Brevet FR2831168A1 — publié le 20030425

La présente invention concerne un procédé d'obtention d'un extrait riche en acides nucléiques (ADN eVou ARN) à partir d'une matière s végétale et notamment d'embryons végétaux ou de graines riches en acides nucléiques, principaiement pour une application en cosmétique. WO 84/03835 décrit une composition cosmétique destinée à éviter le vieillissement de la peau et à assurer la régénération des cellules de la peau. Cette composition renferme un extrait aqueux d'embryons végétaux o enrichi en ADN. Cet extrait est obtenu à partir de germes de blé eVou de soja en utilisant un grand nombre de traitement, dont des traitements par un détergent anionique et différents solvants dont le chloroforme et l'octanol. La présente invention vise à fournir un procédé d'obtention d'un s extrait riche en acides nucléiques à partir d'une matière végétale telle que des germes de blé qui soit simple à mettre en _uvre et donc industrialisable et qui fasse appel à des traitements non dénaturants comme cela peut étre le cas avec des détergents ou différents solvants organiques et en même temps ne laissant pas de trace de produits nocifs o et donc, conduisant à un produit final ayant une meilleure innocuité. La présente invention a ainsi pour objet un procédé d'obtention d'un extrait aqueux riche en acides nuclélques à partir d'une matière végétale, notamment d'embryons végétaux ou de graines riches en ADN ou en ARN, qui consiste à: s - extraire en milieu aqueux la matière végétale, en présence d'enzymes cellulolytiques à un pH initial de 9 à 13, - séparer la matière végétale pour récupérer un extrait aqueux, - traiter l'extrait par une protéase, - séparer les insolubles pour récupérer un extrait aqueux purifié. so La matière végétale utilisée est de préférence constituée d'embryons végétaux tels que des germes de blé ou de soda ou encore de 28311 68 graines riches en ADN ou en ARN et est de préférence utilisée sous forme broyée. Une taille après broyage inférieure à 300 microns est préférée. Pour le traitement par des enzymes cellulolytiques, on peut utiliser notamment des pectinases ou des cellulases. La matière végétale, en particulier des germes de blé, est utilisée avantageusement dans un rapport matière végétale / eau de 5 à 25% poids/volume. L'extractio n effcace d es acid es nucléiq u es est obtenu e en fixant le o pH initial à une valeur relativement basique (9 à 13). Au cours de l'extraction le pH évolue vers la neutralité, ce qui constitue un optimum pour l'action des enzymes cellulotytiques. La température de traitement est avantageusement inférieure à C et est de préférence de 20 à 60 C. La durée de traitement est s avantageusement de 1 à 2 heures et ce traitement est avantageusement effectué, après une dispersion rapide du mélange, sous agitation lente. La séparation de l'extrait aqueux brut de la matière végétale est effectuée à l'aide de dispositifs classiques, tels que filtres, essoreuses, tamis vibrant, et de préférence à l'aide d'un décanteur centrifuge. o L'extrait brut ainsi séparé est ensuite traité par une protéase en vue à la fois de favoriser une séparation ultérieure de produits insolubles et d'hydrolyser des protéines peu solub!es. Ce traitement permet en particulier d'éliminer ensuite une majeure partie de l'amidon encore présent dans l'extrait brut et de ce fait d'obtenir si on le souhaite un extrait sec final plus facilement resoiubilisable, avantage très précieux pour une incorporation ultérieure dans une composition cosmétique. La quantité de protésse utilisée dépend de l'activité enzymatique propre de l'enzyme du commerce utilisée. En général, le traitement par la protéase est effectué à un pH de 5 o à 8 dans des conditions de température, de durée et d'agitation, semblables à celles utilisées pour l'extraction initiale. 28311 68 La séparation des insolubles peut être effectuée selon des méthodes classiques. On préfère toutefois utiliser une ultrafiltration ou une microfiltration tangentielle en utilisant des membranes ayant le seuil de coupure 50 Kd à 0,4 m ou mieux à 0,2,um. s L'extrait aqueux purifié peut être utilisé directement. En général, il est toutefois Iyophilisé ou atomisé en vue d'une utilisation ultérieure. Le produit Iyophilisé ainsi obtenu peut contenir: ADN 0,1 à 1% en poids ARN 0,2 à 1,5% en poids. o Glucides 50 à 70% en poids Protéines 20 à 40% Minéraux 5 à 10% Vitamine B 5 à 50 mg / 100 g Lipides compositions cosmétiques. L'extrait purifié peut être utilisé dans des compositions cosmétiques à des teneurs de 0,01 à 1%, correspondant à des teneurs en ADN de l'ordre de 0,1 à 10 ppm et en ARN de l'ordre de 0,5 à 50 ppm. On donnera ci-après un exemple d'obtention d'un extrait obtenu à partir de germes de blé. 28311 68 EXEMPLE On utilise comme matière première végétale du germe de blé micronisé en poudre à une taille de 50 à 300 1lm. On ajoute les germes de blé à un milieu d'extraction à une teneur de 15%. Le milieu d'extraction contient comme enzymes des cellulases et hemicellulases (Viscozyme de Novozymes) à une dose de 0,1% en poids. Le pH initial est de11. Il se stabilise à environ 7 après quelques minutes. Après agitation rapide pour disperser le mélange, on maintient le o mélange sous agitation lente pendant 2 heures à 50 C. On fait ensuite passer le mélange dans un décanteur centrifuge à 2500 9. L'extrait brut est soumis à l'action de protéase (Flavourzyme de Novozymes) à 0,1% en poids à un pH d'environ 7 pendant 2 heures à s 50 C sous agitation lente. On effectue ensuite une séparation par filtration tangentielle avec une membrane ayant un seuil de coupure 50 Kd de 0,2 m. L'extrait purifié est immédiatement congelé et ultérieurement Iyophilisé. o On obtient une poudre beige ayant la composition suivante: ADN 0,13% en poids ARN 0,59% en poids Glucides 60% en poids Protéines 28% Cendres (minéraux) 8,4% Lipides 28311 68 TESTS L'efficacité de l'extrait d'ADN de germe de blé (extrait sec à 0, 13% d'ADN) a été testée sur une culture monocouche de fibroblastes dermiques humains normaux soumise ou non à une irradiation UVB (250mJ/cm2) . La concentration testée est de 2,26 1lg/ml d'ADN, concentration non cytotoxique. Les fi b robl astes so nt e n se mencés (passage P6) d a ns des plaques 24 puits à raison de 70 000 cellules/puits et laissés incubés dans une étuve pendant 24 heures à 37 C, 5% de CO2 et 95% d'humidité. Le milieu o de culture est composé de Duibecco's Modified Eagle Medium sans rouge de phénol contenant 4,5 g/l de glucose, 10% de sérum de veau nouveau né, 1 OOU/ml de pénicilline, 100 1lg/ml de streptomycine, 2 mM de glutamine et 1% d'une solution d'acides aminés non essentiels. TEST 1 Détermination de l'effet de l'extrait d'ADN de germe de blé sur la protection des fibroblastes dermiques humains normaux soumis aux UVB. Les cellules sont irradiées et traitées 24 heures après l'ensemencement. Les cellules sont irradices à 250 mJ/cm2 d'UVB et o l'extrait à tester est mis en contact avec les cellules pendant l'irradiation à la concentration de 2,26 g/ml d'ADN. De la même manière, on teste de l'ADN pur à la même concentration. L'extrait à togter et l'ADN pur sont dilués dans du tampon phosphate HBSS. En parallèle, un témoin positif (cellules non irradiées) et un témoin négatif (cellules irradiées mais non traitées) son réalisés. Après l'irradiation, les cellules sont rincées 2 fois à l'HBSS puis incubées 24 heures dans le milieu de culture défini précédemment. La protection des fibroblastes est évaluée par quantification de l'activité métabolique des déshydrogénases mitochondriales des cellules so par mesure d'hydrolyse du MTT (bromure de 3-{4,5-diméthylthiazol-2yl} -2,5 diphényl-tétrazolium). 28311 68 Les mesures sont réalisées 24 heures après l'irradiation. La solution de MTT est incubée pendant 3 heures à 37 C. Le MTT est ensuite éliminé et du diméthylsulfoxide est déposé dans chaque puits. Après 5 minutes d'agitation, la lecture est faite à 570 nm. Les résultats concernant l'effet de l'extrait d'ADN de germe de blé sur la protection cellulaire sont: Test % viabilité cellulaire Témoin non rradié I oa% Témoin irradié 51% Irradié avec ADN pur 78% ITadié avec extrait 105% L'extrait d'ADN de germe de blé, à la concentration de 2,26, ug/ml, o engendre une protection des fibroblastes très significative vis- à-vis des UVB. En effet, on observe une protection cellulaire de 47% par rapport aux cellules irradiées mais non traitées. TEST 2 s Détermination de l'effet de l'extraif d'ADN de germe de blé sur la régénérescence des fbroblastes dermiques humains normaux soumis aux UVB Les cellules sont irradiées et traitées 24 heures après l'ensemencement. Les cellules sont incubées dans du tampon phosphate o HBSS et irradiées à 250 mJ/cm2 d'UVB. Après l'irradiation, les cellules sont rincées 2 fois à l'HBSS puis incubées 24 heures avec l'extrait à tester à la concentration de 2,26 g/ml dans le milieu de culture défini précédemment. De la même manière, on teste de l'ADN pur à la même concentration. En parallèle, un témoin positif (cellules non irradiées) et un témoin négatif (cellules irradiées mais non traitées) sont réalisés. 28311 68 La régénérescence des fibroblastes est évaluée par quantification de l'activité métabolique des déshydrogénases mitochondriales des cellules par mesure d'hydrolyse du MTT. Les mesures sont réalisées 24 heures après l'irradiation. La s solution de MTT est incubée pendant 3 heures à 37 C. Le MTT est ensuite éliminé et du diméthylsulfoxide est déposé dans chaque puits. Après 5 minutes d'agitation, la lecture est faite à 570 nm. Les résultats concernant l'effet de l'extrait d'ADN de germe de blé sur la régénérescence cellulaire sont: Test % viabilité cellulaire Témoin non irradié 100 / Témoin irradié 65% Irradié avec ADN pur 65% Irradié avec extrait 93% L'extrait d'ADN de germe de blé, à la concentration de 2,26 1lg/ml, engendre une régénérescence des fibroblastes très significative après irradiation aux UVB. En effet, on observe une régénérescence cellulaire i5 de 35% par rapport aux cellules irradiées mais non traitées. 28311 68 REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un extrait aqueux riche en acides nucléiques à partir d'une matière végétale, notamment d'embryons s végétaux ou de graines riches en ADN ou ARN, qui consiste à: - extraire en milieu aqueux la matière végétale, en présence d'enzymes cellulolytiques à un pH initial de 9 à 13, - séparer la matière végétale pour récupérer un extrait aqueux, - traiter l'extrait par une protéase, o - séparer les insolubles pour récupérer un extrait aqueux purifié. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la matière végétale est constituée de germes de blé. ts 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel les enzymes cellulolytiques sont choisis parrni les pectinases et les cellulases. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le rapport matière végétale / eau est de 5 à 25% poids / volume. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel la séparation de la matière végétale d'un extrait aqueux brut est effectuée à l'aide d'un décanteur centrifuge. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la séparation des insolubles est effectuée à l'aide d'une