Brevet FR2810676A1 — publié le 20011228

La présente invention concerne un milieu de culture chromogène,,destiné à mettre en évidence les bactéries du genre Vibrio. Le genre Vibrio est associé au choléra (V. cholerae) et à plusieurs autres pathologies cliniques. En particulier, V. parahaemolyticus est responsable de certaines gastro-entérites aiguës, en particulier au Japon, observees après ingestion d'aliments contaminés (généralement des produits de la mer, poissons, coquillages, crustacés ou mollusques crus ou peu cuits). La transmission du vibrion cholérique s'effectue généralement d'homme à homme (vomissements, matières fécales, sueurs), ou par l'intermédiaire d'aliments contaminés. Par ailleurs, on trouve naturellement les vibrions dans la flore microbienne des eaux côtières et estuariennes. Parmi leurs hôtes naturels, on compte les mollusques, crustacés, poissons, échinodermes, ou les planctons. Les infections à vibrions posent un problème de santé publique, et il est donc important de disposer d'un test fiable et rapide permettant de détecter les contaminations alimentaires par ces bactéries. Il existe aujourd'hui des milieux de culture plus ou moins sélectifs qui permettent de détecter la présence de vibrions dans des échantillons. En particulier, on utilise la gélose TCBS (Thiosulfate de sodium - Citrate de sodium - Bile de b#uf- Saccharose)(Diagnostics Pasteur, réf. 69456 ; Oxoid, réf. CM 333 ; Merck, réf. 10263). La grande majorité des entérobactéries et les entérocoques poussent peu ou pas du tout sur ce milieu par rapport aux vibrions. La gélose TTG (Taurocholate - Tellurite - Gélatine) est également utilisée, mais est relativement fastidieux à préparer, nécessitant des contrôles réguliers et un dosage rigoureux du tellurite de potassium. Un des inconvénients du milieu TCBS est qu'il ne permet généralement pas de discriminer entre les différentes espèces de vibrions. Il conviendrait en effet de pouvoir identifier l'espèce de Vibrio présente dans l'échantillon analysé. En particulier, il serait avantageux de pouvoir identifier la présence et de discriminer V cholerae, V parahaemolyticus, V alginolyticus. Cette dernière espèce n'est que rarement associée à des pathologies diarrhéiques, mais est probablement l'entité la plus fréquemment isolée dans les pays à climat tempéré, dans une grande diversité d'échantillons cliniques. Afin d'améliorer l'évaluation du risque sanitaire, il convient donc de pouvoir discriminer les différents types de vibrions pouvant être présents.dans des échantillons (alimentaires, fèces...), de façon plus fine que ce qui était obtenu par les milieux précédents, qui ne pouvaient que différentier les bactéries saccharose+ (telles V. alginolyticus ou V. cholerae) des bactéries saccharose- (telles V. par uhaemolyticus) . La présente invention se propose de fournir un nouveau milieu de culture, pour la détection et/ou la discrimination de bactéries du genre Vibrio, caractérisé en ce qu'il comporte, dans un milieu de culture de Vibrio, au moins un agent chromogène choisi parmi les substrats de la (3-glucosidase et les substrats de la ssgalactosidase. L'agent chromogène substrat d'une des enzymes citées ci-dessus comprend un chromophore, qui est libéré par l'hydrolyse du substrat par son enzyme. Ainsi, la colonie bactérienne se colore en fonction du chromophore libéré. De façon préférée, ledit chromophore est choisi parmi les dérivés indoxyle, halogéno-indoxyle (bromo-indoxyle, chloro-indoxyle, fluoro-indoxyle, iodoindoxyle, dichloro-indoxyle, chloro-bromo-indoxyle, tri-chloro-indoxyle), le méthyl-indoxyle, ou hydroxy-quinoline. Des dérivés préférés sont choisis en particulier parmi les dérivés suivants : 6-chloro-indoxyle, 5-bromo-indoxyle, 3bromo-indoxyle, 6-fluoro-indoxyle, 5-iodo-indoxyle, 4,6-dichloro-indoxyle, 6,7dichloro-indoxyle, 5-bromo-4-chloro-indoxyle, 5-bromo-6-chloro-indoxyle, 4,6,7trichloro-indoxyle, N-méthyl-indoxyle et 8-hydroxy-quinoline. Ainsi, de façon préférée, le substrat de la P-glucosidase est un indoxylglucoside, et/ou le substrat de la P-galactosidase est un indoxyl-galactoside. La concentration de chaque agent chromogène dans le milieu est comprise entre environ 0,02 et 0,5 g/1. Une concentration préférée est 0,1g/l. V. parahaemolyticus est décrit comme négatif pour le caractère ssglucosidase (galerie d'identification Rapid 20E de la société BioMérieux, Marcy l'Etoile, France), et comme positif pour le caractère p-galactosidase (galerie d'identification API 20 NE de la société BioMérieux, op. cit.). De façon surprenante, l'invention montre que V parahaemolyticus peut présenter un phénotype inverse pour ces deux caractères sur milieu solide. Ainsi, l'utilisation d'un agent chromogène substrat pour la P-glucosidase permet de colorer les colonies sur milieu solide, alors qu'elles restent incolores lorsqu'un agent chromogène substrat pour la p-galactosidase est utilisé. Il est toutefois difficile de distinguer et discriminer V. parahaemolyticus de V alginolyticus, qui sont souvent trouvés dans les mêmes échantillons d'origine marine, car ces deux espèces présentent de nombreux caractères communs. Ainsi, les deux espèces sont toutes deux positives pour le caractère p-glucosidase. De façon surprenante, l'ajout de saccharose au milieu selon l'invention, en particulier à une concentration élevée, permet de faire disparaître l'activité p-glucosidase de V. alginolyticus, tout en la laissant subsister chez V. parahaemolyticus. Ainsi, le milieu selon l'invention permet de discriminer aisément V parahaemolyticus de V. alginolyticus, par simple coloration ou absence de coloration des colonies présentes sur le milieu de culture. Une concentration élevée de saccharose doit être considérée comme une concentration en saccharose supérieure à 5 g/1, de préférence, comprise entre 5 g/1 et 35 g/1. Une concentration de saccharose efficace est 20 g/1. La présente invention permet également de détecter V. cholerae, et de le discriminer par rapport aux deux autres espèces citées ci-dessus. En effet, V cholerae présente une activité p-galactosidase, sans présenter d'activité p- glucosidase. Ainsi, l'ajout d'un agent chromogène substrat pour la p-galactosidase dans un milieu de culture des Vibrio permet de distinguer V cholerae des autres vibrions, par coloration des colonies formées. Afin de pouvoir discriminer les différentes bactéries en une étape, il est donc intéressant d'utiliser un milieu de culture qui comporte à la fois un agent chromogène substrat de la p-galactosidase et un agent chromogène substrat de la p- glucosidase. En effet, l'ajout de saccharose dans le milieu de culture ne fait pas disparaître le caractère p-galactosidase de V. cholerae. Ce résultat est d'autant plus surprenant qu'une inhibition est observée pour V alginolyticus, qui présente le même caractère saccharose+ que V cholerae. Ainsi, l'utilisation d'un milieu de culture comportant à la fois un agent chromogène substrat de la p-galactosidase et un agent chromogène substrat de la ssglucosidase permet de différentier V. parahaemolyticus (mauve lorsque le 5-bromo- 6-chloro-3-indoxyl-f3-glucoside est utilisé), V. cholerae (bleu lorsque le"5-bromo-4- chloro-3-indoxyl-ss-galactoside est utilisé), et V. alginolyticus (incolore). Un tel milieu selon l'invention permet donc la détection et la discrimination de trois souches différentes de vibrions, alors que les milieux de l'art antérieur ne permettent d'obtenir qu'une différentiation en deux catégories (saccharose' et saccharose-). La présente invention est également dirigée vers un procédé de détection et/ou de discrimination des bactéries du genre Vibrio dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. inoculer un milieu de culture selon l'invention avec ledit échantillon ou un inoculum dérivé de l'échantillon, b. détecter la présence de bactéries du genre Vibrio sur ledit milieu de culture, c. de façon optionnelle, différentier V cholerae, V parahaemolyticus, et V alginolyticus présents sur ledit milieu de culture. L'utilisation de ces milieux est généralement précédée d'une étape d'enrichissement, par des méthodes connues de l'homme du métier. On peut utiliser en particulier de l'eau peptonée alcaline à 1 g % de NaCl (pH 8,6), ou de l'eau peptonée alcaline à 3 g % de NaCl. Divers facteurs sélectifs pour Vibrio bien connus de l'homme du métier peuvent être ajoutés dans le milieu de la présente invention. Ainsi, la présence d'un pH alcalin, de thiosulfate, de citrate, de bile, de sel biliaire, de magnésium, de calcium, de teepol, de SDS, de Polyximine, de colistine, de tellurite... permettent d'améliorer les propriétés du milieu selon l'invention, et d'isoler les Vibrio de manière satisfaisante. EXEMPLES Exemple 1 Un milieu préféré pour la mise en #uvre de l'invention comprend (pour un litre) : - Agar 15 g - Peptone 15 g - Extrait de levure 3 g -NaCl 10 g - 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl-(3-glucoside 0,1 g - 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-p-galactoside 0,1 g - Saccharose 20 g - Glucose 1 g - Lactose 0,1 g - IPTG 0,04 g - Trizma Base 5 g - Citrate de sodium 10 g - Thiosulfate de sodium 10 g - Cholate de sodium 3 g Exemple 2 L'étalement de bactéries sur différents milieux a donné les résultats suivants. TCBS BTB-Teepol Milieu de l'invention (Exemple 1) V cholerae Jaune Jaune Bleu V. alginolyticus Jaune Jaune Incolore V parahaemolyticus Vert Bleu-vert Mauve L'utilisation du milieu selon l'invention permet donc de discriminer les trois espèces de vibrions, par rapport aux milieux de l'art antérieur. Revendications 1. Milieu de culture pour la détection et/ou la discrimination de bactéries du genre Vibrio, caractérisé en ce qu'il comporte, dans un milieu de culture de Vibrio, au moins un agent chromogène choisi parmi les substrats de la p-glucosidase et les substrats de la P-galactosidase. 2. Milieu de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce que l(es) agent(s) chromogène (s) libère, par hydrolyse, un chromophore choisi parmi les dérivés indoxyle, halogéno-indoxyle (bromo-indoxyle, chloro-indoxyle, fluoro- indoxyle, iodo-indoxyle, dichloro-indoxyle, chloro-bromo- indoxyle, tri-chloro- indoxyle), méthyl-indoxyle, ou hydroxy-quinoline, en particulier les dérivés suivants : 6-chloro-indoxyle, 5-bromo-indoxyle, 3-bromo-indoxyle, 6- fluoro- indoxyle, 5-iodo-indoxyle, 4,6-dichloro-indoxyle, 6,7-dichloro-indoxyle, 5- bromo-4-chloro-indoxyle, 5-bromo-6-chloro-indoxyle, 4,6,7-trichloro-indoxyle, N-méthyl-indoxyle ou 8-hydoxy-quinoline. 3. Milieu de culture selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit substrat de la p-glucosidase est un indoxyl-glucoside, et/ou ledit substrat de la p-galactosidase est un indoxyl-galactoside. 4. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il contient à la fois au moins un agent chromogène substrat de la p-glucosidase et au moins un agent chromogène substrat de la p-galactosidase. 5. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il contient en outre une concentration élevée de saccharose. 6. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comporte en outre des facteurs sélectifs pour Vibrio. 7. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le substrat de la P-glucosidase est le 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl-p-glucoside. 8. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le substrat de la p-galactosidase est le 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-p-galactoside. 9. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend (pour un litre) : - Agar 15 g - Peptone 15g - Extrait de levure 3 g -NaCl 10 g - 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl-p-glucoside 0,1 g - 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-p-galactoside 0,1 g - Saccharose 20 g - Glucose 1 g - Lactose 0,1g - IPTG 0,04 g - Trizma Base 5 g - Citrate de sodium 10 g - Thiosulfate de sodium 10 g - Cholate de sodium 3 g 10. Utilisation d'un milieu de culture tel que défini dans l'une des revendications 1 à 9 pour la détection et/ou la discrimination des bactéries du genre Vibrio. 11. Procédé de détection et/ou discrimination des bactéries du genre Vibrio dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. inoculer un milieu de culture tel que défini dans l'une des revendications 1 à 9 avec ledit échantillon ou un inoculum dérivé de l'échantillon, b. détecter la présence de bactéries du genre Vibrio sur ledit milieu de culture, c. de façon optionnelle, différentier V. cholerae, V parahaemolyticus, et V. alginolyticus présents sur ledit milieu de culture.