Brevet FR2809308A1 — publié le 20011130

La présente invention concerne les préparations cosmétiques ou dermo-pharmaceutiques à usage externe, d'hygiène ou de soins de la peau et des cheveux, caractérisées en ce qu'elles contiennent des Heat Shock Proteins (HSP) et/ou Heat Shock Factors (HSF) provenant d'un extrait de champignons ou de levures stressés. L'invention concerne les HSF et les HSP. Les HSP produites appartiennent à une ou à plusieurs des familles de HSP : HSP (10-30 kDa), HSP40, HSP60, HSP70, HSP90, HSP100-110. La conservation des HSP au cours de l'évolution est importante. La plupart des propriétés fonctionnelles et structurelles des protéines très conservées de procaryotes se retrouvent chez leurs homologues eucaryotes. Les HSP sont en effet parmi les plus anciennes et les plus conservées des protéines. Il en existe des homologues dans toutes les espèces et dans tous les règnes vivants. Par exemple, dnaK, un seul gène chez la bactérie, est devenu le complexe multigénique de la famille des HSP70 chez Saccharomyces, chez la drosophile et l'homme. Si les HSP sont apparues très tôt au cours de l'évolution, c'est en raison des conditions environnementales extrêmes auxquelles étaient confrontés les organismes. Au cours de l'évolution, les protéines HSP ont conservé leur rôle vital de protection contre le stress, elles ont également pris en charge de nouvelles fonctions comme par exemple, le transport des protéines à l'intérieur de la cellule. Les protéines HSP sont, à l'origine, des protéines anti-stress. Le mécanisme essentiel de défense de tout organisme est la conservation de son matériel génétique, protéique et membranaire. Pour cela, les protéines HSP dites protéines de stress ou Heat Shock Proteins (HSP) ont pour rôle de protéger ou de réparer le matériel génétique, les peptides et protéines détériorés lors d'un stress. La synthèse des HSP est donc un moyen de défense généralisé, développé par la cellule afin de faire face à la grande diversité des agressions possibles. Afin de faire face au stress, les organismes vivants ont développé plusieurs mécanismes de réponse, en fonction d'une part du type de choc subit, et d'autre part des dégâts susceptibles d'être occasionnés. Les différents types de stress et leurs conséquences biologiques Tous les organismes vivants doivent faire face, à un moment de leur existence, à des variations de leurs conditions environnementales. Selon la nature et l'ampleur de ces modifications, elles peuvent être perçues par l'organisme ou la cellule comme une agression, un stress. Ce stress sera d'ordre physique, chimique ou biologique. Les principaux stress sont les chocs thermiques, l'exposition aux radicaux libres de l'oxygène, les ultraviolets, les métaux lourds, les chocs osmotiques, les chocs de pression, mais aussi les états pathologiques tels fièvre, inflammation, infection virale... Suite à un stress, il y a, en général, diminution, au niveau cellulaire, de l'expression des ARN messagers, de la synthèse des protéines cellulaires normales et de certaines activités enzymatiques, ainsi que des altérations morphologiques. Face à cela, la cellule met en place un système de protection en induisant la transcription d'une famille de gènes spécifiques qui aboutit à la synthèse et l'accumulation intracellulaire de HSP. Les protéines HSP sont également des protéines impliquées dans l'homéostasie cellulaire En l'absence d'agression, les cellules contiennent un taux constitutif d'HSP induit par le cycle cellulaire, le développement et la différentiation, l'oncogenèse et la proto-oncogenèse. L'expression constitutive de la plupart des HSP indique qu'elles jouent un rôle essentiel dans le bon fonctionnement de la cellule en participant, entre autres, à la biosynthèse des protéines, à la transmission des signaux ou à la prolifération cellulaire. Les HSP sont aussi appelées molécules chaperonnes car elles s'associent à d'autres molécules, soit dénaturées soit en cours de biosynthèse. Ces interactions moléculaires ont pour but de prévenir l'agrégation de protéines altérées ou en cours de biosynthèse, d'éliminer les protéines anormales, de participer au transport des protéines du cytoplasme vers la membrane plasmique ou vers des organites tels que les mitochondries, le réticulum endoplasmique, les lysosomes ou le noyau. En interagissant avec d'autres protéines, les HSP vont minimiser la probabilité pour ces protéines d'interagir avec d'autres de façon inappropriée. Les HSP reconnaissent et se lient aux molécules qui ne sont pas dans une conformation native, soit après un stress dénaturant, soit sur les protéines en cours de synthèse, de repliement, d'assemblage, soit encore car elles ne sont pas localisées dans le bon compartiment subcellulaire. Les classes de HSP Les HSP humaines sont habituellement classées en familles, en fonction de leur poids moléculaire apparent sur gel d'électrophorèse en polyacrylamide, leurs principaux agents inducteurs et leurs fonctions. - Les petites HSP (HSP10, HSP27, ...) Les HSP10 sont des protéines qui agissent en coopération avec les HSP60 (voir plus loin) pour assurer un environnement favorable au repliement des protéines. La famille des HSP10 est encore appelée HSP E. La localisation de la protéine est mitochondriale. Les HSP27 confèrent une protection contre la mort cellulaire induite par le TNF, le stress oxydatif et plusieurs agents anticancéreux. De ce fait, la combinaison des HSP27 et HSP70 devrait protéger la cellule de beaucoup de stimuli parfois mortels. La famille des HSP27 est encore appelée famille HSP B et comporte trois protéines chez l'homme : HSP Bl, B2 et B3. Ces petites protéines sont impliquées dans la thermotolérance cellulaire. - Les HSP40 Elles ont un rôle protecteur des chaînes protéiques en cours d'élongation. La famille des HSP40 qui contient les HSP47, est encore appelée famille HSP F. - Les HSP60 Elles présentent une structure caractéristique qui apporte un environnement favorable pour le repliement des protéines nouvellement synthétisées ou dépliées par le stress. La famille des HSP60 est encore appelée famille HSP D. Ce sont des protéines mitochondriales. - Les HSP70 Cette famille contient des protéines constitutives (Heat Shock Cognate, HSC), des protéines inductibles et des protéines contrôlées par le taux de glucose (Glucose Regulated Proteins, GRP). Chez l'homme, la famille des protéines HSP70 est encore appelée famille HSP A. La famille des protéines HSP70 comporte quelques 13 membres chez l'homme (voir tableau ci-dessous). Les gènes HSP A1A (ou HSP70-1), HSP A1B (ou HSP70-2), HSP AIL (ou HSP70-HOM), HSP A2, HSP A3, HSP A4 (ou HSP70-RY), HSP A5 (ou GRP 78, BiP), HSP A6 (ou HSP70B), HSP A7 (ou HSP70B), HSP A8 (ou HSP73, HSC 70), HSP A9A (ou Mortaline 1) et HSP A9B (ou Mortaline 2, PBP74, GRP75), HSP A10 (ou HSC 71). HSP A taille synonyme chromosome remarques HSPA1A 641 aa. HSP70-1 6p21.3 -Induction par la température HSP A1B 641 aa. HSP70-2 6p21.3 -Induction par la température HSPA1L 641 aa. HSP70-HOM 6p21.3 -Pas d'induction par la température HSP A2 639 aa. - 14q24. 1 HSP A3 - 21 HSP A4 840 aa. HSP70-RY 5q31.1-2 HSPA5 654 aa. GRP 78 9q34-Régulation par le glucose BiP -Immunoglobulin heavy chainbinding protein HSP A6 643 aa. HSP70B' lq -Induction par la température HSP A7 639 aa HSP70B lq -95 % d'homologies avec HSP A6 HSP A8 646 aa. HSP73 llq23.3-5 -Expression constitutive HSC 70-Participe au folding des protéines HSP A9A 679 aa. Mortaline 1-forme cytosolique HSP A9B 679 aa. Mortaline 2 5q31.1 -forme péri-nucléaire PBP74-Localisation mitochondriale GRP75-Régulation par le glucose HSP A10 0 646 aa. HSC 71-Expression constitutive Tableau 1 : famille des HSP70 chez l'homme Dans des conditions de vie normale, les HSP70 fonctionnent comme des molécules chaperonnes ATP-dépendantes en assistant le repliement de polypeptides nouvellement synthétisés, l'assemblage de complexes multi-protéiques et le transport de protéines à travers la membrane cellulaire. Sous des conditions de stress, la synthèse de HSP A1A et A1B augmente la faculté des cellules stressées à faire face à l'augmentation des protéines dénaturées ou dépliées. Les HSP70 peuvent sauver des cellules à un stade bien plus avancé de l'apoptose que les autres médicaments ou protéines comme le montre l'étude de Jââttelâ et coll. (EMBO J, 1998). Les HSP70 jouent aussi un rôle dans l'apprêtement et la présentation de l'antigène. C'est le cas des HSP A5. Des études ont montré que les HSP70 sont également impliquées dans les mécanismes de thermotolérance. Elles confèrent à la cellule une résistance à la chaleur (HSP A1A, A1B, A6). - Les HSP90 Cette famille de HSP est abondamment exprimée dans les cellules de mammifères, même en l'absence de stress. Ces protéines se lient par exemple aux récepteurs des hormones stéroïdes (oestrogènes, progestérone, testostérone, glucocorticoïdes) et les stabilise. On pense que les HSP90 permettent une augmentation de l'affinité de liaison des récepteurs pour ces hormones. L'homologue chez la levure est nommée HSP82. La famille des HSP90 est encore appelée famille HSP C. - Les HSP100-110 La HSP 104 est l'homologue, chez la levure, de la HSP110 humaine. Les HSP 100 sont impliquées dans les mécanismes de réparation postérieurs au stress : une fois le stress produit, les HSP100 permettent de replier correctement les protéines et de leur redonner leur entière activité. Des études ont montré que les HSP110 sont impliquées dans les mécanismes de thermotolérance : elles confèrent à la cellule, une résistance à la chaleur. Les HSF : Ce sont les protéines qui vont permettre l'expression des HSP en se fixant dans la région promotrice qui contrôle l'expression des différents gènes de HSP au niveau de séquences spécifiques nommées HSE (Heat Shock Elements). Leur expression est un préalable nécessaire à l'expression des différentes familles de HSP. Un seul type de HSF a été décrit chez la levure alors que plusieurs ont été trouvés chez les vertébrés et les plantes. Chez l'homme, on observe 3 HSF (HSF 1,2,4). HSF 3 n'a été retrouvé à ce jour que chez le poulet. Il existe deux isoformes de HSF4 (HSF4A et HSF4B), provenant de l'épissage alternatif du gène. HSF4A serait un régulateur de l'expression des différentes HSP. D'autre part, les protéines HSF1 et HSF2 sont exprimées de manière ubiquitaire dans les cellules humaines. La liaison de HSF1 à l'ADN nécessite une agression cellulaire, alors que HSF4 est exprimée de manière constitutive. Chez la plupart des eucaryotes, HSF1est présent chez les cellules stressées et non stressées. Etant donné le rôle de ces protéines HSF dans l'expression des HSP, tout apport de HSF dans les cellules entraînera une augmentation de l'expression des HSP. HSP et micro-organismes Chez certains champignons et levures, on retrouve des HSP et HSF semblables aux protéines humaines. Les préparations de la présente invention sont caractérisées en ce que les champignons ou les levures utilisés peuvent appartenir aux genres : Arthroderma, Candida, Claviceps, Fusarium, Galactomyces, Hansenula, Kluyveromyces, Neurospora, Penicillium, Pichia, Saccharomyces (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii...), Schizosaccharomyces, Torula, Torulaspora, Trichoderma, Zygosaccharomyces. Ces micro-organismes contiennent, dans leur état normal, pas ou peu de ces HSP et HSF selon le type de micro-organisme et la famille de HSP étudiés. Lorsqu'ils sont soumis à un stress environnemental, ces micro-organismes vont produire ces HSP et HSF en quantités variables. HSP et peau Au niveau de la peau, des études ont montré la présence des HSP27, HSP47, HSP60, HSP70 et HSP90. Les HSP27 et HSP90 sont exprimées au niveau épidermique dans les couches basale et suprabasales, les HSC70 au niveau suprabasal, les HSP70 au niveau basal (Boechncke et coll., 1994). D'autres études ont montré la présence de HSP47 au niveau épidermique. Des fibroblastes provenant d'individus vivant dans les régions très chaudes expriment plus de HSP et ont une meilleure thermotolérance que des fibroblastes de personnes vivant sous des climats plus cléments. Exemple de diminution ou absence de réponse au stress En vieillissant, la peau accumule progressivement les protéines endommagées et sa capacité d'exprimer des HSP diminue, ainsi que sa résistance aux stress. D'autre part, lorsque la synthèse de protéines est particulièrement intense, comme par exemple, durant les périodes précoces de l'embryogenèse, la plupart des espèces animales ne montrent pas de capacité à répondre à un choc thermique. Ceci peut s'expliquer par le fait que la synthèse et la dégradation de HSP pourrait consommer une grande partie des nutriments et des ressources énergétiques de la cellule, ou alors occuper une part trop grande de l'appareil de synthèse/catabolisme qui manquerait alors aux autres biomolécules essentielles. Il apparaît donc clairement, d'après cette étude, que les HSP jouent un rôle central dans la protection cellulaire, d'où l'intérêt de renforcer la capacité de réponse des cellules face à un stress. L'utilisation d'extraits riches en HSP et HSF, comme ceux décrits dans la présente invention, permet de fournir directement aux cellules une partie de ces HSP et HSF dont elles ont besoin, et d'améliorer leur réponse face à différents stress. L'objectif de la présente invention est donc, d'une part, de prouver l'homologie génétique, par l'étude de la HSP70, des HSP extraites de micro-organismes avec les HSP des cellules humaines, et d'autre part, de montrer l'effet protecteur de ces HSP sur des cellules soumises à un stress. L'extrait de micro-organismes stressés (riche en HSP et HSF) va permettre d'augmenter la concentration des HSP au niveau cellulaire. Conclusion Les extraits de la présente invention seront employés dans les préparations caractérisées en ce qu'elles sont utilisées pour la protection des cellules et de la peau envers les différents types de stress: chocs physiques (thermiques, rayonnement solaire, osmotiques...), chimiques (agents cytotoxiques tels les métaux lourds, les solvants...) ou biologiques (agents viraux, bactériens...), pour la protection des composants cellulaires tels que les protéines, le matériel génétique (ADN, ARN) et les membranes cellulaires et enfin pour renforcer l'homéostasie via les processus vitaux de transcription, de synthèse protéique, de transports intracellulaires et de division cellulaire. Exemple 1 : d'obtention de protéines HSP et HSF extraites de levures soumises à un stress. Culture des levures Les levures sont cultivées en milieu de culture défini puis centrifugées pour obtenir un culot cellulaire. Induction des HSP et HSF Le culot est repris dans un milieu défini principalement aqueux, puis soumis à un ou plusieurs stress inducteurs de HSP et HSF dont les durées varient de quelques secondes à 24 heures. Suite à chaque stress, les levures sont ensuite remises en culture dans leurs conditions normales pendant des temps variables de 0 à 12 heures. Le stress appliqué sur les champignons ou les levures est de nature physique (température, pression, micro-ondes, choc osmotique, absence d'oxygène) et/ou chimique (métaux lourds, solvants) et induit des HSP et/ou HSF. Extraction des HSP et HSF Les HSP et HSF sont extraits en fin de traitement : le contenu cytoplasmique est récupéré après lyse des parois cellulaires. Stabilisation L'extrait de HSP et HSF est traité et stérilisé pour se conformer aux exigences cosmétiques (couleur, odeur, aspect, stérilité...). Une concentration variable de glycérol est ajoutée afin de stabiliser les protéines. De ce fait, l'extrait de champignons ou de levures stressés contient 0 à 15 % de glycérol. Utilisation L'extrait sera utilisé dans des préparations caractérisées en ce que en ce qu'elles peuvent contenir de 0,1% à 15 % de l'extrait de champignons ou de levures stressés. Exemple 2 : Mise en évidence des HSP70 dans l'extrait de levures Voir figure 1 (page 12) 20 l d'extrait de levures non stressées (piste 1) ou stressées (piste 2) ont été analysées afin de mettre en évidence, à l'aide d'un anticorps anti HSP70 humaine, une forte augmentation de l'expression des HSP70. En parallèle, une protéine HSP70 recombinante humaine a été analysée (piste 3), ainsi qu'un extrait de cellules en culture préalablement stressées par la chaleur (piste 4). Dans ce dernier cas, on observe aussi l'expression de HSP90 (l'anticorps anti HSP70 humaine croisant avec la HSP90). Exemple 3 : Mise en évidence des HSF1 et étude de la dégradation des HSF1 et HSP 70 dans l'extrait de levures. Voir figure 2 (page 13) 20 l d'un extrait de levures stressées ont été analysées (pistes 1, 2,3 et 4), soit à l'aide d'un anticorps.anti HSF1humain (piste 1 et 2), soit à l'aide d'un anticorps anti HSP70 humaine (piste 3 et 4). Ces résultats montrent d'une part la présence de HSF1 sous forme dimérisée dans l'extrait de levures, et d'autre part qu'aucune dégradation n'est observée après 25 heures d'incubation à température ambiante, tant au niveau des HSP70 que des HSF1. Exemple 4 : Etude de l'homologie génétique entre HSP de levures et HSP humaines. Evaluation d'un extrait riche en HSP70. Objectif Cette étude a pour but de justifier l'utilisation sur la peau des composés de la présente invention, comme par exemple, un extrait de levures riche en HSP70. En effet, une simple reconnaissance de protéines par les anticorps ne permet pas de conclure que la protéine sera active au niveau de la cellule humaine. Méthode Dans une souche de levure sélectionnée, 9 gènes de la famille des HSP70 ont été clonés par des techniques de biologie moléculaire. Pour chacun de ces gènes, l'expression hétérologue dans des cellules de mammifères en culture a été réalisée. La technique de western blot a permis de mettre en évidence une reconnaissance de certains gènes exprimés par les anticorps anti HSP70 humaine. Résultats Les résultats obtenus montrent que 7 des 9 protéines de cette souche de levure sont reconnues par les anticorps anti HSP70 humaine. Les gènes de levure en question sont fortement homologues aux gènes HSP70 A1A, A1B, AIL, A5 et A6 humains. Un résultat de 70 à 85 % d'homologie protéique a pu être mis en évidence. Conclusion La mise en évidence de la reconnaissance des protéines HSP70 de levure par l'anticorps anti HSP70 humaine (7 protéines sur 9), croisée avec la connaissance de l'homologie de séquence entre ces 7 gènes de levure et les gènes humains (A1A, A1B, AIL, A5 et A6), constitue un argument de poids en faveur de l'hypothèse selon laquelle les HSP de levures vont venir protéger des cellules humaines. Exemple 5 : Etude de la viabilité de fibroblastes humains soumis à un choc thermique. Voir figure 3 (page 14) Objectif Cette étude a pour but d'évaluer l'effet d'un extrait de levures contenant des HSP, sur la viabilité de fibroblastes humains soumis à un choc thermique. La viabilité cellulaire est mesurée directement après marquage par un colorant vital, le MTT (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Le système MTT mesure l'activité déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes. Les déshydrogénases mitochondriales des cellules vivantes coupent le cycle tétrazolium, induisant la formation de cristaux pourpres MTT formazan, insolubles dans les solutions aqueuses. Les cellules vivantes sont donc colorées par le MTT. Méthode Les fibroblastes humains ont été cultivés dans des plaques de 24 puits pendant 48 heures à 37 C et 5 % de CO2 dans une étuve humide. Les traitements des cellules sont les suivants : - Contrôle : cellules sont incubées 24 h avec le milieu de culture. - Arseniate de sodium : les cellules sont incubées pendant 21 h avec le milieu de culture, puis 1 h avec 150 ug/ml d'arséniate de sodium (Na2HAs04). De nombreuses références bibliographiques montrent en effet que l'arséniate de sodium, à cette concentration, est capable d'induire l'expression des HSP qui vont ensuite pouvoir aider la cellule face au stress. Les cellules sont rincées deux fois avec du milieu de culture. - Extrait de levures : les cellules sont incubées 24 h avec 3 % de l'extrait riche en HSP. Induction du stress thermique Après les 24 h d'incubation, toutes les cellules sont soumises à une température de 47 C pendant 1 h. Marquage Le milieu de culture est retiré et remplacé par la solution de MTT 0. 5 mg/ml dans un tampon phosphate (PBS) pendant 4 heures à 37 C. Enfin, le MTT est retiré et 1 ml d'isopropanol/ 0,04 N HC1 est placé dans chaque puits. La lecture de la Densité Optique de chaque puits est réalisée par spectrophotométrie à 540 nm. Résultats Les résultats montrent que les fibroblastes traités avec l'extrait riche en HSP et HSF présentent un taux de viabilité nettement plus important que les cellules témoins, et comparable à celui des cellules traitées en présence d'arséniate de sodium, agent connu pour induire l'expression des HSP. Conclusion Les résultats de cette étude indiquent que les extraits de micro-organismes ayant subi un stress, tels que les champignons et les levures, riches en HSP et HSF, apportent une protection significative des cellules humaines face à un choc thermique. REVENDICATIONS 1. Préparations cosmétiques ou dermo-pharmaceutiques à usage externe, d'hygiène ou de soins de la peau et des cheveux, caractérisées en ce qu'elles contiennent des Heat Shock Proteins (HSP) et/ou Heat Shock Factors (HSF) provenant d'un extrait de champignons ou de levures stressés. 2. Préparations selon la revendication 1 caractérisées en ce que les HSP produites appartiennent à une ou à plusieurs des familles de HSP : HSP (10-30 kDa), HSP40, HSP60, HSP70, HSP90, HSP100-110. 3. Préparations selon les revendications 1 et 2 caractérisées en ce que l'extrait de micro- organismes stressés (riche en HSP et HSF) va permettre d'augmenter la concentration des HSP au niveau cellulaire. 4. Préparations selon les revendications 1, 2 et 3 caractérisées en ce que les champignons ou les levures utilisés peuvent appartenir aux genres : Arthroderma, Candida, Claviceps, Fusarium, Galactomyces, Hansenula, Kluyveromyces, Neurospora, Pénicillium, Pichia, Saccharomyces (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii), Schizosaccharomyces, Torula, Tnrulaspnra, Trichoderma, Zygosaccharomyces. 5. Préparations selon les revendications 1, 2, 3 et 4 caractérisées en ce que le stress appliqué sur les champignons ou les levures est de nature physique (température, pression, micro-ondes, choc osmotique, absence d'oxygène) et/ou chimique (métaux lourds, solvants) et induit des HSP et/ou HSF. 6. Préparations selon les revendications 1,2, 3,4 et 5 caractérisées en ce qu'elles peuvent contenir de 0,1% à 15 % de l'extrait de champignons ou de levures stressés. 7. Préparations selon les revendications 1, 2,3, 4, 5 et 6 caractérisées en ce que l'extrait de champignons ou de levures stressés contient 0 à 15 % de glycérol. 8. Préparations selon les revendications 1,2, 3,4, 5,6 et 7 caractérisées en ce qu'elles sont utilisées pour la protection des cellules et de la peau envers les différents types de stress : chocs physiques (thermiques, rayonnement solaire, osmotiques), chimiques (agents cytotoxiques tels les métaux lourds, les solvants) ou biologiques (agents viraux, bactériens), pour la protection des composants cellulaires tels que les protéines, le matériel génétique (ADN, ARN) et les membranes cellulaires et enfin pour renforcer l'homéostasie via les processus vitaux de transcription, de synthèse protéique, de transports intracellulaires et de division cellulaire.