Brevet FR2826361A1 — publié le 20021227

L'objet de la présente invention concerne l'amélioration de la culture de végétaux ou de leurs constituants : cellules, tissus ou organes, par l'utilisation de nouveaux milieux de culture qui augmentent notablement leur vitesse de croissance tout en renforçant leur vigueur. L'invention concerne principalement l'amélioration de la culture in vitro de cellules, tissus ou organes végétaux, mais l'invention peut être étendue à d'autres domaines de la production de végétaux. Les techniques susceptibles de bénéficier des avantages procurés par la présente invention concernent notamment : 'la culture hors-sol des végétaux, * la culture de cellules, tissus et organes végétaux en vue de la production de métabolites secondaires, 'la biotransformation de molécules d'intérêt par culture cellulaire végétale, . la culture de méristèmes et d'explants végétaux, w la néoformation de plantes à partir de cals, * l'androgenèse et la gynogenèse et la création de plantes haploïdes, . la culture de protoplastes et l'hybridation somatique, . l'embryogenèse somatique, * le génie génétique des plantes. Ces techniques sont utilisées industriellement pour : * la propagation en masse des végétaux, . la sélection variétale, 'la production de molécules d'intérêt pour la pharmacie, la diététique, la cosmétique et la chimie fine, * la création de plantes génétiquement transformées destinées à l'agriculture ou à la production de molécules d'intérêt, notamment en thérapeutique : hormones, anticorps. Les techniques décrites ci-dessus sont susceptibles d'utiliser la culture in vitro , soit dans les phases initiales de développement du végétal, soit dans la totalité du cycle de production Les milieux de culture les plus utilisés en culture in vitro sont le milieu de Murashige et Skoog, le milieu B5 de Gamborg et le Woody Plant Medium de McCown. L'apport en azote et en phosphore de ces différents milieux est constitué de sels minéraux, notamment nitrates de potassium ou de calcium, sels ammoniacaux, phosphates de sodium ou de potassium. A titre d'illustration, la composition en macroéléments du milieu B5 de Gamborg figure sur le tableau 1 : Tableau 1 Composition du milieu B5 de Gamborg (mg/l) KN03 2500,00 (NH4) 2S04 134,00 CaC12 113,24 MgS04 122, 09 NaH2PO4 130,50 11 existe de nombreuses variantes de ces milieux qui dînèrent davantage par leurs concentrations relatives que par la nature des sels minéraux utilisés. Sur ces milieux, la croissance des explants végétaux est relativement lente et peut se révéler très difficile dans le cas de certains végétaux ligneux, par exemple lors de la culture de cellules, du fait du relargage dans le milieu de culture de composés phénoliques qui provoquent la nécrose des cellules et qui peuvent entraîner la perte de la culture. Il a été découvert et c'est l'objet de la présente invention que la croissance et la vigueur de végétaux, de cellules, de tissus et d'organes végétaux en culture pouvaient être fortement améliorées par l'utilisation de milieux de culture dans lesquels sont incorporés conjointement : 'une source d'azote organique, et 'une source de phosphore sous forme d'un ou plusieurs esters phosphoriques acides et/ou de leurs sels alcalins et/ou alcalino-terreux. L'invention concerne donc un milieu de culture convenant notamment à la culture de végétaux et de cellules, tissus et organes végétaux, ledit milieu renfermant des éléments nécessaires à la croissance desdits végétaux et cellules, tissus et organes végétaux, y inclus une source d'azote et une source de phosphore, caractérisé en ce que ledit milieu renferme conjointement une source d'azote d'origine organique et une source de phosphore organique, cette dernière étant sous forme d'un ou plusieurs esters phosphoriques acides et/ou de leurs sels alcalins et/ou alcalino-terreux. En effet, il a été découvert que la présence simultanée dans les milieux de culture d'azote sous forme organique et de phosphore sous forme d'un ou plusieurs esters phosphoriques acides et/ou de leurs sels alcalins et/ou alcalino-terreux conduit à une augmentation considérable et inattendue de la production de biomasse. Les combinaisons de composés azotés et de composés phosphorés selon l'invention peuvent constituer la totalité de l'apport d'azote et de phosphore des milieux de culture ou bien elles peuvent être utilisées comme additifs à des milieux de culture classiques renfermant notamment de l'azote et/ou du phosphore sous forme de sels minéraux. Les compositions azotées préférées selon l'invention sont les protéines animales ou végétales, les hydrolysats de protéines, les peptones, les peptides, les mélanges d'acides aminés. Les mélanges d'acides aminés sont les préférés selon l'invention car la souplesse de leur formulation permet de les adapter aux espèces en culture et à la technique utilisée. Le milieu de culture peut, par exemple être fortement enrichi en acides aminés impliqués dans la biosynthèse de composés azotés tels que les alcaloïdes. Le soufre peut également être introduit sous forme organique avec la composition azotée, sa concentration pouvant être ajustée par celle des acides aminés soufrés : cystine et méthionine par exemple, présents ou introduits dans la composition azotée. Par ester phosphorique acide on entend en particulier un ester partiel d'un acide phosphorique polyvalent quelconque avec un alcool et/ou un polyol aliphatique et/ou cycloaliphatique et/ou un phénol et/ou un aminoalcool et/ou un ester carboxylique partiel de polyol aliphatique et/ou cycloaliphatique, la ou les fonctions acides restantes pouvant être salifiées à l'aide d'un métal alcalin ou alcalino-terreux. On préfère les esters partiels d'acide orthophosphorique. Les compositions phosphorées préférées selon l'invention sont les esters phosphoriques acides tels que les acides glycérophosphoriques zu et , les acides phosphatidiques, l'acide phytique (C6H18024P6). L'acide phytique est le composé préféré selon l'invention. Outre l'apport de phosphore, il peut permettre, de par ses acidités fortes, d'introduire simultanément dans le milieu de culture le potassium, le calcium et le magnésium. L'hydrolyse partielle des esters phosphoriques peut en outre conduire à des composés activant le cycle cellulaire. Un autre avantage de l'invention est de rendre possible de fortes concentrations de phosphore dans les milieux, contrairement aux milieux classiques, limités par la toxicité des phosphates minéraux. Ainsi, dans les milieux selon l'invention, le phosphore peut atteindre des concentrations trente fois plus élevées que dans les milieux classiques sans aucun dommage pour les explants végétaux ou les cellules végétales. Les concentrations d'azote d'origine organique dans les milieux selon l'invention peuvent varier par exemple entre 30 et 4000 milligrammes par litre, les concentrations préférées se situant entre 75 et 1500 milligrammes par litre. Les concentrations en phosphore provenant d'esters phosphoriques acides et/ou de leurs sels alcalins et/ou alcalino-terreux dans les milieux selon l'invention peuvent varier par exemple entre 20 et 1500 milligrammes par litre, les concentrations préférées se situant entre 50 et 1000 milligrammes par litre, étant entendu que, pour obtenir un résultat optimal, les concentrations en azote et en phosphore selon l'invention doivent être adaptées à l'espèce cultivée et à la technique de culture utilisée. Des essais préalables simples permettent de déterminer les concentrations optimales d'azote et de phosphore. Pour un résultat optimal, les milieux de culture pourront renfermer de 5 à 100 % en masse d'azote d'origine organique (0 à 95 % d'azote d'origine minérale) et de 5 à 100% en masse de phosphore sous forme d'ester (s) phosphorique (s) acide (s) et/ou leurs sels alcalins et/ou alcalino-terreux (0 à 95 % de phosphore d'origine minérale). On utilise de préférence des milieux de culture renfermant de 50 à 100 % en masse d'azote d'origine organique (0 à 50 % en masse d'azote d'origine minérale) et de 50 à 100% en masse de phosphore sous forme d'ester (s) phosphorique (s) acide (s) et/ou leurs sels alcalins et/ou alcalino-terreux (0 à 50 % en masse de phosphore d'origine minérale). L'emploi des compositions azotées et phosphorées selon l'invention s'accompagne d'une accélération de la multiplication cellulaire et de la disparition, dans les cultures difficiles, des signaux de stress et de la nécrose de tissus. De façon inattendue, dans les nouveaux milieux de culture selon l'invention, le comportement des cellules végétales tend à ressembler à celui des bactéries et des champignons inférieurs, ce qui ouvre de nouvelles perspectives d'applications industrielles, qu'il s'agisse de cellules normales ou génétiquement transformées. Ainsi l'augmentation de la croissance cellulaire permet d'envisager une réduction importante des coûts de fabrication en bioréacteurs de molécules d'intérêt pharmaceutique, diététique, cosmétique ou de chimie fine, tout en assurant le confinement des productions, particulièrement intéressant dans le cas des espèces génétiquement transformées. La mise en culture d'explants végétaux ou de cellules végétales peut demander une période d'adaptation, et plusieurs passages sur les milieux selon l'invention sont parfois nécessaires pour atteindre l'effet maximal. Les milieux de culture selon l'invention comportent les sucres, les oligoéléments, les vitamines, les facteurs de croissance et autres adjuvants utilisés dans les milieux classiques. Les milieux de culture selon l'invention sont préparés : soit par mélange d'un ou plusieurs esters phosphoriques acides avec le (les) composé (s) azoté (s), éventuellement suivi d'une neutralisation avec des bases et/ou des sels alcalins et/ou alcalino-terreux, soit par la neutralisation d'un ou plusieurs esters phosphoriques acides par des bases et/ou des sels alcalins et/ou alcalino-terreux, suivie du mélange avec le (les) composé (s) azoté (s). Les exemples suivants, donnée à titre d'illustration, ne doivent pas être considérés comme limitatifs de l'invention. Exemple 1 : Préparation du milieu de culture selon l'invention de l'exemple 3 Dans une solution renfermant 6,42 g d'un hydrolysat de caséine contenant 13,1 % en masse d'azote organique total, dont 6,5 % en masse d'azote aminé, on introduit 9,65 g d'une solution d'acide phytique à 34,0 % en masse, correspondant à 924 mg de phosphore, puis successivement 88 mg d'hydroxyde de magnésium, 300 mg de carbonate de calcium et 20,05 ml d'une solution normale d'hydroxyde de potassium. Le volume de cette solution est dilué à 900 ml pour constituer la source de macro-éléments du milieu selon l'invention, volume qui sera porté à 1 litre après addition des autres constituants du milieu. Exemple 2 : Préparation de phytate mixte de potassium, calcium et magnésium. Dans 9,57 grammes de la solution d'acide phytique à 34,0 % en masse décrite à l'exemple 1 sont introduits successivement 102,1 mg de carbonate de calcium, 58,9 mg d'hydroxyde de magnésium et 24,7 ml d'une solution normale d'hydroxyde de potassium.. Ce mélange porté à 100 ml est une solution mère à diluer 10 fois pour constituer l'apport en P, K, Ca, et Mg du milieu de culture. Exemple 3 : Culture de cellules de Nicotiana tabacum. (essais comparatifs) Essai nO 1 : des cellules de Nicotiana tabacum sont cultivées sur le milieu de Murashige et Skoog (Murashige et Skoog 1962 Physiol. Plant. 15 : 473-497) contenant 20 g de glucose et 1 mg d'acide 2, 4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D) par litre, gélifié par 9 g/litre d'agar. Les cultures sont placées dans un incubateur à 241 C, avec une photopériode de 16 heures. La souche est entretenue par des repiquages réguliers toutes les 3 à 4 semaines. Essai n 2 : des cellules de la même souche sont cultivées et régulièrement repiquées sur un milieu contenant les mêmes quantités de glucose, d'oligoéléments, de vitamines, de 2,4-D et d'agar que le milieu précédent, les macro-éléments étant apportés ici par la préparation de l'exemple 1, de telle sorte que les concentrations en azote, en potassium, en calcium et en magnésium soient identiques à celles de l'essai n'l, le volwne final de milieu étant porté à 1 litre. La concentration en phosphore dans l'essai n l est de 38, 8 mg par litre et de 924 mg par litre dans l'essai n 2. Dans les mêmes conditions de culture et de repiquage que celles décrites ci-dessus pour l'essai n l, on observe dans l'essai n 2, pour obtenir la même quantité de biomasse : 'que la croissance dans les premiers repiquages est plus lente que sur le milieu de Murashige et Skoog du premier essai, * qu'après 3 à 4 repiquages aux mêmes intervalles, la vitesse de croissance s'accélère progressivement. La biomasse produite alors en 8 à 10 jours devient égale à celle produite sur le milieu MS en 3 à 4 semaines. Exemple 4 Culture de cellules de Taxus baccata. ( essais comparatifs) Des cellules d'une même souche de Taxus baccata sont cultivées et régulièrement repiquées sur membrane flottante (membrane raft) toutes les 6 à 8 semaines. Les milieux utilisés sont les suivants : Milieu A : milieu de Gamborg B5 (Gamborg, Miller et Ojima 1968 Exp. Cell Res. 50 : 151-158) contenant en outre 30 g/1 de saccharose, 5 % (v/v) de lait de coco, 1 mg/litre d'acide naphtalèneacétique et 0,2 mg/1 de kinétine. Milieu B : de composition en macroéléments identique à celle du milieu A excepté que l'azote provient de 3,0 grammes de peptone de soja contenant 12,5 % en masse d'azote organique total dont 5,3 % en masse d'azote aminé, tandis que le phosphore, le potassium, le calcium et le magnésium proviennent de la préparation de phytate de l'exemple 2, les quantités de saccharose, de lait de coco, d'acide naphtalèneacétique et de kinétine étant identiques à celles du milieu A. Milieu C : de composition en macroéléments identique, à celle du milieu B excepté que l'azote organique provient d'un mélange de 2,8 grammes d'acides aminés dont la composition figure sur le tableau 2. Milieu D : mélange de 85 % en masse de milieu A et de 15 % en masse de milieu B. Milieu E : milieu de Gamborg modifié par ajout de 581 milligrammes de KH2P04 pour porter la concentration en phosphore minéral de ce milieu à 166 milligrammes par litre, identique à la concentration en phosphore organique du milieu D. Pour compenser l'augmentation de la teneur en potassium due à l'apport de KH2P04, la teneur en KN03 est ramenée à 2069 milligrammes, le déficit en azote de ce milieu par rapport au milieu B5 de Gamborg étant compensé par ajout de 171 milligrammes de (NH4) N03. A l'exception du phosphore, tous ces milieux ont la même composition en macroéléments, soit en milligrammes par litre, azote : 375, potassium : 967, calcium : 40,9, magnésium : 24,6. Les cultures sont placées dans un incubateur à 24 i-1 C à l'obscurité. Les teneurs en phosphore des différents milieux et les accroissements de biomasse après 60 jours de culture sont indiqués sur le tableau 3. Tableau 2 Composition en acides aminés de l'apport azoté du milieu C (% masse) Alanine 3, l Arginin 7,8 Acide aspartique 8,2 Cystine 2,0 Acide glutamique 20,7 Glycine 2,6 Histidine 2,3 Isoleucine 4,7 Leucine 7, 6 Lysine 6,7 Méthionine 2,3 Phénylalanine 8, 4 Proline 4,1 Sérine 5,5 Thréonine 3, 7 Tryptophane 1,4 Tyrosine 4, 0 Valine 4,9 Tableau 3 : Accroissement de la biomasse après 60 jours de culture sur membrane flottante. A B C D E Azote 100% 100% 100% 15% 100% minéral organique organique organique minéral 85% minéral Phosphore 100% 100% 100% 15% 100% minéral organique organique organique minéral 85% minéral Phosphore 33,8 916 916 166 166 (mg/l) Accroissement nécrose de la x 2, 7 x 10, 2 x 11, 4 x4, 8 de biomasse la culture REVENDICATIONS 1. Milieu de culture convenant notamment à la culture de végétaux et de cellules, tissus et organes végétaux, ledit milieu renfermant des éléments nécessaires à la croissance desdits végétaux et cellules, tissus et organes végétaux, y inclus une source d'azote et une source de phosphore, caractérisé en ce que ledit milieu renferme conjointement une source d'azote d'origine organique et une source de phosphore organique, cette dernière étant sous forme d'un ou plusieurs esters phosphoriques acides et/ou de leurs sels alcalins et/ou alcalino-terreux. 2. Milieu de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration en azote d'origine organique est de 30 à 4000 milligrammes par litre de milieu de culture et la concentration en phosphore sous forme desdits esters phosphoriques acides et/ou de leurs sels alcalins et/ou alcalino-terreux est de 20 à 1500 milligrammes par litre de milieu de culture. 3. Milieu de culture selon la revendication 2, caractérisé en ce que la concentration en azote d'origine organique est de 75 à 1500 milligrammes par litre et la concentration en phosphore sous forme desdits esters phosphoriques acides et/ou de leurs sels alcalins et/ou alcalino-terreux est de 50 à 1000 milligrammes par litre. 4. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le milieu renferme de 5 à 100% en masse d'azote d'origine organique et de 0 à 95% en masse d'azote d'origine minérale et de 5 à 100% en masse de phosphore sous forme desdits esters phosphoriques acides et/ou de leurs sels alcalins et/ou alcalino-terreux et de 0 à 95% en masse de phosphore d'origine minérale. 5. Milieu de culture selon la revendication 4, caractérisé en ce que le milieu renferme de 50 à 100 % en masse d'azote d'origine organique et de 0 à 50 % en masse d'azote d'origine minérale et de 50 à 100 % en masse de phosphore sous forme desdits esters phosphoriques acides et/ou de leurs sels alcalins et/ou alcalino-terreux et de 0 à 50 % en masse de phosphore d'origine minérale. 6. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la totalité de l'azote est d'origine organique. 7. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la totalité du phosphore est sous forme desdits esters phosphoriques acides et/ou de leurs sels alcalins et/ou alcalino-terreux. 8. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le phosphore d'origine organique est sous forme d'un ou plusieurs esters orthophosphoriques acides et/ou de leurs sels alcalins et/ou alcalino-terreux. 9. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le phosphore d'origine organique est sous forme d'acide glycérophosphorique, d'acide phosphatidique et/ou d'acide phytique et/ou sous forme de leurs sels alcalins et/ou alcalino-terreux. 10. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'azote d'origine organique est sous forme de protéines animales ou végétales, d'hydrolysats de protéines, de peptones, de peptides et/ou de mélanges d'acides aminés. 11. Utilisation d'un milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 pour cultiver des végétaux et/ou des cellules, tissus et organes végétaux, en particulier ceux de l'espèce Taxus.