Brevet FR2820425A1 — publié le 20020809

La présente invention est relative à un mélange de peptides issus d'une protéine Nef ainsi qu'à ses applications en tant que médicament (dans des compositions immunogènes, aptes à stimuler la production de lymphocytes T CD4+ anti-VIH in vivo et donc utiles pour la vaccination contre le SIDA) ou en tant que réactif de diagnostic de lymphocytes T spécifiques du VIH, notamment pour évaluer l'état immunitaire de patients séropositifs ou sous thérapie anti-rétrovirale. Les lymphocytes T CD4+ possèdent un récepteur T réarrangé qui leur permet de reconnaître sélectivement les fragments peptidiques issus de la dégradation de l'antigène par les cellules présentatrices et présentées par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH II). Les déterminants que portent ces fragments peptidiques et que reconnaissent effectivement les lymphocytes T sont appelés épitopes T. Les lymphocytes T CD4+ sont connus pour être une cible privilégiée du virus de'l'immunodéficience humaine (VIH) et peuvent jusqu'à disparaître complètement de la circulation sanguine. De ce fait, les patients infectés par le VIH sont victimes d'infections opportunistes et ne peuvent induire de réponses immunitaires vigoureuses pour les combattre. Les lymphocytes T CD4+ ont en effet un rôle majeur dans l'établissement des réponses immunitaires. Ils sécrètent la plupart des cytokines nécessaires au recrutement de cellules effectrices que sont les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques et les lymphocytes B producteurs d'anticorps. Ils interviennent également dans l'activation des cellules par des contacts cellulaires et par exemple induisent l'activation par le CD40 des cellules dendritiques présentatrices de l'antigène. De par leur rôle majeur, la disparition des lymphocytes T CD4+ entraîne donc un affaiblissement significatif du système immunitaire : en particulier, la disparition des lymphocytes T CD4+ diminue l'immunité spécifique contre le VIH. En effet, des travaux récents ont montré que des individus présentant une réponse proliférative spécifique des cellules CD4+ spécifiques de composants du VIH peuvent contrôler l'infection virale en l'absence de tout traitement (1,2). On constate même une corrélation inverse entre la prolifération de lymphocytes T CD4+ vis-à-vis de la protéine P24 et la charge virale. Il est possible que cette corrélation résulte directement de la capacité des lymphocytes T CD4+ de type TH1 à sécréter des cytokines anti-virales comme l'IFN-y et à être cytotoxiques. Elle peut également résulter indirectement de leur capacité à maintenir une immunité humorale et plus probablement une immunité cellulaire. On sait en effet que les cellules T CD8+ cytotoxiques contribuent de manière importante au maintien des patients séropositifs dans un état non symptomatique. Les récents progrès faits par la chimiothérapie anti-VIH permettent d'espérer qu'on pourra rétablir une immunité normale et protectrice chez les patients infectés par ce virus. On observe en effet que chez les patients sous thérapie antirétrovirale à haute efficacité (HAART ou Highly Active Antiretroviral Therapy), le taux de cellules CD4+ remonte considérablement (3). Cette remontée du nombre de lymphocytes T CD4+ est une condition nécessaire au recrutement de lymphocytes T CD4+ mais elle permet rarement d'obtenir une réponse proliférative contre des composants du virus. L'induction de cette réponse nécessite en effet un traitement spécifique, tel qu'un vaccin. L'activation des lymphocytes T CD4+ se fait sous l'effet de la présentation des peptides viraux par les molécules HLA II, que portent les cellules présentatrices de l'antigène (APC ou Antigen Presentation Cells). Ces peptides, appelés épitopes T, résultent de la dégradation protéolytique des antigènes viraux par l'APC. Ils ont des longueurs variables, généralement de 13 à 25 acides aminés et possèdent une séquence qui les rend capables de se lier aux molécules HLA II. Il est maintenant établi qu'un peptide, épitope T, est capable, au même titre que l'antigène natif, de stimuler in vitro des lymphocytes T CD4+ qui lui sont spécifiques ou de les recruter in vivo. Les épitopes T sont donc suffisants pour induire une réponse CD4+. Toutefois, un des problèmes majeurs qui limite l'utilisation de ces peptides est que leur séquence varie d'un individu à l'autre, en raison du polymorphisme des molécules HLA II, qui sont des hétérodimères, exprimés sur les cellules présentatrices des antigènes (APC) et qui présentent aux lymphocytes T CD4+, les épitopes T desdits antigènes. Ces molécules sont capables de lier un répertoire important de peptides ayant des séquences très différentes, ce qui leur permet de présenter aux cellules T, plusieurs peptides par antigène. Il existe quatre types différents de molécules HLA II par individu : 2 HLA-DR, 1 HLA-DQ et 1 HLA-DP ; la molécule HLA-DR dont la chaîne ss est codée par le gène DRBI (1"gène) est la plus exprimée. On répertorie, actuellement plus de 200 allèles différents pour DRB1, qui définissent différents antigènes ou types comme résumé dans le Tableau 1 ci-après. TABLEAU 1 Molécules exprimées par différents allèles HLA-DRB1 Antigène Allèle Alias DR1 DRB1*0101 DR1 DR3 DRB 1*0301 DR3wl7 DR4 DRB *0401 DR4w4 DRB 1*0405 DR4wl5 DR7 DRB1*0701 DR7 DR8 DRB 1 *0802 DR8w2 DR9 DRB1 *0901 DR9 DRU DRB1 *1101 DR5wll DR12 DRB1*1201 DR5wl2 DR13 DRB1*1301 DRB1*1302 DR6wl9 DR15 DRB1*1501 DR2w2b Chaque allèle possède ses propres propriétés de liaison ; la spécifi- cité large des molécules HLA II et l'existence de plusieurs isoformes et d'un polymorphisme font que chaque individu reconnaît dans un antigène, un ensemble de peptides dont la nature dépend des molécules HLA II qui le caractérise. Comme il existe un grand nombre d'allèles HLA II, il existe donc, pour un antigène donné, un nombre important d'épitopes T, propres à chaque allèle. La répartition des allèles dans une population donnée, n'est pas homogène : par exemple, dans la population française, qui correspond à une population majoritairement caucasienne, seuls 7 allèles du locus DRB1 dépassent les 5 % ; il s'agit des allèles : DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*1101, DRB1*1301 et DRB1 *1501, qui représentent 64 % de la population (4). Ces mêmes allèles sont également majoritaires dans d'autres populations d'Europe, où leur fréquence varie de 53 % (Espagne) à 82 % (Danemark), ainsi qu'en Amérique du Nord (55-58 %). Les molécules HLA-DRB3,-DRB4 et-DRB5 (2 gène), qui sont des molécules HLA-DR dont la chaîne ss n'est pas codée par le gène DRB1, sont également présentes avec des fréquences alléliques importantes dans les différentes populations caucasiennes : 9,2 % pour DRB3*0101 (B3), 28,4 % pour DRB4*0101 (B4) et 7,9 % pour DRB5*0101 (B5). Elles couvrent donc à elles seules 45 % de la fréquence allélique des populations caucasiennes. Les peptides présents dans une séquence peptidique et qui lient l'ensemble de ces allèles incluent les épitopes T de la majorité de la population caucasienne. Pour ce qui concerne le VIH : - la plupart des épitopes déjà décrits sont restreints aux molécules HLA 1 [ (5), (6), Demande internationale WO 98/50423, Demande internationale WO 99/27954, Demande internationale WO 99/40113, Demande internationale WO99/51630) ]. II s'agit donc de peptides reconnus par des lymphocytes T CD8+. Les molécules HLA 1 (HLA-A,-B ou-C) ont des caractéristiques de liaison totalement différentes des molécules de classe II. Elles lient des peptides plus courts, en principe de 9 acides aminés et les motifs de liaison sont propres à chaque allèle. Pour le VIH, les séquences restreintes aux molécules HLA 1 ont été trouvées dans les protéines Env, Pol, Gag et Nef, les deux dernières étant les plus fréquemment reconnues (7). Par exemple, Gahéry-Ségard et al. [ (11) et Demande internationale WO 99/27954)] ont décrit des peptides dérivés de la protéine Nef (peptides corres- pondant respectivement aux acides aminés 66-97 (NI), 117-147 (N2) et 182-205 (N3) de la protéine Nef), qui comprennent des épitopes T restreints aux molécules HLA 1 ; de manière plus précise, les épitopes T mis en évidence dans lesdits peptides NI, N2 et N3 sont les suivants : TABLEAU II Positions protéine Nef Restriction HLA 1 121-128,137-145, 184-191 et 195-202HLA-A1 136-145,190-198 HLA-A2 73-82,84-92 HLA-A11 90-97,182-189 HLA-B8 134-141 HLA-B27 135-143 HLA-B18 Pour produire un vaccin anti-VIH, Gahéry-Ségard et al. (11) préconisent d'associer lesdits peptides NI, N2 et N3 à deux peptides issus de la protéine Gag (GI et G2) et à un peptide issu de la protéine Env (E) ; tous ces peptides sont modifiés à leur extrémité C-terminale par addition d'un groupe palmitoyle-lysylamide Tableau 1 de (11)]. L'immunogénicité et la tolérance de ce vaccin lipopeptidique ont été évaluées chez des volontaires séronégatifs. La réponse spécifique T est évaluée à l'aide d'un test de prolifération des cellules T. Le peptide NI induit une prolifération des cellules T chez 5/10 des donneurs vaccinés, le peptide N2 induit une prolifération seulement chez un seul donneur vacciné et le peptide N3 induit une prolifération chez 4/10 donneurs. Bien que l'on observe une réponse T CD4+, elle est très aléatoire et variable avec les peptides NI, N2 et N3. - des peptides restreints aux molécules HLA II ont également été décrits ; il s'agit de séquences peptidiques (épitopes T) issues de la protéine Nef (10) : et plus particulièrement des peptides Nef 13-23, 46-53, 44-81, 69-82, 180-193, 194- 210 (tableau 4 de 10), qui ont été identifiés à l'aide de clones T spécifiques de la protéine Nef ; la variation des peptides affecte de manière cruciale la réponse des cellules T à la protéine Nef. Les peptides précités sont restreints aux molécules HLA II suivantes Tableau 7 de (10)] : TABLEAU III Clones T Peptides reconnus HLA II qui restreignent la présentation des peptides auxdits clones MM Nef 95. 12 13-23 DRw6 MM Nef 33. 6 13-23 DRw6 JB Nef 1.13 46-53 DQw7 SP Nef 29. 16 69-82 DRl, DRwl5 (2) (=DRBl*1501) GK Nef 6. 38 180-193 DP5 JB Nef 3.2 194-210 DR1 DS Nef 59.25 44-81 DRw5 (2) (=DRB1*1501) L'ensemble des peptides proposés jusqu'à présent correspond à des épitopes T, sélectionnés pour leur aptitude à être conservés parmi les différents isolats ; toutefois, ils ne sont spécifiques que pour des individus particuliers ; en effet, il existe une variabilité interindividuelle des épitopes T, qui rend difficile le choix de molécules adaptées à une vaccination de masse contre le SIDA ; en conséquence, les peptides décrits ci-dessus ne sont pas adaptés à la préparation d'une composition immunogène et vaccinale, apte à stimuler les lymphocytes T CD4+ anti-VIH et à générer une réponse immune protectrice, quel que soit l'individu à protéger, car ils ne stimulent pas une réponse T CD4+ protectrice chez l'ensemble des sujets à traiter. C'est pourquoi les Inventeurs se sont donnés pour but de pourvoir à un ensemble de peptides aptes à être incorporés dans une composition immunogène et à stimuler des lymphocytes T CD4+ anti-VIH, chez la majorité des individus caucasiens européens ou d'Amérique du Nord, particulièrement intéressant en combinaison avec une thérapie anti-rétrovirale à haute efficacité (trithérapie, par exemple), pour induire effectivement une réponse proliférative spécifique contre des composants du virus. Un tel ensemble a pour propriété d'être efficace chez un grand nombre de sujets, alors que les peptides de l'art antérieur sont actifs chez quelques individus et sont inactifs chez la majorité des autres individus parce que ces derniers ne reconnaissent pas la protéine Nef par les mêmes déterminants. Pour ce faire, les Inventeurs ont sélectionné des peptides issus de la protéine Nef de VIH, restreints aux molécules HLA II prépondérantes dans les popu- lations caucasiennes et ont trouvé qu'en association, les peptides sélectionnés induisent effectivement une réponse immunogène et protectrice chez un grand nombre d'individus. La présente invention a en conséquence pour objet un mélange de peptides issus d'une protéine Nef de VIH, caractérisé en ce que chacun desdits peptides se lie à au moins trois molécules HLA-DR codées par les allèles sélectionnés dans le groupe constitué par les allèles HLA DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*1101, DRB1*1301 et DRBl*1501 (molécules DR1, DR3, DR4, DR7, DRU, DR13 et DR15) et à au moins une molécule HLA-DR codée par les allèles sélectionnés dans le groupe constitué par les allèles HLA DRB3*0101, DRB4*0101 et DRB5*0101 (B3, B4 et B5), avec une activité de liaison Un tel mélange de peptides permet d'obtenir, de manière surprenante, une réponse proliférative T CD4+ (stimulation des lymphocytes T CD4+) ainsi qu'une stimulation de la réponse CTL et ce, chez la grande majorité de la population caucasienne à protéger ; on peut donc considérer qu'un tel mélange constitue un premier pas vers une composition immunogène universelle , apte à être utilisée dans un vaccin. Selon un mode de réalisation avantageux dudit mélange, lesdits peptides sont issus de la protéine Nef de n'importe quelle souche de VIH-1. Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit mélange, lesdits peptides sont sélectionnés dans le groupe constitué par le peptide correspondant aux positions 1-36 (peptide Nefl), le peptide correspondant aux positions 66-94 (peptide Nef4), le peptide correspondant aux positions 137-168 (peptide Nef 10), le peptide correspondant aux positions 175-190 (peptide Nefl2) et le peptide correspondant aux positions 182-198 (peptide Nefl3), de la protéine Nef, en référence à la souche Bru (13). De manière particulièrement avantageuse, ledit mélange de peptides selon l'invention est sélectionné dans le groupe constitué par les mélanges suivants, dans lesquels les positions des peptides sont également précisées en référence à la souche Bru (13) : * un mélange comprenant : le peptide correspondant aux positions 1- 36 de la protéine Nef (Nefl), le peptide correspondant aux positions 137-168 (NeflO) et le peptide correspondant aux positions 182-198 (Nefl3). * un mélange comprenant : le peptide correspondant aux positions 137-168 (NeflO), le peptide correspondant aux positions 175-190 (Nefl2) et le peptide correspondant aux positions 182-198 (Nefl3). * un mélange comprenant : le peptide correspondant aux positions 66-94 (Nef4), le peptide correspondant aux positions 137-168 (NeflO) et le peptide correspondant aux positions 182-198 (Nefl3). * un mélange comprenant : le peptide correspondant aux positions 66-94 (Nef4), le peptide correspondant aux positions 175-190 (Nefl2) et le peptide correspondant aux positions 182-198 (Nefl3). En effet : - Nefl se lie avec une bonne affinité aux molécules DRB1*0101, 0401,0701, 1101,1301, 1501 etDRB5*0101, - Nef4 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRB1*0101, 0401,1101, 1501, DRB5*0101 etDRB4*0101 - NeflO se lie avec une bonne affinité aux molécules DRB1 *0101, 0301, 0401, 0701, 1101, DRB5*0101 et DRB4*0101, - Nefl2 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRB1*0701, 1101,1501, DRB3*0101 et DRB4*0101, - Nefl3 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRB1 *0301, 0701,1101, 1301 etDRB3*0101 etDRB5*0101. La présente invention a également pour objet une composition immunogène anti-VIH, caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange de peptides tel que défini ci-dessus, associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et éventuellement à au moins un adjuvant. Les adjuvants utilisés sont des adjuvants classiquement utilisés dans les compositions vaccinales, tels que l'hydroxyde d'alumine et le squalène. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition immunogène, lesdits peptides sont soit sous forme de lipopeptides, soit incorporés dans un virus recombinant, un vecteur viral de thérapie génique (adénovirus...), soit inclus dans une protéine et notamment une protéine recombinante (Leclerc C. et al., Int. Rev. Immunol., 1994, 11, 2, 123-132 ; Janssen R. et al., Int. Rev. Immunol., 1994, 11, 2,113-121), soit modifiés chimiquement. Dans ce dernier cas, ils comportent par exemple des modifications non naturelles comme des acides aminés D, des liaisons pseudo-peptidiques ou des modifications des extrémités C-ou N-terminales. La partie lipidique du lipopeptide est notamment obtenue par addition d'un motif lipidique sur une fonction a-aminée desdits peptides ou sur une fonction réactive de la chaîne latérale d'un acide aminé de la partie peptidique ; elle peut comprendre une ou plusieurs chaînes dérivées d'acides gras en C4-20, éventuellement ramifiées ou insaturées (acide palmitique, acide oléique, acide linoléique, acide linolénique, acide 2-amino hexadécanoïque, pimélautide, trimétauxide) ou un dérivé d'un stéroïde. Le procédé de préparation de tels lipopeptides est notamment décrit dans les Demandes internationales WO 99/40113 ou WO 99/51630. La partie lipi- dique préférée est notamment représentée par un groupe N'-acétyl-lysine Ne (palmitoyl), également dénommé Ac-K (Pam). Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition immunogène, ledit mélange de peptides est associé : - à un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes CD8+ (reconnus spécifiquement par les lymphocytes T cytotoxiques et présentés par les molécules HLA I) et plus particulièrement les épitopes CD8+ issus d'une protéine du VIH-1 (voir Tableau II) et/ou - à d'autres peptides contenant un épitope CD4+, lesquels peptides se lient au moins à une molécule HLA-DR codée par les allèles sélectionnés dans le groupe constitué par les allèles HLA DRB1*0101, DRB 1*0301, DRB 1*0401, DRB1*0701, DRB1*1101, DRB1 *1301 et DRBl*1501 (molécules DR1, DR3, DR4, DR7, DRU, DR13 et DR15) ou à au moins une molécule HLA-DR codée par les allèles sélectionnés dans le groupe constitué par les allèles HLA DRB3*0101, DRB4*0101 et DRB5*0101 (B3, B4 et B5), avec une activité de liaison - à d'autres peptides comprenant des épitopes CD4+ multiples, tels que le peptide de la toxine tétanique TT (positions 830-846), le peptide de l'hémagglutinine d'Influenza HA (positions 307-319), PADRE (Pan DR Epitope, Alexandre J. et al., Immunity, 1994,1, 9,751-761), le peptide 45-69 NefVIH-1 et le peptide LSA3 de Plasmodium falciparum et/ou - à un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes B, plus particulièrement des épitopes B issus d'une protéine du VIH-1, reconnus spécifiquement par des anticorps dirigés contre ces derniers. Les peptides Nef selon l'invention, inclus dans ledit mélange ont été avantageusement sélectionnés à l'aide d'un test de liaison HLA-DR/peptides comprenant : - la purification des molécules HLA-DR d'intérêt, c'est-à-dire celles concernant plus de 5 % d'une population donnée et notamment les molécules HLA DR1, DR3, DR4, DR7, DRU, DR13 et DR15, - l'incubation des molécules HLA-DR ainsi purifiées, avec différentes concentrations de fragments chevauchants et couvrant entièrement la séquence de la protéine Nef et avec un réactif RI ou traceur constitué d'un fragment peptidique associé à un marqueur non radioactif, tel que la biotine et dont la séquence est différente desdits peptides ; le réactif RI ou traceur est choisi de manière à ce qu'il présente une affinité vis-à-vis de l'une des molécules HLA-DR d'intérêt, telle qu'il puisse être utilisé à une concentration (ICso). Ces tests permettent, de manière non ambiguë, d'associer à chaque allèle du 1 er gène ou du ime gène, les séquences des fragments capables de s'y lier ou au contraire qui ne s'y lient pas. Cette démarche permet de définir des compositions immunogènes incluant des peptides qui se lient au plus grand nombre de molécules HLA-DR différentes et qui peuvent être ainsi avantageusement protectrices pour la majorité des patients, même si l'on ne connaît pas leurs molécules HLA. Cette démarche a en outre l'avantage de permettre la sélection de peptides significativement plus spécifiques vis-à-vis du VIH-1 que les démarches cherchant à sélectionner des peptides sur la base de leur capacité à stimuler les lymphocytes T CD4+. Les conditions d'incubation sont propres à chaque molécule HLADR (temps d'incubation, pH, réactif RI, concentration en HLA-DR ou en peptide). Le réactif RI est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences suivantes : . PKYVKQNTLKLAT (HA 306-318) (SEQ ID NO : 1), spécifique des allèles DRB1*0101, DRB1*0401, DRB1*1101, . EAEQLRAYLDGTGVE (A3 152-166) (SEQ ID NO : 2), spécifique de l'allèle DRB1*1501, . AKTIAYDEEARGLE (MT 2-16) (SEQ ID NO : 3), spécifique de l'allèle DRB1*0301, . AAYAAAKAAALAA (YKL) (SEQ ID NO : 4), spécifique de l'allèle DRB1*0701, . TERVRLVTRHIYNREE (BI 21-36) (SEQ ID NO : 5), spécifique de l'allèle DRB1*1301, . ESWGAVWRIDTPDKLTGPFT (LOL 191-210) (SEQ ID NO : 6), spécifique de l'allèle DRB3*0101, et . AGDLLAIETDKATI (E2/E168) (SEQ ID NO : 7), spécifique de l'allèle DRB4*0101. D'autres réactifs RI peuvent être utilisés, notamment ceux décrits dans Southwood et al. (14). En variante, ladite composition immunogène comprend avantageusement les séquences codant pour les peptides tels que définis ci-dessus. En effet, l'utilisation d'ADN nu pour l'immunisation constitue une approche vaccinale efficace : elle consiste à injecter dans l'organisme hôte à vacciner, un ADN nu codant pour un antigène protéique ; cet ADN permet une synthèse prolongée de l'antigène par les cellules de l'hôte ainsi qu'une présentation durable de cet antigène au système immunitaire. La présente invention a également pour objet un vaccin, caractérisé en ce qu'il inclut une composition immunogène telle que définie ci-dessus. La présente invention a également pour objet des peptides issus d'une protéine Nef de VIH, caractérisés : - en ce qu'ils contiennent un épitope CD4+, apte à avoir une activité de liaison dérante dans les populations caucasiennes (le'gène et/ou 2ème gène), telle que définie ci-dessus, à être reconnus par des lymphocytes T CD4+ spécifiques desdits peptides et à stimuler des lymphocytes T CD4+ spécifiques desdits peptides et - en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par les fragments suivants de la protéine Nef, en référence à la souche Bru : le fragment correspondant aux positions 1-36 de la protéine Nef (Nefl), le fragment correspondant aux positions 37-71 de la protéine Nef (Nef3), le fragment correspondant aux positions 66-94 (Nef4), le fragment correspondant aux positions 113-128 (Nef7), le fragment correspondant aux positions 117-132 (Nef8), le fragment correspondant aux positions 132-147 (Nef9), le fragment correspondant aux positions 137-168 (NeflO), le fragment correspondant aux positions 155-185 (Nefl 1), le fragment correspondant aux positions 175-190 (Nefl2), et le fragment correspondant aux positions 182-198 (Nefl3). De tels peptides présentent l'avantage de se lier à au moins une molécule HLA-DR codée par les allèles HLA DRB1*0101, DRB 1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*1101, DRB1*1301 et DRB1*1501 (molécules DR1, DR3, DR7, DR7, DR 11, DR 13 et Dry5), et/ou à au moins une molécule HLADR codée par les allèles HLA DRB3*0101, DRB4*0101 et DRB5*0101 (B3, B4 et B5), avec une activité de liaison De manière plus précise et conformément au Tableau VII ci-après : - les peptides Nef 3, Nef 9 et Nefl1 se lient à moins de trois molécules HLA-DRB1, avec une activité de liaison trois molécules HLA-DRB1 et à au moins une molécule HLA-DR codée par un allèle DRB3, DRB4 ou DRB5, avec une activité de liaison De telles activités de liaison permettent d'utiliser lesdits peptides : - soit en mélange, dans les conditions définies ci-dessus, dans des compositions immunogènes, dans la mesure où ils sont aptes à induire une réponse proliférative des cellules T CD4+ et donc d'aider à induire une réponse cytotoxique ou humorale dans la majorité des populations caucasiennes. Ils peuvent donc avantageusement être incorporés dans une composition vaccinale. - soit, séparément, en tant que réactif de diagnostic, de préférence sous la forme de tétramères, pour évaluer l'état immunitaire d'un individu sain ou de patients séropositifs pour le VIH ou atteints par le SIDA. Par exemple, grâce à ces différents peptides, il est possible de détecter la présence de cellules T CD4+ spécifiques de Nef par des tests de prolifération ou d'ELISPOT (évaluation qualitative) ou d'effectuer un tri cellulaire par cytométrie de flux, mettant en oeuvre les peptides sélectionnés (évaluation quantitative) et marqués ; par exemple, par cytométrie de flux, il est possible d'évaluer le taux de cellules spécifiques de la protéine Nef par rapport à la population de cellules du sang. La présente invention a, en conséquence, également pour objet un réactif de diagnostic, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par un mélange de peptides tel que défini ci-dessus ou l'un des peptides également tels que définis ci-dessus, lesdits peptides étant éventuellement marqués ou complexés, sous la forme de complexes multimériques. De préférence, ledit réactif de diagnostic est constitué par les mélanges de peptides obtenus à partir des peptides Nefl, Nef4, NeflO, Nefl2 et Nefl 3. La présente invention a également pour objet un procédé d'évaluation de l'état immunitaire d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de détection de la présence de cellules T CD4+ spécifiques des peptides Nef tels que définis ci-dessus ; ladite détection est réalisée, de manière avantageuse par l'un des tests suivants : test de prolifération, test ELISPOT [voir par exemple la Demande Internationale WO 99/51630 ou Gahéry-Ségard et al. (11)] ou cytométrie de flux en présence de complexes multimériques constitués à partir desdits peptides Nef. De manière plus précise : * pour ce qui concerne le test de prolifération : Une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec les peptides sélectionnés selon l'invention ou des lymphocytes T clonés) est cultivée pendant 3 à 5 jours en présence des peptides sélectionnés et au besoin de cellules présentatrices appropriées telles que des cellules dendritiques, des PBMC autologues ou hétérologues, des cellules lymphoblastoïdes telles que celles obtenues après infection par le virus EBV ou des cellules génétiquement modifiées. La prolifération des cellules est mesurée par incorporation de thymidine tritiée dans l'ADN des cellules. Les peptides sélectionnés conformément à l'invention, permettent de révéler dans la suspension initiale la présence de cellules spécifiques de ces peptides. * pour ce qui concerne le test ELISPOT : Le test ELISPOT permet de révéler la présence de cellules T spécifiques d'un peptide sélectionné conformément à l'invention et sécrétant de l'IFN-y. De manière plus précise, les cellules T sont révélées par mesure de la sécrétion d'IFN-y après incubation des PMBC des patients avec les peptides sélectionnés selon l'invention, conformément à la méthode décrite dans Gahéry-Ségard et al., 2000 (11). * pour ce qui concerne la mise en oeuvre de complexes multimériques et notamment de complexes tétramériques : - on met en contact un échantillon biologique, de préférence des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) avec des complexes tétramériques produits à partir de complexes peptide Nef tel qu défini ci-dessus-molécule HLA de classe II, telle que définie ci-dessus, soluble et biotinylée et - analyse des cellules marquées par cytométrie de flux. De manière avantageuse, préalablement à la mise en contact de l'échantillon biologique avec ledit complexe, on l'enrichit en cellules T CD4+, en le mettant en contact avec des anticorps anti-CD4, pour enrichir ledit échantillon. Les tétramères sont préparés, comme précisé, par exemple dans E. J. Novak et al. (J. Clin. Investig., 1999,104, R63-R67) ou dans M. J. Kuroda et al. (J. Virol., 2000,74, 18,8751-8756). Brièvement, les tétramères sont fabriqués en incubant, pendant 72 heures à 37 C et dans un tampon phosphate citrate 10 mM, NaCI 0,15 M à un pH compris entre 4,5 et 7, des molécules HLA II solubles et biotinylées avec un excès de 10 de peptides Nef identifiés et sélectionnés conformément à l'invention. La forme tétramérisée est obtenue en ajoutant à la préparation de la streptavidine marquée par un fluorochrome en quantité quatre fois moindre (mole à mode) que de molécules HLA II. L'ensemble est incubé une nuit à température ambiante. Pour utiliser ces tétramères, on met en contact une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec les peptides Nef sélectionnés conformément à la présente invention ou des lymphocytes T clonés) avec un ou plusieurs tétramères (10 à 20 mg/ml) pendant 1 à 3 heures. Après lavage, la suspension est analysée par cytométrie de flux : on visualise le marquage des cellules par les tétramères grâce au fait que ces constructions sont fluorescentes. La cytométrie de flux permet de séparer les cellules marquées par les tétramères des cellules non marquées et d'effectuer ainsi un tri cellulaire. La présente invention a ainsi, en outre, pour objet une méthode de tri de lymphocytes T spécifiques du VIH, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : - incubation ou mise en contact, pendant 1 à 3 heures d'une suspension de cellules à trier avec un ou plusieurs tétramères formés à partir de complexes peptide Nef tel que défini ci-dessus/molécule HLA II soluble et biotinylée, et conjugués à de la streptavidine marquée par un fluorochrome, - analyse par cytométrie de flux et - tri des cellules marquées par les tétramères. EXEMPLE 1 : Principe des tests de liaison. - Synthèse des peptides Les peptides choisis couvrent la séquence de la protéine Nef de la souche Bru publiée par Wain-Hobson et al. (13). Tous les peptides ont été synthétisés selon la stratégie Fmoc en synthèse parallèle sur phase solide, purifiés par HPLC et contrôlés par spectrométrie de masse (ES-MS). . Purification des molécules HLA-DR Les molécules HLA-DR sont purifiées à partir de différentes lignées EBV homozygotes (14) par immunoaffinité. On peut notamment utiliser la méthode décrite dans Southwood et al. (14). Leur origine et les différents allèles qui les caractérisent sont décrits dans le Tableau IV. Tableau IV Lignées Spécificités Allèles DRB 1 Autres allèles DRB LG2 (14) HLA-DR1 DRB1*0101 HOM2 SCHU HLA-DR2 DRB1 *1501 DRB5*0101 MAT (14) HLA-DR3 DRB1*0301 DRB3*0101 STEILIN BOLETH HLA-DR4 DRB 1*0401 DRB4*0101 PREISS (14) PITOUT (14) HLA-DR7 DRB1*0701 DRB4*0101 SWEIG (14) HLA-DR11 DRB1*1101 DRB3*0202 HHKB (17) HLA-DR13DRB1*1301DRB3*0101 L'anticorps monomorphique spécifique des molécules HLA-DR est notamment celui décrit dans Southwood et al. (14) ou celui décrit dans Posch et al. (15). Les anticorps sont purifiés à partir de surnageant de culture sur des colonnes de Protéine A-Sépharose. Ces anticorps sont couplés sur des colonnes Sépharose 4B ou Protéine A-Sépharose pour la purification des molécules HLA-DR. . Tests de liaison HLA-DR/peptides Les tests de liaison des peptides aux molécules HLA-DR sont des tests en compétition avec une révélation immuno-enzymatique, initialement mis au point par Hill sur la molécule HLA-DR (16). Ils sont effectués en plaques 96 puits, ce qui permet d'étudier dans la même expérience de nombreux échantillons. Brièvement, les molécules HLA-DR purifiées sont incubées avec un peptide biotinylé qui sert de traceur et différentes concentrations du peptide à tester. Après 24 à 72 heures d'incubation, les échantillons sont neutralisés, puis 100 ul de chaque échantillon sont transférés sur une plaque ELISA préalablement sensibilisée par l'anticorps monomorphique spécifique des molécules HLA-DR. Les complexes molécules HLA-DR/peptides biotinylés, fixés au fond de la plaque par l'intermédiaire de l'anticorps monomorphique spécifique des molécules HLA-DR sont révélés au moyen de conjugué streptavidine-phosphatase et d'un substrat fluorescent. L'activité de chaque peptide est caractérisée par la concentration de ce peptide qui inhibe 50% de la liaison du peptide biotinylé (IC). . Choix et optimisation des tests de liaison Choix des allèles (l'gène) Les allèles étudiés sont tous les allèles de la population française dont la fréquence dépasse les 5% de la population. Il s'agit des allèles DRB1*0101, DRB 1*0301, DRB 1*0401, DRBl*0701, DRBl*1101, DRBl*1301etDRBl*1501 (Tableau I). Ils représentent à eux seuls 53 à 82% des allèles des populations caucasiennes et font partie de différentes spécificités des séries HLA-DR. Choix des allèles (ime gène) Les allèles étudiés sont les allèles rencontrés les plus fréquemment. Il s'agit des allèles HLA-DRB3*0101, HLA-DRB4*0101 etHLA-DRB5*010L Spécificité des tests Le choix des peptides biotinylés est l'élément déterminant de la spé- cificité du test. La plupart des cellules utilisées possèdent deux molécules HLA-DR différentes (codées par deux allèles) qui sont toutes les deux purifiées par un anticorps monomorphique spécifique des molécules HLA-DR et toutes les deux reconnues par le même anticorps. De manière à étudier sans ambiguïté la liaison d'un peptide à l'allèle DRB1, il est nécessaire de s'assurer que le peptide biotinylé lie cet allèle et ne lie pas le produit de l'autre allèle. Dans ce but, les peptides tels que définis comme réactifs RI cidessus ont été utilisés. Conditions et sensibilité des tests Pour chaque molécule HLA-DRB1, la concentration en molécules du CMH II, la concentration du peptide biotinylé, le pH d'incubation et le temps d'incubation ont été optimisés comme précisé dans le Tableau V ci-après. Tableau V Allèles Concentration Traceurs Concentration pH Temps protéine traceur optimal d'incubation (g/ml) (nM) (h) DRB1*0101 0, 6 HA 306-318 10 6 24 DRB1*0301 2, 3 MT 2-16 50 4, 5 72 DRB1*0401 1, 6 HA 306-318 30 6 24 DRB1*0701 0, 4 YKL 10 5 24 DRB1*1101 1, 3 HA 306-318 20 5 24 DRB1*1301 0, 7 B121-36 200 4, 5 72 DRB1*1501 0, 5 A3 152-166 10 4, 5 24 La sensibilité de chaque test est reflétée par les IC observées avec les peptides non-biotinylés qui correspondent aux traceurs et les résultats obtenus sont illustrés au Tableau VI ci-après. TABLEAU VI Allèles Fréquence Peptides Séquences IC50 biotinylés (nM) DRBI *0101 9, 3 HA 306-318 PKYVKQNTLKLAT 31 DRB 1*0401 5, 6 HA 306-318 PKYVKQNTLKLAT 44 DRB *1101 9, 2 HA 306-318 PKYVKQNTLKLAT 38 DRB l *0701 14, 0 YKL AAYAAAKAAALAA 34 DRB1*0301 10, 9 MT 2-16 AKTIAYDEEARRGLE 100 DRB1*1301 6, 0 B121-36 TERVRLVTRHIYNREE 330 DRB1*1501 8, 0 A3 152-166 EAEQLRRAYLDGTGVE 14 DRB5*0101 7, 9 HA 306-318 PKYVKQNTLKLAT 6, 5 DRB3*0101 9, 2 Loi 191-210 ESWGAVWRIDTPDKLTGPFT 5 DRB4*0101 28, 4 E2/E168 AGDLLAIETDKATI 2 Les fréquences indiquées sont les fréquences alléliques en France et sont représentatives de celles de la population caucasienne. Elles sont issues de Colombani (4) Le Tableau VII ci-après illustre l'activité de liaison des peptides selon l'invention, mesurée dans les conditions précisées ci-dessus. TABLEAU VII Activités de liaison des peptides NEF sélectionnés vis-à-vis des molécules HLA-DR prépondérantes dans la population caucasienne. DRY DRY DR4 DR7 DRU DR13 DR15 B3 B5 B4 Nefl (1-36) 700 > 10000 250 40 550 325 40 > 10000 400 2500 Nef2 (25-39) > 10000 4250 > 10000 > 10000 > 10000 > 10000 > 10000 > 10000 > 10000 > 10000 Nef3 (37-71) 2500 > 10000 70 3000 2000 > 10000 > 10000 > 10000 > 10000 8000 Nef4 (66-94) 55 > 10000 45 5000 850 > 10000 750 > 10000 12 225 Nef5 (86-100) 6000 > 10000 > 10000 > 10000 > 10000 > 10000 > 10000 > 10000 8000 > 10000 Nef6 (100-114) > 10000 > 10000 > 10000 > 10000 3000 > 10000 1750 > 10000 > 10000 1750 Nef7 (113-128) > 10000 > 10000 > 10000 4000 > 10000 > 10000 9000 75 > 10000 > 10000 Nef8 (117-132) > 10000 > 10000 8000 > 10000 > 10000 > 10000 > 10000 120 > 10000 > 10000 Nef9 (132-147) 8, 5 > 10000 > 10000 5500 500 > 10000 1500 > 10000 8000 500 NeflO (137-168) 650 175 150 65 45 > 10000 1250 3500 250 55 Nefll (155-185) 2000 > 10000 > 10000 3750 3000 > 10000 50 > 10000 3000 450 Nefl2 (175-190) > 10000 3500 2500 700 125 10000 13 145 > 10000 275 Nefl3 (182-198) 5000 55 3250 150 48 750 > 10000 250 10 6330 Les résultats sont exprimés sous forme de concentrations donnant 50 % d'inhibition du maximum de liaison. L'unité est le nM. EXEMPLE 2 : Test de prolifération. Pour vérifier la stimulation de la prolifération des cellules T CD4+, à l'aide d'une composition immunogène selon l'invention, un test de prolifération est réalisé in vitro. Les cellules (PBMC), extraites du sang périphérique ont été cultivées dans des microplaques de 96 puits à raison de 5. 105 cellules par puits dans un volume final de 200 n. l de milieu complet. Les cellules ont été stimulées ou non avec 20/-lg/ml d'un mélange de peptides selon l'invention. Après 72 heures de culture à 37OC, les cellules ont été incubées pendant la nuit avec 0, 25/-lCi de eH] thymidine (Amersham, Life technologie). Les cellules ont été récupérées et l'incorporation de [3 H] thymidine a été mesurée dans l'ADN cellulaire. On observe effectivement une stimulation des cellules T CD4+. D'autres cellules peuvent être utilisées : PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec les peptides tels que définis ci-dessus ou lymphocytes clonés. Brièvement, le protocole d'enrichissement est le suivant : les PMBC séparées sur gradient de ficoll sont cultivées à 37 C en présence de 0, 1 à 10 mg/ml de peptides en milieu RPMI supplémenté par 10 % de sérum humain. Au 7ème et 11 jour de culture, 50 unités d'IL-2 humaine recombinante sont ajoutés à la culture. Les cellules sont récoltées le 14ère jour. EXEMPLE 3 : ELISPOT. L'ELISPOT permet de détecter les cellules spécifiques d'un peptide et sécrétant une cytokine donnée. 50 1/puits d'anticorps murin anti-IFN-y humain dilué dans du tampon PBS à une concentration de 4 g/ml sont incubés dans des plaques de 96 puits à fond de nitrocellulose pendant une nuit à 4 C en chambre humide. Les puits sont lavés avec du PBS et saturés avec du milieu RPMI contenant 10 % de sérum de veau pendant 2 heures à 37OC. Si besoin, des cellules présentatrices appropriées telles que des PBMC autologues ou hétérologues, des cellules lymphoblastoïdes obtenues après infection par le virus EBV ou des cellules génétiquement modifiées sont utilisées et sont distribuées dans les puits. Les peptides Nef tels que définis dans l'invention sont alors ajoutés à différentes concentrations (10,5 et 1 g/ml). Les cellules effectrices (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec les peptides Nef ou des lymphocytes clonés) sont ajoutées dans les plaques 96 puits à raison de 20.000 cellules/puits. La culture est incubée pendant 24 heures à 37 C dans une atmosphère contenant 5 % de CO2. Les plaques sont ensuite lavées et incubées pendant 2 heures avec 100 p. I d'un antisérum de lapin spécifique de l'IFN-y humain. Après lavage, un anticorps anti-IgG de lapin conjugué à de la biotine purs de la streptavidine conjuguées à de la phosphatase alcaline sont ajoutés successivement pendant 1 heure. Finalement, la révélation des taches (spots) est effectuée grâce à un substrat chromogénique de la phosphatase alcaline. Le comptage des spots se fait au microscope. Des contrôles négatifs sont donnés par les puits ne contenant pas de peptides. Les contrôles positifs sont fournis par les puits contenant des agents mitogènes tels que l'ionomycine (500 ng/ml) et la phytohémagglutinine (PHA) (10 u. g/ml). RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. E. S. Rosenberg et al., Science, 1997,278, 1447. 2. S. A. Kalams et al., J. Virol., 1999,73, 6715. 3. B. Autran et al., Science, 1997,277, 112. 4. J. Colombani, HLA : fonctions immunitaires et applications médicales, Eds. John Libbey Eurotext, 1993. 5. J. Choppin et al., J. Immunol., 1991,147, 569. 6. J. Choppin et al., J. Immunol., 1991,147, 575. 7. M. Dalod et al., J. Clin. Invest., 1999,104, 1431. 8. J. Estaquier et al., Mol. Immunol., 1992,29, 489. 9. J. D. Ahlers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997,94, 10856. 10. P. A. Wentworth et al., Vaccine, 1994,12, 117. 11. H. Gahery-Segard et al., J. Vire !., 2000,74, 1694. 12. A. Takahashi et al., Vaccine, 1998,16, 1537. 13. S. Wain-Hobson et al., Cell, 1985,40, 9. 14. S. Southwood et al., J. Immunol., 1998,160, 3363-3373. 15. P. E. Posch et al., Eur. J. Immunol, 1996, 26, 1884. 16. C. M. HILL et al., J Immunol., 1994, 152, 2890. 17. M. P. Davenport et al., Proc. AM. Acad. Sei. USA, USA, 1995, 92, 6567. REVENDICATIONS 1 ) Mélange de peptides issus d'une protéine Nef de VIH, caracté- risé en ce que chacun desdits peptides se lie à au moins trois molécules HLA-DR codées par les allèles sélectionnés dans le groupe constitué par les allèles HLA DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*1101, DRB1*1301 et DRB1*1501 (molécules DR1, DR3, DR4, DR7, DR11, DR13 et DR15), et à au moins une molécule HLA-DR codée par les allèles sélectionnés dans le groupe constitué par les allèles HLA DRB3*0101, DRB4*0101 et DRB5*0101 (B3, B4 et B5), avec une activité de liaison 2 ) Mélange de peptides selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits peptides sont issus de la protéine Nef de n'importe quelle souche de VIH- 1. 3 ) Mélange de peptides selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que lesdits peptides sont sélectionnés dans le groupe constitué par le peptide correspondant aux positions 1-36 (peptide Nefl), le peptide correspondant aux positions 66-94 (peptide Nef4), le peptide correspondant aux positions 137-168 (peptide NeflO), le peptide correspondant aux positions 175-190 (peptide Nefl2) et le peptide correspondant aux positions 182-198 (peptide Nefl3), de la protéine Nef, en référence à la souche Bru. 4 ) Mélange de peptides selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les mélanges suivants : * un mélange comprenant le peptide Nefl correspondant aux positions 1-36, le peptide Nefl correspondant aux positions 137-168 et le peptide Nef 13 correspondant aux positions 182-198. * un mélange comprenant le peptide NeflO correspondant aux positions 137-168, le peptide Nefl2 correspondant aux positions 175-190 et le peptide Nefl3 correspondant aux positions 182-198. * un mélange comprenant le peptide Nef4 correspondant aux positions 66-94, le peptide Nef 10 correspondant aux positions 137-168 et le peptide Nefl3 correspondant aux positions 182-198. * un mélange comprenant le peptide Nef4 correspondant aux positions 66-94, le peptide Nefl2 correspondant aux positions 175-190 et le peptide Nefl3 correspondant aux positions 182-198. 5 ) Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et éventuellement à au moins un adjuvant. 6 ) Composition immunogène selon la revendication 5, caractérisée en ce que lesdits peptides sont soit sous forme de lipopeptides, soit incorporés dans un virus recombinant ou un vecteur viral de thérapie génique, soit inclus dans une protéine, soit modifiés chimiquement. 7 ) Composition immunogène selon la revendication 5 ou la revendication 6, caractérisée en ce que ledit mélange de peptides est associé : - à un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes CD8+ et/ou - à d'autres peptides contenant un épitope CD4+, lesquels peptides se lient au moins à une molécule HLA-DR codée par les allèles sélectionnés dans le groupe constitué par les allèles HLA DRB1*0101, DRB 1*0301, DRB 1*0401, DRB1*0701, DRB1*1101, DRB1*1301 et DRB1*1501 (molécules DR1, DR3, DR4, DR7, DRU, DR13 et DR15) ou à au moins une molécule HLA-DR codée par les allèles sélectionnés dans le groupe constitué par les allèles HLA DRB3*0101, DRB4*0101 et DRB5*0101 (B3, B4 et B5), avec une activité de liaison 8 ) Composition immunogène selon la revendication 7, caractérisée en ce que les peptides contenant un épitope CD4+ sont sélectionnés dans le groupe constitué par les peptides correspondant aux positions 37-71 (Nef3), aux positions 113-128 (Nef7), aux positions 117-132 (Nef8), aux positions 132-147 (Nef9) ou aux positions 155-185 (Nef 11) de la protéine Nef de VIH-1. 9 ) Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend avantageusement les séquences codant pour les peptides tels que définis aux revendications 1 à 4. 10 ) Vaccin anti-VIH, caractérisé en ce qu'il inclut une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 5 à 9. 11 ) Peptides issus d'une protéine Nef de VIH, caractérisés : - en ce qu'ils contiennent un épitope CD4+, apte à avoir une activité de liaison 12 ) Réactif de diagnostic, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par un mélange de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou l'un des peptides selon la revendication 11, lesdits peptides étant éventuellement marqués ou complexés, sous la forme de complexes multimériques. 13 ) Procédé d'évaluation de l'état immunitaire d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de détection de la présence de cellules T CD4+ spécifiques des peptides Nef tels que définis aux revendications 1 à 4 ou à la revendication 11, à l'aide d'un test ELISPOT, d'un test de prolifération des cellules T ou d'un test mettant en oeuvre des complexes multimériques. 14 ) Méthode de tri de lymphocytes T spécifiques du VIH, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : - incubation ou mise en contact, pendant 1 à 3 heures d'une suspension de cellules à trier avec un ou plusieurs tétramères formés à partir de complexes peptide Nef tel que défini aux revendications 1 à 4 ou à la revendication 11/molécule HLA II soluble et biotinylée, conjugués à de la streptavidine marquée par un fluorochrome. - analyse par cytométrie de flux et - tri des cellules marquées par les tétramères.