Brevet FR2822701A1 — publié le 20021004

L'invention concerne essentiellement l'utilisation d'un extrait de l'algue Phaeodactylum, en particulier de l'algue Phaeodactylum tricornutum, comme agent cosmétique favorisant l'activité du protéasome des cellules de la peau, en particulier des kératinocytes, des fibroblastes ou des mélanocytes, de préférence humains ainsi qu'une composition cosmétique le contenant, et un procédé de soin cosmétique. L'invention concerne encore essentiellement l'utilisation de l'extrait de l'algue Phaeodactylum, en particulier Phaeodactylum tricornutum, pour la fabrication d'une composition cosmétique destinée à protéger la peau contre les effets néfastes d'une exposition aux UV, ou à prévenir et/ou retarder l'apparition des effets du vieillissement cutané. La recherche de moyens de lutte contre le vieillissement de l'homme mobilise de nos jours un grand nombre de chercheurs. C'est en particulier le cas dans le domaine de la cosmétique où l'on cherche à lutter contre, ou au moins à ralentir, l'apparition des effets apparents du vieillissement cutané, tels que les rides, la perte d'élasticité ou de couleur de la peau, etc. Les expositions plus ou moins prolongées aux radiations solaires, et principalement aux rayonnements ultraviolets sont aujourd'hui bien connues pour leurs conséquences néfastes, à moyen ou long terme. Bien que la pigmentation de la peau protège contre les UVA (longueur d'onde 320 à 400 nanomètres) de manière immédiate mais aussi retardée en ce qui concerne les UVB (longueur d'onde de 290 à 320 nanomètres), une exposition prolongée aux rayonnements ultraviolets peut provoquer un érythème actinique, ou de l'élastose solaire, accélérer l'apparition des effets du vieillissement cutané tel que les rides, et parfois même conduire à la formation d'un cancer cutané. Il est admis que les UVA, dont la majorité traverse l'épiderme, entraînent la production d'espèces oxydantes comme les radicaux libres, des formes réactives de l'oxygène, qui réagissent à divers niveaux dans la peau en produisant des altérations des cellules cutanées, et en particulier des kératinocytes, des fibroblastes ou des mélanocytes. 11 en résulte des manifestations inflammatoires ou l'apparition d'un vieillissement actinique, en particulier sous forme de rides. Il est admis depuis longtemps déjà que la protection par voie topique de la peau contre les rayonnements UV est mise en oeuvre de manière classique par l'emploi de filtres physiques et/ou de filtres chimiques dans les produits solaires ou les produits destinés à lutter contre le vieillissement. On sait d'autre part d'après une publication de Friguet B. et al. dans Ann N. Y. Acad. Sci. 2000 ; 908 : 143-54 intitulée"Protein degradation by the proteasome and its implication in aging"que le protéasome est un complexe protéique multicatalytique connu pour son rôle au niveau de l'assainissement cellulaire et dont la fonction principale est d'effectuer dans les cellules l'élimination des protéines endommagées par oxydation. Au cours de cette élimination se forme des peptides qui sont ensuite métabolisés par la cellule. Ainsi, le protéasome débarrasse la cellule d'éléments inutiles qui entravent son fonctionnement optimal en s'accumulant, comme décrit par Petropoulos, Friguet et al. dans Journal of Gerontol. Biol. Sci., 2000 ; 55A, ? 5 B220-B227 intitulé"Increase of oxidatively modified protein is associated with a decrease of proteasome activity and content in aging epidermal cells". La présente invention a pour but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'un nouvel agent cosmétique capable de favoriser l'activité du protéasome des cellules de la peau, en particulier des kératinocytes, des fibroblastes ou des mélanocytes, de préférence humains. La présente invention a encore pour but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une nouvelle composition cosmétique capable de protéger la peau contre les effets néfastes d'une exposition aux UV, ou pour prévenir et/ou retarder l'apparition des effets du vieillissement cutané. La présente invention a encore pour but de résoudre le problème technique consistant en la fourniture d'un moyen complémentaire de celui de la protection par des filtres classiques UV notamment en secondant leur action en intervenant au niveau du bon fonctionnement cellulaire, en favorisant la détoxication des cellules. L'ensemble de ces problèmes techniques est résolu pour la première fois par la présente invention d'une façon simple, peu coûteuse, fiable, utilisable à l'échelle industrielle en cosmétique. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'un extrait de l'algue Phaeodactylum, en particulier de l'algue Phaeodactylum tricornutum, comme agent cosmétique favorisant l'activité du protéasome des cellules de la peau, en particulier des kératinocytes, des fibroblastes ou des mélanocytes, de préférence humains. Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne encore l'utilisation d'un extrait de l'algue Phaeodactylum, en particulier de l'algue Phaeodactylum Tricornutum, pour la fabrication d'une composition cosmétique destinée à protéger la peau contre les effets néfastes d'une exposition aux UV, ou à prévenir et/ou retarder le vieillissement cutané. Selon un troisième aspect, la présente invention couvre aussi une composition cosmétique favorisant l'activité du protéasome des cellules de la peau, en particulier des kératinocytes, des fibroblastes ou des mélanocytes, de préférence humains, ou en vue de protéger la peau contre les effets néfastes d'une exposition aux UV, ou de prévenir et/ou retarder le vieillissement cutané, caractérisée en ce qu'elle comprend comme l'un de ses agents actifs cosmétiques, un extrait de l'algue Phaeodactylum, en particulier de l'algue Phaeodactylum Tricornutum, éventuellement dans un excipient cosmétiquement acceptable, le soin de la peau étant de préférence un soin de prévention avant exposition aux rayonnements UV, ou un soin de la peau après exposition aux rayonnements UV. Selon un quatrième aspect, la présente invention couvre encore un procédé de soin cosmétique de la peau, caractérisé en ce qu'il comprend l'application topique sur les zones concernées de la peau d'une personne en ayant besoin, d'une quantité efficace d'un extrait de l'algue Phaeodactylum, en particulier de l'algue Phaeodactylum Tricornutum, en vue d'obtenir un effet préventif ou un effet réparateur selon que l'application topique est effectuée avant ou après exposition aux rayonnements UV. L'effet global ainsi obtenu est un effet anti-vieillissement sur lesdites zones de la peau, notamment en améliorant la fermeté cutanée, l'élasticité de la peau, en retardant l'apparition des rides ou en diminuant leur profondeur. Dans le cadre de l'un quelconque des aspects de la présente invention, l'extrait de l'algue Phaeodactylum, en particulier de l'algue Phaeodactylum Tricornutum, peut être présent dans une composition cosmétique comprenant de 0,01 % à 10 % environ, et en particulier de 0,1 % à 5 % environ, par rapport au poids total de la composition cosmétique finale. Il est rappelé que l'algue Phaeodactylum, en particulier l'algue Phaeodactylum Tricornutum, est une algue diatomée qui provient des climats tempérés. Cette algue est connue pour son taux de croissance élevé, ce qui permet à certaines industries comme l'agro-alimentaire de l'utiliser comme source rapide de lipides qui iront enrichir différents produits ou bien comme nourriture pour l'aquaculture. Selon un premier mode de réalisation, l'extrait est obtenu par extraction au moyen d'un solvant d'extraction polaire et/ou d'un solvant d'extraction apolare. L'extrait de l'algue Phaeodactylum, en particulier de l'algue Phaeodactylum tricornutum peut être, en particulier, obtenu par extraction au moyen d'un solvant d'extraction polaire et/ou d'un solvant d'extraction apolare, en particulier un alcool en Cl-C6 ou un mélange hydro-alcoolique, un polyalcool en C2-C6 tel que l'éthylène glycol, un solvant chloré tel que le chloroforme ou le dichlorométhane, un ester en C3-C6 d'acide organique tel qu'acétate d'éthyle, un alcane en C6-C tel que l'heptane, un éther en Cs-Cg comme par exemple l'éther diisopropylique. Selon une variante avantageuse de l'invention, cet extrait est un extrait obtenu par extraction de l'algue Phaeodactylum, en particulier de l'algue Phaeodactylum Tricornutum, avec un alcool ou un mélange eau/alcool éventuellement alcalinisé, ledit alcool étant choisi parmi le groupe consistant de l'isopropanol, de l'éthanol, et du méthanol. On choisira avantageusement comme alcool l'isopropanol ou l'éthanol. D'une manière générale avant toute opération d'extraction, l'algue est avantageusement congelée. De préférence la congélation est réalisée à une température située entrez et-20 C environ et pendant une durée comprise de préférence entre 1 et 7 jours environ. Cette étape préalable est avantageusement utilisée pour réaliser un choc thermique par contact avec le futur solvant d'extraction afin de faciliter la décantation de la silice (issue du squelette des cellules de l'algue). L'algue est ensuite mise en contact avec le solvant d'extraction. Selon une variante de réalisation avantageuse, l'algue congelée est plongée directement dans le solvant d'extraction chauffé. On réalise également avantageusement une macération de l'algue dans le solvant d'extraction à température ambiante. Selon une variante de réalisation avantageuse, on réalise une macération de l'algue à température ambiante et de préférence pendant une durée comprise entre 5 minutes et 80 minutes environ, et de préférence encore, pendant une durée comprise entre 20 minutes et 40 minutes environ. Selon encore une variante de réalisation avantageuse, l'extraction est réalisée sous reflux. Selon encore une autre variante de réalisation avantageuse, l'extraction peut-être réalisée sous atmosphère inerte, de préférence sous atmosphère saturée en azote. Ceci permet d'éviter en particulier une dégradation oxydative prononcée des molécules actives. Le conditionnement de cet extrait est réalisé avantageusement sous gaz inerte tel que de l'azote et des antioxydants peuvent être également ajoutés afin de protéger les molécules actives. Selon une variante de réalisation avantageuse, la quantité de solvant d'extraction utilisée est comprise entre 0,1 litre et 20 litres environ, de préférence comprise entre 2 litres et 10 litres environ, pour une quantité de 100 g d'algue, exprimée en poids sec d'algue. Selon encore une variante avantageuse, dans le cas d'une extraction avec un alcool ou un mélange hydroalcoolique alcalinisé, l'extrait de l'algue précité est obtenu après la succession des étapes suivantes dont certaines sont décrites ci-dessus : a) l'algue est congelée comme décrit précédemment puis plongée dans le solvant d'extraction b) Une macération de l'algue est effectuée c) le solvant d'extraction est alcalinisé jusqu'à un pH compris entre 10 et 14, de préférence à un pH égal à 13, par exemple avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium ou avec une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium, d) les insolubles sont éliminés de la phase alcoolique ou hydro-alcoolique, e) de l'eau distillée est ajoutée à la phase alcoolique ou hydro-alcoolique, f) la solution hydro-alcoolique ainsi obtenue est lavée par un procédé liquide/liquide avec un solvant apolaire non miscible avec la phase alcoolique ou hydro-alcoolique, tel que par exemple l'heptane, l'hexane ou le cyclohexane, g) la phase contenant le solvant apolare est éliminée, h) la phase hydro-alcoolique récupérée après élimination de la phase contenant le solvant apolare, est acidifiée jusqu'à un pH compris entre 1 et 3, de préférence à un pH égal à 2, par exemple avec une solution aqueuse d'acide sulfurique ou avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique, i) la solution obtenue après acidification subit une extraction liquide-liquide avec un solvant apolare non miscible avec la phase alcoolique ou hydro-alcoolique, tel que par exemple l'heptane, l'hexane ou le cyclohexane, j) la phase hydro-alcoolique est ensuite éliminée, k) la phase contenant le solvant apolaire récupérée après élimination de la phase hydro-alcoolique subit une évaporation afin d'obtenir une huile exempte de solvant apolare, cette huile étant l'extrait recherché selon l'invention. L'emploi d'un alcool alcalinisé, puis acidifié permet d'obtenir un extrait aux caractéristiques visuelles et olfactives acceptables dans des compositions cosmétiques (couleur jaune, et odeur acceptable). Selon un deuxième mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait de l'algue précité est obtenu par extraction de l'algue au CO2 supercritique. L'usage de ce solvant particulier implique que l'algue ait été au préalable lyophilisée. D'autres caractéristiques, buts et avantages de la présente invention apparaîtront clairement à la lumière de la description explicative qui va suivre faite en référence à plusieurs exemples de réalisation de l'invention, ainsi qu'à des essais d'activité comparatifs, et des exemples de formulation de compositions cosmétiques, donnés simplement à titre d'illustration et qui ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'invention. Dans les exemples, sauf indication contraire, les proportions données sont exprimées en pourcentage en poids. La température est en degré Celsius et la pression est la pression atmosphérique. Exemple 1 de l'invention-Obtention d'extraits selon l'invention de l'algue Phaeodactylum, en particulier de l'algue Phaeodactylum tricornutum. 1. 1- Extraction avec un solvant polaire, tel que l'isopropanol (IPA), suivant un premier procédé Selon le mode préféré du procédé, l'ensemble de l'extraction est réalisé sous atmosphère inerte (saturation en azote) afin d'éviter une dégradation prononcée des molécules actives. Dans cet exemple, on utilise 250 kg de biomasse (Phaeodactylum Tricornutum). Cette biomasse, qui est congelée à-200C, puis plongée dans de l'isopropanol (IPA) porté au reflux à 80-83OC, et ce, sous agitation. Le choc thermique permet de faciliter la décantation de la silice (issue du squelette des cellules de l'algue). La quantité de solvant utilisée est de 10 litres d'IrA pour 1 litre d'eau contenue dans la biomasse. Ainsi, pour un pourcentage de matière sèche de 30%, les 250 kg précités de biomasse se répartissent comme suit en une quantité de matière sèche de 75 kg et 175 kg d'eau. La quantité d'IrA utilisée est ici de (1750) kg. L'ensemble (biomasse + IPA) est maintenu au reflux pendant une demi-heure sous agitation à environ 80 C, avant d'être refroidi vers 50 C. Après le refroidissement de la biomasse et de l'IPA vers 50 C, l'ensemble est transféré dans un filtre de type GUEDU afin de réaliser la séparation biomasse épuisée/extrait d'algue solubilisé dans l'IPA. L'extrait est concentré dans un réacteur batch (facteur de concentration = 71,5). L'extrait concentré présente un aspect huileux. Cet extrait huileux est ensuite repris dans de l'IPA à froid à raison de 10 kg de solvant pour 1 kg d'huile. L'agitation est prolongée pendant 20 minutes. Le jus est ensuite filtré (ceci permet d'éliminer la boue collante résiduelle). Un traitement de décoloration et de désodorisation est réalisé en deux batchs dans un réacteur Schott de 80 litres et dure 30 minutes à température ambiante par addition de zéolithe et de charbon actif. La quantité de zéolithe (ABSENT 2000, fournisseur UOP) ajoutée est de 0,94 kg et celle de charbon actif (CXV, fournisseur CECA) est de 1,6 kg. Le rapport charbon sur zéolithe est de 1, 7. La zéolithe et le charbon sont ensuite éliminés par filtration sur papier. Des antioxydants (DL a-tocophérol à 0,05% de concentration finale en poids et palmitat d'ascorbyle à 0,05% de concentration finale en poids) sont incorporés par une solution mère dans de l'IPA. Le filtrat contenant les antioxydants est ensuite concentré en batch, sous gaz inerte tel que de l'azote jusqu'à l'obtention d'une huile de couleur brune. Cette huile sera nommée ci-après : l'extrait E1 selon l'invention de l'algue Phaeodactylum Tricornutum. 1.2-Extraction suivant un second procédé en deux étapes, solvant polaire/éthanol, puis extraction liquide/liquide, solvant polaire (hydro- éthanolique), solvant apolaire (heptane) L'extraction débute par une dispersion de 49,8 kg de masse sèche congelée issue de 250 kg de biomasse (Phaeodactylum Tricornutum), soit environ 20% en masse sèche dans 539 kg d'éthanol anhydre à 96%, alcalinisé par 9 kg de solution aqueuse sodique à 30, 5%. Après une macération de 30 minutes au reflux de l'éthanol et sous atmosphère azotée, l'ensemble est refroidi à 18 C. Les insolubles sont alors séparés par essorage sous azote et sont éliminés. Les 573,9 kg de filtrat sont additionnés de 151 kg d'eau distillée. Cette phase hydro-alcoolique est agitée lentement pendant 10 minutes pour être ensuite lavée grâce à un procédé liquide/liquide avec 162 kg d'heptane. L'épiphase heptanique de la partition liquide/liquide est éliminée. L'hypophase est récupérée car elle contient les acides gras sous forme saline, en raison de l'alcalinisation pratiquée au début de l'extraction. L'opération de lavage heptanique est répétée deux autres fois et l'hypophase est récupérée systématiquement. Les 720 kg d'hypophase ainsi obtenus sont acidifiés par ajout de 2,8 kg d'acide sulfurique pour amener le pH à une valeur de 2,2 et obtenir ainsi les acides gras sous forme acide. L'ensemble de la solution est agité 10 minutes sous azote pour être ensuite soumis à une extraction liquide/liquide avec un solvant apolaire, ledit solvant apolare étant constitué ici par une fraction de 158 kg d'heptane. L'opération de lavage à l'heptane est répétée cinq fois pour récupérer au total 697 kg de phase heptanique issus des cinq fractions contenant les acides gras libres. Cette phase évaporée à sec à l'évaporateur rotatif puis par distillation moléculaire fournit l'extrait actif selon l'invention soit une quantité représentant 0,65 kg d'huile. L'huile produite est un liquide homogène et présente une couleur jaune foncée. Cette huile sera nommée ci-après l'extrait E2 selon l'invention de l'algue Phaeodactylum Tricornutum. Exemple 2-Evaluation de l'effet d'un extrait selon l'invention, par exemple E2 de l'exemple 1-2 précité, comme agent favorisant l'activité du protéasome des cellules de la peau humaine, en particulier des kératinocytes en l'absence et en présence d'irradiation U. V. L'extrait de l'algue Phaeodactylum utilisé dans le présent exemple est l'extrait E2 obtenu par le procédé d'extraction précédemment décrit dans le cadre de l'exemple 1-2. Les études décrites ci-après ont été réalisées sur des kératinocytes humains normaux (KHN). L'action de l'extrait E2 selon l'invention sur les cellules de la peau est mesurée de deux manières différentes, soit à partir de 3 activités protéolytiques du protéasome, soit en évaluant la quantité de protéines oxydées qui se sont accumulées de manière plus ou moins importante en fonction de la variation de l'activité protéasomique. 1) Principe des tests 1.1) Mesure des 3 activités enzymatiques représentatives de l'activité du protéasome Le premier type de mesures concerne trois activités représentatives du protéasome : la chymotrypsine similaire, l'hydrolase post-glutamique et enfin la trypsine similaire. Elles sont de plus portées par 3 sites catalytiques différents. Chaque activité peptidase du protéasome est déterminée en utilisant un substrat peptidique fluorogène spécifique de chacune des activités, en présence et en l'absence d'un inhibiteur spécifique du protéasome. Le principe du dosage consiste alors à suivre au cours du temps l'augmentation de fluorescence due à la libération des fluorophores issus des peptides fluorogènes grâce à un spectrof ! uorimètre. 1.2) Mesure de la quantité de protéines oxydées Le second type de mesures est utilisé en complément des mesures d'activités enzymatiques pour évaluer par une méthode classique de détection, la quantité de protéines oxydées. Celle-ci varie en sens inverse de l'activité du protéasome, cette mesure permet ainsi de mesurer l'action de l'agent cosmétique selon l'invention sur l'activité du protéasome. La technique Oxyblot (western blot) employée pour la détection des protéines oxydées est mise en oeuvre de manière classique comme décrit par Leammli U. K. dans Cleavage of structural protéin during the assembly of the head of the bacteriophage T4 Nature, 1970,277, 680-685. La partie relative à l'immunodétection des protéines sur membrane employée dans cette technique bien connue a été, quant à elle, spécialement adaptée à partir de l'incubation par les anticorps. Elle est décrite au 2.6). Dans le cas d'une exposition aux UV, des cultures primaires de kératinocytes humains sont irradiés par des UVA et des UVB avec des doses respectivement de 10 joules/cm2 et de 0.05 joules/cm2. Ces valeurs sont constantes pour toutes les expériences. 1.3) Mesure de la quantité de protéines (protéasome) Parallèlement aux mesures d'activités effectuées par Oxyblot, une autre technique de détection de protéines est mise en oeuvre afin de déterminer systématiquement la quantité de protéines présentes dans chaque prise d'essai de chaque échantillon. Cette technique est connue sous le nom de méthode de Bradford. Elle est employée ici de manière classique comme décrit par Bradford, M., dans A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, z Anal. Biochem., 72,248 (1976). Cette technique est mise en oeuvre systématiquement du fait du protocole expérimental choisi pour les mesures d'activités. En effet, les expériences ci-après décrites sont effectuées à quantité de protéines constante avec des volumes de prise d'essai différents qui sont ensuite complétés à 200/. L1 (volume total constant). 2) Matériel et méthodes 2.1) Culture de kératinocytes humains normaux (KHN) Les cultures de kératinocytes humains normaux (KHN) sont réalisées à partir de prélèvements de peau. Le prélèvement est, dans un premier temps, rincé 4 fois dans du PBS (Phosphate Buffered Saline-Sigma) (tubes 50 mu). il est ensuite décontaminé en le trempant dans deux bains successifs d'éthanol à 70% pendant 3 secondes. Lorsque le prélèvement est décontaminé, il est placé dans une boîte de pétri contenant du PBS. On découpe alors des bandelettes de 1 mm de largeur en prenant soin d'éliminer un maximum de tissu adipeux et de derme. Les bandelettes sont placées au fur et à mesure dans une boîte de pétri contenant du PBS. Pour pouvoir récupérer les kératinocytes de l'épiderme, on place les bandelettes pendant 4h à 37 C dans une solution de trypsine à 25% dans du PBS. On dissocie ensuite le derme de l'épiderme par grattage des bandelettes au scalpel, les cellules épidermiques obtenues sont mises en suspension dans un tube contenant du milieu DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium-Gibco) + 10% de SVF (Sérum de veau foetal- Eurobio). Après homogénéisation de la suspension, on élimine la partie superficielle constituée de cellules de la couche cornée et on filtre sur un tamis. La partie filtrée est centrifugée pendant 5 minutes à 176 g. Le culot est repris avec du milieu KHN-D (DMEM + 10% SVF + hydrocortisone 0, 4 pg/ml + EGF 10 ng/ml (Epidermal Growth Factor) + toxine cholérique 10-9M). Les cellules sont comptées puis ensemencées à 15 x 10'cellules/flacon. Après 24 h de culture, le milieu est changé, les cellules sont rincées avec du PBS et on utilise pour la suite de la culture du milieu de prolifération K-SFM (Gibco). Les kératinocytes se repiquent de manière tout à fait classique, mais il est nécessaire de les repiquer à 60-70% de la confluence pour qu'ils gardent leurs capacités à proliférer. Ainsi, lorsque les cellules sont à 60-70% de la confluence, le milieu d'entretien est éliminé et le tapis cellulaire est rincé avec du PBS. Les cellules sont mises en présence de 3 ml d'une solution de trypsine-EDTA, puis lorsque les cellules se détachent, la trypsine est inhibée par du milieu avec 10% de SVF (Eurobio). La suspension cellulaire est homogénéisée, récupérée puis centrifugée à 20 g pendant 5 minutes à température ambiante. Le culot ainsi obtenu est repris avec du milieu seul. Pour l'entretien, l'ensemencement se fait comme précédemment à 106 cellules175 cm2 dans des flacons ventilés et conservés dans les conditions citées plus haut. La confluence est obtenue au bout d'une dizaine de jours et les cellules peuvent être amplifiées pendant 6 à 7 passages. Dans les cas où l'on souhaite tester l'activité d'une substance sur ces kératinocytes, on effectuera les tests à partir du milieu de culture avec kératinocytes, au moment de la confluence décrite cidessus. 2.2) Tampon de lyse : La préparation du tampon de lyse nécessite au préalable la préparation des solutions suivantes : # Tris-HCL 1,5M, pH=7,5 : 45,375g de Tris base (Sigma ; T1503) à dissoudre dans 200ml d'eau distillée, ajuster le pH à 7,5 avec HCI 12N puis compléter à 250ml = > Solution de saccharose à 1 M (Merck ; réf ; 7654) 8,55g de saccharose à dissoudre dans 25 ml d'eau distillée. = > Solution de MgSO4 à 2mM (Sigma ; réf. M7506) 0, 01g de MgSO4 à dissoudre dans 20ml d'eau distillée = > Solution de Triton X100 à 4% (Sigma ; réf. X100) 0, 8g de Triton X 100 à dissoudre dans 20ml d'eau distillée, puis aliquoter à 0, 5ml et conserver à-20 C # Solution de PMSF à 40mM (Sigma ; réfP7626) 14mg de PMSF à dissoudre dans 2ml d'éthanol absolu, aliquote à 50gui et conserver à-20 C # Solution de leupeptine à 0, 5mg/ml (Sigma ; réf L2884 ; conservé à -20 C). Aliquoter à 50 l et conserver à-20 C n Solution de DL-Dithiothréitol à 1M (Sigma ; réf. D0632 conservé à 4 C). 0, 154g de DL-dithiothréitol à dissoudre dans 1 ml d'eau distillée. Aliquoter à 10 l et conserver à-20 C. En vue de la préparation de 100ml de tampon de lyse, il faut tout d'abord réaliser la solution dite incomplète décrite dans le tableau 1 et aliquoter à 4, 39ml (c'est à dire diviser en petits volumes tous égaux à 4, 39ml) et conserver à-20 C : Tableau 1 Solution incomplète pour préparer le tampon de lyse Solutions finales Tris-HCl 5 mM pH= 7, 5 Saccharose 1 M 25 ml 2,25 M MgSO42 mM 10 ml 0,2 mM EDTA 500 mM 4ml 20 mM Eau distillée 48, 47 ml Le tampon de lyse ou solution dite complète est préparé extemporanément avec 4, 39ml de solution incomplète + 500j de Triton 100X à 4% + 10p. ! de DTT 1M + 50gel de leupeptine 0, 5mg/ml + 50de PMSF à 40mM. 2. 3) Dosage des protéines par la Méthode de Bradford La mise en oeuvre est classique et nécessite la préparation de la gamme étalon suivante : A partir d'une solution mère de BSA : 50ug/ml (BIORAD ; protéine standard ; réf. 500-0006). Dans chaque tube : on additionne 200ul de bleu de Coomassie G250. Ledit bleu est préparé extemporanément par dilution au 1/5 de la solution mère. Pour la préparation des échantillons, on récupère des cellules dans le tampon de lyse puis on les sonique avant de doser leur concentration en protéine. Si la concentration en protéine des échantillons est supérieure à 3mg/ml, il faut les diluer au 1/100, puis prendre 100ul d'extrait cellulaire dilué par 700psi d'eau et 200ul de bleu. Si la concentration est faible, il faut alors prendre 10ul d'extrait cellulaire avec 790ut d'eau et 200ul de bleu de Coomassie. Vortexer. Après 5 minutes d'attente, on effectue une lecture des résultats à 595nm avec un spectrofluorimètre FluoStar BMG Lesdits résultats sont reportés dans le tableau 2. TABLEAU 2 Dosage des protéines (méthode de Bradford) : Etalonnage Qté Prot. (fjg/tube) BSA (pi) H20 (pi) 00800 1 20 780 2 40 760 3 60 740 4 80 720 5 100 700 6120680 8 160 640 2.4) Préparation des échantillons en vue des essais 2.4. 1) Préparation des échantillons en vue d'un dosage d'activité Le principe général de culture, du traitement à base de l'extrait E2 et de l'irradiation par les UVA et UVB est décrit au schéma 1, en fin de description. Les KHN en culture selon 2.1) sont récupérés et lyses grâce à 2.2) à des temps différents selon l'expérience envisagée, c'est à dire avant ou après traitement par l'extrait selon l'invention et/ou avant ou après irradiation par les UV. Les protéasomes recherchés en vue d'être analysés sont présents dans le surnageant de ces lysats cellulaires. Les différents types d'échantillons sont les suivants : - Il = témoin + extrait E2 seul - 12 = témoin + extrait E2 avant U. V. - 13 = témoin + extrait E2 après U. V. Chaque volume de surnageant est divisé en trois fractions aliquotes à chaque fois et les fractions d'un même échantillon sont placées sur un lecteur microplaque. Les substrats peptidiques fluorogènes spécifiques de chaque activité sont rajoutés (en fonction de la quantité de protéines}. Les manipulations au spectrofluorimètre décrites ci-après sont effectuées avec un volume total constant mais avec des prises d'essais de volumes Vi différents pour chaque échantillon. Le fait de travailler en quantité de protéines constante pour des Vi différents implique de contrôler au préalable par la méthode de Bradford décrite au 2.3) la quantité de protéines introduites. On cherche ensuite à rapporter une quantité de protéines présente par mg de protéines introduites. 2.4. 2) Préparation des échantillons en vue d'un dosage pour la mesure des quantités de protéines oxydées On applique le même principe général de culture décrit au schéma 1. La technique de l'Oxyblot (Western blot) ou électrophorèse de protéines fait migrer les échantillons li sur le gel. Ils sont ensuite transférés sur une membrane qui est incubée avec l'anticorps désiré. Pour la mesure de la quantité de protéines oxydées, on effectue une incubation avec un anticorps polyclonal anti-dinitrophényl (anti-DNP) pour détecter les groupements carbonyles des protéines ayant réagi avant d'effectuer le test d'activité. 2.5) Dosage des activités enzymatiques du protéasome a) Préambule Pour le dosage des activités enzymatiques du protéasome, les KHN cultivés sont rincés deux fois avec du PBS puis chaque activité peptidase du protéasome est déterminée en utilisant un substrat peptidique fluorogène spécifique de chacune des activités, en présence et en absence d'un inhibiteur spécifique du protéasome, le MG 132 (N-Cbz-Leu-Leu-Leucinal). Les substrats peptidiques sont les suivants : Leu-Leu-Val-Tyr-aminométhylcoumarine (LLVY-amc) pour l'activité chymotrypsine similaire, Leu-Leu-Glu-ss-naphthylamine (LLEna) pour l'activité hydrolase post-glutamique et Leu-Ser-Thr-Arg-amc (LSTR-amc) pour l'activité trypsine similaire. Le principe du dosage consiste à suivre au cours du temps l'augmentation de fluorescence due à la libération des fluorophores aminométhylcoumarine (amc) ou ss-naphthylamine (na) issus des peptides fluorogènes grâce à un spectrofluorimètre. Pour mesurer l'effet des U. V. sur le protéasome, des kératinocytes humains normaux ou KHN en culture sont irradiés par des doses constantes d'UVA à 10J/cm2 et d'UVB à 0. 05J/cm2, puis ils sont récupérés et lyses à des temps différents après l'irradiation. b) Les trois activités protéolytiques du protéasome Les activités chymotrypsine similaire, Hydrolase postglutamique et Trypsine similaire sont mesurées à partir de protéasomes extraits des lysats cellulaires en utilisant les peptides fluorogènes comme substrat aux concentrations suivantes : LLVY-amc à 12.5 uM, LLE-na à 150 u ! VM et LSTR-amc à 40 uM. Pour chaque série de mesures, il est nécessaire de refaire une incubation avec le substrat fluorescent spécifique de chaque activité. Ces activités sont mesurées en parallèle avec un inhibiteur spécifique du protéasome : le MG132 (N-Cbz-Leu-Leu-leucinal) à 20 uM, afin d'évaluer la part d'activité indépendante du protéasome. 2.5. 1) Mode opératoire pour la détermination de l'activité LLVY (Chymotrypsine similaire) Son principe, qui est le suivant, est d'ailleurs identique aux réactifs près pour les trois activités. L'activité enzymatique dite chymotripsine similaire est l'activité similaire à la chymotrypsine, qui se traduit par une coupure après un acide aminé aromatique, ici la tyrosine. Protéasome (activité LLVY) N-Succinyl-LLVY-amc. N-Succinyl-LLVY + amc fluorescent Par réaction de clivage, le pigment fluorogène est liberé. Ainsi, une lecture au spectrofluorimêtre (FluoStar (BMG)) permet d'accéder dans un premier temps aux résultats bruts exprimés en unité de fluorescence par minute (U. F/min). Cette unité est arbitraire car elle est liée à l'appareil utilisé. Nous avons arbitrairement choisi d'exprimer l'activité du protéasome en pmol de amc libéré par min et par mg de protéines (protéasome) présentes dans l'échantillon. Pour cela, on dose au préalable dans chaque échantillon issu des cultures de KHN la quantité de protéines (protéasome) par la méthode de Bradford. Les expériences sont effectuées avec des volumes Vi différents, seul le volume réactionnel total reste constant et égal à 200) J. On réalise également au préalable une courbe d'étalonnage en amc afin de pouvoir corréler les résultats fournis par l'appareil sur un échantillon donné li et ceux pour lesquels la quantité de protéines est connue. On utilise pour cela les réactifs suivants : -Tampon TRIS 25mM pH 7, 5 -Pour la courbe d'étalonnage : 7-amino-4-méthylcoumarine (amc) (Sigma : A9891) Solution stock à 20mM (3, 5mg/1 ml DMSO) -Pour la mesure d'activité : Substrat fluorogénique : N-Succinyl- Leu-Leu-Val-Tyr-7-amido-4-Méthyl coumarine (Sigma : 56510) Solution stock à 10mM dans le DMSO On réalise une gamme d'étalonnage en amc. Pour cela on dilue la solution stock de amc à 4uM dans le tampon TRIS. Dans une plaque de 96 puits, on distribue chaque quantité en double. Faire un blanc avec 200ul de tampon TRIS. Puis lire les résultats au spectrofluorimètre à une longueur d'onde d'excitation de 350nm et une longueur d'onde d'émission de 440nm Les résultats obtenus pour la courbe d'étalonnage (droite de pente a) sont rapportés au tableau 3 ci-après : TABLEAU 3 COURBE D'ETALONNAGE en AMC Quantité de AMC. (lut) AMC ( l) TRIS ( l) 0 0 200 0,1 5 195 0,2 10 190 0,3 15 185 0,4 20 180 0 , 5 25 175 0 , 6 30 170 0 , 7 35 165 0 , 8 40 160 1, 0 50 150 Pour le dosage de l'activité LLVY, on introduit en double dans une plaque de 96 puits un volume fixe de lysat cellulaire (déterminé par la méthode de Bradford afin d'introduire à terme la même quantité de protéines à chaque fois). En pratique, c'est la concentration la plus faible en protéines des échantillons (qui doit correspondre à 20 g de protéines). On complète à 100ul avec du tampon TRIS. On réalise ensuite une incubation des échantillons en ajoutant 100 l du substrat petidique fluorogène de l'activité LLVY en le diluant préalablement à 25 M dans le tampon TRIS (pour une concentration finale de 12, 51uM). Puis la lecture des résultats est effectuée à l'aide du spectrofluorimêtre à une longueur d'onde d'excitation de 355nm et une longueur d'onde d'émission de 460nm au gain 40 toutes les 2 minutes et ceci pendant 30 minutes. Les résultats bruts sont exprimés en U. F./min, unité propre à l'appareil. Le dosage est réalisé sur un volume réactionnel constant de 200ul contenant un volume Vi de lysat cellulaire fixé en fonction des concentrations de protéines (protéasome) des lysats. La concentration des protéines dosées extemporanément est exprimées en (Jg/jjL A partir de la gamme étalon, l'activité peut être exprimée en pmol d'amc libéré/minute/mg de protéines grâce à la formule empirique suivante : Vitesse moy U. F/min (valeur fournie par l'appareil) x 200 x 10-6 X 10-6x1012 Protéine ug/ul (mesurée par Bradford) xVi. 10-3 x coefficient de la pente a (a=4,568. 104) Pour chaque échantillon li aliquoté, on cherche à déterminer la quantité de amc libéré et à l'exprimer en pmol/mn/mg de protéine. Pour cela, on utilise la courbe d'étalonnage. Le quotient entre la grandeur lue au spectrofluorimètre et la pente de ladite courbe nous donne un premier résultat intermédiaire exprimé en mol/l/min de protéines. Il suffit ensuite de multiplier cette valeur par le volume réactionnel final (200gel) et de diviser par le volume Vi de la prise d'essai de l'échantillon li à doser ainsi que par la quantité de protéines (jig) dosée extemporanément par la méthode de Bradford. Le résultat final peut alors être exprimé, aux coefficients multiplicateurs près, en pmol/min/mg de protéines. Ri = (N. Vt/Vi. Qi). coefficient N= Nbre de mole de protéines libérées par litre et par minute Vt = Volume réactionnel final (200 l) Vi = Volume d'une prise d'essai pour l'échantillon li (gl) Qi = Quantité de protéines (lit) dosée par la méthode de Bradford Si l'on applique la formule décrite ci-dessus, Ri représente la quantité de protéines (protéasome) recherchées exprimée arbitrairement en pmol/mn/mg de protéines (protéasome) introduites. 2.5. 2) Mode opératoire pour la détermination de l'activité LSTR (activité trypsine similaire) On étudie la réaction de clivage suivante : Protéasome (activité LSTR) Nt Boc LSTR-amc Nt Boc LSTR + amc fluorescent L'activité LSTR est accessible par une formule identique en réalisant au préalable un étalonnage en amc à partir des réactifs suivants : -Tampon TRIS 25mM pH 7, 5 -Pour la courbe d'étalonnage : 7-amino-4-méthylcoumarine (amc) (Sigma : A9891) Solution stock à 20mM (3, 5mg/1 mi DMSO) La lecture des résultats bruts est effectuée grâce au spectrofluorimètre réglé à une longueur d'onde d'excitation de 350nm et une longueur d'onde d'émission de 440nm. -Pour les mesures d'activité : Substrat fluorogénique : N-t-BOC-Leu-Ser- Thr-Arg7-7-amido-4-méthylcoumarine (Sigma : B4636) Solution stock à 10mM dans le DMSO Inhibiteur du protéasome : Mg132 (Z-Leu-Leu-Leu-CHO) (Affinity, ZW8440) Solution stock à 20mM dans le DMSO Les résultats obtenus pour la courbe d'étalonnage (droite de pente b) sont rapportés au tableau 4 ci-après : TABLEAU 4 Courbe d'étalonnage en amc Qté de AMC (jM) AMC (pl) TRIS (pl) 00200 0, 1 5 195 0, 2 10 190 0, 3 15 185 0, 4 20 180 0, 5 25 175 0, 6 30 170 0, 7 35 165 0, 8 40 160 1, 0 50 150 Pour les mesures d'activité, la lecture des résultats est faite avec le Fluostar (BMG) à 355nm (longueur d'onde d'excitation) et 460nm (longueur d'onde d'émission) au gain 30 toutes les 2 min et ceci pendant 30 min. On peut également accéder aux résultats par une autre formule empirique similaire à la précédente : Vitesse moy U. F./min (valeur fournie par l'appareil) x 200 x 10-'x 10-6 X 1012 Protéine ug/ul (mesurée par Bradford) x Vi. 10-' x coefficient de la pente b (b= 1, 728. 104) 2. 5. 3) Mode opératoire pour la détermination de l'activité LLE (activité hydrolase post-glutamique) On étudie la réaction de clivage suivante : Protéasome (activité LLE) N-CBZ-LLE-na---- N-CBZ-LLE + na fluorescent On réalise sur le même schéma un étalonnage cette fois par rapport au substrat ss-naphtylamine (na) à partir des réactifs suivants : -Tampon TRIS 25mM, pH =7, 5 -Pour la courbe d'étalonnage : ss-Naphtylamide (na) (Sigma : N8381) Solution stock à 20mM (5, 73mg/2ml DMSO) Les résultats sont recueillis grâce au spectrofluorimètre à une longueur d'onde d'excitation de 333nm et une longueur d'onde d'émission de 410nm. Les résultats obtenus pour la courbe d'étalonnage (droite de pente c) en na sont rapportés au tableau 5 ci-après : Tableau 5 Courbe d'étalonnage en na Qté de na (pM) na (pl) TRIS (pl) 00200 0, 1 5 195 0, 2 10 190 0, 3 15 185 0, 4 20 180 0, 5 25 175 0, 6 30 170 0, 7 35 165 0, 8 40 160 1, 0 50 150 -Pour les mesures d'activité : Substrat fluorogénique N-CBZ-Leu-Leu- Glu-ss-Naphtylamine (Sigma : C0788) Solution stock à 10mM dans le DMSO. Pour la lecture des mesures, on utilise un appareil FLUOstar (BMG) à 340nm (longueur d'onde d'émission) et 410nm (longueur d'onde d'excitation) au gain 83 toutes les 2 minutes pendant 35 minutes. En utilisant la même démarche que pour les activités précédentes, une mesure de l'activité LLE est alors accessible par la formule empirique suivante dans laquelle la quantité de protéine (protéasome) est exprimée en pmol de na libérée/minute/mg de protéines (protéasome) introduites : Vitesse moy U. F./min (valeur fournie par l'appareil) x 200 x 10 x 10-6 X 1012 Protéine ug/ul (mesurée par Bradford) x Vi. 10-' x coefficient de la pente c (c= 0, 966. 104) 2. 6) Détection de la quantité de protéines oxydées accumulées : 2. 6. 1) détection par OXYBLOT (Western Blot) Il s'agit de mettre en évidence les groupements carbonyles (marqueurs de l'oxydation) qui ont été introduits dans les chaînes protéiques par l'intermédiaire des espèces sensibles à l'action de l'oxygène (ROS pour Reactive Oxygen Species) ou bien à d'autres mécanismes d'oxydation tels que la glycation/glycoxydation ou bien la lipoperoxydation, selon un mécanisme site-spécifique. Le principe est le suivant. Les groupes carbonyles dans les chaînes réagissent avec du 2, 4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) pour donner un dérivé hydrazone. Les échantillons marqués au DNP sont séparés sur un gel de polyacrylamide par électrophorèse suivi d'un transfert sur une membrane de nitrocellulose comme pour un Western Blot classique. Ensuite la membrane est incubée en présence du premier anticorps spécifique de la molécule de DNP liée aux protéines possédant un groupement carbonyle. L'étape suivante est l'incubation avec l'anticorps secondaire (anti-lapin) qui est couplé à la peroxydase. La révélation se fait à l'aide des réactifs décrits au 2.6. 2)). 2.6. 2 : Protocole Tous les réactifs utilisés proviennent du kit OXYBLOT (Appligene-Oncor, Illkirch, France). A-Préparation des échantillons et électrophorèse Nous utilisons une quantité de protéines comprise entre 15- 20 ig provenant de 5 III de Iysats de kératinocytes, irradiés ou non. 10 RI de 2,4 dinitrophénylhydrazine sont ajoutés ainsi que 5 pj de SDS à 12 %, puis on laisse agir 15 min à température ambiante. Ensuite 7, 5 de solution neutralisante (solution fournie dans le kit) sont ajoutés. Les échantillons sont alors prêts à être déposés. L'électrophorèse des protéines à faible poids moléculaire est réalisée sur gel de polyacrylamide de 1 mm d'épaisseur à une concentration de 12,5%, en conditions dénaturantes et réductrices, en tampon discontinu selon la méthode de Laemmli (1970). Les gels à 12,5% de T (T=acrylamide+bis-acrylamide), 2,7% de C (C= (bisacrylamide/acrylamide) + bis-acrylamide) permettent de séparer les protéines d'une masse moléculaire variant de 20 à 120 kDa. L'appareil employé provient de la société Hoefer. Toutes les solutions nécessaires à l'élaboration des gels sont présentées ci-dessous : 1) Tampons et solutions utilisés pour la préparation des gels d'électrophorèse en conditions dénaturantes et réductrices, en tampon discontinu Solution de monomères : 40% acrylamide/Bis-acrylamide, 2,6% C (Biorad ; réf. 161-0148) Tampon de gel de résolution : Tris-HCI 1, 5 M, pH=8,8 Dissoudre 18,15g de Tris base (Sigma ; T1503) dans 100ml d'eau distillée, et ajuster le pH à 8,8 avec de l'HCI 12N Tampon de gel de concentration : Tris-HCL 0, 5M, ph=6,8 Dissoudre 6g de Tris base dans 100ml d'eau distillée, et ajuster le pH à 6, 8 avec de l'HCI 12N Tampon de migration 10X : Tris 0,25, pH=8,3, glycine 1, 92M ; SDS 1 % On utilise les réactifs suivants : 12g Tris base, 57,6g de glycine (Research Organics Inc ; 5037G) ; 40ml de SDS à 10% (Sigma ; L5750) et compléter à 400ml avec de l'eau distillée Ces solutions sont conservées à 4 C Persulfate d'ammonium (NH1) ~2Qss : (Sigma ; A1433 à 10% soit 100mg/m). La so ! ution est aliquotée et conservée à -20 C. Tampon d'échantillon réducteur 4X : 2, 5ml de Tris-HCI 0, 25M, pH=6, 8 ; 0, 4g de SDS 8% ; 2ml de Glycérol à 40% ; 1 ml de ss-mercaptoéthanol à 20% ; une pointe de spatule de Bleu de Bromophénol à 0,02%. Cette solution se conserve à température ambiante. Standards précolorés à bas poids moléculaires (Biorad ; réf. 161-0305). Ils sont composés de Phosphorylase B (104 kda), Bovine serum albumin (82 kda), Ovalbumin (48,3 kda), Carbonic anhydrase (33,4 kda), Soybean trypsin inhibitor (28,3 kda), Lysosyme (19,4 kda). Il) Gels d'électrophorèse Préparation du gel de résolution à 12, 5% T Tableau 6 Solutions Volumes pour #oncentration un gel (10ml) finale Solution de monomère 3,12 ml T ; 2,7% C Tampon de gel de résolution 2,5 ml 0,375 M SDS 10% 100 ul 0,1% Persulfate d'ammonium (10%) 70 ut 0, 07 % TEMED (Research Organic Inc ; 3009T) 10 jl Eau distillée 4, 2 ml Préparation du gel de concentration à 4% T Tableau 7 Solutions Volumes pour Concentradeuxgels (10ml) tionfinale Solution de monomère~ 1 mi T ; 2,7% C Tampon de gel de résolution 2, 5 ml 0, 175 M SDS 10% 100 tjl 0,1% Persulfate d'ammonium (10%) 70 pl 0,07 % TEMED (Research Organics Inc ; 3009T) 10 pu Eau distillée 4, 2 ml Préparation du gel de séparation Ce gel peut être coulé soit la veille, soit le jour même, mais de toute façon deux heures avant la migration. Le moule utilisé permet de couler deux gels. Le montage est réalisé comme suit : on dispose dans l'ordre les joints rouges, les joints noirs graissés, un plastique, une grosse plaque, un plastique, une plaque alumine, les spacers (blancs pour les gels de 1 mm ; noirs pour les gels de 1, 5 mm), une plaque de verre, un plastique, une plaque alumine, les spacers, une plaque de verre, trois plastiques puis le couvercle. Le montage ainsi obtenu est maintenu par des pinces et placé sur une zone plane. Le coulage du gel est réalisé à l'aide d'une pipette P5000 jusqu'à environ 0, 5 mm du bas du peigne prévu pour le gel de concentration. Le peigne est enlevé puis de l'eau est ajoutée très doucement pour qu'ils soient plans (+ ou-0, 5 ml d'eau/gel). Le montage qui est recouvert d'aluminium ne doit pas être bougé pendant la durée de la polymérisation. Préparation du gel de concentration (Stacking Gel) Les gels de séparation (entre les plaques d'alumine et de verre) sont retirés du moule et placés sur l'appareil d'électrophorèse. S'il n'y a qu'un seul gel, celui-ci doit être remplacé par une plaque de verre. Le peigne est inséré entre la plaque d'alumine et celle de verre. Le gel est ensuite coulé avec une pipette Pasteur de transfert en polyéthylène (Biorad, réf. 223-9528). Avant la polymérisation, le niveau du gel est vérifié et ajusté si le volume échantillon est élevé. Après une heure, le gel est polymérisé. Préparation des échantillons Avant de récupérer les cellules contenues dans les boîtes, elles sont rincées au PBS, 2 fois. Après le dernier rinçage, le PBS est éliminé au maximum. Les cellules sont récupérées dans du tampon de lyse (voir Schéma 1) par grattage (5. 106 cellules/ml de tampon de lyse minimum). Les lysats sont congelés à-800c. Avant de déposer, les lysats décongelés sont soniqués puis les protéines dudit échantillon sont dosées. Le volume à déposer est fonction de la quantité de protéines (quantité maximale de protéines : 60 ug ; vol. maxi = 25u !, vol. mini = 5ul). Suite aux essais préliminaires, le volume de chaque échantillon déposé correspond à 10 ug de protéines. Le dosage des protéines a été réalisé pendant la polymérisation du gel de séparation. Dépôts 250 ml de tampon de migration sont versés sur le gel, entre le gel, la plaque de verre et l'appareil d'électrophorèse ainsi que dans la cuve. Les échantillons sont alors centrifugés à 10000 G pendant 5 mn puis déposés. 10ul de témoins précolorés (Biorad, Prestained SDS-PAGE standards-réf. 161-0305) sont aussi déposés ainsi que 0, 3ug de HSP32 (TEBU, réf. SPP-730 aliquotée à 0, 1 g/ml et congelée à-20 c). Migration L'électrophorèse est réalisée à température ambiante, sous réfrigération, avec un voltage non limitant de 300V et avec un ampérage constant (15 mA) pendant la migration dans le gel de concentration. L'ampérage est diminué à 10 mA une fois que les échantillons ont atteint le gel de séparation. L'électrophorèse est arrêtée lorsque le front de migration atteint le bas du gel (environ 1 heure 30 de migration). B-Transfert des protéines sur membrane et blocage des sites de liaisons spécifiques Une fois la migration terminée, le gel est équilibré pendant 20 minutes à température ambiante, sous agitation, dans le tampon de transfert à l'origine de cette méthode décrit par Towbin H., Staehelin T. and Gordon J. dans Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets : procedure and some applications Proc. Natl. Sci., USA, 1979,76, 4350-4354. Une membrane de difluorure de polyvinylidène (PDVF) (Biorad, réf. 162-0184), de bonne tenue mécanique et de forte capacité de fixation des protéines, est trempée dans du méthanol à 100% jusqu'à transparence puis équilibrée dans le tampon de transfert jusqu'à son immersion complète (20 min). Dans l'appareil de transfert semi-sec (Biorad), on introduit une feuille de papier filtre épaisse (Biorad, réf. 17033960) préalablement trempée dans le tampon de transfert, la membrane de PDVF, le gel, puis à nouveau une feuille de papier filtre mouillée est déposée sur l'anode Il faut prendre garde à bien éliminer toutes bulles d'air entre les différentes couches à l'aide d'une tige en verre afin d'éviter tout risque de transfert. L'appareil est ensuite fermé par un couvercle jouant le rôle de la cathode. Le transfert des protéines est réalisé à ampérage non limitant (5,5 mA : cm2, 250 mA) et à voltage constant (15V) pendant 30 minutes. La membrane est alors placée sous agitation pendant une nuit à 4 C dans une solution de blocage des sites de liaisons spécifiques constituées de 10% (25g) de lait écrémé (Régilait) dans du tampon TBS-T (25ml). C-Réaction antigène-anticorps : Immunodétection des protéines sur membrane de PVDF On utilise le kit ECL (Enhanced ChimioLuminescence) pour révéler la peroxydase à l'aide de son substrat Après blocage des sites non spécifiques, la membrane est rincée une fois pendant 15 minutes et deux fois pendant 5 minutes dans du TBS-T. Ensuite, cette membrane est mise en présence de l'anticorps primaire de lapin Anti-DNP dilué au 1/150 pendant une heure sous agitation à température ambiante. Elle est ensuite rincée une fois 15 minutes et deux fois 5 minutes dans du TBS-T afin d'éliminer l'excès d'anticorps libre non fixé. Puis elle est mise en contact avec l'anticorps secondaire antilapin couplé à la peroxydase (Amersham ; réf. NA934 ; conservé à 4 C) dilué au 1/5000 dans le TBS-T (5ml) sous agitation à température ambiante. Après une heure d'incubation, elle est rincée rapidement deux fois avec du tampon TBS-T, puis lavée une fois pendant 15 minutes et enfin quatre fois pendant 5 minutes avec le tampon TBS-T. Après avoir été égouttée, elle est placée sur un film alimentaire (SARAN), du côté protéine, c'est à dire vers le haut. La membrane est révélée à l'aide d'un kit de détection hautement sensible par chimioluminescence (Amersham ; ECL Western blotting réf. RPN2106), utilisant le luminol comme substrat de la peroxydase. Sous l'action de la peroxydase et d'un amplificateur, le luminol est oxydé et passe dans un état transitoire excité. Le retour à l'état fondamental se fait par émission de photons qui vont ensuite interagir avec un film autoradiographique placé sur la membrane. 1 ml de chacune des deux solutions du kit de détection sont mélangés (2 ml, volume minimum nécessaire au recouvrement de la membrane). Aussitôt, le mélange est versé uniformément sur la membrane et laissé en contact pendant exactement une minute à température ambiante. La membrane égouttée est protégée sous un film alimentaire Saran et mise sous cassette à l'abri de la lumière, puis recouverte d'un film autoradiographique pré-flashé (Amersham, Hyperfilm ECL réf. RPN2103). Après une heure d'exposition, le film autoradiographique est récupéré et plongé 5 minutes dans un révélateur de film (révélateur radio, LX 24 Kodak), puis rincé à l'eau et enfin fixé par immersion durant un minimum de 5 minutes dans le fixateur (fixateur radio, AL 4 Kodak) avant d'être à nouveau rincé à l'eau. Le film est séché puis les bandes recueillies sont quantifiées grâce au logiciel Gels Analysts 3.01. 3) RESULTATS DES ESSAIS 3.1) Effets de l'extrait E2 selon l'invention sur les activités du protéasome de KHN Les échantillons utilisés ici ont été préparés conformément au protocole décrit au Schéma 1 pour le témoin et pour l'échantillon traité par l'extrait selon l'invention. Une prise d'essai de 15gel est effectuée et des mesures d'activités sont réalisées conformément à 2.5). Les résultats présentés dans les tableaux 8,9, 10 montrent que 7 heures après l'addition de l'extrait de l'algue (Ph) selon l'invention, les 3 activités peptidases du protéasome augmentent et ceci de manière significative pour 2 d'entre elles (les activités chymotrypsine similaire et trypsine similaire). Par ailleurs, on observe que dans les KHN traités par Ph pendant 7 heures la quantité de protéines oxydées intracellulaires est plus faible que celle des cellules témoins (figure 4, pistes 1 et 2). Ceci montre que l'effet stimulateur observé de l'extrait selon l'invention sur les activités peptidases du protéasome se traduit par une diminution du taux de protéines oxydées intracellulaires. En pratique, ce test a été réalisé sur une prise d'essai de 8jig de lysat cellulaire. Les 3 types d'échantillons 11, 12 et 13 ont été préparés 7 heures après l'irradiation et puis incubés en présence de DNPH pendant 15 min. La réaction a été ensuite stoppée par une solution neutralisante fournie dans le kit Amersham. 3.2) Effets des UV A+B sur le protéasome de KHN en culture primaire Des cultures primaires de kératinocytes humains selon 2.1) ont été irradiées par les UVA et les UVB conformément à un protocole répondant au principe du schéma 1. La dose de rayonnement ultraviolet retenue pour cette étude, est de 10 joules/cm2 pour les UVA et 0.05 joule/cm2 pour les UVB. Suite à une irradiation combinée de ces deux doses d'UVA et d'UVB, les trois activités peptidases du protéasome sont mesurées à des temps différents. Pour ce dosage, les cellules sont Iysées 1 heure, 3 heures, 7 heures et 24 heures après l'irradiation et la concentration en protéines (protéasome) est déterminée conformément à 2.3). Les mesures d'activés sont effectuées selon 2.5) avec des concentrations de substrat fluorogène égales à 12, 5, uM pour LLVY-amc, 150 {itvt pour LLE-na et enfin 40 p, tvt pour LSTR-amc. Ces activités ont été mesurées en parallèle avec le MG132 (20 (itvt), afin d'évaluer la part d'activité indépendante du protéasome. Les résultats présentés sur les figures 1,2 et 3 sont exprimés en % par rapport au témoin non irradié et ils montrent que les trois activités peptidases sont diminuées pour les quatre temps analysés après l'exposition aux UVA+B. Cette expérience démontre que le protéasome voit son activité affectée suite à une irradiation par un rayonnement ultraviolet. On constate également que l'effet est d'autant plus important que le temps qui sépare l'irradiation de la mesure d'activité est plus long (7 h et 24 h). 3.3) Effets d'un extrait d'algue Ph sur les activités du protéasome de KHN lorsqu'il est administré avant irradiation UV A+B : Il a été nécessaire de rajouter des vitamines anti-oxydantes (50 M tocophérol et 1 mM d'ascorbyl phosphate) pour préserver l'efficacité de l'extrait E2 pendant et après l'irradiation. Des cultures primaires de kératinocytes humains selon 2.1) ont été traitées par l'extrait selon l'invention (dose de 5jig/ml + vitamines) pendant 48 heures puis irradiées par les UVA+B et enfin Iysées. Les résultats contenus dans les tableaux 11, 12, 13 ci-après montrent que la baisse des activités peptidases du protéasome suite à l'irradiation par les UVA+B est complètement bloquée en présence de l'extrait selon l'invention dans lequel des vitamines ont été ajoutées. Le niveau des activités peptidases du protéasome étant le même pour les KHN témoins non traités/non irradiés que pour les KHN traités/irradiés 24 h après, l'agent cosmétique à base de l'extrait selon l'invention a permis de préserver les activités peptidases du protéasome. 11 a donc un effet protecteur vis-à-vis des UVA+B. 3.4-Effets d'un extrait d'aloue Phaeodactylum (Ph) sur les activités du protéasome de KHN après irradiation. Des cultures primaires de kératinocytes humains sont irradiées par la dose d'UVA et d'UVB puis traitées par une quantité de 2,5 jg/ml d'extrait E2 selon l'invention pendant 7 heures. On constate que la quantité de protéines oxydées intracellulaires est augmentée par l'irradiation UV mais dans une moindre mesure quand les cellules ont été traitées par l'extrait E2 selon l'invention. L'expérience est décrite au 3.1) et les résultats sont présentés à la figure 4 (pistes 3 et 4). L'utilisation dudit extrait permet une meilleure élimination des protéines oxydées. D'autre part, les résultats donnés dans les tableaux 14,15, 16 montrent que le traitement à base de l'extrait E2 selon l'invention restaure les 3 activités du protéasome de manière significative quand le traitement est effectué après l'irradiation. Cette restauration complète des activités du protéasome indique que l'agent à base de Ph a un effet réparateur sur les effets des UVA+B au niveau de l'activité protéasomique. Comme nous l'avions vu au 3-1), pour les KHN traités par l'extrait E2 selon l'invention, la quantité de protéines oxydées intracellulaires est plus faible que dans l'échantillon témoin (voir figure 13, pistes 1 et 2). Ceci montre que l'effet stimulateur observé par l'utilisation de l'extrait E2 selon l'invention sur les activités peptidases du protéasome se traduit par une diminution du taux de protéines oxydées intracellulaires. Les pistes 3 et 4 de la figure 4 montrent quant à elles que l'irradiation par les UV génère bien une quantité (proportionnelle à l'intensité des tâches) plus importante de protéines oxydées mais celle-ci est nettement moins importante suite à l'utilisation dudit extrait selon l'invention. Exemple 1 : Crème de jour pour le visage. anti-âge Glycéryl stéarate + PEG-100 6, 00% stéarate Squalane 3, 00 % Polyisobutène hydrogéné 3, 00 % Tricaprylate/caprate de glycérol 3, 00 % Glycérine 2,00 % Méthoxycinnamate d'octyl 2, 00 % Cire d'abeille 1,50 % Octanoate de cétostéaryl 1, 50 % Alcool cétylique 1,00 % Alcool stéarylique 1,00 % Diméthicone 1, 00 % Extrait E2 d'algue Phaedactylum tricornutum, de l'exemple 1. 21, 00 % Gomme Xanthane 0, 20 % Carbomer0, 15 % Neutralisant qs. Conservateurs qs. Parfum, Colorants qs. Eau qsp 100,00 % Exemple 2 : Emulsion-gel pour le visage, anti-rides Glycérine 5, 00 % Caprylic/capric/Succinic 3, 00 % triglycérides Extrait E2 de l'exemple 1. 22, 00 % Méthoxycinnamate d'octyl 1, 00 % Polymère réticulé : Acrylates/ 0,50 % acrylate d'alkyle en C'oxo Hydrolysat de protéine de blé 0, 50 % Diméthicone copolyol 0, 50 % Neutralisant qs. Conservateurs qs. Parfum, Colorants qs. Eau qsp 100,00 % Exemple 3 : Emulsion raffermissante pour le corps jps Palmitate d'octyl 7, 00 % Tricaprylate/caprate de glycérol 3,00 % Octanoate d'octyl 2, 00 % Phényl triméthicon 2,00 % Glycérine 2, 00 % Acide stéarique 1, 00 % Stéarate de sorbitan, 20 OE 0, 90 % Alcool cétylique 0,50 % Alcool stéarylique 0, 50 % Extrait E2 de l'exemple 1. 20, 50 % Carbomer 0, 40 % Gomme Xanthane 0, 20 % Stéarate de sorbitan 0, 10 % Neutralisant qs. Conservateurs qs. Parfum, Colorants qs. Eau qsp 100,00 % Exemple 4 : Emulsion-gel pour le visage, anti-rides Glycérine 5, 00 % Capryl ic/capric/Succinic 3, 00 % triglycérides Méthoxycinnamate d'octyl 1, 00 % Polymère réticulé Acrylates/0, 50% acrylate d'alkyle en C1-30 Hydrolysat de protéine de blé 0, 50 % Diméthicone copolyol 0,50 % Extrait E2 de l'exemple 1.2. 0,01 % Neutralisant qs. Conservateurs qs. Parfum, Colorants qs. Eau qsp 100,00 % Schéma 1 Culture, traitement (extrait E2 après irradiation) Culture, traitement (Extrait E2 avant irradiation) et et préparation d'échantillons préparation d'échantillons ! n !. rn Ensemencement ! 'KHN31 (65ans) P2 ! '250 000 KHN ! Décongéiation et Préparation des Iysats 1 s 150 m ic lire Obtentiond'unéehanti ! ! ontémoin : Décongélation et Préparation des lysats 1 sonication 15 sec, 38 impulsions centrifugation 30 Min, 15000 tpm récupération du surnageant (extrait E2 après irradiation) DosageparBradford) d'un echantillon Il."'1 , n (extra il E2 aprés irradialion) 1 ge par Bradford X me Oxyblot Tableau 8 (Mesure d'activité LLVY du protéasome issu de KHN après traitement avec l'extrait E2 selon l'invention) Echantillon Protéine en g/ l Vitesse Activité en pmol/min/mg de Test t p** moyenne écart type en protéine/tém/tém UF/min moyenne écart type UV- UV+ 20 l 1,540 480,00 90,96 20 l 1,373 418,80 89,02 91,27 + 6, 75 Témoin 20 gel 1,599 1, 500 : 0, 096 551,04 100,57 20 l 1,488 431,03 84,55 20 l 1,521 555, 11 106,53 Extrait 20 l 1,544 553,17 104,60 102, 15 : 4, 07 0,0329 E2 20 l 1,535 1, 550 + 0, 034 515,22 97,98 S 5 g/ml 20 l 99,49 **Significatif (S) si la valeur de p#0,05 / 0, 2919 X xUF/min pour 15 @l de prise d'essai Tableau 9 : (Mesure d'activité LLE du protéasome issu de KHN après traitement avec l'extrait E2 selon l'invention) Echantillon Protéine en g/ l Vitesse Activité en pmol/min/mg de Test t p** moyenne écart type en protéine/tém/tém UF/min moyenne écart type UV-UV+ 20 l 1,540 357,29 191,97 20 gel 1,373 340,57 205,24 Témoin 20 1,599 1,500 ~ 0, 096 425,01 219,92 199,16 ~ 17, 37 20 l 1,488 322,79 179,52 20 gel 1,521 424,63 231,03 Extrait 20 gel 1,544 425,65 228,20 E2 20 l 1, 535 1,550 + 0, 034 345,36 186,20 211,50 ~ 21, 76 0,4097 5 g/ml 20 l 1,599 387,58 200,55 S **Significatif (S) si la valeur de p#0,05 / 1,3794 # xUF/min pour 15 l de prise d'essai Tableau 10 : (Mesure d'activité LSTR du protéasome issu de KHN après traitement avec l'extrait E2 selon l'invention Echantillon Protéine en g/ l Vitesse Activité en pmol/min/mg de Test t p** moyenne écart type en protéine/tém/tém UF/min moyenne écart type UV-UV+ 20 ici 1,540 951,85 204,36 20 ill 1,373 885,25 213,17 Témoiin 20 l 1,599 1,500 i 0, 096 1104,90 228,45 209,53 i 15, 29 20 l 1,488 864,47 192,11 20 ici 1,521 1141,60 248,19 Extrait 20 1,544 1142,90 244,84 E2 20 l 1,535 1,550 ~ 0, 034 1092,00 235,26 239,01 ~ 9,29 0,0165 5 g/ml 20 l 1, 599 1101,50 227,75 S **Significatif (S) si la valeur de p#0,05 / 0, 3307X xUF/min pour 35 l de prise d'essai If Tableau 11 : (Mesure de l'activité LLVY du protéasome des KHN traités préalablement avec l'extrait E2 selon l'invention, 24 h avant irradiation UVA et UVB.) Echantillon Protéine en g/ l Vitesse Activité en pmol/min/mg de Test t p** moyenne écart type en protéine/tém/tém UF/min moyenne écart type UV- UV+ 20 pi 1,038 260,82 54,99 20 jell 1,030 1,153 ~ 0, 141 363,22 77,22 Témoin 20 l 1,311 351,97 58,76 63,66 ~ 10,19 20 nl 1, 232 392, 97 69,80 Témoin 20 l 1,407 253,25 39,39 37,08 ~ 3, 27 0,0224 + UV 20 l 1,444 1,426 + 0,026 229,26 34, 76S 20 l 0,998 514,70 112,94 Extrait 20 1 1,121 1,203 ~ 0,173 458,06 89,41 E2 20 l 1,326 474,78 78,36 96,90 + 15,88 0,0152 5 g/ml 20 pi 1, 365 666, 44 106, 90S 20 l 1,264 329,56 57,06 ExtraitE 20 pi 1,322 1,255 ~ 0, 073 283,15 46,88 2+UV 20 l 1, 151 369,35 70,23 60,53 ~ 10,76 0,5522 0,0458 20 l 1, 284 398, 45 67, 95 NS S **Significatif(S) si la valeur de p#0,05 / 0, 2189X xUF/min pour 20 l de prise d'essai Tableau 12 : (Mesure de l'activité LLE du protéasome des KHN traités préalablement avec l'extrait E2 selon l'invention, 24 h avant irradiation UVA et UVB) Echantillon Protéine en g/ l Vitesse Activité en pmol/min/mg de Test t p** moyenne écart type en protéine/tém/tém UF/min moyenne écart type UV- UV+ 20 l 1,038 256,79 255, 90 20 l 1,030 1, 153 : 0, 141 377,91 379, 75 Témoin 20 l 1,311 373,48 294,67 310, 11 ~ 53, 70 20 l 1,232 403, 79 338,98 Témoin + 20 ici 1,407 271,40 199,51 192, 42 ~ 10, 02 0,0368 UV 20 l 1,444 1,426 ~ 0,026 258,62 185,34 S 20 l 552,47 Extrait E2 20 l 1, 121 1, 203 : 0, 173 491,76 453,70 5 g/ml 20 l 1,326 595, 53 464,55 493, 35 ~ 44, 66 0,0024 20 l 1, 365663, 05 502, 67 S 20 ici 1,264 335,07 274,17 Extrait E2 20 ici 1,322 1, 255 : 0, 073 315,22 246,69 + UV 20 l 1, 151 381,19 342,55 295, 46 ~ 43, 12 0,5489 0,0342 20 ; il 1, 284 395, 07 318,43 NS S **Significatif (S) si la valeur de p#0,05 / 1,0346X xUF/min pour 20 l de prise d'essai 4 4 Tableau 13 : (Mesure de l'activité LSTR du protéasome issu des KHN, traités préalablement avec l'extrait E2 selon l'invention, 24 h avant irradiation UVA et UVB) Echantillon Protéine en jlg/jll Vitesse Activité en pmol/min/mg de Test t p** moyenne écart type en protéine/tém/tém UF/min moyenne écart type UV- UV+ 50 l 1,038 577,08 128, 68 50 l 1, 030 1,153 ~ 0, 141 789,09 177,42 Témoin 50 l 1, 311 789,96 139,46 148,52 ~ 21, 51 50 l 1, 232844, 41 158,62 Témoin + 50 l 1,407 564,46 92,85 87,33 ~ 7, 80 0,0181 UV 50 l 1,444 1,426 1-0, 026 510,24 81, 82S 50 l 0, 998 1079,40 250,48 Extrait E2 50 l 1, 121 1, 203 ~ 0, 173 1001,40 206,73 5 g/ml 50 l 1,326 1110, 60 193, 85 216, 29 ~ 24, 28 0,0069 50 1, 365 1262, 10 214, 10s 50 l 1, 264 682,00 124,87 Extrait E2 50 l 1, 322 1,255 : 0, 073 + UV 50 l 1,151 771,19 155,07 140,49 15, 13 0,5041 0,021 50 l 1, 284 784, 76 141, 53 NS 4 S **Significatif (S) si la valeur de p0, 05/0, 2315X xUF/min pour 50gel de prise d'essai Il Tableau 14 : (Mesure de l'activité LLVY du protéasome des KHN 7 h après irradiation UVA + UVB puis traitement avec l'extrait E2 selon l'invention) "1 1 Echantillon Protéine en fui vitesse Activité en pmol/min/mg de Test t p** moyenne écart type en protéine /tém UV- /tém UF/min moyenne écart type UV+ 20 il 0,320 532,43 20 l 0,563 0,697 : 0, 321 475,60 184,89 Témoin 20 1 0,857 448,06 114,47 142,53 ~ 37, 32 20 il 1, 050 614, 88 128,24 20 l 0,967 219,93 49,81 Témoin + 20 l 1,067 1,105 ~ 0, 172 211,11 43,29 UV 20 l 1,032 255,43 54,19 51,37 : 6, 38 0, 0043S 20 l 1,355 360, 17 58,18 20 l 0,466 793,98 Extrait E2 20 l 0,486 0,677 ~ 0, 237 703,83 5 g/ml 20 l 0,815 752,11 201,93 189,35 17, 79 0,2090 20 il 0, 940 758, 93 176, 77 NS 20 III 1,257 846,29 147,35 Extrait E2 20 III 1,334 1,248 ~ 0, 100 806,37 132,29 + UV 20 l 1,106 849,40 168,13 163, 40 ~ 31, 88 0,4600 0, 0005 S 20 l 1,296 1218, 50 205, 84 NS **Significatif (S) si la valeur de p#0,05 / 0,2189X xUF/min pour 20 l de prise d'essai 1 Tableau 15 : (Mesure de l'activité LSTR du protéasome issu de KHN 7 h après irradiation UVA et UVB puis traitement avec l'extrait E2 selon l'invention Echantillon Protéine en g/ l Vitesse Activité en pmol/min/mg de Test t p** moyenne écart type en protéine/tém/témUV+ UF/min écart type UV- 40 l 0,320 1115,40 40 l # 0,321 966,14 Témoin 40 l 0,857 821,07 316,91 318,86 # 2,75 40 l 1, 050 1163, 50 320,80 40 1 0,967 463,17 158,48 Témoin + 40 l 1, 067 1,105 ~ 0, 172 498,85 154,55 UV 40 1 1, 032 534,34 171,26 161,03 ~ 7, 18 0,0000 40 l 1,355 748,43 159,84 S 40 l 0,466 1354,50 Extrasit 40 l 0,486 0,677 ~ 0,237 1383,60 5 g/ml 40 l 0,815 1168,20 414,67 397,08 ~ 24, 86 0,0475 40 l 0,940 1232, 40 379, 50 S 40 l 1, 257 1326,90 305,44 Extrait E2 + 401 1, 334 1,248 0, 100 1228,40 266,43 UV 40 l 1, 106 1276,10 333,94 314,44 ~ 37, 30 0,8824 0, 0002 S 40 l 1,296 1575, 90 351, 96 NS **Significatif (S) si la valeur de p#0,05 / 0,2894X xUF/min pour 40 l de prise d'essai a Tableau 16 : (Mesure de l'activité LLE du protéasome issu de KHN 7 h après irradiation UVA et UVB puis traitement avec l'extrait E2 selon l'invention) Echantillon Protéine en g/ l Vitesse Activité en pmol/min/mg de protéine Test t p** moyenne écart type en UF/min moyenne écart type/tém UV-/tém UV+ 20 l 0,320 446,80 20 l 0,563 0,697 : 0, 321 429,01 Témoin 20 il 0,857 391,07 472,22 474,49 ~ 3, 21 20 @l 1, 050 483, 67 476,76 20 l 0,967 183, 97 196, 93 Témoin + UV 20 l 1,067 1,105 ~ 0, 172 177,14 171,70 20 l 1,032 218,01 218,60 204,81 ~ 26, 39 0, 0002 S 20 l 1,355 303, 89 232, 02 20 l 0,466 588,98 Extraie erz 0,486 0,677 : 0, 237 542,38 5 g/ml 20 il 0,815 598,25 759,17 671,61 : 123, 83 0,1533 NS 20 l 0,940 530,53 584,05 20 l 1,257 576,40 474,34 Extrait E2 + 20 l 1,334 1,248 ~ 0, 100 598,01 463,69 UV 20 ici 1,106 637,05 595,98 534,53 ~ 75, 84 0, 3509 S 0, 0002 S 20 fil, 296 756, 6l 604, 10 **Significatif (S) si la valeur de p#0,05 / 1,0346X xUF/min pour 20 de prise d'essai REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un extrait de l'algue Phaeodactylum, en particulier de l'algue Phaeodactylum tricornutum, comme agent cosmétique favorisant l'activité du protéasome des cellules de la peau, en particulier des kératinocytes, des fibroblastes ou des mélanocytes, de préférence humains. 2. Utilisation d'un extrait de l'algue Phaeodactylum, en particulier Phaeodactylum tricornutum, pour la fabrication d'une composition cosmétique destinée à protéger la peau contre les effets néfastes d'une exposition aux UV, ou à prévenir et/ou retarder l'apparition des effets du vieillissement cutané. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on utilise ledit extrait de l'algue dans une composition cosmétique à une concentration de 0,01 % à 10 % environ par rapport au poids total de la composition finale. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'extrait précité a été obtenu par extraction au moyen d'un solvant d'extraction polaire et/ou un solvant d'extraction apolare. 5. Utilisation selon la revendication 4 caractérisée en ce que le ou les solvants d'extraction sont un alcool en Cl-C6 ou un mélange hydroalcoolique, un polyalcool en C2-C6 tel que l'éthylène glycol, un solvant chloré tel que le chloroforme ou le dichlorométhane, un ester en C3-C6 d'acide organique tel qu'acétate d'éthyle, un alcane en C6-C10 tel que l'heptane, un éther en Cs-Cg comme par exemple le diisopropyl éther. 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'extrait précité est obtenu par extraction de l'algue avec un alcool ou un mélange eau/alcool éventuellement alcalinisé, ledit alcool étant choisi dans le groupe constitué de l'isopropanol, de l'éthanol, et du méthanol. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'extrait précité est obtenu par extraction de l'algue avec de l'isopropanol. 8. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'extrait précité est obtenu par l'extraction de l'algue avec de l'éthanol. 9. Utilisation selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisée en ce que, préalablement à son extraction, l'algue est congelée, de préférence la congélation étant réalisée à une température située entre-400 et-20 C environ et pendant une durée comprise de préférence entre 1 et 7 jours environ, puis mise en contact avec le solvant d'extraction. 10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'algue congelée est plongée directement dans le solvant d'extraction chauffé. 11. Utilisation selon l'une des revendications 4 à 10, caractérisée en ce que, avant toute opération d'extraction, on réalise une macération de l'algue dans le solvant d'extraction à température ambiante 12. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'on réalise une macération de l'algue pendant une durée comprise entre 5 minutes et 80 minutes, environ, et de préférence encore, pendant une durée comprise entre 20 minutes et 40 minutes environ. 13. Utilisation selon l'une des revendications 4 à 12, caractérisée en ce que l'extraction est réalisée sous reflux. 14. Utilisation selon l'une des revendications 4 à 13, caractérisée en ce que l'extraction est réalisée sous atmosphère inerte, de préférence sous atmosphère saturée en azote. 15. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 14, caractérisée en ce que l'extrait d'algue précité est obtenu après la succession des étapes suivantes : a) l'algue est congelée selon la revendication 9, et ensuite plongée dans le solvant d'extraction selon la revendication 10, ledit solvant d'extraction étant un solvant alcoolique ou hydro-alcoolique défini aux revendications 6 à 8. b) une macération de l'algue est effectuée suivant la revendication 11 ou 12. c) le solvant d'extraction est alcalinisé jusqu'à un pH compris entre 10 et 14, de préférence à un pH égal à 13, par exemple avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium ou avec une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium, d) les insolubles sont éliminés de la phase alcoolique ou hydro- alcoolique, e) de l'eau distillée est ajoutée à la phase alcoolique ou hydro- alcoolique, f) la solution hydro-alcoolique ainsi obtenue est lavée par un procédé liquide/liquide avec un solvant apolaire non miscible avec la phase alcoolique ou hydro-alcoolique, tel que par exemple l'heptane, l'hexane ou le cyclohexane, g) la phase contenant le solvant apolaire est éliminée, h) la phase hydro-alcoolique récupérée après élimination de la phase contenant le solvant apolare, est acidifiée jusqu'à un pH compris entre 1 et 3, de préférence à un pH égal à 2, par exemple avec une solution aqueuse d'acide sulfurique ou avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique, i) la solution obtenue après acidification subit une extraction liquide-liquide avec un solvant apolare non miscible avec la phase alcoolique ou hydro-alcoolique, tel que par exemple l'heptane, l'hexane ou le cyclohexane, j) la phase hydro-alcoolique est ensuite éliminée, k) la phase contenant le solvant apolare récupérée après élimination de la phase hydro-alcoolique subit une évaporation afin d'obtenir une huile exempte de solvant apolare, cette huile étant l'extrait recherché. 16. Utilisation selon l'une des revendications 4 à 15, caractérisée en ce que la quantité de solvant d'extraction utilisée est comprise entre 0,1 litre et 20 litres environ, de préférence comprise entre 2 litres et 10 litres environ, pour une quantité de 100 g d'algue, exprimée en poids sec. 17. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit extrait de l'algue a été obtenu par extraction au moyen du CO, supercritique. 18. Composition cosmétique favorisant l'activité du protéasome des cellules de la peau, en particulier des kératinocytes, des fibroblastes ou des mélanocytes, de préférence humains, en vue de protéger la peau contre les effets néfastes d'une exposition aux UV, ou de prévenir et/ou retarder les effets du vieillissement cutané, caractérisée en ce qu'elle comprend comme agent actif cosmétique, un extrait de l'algue Phaeodactylum, en particulier d'algue Phaeodactylum tricornutum, éventuellement dans un excipient cosmétiquement acceptable. 19. Composition selon la revendication 18, caractérisée en ce que l'extrait est tel que défini dans l'une quelconque des revendications 4 à 17 et est contenu dans ladite composition à une concentration telle que définie à la revendication 3. 20. Procédé de soin cosmétique de la peau, caractérisé en ce qu'il comprend l'application topique sur les zones de la peau concernée d'une personne en ayant besoin, d'une quantité cosmétiquement efficace d'un extrait d'algue tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 17, sous forme de composition telle que défini à la revendication 18 ou 19, le soin de la peau étant de préférence un soin de prévention avant exposition aux rayonnements UV, ou un soin réparateur de la peau après exposition aux rayonnements UV.