Brevet FR2833082A1 — publié le 20030606

La présente invention a pour objet une méthode de détection et de quantification de molécules biologiques et un dispositif pour la mise en oeuvre d'une telle méthode. ART ANTERIEUR Ces dernières années, des progrès majeurs ont été réalisés en génétique moléculaire et en particulier dans les techniques de séquençage des acides nucléiques et celles permettant de révéler les transcrits d'ARNm et leurs produits de traduction, dans une cellule ou un tissu donné. Ces techniques nécessitent la mise en place de procédés de dispersion spatiale des molécules biologiques selon une ligne ou un plan, selon leurs propriétés physico-chimiques. Cette dispersion peut par exemple être réalisée par hybridation sur les récepteurs appropriés (puces ADN) ou par migration assistée par un champ électrique (électrophorèses effectuées sur des gels réticulés et suivies ou non de transferts en surface de supports conducteurs ou isolants, poreux ou étanches). Usuellement, les molécules ainsi dispersées sont mises en présence de révélateurs ou marqueurs colorés ou fluorescents qui permettent leur détection au moyen de procédés optiques, ou de marqueurs radioactifs détectés par des capteurs de radiations. Les produits révélateurs ou marqueurs sont variés, chacun d'entre eux présentant des avantages et des inconvénients spécifiques, du point de vue de leur efficacité (sensibilité variable selon la nature des protéines), de leur toxicité envers les expérimentateurs ou envers l'environnement, de leur influence sur l'analyse postérieure de prélèvements, de leur adaptation à la réalisation d'analyses quantitatives, ou de leur coût. On connaît ainsi des techniques de visualisation de protéines, de peptides, ou de fragments d'ADN séparés sur gels d'électrophorèse (acrylamide, agarose, etc...) ou sur d'autres supports (membranes de cellulose, après transfert sur membrane de nitrocellulose ou de nylon, sur des plaques de mica, de silice ou de silicium, etc...) qui constituent des techniques de marquage visuel (coloration des protéines ou des peptides au rouge ponceau, au bleu de Coomassie, à l'amidoblack, à l'argent, à l'or ou par marquage à l'aide de sondes fluorescentes ou impression de films photographiques pour les protéines marquées à l'aide d'éléments radioactifs tels que P. 35SMet...). Ce type d'approche est lié à l'historique de la biologie qui privilégiait une observation directe des images. Cependant, la mise en oeuvre de ces outils de visualisation est lourde puisque la majorité des colorants utilisés nécessite l'utilisation de solvants toxiques (méthanol, butanol, isopropanol,...) qui risquent, à terme, d'être bannis des laboratoires parce qu'ils entraînent des risques pour la santé et l'environnement important. Il en va de même de certains produits chimiques utilisés. De plus, la qualité du résultat final dépend du protocole de coloration utilisé, de la fraîcheur des réactifs et de l'expertise du technicien. Actuellement, les gels d'électrophorèse, en particulier les gels 2D (=deux dimensions, masse moléculaire/point isoélectrique) sont employés comme technique de base dans l'étude du protéome. Il s'agit de séparer, de caractériser, puis d'identifier les protéines d'intérêt contenues initialement dans un échantillon (biopsie, culture cellulaire,...). L'enjeu technique est considérable, l'étude du protéome permettant d'accéder plus directement à la physiologie réelle d'une cellule, en particulier aux régulations métaboliques fines dans lesquelles sont impliquées des interactions multiples protéineprotéine, après celle du génome (identification des gènes) et celle du transcriptome (puces d'ADN, identification des ARN messagers). Les gels 2D précités permettent de visualiser l'expression des protéines selon les tissus concernés, la localisation cellulaire (membrane, cytoplasme...), l'état de développement, la pathologie s'il y a lieu ou le traitement thérapeutique en cours. De plus, les gels 2D pourraient permettre de déterminer le taux d'expression de chaque protéine d'intérêt, si les techniques d'analyse rendaient possible la quantification de chaque protéine de manière précise. En effet, on sait que le stade d'évolution ou la sévérité de certaines pathologies sont en rapport avec le taux de production d'une ou plusieurs protéines spécifiques. Les techniques actuelles sont consommatrices de temps et de produits chimiques divers (solvants organiques, colorants, sels détergents...). D'autre part, ces techniques sont toutes du ressort d'un système de coloration des protéines (amido-blue, bleu de Coomassie, révélation à l'argent, à l'or colloïdal, utilisation de fluorochromes) qui utilise le plus souvent l'affinité du colorant pour des structures agrégées protéinedétergent (sodium dodécylsulfate=SDS/protéine). Par ailleurs certaines protéines échappent à la coloration qui elle-même est quasiment non quantifiable. Au vu de l'art antérieur, les présents inventeurs ont identifié le besoin d'une méthode de détection et de quantification de molécules biologiques qui permette notamment d'atteindre les objectifs suivants : - Rendre la détection de protéines/peptides plus quantitative. - S'affranchir des techniques de coloration de gels ou de membranes et donc réduire l'utilisation des solvants. - S'affranchir du marquage des peptides (au 32p pour les dérivés phosphorylés ou à l'aide de sondes fluorescentes) - Détecter des protéines/peptides qui n'auraient pas réagi avec le colorant. - Supprimer la nécessité de digitaliser l'image par scanner pour l'archiver. - Repérer une tâche sur un gel ( spot ) à des fins d'excision automatique avant protéolyse et séquençage. En conséquence, le demandeur s'est attaché à mettre au point un procédé de détection d'une molécule biologique présente sur un support qui possède une sensibilité de détection accrue, par rapport aux procédés de l'état de la technique et qui permette une quantification plus précise de la molécule biologique détectée, en particulier du fait de l'absence d'effet de saturation du détecteur lorsque ladite molécule biologique est présente en grande quantité. Les problèmes techniques ci-dessus ont été résolus selon l'invention, grâce à un procédé de détection et de quantification d'au moins une molécule biologique, ledit procédé utilisant les propriétés dipolaires de cette molécule biologique. Le squelette carboné des protéines présente déjà, du fait de sa structure chimique, un enchaînement de dipôles, ceux de la liaison peptidique-CO-NH-. Les autres charges peuvent être portées par certaines chaînes latérales comme par exemple le dipôle-OH sur les résidus sérine, thréonine et tyrosine ; des charges positives nettes sont portées par les résidus arginine et lysine, en milieu acide ; les résidus glutamate et aspartate portent des charges négatives en milieu basique. Le moment dipolaire résultant peut être calculé, selon la méthode décrite dans le document accessible sur internet à l'adresse suivante : http : //bioin- formatics. weizmann. ac. il/dipol/dipint. html. La contribution de ces charges ou dipôles au potentiel de surface a quelques fois été étudiée après adsorption ou étalement de ces protéines ou de ces peptides à la surface d'une solution aqueuse conductrice. On peut citer des études sur la mélittine (Wacker bauer et al., 1996), la gramicidine (Heitz et al., 1989), la polyalanine, la polyLproline (isemura et al., 1959), etc... Dans ces cas, la mesure de la variation du potentiel de surface à l'interface air-solution utilise une électrode vibrante de 1 à 2 cm2 qui intègre les propriétés électriques sur une grande surface (Davies et aL, 1963). Comme les protéines, les acides nucléiques constituent aussi des molécules biologiques chargées présentant un moment dipolaire. La présente invention concerne une méthode de détection et de quantification d'au moins une molécule biologique éventuellement marquée (telle qu'une protéine, un peptide, un ADN, un ARN...) dans un échantillon comportant une étape de dispersion spatiale, du type électrophorèse, de ladite au moins une molécule sur un support, caractérisée en ce qu'elle comporte (i) une étape de mesure du potentiel de surface dudit support, en chaque point de surface dudit support, à l'aide d'au moins une sonde. Avantageusement, le support sur lequel la ou les molécules biologiques sont spatialement dispersées consiste en un support du type gel d'acrylamide. Lorsque les molécules sont repérables par un effet électrique, la méthode conforme à l'invention présente notamment l'avantage de réduire le type de nuisances-solvants etc...-citées ci-dessus, et de réduire son coût du fait de son automatisation, en détectant sans révélation des effets physiques intrinsèques aux tâches (spots) de molécules biologiques (protéines, peptides, acides nucléiques sur les membranes, les gels et les plaques de transfert par mesure directe du potentiel de surface. En outre, il n'est plus nécessaire de marquer les molécules biologiques, ce qui évite le recours au marquage radioactif (au 32p pour les dérivés phosphorylés) ou encore les marquages à l'aide de sondes fluorescentes Le procédé selon l'invention permet d'éviter l'utilisation de produits intermédiaires, tels que solvants. Le procédé ci-dessus permet de détecter et quantifier directement une ou plusieurs molécules biologiques préalablement dispersées sur un support, grâce à la mesure directe du potentiel de surface, créé par chaque amas de molécules (spot), par chaque dipôle et chaque charge électrique de l'amas. Elle permet également de s'affranchir au moins en partie de l'utilisation de détergents et, dans certains cas éviter toute étape de coloration. Le coût est considérablement abaissé par simple élimination de consommables et par diminution du temps de travail dans la partie la moins automatisable de l'étude du protéome. Au moment de l'étape de séparation, ou dispersion des molécules biologiques ou postérieurement à celle-ci, il n'est plus nécessaire de procéder à un repérage des amas ou spots par coloration à l'argent par exemple, au bleu, ou, après transfert sur membrane, à l'or colloïdal. D'autre part, le problème du repérage d'un amas spot de molécules biologiques à des fins d'excision automatique, avant protéolyse et séquençage par exemple, est totalement résolu par les techniques de cartographie du potentiel de surface mises au point dans le cadre de l'invention. L'acquisition d'une image est réalisée selon une matrice, par déplacement relatif de l'échantillon par rapport à la sonde de mesure. Les coordonnées X et Y de chaque point de surface du support pour lequel une mesure du potentiel de surface est effectuée, ainsi que la mesure du potentiel de surface audit point de surface peuvent être mémorisés, par exemple dans la mémoire d'un ordinateur numérique. La mémoire de l'ordinateur numérique peut être chargée par un programme contenant les instructions permettant la création d'une image, dite 3D, dont les coordonnées X et Y représentent les coordonnées X et Y de chaque point de surface du support pour lequel une mesure du potentiel de surface a été effectuée, et le cas échéant préalablement mis en mémoire, et dont les coordonnées Z représentent la valeur du potentiel de surface audit point de surface. Il est donc possible de repositionner, face à l'électrode de mesure, ou face à un outil de prélèvement, tout point de surface, du support pour lequel une mesure de détection et de quantification a été réalisée antérieurement. Grâce au procédé de l'invention, on supprime aussi la nécessité de digitaliser l'image, par exemple, par scanner en vue de l'archiver, puisque la technique de cartographie mise en oeuvre dans la méthode selon l'invention génère une représentation des mesures dans un système à trois dimensions, par exemple sous la forme d'une représentation d'image 3D. La détection à l'aide d'une sonde Kelvin est parfaitement maîtrisée dans un laboratoire par un personnel normalement qualifié et l'appareil est capable de résister à une atmosphère de laboratoire. Outre les inconvénients rappelés des techniques de l'art antérieur citées ci-dessus, celles-ci conduisent rarement à des résultats quantifiables. La quantification est difficile avec les techniques de coloration puisque, d'une part, par exemple dans un même gel, l'action d'un colorant varie d'une protéine à l'autre, et d'autre part, dans des gels à comparer, et pour une même protéine, la coloration dépend de nombreux paramètres tels que le temps d'imprégnation ou de révélation. Selon un premier mode de réalisation du procédé, la molécule biologique ou l'ion complexe de même squelette carboné qu'elle peut former en solution est marqué par un marqueur détectable (fluorescent ou radioactif). Selon un second mode de réalisation du procédé, la molécule biologique ou l'ion complexe de même squelette carboné qu'elle peut former en solution n'est pas marqué. La valeur du potentiel de surface mesuré en chaque point de la surface du support analysé conformément au procédé de l'invention peut résulter d'une ou de plusieurs conditions physico-chimiques, parmi celles indiquées ci-dessous : - la molécule biologique ou l'ion complexe de même squelette carboné qu'elle peut former en solution est marqué et la valeur du potentiel de surface résulte d'une affinité électronique différente entre les molécules du marqueur et leur environnement ; - la molécule biologique ou l'ion complexe de même squelette carboné qu'elle peut former en solution n'est pas marqué et la valeur du potentiel de surface résulte du moment dipolaire ou de la densité de charges électroniques, respectivement. - la valeur du potentiel de surface correspond à une interaction primaire physico-chimique avec un marqueur porté soit par la molécule ellemême, soit par la sonde. - la valeur du potentiel de surface correspond à un effet secondaire du type réaction hydrophile/hydrophobe de la molécule. Avantageusement, la surface sur laquelle est déposée la molécule est fonctionnalisée et la sonde optimisée. Dans un mode de réalisation particulier du procédé, celui-ci comprend une étape additionnelle de transfert de la molécule biologique sur un deuxième support conducteur d'électricité préalable à l'étape (i) de mesure du potentiel de surface. Dans cet autre mode de réalisation, ledit deuxième support est préférentiellement une membrane mouillable à l'eau, telle qu'une membrane de cellulose ou de nitrocellulose imprégnée d'une solution d'électrolytes ou une membrane de graphite. De préférence, la sonde utilisée pour la mise en oeuvre du procédé est une sonde Kelvin ou condensateur vibrant. Préférentiellement, la vibration de la sonde est produite par un moteur de type haut-parleur électromagnétique ou par un élément piézo-électrique, tel que poutre vibrante encastrée ou pastille. Dans un autre mode de réalisation du procédé, celui-ci comprend une étape additionnelle de transfert de la molécule biologique sur un deuxième support non conducteur d'électricité, poreux, préalable à l'étape (i) de mesure du potentiel de surface. Dans cet autre mode de réalisation, ledit deuxième support non conducteur d'électricité est préférentiellement une membrane de nylon poreuse. Dans un mode de réalisation préféré du procédé, la mesure du potentiel de surface est automatisée et contrôlée par ordinateur. Avantageusement, la méthode de l'invention comporte en outre des étapes consistant à stocker, traiter les données cartographiques obtenues et à comparer par ordinateur ces données à des profils obtenus à partir d'autres échantillons de molécules biologiques. Selon une caractéristique avantageuse de la méthode, le support et la sonde sont implantés dans une enceinte à hygrométrie et atmosphère contrôlée. Préalablement à l'étape (i) de mesure du potentiel de surface en tout point de la surface du support, la méthode de l'invention comprend avantageusement une étape d'étalonnage de la mesure, ladite étape d'étalonnage comprenant les étapes suivantes : (a) déposer un marqueur, tel que l'or colloïdal, sur ledit support, ce par quoi seule la fraction où a été effectué un dépôt de la molécule fixe ledit marqueur, la fraction complémentaire du support se trouvant nue ; (b) placer le support vis-à-vis de la sonde de telle sorte que la surface en regard de la sonde n'ait subi aucun dépôt et mesurer un premier potentiel de surface correspondant à l'absence de molécule biologique, puis placer le support vis- à-vis de la sonde de telle sorte que la surface en regard de la sonde soit entièrement marquée, mesurer un second potentiel de surface correspondant à la quantité maximale de molécules biologiques. La présente invention a encore pour objet un dispositif pour la mise en oeuvre de la méthode de l'invention du type comportant : - un moyen d'adressage spatial de ladite au moins une molécule biologique sur ledit premier support, - un moyen mécanique permettant l'approche automatique de la sonde et son maintien à distance constante de la surface du premier support, - un bloc-support dudit premier support, hydratant et conducteur - une sonde Kelvin, des moyens d'asservissements électroniques de potentiel, de distance et d'approche automatique, - un moyen d'effet de zoom, un moyen de mesure de ladite grandeur se rapportant à une propriété électrique portée par la molécule biologique, - un moyen d'acquisition automatique et de traitement des mesures, et - un moyen de couplage à un système de prélèvement automatique. La présente invention a également pour objet un dispositif pour la mise en oeuvre de la méthode de détection et de quantification d'une molécule biologique décrite ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comporte : - un support (24) à la surface duquel sont immobilisées des molécules biologiques ; - une sonde (22) située à une distance z (26) de la surface du support (14) ; - un moteur (20) provoquant la variation sinusoïdale, de la valeur de la distance z à la fréquence f ; - un générateur de courant continu (16) pour appliquer une différence de potentiel V entre la sonde (21) et le support (14) ; - un générateur de courant sinusoïdal (24) pour appliquer une différence de potentiel V sinusoïdale de fréquence f, la fréquence f et la fréquence f étant choisies de valeurs suffisamment différentes pour pouvoir être aisément séparées par des détections synchrones. Avantageusement, ledit dispositif comprend aussi des moyens permettant le déplacement de la sonde (22) en regard de tout point de surface du support (24). Ainsi la présente invention a trait à la localisation et au dosage de molécules biologiques par mesure d'un effet électrique porté par ces molécules triées au moyen d'un processus adapté (greffage ou champ électrique par exemple) selon une ligne, une colonne ou un plan. En particulier, cette invention est en relation avec le champ émergent de la protéomique et du transcriptome qui met en jeu l'identification et la caractérisation des protéines présentes dans les échantillons biologiques. Elle trouve donc des applications dans les domaines de la caractérisation des protéines animales ou végétales, du diagnostic des maladies ou de leur prévention, du pronostic médical, de l'analyse de l'effet des thérapies, y compris des modifications génétiques. On va maintenant décrire de manière détaillée les objets, caractéristiques et avantages de la présente invention à l'aide d'exemples de réalisation et en référence aux dessins annexés dans lesquels La Figure 1 représente un schéma de principe de la méthode de mesure du potentiel de surface par condensateur vibrant. 10 appareil de mesure de l'intensité électrique 14 support à la surface duquel est mesuré un potentiel de surface, après éventuel transfert sur membrane de la ou des molécules préalablement séparées par exemple sur un gel. 16 Générateur de tension continue. 22 Sonde de mesure. 20 Moteur provoquant la variation sinusoïdale de la distance z entre la surface du support (14) et la sonde (22) à la pulsation. 24 Générateur de tension sinusoïdal à la pulsation co'. 26 distance inter-électrodes, de valeur z. La Figure 2 représente le schéma mécanique du dispositif. 28 Bâtis support de référence. 30 Cuve porte supports, réservoir de liquide 32 Enceinte à hygrométrie contrôlée 14 Support. 34 Isolant. 36 liaison mécanique. 38 Mousse plastique conductrice. 40 Moteur d'actionnement de la table X. 42 Moteur d'actionnement de la table Y. 20 Moteur provoquant la variation sinusoïdale de la distance z entre la surface du support (14) et la sonde (22). 44 système mécanique de translation sans frottement et moteur de translation à noyau plongeur 46 Moteur d'actionnement de la table Z. 48 Potence. 22 Sonde de mesure. 50 Table de déplacement selon l'axe des abscisses X. 52 Table de déplacement selon l'axe des ordonnées Y. 26 distance z entre la surface du support (14) et la sonde (22). 54 Table de déplacement vertical du bloc mobile portant la sonde (22). La Figure 3 représente le schéma synoptique du montage électronique 14 support. 40 Moteur d'actionnement de la table X. 42 Moteur d'actionnement de la table Y. 20 Moteur provoquant la variation sinusoïdale de la distance Z. 44 système mécanique de translation sans frottement et moteur de translation à noyau plongeur. 46 Moteur d'actionnement de la table Z. 22 Sonde de mesure. La Figure 4 représente des exemples de représentation graphique des résultats Fig. 4A : représentation en 3 dimensions d'un spot de protéines, les deux axes horizontaux représentant les coordonnées x et y des points de mesure, et l'axe vertical le potentiel de surface détecté par la méthode de Kelvin. Le spot de protéines apparaît en creux. Fig. 4B : même image qu'en 4A, projetée dans le plan horizontal représentant les coordonnées des points de mesure. Le code de couleurs utilisé représente la valeur du potentiel de surface. Le spot de protéines apparaît en sombre sur fond clair. Fig. 4C : coupe à travers le même spot de protéines représenté en 4-a et 4-b. L'amplitude de la variation de potentiel de surface (coordonnée verticale) permet de caractériser précisément la quantité de protéines présentes dans ce spot. Figure 5 : transfert sur membrane type nylon colorée à l'or colloïdal, scanné optiquement sans traitement d'image. Les auréoles sont dues à un mouillage résiduel par PBS. Figure 6 : gel d'acrylamide coloré au bleu de Coomassie, scanné optiquement sans traitement d'image. Figure 7 : image relevée par la technique du condensateur vibrant, représentant le potentiel de surface des protéines transférées sur support de type nylon, après coloration à l'or colloïdal. Figures 8A et 8C : représentation des valeurs du potentiel de surface lors du balayage des lignes 40 et 145, issues du gel de la figure 7, reproduit aussi à la figure 8B. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention concerne un procédé de détection d'un effet électrique quantitatif porté par des molécules d'origine biologique préalablement séparées sur une surface, ainsi que sur l'appareillage associé. Les effets électriques peuvent se manifester individuellement pour chaque molécule biologique, ou collectivement pour un ensemble de molécules biologiques identiques. Dans ce qui suit est détaillée la méthode selon l'invention dans le cas d'un gel d'électrophorèse pour séparer les molécules biologiques (a), et dans le cas où ledit gel a été transféré sur une membrane de nylon (Western-Blott) et coloré à l'or colloïdal (b). EXEMPLES Les exemples illustratifs qui suivent sont donnés en référence aux figures annexées 1 à 3 et dans la section suivante les résultats sont donnés en référence aux figures 4 à 8. a) Détection de propriétés ou effets électriques portés par les molécules biologiques a. 1) supports Les supports (14) sur lesquels des effets électriques peuvent être mis en évidence doivent présenter une dispersion des molécules biologiques sur une surface. La position de la (ou des) molécule (s) biologique (s) est représentative de sa (leur) nature. a. 2) maintien du support Le support (14) est maintenu face à la sonde (22) sur un bloc-support de façon à ce que la position des molécules biologiques déposées sur la surface soit repérable, suivant une ligne (coordonnée x), suivant une surface plane (coordonnée xy), ou complexe (coordonnées xyz). Le bloc-support doit supporter le support, maintenir son hydratation et transmettre les signaux nécessaires au fonctionnement du système de détection. a. 3) Environnement et milieu d'observation L'hygrométrie, la température, l'atmosphère et la lumière ambiante peuvent être des paramètres de l'expérience qu'il est nécessaire de contrôler (32) a. 4) Principe de la méthode La méthode s'applique à la détection et au dosage d'effets électriques portés par des molécules biologiques ou par des marqueurs qui leur ont été attachés. Les contrastes observés lors d'un balayage topographique de la surface par une sonde de mesure peuvent être dus à une modification locale de l'affinité électronique du matériau, à une modification locale de la concentration de charges électriques, ou à une modification locale de moments dipolaires. a. 5) Mesure d'un effet électrique Mesure du potentiel de surface L'appareillage de mesure du potentiel de surface est constitué à partir du principe du condensateur vibrant de Kelvin : la sonde de mesure (22) et la surface du support (14) de la molécule placé face à elle constituent un condensateur plan de capacité C. Si l'on applique extérieurement aux bornes de ce condensateur une différence de potentiel (-EO), le condensateur se charge sous la différence de potentiel Vcp-EO où si q est la charge de l'électron, qVcp représente la différence entre l'énergie nécessaire pour extraire un électron du support et l'énergie nécessaire pour extraire un électron de la surface de la sonde de mesure. Si l'on modifie la distance z (26) entre l'électrode de mesure et le support, en la faisant varier sinusoïdalement à la fréquence f =oe/2rI (20), la capacité C varie et le courant i qui traverse le condensateur est donné par la relation i = (Vcp-EO) dC/dt où dC/dt représente la variation de C par rapport au temps (Bonnet et al., 1976). Dans le montage expérimental de principe de la Figure 1, sont également illustrés l'appareil de mesure de l'intensité électrique (10) et le générateur de tension continue (16). Le principe de la mesure consiste à ajuster la valeur de EO pour que i = 0. Dans ces conditions, la mesure de EO fournit la valeur de Vcp. La méthode est une méthode de mesure de zéro. Elle ne perturbe pas le support, puisque dans les conditions de la mesure, ce dernier est traversé par un courant électrique nul, que le champ électrique inter-électrodes est lui aussi nul et que la mesure se fait sans contact entre la sonde et le support. Le montage électronique (Palau et al., 1988) réalise automatiquement la condition i = 0. a. 6) Choix de la taille et de la nature de la sonde La taille de la sonde est adaptée à l'aire couverte par les molécules dispersées. a. 7) Effet de zoom Un effet de zoom peut être obtenu en modifiant l'espacement entre les points de mesure, jusqu'à la résolution maximale permise par le diamètre de la sonde de mesure. Comme il est possible de gérer le positionnement du support par rapport à la sonde grâce au système de balayage, cet effet de zoom peut être amélioré par l'utilisation de plusieurs sondes de diamètres différents. Il est ainsi possible d'effectuer sur le support une cartographie grossière de repérage et de la faire suivre d'une cartographie plus fine d'une ou plusieurs régions sélectionnées. a. 8) Réalisation de la sonde L'élément vibrant (20) de la sonde de mesure (22) peut faire appel à différentes technologies. Les techniques de microélectronique pourront être appliquées pour réaliser la sonde lorsque la taille de celle-ci est réduite. a. 9) Distance sonde-support La distance sonde-support z est maintenue constante par l'intermédiaire d'un asservissement. a. 10) Cartographie La cartographie des mesures de l'effet électrique porté par la (ou les) molécule (s) biologique (s) est réalisée par acquisition de la valeur du potentiel électrique lorsque la distance sonde-support est maintenue à sa valeur de consigne. a. 11) Déplacement Le déplacement relatif de la sonde vis à vis du support peut être effectué à l'aide d'une table à mouvements croisés (50,52, 54). a. 12) Pilotage Le pilotage de la table à mouvements croisés, est effectué à l'aide d'un ordinateur équipé de cartes adaptées. Le logiciel permet de choisir les coordonnées du point de départ d'une ligne, la longueur d'une ligne, le nombre de points de mesure par ligne, le nombre de lignes et l'espacement entre les lignes. Il permet aussi de choisir la vitesse de déplacement mécanique entre deux points ainsi que le temps attribué à la mesure en chaque point. Les lignes peuvent être balayées de façon alternée ou toujours dans le même sens. Dans cette dernière option, le balayage de retour de ligne doit être rapide pour ne pas augmenter de façon excessive le temps d'acquisition d'une image. a. 13) Acquisition En chaque point de mesure, les données analogiques fournies par la sonde sont numérisées puis traitées. a. 14) Affichage et visualisation des résultats Lors du relevé d'une ligne, l'importance de l'effet électrique est visualisée en chaque point de mesure, sous forme d'une courbe dont l'axe des abscisses représente la position du point de mesure, et l'ordonnée représente la grandeur mesurée. A la fin du relevé cartographique, l'affichage des résultats se présente sous la forme d'une image en trois dimensions et en tons de gris ou en fausses couleurs, représentant la grandeur physique mesurée en chaque point de la surface. Un exemple de la visualisation des résultats est donné aux Figures 4. Cette visualisation permet une comparaison directe avec le résultat d'une coloration classique, si nécessaire. a. 15) Traitement Le système est équipé d'un traitement informatisé des images qui permet le choix de la palette de couleurs de l'image, le choix d'un seuil de saturation des couleurs, le choix d'un contraste de couleurs, ainsi que le traitement des données brutes (interpolations ou traitements statistiques...). Les résultats sont affichés à l'écran. Cet équipement est bien sur évolutif. a. 16) Sauvegarde des mesures Les fichiers de mesures numérisées sont stockés selon les divers formats usuels. a. 17) Prélèvements Le support étant mobile, il est possible de gérer son positionnement par rapport à la position de la sonde ou par rapport à n'importe quel autre point fixe. Après le relevé cartographique et son interprétation, il est ainsi possible par exemple de positionner n'importe quel point sélectionné en face d'un système de prélèvement. Les molécules prélevées seront caractérisées par des analyses complémentaires. b) Utilisation d'un condensateur vibrant sur un gel d'électrophorèse transféré b. 1) Exemple de support dans le cas de la séparation de molécules de protéines Afin d'appliquer la méthode de la présente invention, un échantillon biologique est soumis à une préparation dans laquelle les protéines sont séparées selon deux axes correspondant à deux de leurs propriétés physicochimiques. C'est par exemple le cas rencontré dans le processus d'électrophorèse 2D effectué sur des gels d'acrylamide. Les protéines peuvent alors être en partie transférées à la surface d'un support isolant poreux et leur présence révélée au moyen du marqueur constitué par de l'or colloïdal. Finalement des atomes d'or se trouvent déposés en certains points de la surface du support, localisés en des lieux dont les coordonnées relatives sont caractéristiques des molécules biologiques présentes. .2) le bloc-support Le bloc-support doit maintenir mécaniquement le support et permettre son hydratation. Il doit aussi transmettre les signaux nécessaires au fonctionnement électrique du montage. Il est donc conducteur et isolé de la masse. Il est réalisé en forme de bac (30) et constitue une réserve en liquide d'hydratation. Au fond du bac est déposée une mousse plastique conductrice (38) sur laquelle repose le support ainsi polarisé et hydraté par capillarité. A la Figure 2, sont représentés le bâtis support de référence (28), un isolant (34), une liaison mécanique (36), des moteurs d'actionnement de la table X, Y, Z respectivement (40,42, 46) et une potence (48). b. 3) Environnement Afin de limiter les pertes par évaporation, par la surface du support, le support et la sonde sont implantés dans une enceinte à hygrométrie et atmosphère contrôlées (32). b. 4) Principe de la méthode L'énergie électrique nécessaire pour collecter un électron depuis la surface d'un matériau dépend de la nature chimique de ce matériau. Elle est donc différente suivant qu'on la mesure à la surface du support nu ou à la surface du support couvert d'un marqueur, tel que l'or. La différence d'énergie électrique se traduit par une différence de potentiel électrique qui peut être mesurée sans contact à l'aide d'une sonde ayant une aire. Dans le cas où la surface du support située en face de l'électrode de mesure n'est que partiellement recouverte d'or, le potentiel mesuré prend une valeur intermédiaire entre celui mesuré sur le support nu et celui relevé sur une couche d'or complète, au prorata des aires concernées (Bonnet et al., 1984). La valeur mesurée évolue proportionnellement au taux de couverture. La sonde effectue ainsi une mesure quantitative. b. 5) Mesure du potentiel de surface Ces mesures sont détaillées au paragraphe a. 5 ci-dessus. b. 6) Choix de la sonde La mesure du potentiel de la surface est effectuée relativement au potentiel de surface de la sonde de mesure. Différents matériaux peuvent être choisis. Pour guider ce choix, on est particulièrement attentif à la stabilité électrique du matériau. b. 7) Réalisation de la sonde vibrante La vibration est générée par un moteur de type haut-parleur électromagnétique, ou par un élément piézo-électrique (poutre vibrante encastrée ou pastille). b. 8) Distance sonde-support La précision de la mesure et la réduction de l'effet des parasites électriques imposent que le courant i détecté en l'absence d'asservissement soit le plus grand possible. Pour cela, la distance inter-électrodes z (26) doit être la plus petite possible. Typiquement, elle est de l'ordre de quelques centaines de micromètres. Afin que cette distance soit maintenue constante lors du déplacement de support dont la surface est à analyser en face de la sonde, l'appareillage est équipé d'un asservissement de la distance z inter-électrodes (Bonnet et al., 1977). Pour effectuer cet asservissement, l'électrode de mesure du potentiel de surface est également utilisée comme capteur de distance. On alimente le condensateur de capacité C par une tension V'sinusoïdale de fréquence f=co'/2IT (24) différente de la fréquence de vibration f, et on mesure à cette fréquence un courant i = CdV'/dt, d'amplitude proportionnelle à la capacité C et donc inversement proportionnelle à la distance z. Les valeurs des fréquences f et f sont choisies suffisamment différentes pour pouvoir être aisément séparées par des détections synchrones. Mécaniquement, afin de maintenir la distance inter-électrodes constante, la sonde de mesure vibrante qui est guidée par un système de translation sans frottement (44) voit sa distance régulée sans à-coup de façon fine grâce à l'utilisation d'un solénoïde et d'un noyau plongeur suspendu. Ce système permet d'obtenir une translation de 2 mm. Des amplitudes de déplacement plus importantes peuvent être obtenues à l'aide d'un moteur rotatif actionnant le plateau d'un micromanipulateur. Ce système est actionné automatiquement par l'électronique de commande lorsque le système de rattrapage fin est hors de ses limites de fonctionnement. Le cas peut se produire lorsque la surface du support n'est pas parallèle à celle du plan de référence et lorsque la surface du support n'est pas plane. Il est ainsi possible de travailler sur des supports de grandes dimensions non parfaitement plans. Un autre effet de l'asservissement de la distance est de permettre une mesure en milieu bruyant. b. 9) Démarrage d'une cartographie L'asservissement de la distance inter-électrodes, utilisant les deux systèmes complémentaires de commande mécanique est également utilisé pour réaliser l'approche automatique de la sonde dans la phase de démarrage d'un relevé cartographique. b. 10) Déplacement du support Afin d'effectuer une cartographie des variations du potentiel électrique du support, il est nécessaire d'effectuer des mesures sur tous les points de coordonnées X et Y de sa surface. Notre système effectue donc un déplacement relatif de la sonde (22) par rapport au support (14). Par exemple, la sonde est maintenue fixe, et la surface du support est déplacée face à la sonde grâce à une table XY à mouvements croisés (50,52) dont le pilotage est géré par un ordinateur. Il est ainsi possible de déterminer les coordonnées du point de départ et le nombre de points de mesure. En chaque point de coordonnées X et Y déterminées, l'ordinateur gère l'acquisition de la mesure du potentiel de la surface en regard de la sonde. b. 11) Pilotage par ordinateur Afin d'éviter le contact accidentel entre le support et l'électrode de mesure lors de ce déplacement, l'ordinateur gère l'éloignement de la sonde avant le retour puis son repositionnement dans les conditions de mesure idéales lorsque le retour a été effectué. En cas de contact accidentel entre la sonde de mesure et le support, le balayage est stoppé, la sonde est éloignée pour supprimer le ménisque liquide qui se forme entre elle et le support, puis elle est à nouveau approchée en position de mesure avant que le balayage ne reprenne. b. 12) Acquisition des mesures Avant le stockage des mesures, on effectue un traitement numérique de ces données. La donnée stockée représente en fait la moyenne de plusieurs mesures effectuées sur le même point, après suppressions de données aberrantes. L'expérimentateur peut choisir le nombre de données entrant dans ce traitement. b. 13) Affichage L'écran est découpé en multi-fenêtres avec menus déroulant. Une fenêtre montre les variations de potentiel relevées en cours de balayage d'une ligne, en fonction de l'abscisse du point de mesure. Cette ligne peut être comparée à celle relevée lors du balayage précédent, qui a été mémorisée et affichée dans une autre fenêtre. En fin de relevé, une fenêtre affiche, en tons de gris, une vue plane des variations de potentiel en surface en fonction des coordonnées X et Y du point. b. 14) Traitement des mesures Une interpolation quadratique classique est utilisée afin de limiter l'effet de relevés aberrants.. b. 15) Sauvegarde et cartographie Les fichiers sont sauvegardés selon un format ASCII. Les images font ensuite l'objet des traitements usuels au moyen des logiciels classiques de traitement de matrices de points. Conformément à la présente invention on utilise des appareils de mesure-sans contact-du potentiel électrique de surface pour cartographier la distribution et la quantité de molécules d'origine biologique séparées par un processus adapté. On réalise tout d'abord une dispersion (ou réseau) uni-ou bidimensionnelle en surface d'un support. La méthode selon l'invention fournit une cartographie digitale représentative de l'identité et de l'abondance des biomolécules détectées à la surface du réseau uni-ou bi-dimensionnel. Cette cartographie permet l'analyse qualitative et quantitative, le stockage des données et leur traitement, y compris la comparaison par ordinateur des profils fournis par d'autres échantillons biologiques. Les mesures sans contact du potentiel électrique de surface peuvent être automatisées et contrôlées par ordinateur. Elles constituent une alternative intéressante aux méthodes classiques de détection optiques ou nucléaires. Elles présentent une complémentarité à ces méthodes en mettant en évidence d'autres propriétés physiques, et en permettant l'utilisation d'autres conditions de mesure qui pourraient être mieux adaptées aux molécules à détecter. Elles permettent d'effectuer des mesures quantitatives avec une grande sensibilité. Les techniques fonctionnent à la température ambiante, et/ou en atmosphère contrôlée. La sonde de mesure peut être couplée à un bras robotisé de prélèvement. Pour les supports de grandes dimensions, la mesure peut être effectuée grâce à un condensateur vibrant de Kelvin adapté. Selon les signaux électriques détectés, l'invention peut permettre de travailler sur différents supports, avec différents révélateurs ou marqueurs, voire sur des gels non révélés. RESULTATS Les résultats qui suivent sont donnés en référence aux figures 4 à 8. Des essais sont effectués à l'aide du condensateur vibrant (=Kelvin) sur des supports de type nylon, après coloration à l'or colloïdal. On a mis en évidence des variations de potentiels de surface qui correspondent à des dépôts de protéines colorées à l'or colloïdal. L'échelle latérale en tons de gris traduit la valeur du potentiel mesuré en chaque point. Le passage par une valeur minimum du potentiel correspond aux tons les plus foncés. Les courbes représentées aux Figures 8A et 8C représentent les valeurs du potentiel relevées lors du balayage des lignes 40 et 145 du gel d'électrophorèse de la Figure 8B, respectivement. Comme le montrent les traits de rappel, les niveaux bas atteints, qui sont différents sur les minima A et B, font apparaître l'aspect quantitatif de la caractérisation. Les données concernant les variations du potentiel de surface peuvent sans difficulté être traitées numériquement pour augmenter les contrastes et/ou faire apparaître des informations complémentaires jusque là noyées dans un fond continu, par exemple la région C de la Figure 8A. Cette technique peut être étendue à différents supports et différentes colorations, voire à des transferts non colorés. Elle pourrait être adaptée à des mesures sur gels d'acrylamide, ce qui éviterait les transferts et permettrait le prélèvement par emporte-pièce automatisé des spots détectés. Comparée aux techniques de coloration antérieures, l'approche conforme à l'invention rend plus finement compte du phénomène, puisque l'on peut distinguer des sous-structures. L'analyse des sous-structures peut renseigner utilement sur le présence de plusieurs protéines sous un spot et donc amener à une plus grande qualité de discrimination entre deux protéines extrêmement voisines, REFERENCES Bonnet J., Palau J. M., Soonckindt L., Lassabatere L.,"Sur l'intérêt d'un amplificateur de courant associé au condensateur vibrant de la méthode de Kelvin", Apparatus and techniques 213-213 (1976) Bonnet J., Soonckindt et Lassabatère L.,"Dispositif asservi pour l'étude topographique du travail de sortie par la méthode du condensateur vibrant de Kelvin, Measurement and Control, MECO 77, Eds. M. H. Hamza, Acta Press (1977). Bonnet J., Soonckindt L., Lassabatere L.,"The Kelvin probe method for work function topographies : technical problems and solutions", Vacuum 34,7 693- 698 (1984) Davies J. T. et Rideal E. K.,"Interfacial Phenomena"page 64,1963 Academic Press. Heitz F., Van Mau N., Bennes R., Daumas P. et Truelle Y.,"Single channels and surface potential of linear gramicidins", Biochimie 71 (1) 83-8 (1989) Isemura T. et Ikeda S.,"The role of prolyl residue in polypeptide monolayers. 1. On the chain configuration deduced from surface pressure and potential measurements", Surface Chemistry of Synthetic Protein Analogs Vill, 32 (2) 178-184 (1959) Palau J. M., Bonnet J.,"Réalisation d'une sonde de Kelvin performante pour l'étude topographique du travail de sortie", J. Phys. E : Sei. Instrum. 21 674- 679 (1988) Wackerbauer G., Weis 1. et Schwarz G.,"Preferential partitioning of melittin into air/water interface : structural and thermodynamic implications", Biophys. J. 71 (3) 1422-7 (1996). REVENDICATIONS 1. Méthode de détection et de quantification d'au moins une molécule biologique éventuellement marquée dans un échantillon comportant une étape de dispersion spatiale, du type électrophorèse, de ladite au moins une molécule sur un support, caractérisée en ce qu'elle comporte (i) une étape de mesure du potentiel de surface dudit support, en chaque point de surface dudit support, à l'aide d'au moins une sonde. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le support est du type gel d'acrylamide. 3. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, où la molécule biologique ou l'ion complexe de même squelette carboné est marqué. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, où la molécule ou l'ion complexe de même squelette carboné n'est pas marqué. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant une étape additionnelle de transfert de la molécule biologique sur un deuxième support, conducteur d'électricité, avant l'étape (i) de mesure du potentiel de surface. 6. Méthode selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit deuxième support est une membrane mouillable à l'eau telle qu'une membrane de cellulose ou de nitrocellulose imprégnée d'une solution d'électrolytes ou une membrane de graphite. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape additionnelle de transfert de la molécule biologique sur un deuxième support non conducteur d'électricité, poreux, préalable à l'étape (i) de mesure du potentiel de surface. 8. Méthode selon la revendication 9, caractérisée caractérisée en ce que ledit deuxième support est une membrane de nylon. 9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la sonde est une sonde Kelvin ou un condensateur vibrant. 10. Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que la vibration de la sonde est produite par un moteur de type haut-parleur électromagnétique ou par un élément piézo-électrique, tel que poutre vibrante encastrée ou pastille. 11. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la mesure du potentiel de surface est automatisée et contrôlée par ordinateur. 12. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre des étapes consistant à stocker, traiter les données cartographiques obtenues et à comparer par ordinateur ces données à des profils obtenus à partir d'autres échantillons de molécules biologiques. 13. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le support et la sonde sont implantés dans une enceinte à hygrométrie et atmosphère contrôlée. 14. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'elle comprend, préalablement à l'étape (i) de mesure du potentiel de surface, une étape additionnelle d'étalonnage de la mesure, ladite étape d'étalonnage comprenant les étapes suivantes : (a) déposer un marqueur, tel que l'or colloïdal, sur ledit premier support, ce par quoi seule la fraction où a été effectué un dépôt de la molécule fixe ledit marqueur, la fraction complémentaire du support se trouvant nue ; (b) placer le support vis-à-vis de la sonde de telle sorte que la surface en regard de la sonde n'ait subi aucun dépôt et mesurer un premier potentiel de surface puis placer le support vis-à-vis de la sonde de telle sorte que la surface en regard de la sonde soit entièrement marquée et mesurer un second potentiel de surface ; 15. Dispositif pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il comporte : - un support (14) à la surface duquel sont immobilisées des molécules biologiques ; - une sonde (22) située à une distance z (26) de la surface du support (14) ; - un moteur (20) provoquant la variation sinusoïdale, de fréquence f de la valeur de la distance z ; - un générateur de courant continu (16) pour appliquer une différence de potentiel (16) de la sonde (21) et le support (14) ; - un générateur de courant sinusoïdal (24) pour appliquer une différence de potentiel V/sinusoïdale de fréquence f, la fréquence f et la fréquence f étant choisies de valeurs suffisamment différentes pour pouvoir être aisément séparées par des détections synchrones. 16. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens permettant le déplacement de la sonde (22) en regard de tout point de surface du support (14).