Brevet FR2826962A1 — publié le 20030110

NOUVEAUX SUBSTRATS CHROMOGENES ET LEUR UTILISATION POUR LE DOSAGE DE L'ACTIVITE DE CARBOXYPEPTIDASES. La présente invention est relative à des composés chromogènes et leur utilisation pour le dosage d'enzymes de la famille des carboxypeptidases N, et des carboxypeptidases U. Elle vise plus spécifiquement l'utilisation desdits composés pour le dosage de l'activité du TAFI (Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor) dans un échantillon sanguin et la méthode de dosage correspondante. Les carboxypeptidases (CP) constituent un groupe d'enzymes au sein de la famille des exopeptidases. Ce sont des enzymes qui coupent les liaisons amide des chaînes polypeptidiques au niveau du dernier acide aminé COOH-terminal. Elles comprennent les sérine carboxypeptidases, les cystéine carboxypeptidases et les métatiocarboxypeptidases. De nombreuses carboxypeptidases ont été isolées et séquencées, chez les bactéries, les levures et les végétaux. Ces enzymes sont également présentes dans un grand nombre de tissus chez les mammifères. Des carboxypeptidases ont notamment été isolées au niveau du prancréas et dans des mastocytes. D'autres carboxypeptidases circulantes dans le plasma ont également été clonées, isolées et séquencées. Toutes ces enzymes ont un rôle IN VIVO dépendant à la fois de leur localisation et de leurs propriétés physiques. Ainsi les carboxypeptidases se classent différemment selon leur spécificité de substrat. Les carboxypeptidases A ont un spectre relativement large : elles hydrolysent la liaison peptidique C-terminale du dernier acide aminé préférentiellement s'il est hydrophobe (Phe, Leu, Val, Ala). Elles hydrolysent plus lentement les acides aminés dicarboxyliques (Asp, Glu) ainsi que la glycine (Gly), et n'hydrolysent pas du tout les acides aminés basiques tels que l'arginine (Arg), la lysine (Lys), l'histidine (His) ou l'ornithine (Orn), un homologue inférieur de la lysine, ni les acides aminés secondaires tels que la proline (Pro) ou l'hydroxyproline (Hyp). Les carboxypeptidases B hydrolysent spécifiquement les derniers acides aminés basiques C-terminaux, tels que Arg, Lys. Cette classe d'enzymes se subdivise en sous-classes constituées par les carboxypeptidases H (également dénommée encéphaline convertase ou carboxypeptidase E), M, N et U. La carboxypeptidase E a été localisée dans les granules sécrétoires des îlots pancréatiques, les glandes surrénales et pituitaires, et le cerveau. La carboxypeptidase M est une enzyme membranaire présente dans de nombreux tissus et cellules en culture. La carboxypeptidase N (désignée parfois ci-après CPN) est une enzyme circulante dans le plasma. Elle protège l'organisme contre l'effet vasoactif et inflammatoire de peptides contenant un acide aminé basique C-terminal (de préférence une lysine), libérés dans la circulation. Cette enzyme existe sous sa forme active dans le sang. Elle est également dénommée kininase du fait de ses substrats naturels qui sont la bradykinine, les kinines, les anaphylatoxines. Enfin, les carboxypeptidases U (unstable) (désignés parfois ci-après CPN) sont des enzymes qui hydrolysent également les acides aminés basiques C-terminaux, avec une préférence pour les arginines, mais qui, contrairement aux carboxypeptidases N, sont très instables lorsqu'elles se trouvent sous leur forme activée. Une revue générale récente sur les enzymes de la famille des carboxypeptidases a été réalisée par BOUMA et al. (1). Le TAFI est une métallocarboxypeptidase à zinc basique (1-4). C'est plus précisément une carboxypeptidase U, car son activité est instable à 37 C. Cette enzyme, dont l'ADNc et la séquence d'acides aminés correspondante chez l'homme sont par exemple décrits dans le brevet US 5,206, 161, est une protéine plasmatique dont le rôle dans la régulation de la fibrinolyse a été initialement envisagé à partir de l'observation IN VITRO d'un retard de la lyse du caillot en présence de TAFI activé. Le TAFI clive les résidus arginine et lysine exposés en position COOH-terminale sur la fibrine en cours de dégradation. Cette hydrolyse conduit à une diminution du nombre de sites de fixation du plasminogène et du tPA à la surface du caillot de fibrine, et donc une diminution de la transformation du plasminogène en plasmin par le tPA. Le TAFI a été successivement identifié sous le nom de procarboxypeptidase B (pro-PCPB) puis de procarboxypeptidase instable (proCPU : Unstable ProCarboxypeptidase) et procarboxypeptidase R (CPR), du fait d'une activité carboxypeptidasique sur les résidus arginine. La forme zymogène est une glycoprotéine à chaîne unique de 60 KDa synthétisée dans le foie et circulante dans le plasma. Le clivage du zymogène est réalisé par la thrombine au niveau du site arg 92. Cette protéolyse libère un peptide N-terminal de 92 acides aminés contenant plusieurs sites de glycosylation. L'action catalytique de la thrombine sur le TAFI est considérablement augmentée par la thrombomoduline en présence d'ions divalents. La vitesse d'activation du TAFI catalysée par la thrombine est ainsi accrue plus de 1000 fois du fait de la formation d'un complexe ternaire avec la thrombomoduline. Le TAFI activé (TAFla) est constitué par le domaine catalytique C-terminal du zymogène et comporte 309 acides aminés. Du fait de son rôle clef dans les mécanismes de régulation du processus de la fibrinolyse, il s'est rapidement avéré utile de pouvoir mesurer la quantité de TAFI activé constitutionnel et de TAFI activable présent dans le plasma dans différents états pathologiques. Plusieurs méthodes de dosage de l'activité de diverses carboxypeptidases utilisant des substrats spécifiques ont été décrites dans l'état de l'art. Ainsi, WOLFF et al. (5) ont comparé les performances des substrats synthétiques Hip-Arg, Hip-Lys, Hip-Orn sur les carboxypeptidases B pancréatiques purifiées par chromatographie en mesurant les différences d'absorption en UV. En 1970, S. SUZUKI et al. (6) ont amélioré la détection du produit d'hydrolyse en dérivatisant la benzoylglycine libérée par le réactif TT (2,4, 6 Trichloro-5-Triazin). Cette dérivation opérait spécifiquement sur le CH2 de la glycine en a d'une fonction acide libre uniquement. Ce dérivé devient jaune vif (longueur d'onde maximale à 382 nm). Cette méthode de développement de coloration jaune sur les restes Hippuryl a largement été utilisée par de nombreux auteurs par la suite. En 1972, K. LORENTZ et al. (7) ont utilisé une réaction de coloration de l'arginine libérée cette fois par action des carboxypeptidases B sur un substrat Hip-Arg en utilisant la p-benzoquinone comme réactif. De cette manière, le dérivé coloré à une longueur d'onde maximale à 480 nm. En 1980, Th. H. Plummer et al. (8) ont utilisé un substrat synthétique : le Furylacryloyl-Ala-Lys pour quantifier les carboxypeptidases N, la lecture se faisant à 324 nm (proche UV mais non visible). En 1985, G. H. Fischer et al. (9) ont utilisé un substrat fluorescent par dansylation N-terminale d'un peptide spécifique de la carboxypeptidase à doser. Ce dosage nécessitait une étape d'extraction des produits d'hydrolyse pour une bonne séparation des espèces avant lecture. En 1986, H. SARUTA et al. ont déterminé par une méthode colorimétrique, l'activité de la carboxypeptidase A (10). Ceux-ci ont utilisé une enzyme spécifique : "l'Hippuricase"pour hydrolyser le dérivé hippuricyl lui-même obtenu par hydrolyse du substrat hydroxy-hippuricyl-Phg par la CPA. Cette réaction était révélée finalement par le 4-Aminoantipyrine pour donner un colorant quinoneimide absorbant à 505 nm. En 1998, NAM JOO HONG et al. ont utilisé un substrat synthétique avec un analogue de l'arginine, le thiaarginine pour doser les CPB (11). Toutefois, les méthodes colorimétriques décrites ci-dessus soit n'ont jamais été utilisées pour doser spécifiquement l'activité enzymatique de CPN ou CPU, notamment le TAFI, soit présentent certains inconvénients incompatibles avec un test de dosage simple et efficace de ce type d'enzyme par colorimétrie. En effet, selon les cas considérés : - soit la réaction de dérivatisation aboutissant à un produit coloré n'est pas spécifique des espèces libérées lors de l'hydrolyse, - soit les réactifs de dérivatisation sont très toxiques et ne peuvent pas être utilisés à l'échelle industrielle, - soit la méthode de révélation colorée est trop longue et contraignante et ne peut être automatisée aisément. En 1996, W. L. Mock et al. ont décrit une méthode de dosage d'une endoprotéase à zinc extracellulaire d'origine bactérienne, la thermolysine, à l'aide de substrats synthétiques se décolorant sous l'action de l'hydrolyse enzymatique (12). Pour ce faire, les auteurs ont synthétisé des composés dipeptidiques constitués d'un résidu leucine portant un groupement N- (4-methoxyphenylazoformyl) greffé au niveau de la fonction amine, et d'un autre acide aminé neutre (Leu, Ala, Phe ou Gly). L'incorporation du groupement arazoformyl donne lieu à un composé fortement coloré. En présence de la thermolysine, la molécule de colorant se réarrange pendant la réaction chimique d'hydrolyse selon un mécanisme bien décrit dans (12 - 13), donnant naissance à des produits non colorés (fragment anizole, N2, CO2 et acide aminé). Il est donc aisé de suivre la vélocité de l'enzyme par la vitesse de décoloration du milieu. Les mêmes auteurs ont également décrit une méthode cinétique de dosage par spectrophotométrie basée sur le même principe que la précédente pour la carboxypeptidase A (13) et la carboxypeptidase B porcine pancréatique (14). Dans ce cas, les composés utilisés étaient constitués d'un seul acide aminé connu pour être clivé par la carboxypeptidase A (Phé, Leu) ou la carboxypeptidase B (Lys), portant un groupement N-arazoformyl. Le clivage enzymatique de ces composés en produits non colorés, était suivi par mesure de la décroissance de coloration du milieu. Partant de ces enseignements, les auteurs de la présente invention ont synthétisé de nouveaux composés colorés pour doser par méthode colorimétrique l'activité de carboxypeptidases N, ou de carboxypeptidases U, et plus particulièrement, l'activité du TAFI. Selon un premier aspect, la présente invention a donc pour objet de nouveaux composés, constituant des substrats de carboxypeptidase N ou U, et plus particulièrement des substrats du TAFI activé. Ces composés sont des substrats chromogènes. Les composés de l'invention sont caractérisés en ce qu'il s'agit des composés arazoformyl de formule générale (1) suivante : dans laquelle : R 0- \-N A = ou ou 00 o-O ou 1 ou 0 oui ou'-o-C > R2-0' - R1, R2 = H,-CHg,-CH (CHs) 2.-OCHs,-Ct,-CFs,-OCFs,-SCHs - rus = un radical d'acide aminé hydrolysable par une carboxypeptidase A. - R4 = un radical d'acide aminé basique. Plus particulièrement, R3 est choisi parmi les radicaux d'acides aminés hydrophobes tels que : - taphenytatanine Rs=-CH-- - t'atanine Rs =-CHs - la valine R3 = -CH- (CH3h - la leu cine R3 = -CH2-CH- (CH3h - l'isoleucine R3 = -CH-CH2-CH3 CH3 - la phenylglycine R3=-'o R4 est plus précisément choisi parmi les radicaux d'acides aminés tels que : NH - l'arginine R4- (CH2) 3- NH-d-' NHs - la lysine (R4 = - (CH2) 4-NH2) - l'ornithine R4="- (CH2) 3- NH2 De préférence, R3 représente la phenylalanine, et R4 l'arginine ou la lysine. Ri est de préférence choisi parmi : -H et-CH3, et, R2 de préférence choisi parmi : -CH3 et-0-CH3 Une famille préférée de composés selon l'invention est représentée par la formule générale : dans laquelle : R Ruz et. R2 - Ri, R2 =-H,-CH3, (CH3) 2 CH-, CH3-0-, CI-,-CF3 - R3 = un radical d'acide aminé hydrolysable par une carboxypeptidase A. -R4 = un radical d'acide aminé basique. R3 représente préférentiellement la phenylalanine, et, R4 représente préférentiellement l'arginine ou la lysine. R1 est de préférence choisi parmi : -H et-CH3, et, R2 de préférence choisi parmi : - CHs et-O-CHs Un composé particulièrement préféré de la famille de la présente invention est un composé de formule (1) dans laquelle : ledit composé étant choisi au sein du groupe constitué par les composés suivants, dans lesquels : * les chiffres entre parenthèses déterminant la position des groupements methyl sur le radical phényl. L'invention concerne en particulier, dans le cadre des définitions données cidessus, chaque composé répondant à la formule (1) et résultant des combinaisons possibles des groupements A, R1, R2, R3 et R4 dont il a été donné une définition préférée ci-dessus. Dans ce qui suit, les composés ainsi définis seront indifféremment dénommés "composés de formule (1) " ou "substrats de formule (1) ". Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet une méthode de dosage colorimétrique de l'activité d'une carboxypeptidase N, ou de préférence de l'activité d'une CPU, dans un échantillon biologique dans laquelle : - on met en contact ledit échantillon avec un composé chromogène de formule (1) tel que défini ci-dessus, et une enzyme de la famille des carboxypeptidases A, dans des conditions permettant l'hydrolyse de l'échantillon et, - on détermine l'hydrolyse dudit composé de formule (1) par la CPN ou la CPU de l'échantillon par la mesure de la décroissance de sa coloration (correspondant à une diminution de l'absorption) à une longueur d'onde sélectionnée à partir du spectre d'absorption dudit composé. La diminution de la coloration résulte de la double hydrolyse du substrat de formule (1) par les carboxypeptidases N ou U de l'échantillon d'une part, par la carboxypeptidase A d'autre part. La méthode selon la présente invention est de préférence réalisée à l'aide d'un composé de formule (1) dans lequel l'acide aminé hydrophobe est la phénylalanine, et l'acide aminé basique est l'arginine ou la lysine. La méthode de l'invention est préférentiellement réalisée à l'aide d'un composé de formule (1) dans laquelle R1 est choisi parmi-H et-CHs et R2 parmi -CH3 et - O-CHs. La méthode de la présente invention est avantageusement réalisée avec la famille de composés de formule (1) dans laquelle : Plus particulièrement le composé de formule (1) utilisé est un composé phenylazoformyl dans lequel : ledit composé éta t n ch > ftT ~ ledit composé étant choisi au sein du groupe constitué par les composés suivants, dans lesquels : Les chiffres entre parenthèses déterminant la position des groupements méthyl sur le radical phényl. La carboxypeptidase A utilisée peut provenir de différentes sources, telles que, par exemple, le pancréas ou des cellules mastocytaires. Elle peut être d'origine humaine ou animale. On utilise préférentiellement dans le cadre de l'invention de la carboxypeptidase A pancréatique d'origine bovine. Le principe de la méthode de l'invention est basé sur une hydrolyse d'un substrat coloré de formule (1) tel que décrit ci-dessus, par l'action de la carboxypeptidase N ou de la carboxypeptidase U éventuellement présente dans l'échantillon analysé, associée à celle de la carboxypeptidase A ajoutée dans le milieu. Cette hydrolyse spécifique conduit à une extinction de la coloration du composé de départ, qui peut être suivie à l'aide d'un spectrophotomètre. Plus précisément, compte tenu des spécificités d'hydrolyse des carboxypeptidases N ou U et A exposées précédemment, et des caractéristiques structurales des composés de formule (1) décrits ci-dessus, la mise en contact d'une carboxypeptidase A et d'une carboxypeptidase N ou U avec un tel composé va générer une coupure au niveau de la liaison entre le premier et le second acide aminé dudit composé du fait de l'action de la carboxypeptidase N ou U, suivie quasi simultanément d'une coupure au niveau de la liaison entre le groupement azoformyl et le premier acide aminé, du fait de l'action de la carboxypeptidase A. La résultante de ces deux réactions sera une décoloration du milieu de départ. Il sera alors aisé de suivre en fonction du temps cette décroissance de coloration en se plaçant à une longueur d'onde d'absorption du colorant [composé formule zu de préférence à la longueur d'onde correspondant à son pic d'absorption. Cette décroissance est représentative de la cinétique d'hydrolyse. La quantité de carboxypeptidase N ou U active présente initialement dans l'échantillon est calculée en comparant la densité optique mesurée à celle d'une courbe d'étalonnage établie à partir d'une gamme de concentrations de carboxypeptidase N ou U purifiée active en solution. Inversement, si l'échantillon ne contient pas de carboxypeptidase N ou U ou si celle-ci est inactive, il n'y aura pas de coupure entre le premier et second acide aminé du composé de formule (1), et donc, la carboxypeptidase A ne pourra pas agir au niveau de la liaison du groupement coloré sur le premier acide aminé. De ce fait, on n'observera pas de diminution de la coloration de la solution de départ. L'invention vise plus particulièrement une méthode de dosage de l'activité d'une CPN ou une CPU dans un échantillon sanguin tel que du sang total ou du plasma pur ou dilué, et, préférentiellement, une méthode de dosage de l'activité du TAFI dans un échantillon sanguin, notamment du plasma pur ou dilué. Dans ce cas, l'échantillon à tester est d'abord mis en présence d'une solution tampon avec, si nécessaire, un activateur de la carboxypeptidase dont on souhaite mesurer l'activité (solution nommée tampon activateur ci-après), et laissé en incubation, le temps nécessaire pour obtenir l'activation de la carboxypeptidase étudiée. L'incubation est de préférence réalisée à température ambiante pendant environ 8 à 12 minutes, de préférence 10 minutes. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'activateur de carboxypeptidase peut être un activateur de la coagulation, que l'on laisse agir de façon à activer la carboxypeptidase U, en particulier le TAFI. Dans ce cas, on ajoute ensuite dans le mélange un inhibiteur des sérine protéases pour aboutir à un blocage du processus de coagulation. L'inhibiteur de sérine protéases est par exemple le PPACK (H-D-Phe-Pro-Arg-chloromethylikétone - Bachem-Réf. N. 1065) utilisé dans une gamme de concentration finale de 10 à 200 uM et de préférence 150 uM. D'autres composés, tels que le Péfabloc [4- (2- aminoethyl)-benzènesulfonylfluoridehypochloride-Penthapharm-Réf. 399. 01] utilisé préféren-tiellement à une concentration de 0,1 mM conviennent également. Simultanément ou immédiatement après l'addition de l'inhibiteur, on ajoute l'un des composés de formule (1) selon l'invention en solution acqueuse. Ce composé est en général utilisé dans une gamme de concentrations finales comprise entre 2,5 et 10 mM. Il est de préférence utilisé à 5 mM. Après une nouvelle phase d'incubation, de préférence à température ambiante, durant laquelle le substrat de formule (1) aura été coupé au niveau de son second acide aminé par la CPN ou CPU de l'échantillon dont on recherche l'activité, l'hydrolyse est arrêtée par addition d'HCI, suivie immédiatement par l'ajout d'une base pour réajuster le pH à une valeur comprise entre 7 et 8. La densité optique du mélange ainsi obtenu est alors mesurée une première fois sans addition de CPA dans le milieu. La CPA est ensuite ajoutée dans le milieu, et la DO est à nouveau mesurée. Sa décroissance peut être suivie au spectrophotomètre. Elle traduit l'hydrolyse du substrat de formule (1) par l'action conjointe de la CPU ou N de l'échantillon et de la CPA. Les delta DO (A DO) mesurés sont comparés avec les valeurs portées sur une courbe d'étalonnage obtenue à partir d'un échantillon déficient en la CPN ou la CPU étudiée, surchargé avec cette enzyme purifiée. Le protocole décrit ci-dessus constitue un mode de réalisation préféré de l'invention. Toutefois, plusieurs variantes de celui-ci sont envisageables, tant en ce qui concerne les séquences d'addition des différents composés utilisés, que la nature de ces composés. Elles entrent également dans la définition de la présente invention. Ainsi, il est par exemple possible d'incorporer le substrat de formule (1) dès le début de la méthode, en même temps que le tampon activateur de la coagulation. Dans le cas où le tampon activateur active la coagulation, l'activation peut être réalisée selon différentes voies connues de l'homme du métier, et utilisées en routine dans les tests de coagulation. Ces voies d'activation sont notamment : - la voie d'activation par le complexe thrombine/thrombomoduline. Cette première possibilité constitue un mode de réalisation préféré de la présente invention. - la voie d'activation par le facteur XI activé, qui dans ce cas remplace la thrombine dans le tampon activateur. Pour accélérer la réaction, il peut être avantageux de rajouter également de la thrombomoduline dans le milieu. - la voie d'activation par des venins, notamment des venins de serpent, avec également l'ajout éventuel de prothrombine dans le milieu. Les venins préférentiellement utilisés sont les venins de la famille des"thrombin-like"tels que le venin d'Arkistrodon rhodostoma ou Bathrops atrox, ainsi que les venins d'activateurs de prothrombine, tels que celui de Notechis scutatus ou d'Echis carinatus (15-18). - la voie d'activation par le facteur tissulaire, en présence de phospholipides et de calcium (activation de la voie exogène selon le principe d'un temps de Quick), - la voie d'activation par la plasmin Avantageusement, la méthode selon l'invention permet de mesurer pour un même échantillon, d'une part l'activité de la CPN et/ou de la CPU"constitutionnelle" présente dans celui-ci, i. e. la CPN et/ou CPU présente sous une forme active "naturellement" (i. e. sans induction de l'activation par un tampon activateur), et d'autre part, l'activité de la CPN et/ou CPU activable, Le. la CPN et/ou la CPU présente dans l'échantillon sous une forme inactive, dont l'activité sera induite ou générée durant le processus d'activation lié à l'effet du tampon activateur. Pour cela, on compare l'activité d'hydrolyse sur un substrat de formule (1) d'un échantillon selon la méthode décrite ci-dessus, en mettant l'échantillon soit en présence de tampon activateur (détection de l'activité totale de la CPN ou la CPU dans l'échantillon), soit en présence d'un tampon physiologique sans activateur (détection de l'activité de la CPN et/ou la CPU constitutionnelle). La différence de delta de DO entre les deux mesures permet d'obtenir l'activité de la CPN ou de la CPU activable présente dans l'échantillon. Selon une variante préférée, la présente invention a pour objet une méthode de dosage du TAFI activé dans un échantillon sanguin, ladite méthode utilisant l'un des composés ou substrats de formule (1) décrits précédemment. L'activité du TAFI constitutionnel et/ou activable est mesurée en traitant l'échantillon tel que cela vient d'être décrit, en présence et en absence d'un inhibiteur spécifique du TAFI. L'inhibiteur qui est de préférence utilisé est le CPI ("Carboxypeptidase Inhibitor from Potato Tubers) dont l'utilisation dans des études in vitro et in vivo sur la fonction du TAFI a été largement décrite dans la littérature (Réf. 1). Il est aujourd'hui bien connu de l'homme du métier que le CPI inhibe spécifiquement le TAFI sans altérer l'activité d'autres CP plasmatiques. Dans le cadre de la méthode de l'invention, le CPI peut être utilisé dans une gamme de concentrations allant de 0,10 à 0,50 mM. Il est de préférence utilisé à 0,38 mM. Selon le principe de cette variante préférée, l'échantillon est activé par le tampon d'activation, par exemple un tampon d'activation de la coagulation par le complexe thrombine/thrombomoduline, et traité selon la méthode décrite précédemment soit en présence soit en l'absence d'inhibiteur du TAFI. La différence de coloration du milieu avec et sans inhibiteur du TAFI permet ainsi de déterminer l'activité enzymatique propre au TAFI activé (TAFia) dans l'échantillon. Plus précisément, la méthode de l'invention peut être réalisée selon le protocole suivant : l'échantillon à tester est divisé en 2 aliquotes ou plus si nécessaire, selon que l'on souhaite déterminer l'activité de tout le TAFI contenu dans l'échantillon ou que l'on souhaite faire la distinction entre l'activité du TAFI constitutionnel et celle du TAFI activable. - Un premier aliquote contenant l'inhibiteur du TAFI est activé et traité selon la méthode décrite précédemment. Celui-ci ne va donc générer qu'une faible décoloration du milieu, résultant d'une hydrolyse résiduelle du substrat de formule (1) par d'autres carboxypeptidases présentes dans l'échantillon. - Un second aliquote est traité de manière identique au précédent, mais en l'absence d'inhibiteur du TAFI. Il va en résulter une forte décoloration du milieu, liée à l'activité d'hydrolyse du substrat de formule (1) par le TAFI activé dans l'échantillon. - On mesure la différence de coloration (A DO) entre le premier et le second aliquote. Celle-ci est ainsi représentative de l'activité spécifique du TAFI activé dans l'échantillon. Si l'on souhaite faire la distinction entre l'activité spécifique du TAFI activable et celle du TAFI constitutionnel, on utilise un troisième aliquote du même échantillon dont on mesure également l'activité d'hydrolyse sur le substrat de formule (1), mais dans lequel on n'aura pas déclenché l'activation, en n'ajoutant pas de tampon activateur dans le milieu. Les A DO entre ces différents aliquotes permettent d'obtenir soit l'activité du TAFI total de l'échantillon, soit celle du seul TAFI constitutionnel, et donc d'en déduire celle du TAFI activable. Selon un troisième aspect, l'invention a pour objet un kit de diagnostic pour le dosage d'une CPN ou une CPU, ledit kit de diagnostic comprenant un substrat de formule (1) tel que défini précédemment. Préférentiellement, le kit de diagnostic selon la présente invention est un kit pour mesurer l'activité du TAFI dans un échantillon sanguin. Un tel kit de diagnostic comprend notamment : - un activateur du TAFI, - de la carboxypeptidase A, - un substrat de formule (1), - un inhibiteur du TAFI, - un inhibiteur des serine protéases. Chacun de ces composants se présentent préférentiellement en poudre ou sous forme lyophilisée. Les exemples ci-après et les figures illustrent la présente invention. Fiqure 1 : Spectre d'absorption des différents composés de formule (1) synthétisés, mesuré avec un spectrophotomètre UV-visible. Fiqure 2 : Analyse du AAFFR effectuée par hydrolyse acide. Fiqure 3 : Courbe d'étalonnage établie à partir d'un plasma déficient en TAFI, surchargé avec du TAFI purifié pour obtenir une gamme de concentration allant de 0 à 26 ug/m !. EXEMPLE NO 1 : Synthèse d'un groupe de composés azolformvl selon l'invention. Le tableau 1 ci-après indique les formules chimiques de 5 des composés préférés parmi les composés de formule (1) selon l'invention. Leurs spectres d'absorption mesurés avec un spectrophotomètre UV-visible (UVIKON-KONTRON) sont reportés sur la figure 1. On décrit ci-après en détail la synthèse de l'un d'eux, le composé n 4 (MxPAFFR). Les étapes décrites ci-dessous pour ce composé sont identiques pour chacun des autres, excepté pour le composé n 5 (MxPAFFK) pour lequel une étape supplémentaire de déprotection de la lysine est nécessaire (voir schéma réactionnel et explications ci-après). TABLEAU 1 : FORMULES Composé 1 : 23DMPAFFR 0 H3C N, NH, , OH - "'rT oH OH NH 1 2, 3-dimethylphenylazoformylphenylalanylarginine Composé 2 : 2, 4 DMPAFFR CHg 0 0 L JL L. NH JL H, CN Hl H3C 1 HaC ! 1 C H'NH2 2, 4-dimethylphenylazoformylphenylalanylarginine Composé 3 : 2, 5 DMPAFFR eus o r AOH NH, &commat;rt,, OH t NH CH3 ! HN NH : 2, 5-dimethylphenylazoformylphenylalanylarginine Composé 4 : MXPAFFR zu NHYOH Nu NH HN NH2 4-methoxypheny) azoformy) pheny) a) anytarginine 4-methoxyphenylazoformyl ph enylalanylargi ni ne Composé 5 : MxPAFFK o r o 0 0 'N'INFr,, OH . JQJv1NiOH CH, Composé 6 : CITAFFR 0 0 0 0 H, N NH0 OH 0 (CH2h 1 NH CI 1 HW" "NH2 3-ch) oro-p-to) y) azoformy) pheny) a) anytarginine Composé 7 : TFMxPAFFR 0 0 OH NH, T, J OH 0 (CH2b \ 1 C/NH F. C. HW" "NH2 4w (trifluoromethoxy) azoformylphenylalanylarginine A/Synthèse du 4-methoxvphenvlazoformvlphenvlalanvlarqinine (Composé 4) Introduction : Toutes les étapes décrites ci-dessous sont identiques pour chaque colorant. Chaque étape est suivie par Chromatographie Liquide Haute Performance et par Analyse d'Acides Aminés pour les couplage avec la Phenylalanin et l'Arginine. 1 étape : Réactif de Griqnard Schéma réactionnel HsC-CA-Br + Mg ( THF anhydre, H30- (-/-MgBr QOC, N2 4-bromoanisole Magnésium Réactif de Grignard Mode opératoire : Préparer 1 éq. de 4-bromoanisole et 1 éq. de magnésium. Introduire le magnésium et 20 % en masse du 4-bromoanisole dans un tricol, reprendre dans du tétrahydrofuranne anhydre (2mL/mmol) et placer le montage sous azote. Initier la réaction en chauffant le tricol en un point avec un décapeur thermique, le milieu réactionnel devient marron. Quand la réaction démarre (effervescence à la surface du magnésium). Placer à reflux à 90 C puis additionner lentement le reste du 4-bromoanisole repris dans du THF anhydre (2mL/mmol). Arrêter le reflux après 1 h. Le bromure de 4- methoxyphenylmagnesium est utilisé tel quel pour l'étape suivante (couleur marron). Remarque : La verrerie et le magnésium sont préalablement séchés à l'étuve à 120 C et les autres produits au dessiccateur. Temps de rétention : Le réactif de Grignard étant un composé très instable et sensible à l'eau, on obtient donc trois temps de rétention caractéristiques des produits de dégradation formés lors de l'analyse HPLC : Temps de rétention 1 : 2. 68 min Temps de rétention 2 : 3. 32 min Temps de rétention 3 : 5. 38 min 2ème étape : Couplage avec le di-t-butvlazodicarboxvlate Schéma réactionnel 0 0 -x J 1 1 H, c-0-\-MgBr.-ONO". Réactif de Gngnard d 0 , IL NHO H3C-0-Q-N" X -) -0 N, N'-bls- (t-butoxycarbon yll) -4- ( methoxy) phenylhydrazme Mode opératoire : Reprendre à part 1 eq. de di-t-butylazodicarboxylate et 1 eq. de 4-methoxyphenylmagnesiumbromide (réactif de Grignard) dans du THF anhydre (2 mL/mmol). Refroidir chacun entre 0-5 C. Additionner le réactif de Grignard sur le di-t-butylazodicarboxylate. Agiter 10 min, ajouter 1. 02 eq. d'acide acétique puis laisser revenir à température ambiante. Effectuer une extraction eau/éther. Sécher la phase éthérée, évaporer à sec. On obtient une huile jaune. Temps de rétention : 7. 85 min 3eme étape : Déprotection Schéma réactionnel 0 J Lj Mode opératoire : Reprendre 1 eq. de N, N-bis- (t-butoxycarbonyl)-4- (methoxy) phenylhydrazine dans de l'isopropanol (10. 2mL/mmol) puis ajouter du HCI dans le dioxane à 4. 8 M (2mL/mmol). Porter à reflux (80 C). Après 15 min, refroidir, ajouter de l'ether (5mL/mmol). La 4methoxyphenylhydrazinehydrochloride précipite. Filtrer et sécher. Reprendre la poudre dans de l'eau puis amener à pH 7. Effectuer une extraction eau/ dichloromethan et évaporer la phase dichloromethan à sec. On obtient la 4methoxyphenylhydrazine (poudre jaune) qui est séchée. Temps de rétention : 2.20 min 4"'étampe : Couplaqe avec le diphenylcarbonate Schéma réactionnel 1 CH3-0-Q-NH-NH2 0 CH-O-Y-NH-NH../\-o-Lo-V ""x benzène à 120'C Cristaliisation hexanelbenzène -mefhoxpenyydraz/ned Mode opératoire : Reprendre 1. 4 eq. de diphenylcarbonate dans du benzène (0. 25 mL/mmol) et porter à reflux à 120 C. Additionner lentement 1 eq. de 4methoxyphenylhydrazine repris dans du benzène (0.7 mL/mmol). Arrêter le reflux après 6h. Concentrer le milieu réactionnel puis effectuer une cristallisation hexane/benzène (4/1). Filtrer et sécher les cristaux blanchâtres au dessiccateur. Temps de rétention : 6.74 min Seme étape : Couplage avec la phénylalanine Schéma réactionnel 0 0 o o ! (")) 0 4-MethoxyPhenytHydrazoforrnate (cristaux blanchàtre) Sel de tflethylammonium de la Phenylalanine 7" Reflux DMF à 95 OC zNR NWIN 3HC, 0 0 N- (4-MethoxyPhenyfHydrazoFonny-L-PhenylAlanine (cristaux blanchâtre) m Mode opératoire : Porter à reflux (95 C) 1. 2 eq. de sel de triethylammonium de la phenylalanin repris dans de la dimethylformamide (3. 33mL/mmol). Additionner lentement 1 éq. de 4-methoxyphenylhydrazoformate repris dans de la dimethylformamide (2mUmmol). Arrêter le reflux après 1h30, laisser revenir à température ambiante, concentrer. Acidifier (pH =2). Purifier par chromatographie (cristaux blanchâtre). Temps de rétention : 6. 12 min 6eme étape : Oxydation ; Passage de la forme"hvdrazo"à la forme"azo" Schéma réactionnel A 1) Eau ; NaOHaq10% ! ! f 2) CH3COONaq 10 % .-. NH A.. . OH--------------- 3) Métapériodate de sodium 0 N- (4-MethoxyPhenyfHydrazoFormyf) -L-PhenyIAlanme (cnstaux blanchâtre) 0 0 r 11 0 4-AoxyP/ ? enazoFom-L-PnyM/an ; ne 3HC, 0 0 N- (4-t4ethoxyPhen4azoFom7l)-L-Phen4AIanine (cnstaim orange) Mode opératoire : Reprendre 1 éq. de N- (4-methoxyphenylhydrazoformyl) -LPhenylalanin dans de l'eau ultra-pure (20. 8 mUmmol) contenant 1 éq. d' hydroxyde de sodium et 1éq. d'acétate d'ammonium. Additionner 1 éq. de metaperiodate de sodium repris dans de l'eau ultra-pure (4. 2 mUmmol). Après 20 min le milieu réactionnel est acidifié (pH=2) puis purifié par chromatographie (cristaux orange). Temps de rétention : 6. 86 min 7"'étape : Couplaqe avec larqinine Schéma réactionnel fl/ 0 2H N-CH-C, ? f. 1. OMe. HC ! 3Hof\.. VN (H2) 3 rrT TNK fijH DMF. DfAE. TBTu 0 0 (L-------- 0 N- (4-MethoxyPhenytAzoFormyl) -L-PhenyIAJanine Argininemethylesterhydrochloride (couleur orange) 0 0 0 il NH . /'/\/\/\/\, /"\ N NH h CH OMe H3C 0 1 NH NH NH HN NH2 N- (4-MethoxyPhenyIAzoFormyl) -L-PhenyIAJanyiArginineMethylester (couleur orange) Mode opératoire : Reprendre 1 éq. d'Argininemethylester, hydrochloride dans de la dimethylformamide (3mUmmol). Ajouter 1. 1 éq. de DIAE (Diisopropylethylamine), 1 éq. de N- (4-methoxyphenylazoformyl) -L-Phenylalanine puis 1. 1 éq. de TBTU (0- (Benzotriazol-1-yl)-N, N, N', N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate). Ajouter la quantité nécessaire de DIAE pour avoir un pH à 7-8. Après 5 min, évaporer à sec et purifier par chromatographie (cristaux orange). Temps de rétention : 6. 06 min 8 étape : Saponification Schéma réactionnel 0 dz il NH C H3'\K) \NH 0 CH N nail - (chez) 3 1) Saponification 't MeOH/Eau (2/3 1/3) NH C 2) Neutralisation HCI1N \ HN NH2 N- (4-MethoxyPhenyIAzoFormyl) -L-PhenyIAIanineArginineMethylesfer 0 ss N NH 1 : 1 ) (NH'cfi''OH N NH CH OH H3C \ a 0 (H2) 3 (HY "OH 0 1 23 NH . A. HN NH2 N- (4-MetnoxyPhen yIAzoFormyl) -L -PhenylAlanineArginine Anfsyl AzofFormy/PhenylalamneAfwmAne AAFFR Mode opératoire reprendre 1 éq. de N- (4-methoxyphenylazoformyl) -L- PhenylalanineArgininemethylester dans un mélange eau/methanol (Ratio : 1/2 ; 3 mL/mmol). Additionner 3 éq. d'hydroxyde de sodium 1N. Après 1 h, acidifier le MR, concentrer puis effectuer une extraction eau/dichloromethane. La phase dichloromethan est évaporée puis séchée. On obtient le N- (4methoxyphenylazoformyl)-L-PhenylalanylArginine qui est une poudre orange. Temps de rétention : 5.5 min Une analyse d'acide aminée du produit final est effectuée après hydrolyse acide pour contrôler l'homogénéité de la séquence. Les résultats de cette analyse sont reportés sur le chromatogramme de la figure 2. Conditions analytiques : > Chaîne HPLC AAA ; Dérivatisation précolonne au PITC (phénylisocyanate) > Colonne C18 ; 100A ; 5u ; 250 x 4. 6 mm > Détection à 254 nm ; Débit = 1 mL/min > Eluants : A : Tampon acétate pH 5.74 B : Tampon 70% CH3CN, 30% AcONa ; 32mM ; pH = 6.10 C : CH3CN Les protocoles de synthèse pour les autres composés sont basés sur les mêmes étapes que celles qui viennent d'être décrites ci-dessus. Ceux-ci sont résumés dans les schémas réactionnels ci-après. Les temps de rétention obtenus à chaque étape de synthèse de ces composés sont reportés dans le tableau Il ci-dessous : TABLEAU Il : Temps de rétention obtenus sur HPLC à chaque étape pour les autres colorants synthétisés Etape 2, 3DMPAFFR 2, 4DMPAFFR 2, 5DMPAFFR MxAPFFR MxPAFFK CITAFFR TFMxPAFFR 1 / / / / / / / 2 9 12 min 9. 18 mm 9. 15 min 7 85 min 7. 85 min 9. 25 min 9. 26 min 3 3. 59 min 3. 81 min 3. 73 min 2. 20 min 2. 20 min 3. 93 min 3. 94 mm 4 7. 87 min 7 96 mm 7. 82 min 6. 74 mm 6. 74 min 8. 06 min 7 92 min 5 7 04 min 7 13 min 7 11 min 6 12 min 6 12 min 7 51 min 7 45 min 6 7. 82 min 7. 88 min 7. 90 min 6 86 min 6 86 min 7. 85 min 7. 79 min 7 7. 10 min 7 02 min 7. 10 min 6. 06 min 9 84 min 7 13 min 7 08 min 8 6. 55min 6. 54 min 6. 62min 5.50min 9. 23 min 671min 6.65min Conditions analytiques : > Colonne C18 ; 5p ; 100x4. 6mm > Détection à 254 nm ; Débit = 1 mL/min > Gradient : z 10% B 10' 90% B > Avec A : Eau à 0.1 % d'acide trifluoroacétique B : Acétonitrile à 0.1 % d'acide trifluoroacétique BI Synthèse du 2, 3-dimethvlphenvlazoformvlphenvlalanvlarqinine (Composé H : 1 étape : Réactif de Grignard 3HC CH3 3HC CH3 o t.. THFanhyefr,/\-) u) nRr Br + Mg (toumur- ;--'- 2"'étape : Couplaqe avec le di-t-butylazodicarboxvlate 3HC CH3 0 0 /VI THF anhydre \/OC, N2 Réactif de Grignard di-t-butyf azodicartJoxylate 0 3HC CH3 NH 0 ' - N, N'-bis- (f-bufoxycartJonyll) -2, 3- (dimethyl) phenylhydrazjne 3ème étape. Déprotection 0 3HC CHg ! ( (X ./\, , 1) HCI dans le dioxane (4 8M) ; Isopropanol ô- 2) NaOH 1N (pH=7) 0 N, N'-bis- -t-butoxycarbony/-2, 3- (dimethyp) phenylhydrazine 3HC CH3 y-NH-NH2 2, 3-fnethy/) pheny/hydrazine 4ème étape : Couplage avec le diphenylcarbonate 3HS 0 eflux benzène à 120 *C 3HC chus 3HC CH3 3 11 NH-NH-cHL 0 0- 5eme étape : Couplage avec la phénylalanine 0 3HC CH3 O H2N > 0sos ls Reflux DMF S 95 C 3HC CH3 0 H2 o il G-le Reflux DMF à 95 *C NH-NF±C-+ N-30 2. 3-dimethyIPhenyIHydrazoformate Sel de triethylammonium de la Phenylalanine (cristaux blanchsstre) CH3 0 CH3 0 Id'0 0 N- (2, 3-dimethylPheny/HydramFormyl-L-PhenyMlanine (cristaux blanchâtre) 6ème étape : Oxydation : Passage de la forme"hvdrazo"à la forme"azo" r 1) Eau ; NaOHaq 10 % fu, o r CH3 0 2) CH3COONaq 10 % 01 "Y'NH ! NH 3) Métap6r) Ot) atedesodium I 0 0 N- (2, 3-dimethytPhenytHydrazoFormyt) -L-PhenylAlanine (cristaux blanchâtre) CH3 0 CH3 0 01 3HC 1 Nz N-N OH 1&num; 0 N-f2, 3-dimethylPhenazoFom ! y)-L-PhenyMianine (cnstaux orange) 7erre étape : Couplage avec l'ArQinine ri 1 2H N-CH-C CH3 0 f J OMe. HC ! DMF. DtAE. TBTu - OH "--------- 1 HN" NH2 cir HP% t" NH2 N- (2, 3-Ofmethy/Phef) yMzoFormyl)-L-P.') e/A/anine Argfnemethylesterhydrochloride (couleur orange) TT' Cl, 0 CH3 0 &num; g CN. . N-C e )) ! & (ÔH - NH NH HN NH2 M-. 3- 8 étape : Saponification f) 1 ss CH3 0. &num; NI YNAnY ?' 3) nu &num; 1 2) Neutralisation HCI1N NH t, HN" NH2 N- (2 3-dimethyJPhenyiAzoFormyJ) -L-PhenylAlanyIArginineMethylester (couleur orange) fil o 1 &num; NHCH OH NH ""NH I NH HV NH2 N- (2. 3-methylPhenyMzoFormyl)-L-PhenyiafanineArptnfne CI Synthèse du 2. 4-dimethvlphenvlazoformvlphenvlalanvlarQinine (Composé 2) : 1 étape : Réactif de Griqnard CH3 CH3 3HBr THF anhydre HMgBr 3HC- T-Br + Mg ( (oumu---'-- HsC- -MgBr O. C ; N2 2, 3 dimethy/pheny/bromide Magnésium Réactif de Grignard 2eme étape : Coup avec le di-t-butvlazodicarboxylate CH3 0 0 H, le-THF anhydre 3 9 + O. C, N2 Réactif de Gngnard d 3"'étape : Déprotection 0 1 CH3 A L CH3 / ; NH 0 0, g dioxane (4 8M) isopropanol 3H f' X.. \==/. -o- 2) Na OH 1 N (pH=7) 0 N, N'-bls- (t-butoxycarbonyll) -2, 4- (dlmethyl) phenvlhydrazine 2, 4- (dimethyl) phenylhydrazine 4eme étape : Couplage avec le diphenvlcarbonate CH3 ", e-Q-NH-N"' 0 0- a-Q Reflux benzène à 120. C H3C- ZU + -0-C-0- ()---------Cristallisation hexane/benzène 2, 4- (dlmethyl) phenylhydrazine diphenylcarbonate CH3 ", e-Q-NH-NH-t il 0- 2, 4- (dimethyl) phenylhydrazoformate seme étape : Couplaqe avec la phénylalanine CH3 0 CH3 0 H2 il G Hr3 C NK-NH-IC01NH-NH-C-0-n\, 1 H'NK-NK-L) Reflux DMF à 95. C "' 2, 4-/mey/P/ ? en/dtazomta 6eme étape : Oxydation : Passage de la forme"hvdrazo"à ta forme"azo" A J l) Eau ; NaOHa ;) lO% N OH 2) CH3COONaq 10 % OF " NK NFrt) ' 3) Métapénodate de sodium 3HC &num; N- (2, 4-dlmethyIPhenyIHydrazoFormyl) -L-PhenyIAJanine (cristaux blanchàtre) CH3 &num;0 N" N'IN H-OF 3H . HC N-V-2, 4-dimethylPhenazoFoymyl)-L-PhenylAanine (cristaux orange) 7eme étape : Couplaqe avec l'arginine fl/ + 2H N-CH-C Jl FX Isse, HCI DMF, DIAE, TBTu (HÛ3 ' 1 NH H3 HN"\ NH2 2, -of/nefhyyP/) enyM2oFonny/)-L-P/tenawne Mnemef/t//esfeyocWoe (couteurotange) 1 0 CH3 0 &num; g CH3 NH 1 0 (H2) 3 H3 &num; 1 NH H3 0 (L H NH2 N- (2. 4-dimethylPhenylAzoFonnjd)-L-PhenyLAJanyMrWnineMethylester (couleur orange) Berne étape : Saponification n 1 g MeOH \NAY . ) 1 0 (tH2h MEOH/Eau (213, 113) (H2) 3'0 &num;1 2) Neutralisation HA 1N sHC"- NH HN NH2 N- (2 4-dimeth yIPhenyIAzoFormyl) -L-PhenytAlanylArginineMethylester (couleur orange) Fo 1 CH3 0 &num; \ N"'-N) lN NH-CH'OH 1 0 (H2h 3HC" NH ( 3H NH HN NH2 N- -dimety/henyMzoFormyl)-L-PhenyiAlanineArg'nfne DI Synthèse du 2. 5-dimethvlphenvlazoformvlphenvlalanvlarqinine (Composé 3) : 1 ere étape : Réactif de Griqnard CH3 CH3 /-Br. Mg 2"'étape : Couplage avec le di-t-butylazodicarboxylate 0 i CH M tX /MgBr. ON=0 . ./" 3HP-3HP C 1 o Réacfff de Gfignard cfi-t-buto azodicarboxylate N. N'bis- (t-butoxycarbonyli)-2, 5- (dime *phenohydrazhe 1 3"'étape : Déprotection 0 CH3 y-CH3 f, N'J (1) HCI dans le dioxane (4. 8M), tsopropano)/\, ....,, \/\ L------------------ \/-NH-NHz H3C 0 H3C HJC 0 H3C N, N'-bls- (f-bufoxycarbonyll) -2, 5- (dimethyJ) phenylhydrazine 2, 5- (dimethyl) phenyJhydrazine 4ème étape : Couplaoe avec le diphenylcarbonate CH3 0 /"-NH-NH,. (O-Lo-y Rne. l20. C Cristalhsabon hexanelbenzène H3C 2, 5- (dlmethyl) phenylhydrazjne diphen carbonate CH3 -NH-NH-Lo-y H3C HSC 2, 5- (dimethyl) phenylhydrazoformate 5eme étape : Couplaqe avec la phénylalanine 0 2K D CH3 C) r. \\ H e le Reflux DMF à 95 *C + - ) ==" = ! 1 H3 0 Z5-dimethylPhenytHydrazoformate (a t aux blanchàtre) Sel de tdethjdammonium de la Phenylalanine JÛ' NHNHY I"R 0 H3 N- (2, 5-dimeth) 4PhenylHydrazoFormyl)-L-PhenyiAlonine cristaux blanchâtre) 6eme étape : Oxydation ; Passaqe de la forme "hydrazo" à la forme "azo" Cl3 0 1 1) Eau ; NaOHaq 10 % ? 2) CH3COONaqlO% 1 0 3) Métapériodate de sOdium H3 H3 N- (2. 5-dimethy PhenylHydrazoFormyt-t.-PhenyWanine (cristaux blanchltre I 0 H3 rr 0 CHs N- (2. 5-dimethytPhenytazoFormyt) -L-PhenytAJanine (estaux orange) 7"'étape : Couplage avec l'Arqinine 1/ j ! J zHN-CW-C \OME, HCI DMF, DIAE, TETU (H2) 3 1 CHs M-C2, 5-offnePenzooyO-L-PhenyM/antne n/nemeeet/foc/oe (couleur orange) H3 CH3 0 o 1 'T NH 3 HNN &num;0 (1 H2) 3 orange) Berne étape : Saponification 0 1 CH3 0. &num; 1) fCH ? ----------t N N O (CH MeOH i Eau (V3, 113) nu 2) NeutralisatMn HCI 1N NH H3 Ó HN NHz N- (24-dlmethylPhenylAzoForm) -L-Pheny/ManyMfptinineMethylester (couleur orange) 0 1 CH 0. &num; fj A ( T CH3 Ó CH3 HN"NH2 HN vdm7ethylphenylA2t7Formy0-L-phenylAlantneAt9mtne N- (2, 4-dmJethyIPhenyIAzoFormyl) -L-PhenyJAlanmeArgmme El Synthèse du 4-metnoxvphenvlazoformvlphenvlalanvllysine : 1 ere étape : Réactif de Griqnard H3c-a-Q-sr + Mg (tournure) THF anhydre.. H3c-a-Q-MgSr O. C. N2 - 4-bromoamsole Magnésium Réacfif de GngnarrJ 2eme étape : Couplage avec le di-t-butvlazodicarboxvlate 0 0 j i A J HaC-O- y-MgBr ±ON=N\"" Réactif de Grignard di-t-buty azodicarboxylate 0 J THPanhyd, H3C-0-/\-N)/ O. C, N2 0 N, N'-bis- (t-buloxycarbonyJ/) -4- (methoxy) phenyfhydrazine 3eme étape : Déprotection 0 NH 0 H'C-a-Q-- > -o-k 1) HCI dans le dioxane (4 SM). lsopropanol Jo 2) Na 2) NAOS 1N (pH=7) 0 N, A/'-tts--tt/ 4eme étape : Couplaqe avec le diphenvlcarbonate CH3-a-Q-NH-NH2 0 0-0-8-0-0 Reflux benzène è 120. C \-/\/\-/Cf'stalfsabon hexane/benzène 4- (methoxy) phenyfhydrazine dlphenylcarbonate 0 Q''- 4- (methoxy) phenylhydrazoformate 3HC, oz NR NH'0-0 4- (med ? OW) PhOnjOihYdamformage1 5eme étape : Couplage avec la phénylalanine 0 0 Hc-oMNKNH o-Q le 0, Z ±N- 1 1 0 4-MethoxyPhenylHydrazoformate (cristaux blanchàtre) Sel de triethylammontum de la Phenyialanine O X Reflux DMF à 95''C NH JL JL. OH 0 N N 3HC, 0 0 N- (4-MethoxyPhenyiHydrazoFormyi) -L-PhenyfAJanine (cristaux blanch4tre) 6eme étape : Oxydation ; Passaqe de la forme"hydrazo"à la forme"azo" 1) Eau, NaOH"q 10 % 0 0 r- 0 r ) ! 2) CH3COONMlO% M 3) Métapénodate de sodium 3HC". 0 0 0 N- (4-MethoxyPhenj/ae N-MoPnoFormyl)-L-PhenyM/anine (cifstaux blanchàtre) (cnsteux orange) (cnstaux OQnge} 7"'étampe : Couplage avec la Lysine fl/ iUJ zHN-CH-C 0 r"1 OMe. HC ! (H2) 3 r\NHY"NH DMF. D. AE. TBTu 3H 0 0 6, 0 HN" NH2 N- (4-MethoxyPhenyMAzmFcnDyO-L-PhenyM/anine Arnemethy/esterhydrocMode (couleur orange) 0 jQo Il . , L. NH C / NT NH Y \OMe H3C 0 6 \ a (H2) 3 NH NH HN"'NH2 N- (4-AthoxyPhenyMzoFormn-L-PhenyM/8fylyrinineMethy ester (couleur orange) 8eme étape : Saponification 0 JO ? N NU IL IleN H C (\ N"NH Y CHOMe. HC) H3C 0 1 1) Saponification "0 9 étape : Déprotection Ce composé particulier nécessite une étape supplémentaire pour déprotéger la chaîne latérale de la lysine (s-Boc : N-s-tertiobutoxycarbonyl). 0 w NH il Mode opératoire : Reprendre 1 eq de N- (4-MethoxyPhenyIAzoformyl) -LPhenylalanyl-L-Lysine (E-Boc) dans du dichloromethan (3mL/mmoL) dans un ballon. Placer sous agitation. Connecter une ampoule à brome contenant de l'acide trifluoroacétique (3mL/mmoL). Additionner lentement (goutte à goutte). Après 15 min, concentrer le milieu réactionnel et le purifier par chromatographie liquide haute performance. On obtient en finale une poudre orangée. FI Synthèse du 3-chloro-p-tolylazoformvlphenylalanylarqinine (Composé 6) : 1 étape : Réactif de Griqnard Schéma réactionnel ci H3C-/Br Mgu '"" y-MgBr O. C ; N2 3-chloro-4-bromotoluène Magnésium Réacde Grignard 2eme étape : Couplage avec le di-t-butvlazodicarboxvlate Schéma réactionnel 0 ci 0 0 ci CI 0 0 : 0- N c-MgBr. O H. C--" Réactif de Grignard di-t-butyl azodicarboxylate N, N'-bIs- {t-butoxycarbonyil) -3- ( chloro-p.. tolyl) hydrazine 3eme étape : Déprotection Schéma réactionnel 0 Ci U CL H 0 1) HCI dans le dioxane (4 8M), Isopropanol H 2) NaOH 1 N (pH=7) 0 \==/ oJ 4"'étampe : Couplage avec le diphenvicarbonate Schéma réactionnel 0 3HC) 3NH NH2 + (} OCOt3 C-VNH-NH,. ( -C) I 3-cNoro-p-tolythydrazkte diphenytcarbOnstO 0 0 Reflux benzène à 120"CCIrT - ( ) Cnsta) i ! sahon hexane/benzéne,. '' > ' h3L semé étape : Couplaqe avec la phénylalanine Schéma réactionnel 0 c NFI 0 H2 G 0 0 H2 HsC" L 3-e/oro-p-y//) ydfazofo/ma (e Se/de (nea/n/non/ufn de/a P/) eny semé étape : Oxydation : Passaqe de la forme"hvdrazo"à la forme"azo" Schéma réactionnel /j 1) Eau, NaOHaq 10 % 2) CH3COONaq 10 % OH OH CK. . NH, A kOH-----------------' 7eme étape : Coup ! acte avec t'Arginme Schéma réactionnel 0 2H zHN-CH-C d OMe, HCI CK. iJOH NH DMF. D ! AE. TB NH HN'" NH2 K,,, eOH H3Vn HPY NH2 N- (3-chlorrrp-tolytAzoFormyi) -L-PhenyIAianine Argininemethyiestemydrochloride 0 O il eN H C '\0NH 0'C'DM. H3 (6H2f. 3 1 NH 1 NH HN'1'NH2 N- (3-chloro-p-lolyiAzoForrnyi) -L-PhenyIAianylArginlneMethylester (couleur orange) 8 étape : Saponification Schéma réactionnel 0 O il C NH C NH H CH ome 1) Saponification Me OH 1 Eau (213. 113) H3 (tH2h. 1 2) Neutralisation HCI1 N NH HN NH2 N- (3-chIOro-p-tolyfAzoFormyfj-L-PhenylAJanylArginineMethyfester (couieur orange) 0 O Il NH C W, C 0 i H3 (tH2h 1 HN. NHz N- (3-chloro-p-tolyIAzoFormyfj-L-PhenyfAJanyIArginine G/Synthèse du 3-chloro-p-tolvlazoformvlphenvlalanvlarqinine (Composé 7) : 1 étape : Réactif de Grignard Schéma réactionnel F F F- (o-/-Br + Mg ( . F-6-0-/-MgBf - O. C. N2 IF I4-bromo (trffluoromethoxv} phen'l1magnesium Magnésium Réactif de Grignarr/ 2eme étape : Couplaqe avec le di-t-butvlazodicarboxvlate Schéma réactionnel Fb t3MgBr + i\D) \W 2\O) t F ! ! F-6-oD-M9Br + 1 Réactif de eGnayddMu aocf/cMboxyate zu F THF anhydre-1 NH 0 0 í NO) L THF anhydre. -D-tf o--k 3eme étape : Déprotection Schéma réactionnel 0 - j ! Z F 1) HCI dans le dioxane (4. 8M) ; isopropanol F 1 NH 0/'/-1 c c F F-C-O-0-N" ok F--C-0- -hr L. 2) NaOH1N (pW=7) j \/ F 0 N, N'-bis- (t-butoxycarbonyfl) -4- (trffluoromethoxy) phenyfhydrazine 4- (trffluoromethoxy) phenylhydralJne 4eme étape : Couplaqe avec le diphenylcarbonate Schéma réactionnel F - 0 F- 0 NH-NH2 + C > -CF-6-0o-NH-NH2 + 0-0-8-0- ( > 5eme étape : Couplaqe avec la phénvlalanine Schéma réactionnel 0 0 l Reflux DMF à 95'c J" Vt' \. 1 F-+ 1-N- \ C-l'1 F 0 4- (trtfluommethoxy) phenyfhydrazofonnate Sel de triethylammonlum de la Phenylalanine . \ 0 0 - \ N% NLN OH F ? OH c 6eme étape : Oxydation ; Passage de la forme"hvdrazo"à la forme"azo" Schéma réactionnel 0 1) Eau, NaOHaq 10 % r, NApf\- " 2) CH. COON10 0 3) Métapénodate de sodium -'\ F c N- (4- (trifJuoromethoxy) phenYIHydrazoFormyf) -L-PhenyfAJanine 0 N N&commat; F "\ F M--twofnethophenyMoonn/O-L-PenjMamne -Ns N (4 (ffiflvommethexyJphenylAzo'orm L-phenAJanzne 7eme étape : Couplaqe avec l'Arqinine Schéma réactionnel 0 0 zHN-CH-C . N ! ! vJL.,, OMe. Ha DMP. D) AE. TBTu + (H2 F-'*\c 0 HP, HNHz F N-fnuofDfnoxphenMzoFon/t-L-PhenyMamne nynemeysteymc/t/orfde 0 0 0 0 il ou j Il NH C 'CÁ'OMe F HN \H2 N- roromethoxy) phenylAzoFo)-L-PhenyManyfBinineMeesr semé étape : Saponification Schéma réactionnel ? ruz 'S. JtL i NH C NH C Ç NOH ) () [ ft NH f) CH OMe 1) Saponification MeOH 1 Eau (213 ; 1/3) 1 > 2) Neutralisation HCl1 N ''F HN NH2 N- (4-fluoromethoxy) phenylAzonnrm-P/-! enylAlany rginineMer (couleur orange) ? r0 ? Il NH C ÇNH N Nl) C OH F OH H \,. (! : Ni H F NHz M-f4-fM ? uon ? meoxp/ ! enyMzoFomty-L-PenyJWanyMMf ! e (couleur orange) EXEMPLE NO 2 : Exemple de protocole de dosaqe de l'activité du TAFI selon la méthode de l'invention. L'échantillon de plasma testé est divisé en deux aliquotes, l'un étant additionné de PCI (Calbiochem-Réf. 217359), l'autre de tampon hépès. Les deux aliquotes sont ensuite traités de manière identique selon le principe suivant : 150 ut de plasma dilué au 1/20 en tampon hépès (ou TAFI purifié à 13 g/ml en tampon hépès. 10 ut PCI ou H20 5 minutes à température ambiante 150 ut tampon activateur de la coagulation 10 minutes à température ambiante 100 ul PPACK+100utMxPAFFR (5mM) 30 minutes à température ambiante 100 ut HCI1M + 100 I NaOH 1M Dilution au 1/3 en tampon hépès Lecture de la DO à 382 nm 25 ut Carboxypeptidase A Lecture de la DO à 382 nm sur 1 minute Autres variantes possibles : - on peut effectuer le dosage à une température de 3r C - le MxPAFFR peut être incorporé dès le départ, en même temps que le tampon activateur - la lecture peut être faite par HPLC Concentrations préférées des différentes produits : - PPACK : H-D-Phe-Pro-Arg-chloromethylketone PM = 451 150 uM (Bachem- Réf. N. 1065). - Péfabloc : il peut être utilisé à la place du PPACK : 0.1 mM (Pentapharm-Réf. 399.01). - MxPAFFR : 5 mM - Carboxypeptidase A : origine pancréas bovin (Sigma-Réf. C 0386). Flacon de 5.1 ml à 5000 unités, 21 mg prot/ml, 47 unités/mg protéine La CPA a été filtrée avec préfiltre, filtre 5 pm et filtre 0.45 um, pour cela on a ajouté ml H20. - PCI : utilisé à 0,38 mM 1 mg de PCI peut inhiber environ 8 mg de TAFI (50 U/mg) à 50 % selon indications du fournisseur (Calbiochem). Tampon activateur : La voie d'activation préférée de la coagulation dans le cadre de la présente invention est la voie d'activation par le complexe thrombine/thrombomoduline. Dans ce cas, le tampon activateur utilisé comprend les constituants suivants : 37 ut thrombomoduline de 0 à 80 nm et préférentiellement à 10 nm (Rabbit lung thrombomodulin-American Diagnostica-Réf. 237). 6 pI thrombine de 0,2 à 10 NIH/ml et préférentiellement à 0,8 NIH/ml (Diagnostica Stago-Produit de recherche). 750 ut chlorure de calcium de 0 à 80 nm et préférentiellement à 40 nM 705 ut tampon hépès 9.4 mM pH = 7.6 Les concentrations sont données pour un volume final de 1498 ut de tampon activateur. N. B. : Le tampon hépès contient : Hépès 20 mM, KCI 4 mM et BSA 1 % d'autres essais ont été réalisés avec Hépès 20 mM et NaCI 150 mM. # Comme cela l'a été indiqué dans la description, d'autres voies d'activation sont possibles dont notamment la voie d'activation par le facteur Xia. Dans ce cas un exemple de tampon activateur contient les constituants suivants : 5 1-11 thrombomoduline à 30 U/ml 30 1-11 Facteur Xia pur (Calbiochem-Réf. 233483). 88 1-11 tampon hépès pH = 7. 4 (Hépès 20 mM et NaCI150 mM). Les concentrations étant données à titre d'exemple et peuvent être réajustées par l'homme du métier. Exemple n 3 : Etablissement d'une gamme d'étalonnage. La figure 3 ci-après représente une courbe d'étalonnage établie à partir d'un plasma déficient en TAFI surchargé avec du TAFI purifié pour obtenir une gamme de concentration en TAFI allant de 0 à 26 ug/mt. Le composé de formule 1 utilisé est le MxPAAFR à une concentration de 5 mM. Les # DO mesurés selon la méthode de l'invention sont reportés dans le tableau III suivant : TABLEAU LIS Concentration en TAFla () jg/m)) 0 1. 63 3. 25 6. 5 13 26 A DO mesuré 0. 168 0. 217 0.273 0. 399 0.624 0. 995 Comme cela apparaît sur la figure 3, la courbe d'étalonnage est linéaire pour les gammes de concentrations étudiée. Celle-ci couvre largement la zone de normalité, le TAFI étant présent dans l'organisme à des concentrations allant de 5 à 15 ug/ml. La méthode de l'invention permet donc de desceller aussi bien des déficits en TAFI que des taux anormalement élevés. Exemple n 4 : Résultats obtenus sur différents types de plasmas. La méthode de l'invention a été appliquée sur différents types de plasmas selon le protocole décrit dans l'exemple n 2. Plasmas frais, plasmas congelés : On peut effectuer le dosage sur plasma frais ou plasmas congelés mais on observe une diminution de DO entre les deux. Celle-ci résulte d'une légère dégradation du TAFI lors de la décongélation (la protéine se dégrade). Plasmas frais Plasmas congelés 9. 4 g/mt 6. 0 pg/ml 11. 2 jjg/ml 6. 5 (jg/ml 10. 7I-1g/ml 5. 6 ! Plasma congelé, plasma lyophilisé : Sur un plasma lyophilisé, le dosage de TAFI est possible et similaire à un plasma congelé. Plasma congelé Plasma lyophilisé A DO : 0. 302 0. 354 Plasma d'origine diverse congelés : Thrombolytique 2. 9 ug/ml CIVD 2. 8 ug/ml Cirhhose 1. 4ug/ml Maternité 7.1 ug/ml Hyperfibrinogénémie 4.6 pg/ml HNF 6.1 g/ml (héparines non fractionnées) AVK 5. 8-8. 2-6. 5-7. 1 jjg/ml (anti-vitamine K). Exemple n 5 : Dosage réalisés avec différents substrats de l'invention. La méthode de l'invention a été appliquée sur une solution contenant du TAFI purifiée, avec différents composés décrits dans l'Exemple n 1. Le test est réalisé sur une solution à 6,5 pg/ml de TAFI purifié dans du tampon hépès. Les résultats sont reportés sur le tableau IV ci-après. TABLEAU IV : Composés Lecture DO de départ DO finale Delta DO 2, 3 DMPAFFR 5 mM 350 nm 0.318 0.089 0.229 2,4 DMPAFFR 5 mM 330 nm 1.004 0.087 0.917 2,5 DMPAFFR 5 mM 320 nm 0.973 0.131 0.842 AAFFK 5 mM 320 nm 0.973 0.131 0.842 EXEMPLE N"6 : Spécificité du TAFia pour les composés de formule (1) de l'invention : L'exemple ci-après vise à démontrer la nécessité d'utiliser la méthode et les composés de formule (1) de l'invention pour doser spécifiquement l'activité des CPN ou U, en particulier le TAFI, par rapport à d'autres carboxypeptidases basiques. 1. Le dosage est dans ce cas réalisé avec un substrat de la famille de composés décrites par Mock dans (14). Ce substrat est constitué d'un seul acide aminé porteur du radical chromophore anizylazoformyl (portion CH3OC6H4-N = N-CO- ). L'acide aminé choisi est l'arginine, un acide aminé basique normalement hydrolysé par les carboxypeptidases B (1). Ce substrat est dénommé ci-après AAFR (AnizylAzoFormyArginine) ou MxAFR (4-MethoxyphenylAzoformylarginine). Ce substrat (0,25 mM) est mis en présence soit d'un échantillon de TAFI plasmatique, soit d'une solution de carboxypeptidase B pancréatique porcine (Sigma-Réf. C9584) à 5,2 molli. La diminution de coloration de chacun des deux échantillons est suivie au spectrophotomètre. Chacun des échantillons est traité selon le protocole suivant : a) échantillon de départ : *TAFI plasmatique (présent dans un pool normal de plasmas-dilué au 1/20) ou . Carboxypeptidase B pancréatique porcine 5,2 molli (dans tampon hépès) b) activation avec complexe thrombine-thrombomoduline-CaCI2 (voir exemple 2) pour l'échantillon de TAFI plasmatique. c) addition de AAFR à 5 mM. d) lecture DO à 382 nm. Résultats : à 382 nm DO de départ DO finale 1 Delta DO CPB porcine 1.054 0.445 0.608 TAFia du plasma 1.730 1. 681 0. 049 Conclusion : Le TAFI activté n'hydrolyse pas le AAFR contrairement à la CPB pancréatique. 2. La méthode de l'invention est ensuite appliquée sur une solution de TAFI purifiée, soit avec un substrat de formule (1) (MxPAFFK), soit avec le MxAFR pour vérifier que le TAFia hydrolyse néanmoins un composé de formule (1). L'activation de la coagulation est déclenchée par le complexe thrombine- thrombomoduline-CaCI2 (voir protocole exemple 2). La diminution de coloration de chacun des deux échantillons est suivie au spectrophotomètre. a) échantillons de départ : solution de TAFI purifié à18 ug/ml (dilué dans tampon hépès). b) activation de la coagulation. c) addition de MxAFR 27 mM ou MxPAFFK (témoin) concentration du MxAFFK. d) addition de CPA dans l'échantillon contenant le MxPAFFK. e) lecture DO à 382 nm. Résultats : DO de départ DO finale Delta DO TAFla + MxAFR 1.356 1.300 0.056 TAFla + MxPAFFK 1.397 0.849 0.548 Conclusion : Le TAFI activé n'hydrolyse pas le MxAFR alors qu'il est actif sur le MxPAFFK. BIBLIOGRAPHIE : 1. BOUMA. B. N. et al :"Thrombin-Activatable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI, Plasma Procarboxypeptidase B, Procarboxypeptidase R, Procarboxypeptidase U)". Thromb. Research, 101 : 329-354,2001. 2. BAJZAR L. :"Purification and Characterization of TAFI, a Thrombin-activable Fibrinolysis Inhibitor". J. of Biol. Chem., 270,24 : 14477-14484,1995. 3. JUHAN-VAGUE 1., ALESSI M.-C. :"TAFI : lien moléculaire entre les processus de coagulation et de fibrinolyse". Sang Thrombose Veineuse, 5, 10 : 314-6,1998. 4. SCHATTEMAN K. et al. :"Carboxypeptidase U at the interface between coagulation and fibrinolysis". Clin. Appl. Thrombosis/Hemostasis, 7 (2) : 93- 101, 2001. 5. WOLF M. et al. :"The kinetics of carboxypeptidase B activity". J. of Biol. Chem., 237, n 10, Octobre 1962. 6. SUZUKI S. et al. :"Spectrophotometric determination of glycine with 2,4, 6- Trichloro-s-Triazine". Analytical Chemistry, Vol. 42, NO 1, January 1970. 7. LORENTZ K. et al. :"Determination of carboxypeptidase B in duodenal contents". Clinica Chimica Acta, 37 : 515-517,1972. 8. PLUMMER Th. H. et al. :"An improved spectrophotometric assay for human plasma carboxypeptidase N". Analytical Biochemistry, 108 : 348-353,1980. 9. FISCHER G. H. et al. :"Synthetic inhibitors of carboxypeptidase N". Adv. Experimental Med. Biol., 198, Part A, 405-410, 1986. 10. SARUTA H. et al. :"Colorimetric determination of carboxypeptidase A activity in serum". Clin. Chem. 32 : 5,748-751, 1986. 11. NAM-JOO HONG et al. :"Development of substrate for carboxypeptidase B by employing Thiaarginine peptides". Bull Korean Chem. Soc., Vol. 19, NO 2, 189-93,1998. 12. MOCK W. L. et al. :"Arazoformyl Dipeptide Substrates for Thermolysin. Confirmation of a Reverse Protonation Catalytic Mechanism". Biochemistry, 35 : 7369-7377,1996. 13. MOCK W. L. et at. :"Arazoformy) Peptide Surrogates as Spectrophotometric Kinetic Assay Substrates for Carboxypeptidase A". Analytical Biochemistry, 239 : 218-222,1996. 14. MOCK W. L. et al. :"Catalytic activity of carboxypeptidase B and of carboxypeptidase Y with anisylazoformyl substrates". Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 9 : 187-192,1999. 15. HATTON M. W. :"Studies on the coagulant enzyme from Agkistrodon rhodostoma venom. Isolation and some properties of the enzyme". Biochem. J., 131 (4) : 799-807,1973. 16. STOCKER K. et al. :"The coagulant enzyme from Bothrops atrox venom (batroxobin)". Methods Enzymol. 45 : 214-223,1976. 17. DENSON K. W. E. :"Clot-inducing substances prevent in such venoms with particular reference to Echis carinatus venom". Thromb. Res., 8 : 351-360, 1976. 18. ROSING J. et al. :"Structural and functional properties of snake venom prothrombin activators". Toxicon, 30 (12) : 1515-1527,1992. REVENDICATIONS 1. Composé de formule (1) suivante : dans laquelle : R R R N A-N- ? yA= \//ou \//ou \// 0 1-0\1 0 ou f \/\/ R1 R2 - R1, R2 = H.-CHs,-CH (CH3) 2,-OCHs,-0,-CFs,-OCFs,-SCHs - R3 = un radical d'acide aminé hydrolysable par une carboxypeptidase A. - R4 = un radical d'acide aminé basique. 2. Composé selon la revendication 1 de formule (1) suivante : dans laquelle : R R R N A= \//ou \//ou \// R2"== R2="R2=N R2-R2 R2 N ou 00 0-0--0R ou - R1, R2 = H,-CHs,-CH (CH3) s,-OCHg,-Cf.-CFs,-OCFs,-SCHs - R3 = un radical d'acide aminé hydrophobe. - R4 = un radical arginine ou lysine. 3. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R3 est choisi parmi les radicaux d'acides aminés suivants : - la phenylalanine, - l'alanine, - la valine, - la leucine, - l'isoleucine, - la phénylglycine. 4. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R3 représente la phenylalanin. 5. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R3 représente la phénylalanine et R4 l'arginine ou la lysine. 6. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R1 est choisi parmi :-H et-CHg, et, R2 est choisi parmi CH3 et O-CH3. 7. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que A est 8. Composé selon la revendication 1 de formule (1), dans laquelle ledit composé étant choisi au sein du groupe constitué par les composés suivants dans lesquels : * les chiffres entre parenthèses déterminant la position des groupements methyl sur le radical phényl. 9. Méthode de dosage de l'activité d'une carboxypeptidase N ou une carboxypeptidase U dans un échantillon biologique, dans laquelle : - on met en contact ledit échantillon avec un composé de formule (1) selon la revendication 1, et une carboxypeptidase A, dans des conditions permettant l'hydrolyse de l'échantillon et, - on mesure la diminution de coloration de l'échantillon contenant le substrat de formule (1) et la carboxypeptidase A, résultant de la double hydrolyse du substrat de formule (1) par la CPN ou la CPU de l'échantillon et par la CPA. 10. Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que R4 est un radical arginine ou lysine. 11. Méthode selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce que le substrat est un composé de formule (1) dans lequel R3 est choisi parmi les radicaux d'acides aminés suivants : - la phénylalanine, - l'alanine, - la valine, - la leucine, - l'isoleucine, - la phénylglycine. 12. Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que le substrat est un composé de formule (1) dans lequel R3 représente la phénylalanine. 13. Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que le substrat est un composé de formule (1) dans lequel R3 représente la phénylalanine et R4 l'arginine ou la lysine. 14. Méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisée en ce que le substrat est un composé de formule (1) dans lequel R1 est choisi parmi-H -H et -CH3, et, R2 est choisi parmi CH3 et O-CH3. 15. Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que le substrat est un composé de formule (1) dans lequel : 16. Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que le substrat est un composé de formule (1) dans laquelle : ledit composé étant choisi au sein du groupe constitué par les composés suivants, dans lesquels : * les chiffres entre parenthèses déterminant la position des groupements methyl sur le radical phenyl. 17. Méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 16, caractérisée en ce que la densité optique du mélange est mesurée sans addition de CPA, puis après addition de CPA. 18. Méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 17, caractérisée en ce que la diminution de coloration mesurée est comparée avec des valeurs portées sur une courbe d'étalonnage obtenue à partir d'un échantillon déficient en la CPN ou CPU étudiée, surchargé avec cette enzyme purifiée. 19. Méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 18, caractérisée en ce que l'échantillon est un échantillon sanguin. 20. Méthode selon la revendication 19, caractérisée en ce que l'échantillon est du plasma. 21. Méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 20, caractérisée en ce que la CPA est de la CPA pancréatique. 22. Méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 21, caractérisée en ce que l'échantillon à tester est mis en présence d'un tampon activateur le temps nécessaire pour obtenir l'activation de la carboxypeptidase N ou U dont on veut mesurer l'activité, puis en présence d'un inhibiteur des serine protéases. 23. Méthode selon la revendication 22, caractérisée en ce que le substrat de formule (1) est ajouté en même temps que le tampon activateur, ou simultanément ou immédiatement après l'inhibiteur des sérine protéases. 24. Méthode selon la revendication 22, caractérisée en ce que l'activation est réalisée par la voie du complexe thrombine/thrombomoduline. 25. Méthode pour doser l'activité de la CPN ou la CPU constitutionnelle d'un échantillon et celle de la CPN ou la CPU activable du même échantillon, caractérisée en ce qu'on compare l'activité d'hydrolyse de l'échantillon sur un substrat de formule (1) après mise en présence de l'échantillon avec un tampon activateur le temps nécessaire pour obtenir l'activation de la carboxypeptidase N ou U dont on veut mesurer l'activité, puis en présence d'un inhibiteur des serine protéases, l'activité d'hydrolyse observée étant comparée avec l'activité d'hydrolyse de l'échantillon sur un substrat de formule (1) en l'absence de tampon activateur selon la revendication 9. 26. Méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 22, caractérisée en ce que la carboxypeptidase est une CPU. 27. Méthode selon la revendication 26, caractérisée en ce que la CPU est le TAFI. 28. Méthode selon l'une quelconque des revendications 22 à 27, caractérisée en ce que l'échantillon est traité en présence et en absence d'un inhibiteur spécifique du TAFI. 29. Méthode selon l'une quelconque des revendications 22 à 28, caractérisée en ce que l'inhibiteur spécifique du TAFI est le CPI. 30. Méthode de dosage du TAFI activé dans un échantillon sanguin, comprenant les étapes suivantes : a) mise en présence d'un aliquote n 1 de l'échantillon avec un inhibiteur spécifique du TAFI, et traitement de celui-ci selon la méthode de la revendication 22, b) traitement d'un aliquote n 2 de l'échantillon selon la méthode de la revendication 22, en l'absence d'inhibiteur spécifique du TAFI, c) mesure du A DO entre l'aliquote n 1 et l'aliquote n 2, représentatif de l'activité du TAFI activé dans l'échantillon. 31. Méthode selon la revendication 30 pour différencier l'activité du TAFI constitutionnel et celle du TAFI activable du même échantillon, caractérisée en ce que l'on mesure l'activité d'hydrolyse d'un troisième aliquote de l'échantillon sur un substrat de formule (1) en l'absence de tampon activateur. 32. Utilisation d'un composé de formule (1) selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour doser l'activité enzymatique d'une carboxypeptidase N ou U dans un échantillon. 33. Utilisation selon la revendication 32 caractérisée en ce que la carboxypeptidase est le TAFI. 34. Kit pour doser l'activité d'une CPN ou une CPU dans un échantillon comprenant un substrat chromogène constitué par un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 35. Kit pour doser l'activité du TAFI dans un échantillon biologique, comprenant - un activateur du TAFI, - de la carboxypeptidase A, - un substrat de formule (1), - un inhibiteur du TAFI, - un inhibiteur des serine protéases.