Brevet FR2810675A1 — publié le 20011228

L'invention concerne une construction pour l'expression d'un gène codant pour une protéine recombinante d'intérêt placé sous le contrôle de l'opéron tryptophane Ptrp dans une cellule hôte procaryote, qui comprend directement en aval du codon d'initiation une séquence nucléique de séquence SEQ ID N 1 et en aval de cette' séquence une cassette de clonage multiple destinée à recevoir le gène codant pour ladite protéine recombinante d'intérêt, au moins un des nucléotides de la séquence SEQ ID N 1 étant muté ou délété de façon à permettre und surexpression de ladite protéine recombinante. L'invention a encore pour objet un vecteur contenant une telle construction, une cellule hôte procaryote transformée par ledit vecteur, tout comme un procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt utilisant une construction selon l'invention. La capacité des biotechnologistes à cloner un gène dans des délais réduits, à l'exprimer sous la forme d'une protéine biologiquement active puis à en créer des variants pour établir des relations séquence/fonction a permis de proposer un large éventail de protéines recombinantes à usage médical ou de recherche. De nombreuses maladies humaines sont désormais traitées ou évitées grâce à la disponibilité de molécules issues des biotechnologies sous forme pure et à un coût acceptable (Koths, 1995). Les cellules bactériennes sont des hôtes privilégiés pour l'expression de protéines recombinantes car elles ont des exigences nutritives limitées tout en étant capables d'atteindre des densités de croissance élevées, mais aussi parce qu'elles ont fait l'objet dans le passé d'investigations nombreuses qui ont conduit à la génération de mutants d'intérêt et de systèmes d'expression plasmidiques variés. Parmi les bactéries, Escherichia coli (E. coli) est l'organisme le plus utilisé et le mieux caractérisé si l'on en juge par l'abondante littérature y relatant l'expression de protéines d'origine procaryote ou eucaryote. Cependant, toutes les protéines n'y sont pas exprimées avec la même efficacité en raison de difficultés pouvant intervenir à différents niveaux : transcription du gène d'intérêt, traduction, événements post-traductionnels affectant le devenir de la molécule dans l'environnement cytoplasmique ou périplasmique de la bactérie (Makrides, 1996). Pour être traduit efficacement, un ARN messager doit contenir une séquence spécifiant la fixation du ribosome bactérien et permettant l'initiation de la traduction. Cette séquence, appelée site de fixation au ribosome Ribosome Binding Site (RBS) est située dans une zone recouvrant le codon initiateur. L'analyse statistique des domaines d'initiation des ARNm bactériens révèle l'existence d'une fenêtre de 34 nucléotides dont la séquence diffère d'une distribution aléatoire (Gold,' 1988). Cette séquence, allant de la position - 20 à la position + 13 de l'ARNm si l'on affecte la position + 1 au premier nucléotide du codon initiateur, joue le rôle de RBS en aidant le ribosome à distinguer les vrais domaines d'initiation parmi l'ensemble des séquences RBS-like . De nombreuses investigations ont permis d'affiner la connaissance du RBS pour en définir quelques éléments caractéristiques : i) La séquence Shine-Dalgarno (SD) : Depuis le séquençage de l'extrémité 3' de l'ARN ribosomal 16S (Shine and Dalgamo, 1974), la séquence dite de Shine-Dalgarno a été définie comme la région des ARNm en 5' du codon d'initiation possédant une complémentarité avec la séquence 5'CCUCCUUA-3' de l'extrémité 3' de l'ARNr 16S. L'existence d'une interaction entre l'ARNr 16S et le RBS médiée par la séquence de Shine-Dalgarno est confirmée par la forte représentation des bases puriques A et G dans la région [-12 ; -7] des RBS naturels d'ARNm d'E. coli. Ce biais est retrouvé dans une collection de 158 RBS randomisés et sélectionnés pour leur capacité à promouvoir l'expression d'un gène rapporteur (Barrick et al., 1994). ii) Le codon d'initiation : C'est le codon AUG qui est utilisé préférentiellement comme codon d'initiation, même si GUG et dans une moindre mesure UUG peuvent être trouvés occasionnellement (Ringquist et al., 1992). iii) La distance entre la séquence SD et le codon d'initiation : Une étude exhaustive de Chen et al. (1994a) a montré l'existence d'une distance optimale séparant l'extrémité 3' de la séquence Shine-Dalgarno et le codon d'initiation. En prenant la séquence consensus 5'-UAAGGAGGU-3' comme séquence SD de référence, l'espacement donnant le niveau d'expression maximal est de 5 nucléotides. Un espacement compris entre 1 et 9 nucléotides demeure favorable en assurant un niveau d'expression au moins égal à 50 % du niveau maximal. iv) Autres séquences primaires : Deux appariements sont connus pour intervenir dans l'initiation de la traduction : l'appariement entre codon d'initiation de l'ARNm et ARNt-fMet d'une part et l'appariement entre séquence SD et extrémité 3' de l'ARNr 16S d'autre part. Des études de mutagénèse et l'analyse d'ARNm atypiques (notamment des ARNm-dépourvus de séquence leader) ont permis d'identifier de nouveaux éléments de séquences dans l'environnement du codon AUG pouvant contribuer à l'efficacité globale du domaine d'initiation. Des motifs riches en adénines immédiatement en aval du codon d'inition sont favorables à l'initiation de la traduction (Scherer et al., 1980 ; Chen et al., 1994b). De même, les codons AAA et GCU qui sont les plus fréquents en position de seconds codons (Gold, 1988) ont un effet positif sur la traduction, surtout lorsque le codon d'initiation est sub-optimal (GUG ou UUG) (Ringquist et al., 1992). Une séquence identifiée sur l'ARNm du gène 0. 3 du phage T7 et nommée Downstream Box (DB) en raison de sa position avale par rapport au codon d'initiation est un autre élément favorisant la traduction (Sprengart et al., 1990). Cette séquence de 12 nucléotides possède une complémentarité avec les nucléotides 1469-1483 de l'ARNr 16S et elle est retrouvée sous des formes semblables sur des domaines d'initiation de la traduction de plusieurs gènes d'E. coli et de bactériophages fortement exprimés (Sprengart et al., 1990). Cette Downstream Box permet l'initiation de la traduction même en l'absence de séquence SD (Sprengart et al., 1996). Des résultats récents indiquent que, contrairement à l'hypothèse initialement émise, la séquence DB agirait par un mécanisme autre qu'un appariement avec la région 1469-1483 de l'ARNr 16S (O'Connor et al., 1999). v) Les structures secondaires : La séquence de l'ARNm à proximité de la région SD peut influencer l'efficacité traductionnelle par le biais de la formation de structures secondaires. De Smit et van Duin (1994) montrent que des appariements intramoléculaires sur l'ARNm peuvent nuire à une bonne traduction en entrant en compétition avec l'appariement ARNm / ARNr, et ce d'autant plus que la complémentarité de la région SD avec l'ARNr 16S est faible. De la même manière, il a été montré que l'expression de prochymosine dans E. coli était dépendante de la composition de la région reliant SD au codon d'initiation : une séquence limitant les structures secondaires favorise l'accessibilité du RBS au ribosome et entraîne une efficacité traductionnelle forte (Wang et al., 1995). Etant donné l'importance de l'étape d'initiation de la traduction sur le rendement d'expression des protéines recombinantes, de nombreuses études ont été menées dans le but d'optimiser la région RBS de vecteurs d'expression bactériens. Une approche intuitive a d'abord consisté à placer la région SD consensus complète (UAAGGAGGU) en amont de gènes d'intérêt (Jay étal, 1981). De manière plus systématique, Marquis :;1 al. (1986) ont placé cette séquence en aval de différents promoteurs et à une distance variable (5 à 9 nucléotides) du codon d'initiation. Avec le gène de l'IL-2 comme modèle, les résultats indiquent qu'un espacement SD/ AUG de 6 nucléotides est optimal pour presque tous les promoteurs testés. Dans une étude comparative entre la séquence SD consensus et la séquence SD du gène lacZ, Mandecki et al. (1986) ont cependant noté que la séquence SD consensus donnait une expression supérieure in vitro mais 2 à 2,5 fois plus faible que celle de lacZ in vivo. Des régions RBS entières issues de gènes de phages avec leur propre séquence SD se sont révélées elles aussi supérieures à la séquence SD consensus pour l'expression de protéines de différentes origines (plantes, cellules de mammifères, bactéries) (Olins et al., 1988). Utilisant le promoteur tryptophane, Curry et Tomich (1988) ont comparé l'efficacité de la séquence SD consensus avec celle présente naturellement dans Ptrp. Leurs résultats indiquent une dépendance très forte vis-à-vis du gène d'intérêt étudié, pour conclure à une impossibilité de construire un vecteur optimal fonctionnant pour tous les gènes hétérologues. Travaillant eux aussi à partir du promoteur tryptophane et de la séquence SD consensus, Olsen et al. (1989) ont obtenu des niveaux d'expression très élevés (20 à 30 % des protéines totales) pour différentes protéines hétérologues (hormones de croissance, TNF) en enrichissant les séquences flanquantes de la région SD en nucléotides A et T. Des résultats similaires avaient été décrits auparavant par De Boer et al. (1983) qui notaient l'effet positif des bases A et T placées en aval de la région SD dans le contexte du promoteur hybride Ptrp/ PlacUV5 exprimant l'interféron a. Tous ces résultats ont été obtenus dans le cadre d'expériences où un nombre limité de paramètres étaient pris en compte. Conscients du nombre important des facteurs, connus ou non, influents dans l'initiation de la traduction, et surtout du rôle a priori non négligeable des interactions entre facteurs qui ne sont pas prises en compte lors d'approches itératives, des auteurs ont par la suite essayé de sélectionner in vivo des RBS synthétiques optimaux à partir de librairies aléatoires de grande taille. Wilson et al. (1994) ont ainsi criblé un répertoire de séquences dégénérées sur 16 positions en amont du codon d'initiation, au sein d'une cassette d'expression contenant le gène de la sslactamase sous le contrôle du promoteur/opérateur lac. Une telle approche a permis d'identifier des séquences ordinales exprimant la P-lactamase avec une efficacité 3 fois supérieure. Avec un autre gène codant pour un scFv, le niveau de surexpression par rapport au RBS d'origine est d'environ 2 fois. Il est établi au vu de ces résultats que des régions RBS décrites comme optimales le sont toujours dans un contexte particulier où interviennent à la fois la séquence du gène d'intérêt et la séquence de la région leader de l'ARNm qui dépend elle-même du type de promoteur utilisé. Le promoteur tryptophane (Nichols and Yanofsky, 1983) est un des systèmes majeurs utilisés en expression de protéines recombinantes (Yansura and Henner, 1990 ; Yansura and Bass, 1997) mais son RBS n'a jamais fait l'objet d'une optimisation systématique par une approche basée sur le criblage de séquences aléatoires. L'intérêt du biotechnologiste désireux de développer des procédés à échelle industrielle est de disposer d'outils garantissant une expression maximale, quelle que soit la protéine d'intérêt. Il existe dès lors un fort intérêt pour toute amélioration permettant d'optimiser l'expression de protéines recombinantes, que les améliorations soient apportées par la souche hôte, par le vecteur d'expression, par le procédé de culture et d'expression ou par toute combinaison entre ces facteurs. Plus particulièrement, la présente invention démontre l'avantage en termes d'efficacité traductionnelle de nouvelles séquences nucléotidiques portées par un vecteur d'expression, dans la région du Ribosome Binding Site (RBS), en aval du promoteur tryptophane (Ptrp). Par l'utilisation d'oligonucléotides dégénérés introduits en amont du codon d'initiation puis par sélection de clones surexprimant le gène rapporteur de la chloramphénicol acétyl-transférase (CAT), la demanderesse a recherché de nouvelles séquences RBS optimisées. En recherchant des séquences optimisées en amont du codon d'initiation, il a été découvert de manière tout à fait surprenante que la séquence nucléique située directement en aval du codon d'initiation pouvait être mutée ou délétée de façon à surexprimer des protéines recombinantes. Les séquences ainsi obtenues présentent un caractère d'amélioration vis-à-vis de l'expression de différents gènes d'intérêt de diverses origines. De plus, un problème actuel majeur au regard des contraintes actuelles de qualité est d'obtenir une protéine recombinante la plus pure possible, c'est-à-dire avec un minimum d'acides aminés greffée en amont ou en aval de la protéine recombinante, acides aminés provenant de la construction utilisée. Lorsque la séquence nucléique située entre le codon d'initiation et le premier site de clonage présente des délétions de façon à surexprimer des protéines recombinantes, ce problème est aussi résolu par la présente invention. La présente invention a ainsi pour objet une construction pour l'expression d'un gène codant pour une protéine recombinante d'intérêt placé sous le contrôle du promoteur de l'opéron tryptophane Ptrp dans une cellule hôte procaryote comprenant directement en aval du codon d'initiation une séquence nucléique de séquence SEQ ID N 1, et en aval de cette séquence une cassette de clonage multiple destinée à recevoir le gène codant pour ladite protéine recombinante d'intérêt, caractérisée en ce qu'au moins un des nucléotides de la séquence SEQ ID N 1 est muté ou délété de façon à permettre une surexpression de ladite protéine recombinante. Il est d'autant plus surprenant d'obtenir une surexpression grâce à l'objet de l'invention, alors que l'art antérieur enseigne d'utiliser cette séquence SEQ ID N 1 telle qu'elle. On peut notamment citer à cet effet les brevets US 5,714,589, US 5,468,845, US 5,418,135, US 4,891,310, US 4,789,702, WO 88/09344, US 4,738,921 et EP 0 212 532 qui enseignent l'utilisation de la séquence SEQ ID N 1 en aval du codon d'initiation pour l'expression de protéines d'intérêt. Par protéine recombinante d'intérêt, on entend désigner toutes protéines, polypeptides ou peptides obtenus par recombinaison génétique, et susceptibles d'être utilisés dans des domaines tels que celui de la santé humaine ou animale, de la cosmétologie, de la nutrition animale, de l'agro-industrie ou de l'industrie chimique. Parmi ces protéines d'intérêt, on peut citer en particulier, mais sans s'y limiter : - une cytokine et notamment une interleukine, un interféron, un facteur de nécrose tissulaire et un facteur de croissance et notamment hématopoïétique (G-CSF, GM- CSF), une hormone de croissance humaine ou l'insuline, un neuropeptide ; - un facteur ou cofacteur impliqué dans la coagulation et notamment le facteur VIII, le facteur von Willebrand, l'antithrombine III, la protéine C, la thrombine et l'hirudine ; - une enzyme et notamment la trypsine, une ribonucléase et la p-galactosidase ; - un inhibiteur d'enzyme tel que l'al antitrypsine et les inhibiteurs de protéase:: "'raies ; - une protéine capable d'inhiber l'initiation ou la progression de cancers, telle que les produits d'expression de gènes supresseurs de tumeurs, par exemple le gène P53 ; - une protéine capable de stimuler une réponse immunitaire ou un antigène, telle que par exemple les protéines, ou leurs fragments actifs, de la membrane de bactérie Gram négatif, en particulier les protéines OmpA de Klebsellia ou la protéine G du virus respiratoire syncytial humain ; - un anticorps monoclonal humanisé ou non ou un fragment d'anticorps tel qu'un scFv ; - une protéine capable d'inhiber une infection virale ou son développement, par exemple les épitopes antigéniques du virus en cause ou des variants altérés de protéines virales susceptibles d'entrer en compétition avec les protéines virales natives ; - une protéine susceptible d'être contenue dans une composition cosmétique telle que la substance P ou une superoxyde dismutase ; - une protéine alimentaire et notamment un alicament ; - une enzyme capable de diriger la synthèse de composés chimiques ou biologiques, ou capable de dégrader certains composés chimiques toxiques ; ou encore - toute protéine ayant une toxicité vis-à-vis du micro-organisme qui la produit, en particulier si ce micro-organisme est la bactérie E. coli, comme par exemple la protéase du virus VIH-1, la protéine ECP "Eosinophil Cationic Protein" ou les protéines 2B et 3A du poliovirus. Par séquence nucléique de séquence SEQ ID N 1 dont au moins un des acides nucléiques est muté ou délété de façon à permettre une surexpression de ladite protéine recombinante, on entend toute séquence qui comporte une délétion ou une mutation d'au moins un nucléotide de la séquence SEQ ID N 1 qui permet une surexpression de la protéine recombinante, par rapport à l'expression de ladite protéine recombinante obtenue en utilisant la séquence SEQ ID N 1 non modifiée. Par délétion, on entend l'élimination d'un ou plusieurs nucléotides à un ou différents sites nucléotidiques de la séquence SEQ ID N 1. La séquence résultante se trouve raccourcie par rapport à celle d'origine. Par mutation, on entend le remplacement d'un nucléotide par un autre (A par C, G ou T ; par A, G ou T ; par A, C ou T ; T par A, C ou G). La séquence restante a la même taille que celle d'origine. La surexpression, c'est-à-dire le fait d'obtenir une expression supérieure à celle obtenue sans la modification en aval du codon d'initiation peut être déterminée notamment en utilisant une des méthodes suivantes : i) migration par SDS-PAGE des protéines totales de la bactérie et révélation de la protéine recombinante par coloration au Bleu de Comassie ou par Western-blot ; ii) dosage de la protéine recombinante par une méthode mettant en jeu un anticorps spécifique (Elisa) ; iii) dosage enzymatique si la protéine recombinante est dotée d'une activité catalytique. Préférentiellement, on utilise la méthode ii), détaillée dans l'exemple III. Par cassette de clonage multiple, on entend une séquence nucléotidique contenant un ou plusieurs sites de restriction, lesquels sites peuvent être utilisés lors d'étapes de clonage du gène d'intérêt en aval du codon d'initiation. Préférentiellement, ledit au moins nucléotide de la séquence SEQ ID N 1 est délété de façon à permettre une surexpression de ladite protéine recombinante. L'invention concerne également une construction selon l'invention dans laquelle ledit au moins nucléotide muté ou délété, préférentiellement délété, est situé sur le fragment de séquence SEQ ID N 2 de la séquence SEQ ID N 1. Un autre objet de l'invention concerne les constructions dans lesquelles ledit au moins nucléotide muté ou délété, préférentiellement muté, est situé sur le codon GTA et/ou sur le codon GCA et/ou sur le codon CTG de la séquence SEQ ID N 1. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite séquence SEQ ID N 1 dont au moins un des nucléotides est muté ou délété, présente au moins en position 1, 2 et 3, le nucléotide A. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, au moins un des nucléotides, et préférentiellement tous les nucléotides, situés entre la séquence nucléique de séquence SEQ ID N 1 et la cassette de clonage multiple destinée à recevoir le gène codant pour ladite protéine recombinante d'intérêt, sont délétés. Dans un autre mode de réalisation encore plus préféré de l'invention, ladite séquence SEQ ID N 1 dont au moins un des acides nucléiques est muté ou délété et tous les nucléotides sitiés entre la séquence nucléique de séquence SEQ ID N 1 et la cassette de clonage multiple sont totalement délétés, de façon à ce que le codon d'initiation se trouve directement en amont de la cassette de clonage multiple. Dans une forme de réalisation préférée de l'invention, les constructions contiennent une séquence nucléique directement en amont du codon d'initiation choisie parmi les séquences de séquence SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5, SEQ ID N 6, SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9 et SEQ ID N 10. L'invention comprend une construction selon l'invention, caractérisée en ce que la cellule hôte procaryote est une bactérie gram négative, de préférence appartenant à l'espèce E. coli. Un autre objet de l'invention concerne un vecteur contenant une construction telle que définie ci-avant, tout comme une cellule hôte procaryote, de préférence appartenant à l'espèce E. coli, transformée par un tel vecteur. La présente invention a aussi pour objet un procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt dans une cellule hôte utilisant une construction telle que définie ciavant. La présente invention a encore pour objet un procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt selon l'invention, dans lequel ladite construction est introduite dans une cellule hôte procaryote, préférentiellement par un vecteur tel que défini ci-avant. On préfère un procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) le clonage d'un gène d'intérêt dans un vecteur selon l'invention ; b) la transformation d'une cellule procaryote par un vecteur contenant un gène codant pour ladite protéine recombinante d'intérêt ; c) la culture de ladite cellule transformée dans un milieu de culture permettant l'expression de la protéine recombinante ; et d) la récupération de la protéine recombinante à partir du milieu de culture ou de ladite cellule transformée. Les exemples et figures qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Légende des figures et des tableaux : Figure 1 : Carte du vecteur plasmidique pTEXmpl8 et séquence SEQ ID N 39 de la région 1-450 comprenant le promoteur/opérateur Ptrp, la région du leader TrpL, le site de clonage multiple mp 18 et le terminateur de transcription. Figure 2 : Carte de restriction de la région du RBS (Ribosome Binding Site) sur le vecteur pTEXmpl8 (SEQ ID N 40). Figure 3 : Estimation sur gel SDS-PAGE de l'expression de CAT dans des bactéries transformées par les vecteurs pTEXCAT ou pTEXCAT4. Figure 4 : Etude comparative de l'expression de la P-galactosidase à partir des vecteurs pTEX-ssGAL et pTEX4-(3GAL (cinétiques en fermenteur). Exemple I Cet exemple illustre un des aspects ayant conduit à l'invention, et notamment la manière dont est construite la librairie de vecteurs plasmidiques porteurs du promoteur tryptophane Ptrp et mutés de manière aléatoire en amont du codon d'initiation. Le vecteur d'origine est décrit en figure 1. Il s'agit d'un plasmide dérivé de pBR322 (Bolivar et al., 1977) dans lequel a été cloné le promoteur/opérateur Ptrp (1-298), suivi de la séquence codant pour les 7 premiers acides aminés du leader TrpL d'E. coli (Yanofsky et al., 1981), d'un site de clonage multiple et du terminateur de transcription trpt d'E. coli (Yanofsky et al., 1981). La partie 3' de Ptrp dans pTEXmpl8 diffère de la séquence naturelle par la présence d'un site de clonage Xbal en amont du codon d'initiation ATG (voir figure 2) et par un espacement plus grand entre SD et codon d'initiation. Pour permettre la sélection de vecteurs modifiés dans leur partie RBS, le gène rapporteur de la chloramphénicol acétyl-transférase (CAT) est cloné aux sites EcoRI et PstI de pTEXmpl8. Pour cela, la séquence codante du gène cat est amplifiée par PCR à l'aide des oligonucléotides CATfor et CATrev dont les séquences sont : ' CATfor : 5'-CCGGAATTCATGGAGAAAAAAATCACTGG-3' (SEQ ID N 11) EcoRI CATrev : 5'-AAACTGCAGTTACGCCCCGCCCTG-3' (SEQ ID N (2) PstI La réaction de PCR est effectuée en utilisant comme matrice le phagemide pBC- SK (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Le produit d'amplification est déposé sur gel d'agarose et purifié selon la méthode GeneClean (Bio101, La Jolla, CA). Le clonage de l'insert dans pTEXmpl8 est vérifié après transformation dans E. coli par l'apparition de colonies se développant sur boîtes de milieu LB agar (Sambrook et al., 1989) en présence de 30 ug/ml de chloramphénicol. La séquence de l'insert est confirmée par séquençage automatique à l'aide du kit Dye Terminator et du séquenceur d'ADN 373A (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA). Le vecteur obtenu est nommé pTEXCAT. L'insertion de RBS ayant une séquence dégénérée en amont du codon d'initiation est effectuée par ligation d'oligonucléotides de synthèse aux sites SpeI et EcoRI du vecteur pTEXCAT. La région allant du site Spel au site EcoRI respectivement en positions - 49 et + 28 (voir figure 2) est délétée par digestion enzymatique et remplacée par un hétéroduplex formé par deux oligonucléotides de synthèse partiellement dégénérés, hybridés entre eux. Deux couples d'oligonucléotides sont utilisés, mettant en jeu respectivement les oligonucléotides RanSDl/RanSD2 et RanSD3/RanSD4 dont les séquences sont : RanSDl : 5'CTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAANNNNNNNNNNNNNNNNATGA AAGCAATTTTCGTACTGAATGCGG-3' (SEQ ID N 13) RanSD2 : 5'AATTCCGCATTCAGTACGAAAATTGCTTTCATNNNNNNNNNNNNNNNNTT TACGTGAACTTGCGTACTAGTTAA-3' (SEQ ID N 14) RanSD3 : 5'CTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAATRRRRRRRNNNNNNATGAAA GCAATTTTCGTACTGAATGCGG-3' (SEQ ID N 15) RanSD4: 5'AATTCCGCATTCAGTACGAAAATTGCTTTCATNNNNNNYYYYYYYATTTAC GTGAACTTGCGTACTAGTTAA-3' (SEQ ID N 16). Les quatre oligonucléotides ont été synthétisés par MWG Biotech (Ebersberg, D) dans des conditions assurant une répartition équimolaire des bases pour chaque dégénérescence. Le couple RanSDl/ RanSD2 apporte une dégénérescence complète (N = mélange des 4 nucléotides A, C, T, G) sur les 16 nucléotides précédant le codon ATG. Le nombre de combinaisons (416 soit environ 4,3 109) autorise le criblage de RBS qui soient optimisés tant du point de vue de leur séquence Shine-Dalgarno (SD), de la séquence située entre la région SD et le codon d'initiation ainsi que dans l'espacement SD-ATG. Cette librairie sera nommée (N16) dans la suite du texte. Le couple RanSD3/ RanSD4 apporte une dégénérescence complète sur 6 nucléotides précédant l'ATG et une dégénérescence partielle sur les 7 nucléotides en amont. L'utilisation exclusive des purines (R = A ou G) sur le brin positif et de pyrimidines sur le brin complémentaire (Y = C ou T) favorise la représentation de séquences de type Shine-Dalgamo à une distance optimale (6 nucléotides) du codon ATG. Cette seconde librairie est nommée (R7N6). La linéarisation du vecteur pTEXCAT et sa purification sur gel, l'hybridation des oligonucléotides par paires, la ligation des hétéroduplex au vecteur pTEXCAT linéarisé et la transformation dans E. coli de la librairie ainsi constituée sont réalisées selon les conditions décrites par Sambrook et al. (1989). Classiquement, 100 fmol de vecteur et 1000 finol d'insert sont engagés dans une réaction de ligation en présence de T4 ligase dans un volume final de 15 l. La réaction est conduite pendant une nuit à 16 C. Des bactéries TOP 10 électrocompétentes (50 l) sont ensuite transformées par électroporation avec 3 l du mélange de ligation dans les conditions recommandées par le fournisseur (Invitrogen, Carlsbad, CA). Le mélange de transformation est étalé sur boîtes de LB agar contenant 200 ug/ml d'ampicilline, donnant lieu après 16 heures d'incubation à 37 C à l'apparition de colonies transformées. Exemple II Le criblage des librairies est effectué en partant de l'hypothèse que les clones surexprimant l'enzyme CAT auront une résistance accrue au chloramphénicol. Ceci est validé par l'expérience dont les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1. Résistance au chloramphénicol de bactéries TOP 10 x pTEXCAT en présence ou absence d'IAA. Concentration en chloramphénicol ( g ml) 0 200 300 400 500 600 700 800 IAA = 0 85 91 74 73 47 0 0 0 +++ +++ ++ + +/- IAA = 25 I1g/ml 75 65 76 53 71 1 0 0 +++ +++ +++ ++ + +/- Les chiffres (rangée supérieure) indiquent le nombre de colonies comptées après 18 h d'incubation à 37 C, chaque milieu ayant été ensemencé avec environ 100 cellules. L'index de la rangée inférieure est un critère qualitatif de croissance des colonies (- = absence de croissance à +++ = croissance maximale). Ces résultats montrent que des bactéries E. coli TOP 10 (Invitrogen, Carlsbad, CA) transformées par le vecteur pTEXCAT et étalées sur boîtes contenant différentes concentrations de chloramphénicol ont, entre 300 et 600 ug/ml de chloramphénicol, un développement plus fort en présence d'acide 3-p indole acrylique (IAA), un analogue du tryptophane agissant comme inducteur par un effet de dérépression de Ptrp (Marmorstein and Sigler, 1989). Ceci laisse supposer que des clones surproducteurs de CAT du fait d'une région RBS optimisée pourront soit se développer plus rapidement que la population sauvage à une concentration en chloramphénicol inférieure à la CMI (concentration minimale inhibitrice), soit se développer en présence de concentrations en chloramphénicol létales pour la population sauvage. Exemple III Cet exemple illustre la sélection de clones parmi les librairies construites selon la description de l'exemple 1. Les librairies obtenues sous forme de tapis de colonies sur boîtes de LB agar + ampicilline sont reprises dans de l'eau stérile de manière à reconstituer une suspension dont la Densité Optique (DO) à 580 nm est voisine de 1. Conformément aux résultats de l'exemple 2, cette suspension est étalée sur boîtes de LB agar contenant de doses létales de chloramphénicol (600,700, 800 et 900 ug/ml) à raison de 100 lde suspension par boîte de Petri. Les boîtes sont mises en incubation à 37 C et l'on observe l'apparition de colonies résistantes en vérifiant dans le même temps que des boîtes ensemencées à partir d'une suspension de bactéries TOP 10 transformées par le vecteur sauvage pTEXCAT ne donnent lieu à aucune croissance. Les colonies résistantes sont isolées et repiquées plusieurs fois sur le milieu de sélection pour confirmer leur phénotype de résistance. Les clones retenus à cette étape sont ensuite soumis à une série d'analyses : (i) extraction du plasmide (kit Qiagen, Hilden, D) et séquençage de la région recouvrant le RBS, (ii) culture en Erlenmeyers avec induction par l'IAA puis estimation du niveau d'expression de CAT par dosage ELISA, (iii) électrophorèse par SDS-PAGE des protéines totales extraites des cultures précédentes et coloration au bleu de Coomassie permettant de visualiser les protéines totales intracellulaires. Le séquençage des clones est réalisé à l'aide du kit Dye Terminator sur séquenceur ABI 373A (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA). Les cultures en erlens sont réalisées en ensemençant 25 ml de milieu TSBY (Tryptic Soy Broth (DIFCO) 30 g/1 + Yeast Extract (Difco) 5 g/1) + tetracycline 8 mg/1 par une colonie sur boîte ou par une suspension bactérienne conservée à - 80 C. Chaque préculture est mise en incubation sur un plateau agité à 200 rpm et 37 C pendant une nuit. Une fraction est transférée dans 50 ml du même milieu de manière à atteindre une densité optique initiale égale à 1. Pour l'induction de la protéine CAT, le milieu est additionné par 25 mg/1 d'IAA puis placé en agitation dans les mêmes conditions pendant 5 heures. Une fraction de la suspension (3 x 1 ml dilués à DO = 0,1) est centrifugée et les cellules conservées à - 20 C pour le dosage de la CAT par ELISA (kit CAT ELISA, Roche Diagnostics, Bâle, CH). Le reste de la biomasse est récupéré par centrifugation à 10000 g, 4 C pendant 15 minutes. La biomasse est reprise dans un tampon TEL (Tris 25 mM, EDTA 1 mM, Lysozyme 500 ug/ml, pH 8) à raison de 5 ml pour 1 g de biomasse humide. Les cellules sont lysées par sonication (sonicateur VibraCell muni d'une micro-sonde, Sonics & Materials, Danbury, CT). Un ml de la suspension résultante est centrifugé 5 min à 12 000 rpm. Le culot est repris par 200 l de TEL pour donner la fraction insoluble (I). Le surnageant est noté S . Les protéines totales contenues dans les fractions 1 et S sont analysées par électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) et coloration au bleu de Coomassie. Le tableau 2 ci-après indique les différentes séquences RBS obtenues après criblage des deux librairies (Ni6) et (R7N6). A la suite de l'alignement dans les bases de données nucléotidiques GenBank et EMBL, nous pouvons conclure qu'aucune des séquences de 16 nucléotides (stratégie (N16)) ou de 13 nucléotides (stratégie (R7N6)) situées immédiatement en amont du codon AUG dans les différents clones isolés n'a été décrite à ce jour. Tableau 2. Nouvelles séquences RBS isolées par l'une des stratégies (N16) ou (R7N6). CLONE STRATEGIE REGION SD - PEPTIDE L (*) PTEXCAT SEQ ID N 19 AAGGGUAUCUAGAAUUAUGAAAGCAAUUUUCGUACUGAAUGCGGAAUUC SEQ ID N 20 M K A I F V L N A E F PTEXCAT4 (Ni6) SEQ ID N 21 GGGCCGGUUUCUUAUUAUGAAAGCAAUUUUCGUACCGAAUGCGGAAUUC SEQ ID N 22 M K A I F V P N A E F pTEXCATl' (R7N6) SEQ ID N 23 UGGGAGGGUCAAUUAUGAAACCAAUUUUCGUACUGAAUGCGGAAUUC SEQ ID N 24 M K P I F V L N A E F pTEXCAT2' (R7N6) SEQID N 25 UAAAGGAACCAUAUAUGAAA***************AAUGCGGAAUUC SEQ ID N 26 M K * * * * * N A F pTEXCAT3' (R7N6) SEQ ID N 27 UAGGAAAGAUAACGAUGAAAGCAAUUUUCGCACUGAAUGCGGAAUUC SEQ ID N 28 M K A I F A L N A E F pTEXCAT5' (R7N6) SEQ ID N 29 UGAGGAGAAGACAGAUGAAAGCAAU*********GAAUGCGGAAUUC SEQ ID N 30 M K A M * * * N A E F pTEXCAT9' (R7N6) SEQ ID N 31 UGAGGAGAGUAAUCAUGAAAGCA***************GCGGAAUUC SEQ ID N 32 M K A * * * * * A E F (*) Chaque séquence nucléotidique (ARN messager) comprend la région mutée en aval du codon d'initiation. La séquence de référence du vecteur pTEXCAT figure en première ligne du tableau. Les séquences nucléiques en amont et en aval du codon d'initiation des vecteurs sont représentées dans ce tableau après transcription sous forme d'ARN. A l'extrémité 3' de ces séquences, seuls les deux premiers cpdons du site de clonage multiple sont représentés, à savoir GAAUUC. C'est ainsi qu'il a été observé de manière tout à fait surprenante que les clones décrits dans le tableau 2 possèdent des mutations dans la région du RBS située immédiatement en aval du codon AUG. Les clones pTEXCAT4, pTEXCATl' et pTEXCAT3' sont porteurs d'une mutation ponctuelle affectant un acide 'aminé de la partie N-terminale de la protéine codée (respectivement Leu7Pro, Ala3Pro et Val6Ala). Les autres clones sont porteurs de réarrangements plus importants : pTEXCAT2', pTEXCAT5' et pTEXCAT9' ont des délétions induisant respectivement la perte des régions Ala3Leu7, Ile4Leu7 et Ile4Asn8. Etant donné que l'analyse au hasard de 10 clones de la librairie (Ni6) sélectionnés sur ampicilline (c'est-à-dire sans pression de sélection au chloramphénicol) ne montre aucune modification dans la région codant pour le peptide TrpL (données non présentées), il en est déduit que les mutations dans TrpL observées sur les clones sélectionnés pour leur capacité d'expression de CAT jouent un rôle dans l'expression. Ainsi, nous démontrons la propriété originale suivante : l'expression de protéines recombinantes est affectée positivement par des mutations en aval du codon d'initiation. La figure 3 présente une analyse par SDS-PAGE des protéines totales de bactéries transformées par pTEXCAT ou pTEXCAT4. On y voit la confirmation du caractère surproducteur du vecteur pTEXCAT4 puisqu'une protéine majoritaire migrant à la position attendue pour CAT (28 kDa) est nettement mise en évidence dans des extraits induits par l'IAA tandis que les extraits du vecteur pTEXCAT obtenus dans les mêmes conditions d'induction ne font apparaître qu'une bande de faible intensité. Pour écarter la possibilité que la surproduction soit causée par des modifications du vecteur en dehors de la partie SpeI-EcoRI, le vecteur pTEXCAT4 a été reconstruit in vitro à partir de pTEXCAT par digestion SpeI-EcoRI et ligation d'un duplex formé par les deux oligonucléotides phosphorylés suivants : SDopt4-f : 5'CTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAACGGAGAAACCCCCCAATGA AAGCAATTTTCGTACCGAATGCGG-3' (SEQ ID N 17) SDopt4-r : 5'AATTCCGCATTCGGTACGAAAATTGCTTTCATTGGGGGGTTTCTCCGTTTT ACGTGAACTTGCGTACTAGTTAA-3' (SEQ ID N 18). Le vecteur résultant noté pTEXCAT-SD4 a ensuite été transformé 'dans E. coli TOP 10 et comparé à pTEXCAT4 en termes de potentiel d'expression de l'enzyme CAT. Les résultats obtenus indiquent que les niveaux d'expression de pTEXCAT4 et pTEXCAT-SD4 sont comparables entre eux et signifiontivement supérieurs à pTEXCAT. Ceci accrédite l'hypothèse que l'amélioration de l'expression observée avec les clones revendiqués dans cette demande de brevet est bien causée spécifiquement par les séquences situées entre les sites Spel et EcoRI. Afin de démontrer la spécificité des séquences mutées ou délétées situées directement en aval du codon d'initiation, la leucine CTG en septième position du vecteur sauvage pTEXCAT a été remplacée par une proline CCG pour donner le vecteur pTEXCAT-L7P. La proline CCG en septième position du vecteur pTEXCAT4 a été remplacée par une leucine CTG pour donner le vecteur pTEXCAT4-P7L. Les résultats de cette expérience figurent dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 3. Comparaison entre les niveaux d'expression donnés par les vecteurs pTEXCAT, pTEXCAT4, pTEXCAT-L7P et pTEXCAT4-P7L. Vecteur Niveau d'expression de CAT PTEXCAT 1 pTEXCAT4 128 0,7 pTEXCAT-L7P 119 2 pTEXCAT4-P7L 1,9 0,1 Les résultats (moyenne écart-type) ont été obtenus sur deux expériences indépendantes. Le niveau 1 est affecté arbitrairement au vecteur pTEXCAT. Ces résultats démontrent que la mutation en aval du codon d'initiation est responsable à elle seule de la surexpression, puisque cette mutation réintroduite dans le vecteur sauvage permet d'obtenir la même surexpression. Exemple IV Cet exemple montre que l'effet de surexpression des nouvelles séquences décrites n'est pas limité au gène rapporteur utilisé pour les sélectionner mais se transpose à d'autres gènes dès lors que ces gènes leur sont liés fonctionnellement sur le même vecteur. A cet effet, le gène CAT des vecteurs pTEXCAT et pTEXCAT4 a été remplacé par la séquence du gène lacZ codant pour la P-galactosidase d'E. coli. Le clonage a été réalisé en amplifiant la séquence lacZ par PCR à partir du vecteur ppGAL-basic (Clontech, Palo Alto, CA) puis en insérant cette séquence en aval de trpL aux sites uniques Bsml et HindIII, pour donner respectivement les vecteurs pTEX-pGAL et pTEX4-bGAL. Les deux vecteurs ont été transformés dans la souche E. coli ICONE 200 (demande de brevet français FR 2 777 292 publiée le 15 Octobre 1999) en vue d'une culture en fermenteur avec suivi en cinétique de l'expression de la (3-galactosidase. Classiquement, les bactéries recombinantes ICONE 200 x pTEX-ssGAL et ICONE 200 x pTEX4-PGAL ont été cultivées dans 200 ml de milieu complet (Tryptic Soy Broth (DIFCO) 30 g/1, Yeast Extract (DIFCO) 5 g/1) pendant une nuit à 37 C. La suspension cellulaire obtenue a été transférée stérilement dans un fermenteur (modèle CF3000 de Chemap, capacité 3,51) contenant 1,8 litres du milieu suivant (concentrations pour 2 litres de culture finale) : 90 g/1, (NH4)2SO4 5 g/1, KH2P04 6 g/1, K2HP04 4 g/1, Na3-citrate 2H20 9 g/1, MgS04 7H20 2 g/1, extrait de levure 1 g/1, oligo- éléments, antimousse 0,06 %, tétracycline 8 mg/1, tryptophane 200 mg/1. Le pH est régulé à 7,0 par ajout d'ammoniaque. Le taux d'oxygène dissous est maintenu à 30 % de la saturation par asservissement de la vitesse d'agitation puis du débit d'aération à la mesure de l'O2 dissous. Lorsque la Densité Optique de la culture atteint une valeur comprise entre 30 et 40, on procède à l'induction par l'ajout de 25 mg/1 d'IAA (Sigma, St Louis, MO). Une analyse en cinétique de la densité optique de la culture (DO à 580 nm) et de l'activité P-galactosidase intracellulaire a été effectuée. Le niveau d'activité p-galactosidase est estimé par un dosage colorimétrique en mélangeant 30 l d'échantillon (fraction S , voir exemple 3), 204 l de tampon (Tris-HCl 50 mM pH 7,5 - MgCl2 1 mM) et 66 ul d'ONPG (4 mg/ml dans Tris-HCl 50 mM pH 7,5). Le mélange réactionnel est placé en incubation à 37 C. La réaction est stoppée par l'ajout de 500 l de Na2C03 1 M. La DO à 420 nm rapportée au temps d'incubation est proportionnelle à l'activité p-galactosidase présente dans l'échantillon. Sachant que E. @@li ICONE 200 a une délétion complète de l'opéron lac, l'activité p-galactosidase mesurée est uniquement due à l'expression du gène lacZ plasmidique. Les résultats de cette étude comparative indiquent que dans deux expériences indépendantes, le vecteur pTEX4-ssGAL donne un niveau d'activité P-galactosidase environ 50 fois supérieur à pTEX-pGAL (figure 4). Nous en déduisons que la séquence originale isolée dans la zone RBS du vecteur pTEXCAT4 potentialise l'expression, non seulement de la protéine CAT, mais aussi d'autres protéines telles que, à titre d'exemple, la P-galactosidase. A partir de cet exemple, nous pouvons conclure que d'autres protéines d'intérêt biotechnologique pourront être avantageusement exprimées à partir d'un des vecteurs selon l'invention en introduisant leur séquence codante en aval des séquences mutées ou délétées selon l'invention. Exemple V Comparaison entre les niveaux d'expression donnés par les vecteurs pTEXwt (ne fait pas partie de l'invention) et les vecteurs pTEX9', pTEXlO', pTEXl l' et pTEX12'. Les vecteurs pTEXlO', pTEXll' et pTEX12' sont issus du vecteur pTEX9 mais comprennent en outre des mutations supplémentaires, telles qu'indiquées dans le tableau 4 ci-dessous : Tableau 4. Comparaison entre les niveaux d'expression donnés par les vecteur pTEXwt, pTEX9', pTEXlO', pTEXl l' et pTEX12'. Vecteur REGION SD - PEPTIDE L (*) Expression CAT PTEXwt SEQ m >~ 19 AASGGUAUCUAGAAUUAUGAAAGCAAUUUUCGUACUGAAUGCGGAAUUC SEQ ID N 20 M K A I F V L N A E F pTEX9' SEQ ID N 31 UGAGGAGAGUAAUCAUGAAAGCA***************GCGGAAWC 249 SEQ ID N 32 M K A * * * * * A E F pTEX10' SEQ ID N 33 UGAGGAGAGUAAUCAUGAAAGCA******************GAAUUC 253 SEQ ID N 34 M K A * * * * * * E F pTEX11' SEQ ID N 35 UGAGGAGAGUAAUCAUGAAA*********************GAAUUC 124 SEQ ID N 36 M K * * * * * * * E F pTEX12' SEQ ID N 37 UGAGGAGAGUAAUCAUG************************GAAUUC 155 SEQ ID N 38 M * * * * * * * * E F (*) : Chaque séquence nucléotidique (ARN messager) comprend la région mutée en aval du codon d'initiation. La séquence de référence du vecteur pTEXCAT figure en première ligne du tableau. Les séquences nucléiques en amont et en aval du codon d'initiation des vecteurs sont représentées dans ce tableau après transcription sous forme d'ARN. A l'extrémité 3' de ces séquences, seuls les deux premiers codons du site de clonage multiple sont représentés, à savoir GAAUUC. Les méthodes de détermination de l'expression sont celles utilisées dans les exemples ci-dessus. Ces résultats démontrent que les délétions en aval du codon d'initiation permettent d'obtenir une surexpression jusqu'à plus de 250 fois supérieure à l'expression observée en utilisant le vecteur sauvage. Bibliographie Barrick, D., Villanueba, K., Childs, J., Kalil, R., Schneider, T. D., Lawrence, C.E., Gold, L., and Stormo, G. D. (1994). Quantitative analysis of ribosome binding -sites in E.coli. Nucleic. Acids. Res. 22,1287-1295. Bolivar, F., Rodriguez, R.L., Greene, P.J., Betlach, M. C., Heyneker, H.L., and Boyer, H.W. (1977). Construction and characterization of new cl@ning vehicles. II. A multipurpose cloning system. Gene 2, 95-113. Chen, H., Bjerknes, M., Kumar, R., and Jay, E. (1994a). 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Construction selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'au moins un des nucléotides de la séquence SEQ ID N 1 est délété. 3. Construction selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit au moins nucléotide muté ou délété est situé sur le fragment de séquence SEQ ID N 2 de la séquence SEQ ID N 1. 4. Construction selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit au moins nucléotide muté ou délété, préférentiellement muté, est situé sur le codon GTA de la séquence SEQ ID N 1. 5. Construction selon la revendication 1, caractérisée en ce ledit au moins nucléotide muté ou délété, préférentiellement muté, est situé sur le codon GCA de la séquence SEQ ID N 1. 6. Construction selon la revendication 1, caractérisée en ce ledit au moins nucléotide muté ou délété, préférentiellement muté, est situé sur le codon CTG de la séquence SEQ ID N 1. 7. Construction selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite séquence SEQ ID N 1 dont au moins un des acides nucléiques est muté ou délété, présente au moins en position 1, 2 et 3 le nucléotide A. 8. Construction selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite séquence SEQ ID N 1 est totalement délétée. 9. Construction selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'au moins un des nucléotides, et préférentiellement tous les nucléotides, situés entre la séquence nucléique de séquence SEQ ID N 1 et la cassette de clonage multiple destinée à recevoir le gène codant pour ladite protéine recombinante d'intérêt, sont délétés. 10. Construction selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la séquence nucléique directement en amont du codon d'initiation est choisie parmi les séquences SEQ ID N 3 à SEQ ID N 10. 11. Construction selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la cellule hôte procaryote est une bactérie gram négative. 12. Construction selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que la cellule hôte procaryote est E. coli. 13. Vecteur contenant une construction selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 14. Cellule hôte procaryote transformée par un vecteur selon la revendication 13. 15. Cellule hôte procaryote selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'il s'agit d' E. coli. 16. Procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt dans une cellule hôte utilisant une construction selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 17. Procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt selon la revendication 16, dans lequel ladite construction est introduite dans une cellule hôte procaryote. 18. Procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt selon la revendication 16 ou 17, dans lequel ladite construction est introduite dans une cellule hôte procaryote par un vecteur selon la revendication 13. 19. Procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt selon l'une des revendications 16 à 18, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) le clonage d'un gène d'intérêt dans un vecteur selon la revendication 13 ; b) la transformation d'une cellule procaryote par un vecteur contenant un gène codant pour ladite protéine recombinante d'intérêt ; c) la culture de ladite cellule transformée dans un milieu de culture permettant l'expression de la protéine recombinante ; et d) la récupération de la protéine recombinante à partir du milieu de culture ou de ladite cellule transformée.