Brevet FR2811677A1 — publié le 20020118

La présente invention concerne des lignées cellulaires exprimant une séquence d'ADN recombinante codant pour une isoforme de prostaglandine synthase (PGHS ou COX). ETAT DE L'ART : Les prostaglandines, incluant notamment PGE2, PGI2, PGD2, PGF2a, représentent un groupe de composés autocrines et paracrines issus du métabolisme des acides gras. Ils appartiennent à une famille d'eicosanoides naturels (prostaglandines, thromboxanes et leucotriènes) qui ne sont pas stockés dans la cellule mais sont synthétisés à partir de l'acide arachidonique, un acide gras polyinsaturé de 20 carbones, libéré par les phospholipides membranaires en réponse à divers stimuli. Dans des conditions normales, les eicosanoides sont produits en faible quantité et servent de médiateurs dans diverses fonctions cellulaires. Cependant, les prostaglandines jouent un rôle crucial en physiopathologie. En particulier, une surproduction de prostaglandines proinflammatoires (principalement PGE2) est observées dans les tissus inflammés. Le rôle central des prostaglandines, principalement de la PGE2, dans l'initiation et le maintien des processus inflammatoires est mis en évidence par les effets thérapeutiques de l'aspirine et des anti-inflammatoires non stéroidiens (AINS) dans les processus inflammatoires. En effet, ces médicaments en inhibant la synthèse des prostaglandines et en particulier la synthèse de PGE2, restent à l'heure actuelle des médicaments très efficaces pour le traitement de pathologies inflammatoires aiguës et chroniques et des douleurs associées. Cependant, l'utilisation des AINS était jusque là souvent limitée par les effets secondaires (ulcères gastriques, insuffisance rénale...) résultant de l'inhibition de la synthèse des prostaglandines dans les tissus non-inflammés. Très récemment, de nouveaux AINS ont été développés car présentant des effets anti-inflammatoires comparables à ceux des AINS de premières génération mais ne présentant pas ou peu d'effets secondaires au niveau gastrique : celecoxib et rofecoxib. Les bases moléculaires expliquant l'inhibition sélective de la synthèse de PGE2 dans les tissus inflammés par ces nouveaux AINS de seconde génération sont bien connues. L'activité cyclooxygénase est la première étape dans la voie de synthèse des prostaglandines. Cette activité est portée par des enzymes, les PGH-synthases qui transforment l'acide arachidonique en PGG2 (acitvité cyclooxygénase proprement dite) puis en PGH2 (activité peroxydase). Deux isoformes de PGH-synthase issues de l'expression de deux gènes distincts ont été largement décrites dans différentes espèces : une isoforme constitutive (PGHS-1 ou COX1) (Funk CD et al. Faseb J. 1991 ; 5:2304- 2312 ; DeWitt DL and Smith WL, Proc. Natl. Acad. Sci. 1988 ; 85 : 1412-1416 ; Merlie JP et al. J. Biol. Chem. 1988 ; 263:3550-3553 ; Yokoyama C et al. FEBS Lett. 1988 ; 231 : 347-351) et une isoforme induite par les facteurs de croissance et les cytokines (PGHS-2 ou COX2) (Xie W et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1991 ; 88 : 2692-2696 ; O'Banion MK et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1992 ; 89 :4888-4892 ; Kujubu DA et al. J. Biol. Chem. 1991 ; 266 : 12866-12872). Dans des conditions normales, le gène de PGHS-1 s'exprime de façon quasi-ubiquitaire dans tous les types cellulaires. Dans des conditions normales, le gène de PGHS-2 ne s'exprime pas, mais il s'exprime très fortement dans les cellules des tissus inflammés rendant compte de l'augmentation de la synthèse de PGE2 dans ces tissus. Les AINS de première génération inhibent à la fois PGHS-2 et PGHS-1. Les AINS de seconde génération inhibent sélectivement la PGHS-2 dans les tissus inflammés sans affecter l'activité PGHS-1 dans les tissus sains, une telle sélectivité rendant compte du meilleur rapport effets thérapeutiques/effets secondaires de ces composés (Pour revue voir Vane JR and Botting RM. Inflamm. Res. 1998 ; 47 : 78-87). Cependant, tous les effets secondaires liés à l'utilisation des AINS de première génération ne sont pas levés par les AINS de seconde génération. En particulier, par leur effets inhibiteurs sur la synthèse de PGD2 et de son métabolite la 15-deoxy#12-14PGJ2 (prostaglandine cyclopentenones anti-inflammatoires, ligands endogènes des récepteurs PPAR gamma) les AINS de seconde comme de première génération retarderaient les processus de régénération tissulaire (Mizuno H et al. Gastroenterology 1997 ; :387- 397 ; Gilroy DW et al. Nature Med. 1999 ; 5(6) : 698-701) suggérant des effets inhibiteurs sur une COX-3 encore inconnue (Willoughby et al. Lancet. 2000 ; 355 :646- 648). En marge de la description des PGHS-1 et PGHS-2. Diaz et collaborateurs (J. Biol. Chem. 267,15, 10816,1992) ont décrit un transcrit issu de l'épissage alternatif sur la région 3' de l'exon 9 du gène de PGHS-1. Ce transcrit était retrouvé dans divers tissus et cellules et pouvait être induit comme celui de PGHS-2 par les facteurs de croissance et les cytokines. Aucune protéine associée à la traduction de ce mRNA n'a jusque là été rapportée. Nos résultats montrent que cet ARNm code pour une isoforme PGHS de- 62 kD, sensible aux AINS de première et de seconde génération. A l'inverse des PGHS-1 et PGHS-2 connues, cette nouvelle isoforme de PGHS produit préférentiellement des prostaglandines anti-inflammatoires (PGD2 et 15-deoxy#12-14PGJ2) lorsque l'ADNc correspondant s'exprime dans des cellules en culture. Ces résultats ouvrent la voie à la recherche et au développement d'AINS de troisième génération inhibant PGHS-2 sans affecter ni PGHS-1 ni cette nouvelle isoforme de PGHS. Ainsi, contrairement aux AINS actuels ces nouveaux principes actifs n'inhiberaient pas les processus de régénération tissulaire. Ainsi, comme les AINS de seconde génération, les composés sélectionnés pourraient être efficaces dans le traitement de la douleur et de l'inflammation associées à la polyarthrite rhumatoïde (pour revue voir Goldenberg MM. Clin. Ther. 1999 ; 1407-1513) mais pourraient avoir d'autres indications en oncologie et dans la maladie d'Alzheimer (Pour revue voir Vane JR and Botting RM. Inflamm. Res. 1998 ; 47 : 78- 87). De plus compte tenu de la nature des métabolites produits par cette nouvelle isoforme de PGHS (ligands endogènes des récepteurs PPARs), la recherche d'effecteurs sélectifs de cette nouvelle isoforme de PGHS (vs PGHS-1 et PGHS-2) pourrait trouver des débouchés non seulement en inflammation et en oncologie mais aussi dans d'autres pathologies telles que le diabète, l'athérosclérose ou l'hypertension (pour revue voir Willson TM et al. J. Med. Chem. 2000 ; 43(4) :527-550). RESUME DE L'INVENTION : La présente invention a pour objet des lignées cellulaires exprimant une séquence d'ADN recombinante correspondant à un épissage alternatif de la région 3' de l'exon 9 du gène de la prostaglandine synthase-1 (PGHS-1 ou COX-1) de mammifère et codant pour une isoforme de la PGHS-1, cette isoforme produisant en présence d'acide arachidonique préférentiellement la prostaglandine D2 (PGD2) ou la 15-deoxyti12-14prostaglandine J2 (15-deoxy#12-14PGJ2). La présente invention a plus spécifiquement pour objet des lignées cellulaires du type précédemment défini exprimant une séquence d'ADN codant pour une isoforme ayant une masse moléculaire de 62 KDa et correspondant à une délétion des acides aminés 396 à 432 de PGHS-1 humaine. La présente invention a-plus spécifiquement pour objet : de telles lignées cellulaires exprimant une séquence d'ADN correspondant à la séquence SEQ ID n 1, l'isoforme de la prostaglandine synthase-1 (PGHS-1 ou COX-1), à l'état isolé, correspondant à la séquence SEQ ID n 2, une molécule d'ADN isolée codant pour l'isoforme de la prostaglandine synthase 1 correspondant à la séquence SEQ ID n 2, une molécule d'ADN isolée ayant une séquence nucléotidique correspondant à la séquence SEQ ID n 1 ou comprenant cette séquence. La séquence ADN a été obtenue par RT-PCR à partir de cellules ou tissus de mammifères (préférentiellement humains) en utilisant des oligonucléotides correspondant à la partie codante du gène de COX-1. Nos résultats démontrent que chez l'homme le produit de traduction des ARNm issus de cette séquence ADN est une protéine de 62 kD reconnue par des anticorps commerciaux dirigés contre les isoformes COX-1. Par commodité cette protéine sera appelée par la suite COX-lb. Par comparaison, les produits de traduction issus de la totalité des parties codantes des gènes de COX-1 et de COX-2 (forme inductible de COX communément impliquée dans les phénomènes inflammatoires) sont des protéines de 70- 74 kD. Par commodité, ces protéines seront respectivement appelées COX-la et COX-2. Nos résultats démontrent que la COXlb est une cyclooxygénase active. Les cellules transfectées produisent préférentiellement des prostaglandines antiinflammatoires telles que la prostaglandine D2 (PGD2) ou la 15-deoxy#12-14 prostaglandine J2 (15-deoxy#12-14PGJ2) lorsqu'elles sont mises en présence d'acide arachidonique exogène. A l'inverse, dans les mêmes conditions, les cellules exprimant les isoformes COX-la et COX-2 produisent préférentiellement des dérivés proinflammatoires telle que la PGE2. Nos résultats démontrent que la COX-lb est inhibée par les anti-inflammatoires non stéroïdiens. Elle présente une pharmacologie propre, différente de celles de COX la et COX-2. En particulier, la COX-lb est plus sensible que la COX-la aux inhibiteurs dits sélectifs de COX2 tels que NS-398, nimesulide, celecoxib ou rofecoxib. Nos résultats démontrent que dans des cellules en culture (fibroblastes, -cellules musculaires, lisses, synovicytes) les taux d'ARNm et de protéine COXlb sont augmentés par un traitement préalable avec des cytokines et/ou des facteurs de croissance. Ces résultats sont en accord avec ceux de Diaz et al. (J. Biol Chem. 1992 ; :10816-10822) obtenus uniquement sur le taux d'ARNm. In vivo, dans des modèles animaux d'inflammations aiguës et chroniques, les taux d'ARNm et de protéine COX-lb sont augmentés dans les cellules inflammatoires de l'exsudat et dans les tissus inflammés. Enfin, dans un modèle animal d'athérosclérose, les taux d'ARNm et de protéine COXlb sont augmentés dans les parois artérielles. Considérant : a) le caractère inductible de l'expression de COXIb tant in vitro qu'in vivo b) les effets anti-inflammatoires des métabolites produits par la COX-lb c) la sensibilité de la COX-lb aux anti-inflammatoire non-stéroïdiens qu'ils soient de première (non sélectif COX-2 vs COX-la) ou de seconde génération (sélectif COX-2 vs COX-la), la présente invention a également pour objet une méthode de criblage de molécules pour évaluer leur pouvoir inhibiteur ou activateur vis à vis de l'activité COXlb par l'utilisation des lignées cellulaires selon la présente invention. Cette méthode peut être utilisée dans un plan de criblage de molécules visant à sélectionner des composés effecteurs sélectifs ou spécifiques de l'une ou l'autre des trois formes de cyclooxygénase : COX-la, COX-lb ou COX-2. Les médicaments ainsi sélectionnés pourront être indiqués pour le traitement de pathologies inflammatoires aiguës et/ou chroniques (en particulier polyarthrite rhumatoïde), d'affections vasculaires (en particulier insuffisance veineuse chronique, athérosclérose), d'affections cutanées (ulcères cutanés), du cancer (en particulier cancer du colon), de la maladie d'Alzheimer, de la douleur et/ou de la migraine. La présente invention a plus spécifiquement pour objet une méthode de criblage qui consiste à : a) mettre des cellules, une fraction subcellulaire issue de ces cellules ou l'isoforme de PGHS-1 isolée ou purifiée à partir de ces cellules en présence d'une quantité prédéfinie d'une molécule dans un milieu approprié au matériel biologique utilisé ; b) ajouter ou non une quantité prédéfinie du substrat acide gras poly-insaturé (notamment d'acide arachidonique) et/ou de co-substrats et/ou de cofacteurs nécessaire à la mesure de l'activité de l'isoforme ; c) déterminer l'activité enzymatique de l'isoforme par la mesure de la quantité de substrat ou de co-substrat consommée ou la mesure de la quantité de produits formés. d) comparer l'activité enzymatique obtenue à celle obtenue en absence de la molécule et ainsi déterminer le pouvoir de la molécule vis à vis de COXIb; e) comparer le pouvoir de la molécule vis à vis de COX-lb à ceux obtenus avec la même molécule vis-à-vis de COX-la et/ou de COX-2. Compte tenu de la nature des métabolites produits par la COX-lb, cette nouvelle isoforme peut être utilisée en thérapeutique pour le traitement de pathologies inflammatoires aiguës et/ou chroniques (en particulier polyarthrite rhumatoïde), d'affections vasculaires (en particulier insuffisance veineuse chronique, athérosclérose), d'affections cutanées (ulcères cutanés) du cancer (en particulier cancer du colon), de la maladie d' Alzheimer, de la douleur et/ou de la migraine. La présente invention a donc également pour objet une composition thérapeutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace de la nouvelle isoforme ou d'un acide nucléique codant pour cette isoforme. La présente invention a également pour objet un procédé de traitement de pathologies inflammatoires, d'affections vasculaires, d'affections cutanées, du cancer, de la maladie d'Alzheimer, de la douleur et/ou de la migraine, qui consiste à administrer une quantité thérapeutiquement efficace de la nouvelle isoforme ou d'un acide nucléique codant pour cette isoforme. DESCRIPTION DES FIGURES : La Figure 1 démontre la séparation sur gel des produits d'amplification de 6 clones COX-1 (COX1-2, COX1-3, COXI-4, COX1-14; COXl-15 et COX1-23) par PCR en utilisant les oligonucléotides permettent de différencier les deux isoformes (N 1 : COX1- 2, N 2 : COX1-3, N 3 : COX1-4, N 4 : COX1-14, N 5 : COX1-15 et N 6 : COX1- 23). La Figure 2 est une comparaison de la séquence ADN du clone COX1-14 à la séquence ADNc codant pour la COX-1humaine (Genbank : M59979). La Figure 3 est une comparaison de la séquence du clone COX1-3 à celle du clone COX1-14. La Figure 4 est une comparaison de la séquence du clone COX1-3 à celle de la séquence ADNc codant pour la COX-1 humaine épissée (Genbank : S36219). La Figure 5 est une comparaison entre espèces de la zone épissée représentée par les petites majuscules. Plusieurs espèces sont comparées (humaines, souris, mouton et rat). La Figure 6 correspond à la séquence peptidique entière de la COX-1 b déterminée à partir de la séquence d'acides nucléiques codant pour la COX-lb humaine (clone COX1-3). Les nucléotides et les acides aminés sont numérotés à partir du codon initiateur ATG. Outre les acide aminés 17 et 245, la divergence essentielle par rapport à la séquence peptidique de COX-laest illustré par les caractères gras. Ceci reflète la délétion des acides aminés 396-432 de la COX-la (Genbank : S36219, M59979, S36271) La Figure 7 présente la description du vecteur pDR2EFla. Ce vecteur de 6449pb contient tous les éléments nécessaires pour effectuer la transcription et la traduction d'un gène spécifique. La Figure 8A représente le résultat de la séparation des protéines traduites in vitro à partir de la séquence d'ADNc COX-lb (clone COX1-3) ; comparaison avec la COX-la (clone COX1-14). (N 1 : standard COX-1 de mouton, N 2 : témoin négatif, N 3 : COXla clone COXI-14 et N 4 : COX-lb clone COX1-3). La Figure 8B est un western blot issu des protéines extraites de la transfection transitoire des cellules COS-7 par un vecteur d'expression eucaryote contenant la séquence d'ADNc codant pour la COX-lb ou pour la COX-la mises en contact avec un Ac monoclonal dirigé contre la COX-1 humaine (N 1 : standard COX-1 de mouton, N 2 et N 3 : COX-la clone COX1-14, N 4 et N 5 : COX-lb clone COXl-3). La Figure 9A représente le résultat d'une RT-PCR réalisée à partir de 1 g d'ARN total extrait à partir des clones isolés COX-lb (clones A1....G4) en utilisant des oligonucléotides spécifiques de la COX-1. La Figure 9B représente le résultat d'une RT-PCR réalisée à partir de 1 g d'ARN total extrait à partir des clones isolés COX-la (clones Al.....A2-3) en utilisant des oligonucléotides spécifiques de la COX-1. La Figure 10 correspond à une RT-PCR réalisée à partir de 1 g d'ADN total extrait à partir de trois clones COX-lb (A2, B4, E4) isolés depuis deux mois, en utilisant des oligonucléotides spécifiques de la COX-1. Comparaison entre les ARN totaux des trois clones (A2, B4 E4) préparés le 14-3-00 à ceux préparés le 16-5-00. La Figure 11A est un western blot réalisé à partir de 10 g de protéines extraites à partir des clones isolés COX-lb (H4....A2) en utilisant des Ac monoclonaux COX-1 humains. La Figure 11B correspond au western blot réalisé à partir de 10 g de protéines extraites à partir des clones isolés COX-la (clones Bl....A2-3) en utilisant des Ac monoclonaux COX-1 humains. La Figure 12 représente les dosages relatifs de la PGD2 et de la PGE2 produites par les 16 clones COX-lb (clones A2.... J3) par rapport à celles produites par les cellules CHO-K1. La Figure 13 décrit l'effet de la sonication sur la production de PGD2 par les cellules transfectées par un vecteur d'expression eucaryote contenant la séquence d'ADNc codant pour la COX-lb. La Figure 14 illustre l'effet du NS-398 (10-6M) sur la production de PGD2 sur des cellules transfectées par un vecteur d'expression eucaryote contenant la séquence d'ADNc codant pour la COX-lb et des cellules transfectées un vecteur d'expression eucaryote contenant la séquence d'ADNc codant pour la COX-la. La Figure 15A illustre la comparaison entre l'expression, par RT-PCR, des ARNm COX-lb et les ARNm COX-la issus de HL-60 dédifférenciées (cultivées en présence de 10% SVF) ou différenciées en monocyte ou macrophage-like cells avec du PMA(100nM) et 1. 5% DMSO (N 1 : HL-60 dédifférenciées, N 2 : HL-60 différenciées en cellules de type monocytaire avec du PMA (100 nM), N 3 :HL-60 différenciées en cellules de type granulocytaire avec 1. 5% DMSO). La Figure 15B représente l'analyse avec un standard GAPDH humain, par RTPCR, des ARN totaux extraits à partir de HL-60 dédifférenciées (cultivées en présence de 10% SVF) ou différenciées en monocyte ou macrophage-like cells avec du PMA(100nM) et 1. 5% DMSO (N 1 : HL-60 dédifférenciées, N 2 : HL-60 différenciées en cellules de type monocytaire avec du PMA (100 nM), N 3 : HL-60 différenciées en cellules de type granulocytaire avec 1. 5% DMSO). La Figure 16 représente une analyse par PCR d'ARN totaux issus d'exsudat de rat prélevés à différents temps (0,2h, 8h, 24h et 48h) au cours d'une pleurésie à la carragénine. (PM : poids moléculaires, N 1 : témoin, N 2 et N 3 : 8h, N 4 et N 5 : 24h, N 6, N 7 et N 8 : 48h). DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION. La présente invention fournit des lignées cellulaires qui contiennent une séquence ADN recombinante de mammifère (préférentiellement humaine), intégrée ou non dans leurs chromosomes, codant pour une isoforme de la prostaglandine-synthase ou cyclooxygénase (PGHS ou COX) active, distincte des deux formes communément décrites dans la littérature, à savoir COX-1 (isoforme dite constitutive) et COX-2 (isoforme dite inductible). Cet ADN recombinant inclut une séquence issue de l'épissage alternatif du gène de cyclooxygénase constitutive de mammifères communément appelée PGHS-consitutive, PGHS-1 ou COX-1. Chez l'homme, cette séquence ADN correspond notamment à la délétion de 111 paires de bases par rapport à la totalité des parties codantes ou exons du gène de COX-1 (voir Séquence SEQ. ID n 1 et Figure 6 à comparer à Yokoyama, C. and Tanabe T. (1989) Biochem Biophys. Res. Commun. 165 :888-894). Cette séquence ADN peut être obtenue par RT-PCR à partir de cellules ou tissus de mammifères (préférentiellement humains) en utilisant des oligonucléotides correspondant à la partie codante du gène de COX-1. En dehors de COX-lb, la lignée cellulaire résultant de l'introduction de la séquence ADN recombinante n'exprime pas COX-la et/ou COX-2 de façon autologue et la séquence ADN recombinante n'exprime pas COX-1 a et/ou COX-2. La lignée cellulaire hôte est préférentiellement d'origine humaine, de primate ou de hamster telles que les cellules de rein de singe COS-7 et les cellules ovariennes de hamster CHO-K1 exemplifiées dans la présente invention, mais d'autres lignées cellulaires dérivées d'autres espèces animales telles que le poulet, le hamster, ou des espèces murines ou ovines peuvent être employées. La lignée cellulaire hôte n'exprime pas de façon autologue COX-la et/ou COX-2. Généralement, la séquence ADN recombinante n'est pas originellement présente dans le génotype des cellules réceptrices ou si elle est présente elle ne s'exprime pas. Le terme ADN recombinant utilisé ici fait référence à une séquence ADN qui est dérivée ou isolée de n'importe quelle source, qui peut être modifiée chimiquement et introduite dans des cellules de mammifères. Un exemple de séquence ADN recombinante dérivée d'une source serait une séquence ADN identifiée comme intéressante dans un organisme donné et qui serait ensuite synthétisée chimiquement. Un exemple de séquence ADN recombinante isolée d'une source serait une séquence ADN d'intérêt qui serait excisée ou extraite de cette source par des moyens chimiques ou enzymologiques (par exemple par utilisation d'enzymes de restriction) de façon à être ensuite manipulée (par exemple par amplification par PCR) par des méthodes de génie génétique pour des utilisations protégées par la présente invention. Ainsi, le terme ADN recombinant utilisé ici inclus des ADN totalement synthétiques, semi-synthétiques isolés de sources biologiques ou dérivés de séquence ARN. Les méthodes générales utilisables pour construire une séquence ADN recombinante susceptible de transformer des cellules hôtes sont bien connues des spécialistes du génie génétique. Les sources de séquence ADN d'intérêt codant pour la COX-lb incluent les ARN poly-A issus de cellules ou de tissus de mammifères (préférentiellement d'origine humaine) à partir desquels l'ARNm codant pour la COX-lb peut être obtenu et utilisé pour la synthèse de l'ADNc correspondant par des techniques bien connues des spécialistes en génie génétique. La séquence ADN recombinante utilisée pour la transformation peut être circulaire ou linéaire, double-brin ou simple-brin. Généralement, la séquence ADN recombinante est un ADN linéaire chimérique, ou est un vecteur d'expression plasmidique ou viral qui peut contenir des régions codantes associées à des séquences régulatrices et/ou promotrices d'expression. A titre d'exemple, la séquence ADN recombinante peut elle même comprendre un promoteur ou utiliser un promoteur déjà présent dans le génotype de la cellule hôte. A côté des séquences codantes et des séquences promotrices, la séquence ADN recombinante peut contenir un gène marqueur de sélection et/ou un gène rapporteur pour faciliter l'identification et la sélection des cellules transformées. Alternativement, ce gène rapporteur peut être porté par une séquence ADN recombinante distincte dans une procédure de co-tranfection. Le gène marqueur de sélection et/ou le gène rapporteur peuvent être associés à des séquence ADN régulatrice et/ou promotrice pour permettre leur expression dans les cellules hôtes. Les gènes marqueurs de sélection sont bien connus des spécialistes du génie génétique et incluent les gènes de résistance aux antibiotiques et aux herbicides. Parmi ceux-ci on peut noter entre autres les gènes de résistance à néomycine, hygromycine, généticine (G-418), zéocine, kanamycine ou hygromycine. Les gènes rapporteurs sont utilises pour l'identification des cellules potentiellement transformées et pour évaluer la fonctionnalité des séquences régulatrices. En général, le gène rapporteur n'est pas présent ou ne s'exprime pas dans les cellules hôtes. Il code pour une protéine dont l'expression peut être évaluée par une propriété facilement détectable (une activité enzymatique par exemple). Ces gènes rapporteurs sont bien connus des spécialistes du génie génétique. Ils incluent entre autres le gène de chloramphénicol acétyl transférase, le gène de béta-glucuronidase ou le gène de luciférase. L'expression du gène rapporteur est évaluée au bout d'un temps suffisant après l'introduction de la séquence ADN recombinante dans les cellules hôtes. D'autres éléments tels que des introns (ADN non codants), des séquences KOZAK, des séquences facilitant l'insertion dans le génome, des enhancers , des séquences poly-A peuvent aussi faire partie de la séquence ADN recombinante. Ces éléments peuvent être nécessaire ou non à l'expression de la séquence ADN codant pour la COXlb. La séquence ADN recombinante peut être introduite dans les cellules hôtes par transfection avec des vecteurs d'expression commerciaux tels que pCR2.1, pcDNA3. 1, pST-blue I ou pTarget. L'introduction de la séquence ADN recombinante dans les cellules hôtes peut être obtenue par des méthodes bien connues des spécialistes du génie génétique. Elles incluent la lipofection, la microinjection, l'électroporation les méthodes utilisant le phosphate de calcium ou le DEAE-dextran. La présente invention concerne par ailleurs d'une méthode pour évaluer le pourvoir inhibiteur et/ou activateur d'une molécule d'origine naturelle, semi-synthétique ou synthétique sur l'activité cyclooxygénase issue de l'expression de la séquence ADN recombinante codant pour la COX-lb dans les cellules transformées. Cette méthode peut être utilisée dans un plan de criblage de molécules visant à sélectionner des composés inhibiteurs sélectifs ou spécifiques de l'une ou l'autre des trois formes de cyclooxygénase : COX-la, COX-lb ou COX-2.. Les médicaments ainsi sélectionnés pourront être indiqués pour le traitement de pathologies inflammatoires aiguës et/ou chroniques (en particulier polyarthrite rhumatoïde), d'affections vasculaires (en particulier insuffisance veineuse chronique, athérosclérose), d'affections cutanées (ulcères cutanés) du cancer (en particulier cancer du colon), de la maladie d'Alzheimer, de la douleur et/ou de la migraine. Lette methode consiste notamment a ettectuer les étapes suivantes de taçon séquentielle : a) mettre des cellules transgéniques contenant la séquence ADN recombinante (préférentiellement humaine) correspondant à l'épissage alternatif des parties codantes du gène de PGHS-1, une fraction subcellulaire issue de ces cellules, ou la protéine COX-lb isolée ou purifiée à partir de ces cellules en présence d'une concentration prédéfinie d'une molécule dans un milieu approprié au matériel biologique utilisé ; b) ajouter ou non une quantité prédéfinie de substrat acide gras poly-insaturé (préférentiellement acide archidonique), et/ou de co-substrats et/ou de cofacteurs nécessaires à la mesure de l'activité COX-lb. c) déterminer l'activité COX-lb par la mesure de la quantité de produits formés (préférentiellement prostaglandines et thromboxanes) et/ou de substrats ou co- substrat consommés (préférentiellement acide-arachidonique et oxygène) dans le milieu réactionnel après un temps défini. Les techniques utilisées peuvent être des techniques ELISA, EIA ou RIA disponibles ou non commercialement. Des techniques chromatographiques, spectrophotométriques ou oxymétrique peuvent aussi être utilisées (exemple : HPLC, chromatographie sur couche mince...) ; d) comparer l'activité COX-lb mesurée ou estimée en présence de composé à celle obtenue sur ces mêmes cellules ou fractions membranaires en absence de ce même composé afin de déterminer le pouvoir inhibiteur et/ou activateur de ce composé ; e) comparer le pouvoir inhibiteur ou activateur (effet maximal mesuré et réactivité déterminée) du composé sur la COX-lb aux pouvoirs inhibiteurs ou activateurs de ce même composé mesurés sur des cellules ou tissus exprimant COX-la et/ou COX-2. L'invention concerne par ailleurs des compositions thérapeutiques comprenant une quantité thérapeutiquement efficace de la nouvelle isoforme ou d'un acide nucléique codant pour cette isoforme, notamment en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. L'isoforme est notamment celle correspondant à la séquence SEQ. ID n 2 et l'acide nucléique codant pour cette isoforme est notamment celui ayant la séquence SEQ. ID n 1. Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques des compositions pharmaceutiques selon l'invention, contenant au moins l'isoforme, peuvent être déterminées de manière usuelle par l'homme du métier, notamment selon les critères généralement pris en compte pour l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient, comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, et les effets secondaires constatés, etc. L'invention a également pour objet une composition thérapeutique comprenant un acide nucléique tel que défini précédemment, codant pour l'isoforme et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, ladite composition étant destinée à être utilisée en thérapie génique. L'acide nucléique de préférence inséré dans un vecteur généralement viral (tels que les adénovirus et les rétrovirus) peut être administré sous forme nue, exempt de tout véhicule favorisant le transfert à la cellule cible, tels que des liposomes anioniques, des lipides cationiques, des microparticules, par exemple des microparticules d'or, des agents de précipitation, par exemple du phosphate de calcium, ou tout autre agent facilitant la transfection. Dans ce cas, l'acide nucléique peut être simplement dilué dans une solution physiologiquement acceptable, telle qu'une solution stérile ou une solution stérile tampon, en présence ou en l'absence d'un véhicule. De manière alternative, un acide nucléique de l'invention peut être associé à des agents qui facilitent la transfection. Il peut être, entre autres, (i) associé à un agent chimique qui modifie la perméabilité cellulaire tel que la bupivacaïne ; (ii) encapsulé dans des liposomes, éventuellement en présence de substances supplémentaires facilitant la transfection ; ou (iii) associé à des lipides cationiques ou des microparticules de silice, d'or ou de tungstène. Lorsque les acides nucléiques de l'invention recouvrent des microparticules, celles-ci peuvent être injectées par voie intradermique ou intraépidermique par la technique du canon à gênes, gene gun (WO 94/24263). Les acides nucléiques de l'invention peuvent être administrées par toute voie d'administration conventionnelle telle que notamment par voie parentérale. Le choix de la voie d'administration dépend en particulier de la formulation choisie. L'invention a donc enfin pour objet un procédé de traitement thérapeutique, notamment des pathologies inflammatoires, dans. laquelle on administre à un patient nécessitant un tel traitement, une quantité efficace d'une isoforme telle que 'définie précédemment ou un acide nucléique codant pour cette isoforme dans le cadre d'une thérapie génique. La présente invention est supportée par les exemples suivants : Exemple 1 : Isolement,clonage et séquençage de l'ADNc issu de l'épissage alternatif du gène de COX-1 constitutive humain. Les cellules promyélocytaires humaines HL-60 (ATCC; Rockville, MD) sont maintenues en suspension, dans un environnement contrôlé (37 C ; 95% 02,5% C02) dans un milieu de culture Iscove contenant 10% de sérum de veau f#tal inactivé par chauffage, de la pénicilline (100 unités/ml) et de la streptomycine (100 g/ml). L'ARN total a été extrait à partir de HL-60 par le Trizol selon la procédure associée au Kit (Gibco BRL). Cette procédure est basée sur la méthode décrite par Chomzynski P. and Sacchi N. (1987) ; Anal. Biochem. 162 :156-159. Deux g d'ARN total ont subi une transcription inverse par la MMLV reverse transcriptase selon la procédure décrite dans le kit (Advantage RT-for-PCR kit ; Deux cent ng d'ADNc simple brin ont été utilisés pour amplifier par PCR l'ADNc codant pour la COX-1 constitutive humaine ou PGHS-1, en utilisant des oligonucléotides spécifiques du gène de PGHS-1 ou COX-1 : 5'-ATGAGCCGGAGTCTCTTGCTCCGG-3' (SEQ ID n 3) incluant le codon start pour le sens et 5'-TCAGAGCTCTGTGGATGGTCCCT-3' (SEQ ID n 4) incluant le codon stop pour l'antisens. Ces oligonucléotides ont été sélectionnés pour synthétiser la totalité de la partie codante de la COX-1 à partir d'ADNc simple brin issu de HL-60. Les conditions de PCR ont été les suivantes : min. à 94 C suivi de 28 cycles de 1min. à 94 C, 1min. à 55 C et 2 min. à 72 C en utilisant la Taq DNA polymerase (Eurogentec, Belgium). Ensuite, 1/10e des produits de PCR soit 5 fil ont été séparés sur un gel d'agarose 1% préparé dans un tampon TBExO.5 contenant du bromure d'éthidium (0.5 g/ml), un agent intercalant, permettant par incorporation entre les bases d'acides nucléiques de les visualiser aux UV. Les produits de PCR ont été directement clonés dans le vecteur plasmidique de clonage pCR2. 1 par TA-cloning selon la procédure indiquée dans le kit (Invitrogen). Brièvement, les fragments de PCR ont été clonés dans le vecteur plaSm1dlque puK2.i par la 14 1J1VA ligase. ensuite les bactéries job. cou compétentes (TOP10F) ont été transformées selon la méthode de Hanahan J Mol Biol 1983,166, 557-580. Vingt quatre colonies ont été repiquées en milieu liquide LB (Luria broth) (comme décrit dans Current protocols of molecular Biology, edited by F.M. Ausubel, Wiley Interscience) contenant un antibiotique (ampicilline ou kanamycine à 50g/ml), l'ADN plasmidique a été extrait et analysé par restriction enzymatique avec l'enzyme de restriction EcoRI. Parmi les sept clones positifs, six ont été envoyés à séquencer (Eurogentec, Belgique). Les résultats du séquençage ont révélé deux populations d'ADNc. Comparaison des 6 clones ADNc COX-1 Les ADN ont été criblés avec des oligonucléotides spécifiques de PGHS-1 ou COX-1 humain : oligonucléotide sens 5'-ACTCGTATTCTGCCCTCTGTGCC-3'(SEQ ID n 5) (nucleotides 442 à 464) et oligonucléotide antisens 5'CTTGCGGTACTCATTGAAGGGCTG-3' (SEQ ID n 6) (nucleotides 1378 à 1401) pour différencier les deux isoformes COX-1. L'amplification de l'ADN par PCR a été la suivante, après une incubation initiale de 5min à 94 C, la réaction d'amplification a été répétée 28 fois (1min à 94 C, 1min à 55 C, 2min à 72 C) en utilisant la Taq DNA polymerase (Eurogentec, Belgium). Les produits de PCR ont été séparés sur un gel d'acrylamide à 8% gel préparé dans un tampon TBExO.5 et révélés dans un tampon TBExO.5 contenant du bromure d'éthidium (0.5 g/ml), un agent intercalant, permettant par incorporation entre les bases d'acides nucléiques de les visualiser aux UV. Ces oligonucléotides ont amplifié des produits de PCR de 849 bp correspondant aux clones COX1-2, COX1-3 et COXI-4 et de 960 bp correspondant aux clones COX1-14, COX1- 15 et COX 1-23 (Figure 1). Les clones COX1-14, COX1-15 et COX1-23 présente une homologie de séquence de 99. 3% à 99. 9% avec les ADNc humains issus de la transcription complète du gène de PGHS-1 (GenBank: M59979, M36271, S78220). La figure 2 correspond à la comparaison des séquences COX1-14 et M59979. Les alignements de séquences du clone COX1-3 avec les séquences COX-1 publiées dans GenBank (M59979, M36271, S78220) et le clone COX1-14 indiquent 93. 7% d'homologies (Figure 3). Les mêmes résultats sont obtenus avec les clones COX1- 2 et COX1-4. Ces alignements montrent que le clone COX1-3 code pour la même séquence que le clone COX1-14 et les séquences COX-1 publiées dans GenBank (M59979, M36271, S78220) à l'exception de deux bases substituées (nucléotides 51 et 736) et de 111 paires de bases (pb) épissées (à partir des nucléotides 1186 jusqu'à 1296). La comparaison de cette séquence du clone COX1-3 épissé à celle décrite par Diaz et al. (1992) J. Biol Chem. 267 :10816-10822) (GenBank : M36219) pour le clone HCO-T9 montre une parfaite homologie (99,9%) à l'exception des nucléotides 51 et 736 (Figure 4). L'alignement de l'ADNc du clone COX1-3 épissé à la séquence génomique complète du gène de PGHS-1 (Yokoyama, C. and Tanabe T. (1989) Biochem Biophys. Res. Commun. 165 : 888-894) montre que les 111 pb absentes sont localisées dans la région 3' de l'exon 9, le cadre de lecture étant conservé pour l'exon 10. L'épissage d'un ARNm requiert des séquences consensus c'est à dire que les deux premiers et deux derniers nucléotides de l'intron sont souvent invariables. L'existence d'un épissage alternatif est confirmé par la présence de cette séquence consensus pour différentes espèces (humain, rat, mouton, souris)(Figure 5). En effet, les deux premiers nucléotides sont conservés entre ces espèces. De plus, la zone épissée est également localisée dans la région 3' de l'exon 9 chez la souris (Kraemer S. A. et al. (1992) Arch of Biochem and Biophys ; 293 :391-400). La séquence en acides aminés de la protéine codée par l'ADNc du clone COX1-3 épissé obtenue a été déduite à partir des résultats de séquençage (Figure 6). Par comparaison avec la COX-1 décrite dans la littérature (Funk CD et al. (1991) Faseb J ; 5 : 2304-2312), la protéine déduite de la séquence ADNc du clone COX1-3 épissé conserve la séquence signal N-terminale ainsi que 3 des 4 sites de N-glycosylation (acides aminés 67,103 et 143). L'absence de 37 acides aminés (396-432), correspondant à l'absence des 111 pb, dans une région proche du site actif, est associée à la perte du site 409 de N-glycosylation de la COX-1 communément décrite dans la littérature (Otto JC et al. (1993) J Biol. Chem. 268 :18234-18242). Pour plus de clarté, nous appellerons COX- la la protéine correspondant au produit de traduction des ARNm non épissés (exon 9 complètement transcrit) et COX-lb, la protéine d'intérêt dans cette invention issue de l'épissage alternatif de la région 3' de l'exon 9 (exon 9 partiellement transcrit). La totalité de la partie codante des ADNc COX-la et COX-lb, contenant ou non une séquence kozak (GCCGCCACC, GCC, ACC) en amont de l'ATG peut être clonée dans les vecteurs plasmidiques d'expression procaryotes (pCR2. 1) et eucaryotes (pcDNA3. 1 (-/+), pcDNA3.1-Néo(-/+), pcDNA3.1-Zéo (-/+), pDR2EFla (Charreau B. et al. (1994) Transplantation ; 58 :1222-1229) (Figure 7). Ces vecteurs ont été utilisés pour la transfection stable par l'utilisation de marqueurs de sélection tels que la néomycine (G418), la zéocine et l'hygromycine. La totalité de la partie codante des ADNc COX-la et COX-lb, contenant ou non une séquence kozak (GCCGCCACC, GCC, ACC) en amont de l'ATG a été clonée dans le vecteurs plasmidique d'expression eucaryote pDR2EFla. Brièvement, La totalité de la partie codante des ADNc COX-la et COX-lb contenant ou non une séquence kozak (GCCGCCACC, GCC, ACC) en amont de l'ATG, cloné dans le vecteur plasmidique pCR2.1a été extrait de ce vecteur par double digestion enzymatique avec des enzymes de restriction adéquats et inséré dans les vecteur plasmidique d'expression eucaryote pDR2EFloc par la Fast-Link DNA ligase (Epicentre). Ensuite les bactéries E. coli compétentes (TOP10F') ont été transformées selon la méthode de Hanahan D (J. Mol Biol, 1983 166,557-580). Dix à 24 ont été repiquées en milieu liquide LB (Luria broth) (comme décrit dans Current protocols of molecular Biology, edited by F. M. Ausubel, Wiley Interscience) contenant un antibiotique (ampicilline à 50 g/ml). L'ADN plasmidique a été extrait et analysé par restriction enzymatique avec les enzymes de restriction BamHI-XbaI. Un des clones positifs a été préparé en grande quantité par la technique de maxi-prep concert High purity system (Gibco-BRL) selon le protocole décrit dans le kit et utilisé pour la transcription in vitro, la transfection transitoire, la transfection stable. Exemple 2 : Transcription et traduction in vitro de la séquence ADNc COX-lb Cinq g de l'ADNc COX-lb (clone COX1-3) et COX-la (clone COX1-14) cloné dans le vecteur plasmidique eucaryote pcDNA3. 1, décrit dans l'exemple 1, ont été linéarisés à l'extrémité 3' pour permettre la transcription in vitro par la T7 RNA polymerase et la traduction dans un lysat de réticulocytes contenant des protéines biotynilées et de l'ARNt chargé en lysine selon la procédure indiquée dans le kit (nonradioactive transcription/translation kit, Boehringer Mannheim). Les protéines obtenues ont été séparées sur un gel 10%Tris/glycine (Bio-Rad) et tranferrées sur membrane de nitrocellulose, lesquelles ont ensuite été saturées avec un tampon TBS contenant 0.1% tween-20 et 5% lait écrémé, et incubées avec de la streptavidine couplée à l'HRP. Les membranes ont été révélées par chemiluminescence avec le réactif ECL (AmershamPharmacia) et exposées sur des films rayon-X (Amersham-Pharmacia). La trancription in vitro-nous a permis de savoir si la séquence d'ADNc codant pour la COX-lb est transcrite puis traduite correctement en protéine. Pour démontrer la présence d'une protéine COX-1 de plus petite taille, nous avons comparé la protéine COX-lb (clone COX1-3) à la COX-la (clone COXI-14). Figure 8A, nous observons que la COX-la (clone COX1-14) code pour un polypeptide de 70KDa, de même taille que le standard COX-1 de mouton déposé. Par contre, la COX-lb (clone COX1-3) synthétise un polypeptide de masse moléculaire plus faible d'environ 62KDa. Exemple 3 : Transfection transitoire dans des cellules COS-7 La totalité de la séquence codante de COX-lb (clone COX1-3) et de COX-la (COX1-14) clonée dans le vecteur d'expression eucaryote pcDNA3.1 (Invitrogen), cité à l'exemple 1, a été transfectée transitoirement dans les cellules COS-7 en utilisant le DEAE-dextran-chloroquine (Sigma). La veille, les cellules ont été ensemencées à 5.104 cellules/ml. Le jour de la transfection 5 g d'ADNc ont été préparés par boite de 100mm, le milieu complet a été remplacé par 5ml de DMEM contenant 200 l de solution DEAE (10mg/ml)/dextranchloroquine (2.5mM) et 5 g d'ADNc. Après une incubation de 3h30 à 37 C, le milieu de complexation a été remplacé par 5ml du PBS contenant 10% DMSO à température ambiante pendant 2min, et le PBS contenant 10% DMSO a été remplacé par 10ml de milieu complet. Après 12 à 20h, les cellules ont été réensemencées. D'autres techniques de transfection ont également été utilisées : les liposomes (DAC-30 liposome (Eurogentec), lipofectamine (Gibco-BRL). Après 72h de transfection, les cellules transfectées ont été lavées une fois avec du PBS et traitées avec le tampon de lyse (Tris 50mMpH8.0, NaCl 150mM, 0. 02% azide de sodium, aprotinine 1 g/ml, 0. 25% tritonx-100, PMSF 100 g/ml et benzamidine 5mM). La concentration en protéine a été évaluée en microplaques par le réactif DC-protein assay (Biorad). Les échantillons ont été conservés à -80 C. La même quantité de protéine a été séparée sur un gel 10%Tris/glycine (Novex) et tranferrée sur membrane de nitrocellulose. Les membranes ont ensuite été saturées, à température ambiante pendant lh, avec un tampon TBS contenant 0.1% tween-20 et 5% lait écrémé et incubées, à température ambiante pendant 2h, avec un premier anticorps monoclonal dirigé contre la COX-1 humain (Cayman). Après plusieurs lavages, les membranes ont été incubées, à température ambiante pendant lh, avec un second anticorps IgG anti-souris conjugué à l'HRP (Biorad) et révélées par chemiluminescence avec le réactif ECL (AmershamPharmacia) et exposées sur des films rayon-X (Amersham-Pharmacia) (Figure 8B). Deux dépots ont été réalisés par échantillon, nous pouvons constater que dans les puits n 2 et 3 correspondant à la séquence codant pour l'ADNc COX-la, le polypeptide de 70KDa obtenu est de taille comparable au standard COX-1 de mouton déposé dans le puits n 1 ; alors que le polypeptide obtenu à partir de la séquence codant pour l'ADNc COX-lb (puits 4 et 5) a un poids moléculaire d'environ 62KDa. Exemple 4 : Transfection stable dans des cellules CHO-K1 La partie codante des ADNc COX-la et COX-lb, contenant ou non une séquence kozak (GCCGCCACC, GCC, ACC) en amont de l'ATG, clonée dans le vecteur plasmidique d'expression eucaryote pDR2EFla , décrit à l'exemple 1, a été transfecté de façon stable dans les cellules CHO-Kl en utilisant la lipofectamine (Gibco-BRL). Brièvement, les cellules ont poussé dans un environnement contrôlé (37 C, 5% C02) en monocouches dans du milieu HamF'12 contenant 5% de sérum de veau foetal (SVF) inactivé par chauffage, 20mM hepes, (100 units/ml) de penicilline et (100 g/ml) de streptomycine. Pour réaliser la transfection, les cellules ont été ensemencées, la veille de la transfection, dans une boîte de 60mm à 5.104cellules/ml dans 5ml de milieu complet. Le jour de la transfection, les cellules ont été lavées avec du milieu HamF'12 sans sérum de veau f#tal. Le milieu a été remplacé par 250 l de milieu HamF'12 sans sérum de veau f#tal contenant 8 l de PLUS reagent et 2 g d'ADNc COX-la ou COXlb. Après 15min à température ambiante, 250.1 de milieu HamF'12 sans sérum de veau f#tal contenant 12 l de Lipofectamine. Après à nouveau 15min à température ambiante, 2ml de milieu HamF'12 sans sérum de veau f#tal a été ajouté. Le complexe liposomeADN a été incubé pendant 4h à 37 C. A la fin de cette période, 2,5ml de milieu HamF'12 contenant 10% SVF et 4% HEPES a été rajouté et les cellules ont été incubées 20h à 37 C. Le lendemain de la transfection, les cellules ont été repiquées dans milieu complet HamF'12 contenant 5% de sérum de veau f#tal (SVF), 20mM hepes, (100 units/ml) de penicilline et (100 g/ml) de streptomycine à une très faible densité (généralement 4 boites de 100mm à raison de 5.103 ou 103cellules/ml) afin de pouvoir par la suite prélever des clones bien individualisés. L'hygromycine a été ajoutée à une concentration de 0.4mg/ml et changée tous les deux jours pendant la période de sélection (1 semaine). Les clones ont été prélevés par la technique des cylindres (cf : current protocols of molecular biology, edited by F. M. Ausubel, Wiley Interscience) et repiqués en plaque 24 puits dans un milieu complet contenant O.lmg/ml d'hygromycine. Lorsque les clones ont été confluents, ils ont été réensemencés en plaque 6 puits pour analyser, par RT-PCR, les ARN totaux préparés à partir de chaque clone isolé. Brièvement, lorsque les cellules ont été confluentes, le surnageant a été éliminé et l'ARNtotal a été extrait avec du Trizol (Gibco-BRL) selon le protocole décrit dans le kit. L'ARN total a été analysé en RT-PCR en utilisant un kit "Ready-to-Go RT-PCR beads" (Amersham-Pharmacia). Selon le protocole décrit dans le kit, les billes ont été réhydratées par addition d'eau DEPC contenant un g d'ARN total et un mélange d'hexanucléotides fournis dans le kit (Amersham-Pharmacia). Le premier brin d'ADN a été synthétisé par une incubation de 30min à 42 C, l'enzyme a été inactivée 5min à 95 C. Après, l'addition des oligonucléotides spécifiques de COX-lhumain (cités en exemple 1) ou d'oligonucléotides spécifiques de PGHS-2 ou COX-2 humain : oligonucléotide sens 5'- ATGCTCGCCCGCGCCCTGCT-3' (SEQ ID n 7) et oligonucléotide antisens 5'CTACAGTTCAGTCGAACGTTCTTT-3'(SEQ ID n 8), la réaction suivante a été répétée 28 fois (1min à 94 C, 1min à 55 C et 2min à 72 C). Ensuite, 1/10e des produits de PCR soit 5 l ont été séparés sur un gel d'agarose 1% préparé dans un tampon TBEx0.5 contenant du bromure d'éthidium (0.5 g/ml), un agent intercalant, permettant par incorporation entre les bases d'acides nucléiques de les visualiser aux UV. Nous avons observé que sur 42 clones COX-lb analysés en RT-PCR avec les amorces COX-1 humain, 16 clones amplifient une bande correspondant à la taille de la COX-lb. Aucun signal n'est détecté avec les cellules CHO-K1 non transfectées. La figure 9A représente 30 des 46 ARN totaux issus clones COX-lb et analysés en RT-PCR. Nous observons une amplification d'un fragment d'environ 1800pb correspondant à la COX-lb avec les clones A2, A5, A6, B4, B5, B6, Cl, C3, C5, El, E2, E3 et E4. Ces douze clones ainsi que trois autres clones (H4, J2, et J4) faiblement exprimés (data not shown) ont été conservés pour les expériences ultérieures. Une bande d'environ 700pb est observée pour les clones A5, A6 et C3, elle correspond probablement à une dégradation partielle des ARNm. Les ARN de ces clones, analysés en RT-PCR avec les amorces COX-2 humain, n'amplifient aucun signal (data not shown). Figure 9B, nous observons que sur 21 clones COX-la analysés en RT-PCR avec les amorces COX-1 humain, 19 clones amplifient de façon plus ou moins intense une bande correspondant à la taille de la COX-la. Six clones (A5, B1, C6, D2, D4 et A2-3) ont été conservés pour les expériences ultérieures. Aucun signal n'est détecté avec les cellules CHO-K1 non transfectées. Les ARN de ces clones, analysés en RT-PCR avec les amorces COX-2 humain, n'amplifient aucun signal (data not shown). En général, lors des transfections de COX-lb dans le génome des cellules CHOK1, nous avons 40 à 50% des clones amplifiés en RT-PCR alors que pour les transfections de COX-la, 90% des clones sont positifs en RT-PCR. Une RT-PCR a été réalisée régulièrement (une fois par mois) sur les cellules transfectées conservées en culture afin de vérifier que l'ADNc codant pour COX-lb est toujours exprimé. Brièvement, lorsque les cellules ont été confluentes, le surnageant a été éliminé et l'ARNtotal a été extrait avec du Trizol (Gibco-BRL) selon le protocole décrit dans le kit. L'ARN total a été analysé en RT-PCR en utilisant un kit "Ready-to-Go RT-PCR beads" (Amersham-Pharmacia). Selon le protocole décrit dans le kit, les billes ont été réhydratées par addition d'eau DEPC contenant un g d'ARN total et un mélange d'hexanucléotides fournis dans le kit (Amersham-Pharmacia). Le premier brin d'ADN a été synthétisé par une incubation de 30min à 42 C, l'enzyme a été inactivée 5min à 95 C. Après, l'addition des oligonucléotides spécifiques de PGHS-1 ou COX-1 humain : oligonucléotide sens 5'-ACTCGTATTCTGCCCTCTGTGCC-3' (SEQ ID n 5)(nucleotides 442 à 464) et oligonucléotide antisens 5'-C'ITGCGGTACTCATTGAAGGGCTG-3' (SEQ n 6)(nucleotides 1378 à 1401), la réaction suivante a été répétée 28 fois (1min à 94 C, 1min à 55 C et 2min à 72 C). Ensuite, 1/l0e des produits de PCR soit 5 fil ont été séparés sur un gel d'agarose 1% préparé dans un tampon TBExO.5 contenant du bromure d'éthidium (0.5 g/ml), un agent intercalant, permettant par incorporation entre les bases d'acides nucléiques de les visualiser aux UV. Figure 10, nous avons analysé 3 clones COX-lb (A2, B4 et E4) à 2 mois d'intervalle. Nous observons que 2 mois après transfection, deux des clones (A2 et E4) sont toujours parfaitement exprimés, bande de 849pb correspondant à la COX-lb, alors que l'expression du troisième clone (B4) est très nettement diminuée. Les 16 clones codant pour la COX-lb et les 6 clones codant pour la COX-la ont été réensemencés en flask de 25cm2 pour vérifier, par western blot, la présence de la protéine COX-la ou COX-lb dans les cellules transfectées. Brièvement, les cellules transfectées ont été lavées une fois avec du PBS et traitées avec le tampon de lyse (Tris 50mMpH8.0, NaCl 150mM, 0. 02% azide de sodium, aprotinine lg/ml, 0. 25% tritonx-100, PMSF 100 g/ml et benzamidine 5mM). La concentration en protéine a été évaluée en microplaques par le réactif DC-protein assay (Biorad). Les échantillons ont été conservés à -80 C. La même quantité de protéine a été séparée sur un gel 10%Tris/glycine (Novex) et tranferrée sur membrane de nitrocellulose. Les membranes ont ensuite été saturées avec un tampon TBS contenant 0.1 % tween-20 et 5% lait écrémé pendant lh à la température ambiante et incubées, à température ambiante pendant 2h, avec un premier anticorps monoclonal dirigé contre la COX-1 humain (Cayman) ou polyclonal dirigé contre la COX-2 humain (Cayman). Après plusieurs lavages, les membranes ont été incubées, à température ambiante pendant lh, avec un second anticorps IgG anti-souris conjugué à l'HRP ou IgG anti-lapin couplé à l'HRP (Biorad) et révélées par l'Opti-4CN (Biorad), un réactif se fixant directement à l'HRP en libérant une coloration orange-brun sur la membrane. Par western blot, nous avons constaté que 14 des 16 clones COX-lb expriment une protéine de taille inférieure à celle du standard COX-1 de mouton (Cayman) correspondant aux lllpb absentes et donc à la COX-lb dont la taille est d'environ 62KDa (Figure 11 A). Les clones A2 et J3 n'expriment pas la COX-lb. Par contre, les 6 clones COX-la a libèrent un polypeptide de 70KDa, de même taille que le standard COX-1 de mouton (Cayman) déposé (Figure 11B). Il est à noter que les cellules CHO-K1 n'expriment pas de COX-1. Les clones stables ont été utilisés pour le dosage des prostaglandines et des préparations membranaires ont été préparées pour évaluer l'activité enzymatique de cette nouvelle enzyme. Exemple 5 : Mesure de l'activité COXlb sur des clones stables et pharmacologie Les 16 clones codant pour la COX-lb, les 6 clones codant pour la COX-la et les cellules CHO-K1 ont été ensemencés en plaque 6 ou 24 puits. Lorsque les cellules ont été confluentes, elles ont été détachées par trypsinisation et aliquotées à une densité de 2.5.105 cellules dans 200/il de PBS contenant du CaCl2 (lmM) (protocole remodelé à partir de l'article de Kargman et al. (1992) ; Biochem. Pharmacol. 52 :1113-1125 réaliser les productions de PGE2 et PGD2. Pour les productions de PGE2 et de PGD2, les cellules ont été mises en présence ou non, pendant 15min à 37 C, de différentes concentrations de NS-398 dilué dans du DMSO (10-9 à 10-5M). Ensuite 10 M d'acide arachidonique (Cayman) a été ajouté pendant 10min à 37 C et à l'obscurité. La réaction a été arrêtée par centrifugation ou par addition de HCI (lOmM) plus NaOH (10mM), les surnageants ont été stockés à -80 C. Nous avons également réalisé une partie des productions en ajoutant une étape de sonication, pour les clones COX-lb, avant de récupérer les surnageants. La quantité de PGE2 et PGD2 produite a été évaluée par dosage EIA selon le proctocole décrit dans le kit (PGE2: Amersham-Pharmacia; PGD2 : Cayman). Les résultats ont démontré, sur des cellules détachées non soniquées, que les clones ayant intégré dans leur génome l'ADNc codant pour la COX-lb ne produisent pas de PGE2 en comparaison des cellules CHO-K1, alors que les clones COX-la produisent de façon non négligeable de la PGE2 (150 à 800ng). Par contre, les clones COX-lb produisent de la PGD2, deux à trois fois plus que les cellules CHO-K1 pour certains d'entre eux (Figure 12). Nous avons comparé l'effet de la sonication sur la production de PGD2 sur un des clones COX-lb (clone B4). Nous avons remarqué une augmentation de 2. 8 fois de PGD2 produite lorsque les cellules sont soniquées alors que pour les cellules CHO-K1 non transfectées, la quantité de PGD2 produite ne varie pas qu'elles soient soniquées ou non (Figure 13). Afin de rechercher une différence d'activité pharmacologique entre la COX-la et la COX-lb, un inhibiteur spécifique COX-2 (le NS-398) a été testé sur la production de PGD2 sur les cellules transfectées ayant intégré dans leur génome l'ADNc codant pour la COX-lb (clone B4) et COX-la (clone D4). Nous avons observé (Figure 14) que le NS- 398 à 10-6M a peu d'effet sur la production de PGD2 par le clone COX-la (D4) (7%) alors que ce produit inhibe la production de PGD2 par le clone COX-lb (B4) d'environ 48%. Exemple 6: Expression de COX-lb au niveau de l'ARNm dans des cellules humaines en culture Les ARNm ou totaux issus de différents types cellulaires (lignées pro- érythroleucémiques (HL-60 différenciées ou non en cellules de types monocytes et granulocytes) ont été préparés selon la procédure décrite dans le kit RNAplus (Bioprobe) et criblés 1) avec des oligonucléotides spécifiques de PGHS-1 ou COX-1 humain : oligonucléotide sens 5'-ACTCGTATTCTGCCCTCTGTGCC-3'(SEQ ID n 5) (nucleotides 442 à 464) et oligonucléotide antisens 5'-CTTGCGGTACTCATTGAAGGGCTG-3' (SEQ ID n 6) (nucleotides 1378 à 1401) pour différencier les deux isoformes COX-1 ; 2) des oligonucléotides contrôles GAPDH humain (Clontech). La présence d'ARNm COX- lb à partir d'ARN total a été réalisée selon deux techniques : en utilisant un kit "Ready- to-Go RT-PCR beads" (Pharmacia). Selon le protocole décrit dans le kit, les billes ont été réhydratées par addition d'eau DEPC contenant cinq g d'ARN total et un mélange d'hexanucléotides fournis dans le kit (Amersham-Pharmacia). Le premier brin d'ADN a été synthétisé par une incubation de 30min à 42 C, l'enzyme a été inhibée 5min à 95 C. Après, addition des oligonucléotides spécifiques de COX-1 humain (cités dans cet exemple), la réaction suivante a été répétée 28 fois (1min à 94 C, 1min à 55 C et 2min à 72 C) pour COX-1 et 28 fois (1min at 94 C, 1min at 50 C, 2min at 72 C) pour l'atubuline. Ensuite, 1/l0e des produits de PCR soit 5 l ont été séparés sur un gel d'agarose 1% préparé dans un tampon TBEx0.5 contenant du bromure d'éthidium (0.5 g/ml), un agent intercalant, permettant par incorporation entre les bases d'acides nucléiques de les visualiser aux UV. 2) en faisant une transcription inverse de 1 à 2 g d'ARN total ont subi une transcription inverse par la MMLV reverse transcriptase selon la procédure décrite dans le kit (Advantage RT-for-PCR kit, Clontech). Cent à deux cent ng d'ADNc simple brin ont été utilisés pour amplifier par PCR l'ADNc codant pour la COX-1 constitutive humaine ou PGHS-1, en utilisant des oligonucléotides spécifiques du gène de COX-1 (cités dans cet exemple). Les conditions de PCR ont été les suivantes: 5 min. à 94 C suivi de 28 cycles de 1min. à 94 C, 1min. à 55 C et 2 min. à 72 C. Ensuite, 1/10e des produits de PCR soit 5 l ont été séparés sur un gel d'agarose 1% préparé dans un tampon TBEx0.5 contenant du bromure d'éthidium (0.5 g/ml), un agent intercalant, permettant par incorporation entre les bases d'acides nucléiques de les visualiser aux UV. En exemple, des expériences ont été réalisées sur des HL-60 dédifférenciées (cultivées en présence de 10% SVF) ou différenciées en cellules de type monocytaire ou de type granulocytaire avec du PMA(100nM) et 1.5% DMSO. Les ARNtotaux issus des HL-60 dédifférenciées ou différenciées en cellules de type monocytaire (PMA 100nM) ou de type granulocytaire (1.5% DMSO) ont été analysés en RT-PCR avec des oligonucléotides permettant de discriminer les deux isoformes COX-1 (Figure 15A) et avec un standard GAPDH humain (Figure 15B). Les résultats indiquent que les HL-60 dédifférenciées expriment les ARNms COX-la représentés par la bande à 960pb et les ARNms COX-lb visualisés par une bande à 849pb. Cependant, lors de la différenciation des HL-60 en cellules de type monocytaire ou de type granulocytaire, COX-la est induit par comparaison avec COX-lb, qui reste inchangé. Les ARN ont été rapportés à la GAPDH d'une taille de 983pb afin de démontrer que la quantité d'ARN utilisée est la même dans chaque condition. Exemple 7: Induction d'expression d'ARNm COX-lb dans des modèles physiopathologiques animaux. Un modèle de pleurésie à la carragénine a été créé chez le rat d'après Tomlinson A et al. (1994) Br. J. Pharmacol. 113 : 693-698. Brièvement, la carragénine à 1% a été injectée dans la cavité pleurale et des prélèvements ont été effectués à différents temps (T=0, 2h, 8h, 24h et 48h). Au moment du sacrifice des rats, l'exsudat de la cavité pleurale, induit par injection de carragénine, a été prélevé. Après comptage des cellules, elles ont été collectées par centrifugation pour préparer les ARN. Les ARNtotaux ont été extrait avec du Trizol (Gibco-BRL) selon le protocole décrit dans le kit. Un g d'ARN total ont subi une transcription inverse par la MMLV reverse transcriptase selon la procédure décrite dans le kit (Advantage RT-for-PCR kit ; Cent ng d'ADNc simple brin ont été amplifiés par PCR en utilisant la Taq polymerase (promega) et des oligonucléotides spécifiques de PGHS-1 ou COX-1 humain : oligonucléotide sens 5'ACTCGTATTCTGCCCTCTGTGCC-3' (SEQ ID n 5)(nucléotides 442 à 464) et oligonucléotide antisens 5'ITGCGGTACTCATTGAACCGCI'G-3' (SEQID n 6)(nucléotides 1378 à 1401) pour différencier les deux isoformes COX-1. Les conditions de PCR ont été les suivantes : min. à 94 C suivi de 10 cycles de 1min. à 94 C, 1min. à 55 C (avec un décrément de l C/min) et 1 min. à 72 C, puis 30 cycles de 1min. à 94 C, 1min. à 55 C et 1 min. à 72 C. Ensuite, 1/10e des produits de PCR soit 5 l ont été séparés sur un gel d'agarose 1% préparé dans un tampon TBExO.5 contenant du bromure d'éthidium (0.5 g/ml), un agent intercalant, permettant par incorporation entre les bases d'acides nucléiques de les visualiser aux UV. La figure 16 représente la PCR réalisée sur des exsudats de rat avec les amorces COX-1 humain. Nous observons, que quelque soit le temps de prélèvement, trois bandes sont amplifiées par PCR avec les amorces COX-1, une bande de 960pb correspondant à la COX-la, une bande de 849pb correspondant à la COX-lb et une troisième bande de 700pb. Par contre, nous n'observons pas d'amplification chez le rat témoin. La variation d'expression de l'une ou l'autre des isoformes n'est pas clairement définie. REVENDICATIONS 1. Lignées cellulaires exprimant une séquence d'ADN recombinante correspondant à un épissage alternatif de la région 3' de l'exon 9 du gène de la prostaglandine synthase-1 (PGHS-1 ou COX-1) de mammifère et codant pour une isoforme de la PGHS-1, cette isoforme produisant en présence d'acide arachidonique préférentiellement la prostaglandine D2 ou la 15-deoxy#12-14 prostaglandine J2. 2. Lignées cellulaires selon la revendication 1 exprimant une séquence d'ADN codant pour une isoforme ayant une masse moléculaire de 62 KDa et correspondant à une délétion des acides aminés 396 à 432 de PGHS-1humaine. 3. Lignées cellulaires selon la revendication 2 exprimant une séquence d'ADN correspondant à la séquence SEQ ID n 1. 4. Isoforme de la prostaglandine synthase-1 (PGHS-1 ou COX-1), à l'état isolé, correspondant à la séquence SEQ ID n 2. 5. Molécule d'ADN isolée codant pour l'isoforme de la prostaglandine synthase 1 correspondant à la séquence SEQ. ID n 2. 6. Molécule d'ADN isolée ayant une séquence nucléotidique correspondant à la séquence SEQ. ID n 1 ou comprenant cette séquence. 7. Méthode de criblage de molécules pour évaluer leur pouvoir inhibiteur ou activateur sur l'activité cyclooxygénase, qui consiste à utiliser des lignées cellulaires selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 8. Méthode de criblage de molécules selon la revendication 7, qui consiste en outre à comparer les pouvoirs inhibiteurs ou activateurs des molécules sur l'isoforme aux pouvoirs inhibiteurs ou activateurs des molécules sur COX-1 ou COX-2. 9. Méthode selon la revendication 8, qui consiste à : a) mettre des cellules, une fraction subcellulaire issue de ces cellules ou l'isoforme de PGHS-1 isolée ou purifiée à partir de ces cellules en présence d'une quantité prédéfinie d'une molécule dans un milieu approprié au matériel biologique utilisé ; b) ajouter ou non une quantité prédéfinie du substrat acide gras polyinsaturé et/ou de cosubstrats et/ou de cofacteurs nécessaire à la mesure de l'activité de l'isoforme ; c) déterminer l'activité de l'isoforme ; d) comparer cette activité à celle obtenue en absence de la molécule pour déterminer un pouvoir inhibiteur ou activateur de la molécule vis à vis de l'isoforme; e) comparer ce pouvoir inhibiteur ou activateur à ceux mesurés par ailleurs vis à vis de la COX-1 (isoforme entière non-épissée) et/ou de COX-2. 10. Composition thérapeutique comprenant une quantité efficace d'une isoforme de la prostaglandine synthase-1 (PGHS-1 ou COX-1) de mammifère produisant en présence d'acide arachidonique préférentiellement la prostagl andine D2 ou la 15-deoxy#12-14 prostaglandine J2 et qui est le produit d'une traduction d'une séquence d'ADN recombinante correspondant à un épissage alternatif de la région 3' de l'exon 9 du gène de la prostaglandine synthase-1 (PGHS-1 ou CIX-1) ou d'un acide nucléique codant pour cette isoforme. 11. Composition thérapeutique selon la revendication 10 comprenant une quantité efficace d'une isoforme de la prostaglandine stnthase-1 (PGHS-1 ou COX- 1) humaine, cette isoforme ayant une masse moléculaire de 62 Kda et correspondant chez l'homme à une délétion des acides aminés 396 à 432 de PGHS-1, ou d'un acide nucléique codant pour cette isoforme. 12. Composition thérapeutique comprenant une quantité efficace d'une isoforme de la prostaglandine synthase-1 selon la revendication 4. 13. Composition thérapeutique comprenant une quantité efficace d'une molécule d'ADN selon la revendication 5. 14. Utilisation pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de pathologies inflammatoires, d'affections vasculaires, d'affections cutanées, du cancer, de la maladie d'Alzheimer, de la douleur et/ou de la migraine, d'une isoforme de la prostaglandine synthase-1 (PGHS-1 ou COX-1) de mammifère produisant en présence d'acide arachidonique préférentiellement la prostaglandine D2 ou la 15-deoxy#12-14 prostaglandine J2 et qui est le produit d'une traduction d'une séquence d'ADN recombinante correspondant à un épissage alternatif de la région 3' de l'exon 9 du gène de la prostaglandine synthase-1 (PGHS-1 ou COX-1) ou d'un acide nucléique codant pour cette isoforme. 15. Utilisation selon la revendication 14 d'une isoforme de la prostaglandine synthase-1 (PGHS-1 ou CIX- 1) humaine, cette isoforme ayant une masse moléculaire de 62 Kda et correspondant chez l'homme à une délétion des acides aminés 396 à 432 de PGHS-1 ou d'un acide nucléique codant pour cette isoforme. 16. Utilisation selon la revendication 14 d'une isoforme de la prostaglandine synthase-1 selon la revendication 4 ou d'une molécule d'ADN selon la revendication 5.