Brevet FR2811678A1 — publié le 20020118

La présente invention est relative à un promoteur actif dans le myocarde et à son application pour exprimer des gènes d'intérêt dans ce tissu, notamment pour le traitement des maladies du myocarde. L'altération des fonctions du myocarde, d'origine génétique ou acquise peut induire des pathologies graves, par exemple la cardiomyopathie hypertrophique familiale, l'infarctus du myocarde et les troubles du rythme cardiaque. La possibilité de moduler les réponses des cellules musculaires cardiaques (cardiomyocytes) en dirigeant l'expression d'un gène d'intérêt dans ces cellules peut trouver de nombreuses applications telles que par exemple : - dans le cas de cardiomyopathies d'origine génétique, la synthèse de la protéine cardiaque non-mutée fonctionnelle telle que la protéine C cardiaque (cardiomyopathie hypertrophique familiale), dans le cas de pathologies acquises : * le contrôle de la division cellulaire, soit pour la stimuler, par exemple afin de régénérer un muscle fonctionnel après un infarctus, soit pour la freiner, par exemple pour inhiber la croissance d'une tumeur cardiaque. Ceci peut-être obtenu par exemple, par la fabrication de mutants dominants négatifs pour des récepteurs de facteur de croissance ou par l'utilisation d'ARN antisens, * le contrôle de la force de contraction ou du rythme des contractions du muscle cardiaque. D'autre part, l'étude des fonctions in vivo des cardiomyocytes, ainsi que la modification de ces fonctions dans un but thérapeutique nécessite l'utilisation de modèles animaux permettant d'évaluer individuellement le rôle de chacune des protéines exprimées par des cardiomyocytes, qu'il s'agisse de sur-exprimer ou de sous-exprimer une protéine produite naturellement par ces cellules, d'évaluer l'activité de nouvelles molécules potentiellement thérapeutiques, ou d'étudier les conséquences fonctionnelles de l'expression d'une protéine hétérologue. Pour être en mesure d'utiliser effectivement les potentialités d'un transfert de gènes dans le muscle cardiaque, il faut disposer de vecteurs permettant d'obtenir une expression stable d'un gène d'intérêt dans les cardiomyocytes, in vitro et également in vivo ainsi que de techniques efficaces et fiables de transfert de gènes thérapeutiques dans les tissus concernés. Cette expression doit en outre, dans certains cas, être spécifique de ce tissu, afin d'éviter les problèmes qui pourraient résulter d'une expression ubiquitaire dans la mesure ou certains vecteurs viraux tels que l'adénovirus sont capables de pénétrer dans de nombreux tissus. On connaît actuellement un certain nombre de protéines qui sont exprimées plus ou moins spécifiquement dans le muscle cardiaque, et dont les promoteurs constituent des candidats potentiels pour l'expression tissu spécifique d'un gène hétérologue ; les chaînes légères de myosine (MLCs), (O'BRIEN et al., Proc. Nat. Acad. Sci. , 1993,90, 5157-5161 ; LEE et al. , J. Biol. Chem., 1992,267, 15875- 15885 ; KELLY et al., J. Cell Biol., 1995129,383-396), la chaîne lourde a de la myosine (a-MHC), (SUBRAMANIAM et al, J. Biol. Chem., 1993,268, 4331-4336), la chaîne lourde (3 de la myosine (P-MHC), (RINDT et al, J. Biol. Chem., 1993,268, 5332-5338), la troponine T cardiaque (cTnT), (IANNELLO et al., J. Biol. Chem., 1991,266, 3309-3313 ; CHRISTENSENJ et al., Mol. Cell. Biol., 1993,13, 6752-6765), la créatinine kinase musculaire (MCK), (AMACHER et al., Mol. Cell. Biol., 1993,13, 2753-2764), le facteur atrial natriurétique (ANF), (SEIDMAN et al., Can. J. Physiol. Pharmacol., 1991,69, 1486- 1492 ; ARGENTIN et al., Mol. Cell. Biol., 14,777-790), l'[alpha]- actine cardiaque (a-cA), (Biben et al., Dev. Biol., 1996, 173,200-212), les peptides natriurétiques de type-A (ANP) et -B (BNP), (DUROCHER et al., Dev. Genet., 1998,22, 250-262). Certains des promoteurs régulant l'expression des gènes ci-dessus ont été clonés et utilisés in vivo pour diriger l'expression de gènes hétérologues dans des souris transgéniques, en particulier ceux des gènes MLC2v (HUNTER et al., J. Biol. Chem., 1995,270, 23173-23178), [alpha]Ca (BIBEN et al., précité), ANF, (FIELD et al., Science, 1988,239, 1029- 1033), a- et P-MHC (RINDT et al., Transgenic Res., 1995, 4, 397-405 ; KNOTTS et al., Dev. Dyn., 1996,206, 182-192) et cTnT (ZHU et al., Dev. Biol., 1995, 169,487-503 ). Même si ces séquences permettent d'exprimer des gènes au niveau cardiaque, leur profil d'expression est soit restreint à un compartiment du c#ur, soit non spécifique du c#ur, à des stades du développement embryonnaire ou chez l'adulte (LYONS et al., J. Cell. Biol., 1990,111, 2427-2436 et J. Cell. Biol., 111,1465-1476). A titre d'exemple : - le promoteur du gène ss-MHC n'est pas adapté à une expression transgénique chez l'adulte ; son expression est restreinte aux ventricules dès le neuvième jour de développement chez la souris, et chute quelques jours avant la naissance (NG et al., Cire. Res., 1991,68, 1742-1745), - le promoteur du gène MLC2v est restreint aux ventricules (HUNTER et al., précité) (O'BRIEN et al., précité), - le promoteur du gène ANF est restreint au ventricule gauche au cours du développement embryonnaire avant de devenir spécifique des oreillettes chez l'adulte (ZELLER et al., Genes Dev., 1987,1, 693-698 ; FIELD, et al., précité), - le promoteur du gène a-MHC est exprimé dans les oreillettes au cours du développement embryonnaire et son expression dans les ventricules augmente quelques jours avant la naissance et persiste après la naissance (PALERMO et al., Cell. Mol. Biol. Res.,1995, 41, 501-509 ; NG et al., précité), - le promoteur du gène a-cA (GUNNING et al ; 1983, Mol. Cell. Biol., 3,1985-1995) et le promoteur du gène cTNT (MAR et al., 1988, J. Cell. Biol., 107,573-585 ; MAR et al., 1992, Symp. Soc. Exp. Biol., 46,237-249) s'expriment à la fois dans le myocarde et dans le muscle squelettique chez l'embryon et chez l'adulte. Des études réalisées chez différentes espèces ont permis d'isoler un certain nombre de facteurs de transcription impliqués dans la différenciation cardiaque et la cardiogénèse. Ces facteurs se lient à des motifs de séquence spécifiques dans les régions régulatrices de ces gènes, appelés éléments-cis de régulation de la transcription et sont capables de transactiver de nombreux gènes cardiaques exprimés spécifiquement dans les cardiomyocytes. Parmi ces facteurs, les mieux connus sont : les protéines MEF-2 (Myocyte Enhancer Factor-2), les facteurs à boîte homéo Csx/Nkx2. 5 et Mhox (Muscle Hox), les facteurs GATA, les protéines ehand et dhand, et les facteurs TEF-1 (Transcription Enhancer factor-1), (OLSON et al., Science, 1996,272, 671-676 ; MABLY et al., Cire. Res., 1996,79, 4- 13) . Cependant, alors que la participation de chacun des facteurs ci-dessus dans la régulation de l'expression de gènes musculaires endogènes est clairement établie, la combinaison exacte de ces facteurs tissu-spécifiques nécessaire et suffisante pour exprimer des gènes hétérologues d'intérêt thérapeutique, spécifiquement dans le c#ur n'a pas été déterminée. A ce premier degré de complexité dans le contrôle de l'expression tissu- spécifique, s'ajoute un degré de complexité supplémentaire dans la mesure où il a été rapporté que la combinaison particulière de ces facteurs tissuspécifiques avec des facteurs ubiquitaires tels que les facteurs apparentés au SRF (Serum Response Factor) dénommés RSRF (Related Serum Response Factor) (PARI et al., Mol. Cell. Biol., 1991,11, 4796-4803 ; KARNS et al., J. Biol Chem., 1995,270, 480-487 ; PARKER et al., J. Biol. Chem. 1992,267, 3343-3450 ; Chen et al., Mol. Cell. Biol., 1996,16, 6372- 6384), Spl (SAFFER et al., 1991, Mol. Cell. Biol., 11,2189- 2199) et Egr-1 (MUTERO et al., J. Biol. Chem., 1995,270, 1866-1872 ; THOMPSON et al., J ; Biol. Chem., 1991,266, 22678-22688 ; GUPTA et al., J. Biol. Chem.,1991, 266,12813- 12816 ; PARMACECK et al., Mol. Cell. Biol.,1994, 14,1870- 1885 ; ZHU et al., Mol. Cell. Biol., 1993,13, 4432-4444) influence également l'expression différentielle de gènes musculaires dans le c#ur et pourrait représenter un mécanisme supplémentaire de contrôle de la transcription de gènes spécifiquement dans le c#ur (SARTORELLI et al., Circ ; Res., 1993,72, 925-931 ; LYONS et al., Curr. Opin. Genet. Dev., 1996,6, 454-460 ; OLSON et al., précité ; et al., précité ; FIRULLI et al., Trends Genet., 1997,13, 364-369 ; Durocher et al., 1998, précité). En conséquence, aucun promoteur permettant l'expression d'un gène d'intérêt dans tous les compartiments du c#ur, précocement chez l' embryon et de façon durable chez l'adulte n'a encore été caractérisé. En outre, la combinaison d'éléments-cis, nécessaire et suffisante pour assurer l'expression d'un gène, spécifiquement dans le muscle cardiaque n'a pas été identifiée. L'ADNc et le gène MYBPC3, codant la protéine C cardiaque humaine ont été isolés (KASAHARA et al., J ; Invest., 1995,94, 1026-1036). Le gène MYBPC3 a une taille d'au moins 21 kb, il est composé de 35 exons (CARRIER et al., Cire . Res., 1997,80, 427-434) et est localisé sur la bande p11.2 du chromosome 11 (llpll.2), (GAUTEL et al., Circ. Res., 1998,82, 124-129). Cependant, aucune séquence contrôlant la transcription de ce gène n'a été précisément identifiée. Parmi les protéines apparaissant exprimées spécifiquement dans le myocarde, la protéine C est une protéine abondante des muscles striés qui représente 2 à 4% des protéines fibrillaires (OFFER et al., J. Mol. Biol., 1973,74, 653-676). Elle fait partie d'un ensemble de protéines possédant des fonctions de structure et/ou de régulation associées à la chaîne lourde de la myosine dans le filament épais (EPSTEIN et al., Science, 1991,251, 1039- 1044). Il existe trois isoformes de protéine C, chacune codée par un gène et exprimée spécifiquement dans un type de muscle : la protéine C squelettique rapide, la protéine C squelettique lente et la protéine C cardiaque (cMyBPC), (YAMAMOTO et al., J. Biol. Chem., 1983,258, 8395-8401). L'expression de la protéine C cardiaque est restreinte exclusivement au muscle cardiaque et on ne la retrouve jamais dans le muscle squelettique tout au long du développement chez l'homme et la souris, et les transcrits du gène MYBPC3 (Myosin Binding Protein-Cardiac 3) codant la protéine-C cardiaque sont présents uniquement dans le c#ur et ce de manière uniforme, dans des embryons de souris ou humains (GAUTEL et al., précité, FOUGEROUSSE et al., Circ. Res., 1998,82, 130-133). Chez l'homme, le gène MYBPC3 codant l'isoforme cardiaque est l'un des huit gènes impliqués dans les affections cardiaques du type CMH (TOWBIN et al., Curr. Opin. Cell. Biol., 1998,10, 131-139 ; MOGENSEN et al., J. Clin. Invest., 1999,103, 39-43). La CMH est une pathologie familiale qui se transmet selon un mode Mendélien autosomique dominant, caractérisée par une hypertrophie inexpliquée du ventricule gauche, prédominante au niveau du septum interventriculaire et associée à une large désorganisation cellulaire et tissulaire (HENGSTENBERG et al., J. Mol. Cell. Cardiol., 1994, 26, 3-10). A partir d'un clone génomique de souris comprenant un fragment du gène de la MYBPC3 codant la protéine C cardiaque, les Inventeurs ont maintenant identifié et cloné la séquence du promoteur du gène MYBPC3, et ont en outre localisé des séquences régulatrices nécessaires et suffisantes à l'activité tissu-spécifique de ce promoteur. Ces travaux leur ont permis d'isoler des fragments de ce promoteur capables d'activer l'expression d'un gène spécifiquement et exclusivement dans le myocarde à tous les stades du développement, de l'embryon à l'adulte. La présente invention a pour objet une molécule d'acide nucléique issue d'un gène MYBPC de mammifère, qui comprend les éléments-cis de régulation nécessaires et suffisants pour diriger l'expression spécifique d'un gène dans le myocarde. La molécule d'acide nucléique selon l'invention est essentiellement constituée par les séquences nécessaires au contrôle de l'initiation de la transcription du gène MYBPC3 (promoteur basal), ainsi que par les séquences intervenant dans la régulation en cis de l'initiation de la transcription, et ce par des mécanismes similaires aux mécanismes naturels de régulation de la transcription du gène MYBPC3 endogène. Les molécules d'acide nucléique conformes à l'invention peuvent avantageusement être utilisées pour diriger l'expression d'un gène hétérologue, notamment un gène d'intérêt thérapeutique. Au sens de la présente invention, on entend par "hétérologue" relativement à une séquence d'un gène donné, toute séquence d'acide nucléique autre que celles qui, dans la nature, sont immédiatement adjacentes à ladite séquence. Parmi les séquences nécessaires au contrôle de l'initiation de la transcription on peut citer notamment les motifs canoniques reconnus par l'ARN polymérase tels que les séquences des boîtes TATA et des boîtes CAT. Parmi les séquences potentielles intervenant en cis dans la régulation de la transcription dans le muscle cardiaque on peut citer les séquences de liaison des facteurs de transcription, ubiquitaires ou spécifiques du muscle cardiaque, telles que les séquences de liaison des facteurs décrits ci-dessus. De manière inattendue les Inventeurs ont montré qu'un fragment du gène MYBPC3 comprenant la boîte TATA et deux sites GATA-4 est capable d'activer l'expression d'un gène hétérologue, uniquement dans les cardiomyocytes in vitro et in vivo. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention ladite molécule d'acide nucléique comprend deux séquences de liaison du facteur de transcription GATA-4 (motif canonique 5'-(A/G) GATA(A/G)-3). Avantageusement, l'un des sites GATA-4 est situé entre les positions-60 et-70 ou entre les positions-1010 et-1020, par rapport au site d'initiation de la transcription du gène MYBPC3. Les facteurs GATA appartiennent à une famille de protéines nucléaires qui possèdent un domaine spécifique de fixation à l'ADN constitué par deux doigts de zinc adjacents de la famille C2/C2 (WHYATT, EMBO J., 1993,12, 4993-5005). Le doigt de zinc C-terminal associé à une région basique adjacente constitue le domaine minimal de reconnaissance du motif canonique 5'-(A/G)GATA(A/G)-3' (KO et al., Mol. Cell. Biol., 1993,13, 4011-4022 ; MERIKA et al., Mol. Cell. Biol., 1993,13, 3999-4010). Six facteurs GATA ont été caractérisés chez les vertébrés dont les facteurs GATA-4/5/6 qui sont impliqués d'une part dans la cardiogénèse et la différenciation cardiaque (JIANG et al., Dev. Biol., 1996, 174, 258-270 ; GOVE et al., EMBO J., 1997,16, 355-368 ; GREPIN, Development, 1997,124, 2387-2395), et d'autre part la différenciation des cellules épithéliales intestinales (GAO, Mol. Cell. Biol., 1998,18, 2901-2911). Les facteurs GATA-4/5/6 sont capables de transactiver de nombreux gènes cardiaques exprimés dans les cardiomyocytes (LAVERRIERE et al., J. Biol. Chem., 1994,269, 23177-23184 ; KELLEY et al., Development, 1993,118, 817-827 ; JIANG et al., précité; MORRISEY et al., Dev. Biol., 1996,177, 309-322 ; 1997,183, 21-36 ; PARMACECK et al., Mol. Cell. Biol., 1992,12, 1967- 1976). Par exemple, le facteur GATA-4 active les gènes des protéines sarcomériques telles que la troponine C. Avantageusement, ladite molécule d'acide nucléique comprend également un ou plusieurs site(s) de liaison d'un facteur impliqué dans la restriction de la transcription du gène MYBPC3 dans les cardiomyocytes. De manière avantageuse, ledit ou lesdits site(s) de liaison sont sélectionnés dans le groupe constitué par : les séquences de liaison du facteur NFAT-3, les séquences de liaison des protéines Ets et les séquences de liaison des facteurs RSRFs. Les Inventeurs ont en outre observé que la séquence qui s'étend de la position-1500 à-800 par rapport au site d' initiation de la transcription du gène MYBPC3 est impliquée dans la restriction de la transcription du gène dans les cardiomyocytes. Les Inventeurs ont analysé ladite séquence et ont localisé des sites potentiels de liaison : - du facteur NFAT-3 ("Nuclear Factor of Activated T cells-3" ; motif canonique 5'-(A/T)GGAAAAT-3'), - des protéines Ets (motif canonique Ets 5'- GGA(A/T)-3', et - des facteurs RSRFs (motif canonique de type CarG : 5' -CC (A/T) GG-3' ) . Le facteur NFAT-3 qui est capable d'interagir avec le facteur GATA-4 est exprimé dans le c#ur, il joue un rôle dans la cardiogénèse (DE LA POMPA et al., Nature, 1998, 392,182-186 ; RANGER et al., Nature, 1998,392, 186-190) et est également impliqué dans l'hypertrophie cardiaque (MOLKENTIN et al., 1998, Cell, 93,215-226). Les protéines Ets régulent l'expression tissuspécifique via des mécanismes d'activation et de répression (CONRAD et al., Mol. Cell. Biol., 1994,14, 1553-1565 ; ROSEN et al., J ; Chem., 1994,269, 15652-15660 ; UMEZAWA et al., Mol. Cell. Biol., 1997,17, 4885-4894), parmi celles-ci, la protéine ERP/Net qui est exprimée dans de nombreux tissus est également présente dans le c#ur (LOPEZ et al., Mol. Cell. Biol., 1994,14, 3292-3309 ; PRICE et al., EMBO J., 1995,14, 2589-2601) et il semblerait qu'elle puisse interagir avec le site de liaison aux RSRFs (PRICE et al., précité ; LOPEZ et al., précité ; WASYLYK et al., Eur . J ; Biochem., 1993,211, 7-18). La liaison de ces facteurs à des éléments de cette séquence pourrait être responsable de la restriction de la transcription du gène MYBPC3 dans les cardiomyocytes et représente un mécanisme supplémentaire de contrôle de l'activité du promoteur MYBPC3 endogène dans les cardiomyocytes. Avantageusement, les sites GATA-4 ainsi que les sites NFAT-3, Ets et RSRFs, s'ils sont présents, sont localisées respectivement aux positions suivantes, par rapport au site d'initiation de la transcription : - site GATA-4 : -63/-58 et-1015/-1010, - site NFAT-3 : -822/-815,-850/-844, - site Ets (-935/-932,-1102/-1099, et - sites RSRF de type CarG (-861/-853 ; -870/- 865 ;-1231/-1221). Une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention est représenté par exemple par : - la séquence qui s'étend de la position-1535 à la position +28 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène MYBPC3 murin ; cette séquence est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO :1, et la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 2 qui s'étend de la position 464 à la position 1563 de la séquence SEQ ID NO . 1 ci-dessus. Il doit être bien entendu que les molécules d'acide nucléique spécifiés ci-dessus, qui peuvent être obtenues à partir du gène MYBPC3 murin ne constituent qu'une illustration de l'objet de l'invention. Celle-ci englobe également en particulier, des molécules d'acide nucléique reproduisant des séquences homologues existant chez l'homme, ou chez d'autres mammifères, et qui peuvent être obtenues par l'homme du métier par des techniques classiques de biologie moléculaire. De même, à partir des molécules d'acide nucléique comprenant au moins les éléments-cis de régulation du gène MYBPC3 spécifiés ci-dessus, l'homme du métier peut construire différentes molécules d'acide nucléique conformes à l' invention, par exemple en procédant à la mutation ou à la délétion de séquences situées en dehors des éléments-cis de régulation, et/ou éventuellement à leur substitution par d'autres séquences. Les molécules d'acide nucléique comprenant les éléments-cis de régulation du gène MYBPC3 peuvent être associées avec des éléments-cis de régulation ou bien avec un promoteur basal provenant de gènes autres que le gène MYBPC3, selon différentes combinaisons, pour obtenir des molécules d'acides nucléiques chimériques qui se distinguent entre elles par leur niveau d'activité, et leur degré de spécificité. Les. molécules d'acide nucléique conformes à l'invention peuvent être utilisées pour contrôler l'expression d'un gène hétérologue dans des cellules de mammifères, et avantageusement, pour obtenir une expression spécifique dans les cellules musculaires cardiaques. L'objet de la présente invention englobe également les molécules d'acide nucléique recombinantes comprenant au moins une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention liée à au moins une séquence hétérologue. L'objet de la présente invention englobe en particulier : a) des cassettes d'expression comprenant : - une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention ; il peut s'agir d'une séquence issue du gène MYBPC3 , ou d'une séquence chimérique, comprenant au moins les éléments-cis de régulation du gène MYBPC3, telles que définies ci-dessus, - et une séquence hétérologue placée sous contrôle transcriptionnel de ladite molécule d'acide nucléique. b) des vecteurs recombinants, comprenant un insert constitué par une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention. Avantageusement ces vecteurs d'expression, comprennent au moins une cassette d'expression telle que définie ci-dessus. De nombreux vecteurs où l'on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. L'invention a en outre pour objet des cellules procaryotes ou eucaryotes transformées par au moins une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention. De préférence, ces cellules sont des cellules animales, en particulier des cellules de mammifères. Il peut s'agir de cellules musculaires cardiaques ou de cellules embryonnaires totipotentes capables de se différencier en cellules musculaires cardiaques. Des cellules transformées conformes à l'invention peuvent être obtenues par tous moyens, connus en eux-mêmes, permettant d'introduire une molécule d'acide nucléique dans une cellule-hôte. Par exemple, dans le cas de cellules animales, on peut utiliser entre autres des vecteurs viraux tels que les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus et les AAV, dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d'intérêt ; on peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules-hôte, par exemple une préparation de liposomes, de lipides ou de polymères cationiques, ou bien l'injecter directement dans la cellule hôte, sous forme d'ADN nu. Le transfert de gènes dans le muscle cardiaque peut par exemple être réalisé à l'aide d'adénovirus recombinant , de virus recombinant associé à l'adénovirus (AAV), de liposomes, de lipides ou de polymères cationiques, ou par injection directe de molécule d'acide nucléique. Ces vecteurs viraux ou non viraux peuvent être administrés soit par injection directe dans le myocarde, soit par perfusion coronaire (BARR et al., Gene Therapy, 1994,1, 51-58 ; BUDKER et al., Gene Therapy, 1998,5, 272-276) ou bien encore par injection dans l'enveloppe péricardique (Lim et al., Circulation, 1991,83, 2007-2011 ; MUHIHAUSER et al., Gene Therapy, 1996,3, 145-153 ; ROTHMANN et al., Gene Therapy, 1996,3, 919-926) . Les Inventeurs ont également obtenu des animaux transgéniques, dans lesquels un gène hétérologue était placé sous contrôle transcriptionnel d'une molécule d'acide nucléique comprenant les éléments-cis de régulation du gène MYBPC3, selon l'invention et ont ainsi constaté que les propriétés de cette molécule d'acide nucléique, et en particulier la spécificité d'expression dans les cellules musculaires cardiaques se manifestaient non seulement ex vivo, mais également in vivo à tous les stades du développement, de l'embryon à l'adulte. La présente invention a pour objet des animaux et en particulier des mammifères transgéniques non-humains, caractérisés en ce que tout ou partie de leurs cellules sont transformées par une molécule d'acide nucléique selon l'invention. Il s'agit par exemple d'animaux dans lesquels on a introduit un gène d'intérêt sous contrôle d'éléments-cis de régulation du gène MYBPC3, ou d'un promoteur chimérique construit à partir des éléments-cis de régulation de celui-ci qui confèrent la spécificité d'expression dans les cellules musculaires cardiaques ; le gène d'intérêt est alors exprimé spécifiquement dans les cellules musculaires cardiaques. Les cellules transformées et les animaux transgéniques conformes à l'invention sont en particulier utilisables comme modèles pour étudier et/ou modifier l'expression de différents gènes dans les cellules musculaires cardiaques. L'invention a également pour objet l'utilisation de molécules d'acide nucléique conformes à l'invention pour l'obtention de médicaments, en particulier de médicaments destinés au traitement des pathologies du myocarde. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de Description qui va suivre, qui se réfère à des exemples décrivant l'obtention et la caractérisation du promoteur du gène MYBPC3 et des fragments de celui-ci permettant une expression spécifique dans le muscle cardiaque, ainsi qu'à leur utilisation pour l'expression de gènes hétérologues spécifiquement dans les cellules musculaires cardiaques dans des cultures de cellules et dans des animaux transgéniques, ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre la carte de restriction et l'organisation des introns et des exons du fragment de 15kb du gène MYBPC3 isolé à partir d'une banque génomique de souris. Ce fragment comprend une séquence de 2,3kb entre le gène Spi-1 et le gène MYBPC3 (région intergénique), contenant le promoteur du gène MYBPC3. S : SacI ; Sp : SphI ; Ac : AccI ; Xb : XbaI ; H : HindIII ; E : EcoRI ; K : KpnI. Les exons du gène Spi-1 sont représentés en noir et les exons du gène MYBPC3 sont représentés en grisé. - la figure 2 illustre la comparaison de la séquence proximale du promoteur du gène MYBPC3 humain et murin. (a) la séquence qui s'étend de la position-238 à la position +83, par rapport au site d'initiation de la transcription (+1) du gène MYBPC3 de la souris est présentée et les sites potentiels de fixation de facteurs de transcription sont encadrés. (b) la séquence qui s'étend de la position-255 à la position +1, par rapport au site d'initiation de la transcription, du gène MYBPC3 de la souris est alignée avec la séquence correspondante du gène MYBPC3 humain (numéro d'accession Y10129) et les sites potentiels de fixation de facteurs de transcription sont encadrés. - la figure 3 illustre la structure des quatre fragments de respectivement 2,5 ; 1,5 ; 0,8 et 0,35kb du promoteur du gène MYBPC3 couplés au gène rapporteur EGFP dans le vecteur pEGFP. - la figure 4 illustre la carte de restriction d'un vecteur d'expression contenant le fragment de l,5kb du promoteur du gène MYBPC3. Exemple 1 : Clonage moléculaire et localisation chromosomique du promoteur du gène MYBP-C3 murin Un fragment de 15 kb du gène MYBPC3 a été isolé par criblage d'une banque #FIXII d'ADN génomique de souris à l'aide d'une sonde de 215 pb correspondant à l'extrémité 5' de la séquence codante de la protéine C cardiaque. Trois fragments de 2 kb, 4 kb et 6 kb, obtenus par restriction du fragment de 15kb issu du clone génomique avec l'enzyme SacI ont été sous-clonés au site SacI du plasmide pBluescript (STRATAGENE). Les plasmides obtenus dénommés respectivement pSac2, pSac4 et pSac6 ont été séquences et la séquence des fragments ci-dessus a été comparée avec les banques de données. La carte de restriction du fragment de 15kb est représentée à la figure 1 : il contient les exons 1 à 20 du gène de la protéine C cardiaque, les deux derniers exons de l'oncogène Spi-1 (numéro d'accession : X17463) et 2,3 kb de séquence intergénique. Chez l'homme, l'organisation chromosomique des gènes Spi-1 (MOREAU-GACHELIN, Oncogene, 1989,4, 1449-1456) et MyBPC3 (GAUTEL et al., précité) est similaire à celle observée chez la souris : ils sont tous les deux localisés dans la région p11.2 du chromosome 11. La région intergénique de 2,3 kb comprenant le promoteur du gène MYBPC3 , issue du plasmide pSac4, a ensuite été analysée. Exemple 2 : Analyse du promoteur du gène MYBPC3 humain et murin 2. 1. Détermination du site d'initiation de la transcription du gène MYBPC3 murin Le site d'initiation de la transcription a été déterminé par la technique d'extension d'amorce et par clonage de l'extrémité 5' de l'ARN messager de la protéine C cardiaque, à l'aide respectivement des kit AMV Reverse Transcriptase Primer Extension System (PROMEGA) et du kit 5'RACE (Rapid Amplification System of cDNA ends), selon les instructions du fabricant. Les résultats montrent que le site d'initiation de la transcription du gène MYBPC3 se situe 47 pb en amont de l'ATG. 2. 2. Recherche des motifs spécifiques de liaison de facteurs de transcription dans les gènes MYBPC3 humains et murins L'alignement de la séquence de 2,3 kb avec la séquence du gène humain (numéro d'accession Y10129 ) montre une homologie de près de 80% entre les positions-200pb et +1 (Figure 2b). La séquence de 2,3kb a été analysée à l'aide du logiciel Matlnspector qui permet la recherche de sites de fixation de facteurs impliqués dans la transcription (QUANDT et al., Nucleic Acid Res., 1995,23, 4878-4884 ; http//www.gsf.de/biodv/matinspector.html). Des éléments de séquences décrits comme ayant une importance dans la régulation de gènes codant des protéines musculaires ont également été recherchés directement sur ces séquences. Les sites potentiels de liaison de facteurs de transcription ubiquitaires ou spécifiques du c#ur identifiés dans la séquence proximale-238 à +83 du promoteur murin et la conservation de ces séquences dans le promoteur humain sont présentés respectivement sur les figures 2a et 2b. L'analyse du promoteur murin montre que le site d'initiation de la transcription est situé 30pb en aval du premier nucléotide d'une boîte TATA (5'-TAAATA-3') reconnue par l'ARN polymérase II qui est également présente dans le promoteur humain. En outre, aucun motif canonique de type CAAT (boîte CAT) n'a été identifié dans les 200 premiers nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription du promoteur murin ou humain. Cependant, il est possible que la séquence CAAGT du promoteur murin ou la séquence CAAT du promoteur humain, située entre-137/-141pb, puissent jouer le rôle d'une boîte CAT. Des sites de liaison de facteurs de transcription suivants ont été identifiés dans le promoteur murin aux positions spécifiées, ceux identiques dans le promoteur humain sont indiqués en gras. : # sites riches en GC de liaison des facteurs Spl et Spl- like : -47/-41 ; -192/-187 ; -282/-278 # sites riches en GC de liaison des facteurs Egr-1 . -169/-161 ; -227/-222 ; -293/-287 ; -503/-490 ; - 669/-662 # sites riches en AT de liaison des facteurs MEF-2 : -32/-24 ; -92/-83 Le premier site de liaison de MEF-2 recouvre la boîte TATA et le second est adjacent à un autre élément-cis de régulation de la transcription (boîte E). # sites riches en AT de liaison de protéines à homéodomaines telles que MHox : -260/-252 ; -758/-752 ; -813/-806 ; -1071/-1063 ; -1710/-1697 # motifs canoniques GATA-4 ((5'-(A/G)GATA(A/G)-3') : -63/-58 ; -1015/-1010 ; -2239/-2234 # motif GATA-4 like -117/-112 ;-244/-239 # motif canonique Nkx2.5 (5'-TNAAGTG-3') . -981/-975 ; -1078/-1072 ; -1631/-1625, (sur le brin anti-sens) # sites GTIIC, SphI et SpHII de liaison des facteurs TEF-1 -105/-100 ; -640/-646 ; -812/-804 ; -2132/-2124, Les sites en position-105/-100 et-640/-646 sont juxtaposés à une boîte E. # site de liaison à l'hormone thyroïdienne (TRE . Thyroïd Responsive Elément) : -70/-64 ; -161/-143 ; -205/-198 ; -967/-959 ; - 1591/-1585 ; -1611/-1604, # motif canonique 5'-CA(G/C) (CIG)TG-3' (boîte E) -82/-77,-109/-104, # motif canonique (5'-GGA(A/T)-3') des facteurs Ets : -101/-95 ; -935/-932 ; -1102/-1099, # motifs palindromiques de forte affinité pour les facteurs Ets : -116/-128 # sites riches en AT de type CarG ou GArC de liaison des facteurs RSFR : -820/-814 ; -848/-843 ; -870/-865 ; -861/-853 ; - 1231/-1221 ; -1721/-1710, # motif canonique (5'-(AIT)GGAAAAT-3') de liaison du facteur NFAT-3 (Nuclear Factor of Activated cells) : -822/-815 ; -850/-844 ; -2200/-2193. Ces résultats montrent d'une part que de nombreux facteurs de transcription sont susceptibles de se lier au promoteur du gène MYBPC3 murin et humain, et d'autre part que la plupart des sites de liaison de ces facteurs sont conservés entre les promoteurs humains et murins. Cependant, la présence de ces sites mêmes s'ils sont canoniques ne signifié pas pour autant qu'ils soient directement impliqués la régulation du promoteur endogène. En conséquence, seule l'analyse fonctionnelle du rôle de ces différents sites dans l'activité du promoteur du gène MYBPC3 permet de déterminer la combinaison minimum de ces séquences, capable d'assurer l'expression tissu-spécifique du gène MYBPC3 dans le c#ur. Exemple 3 : Détermination d'un fragment de promoteur minimum spécifique des cellules cardiaques 3. 1 Activité promotrice de la séquence intergénique de 2,3kb et de fragments issus de cette séquence La région intergénique a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pSac4 de façon à générer des fragments de respectivement 2,5kb, l,5kb (SEQ ID NO : 1), l,lkb (SEQ ID NO : 2), 0,8kb et 0,35kb, possédant une extrémité 3' identique correspondant à la position +28 par rapport au site d'initiation de la transcription et une extrémité 5' variable (figure 3). Dans l'amorce 3', l'ATG en position +24 à +26 du gène MYBPC3 qui pourrait perturber l'initiation de la traduction au niveau du premier ATG d'un gène hétérologue cloné derrière ces séquences est remplacé par un site SacI. Les produits d'amplification obtenus sont clonés au site SacI du plasmide "pGEM-T easy vecteur' (PROMEGA) puis sous-clonés dans les deux orientations (sens et anti-sens) au site SacI du plasmide pEGFP-1 (CLONTECH) qui contient l'ADNc de l'EGFP (Eucaryotic Green Fluorescent Protein). Les plasmides obtenus sont dénommés pEGFP4 (2,5 kb), pEGF 6 (1,5 kb), pEGFP8 (l,lkb), pEGF 10 (0,8 kb) et pEGFP12 (0,35 kb). Les plasmides contenant l'insert dans son orientation anti-sens sont utilisés comme témoins négatifs et le plasmide contenant le fragment de 2,5 kb est utilisé comme témoin positif. Les plasmides contenant les différents fragments de promoteur sont électroporés dans des cellules de carcinome embryonnaire de souris de souche C3H/He (cellules P19 ; Mc Burney et al., Nature, 1982,299, 165-167). Des transfectants stables ayant intégré des copies de ces plasmides sont sélectionnés en présence de généticine, puis maintenus à l'état indifférencié ou induits en différenciation. Les cellules P19 sont des cellules embryonnaires totipotentes capables de se différencier en cellules cardiaques en présence de diméthyl sulfoxide, à la concentration finale de 1% v/v. Les corps embryonnaires constitués de cellules cardiaques en contact les unes avec les autres, sont reconnaissables par des zones battantes rythmiques, un phénotype caractéristique du c#ur en développement in vivo (DOETSCHMAN, J. Embryol. Exp. Morphol., 1985,87, 27-45 ; RUDNIKI, Dev. Biol., 1990,138, 348-358 ; MALTSEV, Mech. Dev., 1993,44, 41-50). Les cellules P19 sont maintenues à l'état indifférencié en milieu de prolifération (DMEM (GIBCO), 15% sérum de veau f#tal, 0,lmM p-mercaptoéthanol). Après trypsination, 2.106 à 5.106 cellules en suspension sont électroporées (GENE PULSER, BIO-RAD, réglé sur 250V et 500F) pendant 5 à 7 ms dans un volume de 8001 de tampon phosphate pH 7,4, contenant 25g de plasmide. Puis, les cellules sont réparties dans des boîtes de culture contenant de la gélatine à 0,1 % additionnée de milieu de prolifération. 2 jours après l'électroporation, la sélection est effectuée en milieu de prolifération contenant 0,7 mg/ml de généticine. La différenciation est réalisée en milieu DMEM contenant 20% de sérum de veau f#tal et 1% de DMSO, par la technique des gouttes pendantes ; les cellules en suspension (25000 cellules /cm3) sont déposées en gouttes de 201 (500 cellules) sur le couvercle d'une boîte de culture cellulaire et incubées pendant 3 jours (les cellules s'agrègent pour former des corps embryonnaires), puis les corps embryonnaires sont détachés et cultivés en suspension pendant 4 jours, et au septième jour de différenciation ils sont transférés dans un milieu de culture gélatiné permettant leur adhésion au support. Les zones battantes apparaissent entre le quatorzième et le vingtième jour de différenciation. L'expression de l'EGFP est déterminée à partir d'un ensemble de 15 corps embryonnaires observés au microscope inversé à fluorescence (OLYMPUS IX50/IX70+IX=FLA) et évaluée par le pourcentage de corps embryonnaires émettant de la fluorescence au niveau des zones battantes. Les résultats de cette expérience sont les suivants : 1) Aucune expression de l'EGFP n'est observée dans les cellules P19 différenciées ou non différenciées, électroporées avec les plasmides dans leur version antisens, ce qui démontre que la fluorescence observée est spécifique de l'activité du promoteur. 2) Avec les plasmides pEGFPIO ou pEGFP12, on observe une expression très faible de l'EGFP dans les cellules P19 non-différenciées, et dans les cellules P19 différenciées en cellules cardiaques, on observe une expression majoritaire de l'EGFP dans les zones battantes avec une expression faible et variable dans des cellules à l'extérieur de ces zones battantes. 3) Avec les plasmides pEGFP4, pEGFP6 et pEGFP8 on observe une absence d' expression de l'EGFP dans les cellules P19 indifférenciées et une expression de l'EGFP uniquement au niveau des zones battantes dans les cellules P19 différenciées en cellules cardiaques. Ces résultats permettent d'établir que seuls les fragments de 2,5kb, 1,5 kb et l,lkb contiennent l'ensemble des séquences du promoteur du gène MYBPC3 murin permettant une expression spécifique des cellules musculaires cardiaques. 3. 2. Détermination des éléments de séquences impliqués dans la spécificité cardiaque du promoteur. 3. 2.1. Mutagénèse des sites GATA-4 Il a été montré précédemment (exemple 2) que le promoteur du gène MYBPC3 contient 2 motifs canoniques GATA-4 dont le plus proximal situé entre-63/-58 pb (site GATA.l) est compris à la fois dans les fragments de l,5kb, de 0,8kb et de 0,35kb, et le plus distal (site GATA.2) situé entre - 1015/-1010 pb est compris uniquement dans le fragment de 1,5Kb (figure 3). Ces motifs étant importants dans l'expression spécifique de gènes cardiaques, les séquences TGATAA (site GATA.l) et AGATAA (site GATA.2) ont été mutées indépendamment en site de restriction XbaI (TCTAGA) dans le plasmide pEGFP6. Le site GATA.l présent dans les plasmides pEGFPIO et pEGFP12 a également été muté en site XbaI. Les plasmides obtenus comprenant ces mutations sont dénommés pEGFP6.1, pEGFP6.2, pEGFP6.1.2, pEGFP10.1 et pEGFP12.1. 3. 2.2 Transfection des plasmides mutés dans des cellules noncardiaques. Afin de vérifier que les mutations empêchent bien la fixation du facteur de transcription GATA-4, les constructions pEGFP6 et pEGFP6 doublement muté (pEGFP6.1.2) sont transfectées de manière transitoire dans des cellules non-cardiaques (lignée de fibroblastes de caille QT6 ; MOSCOVICI et al., Cell, 1977,11, 95-103), en présence ou en l'absence d'un vecteur plasmidique d'expression du facteur GATA-4. 500 000 cellules QT6 cultivées en milieu DMEM contenant 10% de sérum de veau foetal sont transfectées par un mélange contenant lg de plasmide pEGFP6 muté ou non muté, 1 g du plasmide GATA-4 et 3(il de lipide non-liposomal Fugene6 (BOEHRINGER), selon les recommandations du fabricant. Les cellules transfectées par les plasmides pEGFP6 et pEGFP6 mutés seuls sont utilisées comme témoin négatif. 48h après la transfection, l'émission de fluorescence est observée au microscope inversé à fluorescence On observe que seule la construction mutée sur les deux sites n'est pas transactivée par l'expression du facteur GATA-4. Les autres constructions le sont à des degrés plus ou moins importants, la transactivation la plus importante étant obtenue avec le plasmide pEGFP6 non muté. Ces résultats établissent donc que seuls les deux sites canoniques en position-63/-58 et-1015/-1010 permettent une bonne transactivation du fragment de l,5kb du promoteur, par le facteur GATA-4. 3. 2.3 Transfection des plasmides mutés dans des cellules cardiaques. Les plasmides mutés ou non mutés sont électroporés dans des cellules P19 différenciées en cellules cardiaques comme décrit à l'exemple 3.1. Les résultats de 2 séries d'expériences indépendantes sont présentés dans le tableau I ci-dessous. Tableau I plasmide Sites GATA-4 zones zones mutés battantes battantes GATA.1 GATA.2 exprimant exprimant positio positio l'EGFP (%) l'EGFP (%) n-63/- n-1015/- expérience 1 expérience 2 58) 1010 pEGFP 6- - 100 100 pEGFP ± 0 50 6. 1 pEGFP - + 80 63 6. 2 pEGFP + + 0 0 6. 1.2 pEGFP 12- 93 ND pEGFP ± 58 ND 12. 1 pEGFP 10- ND 80 pEGFP ± ND 60 10. 1 *ND= non déterminé Les résultats observés permettent d'établir que dans les cellules cardiaques : 1) le fragment de l,5kb muté sur les deux sites GATA ne présente aucune activité 2) le fragment de l,5kb muté sur l'un ou l'autre des sites GATA présente des activités plus faibles que celle du fragment non muté 3) les fragments plus courts (0,8kb ou 0,5kb) qui ne possèdent aucun des sites GATA par délétion et/ou mutation conservent toujours une activité. Les résultats confirment que le fragment de l,5kb constitue un promoteur minimum fort du gène MYBPC3 le mieux régulé dans les cellules cardiaques et permettent d'établir que les deux sites GATA-4 (-63/-58 et-1015/-1010) sont indispensables à l'activité de ce promoteur. D'autre part, les résultats observés avec les plasmides pEGFP10.1 et pEGFP12.1 comparés à ceux observés pour le plasmide pEGFP6. 1.2 permettent d'établir qu'il existe un mécanisme de régulation négatif impliquant les séquences - 1500/-800. L'analyse des 700pb (voir exemple 3) révèle des motifs consensus de liaison au facteur de transcription NFAT3 [-822/-815 pb (5'-TGGAAAAT-3'), -850/-844 pb (5'-TGGAAAT- 3') ]. En outre, les sites Ets (-935/-932,-1102/-1099) et les sites SRFR (-1231/-1221 ; -861/-853 ; sont des cibles potentielles du facteur ERP/Net, qui est exprimé dans le c#ur. Le facteur NFAT-3 qui se lie au motif canonique 5'-(A/T)GGAAAAT-3' (HOEY et al., Immunity, 1995,2, 461-472) fait partie d'une famille multigénique dont les membres sont exprimées essentiellement dans les lymphocytes (RAO et al., Annu. Rev. Immunol., 1997,15, 707-747). NFAT-3 est exprimé dans le c#ur et joue un rôle dans la cardiogénèse (DE LA POMPA et al., Nature, 1998,392, 182-186 ; RANGER et al., Nature, 1998,392, 186-190), il a également été rapporté que NFAT-3 interagit avec GATA-4 pour activer la transcription du gène BNP (type B Natriuretic Peptide), impliqué dans l'hypertrophie cardiaque (MOLKENTIN et al., précité). Les protéines Ets qui reconnaissent la séquence 5'-GGA(A/T)-3' (TREISMAN et al., Curr. Opin. Dev. Genet., 1994,4, 96-101) régulent l'expression tissu-spécifique via des mécanismes d'activation et de répression (CONRAD et al., Mol. Cell. Biol., 1994,14, 1553-1565 ; ROSEN et al., J. Biol. Chem., 1994,269, 15652-15660 ; UMEZAWA et al., Mol. Cell. Biol., 1997,17, 4885-4894). Parmi celles-ci, la protéine ERP/Net qui est exprimée dans de nombreux tissus dont le c#ur (LOPEZ et al. , Mol. Cell. Biol., 1994,14-3292- 3309 ; PRICE et al., EMBO J., 1995,14, 2589-2601) interagit avec un seul site de fixation Ets (LOPEZ et al., précité) et il semblerait qu'elle puisse également interagir avec le site de liaison aux SRFRs (PRICE et al., EMBO J., 1995,14, 2589- 2601 ; LOPEZ et al., précité ; WASYLYK et al., Eur. J. Biochem., 1993,211, 7-18). Ce mécanisme de régulation négatif représente un mode de contrôle supplémentaire de l'expression spécifique dans le c#ur pour le fragment de l,5kb du promoteur du gène MYBPC3 . Exemple 4 : Construction d'un vecteur d'expression selon l'invention Un vecteur d'expression, dénommé pU523, permettant l'expression d'un gène hétérologue sous le contrôle transcriptionnel du fragment de l,5kb du promoteur du gène MYBPC3 a été construit selon les étapes suivantes : 1) le fragment SalI-NotI du site multiple de clonage du plasmide pSL1190 "superlinker phagemid" (PHARMACIA) a été inséré entre les sites SalI et NotI du plasmide pEGFP-1 (CLONTECH) pour donner le plasmide p#EGFP, délété du promoteur et de la partie codante de l'ADNc de l' EGFP, 2) le fragment XhoI-SmaI du plasmide pCMVp (CLONTECH) contenant un intron ainsi qu'un site donneur et un site accepteur d'épissage (SD/SA) a été inséré entre les sites SalI et SmaI du plasmide pAEGFP, 3) un site PmeI a été introduit par PCR aux extrémités du fragment Eco47III- Afl-II du plasmide pAEGFP (700pb), contenant l'intron, le SD/SA et la séquence de polyadénylation de SV40. 4) le produit d'amplification obtenu a été cloné dans le plasmide pGEM-T easy vecteur (PROMEGA) pour donner le plasmide pPmeI et 5) le fragment SalI-HindIII du plasmide pGEM-T6 contenant le fragment de l,5kb du promoteur du gène MYBPC3, obtenu comme décrit à l'exemple 3, a été inséré entre les sites XhoI et HindIII du fragment PmeI du plasmide pPmeI pour donner le plasmide pU523. La carte du vecteur pU523 est illustrée par la figure 4 : il comprend le fragment de l,5kb du promoteur du gène MYBPC3, un petit intron, un site multiple de clonage et une séquence de polyadénylation, bordés d'un site de restriction rare (site PmeI) qui permet d'isoler la cassette d'expression et de la cloner dans un autre vecteur. Exemple 5 : Activité du promoteur minimum de l,5kb in vivo dans des souris transgéniques. Le plasmide pEGFP6, obtenu comme décrit à l'exemple 3, a été digéré par les endonucléases SacI et AflII et le fragment de restriction obtenu , qui comprend le fragment de l,5kb du promoteur du gène MYBPC3 lié au gène de l'EGFP a été purifié. Ce fragment a été injecté dans des #ufs de souris fertilisés qui ont ensuite été réimplantés dans des souris pseudo-gestantes. L'expression de l'EGFP dans les 10 lignées de souris obtenues a été analysée par observation directe de différents organes au microscope inversé à fluorescence. 7 des 10 lignées expriment fortement l'EGFP, cette expression est détectée uniquement au niveau du c#ur Ces résultats permettent d'affirmer que le fragment de 1,5 kb est actif in vivo et permet d'exprimer un gène hétérologue à des niveaux élevés, exclusivement dans le c#ur. La cassette d'expression telle que définie ci-dessus permet donc d'évaluer l'activité de nouvelles molécules thérapeutiques à visée cardiaque ou cardiovasculaire et d'étudier les conséquences fonctionnelles de l'expression d'une protéine hétérologue dans le muscle cardiaque. Exemple 6 : Activité du promoteur minimum de l,5kb in vivo dans le muscle cardiaque après injection d'un vecteur recombinant contenant le promoteur lié au gène rapporteur de la P-galactosidase 6. 1. Injection d'un plasmide recombinant Un plasmide recombinant dénommé pShMYBPC3-LacZ, contenant la séquence codante du gène lacZ, sous le contrôle du fragment de 1,5 kb du promoteur du gène MYBPC3 murin a été construit en suivant les étapes suivantes. Le fragment XhoISalI du plasmide pCMVp (CLONTECH) contenant la séquence codante du gène lacZ a été inséré au site SalI du plasmide navette de l'adénovirus pAdeasy (HE et al., 1998, Proc. Nat. Acad. Sci., 95, 2509-2514). Le plasmide obtenu contient la séquence codante du gène lacZ, flanquée en 5' d'un site accepteur d'épissage, d'un intron et d'un site donneur d'épissage provenant de la région tardive de SV40 et en 3' d'un site de polyadénylation. Puis ce plasmide a été digéré par les endonucléases XhoI et HindIII et le fragment XhoIHindIII du plasmide pEGFP6 contenant le promoteur du gène MYBPC3 a été inséré entre ces deux sites pour donner le plasmide pShMYBPC3-LacZ. Des rats Wistar adultes de sexe mâle ont été injectés avec 50 à 500 g du plasmide recombinant obtenu, contenant le gène de la P-galactosidase sous le contrôle transcriptionnel du fragment de l,5kb du promoteur du gène MYBPC3. 2 séries d' expérimentation ont été réalisées sur des lots de 3 animaux : 1) injection intramyocardique, au niveau de la paroi du ventricule gauche, de 50 à 250 g de plasmide recombinant dans du soluté glucose à 5% P/V dans un volume d' inj ection de 1001, 2) injection intramusculaire, au niveau du muscle squelettique Tibialis anterior de 50 à 500 g de plasmide recombinant dans du soluté glucose à 5% P/V dans un volume d' inj ection de 100 l. Le plasmide ne contenant pas de promoteur a été utilisé comme témoin négatif et le plasmide pCMVp (CLONTECH) comme témoin positif de l'expression de la ss-galactosidase dans les deux types de tissus musculaires 7 jours après l'injection, les animaux ont été sacrifiés et le c#ur ainsi que le muscle ont été prélevés. Des cryocoupes transversales ou longitudinales sériées, de ces deux organes ont été effectuées. Après incubation en présence du substrat X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-p-galactoside), les coupes ont été observées au microscope afin d'analyser les cellules exprimant la (3-galactosidase. Après injection du plasmide témoin sans promoteur dans le myocarde ou bien dans le muscle squelettique, aucune cellule exprimant la P-galactosidase n'est détectée dans les deux types de muscles. Après injection dans le myocarde, de nombreuses cellules exprimant la P-galactosidase sont détectées aussi bien chez les animaux ayant reçu le plasmide pCMVp que chez les animaux ayant reçu le plasmide pShMYBPC3-LacZ. En revanche, après injection dans le muscle squelettique, aucune cellule exprimant la p-galactosidase n'est détectée chez les animaux ayant reçu le plasmide pShMYBPC3-LacZ alors que de nombreuses cellules exprimant la P-galactosidase sont détectées chez les animaux ayant reçu le plasmide pCMVp. Ces résultats permettent dafirmer que l'administration in vivo d'un vecteur d'expression plasmidique contenant un gène hétérologue sous le contrôle du fragment de l,5kb du promoteur MYBPC3 permet d'exprimer ce gène hétérologue, uniquement dans le myocarde. 6. 2 Injection d'un adénovirus recombinant Un adénovirus recombinant, dénommé AdMYBPC3-pgal contenant le gène de la p-galactosidase sous le contrôle transcriptionnel du fragment de l,5kb du promoteur du gène MYBPC3, en lieu et place de la région El d'un adénovirus défectif #E1, a été obtenu par recombinaison homologue à partir du plasmide navette de l'adénovirus pShMYBPC3. L'adénovirus recombinant décrit par DAVIDSON et al.(Nature Genetics, 1993,3, 219-223), contenant le gène de la pgalactosidase sous le contrôle transcriptionnel du promoteur ubiquitaire du cytomégalovirus (AdCMV-pgal) a été utilisé comme témoin. Des lots de 3 rats Wistar adultes de sexe mâle ont été injectés avec 109 ufp (unités formant plage) de l'adénovirus AdMYBPC3-bgal ou AdCMV-Pgal. 4 séries d'expérimentation ont été réalisées : 1) injection intramyocardique, au niveau de la paroi du ventricule gauche, de la préparation d'adénovirus dans du soluté Ringer-lactate dans un volume d'injection de 1001, 2) injection intramusculaire, au niveau du muscle squelettique Tibialis anterior de la préparation d'adénovirus dans du soluté Ringer-lactate dans un volume d'injection de 1001, 3) injection intrapéricardique, selon le procédé décrit dans FROMES et al., 1999, Gene Therapy, 6,683-688, de la préparation d'adénovirus dans du soluté Ringer-lactate dans un volume d'injection de 7501, 4) injection intraartérielle de la préparation d'adénovirus dans du soluté Ringer-lactate, dans un volume d'injection de 100 l 7 jours après l'injection, les animaux ont été sacrifiés et le c#ur, le muscle ainsi que les autres organes (poumon, diaphragme, foie, rein , rate) ont été prélevés. Des cryocoupes transversales et/ou longitudinales sériées, de ces organes ont été effectuées. Après injection dans le muscle squelettique, aucune cellule exprimant la p-galactosidase n'est détectée dans les animaux ayant reçu l'AdMYBPC3-pgal alors que de nombreuses cellules positives sont observées chez les animaux ayant reçu l'AdCMV-pgal. Après injection intrapéricardique, l'expression de la p-galactosidase est limitée aux cellules du myocarde ainsi qu'à des cellules de la rate chez les animaux ayant reçu l'AdMYBPC3-pgal alors que des cellules exprimant la ssgalactosidase sont observées dans de nombreux organes (foie, c#ur, rate, poumon, rein) des animaux ayant reçu l'AdCMV- ssgal. Après injection intraartérielle, aucune cellule exprimant la p-galactosidase n'est observée chez les animaux ayant reçu l'AdMYBPC3-pgal alors que des cellules exprimant la P-galactosidase sont observées dans de nombreux organes, en particulier dans le foie, mais jamais dans le c#ur, des animaux ayant reçu l'AdCMV-pgal. Ces résultats permettent dafirmer que l'administration in vivo, directement dans le c#ur ou bien par voie systémique, d'un adénovirus recombinant contenant un gène hétérologue sous le contrôle du fragment de l,5kb du promoteur MYBPC3 permet d'exprimer ce gène hétérologue, à des niveaux élevés, uniquement dans le myocarde. Ce vecteur recombinant permet donc de limiter les effets indésirables liés à l'expression d'un gène hétérologue dans un autre tissu que le myocarde. REVENDICATIONS 1 ) Molécule d'acide nucléique capable de diriger l'expression spécifique d'un gène dans le myocarde, caractérisée en ce qu'elle comprend les éléments-cis de régulation de la transcription du promoteur d'un gène MYBPC3 de mammifère, lesquels éléments de régulation de la transcription comprennent au moins deux séquences de liaison d'un facteur de transcription GATA-4. 2 ) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend un site GATA-4 entre les positions-60 et-70 ou entre les positions -1010 et-1020, par rapport au site d'initiation de la transcription du gène MYBPC3. 3 ) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend également un ou plusieurs sites de liaison d'un facteur de transcription impliqué dans la restriction de la transcription du gène MYBPC3 dans les cardiomyocytes. 4 ) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit ou lesdits site(s) de liaisons sont sélectionnés dans le groupe constitué par : les séquences de liaison du facteur NFAT-3, les séquences de liaison des protéines Ets et les séquences de liaison des facteurs RSRFs. 5 ) Molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que sa séquence est sélectionnée dans le groupe constitué par : - la séquence qui s'étend de la position-1535 à la position +28 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène MYBPC3 murin représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO :1 et - la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO :2 qui s'étend de la position 464 à la position 1563 de la séquence SEQ ID NO : 1. 6 ) Vecteur recombinant comprenant un insert constitué par une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 7 ) Cellule transformée par au moins une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 8 ) Cellule transformée selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite cellule est une cellule de mammifère. 9 ) Animal transgénique non-humain, caractérisé en ce que tout ou partie de ses cellules sont transformées par une molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 5. 10 ) Animal transgénique selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un mammifère. 11 ) Utilisation d'une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour l'obtention de médicaments.