Brevet FR2833613A1 — publié le 20030620

La présente invention se rapporte à une méthode pour détecter des microorganismes présents dans un échantillon, dans laquelle on inocule un milieu de culture avec ledit échantillon, ledit milieu de culture contenant de préférence des agents chromogènes libérant des chromophores en présence des microorganismes cibles ou des agents fluorogènes, ledit milieu de culture étant dans un récipient présentant un fond coloré, la détection étant facilitée par le contraste entre le fond coloré du récipient et les colonies isolées. La détection rapide de microorganismes présents dans des échantillons biologiques, alimentaires, ou en milieu hospitalier est indispensable, afin de définir le plus rapidement possible les mesures à prendre en cas de contamination. n apparaît également important de pouvoir différencier les différents contaminants, afin de pouvoir procéder à des désinfection adaptées. Des méthodes existent, comme la PCR, qui est rapide et spécifique, mais qui nécessite l'emploi d'appareils comme les thennocycleurs, et qui ne peut pas toujours être mise en oeuvre en milieu hospitalier. Par ailleurs, cette méthode peut demander une préparation des échantillons à tester, ce qui n'est pas toujours aisé à mettre en oeuvre. Des méthodes basées sur la culture des microorganismes contaminants sur des milieux adaptés, et sur leur identification du fait de l'ajout d'agents chromogènes libérant un chromophore après action d'une enzyme spécifique du microorganisme ont été décrits. Ainsi, les demandes de brevets WO 00/53799, WO 00/46345, WO 97/39103, WO 95/04156, WO 94/09152 décrivent des milieux de culture pour identifier les staphylocoques, les bactéries anaérobies ou les colifbrmes entérohémorragiques, les salmonelles ou d'autres microorganismes tels que les candida. Toutefois, les milieux utilisés étant en général relativement transparents, il peut parfois s'avérer difficile de bien déterminer les couleurs des chromophores libérés, du fait d'un manque de contraste suffisant. Ainsi, l'utilisation du milieu C décrit dans la demande de brevet WO 95/04156 permet une bonne discrimination des différentes levures candida, mais les couleurs obtenues sont claires, ce qui peut être problématique pour certains utilisateurs. De même, la méthode décrite dans la demande WO 00/46345 pour identifier les staphylocoques peut nécessiter d'ajouter un agent de contraste au milieu de culture, par exemple un opacifiant. Un tel besoin de contraste se fait également sentir pour des milieux pour détecter les salmonelles, tel que le Rambach Agar vendu par la société Chromagar (Paris, France). On a notamment proposé l'ajout de kaolin pour opacifier les milieux, notamment pour détecter E. coli, à l'aide du phénylglucuronide. Toutefois, l'ajout de ce type composant, outre qu'il augmente les coûts de fabrication du milieu, peut s'avérer poser de nombreux problèmes pour la fabrication industrielle de milieux de détection (notamment précipitation). La présente invention se propose de répondre au problème posé par le manque de contraste observé entre les colonies isolées et le milieu de culture, en particulier lorsque ces colonies sont colorées du fait de la présence d'agents chromogènes dans le milieu de culture. Ainsi, la présente invention se rapporte à une méthode pour détecter des microorganismes présents dans un échantillon comprenant les étapes consistant à : a) préparer un milieu de culture adapté auxdits microorganismes cibles, b) couler ledit milieu dans un récipient présentant un fond coloré, c) inoculer le milieu de culture solide de a) avec ledit échantillon ou un inoculum dérivé de l'échantillon et incuber, d) détecter la présence desdits microorganismes sur ledit milieu de culture en utilisant le contraste entre la couleur du fond du récipient et les colonies isolées. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention se rapporte à une méthode pour détecter des microorganismes présents dans un échantillon par libération enzymatique de chromophores à partir d'agents chromogènes présents dans un milieu de culture adapté auxdits microorganismes comprenant les étapes consistant à : a) préparer un milieu de culture adéquat contenant les agents chromogènes appropriés à la détection des microorganismes cibles, b) couler ledit milieu dans un récipient présentant un fond coloré, c) inoculer le milieu de culture solide de a) avec ledit échantillon ou un inoculum dérivé de l'échantillon, et incuber, d) détecter la présence des microorganismes présents dans ledit échantillon, sur ledit milieu de culture, en utilisant le contraste lié à la couleur du fond du récipient par rapport à la coloration due aux chromophores libérés. Dans un autre mode de réalisation, le milieu de culture contient des produits lui donnant une coloration (par exemple, le McConkey Agar...). Dans un autre mode de réalisation, le milieu de culture contient des agents fluorogènes, libérant des fluorophores en présence des microorganismes cibles. On peut notamment utiliser le 4-méthyl umbelliféryl, en tant que fluorophore, par exemple lié à un galactoside (4-methylumbelliferyl-ss-D-galactoside). Dans un mode de réalisation préféré, le récipient selon l'invention est de forme ronde et notamment une boîte de Pétri, d'un diamètre allant de 40mm à 210mm. De préférence, le diamètre du récipient selon l'invention est égal à 47mm, 55mm, 90mm, 100mm ou 200mm. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la surface du récipient est telle qu'il est possible d'inoculer le milieu de culture contenu dans le récipient de telle façon qu'on obtienne croissance de colonies isolées. Ainsi, la surface du récipient selon l'invention est de préférence supérieure à environ 15-17cm2. Dans un mode de réalisation de la présente invention, ledit récipient présente un fond coloré opaque. Dans un autre mode de réalisation, ledit récipient présente un fond coloré transparent. De préférence, ledit récipient présente un fond d'une couleur choisie parmi les couleurs bleue, rouge, jaune, noire ou blanche opaque. Dans un mode de réalisation de l'invention, lesdits chromophores ou autres produits colorés sont libérés par hydrolyse du fait de l'action d'une enzyme spécifique du microorganisme sur les agents chromogènes présents dans le milieu de culture., et le (s) dit (s) agent (s) chromogène (s) est (sont) choisi (s) parmi les substrats des enzymes liés au métabolisme des sucres, et notamment dans le groupe constitué des substrats de la ss-glucosidase, des substrats de la ss-galactosidase, et des substrats de la ss-glucuronisase, et des substrats de la phosphatase. De préférence, le (s) dit (s) chromophore (s) est (sont) choisi (s) dans le groupe constitué des dérivés indoxyle, halogéno-indoxyle (bromo-indoxyle, chloroindoxyle, fluoro-indoxyle, iodo-indoxyle, dichloro-indoxyle, chloro-bromoindoxyle, tri-chloro-indoxyle), méthyl-indoxyle, et hydroxy-quinoline, en particulier parmi les dérivés suivants : 6-chloro-indoxyle, 5-bromo-indoxyle, 3-bromoindoxyle, 6-fluoro-indoxyle, 5-iodo-indoxyle, 4,6-dichloro-indoxyle, 6, 7-dichloroindoxyle, 5-bromo-4-chloro-indoxyle, 5-bromo-6-chloro-indoxyle, 4,6, 7-trichlorindoxyle, N-méthyl-indoxyle ou 8-hydroxy-quinoline. Afin de pouvoir limiter la croissance des microorganismes qui ne sont pas recherchés, il est avantageux que le milieu de culture contienne également des facteurs sélectifs pour les microorganismes recherchés. Dans un mode de réalisation particulier, le milieu de culture contient également une concentration élevée de saccharose ou du glucose. La méthode de l'invention est avantageusement mise en oeuvre lorsque le microorganisme cible est de l'espèce Candida, en particulier avec le Chromagar Candida décrit dans WO 95/04156. On utilise alors un récipient coloré, transparent ou opaque, la couleur dépendant de la nature de la levure la plus recherchée. La méthode de l'invention est également particulièrement adaptée lorsque ledit microorganisme cible est de l'espèce Staphylococcus et l'on choisit alors de préférence ledit récipient afin qu'il présente un fond coloré opaque, de préférence blanc opaque. On peut aussi mettre la méthode en oeuvre lorsque ledit microorganisme cible est de l'espèce Vibrio, de l'espèce des colifonnes et en particulier des bactéries E. coli entérohémorragiques. On utilise en particulier les enseignements des demandes de brevets WO 00/53799, WO 00/46345, WO 97/39103, WO 95/04156, WO 94/09152, afin de définir les couleurs des microorganismes en fonction de la nature des milieux obtenus. Les enseignements de ces demandes de brevets et des brevets délivrés correspondants, en particulier les enseignements des exemples sont inclus par référence dans la présente demande. L'invention se rapporte également à un kit de détection de microorganismes, constitué de la combinaison d'un récipient présentant un fond coloré avec un milieu de culture contenant de préférence des agents chromogènes libérant des chromophores en présence desdits microorganismes cibles. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un récipient présentant un fond coloré en tant que support dans lequel on coule un milieu de culture contenant de préférence des agents chromogènes libérant des chromophores après action d'enzymes spécifiques présentes dans des souches de microorganismes. La couleur des récipients utilisés (en général des boîtes de Pétri) est avantageusement choisie de telle sorte qu'elle présente un contraste utile avec les colonies de microorganismes, ou les chromogènes utilisés. Le contraste utile est défini comme un contraste aidant à la discrimination des couleurs des colonies, par rapport au fond de la boîte. Ainsi, lorsque le milieu de culture ne contient pas de chromogènes, les colonies sont généralement claires et le fond du récipient est plutôt foncé. La couleur du fond de la boîte est aussi choisie en fonction de la couleur des chromophores libérés. Ainsi, le chromogène bleu 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl présente une absorption à 615 nm, que l'on peut aisément différentier lorsque l'on utilise des boîtes rouges (environ 515 nm). Pour les chromogènes produisant des colonies mauve, rouge, ou pourpre, on utilise des boîtes avec une couleur telle que la longueur d'onde soit éloignée, par exemple des boîtes jaunes. Lorsque l'on obtient des colonies de couleur claire, on utilise des boîtes de couleur foncée et/ou opaques. Chromogène Couleur Absorption max Couleur de la boîte (nm) (exemple) 5-Bromo-4-chloro-bleue 615 rouge 3-indoxyl 5-Bromo-6-chloro-rouge-pourpre 565 jaune 3-indoxyl (magenta) 6-chloro-3-indoxyl gris-pourpre 540 Blanc opaque, ou (saumon) couleur foncée Les chromophores utilisables pour la mise en oeuvre de la présente invention ont alors la formule générale suivante, et sont obtenus par oxydation d'un agent chromogène lié à un substrat enzymatique. Ces chromophores sont insolubles, ce qui induit la formation d'un précipité coloré. On note que les chromophores peuvent être obtenus après action des glycosidases, mais aussi après action de phosphatases. Une liste d'agents chromogènes peut être obtenue du brevet US 6,130, 057, et est incorporée par référence à la présente demande. Formule de chromophores utilisables dans le cadre de l'invention : RI R2 R3 R4 Couleur H H H H Bleu Cl Br H H Bleu H Br Cl H Magenta H H Cl H Saumon H 1 H H Pourpre H Br H H bleu Un autre avantage de la méthode et du kit selon l'invention est la possibilité de repérer facilement les boîtes comprenant certains agents. En effet, les milieux contenant des agents chromogènes sont incolore avant réaction des microorganismes et libération des chromophores. Leur conditionnement dans des boîtes de couleur s'avère donc utile pour ranger et retrouver facilement les milieux d'intérêt, la couleur de la boîte étant choisie en fonction des et corrélée aux chromogènes présents dans le milieu, et aux couleurs attendues en présence de microorganismes. Revendications 1. Méthode pour détecter des microorganismes présents dans un échantillon comprenant les étapes consistant à : a) préparer un milieu de culture adapté auxdits microorganismes cibles, b) couler ledit milieu dans un récipient présentant un fond coloré, c) inoculer le milieu de culture solide de a) avec ledit échantillon ou un inoculum dérivé de l'échantillon et incuber, d) détecter la présence desdits microorganismes sur ledit milieu de culture en utilisant le contraste entre la couleur du fond du récipient et les colonies isolées. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit milieu de culture contient des agents fluorogènes libérant des fluorophores en présence desdits organismes cibles. 3. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit milieu de culture contient des agents chromogènes appropriés à la détection des microorganismes cibles, par libération enzymatique de chromophores à partir desdits agents chromogènes. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit récipient présente un fond coloré opaque. 5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit récipient présente un fond coloré transparent. 6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit récipient présente un fond d'une couleur choisie parmi les couleurs bleue, rouge, jaune, noire, ou blanche opaque. 7. Méthode selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisée en ce que lesdits chromophores sont libérés par hydrolyse du fait de l'action d'une enzyme spécifique du microorganisme sur les agents chromogènes présents dans le milieu de culture. 8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que le (s) dit (s) agent (s) chromogène (s) est (sont) choisi (s) parmi les substrats des enzymes liés au métabolisme des sucres, et notamment dans le groupe constitué des substrats de la ss-glucosidase, des substrats de la ss-galactosidase, et des substrats de la ss- glucuronisase. 9. Méthode selon l'une des revendications 3 à 8, caractérisée en ce que le (s) dit (s) chromophore (s) est (sont) choisi (s) dans le groupe constitué des dérivés indoxyle, halogéno-indoxyle (bromo-indoxyle, chloro-indoxyle, fluoro- indoxyle, iodo-indoxyle, dichloro-indoxyle, chloro-bromo-indoxyle, tri-chloro- indoxyle), méthyl-indoxyle, et hydroxy-quinoline, en particulier parmi les dérivés suivants : 6-chloro-indoxyle, 5-bromo-indoxyle, 3-bromo-indoxyle, 6- fluoro-indoxyle, 5-iodo-indoxyle, 4,6-dichloro-indoxyle, 6, 7-dichloro-indoxyle, 5-bromo-4-chloro-indoxyle, 5-bromo-6-chloro-indoxyle, 4,6, 7-trichloro- indoxyle, N-méthyl-indoxyle ou 8-hydroxy-quinoline. 10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le milieu de culture contient également des facteurs sélectifs pour les microorganismes recherchés. 11. Méthode selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que le microorganisme cible est de l'espèce Candida. 12. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4 et 7 à 10, caractérisée en ce que ledit microorganisme cible est de l'espèce Staphylococcus et que ledit récipient présente un fond coloré opaque, de préférence blanc opaque. 13. Méthode selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ledit microorganisme cible est de l'espèce Vibrio. 14. Méthode selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ledit microorganisme cible est de l'espèce des coliformes et en particulier des bactéries E. coli entérohémorragiques. 15. Kit pour la détection de microorganismes, constitué de la combinaison d'un récipient présentant un fond coloré et d'un milieu de culture, la couleur dudit récipient étant choisie de telle sorte qu'elle présente un contraste utile avec la couleur des colonies isolées. 16. Kit selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit milieu de culture contient des agents fluorogènes libérant des fluorophores en présence desdits microorganismes cibles. 17. Kit selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit milieu de culture contient des agents chromogènes libérant des chromophores en présence desdits microorganismes cibles, la couleur dudit récipient étant choisie de telle sorte qu'elle présente un contraste utile avec la couleur des chromophores libérés. 18. Utilisation d'un récipient présentant un fond coloré en tant que support dans lequel on coule un milieu de culture apte à la croissance de microorganismes, la couleur du fond du récipient permettant un contraste avec les colonies desdits .. microorganismes. 19. Utilisation selon la revendication 18, caractérisée en ce que ledit milieu de culture contient des agents fluorogènes libérant des fluorophores en présence desdits microorganismes cibles. 20. Utilisation selon la revendication 18, caractérisée en ce que ledit milieu de culture contient des agents chromogènes libérant des chromophores après action d'enzymes spécifiques présentes dans des souches de microorganismes, la couleur dudit récipient étant choisie de telle sorte qu'elle présente un contraste utile avec la couleur des chromophores libérés.