Brevet FR2825371A1 — publié le 20021206

La présente demande de brevet a pour objet des cellules révertantes de lignées cellulaires issues de tumeurs solides de cancer du sein. La plupart des chercheurs dans le domaine du cancer ont essayé de répondre à la question suivante : comment une cellule normale devient-elle tumorale ? Les efforts de milliers de chercheurs durant ces vingt dernières années ont permis de répondre, du moins partiellement, à cette question. La mise au point de produits thérapeutiques à partir des résultats issus de ces travaux semble cependant poser d'importantes difficultés. En particulier, il ne semble notamment pas possible de réparer un chromosome cassé, un oncogène activé par une mutation ou une translocation, ou encore, un gène suppresseur de tumeurs ayant perdu sa fonction. Les inventeurs ont donc considéré qu'il était crucial de répondre à une question différente, mais plus pratique, et qui va droit au but thérapeutique, à savoir : comment une cellule tumorale peut-elle perdre son phénotype malin et donc réverter ? Certains chercheurs s'étaient d'ailleurs posé en partie cette question au début des années 80. Ils avaient remarqué que des fibroblastes transformés par l'oncogène ras pouvaient perdre leur phénotype malin. Ces fibroblastes révertants se distinguaient par leur morphologie, et ont été appelés les fiat revertants . Des expériences ultérieures ont démontré que l'effet oncogénique du ras était antagonisé par le gène K-rev dans ces cellules révertantes. Néanmoins, ces chercheurs n'ont pas apporté de réponse quant à savoir si une cellule tumorale provenant de patients pouvait réverter. Leurs recherches étaient uniquement focalisées sur les single gene revertants , et n'abordaient pas le problème à un niveau plus global. Les premiers travaux des inventeurs dans ce domaine au début des années 90 ont essayé d'apporter des modèles de réversion à un niveau global. A partir de cellules provenant de lignées leucémiques humaines (K562, U937), ils ont réussi à isoler ces révertants (KS et US) (Telerman et al., PNAS, vol 90 pp8702-8706,1993 ; Nemani et al., PNAS, vol 93, pp 9039-9042,1996). Leur hypothèse de départ était la suivante : chez une personne normale, on sait que des cellules avec des mutations fréquentes aboutissent à la formation de cellules cancéreuses et que ces dernières sont détruites, notamment par le système immunitaire (de telle sorte qu'en fait le passage de certaines cellules "', 7 d'un état normal à un état tumoral passe la plupart du temps inaperçu). Sur cette base, les inventeurs ont donc considéré, qu'en sens inverse , au sein d'une tumeur contenant des centaines de millions de cellules, de très rares cellules devaient décider de quitter la voie tumorale. Dans le but de pouvoir distinguer ces rares révertants au sein d'une population tumorale, les inventeurs ont employé comme outil le parvovirus H-1, qui tue de manière préférentielle les cellules tumorales et épargne celles qui ne le sont pas. C'est en appliquant cette technologie qu'à partir des cellules dérivées de lignées leucémiques, les inventeurs ont établi les clones révertants. Le problème était cependant entièrement à revoir dans le cas des tumeurs solides. Dans ce cas, notamment les tumeurs du sein, les cellules ne poussent pas en suspension, mais sont adhérentes ; il est donc plus compliqué d'isoler les cellules révertantes. Vu la fréquence très élevée de tumeurs du sein, il était donc important de pouvoir résoudre la problématique. Les inventeurs ont mis au point un protocole permettant d'isoler les cellules de lignées cellulaires issues d'une tumeur solide de cancer du sein ayant réverté. Par cellule révertante on entend une cellule d'origine tumorale ayant perdu une partie significative des propriétés la définissant comme cellule tumorale. Par exemple, alors qu'une cellule tumorale n'a pas besoin d'accrochage pour croître, la cellule révertante, comme la cellule saine d'ailleurs, a besoin d'un tel accrochage pour croître. Cependant, la réversion tumorale telle que mise en évidence par les inventeurs ne peut pas être considérée comme résultant simplement d'une inversion de la transformation maligne d'une cellule saine mais plutôt comme un phénomène biologique propre comprenant un processus de reprogrammation cellulaire conduisant à la suppression de la tumorégénicité. telle que l'exigence d'accrochage pour la croissance. Les inventeurs ont donc réussi a isolé des cellules tumorales révertantes en soumettant plusieurs lignées cellulaires issues de tumeurs solides de cancer du sein à une infection au parvo virus HL Une telle infection présente la caractéristique, comme indiqué précédemment, de tuer toutes les cellules malignes en épargnant seulement les cellules, qui ont perdu, de façon significative, leur pouvoir tumorigène. La présente invention a donc pour objet des cellules révertantes d'une lignée cellulaire issue d'une tumeur solide de cancer du sein susceptibles d'être obtenues par la mise en oeuvre d'un procédé comprenant les étapes : - d'infection des cellules de ladite lignée cellulaire avec un parvovirus Hl présentant une MOI (multiplicité d'infection) comprise entre 10 et 1000 pfu/cellule, d'isolement et récupération des cellules ayant survécu à l'effet cytopathique du parvovirus H1, ces cellules étant dites révertantes. En particulier, les cellules révertantes conformes à l'invention présentent la caractéristique, lorsqu'elles sont cultivées dans des conditions de croissance normale : - de former un nombre de colonies réduit d'au moins 50 % par rapport au nombre de colonies formées dans les mêmes conditions par les cellules de la lignée cellulaire dont lesdites cellules révertantes sont issues, et - de former des colonies dont la taille est réduite d'au moins 40 % par rapport à la taille des colonies formées dans les mêmes conditions par les cellules de la lignée cellulaire dont lesdites cellules révertantes sont issues. Par conditions de croissance normales , il faut entendre des conditions de croissance standard connues de l'homme du métier, c'est-à-dire mettant en oeuvre un milieu susceptible d'apporter à la cellule tout ce dont elle a besoin pour croître sans rechercher l'obtention d'un résultat particulier en dehors de la croissance desdites cellules. Plus particulièrement encore, les cellules révertantes conformes à la présente invention sont caractérisées en ce que ; la lignée cellulaire soumise à l'infection du parvovirus Hl est choisie parmi la lignée BT-20 (ATCC n HTB- 19), la lignée T-47D (ATCC n HTB-133) et la lignée-CAMA-1 (ATCC n HTB- 21). FIGURES La figure 1 illustre l'induction de tumeurs dans les souris scid-scid par les cellules BT-20 et BT-20S. Une lignée cellulaire tumorale (BT-20) et les cellules révertantes issues de cette lignée (BT-20S) ont été cultivées comme décrit dans les exemples. Le jour de l'injection desdites cellules, celles-ci ont été détachées avec de la trypsine, neutralisées avec le milieu de croissance et lavées au moyen d'un milieu de croissance sans FBS. 1 x 107 cellules ont été injectées dans 0,2 ml de milieu sans FBS. Chaque souris a reçu 4 injections de cellules (tumorales ou révertantes) localisées comme suit : une dans chaque flanc et une dans chaque épaule. La figure 1A illustre le volume des tumeurs en mm3 en fonction du nombre de jours de croissance des tumeurs. On peut par exemple noter qu'au bout de 80 jours, le volume des tumeurs générées par l'injection des cellules tumorales BT-20 est de 40,35 mm3 alors que le volume des tumeurs générées par l'injection des cellules révertantes BT-20S n'est que de 3,67 mm3. La figure 1B illustre le pourcentage de tumorigénicité en fonction des cellules injectées. On notera que sur 20 points d'injection, 13 d'entre eux ont donné lieu à des tumeurs quand les cellules injectées étaient les cellules tumorales BT-20, tandis que l'injection des cellules BT-20S n'a donné lieu à aucune croissance tumorale. Les figures 2,3 et 4 illustrent des tests de croissance en milieu semisolide. Les cellules quelles qu'elles soient ont été détachées du milieu de culture, comptées et mixées dans un milieu semi-solide d'Agar Noble à 0,3 % (Diffco). Différentes dilutions ont été ensemencées sous une couche d'Agar Noble à 0,61 %. Pour les deux couches, la force du milieu final est 1,0 x C et FBS à 10 %. Les cellules ont été incubées à 37 C, 5 % de CO2 et les colonies ont été comptées après 3 à 4 semaines. Les figures 2A, 3A et 4A illustrent le nombre de colonies ainsi obtenues pour les cellules BT-20 et BT-20S, T-47D et T-47DS, CAMA-1 et CAMA-1S respectivement, étant entendu que le nombre de colonies indiqué correspond au nombre moyen de colonies pour 10 champs observés au microscope à l'objectif x 4 pour ce qui concerne les cellules BT-20, BT-20S, T- 47D et T-47DS et à l'objection x 10 pour les cellules CAMA-1 et CAMA-1S. Les figures 2B, 3B et 4B illustrent la taille des colonies en u. m pour les cellules BT-20 et BT-20S, T-47D et T-47DS, CAMA-1 et CAMA-1S respectivement, étant entendu que la taille reportée sur ces figures correspond à une taille moyenne observée pour 100 colonies. Les exemples ci-après aideront à la compréhension de la présente invention mais ne sont mentionnés qu'à titre purement illustratif EXEMPLES Exemple 1 : La propagation du parvovirus Hl Matériels - Parvovirus Hl - Producteur et indicateur de cellules : NB-E, cellules de rein de nouveaux nés humains transformés par SV40 - Milieu de propagation NB-E : . milieu essentiel minimal de Eagle avec des sels de Earle (Life Technologies) supplémenté avec : . 1 % d'acides aminés non essentiels MEM (Life Technologies) . 1 % de L-glutamine (Life Technologies) . 40 ug/ml de gentamycine (Life Technologies) et . 10 % de sérum bovin foetal (inactivé par la chaleur) (Bio ,., Whittaker) - Eau : PPI Fresenius, France Solution Alsever pour 1 litre : . 20, 5 g de D-glucose . 4, 2 g de NaCl . 8, 0 g de citrate de Na (citrate de trisodium déshydraté) . 0, 55 g d'acide citrique pour ajuster le pH entre 6, 1 et 6,4 stérilisée par une filtration à 0,2 um - Virus-TE : . 50 mM de Tris . 0, 5 mM de sel de sodium EDTA pH = 8,7 autoclave - Tampon borax A = 0,2 M d'acide boric B = 0,05 M de borax de Na (= tétraborate de disodium) 50,0 ml de A 59,0 ml de B 91, 0 ml d'H2O, pH = 9, 0 stérilisé à travers un filtre de 0,2 m - CsCI : . 50, 00 g de CsCl dans 90,0 ml de virus-TE - Densité : 1,4 g/ml . filtration à travers un filtre de 0,22 m - Sucrose : . 1 M dans le virus-TE . autoclave Méthodes Les cellules NB-E ont été cultivées sur des boîtes de culture Nunc dans le milieu de culture décrit ci-dessus à 37 C, 9, ; 5 % d'humidité relative et 5 % de CO2, et ont été maintenues pendant au moins 1 mois avant la production de virus. Les cultures confluantes ont été traitées avec une solution trypsine/EDTA (Life Technologies) et ont été divisées dans un rapport de 1 pour 8. Pour une production virale typique, 21 boîtes identiques de 10 cm ont été ensemencées. Quand la culture a atteint 80 % de confluence, une boîte a été traitée à la trypsine et la quantité de cellules a été déterminée avec un hémocytomètre. Toutes les boîtes ont été lavées avec du PBS contenant du Ca++ et du Mg++ (PBS++, Life Technologies) et infectées pendant 1 h avec le virus Hl avec une multiplicité d'infections (MOI) de 10-3 dans 800 ni de PBS++ avec une agitation intermittente toutes les 10 min. Les cellules ont été ensuite remises dans le milieu de culture et incubées ensuite pendant 4 h. Toutes les boîtes ont été traitées avec de la trypsine/EDTA et divisées de façon égale en 200 boîtes. 5 jours après l'infection, les cellules ont été raclées avec une raclette en caoutchouc et la suspension a été introduite dans une bouteille d'1 1 (bouteille roller Costar). La suspension a été refroidie dans la glace et le virus s'est agglutiné pendant 4 h sous agitation continuelle à 4 C avec 0,2 % de cellules de globules rouges de Guinea Pig. Les érythrocytes de Guinea pig ont été isolés à partir de 15 m1 de sang complet (Charles River, France), supplémentés avec 0,3 ml de citrate de sodium à 1 M pour 15 m1 de sang. Le sang a été centrifugé à 1 000 g pendant 5 min dans une centrifugeuse clinique et le plasma surnageant a été éliminé avec une pipette pasteur. Les cellules centrifugées ont été mises en suspension dans la solution Alsever et centrifugées comme indiqué ci-dessus. Le surnageant a été éliminé et cette étape a été répétée 5 fois pour éliminer les globules blanc et les plaquettes. Les érythrocytes ont été finalement mis en suspension, pour donner lieu à une suspension à 50 % (v/v), dans une solution Alsever réfrigérée à 4 C et utilisée pendant 15 jours. Le virus agglutiné a été centrifugé pendant 30 min à 805 g à 4 C dans une centrifugeuse Eppendorf 5810R équipée avec un rotor swingout avec des ""1 tubes de centrifugeuses coniques 4 x 225 ml (Falcon 352075). Le surnageant a été éliminé au moyen d'une pipette pasteur branchée à une. ligne de vide et le reste du mélange a été additionné au culot et centrifugé dans les mêmes conditions. Les culots ont été mis en suspension dans 20 ml de PBS++ et collectées dans un tube de 50 ml (TPP). Tous les tubes ont été rincés avec 1 x 20 ml de PBS++ et 1 x 10 ml de PBS++, l'ensemble a été centrifugé à 3 000 rpm dans le même rotor pendant 30 min à 4 C. Les culots ont été suspendus dans 7 ml de virus-TE et congelés dans de l'azote liquide pendant quelques minutes, ils ont été ensuite décongelés à 37 C pour détruire les cellules et ont été régulièrement soumis au vortex pendant la décongélation. Cette étape de congélation/décongélation a été répétée 3 fois. Le mélange de virus et débris cellulaires a été mis dans un tube de centrifugeuse de 10 ml (Nalgene ref 3119-0010) et a été centrifugé pendant 30 min à 12 000 g à 4 C (centrifugeuse Eppendorf 581OR). Le surnageant a été stocké dans un tube de 15 ml de polypropylène (TPP). Le culot a été suspendu dans 2 ml de virus-TE et a ensuite été placé dans un tube différent de 15 ml et a subi un cycle de congélation/décongélation 3 fois comme indiqué ci-dessus dans de l'azote liquide. La suspension a ensuite été placée dans un tube à centrifugeuse Nalgène, le tube de 15 ml a été lavé avec 1 ml de virus-TE et les suspensions ont été mises ensemble à centrifuger à 12 000 g pendant 30 min à 4 C. Les deux surnageant ont été mis ensemble et ont a été traités pendant 30 min à 37 C avec de la nucléase de micrococcus (Pharmacia-Amarsham) à une concentration finale de 0,01 mg/ml, solution stock à 1 mg/ml dans un tampon borax. La nucléase a été activée avec 5 mM de CaClz et ta réaction a été stoppée avec 5 mM de EDTA. 5 ml de CsCI ont été ajoutés ensuite par tube d'ultracentrifugation (Beckman 331372), le contenu du tube a ensuite été recouvert par 1 ml de sucrose, puis avec une couche soigneusement étalée à sa surface de 6 ml d'une préparation virale. L'ensemble a été centrifugé pendant 24 h à 39 000 rpm à 15 C dans un rotor SW41 (Beckman). Le gradient a été fractionné et le profil du gradient ainsi que la position des virions et des capsides vides aL été déterminé par un test d'hémagglutination. Les fractions d'intérêt ont été rassemblées et dialysées de façon extensive (Slide A-Iyzer, PIERCE) contre la solution de virus-TE à 4 C. La concentration du virus a été déterminée par un plaque-assay avec NB-E en tant qu'indicateur cellulaire. Exemple 2 : Isolement de cellules révertantes Exemple 2A : Isolement de cellules révertantes à partir de la lignée BT-20 de cancer du sein Matériels - Cellules BT-20 : ATCC nO HTB19 Nombre de passages : 294 Espèce humaine, type caucasien, femme de 74 ans ; cryologie nombre modal 50, hyperdiploïdie, chromosomes fragmentés Tissu/Organe : glande mammaire, sein Morphologie : épithéliale Tumeur : carcinome - Milieu de propagation BT-20 : . milieu essentiel minimal Eagle avec des sels de Earle (Life Technologies) supplémenté avec : . 1 % d'acides aminés non essentiels MEM (Life Technologies) . 1 % de L-glutamine (Life Technologies) . 1 % de pyruvate de Na (Life Technologies) . 40 g/ml de gentamycine (Life Technologies) ou . 100 U/ml de pénicilline, 100 J. 1g1m1 de streptomycine (Bio Whittaker) . 10 % de sérum de bovin foetal (inactivé par la chaleur) (Bio Whittaker) - Trypsine/EDTA (Lifë Technologies) - Collagénase/dispase (Roche),' Méthodes Les cellules BT-20 ont été obtenues à partir de la collection ATCC et ont été cultivées dans des flacons TC Nunc, propagées dans le milieu de BT-20 cidessus décrit à 37 C, 95 % d'humidité relative et 5 % de CO2. Le milieu de culture a été remplacé 2 fois par semaine et les cellules ont été sous-cultivées quand la culture a atteint une confluence de 80-90 %. Le procédé de sous-culture des cellules était différent avant et après l'isolement de cellules révertantes. Quand les cultures ont atteint la confluence, en générale 1 fois par semaine, le milieu a été aspiré avec une pipette pasteur et les cellules ont été lavées avec 2 ml d'une solution chaude de trypsine/EDTA. La solution enzymatique a été directement remplacée par la même solution à raison de 2 ml/75 cm2 et les cellules ont été incubées à 37 C pendant 5 min. Les cellules ont été resuspendues dans 8 ml de milieu de culture complet et centrifugées à température ambiante pendant 7 min à 900 rpm (centrifugeuse Eppendorf581OR). Le surnageant a été éliminé et le culot de cellule a été placé en suspension et divisé dans 4 flacons identiques. Les cellules BT-20 ont été cultivées pendant 18 semaines comme décrit ci-dessus avant de procéder à l'isolement des révertantes. Pour l'isolement des révertantes, le contenu d'un flacon a fait l'objet d'une sous-culture comme indiqué ci-dessus et a été divisé de façon identique en 3 flacons. Quand la culture a atteint 80 % de confluence, on a procédé au comptage d'un flacon parallèle de façon à déterminer la quantité de pfu (plaque formant une unité) de parvovirus Hlwt. Le contenu des deux autres flacons soeurs BT-20 (passage 312) a été infecté avec le parvovirus Hlwt comme indiqué ci-après. Le milieu a été aspiré avec une pipette pasteur reliée au vide, les cellules ont été lavées avec du PBS++ chaud et les cellules ont été recouvertes avec 0,4 ml de PBS++ présentant une multiplicité d'infection (MOI) de 10 pfu/cellule de Hlwt. Les cellules ont été incubées à 37 C pendant 1 h avec une agitation intermittente toutes les 10 min pour garder les cellules couvertes. Après l'infection, le virus n'a pas été aspiré, les cellules ont été recouvertes avec du milieu de croissance et si ensuite incubées pendant 2 h dans l'incubateur. Les cellules ont été lavées avec 2 ml de solution chaude de trypsine et dissociée avec de la trypsine. Les cellules ont été lavées 1 fois dans le milieu de croissance et diluées dans du milieu de croissance à raison de 5 000 cellules/ml. Les cellules infectées ont été ensemencées dans des multi-puits d'un type à 6 puits (TPP) à raison de 20 000 cellules/puits. Une semaine après l'infection, la culture a été complètement lysée. On a observé les cultures 1 fois par semaine et le milieu a été remplacé 1 fois par semaine comme indiqué ci-après. Le milieu a été délicatement éliminé avec une pipette pasteur à partir du ménisque laissant 1/3 de milieu dans le puits. Les puits ont été rechargés avec 4 ml de milieu de croissance chaud en prenant soin de ne pas perturber le micro-environnement des colonies émergeantes. Les colonies ont été soulignées avec un marqueur et isolées dans un cylindre de clonage de 8 mm (Sigma) comme indiqué ci-après. Le contenu des puits contenant une colonie a été complètement aspiré et le cylindre de clonage a été placé avec une pince stérile sur la colonie marquée. Le cylindre a été rempli avec 150 ul de collagénase/dispase et incubé pendant 30 min à 37 C. Les cellules se sont détachées du plastique mais sont restées comme une feuille ensemble. Les cellules BT-20S ont été isolées 7 semaines après l'infection et ensemencée dans un puits (plaque Nunc à 96 puits). Le milieu a été remplacé 1 fois par semaine comme décrit ci-dessus laissant 1/3 de milieu dans le puits. Quand la culture a atteint la confluence, le milieu a été aspiré avec une pipette et gardé pour servir plus tard à faire un milieu conditionné. Les cellules ont été lavées avec du PBS-' (sans calcium ni magnésium) et détachées avec la collagénase/dispase. Les cellules ont été resuspendues dans du milieu de culture et centrifugées pendant 7 min à 900 rpm. Le culot de cellules a été resuspendu dans du milieu conditionné, à savoir un nouveau milieu de croissance contenant 20 % du milieu ancien, et réparti selon un ratio de 1 : 2. Les cellules BT-20S sont la seule culture qui a survécu. Les autres colonies meurent dans la boîte mère ou rapidement après le transfert dans la plaque à 96 puits. Il La lignée cellulaire tumorale parentale BT-20 a été cultivée de la même façon dans le but de comparer les 2 lignées cellulaires selon un test de croissance en milieu semi-solide (soft agar) (figure 2) et sous l'aspect de la formation des tumeurs dans des souris scid-scid (figure 1). Ces tests ont confirmé l'exigence d'accrochage pour la croissance pour les cellules BT-20S contrairement aux cellules BT-20 qui ont formé des colonies en milieu semi-solide (soft agar). Exemple 2B : Isolement de cellules révertantes à partir de la lignée T- 47D de cancer du sein Matériels - Cellules T-47D : ATCC n HTB-133 Nombre de passages : 87 Espèce humaine, type caucasien, femme de 54 ans, cryologie hypertriploïdie, nombre modal 65 Tissu/organe : sein Morphologie : épithéliale Tumeur : carcinome ductal - Milieu de propagation des cellules T-47D : . milieu : RPMI 1640 (Life Technologies) supplémenté avec : . 1 % de L-glutamine (Life Technologies) . 0,2 IU d'insuline bovine/ml (Life Technologies) . 40 J. ! g/m1 de gentamycine (Life Technologies) ou . 10 % de sérum bovin foetal (inactivé par la chaleur) Bio Whittaker) - Trypsine/EDTA (Lifë Technologies) - Collagénase/diospase (Roche) Méthodes Pour isoler des cellules révertantes à. partir de cellules T-47D issues d'un carcinome ductal, les Inventeurs ont utilisé la même approche que celle mise en oeuvre dans le cadre de l'isolement des cellules révertantes obtenues à partir des cellules BT-20 et appelées BT-20S, à l'exception de la modification suivante et des caractéristiques de cette tumeur. Les cellules T-47D ont été obtenues à partir de la collection ATCC et propagées dans du milieu de croissance T-47D. Ces cellules ont été cultivées pendant 8 semaines avant que l'isolement des révertantes ne commence. Les cellules T-47D ont été infectées par une multiplicité d'infections (MOI) de 1 000 pfu/cellule et ont été réparties dans des plaques à 6 puits (TPP) à une densité de 42 500 cellules par puits. L'isolement des clones qui ont survécu à une infection par le parvovirus Hlwt, a commencé 4 semaines après l'infection. Les cellules ont été gardées dans du milieu conditionné et détaché du récipient de culture au moyen de la collagénase/dispase. Un clone a été sélectionné pour ses propriétés comprenant une réversion du phénotype malin, ce clone a été appelé T-47DS. Les cellules T-47DS ont été isolées 6 mois après l'infection avec le parvovirus Hlwt. Exemple 2C : Isolement de cellules révertantes à partir de la lignée CAMA-1 de cancer du sein Matériels - Cellules CAMA-1 : ATCC n HTB-21 Nombre de passages : 30 Espèce humaine, type caucasien, femme de 51 ans ; caryologie : nombre modal : 80, rang : 68 à 83, hypertriploïdie Tissu/organe : glande mammaire, sein Morphologie : patches adhérents aux cellules épithéliales Tumeur : adénocarcinome - Milieu de propagation des cellules CAMA-1 : . milieu essentiel minimum Eagle avec les sels Earle (Life Technologies) supplémenté avec : . e zu . 1 % d'acides aminés non essentiels MEM (Life Technologies) . 1 % de L-glutamine (Life Technologies) . 1 % de pyruvate de Na (Life Technologies) . 40 ug/ml de gentamycine (Lige Technologies) . 10 % de sérum bovin foetal (inactivité par la chaleur) (Bio Whittaker) - Trypsine/EDTA (Lifë Technologies) - Collagenase/dispase (Roche) Méthodes Pour isoler des cellules révertantes à partir de la lignée CAMA-1 d'adénocarcimone, la même approche a été utilisée que celle mise en oeuvre pour l'isolement des cellules révertantes à partir de la lignée BT-20 et appelées BT- 20S, à l'exception de la modification suivante et des caractéristiques de cette tumeur. La lignée cellulaire CAMA-1 a été obtenue à partir de la collection ATCC et propagée dans le milieu de croissance CAMA-1. CAMA-1 est une lignée cellulaire à croissance lente et a été adaptée à l'environnement pendant 8 semaines. Les cellules de CAMA-1 ont été infectées avec une multiplicité d'infection (MOI) de 1 000 pfu/cellule et ont été réparties dans des plaques à 6 puits (TPP) à une densité de 43 700 cellules/puits. L'isolement des clones qui ont survécu à l'infection du parvovirus Hlwt a commencé 10 semaines après l'infection. Les clones survivants ont été très rares et ont eu une croissance en patches avec des cellules qui y étaient attachées de façon lâche. Les cellules monoclonales ont été isolées avec une pipette et mises en croissance dans une plaque de type-1 collagène à 96 puits. Les cellules ont été conservées dans un milieu conditionné et détachées du récipient de culture au moyen de la collagénase/dispase. Un clone a été sélectionné pour ses propriétés comprenant une réversion du phénotype malin, ce clone a été appelé CAMA-1S. REVENDICATIONS 1. Cellules révertantes d'une lignée cellulaire issue d'une tumeur solide de cancer du sein susceptibles d'être obtenues par la mise en oeuvre d'un procédé comprenant les étapes : - d'infection des cellules de ladite lignée cellulaire avec un parvovirus Hl présentant une MOI (multiplicité d ! infection) comprise entre 10 et 1000 pfu/cellule, d'isolement et récupération des cellules ayant survécu à l'effet cytopathique du parvovirus Hl, ces cellules étant dites révertantes. 2. Cellules révertantes selon la revendication 1, caractérisées par le fait que lorsqu'elles sont cultivées dans des conditions de croissance normales : - elles forment un nombre de colonies réduit d'au moins 50 % par rapport au nombre de colonies formées dans les mêmes conditions par les cellules de la ligné cellulaire dont lesdites cellules révertantes sont issues, et - elles forment des colonies dont la taille est réduite d'au moins 40 % par rapport à la taille des colonies formées dans les mêmes conditions par les cellules de la lignée cellulaire dont lesdites cellules révertantes sont issues. 3. Cellules révertantes selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce que ladite lignée cellulaire est choisie parmi la lignée BT-20 (ATCC n HTB-19), la lignée T-47D (ATCC n HTB-133) et la lignée CAMA-1 (ATCC n HTB-21).