Brevet FR2816308A1 — publié le 20020510

La présente invention concerne un procédé de production en continu d'un sel d'acide succinique en vue de la préparation d'acide succinique. L'acide succinique, diacide organique à quatre atomes de carbone, est un intermédiaire chimique utilisé dans divers domaines industriels. Il peut être employé comme agent de saveur ou exhausteur de goût dans l'industrie alimentaire, comme agent moussant entrant dans la composition de détergent, comme composant de plastique biodégradable mais il est également utilisé dans l'industrie pharmaceutique. La production actuelle est de 15 000 tan et celle-ci est effectuée par voie pétrochimique à partir de butane. Ce procédé est d'une part relativement coûteux et d'autre part limite l'utilisation de l'acide succinique pour certaines applications (Zeikus J. G., Jain M. K. et Elankovan P. (1999) Appl. Microbiol. Biotechnol., 51,545-552). C'est pourquoi, la production d'acide succinique par fermentation de sucres présente des potentialités intéressantes. Historiquement, comme microorganismes qui ont été isolés pour le produire comme produit principal de fermentation on peut notamment citer : Fibrobacter succinogenes, Bacteroides fragilis, Anaerobiospirillum succiniciproducens. Au début des années 90, cette dernière souche a été décrite comme une bactérie performante pour la production d'acide succinique (Samuelov N. S., Lamed R., Lowe S. and Zeikus J. G. (1991) Appl. Environ. Microb., 57,3013-3019). C'est ainsi que de 1986 à 1990 ont été développées des techniques en aval de la fermentation de A. succiniciproducens pour traiter le bouillon de culture par des étapes alternatives ou complémentaires consistant à précipiter, concentrer, extraire, purifier, et cristalliser l'acide succinique. Comme documents décrivant de telles techniques, on peut citer : EP 289 773 qui enseigne la fermentation de A. succiniciproducens puis la précipitation et l'extraction de succinate de calcium. EP 389 103 qui décrit la production d'acide succinique par la fermentation de A. succiniciproducens puis l'électrodialyse bipolaire avec dissociation d'eau suivie de deux étapes d'échange d'ions. EP 405 707 qui enseigne la fermentation de A. succiniciproducens, la précipitation de succinate de calcium, la filtration, le traitement à l'acide sulfurique pour former l'acide succinique, puis l'échange d'ions. EP 410 728 qui décrit la production d'acide succinique hautement purifié par la fermentation de A. succiniciproducens afin de produire du succinate et de l'acétate, l'électrodialyse bipolaire avec dissociation d'eau et la cristallisation. Les procédés décrits dans ces documents et utilisant cette souche sont par ailleurs des procédés discontinus conduisant à la production de succinate à une concentration moyenne de 30 gll. Cette concentration relativement faible impose, comme il vient d'être rappelé, de réaliser plusieurs étapes successives de concentration, extraction et purification pour former des cristaux d'acide succinique. Toutefois certains des documents cités ci-dessus mentionnent le mode continu mais sans autre précision quant aux paramètres conduisant à la maîtrise d'un tel mode de production. A partir du milieu des années 90 et jusqu'à récemment, ce sont développées des techniques en amont de la fermentation à proprement parler, au sens où des souches plus performantes dérivant de A. succiniciproducens ou de E. coli ont été mises au point afin d'augmenter les rendements d'acide succinique. Comme documents décrivant de telles techniques, on peut citer : US 5 504 004 qui décrit Bacterium 130 Z US 5 521 075 qui enseigne un variant de A. succiniciproducens US 5 573 931 qui décrit un variant de Bacterium 130 Z US 5 723 322 qui enseigne encore un autre variant de Bacterium 130 Z US 5 770 435, US 5 869 301 et US 5 958 744 qui décrivent des souches de E. coli. Par ailleurs, il y aura bientôt une vingtaine d'années, était décrite dans le document FR 2 555 200 une technologie dans le domaine relatif à la production d'acide lactique, à partir de petit lait, et associant la fermentation de bactéries du genre Lactobacillus, l'ultrafiltration et l'électrodialyse en mode continu. En particulier, y sont enseignées une ultrafiltration préalable du petit lait, substrat de fermentation, pour récupérer dans le perméat un petit lait déprotéiné afin d'alimenter le fermenteur ainsi qu'une ultrafiltration du jus de fermentation qui permet de récupérer dans le rétentat principalement des cellules entières, recyclées vers le fermenteur, et dans le perméat du lactose et du lactate, soumis à l'électrodialyse. Les praticiens dans le domaine de la production d'acide succinique ont clairement renoncé à utiliser la bactérie A. succiniciproducens avec ce type de technologie, alors qu'il n'y avait pas a priori de frein technologique. En effet, ils ont montré, comme précisé en particulier dans le document EP 0.389. 103 A1 : - l'absence de colmatage des membranes de l'électrodialyseur par un bouillon de fermentation non ultrafiltré (page 3, lignes 27 à 45 ; page 10, lignes 34-35), et - l'absence de perte d'efficacité au niveau du fermenteur et de l'électrodialyseur (page 11, lignes 53 à 56) avec recyclage du bouillon de fermentation complet (sans filtration des cellules). De surcroît, les praticiens du domaine ont plus récemment constaté qu'il n'existe pas à l'heure actuelle de procédé de production d'acide succinique au stade industriel par fermentation de A. succiniciproducens et que celle-ci est difficile à effectuer même au stade du laboratoire (US 5 869 301, col 1, 1. 59 à col. 2, 1. 21). C'est dans ce contexte que les présents inventeurs ont eu la démarche de revenir vers une technologie jadis utilisée dans un autre domaine et abandonnée, voire déconseillée, par des praticiens du domaine dans l'application à la production d'acide succinique par A. succiniciproducens afin de la mettre en oeuvre d'une manière tout à fait performante, extrapolable au stade industriel, et en ont obtenu des résultats et des avantages inattendus. La présente invention a donc notamment pour but l'obtention, en mode continu, d'une productivité élevée en sel d'acide succinique, jamais rapportée jusqu'ici, de l'ordre de 10 à 15 g/l/h à un coût compatible avec une exploitation au stade industrie. Dans ce but, l'invention propose un procédé de production en continu d'un sel concentré d'acide succinique comportant les étapes consistant à : réaliser dans un fermenteur la culture anaérobie de cellules bactériennes de A. succiniciproducens aptes à produire le sel d'acide succinique dans un milieu de culture approprié, puis concentrer le sel obtenu dans un électrodialyseur en continu caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape consistant à ultrafilter la culture provenant du fermenteur et à recycler le rétentat obtenu à une vitesse linéaire déterminée appropriée vers le fermenteur et à alimenter le perméat obtenu dans l'électrodialyseur et à recycler le diluat de l'electrodialyseur dans le fermenteur. Les autres caractéristiques complémentaires ou alternatives de l'invention sont les suivantes : - la vitesse linéaire (m/s) du rétentat dans l'ultra-filtre est telle que l'écoulement du liquide est de type turbulent. - un excès de perméat est recyclé dans le fermenteur. - il est prévu une purge des cellules du fermenteur à un taux d'environ 0,01 h-'à environ 0,05 h-1, de préférence environ 0,03 h-1. - le rapport du débit sortant de la cuve saumure de l'électrodialyseur au volume réactionnel est d'environ 0,05 h-1 à environ 0,5 h-1 de préférence environ 0,13 h-1. - le milieu de culture comporte une source de glucides, de préférence le glucose, à une concentration initiale d'environ 60 gll à environ 200 g/l, de préférence environ 120 g/l. - la concentration des cellules dans le fermenteur est d'environ 5 gll à environ 85 gll, de préférence environ 15 gl 1. - l'utrafiltration est réalisée avec une membrane plane ayant un seuil de coupure d'environ 15 KD à environ 300 KD, de préférence 50 kD. -l'ultra-filtration est réalisée avec une membrane plane dans laquelle la vitesse linéaire du rétentat dans l'ultra-filtre est d'environ 0,06 m/s à environ 1 m/s, de préférence 0,45 m/s. - l'électrodialyseur est un électrodialyseur monopolaire comportant un compartiment produit et un compartiment saumure. - il est prévu un recyclage vers le fermenteur de la solution appauvrie en succinate en provenance du compartiment produit de l'électrodialyseur et comprenant des éléments nutritifs en excès. - le procédé comporte en outre les étapes consistant à acidifier, évaporer puis cristalliser la solution de sel d'acide succinique issue de l'électrodialyseur ce par quoi des cristaux d'acide succinique de haute pureté sont obtenus. La présente invention va maintenant être décrite de manière détaillée à l'aide d'exemples donnés à titre purement illustratif et non limitatif et en référence aux dessins dans lesquels : - la figure 1 est un schéma de l'installation fermenteur à membrane/électrodialyseur mise au point pour la production continue de solution concentrées en succinate selon le procédé de l'invention ; - la figure 2 est un schéma du fermenteur à membrane mis au point pour la fermentation d'A. succiniciproducens à haute densité cellulaire et à hautes productivités volumiques en l'absence d'électrodialyse ; - la figure 3 montre l'influence de l'augmentation du taux de dilution du perméat et de la vitesse linéaire de la culture dans la membrane d'ultrafiltration sur la concentration des cellules lors de la production en fermenteur à membrane en absence d'électrodialyse ; - la figure 4 montre l'influence de l'augmentation du taux de dilution du perméat et de la vitesse linéaire de la culture dans la membrane d'ultrafiltration sur les productivités en succinate et acétate et sur la vitesse de consommation du glucose lors de la production en fermenteur à membrane en absence d'électrodialyse ; - la figure 5 montre l'influence de l'augmentation du taux de purge des cellules de 0,01 h-'à 0,043 h-'sur les productivités en succinate et acétate et sur la vitesse de consommation du glucose lors de la production en fermenteur à membrane en absence d'électrodialyse ; - la figure 6 montre l'influence de l'augmentation du taux de purge des cellules de 0,01 h-1 à 0,043 h-1 sur les vitesses spécifiques de production de succinate et acétate et la vitesse spécifique de consommation du glucose lors de la production en fermenteur à membrane en absence d'électrodialyse ; - les figures 7A et 7B montrent l'influence de la diminution de la concentration en glucose de 30 g/1 à 20 g/ ! sur les concentrations en biomasse, succinate, et acétate lors de la production en fermenteur à membrane en absence d'électrodialyse ; - la figure 8A illustre le principe de fonctionnement de l'électrodialyseur monopolare mis en oeuvre dans le procédé de l'invention ; - la figure 8B est un schéma du montage réalisé pour déterminer les consignes de fonctionnement de l'électrodialyseur selon un mode continu en absence du fementeur à membrane ; - les figures 9A à 9C montrent l'évolution de la conductivité et des concentrations des différents produits dans les cuves produit et saumure de l'électrodialyseur au cours de l'étape de mise au point de concentration en continu en absence du fermenteur à membrane ; - les figures 10A et 10B illustrent l'évolution des concentrations en biomasse, glucose, succinate, acétate, et formiate dans le fermenteur au cours de la fermentation de A. succiniciproducens utilisant le procédé de couplage du fermenteur à membrane/électrodialyse selon l'invention ; - la figure 11 montre l'évolution des concentrations en succinate, acétate, et formiate dans la cuve saumure de l'électrodialyseur au cours de la fermentation de A. succiniciproducens utilisant le procédé de couplage du fermenteur à membrane/électrodialyse selon l'invention ; et - la figure 12 montre l'évolution des flux transférés en produits au cours de la fermentation de A. succiniciproducens utilisant le procédé de couplage du fermenteur à membrane/électrodialyse selon l'invention. 1. Matériel et méthodes 1.1. : Microorganisme : La souche Anaerobiospirillum succiniciproducens utilisée au cours de cette étude est fournie par l'American Type Culture Collection sous forme lyophilisée, sous la référence ATCC 53488. 1. 2. : Milieux de culture : 1. 2. 1. : milieu de culture de l'inoculum Glucose 20 g/l (stérilisé à part) ; Peptone caséine-viande (mis dans le commerce par la société Biokar) 10 g/I ; Extrait de levure (mis dans le commerce par la société Biomérieux) 5 g/ ! ; K2HP04 3 g/ ! ; NaCI 1 g/l ; (NH4) 2SO4 1 9/1 ; MgCi. 6H2O 0, 2 g/ ! ; CaClz. O 0, 2 g/ ! ; FeSO4, 7H0 10 mag/ ! ; Na2CO32 g/l ; MOPS 0, 2M. Le pH du milieu de culture est ajusté à 6, 8 avec de l'ammoniaque concentré. Après conditionnement dans des fioles pour culture anaérobie à raison de 20 ml par bouteille, le milieu est dégazé pendant une demi-heure sous dioxyde de carbone, et stérilisé 20 minutes à 121 C à l'autoclave. 1.2. 2. : conservation de la souche : A. succiniciproducens est conservée sous forme liquide dans le milieu décrit en 1.2. 1 additionné d'une solution de glycérol (20 % final vol/vol) au congélateur à -80 C aliquotée par 4 ml dans des petites fioles pour culture anaérobie. 1.2. 3. : milieu de production utilisé en bioréacteur à membrane en absence d'électrodialyse (voir Exemple 1) La composition du milieu de culture est la suivante (stérilisé par filtration sur cartouche mise dans le commerce par la société SARTORIUS) : Glucose 20 g/I ; Peptone caséine-viande (Biokar) 10 g/ ! ; Extrait de levure (Biokar) 5 g/ ! ; K2HPO, 3 g/l ; NaCt 1 g/ ! ; (NH4) 2SO4 1 g/ ; ; gCiHO 0, 2 g/ ! ; CaCHO 0, 2 g/1 ; FeSO4, 7H0 0 mag/1 ; Na2CO3 2 g/) ; struktol J 673 0, 1 ml/1 (Schill + Seilacher), NazS Cystéine HC115g/1. 1. 2. 4. : milieu de production utilisé lors du couplage fermenteur à membrane/électrodialyseur selon le procédé de l'invention (voir Exemple 3) : La composition du milieu de culture est identique à celle présentée au paragraphe 1.2. 1. à l'exception de la concentration en glucose qui est de 60 gll ou de 120 g/I. Lorsque la concentration initiale en glucose est de 120 gll, la concentration de tous les autres composés du milieu est doublée. 1.3. Techniques 1.3. 1. Electrodialyse : Concentration d'une solution de succinate par électrodialyse monopolaire selon un mode de fonctionnement continu en absence de fermenteur à membrane (voir Exemple 2) Avant l'étape de concentration, les cuves produit, électrolyte et saumure du pilote d'électrodialyse (dont le mode de fonctionnement sera décrit ultérieurement et mis dans le commerce par la société EIVS France, surface utile totale 0,27 m2) (membranes AMV/CMV) sont remplies respectivement de solutions de NaCI 5 g/I, NaCI 10 gll et d'une solution d'ultra-filtrat contenant du succinate à une concentration de 60 g/l. La tension appliquée, nécessaire au transfert des molécules chargées de la cuve produit vers la cuve saumure, est de 25 V. La cuve produit de l'électrodialyseur est alimentée en continu avec une solution d'ultra-filtrat contenant du succinate à une concentration de 30 g/) à un débit fixe de 0,42 I/h (figure 8B). Les volumes des cuves produit et saumure de l'électrodialyseur sont régulés à 1 1 à l'aide de régulations de niveau. Au cours de l'étape de concentration, l'intensité, les conductivités, les concentrations en produits et les débits de soutirage dans les cuves produit et saumure sont mesurés en continu (figure 9A à 9C). 1. 3. 2. : Techniques de cultures : 1. 3. 2. 1. : Culture en fiole : Les fioles conditionnées comme indiqué au paragraphe 1.2. sont ensemencées à 10 % à partir des cultures stock conservées à-80 C. L'incubation est effectuée à 37 C, sans agitation, pendant 24 heures. 1.3. 2.2. : Culture en fermenteur à membrane en l'absence d'électrodialyseur : - Inoculum : L'inoculum est réalisé dans des fioles pour cultures anaérobies contenant 50 ml du milieu de culture complexe décrit au paragraphe 1. 2., et ensemencé à 10 % à partir des cultures stock conservées à-80 C. Après 24 heures à 37 C, l'inoculum est utilisé pour ensemencer le réacteur (450 ml). - Production : La culture effectuée à l'aide du fermenteur à membrane est mise en oeuvre dans un fermenteur de volume total 500 ml, couplé à une membrane plane d'ultrafiltration (dénomination commerciale TAMI, seuil de coupure 50 KD, 5 paquets, surface = 0,25 m2, dimensions (L x 1 x h) 202 x 170 x 38 10-3 m). Le réacteur, la membrane de filtration et le bidon d'alimentation contenant le milieu de culture (50 1) sont stérilisés séparément, puis sont assemblés stérilement à l'aide de connexions rapides. Le fermenteur est inoculé à 10% en volume. Les conditions de culture sont telles que le volume réactionnel de la culture est de 450 ml, le taux de purge des cellules est nul au départ, puis lorsque la limitation en glucose est atteinte varie par palier entre 0,01 h t et 0,043 h-1. Le débit de perméat est fixé à 0,42 I/h, l'excés est recyclé dans le réacteur de sorte à réguler le débit dans la membrane. La température est de 39 C, le pH est régulé à 6, 4 par addition d'une solution de carbonate de sodium 2M et un flux de dioxyde de carbone est maintenu en continu durant toute la culture. Des prélèvements sont effectués toutes les 8 h environ. La densité optique, la biomasse ainsi que les concentrations en substrat et produits sont déterminées. 1.3. 2.3. : Culture en fermenteur à membrane couplé à un électrodialyseur : - Inoculum : L'inoculum est réalisé comme indiqué au paragraphe 1.3. 2.2. - Production par culture continue en fermenteur à membrane couplé à un électrodialyseur monopolaire selon le procédé conforme à l'invention ( voir Exemple 3) Une installation pour la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention est illustrée à la Figure 1. Le fermenteur à membrane est constitué d'un fermenteur (10) de volume total 500 ml connecté à une membrane tubulaire ou plane d'ultrafiltration, de préférence plane (12). La sortie ultrafiltrat (perméat) de la membrane est connectée à un électrodialyseur monopolare (16). Avant la production, les cuves produit (13), électrolyte (14) et saumure (15) de l'électrodialyseur monopolaire sont respectivement remplies d'une solution de NaCI 5 9/l, NaCI 10 g/i et de succinate 40 g/i préalablement stérilisées. Le fermenteur, la membrane de filtration, le bidon d'alimentation contenant le milieu de culture (50 1) et l'électrodialyseur sont stérilisés séparément, puis sont assemblés stérilement à l'aide de connexions rapides. Pour éviter la contamination de la solution en recirculation dans la cuve produit de l'électrodialyseur monopolare, deux stérilisateurs UV (dénomination commerciale, Aqua Stauz Baby, mis dans le commerce par la société SETEMA, France) sont avantageusement placés en série sur cette cuve. Après 24 heures de culture inoculum à 37 C, le fermenteur est inoculé à 10% en volume. Les conditions de culture sont telles que le volume total de la culture est de 500 ml. La température est de 39 C, le pH est régulé à 6, 4 (11) par addition d'une solution de carbonate de sodium 2M et un flux de dioxyde de carbone est maintenu en continu durant toute la culture. Après 12 heures environ de culture discontinue, la culture est mise en recirculation dans la membrane avant que le perméat soit soutiré en continu à un débit fixe de 0,44 I/h. Un excès de perméat (20) est recyclé dans le fermenteur pour réguler le débit a travers la membrane. Le perméat alimente en continu la cuve produit de l'électrodialyseur. Le volume des cuves produit et saumure de l'électrodialyseur est régulé à 1 1 à l'aide d'une régulation de niveau. L'excès de la solution de la cuve saumure est collectée en continu et l'excès de la solution de la cuve produit est recyclée dans le fermenteur. La tension appliquée, nécessaire au transfert des molécules chargées de la cuve produit vers la cuve saumure, est de 25 V. L'intensité du courant électrique appliqué et les conductivités dans les cuves produit et saumure de l'électrodialyseur sont mesurées en continu. 1.3. 3. Techniques analytiques : 1.3. 3.1. Détermination de la biomasse. La densité cellulaire est déterminée par lecture de la densité optique à 660 nm à l'aide d'un spectrophotomètre. La biomasse sèche (g/l) est déterminée par la technique des poids secs. Après centrifugation d'un volume de culture dans des tubes Eppendorf préalablement pesés, le culot est lavé à l'eau puis séché 24 h à l'étuve à 60 C sous vide. La corrélation entre la densité optique et la biomasse sèche déterminée est de 0, 53 g/unité de densité optique. 1.3. 3.2. Dosage des substrat et produits de fermentation. Les concentrations en substrat et produits de fermentation sont déterminées par chromatographie liquide haute performance échangeuse de cations (HPLC). Le matériel utilisé est composé d'un injecteur automatique (dénomination commerciale, SPECTRA PHYSIC), d'une pompe haute pression (dénomination commerciale, WATERS) équipé d'un réfractomètre (dénomination commerciale, ICS) et d'un logiciel (mis dans le commerce par la société HEWLETT PACKARD) permettant l'acquisition des données. Après centrifugation et filtration, 20 ut de chaque échantillon sont déposés sur une colonne HPX 87 H+ (mis dans le commerce par la société BIORAD) connectée à une précolonne présentant les mêmes caractéristiques. Les produits sont élués à l'aide d'une solution d'acide sulfurique 5 mM (48 C, débit : 0, 5 ml/min) et leurs concentrations sont déterminées à l'aide de courbes de calibration. 2. EXEMPLES Exemple 1 : Optimisation des conditions de production de succinate dans un fermenteur à membrane en l'absence du système d'électrodialyse. Les conditions de production de succinate par fermentation d'A. succiniciproducens en fermenteur à membrane ont été optimisées pour une concentration en glucose de 20 gll qui conduit à une inhibition faible par l'acide succinique produit. Comme on peut le voir à la Figure 3, les inventeurs ont pu montrer qu'il est avantageux de travailler à une vitesse linéaire de la culture dans la membrane de 0,45 m/s pour maintenir un taux de dilution du perméat proche de 1 h-'La vitesse linéaire est le rapport du débit de recirculation de la culture, par couche ou paquet contenu dans la membrane, sur la section de veine liquide de la membrane (caractéristiques de la membrane). Comme le montre encore la Figure 3, l'augmentation de la vitesse de recirculation dans la membrane entraîne une augmentation de la concentration des cellules. En effet, pour un taux de dilution du perméat moyen de 0, 22 h-', l'augmentation de la vitesse linéaire de la culture dans la membrane de 0,06 m/s à 0,45 m/s entraîne une augmentation de la concentration des cellules de 10 g/l à 18 g/l sans affecter de manière significative les vitesses de production des acides. Pour une vitesse linéaire dans la membrane de 0,45 m/s et pour un taux de purge des cellules de 0,02 h-', l'augmentation du taux de dilution du perméat de 0,22 h-'à 0,93 h-1 conduit à l'augmentation de la concentration des cellules de 18 g/l à 42 g/l. La figure 4 illustre l'influence de l'augmentation du taux de dilution du perméat sur les productivités en succinate et en acétate ainsi que sur la vitesse de consommation du glucose. On observe que l'augmentation du taux de dilution du perméat de 0,22 h-1 à 0,93 h-', pour un taux de purge des cellules constant de 0,02 h-', entraîne une augmentation de la productivité en succinate qui atteint 14, 8 g/l/h, de la productivité en acétate qui atteint 3, 4 g/l/h et de la vitesse de consommation du glucose qui atteint 18, 7 g/l/h. Ces résultats démontrent que pour un couple taux de dilution du perméat/taux de purge des cellules de 0,93 h-/0, 02 h-1, une productivité volumique en succinate de 15 g/l/h est atteinte. Cette productivité en sel d'acide succinique est plus de 7,5 à 20 fois supérieure à celle mesurée antérieurement en culture discontinue (0,7 à 2 g/l/h) sans ajout d'acétate. L'influence de l'augmentation du taux de purge des cellules de 0, 01 h-' à 0, 022 h-', puis à 0, 043 h-', pour un taux de dilution constant du perméat de 0,93 h-', a été étudiée. Comme on peut le voir à la figure 5, l'augmentation du taux de purge de 0,01 h-1 à 0,043 h-1, entraîne une diminution de la concentration des cellules de 85 g/ ! à 21 g/l, mais n'affecte pas les vitesses de production de succinate et d'acétate et de consommation de glucose. Ce dernier résultat montre qu'il est possible d'augmenter les vitesses spécifiques tout en conservant une productivité volumique constante. Les inventeurs ont aussi étudié l'influence de l'augmentation du taux de purge des cellules de 0,01 h-1 à 0,043 h-1, sur les vitesses spécifiques de production de succinate et d'acétate et la vitesse spécifique de consommation du glucose. Comme le montre la figure 6, pour un couple taux de dilution du perméat/taux de purge des cellules de 0,93 h-1/0, 043 h-', la vitesse spécifique de production de succinate atteint 0,92 g/g cellules/h, alors qu'elle était de seulement 0,35 g/g cellules/h pour un taux de purge de 0,022 h-1. L'ensemble des résultats présentés ci-dessus montrent donc que l'augmentation du taux de dilution du perméat à 0,93 h-1 pour un taux de purge des cellules de 0,022 h-1 conduit à une augmentation de la productivité en succinate à 15 g/l/h. Par ailleurs, l'augmentation du taux de purge des cellules à 0, 043 h-', conduit à la diminution de la concentration des cellules sans modifier les productivités volumiques. Ce phénomène est particulièrement intéressant. En effet, cette découverte permet de fixer la concentration préférée des cellules dans le procédé selon l'invention à une valeur inférieure compatible avec une utilisation industrielle de la membrane d'ultrafiltration-le colmatage de la membrane étant retardé-et ce, pendant de longues périodes sans diminuer la vitesse de production du succinate. La purge cellulaire effectuée (22) détermine le taux de croissance de la souche dans le fermenteur. Un mode de fonctionnement à recyclage partiel avantageux de la biomasse permet d'éliminer les débris et d'éviter la formation de mousses. Par ailleurs, il permet d'atteindre des régimes permanents caractérisés par une concentration résiduelle en glucose nulle dans le fermenteur, une concentration de cellules et des concentrations en produits constantes. Les figures 7A et 7B présentent la production de succinate par fermentation d'A. succiniciproducens dans un fermenteur à membrane en absence d'électrodialyse lorsque la concentration en glucose dans l'alimentation est augmentée à 30 g/1. Comme on peut le voir en début de culture, une concentration initiale en glucose de 30 g/1 entraîne une augmentation de la concentration en acide succinique à 20 g/1. Toutefois, dans ces conditions la culture ne se stabilise pas en raison de l'inhibition par l'acide succinique. Aussi, une succession de cycles est observée : cycles où la concentration en acide succinique est élevée et la concentration en glucose est faible suivis de cycles caractérisés par une faible concentration en acide succinique et une concentration résiduelle en glucose supérieure. Ce phénomène typique d'une inhibition par le produit empêche d'une part d'atteindre un régime permanent, et d'autre part, de fermenter des solutions concentrées en glucose. En effet, lorsqu'en fin de culture la concentration en glucose est diminuée à 25 g/1 puis 20 9/l-respectivement à un temps de culture de 250 h et 340 h environ, avec une purge des cellules (g = 0,02 h-') à 400 h de culture environ-, la limitation en glucose est atteinte et un régime permanent s'établit. C'est pourquoi, le couplage d'un électrodialyseur monopolare avec le fermenteur à membrane comme il est décrit dans le procédé de l'invention apporte une amélioration capitale du procédé. Il permet d'extraire et de concentrer en continu l'acide succinique produit et de recycler dans le fermenteur une solution appauvrie en succinate diminuant ainsi le phénomène d'inhibition. Il est alors possible de fermenter des solutions très concentrées en glucose et de limiter la production d'effluents. comme décrit à l'Exemple 3. Exemple 2 : Concentration d'une solution de succinate par électrodialyse monopolare selon un mode de fonctionnement continu en absence de fermenteur à membrane. L'électrodialyse monopolare est un procédé électrochimique connu qui permet d'extraire les ions contenus dans une solution par migration au travers de membranes sélectives sous l'influence d'un champ électrique. Comme on peut le voir à la Figure 8A, deux compartiments (17,18) sont délimités par des membranes alternativement anioniques et cationiques. Les membranes anioniques ne se laissant traverser que par les anions et les membranes cationiques que par les cations. Sous l'action du courant électrique, les cations migrent vers la cathode et les anions vers l'anode, chacun d'eux étant bloqué lorsqu'il rencontre une membrane cationique pour les anions et une membrane anionique pour les anions. Il en résulte une concentration des sels dans l'un des compartiments (18) appelé compartiment de concentration ou saumure ou encore concentrat , et un appauvrissement en sels dans l'autre compartiment (17), appelé compartiment produit ou encore diluat . Afin de déterminer les consignes de fonctionnement en mode continu de l'électrodialyseur monopolare, une étape de concentration en continu d'une solution d'ultrafiltrat a été réalisée. L'objectif de cette étude est de déterminer, d'une part, l'efficacité de l'électrodialyseur monopolare pour concentrer le succinate en continu, et d'autre part, les débits de soutirage de la cuve saumure et de la cuve produit de l'électrodialyseur monopolare, afin de pouvoir définir le débit d'alimentation de la culture lors du couplage fermenteur à membrane/électrodialyse. En référence à la figure 8B, la cuve produit de l'électrodialyseur monopolare est alimentée en continu par une solution de perméat contenant du glucose, du succinate, de l'acétate et du formiate à un débit de 0,42 I/h. Ce débit est celui auquel sera soutiré le perméat en sortie de la membrane d'ultrafiltration du fermenteur à membrane selon l'Exemple 3. Les volumes des cuves produit et saumure sont régulés à 1 1. Sous l'effet du champ électrique, les molécules chargées sont transférées de la cuve produit de l'électrodialyseur monopolare vers la cuve saumure. Ce transfert s'accompagne d'une augmentation de volume dans la cuve saumure. Le volume dans cette cuve étant constant, l'excès de solution est collectée à un débit Q2. Ce débit étant inférieur au débit d'alimentation Q1 de la cuve produit, l'excès de solution contenue dans la cuve produit est soutiré en continu à un débit Q3 afin de maintenir dans cette cuve également un volume constant. Les débits Q2 et Q3 ainsi que la conductivité et les concentrations en produits dans les cuves produit et saumure sont mesurés en continu au cours de l'étape de concentration (figure 8B, figures 9 A à C, Tableau 1). Comme le montrent les résultats présentés aux Figures 9A à 9C, le système se stabilise au bout de 80 minutes de fonctionnement. La conductivité et les concentrations en produits dans les deux cuves de l'électrodialyseur monopolaire sont constantes. La cuve produit s'appauvrit en succinate, acétate et formiate, alors que la cuve saumure s'enrichit et concentre ces mêmes molécules. Ainsi, pour un débit d'alimentation de 0,42 I/h une concentration en succinate moyenne de 80 g/1 est atteinte, soit un facteur de concentration de 2,7. L'augmentation du débit d'alimentation Q1 à 0,84 I/h entraîne une augmentation de la concentration en succinate à 98 g/1. D'autre part, il est à noter que les concentrations résiduelles en acides dans la cuve produit sont faibles (de l'ordre de 5 g/1), ce qui confirme que lors du couplage fermenteur à membrane/électrodialyse une solution appauvrie en acides sera recyclée dans le fermenteur. Ce système devrait donc permettre d'éviter l'inhibition de la croissance de la souche par les produits. Par ailleurs, un régime permanent ayant été rapidement atteint, les débits moyens de soutirage de la cuve saumure et de la cuve produit ont pu être déterminés comme suit : Pour un débit d'alimentation Q1 de 0,42 I/h, Q2 moyen = 0, 14 l/h, Q3 moyen = 0,28 I/h ; pour un débit d'alimentation de 0,84 I/h : Q2 moyen = 0, 207 I/h, Q3 moyen = 0, 63 l/h. Les flux pour chacun des acides ont pu ainsi être calculés (Tableau 1). Tableau 1 : Détermination des flux en produits pour les deux débits d'alimentation : Flux d'entrée Flux de sortie (g/h) Flux Flux récupéré (g/h) Bil (g/h) Bhan (cuve produit) transféré (cuve saumure) (cuve produit) matière Q3 x [P]t (g/h) Q2 x [P]t Q1 x Débit d'alimentation 0. 42 l/h Succinate 12. 18 0.423 11.75 11.04 94% Acétate 2.94 0.2 2.74 2.48 90% Formiate 1. 41 0 1.41 1.32 93% D d'alimentation 0, 84Mt Succmate 24. 36 2.53 21.83 20.3 93% Acétate 5.88 0.633 5.24 4.92 94% Formiate 2.82 0 2. 82 2.59 92% Cette étape préliminaire de concentration de succinate à l'aide de l'électrodialyseur monopolare a permis de vérifier que c'est un système performant pour extraire le succinate du milieu de fermentation et pour le concentrer dans la cuve saumure. Pour un débit d'alimentation de 0, 42 I/h, une solution concentrée en succinate de 80 g/1 est obtenue après 80 minutes de fonctionnement. Le système se stabilise pendant plusieurs heures de fonctionnement. Les rendements de transfert déterminés sont performants puisqu'ils atteignent 95% et confirment donc l'efficacité du système. Enfin, la détermination du débit de soutirage de la cuve saumure de l'électrodialyseur monopolare a permis d'estimer le débit d'alimentation en milieu de culture à appliquer lors de la production par couplage fermenteur à membrane/électrodialyse. Exemple 3 : Production continue d'une solution de succinate concentrée par le procédé de couplage fermenteur à membrane/électrodialyse conforme à l'invention. L'optimisation des conditions de fermentation dans un fermenteur à membrane et des consignes de fonctionnement de l'électrodialyseur monopolare en mode continu ont permis de définir les conditions de fonctionnement à appliquer lors de la production continue de succinate par couplage fermenteur à membrane/électrodialyse. En particulier, la détermination du flux de glucose à satisfaire et du débit d'alimentation de la culture ont permis de déterminer la concentration initiale en glucose à utiliser pour conduire à la production d'une solution concentrée en succinate. Dans un premier temps, la culture est alimentée en continu avec un milieu de culture contenant 60 g/ ! de glucose. Après une phase de culture discontinue, le perméat est soutiré en continu à un débit moyen de 0, 44 I/h et alimente la cuve produit de l'électrodialyseur monopolaire. La concentration en biomasse augmente. Lorsque la concentration en glucose devient presque limitante, les cellules sont soutirées à un taux de purge fixe avantageux de 0,03 h-'. Dans un deuxième temps, lorsque ce premier régime permanent a été maintenu pendant plusieurs heures, la concentration initiale de glucose est augmentée à 120 g/l. Un deuxième régime permanent est atteint caractérisé toujours par une concentration résiduelle en glucose nulle dans le fermenteur et des concentrations en biomasse et produits constantes (Figures 10Aet 10B). Le premier régime permanent atteint pour une concentration initiale en glucose de 60 g/l est caractérisé par une concentration en biomasse dans le fermenteur de 9,8 g/l, une concentration résiduelle en succinate de 6,2 g/l, une concentration en acétate de 2,4 g/l et une concentration en formiate de 0,6 g/l. Du succinate à une concentration de 38 g/l est produit en continu en sortie de la cuve saumure de l'électrodialyseur monopolaire (Figure 11). L'augmentation de la concentration initiale de glucose à 120 g/l conduit à un autre régime permanent caractérisé par un niveau de biomasse supérieur (15 g/l) et des concentrations supérieures en produits dans le fermenteur : succinate 20 g/l ; acétate 4,4 g/l ; formiate 0,23 9/l. La concentration moyenne en succinate en sortie de la cuve saumure de l'électrodialyseur monopolare est alors de 81 g/l. Une production pendant plus de 150 heures de cette solution concentrée en succinate a été maintenue. Ainsi, le passage à des concentrations initiales de glucose de 120 g/l, voire supérieures, est désormais possible, alors que selon l'art antérieur il est déconseillé de dépasser le seuil de 100 g/l en raison de l'osmotolérance des cellules bactériennes. Les inventeurs ont montré qu'un doublement de la concentration initiale de glucose tel que le passage de 60 g/1-avec une concentration des cellules de 9,8 g/l, des concentrations de sels d'acide succinique et acétique respectivement de 6,2 g/l et 2,4 g/t-à 120 g/l de glucose conduit à un régime permanent caractérisé par une plus forte densité cellulaire (concentration des cellules de l'ordre de 15 g/l) et des concentrations de sels d'acide succinique et d'acide acétique respectivement de 20 g/l et 4,4 g/l soit un facteur de concentration pour le succinate de 3,23 alors qu'il n'est que de 1,83 pour l'acétate. Ce résultat est surprenant et intéressant à la fois car le fermenteur produit préférentiellement du sel d'acide succinique. La détermination des flux transférés au niveau de l'électrodialyseur monopolare montrent que pour les deux régimes permanents le flux en succinate transféré au niveau de l'électrodialyse atteint les valeurs constantes suivantes (Figure 12) de : - 2 g/h, pour une concentration en glucose initiale de 60 g/) - 5 g/h, pour une concentration en glucose initiale de 120 g/1. Ces flux transférés au niveau de l'électrodialyse sont plus faibles que ceux déterminés lors de l'essai de concentration par l'électrodialyseur monopolare seul d'une solution de succinate. (Tableau 1). Ce phénomène peut s'expliquer par une diminution de la conductivité de la solution de la cuve diluée de l'électrodialyseur monopolaire lors du couplage fermenteur à membrane/électrodialyse monopolaire. En effet, une partie de la solution de la cuve diluée appauvrie en molécules chargées étant recyclée dans le fermenteur, la conductivité de cette solution est plus faible que lorsque la cuve de l'électrodialyseur monopolaire était alimentée par une solution de perméat contenant une concentration en molécules chargées supérieure. Le Tableau 2 ci-dessous présente un récapitulatif des résultats obtenus au cours de la production de solution de succinate concentrées à l'aide d'un procédé de couplage fermenteur à membrane/électrodialyse monopolaire selon l'invention. Tableau 2 Alimentation (Glucose) 60 g/l ; Q = 0, 052 1/h 121 g/l ; Q = 0,054 I/h Diluat recyclé (succinate) 1,71 g/l ; Q = 0,322 I/h 9,3 g/l ; Q = 0,373 I/h Concentrat (succinate) 38 g/l ; Q = 0,064 I/h 81 g/l/h ; Q = 0,066 I/h Productivité volumique 4, 8 g/l/h 10, 7 g/l/h Ces résultats sont obtenus aux principales conditions opératoires résumées suivantes : Un fermenteur (10) de volume 500 ml avec sortie de gaz, une régulation de pH (11) au carbonate de sodium 2M (0,031 I/h), un taux de purge (22) de 0,03 h-', une concentration de glucose nulle en régime permanent, le perméat de 1'ultrafiltration (12) soutiré à un débit Q de 0,44 I/h et une alimentation de glucose à environ 120 g/1. Le procédé selon l'invention conduit à la production de solutions concentrées en succinate (15) (81 g/1) avec une productivité volumique de 10,7 g/I. h. Cette productivité est largement supérieure à celle obtenue en culture discontinue (0,7 g/I. h). Le rendement en succinate est de 0,89 g succinate produit/g glucose consommé. Ainsi, dans le procédé selon l'invention, l'étape d'électrodialyse monopolare permet de manière avantageuse d'une part de concentrer le sel d'acide succinique contenu dans le perméat collecté en sortie du fermenteur et d'autre part de recycler dans le fermenteur une solution appauvrie en sels d'acide succinique (compartiment produit). Dans le cadre de la présente invention, on entend par solution appauvrie de succinate, une solution comprenant une concentration inférieure à environ 5 g/) ou 10 g/1, lorsque le glucose est présent dans l'alimentation à une concentration d'environ 60 g/ ! ou 120 g/I, respectivement. Exemple 4 : Cristallisation de l'acide succinique à partir d'une solution concentrée de succinate. La solution récupérée en sortie de la cuve saumure de l'électrodialyseur monopolaire est acidifiée jusqu'à pH = 3, de préférence, avec une solution d'acide sulfurique, puis est concentrée par évaporation sous vide jusqu'à une concentration de 120 g/1 à 150 g/i environ correspondant à une haute densité de cristaux, puis est refroidie pour cristaliser les cristaux d'acide succinique et sulfate de soude ; les cristaux sont séparés en continu avantageusement sur une essoreuse centrifuge. Les cristaux d'acide succinique sont ensuite dissous de préférence dans l'éthanol ; la solution alcoolique est filtrée pour séparer les cristaux minéraux non dissous, puis concentrée, par exemple, par évaporation pour précipiter l'acide succinique sous forme de cristaux purs ; si nécessaire pour améliorer la pureté on réalise une adsorption sur charbon actif de la solution alcoolique filtrée avant évaporation pour éliminer des impuretés. Il peut être procédé à un clairçage des cristaux. La solubilité de l'acide succinique dans l'eau à température ambiante étant de 76,7 g/1, elle atteint 120 g/1 à 80 C : à cette concentration des cristaux d'acide succinique se forment spontanément dès le refroidissement et sont séparés, par exemple, sur essoreuse. Les cristaux d'acide succinique obtenus sont séchés. Les cristaux dosés par chromatographie haute performance sont purs à 99%. Le rendement de récupération est de l'ordre de 70% mais ce dernier pourrait être augmenté par recyclage de l'acide succinique non précipité en début du procédé de purification. Avantages du procédé conforme à l'invention : Le procédé selon l'invention mettant en oeuvre un fermenteur à membrane conduit à une augmentation de la concentration en biomasse et, par conséquent, permet d'atteindre des productivités volumiques élevées. Ce système appliqué à la fermentation de A. succiniciproducens a donc permis d'augmenter la vitesse de production en succinate de 0,7 g/I. h en culture discontinue à 10,4 g/I. h en utilisant le procédé de l'invention. De plus, dans le procédé de l'invention le perméat collecté en sortie de la membrane d'ultrafiltration est exempt de cellules et peut donc alimenter directement la solution de la cuve produit de l'électrodialyse. Ainsi, le succinate produit en continu, est éliminé du fermenteur en continu, et est concentré en continu dans la cuve saumure de l'électrodialyseur monopolare. En raison des productivités volumiques atteintes et de la concentration de succinate élevée obtenue grâce au procédé selon l'invention, il est désormais possible d'envisager des installations de taille raisonnable, compatibles avec une réalisation au stade industrie. Le procédé selon l'invention présente en outre plusieurs avantages par rapport aux procédés déjà décrits : - il nécessite uniquement un système de couplage fermenteur à membrane/électrodialyse monopolare. Les étapes d'électrodialyse bipolaire avec dissociation d'eau et de traitement ultérieur sur des colonnes échangeuses d'ions préconisées par certains auteurs sont donc supprimées, ce qui diminue considérablement les coûts de production. - il permet la production continue de solutions très concentrées de succinate (de l'ordre de 81 g/l). L'abaissement du pH de cette solution et sa concentration par évaporation, conduit à la formation de cristaux d'acide succinique. - il permet d'éliminer en continu le succinate produit qui est un inhibiteur de la croissance de la souche. Ce phénomène limitait la production en culture discontinue à des titres relativement faibles d'acide succinique de 30 g/1, en moyenne. - le principe de couplage fermenteur à membrane/électrodialyse permet de recycler une solution appauvrie en succinate dans le fermenteur. Ainsi, certains éléments nutritifs en excès sont recyclés et des solutions très concentrées en glucose (de l'ordre de 120 g/1) peuvent être fermentées sans observer un phénomène d'inhibition de la croissance par le substrat ou le produit. Cette condition permet de limiter de manière déterminante la production d'effluent. REVENDICATIONS 1. Procédé de production en continu d'un sel concentré d'acide succinique comportant les étapes consistant à : réaliser dans un fermenteur la culture anaérobie de cellules bactériennes de A. succiniciproducens aptes à produire le sel d'acide succinique dans un milieu de culture approprié, puis concentrer le sel obtenu dans un électrodialyseur en continu caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape consistant à ultrafilter la culture provenant du fermenteur et à recycler le rétentat obtenu à une vitesse linéaire déterminée appropriée vers le fermenteur et à alimenter le perméat obtenu dans l'électrodialyseur et à recycler le diluat de l'électrodialyseur dans le fermenteur. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la vitesse linéaire du rétentat dans l'ultra-filtre est telle que l'écoulement du liquide est de type turbulent. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'un excès de perméat est recyclé dans le fermenteur. 4. Procédé selon l'une quelquonque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est prévu une purge des cellules du fermenteur à un taux d'environ 0,01 h-'à environ 0,05 h-', de préférence environ 0,03 h-'. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le rapport du débit sortant de la cuve saumure de l'électrodialyseur au volume réactionel est d'environ 0,05 h-1 à environ 0,5 h-1 de préférence environ 0,13 h-1. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu de culture comporte une source de glucides, de préférence le glucose, à une concentration initiale d'environ 60 g/ ! à environ 200 g/1, de préférence environ 120 g/). 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration des cellules dans le fermenteur est d'environ 5 9/l à environ 85 9/l, de préférence environ 15 g/l. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'utrafiltration est réalisée avec une membrane plane ayant un seuil de coupure d'environ 15 KD à environ 300 KD, de préférence 50 kD. 9. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l'ultra-filtration est réalisée avec une membrane plane dans laquelle la vitesse linéaire du rétentat dans l'ultra-filtre est d'environ 0,06 m/s à environ 1 m/s, de préférence 0,45 m/s. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'électrodialyseur est un électrodialyseur monopolare comportant un compartiment produit et un compartiment saumure. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est prévu un recyclage vers le fermenteur d'une solution appauvrie en succinate en provenance du compartiment produit de l'électrodialyseur et comprenant des éléments nutritifs en excès. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les étapes consistant à acidifier, évaporer puis cristalliser la solution de sel d'acide succinique issue de l'électrodialyseur ce par quoi des cristaux d'acide succinique de haute pureté sont obtenus.