Brevet FR2810046A1 — publié le 20011214

PROCEDE D'IMMORTALISATION CONDITIONNELLE DE CELLULES ET LES CONSTRUCTIONS PROTEIQUES POUR SA MISE EN #UVRE. La présente invention concerne la préparation de cellules immortalisées de manière conditionnelle, utiles pour le traitement par thérapie cellulaire de multiples pathologies ou comme modèle pour la compréhension de phénomène cellulaire ou le criblage de substances actives ou le diagnostic de multiples pathologies. Plus particulièrement, l'invention a pour objet un procédé de préparation de cellules immortalisées consistant à introduire dans lesdites cellules une ou plusieurs protéines immortalisantes . On entend au sens de la présente invention par immortalisation conditionnelle, l'extension de la capacité et de la durée de prolifération des cellules. Ainsi, selon l'invention, une protéine immortalisante est une protéine capable d'étendre la capacité et la durée de prolifération des cellules dans lesquelles elle a été introduite. L'immortalisation conditionnelle selon la présente invention est remarquable en ce qu'elle est non génétique. Les cellules de mammifères et plus particulièrement les cellules humaines isolées à partir de l'organisme ont une capacité à proliférer tout à fait limitée. Dans un certain nombre de pathologies chroniques comme la maladie de Parkinson, l'ischémie des muscles cardiaques ou des membres périphériques, la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), la rétinite pigmentaire, le diabète, etc..., il peut se produire une dégénérescence ou une disparition de certaines cellules, telles que par exemple les cardiomyocytes dans les ischémies du muscle cardiaque, les neurones dopaminergiques dans le système nerveux pour la maladie de Parkinson, ou bien les cellules de l'épithélium de la rétine dans le cas de la DMLA, les îlots de Langerhans dans le cas du diabète. Or, les cellules qui dégénèrent ou disparaissent ne sont pas remplacées. Un moyen de palier à ce défaut réside dans des approches de thérapies substitutives ou des cellules pouvant remplir les fonctions déficientes sont apportées. Il peut s'agir de cellules autologues, allogéniques, voire même xénogéniques. Différentes techniques ont été proposées dans l'art antérieur pour développer ou utiliser de telles cellules. Par exemple des cellules souches autologues ou allogéniques de précurseurs hématopoïétiques peuvent être obtenues en grande quantité et regreffées. Il s'agit souvent de cellules primaires. Malheureusement, dans bon nombre de cas, les cellules d'intérêt ne peuvent pas être obtenues en quantités suffisantes. Une approche très utilisée réside dans le développement de lignées de cellules immortalisées qui dérivent d'un type cellulaire et peuvent être utilisées de façon indéfinies. Il s'agit de lignées cellulaires allogéniques ou xénogéniques qui permettent de remplacer les cellules manquantes ou défectives. Les lignées obtenues présentent l'avantage de pouvoir être propagées de manière extensive, ce qui permet de générer un grand nombre de cellules et est donc compatible avec une utilisation commerciale. Ces cellules peuvent en outre être testées de manière intensive, aussi bien au niveau microbiologique qu'au niveau de la tumorigénicité. Toutefois, l'immortalisation définitive conduit à une dédifférenciation partielle des cellules qui leur fait perdre un certain nombre de caractéristiques des cellules primaires dont elles dérivent. Par ailleurs les cellules sont immortalisées avec un ou plusieurs oncogènes ce qui les rend plus proche d'un événement de transformation et peut conduire potentiellement à des tumeurs chez les patients après la greffe de ces cellules. De plus, il est relativement difficile d'obtenir des lignées stables non tumorigènes. Il s'agit en effet d'un processus long et méticuleux qui est en outre empirique en ce sens qu'il n'y a pas de règles établies. Une autre approche réside dans l'utilisation de cellules primaires autologues, mais plus généralement allogéniques, voire même xénogénique. L'utilisation de cellules xénogéniques pose à la fois un problème de sécurité virale du fait d'une transmission horizontale potentielle d'un agent infectieux d'une espèce donnée à l'homme, et un problème de réponse immune de l'hôte contre le greffon, surtout dans le cas de pathologies chroniques du type mentionnées précédemment. Ainsi, la greffe de neurones foetaux humains a été utilisé chez des patients atteints de la maladie de Parkinson. Le recul de plusieurs années montre que cela est tout à fait positif en terme de bénéfice pour le patient. Toutefois, cette approche souffre d'une limitation majeure, qui est l'approvisionnement en cellules. Ceci limite aujourd'hui une utilisation thérapeutique à grande échelle, car, même s'il s'agit d'une approche allogénique, il demeure un problème de sécurité en terme de contaminations potentielles du receveur de la greffe par les cellules du donneur. Il a également été proposé une immortalisation conditionnelle des cellules obtenue par transfert rétroviral d'un oncogène et excision par recombinaison site- spécifique (Westerman K. Y. and Leboulch P., Proc. Natl. Acad. Sci. 1996 ; 93 : 8971-8976.1996 ; Kobayashi N., Fujiwara T., Westerman K.A., Inoue Y., Sakaguchi M., Noguchi H., Miyazaki M., Cai J., Tanaka N., Fox I.J., Leboulch P., Science. 2000 ; 287 : 1258-1262). La présente invention a précisément pour but de s'affranchir des inconvénients ci-dessus liés à l'emploi de lignées ou de cellules primaires et des cellules souches. Ce but est atteint selon l'invention grâce à un procédé de préparation de cellules immortalisées conditionnellement comprenant la mise en contact de cellules avec une ou plusieurs protéines immortalisantes dans des conditions permettant la pénétration de la ou desdites protéines dans les cellules. L'introduction d'une ou plusieurs protéines immortalisantes dans les cellules selon le procédé de l'invention présente l'avantage d'être temporaire et réversible. Le procédé de l'invention est remarquable en ce qu'il permet aux cellules de passer l'étape de sénescence et donc d'être propagées de manière avantageuse jusqu'à la crise et au delà. En outre, l'addition de plusieurs protéines immortalisantes dans les cultures permettent aux cellules de passer l'étape de crise. Les cellules obtenues par le procédé de l'invention pourront être clonées de manière à avoir une descendance cellulaire clonale si cela s'avère nécessaire. Le procédé de l'invention concerne tout particulièrement la préparation de cellules primaires immortalisées de manière conditionnelle. Il peut s'agir de : - cellules pancréatiques (3 impliquées dans les diabètes de type I, - cellules souches neuroépithéliales impliquées dans les maladies neurodégénératives, - cellules génitrices hématopoïétiques, - cellules épithéliales rétiniennes pigmentées impliquées dans la dégénérescence maculaire liée à l'âge, - cellules endothéliales, - les cellules de l'épithélium de la rétine, - les neurones et notamment les neurones photorécepteurs, - les kératinocytes - les hépatocytes, - les cellules issues d'îlots de Langerhans, - les cellules musculaires lisses, - les chondrocytes, - les cellules de l'épiderme et du derme, - les ostéoblastes, - les astrocytes, - les oligodendrocytes, - les cellules associées aux tendons. Plus particulièrement, le procédé de l'invention permet de disposer de moyens de traitement des pathologies grâce à la greffe de cellules immortalisées de manière conditionnelle. Il peut s'agir dans le cas de la rétine de la greffe de cellules de l'épithélium de la rétine, voire même de neurones photorécepteurs dont la capacité et la durée de prolifération seraient étendues, lorsque ces neurones ont disparu ou sont déficients dans des pathologies comme la dégénérescence maculaire liée à l'âge ou bien la rétinite pigmentaire. Dans le cas d'hépatite fulminante, il est envisageable de greffer des hépatocytes immortalisées. Dans le cas du diabète, il est possible de greffer des cellules issues d'îlots de Langerhans capables de sécréter de l'insuline. Des pontage coronariens peuvent être réalisés avec des cellules endothéliales et éventuellement des cellules musculaires lisses. Dans le cas d'ulcères de la peau, il est envisageable de greffer des kératinocytes immortalisées . L'immortalisation conditionnelle et temporaire ou l'extension de la capacité et de la durée proliférative des cellules réalisés par le procédé de l'invention peut aussi concerner des chondrocytes pour traiter des lésions traumatiques localisée du cartilage, ou encore des arthroses liées au viellissement. De même des applications dans des domaine des greffes de peau comprenant entre autre la mise en oeuvre de cellules de l'épiderme et du derme. D'autres applications concernant les ostéoblastes, les cellules associées aux tendons sont possibles grâce au cellules immortalisées de l'invention. L'invention concerne donc aussi une méthode de traitement d'une pathologie impliquant la disparition ou la déficience d'un type cellulaire consistant à greffer chez un patient atteint d'une telle pathologie une quantité efficace de cellules immortalisées selon l'invention correspondant au type cellulaire absent ou déficient. L'invention a donc également pour objet l'utilisation des cellules immortalisées conditionnellement obtenues par le procédé de l'invention pour la préparation de compositions pharmaceutiques utiles en diagnostic ou thérapie ainsi que les compositions pharmaceutiques comprenant à titre d'agents actifs des cellules immortalisées conditionnellement obtenues selon ce procédé. Les cellules immortalisées de manière conditionnelle selon le procédé de l'invention peuvent être des cellules génétiquement modifiées, non pour leur immortalisation conditionnelle mais en vue de l'expression d'un gène permettant de modifier une ou plusieurs de leurs propriétés. Ces modifications génétiques pourront être obtenues après introduction d'un vecteur d'expression qui pourra être choisi entre autre parmi les plasmides, les AAV, les rétrovirus, les vecteurs lentiviraux, ou tout autre vecteur intégratif ou épisomal. Il peut s'agir de cellules génétiquement modifier pour exprimer par exemple un facteur de croissance, un facteur neurotrophique, un facteur angiogénique ou anti-angiogénique, une cytokine, chemokine, ou de tout autre facteur diffusible à effet thérapeutique. Le procédé de l'invention est particulièrement avantageux car il permet de réaliser une propagation de cellules basée sur une immortalisation non génétique. En effet, ce sont les conditions de culture qui conditionnent les cellules quant à leur capacité de proliférer. Le génome des cellules manipulées n'est en aucun cas modifié par un l'ajout d'un gène immortalisant ou augmentant la capacité proliférative des cellules. Ainsi, le procédé de l'invention comprend la culture des cellules dans un milieu contenant lesdites protéines immortalisantes. Le procédé de l'invention peut comprendre plusieurs passages de culture des cellules dont tout ou partie desdits passages comprend l'addition de protéines immortalisantes. Les cellules primaires, mise en contact avec une ou plusieurs protéines permettant d'étendre leur capacité de prolifération, pourront être cultivées un nombre de fois suffisant avant leur injection chez les patients à traiter. Les cellules primaires, mise en contact avec une ou plusieurs protéines permettant d'étendre leur capacité et leur durée de prolifération, peuvent être cultivées un nombre de fois suffisant avant leur injection chez les patients à traiter. Les protéines permettant d'étendre la capacité de prolifération des cellules pourront ne plus être ajoutées dans le milieu de culture au cours du ou des derniers passages avant l'injection chez les patients. En effet il a été montré par Kobayashi et al. (Kobayashi N., Fujiwara T., Westerman K.A., Inoue Y., Sakaguchi M., Noguchi H., Miyazaki M., Cai J., Tanaka N., Fox I.J., Leboulch P., Science. 2000 ; 287 : 1258-1262) que l'excision d'un gène immortalisant, tel que le gène codant pour l'antigène grand T de SV40, conduisait à une différentiation des cellules immortalisées vers le phénotype des cellules dont elles dérivent. Cette propriété est tout à fait intéressante dans la mesure où elle doit conduire à une réversion des cellules vers un phénotype totalement différencié et donc vers une meilleure activité biologique. Les protéines immortalisantes introduites dans les cellules selon le procédé de l'invention peuvent être des protéines, polypeptides ou peptides possédant une fonction proliférative aussi désigné en anglais comme conférant une "extended life-span". A titre d'exemple, on peut citer les protéines suivantes : - les produits des oncogènes cellulaires et viraux comme notamment SV40Tag, ElA de l'adénovirus, E6, E7 de l'EBV, v-myc, c-myc, src, ras, bmi-1, - les produits des gènes anti-senescence comme notamment la telomerase, - les produits des gènes anti-apoptotiques comme par exemple bcl2, FLIP, ou un mélange de ceux-ci. On entend ainsi, selon l'invention, par protéines immortalisantes au pluriel tant la quantité d'une protéine immortalisante qu'un mélange de protéines immortalisantes. Aussi, le singulier et le pluriel sont utilisés indifféremment et sauf indication contraire, l'emploi de protéine immortalisante au singulier couvre le pluriel et vice versa. Le type de protéines immortalisantes et leur quantité sont fonction de la nature des cellules à immortaliser et des milieux de culture. La mise en contact en vue de l'introduction de protéines immortalisantes dans les cellules selon le procédé de l'invention admet plusieurs formes de mise en #uvre. Celles-ci peuvent être fonction de la nature des cellules, de leur milieu de culture et de la protéine immortalisante. Il peut s'agir de tout composé ou motif chimique et notamment des peptides, polypeptides ou protéine, de particules, nanoparticules comme des liposomes, auxquels sont associées, conjuguées ou couplées par tout type de liaison, covalente ou non, des protéines immortalisantes, et capables de permettre le transfert desdites protéines immortalisantes dans le cytoplasme et/ou le noyau des cellules. Une première forme de réalisation du procédé de l'invention consiste à introduire les protéines immortalisantes dans les cellules à l'aide de particules contenant ou comprenant à leur surface lesdites protéines immortalisantes. Il peut s'agir par exemple de liposomes ayant des propriétés fusogènes permettant de délivrer leur contenu protéique dans les cellules. Mais il peut s'agir aussi d'autres types de particules permettant d'introduire la ou les protéines par des méthodes physiques comme le bombardement de particules ou l'utilisation de champs électriques ou encore l'électroporation. Une deuxième forme de réalisation du procédé de l'invention consiste à utiliser des dendrimers sur lesquels les protéines pourront être adsorbées. Une troisième forme de réalisation du procédé de l'invention consiste à introduite les protéines immortalisantes à l'aide de substance vectrice. Un premier type de substance vectrice consiste en des systèmes de transport intracellulaire utilisant des virus inactivés tel que proposé pour transférer des plasmides dans les cellules. Un second type de substance vectrice consiste en les domaines cargo permettant le transfert de protéines liées en cis, de l'espace extracellulaire vers l'espace intracellulaire. Enfin un troisième type de substance vectrice consiste en tout motif chimique permettant le couplage de protéines conformes à l'invention et permettant la translocation des dites protéines depuis le milieu extracellulaire vers le cytoplasme et/ou le noyau (Service R. F., Science. 2000 ; 288 : 28-29. ). Les domaines dit " cargo " sont définis comme permettant le transfert en cis d'une protéine du milieu de culture vers l'intérieur des cellules. Divers motifs protéiques décrits dans l'art antérieur peuvent assurer de telles fonctions cargo. Une forme de mise en oeuvre préférée de ce mode de réalisation de l'invention consiste à introduire dans les cellules la protéine immortalisante associée à une protéine ou peptide de transport ou peptide cargo à travers la membrane plasmique. Parmi ceux-ci, on peut citer plus particulièrement, la protéine VP22 du virus HSV-1, l'homéodomaine du facteur du transcription Antennapédia ou la troisième hélice de l'homéodomaine de cette protéine, le domaine de transduction protéique de la protéine TAT du VIH, la séquence de translocation de membrane K-FGF, ou encore certains anticorps murins ou humain, polyclonaux ou monoclonaux reconnaissant l'ADN ou bien des peptides dérivés de ces anticorps, des motifs chimiques comme les poly- arginines, ou des séquences ou fragments dérivés de ceux-ci. Ces peptides ou protéines présentent la capacité de traverser la membrane plasmique des cellules et de véhiculer des agents qui leur sont couplés. Il sera indiqué ci-après plusieurs exemples préférés de peptide ou protéine utile pour introduire les protéines immortalisantes dans des cellules selon le procédé l'invention. 1) Le couplage de protéines immortalisantes à la protéine VP22 du virus HSV-1. La protéine VP22 du virus HSV-1 est un constituant de 38 kDa du tégument, structure localisée entre la capside et l'enveloppe du virus (Dargan D. The structure and assembly of herpes viruses. In : Harris J.R., Horne R. W. (eds) Viral Structure. New York : Academic Press, 1986, pp 359-437). Récemment, Elliot et O'Hare (Elliot G. and O'Hare P., Gene Therapy 1999 ; 6 : 149-151) ont démontré que VP22 présente une nouvelle propriété de transport tant dans les cellules transfectées que dans des cellules infectées. Dans les cellules transfectées, VP22 est localisée principalement dans le cytoplasme où elle est associée aux microtubules. Cependant VP22 peut être transportée depuis le cytoplasme d'une cellule productrice vers les cellules avoisinantes où elle s'accumule dans le noyau. Ce mécanisme de transport n'est pas encore complètement élucidé mais semble impliquer une voie indépendante du Golgi faisant intervenir l'actine du cytosquelette (Elliot G. and O'Hare P., Cell 1997 ; 88 : 223-233). Par ailleurs ces auteurs ont montré que la protéine VP22 fusionnée à un peptide reporteur tel que la GFP conserve ses capacités de translocation démontrant la possibilité d'utiliser les propriétés d'internalisation de la VP22 pour délivrer des protéines hétérologues dans le cytoplasme et le noyau de cellules. Ainsi Phelan et al. (Phelan A., Elliot G. and O'Hare P., Nat. Biotechnol. 1998 ; 16 : 440-443. ), ont démontré qu'une protéine chimérique VP22-p53 conserve sa capacité à être sécrétée ainsi que ses propriétés d'internalisation et de ciblage nucléaire. De plus la protéine de fusion VP22-p53 induit l'apoptose de cellules d'ostéosarcome humain n'exprimant pas p53 (SAOS-2). Récemment, Dilber et al. (Dilber M.S., Phelan A., Aints A., Mohamed A.J., Elliott G., Edvard Smith C.I. and O'Hare P., Gene Therapy 1999 ; 6 : 12-21) ont mis en évidence qu'une protéine de fusion formée de VP22 en phase avec la thymidine kinase (TK) du HSV conserve aussi les propriétés de transport intercellulaire de la VP22 ainsi que l'activité enzymatique de la TK. Dans cette étude, les auteurs montrent que le traitement par le ganciclovir de cellules n'exprimant pas de "gap junctions" (Neuro2-A) mais exprimant la protéine de fusion VP22-TK, conduit in vitro à un effet cytotoxic 'bystender' et à une régression tumorale in vivo. 2) La fusion de protéine immortalisante à l'homéodomaine d'une homéoprotéine connue pour présenter la capacité de traverser les membranes biologiques. Les homéoprotéines constituent une classe de facteurs de transcription initialement découverts chez la Drosophile et impliqués dans de nombreux processus morphologiques. Ces protéines se lient à l'ADN grâce à une séquence spécifique de 60 acides aminés appelée homéodomaine. L'homéodomaine est formé de trois a-hélices et d'un coude localisé entre la seconde et la troisième hélice (Qian Y. Q., Billeter M., Otting G., Muller M., Gehring W.J. and Wuthrich K., Cell 1989 ; 59 : 573-80). Tous les vertébrés, mammifères inclus, synthétisent de nombreuses homéoprotéines phylogénétiquement reliées aux protéines initialement caractérisées chez la Drosophile. Différents travaux sur l'homéodomaine du facteur de transcription Antennapedia de Drosophile ont permis de montrer que les peptides homéodomaines traversent les membranes plasmiques par un processus énergie-indépendant et donc distinct de l'endocytose. La 3ième hélice du peptide homéodomaine possède les mêmes propriétés (Joliot A., Pernelle C., Deagostini-Bazin H. and Prochiantz A., Proc. Natl. Acad. Sci. 1991 ; 88 : 1864-1868 ; Derossi D., Joliot A.H., Chassaing G. and Prochiantz A., J. Cell. Biol. 1994 ; 269 : 10444-10450). Ces propriétés ont été utilisées pour internaliser, dans des cellules, des polypeptides et des oligonucléotides liés à l'homéodomaine ou à la 3ième hélice (Derossi D., Chassaing G. and Prochiantz A., Trends Cell Biol. 1998, 8 : 84-87 ; Selivanova G., Iotsova I., Okan I ., Fritsche M., Strôm M., Groner B., Grafstrôm R. C. and Wiman K. G., Nature Med. 1997, 6 : 632-638 ; Bandara L. R., Girling R. and La Thangue N. B., Nat. Biotechnol. 1997, 15 : 896-901. ; Kato D., Miyazawa K., Ruas M., Starborg M., Wada I., Oka T., Sakai T., Peters G. and Hara E., FEBS Lett. 1998, 427 : 203-208. ; Fàhraeus R. , Lain S., Ball K. L. and Lane D., Oncogene 1998,16, 587-596 ; Fàhraeus R., Paramio J. M., Ball K. L., Lain S. and Lane D., Curr. Biol. 1996 ; 6 : 84-91. ; Ball K. L., Lain S., Fàhraeus R., Smythe C. and Lane D., Curr. Biol. 1996, 7 : 71-80 ; Bonfanti M., Taverna S., Salmona M., D'Incalci M. and Broggini M., Cancer Res. 1997, 57 : 1442-1446 ; Warbrick E., Lane D., Glover D. M. and Cox L. C., Curr. Biol. 1995, 5 : 275-282). Le plus petit fragment de l'homéodomaine capable de traverser les membranes et de servir de vecteur à d'autres peptides ou bien à des oligonucléotides est un peptide de 16 acides aminés correspondant à la troisième hélice de l'homéodomaine et incluant les acides aminés 43 à 58 de l'homéodomaine. 3) La fusion de protéine immortalisante à la séquence complète d'homéoprotéines telles que Hoxa5 et Enarailed. Différents travaux ont montré que ces protéines, bien qu'étant des facteurs de transcription, sont associées à des vésicules de type cavéoles et sécrétées dans le milieu extracellulaire. Une fois sécrétées ces protéines présentent, à l'image de leur homéodomaine, la capacité à traverser la membrane plasmique des cellules avoisinantes et s'accumulent dans le noyau (Chatelain L., Volovitch M., Joliot A. H., Perz F. and Prochiantz A., Mech. Dev. 1997, 55 : 111-117 ; Joliot A., Trembleau A., Raposo G., Calvet S., Volovitch M. and Prochiantz A., Development 1997, 124 : 1865-1875 ; Joliot A., Maizel A., Rosenberg D., Trembleau A., Dupas S., Volovitch M. and Prochiantz A., Curr. Biol. 1998, 8 : 856-863 ; Maizel A., Bensaude 0., Prochiantz A. and Joliot A., Development 1999, 126 : 3183-3190). Par ailleurs Joliot et al. (1998) et Maizel et al. (1999) ont identifié une séquence de 11 acides aminés localisée entre la seconde et la troisième hélice de l'homéodomaine d'Engrailed et ont démontré que cette séquence est nécessaire à l'export nucléaire et à la sécrétion de la protéine. 4) La fusion de protéine immortalisante au domaine de transduction protéique de la protéine TAT du HIV. En effet, différentes études ont montré que la protéine TAT du VIH présente la capacité de traverser la membrane plasmique des cellules sans interaction avec un récepteur spécifique (Green M.and Loewenstein P. M., Cell 1988, 55 : 1179-1188 ; Frankel A. D. and Pabo C. 0., Cell 1988, 55 : 1189-1193). Par la suite Fawell et al., (Fawell S., Seery J., Daikh Y., Moore C., Chen L. L., Pepinsky B. and Barsoum J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91 : 664-668) ont mis montré que des protéines hétérologues telle que la Pgalactosidase, chimiquement couplée à un domaine de 36 acides aminés de la protéine TAT peuvent-être internalisées par différents types cellulaires (Pepinsky R. B., Androphy E. J., Corina K., Brown R. and Barsoum J., DNA Cell Biol. 1994, 13 : 1011-1019). Récemment, Nagahara et al., (Nagahara H., Vocero-Akbani A. M., Snyder E. L., Ho A., Latham D.G., Lissy N. A., Becker-Hapak M., Ezhevsky S. A. and Dowdy S.F., Nat. Med. 1998, 4 : 1449-1452) ont démontré qu'une protéine de fusion TAT-p27Kip1 comportant la totalité de la séquence p27Kip1 en phase avec un fragment de 11 acides aminés constituant le domaine de transduction protéique de la protéine TAT peut-être internalisée par des cellules en culture. Par ailleurs, la ~ galactosidase (120 kDa) fusionnée au domaine de transduction protéique de la protéine TAT, après injection intrapéritonéale, chez la souris, peut-être internalisée par tous les tissus, notamment par le cerveau. La protéine de fusion internalisée conserve l'activité enzymatique de la ss galactosidase (Schwarze S. R., Ho A., Vocero-Akbani A. and Dowdy S. F., Science 1999, 285 : 1569-1572). 5) La liaison de protéine immortalisante à un anticorps monoclonal polvréactif anti-ADN, à un fragment F(ab')2, à un fragment F (ab) ou à un peptide correoondant aux CDR2 et CDR3 (CDR2-3) du dit anticorps. Les anticorps monoclonaux polyréactifs anti-ADN peuvent pénétrer dans différents types cellulaires in vitro et s'accumulent dans le noyau. Ces anticorps ce fixent à des antigènes membranaires, mais aucune corrélation n'a pu être établie entre cette fixation et leur capacité à passer la membrane. De tels anticorps, fragments F(ab')2, F (ab) et peptide CDR2-3 présentent la capacité de traverser la membrane plasmique des cellules. Différentes molécules (Biotin, fluorescéine, oligonucléotides, peroxidase et IgG) liées de manière covalente à un anticorps monoclonal antiADN ou à fragment F(ab')2 ou F(ab) ou encore au peptide CDR2-3 peuvent être transloquées au travers de la membrane des cellules et s'accumuler dans le noyau (Avrameas A., Ternynck T., Nato F., Buttin G. and Avrameas S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95 : 5601-5606 ; Ternynck T., Avrameas A., Ragimbeau J., Buttin G. and Avrameas S., J. Autoimmun 1998, 11 : 511-521). L'utilisation de substances vectrices consistant en des peptides, polypeptides ou protéines constitue un mode de mise en #uvre préféré du procédé de l'invention dans la mesure ou le couplage de la protéine immortalisante à la substance vectrice peut être réalisée non seulement par couplage chimique mais également grâce à la production de protéine de fusion par des techniques de génie génétiques bien connues de l'homme du métier. Ces protéines recombinantes constituent alors les protéines immortalisantes de fusion utilisées conformément au procédé de l'invention. L'invention a donc aussi pour objet une protéine immortalisante associée, conjuguée ou couplée par tout type de liaison à une substance vectrice capable de permettre le transfert de ladite protéine immortalisante dans le cytoplasme et/ou le noyau de cellules. L'invention concerne plus particulièrement une protéine de fusion constituée d'une protéine immortalisante et d'un peptide, polypeptide ou protéine de transport dans le cytoplasme et/ou le noyau de cellules comme défini précédemment. Comme indiqué précédemment, les cellules immortalisées selon le procédé de l'invention peuvent être des cellules génétiquement modifiées, non pour leur immortalisation mais en vue de l'expression d'un gène permettant de modifier une ou plusieurs de leurs propriétés. Le procédé selon l'invention permet de réaliser conjointement, l'immortalisation conditionnelle, grâce à la mise en contact des cellules avec des protéines immortalisantes, et la transformation des cellules, par la mise en contact des cellules avec un vecteur d'expression destiné à introduire un gène d'intérêt dans lesdites cellules. L'invention concerne aussi bien entendu les cellules obtenues par le procédé de l'invention ainsi qu'une culture de cellules sur un milieu comprenant les éléments nécessaire à la culture desdites cellules et une ou plusieurs protéines immortalisantes. Le milieu peut aussi contenir un vecteur d'expression pour la transformation desdites cellules. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront de l'exemple qui suit concernant l'expression et la purification d'une protéine de fusion entre un peptide présentant la capacité de traverser la membrane plasmique et une protéine immortalisante et des essais sur cultures primaires. 1) Préparation de laprotéine de fusion. Le vecteur d'expression bactérien pCRT7 TOPO TA (Invitrogen) est utilisé dans cet exemple mais n'est pas restrictif. pCRT7 TOPO TA est dérivé de pET-3a (Rosenberg A. H., Lade B. N., Chui D. S., Lin S. W., Dunn J. J. and Studier F. W., Gene 1987, 56 : 125-135). Dans ce vecteur, l'expression du gène d'intérêt est induite en apportant une source de T7 RNA polymérase. Ceci est accompli en utilisant la souche BL21(DE3)pLysS de Escherichia coli qui contient une copie chromosomique du gène codant pour la T7 RNA polymérase. Le gène de la T7 RNA polymérase est sous le contrôle du promoteur LacUV5 inductible par l'IPTG. Ce vecteur offre la possibilité de cloner directement un produit de PCR en amont du promoteur T7 grâce à l'action de la topoisomérase I. Par ailleurs, ce vecteur présente, en phase, un épitope Xpress localisé en N-terminal permettant la détection de la protéine produite à l'aide d'anticorps anti-Xpress, un tag polyhistidine en N-terminal permettant la purification de la protéine produite sur colonnes de résine d'agarose chargée au nickel (Probond, Invitrogen), et un site de clivage enterokinase permettant l'élimination des tag localisés dans la partie N-terminale de la protéine. pCRT7 TOPO TA comporte en outre un gène de résistance à l'ampiciline et une origine de réplication bactérienne ori. Le cDNA codant pour la protéine immortalisante, par exemple la protéine E1A de 32 kDa de l'adénovirus est amplifié par RT-PCR en utilisant un couple d'amorces spécifiques. L'amorce 5' comporte, de plus, une séquence codant pour la troisième hélice de l'homéodomaine d'Antennapedia. Cette amplification par RT-PCR est réalisée sur des d'ARN totaux purifiés à partir de cellules exprimant le gène codant pour la protéine immortalisante, par exemple des cellules exprimant le gène ElA de l'adénovirus telles que les cellules 293. La protéine de fusion est produite dans la souche bactérienne Escherichia coli BL21(DE3)LysS et purifiée sur une colonne Probond Resin (Invitrogen) (Perez F., Joliot A., Bloch-Gallego E., Zahraoui A., Triller A. and Prochiantz A., J. Cell. Sci. 1992, 102 : 717-722 ; Perez F., Lledo P. M., Karagogeos D., Vincent J. D., Prochiantz A. and Ayala J., Mol Endocrinol 1994 ; 8 :1278-1287). 2) Essais sur cultures primaires. Des cultures primaires par exemple de cellules endothéliale cérébrales ou de cellules épithéliales pigmentées de la rétine sont incubées en présence de concentrations croissantes de la protéine de fusion allant de 0.1 ug/ml à 100 ug/ml ; le milieu de culture pouvant être changé quotidiennement. L'index de prolifération des cellules traitées peut être comparé à celui de cellules primaires en absence de protéine de fusion par exemple par un test d'incorporation de thymidine tritiée ou par un test d'incorporation de BrdU connus de l'homme du métier. Les cellules peuvent être passées et les conditions conduisant à une absence de survenue de la sénescence seront ainsi déterminées. Ainsi les conditions optimales pour augmenter la capacité et la durée de prolifération de cultures primaires, au moyen d'une ou plusieurs protéines exogènes, peuvent être définies. REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation de cellules immortalisées de manière conditionnelle, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact de cellules avec une ou plusieurs protéines immortalisantes dans des conditions permettant la pénétration de la ou desdites protéines dans les cellules. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules primaires humaines ou non humaines. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les cellules sont choisies parmi : les cellules pancréatiques ss, les cellules souches neuroépithéliales, les cellules génitrices hématopoïétiques, les cellules épithéliales rétiniennes pigmentées, les cellules endothéliales, les cellules de l'épithélium de la rétine, les neurones et notamment les neurones photorécepteurs, les hépatocytes, les kératinocytes, les cellules issues d'îlots de Langerhans, les cellules musculaires lisses, les chondrocytes, les cellules de l'épiderme et du derme, les ostéoblastes, les astrocytes, les oligodendrocytes, les cellules associées aux tendons. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules génétiquement modifiées en vue de l'expression d'un gène permettant de modifier une ou plusieurs de leurs propriétés différente de l'immortalisation. 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend la culture des cellules dans un milieu contenant lesdites protéines immortalisantes. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la culture comprend plusieurs passages de culture des cellules dont tout ou partie desdits passages comprend l'addition de protéines immortalisantes. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les protéines immortalisantes sont choisies parmi : - les produits des oncogènes celulaire et viraux comme notamment SV40Tag, ElA de l'adénovirus, E6, E7 de l'EBV, v-myc, c-myc, src, ras, bmi-1, - les produits des gènes anti-senescence comme notamment la telomerase, - les produits des gènes anti-apoptotiques comme par exemple bcl2, FLIP, ou un mélange de ceux-ci. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les protéines immortalisantes sont associées, conjuguées ou couplées par tout type de liaison à une substance ou motif chimique ou particule capables de permettre le transfert desdites protéines immortalisantes dans le cytoplasme et/ou le noyau des cellules. 9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les cellules sont mises en contact avec des particules contenant ou comprenant à leur surface lesdites protéines immortalisantes. 10) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les cellules sont mises en contact avec des dendrimers sur lesquels les protéines immortalisantes sont adsorbées. 11) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les protéines immortalisantes sont mises en contact avec une substance vectrice associée, conjuguée ou couplée par tout type de liaison aux protéines immortalisantes et permettant la pénétration desdites protéines immortalisantes dans les cellules. 12) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la substance vectrice est choisie parmi : des virus inactivés, des protéines, polypeptides ou peptides de transport, des motifs chimiques. 13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la substance vectrice est choisie parmi : la protéine VP22 du virus HSV-1, l'homéodomaine du facteur du transcription Antennapédia ou la troisième hélice de l'homéodomaine de cette protéine, le domaine de transduction protéique de la protéine TAT du VIH, la séquence de translocation de membrane K-FGF, ou encore certains anticorps murins ou humain, polyclonaux ou monoclonaux reconnaissant l'ADN ou bien des peptides dérivés de ces anticorps, des motifs chimiques comme les poly- arginines, ou des séquences ou fragments dérivés de ceux-ci. 14) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la substance vectrice consiste en un peptide, un polypeptide ou une protéine et en ce que la protéine immortalisante est fusionnée à la substance vectrice. 15) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les cellules sont mises en contact avec un vecteur d'expression pour la transformation desdites cellules en vue de l'expression d'un gène permettant de modifier une ou plusieurs de leurs propriétés différente de l'immortalisation. 16) Des cellules obtenues par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15. 17) Une protéine immortalisante associée, conjuguée ou couplée par tout type de liaison à une substance vectrice capable de permettre le transfert de ladite protéine immortalisante dans le cytoplasme et/ou le noyau de cellules et susceptible d'être utilisée dans le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15. 18) Une protéine de fusion selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une protéine immortalisante et d'un peptide, polypeptide ou protéine de transport dans le cytoplasme et/ou le noyau de cellules. 19) Une culture de cellules sur un milieu comprenant les éléments nécessaire à la culture desdites cellules et une ou plusieurs protéines immortalisantes. 20) Une culture de cellule selon la revendication 19, caractérisé en ce que le milieu de culture contient un vecteur d'expression pour la transformation desdites cellules.