Brevet FR2832418A1 — publié le 20030523

PROCEDE DE PREPARATION D'UNE HUILE DE COURGE HYDROLYSEE, L'HUILE DE COURGE HYDROLYSEE SUSCEPTIBLE D'ETRE OBENUE PAR CE PROCEDE ET SON UTILISATION. La présente invention est relative à un procédé de préparation d'une huile de courge hydrolysée, à l'huile de courge hydrolysée susceptible d'être obtenu par ce procédé, à son utilisation pharmaceutique, cosmétique ou à titre de complément alimentaire et aux compositions la contenant. La courge du nom latin Cucurbita pepo, appartient à la famille des Cucurbitacées. C'est une grande plante herbacée annuelle à tige anguleuse, très rameuse et couchée sur le sol. Les feuilles sont simples, alternes, longuement pétiolées. Les fleurs, jaunes, sont unisexuées. Le fruit est une grosse baie volumineuse ou oblongue à pulpe charnue, spongieuse. Il est de couleur variable. Les graines sont nombreuses, plates, ovoïdes, de 7 à 15 mm de longueur et 8 à 9 mm de largeur. La floraison de la plante s'effectue de juillet à août. La plante est cultivée et serait originaire d'Amérique Centrale. Les pépins sont composés chimiquement en moyenne de 35 à 50% d'huile, de 25 à 40% de protéines, de 10% de pectines et de 4 à 5% d'éléments minéraux. L'huile est la partie la plus intéressante et, est couramment utilisée. On utilisera dans la suite de l'exposé indifféremment les termes de"huile de courge"et"huile de pépins de courge". Il s'agit d'une huile fortement insaturée dont la composition en acides gras est la suivante : Acide palmitique C16 : 0 de 10 à 15 % a Acide stéarique C18 : 0 de 4 à 10 % Acide oléique C18 : 1 9c de 30 à 40 % Acide linoléique C18 : 2 9c, 11 c de 40 à 50 % Les acides gras sont majoritairement liés à du glycérol pour former des triglycérides. L'huile de courge contient en moyenne entre 1,5 à 2,5 % en insaponifiable. La fraction insaponifiable d'un corps gras ou"insaponifiable"est définie par l'ensemble des constituants qui, après saponification de l'huile, sont solubles dans les solvants classiques des corps gras (hexane, oxyde d'éthyle,...). L'insaponifiable est un mélange complexe de composés dont certains sont présents à l'état de traces, et qui appartiennent à des familles très diverses. Ainsi, l'insaponifiable d'huile de courge est composé d'hydrocarbures, de tocophérols (teneurs moyenne 650 mg/kg, le y tocophérol est le composé majoritaire), d'alcools triterpéniques (teneur moyenne 2 g/kg, ) de méthyl-4-stérols et de stérols. Ces derniers sont composés majoritairement de Delta-7-stérols à hauteur de 95% et de 5% de Delta-5-stérol. Parmi ces stérols sont présents le campestérol, le stigmastérol, le sitostérol, le spinostérol, le stigmastotriene-7,-22, 25-ol, le stigmastodiene-7, 25-ol, le stigmastène-7-ol et le stigmastodiene-7,-24-ol. La richesse en Delta-7-stérols est une caractéristique chimique de l'insaponifiable de l'huile de courge. L'huile de courge est classiquement et essentiellement utilisée per os en complément de traitement des troubles fonctionnels prostatiques et des difficultés de diurèse. On dit ainsi que l'huile de courge agit comme décongestionnant prostatique. Parmi les troubles fonctionnels prostatiques on peut notamment citer l'hypertrophie bénigne de la prostate ou l'adénome prostatique. Cette hypertrophie est une affection atteignant un grand nombre d'hommes à partir de 40 à 50 ans et se manifestant par la prolifération du tissu prostatique. A 60 ans, 50 % des hommes en sont atteints et 90 % à 85 ans. Mais beaucoup d'entre eux restent asymptomatiques tout au long de leur vie. En phytothérapie peu de plantes sont utilisées pour réduire la symptomatologie fonctionnelle de l'hypertrophie bénigne de la prostate. Ces plantes sont le Serenoa repens, l'Urtica dioïca, le Pygeum africanum et Cucurbita pepo. Le mode d'action reconnu lié à l'effet décongestionnant prostatique de l'huile de courge Cucurbita pepo est l'inhibition de l'enzyme 5a-réductase. Les molécules à l'origine de cette activité sont les Delta-7-stérols contenus dans l'insaponifiable. Ainsi, une étude clinique effectuée sur un mélange de ses composés a confirmé cette activité (Bach D. Schmitth, Ebeling GL (1996) Phytopharmaceutical and synthetic agents in the treatment of benign prostatic hyperplasia - Phytomedicin 3 (4), 309-313). Les auteurs expliquent l'activité observée par l'analogie conformationnelle des Delta-7stérols avec la Dihydrostérone que l'on ne retrouve pas dans les Delta-5-stérols. L'huile de courge est par ailleurs utilisée pour le traitement des peaux grasses. Il est connu de traiter les peaux grasses par un inhibiteur de 5a-réductase, enzyme clé dans l'hyperséborrhée. Cette dernière pathologie peut notamment provoquer la chute des cheveux et l'alopécie androgéno-génétique. La 5a-réductase est une enzyme qui a tout d'abord été découverte dans la prostate. Elle catalyse la conversion de testostérone en dihydrotestostérone qui a son tour se lie au récepteur androgène et initie le développement des parties génitales et de la prostate. Plus récemment, la 5a-réductase a été trouvée dans le cuir chevelu et ailleurs dans la peau, où la même réaction que dans la prostate se déroule. On pense que les troubles dans l'activité de la 5a-réductase peuvent provoquer l'alopécie, l'acné et l'hirsutisme. On a maintenant trouvé que l'activité inhibitrice de la 5a-réductase de l'huile de courge pouvait être potentialisée lorsqu'elle subit une étape d'hydrolyse. Ainsi, lors de cette opération, les triglycérides libèrent en partie ou totalement les acides gras sous forme libre. Les acides gras sont en effet liés au glycérol par des liaisons esters. Dans le cadre de la présente invention, ces liaisons peuvent alors être hydrolysées par voie chimique (saponification) ou par voie enzymatique avec une estérase également appelée lipase. La voie enzymatique, outre le fait qu'elle soit naturelle, présente l'avantage d'être plus spécifique et provoque moins de dégradations. Elle sera donc préférée dans le cadre de la présente invention. La présente invention a donc pour objet un procédé de préparation d'une huile de courge hydrolysée, caractérisé en ce qu'il contient une étape d'hydrolyse de l'huile extraite des pépins de courge Cucurbita pepo. Un deuxième objet de l'invention est l'huile de courge hydrolysée susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention. Enfin, l'invention a également pour objet cette huile de courge hydrolysée pour une application comme médicament et son utilisation pour la préparation d'un médicament destiné à lutter contre toutes les pathologies ou tous les désordres relevant d'un dysfonctionnement de l'activité 5a-réductase. L'huile de courge hydrolysée peut être administrée par voie orale ou par voie topique. Elle peut notamment être utilisée pour la préparation d'un médicament destiné à traiter les troubles fonctionnels prostatiques parmi lesquels l'hypertrophie prostatique et l'adénome prostatique, l'alopécie, l'hyperséborrhée, l'hirsutisme et l'acné. Une composition pharmaceutique pour administration par voie orale contenant une huile de courge hydrolysée selon la présente invention et une composition dermatologique pour administration topique contenant cette même huile de courge hydrolysée font également partie de l'invention. L'invention concerne en outre une composition cosmétique pour application topique contenant de l'huile de courge hydrolysée, objet de la présente invention. Une telle composition cosmétique peut permettre d'améliorer l'apparence de la peau. Enfin une composition alimentaire ou complément alimentaire contenant de l'huile de courge hydrolysée, objet de la présente invention fait également partie de l'invention. Une composition pharmaceutique pour l'administration orale peut comprendre de 10 mg à 2 g d'huile de courge hydrolysée selon l'invention, et de préférence entre 1 et 100% en poids, par rapport au poids total de la composition. Selon l'invention, la composition pharmaceutique peut en effet se présenter sous forme d'une capsule molle à base de glycérine ou de gélatine contenant de l'huile de courge hydrolysée pure sans additif. Une composition dermatologique pour administration topique peut comprendre de 0,01% à 30% en poids d'huile de courge hydrolysée selon l'invention, de préférence entre 0,3 et 5 % en poids, par rapport au poids total de la composition. Une composition cosmétique peut comprendre de 0,01 à 30% en poids d'huile de courge hydrolysée selon l'invention, de préférence entre 0,3 et 5% en poids, par rapport au poids total de la composition. Une composition alimentaire ou complément alimentaire peut comprendre de 1 à 100% en poids d'huile de courge hydrolysée selon l'invention. La dose journalière en huile de courge hydrolysée qui peut ainsi être ingérée sous forme de composition alimentaire peut être comprise entre 10 mg et 10 g. Les formulations galéniques des compositions pharmaceutiques et dermatologiques peuvent être effectuées selon des méthodes connues de l'homme de l'art. Selon un mode particulier de l'invention, l'huile de courge est avantageusement mise en émulsion sous agitation dans une solution aqueuse préalablement à l'étape d'hydrolyse. Cette solution aqueuse est de préférence tamponnée à un pH variant de 7 à 9 et la température varie avantageusement de 25 à 45 C. La solution aqueuse peut notamment être tamponnée à l'aide d'hydrogénophosphate de sodium (Na2 HP04). Parmi les microorganismes producteurs de lipases adaptées au procédé selon l'invention, on peut citer le Thermomyces lanuginosus également appelé Humicola lanuginosa, l'Aspergillus oryzae, le Rhizomucor miehei. Le Novozym@ 27007 et le Novozym@ 398 commercialisé par la société NOVO sont plus particulièrement adaptés à titre de lipase Le rapport huile de courge/solution aqueuse peut varier de 4/1 à 1/4. Dans le cas où l'hydrolyse s'effectue par une lipase, le procédé peut être décrit de la façon suivante : On ajoute à l'émulsion, préalablement fabriquée, une lipase dans une proportion par rapport à l'émulsion créée variant de 1/0,1 à 1/0,001. On maintient la température et l'agitation pendant toute l'hydrolyse. On maintien le pH à 6 pendant toute l'opération d'hydrolyse par ajout successif d'une solution tampon. L'hydrolyse enzymatique peut être suivie par la détermination de l'indice d'acide de la partie huileuse. L'hydrolyse enzymatique peut être totale dans un délai pouvant varier de 1 à 10 heures. De façon optionnelle, on peut procéder alors à une séparation liquide/liquide des phases huileuse et aqueuse. Cette opération peut se faire par simple décantation, par centrifugation ou par ajout d'un solvant organique tel que l'acétone, un alcool de CI à C4, de l'hexane ou du dichlorométhane. Dans ce cas, on évapore le solvant après séparation. Si on ne souhaite pas séparer les 2 phases liquides, aqueuse et huileuse, on peut stabiliser l'émulsion par un émulsionnant classique. Ainsi, l'émulsion peut être utilisée directement dans les applications pharmaceutiques décrites ci-après, notamment par voie orale ou par voie topique. L'indice d'acide de l'huile de courge hydrolysée peut être déterminé par la technique de la Pharmacopée française. Il varie de 100 à 200 une fois l'hydrolyse effectuée. La coupe d'acide gras peut être déterminée par CPG sur l'huile de courge hydrolysée et méthylée. Les teneurs moyennes sont fortement similaires à la coupe d'acide gras de l'huile de départ. Ainsi, les teneurs moyennes, pouvant varier selon les lots, sont de 10 à 15 % pour l'acide palmitique, de 4 à 10 % pour l'acide stéarique, de 30 à 40% pour l'acide oléique et de 40 à 50 % pour l'acide linoléique. Enfin on détermine la teneur en insaponifiable de l'huile de courge hydrolysée : il est le même que celui de l'huile de départ, soit en moyenne comprise entre 1,5 à 2,5 % Les exemples ci-après illustrent la présente invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1 100 kg d'huile de courge sont introduits dans un réacteur thermostaté sous agitation. On rajoute 65 kg d'une solution aqueuse de Na2HP04 à 20 % à un pH de 8,5. Quand la température de l'émulsion atteint 37 C on ajoute 1 kg d'une lipase Novozym 27007. On maintient l'agitation et le pH à 6 par ajout de la solution tampon initiale ainsi que la température tout le long de l'hydrolyse. On prélève régulièrement un aliquot de l'émulsion sur lequel on effectue la détermination de l'indice d'acide. Quand ce dernier a atteint une valeur de 140 on ajoute à l'émulsion 100 kg d'acétone et on réalise une extraction liquide/liquide. La phase organique est isolée, l'acétone évaporée sous vide. On récupère ainsi l'huile de courge hydrolysée. Son indice d'acide est confirmé à 140 ainsi que la similitude de sa coupe d'acide gras avec l'huile de départ et de son insaponifiable. Exemple 2 1 kg d'huile de courge est introduit dans un réacteur sous agitation. Sa température est régulée à 40 C. On ajoute 3 kg d'une solution aqueuse tamponnée à pH 8 par du Na2HP04 à 20 %. Quand la température de l'émulsion atteint 40 C on ajoute 200 g d'une lipase Novozym (R) 398. Le pH de l'émulsion est maintenu à 6 par addition de la solution tampon initiale. L'agitation et la température restent constante tout le long de l'hydrolyse. Cette dernière est suivie par détermination de l'indice d'acide. Quand celui-ci atteint une valeur constante de 150 on stoppe l'agitation. L'émulsion est centrifugée de façon à séparer l'huile hydrolysée de la phase aqueuse. L'huile de courge hydrolysée obtenue a un indice d'acide proche de 150, sa coupe d'acides gras correspond à celle de l'huile de départ ainsi que son insaponifiable. Exemple 3 Test sur la production de 5a-réductase Les caractérisations chimiques de l'huile de courge hydrolysée sont de contenir l'insaponifiable de l'huile de courge associée à des acides gras sous forme libre. On teste l'activité sur l'inhibition de la production de la 5a-réductase sur des fibroblastes de l'huile de courge hydrolysée, l'huile de courge classique ainsi qu'une huile reconstituée sans insaponifiable mais composée de l'association des acides gras majoritaires = acide palmitique 13 %, stéarique 6 %, oléique 35 % et linoléique 45 %. Le système de test est constitué de fibroblastes dermiques humains normaux utilisés en monocouche. Les fibroblastes sont isolés à partir d'une plastie. Le milieu d'incubation des fibroblastes est constitué d'un milieu nutritif additionné de testostérone tritié et de testostérone non-radio marquée. Les fibroblastes sont préincubés en présence des produits à tester pendant 24 h. Après cette période, on fait subir aux cellules une lyse bactérienne. Les lysats obtenus sont extraits au dichlorométhane. Après évaporation, les résidus secs sont repris dans le méthanol et déposés sur plaques de silice puis chromatographiés. A la fin de la migration, la radioactivité des spots séparés est comptée par un analyseur de radioactivité. La métabolisation de la testostérone en 5 adihydrotestostérone par la 5a-réductase est calculée. Ils sont exprimés en pourcentage de l'activité de 5a-réductase présente dans le témoin. Inhibition de l'activité 5a-réductase Huile de courge 0, 1 mg/ml Pas d'activité 0,02 mg/ml Pas d'activité Huile de courge reconstituée 0,1 mg/ml-18% 0,02 mg/ml-7 % Huile de courge hydrolysée 0,1 mg/ml -45 % 0,02 mg/ml-27 % Dans ce test, l'huile de courge contenant l'insaponifiable ne montre pas d'activité aux concentrations testées alors que l'huile de courge reconstituée, composée d'acides gras libres sans insaponifiable montre une activité mais inférieure à l'huile de courge hydrolysée contenant l'insaponifiable aux mêmes concentrations. On remarque donc une synergie d'action entre l'insaponifiable et les acides gras sous forme libre ce qui explique la supériorité d'action de l'huile de courge hydrolysée sur l'inhibition de la 5a-réductase. Exemple 4 Activité inhibitrice de 5a-réductase sur la glande costo-vertébrale du hamster. Ce test consiste à traiter à l'aide de produit témoin ou à tester des hamsters mâles castrés par massage sur les glandes costo-vertébrales pendant 4 semaines. Les paramètres suivis sont la surface et l'étude histologique des glandes. Les animaux castrés non traités ont une diminution importante de la taille des glandes à 29 jours. Les animaux traités par de la testostérone ont une augmentation sensible de la surface des glandes, +34 % à 29 jours. Les produits à tester sont appliqués en association avec la testostérone. L'activité inhibitrice de la 5a-réductase se traduit par une non métabolisation de la testostérone inactive en dihydrotestostérone active et donc par une inhibition de l'augmentation de la surface des glandes costo-vertébrales des hamsters. L'huile de courge hydrolysée est appliquée diluée à 60 % et à 30 % dans un solvant neutre. Le flutamide à 3 % sert de témoin actif. Le flutamide est un antagoniste des récepteurs aux androgènes permettant le contrôle de la croissance des cellules cancéreuses androgènes dépendantes. Sur le paramètre surface des glandes costo-vertébrales, l'huile de courge hydrolysée diluée à 60% sur certains temps a une réduction significative. Par contre, l'huile de courge hydrolysée diluée à 30 % ne montre pas d'activité. L'étude histologique des glandes permet de déterminer le diamètre maximal de chaque amas globulaire et l'épaisseur de l'épiderme inter-glandulaire. D'autres paramètres peuvent être étudiés mais dans le test effectué même le témoin positif, le flutamide, n'a pas un comportement actif. Ces paramètres ne peuvent donc pas être retenus. Pour le paramètre maximal de la glande costo-vertébrale, le flutamide, produit témoin, réduit l'action de la testostérone sur l'augmentation du diamètre maximum de 84,2 %. L'huile de courge hydrolysée diluée à 30 % le réduit de 37,4 % et l'huile de courge hydrolysée diluée à 60% de 53,9 %. Le traitement à la testostérone permet un développement histologique normal de l'épaisseur de l'épiderme de la glande. Par contre les animaux traités au flutamide voient l'épaisseur de leur épiderme augmenter de 28 %. L'huile de courge hydrolysée diluée à 30 % n'a pas de répercussion ; l'huile de courge hydrolysée provoque par contre une augmentation de l'épaisseur de 29 %. Exemple 5 Gel moussant sans savon Ingrédients Quantité (g) Lauryl ether sulfate 70% 0-12 Cocamidopropylbétaine 0-20 Decyl glucoside 0-15 Polysorbate 20 0-10 Laurylsarcosinate de sodium 0-15 Ceteareth-60 myristyl glycol 0-10 Glycérine 0-10 Méthyl gluceth-20 0-5 Gluconate de zinc 0-1 Cetrimonium chloride 0-0,5 Huile de cucurbita pepo hydrolysée 0,01-5 Conservateurs qs Parfum qs Colorant qs Eau déminéralisée qsp 100 g Exemple 6 Emulsion H/E Ingrédients Quantité (g) Sepigel305 2-10 Cyclomethicone 0-10 Propylène glycol 0-10 Glycérine 0-7 Polymethyl methacrylate 0-3 Gluconate de zinc 0-1 Cetrimonium chloride 0-0,5 Acide salicylique 0-1 Huile de cucurbita pepo hydrolysée 0,01-5 Tri ethanolamine qs pH Parfum qs Conservateurs qs Eau déminéralisée qsp 100 g REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'une huile de courge hydrolysée caractérisée en ce qu'il contient une étape d'hydrolyse de l'huile extraite des pépins de courge Cucurbita pepo. 2. Procédé de préparation d'une huile de courge hydrolysée selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'hydrolyse est effectuée à l'aide d'une lipase. 3. Procédé de préparation d'une huile de courge hydrolysée selon la revendication 2, caractérisé en ce que les microorganismes producteurs de lipase sont choisis parmi le Thermomyces lanuginosus également appelé Humicola lanuginosa, l'Aspergillus oryzae et le Rhizomucor miehei. 4. Procédé de préparation d'une huile de courge hydrolysée selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3, caractérisé en ce que l'huile extraite de pépins de courge est, préalablement à l'étape d'hydrolyse, mise en émulsion sous agitation dans une solution aqueuse. 5. Procédé de préparation d'une huile de courge hydrolysée selon la revendication 4, caractérisé en ce que la solution aqueuse est tamponnée à un pH variant de 7 à 9 et caractérisé en ce que l'émulsion est maintenue à une température variant de 25 à 45OC. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que le rapport huile extraite de pépins de courge/solution aqueuse varie de 4/1 à 1/4. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que l'étape d'hydrolyse par une lipase est suivie par une séparation liquide/liquide des phases huileuse et aqueuse. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la séparation des phases liquide/liquide des phases huileuse et aqueuse est opérée par décantation, par centrifugation ou par ajout d'un solvant organique. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le solvant organique est choisi parmi l'acétone, l'alcool de CI à C4, l'héxane ou le dichlorométhane. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 9, caractérisé en ce qu'on ajoute un émulsionnant pour stabiliser l'émulsion ainsi obtenue. 11. Huile de courge hydrolysée susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10. 12. Huile de courge hydrolysée selon la revendication 11, caractérisée en ce que l'indice d'acide est compris entre 100 et 200. 13. Huile de courge hydrolysée selon la revendication 11 et 12, caractérisée en ce qu'elle contient de 4 à 10 % en acide stéarique, de 30 à 40 % en acide oléique, et de 40 à 50 % en acide linoléique par rapport au poids total de l'huile de courge hydrolysée. 14. Huile de courge hydrolysée selon la revendication 13, caractérisée en ce que sa teneur en insaponifiable est comprise entre 1,5 et 2,5 % par rapport au poids total de l'huile de courge hydrolysée. 15. Huile de courge hydrolysée selon l'une quelconque des revendications 11 à 14 pour son utilisation comme médicament. 16. Huile de courge hydrolysée selon la revendication 15 pour son utilisation comme inhibiteur de la 5a-réductase. 17. Utilisation de l'huile de courge hydrolysée selon l'une quelconque des revendications 11 à 14 pour la préparation d'un médicament destiné à lutter contre toutes les pathologies ou tous les désordres relevant d'un dysfonctionnement de l'activité de la 5a-réductase. 18. Utilisation de l'huile de courge hydrolysée selon la revendication 17, caractérisée en ce que le médicament peut être administré par voie orale ou topique. 19. Utilisation de l'huile de courge hydrolysée selon l'une quelconque des revendications 11 à 14 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des troubles fonctionnels prostatiques. 20. Utilisation de l'huile de courge hydrolysée selon l'une quelconque des revendications 11 à 14 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de l'alopécie ou de l'hyperséborrhée, de l'hirsutisme ou de l'acné. 21. Utilisation cosmétique de l'huile de courge hydrolysée selon l'une quelconque des revendications 11 à 14 pour améliorer l'apparence de la peau. 22. Utilisation de l'huile de courge hydrolysée selon l'une quelconque des revendications 11 à 14 à titre de composition ou de complément alimentaire. 23. Composition pharmaceutique pour administration par voie orale contenant une huile de courge hydrolysée selon l'une quelconque des revendications 11 à 14. 24. Composition dermatologique pour administration topique contenant une huile de courge hydrolysée selon l'une quelconque des revendications 11 à 14. 25. Composition cosmétique pour administration par voie topique contenant une huile de courge hydrolysée selon l'une quelconque des revendications 11 à 14. 26. Composition alimentaire ou complément alimentaire pour administration par voie orale contenant une huile de courge hydrolysée selon l'une quelconque des revendications 11 à 14.