Brevet FR2830854A1 — publié le 20030418

L'invention concerne des microrganismes capables de dégrader le méthyl-tert-butyl éther. Elle s'applique particulièrement à l'industrie du traitement de l'eau. Il est connu que le méthyl-tert-butyl éther-désigné ci-après sous le terme de MTBE- est un des éthers qui peut être utilisé comme additif oxygéné dans les essences sans plomb dans le but d'augmenter leur indice d'octane. L'utilisation croissante d'additifs comme le MTBE entraine des volumes importants stockés et transportés, en mélange dans les essences notamment. Il est donc nécessaire de connaitre le devenir de ce composé en cas de déversement accidentel conduisant à une pollution des sols et des eaux souterraines ou de surface. Le MTBE est un éther produit par condensation du méthanol sur l'isobutène. Sa structure, qui comporte une liaison éther ainsi qu'un carbone tertiaire, est de nature à le rendre résistant à la biodégradation par les microorganismes présents dans l'environnement. La littérature récente relative à la biodégradation des éthers d'alkyle utilisés dans les essences indique que le métabolisme de ces composés dans l'environnement n'est pas un phénomène commun et qu'il est relativement lent, tant en conditions aérobies qu'anaérobies. La Demanderesse avait isolé et décrit dans le brevet FR-A-2.787.783 une bactérie, Gordonia terrae 1-2194, pour sa capacité à pousser sur ETBE comme source de carbone et d'énergie. Cette bactérie dégradait l'ETBE en tertio-butanol (TBA). Cette bactérie s'était également avérée capable de dégrader le MTBE en présence d'un substrat de croissance carboné. Néanmoins, que le composé à dégrader soit l'ETBE ou le MTBE, du TBA était formé dans le milieu de croissance. Une deuxième bactérie devait donc être mise en #uvre pour une épuration totale des effluents à traiter. Trois bactéries différentes ont été isolées et sont capables de pousser sur TBA comme source de carbone et d'énergie. Il s'agit selon le brevet FR-A-2.800.748 de B.cepacia 1- 2052, Alcaligenes sp. 1-2561 et Mycobacterium sp. I-2562. Il en ressort qu'il est nécessaire de trouver et d'identifier de nouveaux microorganismes capables de biodégrader le MTBE et d'étudier leur mise en #uvre dans des procédés de traitement de l'eau permettant d'abaisser significativement les concentrations résiduelles en MTBE d'eaux résiduaires urbaines ou industrielles ou de nappes aquifères contaminées, désignées sous le nom général d'effluents, contaminées par ce produit. Une des nouvelles bactéries isolée par la Demanderesse et permettant de dégrader le tertio-butanol (TBA) en solution dans l'eau, Mycobacterium sp. 1-2562, s'est avérée capable de dégrader également le MTBE en solution dans l'eau. Un fait notable est que Mycobacterium sp. 1-2562 est capable d'utiliser le MTBE comme seule source de carbone et d'énergie. Un des objectifs de l'invention est de décrire les nouvelles potentialités de cette bactérie capable de dégrader le MTBE contenu en solution dans l'eau, afin qu'elle soit utilisée pour le traitement des eaux polluées. De manière plus détaillée, l'invention concerne une nouvelle souche bactérienne, isolée de l'environnement, qui est capable de dégrader le MTBE de façon complète sans accumulation d'intermédiaire de dégradation. Cette nouvelle bactérie déposée à l'Institut Pasteur (CNCM de l'Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS CEDEX 15) est Mycobacterium sp. I-2562. Plus précisément, l'invention décrit un procédé de traitement d'effluents aqueux contenant au moins un éther : méthyl tertio butyl éther (MTBE) afin de réduire la concentration dudit éther, caractérisé en ce qu'on fait croître en conditions aérobies une bactérie Mycobacterium sp. I-2562 en présence d'un substrat de croissance contenant au moins le dit éther et on fait dégrader le dit éther par ladite bactérie jusqu'aux produits ultimes de dégradation, le dioxyde de carbone et l'eau. Selon une caractéristique de l'invention, les effluents aqueux peuvent être un aquifère contenant au moins du MTBE et dans lequel on introduit sous la forme adéquate la bactérie Mycobacterium sp. I-2562 afin de réduire la concentration de MTBE dans l'aquifère. Selon une autre caractéristique, on peut ajouter au substrat de croissance de l'extrait de levure dans des proportions comprises entre 10 et 200 mg/L. La bactérie a été isolée de boues activées collectées à une station d'épuration d'eaux résiduaires urbaines, qui ont été traitées selon des techniques d'enrichissement en microrganismes spécifiques. La souche bactérienne résultante a été isolée après enrichissement spécifique sur tertio-butanol (TBA) et testée en culture pure pour sa capacité à dégrader le MTBE. Dans ces expérimentations, il faut noter que le MTBE peut être fourni comme seule source de carbone mais des additifs nutritionnels peuvent être rajoutés au milieu de croissance pour accélérer la croissance sur MTBE de cette nouvelle bactérie. Des ~%aT >a V % r concentrations en MTBE élevées, par exemple au plus égales à 2 g/L sont dégradées par la nouvelle bactérie à des taux pouvant aller jusqu'à 100% . Mycobacterium sp. 1- 2562 est également capable de dégrader des concentrations très faibles en MTBE. On a obtenu d'excellents résultats avec des concentrations en MTBE dans l'effluent aqueux comprises entre 0,05 mg/L et 200 mg/L. La mise en #uvre de ces bactéries pour le traitement en continu d'effluents pollués par du MTBE peut être réalisée ,par exemple dans un biofiltre où les bactéries sont fixées sur un support minéral ou organique ou bien elles peuvent être ajoutées comme inoculum à des boues de station d'épuration, ou dans tout autre système adapté au traitement des eaux et des sols (biobarrière). Plus précisément, on peut faire développer la bactérie sur un système de biofiltre ou de biobarrière de volume adéquat, on introduit les effluents contenant ledit éther en présence d'air ou d'oxygène dans le biofiltre ou dans la biobarrière à un débit d'alimentation en MTBE inférieur à 30 mg/L de biofiltre et par heure et on soutire l'effluent avec une concentration réduite en ledit éther. L'invention sera mieux comprise par les exemples suivants donnés à titre illustratif ainsi que par les figures, parmi lesquelles : - La figure 1 illustre la croissance de Mycobacterium sp. I-2562 sur un milieu minéral en présence de MTBE comme seule source de carbone. - La figure 2 représente l'effet de l'addition d'extrait de levure sur la croissance de Mycobacterium sp. 2562 sur MTBE comme seule source de carbone. - La figure 3 montre la croissance de Mycobacterium sp. I-2562 sur différentes concentrations élevées en MTBE en présence d'extrait de levure (100 mg/L). EXEMPLE 1 Croissance de Mycobacterium sp. 1-2562 sur un milieu minéral en présence de MTBE comme seule source de carbone On effectue une préculture de la bactérie Mycobacterium su.1-2562: on ensemence la souche Mycobacterium sp. I-2562 sur milieu minéral salin MM supplémenté en tertiobutanol ou TBA à 1 g/L comme source de carbone et d'énergie. Le milieu MM a la composition suivante : KH2P04 1,4 g K2HP04 1,7 g - NaN03 ..................................................... 1,5 g MgS04, 7H20 .......................................... 0,5g - CaCl2, 2H20 0,04 g - FeCl3, 6H2O 0,012 g - Solution concentrée de vitamines ............. 1 mL - Solution concentrée d'oligoéléments ........ 1 mL - H20 ........................................................ q.s.p.1litre La solution concentrée de vitamines a la composition suivante pour 1 litre d'eau distillée : - Biotine 200 mg - Riboflavine ................................................ 50 mg - Acide nicotinamique ................................. 50 mg - Panthoténate 50 mg - Acide p-aminobenzoïque .......................... 50 mg - Acide folique 20 mg - Thiamine 15 mg - Cyanocobalamine ..................................... 1,5 mg La solution concentrée d'oligoéléments a la composition suivante pour 1 litre d'eau distillée : - CUS04, 5 H20 0,1 g - MnS04, 2H20 1 g - ZnS04,7 H20 .......................................... 1 g - AlCl3, 6H2O 0,4 g NiCl2,6 H2O 0,25 g H3BO3 ....................................................... 0,1 g - CoCl2, 6 H2O 1 g - Na2Mo04, 2H20 ........................................ 1 g - Na2W04, 2H20 1 g Après croissance, cette préculture est centrifugée, lavée avec du milieu MM pour enlever toute trace de TBA résiduel et le culot bactérien ainsi obtenu est utilisé pour ensemencer 50 mL de milieu MM auquel on ajoute du MTBE à une concentration finale d'environ 70 mg/L dans une fiole d'Erlenmeyer d'une contenance de 500 mL fermé avec un bouchon téflonné afin d'éviter toute perte de MTBE au cours de la croissance. Un prélèvement est effectué au temps t=0 pour une mesure de la densité optique à 600 nm (D. O. 600 nm) et un dosage du MTBE au départ par analyse en chromatographie en phase gazeuse (CPG). La fiole est ensuite incubée à 30 C dans un agitateur rotatif. Un prélèvement pour la mesure de la D.O.600 nm ainsi qu'un dosage du substrat et de ses éventuels produits de dégradation est effectué à intervalle régulier. Lorsque tout le MTBE de départ a été consommé, une deuxième addition de MTBE est réalisée à t = 80 heures et seul le suivi de la mesure de la DO600 nm est alors effectué dans cette deuxième partie de l'expérimentation. Le résultat de cette expérimentation est présenté dans la figure 1 qui montre en ordonnée la concentration résiduelle en mg/L de trois constituants (MTBE, TBA, TBF) ainsi que la densité optique en fonction du temps, en abscisse. Comme on le voit sur cette figure, la première addition de MTBE se traduit par une croissance de la bactérie Mycobacterium sp.l-2562. Le MTBE est dégradé en partie en tertio-butyl formiate (TBF) et en tertio-butyl alcool (TBA). Ces deux composés sont ensuite utilisés comme substrat de croissance et on obtient une augmentation de la DO pendant leur consommation. Quand il ne reste plus de composé carboné, la DO baisse légèrement, ceci est classiquement observé en fin de croissance des bactéries. Une deuxième addition de MTBE permet alors la reprise de la croissance. Cet exemple montre bien que Mycobacterium sp. I-2562 utilise le MTBE comme seule source de carbone et d'énergie. Aucun autre substrat carboné n'est nécessaire. Les produits intermédiaires accumulés sont ensuite eux-même dégradés. La minéralisation du MTBE peut donc avoir lieu sans présence d'un autre substrat carboné et en absence d'une autre souche dégradant le TBA et le TBF. EXEMPLE 2 Effet de l'addition d'extrait de levure sur la croissance de Mycobacterium sp. 1- 2562 sur MTBE comme seule source de carbone On a voulu tester si l'addition d'une faible quantité d'extrait de levure dans le milieu de culture pouvait permettre une utilisation plus rapide du MTBE fourni comme seule source de carbone à Mycobacterium sp.l-2562. Une préculture de la bactérie Mycobacterium sp. I-2562 est réalisée dans les mêmes conditions que celles décrites dans l'exemple 1. On prépare 50 mL de milieu MM contenant de l'extrait de levure à une concentration finale de 100 mg/L dans une fiole d'Erlenmeyer à bouchon vissé et téflonné et on ajoute du MTBE à une concentration similaire à celle décrite dans l'exemple 1. Comme décrit dans l'exemple 1, après ensemencement du milieu de culture on suit la croissance et le devenir du substrat. Le résultat de cette expérimentation est présenté sur la figure 2 qui montre, en ordonnée, la concentration résiduelle en mg/L des trois constituants (MTBE, TBA, TBF) ainsi que la densité optique avec ou sans MTBE, en fonction du temps en abscisse. Comme on le voit sur cette figure, et par comparaison avec le résultat de l'exemple 1, l'addition d'une faible quantité d'extrait de levure permet d'augmenter la vitesse de dégradation du MTBE. Alors que dans l'exemple précédent, une durée d'incubation de la culture de 288 heures était nécessaire pour dégrader totalement le MTBE (c'est-àdire, le MTBE lui-même et ses intermédiaires de dégradation que sont le TBF et le TBA), une durée bien moindre, égale à 168 heures, est nécessaire en présence d'extrait de levure pour obtenir le même résultat. On notera que, dans le témoin de l'expérimentation qui est constitué par une fiole de milieu MM supplémenté avec de l'extrait de levure à la même concentration que dans l'essai (100 mg. L) ensemencée avec la souche Mycobacterium sp. I-2562 mais sans addition de MTBE, aucune croissance n'est observée. Ce qui prouve bien que la croissance de la bactérie Mycobacterium sp. I-2562 est bien exclusivement due à sa capacité de croissance sur MTBE. EXEMPLE 3 Croissance de Mycobacterium sp. 1-2562 sur différentes concentrations élevées en MTBE en présence d'extrait de levure (100 mg.L-1) On a voulu tester les capacités de croissance de la bactérie Mycobacterium sp. I-2562 sur des concentrations plus élevées de MTBE. L'expérimentation est la même que celle décrite dans l'exemple 2 , c'est-à-dire effectuée sur du milieu MM supplémenté avec de l'extrait de levure à 100 mg/L. On ensemence trois fioles d'Erlenmeyer de 1 L à bouchon téflonné et vissé contenant 100 mL de milieu MM supplémenté en extrait de levure avec une préculture préparée comme dans l'exemple 1. On ajoute à deux de ces fioles du MTBE à 200 ou à 400 mg/L. La troisième de ces fioles ne contient pas de MTBE et est le témoin de l'expérimentation sur extrait de levure seul. On effectue un prélèvement pour mesurer la DOsoo nm initiale. Ces cultures sont incubées à 30 C sur un agitateur rotatif. Des prélèvements sont effectuées régulièrement pour le suivi de la croissance par mesure de la DOsoo nm Du MTBE est ensuite ajouté à intervalles réguliers au milieu de culture à raison de 100 mg/L. Le résultat de cette expérimentation est montré dans la figure 3 qui représente en ordonnée la densité optique à 600 nm à différentes concentrations de MTBE en présence d'extrait de levure en fonction du temps en heures, en abscisse ainsi que la densité optique en présence d'extrait de levure seul. Sur cette figure, les additions successives de MTBE à 100 mg/L sont figurées par des flêches. Cette courbe montre que la croissance est bien liée à l'addition de MTBE dans le milieu de culture. Sur cette figure, on voit que l'addition de concentrations plus élevées se traduit par un temps de latence avant croissance qui est important. Il est d'une centaine d'heures à une concentration en MTBE de 200 mg/L, et d'environ 200 heures à une concentration en MTBE de 400 mg/L. Par ailleurs, il est notable que la souche Mycobacterium sp. 1- 2562 est capable de se développer même à des concentrations élevées de MTBE. Comme dans l'exemple 2, on n'observe aucune croissance sur extrait de levure seul. Revendications 1 Procédé de traitement d'effluents aqueux contenant au moins un éther, le méthyl tertio butyl éther (MTBE) afin de réduire la concentration dudit éther, caractérisé en ce qu'on fait croître en conditions aérobies une bactérie Mycobacterium sp. I-2562 en présence d'un substrat de croissance contenant au moins le dit éther et on fait dégrader le dit éther par ladite bactérie jusqu'aux produits ultimes de dégradation, le dioxyde de carbone et l'eau. 2 Procédé selon la revendication 1 dans lequel les effluents aqueux sont un aquifère contenant au moins du MTBE et dans lequel on introduit sous la forme adéquate la bactérie Mycobacterium sp. 1- 2562 afin de réduire la concentration de MTBE dans l'aquifère. 3 Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 dans lequel on ajoute au substrat de croissance de l'extrait de levure, dans des proportions comprises entre 10 et 200 mg/L. 4 Procédé selon d'une des revendications 1 à 3 dans lequel la concentration en MTBE dans les effluents aqueux à traiter est au plus égale à 2 g/L et de préférence comprise entre 0,05 mg/L et 200 mg/L. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 dans lequel on fait développer la dite bactérie sur un système de biofiltre ou de biobarrière de volume adéquat, on introduit les effluents contenant le dit éther en présence d'air ou d'oxygène dans le biofiltre ou la biobarrière à un débit d'alimentation en MTBE inférieur à 30 mg/L de biofiltre et par heure et on soutire l'effluent avec une concentration réduite en le dit éther.