Brevet FR2830940A1 — publié le 20030418

La présente Invention est relative à un procédé de sélection de ligands d'HLA-DP4 et à ses applications. Les lymphocytes T CD4+ font partie des principales cellules régu- latrices de la réponse immunitaire. Spécifiques des antigènes, ils sont en effet capables de reconnaître la présence d'un agent pathogène, d'un allergène ou d'une cellule tumorale et de déclencher une réponse immunitaire. La reconnaissance de ces anti- gènes conduit en effet à l'activation des lymphocytes T CD4+ qui sécrètent la plupart des cytokines nécessaires au recrutement de cellules effectrices que sont les lympho- cytes CD8+ cytotoxiques et les lymphocytes B producteurs d'anticorps. Les lympho- cytes T CD4+ interviennent également dans l'activation des cellules par des contacts cellulaires et par exemple induisent l'activation, par la molécule CD40, des cellules dendritiques présentatrices de l'antigène. L'activation des lymphocytes T CD4+ est un pronostic favorable lors des infections par des virus tels que le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), les papillomavirus humains (HPV) ou le virus de l'hépatite C (HCV) et ces cellules apparaissent comme nécessaires à l'immunité anti-tumorale. Leur rôle n'est toutefois pas systématiquement bénéfique pour l'organisme. Les maladies autoimmunes résultent très souvent d'une activation incontrôlée de lymphocytes T CD4+. C'est le cas de la sclérose en plaque et du diabète insulino-dépendant. Ces lymphocytes contribuent également à l'établissement des maladies allergiques. L'IL4, qui est principalement sécrétée par les lymphocytes T CD4+, est en effet le principal facteur qui conduit à la production d'IgE. Enfin, le rôle des lymphocytes T CD4+ dans le déclenchement du rejet de greffe est bien établi. Ainsi, selon la maladie, les traitements visent à déclencher l'activation des lymphocytes T CD4+ (vaccination contre un agent pathogène ou une cellule tumorale) ou à diminuer l'état d'activation des lymphocytes T CD4+ (désensibilisation contre l'allergie, prévention du rejet de greffe). L'activation des lymphocytes T CD4+ se fait sous l'effet de la présentation de peptides antigéniques par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de type II que portent les cellules présentatrices d'antigène (APC pour Antigen Presenting Cell) ; chez l'homme, elles sont dénommées molécules HLA II pour Human Leucocyte Antigen type II. Ces peptides antigéniques, appelés épitopes T, résultent de la dégradation protéolytique des antigènes par les cellules présentatrices d'antigène. Ils ont des longueurs variables, généralement de 13 à 25 acides aminés et possèdent une séquence qui les rend capables de se lier aux molécules HLA II. Il est bien connu qu'au même titre que l'antigène natif, un peptide épitope T est capable de stimuler in vitro des lymphocytes T CD4+ qui lui sont spécifiques ou de les recruter in vivo. Il est donc suffisant pour induire une réponse T CD4+. D'une manière intéressante, on sait également que selon les modes de présentation (voie d'administration, doses, adjonction ou non d'un adjuvant), la reconnaissance de ces peptides entraîne soit une activation des lymphocytes T CD4+ (ALEXANDER et al., J. Immunol., 2000, 164,1625-1633 ; DEL GUERCIO et al., Vaccine, 1997, 15, 441-448 ; FRANKE et al., Vaccine, 1999,17, 1201-1205), soit leur anergie (MULLER et al., J. Allergy Clin. Immunol., 1998,101, 747-754 ; OLDFIELD et al., J. Immunol., 2001,167, 1734- 1739). Ces peptides épitopes T sont donc susceptibles à la fois de participer à la composition d'un vaccin ou de servir à diminuer l'activation non désirée de lymphocytes T CD4+. Ils sont également susceptibles de participer à un test de diagnostic de l'état immunitaire de patients ou d'individus normaux reposant sur la détection directe (test de prolifération lymphocytaire) ou indirecte (production d'anticorps, de cytokines...) desdits lymphocytes T CD4+ activés. Un des problèmes majeurs qui limite l'utilisation de ces peptides est l'identification de ces épitopes, étant donné que leur séquence varie d'un individu à l'autre en raison du polymorphisme des molécules HLA II. En effet, les molécules HLA II sont des hétérodimères constituées d'une chaîne alpha (a) et d'une chaîne béta (p) polymorphes. Il existe quatre types de molécules HLA II par individu (2 HLA-DR, 1 HLA-DQ et 1 HLA-DP). La molécule HLA-DR dont la chaîne béta (p) est codée par le gène DRB 1 est la plus exprimée. A ce jour, la chaîne béta codée par le gène DRB1 est la plus polymorphe et compte 273 allèles. Pour les molécules HLA-DQ et HLA-DP, les deux chaînes (a et ss) qui les constituent sont polymorphes mais elles présentent moins d'allèles. On compte en effet 21 allèles DQA1 (chaîne a de HLA- DQ), 45 allèles DQB1 (chaîne P de HLA-DQ), 19 allèles DPA1 (chaîne a de HLADP) et 93 allèles DPB1 (chaîne P de HLA-DP). Cependant, la combinaison entre les deux chaînes a et P codées par ces allèles donne naissance à de nombreuses molécules HLA-DQ et HLA-DP. Du fait de ce polymorphisme, ces isoformes possèdent des propriétés de liaison différentes entre elles, ce qui implique qu'elles peuvent lier des peptides différents d'un même antigène. Ainsi, chaque individu reconnaît dans un antigène un ensemble de peptides dont la nature dépend des molécules HLA II qui le caractérise. Comme il existe un grand nombre d'allèles HLA II, on peut supposer qu'il existe dans une séquence donnée un répertoire important de peptides épitopes T de séquences très différentes, chacun spécifique d'un allèle différent. Toutefois, cette diversité de molécules HLA II n'est pas aussi importante à l'échelle de chaque population qu'à l'échelle mondiale comme illustré par le Tableau Ici-dessous. Tableau 1 : Fréquences géniques des molécules HLA de classe II les plus abondantes dans la population Caucasienne (Europe, USA) *, d'après Colombani J., 1993, HLA : fonctions immunitaires et applications médicales, Eds John Libbey Eurotext. Molécules Chaîne a Fréquence Chaîne P Fréquence Molécules abondantes (%) (%) HLA-DR DRA*0101 100 DRBI*0101 9,3 DRA*0101/DRB1 *0101 DRBI*1501 8,0 DRA*0101/DRB1*1501 DRB1*0301 10,9 DRA*OI01/DRB1*0301 DRBI*0401 5,6 DRA*0101/DRBI*040I DRB1 *1101 9,2 DRA*0101/DRB1*1101 DRB1*1301 6,0 DRA *0101/DRB 1 * 130 1 DRBI*0701 14,0 DRA*0101/DRBI*0701 DRB3*0101 9,2 DRA*0101/DRB3*0101 DRB3*0202 12,0 DRA*0101/DRBI*0202 DRB4*0101 28,4 DRA *0101/DRB4*0101 DRB5*0101 7,9 DRA*0101/DRB5*0101 HLA-DQ DQA1*0101 17,0 DQB1*0501 14,9 DQA1*0101/DQB1*0501 DQAI*0102 15,8 DQB 1 *0602 9,8 DQA1*0501/DQB1*0301 DQAI*0201 12,4 DQB 1 *0603 5,8 DQA1*0501/DQB1*0201 DQAI*0301 14,5 DQB1 *0201 21,3 DQA1*0301/DQB1*0302 DQAI*0501 20,9 DQBI*030I 12,0 DQA1 *0 102/DQBI*0602 DQBI*0302 13,0 DQA1 *0201/DQB1 *0201 HLA-DP DPA1*0103 78,2 DPB1*0101 7,1 DPA1*0201/DPB1*0101 DPA1*0201 21,2 DPBI*0201 11,9 DPA1*0103/DPBI*0201 DPB1*0301 9,1 DPA1 *0103/DPB1 *0301 DPB1*0401 40,1 DPA1*0103/ DPB1*0401 DPB1*0402 11,0 DPA1*0103/ DPB1*0402 *Les frequences geniques des 2 molecules HLA-DP4 sont indiquées en gras. Ainsi, pour les molécules HLA-DR et HLA-DQ, une dizaine d'allèles suffisent pour couvrir plus de 60 % de la fréquence génique retrouvée dans la population caucasienne et donc concerner plus de 85 % de la population caucasienne. Pour les molécules HLA-DP, la molécule la plus fréquente est la molécule DP4 issue des allèles Dopa1*0103 et DPB 1 *0401 qui ont des fréquences géniques de 78,2 % et 40 % respectivement. Trois autres molécules DP ont des fréquences qui dépassent les 5 % : une molécule DP3 (DPA1*0103/DPB1*0301), une molécule DP2 (DPA1*0103/DPB1*0201) et une molécule DP4 (DPA1*0103/DPB1*0402) ; les molécules HLA II sont dénommées en fonction de l'allèle DPB 1 codant la chaîne P qui est la plus polymorphe. Ainsi, quatre molécules HLA-DP (1 molécule DP3, 1 molécule DP2 et 2 molécules DP4) suffisent donc pour couvrir 71 % de la fréquence génique de la population caucasienne, les deux molécules DP4, couvrant à elles seules 51 %. Chacune de ces molécules DP4 comprend une chaîne a variable codée, soit par DPA1*0103 qui est la plus fréquente (78,2 %), soit par DPA 1*0201 (20,2 %), les deux chaînes a différant uniquement au niveau de 3 acides aminés (positions 31,50 et 83 ; Tableau II). Tableau II : Polymorphisme des chaînes a et ss des molécules HLA-DP dans la population Caucasienne (Europe, USA), d'après Colombani J., précité. Positions polymorphiques. Chaîne p Allèles Freq (%) 8 9 11 37 38 57 58 59 67 71 78 86 87 88 89 401 40. 1 L F G F A A A E 1 K M G G P M 402 11. 0 V D E 201 11. 9----V 0 E--E----- 501 1. 3---L y E-----D--- 101 7. 1 V Y G Y-------D E A V 301 9.1 V Y L-V D E D L-V D E A V 901 1.1 V H L-V D E D 1 E V D E A V Chaîne ex Allèles Freq (%) 31 50 83 103 78.2 M Q T 201 21.2 Q R A * Les séquences, disponibles sur le site internet http : //www. ebi. ac. uk/imgt/hla. sont numérotées selon la numérotation de STERN et al. (Nature, 1994, 368,215-221) pour la molécule HLA-DR ; comme les résidus en positions 23 et 24 sont absents dans les séquences de DPB, les résidus indiqués aux positions 37,38, 57,59, 67,71, 78,86, 87,88 et 89 correspondent respectivement aux positions 35,36, 55,56, 57,65, 69,76, 84,85, 86 et 87 dans la séquence de DPB. Pourtant, malgré leur fréquence élevée chacune de ces molécules DP4 n'a été que très partiellement étudiée ; les études les plus nombreuses résultent en fait de l'isolement de clones de lymphocytes T CD4+ restreints aux molécules HLA- DP4 et spécifiques des peptides présentés dans le Tableau III, ci-après, issus des anti- gènes suivants : - antigènes de microorganismes pathogènes tels que la toxine tétanique (WYSS CORAY et al., Eur J. Immunol, 1992, 22, 2295), l'antigène WI-1 de Blastomyces dermatitidis (CHANG et al., Inf Immun., 2000,68, 502), la protéine hsp 65 de Mycobacterium bovis (GASTON et al., Int. Immunol., 1991,3, 965-972), l'antigène S du virus de l'hépatite B (HBsAg pour Hepatitis B virus S antigen ; CELIS et al., J. Virol., 1989,63, 747), la phosphoprotéine du virus de la rage (RV-NS pour Rabies Virus Non-Structural phosphoprotein) ou la neuraminidase du virus de la grippe (IBV-Nm pour influenza B virus Neuraminidase ; CELIS et al., J. Immunol., 1990,145, 305) et la protéine UL21 du virus de l'Herpes simplex de type 1 (KOELLE et al., J Virol., 2000,74, 10930-10938), - allergènes tels que l'allergène majeur de Dermatophag ado ptero- nyssinus (HIGGINS, J Allergy Clin. Immunol., 1992,90, 749), et - antigènes tumoraux tels que MAGE-A3 (SCHULTZ et al., Cancer Res., 2000,60, 6272), etNY-ESOl (ZENG et al., P. N. A. S., 2001,98, 3964-3969). Tableau III : Séquences des peptides ligands des molécules HLA-DP4 Peptides Séquences Numéro Référence d'identification TT 947-967 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE SEO ID NO : 1 Wyss Coray et al., 1992 PSN 265DPYCDWDPYHEKYDWDLWNKWCN SEQ ID NO : 2 Chang et al., 2000 S1d FFLL TRIL TI SEO ID NO : 3 Ce lis et al., 1989 (HBsAg 19-28) NS-p2 GVQIVRQIRSGERFLKIWSQ SEQ ID NO : 4 Celis et al., 1990 (RV NS 101-120) FLU-p1 GISKCRFLKIREGR SEQ ID NO : 5 Celis et al., 1990. (VIB Nm 247-260) MT 451-466 IAFNSGMEPGVVAEKV SEQ ID NO : 6 Gaston et al., 1991 MT 456-471 GMEPGVVAEKVRNLSV SEO ID NO : 7 Gaston et al., 1991 Derp 101-119 PNAQRFGISNYCQIYP SEQ ID NO : 8 Higgins, 1992 MAG 247-258 TQHFVQENYLEY SEQ ID NC : 9 Schultz et al., 2000 NY-ESO1 161-180 MWITQCFLPVFLAQPPSGQR SEQ ID NO:10 Zeng et ai., 2001 NY-ESO1 156-175 QLSLLMWITQCFLPVFLAQPP SEQ ID NO : 11 Zeng et al., 2001 UL21 283-293 RELWWVFYAGD SEQ ID NO : 12 Koelle et al., 2000 IL3 127-146 GPGAPADVQYDLYLNVANRR SEQ ID NO : 13 Falk et al., 1994 UNK1 EKKYFAATQFEPLAARL SEQ ID NO : 14 Falk et al., 1994 (UNK11-17) UNK2 KKYFAATQFEPLAARL SEQ ID NO : 15 Falk et al., 1994 (UNK 2-17) UNK3 EKKYFAATQFEPL SEQ ID NO : 16 Falk et al., 1994 (UNK 1-13) Les études précitées qui reposent sur l'isolement de clones de lymphocytes T CD4+ restreints aux molécules HLA-DP4 mettent en oeuvre un test fonctionnel (test de prolifération) qui n'a pas permis de mettre en évidence un motif de liaison aux molécules DP4, partagé par l'ensemble de ces peptides. En outre, ce test est très lourd à mettre en oeuvre du fait qu'il nécessite de nombreux patients correctement échantillonnés, de manière à ce qu'ils représentent la diversité des molécules HLA II de l'ensemble de la population. En outre, les épitopes définis sont ceux utilisés par le système immunitaire des patients lors de l'infection naturelle par un antigène ; ces épitopes ne sont pas nécessairement les plus efficaces pour induire une réponse immunitaire contre ce même antigène. En utilisant une autre approche, à savoir l'analyse de quatre peptides naturellement présents sur les molécules DP4 peptide 127-146 de la chaîne a du récepteur de l'IL3 (IL3 127-146 ; SEQ ID NO : 13) et trois peptides d'origine inconnue : UNKI (SEQ ID NO : 14), UNK2 (SEQ ID NO : 15) et UNK3 (SEQ ID NO : 16) ; Tableau III], FALK et al. (Immunogenetics, 1994,39, 230-242) ont proposé une séquence consensus de liaison aux molécules DP4. Cette séquence comprend trois résidus d'ancrage respectivement en positions Pl, P7 et P9/P10. PI et P7 sont hydro- phobes ou aromatiques (Y, V, L, F, I, A, M, W) et P9/P 1 0 sont de préférence alipha- tiques ; toutefois, un résidu Y est toléré en position P9/P10 mais pas un résidu F. Les résidus PI et P7 sont précédés de groupes de résidus chargés (K, R, E, N, Q pour PI et N, K, E pour P7), et des résidus de petite taille (A, V) sont fréquents en position P3 et P9. Le Tableau III montre que les seuls autres peptides ligands de DP4 présentant ce motif sont les peptides chevauchants NY-ESOI 161-180 et NY-ESO1 156-175. En conséquence, ce motif proposé par FALK et al. ne permet pas de définir un motif de liaison aux molécules DP4 partagé par l'ensemble des peptides ligands des molécules DP4, identifiés par des tests fonctionnels. Alors que des tests de liaison aux molécules DP9 (DONG et al., J Immunol., 1995,4536-4545) et DP2 (CHICZ et al., J Immunol., 1995,154, 4536- 4545), dérivés de ceux développés pour les molécules DR [MARSHALL et al., J Immunol., 1994,152, 4946 (HLA-DR1) ; Brevet FR 99 0879 et TEXIER et al., J. Immunol., 2000,164, 3177 (HLA-DR1,-DR2,-DR3,-DR4,-DR7,-DRU et-DR13)] permettent d'isoler des peptides spécifiques de respectivement DP9 et DP2, ces tests ne permettent pas d'isoler des peptides spécifiques de DP4 (CHICZ et al., précité) : les peptides isolés par le test de liaison à DP2 ont une forte affinité pour DP2 (activité de liaison En outre, du fait des différences importantes des résidus du site de liaison, entre les principales molécules DP, les tests de liaison développés pour ces molécules ne permettent pas d'identifier des peptides restreints à DP4. Ainsi, les motifs de liaison partagés par l'ensemble des peptides capables de se lier aux molécules HLA-DP4 n'ont pas été identifiés, notamment du fait qu'il n'existe pas de procédé d'identification de tels peptides qui soit simple à mettre en oeuvre et adapté au criblage simultané d'un grand nombre de peptides comme des banques de peptides chevauchants représentant la séquence d'antigène d'intérêt. Pourtant, compte tenu de la fréquence des molécules DP4, les peptides qui se lient aux molécules DP4 constituent des peptides candidats pour l'immunothérapie spécifique et la vaccination et pourraient servir au diagnostic de l'état immunitaire de patients ou d'individus normaux. Les Inventeurs ont donc développé un procédé de sélection de ligands d'HLA-DP4 qui leur a permis d'isoler des ligands spécifiques d'HLA-DP4, notamment des peptides et de préciser le motif de liaison partagé par les peptides ligands d'HLA-DP4, à partir des peptides obtenus. En conséquence, la présente invention a pour objet un procédé de sélection de molécules ligand d'HLA-DP4, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (i) incubation d'HLA-DP4 purifiée avec un traceur constitué par un peptide préalablement marqué et apte à être détecté par un signal approprié, lequel peptide traceur est choisi dans le groupe constitué par les peptides présentant un rapport signal/bruit de fond supérieur à 5, à la concentration de 10 nM, dans un test direct de liaison à HLA-DP4, et répondant à la formule générale (1) ZlXtX2X3X4XSX6X7XSX9Z2 dans laquelle : - Zl et Z2, identiques ou différents, sont nuls ou représentent chacun un peptide de 1 à 100 acides aminés naturels ou synthétiques, de préférence de 1 à 30 acides aminés ; de manière encore plus préférée, de 1 à 10 acides aminés, - X6 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe, - au moins Xl ou X9 représentent un acide aminé aromatique ou hydrophobe, et - X2, X3, X4, X5, X7 et Xg représentent chacun un acide aminé naturel ou synthétique, en présence de différentes concentrations de molécule (s) à tester, (ii) séparation des différents complexes formés, (iii) révélation des complexes HLA-DP4/peptide traceur par mesure du signal associé audit peptide traceur et (iv) sélection des molécules ligand qui présentent une activité de liaison ICo Les acides aminés aromatiques ou hydrophobes de la formule générale (I) telle que définie ci-dessus, constituent les résidus d'ancrage dans les poches de la molécule d'HLA-DP4. Ces résidus XI, X6 et X9 sont également dénommés respecti- vement résidus PI, P6 et P9. Parmi ces résidus, les résidus XI (ou PI) et X6 (ou P6) sont les résidus qui contribuent majoritairement à la liaison à HLA-DP4. Le résidu X9 ou P9 est moins important et contribue plus faiblement à la liaison à HLA-DP4. Au sens de la présente invention, on entend par : - acides aminés naturels ou synthétiques, les 20 a-acides aminés naturels communément trouvés dans les protéines (A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y et V), certains acides aminés rarement rencontrés dans les protéines (hydroxyproline, hydroxylysine, méthyllysine, diméthyllysine..), les acides aminés qui n'existent pas dans les protéines tels que la P-alanine, l'acide y-aminobutyrique, l'homocystéine, l'omithine, la citrulline, la canavanine, la norleucine, la cyclohexylalanine..., ainsi que les énantiomères et les diastéréoisomères des acides aminés précédents. - acide aminé hydrophobe, un acide aminé sélectionné parmi (code à une lettre) : A, V, L, I, P, W, F et M. - acide aminé aromatique, un acide aminé sélectionné parmi (code à une lettre) : F, W et Y. L'utilisation d'un peptide traceur, tel que défini à l'étape (i) permet de sélectionner effectivement des ligands spécifiques d'HLA-DP4, c'est-à-dire des molécules, notamment des peptides, qui présentent une bonne affinité pour HLA-DP4 c'est-à-dire une activité de liaison Un peptide traceur conforme à l'invention est sélectionné en mettant en oeuvre un test direct de liaison à HLA-DP4, par exemple en suivant les étapes (i) (ii) et (iii) du protocole défini ci-dessus mais en l'absence de compétiteur, correspondant à la molécule à tester. Le signal approprié détecté (fluorescence...) révèle les complexes HLA-DP4/peptide traceur [étape (iii)] et le bruit de fond représente le signal correspondant, obtenu en l'absence d'HLA-DP4. De préférence, Xl et X9 sont choisis dans le groupe constitué par F, W, L, Y, A, V et I et X6 est choisi dans le groupe constitué par F, W, Y, L et V. Des peptides traceurs conformes à l'invention sont représentés par les peptides TT 947-967 (SEQ ID NO : 1), NS-p2 (SEQ ID NO : 4), MAG 247-258 (SEQ ID NO : 9), UL21 283-293 (SEQ ID NO : 12), IL3 127-146 (SEQ ID NO : 13), UNK1 (SEQ ID NO : 14) et MAG 245-258 (SEQ ID NO : 19). Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, le peptide traceur est choisi dans le groupe constitué par les peptides biotinylés, radiomarqués et les peptides couplés à un fluorochrome. A l'étape (ii), la séparation des complexes formés des peptides non liés est effectuée par exemple, par transfert des complexes formés sur une plaque de microtitration préalablement recouverte d'un anticorps spécifique d'HLA-DP, par chromatographie sur une colonne de gel-filtration ou par centrifugation. Lorsque le peptide traceur est radiomarqué ou couplé à un fluorochrome, notamment à l'europium, les complexes HLA-DP4/peptide traceur sont détectés (signal obtenu) de manière directe par la mesure de la radioactivité ou de la fluorescence émise par lesdits complexes. Lorsque le peptide traceur est biotinylé, les complexes HLADP4/peptide traceur sont détectés (signal obtenu) de manière indirecte à l'aide de streptavidine conjuguée, par exemple par une révélation immunoenzymatique à l'aide de streptavidine conjuguée à une enzyme telle que la phosphatase alcaline et d'un substrat de la phosphatase alcaline tel que le 4-méthyl-umbelliféryl-phosphate (MUP). Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, le peptide traceur est utilisé à une concentration Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ladite HLA-DP4 de l'étape i) est choisie dans le groupe constitué par les molécules codées par les allèles DPA 1 * 103/DPB 1 *0401 et DPA1 *103/DPB 1 *0402. Le procédé selon l'invention permet avantageusement de sélectionner n'importe quel ligand d'HLA-DP4 ; il s'agit aussi bien de molécules minérales ou organiques comme les peptides et les pseudopeptides. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, lesdites molécules à tester représentent une banque de peptides chevauchants recouvrant la séquence d'un antigène. La présente invention a également pour objet des ligands d'HLADP4 susceptibles d'être obtenus par le procédé de sélection tel que défini ci-dessus, correspondant ou constitués par des molécules minérales ou organiques, naturelles ou synthétiques, présentant une activité de liaison à HLA-DP4 inférieure à 1000 nM. L'activité de liaison à HLA-DP4 d'une molécule ligand, telle que définie ci-dessus, correspond à la concentration de ladite molécule ligand qui inhibe 50 % de la liaison à HLA-DP4 d'un peptide traceur marqué, dans un test en compétition comme le procédé de sélection de ligands d'HLA-DP4 défini ci-dessus. Parmi ces molécules ligand, on peut citer notamment les peptides et les peptides modifiés tels que les glycopeptides, les lipopeptides, les peptides comprenant des acides aminés D, des liaisons pseudo-peptidiques (pseudo-peptides) ou des modifications des extrémités C-ou N-terminales pseudopeptides. La partie lipidique du lipopeptide ligand est notamment obtenue par addition d'un motif lipidique sur une fonction a-aminée desdits peptides ou sur une fonction réactive de la chaîne latérale d'un acide aminé de la partie peptidique ; elle peut comprendre une ou plusieurs chaînes, dérivées d'acides gras en C4-C20, éventuellement ramifiées ou insaturées (acide palmitique, acide oléique, acide linoléique, acide linolénique, acide 2-amino hexadécanoïque, pimélautide, trimétauxide) ou dérivées d'un stéroïde. Le procédé de préparation de tels lipopeptides est notamment décrit dans les Demandes internationales WO 99/40113 ou WO 99/51630. La partie lipi- dique préférée est notamment représentée par un groupe N'-acétyl-lysine N8 (palmitoyl), également dénommé Ac-K (Pam). Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide ligand d'HLA-DP4 tel que défini ci-dessus, sa séquence peptidique répond à la formule générale (1) Z [XtX2X3X4X3X6X7XgX9Z2, dans laquelle : - Zl et Z2, identiques ou différents, sont nuls ou représentent chacun un peptide de 1 à 100 acides aminés tels que définis ci-dessus, de préférence de 1 à 30 acides aminés ; de manière encore plus préférée, de 1 à 10 acides aminés, - X6 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe, - au moins XI ou X9 représentent un acide aminé aromatique ou hydrophobe, et - X2, X3, X4, Xs, X7 et X8 représentent chacun un acide aminé naturel ou synthétique, à condition que ledit peptide ligand d'HLA-DP4 de formule générale (1) ne corresponde à aucune des séquences SEQ ID NO : 1 à 17. Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide ligand, Xl et c X9 sont choisis dans le groupe constitué par F, Y, W, L, A, V et I et X6 est choisi dans le groupe constitué par F, W, Y, L et V. Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit peptide ligand, il se lie spécifiquement à DPB1*0401 (activité de liaison à DPB1*0401 au moins deux fois supérieure à l'activité de liaison à DPB 1 *0402) et X9 représente A, et/ou XI est différent de A, et/ou X4 est différent de K ou de R. Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit peptide ligand, il se lie spécifiquement à DPB 1 *0402 (activité de liaison à DPB 1 *0402 au moins deux fois supérieure à l'activité de liaison à DPB 1*0401) et Xl représente A, et/ou X4 représente K ou R, et/ou X9 est différent de Y. Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit peptide ligand, Z) et Z2 sont choisis dans le groupe constitué par : - les séquences de l'antigène qui sont adjacentes à l'épitope CD4+ c restreint à HLA-DP4 tel que défini ci-dessus, et/ou - un ou plusieurs épitopes T CD8+, et/ou - des épitopes CD4+ multiples, tels que le peptide 830-846 de la toxine tétanique TT (O'SULLIVAN et al., J Immunol., 1991,147, 2663-2669), le peptide 307-319 de l'hémagglutinine HA du virus de la grippe (O'SULLIVAN et al, précité), l'épitope Pan DR (PADRE), (ALEXANDER et al., DEL GUERCIO et al., FRANKE et al, précités) et des peptides issus des antigènes de Plasmodium falciparum tels que le peptide CS. T3 (SINIGAGLIA et al., Nature, 1988,336, 778-780) et les peptides CSP, SSP2, LSA-1 et EXP-1 (DOOLAN et al., J Immunol., 2000,165, 1123-1137) et/ou - un ou plusieurs épitopes B, par exemple un peptide ou un glycopeptide dans lequel ledit épitope B est constitué par un sucre (ALEXANDER et al., précité). De telles séquences permettent avantageusement de déclencher ou de moduler une réponse immunitaire, de manière appropriée. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux dudit peptide ligand, il présente la séquence SEQ ID NO : 84 correspondant au peptide NU-SOI 87-111. La présente invention englobe également les peptides ligands tels que définis ci-dessus, polymérisés. La présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour un peptide ligand tel que défini cidessus. L'objet de l'invention englobe également les molécules d'acide nucléique recombinantes comprenant au moins une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention liée à au moins une séquence hétérologue. 'ID Au sens de la présente invention, on entend par séquence hétérologue relativement à une séquence d'acide nucléique codant un peptide ligand, toute séquence d'acide nucléique autre que celles qui, dans la nature, sont immédiatement adjacentes à ladite séquence d'acide nucléique codant un peptide. L'objet de la présente invention englobe en particulier : a) des cassettes d'expression comprenant au moins une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention et les séquences nécessaires au contrôle de la transcription et de la traduction de ladite molécule d'acide nucléique (promoteur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation), et b) des vecteurs recombinants, comprenant un insert constitué par une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention. Avantageusement ces vecteurs d'expression, comprennent au moins une cassette d'expression telle que définie cidessus. De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser entre autres des vecteurs viraux tels que les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus et les AAV, dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d'intérêt ; on peut également associer ladite séquence (iso- lée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules-hôte, par exemple une préparation de liposomes, de lipides ou de polymères cationiques, ou bien l'injecter directement dans la cellule hôte, sous forme d'ADN nu. L'invention a en outre pour objet des cellules procaryotes ou euca- ryotes transformées par au moins une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention. Des cellules transformées conformes à l'invention peuvent être obtenues par tous moyens, connus en eux-mêmes, permettant d'introduire une molécule d'acide nucléique dans une cellule-hôte. Par exemple, dans le cas de cellules animales, on peut utiliser les vecteurs ou les préparation de lipides tels que définis cidessus. La présente invention a également pour objet une composition immunomodulatrice, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un ligand d'HLADP4 ou une molécule d'acide nucléique codant un peptide ligand d'HLA-DP4 tels que définis ci-dessus, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Avantageusement, ladite molécule d'acide nucléique est incluse dans un vecteur tel que défini ci-dessus. Selon le choix du ligand d'HLA-DP4 et de son mode de présentation (voie d'administration, dose, adjonction ou non d'adjuvant), une telle composition immunomodulatrice entraîne, soit une activation des lymphocytes T, soit leur anergie. En effet, il a été montré qu'une injection unique, par voie sous-cutanée, d'une faible quantité de peptide entraîne une anergie (OLDFIELD et al., 1. Immnol., 2001,167, 1734-1739. ). En revanche, il est connu que des injections répé- tées de quantités supérieures de peptide en présence d'adjuvant entraîne une activation des lymphocytes T. En outre, l'association à des peptides Zl et Z2 tels que définis cidessus, permet également d'augmenter la réponse immunitaire spécifique de l'antigène (ALEXANDER et al., précité). En conséquence, ladite composition est utilisée aussi bien pour la vaccination contre un agent pathogène ou une cellule tumorale, que pour le traitement des maladies autoimmunes (sclérose en plaques, diabète insulino-dépendant), de l'allergie ou du rejet de greffe. La présente invention a également pour objet un réactif de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un ligand d'HLA-DP4 tel que défini ci-dessus, éventuellement marqué ou complexé, notamment complexé à des molécules HLA-DP4 marquées (biotinylées), sous la forme de complexes multimériques comme des tétramères. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un ligand d'HLA-DP4 ou d'une molécule d'acide nucléique codant un peptide ligand d'HLADP4 tels que définis ci-dessus pour la préparation d'un médicament immunomodula- teur ou d'un réactif de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu. c Au sens de la présente invention, on entend par diagnostic de l'état immunitaire d'un individu, la détection de la présence, chez ledit individu, de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène issu d'un agent pathogène ou d'une cellule tumorale, d'un allergène, d'un alloantigène ou d'un autoantigène. 1 c Le réactif conforme à l'invention qui est apte à détecter la présence de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène est utilisé pour la détection : d'une infection par un agent pathogène, d'un cancer, d'une maladie autoimmune, d'une allergie ou d'un rejet de greffe, à partir d'un échantillon biologique d'un patient. La présente invention a également pour objet une méthode de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu comprenant les étapes de : - mise en contact d'un échantillon biologique dudit individu avec un réactif de diagnostic tel que défini ci-dessus, et - détection de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène par tout moyen approprié. La présente invention a également pour objet un kit de détection de l'état immunitaire d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un réactif tel que défini ci-dessus, associé à un moyen de détection de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène. La détection des lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène, est effectuée par tous moyens, connus en eux-mêmes. Par exemple, on peut utiliser des moyens directs comme les tests de prolifération lymphocytaire ou la cytométrie de flux en présence de complexes multimériques tels que définis ci-dessus, ou bien des moyens indirects comme le dosages de cytokines telles que l'IL2, 1'IL4, 1'IL5 et l'INFy, notamment par des techniques immunoenzymatiques (ELISA, RIA, ELISPOT). De manière plus précise : * pour ce qui concerne le test de prolifération : Une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec les peptides tels que définis ci-dessus ou des lymphocytes T clonés) est cultivée pendant 3 à 5 jours en présence desdits ligands d'HLA-DP4 et au besoin de cellules présentatrices appropriées, telles que des cellules dendritiques, des PBMC autologues ou hétéID rologues, des cellules lymphoblastoïdes telles que celles obtenues après infection par 1 : 1 le virus EBV ou des cellules génétiquement modifiées. La prolifération des cellules est mesurée par incorporation de thymidine tritiée dans L'ADEN des cellules. Les peptides tels que définis ci-dessus, permettent de révéler dans la suspension initiale la présence de cellules spécifiques de ces peptides. * pour ce qui concerne le test ELISPOT : Le test ELISPOT permet de révéler la présence de cellules T sécrétant de l'IFN-y, spécifiques d'un peptide tel que défini ci-dessus. De manière plus précise, les cellules T sont révélées par mesure de la sécrétion d'IFN-y après incubation des PMBC des patients avec lesdits peptides conformément à la méthode décrite dans la Demande Internationale WO 99/51630 ou Gahéry-Ségard et al., (J. Virol., 2000, 74, 1964). * pour ce qui concerne la mise en ceuvre de complexes multimériques et notamment de complexes tétramériques : - on met en contact un échantillon biologique, de préférence des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) avec des complexes tétramériques tels que définis ci-dessus, et - on analyse des cellules marquées par cytométrie de flux. De manière avantageuse, préalablement à la mise en contact de l'échantillon biologique avec ledit complexe, on l'enrichit en cellules T CD4+, en le mettant en contact avec des anticorps anti-CD4, pour enrichir ledit échantillon. Les tétramères sont préparés, comme précisé, par exemple dans NOVAK et al. (J. Clin. Investig., 1999,104, R63-R67) ou dans KURODA et al. (J. ., 2000,74, 18, 8751-8756). Brièvement, les tétramères sont fabriqués en incubant, pendant 72 heures à 37 C et dans un tampon phosphate citrate 10 mM, NaCI 0,15 M à un pH compris entre 4,5 et 7, des molécules HLA II solubles et biotinylées avec un excès d'un facteur 10 de ligands d'HLA-DP4 tels que définis ci-dessus. La forme tétramérisée est obtenue en ajoutant à la préparation de la streptavidine marquée par un fluorochrome en quantité quatre fois moindre (mole à mole) par rapport aux molécules HLA II. L'ensemble est incubé une nuit à température ambiante. Pour utiliser ces tétramères, on met en contact une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec les ligands d'HLA-DP4 tels que définis ci-dessus ou des lymphocytes T clonés) avec un ou plusieurs tétramères (10 à 20 mg/ml) pendant 1 à 3 heures. Après lavage, la suspension est analysée par cytométrie de flux : on visualise le marquage des cellules par les tétramères grâce au fait que ces constructions sont fluorescentes. La cytométrie de flux permet de séparer les cellules marquées par les tétramères des cellules non marquées et d'effectuer ainsi un tri cellulaire. La présente invention a ainsi, en outre, pour objet un procédé de tri de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : - mise en contact d'un échantillon cellulaire avec des tétramères marqués par un fluorochrome, préparés à partir de complexes entre des ligands d'HLA-DP4 tels que défini ci-dessus et des molécules HLA-DP4 solubles, et - tri des cellules liées audit tétramères, en cytométrie de flux. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'objet de la présente invention, avec références aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre l'activité de liaison de peptides aux molécules HLA-DP4 codées respectivement par DPB 1 *0401 (A) et DPB 1 *0402 (B), déterminée selon le procédé conforme à l'invention avec comme peptide traceur, le peptide UNKI biotinylé (10 nM) ; le pourcentage de liaison aux molécules DP4 est exprimé en fonc- tion de la concentration molaire des peptides. La liaison maximale (100 %) correspond à la valeur obtenue pour le peptide traceur seul, en l'absence de peptide compétiteur. EXEMPLE 1 : PRINCIPE DU TEST DE LIAISON HLA-DP4-PEPTIDE 1) Préparation des peptides Tous les peptides ont été synthétisés selon la stratégie Fmoc en synthèse parallèle sur phase solide, purifiés par HPLC et contrôlés par spectrométrie de masse (ES-MS). Les peptides sont biotinylés au niveau de leur résidu NH2 terminal, selon le protocole tel que décrit dans Texier et al., précité. 2) Préparation des anticorps Les anticorps spécifiques des molécules HLA-DP tel que l'anticorps B7/21 (WATSON et al., Nature, 1983, 304, 358-361), sont purifiés à partir du surnageant de culture des hybridomes correspondants, sur des colonnes de Protéine ASépharose. Ces anticorps sont ensuite couplés sur des colonnes Sépharose 4B ou protéine A-Sépharose pour la purification des molécules HLA-DP4. D'une manière plus précise, après centrifugation à 1100 g, le surnageant de culture des cellules productrices de l'anticorps B7/21 est filtré à 0,22 u. m et son pH est ajusté à 7-8 avec du tampon Tris-HCI 0,1 M, pH 8. Ce surnageant est ensuite appliqué sur une colonne de Protéine A Sépharose 4 Fast Flow de 10 ml, préalablement lavée avec 100 ml de tampon Tris-HCI 0,1 M, pH 8. Puis, la colonne est lavée avec 100 ml de tampon Tris-HCl 0,1 M, pH 8 et 100 ml de tampon Tris-HCl 0,01 M, pH8. Les anticorps sont élués avec le tampon glycine HCI 0,1 M, pH 3. Le rinçage de la colonne s'effectue avec 100 ml de tampon Tris-HCI 0,1 M, pH 8. La fraction éluée qui contient l'anticorps B7/21 est immédiatement neutralisée avec du tampon Tris-HCI 1 M, pH 8 avant d'être dialysée extensivement contre du tampon borate 0,1 M, pH 8,2. La quantité d'anticorps obtenus est déterminée à partir de la densité optique (D. O. ) à 278 nm. Les colonnes d'affinité destinées à la purification des molécules HLA-DP4 sont préparées de la manière suivante : 0,75 g de Protéine A Sépharose 4B (3 ml de gel final) sont mis à gonfler dans de l'eau puis dans du tampon borate 0,1 M pH 8,2. 15 mg d'anticorps monoclonal, tel que B7/21 en tampon borate 0,1 M pH 8,2 sont ajoutés au gel, préalablement centrifugé. Le couplage est effectué pendant deux heures à température ambiante puis contrôlé par l'absorbance à 278 nm du surnageant. Le gel est ensuite lavé successivement avec 100 ml de tampon borate 0,1 M, pH 8,2, 120 ml de tampon triéthanolamine 0,2 M, pH 8, 2 ; 120 ml de tampon diméthylpyrimidate 20 mM, triéthanolamine 0,2 M, pH 8,2 et 150 ml de tampon éthanolamine 0,2 M pH 8,2. Après coulage du gel, celui-ci est rincé avec 150 ml de tampon borate 0,1 M, pH 8, 2. Le contrôle final du couplage est effectué par une élution en tampon glycine z : l 0,1 M, pH 2,5, NaCl 0,5 M, l'absorbance à 278 nm des fractions de 1 ml devant être inférieure à 0,1. La colonne est immédiatement rincée par 50 ml de tampon borate 0,1 M, pH 8, 2 et 20 ml de tampon borate 0,1 M, NaN3 0,02 %, pH 8,2. Elle est conservée dans ce tampon à 4 C jusqu'à l'emploi. 3) Purification des molécules HLA-DP4 Les molécules HLA-DP4 sont purifiées à partir de différentes lignées humaines de lymphocytes B transformées par le virus Epstein Barr (EBV) homozygotes pour DP, par immunoaffinité au moyen d'anticorps monoclonaux spéci- 1 fiques de toutes les molécules DP. L'origine des lignées et les allèles qui les caractérisent sont indiqués dans le Tableau IV. Tableau IV Lignées Spécificité Allèle Allèle référence DP DPA1 DPB1 HOM2 DP4 DPA1*0103 DPB1*0401 * BOLETH DP4 DPA1*0103 DPB1*0401 * PITOUT DP4 DPA1*0103 DPB1*0401 SOUTHWOOD et al., précité HHKB DP4 DPA1*0103 DPB1*0401 DAVENPORTH et al, P. N.A.S., 1995,92, 6567. SHU DP4 DPA1*0103 DPB1*0402 * MLF DP4 DPA1*0103 DPB 1*0402 * BM92 DP4 DPA1*0103 DPB 1 *0402 * *l'origine des lignées est décrite sur le site internet de la Collection européenne de Culture Cellulaire e e (http ://fuseiv. co. uk/camr/.) La purification des molécules HLA-DP4 est effectuée à partir d'un culot de ces cellules humaines transformées par EBV, selon un protocole dérivé de ceux utilisés pour les molécules HLA-DR (GORGA et al., J BioI. Chem., 1987, 262, 16087 ; TEXIER et al., précité). D'une manière plus précise, 5 à 6. 109 cellules sont lysées à une concentration d'environ 108 cellules/ml en tampon de lyse (Tris 0, 01 M, NaCI 0, 15 M, NaN3 0, 02%, pH 7, NP40 1%, aprotinine 10 ng/ml, EDTA 5 mM, PMSF 10 M) dans la glace pendant 30 minutes. Le milieu de lyse est débarrassé des gros débris celluIn laires par centrifugation à 1100 g pendant 10 minutes à 4 C. Le surnageant est ensuite 1 : 1 C > ultracentrifugé à 100 000 g à 40C pendant 1 heure. La suite de la purification se c déroule en chambre froide à 4 C. Le lysat est passé successivement sur une colonne de Sépharose 4B (10 ml de gel préparés en PBS 1 x), une colonne de Protéine A Sépharose 4B (5 ml de gel préparés en PBS lx) puis sur la colonne d'affinité anti-DP. Les colonnes sont ensuite rincées par 250 ml de tampon de lyse. La colonne Sépharose 4B est jetée. La colonne Protéine A Sépharose 4B est rincée avec 25 ml de tampon TBS lx (Tris 0, 01 M, NaCI 0, 15 M, NaN3 0, 02%, pH 7) ; 50 ml de tampon (glycine, 0, 1 M ; NaCI 0, 5M, pH 2, 5) et 200 ml de tampon PBS lx, avant d'être stockée à 4 C. La colonne anti-DP est rincée avec 250 ml de tampon TBS contenant 1 mM de dodécyl maltoside (DM). Elle est ensuite éluée individuellement avec le tampon d'élution (TCOj 100 mM, NaCI 500 mM, NaN3 0, 02%, DM 1, 1 mM, pH 11, 5) en 15 fractions de 3 ml. L'éluat est immédiatement neutralisé avec 10% de tampon (Tris-HCI 2 M, pH 6, 8), puis dialysé extensivement à 4 C contre du tampon PBS lx contenant 1 mM de DM. 4) Test de liaison HLA-DP4-peptide Le test de liaison des peptides aux molécules HLA-DP4 est un test en compétition avec une révélation immuno-enzymatique, dérivé de celui mis au point pour des molécules HLA-DR (HLA-DR1 : MARSHALL et al., précité, HLA-DRI, - DR2,-DR3,-DR4,-DR7,-DRU et-DR13 : Brevet FR 99 0879 et TEXIER et al., précité). Il est effectué en plaques 96 puits, ce qui permet d'étudier de nombreux échantillons dans la même expérience. Brièvement, les molécules HLA-DP4 purifiées sont incubées avec un peptide biotinylé qui sert de traceur et différentes concentrations du peptide à tester. Le peptide biotinylé est un peptide ligand de DP4, il s'agit d'un peptide reconnu par des lymphocytes T CD4+ spécifiques de DP4 tel que ceux précisés dans le Tableau III ci-dessus ou d'un nouveau peptide isolé à l'aide du présent test de liaison à DP4. Parmi ces peptides, on peut citer par exemple le peptide UNKI ou le peptide IL3 127-146. L'incubation se fait dans un tampon, dont le pH peut varier. Il est généralement de 5, l'incubation dure généralement 24h. Après l'incubation, les échantillons sont neutralisés, puis 100 ul de chaque échantillon est transféré sur une plaque ELISA préalablement sensibilisée par un anticorps anti-DP, tel que B7/21. Les complexes molécules HLA-DP/peptides biotinylés fixés au fond de la plaque par l'intermédiaire de l'anticorps sont révélés au moyen de streptavidine phosphatase et d'un substrat fluorescent. L'activité de chaque peptide est caractérisée par la concentration qui inhibe 50 % de la liaison du peptide biotinylé (IC50). EXEMPLE 2 : DETERMINATION DES PARAMETRES DU TEST DE LIAISON 1) Peptide traceur a) Matériel et méthodes La liaison de peptides aux deux molécules DP4 (DP401 codé par l'allèle DP Al *0 1 03/DPB 1 *0401 et DP402 codé par l'allèle DPA1*0103/DPB1*0402) a été analysée en ELISA par le test direct de liaison suivant : Les molécules HLA-DP4 purifiées selon le protocole décrit à l'exemple 1 sont diluées 10 fois en tampon phosphate 10 mM (dilution 1/10). Elles sont ensuite incubées avec différentes concentrations d'un peptide biotinylé (10-6M, 10-7M et 10-8M) dans du tampon phosphate 10 mM, NACI 150 mM, DM 1 mM, citrate 10 mM, thimérosal 0, 00 3%, pH 5, dans des plaques 96 puits en polypropylène, pendant 24 h à 37 C. Des échantillons sans molécules DP4 sont utilisés comme témoin. A la fin de l'incubation, les échantillons sont neutralisés avec 50 jj. I de tampon Tris-HCI 450 mM2 pH 7, 5, thimérosal 0, 003 %, BSA 0, 3 %, DM 1 mM. Ils sont ensuite transférés sur des plaques ELISA maxisorp 96 puits sur lesquelles les anticorps anti-DP ont été préalablement adsorbés. Très exactement, 10) g/ml d'anticorps 1 : 1 anti-DP ont été incubés une nuit à 4 C (100 utl/puits) puis les plaques ont été saturées avec le tampon Tris-HCI 100 mM, pH 7, 5, BSA 0, 3 %, thimérosal 0, 003 % pendant une nuit à 4 C. L'incubation des échantillons sur ces plaques est réalisée pendant deux heures à température ambiante, comme la suite du test puis des lavages extensifs sont effectués entre chaque étape en tampon Tris-HCI 0, 1 M pH, 7, 5, Tween-20 0, 05%. Le peptide biotinylé lié aux molécules HLA-DP est détecté par l'ajout de 100 u. I/puits du conjugué streptavidine-phosphatase alcaline (45 minutes) dilué au 1/2000 dans le tampon Tris 10mM pH 7, NaCI 0, 15 M ; Tween 20 0, 05 %, BSA 0, 2 %, thimérosal 0, 003 %, puis par l'ajout de 200 u. I/puits du substrat MUP 100 uM en tampon NaHC03 0, 05 M pH 9, 8, MgCl2 1 mM. L'émission de fluorescence par le produit de la réaction enzymatique est mesurée à 450 nm après excitation à 365 nm et le rapport des valeurs obtenues avec ou dans DP4 est déterminé (RF = valeur de fluorescence en présence de DP4/valeur de fluorescence en l'absence de DP4). b) Résultats La liaison à la molécule DP401 de peptides dérivés des peptides ligands de DP4 précédemment décrits (Tableau III), a été testée : - peptide bUL21 283-302 (RELWWVFYAGDRALEEPHAE ; SEQ ID NO : 18) - pepti - peptide bIL3 127-146 (SEQ ID NO : 13) - peptide bMAG 245-258 (LLTQHFVQENYLEY ; SEQ ID NO : 19) - peptide bMT 451-466 (SEQ ID NO : 6) - peptide bNS-p2 (SEQ ID NO : 4) - peptide bTT 947-963 (FNNFTVSFWLRVPKVSA ; SEQ ID NO : 20) - peptide bUNKI (SEQ ID NO : 14) Deux peptides spécifiques respectivement de DR1 et de DR7 ont été utilisés comme témoin de la spécificité de liaison à DP4 : - peptide bHA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT ; SEQ ID NO : 21) décrit par HILL et al., 1. immunol., 1994,152, 2890, et - peptide bYKL (AAYAAAKAAALAA ; SEQ ID NO : 22) décrit par MARSHALL et al., précité. Les résultats sont illustrés par le Tableau V. Tableau V : Sélection des traceurs par un test direct de liaison à HLA-DP4 RF = valeur de fluorescence en présence de DP4/valeur de fluorescence en l'absence de DP4 peptide 10-6 M 10-7 M 10-8 M bUL21 283-302 8,3 13,3 10,1 bIL3 127-146 10 20 17,3 bMAG 245-258 1, 5 6, 7 5, 4 bMT 451-466 5, 5 4 2 bNS-p2 1 4, 2 7, 8 bTT 947-963 1 1, 7 3, 6 2, 7 bUNKI21, 6 21, 7 20 bHA 306-318 4,9 4,7 2,7 bYKL 4, 83 2 3 Les résultats montrent que : - les peptides bUNK1, bIL3 127-146 ont une forte capacité de liaison à DP4, - les peptides bTT 947-963 et bMT 451-466 ont une faible capacité de liaison et - les peptides bNS-p2, bUL21 283-302 et bMAG 245-258 ont une capacité de liaison intermédiaire. Les peptides présentant un RF Le peptide UNKI qui a donné les meilleurs résultats a été utilisé pour optimiser le test de liaison. 2) temps, pH, concentration du peptide traceur De manière à disposer d'un test sensible et spécifique de DP4, la concentration en molécules HLA-DP4, la concentration du peptide biotinylé, le pH et le temps d'incubation peptides-molécule HLA-DP4 ont été optimisés avec le peptide b UNK 1. a) Matériels et méthodes Les molécules HLA-DP4 purifiées selon le protocole décrit à l'exemple 1 ont été diluées au 1/10, 1/20,1/40 et 1/80, en tampon phosphate 10 mM ; NaCI 150 mM, DM 1 mM ; citrate 10 mM, thimérosal 0,003 % à différents pH (pH 4 ; 5 ; 5, 5 ; 6 ; 6,5 et 7), avec le peptide bUNKl à différentes concentrations et plusieurs concentrations de peptides compétiteurs dans des plaques 96 puits en polypropylène. A la fin de l'incubation à 37 C, les échantillons ont été neutralisés avec 50 J. I de tampon Tris-HCI 450 mM, pH 7,5, thimérosal 0,003 %, BSA 0,3 %, DM 1 mM. Ils ont ensuite été transférés sur des plaques ELISA maxisorp 96 puits sur lesquelles les anticorps anti-DP ont été préalablement adsorbés. Très exactement, 10 g/ml d'anticorps anti-DP ont été incubés une nuit à 4 C (100 j. I/puits) puis les plaques ont été saturées avec le tampon Tris-HCI 100 mM pH 7,5, BSA 0,3 %, thimérosal 0, 003 % pendant une nuit à 4 C. L'incubation des échantillons sur ces plaques a été réalisée pendant deux heures à température ambiante, comme la suite du test puis des lavages extensifs ont été effectués entre chaque étape en tampon Tris-cl 0,1 M, pH 7,5, Tween-20 0,05 %. Le peptide biotinylé lié aux molécules HLA-DP a été détecté par l'ajout de 100 ul/puits du conjugué streptavidine-phosphatase alcaline (45 minutes) diluée au 1/2000 dans le tampon Tris 10 mM pH 7, NaCI 0,15 M, Tween 20 0,05 %, BSA 0,2 %, thimérosal 0,003 %, puis par l'ajout de 200 ll/puits du substrat MUP 100 M en tampon NaHC03 0,05 M, pH 9,8, MgCL 1 mM. L'émission de fluorescence par le produit de la réaction enzymatique a été mesuré à 450 nm après excitation à 365 nm. La liaison maximale a été déterminée en incubant le peptide biotinylé avec la molécule de CMH II en l'absence de peptide compétiteur. La spécificité de liaison a été contrôlée par l'ajout d'un excès de peptide non biotinylé. Le bruit de fond obtenu ne diffère pas significativement de celui obtenu en incubant le peptide biotinylé sans les molécules de CMH II. Les résultats sont exprimés sous la forme de la concentration de peptide compétiteur qui inhibe 50 % de la liaison maximale du peptide marqué (ICo). b) Résultats Les conditions optimales sont présentées dans le Tableau VI : Tableau VI : Conditions du test de liaison aux molécules DP4 Molécules DPA1*0103/DPB1*0401 DPA1*0103/DPB1*0402 Peptide biotinylébUNK 1-17 bUNK 1-17 Concentration 10 nM 10 nM Ph 5 5 Temps d'incubation 24h 24h Concentration en HLA-DP4Dilution 1/20 à 1/40* * les dilutions indiquées sont effectuées à partir de la préparation de molécules HLA-DP4 purifiées obtenues à l'exemple 1. EXEMPLE 3 : SENSIBILITE ET SPECIFICITE DU TEST DE LIAISON AUX MOLECULES DP4 a) Spécificité Les résultats, illustrés par la figure 1 montrent que l'activité de liai- son mesurée dans le test est spécifique d'HLA-DP4 dans la mesure où : - des peptides connus pour être des ligands de molécules DP4 lient effectivement les molécules HLA-DP*0401 et 0402. Il s'agit du peptide IL3 127-147 1 (naturellement présent sur une molécule DP4), des peptides spécifiques de lymphocytes T CD4+ restreints à DP4 : NS-P2, TT947-963 et dans une moindre mesure le peptide MAG 245-258, et - des peptides connus pour lier d'autres molécules HLA II ne se lient pas aux molécules HLA-DP*0401 et 0402. Il s'agit des peptides : DQB 43-57 (DVEVYRAVTPLGPPD, SEQ ID NO : 23), HCI 46-63 (EPRAPWIEQEGPEYWDQE, SEQ ID NO : 24) et HA 306-318 (SEQ ID NO : 21) qui sont connus pour se lier respectivement à des molécules HLA-DQ3, HLA-DQ2 et HLA-DR (MARSHALL et al., précité, JOHANSEN et al., Immunogencics, 1996,45, 142). La spécificité du test résulte de l'utilisation : - d'un anticorps spécifique des molécules HLA-DP pour la purification et pour l'adsorption sur les plaques ELISA, et - du peptide biotinylé qui se lie avec une forte affinité, la figure 1 montre que le peptide UNK qui est la contrepartie non biotinylé du peptide traceur bUNK inhibe totalement la liaison du traceur aussi bien sur la molécule HLADPB 1 *0401 que sur la molécule DPB 1 *0402. b) Sensibilité La sensibilité du test est reflétée par l'IC5o observée avec le peptide non-biotinylé (UNK1) correspondant au traceur (bUNKI). La figure 1 indique des valeurs de respectivement 8 et 9 nM pour DPB 1*0401 et DPB 1 *0402, traduisant une bonne sensibilité. La figure 1 montre également que les activités de liaison des peptides aux molécules DPB 1*401 et DPBI*402, bien que comparables, sont distinctes. Ces résultats confirment que les molécules DPB 1*401 et DPB 1*402 présentent des différences qui peuvent être détectées par ce test de liaison. EXEMPLE 4 : CRIBLAGE DE PEPTIDES LIGANDS DE HLA-DP4 A PARTIR D'UNE BANQUE DE PEPTIDES 1) Matériels et méthodes Les peptides chevauchants couvrant la séquence totale de l'allergène majeur du venin d'abeille (Api ml), décrits dans le Brevet FR 99 00879, ont été synthétisés et soumis aux tests de liaison à la molécule DP401 et à la molécule DP402, dans les conditions définies dans le Tableau VI. 2) Résultats Les résultats sont présentés dans le Tableau VII, ci-après : Tableau VII : Liaison des peptides de Api ml aux molécules HLA-DPB1*0401 etDPBl*0402 peptid iso (nM) DP0401 DP0402 1-18 > 10000 > 10000 5-22 > 10000 > 10000 . 9-26 > 10000 > 10000 13-30 > 10000 > 10000 17-34 > 10000 > 10000 21-38 > 10000 > 10000 25-42 > 10000 > 10000 29-46 > 10000 > 10000 33-50 > 10000 > 10000 37-54 > 10000 > 10000 41-58 > 10000 > 10000 45-62 > 10000 > 10000 49-66 > 10000 > 10000 53-70 > 10000 > 10000 57-74 > 10000 > 10000 61-78 > 10000 > 10000 65-82 50000 6500 69-86 > 10000 > 10000 73-90 > 10000 > 10000 77-94 450 175 81-98 2250 1225 85-102 > 10000 > 10000 89-106 > 10000 > 10000 93-110 > 10000 > 10000 97-114 > 10000 > 10000 101-118 > 10000 > 10000 105-122 > 10000 > 10000 109-126 > 10000 > 10000 113-130 > 10000 > 10000 117-134 > 10000 > 10000 Ces résultats montrent que le peptide 77-94 de l'antigène majeur du venin d'abeille 94 (Api ml 77-94 : TISSYFVGKMYFNLIDTK, SEQ ID NO : 17) est un peptide ligand des molécules DPB 1 *0401 et DPB 1 *0402. EXEMPLE 5 : DETERMINATION DES MOTIFS DE LIAISON AUX MOLECULES DP4 1) Matériel et méthodes a) détermination d'un peptide minimum dérivé d'UNKI capable de se lier aux molecules DP4 Des peptides dérivés du peptide UNK1 (UNK 1-17, SEQ ID NO : 14) comprenant des délétions croissantes à l'une des extrémités NH2 ou COOH ou bien aux deux extrémités, ont été synthétisés. La séquence de ces peptides (UNK 1-11, 1- 12, 1-13, 2-14, 3-15, 4-16, 5-17, 6-17, 7-17, 3-17 et 1-15) correspondant respectivement aux SEQ ID NO : 25-26, 16 et 27-34 est présentée dans le Tableau IX. L'activité de liaison des peptides, exprimée par la valeur IC50, a été déterminée par le test de liaison en compétition, dans les conditions définies au Tableau VI. b) détermination des résidus du peptide UNKI impliqués dans la liaison aux molécules DP4 Des mutants du peptide UNK 3-15 (KYFAATQFEPLAA ; SEQ ID NO : 28) ont été synthétisés ; chaque mutant contient un seul des résidus Y4, F5, T8, Q9, F10, El 1, P12, L13 substitué en alanine ou en lysine, le résidu K3 substitué en alanine, ou bien l'un des résidus A6, A7, A14 et A15 substitué en lysine. La séquence de ces peptides (UNK K3A, Y4A, F5A, T8A, Q9A, FlOA. EllA, PI2A, L13A, Y4K, F5K, A6K, A7K, T8K, Q9K, FI0K, EllK, P12K, Ll3K, A14K et A15K) correspondant respectivement aux séquences SEQ ID NO : 35 à 55 est présentée dans le Tableau X. L'activité de liaison des peptides, exprimée par la valeur IC$o, a été déterminée par le test de liaison en compétition, dans les conditions définies au Tableau VI. La perte de liaison des peptides mutants est exprimée par le rapport des IC50 du peptide mutant et du peptide UNKI. c) détermination des motifs de liaison aux molécules DP401 et DP402 Les résidus F en PI, T en P4, F en P6 ou L en P9 du peptide UNK1 ont été substitués par l'un des résidus suivants : -Pl : Y, L, E, NouT - P4 : F, L, E, D, N, Y, R ou S - P6 : Y, L, W, E, N ou T - P9 : F, Y, E, D, N, R ou V. La séquence de ces peptides (UNK F5Y, F5L, F5E, F5T, T8F, T8L, T8E, T8D, T8N, T8Y, T8R, T8S, FI0Y, FIOL, FlOW, FIOE, FION, FlOT, L13F, L13Y, L13E, L13D, L13N, L13R, L13V) correspondant respectivement aux séquences SEQ ID NO : 56 à 81 est présentée dans le Tableau XI. La perte de liaison des peptides mutants aux molécules DP4 a été déterminée par le test décrit pour les mutants alanine et lysine. 2) Résultats a) détermination d'un peptide UNK1 minimum Les résultats sont présentés dans le Tableau IX, ci-après : Tableau IX : Liaison à DP401 et DP402 des peptides dérivés de UNKI (UNK 1-17) peptides Positions des séquences ICso (nM) 12345678910 11 12 13 14 15 16 17 401 402 UNK 1-17 E K K Y F A A T Q F E P L A A R L 11 14 UNK 1-11 E K K Y F A A T Q F E 55 95 UNK 1-12 E K K Y F A A T Q F E P 93 100 UNK 1-13 E K K Y F A A T Q F E P L 14 28 UNK2-14 K K Y F A A T Q F E P L A 15 23 UNK 3-15 K Y F A A T Q F E P L A A 19 23 UNK 4-16 Y F A A T Q F E P L A A R 38 25 UNK 5-17 F A A T Q F E P L A A R L 65 38 UNK 6-17 A A T Q F E P L A A R L 15000 6000 UNK7-17 A T Q F E P L A A R L 15000 12500 UNK 3-17 K Y F A A T Q F E P L A A R L 18 14 UNK 1-15 E K K Y F A A T Q F E P L A A 18 17 Les résultats obtenus montrent que : - la perte de liaison observée avec les peptides UNK 1-11, UNK 1- 12, UNK 4-16, UNK 5-17 suggère que le peptide minimum à une taille de 13 à 15 acides aminés, - la perte de liaison observée avec les peptides UNK 6-17 et UNK 7- 17 suggère que le résidu F en position 5 est le premier résidu d'ancrage des peptides dans le site de liaison des molécules DP4 (résidu PI). b) détermination des résidus du peptide UNK 1 impliqués dans la liaison aux molécules DP4 Les résultats sont présentés dans le Tableau X, ci-après : Tableau X : Perte de liaison à DP401 et DP402 des mutants alanine et lysine PEPTIDE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 DP*0401 DP'0402 UNKI E K K Y F A A T Q F E P L A A R L) t. OO UNK 3-15 K Y F A A T Q F E P L A A 1, 5 1, 7 PI Pi P6 P9 UNK K3A A Y F A A T Q F E P L A A 0, 9 \ UNK Y4A K A F A A T Q F E P L A A 1, 2 0, 9 UNK F5A K Y A A A T Q F E P L A A 41 5,7 UNK TSA K Y F A A A Q F E P L A A 0, 8 0, 8 UNK Q9A K Y F A A T A F E P L A A 0, 8 0, 6 UNK F10A K Y F A A T Q A E P L A A 336 62 UNK EIlA K Y F A A T Q F A P L A A 0, 5 0, 5 UNK P12A K Y F A A T Q F E A L A A 1, 2 0,9 UNK L13A K Y F A A T Q F E P A A A 3, 1 2,3 UNK Y4K K K F A A T Q F E P L A A 1, 2 1 UNK F5K K Y K A A T Q F E P L A A 569 297 UNK. A6K K Y F K A T Q F E P L A A 1, 6 1 UNK A7K K Y F A K T Q F E P L A A 2 1, 2 UNK T8K K Y F A A K Q F E P L A A 31 3,6 UNK Q9K K Y F A A T K F E P L A A 1, 6 0, 9 UNK FIOK K Y F A A T Q K E P L A A 420 350 UNK E11K K Y F A A T Q F K P L A A), 3 0,7 UNK P12K K Y F A A T Q F E K L A A 1, 8 1, 4 UNK : L ! 3K K Y F A A T Q F E P K A A 81 70 UNKA14K K Y F A A T Q F E P L K A 1, 7 1, 4 UNK A15K K Y F A A T Q F E P L A K 1, 7 1, 4 Les résultats montrent une perte de liaison pour F5A, FI OA, F5K, FIOK et L 13K, ce qui suggère fortement que les résidus d'ancrage des peptides dans le 1 : 1 1-D site de liaison des molécules DP4 sont respectivement la F5 en position PI, la FI 0 en position P6 et la L13 en position P9. c) détermination des motifs de liaison aux molécules DP401 et DP402 Les résultats sont présentés dans les Tableaux XI et XII, ci-après : Tableau XI : Perte de liaison à DP401 et DP402 des mutants en PI, P4, P6 et P9 PEPTIDE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 DP*0401 DP*0402 UNKI E K K Y F A A T Q F E P L A A R L 1, 00 1,00 UNK 3-15 K Y F A A T Q F E P L A A 1, 4 1, 4 Pi P4 P6 P9 UNS FRY K Y Y A A T Q F E P L A A 3 3, 9 UNK FSL K Y L A A T Q F E P L A A 3, 6 6 UNK F5E K Y E A A T Q F E P L A A 117 123 UNK : F5N K Y N A A T Q F E P L A A 398 76 UNK F5T K Y l A A T Q F E P L A A 234 126 UNK T8F K Y F A A F Q F E P L A A 2, 7 1, 7 UNK T8L K Y F A A L Q F E P L A A 1, 9 2,6 UNKKTSE K Y F A A E Q F E P L A A 2, 7 3, 7 UNK T8D K Y F A A D Q F E P L A A 2 2,3 UNK T8N K Y F A A N Q F E P L A A 4, 1 4, 8 UNK T8Y K Y F A A Y Q F E P L A A 4, 1 2,4 UNK T8R K Y F A A R Q F E P L A A 17 6, 7 UNK T8S K Y F A A S Q F E P L A A 2,7 3, 4 UNK F10Y K Y F A A T Q Y E P L A A 2, 4 3,4 UNK FIOL K Y F A A T Q L E P L A A 7, 2 6,7 UNS FLOW K Y F A A T Q W E P L A A 2,2 2, 5 UNK FIOE K Y F A A T Q E E P L A A 1405 1190 UNK FION K Y F A A T Q N E P L A A 2460 1809 UNK FIOT K Y F A A T Q T E P L A A 1171 476 UNK L13F K Y F A A T Q F E P F A A 1, 7 4 U1\K LI3Y K Y F A A T Q F E P Y A A 2 H UNK L13E K Y F A A T Q F E P E A A 11 11 UNK L13D K Y F A A T Q F E P D A A 9,4 9 UNK L13N K Y F A A T Q F E P N A A 17 10 UNK L13R K Y F A A T Q F E P R A A 64 43 UNK L13V K Y F A A T Q F E P V A A 2,5 1, 9 Tableau XII : Spécificité de la liaison aux molécules DP4* P1 P4 P6 P9 ±±±+. DP* F, Y, L F, Y, L F, Y, L, W F, Y, V 0401 T, 6 T, A, S A, T A K K, R K K. R E, N E, D, N E, N D E, N DP* F, Y, L F, Y, L F, Y, L, W F, V y 0402 A T T, A, S A, T A K K, R K K, R E, N E, D, N E, N D E, N Les acides aminés qui provoquent respectivement une perte de liaison d'un facteur supérieur à 10 et inférieur à 10 sont indiquées dans la colonne (-) et la colonne (+) ; les résidus d'ancrage sont représentés en gras et les différences entre DPB 1 *040 1 et DPB 1 *0402 sont soulignées. Les résultats obtenus montrent que : - les poches PI, P6 et P9 du site de liaison des molécules DP4 acceptent des résidus aromatiques et hydrophobes, - la poche P4 du site de liaison des molécules DP4 est très permissive, et - la spécificité des allèles DPB1*0401 et DPB1*0402 est liée aux résidus en PI et en P9 ; l'allèle DPB 1*0402 accepte un résidu alanine en PI, alors que ce résidu n'est pas accepté par DPB 1*0401 et l'allèle DPB 1*0401 accepte un résidu tyrosine en P9, alors que ce résidu n'est pas accepté par DPB 1*0402. d) Identification d'un motif de liaison dans la séquence de peptides ligands de DP4 L'activité de liaison de différents peptides ligands de DP4 a été mesurée par le test de liaison en compétition, dans les conditions définies au Tableau VI. Les résultats sont exprimés par la valeur ICo (Tableau XIV) ou par la valeur du rapport des ICo du peptide ligand et du peptide UNKI (Tableau XIII). Les peptides testés correspondant respectivement aux séquences SEQ ID NO : suivantes, sont présentés dans les tableaux XIII et XIV : - TT 947-963 (SEQ ID NO : 20), - UNK 1 (SEQ ID NO : 14), - NY-ES01 87-11, 119-143,158-180, 166-180 (SEQ ID NO : 94,83, 82,95), - UL21 283-302 (SEQ ID NO : 18), - IL3 127-146 (SEQ ID NO : 13) - NS-P2 (SEQIDNO : 4) - Api-m1 65-72,69-86, 73-90,77-94, 81-98 (SEQ ID NO : 85,88, 89, 17,86) - MAG 245-258 (SEQ ID NO : 19) - MART1 1-20,41-60, 51-73,62-72, 103-118 (SEQ ID NO : 90,91, 87,92, 93). En parallèle, les séquences de ces peptides ligands de DP4 ont été alignées et la présence d'un motif de liaison à DP4 tel que défini au Tableau XII, a été recherchée (Tableaux XIII et XIV). Tableau XIII : Alignement des séquences des peptides ligand de DP4 Peptides Séquences 0401 0402 P1 P6 P9 TT 947-963 FNNFTVSFWLRVPKVSA 0, 57 075 UNK1 EKKYFAATQFEPLAARL 1 1 NYESO1 158-180LLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR 2 7 UL21 283-302 RELWWVFYAGDRALEEPHAE 2, 86 278 iL3127-146 3 127-146 GPGAPADVQYDLYLNVANRR 3, 98 3,06 NS-p2 GVQIVRQIRSGERFLKIWSQ 4, 69 3,89 NY-ESO1 119-143 PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR 12 12 NY-ESO1 119-143 PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR 12 12 NY-ESO1 87-111 LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ 20 9 Api ml 77-94TISSYFVGKMYFNLIDTK30 10 Api m1 77-94 TISSYFVGKMYFNLIDTK 30 10 Api m1 65-72 DKFYDCLKNSADTSSYF NT 371,4 MAG 245-258 LbTQHFYQENYLEY 30, 2 38,89 Apl m1 81-98 YFVGKMYFNLIDTKCYKL 150 70 MART151-73RNGYRALMDKSLHVGTQCALTRR857 414 'U4U1 liaison des peptides a UPHT 0401 relativement au peptide UNK1 *0402 liaison des peptides à OPB1* 0402 relativement au peptide UNKl Tableau XIV : Liaison des peptides Api ml, NY-ES01 et MART1 à DPB1*0401 et DPB1*0402. ICso (nM) peptides Sequences 401 402 UNK1 EKKYFAATQFEPLAARL 12 13 Api ml 65-72 DKFYDCLKNSADTISSYF 50000 6500 Api ml 69-86 DCLKNSADTISSYFVGKM > 10000 > 10000 Api ml 73-90 NSADTISSYFVGKMYFNL > 10000 > 10000 Api ml 77-94 TISSYFVGKMYFNLIDTK 450 175 Api ml 81-98 YFVGKMYFNLIDTKCYKL 2250 1225 MART1 1-20 MPREDAHFIYGYPKKGHGHS > 10000 > 10000 MART1 41-60 LLIGCWYCRRRNGYRALMDK > 10000 > 10000 MART1 51-73** RRNGYRALMDKSLHVGTQCALTRR 8000 4000 ! MART1 62-72LMDKSLHVGTQCALTRRCPQ > 10000 > 10000 MARTl 103-118 AYEKLSAEQSPPPYSP > 10000 > 10000 NY-ES01 87-111 LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ 183 83 NY-ESO1 PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR 110 117 119-143*** NY-ES01 158-180 LLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR 20 67 NY-ES01 166-180FLPVFLAQPPSGQRR > 10000 > 10000 * Les acides amines compatibles avec le motit de liaison aux allèles DPBi*04Ul et DPB 1 *0402 sont indiqués en gras et les motifs de liaison complets sont soulignés. c ** La séquence de ce peptide est décrite dans Zarour et al., PNAS, 2000,97, 400-405. *** La séquence de ce peptide est décrite dans Zarour et al., Cancer Res., 2000,60, 4646- 4952. Les résultats montrent qu'il existe pour la plupart des peptides ligands de DP4 une forte corrélation entre la présence d'au moins 2 résidus PI et P6 ou P6 et P9 tels que définis au Tableau XII et une affinité élevée pour les molécules DP4 (ICo REVENDICATIONS 10) Procédé de sélection de molécules ligand d'HLA-DP4, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (i) incubation d'HLA-DP4 purifiée avec un traceur constitué par un peptide préalablement marqué et apte à être détecté par un signal approprié, lequel peptide traceur est choisi dans le groupe constitué par les peptides présentant un rapport signal/bruit de fond supérieur à 5, à la concentration de 10 nM, dans un test direct de liaison à HLA-DP4, et répondant à la formule générale (1) ZIXIXZX3X4XSX6X7XgX9ZZ, dans laquelle : - Z ; et Z2, identiques ou différents, sont nuls ou représentent chacun un peptide de 1 à 100 acides aminés naturels ou synthétiques, de préférence de 1 à 30 acides aminés ; de manière encore plus préférée, de 1 à 10 acides aminés, - X6 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe, - au moins Xl ou X9 représentent un acide aminé aromatique ou hydrophobe, et - X2, X3, X4, X, X ? et Xs représentent chacun un acide aminé naturel ou synthétique, en présence de différentes concentrations de molécule (s) à tester, (ii) séparation des différents complexes formés, (iii) révélation des complexes HLA-DP4/peptide traceur par mesure du signal associé audit peptide traceur, et (iv) sélection des molécules ligand qui présentent une activité de liaison ICo 2 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites molécules à tester représentent une banque de peptides chevauchants recouvrant la séquence d'un antigène. 3 ) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que l'HLA-DP4 de l'étape i) est choisie dans le groupe constitué par les molécules codées par les allèles DPA 1 * 103/DPB 1 *0401 et DPA 1 * 103/DPB 1 *0402. 4 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que dans ledit peptide traceur de formule générale (I), Xl et X9 sont choisis dans le groupe constitué par F, W, L, V, Y, A et I, et X6 est choisi dans le groupe constitué par F, W, Y, L et V. 5 ) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit peptide traceur est choisi dans le groupe constitué par les peptides de séquence SEQ ID NO : 1,4, 9,12, 13, 14 et 19. 6 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit peptide traceur est choisi dans le groupe constitué par les peptides biotinylés, radiomarqués et les peptides couplés à un fluorochrome. 7 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit peptide traceur est utilisé à une concentration 8 ) Ligand d'HLA-DP4 susceptible d'être obtenu par le procédé de sélection selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il correspond à une molécule minérale ou à une molécule organique, naturelle ou synthétique, présentant une activité de liaison à HLA-DP4 inférieure à 1000 nM. 9 ) Ligand d'HLA-DP4 selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite molécule organique est un peptide ou un peptide modifié tel qu'un glycopeptide, un lipopeptide ou un pseudopeptide. 10 ) Peptide ligand d'HLA-DP4 selon la revendication 9, caractérisé en ce que sa séquence peptidique répond à la formule générale (1) Z (XIX2X3X4X, X6X7X8X9Z2, dans laquelle : - Zl et Z2, identiques ou différents, sont nuls ou représentent chacun un peptide de 1 à 100 acides aminés naturels ou synthétiques, de préférence de 1 à 30 acides aminés ; de manière préférée, de 1 à 10 acides aminés, - X6 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe, - au moins Xl ou X9 représentent un acide aminé aromatique ou hydrophobe, et - X2, X3, X4, Xs, X7 et Xs représentent chacun un acide aminé naturel ou synthétique, à condition que ledit peptide ligand d'HLA-DP4, de formule générale (1) ne corresponde à aucune des séquences SEQ ID NO : 1 à 17. 11 ) Peptide selon la revendication 10, caractérisé en ce que : - Xi et X9 sont choisis dans le groupe constitué par F, W, L, V, Y, A et I, et X6 est choisi dans le groupe constitué par F, W, Y, L et V. 12 ) Peptide selon la revendication 10 ou la revendication 11, caractérisé en ce qu'il se lie spécifiquement à la molécule HLA-DPB1*0401 et en ce que Xg représente A, et/ou Xl est différent de A, et/ou X4 est différent de K ou de R. 13 ) Peptide selon la revendication 10 ou la revendication 11, caractérisé en ce qu'il se lie spécifiquement à la molécule DPB 1*0402 et en ce que Xi représente A, et/ou X4 représente K ou R, et/ou Xg est différent de Y. 14 ) Peptide selon la revendications 11, caractérisé en ce qu'il présente la séquence SEQ ID NO : 84. 15 ) Molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour un peptide selon l'une quelconque des revendications 10 à 14. 16 ) Cassette d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une molécule d'acide nucléique selon la revendication 15 et les séquences nécessaires au contrôle de la transcription et de la traduction de ladite molécule d'acide nucléique. 17 ) Vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend un insert constitué par une molécule d'acide nucléique selon la revendication 15 ou une cassette d'expression selon la revendication 16. 18 ) Cellule transformée par au moins une molécule d'acide nucléique selon la revendication 15 ou un vecteur selon la revendication 17. 19 ) Composition immunomodulatrice, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un ligand d'HLA-DP4 selon l'une quelconque des revendications 8 à 14 ou une molécule d'acide nucléique selon la revendication 15. 20 ) Réactif de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un ligand d'HLA-DP4 selon l'une quelconque des revendications 8 à 14. 21 ) Méthode de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu comprenant les étapes de : - mise en contact in vitro d'un échantillon biologique dudit individu avec un réactif de diagnostic selon la revendication 20, et - détection de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène. 22 ) Kit de détection de l'état immunitaire d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un réactif selon la revendication 20, associé à un moyen de détection des lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène. 23 ) Utilisation d'un ligand d'HLA-DP4 selon l'une quelconque des revendications 8 à 14 ou d'une molécule d'acide nucléique selon la revendication 15, pour la préparation d'un médicament immunomodulateur ou d'un réactif de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu. 24 ) Procédé de tri de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : - mise en contact de cellules avec des tétramères marqués par un fluorochrome, préparés à partir des complexes entre un ligand d'HLA-DP4 selon l'une quelconque des revendications 8 à 14 et des molécules HLA-DP4 solubles, et - tri des cellules liées audit tétramères, en cytométrie de flux.