Brevet FR2826975A1 — publié le 20030110

La présente invention concerne l'utilisation d'au moins une fraction de lipoprotéines oxydées choisies parmi les VLDL oxydées et/ou les IDL oxydées et/ou LDL oxydées pour obtenir la différenciation de monocytes en cellules dendritriques matures. Les cellules dendritiques sont impliquées dans le développement d'une réponse immune et dans l'initiation d'une réponse lymphocytaire T spécifique par reconnaissance, capture et présentation des antigènes notamment des agents infectieux (Steinman et al. 1997, Immuno. Rev., 156 : 25-37 ; Cella et al. 1997, Curr. Opin. Immunol., 9 : 10-16). Les cellules dendritiques immatures sont localisés dans les tissus non lymphoïdes. Ces cellules sont également appelées cellules de Langerhans lorsqu'elles sont localisées au niveau de la peau, et dans tous les épidermes hormis l'intestin. Des cellules dendritiques, en plus faible quantité, sont également localisées dans les organes tels que le foie, le poumon, l'intestin. Ces cellules dendritiques immatures captent et digèrent les antigènes des agents infectieux de façon très efficace. Si les cellules dendritiques existent à l'état immature dans le plupart des tissus, certains signaux, comme les agents bactériens ou les cytokines inflammatoires, peuvent les activer en induisant un processus de maturation. L'activation des cellules dendritiques est l'étape initiale du déclenchement de la réponse immunitaire adaptative. En effet, au cours de cette activation, les cellules dendritiques acquièrent la capacité à migrer vers les organes lymphoïdes où se trouvent les lymphocytes T et la capacité à transmettre des signaux de co-stimulation indispensables à l'activation des lymphocytes T naïfs. Ainsi, durant la migration des cellules dendritiques vers les organes lymphoïdes, les cellules dendritiques subissent des modifications fonctionnelles et phénotypiques que l'on regroupe sous le terme de maturation, qui se caractérise par : 1) une augmentation à la surface des cellules dendritiques de molécules impliquées dans l'activation des lymphocytes T (telles que CD40, CD80, CD83, CD86 et les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe 1 et II) 2) la production de cytokines proinflammatoires (telles que les interleukines IL- 12, IL-lpet IL-6). 3) la diminution de la capacité des cellules dendritiques à capter et à digérer l'antigène. De part leurs capacités de développement d'une réponse immune et d'initiation d'une réponse lymphocytaire T spécifique, les cellules dendritiques présentent un intérêt thérapeutique particulier notamment dans les domaines de vaccination antiinfectieuse et anti-tumorale et de l'immunothérapie (Austin. 1998, Curr. Opin. Hematol. 5 : 3-15 ; Reise Sousa et al. 1999, Curr. Opin. Immunol. Il : 392-399). In vivo, les monocytes sont des cellules circulantes qui peuvent pénétrer dans les tissus. En traversant la paroi vasculaire endothéliale les monocytes entrent au contact de facteurs environnementaux qui influencent leur devenir. Schématiquement, on envisage trois possibiblités pour ces cellules 1) la sortie des tissus et le retour vers les ganglions lymphatiques, . 2) la différenciation en macrophages, 3) la différenciation en cellules dendritiques immatures. La nature des facteurs environnementaux endogènes qui orientent les monocytes vers l'une ou l'autre de ces voies est encore méconnue. ln vitro, la première étape pour obtenir des cellules dendritiques matures à partir de monocytes est une induction de la différenciation des monocytes en culture en cellules dendritiques immatures par notamment l'interleukine IL-4 et le facteur GMCSF (Granulocyte Macrophage-Stimulating factor). Au bout de 6 jours, 95% des cellules en culture sont des cellules dendritiques immatures. La deuxième étape est une activation de la maturation des cellules dendritiques immatures qui est généralement induite par des agents exogènes, tels que des agents bactériens ou viraux ou tout autre molécules susceptibles d'induire la maturation. Il a ainsi été décrit par Pascale Jeannin et al. (Nature Immunology, 2000,1 : 502-509) que la protéine kpOmpA de Klebsiella pneumonie, ajoutée au 6tmt jour de culture sur des cellules dentritiques immatures était capable d'induire la maturation de ces cellules. Comme cela est connu de l'homme du métier et illustré notamment par les expériences décrites par Jeannin et al. précitée, le délai pour l'obtention de cellules dendritiques matures est substantiellement long puisqu'il nécessite 6 jours pour arriver à l'état de cellules dendritiques immatures et 2 jours pour leur maturation. Par ailleurs, la maturation des cellules dendritiques est habituellement initiée par des molécules exogènes dérivés d'agents infectieux. Outre les problèmes sécuritaires et financiers, liés à l'utilisation d'agents infectieux (effets secondaires directs ou indirects in vivo ; nécessité de purification très importante selon des exigences légales ou réglementaires très strictes), l'utilisation de ce type de molécules est difficilement envisageable dans le cadre de la vaccinologie et de l'immunothérapie. L'invention se propose de répondre à l'ensemble des inconvénients de l'état de la technique, en diminuant d'une part le temps nécessaire à l'obtention de cellules dendritiques matures, et en évitant d'autre part l'utilisation de molécules exogènes dérivés d'agents infectieux pour activer la maturation. Dans la présente invention, les inventeurs ont utilisés des lipoprotéines oxydés, notamment des LDL oxydés (Low Density Lipoprotein oxydés) pour la différenciation de monocytes en cellules dendritiques matures. Les lipoprotéines sont des particules sphériques solubles dans l'eau qui transportent des lipides non polaires. Chez l'homme, les LDL sont les principaux transporteurs du cholestérol, et sont formés d'un coeur hydrophobe contenant des molécules d'ester de cholesterol et d'une enveloppe formée d'une couche de lipides polaires (principalement des phospholipides) dans laquelle s'insère l'apolipoprotéine B. Les LDL plasmatiques peuvent traverser l'endothélium et subir des modifications oxydatives notamment dans l'espace subendothélial (Witztum et al. 1991, J. Clin. Invest., 88 : 1785-1792 ; Steinberg et al. 1988, In atherosclerosis reviews. Raven Press, NY, 1-23). Les LDL oxydés présentent des activités inflammatoires. Les modifications oxydatives pro-inflammatoires des LDL sont sous le contrôle des LDL natives et des HDL natives (High Density Lipoprotein). Il a été montré notamment que les enymes paraoxonase et platelet-activating factor acetylhydrolase (ou PAF-AH) préviennent, dans les conditions normales l'accumulation de LDL oxydés (Mackness et al. 1991, FEBS Lett., 286 : 152-154 ; Watson et al. 1995, J. Clin. Invest. 96 : 2882-2891 ; Watson et al., 1995, J. Clin. Invest. 95 : 774-782). Lors de la phase aiguë d'une agression, des modifications importantes apparaissent dans le plasma et en particulier dans la composition des lipoprotéines. Par exemple, la composition des HDL varie, ce qui a pour conséquence de transformer des HDL anti-inflammatoires en HDL pro-inflammatoires. les LDL oxydés stimulent notamment l'expression de MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1), M-CSF (Macrophage-Colony Stimulating Factor) et GM-CSF (Granulocyte Macrophage- Colony stimulating factor) par les cellules endothéliales et augmentent l'adhérance des monocytes et leur transmigration à travers les cellules endothéliales (Kruth, 1985, Atherosclerosis, 57 : 337-341 ; Simionescu et al, 1986, Am. J. Pathol., 123 : 109-125 ; Frank et al. 1989, J. Lipid Res., 30 : 967-978 ; Rajavashisth et al. 1990, Nature, 344 : 254-257 ; Navab et al. 1991, J. Clin. Invest., 88 : 2039-2046). A ce jour, aucun élément de l'art antérieur ne décrit, ni ne suggère la différenciation des monocytes en cellules dendritiques matures en présence de LDL oxydés. Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation d'au moins une fraction de lipoprotéines oxydées choisies parmi les VLDL (Very Low Density Lipoprotein) oxydées et/ou les IDL (Intermediate Density Lipoprotein) oxydées et/ou LDL (Low Density Lipoprotein) oxydées pour obtenir la différenciation de monocytes en cellules dendritriques matures. Selon un mode préféré de l'invention, la différenciation des monocytes en cellules dendritiques matures est réalisée in vitro. Les fractions sont obtenues à partir de centrifugation de plasma et définies par leur densité : densité inférieure à 1,0063 g/ml pour la fraction VLDL, densité comprise entre 1,025 et 1,0063 g/ml pour les IDL et densité comprise entre environ 1, 06 et 1, 025 g/ml pour les LDL, de préférence entre 1,055 et 1,025 g/ml. La présente invention concerne aussi l'utilisation d'au moins une fraction de lipoprotéines oxydées choisie parmi les VLDL oxydées et/ou les IDL oxydées et/ou LDL oxydées pour la fabrication d'un médicament destiné à obtenir la différenciation de monocytes en cellules dendritiques matures. Selon un mode préféré de l'invention, ce médicament peut servir à la production de cellules dendritiques matures après mise en contact avec un agent biologique. Cet agent biologique peut être notamment choisi parmi les antigènes de bactéries, de virus, de levures, de parasites, de champignons, les antigènes tumoraux, les lysats de cellules tumorales autologues et/ou héterologues. Au sens de la présente invention, un antigène tumoral est défini comme une protéine ou un peptide tumoral, et notamment comme un épitope, notamment un épitope CTL (lymphocyte T cytotoxique) (séquences peptidiques interagissant avec les molécules de classe 1 et présentés aux lymphocytes T CD8+) ou comme la séquence nucléique codant pour cet antigène. On peut citer à titre non limitatif les antigènes tumoraux suivants : MAGE-2, MAGE-3, MART, MUC-1, MUC-2, HER-2, GD2, carcinoembryonic antigen (CEA), TAG-72, ovarian-associated antigens OV-TL3 et MOV18, TUAN, alpha-feto protein (AFP), OFP, CA-125, CA-50, CA-19-9, renal tumor-associated antigen G250, EGP-40 (ou EpCAM), S 100 (malignant meanomaassociated antigen), p53, prostate tumor-associated antigens (e. g., PSA et PSMA) et p2lras. Au sens de la présente invention, on entend par cellules tumorales autologues, des cellules de tumeurs appartenant au sujet qui va recevoir le médicament selon l'invention. Par cellules tumorales hétérologues, on entend des cellules issues de tumeurs provenant d'un sujet différent de celui qui va recevoir le médicament selon l'invention. L'utilisation de cellules hétérologues permet notamment d'obtenir un médicament permettant de traiter des patients atteints de cancer chez qui un prélèvement de cellules tumorales n'est pas possible. Les cellules tumorales peuvent être obtenues par prélèvement de tissus cancereux, notamment une biopsie ou résection chirurgicale. Au sens de la présente invention, on entend par lysat cellulaire un mélange d'antigènes intra-cellulaires et/ou membranaires, ledit lysat pouvant être obtenu notamment par une lyse mécanique, chimique ou enzymatique de cellules tumorales. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'agent biologique est un acide nucléique qui code au moins un antigène choisi parmi les antigènes de bactéries, de virus, de levures, de parasites, de champignons, les antigènes tumoraux. Selon un mode préféré de l'invention, le médicament selon l'invention est destiné au traitement et/ou la prévention d'une infection d'origine bactérienne, virale, fongique, parasitaire ou provoquée par une levure, pour le traitement et/ou la prévention des cancers. La présente invention concerne également un procédé pour la différenciation in vitro de monocytes en cellules dendritriques matures selon lequel on dispose de monocytes dans un milieu approprié permettant leur différenciation et on additionne audit milieu, en une quantité prédéterminée, au moins une fraction de lipoprotéines oxydées choisies parmi les VLDL oxydées et/ou les IDL oxydées et/ou LDL oxydées. Par milieu approprié, on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à la viabilité des cellules. On peut citer à titre d'exemple le milieu RPMI 1640 et ses dérivés. Selon un mode préféré de l'invention, l'addition de lipoprotéines oxydées audit milieu est effectuée in vitro, en une quantité comprise notamment entre environ 1 et 20 pg/ml, préférentiellement entre environ 2, 5 et 15 ug/ml et avantageusement entre environ 8 et 12 ug/ml. Selon un mode préféré de l'invention, la ou les fractions de lipoprotéines oxydées est ou sont ajoutée (s) dans ledit milieu entre le F" et 6 jour de différenciation des monocytes, préférentiellement entre le 4ème et le 5ème jour de différenciation des monocytes. La présente invention concerne également les cellules dendritiques matures susceptibles d'être obtenues selon le procédé tel que défini précédemment, ainsi que l'utilisation desdites cellules dendritiques et d'au moins un agent biologique pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des cancers. La présente invention concerne également un dispositif pour la différenciation de monocytes en cellules dendritiques matures, comprenant au moins une fraction de lipoprotéines oxydées choisies parmi les VLDL oxydées et/ou les IDL oxydées et/ou LDL oxydées. Les exemples qui suivent sont données à titre explicatifs et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention. Exemple 1-Différenciation de monocytes en culture en cellules dendritiques en absence de LDL oxydés dans le milieu de culture Isolement, mise en culture et initiation de la différenciation des monocytes-Les monocytes sont isolés de sang périphérique humain par une première centrifugation suivant le gradient de densité (400g ; 20 minutes) dans du Ficoll-Hypaque, suivie d'une deuxième centrifugation (400g ; 20 minutes) dans une solution à 50% en Percoll. Les monocytes sont ensuite purifiés par déplétion immunomagnétique (Dynal, Oslo, Norway), en utilisant un cocktail d'anticorps monoclonaux anti CD19 (hybridome 4G7) (Becton Dickinson, Francklin Lakes, NJ, USA), anti-CD3 (OKT3, American Type Culture Collection, Rockeville, MD) et anti-CD56 (NKH1, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) Les monocytes ainsi obtenus sont alors purifiés à au moins 90%, comme montré par l'absence des marqueurs CD la et CD14. La différenciation des monocytes en cellules dendritiques est initiée par 40ng/ml de GM-CSF (Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor) humain recombiné et 250U/ml d'interleukine IL-4 humain recombiné. Les monocytes sont mis en culture dans le milieu RPMI 1640 (Life technologies, Rockeville, MD, USA) enrichi par 2mM de glutamine (Life technologies), 10mM d'Hepes (Life Technologies), 40ng/ml de gentamycine (Life technologies) et 'soit 10% de sérum de veau foetal (Biowest, Nuailles, France) (ou milieu de culture FCS) soit 10% de sérum de veau foetal dépourvu de lipoprotéines (Sigma, St Quentin-Fallavier, France) (ou milieu de culture LPDS). Ce milieu est choisi pour se placer dans des conditions optimales pour obtenir un effet des LDL oxydés. Phénotype des cellules en culture-Le phénotype des cellules en culture 6 jours après l'initiation de la différenciation des monocytes est analysé par cytométrie de flux sur un FACSCalibur (Becton Dickinson, Francklin Lakes, NJ, USA) par l'utilisation de conjugué FITC (isothiocyanate de fluorosceine) anti-CD14, anti-HLA-DR, anti-CD80 et conjugué PE (phycoerythrine) anti-CDla, anti-CD83, anti-CD86, anti-CD40 (Beckman Coulter). Ainsi, les monocytes ont préférentiellement un phénotype CD14+ CD la-, les cellules dendritiques immatures ont préférentiellement un phénotype CD 14CDla+ CD86-, les cellules dendritiques matures ont préférentiellement un phénotype CD 14-CD la intermédiaire-CD86+. Après 6 jours de culture en présence de GM-CSF et IL-4, plus de 95% des monocytes en culture présentent un phénotype comparables à celui de cellules dendritiques immatures. Les résultats sont comparables lors de la culture des monocytes dans un milieu FCS ou dans un milieu LPDS. Exemple 2-Différenciation de monocytes en culture en cellules dendritiques en présence de LDL oxydés dans le milieu de culture. Préparation des LDL-Les LDL (low density protéine ; densité comprise entre 1,025 et 1,055 g/ml) sont isolés de plasma humain par centrifugation. La densité du plasma a été amenée à 1, 025g/ml par l'utilisation de NaBr. Après une première centrifugation réalisée à 100 000 tours par minute, à une température de 4 C pendant 4h (centrifugeuse Beckman TL 100), la fraction supérieure contenant les chylomicrons, les VLDL (very low density protein) et les IDL (intermediate density lipoprotein) est éliminée. La densité est alors ajustée à 1, 055g/ml avec du NaBr. Une deuxième centrifugation est réalisée d'une façon comparable à la 1ère centrifugation décrite précédemment. La fraction supérieure, contenant les LDL, est récupérée, dialysée contre une solution NaCl 150mM, EDTA 2,4mM, pH 7,2 à 4 C et filtrée à 0, 45 um et conservée dans l'azote. Le contenu en protéine de cette fraction de LDL est déterminé par la technique dite Coomassie Protein Micro-assay (nom commercial, Pierce, Rockford, IL, USA). Le contenu en lipides de cette fraction de LDL est déterminé par l'utilisation des kits Cholesterol RTU, Triglycerides enzymatic PAP150 et Phospholipids enzymatic PAP 150 (noms commerciaux, bioMérieux, Marcy l'Etoile, France). L'analyse montre que les LDL sont composés de 23 1% de protéines (protéine Apo B uniquement), 41 4% de cholesterol, 24 1% de phospholipides et 13 4% de triglycérides. Les endotoxines présentes dans la fraction sont estimées par un test Etoxate (nom commercial, Sigma, St Quentin-Fallavier, France). La concentration en endotoxines est inférieure à 0,6 pg/ml dans la concentration finale de LDL ou de LDL oxydés. Oxydation des LDL-La concentration en LDL est ajustée à Img/ml par dilution dans du PBS. L'EDTA est éliminée par dialyse contre du PBS à 4 C. L'oxydation par CU2+ est effectuée à 37 C pendant 24h par dialyse contre une solution PBS, CUS04, 5uM. La réaction est stoppée par addition de Toluene Hydroxy-butyl (ref. B1378, Sigma, St Quentin-Fallavier, France), 40uM et dialyse poussée à 4 C contre du PBS contenant de l'acide diethylene diamine pentaacétique, lOOuM. Le degré d'oxydation est déterminé par la production de malondialdehyde mesurée par la technique dite LPO- 586 assay (Oxis, Portland, OR, USA). Isolement, mise en culture et initiation de la différenciation des monocytes en présence de LDL oxydés-Ces étapes sont effectuées suivant le protocole de l'exemple 1., en présence de LDL oxydés. Pour cela, lOug/ml de LDL oxydés sont ajoutés dans le milieu de culture FCS ou LPDS à JO, jour où la culture des monocytes est initiée, JI, J2, J3, J4, J5 et J6, correspondant respectivement au 1er, 2ème, 3ème, 4ème, 5ème et 6ème de culture. Phénotype des cellules en culture-Le phénotype des cellules en culture est analysé, quant à la présence des marqueurs CD86 suivant le protocole de l'exemple 1. 'six jours après l'initiation de la différenciation des monocytes lorsque les LDL oxydés ont été ajoutés à JO, J3, J4, J5 * sept jours après l'initiation de la différenciation des monocytes lorsque les LDL oxydés ont été ajoutés à J6 Les cellules obtenues par différenciation des monocytes en FCS et en présence de LDL oxydés à partir de J0 expriment plus de marqueur CD86 que les cellules obtenues par différenciation des monocytes en l'absence de LDL oxydés. Les résultats concernant la présence du marqueur CD86 (exprimés en intensité moyenne de fluorescence) par des cellules en culture dans un milieu LPDS en absence (contrôle) ou en présence de lOug/ml de LDL oxydés ajoutés à J0, J3, J4, J5 et J6 sont présentés dans le tableau 1. TABLEAU 1-Expression du marqueur CD86 en l'absence (contrôle) ou en présence de LDL oxydés (10 g/ml) ajoutés à J0, J3, J4, J5 ou J6 Contrôle JO J3 J4 J5 J6 CD86 44 187 178 370 403 173 L'induction de l'expression de CD86 est optimale au 4ème ou au 5éme jour de différenciation des monocytes et est dépendant de la dose de LDL oxydés ajoutée, comme représenté dans le tableau 2. TABLEAU 2-Expression du marqueur CD86 en l'absence (contrôle) ou en présence de LDL oxydés à une concentration de 2, 5 ; 5 ou l0u. g/ml aioutés à J5 Contrôle 2, 5 5 10 CD86 100 195 336 528 De plus, en milieu LPDS, l'ajout de LDL oxydés à JO et, d'une façon plus marqué, à J5 dans le milieu de culture de monocytes en voie de différenciation induit un phénotype caractéristique de cellules dendritiques matures objectivé par les marqueurs CD83, CD80, CD86, MHC de classe II, CD40 par comparaison aux monocytes en culture en l'absence de LDL oxydés (contrôle) (tableau 3). TABLEAU 3-Expression des marqueur CD83, CD80 et CD86 en l'absence (contrôle) ou en présence de LDL oxydés (10 g/ml) ajoutés à J0 ou J5 CD83 CD80 CD86 Contrôle 3,3 7,5 44 J0 6,3 4,6 187 J5 20, 6 16, 2 403 Exemple 3 - Capacité d'internalisation des cellules obtenues par différenciation de monocytes en l'absence ou en présence de LDL oxydés dans le milieu de culture Les cellules sont obtenues après 6 jours de différenciation des monocytes en milieu LPDS réalisée * en l'absence de LDL oxydés (selon le protocole de l'exemple 1) * en présence de lûug/ml de LDL oxydés ajoutés dans le milieu de culture au 5ètne jour de différenciation des monocytes (J5, selon le protocole de l'exemple 2) Au 6ème jour de culture, les cellules sont remises en suspension dans un milieu de culture FCS et incubées à 37 C : pendant 30 minutes avec Img/ml de FITC-T70-Dextran (Sigma) afin d'estimer la capacité d'internalisation de ces cellules par endocytose par récepteur e pendant 30 minutes avec Img/ml de Lucifer Yellow (ref. L0259, Sigma, St Quentin-Fallavier, France) afin d'estimer la capacité d'internalisation de ces cellules par pinocytose pendant 3 heures avec carboxylate-modified yellow-green FluoSpheres (nom commercial, 0, 45 pu, Molecular Probes, Leiden, The Netherlands) afin d'estimer la capacité d'internalisation de ces cellules par macropinocytose. L'internalisation est stoppée sur glace par un tampon PBS froid contenant 1% de BSA (Bovine serum Albumin, albumine sérique bovine) et 0,05% de NaN3. Les cellules sont lavées 3 fois à 4 C dans ce même tampon et la fluorescence est quantifiée par FACScalibur (nom commercial, Becton Dickinson). Comme le montre le tableau 4, les capacités d'internalisation par endocytose, pinocytose et macropinocytose sont fortement diminuées lors de l'ajout de 10/lg/ml de LDL oxydés dans le milieu de culture à J5 par rapport au contrôle réalisé en l'absence de LDLoxydés. TABLEAU 4-Capacité d'internalisation par endocytose, pinocytose et macropinocytose des monocytes différenciés en absence (contrôle) ou en présence de LDL oxydés (10g/ml aioutés à J5) Endocytose Pinocytose Macropinocytose Contrôle 100% 100% 100% 10 g/ml de LDL ox 41% 39% 54% La réduction des capacités d'internalisation est une des caractéristiques des cellules dendritiques matures. Ces résultats montrent que en présence de LDL oxydés, ajoutés au 5ème jour de différenciation, les monocytes ont une forte tendance à se différencier directement en cellules dendritique matures. Exemple 4-Quantification de la sécrétion de cytokines par les cellules obtenues par différenciation de monocytes en l'absence ou en présence de LDL oxydés Les cellules sont obtenues après 6 jours de différenciation des monocytes en LPDS réalisée * en l'absence de LDL oxydés (protocole de l'exemple 1), * en présence de lOug/ml de LDL oxydés ajoutés dans le milieu de culture à Seme jour de différenciation des monocytes (J5, protocole de l'exemple 2). La présence de cytokines, notamment les interleukines ILl0 (cytokine anti inflammatoire) et IL12p70 (cytokine pro inflammatoire), sécrétées par les cellules dendritiques matures, est déterminée par un kit ELISA spécifique pour les cytokines (Endogen, Woburn, MA, USA). Comme le présente le tableau 5, les cellules obtenues par différenciation des monocytes en présence de LDL oxydés ajoutés dans le milieu de culture au 5ème jour de différenciation des monocytes ont acquis la capacité à sécréter l'interleukine IL12p70 par rapport aux cellules obtenues par différenciation des monocytes en l'absence de LDL oxydés (contrôle). La sécrétion d'ILI0 n'est obtenue dans aucune des conditions. TABLEAU 5-Sécrétion de cytokines par les monocytes différenciés en absence (contrôle) ou en présence de LDL oxydés (10 g/ml ajoutés à J5) Sécrétion de cytokines (pg/ml) IL10 IL12p70 Contrôle 12 1 9 11 10 g/ml de LDL ox 17 ~ 8 159 ~ 24 Ces résultats montrent une plus forte tendance des monocytes à se différencier directement en cellules dendritiques matures phénotypiquement et fonctionnellement lors de l'ajout de LDL oxydés au 5è'e jour de différenciation. Exemple 5-Capacité des cellules obtenues par différenciation de monocytes en l'absence ou en présence de LDL oxydés à stimuler les lymphocytes T Les cellules sont obtenues après 6 jours de différenciation des monocytes en milieu de culture LPDS réalisée * en l'absence de LDL oxydés, dans un milieu de culture LPDS selon le protocole de l'exemple 1 * en présence de lûug/ml de LDL oxydés ajoutés dans un milieu de culture LPDS au sème jour de différenciation des monocytes (J5, protocole de l'exemple 2) Les lymphocytes T naïfs sont isolés de sang périphérique humain. Les cellules mononuclées du sang périphérique sont isolées par centrifugation (400g, 20 minutes) selon le gradient de densité en présence de Ficoll-Hypaque. Après élimination des monocytes sur gradient de Percoll, les lymphocytes du sang périphérique se situent dans la fraction dense. Les lymphocytes T sont purifiés par déplétion immunomagnétique par l'utilisation d'un cocktail d'anticorps monoclonaux anti-CD19 (anticorps 4G7), anti- CD16 (anticorps 3G8), anti-CD56 (anticorps NKH1), anti-glycophorin A (anticorps IIE4B7. 6) et anti-CD14 (anticorps RMP052), commercialisés par Beckman Coulter. Les lymphocytes T purifiés, comme le montre la présence de marqueur CD3, sont cultivés dans des plaques de culture de 96 puits à fond plat avec les cellules présentatrices d'antigène. Par cellules présentatrices d'antigène on entend les monocytes différenciés en présence ou non de LDL oxydés. 2x105 cellules T allogéniques ou syngéniques sont cultivées dans 200nul de milieu de culture selon un rapport de 1 : 5,1 : 10 ou 1 : 20 cellules présentatrices d'antigène/cellules T. Après 4 jours, 50ul du surnageant de culture sont utilisés pour déterminer la sécrétion d'IL-2 (interleukine 2) par un kit ELISA (Endogen, Woburn, MA, USA), et remplacés par 50/-l1 d'un milieu contenant luCi de [H]-Thymidine. Après 16h de culture, les cellules sont collectées sur du papier filtre et l'incorporation de thymidine traduisant la prolifération des lymphocytes T, est mesurée par l'utilisation d'un compteur Matrix 9600 Direct beta (nom commercial, Packard, Meriden, CT, USA). a) Sécrétion d'interleukine 2 (IL-2) Comme le présente le tableau 6, la sécrétion d'IL2 par les lymphocytes T allogéniques (exprimée classiquement selon le ratio cellules dendritiques/lymphocyte T, ratio DC/LT) est induite lorsque les cellules dendritiques proviennent de la différenciation de monocytes en présence de LDL oxydés ajoutés à J5, par comparaison aux résultats obtenus en l'absence de LDL oxydés (contrôle). TABLEAU 6-Stimulation de la sécrétion de cytokines par lymphocytes T allogéniques (selon le ratio DC/LT) induite par les monocytes différenciés en absence (contrôle) ou en présence de LDL oxydés (10 g/ml ajoutés à J5) Ratio DC/LT 0 0, 05 0,1 0,2 Contrôle 0 72 64 84 10 g/ml de LDL ox 0 189 373 454 Ces résultats montrent une augmentation des capacités d'allostimulation des monocytes différenciés en présence de LDL oxydés. b) Prolifération de lymphocytes T Comme le présente le tableau 7, la prolifération des lymphocytes T allogéniques, prolifération estimée par l'incorporation de 3H-thymidine induite par les cellules présentatrices d'antigène est fortement augmentée lorsque ces cellules sont 1 obtenues par différenciation des monocytes en présence de LDL oxydés à J5, par comparaison aux résultats obtenus en l'absence de LDL oxydés (contrôle). Cet effet est dépendant de la dose de LDL oxydés présente dans le milieu de culture (2, 5 ; 5 ou 10 g/ml). TABLEAU 7-Incorporation de 3H-thymidine (coup par minute) par les lymphocytes T allogéniques induite par des monocytes différenciés en absence (contrôle) ou en présence de LDL oxydés à une concentration de 2, 5 : 5 ou 10llg/ml ajoutés à J5 Contrôle 2, 5 5 10 3H-thymidine 11712 2476 13650 1703 14906 3387 25010 1754 Les monocytes différenciés en présence de LDL oxydés (10 g/ml) à J5 sont également capables d'induire la prolifération de lymphocytes T syngéniques beaucoup plus efficacement que les monocytes différenciés en l'absence de LDL oxydés (contrôle), c'est à dire les cellules dendritiques immatures classiques. comme présenté dans le tableau 8. TABLEAU 8 - Incorporation de 3H-thymidine (coup par minute) par les lymphocytes T syngéniques induite par des monocytes différenciés en absence (contrôle) ou en présence de LDL oxydés dOu. g/mi) ajoutés à J5 Contrôle 10 g/ml de LDL ox 3H-thymidine 920 ~ 331 2983 ~ 501 Ces résultats indiquent que les LDL oxydés favorise la production de cellules capables de présenter des peptides provenant de la dégradation de protéines exogènes internalisées. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'au moins une fraction de lipoprotéines oxydées choisies parmi les VLDL oxydées et/ou les IDL oxydées et/ou LDL oxydées pour obtenir la différenciation, in vitro, de monocytes en cellules dendritiques matures. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la fraction de lipoprotéines oxydées consiste en une fraction de LDL oxydés. 3. Utilisation d'au moins une fraction de lipoprotéines oxydées choisies parmi les VLDL oxydées et/ou les IDL oxydées et/ou LDL oxydées pour la fabrication d'un médicament destiné à la différenciation de monocytes en cellules dendritiques matures. 4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que la fraction de lipoprotéines oxydées consiste en une fraction de LDL oxydés. 5. Utilisation selon la revendication 3 ou 4 et d'au moins un agent biologique. 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'agent biologique est choisi parmi les antigènes de bactéries, de virus, de levures, de parasites, de champignons, les antigènes tumoraux, les lysats de cellules tumorales autologues et/ou héterologues. 7. Utilisation selon le revendication 5, caractérisée en ce que l'agent biologique est un acide nucléique qui code pour au moins un antigène choisi parmi les antigènes de bactéries, de virus, de levures, de parasites, de champignons, les antigènes tumoraux. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6 ou 7 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement et/ou la prévention d'une infection d'origine bactérienne, virale, fongique, parasitaire ou provoquée par une levure. 9. Utilisation selon la revendication 6 ou 7 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement et/ou la prévention des cancers. 10. Procédé pour la différenciation in vitro de monocytes en cellules dendritiques matures selon lequel on dispose de monocytes dans un milieu approprié permettant leur différenciation et on additionne audit milieu, en une quantité prédéterminée, au moins une fraction de lipoprotéines oxydées choisies parmi les VLDL oxydées et/ou les IDL oxydées et/ou LDL oxydées. 11. Procédé selon la revendication 10, selon lequel on additionne une fraction de LDL oxydées. 12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, selon lequel les fractions de lipoprotéines oxydées ou la fraction de lipoprotéines oxydées sont ou est additionnée (s) audit milieu en une quantité comprise entre environ 1 à 20flg/ml, préférentiellement entre environ 2,5 et 15 ug/ml et avantageusement entre 8 et 12 g/ml. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, selon lequel les fractions de lipoprotéines oxydées ou la fraction de lipoprotéines oxydées sont ou est ajoutée (s) dans ledit milieu entre le 3ème et 6ème jour de différenciation des monocytes, eme préférentiellement entre le 4ème et le 5ème jour de différenciation des monocytes. 14. Cellules dendritiques matures susceptibles d'être obtenues selon le procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 10 à 13. 15. Utilisation de cellules dendritiques matures selon la revendication 14 et d'au moins un agent biologique pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des cancers. 16. Agent d'activation pour la différenciation de monocytes en cellules dendritiques matures, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une fraction de lipoprotéines oxydées choisies parmi les VLDL oxydées et/ou les IDL oxydées et/ou LDL oxydées. 17. Agent selon la revendication 16, caractérisé en ce que la fraction de lipoprotéines oxydées consiste en une fraction de LDL oxydées.