Brevet FR2831540A1 — publié le 20030502

Peptide isolé du facteur de croissance hépatocytaire et ses variants, Ilprocédé de préparation et utilisation en thérapeutique en tant qu'agents antiangiogéniques Domaine de l'invention La présente invention a trait, en tant que produits industriels nouveaux, à un peptide (désigné ici N) isolé du facteur de croissance hépatocytaire (HGF) et ses variants. Elle concerne également leur procédé de préparation ainsi que leur utilisation en thérapeutique en tant qu'agents antiangiogéniques intervenant en tant qu'inhibiteurs de l'angiogenèse. Les abréviations et acronymes utilisés ici sont définis de façon complète plus loin. Art antérieur HGF est actuellement reconnu comme étant un facteur pléïotrope possédant une spécificité assez large vis-à-vis de nombreuses cibles cellulaires. En particulier, il joue un rôle important de médiateur dans les interactions mésenchymales-épithéliales/endothéliales qui contribuent à des processus biologiques complexes, tels que l'embryogenèse, la régénération tissulaire et la tumorogenèse [voir K. Matsumoto et a !., Ciba Found. Symp., 1997 ; 212 : 198-211]. On sait également que HGF est un puissant activateur de l'angiogenèse [voir F. Bussolino et al., J Cell Bio !., 1992 ; 119 : 624-641], dont l'efficacité in vivo pourrait être supérieure à celle de VEGF [voir E. van Belle et al., Circulation, 1998 ; 97 : 381-390]. Eu égard à sa structure, HGF est un peptide apparenté aux enzymes de la cascade de la coagulation sanguine. Le HGF mature est un peptide composé de deux chaînes (ou sous-unités) : les chaînes a et ss. Dans le HGF natif (voir figure 1 ci-après), la portion de la séquence des aminoacides (aa 1-478), qui fournit la chaîne ex, comporte depuis son extrémité N-terminale jusqu'à son extrémité C-terminale : (i) un peptide L comprenant 31 résidus aminoacides (aa 1-31) qui (i) ne présente vraisemblablement aucun intérêt sur le plan pharmacologique et (ii) intervient en tant que peptide signal, (ii) un domaine N contenant une boucle dite en épingle à cheveux, ayant 96 résidus aminoacides (aa 32-127) et comprenant quatre résidus Cys (le peptide N est celui qui est utile selon la présente invention), et (iii) quatre domaines kringles (dénommés Kl, K2, K3 et K4) comportant chacun 6 à 7 résidus Cys, Kl comprenant 79 résidus aminoacides (aa 128-206), K2 comprenant 78 résidus aminoacides (aa 211-288), K3 comprenant 79 résidus aminoacides (aa 305-383) et K4 comprenant 79 résidus aminoacides (aa 391-469). La chaîne a de HGF représente le site principal d'interaction de HGF avec son récepteur qui est exprimé par le proto-oncogène c-Met et qui a (après fixation de HGF sur son récepteur) une activité enzymatique de tyrosine kinase. Dans ce qui suit ce récepteur est dénommé HGF-R. La chaîne ss, qui présente une homologie avec le domaine catalytique des sérine protéases, ne semble pas se lier au récepteur HGF-R mais est indispensable à l'autophosphorylation dudit récepteur et par suite à son interaction avec certains agents (les"effecteurs") impliqués dans la signalisation intracellulaire. Dépourvu de la chaîne ss, le peptide constitué par la chaîne a, qui se lie au récepteur HGF-R, est un antagoniste de HGF [voir K. Date et al., FEBS Letters, 1997 ; 420 : et intervient en tant qu'inhibiteur des réponses biologiques de HGF, notamment la réponse angiogénique de ce facteur [voir K. Kuba et al., Cancer Res., 2000 ; 60 : 6737-6743], selon un mécanisme de compétition. On sait en particulier de WO-A-99/55361 que la chaîne a de HGF a été séquencée. Plus précisément, on sait que le peptide dénommé NK4, qui commence par un groupe pyroglutamate et comprend les aminoacides de ladite chaîne a (i. e. aa pyrGlu32 à Val de HGF natif), a des effets antitumoraux [voir EP-A-0890361] et des effets antiangiogéniques qui se manifestent par une inhibition de la néovascularisation [voir la publication de K. Kuba et al. et la demande WO-A-99/55361 précitées]. En bref, les mécanismes connus à ce jour sont les suivants : (A) par clivage du peptide L, HGF natif donne (ou est"activé"en) HGF mature ; (B) HGF mature se fixe, par sa chaîne a, à son récepteur HGF-R ; (C) grâce à la fixation de HGF mature sur HGF-R, l'activité enzy- matique de HGF-R, qui est du type tyrosine kinase, se manifeste ; il s'agit là d'une"activation"par laquelle l'enzyme contenu dans le domaine intracellulaire de la protéine HGF-R devient apte à exercer son effet du type tyrosine kinase ; (D) lorsqu'il est utilisé, le peptide NK4, qui se fixe sur HGF-R sans que celui-ci exerce son activité enzymatique du type tyrosine kinase, intervient en tant qu'inhibiteur compétitif de HGF. Origine de l'invention Comme les domaines Kl, K2, K3 et K4 de la chaîne a de HGF sont assez similaires aux kringles antiangiogéniques de certaines autres protéines (telles que l'angiostatine et le deuxième kringle de la prothrombine), on s'est demandé lors de la genèse de la présente invention si (1 ) les kringles Kl, K2, K3 et/ou K4 de la chaîne a de HGF possèdent une activité antiangiogénique et si (2 ) le mécanisme de l'activité antiangiogénique éventuellement possible d'un ou plusieurs de ces kringles réside dans la fixation compétitive de Kl, K2, K3 et/ou K4 sur le récepteur HGF-R. Après avoir isoler et tester les peptides N, Kl, K2, K3 et K4 de la chaîne a de HGF, on vient de trouver de façon surprenante que le peptide N, qui était sensiblement inclus dans la séquence de NK4 [N diffère de la séquence de NK4 par la nature du premier aminoacide, Glnl remplaçant PyrGlu' (i. e. en position 32 de HGF natif)], a des propriétés antiangiogéniques qui se manifestent selon un mécanisme différent de celui des kringles de NK4. En bref, comme illustré ci-après, il a été observé selon l'invention que : N intervient en tant qu'inhibiteur de HGF selon un mécanisme différent de la fixation compétitive avec HGF sur le récepteur HGF- R ; selon les résultats des essais du Demandeur, N ne se fixe pas substantiellement sur HGF-R, à la différence de NK4 ; on a tout lieu de présumer que N agit en tant qu'inhibiteur de HGF dès lors qu'il semble intervenir au niveau de l'interaction de HGF avec les GAGs en inhibant la fixation HGF/GAG ; et, Subsidiairement, le peptide N, qui comporte l'épingle à cheveux de NK4 et est issu de la chaîne a de HGF, renferme dans sa séquence les aminoacides 2-96 de NK4 (i. e. Arg-Asn de HGF natif) mais se différencie de NK4 par le premier aminoacide (i. e. Gins au lieu du groupe pyroglutamate pyrOlu32 de HGF natif selon EP-A-0890361 et WO-A- 99/55361 précités). But de l'invention Selon l'invention on se propose de fournir (a) une nouvelle substance qui a des propriétés antiangiogéniques, (b) un procédé pour sa préparation et (c) une utilisation en thérapeutique de cette substance. Objet de l'invention On préconise donc selon l'invention une nouvelle substance peptidique caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi l'ensemble constitué par : (i) le peptide N issu de la chaîne a de HGF et ayant la séquence aminoacide représentée par SEQ ID No. : 2, et (ii) ses variants peptidiques dérivant de la séquence dudit peptide N par suppression, substitution ou addition d'un ou plusieurs aminoacides, ledit peptide N et ses variants ayant une activité antiangiogénique selon un mécanisme différent de la fixation compétitive avec HGF sur le récepteur HGF-R. Selon un autre aspect de l'invention, on préconise une composition thérapeutique qui est caractérisée en ce qu'elle renferme, en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable, une quantité thérapeutiquement efficace d'une substance peptidique choisie parmi l'ensemble constitué par : (i) le peptide N issu de la chaîne a de HGF et ayant la séquence aminoacide représentée par SEQ ID No. : 2, et (ii) ses variants peptidiques dérivant de la séquence dudit peptide N par suppression, substitution ou addition d'un ou plusieurs aminoacides, pour combattre les désordres associés à l'angiogenèse. On préconise également l'utilisation de ladite substance peptidique antiangiogénique vis-à-vis desdits désordres associés à l'angiogenèse. Enfin on préconise, en tant que produits industriels nouveaux, le fragment de DNA codant pour le peptide N ou ses variants précités, le plasmide contenant ledit fragment de DNA et la bactérie contenant ledit plasmide. Brève description des dessins Dans les dessins annexés, - la figure 1 représente schématiquement la structure de HGF natif avec les cinq domaines principaux de la chaîne a (N, Kl, K2, K3 et K4), le fragment PD représentant la chaîne ss ; les figures 2a et 2b montrent le niveau de purification des peptides isolés N, Kl, K2, K3 et K4 selon coloration au bleu de coomassie (Fig. 2a) et immunoempreinte ("Western blotting") avec un anticorps anti (HGF) (Fig. 2b) ; - la figure 3 représente, sous forme graphique, les résultats obtenus au cours des essais relatifs à la stimulation de la prolifération de cellules HUVEC par bFGF (lOng/ml) en présence de doses croissantes (de 0 à 50Ilg/ml) de peptide N, Kl, K2, K3 ou K4 ; - la figure 4 est un graphique illustrant l'inhibition de la prolifération de cellules HUVEC par le peptide N en présence d'un GF tel que bFGF, HGF, VEGF 165 et VEGF 121 ; - la figure 5 est un graphique illustrant l'effet de HGF, HGF + N, HGF + Kl, HGF + K2, HGF + K3 et HGF + K4 sur la migration de cellules HUVEC à travers une membrane poreuse ; - la figure 6 comprend six photographies relatives à l'inhibition de la formation de structure du type"tube capillaire par HUVEC dans un gel de collagène tridimensionnel comparaisons de bFGF avec bFGF + N, de VEGF avec VEGF + N (où VEGF est VEGF165) et de HGF avec HGF + N] ; et, - la figure 7 est un graphique montrant que le peptide N selon l'invention se distingue de Kl, K2, K3 et K4 par la fixation intense de Hep. Abréviations Par commodité, voici la liste des abréviations et acronymes techniques qui ont été utilisés dans la présente description. aa aminoacide (s) ; c-Met fragment de DNA de proto-oncogène codant pour une protéine, qui a une activité enzymatique de tyrosine kinase et représente le récepteur [dénommé ici HGF-R] de HGF ; cpm comptes par minute ; DNA acide désoxyribonucléique (de l'anglais :"deoxyrubonucleic acid") ; FBS sérum foetal bovin ; FGF facteur de croissance de fibroblastes (de l'anglais :"fibroblast growth factor") ; parmi les FGFs on distingue notamment les aFGF (facteur de croissance de fibroblastes acide) et bFGF (facteur de croissance de fibroblastes basique) ; GAG glycosylaminoglycane ; GF facteur de croissance ; Hep héparine ; HEPES acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthanesulfonique, produit intervenant en tant que tampon ; HGF facteur de croissance hépatocytaire (de l'anglais :"hepatocyte growth factor") ; sauf indication contraire HGF désigne ici le facteur de croissance hépatocytaire humain (hHGF) ; hHGF facteur de croissance hépatocytaire humain ; HGF-R récepteur de HGF (la notation"HGF-R"est préférée ici à la nomenclature de"c-Met"qui prête à confusion avec le gêne "c-Met") ; HUVEC cellules endothéliales de cordon ombilical humain (de l'anglais :"human umbilical cord endothelial cells") ; Kl domaine kringle 1 de HGF ou peptide correspondant ; K2 domaine kringle 2 de HGF ou peptide correspondant ; K3 domaine kringle 3 de HGF ou peptide correspondant ; K4 domaine kringle 4 de HGF ou peptide correspondant ; M199 milieu de culture commercialisé par la société américaine LIFE TECHNOLOGIES (Rockville, MD) ; M199i milieu M199 complémenté avec 15 mM d'HEPES (pH 7,4), 2 mM de glutamine, 50 U/ml de pénicilline, 50 u. g/ml de streptomycine et 2, 5 lg/ml d'amphotéricine B ; N domaine de la boucle en épingle à cheveux de HGF, le peptide correspondant ou mieux le peptide selon l'invention dont l'extrémité N-terminale est Gln (au lieu de PyrGlu selon l'art antérieur illustré par WO-A-99/55361) ; NK4 peptide constitué par la séquence des aminoacides de N à K4 dans HGF (i. e. aa 32-478 de HGF natif) ; RT température ambiante ; RU unité de résonance (1 000 RU correspondent à une fixation de 1 ng de protéine par mm2) ; VEGF facteur de croissance endothélial vasculaire (de l'anglais : "vascular endothelial growth factor") ; parmi les VEGFs on distingue notamment les facteurs VEGFjes et VEGF 121. Description détaillée de l'invention Le facteur hHGF a déjà été séquencé. En particulier, la séquence PyrGlu-Val de NK4 est donnée dans WO-A-99/55361). Selon l'art antérieur NK4 intervient en tant que substance antitumorale et antiangiogénique selon un mécanisme de compétition entre NK4 et HGF vis-à-vis de R (c-Met), qui est le récepteur de HGF. Après synthèse (par expression selon une technique de génie génétique) puis purification, le peptide N selon l'invention (dans lequel le premier aa de l'extrémité N-terminale est Gln au lieu de PyrGlu) et ses variants ont été testés. Ledit peptide N, qui est nouveau par rapport à l'enseignement de la séquence de NK4, et ses variants se distinguent de Kl, K2, K3 et K4 par leurs interactions avec les GAGs notamment Hep (héparine de haut poids moléculaire, héparine normale et héparine de bas poids moléculaire), le dermatan sulfate, l'héparan sulfate, etc]. Globalement on constate que N et ses variants inhibent l'interaction de HGF (et des certains autres GFs tels que VEGF et bFGF) avec les GAGs, par suite (i) ils empêchent la liaison du GF concerné sur son récepteur, et (ii) l'activité dudit GF est réduite voire supprimée. On présume, mais il s'agit là d'une théorie qui ne lie pas le Demandeur, que ledit peptide N et ses variants fixent les GAGs, ce qui empêche : (a) l'adhésion des GAGs sur HGF ou l'activation de HGF par les GAGs, puis (b) la fixation de HGF sur HGF-R pour activer ce dernier. La conséquence est que, en l'absence de la fixation du point (b) cidessus, HGF n'exerce pas ses effets angiogéniques. On constate également que l'inhibition du mécanisme (a) + (b) concerne non seulement HGF mais également d'autres GFs qui ne peuvent se fixer sur HGF-R, le récepteur de HGF, et sur les récepteurs spécifiques des autres GFs. Les variants selon l'invention sont ceux qui dérivent du peptide N par suppression, substitution ou addition d'un ou plusieurs aa. Ici la suppression ou délétion ne concerne pas le résidu Cys. En revanche la suppression ou délétion peut porter sur un ensemble de 1 à 5 aa contigus. Par exemple on peut écarter, d'une part, un ou plusieurs des résidus Met, Trp et/ou Tyr, et, d'autre part, un fragment peptidique d'au plus 5 aa situé dans la séquence de N notamment entre (a) Val33 et Glu38, (b) Leu et Val77, ou (c) Glu84 et Asn90. Les substitutions portent ici sur un ou plusieurs ensembles de 1 à 3 aa. Par exemple, un au moins des Cys (voire même la totalité) peut être remplacé par Ser, et certains résidus à chaîne latérale basique (en particulier Arg, His et Lys) peuvent être remplacés par Ala, Glu ou Asp. Les additions concernent principalement des fragments de 1 à 3 aa à chaîne latérale basique (de préférence Arg et/ou Lys) au voisinage des aminoacides basiques isolés de N, notamment au voisinage de Lysl6, Lys21, Arg42, Arg45, Lys47, Lys54, Lys60, His83, Lys91 et Arg95. Sans modifier l'activité de N, l'on peut en outre incorporer 1 à 22 aa en amont de Glnl (i. e. en amont de Gln32 dans la séquence de HGF natif), selon le vecteur d'expression utilisé. Ainsi en amont de Gln, on peut ajouter l'une des extrémités N-terminales suivantes : (Al) M, (A2) MASMTGGQQMGRD, (A3) MGSSHHHHHSSGLVPRGSHM. Les variants du peptide N selon l'invention peuvent, bien entendu, résulter d'une combinaison de suppressions, substitutions et/ou additions. Le procédé de préparation que l'on préconise selon l'invention, consiste à faire appel à une molécule de DNA codant pour le peptide N ou l'un de ses variants puis, (1 ) introduire du côté de l'extrémité 5'un fragment de DNA codant pour un premier site de restriction, (2 ) introduire du côté de l'extrémité 3'un fragment de DNA codant pour un second site de restriction, les étapes 10 et 20 étant réalisées dans un ordre quelconque, puis, (3 ) insérer le peptide résultant de l'ensemble des étapes 10 et 20 dans un plasmide bactérien, notamment un plasmide d'Escherichia coli, (4 ) cultiver la souche contenant le plasmide ainsi modifié à une température de 30-37 C, (5 ) exprimer le peptide N ou l'un de ses variants à une température de25-30 C. Le peptide ainsi obtenu est purifié selon une méthode connue en soi, notamment par chromatographie. Exemples 1 à 4 L'exemple 1 de l'invention est constitué par le peptide N dont la séquence des aa est donnée dans SEQ ID No. : 2. Le fragment de DNA exprimant Ex 1 est décrit dans SEQ ID No. : 1. L'exemple 2 de l'invention est le peptide constitué par A3-N. Il comporte le peptide A3 au niveau de son extrémité N-terminale en amont du peptide N. La séquence des aa de Ex 2 est donnée dans SEQ ID No. : 4. Le fragment de DNA exprimant Ex 2 est fourni dans SEQ ID No. : 3. L'exemple 3 de l'invention résulte de la suppression d'un fragment de 4-aminoacides (aa Met à Gly97) de Ex 2 (i.e. Met73 à Gly du peptide N). La séquence de Ex 3 et celle du DNA qui le code sont données dans SEQ ID No. : 5 et, respectivement, SEQ ID No. : 7. L'exemple 4 de l'invention résulte de Ex 2 par insertion de 2 aa (LysArg) après Lys (i. e. Lys de N), d'une part, et remplacement des deuxième et troisième résidus Cys [Cys64 et Cys74 de Ex 2 (i.e. Cys43 et Cys53 de N)] par Ser, d'autre part. La séquence de Ex 4 et celle du DNA qui le code sont données dans SEQ ID No. : 6 et respectivement, SEQ ID No. : 8. On a résumé ci-après une partie des résultats des essais qui ont été entrepris. Dans ces essais, les cellules HUVEC ont été utilisées en tant que modèle principal d'analyse d'angiogenèse ex vivo. Les cellules HUVEC ne produisent pas HGF, en revanche elles fournissent le proto-oncogène c-Met qui exprime le récepteur R (c-Met) de HGF et dont le niveau est modulable selon les conditions de culture. Les cellules quiescentes, à confluence, fournissent une faible quantité de c-Met. Cette expression augmente lorsque les cellules entrent en phase exponentielle de croissance, ou lorsqu'elles forment des structures similaires à des capillaires (ou tubes capillaires) dans un gel de collagène tridimensionnel. Essai 1 On a apprécié la stimulation de la prolifération de cellules HUVEC par bFGF en l'absence et en présence de quantités croissantes de peptides N, Kl, K2, K3 et K4, la prolifération des cellules HUVEC étant mesurée au moyen de [H] thymidine. On recueille les cellules HUVEC quand elles ont atteint l'état de confluence et on les place sur des plaques à 24 puits à la concentration de 2 x 104 cellules/puits dans 0,5 ml de M199i supplémenté avec 2,5 % de FBS. On laisse les cellules s'attacher pendant 4 h à 37 C et on induit la prolifération au moyen de 10 ng/ml de bFGF ajouté seul ou en association avec des quantités croissantes (0, 1-50 g/ml) de peptide purifié N, Kl, K2, K3 ou K4. Après incubation supplémentaire de 24 h, on ajoute 3,7 x 104 Bq (1 u. Ci) de [H] thymidine (produit commercialisé par la société Amersham Pharmacia Biotech) à chaque puits pendant les dernières 18 h d'incubation. Les cellules sont lavées trois fois par PBS puis traitées pendant 0,5 h avec une solution à 10 % (p/v) d'acide trichloroacétique refroidie au bain de glace. Les précipités résultants sont solubilisés avec NaOH 0,3 N (0,5 ml/puits) pendant 0,5 h à RT. On neutralise ensuite avec HCI IN. On mesure la radioactivité [H] au moyen d'un compteur à scintillation liquide (dispositif Beckman LS-6500 multipurpose scintillation counter). Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne [compte/minute ( erreur standard à la moyenne)] de trois cultures par dose de produit à tester. Les résultats consignés dans la figure 3 montrent qu'aucun des kringles Kl à K4 n'a un effet sur la prolifération de cellules HUVEC induite par bFGF puisque le comptage de [H] thymidine ne varie pas de façon statistiquement significative. En revanche, le peptide N inhibe la prolifération des cellules HUVEC induite par bFGF selon un mode dépendant de la concentration, la moitié de l'effet maximal se manifestant à une dose du peptide N d'environ 7 nM. Essai 2 On a apprécié la prolifération de cellules HUVEC selon les modalités décrites ci-dessus en induisant la prolifération de ces cellules par addition de 10 ng/ml de HGF, ou 10 ng/ml de chacune des isoformes de VEGF (VEGF, 65 et VEGF121) avec bFGF dans les puits, en l'absence ou en présence de 4 uM de peptide N. Les résultats consignés dans la figure 4 (qui sont exprimés en cpm) montrent que le peptide N inhibe de façon remarquable les proliférations des cellules HUVEC induites par l'un quelconque des FGs. Essai 3 On a évalué la migration chémotactique de cellules HUVEC selon une technique dérivant de l'art antérieur (essai modifié avec chambre de Boyden). Des inserts ("Transwell") de chambre de culture de cellules pariétale commercialisés par la'société Coming Costar Corporation (Cambridge, MA) et pourvus de filtres poreux en polycarbonate (dimensions des pores : 8 u. m) ont été enduits avec 0,1 % de gélatine. Des cellules HUVEC (4 x 104) dans le milieu M199i supplémenté avec 2,5 % de FBS ont été ajoutées aux dispositifs Transwell. Les inserts sont placés audessus de chambres contenant lOng/ml de HGF et un des peptides purifiés N, Kl, K2, K3 ou K4, chacun à la dose de 50 ug/ml. On incube les chambres pendant 5 h à 37 C. Les filtres sont ensuite rincés avec PBS, fixés et colorés au moyen d'hématoxyline. La surface supérieure des filtres est raclée pour éliminer les cellules qui n'ont pas migré. On enregistre le nombre de cellules dans un champ de haute puissance (x 400) à raison de 10 champs/filtre en triple. Les résultats consignés dans la figure 5 mettent en évidence que le peptide N inhibe complètement la migration induite des cellules HUVEC à travers la membrane poreuse. On observe en outre que quelques kringles (K3 et K4) présentent un faible effet inhibiteur, cet effet n'étant toutefois pas statistiquement significatif. Essai 4 On a étudié l'inhibition par le peptide N de la formation de tubes capillaires de cellules HUVEC dans un gel de collagène tridimensionnel. Du collagène de queue de rat de type 1 a été obtenu de la société BD Biosciences (Bedford, MA) et les gels ont été formés selon les recommandations du fabricant. En bref, une solution de collagène refroidie à la glace est neutralisée par addition de NaOH IN et mélangée avec PBS dans le rapport 9/1 v/v. Des cellules HUVEC, isolées par traitement au moyen de trypsine-EDTA et mises en suspension dans le milieu M199i complémenté par 2,5 % de FBS, sont mélangées avec la solution neutralisée de collagène jusqu'à une concentration finale de 1 mg/ml de collagène. On verse 0,4 ml de cette suspension (5 x 105 cellules/ml) dans les puits d'une plaque à 24 puits et on laisse les gels se former par incubation à 37 C pendant 40 minutes. Les gels sont revêtus avec 0, 5 ml de milieu M199i supplémenté avec 2,5 % de FBS et 10 ng/ml de l'un des trois FGs : bFGF, VEGF165 ou HGF. On ajoute dans des puits le peptide N purifié (1 fi) en même temps que le facteur de croissance. Les cultures sont incubées pendant 48 h à 37 C sous atmosphère humide contenant 5 % de CO2. On examine les gels au moyen d'un microscope ("Zeiss Axiovert 25") et enregistre les images en utilisant le logiciel"Archimed Pro 2.1". Quand les cellules HUVEC sont mises en croissance dans un gel de collagène, elles donnent lieu rapidement à une morphogenèse pour donner un filet de tubes capillaires. La formation de ces tubes s'effectue spontanément ou est induite par des facteurs de croissance. Les résultats consignés dans la figure 6 montrent que bFGF, VEGF165 et HGF induisent dans les conditions expérimentales utilisées l'organisation de la majorité des cellules HUVEC en tubes capillaires. La formation de ces tubes est totalement inhibée par le peptide N selon l'invention quand il est ajouté en même temps que l'un quelconque desdits facteurs de croissance. On n'observe également aucune modification de la morphogenèse des cellules HUVEC quand la formation de tube capillaire est induite en présence de l'un des kringles Kl, K2, K3 ou K4 (ces résultats ne figurent pas dans la figure 6). Essai 5 Pour mettre en évidence que le peptide N selon l'invention constitue le site principal impliqué dans l'interaction HGF avec un GAG tel que Hep, on a analysé les affinités des peptides N, Kl, K2, K3 et K4 pour l'héparine par résonance plasmonique de surface (en anglais :"surface plasmon resonance") en utilisant un instrument"BIAcore 2000" (commercialisé par la société BIAcore, Uppsala, Suède). De l'héparine de haut poids moléculaire a été biotinylée avec le produit EZ-Link Biotin-LC-Hydrazide (fabriqué par la société Pierce, Rockford, IL) et a été utilisée pour capter des détecteurs surfaciques enduits de streptavidine. Les peptides purifiés ont été dilués dans le tampon usuel de l'instrument BIAcore (PBS contenant 0,005 % de tween-20) et injectés à raison de 20 ml/minute sur de l'héparine immobilisée. Les expérimentations ont été réalisées dans un intervalle de concentration peptidique. Les résultats obtenus ont été analysés automatiquement au moyen du logiciel BIAevaluation de la société BIAcore. Les résultats obtenus ont été consignés dans la figure 7 où l'on voit que le peptide N a une très grande affinité vis-à-vis de l'héparine par rapport aux quatre kringles Kl, K2, K3 et K4. Les cinq peptides sont capables de se lier à l'héparine mais ils présentent des différences au niveau de la liaison. La réponse la plus importante est celle obtenue pour la liaison de 0,7 uM de peptide N, c'est-à-dire à une concentration approximativement 20 fois plus faible que celles des kringles (environ 2 000 RU pour le peptide N au lieu de 600 RU pour K3). Aux concentrations physiologiques l'interaction HGF/GAG est donc principalement assurée par le peptide N. Conclusions Eu égard aux résultats donnés ci-dessus dans les essais 1-5 et consignés dans les figures 3-7, il est clair que le peptide N agit en tant qu'inhibiteur de HGF. A la différence du peptide NK4 déjà connu, le peptide N selon l'invention n'intervient pas substantiellement sur la fixation compétitive avec HGF vis-à-vis du récepteur HGF-R. En revanche, eu égard à l'essai 5 et à la figure 7, le peptide N semble intervenir plus précisément au niveau de l'interaction de HGF avec un GAG tel que Hep en empêchant l'adhésion de Hep sur HGF ou l'activation par Hep de HGF ; par suite HGF ne peut plus agir sur ou activer HGF-R pour que celui-ci exerce son effet de tyrosine kinase. Les peptides des exemples 2-4 présentent le même mode d'action que le peptide N. En tant que substances antiangiogéniques, N et ses variants sont utiles dans le traitement des désordres associés à l'angiogenèse et notamment induits par l'hyperangiogenèse. Ils sont particulièrement indiqués en tant qu'inhibiteur de la néovascularisation et antagonistes de HGF (notamment vis-à-vis de la polyarthrite rhumatoïde, de la rétinopathie diabétique, de la dégénérescence de la macula liée à l'âge et de la formation excessive de cicatrice lors de la cicatrisation d'une blessure), en tant que modulateurs de prolifération cellulaire anormale (notamment vis-à-vis du psoriasis, du syndrome d'Osler-Webber, des angiomes et des tumeurs bénignes ou malignes), et en tant qu'inhibiteurs de l'hyperstimulation des cellules endothéliales. En bref, le peptide N et ses variants sont particulièrement intéressants en tant qu'agents anti-néovascularisation, anti-rhumatisme, antiarthritiques, anti-inflammatoires, anti-sporiasis, anti-prolifération, antitumoraux et/ou cytostatiques. Revendications 1. Substance peptidique caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi l'ensemble constitué par : (i) le peptide N issu de la chaîne a de HGF et ayant la séquence aminoacide représentée par SEQ ID No. : 2, et (ii) ses variants peptidiques dérivant de la séquence dudit peptide N par suppression, substitution ou addition d'un ou plusieurs aminoacides, ledit peptide N et ses variants ayant une activité antiangiogénique selon un mécanisme différent de la fixation compétitive avec HGF sur le récepteur HGF-R. 2. Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle renferme, en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable, une quantité thérapeutiquement efficace d'une substance peptidique choisie parmi l'ensemble constitué par : (i) le peptide N issu de la chaîne a de HGF et ayant la séquence aminoacide représentée par SEQ ID No. : 2, et (ii) ses variants peptidiques dérivant de la séquence dudit peptide N par suppression, substitution ou addition d'un ou plusieurs aminoacides, pour combattre les désordres associés à l'angiogenèse. 3. Utilisation d'une substance peptidique suivant la revendication 1 en tant qu'agent antiangiogénique pour combattre les désordres associés à l'angiogenèse. 4. Fragment de DNA, caractérisé en ce qu'il code pour la substance peptidique suivant la revendication 1. 5. Plasmide caractérisé en ce qu'il renferme le fragment de DNA suivant la revendication 4. 6. Souche bactérienne contenant le plasmide suivant la revendication 5. 7. Procédé de préparation d'une substance peptidique suivant la revendication 1, dans lequel on fait appel à une molécule de DNA codant pour le peptide N ou l'un de ses variants, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : (1 ) introduire du côté de l'extrémité 5'un fragment de DNA codant pour un premier site de restriction, (2 ) introduire du côté de l'extrémité 3'un fragment de DNA codant pour un second site de restriction, les étapes 10 et 20 étant réalisées dans un ordre quelconque, puis, (3 ) insérer le peptide résultant de l'ensemble des étapes 10 et 20 dans un plasmide bactérien, notamment un plasmide d'Escherichia coli, (4 ) cultiver la souche contenant le plasmide ainsi modifié à une température de 30-37OC, et (5 ) exprimer le peptide N ou l'un de ses variants à une température de 25-30 C. 8. Substance peptidique suivant la revendication 1, caractérisée en ce que sa séquence d'aminoacides est celle de SEQ ID No. : 4 9. Substance peptidique suivant la revendication 1, caractérisée en ce que sa séquence d'aminoacides est celle de SEQ ID No. : 5. 10. Substance peptidique suivant la revendication 1, caractérisée en ce que sa séquence d'aminoacides est celle de SEQ ID No. : 6.