Brevet FR2831084A1 — publié le 20030425

PROCEDE ET SYSTEME POUR MANIPULER PAR DIELECTROPHORESE DES PARTICULES DIELECTRIQUES, EN PARTICULIER DES CELLULES BIOLOGIQUES. L'invention concerne un procédé et système pour manipuler par diélectrophorèse des particules diélectriques, en particulier des cellules biologiques. D'une manière générale, la diélectrophorèse découverte en 1951 par POHL désigne la force exercée par un champ électrique alternatif non uniforme sur une particule polarisable, mais non nécessairement pourvue d'une charge électrique. L'une des applications importantes de la diélectrophorèse concerne la séparation de particules en suspension dans un milieu. Si une particule est davantage polarisable que son milieu de suspension, la force de diélectrophorèse sera positive et la particule sera dirigée vers une région où le champ électrique local est maximum et, dans le cas contraire, la particule sera dirigée vers une région où le champ électrique local est minimum. D'une manière générale, la distribution du champ électrique dépend de la géométrie des électrodes, et la force de diélectrophorèse varie avec la fréquence en fonction des propriétés diélectriques du milieu et des particules. Un but de l'invention est de concevoir un procédé et un système à haute densité ou à fort degré d'intégration pour pouvoir manipuler un grand nombre de particules, ce qui implique une conception particulière pour la disposition des électrodes et leur alimentation. A cet effet, l'invention propose un procédé pour manipuler par diélectrophorèse des particules diélectriques, en particulier des cellules biologiques, qui sont mises en suspension dans un milieu et soumises à l'action d'un champ électrique alternatif dont la répartition est rendue non uniforme au moyen d'électrodes formées à la surface d'un support et mises au contact du milieu, procédé qui est caractérisé en ce qu'il consiste : - à disposer les électrodes selon un réseau régulier et à leur donner des formes géométriques aptes à définir des zones locales où le champ électrique est minimum ; et - à jouer sur la fréquence du champ électrique et à choisir une conductivité électrique du milieu appropriée pour faire en sorte que le milieu soit plus polarisable que les particules à manipuler, et pouvoir ainsi diriger les particules vers la partie centrale des zones locales par suite de l'action de forces de diélectrophorèse négatives pour les concentrer suivant un réseau matriciel. D'une manière générale, le procédé consiste à former le réseau d'électrodes et sa connexion aux plots d'alimentation en réalisant un support de type multicouche pour que le principe de connexion reste indépendant du nombre d'électrodes adopté et permettre ainsi la réalisation d'un système de manipulation à haut degré d'intégration. L'invention a également pour objet un système de manipulation par diélectrophorèse des particules diélectriques, en particulier des cellules biologiques, pour la mise en oeuvre du procédé tel que défini précédemment, ce système comprenant au moins des électrodes formées à la surface de la couche supérieure isolante d'un support et en contact avec un milieu où les particules sont en suspension, et qui est caractérisé en ce que les électrodes sont disposées suivant un réseau régulier pour obtenir des concentrations de particules en différentes zones locales réparties suivant un réseau matriciel, chaque zone locale étant délimitée par un groupement élémentaire d'au moins deux paires d'électrodes et présentant un champ électrique minimum dans sa zone centrale. D'une manière générale, les électrodes sont régulièrement espacées suivant plusieurs lignes parallèle à un axe X, les électrodes d'une ligne ont la même polarité, et les électrodes de deux lignes adjacentes ont des polarités opposées. Avantageusement, le réseau d'électrodes est formé à la surface d'un support multicouche, et en ce que toutes les électrodes de même polarité du réseau sont reliées à un plot d'alimentation commun au travers de deux réseaux de pistes conductrices qui sont à un niveau intermédiaire situé en dessous des électrodes et reliés à celles-ci par des trous traversant la couche isolante. D'une manière générale, le système comprend également une chambre formée au-dessus du support pour recevoir des particules en suspension, cette chambre étant délimitée par exemple par un joint d'étanchéité qui entoure au moins le réseau d'électrodes et par une plaque rapportée sur le joint, ainsi qu'une source de tension alternative pour alimenter les deux plots de connexion aux électrodes. D'autres avantages, caractéristiques et détails de l'invention ressortiront de la description explicative qui va suivre en référence à des dessins annexés, donnés uniquement à titre d'exemple et dans lesquels : - la figure 1 est une vue schématique de dessus d'un exemple de réseau d'électrodes formé à la surface d'une couche isolante supérieure d'un support multicouche et qui peut être utilisé pour manipuler par diélectrophorèse des particules diélectriques, - la figure 2 est une vue de dessus de deux réseaux de pistes conductrices qui alimentent le réseau d'électrodes de la figure 1, - la figure 3 est une vue en coupe suivant la ligne ftt-ttt de la figure 1 pour illustrer la position des réseaux de pistes conductrices de la figure 2 par rapport au réseau d'électrodes de la figure 1, - les figures 4 et 5 illustrent de façon schématique deux autres formes de réalisation possibles pour le réseau d'électrodes de la figure 1, - les figures 6a et 6b illustrent deux autres formes d'électrodes, et - la figure 7 est une vue schématique d'un mode de réalisation d'un système pour manipuler par diélectrophorèse des particules diélectriques en suspension dans un milieu en contact avec le réseau d'électrodes des figures 1,4 ou 5. Selon l'exemple illustré aux figures 1 à 3, un réseau régulier R d'électrodes E1 et E2 est formé à la surface de la couche supérieure isolante 1 d'un support multicouche 1, et connecté à deux plots d'alimentation Pi et Pg par deux réseaux R1 et R2 de pistes conductrices C1 et C2. Le réseau R d'électrodes E1 et E2 est conçu pour répartir de manière non uniforme un champ électrique alternatif appliqué à partir des deux plots d'alimentation P 1 et Pg, et pour délimiter à la surface de la couche isolante 1 des zones locales L régulièrement espacées où le champ électrique sera minimum. D'une manière générale, une zone locale L est délimitée par un groupement élémentaire d'au moins deux paires d'électrodes, ce qui correspond à l'exemple illustré sur la figure 1. Les électrodes E1 et E2 sont régulièrement espacées suivant plusieurs lignes parallèles à un axe X, sachant que les électrodes d'une ligne ont la même polarité, et que les électrodes de deux lignes adjacentes ont des polarités opposées. Autrement dit, des lignes d'électrodes E2 sont intercalées entre des lignes d'électrodes E1, ou inversement. Chaque zone locale L à champ électrique minimum est ainsi délimitée entre deux électrodes adjacentes E1 ou E2 d'une même ligne, et deux électrodes E2 ou E1 en vis-à-vis et respectivement situées sur les deux lignes adjacentes à ladite ligne. Dans cet exemple, une même électrode E1 ou E2 peut être ainsi utilisée pour définir quatre zones locales L, et les électrodes de deux lignes adjacentes sont disposées en quinconce. Les figures 2 et 3 illustrent la connexion des électrodes E1 et E2 aux deux plots d'alimentation P 1 et P. Cette connexion est assurée par les deux réseaux R1 et R2 de pistes conductrices C1 et C2 parallèles et qui s'étendent également suivant l'axe X. Ces deux réseaux R1 et R2 sont respectivement reliés aux deux plots d'alimentation P1 et P2 qui bordent le réseau R d'électrodes E1 et E2 en s'étendant suivant un axe Y perpendiculaire à l'axe X. Chaque plot d'alimentation P 1 et Pg forme un peigne avec son réseau associé R1 ou R2 de pistes conductrices, et les deux peignes sont imbriqués l'un dans l'autre (figure 2). Les deux réseaux R1 et R2 sont logés dans la couche isolante 1, c'est-à-dire que la connexion des électrodes E1 et E2 s'effectue à un niveau différent de celui où elles sont situées (figure 3), de manière à ce que le principe de connexion des électrodes reste indépendant du nombre des électrodes adopté. Un exemple de fabrication du réseau R d'électrodes et des réseaux R1 et R2 de connexion aux plots d'alimentation P1 et P2, est illustré sur la figure 3 en partant d'un support de base 2 constitué d'une tranche de silicium monocristallin faiblement dopé pour réaliser les réseaux R, R1 et R2. Dans une première étape, on forme par oxydation une couche d'oxyde de silicium 3 qui recouvre la surface du substrat 1 sur une épaisseur de l'ordre de 500nm pour éviter le passage des lignes de champ électrique via le substrat 1. Dans une deuxième étape, on recouvre la couche 3 par une couche conductrice 5 en aluminium par exemple qui est déposée par évaporation sur une épaisseur de l'ordre de 300nm, et on forme les réseaux R1 et R2 de pistes conductrices C1 et C2, ainsi que les plots d'alimentation P1 et P2, par photolithographie et gravure humide de l'aluminium. Dans une troisième étape, la couche isolante 1 en oxyde de silicium déposée suivant la technique APCVD ("Atmospheric Pressure Chemical Vapor Déposition"en langue anglaise) vient recouvrir l'ensemble et, au moyen d'un masque et par photolithographie et une gravure plasma de la couche d'oxyde au SF6, on réalise de petites ouvertures 9 régulièrement espacées le long des pistes conductrices C1 et C2 ainsi que deux grandes ouvertures 11 au niveau des plots d'alimentation P1 et P2. Dans une quatrième étape, on évapore sur l'ensemble une nouvelle couche conductrice 13 en aluminium sur une épaisseur supérieure de l'ordre de 100nm à celle de la couche inférieure 1 et qui vient combler les ouvertures 9 et 11 pour assurer la connexion avec les réseaux R1 et R2 de pistes conductrices C1 et C2. Enfin, dans une cinquième étape par photolithographie et gravure de l'aluminium, on dessine la forme du réseau R d'électrodes E1 et E2. En variante de ce mode de réalisation, le support de base 2 peut être une lame de verre et, on peut envisager de réaliser le réseau R d'électrodes ainsi que les réseaux R1 et R2 en un autre matériau que l'aluminium, l'or ou le chrome par exemple, en adaptant la technique de fabrication au métal choisi. En effet, selon l'invention, il est important que le réseau R d'électrodes E1 et E2 et sa connexion aux plots d'alimentation P1 et P 2 par les deux réseaux R1 et R2, soient situés à des niveaux différents, c'est-à-dire que le support 1 est de type multi-couche. Cette caractéristique donne la possibilité de fabriquer un dispositif à haut degré d'intégration. A titre d'exemple non limitatif, on peut fabriquer un dispositif de 1 cm de côté avec de 1 000 à 50 000 zones locales L. Si les figures 1 à 3 n'illustrent qu'un nombre réduit d'électrodes E1, E2 et de zones locales L, ce n'est uniquement que pour des raisons de clarté des dessins. Sur les figures 4 et 5, on a schématiquement illustré deux autres formes possibles pour le réseau R d'électrodes E1 et E2, sachant que les électrodes E1 et E2 sont reliées aux plots d'alimentation P et P2 par deux réseaux R1 et R2 de pistes conductrices C1 et C2 d'une manière similaire à l'exemple illustré sur la figure 2. Chaque zone locale L est délimitée par trois paires d'électrodes E1 et E2 selon la figure 4, et par quatre paires d'électrodes E1 et E2 selon la figure 5. Il ressort de ces exemples, qu'une zone locale L est définie à partir d'au moins deux paires d'électrodes E1 et E2, sachant que le nombre de paires d'électrodes peut être pair ou impair. Selon l'exemple de la figure 1, les électrodes E1 et E2 ont globalement une forme ovoïde ou en pétale de fleur, et quatre électrodes qui délimitent une zone locale L forment globalement une trèfle à quatre feuilles, et une forme ronde dans l'exemple des figures 4 et 5, sachant que l'on peut envisager d'autres formes, comme par exemple une forme carrée (figure 6a) ou une forme sensiblement carrée (figure 6b), symétrique avec au moins quatre coins (figure 6b), chaque coin d'une électrode pointant vers le centre d'une zone locale L. Un mode de réalisation d'un système pour manipuler des particules diélectriques est schématiquement illustré sur la figure 5. Le système comprend un substrat 1 tel que défini précédemment et avec son réseau R d'électrodes E1 et E2, un joint d'étanchéité 20 en silicone qui entoure le réseau R et une plaque de verre 22 rapportée sur le joint 20 pour délimiter une chambre 25 destinée à recevoir des cellules biologiques par exemple en suspension dans un milieu et introduites dans la chambre 25 au moyen d'une pipette par exemple. Les deux plots P1 et P2 sont connectés à une source 30 de tension alternative. Bien entendu, la chambre 25 pourrait être réalisée différemment. D'une manière générale, ce système est plus particulièrement conçu pour appliquer aux cellules en suspension dans la chambre 25 des forces de diélectrophorèse négatives. A cet effet, on joue sur la fréquence du champ électrique et on choisit une conductivité électrique appropriée pour faire en sorte que le milieu soit plus polarisable que les particules à manipuler, et pouvoir ainsi diriger les particules vers la partie centrale des zones locales L par suite de l'action de forces de diélectrophorèse négatives pour les concentrer suivant un réseau matriciel. En jouant sur les paramètres du champ électrique, on peut avantageusement diriger les particules au point central des zones locales L de manière à favoriser des concentrations de particules régulièrement réparties à la surface de la couche isolante 1 du support 1. Pour matérialiser ce résultat, on a illustré sur la figure 1 des concentrations de particules c qui sont présentes dans la partie centrale des zones locales L et régulièrement réparties à la surface du substrat 1. A titre d'exemple, on alimente les deux plots P1 et P2 avec une tension alternative sinusoïdale d'environ 5 à 10 volts crète-à-crète, et on fait varier la fréquence dans une gamme de l'ordre de 10kHz à 10MHz. Selon un exemple particulier, pour un milieu de conductivité 300uS. cm-1, une fréquence de 100kHz environ et une tension sinusoïdale d'environ 5 volts crète-à-crète, on parvient à regrouper des billes en latex d'un diamètre de 3pm, sachant que les paramètres du champ électrique et la conductivité du milieu doivent être ajustés en fonction de la particule à manipuler. Une fois que les cellules ont été réparties à la surface du substrat, il est possible de procéder à leur électroporation ou à leur lyse selon les applications envisagées. D'une manière générale, le système selon l'invention peut être utilisé pour effectuer un criblage à haut débit de produits pharmacologiques, un transfert de gènes dans des cellules,..., et pour séparer deux espèces de cellules en solution, une espèce étant orientée vers le centre des zones locales délimitées entre les électrodes, alors que l'autre espèce sera orientée vers les électrodes. REVENDICATIONS 1. Procédé pour manipuler par diélectrophorèse des particules diélectriques, en particulier des cellules biologiques, qui sont mises en suspension dans un milieu et soumises à l'action d'un champ électrique alternatif dont la répartition est rendue non uniforme au moyen d'électrodes (E1, E2) formées à la surface de la couche supérieure isolante (1) d'un support (1), reliées à deux plots d'alimentation (P1, P2) et mises au contact du milieu, caractérisé en ce qu'il consiste : - à disposer les électrodes (E1, E2) selon un réseau régulier (R) et à leur donner des formes géométriques aptes à définir des zones locales (L) où le champ électrique est minimum ; et - à jouer sur la fréquence du champ électrique et à choisir une conductivité électrique du milieu appropriée pour faire en sorte que le milieu soit plus polarisable que les particules à manipuler, et pouvoir ainsi diriger les particules vers la partie centrale des zones locales (L) par suite de l'action de forces de diélectrophorèse négatives pour les concentrer suivant un réseau matriciel. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à former le réseau (R) d'électrodes (E1, E2) et sa connexion aux plots d'alimentation (P1, P2) en réalisant un support (1) de type multicouche pour que le principe de connexion reste indépendant du nombre d'électrodes adopté (E1, E2) et permettre ainsi la réalisation d'un système de manipulation à haut degré d'intégration. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste à concentrer les particules au point central des zones locales (L) en ajustant les paramètres du champ électrique. 4. Système de manipulation par diélectrophorèse des particules diélectriques, en particulier des cellules biologiques, pour la mise en oeuvre du procédé tel que défini par l'une quelconque des revendications précédentes, ce système comprenant au moins des électrodes (E,, Eg) formées à la surface de la couche supérieure isolante (1) d'un support (1) et en contact avec un milieu où les particules sont en suspension, caractérisé en ce que les électrodes (E1, E2) sont disposées suivant un réseau régulier (R) pour obtenir des concentrations de particules en différentes zones locales (L) réparties suivant un réseau matriciel, chaque zone locale (L) étant délimitée par un groupement élémentaire d'au moins deux paires d'électrodes (E1, E) et présentant un champ électrique minimum dans sa zone centrale. 5. Système selon la revendication 4, caractérisé en ce que les électrodes (E.,, Eg) sont régulièrement espacées suivant plusieurs lignes parallèle à un axe X, en ce que les électrodes d'une ligne ont la même polarité, et en ce que les électrodes de deux lignes adjacentes ont des polarités opposées. 6. Système selon la revendication 5, caractérisé en ce que les zones locales (L) de concentration de particules sont régulièrement espacées suivant plusieurs lignes parallèles à l'axe X. 7. Système selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que les électrodes (E1, E2) ont une forme sensiblement circulaire. 8. Système selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que les électrodes (E1, E2) ont une forme sensiblement carrée avec quatre coins, chaque coin d'une électrode pointant vers le centre d'une zone locale (L). 9. Système selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que les électrodes (E1, E2) présentent une forme symétrique avec au moins quatre coins, chaque coin d'une électrode pointant vers le centre d'une zone locale (L). 10. Système selon l'une quelconque des revendications 4 à 9, caractérisé en ce que le réseau (R) d'électrodes (E1, E2) est formé à la surface d'un support multicouche (1), et en ce que toutes les électrodes (E1, E2) de même polarité du réseau sont reliées à un plot d'alimentation commun (P1'P2) au travers de deux réseaux (R1, R2) de pistes conductrices (C1, C2) qui sont à un niveau intermédiaire situé en dessous des électrodes (E1, E2). 11. Système selon la revendication 10, caractérisé en ce que les électrodes (E1, E2) sont séparées des deux réseaux (R1, R ?) de pistes conductrices (C1, C2) par la couche isolante (1), et sont connectées au réseau associé de pistes conductrices au travers de trous (9) traversant la couche isolante (1). 12. Système selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que le support multicouche (1) comprend un support de base (2) et au moins une couche conductrice (5) qui recouvre le support (1) pour former les réseaux de connexion (R1, R2) des électrodes (E1, E2), la couche isolante (1) qui recouvre la couche (5) et une couche conductrice (13) qui recouvre la couche isolante (1) pour former le réseau (R) d'électrodes. 13. Système selon l'une quelconque des revendications 4 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend également une chambre (25) formée au-dessus du support (1) pour recevoir des particules en suspension. 14. Système selon la revendication 13, caractérisé en ce que la chambre (25) est délimitée par un joint d'étanchéité (20) qui entoure au moins le réseau (R) d'électrodes (E1, E2) et par une plaque (22) rapportée sur le joint (20), et en ce qu'il comprend également une source de tension alternative (30) pour alimenter les deux plots (P1, P2).