détectée à une autre longueur. Selon une forme de réalisation particulière, à l'étape (iii), on expose les substances cibles successivement : - d'une part, à une lumière dont la longueur d'onde excite au moins un fluorophore donneur, de manière à induire un transfert d'énergie si le peptide est replié, - d'autre part, à une lumière dont la longueur d'onde excite au moins un fluororphore accepteur, et dans les deux cas la détection de fluorescence est effectuée par émission de fluorescence du fluorophore accepteur. L'invention se rapporte plus particulièrement à une méthode d'analyse des lipoprotéines d'un échantillon prélevé sur un individu ; avantageusement, il s'agit d'un échantillon de plasma. Tout spécialement, l'invention se rapporte à l'analyse des lipoprotéines de sujets normaux et hyperlipidémiques. En effet, le peptide issu de l'apolipoprotéine E décrit précédemment constitue une sonde conformationnelle, qui lorsqu'elle est incubée avec des sérums de patients normaux ou hyperlipidémiques, peut s'associer aux lipoprotéines. Les mesures de fluorescence après séparation, par exemple par filtration sur gel, des lipoprotéines suivant leur taille, permettent d'identifier et de caractériser à la fois qualitativement et quantitativement les différentes sousclasses de lipoprotéines présentes dans des sérums et d'établir des différences entre sujets normaux et hyperlipidémiques. Ces mesures permettent également d'établir les propriétés physicobiochimiques de certaines de ces sous-classes de lipoprotéines, liées à la conformation du peptide au niveau de leur interface lipidique. La méthode d'étude des lipoprotéines de sujets normaux et hyperlipidémiques selon l'invention repose sur l'affinité sélective du peptide pour les différentes sous classes de lipoprotéines, HDL et VLDL essentiellement. Entre les sujets normaux et hyperlipidémiques, on observe une répartition différente du peptide dans les sous-classes de lipoprotéines. Ainsi, la mise en oeuvre d'un peptide comprenant comme fluorophore accepteur l'AEDANS, permet une détection par émission de fluorescence de l'AEDANS à 500 nm, mais deux longueurs d'onde d'excitation sont avantageusement utilisées alternativement. L'une permet l'excitation directe du fluorophore AEDANS à 360 nm, l'autre permet son excitation par transfert d'énergie de fluorescence des tryptophanes vers l'AEDANS en excitant les résidus trytophanes à 295 nm. En excitant le fluorophore AEDANS directement (vers 360 nm) on observe : - Des différences quantitatives. Des quantités relatives plus importante du peptide sont observées dans les sous-classes lipoprotéiques de grande taille (VLDL) chez les sujets hyperlipémiques comparativement aux sujets normauxlipémiques. La quantité de peptide retrouvée dans les sousclasses de petite taille (HDL) est plus faible chez les sujets hyperlipémiques comparativement aux normaux-lipémiques. - Des différences qualitatives. La présence du peptide dans certaines sous-classes lipoprotéiques de grande taille (chez des sujets hyperlipémiques) est observée alors qu'il est totalement absent dans ces mêmes sous-classes de taille chez les sujets normaux-lipémiques. 1 En excitant les tryptophanes vers 295 nm, on appréhende par la mesure de l'efficacité de transfert d'énergie - Des différences physico-chimiques du peptide qui révèlent son degré d'ouverture au sein de l'interface des différentes sous-classes de lipoprotéines. - Ces différences physico-chimiques sont en relations avec des différences biologiques. En particulier lorsque le peptide est refermé sur lui-même (structure compacte) il n'est pas reconnu par le récepteur LDL (apo B/E). Cette méthode d'identification des lipoprotéines est remarquable en ce qu'elle est entièrement automatisable et permet une diagnostic fin et précis des hyperlipidémies. Elle peut être directement appliquée sur un sérum total sans nécessiter la séparation préalable des lipoprotéines. Elle autorise un dépistage précoce avant l'apparition des signes cliniques d'athérosclérose. De plus, la méthode de l'invention permet un ajustement individualisé des traitements hypolipémiants (Fibrates et Statines (inhibiteur d'HMG-CoA reductase)) qui sont des traitements au long terme pour lesquels en suivant le principe de précaution il vaut mieux utiliser une posologie au niveau minimal efficace pour chaque patient. La méthode de l'invention est aussi utile pour l'étude du métabolisme lipidique chez les animaux destinés à la boucherie, notamment vis-à-vis de la digestibilité de tourteaux de céréales avec ou sans complément lipidique). L'invention a aussi pour objet le peptide 1-191 de l'apo E. Ce peptide qui est reconnu par le LDL récepteur est utile pour vectoriser des substances d'intérêts en diagnostic ou thérapeutique vers les cellules cancéreuses exprimant fortement ce récepteur. L'invention a, bien entendu, aussi pour objet ce peptide sur lequel est greffé l'AEDANS. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : - la figure 1 représente la gel filtration sur une colonne superose 6 d'un plasma normolipemic (cholestérol-LDL 4, 1 mmol/L et triglycerides - la figure 2 représente la gel filtration sur une colonne superose 6 d'un plasma hyperlipemic (cholestérol-LDL > 4,1 mmol/L ou triglycerides > 1,7 mmol/L). I-Production du fragment N-terminal (1-191) de l'apolipoprotéine-E humaine. Le fragment correspondant au domaine N-terminal de l'apolipoprotéine-E humaine est produit chez Escherichia coli. Un insert provenant d'un ADN complémentaire correspondant au fragment de séquence 1 à 191 de l'apolipoprotéine-E humaine mature, qui comporte 299 acides aminés totaux, est utilisé. Ce domaine de l'apolipoprotéine-E humaine (1-191) intègre la partie reconnue par le LDL récepteur et correspond au fragment thrombolytique N-terminal de l'apolipoprotéine-E humaine (Aggerbeck, L. P. et al., J. Biol. Chem., 1988 ; 263 : 6249-6258 ; Wetterau, J. R. et al., J. Biol. Chem., 1988,263 : 6240-6248 ; Fisher CA. et al., Biochem. Cell. Biol. 1997,75 (1) : 45-53). Cet insert est incorporé dans un vecteur d'expression, comme le plasmid pETl1a (Novagen). L'expression est réalisée dans la souche BL21 chez Escherichia coli après induction par l'IPTG suivant un protocole proche de celui décrit par Fischer et al. concernant le fragment 1-183 de l'apo E humaine (Fisher CA. et al., Biochem. Cell. Biol., 1997, 75 (1) : 45-53). II-Purification du peptide. Après extraction du peptide par lyse cellulaire, le peptide est purifié par chromatographie d'affinité sur gel d'héparine (Poros 20 HE, Perseptive). 5 mg de peptide par litre de culture sont obtenus par cette méthode. III-Marquage fluorescent du fragment N-terminal (1-191) de l'apo E-humaine. Le peptide est marqué de façon covalente au niveau de son unique cystéine en position 112 à l'aide d'un fluorophore de type iodacétamide : le N-iodoacetyl-N'- (5-sulfo- 1-naphthyl) ethylenediamine (AEDANS, Molecular Probes). IV-Incubation du peptide fluorescent avec des sérums de sujets normaux et hyperlipidémiques. 100 pl de sérum normal (ou hyperlipémiques) sont incubés avec 10 pg de peptide (contenu dans 5 pl de tampon physiologique) et incubés pendant 12H à 37 C à l'obscurité. V-Séparation des différentes sous-classes de lipoprotéines par gel-filtration. Le mélange sérum plus peptide (105 pl au total) est passé en gel-filtration sur une colonne superose 6 HR 10/30 (Pharmacia-Amersham) à un débit de 0,4 ml/mn afin de séparer les différentes sous-classes de lipoprotéines, une trentaine de fractions (30 ml) sont recueillies. Des fractions de un millilitre sont collectées et analysées par fluorescence. On peut ensisager une analyse continue par fluorescence sur les éluats de colonne. VI-Détection des sous-classes de lipoprotéines contenant le peptide fluorescent. Ce peptide modifié constitue une sonde conformationnelle et fonctionnelle. Incubé avec des sérums de patients normaux ou hyperlipidémiques, il peut s'associer aux lipoprotéines et adopter une conformation étalée ou compacte à l'interface lipidique des différentes sous classes de lipoprotéines. Seule une conformation étendue est reconnue par le récepteur LDL (Fisher CA., et Ryan RO., J. Lipid Res. 1999 Jan, 40 (1) : 93-9 ; Fisher CA, Wang J, Francis GA, Sykes BD, Kay CM, Ryan RO., Biochem. Cell Biol., 1997,75 (1) : 45-53). L'examen des profils d'élution fournit au moins trois types d'informations et permet donc : - De définir un profil de taille des lipoprotéines (présence ou absence de certaines sous-classes). - De définir la répartition relative du peptide dans les différentes sous-classes de lipoprotéines et notamment d'identifier la présence de particules de grande taille et de taille intermédiaire contenant l'apo B et décrite comme athérogène. - D'apprécier la conformation de l'apo E au sein de différentes sous-classes. Cette conformation détermine leur interaction avec les récepteurs responsables de leur épuration plasmatique. VII-Conclusion. La méthodologie mise en oeuvre dans ces exemples comprend trois étapes dont les deux premières sont détaillées ci-dessus en M IV-Incubation du peptide fluorescent avec des sérums de sujets normaux et hyperlipidémiques , et en VSéparation des différentes sous-classes de lipoprotéines par gel-filtration . Enfin une dernière étape de détection des sousclasses de lipoprotéines contenant le peptide fluorescent a lieu dans les fractions par gel filtration. Cette détection se fait par émission de fluorescence de l'AEDANS à 500 nm, mais deux longueurs d'onde d'excitation sont utilisées alternativement. L'une permet l'excitation directe du fluorophore à 360 nm, L'autre permet son excitation par transfert d'énergie de fluorescence des tryptophanes vers l'AEDANS en excitant les résidus trytophanes à 295 nm. La méthode d'étude des lipoprotéines de sujets normaux et hyperlipidémiques selon l'invention repose sur l'affinité sélective de ce peptide pour les différentes sous classes de lipoprotéines (HDL et VLDL essentiellement). Entre les sujets normaux et hyperlipidémiques on observe une répartition différente du peptide dans les sous-classes de lipoprotéines : 1) En excitant le fluorophore directement vers 360 nm (signal B), on observe : - Des différences quantitavives car des quantités relatives plus importantes du peptide sont observées dans les sous-classes lipoprotéiques de grande taille (type VLDL) correspondant aux fractions 7 à 11, chez les sujets hyperlipémiques (Fig. 2) comparativement aux sujets normauxlipémiques (Fig. 1). La quantité de peptide retrouvée dans les sous-classes de petite taille (HDL) correspondant à la fraction 16 est plus faible chez les sujets hyperlipémiques (Fig. 2) comparativement aux normaux-lipémiques (Fig. l). Des différences qualitatives. La présence du peptide dans certaines sous-classes lipoprotéiques de grande taille (fractions 7 à 9) chez des sujets hyperlipémiques (Fig. 2) est observée alors qu'il est totalement absent dans ces mêmes sous-classes de taille chez les sujets normauxlipémiques. 2) En excitant les tryptophanes vers 295 nm (signal A) et en le divisant par le signal B on estime l'efficacité de transfert d'énergie au sein du peptide entre les tryptophanes et l'AEDANS du peptide présent dans les différentes fractions (la multiplication par 4 de ce signal n'a pour seule raison que sa présentation). Dans ces conditions on observe des variations importantes (de 3 à 1) de ce signal (4*signal A/signal B), qui a tendance à diminuer des fractions 19 à 9 chez les sujets normaux-lipémiques (Fig. l), traduisent une ouverture du peptide (une extension) à la surface des lipoprotéines de grande taille (fraction 9) alors qu'il reste compacte dans les fraction de petites tailles (18 et 19). Chez les sujets huperlipidémiques (Fig. 2) ce signal a tendance à maintenir une valeur élevée entre 2 et 3 quelquesoit la fraction considérée, ce qui traduit une structure compacte du peptide. Ces différences physico-chimiques du peptide révèlent son degré d'ouverture au sein de l'interface des différentes sous-classes de lipoprotéines. Ces différences physico-chimiques sont en relations avec des différences biologiques. En particulier lorsque le peptide est refermé sur lui-même (structure compacte) il n'est pas reconnu par le récepteur LDL (apo B/E). REVENDICATION 1) Méthode d'analyse de la conformation d'un peptide présentant une affinité pour des substances cibles, caractérisée en ce que la conformation ouverte ou fermée du peptide associé à ces substances cibles est déterminée par mesure du transfert d'énergie entre des fluorophores présents sur le dit peptide. 2) Méthode d'analyse de la conformation d'un peptide selon la revendication 1, caractérisée en ce que le peptide comprend au moins un premier fluorophore donneur, qui lorsqu'il est exposé à une lumière d'excitation va ré-émettre une lumière d'excitation d'au moins un second fluororphore accepteur, lequel, si le peptide est replié, ré-émet à son tour une fluorescence qui est détectée à une autre longueur d'onde. 3) Méthode d'analyse de la conformation d'un peptide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le peptide comprend la région de fixation au récepteur des LDL du domaine N-terminal de l'apolipoprotéine E. 4) Méthode d'analyse de la conformation d'un peptide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le dit peptide comprend ou est constitué par la séquence en acides aminés située entre les résidus 1 à 191 de la séquence SEQ ID NO. 1. 5) Méthode d'analyse de la conformation d'un peptide selon la revendication 4, caractérisée en ce que le peptide comprend un fluorophore greffé sur la cystéine en position 112. 6) Méthode d'analyse de la conformation d'un peptide selon la revendication 5, caractérisée en ce que le transfert d'énergie est réalisé entre les tryptophanes dudit peptide et l'AEDANS. 7) Méthode d'analyse de la conformation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisée en ce que le peptide présente une conformation ouverte ou fermée lorsqu'il est associé à des lipoprotéines. 8) Méthode d'analyse de substances cibles, caractérisée en ce qu'elle comprend la détermination de la conformation d'un peptide lié aux dites substances cibles par mesure du transfert d'énergie entre des fluorophores présents sur ledit peptide. 9) Méthode d'analyse de substances cibles selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle comprend : i) la mise en contact des dites substances cibles avec un peptide comprenant des fluorophores aptes à réaliser un transfert d'énergie, ledit peptide étant capable de se présenter sous une forme ouverte ou une forme repliée selon le type de substances cibles auxquels il est associé, ii) la séparation de chaque type de substances cibles associés au peptide, iii) l'exposition des substances cibles associées au peptide, séparées à l'étape (ii), à une lumière dont la longueur permet le transfert d'énergie entre les fluorophores présents sur ledit peptide, iv) la détection de la fluorescence émise à une autre longueur d'onde. 10) Méthode d'analyse de substances cibles selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'à l'étape (iii), on expose les substances cibles à une lumière dont la longueur d'onde excite au moins un fluorophore donneur, de façon à ce que si le peptide présente une conformation repliée un transfert d'énergie ait lieu et entraîne l'émission de fluorescence par au moins un second fluorophore accepteur qui sera détectée à une autre longueur d'onde. 11) Méthode d'analyse de substances cibles selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce qu'à l'étape (iii), on expose les substances cibles successivement : - d'une part, à une lumière dont la longueur d'onde excite au moins un fluorophore donneur, de manière à induire un transfert d'énergie si le peptide est replié, - d'autre part, à une lumière dont la longueur d'onde excite au moins un fluorophore accepteur, et en ce que dans les deux cas la détection de fluorescence est effectuée par émission de fluorescence du fluorophore accepteur. 12) Méthode d'analyse selon l'une des revendication 8 à 11, caractérisée en ce que les dites substances cibles sont les lipoprotéines contenues dans un échantillon prélevé sur un individu et en ce que le peptide comprend ou est constitué par la séquence en acides aminés située entre les résidus 1 à 191 de la séquence SEQ ID NO. 1 où est greffé sur la cystéine en position 112 un fluorophore. 13) Méthode d'analyse selon la revendication 12, caractérisée en ce que le transfert d'énergie est réalisé entre les tryptophanes du peptide et l'AEDANS. 14) Méthode d'analyse selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisée en ce que qu'elle comprend la détection par émission de fluorescence de l'AEDANS à 500 nm, aux deux longueurs d'onde d'excitation suivantes utilisées alternativement : - une première longueur l'excitation directe du fluorophore AEDANS autour de 360 nm, - une seconde longueur l'excitation par transfert d'énergie de fluorescence des tryptophanes vers l'AEDANS en excitant les résidus trytophanes à une longueur d'onde supérieur ou égale à 295 nm. 15) Application de la méthode d'analyse selon l'une des revendications 12 à 14 au diagnostic des hyperlipidémies. 16) Un peptide susceptible d'être utilisée dans une méthode selon l'une quelconque des revencication 1 à 15, caractérisé en ce qu'il est constitué par la séquence en acides aminés située entre les résidus 1 à 191 de la séquence SEQ ID NO. 1 où est greffé sur la cystéine en position 112 un fluorophore. 17) Un peptide selon la revendication 16, caractérisé en ce que le fluorophore est l'AEDANS.