Brevet FR2828284A1 — publié le 20030207

DESCRIPTION La présente invention concerne la détection de molécules biologiques par l'utilisation d'un procédé d'amplification à rendement amélioré. La reconnaissance d'une molécule biologique cible par une molécule de reconnaissance spécifique de cette molécule biologique cible est une propriété couramment utilisée dans le domaine du diagnostic. De nombreuses molécules biologiques (ADN, ARN, protéine, anticorps, antigène) sont ainsi actuellement détectables et quantifiables grâce à ces méthodes de reconnaissance. Des techniques comparables à celles utilisées pour la détection de molécules biologiques, sont également utilisées dans le domaine agro-alimentaire pour détecter la présence de micro-organismes telles que les bactéries. La première étape de ces techniques de détection consiste à fixer la molécule de reconnaissance sur un support. Le support qui sert à fixer les molécules de reconnaissance est généralement une surface plane ou poreuse composée de matériaux, tels que : le verre, matériau peu onéreux, inerte et mécaniquement stable ; 1a surface peut être recouverte d'une grille de Teflon qui délimite des zones hydrophiles et hydrophobes, les polymères tels que le polypyrrol, le silicium, les métaux, notamment l'or et le platine. Suivant la nature de la molécule biologique cible recherchée, ADN ou protéine, la molécule de reconnaissance peut être respectivement constituée par un autre ADN, un ARN, un oligonucléotide (ou ODN), ou par un antigène, un anticorps. Pour la fixation des molécules de reconnaissance, on distingue trois grands types de fabrication. Il y a, tout d'abord, une première technique qui consiste en un dépôt de sondes pré-synthétisées. La fixation des sondes se fait par transfert direct, au moyen de micropipettes, de micro-pointes ou par dispositif type jet d'encre. Cette technique permet la fixation de sondes de taille relativement importante : de 60 bases (impression) à quelques centaines de bases (micro-déposition) : * L'impression est une adaptation du procédé utilisé par les imprimantes à jets d'encre. Elle repose sur la propulsion de très petites sphères de fluides (volume * La micro-déposition consiste à fixer des sondes longues de quelques centaines à plusieurs centaines de bases à la surface d'une lame de verre. Ces sondes sont généralement extraites de bases de données et se présentent sous forme de produits amplifiés et purifiés. Cette technique permet de réaliser des puces dénommées microarrays portant environ dix mille spots d'ADN sur une surface d'un peu moins 2 de 4 cm2. Il ne faut toutefois, pas oublier l'emploi de membranes de Nylon, dites macroarrays , qui portent des produits amplifiés, généralement par PCR, avec un 2 diamètre de 0, 5 à 1 mm et dont la densité maximale est de 25 spots/cm2. Cette technique très flexible est utilisée par de nombreux laboratoires. Dans la présente invention, cette dernière technique est considérée comme faisant partie des biopuces. La deuxième technique de fixation des sondes sur le support est appelée la synthèse in situ. Cette technique aboutit à l'élaboration de sondes courtes directement à la surface de la puce. Elle repose sur la synthèse d'oligonucléotides in situ inventée par Edwin Southern, et est fondée sur le procédé des synthétiseurs d'oligonucléotides, elle consiste à déplacer une chambre de réactions, où se déroule la réaction d'élongation d'oligonucléotides, le long de la surface de verre. Enfin, la troisième technique est appelée la photolithographie, qui est un procédé à l'origine des biopuces développées par Affymetrix. La photolithographie est dérivée des techniques des microprocesseurs. La surface de la puce est modifiée par la fixation de groupements chimiques photolabiles pouvant être activés par la lumière. Une fois illuminés, ces groupes sont susceptibles de réagir avec l'extrémité 3'd'un oligonucléotide. En protégeant cette surface par des masques de formes définies, on peut illuminer et donc activer sélectivement des zones de la puce où l'on souhaite fixer l'un ou l'autre des 4 nucléotides. L'utilisation successive de masques différents permet d'alterner des cycles de protection/réaction et donc de réaliser les sondes d'oligonucléotides sur des spots d'environ quelques dizaines de micromètre carré (u. m). Cette résolution permet de créer jusqu'à plusieurs dizaines de milliers de spots sur une surface de quelques centimètres carré (cm2). La photolithographie présente des avantages : massivement parallèle, elle permet de créer une puce de N-mères en seulement 4 x N cycles. Toutes ces techniques sont bien entendues utilisables avec la présente invention. La deuxième étape de ces techniques de détection consiste à hybrider spécifiquement une molécule cible sur la molécule de reconnaissance. A noter qu'il est également possible de former l'hybride molécule de reconnaissance/molécule cible avant la fixation sur le support. La troisième étape de ces techniques de détection consiste soit à utiliser une molécule cible déjà marquée soit à hybrider sur la molécule cible une molécule de détection. Selon la première variante, afin de pouvoir détecter l'hybridation ou le complexe molécule de reconnaissance et molécule cible après l'hybridation ou la complexation, la molécule cible est préalablement marquée. Plusieurs techniques de marquage ont été décrites jusqu'alors dans la littérature. La Demanderesse a d'ores et déjà déposé une demande de brevet, WO-A-99/65926 sous priorité du 17 juin 1998, sur un marquage d'acides nucléiques qui est couplé à la fragmentation de ceux-ci. Une autre technique classique de marquage consiste à greffer un marqueur fluorescent sur la molécule cible. Après excitation du marqueur, un signal lumineux est émis, et peut être détecté et analysé en microscopie à fluorescence ou par luminométrie. Dans le cadre de la détection d'ADN, la limite de détection par fluorescence est de l'ordre de 10' à 10' mole par litre (mol/1) d'oligonucléotides complémentaires marqués, Lü, Hua. Characterization of DNA hybridization on the optical fiber surface Colloids and Surfaces A : Physiochemical and Engineering Aspects-Vol. 175, Issues 1 : p. 147-152. 15 Dec. 2000. Une technique comparable consiste à greffer un marqueur radioactif sur la sonde de détection. Cette technique est couramment utilisée, notamment pour la détection d'ADN ou d'ARN. La quantification du signal s'effectue par autoradiographie, par une plaque photographique sensible aux rayons X. La chimiluminescence est une autre technique de marquage plus récente. Le marquage s'effectue chimiquement par un composé chimiluminescent. Différents marqueurs chimiluminescents ont déjà été décrit dans l'art antérieur tels que le luminol, la lucigénine, l'anthracène, le rubène. Après hybridation sonde/cible marquée, le composé chimiluminescent est porté à un état excité. Suivant le marqueur, l'excitation s'effectue par modification du pH (luminol, lucigenine) ou par la présence de peroxyoxalate (anthracène, rubène). Ce composé excité émet alors un rayonnement dans le visible, permettant la détection du complexe sonde/cible, par luminométrie. D'une façon comparable, la détection peut également se faire par électrochemiluminescence, comme cela est notamment développé dans le brevet WO-A-98/12539. Dans ce cas, le marqueur est excité électriquement, ce qui conduit à l'émission d'un photon, détectable par luminométrie. Par électrochimie, la limite de détection est plus élevée que lors de l'utilisation de marqueurs fluorescents et peut atteindre environ 10-12 à 10-13 mole d'ADN recherché dans le cadre de la détection d'ADN. Une autre technique enfin, fait appel à une modification de la signature électrochimique d'un polymère conjugué portant la sonde, lors de l'hybridation du complexe molécule de reconnaissance/ molécule cible. Ainsi, dans la demande de brevet FR94/5064, un polymère conjugué, électriquement conducteur et électro-actif lié à une première molécule biologique (molécule de reconnaissance) est utilisé pour détecter ou doser spécifiquement une seconde molécule biologique (molécule cible). La détection de cette dernière s'effectue alors électriquement, par mesure d'une différence de potentiel entre le polymère conjugué non lié à la molécule cible et le polymère conjugué lié à la molécule cible. Une étude comparable est présentée dans la demande de brevet WO-A-00/77523. Selon la seconde variante, afin de pouvoir détecter l'hybride ou le complexe molécule de reconnaissance et molécule cible après l'hybridation ou complexation, la molécule cible est ensuite marquée indirectement par hybridation spécifiques d'une molécule de détection. Plusieurs techniques de marquage ont été décrites jusqu'alors dans la littérature. Des compléments d'information en relation avec cette seconde variante peuvent être trouvés dans les documents suivants : 'E. Lopez-Crapez, H. Bazin, E. Andre, J. Noletti, J. Grenier and G. Mathis-A homogeneous europium cryptate-based assay for the diagnosis of mutations by time- resolved fluorescence resonance energy transfert-Nucleic acids Res. 2001 29 : e70, et . Yuzhi Zhang, Brendan D. Price, Sotirios Tetradis, Subrata Chakrabarti, Gautam Maulik and Mike Makrigiorgos-Reproductible and inexpensive probe preparation for oligonucleotide arrays-Nucleic acids Res. 2001 29 : e66. Toutes ces techniques peuvent être appliquées au domaine des biopuces. On entend par biopuce, une puce ou un support présentant à sa surface une pluralité de zones de reconnaissance, équipées de molécules présentant des propriétés de reconnaissance. Dans la suite du texte, et par abus de langage, le terme biopuce est utilisé indépendamment de la destination de la puce à une analyse chimique ou biologique. La présente invention concerne enfin des hybrides ou complexes pouvant être utilisés sur de tels biopuces. Le concept de biopuce, plus précisément de puce à ADN, date du début des années 90. De nos jours, ce concept s'est élargi puisque des puces à protéine commencent à se développer. Il repose sur une technologie pluridisciplinaire intégrant la micro-électronique, la chimie des acides nucléiques, l'analyse d'images et l'informatique. Le principe de fonctionnement repose sur un fondement de la biologie moléculaire : le phénomène d'hybridation ; c'est à dire l'appariement par complémentarité des bases de deux séquences d'ADN. La méthode des biopuces repose sur l'emploi de sondes (séquences d'ADN représentant une portion d'un gène ou un oligonucléotide), fixées sur un support solide sur lesquelles on fait agir un échantillon d'acides nucléiques marqués directement ou indirectement avec des fluorochromes. Les sondes sont positionnées de manière spécifique sur la puce et chaque hybridation donne un renseignement sur chaque gène représenté. Ces informations sont cumulatives, et permettent de détecter la présence d'un gène ou de quantifier le niveau d'expression de ce gène dans le tissu étudié. Après hybridation, la puce est lavée, lue par un scanner et l'analyse de la fluorescence est traitée par informatique. Ainsi, les puces Micam (marque déposée) ont une surface effective inférieure à 2 mm2. Après hybridation avec des ADN cibles marqués (volume réactionnel de l'ordre de quelques nul), la puce est lue en fluorescence (voir à ce propos M. Cuzin-DNA chips : a new tool for genetic analysis and diagnostics-Transfusion Clinique et Biologique, Volume 8. Issue 3, June 2001, pages 291-296). D'autres systèmes de biopuces utilisés dans le diagnostic génétique ont également été décrits d'une façon comparable (Vo-Dinh 1998 ; WO-A-99/2714 ; WO-A-00/43552), et peuvent être d'une manière plus large appliqués à la détection de protéines cibles ou de bactéries (US-A- 5,814, 516). Toutefois, bien que des techniques très sensibles (fluorescence, électrochimie) soient utilisées comme mode de détection, ces procédés présentent des limites de détection qui sont intrinsèquement associées à ces techniques. Ainsi, la limite de détection par fluorescence, c'est à dire le nombre de photons que l'on est capable de distinguer correspond à environ 10-9 à 10-10 mole. Par électrochimie, il semble que la limite de détection puisse atteindre environ 10-12 à 10-13 mole. Bien que des techniques de traitement de signal pourraient permettre de faire reculer ces limites de détection d'un facteur de 10, voire 100, les valeurs attendues sont évidemment bien en deçà des souhaits des chercheurs et praticiens de caractériser notamment quelques dizaines ou centaines de copies dans l'analyse d'ADN en solution. L'invention se propose de répondre à l'ensemble des inconvénients de l'état de la technique. A cet effet, la présente invention concerne un procédé de détection au niveau d'un support solide d'une complexation ou d'une hybridation entre au moins deux molécules, l'une des molécules étant initialement fixée sur le support, dite molécule de reconnaissance, et l'autre étant en solution dans un échantillon liquide, dite molécule cible, consistant à : * utiliser un élément chimique ou biologique, lié spécifiquement au complexe ou à l'hybride formé, * exciter ledit complexe ou ledit hybride, afin que l'élément chimique ou biologique libère un signal lumineux, * réceptionner le signal lumineux et le transformer en signal chimique au niveau dudit support, et 'détecter un signal électrique, du au signal chimique. Selon un mode préféré de l'invention, l'élément chimique ou biologique libère au moins un photon lors de l'excitation. Selon un autre mode préféré de l'invention, le signal amplifié est réalisé par un précipité métallique, préférentiellement par un précipité d'halogénure d'argent. Selon un autre mode préféré de l'invention, la détection est réalisée par détection électrique, et/ou luminométrie, et/ou fluorométrie, et/ou radiométrie, et/ou photodiode. L'invention concerne également un support solide de détection d'une complexation ou d'une hybridation entre au moins deux molécules, l'une des molécules étant en contact avec le support, dite molécule de reconnaissance, et l'autre étant en solution dans un échantillon liquide, dite molécule cible, constitué par une paroi en un matériau transparent comportant : une première face pour l'accrochage des complexes ou des hybrides, et une seconde face portant des moyens d'amplification chimique d'un signal lumineux provenant d'un élément chimique ou biologique, lié spécifiquement au complexe ou à l'hybride formé. L'invention concerne également un support solide de détection d'une complexation ou d'une hybridation entre au moins deux molécules, l'une des molécules étant en contact avec le support, dite molécule de reconnaissance, et l'autre étant en solution dans un échantillon liquide, dite molécule cible, l'accrochage des complexes ou des hybrides et les moyens d'amplification chimique d'un signal lumineux provenant d'un élément chimique ou biologique, lié spécifiquement au complexe ou à l'hybride formé sont sur la même face du support. Selon un mode préféré de l'invention décrite dans les deux paragraphes précédents, la face du support, qui porte les moyens d'amplification chimique d'un signal lumineux, porte également des moyens de détection du signal amplifié. Selon un autre mode préféré de l'invention, le support est de faible épaisseur comprise entre 0, 1 um et 100 um, préférentiellement entre 0, 5 um et 10 J. m, et encore plus préférentiellement de 1 um. Préférentiellement, le support est en forme sensiblement de parallélépipède. Selon un mode préféré de l'invention, la seconde face du support est accolée à une carte d'analyse, l'espace entre les deux éléments circonscrivant les moyens d'amplification du signal lumineux et/ou les moyens de détection du signal chimique. Selon un autre mode préféré de l'invention, l'élément chimique ou biologique constitue tout ou partie de l'une des deux molécules de reconnaissance ou cible ou est constitué d'un atome ou une molécule de détection initialement portée par l'une desdites deux molécules de reconnaissance ou cible. Préférentiellement, l'élément est constitué par un atome ou un groupement d'atomes rapporté sur l'une des deux molécules de reconnaissance ou cible. Selon un autre mode préféré de l'invention, toutes les molécules de reconnaissance identiques structurellement ou fonctionnellement, c'est-à-dire qui s'hybrident ou se complexent aux mêmes molécules cibles, sont regroupées en une zone de reconnaissance ; le support pouvant contenir au moins deux zones de reconnaissance, préférentiellement entre cent et un million de zones de reconnaissance et encore plus préférentiellement de trois cents à mille zones de reconnaissance. Préférentiellement, chaque zone de reconnaissance est associée à des moyens d'amplification qui lui sont propres, ou sont communs avec toute ou partie des autres zones de reconnaissance du support. Préférentiellement, les moyens d'amplification couvrent toute ou partie de la face du support où ils sont implantés. Selon un autre mode préféré de l'invention, les moyens d'amplification du signal lumineux sont constitués d'une couche métallique, préférentiellement une couche d'argent, qui donne un précipité métallique préférentiellement d'argent en présence d'au moins un photon. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les moyens de détection du ou des signaux amplifiés sont constitués par un réseau électrique matriciel. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le support et/ou les zones de reconnaissance est/sont en verre ou en polymère ou en silice. L'invention concerne également une biopuce incorporant un support selon l'invention décrit dans le paragraphe précédent. Préférentiellement, la biopuce est utilisée dans un test de diagnostic. Les figures ci-joints sont donnés à titre d'exemple explicatif et n'ont aucun caractère limitatif. Elles permettront de mieux comprendre l'invention. La figure 1 représente une vue en perspective partielle d'une carte d'analyse selon l'invention. La figure 2 représente une vue en coupe selon A-A de la figure 1, la partie supérieure de la carte d'analyse étant en place. La figure 3 représente une vue en perspective partielle d'une carte d'analyse selon l'invention, mettant en évidence le réseau électrique matriciel, vu en transparence. La figure 4 représente une vue en coupe d'un support selon l'invention, après complexation d'une molécule de reconnaissance sur sa surface extérieure. La figure 5 représente une vue en coupe d'un support selon l'invention, après hybridation d'une molécule cible sur la molécule de reconnaissance déjà complexée sur la surface extérieure du support. Enfin, la figure 6 représente une vue en coupe d'un support selon l'invention, après hybridation d'une molécule de détection sur l'hybride entre une molécule cible et une molécule de reconnaissance déjà complexé sur la surface extérieure du support. L'exemple qui suit est donné à titre explicatif et n'a aucun caractère limitatif. Il permettra de mieux comprendre l'invention. Ainsi l'exemple donné concerne essentiellement les acides nucléiques, mais il est tout à fait envisageable de l'utiliser par exemple avec des anticorps et des antigènes. De manière générale, le concept de biopuce, plus précisément de puce à ADN, date du début des années 90. De nos jours, ce concept s'est élargi puisque des puces à protéine commencent à se développer. Il repose sur une technologie pluridisciplinaire intégrant la micro-électronique, la chimie des acides nucléiques, l'analyse d'images et l'informatique. Le principe de fonctionnement repose sur un fondement de la biologie moléculaire : le phénomène d'hybridation ; c'est à dire l'appariement par complémentarité des bases de deux séquences d'ADN. La méthode des biopuces repose sur l'emploi de sondes (séquences d'ADN représentant une portion d'un gène ou un oligonucléotide), fixées sur un support solide sur lesquelles on fait agir un échantillon d'acides nucléiques marqués directement ou indirectement avec des fluorochromes. Les sondes sont positionnées de manière spécifique sur la puce et chaque hybridation donne un renseignement sur chaque gène représenté. Ces informations sont cumulatives, et permettent de détecter la présence d'un gène ou de quantifier le niveau d'expression de ce gène dans le tissu étudié. Après hybridation, la puce est lavée, lue par un scanner et l'analyse de la fluorescence est traitée par informatique. Le support qui sert à fixer les sondes est généralement constitués de surface plane ou poreuse composée de matériaux, tels que : le verre, matériau peu onéreux, inerte et mécaniquement stable ; la surface peut être recouverte d'une grille de Téflon qui délimite des zones hydrophiles et hydrophobes, les polymères tels que le polypyrrol, le silicium, les métaux, notamment l'or et le platine. Pour la fixation des sondes également appelées par la suite molécules de reconnaissance, on distingue trois grands types de fabrication. Il y a, tout d'abord, une première technique qui consiste en un dépôt de sondes pré-synthétisées. La fixation des sondes se fait par transfert direct, au moyen de micropipettes, de micro-pointes ou par dispositif type jet d'encre. Cette technique permet la fixation de sondes de taille relativement importante : de 60 bases (impression) à quelques centaines de bases (micro-déposition) : L'impression est une adaptation du procédé utilisé par les imprimantes à jets d'encre. Elle repose sur la propulsion de très petites sphères de fluides (vo1ume nl) et à un rythme pouvant atteindre 4000 gouttes/secondes. L'impression n'implique aucun contact entre le système libérant le fluide et la surface à laquelle il est déposé. La micro-déposition consiste à fixer des sondes longues de quelques centaines à plusieurs centaines de bases à la surface d'une lame de verre. Ces sondes sont généralement extraites de bases de données et se présentent sous forme de produits amplifiés et purifiés. Cette technique permet de réaliser des puces dénommées microarrays portant environ dix mille spots d'ADN sur une surface d'un peu moins 2 de 4 cm2. Il ne faut toutefois, pas oublier l'emploi de membranes de Nylon, dites macroarrays , qui portent des produits amplifiés, généralement par PCR, avec un diamètre de 0,5 à 1 mm et dont la densité maximale est de 25 spots/cm2. Cette technique très flexible est utilisée par de nombreux laboratoires. Dans la présente invention, cette dernière technique est considérée comme faisant partie des biopuces. La deuxième technique de fixation des sondes sur le support est appelée la synthèse in situ. Cette technique aboutit à l'élaboration de sondes courtes directement à la surface de la puce. Elle repose sur la synthèse d'oligonucléotides in situ inventée par Edwin Southern, et est fondée sur le procédé des synthétiseurs d'oligonucléotides, elle consiste à déplacer une chambre de réactions, où se déroule la réaction d'élongation d'oligonucléotides, le long de la surface de verre. Enfin, la troisième technique est appelée la photolithographie, qui est un procédé à l'origine des biopuces développées par Affymetrix. La photolithographie est dérivée des techniques des microprocesseurs. La surface de la puce est modifiée par la fixation de groupements chimiques photolabiles pouvant être activés par la lumière. Une fois illuminés, ces groupes sont susceptibles de réagir avec l'extrémité 3'd'un oligonuclétide. En protégeant cette surface par des masques de formes définies, on peut illuminer et donc activer sélectivement des zones de la puce où l'on souhaite fixer l'un ou l'autre des quatre nucléotides. L'utilisation successive de masques différents permet d'alterner des cycles de protection/réaction et donc de réaliser les sondes d'oligo sur des spots d'environ quelques dizaines de micromètre carré (lam2). Cette résolution permet de créer jusqu'à plusieurs dizaines de milliers de spots sur une surface de quelques centimètres carré (cm2). La photolithographie présente des avantages : massivement parallèle, elle permet de créer une puce de N-mères en seulement 4 x N cycles. Toutes ces techniques sont bien entendues utilisables avec la présente invention. Des procédés utilisant des biopuces peuvent essentiellement être de deux natures différentes. D'une part, il peut s'agir de procédés pour : 'la recherche de la présence ou de l'absence d'un agent pathogène, par exemple d'une bactérie dans la viande. * la recherche de la présence ou de l'absence de mutations, connaissant le gène, on fabrique des oligonucléotides qui représentent ce gène. En présence de l'échantillon biologique, l'image obtenue par fluorescence permet de savoir s'il y a une mutation et en quelle position elle est située. Dans cette application, l'utilisation des puces à ADN est l'équivalent d'un séquençage pour un diagnostic de mutation, avec un énorme avantage en terme de rapidité. . 1a mesure du niveau d'expression de gènes dans un tissu. Le réseau de la puce porte de très nombreuses sondes qui correspondent à l'ensemble des gènes de l'espèce à étudier. On hybride un échantillon, par exemple d'ARNm qui représente les gènes actifs du tissu. L'analyse par fluorescence permet de connaître le niveau d'expression de chaque gène. L'efficacité des biopuces a été testée sur des systèmes biologiques bien connus tel que la levure (cycle cellulaire, métabolisme respiratoire, fermentation...). La comparaison des résultats obtenus par les puces avec ceux préalablement obtenus par d'autres approches a démontré une concordance pour les gènes dont l'expression était déjà bien connue dans ces systèmes biologiques. Ces travaux ont ainsi permis de valider la technologie des biopuces. Les puces à ADN ont ouvert la voie à une nouvelle instrumentation en biologie moléculaire qui peut même intégrer différentes étapes d'analyses sous forme miniaturisée, voir à ce propos les demandes de brevet WO-A-00/78452 sous priorité du 22 juin 1999 et FROO/10978 déposée 28 août 2000 de la Demanderesse. De plus, et comme déjà indiqué ci-dessus, le très fort intérêt suscité ces derniers temps par la protéomique, la discipline clef de la post-génomique, s'accompagne de l'émergence du concept de puces à protéines. Celles-ci font également parties des biopuces selon l'invention. Les molécules de reconnaissance peuvent être, par exemple, des oligonucléotides, des polynucléotides, des protéines telles que des anticorps ou des peptides, des lectines ou tout autre système du type ligand-récepteur. En particulier, les molécules de reconnaissance peuvent comporter des fragments d'ADN ou d'ARN. Lorsque la biopuce est mise en contact avec un échantillon à analyser, les molécules de reconnaissance sont susceptibles d'interagir, par exemple par hybridation dans le cas où il s'agit d'acides nucléiques ou par complexation dans le cas où il s'agit d'anticorps et d'antigène, avec des molécules cibles présentes dans un échantillon biologique liquide. Ainsi, en équipant une biopuce d'une pluralité de zones de reconnaissance avec différentes molécules de reconnaissance différentes, où chaque molécule de reconnaissance est spécifique d'une molécule cible, il est possible de détecter et éventuellement de quantifier une grande variété de molécules contenues dans l'échantillon. Il est bien entendu évident que chaque zone de reconnaissance ne comporte qu'un seul type de molécules de reconnaissance identiques entre elles. L'ensemble support-molécule de reconnaissance-molécule cible-molécule de détection constitue un test en format sandwich Les tests en format sandwich sont largement utilisés en diagnostic, que ce soit en diagnostics moléculaires, par exemple test ELOSA (Enzyme-Linked Oligo-Sorbent Assay), ou en diagnostics immunologiques, par exemple test ELISA (Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay). De façon générale, ils comprennent une molécule de reconnaissance, telle qu'une sonde d'acide nucléique ou un antigène (cas d'un sandwich antigène) ou un anticorps (cas d'un sandwich anticorps), qui sert à capturer une cible, qui sera respectivement constituée par une sonde d'acide nucléique ou un anticorps ou un antigène. Cette molécule de reconnaissance est fixée sur support solide de manière connu pour l'homme du métier, soit par adsorption, soit par couplage direct, soit par l'intermédiaire d'une protéine intermédiaire, comme par exemple l'avidine ou la protéine A. L'ensemble molécule de reconnaissance et molécule cible est ensuite détecté par une molécule de détection, qui sera respectivement constituée d'une sonde d'acide nucléique ou un anticorps ou un antigène. Cette molécule de détection porte ou pourra être ultérieurement associée à un marqueur, marqueur qui est nécessaire pour permettre la détection et/ou la quantification. La molécule de détection qu'elle soit ou pas encore associée à un marqueur sera toujours appelée molécule de détection. Par la suite, la fixation d'un acide nucléique sur un autre acide nucléique est appelée hybridation, alors que la fixation d'un anticorps sur un antigène est appelé complexation. Les tests actuellement disponibles sont des tests tels que ceux développés par l'une des Demanderesses pour les dosages immunologiques ou les puces à ADN mises au point par la société Affymetrix ("Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays", M. Shee et al., Science, 274, 610-614."Light-generated oligonucleotide arrays for rapide DNA sequence analysis", A. Caviani Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994,91, 5022-5026), pour les diagnostics moléculaires. Dans cette technologie, les sondes de capture sont généralement de tailles réduites, autour de vingt nucléotides. Dans le domaine ELOSA, c'est-à-dire de la détection des acides nucléiques, voir à ce propos la demande de brevet déposée par la Demanderesse WO-A-91/19812, on définit de la même façon un oligonucléotide de capture, une cible acide nucléique qui est soit de l'ADN soit de l'ARN, et un oligonucléotide de détection. Les oligonucléotides de capture et de détection sont complémentaires d'une partie de la cible mais au niveau de régions de la cible qui sont respectivement différentes structurellement et physiquement, de sorte que les oligonucléotides de capture et de détection ne peuvent pas s'hybrident l'un à l'autre. Que ce soit en diagnostics moléculaires ou en dosages immunologiques, les éléments de détection portent un marqueur qui permet la détection et/ou la quantification de la cible. Dans l'état de la technique, différents marqueurs ont été développés avec l'objectif permanent d'améliorer la sensibilité. Ils peuvent être soit radioactifs, soit enzymatiques, soit fluorescents soit sous la forme de microparticules ou de nanoparticules. Par marquage, on entend la fixation d'un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces marqueurs suit : les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la péroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la P-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase, les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants, les groupements à densité électronique détectable par microscopie électronique ou par leur propriété électrique comme la conductivité, l'ampérométrie, la voltamétrie, l'impédance, les groupements détectables, par exemple dont les molécules sont de tailles suffisantes pour induire des modifications détectables de leurs caractéristiques physiques et/ou chimiques, cette détection peut être réalisée par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation de surface, la variation d'angle de contact ou des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, les molécules radioactives comme le 32p, le 35S ou le 1251. Dans la présente invention le marqueur est essentiellement constitué par un groupement pouvant fournir un photon. Des systèmes indirects peuvent aussi être utilisés, comme par exemple des ligands capables de réagir avec un anti-ligand. Les couples ligand/anti-ligand sont bien connus de l'homme du métier, ce qui est le cas par exemple des couples suivants : . biotine/streptavidine, * haptène/anticorps, 'antigène/anticorps, * peptide/anticorps, . sucre/lectine, # polynucléotide/complémentaire du polynucléotide. Dans ce cas, c'est le ligand qui porte l'agent de liaison. L'anti-ligand peut être détectable directement par les marqueurs décrits au paragraphe précédent ou être luimême détectable par un ligand/anti-ligand. Ces systèmes de détection indirects peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal. Cette technique d'amplification du signal est bien connue de l'homme du métier, et l'on pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures FR98/10084 ou WO-A-95/08000 de la Demanderesse ou à l'article J. Histochem. Cytochem. 45 : 481-491,1997. Tous ces éléments évoqués ci-dessus sont susceptibles d'être incorporés dans l'invention afin d'améliorer encore les performances de celle-ci. Si l'on se réfère maintenant aux figures, on remarque en figure 1 que l'invention concerne une carte d'analyse 1, dont seule la première partie dite de base 17 est représentée. Celle-ci 1 comporte sur l'une de ses faces plate un certains nombre de zones de reconnaissance 14, qui ensemble constituent un support 3. Le support 3 absorbe très largement les ultraviolets mais est transparent dans le visible. Pour cela, ledit support 3 en verre est préalablement chargé au plomb. Comme représenté à la figure 2, le support 3 est lui même déposé au sein de la carte d'analyse 1, qui peut être en verre également, ou en un plastique approprié. Cette carte 1 telle que représentée sur la figure 2 est constituée de deux parties, la première partie dite de base 17, déjà évoquée précédemment, et une seconde partie constituée par un couvercle 16, qui délimitent, conjointement avec les supports 3, un espace 18 où un échantillon liquide à tester 2 peut être introduit via tout moyen de l'état de la technique connu de l'homme du métier. Cette première partie dite de base 17 et chaque support 3 délimitent ensemble un réservoir 4 où un moyen d'amplification de signal 5 est présent. La nature et le fonctionnement de ce moyen d'amplification de signal 5 sera décrit ultérieurement. De part et d'autre du réservoir 4, on remarque la présence d'une borne électrique amont 6 et d'une borne électrique aval 7, qui n'ont aucun contact direct entre elles. Par contre, ledit moyen d'amplification de signal 5 est en contact à la fois avec la borne électrique amont 6 et avec la borne électrique aval 7. La figure 3 permet de mieux comprendre de l'intérieur la partie de base 17. Elle comporte sur cette figure un certain nombre de supports 3, chacun associé à un réservoir 4 et à un moyen d'amplification de signal 5, lui-même associé à une borne électrique amont 6 et une borne électrique aval 7. L'ensemble des bornes électriques amont 6 est en position perpendiculaire de l'ensemble des bornes électriques aval 7 sans contact entre ces deux ensemble, et forment conjointement un réseau électrique 13 matriciel. Sur ces figures 4 à 6, et dans un souci de faciliter la compréhension de l'invention, le couvercle 16 n'a pas été représenté et la molécule de reconnaissance 8, ainsi que les autres molécules évoquées par la suite qui coopèrent avec elle, n'ont été représentées qu'en un seul exemplaire et de manière stylisée et grossie. Sur la figure 4, une molécule de reconnaissance 8 est déposée sur une des zones de reconnaissance 14 d'un support 3 en verre, selon une technique classique de microdépôt, déjà évoquée précédemment. Bien entendu cette fixation est réalisée préalablement à l'introduction dans l'espace 18 de l'échantillon 2 à tester. La figure 5 représente l'étape suivante qui consiste à permettre l'hybridation sur la molécule de reconnaissance 8 d'une molécule cible 9. Cette hybridation n'entraîne aucune modification au niveau de la partie de base 17 de la carte 1, y compris du support 3. Enfin la figure 6, représente la dernière étape biologique. Elle consiste à permettre l'hybridation sur l'hybride constitué par la molécule de reconnaissance 8 et la molécule cible 9, d'une troisième molécule dite de détection 10. Bien entendu il est également possible que cette molécule de détection 10 soit une partie intégrante de la molécule cible 9, auquel cas cette étape n'a pas de raison d'être puisque la détection sera réalisable dès la formation de l'hybride 8 et 9. La molécule de détection 10 est un groupement moléculaire apte à se lier spécifiquement sur la molécule cible 9 ou sur l'hybride 8 et 9, et apte à donner au moins un photon pour donner un signal lumineux 11. Cette hybridation n'entraîne aucune modification au niveau du support 3. Par contre, elle entraîne une modification au niveau du réservoir 4 de la partie de base 17 de la carte 1, et plus précisément au niveau du moyen chimique d'amplification 5 du signal lumineux 11, qui est constitué par un halogénure d'argent (AgX, tel que AgCl, AgBr, etc. ). Ainsi le signal lumineux 11 va engendrer une précipitation d'argent 15 au sein dudit réservoir 4. Cette précipitation va alors fermer le circuit électrique entre les bornes électriques amont 6 et aval 7, ce qui va permettre la conduction d'un signal électrique 12. Le réseau électrique 13 de la figure 3 va ainsi permettre par le quadrillage matriciel de micro-circuits lignes 6 et colonnes 7 laisser apparaître ou non à chaque intersection un précipité, correspondant en coordonnées, aux molécules de reconnaissance 8 ayant spécifiquement hybridées des molécules cibles 9. A noter que la molécule cible 9 est marquée par un élément chimique 10 fluorescent, selon une technique classique de marquage connue de l'homme du métier. L'hybride 8 et 9 formé, lié à l'élément chimique 10 fluorescent, est soumis à une excitation globale par ultraviolet. Des émissions locales ont lieu dans le visible à partir de l'hybride 8 et 9, formant un signal lumineux 11. Contrairement aux ultraviolet d'excitation, ce signal lumineux 11 traverse le support 3, transparent dans le visible et est transformé en signal chimique 15 par la précipitation de l'halogénure d'argent 5. L'interaction de ce signal lumineux 11 et de l'halogénure d'argent 5 conduit à la formation dans le réservoir 4 du signal chimique 15 comprenant des microcristallites d'argent au regard de l'hybride 8 et 9 formé. Ces microcristallites d'argent établissent un contact entre ligne et colonne du quadrillage matriciel. Ainsi, la conductivité établie entre ligne et colonne, liée à la taille des microcristallites formées est directement liée à la quantité de lumière émise, et donc directement liée à la quantité de molécules de reconnaissance 8 et de molécules cibles 9 hybridées. REFERENCES 1. Carte d'analyse 2. Echantillon liquide à tester 3. Support solide ou zone de reconnaissance 4. Réservoir 5. Moyen d'amplification d'un signal ou solution métallique ou solution d'argent 6. Borne électrique amont 7. Borne électrique aval 8. Molécule de reconnaissance 9. Molécule cible 10. Elément chimique ou biologique ou molécule de détection 11. Signal lumineux 12. Signal électrique 13. Réseau électrique 14. Zones de reconnaissance du support 3 15. Signal chimique ou précipité métallique préférentiellement d'argent 16. Couvercle de la carte 1 17. Partie de base de la carte 1 18. Espace circonscrit par un support 3, le couvercle 16 et la partie de base 17 REVENDICATIONS 1. Procédé de détection au niveau d'un support (3) solide d'une complexation ou d'une hybridation entre au moins deux molécules (8 et 9), l'une des molécules étant initialement fixée sur le support (3), dite molécule de reconnaissance (8), et l'autre étant en solution dans un échantillon liquide (2), dite molécule cible (9), caractérisé en ce qu'il consiste à : * utiliser un élément chimique ou biologique (10), lié spécifiquement au complexe ou à l'hybride formé, * exciter ledit complexe ou ledit hybride, afin que l'élément chimique ou biologique (10) libère un signal lumineux (11), * réceptionner le signal lumineux (11) et le transformer en signal chimique (15) au niveau dudit support (3), et * détecter un signal électrique (12), dû au signal chimique (15). 2. Procédé, selon la revendication 1, caractérisé en ce que, lors de l'excitation, l'élément chimique ou biologique (10) libère au moins un photon. 3. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le signal chimique (15) est réalisé par un précipité métallique, préférentiellement par un précipité d'halogénure d'argent. 4. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la détection est réalisée par détection électrique (12), et/ou luminométrie, et/ou fluorométrie, et/ou radiométrie, et/ou photodiode. 5. Support solide (3) de détection d'une complexation ou d'une hybridation entre au moins deux molécules (8 et 9), l'une des molécules étant en contact avec le support (3), dite molécule de reconnaissance (8), et l'autre étant en solution dans un échantillon liquide (2), dite molécule cible (9), caractérisé par le fait qu'il est constitué par au moins une paroi en un matériau transparent comportant : une première face pour l'accrochage des complexes ou des hybrides, et une seconde face délimitant des moyens d'amplification (5) chimique d'un signal lumineux (11) provenant d'un élément chimique ou biologique (10), lié spécifiquement au complexe ou à l'hybride formé. 6. Support solide (3) de détection d'une complexation ou d'une hybridation entre au moins deux molécules (8 et 9), l'une des molécules étant en contact avec le support (3), dite molécule de reconnaissance (8), et l'autre étant en solution dans un échantillon liquide (2), dite molécule cible (9), caractérisé par le fait que l'accrochage des complexes ou des hybrides et les moyens d'amplification (5) chimique d'un signal lumineux (11) provenant d'un élément chimique ou biologique (10), lié spécifiquement au complexe ou à l'hybride formé sont sur la même face dudit support (3). 7. Support, selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, caractérisé par le fait que la face du support (3), qui porte les moyens d'amplification (5) chimique d'un signal lumineux (11), porte également des moyens de détection (6,7 et 12) du signal chimique (15). 8. Support, selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé par le fait que le support (3) est de faible épaisseur comprise entre 0, 1 um et 100 am, préférentiellement entre 0, 5 um et 10 um, et encore plus préférentiellement de 1 um. 9. Support, selon la revendication 8, caractérisé par le fait que le support (3) est en forme sensiblement de parallélépipède. 10. Support, selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé par le fait que la seconde face du support (3) est accolée à une carte d'analyse (1), l'espace entre les deux éléments (3 et 1) circonscrivant les moyens d'amplification (5) du signal lumineux (11) et/ou les moyens de détection (6,7 et 12) du signal chimique (15). 11. Support, selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, caractérisé par le fait que l'élément chimique ou biologique (10) constitue tout ou partie de l'une des deux molécules de reconnaissance (8) ou cible (9) ou est constitué d'un atome ou une molécule de détection initialement portée par l'une desdites deux molécules de reconnaissance (8) ou cible (9). 12. Support, selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, caractérisé par le fait que l'élément chimique ou biologique (10) est constitué par un atome ou un groupement d'atomes rapporté sur l'une des deux molécules de reconnaissance (2) ou cible (5). 13. Support, selon l'une quelconque des revendications 5 à 12, caractérisé par le fait que toutes les molécules de reconnaissance (8) identiques structurellement ou fonctionnellement, c'est-à-dire qui s'hybrident ou se complexes aux mêmes molécules cibles (9), sont regroupées en une zone de reconnaissance (14) ; le support (3) pouvant contenir au moins deux zones de reconnaissance (14), préférentiellement entre cent et un million de zones de reconnaissance (14) et encore plus préférentiellement de trois cents à mille zones de reconnaissance (14). 14. Support, selon la revendication 13, caractérisé par le fait que chaque zone de reconnaissance (14) est associée à des moyens d'amplification (5) qui : * lui sont propres, ou sont communs avec toute ou partie des autres zones de reconnaissance (14) du support (3). 15. Support, selon la revendication 13, caractérisé par le fait que les moyens d'amplification (5) couvrent toute ou partie de la face du support (3) où ils sont implantés. 16. Support, selon l'une quelconque des revendications 5 à 15, caractérisé par le fait que les moyens d'amplification (5) du signal lumineux (11) sont constitués d'une couche métallique, préférentiellement une couche d'argent, qui donne un précipité métallique (15) préférentiellement d'argent en présence d'au moins un photon. 17. Support, selon l'une quelconque des revendications 7 à 16, caractérisé par le fait que les moyens de détection (6 et 7) du ou des signaux chimiques (15) sont constitués par un réseau électrique matriciel (13). 18. Support, selon l'une quelconque des revendications 5 à 17, caractérisé par le fait que le support (3) et/ou les zones de reconnaissance (14) est/sont en verre ou en polymère ou en silice. 19. Biopuce incorporant un support (3), selon l'une quelconque des revendications 5 à 18. 20. Utilisation d'une biopuce, selon la revendication 19, dans un test de diagnostic.