Brevet FR2822954A1 — publié le 20021004

METHODE D'IDENTIFICATION ET DE PURIFICATION DE CELLULES BETA PANCREATIQUES HUMAINES AU MOYEN D'UNE SONDE FLUORESCENTE SPECIFIQUE DU ZINC. La présente invention se rapporte au domaine de l'identification et de la purification de cellules bêta pancréatiques sécrétant l'insuline, à partir de préparations cellulaires d'îlots du pancréas, au moyen d'une nouvelle sonde spécifique du cation Zen2+. Il est connu que les îlots pancréatiques contiennent une bien plus forte concentration en zinc que d'autres tissus. Le zinc joue un rôle important dans le stockage de l'insuline et il est bien établi qu'il fait partie intégrante du cristal d'insuline dont les hexamères sont reliés par le Zen2+. De plus, on trouve du zinc libre ionisé dans les espaces extragranulaires des cellules bêta où il peut se comporter comme un réservoir pour le zinc granulaire (Figlewicz et al. 1984). Ces populations de zinc, libre ou faiblement lié, peuvent être visualisées par des méthodes histochimiques à la différence du zinc fortement complexé aux protéines tel que celui trouvé dans les métalloprotéines dont les facteurs de transcription et les métalloenzymes. Des nombreuses sondes fluorescentes liant les métaux divalents et ayant une bonne spécificité pour le zinc sont connues, un recensement de telles sondes a été effectué (Haugland RP, 1996) et le catalogue de Molecular Probes en référence plusieurs. Ainsi, parmi les sondes chélatant les ions divalents et utilisées pour l'examen microscopique d'îlots in vitro, la dithizone (DTZ) colore les îlots en rouge brillant, lesquels peuvent être ainsi visualisés par la lumière blanche d'un microscope optique. La DTZ peut également produire une fluorescence lorsqu'elle est solubilisée dans du DMSO, cependant cette fluorescence pâlit trop rapidement pour permettre ensuite une détection et un tri convenable. (Conget JI. 1994). D'autres sondes ont été utilisées pour le marquage cellulaire du zinc labile, comme les dérivés de quinoline tels que le TSQ ou N-[6-méthoxy-8-quinolyl]- para-toluenesulfonamide (Jindal et al. 1993) et sa forme soluble dans l'eau le TFL-Zn ou (N-[6-méthoxy-8- quinolyl]-para-carboxbenzoylsulfonamide) (Budde et al. 1997). Le TSQ a été décrit en 1992 par Jindal et al comme outil de purification des îlots entiers, mais son emploi exige l'utilisation de buses de cytomètre hors standard. De plus cette sonde ne peut être utilisée de manière quantitative sur des cellules isolées en raison de sa complexation au zinc lié aux membranes et de la variabilité des rendements de fluorescence selon sa localisation dans les lipides membranaires ou les solutions aqueuses, en outre, sa forme non estérifiée, très peu soluble dans les milieux aqueux, ne permet pas le marquage sélectif des cellules vivantes. Une autre sonde intéressante est le Zinquin (acide A-méthyl-8-p-toluensulfonamido-6-quinolyloxy acétique) (Zalewski et al. 1993) qui a également été développée pour la coloration in vitro des cellules vivantes et a été utilisée avec succès dans la détermination du cation Zn2+ dans des thymocytes, des cellules humaines de la leucémie lymphoïde chronique (LCC), et des hépatocytes (Zalewski et al. 1994). Le Zinquin a été utilisé en analyse d'image sur îlots entiers ou cellules isolées, cependant sa capacité de charge est faible et sa fluorescence n'est pas uniformément distribuée à l'intérieur des cellules. Ces deux dernières sondes présentent de plus le désavantage d'être excitables dans l'ultraviolet, ce qui demande un équipement coûteux et rare en cytométrie et microscopie confocale Une autre approche de marquage spécifique des cellules bêta pancréatiques consiste à infecter des cellules d'îlot humains avec un adénovirus recombinant exprimant une protéine de fluorescence verte sous le contrôle du promoteur de l'insuline (Meyer et al. 1998). cette technique élégante est toutefois trop longue et trop sophistiquée pour des applications en routine. Les inventeurs, dans le cadre de la présente invention, ont d'abord recherché une nouvelle sonde nontoxique, répondant essentiellement aux deux critères suivants : se lier sélectivement au zinc labile dans des cellules vivantes et présenter des longueurs d'onde d'excitation et d'émission dans le spectre visible, afin d'être exploitable dans la plupart des instruments et en particulier le trieur cellulaire et le microscope confocal. Parmi les sondes plus récemment citées en revue (Canzoniero et al., 1997), une autre sonde spécifique du zinc, le Newport Green (Haughland 1996), est mentionnée, mais les auteurs ne l'ont pas retenue pour le marquage de leurs neurones corticaux en raison de sa trop faible affinité pour le zinc contenu dans ce type de cellules. Le Newport Green est en effet une sonde excitable à 485 nm avec une constante de dissociation de l'ordre du micromolaire correspondant à une affinité faible pour le zinc. Cette sonde existe sous deux formes : un sel de potassium hydrosoluble (NG-K) représentée par la formule I et une forme ester diacétate liposoluble (NGAc) représentée par la formule II. NG-K NG-Ac Formule l Formule II 0 0 Il Il ,, . J.. .. . crJ'a Cl wCI Cl wCI , Ct-O-C0 Il 1 0 C=O 2K+ C=O l NH NH N f . CH2NCH, . CH2NCH, C N C : fN ' 'N'-' Cette dernière forme présente l'avantage de marquer de manière spécifique les cellules vivantes seulement. En effet, un clivage enzymatique de la forme ester NG-Ac par les estérases cellulaires est nécessaire pour que la sonde puisse se lier au cation Zen2+. Dans le cadre de cette invention on désignera par sonde tant la sonde native que la sonde transformée à l'intérieur des cellules vivantes. Les inventeurs ont donc d'abord effectué des travaux de recherche pour vérifier que le Newport Green, était capable de marquer sélectivement le zinc labile dans les cellules bêta vivantes. Ainsi, les techniques d'identification de cellules bêta utilisant cette sonde seraient exploitables par la plupart des instruments tant dans des applications cliniques que dans des applications de recherche. Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont permis de mettre en évidence la validité de cette sonde Newport Green pour localiser, quantifier et isoler des cellules productrices d'insuline à partir de préparations d'îlots. Plus précisément l'invention a pour objet une méthode d'identification de cellules bêta pancréatiques vivantes, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact d'une préparation de cellules pancréatiques avec une sonde fluorescente qui émet une forte intensité de lumière après sa liaison aux cations Zn2+ présents dans les cellules uniquement lorsque celles-ci sont vivantes, b) la détection de la lumière émise par la sonde après sa liaison aux cations Zn2+ présents dans les cellules vivantes par tout moyen optique. Avantageusement la sonde mise en oeuvre à l'étape (a) de la méthode selon l'invention est une sonde capable de se lier au cation Zn2+ uniquement lorsqu'elle est transformée par des cellules vivantes. Avantageusement la sonde mise en oeuvre à l'étape (a) de la méthode selon l'invention a une constante de dissociation (Kd) pour le cation Zn2+ comprise entre 0, 1 yam et 5 yam, de préférence comprise entre 1 M et 3 hum. De manière préférentielle, la sonde fluorescente a des longueurs d'onde d'excitation et d'émission dans la région visible. De manière tout à fait préférentielle, la sonde mise en oeuvre à l'étape (a) de la méthode selon l'invention, est la forme diacetate du Newport Green. Selon un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, la détection de la lumière émise lors de la réalisation de l'étape (b) est effectuée au moyen d'un microscope confocal. Selon un mode tout à fait préféré de mise en oeuvre de l'invention, la détection de la lumière émise lors de la réalisation de l'étape (b) comporte la détection de l'intensité et de la diffraction latérale de ladite lumière au moyen d'un trieur de cellules à balayage de fluorescence. Les travaux expérimentaux menés sur des cellules pancréatiques, dans le cadre de la présente invention ont permis de vérifier les caractéristiques suivantes de la sonde Newport Green : - faible affinité et bonne spécificité pour le zinc permettant de ne lier que le zinc labile ou faiblement lié, formes majoritairement représentées dans les cellules bêta, marquage sélectif des cellules vivantes grâce à sa forme estérifiée, charge rapide et non toxique pour les cellules pancréatiques, excitation dans le visible permettant l'utilisation des microscopes confocaux, analyseurs d'image et cytomètres de type courant, - fluorescence peu labile compatible avec un tri prolongé et corrélation entre intensité de fluorescence, nombre d'îlots et insuline intracellulaire La validation de la sonde Newport Green pour l'identification des cellules bêta pancréatiques permet : (1) de visualiser les cellules bêta dans les îlots pancréatiques par microscopie confocale ou analyse d'images, (2) d'isoler lesdites cellules bêta pour des études physiologiques, (3) d'estimer rapidement, lors de la gestion d'allogreffes, la quantité de cellules bêta viables dans les préparations semi-purifiées contenant des cellules exocrines contaminantes. En effet, l'évaluation préalable des cellules bêta avant le transplantation est devenue une condition cruciale pour assurer le succès de l'implantation de la greffe. L'invention se rapporte également à une méthode de purification de cellules bêta pancréatiques vivantes dans laquelle on détecte lesdites cellules par une méthode de détection selon l'invention, et on sépare ensuite les cellules comprenant ladite sonde liée aux cations Zn2+ émettant la plus forte intensité de lumière. Avantageusement la méthode de purification de cellules bêta pancréatiques vivantes selon l'invention comprend une étape de séparation des cellules comprenant ladite sonde liée aux cations Zon21 émettant la plus forte intensité de lumière et présentant la plus importante diffraction latérale de lumière, au moyen d'un trieur de cellules à balayage de fluorescence Enfin l'invention se rapporte aussi à l'utilisation de la forme diacetate du Newport Green comme sonde pour la détection et/ou la purification de cellules bêta pancréatiques vivantes présentes dans une préparation de cellules pancréatiques. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent concernant la vérification des caractéristiques de la sonde Newport Green sur les cellules bêta pancréatiques, permettant leur détection spécifique et leur purification. Il sera fait références aux dessins en annexe dans lesquels : La figure 1 illustre l'intensité de fluorescence de la sonde NG en fonction de la concentration du zinc. - La figure 2 montre la spécificité de la sonde fluorescente NG pour le zinc. - La figure 3 montre la corrélation entre la fluorescence NG et le nombre d'îlots. La figure 4 montre les études de cytotoxicité de la sonde NG. La figure 5 montre l'examen des îlots colorés, par microscopie confocale. - Les figure 6 et 7 montrent les analyses en cytométrie de flux. La figure 8 illustre l'analyse immunocytochimique des cellules triées. - La figure 9 montre la relation entre les indices Zn/ADN et d'autres paramètres. I MATERIEL ET METHODES 1-Préparation d'îlots humains Des pancréas humains (n=ll, moyenne d'âge 35±12 ans) ont été dilacérés à partir de donneurs adultes en état de mort cérébrale, en accord avec les Régles françaises et le Comité d'éthique institutionnel local. Les îlots pancréatiques ont été isolés après distension des pancréas et digestion de leur tissus par de la Liberaseo (Roche Diagnostics) selon la méthode automatisée de Ricordi et al. (1988) modifiée, (KerrConte et al. 1994). La semi-purification est accomplie sur des gradients d'histopaque (Sigma) de densité discontinue à l'aide d'un séparateur de cellules (Lake et al. 1989). Le nombre d'îlots et leur diamètre ont été déterminés en triplicates sur chaque échantillon après marquage à la dithizone (DTZ) (Latif et al. 1988) et exprimés en îlots équivalents (IE) correspondant aux îlots dont le diamètre est de 150 lit (Ricordi et al. 1990). La viabilité des îlots est vérifiée dans chaque préparation par examen microscopique après coloration à la DTZ et au Bleu trypan. Les préparations utilisées dans cette étude ont montré une viabilité de 86+5% et un rendement moyen de 2320+420 IE/g. Les îlots semi-purifiés ont été mis en culture durant 24 heures à 37 C dans un milieu CMRL 1066 contenant 2% d'Ultroser G (Gibco BRL) et des antibiotiques. 2-Culture cellulaire Des cellules bêta pancréatiques d'origine murine, incluant des cellules INS-1 données par le Dr. Wolheim (Asfari et al. 1992) et des cellules beta-TC3 données par le Dr. Efrat et al. (1988), ont été utilisées de manière à vérifier certaines caractéristiques de la sonde. Le milieu de culture pour les cellules INS-1 consiste en du milieu RPMI-1640 contenant 10% de sérum de veau foetal (SVF), 1,1 mM de pyruvate de sodium, 50M de 2-mercaptoéthanol et des antibiotiques. Pour les cellules beta-TC3 il a été utilisé du milieu DMEM contenant 2,5% de SVF, 15% de sérum de cheval et des antibiotiques. 3-Marquage fluorescent avec du Newport Green. Le Newport Green (Molecular Probes Europe) est disponible soit en tant que sel (forme potassique : NG-K) soit en tant qu'ester (forme diacétate : NG-Ac). La forme potassique soluble dans l'eau a été utilisée pour les études fluorométriques destinées à déterminer les constantes de liaison de NG par des courbes de titration du Cl, Zn et sa spécificité à partir d'autres solutions d'ions métalliques. Du NG-K (6pom) a été ajouté dans les puits d'une microplaque de 96 puits conservée dans le noir durant 10 minutes. La fluorescence a été mesurée à température ambiante dans un fluoromètre équipé d'accessoires pour lecture de microplaques (Fluorocount, Packard). La sonde Newport Green montre une augmentation de l'émission de la fluorescence après liaison au Zinc avec un faible déplacement de longueur d'onde. Les pics d'excitation et d'émission ont été fixés aux longueurs d'onde de 485 et de 530 nm respectivement. La forme ester (NG-Ac) a été utilisée pour les études de fluorescence sur les cellules vivantes. La sonde NG-Ac est capable de diffuser à travers la membrane cellulaire, une fois à l'intérieur des cellules, cet ester est clivé par les estèrases intracellulaires et libère une sonde fluorescente capable de se lier au zinc mais qui ne peut plus diffuser à travers la membrane cellulaire. Des cellules dans du tampon salin tamponné par le phosphate (PBS) ont été exposées durant 30 minutes à 37 C à 25 M NG-Ac contenant 1, 51/ml de Pluronic F127 de manière à optimiser la pénétration de la sonde. Après lavage dans du PBS, la fluorescence a été estimée par spectrofluorimétrie en microplaque comme décrit précédemment ou par microscopie confocale ou cytométrie. La standardisation de la fluorescence lors des mesures fluorométriques est effectuée en utilisant un blanc consistant en 25lit NG-Ac dans du PBS qui est toujours fixé à la même valeur de fluorescence. 4-Distension cellulaire et dissociation. la distension des îlots est effectuée durant 5 minutes à 37 C dans un tampon de dispersion consistant en une solution saline de Earle sans cations Ca2+ ni Mg2+ et supplémentée par 10 mM HEPES, 3mM EGTA, 2,8 mM glucose et 2,5 mg/ml d'albumine de sérum bovin (BSA). La dissociation totale des cellules à partir des préparations d'îlots est accomplie sur les culots d'îlots (200g, 3 minutes), par léger pipetage durant 10 minutes dans 4,5 ml de tampon de dispersion. Une dissociation enzymatique est alors effectuée par addition de 100 gg/ml de trypsine et stoppée par addition de deux volumes de SVF et un volume d'inhibiteur de trypsine à 0,0035% (type 1-S, Sigma) lorsque environ 80% des îlots apparaissent comme des cellules uniques. La suspension cellulaire est ensuite centrifugée (500g, 5 minutes) et le culot remis en suspension dans du milieu F10 sans cation Ca2+ et contenant 2,8 mM glucose. la suspension cellulaire est alors filtrée à travers une membrane de nylon de 70 Mm. 5-Microscopie confocale. Les analyses en microscopie confocale ont été effectuées sur un microscope confocal inversé (Leica TCSNT) sur des cellules dissociées ou des îlots étalés dans des chambres Lab-Teks (Nalge Nunc) dont les lamelles sont recouvertes de poly-L-lysine. Lorsque les îlots sont particulièrement compacts, une légère distension des îlots est réalisée avant marquage durant 5 minutes dans le tampon de dispersion, de manière à éviter une pénétration insuffisante de la sonde. Le marquage est effectué après une période de latence de 90 minutes dans du milieu F10 contenant 2,8 mM glucose afin de restaurer l'intégrité cellulaire. 6-Tri cellulaire. Le tri cellulaire a été effectué après dissociation totale des îlots. Le marquage est accompli après une période de 90 minutes dans du milieu F10 sans cation Ca 2+ et contenant 2,8 mM glucose. Ce tri a été effectué soit avec un cytomètre de flux Epics XL-MCL soit avec un appareil Elite Coulter tous deux équipés d'un laser à argon (Coultronics). L'excitation a été effectuée à 488 nm et l'émission mesurée à travers un filtre de bande passante 530/30. 7-Teneur en insuline et sécrétion. La teneur en insuline des îlots pancréatiques humains a été mesurée dans des culots obtenus par centrifugation et qui ont été homogénéisés par sonication (20 Khz, 30 W durant 15 secondes dans 200 fll de tampon Tris HCl contenant 1 mM EDTA à pH 7,4) et conservés congelés à-20 OC. La teneur en insuline a été mesurée par un dosage radioimmunométrique (Bi-insulin IRMA Diagnostics Pasteur) après extraction acide-éthanolique (0,18 M HCl dans de l'éthanol 95%) d'aliquots de 50 fll d'homogénats pendant une nuit à 4 C. Les sécrétions d'insuline en réponse à une stimulation par le glucose ont été étudiées comme suit : une heure de préincubation dans un tampon Kreb contenant 3,6 mM glucose suivie par trois périodes d'incubation d'une heure chacune avec 3,6 mM, 16,7 mM et 3,6 mM glucose. Les milieux d'incubation ont été collectés et. les indices de stimulation (IS) ont été calculés en divisant la sécrétion d'insuline en présence de teneurs élevés en glucose par la moyenne des niveaux de sécrétion basale d'insuline. 8-Test d'ADN L'ADN a été testé sur des aliquots d'homogénat à l'aide d'une sonde fluorescente : le PicoGreen (Molecular Probes) à une dilution 1/200 dans du PBS contenant 20 mM EGTA. Après une brève période de contact (15 minutes), les échantillons ont été excités à 485 nm et l'intensité de la fluorescence d'émission a été mesurée à 530 nm. 9-Analyse immunocytochimique. Les cellules ont été cultivées sur des lames de verre, lavées dans du PBS et traitées à 4 C comme décrit par Brelje et al. (1989). Elles ont été fixées durant 18 heures dans le fixateur de Zamboni (Stefanini et al. 1967) et après des lavages exhaustifs dans du tampon salin de Sorenson tamponné au phosphate contenant 01% Triton X-100, elles ont été incubées avec 10% de sérum normal de chèvre dans du PBS contenant 0,1% triton X-100 (PBS-T) durant 4 heures. Après des lavages dans du PBS-T, les cellules ont été incubées durant 18 heures avec une dilution 1 : 300 d'un premier anticorps (anticorps monoclonal dirigé contre l'insuline/proinsuline, Biogenesis, Newfields, UK). l'incubation a été arrêtée avec trois lavages dans du PBS-T et est suivie d'une deuxième incubation avec soit un anticorps antiimmunoglobuline de souris conjugué à la l'isothiocyanate de fluorescéine (Dako, Trappes, France) dilué 1 : 100, soit avec un anticorps anti-immunoglobuline de souris révélé avec du PhtaloRed (Kirkegaard & Perry Lab Inc). Les contrôles incluent le remplacement du premier anticorps par du PBS contenant 1% de BSA. Les noyaux sont contrecolorés avec de l'hematoxyline de Carazzi. II RESULTATS 1-Propriétés du Newport Green La fluorescence du NG-K (6 MM) dans du TrisHCl 10 mM est augmentée par le cation Zn2+ qu'il soit sous la forme de C12Zn ou d'insuline cristalline (Actrapid). La sonde est saturée à environ 10 MM Zn ; sa demi-saturation est obtenue à une concentration de 2-3 MM Zn2+. Les études de liaison en utilisant le NG-Ac confirment que la forme ester est incapable de lier le zinc. Ces résultats, montrant l'intensité de la sonde NG en fonction de la concentration du cation Zn2+ sont illustrés figure 1 en annexe dans laquelle : 0. Le cation Zn2+ se trouve sous la forme C12Zn dans 10 mM Tris-Cl : ; N : le cation Zn2+ se trouve sous la forme d'une solution d'insuline-Zn (Actrapid Novo Nordisk : 40 IU/ml correspondant à 100 M Zn2+). (-) : incubation avec la sonde potassique (--) : Incubation avec la forme estérifiée de la sonde NG dans du PBS (NG-Ac, 25 M). Les valeurs sont les moyennes sem de seize expériences (Cl2Zn) ou de quatre expériences (Actrapid). La longueur d'onde d'excitation : 485 nm, la longueur d'onde d'émission : 530 nm. La fluorescence dépendante du Zn2+ de la sonde NG-K n'est pas affectée lorsque des excès d'ions métalliques fréquemment présents dans les cellules vivantes, tels que Ca2+, Mg2+ ou Fe sont ajoutés sous forme de sels. Parmi les autres ions métalliques analysés, le Cu2+, Cd et Pb2+ diminue la fluorescence alors que d'autres tels que le Co2+ et le Ni augmentent la fluorescente dépendante du Zn, cependant, ils sont trouvés seulement à l'état de traces dans les cellules vivantes. Comme il était prévu, l'EDTA et l'EGTA, ainsi qu'un pH acide ont une influence sur la fluorescence liée au zinc de la sonde NG-K. Les résultats de cette expérience dans laquelle le cation Zn2+ (6 M) est incubé avec 2, 5 MM de la sonde NG-K (contrôle) et les compétiteurs suivants : Mg2+ et Ca à une concentration finale de 1 mM, Fe2+, Ba2+, Cu2+, Cd2+, Pb2+, Hg2+, Co2+ et Ni à une concentration finale de 1 mM sont montrés figure 2 en annexe. Les valeurs sont exprimées en pourcentage des valeurs du contrôle, et sont les moyennes ì de quatre expériences. 2-Contrôle du chargement cellulaire. Des îlots récupérés manuellement sont chargés avec un ml de 25 MM de NG-Ac après distension des cellules pendant 5 minutes. Les résultats montrant une excellente corrélation entre l'intensité de la fluorescence et le nombre d'îlots sont illustrés figure 3 en annexe. L'équation de régression est : y=272x + 15203, r=0,989, p L'intensité de la fluorescence est également augmentée dans les cellules murines cultivées en présence de ClZn (25 M) et de pyrithione (4 AM), un ionophore du zinc. Les rapports de Zn/ADN exprimés en unités arbitraires sont 2,5 et 12 fois supérieurs dans les cellules INS-1 ainsi que dans les cellules bêta Tc3 comparées respectivement aux cellules contrôle. 3-Etude de toxicité de la sonde NG. Des cellules INS-1 sont incubées avec ou sans 25 AM NG-Ac pendant 30 minutes et cultivées ensuite pendant sept jours. Les résultats observés, illustrés figure 4 en annexe, montrent que les cellules traitées présentent le même profil de croissance que les cellules non traitées. Sur cette figure, les valeurs indiquées correspondent aux moyennes ì sem de quatre expériences et les colonnes pleines correspondent aux cellules contrôle, tandis que les colonnes ouvertes correspondent aux cellules traitées avec la sonde NG-Ac. Les îlots (40IE) ont été marqués durant 30 minutes par le NG-Ac (25 AM) ou le DTZ (10 g/ml). Ils ont été stimulés immédiatement par du glucose (3,6 mM et 16,7 mM) ou stimulés après 72 heures de culture dans du milieu CMRL 1066. Les indices de stimulation (IS) ont été calculés comme décrit précédemment dans la section l : "Matériel et méthodes". Les îlots pancréatiques humains marqués par le NG-Ac (25 M, durant 30 minutes) montrent la même capacité de sécrétion d'insuline glucose-dépendante que les îlots contrôle. Au contraire, le marquage à la DTZ (30 minutes, 10 g/ml) conduit à une diminution modérée des indices de stimulation. L'ensemble des résultats est présenté sur le tableau 1 ci-dessous qui illustre l'effet de NG et DTZ dans la sécrétion d'insuline induite par le glucose dans les îlots pancréatiques humains. Tableau 1 Contrôle Coloration NG Coloration DTZ SI sem (n=6) 0 heures 2, 61 0, 28 2, 50 ~ 0,31 1, 90 ì 0,25 2 heures 1,33 0, 11 1, 27 ì 0, 13 1, 14 ~ 0,04 4-Imagerie cellulaire Le marquage des îlots a été visualisé par des études de microscopie confocale. Les résultats de ces travaux sont illustrés figures 5A à 5F en annexe dans lesquelles : - La figure 5A montre la projection de 60 sections optiques acquises à des intervalles d'i lim à travers un îlot humain marqué par la sonde NG-Ac, barre = 50 M. - La figure 5B illustre la projection de 60 sections optiques acquises à des intervalles de 2 film à travers un îlot humain coloré avec la sonde NG-Ac (cellules vertes vivantes) et avec du iodure de propidium (cellules rouges mortes) après légère distension des cellules comme décrit dans la section I :"Matériel et méthodes", barre = 50 Mm. - La figure 5C montre une section d'un îlot particulièrement volumineux et compact montrant une pénétration insuffisante de la sonde, barre = 50 film. - La figure 5D montre une section à travers un îlot standard marqué par la sonde NG-Ac ; il est à noter la pénétration complète de la sonde dans le centre de l'îlot, barre =30 Mm. - La figure SE montre des cellules d'îlots marquées par la sonde NG-Ac et posées sur une lame recouverte de poly-L-Lysine. Il est à noter la fluorescence hétérogène des cellules marquées par la sonde NG et les noyaux non colorés, barre= 15 Mm. La figure 5F montre des cellules en monocouche immunomarquées par l'insuline, barre = 40 Mm. Les cellules positivement marquées par le NG apparaissent en vert ; les cellules mortes marquées par l'iodure de propidium (4 yam) apparaissent en rouge (Figures 5A et 5B). Les analyses de sections optiques individuelles indiquent une coloration homogène depuis la périphérie vers le centre quand les cellules sont faiblement liées dans l'îlot (Figure 5D). Cependant, une pénétration insuffisante de la sonde est notée lorsque les îlots sont particulièrement compacts. Par conséquent, une distension légère des îlots est systématiquement effectuée durant 5 minutes avant le marquage, comme décrit précédemment. Le marquage des cellules montre une intensité hétérogène de fluorescence avec des spots cytoplasmiques (Figure 5E). Des images similaires ont été obtenues en utilisant le marquage de l'insuline par un anticorps anti insuline/proinsuline conjugué à la fluorescéine, des marquages nucléaires n'ont pas été observés (Figure 5F). 5-Etudes quantitatives Les analyses par FACS des cellules marquées par le NG et provenant de préparations semi-purifiées contenant donc des cellules bêta endocrines et des cellules non-bêta ainsi que des cellules exocrines sont illustrées sur la figure 7 en annexe. La figure 7A représente l'histogramme des signaux de diffraction latérale de la lumière (SS). Les cellules dissociées et marquées par la sonde NG-Ac sont distribuées en deux régions I et II selon leur pouvoir de diffraction qui est fonction de la granulosité des cellules. La figure 7B est un graphique de diffraction en fonction de la fluorescence des cellules dissociées à partir d'une préparation d'îlots. Deux fenêtres de paramètres ont été établies pour la séparation des cellules dissociées marquées par la sonde NG-Ac : R2 forte diffraction et forte fluorescence correspondant aux cellules bêta et RI : faible diffraction et faible fluorescence correspondant aux cellules non-bêta. Ces résultats montrent une large gamme (environ x 300) d'unités de fluorescence relative (RFU). En comparaison, la gamme d'autofluorescence est plus limitée environ x 10. ) Le rendement après tri est toujours supérieur à 85% et la viabilité constatée par exclusion au bleu trypan est toujours supérieure à 95%. Deux populations cellulaires ont été observées selon leurs profils de diffraction (ss) et de RFU et ont été séparées par tri. Leurs caractéristiques sont illustrées sur la figure 8 où A : représente les contrôles qui incluent le remplacement du premier anticorps par du PBS contenant 1% de BSA, B représente les cellules triées dont la fluorescence était faible ; et C : les cellules triées dont la fluorescence était forte. Les cellules triées et isolées à partir des régions RI et R2 ont été placées dans des chambres LabTek, traitées avec de la poly-L-Lysine et cultivées durant 24 heures avant l'immunomarquage avec un anticorps anti-insuline révélé avec du PhtaloRed comme décrit dans "Matériel et méthodes". Les noyaux ont été contrecolorés avec de l'hematoxyline de Carazzi. Les rapports des valeurs moyennes sem) dans les deux populations sont de 10, 51, 8 (n=5) pour SS et 12, 1+1, 14 (n=5) pour RFU. La teneur en insuline des cellules séparées a été analysée, les rapports d'insuline par ADN dans les deux populations triées sont de 30+9, 4 (n=5) prouvant une distinction nette entre les cellules bêta et les cellules non-bêta. Les analyses immunocytochimiques de ces deux populations cellulaires confirment également la présence d'une grande majorité de cellules insulino-positives dans la population triée la plus fluorescente comparée à la population la moins fluorescente. Lorsque l'on compare la population cellulaire avant le tri, c'est à dire contenant les cellules endocrines plus les cellules exocrines, versus la population triée la plus fluorescente, l'enrichissement en cellules bêta, estimé par les rapports d'insuline par l'ADN, est extrêmement variable (depuis 1,3 jusqu'à 7, moyenne 3, 2+1, 04, n=5), car il dépend de la pureté de la préparation initiale, plus la préparation initiale est pure, plus le rapport d'enrichissement est faible. En terme de fonction, les cellules dissociées, étudiées avant et après le tri et cultivées durant 72 heures, montrent les mêmes profils de stimulation d'insuline glucose-dépendante, cependant, les cellules triées les plus fluorescentes sécrètent environ 10 fois plus d'insuline que celles les moins fluorescentes Après dissociation à partir des préparations d'îlots sémi-purifiées, les cellules ont été marquées par la sonde NG-Ac à 25 M durant 30 minutes. Une fraction de cellules a été triée par FACS comme décrit précédemment. Les cellules contrôle et les cellules triées ont été placées dans des plaques de 48 puits (105 cellules/puits) et cultivées pendant 72 heures avant stimulation. Les cellules contrôle étaient des cellules dissociées et marquées mais non triées. Les résultats obtenus, montrant dans les différentes populations la fonctionnalité des cellules bêta, sont présentés sur le tableau 2 cidessous. Tableau 2 Insuline sécrétée IS (ng/105 cellules) pendant une heure à 16,7 mM glucose moyenne esm, (n=3) Cellules 41,4 0,16 contrôle Fraction 0,12 fortement fluorescent Fraction 0,44 ì 0,02 0,98 0,31 faiblement fluorescent La détermination de la teneur en zinc par unité d'ADN a été effectuée sur les préparations d'îlots de donneurs différents dans le but de rechercher si un indice destiné à estimer la pureté et la viabilité de ces préparations, pouvait être établi. Le marquage des cellules a été effectué en six replicates de 40IE marqués par 25 liM NG-Ac après une légère distension des îlots. La relation entre les indices Zn/ADN et d'autres paramètres est montrée figure 9 en annexe dans laquelle les indices Zn/ADN, exprimés en unités arbitraires, son déterminés comme décrit dans "matériel et méthodes". les valeurs représentent les moyennes ì sem de six replicates de 40 IE et où : A : représente l'analyse de régression entre le rapport Z, /ADN et la pureté exprimée en pourcentage de cellules colorées par la DTZ ; l'équation de régression est : y= 0, 391x + 1,38, r=0, 63, p=0, 011. B : représente l'analyse de régression entre le rapport Zn/ADN et la teneur en insuline exprimée en flU/40 IE ; moyenne de 5 replicates). La courbe de régression est y=O, OOlx + 5,98, r=0,81, p=0,007. (---) représente l'intervalle de confiance 95% Ces résultats montrent une variabilité importante des valeurs entre les différentes préparations. Les analyses de régression montrent de bonnes corrélations entre les valeurs Zn/ADN et la pureté, estimée qualitativement par le pourcentage de cellules marquées par la DTZ dans la préparation (r=0,63, p=0, 011, n=15) et entre les valeurs Zn/ADN et la teneur en insuline (r=0,81, p=0, 007, n=9). L'augmentation de la fluorescence dépendante du zinc n'a pas pu être démontrée en utilisant la sonde estérifiée NG-Ac et une solution saline de zinc. La forme saline de cette sonde (NG-K) a permis de mesurer la constante de dissociation de l'ordre du micromolaire, c'est à dire environ 2-3 UM, correspondant à une faible affinité pour le zinc. De ce fait, en raison de leur forte affinité pour le zinc, les sites actifs des enzymes et les facteurs de transcription ne peuvent se lier à la sonde NG qui ne peut détecter que le zinc faiblement lié dans les cellules, incluant le zinc libre ou le zinc faiblement associé à des protéines ou des lipides cellulaires. La spécificité de la sonde NG pour le zinc est satisfaisante, étant donné que, en particulier, un excès molaire important d'ion Ca2+, le cation divalent le plus abondant et qui se trouve stimulé dans les cellules bêta pancréatiques n'altère pas la fluorescence de la sonde NG dépendante du zinc. Le chargement de la forme estérifiée lipophilique du Newport Green est simple, rapide et non toxique pour les cellules. L'examen de sa distribution à l'intérieur de cellules par microscopie confocale met en évidence une fluorescence intense principalement associée avec les granules de sécrétion, démontrant que la sonde NG entre en compétition avec l'insuline pour sa liaison au zinc, de plus les noyaux ne sont pas marqués par la sonde NG. Les analyses des sections optiques sériées en microscopie confocale révèlent une absence de pénétration de la sonde dans le coeur des îlots, lorsque ceux-ci sont particulièrement volumineux et compacts. Cette situation peut-être évitée par une distension légère systématique des îlots préalablement à leur marquage. Dans ces conditions, une relation linéaire entre l'intensité de la fluorescence et le nombre d'îlots peut être trouvée spectrofluométriquement. Les analyses par FACS des préparations semipurifiées, révèlent une large gamme d'intensité de fluorescence des cellules qui peuvent être séparées par tri selon l'importance de la diffraction latérale de la lumière (SS). Deux populations cellulaires peuvent ainsi être isolées : une montrant une forte diffraction de la lumière et une fluorescence élevée correspondant aux cellules contenant de l'insuline, et l'autre avec des valeurs plus petites des deux paramètres, correspondant au cellules non-bêta. Les cellules bêta manifestent une fluorescence NG supérieure d'environ 12 fois à celle des cellules non-bêta et leur pouvoir de diffraction de la lumière est d'environ 10 fois plus élevé. Comme conséquence, une distinction nette entre les deux populations peut-être établie facilement pour des applications de recherche. De plus, les cellules triées contenant l'insuline conservent leur fonction en terme de sécrétion d'insuline glucose-dépendante. En clinique, la transplantation d'îlots de pancréas est maintenant reconnue comme traitement de choix pour les patients atteints de diabète mellitus de type I (Shapiro et al. 2000). La qualité des préparations d'îlots humains, en incluant le pourcentage de cellules vivantes contenant de l'insuline est un paramètre important dans la maîtrise des programmes de greffe d'îlots. Cependant cette qualité est inconstante et dépend de multiples facteurs tels que la durée de l'ischémie froide et du temps de digestion du pancréas par la collagènase, ainsi que l'indice de masse corporelle et l'âge du donneur (Lakey et al. 1996). La détermination d'un indice destiné à apprécier la pureté de la préparation est par conséquent d'une importance capitale dans la gestion des allogreffes d'îlots. Cet indice que nous avons défini, exprimé en unités standardisées NG-RFU par ADN tient compte de la viabilité des cellules et de leur teneur en zinc, un reflet de la synthèse et du contenu en insuline (Figlewicz et al. 1984). A l'heure actuelle, la méthode la plus adéquate pour déterminer la pureté d'une préparation d'îlots est l'examen au microscope optique des cellules marquées par la dithizone, les cellules bêta apparaissent colorées en rouge et une comptage grossier de leur pourcentage est établi. Cette technique est approximative et subjective, toutefois il a été trouvé une bonne corrélation entre ces pourcentages et les indices calculés. Cependant, des discordances sont particulièrement évidentes dans les cas d'îlots fortement fragmentés, pour lesquels l'examen microscopique semble sous-estimer le pourcentage de cellules colorées. Dans son ensemble, le marquage du Zinc par la sonde NG semble fournir une méthode valable pour identifier spécifiquement, quantifier et isoler des cellules sécrétant l'insuline à partir de préparations semi-purifiées d'îlots pancréatiques humains. Cette sonde du zinc, la première capable de marquer spécifiquement des cellules vivantes dans le spectre visible, semble par conséquent prometteuse dans la manipulation de cellules bêta tant pour des applications cliniques que pour des application de recherche. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Asfari M, Janjic D, Meda P, Li G, Halban PA, Wollheim CB (1992) Establishment of 2-mercaptoethanol-dependent differentiated insulin-secreting cell lines. 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REVENDICATIONS 1) Méthode d'identification de cellules bêta pancréatiques vivantes, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact d'une préparation de cellules pancréatiques avec une sonde fluorescente qui émet une forte intensité de lumière uniquement lorsqu'elle est liée aux cations Zn2+ présents dans des cellules vivantes, b) la détection de la lumière émise par la sonde fluorescente après sa liaison aux cations Zn2+ présents dans les cellules vivantes par tout moyen optique. 2) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la sonde est capable de se lier au cation Zn2+ uniquement lorsqu'elle est transformée dans les cellules vivantes. 3) Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la sonde a une constante de dissociation (Kd) pour le cation Zn2+ comprise entre 0,1 M et 5 M, de préférence comprise entre 1 yam et 3 gM. 4) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que la sonde fluorescente a des longueurs d'onde d'excitation et d'émission dans la région visible. 5) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la sonde est la forme diacetate du Newport Green. 6) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'à l'étape (b) la détection de la lumière émise est effectuée au moyen d'un microscope confocal. 7) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'à l'étape (b) la détection de la lumière émise comporte la détection de l'intensité et de la diffraction latérale de ladite lumière au moyen d'un trieur de cellules à balayage de fluorescence. 8) Méthode de purification de cellules bêta pancréatiques vivantes, caractérisée en ce que l'on détecte lesdites cellules par une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, et en ce que l'on sépare, lors de la détection, les cellules comprenant ladite sonde liée aux cations Zn2+ émettant la plus forte intensité de lumière. 9) Méthode de purification de cellules bêta pancréatiques vivantes caractérisée, en ce que l'on détecte lesdites cellules par une méthode selon la revendication 7, et en ce que l'on sépare, lors de la détection, les cellules comprenant ladite sonde liée aux cations Zn2+ émettant la plus forte intensité de lumière et présentant la plus importante diffraction latérale de lumière. 10) Utilisation de la forme diacetate du Newport Green comme sonde pour la détection et/ou la purification de cellules bêta pancréatiques vivantes présentes dans une préparation de cellules pancréatiques.