Brevet FR2826650A1 — publié le 20030103

PROCEDE DE REDUCTION ENANTIOSELECTIF D'UNE CETONE AROMATIQUE PROCHIRALE COMPRENANT AU MOINS UN GROUPE TRIFLUOROMETHYLE SUR LE CYCLE AROMATIQUE. La présente invention a pour objet un procédé de réduction énantiosélectif d'une cétone aromatique prochirale comprenant au moins un groupe trifluorométhyle sur le cycle aromatique, selon un procédé de biocatalyse ou de bioconversion. Les composés de type phénylalcanolique, optiquement actifs, et en particulier le (R) ou (S) -1-phényléthanol, sont des composés très utilisés comme synthons dans le domaine de la pharmacie et de l'agrochimie. L'objectif est d'obtenir l'énantiomère ayant la propriété recherchée et de minimiser la formation de l'autre énantiomère. Il est connu selon K. Nakamura (J. Org. Chem. 1998,63, 8957-8964) d'effectuer une réduction d'un dérivé d'acétophénone portant un groupe trifluorométhyle, en position o-, m-ou p-, en alcool, à l'aide de l'enzyme provenant de Geotrichum candidum. Toutefois, l'alcool obtenu présente une configuration (S). Le procédé décrit conduisant à un alcool (S), l'objectif de l'invention est de fournir un alcool optiquement actif souhaité de configuration (R) selon un procédé de réduction énantiosélectif de la cétone correspondante. Il a maintenant été trouvé et c'est ce qui constitue l'objet de la présente invention, un procédé de réduction énantiosélectif d'une cétone aromatique prochirale comprenant au moins un groupe trifluorométhyle sur le cycle aromatique caractérisé par le fait que la réduction est effectuée en présence de l'enzyme provenant de Lactobacillus. L'enzyme préférée mise en oeuvre selon l'invention est l'enzyme provenant de Lactobacillus Kefiri. Le procédé de l'invention permet d'accéder majoritairement à l'alcool de configuration (R). Dans la suite du présent texte, on désigne par composé cétonique , le substrat de départ à savoir, la cétone aromatique prochirale comprenant au moins un groupe trifluorométhyle sur le cycle aromatique. Conformément à l'invention, la réduction est effectuée en présence d'une enzyme de type alcool-déshydrogénase. Une première variante de l'invention consiste à mettre en oeuvre l'enzyme isolée. Une autre variante de l'invention est de mettre en jeu une biomasse comprenant ladite enzyme. Intervent dans le procédé de l'invention, un composé cétonique répondant à la formule générale : dans ladite formule (1) : - Ri représente un groupe alkyle, alcényle, cycloalkyle, aryle ou arylalkyle, - n est un nombre au moins égal à 1, de préférence compris entre 1 et 3, - au moins un groupe trifluorométhyle est en position 3,4 ou 5. Dans le cadre de l'invention, on entend par alkyle , une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée ayant de 1 à 15 atomes de carbone et de préférence de 1 ou 2 à 10 atomes de carbone. Par alcényle , on entend un groupe hydrocarboné, linéaire ou ramifié ayant de 2 à 15 atomes de carbone, comprenant une ou plusieurs doubles liaisons, de préférence, 1 à 2 doubles liaisons. Par cycloalkyle , on entend un groupe hydrocarboné cyclique, comprenant de 3 à 8 atomes de carbone, de préférence, un groupe cyclopentyl ou cyclohexyl. Par aryle , on entend un groupe mono-ou polycyclique aromatique, de préférence, mono-ou bicyclique comprenant de 6 à 12 atomes de carbone, de préférence, phényle ou naphtyle. Par (arylalkyle , on entend un groupe hydrocarboné, linéaire ou ramifié porteur d'un cycle aromatique monocyclique et comprenant de 7 à 12 atomes de carbone, de préférence, benzyl. Les substrats mis en oeuvre préférentiellement dans le procédé de l'invention répondent à la formule (1) dans laquelle : - Ri représente un groupe alkyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone, de préférence, 1 ou 2, - et n est un nombre égal à 1 ou 2. Si le composé de formule (1) comprend un seul groupe trifluorométhyle (n = 1), celui est avantageusement en position 3 ou 4. Si le composé de formule (1) comprend deux groupes trifluorométhyle (n = 2), ceux-ci se situent de préférence, en position 3 et 4 ou 3 et 5. Selon le procédé de l'invention, on effectue la réduction en mettant en oeuvre préférentiellement, l'enzyme provenant de Lactobacillus Kefiri. Cette enzyme est disponible dans le commerce et commercialisée par la Société Fluka sous la dénomination 05643. Le microorganisme est un microorganisme de collection DSM20587. Comme mentionné précédemment, on peut conduire la réduction en présence de l'enzyme isolée ou d'une biomasse la contenant. Selon la première variante de l'invention, on introduit l'enzyme dans un milieu tamponné ayant un pH d'environ 7, de préférence obtenu avec un tampon phosphate comprenant 0,1 molli de phosphate mono-et dipotassique. On ajoute un co-facteur à savoir, NADPH (nicotine-adénine-dinucléotide- phosphate). Généralement, on en met de telle sorte que la concentration finale du co-facteur dans le milieu final soit compris de préférence, entre 0,1 à 1 mmol/t. Selon un mode préféré de l'invention, on régénère le co-facteur qui subit une oxydation en cours de réaction, par un moyen classique tel que par exemple, la mise en oeuvre d'un alcool secondaire, de préférence, le cyclopentanol ou l'isopropanol. La quantité d'alcool mise en oeuvre est excédentaire par rapport à la stoechiométrie du substrat. Elle est déterminée de telle sorte que la concentration de l'alcool dans le milieu soit comprise entre 20 à 100 mmot/t. On introduit ensuite le composé cétonique à réduire. Il est mis en oeuvre à une concentration avantageusement comprise entre 5 à 20 mmot/t. On conduit la réaction à une température de préférence, comprise entre 30 C et 37 C. La réaction est conduite sous pression atmosphérique et le milieu réactionnel est de préférence, agité. On maintient le milieu sous agitation pendant une durée qui peut être très variable. Elle est le plus souvent comprise entre 6 et 24 heures. En fin de réaction, on sépare l'alcool optiquement actif obtenu d'une manière habituelle par exemple, en effectuant une extraction à l'aide d'un solvant organique adéquate tel que par exemple, le dichlorométhane, l'éther éthylique, l'acétate d'éthyle ou de tout autre solvant convenant. Selon l'autre variante du procédé de l'invention et qui est préférée, on met en oeuvre l'enzyme contenue dans les cellules du microorganisme. Une première étape du procédé de l'invention consiste à effectuer la fermentation de la souche Lactobacillus Kefiri, dans un milieu classique utilisé pour cultiver les Lactobacilli. Une deuxième étape est d'effectuer la réaction de réduction en présence de la biomasse précédemment obtenue. A cet effet, on part d'un milieu de fermentation comprenant par exemple, une source de carbone, une source d'azote et des sels minéraux. Comme exemples de sources de carbone, on peut mentionner notamment, le maltose, le glucose, le saccharose, le lactose, le glycérol, l'amidon, le sorbitol, le mannitol, le propylène glycol. Pour ce qui est de la source d'azote, on peut faire appel de préférence aux extraits de levure, aux extraits de boeuf, à la peptone, au sulfate d'ammonium, au citrate d'ammonium, au nitrate de sodium ou toute autre source d'azote contenant des acides aminés. Généralement, des sels minéraux peuvent être ajoutés et en plus de ceux cités comme source d'azote, on peut mentionner l'acétate de sodium, le sulfate de magnésium, le sulfate de manganèse ou le phosphate de potassium. On se référera aux exemples pour illustrer la composition et les concentrations des différents constituants du milieu de fermentation. La culture des Lactobacilli s'effectue, en anaérobie ou pseudo-anaérobie et l'Homme du Métier sait parfaitement conduire la fermentation dans ces conditions. D'un point de vue pratique, on ensemence le milieu de fermentation avec un inoculum de Lactobacillus, de préférence, Lactobacillus Kefiri qui se présente, le plus souvent sous forme d'une suspension aqueuse pouvant contenir un d'agent cryo-protecteur par exemple, le diméthylsulfoxyde ou le glycérol à raison d'une concentration, par exemple, de 10 à 20 % en poids. La fermentation s'effectue à un pH compris avantageusement entre 6 et 7 et à une température comprise de préférence, entre 25 à 30 C. La durée de fermentation est généralement de 2 à 4 jours et est le plus souvent de 3 jours. En fin de fermentation, on récupère la biomasse d'une manière classique. Par exemple, on peut effectuer une centrifugation d'environ 3 à 15 min puis on élimine le surnageant par décantation et l'on récupère un culot qui est le plus souvent lavé avec de l'eau physiologique. La biomasse de Lactobacillus obtenue est de 1 à 5 g/t exprimée en cellules sèches. On effectue ensuite la réduction énantiosélective du composé cétonique en présence de la biomasse de Lactobacillus exprimant l'activité d'alcooldéshydrogénase. On introduit la biomasse à raison de 10 à 30 g de matières sèches par litre de milieu réactionnel comprenant également un tampon. On choisit comme précédemment un milieu tamponné ayant un pH d'environ 7, de préférence obtenu avec un tampon phosphate comprenant 0,1 molli de phosphate mono-et dipotassique. On introduit ensuite le composé cétonique à réduire. Il est mis en oeuvre à une concentration avantageusement comprise entre 5 à 20 mmol/t. On conduit la réaction à une température avantageusement comprise entre 30 C et 37 C. La réaction est conduite sous pression atmosphérique et le milieu réactionnel est de préférence, agité. On maintient le milieu sous agitation pendant une durée qui peut être très variable. Elle est le plus souvent comprise entre 6 et 24 heures. En fin de réaction, on sépare la biomasse d'une manière classique, par exemple par centrifugation. On récupère le surnageant comprenant l'alcool optiquement actif et on le sépare, d'une manière habituelle par exemple, en effectuant une extraction à l'aide d'un solvant organique adéquate tel que par exemple, le dichlorométhane, l'éther éthylique, l'acétate d'éthyle ou de tout autre solvant convenant. Conformément au procédé de l'invention, on peut obtenir l'alcool optiquement actif à partir d'une cétone prochirale avec un excellent rendement et un excès énantiomérique très élevé pouvant atteindre 100 %. L'alcool obtenu majoritairement est de configuration (R). On donne ci-après des exemples de réalisation de l'invention donnés à titre illustratif et sans caractère limitatif. Exemple 1 : Culture de la souche exprimant l'alcool-déshvdroqénase. La souche Lactobacillus kefiri DSM20587 est cultivée en culture statique quasi-anaérobie dans le milieu Man-Rogosa-Sharp (MRS) décrit ci-dessous à 25 C, pendant 72 heures. Le milieu de culture [milieu MRS (Difco-0881)] a la composition suivante : - Peptone n 3 10 g - Extrait de boeuf 10 g - Extrait de levures 5 g - Dextrose 20 g - Tween 80 (ester de sorbitol) 1 g - Citrate d'ammonium 2 g - Acétate de sodium 5 g - Sulfate de magnésium 0,1 g - Sulfate de manganèse 0, 05 g - Phosphate dipotassique 2 g - Eau 1 1 Le pH est de 6,5. Le milieu est tout d'abord stérilisé d'une manière classique par chauffage dans un autoclave à une température de 121 C, pendant 20 min. Le milieu (100 ml) est ensemencé avec 0,1 ml d'une suspension cellulaire de Lactobacillus Kefiri sockée dans l'eau glycérolé (15 % de glycérol) et incubée 72 heures à 25 C. La biomasse obtenue est de 1,5 g/f exprimée en cellules sèches. Les cellules obtenues sont lavées par de l'eau physiologique. Exemple 2 : Réduction de la 3,5-bis(trifluorométhyl)acétophénone (BTA). Les cellules obtenues telles que décrites dans l'exemple 1, sont mises en suspension dans un tampon phosphate 0,1 mol pH 7 à une concentration cellulaire de 15 g de matières sèches par litre. A 37 C, on ajoute la BTA à raison de 10 mmo)/ !. Après 8 h, la réaction est complète, les cellules sont séparées par centrifugation ; le surnageant étant extrait avec du dichlorométhane. Le solvant organique est évaporé et le rendement est déterminé par analyse par chromatographie liquide sur une colonne phase reverse (colonne LiChrospher 100 RP- 18, 5/lm ; éluant A : eau/acide trifluoroacétique 0,1 % (v/v) et éluant B : acétonitrile/acide trifluoroacétique 0,1 % (v/v) ; gradient 90 A/ 10 B à 10 A/90 Ben 5 min). L'excès énantiomérique ee exprimé en % qui est le rapport entre [ (R)- (S)] et [ (R) + (S)] x 100, est déterminé par chromatographie en phase gazeuse (CPG) sur la colonne chirale Chiralsil Dex CB : 100 C à 160 C avec une vitesse de 2 C par min. Les résultats obtenus sont les suivants : - Rendement en alcool (R) : 100 % - Pureté optique : ee = 100 % en alcool (R) Exemples 3 et 4 On répète le mode opératoire des exemples 1 et 2 mais en mettant en oeuvre des substrats cétoniques monosubstitués par un groupe trifluorométhyle à savoir : - 3-trifluorométhylacétophénone (exemple 3), -4-trifluorométhylacétophénone (exemple 4). Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau (1) : Tableau (1) Substrat Rendement Excès énantiomérique (%) ee (%) en alcool (R) 3-trifluorométhylacétophénone 45 45 4-trifluorométhylacétophénone uorométhylacétophénone 84 72 REVENDICATIONS 1-Procédé de réduction énantiosélectif d'une cétone aromatique prochirale comprenant au moins un groupe trifluorométhyle sur le cycle aromatique caractérisé par le fait que la réduction est effectuée en présence de l'enzyme provenant de Lactobacillus. 2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que l'enzyme mise en oeuvre est l'enzyme provenant de Lactobacillus Kefiri. 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé par le fait que le composé cétonique répond à la formule générale : dans ladite formule (1) : - Ri représente un groupe alkyle, alcényle, cycloalkyle, aryle ou arylalkyle, - n est un nombre au moins égal à 1, de préférence compris entre 1 et 3, - au moins un groupe trifluorométhyle est en position 3,4 ou 5. 4 - Procédé selon la revendication 3 caractérisé par le fait que le composé cétonique répond à la formule générale (1) dans laquelle R1 représente un groupe alkyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone, de préférence, 1 ou 2. 5 - Procédé selon l'une des revendications 3 et 4 caractérisé par le fait que le composé cétonique répond à la formule générale (1) dans laquelle n est égal à 1 ou 2. 6 - Procédé selon la revendication 3 caractérisé par le fait que le composé cétonique répond à la formule (1) dans laquelle n est un nombre égal à 1 et le groupe trifluorométhyle est en position 3 ou 4. 7 - Procédé selon la revendication 3 caractérisé par le fait que le composé cétonique répond à la formule (1) dans laquelle n est un nombre égal à 2 et les deux groupes trifluorométhyle se situent en position 3 et 4 ou 3 et 5. 8 - Procédé selon la revendication 3 caractérisé par le fait que le composé cétonique est choisi parmi : - la 3,5-bis (trifluorométhyl) acétophénone, - la 3-trifluorométhylacétophénone, - la 4-trifluorométhylacétophénone. 9 - Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé par le fait que l'on met en oeuvre l'enzyme isolée. 10 - Procédé selon la revendication 9 caractérisé par le fait que l'on introduit l'enzyme dans un milieu tamponné ayant un pH d'environ 7, on ajoute un cofacteur à savoir, NADPH et le composé cétonique à réduire. 11 - Procédé selon la revendication 10 caractérisé par le fait que l'on régénère le co-facteur par la mise d'un alcool secondaire, de préférence, le cyclopentanol ou l'isopropanol. 12 - Procédé selon la revendication 10 caractérisé par le fait que l'on conduit la réaction à une température de préférence, comprise entre 300C et 37 C. 13 - Procédé selon la revendication 10 caractérisé par le fait que l'on sépare, en fin de réaction, l'alcool optiquement actif, de préférence, par extraction à l'aide d'un solvant organique. 14 - Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé par le fait que l'on effectue la réduction en présence d'une biomasse comprenant ladite enzyme. 15 - Procédé selon la revendication 14 caractérisé par le fait que l'on effectue la fermentation de la souche Lactobacillus, de préférence, Lactobacillus Kefiri, puis l'on conduit la réaction de réduction en présence de la biomasse précédemment obtenue. 16 - Procédé selon la revendication 15 caractérisé par le fait que l'on ensemence un milieu de fermentation comprenant une source de carbone, une source d'azote et des sels minéraux avec un inoculum de Lactobacillus, de préférence, Lactobacillus Kefiri. 17 - Procédé selon la revendication 16 caractérisé par le fait que la fermentation s'effectue à un pH compris entre 6 et 7 et à une température comprise de préférence, entre 25 à 30 C. 18 - Procédé selon la revendication 16 caractérisé par le fait que l'on récupère la biomasse de Lactobacillus à raison de 1 à 5 g/l exprimée en cellules sèches. 19 - Procédé selon la revendication 15 caractérisé par le fait que l'on introduit la biomasse dans un milieu tamponné ayant un pH d'environ 7 et l'on ajoute le composé cétonique à réduire. 20 - Procédé selon la revendication 19 caractérisé par le fait que l'on conduit la réaction à une température de préférence, comprise entre 30 C et 37 C. 21 - Procédé selon la revendication 19 caractérisé par le fait que l'on sépare, en fin de réaction, l'alcool optiquement actif, de préférence, par extraction à l'aide d'un solvant organique.