Brevet FR2823977A1 — publié le 20021031

non toxiques, pharmaceutiquement acceptables. L' invention est relative à l'utilisation du Mangafodipir dans le cadre du traitement de pathologies impliquant un stress oxydatif, et notamment des insuffisances hépatocellulaires. Le manganèse dipyridoxyl phosphate (Mn-DPDE), également dénommé Mangafodipir (DCI), est utilisé en radiologie comme produit de contraste paramagnétique dans le cadre du diagnostic par IRM (imagerie par résonnance magnétique); pour revue sur les propriétés du Mangafadipir, cf. ROCKLAGE et al., Inorg. Chem., 28, 477-485, (1989). Or, les Inventeurs ont maintenant constaté que le Mangafodipir posséJait des propriétés de mimétique de différentes enzymes intervenant dans la détoxification des radicaux oxygénés libres. Ils ont ainsi observé que le Mangafodipir possédait notamment une activité superoxyde dismutase, et également une activité catalase et une activité glutathion réductase. L'activité superoxyde dismutase (EC 1.15.1.1) intervient dans la détoxification des radicaux oxygénés libres, en catalysant la dismutation de l' anion superoxyde (o. 2) en peroxyde d'hydrogène (H202). On distingue différents types de superoxyde dismutase, parmi lesquels on citera notamment les superoxyde dismutases à cuivre et zinc (CuZnSOD), également connues sous la désignation superoxyde dismutase-1, qui, chez les organismes eucaryotes, sont principalement localisées dans le cytoplasme, et les superoxyde dismutases à manganèse (MnSOD), également connues sous la désignation superoxyde dismutase-2, que l'on trouve principalement chez les procaryotes et dans les organites intracellulaires des cellules eucaryotes. La catalase et la glutathion-réductase participent à la détoxification du peroxyde d'hydrogène généré par l'activité SOD. Le rôle joué par les radicaux oxygénés libres dans le stress oxydant impliqué dans l' apparition et le développement de nombreuses maladies, notamment des cancers, ainsi que des maladies inflammatoires et autoimmunes, est reconnu. Il a ainsi été proposé, pour le traitement de ces diverses pathologies, d'utiliser des produits posséJant une activité de détoxification de ces radicaux. En particulier, l'utilisation de mimétiques de SOD a ainsi été proposée dans le cadre de diverses pathologies impliquant un stress oxydant provoqué par l' anion superoxyde ou ses métabolites [pour revue cf. PATEL et DAY, Trends Pharmacol. Sci., 20, 359-364 (1999)]. La mise en évidence par les Inventeurs des propriétés du Mangafodipir permet de proposer l'utilisation de ce produit en tant que mimétique de la SOD. Le Mangafodipir peut ainsi être emplayé dans les indications thérapeutlques des mimétiques de la MnSOD, et notamment des mimétiques de la MnSOD. En outre, ses propriétés de propriétés de mimétique de la catalase et de la glutathion réductase, également mises en évidence par les Inventeurs, lui permettent de participer à la détoxication d'espèces oxygénées réactives autres que l' anion superoxyde, et rendent son utilisation particulièrement avantageuse dans le cadre du traitement et/ou de la prévention de pathologies impliquant un stress oxydant o interviennent ces espèces oxygénées réactives. La présente invention a pour objet l'utilisation du Mangafodipir pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif d'une pathologie impliquant un stress oxydant, et notamment un stress oxydant induit par l'anion superoxyde ou le peroxyde d'hydrogène. Selon un mode de mise en _uvre préféré de la présente invention, ladite pathologie est une insuffisance hépatocellulaire. On désigne sous le terme d'insuffisance hépatocellulaire un ensemble de manifestations pathologiques résultant de la destruction des hépatocytes. Selon l'étendue de la destruction cellulaire, ces manifestations cliniques sont plus ou moins graves et réversibles. Dans des cas extrêmes, la destruction massive et subite des hépatocyLes aboutit à une insuffisance hépatique aigué, également dénommée hépatite fulminante, qui peut entraîner la mort en quelques j ours. Parmi les causes les plus fréquentes de destruction des hépatocyLes pouvant entraîner une insuffisance hépatocellulaire on mentionnera notamment les infections virales, dues aux différents types de virus de l'hépatite, ainsi que les intoxications, notamment par certains médicaments ou par l'alcool. On dispose actuellement de plusieurs modèles expérimentaux animaux d'insuffisance hopatocellulaire de différentes origines, qui permettent notamment d'induire expérimentalement une insuffisance hépatique aigué, et d'étudier les mécanismes aboutissant à la destruction cellulaire. Différents mécanismes impliquant des radicaux oxygénés libres ont ainsi été proposés. Par exemple, l'insuffisance hépatique aigué d'origine texique, induite notamment par l'acétaminophène, résulte d'une saturation des mécanismes normaux de détexication hépatique. En effet, aux doses pharmacologiques, l'acétaminophène est principalement éllminé par glucoro- et sulfoconjugaison, mais est également oxydé par le cytochrome P450 en N-acétylp-benziquinone-imine (NAPQI), qui peut normalement être ensuite éliminée après conjugaison avec le glutathion. En cas de surdosage, on observe la saturation des voies de glucoro- et sulfo-conjugaison, et une production accrue de NAPQI [PRESCOTT, Drugs, 25, 290-314, (1983)]. Ce métabolite très réactif est supposé être l'effecteur principal des lésions des hopatocyLes, et les traitements médicamenteux proposés sont basés essentiellement sur l'utilisation d'antioxydants, tels que la N-acétyl-L- cystéine, qui ont pour but de permettre la reconstitution des réserves intracellulaires de glutathion et la neutralisation du NAPQI. L'efficacité de ces traitements est toutefois inconstante [CARACENI et VAN THIEL, Lancet, 345, 163-169, (1995) i SCHIODT et al., N. Engl. J. Med. , 337, 1112-1117, (1997)], et en cas d'hépatite fulminante, la greffe du foie constitue actuellement le seul traitement récllement efficace. Dans le cas de l'insuffisance hopatocellulaire induite par l'alcoal, plusieurs mécanismes ont été proposés, faisant intervenir notamment la génération de métabolites toxiques comme l'acétaldéhyde,. l'anion superoxyde ou le peroxyde d'hydrogène. Les Inventeurs ont recherché l'effet du Mangafodipir sur l'insuffisance hépatique aiguë d'origine toxique, en utilisant un modèle expérimental d'insuffisance hépatique aiguë induite par administration d'acétaminaphène. Ils ont ainsi constaté que l'administration du Mangafodipir permet d' augmenter très significativement le taux de survie après administration d' une dose létale d' acétaminophène, et d'en réduire considérablement les effets toxiques. Il apparaît donc que le Mangafodipir protége très efficacement les hopatocyLes des effets destructeurs de substances toxiques, et exerce ainsi un effet à la fois préventif et curatif sur l'insuffisance hépatocellulaire, notamment d'origine toxique (médicamenteuse ou induite par l'alcool). En outre, les Inventeurs ont constaté que les effets bénéfiques du Mangafodipir sont observés non seulement lorsque celui-ci est administré à titre préventif, mais également lorsqu'il est administré à titre curatif, c'est à dire après l' apparition des premiers effets hépatotoxiques. Selon un mode de mise en _uvre préféré de la présente invention, le Mangafodipir est utilisé pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif d'une insuffisance hépatocellulaire d'origine toxique, et notamment au traitement d'une insuffisance hépatocellulaire induite par l'acétaminophène, ou d'une insuffisance hépatocellulaire induite par l'alcoal. Le Mangafadipir peut en particulier être utilisé pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement d'une insuffisance hopatocellulaire aiguë, se manifestant notamment sous forme d'une hépatite fulminante. L'activité glutathion réductase du Mangafadipir qui permet de régénérer le peol intracellulaire de glutathion, peut compléter avantageusement son activité SOD, par exemple dans le cadre du traitement de l'insuffisance hopatique aiguë d'origine toxique, notamment induite par l'acétaminaphène. Pour la mise en _uvre de la présente invention, le Mangafodipir sera généralement employé dans des formulations permettant l'administration d'une dose de principe actif comprise entre 0,1 et 10 mg/kg/jour (administration de façon préventive) ou entre 5 et mg/kg/jour (administration de façon curative) i des doses plus élevéss peuvent toutefois être utilisées, compte tenu de la faible toxicité de ce produit. Il est bien entendu que l'homme de l'art peut adapter ces doses en fonction des particularités de chaque patient et de la pathologie concernée. Dans le cadre de la mise en _uvre de la présente invention, le Mangafadipir peut être administré par différentes voies. Généralement, il sera administré par voie orale, ou par injections, en particulier par injections sous cutances, intra-musculaires ou intra-veineuse. D'autres voies d' administration pourront être envisagées si elles augmentent l'efficacité, la biodisponibilité ou la tolérance des produits. La présente invention sera mieux comprise à l' aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs démontrant l'activité mimétique de la SOD, de la catalase, et de la gluthation réductase du Mangafodipir et son effet in vitro et in vivo sur l'insuffisance hépato-cellulaire. EXEMPLE 1: ACTIVITE MIMETIQUE DE LA SOD DU MNGAFODIPIR. L'activité SOD d'un composé chimique peut être déterminée par la méthode de réduction du NBT (nitro bleu de tétrazolium) selon la technique décrite par BEAUCHAMP et FRIDOVICH [Anal. Biochem., 44(1), 276-87, (1971)]. Le test est réalisé à 25 C dans un volume final de tampon de 0,8 ml (50mM TRIS/HCl, pH 7,6), contenant 22 uM de xanthine, 500 U/ml de catalase et 0, 2 U/ml de xanDhine oxydase. La réduction du NBT, en présence de 1,5 ug de Mangafodipir, ou à titre de contrôle, en l' absence de Mangafadipir, est mesurse toutes les 30 secondes pendant minutes. Une unité SOD (U SOD) est définie par la quantité d'enzyme capable d'inhiber le taux de réduction du NBT de %. Les résultats sont illustrés dans la figure 1. Légende de la Figure 1: : Contrôle À: Mangafadipir (1,5 ug) Ils montrent que la vitesse de réduction du NBT passe de 0,0302/minute à 0,01556 lorsque 1,5 ug de Mangafadipir est ajouté dans le mélange réactionnel. A partir de ces résultats, l'activité SOD du Mangafodipir a été évaluce à 680 U SOD par milligramme de Mangafadipir. EXEMPLE 2: ACTIVITE MIMETIQUE DE LA CATALASE DU MANGAFODIPIR. Le dosage de l'activité catalase a été réalisé selon la méthode décrite par AEBI [Methads Enzymol., 105, 121-126, (1984)]. La décroissance de la densité optique (DO) à 240 nm d'une solution d'H2O2 10 mM en tampon phosphate (50 mM Na2HPO4/KH2PO4, 0,1 mM EDTA, pH 7,4) a été mesurce en présence de 75,7,ug de Mangafodipir, ou à titre de référence, en présence de 1 unité de catalase bovine. Dans ces conditions, l'activité catalase du Mangafadipir a été évaluée à 2 U catalase par milligramme de Mangafadipir. EXEMPLE 3: ACTIVITE MIMETIQUE DE LA GLUTHATION REDUCTASE DU MANGAFODIPIR. Le dosage de l'activité gluthation réductase à été réalisé à l' aide de la trousse: " Gluthathione reductase assay kit " commercialisée par la société CALBIOCHEM. Le mélange réactionnel est analysé par spectrophotométrie à 340nm pendant 5 minutes. L'activité gluthation réductase du Mangafodipir a été évaluce à 19,9 + 1, 75 mU gluthation réductase par milligramme de Mangafadipir. EXEMPLE 4: ACTIVITE PROTECTRICE DU MANGAFODIPIR SUR DES HEPATOCYTES EN CULTURE SOUMIS A L' ACTION DE L'ANION SUPEROXYDE O2O-. La lignée de cellules hépatiques humaines Hep 3B a été utilisce pour ces expériences. Les cellules ont été ensemencoes dans une plaque de culture de 96 puits, à raison de 5x104 cellules par puits, dans un volume final de 50 ul. Cent,ul de solution de Mangafodipir à différentes concentrations (62,5, 125, 250 ug/ml) ont été déposés dans chaque puits (trois puits par concentration testée). Après une heure d' incubation, 50 ul d'une solution de xanChine à uM et de 2 U/ml de xanthine oxydase (solution X/XO) ont été déposés dans chaque puits. Dix puits n'ont pas requ de solution X/XO et ont servi de témoins pour évaluer la viabilité de base des cellules. Douze heures après le dépôt de la solution X/XO, les cellules ont été lavées avec une solution saline et la viabilité déterminée grâce à un test au MTT. Une solution de MTT 0,2% a été déposée dans chaque puits et incubée 4 heures à 37 C. Ensuite, les cellules ont été lavées et le test révélé par addition dans chaque puits de ,ul de Diméthylsulfaxyde (DMSO). Les plaques ont ensuite été lues au spectrophotomètre à une longueur d'onde de 550 nm. Les résultats (pourcentage de viabilité en fonction de la concentration en Mangafodipir) sont illustrés par la figure 2. Ces résultats montrent que l' addition de Mangafodipir prévient la mortalité des cellules hopatiques soumises à un stress oxydatif médié par l' anion superoxyde. EXEMPLE 5: ACTIVITE PROTECTRICE DU MANGAFODIPIR SUR DES HEPATOCYTES EN CULTURE SOUMIS A L' ACTION DU PEROXYDE D'HYDROGENE (H202). La lignée de cellules hépatiques humaines Hep 3B a également été utilisse pour ces expériences. Les cellules ont été ensemencées dans une plaque de culture de 96 puits, à raison de 5xlOi cellules par puits, dans un volume final de 50 ul. Cent pl de solution de Mangafodipir à différentes concentrations (62,5, 125, 250 ug/ml) ont été déposés dans chaque puits (trois puits par concentration testée). Après une heure d'incuLation, 50,ul d'une solution d'H2O2 à 4mM ont été déposés dans chaque puits. Dix puits n'ont pas requ d'H2O2 et servent de témoins pour évaluer la viabilité de base des cellules. Douze heures après le dépôt de la solution d'H202, les cellules ont été lavoes avec une solution saline et la viabilité détermince grâce à un test au MTT, comme décrit dans l'exemple 4 ci-dessus. Le s résult at s ( pourcentage de viabi l ité en fonction de la concentration en Mangafodipir) sont illustrés par la figure 3. Ces résultats montrent que l'addition de Mangafadipir prévient la mortalité des cellules hépatiques soumis à un stress oxydatif médié par le peroxyde d'hydrogène. EXEMPLE 6: ACTIVITE DU MANGAFODIPIR SUR L'INSUFFISANCE HEPATIQUE AIGU INDUITE PAR L'ACETAMINOPHENE. L' injection intrapéritonéale d'acétaminophène chez la souris induit une hépatotoxicité sévère, dont le degré peut être évalué par la survie des animaux, et l'examen macroscopique et microscopique des foies. Survie des animaux Le Mangafodipir, (commercialisé sous le nom de TESLASCAN par Nicomed-Amerebam) est administré sous forme de bolus, par voie intrapéritonéale. L'acétaminaphène (APAP), en solution à 100 mg/ml dans du PBS à pH 7,4 est administré par voie intrapéritonéale. Dans une première série d'expérimentations, un groupe de souris a requ une dose de 1000 mg/kg d'acétaminophène i un second groupe a reçu une dose de 1000 mg/kg d'acétaminophène, et une dose de 10 mg/kg de Mangafadipir administrée soit 2 h avant l'acétaminaphène, soit 6 h après; un groupe témoin a requ soit du Mangafodipir seul (10 mg/kg), soit du PBS seul. La survie des animaux est suivie pendant 24 heures après l'administration d'acétaminophène. Groupe I: PBS Groupe II: APAP 1000 mg/kg Groupe III: APAP 1000 mg/kg + Mangatodipir 10 mg/kg préventif Groupe IV: APAP 1000 mg/kg + Mangafodipir 10 mg/kg Curatif Les résultats (nombre d'animaux survivants) sont résumés dans le tableau I ci-après: Tableaul Temps (heures) 0 6 8 _ 10 11 12 13 14 15 16 17 18 20 22 24 Groupe1(n=16) 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 _ __ Groupe 11 (n=12) 12 12 10 9 8 6 5 5 4 4 4 3 3 3 2 2 Groupe 111 (n=12) 12 12 12 12 11 11 11 10 10 10 9 9 9 9 8 8 Groupe IV (n=12) 12 12 11 11 10 9 9 8 8 8 7 7 7 6 6 5 Ces résultats montrent que 24 heures après l' injection d'acétaminaphène, 16% des animaux intoxiqués par l'APAP à la dose de 1000 mg/kg sont morts, alors que le taux de survie est supérieur à 41% chez les animaux intoxiqués par l'APAP mais ayant requ le Mangafodipir après l' administration d'acétaminophène (protocole curatif), et de l'ordre de 66% chez les animaux ayant reçu le Mangafodipir avant l'administration d'acétaminaphène (protocole préventif). Aucun décès n'est observé chez les animaux ayant requ le PBS seul. Etude histologique Dans chacun des groupes, les foies de plusieurs animaux ont été prélevés, pour effectuer une étude histologique. Dans le cas des souris ayant reau de l'acétaminaphène on observe beaucoup moins de lésions apoptotiques chez les animaux traités au Mangafodipir que chez les animaux non traités. Aucune lésion apoptotique n'est visible chez les souris du groupe témoin n'ayant pas requ d'acétaminophène. EXEMPLE 7: COMPARAISON DES ACTIVITES DU MANGAFODIPIR, DU MNTBAP, ET DU CODIPS SUR L'INSUFFISANCE HEPATIQUE AIGUÉ INDUITE PAR L'ACETAMINOPHENE. Le CuDIPS (Cu[II]-[diisopropylsalicylate]2 est un mimétique de référence de la CuZnSOD (Mc KENZIE et al., Br. J. Pharmacol. 127, 1159-1164, (1999)] i le MnTBAP (Mn(III) tetrakis (5,10,15,20-benzoic acid) porphyrin) est un mimétique de référence de la MnSOD. L'effet du CuDIPS et du MnTBAP sur la survie de souris après injection intrapéritonéale de 1000 mg/kg d'acétaminophène (APAP) a été comparé à celui du Mangafodipir. Le protocole expérimental est le suivant: Le Mangafodipir, le MnTBAP ou le CuDIPS sont administrés sous forme de bolus, à titre préventif, 2 heures avant l'acétaminophène. Différents groupes d'animaux ont reçu les traitements suivants: Groupe I: PBS Groupe II: APAP 1000 mg/kg Groupe III: APAP 1000 mg/kg; MnTBAP 10 mg/kg Groupe IV: APAP 1000 mg/kg; CuDIPS 10 mg/kg Groupe V: APAP 1000 mg/kg; Mangafadipir 10 mg/kg La survie des animaux est suivie pendant 24 heures après l' administration d'acétaminophène. Les résultats, exprimés en nombre d'animaux survivants sont illustrés par le tableau II ci après. Tableau II Temps (h) 0 6 3 _ 10 11 12 13 14 15 16 17 18 20 22 24 Groupe i (n=16) 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 Groupe 11 (n=12) 12 12 10 9 8 6 5 5 4 4 4 3 3 3 2 2 Groupe 111 (n=12) 12 12 12 12 11 10 10 10 9 _ 8 8 8 8 7 7 Groupe IV (n=12) 12 12 11 10 _ 7 7 5 5 5 4 4 3 3 3 3 Groupe V (n=12) 12 12 12 12 11 11 11 10 10 10 __ 9 9 8 8 Ces résultats montrent que: - le Mangafadipir administré prévéntivement augmente le taux de survie de manière au moins égale au MnTBAP i - le CuDIPS n'augmente pas le taux de survie de manière significative. Do s age de s tran s aminase s Dans une seconde série d'expériences, un groupe de souris a reçu une dose de 500 mg/kg d'acétaminophène; un second groupe a reçu la même dose d'acétaminophène, et une dose de 10 mg/kg de Mangafodipir administrée 2 h avant l'acétaminophène i un troisième groupe d'animaux a reçu la même dose d'acétaminophène, et une dose de 10 mg/kg de MnTBAP, un quatrième groupe d'animaux a requ la même dose d'acétaminaphène, et une dose de 10 mg/kg de CuDIPS. Les transaminases sériques ASAT sont dosces 12 heures après l' administration d'acétaminophène. Les résultats sont illustrés par la figure 4. Légende de la figure 4: NS: non significatif par rapport aux souris non traitées *: P ont requ préalablement un traitement par le Mangafadipir. Ces résultats montrent que dans tous les cas, l'administration de Mangafodipir réduit les activités transaminases, qui reflètent la cytolyse hépatique. REVENDICATIONS 1) Utilisation du Mangafadipir pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement préventlf ou curatif d'une pathologie impliquant un stress oxydant. 2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite pathologie est une insuffisance hépatocellulaire. 3) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite insuffisance hopatocellulaire est d'origine toxique. 4) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite insuffisance hépatocellulaire est induite par l'acétaminophène. ) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite insuffisance hépatocellulaire est induite par l'alcool. 6) Utilisation selon une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisée en ce que ladite insuffisance hépatocellulaire se manifeste sous forme d'une hopatite fulminante. 7) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le Mangafadipir est utilisé pour l'obtention d'un médicament destiné à un traitement préventif. 8) Utilisation selon une queleonque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le Mangafodipir est utilisé pour l'obtention d'un médicament destiné à un traitement curatif. 9) Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit médicament est formulé pour permettre l' administration d'une dose de Mangafodipir comprise entre 0,1 et 10 mg/kg/jour. ) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit médicament est formulé pour permettre l' administration d'une dose de Mangafadipir