Brevet FR2825364A1 — publié le 20021206

VECTEUR PEPTIDIQUE POUR LE TRANSFERT D'ACIDES NUCLEIQUES DANS DES CELLULES EUCARYOTES L'invention concerne un nouveau vecteur peptidique pour le transfert d'une substance anionique d'intérêt, en particulier un acide nucléique, dans une cellule eucaryote. Elle concerne aussi le complexe incorporant à la fois le vecteur et l'acide nucléique. Elle se rapporte également à l'utilisation dudit vecteur en thérapie génique. L'introduction de matériel génétique dans une cellule permet l'expression d'une protéine de manière à déclencher une réponse immune ou suppléer à l'absence ou la déficience d'une protéine. Ce type de technologie trouve une application directe dans le traitement ou la prévention de certaines maladies de même que dans la production de certaines protéines in vitro. On a démontré que le transfert d'un acide nucléique dans un noyau cellulaire au moyen d'un vecteur était généralement effectué en quatre étapes, respectivement l'entrée dans la cellule de l'acide nucléique sous forme condensée, par endocytose spécifique ou non spécifique ; la libération de l'acide nucléique depuis l'endosome dans le cytosol ; le transport de l'acide nucléique du cytosol jusqu'à la membrane nucléaire, puis l'entrée de l'acide nucléique dans le noyau. On distingue deux types de vecteurs de transfection, respectivement les vecteurs viraux et les vecteurs synthétiques. Les vecteurs viraux, comme par exemple ceux dérivant d'adénovirus et de rétrovirus, présentent un intérêt certain, puisque leur structure et leurs propriétés naturelles leur permettent de pénétrer dans la cellule par l'intermédiaire d'interactions avec des récepteurs membranaires, puis d'introduire la séquence nucléique efficacement dans le cytosol. Cependant, une des principales limites à l'utilisation des virus en tant que vecteurs de transfection réside dans la production de qualité clinique de tels vecteurs à grande échelle, ainsi que leur coût de production. La deuxième catégorie de vecteurs correspond aux vecteurs non viraux, l'objectif étant de développer des vecteurs présentant des propriétés de transfection similaires à celles des vecteurs viraux sans pour autant en présenter les inconvénients. On distingue trois grandes catégories de vecteurs que sont les lipides cationiques, les polymères cationiques et les peptides. Les lipides cationiques sont capables de former des complexes avec des molécules anioniques du type acide nucléique, conduisant à neutraliser les charges négatives, et faciliter ainsi le passage dudit complexe dans la cellule. Des vecteurs tels que par exemple, le DOGS (di-octadécylamidoglycylspermine) sont parfaitement connus et plus particulièrement décrits dans le document Rémy et al, q Gene transfer with a series of lipophilic DNA-binding molecules)) Bioconjugate Chem, 1994 ; 5 : 647-654. Les polymères cationiques présentent également une bonne capacité de condensation de l'acide nucléique par interactions ioniques. On connaît ainsi les polymères du type polylysine, polyarginine, dendrimères (PAMAM), po1yéthy1ènimine ou polypropylènimine (voir par exemple Haensler J et al, Polyamidoamine cascade polymers mediate efficient transfection of cells in culture Bioconjugate Chem, 1993 ; 4 : 372-379). Comme déjà dit, si les lipides et polymères cationiques ont certes une réelle capacité à complexer l'acide nucléique et à améliorer la livraison dans les cellules eucaryotes, en revanche il semble que certains transporteurs soient incapables de provoquer, seuls, la rupture de l'endosome et donc la libération de l'acide nucléique dans le cytoplasme. Il est donc nécessaire de modifier leur structure et/ou de les associer à d'autres molécules. Dans le document Midoux et al efficient gene transfer by histidylated polylysine/pDNA complexes (Bioconjugate Chem, 1999 ; 10 : 406-411), on a proposé un complexe associant DNA et polylysine dans lequel des résidus lysine ont été substitués par des résidus histidine, dont on suppose qu'ils favorisent la sortie de 1'ADN des endosomes, lorsque ceux-ci s'acidifient. La rupture par lyse ou fusion de la paroi de l'endosome peut également être obtenue par association du lipide ou du polymère avec de la chloroquine ou un peptide dit fusiogène . Ainsi, le document Wagner E. effects of membrane-active agents in gene delivery (J Controlled Release (1998) 53 : 155-158) décrit un peptide présentant une activité fusiogène pH dépendante, dérivé de l'extrémité peptidique N terminale de la sous unité HA 2 de l'hemagglutinine du virus influenza. A pH acide, ce peptide adopte une conformation a-hélicoidale conduisant à la lyse ou la fusion de la membrane phospholipidique. Dans le document Membrane Permeabilization and Efficient Gene Transfer by a Peptide Containing Several Histidines (Bioconjugate Chem. 1998 ; 9,260-267), MIDOUX et al décrivent l'utilisation d'un peptide H5WYG, qui est un analogue du segment N terminal du HA-2 précité, dans lequel les résidus G-4, G-8, E-11, T-15 et D-19 ont été remplacés par des résidus histidine, tandis que le résidu M-17 a été remplacé par un résidu leucine. Ce peptide est utilisé en tant que peptide fusiogène en association avec un polymère cationique du type polylysine. On connaît également un peptide dénommé JTS 1 développé par Gottschalk et al A novel DNA peptide complexfor efficient gene transfert and expression in mammalian cells Gene Therapy (1996), 3 (5) : 48-57, lequel permet également de rompre la paroi de l'endosome. Il ressort donc de ce qui précède qu'un certain nombre de peptides sont utilisés en temps que substance fusiogène en association avec des lipides ou polymères cationiques ou avec d'autres peptides. Cependant, d'autres peptides ont été développés, en particulier pour constituer des ligands permettant la liaison à des récepteurs cellulaires afin d'avoir une endocytose spécifique des complexes. C'est par exemple le cas du peptide RGD décrit dans le document Peptide-based gene delivery de Ram I Mahato et al (Current opinion in Molecular Therapeutics 1999 1 (2) : 226-243). Enfin, certains peptides sont également connus pour leur capacité à favoriser le transport nucléaire, en particulier les peptides NLS, tel que par exemple mentionné dans le document précité Ram I Mahato et al. En d'autres termes, la plupart des peptides développés à ce jour sont utilisés en temps que substance auxiliaire, pour assurer soit la compaction de l'ADN, soit la spécificité de l'endocytose, soit la libération de 1'ADN depuis l'endosome, soit le transport nucléaire, associée à d'autres peptides ou encore des polymères ou lipides cationiques. L'un des objectifs désormais est de proposer des vecteurs peptidiques multifonctionnels, correspondant à la troisième catégorie de vecteurs précitée, qui permettent, seuls, donc en l'absence de toute substance auxiliaire, de favoriser à la fois la complexation de 1'ADN, la livraison dans les cellules, la sortie des acides nucléiques des vésicules d'endocytose et peut-être encore d'autres étapes (protection de l'ADN, amélioration du transport nucléaire,...) Le document Design, synthesis and characterization of a ccionic peptide that binds to nucleic acids and penneabilizes bilayers de Tara B. Wyman et al (Biochemistry 1997,36, 3008-3017) décrit un peptide cationique amphipatique désigné KALA (WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA) qui adopte dans environ 50 % des cas, une conformation a-hélicoidale à pH neutre. Du fait de son caractère amphipatique, le peptide KALA présente une partie hydrophobe constituée de résidus alanine et leucine et une partie hydrophile constituée par des résidus lysine. On note en outre que la face hydrophile de l'hélice a présente un résidu histidine. Il est par ailleurs indiqué dans ce document que les résidus hydrophiles lysine sont destinés à lier FADN tandis que les résidus acide glutamique sont positionnés de sorte à améliorer la solubilité aqueuse du peptide à pH physiologique. Wyman montre que le peptide KALA permet de transfecter différentes lignées cellulaires sans pour autant nécessiter l'ajout d'un autre composant du type polymère, lipide cationique, chloroquine, etc.... Le KALA présente cependant une toxicité non négligeable du fait qu'il doit être utilisé en quantité importante pour permettre une transfection satisfaisante de l'ADN. De plus, son efficacité reste médiocre, comme il sera démontré par la suite. Le problème que se propose de résoudre l'invention est donc de développer un vecteur peptidique multifonctionel dénué de toxicité et présentant une efficacité de transfection supérieure à celle des vecteurs connus du Demandeur. Pour ce faire, l'invention propose un vecteur peptidique amphipatique cationique, présentant une charge absolue supérieure ou égale à 2, à pH 7,4, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une partie hydrophile comprenant au moins trois résidus aptes à se protoner à pH inférieur à 7,4. Dans la suite de la description et dans les revendications, on entend par les expressions suivantes : - peptide amphipatique : peptide présentant des résidus hydrophobes, ainsi que des résidus hydrophiles, susceptible de délimiter au moins une zone hydrophile et au moins une zone hydrophobe distincte, telle qu'illustrée d'après le diagramme d'Edmundson ; - peptide cationique : peptide présentant plus de charges positives que de charges négatives, c'est à dire présentant une charge absolue positive à pH neutre, les charges positives pouvant provenir d'acides aminés ou d'autres molécules chargées positivement qui incluent, mais ne sont pas limitées à lysine, éthy1èneimine, arginine, méthacrylate, spermine et spermidine. En pratique, mais sans que ce soit limitatif, les résidus protonables sont des groupements imidazole tels que par exemple ceux présents dans l'histidine. Selon un mode de réalisation préféré, le peptide de l'invention présente une partie hydrophile contenant quatre résidus capables de se protoner à des pH inférieurs à 7, 4, préférentiellement à un pH compris entre 4, 5 et 7. Dans ce cas, la partie hydrophile se trouve en opposition avec la partie hydrophobe, comme il sera vu par la suite dans la représentation schématique selon Edmunson. Des vecteurs peptidiques de l'invention répondant à la définition ci-dessus sont par exemple les peptides comprenant les séquences d'acides aminés suivantes : - KKALLALALHHLAHLALHLALALKKA désignée ci-après LAH4 (5 charges positives à pH 7, 4) et correspondant à la SEQ ID NO 1 ; - KKALLALALHHLALLAHHLALALKKA désignée LAH4-L3 (5 charges +) et correspondant à la SEQ ID NO 2 ; - KKALLALALHHLALLAHLLALHLKKA désignée LAH4-L4 (5 charges +) et correspondant à la SEQ ID NO 3. Dans une autre forme de réalisation, le vecteur peptidique de l'invention présente une partie hydrophile contenant cinq résidus hydrophiles. Des vecteurs peptidiques répondant à cette définition sont par exemple les peptides présentant la séquence suivante : - KKKGLFHAIHGFIHNGWHGMIHGWYGKKK désignée ci-après KH-INF7 (7 charges +) et correspondant à la SEQ ID NO 4 ; - RRRRRRRRGLFHAIHGFIHNGWHGMIHGWYG désignée R8H-INF7 (9 charges +) et correspondant à la SEQ ID NO 5 ; - KKALLALALHHLAHLAHHLALALKKA désignée LAH5 (5 charges +) et correspondant à la SEQ ID NO 6 ; - CKKKGLFHAIHGFIHNGWHGMIHGWYGKKKC désignée C2-KHINF7 (7 charges +) et correspondant à la SEQ ID NO 7. L'invention concerne également le vecteur peptidique tel que précédemment décrit associé à au moins un composé. Par le terme associé , on désigne soit le couplage covalent du composé sur le peptide (via des méthodes conventionnelles), soit le simple ajout du composé au peptide, le couplage covalent étant préféré. Ledit composé peut être un ligand de ciblage au vecteur peptidique utile lorsque l'on souhaite sélectionner le type de cellules dans lequel la substance active doit être transférée, ou comme il a été vu précédemment, lorsque l'on souhaite faciliter la pénétration de la substance active dans la cellule. C'est par exemple le cas du peptide RGD, qui pourra être avantageusement associé aux peptides de l'invention. Le vecteur peptidique de l'invention peut également être associé à d'autres composés choisis dans le groupe comprenant les peptides fusiogéniques (par exemple JTS-1), les lipides, les polymères, les peptides de localisation nucléaire (NLS), les résidus polyéthylène glycols, pris seuls ou en combinaison. On a constaté que le vecteur de l'invention permettait de condenser efficacement les molécules anioniques, et notamment les acides nucléiques, conduisant ainsi à la formation d'un complexe. Dès lors, l'invention se rapporte également à un complexe de transfert. Ce complexe se caractérise en ce qu'il comprend l'association du vecteur peptidique tel que décrit précédemment avec une substance anionique. Dans une forme de réalisation avantageuse, la substance anionique est choisie dans le groupe comprenant les protéines et les acides nucléiques. Sous le terme acides nucléiques , on regroupe à la fois les acides désoxyribonucléiques et les acides ribonucléiques. L'acide nucléique peut comprendre des séquences d'origine naturelle ou artificielle, en particulier du DNA génomique, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, séquence hybride (RNA/DNA par exemple), séquence synthétique ou semi-synthétique. Les acides nucléiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne ou encore virale. Ils peuvent être obtenus par toutes techniques connues de l'homme du métier, puis éventuellement incorporés dans des vecteurs plasmidiques. Dans le cas spécifique des acides désoxyribonucléiques, ceux-ci peuvent être à simple brin ou double brins et transporter des gènes d'intérêt, des séquences de régulation de la transcription, des séquences antisens, des molécules d'adhésion, etc... A titre d'exemple de gène d'intérêt thérapeutique, on peut citer les gènes codant pour une ou plusieurs protéines présentant une activité pharmacologique, telles que par exemples enzymes, hormones, facteurs de croissance, cytokines, apolipoprotéines et autres. On peut citer notamment le gène thymidine kinase, le gène codant pour une cytokine, telle que TNF, l'interleukines 1 à 12 et interféron. L'ADN peut également comprendre des gènes marqueurs. Par séquence antisens, on désigne une séquence capable de réduire ou de supprimer directement ou indirectement (après transcription de l'ADN), l'expression de la protéine cible. Les séquences antisens comprennent également des séquences codant pour des ribozymes, capables de supprimer sélectivement des ARN cibles. Dans le cas des acides ribonucléiques, ils peuvent être des RNA antisens capables de bloquer au moins l'expression d'un gène (d'origine cellulaire, virale, bactérienne ou autre). Les acides ribonucléiques peuvent être également des ribozymes ou des acides nucléiques capables de se lier à d'autres acides nucléiques pour former une triple hélice. L'invention concerne également le procédé de fabrication du complexe de transfection, selon lequel on mélange le vecteur peptidique précédemment décrit avec une substance anionique. L'invention a également pour objet un procédé de transfection d'une substance anionique et en particulier d'acide nucléique dans une cellule cible, selon lequel on met en contact au moins un complexe tel que décrit précédemment avec des cellules eucaryotes. Par cellules cibles , on désigne tous types ou espèces de cellules, en particulier les cellules eucaryotes, telles que les cellules de mammifères, notamment les cellules humaines ou de souris, singe, hamster et autres. Les cellules dans lesquelles sont transférées les molécules anioniques d'intérêt comprennent également les cellules somatiques, incluant elles-mêmes les cellules primaires, de même que les lignées cellulaires. Parmi ces cellules, on utilise notamment, mais de façon non limitative, les cellules du système immunitaire, telles que les lymphocytes T et B, les macrophages, les cellules dendritiques. L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant au moins un complexe tel que décrit précédemment. Les complexes ou compositions pharmaceutiques peuvent être administrés in vivo, notamment sous forme injectable, par exemple par voie intramusculaire, voie intra-veineuse, instillation nasale, sous cutanée, intra-trachéale, voie orale, intra-craniale, en aérosol, intra-artérielle. Les acides nucléiques, les peptides ou les complexes peuvent éventuellement être lyophilisés. Dans ce cas, la formulation serait reconstituée en ajoutant une solution stérile adaptée avant utilisation. L'invention concerne également l'utilisation du complexe tel que décrit précédemment pour la préparation d'un médicament pour le traitement du corps humain ou animal. L'invention concerne enfin aussi une cellule transfectée par un complexe ou une composition pharmaceutique telle que précédemment décrite. Cette cellule peut être avantageusement une cellule eucaryote, en particulier une cellule de mammifère, et notamment une cellule humaine. L'invention ressortira mieux des exemples de réalisation suivants à l'appui des figures annexées. La figure 1 est une représentation des peptides de l'invention, respectivement LAH4, KH-INF7, LAH4-L3, LAH4-L4, selon le diagramme d'Edmundson. La figure 2 est une représentation selon Edmundson du peptide histatin-5. La figure 3 représente la capacité des peptides LAH4 et KH-INF7 à condenser l'ADN. La figure 4 représente l'efficacité de transfection des peptides LAH4 et KHINF7 sur des cellules 293. La figure 5 représente l'efficacité de transfection des peptides LAH4 et KHINF7 sur des cellules HeLa et des cellules NIH 3T3. La figure 6 représente l'efficacité de transfection des peptides LAH4 sur des cellules HepG2, Rob l et CHQ5B. La figure 7 représente l'efficacité de transfection des peptides LAH4, LAH5, LAH4-L3 et LAH4-L4 sur des cellules Hep G2. La figure 8 représente l'efficacité de transfection des peptides LAK4, LAK5X2 et LAK5X2W2 par rapport à LAH4 sur des cellules 293. La figure 9 représente l'effet du MG132, de la bafilomycine A1 et du sérum sur l'efficacité de transfection des peptides LAH4 et KH-INF7. La figure 10 représente l'influence de la nature du milieu de complexation ADN/LAH4 sur l'activité de transfection. La figure 11 représente l'efficacité de LAH4 sur des cellules HepG2, lorsque la quantité de plasmide CMV-Luc est diminuée. La figure 12 représente l'efficacité de transfection de KH-INF7 sur des cellules HeLa en présence d'un ligand de ciblage (RGD). La figure 13 représente l'efficacité d'intégration du plasmide après transfert de gènes par LAH4 sur des cellules Hep G2. La figure 14 représente l'activité hémolytique de LAH4 et KH-INF7 à pH 7 et 5 avec ou sans ADN. La figure 15 représente l'efficacité des peptides LAH4 et C2KH-INF7 versus celle de KALA sur trois lignées cellulaires. 1-Procédé de fabrication des peptides Il existe différentes manières d'obtenir les peptides de l'invention. La première consiste à exprimer une séquence d'acides nucléiques codant pour les peptides de l'invention par E. Coli ou tout autre système d'expression. Le peptide produit est ensuite purifié par des techniques conventionnelles. La seconde consiste à synthétiser les peptides en utilisant un synthétiseur (pour exemple, voir B. Bechinger J. Mol. Biol 1996, 263,768-775). Dans les exemples qui suivent, les peptides sont les suivants. Le peptide Histatin-5 a été acheté chez Bachem. Les peptides KH-INF7, C2KH-INF7, R8HINF7, KH-INF7-RGD et KALA ont été synthétisés par la société Synt : em. Le peptide LAH4 et dérivés ont été synthétisés par le groupe de B. Bechinger (Max Planck, Allemagne), (voir pour exemple B, Bechinger, J. Mol. Biol., 1996,263, 768-775). Tous les peptides sont dissous soit dans de l'eau stérile, soit dans un tampon citrate filtré 0,22 f-lm (5 mM acide citrique, 10 mM NaHPO, pH 5,3) à 0,5 mg/ml ou 1 mg/ml et sont stockés à-80 C. 2-Représentation des peptides selon Edmundson a) Exemples de peptides de l'invention Sur la figure 1, on a représenté quelques peptides de l'invention sous la représentation selon Edmundson. Comme le montre chacune des figures 1A (LAH4), 1B (KH-INF7), 1C (LAH4-L3) et 1D (LAH4-L4), les peptides de l'invention sont des peptides amphipatiques présentant une partie hydrophobe constituée, dans ces exemples, majoritairement d'acides aminés non polaires, c'est-à-dire hydrophobes, et d'une partie hydrophile contenant systématiquement au moins 4 résidus histidine. Comme il ressort de ces figures, la partie hydrophile est distincte de la partie hydrophobe, l'ensemble des résidus histidine se trouvant du même côté de l'hélice, c'est-à-dire le côté opposé à la partie hydrophobe. b) Histatin-5 Sur la figure 2, on a représenté selon le même principe le peptide histatin-5 fourni par Bachem. Comme le montre cette figure, ce peptide n'a pas de face hydrophile, ni de face hydrophobe bien définie, de sorte qu'il ne peut être qualifié d'amphipatique au sens de l'invention. 3-Gel retard La capacité de liaison à 1'ADN a été étudiée au moyen d'un essai retard sur gel d'agarose. Des quantités croissantes de produit à tester sont diluées dans 25 gel d'une solution de NaC1 (150 mM). Ces échantillons sont ensuite mélangés avec 1 g de plasmide également dilué dans une solution saline (150 mM) de 25 jj. l. Après 20 minutes de complexation, 5 n. l de tampon de charge sont ajoutés, et 20 y p. l de cette solution sont déposés sur un gel d'agarose à 1 % dans du tampon Trisborate-EDTA contenant 0,4 mg/1 de bromure d'éthidium (lorsque celui-ci s'intercale dans l'ADN, il fluoresce ; c'est ce qui permet de visualiser l'ADN). L'électrophorèse est faite à 80 V pendant 45 minutes environ. Dans le tableau suivant, on a représenté la quantité de peptide nécessaire pour retarder la migration d'1 Fig d'ADN. PEPTIDE Quantité de peptide nécessaire pour retarder mg d'ADN KH-INF7 2, 5 C2KH-INF7 1 RH8-INF7 1 LAH4 2,5 LAH4-L3 2,5 LAH4-L4 1 LAH5 2,5 Histatin-5 > 30a a) la quantité maximale testée à été 30 gag Comme le montre le tableau, les peptides cités sont tous capables, excepté l'Histatin-5, de retarder la migration de l'ADN. La quantité requise est, pour ces peptides, inférieure ou égale à 2, 5 pig. L'Histatin-5, testée jusqu'à 30 J. g, a été incapable de retarder la migration de l'ADN. 4-Capacité des peptides LAH4 et KH-INF7 à condenser l'ADN La capacité de condensation de l'ADN par ces deux peptides a été étudiée par fluorescence. L'essai consiste à ajouter des quantités croissantes de chacun des deux peptides à 2 u. g d'ADN une solution de 100 III de NaCl (150 mM) contenant 8 jj. g par ml de BET (bromure d'éthidium), molécule qui fluoresce lorsqu'elle est intercalée dans l'ADN. Grâce à la fluorescence, on peut mesurer l'accessibilité de 1'ADN par le BET. Note : pour simplifier le calcul du rapport de charge +/-des complexes, on a considéré que les Histidines étaient chargées positivement. Comme le montre la figure 3, le pourcentage de fluorescence diminue au fur et à mesure de l'ajout de LAH4 ou de KH-INF7, ce qui témoigne de l'efficacité de la condensation de l'ADN par ces deux peptides. 5-Méthode générale de transfection des cellules a) Culture cellulaire Toutes les cellules qui ont été utilisées dans les expériences suivantes sont adhérentes. Les cellules sont maintenues en culture dans du milieu DMEM complémenté avec 10 % de sérum de veau foetal, 100 glm1 de streptomycine et 100 U/ml de pénicilline (excepté les cellules CHQ5B cultivées dans du milieu Ham F-10 20 % sérum). Les cellules sont incubées à 37 C dans une atmosphère humide contenant 5 % de C02. Pour la transfection, les cellules sont ensemencées à 150 000-300 000 cellules par puits (pour des plaques 24 puits) en fonction de la lignée utilisée, un à deux jours avant la transfection. b) Préparation des complexes Ces expériences sont réalisées en duplicats. Pour des plaques 24 puits, la molécule à tester est diluée dans du NaCl150 mM de façon à obtenir un volume de solution de 100 j.. t1. Puis 100 gel d'une solution saline à 150 mM contenant 4 zu de plasmide CMV-Luc lui sont ajoutés. CMV-Luc correspond à l'abréviation SMD2-LucAITR (7,6 kB) désignant un gène rapporteur exprimant la luciférase sous le contrôle d'un promoteur du cytomégalovirus humain (CMV). Après 20 minutes de complexation, la solution est complétée à 1 ml par du milieu DMEM ne contenant pas de sérum. Lorsque la transfection est effectuée en présence de drogues (bafilomycine Al, MG132) ou de sérum, on ajoute ces composés au milieu de transfection. On ajoute ensuite 0,5 ml par puits de milieu de transfection. Un protocole identique est utilisé lorsque les expériences sont réalisées dans des plaques 48 puits, sauf que la quantité de CMV-Luc utilisé par duplicat est de 3 ou de 2 u. g. c) Transfection et mesure de l'activité luciférase Les puits contenant les cellules sont vidés et la solution contenant les complexes est répartie dans deux puits (duplicats) pour une durée de 2 h 30-4 h à 37 C. Le contenu des puits est ensuite remplacé par un 1 ml de milieu contenant 10 % de sérum de veau foetal. Le test luciférase (permettant d'évaluer l'efficacité du transfert de gènes) est effectué 30 à 48 heures après transfection (il s'agit d'une réaction de chimio-luminescence : le test repose sur l'oxydation de la luciférine par la luciférase avec production concomitante d'un photon). Test luciférase : après élimination du milieu, 250 jl de tampon de lyse (8 mM MgC12, 1 mM dithiothréitol, 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 15 % glycérol et 25 mM Tris-phosphate pH 7,8) sont ajoutés dans chaque puits. Au bout de 5 minutes d'attente, la plaque est vortexée, puis les lysats sont resuspendus et centrifugés pendant 3 minutes à 10 000 rpm, afin d'éliminer les débris cellulaires. 50 fl de surnageant sont alors déposés dans une plaque opaque de lecture. Lors de la mesure (qui s'effectue sur 10 secondes), 100 1 de tampon d'essai (même tampon que le tampon de lyse excepté qu'il n'y a pas de Triton X-100 mais 2 mM d'ATP) et 100 u. l de luciférase (167 gM) sont injectés successivement dans chaque puits. Le bruit de fond est ensuite déduit de chaque valeur obtenue et l'efficacité de transfection est exprimée en unités lumière/10 secondes/puits. 6 - Efficacité de transfection des peptides LAH4 et KH-INF7 sur des 293 (cellules de rein embryonnaire humain) La figure 4 montre que les deux peptides se comportent de manière tout à fait comparable sur la lignée 293, à savoir qu'avec 11, 25 1g de peptide pour 3 lug d'ADN, l'efficacité de tranfection est déjà très élevée (les cellules non transfectées ont une activité luciférase équivalente à 0 unité lumière). A partir de 15 ig de peptide pour 3 1g de CMV-Luc, le pic d'activité est pratiquement atteint et ce niveau d'activité est conservé même lorsqu'on augmente la quantité de peptide (au moins jusqu'à 26,25 ug). 7-Efficacité de transfection de LAH4 et KH-INF7 sur HeLa (cellules dérivant d'un carcinone du cervix humain) et NIH 3T3 (fibroblastes murins) La figure 5 montre que les deux peptides sont capables de transfecter efficacement les cellules HeLa et NIH 3T3. 8-Efficacité de transfection de LAH4 sur HepG2 (hépatocarcinome humain), Rbl (cellules de muscle lisse d'aorte de lapin) et CHQ5B (myoblastes primaires humains) On effectue la même expérience que précédemment, étant rappelé que la mesure de l'activité luciférase est effectuée : - 31 heures après transfection concernant Hep G2, - 43 heures après transfection concernant Rb 1, et 46 heures après transfection concernant CHQ5B. La figure 6 montre que l'utilisation du peptide LAH4 permet une expression significative de la luciférase sur les 3 types cellulaires testés, y compris sur les myoblastes primaires humains. 9-Efficacité de transfection de LAH4, LAH4-L3, LAH4-L4 et LAH5 sur HepG2 La figure 7 montre l'efficacité de la transfection des peptides LAH4, LAH4L3, LAH5 et LAH4-L4. L'activité transfectrice des quatre peptides, très élevée sur les HepG2, est à peu près comparable. On peut cependant noter que LAH4-L3 est légèrement meilleur que LAH4, qui lui-même est un peu meilleur que LAH4-L4. 10-Etude comparative de l'efficacité de transfection de LAK4, LAK5X2 et LAK5X2W2 par rapport à LAH4 sur des cellules 293 Dans cette expérience, on teste des peptides similaires à LAH4, mais dans lesquels les histidines sont remplacés par les lysines. Ces peptides ont les séquences suivantes : LAK4 : KKLAKALAKALAKALKLALALAKK LAK5X2 : KKALLALAXKKLAKLAKKXALALKKA LAK5X2W2 : KKALLALAXKKWAKLWKKXALALKKA avec X = acide amino-isobutyrique On mesure l'activité luciférase 42 heures après la transfection. Les résultats sont représentés sur la figure 8, laquelle montre une bien meilleure efficacité du peptide de l'invention LAH4 au regard des autres peptides, dans lesquels les résidus histidine ont été remplacés par des résidus lysine. 11-Effet du MG132, de la bafilomycine Al et du sérum FCS (foetal calf serum) sur l'efficacité de transfection des peptides LAH4 et KH-INF7 On mélange 24 Jlg de LAH4 ou de KH-INF7 avec 4 Jlg d'un gène rapporteur CMV-Luc. On laisse incuber ensuite ces complexes avec des cellules en présence de : -soit 8, uM de MG132 (inhibiteur de protéasome) ; - soit 180 nanomolaire de bafilomycine Al ; - soit 5 % de sérum (FCS). L'incubation est effectuée sur des cellules HepG2. On mesure l'activité luciférase 29 heures après la transfection. Les résultats sont représentés sur la figure 9. L'efficacité de transfection des peptides LAH4 et KH-INF7 est diminuée de manière significative en présence d'un inhibiteur des pompes à proton (bafilomycine Al), suggérant par là que l'acidification des vésicules d'endocytose joue un rôle dans l'efficacité de libération de l'ADN CMV-Luc des endosomes. La figure 9 montre également qu'il est possible d'améliorer légèrement l'efficacité de transfection des deux peptides lorsqu'un inhibiteur du protéasome (MG 132) est présent en même temps que s'effectue la transfection. Ceci suggère qu'une partie des complexes transfectants peut être la cible du protéasome. Les résultats montrent également que la présence de 5 % de sérum n'altère pas de manière significative l'efficacité de transfection des deux peptides. 12-Influence de la nature du milieu transfectant sur l'activité de transfection des peptides LAH4 L'objectif de cette expérience est de montrer que quelle que soit la nature du milieu de complexation, l'efficacité de transfection reste identique. Dans cet exemple, on remplit une plaque 48 puits de cellules HepG2 deux jours avant la transfection. On prépare des complexes associant 12 g de LAH4 mélangé avec 2 g de CMV-Luc dans différentes solutions (NaCl 150 mM, eau, glucose 5 %, tampon citrate, PBS et optiMEM, qui est un milieu de culture spécial commercialisé par Gibco-BRL). On laisse incuber les complexes 3 heures dans les cellules en l'absence de sérum. On mesure l'activité luciférase 44 heures après la transfection. Les résultats sont représentés sur la figure 10 et montrent que l'efficacité de transfection de LAH4 reste identique quel que soit le milieu de préparation des complexes LAH4/ADN, qui a été utilisé. 13-Efficacité de transfection de LAH4 en fonction de la quantité de CMV-Luc utilisée 95 000 cellules HepG2/puits (plaque 48 puits) ont été ensemencés la veille de la transfection. Les complexes 12 g LAH4/2 g CMV-Luc ont été préparés comme décrit précédemment. Pour vérifier l'importance de la quantité de complexes sur l'efficacité de transfection, les conditions suivantes ont été testées : - 6 g LAH4/1 g CMV-Luc - 3 fig LAH4/0, 5 ug CMV-Luc mg LAH4/0, 25 ug CMV-Luc - 0, 75 ug LAH4/0, mg CMV-Luc D'autres conditions ont cependant été testées afin de déterminer si un excès de peptide est capable de compenser la diminution de la quantité de CMV-Luc. Pour cela, la quantité d'ADN a été gardée constante (0, 125 jg/duplicat) et les quantités de peptide augmentées. Les résultats (figure 11) montrent que l'efficacité de transfection de LAH4 baisse de manière très importante lorsque la quantité de CMV-Luc passe de 2 à 0, 125 ig (en conservant le rapport peptide/ADN poids par poids constant, en l'occurrence égal à 6). Cependant, il est possible d'améliorer très significativement l'efficacité de LAH4 dans ces conditions sub-optimales en augmentant la quantité de peptide utilisé (optimum dans cet exemple avec un rapport poids/poids = 24). 14-Efficacité de la transfection de KH-INF7-RGD par rapport à KHINF7 seul On ensemence une plaque 48 puits de cellules HeLa. On mélange des quantités croissantes de KH-INF7 ou de KH-INF7 présentant un ligand de ciblage (RGD), (séquence peptide : KH-INF7-GYGGRGDTP) avec une quantité constante de CMV-Luc (3 lug). On laisse incuber le complexe dans les cellules pendant 3 heures en l'absence de sérum. On mesure l'activité luciférase environ 30 heures après la transfection. La figure 12 montre que l'efficacité de transfection de KH-INF7 augmente en présence de ligand de ciblage. Il est à souligner que les cellules HeLa présentent le récepteur membranaire capable de reconnaître le motif peptidique RGD. 15-Efficacité d'intégration du plasmide après transfert de gènes par LAH4 sur des cellules Hep G2 On ensemence une plaque 6 puits avec des cellules HepG2 deux jours avant la transfection. On mélange ensuite 54 jug de LAH4 avec 9 jj. g d'un gène rapporteur pCiNeo-Luc (3 gag) et la transfection est réalisée en triplicats. On laisse incuber le complexe obtenu avec les cellules pendant 3 heures 30 en l'absence de sérum. L'un des puits est utilisé pour étudier l'efficacité de la transfection par mesure de l'activité luciférase, tandis que deux autres puits sont utilisés pour étudier l'efficacité de l'intégration. Pour ce faire, on ajoute 1 mg/ml du principe actif G418 par puits. 19 jours plus tard, on lave les cellules avec du PBS et on les colore avec une solution de crystal violet. Le G-418 (ou Geneticin) est un aminoglycoside qui est employé comme agent de sélection dans des expériences de transfection. Cette molécule est toxique pour les cellules lorsque celles-ci n'expriment pas le gène de résistance. Dans cette expérience, le plasmide utilisé est porteur d'un tel gène, de sorte qu'il confère une résistance aux cellules ayant été transfectées avec succès. Le fait de laisser se poursuivre l'expérience sur 19 jours permet de mesurer l'efficacité de transfection dite stable , c'est-à-dire qu'on mesure l'évènement intégration du plasmide dans le génome de la cellule. Sur la figure 13, on a représenté les cellules non transfectées sur la gauche et les cellules transfectées sur la droite. Comme le montre cette figure, toutes les cellules contrôles (c'est-à-dire non transfectées) sont mortes à l'issue de l'expérience. En revanche, on peut noter qu'un nombre important de cellules transfectées par LAH4 ont pu survivre, indiquant que la transfection par LAH4 a permis dans un certain nombre de cas l'intégration du plasmide délivré dans le génome. 16 - Activité hémolytique de LAH4 et KH-INF7 à pH 7 et 5 avec ou sans ADN plasmidique Des érythrocytes fraîchement préparés sont lavés et resuspendus dans un tampon d'essai ayant le pH désiré (11 mM de sodium de citrate dans du tampon HBS pH 7,3 ou 200 mM de sodium citrate pH 5) à une concentration de 108/ml. Un aliquot de 75 kl est ajouté par puits dans une plaque 96 puits contenant déjà 75 u. l d'une dilution en série d'une solution de tampon essai avec du peptide ADN (rangées B à G de la plaque). La plaque est ensuite agitée pendant 1 h à 37 C. Après avoir éliminé les érythrocytes non lysés par centrifugation, 100 ul du surnageant sont transférés dans une nouvelle plaque de microtitration (96 puits) et la densité optique est mesurée à 450 nm (permet de déterminer la quantité d'hémoglobine présente dans le surnageant). Le 100 % de lyse est obtenu en ajoutant 1 gl de Triton X-100 à 10 % dans la rangée A avant centrifugation. Comme le montre la figure 14, l'activité hémolytique des vecteurs peptidiques de l'invention est très faible, puisqu'elle est inférieure à 15 %, quelle que soit la condition testée. 17-Efficacité de transfection du peptide KALA, LAH4 et C2KH-INF7 sur HepG2, Hela et 293 Des quantités croissantes de peptide (KALA, LAH4 et C2KH-INF7) ont été mélangées à une quantité constante de CMV-Luc (2 ug/duplicat). Les transfections, réalisées sur plaques 48 puits, ont été stoppées après environ 30 heures. Les résultats montrent que les peptides LAH4 et C2KH-INF7 ont une efficacité de transfection nettement supérieure à celle du peptide KALA, et ce, sur les trois lignées utilisées. REVENDICATIONS 1/Vecteur peptidique amphipatique cationique présentant une charge absolue supérieure ou égale à 2, à pH à 7,4, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une partie hydrophile comprenant au moins trois résidus aptes à se protoner à pH inférieur à 7,4. 2/Vecteur peptidique selon la revendication 1, caractérisé en ce que les résidus sont des groupements imidazole d'histidine. 3/Vecteur peptidique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente une partie hydrophile contenant quatre résidus capables de se protoner à pH inférieur à 7,4. 4/Vecteur selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés correspondant à la SEQ ID NO 1. 5/Vecteur selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés et correspondant à la SEQ ID NO 2. 6/Vecteur selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés et correspondant à la SEQ ID NO 3. 7/Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente une partie hydrophile contenant cinq résidus capables de se protoner à pH inférieur à 7,4. 8/Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés et correspondant à la SEQ ID NO 4. 9/Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés et correspondant à la SEQ ID NO 5. 10/Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés et correspondant à la SEQ ID NO 6. 11/Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés et correspondant à la SEQ ID NO 7. 12/Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est associé à un composé choisi dans le groupe comprenant les ligands de ciblage, les peptides fusiogéniques, les lipides, les polymères, les peptides de localisation nucléaire, les résidus polyéthylène glycol, pris seuls ou en combinaison. 13/Complexe de transfert d'une substance anionique, caractérisé en ce qu'il comprend l'association du vecteur peptidique objet de l'une des revendications 1 à 11 avec une substance anionique. 14/Complexe selon la revendication 13, caractérisé en ce que la substance anionique est un acide nucléique. 15/Procédé de fabrication du complexe objet de l'une des revendications 13 à 14, caractérisé en ce que l'on mélange le vecteur peptidique objet de l'une des revendications 1 à 11 avec une substance anionique. 16/Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un complexe objet de l'une des revendications 13 ou 14. 17/Utilisation du complexe objet de l'une des revendications 13 ou 14 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement du corps humain ou animal. 18/Cellule transfectée par un complexe objet de l'une des revendication 13 à 14 ou par une composition pharmaceutique objet de la revendication 16. DEPOSANTS : GENETHON III MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FOERDERUNG DER WISSENSCHAFTEN e. V. MANDATAIRE : Cabinet LAURENT et CHARRAS