Brevet FR2816713A1 — publié le 20020517

La présente invention concerne un dispositif pour réaliser des analyses spectroscopiques in vivo, qualitatives et quantitatives des métabolites d'un milieu de culture cellulaire, par résonance magnétique nucléaire. Elle concerne également un ensemble comprenant un réacteur contenant le milieu de culture et un tel dispositif. La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire, technique non invasive et non destructrice, est l'outil analytique le mieux adapté pour analyser in vivo le métabolisme intracellulaire. Néanmoins son utilisation pour la caractérisation précise de la physiologie d'un système vivant à un instant donné, par le profil métabolique qualitatif et quantitatif de ses composants intracellulaires, constitue encore actuellement un problème mal résolu. Les deux points faibles de la technologie par résonance magnétique nucléaire in vivo, résident d'une part dans la difficulté à reproduire dans un tube de mesure des conditions contrôlées du milieu cellulaire, et d'autre part dans sa faible sensibilité (le rapport signal/bruit de fond est faible). Ce rapport signal/ bruit de fond dépend du nombre d'accumulations et donc du temps d'accumulation du signal et de la concentration cellulaire dans le tube de mesure. Plus le temps d'accumulation du signal et/ou la concentration cellulaire sont élevés, plus ce rapport signal/bruit de fond est grand. La rapidité avec laquelle le métabolisme d'un système vivant répond à une perturbation montre qu'il n'est pas recommandé d'augmenter le temps d'accumulation. L'analyse spectroscopique du métabolisme in vivo par résonance magnétique nucléaire nécessite donc une haute densité cellulaire ce qui accentue les problèmes liés au contrôle des paramètres physico-chimiques du milieu cellulaire contenu dans le tube de mesure et plus particulièrement ceux liés à l'oxygénation des cellules. Afin de pallier aux inconvénients précités, la présente invention propose un nouveau dispositif qui permet de réaliser en continu une analyse spectroscopique in vivo des métabolites d'un milieu de culture par résonance magnétique nucléaire. Plus particulièrement selon l'invention, le dispositif comprend un agencement de conduits tubulaires destiné à être positionné dans un appareil d'analyse par résonance magnétique nucléaire, cet agencement de conduits tubulaires présentant entre une entrée et une sortie aptes à être raccordées à un réacteur contenant le milieu de culture, une première partie dans laquelle il est défini un trajet hélicoïdal du milieu de culture durant lequel s'opère la magnétisation des noyaux des cellules du milieu de culture, et une deuxième partie dans laquelle il est défini un trajet rectiligne suivant un sens et le sens opposé du milieu de culture au cours duquel s'opère l'analyse par résonance magnétique nucléaire par excitation des noyaux, dispositif dans lequel il est prévu des moyens pour établir depuis le réacteur, une circulation en continu du milieu de culture entre l'entrée et la sortie dudit agencement conduits tubulaires. Selon d'autres caractéristiques avantageuses et non limitatives du dispositif selon l'invention : - les moyens de circulation du milieu de culture dans l'agencement de conduits tubulaires, comprennent une pompe positionnée entre le réacteur et l'entrée dudit dispositif et présentant un débit de l'ordre de 1 ml/s ; le trajet hélicoidal définit dans la première partie de l'agencement de conduits tubulaires, s'étend sur une longueur déterminée de sorte que, au débit de la pompe choisi, le temps de parcours dudit trajet hélicoïdal par le milieu de culture soit compris entre environ 3 et 5 fois le temps de relaxation longitudinal T1 des noyaux cellulaires analysés du milieu de culture ; la deuxième partie de l'agencement de conduits tubulaires présente une zone de prise de mesure par l'appareil d'analyse par résonance magnétique nucléaire, couvrant une partie du trajet rectiligne aller et retour parcouru par le milieu de culture ; il est prévu des conduits souples en matière plastique pour le raccordement de l'entrée et de la sortie du dispositif avec l'intérieur du réacteur contenant le milieu de culture ; - il comprend une pièce de protection réalisée en matière plastique positionnée autour de la première partie de l'agencement de conduits tubulaires, cette pièce de protection étant conformée pour permettre le maintien du dispositif dans l'appareil d'analyse par résonance magnétique nucléaire. De manière préférée, la pièce de protection et de maintien (130) est réalisée en polyamide, et de préférence en Plexiglas. Selon un mode de réalisation avantageux du dispositif conforme à l'invention, il comprend un premier conduit tubulaire qui présente une amorce sensiblement rectiligne ouverte à une extrémité pour former l'entrée du dispositif, puis une portion en spirale formant le trajet hélicoïdal, suivie d'une portion rectiligne formant le trajet rectiligne aller qui communique avec un deuxième conduit tubulaire sensiblement rectiligne formant le trajet rectiligne de retour et dont une partie s'étend au travers de ladite portion en spirale du premier conduit tubulaire pour déboucher par une ouverture formant la sortie dudit dispositif. Préférentiellement, les sections d'entrée et de sortie des premier et deuxième conduits tubulaires sont identiques. Le deuxième conduit et la portion rectiligne du premier conduit peuvent être positionnés de manière concentrique ou la portion rectiligne du premier conduit tubulaire peut être juxtaposée et parallèle à une partie du deuxième conduit tubulaire, lesdits conduits se raccordant par un fond coudé. La portion rectiligne du premier conduit tubulaire et ladite partie du deuxième conduit tubulaire sont formées par un seul tube coupé longitudinalement par une paroi centrale en deux parties égales. Selon un mode préféré de réalisation, la partie en spirale du dispositif selon l'invention comporte dix spires. Avantageusement, les conduits tubulaires sont réalisés en verre, et les premier et deuxième conduits forment une seule pièce. L'invention propose également un ensemble pour l'analyse spectroscopique in vivo des métabolites d'un milieu de culture, par résonance magnétique nucléaire, qui comprend un dispositif tel que précité et un réacteur contenant le milieu de culture à analyser. Cet ensemble comporte un appareil d'analyse spectroscopique par résonance magnétique nucléaire spécialement adapté pour recevoir ledit dispositif d'analyse. La description qui va suivre en regard des dessins annexés, donnés à titre d'exemples non limitatifs, fera bien comprendre en quoi consiste l'invention et comment elle peut être réalisée. Sur les dessins annexés : - la figure 1 est une vue schématique en perspective de côté d'un premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention ; la figure 2 est une vue schématique en coupe longitudinale de la figure 1 ; - la figure 3 est une vue schématique de côté d'un deuxième mode de réalisation du dispositif selon l'invention ; - la figure 4 illustre un spectre RMNIH de l'éthanol à t = 26'au cours de l'essai protocolaire 1 ; - la figure 5 montre la cinétique de l'intensité du signal H du méthyle de l'éthanol lors de l'augmentation de sa concentration de 1 à 4 mM puis de 4 à 20 mM au cours de l'essai protocolaire 1 ; - la figure 6 illustre le spectre RMN 13C de l'éthanol à t = 30'au cours de l'essai protocolaire 2 ; - la figure 7 montre la cinétique de l'intensité du signal 13C du méthyle de l'éthanol lors de l'augmentation de sa concentration de 0,24 à 1M au cours de l'essai protocolaire 2. Préliminairement, on notera que, d'une figure à l'autre, les éléments identiques ou similaires des différents modes de réalisation de l'invention seront dans la mesure du possible référencés par les mêmes signes de référence, et ne seront pas redécrits à chaque fois. Sur les figures 1 à 3, on a représenté un dispositif 100 pour l'analyse spectroscopique in vivo des métabolites d'un milieu de culture par résonance magnétique nucléaire. Il comprend un agencement de conduits tubulaires destiné à être positionné selon l'axe Z dans un appareil d'analyse par résonance magnétique nucléaire, ici non représenté. Cet agencement de conduits tubulaires présente une entrée 109 et une sortie 115 destinées à être raccordées par des conduits souples (non représentés) en matière plastique, à l'intérieur d'un réacteur (non représenté) contenant le milieu de culture. L'agencement de conduits tubulaires représenté sur les figures 1 à 3 comprend entre l'entrée 109 et la sortie 115 dudit dispositif, une première partie 101 dans laquelle il est défini un trajet hélicoïdal du milieu de culture durant lequel les noyaux des cellules du milieu de culture sont magnétisés, et une deuxième partie 102 dans laquelle il est défini un trajet rectiligne d'aller-retour selon l'axe Z (c'est-à-dire suivant un sens et le sens opposé) du milieu de culture, au cours duquel s'effectue l'excitation des noyaux analysés. Il est prévu également dans ce dispositif 100 des moyens (non représentés) pour établir une circulation continue du milieu de culture prélevé dans le réacteur, entre l'entrée 109 et la sortie 115 dudit agencement de conduits tubulaires. Ici, le dispositif 100 comprend un premier conduit tubulaire 110 qui présente une amorce 110a sensiblement rectiligne ouverte à une extrémité pour former l'entrée 109 du dispositif, puis une portion en spirale 111 formant le trajet hélicoïdal, suivie d'une portion rectiligne 112 selon l'axe Z, formant le trajet rectiligne aller, qui communique avec un deuxième conduit tubulaire 120 sensiblement rectiligne selon l'axe Z, formant le trajet rectiligne de retour et dont une partie s'étend au travers de ladite portion en spirale 111 du premier conduit tubulaire, pour déboucher par une ouverture 115 formant la sortie dudit dispositif. Les sections d'entrée et de sortie des premier et deuxième conduits tubulaires 110,120 sont avantageusement identiques, ce qui permet d'éviter notamment la formation de bulles d'air dans le milieu de culture qui circule dans lesdits conduits. Selon l'exemple représenté sur les figures, les conduits tubulaires sont réalisés en verre et forment une seule pièce. Selon l'exemple représenté plus particulièrement sur les figures 1 et 2, une partie 113 du deuxième conduit 120 et la portion rectiligne 112 du premier conduit 110 sont positionnés de manière concentrique de sorte qu'ils communiquent par le fond 112a de ladite portion rectiligne 112, ladite partie 113 comportant une ouverture 114 débouchant à ce niveau. Selon l'exemple représenté sur la figure 3, la portion rectiligne 112 du premier conduit tubulaire 110 est juxtaposée et parallèle à une partie 113 du deuxième conduit tubulaire 120, lesdits conduits 112,113 se raccordant par un fond coudé 112a. Selon le mode de réalisation représenté sur la figure 3, la portion rectiligne 112 du premier conduit tubulaire 110 et ladite partie 113 du deuxième conduit tubulaire 120 sont formées par un seul tube coupé longitudinalement par une paroi centrale en deux parties égales communiquant par le fond 112a. Sur les figures 1 à 3, la deuxième partie 102 de l'agencement de conduits tubulaires 110,120 présente une zone de prise de la mesure 103 par l'appareil d'analyse par résonance magnétique nucléaire, couvrant une partie du trajet rectiligne aller-retour parcouru par le milieu de culture. Ici, les conduits tubulaires en verre présentent un diamètre externe d'environ 4 mm et un diamètre interne d'environ 3 mm, l'encombrement extérieur des conduits tubulaires formant la deuxième partie 102 du dispositif est ici de l'ordre de 5 mm de façon à être spécialement adaptés pour un spectromètre à résonance magnétique nucléaire comportant une sonde de 5 mm et fonctionnant à une fréquence de 500 MHz. Sur la figure 3, la portion en spirale du premier conduit tubulaire 111 comporte 10 spires et selon les exemples des figures 1 et 2, elle comporte 8 spires. En outre, les moyens de circulation du milieu de culture dans l'agencement de conduits tubulaires 110,120 du dispositif 100, comprennent une pompe non représentée positionnée entre le réacteur et l'entrée dudit dispositif et présentant avantageusement un débit de l'ordre de lml/s. Le nombre de spires est défini de telle sorte que le trajet hélicoïdal du dispositif s'étend sur une longueur déterminée de façon que, au débit de la pompe choisi, le temps de parcours dudit trajet hélicoïdal par le milieu de culture soit compris entre environ 3 et 5 fois le temps de relaxation des noyaux cellulaires du milieu de culture. Plus particulièrement, la longueur selon l'axe Z de la portion en spirale est ici fixée à 40 mm et la longueur de la portion rectiligne aller-retour située dans le prolongement selon l'axe Z de la portion en spirale, est fixée à environ 85 mm. Le procédé de détection en continu et in vivo des métabolites des cellules cultivées in situ dans un réacteur à l'aide d'un tel dispositif 100 consiste à établir une circulation desdites cellules depuis le réacteur vers le dispositif 100 positionné dans l'appareil d'analyse spectroscopique par résonance magnétique nucléaire, de telle sorte qu'on magnétise durant le trajet en spirale les noyaux du milieu cellulaire en circulation, et qu'on excite certains noyaux et qu'on enregistre le spectre de résonance magnétique nucléaire de ces noyaux, puis on compare le spectre enregistré à des spectres obtenus pour des conditions différentes du milieu de culture dans le réacteur. Deux essais protocolaires ont été réalisés à l'aide du dispositif 100 précité, les conditions de réalisation de ces essais et les résultats sont explicitées ci-après. La présente invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés, mais l'homme du métier saura y apporter toute variante conforme à son esprit. EXEMPLES 1-Matériel et méthodes Les essais protocolaires sont réalisés selon le dispositif 100 précité. Les analyses sont effectuées avec un spectromètre Bruker 500, avec lequel la fréquence de résonance des protons est de 500 MHz. Le montage utilisé est celui présenté sur les figures 1 et 2. Le volume total du circuit est de 79 ml, le débit de la pompe de 0,5 ml/s. Le volume total de liquide dans le circuit est de 100 ml. La durée moyenne de parcours du circuit est donc de 200 secondes. Le tuyau d'arrivée dans le réacteur est placé audessus du liquide de manière à obtenir un goutte-àgoutte, et le tuyau de départ est placé au fond du réacteur, de telle façon que la solution s'homogénéise dans le réacteur et que la concentration en éthanol soit uniforme dans tout le circuit après quelques périodes de 200 secondes. Avant chaque essai protocolaire, l'optimisation de l'homogénéisation du champ magnétique dans la zone d'enregistrement des spectres (zone 103) est effectuée à l'aide d'une solution 10% D20 et 90% H20, sans circulation de liquide. Puis le circuit est vidé. 2-Essai protocolaire 1 Initialement, le circuit contient 100 ml d'une solution aqueuse d'éthanol 1 mM. A l'instant t=0, est introduit un petit volume d'une solution concentrée d'éthanol, de manière que la concentration finale, après homogénéisation dans tout le circuit, soit de 4 mM. Immédiatement débute l'acquisition en continu de spectres ID IH constitués de 8 acquisitions composées chacune d'une période de préparation d'une durée de 900 ms durant laquelle le signal intense du solvant est saturé, suivie d'une impulsion haute puissance correspondant à une excitation des spins de 90 , suivie d'une période d'acquisition d'une durée de 1370 ms. Chaque spectre est donc enregistré en 18 secondes. Le spectre H (figure 4) obtenu à t = 26'montre les deux signaux caractéristiques de l'éthanol (CH3 à 1, 19 ppm, S/B = 13 ; CH2 à 3, 67 ppm, S/B = 7). Ces résultats montrent que le montage permet la détection d'une variation de concentration de 1,0 mM d'une molécule caractérisée par un unique proton par l'enregistrement de spectres H de 1 minute. A t=27', l'essai est répété dans les mêmes conditions, excepté le volume de la solution concentrée d'éthanol introduit dans le réacteur, tel que la concentration finale, après homogénéisation, dans tout le circuit soit de 20 mM. La cinétique totale d'apparition du signal du CH3 est représentée figure 5. Il apparaît clairement sur la figure l'augmentation initiale rapide de la concentration d'éthanol au niveau de la sonde de mesure, puis après quelques oscillations sa stabilisation. 3-Essai protocolaire 2 L'expérience est répétée, avec initialement dans le circuit une solution 0,24 M d'éthanol. A l'instant t=0 est introduit un volume de solution concentrée d'éthanol, de manière que la concentration finale, après homogénéisation dans tout le circuit, soit de 1 M. Immédiatement débute l'acquisition en continu de spectres D C constituée de 64 acquisitions composées chacune d'une période de préparation d'une durée de 10 ms suivie d'une impulsion haute puissance correspondant à une excitation des spins 13C de 900, suivie d'une période d'acquisition d'une durée de 590 ms, au cours de laquelle les couplages scalaires C-H sont supprimés par saturation de tous les protons. Chaque spectre est donc enregistré en 38 secondes. Le spectre C (figure 6) obtenu à t = 30'montre les deux signaux caractéristiques de l'éthanol (CH3 à 16,7 ppm, S/B = 8, 7 CH2 à 57,4 ppm, S/B = 5,4). Ces résultats montrent que le montage permet la détection d'une variation de concentration de 180 mM d'une molécule non enrichie en 13C par l'enregistrement de spectres 13C de 1 minute. La cinétique totale d'apparition du signal du CH3 est représentée figure 7. REVENDICATIONS 1. Dispositif (100) pour l'analyse spectroscopique in vivo des métabolites d'un milieu de culture, par résonance magnétique nucléaire, caractérisé en ce qu'il comprend un agencement de conduits tubulaires (110,120) destiné à être positionné dans un appareil d'analyse par résonance magnétique nucléaire, cet agencement de conduits tubulaires présentant entre une entrée (109) et une sortie (115) aptes à être raccordées à un réacteur contenant le milieu de culture, une première partie (101) dans laquelle il est défini un trajet hélicoïdal du milieu de culture durant lequel les noyaux des cellules du milieu de culture sont magnétisés, et une deuxième partie (102) dans laquelle il est défini un trajet rectiligne suivant un sens et le sens opposé du milieu de culture au cours duquel s'effectue l'excitation de certains noyaux, et en ce qu'il est prévu des moyens pour établir depuis le réacteur, une circulation en continu du milieu de culture entre l'entrée et la sortie dudit agencement de conduits tubulaires. 2. Dispositif (100) selon la revendication 1, caractérisé en ce que les moyens de circulation du milieu de culture dans l'agencement de conduits tubulaires, comprennent une pompe positionnée entre le réacteur et l'entrée (109) dudit dispositif et présentant un débit de l'ordre de 1 ml/s. 3. Dispositif (100) selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le trajet hélicoïdal définit dans la première partie (101) de l'agencement de conduits tubulaires, s'étend sur une longueur déterminée de sorte que, au débit de la pompe choisi, le temps de parcours dudit trajet hélicoïdal par le milieu de culture soit compris entre environ 3 et 5 fois le temps de relaxation longitudinal Tl des noyaux cellulaires du milieu de culture. 4. Dispositif (100) selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la deuxième partie de l'agencement de conduits tubulaires présente une zone (103) de prise de la mesure par l'appareil d'analyse par résonance magnétique nucléaire, couvrant une partie du trajet rectiligne aller et retour parcouru par le milieu de culture. 5. Dispositif (100) selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est prévu des conduits souples en matière plastique pour le raccordement de l'entrée (109) et de la sortie (115) du dispositif avec l'intérieur du réacteur contenant le milieu de culture. 6. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend une pièce de protection (130) réalisée en matière plastique positionnée autour de la première partie (101) de l'agencement de conduits tubulaires, cette pièce de protection est conformée pour permettre le maintien du dispositif dans l'appareil d'analyse par résonance magnétique nucléaire. 7. Dispositif (100) selon la revendication 6, caractérisé en ce que la pièce de protection et de maintien (130) est réalisée en polyamide et de préférence en Plexiglas". 8. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un premier conduit tubulaire (110) qui présente une amorce (110a) sensiblement rectiligne ouverte à une extrémité pour former l'entrée (109) du dispositif, puis une portion en spirale (111) formant le trajet hélicoïdal, suivie d'une portion rectiligne formant le trajet rectiligne aller qui communique avec un deuxième conduit tubulaire sensiblement rectiligne formant le trajet rectiligne de retour et dont une partie s'étend au travers de ladite portion en spirale (111) du premier conduit tubulaire pour déboucher par une ouverture formant la sortie (115) dudit dispositif. 9. Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce que les sections d'entrée et de sortie des premier et deuxième conduits tubulaires sont identiques. 10. Dispositif selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que le deuxième conduit (120) et la portion rectiligne (113) du premier conduit (110) sont positionnés de manière concentrique. 11. Dispositif selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que la portion rectiligne (112) du premier conduit tubulaire (110) est juxtaposée et parallèle à une partie (113) du deuxième conduit tubulaire (120), lesdits conduits se raccordant par un fond coudé (112a). 12. Dispositif selon la revendication Il, caractérisé en ce que la portion rectiligne (112) du premier conduit tubulaire (110) et ladite partie (113) du deuxième conduit tubulaire (120) sont formées par un seul tube coupé longitudinalement par une paroi centrale en deux parties égales. 13. Dispositif selon l'une des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que la partie en spirale (111) comporte 10 spires. 14. Dispositif selon l'une des revendications 8 à 13, caractérisé en ce que les conduits tubulaires sont réalisés en verre. 15. Dispositif selon l'une des revendications 8 à 14, caractérisé en ce que les premier et deuxième conduits (110,120) forment une seule pièce. 16. Ensemble pour l'analyse spectroscopique in vivo des métabolites d'un milieu de culture, par résonance magnétique nucléaire, caractérisé en ce qu'il comprend un dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes et un réacteur contenant le milieu de culture à analyser. 17. Ensemble selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comporte un appareil d'analyse spectroscopique par résonance magnétique nucléaire spécialement adapté pour recevoir ledit dispositif d'analyse.