Brevet FR2819811A1 — publié le 20020726

Vecteur pour l'introduction de molécules dans les cellules eucaryotes et molécules vectorisées par un tel vecteur. L'invention concerne le domaine de la biochimie, de la biologie cellulaire et de la médecine. Plus précisément, l'invention concerne un outil moléculaire, ci-après dénommé"vecteur", destiné à être utilisé pour l'introduction de tout type de molécules dans des cellules eucaryotes. L'invention trouve tout particulièrement son application pour l'incorporation intracellulaire d'acides aminés, ou de peptides de tailles et de séquences quelconques (di-peptides, tri-peptides, polypeptides, protéines...) et/ou pouvant être modifiés chimiquement. L'invention concerne également toute molécule vectorisé par un tel vecteur. On notera que l'on entend dans la présente description les termes"molécule vectorisé"comme visant l'ensemble constitué le vecteur fusionné avec la molécule à transporter dans la cellule. Selon l'art antérieur, l'apport de peptides dans les cellules eucaryotes peut être effectuée : - par transgenèse, c'est-à-dire par une technique mettant en oeuvre des transgènes artificiels à partir desquels sont synthétisés, à l'intérieur même desdites cellules, les peptides en question ; - par vectorisation de gènes dans les cellules au moyen de vecteurs viraux ou non viraux, comme par exemple les lipocomplexes, liposomes, polyamines, argiles, etc... - par fusions avec des domaines polypeptidiques d'incorporation cellulaire ("cell-permeable peptides") tels que notamment un peptide hydrophobe cell-permeable peptide import (CPPI) selon Lin et al. (J. Biol. chem. 270, pp 14255-14258,1995), un peptide dérivé du domaine de liaison à l'ADN de facteurs de transcription à homéoboîtes selon Derossi et al. (Trends Cell. Biol. 8, pp 84-87,1998), un peptide dérivé de la protéine Tat du virus du SIDA (HIV) selon Schwarze et coll. (Trends Cell Biol. 10, pp 290-295,2000). un dérivé de la protéine VP22 du virus HSV-1, selon Elliott et O'Hare, (cell 88, pp 223-233,1997). La synthèse de peptides en cellules à partir de transgènes artificiels ne permet de produire ni des peptides très courts (di-ou tri-peptides), ni des peptides dont le premier acide aminé n'est pas une méthionine, ni des peptides modifiés chimiquement. De plus, la transgénèse nécessite une manipulation génétique des cellules ou des organismes à un stade de développement très précoce, et ne permet donc pas l'introduction de molécules dans des organismes déjà constitués. Enfin les fusions CPP simples présentent plusieurs inconvénients, notamment : de pouvoir interférer avec le bon fonctionnement intracellulaire de la molécule (X) transportée, ce qui est particulièrement à craindre avec les peptides de transport actuellement connus qui sont très chargés électriquement. - d'imposer une localisation intracellulaire inadéquate de la molécule (X) transportée, telle qu'une localisation nucléaire. - d'induire une sortie extracellulaire de la molécule (X) transportée. Plusieurs peptides de translocation identifiés possèdent en effet la double potentialité d'incorporation et de sécrétion cellulaire. De telles limites de l'état de la technique en constituent les inconvénients. L'objectif de la présente invention est donc de proposer une technique d'introduction de molécules dans les cellules eucaryotes présentant des avantages nouveaux par rapport aux techniques de l'art antérieur. Notamment, un objectif de la présente invention est de proposer un vecteur permettant d'acheminer dans les cellules eucaryotes tout type de molécule et notamment tout type de peptides, y compris les peptides très courts tels que des simples acides aminé, des dipeptides ou des tripeptides mais également des peptides dont le premier acide aminé n'est pas la méthionine. Ces objectifs sont atteints grâce à l'invention qui concerne un vecteur pour l'introduction dans une cellule eucaryote d'une molécule (X) présentant au moins une extrémité amino-terminale caractérisé en ce qu'il est constitué par l'association d'un module d'incorparation cellulaire permettant la translocation membranaire, et d'un module ubiquitine ou autre peptide conjugable apparenté, ledit vecteur présentant une extrémité carboxy-terminale destinée à être fusionnée par liaison peptidique à l'extrémité amino-terminale de ladite molécule (X). On notera que l'on entend dans la présente description les termes"ubiquitine ou autres peptides conjugables apparentés", ci-après dénommés"UBL", comme désignant l'ubiquitine ou les peptides apparentés tels que NEDD-8, SUMO (Small Ubiquitinrelated MOdifier), UCRP (Ubiquitin Cross-Reacting Protein), RUB (Related to UBiquitin) et d'autres (Jentsch et Pyrowolakis 2000. Trends Cell Biol. 10,335-342) qui sont naturellement synthétisés en fusion avec des extensions carboxy-terminales. Ces extensions, constituées de simples acides aminés, de polypeptides ou de protéines, doivent être éliminées pour permettre la conjugaison ultérieure des UBL. Les protéases responsables de ces clivages endoprotéolytiques très précis présentent deux avantages déterminants pour ce système : elles sont répandues dans la plupart des cellules eucaryotes et constitutivement actives, et leur clivage n'est conditionné que par la reconnaissance de la séquence en acides aminés située en-NH2du site de clivage, ce qui rend possible l'introduction de n'importe quelle séquence du côté-COOH. La présente invention tire profit de l'existence naturelle de ces enzymes pour libérer dans les cellules eucaryotes les composés fusionnés aux UBL. L'utilisation de versions modifiées ou raccourcies d'UBL est possible si leur reconnaissance et leur clivage par les hydrolases carboxy-terminales ne sont pas affectées. De très nombreux types de molécules (X) peuvent être vectorisées par le vecteur selon l'invention et notamment de simples acides aminés et des peptides de taille quelconque, et indépendemment de toute contrainte de composition et de séquence. Le vecteur selon l'invention permet également de vectoriser des peptides chimiquement modifiés. Le vecteur selon l'invention peut aussi être utilisé pour l'incorporation cellulaire de molécules non peptidiques, comme par exemple des oligonucléotides ou des composés chimiques hydrophiles qui auront été greffées préalablement chimiquement à l'extrémité carboxy-terminale d'un oligopeptide. On notera aussi qu'il sera possible de modifier chimiquement les molécules vectorisées, à condition que la liaison peptidique entre la molécule vectorisée et le vecteur reste accessible pour les hydrolases C-terminales d'UBL. A titre d'exemple une acylation C-terminale de la molécule (X) permettra son ancrage membranaire intracellulaire. L'utilisation du vecteur selon la présente invention induit l'avantage de ne pas nécessiter l'introduction d'acides nucléiques dans les cellules et donc de ne pas impliquer les inconvénients inhérents à cet art antérieur. Le vecteur selon l'invention présente l'avantage de permettre l'incorporation intracellulaire de molécules sans modification génétique des cellules receveuses. A ce titre, cet outil est applicable à des cellules dans lesquelles il est techniquement difficile d'introduire des acides nucléiques (non transfectables), telles que des cellules normales en culture primaire, ou des cellules présentes in vivo dans des organismes intacts. Le vecteur selon la présente invention présente aussi des avantages par rapport aux peptides simplement associés à des peptides de translocation membranaires tels qu'énoncés précédemment. Plus précisément, la présente invention permet le relargage intracellulaire des molécules (X) transportées, sous une forme totalement libre de toute fusion, contrairement aux méthodes classiques de transport protéique par fusion à des peptides de translocation. Cette libération intracellulaire de la molécule (X) du peptide de transport affranchit la molécule (X) des mouvements ultérieurs du peptide de transport : concentration intranucléaire ou sécrétion extracellulaire. Le module d'incorporation du vecteur selon l'invention pourra être constitué différemment selon les modes de réalisation. Il assurera l'introduction de l'inhibiteur à l'intérieur des cellules et permettra de s'affranchir de manipulations compliquées devant être utilisées, selon l'état de la technique, comme l'introduction de transgènes dans les cellules ou la perméabilisation chimique membranaire. On connaît dans l'état de la technique plusieurs molécules susceptibles d'être utilisées dans le cadre de la présente invention pour constituer le module d'incorporation. Ainsi ce module pourra notamment être constitué par : - un peptide hydrophobe cell-permeable peptide import (CPPI) selon Lin et al. (J. Biol. chem. 270, ppl4255-14258, 1995), - un peptide dérivé du domaine de liaison à l'ADN de facteurs de transcription à homéoboîtes selon Derossi et al. (Trends Cell. Biol. 8, pp 84-87, 1998), -un peptide dérivé de la protéine Tat du virus du SIDA (HIV) selon Schwarze et coll.. (Trends Cell Biol. 10, pp 290-295,2000). - la protéine VP22 du virus HSV-1, selon Elliott et O'Hare, (cell 88, pp 223-233,1997). La conception raisonnée de nouveaux peptides de séquences artificielles possédant cette activité est également envisagée. Par exemple il a été montré que les peptides riches en arginine possèdent une bonne efficacité d'incorporation cellulaire (Futaki et coll. 2001. J. Biol. Chem.). Il a été montré pour certains de ces peptides non seulement une forte activité d'incorporation cellulaire, mais également une grande capacité de diffusion dans l'organisme, comme par exemple à travers la barrière hémato-encéphalique (Schwarze et coll. 2000. Trends Cell Biol. 10,290-295). Préférentiellement, ledit module d'incorporation est un peptide de translocation membranaire tel qu'un peptide dériné de la protéine TAT du virus du sida (HIV). Selon une variante de l'invention, ledit inhibiteur comprend de plus au moins un module d'étiquetage. Préférentiellement, ce module d'étiquetage est un polypeptide tel la polyhistidine. Un tel module d'étiquetage pourra notamment être utilisé pour faciliter la purification du polypeptide vectorisé par exemple par affinité pour les métaux dans le cas de la poly-histidine. On notera que l'intégration d'un tel module d'étiquetage dans le vecteur n'est absolument pas obligatoire. On connaît dans l'état de la technique plusieurs molécules susceptibles d'être utilisées dans le cadre de la présente invention pour constituer le module UBL, telles que l'ubiquitine, SUMO, NEDD-8, UCRP, RUB ou d'autres (voir Jentsch et Pyrowolakis, Trends Coll. Biol. 10, pp 335-342, 2000). Préférentiellement ce module est l'ubiquitine. L'invention concerne également toute molécule vectorisée caractérisée en ce qu'elle est constituée par la fusion d'une molécule (X) présentant au moins une extrémité amino-terminale dont ladite extrémité amino-terminale est fusionnée par liaison peptidique à l'extrémité carboxy-terminale du vecteur tel que décrit ci-dessus. Selon une variante, ladite molécule (X) est un acide aminé ou un peptide, éventuellement chimiquement modifié. Selon une autre variante, ladite molécule (X) est une molécule non peptidique greffée à l'extrémité carboxy-terminale d'un oligopeptide. Lorsque le module d'incorporation cellulaire et le module d'étiquetage sont des polypeptides, il est possible de produire l'ensemble vecteur + peptide vectorisé comme une protéine recombinante en systèmes d'expression appropriés, eucaryotes (par exemple baculovirus) ou procaryotes (bactéries) L'invention sera mieux comprise grâce aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 représente une molécule vectorisée selon l'invention ; - la figure 2 représente schématiquement le fonctionnemnent de l'invention. En référence à la figure 1, une molécule vectorisée 1 est constituée par la fusion, de NH2 en COOH, d'un module d'incorporation cellulaire 2 pouvant par exemple être constituée par peptide dérivé de la protéine TAT du virus du Sida (HIV), d'un module d'étiquetage (3) pouvant par exemple être de la polyhistidine, d'un module ubiquitine ou autre peptide conjugable apparenté (UBL) 4 et d'une molécule à transporter 5. Une fois incorporée dans les cellules, la molécule vectorisée est clivée entre 4 et 5 par une hydrolase spécifique 6. En référence à la figure 2, la molécule vectorisée 1 est introduite dans le milieu extracellulaire A, par addition dans le milieu de culture dans le cas de cellules, ou par injection dans l'organisme dans le cas d'un organisme entier. Grâce au module module d'incorporation cellulaire 2 qu'elle contient, cette molécule franchit la membrane cellulaire C et se retrouve dans le cytoplasme B. Grâce à une hydrolase spécifique 6 symbolisée sur la figure 2 par la paire de ciseaux la liaison peptidique entre la molécule 5 et l'UBL 4 est rompue et la molécule 5 est relarguée avec son extrémité amino-terminale libre. Cette molécule peut y exercer son activité biologique. Le devenir du vecteur 1', constitué par la fusion des modules 2,3, 4, n'a quant à lui plus d'influence sur la fonction de la molécule transportée 5. L'invention offre une large gamme d'applications, depuis la recherche fondamentale à la clinique. Puisqu'elle n'impose aucune condition sur la nature de la molécule X, elle permet l'introduction en cellules de polypeptides aussi bien naturels qu'artificiels. Par exemple, on peut choisir des peptides sélectionnés comme des ligands spécifiques de protéines régulatrices connues, à travers des stratégies de criblage de banques peptidiques aléatoires, de double hybride direct ou inverse, ou encore de modélisation assistée par ordinateur. L'invention est aussi directement adaptable au criblage de banques peptidiques aléatoires, qui offrent des milliards de configurations tridimentionnelles possibles. Pour cela, une banque peut être construite en utilisant directement le vecteur décrit ci-dessus, en insérant des séquences nucléotidiques aléatoires en 3'de la région codant l'UBL. REVENDICATIONS 1. Vecteur pour l'introduction d'une molécule (X) présentant au moins une extrémité amino-terminale dans une cellule eucaryote caractérisé en ce qu'il est constitué par l'association d'un module d'incorparation cellulaire permettant la translocation membranaire, et d'un module ubiquitine ou autre peptide conjugable apparenté, ledit vecteur présentant une extrémité carboxy-terminale destinée à être fusionnée par liaison peptidique à l'extrémité amino-terminale de ladite molécule (X) 2. Vecteur selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est consitué par l'association, de NH2 en COOH, d'un module d'incorporation cellulaire permettant la translocation membranaire, d'un module d'étiquetage et d'un module ubiquitine ou autre peptide conjugable apparenté. 3. Vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que ledit module d'incorporation est un peptide de translocation membranaire. 4. Vecteur selon la revendication 3 caractérisé en ce que ledit module d'incorporation est un peptide dérivé de la protéine TAT du virus du Sida (HIV). 5. Vecteur selon l'une quelconque des revendications 2 à 4 caractérisé en ce que ledit module d'étiquetage est un polypeptide. 6. Vecteur selon la revendication 5 caractérisé en ce que ledit module d'étiquetage est la polyhistidine. 7. Molécule vectorisée caractérisée en ce qu'elle est constituée par la fusion d'une molécule (X) présentant au moins une extrémité amino-terminale dont ladite extrémité amino-terminale est fusionnée par liaison peptidique à l'extrémité carboxy-terminale du vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 8. Molécule vectorisée selon la revendication 7 caractérisée en ce que ladite molécule (X) est un acide aminé ou un peptide. 9. Molécule vectorisée selon la revendication 8 caractérisée en ce que ladite molécule (X) est un acide aminé ou un peptide chimiquement modifié. 10. Molécule vectorisée selon la revendication 7 caractérisée en ladite molécule (X) est une molécule non peptidique greffée à l'extrémité carboxyterminale d'un oligopeptide.