Brevet FR2825700A1 — publié le 20021213

La présente invention concerne une procédé d'immobilisation de molécules et plus particulièrement de macromolécules biologiques telles que protéines, anticorps et polynucléotides, ainsi qu'un dispositif utilisant un tel procédé et son application à la détection et la séparation de diverses macromolécules. Dans le domaine des techniques analytiques, l'immobilisation de macromolécules biologiques, ou de fragments de macromolécules, ayant des propriétés enzymatiques ou de reconnaissance moléculaire vis-à-vis d'autres espèces telles qu'antigènes, anticorps, acides nucléiques, polysaccharides, etc, se fait généralement sur des supports solides organiques ou minéraux, par liaisons covalentes, ou non covalentes stables, par exemple du type avidine-biotine. Cependant, ce dernier procédé nécessite des réactifs coûteux et, de plus, la dissociation de la liaison est effectuée dans des conditions difficiles qui limitent la durée de vie du capteur utilisé. De nombreux matériaux à base de cyclodextrine immobilisée sur des supports poreux, tels que des silices, ont été décrits dans la littérature pour la fixation et la séparation de diverses substances, notamment par des techniques chromatographiques. D'une manière générale, les techniques consistent à opérer en deux étapes, en faisant réagir tout d'abord les groupes SiOH de la silice avec des silanes réactifs de formule A-R'-Si- (OR) 3 où R est un groupe alkyle, R'est un groupe de liaison, par exemple une chaîne hydrocarbonée, et A est un groupe réactif, et à fixer la cyclodextrine dans une deuxième étape par l'intermédiaire du groupe réactif A. Ainsi, le brevet US-A-4.539. 399 décrit un matériau obtenu en faisant réagir un gel de silice avec un silane comportant 1 un groupe terminal réactif tel qu'un groupe époxy, puis avec une cyclodextrine. Un tel matériau peut être utilisé en chromatographie pour la séparation de certains isomères. Le brevet EP-A-445.604 décrit un matériau utilisable en chromatographie, constitué par un support à base de silice comportant des groupes amino libres servant à la fixation de cyclodextrine par liaison covalente du type acide carbamique. Ces divers matériaux sont obtenus par des procédés impliquant des conditions de greffage de la silice très contraignantes, notamment des réactifs purifiés, une déshydratation très poussée de la silice, une température de greffage élevée pendant une période de temps relativement longue ; la reproductibilité des procédés est difficile à contrôler en raison de la formation de silanes polymérisés. De plus, la stabilité du greffage est très variable en fonction de la nature du groupement réactif utilisé. D'autre part, les silanes utilisés sont des composés de prix élevé, dont la purification et la conservation sont difficiles. Des polymères à base de cyclodextrine et d'épichlorhydrine, obtenus par addition d'un sel d'époxy-ammonium à un polycondensat cyclodextrine-épichlorhydrine, sont décrits dans le brevet FR-A-2.671. 087. Ces polymères sont immobilisés sur un support de silice par adsorption résultant de liaisons non covalentes, et sont utilisables en chromatographie, pour la séparation d'isomères. Cette technique évite les inconvénients décrits ci-dessus, mais le contrôle de la réaction doit être très rigoureux en raison du risque de formation de gels insolubles, et, de plus, il est généralement nécessaire de prévoir une étape supplémentaire de réticulation du polymère pour améliorer la stabilité. La présente invention a pour objet un procédé d'immobilisation réversible de macromolécules biologiques au moyen de polymères peu coûteux, et assurant une réversibilité aisée dans des conditions douces. La présente invention a plus particulièrement pour objet un procédé d'immobilisation de molécules, notamment de macromolécules biologiques, par formation d'inclusion entre des polymères de cyclodextrine et des polymères hydrophiles possédant des groupes hydrophobes. L'invention a également pour objet un dispositif adapté à la mise en oeuvre d'un tel procédé, comprenant un substrat sur lequel est fixé un polymère de cyclodextrine, associé à un réactif constitué par un polymère hydrophile comportant des groupes hydrophobes, susceptible de se lier à la molécule ou macromolécule biologique. Le procédé conforme à la présente invention comprend essentiellement les étapes consistant à : - fixer une cyclodextrine ou un polymère de cyclodextrine sur un substrat ; - établir une liaison covalente entre un polymère hydrophile possédant des groupes hydrophobes et la molécule ou macromolécule biologique à immobiliser ; - mettre en contact la molécule ou macromolécule biologique ainsi modifiée avec le substrat portant la cyclodextrine ou le polymère de cyclodextrine. Une fois la molécule ou macromolécule biologique modifiée fixée sur le substrat par l'intermédiaire de la cyclodextrine ou du polymère de cyclodextrine, on peut, si nécessaire, la dissocier et régénérer le substrat afin de l'utiliser ensuite pour une nouvelle immobilisation. Le substrat utilisé dans la présente invention peut être un support minéral tel qu'un oxyde de métal présentant une porosité et une granulométrie appropriées, et possédant à sa surface des groupes-MOH, où M est un atome de métal, tel que l'aluminium, le silicium, le titane ou le zirconium, qui confèrent au matériau une polarité élevée. On peut utiliser en particulier une silice, un oxyde de titane, une zircone ou une alumine d'un type disponible dans le de silice iichrospher (b, ou le commerce, par exemple un gel de silice Lichrospher@, ou Spherisorb@ dont la granulométrie peut être choisie en fonction de l'application envisagée, et peut être comprise par exemple entre 5 et 100 um, ces valeurs n'étant pas limitatives. Suivant l'invention, on peut aussi utiliser un. support métallique tel qu'une lame métallique, et par exemple une lame d'or. D'une manière générale, le substrat peut avoir une forme quelconque, et par exemple il peut être constitué par une surface plane telle que plaque ou lame, ou par des billes, un support poreux, des fibres, etc. La cyclodextrine peut être choisie parmi celles bien connues dans la technique pour leur capacité à former des complexes d'inclusion. On peut utiliser par exemple une a-, une P-ou une y-cyclodextrine qui sont des oligosaccharides cycliques comprenant 6,7 ou 8 unités glucopyrannose, respectivement, ou encore des dérivés de cyclodextrines tels que des dérivés aminés, sulfatés ou hydroxypropylés. Suivant la présente invention, on utilise de préférence une P-cyclo- dextrine, ou une ss-cyclodextrine aminée, ou encore une polycyclodextrine. La fixation de la cyclodextrine ou du polymère de cyclodextrine sur le substrat s'effectue de préférence par l'intermédiaire d'un composé approprié, par exemple un composé à chaîne carbonée comprenant de 2 à 20 atomes de carbone possédant une fonction de fixation au substrat à une extrémité et une fonction réactive à l'autre. Cette fonction réactive (groupe carboxyle ou amino, par exemple) facilite l'accrochage de la cyclodextrine tandis que la fonction de fixation au substrat peut être obtenue par un groupement thiol, par exemple dans le cas d'un support métallique tel qu'une lame d'or. Le cas échéant, suivant une variante du procédé de l'invention, on fait réagir un composé réactif sur les fonctions réactives carboxyle ou amino indiquées ci-dessus, et par exemple un N-hydroxysuccinimide qui réagit avec les fonctions carboxyle, de préférence en présence d'un activateur de condensation, et facilite ensuite la fixation de la cyclodextrine. Le polymère hydrophile à groupes hydrophobes permet la formation d'inclusions avec la cyclodextrine, et possède de préférence une faible teneur en groupes hydrophobes. Les groupes hydrophobes peuvent être choisis par exemple parmi les groupes adamantyle et naphtyle. Le polymère hydrophile utilisé dans la présente invention est de préférence un polyéthylène glycol. Comme indiqué ci-dessus, la molécule ou macromolécule biologique ainsi immobilisée de manière stable, peut être libérée dans des conditions douces, par simple utilisation d'un détergent, par exemple au moyen d'une solution de dodécylsulfate de sodium Le procédé conforme à la présente invention présente plusieurs avantages qui permettent de le mettre en oeuvre dans diverses applications de techniques analytiques. En particulier, il permet de réaliser une association stable des deux polymères, et par conséquent de la macromolécule biologique sur le substrat, et cette association est réversible dans des conditions douces, facilitant ainsi la régénération du substrat. De plus, le substrat peut être un support de forme quelconque, adaptée à des applications spécifiques, et les deux polymères mis en oeuvre sont facilement accessibles et peu coûteux. Ces avantages permettent d'envisager l'utilisation du procédé de l'invention dans les mêmes applications que le système classique avidinebiotine, avec un moindre coût. Le procédé de l'invention est particulièrement utile pour l'immobilisation de diverses macromolécules biologiques, par exemple pour l'identification et la mesure de macromolécules biologiques telles que protéines, antigènes, anticorps, acides nucléiques, polysaccharides. Ainsi le procédé de l'invention peut être mise en oeuvre dans les domaines des techniques de fixation, séparation, détection de molécules, et plus particulièrement dans les colonnes de fixation de molécules biologiques ainsi que pour la réalisation de biocapteurs analytiques obtenus par immobilisation d'anticorps ou de fragment d'acide nucléique, de bioréacteurs obtenus par immobilisation d'enzymes, de détecteurs de polynucléotides, notamment les puces à ADN, et d'appareils d'immuno-chromatographie. Le procédé de l'invention est tout particulièrement avantageux dans les techniques nécessitant une régénération des capteurs. Les exemples suivants illustrent l'invention plus en détail sans en limiter la portée. Exemple 1 Immobilisation de la cyclodextrine sur le substrat Une couche d'or déposée sur une lame de verre est recouverte d'une solution d'acide 11-mercaptoundécanoïque (MUA) en solution dans l'éthanol. Après contact pendant 16 heures, la lame est rincée à l'éthanol puis à l'eau. Les fonctions acides sont activée dans un milieu aqueux par l'hydroxysuccinimide en présence d'un carbodiimide activateur de condensation pendant 10 minutes (EDC 1- (3-diméthylaminopro- pyl)-3-éthylcarbodiimide). Une solution aqueuse de poly-p-cyclodextrine aminée est mise au contact de la lame de verre ainsi activée pendant 15 minutes, puis la lame est traitée par une solution d'éthanolamine pendant 10 minutes pour désactiver les fonctions réactives résiduelles. Enfin, la lame est rincée à l'eau. Préparation d'un réactif On prépare un réactif à base de polyéthylène glycol (PEG) portant une fonction réactive à une extrémité et un groupe adamantyle à l'autre. A cet effet, un PEG (Mn = 4600g. mol-1) est traité par 1 équivalent de chlorure d'adamantoyle (Ad-COCl) dans le dichloroéthane en présence d'un catalyseur (DMAP) et d'un capteur de proton (pyridine). La réaction s'effectue pendant 3 heures à la température de 70oC, puis le produit obtenu est précipité et recristallisé dans l'éthanol. Le produit obtenu est traité dans l'acétonitrile par du nitrophénylchloroformiate (NP-OCOCl) en, présence de triéthylamine. Après précipitation par l'éther, le produit est recristallisé dans l'éthanol. On obtient ainsi le produit de formule : Ad- (CO)-0-CH2CH2- (0-CH2CH2) n-0- (CO)-NP dans laquelle n est un entier compris entre 0 et 50 environ. Fixation d'une protéine Le réactif préparé comme indiqué ci-dessus est ajouté à une solution d'IgG (lapin) en milieu tampon phosphate à pH 8. Après 3 heures de contact, le mélange est dialysé à l'aide d'une membrane de seuil de coupure 50.000. Après 48 heures de dialyse, le produit est lyophylisé, et la protéine ainsi modifiée est placé dans une solution tamponnée (PBS pH 7,4) à la concentration de 0,05 g/l. Lorsque l'on place la lame d'or revêtue de cyclodextrine comme indiqué ci-dessus au contact de cette solution, on constate une fixation de l'IgG, observée par un appareil à résonance de plasmons de surface (SPR). La fixation se maintient même après rinçage par la solution de PBS, ce qui confirme sa stabilité. L'introduction dans le système d'une solution d'anti-IgG se traduit par une fixation de cet anticorps mise en évidence par le signal de SPR. Exemple 2 Régénération de la plaque La régénération de la plaque peut s'effectuer en deux étapes ou en une seule étape comme indiqué ci-après. Suivant une première méthode, on peut procéder en deux temps. Dans une première étape on dissocie le complexe IgGanti-IgG au moyen d'une solution acide (soit HCl 0,1 N, soit une solution de tampon glycine 0,2 M à pH acide). Dans une deuxième étape, on enlève l'IgG initialement fixée sur la couche d'or portant la cyclodextrine en intro- duisant une solution de dodécylsulfate de sodium à 1 %, ce qui a pour effet de ramener la lame dans son état initial (MUA + polycyclodextrine). Suivant une deuxième méthode la régénération de la plaque s'effectue en une seule étape, par introduction d'une solution acide (tampon glycine) contenant 1 % de SDS qui enlève les complexe IgG-anti-IgG de la surface d'or. Dans les deux méthodes, la lame régénérée peut être à nouveau utilisée pour la fixation de la protéine (IgG) portant des groupements hydrophobes dans les mêmes conditions que celles décrites plus haut. REVENDICATIONS 1. Procédé d'immobilisation réversible de molécules ou macromolécules biologiques caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à : - fixer une cyclodextrine ou un polymère de cyclodextrine sur un substrat ; - établir une liaison covalente entre un polymère hydrophile possédant des groupes hydrophobes et la molécule ou macromolécule biologique à immobiliser ; - mettre en contact la molécule ou macromolécule biologique ainsi modifiée avec le substrat portant la cyclodextrine ou le polymère de cyclodextrine. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la cyclodextrine est choisie parmi les a-, ss- ou y-cyclodextrines, et des dérivés aminés, sulfatés ou hydroxypropylés de cyclodextrines. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère hydrophile à groupe hydrophobes est un polyéthylène glycol. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le polyéthylène glycol comprend des groupes hydrophobes choisis parmi les groupes adamantyle et naphtyle. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat est une silice, un oxyde de titane, une zircone, une alumine, ou un métal. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la cyclodextrine est fixée sur le substrat par l'intermédiaire d'un composé à chaîne carbonée comprenant de 2 à 20 atomes de carbone possédant une fonction thiol de fixation au substrat à une extrémité et une fonction réactive carboxyle ou amino à l'autre. 7. Dispositif pour l'immobilisation réversible de molécules ou macromolécules biologiques suivant le procédé de la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un substrat sur lequel est fixé un polymère de cyclodextrine, associé à un réactif constitué par un polymère hydrophile comportant des groupes hydrophobes, susceptible de se lier à la molécule ou macromolécule biologique. 8. Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que le substrat est une lame métallique, notamment d'or.