Brevet FR2825925A1 — publié le 20021220

PROCEDE DE PREPARATION D'UN PRINCIPE ACTIF A PARTIR DE RIZ, PRINCIPE ACTIF OBTENU ET COMPOSITIONS ADAPTEES La presente invention concerne un procède de preparation d'un prinCipe actif à partir de riz et le principe actif obtenu. L'invention couvre aussi des compositions utilisant un tel principe actif. Dans le cas de la peau, le principe actif selon la présente invention a pour but de présenter de fortes capacités d'assimilation par la peau afin de lui apporter rapidement des éléments nutritionnels. Ces éléments nutritionnels vont faciliter les fonctions métaboliques et permettre aux cellules de la peau soumises au stress, de récupérer rapidement. Pour cet effet, l'invention propose un principe actif à partir d'éléments à structure peptidique ayant un faible poids moléculaire. Les unités peptidiques purifiées ainsi apportées accélèrent l'assimilation cellulaire et vitalisent la peau. Une peau ainsi nourrie, revitalisée permet notamment de lutter contre le vieillissement tissulaire donc de combler les rides. On connaît un procédé de fabrication d'un hydrolysat de protéines riches en di-et tri-peptides pour la nutrition artificielle et utilisées en diététique. Ce procédé consiste à soumettre une protéine du blanc d'oeuf ou de la caséine, à l'action simultanée ou successive d'enzymes, en l'occurrence une protéase bactérienne utilisable en milieu neutre, une protéase bactérienne utilisable en milieu alcalin et une enzyme pancréatique d'origine animale. Dans la présente demande, il convient d'obtenir un hydrolysat de protéines avec une fraction à faible poids moléculaire pour être absorbée par la peau. Dans l'art antérieur, comme il s'agit d'alimentation artificielle, le poids moléculaire n'est pas une contrainte et les produits obtenus par ces procédés ne permettraient aucunement une application à la cosmétologie. L'invention est maintenant décrite en détail, tant dans ses étapes du procédé d'obtention que dans la caractérisation du produit obtenu et à travers des compositions cosmétiques adaptées. Les différentes figures représentent : - figure 1, une courbe de distribution des fractions peptidiques obtenues. - figure 2, tableau des résultats sur la prolifération de fibroblastes au cours du temps, - figure 3, tableau des résultats sur la prolifération de fibroblastes comparée à d'autres compositions, - figure 4, tableau des résultats de récupération cellulaire après un stress UV, - figure 5, tableau des résultats de l'activité stimulante du principe actif, - figures 6A et 6B, des tableaux de résultats de pression partielle d'oxygène et de dioxyde de carbone, - figures 7A et 7B, des tableaux de résultats d'analyses sur volontaires concernant l'oxygénation tissulaire, et - figure 8, tableau récapitulant les améliorations vis-à-vis des rides. 1/PROCEDE D'EXTRACTION D'UN PRINCIPE ACTIF A PARTIR DE RIZ Le produit selon l'invention dont on souhaite obtenir un concentrat constituant le principe actif selon l'invention, est du riz, notamment la variété Orysa Sativa. Le procédé consiste à réaliser la succession des étapes suivantes : - solubilisation d'un concentré de protéines de riz dans l'eau, notamment la variété Orysa Sativa, à raison d'au moins 5% en poids. - hydrolyses successives de cette suspension en présence d'une- protéase stomacale d'origine animale utilisable en milieu acide, - concentration de la fraction active en petits peptides de masse moléculaire inférieure à 1 400 daltons, - filtration stérilisante pour atteindre une flore mésophile totale inférieure à 100 germes/g, et une absence de levures et de moisissures. On réalise une courbe représentée sur la figure 1 sur une colonne commercialisée sous la dénomination Superdex Peptide. On utilise une solution tampon phosphate 0,02 mole additionnée de 0,25 mole NaCI et on travaille à pH 7,2. Le débit sur la colonne est de 0,25 ml/mn et se traduit sur papier par 0,25 cm/mn. On constate que la fraction inférieure à 1355 daltons est répartie de la façon suivante : - f3 : 32, 63% (1400 22, 5% sont supérieurs à 1400 daltons Cette structure peptidique du principe actif selon l'invention est spécifique et de faible masse moléculaire, permettant ainsi les applications à la cosmétique comme le montrent les résultats qui vont suivre. 2/CARACTERISATION DU PRINCIPE ACTIF OBTENU Taux de matière sèche : Le taux de matière sèche est obtenu par passage du principe actif extrait dans une étuve à 105 C jusqu'à obtention d'un poids constant. La quantité de matière sèche obtenue est comprise entre 20 et 150 g/l, plus particulièrement comprise entre 50 et 80 g/t. Mesure du pH : Le pH est mesuré par la méthode potentiométrique à température ambiante. Le pH est compris entre 4,0 et 10, plus particulièrement entre 5,0 et 7,0. Détermination de la teneur en azote : La détermination est réalisée par la méthode de Kjeldhal. La teneur en protéines déduite est comprise entre 10 et 100 g/ ! et plus particulièrement entre 40 et 60 girl. 3/EFFETS DU PRINCIPE ACTIF SUR LA PROLIFERATION DE FIBROBLASTES HUMAINS 3-1 Effets au cours du temps : L'étude est conduite sur des fibroblastes humains auxquels on ajoute le principe actif selon l'invention à 1 % et 2% en volume. Après 48 et 72 heures supplémentaires, on mesure le pourcentage de prolifération. Les résultats sont consignés dans le tableau de la figure 2. Le principe actif augmente fortement la prolifération des cellules, de façon dose dépendante, plus particulièrement après 72 heures de traitement. 3-2 Influence de la structure chimique Le but est d'étudier l'influence de la structure biochimique du principe actif selon la présente invention sur le métabolisme de fibroblastes humains en culture. A cet effet, on compare les effets de quatre compositions sur la prolifération après 72 heures de traitement : - principe actif selon la présente invention avec 77% de peptides de masse moléculaire - mélange modèle d'acides aminés, ceux-ci n'étant pas structurés en petits peptides, - solution de protéines hautement structurées, et - solution de peptides de riz non sélectionnés avec seulement 37% de masse moléculaire inférieure à 1400 daltons. On constate à travers les résultats du tableau de la figure 3, que le principe actif selon la présente invention augmente considérablement la prolifération des fibroblastes. Sa structure peptidique optimale est adaptée à la prolifération cellulaire. Le mélange modèle d'acides aminés ne modifie pas la capacité de prolifération, ce qui montre que ce n'est pas la composition en acides aminés du principe actif qui procure à ce principe actif sa capacité à favoriser la prolifération. Les protéines hautement structurées ne modifient pas non plus la capacité de prolifération et elles ne sont pas assimilées. Les cellules doivent consommer de l'énergie lors d'une hydrolyse préalable afin d'utiliser cette source protéique. Les peptides de riz non sélectionnés ne permettent pas d'améliorer l'activité prolifératrice des cellules autant que le principe actif. 4/EFFET DU PRINCIPE ACTIF A COMPENSER LES EFFETS D'UN STRESS SOLAIRE Cette étude a pour but de démontrer que le principe actif selon l'invention favorise la récupération après un stress, par exemple un stress solaire. Pour ce test, on mesure la viabilité cellulaire des fibroblastes humains soumis à des irradiations UVA et UVB, en présence ou non de principe actif selon la présente invention après 48 ou 72 heures. Les doses sont de 6 joules/cm2 en UVA et de 0,48 joules/cm2 en UVB et les résultats sont exprimés en densité optique à 540 nm. On constate dans le tableau de la figure 4 que le stress solaire induit une forte toxicité et provoque la mort de 60% des fibroblastes. Le principe actif à 1 % permet d'augmenter de 35% le nombre de cellules en activant les fonctions métaboliques des cellules. 5/EFFET DU PRINCIPE ACTIF SUR L'EXPRESSION DES ARNm Le principe actif selon la présente invention a une action sur les ARN messagers codant pour les collagènes VII et t) t et) a fibronectine en milieu nutritif carencé. En effet, des fibroblastes humains sont incubés dans un milieu complet et dans un milieu nutritif carencé, en présence du principe actif. Les résultats obtenus sont exprimés en pourcentage d'expression de l'ARNm de la protéine étudiée par rapport à un témoin. Ils font l'objet du tableau de la figure 5. Le principe actif augmente de façon significative l'expression des ARNm codant pour les coilagènes lil, Vll et la fibronectine donc des protéines constitutives du derme. Le principe actif permet de maintenir l'équilibre indispensable à la diététique cellulaire. 6/EFFET DU PRINCIPE ACTIF SUR LE METABOLISM PAR MESURE DE SYNTHESE D'ATP Cette étude permet d'évaluer l'activité stimulante du principe actif selon la présente invention sur le stock d'adénosinetriphosphate intracellulaire On applique sur plusieurs épidermes une formulation de principe actif à 4% selon la présente invention, après 24 heures de contact, on dose l'ATP par luminométrie à l'aide d'un test du commerce. On remarque dans le tableau de la figure 6 que les réserves d'ATP intracellulaire sont diminuées de 37% pour orienter l'énergie vers la synthèse cellulaire, augmentant ainsi les capacités de défense de la peau. 7/EFFET DU PRINCIPE ACTIF SUR L'OXYGENATION TISSULAIRE L'objectif de cette étude est de quantifier, in vivo, sur l'homme, l'effet oxygénant du principe actif. A cet effet, on mesure les pressions partielles d'oxygène et de dioxyde de carbone transcutanées sur une zone traitée avec une formulation à 4% de principe actif contre placebo. Les mesures sont réalisées avant et après 28 jours d'applications bi-- quotidiennes du principe actif. Les mesures de pression partielle sont effectuées de façon connue pour l'oxygène par mesure des variations de microcourants électriques et pour le dioxyde de carbone par détermination du pH d'un électrolyte également par mesure des variations de microcourants électriques. Les variations du pH sont proportionnelles au logarithme des variations de la pression partielle en dioxyde de carbone. Les mesures sont exprimées en mm de mercure. Les tableaux des figures 7A et 7B regroupent les résultats et font apparaître une augmentation de la pression partielle d'oxygène chez 54% des volontaires et de la pression partielle de C02 chez 61 % des volontaires. Ainsi, on constate que le principe actif tend à permettre une meilleure diffusion de l'oxygène dans les cellules et les tissus. 81 EFFET ANTI-RIDES DU PRINCIPE ACTIF Le but de l'étude est de vérifier sur 20 volontaires l'efficacité anti-rides du principe actif formulé à 5% contre placebo, appliqué biquotidiennement pendant deux mois. L'étude anti-rides consiste à analyser par observation des empreintes des pattes d'oie, à l'aide d'un profilomètre muni d'un analyseur d'images. Les quatre paramètres étudiés sont : - surface totale ridée, - longueur des rides, - profondeur des rides, et - nombre de rides. Les résultats sont regroupés dans le tableau de la figure 8. L'analyse montre une forte diminution de 32% de la surface totale ridée et de 24% de la longueur des rides et la distribution confirme que cette diminution intéresse 70% des volontaires. L'invention couvre aussi la composition cosmétique obtenue. Cette composition cosmétique nutritionnelle à fortes capacités d'assimilation comprend 0,10% à 5,00% de principe actif selon l'invention, associé (s) à des excipients et sous une forme galénique adaptée tel que : crème, gel, onguent, lotion, lait, émulsion ou solution. REVENDICATIONS 1. Procédé d'extraction d'un principe actif ayant une action nutritionnelle de la peau, caractérisé en ce qu'il comprend la succession des étapes suivantes : - solubilisation d'un concentré de protéines de riz dans l'eau, notamment la variété Orysa Sativa, à raison d'au moins 5% en poids, - hydrolyses successives de cette suspension en présence d'une protéase stomacale d'origine animale, utilisable en milieu acide, - concentration de la fraction active en petits peptides de masse moléculaire inférieure à 1 400 daltons, - filtration stérilisante pour atteindre une flore mésophile totale inférieure à 100 germes/g, et une absence de levures et de moisissures. 2. Principe actif obtenu par le procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente : - une faible masse moléculaire inférieure à 1 400 daltons - un taux de matière sèche compris entre 20 et 150 g/t - un pH compris entre 4,0 et 10,0 et - une teneur en protéines comprise entre 10 et 100 g/t 3. Principe actif selon la revendication 2, caractérisé en ce que la masse moléculaire est répartie de la façon suivante : - 22, 50% ayant une masse molaire supérieure à 1400 daltons, - 33, 00% ayant une masse moléculaire comprise entre 1400 et 175 daltons, - 42, 00% 175 et 75 daltons et - 3, 00% ayant une masse moléculaire inférieure 75 daltons. 4. Principe actif selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce qu'il présente : - un taux de matière sèche est compris entre 50,0 et 80,0 g/l, - un pH compris entre 5,0 et 7,0 et - une teneur en protéine est comprise entre 40,0 et 60,0 g/t. 5. Composition cosmétique nutritionnelle à fortes capacités d'assimilation, caractérisée en ce qu'elle comprend 0,10% à 5,00% de principe actif selon l'une des revendications 2,3 ou 4 associé (s) à des excipients et sous une forme galénique adaptée tel que : crème, gel, onguent, lotion, lait, émulsion ou solution.