Brevet FR2826007A1 — publié le 20021220

COMPOSES TETRAHYDROFURANES SUBSTITUES PRESENTANT DES PROPRIETES ANTIMICROBIENNES, LEURS PROCEDES DE PREPARATION ET LES COMPOSITIONS LES CONTENANT. La présente invention a pour objet des composés tétrahydrofuranes substitués par des groupements cationiques et ayant des propriétés antimicrobiennes. L'invention concerne également leurs procédés de préparation et les compositions antimicrobiennes les contenant utilisables en thérapie humaine et animale ainsi qu'en agriculture. On a décrit, dans l'art antérieur, différentes substances notamment peptidiques présentant des propriétés antimicrobiennes, plus particulièrement bactéricides ou fongicides. En santé humaine, on peut rappeler que l'incidence des infections microbiennes opportunistes est en constante progression depuis ces dernières années. Selon l'Organisation Mondiale de la Santé plus de 95% des souches bactériennes Staphylococcus aureus sont résistantes à la pénicilline et plus de 60% sont également devenues résistantes à son dérivé, la méthicilline (The new antibiotics, Holger Breithaupt, Nature Biotechnologie, Vol 17 December 1999). Les microorganismes opportunistes ont pour cibles premières les sujets immunodéprimés, chez lesquels ils peuvent conduire au développement de pathogènes, le plus souvent résistants. L'immunosuppression peut être le résultat d'une variété de causes telles par exemple la corticothérapie, la chimiothérapie, la transplantation, l'infection par le VIH. Il existe donc un réel besoin de caractériser de nouvelles classes de composés antimicrobiens pour suppléer au phénomène de résistance que les microorganismes développent envers les antimicrobiens classiques. Des peptides dotés de propriétés antimicrobiennes sont produits par une grande variété d'espèces tant animales que végétales, chez lesquelles ils participent à des mécanismes non spécifiques de défense contre les infections (Host defence cationic peptides : what is their future clinical potential ?, Hancock, Drugs 1999,57 : 469-473). Ces peptides peuvent être subdivisés en 4 groupes en fonction de leur séquence en acides aminés et de leur structure secondaire : - les peptides comprenant 2 hélices a amphipatiques (cécropines et mélittines d'insectes, cécropines et cathélicidines de mammifères et magainines de la peau de batraciens ; Amphipatic a-helical Antimicrobial Peptides, Tossi A., Sandri L., Giangaspero A., Biopolymers (Peptide Science), Vol. 55,4-30, 2000) - les peptides comprenant des ponts disulfures intramoléculaires (défensines d'insectes ou de mammifères, brévinines de la peau de batraciens, protégrines de mammifères, thanatine d'insectes WO 99/24594, tachyplésines de crustacés et androctonines de scorpions WO 97/300082 ; Cystéines-rich antimicrobial peptides in invertebrates, JL. Dimarcq, P. Bulet, C. Hetru, J. Hoffmann, Biopolymers (Peptide Science), Vol. 47,465-477, 1998), - les peptides riches en proline (apidaecines, abaecines, drosocine et pyrrhocoricine produits par les insectes, bacténécines de mammifères), et les peptides ou polypeptides riches en glycines (attacines, sarcotoxines, diptéricines d'insectes). Ces dernières années, l'industrie pharmaceutique s'est fortement intéressé au développement d'analogues de substances connues, comme par exemple le peptide cationique pexiganan dérivé de la magainine extraite de la peau de batraciens mais qui ne présente pas d'activité accrue par rapport aux antibiotiques conventionnels (The new antibiotics, Holger Breithaupt, Nature Biotechnologie, Vol 17 December 1999). Il est également connu de l'homme de l'art que les peptides présentent, de par leur nature, des propriétés physicochimiques non favorables aux applications pharmaceutiques, notamment en matière de biodisponibilité. Les peptides sont en effet facilement et rapidement dégradés par des enzymes protéolytiques, comme par exemple la chymotrypsine et la trypsine (Peptide metabolism by gastric, pancreatic and lysosomal protéinases, R. Krishnamoorthy, A. K. Mitra, Peptide-Based Drug Design : Controlling Transport and Metabolism, 1995,47-68) ce qui se traduit in vivo par une demi-vie courte. D'autre part, les barrières biologiques telle notamment la muqueuse intestinale sont non seulement de part leur structure peu perméables aux peptides mais également riches en enzymes protéolytiques, limitant ainsi davantage l'absorption de la substance active par l'organisme (Peptide absorption, Gastroenterology 71,1976, 151-161 ; V. H. L. Lee, A. Yamamoto, Penetration and enzymatic barriers to peptide and proteine absorption, Adv. Drug Deliv. Rev. 4,1990, 171-207 ; V. H. L. Lee, R. D. Traver, M. E. Taub, Enzymatic barriers to peptide and protein drug delivery, Peptide and Drug Delivery, Marcel Dekker, New York, 1991,303-357). Par ailleurs, la mise en oeuvre de systèmes de production de peptides à haut débit est longue et coûteuse. La présente invention vise précisément à offrir de composés qui miment globalement la structure des peptides antimicrobiens de façon à s'affranchir de leurs désavantages précédemment exposés tout en améliorant leurs activités. La demanderesse a isolé et caractérisé à partir de coccinelles de l'espèce Harmonia axyridis un composé présentant une activité antibactérienne (contre les germes à Gram positif et à Gram négatif). Ce composé est une diamine à longue chaîne hydrocarbonée faisant le lien entre les fonctions amines. La chaîne intermédiaire comporte une double liaison en son centre de configuration cis. D'un côté le carbone a voisin de la fonction amine porte une fonction alkyle courte à savoir un groupement méthyle. De l'autre côté de la chaîne, la fonction amine primaire est portée par un carbone non substitué. La formule développée de la diamine a été identifiée comme suit : Ce composé cis-l, 17-diaminooctadec-9-ène sera aussi désigné ci-après harmonine . La demanderesse a synthétisé le composé harmonine par voie chimique. Les activités antibactériennes in vitro dudit composé et de celui isolé à partir de l'insecte sont identiques et sont rapportées dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 Composé Micrococcus E. coli Staphyllococluteus Activité cus aureus Activité spécifique Activité spécifique (pg/ml) spécifique (pg/ml) Activité (pg/ml) Activité molaire Activité molaire (UM) molaire (pM) (pM) cis-1,17diaminooctadec 1,5 6 4 - 9-ène 4,2 17 11,2 (harmonine) L'activité hémolytique de l'harmonine a ensuite été testée in vitro sur du sang de singe. Une hémolyse de 20% est observée pour une concentration de 200 pg/ml. Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont donc consisté à synthétiser des variants de l'harmonine présentant des activités antimicrobiennes améliorées et étant non toxiques envers les cellules sanguines. Une analyse structure-activité a permis à la demanderesse de concevoir puis de synthétiser des composés ayant une structure plus compacte pharmacologiquement plus favorable. Les composés selon la présente invention présentent un squelette rigidifié par un cycle qui rend les composés compacts et qui réduit le degré de liberté de rotation autour des liaisons sigma. L'introduction d'un atome d'oxygène dans ledit cycle favorise la solubilisation des composés dans l'eau (30 mg de composés sont totalement solubilisés dans 1 ml d'eau) tout en évitant leur précipitation en présence de sels (NaCl physiologique) ainsi que dans des tampons phosphates (Phosphate Buffer Salin 1 fois). Les composés de la présente invention ne sont par ailleurs pas hygroscopiques malgré leur forte solubilité dans l'eau. Enfin, le squelette des composés porte un plus grand nombre de substituant par rapport au squelette de l'harmonine, lesdits substituants étant selon la présente invention des groupements cationiques. Les composés de la présente invention, précédemment exposés sont ainsi nommés tétrahydrofuranes a, a, a', a' tétrasubstitués polycationiques et seront aussi désignés ci-après THF : n . La présente invention a donc pour objet un composé de formule générale (I) : dans laquelle : - R représente un groupe alkyle en C4-C10 linéaire, ramifié ou cyclique, et de préférence un groupe alkyle en C6-C10 linéaire, ramifié ou cyclique, -Y représente un groupe amine ou ammonium de formule-N (Z) z (H) 3-z, où Z un groupe alkyle en C1-C7 linéaire ou ramifié, un groupe arylméthyle, en particulier un benzyle ou encore le groupe-N (Z) z (H) 3-z forme un radical pyridinium, et z est un nombre entier compris entre 0 et 3, - Ri, Ri', R2, R2', identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C4 ou encore Ri et R2 forment ensemble un cyclopentyle ou un cyclohexyle. Selon la présente invention, on entend par R représente un groupe alkyle cyclique, un groupement R qui est constitué ou comprend un cyclopentane ou un cyclohexane. Des composés avantageux selon l'invention sont ceux dans lesquels les groupements Y sont identiques et/ou les groupements R sont identiques. Un premier groupe préféré de composés selon la présente invention sont ceux de formule (I) dans laquelle les groupements Ri, Ri', R2, R2'représentent des atomes d'hydrogène, et dans lequel les groupements Y sont identiques et/ou les groupements R sont identiques. Ces composés répondent à la formule (Ia) suivante : Un second groupe préféré de composés selon la présente invention sont ceux de formule (I) dans laquelle au moins un des groupements Ri, R2, RI', R2'représente un groupe alkyle en Cl-C4, dans laquelle le ou les groupements restants représentent des atomes d'hydrogène, et dans laquelle les groupements Y sont identiques et/ou les groupements R sont identiques. Ces composés répondent à la formule (Ib) suivante où Alk signifie groupe alkyle : Un troisième groupe préféré de composés selon la présente invention sont ceux de formule (I) dans laquelle les groupements Ri et R2 forment ensemble un cyclopentyle ou un cyclohexyle, et dans laquelle les groupements Ri'et R2'représentent des atomes d'hydrogène, et les groupements Y sont identiques et/ou les groupements R sont identiques. Ces composés répondent à la formule (Ic) suivante : L'invention envisage tout particulièrement les composés ci-dessous : -la tétramine-THF : 7 répondant à la formule (II) suivante : Les composés synthétisés par la demanderesse ont été testés in vitro pour leur activité antibactérienne (anti-Gram positif et anti-Gram négatif) ainsi que pour leur activité anti-fongique. Les résultats des tests d'activité sont rapportés dans le tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 Tetramine-Harmonine THF : 7 (Référence) Activité Activité spécifique spécifique (pg/ml) (pg/ml) Activité molaire Activité molaire (pM) (pM) E. coli 0,8 6 1, 2 17 Staphylococcus aureus 0,8 4 1, 2 11, 2 Micrococcus luteus 0,6 1,5 0, 9 4, 2 Salmonella cloacae 1,5 3 2, 2 8, 4 Pseudomonas aeruginosa 6 25 9 70 Neurospora crassa 3 12 4, 5 34 Aspergillus fumigatus 100 > 50 150 > 140 Ce tableau montre un gain d'activité significatif des composés tétrahydrofuranes en comparaison avec le composé référence harmonine. Les composés tétrahydrofuranes présentent par ailleurs une activité sélective envers les bactéries (à Gram positif et à Gram négatif). Les composés synthétisés par la demanderesse ont ensuite été testés in vitro pour leur activité hémolytique sur du sang de singe. Les résultats des tests d'activité sont rapportés dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 Tetramine-Harmonine THF : 7 (Référence) Activité hémolytique Activité hémolytique (g/ml) (jug/ml) hémolyse 20% 1600 200 Les résultats montrent que les composés tétrahydrofuranes sont nettement moins hémolytiques que le composé de référence harmonine. La présente invention concerne également une composition antimicrobienne, plus particulièrement antibactérienne ou antifongique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d'agent actif au moins un composé tétrahydrofurane tel que défini précédemment. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un composé tétrahydrofurane pour la préparation d'une composition pour la prévention ou le traitement des infections microbiennes chez l'homme, l'animal ou les plantes. La composition selon la présente invention peut être administrée par voie orale, parentérale, rectale ou topique. Les composés tétrahydrofuranes de la présente invention sont donc des composés mimant les peptides antimicrobiens, avec une région hydrophobe et une région portant des groupements cationiques. Leur structure compacte leur confère l'avantage d'être résistant aux protéases qui dégradent communément et rapidement les peptides et d'être sélectifs envers les microorganismes. Les propriétés de solubilité des composés ainsi que leur petite taille (inférieure à 1 kDa) permettent un passage facilité desdits composés tétrahydrofuranes à travers les barrières biologiques telle notamment la muqueuse intestinale. Le nombre élevé de substituant et plus particulièrement de groupements cationiques, des composés tétrahydrofuranes favorise les contacts avec les têtes polaires des lipides des membranes des microorganismes opportunistes. L'ensemble des propriétés physico-chimiques exposées concourt ainsi à favoriser la biodisponibilité desdits composés. La simplicité structurale des composés tétrahydrofuranes présente également l'avantage de pouvoir synthétiser ces composés de façon aisée et sans surcoût. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant la synthèse de composés tétrahydrofuranes selon l'invention, leurs activités antimicrobiennes in vitro et leurs activités hémolytiques in vitro et dans lesquels il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : - la figure 1 représente un schéma général de synthèse des tétrahydrofuranes a, a, a', a' tétrasubstitués polycationiques. Les composés de l'invention peuvent être préparés selon le schéma général de synthèse des tétrahydrofuranes a, a, a', a' tétrasubstitués polycationiques donné à la figure 1 des dessins en annexe. Un-diacide organique est tout d'abord estérifié. Les fonctions esters peuvent réagir avec des organomagnésiens qui sont m-fonctionnalisés. Ce groupement chimique est présent sous forme d'un précurseur (benzyloxy), facilement convertible en d'autres groupements chimiques par déprotection (débenzylation) et activation de la fonction alcool résultante (mésylation). Par ce moyen une grande diversité de fonctionnalisations est accessible. Nous nous sommes limités à la conversion des tétrols en tétramines (tétrammoniums). Des amines primaires peuvent être obtenues par substitution des mésylates par des ions azidures et réduction des tétrazides par la réaction de Staudinger connue de l'homme de l'art. Des tétrammoniums peuvent être obtenus par peralkylation des amines primaires ou par substitution directe des mésylates convertis en tétrabromures par une amine tertiaire. Des amines secondaires sont accessibles par amidation des amines primaires et réduction des amides obtenus. La réaction des organomagnésiens sur les diesters donne des 1,4 diols tertiaires qui sont cyclisés dans des conditions de déshydratation de Dean-Stark connue de l'homme de l'art. Les molécules cycliques contenant le tétrahydrofurane sont alors fonctionnalisés comme décrit. Les amines finales sont purifiées par précipitation au HCl gazeux dans l'éther ou le dichlorométhane suivant la solubilité des tétramines. Exemple 1 : Synthèse de la tétramine-THF : 7. La demanderesse a synthétisé la tétramineTHF : 7 selon les 5 étapes qui suivent, rapportées à la figure 1 des dessins en annexe. Etape 1 : Formation du tétrabenzoxydiol Tl. Intermédiaire Tl, C60H9006 PM = 907,35 Un ballon bicol de 50 ml est surmonté d'un réfrigérant (verrerie séchée à l'étuve à 120 C puis laissée refroidir sous vide). 267,41 mg de tournures de magnésium (Mg, 11 mmoles, PM=24,31) sont introduits et placés sous argon, le montage étant fermé par des sérum caps. 2,852 g de 7-bromo-1-benzyloxyheptane (10 mmoles, PM=285,23) est pesé dans un ballon piriforme (séché dans l'étuve), placé sous argon et dissous dans 8 ml d'éther (distillé sur du sodium-benzophénone). Cette solution est rajoutée par portions de 0,5 ml sur le magnésium à l'aide d'une seringue. La réaction démarre après le troisième rajout et chauffage par sèche-cheveux. L'addition complète se fait pendant un intervalle de 10 minutes, puis le milieu réactionnel est placé 10 minutes à reflux. 217,75 mg de diéthylsuccinate (1,25 mmoles, 1/8 éq. ; PM=174,2) est dissous dans 25 ml de THF (distillé sur du sodiumbenzophénone) et rajouté goutte à goutte sur l'organomagnésien, par une ampoule à addition, pendant une demi-heure. La réaction est laissée à 230C pendant 20 heures. Pour arrêter la réaction le milieu réactionnel est versé dans de l'eau et la phase aqueuse est neutralisée par rajout de quelques gouttes de HCl concentré. La phase aqueuse est saturée en NaCl et extraite avec de l'éther. La phase organique est séchée sur MgS04, puis évaporée à sec. Le brut est chromatographié sur colonne de silice (3 x 17 cm, éluant : 50 % puis 70 % éther dans l'hexane). Le produit avec la plus forte polarité est ciblé. Lorsqu'il commence à sortir, les premières fractions sont accompagnés d'un contaminant révélant à la vanilline et de polarité légèrement plus faible. Ces fractions mixtes sont repurifiées lors d'une deuxième colonne. En total 538,4 mg de diol Tl sont récupérés, ce qui correspond à 0,593 mmoles et à un rendement de 47,5 %. RF = 0,41, éluant : 70 % éther dans l'hexane ; révélation à la vanilline : couleur noir 1H-RMN (méthanol d) : 7,18-7, 33 ppm ; multiplet ; 20 H ; 4 Phényles 4,85 ppm ; singulet ; 2 H ; 2 OH 4,438 ppm ; singulet ; 8 H ; 4 OCH2Ph 3,429 ppm ; triplet ; J = 6,4 Hz ; 8 H ; CH20Bn 1,46-1, 65 ppm ; multiplet ; 8 H ; CH2CH20Bn 1,18-1, 45 ppm ; multiplet ; 44 H ; 20 CH2 intrachaîne et 2 CH2 du milieu 13C-RMN (méthanol d) : 139,95 ppm (CO) ; 129,42 ppm (CH) ; 128,83 ppm (CH) ; 128,66 ppm (CH) ; 75,11 ppm (CO) ; 73,89 ppm (CH2) ; 71,49 ppm (CH2) ; 40,15 ppm (CH2) ; 33,36 ppm (CH2) ; 31,44 ppm (CH2) ; 30,83 ppm (CH2) ; 30,62 ppm (CH2) ; 27,31 ppm (CH2) ; 24,49 ppm (CH2) Etape 2 : Cyclisation du diol Tl. Intermédiaire T2, C60H8805 PM = 889,34 538 mg du diol Ql (0,445 mmoles, 1 éq. ; PM=907,37) sont dissous dans 30 ml de toluène dans un monocol de 50 ml et le ballon est surmonté d'un piège DeanStark couplé à un réfrigérant. 22,5 mg d'acide paratoluènesulfonique (0,12 mmoles, 0,2 éq. PM=190,22) sont rajoutés et le milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant 2 heures. Pour arrêter la réaction le toluène est évaporé sous évaporateur rotatif. Sur chromatographie en couche mince, on voit que le produit recherché est accompagné d'un produit secondaire de plus faible polarité et de même intensité. Le brut réactionnel est purifié par chromatographie sur silice (17 x 3 cm) avec comme éluant un mélange de 10 % puis 20 % éther dans l'hexane. 195,6 mg de T2 sont obtenus, ce qui correspond à 0,220 mmoles et à un rendement de 37,3 %. Rf = 0,31 ; éluant : 20 % éther dans l'hexane, révélation à la vanilline en violet 1H-RMN (CDC13) : 7,25-7, 47 ppm ; multiplet ; 20 H ; 4 phényles 4,557 ppm ; singulet ; 8 H ; 4 OCH2Ph 3, 518 ppm ; triplet ; J = 6, 6 Hz ; 8 H ; CH20Bn 1,766 ppm ; singulet ; 4 H ; H du cycle 1,58-1, 73 ppm ; multiplet ; 8 H ; CH2CH20Bn 1,20-1, 52 ppm ; multiplet ; 40 H ; 20 CH2 intrachaîne 13C-RMN (méthanol d) : 138,81 ppm (CO) ; 128,38 ppm (CH) ; 127,65 ppm (CH) ; 127,51 ppm (CH) ; 85,16 ppm (CO) ; 72,91 ppm (CH2) ; 70,60 ppm (CH2) ; 39,72 ppm (CH2) ; 35,58 ppm (CH2) ; 30,40 ppm (CH2) ; 29,85 ppm (CH2) ; 29,60 ppm (CH2) ; 26,28 ppm (CH2) ; 24,59 ppm (CH2) Etape 3 : Débenzylation de T2 pour former T3. Intermédiaire T3, C32H6405 PM = 528,85 195,6 mg de T2 (0,220 mmoles, PM=889,34) sont dissous dans 25 ml d'acétate d'éthyle et introduits dans un ballon bicol de 50 ml. L'air est remplacé contre de l'argon, par cycles successifs de vide et d'argon. 20 mg de Pd/C (5%) sont introduits. Le milieu est placé sous argon, puis l'argon est remplacé par du dihydrogène sous une pression d'une atmosphère. L'hydrogénation catalytique se fait pendant 24 heures à température ambiante. L'hydrogène est remplacé contre de l'argon pour arrêter la réaction. Le milieu réactionnel est dilué avec un mélange de CH2CI2- méthanol (50 : 50) et filtré sur papier filtre. Le filtre est lavé avec du CH2Cl2-méthanol et les solvants récupérés sont évaporés. Le tétrol solide (le brut réactionnel est très peu contaminé d'après analyse de chromatographie en couche mince) est purifié par chromatographie sur silice (3 x 18 cm, équilibrée avec de l'acétate d'éthyle). Le tétrol étant peu soluble dans l'acétate d'éthyle est dissous dans 3 ml d'acétate d'éthyle contenant 20 % de méthanol et déposé sur colonne. On élue avec 100 ml d'acétate d'éthyle 100%, puis avec un gradient 1 à 10 % de méthanol dans l'acétate d'éthyle (100 ml pour chaque n %). Le produit majeur sort avec 6 à 8 % de méthanol. Les fractions pures réunies fournissent 82,6 mg du tétrol T3, ce qui correspond à 0,155 mmoles et à un rendement de 70,5 %. Rf = 0,28 ; éluant : 10% méthanol dans CH2Cl2 1H-RMN (méthanol d) : 4,833 ppm ; singulet ; 4 H ; 4 OH 3,496 ppm ; triplet ; J = 6,5 Hz ; 8 H ; 4 CH20H 1,733 ppm ; singulet ; 4 H ; H du cycle 1,40-1, 58 ppm ; multiplet ; pics maj. : 1,489 ppm, 1,458 ppm ; 8 H ; 4 CH2CH20H 1,12-1, 40 ppm ; multiplet ; pic maj. : 1,287 ppm ; 40 H ; 20 CH2 intrachaîne 13C-RMN (méthanol d) : 86,93 ppm (CO) ; 63,04 ppm (CH2) ; 40,68 ppm (CH2) ; 36,52 ppm (CH2) ; 33,73 ppm (CH2) ; 31,47 ppm (CH2) ; 30, 67 ppm (CH2) ; 26,99 ppm (CH2) ; 25,58 ppm (CH2) Etape 4 : Activation de la molecule par formation du tétramésylate et conversion en tétrazide T4. Intermédiaire T4, C32H60N120 PM = 628,91 - Activation de la molécule par formation du tétramésylate : 82,5 mg du tétrol T3 (0,155 mmoles, 1 éq., PM=528,86) est dissous dans 10 ml de CH2C12 dans un ballon de 50 ml. 125 mg de chlorure de mésyle (1,092 mmoles, 7 éq. , PM=114, 55), dissous dans 2 ml de CH2C12 sont rajoutés. 127 mg de triéthylamine (1,25 mmoles, 8 éq., PM=101,12), dilués dans 2 ml de CH2C12, sont additionnés goutte à goutte. Le milieu réactionnel est agité pendant une 16 heures. Le milieu réactionnel est légèrement jaunâtre. La réaction est lente, et pour l'accélerer 50 mg de Et3N (0,49 mmoles) et 50 mg de MsCl (0,43 mmoles) sont rajoutés. Le milieu réactionnel vire au jaune orange après le rajout. Les solvants sont évaporés. Le solide résultant est repris dans du dichlorométhane (50 ml), puis lavé avec une solution aqueuse saturée en NaHC03 (30 ml) : La phase aqueuse est relavée avec du dichlorométhane (50 ml). Les phases organiques réunies sont relavées avec 30 ml d'eau et évaporées sous vide. Rf = 0,87 ; éluant : 10 % MeOH dans CH2C12 ; révélation à la vanilline avec couleur noire, le brut réactionnel contient un seul produit - Conversion en tétraazide T4 : Le solide récupéré de la réaction précédente est repris dans 9 ml de diméthylformide (DMF) et placé dans un ballon monocol de 25 ml, surmonté d'un réfrigérant vigreux. 202,8 mg d'azidure de sodium (3,12 mmoles ; 20 éq. ; PM=65,01) sont rajoutés, et le milieu réactionnel est chauffé à 73 C pendant 16 heures. Après refroidissement du milieu, 10 ml d'eau sont rajoutés et le milieu réactionnel est extrait avec de l'éther (3 x 100 ml). Les phases organiques réunies sont lavées avec de l'eau (50 ml), puis séchées avec du MgS04. La filtration sur célite et l'évaporation des solvants fournit un brut qui est purifié par chromatographie sur silice (colonne : 3 x 18 cm, éluant : 5 % éther dans l'hexane). 59 mg du produit purifié sont récupérés, ce qui correspond à 0,094 mmoles et à un rendement de 60, 1%. Rf = 0,28 ; éluant : 10 % éther dans l'hexane ; révélation faible à la vanilline (couleur brun rose) et révélation très faible à l'iode. 1H-RMN (CDC13) : 3,211 ppm ; triplet ; J = 6,8 Hz ; 8 H ; 4 CH2N3 1,675 ppm ; singulet ; 4 H ; H du cycle 1,45-1, 63 ppm ; multiplet ; pics maj. : 1,588 ppm, 1,555 ppm, 1,521 ppm ; 8 H ; 4 CH2CH2N3 1,05-1, 48 ppm ; multiplet ; pics maj. : 1,389 ppm, 1,277 ppm ; 40 H ; 20 CH2 intrachaîne 13C-RMN (CDC13) : 85,10 ppm (CO) ; 51,52 ppm (CH2) ; 39,63 ppm (CH2) ; 35,56 ppm (CH2) ; 30,22 ppm (CH2) ; 29,21 ppm (CH2) ; 28,88 ppm (CH2) ; 26,75 ppm (CH2) ; 24,48 ppm (CH2) Etape finale : Réduction de l'azide en tétramine et formation du tétrachlorhydrate de la tétramine THF : 7 : Produit final, C32H72C14N40 PM = 670,75 49 mg du tétraazide T4 (0,094 mmoles ; 1 éq. ; PM = 628,91) sont introduits dans un pilulier de 5 ml. 300 III de THF et 30 III d'eau (1,6 mmoles ; 18 éq. ) sont rajoutés. 196,8 mg de triphénylphosphine (0,7504 mmoles ; 8 éq. ; PM = 262,3) sont additionnés, spatule par spatule. Le dégagement gazeux est fort et la réaction est exothermique. Le pilulier est fermé d'un bouchon transpercé par l'aiguille d'une seringue, le milieu réactionnel étant agité par un barreau aimanté de 2 mm. Le milieu réactionnel reste homogène pendant toute la réaction. Après 6 jours de réaction totale, le milieu réactionnel est repris dans 100 ml de CH2C12 et filtré sur papier filtre, pour piéger les traces d'eau excédentaire. L'amine est alors précipitée par de l'HCl gazeux (préparé par action de H2S04 sur un mélange de HCl concentré et de NH4Cl, et lavage du gaz par passage à travers de H2S04 concentré) dans un ballon bicol. Par filtration on récupère 50,0 mg du tétrachlorhydrate de la tétramine, ce qui correspond à 0,0745 mmoles et à un rendement de 79 %. Rf = 0,015 ; éluant : méthanol-dichlorométhane- ammoniaque 10/10/1 ; révélation à la vanilline ; couleur brune 1H-RMN (méthanol d) : 4,836 ppm ; singulet ; 12 H ; NH3+ 2,893 ppm ; triplet ; J = 7,6 Hz ; 8 H ; 4 CH2NH3+ 1,751 ppm ; singulet ; 4 H ; H du cycle 1,55-1, 72 ppm ; multiplet ; pics maj. : 1,679 ppm, 1,645 ppm, 1,608 ppm ; 8 H ; 4 CH2CH2NH3+ 1,15-1, 52 ppm ; multiplet ; pics maj. : 1,331 ppm ; 40 H ; 20 CH2 intrachaîne 13C-RMN (méthanol d) : 86,91 ppm (GO) ; 40,87 ppm (CH2) ; 40,70 ppm (CH2) ; 36,49 ppm (CH2) ; 31,32 ppm (CH2) ; 30,39 ppm (CH2) ; 28,65 ppm (CH2) ; 27,63 ppm (CH2) ; 25,65 ppm (CH2) Exemple 2 : Tests antimicrobiens in vitro. Les tests in vitro ont été réalisés suivant les conditions décrites dans"Strategies for the Isolation and Characterisation of Antimicrobial Peptides of Invertebrates, C. Hetru, P. Bulet, Methods in Molecular Biology, Vol. 78 : Antibacterial Peptide Protocols, Edited by Shafer, Humana Press Inc., Totowa, NJ". Pour déterminer les Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) des cascades de dilutions des chlorhydrates des tétrahydrofuranes ont été réalisées dans de l'eau stérile suivant un mode de dilution deux à deux, en commençant à 1 mg/ml. Pour les tests 10111 de chaque dilution sont mis ensemble avec 90 111 d'une suspension de bactéries ou de spores de champignons dans des plaques multipuits à 96 puits. La CMI pour les bactéries représente la concentration la plus faible où aucune pousse de bactéries ne peut être constatée après 24 heures de culture à 29 C. La densité de bactéries est mesurée par lecture de la turbidité dans les puits de culture exprimée par l'absorbance à 600 nm (densité optique, DO). La CMI pour les champignons est déterminée après 48 heures de culture à 29 C par analyse microscopique des ifs formés et correspond à la concentration minimale où aucune germination n'est visible. Les résultats des tests d'activité sont rapportés dans le tableau 2. Exemple 3 : Tests d'hémolyse in vitro. Un composé agissant sur les membranes de bactéries peut potentiellement perturber les membranes de cellules de Mammifère. Les globules rouges ou érythrocytes servent de modèle de cellules d'eucaryotes où le degré de la perméabilité membranaire est facilement évalué par mesure de la quantité d'hémoglobine libérée à travers les pores des membranes fragilisées et dont la concentration est directement proportionnelle à la densité optique à 450 nm. Les erythrocytes sont préparés à partir de sang de singe (Maccaque) fraîchement prélevé. Le sang héparinisé est centrifugé et lavé trois fois avec du PBS froid et remis en suspensions à 10 % (v/v) dans le PBS. A 90 l de suspension de globules rouges sont rajoutés 10 ! d'une solution aqueuse des produits à tester. Les érythrocytes sont mis à incuber pendant une heure à 37 C. La suspension est centrifugée afin de récupérer le surnageant qui est plus ou moins rouge suivant le degré d'hémolyse. La concentration d'hémoglobine libérée dans le surnageant est mesurée par la densité optique à 450 nm. Dans le contrôle négatif les globules rouges sont incubés en absence de produit et montre une DO de 0. L'hémolyse 100 % est obtenue avec 100 ! -Ag de chlorure de cétylpyridinium par ml de suspension. Le degré d'hémolyse est évalué par rapport au témoin positif pour les différentes concentrations des produits testés. REVENDICATIONS 1) Composé de formule (I) : dans laquelle : - R représente un groupe alkyle en C4-C10 linéaire, ramifié ou cyclique, et de préférence un groupe alkyle en C6-C10 linéaire, ramifié ou cyclique, - Y représente un groupe amine ou ammonium de formule-N (Z) z (H) 3-z, où Z un groupe alkyle en C1-C7 linéaire ou ramifié, un groupe arylméthyle, en particulier un benzyle ou encore le groupe-N (Z) z (H) 3-z forme un radical pyridinium, et z est un nombre entier compris entre 0 et 3, Ri, Ri', R2, R2', identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C4 ou encore Ri et R2 forment ensemble un cyclopentyle ou un cyclohexyle. 2) Composé de formule (I) selon la revendications 1, caractérisé en ce que les groupements Y sont identiques. 3) Composé de formule (I) selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les groupements R sont identiques. 4) Composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les groupements RI, Ri', R2, R2'représentent des atomes d'hydrogène. 5) Composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'un au moins des groupements Ri, Ri', R2, R2'représente un groupe alkyle en Cl-C4 et en ce que le ou les groupements restants représentent des atomes d'hydrogène. 6) Composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les groupements RI et R2 forment ensemble un cyclopentyle ou un cyclohexyle et en ce que les groupements RI'et R2' représentent des atomes d'hydrogène. 7) Composé de formule (I) selon l'une des revendications de 1 à 4, caractérisé en ce qu'il répond à la formule (II) suivante : 8) Composition antimicrobienne, plus particulièrement antibactérienne ou antifongique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d'agent actif au moins un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9) Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la préparation d'une composition antimicrobienne utile pour la prévention ou le traitement des infections bactériennes chez l'homme, l'animal ou les plantes. 10) Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la préparation d'une composition antimicrobienne utile pour la prévention ou le traitement des infections fongiques chez l'homme, l'animal ou les plantes.