Brevet FR2824823A1 — publié le 20021122

B 13687.4 PA 1 2824823 Procédé de préparation d'acides carboxyliques aliphatiques par hydrolyse euzymatique de composés nitriles aliphatiques La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation d'acides carboxyliques aliphatiques par hydrolyse enzymatique de composés nitriles aliphatiques. De nombreux acides carboxyliques aliphatiques ont des applications industrielles, ou sont des précurseurs de composés ayant de telles applications, dans les domaines pharmaceutiques, agrochimiques ou nutritionnels. A titre d'exemple, on peut citer l'acide 2-hydroxy-4-méthylthiobutyrique (hyroxy analogue de la méthionine) largement employé en tant qu'additif alimentaire dans le domaine de l'alimentation animale, notamment l'alimentation des volailles. D'autre part, les monocyanoacides sont des composés particulièrement utilisés dans l'industrie chimique des polymères. La plupart des procédés permettant de synthétiser ces composés sont essentiellement des procédés de synthèse organique faisant intervenir la chimie conventionnelle. En ce qui concerne la synthèse d'acides carboxyliques aliphatiques par hydrolyse des composés nitriles correspondants, on connait des procédés faisant intervenir des catalyseurs organométalliques. À titre d'exemple, nous pouvons notamment citer ceux faisant intervenir des complexes de métaux de transition tels que le palladium (Paraskewas, 1974, Synthesis: 574), le cobalt (Chin et Kim, 1990, Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 29: 523), ou le platine (Bennet et Yoshida, 1973, J. Am. Chem. Soc. 95: 3030) qui ont été employés avec plus ou moins de succès. Néanmoins, l'inconvénient majeur de ces méthodes réside dans l'élaboration complexe et onéreuse du catalyseur organométallique. De plus en plus de procédés de synthèse organique font intervenir la biocatalyse. De nombreuses études ont porté sur les enzymes à pouvoir hydrolytique appelées plus communément les hydrolases (lipases, estérases et acylases), notamment pour leur aptitude à bioconvertir un grand nombre de substrats naturels ou non-naturels dans des conditions opératoires identiques (Zhu et Telford, 1990, Tetrahedron 46: 6587; Santaniello et al. , 1992, Chem. Rev. 92, 1071). Comparativement, un faible nombre d'euzymes catalysant l'hydrolyse (nitrilase) ou l'hydratation (nitrile hydratase) des nitriles en acides carboxyliques ou amides a été identifié. Cependant, de telles enzymes constituent des réactifs importants pouvant étre employés dans des biocatalyseurs destinés à la synthèse d'acides carboxyliques ayant des applications dans les domaines agrochimique, pharmaceutique ou nutritionnel. Un autre avantage des enzymes 2 2824823 nitrilasiques est leur remarquable tolérance vis-à-vis des groupes fonctionnels (de Raadt et al., 1991, Tetrahedron Lett. 32: 341). De plus, les conditions expérimentales et les réactifs généralement employés sont dénués de toxicité et peuvent donc étre engagés dans des schémas de synthèse de composés à visée pharmaceutique ou agrochimique. Il est connu que certaines nitrilases convertissent efficacement différents types de nitriles. En particulier, la nitrilase de la bactérie Alcaligenes faecalis ATCC 8750 est capable de produire de l'acide R-(-)-mandélique à partir de mandélonitrile racémique (Yamamoto et al., 1991, Appl. Environ. Microbiol. 57(10): 3028-3032). De part cette activité, cette enzyme était réputée pour avoir un forte affinité pour les nitriles benzyliques, et donc pour étre une arylacétonitrilase (Yamamoto et al., 1992, J. Ferm. Bioeng. 73: 425). D'autres nitrilases, par exemple la nitrilase de la bactérie Comumonas testosteroni, ont été identifiées pour leur capacité à hydrolyser les nitriles aliphatiques (Levy-Schil et al., 1995, Gene 161(1): 15-20). Par ailleurs, on connait de la demande de brevet WO 98/18941 l'utilisation de la nitrilase d'Alcaligenes faecalis ATCC 8750 pour la conversion par hydrolyse enzymatique du 2-hydroxy 4-méthylthio butyronitrile en acide 2-hydroxy 4-méthylthio butyrique et/ou son sel d'ammonium. La nitrilase de la bactérie Alcaligenes faecalis ATCC 8750 est donc particulièrement efficace, mais aucun procédé connu n'a jusqu'alors permis de généraliser son utilisation industrielle à un grand nombre de nitriles. Toutefois, de nombreux autres acides carboxyliques aliphatiques ont des applications industrielles, et aucun procédé de synthèse de ces autres composés par biocatalyse n'a été développé. La présente invention a pour but de pallier cet inconvénient en proposant un système efficace de synthèse enzymatique d'acides carboxyliques aliphatiques variés à partir de leurs nitriles correspondants, mettant en _uvre la nitrilase d'Alcaligenes faecalis ATCC 8750. 3 2824823 Description La présente invention concerne un pro cédé de préparati on d'acides carboxyliques aliphatiques, à l'exception de l'hydroxyanalogue de la méthionine, par hydrolyse enzymatique de composés nitriles aliphatiques, à l'exception du 2-hydroxy 4-méthylthio butyronitrile, caractérisé en ce que: (a) on prépare un matériel biologique ayant une activité nitrilase, (b) on immobilise ledit matériel biologique (c) on met en présence un composé nitrile avec le matériel biologique ainsi immobilisé, pour obtenir le sel d' ammonium de l'acide carboxylique aliphatique formé (d) éventuellement, on purifie l'acide formé Selon l'invention, on entend par acide carboxylique aliphatique tous les acides carboxyliques aliphatiques à l'exception de l'hydroxyanalogue de la méthionine. De méme, on entend par composés nitriles aliphatiques tous les nitriles aliphatiques à l'exception du 2 hydroxy 4-méthylthio butyronitrile. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les composés nitriles aliphatiques hydrolysés par le procédé selon l'invention sont des dérivés O-substitués du 2-hydroxy 4- méthylthio butyronitrile, et les acides formés sont des dérivés Osubstitués de l'hydroxyanalogue de la méthionine. De prétérence, les dérivés O-substitués du 2-hydroxy 4-méthylthio butyronitrile sont des dérivés O-acétylés ou O-hydroxyalkylés. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les composés nitriles aliphatiques hydrolysés par le procédé selon l'invention sont des nitriles multi-fonctionnels sélectionnés parmi les nitriles aliphatiques, les nitriles vinyliques, les nitrile-esters, les nitrile-ester allyliques, et les nitrile-éther. Par nitriles multi-fonctionnels, on entend les nitrile possédant une fonction nitrile et au moins une fonction supplémentaire autre que nitrile. S elon un autre mode de réal i sation de l' invention, les composés nitriles aliphati ques hydrolysés par le procédé selon l'invention sont des dinitriles aliphatiques symétriques ou dissymétriques et les acides formés sont des cyanoacides. A titre d'exemple, les dinitriles aliphatiques symétriques peuvent être le malononitrile, l'adiponitrile, le fumaronitrile, ou le 1,4- dicyanobut-2-ène. A titre de dinitriles aliphatiques dissymétriques, on peut citer les 2-alkyl et les 2-aryl dinitriles aliphatiques de structure générale: 4 2824823 NC CH (CH2)n CN R dans laquelle: n est un nombre entier quelconque, et R est un groupe alkyl, un groupe aryl ou une châîne multifonctionnelle. S elon un mode particul ier de réalisation de l' invention, les dinitriles aliphatiques dissymétriques sont le 2-méthylglutaronitrile, le 2-méthylsuccinonitrile, ou le 2 méthyladiponitrile. D'une manière générale, l'homme du métier saura adapter le procédé selon l'invention à tout type de dinitrile, en particulier à tout dinitrile dissymétrique. Lorsque le procédé selon l'invention s'applique aux dinitriles dissymétriques tels que décrits ci-dessus, l'hydrolyse du dinitrile en cyanoacide s'effectue sur de la fonction nitrile la moins encombrée stériquement. L'étape (a) du procédé selon l'invention consiste à préparer un matériel biologique ayant une activité nitrilase. Le matériel biologique peut consister en des cellules entières, vivantes ou mortes, ou des cellules brisces ayant une activité nitrilase. Elle peut aussi consister en une solution enzymatique comprenant une enzyme à activité nitrilase purifiée ou non. Avantageusement, on utilise un microorganisme exprimant une nitrilase. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on utilise un microorganisme transformé exprimant une nitrilase recombinante. De manière préférentielle, l'activité nitrilase provient d'une bactérie du genre Alcaligenes, de préférence de la bactérie Alcaligenes faecalis ATCC 8750. S elon un mo de préféré de réalisation de l' invention, le microorganisme transformé utili sé est une bactérie Escherichia coli exprimant le gène nitB d'Alcaligenes faecalis ATCC 8750, telle que décrite dans la demande de brevet WO 98/18941. L'étape (b) du procédé consiste à immobiliser le matériel biologique. Cette immobilisation se fait avantageusement en présence d'un support solide et permet d'obtenir des particules solides dont la taille, la forme et la résistance mécanique peuvent être contrôlées. Elle offre également la possibilité d'employer simultanément un polymère de polyazétidine ou d'autres agents réticulants. 2824823 Ce procédé d'immobilisation peut faire intervenir des cellules entières ou perméabilisces, en particulier des cellules d'E. coli selon l'invention. Il peut aussi s'appliquer à une solution enzymatique de nitrilases selon l' invention exempte de cellules. Le procédé d'immobilisation consiste à immobiliser le matériel blologique actif sur un support solide, de granulométrie notamment comprise entre 1 m et 500 1lm, de prétérence 1lm et 200 m, grâce à des agents chimiques réagissant avec les fonctions amine (NH2, NH), carboxyle (COOH), hydroxy (OH), thiol (SH) ou amide (CONH2) de l'agent biologique et du support. Ces agents chimiques permettent aussi d' insolubiliser dans l' eau le matériel blologique et le support. La masse obtenue est très malléable et peut être mise en forme afin d'obtenir des particules de forme et de taille souhaitées. La cohésion et la dureté de ces particules sont ensuite obtenues par séchage. Le matériel biologique à immobiliser peut éventuellement contenir également un matériel biologique inactif présent à raison de 0 à 200 % en poids. Ce matériel inactif biologique peut être des protéines (albumine, gélatine) ou des polysaccharides (Chitosan, kcarraghénane, alginate). Le support solide, sur lequel sont déposés le matériel biologique, et éventuellement le polymère, peut se composer de particules organiques ou inorganiques, poreuses ou non poreuses, hydrophiles ou hydrophobes. Parmi ces particules on peut signaler, sans que cela ne soit limitatif: - les résines échangeuses d'ions, - l'alumine, - les silices de synthèse ou diatomées et les gels de silice, - les zéolites, - les charbons, - les protéines partiellement solubles ou insolubles dans l'eau, comme le gluten, - les polysaccharides, comme l'amidon. Le support solide peut constituer de 0,01 à 200 % en poids du matériel biologique et de prélérence de 10 à 100 %. Les agents chimiques utilisés pour insolubiliser le matériel biologique peuvent être des polymères ou des molécules bi-fonctionnalisées qui réagissent avec les fonctions amine (NH2, NH), carboxy lique (C O OH), hydroxy (OH), thiol ( SH), amide (CONH2). A titre d' exemple, on peut citer: - les polymères de polyazétidine, 6 2824823 - les polymères de polyéthylènimine, - les polymères de polyamide, - les polymères d'isocyanates, - les gels d'alginate, - les gels de kcarraghénane, - les amines comme l'hexaméthylène diamine, - les aldéhydes comme le glutaraldéhyde, - les acides carboxyliques comme l'acide adipique, et - les isocyanates. Le procédé d'immobilisation peut faire intervenir un ou plusieurs de ces agents chimiques. L'agent chimique est ajouté selon une concentration comprise entre 1 et 50 % en poids par rapport au matériel biologique et au support. On préférera une quantité comprise entre et 30 % afin d'obtenir des particules suffisamment solides et qui conservent une activité importante et qui ne présentent pas trop de problèmes de diffusion interne. La durée du traitement de réticulation est comprise entre 0,5 et 24 heures. La température du procédé est généralement comprise entre 4 et 65 C. On préférera une température comprise entre 20 et 40 C. La température employée lors du procédé d'immobilisation peut étre aussi très dépendante de la stabilité du matériel biologique employé. Le pH durant la phase d'immobilisation est maintenu entre 5 et 11. On prétérera un pH compris entre 6 et 10 avec une prétérence vers les pH alcalins. Le pH est aussi choisi en fonction de la résistance du matériel biologique et sera aisément déterminé par l'homme du métier. De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le rapport entre la masse de matériel biologique immobilisé et la masse de substrat est compris entre 0,1 et 10. La mise en forme du matériel biologique immobilisé doit permettre son emploi dans un système quelconque, notamment dans un lit fixe. Une méthode de formulation peut étre l' extrusion. Pour ce faire, le matériel biologique et le support sont réticulés par ajout d'un ou plusieurs agents chimiques. Après traitement, la masse insoluble est récupérée par centrifugation ou après floculation et filtration. Un taux de matière sèche d'au moins 10% est prétéré. La masse est ensuite extrudée. Par cette méthode, on obtient de prétérence des vermicelles de diamètre compris entre 0,3 et 0,5 mm et d'une longueur comprise entre 1 et 10 mm. Ces vermicelles peuvent étre sphéronisés. Les particules obtenues sont ensuite séchées. 7 2824823 Une autre méthode de formulation peut être le pelliculage ("spray coating"). Pour ce faire, le matériel biologique est mélangé avec un ou plusieurs agents chimiques. Après réaction, le mélange est pulvérisé sur le support sous forme d'une couche mince. Par cette méthode, on obtient des granulés de diamètre moyen compris entre 0,1 et 2 mm. Les particules obtenues peuvent éventuellement être ensuite plongées dans une solution d'un agent réducteur comme le borohydrure de sodium afin de réduire les fonctions imines formées lors de la réticulation. Les particules obtenues sont suffisamment solides et résistantes à l'attrition pour être employées dans un lit-fixe, un lit fluidisé ou un réacteur agité. L'étape (c) du procédé selon l'invention consiste à mettre en _uvre le matériel biologique immobilisé dans une ou plusieurs colonnes ou réacteurs. Le but de cette étape est de pouvoir produire en continu les acides carboxyliques aliphatiques à partir des composés nitriles aliphatiques. La ou les colonnes ou réacteurs sont alimentés par une solution pure ou diluée d'un composé nitrile aliphatique. La ou les colonnes ou réacteurs sont mises en _uvre de prétérence à une température comprise entre 10 et 60 C et à un pH compris entre 5 et 9. Le système mis en _uvre peut être constitué de deux ou plusieurs colonnes connectées l'une à l'autre en série. Selon une première manière de mettre en _uvre l'invention, l'alimentation de la solution aqueuse du composé nitrile aliphatique est réalisée en tête de la première colonne avec une alimentation simultanée d'autres colonnes avec la solution du composé nitrile aliphatique en une quantité limitée à la solubilité de ce composé dans le mélange réactionnel; ce système est intitulé système étagé. Selon une deuxième manière de mettre en _uvre l'invention, on utilise une ou plusieurs colonnes connectées l'une à l'autre en parallèle dans une boucle de circulation. Selon cette installation, le composé nitrile aliphatique en solution aqueuse alimente la boucle en continu, et le milieu de réaction est pompé en continu de façon à conserver un volume constant dans ladite boucle; ce système est intitulé système boucle. Le type de réacteur utilisé dans cette invention peut être du type lit fixe, lit fluide, ou du type agité en continu. On prétère utiliser les réacteurs du type lit fixe parce qu'ils réduisent les problèmes d'attrition qui peuvent être rencontrés avec les particules de cellules immobilisées. Lorsque le matériel biologique consiste en un microorganisme entier, on prétérera utiliser un 8 2824823 réacteur agité couplé à un module d'ultrafiltration pour séparer de façon continue le microorganisme du produit d'intérêt. L'étape (d), facultative, consiste à purifier l'acide formé. A titre d'exemple, une méthode de purification de l'acide formé est donnée. L'homme du métier saura identifier ou adapter d' autres méthodes de purification au procédé selon l' invention. Dans un premier temps, le matériel biologique immobilisé peut être récupéré par simple filtration. La phase aqueuse peut ensuite être concentrée à l'aide d'un évaporateur, puis extraite à l'aide d'un solvant organique. La phase organique est alors séchée puis évaporée. La phase aqueuse restante est ensuite concentrée au maximum, et le résidu obtenu est mis en suspension dans un solvant polaire. Les sels insolubles de l'acide formé sont filtrés puis la solution est séchée, filtrée et évaporée. L'ensemble de ces opérations permet d'extraire l'acide, éventuellement l'amide formée et le nitrile non converti. D'autres méthodes de purification de sont par exemple décrites dans la demande de brevet WO 98/18941. 9 2824823 Les exemples ci-après permettent d'illustrer la présente invention, sans toutefois en limiter la portée. Exemples Exemple 1: Protocole général de l'hydrolyse enzymatique des nitriles Le substrat est mis en suspension dans 750 mL d'eau millipore thermostatée à 30 C et tamponnée par KH2PO4 et K2HPO4 à pH = 7,3. L'agitation est maintenue constante à 250 rpm pendant toute la durce de l'essai. La quantité du matériel biologique immobilisé est ensuite additionnée de façon que MCaayseur / Msubsra= 0,55. Le degré d'avancement de la réaction est déterminé par chromatographie HPLC ou CPG. La réaction termince, le matériel biologique immobilisé est récupéré par simple filbation. La phase aqueuse est ensuite concentrce à l'évaporateur rotatifjusqu'à 200 mL environ puis acidifiée par de l'HC1 36% jusqu'à pH = 1,5. La phase aqueuse est extraite à l'acétate d'éthyle ou à l'éther. La phase organique est séchée sur Na2SO4 puis évaporée. La phase aqueuse est concentrée au maximum. Le résidu obtenu est mis en suspension dans du méthanol. Les sels insolubles sont filtrés puis la solution méthanolique est séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée. L'ensemble des opérations permet d'extraire l'acide, éventuellement l'amide formée et le nitrile non converti. Exemple 2: Hydrolyse euzymatique des précurseurs de dérivés O-substitués de l'hydroxyanalogue de la méthionine Exemple 2.1: Sythèse de l'acide ()2-acétoxy-4-méthylthiabutanoique (Composé 1) Dans un réacteur parfaitement agité à 250 rpm, thermostaté à 30 C, 13,0 g (0,075 mole) du (+)-2-acétoxy-4-méthylthiobutyronitrile sont introduits dans 750 mL d'eau millipore tamponnée à pH = 7,3. 7,15 g de matériel biologique immobilisé sont ensuite additionnés. Le suivi cinétique est réalisé par HPLC (éluant: eau / acétonitrile 80/20 (vlv) / 0,05% (v/v) d'acide trifluoroacétique (TFA); = 210 nm; Débit = 1 mL/min; colonne: Nucléosil RP C18 (5 1lm, 100 ). Le mélange est laissé sous agitation à 30 C pendant 48 heures. Le rendement obtenu, après 48 heures, est de 89% en acide (+)-2-acétoxy-4-méthylthiobutanoïque (Composé la). L'analyse RMN 'H révèle la présence de 6% molaire d'acide (+)-2-hydroxy-4- méthylthiobutanoique (Composé lb). H RMN (DMSO d6) H ppm: 1,75 (m, 2H, S- CH2-CH2-), 1,79 (s, 3H, CH3CO2-), 1,84 (s, 3H, CH3-S-), 2,28 (t, 2H, CH3- S-C_2-), 4,69 (td, 1H, -C_(OAc)CN), 11,9 (s, 1H, CO2H). i3C RMN (DMSO d6) éc ppm: 15,24 (CH3-S), 21,17 (_H3-CO), 29,73 (CH3-S-CH2), 2824823 ,96 (S-CH2-CH2-), 71,35 (-_H(OAc)CN), 170,77 (CH3-COO), 171,86 (CO2H). IR (CHCl3) cm':2500-3500, 1745, 1720. Masse FAB- (NBA): m/e (intensité relative) 191 (100), 149 (70), 59 (25). Exemple 2.2: Synthèse de l'acide (f)-2-(1-éthexyéthoxy)-4méthylthiabutanoque (Composé 2) Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 3,0 g (0,022 mole) du (+)-2-(l-éthoxyéthoxy)-4 méthylthiobutyronitrile et 3,0 g de matériel biologique immobilisé dans 220 mL d'eau millipore. Le suivi cinétique est réalisé par HPLC (éluant: eau / acétonitrile 95/5 (vlv) / 0,05% (v/v) de TFA). Le rendement obtenu, après 25 heures, est de 93% en acide (+)-2-(1-éthoxyéthoxy)-4 méthylthiobutanoïque (Composé 2a). H RMN (DMSO d6) H ppm: 1,09 (td, 3H, C_3-CH2-O), 1,18 (dd, 3H, CH3-CH), 1, 72-1,84 (m, 2H, -S-CH2-C_2-), 2,10 (s, 3H, C_3-S), 2,52 (t, 2H, S C_2-CH2) , 3,51 (m, 2H, O-CH2-CH3), 3,84 (m, 1H, O-C_-CO2H), 4,72 (qd, 1H, -OC_(CH3) O). '3C RMN (DMSO d6) c ppm: 15,42 (CH3-S), 16,1 (CH3-CH2-O), 21, 32 (CH3-CH-), 30,07 (S-CH2-CH2-CH), 33,89 (S-CH2-CH2-CH), 62,00 (CH3-CH2-O), 77,06 (CH(CO2H)O), 99,49 ( O-CH(CH3)-O), 176,42 (CO2H). IR (CHCl3) cml: 2500-3500, 1725. Masse FAB(NBA): m/e (intensité relative) 221 (100), 152 (40), 122 (30), 46 (65). Exemple 2.3: Synthèse de l'acide (f)-2-méthoxyméthoxy-4méthylthiabutanoque (Composé 3) Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 3,80 g (0,022 mole) du (+)-2-méthoxyméthoxy-4 méthylthiobutyronitrile et 2,10 g de matériel biologique immobilisé dans 220 mL d'eau millipore. Le suivi cinétique est réalisé selon les mêmes conditions d'élution que celui décrit à l'exemple 2.1. Le rendement obtenu, après 120 heures, est de 70% en acide (+)-2-méthoxyméthoxy-4 méthylthiobutanoque (Composé 3a). H RMN (DMSO d6) OH ppm: 1,96 (m, 2H, S-CH2-CH2 CH), 2,05 (s, 3H, C 3-SCH2), 2,59 (t, 2H, -S-C_2-CH2), 3,31 (s, 3H, C_3-O), 3,91 (m, 1H, O C_CO2H), 4,60-4,72 (dd, 2H, O-C_2-O), 11,32 (CO2H). '3C RMN (DMSO d6) oc ppm: 15,37 (CH3-S), 30,80 (CH3-S-CH2-), 33,60 (S-CH2-_H2-CH) 55,74 (CH3-O), 76,55 (O_H-CO2H), ,44 (O-CH2-O), 176,13 (CO2H). IR (CHC13) cm: 1720. Masse FAB- (NBA): m/e (intensité relative) 193 (70), 149 (55), 115 (20), 46 (100). Les résultats des exemples 2.1 à 2.3 sont compilés dans le Tableau 1 cidessous. 1 1 2824823 Tableau 1: Hydrolyse encymatique des précurseurs de dérivés O-substitués de l'hydroxyanalogue de la méthionine Substrat Conditionsé Produit formé Rendement (%)b 1 0,55 (33) la (lb) 82 (6) 2 0,55 (115) 2a 93 3 0,55 (120) 2a 70 a Equivalents de matériel biologique immobilisé /substrat (w/w); temps de réaction (h) b Rendement en acide obtenu après extraction puis purification Exemple 3: Hydrolyse euzymatique de composés nitriles bi-fonctionnels Exemple 3.1: Hydrolyse euaymatique de l'isoutyroritrile (Composé 4) Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes 5,21 g (0,075 mole) d'isobutyronitrile commercial et 2,86 g de matériel biologique immobilisé sont ensuite additionnés. Le rendement obtenu, après 58 heures, est de 71% en acide isobutyrique. 'H RMN (DMSO d6) H ppm: 1,05 (d, 6H, (C_3)2-CH), 2,40 (h, 1H, (CH3)2-C_), 11,74 (s, 1H, CO2_).}3C RMN (DMSO d6) éc ppm: 19,61 ((CH3)2-CH), 33,90 (CH3)2-CH), 178,7 (s, 1H, CO2H). IR (CHCl3) cml: 2500-3500, 1715. Masse FAB- (GT): mle (intensité relative) 87 (100), 79 (20). Exemple 3.2: Hydrolyse euzymatique de l'acrylonitrile fComposé 5) Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 4,0 g (0,075 mole) d'acrylonitrile commercial et 2,30 g de matériel biologique immobilisé. Le rendement obtenu, après 9 heures, est de 93% en acide acrylique. L'analyse RMN révèle la présence de 0,8% molaire d'acrylamide. 'H RMN (DMSO d6) H ppm: ,90-6,13 (m, 2H, CH2=CH), 6,32 (dd, 1H, CH2=C_), 12,43 (s, 1H, CO2_). i3C RMN (DMSO d6) âC ppm: 130,7 (CH2=CH), 131,45 (_H2=CH), 171,16 (_O2H). IR (CHC13) cm: 2500-3500, 1695. Masse FAB- (GT): m/e (intensité relative) 71 (70), 53 (20). Exemple 3.3: Hydrolyse ezymatique du ()-2-acétexy-3-butènenitrile (Composé 6) Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 9,40 g (0, 075 mole) du (+)-2-acétoxy-3-butènenitrile commercial et 5,20 g de matériel biologique immobilisé sont ensuite additionnés. Le rendement obtenu, après 12 2324823 27 heures, est de 92% en acide (+)-2-acétoxybut-3-ènoique. L'analyse RMN révèle la présence de 6% molaire de l'acide (+)-2-hydroxy-but-3-ènoique. H RMN (DMSO d6) H ppm: 2,01 (s, 3H, CH3-CO2), 4,87-5,25 (m, 3H, C_2=CH-C_), 5,93-6,01 (m, 1H, CH2=CH-CH), 12, 33 (CO2H). 13C RMN (DMSO d6) c ppm: 21,77 (CH3-CO2), 76,69 (CH2=CH-CH), 115,12 (_H2=CH), 135,59 (CH2=_H), 171,24 (CH3-CO2), 176,86 (_O2H). IR (CHCl3) cm: 2500-3500, 1740, 1715. Masse FAB- (GT): m/e (intensité relative) 143 (100), 59 (30). Exemple 3.4: Hylrolyse euzymatique du (+)-2-(1-éthexyéthoxy)-but-3ènenitrile (Composé 7) Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 7,8 g (0,05 mole) du (+)-2-(1-éthoxyéthoxy)-but-3-ènenitrile et 4,5 g de matériel biologique immobilisé dans 500 mL d'eau millipore. Le rendement obtenu, après 26 heures, est de 86% en acide (+)-2-(1-éthoxyéthoxy)-but-3ènoique. H RMN (DMSO d6) H ppm: 1,06 (t, 3H, C_3-CH2-O), 1,19 (d, 3H, C_3CH), 3,40-3,55 (m, 2H, CH3-C_2-O-), 4,32 (m, 1H, CH2=CH-CH), 4,75-4,66 (qd, 1H, O-C_-O), 4,95-5,2 (m, 2H, C_2=CH-), 5,78-5,91 (m, 1H, CH2=CH), 12,32 (s, 1H, CO2H). 3C RMN (DMSO d6) c ppm: 15,94 et 16,06 (CH3-CH2-O ), 20,75 et 21,15 (CH3-CH), 60,24 et 61,10 (CH3-_H2-O-), 78,61 et 78,92 (CH2=CH-CH), 98,31 et 98,87 (O-CH-O), 113,86 et 115,0 (_H2=CH-), 138,25 et 138,56 (CH2=CH), 174,56 (CO2H). IR (CHCl3) cm: 2500-3500, 1725. Masse FAB- (GT): m/e (intensité relative) 173 (100), 43 (35). Exemple 3.5: Hydrolyse euzymatique du (f)-2méthexyméthoxy-but-3-ènenitrile (Composé 8) Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 3,81 g (0,030 mole) du (+)-2-méthoxyméthoxy-but-3ènenitrile et 4,5 g de matériel biologique immobilisé dans 300 mL d'eau millipore. Le rendement obtenu, après 47 heures, est de 80% en acide (+)2-méthoxyméthoxy-but-3-ènoïque. 'H RMN (DMSO d6) H ppm: 3,30-3,95 (m, 3H, C_3-O-), 4,37 (m, 1H, CH2=CH-C_), 4,62-4,71 (dd, O-C_2-O), ,07-5,23 (m, 2H, CH'=CH-), 5,91-5,98 (m, 1H, CH2=C_), 11,47 (s, 1H, CO2_). 3C RMN (DMSO d6) c ppm: 55,58 (CH3-O-), 78,87 (CH2=CH-CH), 94,62 (O-CH2-O), 114, 38 (CH2=CH-), 138,11 (CH2=CH), 173,67 (s, 1H, CO2H). IR (CHCl3) cml: 25003500, 1725. Masse FAB- (GT): m/e (intensité relative) 193 (100) Exemple 3.6: Hydrolyse euzymatique du 2-cyaneacétate d 'éthyle (Composé 9) Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 8,50 g (0,075 mole) du 2- cyanoacétate d'éthyle et 4,7 g de matériel 13 2824823 biologique immobilisé sont ensuite additionnés. Le rendement obtenu, après 7 heures, est de 94% en acide 2-carbétoxyacétique. H RMN (DMSO d6) H ppm: 1,19 (t, 3H, C_3-CH2-O), 3,33 (s, 2H, HO2C-C_2-CO2Et), 4,12 (q, 3H, CH3-C_2-O), 10,71 (s, 1H, CO2_). 3C RMN (DMSO d6) c ppm: 14,66 (_H3-CH2O-), 42,34 (HO2C-CH2-CO2Et), 64,47 (CH3-CH2-O), 167,7 (-CO2 CH2-CH3), 168, 9 (_O2H). IR (CHCl3) cm: 2500-3500, 1745, 1725. Masse FAB- (GT): m/e (intensité relative) 131 (65), 104 (40), 87 (100), 41 (25). Les résultats des exemples 3.1 à 3.6 sont compilés dans le Tableau 2 cidessous. Tableau 2: Hydrolyse encymatique de composés nitriles bi-fonctionnels Substrat Temps de réaction (h) Rendement (%)a - 4 58 71 9 93 6 27 92 7 25 86 8 47 80 9 7 94 a Rendement en acide extrait après bioconversion totale du nitrile (excepté pour le nitrile 4) Exemple 4: Hydrolyses euzymatiques de dinitriles Exemple 4,1: Hydrolyse encymatique du malononitrile (Composé 10) Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 5,0 g (0,075 mole) de malononitrile commercial et 2,75 g de matériel biologique immobilisé. Le rendement obtenu, après 51 heures, est de 87% en acide 2 cyanoacétique (Composé 10a). H RMN (DMSO d6) OH ppm: 3,57 (s, 2H, -C_2-), 11,57 (s, 1H, CO2_). 3C RMN (DMSO d6) c ppm: 25,46 (CH2-CN), 115,4 (CN), 165,6 (CO2H). IR (CHCl3) cm': 2500-3500, 2240, 1725. Masse FAB- (GT): m/e (intensité relative) 84 (100), 46 (60). Exemple 4.2: Hydrolyse encymatique de l 'adiponitrile (Composé 11) Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 8,02 g (0,075 mole) d'adiponitrile commercial et 4,50 g de matériel biologique immobilisé. Le rendement obtenu, après 53 heures, est de 90% en acide 5 cyanopentanoque. H RMN (DMSO d6) H ppm: 1,60 (m, 2H, HO2C-CH2-C_2-), 1,62 (m, 2H, 14 2324823 NC-CH2-C_2-), 2,23 (t, 2H, -C_2-CO2H), 2,51 (t, 2H, -C_2-CN), 12,41 (s, 1H, CO2H). 3C RMN (DMSO d6) c ppm: 16,92 (NC-_H2-CH2), 24,92 (NC-CH2-CH2), 25,31 (CH2-CH2 CO2H), 34,95 (CH2-CO2H), 121,38 (CN), 176,41 (s, 1H, CO2H) . IR (CHCl3) cm: 2500-3500, 2245, 1730. Masse FAB- (GT): m/e (intensité relative) 126 (100). s Exemple 4.3: Hydrolyse euaymatique du fumaronitrile (Composé 12) Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 5,90 g (0,075 mole) de fumaronitrile commercial et 3,25 g de matériel biologique immobilisé. Le rendement obtenu, après 25 heures, est de 72% en acide 3 cyanoacrylique et de 28% en 3-cyanoacrylamide. Acide 3-cyanoucrylique H RMN (DMSO d6) H ppm: 5,84 (d, 1H, HO2C-CH=C_-CN), 6,54 (d, 1H, HO2C-CH=CH CN), 13,10 (s, 1H, CO2_).3C RMN (DMSO d6) c ppm: 115,03 (HO2C-CH=CH-CN), 119,09 (CN), 153,22 (HO2C-CH=CH-CN), 167,13 (CO2H). IR (CHC13) cml: 2500-3500, 2225, 1695. Masse FAB- (GT): m/e (intensité relative) 96 (100), 52 (10). 3-cyanoacrylamide lH RMN (DMSO d6) H ppm: 6,56 (d, 1H, H2NOC-CH=C_-CN), 7, 04 (d, 1H, H2NOC-C_=CH CN), 7,72-7,99 (d, 2H, CON_2). '3C RMN (DMSO d6) c ppm: 109,54 (H2NOC-CH=CH-CN), 117,95 (CN), 144,95 (H2NOC-CH=CH-CN), 164, 01 (CONH2). IR (CHC13) cm: 3100-3500, 2235, 1695. Masse FAB- (GT): m/e (intensité relative) 95 (10). Exemple 4.4: Hydrolyse ezymatique du 1,4-dicyanabut-2-ène (Composé 13) Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 5,30 g (0,05 mole) de 1,4dicyanobut-2-ène commercial et 3,0 g de matériel biologique immobilisé dans 500 mL d'eau millipore. Le rendement obtenu, après 25 heures, est de 82% en acide 5-cyanopent-3-ènoque.'H RMN (DMSO d6) H ppm: 3,04 (dd, 2H, HO2C-C_2), 3,31 (dd, 2H, C_2-CN), 5,51 (td, 1H, NC-CH2-CH=), 5,82 (td, 1H, H2OC-CH2 C_=), 10,51 (s, 1H, CO2_). 3C RMN (DMSO d6) âc ppm: 20,34 (CH2CN), 38,14 (H2OC CH2), 119,44 (CN), 122,21 (NC-CH2-CH=), 128,75 (H2OC-CH2-CH=), 173,44 (CO2H). IR (CHCl3) cm: 2500-3500, 2255, 1725. Masse FAB- (GT): m/e (intensité relative) 124 (100), 80 (25), 46 (30). 2824823 Exemple 4.5: Hydrolyse erzymatique du 2-méthylglutaronitrile (Composé 14) Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 8,27 g (0,075 mole) de 2méthylglutaronitrile commercial et 4,56 g de matériel biologique immobilisé. Le rendement obtenu, après 96 heures, est de 91% en acide 4 cyanopentanoique. H RMN (DMSO d6) âH ppm: 1,23 (d, 3H, CH3-CH), 1,79 (td, 2H, NC CH(CH3)-C_2-), 2,35 (td, 2H, -C_2-CO2H), 2,84 (m, 2H, -C_-CN), 10, 89 (s, 1H, CO2_). 13C RMN (DMSO d6) éc ppm: 18,08 (_H3-CH), 24,94 (NC-_H-) , 29,33 (CH2-CH2-CO2H), 31,89 (CH2-CO2H), 123,78 (CN), 174,25 (s, 1H, CO2H). IR (CHCl3) cml: 2500-3500, 2240, 1735. Masse FAB- (GT): m/e (intensité relative) 126 (100), 54 (5). Les résultats des exemples 4.1 à 4.5 sont compilés dans le Tableau 3 cidessous. Tableau 3: Hydrolyse erzymatique de composés dirifriles Substrat Temps de réaction (h) Conversion (%) a Rendement (o/O) b 51 89 87 11 53 91 90 12 25 100 72 13 25 98 82 14 96 92 91 a /0 conversion du dinitrile b Rendement en monoacide obtenu après puriiication 16 2824823 Revendications 1- Procédé de préparation d'acides carboxyliques aliphatiques, à l'exception de l'hydroxyanalogue de la méthionine, par hydrolyse enzymatique de composés nitriles aliphatiques, à l'exception du 2-hydroxy 4-méthylthio butyronitrile, caractérisé en ce que: (a) on prépare un matériel biologique ayant une activité nitrilase, (b) on immobilise ledit matériel biologique (c) on met en présence un composé nitrile avec le matériel biologique ainsi immobilisé, pour obtenir le sel d'ammonium de l'acide carboxylique aliphatique formé (d) éventuellement, on purife l'acide formé 2- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les composés nitriles aliphatiques sont des dérivés O-substitués du 2hydroxy 4-méthylthio butyronitrile et que les acides formés sont des dérivés O-substitués de l'hydroxyanalogue de la méthionine 3- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les dérivés O-substitués du 2 hydroxy 4-méthylthio butyronitrile sont des dérivés O-acétylés ou Ohydroxyalkylés 4- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les composés nitriles aliphatiques sont des nitriles multi-fonctionnels sélectionnés parmi les nitriles aliphatiques, les nitriles vinyliques, les nitrile-esters, les nitrile-ester allyliques, et les nitrile-éther Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les composés nitriles aliphatiques sont des dinitriles aliphatiques symétriques ou dissymétriques et que les acides formés sont des cyanoacides 6- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les dinitriles aliphatiques symétriques sont sélectionnés parmi le malononitrile, l'adiponitrile, le fumaronitrile, ou le 1,4 dicyanobut-2-ène 7- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les dinitriles aliphatiques disymétriques sont des 2-alkyl ou des 2-aryl dinitriles aliphatiques de structure générale: 17 2824823 NC CH (CH2)n CN R dans laquelle: n est un nombre entier quelconque, et R est un groupe alkyl, un groupe aryl ou une châîne multifonctionnelle s 8Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les dinitriles aliphatiques dissymétriques sont le 2-méthylglutaronitrile, le 2-méthylsuccinonitrile, ou le 2- méthyladiponitrile 9- Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'activité nitrilase est obtenue à partir d'une nitrilase d'une bactérie du genre Alcaligenes Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'activité nitrilase est obtenue à partir de la nitrilase de la bactérie Alcaligenes faecalis ATCC8750 11 - Procédé selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que le matériel biologique consiste en un microorganisme hôte transformé exprimant une activité nitrilase recombinante 12 - Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le microorganisme hôte est la bactérie Escherichia coli exprimant le gène nitB d 'Alcaligenes faecalis ATCC 8750 13- Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le matériel biologique de l'étape (a) est immobilisé sur un support solide. 14- Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le support solide a une granulométrie comprise entre 1 m et 500 m, de prétérence 10 m et 200 m, et en ce qu'il constitue de 0,01 à 200 %, de préférence 10 à 100 % en poids du matériel biologique. 15- Procédé selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que le support solide est choisi parmi: - les résines échangeuses d'ions, 18 2824823 - l'alumine, - les silices de synthèse ou diatomées et les gels de silice, - les zéolites, - les charbons, - les protéines partiellement solubles ou insolubles dans l'eau, et - les polysaccharides. 16 - Procédé selon la revendication 1S, caractérisé en ce que le support solide est le gluten. 17- Procédé selon l'une des revendications 1 à 16 caractérisé en ce que le rapport entre la masse de matériel biologique immobilisé et la masse de substrat est de 0, 1 et 10 18- Procédé selon l'une des revendications 13 à 17, caractérisé en ce que le matériel biologique immobilisé est formulé selon une méthode de pelliculage 19- Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que l'étape (c) est réalisée dans une ou plusieurs colonnes ou réacteurs 20- Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que la ou les colonnes ou réacteurs sont mis en _uvre à une température comprise entre 10 et 60 C 21- Procédé selon l'une des revendications 19 ou 20, caractérisé en ce que la ou les colonnes ou réacteurs sont mis en _uvre à un pH compris entre 5 et 9