Brevet FR2822831A1 — publié le 20021004

NOUVELLE PROTEINE D'ANCRAGE DES CHOLINESTERASES, ACIDES NUCLEIQUES CORRESPONDANTS ET LEUR APPLICATION A LA PREPARATION DE MEDICAMENTS L'invention concerne une nouvelle protéine d'ancrage des cholinestérases et les acides nucléiques correspondants. L'invention concerne également leur application à la préparation de médicaments. L'acétylcholinestérase est une enzyme qui permet efficacement l'hydrolyse du neurotransmetteur acétylcholine et qui contrôle ainsi le niveau et la durée de stimulation de différents récepteurs de l'acétylcholine. Cette fonction est confirmée en particulier par l'observation des nombreuses conséquences de la modulation de l'activité de l'AChE. Ainsi, l'inhibition de l'AChE provoque des effets drastiques, allant de la nécrose locale des jonctions neuromusculaires à la paralysie respiratoire et la mort. D'autre part, de nombreux traitements pour des pathologies telles que la myasthenia gravis ou la maladie d'Alzheimer ciblent l'activité de l'AChE par la prescription d'inhibiteurs de l'AChE. La butyrylcholinestérase (BChE) est une autre cholinestérase qui est fortement exprimée dans les muscles. L'absence totale de la BChE n'est pas dommageable à l'homme. Cependant, on sait que la BChE participe à l'hydrolyse de l'acétylcholine dans les muscles et dans le cerveau. Dans le cerveau des mammifères, l'AChE existe principalement sous trois formes moléculaires : monomères, dimères et tétramères. Cette enzyme est intégrée dans les structures cellulaires, par exemple au niveau des synapses cholinergiques, grâce à son association avec des protéines d'ancrage. On connaît déjà l'existence d'une protéine d'ancrage, à savoir le collagène ColQ, dont l'association avec l'AChE produit les formes asymétriques localisées dans les lames basales des jonctions neuromusculaires, où ces formes asymétriques jouent un rôle physiologique prépondérant. Les monomères et les dimères de l'AChE sont essentiellement intracellulaires et représentent les précurseurs des tétramères. Ces tétramères sont ancrés à la surface des neurones par leur association avec une protéine hydrophobe spécifique et représentent la forme mature et physiologiquement active de l'AChE du cerveau. En effet, il est bien établi que la forme moléculaire principale de l'AChE dans le cerveau des mammifères adultes est un tétramère lié aux membranes cellulaires ; la proportion de cette forme augmente au cours du développement par rapport aux monomères et aux dimères, et atteint plus de 80% de l'activité totale chez l'adulte (Muller et al., 1985 ; Femandez et al., 1996). Par ailleurs, cette forme moléculaire existe aussi dans les muscles, où elle semble jouer un rôle spécifique, encore mal compris : en effet, l'exercice musculaire contrôle spécifiquement le niveau de cette forme d'enzyme dans les muscles rapides sans affecter notablement les autres formes moléculaires, y compris les formes asymétriques (Gisiger et al., 1994). Par ailleurs, bien que l'existence d'une ancre membranaire soit connue depuis plusieurs années et que des fragments de séquences peptidiques aient déjà été déterminés, les tentatives précédentes de clonage pour identifier la séquence nucléotidique et protéique ont échoué essentiellement pour les trois raisons principales suivantes : a) cette protéine n'est pas exprimée de façon abondante, b) elle contient une région riche en prolines qui est très difficile à traverser pour la transcriptase inverse, c) plusieurs séquences peptidiques ont été déterminées, correspondant à deux protéines distinctes. L'inhibition de l'AChE est la base des thérapies utilisées pour le traitement de la myasthenia gravis et de la maladie d'Alzheimer, dans le but d'augmenter le taux d'acétylcholine, avec pour objectif le rétablissement de l'efficacité de la transmission cholinergique au niveau neuromusculaire dans le premier cas, au niveau du système nerveux central dans le deuxième cas. Ces thérapies utilisent des inhibiteurs qui agissent sans discrimination sur toutes les formes moléculaires de l'enzyme, avec comme seule limitation leur accessibilité, en particulier le passage de la barrière hémato-encéphalique en ce qui concerne le système nerveux central. On observe par ailleurs que la thérapie anti-cholinestérasique de la myasthenia gravis peut perdre son efficacité avec le temps, et que dans le cas de la maladie d'Alzheimer, une proportion très significative des patients (environ 20%) n'en tire aucun bénéfice (Giacobini, 2000). Actuellement, les traitements de la maladie d'Alzheimer sont uniquement des traitements symptomatiques et peuvent entraîner des effets secondaires indésirables. En ce qui concerne la myasthenia gravis, les traitements actuels sont également peu efficaces. L'invention a pour but de fournir une nouvelle protéine, isolée chez la souris et chez l'homme, et les séquences d'ADN et d'ARN correspondantes. L'invention a également pour but l'utilisation de cette protéine dans la mise en oeuvre d'un procédé de criblage de composés inhibiteurs de l'ancrage membranaire de l'AChE. L'invention a également pour but la mise au point de médicaments notamment destinés au traitement de la maladie d'Alzheimer, en inhibant l'ancrage membranaire de l'AChE. L'invention concerne une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par : - la séquence SEQ ID NO : 2 représentant la protéine d'origine humaine d'ancrage à la surface des membranes cellulaires des cholinestérases, notamment de l'acétylcholinestérase AChE ou de la butyrylcholinestérase BChE, - ou toute séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un fragment défini ci-dessous, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve qu'elle permette l'ancrage membranaire des cholinestérases, notamment de l'AChE ou de la BChE, - ou toute séquence homologue de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un fragment défini ci-dessous, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 70%, et notamment 85%, avec la séquence SEQ ID NO : 2, sous réserve qu'elle permette l'ancrage membranaire des cholinestérases, notamment de l'AChE ou de la BChE, - ou tout fragment d'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve qu'il permette l'ancrage membranaire des cholinestérases, notamment de l'AChE ou de la BChE, notamment tout fragment étant constitué d'au moins environ 6 acides aminés, notamment d'au moins environ 40 acides aminés contigus dans la séquence SEQ ID NO : 2. La séquence SEQ ID NO : 2 est une nouvelle protéine isolée chez l'homme, nommée PRiMA-h, et est représentée sur la Figure 1. Cette protéine est une protéine d'ancrage membranaire de l'AChE et elle permet également l'ancrage membranaire de la BChE. Cette protéine présente plusieurs domaines fonctionnels : - un peptide signal permettant à la protéine d'être engagée dans la voie sécrétoire, - un domaine extracellulaire contenant le domaine riche en prolines (PRAD), un site de N-glycosylation et deux sites potentiels de O-glycosylation, - un segment hydrophobe transmembranaire, - une région C-terminale cytoplasmique contenant deux sites potentiels de phosphorylation. Le domaine riche en prolines est notamment nécessaire pour former les tétramères d'AChE à partir de quatre molécules d'AChE. Le domaine transmembranaire permet notamment d'accrocher l'AChE à la surface des neurones. La région C-terminale joue probablement un rôle dans le positionnement précis de l'enzyme dans le système nerveux. Afin de vérifier que la protéine mentionnée ci-dessus permet l'ancrage membranaire d'une cholinestérase, on effectue notamment le test tel que décrit dans la partie Matériels et Méthodes, paragraphe F. Ce test permet de vérifier que la coexpression de la protéine PRIMA et de l'AChE ou de la BChE aboutit à la production de tétramères amphiphiles détectés par analyse de la sédimentation des formes moléculaires de cholinestérases en gradients de saccharose. Ce test permet également de vérifier qu'on peut détecter la présence d'AChE, par exemple par un marquage avec de la fasciculine, ou la présence de BChE, par exemple par un marquage avec des anticorps anti-BChE ou selon la méthode de Kamovsky (Kamovsky et al., 1964), à la surface des cellules coexprimant la protéine PRiMA et l'AChE ou la BChE. Selon un mode de réalisation avantageux, la protéine de l'invention est une protéine homologue de la séquence SEQ ID NO : 2 telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle correspond à la séquence SEQ ID NO : 4 représentant la protéine d'origine murine d'ancrage à la surface des membranes cellulaires des cholinestérases, notamment de l'AChE ou de la BChE. La séquence SEQ ID NO : 4 est une nouvelle protéine isolée chez la souris, nommée PRiMA-s, et est représentée sur la Figure 2. L'invention concerne des fragments de protéine caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi les suivants : - les fragments de la séquence SEQ ID NO : 2 représentés par les séquences SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18 et SEQ ID NO : 20, - les fragments de la séquence SEQ ID NO : 4 représentés par les séquences SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 34 et SEQ ID NO : 36, - le fragment de la protéine d'ancrage à la surface des membranes cellulaires de l'AChE de rat homologue de la séquence SEQ ID NO : 2, ledit fragment correspondant à la séquence SEQ ID NO : 37. La séquence SEQ ID NO : 6, représentée sur la Figure 3, est un fragment de la nouvelle protéine PRIMA humaine, délimité de l'acide aminé en position 36 à l'acide aminé en position 88, et correspond au domaine riche en prolines (PRAD) de la protéine humaine. La séquence SEQ ID NO : 8, représentée sur la Figure 4, est un fragment de la nouvelle protéine PRIMA humaine, délimité de l'acide aminé en position 89 à l'acide aminé en position 113, et correspond au segment hydrophobe transmembranaire de la protéine humaine. La séquence SEQ ID NO : 10, représentée sur la Figure 5, est un fragment de la nouvelle protéine PRIMA humaine, délimité de l'acide aminé en position 114 à l'acide aminé en position 153, et correspond au domaine cytoplasmique de la protéine humaine. La séquence SEQ ID NO : 12, représentée sur la Figure 6, est un fragment de la nouvelle protéine PRIMA humaine, délimité de l'acide aminé en position 36 à l'acide aminé en position 113, et correspond à l'ensemble formé par le domaine PRAD et le segment transmembranaire de la protéine humaine. La séquence SEQ ID NO : 14, représentée sur la Figure 7, est un fragment de la nouvelle protéine PRIMA humaine, délimité de l'acide aminé en position 89 à l'acide aminé en position 153, et correspond à l'ensemble formé par le segment transmembranaire et le domaine cytoplasmique de la protéine humaine. La séquence SEQ ID NO : 16, représentée sur la Figure 8, est un fragment de la nouvelle protéine PRIMA humaine, délimité de l'acide aminé en position 36 à l'acide aminé en position 153, et correspond à l'ensemble formé par le domaine PRAD, le segment transmembranaire et le domaine cytoplasmique de la protéine humaine. La séquence SEQ ID NO : 18, représentée sur la Figure 9, est un fragment de la nouvelle protéine PRIMA humaine, délimité de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 88, et correspond à l'ensemble formé par le peptide signal et le domaine PRAD de la protéine humaine. La séquence SEQ ID NO : 20, représentée sur la Figure 10, est un fragment de la nouvelle protéine PRIMA humaine, délimité de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 113, et correspond à l'ensemble formé par le peptide signal, le domaine PRAD et le segment transmembranaire de la protéine humaine. La séquence SEQ ID NO : 22, représentée sur la Figure 11, est un fragment de la nouvelle protéine PRIMA murine, délimité de l'acide aminé en position 36 à l'acide aminé en position 88, et correspond au domaine PRAD de la protéine murine. La séquence SEQ ID NO : 24, représentée sur la Figure 12, est un fragment de la nouvelle protéine PRiMA murine, délimité de l'acide aminé en position 89 à l'acide aminé en position 113, et correspond au segment hydrophobe transmembranaire de la protéine murine. La séquence SEQ ID NO : 26, représentée sur la Figure 13, est un fragment de la nouvelle protéine PRIMA murine, délimité de l'acide aminé en position 114 à l'acide aminé en position 153, et correspond au domaine cytoplasmique de la protéine murine. La séquence SEQ ID NO : 28, représentée sur la Figure 14, est un fragment de la nouvelle protéine PRIMA murine, délimité de l'acide aminé en position 36 à l'acide aminé en position 113, et correspond à l'ensemble formé par le domaine riche en prolines PRAD et le segment transmembranaire de la protéine murine. La séquence SEQ ID NO : 30, représentée sur la Figure 15, est un fragment de la nouvelle protéine PRIMA murine, délimité de l'acide aminé en position 89 à l'acide aminé en position 153, et correspond à l'ensemble formé par le segment transmembranaire et le domaine cytoplasmique de la protéine murine. La séquence SEQ ID NO : 32, représentée sur la Figure 16, est un fragment de la nouvelle protéine PRIMA murine, délimité de l'acide aminé en position 36 à l'acide aminé en position 153, et correspond à l'ensemble formé par le domaine PRAD, le segment transmembranaire et le domaine cytoplasmique de la protéine murine. La séquence SEQ ID NO : 34, représentée sur la Figure 17, est un fragment de la nouvelle protéine PRIMA murine, délimité de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 88, et correspond à l'ensemble formé par le peptide signal et le domaine PRAD de la protéine murine. La séquence SEQ ID NO : 36, représentée sur la Figure 18, est un fragment de la nouvelle protéine PRIMA murine, délimité de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 113, et correspond à l'ensemble formé par le peptide signal, le domaine PRAD et le segment transmembranaire de la protéine murine. La séquence SEQ ID NO : 37 est un fragment de la nouvelle protéine PRIMA de rat, délimité de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 35, et est représentée sur la Figure 19. L'invention concerne une séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie ci-dessus. En particulier, l'invention concerne une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par : - la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 codant pour SEQ ID NO : 2, - ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de la séquence SEQ ID NO : 1, et codant pour une protéine représentée par SEQ ID NO : 2, - ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de la séquence SEQ ID NO : 1 codant pour une protéine dérivée de SEQ ID NO : 2, telle que définie ci-dessus, - ou toute séquence nucléotidique homologue de SEQ ID NO : 1, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 70%, avec la séquence SEQ ID NO : 1 codant pour une protéine homologue de SEQ ID NO : 2, telle que définie ci-dessus, - ou tout fragment de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 ou des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 20 nucléotides contigus dans ladite séquence, - ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences ou fragments susmentionnés, - ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences ou d'un des fragments susmentionnés. La séquence SEQ ID NO : 1, représentée sur la Figure 1, est une nouvelle séquence d'acide nucléique, identifiée chez l'homme, codant pour la nouvelle protéine PRIMA humaine, représentée par la séquence SEQ ID NO : 2. L'expression"hybrider dans des conditions stringentes"correspond notamment à un tampon d'hybridation tel que"Expresshyb Hybridation solution" (Clontech), à une température d'hybridation supérieure ou égale à 42OC, ainsi qu'à un milieu de lavage tel que le tampon SSC 0, 1 X (15 mM NaCl ; 1, 5 mM citrate de sodium pH = 7) et à une température de lavage supérieure ou égale à 42OC. Un fragment d'acide nucléique avantageux est un fragment d'acide nucléique tel que défini ci-dessus, codant pour l'un des fragments de protéine ayant la séquence SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 36 et SEQ ID NO : 37. Ces fragments de protéine ont été définis précédemment et permettent de tenir compte de la dégénérescence du code génétique. Les fragments de protéine SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18 et SEQ ID NO : 20 sont des fragments de la nouvelle protéine humaine. Le fragment de protéine SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 34 et SEQ ID NO : 36 sont des fragments de la nouvelle protéine murine. Le fragment de protéine SEQ ID NO : 37 est un fragment de la nouvelle protéine de rat. L'invention concerne également des fragments d'acide nucléique choisis parmi les suivants : - les séquences SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 17, et SEQ ID NO : 19, codant respectivement pour les séquences SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18, et SEQ ID NO : 20, - les séquences SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 33, et SEQ ID NO : 35, codant respectivement pour les séquences SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 34, et SEQ ID NO : 36. La séquence SEQ ID NO : 5, représentée sur la Figure 3, délimitée du nucléotide en position (106) au nucléotide en position (264), est une séquence nucléotidique, identifiée chez l'homme, et codant pour le fragment de protéine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 6. La séquence SEQ ID NO : 7, représentée sur la Figure 4, délimitée du nucléotide en position (265) au nucléotide en position (339), est une séquence nucléotidique, identifiée chez l'homme, et codant pour le fragment de protéine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 8. La séquence SEQ ID NO : 9, représentée sur la Figure 5, délimitée du nucléotide en position (340) au nucléotide en position (459), est une séquence nucléotidique, identifiée chez l'homme, et codant pour le fragment de protéine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 10. La séquence SEQ ID NO : 11, représentée sur la Figure 6, délimitée du nucléotide en position (106) au nucléotide en position (339), est une séquence nucléotidique, identifiée chez l'homme, et codant pour le fragment de protéine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 12. La séquence SEQ ID NO : 13, représentée sur la Figure 7, délimitée du nucléotide en position (265) au nucléotide en position (459), est une séquence nucléotidique, identifiée chez l'homme, et codant pour le fragment de protéine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 14. La séquence SEQ ID NO : 15, représentée sur la Figure 8, délimitée du nucléotide en position (106) au nucléotide en position (459), est une séquence nucléotidique, identifiée chez l'homme, et codant pour le fragment de protéine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 16. La séquence SEQ ID NO : 17, représentée sur la Figure 9, délimitée du nucléotide en position (1) au nucléotide en position (264), est une séquence nucléotidique, identifiée chez l'homme, et codant pour le fragment de protéine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 18. La séquence SEQ ID NO : 19, représentée sur la Figure 10, délimitée du nucléotide en position (1) au nucléotide en position (339), est une séquence nucléotidique, identifiée chez l'homme, et codant pour le fragment de protéine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 20. La séquence SEQ ID NO : 21, représentée sur la Figure 11, délimitée du nucléotide en position (106) au nucléotide en position (264), est une séquence nucléotidique, identifiée chez la souris, et codant pour le fragment de protéine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 22. La séquence SEQ ID NO : 23, représentée sur la Figure 12, délimitée du nucléotide en position (265) au nucléotide en position (339), est une séquence nucléotidique, identifiée chez la souris, et codant pour le fragment de protéine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 24. La séquence SEQ ID NO : 25, représentée sur la Figure 13, délimitée du nucléotide en position (340) au nucléotide en position (459), est une séquence nucléotidique, identifiée chez la souris, et codant pour le fragment de protéine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 26. La séquence SEQ ID NO : 27, représentée sur la Figure 14, délimitée du nucléotide en position (106) au nucléotide en position (339), est une séquence nucléotidique, identifiée chez la souris, et codant pour le fragment de protéine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 28. La séquence SEQ ID NO : 29, représentée sur la Figure 15, délimitée du nucléotide en position (265) au nucléotide en position (459), est une séquence nucléotidique, identifiée chez la souris, et codant pour le fragment de protéine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 30. La séquence SEQ ID NO : 31, représentée sur la Figure 16, délimitée du nucléotide en position (106) au nucléotide en position (459), est une séquence nucléotidique, identifiée chez la souris, et codant pour le fragment de protéine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 32. La séquence SEQ ID NO : 33, représentée sur la Figure 17, délimitée du nucléotide en position (1) au nucléotide en position (264), est une séquence nucléotidique, identifiée chez la souris, et codant pour le fragment de protéine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 34. La séquence SEQ ID NO : 35, représentée sur la Figure 18, délimitée du nucléotide en position (1) au nucléotide en position (339), est une séquence nucléotidique, identifiée chez la souris, et codant pour le fragment de protéine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 36. Le tableau ci-dessous récapitule l'ensemble des protéines, fragments de protéine et les séquences nucléotidiques correspondantes, selon l'invention, et auxquels sont attribués des numéros de séquences. délimitation Séquence SEQ ID NO Protéine ou fragment de protéine correspondant en acides nucléotidique aminés correspondante 2 PRIMA entier homme 1-153 SEQ ID NO : 1 cu z 6 domaine PRAD seul homme 36-88 SEQ ID NO : 5 vu ë. 8 segment hydrophobe transmembranaire homme 89-113 SEQ ID NO : 7 36 peptide signal + PRAD + transmembranaire souris 1-113 SEQ ID NO : 35 37 fragment de PRiMA de rat 1-35 L'invention concerne également un vecteur recombinant, notamment plasmide, cosmide, phage ou ADN de virus, contenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus. Un vecteur avantageux de l'invention est un vecteur recombinant tel que défini cidessus, contenant les éléments nécessaires à l'expression dans une cellule hôte des polypeptides codés par les acides nucléiques tels que définis ci-dessus, insérés dans ledit vecteur. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le vecteur recombinant défini ci-dessus contient notamment un promoteur reconnu par l'ARN polymérase de la cellule hôte, en particulier un promoteur inductible et éventuellement une séquence de transcription, de terminaison, et éventuellement une séquence signal et/ou d'ancrage. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le vecteur recombinant, tel que défini ci-dessus, contient les éléments qui permettent l'expression d'une séquence nucléotidique, telle que définie ci-dessus, en tant que protéine mature ou protéine de fusion. L'invention concerne également une cellule hôte, choisie notamment parmi les bactéries, les virus, les levures, les champignons, les plantes ou les cellules de mammifères, ladite cellule hôte étant transformée, notamment à l'aide d'un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la cellule hôte telle que définie ci-dessus, contient les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus. L'invention concerne également le produit de l'expression d'un acide nucléique exprimé par une cellule hôte transformée, telle que définie ci-dessus. L'invention concerne également des oligonucléotides antisens ou ARN messager antisens dérivés des séquences nucléotidiques telles que définies ci-dessus. L'invention concerne un anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé de manière spécifique contre une protéine telle que définie ci-dessus. On ne se limite pas aux anticorps polyclonaux ; l'invention concerne également tout anticorps monoclonal produit par tout hybridome susceptible d'être formé selon les méthodes classiques à partir, d'une part, de cellules de rate d'animaux, en particulier de souris ou de rat, les cellules de l'animal étant immunisées contre la protéine de l'invention, et d'autre part, de cellules d'une lignée cellulaire de myélome, ledit hybridome étant susceptible d'être choisi selon la capacité de la lignée cellulaire à produire des anticorps monoclonaux reconnaissant la protéine utilisée au préalable pour l'immunisation des animaux. L'invention concerne une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un oligonucléotide antisens tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable. L'invention concerne également une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable. L'invention concerne également l'utilisation d'oligonucléotides antisens tels que définis ci-dessus, ou d'anticorps tels que définis ci-dessus, pour la préparation de médicaments destinés au traitement de pathologies liées à une diminution du taux de l'AChE dans l'organisme, notamment de maladies liées à la transmission cholinergique au niveau des cellules du système nerveux central, en particulier dans le cas de la maladie d'Alzheimer, ou au traitement de maladies liées à la transmission cholinergique au niveau neuromusculaire, notamment les myasthénies et plus particulièrement la myasthenia gravis. L'invention concerne également l'utilisation d'oligonucléotides antisens tels que définis ci-dessus, ou d'anticorps tels que définis ci-dessus, pour la préparation de médicaments destinés au traitement de pathologies liées à une diminution du taux de la butyrylcholinestérase dans l'organisme, notamment les pathologies liées à la transmission cholinergique, telles que la maladie d'Alzheimer ou les myasthénies. L'invention concerne l'utilisation de cellules sélectionnées parmi celles produisant l'AChE et une protéine telle que définie ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage de composés spécifiquement inhibiteurs de l'AChE telle que présente à la surface cellulaire, ou de composés inhibiteurs de l'ancrage membranaire de l'AChE, lesdits composés étant susceptibles de pouvoir être utilisés pour la préparation de médicaments destinés au traitement de pathologies telles que définies ci-dessus. L'invention concerne également l'utilisation de cellules sélectionnées parmi celles produisant la BChE et une protéine telle que définie ci-dessus, pour la mise en ceuvre d'un procédé de criblage de composés spécifiquement inhibiteurs de la BChE telle que présente à la surface cellulaire, ou de composés inhibiteurs de l'ancrage membranaire de la BChE, lesdits composés étant susceptibles de pouvoir être utilisés pour la préparation de médicaments destinés au traitement de pathologies telles que définies ci-dessus. L'invention concerne également l'utilisation telle que définie ci-dessus, de cellules choisies parmi : - celles dont le génome code sans transformation préalable pour l'AChE et une protéine telle que définie ci-dessus, - celles telles que définies ci-dessus, dont le génome code sans transformation préalable pour l'AChE, et ayant été transformées par une séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie ci-dessus, - celles dont le génome code sans transformation préalable pour une protéine telle que définie ci-dessus, et ayant été transformées par une séquence nucléotidique codant pour une AChE, - des cellules telles que définies ci-dessus, ayant été transformées par un gène codant pour l'AChE et par une séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie ci-dessus. Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus de cellules telles que des neuroblastomes N18TG2 (Lazar et al., 1980). L'invention concerne également l'utilisation telle que définie ci-dessus, de cellules choisies parmi : - celles dont le génome code sans transformation préalable pour la BChE et une protéine telle que définie ci-dessus, - celles telles que définies ci-dessus, dont le génome code sans transformation préalable pour la BChE, et ayant été transformées par une séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie ci-dessus, - celles dont le génome code sans transformation préalable pour une protéine telle que définie ci-dessus, et ayant été transformées par une séquence nucléotidique codant pour la BChE, - des cellules telles que définies ci-dessus, ayant été transformées par un gène codant pour la BChE et par une séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie ci-dessus. L'invention concerne également un procédé de criblage de composés spécifiquement inhibiteurs de l'AChE telle que présente à la surface cellulaire, ou de composés inhibiteurs de l'ancrage membranaire de l'AChE, lesdits composés étant susceptibles de pouvoir être utilisés pour la préparation de médicaments destinés au traitement de pathologies telles que définies ci-dessus, et qui comprend les étapes suivantes : - mise en présence de cellules telles que définies ci-dessus avec le composé testé, - détection de l'éventuelle diminution de l'activité de l'AChE à la surface des cellules par rapport à l'activité de l'AChE à la surface de cellules témoins n'ayant pas été mises en présence du composé testé. Le principe d'une telle méthode de criblage est d'utiliser un système cellulaire produisant en surface de l'AChE ancrée par la protéine PRIMA. Cette activité de surface de l'enzyme AChE à l'extérieur des cellules peut être mesurée par différentes méthodes histochimiques ou colorimétriques, par exemple : méthode histochimique de Kamovsky (Kamovsky et al., 1964), méthode colorimétrique d'Ellman (Ellman et al., 1961) sur des cellules non perméabilisées. Cette activité peut également être mesurée en utilisant de la fasciculine marquée (Peng et al., 1999), des anticorps anti-AChE (Marsh et al., 1984) ou des anticorps anti-PRiMA. Le crible consiste alors à appliquer sur les cellules le composé testé pour son activité inhibitrice de l'ancrage membranaire de l'AChE et à observer une éventuelle diminution de l'activité de l'AChE membranaire. L'invention concerne également un procédé de criblage de composés spécifiquement inhibiteurs de la BChE telle que présente à la surface cellulaire, ou de composés inhibiteurs de l'ancrage membranaire de la BChE, lesdits composés étant susceptibles de pouvoir être utilisés pour la préparation de médicaments destinés au traitement de pathologies telles que définies ci-dessus, et qui comprend les étapes suivantes : - mise en présence de cellules telles que définies ci-dessus avec le composé testé, - détection de l'éventuelle diminution de l'activité de la BChE à la surface des cellules par rapport à l'activité de la BChE à la surface de cellules témoins n'ayant pas été mises en présence du composé testé. L'éventuelle diminution de l'activité de l'AChE ou de la BChE à la surface des cellules est détectable par l'observation d'une diminution de l'activité mesurée par les techniques présentées ci-dessus. Par exemple, la méthode d'Ellman (Ellman et al., 1961), appliquée à un échantillon de cellules non perméabilisées en suspension, permet d'obtenir directement une mesure de la quantité totale d'activité de l'AChE ou de la BChE présente à la surface des cellules avant et après traitement avec le composé à tester. Les techniques de détection de la diminution de l'activité de la BChE sont identiques à celles de l'AChE, sauf pour la fasciculine. En effet, cette technique s'applique uniquement à l'AChE. Les techniques d'Ellman (Ellman et al., 1961) et de Kamovsky (Kamovsky et al., 1964) s'appliquent aux deux types de cholinestérases. On distingue donc l'AChE de la BChE par l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques de l'une ou l'autre des enzymes. En ce qui concerne les anticorps, il faut utiliser des anticorps spécifiques respectivement de l'AChE et de la BChE. L'invention concerne également un procédé de criblage pour rechercher des ligands d'une protéine PRIMA purifiée. L'invention concerne également un procédé de criblage pour rechercher des ligands du complexe formé entre la protéine PRiMA et le tétramère AChE. DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 et la séquence d'aminoacides correspondante de la protéine PRiMA humaine, représentée par la séquence SEQ ID NO : 2. La Figure 2 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 3 et la séquence d'aminoacides correspondante de la protéine PRIMA de souris, représentée par la séquence SEQ ID NO : 4. La Figure 3 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 et la séquence d'aminoacides correspondante du fragment de protéine PRIMA humaine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 6. La Figure 4 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7 et la séquence d'aminoacides correspondante du fragment de protéine PRIMA humaine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 8. La Figure 5 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 9 et la séquence d'aminoacides correspondante du fragment de protéine PRIMA humaine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 10. La Figure 6 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : Il et la séquence d'aminoacides correspondante du fragment de protéine PRiMA humaine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 12. La Figure 7 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 13 et la séquence d'aminoacides correspondante du fragment de protéine PRIMA humaine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 14. La Figure 8 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 15 et la séquence d'aminoacides correspondante du fragment de protéine PRIMA humaine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 16. La Figure 9 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 17 et la séquence d'aminoacides correspondante du fragment de protéine PRiMA humaine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 18. La Figure 10 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 19 et la séquence d'aminoacides correspondante du fragment de protéine PRIMA humaine, représenté par la séquence SEQ ID NO : 20. La Figure 11 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 21 et la séquence d'aminoacides correspondante du fragment de protéine PRIMA de souris, représenté par la séquence SEQ ID NO : 22. La Figure 12 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 23 et la séquence d'aminoacides correspondante du fragment de protéine PRIMA de souris, représenté par la séquence SEQ ID NO : 24. La Figure 13 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 25 et la séquence d'aminoacides correspondante du fragment de protéine PRIMA de souris, représenté par la séquence SEQ ID NO: 26. La Figure 14 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 27 et la séquence d'aminoacides correspondante du fragment de protéine PRIMA de souris, représenté par la séquence SEQ ID NO: 28. La Figure 15 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 29 et la séquence d'aminoacides correspondante du fragment de protéine PRIMA de souris, représenté par la séquence SEQ ID NO : 30. La Figure 16 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 31 et la séquence d'aminoacides correspondante du fragment de protéine PRIMA de souris, représenté par la séquence SEQ ID NO : 32. La Figure 17 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 33 et la séquence d'aminoacides correspondante du fragment de protéine PRIMA de souris, représenté par la séquence SEQ ID NO : 34. La Figure 18 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 35 et la séquence d'aminoacides correspondante du fragment de protéine PRIMA de souris, représenté par la séquence SEQ ID NO : 36. La Figure 19 représente la séquence protéique SEQ ID NO : 37 correspondant au fragment de protéine PRiMA de rat. La Figure 20 représente la carte génomique partielle du chromosome humain 14, avec les positions des BAC ("bacterial artificial chromosome" : chromosome artificiel bactérien) AL132642 et AL157858 (orientation inversée) dans la région codant pour la protéine PRiMA. Elle représente également la structure des exons et des introns du gène PRIMA : les cinq exons sont représentés à l'échelle par des rectangles blancs (région non codante) et des rectangles gris (région codante). Le codon d'initiation de la traduction ATG et le codon stop sont également indiqués. Les sites de polyadénylation sont indiqués par des étoiles. La Figure 2 la correspond à l'utilisation de la protéine fluorescente EGFP comme contrôle de la transfection. Dans la Figure 21b, les cellules N18TG2 non perméabilisées ont été marquées avec de la fasciculine couplée à de la rhodamine. Les Figures 21a et 21b correspondent à des cellules N18TG2 transfectées exprimant de l'AChET sans la protéine PRiMA. La Figure 21c représente le profil de sédimentation de l'activité de l'AChE dans des extraits de cellules N18TG2 transfectées qui expriment l'AChET sans PRIMA. Les différentes formes moléculaires sont représentées de façon schématique au-dessus de chaque pic : les sous-unités de l'AChE sont représentées par des cercles blancs et PRIMA par un rectangle grisé. On a représenté l'activité de l'AChE en unités arbitraires en fonction du coefficient de sédimentation (S). La Figure 22 représente la coexpression d'une sous-unité de l'AChE de type T (AChET est un variant d'épissage des transcrits de l'AChE ; c'est le principal variant présent dans les muscles et le système nerveux central des mammifères adultes). Cette coexpression permet la formation de tétramères d'AChE et leur ancrage au niveau des membranes cellulaires, dans des neuroblastomes N18TG2 indifférenciées. La Figure 22a correspond à l'utilisation de la protéine fluorescente EGFP comme contrôle de la transfection et dans la Figure 22b, les cellules N18TG2 non perméabilisées ont été teintées avec de la fasciculine couplée à de la rhodamine. Les Figures 22a et 22b correspondent à des cellules N18TG2 transfectées exprimant de l'AChET avec la protéine PRIMA. L'AChE est visualisée à la surface des cellules seulement lorsqu'elle est coexprimée avec la protéine PRiMA. La Figure 22c représente le profil de sédimentation de l'activité de l'AChE dans des extraits de cellules N18TG2 transfectées qui expriment l'AChET avec PRIMA. Les différentes formes moléculaires sont représentées de façon schématique au-dessus de chaque pic : les sous-unités de l'AChE sont représentées par des cercles blancs et PRiMA par un rectangle grisé. La cotransfection avec PRiMA entraîne la production de tétramères d'AChE amphiphiles. On a représenté l'activité de l'AChE en unités arbitraires en fonction du coefficient de sédimentation (S). Les Figures 23a, 23b et 23c concernent l'expression d'une construction de PRIMA étiquetée avec un épitope (Flag-PRiMA) dans des cellules N18TG2 indifférenciées."Flag"correspond à un épitope de séquence DYKDE. La Figure 23a représente la visualisation de Flag-PRiMA sur des cellules non perméabilisées avec des anticorps MI anti-Flag. Les Figures 23b et 23c correspondent à des cellules coexprimant l'AChET et Flag-PRiMA marquées respectivement avec des anticorps Ml (Figure 23b) et de la fasciculine couplée à de la rhodamine (Figure 23c), révélant la présence à la fois de PRIMA et d'AChE colocalisées à la surface des cellules. Les flèches indiquent les cellules transfectées exprimant à la fois AChE et la construction Flag-PRiMA. La Figure 24 correspond à la représentation schématique des différentes régions de PRIMA : le peptide signal N-terminal ; le domaine extracellulaire contenant cinq cystéines (C), le motif riche en prolines et des sites de N-et 0-glycosilation ; la région transmembranaire et le domaine cytoplasmique C-terminal contenant une cystéine à la limite de la région transmembranaire et des sérines représentant des sites potentiels de phosphorylation. Les Figures 25a, 25b et 25c concernent la suppression du motif riche en prolines, ce qui supprime l'interaction entre PRIMA et l'AChE mais pas l'ancrage de l'AChE à la surface des cellules. Les Figures 25a et 25b concernent la visualisation de cellules N18TG2 transfectées non perméabilisées avec, comme contrôle, respectivement de l'EGFP et de la fasciculine couplée à de la rhodamine, afin d'identifier les cellules transfectées. Les cellules exprimant l'AChET et la construction Flag-PRiMA APRAD ne présentent pas d'AChE à leur surface. La Figure 25c permet de constater que FlagPRiMA APRAD est présent à la surface des cellules transfectées, comme on le constate avec les anticorps MI anti-Flag. Les flèches indiquent des cellules exprimant l'AChE et la construction Flag-PRiMA APRAD. La Figure 26a représente le profil de sédimentation des extraits cellulaires de cellules N18TG2 exprimant de l'AChET et PRIMA APRAD. La Figure 26b représente le profil de sédimentation des extraits cellulaires de cellules N18TG2 exprimant de la BChE seule (ronds noirs) ou avec PRIMA (carrés blancs). L Figure 26c représente le profil de sédimentation des extraits cellulaires de cellules N18TG2 exprimant de l'AChET mutée ne contenant pas la cystéine C-terminale (C572S en numérotation standard, définie par rapport à l'AChE de torpille) avec PRIMA. Les structures des différents oligomères sont indiquées schématiquement pour chaque composé : les sousunités de l'AChE sont représentées par des cercles blancs, les sous-unités de la BChE sont représentées par des cercles gris et PRIMA est représentée par un rectangle grisé. Ces profils montrent que PRIMA induit la formation de tétramères amphiphiles d'AChE, même sans la cystéine C-terminale, ainsi que la formation de tétramères amphiphiles de la BChE, mais que PRiMA APRAD ne le permet pas. Dans les Figures 26a, 26b et 26c, on a représenté l'activité de l'AChE en unités arbitraires en fonction du coefficient de sédimentation (S). La Figure 27 correspond à l'analyse par transfert d'ARN (Northern Blot) de transcrits de PRiMA dans des tissus de souris. Les différentes colonnes correspondent à 2 ig d'ARNm provenant du coeur, du cerveau, de la rate, des poumons, du foie, des muscles squelettiques, des reins et des testicules, hybridés avec une sonde marquée avec du 32p, correspondant à la séquence codante de PRIMA. Les Figures 28a et 28b représentent les profils de sédimentation de l'AChE dans des extraits tissulaires provenant respectivement du cerveau de souris et du muscle squelettique, extraits dans lesquels on a supprimé les formes moléculaires liées de PRIMA en utilisant un anti-sérum dirigé contre PRIMA (courbe avec les carrés blancs) ou, comme contrôle, avec le sérum pré-immun (courbe avec les ronds noirs). Les Figures 28c et 28d représentent les profils de sédimentation de la BChE dans des extraits tissulaires provenant respectivement du cerveau de souris et du muscle squelettique, extraits dans lesquels on a supprimé les formes moléculaires liées de PRiMA en utilisant un anti-sérum dirigé contre PRIMA (courbe avec les carrés blancs) ou, comme contrôle, avec le sérum pré-immun (courbe avec les ronds noirs). Dans les Figures 28a, 28b, 28c et 28d, on a représenté l'activité de l'AChE en unités arbitraires en fonction du coefficient de sédimentation (S). MATERIELS ET METHODES A. Obtention de l'ADNc de PRIMA de souris à partir d'ARNm de cellules différenciées de neuroblastome : La séquence peptidique N-terminale EPQKSCSKYTD, obtenue par séquençage chimique de l'extrémité N-terminale d'une protéine de 20 kDa copurifiée avec l'AChE de cerveau de boeuf (Boschetti and Brodbeck, 1996 ; Perrier et al., 2000), correspond à un fragment codant dans une portion de séquence génomique murine du chromosome 14 (AL132642). Ce peptide a semblé inclus dans un exon contenant en phase un domaine riche en prolines. L'exon putatif de souris correspondant a été obtenu par PCR à partir d'ADN génomique de souris en utilisant les 4 amorces chevauchantes SI, RI puis S2, R2 (voir tableau 1 ci-dessous) déduites de la séquence génomique murine AL132642. Tableau 1 : Liste des amorces de PCR utilisées : SI GGTGAGCCCCAGAAGTCCTG RI CTGGGGCGGAGAGGAGTCTGG S2 AGAAGTCCTGCTCCAAAGTGA R2 GAGAGGAGTCTGGGAGGTGGC mS3 GTGACTGACAGCTGCCAACACATCTG mS4 GCCAACACATCTGCCAGTGCCGGCC mR4 GGCCGGCACTGGCAGATGTGTTGGC mR3 CAGATGTGTTGGCAGCTGTCAGTCAC Qt CAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT Qo CCAGTGAGCAGAGTGACGA QI GAGGACTCGAGCTCAAGC A partir de la séquence de l'exon putatif de souris ainsi obtenue par séquençage des fragments amplifiés, des expériences de RACE-PCR (amplification rapide par PCR des extrémités 5'et 3') ont pu être menées à bien pour obtenir un ADN complémentaire de souris contenant l'exon putatif initial. Pour cela, quatre amorces chevauchantes spécifiques de l'exon putatif (mS3 et mS4 pour le 3'RACE ; mR4 et mR3 pour le 5' RACE ; voir tableau 1 ci-dessus) ont été utilisées en combinaison avec une série d'amorces non spécifiques de l'exon (Qt contenant les deux amorces"nichées"Qo et QI ; voir tableau 1 ci-dessus) selon le protocole décrit par Frohman (Frohman et al., 1988) et à partir d'ARN poly A+ (lug) extrait de neuroblastomes N18TG2 (Lazar et al., 1980) cultivés en présence de DMSO 2% pendant 5 jours. Les fragments d'ADN issus des expériences de 5'et 3'RACE-PCR ont été fusionnés et sous-clonés dans le vecteur pCRII-TOPO (Invitrogen) puis sous-clonés à nouveau dans les vecteurs pcDNA3.1 et pIRES2-EGFP (Clontech) au niveau du site de restriction EcoRI. Pour les constructions pCDNA3.1 PRIMA APRAD et Flag-PRIMA, nous avons effectué une mutagenèse, dirigée selon la méthode de Kunkel (Kunkel et al., 1987) pour déléter les acides aminés compris entre les positions 56 et 70 ou pour insérer l'épitope Flag (DYKDE à la position 36). Pour la construction pcDNA3.1 PRIMA ACter, les acides aminés compris entre les positions 122 à 153 ont été délétés et un codon STOP a été inséré par PCR. B. Culture cellulaire : Le clone murin de neuroblastome N18TG2 (Lazar et al., 1980) est maintenu en culture dans du milieu Dulbecco modifié (Dulbecco's modified Eagle's medium : DMEM, Gibco) additionné de 10% de sérum de veau foetal décomplémenté, 2 mM de glutamin, 1 mM de pyruvate de sodium, la différenciation des cellules est induite par addition de 2% DMSO. Les cellules sont dissociées mécaniquement tous les 3 à 4 jours puis cultivées dans des flacons de 75 cm2 sans changer le milieu, dans une atmosphère saturée en eau contenant 5% de CO2. Les cellules COS-7 sont maintenues en culture selon une méthode classique (Bon and Massoulié, 1997). C. Transfections de cellules : Les cellules N18TG2 sont transfectées dans des plaques de culture à puits de 60 mm de diamètre avec 1 à 3 gag d'ADN et 3 à 6 u. l de Fugen 6 (Boehringer-Mannheim) selon les instructions du fabricant. Les cellules COS sont transfectées dans des boites de cultures de 100 mm de diamètre avec 3 à 5 ug de chaque ADN selon la méthode décrite dans les références Bon and Massoulié (1997) et Simon et al. (1998). D. Extraction des formes moléculaires d'AChE et de BChE : La surface des cellules à extraire est rincée une fois avec du tampon PBS (solution saline de tampon phosphate), puis les cellules sont collectées. Le culot de cellules est alors homogénéisé dans la solution d'extraction (25 mM Tris-HCl pH 7,10 mM MgCl2, 2 mM Benzamidin, 2% Triton X100 (Sigma), 0, 8 M NaCl, 20 ug/ml pepstatine, 40 u. g/ml leupeptine) par plusieurs pipettages répétés et plusieurs passages dans un Potter (Téflon-verre). L'extrait est alors clarifié par centrifugation pour faciliter la détermination de l'activité des cholinestérases selon la méthode décrite dans la référence Ellman et al. (1961). E. Analyse des formes moléculaires de ChE par sédimentation en gradients de saccharose : Les analyses par sédimentation sont réalisées dans des gradients de saccharose 5- 20% (poids/volume) contenant 0,8 M NaCl, 50 mM Tris HC1 pH 7,10 mM MgClz, et 1% Brij-96 ou Brij-97 (Sigma) et centrifugées à 40000 tours/minute à 7 C pendant 16 heures, en utilisant un rotor de type SW41 (Beckman Instruments, Fullerton CA). L'activité des fractions collectées à partir d'un gradient (environ 50 fractions) est mesurée en utilisant la méthode colorimétrique décrite par Ellman et al. (1961). Les coefficients de sédimentation sont déduits d'après la position de deux protéines marqueurs internes, la phosphatase alcaline (6,1 S) et la ss-galactosidase (16 S) d'Escherichia coli, en admettant qu'il existe une relation linéaire entre le coefficient de sédimentation et la position dans le gradient. F. Détection de l'AChE à la surface des cellules : La fasciculine, toxine de serpent très spécifique de l'AChE, est couplée chimiquement à de la rhodamine selon les recommandations décrites dans Peng et al. (1999). Les cellules N1STG2 transfectées sont mises en culture pendant une journée sur des lamelles de verre recouvertes avec de la polyomithine (10 u. g/ml de poly-Lornithine dans du PBS à 37 C pendant 48 h). Les lamelles sont alors lavées au PBS et incubées pendant 15 minutes à température ambiante dans un tampon de blocage ("serum-free protein blocking ready-to-use solution", solution de blocage prête à utiliser, DAKO). Puis, les lamelles sont incubées une heure à température ambiante avec de la fasciculine couplée à la rhodamine (à 1 pg/ml) dans du tampon TBS-BSA ("Tris-buffered saline", tampon salin à base de Tris contenant 0,3% de sérum albumine de boeuf). Après plusieurs lavages, les lamelles sont montées sur lame avec une solution contenant de la glycine (Fluoprep, Biomérieux). G. Extraction des cholinestérases de tissus et immuno-déplétion de formes de cholinestérases liées à PRiMA : Un cerveau entier ou un muscle squelettique (gastrocnémien) de souris est broyé dans un homogénéisateur à lames (Polytron) dans un tampon d'extraction sans détergent (25 mM Tris-HCl pH 7,10 mM MgCl2, 20 u. g/ml pepstatine, 40 iig/ml leupeptine). Les extraits sont maintenus 45 minutes à 4 C puis centrifugés 30 minutes à 15000 g. Les culots sont lavés une fois avec le tampon d'extraction, puis ils sont extraits à nouveau avec un tampon contenant du détergent (25 mM Tris-HCl pH 7, 10 mM MgCh, 2% Triton X100, 20 ug/ml pepstatine, 40 u. g/ml leupeptine). Les extraits obtenus, clarifiés par centrifugation, contiennent les formes moléculaires membranaires de cholinestérases. Un centième de l'extrait de cerveau et un dixième de celui de muscles sont incubés à 4 C en présence d'anti-sérum de lapin anti-PRiMA ou du sérum préimmun (comme contrôle) (dilution 1 : 50). Après deux heures d'incubation, on ajoute 50 RI d'une suspension de protéine-G-agarose (Roche) à chaque extrait et on incube pendant 2 heures à 4 C. Après une courte centrifugation (10 minutes à 15000 g), les surnageant sont analysés par sédimentation en gradient de saccharose. Les activités de l'AChE et de la BChE sont mesurées en utilisant la méthode colorimétrique d'Ellman en présence d'iso-OMPA 10-4 M (Austin and Berry, 1953), qui est un inhibiteur spécifique de la BChE ou de BW284c51 10-6 M (Austin and Berry, 1953), qui est un inhibiteur spécifique de l'AChE. RESULTATS A. ADNc et gène codant pour PRIMA, l'ancre membranaire des cholinestérases : On a identifié une séquence génomique humaine qui correspond au peptide aminoterminal de PRiMA, obtenu auparavant par séquençage chimique de l'extrémité de la sous-unité de 20 kDa. Cette protéine-ancre a été éluée avec du gel SDS d'AChE purifié à partir d'un extrait de détergent de cerveau bovin (Boschetti and Brodbeck, 1996 ; Perrier et al., 2000). En partant de cette information génomique (voir Figure 20) et en utilisant l'ARNm des cellules de neuroblastomes N18TG2 différenciées, qui expriment la forme tétramérique liée à la membrane de l'AChE (Perrier et al., 2000), on a obtenu un ADNc de souris par RACE 3'et 5' (Amplification rapide des extrémités 3' et 5'par PCR). L'ADNc de 900 paires de bases contient une unique phase ouverte de lecture. Les séquences primaires déduites de PRIMA de souris et d'homme sont très similaires, avec un pourcentage d'identité de 90,9% (pourcentage d'homologie de 93,5%). En parallèle avec cette analyse, on a étudié l'éventuelle existence de variants d'épissage alternatif de PRIMA. Des analyses de transfert d'ARN messager (Northem blot) de cerveau de souris, en utilisant une sonde correspondant à la séquence codante entière de PRiMA ont révélé l'existence d'un transcrit principal de 3,3 kb (voir Figure 27). Les deux transcrits de 0,9 et 3,3 kb codent pour la même protéine, à savoir PRIMA. Le gène de PRIMA est localisé sur le chromosome humain 14 (14q32.12), à 93,7 Mb du centromère en orientation inverse (voir Figure 20). Une analyse de cette région a montré que ce gène s'étend sur approximativement 70 kb et que l'ARNm est constitué d'un exon 5'non codant et de quatre exons codants, le dernier contenant la longue séquence 3'non codante (voir Figure 20). B. PRiMA ancre les tétramères de l'AChE dans les membranes cellulaires : La fonction attendue de PRiMA est de cibler AChET au niveau de la membrane cellulaire sous la forme d'un tétramère ; cela peut être analysé simplement par transfection dans des lignées cellulaires. Lorsque l'ADNc de l'AChET est transfecté seul dans des cellules N18TG2 non différenciées ou dans des cellules COS, l'enzyme n'est pas exposée à la surface des cellules (voir Figure 21a et 21b), comme décrit précédemment dans la référence Bon et al. (1997). Au contraire, un marquage clair et uniforme de l'AChE est observé à la surface des cellules, lorsque AChET est exprimée avec PRIMA (voir Figure 22a et 22b). Cette localisation de l'AChE à la surface des cellules transfectées a été examinée avec de la fasciculine, une toxine du venin présentant une haute affinité vis-à-vis de l'AChE, couplée à de la rhodamine. Pour s'assurer que le complexe est ciblé en surface, on a inséré un épitope"Flag" (DYKDE) entre le peptide signal putatif et l'extrémité N-terminale de la protéine PRIMA mature (position 36). Lorsque l'AChET a été exprimée avec la construction Flag-PRiMA, l'immunomarquage des cellules non perméabilisées avec l'anticorps monoclonal antiFlag (Ml) a montré que PRiMA est exposée à la surface des cellules transfectées et que les deux protéines sont colocalisées (voir Figures 23b et 23c). Ce résultat montre tout d'abord que l'épitope Flag est maintenu dans la protéine mature, étant donné qu'il est reconnu par les anticorps MI uniquement lorsqu'il est situé à l'extrémité N-terminale, ce qui confirme la position du site putatif de clivage du peptide signal. Ce résultat montre également que la région N-terminale de PRiMA est extracellulaire et que AChE et PRiMA sont associées. Cependant, le ciblage de PRiMA à la surface des cellules ne nécessite pas son association avec AChE car PRiMA, exprimée seule, intègre la membrane (voir Figure 23a), contrairement à l'AChE. Le caractère biochimique du tétramère lié à la membrane nécessite une concentration élevée de Triton X100 pour l'extraction. Les formes moléculaires de l'AChE, extraites en présence de Triton X100 2% à partir de cellules COS exprimant AChE, avec ou sans PRiMA, ont été analysées par des gradients de saccharose contenant 1% de Brij-97. L'expression de l'AChE seule produit de nombreuses formes moléculaires qui peuvent toutes être extraites sans détergent à partir des cellules (voir Figure 21c). Les profils de sédimentation ont révélé que la coexpression de PRiMA avec l'AChE produit une forme moléculaire particulière, dont le coefficient de sédimentation est 7,8 S dans les conditions expérimentales de la Figure 21c, soluble uniquement en présence d'un détergent, en plus des nombreuses formes générées par l'expression de l'AChET seule (voir Figure 22c). Cette espèce spécifique d'enzyme est amphiphile, comme indiqué par le fait que sa sédimentation est plus lente en présence de Brij-97 qu'en présence de Triton (Sigma), et correspond au tétramère ancré dans la membrane. Pour démontrer la présence de PRiMA dans les tétramères membranaires, on a utilisé un sérum immun contre une protéine de fusion GST avec le domaine cytoplasmique C-terminal de PRiMA. Après l'immunoabsorption avec ce sérum immun mais pas avec le sérum pré-immun d'extrait des cellules coexprimant PRIMA et AChE, on a observé une absence quasi complète des tétramères membranaires. On a ainsi démontré que ces cellules produisaient des tétramères d'AChE ancrés par PRIMA sur des membranes. C. Le domaine extracellulaire de PRIMA contient un nouveau domaine t PRAD pour l'AChE et la BChE : Dans la structure primaire de PRIMA, on peut distinguer quatre régions distinctes (voir Figure 24) : un peptide signal et des domaines extracellulaire, transmembranaire et cytoplasmique. A part une séquence riche en proline, aucune ressemblance avec des motifs peptidiques déjà identifiés n'a été trouvée. Le domaine extracellulaire de la protéine mature contient un motif riche en prolines (positions 56 à 70) similaire au domaine PRAD du collagène ColQ (Bon et al., 1997). Ce motif consiste en deux étendues de 4 et 10 prolines, suivies par un doublet de leucines. Afin d'examiner l'importance de ce motif riche en prolines dans l'attachement des sous-unités AChE, on a supprimé cette région dans PRIMA et dans la construction Flag-PRiMA. Dans les cellules transfectées N18TG2, ces constructions ont été correctement localisées sur la membrane, mais elles n'ont pas permis d'ancrer l'AChE (voir Figures 25a, 25b et 25c), comme indiqué par le marquage avec des anticorps Ml et avec de la fasciculine, respectivement. Les analyses par gradients de saccharose ont montré que le profil des formes moléculaires de l'AChE (voir Figure 26a) est identique au profil généré par l'expression de l'AChET seule (voir Figure 21c). Ainsi, la région riche en prolines de PRIMA est essentielle pour la liaison avec l'AChE. Dans le cas du collagène ColQ, le domaine PRAD ne permet pas seulement de former les tétramères d'AChE mais également les tétramères de BChE. Pour vérifier s'il en est de même pour PRIMA, de la BChE a été exprimée avec PRiMA dans des cellules COS. Les formes moléculaires de la BChE produites par ces cellules ont été analysées par des gradients de saccharose : on a alors observé un nouveau composé principal à 9,8 S (dans les conditions expérimentales de la Figure 26b) qui correspond au tétramère amphiphile de la BChE similaire au tétramère membranaire de la BChE extraite des muscles (voir plus loin). La séquence riche en prolines est précédée par quatre cystéines qui peuvent former des ponts disulfure avec la cystéine C-terminale de l'AChET, comme indiqué par Roberts (1991). Cependant, des expériences antérieures ont montré que les résidus cystéines de ColQ ou du domaine WAT ("tryptophan amphiphilic domain tetramerisation", domaine amphiphile de tétramérisation, voir Simon et al., 1998) n'étaient pas indispensables pour l'assemblage d'un tétramère de l'AChE avec le domaine PRAD (Bon et al., 1997). Cela peut expliquer le fait que les analyses par électrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE) de l'AChE liée à la membrane sans réduction ont montré que l'ancre membranaire était associée à plusieurs complexes, représentant les monomères, les dimères, les trimères et les tétramères (Liao et al., 1993) alors que dans les gradients il n'y a que des tétramères. Pour savoir si les ponts disulfures entre PRIMA et les sous-unités AChET sont nécessaires pour leur association, on a transfecté des cellules COS avec PRIMA et avec un mutant de l'AChE sans la cystéine C-terminale, AChET (C572S en numérotation standard, définie par rapport à l'AChE de torpille) (Bon et al., 1997). Les analyses de sédimentation ont montré que ces cellules produisent des tétramères amphiphiles, identiques à ceux contenant les sous-unités AChET de type sauvage (voir Figure 26b). Ainsi, les ponts disulfures ne sont pas nécessaires pour l'organisation des tétramères de l'AChE associés avec PRIMA, ce qui suggère que les associations quaternaires de l'AChET avec ColQ et avec PRIMA sont similaires. Cela suggère également que l'organisation d'un tétramère ne nécessite pas que les cystéines de PRIMA forment des ponts disulfure avec la cystéine C-terminale de l'AChET. D. PRIMA ancre l'AChE et la BChE dans le cerveau et les muscles de souris : Des analyses par transfert d'ARN (Northern Blot) ont montré que le transcrit de PRIMA de 3,3 kb est exprimé dans le cerveau, le coeur et les muscles (voir Figure 27). L'absence des transcrits de PRIMA dans le foie suggère que la forme tétramérique soluble de la BCHE dans le plasma sanguin (qui provient du foie) ne se groupe ni avec PRIMA, ni avec un fragment d'une protéine soluble dérivée du même gène. Dans le rein et les testicules, on a observé un transcrit de 0, 9 kb qui semble correspondre à l'ADNc court qui a été cloné. Ces transcrits peuvent dériver des glandes médullosurrénales, qui contiennent les tétramères d'AChE liés à la membrane, plutôt que du rein lui-même qui ne produit pas cet oligomère. En conclusion, on a démontré que les tétramères d'ACHE et de BChE associés à la membrane et provenant du cerveau de souris et des muscles squelettiques contiennent PRiMA, car ils peuvent être absorbés par un sérum dirigé contre la région cytoplasmique de cette protéine : les pics correspondants disparaissent de manière spécifique des profils de sédimentation après immunoabsorption avec ce sérum immun mais pas avec le sérum pré-immun (voir Figure 28a, 28b, 28c et 28d). REFERENCES - Austin, L. and Berry, WK (1953) Two selective inhibitors of cholinesterase. Biochem J. 125,183-196, - Bon, S. and Massoulié, J. (1997) Quaternary associations of acetylcholinesterase. 1 Oligomeric associations of T subunits with and without the amino-terminal domain of the collagen tail. J. 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Chem. 266,7481-7487, - Simon, S., Krejci, E. and Massoulié, J. (1998) A four-to-one association between peptide motifs : four C-terminal domains from cholinesterase assemble with one proline-rich attachment domain (PRAD) in the secretory pathway. EMBO J. 17, 6178-6187. REVENDICATIONS 1. Protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par : - la séquence SEQ ID NO : 2 représentant la protéine d'origine humaine d'ancrage à la surface des membranes cellulaires des cholinestérases, notamment de l'acétylcholinestérase AChE ou de la butyrylcholinestérase BChE, - ou toute séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un fragment défini ci-dessous, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve qu'elle permette l'ancrage membranaire des cholinestérases, notamment de l'AChE ou de la BICHE, - ou toute séquence homologue de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un fragment défini ci-dessous, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 70%, et notamment 85%, avec la séquence SEQ ID NO : 2, sous réserve qu'elle permette l'ancrage membranaire des cholinestérases, notamment de l'AChE ou de la BChE, - ou tout fragment d'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve qu'il permette l'ancrage membranaire des cholinestérases, notamment de l'AChE ou de la BChE, notamment tout fragment étant constitué d'au moins environ 6 acides aminés, et notamment d'au moins environ 40 acides aminés contigus dans la séquence SEQ ID NO : 2. 2. Protéine homologue de la séquence SEQ ID NO : 2 selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle correspond à la séquence SEQ ID NO : 4 représentant la protéine d'origine murine d'ancrage à la surface des membranes cellulaires des cholinestérases, notamment de l'AChE ou de la BChE. 3. Fragments de protéine caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi les suivants : - les fragments de la séquence SEQ ID NO : 2 représentés par les séquences SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18 et SEQ ID NO : 20, - les fragments de la séquence SEQ ID NO : 4 représentés par les séquences SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO :, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 34 et SEQ ID NO : 36, - le fragment de la protéine d'ancrage à la surface des membranes cellulaires de l'AChE de rat homologue de la séquence SEQ ID NO : 2, ledit fragment correspondant à la séquence SEQ ID NO : 37. 4. Séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie dans l'une des revendications 1 à 3. 5. Séquence nucléotidique selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par : - la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 codant pour SEQ ID NO : 2, - ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de la séquence SEQ ID NO : 1, et codant pour une protéine représentée par SEQ ID NO : 2, - ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de la séquence SEQ ID NO : 1 codant pour une protéine dérivée de SEQ ID NO : 2, telle que définie dans la revendication 1, - ou toute séquence nucléotidique homologue de SEQ ID NO : 1, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 70%, avec la séquence SEQ ID NO : 1 codant pour une protéine homologue de SEQ ID NO : 2, telle que définie dans la revendication 1, - ou tout fragment de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 ou des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 20 nucléotides contigus dans ladite séquence, - ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences ou fragments susmentionnés, - ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences ou d'un des fragments susmentionnés. 6. Fragments d'acide nucléique choisis parmi les suivants : - les séquences SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 17, et SEQ ID NO : 19, codant respectivement pour les séquences SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18 et SEQ ID NO : 20, - les séquences SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 33, et SEQ ID NO : 35, codant respectivement pour les séquences SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 34 et SEQ ID NO : 36. 7. Vecteur recombinant, notamment plasmide, cosmide, phage ou ADN de virus, contenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 4 à 6. 8. Vecteur recombinant selon la revendication 7, contenant les éléments nécessaires à l'expression dans une cellule hôte des polypeptides codés par les acides nucléiques selon l'une des revendications 4 à 6, insérés dans ledit vecteur. 9. Cellule hôte, choisie notamment parmi les bactéries, les virus, les levures, les champignons, les plantes ou les cellules de mammifères, ladite cellule hôte étant transformée, notamment à l'aide d'un vecteur recombinant selon l'une des revendications 7 ou 8. 10. Oligonucléotides antisens ou ARN messager antisens dérivés des séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 4 à 6. 11. Anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé de manière spécifique contre une protéine selon l'une des revendications 1 à 3. 12. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un oligonucléotide antisens selon la revendication 10, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable. 13. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps selon la revendication 11, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable. 14. Utilisation d'oligonucléotides antisens selon la revendication 10, ou d'anticorps selon la revendication 11, pour la préparation de médicaments destinés au traitement de pathologies liées à une diminution du taux de l'AChE dans l'organisme, notamment de maladies liées à la transmission cholinergique au niveau des cellules du système nerveux central, en particulier dans le cas de la maladie d'Alzheimer, ou au traitement de maladies liées à la transmission cholinergique au niveau neuromusculaire, notamment les myasthénies et plus particulièrement la myasthenia gravis. 15. Utilisation de cellules sélectionnées parmi celles produisant l'AChE et une protéine telle que définie dans l'une des revendications 1 à 3, pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage de composés spécifiquement inhibiteurs de l'AChE telle que présente à la surface cellulaire, ou de composés inhibiteurs de l'ancrage membranaire de l'AChE. 16. Utilisation selon la revendication 15, de cellules choisies parmi : - celles dont le génome code sans transformation préalable pour l'AChE et une protéine selon la revendication 1, telles que des neuroblastomes N18TG2, - celles telles que définies dans la revendication 9, dont le génome code sans transformation préalable pour l'AChE, et ayant été transformées par une séquence nucléotidique codant pour une protéine définie dans l'une des revendications 1 à 3, - celles dont le génome code sans transformation préalable pour une protéine selon la revendication 1, et ayant été transformées par une séquence nucléotidique codant pour une AChE, - des cellules telles que définies dans la revendication 9, ayant été transformées par un gène codant pour l'AChE et par une séquence nucléotidique codant pour une protéine définie dans l'une des revendications 1 à 3. 17. Procédé de criblage de composés spécifiquement inhibiteurs de l'AChE telle que présente à la surface cellulaire, ou de composés inhibiteurs de l'ancrage membranaire de l'AChE, et qui comprend les étapes suivantes : - mise en présence de cellules telles que définies dans la revendication 16 avec le composé testé, - détection de l'éventuelle diminution de l'activité de l'AChE à la surface des cellules par rapport à l'activité de l'AChE à la surface de cellules témoins n'ayant pas été mises en présence du composé testé.