Brevet FR2821855A1 — publié le 20020913

Gènes synthétiques et plasmides bactériens dépourvus de CpG DOMAINE DE L'INVENTION La présente demande est relative à des gènes synthétiques et à des plasmides entièrement 1 dépourvus de CpG. ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE Les plasmides sont des éléments génétiques essentiellement trouvés chez les bactéries, formés par une molécule d'acide désoxyribonucléique, le plus souvent circulaire dont la réplication est autonome et indépendante de celle de l'ADN génomique. Les plasmides naturels isolés à partir d'une très large variété de bactéries sont capables d'accomplir plusieurs fonctions cellulaires. La 1 : 1 première, vitale pour tous les plasmides, est celle responsable de leur réplication, généralement réalisée en synchronie avec la réplication de l'ADN génomique et la division cellulaire. Outre la région nécessaire à la réplication du plasmide, tous les plasmides naturels portent des gènes qui 1 1 codent pour des protéines dont la fonction reste le plus souvent non connue par absence d'investigation spécifique sur ces gènes. Le nombre de gènes présents sur un plasmide détermine 'ID la taille de ce plasmide, les plus petits plasmides naturels ne renfermant que deux à trois gènes. 1 Les propriétés des plasmides ont très tôt attiré les chercheurs pour en faire des véhicules de transport et d'expression de gènes dans les cellules procaryotes comme eucaryotes. Les progrès très rapides observés dans les domaines de la biologie moléculaire des acides nucléiques et des 1 protéines, ces deux dernières décennies, sont en partie attribuables à l'exploitation de plasmides recombinés construits à partir de fragments d'ADN naturel d'origine plasmidique ou autres ADN ZD cellulaires, et même synthétisés chimiquement. Les quatre bases adénine (A), guanine (G), cytosine (C) et thymine (T) qui constituent l'acide désoxyribonucléique (ADN) se répartissent en 16 configurations dinucléotidiques à savoir CG, GC, TA, AT, CC, GG, TT, AA, TG, CA, AG, CT, AC, GT, GA et TC. L'analyse de la distribution qualitative des dinucléotides de l'ADN des milliers de plasmides dont les séquences sont connues révèle que les 16 dinucléotides sont toujours présents dans tous les plasmides naturels ou construits en laboratoire. Cependant l'analyse de la distribution quantitative des dinucléotides des plasmides montrent de fortes disparités qui sont, en partie seulement, fonction du pourcentage de chacune des quatre bases de l'ADN. En effet, la comparaison des fréquences observées de chacun des dinucléotides à celles des fréquences calculées sur la base d'une association aléatoire entre deux bases pour un plasmide donné peut mettre en évidence des écarts importants pour plusieurs dinucléotides dans le sens d'une sur-représentation ou au contraire une sous-représentation (Campbell A., Mrazek J. et Karlin S. (1999) Proc Natl Acad Sci U S A 96, 9184-9). Les écarts constatés dans la distribution de certains dinucléotides, pas toujours les mêmes, de plasmides naturels isolés de bactéries d'espèces phylogéniquement éloignées ont été expliqués par des différences de spécificité dans les mécanismes de réparation, recombinaison et réplication agissant sur les ADN cellulaires. Les transferts de gènes in vitro dans des cellules en cultures et in vivo chez divers animaux sont des pratiques en grand développement dans le but d'une part de mieux connaître le fonctionnement cellulaire, et d'autre part afin d'appliquer ces techniques aux thérapies cellulaires et géniques. Aucun des vecteurs viraux et des vecteurs plasmidiques parmi la panoplie de 1 vecteurs disponibles pour le transfert de gènes chez les animaux, n'a pris un avantage décisif sur D les autres car chacun présente des avantages mais aussi des inconvénients. Il est cependant une application où l'ADN plasmidique nu ou complexé avec diverses substances pour faciliter le transport de l'ADN vers le noyau fait l'objet d'une intense activité de recherche, à savoir celui de l'ADN vaccinant. Le principe de l'ADN vaccinant repose sur les réponses immunitaires constatées chez des animaux de laboratoire traités par injection intramusculaire, intradermique ou inhalation avec de l'ADN plasmidique codant pour un peptide antigénique. Il est maintenant bien établi qu'une première conséquence de l'introduction d'un ADN plasmidique issu de la bactérie E. coli dans l'organisme d'un animal expérimental par les voies intraveineuse et musculaire est la production rapide de diverses cytokines par des cellules de garde du système immunitaire (Krieg A. M. et Kline J. N. (2000) Immunopharmacology 48,303-305). Cette réponse est extrêmement spécifique de l'ADN bactérien puisque de l'ADN extrait de cellules animales ne provoque pas une telle induction de cytokines dans les mêmes conditions. Les mécanismes cellulaires impliqués dans cette réponse immunitaire sont loin d'être parfaitement connus. Cependant nous savons que la reconnaissance discriminatoire entre l'ADN bactérien et l'ADN d'origine animale se fait au niveau de différences structurales portant sur la méthylation de certaines cytosines de la molécule. En effet, l'ADN de mammifères est naturellement méthylé au niveau de la cytosine de tous les dinucléotides CG (écrit par la suite CpG) à l'exception de zones courtes de haute densité en CpG appelées îlots CpG présentes dans des régions fonctionnelles au niveau de certains promoteurs. L'ADN extrait d'E. coli ne présente pas ce type de méthylation par absence de l'activité enzymatique capable d'accomplir cette modification chez cette bactérie. Il est néanmoins possible de méthyler les CpGs de l'ADN plasmidique extrait d'Ecoli en tube à essai par une enzyme appropriée. Dans ces conditions l'ADN méthylé in vitro perd une grande partie de son activité immunostimulante par rapport à l'ADN non méthylé témoin. La soitche E. coli K12 dont sont issues la quasi totalité des souches mutantes utilisées pour la production d'ADN plasmidiques renfenne une activité enzymatique (DNA méthylase dcm (Palmer B. R. et Marinus M. G. (1994) Gene 143, 1-12) conduisant à la méthylation de cytosine se trouvant dans le contexte nucléique CC (A/T) GG. Tous les vecteurs plasmidiques de transfert de gène renferment cette séquence en nombre variable et de ce fait leur molécule ADN contient des cytosines méthylées qui ne se retrouvent pas dans l'ADN de mammifères. Cette forme de méthylation spécifique à E coli introduit ainsi une autre différence au niveau des méthylations des cytosines entre l'ADN bactérien et celui des mammiferes qui pourrait contribuer au pouvoir immunostimulant de l'ADN plasmidique. La fréquence des CpG des ADN des primates et rongeurs est globalement très inférieure à celle attendue sur la base de la fréquence des cytosines et des guanines. Le déficit en CpG est dépendant pour un fragment d'ADN donné du rôle biologique de ce fragment, les régions intergéniques ne renferment qu'un cinquième de la fréquence attendue alors que les exons ont un déficit moins marqué et à l'autre extrême quelques promoteurs renfermant un ilôt CpG de grande taille présentent un pourcentage de CpG proche de celui attendu. L'analyse des données du séquençage des ADNc et des chromosomes humains révèle néammoins de larges hétérogénéités dans la fréquence de CpG pour des régions promotrices et des ADNc. Cette observation est illustrée par l'ADNc du gène humain codant pour l'interleukine 2 qui ne possède qu'un seul CpG. De même une partie du promoteur de ce gène renfermant la boîte TATA ne contient pas de CpG mais par contre la partie amont riche en sites de reconnaissance de facteurs de transcription renferme des CpG. Les régions en 3'des gènes formées par les 3'UTR (régions non traduites) et les séquences de polyadénylation et fin de transcription sont plutôt pauvres en CpG. Il n'est pas inhabituel de trouver chez l'homme des régions immédiatement en aval des gènes dépourvues de lt > CpG. Cependant les données du séquençage humain disponible en fin de l'an 2000 n'ont pas permis de mettre en évidence une seule unité transcriptionnelle formée par les régions promotrices de la transcription, un gène avec ou sans intron et la région de polyadénylation qui soit entièrement dépourvue de CpG. La situation des CpG chez E. coli est toute autre que celle des cellules animales puisque la fréquence des CpG dans l'ADN génomique de cette bactérie est en léger excès par rapport à la fréquence calculée. Il en est de même pour les CpGs des plasmides naturels isolés à partir de souches hospitalières d'E. coli. Les plasmides recombinés résultant de manipulations génétiques, utilisés pour le transfert de gènes, présentent des variations dans leurs nombres de CpG qui dépendent de l'origine des fragments insérés dans le vecteur. Une analyse des séquences de 1 plusieurs dizaines de plasmides recombinés d'E. coli pris de façon aléatoire dans la banque de données GenBank montrent que les plasmides les plus pauvres en CpG ont tout au plus un déficit de 50 % du nombre de leurs CpG. La présente invention fournit quant à elle des produits et méthodes pour synthétiser un ADN plasmidique chez E. coli qui est complètement dépourvu de CpG et dont les cytosines placées dans le contexte CC (A/T) GG ne sont pas méthylées. A la connaissance de la Demanderesse, il s'agit de la première description de tels produits qui présentent une telle structure tout en ayant conservé leur fonction. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente demande est relative à des gènes qui peuvent être exprimés chez E. coli, à une méthode pour leur obtention, à des promoteurs adaptés à leur expression, à des plasmides et des origines de réplication adaptés à leur transformation bactérienne, ainsi qu'aux applications biotechnologiques et médicales de ces produits. Chacun de ces produits présente la caractéristique particulière d'être entièrement dépourvu de CpG, tout en ayant conservé leur fonctionnalité. La présente demande fournit également une souche E. coli optimisée pour la réplication de tels plasmides, cette souche présentant elle-aussi la caractéristique particulière de permettre la réplication stable de ces plasmides et du matériel génétique qu'ils transportent, sans altérer leur fonction et sans pour autant induire de méthylation au niveau des sites CC (A/T) GG. Un des concepts communs liant les différents aspects de l'invention est donc de fournir des moyens de transfection donnant accès à du matériel nucléotidique qui évite la méthylation au niveau des cytosines tout en conservant ses propriétés fonctionnelles. A la connaissance de la Demanderesse, il s'agit de la première description de tels moyens. La création de plasmides d'E. coli dépourvus de CpG demande obligatoirement de disposer de gènes fonctionnels qui ne renferment pas de CpG. Ainsi, la sélection des bactéries transformées par un ADN plasmidique recombiné fait intervenir un gène dont la protéine confère un avantage dominant à la bactérie. Le plus souvent, le marqueur sélectif est apporté par un gène de résistance 1 à un antibiotique actif sur la bactérie E. coli. L'analyse des séquences des gènes de résistance dans leur grande variété utilisés chez E. coli montre que sans aucune exception tous renferment des 1 CpG, bien souvent en nombre très élevé pour les gènes de résistance trouvant leur origine chez les Streptomyces producteurs de l'antibiotique de sélection. De même, il est nécessaire de disposer de gènes rapporteurs qui soient sans CpG tout en restant fonctionnels. Or, une analyse de plusieurs centaines de gènes chromosomiques et plasmidiques de la bactérie 1 E. coli dont les séquences bien caractérisées sont disponibles dans plusieurs banques de données révèlent que tous les gènes sans exception dont la taille est supérieure à 250 pb sont constitués par les 16 dinucléotides. La présente invention démontre qu'il est malgré tout possible de construire des gènes fonctionnels chez E. coli qui soient dépourvus de CpG. Les inventeurs ont en effet mis au point une méthode pour l'obtention de gènes dépourvus de CpG tout en étant exprimables chez E. coli. Cette méthode est basée sur la synthèse d'un enchaînement polynucléotidique en suivant l'enchaînement d'acides aminés d'une protéine qui peut être exprimée chez E. coli, en affectant à chaque acide aminé un codon nucléotidique choisi parmi ceux qui, selon le code génétique, et en tenant compte de la dégénérescence de ce code, correspondent à cet acide aminé, mais en éliminant de ce choix : i. tous les codons contenant un CpG dans leur séquence : sont concernés les codons ACG (Thr), CCG (Pro), GCG (Ala), TCG (Ser), CGA (Arg), CGC (Arg), CGG (Arg) et CGT ( Arg), 0 ii. les codons dont les fréquences sont faibles dans les protéines d'origine humaine sont éliminés : sont concernés les codons ATA (Ile), CTA (Leu), GTA (Val) et TTA (Leu), et iii. les codons finissant par un C quand le codon qui le suit directement commence par un G. L'ensemble des codons possibles correspond donc à l'ensemble suivant : GCA (Ala), GCC (Ala), GCT (Ala), AGA (Arg), AGG (Arg), AAC (Asn), AAT (Asn), GAC (Asp), GAT (Asp), TGC (Cys), ), TGT (Cys), CAA (ein), CAG (Gln), GAA (Glu), GAG (Glu), GGA (Gly), GGC (Gly), GGG (Gly), GGT (Gly), CAC (His), CAT (His), ATC ( Ile), ATT (Ile), CTC (Leu), CTG (Leu), CTT (Leu), TTG (Leu), AAA (Lys), AAG (Lys), TTC (Phe), TTT (Phe), CCA (Pro), CCC (Pro), CCT (Pro), TCA (Ser), TCC (Ser), TCT ( Ser), AGC (Ser), AGT (Ser), ACA (Thr), ACC (Thr), ACT (Thr), TAC (Tyr), TAT (Tyr), GTC (Val) GTG (Val), GTT (Val), auquel il faut bien entendu appliquer la règle iii. ci-dessus. De manière préférentielle, ledit choix de codon se fera également de manière à éviter des 1 structures non favorables pour l'ARN messager, comme la présence de séquences d'épissage, de séquences répétées directes ou inversées, des structures en épingle à cheveux ou de signaux de Z : D polyadénylation. Le nombre et la variété de taille des gènes synthétisés par cette méthode sont illustrés dans les exemples ci-dessous qui montrent qu'il est ainsi possible de concevoir la synthèse de gènes entièrement dépourvus de CpG qui n'en reste pas moins fonctionnels chez E. coli. Comme protéine de référence, on peut choisir toute protéine qui peut être exprimée par E. coli, par exemple une protéine codée par un gène de résistance à un antibiotique tel que les gènes de résistance à la zéocine (phléomycine), à l'hygromycine, à la blasticidine, à la puromycine, ou une protéine codée par un gène rapporteur tel que lacZ. ZD La présente demande vise une telle méthode d'obtention de gènes dépourvus de CpG exprimables chez E. coli, ainsi que tout gène d'au moins 250 pb qui est susceptible d'être obtenu par cette méthode. Plus particulièrement, la présente demande vise : tout gène dont la séquence comprend la séquence SEQ ID ? 1 de la position 3 à la position 374 (Figure 1), la séquence SEQ ID ? 3 de la position 3 à la position Z-P 1025 (Figure 3), la séquence SEQ ID ? 5 de la position 3 à la position 422 (Figure 5), la séquence SEQ ID ? 7 de la position 3 à la position 599 (Figure 7), ainsi que toute utilisation de ces gènes en tant que marqueurs de sélection, et tout gène dont la séquence comprend la séquence SEQ ID ? 9 de la position 3 à la position 3056 (cf. Figure 9), ainsi que toute utilisation de ce gène en tant que gène rapporteur. D L'expression d'un gène plasmidique nécessite également de disposer de promoteurs adaptés à la cellule hébergeant le plasmide. La connaissance complète du génome d'Ecoli depuis quelques années a facilité l'étude de différents éléments non codants présentant des fonctions particulières. Les résultats des travaux portant sur la nature des promoteurs d'E. coli sont continuellement mis à jour et rendus publics sur le site PromEC accessible par internet (http : //bioinfo. md. huji. ac. il/marg/promec). Une analyse des 471 promoteurs bien définis de la base-75 à +25 par rapport au point +1 d'initiation de la transcription révèle que seulement 6 d'entre eux ne possèdent pas de CpG. L'addition de chacun des 6 promoteurs synthétisés chimiquement et placés en amont du gène lacZ codant pour la ss-galactosidase d'E. coli s'est révélée négative pour la révélation de l'activité de ce gène rapporteur. Le manque de forte homologie avec les séquences consensus des boîtes canoniques-10 et-35 suggère que la force de 1 1 ces promoteurs est faible et alternativement que ceux-ci pourraient être régulés par des conditions d'induction à définir pour chacun d'entre eux. Une analyse des promoteurs bien caractérisés d'E. coli a révélé qu'une dizaine seulement ne renfermaient pas de CpG au niveau des boîtes spécifiques de reconnaissance par la RNA polymérase. Une recherche bibliographique a en outre révélé que ces promoteurs étaient tous de nature inductible par divers stimuli, une situation parfois voulue mais le plus souvent délaissée pour un caractère constitutif de l'expression. Les inventeurs ont quant à eux réussi, par assemblage aléatoire PCR de fragments présentant des courtes séquences consensus dépourvues de CpG puisées parmi plusieurs promoteurs forts, à mettre au point des promoteurs inédits qui sont adaptés à l'expression de gènes sans CpG chez E. coli, et qui présentent l'avantage particulier d'être des promoteurs constitutifs très forts et d'être entièrement dépourvus de CpG. L'exemple 6 ci-dessous illustre la construction du promoteur inédit EM2K par cette technologie. La présente demande vise plus particulièrement tout promoteur dont la séquence comprend la séquence SEQ ID No. 11 (cf. Figure 11). Les terminateurs caractérisés de transcription chez E. coli sont formés par des séquences courtes dont plusieurs ne possèdent pas de CpG, et les inventeurs ont pu vérifier que de tels terminateurs assurent effectivement leur fonction lorsqu'ils sont associés chez E. coli à un promoteur et un gène sans CpG selon l'invention. La présente demande vise ainsi toute unité transcriptionnelle qui comprend au moins un gène 1 : 1 sans CpG selon l'invention, et au moins un promoteur sans CpG selon l'invention. Une telle unité transcriptionnelle peut en outre comprendre au moins un terminateur sans CpG. L'invention fournit ainsi, pour la première fois, un ensemble nucléotidique qui est entièrement dépourvu de CpG, et qui peut néanmoins être exprimé chez E. coli en y assurant ses fonctions normales. Les plasmides isolés à partir de souches sauvages de bactéries accomplissent généralement trois fonctions en rapport avec la réplication, à savoir initiation de la réplication de l'ADN, contrôle de la réplication et maintenance stable du plasmide au cours des divisions successives. Les plasmides construits en laboratoire ne présentent pas toujours l'ensemble de ces fonctions. Le nombre de copies des plasmides est par exemple bien souvent augmenté par rapport au plasmide parent dénotant que des éléments du contrôle de la réplication ont été modifiés. Le plasmide R6K renferme trois origines de réplication alpha, gamma et beta, liées sur un même fragment d'ADN 15 (Filutowicz M. et Rakowski S. A. (1998) Gene 223,195-204). Chacune des origines est activée par la protéine d'initiation pi spécifique de R6K, codée par le gène R6K pir. Les trois origines ont besoin, pour être fonctionnelles, d'une séquence de 277 pb, connue par l'homme du métier sous le nom de core (cceur), située au centre du fragment portant les trois origines, et aussi d'un fragment unique supplémentaire positionné en cis c'est-à-dire présent sur la même molécule d'ADN. Lorsque les séquences des origines alpha et beta sont délétées, l'origine gamma restante permet la duplication autonome du plasmide à la condition que le gène pir soit présent en cis sur le plasmide ou en trans sur le chromosome de la bactérie. Les inventeurs ont fait le choix de s'intéresser plus particulièrement à la plus petite des trois origines, à savoir l'origine gamma, qui présente l'avantage de contenir tous les éléments nécessaires pour une réplication contrôlée du plasmide, à savoir le core et une séquence adjacente activatrice. Le core est formé par une séquence de fixation de la protéine pi répétée 7 fois et d'une séquence riche en AT. La région activatrice renferme des sites de fixation de plusieurs protéines cellulaires de la bactérie requis pour un maintien stable du plasmide. Le nombre de copies des plasmides renfermant la seule origine gamma dépend de la protéine pi, des formes mutantes de pi conduisant à une forte augmentation du nombre de copies du plasmide ont été isolées et caractérisées. Comme présenté plus en détail dans les exemples ci-dessous, les inventeurs ont réussi à construire à partir de l'origine de réplication du plasmide R6K gamma des origines de réplication qui ne présentent 1 plus aucun CpG, tout en ayant conservé leur fonctionnalité intacte. Il peut être noté que le choix particulier de R6K gamma comme matériel de départ, à savoir le choix d'un réplicon de petite 1 taille qui ne présente qu'un nombre réduit de CpG, est un choix particulièrement pertinent, dans la mesure où lorsque l'on part d'autres plasmides tels que ceux de la série pUC, on ne parvient pas à obtenir de plasmides sans CpG qui restent fonctionnels : toutes les tentatives menées par les inventeurs pour reconstituer par voie chimique la séquence minimale pUC en remplaçant les cytosines des CpG par une guanine ou une adénine ont abouti à des fragment d'ADN ayant perdu toute activité fonctionnelle de réplication. Les plasmides qui comprennent une origine de réplication sans CpG selon l'invention ont quant à eux conservé leur capacité à se répliquer de manière stable à l'intérieur d'une cellule procaryote telle que E. coli, et E. coli K12 en particulier, dans la mesure où bien entendu on leur fournit la protéine pi nécessaire à l'activation de la réplication (pir sauvage ob per muté tel que perl 16 en cis ou en trans). Une origine de réplication pour plasmide selon l'invention est caractérisée en ce que sa séquence correspond à celle de l'origine de réplication R6K gamma dans laquelle chaque G des CpG de la région répétée du core a été remplacé par un A, un C ou un T, ou chaque C des CpG a été remplacé par un G, un A ou un T. Ont ainsi été obtenues différentes origines de réplication sans CpG, qui de manière surprenante, étaient toujours capables d'assurer les fonctions d'origine de réplication de 1 plasmides chez E. coli, et qui plus est, étaient capables d'assurer ces fonctions pour des gènes et des unités transcriptionnelles qui eux-mêmes étaient dépourvus de CpG. Les exemples ci-dessous en donnent quelques illustrations (cf. origines R6K gamma M2A, R6K gamma M2C, R6K gamma M2T en exemples 7-10). La présente demande vise plus particulièrement toute origine de réplication dont la séquence comprend la séquence SEQ ID N 12 ou la séquence SEQ ID N 13 (Figures 12 et 14). Il a également été mis en évidence que la séquence de fixation de la protéine pi peut ne pas être répétée 7 fois, comme cela est observé chez l'origine R6K gamma standard 1 avec CpG, mais qu'on en peut limiter le nombre à 5 ou 6, sans pour autant altérer les fonctions de l'origine de réplication. La présente demande vise ainsi toute origine de réplication selon 1 l'invention comme ci-dessus définie, qui ne comprendrait que 5 ou 6 répétitions de la séquence de fixation de la protéine pi. Grâce à ces origines de réplication fonctionnelles sans CpG, les inventeurs ont pu construire différents plasmides, qui, de manière remarquable, ont conservé leurs fonctions de vecteurs de transfection. La présente demande vise ainsi tout plasmide qui comprend une origine de réplication selon l'invention. De tels plasmides peuvent en outre comprendre un gène sans CpG selon l'invention et/ou un promoteur sans CpG selon l'invention et/ou un terminateur de transcription sans CpG, ou une unité transcriptionnelle selon l'invention. Les plasmides selon l'invention présentent donc l'avantage de pouvoir ne présenter aucun CpG dans leur structure, tout en étant toujours capables d'assurer les fonctions de vecteurs d'Expression. (-). Des exemples de tels plasmides sont donnés dans les exemples ci-dessous. La présente demande vise plus particulièrement tout plasmide de SEQ ID No. 14 (Figure 15). Entre également dans le champ de la présente demande toute cellule transformée par au moins un élément sélectionné parmi le groupe constitué par les gènes sans CpG selon l'invention, les promoteurs sans CpG selon l'invention, les origines de réplication sans CpG selon l'invention, les plasmides sans CpG selon l'invention. Une telle cellule selon l'invention peut en outre comprendre un gène codant pour une protéine pi, tel que pir sauvage ou pir muté pirl 16. Avantageusement, une cellule transformée selon l'invention est une cellule d'E. coli. Pour répliquer en un nombre suffisant de copies fonctionnelles un plasmide selon l'invention, l'homme du métier a à sa disposition de nombreuses bactéries, telles que par exemple les E. coli K12 qui sont classiquement utilisées à des fins de réplication plasmidique. Or, La souche originelle K12 d'E. coli possède une méthylase de l'ADN, qui introduit un groupement méthyl sur toutes les cytosines placées dans le contexte CC (A/T) GG des ADN génomique et plasmidique de la bactérie. L'ensemble des diverses souches de la lignée K12 possède cette activité du fait d'une méthylase codée par le gène dcm (Palmer B. R. et Marinus M. G. (1994) Gene 143,1-12). Dans la mesure où la méthylation des ADN plasmidiques préparés à partir des souches dc d'E. coli entraîne une modification de la molécule d'ADN non voulue pour le transfert de gènes en cellules eucaryotes, les inventeurs ont mis au point une souche qui permette à la fois le fonctionnement des plasmides avec l'origine R6K gamma sans CpG conformément à l'invention, et l'obtention d'ADN plasmidique dépourvu de méthylation sur les sites dem. Pour cela, un nouveau gène a été construit par les inventeurs en délétant le gène dcm de la position +3 après l'ATG à la position- 14 avant le TGA dans le gène dcm d'une souche pirl 16 (cf. exemple 10 ci-dessous). Le gène dcm est situé dans une région chromosomique dont la séquence peut être obtenue via GenBank avec le numéro d'accession D90835 (cloneKohara &num;344 : 43, 5-43, 9 min). Une délétion dans le gène (-) apporte l'avantage supplémentaire d'éviter toute réversion du gène c vers la forme sauvage. Des souches mutantes dcm- ont ainsi été produites par les inventeurs ; elles 1 : 1 ne présentent aucun phénotype négatif qui pourrait altérer la croissance des bactéries ou modifier la qualité et la quantité de l'ADN plasmidique. Plus particulièrement, une souche optimisée d'E. coli a été construite par inactivation ciblée du gène dcm à partir d'une souche parente e exprimant une protéine pi mutée en un site conduisant à l'augmentation du nombre de copies des plasmides sans CpG. Cette souche optimisée permet une production de qualité et en abondance des ADN plasmidiques objets de cette invention dépourvus de CpG et exempts de méthylation sur les cytosines des sites dcm. La présente demande vise donc toute cellule comprenant un gène codant pour la protéine pi, qui est transformée par le gène dcm délétée selon l'invention, et toute méthode de réplication de plasmides qui comprend la transformation d'une telle cellule par un plasmide, et la culture de la cellule transformée dans des conditions adaptées à la réplication de ce plasmide. Entre également dans le champ de la présente demande tout kit de production de plasmides, qui comprend au moins une cellule selon l'invention. Ces kits sont particulièrement adaptés à la réplication de plasmides selon l'invention, afin d'éviter que ces plasmides dont le structure est dépourvue de CpG soit par ailleurs lors de leur réplication méthylés en CC (A/T) GG. L'invention fournit ainsi un ensemble complet de moyens de transformation dépourvus de CpG : gènes sans CpG, promoteurs sans CpG, unités transcriptionnelles sans CpG, origines de réplication pour plasmide sans CpG, plasmides sans CpG, cellules optimisées pour la réplication de plasmides sans méthylation de cytosines. Ces nouveaux moyens trouvent des applications directes pour la transformation génétique de cellules à visée biotechnologique ou médicale. De tels produits sont en effet exceptionnellement bien adaptés à la réalisation de compositions vaccinales à ADN destinées à l'homme ou l'animal. (-) L'invention est illustrée par les exemples suivants, dans lesquels il est fait référence aux figures : Figure 1 : séquence du gène Sh ble ACpG (sans CpG), - Figure 2 : liste des oligonucléotides utilisés pour l'assemblage du gène Sh ble ACpG, - Figure 3 : séquence du gène Hph ACpG, Figure 4 : liste des oligonucléotides utilisés pour l'assemblage du gène Hph ACpG, - Figure 5 séquence du gène Bsr ACpG, Figure liste des oligonucléotides utilisés pour l'assemblage du gène Bsr ACpG, - Figure séquence du gène Pac ACpG, - Figure 8 liste des oligonucléotides utilisés pour l'assemblage du gène Pac ACpG, 1 1 - Figure : séquence du gène LacZ ACpG, - Figure 10A : liste des oligonucléotides utilisés pour l'assemblage du premiers tiers du gène LacZ ACpG, - Figure 10B : liste des oligonucléotides utilisés pour l'assemblage du deuxième tiers du 'ID gène LacZ ACpG, Figure 10C : liste des oligonucléotides utilisés pour l'assemblage du troisième tiers du 1 gène LacZ ACpG, - Figure 11 : séquence du promoteur EM7 (1-), des oligonucléotides dégénérés (2-) ID In utilisés pour construire le promoteur EM2K dépourvu de CpG (3-), - Figure 12 : séquence de l'origine de réplication R6K gamma M2A, - Figure 13 : liste des oligonucléotides utilisés pour l'assemblage de l'origine de z : l réplication R6K gamma M2A, - Figure 14 : séquence de l'origine R6K gamma du plasmide pGTR6Kneoc9 délimitée par les sites Pack, - Figure 15 : séquence du plasmide pSh-LacZACpG, - Figure 16 : carte du plasmide pShACpG, - Figure 17 : carte du plasmide pSh-LacZACpG. EXEMPLE 1 : Construction du gène Sh ble de résistance à la Zéocine dépourvu de CpG. Le gène Sh ble ACpG dont la séquence présentée en figure 1 (position 3 à 377 de SEQ ID No. 1) a été synthétisé à partir d'un assemblage d'oligonucléotides chevauchants (taille 20-40 pb) dont les séquences sont données dans la figure 2. La méthode d'assemblage se fait en trois étapes, la première consiste en la phosphorylation des oligonucléotides du brin codant, dans une deuxième étape l'ensemble des oligonucléotides des deux brins sont associés par hybridation et ligation et, ZD dans la dernière étape, le gène est amplifié par PCR. Cette méthode a été utilisée avec succès pour la synthèse de tous les gènes synthétiques mentionnés dans les exemples 1, 2, 3, 4, 5. La méthode 1 1 est détaillée pour le gène Sh ble ACpG : Les 10 oligonucléotides de OL26199 à OL27099 (figure 2) correspondant au brin codant sont phosphorylés selon la procédure suivante : 1 fll de chacun des oligonucléotides repris dans de l'eau c à 250 flM sont mélangés dans un microtube contenant 15 al d'eau pour amener la solution finale à une concentration de 100 picomoles par microlitre. On mélange ensuite 5 ul de cette solution à c 10 ul de tampon de la polynucléotide-Kinase concentré 10 fois, 0, 4 ul d'une solution d'ATP 50mM, 85 ul d'eau et 1 ul de l'enzyme (à 10 u/ul) et le tout est incubé 4'heures à 37 C (solution A). Une solution des oligonucléotides du brin non codant est constituée en mélangeant 1 ul de chaque 1 oligonucléotide (OL27199 à OL28199 ; cf. figure 2) et 1 ul de l'oligonucléotide OL26099 (figure 1 2) dans laquelle on ajoute 43 III d'eau afin d'obtenir une solution finale à 54 picomoles par III (solution B). L'assemblage du gène est réalisé d'abord en mélangeant 10 III de la solution A, 1 l de la solution B, 6 III d'une solution de KC1 à 100 mM, 3 III d'une solution de NP-40 à 0,5%, 4 fll d'une solution de MgC12 à 50 mM, 3 l d'une solution d'ATP à 10 mM et 7,5 III de ligase Pfu (30 unités) puis le mélange est chauffé dans un thermocycleur programmable 3 minutes à 95 C puis 3 minutes à 80 C avant de subir 3 cycles d'une minute à 95 C, suivie d'un passage de 95 C à 700C en 1 minute, puis d'un passage de 70 C à 55 C en 1 heure et enfin 2 heures à 55 C. Puis le mélange des oligonucléotides assemblés est amplifié avec les amorces OL26099 et OL27199. 1 Le produit d'amplification est purifié sur colonne Promega, digéré par les enzymes de restriction NcoI et NheI et cloné dans le plasmide pMODlLacZ (wt) linéarisé par NcoI et Nhel. Les séquences de l'ADN plasmidique de 2 clones résistants à la zéocine apparus après transformation de la souche d'Ecoli GT100 (disponible auprès de Invivogen) par le mélange de la ligation entre le fragment vecteur et le fragment PCR, ont été trouvées conformes à la séquence désirée présentée en Figure 1. Ce gène synthétique placé sous la dépendance du promoteur bactérien EM7 (vecteur pMODISh ACpG) confère une résistance à la zéocine identique à celle apportée par le même vecteur contenant le gène natif Sh ble avec la souche d'E coli réceptrice GT100. EXEMPLE 2 : Construction du gène Hph de résistance à l'hygromycine dépourvu de CpG Le gène synthétique Hph ACpG (séquence SEQ ID No. 3 présentée en Figure 3) a été construit selon la méthode décrite dans l'exemple 1. Les deux brins ont été synthétisés à l'aide d'oligonucléotides de 60 bases plus deux oligonucléotides de 30 bases avec une région chevauchante de 30 bases. L'assemblage des différents oligonucléotides présentés en Figure 4 a ID été réalisé par une PCR finale avec les oligonucléotides sens TTCAGCTGAGGAGGCACATC (SEQ ID No. 299) et reverse CTCAGGATCCGCTAGCTAAT (SEQ ID No. 300) selon les conditions expérimentales mentionnées dans l'exemple précédent. Le fragment amplifié et purifié (1068 pb) a été ensuite digéré par les enzymes de restriction BspHI et Nhel et cloné dans le vecteur pMOD2 LacZ (wt) dans lequel le site NcoI de pMODl est remplacé par le site BspHI. La sélection des clones d'E. coli contenant ce vecteur recombinant a été effectuée sur milieu FastMedia Hygro Agar (Cayla). La séquence SEQ ID No. 3 de la figure 3 a été confirmée par séquençage sur les deux brins de l'ADN plasmidique de deux clones résistants à l'hygromycine. Ce gène synthétique placé sous la dépendance du promoteur bactérien 1 EM7 (vecteur pMOD2 Hph ACpG) confère une résistance à l'hygromycine B au moins égale à celle apportée par le même vecteur contenant le gène natif Hph avec la souche d'E. coli réceptrice GTIOO. EXEMPLE 3 : Construction du gène Bsr de résistance à la blasticidine dépourvu de CpG. Le gène Bsr ACpG dont la séquence est présentée en figure 5 (SEQ ID No. 5) a été synthétisé à ZD partir des oligonucléotides indiqués en 6 en suivant la méthode décrite dans l'exemple 1. Le mélange des oligonucléotides assemblés a été amplifié avec les amorces OL64 et OL76 (cf. Figure 6). Le fragment amplifié et purifié a été ensuite digéré par les enzymes de restriction BspHI et Nhel et cloné dans le vecteur pMOD2 LacZ (wt). La sélection des clones d'Ecoli contenant ce vecteur recombinant a été effectuée sur milieu FastMedia Blasti Agar (Cayla). La séquence SEQ ID No. 5 de la figure 5 a été confirmée par séquençage sur les deux brins de l'ADN plasmidique de deux clones résistants à la blasticidine. Ce gène synthétique placé sous la dépendance du promoteur bactérien EM7 (vecteur pMOD2 Bsr ACpG) confère une résistance à la blasticidine identique à celle apportée par le même vecteur contenant le gène natif Bsr avec la souche d'Ecoli réceptrice GTIOO. EXEMPLE 4 : Construction du gène Pac de résistance à la puromycine dépourvu de CpG Le fragment BspHI-NheI (gène Pac ACpG ; SEQ ID No. 7) dont la séquence est présentée en figure 7 a été synthétisé par un assemblage des oligonucléotides indiqués en Figure 8. Le mélange des oligonucléotides assemblés a été amplifié avec les amorces sens pur24 (AGGACCATCATGACTGAG ; SEQ ID No. 301) et reverse pur25 (ATCATGTCGAGCTAGCTC ; SEQ ID No. 302). Le fragment BspHI-NheI purifié a été cloné dans le plasmide pMOD2LacZ (wt) entre les sites BspHI et Nahe !. Les séquences de l'ADN plasmidique de 2 clones de la souche GT100 résistants à la puromycine apparus sur le milieu FastMedia puro Agar (Cayla) après transformation par le produit de la ligation entre le ID fragment vecteur et le fragment PCR, ont été trouvées conformes à la séquence désirée présentée en Figure 7. Le gène synthétique Pac ACpG placé sous la dépendance du promoteur bactérien c ID EM7 (vecteur pMOD2 Pac ACpG) confère une résistance à la puromycine légèrement supérieure à celle apportée par le même vecteur contenant le gène natif pac avec la souche réceptrice GT100 d'E. coli. EXEMPLE 5 : Construction du gène LacZ dépourvu de CpG codant pour la ss-galactosidase d'E. coli Le gène synthétique LacZ ACpG (SEQ ID No. 9 présentée en Figure 9) a été construit selon la méthode décrite dans les exemples précédents. Compte-tenu de la taille du gène à réaliser (plus de 3000 pb), la construction a été effectuée en trois parties distinctes en conservant les sites de restriction EcoRV et SacI aux mêmes sites que sur la séquence native du gène lacZ. Pour chaque partie, les deux brins ont été synthétisés à l'aide d'oligonucléotides de 40 bases plus deux oligonucléotides de 20 bases avec une région chevauchante de 20 bases. La première région correspond au fragment NcoI-EcoRV (Partie I), la deuxième région correspond au fragment EcoRV-SacI (Partie II) et la troisième région correspond au fragment SacI-NheI. L'assemblage des différents oligonucléotides présentés dans les figures 10A (oligonucléotides utilisés pour l'assemblage de la partie I), 10B (oligonucléotides utilisés pour l'assemblage de la partie II), 10C (oligonucléotides utilisés pour l'assemblage de la partie III), a été réalisé par PCR selon les mêmes conditions expérimentales énoncées dans les exemples précédents. Le clonage progressif des trois parties du gène synthétique a été effectué dans le vecteur pMOD 1 LacZ (wt). La fonctionnalité de chaque partie clonée ainsi que celle du gène synthétique complet présent sur le vecteur pMODl LacZ a été démontrée par la révélation de l'activité ss-galactosidase sur milieu FastMedia Amp Xgal Agar (Cayla) des clones recombinants obtenus dans la souche MC1061ALac. Le gène synthétique complet LacZ ACpG mis sous la dépendance du promoteur EM7 donne 30% de moins d'activité ss-galactosidase (dosage luminométrique d'extraits protéiques de culture) par rapport à l'expression du gène natif 1 LacZ dans le même environnement plasmidique. EXEMPLE 6 : Construction d'un promoteur constitutif fort d'E. coli dépourvu de CpG Le promoteur bactérien EM7 présent sur les vecteurs de type pMODl est un promoteur synthétique, constitutif et fort chez E. coli. Sa séquence qui contient 3 CpG (SEQ ID No. 297 en Figure 11) a servi de référence pour élaborer un promoteur bactérien dépourvu de CpG. Nous avons réalisé des oligonucléotides"linker"dégénérés à 4 endroits (indiqués W, D, W et H sur la séquence SEQ ID No. 298 en Figure 11) et compatibles avec les sites de restriction AseI et NcoI. Ces différents oligos ont été hybridés et clonés dans le pMOD ShACpG entre les sites de restriction AseI et NcoI du promoteur EM7. Après sélection des clones recombinants sur milieu FastMediaZeo Agar et détermination de la séquence promotrice du clone le plus résistant à la zéocine, nous avons retenu le promoteur EM2K (séquence SEQ ID No. 11 en Figure 11) comme promoteur bactérien dépourvu de CpG. EXEMPLE 7 : Synthèse des origines R6K gamma dépourvues de CpG Le fraLe fragment d'ADN Pacl contenant l'origine R6K gamma M2A (SEQ ID No. 12 en Figure 12) a été synthétisé par PCR à partir de l'assemblage des oligonucléotides indiqués en Figure 13. L'assemblage du fragment R6K gamma M2A a été amplifié avec les amorces RK15 (GCAGGACTGAGGCTTAATTAAACCTTAAAAC ; SEQ ID No. 303) et RK16 (AAGTCTCCAGGTTAATTAAGATCAGCAGTTC ; SEQ ID No. 304), et les fragments après digestion par l'enzyme PacI ont été clonés dans un plasmide (pGTCMVneo) contenant le gène de résistance à la kanamycine et l'origine de réplication pUC bornée par 2 sites PacI. De nombreux transformants de la souche GT97 (qui exprime la protéine pi) ont été analysés et n'ont été retenus que des clones contenant un plasmide à forte copie et conservé après plusieurs sous-cultures en absence de kanamycine. Il a été trouvé après séquençage que le fragment ori de la plupart de ces plasmides pouvait posséder un nombre plus réduit (5-6) de séquences répétées au lieu des 7 de l'origine naturelle du plasmide R6K. Une de ces nouvelles séquences de l'origine R6K gamma synthétique dépourvue de CpG est présentée en SEQ ID No. 13 en Figure 14. Deux autres versions de l'origine R6K gamma dans lesquelles le G de chaque CpG présent dans les séquences répétées (élément de 22 bp répété plusieurs fois dans la région de fixation de la protéine pi) a été remplacé par un C pour donner l'origine (R6K gamma M2C) ou un T pour donner l'origine (R6K gamma M2T) ont été synthétisées d'une manière analogue. La fonctionnalité de ces nouvelles origines R6K gamma dans lesquelles le G des CpG des séquences 1 > répétées est remplacé par un C ou par un T, ajouté à l'exemple de l'origine de la Figure 13 où le 1 G est remplacé par un A démontre que les CpGs de ces séquences répétées n'ont pas de rôle dans la fonctionnalité de l'origine. ZD EXEMPLE 8 : Assemblage de vecteurs plasmidiques entièrement dépourvus de CpG exprimant un gène de résistance chez E. coli En premier lieu une cassette PacI-PacI contenant le promoteur bactérien EM2K, le gène de résistance à la Zéocine Sh ACpG suivi d'un terminateur bactérien sans CpG a été réalisé. Pour cela, des oligonucléotides"linker"contenant la séquence du tenninateur tl de la région intergénique rpsO-pnp d'E. coli ont été hybridés et clonés entre les sites Nhel et Pacl du vecteur pMODl EM2K Sh ACpG : Oligonucléotides"linker" : rpsO-1 (5'- > 3') : CTAGCTGAGTTTCAGAAAAGGGGGCCTGAGTGGCCCCTTTTTTCAACTTAAT SEQ ID No. 305 raps0-2 (5'- > 3') : TAAGTTGAAAAAAGGGGCCACTCAGGCCCCCTTTTCTGAAACTCAG SEQ ID No. 306 Le vecteur recombinant obtenu (pMOD1 EM2K Sh ACpG Term) a été vérifié par séquençage au niveau de la séquence terminatrice qui ne contient pas naturellement de CpG. La cassette EM2KSh ACpG-Term contenue dans ce vecteur a été ensuite amplifiée par PCR pour la borner des deux côtés par des sites Pacl à l'aide des amorces suivantes : PACI-UP (5'- > 3') : ATCGTTAATTAAAACAGTAGTTGACAATTAAACATTGGC SEQ ID No. 307 PACI-DOWN (5'- > 3') : ATCGTTAATTAAGTTGAAAAAAGGGGCC SEQ ID No. 308 Ce fragment amplifié a été ensuite purifié et coupé par PacI puis assemblé au fragment PacI contenant l'origine R6K gamma ACpG décrite dans l'exemple 7. Après transformation de ce mélange de ligation dans la souche GT97 (qui exprime la protéine pi) et sélection sur milieu Zl > FastMediaZeo, l'analyse des clones recombinants obtenus a révélé deux orientations possibles du fragment PacI-PacI contenant l'origine R6K gamma ACpG. L'orientation retenue dans le pSh ACpG est représentée en Figure 16. EXEMPLE 9 : Assemblage d'un vecteur plasmidique entièrement dépourvu de CpG exprimant le gène de résistance à la zéocine et le gène de la ss-galactosidase chez E. coli. Le vecteur pSh ACpG décrit dans l'exemple 8 (Figure 16) a été utilisé pour insérer le gène synthétique LacZ dépourvu de CpG entre les sites EcoRI et Nhel. Pour cela des oligonucléotides "linker", compatibles EcoRI et Ncol, contenant une séquence consensus de site de fixation des ribosomes d'E. coli ont été hybridés et clonés avec le fragment LacZilCpG NcoI-NheI du pMODl LacZACpG entre les sites EcoRI et NheI du vecteur pMOD1 EM2K ShACpG. Oligonucléotides"linker"utilisés : rbs-l (5'- > 3') : AATTCTGAGGAGAAGCT SEQ ID No. 309 rbs-2 (5'- > 3') : CATGAGCTTCTCCTCAG SEQ ID No. 310 La transformation de ce mélange de ligation dans la souche GT97 (qui exprime la protéine pi) et la sélection sur milieu FastMediaZeo Xgal ont permis l'obtention des clones recombinants contenant le vecteur pSh-LacZACpG (Figures 15 et 17). Ce vecteur co-exprime, sous la dépendance du promoteur bactérien EM2K, en système d'opéron artificiel les gènes ShACpG et LacZACpG. EXEMPLE 10 : Obtention d'une souche d'E. coli exprimant la protéine mutante pil l 6 et portant une délétion dans le gène dcm. Le gène pir codant pour la protéine pi indispensable à l'initiation de la réplication de l'origine lt > R6K gamma ainsi que que le gène muté pirl l 6 conduisant à une augmentation du nombre de copies des plasmides R6K gamma ont été introduits sous une forme fonctionnelle dans diverses souches d'E. coli K12 par différents groupes. Des souches de ce type peuvent être obtenues auprès du E. coli Genetic Stock Center (http : //cgsc. biology. yale. edu), et sont aussi commercialement disponibles auprès d'entreprises spécialisées dans la fourniture de matériel biologique pour la recherche. C'est le cas par exemple des souches pirl (perl 16) et pir2 (pir sauvage) proposées par la société Invitrogen dont les produits peuvent être achetés dans tous les pays européens. La souche GT 97 de lignée K12, de génotype Jlac769 hsdR514 endA7 recAl codBA uidA (flL. pir 116 (disponible auprès de InvivoGen), a été choisie pour sa rusticité, la constance des préparations d'ADN des plasmides R6K gamma et ses niveaux élevés de compétence parmi plusieurs souches K12 pif de génotype distinctif pour quelques gènes. L'introduction d'une délétion dans le gène dcm de la souche GT 97 a été réalisée de la façon suivante : Deux régions d'ADN de 1, 8 kb et 1, 5 kb, bordant respectivement le codon d'initiation ATG (fragment A) et le codon stop TGA (fragment B) du gène dcm ont été amplifiés par PCR. Le fragment A a été amplifié avec le couple d'amorces OLdcmAF 1 (TTTTGCGGCCGCTTGCTGCGCCAGCAACTAATAACG ; SEQ ID No. 311) et OLdcmAR (CCTTGGATCCTGGTAAACACGCACTGTCCGCCAATCGATTC ; SEQ ID No. 312) et le fragment B a été amplifié avec le couple d'amorces OLdcmBF (TTTTGGATCCTCAGCAAGAGGCACAACATG ; SEQ ID No. 313) et OLdcmBR (TTTTCTCGAGAAACGGCAGCTCTGATACTTGCTTC ; SEQ ID No. 314). Les sites de restriction pour les enzymes Not ! (GCGGCCGC) BamHI (GGATCC) et XhoI (CTCGAG) ont été introduits dans les amorces afin d'associer le fragment A et le fragment B entre eux en formant un élément génétique borné par les sites Not ! et Xhol. La région du gène dcm est ainsi reconstituée en créant une délétion qui s'étend de la position +3 après l'ATG à la position-14 avant le TGA. Cet élément génétique a été cloné dans pKO3 (Link A. J., Phillips D. et Church G. M. (1997) J Bacteriol 179,6228-37), vecteur développé pour le remplacement d'allèle chez Escherichia coli à réplication thermosensible entre les sites Not ! et SalI pour donner le plasmide désigné pK03Adcm. Ce plasmide a été co-transformé dans la souche GT97 avec un plasmide qui exprime la protéine RecA (pFL352). Un transformant contenant les deux plasmides a été cultivé à une température non permissive (42 C) en présence de chloramphénicol pour sélectionner des clones qui ont intégré par recombinaison homologue le pK. 03Adcm dans le chromosome bactérien. Un sous clone résistant au chloramphénicol à 42 C a ensuite été cultivé à 30 C sur un milieu contenant une forte concentration de saccharose (5%) pour contre-sélectionner les souches qui après un deuxième événement de recombinaison homologue ont échangé la région chromosomique du gène dcm avec le fragment homologue cloné dans le plasmide. La délétion introduite dans le clone retenu (GT106) a été vérifié par PCR avec le couple d'amorces OldcmAF et OldcmBR générant un fragment d'une taille inférieur à celle obtenue avec la souche parentale et par une PCR avec l'amorce OldcmBR et une amorce positionnée à l'extérieur de la région échangée (OldcmCF TTTTGCGGCCGCGTTGCGGTATTACCCTTGTC ; SEQ ID No. 315). z : l Le génotype dcm- de la souche GT106 a été confirmé en introduisant dans celle-ci et dans GT106 un plasmide contenant un site de restriction de l'enzyme SexAI sujet à la méthylation dcm. Le plasmide purifié à partir de GT106 est clivé par SexAI alors qu'il est résistant à l'enzyme quand il est purifié à partir de GT97. Cette dernière souche désignée GT106 présente les mêmes caractéristiques de croissance de la souche parentale GT97 et comme attendue aucune modification négative de la quantité des ADN D des plasmides R6K gamma n'a été observée, seule la qualité des ADN estimée par l'absence de méthylation des cytosines des sites dcm a été améliorée. La souche GT106 sera disponible auprès de la société Invivogen à compter du jour du dépôt de cette demande de brevet. REVENDICATIONS 1. Méthode pour l'obtention d'un gène qui est dépourvu de CpG tout en étant exprimable chez E. coli, caractérisée en ce que l'on synthétise un enchaînement polynucléotidique en suivant l'enchaînement d'acides aminés d'une protéine qui peut être exprimée par E. coli, et en attribuant à chaque acide aminé un codon nucléotidique choisi parmi ceux qui, selon le code génétique, et en tenant compte de la dégénérescence de ce code, correspondent à cet acide aminé tout en éliminant de ce choix : - les codons ACG (Thr), CCG (Pro), GCG (Ala), TCG (Ser), CGA (Arg), CGC ( Arg), CGG (Arg), CGT (Arg), ATA (Ile), CTA (Leu), GTA (Val) et TTA (Leu), et - les codons finissant par un C quand le codon qui le suit directement commence par un G 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite protéine est codée par un gène de résistance à un antibiotique. 3. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite protéine est codée par lacZ. 4. Gène d'au moins 250 pb, susceptible d'être obtenu par la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 5. Gène dont la séquence comprend la séquence SEQ ID ? 1 de la position 3 à la position 374, la séquence SEQ ID ? 3 de la position 3 à la position 1025, la séquence SEQ ID ? 5 de la position 3 à la position 422, la séquence SEQ ID ? 7 de la position 3 à la position 599. 6. Gène dont la séquence comprend la séquence SEQ ID ? 9 de la position 3 à la position 3056. 7. Promoteur, caractérisé en ce que sa séquence comprend la séquence SEQ ID Null. 8. Unité transcriptionnelle, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un gène selon la revendication 6 et au moins un promoteur selon la revendication 7. 9. Utilisation d'un gène selon la revendication 5 en tant que gène de sélection. 10. Utilisation d'un gène selon la revendication 6, ou d'une unité selon la revendication 8, en tant que gène rapporteur. 11. Origine de réplication pour plasmide, caractérisée en ce que sa séquence correspond à celle de l'origine de réplication R6K gamma dans laquelle chaque G des CpG de la région répétée du core a été remplacé par un A, un C ou un T, ou chaque C des CpG a été remplacé par un G, un A ou un T. 12. Origine de réplication selon la revendication 11, caractérisée en ce que sa séquence comprend la séquence SEQ ID ? 12 ou la séquence SEQ ID ? 13. 13. Origine de réplication selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce que la séquence de fixation de la protéine pi est répétée 5 ou 6 fois. 14. Plasmide comprenant une origine de réplication selon l'une quelconque des revendications 11 à 13. 15. Plasmide selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un gène selon l'une quelconque des revendications 4 à 6. 16. Plasmide selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un promoteur selon la revendication 7. 17. Plasmide selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une unité transcriptionnelle selon la revendication 8. 18. Plasmide selon l'une quelconque des revendications 14 à 17, caractérisé en qu'il comprend en outre un terminateur de transcription sans CpG. 19. Plasmide selon l'une quelconque des revendications 14 à 18, caractérisé en qu'il est entièrement dépourvu de CpG. 20. Plasmide de séquence SEQ ID ? 14. 21. Cellule transformée par au moins un élément sélectionné parmi le groupe constitué par les gènes selon les revendications 4 à 6, le promoteur selon la revendication 7, l'unité transcriptionnelle selon la revendication 8, les origines de réplication selon les revendications 11 à 13, les plasmides selon les revendications 14 à 20. 22. Cellule transformée selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un gène codant pour une protéine pi. 23. Cellule transformée selon la revendication 21 ou 22, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule E. coli. 24. Gène dcm délété de la position +3 après l'ATG à la position-14 avant le TGA 25. Cellule comprenant un gène codant pour la protéine pi, caractérisée en ce qu'elle est mutée dans le gène dcm selon la revendication 24. 26. Méthode pour la réplication de plasmides tels que définis dans l'une quelconque des revendications 14 à 20, caractérisée en ce qu'on transforme une cellule selon la revendication 25 avec un plasmide selon l'une quelconque des revendications 14 à 20, et ce qu'on place la cellule transformée dans des conditions adaptées à la réplication de ce plasmide. 27. Kit de production de plasmides tels que définis dans l'une quelconque des revendications 14 à 20, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cellule selon la revendication 25.