Brevet FR2813613A1 — publié le 20020308

DESCRI PTION La présente invention concerne le domaine des cosmétiques et concerne un procédé d'analyse du vieillissement cutané par détermination du niveau d'apoptose, ainsi que l'utilisation d'extraits de plante particuliers en tant qu'agents actifs contre la mort cellulaire. On entend par le terme "apoptose" la mort cellulaire active qui survient comme résultat de modifications morphologiques et biochimiques dans un organisme. Des analyses histologiques ont montré que les cellules apoptotiques subissaient une succession constante d'étapes. il s'agit à cet égard en règle générale non pas d'une modification pathologique, mais d'une modification qui sert bien plus à réguler le nombre de cellules ou à éliminer des cellules endommagées ou dégénérées qui peuvent sinon déclencher un cancer. Les travaux de Kerr et al., dans Br. J. Cancer, 26, 239 (1992), de McConkey et al., dans Cell Biol. 4, 370 (1994) ou de Polakowska et al., Cell Death differ., 1, 19 (1994), proposent à cet égard un récapitulatif. Les facteurs déclenchants de la mort cellulaire peuvent être multiples et très différents. Selon Kroemmer et al., ce sont essentiellement des facteurs de stress tels que le rayonnement UV qui y contribuent [FASEB J., 9, 1277 (1995)]. D'autre part, les cellules se trouvent toujours dans un cycle de vie depuis la naissance, la propagation et enfin la mort, lequel cycle est commandé par les facteurs de croissance. Les mêmes grandeurs d'influence primaires peuvent déclencher tant la division cellulaire que l'apoptose, selon que des facteurs secondaires déterminés sont ou non présents. La mort cellulaire est par exemple déclenchée par des signaux contradictoires irréguliers, tandis que la mitogénèse est le résultat de facteurs qui agissent tous dans une même direction et se renforcent alors. Il n'est ainsi, selon Haake et al., pas nécessaire d'avoir obligatoirement des polluants définis pour l'apoptose, mais le programme de suicide peut être lui-même déclenché du fait que les récepteurs correspondants n'ont pas obtenu de signaux pour survivre [J. Invest. Derm., 3(1), 28 (1998)]. Pendant le vieillissement cutané, un phénomène similaire pourrait être responsable de la formation des rides et des manifestations similaires du vieillissement. On sait ainsi depuis longtemps que l'aptitude de l'organisme à former des facteurs de croissance et de survie cellulaire diminue avec les années, ce qui aboutit finalement à une augmentation de l'apoptose et à une réduction du nombre de cellules. L'objet de la présente invention a d'une part consisté à développer, par provocation artificielle de la mort cellulaire et détermination du niveau d'apoptose, un modèle de la simulation du vieillissement cutané, et d'autre part à tester des substances actives dans ce modèle pour savoir si elles sont appropriées en tant qu'agents anti-apoptose. Un autre objet en découle directement, à savoir mettre à disposition de façon correspondante des substances appropriées pour fabriquer des préparations cosmétiques, en particulier des agents de soin de la peau, et en particulier des agents anti-âge ou anti-vieillissement. L'objet de la présente invention est un procédé d'analyse du vieillissement cutané par provocation de l'apoptose de cultures cellulaires humaines par privation de facteurs de croissance, de substances nutritives et/ou de vitamines, et détermination consécutive du nombre de cellules apoptotiques (niveau d'apoptose). De par la privation de facteurs correspondants, qui envoient des messagers de survie aux cellules, il est possible d'amorcer le programme de mort programmée et de déclencher l'apoptose. Une détermination consécutive du nombre de cellules permet d'informer sur l'étendue de la mort cellulaire déclenchée. Le système est par conséquent au mieux approprié pour suivre l'effet des substances actives anti- apoptose. A cet égard, le procédé peut être appliqué tant sur des cultures de peau ex vivo qu'in vitro (fibroblastes, kératinocytes, cellules épithéliales), que sur des cultures ex vivo de follicules pileux humains. Détection de l'apoptose et détermination de la teneur en cellules apoptotiques Au cours de l'apoptose, les fragments des brins d'ADN contenus dans les noyaux cellulaires sont divisés par intervention des endonucléases et déchargés dans le cytoplasme. Cela entraîne le fait que la teneur en ADN double brin dans les cellules apoptotiques est inférieure à celle des cellules non endommagées. Comme cela est décrit par exemple par Henseleitet et al. dans Archiv. Dermatolog. Res. 288 (11), 676 (1996) ou par Parat et al. dans J. Photochem. Photobiol B. Biol. 37, 101 (1997), le niveau d'apoptose peut être par exemple déterminé selon la méthode ELISA (Méthode 1). Une forme de réalisation particulière du procédé en accord avec la présente invention consiste à colorer des échantillons avec du bromure d'éthidium et de l'acridine orange, puis à déterminer la teneur en ADN double brin non endommagé et par conséquent le niveau d'apoptose à l'aide de la cytométrie de flux. (Méthode 2). Dans une autre forme de réalisation du procédé en accord avec la présente invention, on colore, pour déterminer la teneur en cellules nécrotiques, un échantillon cellulaire au bleu trypane, tandis qu'un second échantillon est fixé tel que décrit précédemment et coloré avec du bromure d'éthidium (colorant fluorescent) pour déterminer la quantité d'ADN double brin non endommagé. La diminution de la teneur en ADN double brin non endommagé dans les noyaux cellulaires lors de la transformation en cellules apoptotiques peut être déterminée au moyen d'une cytométrie de flux, les cellules apoptotiques apparaissant dans l'histogramme en tant que "sous-pic G1" avant le pic G1. Le niveau d'apoptose peut également être déterminé d'une façon immunohistologique à l'aide d'anticorps. Ainsi, l'antigène Fas, une molécule cytotoxique transmembranaire qui déclenche l'apoptose et qui est disponible auprès de la société Tebu, joue un rôle important dans la pathogénèse des kératinocytes [cf. J. Invest. Derm., 103 (3), 330 (1994)]. Le marquage s'effectue par un anticorps monoclonal, l'anti-Fas. On sait de plus à partir d'analyses de Kroemer et al. que l'apoptose s'accompagne d'une destruction de la membrane mitochondriale. L'anticorps monoclonal APO 2.7, pouvant être obtenu auprès de la société Immunotech, réagit avec des protéines 38 KDa de la membrane mitochondriale et peut ainsi également fournir des renseignements sur l'étendue de l'apoptose. L'agent suppresseur de tumeur p53, une protéine disponible auprès de Ventana Medical Systems, participe à la réparation des brins d'ADN et à la régulation du cycle cellulaire, pour supprimer des dommages provoqués par exemple par le rayonnement UV, et est également approprié pour la détermination. De même TUNEL (Tdt-medicated UTP nick end labelling, Boehringer), qui est utilisé pour la détermination des noyaux apoptotiques, est indirectement approprié pour déterminer le niveau d'apoptose par la détection des modifications structurelles intervenant dans les noyaux cellulaires (apoptose du noyau cellulaire). Les réactions provoquées par les anticorps doivent être quantifiées pour déterminer le niveau d'apoptose. On utilise alors en règle générale soit un microscope optique (réaction AEC) ou un microscope à balayage laser confocal. Les images ainsi enregistrées sont évaluées par analyse d'image. L'intensité de la réaction s'exprime alors par un coefficient qui est proportionnel à la surface analysée. Substances actives contre l'apoptose La détection du niveau d'apoptose suppose que l'on réussit à provoquer artificiellement la mort cellulaire par privation de facteurs de croissance, de substances nutritives et/ou de vitamines. Ce n'est qu'ensuite que l'on peut à l'inverse constater si les substances ajoutées sont appropriées pour améliorer l'état des cellules, par exemple augmenter le nombre de cellules par stimulation de la formation des facteurs de croissance et de survie. On peut à cet égard par exemple pour le procédé in vitro cultiver des cellules épithéliales humaines dans un milieu de culture avec sérum de veau foetal (FCS, ou foetal calf serum) et bromodésoxyuridine (BrdU). Après une durée d'incubation de 4 jours, le milieu de culture est remplacé par un milieu de survie, qui est exempt de FCS ou d'autres facteurs de croissance, mais qui contient les substances test, et on détermine après 4 à 5 jours supplémentaires le niveau d'apoptose d'après l'une des méthodes précédemment décrites. Concernant l'analyse ex vivo, on prépare des cultures de peau ex vivo dans une solution de sel, et on prive celles-ci une nouvelle fois des facteurs de croissance, des substances nutritives, des vitamines et équivalents. L'analyse des substances actives est réalisée par application topique (2 mg de substance activelcm2). Après une durée d'incubation de 7 à 12 jours à 37 C, on analyse alors les échantillons d'une façon histologique tel que décrit précédemment. Comme les inventeurs ont pu le vérifier par de nombreuses analyses, des extraits de plantes déterminés possèdent des propriétés qui influencent positivement l'apoptose tant dans des cultures de cellules ex vivo qu'in vitro, étant donné qu'ils stimulent la formation de facteurs de croissance et de survie. Un autre objet de la présente invention concerne par conséquent l'utilisation d'extraits des plantes Cassia alata et/ou Vigna trilobata en tant que substances actives contre l'apoptose de cellules humaines. Les extraits peuvent être compris dans des quantités comprises entre 0,1 et 5, de préférence entre 0,5 et 1 % en masse - sur la base de la substance sèche - dans des préparations cosmétiques ou dermopharmaceutiques, de préférence dans des agents de traitement de la peau, et en particulier dans des agents anti-âge. Exemples Exemples 1 à 5, exemple comparatif V1. On a déclenché artificiellement l'apoptose dans des cultures in vitro de kératinocytes humains par privation de facteurs de croissance ; ces cultures servaient de norme de comparaison. Dans les exemples en accord avec la présente invention, on a ajouté aux cultures différentes concentrations d'extraits des plantes Cassia alata ou Vigna trilobata. Le niveau d'apoptose, à savoir le nombre de cellules, ainsi que la teneur en fragments d'ADN cytoplasmique, ont été déterminés selon la méthode 1. On indique dans le tableau 1 la modification par rapport à la norme. Comme on le reconnaît, le nombre de cellules est considérablement augmenté par l'ajout des extraits de plante, c'est à dire que le niveau d'apoptose est réduit. De même, la teneur en fragments d'ADN dans le cytoplasme est réduite. Tableau 1 Nombre de cellules et quantité de fragments d'ADN cytoplasmiques (indications en % relatif) Ex. Ajout c, Nombre de Fragments masse cellules d'ADN V1 Sans 0 100 100 1 Cassia alata 0,01 105 5 63 3 2 Cassia alata 0,02 105 1 39 2 3 Cassïa alata 0,05 108 1 25 2 4 Vigna trilobata 0,01 107 10 44 17 5 Vigna trilobata 0,03 104 11 47 18 Exemples 6 à 10, exemples comparatifs V2 et V3. On a répété les exemples 1 à 5 et V1 en utilisant des quantités différentes de l'extrait de Cassia alata, mais on a déterminé les cellules apoptotiques ou nécrotiques selon la méthode 2 ou 3. L'ajout de l'extrait de plante entraîne une réduction du niveau d'apoptose sans augmenter le nombre de cellules nécrotiques. Les résultats sont résumés dans le tableau 2. Tableau 2 Détermination du niveau d'apoptose et de nécrose (indications en relatif) Ex. Méthode c, Cellules non Cellules Cellules mgll apoptotiques apoptotiques nécrotiques V2 2 0 65 4 14 4 19 2 6 2 0,5 64 2 12 3 22 3 1 7 2 1,0 68 4 9 3 21 2 8 ; 2 2,0 I 77 4 i 6 1 16 3 9 2 5,0 77 3 4 1 17 3 10 2 10,0 76 2 3 1 20 3 V3 3 0 1 67 2 14 4 36 2 6 3 0,5 70 4 8 1 30 4 7 3 1,0 75 1 7 2 25 1 I '8 3 2,0 75 3 6 1 25 3 9 3 5,0 71 3 4 1 29 3 10 3 10,0 65 8 3 1 35 8 Exemples 11 et 12, exemples comparatifs V4 et V6. On a traité une culture d'épiderme humain en absence de facteurs de croissance avec un extrait de Vigna trilobata, et on a déterminé d'une façon histologique le niveau d'apoptose. L'efficacité des extraits de plante contre l'apoptose se manifeste par une diminution de p53 et de l'apoptose de noyau (TUNEL), ainsi que par une augmentation de APO 2.7 et de Fas. Les résultats sont résumés dans le tableau 3. Tableau 3 Détermination du niveau d'apoptose (indications en % relatif Ex. Ajout c, p53 Apoptose APO Fas en (TUNEL) 2.7 masse V4 Sans 0 j 0,1 ' 4799 1104 V5 BSS* 521 16 7 321 V6 BSS + placebo 2262 18 66 39 Hydrogel 11 BSS + Hydrogel 0,3 2201 13 611 1117 avec Vigna trilobata 12 BSS + Hydrogel 0,6 607 5 1949 avec Vigna trilobata BSS = Solution de sel équilibrée Bien entendu, l'invention n'est pas limitée au mode de réalisation décrit. Des modifications restent possibles, notamment du point de vue de la constitution des divers éléments ou par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour autant du domaine de protection de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé d'analyse du vieillissement cutané par provocation de l'apoptose de cultures de cellules humaines par privation de facteurs de croissance, de substances nutritives et/ou de vitamines, et détermination consécutive du nombre de cellules apoptotiques (niveau d'apoptose). 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise des cultures de peau ex vivo. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise des cultures ex vivo de follicules pileux humains. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise des cultures de peau in vitro, telles que des cultures de fibroblastes, de kératinocytes ou de cellules épithéliales. 5. Procédé selon au moins l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on détermine le niveau d'apoptose selon la méthode ELISA. 6. Procédé selon au moins l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on colore les échantillons avec du bromure d'éthidium et de l'acridine orange, et que l'on détermine le niveau d'apoptose au moyen d'une cytométrie de flux. 7. Procédé selon au moins l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on colore les échantillons avec le colorant fluorescent bromure d'éthidium, et que l'on détermine le niveau d'apoptose par sommation via le sous-pic G1 au moyen de la cytométrie de flux. 8. Procédé selon au moins l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on détermine le niveau d'apoptose au moyen d'anticorps. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on utilise comme anticorps p53, APO 2.7 ou Fas. 10. Procédé selon les revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on détermine le niveau d'apoptose par l'apoptose du noyau cellulaire selon la technique dite de TUNEL. 11. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 pour tester des substances actives, notamment des extraits de plantes déterminées, en tant qu'agents anti-apoptoses.