Brevet FR2828693A1 — publié le 20030221

ou séquentielles obéissant aux règles de l'algèDre de Boole. -- Nouvelle Cible Moléculaire de la Neurotoxicité La présente invention concerne le domaine de la blologie, de la génétique et de la médecine. Elle concerne notamment de nouvelles méthodes pour la s détection, la caractérisation eVou le traitement (ou la prise en charge) de pathologies neurodépénératives, notamment de la sclérose latérale amyotrophique. L'invention concerne également des méthodes pour l'identification ou le screening de composés actifs dans ces pathologies. L'invention concerne également les composés, gènes, cellules, plasmides ou o compositions utiles pour la mise en _uvre des méthodes ci-dessus. L'invention découle notamment de l'identification du rôle de la phosphodiestérase 4B dans ces pathologies et décrit son utilisation comme cible ou marqueur thérapeutique, diagnostique ou expérimental de ces désordres. s De nombreuses pathologies neurodégénératives ont été décrites comme ayant une composante ou un stade lié au phénomène d'excitotoxicité. C'est le cas de la maladie d'Alzheimer, de la maladie de Parkinson, de la sclérose en plaques et de la chorée de Huntington. La sclérose amyotrophique latérale (SAL ou ALS pour Amyotrophic Lateral Sclerosis) est une maladie neurodégénérative associce à différents types d'inclusions tels les corps de Lewis et caractérisée par une apoptose des moto neu ro nes s pi naux et cortica ux do nt l ' iss ue fata le est pa rfo is associée à u ne démence frontale. Des formes sporadiques, sans aucune mutation décrite, coexistent avec des formes familiales (FALS) associées à des mutations dans le gène SOD1 codant pour la superoxide dismutase. La majorité des cas est sporadique, les formes familiales (FALS) étant très rares. Il est vraisemblable qu'une longue période asymptomatique précède l'apparition des symptômes cliniques qui sont variés et dont la classification est complexe. Les futurs o développements thérapeutiques substitueront aux traitements de la symptomatologie des stratégies basées sur les causes moléculaires de la pathologie. Au niveau cellulaire, ces symptômes sont associés à une mort des motoneurones corticaux et des motoneurones spinaux. Cette mort neuronale a été reliée à différents phénomènes qui constituent la base de plusieurs pathologies neurodégénératives. C'est le cas de l'excitotoxicité liée au glutamate, du stress oxydatif, d'une certaine auto immunité dirigée contre des marqueurs neuronaux (les canaux calciques dans le cas de l'ALS) ainsi que d'anomalies du cytosquelette. Si ces phénomènes sont décrits, la ou les causes de ces maladies, dont l'ALS, sont obscures. Même si les FALS sont liées à des mutations dans le gène SOD1 qui code pour la superoxide dismutase, les mécanismes qui engagent les neurones vers la mort cellulaire dont au moins o une composante est l'apoptose, sont inconnus. L'identification des évènements moléculaires impliqués dans les différents phénomènes impliqués dans la mort cellulaire permettra de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'étude de ces évènements est diffficilement réalisable à partir de biopsies humaines. Ces blopsies proviennent évidemment d'échantillons post-mortem dont la qualité est difficilement contrôlable et ne représentent que des états pathologiques représentatifs des phases tardives de la maladie. o Les modèles animaux donnent accès à des échantillons blologiques qui permettent d'analyser différentes étapes du développement d'une pathologie et de comparer ces étapes à des témoins sains. A cet égard, des souris transgéniques qui expriment le gène humain SOD1 portant l'une des mutations qui prévaut dans les FALS (mutation G93A) sont disponibles auprès de Jackson s Laboratory, sous condition de prise d'une licence d'utilisation auprès de la NorthWestern University. Ce modèle reproduit en 120 jours l'issue fetale de la maladie avec des symptômes comparables à ceux de la maladie humaine. L'apparition des symptômes d'ALS liés à la mutation G93A dans SOD1 n'est pas la conséquence d'une réduction de l'activité superoxyde dismutase mais o d'un gain de fonction qui augmente la capacité de l'enzyme à générer des radicaux libres. Malgré ces informations, les évènements moléculaires qui président aux différentes étapes de l'ALS sont mal connus. La complexité de - ces évènements moléculaires reflète l'évolution de la pathologie: Dans le modèle transgénique étudié, aucune déréqulation neuronale ou manifestation clinique n'a été rapportée à 30 jours. 60 jours correspondent à un stade qui précède de peu les premiers symptomes, mais qui est déjà caractérisé au s niveau cérébral par des changements dans la physiologie cellulaire tels qu'une altération du métabolisme mitochondrial, un stress et une mort neuronale associés à un phénomène d'excitotoxicité. A 90 jours, 50% des motoneurones corticaux et spinaux sont morts et un processus actif d'apoptose neuronale est engagé parallèlement à une activation astrocytaire. Le phénomène o d'excitotoxicité n'est plus observé à ce stade. La mort neuronale y est associée à l'activation de caspases qui ne semblent pas impliquées dans les phases précoces de la pathologie. Identifier les différents évènements moléculaires spécifiques des différentes s phases de la pathologie doit permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques aussi bien que de nouveaux marqueurs diagnostiques. L'une des approches les plus efficaces pour réaliser cette identification consiste à identifier les gènes et les protéines dont l'expression caractérise un état physiopathologique. La présente invention décrit à présent l'identification d'événements génétiques impliqués dans les phénomène d'excitotoxicité et de mort neuronale. La présente invention fournit ainsi de nouvelles approches thérapeutiques et diagnostiques des pathologies associées à ces phénomènes, ainsi que de nouvelles cibles pour 1'identification de composés actifs. Plus particulièrement, une analyse qualitative différentielle a été effectuée à partir d'ARN extraits d'échantillons de cerveau et de moelle épinière sans isolement préalable des neurones afin de prendre en compte un maximum o d'évènements d'épissages alternatifs liés au développement de la pathologie. Cette analyse a été effectuée par criblage différentiel qualitatif selon la technique DATAS (décrite dans la demande n WO99/46403), qui présente des avantages inégalés. La présente demande de brevet découle notamment de la construction par la s demanderesse d'un répertoire des altérations d'épissage dans le cerveau des animaux modèles de l'ALS âgés de 60 jours. Ce répertoire qui contient plus de séquences distinctes, implique des acteurs clefs du phénomène d'excitotoxicité tels q ue les canaux potassiq ues et le récepteur NM DA. Des séquences dérivées d'ARNs codant pour des protéines impliquées dans la o réponse au stress, dont des protéines de choc thermique, font également partie de ce répertoire, so ul ig nant l' imp l ication d e cette réponse da ns les phases précoces de l'ALS. Une altération du métabolisme énergétique appara^'t clairement affecter les motoneurones corticaux des animaux qui développent la pathologie. Par exemple, I'intron 6 de la forme mitochondriale de la créatine kinase est isolé spécifiquement à partir des ARN messagers exprimés en conditions pathologiques chez les animaux âgés de 60 jours. Cette interruption de la séquence codante par cette rétention d'intron aboutit à un ARN messager qui code pour une forme inactive de l'enzyme. Cette observation est en accord avec les observations biochimiques qui ont montré une diminution de l'activité o créatine kinase mitochondriale corrélée avec une diminution de la quantité de cette enzyme dans les neurones des animaux du même modèle transgénique. La spécificité des séquences qui constituent ce répertoire est attestée par le fait que la même analyse différentielle qualitative de l'expression génétique réalisée sur des animaux âgés de 90 jours aboutit à un répertoire différent dont sont absents notamment les différents marqueurs de 1'excitotoxicité. L'analyse des modifications d'épissage confirme que les évènements moléculaires sont différents selon le stade de la pathologie. La réalisation de DATAS sur des ARN d'animaux contrôles et transgéniques o âgés de 60 jours a permis d'isoler un fragment d'ADNc dérivé de l'ARNm de la phosphodiestérase 4B. Ce fragment correspond à un fragment d'exon spécifiquement présent dans les animaux contrôles et donc spécifiquement i délété dans les animaux transgéniques pour SOD1G93A au stade 60 jours. Ce fragment recouvre les nucléotides 377 à 486 référencés à partir du codon stop de la PDE4B de souris (SEQ ID NO:1) (séquence également accessible dans GenBank, n AF208023). Cette séquence comprend 2912 bases, le fragment s délété co rrespond ant aux bases 2760 à 2869. Cette rég ion est no n cod ante et est exprimée différentiellement entre les animaux contrôles et les animaux transgéniques, du fait de l'utilisation alternative d'un exon 3' non codant ou du fait de l'utilisation de deux sites de polyadénylation alternatifs. Cette expression différentielle a été mise en évidence par des expériences de RT PCR o présentées sur les figures 1 et 2. La présente demande démontre donc l'implication de la phosphodiestérase 4B dans le dévelo ppe ment d es processus d 'excitotoxicité et de mort neurona le. Les résultats obtenus montrent une expression plus prononcée de PDE4B dans les s tissus nerveux pathologiques, liée à une modification structurale de l'ARN correspondant, notamment à la délétion d'une région dans la partie 3' non- codante. Ce résultat est tout à fait compatible avec la présence de séquences de déstabilisation des ARNm dans la séquence identifiée par DATAS. Leur délétion de l'ARNm de la PDE4B, par épissage ou par utilisation de séquences o de polyadénylation alternatives, peut aboutir à une stabilisation, donc à une augmentation de l'expression de la partie codante de cet ARN. Cet événement se produit spécifiquement dans le cerveau des animaux transpéniques et non dans les animaux contrôles. La présente invention décrit donc un événement moléculaire original qui aboutit s à une augmentation de l'expression de l'ARNm de la PDE4B dans le cerveau des animaux transpéniques et qui est corrélé dans le temps avec le phénomène d'excitotoxicité eVou de mort neuronale. L'invention montre également, pour la première fois, qu'une augmentation de l'expression de la PDE4B est associée aux stades précoces de l'ALS. La PDE4B constitue donc une cible o thérapeutique nouvelle et importante dans le développement de thérapeutiques de ces pathologies, utilisables notamment à des phases précoces de leur développement, et s'adressant aux véritables bases moléculaires de la l pathologie et non aux symptômes ou composantes inflammatoires associées. L'invention décrit également de nouvelles méthodes de diagnostic, dépistage, détection, détermination d'une prédisposition ou de suivi de l'évolution ou de l'efficacité du traitement de ces pathologies. Un objet de l'invention réside donc dans une méthode de détection d'une situation d'excitotoxicité ou de stress neuronal chez un sujet, comprenant la mesure in vitro de l'expression de la phosphodiestérase 4, notamment de la phosphodiestérase 4B dans un échantillon provenant du sujet. La méthode o comprend avantageusement une mesure de l'expression différentielle de la région 3' non-codante du gène PDE4B et du reste du gène, notamment de la partie codante. Un autre objet de l'invention réside donc dans une méthode de détection d'une situation d'excitotoxicité ou de stress neuronal chez un sujet, comprenant la détection de la présence d'une forme mutée de l'ARN de la phosphodiestérase 4, notamment de la phosphodiestérase 4B dans un échantillon provenant du sujet, en particulier d'une forme délétée de tout ou partie de la région 3' non- codante. Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un acide nuclélque comprenant tout ou partie d'une séquence dérivée du gène ou de l'ARN messager de la PDE4B pour la mise en _uvre d'une méthode de diagnostic ou de détection d'une situation de stress neuronal et plus particulièrement la situation d'excitotoxicité. L'invention réside, généralement, dans l'utilisation d'un acide nuclélque complémentaire de tout ou partie du gène ou du messager de la PDE4B, pour la détection d'événements pathologiques de type excitotoxicité, stress ou mort neuronale, etc. i Il s'agit plus particulièrement d'acides nucléiques capables de mettre en évidence une forme délétée de l'ARNm de la PDE4B, notamment une forme dépourvue de tout ou partie de la région 3' non codante. A titre d'exemple spécifique, on utilise un acide nuclélque complémentaire de tout ou partie de la région comprise entre les résidus 2760 à 2869 de la séquence SEQ ID NO:1, ou des résidus correspondants de la séquence du gène ou de l'ARNm de la PDE4B humaine. La séquence de l'ADNc codant la PDE4B humaine et de la protéine correspondante sont représentées dans les séquences SEQ ID NO: 3 et 4 (voir également Genbank, n NM_002600). La région 3' non-codante de o l'ARN ou du gène PDE4B humain correspond aux résidus 2461 à 4068 de SEQ ID NO:3. L'invention est applicable au diagnostic ou la détection de différentes pathologies impliquant les phénomènes d'excitotoxicité, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques, la chorée de Huntington ou l'ischémie cérébrale. Elle peut être utilisée pour la détection précoce, la mise en évidence d'une prédisposition, le choix et l'adaptation d'un traitement, le suivi de l'évolution de la pathologie, etc. Elle est particulièrement adaptée à la détection à un stade précoce de la sclérose en plaques. Les phosphodiestérases hydrolysent les acides nucléiques cycliques tels l'AMPc et le GMPc, réqulant différentes cascades de signalisation. La PDE4B hydrolyse l'AMPc, régulant ainsi la concentration intracellulaire de ce second messager. L'implication de l'AMPc dans la balance qui existe entre la viabilité cellulaire et I'apoptose est bien décrite dans la littérature. Notamment, la cascade AMPc est bien intégrée dans les cascades de survie cellulaire impliquant des kinases telles Akt et Pl3K de même que dans la régulation de l'activité du facteur de transcription CREB. Il est à noter que ce facteur de transcription est impliqué d ans la su rvie neu ro nale et la cro issance d es neurites. To utefo is, I ' util isatio n o d'inhibiteurs de PDE et avantageusement de PDE4 n'a jamais été envisagée pour améliorer la viabilité neuronale et plus particulièrement leur protection contre l'excitotoxicité. Les inhibiteurs de PDE4, développés pour inhiber les phénomènes inflammatoires, ont été suggérés comme potentiellement utiles da ns des patho log ies n eu rodégénératives co m me la ma lad ie d 'Alzh ei mer. Cette suggestion s'appuie sur la volonté de réduire les inflammations qui sont observoes dans le cerveau au cours des processus neurodégénératifs et nullement sur un rationnel visant à inhiber directement la mort neuronale. La présente invention fournit la base moléculaire qui justifie l'utilisation d'inhibiteurs de PDE4 pour le traitement de l'ALS et plus généralement pour améliorer la viabilité neuronale lors des phénomènes d'excitotoxicité, en o particulier dès les phases précoces de ces pathologies. L'invention montre en effet l'existence d'événements d'épissage ou de sites de polyadénylation alternatifs affectant le gène de la PDE4B, associés au développement de l'excitotoxicité neuronale, et propose des méthodes de s détection ou dépistage de dysfonctionnements basés sur la mise en évidence de la présence de ces formes épissées dans des échantillons biologiques. Avantageusement, I'acide nucléique utilisé (comme sonde) comprend tout ou partie de la séquence codant la région 3' non-codante du gène ou de l'ARN de o la PDE4B comprise entre les nucléotides 2384 et 2869 de la séquence SEQ ID NO:1 ou entre les nucléotides 2461 et 4068 de la séquence SEQ ID NO:3 ou une séquence complémentaire de celles-ci. Selon des modes particuliers de mise en _uvre, I'invention utilise un acide nuclélque complémentaire d'une région comprise dans une séquence suivante: - résidus 2384 à 2869 de SEQ ID n 1 - résidus 2500 à 2869 de SEQ ID n 1 - résidus 2760 à 2869 de SEQ ID n 1 - résidus 2780 à 2850 de SEQ ID n 1 - résidus 2790 à 2810 de SEQ ID n 1 - résidus 2600 à 4040 de SEQ ID n 3 - résidus 3000 à 4040 de SEQ ID n 3 s - résidus 3500 à 4040 de SEQ ID n 3 - résidus 3900 à 4040 de SEQ ID n 3. Selon un autre mode particulier, on utilise un acide nucléique complémentaire de la séquence de la région de l'ARN de PDE4 résultant de la délétion de tout ou partie de la partie 3' non codante. L'élimination d'un domaine créé en effet de nouvelles jonctions dans la séquence, qui sont spécifiques de la forme délétée et peuvent être utilisées pour mettre en évidence la présence d'une telle forme dans un échantillon. La complémentarité est. de préférence parfaite, pour assurer une meilleure spécificité d'hybridation. Toutefois, il est entendu que certains mésappariements peuvent être tolérés. L'acide nucléique utilisé pour la mise en _uvre des méthodes ci-dessus peut être un ADN ou un ARN, de préférence un ADN d'origine synthétique. Il comporte de préférence de 10 à 500 bases, typiquement de 10 à 100 bases. Il est entendu qu'un acide nuclélque plus long peut être utilisé, si désiré, bien que cela ne soit pas préféré. L'acide nucléique est avantageusement un ADN simple brin, de 10 à 500 bases, complémentaire d'une région au moins de la séquence 3'non codante de la PDE4B. L'acide o nuclélque peut être marqué, par exemple par voie radioactive, enzymatique, luminescente; fluorescente, chimique, etc. Pour la mise en _uvre des méthodes selon l'invention, on met en contact in vitro un échantillon blologique d'un sujet, contenant un acide nucléique, avec un acide nuclélque tel que défini ci-dessus, et on détecte la formation d'un hybride. L'échantillon biologique peut être un échantillon de sang, de fluide, de cellule, de tissu, etc. L'acide nuclélque peut être immobilisé sur un support, de type verre, silice, nylon, etc. so Le procédé de détection, dépistage ou diagnostic peut être mis en _uvre à partir de différents types d'échantillons provenant d'un sujet, comme par exemple des biopsies de tissus, notamment de tissu nerveux. De manière J particulièrement surprenante et avantageuse, la présente invention montre par ailleurs que la dérégulation de l'expression de PDE4, corrélée au phénomène d'excitotoxicité, peut être mise en évidence directement dans le tissu musculaire. Ceci est tout particulièrement remarquable dans le cas de pathologies neurodégénéatives telles que 1'ALS. Au cours du développement de l'ALS, les phénomènes dégénératifs se produisent non seulement dans le cerveau mais également dans la moëlle épinière et en conséquence dans le muscle par défaut d'innervation. La figure 2 o présente les modifications d'expression de l'ARNm de la PDE4B dans les muscles de souris contrôles et transgéniques, suivies en utilisant les mêmes amorces de PCR que lors de l'étude sur les ARN de cerveaux de ces mêmes animaux. De façon analogue, toutefois moins prononcée, une diminution de l'expression de la région 3' non codante de la PDE4B, et non du reste de cet s ARNm (notamment la partie codante), est observée spécifiquement dans le muscle des animaux en fin de phase pré-symptomatique, c'est à dire âgés de jours. L'u ne d es d iffficultés renco ntrées lors d es études et d es traitements de l 'ALS est la diffficulté de poser un diagnostic précoce. Cette observation de déréqulation o de l'ARNm de la PDE4B dans le muscle ALS permet de proposer un diagnostic précoce à partir de blopsies musculaires de patients. Ce diagnostic est basé sur la détection de l'expression différentielle de la région 3' non codante et du reste de la séquence, notamment codante, de la PDE4B. Un procédé particulier de détection d'une situation de stress neuronai, notamment d'excitotoxicité, en particulier liée à une pathologie neurodégénérative chez un sujet, comprend la mesure de l'expression du gène PDE4B, ou de la présence de formes délétées du messager de PDE4B, dans un échantillon de cellules musculaires provenant dudit sujet. Pour mesurer l'expression différentielle, on utilise par exemple une sonde correspondant à (c'est-à-dire spécifique de) une partie de la région 3' non codante et une sonde correspondant à une partie de la région codante de la PDE4B. Le signal détecté avec chacune de ces sondes permet d'évaluer le différentiel d'expression. Une autre approche utilise deux couples d'amorces permettant une amplification d'une portion de la région 3' non codante d'une s part et d'une partie de la région codante d'autre part. Typiquement, I'expression de la PDE4B, ou le différentiel d'expression, ou la présence d'une forme altérée peuvent être déterminés par des techniques conventionnelles de biologie moléculaire, comme par exemple par séquen,cage, hybridation, amplification, RT-PCR, migration sur gel, etc. A cet égard, un objet de l'invention réside dans une amorce complémentaire d'une partie de la région 3' non-codante de la PDE4B, et permettant l'amplification d'une partie de cette région. L'amorce comporte avantageusement de 8 à 20 bases. Elle est préférentiellement composée d'un s fragment de 8 à 20 résidus consécutifs de la séquence comprise entre les nucléotides 2384 et 2869 de la séquence SEQ ID NO:1 ou entre les nucléotides 2461 et 4068 de la séquence SEQ ID NO:3 ou d'une séquence complémentaire de celles-ci. Un autre objet de l'invention réside dans un couple d'amorce permettant l'amplification spécifique d'une partie au moins de la région 3' non o codante de la PDE4, le dit couple comprenant au moins une amorce tekile que définie ci-dessus. Un autre objet réside dans un kit pour l'analyse de l'expression de la PDE4, notamment de l'expression différentielle entre la région 3' noncodante et la s région codante, le kit comprenant une sonde nucléotidique spécifique d'une partie de la séquence de la région 3' non-codante et une sonde nucléotidique spécifique d'une partie de la séquence de la région codante. Un autre objet réside dans un kit pour l'analyse de l'expression de la PDE4, so notamment de l'expression différentielle entre la région 3' noncodante et la région codante, le kit comprenant un couple d'amorces nucléotidiques permettant l'amplification spécifique d'une partie au moins de la région 3' non . codante de la PDE4 et un couple d'amorces nucléotidiques permettant l'amplification spécifique d'une partie au moins de la région codante de la PDE4. Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé capable d'inhiber ou de réduire l'expression ou l'activité de la PDE4B, pour la préparation d'une composition destinée au traitement des maladies neurodégénératives, notamment en phase précoce, plus préférentiellement pour réduire l'excitotoxicité neuronale précoce associée aux maladies o neurodégénératives telles l'ALS, Alzheimer ou Parkinson. Dans le contexte de l'invention, le terme " traitement " désigne le traitement préventif, curatif, palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression s de la maladie), etc. Le traitement peut en outre être réalisé en combinaison avec d'autres agents ou traitements, notamment adressant les événements tardifs de la pathologie, tels que des inhibiteurs de caspases ou autres composés actifs. Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé capable o d'inhiber (de préférence de manière sélective) I'expression ou l'activité de la PDE4B de séquence SEQ ID n 2 ou 4 pour la préparation d'une composition destinée à réduire l'excitotoxicité neuronale. Un autre objet de l'invention réside dans une méthode de traitement d'une pathologie associée à un stress neuronal, notamment à une excitotoxicité, comprenant l'administration à un sujet d'un composé inhibiteur de l'activité ou de l'expression de la PDE4B, de préférence un composé inhibiteur sélectif de PDE4. o Le composé utilisé peut être tout composé capable d'inhiber l'expression de la PDE4, notamment la PDE4B, c'est-àdire en particulier tout composé inhibant la transcription du gène, la maturation des ARNs, la traduction de l'ARNI, la modification posttraductionnelle de la protéine, etc. Il peut s'agir d'un composé inhibant la modification de l'ARN, notamment la délétion d'une partie de la région 3' non-codante. Dans un mode de réalisation particulier, le composé est un acide nucléique anti- sens, capable d'inhiber la transcription du gène de la PDE4B ou la traduction du messager correspondant. L'acide nuclélque anti- sens peut comprendre tout ou partie de la séquence du gène de la PDE4B, d'un fragment de celle-ci, du messager de la PDE4B, ou d'une séquence complémentaire à celles-ci. o L'antisens peut notamment comprendre une région complémentaire de la séquence comprise entre les résidus 218-2383 de SEQ ID NO:1 ou 766-2460 de SEQ ID NO:3, et inhiber (ou réduire) sa traduction en protéine. L'antisens peut être un ADN, un ARN, un ribozyme, etc. Il peut être simple-brin ou double- brin. Il peut également s'agir d'un ARN codé par un gène antisens. S'agissant s d'un oligonucléotide antisens, il comprend typiquement moins de 100 bases, par exemple de l'ordre de 10 à 50 bases. Cet oligonucléotide peut être modifié pour améliorer sa stabilité, sa résistance aux nucléases, sa pénétration cellulaire, etc. Selon un autre mode de réalisation, le composé est un composé chimique, d'origine naturelle ou synthétique, notamment une molécule organique ou inorganique, d'origine végétale, bactérienne, virale, animale, eucaryote, synthétique ou semi-synthétique, capable de moduler l'expression ou l'activité de la PDE4B. A titre d'exemple préféré, on peut citer de manière non limitative la pentoxifylline ou l'étazolate. Selon un autre mode de réalisation, il peut s'agir d'un peptide, par exemple comprenant une région de la protéine PDE4 (notamment PDE4B) et capable d'antagoniser son activité. La présente invention propose donc, pour la première fois, la PDE4B comme cible thérapeutique pour le traitement des événements moléculaires associés à l'excitotoxicité. Selon des modes de mise en _uvre particuliers, I'invention peut être utilisée pour inhiber ou réduire l'excitotoxicité neuronale en phase précoce des maladies neurodépénératives. Elle est applicable notamment au traitement de la maladie d'Alzheimer, de la maladie de Parkinson, de la sclérose en plaques, de la chorée de Huntington ou de l'ischémie cérébrale. D'autres objets de l'invention résident dans: I'utilisation des composés ci-dessus pour le traitement de l'ALS, notamment pour réduire l'excitotoxicité neuronale en phase précoce de l'ALS, I'utilisation de la pentoxifylline pour la préparation d'une composition o destinée à inhiberl'activité de la PDE4B chez les patients atteints d'ALS, ou I'utilisation de l'étazolate pour la préparation d'une composition destince à inhiber l'activité de la PDE4B chez les patients atteints d'ALS. L'invention concerne également des méthodes de traitement de l'ALS comprenant l'administration d'un composé inhibant sélectivement l'expression ou l'activité de la PDE4B de séquence SEQ ID n 2 ou 4. De préférence, les méthodes de l'invention sont utilisées pour le traitement en phase précoce des maladies neurodégénératives. o L'administration peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, de préférence par injection, typiquement par voie intrapéritonéale, intra- cérébrale, intra-veineuse, intra-artérielle ou intra-musculaire. Ces doses injectées peuvent être adaptées par l'homme de l'art. Typiquement, de 0,01 mg à 100 mg I kg environ sont injectés, pour des composés inhibiteurs de nature s chimique. Pour des composés nuclélques, les doses peuvent varier par exemple entre 0,01 mg et 100 mg par dose. Il est entendu que des injections répétées peuvent être réalisées, éventuellement en combinaison avec d'autres agents actifs ou tout véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique (e.g., tampons, solutions saline, isotonique, en présence d'agents stabilisants, etc.). L'invention est utilisable chez les mammifères, notamment chez l'être humain. Les résultats présentés dans les exemples illustrent l'efficacité d'inhibiteurs de . PDE4B pour améliorer la viabilité de neurones placés en conditions d'excitotoxicité. D'autres objets de l'invention concernent des méthodes de sélection, identification ou caractérisation de composés actifs sur les pathologies associées à l'excitotoxicité, ou au stress neuronal, comprenant la mise en contact de composés tests avec une cellule exprimant la PDE4B (notamment un variant dépourvu de domaine 3' non-codant), et la mise en évidence des composés inhibant l'expression ou l'activité de cette protéine. Les méthodes peuvent étre mises en _uvre avec différentes populations cellulaires, telles que des cellules primaires ou des lignées de cellules d'origine mammifère (humaine, murine, etc.). On utilise avantageusement des cellules qui n'expriment pas naturellement la PDE4B, transfectées avec un acide nuclélque codant le variant souhaité. De cette manière, la sélectivité de la méthode est augmentée. On peut également utiliser des cellules encaryotes inférieures (levure, etc.) ou des cellules procaryotes. Les méthodes de screening peuvent également étre réalisées en système o acellulaire, par mesure de la capacité de composés tests à iier la PDE4B ou un variant ou fragment de celle-ci. Un autre objet de l'invention concerne tout acide nuclélque codant un polypoptide tel que défini ci-dessus, les vecteurs le contenant, cellules recombinantes, et utilisations. Les vecteurs peuvent étre des plasmides, phages, cosmides, virus, chromosomes artificiels, etc. Des vecteurs préférés sont par exemple des vecteurs plasmidiques, comme ceux dérivés de plasmides commerciaux (pUC, pcDNA, pBR, etc.). De tels vecteurs comportent avantageusement un gène de sélection eVou une origine de réplication eVou un so promoteur transcriptionnel. D'autres vecteurs particuliers sont par exemples des virus ou des phages, notamment des virus recombinants défectifs pour la réplication, tels que des virus dérivés de rétrovirus, adénovirus, AAV, herpès e virus, baculovirus, etc. Les vecteurs peuvent être utilisés dans tout hôte compétent, comme par exemple des cellules prokaryotes ou eukaryotes. Il peut s'agit de bactéries (par exemple E. coli), levures (par exemple Saccharomyces ou Kluyveromyces), cellules végétales, cellules d'insectes, cellules de mammifères, notamment humaines, etc. Il peut s'agir de lignées, cellules primaires, cultures mixtes, etc. D'autres aspects et avantages de la présente invention appara^'tront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non o limitatifs. LEGENDE DES FIGURES Figure 1: PCR semi-quantitative de PDE4B à partir d'échantillons de cerveau. s Figure 2: PCR semi-quantitative de PDE4B à partir d'échantillons de muscle. Figure 3: La Pentoxifylline protège les neurones primaires de granules cérébelleux de l'excitotoxicité induite par 10OIJM NMDA/10,uM serine et par ,uM kainate. EXEMPLES Exemple 1: Identification de la PDE4 comme cible moléculaire de l'excitotoxicité s L'analyse qualitative différentielle a été effectuée à partir d'ARN poly adénylés (poly A+) extraits d'échantillons de cerveaux d'animaux correspondant aux différents stades, sans isolement préalable des neurones afin de prendre en compte un maximum d'évènements d'épissages alternatifs liés au développement de la pathologie. so Les ARN poly A+ sont préparés selon des techniques connues de l'homme de métier. Il peut s'agir en particulier d'un traitement au moyen d'agents chaotropiques tels que le thiocyanate de guanidium suivi d'une extraction des ; ARN totaux au moyen de solvants (phénol, chloroforme par exemple). De telles méthodes sont bien connues de l'homme du métier (voir Maniatis et al., Chomczynsli et al., Anal. Biochem. 162 (1987) 156), et peuvent être aisément pratiquces en utilisant des kits disponibles dans le commerce. A partir de ces ARN totaux, les ARN poly A+ sont préparés selon des méthodes classiques connues de l'homme de métier et proposées par des kits commerciaux. Ces ARN poly A+ servent de matrice à des réactions de transcription inverse à l' aid e de reve rse transcri ptase. Avantageusement so nt uti l isées d es reverse transcripteses dépourvues d'activité RNase H qui permettent d'obtenir des o premiers brins d'ADN complémentaire de tailles supérieures à ceux obtenus avec des reverse transcriptases classiques. De telles préparations de reverse transcriptases sans activité RNase H sont disponibles commercialement. Pour chaque point de la cinétique de développement de la pathologie (30 jours, jours et 90 jours) les ARN poly A+ ainsi que les ADNc simple brins sont s préparés à partir des animaux transgéniques (T) et des animaux contrôles syngéniques (C). Conformément à la technique DATAS, pour chaque point de la cinétique sont réal isées d es hybrid ations d 'ARN m (C) avec des ADN c (T) et des hybridatio ns réciproques d'ARNm (T) avec des ADNc (C). Ces hétéroduplex ARNm/ADNc sont ensuite purifiés selon les protocoles de la technique DATAS. Les séquences d'ARN non appariées avec un ADN complémentaire sont libérées de ces hétéroduplex sous l'action de la RNase H. cette enzyme dégradant les séquences d'ARN appariées. Ces séquences non appariées représentent les différences qualitatives qui existent entre des ARN par ailleurs homologues entre eux. Ces différences qualitatives peuvent être localisées n'importe o sur la séquence des ARN, aussi bien en 5', 3' ou à l'intérieur de la séquence et notamment dans la séquence codante. Selon leur localisation, ces séquences peuvent être non seulement des modifications d'épissage mais o également des conséquences de translocations ou de délétions. Les séquences d'ARN représentant les différences qualitatives sont ensuite clonées selon les techniques connues de l'homme de métier et notamment celles décrites dans le brevet de la technique DATAS. Ces séquences sont regroupées au sein de banques de cDNA qui constituent des banques qualitatives différentielles. Une de ces banques contient les exons et les introns spécifiques de la situation saine; les autres banques contiennent les évènements d'épissage caractéristiques des conditions pathologiques. L'expression différentielle des clones a été vérifiée par hybridation avec des sondes obtenues par reverse-transcription à partir d'ARN messagers extraits o des différentes situations étudiées. Les clones hybridant de façon différentielle ont été retenus pour analyse ultérieure. Les séquences identifiées par DATAS correspondent à des introns eVou à des exons exprimées de façon différentielle par épissage entre les situations pathologiques et la situation saine. Ces évènements d'épissage peuvent être spécifiques d'une étape donnée du développement de la pathologie ou caractéristiques de l'état sain. La comparaison de ces séquences avec les banques de donnces permet de classifier les informations obtenues et de proposer une sélection raisonnée des séquences selon leur intérêt diagnostique ou thérapeutique. La réalisation de DATAS sur des ARN d'animaux contrôles et transgéniques âgés de 60 jours a permis d'isoler un fragment d'ADNc dérivé de l'ARNm de la phosphodiestérase 4B. Ce fragment correspond à un fragment d'exon spécifiquement présent dans les animaux contrôles et donc spécifiquement délété dans les animaux transgéniques pour SOD1G93A au stode 60 jours. Ce fragment recouvre les nucléotides 377 à 486 référencés à partir du codon stop de la PDE4B de souris (SEQ ID NO:1). Cette séquence comprend 2912 bases, le fragment délété correspondant aux bases 2760 à 2869. Cette région est non codante et est exprimée différentiellement entre les animaux contrôles et les o animaux transgéniques, du fait de l'utilisation alternative d'un exon 3' non codant ou du fait de l'utilisation de deux sites de polyadénylation alternatifs. j Exemple 2: Expériences de RT-PCR: Confiirmation de l'expression différentielle: L'expression différentielle de la PDE4B dans une situation de stress neuronal, par rapport à une situation de référence, a été vérifiée par des expériences de RT PCR présentées sur les figures 1 et 2. Ces expériences ont été réalisées selon des techniques bien connues de l'homme de métier et ont permis de suivre les expressions de deux régions distinctes de l'ARNm de la PDE4B. Une de ces régions recouvre le codon o d'initiation de cet ARNm (PDE4B 5'), I'autre recouvre en partie le fragment identifié selon la technique DATAS (PDE4B DATAS). Les localisations des amorces de PCR utilisées sont indiquces sur les figures 1 et 2. L'ARN PO correspond à un ARN ribosomal utilisé comme contrôle interne destiné à vérifier que la même quantité d'ARN est utilisée pour chaque point s expérimental. Les analyses ont été réalisées à partir d'ARN extraits d'animaux contrôles (C) et transgéniques (T) âgés de 30, 60 et 90 jours, c'est à dire avant l'apparition des symptômes pathologiques. La figure 1 présente les résultats obtenus à partir d'ARN extraits des cerveaux des animaux. Alors que la même quantité d'ADNc est amplifiée à partir de l'ARN de PO dans o tous les échantillons, de variations sont observées pour l'ARNm de la PDE4B: les variations les plus significatives sont détectées chez les animaux âgés de 90 jours: alors qu'une augmentation du niveau d'expression du fragment PDE4 5' est observée dans le cerveau des animaux trangéniques, une très forte diminution de l'expression de PDE4B (DATAS) est observée dans le cerveau des animaux trangéniques. Ce résultat établit une corrélation entre la diminution de l'expression d'un fragment 3' non codant de 1'ARNm de la PDE4B et l'augmentation de l'expression de la partie 5' codante de ce même messager. Ce résultat est tout à fait compatible avec la présence de séquences de déstabilisation des ARNm o dans la séquence identifiée par DATAS et démontre la corrélation entre l'expression de PDE4B et le phénomène d'excitotoxicité. Exemple 3: Inhibition de l'excitotoxicité par des inhibiteurs de PDE4 Pour cet exemple, des neurones granulaires du cervelet de rat ont été mis en culture selon les techniques connues de l'homme de métier. L'excitotoxicité a été induite sur ces cellules par deux types de traitement: I'administration conjointe de 100,uM de NMDA (N-Methyl-Dapartic acid) et de 10,uM de sérine d'une part, I'administration de 50,uM de keinate d'autre part. Dans les conditions expérimentales retenues, 30 à 40% de toxicité est observée et mesurée par des tests MTT connus de l'homme de l'art. o Lors du co-traitement des neurones par un inhibiteur de PDE4, un effet protecteur dose-dépendent est observé dans les deux modes d'induction de l'excitotoxicité. Un tel effet protecteur est observé à l'aide de la pentoxifylline, de l'étazo late et de la de n bufyll ine. La fig u re 3 présente d es résultats obten us à l'aide de la pentoxifylline qui permet d' atteindre un effet protecteur de 50% dans s le cas du traitement NMDA/Ser et 80% dans le cas de la toxicité induite par le kainate (Figure 3). La présente invention documente donc non seulement l'implication de la PDE4B dans les mécanismes d'excitotoxicité, notamment dans un modèle d'ALS, mais aussi documente la capacité d'inhiteurs de PDE4 à préserver la viabilité neuronale lors de stress liés à l'excitotoxicité. D'autres aspects et applications de l'invention résident dans: I'utilisation de tout ou partie d'une séquence dérivée de l'ARN messager de la PDE4B à des fins de diagnostic ou de dépistage ou de caractérisation de pathologies neurodégénératives ayant une composante ou un stade lié au phénomène d'excitotoxicité, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques, la chorée de Huntington ou l'ischémie cérébrale, -I'utilisation de tout fragment d'acide nuclélque y compris des ARN anti-sens dans le but d'inhiber l'expression de la PDE4B e chez les patients atteints de telles pathologies, -I'utilisation de tout composé chimique, notamment de la pentoxifylline ou de I'étazolate, ou de toute composition pharmaceutique les contenant, dans le but d'inhiber l'activité de la PDE4B chez les patients atteints de telles pathologies, -I'utilisation de tout ou partie d'une séquence dérivée de l'ARN messager de la PDE4B à des fins de caractérisation du tissu et de la situation ischémique. i REVENDICATIONS 1. Méthode de détection d'une situation d'excitotoxicité ou de stress neuronal chez un sujet, comprenant la mesure in vitro de l'expression de la s phosphodiestérase 4, notamment de la phosphodiestérase 4B dans un échantillon provenant du sujet. 2. Méthode de détection d'une situation d'excitotoxicité ou de stress neuronal chez un sujet, comprenant la détection de la présence d'une forme mutée de o l'ARN de la phosphodiestérase 4, notamment de la phosphodiestérase 4B dans un échantillon provenant du sujet, en particulier d'une forme délétée de tout ou pa rtie de la rég ion 3' non-coda nte. 3. Utilisation d'un acide nuclélque comprenant tout ou partie d'une séquence dérivée du gène ou de 1'ARN messager de la PDE4B pour la mise en _uvre d'une méthode de diagnostic ou de détection d'une situation de stress neuronal et plus particulièrement la situation d'excitotoxicité. 4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que 1'acide nucléique comprend tout ou partie de la PDE4B, ou de la séquence résultant de la jonction entre les régions non délétées, ou une séquence complémentaire de cellesci. 5. Utilisation selon la revendication 3 ou 4, pour le diagnostic ou la détection de la maladie d'Alzheimer, de la maladie de Parkinson, de la sclérose en plaques, de la chorce de Huntington ou de l'ischémie cérébrale. 6. Utilisation selon la revendication 5, pour la détection à un stade précoce de la sclérose en plaques. o 7. Méthode selon la revendication 1 ou 2, comprenant ia mise en contact in vitro d'un échantillon biologique d'un sujet, contenant un acide nuclélque, avec un i acide nucléique tel que défini dans les revendications 3 ou 4, et la détection de la formation d'un hybride. 8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'échantillon s comprend des cellules nerveuses ou musculaires. 9. Utilisation d'un composé inhibant ou réduisant l'expression ou l'activité de la PDE4B, pour la préparation d'une composition destinée au traitement des maladies neurodégénératives. 10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que le composé est acide nuclélque anti-sens, capable d'inhiber la transcription du gène de la PDE4B ou la traduction du messager correspondant. 11. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que le composé est un composé chimique, d'origine naturelle ou synthétique. 12. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que le composé est choisi parmi la pentoxifylline et l'étazolate. 13. Utilisation selon l'une des revendications 9 à 12, pour inhiber ou réduire l'excitotoxicité neuronale en phase précoce des maladies neurodégénératives. 14. Utilisation selon l'une des revendications 9 à 13, pour le traitement de la maladie d'Alzheimer, de la maladie de Parkinson, de la sclérose en plaques, de la chorée de Huntington ou de l'ischémie cérébrale. 15. Utilisation selon l'une des revendications 9 à 14, pour le traitement de l'ALS, notamment pour réduire l'excitotoxicité neuronale en phase précoce de l'ALS. 16. Utilisation de la pentoxifylline pour la préparation d'une composition destinée à inhiber l'activité de la PDE4B chez les patients atteints d'ALS. 17. Utilisation de l'étazolate pour la préparation d'une composition destinée à inhiber l'activité de la PDE4B chez les patients atteints d'ALS. s 18. Amorce nucléotidique, caractérisée en ce qu'elie est composée d'un fragment de 8 à 20 résidus consécutifs de la séquence comprise entre les nucléotides 2384 et 2869 de la séquence SEQIDNO:lou entre les nucléotides 2461 et 4068 de la séquence SEQIDNO:3OU d'une séquence complémentaire de celles-ci. 19. Kit pour l'analyse de l'expression de la PDE4, notamment de l'expression différentielle entre la région 3' non-codante et la région codante, le kit comprenant une sonde nucléotidique spécifique d'une partie de la séquence de la région 3' non-codante et une sonde nucléotidique spécifique d'une partie de la séquence de la région codante. 20. Kit pour l'analyse de l'expression de la PDE4, notamment de l'expression différentielle entre la région 3' non-codante et la région codante, le kit comprenant un couple d'amorces nucléotidiques permettant l'amplification o spécifique d'une partie au moins de la région 3' noncodante de la PDE4 et un couple d'amorces nucléotidiques permettant l'amplification spécifique d'une