Brevet FR2823754A1 — publié le 20021025

R4 PEPTIDES ANTIBACTERIENS, LES COMPOSITIONS LES CONTENANT ET LEURS UTILISATIONS. La présente invention a pour objet des peptides antibactériens produits par des microorganismes et présentant une structure tridimensionnelle avec une hélice X et un feuillet antiparallèle reliés par trois ponts disulfures. L'invention concerne également les compositions contenant lesdits peptides et utiles en thérapie humaine et animale ainsi qu'en agriculture. On a décrit, dans l'art antérieur, différentes substances antibactériennes produites par des micro organismes. Parmi les plus connues, on peut citer les antibiotiques p-lactam comme la pénicilline et la céphalosporine qui sont respectivement produits par les champignons filamenteux Aspergillus nidulans ou Penicillium chrysogenum et par des bactéries ou des champignons filamenteux comme AcremonJum chrysogenum (Strain improvement and preservation of,B-lactam-producing microorganisms, Elander RP, Antibiotics Contening the,B Lactam Structure pp. 97-146, (1983) Demain AL & Solomon NA (eds), Spinder, Heidelberg; Penicillin and cephalosporin biosynthetic genes: structure, organization, requlation and evolution, Aharonowitz Y., Cohen G. & Martin JF., Annu. Rev. Microbiol. (1992) 46:461-496). En santé humaine, on peut rappeler que l' incidence des infections bactériennes opportunistes est en constante progression depuis ces dernières années. Selon l'Organisation Mondiale de la Santé plus de 95% des souches bactériennes Staphylococcus aureus sont résistantes à la pénicilline et plus de 60% sont également devenues résistantes à son dérivé, la méthicilline (The new antibiotics, Holger Breithaupt, Nature Biotechnologie, Vol 17 December 1999). Les bactéries opportunistes ont pour cibles premières les sujets immunodéprimés, chez lesquels ils peuvent conduire au développement de pathogènes, le plus souvent résistants. L'immunoeuppression peut être le résultat d'une variété de causes telles par exemple la corticothérapie, la chimiothérapie, la transplantation, l' infection par le VIH. I1 existe donc un réel besoin de caractériser de nouvelles classes de composés antibactériens pour suppléer au phénomène de résistance que les bactéries développent envers les antibactériens classiques. On connaît de longue date que les insectes ont développé un système de défense efficace contre les microorganismes. Cette réponse immunitaire s'appuie pour une large part sur la synthèse rapide et transitoire de plusieurs familles de peptides antimicrobiens à large spectre d'activité (Bulet et al., 1999, Dev. Comp. Immunol. 23, 329-344). Cette synthèse est induite par une blessure septique ou par l'injection d'une faible dose de bactéries. Parmi les peptides antibactériens induits chez- ces insectes, on peut distinguer les quatre groupes suivants: - Des peptides cationiques de 4 kDa, formant deux hélices amphipathiques. Dans ce groupe, on classe par exemple les cécropines qui sont plus particulièrement actives contre les bactéries à Gram négatif. - Des peptides comprenant des ponts disulfures intramoléculaires. Dans ce groupe, on classe les défensines d'insecte (4 kDa, 3 ponts disulfure) qui sont plus particulièrement actives contre les bactéries à Gram positif. Des peptides cationiques riches en proline, de taille comprise entre 2 kDa et 4 kDa, pour la plupart actifs contre les bactéries à Gram négatif et qui peuvent être glycosylés, comme la drosocine, la pyrrhocoricine, et les lébocines, ou non glycosylés comme les apidaecines et les métaluikowines. - Plusieurs polypeptides distincts, ayant un poids moléculaire de 8 à 27 kDa, pour la plupart cationiques et fréquemment riches en résidus glycine comme les attacines, les sarcotoxines II, les diptéricines et la coléoptéricine. La présente invention s'intéresse aux peptides présentant une structure tridimensionnelle avec une hélice 2 0 et un feui l let ant iparal lèle rel iés par trois ponts disulfures, également désignée structure CSap. Ce motif structural est caractéristique de peptides isolés à partir d'insectes, dénommés défensines. Ces défensines d'insectes présentent une activité antibactérienne, en particulier contre les bactéries à Gram positif, utile dans le traitement d' infection chez l'homme et l' animal ainsi que chez les plantes. Les défensines d'insectes ont fait l'objet de nombreuses publications, brevets et demandes de brevet parmi lesquels on peut citer: Cystéines-rich antimicrobial peptides in invertobrates, JL. Dimarcq, P. Bulet, C. Hetru, J. Hoffmann, Biopolymers (Peptide Science), Vol. 47, 465-477 (1998); Antimicrobial Peptides from insects, C. Hetru, D. Hofmann, P. Bulet, Molecular Mechanism of Immune Responses of Insects, edited by Paula T. Brey and Dan Hultmark, published in 1998 by Chapman & Hall, London; Antimicrobial peptides in insects: structure and function, P. Bulet, C. Hetru, J-L Dimarcq, D. Hoffmann, Developmental and Comparative Immunology 23 (1999) 329 344; Defensins, T. Gauz, R. I. Lehrer, Pharmac. Ther. Vol.66, pp. 191-205, 1995; EP 0349451; EP 0546213 et FR 2695392. La demanderesse a maintenant identifié de façon surprenante, des peptides antibactériens présentant le motif CSap caractéristique des défensines d'insectes, dans des microorganismes. Dans les séquences rapportées ci-après, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre selon la nomenclature ci-dessous: A Ala alanine C Cys cystéine D Asp acide aspartique E Glu acide glutamique F Phe phénylalanine G Gly glycine - H His histidine I Ile isoleucine K Lys lysine L Leu leucine M Met methionine N Asn asparagine P Pro proline Q Gln glutamine R Arg arginine S Ser sérine T Thr thréonine V Val valine W Trp tryptophane Y Tyr tyrosine La présente invention a donc pour objet un peptide ant ibactérien présentant un mot if CSap de formule générale (I) produit par un micro-organisme: Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-XadCys-Xae-Cys-Xaf Cys-Xag (I) dans laquelle: Xaa est un groupe -NH2 ou un reste peptidique comprenant de 1 à 8 acides aminés, Xab est un reste peptidique comprenant de 1 à 12 acides aminés, Xac est un reste peptidique comprenant 3 acides amlnés, Xad est un reste peptidique comprenant de 1 à acides aminés, Xae est un reste peptidique comprenant de 1 à 5 acides aminés, Xaf est un reste peptidique comprenant 1 acide amlné, Xag est un groupe -OH ou un reste peptidique comprenant 1 ou 2 acides aminés. Les acides aminés entrant dans la composition de Xaa à Xag peuvent être quelcouque, et de préférence: Xaa comprend 2 acides aminés qui sont des sérines, Xab comprend 12 acides aminés, identiques ou différents, choisis parmi la glycine, l'alanine, la lencine, l'isoleucine, la phénylalanine, l'acide aspartique ou la glutamine, Xac comprend 3 acides aminés, identiques ou différents, choisis parmi l'alanine ou la sérine, Xad comprend 10 acides aminés, identiques ou différents, choisis parmi la glycine, l'alanine, la thréonine, l'isoleucine, la tyrosine, l'arginine ou l'histidine, Xae comprend de préférence 5 acides aminés, identiques ou différents, choisis parmi la valine, l'acide aspartique, l'asparagine, la glutamine ou la lysine, Xaf est l'isolencine, Xag comprend 2 acides aminés, identiques ou différents, choisis parmi la thréonine ou l'histidine. Les paptides de l'invention peuvent être préparés par synthèse chimique ou par génie géntique selon des méthodes conventionnelles ou encore être éventuellement isolés à partir d'un micro-organisme puis caractérisé par des méthodes conventionnelles. On entend par microorganisme, tout organisme choisi parmi une bactérie, un champignon ou une levure. Il s'agit tout particulièrement de bactéries choisies parmi les bactéries de genre Acinetobacter, Actinobacillus, Actinomyces, Agrobacterium, Bacillus, Bacteroides, Bordetella, Borrelia, Brucella, Chlamydia, Clostridium, Corynebacterium, Coxiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Francisella, Gardnerella, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Legionella, Listeria, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Proteus, PseuJomonas, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Treponema, Vibrio, Xanthomonas, Yersinia. I1 s'agit tout particulièrement de champignons choisis parmi les champignons dermatophytes de genre Epidermophyton, Microsporum et Trichophyton ou parmi les champignons filamenteux de genre Absidia, AcromonJum, Alternaria, Aspergillus, Cunningbamella, FusarJum, Mucor, Nattrassia, Nectria, Neurospora, Penicillium, Rhizomucor, Rhizopus, ScedosporJum, Syncephalastrum et Wangiella. I1 s'agit tout particulièrement de levures choisies parmi les levures de genre Candida, Cryptococcus, Malassezia et Trichosporon. Un groupe préféré de peptides de formule générale (I) selon la présente invention sont ceux dans lesquels: Xaa comprend de préférence 2 acides aminés, Xab comprend de préférence 12 acides aminés, Xac comprend de préférence 3 acides aminés, Xad comprend de préférence 10 acides aminés, Xae comprend de préférence 5 acides aminés, Xaf comprend de préférence 1 acide aminé, Xag comprend de préférence 2 acides aminés. Parmi ce groupe, un peptide préféré est représenté dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID NO:1: S S C Q L G G I F G A G D A A C S A S C I R A G T Y H G G Y C N D K Q V C I C T H (SEQ ID NO:1) Le peptide de séquence antibactérien SEQ ID NO:1 est produit par le champignon filamenteux Aspergillus nidulans et est préférentiellement actif contre les bactéries à Gram positif. Ce peptide a été synthétisé chimiquement (Altergen). Sa masse moléculaire, mesurce par spectrométrie de masse MALDI-TOF, est de: 4123 Da. Sa masse moléculaire calculée est de: 4121 Da. Cette corrélation confirme la séquence ci-dessus. La demanderesse a également testé l'activité antibactérienne du peptide SEQ ID NO:1. Ledit peptide inhibe la croissance de la bactérie à Gram positif Staphyllocaccus aureus de 100 à 50 M et de 50 à 25 M. L' invention concerne également des dérivés des peptides de formule I. De tels dérivés sont ceux dans lesquels les séquences ci-dessus comprennent des délétions, des additions et/ou des modifications au niveau d'un ou plusieurs acides aminés, dès lors que ces délétions, additions et/ou modifications ne modifient la structure CSp ni l'activité antibactérienne du peptide dont ils sont issus. Ces dérivés peuvent alors être considérés comme des équivalents fonctionnels des poptides de l'invention. L'invention couvre également les rétropeptides et les rétroinversopeptides, de même que les peptides dont la chaîne latérale d'un ou plusieurs des acides aminés est substitue par des groupemenLs qu1 ne modifient pas l'activitd antibact6rienne des pept1des de l'invent10n. L'invention concerne aussi des polypaptides constituA par ou compreant un desdits peptides. Ainsi, 1'invention envisage un peptide comprenant 1'ue et/ou l'autre de ses extrmits, un rsidu peptidique ncessaire, par exemple son expressio et/ou au ciblage dans un organisme bate. Par organisme bate, on entend tout organiGme mono ou pluricellulaire, infrieur ou sup6rieur dans lequel ledit peptide peut atre introduit. La prAsente ivention concerne Agalement ue composition, caractrise en ce qu'elle comprend tiLre d'agent actif au moins un paptide ou un polypaptide tel ue dfini prAcdemment, avantageusement associ dans ladiLe composition un vhicule acceptable. Le vbicule acceptable a pour premi@re qualit de ne pas dgrader de mai@re substantielle le ou les paptides dans ladite composition et de ne pas diminuer les 2Q propriAt6s antibactAriennes. La pr6sente ivention a Agalement pour objeL l'utilisation d'au moins un peptide ou d'un polypaptide pour la prAparation d'une composiLion pour la prAvenLion ou le LraiLement des infections d'origine bactAriennes chez 1'homme, 1'animal ou les plantes. D'autres avantages et caractristiques de l'invetio apparaitront des exemples qui suivent concernant leur activit antibactrienne. 1Q Exem le 1 Test de détection d'activité P antibactérienne. Les souches bactériennes utilisces sont des souches à 400 mDO et stockées à -80 C dans du milieu LB (Luria Bertani) à 13% de glycérol. Pour chaque souche, 28 l de suspension bactérienne sont ajoutés à 10 ml de milieu LB. Les suspensions de bactéries (1,11 mDO) sont mises en incubée à 30 C pendant une nuit sous agitation lente puis la densité optique à 600 nm est mesurée. On dépose 20 p1 de chaque fraction (à 500M) dans le premier puits dune plaque de microtitration (96 puits) et on dilue volume à volume avec de l'eau stérile de puits en puits. Les concentrations s'échelonnent de 50 M dans le premier puits à 0,2 M dans le dernier puits. Les plaques de microtitration sont incubées 24 heures à 25 C. La détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) se fait par mesure de l'absorLance à 600nm. REVENDICATIONS 1) Peptide antibactérien présentant une structure tridimensionnelle avec une hélice et un feuillet antiparallèle reliés par trois ponts disulfures produit par un microorganisme et répondant à la formule générale (I): XaaCys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf Cys-Xag (I) dans laquelle: Xaa est -NH2 ou un reste peptidique comprenant de 1 à 8 acides aminés, Xab est un reste peptidique comprenant de 1 à 12 acides aminés, Xac est un reste peptidique comprenant 3 acides aminés, Xad est un reste poptidique comprenant de 1 à acides aminés, Xae est un reste peptidique comprenant de 1 à 5 acides aminés, Xaf est un reste peptidique comprenant 1 acide aminé, Xag est -OH ou un reste peptidique comprenant 1 ou 2 acides aminés. 2) Peptide antibactérien selon la revendication 1, caractérisé en ce que: Xaa comprend 2 acides aminés, Xab comprend 12 acides aminés, Xac comprend 3 acides aminés, Xad comprend 10 acides aminés, Xae comprend de préférence 5 acides aminés, Xaf comprend 1 acide aminé, Xag comprend 2 acides aminés. 3) Peptide antibactérien selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que: Xaa comprend 2 acides aminés qui sont des . serlnes, Xab comprend 12 acides aminés, identiques ou différents, choisis parmi la glycine, l'alanine, la leucine, l'isoleucine, la phénylalanine, l'acide aspartique ou la glutamine, Xac comprend 3 acides aminés, identiques ou différents, choisis parmi l'alanine ou la sérine, Xad comprend 10 acides aminés, identiques ou différents, choisis parmi la glycine, l'alanine, la thréonine, l'isoleucine, la tyrosine, l'arginine ou l'histidine, Xae comprend de préférence 5 acides aminés, identiques ou différents, choisis parmi la valine, l'acide aspartique, l'asparagine, la glutamine ou la lysine, Xaf est l'isoleucine, Xag comprend 2 acides aminés, identiques ou différents, choisis parmi la thréonine ou l'histidine. 4) Peptide antibactérien selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il répond à la séquence SEQ ID NO:1 suivante: S S C Q L G G I F G A G D A A C S A S C I R A G T Y H G G Y C N D K Q V C I C T H (SEQ ID NO:1) ) Peptide antibactérien selon l'une des revendications de 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est produit par un micro-organisme choisi parmi une bactérie, un champignon ou une levure. 6) Peptide antibactérien selon les revendications 4 et 5, caractérisé en ce qu'il est produit par le champignon filamenteux Aspergillus nidulans. 7) Peptide antibactérien selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est actif contre les bactéries à Gram positif. 8) Polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend un peptide selon l'une des revendications de 1 à 7. 9) Polypeptide selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend un peptide selon l'une des revendications de 1 à 6 dont l'une et/ou l'autre des extrémités dudit peptide comprend un résidu peptidique nécessaire à son expression et/ou au ciblage dans un organisme hôte. ) Composition antibactérienne caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d' agent actif au moins un peptide selon l'une des revendications de 1 à 7 ou un polypeptide selon l'une des revendications 8 ou 9, avantageusement associé dans ladite composition avec un véhicule acceptable. 11) Composition selon la revendication 10 pour être utilisée chez l'homme ou l' animal. 12) Composition selon la revendication 10 pour être utilisée chez les plantes. 13) Utilisation d'un peptide selon l'une des revendications de 1 à 7 ou d'un polypeptide selon l'une des revendications 8 ou 9, pour la préparation d'une composition utile pour la prévention ou le traitement des infections d'origine bactérienne chez l'homme ou l' animal. 14) Utilisation d'un peptide selon l'une des revendications de 1 à 7 ou d'un polypeptide selon l'une des revendications 8 ou 9, pour la préparation d'une composition utile pour la prévention ou le traitement des