Brevet FR2826012A1 — publié le 20021220

L'invention concerne un complexe protéine-protéine impliqué dans la prédisposition aux cancers du sein et de l'ovaire. Plus particulièrement cette interaction protéine-protéine présente des applications pour le criblage de molécules ayant une activité thérapeutique dans le traitement et la prévention du cancer, ainsi que des applications diagnostiques de l'interaction elle-même ou des partenaires de cette interaction. Le cancer du sein est une affection très fréquente, qui touche près de 10 % des femmes du monde occidental. Il existe deux formes de ce cancer : une forme sporadique majoritaire et une forme familiale concernant 5 à 10 % des cas. Dans les familles prédisposées, la transmission du risque se fait selon un mode autosomal dominant (1), et les tumeurs mammaires sont fréquemment associées à d'autres cancers, notamment le cancer de l'ovaire. L'étude de familles prédisposées a permis d'identifier deux gènes majeurs de prédisposition au cancer du sein : BRCA1, localisé en 17q21 (2) et BRCA2, localisé en 13q12-13 (3). La majorité des cas familiaux de cancers du sein et/ou de l'ovaire sont liés à des mutations du gène BRCA1 (1). Le gène BRCA1 s'étend sur près de 81 kb (4) et code pour un transcrit ubiquitaire de 7,8 kb traduit en une protéine de 1 863 acides aminés. Le gène BRCA1 est très conservé, son homologue murin code pour une protéine de 1812 acides aminés identique pour 58 % à la protéine BRCA1 humaine (5). La fonction de la protéine BRCA1 est encore mal connue et l'étude de sa localisation cellulaire a fait l'objet de controverses. D'après les études les plus récentes, BRCA1 est une protéine nucléaire de 220 kDa (6). La forme raccourcie par épissage de l'exon 11, exon qui contient deux séquences codant pour des signaux de localisation nucléaire, est, elle, une protéine cytoplasmique de 110 kDa. Malgré la grande taille de cette protéine, seuls deux domaines remarquables ont été mis en évidence : un domaine en doigts de zinc à l'extrémité amino-terminale (2), et un domaine BRCT (BRCA1 Cterminale) à l'extrémité carboxy-terminale (7-9). Les données actuelles sur la fonction de la protéine BRCA1 suggèrent un rôle dans différents mécanismes biologiques : 1) une fréquente perte d'hétérozygotie concernant l'allèle sauvage BRCA1 a été mise en évidence dans les tumeurs mammaires (10), suggérant que BRCA1 puisse agir comme un suppresseur de tumeur ; 2) la protéine BRCA 1 semble jouer un rôle essentiel au cours du développement embryonnaire et de la différenciation de la glande mammaire chez la souris (11), et aussi chez l'homme (12) ; 3) BRCA1 serait un transactivateur de la transcription (13,14) et serait associée à l'ARN polymérase Il (15) ; 4) BRCA1 serait impliquée dans les voies de réparation de l'ADN (16-18) et le contrôle du cycle cellulaire (19) ; 5) Enfin, plusieurs protéines connues ont été identifiées comme étant des partenaires de BRCAL, dont BARD1 (20), p53 (21), c-Myc (22), Rad 51 (6), BRCA2 (23), CtlP (24), i'ARN hélicase A au sein du complexe ARN polymérase Il holoenzyme (25), le complexe histone déacétylase (26) ; leurs régions d'interaction sont réparties sur l'ensemble de la protéine BRCA1. En 1996, une recherche de similitudes de séquence entre la protéine BRCA1 et les protéines connues des banques de données a permis de mettre en évidence une région d'intérêt située à l'extrémité C-terminale de la protéine BRCA1 : le domaine BRCT (BRCA 1 C-terminal) (7). Une étude plus approfondie de cette région par la technique"Hydrophobic Cluster Analysis" (HCA) (8) a permis de caractériser le domaine BRCT. Il est constitué par la duplication d'un module d'une centaine d'acides aminés comportant des séquences très conservées. Ce module BRCT est retrouvé au sein d'une quarantaine de protéines présentes dans diverses espèces (9). Parmi les protéines à BRCT dont la fonction est caractérisée, la plupart sont impliquées dans les mécanismes de réparation de l'ADN et de contrôle du cycle cellulaire. Dans certaines de ces protéines, le module BRCT semble jouer un rôle majeur dans la médiation d'interactions protéiques (complexes XRCCA/ADN ligase IV (27), XRCC1/ADN ligase tii (28) et XRCC1/PARP (29)). Il serait aussi responsable de l'homodimérisation de la protéine XRCC1 (30). Dans la protéine BRCAI, le domaine BRCT est particulièrement bien conservé : l'identité de séquence avec la forme murine est de 72 % pour cette région contre seulement 58 % pour la protéine totale (5), et sa structure globulaire est conservée. La majorité des mutations germinales délétères, ne permettent pas la synthèse de cette région de BRCA1. De plus, un grand nombre de mutations faux-sens affectent directement ce domaine. Cette partie C-terminale semble par ailleurs essentielle à la fonction normale de la protéine : sa suppression conduit à retirer à BRCA1 sa capacité à inhiber la croissance des cellules cancéreuses, ainsi que sa fonction de transactivateur de la transcription. Enfin, des partenaires protéiques de BRCA1 interagissant spécifiquement avec son extrémité C-terminale contenant le domaine BRCT ont déjà pû être identifiés : BRCA2 (23), CtlP (24),l'ARN hélicase A (25) et le complexe histone déacétylase (26). Les travaux des inventeurs portant sur le rôle fonctionnel de BRCA1 ayant conduit à la présente invention ont permis de mettre en lumière une nouvelle interaction protéine-protéine impliquant d'une part la protéine BRCA1 et plus particulièrement le domaine BRCT situé à l'extrémité carboxyterminale de celle-ci et, d'autre part, une protéine connue, l'acétyl-Coenzyme A-carboxylase, forme a (AAC-a). La protéine BRCA1 et le gène codant pour cette protéine sont décrits dans EP 699 754 et EP 705 902. L'ACC-a est une protéine cytoplasmique de 265 kDa ayant une activité enzymatique et impliquée dans le contrôle de la biogénèse des acides gras à chaîne longue. Le gène ACC-a humain a été cloné en 1995 par Abu-Elheiga et coil. (31). Sa séquence est très conservée chez l'homme, le rat, le poulet et la levure, en particulier au niveau des sites de liaison à la biotine, à l'ATP et au coenzyme A. Des expériences de co-immunoprécipitation, avec un anticorps anti-Brca1, sur des Iysats cellulaires Bosc transfectés par la forme sauvage de la protéine Brca1 murine ou sa forme épissée AU ont été réalisées. Elles ont permis de confirmer que les deux formes de la protéine murine s'associent à l'ACC-a in vivo. De la même façon, la protéine BRCA1 entière humaine coprécipite avec l'ACC-a endogène de cellules Bosc transfectées. Afin de préciser le domaine d'interaction de l'ACC-a sur BRCAI, différentes protéines de fusion GST-BRCT ont été préparées et testées par cosédimentation sur des Iysats de fibroblastes murins NIH3T3, et ont permis de montrer qu'une forme plus longue du domaine BRCT (résidus 1512-1812), comme le domaine BRCT complet testé en premier lieu (résidus 1583-1812), interagissent avec l'ACC-a. En revanche, des protéines de fusion à la GST contenant, soit le module BRCT A seul, soit le module BRCT B seul, sont incapables de s'associer à l'ACC-a. Une protéine de fusion à la GST exprimant les 220 résidus amino-terminaux de la protéine Brca1 a permis de confirmer la spécificité de l'interaction de l'ACC-a avec l'extrémité carboxy-terminale de BRCA1. De nombreuses mutations familiales prédisposant au cancer du sein ont été localisées au niveau de la région carboxy-terminale de BRCA1. Afin de mesurer l'incidence de telles mutations sur l'interaction ACC-a/BRCAl, une première protéine de fusion a été préparée et testée en co-sédimentation. La mutation choisie, R1835X, est située dans le domaine BRCT le plus distal. Elle introduit un codon stop empêchant la synthèse des 29 derniers acides aminés de la protéine qui présente donc un domaine BRCT incomplet. La protéine de fusion à la GST contenant la mutation W1777X, qui mime la mutation germinale humaine R1835X sur la protéine murine, abolit l'interaction de Brca1 avec l'ACC-a. Compte tenu du rôle important de l'extrémité C-terminale de la protéine BRCA1 dans la prédisposition au cancer du sein, l'interaction BRCA1/ACC-a pourrait être mise à profit de façon avantageuse pour la mise au point de molécules à visée thérapeutique. L'invention a pour objet un complexe moléculaire comprenant : - un polypeptide correspondant aux résidus d'acides aminés 1640 à 1864 de la protéine BRCA1 humaine ou comprenant le domaine correspondant d'une espèce animale, notamment d'un mammifère non humain (protéine Brca1 murine, acides aminés 1583-1812), et ta protéine ACC-a humaine ou la protéine correspondante d'une espèce animale notamment d'un mammifère non humain. L'invention a également pour objet une méthode de criblage de molécules capables de moduler l'interaction entre BRCA1 et ACC-a. Cette méthode comprend les étapes suivantes : a) mise en présence du peptide comprenant le domaine minimal de liaison de BRCAI, tel que défini ci-dessus, avec un peptide comprenant le domaine minimal de ACC-a, dans un milieu biologique, un des peptides au moins étant marqué ; b) addition d'une molécule candidate capable de moduler l'interaction ; c) incubation des peptides comprenant respectivement le domaine minimal de liaison de BRCA1 à ACC-a et le domaine minimal de liaison d'ACC-a à BRCA1 en présence de la molécule candidate dans des conditions et pour une période de temps suffisante pour que ladite liaison entre les domaines respectifs de BRCA1 et ACC-a ait lieu ; d) quantification du nombre de molécules marquées liées en présence de concentrations croissantes de la molécule candidate. Parmi ces molécules, certaines sont des agonistes, d'autres des antagonistes de l'interaction BRCA 1/ACC-a. Des molécules candidates ainsi déterminées capables de moduler l'interaction entre BRCA1 et ACC-a peuvent être utilisées pour le traitement et/ou la prévention de cancers du sein et/ou de l'ovaire, notamment des formes familiales du cancer du sein et/ou de l'ovaire. L'invention a également pour objet une méthode de diagnostic d'une prédisposition au cancer du sein et de l'ovaire chez un sujet humain de sexe féminin dans laquelle on recherche une altération germinale (un allèle) de la séquence du gène ACC-a ou de la séquence de régulation de ce gène, dans un tissu dudit sujet, ladite altération étant indicative d'une prédisposition audit cancer. L'invention a également pour objet une méthode de diagnostic chez un sujet humain d'une lésion néoplasique associée au locus du gène ACC-a, qui comprend la recherche d'une altération de la séquence (altération somatique) du gène ACC-a ou de la séquence de régulation de ce gène, dans un prélèvement de ladite lésion, ladite altération étant indicative d'une néoplasie. Ladite lésion est avantageusement une lésion cancéreuse du sein ou de l'ovaire. Les mutations peuvent prendre un grand nombre de formes. Les formes plus sévères consistent en des mutations entraînant un déplacement du cadre de lecture ou de grandes délétions dont le résultat est un gène codant pour une protéine anormale, ou encore des mutations modifiant de façon substantielle l'expression de la protéine. Des mutations moins sévères comprennent des petites délétions ne modifiant pas le cadre de lecture et des substitutions non conservatrices d'acides aminés qui auraient un effet significatif sur la protéine produite, notamment des modifications de résidus d'acides aminés en particulier une substitution d'un acide aminé basique par un acide aminé acide ou vice versa ou d'un acide aminé hydrophobe par un acide aminé hydrophile ou vice versa ou d'autres mutations qui affectent la structure secondaire, tertiaire ou quaternaire de la protéine. On peut également citer des mutations n'interférant pas avec la fonction de la protéine mais qui seraient des allèles en déséquilibre de liaisons avec lesdites mutations. Les mutations silencieuses ou résultant en des substitutions d'acides aminés de même types biochimique ne sont a priori généralement pas susceptibles d'interférer avec la fonction de la protéine. Conformément à la méthode de diagnostic et de pronostic de la présente invention, on détecte une altération du locus du gène ACCa de type sauvage. En outre, la méthode peut être mise en oeuvre pour détecter le locus du gène AACa de type sauvage et confirmer l'absence de prédisposition à ce locus donné. Les"altérations du gène de type sauvage"comprennent toutes formes de mutations incluant les délétions, les insertions, les mutations ponctuelles pour les régions codantes et non codantes. Les délétions peuvent affecter le gène entier ou uniquement une partie du gènes. Les mutations ponctuelles peuvent résulter en un codon stop entraînant une modification du cadre de lecture ou en substitution d'acides aminés. Les mutations somatiques sont celles qui se produisent uniquement dans certains tissus, par exemple tels que les tissus tumoraux mais qui ne sont pas héritées dans la lignée germinale. Les mutations germinales peuvent être trouvées dans tous types de tissus de l'organisme et sont héréditaires. Lorsqu'un seul allèle est muté de façon somatique, cette mutation est généralement indicatrice d'un état néoplasique précoce. Lorsque les deux allèles sont mutés de façon somatique, les mutations sont généralement indicatrices d'un stade néoplasique tardif. L'identification de mutations du gène ACCa fournit ainsi des informations quant au diagnostic et au pronostic. En outre, on suppose que de nombreuses mutations retrouvées dans les tissus tumoraux sont du type diminuant l'expression du gène ACCa. L'invention a également pour objet une méthode de détermination in vitro d'une prédisposition au cancer du sein et/ou de l'ovaire, dans laquelle on détermine une modification de l'expression du gène codant pour ACC-a humain ou de l'activité biologique de l'enzyme par rapport à une population de sujets standards ne présentant pas de prédisposition à développer un cancer du sein et/ou de l'ovaire, ces modifications de l'expression ou de l'activité étant associées à une variation du risque de développer un cancer du sein et/ou de l'ovaire, soit dans la population générale, soit chez les porteuses de mutations germinales de BRCA1. Le niveau d'expression du gène ACC-a peut être déterminé par tout moyen connu, soit au niveau du transcrit (ARNm), de la protéine, ou de l'activité biologique. Ces mesures pourront soit être effectuées dans les tissus cibles (sein, ovaire) à partir de biopsies, soit à partir d'autres matériels biologiques tels que des prélèvements sanguins. Le taux de l'ARNm est analysé, après extraction de l'ARNm, par amplification par RT-PCR (Réaction de Polymérisation en chaîne par transcription inverse), à l'aide d'amorces spécifiques appropriées. Les mutations de ce type surviennent notamment dans les régions de régulation, par exemple dans la région du promoteur du gène et conduisent à une absence ou une diminution de l'expression de l'ARNm. On peut également citer des mutations ponctuelles abolissant le traitement efficace de l'ARNm ou conduisant à une diminution de la stabilité de l'ARNm ou de l'efficacité de la traduction. La méthode de recherche de mutations de l'invention comprend la comparaison de la séquence du gène ACC-a dudit échantillon avec la séquence de type sauvage du même gène. La recherche des mutations peut être effectuée à l'aide de toute technique traditionnellement utilisée dans le domaine. Généralement la méthode utilisée comprend une première étape d'amplification de la séquence du gène ACC-a d'interêt, notamment une méthode d'amplification par PCR (réaction de polymérisation en chaîne, dite Polymerase chain reaction ), à l'aide d'amorces appropriées. Après amplification, la séquence d'acide nucléique résultante peut être séquencée ou utilisée comme substrat pour des sondes d'ADN. On peut citer également des méthodes détectant une variation de la séquence d'ADN autres que le séquençage, en particulier la méthode d'analyse de polymorphisme de conformation de brin simple (SSCA) décrite par Orita et al, 1989. Toutefois, cette méthode ne détecte pas toutes les modifications de séquences, en particulier lorsque le format d'ADN atteint une longueur supérieure à 100 paires de bases mais peut être optimisée pour détecter la plupart des variations de la séquence d'ADN. D'autres approches sont basées sur la détection de mésappariements entre deux brins d'ADN complémentaires et comprennent l'électrophorèse sur gel dénaturant (DGGE de Sheffield et al, 1991), la méthode d'analyse d'hétéroduplex (HA) décrite par White et al, 1992 et la méthode de clivage chimique de mésaparriements (CMC décrite par Grompe et al, 1989) ou la PCR spécifique d'allèles. Toutefois, ces méthodes ne détectent généralement pas de grandes délétions ou de duplications/insertions ni de mutations de régions de régulation qui affectent la transcription ou la traduction d'un produit. D'autres méthodes capables de détecter ce type de mutations peuvent être trouvées dans l'ouvrage de Grompe et al, (1993). Lorsqu'une mutation est connue, une approche pour la détection peut être l'hybridation d'oligonucléotides spécifiques d'allèle, qui peut être utilisée pour cribler de manière rapide un grand nombre d'échantillons pour la même mutation. L'invention concerne également une méthode de détermination in vitro d'une prédisposition au cancer du sein et/ou de l'ovaire, dans laquelle on détermine une modification de l'expression du gène codant pour ACC-a humain ou de l'activité biologique de l'enzyme par rapport à une population de sujets standards ne présentant pas de prédisposition à développer un cancer du sein et/ou de l'ovaire, un taux d'expression ou une activité anormaux du gène ACC-a humain étant associés à une variation du risque de développer un cancer du sein et/ou de l'ovaire, soit dans la population générale, soit chez les porteuses de mutations germinales de BRCA1. Les exemples suivants illustrent l'invention : PROCEDURE EXPERIMENTALE - Constructions plasmidiques - Vecteurs d'expression eucaryotes : Les plasmides pUHD 10,3 exprimant soit Brca1 de type sauvage, soit la forme A11, ont été préparés comme décrit (32). Le plasmide pcDNA3ss- BRCA1wt exprimant la forme humaine de BRCA1 a été précédemment décrite (6). - Vecteurs d'expression dans les bactéries Le plasmide pGEX-BRCT a été obtenu par amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) des nucléotides 4747 à 5436 de Brca1 en utilisant l'ADNc de Brca1 murin cloné en tant que matrice, et les amorces suivantes : 5'-GCGAATTCACATCTTCAGAAGAAAGAGC-3'et 5'GCGTCGACTTAATCATTGGAGTCTTGTGG-3'. Le produit de réaction de polymérisation en chaîne de 0,7 kb a été cloné dans les sites EcoRI/Sa/1 de pGEX-4T-1 (Amersham Pharmacia Biotech). Des constructions plus courtes avec les premier ou second modules du tandem BRCT ont été obtenues avec les amorces suivantes : 5'-GCGAATTCACATCTTCAGAAGAAAGAGC-3'et 5'- GCGTCGACTCAGCCCTTGAAGAGCTTTTCC-3'pour la construction pGEXBRCT A, 5'-GCGAATTCCGGGAAAAGCTCTTCAAGG-3'et 5'- GCGTCGACTTAATCATTGGAGTCTTGTGG-3'pour la construction pGEXBRCT B. Une forme plus longue pGEX-BRCT L contenant les nucléotides 4534 à 5436 de Brca1 a également été préparée en utilisant les amorces suivantes : 5'-GCGAATTCGAAGGAACCCCATACCTG-3'et 5'- GCGTCGACTTAATCATTGGAGTCTTGTGG-3'. Un mutant pGEX-BRCT (M) a été produit avec les mêmes amorces que celles utilisées pour GST-BRCT de type sauvage en utilisant un ADNc Brca1 ayant la mutation non-sens 1777X, en tant que matrice. Le plasmide pGEX-BRCTh exprimant la forme humaine du tandem BRCT a été obtenu par amplification des nucléotides 4917 à 5592 en utilisant l'ADNc de BRCA1 inséré dans pcdna3 ss, et les amorces suivantes : 5'- GCGGATCCACAGCTTCAACAGAAAGGG-3'et 5'GCGTCGACTCAGTAGTGGCTGTGGGG-3'. - Culture cellulaire : Les cellules ont été cultivées dans un milieu DMEM additionné de 10 % de sérum fatal de veau. Les cellules MCF7 ont été cultivées dans le même milieu avec 5 mg/ml d'insuline. Pour le radiomarquage, les cellules ont été cultivées pendant une heure dans un milieu DMEM sans méthionine, puis pendant trois heures dans un milieu DMEM sans méthionine contenant 250 uCi de méthionine marquée au [35S]. Pour la transfection, la méthode standard de précipitation au phosphate de calcium a été utilisée (Gibco BRL) avec 5 pg d'ADN plasmidique total. Des cellules ont été récoltées 48 heures après la transfection. - Essais de co-sédimentation avec GST : Les protéines de fusion avec GST ont été synthétisées dans Escherichia coli, souche JM 109 (Promega) transformées avec pGEX-4T-1, pGEX-BRCT, pGEX-BRCT A, pGEX-BRCT B, pGEX-BRCT L, pGEX-BRCT M ou pGEX-BRCTh. Elles ont été purifiées par chromatographie d'affinité sur Glutathione-Sepharose. L'essai de liaison par co-sédimentation a été réalisé in vitro en incubant des Iysats cellulaires, en présence de protéines GST non recombinantes ou de protéines de fusion-GST et de billes GlutathioneSepharose. 10 ug de GST ou GST-fusion ont été utilisés dans chaque essai de liaison. Les complexes protéiques ont été soigneusement lavés (50 mM Tris HCI pH 7,6, 100 mKCI, 0,05% Tween 20,1 mM DTT, 0,2 mM PMSF) pour éliminer les interactions protéiques non spécifiques et libérés par un chauffage à 100 C dans un tampon de charge 5X SDS-PAGE et 100 mM DTT. Les protéines ont été analysées par SDS-PAGE et visualisées par autoradiographie, coloration à l'argent (Bio-Rad SilverStain) ou coloration au Bleu de Comassie selon la nature du Iysat utilisé. - Préparation des extraits cellulaires totaux : Les cellules ont été lisées de manière douce par choc thermique (azote/37 C) dans le tampon suivant : 25 mM Tris HCI pH 7,6, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,2 mM PMSF, 10 ug/ml de leupeptine, pepstatine A et aprotinine. - Immunoprécipitation et analyse en Western Blot : Les immunoprécipitations de protéines endogènes ou surexprimées in vivo ont été réalisées dans un tampon de lyse avec 1 ug d'anticorps spécifique et la protéine G-sépharose pendant deux heures à 4 C. Après précipitation, les billes ont été lavées à trois reprises avec le tampon de lyse et les protéines ont été éluées par chauffage pendant cinq minutes dans le tampon de charge SDS. Les protéines ont été séparées sur des gels de polyacrylamide de 6 à 10 % contenant du SDS (SDS-PAGE) et chargées sur des membranes de poly (difluorure de vinylidène) (PVDF) (Immobilon-P, Millipore). Les membranes ont été saturées dans du TBS contenant 0,05 % de Tween 20 et 5 % de poudre de lait. Les incubations avec les anticorps primaires et secondaires ont été réalisées dans du TBS contenant 0,05 % de Tween 20 et 2 % de poudre de lait, et les protéines ont été détectées par chimioluminescence (ECL, Amersham Pharmacia Biotech ou Super Signal West Dura Extended, Pierce). - Fractionnement subcellulaire : La fraction cytosolique a été obtenue après incubation des cellules pendant 10 minutes sur de la glace dans un tampon RYMO (10 mM Tris HCI pH 7,6, 1 mM Mg ! 2, 0,5 mM de CaCI2, 0,25M de saccharose, 0,6 % NP40), et centrifugation (2 000 rpm, 5 minutes). Le culot nucléaire a ensuite été clarifié pendant 10 minutes sur de la glace dans un tampon RIPA (137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 25 mM Tris pH 8,1 % NP 40) et centrifugé à 13 000 rpm pendant cinq minutes pour éliminer les matières insolubles. Toutes les fractions ont été ajustées à 150 mM NaCI, 25 mM Tris pH 7,6 et des inhibiteurs de protéase ont été ajoutés (2 mM PMSF, 10 0 g/ml de leupeptine, pepstatine A et aprotinine). Des fractions ont été testées pour leur concentration en protéines par la méthode de Bradford (Bio-Rad Protein Assay), et soumises à des analyses par Western Blot avec des anticorps dirigés contre la p-tubuline (KMX-1, Roche Molecular Biochemical) ou p300 (N-15, Santa Cruz Biotechnology). - Séquençage peptidique par spectrométrie de masse - digestion sur gel : La protéine de 210 kDa d'intérêt colorée au Bleu de Comassie a été excisée du gel SDS-PAGE puis lavée avec 50 mM de tampon d'acétate d'ammonium, pH 7 pendant une heure. Le surnageant a été jeté et la tranche de gel lavée dans une solution 50/50 % (v/v) d'acétonitrile/25 mM d'acétate d'ammonium, pH 7,5 pendant une heure et enfin avec de l'eau pure avant déshydratation complète dans une centrifugeuse sous vide. Les pièces de gel ont été réhydratées avec une quantité minimale d'une solution de trypsine porcine modifiée (PROMEGA Madison, WI, USA) contenant 0,25 pg de protéase. Si nécessaire, du tampon supplémentaire a été ajouté jusqu'à ce que la pièce de gel ait été complètement réhydratée. La digestion a eu lieu à 370C pendant quatre heures. -Spectrométrie de masse : SM-MALDI : Les spectres de masse des produits de digestion tryptique ont été obtenus sur un spectromètre de masse MALDI-TOF Voyager Elite X1 (Perspective Biosystems), équipé d'une extraction différée. L'instrument a été utilisé en mode reflectron. 1 ut du produit de digestion a été déposé directement sur le support d'échantillon et mélangé avec 1 ut d'une solution saturée d'acide 2,5-dihydrobenzoïque. Une liste de masses de peptides a été obtenue pour chaque produit de digestion protéique. Ce profil de masses peptidiques a ensuite été traité avec un logiciel approprié dans le but d'identifier les protéines (MS- FIT : http : //prospector. ucsf. edu/ucsfhtml3. 2/msfit. htm, ou PROFOUND : http ://129. 85. 19. 192/prowlcgi/ProFound. ex). Les peptides tryptiques de la protéine de 210 kDa ont été identifiés à partir de la carte de masse des fragments tryptiques. Les produits de digestion tryptiques ont été extraits à deux reprises avec une solution à 50/50 % (v/v) d'acétronitrile/25 mM d'acétate d'ammonium pH 7,5. La solution de digestion et les extraits ont été rassemblés, séchés dans une centrifugeuse sous vide et dessalés avec ZipTip C18 (Millipore, Bedford, Ma, USA) avant analyse SM/SM. - SMISM-nanospray : Un instrument Q-TOF (Micromass, Manchester, Royaume Uni) a été utilisé avec une source ionique Z-Spray fonctionnant en mode"nanospray". Environ 3 à 5 pI de chaque échantillon dessalé ont été introduits dans une aiguille (aiguille de prélèvement moyenne, PROTAN Inc., Odense, Danemark) pour la réalisation des expérimentations SM/SM. Le voltage capillaire a été réglé à un voltage moyen de 1 000 volts et le cône échantillon à 50 volts. Du glufibrinopeptide a été utilisé pour calibrer l'instrument pour le mode SM/SM. Les spectres SM/SM ont été transformés en utilisant MaxEnt3 (MassLynx, Micromass Ltd), et les séquences d'acides aminés ont été analysées à l'aide de PepSeq (BioLynx, Micromass Ltd). Les séquences d'acides aminés, les fragments de séquences ou les fragments ioniques peptidiques qui ont pu être déterminés ont été utilisés pour cribler des banques de protéines et d'EST à l'aide des logiciels appropriés : Pepfrag (http : l/prowl 1. rockefeller. edu/prowi/pepfragch. html), Scan (http : //dna. standford. edu/scan) ou BLAST pour les recherches d'homologies (http : //www. ncbi. nim. nih. gov/blast/blast). - Séquençage peptidique par dégradation d'Edman : L'essai de co-sédimentation préparatif a été réalisé à partir de 5. 107 cellules NIH3T3 et séparé par SDS-PAGE suivi d'une coloration au noir amido. Dans ces conditions, la bande d'intérêt contenait une quantité suffisante de protéines (25 pmoles correspondant à 5 ug de la protéine 210 kDa) pour être analysée par séquençage peptidique. La tranche de gel de polyacrylamide correspondant à la bande de 210 kDa a été excisée et incubée avec une solution de 0,05 Tris HCI pH 8,6/0, 03 % SDS contenant 0, 4 ug d'endolysine à 350C pendant 18 heures. Les peptides endolytiques ont été séparés par HPLC sur une colonne DEAE-C18 avec un gradient acétonitrile/TFA à 0,1 %. Le séquençage des peptides isolés a été réalisé conformément à la dégradation d'Edman sur un séquenceur Procise d'Applied Biosystems. Les séquences d'acides aminés ont servi à cribler la banque de données protéique pour la recherche d'homologies : BLAST (http ://www. ncbi. nim. nih. gov/blast/blast), ExPASy (http : //www. expasy. ch). RESULTATS : - Essais de co-sédimentation avec GST et isolement de la protéine cytoplasmique interagissant avec Brca 1 : Pour identifier des protéines qui interagissent avec le tandem formé des deux modules BRCT de Brca1, les inventeurs ont réalisé un essai de co-sédimentation avec GST à l'aide de la lignée cellulaire de fibroblastes murins NIH3T3. Une protéine de fusion contenant les acides aminés 1583 à 1812 de Brca1 murin, nommée GST-BRCT, a été construite, exprimée dans Escherichia coli, et purifiée sur des billes de glutathione-sepharose. Des Iysats de cellules entières ont été préparés à partir de 7. 106 cellules NIH3T3 marquées à la 35S méthionine. Les lysats ont été pré-purifiés à l'aide de billes de glutathione-Sépharose. Ils ont été ensuite mis en contact avec soit des billes de glutathione seules, soit des billes de glutathione additionnées de GST, soit des billes de glutathione additionnées de GST-BRCT. Après plusieurs lavages, les complexes de co-sédimentation ont été séparés par SDS-PAGE et visualisés par auto-radiographie. Une bande majeure de 210 kDa était visible uniquement dans l'échantillon GST-BRCT (figured). Pour déterminer la localisation subcellulaire de la protéine interagissant avec le tandem BRCT, des cellules NIH3T3 ont été séparées en fractions nucléaire et cytoplasmique. Un essai de cosédimentation réalisé sur ces deux fractions a été analysé par SDS-PAGE suivi d'une coloration par l'argent. Les résultats ont montré que la protéine d'interaction était majoritairement cytoplasmique. Le bon fractionnement de ces cellules a été contrôlé à l'aide d'anticorps dirigés contre p300 nucléaire et la-tubuline cytoplasmique. - identifiée comme étant la protéine interagissant avec Brca 1 : Pour identifier la protéine qui interagit avec le tandem BRCT de Brca1, un essai de co-sédimentation préparatif a été réalisé à partir de 5. 107 cellules NIH3T3 (représentant approximativement 10 essais de cosédimentation analytique avec GST, décrits ci-dessus) et séparés par SDSPAGE. Dans ces conditions, la bande de 210 kDa pouvait être détectée par coloration au Bleu de Coomassie. Ceci indique que cette bande contient une quantité suffisante de protéines pour être analysée par spectrométrie de masse. Des tranches de gel de polyacrylamide correspondant à la bande de 210 kDa ont été excisées. La protéine a été digérée en plusieurs peptides de façon enzymatique par la trypsine, puis le mélange a été analysé par MALDISM en utilisant le mode reflectron. Les masses mono-isotopiques de peptides provenant de la digestion protéolytique ont été comparées aux masses d'une banque de données peptidique, calculée à partir de la banque de donnée protéique nr de NCBI avec des tolérances de masse de 0,2 Da et avec des restes de méthionine partiellement oxydés (valeurs m/z listées dans des programmes profound et sm-fit (voir procédure experimental) : 920.47, 931.52, 938.49, 948.51, 1034.51, 1045.62, 1065.63, 1084.51, 1087.66, 1092.59, 1097.66, 1165.73, 1179.76, 1199.73, 1232.77, 1235.68, 1267.70, 1300.64, 1308.75, 1322.72, 1365.71, 1438.79, 1493.77, 1571.72, 1791.77). Les autres paramètres étaient les suivants : domaine de variation de la masse protéique de 100-300 kDa ; cystéines non modifiées, maximum de trois sites de clivage non pris en compte. La protéine arrivant en tête était l'acétyl-CoA carboxylase de Rattus norvegicus (EC 6.4. 1.2 ; swiss prot code d'accès P 11497) avec 16 peptides possibles sur les 25 peptides listés avait une probabilité proche de 1 (9. ge-1) et se distinguait nettement du candidat venant en deuxième position trouvé lors de la recherche (protéine KIAA 1286 d'homo sapiens ; probabilité de 4.0e-3). Ce résultat a été confirmé par des expérimentations sm/sm sur des ions m/z 634.32, 720.36 et 786.33 correspondant aux ions doublement chargés de peptides 1266.7, 1438.79 et 1570.7 Da réalisés avec un Q-TOF (voir procédure experimental). Le spectre de reconstruction sm/sm de 1570.7 Da est montré dans la figure 2. Les séquences peptidiques déduites des ions b et y ont été utilisées pour cribler le programme BLAST. Les séquences VEVGTEVTDYR, EASFEYLQNEGER et ta séquence partieite du peptide 1438.79 (DFTVASP) ont montré 100 % d'homologie avec l'acétylCoA carboxylase de Rattus norvegicus et confirmé les résultats précédents. Pour confirmer l'identité de la protéine interagissant avec BRCT, un microséquençage du peptide a également été réalisé. Un essai de cosédimentation préparatif du GST utilisant 5. 107 cellules NIH3T3 a été réalisé pour obtenir 25 pmoles de protéine destinés à être digérés et séquencés. Une tranche de gel de polyacrylamide contenant 5 ug de la bande de 210 kDa d'intérêt (approximativement 25 pmoles) a été excisée. La protéine a été digérée enzymatiquement en peptides par l'endolysine, puis les peptides ont été séparés par chromatographie sur DEAE-C18 et séquencés. Les séquences KAAEEVGYP ET KDLVEWLEKs ont été obtenues. Comme attendu, elles ont montré 100 % d'homologie avec l'acétyl-CoA carboxylase de Rattus norvegicus (EC 6.4. 1.2 ; swiss prot numéro d'accès P 11497). Deux formes majeures d'ACC d'origine animale ont été décrites jusqu'à présent : l'ACC-a de 265 kDa et l'ACC-ss de 280 kDa. Les 5 séquences peptidiques obtenues ici présentent 100 % d'homologie avec l'ACC-a du rat. Le gène ACC-a murin n'a pas été cloné. Néanmoins, la séquence codante du gène a est bien conservée chez les différentes espèces. Ainsi, la séquence d'ADNc de l'ACC-a de rat (33) est hautement similaire (90 %) à la séquence de l'ACC-a humaine (31). Le site de liaison à la biotine hautement conservé et les sites de liaison putatifs à l'ATP et au coenzyme A sont identiques chez l'homme, le rat et la levure. - LACC-A interagit spécifiquement avec l'intégralité du tandem des modules BRCT de Brca 1 : De façon à cartographier le domaine d'interaction de ACC-a sur le tandem BRCT de Brca1, des essais de co-sédimentation avec six protéines de fusion distinctes ont été réalisés. Les complexes protéiques de cosédimentation ont été résolus par SDS-PAGE et visualisés par Western-Blot. La protéine ACC contenant la biotine a été détectée en utilisant de la peroxydase couplée à la streptavidine, la streptavidine ayant une haute affinité pour la biotine est ainsi une sonde très sensible pour détecter l'ACC (34). Les résultats montrent que le fragment GST-BRCT L contenant les résidus 1512- 1812 de Brca1, de même que GST-BRCT, interagissent avec ACC-a. Toutefois, le fragment GST-BRCT A auquel manquent les séquences du domaine B de BRCT est incapable de s'associer avec l'ACC-a. De même, le fragment GST-BRCT B auquel manquent les séquences du domaine BRCT A ne lie pas ACC-a. GST-Brca1 N contenant les 220 résidus N-terminaux de Brca1, de même que GST tout seul, n'ont pas été capables de capturer ACC-a, ce qui démontre la spécificité de l'interaction entre ACC-a et la région carboxyterminale de Brca 1. De nombreuses mutations familiales ont été retrouvées dans le segment carboxy terminal de BRCA1. L'une d'entre elles, R1835X, localisée dans le domaine distal de BRCT, introduit un codon non-sens qui supprime les 29 derniers acides aminés de Brca1 et rompt ainsi le second domaine BRCT. Pour déterminer si cette mutation pouvait abolir l'interaction du tandem BRCT avec ACC-a, la mutation W1777X qui mime la mutation humaine R1835X a été introduite sur l'ADNc murin de Brca1 et un essai de co-sédimentation a été réalisé avec le tandem muté (GST-BRCT M). La mutation germinale abolit l'interaction avec ACC-a. L'ensemble de ces données indique que la séquence minimale Brca 1 requise pour l'association avec ACC-a correspond précisément au tandem des domaines BRCT, ce qui signifie que les deux motifs BRCT sont impliqués dans l'interaction avec ACC-a. - ACC- se lie au tandem de modules BRCT dans les cellules épithéliales de glande mammaire : Les inventeurs ont démontré que le tandem BRCT de Brca1 se liait à l'ACC-a endogène dans des fibroblastes murins. Etant donné que le gène BRCA1 est associé à une forme familiale du cancer du sein, les inventeurs ont recherché l'interaction entre le tandem BRCT et ACC-a dans la glande mammaire. Les essais de co-sédimentation GST ont été réalisés avec quatre lignées cellulaires épithéliales murines mammaires, à savoir Be4a, 13G2, Tac-2 et J3B1, et les protéines liées ont été détectées à l'aide de peroxydase couplée à la streptavidine. La capacité du tandem BRCT à lier l'ACC-a est conservée dans toutes ces lignées cellulaires. Un essai a été réalisé pour examiner si le tandem BRCT de BRCA1 murin pouvait également s'associer avec la forme humaine de l'ACCa présente dans la glande mammaire. A cet effet, ils ont réalisé un essai de cosédimentation avec deux lignées cellulaires d'épithélium mammaire humain (HBL 100 et MCF 7). Une étude par Western Blot, à I'aide de peroxydase couplée à la streptavidine, a montré que la capacité du tandem BRCT murin à lier l'ACC-a était conservée dans les cellules épithéliales mammaires humaine. Les séquences des deux domaines BRCT de Brca1 murin partagent 75 % et 58 % d'identité avec ceux de la protéine BRCA1 humaine, respectivement (8,35). De plus, la séquence d'ADNc de l'ACC-a de rat (33) est hautement similaire (90 %) avec la séquence d'ACC-a humaine (31). Les résultats représentés ici indiquent que le tandem murin BRCT se lie aussi bien à la forme ACC-a humaine qu'à la forme murine. En conséquence, pour caractériser davantage cette interaction, les inventeurs ont recherché la capacité du tandem BRCT humain à lier les formes murines et humaines de l'ACC-a. Des essais de co-sédimentation ont été réalisés sur les lignées cellulaires de fibroblastes NIH3T3 murin et la lignée épithéliale mammaire humaine HBL 100. Les résultats démontent que l'interaction entre le tandem BRCT humain et l'ACC-a est maintenue dans les espèces murine et humaine. Ensemble, ces données démontrent une interaction protéineprotéine bien conservée entre le tandem BRCT de BRCA1 et la protéine ACCa dans les espèces murines et humaines. BRCA et sa forme courte Brcal-All s'associent in vivo à l' ACC-a : Afin de déterminer si la protéine Brca1 peut interagir avec ACC-a in vivo, des expériences de co-immunoprécipitation ont été réalisées avec des Iysats de cellules Bosc transfectées. A cet effet, les cellules Bosc ont été transfectées avec des plasmides d'expression codant pour Brca1 de longueur totale ou la forme courte Brca1-A11. Les Iysats préparés à partir de ces cellules transfectées ont été immunoprécipités avec l'anticorps D16 dirigé contre Brca1 et chaque immuno-précipité a été fractionné par SDS-PAGE. La présence de t'ACC-a endogène dans ces immuno-précipités a alors été déterminée par Western blot à l'aide de peroxydase couplée à la streptavidine. L'ACC-a endogène a été co-immunoprécipitée à partir de cellules exprimant Brca1 et de cellules exprimant la forme courte Brca1-11. Pour étudier plus avant si la forme humaine de BRCA1 pouvait s'associer avec l'ACC-a endogène, des cellules Bosc ont été transfectées avec un plasmide exprimant la protéine BRCA1. Des Iysats ont été immunoprécipités avec l'anticorps OP92 dirigé contre BRCA1 et la présence d'ACC-a endogène dans les coimmunoprécipités a été analysée par Western Blot à l'aide de peroxydase couplée à la streptavidine. Comme attendu, BRCA1 humain coprécipite avec l'ACC-a endogène. Parce que BRCA1 est majoritairement une protéine nucléaire, les résultats obtenus dans les essais de co-sédimentation et les résultats concernant la localisation cytoplasmique de ACC-a soulèvent la question de la signification physiologique de l'interaction entre BRCA1 et ACC-a. Les inventeurs ont réexaminé la localisation sub-cellulaire de BRCA1 et de l'isoforme murine Brat-ah exprimé de façon transitoire dans des cellules Bosc. A cet effet, des techniques de fractionnement ont été utilisées pour étudier la localisation sub-cellulaire de BRCA1 et de la forme Brca1-A11 murine (32). Après fractionnement cellulaire, des extraits nucléaires et cytoplasmiques des cellules transfectées ont été séparés par SDS-PAGE et soumis à une analyse par Western Biot. Comme attendu, la protéine BRCA1 humaine endogène a été détectée dans la fraction nucléaire tandis que BRCA1 exprimée de façon ectopique était majoritairement cytoplasmique. Ces résultats sont en accord avec les observations précédentes (32). En outre, l'isoforme Brca1-11 murine exogène était majoritairement présente dans la fraction cytoplasmique. Pris ensemble, ces résultats indiquent que l'ACC-a qui est localisée dans le cytoplasme lie les protéines BRCA1 de longueur totale et la forme courte BRCA 1- 11 exprimées de façon ectopique, via le tandem des domaines BRCT présents à la fois dans les formes humaines et murines. BIBLIOGRAPHIE 1. Ford D. et coil. (1998). Genetic heterogeneity and penetrance analysis of the BRCA 1 and BRCA2 genes in breast cancer families. Am. J. Hum. Genet. 62 : 676-689. 2. Miki Y. et coil. (1994). A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA 1. Science. 266 : 66-71. 3. Wooster R. et coll. (1995). Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2. Nature. 378 : 789-792. 4. Smith T. M. et coil. (1996). 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Complexe moléculaire comprenant : - un polypeptide correspondant aux résidus d'acides aminés 1640 à 1864 de la protéine BRCA1 humaine ou comprenant le domaine correspondant d'une espèce animale, notamment d'un mammifère non humain, et - la protéine ACC-a humaine ou la protéine correspondante d'une espèce animale, notamment d'un mammifère non humain. 2. Méthode de criblage de molécules capables de moduler l'interaction entre BRCA1 et ACC-a comprenant les étapes suivantes : - mise en présence du peptide comprenant le domaine minimal de liaison de BRCA 1 tel que défini à la revendication 1 avec un peptide comprenant le domaine minimal de ACC-a, dans un milieu biologique, un des peptides au moins étant marqué ; - addition d'une molécule candidate capable de moduler l'interaction - incubation des peptides comprenant respectivement le domaine minimal de liaison de BRCA1 à ACC-a et le domaine minimal de liaison d' ACC-a à BRCA1 en présence de la molécule candidate dans des conditions et pour une période de temps suffisante pour que ladite liaison entre les domaines respectifs de BRCA1 et ACC-a ait lieu ; - quantification du nombre de molécules marquées liées en présence de concentrations croissantes de la molécule candidate.