Brevet FR2823219A1 — publié le 20021011

La présente invention se rapporte à un procédé d'évolution artificielle in vivo de protéines, ledit procédé permettant de faire évoluer une protéine X par complémentation d'une protéine apparentée Y, X et Y appartenant tous deux à la même classe de la nomenclature enzymatique EC ou à des classes voisines. Les mutants D133E et Rl04Q de la désoxycytidine kinase (DCK) ont été obtenus, chacune de ces mutations conférant l'acquisition de l'activité thymidine kinase par DCK. Les techniques de séquençage et d'amplification PCR font appel à une gamme de plus en plus diversifiée de nucléosides triphosphates, les monomères activés qui peuvent être condensés par les ADN polymérases. De tels monomères artificiels se distinguent des quatre monomères naturels tant par des altérations chimiques de la base hétérocyclique [Sala et al, 1996] que du sucre pentose et du groupement triphosphate. La préparation des dérivés triphosphate s'effectue généralement à partir des nucléosides correspondants en soumettant l'alcool 5'libre à une phosphorylation puis en condensant le 5'phosphate au pyrophosphate, pour donner le triphosphate. La catalyse de l'étape de phosphorylation par une nucléoside kinase consommant de l'ATP constitue un procédé valide à l'échelle industrielle. Un tel procédé de synthèse n'est envisageable qu'avec des enzymes présentant une activité élargie, c'est à dire des nucléosides kinases capables de phosphoryler n'importe quel nucléoside avec une efficacité similaire. D'une manière plus générale, l'obtention d'enzymes présentant des activités élargies permettrait d'avoir accès à des outils puissants pour toute sorte d'applications biotechnologiques. Diverses solutions pour effectuer des mutations dirigées dans une molécule d'ADN ont été décrites dans l'état de la technique. Ces techniques consistent à introduire in vitro une mutation, une délétion ou une insertion en un site déterminé dans une molécule d'ADN par exemple en utilisant la PCR. Ces diverses techniques sont décrites dans Hall, et al. Protein Eng. 4 : 601 (1991) ; Hemsley, et al. Nucleic Acids Research 17 : 6545-6551 (1989) ; Ho, et al. Gene 77 : 51-59 (1989) ; Hultman, et al. Nucleic Acids Research 18 : 5107-5112 (1990) ; Jones, et al. Nature 344 : 793-794 (1990) ; Jones, et al. Biotechniques 12 : 528-533 (1992) ; Landt, et al. Gene 96 : 125-128 (1990) ; Nassal, et al. Nucleic Acids Research 18 : 3077-3078 (1990) ; Nelson, et al. Analytical Biochemistry 180 : 147-151 (1989) ; Vallette, et al. Nucleic Acids Research 17 : 723-733 (1989) ; Watkins, et al. Biotechniques 15 : 700-704 (1993) ; Weiner, et al. Gene 126 : 35-41 (1993). Yao, et al. PCRMethods and Applications 1 : 205-207 (1992) et dans Weiner et al, Gene 151 : 1/9-123 (1994). Outre les problèmes techniques rencontrés, il est impossible de savoir à l'avance quelle serait l'effet d'une mutation donnée sur l'activité d'une protéine avec de telles techniques. D'autres méthodes consistent à introduire des mutations au hasard dans le génome par l'emploi d'agents mutagènes (2-aminopurine, hydroxylamine ou ACRIDINE) et à sélectionner les cellules ou organismes montrant le phénotype recherché. Néanmoins, ces méthodes conduisent à l'introduction de nombreuses mutations, parfois létales, et ne sont pas adaptées à faire évoluer une protéine donnée dans un but précis. L'art antérieur montre également que l'on peut employer des systèmes in vivo, par exemple en utilisant des ADN polymérase exo-, ou d'autres protéines pouvant introduire des mutations (US 6,015, 705), mais aucune de ces techniques ne s'apparente à la méthode proposée par la présente invention. Pour répondre aux besoins et problèmes évoqués précédemment, la présente invention propose un procédé d'évolution artificielle in vivo de protéines. Ce procédé permet de faire évoluer in vivo une protéine X par complémentation d'une protéine apparentée Y, X et Y appartenant tous deux à la même classe de la nomenclature enzymatique EC ou à des classes voisines. En effet, on a démontré qu'il est possible de modifier par mutation l'activité d'un enzyme d'une classe, non seulement à l'intérieur d'une même classe, mais également de lui faire acquérir les activités caractérisant les classes voisines (3 premiers chiffres de la nomenclature EC en commun). En d'autres termes, l'invention apporte un procédé pour faire évoluer une protéine X pour qu'elle acquière l'activité d'une autre protéine Y, X conservant au moins une de ses propriétés ou activités initiales et donc présentant in fine une activité élargie. Ce procédé est particulièrement adapté à des enzymes du type nucléotidyl kinase, phosphorylase et nucléotidyl transférases, car on peut mettre à profit leur capacité à introduire des mutations dans leur propre gène. A ce titre, l'invention a été mise en oeuvre pour la désoxycytidine kinase d'Homo sapiens (DCK) qui est un enzyme capable de phosphoryler une large gamme de nucléosides présentant une parenté chimique avec la désoxycytidine (dC), suivant la réaction : dC + ATP- dCMP + ADP. En plus de la désoxycytidine, cet enzyme reconnaît comme substrats les désoxynucléosides puriques dA et dG ainsi que des analogues structuraux de bases ou de sucres, comme la 5-aza-cytidine (5azadC) et l'arabinocytidine. Toutefois, la thymidine n'est pas substrat de l'enzyme in vitro [Datta et al, 1989]. L'ADNc spécifiant la désoxycytidine kinase humaine a été cloné et séquencé [Chottiner et al, 1991, numéro d'accession dans GENBANK : M60527], révélant des similarités entre DCK et les thymidine kinases des virus herpétiques [Harrison et al, 1991]. De même, la structure tridimensionnelle de la thymidine kinase de l'herpès a été résolue par radiocristallographie [Brown et al, 1995]. Le brevet américain US 6,063, 376 décrit une seconde désoxycytidine kinase humaine appelée DCK2 qui possède 60 % d'identité avec DCK1. Dans le procédé selon l'invention, on a mis à profit la propriété de mutateur conditionnel de DCK en présence d'analogues de nucléosides promutagènes pour soumettre son propre gène dck à un épisode de mutagénèse in vivo. Ainsi, des bactéries de génotype Adeo tdk p.': dckH+ furent exposées soit à la 2amino-2'-désoxyribosyl-purine (disoA) soit à la 2-amino-désoxyribosyl-2-hydroxy- purine (disoG), puis incubées sur milieu solide riche en présence de triméthoprime et de thymidine. Des colonies sont apparues suite à l'administration des deux composés à une fréquence de l'ordre de 10-8. Aucune colonie ne survint en absence de nucléoside promutagène. Le séquençage des gènes de 7 plasmides mutants obtenus indépendamment (4 après mutagénèse par disoG, 3 par disoA) a mis en évidence deux mutations ponctuelles D133E et R104Q, chacune conférant l'acquisition de l'activité thymidine kinase par DCK. En outre, un plasmide réunissant les deux mutations dans un même allèle a été construit et introduit dans la souche ss7117 de génotype Adeo tdk. Il a permis la complémentation de la tdk inactivée par mutation ou délétion, exprimant donc aussi une activité thymidine kinase. Description Ainsi, de manière générale, la présente invention se rapporte à un procédé d'évolution in vivo artificielle de protéines, ledit procédé permettant de faire évoluer in vivo une protéine X par complémentation d'une protéine apparentée Y, X et Y appartenant tous deux à la même classe de la nomenclature enzymatique EC ou à des classes voisines. Un tel procédé permet de faire évoluer une protéine X de sorte à en modifier ses caractéristiques et comprend les étapes suivantes : a) obtention de cellules comportant un génotype [protéine Y* : : protéine X+], par transformation de cellules [protéine Y*] avec un acide nucléique comprenant le gène codant pour la protéine X, Y* signifiant que le gène codant pour Y a été inactivé, Y étant une protéine appartenant à une classe voisine de X possédant une activité voisine, les classes de X et Y se caractérisant en ce qu'elles possèdent au moins les trois premiers chiffres appartenant aux classes EC de la nomenclature internationale à 4 chiffres, lesdites cellules présentant un phénotype auxotrophe nécessitant pour survivre l'apport du produit de la réaction de Y sur son substrat dans le milieu de culture ; b) exposer les cellules obtenues à l'étape a) à un mutagène, c) mettre en culture lesdites cellules dans un milieu comprenant le substrat de Y, le produit de la réaction de Y sur son substrat étant nécessaire à la survie de ladite cellule, d) sélectionner les cellules qui ont survécu à l'étape c) dans lesquelles la protéine X, modifiée par l'action dudit agent mutagène, complémente la déficience en la protéine Y. A l'étape b), toute technique visant à augmenter la sensibilité de la cellule vis-à-vis d'un mutagène ou d'un promutagène, par exemple par expression d'une kinase, d'une phosphorylase ou d'une ADN pol exo-, peut être utilisée. De préférence, on utilise un vecteur d'expression de la DCKI comportant les mutations D133E et R104Q décrite ci-après. Dans le cadre de l'invention, le terme Y* signifie que le gène codant pour Y a été inactivé, c'est à dire qu'il a été délété en tout ou en partie, ou inactivé par insertion d'une séquence ou par introduction d'une mutation. Il faut signaler que l'invention peut également être exécutée dans le cas de modification du gène Y conduisant à un phénotype du type Ts (température sensible). Dans ce cas, les cellules sont cultivées à des températures non permissible pendant la phase de sélection (étapes c) et d)). Parmi, les protéines que l'on cherche à faire évoluer, on peut citer notamment : - les protéines appartenant à la famille des kinases, telles que par exemple Numéro EC Nom selon la nomenclature internationale 2.7. 1.20 Adenosine kinase. 2.7. 1.21 Thymidine kinase. 2. 7. 1. 38 Phosphorylase kinase. 2. 7. 1. 49 Hydroxymethylpyrimidine kinase. 2.7. 1. 74 désoxycytidine kinase (DCK). 2.7. 4.6 Nucleoside-diphosphate kinase. 2.7. 4.7 Phosphomethylpyrimidine kinase. 2.7. 4.8 Guanylate kinase. 2.7. 4.9 Thymidylate kinase. 2.7. 4.10 Nucleoside-triphosphate--adenylate kinase. 2.7. 4. 11 (Deoxy) adenylate kinase. 2.7. 4.12 T2-induced deoxynucleotide kinase. 2.7. 4. 13 (Deoxy) nucleoside-phosphate kinase. - les nucléotidyl transférase, telles que par exemple Numéro EC Nom selon la nomenclature internationale 2.7. 7.6 DNA-directed RNA polymerase. 2.7. 7.7 DNA-directed DNA polymerase. 2.7. 7.8 Polyribonucleotide nucleotidyltransferase. 2.7. 7. 19 Polynucleotide adenylyltransferase. 2.7. 7.25 tRNA adenylyltransferase. 2.7. 7.48 RNA-directed RNA polymerase. 2.7. 7.49 RNA-directed DNA polymerase. 2.7. 7.50 MARNA guanylyltransferase. - les phosphorylases, telles que par exemple Numéro EC Nom selon la nomenclature internationale 2.4. 2.1 Purine-nucleoside phosphorylase. 2.4. 2.2 Pyrimidine-nucleoside phosphorylase. 2.4. 2.3 Uridine phosphorylase. 2.4. 2.4 Thymidine phosphorylase. 2.4. 2.7 Adenine phosphoribosyltransferase. 2.4. 2.8 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase. 2.4. 2.9 Uracil phosphoribosyltransferase. 2.4. 2. 15 Guanosine phosphorylase. 2.4. 2.23 Deoxyuridine phosphorylase. 2.4. 2.28 5'-methylthioadenosine phosphorylase. Bien entendu, d'autres enzymes, notamment les enzymes du métabolisme ou du catabolisme, peuvent faire l'objet d'une évolution grâce au procédé selon l'invention. Ces enzymes et leur numéro EC respectif sont répertoriés par le Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) à l'adresse suivante : http : //expasy. proteome. org. au/enzyme/ Dans un mode de réalisation préféré, l'invention se rapporte à un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel la protéine X a la propriété d'introduire des mutations dans l'ADN. La propriété de mutateur conditionnel de la protéine X en présence d'analogues de nucléosides promutagènes permet de soumettre son propre gène à un épisode de mutagénèse in vivo. En ce sens, le procédé selon l'invention permet de faire évoluer une kinase X de sorte à en modifier ses caractéristiques, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) obtention de cellules comportant un génotype [kinaseY* : : kinaseX+], par transformation d'une cellule [kinaseY*] avec un acide nucléique comprenant le gène codant pour la kinase X, Y* signifiant que le gène codant pour Y a été inactivé, Y étant une kinase appartenant à une classe voisine de X montrant une activité voisine, les classes de X et Y se caractérisant en ce qu'elles possèdent au moins les trois premiers chiffres appartenant aux classes EC 2.7. 1.- de la nomenclature internationale à 4 chiffres, lesdites cellules présentant un phénotype auxotrophe nécessitant pour survivre l'apport du produit de la réaction de Y sur son substrat dans le milieu de culture ; b) exposer les cellules obtenues à l'étape a) à un analogue de nucléosides promutagènes pendant un temps donné, la kinase X étant capable de phosphoryler ledit analogue, c) mettre en culture lesdites cellules dans un milieu comprenant le substrat de Y, le produit de la réaction dudit substrat avec Y étant nécessaire à la survie de ladite cellule, d) sélectionner les cellules qui ont survécu à l'étape c) dans lesquelles la kinase X, modifiée par l'action dudit analogue de nucléoside promutagène, complémente la déficience en la kinase Y. Par complément , on entend la suppression du phénotype auxotrophe résultant de l'inactivation du gène Y. Lesdites cellules sont des cellules procaryotes ou eucaryotes, de préférence E. coli. Dans le cas où la protéine X est une kinase, le substrat est sélectionné parmi les nucléosides et leurs analogues. Avantageusement, la kinase X est une déoxycytidine kinase appartenant à la classe EC 2.7. 1.74. La kinase Y est de préférence une kinase n'appartenant pas à EC 2.7. 1. 74, notamment une thymidine kinase (TDK) appartenant à la classe EC 2.7. 1.21. Dans la mesure où X est une phosphorylase ou une polymérase, Y est une phosphorylase ou une polymérase différente de X. Ainsi, le procédé évoqué ci-dessus peut comprendre les étapes suivantes : a) obtention d'une bactérie E. coliddeo tdkp : : dckH+, mise en culture des cellules obtenues à l'étape a) dans un milieu comprenant : - un agent mutagène sélectionné parmi les analogues de nucléosides promutagènes et du triméthoprime qui bloque la synthèse du thymidylate par la thymidylate synthase ; - et la thymidine qui est nécessaire à la survie de ladite cellule, b) sélection des cellules qui ont survécu à l'étape b) dans lesquelles la DCKH, modifiée par l'action dudit analogue promutagène, complémente la déficience en TDK. Avantageusement, la kinase X est une désoxycytidine kinase, notamment la DCKI humaine de séquence déposée dans GENBANK sous le numéro d'accession M60527 comportant au moins une mutation sélectionnée parmi les mutations D133E et R104Q. La séquence double mutante de DCKI (SEQ ID Nol) est : 1 MATPPKRSCP SFSASSEGTR IKKISIEGNI AAGKSTFVNI LKQLCEDWEV VPEPVARWCN 61 VQSTQDEFEE LTMSQKNGGN VLQMMYEKPE RWSFTFQTYA CLSRIRAQLA SLNGKLKDAE 121 KPVLFFERSV YSDRYIFASN LYESECMNET EWTIYQDWHD WMNNQFGQSL ELDGIIYLQA 181 TPETCLHRIY LRGRNEEQGI PLEYLEKLHY KHESWLLHRT LKTNFDYLQE VPILTLDVNE 241 DFKDKYESLV EKVKEFLSTL En outre, la kinase X est de préférence capable d'activer un analogue de nucléoside promutagène, lequel analogue introduit des mutations dans son propre gène. A l'issu du procédé, la kinase X mutée est capable de remplacer (complémentation) la kinase Y et présente donc une activité élargie par rapport à son activité initiale. Ainsi, dans un deuxième aspect, l'invention vise une protéine X mutée, notamment une kinase X mutée, susceptible d'être obtenue à partir du procédé décrit ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle présente une activité élargie par rapport à la protéine X initiale (ou à la kinase X initiale). Il peut s'agir par exemple de la kinase DCK 1 humaine mentionnée ci-dessus comportant au moins une mutation sélectionnée parmi les mutations D133E et R104Q. L'invention porte également sur un acide nucléique comprenant une séquence codant pour la kinase DCKI humaine telle que définie cidessus et un vecteur comprenant cette séquence codante, ladite séquence pouvant être fusionnée à un promoteur efficace dans les cellules eucaryotes et/ou procaryotes. De préférence, le vecteur est un plasmide qui peut être introduit dans une bactérie telle que par exemple E. coli par transformation ; le vecteur se maintient dans la bactérie de manière stable ou transitoire. L'invention porte également sur une cellule hôte comprenant un vecteur exposé cidessus. Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'une kinase, explicitée précédemment, dans un procédé tel que défini ci-dessus pour rendre actif un analogue de nucléoside promutagène. Plus généralement, l'invention vise l'utilisation d'une kinase mentionnée ci-dessus dans tout procédé d'hypermutagénèse, pour convertir des nucléosides, naturellement réfractaires à la phosphorylation enzymatique, en leur dérivé 5'phosphate respectif. L'invention porte également sur l'utilisation concomitante d'une kinase selon l'une des revendications 12 et 13 et d'autres enzymes tels que AMK et/ou la transdesoxyribosylase (NTD) pour élargir in vivo la gamme de la mutagénèse à l'aide de promutagènes. En outre, il faut signaler que le vecteur mentionné ci-dessus peut être utilisé pour la préparation d'un médicament destiné à la thérapie génique pour permettre l'incorporation d'analogues de nucléosides dans l'ADN. L'invention vise également un procédé de mutagénèse in vivo d'une séquence d'ADN déterminée, ladite séquence d'ADN étant dans une cellule, comprenant les étapes consistant à : - effectuer la mutation par insertion d'au moins un type de nucléosides promutagènes dans ladite séquence, la cellule exprimant au moins un système enzymatique permettant l'insertion dudit nucléotide promutagène dans l'ADN, - et détecter la présence de la séquence mutée, caractérisé en ce que le système enzymatique comprend une kinase telle que définie ci-dessus. Ce procédé permet de faire évoluer une protéine spécifique de la cellule. En ce sens, on inactive un gène codant pour une protéine apparentée à ladite protéine spécifique, la protéine apparentée étant nécessaire à la survie de la cellule, et on détecte la complémentation après mutation du gène codant pour ladite protéine spécifique. Ladite protéine spécifique et ladite protéine apparentée sont de préférence des enzymes appartenant à une classe voisine ayant en commun au moins les trois premiers chiffres de la nomenclature internationale EC à 4 chiffres. Ces protéines sont sélectionnées parmi les kinases appartenant aux classes EC 2.7. 1. : on peut également envisager les nucléotidyl transférases appartenant aux classes EC 2.7. 7. -notamment les polymérases, et les phosphorylases appartenant aux classes EC 2.4. 2.- en utilisant des cribles appropriés. Avantageusement, lesdites protéines ont la propriété de pouvoir faire évoluer leur propre gène. L'invention porte également sur la souche d'E. coli 8 7151 de génotype Adeo tdk comprenant un vecteur exprimant la DCK mutée D133E déposée le 21 février 2001 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France) sous le numéro d'accession 1-2631. L'invention porte également sur une souche d'E. coli 13 7134 de génotype Adeo tdk comprenant un vecteur exprimant la DCK humaine déposée le 21 février 2001 à la CNCM sous le numéro d'accession 1-2630. L'invention porte également sur une souche d'E. coli 7338 de génotype Adeo tdk comprenant un vecteur exprimant la DCK double mutante D133E et R104Q déposée le 27 mars 2001 à la CNCM sous le numéro d'accession 1-2650. Légendes Figure 1 : crible permettant la sélection d'une activité thymidine kinase chez Escherichia coli. Figure 2 : spécificités comparées de la thymidine kinase d'Escherichia coli et de la désoxycytidine kinase humaine. Figure 3 : exemples d'analogues de nucléosides Matériels et méthodes Composés chimiques : les composés 3'-azido-3'-désoxythymidine (AZT), 2'désoxyinosine (dal), N4-amino-2'-désoxycytidine (désoxyribonucléoside de la 2- hydroxy-4-hydrazino-pyrimidine, désigné 4am'dC), 5-aza-2'-désoxycytidine (5azadC), 5-iodo-2'-désoxycytidine (5IdC), 5-bromo-2'-désoxycytidine (5BrdC) and 5-methyl-2'-désoxycytidine (5MedC) ont été achetés chez Sigma. La 2-désoxy-isoadénosine (disoA) (2-amino-9- (2'-désoxy-B-D-ribofuranosyI) purine) a été préparée par transglycosylation enzymatique en utilisant un extrait brut de Ndeoxyribosyltransferases de Lactobacillus leichmannii. La synthèse de la 2'- désoxyisoguanosine (2-hydroxy-6-amino-9- (2'-deoxy-B-D-ribofuranosyl) purine) a été réalisée par fermeture du cycle du 5-amino-l- (2'-désoxy-B-D- ribofuranosyl) imidazole-4-carboxamide. La préparation du 1- (2'- désoxyribofuramosyl) -imidazole-4-carboxamide (dY) a été décrite dans Pochet et al, 1995. Culture des souches bactériennes : les bactéries ont été cultivées dans un milieu riche Luria-Bertani (LB) ou dans un milieu minimum supplémenté avec 2g/l de glucose (MS). Les mêmes milieux de croissance ont été solidifiés avec 15g/l d'agar (Difco) pour la préparation des boîtes de Pétri. Les cultures liquides et solides ont été incubées à 37OC. Dans certains cas, des antibiotiques ont été rajoutés aux concentrations suivantes : 100mg/1 de carbenicilline, 25mg/l de kanamycine, 15mg/l de tétracycline. Le triméthoprime a été utilisé à une concentration de 100 mg/1 dans un milieu LB supplémenté avec 0,3 mM de thymidine. Pour l'induction de l'expression du gène, l'isopropyl-ss-D-thiogalactoside (IPTG) a été rajouté à 0,5 mM. Souches et constructions plasmidiques : la liste des souches E. coli Kl 2 utilisées et les plasmides construits dans le cadre de la présente invention est donnée dans le tableau 1 ci-après. Tableau 1 : souches bactériennes et plasmides Souche Phénotype Construction MG1655 F-'B. Bachmann KU8 trxB : : TnlOKan AserB zjj : : T Ml0 Uhland et al. S0928 Adeo Alac thi upp udp ton P. Nygaard S05110 cdd : : Tu 10 P. Nygaard CC 101 ara A (lac proB) 13 Cupples and Miller F'cZ : Glu461a/KS+ CC 102 ara A (lac proB) 13 Cupples and Miller F'cZ : G ! u461G ! yoZ ? + CC103 ara A (laccpro 13 Cupples and Miller F'lacZ ! u461GIn nroB+ CC104 ara A (lac proB) 13 Cupples and Miller F'lacZ : Glu461AlaproB+ CC105 ara A (lac prob) 13 Cupples and Miller F'lacZ prob+ CC 106 ara à (lac prob) 13 Cupples and Miller F'/ocZ : G ! u461Lys-o. 6+ ss7069 tdk Mutant MG1655 (résistance spontanée à l'AZT) 87117 Adeo tdk Transductions séquentielles de ss7069 avec des lysats Pl de KU8 et S0928 ss 7134 Adeo tdk Transformation de R7117 pDCKllacT dck+) p7151 Adeo tdk Plasmide pDCK D133E B7320 Ade o tdk cdd. : Tn 10 Transduction de ss7117 avec lelysat Pl de S05110 87334 Adeo tdk cdd- : Tn 10 Transformation de B7320 pSUTrc (kan+ lac76) 87335 Adeo tdkodd : : TnlO Transformation de 67320 pSUDCK1 (kan+ lac7Q dck+) 87336 Adeo tdkcdd : : Tn 10 Transformation de 87320 pSUDCK2 (kan+ lac7Q dck . D133E) 87337 Adeo tdk cdd. : : TMO Transformation de 87320 pSUDCK3 (kan+ 87347 Adeo deo tdk cdd : : Tn 10 Double transformation de 97320 pSUDCK3 (kan+ lac7Q dck.-R104Q) pAKT39A (bla+ lac7Q adk . T39A) B7348 Adeo tdk cdd. : : Tnl O Double transformation de 87320 pSUDCK4 (kan+ lac7Q k : D133E-R104Q) pAKT39A (bla+ lacis adk : T39A) 87351 ara A (lac pros) 13 Transformation de CC 101 F'lacZ.-Glu46lamproB+ pSUDCK2 (kan+ lac7edcD133E) B7352 ara A (lac proB) 13 Transformation de CC102 F'/a'cZ ; Gtu461G ! y6+ pSUDCK2 (kan+ lacIQ cek : D133E) 87353 araA (lac proB) 13 Transformation de CC103 F'lacZ.-Glu461GInproB+ pSUDCK2 (kan+ lac7 dck . D133E) 67354 ara A (lac proB) 13 Transformation de CC 104 F'lacZ,-Glu46 lAlaproB+ pSUDCK2 (kan+ lac76dck.-D133E) B7355 ara à (lac proB) 13 Transformation de CC105 F'lacZ : Glu461ValproB+ pSUDCK2 (kan+ ack.-D133E) B7356 ara A (lac prob) 13 Transformation de CC106 F'lacZ : Glu461Lys proB+ pSUDCK2 (kan+ lac76dck.-D133E) 67357 ara A (lac proB) 13 Double transformation de Cl 101 F'lacZ.-Glu46lamproB+ pSUDCK2 (kan+ lac7Q dck.-D133E) pAKl (bla+ lac7Q adk+) 87358 ara A (lac prob) 13 Double transformation de CC 102 F'lacZ.-Glu461GlyproB+ pSUDCK2 (kan+ c76c ; D133E) pas (bla+ lac7 adk+) 67359 ara A (lac proB) 13 Double transformation de CC103 F'lacZ : Glu461GlnproB+ pSUDCK2 (kan+ lac76dck : D133E) pAKl (bla+ lac76adk+) ss7360 ara A (lac prob) 13 Double transformation de CC 104 F'lacZ : Glu461AlaproB+ pSUDCK2 (kan+ lac7 dck . D133E) pas (bla+ lac7adk+) ss7361 ara A (lac prob) 13 Double transformation de CC105 F'lacZ : Glu461Val /oB+ pSUDCK2 (kan+ lac76dck : D133E) pas (bla+ lac7 adk+) 87362 ara A (lac prob) 13 Double transformation de CC 106 F'lacZ.-Glu461Lys proB+ pSUDCK2 (kan+ lac/6dck : D133E) pAKI (bla+ lacIQ adk+) Plasmides pTrc99A bla+ lac76 ColEl réplicon (Pharmacia) pDCKl la+ lacIQ dck+ Bouzon & Marlière pDCK2 bla+ lacIQ dck.-D133E Mutagénèse In vivo/disoG de B7134 pDCK3 bla+ lacIQ dck -RR 04Q Mutagénèse In vivo/disoA de B7134 pDCK4 bla+ lac76 dck : D133E-R104Q Substitution d'un fragment-S'a'clBamHI de 466 bases de pDCK3 par celui de pDCK2 pSUTrc kan+ lac76 Clonage du fragment SpahiBamHI de pTrc99A dans pSU39 pSUDCK kan+ lac7' dck+ Clonage du fragment Spahi- 07/1 de pDCKl dans pSU39 pSUDCK2 kan+ lac76 ck : D133E Clonage du fragment SphlBamHI de pDCK2 dans pSU39 pSUDCK3 kan+ lac7Q dck.-R104Q Clonage du fragment SphIBamHI de pDCK3 dans pSU39 pSUDCK4 kan+ lac7Q dck :.D133E-R104Q Clonage du fragment SpahiBamm de pDCK4 dans pSU39 PAKI bla+ lac7Q adk+ Dr T. Okajima pAKT39A bla+ lacIQ adk . T39A Dr. T. Okajima La souche B7069 a été sélectionnée comme étant un mutant spontané résistant à l'AZT de MG1655 cultivée sur boîte LB supplémentée avec 30 uM d'AZT. Le phénotype tdk a été déterminé par l'absence de croissance sur milieu riche MuellerHinton (MH) comprenant du triméthoprime et de la thymidine. On a contrôlé que la mutation ss7069 tdk ne réverse pas spontanément en repiquant les cellules sur le milieu MH supplémenté avec du triméthoprime et de la thymidine après 20 générations en LB. La souche 137117 Adeo tdk a été obtenue après deux transductions PI consécutives. Les bactéries B7069 ont d'abord été infectées avec le lysat PI provenant de KU8 dans le but de transférer la délétion JserB et le marqueur proximal Trio. Les clones résistants à la tétracycline ont été sélectionnés et testés pour leur auxotrophie à la sérine. Un de ces clones a ensuite été infecté avec le lysat Pl provenant de S0928 et les prototrophes à la sérine ont été sélectionnés sur milieu minimum. Tous les transductants Ser+ sélectionnés comportent la délétion de l'opéron deo car ils sont incapables de croître en milieu minimum avec de la thymidine comme seule source de carbone. Le plasmide pDCK4 a été construit en substituant le fragment SacI-BamHI de 466 bases de long de pDCK3 par celui de pDCK2. La présence des mutations D133E et R104Q sur pDCK4 a été déterminée par séquençage. Sélection in vivo des mutants DCK : une culture de 12 heures des cellules B7134 en milieu MS supplémenté avec 50 mg/1 de carbenicilline a été diluée 100 fois dans le même milieu et cultivée en aération jusqu'au moment où une turbidité de 0,100 (600nm) soit atteinte. La culture a ensuite été diluée 25 fois dans le même milieu avec ou sans IPTG et supplémentée avec des concentrations variables (5 à 30uM) des analogues de nucléosides promutanégiques disoG et disoA puis cultivée en aération pendant 18 heures. Les cellules ont été rincées puis étalées sur des boîtes MH supplémentées avec du triméthoprime, de la thymidine et de l'IPTG. Des colonies sont apparues après 36 heures d'incubation à 37OC. Aucune colonie n'a été obtenue en l'absence d'analogue de nucléoside. Test de détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) : la CMI des analogues de nucléosides a été déterminée conformément aux méthodes classiques avec les modifications suivantes : une culture bactérienne de 12 heures en milieu MS avec les antibiotiques appropriés a été diluée 100 fois dans le même milieu et cultivée à 37 C en aération jusqu'à l'obtention d'une turbidité d'environ 0,1 OD. (600nm). La culture a ensuite été diluée 100 fois dans le même milieu supplémenté avec IPTG et distribuée sur microplaque 96 puits dans un volume final de 100 Ill dans une série de dilutions de 2 en 2 d'analogues de nucléotide. Chaque analogue a été testé deux fois. Après une incubation pendant 18 heures à 37 C avec agitation, le CMI a été déterminé comme correspondant à la concentration la plus faible en analogue pour laquelle aucune turbidité n'est détectable. Test de réversion : Des cellules des souches lac CCIOI à CCI 06 ont été transformées, soit avec le plasmide pSUDCK2 seul, soit avec les plasmides pSUDCK2 et PAKI. Les transformations ont été cultivées pendant 12 heures en milieu minimum comprenant 0,2% de glucose avec les antibiotiques appropriés pour la maintenance des plasmides. La culture a ensuite été diluée 100 fois dans le même milieu et cultivée jusqu'à l'apparition d'une DO de 0, 1 (600nm). Ensuite, les cultures ont été diluées 100 fois dans le même milieu supplémenté avec 0,5 mM IPTG puis diluées 10 fois avec une solution 10 fois concentrée de l'analogue de nucléoside à tester. Les cellules ont été cultivées pendant 18 heures à 37 C avant la mise en culture sur boîte. Le dénombrement des cellules viables a été réalisé sur milieu solide LB. Les révertants Lac+ ont été sélectionnés en milieu minimum contenant 0,2% de lactose comme source de carbone. La fréquence de mutation a été définie comme étant le ratio : nombre de cellules mutantes sur nombre de cellules viables. Diverses concentrations finales des analogues nucléosidiques correspondant aux CMI/2, CMI/4, CMI/10 et CMI/20 ont été testées, car la sensibilité des souches dérivées de celles de Miller vis-à-vis des différents analogues n'est pas identique à celle des souches dérivées de MG1655. La fréquence de mutations a été déterminée en utilisant les cultures obtenues avec la concentration la plus élevée en analogue nucléosidique permettant une croissance visible après 18 heures. Exemple 1 : crible sélectif Escherichia coli ne possède pas d'activité désoxynucléoside kinase à l'exception d'une thymidine kinase, codée par le gène tdk, très spécifique de la thymidine et de la désoxyuridine. Nous avions montré précédemment comment l'introduction de l'activité désoxycytidine kinase chez E coli ouvre une voie métabolique inexistante dans cet organisme, et permet aux désoxynucléosides naturels et à des analogues structuraux d'accéder au pool des monomères de l'ADN [Bouzon & Marlière, 1997]. Une souche portant un allèle défectif du gène tdk ne peut utiliser la thymidine comme source de thymidylate (dTMP) et sa croissance dépend de l'intégrité de la voie de synthèse de novo de celui-ci (Figure 1). La synthèse de dTMP à partir de dUMP est catalysée par la thymidylate synthase (gène thyA). Elle peut être bloquée par le triméthoprime qui par inhibition de l'activité de la dihydrofolate réductase conduit à l'épuisement du pool intracellulaire du 5, 10-méthylène-tétrahydrofolate, donneur du groupement méthyle dans la réaction. Nous avons d'abord montré qu'une souche dont le gène tdk est inactivé ne prolifère pas sur milieu riche en présence de triméthoprime et de thymidine. Ce crible sélectif qui impose le maintien d'une activité thymidine kinase a été mis en oeuvre pour faire évoluer l'activité de la désoxycytidine kinase humaine chez E. coli. On le trouve schématisé dans la Figure 1. Exemple 2 : sélection de mutants dckH présentant une activité élargie Nous avons mis à profit la propriété de mutateur conditionnel de DCK en présence d'analogues de nucléosides promutagènes pour soumettre son propre gène dck à un épisode de mutagénèse in vivo. Ainsi, des bactéries de génotype Ztdeo tdk p : : dckH+ furent exposées soit à la 2'-désoxy-iso-adénosine (disoA) soit à la 2'-désoxy-iso- guanosine (disoG), puis incubées sur milieu solide riche en présence de triméthoprime et de thymidine. Des colonies sont apparues suite à l'administration des deux composés à une fréquence de l'ordre de 10-8. Aucune colonie ne survint en absence de nucléoside promutagène. Le séquençage des gènes de 7 plasmides mutants obtenus indépendamment (4 après mutagénèse par disoG, 3 par disoA) mit en évidence deux mutations ponctuelles D133E et R104Q, chacune conférant l'acquisition de l'activité thymidine kinase par DCK. Ces allèles sont désignés dckH*. Un plasmide réunissant les deux mutations dans un même allèle, dckH**, fut construit et introduit dans la souche B7117 de génotype zdeo o k. Il permit la complémentation de la mutation tdk, exprimant donc aussi une activité thymidine kinase. Les différents allèles sélectionnés sont répertoriés dans le Tableau 2 ci-après. Tableau 2 : mutations du gène hétérologue dckH supprimant le phénotype tdk de Escherichia coIL Mutagène Mutation Fréquence Site de la mutation substitution détectée acide aminé disoG C--A 4/4 codon 133 GAC Asp- > Glu disoA C--A 1/3 codon 133 GAC Asp- > Glu C-G 1/3 codon 133 GAC Asp- > Glu G-)-A 1/3 codon 104 CGA Arg- > Gln Les détails de la sélection et de l'analyse génétique sont donnés dans la section Matériels et Méthodes. Exemple 3 : propriétés fonctionnelles des mutants dckH La toxicité d'analogues de nucléosides, déviant soit par le sucre soit par la base, a été évaluée dans des souches de génotype Ado tdk cdd exprimant sur un plasmide les différents allèles de dckH, allèle sauvage, D133E, Rl04Q et double mutant. Le marqueur Adeo correspond à l'inactivation de l'opéron catabolique des désoxynucléosides et le marqueur cdd à l'inactivation de la désoxycytidine désaminase ; ces marqueurs évitent que les analogues de nucléosides apportés dans le milieu engendrent des dérivés autres que le dérivé phosphorylé souhaité par action de DCK ; ils permettent l'emploi de doses plus faibles des analogues. Les résultats sont indiqués dans le Tableau 3 ci-après. Tableau 3 : toxicité d'analogues de deoxynucléoside induite par la deoxycytidine kinase sur Escherichia coli. Analogue de Souche et allèle dck nucléoside Ado tdk cdd : : Ton 10 B7334 B7335 ss7336 B7337 B7338 none wt D133E R104Q D133E R104Q ddA 80 80 80 80 80 ddU > > > > > ddT > > > > > ddC > > > > > ddl 80 40 40 20 40 araC > 160 20 20 320 AZT > > 640 640 1280 5'-amino-dT > > > > > disoA > > 10 > > disoG > > > > > dl > > 1. 25 > 320 disol > > > > > 8ho'dl (*) > > 1280 > > DAP > > > > > d-oxanosine > > 80 > > dY > > > > > dJ > > > > > amino-dC > > 20 2. 5 20 5-aza-dC > 1. 25 1. 25 1. 25 1. 25 5-iodo-dC > > > > > 5-bromo-dC > > > > > 5-methyl-dC > > > > > 5-methyl-disoC > > > > > 5-chloro-dU > > > > > 5-bromo-dU > > > > > 5-iodo-dU > > > > > 5-hm-dU > > > > > (*) désoxyribonucléoside de la 8-hydroxy-hypoxanthine Les concentrations inhibitrices minimales, exprimées en microM, ont été déterminées comme indiqué dans la section Matériels et Méthodes. Chaque dosage a été effectué trois fois : aucune toxicité n'a pu être détectée à plus haute concentration en analogue, 1,28 mM. Le génotype détaillé des souches hôtes de chaque allèle est indiqué au Tableau 1. Bien que conduisant toutes deux à l'acceptation de la thymidine comme substrat, les mutations ponctuelles D133E et R104Q ont des effets contrastés sur la phosphorylation des différents analogues testés. Les souches sauvages d'E. coli sont sensibles à de faibles concentrations d'AZT, tandis que les souches tdk, qui ont perdu l'activité thymidine kinase, y sont réfractaires [Elwell et al, 1987]. Les tests rapportés dans le Tableau 3 indiquent que l'AZT n'est pas substrat de DCK wt, mais que le mutant D133E active l'analogue de telle façon qu'on détecte une toxicité à haute concentration de l'analogue (CMI= 1280 microM). Il est probable que cette toxicité provient de l'incorporation de l'AZT triphosphate par l'ADN polymérase et le blocage de l'élongation par ce terminateur de chaine après les actions successives de la dTMP kinase et de la nucléoside diphosphokinase sur l'AZT monophosphate. Poursuivant l'analyse des résultats du Tableau 3, la mutation D133E entraîne une forte toxicité de disoA, (CMI= 10 microM). La mutation R104Q n'a pas d'effet vis-à- vis de ce composé. De même, la mutation D133E entraîne une très forte toxicité de la désoxyinosine, dl (CMI= 1 microM). Le désoxyribonucléoside de la 2-hydroxy-4hydrazino-pyrimidine (désignée 4am'dC) apparait meilleur substrat du mutant R104Q que du mutant D133E, les deux mutations causant une très forte augmentation de la toxicité de l'analogue. La 5-aza-désoxycytidine (désignée 5azadC) est toxique à très faible concentration (CMI Globalement, l'allèle dckH-D133E se montre le plus intéressant, augmentant la sensibilité pour le plus grand nombre d'analogues. La combinaison des deux mutations D133E et R104Q mène à un spectre d'activité apparemment intermédiaire entre chacun des deux mutants individuels. Exemple 4 : diversification métabolique par coexpression de gènes hétérologues L'absence d'effet toxique par un analogue de nucléoside vis-à-vis d'une souche d'E. coli exprimant le gène dckH ou l'un de ses allèles mutants peut avoir plusieurs raisons, si on suppose que tout effet toxique résulte de l'incorporation de monomères erronés dans les chaînes d'ADN : (i) l'analogue n'est pas substrat ou est un mauvais substrat de l'enzyme DCK ; (ii) l'analogue est phosphorylé en monophosphate par DCK mais les étapes ultérieures de phosphorylation en diphosphate puis en triphosphate échouent ; (iii) l'analogue triphosphate n'est pas substrat de l'ADN polymérase. Il est connu que les nucléoside monophosphate kinases, qui produisent les diphosphates à partir des triphosphates acceptent le ribose et le désoxyribose, mais sont très spécifiques de la base. On s'attendait donc à ce que la coproduction d'un enzyme formant une variété élargie de monophosphates (allèles mutés DCK) et d'un enzyme formant une variété élargie de diphosphates dans la même cellule d'E. coli révèle les substrats nucléosidiques portant des bases déviantes susceptibles d'être phosphorylés en monophosphates par DCK wt ou DCK muté mais dont la conversion en diphosphate ne puisse être catalysée par les enzymes d'E. coli. L'adénosine monophosphate kinase des eucaryotes (AMK) présente une parenté de structure avec les UMP/CMP kinases des bactéries [Okajima et al, 1993]. Sa fonction physiologique serait de catalyser l'échange de phosphate entre AMP et ATP : AMP + ATP ADP + ADP ; l'enzyme agit également sur un substrat portant le désoxyribose : dAMP + ATP dADP + ADP. Le mutant T39A du gène de l'enzyme du poulet (amkG*) a été construit par mutagénèse dirigée en se guidant sur des comparaisons de séquence, par un groupe au Japon [Okajima et al, 1993]. In vitro, l'activité de AMK sur CMP est inférieure à 1 % de son activité sur AMP. La mutation T39A modifie le spectre d'activité de l'enzyme et augmente significativement la conversion de CMP et UMP [Okajima et al, 1993]. Nous avons exprimé conjointement dans le contexte génétique Zdeo tdk cdd chacun des quatre allèles de dckH avec chacun des deux allèles wt et T39A de amkG, et testé la toxicité des différents analogues de nucléosides déjà testés précédemment (Tableau 4 ci-après). Tableau 4 : toxicité d'analogues de deoxynueléoside induite par la coexpression de la deoxycytidine kinase and de l'adenosine monophosphate kinase dans Escherichia coli. Analogue Strain de dckH allele Nucléoside amkG allele B7339 ss7340 ss7341 B7342 87343 ss7344 ss7345 67346 ss7347 ss7348 none wt D133 R104 D133E none wt D133 R104 D133E E Q R104Q E Q R104Q wt wt wt wt wt T39A T39A T39A T39A T39A AZT > > > > > > > 1280 > > disoA > > 5 > 1280 > > 10 > > disoG > > > > > > > > > > dl > > : : ; 1. 25 > 1280 > > - 1280 8oxodl > > 1280 > > > > 1280 > > dY > > > > > > > 1280 > > 4am'dC > > 80 1. 25 80 > > 640 5 320 5azadC > : : ; 1. 25 1. 25 1. 25 > 1. 25 1. 25 L25 : : ; 1. 25 : 91. 25 1. 25 : 91. 25 5MedC > : 25 1. 25 : : ; 1. 25 : 91. 25 1. 25 Les concentrations inhibitrices minimum, exprimées en microM, ont été déterminées comme indiqué dans la section Matériels and méthodes. Chaque expérience a été effectuée trois fois : aucune toxicité n'a pu être détectée à plus haute concentration en analogue, 1280 microM. Le génotype détaillé des souches hôtes de chaque allèle est indiqué au Tableau 3. Il est apparu que la coexpression des deux gènes eucaryotes entraîne la conversion métabolique des dérivés 5-halogénés (5BrdC, 5IdC) et 5-méthylé (5MedC) de la désoxycytidine dC en dérivés inhibiteurs pour les bactéries recombinantes, tandis que l'expression d'un seul des deux gènes laisse les bactéries réfractaires aux mêmes analogues. La très grande toxicité de l'analogue lorsqu'il y a expression concomitante de DCK et AMK indique que DCK phosphoryle ces substrats mais que c'est l'étape ultérieure de phosphorylation par les monophosphates kinases qui est limitante. Comme on le voit dans le Tableau 4, la conjonction de l'allèle DCK-D133E et de l'allèle AMK-T39A entraîne une toxicité des souches d"E. coli qui les portent vis-àvis du nucléoside simplifié dY, désoxyribosyl-imidazole-carboxamide [Pochet et al, 1995]. Les effets mutagènes de la base Y avaient été démontrés ex vivo au cours de réactions d'amplification PCR, causant en particulier des transitions A : T- > G : C et des transversions A : T- > T : A [Sala et al, 1996]. La toxicité de dY à 1 mM vis-à-vis des souches rapportées ici s'accompagne d'une augmentation du même spectre de mutations in vivo. REFERENCES Bouzon M. & Marliere P. (1997) Human deoxycytidine kinase as a conditional mutator in Escherichia coli. Comptes Rendus de 1 Academie des Sciences-Serie III, Sciences de la Vie. 320 (6) : 427-34 Brown DG. Visse R. Sandhu G. Davies A. Rizkallah PJ. Melitz C. Summers WC. Sanderson MR. (1995) Crystal structures of the thymidine kinase from herpes simplex virus type-1 in complex with deoxythymidine and ganciclovir. 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Procédé pour faire évoluer une protéine X de sorte à en modifier ses caractéristiques comprenant les étapes suivantes : a) obtention de cellules comportant un génotype [protéine Y* : : protéine X+], par transformation de cellules [protéine Y*] avec un acide nucléique comprenant le gène codant pour la protéine X, Y* signifiant que le gène codant pour Y a été inactivé, Y étant une protéine appartenant à une classe voisine de X possédant une activité voisine, les classes de X et Y se caractérisant en ce qu'elles possèdent au moins les trois premiers chiffres appartenant aux classes EC de la nomenclature internationale à 4 chiffres, lesdites cellules présentant un phénotype auxotrophe nécessitant pour survivre l'apport du produit de la réaction de Y sur son substrat dans le milieu de culture ; b) exposer les cellules obtenues à l'étape a) à un mutagène, c) mettre en culture lesdites cellules dans un milieu comprenant le substrat de Y, le produit de la réaction de Y sur son substrat étant nécessaire à la survie de ladite cellule, d) sélectionner les cellules qui ont survécu à l'étape c) dans lesquelles la protéine X, modifiée par l'action dudit agent mutagène, complémente la déficience en la protéine Y. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la protéine X est sélectionnée parmi les kinases appartenant aux classes EC 2.7. 1. -, les nucléotidyl transférases appartenant aux classes EC 2.7. 7. -, notamment les polymérases et les phosphorylases appartenant aux classes EC 2. 4. 2.-.. 3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en que en ce que la protéine X est capable d'activer un analogue de nucléosides promutagène, lequel analogue introduit des mutations dans son propre gène. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 pour faire évoluer une kinase X de sorte à en modifier ses caractéristiques caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) obtention de cellules comportant un génotype [kinaseY* : : kinaseX+], par transformation d'une cellule [kinaseY*] avec un acide nucléique comprenant le gène codant pour la kinase X, Y* signifiant que le gène codant pour Y a été inactivé, Y étant une kinase appartenant à une classe voisine de X montrant une activité voisine, les classes de X et Y se caractérisant en ce qu'elles possèdent au moins les trois premiers chiffres appartenant aux classes EC 2.7. 1.- de la nomenclature internationale à 4 chiffres, lesdites cellules présentant un phénotype auxotrophe nécessitant pour survivre l'apport du produit de la réaction de Y sur son substrat dans le milieu de culture ; b) exposer les cellules obtenues à l'étape a) à un analogue de nucléosides promutagènes pendant un temps donné, la kinase X étant capable de phosphoryler ledit analogue, c) mettre en culture lesdites cellules dans un milieu comprenant le substrat de Y, le produit de la réaction de Y sur son substrat étant nécessaire à la survie de ladite cellule, d) sélectionner les cellules qui ont survécu à l'étape c) dans lesquelles la kinase X, modifiée par l'action dudit agent mutagène, complémente la déficience en la kinase Y. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que lesdites cellules sont des cellules procaryotes ou eucaryotes, de préférence E. coli. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que ledit substrat est sélectionné parmi les nucléosides et leurs analogues. 7. Procédé selon l'une des revendications 4 à 6 caractérisé en ce que la kinase X est une déoxycytidine kinase (DCK) appartenant à la classe EC 2.7. 1. 74. 8. Procédé selon l'une des revendications 4 à 7 caractérisé en ce que la kinase Y est une thymidine kinase (TDK) appartenant à la classe EC 2. 7. 1. 21. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) obtention d'une bactérie E. coli Meo tdk p : : dckH+, b) mise en culture des cellules obtenues à l'étape a) dans un milieu comprenant : - un agent mutagène sélectionné parmi les analogues de nucléosides promutagènes et du triméthoprime qui bloque la synthèse du thymidylate par la thymidylate synthase ; - et de la thymidine qui est nécessaire à la survie de ladite cellule, c) sélection des cellules qui ont survécu à l'étape b) dans lesquelles la DCKH, modifiée par l'action dudit analogue promutagène, complémente la déficience en TDK. 10. Procédé selon l'une des revendications 4 à 9 caractérisé en ce que la kinase X est une désoxycytidine kinase, de préférence la DCK 1 humaine possédant la séquence déposée dans GENBANK sous le numéro d'accession M60527 comportant au moins une mutation sélectionnée parmi les mutations D133E et RI 04Q. 11. Protéine X mutée susceptible d'être obtenue à partir du procédé selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisée en ce qu'elle présente une activité élargie par rapport à la Protéine X initiale. 12. Kinase X mutée susceptible d'être obtenue à partir du procédé selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisée en ce qu'elle présente une activité élargie par rapport à la kinase X initiale. 13. Kinase selon la revendication 12 caractérisée en ce qu'il s'agit de la DCKI humaine possédant la séquence déposée dans GENBANK sous le numéro d'accession M60527 comportant au moins une mutation sélectionnée parmi les mutations D133E et R104Q. 14. Acide nucléique comprenant la séquence codante pour la kinase selon la revendication 13. 15. Vecteur d'expression comprenant la séquence codante pour la kinase selon la revendication 13. 16. Vecteur selon la revendication 15 caractérisé en ce que ladite séquence est fusionnée à un promoteur efficace dans les cellules eucaryotes et/ou procaryotes. 17. Vecteur selon l'une des revendications 15 et 16 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide capable de transformer et de se maintenir chez E. coli. 18. Cellule hôte comprenant un vecteur selon l'une des revendications 15 à 17. 19. Utilisation d'une kinase selon l'une des revendications 12 et 13 dans un procédé non-thérapeutique selon l'une des revendications 1 à 10 pour l'activation dudit analogue promutagène. 20. Utilisation d'une kinase selon l'une des revendications 12 et 13 dans un procédé non-thérapeutique d'hypermutagénèse. 21. Utilisation d'une kinase selon l'une des revendications 12 et 13 dans un procédé non-thérapeutique pour convertir des nucléosides, naturellement réfractaires à la phosphorylation enzymatique, en leur dérivé 5'phosphate respectif. 22. Utilisation concomitante d'une kinase selon l'une des revendications 12 et 13 et d'autres enzymes tels que AMK et/ou la transdesoxyribosylase (NTD) pour élargir in vivo la gamme de la mutagénèse à l'aide de promutagènes. 23. Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 15 à 17 pour la préparation d'un médicament destiné à la thérapie génique pour permettre l'incorporation d'analogues de nucléosides dans l'ADN. 24. Procédé non thérapeutique de mutagénèse in vivo d'une séquence d'ADN déterminée, ladite séquence d'ADN étant dans une cellule, comprenant les étapes consistant à : - effectuer la mutation par insertion d'au moins un type de nucléosides promutagènes dans ladite séquence, la cellule exprimant au moins un système enzymatique permettant l'insertion dudit nucléotide promutagène dans l'ADN, - et détecter la présence de la séquence mutée, caractérisé en ce que le système enzymatique comprend une kinase selon l'une des revendications 12 et 13. 25. Procédé selon la revendication 24 pour faire évoluer une protéine spécifique, ladite protéine étant exprimé de la cellule, caractérisé en ce qu'on inactive un gène codant pour une protéine apparentée à ladite protéine spécifique, la protéine apparentée étant nécessaire à la survie de la cellule, et on détecte la complémentation après mutation du gène codant pour ladite protéine spécifique. 26. Procédé selon la revendication 25 caractérisé en que ladite protéine spécifique et ladite protéine apparentée sont des enzymes appartenant à une classe voisine ayant en commun au moins les trois premiers chiffres de la nomenclature internationale EC à 4 chiffres. 27. Procédé selon la revendication 26 caractérisé en que lesdites protéines ont la propriété de pouvoir faire évoluer leur propre gène. 28. Souche d'E. coli 8 7151 de génotype Adeo tdk comprenant un vecteur exprimant la DCK mutée D133E déposée à la CNCM sous le numéro d'accession 1-2631. 29. Souche d'E. coli 13 7134 de génotype Ado tdk comprenant un vecteur exprimant la DCK humaine déposée à la CNCM sous le numéro d'accession 1-2630. 30. Souche d'E. coli i ss7338 de génotype Meo tdk comprenant un vecteur exprimant la DCK double mutante D133E et R104Q déposée à la CNCM sous le numéro d'accession 1-2650.