Brevet FR2809309A1 — publié le 20011130

La présente invention concerne le domaine des microparticules destinées à être administrées par voie injectable, sous-cutanée ou intramusculaire. Il existe à l'heure actuelle un besoin de formulations pharmaceutiques à libération prolongée, destinées à l'administration de protéines par voie injectable, qui soient dépourvues de toute trace de solvants organiques. Des efforts intenses doivent être réalisés pour développer de nouveaux systèmes efficaces d'administration de protéines. Toutes les techniques classiques de préparation de systèmes microparticulaires injectables à libération contrôlée, que ce soit la préparation de microcapsules par la méthode d'émulsion (huile/eau)/évaporation de solvant (Hora et al., Pharm. Res., 7 (1990), 1190-1194 ; Jalil, R. et al., L Microencapsulation, 7 (1990) 294-325), de coacervation en phase organique (Ruiz et al., Pharm. Res., 7 (1990) 928-934 ; Mc Gee, J. P. et al., J. Controlled Release, 34 (1995) 77-86) ou par la technique de double émulsion (eau/huile/eau)/évaporation de solvant (Ogawa, Y et al., Chem. Pharm. Bull., 36 (1988) 1095-1103) conduisent à l'utilisation de solvants organiques. Ceux-ci nécessitent des étapes de contrôle et de dosage précis des taux de solvants résiduels afin de limiter ces taux et d'éviter tout effet secondaire nuisible au patient De plus, les autorités gouvernementales mettent en place des normes sévères pour éviter la contamination de l'environnement avec les solvants organiques inhérents aux procédés de production et limiter voire supprimer l'emploi de solvants organiques dans les compositions pharmaceutiques. Enfin, dans les formulations de protéine, des problèmes de dénaturation induits par le contact avec les solvants et des phénomènes indésirables d'adsorption aux interfaces solvants/eau peuvent apparaître. La présente invention a pour objet des microsphères destinées à être administrées par voie injectable comprenant un principe actif protéique et un agent enrobant le principe actif destiné à prolonger sa libération. Les microparticules selon l'invention, contenant un principe actif protéique, se distinguent des microparticules de l'art antérieur par leur structure matricielle et par l'absence de toute trace de solvant organique Les microparticules selon l'invention sont dépourvues de toute trace de solvant organique et elles sont susceptibles d'être obtenues selon un procédé d'enrobage impliquant la mise en contact sous agitation du principe actif et de l'agent enrobant dans un fluide- supercritique, ledit agent enrobant étant soluble dans le fluide supercritique. Le principe actif protéique est quant à lui insoluble dans le fluide supercritique. La taille moyenne des microparticules selon l'invention est comprise entre 0,1 et 150 m Leur teneur en principe actif est comprise entre 0,5 et 50 % en poids, de préférence entre 3 et 20 % en poids Il a été mis en évidence que la mise en #uvre d'un procédé de préparation de microparticules par une technique utilisant un fluide supercritique et un agent enrobant soluble dans ce fluide permet d'obtenir des microsphères aux propriétés avantageuses. La demande EP 706 821 décrit l'enrobage de substances actives particulaires dans le cas où l'agent enrobant utilisé est soluble dans le CO2 supercritique. Après solubilisation dans le C02 supercritique, l'agent enrobant est mis en contact avec la protéine à enrober dans un réacteur fermé sous agitation. Des modifications de pression et de température dans celui-ci conduisent à la désolvatation de l'agent enrobant et donc à sa précipitation sur la substance active Cette méthode ne fait intervenir ni solvant organique, ni eau, et est réalisée à relativement basse température. Plus précisément, les particules de substance active sont mises en suspension dans le C02 supercritique, puis l'agent enrobant est dissous dans la suspension. La pression et/ou la température sont ensuite diminuées de façon contrôlée pour réduire la solubilité de l'enrobant dans le fluide supercritique et provoquer le dépôt de l'enrobant à la surface des particules de substance active. La couche d'enrobage peut être monomoléculaire ou atteindre jusqu'à 100 m d'épaisseur. La taille des particules encapsulées est comprise entre 20 nm et 500 m. L'enrobant est un corps gras ou un polymère biodégradable soluble dans le C02 supercritique. Le dépôt de l'enrobant est effectué entre 30 et 80 C, entre 70 et 250 bars pendant 30 minutes à 4 heures, sous agitation. La mise en #uvre du procédé selon l'invention consiste à mettre un principe actif en suspension sous agitation dans un fluide supercritique contenant au moins un agent enrobant dissous dans celui-ci, puis à modifier les conditions de pression et/ou de température du milieu pour assurer la coacervation des particules, par désolvatation de l'agent enrobant autour des particules de principe actif, c'est-à-dire assurer la coacervation des particules par modification physico-chimique du milieu. Ce procédé conduit à des microparticules matricielles contenant plusieurs particules de principe actif protéique. Il a été découvert dans le cadre de la présente invention qu'en adaptant la valeur de certains paramètres du procédé, notamment la teneur en principe actif équivalent au ratio principe actif/agent enrobant, le mode d'agitation, et le ratio agent enrobant/fluide supercritique, on obtient des microsphères aux propriétés avantageuses présentant une structure matricielle. Le fluide supercritique préférentiellement utilisé est le C02 supercritique (C02SC), les conditions de fonctionnement initiales typiques de ce procédé sont d'environ 31 à 80 C et de 75 à 250 105 Pa, bien que l'on puisse utiliser des valeurs plus élevées de l'un ou l'autre des deux paramètres ou les deux, à condition bien sûr que les valeurs plus élevées n'aient aucun effet nuisible ou de dégradation sur le principe actif en cours de revêtement, ni sur les agents enrobants. Ce procédé implique la mise en suspension dans un autoclave, d'un principe actif non soluble dans le fluide supercritique, puis l'introduction dans cet autoclave de l'agent enrobant qui se trouve à l'état de soluté dans le fluide supercritique. La pression et/ou la température sont ensuite modifiées de manière à diminuer la solubilité de l'agent enrobant dans le fluide. Ainsi l'affinité de l'agent enrobant pour le principe actif s'accroît de façon telle que cet enrobant s'adsorbe autour du principe actif Une fois cet agent enrobant déposé sur le principe actif, l'autoclave est dépressurisé et les microparticules sont récupérées. Pour mettre en #uvre ce procédé, on place le principe actif à revêtir dans un autoclave équipé d'un agitateur, puis on pressurise le système en introduisant dans l'autoclave un fluide amené dans des conditions supercritiques. Finalement, on introduit le ou les agents enrobants dans l'autoclave, puis on modifie la température et/ou la pression à l'intérieur de l'autoclave d'une manière contrôlée et régulée de sorte à réduire progressivement la solubilité du ou des agents enrobants. Lorsque la solubilité de ce ou ces agents enrobants dans le fluide supercritique diminue, il(s) précipite(nt) et l'affinité de ces agents pour la surface du principe actif conduit à leur adsorption sur cette surface. Une variante de ce procédé consiste à placer l'agent enrobant dans l'autoclave avant d'y introduire le principe actif ou encore en y introduisant le principe actif puis un fluide susceptible de passer à l'état supercritique. La pressurisation de l'autoclave pour produire un état de fluide supercritique provoquera alors la dissolution de l'agent enrobant dans ledit fluide supercritique. Les vitesses d'agitation peuvent varier entre 200 et 1000 tours/min, de préférence 450 t/min. Une telle agitation assure la mise en suspension du principe actif dans le fluide supercritique lorsque celui-ci est introduit. Les conditions supercritiques sont assurées par une modification de la température et/ou de la pression à l'intérieur de l'autoclave. Ainsi, la température de l'autoclave est comprise entre 35 et 80 C, de préférence entre 35 et 45 C et la pression est comprise entre 100 et 250 105 Pa et de préférence entre 180 et 220 105 Pa. L'agent enrobant est introduit dans l'autoclave en même temps que le fluide supercritique ou bien après l'introduction dans l'autoclave du fluide supercritique En tous les cas pour assurer une bonne solubilisation de l'agent enrobant dans le fluide supercritique, on maintient le système à l'équilibre sous agitation, on établit la concentration adéquate en principe actif et en agent enrobant en fonction de la microparticule voulue et on laisse cet équilibre sous agitation pendant une heure environ. On module ensuite la température et la pression à une vitesse suffisamment lente pour transférer complètement le ou les agents enrobants du fluide supercritique à la surface du principe actif et on dépressurise le système pour isoler les microparticules que l'on retire de l'autoclave. La concentration en agent enrobant dans le fluide supercritique est de préférence comprise entre 1,5 et 4,5 g/l, de préférence égale à 2 g/l. Selon un mode de mise en #uvre préféré de l'invention, un insert cylindrique est placé dans l'autoclave, et est vissé au couvercle avant fermeture. Le fluide subcritique est de préférence introduit par la partie haute de l'insert après fermeture de l'autoclave. Cet insert est avantageusement équipé de deux frittages permettant l'entrée et la sortie du fluide supercritique. L'insert est de préférence pourvu d'un frittage annulaire dans sa partie haute, et d'un frittage discoïde constituant le fond dudit insert Les deux frittages ont avantageusement une porosité inférieure à la taille des microsphères que l'on souhaite préparer. L'insert permet de recueillir les microsphères contenant le principe actif. En fin de procédé il est dévissé et déplacé, éventuellement dans une enceinte contenant un gaz inerte lorsque le principe actif protéique est sensible à l'humidité, et est renversé afin de recueillir les microsphères. Il permet l'utilisation d'un gaz inerte propulseur pour faciliter la récupération des microsphères contenant le principe actif lorsque ledit principe actif est sensible à l'humidité. L'agent enrobant entrant dans la composition des microsphères de l'invention, éventuellement choisi pour la mise en oeuvre de leur procédé de préparation, peut être un polymère biodégradable ou un corps gras L'agent enrobant est particulièrement choisi parmi - les polymères et copolymères biodégradables des acides [alpha]- hydroxycarboxyliques, notamment les homopolymères et copolymères des acides lactiques et glycoliques, plus particulièrement le PLA (Poly-Llactide) et le PLGA (Poly-Lactic-co-Glycolic-Acid), - la poly (8-caprolactone) et ses dérivés, les poly(phydroxybutyrate), poly(hydroxyvalérate) et les copolymères (sshydroxybutyrate-hydroxyvalérate), le polyacide maliquè, les polymères-blocs amphiphiles de type polyacide lactiquepolyoxyde d'éthylène, les polymères biocompatibles de type polyéthylène glycol, polyoxydes d'éthylène, les copolymères-blocs de type polyoxydes d'éthylène-polyoxydes de propylène, les polyanhydrides, les polyorthoesters, les polyphosphazènes, et leurs mélanges Ces polymères, choisis pour être des agents enrobants efficaces, présentent une masse molaire supérieure à 103 g/mole, de préférence supérieure à 2.103 g/mole et plus particulièrement comprise entre 2.103 et 2.105 g/mole. On choisit le polymère de telle sorte qu'il soit soluble dans le fluide supercritique, en adaptant notamment la granulométrie, la cristallinité, la masse moléculaire en poids, la composition chimique, la fonctionnalisation des groupes latéraux et/ou terminaux et l'indice d'acide. Tous ces paramètres sont ajustés pour obtenir la solubilité souhaitée du polymère dans le fluide supercritique et/ou obtenir le profil de libération souhaité du principe actif protéique L'agent enrobant est également choisi parmi les corps gras tels que les phospholipides, notamment la phosphatidylchline le phosphatidylglycérol, le diphosphatidylglycérol, la dipalmitoyl- phosphatidylcholine, la dioléyl-phosphatidylétanolamine, la dioléylphosphatidylcholine, le dimyristoyl-phosphatidylglycérol, ou les triglycérides, notamment les triglycérides en C8 à C12 comme les triglycérides des acides capriques et capryliques, les esters d'acide gras solides, notamment les esters d'acides gras en C8 à C18 comme le palmitate d'éthyle, le myristate d'éthyle, le myristate d'octyldodécyle, de préférence les esters d'acide gras en Cs à C12 et leurs mélanges. L'agent enrobant peut être également un mélange d'un des polymères et d'un des corps gras précédemment cités. Un agent enrobant particulièrement préféré dans le cadre de la présente invention est un Gélucire# (mélange -de mono-, di- et triglycérides, d'esters d'acide gras et de polyéthylène glycol) Selon un mode de mise en #uvre préféré, l'agent enrobant est un Gélucire, la température de l'autoclave est de l'ordre de 45 C, la pression de l'autoclave est de l'ordre de 200 bars et la vitesse d'agitation est de l'ordre de 450 t/min. Le principe actif protéique peut être une protéine ou un peptide. Les protéines entrant dans le cadre de la présente invention sont choisies parmi la protéine correspondant à l'hormone parathyroïde ("Parathyroïd hormone related protein"), l'hormone de croissance ("Growth hormone", GH), les interférons [alpha], ss ou y, l'érythropoiétine a ou (3 (EPO), le facteur stimulateur de colonies de granulocytes ("Granulocyte colony stimulating factor", GCSF), le facteur stimulateur de colonies macrophages de granulocytes ("Granulocyte macrophage colony stimulating factor", GMCSF), le polypeptide PACAP ("Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide"), le peptide vasoactif intestinal ("Vasoactive intestinal peptide", VIP), l'hormone libératrice de thyrotropine ("Thyrotropin releasing hormone", THR), l'hormone libératrice de thyrotropine ("Corticotropin releasing hormone", CRH), l'arginine vasopressine (AVP), l'angiotensine, l'insuline, la somatotropine, l'antigène HBS du virus de l'hépatite B, l'activateur de tissu plasminogène, les facteurs de coagulation VIII et IX, la glucosylcéramidase, la sargramostime, la lénograstine, la filgrastine, l'interleukine 2, la dornase a, la molgramostime, la PEG-L-asparaginase, la PEG-adenosine deaminase, l'hirudine, l'eptacog a (facteur Vlla de coagulation du sang humain) et les facteurs de croissances nerveuses (NGF, CNTF, BDNG, FGF, GDNF). Une protéine particulièrement préférée dans le cadre de l'invention est l'érythropoiétine, une hormone protéique glycosylée qui a une action de facteur de croissance hématopoiétique. Elle est produite par génie génétique sous le nom d'époétine, et utilisée en clinique pour maintenir ou élever le taux de globules rouges du patient. Elle est indiquée dans les cas d'anémie, lors de l'hémodialyse d'insuffisants rénaux chroniques, en parallèle à une chimiothérapie, chez les malades HIV ou avant une intervention chirurgicale. Le traitement nécessite au moins trois injections par semaine. Une autre protéine particulièrement préférée dans le cadre de l'invention est l'interféron alpha Son spectre d'action est très large puiqu'il est utilisé à la fois pour ses propriétés antivirales, anticancéreuses et immunomodulatrices. Il est notamment utilisé pour le traitement de l'hépatite B, l'hépatite C, certaines leucémies et le syndrome de Kaposi. Le traitement comprend trois injections par semaine pendant 6 à 12 mois. Des peptides, comme les dérivés de la LHRH ou de la somatostatine, la triptoréline, la bombésine, la calcitonine, l'hormone parathyroïde, le peptide libérateur de gastrine ("Gastrine releasing peptide", GRP), l'hormone libératrice d'hormone lutéinisante ("Luteinizing hormone releasing hormone", LHRH), le facteur libérateur d'hormone de croissance ("Growth hormone releasing factor", GRF), le dérivé de peptide Acétyl-Ser-Asp-Lys-Pro et l'amyline peuvent également être utilisés comme principe actif dans le cadre de la présente invention. La taille des particules de principe actif protéique entrant dans la composition des microsphères est comprise entre 20 nm et 60 m, de préférence entre 15 et 50 m. La figure 1 est une photographie au microscope optique de trois microsphères obtenues selon l'exemple 1 La figure 2 permet de mettre en évidence la structure matricielle des microsphères de la figure 1. Après ajout de quelques gouttes de dichlorométhane (solvant de l'agent enrobant), une quinzaine de cristaux de BSA (insoluble dans le dichlorométhane) sont visibles. La figure 3 est une photographie au microscope optique de particules d'érythropoïétine utilisés dans l'exemple 2, avant leur enrobage. La figure 4 est une photographie au microscope optique d'une microsphère contenant des particules d'érythropoïétine obtenue selon l'exemple 2. La figure 5 permet de mettre en évidence la structure matricielle de la microsphère de la figure 4 Après l'ajout de quelques gouttes de dichlorométhane (solvant de l'agent enrobant), trois cristaux d'érythropoïétine sont visibles. Exemple 1 : Microsphères de Gélucire 50/02 contenant la protéine modèle albumine de sérum bovin (BSA) Matériel Autoclave de 300 ml muni d'un insert de volume 180 ml, poreux (10 m) en haut et en bas Autoclave muni d'une double enveloppe pour la régulation de température : circulation d'huile de silicone, chauffée ou refroidie par un bain thermostaté. Agitation dans l'autoclave : moteur régulé par contrôle PID, axe avec un mobile à deux pales en forme d'ancre marine. Produits BSA Fraction V (Sigma A-7906) broyée au mortier et tamisée. Fraction 32 à 50 m : 118,45 mg Gélucire# 50/02 (Gattefossé) masse cireuse réduite en copeaux à la spatule : 452,8 mg Procédure Les deux produits sont placés au fond de l'insert. L'autoclave est fermé et mis sous agitation à 495 t/min. Les séquences successives de formation des microsphères sont alors les suivantes : - injection de C02 par équilibration avec le réservoir puis la colonne jusqu'aux conditions initiales de 24,9 C (T bas) et 99 bars. - chauffage de l'autoclave par circulation d'eau chaude dans la double enveloppe Le chauffage est régulé par PID; -Durée du chauffage 34 min. - maintien à l'équilibre des paramètres température/pression à 45,1 C et 183 bars. Ces conditions sont maintenues pendant 66 min, agitation 495 t/min. - refroidissement par circulation de fluide dans la double enveloppe. Durée 41 min, jusqu'à : T = 20 C, P = 79 bars. - décompression dans un récipient-tampon jusqu'à : T = 25 C, P atmosphérique. Durée = 7 min. Les particules enrobées sont recueillies dans l'insert On en recueille environ 150 mg Exemple 2 : Microsphères de Gélucire# 50/02 contenant une préparation commerciale d'érythropoïétine solide (Hémax#) Matériel Identique à celui utilisé dans l'exemple 1. Produits Hémax 2000 UI : 64 mg. Gélucire# 50/02 (Gattefossé) masse cireuse réduite en copeaux à la spatule : 259 mg. Procédure Les deux produits sont placés au fond de l'insert. L'autoclave est fermé et mis sous agitation à 460 t/min Les séquences successives de formation des microsphères sont alors les suivantes : - injection de CO2 par équilibration avec le réservoir puis la colonne jusqu'aux conditions initiales de T = 23 C, P = 100 bars. - chauffage de l'autoclave par circulation d'eau chaude dans la double enveloppe. Le chauffage est régulé par un système PID. Durée du chauffage 24 min. - stabilisation des température/pression à 45 C et 203 bars. Ces conditions sont maintenues pendant 65 min, agitation 460 t/min. - refroidissement par circulation de fluide dans la double enveloppe Durée 49 min, jusqu'à : T = 17 C, P = 74 bars - décompression par ouverture à l'évent jusqu'à : T = 25 C, P atmosphérique. Durée = 25 min. - récupération des particules sous atmosphère d'azote. On en récupère 150 à 160 mg. REVENDICATIONS 1. Microsphères destinées à être administrées par voie injectable sous cutanée ou intra-musculaire comprenant un principe actif protéique et un agent enrobant le principe actif destiné à prolonger sa libération, caractérisées en ce qu'elles sont dépourvues de toute trace de solvant organique et qu'elles sont susceptibles d'être obtenues selon un procédé d'enrobage impliquant la mise en contact sous agitation du principe actif et de l'agent enrobant dans un fluide supercritique, ledit agent enrobant étant soluble dans le fluide supercritique. 2. Microsphères selon la revendication 1, caractérisées en ce que leur taille moyenne est comprise entre 0,1et 150 m. 3. Microsphères selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce que leur teneur en principe actif est comprise entre 0,5 et 50 % en poids, de préférence entre 3 et 20 % en poids 4. Microsphères selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que le principe actif protéique est une protéine choisie parmi la protéine correspondant à l'hormone parathyroïde ("Parathyroïd hormone related protein"), l'hormone de croissance ("Growth hormone", GH), les interférons a, p ou y, l'érythropoiétine a ou ss (EPO), le facteur stimulateur de colonies de granulocytes ("Granulocyte colony stimulating factor", GCSF), le facteur stimulateur de colonies macrophages de granulocytes ("Granulocyte macrophage colony stimulating factor", GMCSF), le polypeptide PACAP ("Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide"), le peptide vasoactif intestinal ("Vasoactive intestinal peptide", VIP), l'hormone libératrice de thyrotropine ("Thyrotropin releasing hormone", THR), l'hormone libératrice de thyrotropine ("Corticotropin releasing hormone", CRH), l'arginine vasopressine (AVP), l'angiotensine, l'insuline, la somatotropine, l'antigène HBS du virus de l'hépatite B, l'activateur de tissu plasminogène, les facteurs de coagulation VIII et IX, la glucosylcéramidase, la sargramostime, la lénograstine, la filgrastine, l'interleukine 2, la dornase a, la molgramostime, la PEG-L- asparaginase, la PEG-adenosine deaminase, l'hirudine, l'eptacog a (facteur VIIa de coagulation du sang humain) et les facteurs de croissances nerveuses (NGF, CNTF, BDNG, FGF, GDNF). 5. Microsphères selon la revendication 4, caractérisées en ce que le principe actif est l'érythropoiétine. 6. Microsphères selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que le principe actif protéique est un peptide choisi parmi les dérivés de la LHRH ou de la somatostatine, la triptoréline, la bombésine, la calcitonine, l'hormone parathyroide, le peptide libérateur de gastrine ("Gastrine releasing peptide", GRP), l'hormone libératrice d'hormone lutéinisante ("Luteinizing hormone releasing hormone", LHRH), le facteur libérateur d'hormone de croissance ("Growth hormone releasing factor", GRF), le dérivé de peptide Acétyl-Ser-Asp-Lys-Pro et l'amyline. 7. Microsphères selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisées en ce que l'agent enrobant est choisi parmi - les polymères et copolymères biodégradables des acides [alpha]- hydroxycarboxyliques, notamment les homopolymères et copolymères des acides lactiques et glycoliques, plus particulièrement le PLA (Poly- L-lactide) et le PLGA (Poly-Lactic-co-Glycolic-Acid), - la poly (s-caprolactone) et ses dérivés, les poly(ss-hydroxybutyrate), poly(hydroxyvalérate) et les copolymères ((3-hydroxybutyrate- hydroxyvalérate), le polyacide malique, - les polymères-blocs amphiphiles de type polyacide lactique- polyoxyde d'éthylène, les polymères biocompatibles de type polyéthylène glycol, polyoxydes d'éthylène, les copolymères-blocs de type polyoxydes d'éthylène-polyoxydes de propylène, - les polyanhydndes, les polyorthoesters, les polyphosphazènes, et leurs mélanges. 8. Microsphères selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisées en ce que l'agent enrobant est choisi parmi les corps gras tels que les phospholipides tels que notamment la phosphatidylcholine, le phosphatidylglycérol, le diphosphatidylglycéro, la dipalmitoyl- phosphatidylcholine, la dioléyl-phosphatidylétanolamine, la dioléyl- phosphatidylcholme, le dimynstoyl-phosphatidylglycérol, ou des triglycérides, notamment les triglycérides en Cs à C12 comme les triglycérides des acides capriques et capryliques, les esters d'acide gras solides, notamment les esters d'acides gras en Ce à C18 comme le palmitate d'éthyle, le myristate d'éthyle, le myristate d'octyldodécyle, de préférence les esters d'acide gras en Ce à C12, et leurs mélanges. 9. Microsphères selon la revendication 8, caractérisées en ce que l'agent enrobant est un Gélucire#. 10. Microsphères selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisées en ce que un procédé de préparation comprend les étapes suivantes - mise en suspension et dissolution sous agitation respectivement du principe actif et de l'agent enrobant dans le fluide supercritique, - modification de la température et/ou de la pression pour désolvater de façon contrôlée l'agent enrobant et provoquer sa coacervation sur le principe actif, l'agitation étant maintenue. 11. Microsphères selon la revendication 10, caractérisées en ce que la concentration en agent enrobant dans le fluide supercritique est comprise entre 1,5 et 4,5 g/l, de préférence égale à 2 g/l environ. 12. Microsphères selon la revendication 10 ou 11, caractérisées en ce que la température de coacervation est comprise entre 35 et 80 C, de préférence entre 35 et 45 C, la pression de coacervation est comprise entre 100 et 250 105 Pa, de préférence entre 180 et 220 105 Pa, et la vitesse d'agitation est comprise entre 200 et 1000 t/min, de préférence égale à 450 t/min. 13. Microsphères selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisées en ce qu'un insert est placé dans l'autoclave et que la mise en suspension et la dissolution du principe actif et de l'agent enrobant sont respectivement réalisées dans l'insert 14. Microsphères selon la revendication 13, caractérisées en ce que l'insert est muni de deux frittages permettant l'entrée et la sortie du fluide supercritique.