Brevet FR2814472A1 — publié le 20020329

La présente invention est relative à un vecteur d'expression procaryote inductible utilisable dans des organismes procaryotes et à ses applications, en particulier pour la production de protéines recombinantes. Les vecteurs d'expression procaryotes sont des vecteurs de choix pour l'expression en quantités importantes de protéines recombinantes d'intérêt notamment pharmaceutique. Dans ce contexte, pour obtenir un vecteur d'expression performant, le choix d'un promoteur réunissant les caractéristiques suivantes est essentiel : - la transcription à partir du promoteur ne doit pas perturber la réplication du vecteur et le système d'expression doit être compatible avec la stabilité génétique du vecteur. - il doit permettre la synthèse rapide d'une quantité abondante d'ARNm et par conséquent l'expression en quantités importantes de la protéine recombinante correspondante, de manière à ce que dans des conditions optimales, cette protéine recombinante puisse représenter entre 5 % et 10 % des protéines cellulaires totales, et - il doit être régulé de façon efficace : son activité au cours de la croissance des bactéries doit pouvoir être induite spécifiquement (activité basale réduite) et à des niveaux importants (facteur d'induction élevé). En particulier, le stade idéal de croissance des bactéries pour obtenir une quantité importante de protéines est la phase de croissance exponentielle tardive et le début de la phase stationnaire où la biomasse est maximale. En outre, dans le cas de protéines instables, rapidement dégradées, une induction rapide et efficace de l'activité du promoteur est nécessaire pour obtenir des protéines de qualité, en quantités importantes. De plus, une activité basale réduite est indispensable à la croissance élevée des bactéries hôtes et à la stabilité génétique du vecteur, notamment dans le cas de protéines possédant une toxicité pour les bactéries hôtes, ce qui est assez courant (environ 5 % des protéines exprimées). L'activité d'un promoteur peut être régulée soit positivement soit négativement. Une régulation positive signifie qu'un activateur ou une ARN polymérase spécifique doit être présent pour permettre l'initiation de la transcription ; en général l'activité de la protéine activatrice est contrôlée par un changement métabolique dans le milieu ou bien par l'addition d'un inducteur spécifique (physique ou chimique). Une régulation négative signifie qu'un répresseur, généralement une protéine, empêche l'initiation de la transcription ; cette régulation négative peut être contrôlée soit par induction soit par répression. G. Sawers et al. ont fait le point sur les différents vecteurs d'expression mettant en oeuvre des promoteurs régulés (Appl. Microbiol. Biotechnol., 1996,46, 1-9). Il ressort de leur étude que les promoteurs forts et bien régulés les plus couramment utilisés dans des vecteurs d'expression procaryotes sont des promoteurs tels que : - le promoteur de l'opéron lactose (Plac), le promoteur de l'opéron tryptophane (Ptrp) ou des promoteurs hybrides combinant différentes portions de ces promoteurs (promoteurs tac, trc et tic), - le promoteur PL du phage # et - les promoteurs du phage T7 (PT7), notamment le promoteur 10. Les promoteurs Plac, P (fp et PL sont régulés négativement alors que le promoteur du phage T7 est régulé positivement et nécessite l'introduction et le contrôle de l'expression de la polymérase du phage T7 dans la bactérie hôte. Toutefois, ces différents promoteurs présentent des limites techniques et économiques dans le cadre d'une production industrielle de protéines recombinantes : . ces promoteurs ne permettent pas l'expression en quantités impor- tantes de protéines toxiques pour la bactérie hôte, du fait de l'expression résiduelle des protéines recombinantes, en l'absence d'inducteur (Plac) ou en présence de co-répresseur (Ptrp) . ces systèmes d'expression régulés négativement ou utilisant le promoteur Plac pour contrôler l'expression d'une polymérase spécifique (promoteur du phage T7), nécessitent l'utilisation de quantités importantes d'inducteur (isopropyl- thiogalactoside (IPTG) pour Plac ou acide 3-indole-acrylique (IAA) qui mime la déplétion en co-répresseur (tryptophane) pour Ptrp) qui sont des produits chers et qui doivent être ajoutés dans les fermenteurs rapidement et de façon homogène pour obtenir une induction efficace. La présence de ces inducteurs en quantité importante dans les milieux de culture représente également un inconvénient pour les étapes ultérieures de purification dans la mesure où ils ne sont pas métabolisés et peuvent être co-purifiés avec la protéine recombinante. . l'augmentation du nombre de molécules de répresseur dans la cellule hôte, indispensable à une répression plus efficace de ces promoteurs, peut avoir des conséquences néfastes sur la croissance des bactéries hôtes et la stabilité génétique du vecteur. En raison des inconvénients liés à l'utilisation des promoteurs précédemment décrits, des promoteurs mieux adaptés aux contraintes industrielles ont été utilisés pour produire des protéines recombinantes en quantités importantes, par des procédés plus simples et moins coûteux (Sawers et al., précité). Dans ces systèmes, le promoteur est activé par des modifications, qui interviennent naturellement au cours du processus de fermentation (appauvrissement en une source de carbone, de phosphore ou d'azote), ou qui peuvent être effectuées simplement (modification du flux d'oxygène). En particulier, les promoteurs suivants ont été utilisés : des promoteurs régulés par la diminution de la concentration en phosphate inorganique (promoteur du gène de la phosphatase alcaline d'E. coli (PphA) et le promoteur Pua de l'opéron ugpBAECQ), des promoteurs régulés par la diminution de la concentration en sucres (promoteur Pub de l'opéron mglBAEC codant pour un transporteur de galactose et promoteur PB de l'opéron arabinose de Salmonella typhimurium), des promoteurs régulés par la diminution de la quantité d'oxygène dissous dans le milieu (promoteur du gène de l'hémoglobine de Vitreoscilla (PVHb), promoteur du gène de la Pyruvate formate-lyase (Ppf) et promoteur du gène nirB, un promoteur induit par une carence en azote (promoteur P, de l'opéron de la glutamine-synthétase d'E. coli, et - des promoteurs dont l'activité est régulée par l'osmolarité. Ces promoteurs forts régulés par des changements dans l'environnement de culture, notamment dans la composition du milieu de culture, sont d'une utilisation plus simple et moins coûteuse que les promoteurs Piats Ptp et PT7 couramment utilisés dans la plupart des vecteurs d'expression procaryotes. Toutefois, certains de ces vecteurs présentent un facteur d'induction faible, possèdent une activité basale élevée (Ppf) ou nécessitent un contrôle très précis de la composition du milieu (P). Par conséquent, il existe un besoin de disposer de nouveaux promoteurs procaryotes forts et bien régulés par des changements dans l'environnement de culture, notamment dans la composition du milieu de culture, et/ou par des inducteurs métabolisés peu coûteux, qui permettent de développer de nouveaux vecteurs d'expression procaryotes. Les Inventeurs ont trouvé que, de manière inattendue, la régulation d'autres voies métaboliques que celles proposées dans l'art antérieur permet de construire des vecteurs d'expression présentant les avantages précités. Le catabolisme des composés phénylpropanoïdes, par des microorganismes, joue un rôle fondamental dans la dégradation des protéines et des constituants végétaux. Ainsi, la dégradation de certains d'entre eux, tels que le 3-phénylpropionate (3P) a été rapportée chez différentes bactéries, notamment Acinetobacter sp. (Dagley et al., Biochem. J., 1965, 97, 643-650), Pseudomonas sp. (Andreoni et al., Appl. Environ. Microbiol., 1986, 52, 930-934) et E. coli (Burlingame et al., J. Bacteriol., 1983, 155, 113-121). Le 3P et ses dérivés proviennent de l'action de la flore intestinale sur les constituants végétaux, la phénylalanine, la tyrosine et leurs métabolites (Burlingame et al., précité). D'une manière générale, le catabolisme aérobie des composés aromatiques a lieu aussi bien dans le sol, les sédiments, l'eau et le tube digestif des animaux à sang chaud (Savage, Annu. Rev. Microbiol., 1977,31, 107-133). Le catabolisme du 3P a été étudié chez E. coli (Burlingame et al., précité) et des mutants déficients pour cette voie métabolique ont été isolés (Burlingame et al., J. Bacteriol., 1986,168, 55-64). Les deux premières étapes de dégradation du 3P qui aboutissent à la formation de 3- (2, 3-dihydroxyphényl) propionate (DHPP) par oxydation du 3P par la 3-3-phénylpropionate dioxygénase, puis par la 3-phénylpropionate-2', 3'-dihydrodioldéhydrogénase, constituent la voie dioxygénolytique du 3P. Le DHPP subit ensuite une série de dégradations, appelée voie de dégradation tardive du 3P, qui aboutit à la formation d'intermédiaires du cycle de Krebs (pyruvate, succinate, fumarate, Acétyl coenzyme A). Le DHPP peut également être produit par l'oxydation du 3- (3-hydroxyphényl) propionate (3HPP) par la 3- (3-hydroxyphényl) propionate 2-hydroxylase. Ainsi les voies de dégradation du 3P et du 3HPP se rejoignent au niveau de la formation du DHPP et la dégradation tardive de ces deux composés est commune. La voie de dégradation du 3HPP a été étudiée : 7 gènes (maya, B, C, D, E, F, R), impliqués dans le catabolisme de ce composé ont été clonés, séquencés et caractérisés, sur la base de l'analogie de leur séquence avec les gènes d'enzymes connues (Ferrandez et al., J. Bacteriol., 1997,179, 2573-2581). Il a été montré que les enzymes codées par maps, mhpc, mhpd, mhpe et mhpF sont impliquées dans la voie de dégradation du DHPP, et que mhpA code la 3- (3-hydroxyphényl) propionate 2hydroxylase. Deux gènes dénommés hcaA et scab, codant pour des enzymes impliquées dans les premières étapes de dégradation du 3P ont été décrits (Burlingame et al., 1983,1986, précités). Plus récemment, chez E. coli, d'autres gènes codant pour des protéines impliquées dans cette voie catabolique ont été isolés à partir d'un fragment EcoRI de 13,2 kb. Une famille de 7 gènes, dénommée la famille des gènes hca, a été séquencée et caractérisée ; elle comprend 5 gènes (hcaA1A2CBD) dont l'organisation ressemble à celle d'un opéron ainsi que deux autre gènes hcaT et hcaR transcrits en orientation opposée aux gènes précédents, le gène hcaR étant situé en 5' du gène hcaAl (Diaz et al., J. Bacteriol., 1998,180, 2915-2923). Il a été montré (Diaz et al., précité) que la protéine codée par hcaal présente une forte homologie avec la sous-unité a de la benzène dioxygénase de Pseudomonas putida (Irie et al., J. Bacteriol., 1987,169, 5174-5179) et le produit du gène hcaR est similaire aux protéines régulatrices de la famille LysR (Stragier et al., J. Mol. Biol., 1983,168, 333- 350). Il a également été montré qu'une coloration rouge brunâtre apparaissait dans les cultures de souches d'E. coli FB 80 (Perrotte et al., Biochimie, 1998, 81, 245-253) et MC1061 (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning.. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) portant une grande délétion dans l'opéron lactose (délétion slack74 ; Perrotte et al., Biochimie, 1998,81, 245-253), cultivées dans un milieu riche contenant du 3P (Burlingame et al., 1986, précité). La délétion Slack74 porte aussi sur les premiers gènes de la famille mhp qui sont adjacents à l'opéron lactose ; en conséquence, ces bactéries sont incapables de cataboliser le DHPP, qui s'accumule dans le milieu et est oxydé en dérivés quinones et semi-quinones responsables de cette coloration rougebrûnatre. En utilisant ces souches portant la délétion JlacX74 ainsi que des souches incapables de cataboliser les composés phénylpropanoïdes telles que Salmonella typhimurium, Diaz et al. (précité) ont montré que la protéine codée par hcaal est impliquée dans les premières étapes du catabolisme du 3P et que, chez S. typhimurium, le produit du gène hcaR est indispensable à l'expression de la famille hca, initialement isolée chez E. coli. En effet, cette coloration rouge-brunâtre est absente dans les cultures de bactéries dont le gène hcaAl est inactivé et les cultures de souches de bactéries incapables de cataboliser le 3P. Les Inventeurs ont cloné les régions promotrices et régulatrices (promoteur) du gène hcaAl d'E. coli et ils ont montré de manière inattendue que la régulation de l'activité de ce promoteur isolé, présentait des caractéristiques intéressantes pour la construction d'un nouveau vecteur d'expression inductible procaryote. En effet, les Inventeurs ont montré que : l'expression du gène hcaAl est fortement inductible uniquement lors de la phase exponentielle tardive et au début de la phase stationnaire, c'est-à-dire lors de la phase post-exponentielle, lorsque la biomasse est maximale, - le facteur d'induction est élevé, l'induction se fait par activation, et non par répression, ce qui, en l'absence d'inducteur, évite un niveau d'expression résiduelle de la protéine recombinante et rend le système plus stable vis-à-vis d'éventuelles mutations, le 3-phénylpropionate (3P) est un inducteur spécifique du gène hcaAl peu coûteux et métabolisé par les bactéries, le produit du gène hcaR (HcaR) est un activateur du gène hcaal ; l'expression de hcaR est autorégulée négativement et elle est réprimée en présence de glucose. En conséquence, les Inventeurs se sont donnés pour but la construction d'un nouveau vecteur d'expression inductible comprenant les régions régulatrices et promotrices du gène hcaAl d'un organisme procaryote qui réponde mieux aux besoins de la pratique : en ce qu'il permet la production de protéines hétérologues en quantité très importante dans des cellules hôtes procaryotes car il est inductible à des niveaux élevés, uniquement lors de la phase exponentielle tardive et au début de la phase stationnaire, c'est-à-dire lors de la phase post-exponentielle, lorsque la biomasse est maximale, en ce qu'il permet la production de protéines toxiques pour la cellule hôte car l'induction brutale de l'expression lors de la phase post-exponentielle n'empêche pas la phase initiale de croissance exponentielle des bactéries, en ce qu'il permet la production de protéines instables rapidement dégradées car l'induction en phase post-exponentielle est rapide, en ce qu'il est facile d'utilisation car la présence de 3P qui est métabolisé ne perturbe pas les étapes ultérieures de purification des protéines recombinantes et en ce qu'il est économique car le 3P est peu coûteux. La présente invention a pour objet une molécule d'acide nucléique dont la séquence est celle du promoteur du gène hcaAl d'un organisme procaryote capable de cataboliser des composés phénylpropanoïdes. Au sens de la présente invention, on entend par promoteur une séquence d'acide nucléique essentiellement constituée par les éléments nécessaires au contrôle de l'initiation de la transcription du gène hcaAl. Au sens de la présente invention, on entend par composés phénylpropanoïdes des composés tels que le 3-phénylpropionate (3P). Les organismes procaryotes conformes à l'invention sont avantageusement sélectionnés dans le groupe constitué par Escherichia coli, Acinetobacter sp., Pseudomonas sp., Arthrobacter sp. et Rhodococcus globerulus. En variante, la séquence du promoteur telle que définie ci-dessus est associée à une séquence nucléotidique codant pour un activateur du gène hcal. Selon un mode de réalisation avantageux de cette variante, ladite séquence codant pour un activateur est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences codant pour des protéines de la famille LysR. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence code pour la protéine HcaR. Des molécules d'acide nucléique conformes à l'invention sont représentées en particulier par : a) un fragment de 163 pb (SEQ ID NO : 1) dont la séquence s'étend de la position-87 à la position + 76 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène hcaAI d'E. coli ; cette séquence correspond à la région entre les gènes hcaAl et hcaR (région intergénique), b) un fragment de 258 pb (SEQ ID NO : 2) comprenant 159 pb de la séquence SEQ ID NO : 1, 3 pb de la région de contrôle de la traduction de hcaR et les 96 premiers nucléotides de la séquence du gène hcaR, c) un fragment de 1050 pb (SEQ ID NO : 3) comprenant 159 pb de la séquence SEQ ID NO : 1 et 891 nucléotides contenant la totalité du gène hcaR, et d) un fragment de longueur comparable à celle de l'un des fragments a), b) ou c) tel que défini ci-dessus, qui s'hybride avec l'un des fragments précédents dans des conditions stringentes. Au sens de la présente invention, on entend par conditions stringentes d'hybridation, une hybridation à 42 C dans du tampon d'hybridation 5 X SSC. Le fragment de 163 paires de bases qui correspond à la SEQ ID NO : 1 comprend les éléments caractéristiques d'un promoteur procaryote à savoir : un site d'initiation de la transcription correspondant au nucléotide A en position 77 de ladite séquence, situé en aval des séquences consensus-10 : CAACAT et-35 : TTCACA reconnues par l'ARN polymérase. Le fragment correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 comprend en 5'de la séquence ci-dessus (SEQ ID NO : 1), diminuée de 4 nucléotides corres- pondant à un site de restriction, 3 nucléotides de la région de contrôle de la traduction de hcaR et 96 nucléotides de la séquence du gène hcaR qui est localisé en 5'du gène hcaAl. Le fragment correspondant à la séquence SEQ ID NO : 3 comprend en 5'de la séquence ci-dessus (SEQ ID NO : 1), diminuée de 4 nucléotides correspondant à un site de restriction, 891 nucléotides contenant la totalité du gène hcaR qui code la protéine HcaR ; le gène hcaR est localisé en 5'du gène hcaal et est transcrit en orientation opposée au gène hcaal. Les promoteurs obtenus à partir des molécules d'acide nucléique conformes à la présente invention peuvent être utilisés pour contrôler l'expression d'un gène hétérologue dans des cellules procaryotes. En conséquence, la présente invention a également pour objet des cassettes d'expression d'une protéine hétérologue comprenant au moins une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus et une séquence hétérologue placée sous le contrôle transcriptionnel dudit promoteur. Au sens de la présente Invention on entend par"hétérologue"relativement à une séquence donnée, toute séquence d'acide nucléique autre que celles qui, dans la nature, sont immédiatement adjacentes à ladite séquence. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite cassette, elle comprend au moins un fragment d'acide nucléique tels que ceux définis ci-dessus (SEQ ID NO : 1 à 3 ou fragment s'hybridant avec une des séquences précédentes dans des conditions stringentes). La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus, liée à un site multiple de clonage ou une cassette d'expression telle que définie ci-dessus. Au sens de la présente invention, on entend par vecteur d'expression aussi bien un vecteur chargé comprenant une cassette d'expression telle que définie cidessus qu'un vecteur non-chargé comprenant un promoteur tel que défini ci-dessus, lié à un site multiple de clonage. Un vecteur d'expression non-chargé tel que défini ci-dessus est apte à recevoir n'importe quelle séquence donnée d'ADN codant pour une protéine hété- rologue, cette séquence étant insérée dans ledit vecteur au niveau du site multiple de clonage et ainsi placée sous le contrôle transcriptionnel du promoteur du gène hcaa 1. Des vecteurs d'expression conformes à l'invention sont représentés en particulier par : - le vecteur comprenant la séquence SEQ ID NO : 1, déposé selon le Traité de Budapest auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes en date du 6 avril 2000, sous le numéro 1-2434. Ce vecteur d'expression est dénommé pDIA 10123 ; il dérive du vecteur multi-copies pUC18 (Yanisch et al., Gene, 1985, 33,103-119) qui contient l'origine de réplication colEl d'E. coli, le gène de résistance à l'ampicilline et un site multiple de clonage. - le vecteur comprenant la séquence SEQ ID NO : 2, déposé selon le Traité de Budapest auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes en date du 6 avril 2000, sous le numéro 1-2435. Ce vecteur d'expression est dénommé pDIA 10124 ; il dérive également du vecteur pUC18 ci-dessus. - le vecteur comprenant la séquence SEQ ID NO : 3, déposé selon le Traité de Budapest auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes en date du 6 avril 2000, sous le numéro 1-2436. Ce vecteur d'expression est dénommé pDIA 10125 ; il dérive également du vecteur pUC 18. Ces vecteurs d'expression comprenant le promoteur du gène hcaAI sont utilisables dans les souches de bactéries contenant au moins les gènes / ! c7t2CD et/ ! ca. R, à l'état naturel comme les souches de bactéries capables de dégrader les composés phénylpropanoïdes (Escherichia coli, Acinetobacter sp., Pseudomonas sp., Arthrobacter sp. et Rhodococcus globerulus), ou bien après trans- formation ou intégration desdits gènes (lorsque ceux-ci sont absents). La présente Invention a également pour objet des cellules procaryotes transformées par au moins un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus. Les cellules conformes à l'invention sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par : - les bactéries capables de dégrader les composés phénylpropanoïdes, telles que : Escherichia coli, Acinetobacter sp., Pseudomonas sp., Arthro- bacter sp. et Rhodococcus globerulus, et - les bactéries transformées contenant au moins une copie des gènes hcaA 7A2BCD et hcaR, lesdits gènes étant soit portés par un plasmide, soit intégrés dans le chromosome des bactéries Avantageusement, lesdites bactéries contiennent également une délétion dans au moins le gène mhpB et sont incapables de métaboliser le 3- (2, 2dihydroxyphényl) propionate (DHPP). En effet, les Inventeurs ont montré que les bactéries comprenant également une délétion d'au moins le gène maps, telles que les souches FB 80 ou MC1061 d'E. coli qui portent la délétion Slack74, sont très intéressantes pour l'expression de protéines hétérologues à partir d'un vecteur contenant l'ADN de ladite protéine sous le contrôle transcriptionnel du promoteur du gène hcaAl. Ainsi, les Inventeurs ont montré que dans ces bactéries contenant ledit vecteur d'expression, lorsque le 3P est présent dans le milieu de culture, l'induction du promoteur hcaAI qui contrôle à la fois l'expression du gène hca. 47 autologue et de la protéine hétérologue est détectable par l'apparition d'une coloration rouge du milieu de culture au moment de l'entrée en phase stationnaire. En effet, ces bactéries sont capables d'effectuer les premières étapes de dégradation des composés phénylpropanoïdes tels que le 3P qui sont catabolisées par la famille de gènes hca. En revanche, elles sont incapables d'effectuer les étapes de dégradation tardive de ces composés (dégradation du DHPP) qui sont catabolisés par le produit des gènes mhp. La présente invention a en outre pour objet un procédé d'expression d'une protéine hétérologue, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : a) transformation d'une souche de bactéries par un vecteur d'expression, tel que défini ci-dessus dans lequel a été préalablement inséré l'ADN codant ladite protéine hétérologue, b) culture desdites bactéries transformées dans un milieu riche comprenant un composé phénylpropanoïde et c) récolte des bactéries lors de la phase post-exponentielle. Au sens de la présente invention, on entend par phase post-exponentielle la phase qui correspond au sommet de la courbe de croissance des bactéries et qui comprend la période exponentielle tardive et le début de la phase stationnaire. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ledit composé phénylpropanoïde est le 3-phénylpropionate. Au sens de la présente invention on entend par milieu riche, un milieu tel que le milieu LB ou un milieu qui contient comme source de carbone du glycérol, du pyruvate ou du succinate à une concentration finale d'au moins 0,4% (p/v). Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le 3-phénylpropionate est utilisé à une concentration d'au moins 1,3 mM. Selon un autre mode de mise en oeuvre dudit procédé, les bactéries sont sélectionnées dans le groupe constitué par les bactéries capables de dégrader les composés phénylpropanoïdes, telles que : Escherichia coli, Acinetobacter sp., Pseudo- monas sp., Arthrobacter sp. et Rhodococcus globerulus. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre dudit procédé : à l'étape a) ladite souche de bactérie comprend une délétion dans au moins le gène mh, pb et est incapable de cataboliser le DHPP et à l'étape c) ladite récolte des bactéries lors de la phase post-exponentielle est indiquée par l'apparition d'une coloration rouge dans le milieu de culture. La présente invention a en outre pour objet l'utilisation des vecteurs d'expression et des bactéries transformées contenant lesdits vecteurs pour des applications dans des domaines tels que la production de protéines recombinantes. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, laquelle se réfère à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 représente l'organisation génétique de la famille de gènes hca sur le chromosome d'E. coli. Les flèches représentent différents gènes et indiquent l'orientation de leur transcription. la figure 2 représente l'expression de la fusion transcriptionnelle hcaAl : : lacZ dans la souche FB81 cultivée en milieu LB, en présence (A) ou en l'absence (El) de 3-phénylpropionate (1, 3 mM). L'activité spécifique de la ss-galactosidase (échelle de droite) est mesurée à différents phases de la courbe de croissance des bactéries indiquées par les valeurs de la densité optique (DO) à 600 nm (échelle de gauche). Les valeurs représentent la moyenne de 3 mesures indépendantes. la figure 3 représente la courbe de croissance de la souche sauvage d'E. coli FB 8 (El) et de sa dérivée FB 812 (+) inactivée pour le gène hcaR, cultivées en milieu minimum (M63) en présence de 3P (5,2 mM) comme source de carbone. DO : densité optique. la figure 4 représente l'expression de la fusion transcriptionnelle hcaR.'.'lacZ, dans la souche FB 82 et dans ses mutants déficients pour les gènes repos (FB 821) et hear (FB 822). Les bactéries sont cultivées en milieu LB et l'activité spécifique de la ss-galactosidase est mesurée en phase exponentielle et en phase stationnaire (les valeurs indiquées représentent la moyenne de 3 mesures indépendantes : erreur standard). la figure 5 représente l'expression de la fusion transcriptionnelle hcar : : lack, en présence de différentes sources de carbone. Les bactéries sont cultivées en milieu LB ou en milieu minimum M63, supplémenté en glucose, en succinate ou en glycérol comme source de carbone, et éventuellement en AMPc (0,5 mM). L'activité spécifique de la ss-galactosidase est mesurée en phase exponentielle (les valeurs indiquées représentent la moyenne de 3 mesures indépendante si erreur standard). la figure 6 représente la structure du vecteur d'expression inductible pDIA 10123, contenant le promoteur du gène hcaAl. la figure 7 représente la séquence du promoteur du gène hcaA47 dans le plasmide pDIA 10123 (SEQ ID NO : 1). La séquence s'étend des positions-87 à +76 par rapport au site d'initiation de la transcription (+1), indiqué par une flèche. Les séquences consensus-10 et-35 sont soulignées. Il doit être entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1 : Analyse de la régulation de l'expression du gène hcaAl d'E. coli par le 3-phénylpropionate (3P) et de son contrôle par le produit du gène hcaR (HcaR). 1-1 Matériels et méthodes a) souches de bactéries, phases. plasmides La liste des souches d'E. coli, des phages et des plasmides utilisés est présentée dans le Tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 : Bactéries, phages et plasmides Souche d'E. coli, caractéristiques référence plasmide ou phage Souche FB8 F-Bruni et al., 1977, J Bactériol., 130, 4-10 Perrotte-Picquemal et al., Souche FB80 F'JlacX74 1988, J. Mol. Biol., 1, 165- 178 pHP 450-cat Ap, Cm Fellay et al., 1987, Gene, 52, 147-154 Plasmide pDIA 100 cyaA d'E. coli inséré dans Fellay et al., 1987, Gene, 52, pBR3222, Ap'147-154 Plasmide pDIA 6526 cyaB d'A. hydrophylai inséré Roy et al., 1983, EMBO J., 2, dans pBR 322, ApR 791-797 Plasmide pRS 415 ApR Sismeiro et al., 1988, J. Bactériol., 180, 3339-3344 Phage ARS 45 Simons et al., 1987, Gene, 53, 85-96 b) milieux et conditions de culture Les bactéries sont cultivées en conditions aérobies, à 37OC, dans du milieu LB ou du milieu minimum M63 (Miller et al., Experiments in molecular genetics. 1972 New York : Cold Spring Harbor Laboratory), supplémenté avec du glucose (0,4 %), du glycérol (0,4 %), du succinate (0,4 %) ou du 3-phénylpropionate (5,2 mM), comme source de carbone. Les antibiotiques sont utilisés aux concentrations suivantes : ampicilline, 50 g/ l ; chloramphénicol, 40 jg/1 ; kanamycine, 25 g/ l. L'induction est réalisée en présence de 3P à une concentration finale de 1,3 mM. Si nécessaire, de l'adénosine monophosphate 3'-5'cyclique (AMPc) est ajouté à une concentration finale de 0, 5 mM. Le milieu solide contient 1, 5 % de Difco agar. c) techniques de génétique La production des lysats de phages et les expériences de transduction de bactéries par ces phages sont réalisées selon les techniques décrites par Miller et al, précité. La transformation des bactéries est réalisée par la technique du chlorure de calcium décrite dans Sambrook et al., précité ou par électroporation (Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res., 16,6127-6145). d) Construction de mutants d'insertion chromosomique Les gènes de résistance à la kanamycine (Km) et au Chloramphénicol (Cm), isolés à partir de dérivés de pH45Q (Fellay et al., 1987, Gene, 52,147-154) sont insérés au niveau de sites de restrictions présents dans les gènes hcaA7, hcaR, heat, issus du plasmide pDIA10120. Puis, les fragments d'ADN contenant les gènes hca7,l hcaR et hcaT, interrompus par un gène de résistance (Km ou Cm) sont isolés par électroélution et introduits dans une souche recD déficiente (Russell et al., 1989, J. Bacteriol., 171,2609-2613). Le site d'insertion chromosomique est vérifié par Southern-blot ou par PCR selon les techniques classiques décrites dans Sambrook et al., précité. e) Construction de fusion d'opéron chromosomique Les fragments EcoRI-BamHl de 927 pb et EcoRI-BamHl de 416 pb, issus du plasmide pDIA10120, contenant respectivement le promoteur des gènes hcaAl et hcaR, sont insérés dans le site multiple de clonage de pRS415, devant l'opéron lactose (opéron lac) et transférés dans RS45 par recombinaison homologue. Le phage obtenu est ensuite utilisé pour lysogéniser la souche FB 8 Slack74 (FB 80), selon la technique décrite dans Simons et al, 1987, Gene, 53,85-96. L'insertion unique du prophage est vérifiée par PCR, selon la technique décrite dans Powell et al., Nucleic Acids Res., 1994,22, 5765-5766. Manipulation d'ADN et clonage moléculaire L'ADN chromosomique est isolé selon la technique décrite dans Marmur et al., J. Mol. Biol., 1961,3, 208-218. La purification d'ADN plasmidique, en grande quantité, est réalisée en utilisant le kit Plasmid Maxi kit (Qiagen Inc.), selon les instructions du fabricant. La purification d'ADN plasmidique, en petite quantité, est réalisée selon la technique décrite dans Bimboim et al., Nucleic Acids Res., 1979, 7, 1513-1523. Les restrictions, les modifications et les ligations sont réalisées selon les instructions du fabricant. L'amplification PCR est réalisée dans un thermocycleur (Hybaid), dans les conditions recommandées par le fabricant. g) dosage de protéines La concentration en protéines est déterminée selon la technique décrite par Bradford (Bradford, Anal. Biochem., 1976, 72, 248-254). h) dosage enzymatique L'activité p-galactosidase est mesurée selon la technique décrite par Pardee (Pardee et al., J. Mol. Bol., 1959, 1, 165-178). 1-2 Résultats a) L'induction du gène hcaAl par le 3P est dépendante de la phase de croissance (Figure 2) La souche FB81, dérivée de la souche FB80, a été construite par insertion chromosomique d'une fusion entre le promoteur du gène hcaAl et l'opéron lac, délété de son promoteur (Tableau II). Tableau II : Constructions de souches dE. coli et de plasmides Souche d'E. Coli, plasmides caractéristiques FB 8 hcaR : : cat F-CmR FB 8 hcaT : : Kan FKmR FB 81 F-LJlacX74, hcaAJ.... lacZ FB 811 F'JlacX74, h: c: : lacZ, rpoS FB 812 F'JlacX74, h! c: : lacZ, hcaR FB82F'Jc7Aca/cZ FB 821 F'JlacX74, hcaR.-/acZ, rpoS FB 821 F-JlacX74, hear : : laez, rpos FB 822 F'JlacX74, h: c . lacZ, hccR FB 823F'JlacX74, hcaR : : lacZ, cya, FB 824 F'JlacX74, hc : lacZ, cya, gly, crp Plasmide pDIA 10120 Fragment d'ADN de E. coli de 4, 6kb inséré dans pUC18 (ApR) Plasmide pDIA 10121 hcaR d'E. coli inséré dans pUC 19, ApR Plasmide pHP 45 Q-kan ApR, Km La régulation de l'expression du gène hcaAl a été étudiée dans la souche FB 81 en mesurant l'activité de la ss-galactosidase, à différentes phases de la de croissance des bactéries (phase exponentielle, phase post-exponentielle et phase stationnaire), dans différentes conditions de culture (milieu riche ou milieu minimum). al) culture en milieu riche L'expression de la fusion transcriptionnelle hcaAl : : lacez dans la souche FB81 cultivée en milieu riche (milieu LB), en présence ou en l'absence de 3phénylpropionate (1, 3 mM) et d'AMPc (0, 5 mM) est présentée dans le Tableau III, cidessous. L'activité spécifique de la ss-galactosidase est mesurée à différentes phases de la croissance des bactéries et les valeurs indiquées représentent la moyenne de 3 mesures indépendantes (i écart-type). Tableau III : Expression de la fusion hcaal : : lacZ dans les souches FB 81 et FB 81 mutées pour le gène hcaal, cultivées en milieu riche en présence ou en l'absence de 3-phénylpropionate (1, 3 mM) et d'AMPc (0, 5 mM) Activité spécifique (nmoles de substrat converties/min/mg de poids sec de bactéries) Souche PhaseLBLB+3PLBLB+3P LB+3P décroissance +3 (3-HP)' +g) ucose +giucose +AMPc FB 81 Phase 15, 0 0, 7 126, 3 i 32, 0 458, 2 14, 51, 8 16, 91, 3 exponentielle Phase 45, 8 i 7, 8 9851 803 13020, 00 62, 48, 0 63, 93. 3 post-exponentielle Phase stationnaire 47, 9 i 5, 6 3058, 2 152 82 8, 5 25, l + 7, 8 31, 68, 9 FB 81 Phase 21, 5 i 7, 8 93, 003, 3 ND ND ND (hcaA1) exponentielle Phase 36, 8 3, 3 10964 544 ND ND ND post-exponentielle Phase stationnaire 47, 9 5. 6 4890, 3 : t 410 ND ND ND ND : non déterminé ; * 3 (3-HP) : 3- (3-hydroxyphényl) propionate. Lorsque la souche FB 81 est cultivée en milieu riche (milieu LB), l'activité ss-galactosidase triple lors de l'entrée en phase stationnaire (Tableau III). Lorsque le 3P est ajouté dans le milieu de culture à une concentration finale de 1, 3 mM, l'activité ss-galactosidase augmente d'un facteur 10 pendant la phase exponentielle de croissance et, à la fin de la phase exponentielle, le facteur d'induction augmente drastiquement et transitoirement pour atteindre une valeur de 200 (Tableau III et figure 2). Cette induction de l'expression de la fusion hcaAl : : lacZ, par le 3P, est aussi détectée chez un mutant déficient pour la première étape de dégradation du 3P (Tableau III). En revanche, cette fusion n'est pas induite si l'on ajoute du 3HPP dans le milieu (Tableau III). Ces résultats montrent que le gène hcaal est induit spécifiquement par le 3P, en phase exponentielle tardive et au début de la phase stationnaire, correspondant à la phase post-exponentielle de croissance des bactéries. Lorsque du glucose est ajouté dans un milieu riche (milieu LB), les niveaux d'expression du gène hcaAl, lors de la phase exponentielle de croissance sont équivalents, en présence ou en absence de 3P (Tableau III). En revanche, en présence de glucose, l'addition de 3P dans le milieu, n'induit pas d'augmentation de l'expression du gène hcaAl à la fin de la période exponentielle de croissance (Tableau III), et cette induction d'expression n'est pas rétablie par l'addition d'AMPc à une concentration finale de 0,5 mM (Tableau III). a2) culture en milieu minimum Le Tableau IV ci-dessous présente l'expression de la fusion transcriptionnelle hcaal : : lac dans la souche FB 81 cultivée en milieu minimum (milieu M63), en présence ou en l'absence de 3-phénylpropionate (1,3 mM) et d'AMPc (0,5 mM). L'activité spécifique de la ss-galactosidase est mesurée en phase exponentielle et les valeurs indiquées représentent la moyenne de 3 mesures indépendantes erreur standard. Tableau IV : Expression de la fusion hcaal : : lacZ dans la souche FB 81 cultivée en milieu minimum (milieu M63), en présence ou en l'absence de 3- phénylpropionate (1, 3 mM) et d'AMPc (0, 5 mM) Activité spécifique (nmoles de substrat converties/min/mg de poids sec de bactéries) Souche Phase de glucose glucose glucose glucose succinate succinate croissance +AMPc +3P +3P +3P +AMPc Phase 7, 30, 8 7, 20, 8 437, 896 364, 321 11, 63, 6 554, 9 i 74 FB81 exponentielle Phase post-7, 3 2, 2 7, 6 0, 9 4784 551 3447 338 16 0, 7 8585 : 1 : 586 exponentielle Le Tableau IV montre que lorsque la souche FB 81 est cultivée en milieu minimum (milieu M63), et que le glucose remplace le succinate comme source de carbone, l'activité ss-galactosidase est deux fois plus faible (Tableau IV). Cependant, lorsque du 3P est ajouté au milieu minimum, une forte induction de l'expression de la fusion hcaal, en phase post-exponentielle, est observée avec les deux sources de carbones (Tableau IV). L'ensemble des résultats montre que dans un milieu riche, l'excès de glucose inhibe l'induction du gène hcaAl par le 3P, lors de la phase post-exponentielle. Cette répression n'est pas observée en milieu minimum, lorsque le glucose est utilisé comme source de carbone pour les bactéries. b) L'induction du gène hcaAl par le 3P est dépendante du gène hcaR (Figure 3j Pour étudier le rôle de la protéine HcaR dans la régulation de l'expression du gène hcaal chez E. coli, le mutant d'insertion chromosomique FB 812 a été construit. Ce mutant a été obtenu par inactivation du gène hcaR, issu du fragment de 4,6 kb du plasmide pDIA10120, par insertion d'une cassette d'expression du gène de résistance au chloramphénicol, puis par introduction du gène hcaR inactivé dans le chromosome de la souche d'E. coli V355 par recombinaison homologue, selon les protocoles expérimentaux décrits dans la section matériels et méthodes. Les résultats montrent que l'inactivation du gène hcaR, abolit l'utilisation du 3P par la souche FB 812 (Figure 3). Cependant, cette souche a une croissance normale lorsque le 3 (3-HP) est utilisé comme source de carbone et sa croissance est rétablie par introduction d'un plasmide multi-copies contenant le gène hcaR. Le Tableau V ci-dessous présente l'expression de la fusion transcrip- tonnelle hcaal : lacz dans la souche FB 81 et dans ses mutants repos (FB 811) et hcaR (FB 812), cultivés en milieu LB, en présence ou en l'absence de 3-phényl- propionate (1,3 mM). L'activité spécifique de la ss-galactosidase est mesurée lors de la phase exponentielle et lors de la phase stationnaire et les valeurs indiquées représentent la moyenne de 3 mesures indépendantes erreur-standard ; le gène rpoS codant pour le facteur Tableau V : Expression de la fusion hcaAl : : lacZ dans la souche FB 81 et dans ses mutants repos (FB 811) et hcaR (FB 812), cultivés en milieu LB, en présence ou en l'absence de 3-phénylpropionate (1, 3 mM). Activité spécifique (nmoles de substrat converties/min/mg de poids sec de bactéries) Souche LB LB + 3P Phase Phase Phase Phase exponentielle stationnaire exponentielle stationnaire FB 81 13, 1 2, 2 72, 4 9, 8 117, 1 20, 9 2750 293, 6 FB 811 (rpoS) 14, 8 2, 0 70, 3 : 6, 282, 5 28, 4 2704 190, 9 FB 812 (hcaR) 15, 2 1, 632, 8 : 3, 3 22, 0 : 4, 930, 5 8, 7 FB 812 (hear) 14, 8 : t 2 0 29, 1 2, 9 141, 5 5, 62944, 1 202, 2 +pDIA 10121 Le Tableau V montre qu'en milieu LB sans 3P, l'inactivation du gène hcaR, chez le mutant FB 812 n'a pas d'effet significatif sur l'expression du gène hcaal lors de la phase exponentielle mais, qu'il réduit l'induction de l'expression de ce gène, lors de la phase stationnaire. Cependant, les résultats observés en présence de 3P montrent que l'inactivation du gène hcaR, chez le mutant FB 812, réduit d'un facteur 4 l'expression du gène hcaa 1 lors de la phase exponentielle et abolit l'induction de ce gène hcaa lors de la phase stationnaire (Tableau V). Cette induction peut-être restorée par introduction d'un plasmide multi-copies exprimant le gène hear (Tableau V). Les résultats montrent également que l'induction du gène hcaAl en phase stationnaire n'est pas détectée chez les mutants rpos (FB 811) (Tableau V), et qu'elle n'est pas médiée par le facteur 5 de l'ARN polymérase, responsable de l'expression de nombreux gènes inductibles en phase stationnaire, tels que ceux décrits par Hengge-Aronis et al., Mol. Microbial., 1996, 21, 887-893. L'ensemble des résultats montre que chez E. coli le produit du gène hcaR (HcaR) est indispensable : - à l'utilisation du 3P par les bactéries, - à l'induction massive du gène hcaal en phase postexponentielle et, à l'induction de l'expression du gène hcaAl, par le 3P, lors de la phase exponentielle tardive et au début de la phase stationnaire (phase postexponentielle). b) L'expression du gène hcaR est dépendante de la phase de croissance (Figure 4) Afin d'étudier la régulation de l'expression du gène hcaR, une souche portant une fusion transcriptionnelle hcar lacez, dénommée FB 82, a été construite à partir de la souche FB 81, selon les protocoles décrits dans les matériels et méthodes. Des mutants d'insertion chromosomique déficients pour les gènes repos (FB 821) et hcaR (FB 822) ont été construits à partir de la souche FB 82, selon les protocoles décrits dans les matériels et méthodes. La souche FB 82 et les mutants FB 821 et FB 822 sont cultivés en milieu LB et l'activité ss-galactosidase spécifique est mesurée lors des différentes phases de la croissance des bactéries (Figure 4). Les résultats montrent que, dans la souche FB 82, l'activité galactosidase double lors de l'entrée en phase stationnaire (Figure 4). Cette augmen- tation est aussi observée chez le mutant repos (FB 821), ce qui indique que le gène hcaR n'est pas une cible du facteur crs, codé par le gène repos (Figure 4). c) L'expression du gène hcaR est autorégulée négativement (Figure 4) Des homologies de séquence indiquent que le produit du gène hcaR appartient aux protéines régulatrices de la famille LysR, qui jouent le rôle de régulateurs positifs de la transcription et s'autorégulent négativement. L'autorégulation de l'expression du gène hcaR est étudiée chez le mutant FB 822 (hcar : : lacZ, hcaR). Les résultats montrent que l'expression du gène hcaR est autorégulée négativement puisqu'en phase exponentielle, l'expression de la fusion hcaR.:.: lacZ est deux fois plus élevée dans la souche mutante FB 822 que dans la souche sauvage (FB 82). En phase stationnaire, le facteur d'induction de l'expression du gène hcaR est encore plus élevé, comme le montre le niveau d'expression de ce gène dans la souche mutante FB 822, par rapport à celui observé dans la souche sauvage (FB 82), (Figure 4). d) L'expression du gène hcaR est réprimée par le glucose (Figure 5) La régulation de l'expression du gène hcaR est étudiée dans la souche FB 82 en mesurant l'activité de la ss-galactosidase, en phase exponentielle, dans différentes conditions de culture (milieu riche ou milieu minimum), en présence ou en l'absence de glucose et d'AMPc (Figure 5). Dans la souche FB 82 cultivée en milieu LB, l'addition de glucose réduit l'expression du gène hcaR d'un facteur 10 (Figure 5). Dans la souche FB 82 cultivée en milieu minimum (M 63), l'expression du gène hcaR est réprimée lorsque le glucose est utilisé comme source de carbone (Figure 5). Cette répression de l'expression du gène hcaR n'est pas observée lorsque le glycérol ou le succinate sont utilisés comme source de carbone (Figure 5). L'expression du gène hcaR en présence de glucose, est toujours plus faible dans le milieu LB que dans le milieu M63. Ces résultats montrent que lorsque les bactéries sont cultivées en présence de glucose, comme unique source de carbone, l'expression du gène hcaR, comme celui d'autres opérons connus, est soumis à une répression par ce catabolite (glucose). Cette répression n'est pas levée par l'addition d'AMPc à une concentration finale de 0,5 mM (Figure 5). La relation entre l'AMPc et l'expression du gène hear, en l'absence d'effet lié au glucose, a été étudiée dans les souches FB 823 et FB 824, capables d'utiliser le glycérol comme unique source de carbone et incapable de synthétiser l'AMPc, et portant une fusion transcriptionnelle hcaR.:.: lacZ. Le Tableau VI ci-dessous montre l'effet de l'AMPc sur l'expression de la fusion transcriptionnelle hca7.:.: lacZ dans les souches FB 82, FB 823 et FB 824 cultivés en milieu minimum (milieu M63) contenant du glycérol comme source de carbone et en présence ou en l'absence d'AMPc à une concentration de 0,5 mM ou de 5 mM. L'activité spécifique de la ss-galactosidase est mesurée lors de la phase exponentielle de croissance et les valeurs indiquées représentent la moyenne de 3 mesures indépendantes erreur-standard. Tableau VI : Effet de l'AMPc sur l'expression de la fusion transcriptionnelle hcaAl : : lacZ dans les souches FB 82, FB 823 et FB 824 cultivés en milieu minimum (milieu M63) Activité spécifique (nmoles de substrat converties/min/mg de poids sec de bactéries) Souche M63 + glycérol M63 + glycérol M63 + glycérol + 0, 5 mM AMPc + 5 mM AMPc FB 82 253 6, 2 ND ND FB 823 25, 1 3, 1 30, 3 1, 8 121, 012, 2 (cya gly) FB 824 32, 9 2, 7 33, 2 6, 0 31, 1 3, 8 (crp cya gly) FB823+ 124, 5 10, 0 ND ND PODIA 100 FB 824 + 32, 1 5, 1 27, 1 7, 8 ND pDIA 100 FB 823 + 215, 730, 4 ND ND pDIA 6526 ND : non déterminé. Les résultats montrent que l'expression du gène car est fortement réprimée dans les souches FB 823 et FB 824. L'introduction d'un plasmide contenant le gène cyaA d'E. coli (pDIA 100) s'accompagne d'une augmentation significative de l'expression du gène hcaR dans la souche FB 823 modifiée, cependant les niveaux d'expression obtenus sont inférieurs à ceux observés dans la souche parentale FB 82 capable de synthétiser l'AMPc. En revanche, l'introduction d'un plasmide multi-copies contenant le gène cyaB d'Aeromonas hydrophila (pDIA 6526), qui provoque une synthèse significative d'AMPc, s'accompagne de l'expression du gène hcaR, à des niveaux comparables à ceux observés dans la souche parentale FB 82, capable de synthétiser l'AMPc. L'inactivation du gène crp dans la souche FB 823 abolit l'augmentation de l'expression du gène hear provoquée par l'addition d'AMPc, à une concentration finale de 5 mM, ou bien par l'introduction du gène cya d'E. coli. L'ensemble des résultats obtenus à l'aide de fusion transcriptionnelle chromosomique hcaA7 :.: lacZ montrent que chez E. coli, l'expression d'un gène hétérologue (gène lacZ), sous le contrôle du promoteur hcaAl isolé : - est inductible par le 3P, présente un niveau d'inductibilité élevé, uniquement en phase exponentielle tardive et au début de la phase stationnaire (phase post-exponentielle), et - est dépendante de la protéine activatrice HcaR. L'inductibilité de ce système d'expression est avantageusement utilisé pour la construction de nouveaux vecteurs d'expression inductibles dérivés du promoteur du gène hcaA destinés à la production de protéines hétérologues dans des cellules hôtes procaryotes. Exemple 2 : Construction d'un vecteur d'expression inductible par le 3P. 2-1 Matériels et méthodes Les techniques utilisées sont celles décrites à l'Exemple 1 2-2 Résultats a) Construction du vecteur pDIA 10123 Le fragment de 162 pb correspondant au fragment BglII-EcoRI du promoteur du gène hcaAl est amplifié par PCR à l'aide des amorces : - BglII : 5'-ATGGAAGATCTTCCCCTTGTTATCG-3', SEQ ID NO : 4 et - EcoRI : 5'-CCGAATTCCAAATCTGAGGGTGTGGTC-3', SEQ ID NO : 5. Les extrémités du produit obtenu sont complétées en utilisant l'ADN polymérase du phage T4 (Boehringer). Puis, ce fragment est inséré par ligation au site EcoRI du plasmide pUC19 (Perron et al., 1985, Gene, 33,103-119), préalablement rempli en utilisant l'ADN polymérase du phage T4. La ligation est effectuée à l'aide de l'ADN ligase du bactériophage T4 (Boehringer), pendant 18 heures à 4 C, dans les conditions recommandées par le fabricant. Après transformation de bactéries de soucheUI blue d'E. coli (regal end7 gyrA96 thi-l hsdR17 supE44 [F proAB lac zdM15 TnlO (Tet) par la technique au chlorure de calcium, et étalement des bactéries transfor- mées sur un milieu contenant de l'IPTG et du X-gal, selon les protocoles classiques décrits dans Sambrok et al., précités. Les colonies blanches, contenant le plasmide recombinant contenant le promoteur hcaA, cloné devant le site multiple de clonage, entre le promoteur et le gène lac et en orientation opposée à celle du promoteur lac, sont sélectionnées (figure 5). L'ADN de ces bactéries est extrait par les techniques décrites à l'exemple 1 et la séquence de l'insert est déterminée selon les techniques classiques décrites à l'exemple 1, à l'aide des amorces universelles 17-mer Sequencingprimer (-40) et 24-mer sequencing primer (-48) (Amersham). b) Construction du vecteur pDIA 10124 Le fragment de 258 pb correspondant au fragment comprenant 159 pb de la séquence SEQ ID NO : 1 du promoteur du gène hcaA, 3 pb de la région de contrôle de la traduction de hcaA et les 96 premiers nucléotides de la séquence du gène hcaR est amplifié par PCR à l'aide des amorces sens (SEQ ID NO : 6) et antisens (SEQ ID NO : 5). Les extrémités du produit obtenu sont complétées en utilisant l'ADN polymérase du phage T4 (Boehringer). Puis, ce fragment est inséré par ligation au site EcoRI du plasmide pUC19 comme décrit ci-dessus. Les étapes ultérieures de transformation et de sélection du plasmide recombinant sont identiques à celles décrites pour le plasmide pDIAD 10123. c) Construction du vecteur pDIA 10125 Le fragment de 1050 pb correspondant au fragment comprenant 159 pb de la séquence SEQ ID NO : 1 du promoteur du gène hcaA et 891 pb contenant la totalité du gène hcaR est amplifié par PCR à l'aide des amorces sens (SEQ ID NO : 7) et antisens (SEQ ID NO : 5). Les extrémités du produit obtenu sont complétées en utilisant la polymérase à ADN du phage T4 (Boehringer). Puis, ce fragment est inséré par ligation au site EcoRI du plasmide pUC19 comme décrit ci-dessus. Les étapes ultérieures de transformation et de sélection du plasmide recombinant sont identiques à celles décrites pour le plasmide PDIAD 10123. d) Résultats Parmi les clones sélectionnés : - le clone pDIA 10123, contient un insert dont la séquence (SEQ ID NO : 1) est celle du fragment de 163 pb du promoteur du gène hcaal (figure 6), - le clone pDIA 10124, contient un insert dont la séquence (SEQ ID NO : 2) est celle du fragment de 258 pb du promoteur du gène hcaAl qui comprend de 3'en 5' : 159 pb du fragment de 163 pb, 3 pb de la région de contrôle de la traduction de hcaR et les 96 premiers nucléotides du gène hcaR. - le clone pDIA 10125, contient un insert dont la séquence (SEQ ID NO : 3) comprend de 3'en 5' : 159 pb de la séquence du fragment de 163 pb et 891 pb contenant la totalité de la séquence du gène hcaR. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 ) Molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce que sa séquence est celle du promoteur du gène hcaAl d'un organisme procaryote capable de cataboliser des composés phénylpropanoïdes. 2 ) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit organisme procaryote est sélectionné dans le groupe constitué par : Escherichia coli, Acinetobacter sp., Pseudomonas sp., Arthrobacter sp. et Rhodococcus globerulus. 3 ) Molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce que la séquence du promoteur du gène hcaAl selon la revendication 1 ou la revendication 2 est associée à une séquence nucléotidique codant pour un activateur du gène hcaAl. 4 ) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite séquence nucléotidique est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences codant pour des protéines de la famille LysR. 5 ) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite séquence code pour la protéine HcaR. 6 ) Molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par : a) un fragment de 163 pb (SEQ ID NO : 1) dont la séquence s'étend de la position-87 à la position + 76 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène hcaAl d'E. coli, b) un fragment de 258 pb (SEQ ID NO : 2) comprenant les 96 premiers nucléotides de la séquence du gène hcaR, c) un fragment de 1050 pb (SEQ ID NO : 3) comprenant la totalité du gène hcaR, et d) un fragment de longueur comparable à celle de l'un des fragments a), b) ou c) ci-dessus, qui s'hybride avec l'un des fragments précédents dans des conditions stringentes. 7 ) Cassette d'expression d'une protéine hétérologue, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un promoteur constitué par une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et une séquence hétérologue placée sous le contrôle transcriptionnel dudit promoteur. 8 ) Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cassette d'expression selon la revendication 7 ou une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 liée à un site multiple de clonage. 9 ) Vecteur d'expression selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID NO : 1 et qu'il a été déposé selon le Traité de Budapest auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes en date du 6 avril 2000, sous le numéro 1-2434. 10 ) Vecteur d'expression selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID NO : 2 et qu'il a été déposé selon le Traité de Budapest auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes en date du 6 avril 2000, sous le numéro 1-2435. 11 ) Vecteur d'expression selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID NO : 3 et qu'il a été déposé selon le Traité de Budapest auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes en date du 6 avril 2000, sous le numéro 1-2436. 12") Cellule procaryote transformée par au moins un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 8 à 11. 13 ) Cellule procaryote selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par : - les bactéries capables de transformer les composés phénylpropanoïdes telles que Escherichia coli, Acinetobacter sp., Pseudomonas sp., Arthrobacter sp. et Rhodococcus globerulus, et - les bactéries transformées contenant au moins une copie des gènes hca4lA2BCD et hcaR. 14 ) Cellule procaryote selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle contient également une délétion dans au moins le gène mhpB et est incapable de métaboliser le 3- (2, 2-dihydroxyphényl) propionate. 15 ) Procédé d'expression d'une protéine hétérologue, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : a) transformation d'une souche de bactéries par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications Sali dans lequel a été préalablement inséré l'ADN codant ladite protéine hétérologue, b) culture desdites bactéries transformées dans un milieu riche comprenant un composé phény ! propanoïde et d) récolte des bactéries lors de la phase post-exponentielle. 16 ) Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit composé phénylpropanoïde est le 3-phénylpropionate. 17 ) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le 3phénylpropionate est utilisé à une concentration d'au moins 1,3 mM. 18 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisé en ce que lesdites bactéries sont sélectionnées dans le groupe constitué par : Escherichia coli, Acinetobacter sp., Pseudomonas sp., Arthrobacter sp. et P. et Rhodococcus globerulus. 19 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisé en ce que : - à l'étape a) ladite souche de bactérie comprend une délétion dans au moins le gène mhpB et est incapable de cataboliser le 3- (2, 3-dihydroxyphényl) propionate et - à l'étape c) ladite récolte des bactéries lors de la phase postexponentielle est indiquée par l'apparition d'une coloration rouge dans le milieu de culture.