Brevet FR2812885A1 — publié le 20020215

La présente invention se rapporte à un procédé de détection d'une mutation dans un acide nucléique cible comprenant l'amplification de l'ADN cible, l'hybridation spécifique d'une sonde avec l'ADN cible, l'extension de la sonde avec addition sélective d'un oS- phosphothioatedésoxynucléotide complémentaire de la mutation dans un tube A et addition d'un acS-phosphothioatedésoxynucléotide complémentaire de la base naturelle correspondant à ladite mutation dans un tube B; la sonde ainsi allongée étant résistante à la digestion par une exonucléase, en particulier par l'exonucléase III. La détection de la mutation et de la base naturelle est effectuée par mesure directe ou indirecte dans les tubes A et B. Les mutations dans les cellules germinales ou dans les lignées somatiques peuvent avoir des conséquences redoutables sur l'organisme en provoquant par exemple des maladies génétiques héréditaires ou l'apparition de cancer. L'effet d'une mutation dépend étroitement de sa localisation dans l'ADN. Dans le cas d'une mutation dans une région codante, on peut observer la perte de la fonction de la protéine codée. Si la mutation se trouve dans une région régulatrice, l'expression de l'ADN peut être abolit ou augmenter. Une mutation dans un gène impliqué dans le cancer au niveau de la lignée germinale ne signifie pas obligatoirement que l'individu concerné contractera effectivement une tumeur, mais seulement que le risque de celle-ci est accru. En outre, lorsque l'on cherche à diagnostiquer le potentiel invasif d'une tumeur déjà établie, on ne sait pas d'avance quelles mutations il faut attendre car celles-ci peuvent se trouver sur plusieurs gènes ou à plusieurs endroits d'un même gène. Dès lors, il apparaît nécessaire de disposer d'un test simple, rapide, et fiable, pouvant détecter aisément de nombreuses mutations. Le besoin en une technique de détection de mutations, de typage ou encore d'étude du polymorphisme se fait de plus en plus ressentir dans l'industrie soit pour permettre la découverte de nouvelles cibles biologiques d'intérêts, soit pour connaître précisément le profil génétique d'une tumeur ou d'un patient et envisager des thérapies adaptées. Ce besoin a conduit au développement de diverses techniques telles que la LCR, la SSCP et la RFLP mais elles restent difficiles à mettre en oeuvre à grande échelle. L'objectif à la base de la présente invention a été de mettre au point une technique permettant la détermination rapide et aisée de nucléotides à identifier et par conséquent le diagnostic de mutations et de polymorphismes de gènes, ou l'identification de micro-organismes pathogènes ou génétiquement modifiés. Plus 1 0 spécifiquement, le problème réside en une compilation de différentes techniques alliant, au sein d'un même tube, l'amplification de l'ADN d'un échantillon et la détection d'un nucléotide donné. Cette méthode s'avère facile d'utilisation, génère des signaux qui ne nécessite pas un traitement fastidieux et une interprétation compliquée. Dans le cadre de la présente invention, on a mis au point un système dans lequel on effectue l'ensemble des étapes conduisant aux résultats dans un même tube qui repose sur l'amplification de l'ADN cible, l'hybridation spécifique d'une sonde (servant dans le cas présent d'amorce oligonucléotidique) avec l'ADN cible, 2 0 l'extension de la sonde avec addition sélective d'un cLS- phosphothioatedésoxynucléotide à l'extrémité 3' de l'amorce complémentaire de l'ADN cible; l'amorce ainsi allongée étant résistante à la digestion par une exonucléase, en particulier par l'exonucléase III. Ainsi, la sonde reste présente dans le tube seulement lorsque les conditions suivantes sont réunies: 2 5 a) hybridation entre la sonde et l'ADN cible de l'échantillon, et b) présence d'une base complémentaire dans l'ADN cible permettant l'incorporation du ctS- phosphothioatedésoxynucléotide dans la sonde; ce qui empêche sa dégradation par la nucléase. Les étapes clés de ce procédé sont illustrées dans l'exemple présenté à la figure 1 ci- 3 0 après. La technique décrite dans US 4,656,127 consiste en l'incorporation d'un thio-dNTP qui protège de la dégradation de l'exonuclease. Toutefois, le procédé selon l'invention offre l'avantage de la rapidité, de la simplicité de mise en ceuvre et de la facilité d'interprétation des résultats. En effet, l'utilisation de deux tubes distincts A et B, l'un étant destiné à la détection de la base mutée (tube A) et l'autre étant destiné à la détection de la base normale correspondante à ladite base mutée (tube B), permet 1 0 une excellente fiabilité (présence d'un contrôle positif, quelque soit le génotype à tester) et une interprétation directe des résultats. On peut également utiliser un nombre plus élevé de tubes. Ainsi, dans un cas particulier et avantageux, on utilise quatre tubes, afin de pouvoir tester la présence de chaque base sur l'ADN cible. Ceci permet de d'affiner l'analyse lorsque la base testée est très polymorphe. Un deuxième intérêt du procédé selon l'invention est conféré par l'accrochage d'une des amorces au tube utilisé pour l'amplification et d'ancrer ainsi les produits d'amplification sur les parois des tubes. L'avantage de cet ancrage est de pouvoir effectuer ensuite toutes les réactions conduisant à la révélation colorée, y compris des 2 0 lavages dans le même tube ce qui évite notamment les risques de contamination et représente un gain de temps important, surtout sachant que l'utilisation d'un même support solide pour toutes les étapes du procédé facilite l'automatisation. Un troisième intérêt de la présente invention est de différencier des porteurs 2 5 homozygotes et hétérozygotes de la mutation ciblée grâce à l'utilisation de deux tubes distincts. En effet, la révélation aboutie à une coloration dans un seul des deux tubes si la mutation est présente à l'état homozygote, alors que la coloration est présente dans les deux tubes si la mutation est présente à l'état hétérozygote. Par ailleurs, le résultat peut être obtenu en 30 à 40 minutes après amplification PCR et ne nécessite pas d'environnement lourd particulier. De plus, certaines étapes peuvent être combinées (exonucléase et révélation en particulier) afin de diminuer le temps de mise en oeuvre sans pour autant modifier la spécificité. Grâce à un tel procédé, on peut renouveler l'expérience de détection contrairement à la technique décrite dans US 4,656,127. En effet, l'utilisation du support solide permet de conserver le brin d'acide nucléique à analyser et l'exonuclease dégradant la sonde non protégée, l'étape d'hybridation et de détection peut être renouveler dans le même tube si besoin est. L'industrialisation d'un tel procédé paraît ainsi beaucoup plus facile car la réalisation de toutes les étapes dans le même tube y compris la PCR, les différentes incubations et les différents lavages permettent d'envisager une automatisation rapide du procédé sur n'importe quelle plate-forme automate commercialisée de biologie moléculaire. Description La présente invention se rapporte à un procédé permettant l'identification d'une mutation ou d'un polymorphisme connu dans une séquence nucléique comprenant l'amplification de la région d'intérêt par PCR, cette étape d'amplification étant réalisée avantageusement en utilisant une amorce fixée à la paroi de deux tubes A et B (PCR asymétrique); l'hybridation d'une sonde spécifique dessinée de manière à ce que son extrémité soit positionnée juste en amont de la base à révéler; l'allongement de cette sonde au moyen d'une polymérase avec un nucléotide modifié, 2 5 avantageusement un phosphothionucléotide, notamment un aS- phosphothioatedésoxynucléotide, complémentaire de la mutation à révéler (tube A) et complémentaire de la base normale correspondante à la mutation à révéler (tube B); l'action d'une exonucléase de sorte que seules les sondes élongées ne sont pas dégradées. La détection de la présence ou de l'absence d'une mutation est effectuée 3 0 par révélation directe ou indirecte de la sonde. Avantageusement, toutes les étapes de la méthode sont réalisées dans le même tube (de l'amplification PCR à la révélation) de sorte que la présence d'une mutation est révélée directement par l'apparition d'une coloration dans le tube ayant servi à la PCR (voir Figure 1). On peut également détecter la présence de la mutation par d'autres méthodes de détection, en particulier la fluorescence, ou en utilisant des sondes radioactives (voir infra). Ainsi, dans un premier aspect, l'invention concerne un procédé de détection d'une mutation se trouvant en position n dans un acide nucléique cible, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) amplification sur au moins deux supports solides distincts A et B de la région d'intérêt comprenant ladite mutation à l'aide d'au moins une amorce liée en 5' aux supports, b) déshybridation des brins d'ADN et élimination des brins en suspension par lavage, c) hybridation d'une sonde avec les brins d'ADN liés aux supports solides A et B, l'extrémité 3' de ladite sonde s'hybridant au maximum jusqu'au nucléotide n-1 desdits brins, d) réaction d'élongation de la sonde hybridée à l'étape c) par incorporation dans la direction 5'-3' de nucléotides complémentaires desdits brins d'ADN au moyen d'un mélange réactionnel comprenant une ADN polymérase et un dérivé de nucléotide résistant à la dégradation par une exonucléase (dNTP*), le mélange réactionnel utilisé pour le support A comprenant un dNTP* complémentaire de ladite mutation et le mélange réactionnel utilisé pour le support B comprenant un dNTP* complémentaire de la base normale correspondante à ladite mutation, e) dégradation par ladite exonucléase de sorte que seules les sondes élongées à l'étape d) ne sont pas dégradées, lavage, f) révélation directe ou indirecte de la sonde non dégradée, ladite révélation étant positive soit dans le cas o le brin d'ADN sur le support A contient la mutation, soit dans le cas o le brin d'ADN sur le support B contient la base normale correspondante à ladite mutation. La liaison de l'amorce en 5' aux supports (étape a) est avantageusement une liaison suffisamment forte afin que l'ADN reste fixé au support lors des différentes étapes du procédé. Ce peut être une liaison covalente, mais aussi une liaison non covalente, telle une liaison avidinestreptavidine / biotine, ou une liaison du type anticorps / antigène. Dans l'étape c), la sonde s'hybridant au maximum jusqu'au nucléotide n-1 desdits brins signifie que la sonde peut également s'hybrider en n-2, n-3, n-4... Il faudra alors donc fournir, lors de l'étape d'élongation (d), les nucléotides complémentaires aux bases manquantes afin de permettre l'élongation de la sonde jusqu'à la base mutée pour laquelle on fournit le dNTP*. Une " sonde " se définie comme étant un fragment nucléotidique comprenant par exemple de 10 à 100 nucléotides, notamment de 15 à 35 nucléotides, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique cible. Les sondes selon l'invention peuvent porter un agent marqueur permettant ou améliorant leur détection. Bien entendu, la sonde sert également d'amorce dans le cadre de l'invention puisque l'objectif est d'incorporer un nucléotide modifié en position n correspondant à la position de la mutation que l'on recherche. L'extrémité 3' de la sonde se termine donc au maximum et de préférence à n-1. La sonde peut être marquée au moyen d'un marqueur choisi par exemple parmi les 2 5 isotopes radioactifs, des enzymes, en particulier des enzymes susceptibles d'agir sur un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent (notamment une peroxydase ou une phosphatase alcaline) ou encore des enzymes produisant ou utilisant des protons (oxydase ou hydrolase); des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de base nucléotitiques, et des ligands tels que la biotine. Le marquage des sondes selon l'invention est réalisé par des éléments sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, l'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémiluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents. Une autre possibilité est de marquer la sonde avec un peptide comprenant un épitope reconnu par un anticorps donné. La présence de cet anticorps peut être révélé au moyen d'un second anticorps marqué. Dans ce procédé, la sonde est avantageusement marquée avec une des molécules précitées, lesdites molécules permettant l'apparition directe ou indirecte d'une coloration lorsque la sonde non dégradée est présente sur le support, ladite coloration pouvant être détectée de préférence par lecture optique ou simple observation. On entend par " lecture optique ", toute mesure d'absorption, de transmission ou d'émission de lumière qui peut éventuellement se trouver à une longueur d'onde spécifique soit directement de l'ADN (260 nm par exemple), soit de toute molécule marqueur liée à la sonde. Cette définition comprend également toute mesure de la fluorescence émise par des marqueurs (fluorescéine et/ou phycoérythrine). Avantageusement, on détecte donc à l'étape f) la présence ou l'absence de la mutation soit par lecture optique, soit par simple observation d'une coloration sur le support solide. Le support solide servant à l'ancrage de l'amorce peut être un matériau plastique (polystyrène, polycarbonate par exemple), ou bien du nylon ou du verre, de sorte que ce support est un tube, une membrane ou une bille sur lequel la région d'intérêt est amplifiée pour son analyse, c'est-à-dire la détection d'un changement de base. 2 5 Avantageusement, le support est un tube (individuel ou en barette ou en plaque) servant à l'amplification, et donc compatible avec les différents thermocycleurs (Perkin Elmer 9700 par exemple). Les tubes peuvent également être n'importe quels tubes ou plaque type ELISA sur lesquels une fixation covalente d'acides nucléiques peut être effectuée. Différentes méthodes d'immobilisation d'un oligonucléotide sur un support sont possibles et sont notamment décrites dans US 6,030,782. Ces méthodes peuvent être une immobilisation directe par liaison chimique par exemple ou une immobilisation indirecte (par l'intermédiaire d'un linker ou d'un conjugué comme la streptavidine par exemple). Dans un mode préféré de réalisation, les supports A et B sont des tubes sur lesquels une fixation covalente d'acides nucléiques peut être effectuée. De préférence, ces tubes sont des barrettes NucleolinkTM (NUNC, référence du catalogue n 248259) qui possèdent un revêtement particulier permettant la fixation covalente directe d'oligonucleotides par leur extrémité 5' phosphate (Rasmussen, S. R. et al., Anal. Biochem, 198:138-142 (1991)). Le format de ce procédé est ainsi le format standard 96 puits (12 barrettes de 8 puits), mais les barrettes étant sécables, le nombre voulu de tubes peut être utilisé. D'autres formats peuvent être utilisés en particulier si d'autres méthodes de fixation sont utilisées. Par exemple, il est possible d'attacher les acides nucléiques par pont disulfure en suivant la méthode préconisée dans US 6,300,782. On utilise de préférence à l'étape d) un cxSphosphothioatedésoxynucléotide, de préférence acS-dATP, acS-dTTP, aS-dCTP, cxS-dGTP, aS-dUTP ou oS-dITP et à l'étape e) une exonucléase, notamment l'exonucléase III. On entend par " exonucléase >" tout enzyme naturel ou modifié ayant une activité exonucléasique. On peut également envisager l'utilisation des ADN polymérase possédant une activité de pyrophophorolyse (en présence d'une forte concentration en pyrophosphate, cet enzyme ajoute un pyrophosphate sur la dernière liaison phosphodiester et relâche donc le nucléotide en 3'. Ce produit est disponible chez Promega sous la marque READITT M, et des variants utilisant un système de révélation à la luciférase est disponible sous la marque READaseTM. D'une manière générale, un puits reçoit un ADN, puis une sonde et on ne permet l'incorporation que d'un seul nucléotide (dNTP*). Donc, au moins deux tubes sont nécessaires pour chaque ADN à tester, l'un recevant la base normale et l'autre recevant la base mutée. Ainsi, le procédé décrit ci-dessus se caractérise en ce qu'on utilise deux tubes, l'un étant destiné à la détection de la base mutée (tube A) et l'autre étant destiné à la détection de la base normale correspondante à ladite base mutée (tube B). Bien entendu, on peut utiliser plusieurs séries de tubes A et B, notamment dans une plaque à 96 puits et un tube C comme témoin négatif pour chaque série de tubes A et B. Dans le mode préféré de réalisation, ledit dNTP* est un cLS- phosphothioatedésoxynucléotide tel que ccS-dATP, ctS-dTTP, xS-dCTP, c*SdGTP, ctS-dUTP ou ccS-dITP qui est incorporé à l'extrémité 3'de la sonde. Cela peut s'effectuer par exemple par LCR, ou de préférence par PCR asymétrique. Les caS- phosphothioatedésoxynucléotides peuvent être aisément incorporés dans des polynucléotides par toutes les polymérases et transcriptases inverses testées, ce qui permet d'utiliser des ADN polymérases d'un prix de revient plus avantageux que dans d'autres détections de mutations. On entend par " ADN polymérase ", tout enzyme naturel ou modifié ayant une activité polymérasique. On peut citer par exemple les 2 0 ADN pol exo-, notamment la T7 ou le fragment de klenow. Avantageusement, les étapes e) et f) sont réalisées simultanément dans un même mélange réactionnel comprenant ladite exonucléase et les moyens nécessaires pour révéler la coloration. Ces moyens dépendent du marqueur ou du ligand qui se trouve 2 5 sur la sonde. Un autre aspect de l'invention concerne un dispositif ou kit permettant de mettre en oeuvre le procédé défini ci-dessus. 3 0 Un tel kit se caractérise en ce qu'il comprend: - des tubes A et B dans lesquels au moins une amorce permettant d'amplifier la région comprenant la mutation spécifique est liée en 5' par une liaison covalente, - des mélanges réactionnels A et B comportant chacun un aS- phosphothioatedésoxynucléotide différent sélectionné parmi aS-dATP, cCS dTTP, acS-dCTP, cxS-dGTP, caS-dUTP et ccS-dITP, le mélange réactionnel utilisé pour le support A comprenant un cxSphosphothioatedésoxynucléotide complémentaire de ladite mutation et le mélange réactionnel utilisé pour le support B comprenant un caSphosphothioatedésoxynucléotide complémentaire de la base normale correspondante à ladite mutation. Ce kit peut comprendre en outre au moins un élément sélectionné parmi une exonucléase, en particulier l'exonucléase III, un réactif permettant de révéler la coloration, une ADN polymérase et différents tampons ou solutions nécessaires à la mise en oeuvre du procédé. Avantageusement, le kit selon l'invention comprend une série de tubes A et B, chaque série permettant de détecter une mutation donnée et des tubes C comme témoins négatifs. Lesdits tubes peuvent être des tubes NUNC. Dans un autre aspect, l'invention porte sur l'utilisation du procédé et du kit décrits ci- dessus pour la détection de mutations de gènes impliquées dans des maladies, notamment dans des maladies génétiques héréditaires, en particulier l'hémochromatose, l'anémie à hématies falciformes, les [3 et a thalassemies, la fibrose kystique, l'hémophilie, les maladies neurodégénératives et des mutations dans les gènes impliqués dans le cancer. Une liste exhaustive des mutations dans ces gènes est donné sur le site internet suivant: ftp://ncbi.nlm.nih. gov/repository/OMIM/morbidmap Le procédé et le kit selon l'invention sont également utiles pour l'étude du polymorphisme des gènes ou de toute région génétique et pour la détection et/ou à l'identification d'organismes génétiquement modifiés (OGM). Légendes Figure lA: amplification PCR en phase solide Amplification de la région génétique d'intérêt Figure lB: dénaturation Le double brin d'ADN est dénaturé, puis les lavages permettent de ne conserver que le brin ancré Figure 1C: incorporation d'un nucléotide modifié Une réaction enzymatique catalyse l'élongation d'une sonde résultant en l'insertion d'un nucléotide modifié, par exemple un cxSphosphothioatedésoxynucléotide à l'extrémité 3' de la sonde. Deux réactions dans les deux tubes A et B sont nécessaires pour chaque échantillon avec l'incorporation d'une seule base pour détecter les génotypes normaux (tube B) et/ou mutants (tube A). Figure 1D: détection La sonde élonguée est protégée de l'action de dégradation de l'exonuclease et une coloration bleue se développe pendant l'incubation avec le substrat. La sonde non élonguée est éliminée, aucune coloration n'est obtenue. Par exemple, on peut effectuer la détection avec une sonde marquée au FITC et un anticorps marqué anti- FITC. Figure 1E: interprétation visuelle très facile des résultats 2 5 Les résultats pour 4 séries de tubes A et B (pour 4 individus ou 4 mutations différents chez un même individu) sont présentés. Les résultats positifs sont bleus (gris foncé dans le texte) et les négatifs sont incolores. Pour chaque individu, qu'il soit muté ou normal, on obtient une coloration. Dans le cas d'hétérozygote, une coloration est obtenue dans les deux puits. Figures 2A et 2B: détection des mutations C282Y et H63D responsables de l'hémochromatose. Figure 3: amorces utilisées pour la détection des mutations responsables de la mucoviscidose. F = " Forward " R = " Reverse >" (1) correspond à l'exon du gène CFTR dans lequel la mutation est trouvée (2) correspond à l'oligonucléotide fixé = amorce B (3) correspond au nucléotide modifié qui sera incorporé lors de l'extension: A=aS- dATP, T=caS-dTTP, C=cS-dCTP, G=cxS-dGTP Figures 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F et 4G: détection de 7 mutations responsables de la mucoviscidose. Figures 5A et 5B: détection des mutations C282Y et H63D responsables de l'hémochromatose (procédé préféré selon l'invention dans lequel les étapes de dégradation et de révélation sont couplées). Exemple 1: protocole permettant de mettre en oeuvre le procédé selon l'invention Le procédé selon la présente invention permet de déterminer le génotype d'un échantillon, celui-ci étant préalablement amplifié en utilisant une amorce fixée à la paroi du tube. Les tubes utilisés sont les barrettes Nucleolink (NUNC), la fixation de 2 5 l'amorce est effectuée selon les indications du fournisseur. 1. Amplification par PCR de la région d'intérêt Dans un tube contenant l'amorce B préalablement fixée, introduire les différents composants conformément aux différents fournisseurs et permettant l'amplifictaion de la région à analyser par PCR asymétrique: Tampons PCR, dNTP, amorce A I iM final, amorce B 0,12 gM final, Taq polymérase et ADN à tester. Remarque: Les produits d'amplification obtenus en phase liquide peuvent être jetés ou gardés pour être analysés sur un gel d'agarose à 1,5% coloré au bromure d'éthidium. 2. Déshybridation - laver le puits à l'eau distillée; - déposer 25 pl de soudre (NaOH) 0,4M) dans chaque puits et laisser la plaque 5 minutes à température ambiante; - enlever la soude et laver à l'eau distillée. 3. Hybridation et élongation - Distribuer 25 pIl de solution d'hybridation N (normale) ou M (mutante) dans leur tube respectif; ces deux solutions étant composées de Sonde 0,05 iM, Bst DNA polymérase (Biolabs) 0,4 U, tampon Bst 1 X, Solution (SSC 2,5X - Blocking Reagent 0, 25% (Amersham) et ne différant que par la présence du dNTP modifié (dNTP*) 10 PM; - Incuber 15 minutes à 50 C. 4. Lavages Vider les puits et laver avec une solution NaCl 2,5%. 5. Digestion enzymatique - Déposer par puits 25 4l de solution contenant 0,01 U d'Exonucléase III dans son tampon (concentrations finales: Tris 50 mM, DTT 1 mM, MgCl2 10 mM); - Incuber 10 minutes à 37 C. 6. Lavages Vider les puits et laver avec une solution lavage PBS IX, Tween 0,1%. 7. Révélation - Ajouter 25 pi1 d'anticorps anti-FITC-POD (Boehringer) 1/2000ème dans PBS- BSA 3% dans chaque puits et laisser à température ambiante 10 minutes; Vider le puits et laver avec une solution PBS IX, Tween 0,1%; - Déposer 25 p.l de substrat TMB (Tetramethylbenzidine - Sigma) par puits; - Incuber 15 minutes à température ambiante; - Il est possible de stopper la réaction avec 25 pl d'H2SO4. 1 0 8. Résultats La lecture peut alors d'effectuer à l'oeil nu; un coloration bleue apparaissant dans les puits positifs. Il est également possible de lire la densité optique à 655 nm à l'aide d'un lecteur de microplaque ou à 450 nm si la réaction a été stoppée. 9. Interprétation des résultats La détermination du génotype d'un échantillon donné peut s'effectuer: par lecture à l'oeil nu: une coloration bleue apparaît dans les puits positifs et les puits négatifs restent incolores. Les quatre profits de coloration possibles sont décrits ci-dessous: *Q Cas 1 Normal Q. Cas 2 Mutant * * Cas 3 Hétérozygote Q Q Cas 4 Contrôle négatif - par lecture de la densité optique à 655 mn (ou 450 nm si la réaction est stoppée). On détermine le rapport R = [DO(N) / DO (MI 2 5 Si R > 2 alors le génotype est Normal Si 0,5 dans le cas de la solution mutante H63D. Détection de la mutation C282 Y: Amorces utilisées: - Amorce A 5'CATGAAGTGGCTGAAGGATAA3' (SEQ ID N l) - Amorce B 5'GCACTCCTCTCAACCCCCA3' (SEQ ID N 2) - Sonde marquée FITC 5'FITC-GGAAGAGCAGAGATATACGT3' (SEQ ID N 3) Cas normal: incorporation d'un ccS-dGTP, région du SNP C282Y et sa région complémentaire, incluse dans la région amplifiée par les amorces SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2, la sonde SEQ ID N 3 étant soulignée, la base polymorphe étant en gras. GGGAAGAGCAGAGATATACGTGATGAGAGT (SEQ ID N 4) CCCTTCTCGTCTCTATATGCACTACTCTCA (SEQ ID N 5) Cas mutant: incorporation d'un cS-dATP, région du SNP C282Y et sa région complémentaire, incluse dans la région amplifiée par les amorces SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2, la sonde SEQ ID N 3 étant soulignée, la base polymorphe étant en gras. GGGAAGAGCAGAGATATACGTAATGAGAGT (SEQ ID N 6) CCCTTCTCGTCTCTATATGCATTACTCTCA (SEQ ID N 7) Détection de la mutation H63D: Amorces utilisées: - Amorce A 5'ACATCTGGCTTGAAATTCTACT3' (SEQID N 8) - Amorce B 5'TCTCCAGGTTCACACTCTCT3' (SEQID N 9) - Sonde marquée FITC 5'FITC- CCACACGGCGACTCTCAT3' (SEQID N 10) Cas normal: incorporation d'un cS-dGTP, région du SNP H63D et sa région complémentaire, incluse dans la région amplifiée par les amorces SEQ ID N 8 et SEQ ID N 9, la sonde SEQ ID N 10 étant soulignée, la base polymorphe étant en gras. TATGATCATGAGAGTCGCCGTGTGGAGCCC (SEQ ID N 11) ATACTAGTACTCTCAGCGGCACACCTCGGG (SEQ ID N 12) Cas mutant: incorporation d'un caS-dCTP, région du SNP H63D et sa région complémentaire, incluse dans la région amplifiée par les amorces SEQ ID N 8 et SEQ ID N 9, la sonde SEQ ID N 10 étant soulignée, la base polymorphe étant en gras. TATGATGATGAGAGTCGCCGTGTGGAGCCC (SEQ ID N0 13) ATACTACTACTCTCAGCGGCACACCTCGGG (SEQ ID N 14) Les résultats sont présentés à la Figure 2. Exemple 3: Diagnostic de la mucoviscidose, détection de sept mutations responsables de la mucoviscidose. Mutation Localisation Fréquences Oligo F Oligo R Sonde (%/)* DF508 exon 10 66,11 SEQ ID 15 SEQID16 SEQID17 1717-1G-A intron 10 2,6 SEQ ID 18 SEQID19 SEQ ID 20 G542X exon 11 2,11 SEQ ID 21 SEQ ID 22 SEQ ID 23 G551D exon 11 1,69 SEQ ID 24 SEQ ID 25 SEQID 26 2789+5G-A intron 14b 1,15 SEQ ID 27 SEQ ID 28 SEQ ID 29 W1282X exon 20 0,88 SEQ ID 30 SEQ ID 31 SEQ ID 32 N1303K exon 21 0,76 SEQ ID 33 SEQ ID 34 SEQ ID 35 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ I I I Fréquences (%)*:Fréquences calculées d'après Cyctic Fibrosis Mutation Data Base février 2000 (http://www.genet.cikkids.on.ca/cftr/newfreq/All.html). Amorces et sondes utilisées (voir Figure 3) Remarque: Le protocole utilisé et identique à la description générale, l'utilisation de barrettes Nucleolink (NUNC) permet de tester sur un format 96 puits 7 mutations chez 6 personnes. Les résultats sont indiqués à la Figure 4. Exemple 4: Perfectionnement du protocole, couplage des étapes de digestion par l'exonucléase et de révélation. Les étapes 1 à 4 sont identiques à celles de l'exemple 1, seules les étapes suivantes sont modifiées de sorte que la digestion par l'Exonucléase III et la révélation par l'anticorps sont réalisées en une seule étape. - Déposer par puits 25 Il de solution contenant 0,01 U d'Exonucléase III (New England Biolabs) dans son tampon, 2,5 pl d'anticorps anti-FITC-POD (Boehringer Mannheim) 1/200ème dans PBS-BSA 3% et 0,25 gl Tween 20; Incuber 10 minutes à 37 C; - Effectuer 3 lavages avec la solution de lavage PBS IX, Tween 0,1%; - Déposer 25 gil de TMB et incuber 15 minutes à 37 C; Les résultats présentés à la Figure 5 sont interprétés comme indiqué dans l'exemple I. Exemple 5: Perfectionnement du protocole, en utilisant un système streptavidine / biotine (sonde biotynilée et streptavidine conjuguée) Les étapes 1 à 2 sont identiques à celles de l'exemple I, seules les étapes suivantes sont modifiées de sorte que la révélation finale s'effectue grâce à la streptavidine, la sonde ayant été au préalable couplée à une biotine. 2 5 3. Hybridation et élongation - Distribuer 25 pl de solution d'hybridation N (normale) ou M (mutante) dans leur tube respectif; ces deux solutions étant composées de: Sonde biotinylée 0,05 p.M, Bst polymerase (New England Biolabs) 0,4 U, Tampon Bst 10 X: 2,5 pl, Solution (SSC 2,5 Blocking Reagent 0,25 % (Amersham)) et ne différant que 3 0 par la présence du dNTP modifié 10 iM. - Incuber 15 minutes à 50 C. 4. Lavages Vider les puits et laver avec une solution contenant 2,5% NaCl. 5. Digestion enzymatique - Déposer par puits 25 pil de solution contenant 0,01 d'U d'Exonucléase III (New England Biolabs) dans son tampon; - Incuber 10 minutes à 37 C. 6. Lavages Vider les puits et effectuer 3 lavages avec une solution de lavage PBS iX, Tween 0,1%. 7. Révélation - Ajouter 25 ffl de Streptavidine 1 mg/ml diluée au 1/2000ème dans du PBS); - Laisser incuber 10 minutes à température ambiante. 8. Effectuer 3 lavages avec la solution de lavage PBS IX, Tween 0,1%. 9. Déposer 25 pl de TMB et incuber 15 minutes à 37 C. 10. Résultats et interprétation des résultats comme indiqué dans l'Exemple 1. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection d'une mutation se trouvant en position n dans un acide nucléique cible, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) amplification sur au moins deux supports solides distincts A et B de la région d'intérêt comprenant ladite mutation à l'aide d'au moins une amorce liée en 5' aux supports, b) déshybridation des brins d'ADN et élimination des brins en suspension par lavage, c) hybridation d'une sonde avec les brins d'ADN liés aux supports solides A et B, l'extrémité 3' de ladite sonde s'hybridant au maximum jusqu'au nucléotide n-1 desdits brins, d) réaction d'élongation de la sonde hybridée à l'étape c) par incorporation dans la direction 5-3' de nucléotides complémentaires desdits brins d'ADN au moyen d'un mélange réactionnel comprenant une ADN polymérase et un dérivé de nucléotide résistant à la dégradation par une exonucléase (dNTP*), le mélange réactionnel utilisé pour le support A comprenant un dNTP* complémentaire de 2 0 ladite mutation et le mélange réactionnel utilisé pour le support B comprenant un dNTP* complémentaire de la base normale correspondante à ladite mutation, e) dégradation par ladite exonucléase de sorte que seules les sondes élongées à l'étape d) ne sont pas dégradées, lavage, f) révélation directe ou indirecte de la sonde non dégradée, ladite révélation étant 2 5 positive soit dans le cas o le brin d'ADN sur le support A contient la mutation, soit dans le cas o le brin d'ADN sur le support B contient la base normale correspondante à ladite mutation. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la sonde est marquée avec des molécules sélectionnées parmi des enzymes, en particulier des enzymes susceptibles d'agir sur un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent (notamment une peroxydase ou une phosphatase alcaline), des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de base nucléotitiques, et des ligands tels que la biotine, lesdites molécules permettant l'apparition directe ou indirecte d'une coloration lorsque la sonde non dégradée est présente sur le support, ladite coloration pouvant être détectée de préférence par mesure optique ou simple observation. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que l'on détecte à l'étape f) la présence ou l'absence de la mutation soit par lecture optique, soit par simple observation d'une coloration sur le support solide. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé que ce que les supports A et B sont des tubes sur lesquels une fixation covalente d'acides nucléiques peut être effectuée, de préférence des tubes en un matériau plastique tel que le polystyrène, ou le polycarbonate, notamment des tubes de type NucleolinkTM. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'on utilise à l'étape d) un czS-phosphothioatedésoxynucléotide, de préférence aS-dATP, caS- 2 0 dTTP, aS-dCTP, aS-dGTP, xS-dUTP ou axS-dITP. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'on utilise à l'étape e) l'exonucléase III. 2 5 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'on utilise deux tubes, l'un étant destiné à la détection de la base mutée (tube A) et l'autre étant destiné à la détection de la base normale correspondante à ladite base mutée (tube B). 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'on utilise plusieurs séries de tubes A et B, notamment dans une plaque à 96 puits. 9. Procédé selon l'une des rcvendications précédentes caractérisé en ce qu'on utilise en outre un tube C comme témoin négatif. 10. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les étapes e) et f) sont réalisées simultanément dans un même mélange réactionnel comprenant ladite exonucléase et les moyens nécessaire pour révéler la coloration. 11. Dispositif ou Kit permettant de mettre en oeuvre le procédé selon l'une des 1 0 revendications précédentes. 12. Kit selon la revendication 1 1 caractérisé en ce qu'il comprend - des tubes A et B dans lesquels au moins une amorce permettant d'amplifier la région comprenant la mutation spécifique est liée en 5' par une liaison covalente, - des mélanges réactionnels A et B comportant chacun un cS- phosphothioatedésoxynucléotide différent sélectionné parmi cS-dATP, aS dTTP, aoS-dCTP, a(S-dGTP, (xS-dUTP et aS-dITP, le mélange réactionnel utilisé pour le support A comprenant un ccSphosphothioatedésoxynucléotide complémentaire de ladite mutation et le mélange réactionnel utilisé pour le support B comprenant un (xSphosphothioatedésoxynucléotide complémentaire de la base normale correspondante à ladite mutation. 13. Kit selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un élément sélectionné parmi une exonucléase, en particulier l'exonucléase III, un réactif permettant de révéler la coloration, une ADN polymérase et différents tampons ou solutions nécessaires à la mise en oeuvre du procédé. 14. Kit selon l'une des revendications 1 1 à 13 caractérisé en ce qu'il comprend une série de tubes A et B, chaque série permettant de détecter une mutation donnée. 15. Kit selon l'une des revendications 1 1 à 14 caractérisé en ce qu'il comprend en outre des tubes C comme témoins négatifs. 16. Kit selon l'une des revendications 11 à 15 caractérisé en ce que lesdits tubes sont des tubes en un matériau plastique tel que le polystyrène, ou le polycarbonate, notamment des tubes de type NucleolinkTM. 17. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 10 et du kit selon l'une des revendications 11 à 16 pour la détection de mutations de gènes impliquées dans des maladies, notamment dans des maladies génétiques héréditaires, en particulier l'hémochromatose, l'anémie à hématies falciformes, les 13 et ax thalassemies, la fibrose kystique, l'hémophilie, les maladies neurodégénératives et des mutations dans les gènes impliqués dans le cancer. 18. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 10 et du kit selon l'une des revendications 11 à 16 pour l'étude du polymorphisme des gènes ou de toute région génétique. 19. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 10 et du kit selon l'une des revendications 11 à 16 pour la détection et/ou à l'identification d'organismes génétiquement modifiés (OGM).