Brevet FR2813499A1 — publié le 20020308

MAMMIFERE NON-HUMAIN MUTANT POUR L'EXPRESSION DE LA SOUSUNITE ALPHA6 DU RECEPTEUR NICOTINIQUE DE L'ACETYLCHOLINE ET UTILISATION POUR LE CRIBLAGE DE SUBSTANCES SUSCEPTIBLES D'INTERAGIR AVEC CE RECEPTEUR. La présente demande a pour objet des mammifères non-humains, mutants pour l'expression de la sous-unité alpha6 du récepteur nicotinique de l'acétylcholine, ci-après désigné par l'expression abrégée nAChR et l'utilisation de ces mammifères pour l'identification ou le criblage de molécules susceptibles d'interagir avec ce récepteur. A ce jour, le rôle des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine dans le système nerveux central est peu connu. On sait que ces récepteurs (Marubio, L. M., et al. Reduced antinociception in mice lacking neuronal nicotinic receptor subunits. Nature, 1999.398 : p. 805-810) sont impliqués dans la nociception, la mémoire, le contrôle de la locomotion, la dépendance à la nicotine, et certains désordres neurodégénératifs tels que la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzeimer (Newhouse, P., et al, Nicotinic system involvement in Alzheimer's and Parkinson's diseases. Implications for therapeutics. Durgs Aging, 1997. 11(3): p. 206-228), les mécanismes de cette implication n'ayant néanmoins pas été identifiés. En ce qui concerne la dépendance à la nicotine, des travaux récents ont fait état de l'importance de la sous-unité beta2 du nAChR vis à vis des propriétés de dépendance de la nicotine chez les rongeurs (Picciotto, M. et al, Acetylcholine receptors containing beta2-subunit are involved in the rein forcing properties of nicotine. Nature, 1998. 391 : p. 173-177). Dans ces travaux antérieurs, des souris dépourvues de sous-unité beta2, étaient incapables de maintenir un comportement d'auto-administration lorsque la cocaïne était remplacée par la nicotine. Cette étude soulignait également l'absence de réponse électrophysiologique des neurones dopaminergiques mésencéphaliques des souris mutantes, en réponse à la nicotine. De plus, des expériences de microdialyse réalisées sur des souris mutantes ont établi que la libération de dopamine était affectée dans le noyau accumbens (correspondant à la partie ventrale du striatum) après l'administration de nicotine par voie systémique. Ces observations contribuent à mettre l'accent sur le parallèle pouvant exister entre la nicotine et d'autres drogues à dépendance, telles que l'héroïne ou la cocaïne, dont les effets de dépendance sont liés à l'augmentation du niveau basal de dopamine dans le noyau accumbens. Toutefois, le profil d'expression cellulaire étendu de la sous-unité beta2 n'a pas permis la définition précise des régions du cerveau contribuant à l'initiation de la dépendance à la nicotine, et la nature des sous-unités alpha associées avec la sous-unité beta2 dans ce procédé, n'a pas été identifiée. Parmi les huit sous-unités alpha du nAChR déjà identifiées dans le cerveau de rongeurs, certaines ont été utilisées, notamment la sous-unité alpha4, pour examiner leurs propriétés. Dans le cadre de la présente demande, les inventeurs ont choisi de s'intéresser à une sous-unité particulière, la sous-unité alpha6 des récepteurs neuronaux nicotiniques de l'acétylcholine, cette sous-unité pouvant être associée avec la sous-unité beta2 et présentant un profil d'expression restreint aux neurones catécholaminergiques (Le Novere, N. et al., Neuronal nicotinic receptor alpha 6 subunit mRNA is selectively concentrated in catecholaminergic nuclei of the rat brain European Journal of Neuroscience, 1996. 8(11): p. 2428-39). De façon tout à fait intéressante dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont sélectionné cette sous-unité pour son profil d'expression principalement localisé au niveau de la substance noire, de l'aire tegmentale ventrale et du locus coeruleus. Des études (Le Novere, N. et al, Involvement of alpha6 nicotinic receptor subunit in nicotine-elicited locomotion, demonstrated by in vivo antisense oligonucleotides infusion. NeuroReport, 1999.10 : p. 2497-2501) ont attesté que des oligonucléotides antisens permettent de démontrer l'importance de la sousunité alpha6 dans l'effet hyperlocomoteur de la nicotine en environnement habitué, un effet qui serait médié par le système dopaminergique mésencéphalique. Ces éléments ont conduit certains auteurs à émettre l'hypothèse que la sous-unité alpha6 pourrait avoir un rôle dans la régulation de la libération de dopamine par des agonistes nicotiniques (Reuben M. B. S., et al., Nicotinic receptors modulatig somatodendritic and terminal dopamine relase differ pharmacologically. Eur J. Pharmacol, 2000.393(1-3) : p. 39-49). Cependant, ces auteurs ont observé que le résultat obtenu sur le potentiel et l'efficacité de l'agoniste testé associé avec la libération de dopamine ne ressemble pas à celui qui était obtenu avec des cholinorécepteurs nicotiniques recombinants contenant la sous-unité alpha6. L'invention propose des moyens permettant l'observation in vivo ou dans un système in vitro susceptible de se rapprocher des conditions existant in vivo, pour identifier ou cribler des molécules susceptibles d'interagir, dans une réaction de type ligand/récepteur, avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine et en particulier avec ceux d'entre eux comportant la sous-unité alpha6 de ces récepteurs. L'invention a donc pour objet des mammifères non-humains, en particulier des rongeurs et notamment des souris, qui sont mutés pour le gène codant pour la sous-unité alpha6 du nAChR, ces mammifères étant dépourvus de sous-unité alpha6 fonctionnelle. Dans la suite de la description, ces animaux seront dit knockout , pour qualifier la mutation qu'ils présentent au niveau du gène codant pour la sous-unité alpha6 des récepteurs nAChR. Ces mammifères peuvent constituer des modèles animaux pour identifier des substances, et notamment des substances ayant des propriétés pharmacologiques, interagissant avec ladite sous-unité alpha6 au sein de récepteurs nAChR. Ces récepteurs comportant la sous-unité alpha6 pourraient être de type 2a6, 2ss2, ss3 (Le Novere N. et al, European Journal of Neuroscience, 1996. 8(11), p. 2428-39). En particulier, l'invention fournit au moyen de ces animaux, ou de produits, notamment de cultures cellulaires, qui peuvent en être dérivés, un modèle permettant de déterminer la sélectivité de substances d'intérêt vis-à-vis des récepteurs nAChR présents au niveau de certaines populations neuronales et en particulier au niveau des neurones catécholaminergiques. Ainsi, des substances déterminées peuvent être testées sur des animaux exprimant normalement la sous-unité alpha6 des nAChR et le même test peut être réalisé sur les animaux selon l'invention mutants pour cette sous-unité exprimée sous forme fonctionnelle, de façon à comparer les effets respectifs observés, notamment l'éventuelle interaction de la substance testée, avec la transmission nicotinique et la transmission dopaminergique médiée par la sous-unité alpha6 des récepteurs nAChR. Les moyens selon l'invention sont particulièrement adaptés au criblage et en particulier au criblage pharmacologique, de substances susceptibles de se comporter comme des ligands des récepteurs nAChR, via leur interaction avec le site de fixation de la nicotine de la sous-unité alpha6 et en particulier susceptibles d'une activité agoniste ou antagoniste de type nicotinique. De façon particulièrement avantageuse, les substances identifiées se fixent aux nAChR par l'intermédiaire de la sous-unité alpha6 et ont une spécificité restreinte aux neurones dopaminergiques. Cette spécificité peut être détectée du fait de l'expression de la sous-unité alpha6 du récepteur nAChR, restreinte à ces neurones dopaminergiques,. On a par exemple observé que la maladie de Parkinson est caractérisée par une dégénérescence sélective des neurones dopaminergiques de la substance noire. La capacité des substances identifiées à se comporter comme des ligands de la sous-unité alpha6 des nAChR définit dans le cadre de l'invention, des substances ayant une activité comparable à celle de l'acétylcholine, ou à celles d'agonistes tels que la nicotine, au moins en ce qui concerne la capacité de l'acétylcholine ou de la nicotine, à se lier aux récepteurs nAChR comprenant la sous-unité alpha6. Des substances possédant ces propriétés sont par exemple la nicotine, la cytisine, l'épibatidine, ainsi que leurs dérivés obtenus par modification chimique. Des substances antagonistes se liant à la susdite sous-unité alpha6 des nAChR sont par exemple la DhpE, l'hexaméthotium, l'alpha-bungarotoxine, la nbungarotoxine. Des exemples sont mentionnés dans les publications de Spang J. et al. (Chem Biol, 2000. 7(7) : p. 545-555) et Sharples C. et al (J. Neurosci, 2000. 20(8) : p. 2783-91). Les résultats disponibles sur l'effet neuroprotecteur de la nicotine dans la maladie de Parkinson (Newhouse, P ; et al. Durgs Aging, 1997. 11(3) : p. 206-228) ouvrent de nouvelles possibilités pour des thérapies différentes avec des agents nicotiniques. La conception de substances nicotiniques, susceptibles d'avoir des propriétés thérapeutiques et d'être utilisées dans la conception d'un médicament, qui présenterait une sélectivité pour des récepteurs contenant la sous-unité alpha6, pourrait présenter un intérêt notamment en évitant des effets secondaires indésirables tels que les risques cardiovasculaires associés à l'exposition à la nicotine. L'invention a donc pour objet un mammifère non-humain, porteur d'une mutation dans le gène codant pour la sous-unité alpha6 du récepteur nicotinique de l'acétylcholine (nAChR), ladite mutation empêchant l'expression chez le mammifère de ladite sous-unité alpha6 du nAChR sous une forme fonctionnelle. Par l'expression forme fonctionnelle , on entend dans le cadre de l'invention, la forme de la sous-unité alpha6 (a6) du nAChR qui permet la reconnaissance et l'interaction entre cette sous-unité et des agonistes ou des antagonistes des récepteurs dans lesquels elle est présente, et plus particulièrement qui permet la fixation de l'acétylcholine. La forme fonctionnelle de la sous-unité alpha6 est donc celle dans laquelle ladite sous-unité comporte un site de fixation fonctionnel de molécules agonistes ou antagonistes. Le caractère fonctionnel du site de fixation peut être vérifié par le fait que l'acétylcholine, présente ou administrée dans des conditions permettant son interaction avec les récepteurs nAChR comportant la sous-unité alpha6, modifie le niveau de libération de dopamine, par rapport au niveau de dopamine qui peut être libéré lorsque la sous-unité alpha6 est absente ou non fonctionnelle. En d'autres termes l'absence de la sous-unité alpha6, ou sa présence sous forme non fonctionnelle altère l'amplitude ainsi que la pharmacologie de la réponse des récepteurs nAChR, à la nicotine. A cet égard, les exemples décrivent des tests utilisables. On utilisera aussi dans la suite, la référence à la forme fonctionnelle du gène pour traduire la capacité du gène à exprimer une sous-unité alpha6 sous forme fonctionnelle. Les mammifères non-humains selon l'invention sont donc ceux qui ont subi une inactivation génique du gène codant pour la sous-unité alpha6 des nAChR. Dans un premier mode de réalisation de l'invention, le mammifère nonhumain est caractérisé en ce que le gène codant pour la sous-unité alpha6 du nAChR est muté par délétion de tout ou partie de ses exons. Un site de fixation de la sous-unité alpha6 de nAChR reconnu par la nicotine et par d'autres agonistes et antagonistes de ce récepteur est codé par les exons 2,3 et 4 du gène codant pour cette sous-unité alpha6. En outre, la délétion des exons 1 et 2, par leur destruction, empêche la traduction correcte de l'ARNm (du fait de la destruction de l'ATG ainsi que des sites d'épissage) même dans l'hypothèse d'une transcription du gène. En réalité, l'absence des exons 1 et 2 empêche la transcription du gène. L'invention a donc pour objet en particulier un mammifère non-humain, caractérisé en ce que le gène codant pour la sous-unité alpha6 du nAChR est muté par délétion d'au moins une partie de l'exon 1 et/ou d'au moins une partie de l'exon 2, suffisante pour empêcher, au niveau de la sous-unité alpha6 du nAChR exprimé chez le mammifère, la liaison de ladite sous-unité alpha6 du nAChR avec ses agonistes et/ou ses antagonistes. De façon préférée, le mammifère non-humain selon l'invention est muté par délétion essentiellement complète des exons 1 et 2. En particulier, l'invention a pour objet un mammifère non-humain, en particulier un rongeur et notamment une souris, caractérisé en ce que la mutation du gène codant pour la sous-unité alpha6 du nAChR est de type homozygote. La mutation est par exemple telle que le mammifère a de ce fait un phénotype ([alpha]6-/-) et n'exprime plus la sous-unité alpha6 du nAChR, les deux allèles du gène étant mutés de façon semblable. Selon un autre mode de réalisation, l'invention a pour objet un mammifère non-humain caractérisé en ce que la mutation du gène codant pour la sous-unité alpha6 du nAChR est homozygote, ledit mammifère ayant un phénotype ([alpha]#1-2/#1- 2). Le phénotype ([alpha]6#1-2/#1-2) correspond à l'expression d'un gène codant pour la sous-unité alpha6, ce gène étant tronqué au niveau des exons 1 et 2, de sorte que si cette sous-unité est effectivement exprimée et notamment comporte la partie transmembranaire de la sous-unité alpha6 native, le récepteur exprimé n'est pas fonctionnel pour la fixation des agonistes laquelle est normalement dépendante de la transcription et de la traduction correcte des exons 1 et 2. Ces mammifères non-humains peuvent être obtenus par recombinaison homologue du gène sauvage codant pour la sous-unité alpha6 du nAChR, avec une construction du type de la construction cible de la figure 1. Le caractère homozygote de la mutation peut résulter du croisement de deux animaux dont un allèle du gène est muté, la descendance homozygote étant ensuite sélectionnée. Alternativement, le caractère homozygote de la mutation peut être obtenu directement au niveau des cellules ES en augmentant la concentration de néomycine utilisée pour la sélection et en ne retenant que les clones ayant subi une double recombinaison homologue. Les mammifères non-humains selon l'invention peuvent être obtenus de façon telle que l'expression non fonctionelle de la sous-unité alpha6 du nAChR ou l'absence d'expression de cette sous-unité alpha6 est constitutive, l'animal étant muté pour le gène fonctionnel ou incapable d'exprimer son produit de transcription. Alternativement, l'invention a pour objet des mammifères non-humains, caractérisés en ce que la mutation du gène codant pour la sous-unité alpha6 du nAChR est de type inductible ou de type conditionnel. Le caractère inductible ou conditionnel de la mutation peut être utile notamment pour que l'animal mutant par induction, pour l'expression sous forme fonctionnelle du gène de la sous-unité alpha6, ne soit pas en situation de subir des adaptations comportementales par exemple par compensation et de ce fait, de modifier son comportement vis-à-vis d'agonistes ou d'antagonistes, et de façon générale, de toute substance susceptible d'interagir normalement avec la sousunité alpha6 native du nAChR. Des mammifères selon l'invention chez lesquels la mutation en question est inductible peuvent être obtenus notamment en ayant recours à des techniques de recombinaison spécifiques, permettant à la recombinaison destinée à établir la délétion ou la mutation du gène, de se réaliser sous le contrôle de certains agents notamment la tétracycline ou le RU486 (Kellendonk C. et al, J. Mol. Biol. 1999, 285(1): p. 175-82), par exemple dans certaines populations cellulaires neuronales. L'inactivation génique inductible repose sur l'utilisation d'un promoteur inductible (par exemple le système TRE/rtta (Gossen M. et al, Science, 1995. 268: p. 1766-9) qui contrôle l'expression d'une enzyme, la Cre-recombinase. Dans ce système, on génère des animaux transgéniques exprimant à la fois l'activateur synthétique rtta sous contrôle d'un promoteur spécifique de certains tissus, et la Cre-recombinase sous contrôle du promoteur inductible TRE. Ainsi, en présence de la tétracycline, l'activateur rtta se fixe au promoteur TRE et induit l'expression de la Cre-recombinase dans les seules cellules où rtta est exprimé. En parallèle, on obtient, via une recombinaison homologue, des animaux chez lesquels le gène codant pour la sous-unité alpha6 est flanqué de deux sites LoxP. Ces sites sont la cible de la Cre-recombinase qui provoque l'excision de tout fragment d'ADN situé entre deux sites LoxP. En croisant ces animaux, on obtient des descendants chez lesquels on peut induire l'excision du gène alpha6 par simple adjonction de tétracycline à l'eau de boisson. Les sites LoxP en question peuvent, alternativement être insérés dans le gène de façon à encadrer un fragment du gène dont la délétion est suffisante pour inactiver le gène ou conduire à l'expression d'une sous-unité alpha6 non fonctionnelle. D'autres systèmes équivalents peuvent être utilisés. Les mammifères non-humains selon l'invention, en particulier les rongeurs et notamment les souris, peuvent être obtenus par croisement d'animaux portant les constructions génétiques nécessaires pour obtenir la mutation recherchée du gène codant pour la sous-unité alpha6 du nAChR et ce, de façon à rendre homozygote ladite mutation. L'invention concerne également les animaux de la descendance des susdits animaux. L'invention concerne aussi des mammifères non-humains knockout, chez lesquels le gène de la sous-unité alpha6 est muté de façon hétérozygote. Ces animaux montrent du fait de cette mutation hétérozygote, une sensibilité diminuée aux ligands de la sous-unité alpha6 et sont donc intéressants pour confirmer que la diminution d'un effet, agoniste ou antagoniste vis-à-vis de la sous-unité alpha6, observé avec une substance est effectivement attribuable à la mutation. Différentes constructions ont été réalisées pour rendre possible la préparation des animaux selon l'invention. Ces constructions sont décrites en détails dans les exemples qui suivent et en particulier l'invention a pour objet un mammifère non-humain et notamment une souris, caractérisé en ce que son gène codant pour la sous-unité alpha6 du nAChR est muté par recombinaison homologue avec la séquence désignée a6KO contenue dans la souche E. coli déposée à la CNCM sous le numéro 1-2550, le 29 août 2000. L'invention concerne par ailleurs des populations cellulaires et en particulier des cultures cellulaires telles qu'elles peuvent être obtenues à partir d'un mammifère non-humain tel que décrit dans ce qui précède. Dans le cadre de la réalisation de l'invention, ces populations cellulaires sont notamment les populations neuronales et en particulier les populations cellulaires qui expriment normalement la sous-unité alpha6 des récepteurs nAChR tels que les neurones catécholaminergiques. Des populations cellulaires intéressantes sont également par exemple les cellules neuronales mésencéphaliques. L'invention concerne aussi des préparations de synaptosomes striataux. L'invention a par ailleurs pour objet, l'utilisation d'un mammifère nonhumain d'une préparation de synaptosomes ou d'une culture cellulaire, définis dans le cadre de ce qui précède, pour étudier les effets de substances déterminées sur les récepteurs nicotiniques. Une utilisation particulièrement intéressante de l'invention dans ce cadre, est destinée à l'étude des effets de drogues à dépendance sur les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine, ces drogues pouvant être déjà connues et identifiées comme telles en général ou étant connues sans que leurs propriétés soient identifiées, ou encore étant nouvelles dans leur structure et leurs fonctions. En particulier, l'utilisation des animaux selon l'invention ou des préparations de synaptosomes, ou des cultures cellulaires dérivées permet, par la mesure du niveau de libération de dopamine, de déterminer l'effet d'agonistes de récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (nAchR), en particulier sur la sous-unité alpha6 de ces récepteurs. De façon particulièrement intéressante, les animaux, les préparations de synoptosomes, ou les cultures cellulaires de l'invention sont utilisables dans des protocoles de criblage, notamment pharmacologique, de substances agonistes ou antagonistes des nAChR. De façon plus spécifique, les animaux knockout selon l'invention, ou les cultures cellulaires, ou les préparations de synaptosomes permettent d'identifier, parmi les substances agonistes ou antagonistes des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine, celles qui peuvent avoir un effet restreint aux neurones catécholaminergiques notamment restreint aux neurones dopaminergiques. Les substances testées sont des substances connues, par exemple pour leurs propriétés agonistes ou antagonistes vis-à-vis de récepteurs et en particulier vis-à-vis des récepteurs nAChR. Il peut s'agir également de substances nouvelles dont l'invention permettrait d'identifier certaines propriétés en particulier certaines caractéristiques pharmacologiques vis-à-vis des récepteurs nAChR. L'invention a donc pour objet un procédé de criblage de substances susceptibles d'interagir avec la sous-unité alpha6 du nAChR, sélectionnées parmi les substances interagissant avec les récepteurs nAChR, comprenant : - la mise en contact de la substance sélectionnée avec un mammifère non-humain selon l'invention, dans des conditions permettant l'interaction entre ladite substance et les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine, - la détection du niveau de la dopamine libérée dans le striatum. L'invention a également pour objet un procédé de criblage de substances susceptibles d'interagir avec la sous-unité alpha6 du nAChR, sélectionnées parmi les substances interagissant avec les récepteurs nAChR, comprenant : - la mise en contact de la substance sélectionnée avec une culture cellulaire selon l'invention, dans des conditions permettant l'interaction entre ladite substance et les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine, - la détection du niveau de la dopamine libérée. L'invention a également pour objet un procédé de criblage de substances susceptibles d'interagir avec la sous-unité alpha6 du nAChRn sélectionnées parmi les substances interagissant avec les récepteurs nAChR, comprenant : - la mise en contact de la substance sélectionnée avec une préparation de synaptsomes selon l'invention, dans des conditions permettant l'interaction entre ladite substance et les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine, - la détection du niveau de la dopamine libérée. Des procédés pour tester la capacité de substances à interagir avec la sous-unité alpha6 du nAChR sont par exemple ceux qui mettent en #uvre le système du double hybride, tels que décrits dans la demande de brevet WO 99/42612. La variation du niveau de dopamine détectée peut être évaluée par comparaison du niveau de dopamine libérée, avec le niveau basal de dopamine libérée chez un animal exprimant normalement la sous-unité alpha6 du nAChR, ou libérée dans une préparation de synaptosomes effectuée à partir d'un tel animal, ou dans une culture cellulaire exprimant cette sous-unité, lorsque l'animal, la préparation ou la culture en question sont mis en contact avec la substance testée dans des conditions permettant son interaction avec la sous-unité alpha6. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le procédé de criblage met en #uvre des substances dont on n'a pas préalablement recherché la capacité à se lier à des nAChR. Selon un autre mode de réalisation, les cultures cellulaires selon l'invention sont utilisées pour étudier ou identifier, parmi les substances agonistes ou antagonistes des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine, celles qui peuvent avoir un effet neuroprotecteur. L'invention a donc pour objet un procédé de criblage de substances susceptibles d'interagir avec la sous-unité alpha6 du nAChR, sélectionnées parmi les substances interagissant avec les récepteurs nAChR, comprenant : - la mise en contact de la substance sélectionnée avec une culture cellulaire selon l'invention, dans des conditions permettant l'interaction entre ladite substance et les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine, - l'application d'une agression à cette culture cellulaire, - l'observation de l'effet neuroprotecteur de cette substance sur cette culture vis-à-vis de cette agression. L'agression d'une culture cellulaire est par exemple décrite dans la publication de Akaike A. et al (Brain Res., 1994. 644(2) :p. 181-7). L'effet de cette agression peut être la mort cellulaire. Dans ce cas, l'observation de l'effet neuroprotecteur peut consister en la comparaison de la mort cellulaire engendrée par cette agression sur une culture exprimant la sous-unité alpha6 avec celle engendrée par cette agression sur la culture cellulaire selon l'invention. Le procédé de l'invention ainsi défini, qui peut être mis en #uvre pour les utilisations qui ont précédemment été décrites de l'invention, permet notamment d'identifier des substances ayant une affinité pour la sous-unité alpha6, et interagissant dans la transmission nicotinique et la transmission dopaminergique de façon sélective par fixation aux récepteurs comportant la sous-unité alpha6 par le biais de cette sous-unité. Ce procédé est particulièrement intéressant pour étudier l'interaction des drogues à dépendance avec la sous-unité alpha6 du nAchR et en particulier pour étudier leur sélectivité vis-à-vis de populations neuronales identifiées. La détection de la variation éventuelle du niveau de la dopamine libérée dans le striatum d'un animal selon l'invention peut être faite par des techniques connues et notamment par les techniques décrites dans les exemples qui suivent. Par exemple, on détectera à l'issue de la mise en oeuvre du procédé, la variation, en particulier l'augmentation, du niveau de dopamine libérée, par rapport au niveau basal de dopamine, détecté chez un animal exprimant normalement la sous-unité alpha6 du récepteur nAChR. Lorsque la mutation de la sous-unité alpha6 est conditionnelle ou inductible, le niveau basal de dopamine libérée recherché peut être détecté préalablement à l'induction de la mutation et comparé ultérieurement avec le niveau de dopamine chez le même animal chez lequel la mutation aura été induite. Dans ce cas, la mesure du niveau de dopamine libérée est effectuée par microdialyse (Marshall D. et al., J. Neurochem, 1997.68(4) : p. 1511-9). Dans un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, les substances testées sont des substances dont on recherche l'affinité sélective pour les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine restreints aux neurones dopaminergiques. Selon un mode de réalisation préféré du procédé de l'invention, les substances testées sont des substances ayant une affinité pour les récepteurs nAChR comportant une sous-unité alpha6 dont on recherche la sélectivité vis-àvis de cette sous-unité, le procédé comprenant : - a) la mise en contact de la substance sélectionnée avec un mammifère non-humain défini ci-dessus, dans des conditions permettant l'interaction entre ladite substance et les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine, - b) la détection du niveau de dopamine libérée dans le striatum, - c) la comparaison du niveau de dopamine libérée dans le striatum à l'étape b), avec le niveau de dopamine libérée dans le striatum de mammifère non-humain, exprimant la sous-unité alpha6 du nAChR. Selon un autre mode de réalisation, ce procédé comprend : - a) la mise en contact de la substance sélectionnée avec une préparation de synaptosomes définie selon l'invention, dans des conditions permettant l'interaction entre ladite substance et les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine, - b) la détection du niveau de dopamine libérée, - c) la comparaison du niveau de dopamine libérée détecté à l'étape b) avec le niveau de dopamine libérée dans une préparation de synaptosomes de mammifère non-humain exprimant la sous-unité alpha6 du nAChR. Selon un autre mode de réalisation, ce procédé comprend : - a) la mise en contact de la substance sélectionnée avec une culture cellulaire définie selon l'invention, dans des conditions permettant l'interaction entre ladite substance et les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine, - b) la détection du niveau de dopamine libérée, - c) la comparaison du niveau de dopamine libérée détecté à l'étape b) avec le niveau de dopamine libérée dans une culture cellulaire exprimant la sous-unité apha6 du nAChR. Dans un mode de réalisation particulier des procédés de criblage selon l'invention, les mammifères non-humains, les préparations de synaptosomes, ou les cultures cellulaires sont des contrôles de l'interaction de substances sélectionnées, avec la sous-unité alpha6 des récepteurs nAChR et ces procédés comprennent une étape dans laquelle l'effet de la substance testée sur la sousunité alpha6 est déterminé sur un animal de type sauvage pour l'expression de ladite sous-unité alpha6 ou sur une préparation de synaptosomes d'un tel animal ou sur une culture cellulaire exprimant normalement cette sous-unité. L'invention a également pour objet, les substances identifiées à l'issue d'un procédé de criblage selon l'invention, ainsi que leur utilisation pour la préparation de compositions notamment à visée thérapeutique. L'invention concerne par ailleurs des vecteurs et en particulier des plasmides comportant tout ou partie du gène codant pour la sous-unité alpha6 du récepteur nAChR, notamment des vecteurs portant un gène muté de la sous-unité alpha6, ces vecteurs pouvant constituer notamment des moyens pour la préparation des constructions destinées à la réalisation des animaux selon l'invention. A cet égard, des plasmides particulièrement intéressants sont ceux sélectionnés parmi les plasmides suivants déposés à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Paris, France) : a6HN : CNCM N 1-2500 déposé le 22 juin 2000 a6EH : CNCM N 2501 déposé le 22 juin 2000 a6EE : CNCM N 2502 déposé le 22 juin 2000 a6PP : CNCM N 2503 déposé le 22 juin 2000 a6KO : CNCM N 2550 déposé le 29 août 2000, ou le chromosome artificiel bactérien (BAC) désigné a6BAC, déposé à la CNCM sous le n I-2504, le 22 juin 2000. L'invention a également pour objet une séquence de nucléotides contenue dans un des plasmides identifiés ci-dessus ou dans le chromosome artificiel bactérien identifié également précédemment. Une séquence de nucléotides préférée selon l'invention est définie en ce qu'elle comprend tout ou partie des enchaînements représentés dans les figures 2, 3, 4, 5 ou 6 et en particulier les enchaînements séquences de ces figures. L'invention concerne également les fragments de ces séquences et notamment les exons identifiés du gène codant pour la sous-unité alpha6 du nAChR. L'invention concerne par ailleurs des cellules recombinantes comprenant une séquence nucléotidique telle qu'identifiée précédemment ou un vecteur la contenant. Des cellules recombinantes particulièrement intéressantes sont les cellules neuronales et en particulier les neurones dopaminergiques ou les cellules dérivées de la région mésencéphalique du cerveau des animaux selon l'invention. D'autres caractéristiques et propriétés de l'invention apparaissent dans les exemples qui suivent. Légende des figures Figure 1 Ciblage du gène de la sous-unité alpha6 du récepteur neuronal nAChR. a) Structure génomique du gène de la sous-unité alpha6, incluant les exons 1 à 6, ainsi que la structure du vecteur de transfert. Sites de restriction : E, EcoRI ; H, Hindlll ; S, Slal ; P, Pstl ; N, Notl. Le site Notl indiqué entre parenthèses est dans le phage utilisé pour la construction du vecteur, il est absent de l'allèle de type sauvage. Les fragment EcoRI-EcoRI de 5 kb et Hindlll-Notl de 4,6 kb utilisés pour construire les bras d'homologie, sont montrés au-dessus de l'allèle de type sauvage (WT). Le vecteur de recombinaison a été utilisé pour obtenir une mutation par remplacement ; et il contient un gène de résistance à la néomycine (neo) comme marqueur de sélection positif et un gène de la toxine diphérique (DTA) comme marqueur de sélection négatif. Après recombinaison homologue, une délétion de 4 kb incluant les exons 1 et 2 a été formée. Les fragments d'ADN digéré par Pstl, détectés par la sonde Sall-Spel sont indiqués par des lignes en pointillés. b) analyse Southern blot identifiant les animaux de type alpha6 homozygotes nuls (-/-), hétérozygotes (+/-) et de type sauvage (+/+). Figure 2 : A : Carte de restriction du chromosome artificiel bactérien désigné a6BAC (CNCM I-2504, déposé le 22 juin 2000). Le bac contient environ 130 kb d'insert provenant d'une banque d'ADN de souris de la lignée 129Sv. Cet insert correspond au locus de la sous-unité alpha6 du récepteur nicotinique de l'acétylcholine. B : Séquence de l'insert de 13 kb, orientée dans le sens de la transcription. Figure 3 : A : Carte de restriction du plasmide a6HN (CNCM I-2500, déposé le 22 juin 2000). Le plasmide a6HN est constitué d'un vecteur KS-Bluescript et d'un insert de 4,6 kb, cloné dans les sites Hindlll, Notl, provenant du gène de la sousunité alpha6 du récepteur nicotinique de l'acétylcholine de souris (ADN provenant de la souche SV/D3 de cellules ES). Ce fragment contient notamment les exons 3 à 5 de la sous-unité alpha6. (Sens de transcription : Hindlll vers Notl). B : Séquence de l'insert de 4,6 kb. Les exons 3,4 et 5 sont en majuscules. n représente des bases non séquencées. Figure 4 : A : Carte de restriction du plasmide a6EH (CNCM 1-2501, déposé le 22 juin 2000). Le plasmide a6EH est constitué d'un vecteur, SK et d'un insert de 4 kb, cloné dans les sites EcoRI-Hindlll. Cet insert est un fragment EcoRI-Hindlll du gène de la sous-unité alpha6 du récepteur nicotinique de l'acétylcholine de souris (ADN provenant de la souche 129 SV/D3 de cellules ES). Il contient notamment les deux premiers exons de la sous-unité alpha6. (Sens de transcription : EcoRI vers Hindlll). B : Séquence de l'insert de 4 kb. Les exons 1 et 2 sont en majuscules. n représente des bases non séquencées. Figure 5 : A : Carte de restriction du plasmide a6EE (CNCM I-2502, déposé le 22 juin 2000). Le plasmide a6EE est constitué d'un vecteur, SK-Bluescript et d'un insert de 5 kb, cloné dans le site EcoRI. Cet insert est un fragment EcoRI-EcoRI du gène de la sous-unité alpha6 du récepteur nicotinique de l'acétylcholine de souris (ADN provenant de la souche 129 SV/D3 de cellules ES). Il contient 5 kb de séquence non codante, immédiatement en amont de l'ATG d'alpha 6. Ces 5 kb de promoteur sont orientés dans le sens Sacl-Kpnl de SK. B : Séquence du fragment de 5 kb. Les sites de restriction apparaissent en majuscules. La séquence (EcoRI-EcoRI) est orientée de 5' vers 3' dans le sens de la transcription. n représente des bases non séquencées. Figure 6 : A : Carte de restriction du plasmide a6PP (CNCM I-2503, déposé le 22 juin 2000). Le plasmide a6PP est constitué par l'insertion d'un fragment Pstl-Pstl de 4,5 kb de la sous-unité alpha6 du récepteur nicotinique de l'acétylcholine de souris (ADN provenant de la souche 129 SV/D3 de cellules ES), dans le site Pstl du vecteur SK-Bluescript. Ces 4,5 kb de séquence appartiennent à la région promotrice d'a6. L'extrémité 3' de ce fragment se trouve à 3,9 kb en 5' de l'ATG du gène a6. B : Séquence du fragment de 4,5 kb, orientée dans le sens de la transcription. n représente des bases non séquencées. Figure 7 : A : Carte de restriction du plasmide a6KO (CNCM 1-2550, déposé le 29 août 2000) contenu dans des bactéries E. coli de la souche DH5a. Le plasmide est utilisé pour la recombinaison homologue dans le locus de la sous-unité alpha6 du récepteur nicotinique de souris. Ce plasmide est constitué d'un vecteur SK Bluescript et d'un insert de 12 kb. Cet insert contient deux bras d'homologie appartenant à la séquence du gène alpha6 de souris (4 kb et 5 kb) flanquant une cassette de résistance à la néomycine (3,3 kb). Une cassette d'expression de la toxine diphtérique est également incluse (1,4 kb). Figure 8 : des différents fragments de restriction a6PP, a6EE, a6EH, a6HN. Figure 9: Séquence du locus alpha6 de la sous-unité alpha6 de récepteur nAChR. Les exons sont en lettres capitales EXEMPLES : MATERIEL ET METHODE Préparation de souris knockout (souris mutantes pour le gène codant pour la sous-unité alpha6 des nAChR, l'expression sous forme fonctionnelle de la sousunité alpha6 du récepteur nAChR étant altérée). La plupart des protocoles, utilisés pour la préparation des souris knock-out sont décrits dans Laboratory Protocols for Conditional Gène Targeting..., Torres R. et Kühn R., édition Oxford University Press (1997). 1.1. Construction du vecteur de recombinaison: Une stratégie basée sur la PCR (Israel, D., A PCR Based method for high stringency screening of DNA libraries. Nucleic Acids Res., 1993. 21(11) : p. 2627- 31) a été utilisée pour cribler une banque d'ADN génomique de souris préparée à partir d'une souche de cellules embryonnaires (cellules ES) de la lignée 129SV/D3. D'autres souris disponibles commercialement (Janvier, Charles River) peuvent être utilisées. Quoi qu'il en soit, il est préférable d'utiliser la même lignée que celle dont dérivent les cellules ES utilisées pour la recombinaison homologue. Des oligonucléotides ont été choisis dans la séquence de l'ADNc de la sous-unité alpha6 du rat. Amorce amont (Forward primer) : 5'ACTGCTGTGAAGAGATTTACACA3' Amorce reverse (Reverse primer) : 5'AAGATGGTCTTCACCCACTTG3' Ce criblage a permis d'isoler un phage contenant approximativement 17 kb du gène de la sous-unité alpha6 du récepteur nitcotinique de l'acétylcholine (a6 nAChR). Une cartographie de restriction et un séquençage partiel ont permis de déterminer la position des cinq premiers exons. Le sixième exon était en dehors de la séquence clonée (voir figure 1). Un vecteur de recombinaison, du type de remplacement, a ensuite été construit afin d'introduire une délétion de 4 kb dans le locus de la sous-unité alpha6, de façon à supprimer les exons 1 et 2. Pour préparer le vecteur de recombinaison, le fragment Hindlll-Notl de 4,6 kb et le fragment EcoRI-EcoRI de 5 kb ont été sous-clonés dans des plasmides KS bluescript de façon à générer des plasmides a6HN et a6EE (KS) Pour apporter de nouveaux sites de restriction, le fragment Spel-Xhol du plasmide a6EE a ensuite été sous-cloné dans un vecteur bluescript modifié, dont le polylinker avait été remplacé par Sacl-Sfil-Apal-Spel-Xhol-Xbal-Notl, pour constituer le plasmide a6EE (NS). Pendant ce temps, une cassette d'expression Neor a été introduite dans les sites Xhol-Hindlll de a6HN. Le fragment Xhol-Notl du plasmide résultant a ensuite été sous-cloné dans les sites Sal1-Not1 de a6EE (NS). Finalement, une cassette d'expression de la toxine diphtérique a été introduite dans le site Sali (de l'exon 5 de la sous-unité alpha6)-Notl de ce plasmide, réduisant ainsi la longueur d'homologie du bras droit à 2,5 kb. 1. 2 Transfection 107 cellules souches embryonnaires pluripotentes (cellules ES) dérivées de la lignée de souris 129sv/Pas (Kress C. et al, Nonpermissiveness for mouse embryonic stem (ES) cell derivation circumvented by a single backcross to 129/Sv strain: establishment of ES cell fines bearing the Omd conditional lethal mutation . Mamm Genome, 1998. 9(12):: p. 998-1001) ont été électroporés avec 20 g d'ADN de vecteur de recombinaison linéarisé avec Sca I, en utilisant un appareil d'électroporation Bio-Rad (250V, 500 F). Après 8 jours de sélection dans un milieu contenant l'antibiotique G418 (Gibco-BRL) (400 pg/ml), 200 colonies résistantes à l'antibiotique ont été prélevées et dissociées en trypsine pour être réparties sur des plaques de 96 puits. Après 2 jours de croissance, chaque clone était dissocié en trypsine et réparti sur deux puits d'une plaque de 48 puits. Le contenu de l'un de ces puits a été utilisé pour congélation alors que le contenu de l'autre a été réparti sur une plaque à 24 puits pour la préparation de l'ADN génomique. 1. 3. Criblage des clones de cellules ES recombinantes par Southern génomique a) Préparation de l'ADN Des puits à confluence de la plaque de 96 puits ont été lavés avec du PBS et incubés à 37 C pendant 12 heures avec 500 l de tampon de lyse cellulaire (100mM Tris-HCI pH8 : 5mM EDTA ; 0,2% SDS ; 200 mM NaCI, 100 g/ml proteinase K). L'ADN génomique a ensuite été récupéré avec une précipitation à l'éthanol et resuspendu dans 150 l d'eau. b) Digestion et transfert 50 l de cette préparation d'ADN génomique ont été utilisés pour la digestion avec 50 unités de Pstl pendant 6 heures à 37 C. Le produit de digestion a ensuite été chargé sur un gel d'agarose à 0,8% et soumis pendant 20 heures à une électrophorèse TAE à 40V. L'ADN digéré a été transféré sur une membrane de nylon (Hybon-N+. Amersham) par transfert Southern dans un tampon 20x SSC. L'accrochage de l'ADN à la membrane a été réalisé par exposition à une lumière UV pendant 5 minutes. c) Marquage de la sonde 25 ng de fragment Sall-Spel de 800 pb du gène alpha6 ont été marqués en utilisant un kit d'amorçage aléatoire de Amersham (RPN 1607). Cette sonde est localisée en 3' par rapport au bras droit d'homologie, à l'extérieur de la construction de ciblage. d) Hybridation et lavage Des membranes transférées ont été préhybridées pendant 30 minutes dans 40 ml de tampon d'hybridation (0,5 M NaHP04 (pH 7,6), 7% SDS, 0,1 mg/ml d'ADN de sperme de saumon), à 65 C. L'hybridation a été réalisée dans 10 ml du même tampon contenant 106 cpm/ml de la sonde dénaturée (3 min à 100 C) pendant 15- 20 heures à 65 C. Les membranes ont ensuite été lavées deux fois avec 0,1 SSC ; 0,1 % SDS et exposées dans une cassette de Phosphorlmager (Molecular Dynamics) pendant 24 heures, avant révélation. Cette sonde (fragment Sall-Spel) et cette enzyme de restriction (Pstl) ont permis de détecter deux bandes dans les clones recombinants : une bande de 8 kb correspondant à l'allèle de type sauvage, et une bande de 4 kb correspondant à l'allèle muté. Les trois clones de cellules ES recombinantes obtenus ont été multipliés et gardés sous forme congelée en petites aliquotes dans de l'azote liquide avant l'utilisation dans l'agrégation. 1. 4. Préparation de chimères Les chimères ont été obtenues en utilisant un protocole d'agrégation selon la publication de Khillan J. et Y. Bao, Preparation of animais with a high degree of chimerism by one-step coculture of embryonic stem cells and preimplantation embryos. Biotechniques, 1997. 22(3) p. 544-9), modifié : Une culture pendant une nuit dans un incubateur de culture cellulaire standard a permis à de petites quantités de cellules ES recombinantes d'agréger avec des embryons de préimplantation de type sauvage. Les agrégats s'étant développés sous forme de blastocytes ont été ensuite réimplantés chez des mères porteuses dans un état de pseudo gestation pour préparer des animaux chimères. a) Préparation de cellules ES Deux jours avant l'agrégation, un cryotube contenant 5.106 cellules ES a été utilisé pour ensemencer une boîte de 50 mm contenant du milieu de culture. Le jour suivant, les cellules ont été dissociées et déposées à différentes concentrations sur une plaque de 6 puits (plus particulièrement, des dilutions de 1/3,1/6, 1/12 et 1/24 ont été déposées sur la plaque de 50 mm initiale pour être utilisées dans les trois jours d'agrégation à venir). Le jour de l'agrégation, les cellules ES ont été soumises à une dissociation douce (4 min dans la Trypsin) de façon à générer de petits agrégats de cellules ES (4- 20). La trypsine a été inhibée par l'addition de milieux contenant du sérum. Après une dissociation douce en utilisant une pipette de 10 ml, les cellules ont été réparties sur une plaque de culture de tissus gélatinisée, et placées dans un incubateur pendant 20 minutes. Cette étape a permis de retirer de façon sélective, les fibroblastes nourriciers et les gros agrégats des cellules ES qui sédimentent plus rapidement. Le surnageant contenant les cellules ES a été récolté et gardé sur la glace pendant la préparation des embryons. b) Préparation d'embryons Cinq jours avant l'agrégation, des souris femelles âgées de 3 semaines (CD1 ou C57BI6 ont été superovulées par injection de 5 unités de PMS suivie 46 heures plus tard, par une injection de 5 unités de HCG (Intervet) puis accouplées avec des souris mâles âgées de deux mois de la lignée correspondante, Le., CD1 ou C57 B16. Le jour de l'agrégation, (2,5 jours pc), 9 souris superovulées ont été sacrifiées pour récupérer des embryons au stade morules, qui ont été conservées en milieu M2 (Sigma). On a alors retiré la zone pellucide par une incubation dans une solution de Tyrode (Sigma) : cette étape est réalisée à température ambiante, sous microscope. Dès la disparition de la zone pellucide, les embryons sont transférés dans des gouttes de milieu M2 afin de limiter leur exposition à la solution de Tyrode. c) Préparation des plaques d'agrégation On a placé 6 gouttes (5 NI) de milieu d'agrégation (50 % M16 + 50 % de milieu standard de cellules ES) sur une plaque de culture non traitée de 35 mm. Ces gouttes ont ensuite été couvertes avec de l'huile minérale pour éviter l'évaporation. En utilisant le bout d'une pince de dissection, on a préparé 6-8 petites dépressions (puits d'agrégation) dans chaque goutte. Chaque puits a reçu un petit agrégat de cellules ES (4-8 cellules pour les embryons de C5716 et 8-12 cellules pour les embryons de CD1) et une morule. On a pris soin de maximiser le contact entre les cellules et l'embryon pour permettre l'agrégation. La plaque a ensuite été placée dans un incubateur pendant une nuit. d) Réimplantation des agrégats Le jour suivant l'agrégation, 90% des agrégats s'étaient développés sous forme de blastocytes. Ces blastocytes ont ensuite été réimplantés dans l'utérus de souris B6D2 (2,5 pc) femelles en état de pseudogestation. 1. 5. Préparation de souris knockout homozygotes Pour chaque souche (C57BI6 ou CD1), un transmetteur de lignée germinale a été obtenu et croisé avec des souris B6D2/F1 ou CD1 (respectivement) pour une sélection par la couleur du pelage des nouveaux-nés résultants. Les nouveauxnés ayant une couleur Agouti ont ensuite été analysés par Southem genomique. La mutation a été transmise par croisement, à des souris C57BI/6J pour les expériences ultérieures. 2) Libération de dopamine à partir des synaptosomes striataux superfusés 2. 1. Préparation de synaptosomes Les striata de deux souris ont été rapidement disséqués sur la glace (poids total humide = 60 mg) et placés dans 10 vol de 0,32 M sucrose/ 5 mM HEPES pH7,5 refroidis sur glace. Les striata ont ensuite été homogénéisés dans un homogénéisateur verre/Teflon (15 coups à 900 tours/min). L'homogénat a été centrifugé à 1000g pendant 5 minutes à 4 C pour retirer les noyaux et les débris cellulaires. Le surnageant a ensuite été centrifugé à 12000 g pendant 20 minutes à 4 C. Le culot final, consistant en une préparation synaptosomale brute (P2) est resuspendu dans un tampon de superfusion (6 mg de poids tissulaire initial / ml). Le tampon de superfusion (SB) est composé ainsi (mM) : NaCl 128, Kcl 2,4, CaCl2 3,2, KH2P04 1,2, MgS04 0,6, HEPES (pH 7,5) 25, D-Glucose 10, L-acide ascorbique 1 et pargyline 0,1. 2. 2. Charge des synaptosomes en dopamine tritiée La préparation de synaptosomes a été incubée avec de la dopamine [3H] (100 nM) pendant 20 min à 37 C puis centrifugée à 12000g pendant 5 minutes. Le culot est resuspendu dans le tampon SB et chargé sur un filtre en fibres de verre A/E de 13 mm de diamètre (Gelman Sciences) sous vide léger. (Les synaptosomes striataux de 2 souris sont généralement suffisants pour 12 filtres). 2. 3. Superfusion L'appareil de superfusion est commercialement disponible (Brandel), il consiste en 6-20 canaux identiques. Chaque canal est constitué d'une chambre de rétention (vol=100 l) contenant les filtres qui portent des synaptosomes. Cette chambre est reliée, via un tube Tygon (diamètre intérieur = 1,14 mm), à une pompe péristaltique multicanaux (Masterflex) et à un dispositif de collecte de l'effluent. Le tampon de superfusion (SB) est pompé de façon continue à travers la chambre, à la vitesse de 500 l/min. Après une période de rinçage de 15 minutes, l'effluent a été collecté toutes les minutes, dans des fioles à scintillation contenant 5 ml de scintillant. Après 5 minutes de collecte, la drogue étudiée a été administrée pendant 1 minute et l'effluent collecté sur une nouvelle période de 10 minutes. Enfin, la quantité de dopamine tritiée libérée dans chaque échantillon a été mesurée au moyen d'un compteur à scintillation (Wallac 1214 Rackbeta). 2. 4. Analyse des données Le niveau de base de la libération de dopamine a été estimé en ajustant les données des 5 premiers échantillons collectés avant administration de la drogue avec une courbe de décroissance exponentielle (y = a.exp(-bt)). Le pic de libération a alors été défini comme étant le maximum du rapport 100 x (Dopamine mesurée - ligne de base)/ligne de base pour les 10 échantillons consécutifs à l'administration de drogue. Cette méthode de calcul permet de s'affranchir des problèmes liés aux différences dans la quantité totale de radioactivité présente sur chaque filtre. REVENDICATIONS 1. Mammifère non-humain, porteur d'une mutation dans le gène codant pour la sous-unité alpha6 du récepteur nicotinique de l'acétylcholine (nAChR), ladite mutation empêchant l'expression chez le mammifère de ladite sous-unité alpha6 du nAChR sous une forme fonctionnelle. 2. Mammifère non-humain selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gène codant pour la sous-unité alpha6 du nAChR est muté par délétion de tout ou partie de ses exons. 3. Mammifère non-humain selon la revendication 2, caractérisé en ce que le gène codant pour la sous-unité alpha6 du nAChR est muté par délétion d'au moins une partie de l'exon 1 et/ou de l'exon 2, cette délétion étant suffisante pour empêcher, au niveau de la sous-unité alpha6 du nAChR exprimé chez le mammifère, la liaison de ladite sous-unité alpha6 du nAChR avec ses agonistes et/ou ses antagonistes. 4. Mammifère non-humain selon la revendication 3, caractérisé en ce que le gène codant pour la sous-unité alpha6 du nAChR est muté par délétion des exons 1 et 2. 5. Mammifère non-humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la mutation du gène codant pour la sous-unité alpha6 du nAChR est homozygote et conduit à l'absence d'expression de la sous-unité alpha6, ledit mammifère ayant un phénotype ([alpha]6-/-). 6. Mammifère non-humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la mutation du gène codant pour la sous-unité alpha6 du nAChR est homozygote, ledit mammifère ayant un phénotype ([alpha]6#1-2/#1-2). 7. Mammifère non-humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la mutation du gène codant pour la sous-unité alpha6 du nAChR est inductible. 8. Mammifère non-humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une souris. 9. Mammifère non-humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que son gène codant pour la sous-unité alpha6 du nAChR est muté par recombinaison homologue avec la séquence contenue dans la souche E. coli déposée à la CNCM sous le numéro I-2550, le 29 août 2000. 10. Mammifère non-humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que son gène de la sous-unité alpha6 est muté de façon hétérozygote. 11. Culture cellulaire obtenue à partir des cellules d'un mammifère nonhumain selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'il s'agit de cellules neuronales. 12. Culture cellulaire selon la revendication 11, caractérisée en ce que les cellules sont des neurones mésencéphaliques. 13. Préparation obtenue à partir des cellules d'un mammifère non-humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'il s'agit de synaptosomes striataux. 14. Utilisation d'un mammifère non-humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou d'une culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 11 à 12 ou d'une préparation selon la revendication 13, pour étudier les effets de substances déterminées, sur les récepteurs nicotiniques. 15. Utilisation selon la revendication 14 pour étudier les effets de drogues à dépendance, sur les récepteurs nicotiniques. 16. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15 pour déterminer l'effet d'agonistes de récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (nAchR) sur la libération de dopamine. 17. Utilisation d'un mammifère non-humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou d'une culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 11 à 12 ou d'une préparation selon la revendication 13, pour le criblage de substances agonistes ou antagonistes des nAchR. 18. Utilisation d'un mammifère non-humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou d'une culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 11 à 12 ou d'une préparation selon la revendication 13, pour le criblage de substances agonistes ou antagonistes des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine des neurones catécholaminergiques ou dopaminergiques. 19. Procédé pour le criblage de substances susceptibles d'interagir avec la sous-unité alpha6 du nAChR, sélectionnées parmi les substances interagissant avec les nAChR, comprenant : - la mise en contact de la substance sélectionnée avec un mammifère non-humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou avec une culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 11 à 12, ou d'une préparation selon la revendication 13 dans des conditions permettant l'interaction entre ladite substance et les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine, - la détection du niveau de dopamine libérée, cette détection étant réalisée dans le striatum lorsqu'un mammifère non-humain est utilisé. 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que les substances testées sont des agonistes nicotiniques des nAChR ou des antagonistes des nAChR. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 ou 20 dans lequel les substances testées sont sélectionnées dans le groupe des drogues nicotiniques sélectives vis à vis des neurones dopaminergiques. 22. Procédé pour l'identification de substance ayant une affinité pour la sous-unité alpha6 des nAChR, sélective vis-à-vis des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine restreints aux neurones dopaminergiques, comprenant : - la mise en contact de la substance sélectionnée avec un mammifère non-humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou avec une culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 11 à 12 ou d'une préparation selon la revendication 13, dans des conditions permettant l'interaction entre ladite substance et les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine, - la détection du niveau de dopamine libérée, cette détection étant réalisée dans le striatum lorsqu'un mammifère non humain est utilisé. 23. Procédé selon la revendication 22 pour l'identification de substances ayant une affinité sélective pour les récepteurs nAChR comportant une sous-unité alpha6, comprenant : - a) la mise en contact de la substance testée ayant une activité de liaison aux récepteurs nAChR, avec un mammifère non-humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou avec une culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 11à 12 ou d'une préparation selon la revendication 13, dans des conditions permettant l'interaction entre ladite substance et les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine, - b) la détection du niveau de dopamine libérée, cette détection étant réalisée dans le striatum lorsqu'un mammifère non-humain est utilisé, - c) la comparaison de l'augmentation du niveau de dopamine libérée dans le striatum à l'étape b), avec le niveau de dopamine libérée dans le striatum de mammifère non-humain ou de cultures cellulaires, exprimant la sous-unité alpha6 du nAChR. 24. Plasmide contenant tout ou partie du gène codant pour la sous-unité alpha6 du récepteur nicotiniques de l'acétylcholine de souris, sélectionné parmi les plasmides suivants déposés à la CNCM : a6HN : CNCM N I-2500 déposé le 22 juin 2000 a6EH : CNCM N 1-2501 déposé le 22 juin 2000 a6EE : CNCM N I-2502 déposé le 22 juin 2000 a6PP : CNCM N I-2503 déposé le 22 juin 2000 a6KO : CNCM N I-2550 déposé le 29 août 2000, ou le chromosome artificiel bactérien (BAC) désigné a6BAC, déposé à la CNCM sous le n I-2504, le 22 juin 2000. 25. Séquence de nucléotides caractérisée en ce qu'il s'agit d'une séquence du gène codant pour la sous-unité alpha6 du récepteur nAChR, contenue dans un plasmide sélectionné parmi a6HN (CNCM, 1-2500), a6EH (CNCM 1-2501), a6EE (CNCM, I-2502), a6PP (CNCM, I-2503), a6KO (CNCM, I-2550) ou dans le chromosome artificiel bactérien a6BAC (CNCM, I-2504). 26. Séquence de nucléotides sélectionnée parmi les enchaînements représentés par les séquences SED ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 6 ou toute partie de ces enchaînements correspondant à un fragment séquence du gène de la sous-unité alpha6 du nAChR. 27. Cellules recombinantes, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 24 à 26. 28. Cellules recombinantes selon la revendication 27, caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules neuronales du groupe des neurones dopaminergiques. 29. Cellules recombinantes selon la revendication 28, caractérisées en ce qu'elles sont dérivées de la région mésencéphalique du cerveau de souris. 30. Procédé de criblage de substances susceptibles d'interagir avec la sous-unité alpha6 du nAChR, sélectionnées parmi les substances interagissant avec les récepteurs nAChR, comprenant : - la mise en contact de la substance sélectionnée avec une culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12, dans des conditions permettant l'interaction entre ladite substance et les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine, - l'application d'une agression à cette culture cellulaire, - l'observation de l'effet neuroprotecteur de cette substance sur cette culture vis-à-vis de cette agression. 31.Substances obtenues à l'issue d'un procédé de criblage selon l'une quelconque des revendications 19 à 23 ou 30.