Brevet FR2812087A1 — publié le 20020125

PROCEDE DE CRIBLAGE DE PEPTIDES UTILISABLES EN IMMUNOTHERAPIE La vaccination ou immunothérapie peptidique est une approche thérapeutique qui fait actuellement l'objet d'un grand intérêt dans le cadre de la prévention ou du traitement des pathologies virales ou cancéreuses. Son principe repose sur l'immunisation par des peptides reproduisant des épitopes T d'antigènes viraux ou tumoraux reconnus par les cellules T cytotoxiques (CTL), en général de type CD8+, qui jouent un rôle majeur dans l'élimination des cellules exprimant ces antigènes à leur surface. On rappellera que les CTL ne reconnaissent pas les antigènes protéiques entiers, mais des fragments peptidiques de ceux-ci, comprenant généralement 8 à 10 acides aminés, présentés par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH I) exprimées à la surface des cellules présentatrices de l'antigène (CPA). La présentation de ces peptides résulte d'un processus complexe, dénommé apprêtement de l'antigène , qui implique 3 étapes principales : la dégradation cytosolique des protéines antigéniques par un complexe multienzymatique dénommé protéasome ; - la translocation des peptides issus de cette dégradation dans le réticulum endoplasmique (RE) par les transporteurs TAP ; l'association de ces peptides avec les 2 chaînes du CMH I pour former des complexes stables peptide/CMH I, qui seront exportés à la surface cellulaire. Les complexes peptide./CMH I interagissent avec les récepteurs à l'antigène (TCR) correspondants des lymphocytes T. Cette interaction induit la stimulation de ces lymphocytes, et leur division cellulaire (prolifération clonale) qui aboutit à la génération des lymphocytes effecteurs portant le même TCR, qui assureront l'élimination de l'agresseur vis-à-vis des antigènes duquel la réponse immunitaire a été induite. Au cours du processus d'apprêtement s'opère une sélection des peptides, qui aboutit à une hiérarchie de présentation par le CMH I à la surface de la cellule. La représentation des épitopes à la surface cellulaire dépendra notamment de la stabilité de la protéine antigénique dans le cytosol, des sites et de la fréquence des coupures effectuées par le protéasome, de l'efficacité de la translocation dans le RE par les transporteurs TAP, et surtout de la capacité des peptides à se fixer aux différentes molécules de CMH I et à former des complexes peptide/CMH I stables. Les peptides qui sont préférentiellement présentés par le CMH à l'issue du processus d'apprêtement constituent des épitopes immunodominants, qui sont les principaux participants à la réponse CTL aux antigènes natifs dont il sont issus. En revanche les peptides qui ne sont que faiblement présentés constituent des épitopes sousdominants/cryptiques, qui ne participent que peu ou pas à cette réponse. Il a été proposé d'utiliser des peptides correspondant à ceux présentés par le CMH I pour induire une réponse protectrice, notamment vis-à-vis d'antigènes viraux ou tumoraux. Il a ainsi été montré que des vaccins basés sur des peptides immunodominants, généralement sélectionnés sur la base de leur forte affinité pour les molécules de CMH I, permettaient d'assurer une protection antivirale ou antitumorale dans de nombreux modèles expérimentaux murins et plus récemment, chez les humains [SCHULTZ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,991 (1991) ; KAST et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,2283, (1991) ; MARCHAND et al., Int. J. Cancer, 80,219, (1999) ; ROSENBERG et al., Nature Med., 4, 321, (1998)]. Cependant, il a également été montré récemment que la vaccination avec les peptides immunodominants pourrait, dans certains cas, s'avérer inefficace. Ainsi, lors de l'infection chronique avec un virus dont le taux de mutation est élevé, comme HIV ou HBV, la pression de sélection imposée par la réponse CTL antivirale naturelle favorise la survie de variants ayant muté dans la séquence de leurs peptides immunodominants. Ces variants ne sont plus reconnus par des CTL spécifiques d'épitopes immunodominants [KLENERMAN et al., Nature, 369,403, (1994) ; BERTOLETTI et al., Nature, 369,407, (1994) ; MOSKOPHIDIS et ZINKERNAGEL, J. Virol., 69,2187, (1995) ; BORROW et al., Nat. Med., 3, 205, (1997) ; GOULDER et al., Nat. Med., 3,212, (1997)]. Également, dans le cas de tumeurs exprimant à des taux élevés des protéines qui sont aussi exprimées dans des tissus normaux, et qui constituent des antigènes du soi , un phénomène de tolérance peut se développer. Cette tolérance concerne principalement les épitopes immunodominants à forte affinité pour MHC. La stimulation du répertoire CTL spécifique de ces épitopes ne parait donc pas être la meilleure voie pour obtenir une protection antitumorale efficace. L'utilisation d'épitopes sousdominants/cryptiques, de faible affinité pour le CMH, a donc été proposée. Dans le cas de la vaccination antivirale, ces épitopes, qui ne sont pas soumis à une pression de sélection similaire à celle des épitopes immunodominants, peuvent représenter des cibles utiles pour éliminer des virus de type sauvage ainsi que leurs variants. Dans le cas de la vaccination antitumorale, les épitopes de faible affinité ne participant que peu ou pas à l'établissement de la tolérance, le répertoire de CTL anti-tumoraux spécifiques de ces épitopes, pourrait rester disponible pour un recrutement in v1v0. Lors de travaux précédents, l'équipe des Inventeurs a montré [OUKKA et al., J. Immunol., 157,3039, (1996)] qu'il était possible d'utiliser les peptides sousdominants/cryptiques en vaccination anti-virale. Ils ont également observé que l'efficacité de protection induite par des épitopes sous-dominants/cryptiques était inférieure à celle obtenue avec la vaccination par le peptide dominant, mais qu'elle pouvait être augmentée en rendant ces peptides plus immunogènes par l'augmentation de leur affinité pour le CMH I [TOURDOT et al., J. Immunol., 159,2391, (1997]. La stratégie habituelle pour augmenter l'immunogénicité des épitopes viraux ou tumoraux, consiste à augmenter leur affinité pour le CMH 1 et/ou la stabilité du complexe peptide/CMH 1 par des substitutions d'acides aminés. Il a en effet été observé que les peptides capables de former un complexe avec un allèle de CMH donné ont en commun la présence, à certaines positions, de résidus d'acides aminés conservés. On a ainsi défini pour chaque allèle du CMH I un motif d'ancrage spécifique, impliquant des acides aminés dénommés résidus d'ancrage primaires . Il a aussi été montré que des résidus situés en dehors des sites d'ancrage (résidus d'ancrage secondaires) pouvaient exercer un effet favorable ou défavorable sur l'affinité du peptide pour le CMH ; la présence de ces résidus d'ancrage secondaires permet d' expliquer qu' il existe, au sein des peptides possédant le même motif d'ancrage spécifique d'un CMH I donné, une grande variabilité dans l'affinité de fixation, et que des peptides n'ayant pas le motif d'ancrage primaire complet puissent être présentés par les molécules de CMH I et posséder pour ces molécules une forte affinité. De nombreuses équipes sont ainsi parvenues à augmenter l'immunogénicité de peptides identifiés comme immunogènes viraux ou tumoraux potentiels, en augmentant leur affinité pour le CMH I. Par exemple, chez la souris, LIPFORD et al. [Vaccine, 13,313, (1995) ] ont montré que la substitution de D par I en position 2 du peptide sur l'épitope 50-57 de l'Ag E6. 1 du papillomavirus présenté par la molécule Kb augmentait la stabilité des complexes formés avec la molécule Kb, et rendait l'épitope immunogène in vivo, les CTL induites reconnaissant les cellules transformées par le papillomavirus. BRISTOL et al. [J. Immunol., 160,2433, (1998) ] ont également montré que le remplacement du résidu V en position C-terminale de l'épitope 4-12 de l'oncogène Ras p21 muté, par I ou L, qui sont les acides aminés d'ancrage en position 9 spécifiques de la molécule Kd, permettait l'induction d'une réponse CTL spécifique chez la souris BALB/c. HUDRISIER et al. [Mol. Immunol., 32,895, (1995)] ont identifié les résidus du peptide SMIENLEYM qui intervenaient dans la liaison à la molécule Db, et ont produit une série de peptides à forte affinité dérivés de la séquence X1AIX4NAEAL où X1=Y ou K et X4=E ou K. Chez l'homme, POGUE et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92,8166, (1995)] ont substitué des acides aminés aux différentes positions de l'épitope 767-484 de la transcriptase inverse du virus HIV-1, présenté par la molécule HLA A2. 1, et ont montré que la substitution par Y ou F du résidu en position 1 augmentait l'affinité du peptide et sa capacité à induire des CTL à partir de PBL de donneurs séropositifs possédant l'allèle HLA A2.1. PARKHURST et al. [J. Immunol., 157,2539, (1996) ] ont réalisé des substitutions uniques aux positions 1,2, 3, ou doubles aux positions 1 et 2, ou 2 et 3, dans les épitopes gplOO 209, gplOO 280 et gplOO 154 de l'Ag gplOO associé au mélanome, et ont montré que les épitopes modifiés gplOO 209 2M, et gplOO 280 9V avaient une affinité plus forte que l'épitope nonmodifié. BAKKER et al. [Int. J. Cancer, 70,302, (1997) ], ont obtenu par substitution à une des positions d'ancrage (position 2) ou en dehors des positions d'ancrage (position 8), des variants de l'épitope gplOO 154, possédant une plus forte affinité que l'épitope natif. SAROBE et al. [J. Clin. Invest., 102,1239, (1998)] ont obtenu un variant immunogène de l'épitope C7A de la protéine core du virus HCV présenté par HLA A2.1. VALMORI et al. [J. Immunol., 160,1750, (1998)] ont obtenu un dérivé à forte affinité de l'épitope 26-35 de l'antigène de mélanome MART-1 présenté par HLA A2.1. Il apparaît donc possible d'augmenter l'immunogénicité d'épitopes sous-dominants/cryptiques, afin de les utiliser en immunothérapie. Cependant, ceci nécessite l'identification préalable de ces épitopes. Or, celle-ci demeure problématique, du fait précisément de leur faible immunogénicité. Dans le but de remédier à ce problème, les Inventeurs ont recherché s'il était possible de définir des règles générales de substitution des acides aminés qui permettrait d'augmenter l'affinité et donc l'immunogénicité de la majorité des épitopes tumoraux présentés par le CMH (par les molécules HLA de classe I et notamment la molécule HLA A2.1), et ce, qu'ils possèdent ou non les acides aminés d'ancrage spécifiques de cette molécule, et de façon générale, indépendamment de leur séquence d'origine. Les Inventeurs ont ainsi constaté que la seule substitution de l'acide aminé N-terminal par un résidu tyrosine augmentait, quelle que soit la séquence du peptide natif, l'affinité de ce peptide pour les molécules HLA de classe I et notamment la molécule HLA A2. 1, et la stabilité du complexe peptide/CMH I formé, et ce dans une proportion d'autant plus importante que l'affinité du peptide natif était plus faible. Ils ont en outre observé que les peptides modifiés de la sorte conservaient la spécificité antigénique des peptides naturels, et devenaient immunogènes, et capables de recruter in vivo un répertoire'CTL spécifique du peptide natif correspondant. La présente invention a pour objet un procédé d'identification d'épitopes sous-dominants/cryptiques présentés par une molécule HLA de classe I, par exemple HLA A2. 1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : a) le choix, à partir de la séquence d'une protéine vis-à-vis de laquelle on souhaite induire une réponse cytotoxique T, d'au moins une séquence peptidique de 8 à 11 acides aminés susceptible de constituer un épitope de ladite protéine présenté par une molécule HLA de classe I, par exemple HLA A2. 1, et correspondant à un peptide à faible affinité pour ladite molécule HLA de classe I et nonimmunogène ; b) la préparation, pour chaque séquence sélectionnée, d'un peptide variant dérivé de ladite séquence par substitution de l'acide aminé N-terminal par un résidu tyrosine ; c) la détermination de l'immunogénicité de chaque peptide variant obtenu à l'étape b) par la sélection, parmi ceux-ci, de chaque peptide immunogène, générant une réponse CTL spécifique vis-à-vis de cellules cibles exprimant la protéine dont il est issu et l'identification de la séquence peptidique dont dérive ledit peptide immunogène. Dans le cadre de l'exposé de la présente invention, on entend par peptide immunogène un peptide capable d'induire une réponse CTL spécifique et par peptide non-immunogène un peptide incapable d'induire une réponse CTL spécifique. Le choix des séquences peptidiques susceptibles de constituer des épitopes présentés par une molécule HLA de classe I, notamment HLA A2.1 peut s'effectuer, de manière classique, par l'analyse de la séquence peptidique de la protéine choisie, afin de sélectionner les peptides possédant tout ou partie du motif d'ancrage primaire d'une molécule HLA de classe I, notamment d'HLA A2.1 (L en position 2 et/ou V/L en position C-terminale). On éliminera, bien entendu, les peptides connus comme étant immunogènes. Eventuellement, on pourra effectuer une sélection complémentaire des peptides dont la capacité de liaison potentielle à HLA de classe I, notamment HLA A2. 1, prédite par analyse informatique, apparaît la plus faible. Des algorithmes utilisables dans ce but sont connus en eux-mêmes ; à titre d'exemple, on citera ceux décrits par Parker et al., J. Immunol., 1994,152, 163. Cette analyse pourra avantageusement être complétée par la détermination expérimentale de l'affinité de liaison du peptide pour HLA de classe I, notamment HLA A2.1, et de la stabilité du complexe peptide/HLA de classe I. Des peptides non-immunogènes présentent le plus souvent une faible affinité pour HLA de classe I, et/ou forment avec celui-ci un complexe peu stable. Des méthodes pour déterminer l'affinité du peptide pour HLA A2.1, et la stabilité du complexe formé sont connues en elles-mêmes. On citera par exemple celle décrite par Firat et al. Eur.J.Immunol., 1999, 29,3112. L'affinité d'un peptide pour HLA de classe I, notamment HLA A2.1 est le plus souvent définie par rapport à celle d'un peptide de référence, sous forme d'affinité relative. L'affinité relative est définie comme le rapport de la concentration dudit peptide permettant la formation d'une certaine quantité de complexe peptide/HLA de classe I, à la concentration du peptide de référence permettant la formation, dans les mêmes conditions, de la même quantité de complexe peptide/HLA de classe I. Dans ce cas, plus l'affinité relative est importante, plus l'affinité de liaison du peptide pour HLA de classe I sera faible. A titre d'exemple, pour un complexe peptide/HLA A2.1, en prenant comme peptide de référence, le peptide de séquence IVGAETFYV, plus de 84% des peptides non-immunogènes auront fréquemment une affinité relative supérieure à 10. La stabilité du complexe peptide/HLA A2.1 est souvent définie par la DC50, ,qui représente le temps nécessaire à la dissociation de 50 % de complexes formés. Généralement, ce temps est inférieur à 2 heures pour les peptides non-immunogènes. Ainsi, si un peptide présenté par HLA A2.1, possède une affinité relative (par rapport à HIVpol 589) supérieure à 10, et une DC50 inférieure à 2 heures, il sera très probablement non-immunogène. L'immunogénicité des peptides retenus à l'étape c) pourra être facilement vérifiée, par exemple par des méthodes classiques de détermination de la capacité de ce peptide à générer, in vivo, ex vivo, ou in vitro une réponse CTL spécifique vis-à-vis de cellules cibles exprimant la protéine dont il est issu. Une fois ce choix effectué, les peptides variants, dérivés des séquences retenues par substitution de l'acide aminé N-terminal par un résidu tyrosine, peuvent être très facilement préparés, notamment par synthèse peptidique, selon des techniques classiques bien connues en elles-même de l'homme du métier. Avantageusement, avant la détection de l'immunogénicité de ces peptides variants, effectuée à l'étape c) du procédé conforme à l'invention, ledit procédé comprend une présélection desdits peptides variants par la détermination de l'affinité relative du peptide pour une molécule HLA de classe I, notamment HLA A2.1, et/ou de la stabilité du complexe peptide/HLA de classe I formé, et la sélection des peptides variants présentant une affinité relative pour HLA A2.1inférieure à celle des peptides natifs dont ils sont dérivés, et/ou une DC50 supérieure à 2 heures. Chaque peptide répondant à ces critères peut ensuite être testé, pour rechercher s'il peut induire un répertoire CTL spécifique du peptide natif non-immunogène dont il dérive, et capable notamment d'entraîner la lyse de cellules-cibles exprimant la protéine native dont ce peptide non-immunogène est issu. Si ce test est positif, on peut considérer que ce peptide natif non-immunogène représente un épitope sousdominant/cryptique, présenté par HLA A2. 1, dudit antigène. La mise en #uvre du procédé ci-dessus a par exemple permis aux Inventeurs d'identifier de nouveaux épitopes sous-dominants/cryptiques présentés par HLA A2.1 de l'antigène tumoral HER-2/neu, de la télomérase et du virus HIV-1. Ces épitopes sous-dominants/cryptiques sont les suivants : Pour HER-2/neu: le peptide HER-2/neu 650 : PLTSIISAV le peptide HER-2/neu 466 : ALIHHNTHL le peptide HER-2/neu 402 : TLEEITGYL le peptide HER-2/neu 391: PLQPEQLQV Pour HIV-1: le peptide gagp24-212 : EMMTACQGV le peptide pol79 : LLDTGADDTV Pour la télomérase: le peptide mhp 572 : RLFFYRKSV le peptide mhp 988 : DLQVNSLQTV La présente invention a également pour objet des épitopes peptidiques immunogènes dérivés d'épitopes sousdominants/cryptiques pouvant être identifiés par la mise en #uvre du procédé conforme à l'invention, et notamment des épitopes sous-dominants/cryptiques de HER/neu, du virus HIV- 1, et de la télomérase mentionnés ci-dessus. Un épitope peptidique immunogène conforme à l'invention peut être obtenu par différentes modifications de la séquence peptidique de l'épitope sous-dominant/cryptique dont il dérive. Très avantageusement, ces modifications comprennent au moins la substitution de l'acide aminé Nterminal par un résidu tyrosine. Il peut s'agir notamment d'un peptide variant sélectionné à l'issue de l'étape c) du procédé conforme à l'invention, ou éventuellement de tout dérivé de celui-ci comprenant d'autres modifications de séquence permettant d'accroître son immunogénicité. La présente invention a également pour objet des compositions comprenant au moins un épitope peptidique immunogène conforme à l'invention. Les épitopes peptidiques immunogènes conformes à l'invention sont utilisables dans tous les traitements d'immunothérapie pour lesquels il est souhaitable d'induire une réponse CTL dirigée contre des épitopes sousdominants/cryptiques, et notamment dans le cadre de la thérapie antivirale ou anti-tumorale. Avantageusement, il s'agit de compositions multiépitopiques, capables de générer une réponse CTL polyspécifique, et qui dans ce but comprennent également un ou plusieurs autre(s) épitope(s) immunogène(s). Il peut s'agir d'un ou plusieurs autre(s) épitope(s) sousdominant(s)/cryptique(s) et/ou d'un ou plusieurs épitope(s) immunodominant(s). Ces épitopes peuvent être issu du même antigène, ou de deux ou plusieurs antigènes différents. Avantageusement, des compositions multiépitopiques conformes à l'invention peuvent également comprendre au moins un épitope présenté par une molécule du CMH II, et capable d'induire une réponse T auxiliaire. Elles peuvent comprendre en outre, pour être plus largement utilisables sur une population dont les individus portent des allèles HLA différents, un ou plusieurs épitopes présentés par des molécules du CMH I autres que HLA A2. Selon un mode de réalisation préféré d'une composition conforme à l'invention, elle comprend au moins un polypeptide chimérique comprenant une ou plusieurs copies d'un épitope peptidique immunogène conforme à l'invention. Dans le cas d'une composition multiépitopique, ledit polypeptide chimérique comprend en outre une ou plusieurs copies d'au moins un autre épitope immunogène. Un tel polypeptide chimérique peut être facilement obtenu par des méthodes connues en elles-mêmes, et notamment par les techniques classiques de l'ADN recombinant. La présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique codant un polypeptide chimérique conforme à l'invention. La présente invention. a également pour objet l'utilisation d'un épitope peptidique immunogène, d'une composition, ou d'une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention pour l'obtention d'un médicament, et notamment d'un médicament destiné à l'immunothérapie antivirale ou antitumorale. La présente invention englobe également les médicaments comprenant, en tant que principe actif, au moins un épitope peptidique immunogène, une composition, ou une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, lesdits médicaments sont des vaccins. Des médicaments conformes à l'invention peuvent comprendre en outre les excipients usuels, ainsi que des adjuvants habituellement utilisés en immunothérapie, et permettant par exemple de favoriser l'administration du principe actif, de le stabiliser, d'augmenter son immunogénicité, etc. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs d'identification de nouveaux peptides et de nouveaux antigènes potentiellement utilisables en immunothérapie, par la mise en #uvre du procédé conforme à l'invention. EXEMPLE 1 : RELATION ENTRE L'AFFINITE, LA STABILITE DES COMPLEXES HLA A2. 1/PEPTIDE ET L'IMMUNOGENICITE DES PEPTIDES VIRAUX ET TUMORAUX. Trente-deux peptides provenant d'antigènes viraux (HBV, HIV, Flu) et de tumeurs (HER-2/neu, mélanome gplOO, Tyrosinase, Mart-1) ont été testés pour leur capacité à fixer et à stabiliser la molécule HLA'A2.1 : ces peptides sont représentés dans le Tableau I ci-après. Tableau # Peptides Séquences Tyrosinase 224 KLTGDENFTI Tyrosinase 207 FLPWHRLFLL Tyrosinase 1 * MLLAVLYCL gp100 154* KTWGQYWQV gp100 476* VLYRYGSFSV gp100 209* TDQVPFSV gp100570* SLADTNSLAV gp100 177* AMLGTHTMEV gp100 178 MLGTHTMEV gp100 457* LLDGTATLRL mart-1 27* AAGIGILTV mart-1 32* ILTVILGVL HER-2/neu 789* CLTSTVQLV HER-2/neu 48 HLYQGCQVV HER-2/neu 650 PLTSIISAV HER-2/neu 466 ALIHHNTHL HER-2/neu 402 TLEEITGYL HER-2/neu 661 ILLVVVLGV HER-2/neu 799* QLMPYGCLL HER-2/neu 369* KIFGSLAFL HER-2/neu 851 VLVKSPNHV HER-2/neu 5* ALCRWGLLL HER-2/neu 391 PLQPEQLQV HER-2/neu 773* VMAGVGSPYV HER-2/neu 971 * ELVSEFSRM HBVpol 985 NLQSLTNLL HBVpol 765 LLGCAANWIL HBVpol 28 LLDDEAGPL HBV pol 575* FLLSLGIHL H BVpol 594 PLEEELPRL FluM 58* GILGFVFTL HIVgag 76* SLYNTVATL HIVrt 309* ILKEPVHGV Vingt de ces peptides (signalés par un astérisque dans le Tableau I) sont déjà connus en tant qu'épitopes, présentés par HLA A2.1 et générant une réponse cytotoxique CTL chez l'homme ; les 12 autres peptides, ne sont pas encore été décrits en tant qu'épitopes, ont été choisis en fonction de deux critères : la présence de motifs d'ancrage primaires de HLA A2.1 (L en position 2 et V/L en position C-terminale) et un score de liaison faible, selon une évaluation effectuée par le programme BIMAS [PARKER et al., J. Immunol., 152,163, (1994) ]. L'affinité pour HLA A2. et la stabilité du complexe du complexe peptide/HLA A2.1 ont été évaluées par cytométrie de flux, et l'immunogénicité a été évaluée par génération de CTL sur des souris transgéniques HDD [PASCOLO et al. J. Exp. Med., 185,2043, (1997) ]. Les protocoles utilisés sont les suivants (Firat et al., Eur. J. Immunol., 1999,29, 3112) : Affinité : Des cellules T2 (Firat et al., Eur. J. Immunol . , 1999,29, 3112) (3xlO5 cellules/ml) humaines, qui sont déficientes en transporteurs TAP, sont incubées à 37 C pendant 16 heures avec diverses concentrations de chaque peptide à tester dans du milieu RPMI 1640 sans sérum, supplémenté avec 100 ng/ml de (32-microglobuline humaine. Ensuite, elles sont lavées deux fois, et marquées avec l'anticorps monoclonal BB7.2 (Parham et al., Hum. Immunol., 1981,3, 4,277-299) qui est spécifique de la molécule HLA A2. 1, puis avec un anticorps de chèvre anti-Ig de souris, couplé à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC). Les cellules sont ensuite analysées en cytométrie de flux. Pour chaque concentration de peptide, la fluorescence spécifique de HLA A2.1 est calculée en tant que % de la fluorescence obtenue avec 100 M d'un peptide de référence (HIVpol 589 ; IVGAETFYV). L'affinité relative (RA) est définie comme le rapport de la concentration de chaque peptide induisant 20% de la fluorescence obtenue avec 100 uM du peptide de référence, à la concentration du peptide de référence induisant 20% de la fluorescence obtenue avec 100 M dudit peptide de référence. Plus l'affinité relative est faible, et plus fortement le peptide se lie à HLA A2.1. La RA moyenne pour chaque peptide est déterminée à partir d'au moins trois expériences indépendantes. Dans toutes les expériences, 20% de la fluorescence maximale ont été obtenus pour 1 à 3 uM du peptide de référence. Stabilité : Des cellules T2 (106/ml) sont incubées pendant une nuit à 37 C avec 100 uM de chaque peptide à tester dans du milieu RPMI 1640 sans sérum, supplémenté avec 100 ng/ml de 2-microglobuline humaine. Ensuite, elles sont lavées à quatre reprises pour éliminer les peptides libres, incubées avec du Brefeldin A (SIGMA ; 10 ug/ml) pendant une heure pour prévenir l'expression à leur surface des molécules HLA A2.1 nouvellement synthétisées, lavées et incubées à 37 C pendant 0,2, 4,6 ou 8 heures. Pour chaque temps d'incubation, les cellules sont ensuite marquées, comme indiqué ci-dessus, avec l'anticorps BB7. 2, et analysées en cytométrie de flux pour évaluer la quantité de complexe peptide/HLA A2. présent à leur surface. Cette quantité est évaluée par la formule : (fluorescence moyenne des cellules T2 préincubées avec le peptide - fluorescence moyenne des cellules T2 traitées dans des conditions similaires en l'absence de peptide). Le DC50 (complexe de dissociation : DC) est défini comme étant le temps requis pour la perte de 50% des complexes HLA A2. 1/peptide stabilisés à t=0. Immunogénicité : Les souris HHD utilisées sont (32m-/-,Db-/- et expriment une monochaîne HLA A2.1 composée des domaines al et a2 de HLA A2.1et des domaines a3 et intracellulaire de Db reliée par son N-terminal au C-terminal de ss2-m humain par un peptide de 15 acides aminés. Les souris reçoivent une injection sous-cutanée à la base de la queue avec 100 ug de chaque peptide à tester émulsifié dans de l'adjuvant incomplet de Freund, en présence de 140 ug d'un épitope auxiliaire T dérivé de l'antigène core de HBV (128-140, séquence TPPAYRPPNAPIL). Après 11 jours, des cellules spléniques prélevées sur les souris (5x107 cellules dans 10 ml) sont stimulées in vitro avec le peptide à tester (10 uM). Le 6ème jour de culture, les populations qui répondent sont testées pour déterminer une cytotoxicité spécifique. Dans certains cas, les cellules qui répondent sont restimulées in vitro à des intervalles d'une semaine avec 2x106 cellules spléniques HHD irradiées (3000 rads) et 10 uM de peptide en présence de 20 UI/ml d'IL2 recombinante. Des cellules RMA-HHD et RMAS-HHD, sont utilisées comme cibles pour étudier la cytotoxicité. Ces cellules sont respectivement obtenues par transfection de cellules RMA murines et de leurs cellules RMAS variantes déficientes en TAP avec la construction HHD comme décrit par NOWAK et al. [Nature, 375,606, (1995) ]. Elles sont infectées par des virus exprimant les différents antigènes dont sont issus les peptides à tester. Les virus utilisés sont les suivants : le virus recombinant de la vaccine exprimant VIHgag VVTG1144 (vacVIHgag) décrit par Johnson, J.Immunol.1991, 147,1512 ; le virus recombinant de la vaccine exprimant HER-2/neu VT39 (vac-neu) (Therion Biologics) ; le virus de la vaccine vacgplOO, décrit par Yang (J. Immuno1.2000, 164, 4204) ; un virus de la vaccine de type sauvage (vac-WT) ; et le virus flu PR8 de l'influenza décrit par JL Virelizier (J. Immunol, 1975,115, 2, 434-439). Pour les infections virales, les cellules RMA-HHD sont incubées pendant 16 heures avec les virus de la vaccine (10 PFU/cellule), recombinants ou sauvage, ou avec le virus flu PR8 (50 HAU) pendant 2 heures. Les cellules-cibles sont marquées avec 150 Ci de 51Cr pendant 90 minutes, puis lavées trois fois et étalées dans des plaques de 96 puits à fond rond (104 cellules/puits dans 100 l de RPMI 1640 + 3% de sérum de veau f#tal). Des cellules RMA HHD ou RMAS HHD non infectées sont pulsées avec 1 M de peptide à tester, à 37 C pendant 90 minutes. Ensuite, 100 l des cellules effectrices à différentes concentrations, sont ajoutés dans les puits et les plaques sont incubées à 37 C pendant 4 heures. Après incubation, 100 l de surnageant sont collectés et la radioactivité est mesurée dans un compteur y. Le pourcentage de lyse spécifique est calculé par la formule : [(libération de 51Cr expérimentale-libération de 51 Cr spontanée)/(libération de 5lCr maximale-libération de zur spontanée)] x 100. Dans toutes les expériences, la libération spontanée est inférieure à 20% de la libération maximale induite par HC1 3N. En fonction de leur capacité à fixer et à stabiliser la molécule HLA A2.1, et de leur immunogénicité, les 32 peptides ont été classés en trois groupes différents ; les résultats de ce classement sont représentés dans le Tableau II. Tableau Il Peptides RA DC50 (heures) Répondeurs*/Souris totales Group @ HIV gag 76 1,0 >8 7/10 Flu M58 0,2 >8 4/6 HBV pol 575 2,5 >8 6/8 HBV pol 765 2,0 4 ND Mart-1 27 2,2 2-4 4/5 gp100177 0,5 >6 3/5 gp 100 178 0,3 6-8 4/6 gp 100 154 2,3 6-8 7/9 gp 100 570 1,0 4-6 6/9 gp100 209 1,3 4 4/6 gp100 476 10,0 6 8/10 gp 100 457 1,6 2-4 4/6 HER-2/neu 799 1,0 6-8 % HER-2/neu 369 2,3 4 12/13 HER-2/neu 789 1,6 6-8 4/6 HER-2/neu48 1,7 >8 5/6 HER-2/neu 773 1,7 6 2/3 HER-2/neu 5 2,3 >8 5/6 Groupe Il Tyrosinase 1 >60,0 2-4 4/23 Mart-1 32 21,1 4 0/10 HER-2/neu851 24,0 4 1/12 HER-2/neu 661 >60,0 2-4 0/6 Groupe III HBV pol 28 5,3 0/6 HBV pol 594 4,2 0/6 HBV pol 985 43,3 0/6 Tyrosinase 224 >50,0 0/6 Tyrosinase 207 >50,0 2 0/6 HER-2/neu 650 1,4 0/6 HER-2/neu 466 4,8 2 0/6 HER-2/neu 402 19,0 0/6 HER-2/neu 391 >70,0 2 0/6 HER-2/neu 971 >70,0 2 0/6 On considère que les souris répondent lorsqu'une cytotoxicité spécifique contre des cribles pulsés par un peptide est supérieure à 15% de la toxicité vis-à-vis des cibles non puisées. Le premier groupe est constitué de 18 peptides ayant une RA # 10 et un DC50 > 2 heures. Ils correspondent à des épitopes d'antigènes de virus ou de tumeurs (à l'exception de HBVpol 765 et HER-2/neu 48) et déclenchent une réponse CTL chez un pourcentage élevé (60 à 92%) des souris HHD. Le deuxième groupe de quatre peptides avec une RA > 10 et un DC50 > 2 heures comprend trois épitopes connus, et un épitope potentiel (HER-2/neu 661). Deux d'entre eux sont non-immunogènes (Mart-1 32, HER-2/neu 661), tandis que HER-2/neu 851 et tyrosinase 1 induisent une réponse chez un faible pourcentage de souris HHD (8% etl7%, respectivement). Dix peptides avec DC50 correspondent pas à des épitopes connus (à l'exception de HER-2/neu 971) et ils sont non-immunogènes chez des souris HHD, même s'ils ont une RA élevée, comme HBVpol 28, HBVpol 594, HER-2/neu 650 et HER-2/neu 466. Les conclusions suivantes peuvent être tirées de ces résultats : (i) des motifs d'ancrage secondaires influencent fortement la liaison HLA A2.1 puisque des peptides ayant les résidus d'ancrage primaires HLA A2.1 optima présentent un très large spectre d'affinités, (ii) l'affinité de liaison n'est pas toujours en corrélation avec l'aptitude à stabiliser la molécule HLA A2.1. Les peptides Mart-1 32 et HER-2/neu 851 sont de faibles liants mais ils forment des complexes peptide/HLA A2.1stables. Au contraire, les peptides HBVpol 28, HBVpol 594, HER-2/neu 650 et HER- 2/neu 466 sont des liants puissants mais ils forment des complexes instables avec la molécule HLA A2.1, (iii) l'immunogénicité des peptides dépend principalement de leur capacité à stabiliser la molécule HLA A2.1. Des peptides ayant un DC50 2 heures peuvent être non immunogènes (Mart-1 32 et HER-2/neu 661) ou très faiblement immunogènes (Tyrosinase 1 et HER-2/neu 851) s'ils présentent une faible affinité de liaison. Il apparaît donc qu'il est nécessaire d'améliorer à la fois l'affinité de liaison et l'aptitude à stabiliser la molécule HLA A2.1 pour que des peptides génèrent une forte réponse CTL. EXEMPLE 2 : EFFET DU REMPLACEMENT DU RESIDU EN POSITION P1 PAR UNE TYROSINE SUR L'AFFINITE ET LA STABILITE DU COMPLEXE HLA A2.1/PEPTIDE. Des variants des 32 peptides décrits dans l' exemple 1, résultant de la substitution du 1er acide aminé N-terminal par une tyrosine (substitution P1Y), ont été synthétisés. Ces variants ont été testés pour leur affinité pour la molécule HLA A2.1 et leur capacité à stabiliser le complexe formé. Les résultats sont illustrés par le Tableau III. Tableau III Peptide RA WT/RA Y1 DC50 Y1-DC50 WT HIV gag 76 # 3,0 = 0 Flu M58 # 2,4 =0 H BV pol 575 # 2,6 = 0 HBV pol 765 # 40,4 # 4 Mart-127 # 2 =0 gp100177 = 0,6 # 2 gp100178 = 0,8 # 2 gp100 154 = 0,8 # -2 gp 100 570 # 3,4 # >2 gp100 209 = 1,7 # 2 gp100 476 Î4,2 # 2 gp 100 457 1 2,3 T >2 HER-2/neu 369 # 3,9 # >2 HER-2/neu 799 # 3,9 # >2 HER-2/neu 789 # 2,1 = 0 HER-2/neu 48 # 3,0 = 0 HER-2/neu 773 # 2,0 # 2 HER-2/neu 5 = 1,1 = 0 Tyrosinase 1 T >3,7 T >2 Mart-1 32 # 16,2 # 2 HER-2/neu 851 # 3,0 # 2 HER-2/neu 661 # >1,5 # 2 HBV pol 28 # 2,3 # >2 HBV pol 594 # 14,8 # >6 H BV pol 985 # 13,7 # >6 Tyrosinase 224 # >5,1 T >2 Tyrosinase 207 # >6,4 # >4 HER-2/neu 650 # 6,0 # >4 HER-2/neu 466 # 3,3 # >4 HER-2/neu 402 # 5,2 # >2 HER-2/neu 391 # 55,5 # >6 HER-2/neu 971 # 11,6 # 2 Ces résultats montrent que la substitution P1Y augmente la liaison de tous les peptides de faible affinité, et favorise la stabilisation de HLA A2.1 pour tous les peptides stabilisants faibles (groupes II et III dans le Tableau II). L'augmentation d'affinité, mesurée par le rapport entre les RA du peptide modifié et du peptide naturel, est au minimum de 1,5 et va jusqu'à 55,5, tandis que l'augmentation de la stabilisation de HLA A2. 1, mesurée par la différence entre les DC50 du peptide modifié et du peptide naturel est au minimum de 2 heures et va jusqu'à 6 heures. Le RA de tous les peptides modifiés, à l' exception d'un d'entre eux (HER-2/neu 661Y1) est inférieur à 10, et leur DC50 est > 4 heures. Pour les peptides Tyrosinase 1 et HER-2/neu 661, la modification P1Y ne génère pas de peptides ayant une très forte affinité. Ceci est dû à la présence dans ces peptides de résidus d'ancrage secondaires P3-P8/9 défavorables pour la liaison de HLA A2.1. L'effet de la substitution PlY n'est pas limité aux peptides de faible affinité mais est aussi observé avec la majorité des peptides de forte affinité (groupe I du le Tableau II). Deux seulement des dix-huit peptides de forte affinité n'ont amélioré ni leur affinité de liaison, ni leur capacité de stabilisation (gplOO 154 et HER-2/neu 5). Il faut noter qu'une augmentation d'affinité est indépendante de la nature du résidu en position 1 du peptide natif et qu'elle est observée même si le résidu substitué n'est pas un résidu défavorable à la liaison avec HLA A2.1. Quatre seulement des 19 peptides ayant un rapport RA du peptide naturel/RA de peptide modifié supérieur à 3 ont un résidu défavorable en P1 (P pour HER-2/neu 391, HER-2/neu 650 et HBVpol 594, E pour HER-2/neu 971).L'augmentation d'affinité de ces quatre peptides est toutefois très importante : elle est comprise entre 6 et 55,5. Cependant, l'affinité est augmentée même lorsque Y substitue un autre résidu favorable comme F (HBVpol 575 et Tyrosinase 207). Ces résultats démontrent qu'une substitution PlY augmente la liaison à HLA A2.let la capacité de stabilisation du complexe formé pour presque tous les peptides liés à HLA A2.1. Cet effet est bien plus prononcé pour les peptides nonimmunogènes de faible affinité pour HLA A2.1. EXEMPLE 3 : RECONNAISSANCE CROISEE DES PEPTIDES NATURELS ET DE LEURS VARIANTS PlY PAR DES CTL SPECIFIQUES. L'augmentation de l'affinité pour HLA A2.1 est la première condition pour rendre immunogènes des peptides de faible affinité. Il est cependant également nécessaire que leur conformation dans le complexe avec HLA A2.1 ne soit pas modifiée, et que leur spécificité antigénique soit conservée. Si tel est le cas, des CTL générés chez des souris HHD vaccinées par le peptide natif doivent reconnaître celui-ci et son variant P1Y avec la même efficacité. De plus, les variants P1Y doivent être capables de recruter in vivo le répertoire des CTL spécifiques du peptide naturel. La reconnaissance des variants P1Y par des CTL spécifiques de peptide naturel a d'abord été étudiée. Des CTL induits chez des souris HHD sensibilisées avec les peptides HIVgag 76, HBVpol 575, gplOO 154, gplOO 457, gplOO 476, gplOO 570, gplOO 177 ou HER-2/neu 369 ont été testés pour leur capacité à tuer des cibles RMAS HHD pulsées avec soit les peptides naturels (WT), soit les variants P1Y correspondants (P1Y). La Figure 1 illustre les résultats (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles) obtenus avec huit peptides différents. Cellules RMAS-HHD pulsées avec le peptide naturel: . Cellules RMAS-HHD pulsées avec le peptide P1Y : Cellules RMAS-HHD non-pulsées: . Ces résultats montrent que des CTL induits chez des souris HHD sensibilisées avec les peptides HIVgag 76, HBVpol 575, gplOO 154, gplOO 457, gplOO 476, gplOO 570, gplOO 177 et HER-2/neu 369 tuent avec la même efficacité les cellules RMAS-HHD pulsées avec le peptide naturel ou avec son variant P1Y. Les variants P1Y sont aussi capables de recruter les CTL spécifiques du peptide naturel in vivo. Des cellules spléniques de souris HHD sensibilisées avec les variants P1Y HIVgag 76Y1, HBVpol 575Y1, gplOO 154Y1, gplOO 457Y1; gplOO 476Y1 gplOO 570Y1, gplOO 177Y1 et HER-2/neu 369Y1, sont testées pour leur capacité à tuer des cibles RMAS HHD pulsées avec soit les variants P1Y (P1Y), soit avec les peptides de type sauvage (WT). Les résultats (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles) sont illustrés par la Figure 2. Cellules RMAS-HHD pulsées avec le peptide naturel: . Cellules RMAS-HHD pulsées avec le peptide P1Y : # Cellules RMAS-HHD non-pulsées: . Ces résultats montrent que les variants P1Y génèrent des CTL qui tuent les cibles RMAS-HHD pulsées avec le peptide variant, ou avec le peptide naturel correspondant. En outre, tous ces peptides variants à l'exception de gplOO 154Y1, induisent des CTL chez un pourcentage plus élevé de souris HHD que ne font les peptides naturels correspondants. Trois à huit souris HHD ont été testées pour chaque peptide et une réponse CTL a été induite chez 100% des souris sensibilisées par HIVgag 76Y1, HBVpol 575Y1, gplOO 476Y1, gplOO 570Y1 et HER-2/neu 369Y1 et chez 75% des souris sensibilisées par gplOO 457Y1, gplOO 177Y1 et gplOO 154Y1. De plus, les CTL induits par les variants P1Y reconnaissent ces variants et les peptides naturels correspondants avec des avidités comparables. Les CTL générés chez des souris sensibilisées avec les variants P1Y HER-2/neu 369Y1, HIVgag 76Y1 et gplOO 154Y1 ont été testés pour leur aptitude à tuer des cibles RMAS-HHD pulsées avec différentes concentrations du peptide variant P1Y, ou du peptide sauvage correspondant. Les résultats (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles) sont illustrés par la Figure 3. Cellules RMAS-HHD pulsées avec le peptide naturel: . Cellules RMAS-HHD pulsées avec le peptide P1Y : # Ces résultats montrent que les CTL induits par les variants P1Y donnent une cytolyse égale à la moitié de la cytolyse maximale pour des quantités similaires de variant P1Y et de peptide naturel. Pour envisager une utilisation des variants P1Y en immunothérapie, il est en outre nécessaire que les CTL induits par ces variants reconnaissent des épitopes apprêtés naturellement de l'antigène dont ils sont dérivés. Des CTL générés chez des souris sensibilisées par HIVgag 76Y1, HER-2/neu 369Y1, HER-2/neu 5Y1, gplOO 476Y1 et fluM 58Y1 sont testés pour déterminer leur aptitude à tuer des cellules RMA-HHD infectées par les virus recombinants vac-HIVgag, vav-neu, vac-gplOO ou flu PR8 et exprimant de façon endogène les antigènes viraux correspondants, ou infectées avec le virus sauvage vac-WT. Les résultats (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles) sont illustrés par la Figure 4 : Cellules RMA-HHD infectées avec vac-WT (#) ; Cellules RMA-HHD infectées avec vac-HIVgag (#) ; Cellules RMA-HHD infectées avec vac-neu (#) ; Cellules RMA-HHD infectées avec vac-gplOO (#) ; Cellules RMA-HHD infectées avec flu PR8 (#) Ces résultats montrent que des CTL spécifiques des variants P1Y reconnaissent l'épitope maturé naturellement puisqu'ils tuent des cibles infectées avec le virus correspondant mais non les cibles infectées par vac-wt. Il apparaît donc que la substitution P1Y satisfait aux deux critères qui sont nécessaires à l'induction d'une réponse CTL contre un quelconque peptide de faible affinité pour HLA A2.1, quelle que soit sa séquence. D'abord, elle augmente l'affinité de liaison et la capacité de stabilisation des peptides liés à HLA A2.1 et en second lieu, elle n'interfère pas avec l'interaction peptide/TCR et ne modifie donc pas leur spécificité antigénique. EXEMPLE 4 : RESTAURATION DE L'IMMUNOGENICITE DE PEPTIDES NON IMMUNOGENES DE FAIBLE AFFINITE POUR HLA A2.1 PAR UNE SUBSTITUTION P1Y. Des souris ont été vaccinées avec les variants P1Y des peptides HER-2/neu 402, HER-2/neu 466, HER-2/neu 650, HER-2/neu 391, Tyrosinase 207, HBVpol 594, HBVpol 28 et HBVpol 985 . Onze jours plus tard, leurs cellules spléniques sont restimulées in vitro avec le peptide naturel correspondant, et les CTL générés sont testés contre des cellules-cibles RMAS HHD non pulsées ou pulsées avec le peptide naturel. Les résultats (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles) sont illustrés par la Figure 5 : Cellules RMAS-HHD pulsées avec le peptide naturel: . Cellules RMAS-HHD non-pulsées: . Pour chaque peptide, le nombre de souris qui répondent est indiqué. Ces résultats montrent que les souris HHD sensibilisées avec des variants P1Y génèrent des CTL spécifiques du peptide naturel. En outre, le pourcentage des souris qui fournissent une réponse est relativement élevé : il est compris entre 33 et 77%. Ces données démontrent qu'une substitution P1Y constitue une stratégie générale pour augmenter l'immunogénicité de peptides non-immunogènes de faible affinité pour HLA A2.1. EXEMPLE 5 : IDENTIFICATION D'EPITOPES SOUSDOMINANTS/CRYPTIQUES A L'AIDE DE VARIANTS P1Y. La possibilité d'induire une réponse CTL contre des peptides de faible affinité pour HLA A2.1 permet d'identifier des épitopes sous-dominants/cryptiques viraux ou tumoraux, utiles pour une immunothérapie spécifique. Cette possibilité est illustrée ci-après par l'exemple de 3 antigènes différents : l'antigène tumoral HER- 2/neu, le virus HIV-1 et la télomérase. Epitopes HER-2/neu : Le peptide HER-2/neu 650 ne participe pas à la réponse CTL spécifique de HER-2/neu développée chez des patients portant une tumeur HER-2/neu+. 2 hypothèses sont possibles : ou bien il s'agit d'un épitope qui n'est pas naturellement maturé par des cellules tumorales exprimant HER-2/neu, ou bien il s'agit d'un épitope sousdominant/cryptique. Comme décrit à l'Exemple 1 ci-dessus, le peptide HER-2/neu 650 forme des complexes HLA A2. 1/peptide instables et n'est donc pas immunogène. 1) Pour étudier si le peptide HER-2/neu 650 correspond à un épitope sous-dominant/cryptique, les CTL générés chez des souris sensibilisées par le variant HER- 2/neu 650Y1 sont testés pour leur capacité à tuer des cellules RMA HHD infectées par vac-neu. Les résultats (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles) sont illustrés par la Figure 6 : Cellules RMA-HHD infectées avec vac-WT (#) ; Cellules RMA-HHD infectées avec vac-neu (#) ; Ces résultats montrent que des CTL spécifiques de HER-2/neu 650 tuent des cellules cibles infectées par vacneu, mais non des cibles infectées par vac-WT, ce qui démontre que le peptide HER-2/neu 650 est un épitope sousdominant/cryptique de HER-2/neu. Les variants P1Y des peptides HER-2/neu 466, HER- 2/neu 402, HER-2/neu 661 et HER-2/neu 391 ont été testés de la même manière ; à l'exception du variant P1Y de HER-2/neu 661, les résultats sont similaires' à ceux observés pour HER- 2/neu 650. Les peptides HER-2/neu 466, HER-2/neu 402 et HER- 2/neu 391 constituent donc également des épitopes sousdominant/cryptiques de HER-2/neu. En ce qui concerne HER-2/neu 661, les résultats obtenus confirment ceux relatifs à la faible augmentation de l'affinité décrits à l'exemple 2 ci-dessus. Des modifications supplémentaires devront être effectuées pour envisager l'utilisation de ce peptide en immunothérapie. 2) L'immunogénicité des variants HER-2/neu 466 Y1, HER-2/neu 402 Y1, HER-2/neu 650 Yl,et HER-2/neu 391 Y1 conformes à l'invention, par rapport à un peptide immunodominant a également été évaluée sur des cellules humaines, et comparée à celle du peptide immunodominant HER- 2/neu 369. Des cellules mononucléées du sang périphérique (PMBC) ont été obtenues à partir de donneurs sains HLA A2.1, et resuspendues dans 2 ml de milieu de culture RPMI 1640 supplémenté avec 10 nM de glutamine, 250 unités/ml de pénicilline-streptomycine, et, 10% de sérum humain AB inactivé par la chaleur), et incubés à 37 C pendant 2 heures. Les cellules non-adhérentes sont collectées, et les cellules adhérentes restantes sont pulsées avec le peptide à tester (5 M) à 37 C pendant 90 minutes, et irradiées à 3000 rads ; elles sont ensuite lavées pour éliminer le peptide libre. 3x106 cellules non-adhérentes sont ajoutées à un volume final de 2 ml de milieu de culture supplémenté avec 50 UI/ml d'IL-2 recombinante. Au septième jour, elles sont récoltées, lavées, et suspendues dans du milieu de culture, et restimulées avec 5x106 cellules autologues adhérentes préalablement pulsées avec le peptide à tester comme décrit ci-dessus. Le lendemain, 150 UI/ml d'IL-2 recombinante sont ajoutées. Le neuvième ou le dixième jour, les cultures sont complémentées avec 300 UI/ml d'IL-2 recombinante. Lorsque nécessaire, le milieu est changé en prélevant 1 ml de surnageant de culture et en le remplaçant par 1 ml de milieu de culture contenant 300 UI/ml d'IL-2 recombinante. Cette procédure est répétée au moins 3 fois à intervalles d'une semaine. Des cellules T2 pulsées avec le peptide natif (1 M de peptide, 37 C , 90 minutes) correspondant au peptide P1Y à tester sont utilisées comme cibles pour étudier la cytotoxicité. Les résultats (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles) pour chacun des peptides testés sont illustrés par la Figure 7 : Cellules T2 pulsées avec le peptide naturel: . Cellules T2 non-pulsées : #. Ces résultats montrent que la substitution P1Y augmente également l'immunogénicité vis-à-vis de cellules humaines. 3) Pour vérifier si les peptides P1Y induisaient des CTL humains spécifiques d'épitopes tumoraux naturellement apprêtés, des CTL générés, comme décrit ci-dessus, à partir de PBMC humains, provenant de 3 donneurs différents, stimulés par HER-2/neu 369, ou par les peptides HER-2/neu 466 Yl, HER- 2/neu 402, HER-2/neu 650 Yl,et HER-2/neu 391 Yl ont également été testés pour leur capacité à tuer des cellules de tumeurs humaines HLA A2. 1+, exprimant en quantité plus ou moins importante l'épitope HER-2/neu. Les cellules tumorales utilisées comme cellulescibles sont les suivantes : - 4 lignées cellulaires HLA A2.1+/ HER-2/neu+ : MC F-7 (Zaks, Cancer Res., 1998,58, 4902) ; PUB/N (lignée tumorale humaine de cancer du poumon pas à petites cellules ) ; (Brossart, Cancer Res., 1998,58, 732) ; LAW (lignée tumorale humaine de cancer rénal) ; - 2 lignées cellulaires HLA A2.1+/ HER-2/neu- : ZR75.1 (Osborne et al., Cancer Res., 1979,39, 2422-2428) ; SUP/M2 (Morgan R. et al., Blood, 1989,73, 8,2155-2164) ; - à titre de témoin, la lignée K562, sensible à la lyse par les cellules NK. L'expression de l'antigène tumoral HER-2/neu par ces cellules, évaluée par immunofluorescence à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-HER-2/neu, est illustrée par le Tableau IV ci-après. TableauIV ugnee cellulaire HER-2/neu (FI) ZR75. 1 0,12 SUP/M2 0,11 MC F-7 1,94 HCT-116 1,23 PUB/N 1,33 LAW 0,35 Les résultats de ces essais de cytotoxicité (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles ; rapports E/T : 40/1 ; 20/1) pour chacun des peptides testés sont illustrés par la Figure 8 : Cellules zR75.1 : # Cellules SUP/M2 : Cellules MC F-7 : # Cellules HCT-116 : # Cellules PUB/N : # Cellules LAW : # Aucune cytotoxicité vis-à-vis des cellules K562 n'est observée. Ces résultats montrent que les CTL obtenues à partir des PMBC de 3 donneurs différents, stimulées par les peptides variants P1Y, lysent les cellules HER-2/neu+ MC F-7, PUB/N, HCT-116, et LAW, mais pas les cellules HER-2/neuZR75. 1 et SUP/M2. Il est à noter que la lyse est aussi efficace dans le cas des cellules LAW, qui n'expriment que faiblement l'antigène HER-2/neu que dans celui des cellules MC F-7, PUB/N, et HCT-116, qui l'expriment à un niveau élevé. Ceci montre que la présentation des épitopes de faible affinité ne nécessite pas l'expression de l'antigène à un niveau élevé. Epitopes de HIV 1 : La substitution P1Y a été utilisée pour identifier de nouveaux épitopes sous-dominants/cryptiques de HIV 1. 17 peptides de Gag, Pol, Env et Nef de HIV, ont été choisis à partir de la séquence polypeptidique complète de HIV 1. La liste de ces peptides est représentée dans le Tableau V ci-après. Tableau V Protéine d'origine* Peptides Fréquence parmi les isolats Protéine d'origine* Peptides de HIV 1 (%)** GAG p17 (77-85) SLYNTVATL (S9L) 39.6 p24 (19-27) TLNAWVKVV (T9V) 62. 5 p24 (212-221) EMMTACQGV (E9V) 95.8 POL (79-88) LLDTGADDTV(LIOV) 96. 8 (188-196) ALVEICTEM (A9M) 46. 2 (263-273) VLDVGDAYFSV (V11 V) 84. 9 (334-342) VIYQYMDDL (V9L) 84. 9 (464-472) ILKEPVHGV (19V) 68. 8 (576-584) PLVKLWYQL (P9L) 87.1 (669-679 ESELVNQIIEQ (E11Q) 33.3 (671-680) ELVNQIIEQL (E10L) 33. 3 (956-964) LLWKGEGAV (L9V) 98.9 ENV gp120 (120-128) KLTPLCVSL (K9L) 8. 9 gp120 (120-128) KLTPLCVTL (K9L/T) 79. 4 gp41 (260-268) RLRDLLLIV (R9V) 0.3 NEF (134-143) PLTFGWCFKL (P10L) 0. 1 (188-196) AFHHVAREL (A9L) * La numérotation des acides aminés est basée sur la séquence du clone HIV 1 WEAU 1.60 (Numéro d'accès Genbank U21135). Cette référence est simplement donnée pour indiquer la localisation des peptides de ce tableau par rapport aux protéines virales ; la séquence de ces peptides n'est pas toujours totalement identique à celle des peptides correspondants du clone WEAU. *'*La fréquence a été calculée à partir des isolats disponibles sur la base de données HIV Molecular Immunology Database . L'affinité relative de ces peptides pour HLA A2.1 (peptide de référence I9V), et la stabilité du complexe peptide/ HLA A2.1 ont été déterminées comme décrit dans l'exemple 1 ci-dessus, pour le peptide natif, et pour son variant résultant de la substitution de l'acide aminé N- terminal par une tyrosine. Les résultats sont illustrés dans le Tableau VI ci-dessous : Tableau VI Peptides épitopiques CD8 Peptides natifs Peptides P1Y GAG S9L 2,2 >6h 5 >6h T9V 5,5 3,5h 5,5 >6h E9V 21 1,7 >6h POL L10V 10 1,5 4h A9M 5 2h 1,75 >6h V11 V 4,5 2h 2,5 3,5h V9L >100 ND 8,6 19V 1 5h ND ND P9L >100 ND 4,6 E11Q >100 ND >100 ND E10L >100 ND 10 L9V 3,1 >6h 1,3 >6h ENV K9L 1,35 >6h 0,7 >6h K9L/T 0,65 >6h 0,4 >6h R9V >100 ND 5 ND NEF P10L >100 ND 5 ND A9L >100 ND 7 >6h Les deux peptides gagp24-212 (E9V) et pol79 (L10V)'ont une affinité et une capacité de stabilisation faibles (RA > 5 et DC50 2 heures). L'immunogénicité des peptides E9V et L10V et de leurs variants PlY a également été testée. Les peptides natifs ne sont pas immunogènes ; en revanche leurs variants sont immunogènes aussi bien chez les souris HHD que chez l'homme. En outre, des CTL générés, à partir de PBMC humains, provenant de 6 donneurs différents, stimulés in vitro par des cellules autologues pulsées avec le peptide variant E9VY, ou le peptide variant L10VY, ou par le peptide natif immunodominant S9L ont également été testés pour leur capacité à tuer des cellules RMA-HHH (cellules RMA exprimant la molécule HLA A2.1 native) infectées par un virus de la vaccine recombinant exprimant soit la protéine gag, soit la protéine pol de HIV1 (isolat LAI), ou par un virus de la vaccine contrôle, de type sauvage. Les résultats sont illustrés par la Figure 9 (en abscisse le % de lyse spécifique ; en ordonnée le rapport cellules effectrices/cellules cibles). Ces résultats montrent que les peptides E9V et L 10V sont naturellement présentés par des cellules qui expriment HLA-A2.1et la protéine virale dont ils sont issus (gag pour E9V et pol pour L10V). Epitopes de la télomérase : La substitution P1Y a été utilisée pour déterminer si la télomérase possédait des épitopes capable d'induire une réponse T cytotoxique. 8 peptides ont été choisis à partir de la séquence polypeptidique de la télomérase. L'affinité relative de ces peptides pour HLA A2. 1, et la stabilité du complexe peptide/ HLA A2.1 ont été déterminées comme décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus (peptide de référence : HIVpol 589). Les résultats sont illustrés dans le Tableau VII ci-dessous : Tableau VII peptides natifs Séquences RA DC50 mp530 ILATFLAWL 0,8 >6 mp534 FLFWLMDTYV 0,2 >6 mp545 QLLRSFFHFL 1,8 >6 mp797 SLFDFFHFL 1,5 >6 mp876 FLSTLVHGV 1,2 >6 hp540 ILAKFLHWL 0,3 >6 mhp572 RLFFYRKSV 25,3 mhp988 DLQVNSLQTV 28,6 Les deux peptides mhp 572 et mhp 988 ont une affinité et une capacité de stabilisation faibles (RA>5 et DC Les résultats, illustrés dans le Tableau VIII ci- dessous, montrent que ces variants mhp572Yl et mhp988 Yl ont une affinité et une capacité de stabilisation fortes (RA 2heures). TableauVIII peptides modifiés Séquences RA DC50 mhp572Y1 YLFFYRKSV 2,2 5 mph988Y1 YLQVNSLQTV 2,1 >6 Des CTL générés à partir de PBMC humains, provenant de donneurs sains, stimulés in vitro par des cellules dendritiques autologues pulsées avec le peptide variant mhp572Yl, ou le peptide variant mhp988Yl ont été testés pour leur capacité à tuer des cellules tumorales humaines HLA A2.1+/hTRT+ : U266 (Vonderheide, Immunity, 1999, 10, 11), ou HLA A2.1-/hTRT+ : (Vonderheide, Immunity, 1999, 10,11) Les résultats (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles ; rapports E/T : 40/1 ; 20/1 ; 10/1) sont illustrés par la Figure 10 : on n'observe aucune lyse pour les cellules tumorales HSS qui n'expriment pas HLA A2.1 ; en revanche, on observe une lyse importante dans le cas des cellules tumorales U266 qui expriment à la fois la télomérase et HLA A2.1. Ces résultats montrent que les peptides mhp 572 et mhp 988 sont naturellement présentés par les cellules tumorales humaines, et que des dérivés immunogènes de ces peptides sont potentiellement utilisables en immunothérapie anti-tumorale. REVENDICATIONS 1 ) Procédé d'identification d'épitopes sousdominants/cryptiques présentés par une molécule HLA de classe I, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : a) le choix, à partir de la séquence d'une protéine vis-à-vis de laquelle on souhaite induire une réponse cytotoxique T, d'au moins une séquence peptidique de 8 à 11 acides aminés susceptible de constituer un épitope de ladite protéine présenté par une molécule HLA de classe I, et correspondant à un peptide à faible affinité pour ladite molécule HLA de classe I et non-immunogène ; b) la préparation, pour chaque séquence sélectionnée, d'un peptide variant dérivé de ladite séquence par substitution de l'acide aminé N-terminal par un résidu tyrosine ; c) la détermination de l'immunogénicité de chaque peptide variant obtenu à l'étape b) par la sélection, parmi ceux-ci, de chaque peptide immunogène, générant une réponse CTL spécifique vis-à-vis de cellules cibles exprimant la protéine dont il est issu et l' identification de la séquence peptidique dont dérive ledit peptide immunogène. 2 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite molécule HLA de classe I est HLA A2.1. 3 ) Épitope peptidique immunogène dérivé d'un épitope sous-dominant/cryptique présenté par une molécule HLA de classe I, identifié par le procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2. 4 ) Épitope peptidique immunogène selon la revendication 3, dérivé d'un épitope sous-dominant/cryptique présenté par HLA A2.1choisi parmi : le peptide HER-2/neu 650 : PLTSIISAV le peptide HER-2/neu 466 : ALIHHNTHL le peptide HER-2/neu 402 : TLEEITGYL le peptide HER-2/neu 391: PLQPEQLQV le peptide gagp24-212 : EMMTACQGV le peptide pol79 : LLDTGADDTV le peptide mhp 572 : RLFFYRKSV le peptide mhp 988 : DLQVNSLQTV 5 ) Épitope peptidique immunogène dérivé d'un épitope sous-dominant/cryptique présenté par HLA A2.1, selon une quelconque des revendications 3 ou 4, par au moins une modification de séquence constituée par la substitution de l'acide aminé N-terminal dudit épitope sousdominant/cryptique par un résidu tyrosine. 6 ) Composition comprenant au moins un épitope peptidique immunogène selon une quelconque des revendications 3 à 5. 7 ) Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un ou plusieurs autre (s) épitope (s) immunogène(s). 8 ) Composition selon une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide chimérique comprenant une ou plusieurs copies d'un épitope peptidique immunogène selon une quelconque des revendications 3 à 5. 9 ) Composition selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit polypeptide chimérique comprend en outre une ou plusieurs copies d'un ou plusieurs autre(s) épitope (s) immunogène(s). 10 ) Molécule d'acide nucléique codant un polypeptide chimérique selon une quelconque des revendications 8 ou 9. 11 ) Médicament comprenant, en tant que principe actif, au moins un épitope peptidique immunogène selon une quelconque des revendications 3 à 5, ou au moins une composition selon une quelconque des revendications 6 à 8,, ou au moins une molécule d'acide nucléique une molécule d'acide nucléique selon la revendication 10. 12 ) Médicament selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est destiné à l'immunothérapie antivirale ou antitumorale, préventive ou curative. 13 ) Médicament selon une quelconque des revendications 11 ou 12, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vaccin. 14 ) Utilisation d'un épitope peptidique selon une quelconque des revendications 3 à 5, d'une composition selon une quelconque des revendications 6 à 8, ou d'une molécule d'acide nucléique selon la revendication 10, pour l'obtention d'un médicament destiné à l'immunothérapie antivirale ou antitumorale.