Brevet FR2819263A1 — publié le 20020712

PROCEDE DE MATURATION DES CELLULES DENDRITIQUES ET D'ACTIVATION DES MACROPHAGES AVEC LE RU 41740 DESCRIPTION La présente invention se situe dans le domaine de la thérapie cellulaire. Elle a pour objet un procédé capable de générer des cellules dendritiques matures et/ou des macrophages activés de mammifères à partir de monocytes, de précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques. Les cellules dendritiques jouent un rôle critique dans l'émergence de la réponse immunitaire antitumorale, anti-infectieuse et auto-immune. En effet, les cellules dendritiques sont les seules cellules capables d'induire une réponse primaire à partir des lymphocytes T. Elles ont donc un rôle clef dans l'initiation de la réponse immunitaire. Une telle fonction est à rapprocher de nombreuses propriétés morphologiques et des molécules de surface des cellules dendritiques. En effet, grâce à de larges expansions de leur membrane cytoplasmique, les cellules dendritiques ont une surface de contact avec leur environnement particulièrement importante. De plus, elles possèdent à leur surface de très nombreux antigènes d'histocompatibilité de lasse 1 et de classe Il qui permettent la présentation antigénique. Après sa prise en charge par la cellule dendritique, l'antigène subit un apprêtement (processing en anglais) avant d'être présenté au lymphocyte T. L'apprêtement (remaniement), qui nécessite un métabolisme cellulaire actif, comporte quatre étapes : la captation de l'antigène, sa dégradation enzymatique en petits fragments peptidiques dans un compartiment intracellulaire, l'association de ces fragments aux molécules de lasse 11 du CMH, et la migration des complexes peptides-molécules de classe Il à la surface de la cellule présentatrice de l'antigène (CPA) pour la présentation au récepteur des cellules T (RcT) du lymphocyte T auxiliaire (Th). La première étape (captation), qui est indépendante de la température, s'effectue par l'intermédiaire de récepteurs non spécifiques ou par d'autres mécanismes encore mal connus. Plus les molécules sont de taille importante, mieux elles sont captées. La deuxième étape, qui est dépendante de la température (elle est bloquée à 4 degrés), est l'internalisation de l'antigène dans les phagosomes qui, ensuite, fusionnent avec les lysosomes (organites intracytoplasmiques riches en protéases), donnant ainsi naissance aux endosomes à pH acide. La protéolyse de l'antigène en fragments peptidiques s'effectue, dans ces vésicules, sous l'action, notamment, des cathepsines B, puis D. Cette étape peut être bloquée par les ions ammonium, qui inhibent la liaison phagosome-lysosome, ou par la chloroquine, qui élève le pH des lysosomes. La troisième étape est un processus complexe encore mal connu dans ses détails, qui aboutit à l'association entre la molécule de classe Il du CMH, et certains fragments particuliers de l'antigène dégradé constitués généralement de neuf à vingt-cinq acides aminés. La quatrième étape implique la migration du complexe molécule de classe 11-peptide (dite forme C3) à la surface de la CPA. Le complexe ainsi formé peut alors interagir avec le RcT approprié à la surface du lymphocyte Th sous réserve que les molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH) du lymphocyte appartiennent au même haplotype que celles de la cellule présentatrice (restriction allogénique). Les cellules dendritiques sont par ailleurs très riches en molécules de costimulation de la réponse immunitaire, telles que les molécules CD80, CD86, CD40 qui activent respectivement les molécules CD28, CTLA-4 et CD40L des lymphocytes T en initiant la réponse immunitaire. Elles possèdent aussi de très nombreuses molécules de l'adhésion, comme la molécule CD54 ou la molécule CD11a/CD18, ce qui facilite la coopération entre les cellules dendritiques et les cellules T. Une autre caractéristique particulière des cellules dendritiques est de déployer des fonctions différentes en fonction de leur stade de différenciation. Ainsi, la capture de l'antigène et sa transformation sont les deux fonctions principales de la cellule dendritique immature, tandis que ses capacités à présenter l'antigène pour stimuler les cellules T augmentent au fur et à mesure que les cellules dendritiques migrent dans les tissus et les ganglions lymphatiques. Ce changement de fonctionnalité correspond à une maturation de la cellule dendritique. Ainsi, le passage de la cellule dendritique immature à la cellule dendritique mature représente une étape fondamentale dans l'initiation de la réponse immunitaire. Cette maturation peut être facilement suivie grâce à l'évolution des marqueurs de surface durant ce processus. Les marqueurs de surface caractéristiques des différents stades de maturation des cellules dendritiques sont résumés dans le tableau ci-après. Type cellulaire Marqueurs de surface zu Monocytes CD14++, DR+, CD86+, CD16+/-, CD54+, CD40+ Cellule dendritique immature CD14-, CD16-, CD80+/-, CD83-, CD86+, CD1a+, CD54+, DQ+, DR++ Cellule dendritique mature CD14-, CD83++, CD86++, CD80++, DR+++, DQ++, CD40++, CD54++, CD1a-. Tableau 1 L'isolement des cellules dendritiques du sang périphérique est très difficile puisque moins de 1 % des globules blancs appartiennent à cette catégorie. De la même façon, l'extraction à partir des tissus est impossible chez l'homme et fort complexe chez l'animal. C'est pourquoi une avance importante a été réalisée lorsque l'on a pu générer des cellules dendritiques à partir de précurseurs hématopoïétiques et des monocytes en présence de différentes cytokines. La production de cellules dendritiques à partir de monocytes peut se faire en présence de GM-CSF et d'IL-4 pour obtenir des cellules dendritiques immatures, qui matureront après contact avec du TNF-a ou avec d'autres agents tels que le CD40-ligand, le LPS ou des milieux conditionnés à partir de macrophages. Ces derniers agents sont des substances toxiques ou complexes. De même, l'activation des macrophages in vivo est complexe et difficilement contrôlable. C'est pourquoi l'activation ex vivo représente un moyen approprié pour des études expérimentales et des applications thérapeutiques. Les macrophages activés sont des cellules que l'on rencontre dans les tissus après une activation du processus inflammatoire par des inducteurs spécifiques ou non spécifiques. Ces cellules interviennent dans l'élimination des agents toxiques, pathogènes ou des cellules altérées ou cancéreuses. Le RU 41740, commercialisé sous la marque Biostim par les Laboratoires Cassenne (France), est un médicament composé d'extraits glycoprotéiques obtenus à partir d'une souche de Klebsiella pneumonie K201 (souche 01 K2 NCTC 5055). Il est obtenu après lyse des parois bactériennes, extraction organique, centrifugation et ultrafiltration. Il se compose de :-80 % de glycoprotéines - d'acides aminés, de lipides et d'acides nucléiques. La partie glycoprotéique est divisée en 3 fractions : P1, F1, F2. P1, d'origine capsulaire, représente environ 50 % du RU 41740, et a un poids moléculaire moyen de 95 kD, F1 est d'origine membranaire et représente environ 20 % du RU 41740, et a un poids moléculaire moyen de 350 kD F2 semble être une partie de P1. Le RU 4170 ne provoque pas d'effet pyrogène, comme en atteste la négativité du test au Limulus effectué avec ce composé. La présente invention décrit un nouveau procédé de maturation des cellules dendritiques en utilisant, comme agent inducteur de cette maturation, le RU 41740 ou un analogue de celui-ci tel que défini ci-après. Parmi les agents permettant la maturation des cellules dendritiques, le TNF-oc est celui dont l'activité a été le mieux caractérisée. Malheureusement, cette lymphokine est très toxique et peut déclencher des réponses extrêmement violentes in vivo, ce qui présente un obstacle majeur à son utilisation en thérapie cellulaire. Le LPS est un autre composé capable d'induire la maturation des cellules dendritiques. Il présente aussi une toxicité importante et induit un effet pyrogène puissant, ce qui est attesté par la positivité du test au Limulus effectué avec le LPS. Il produit en outre des résultats variables suivant le lot utilisé. Le LPS présente enfin l'inconvénient de se dégrader très rapidement. Quant au ligand du CD40 (CD40L), il oriente la différenciation des cellules dendritiques de façon variable selon la concentration et la période d'incubation, ce qui le rend difficilement utilisable en thérapie cellulaire. Comme cela est illustré dans les exemples expérimentaux ci-après, le RU 41740 permet d'induire la maturation des cellules dendritiques avec une efficacité comparable ou supérieure aux agents de référence cités ci-dessus. Il présente en outre plusieurs avantages importants par rapport à ces agents. En particulier, le RU 41740, commercialisé sous la marque Biostim, est utilisé depuis 1982 comme médicament pour stimuler le système immunitaire lors d'infections chroniques (bronchite chronique, otite, rhinite,...), à titre curatif ou préventif. Sa parfaite tolérance par l'organisme a été démontrée. De plus, le RU 41740 est un composé extrêmement stable, et l'inventeur a montré qu'il induisait la maturation des cellules dendritiques de façon très reproductible et dépendante de la dose utilisée. Dans une perspective de thérapie cellulaire nécessitant des cellules dendritiques matures, le RU 41740 est donc particulièrement intéressant, de par son innocuité et sa simplicité d'utilisation liée à sa stabilité et à la reproductibilité des résultats obtenus. L'utilisation de tout composé analogue du RU 41740 et présentant des propriétés comparables à celui-ci, dans des procédés tels que ceux décrits ci-dessous, entre bien évidemment dans le cadre de la présente invention. Dans la suite, on appellera analogue du RU 41740 un composé comportant 5 à 30 % de LPS et 60 à 90 % de glycoprotéines, et capable d'induire, lors de sa mise en contact de cellules dendritiques immatures, à des concentrations inférieures ou égales à 1 mg/ml, une augmentation significative de l'expression des molécules CD40, CD83, CD86 et HLA-DR et une diminution très marquée de l'expression des molécules CD14 et CD1a par lesdites cellules dendritiques. Dans la suite du texte, le terme RU 41740 désignera aussi bien le RU 41740 proprement dit, constituant le principe actif du Biostim, qu'un analogue de celui-ci. Un analogues du RU 41740 est défini ici comme un composé d'extraits glycoprotéiques obtenus à partir d'une souche de Klebsiella (par exemple, la souche 01 K2 NC TC 5055 de Klebsiella pneumonie), par les étapes suivantes : 'culture de la souche 'lyse des parois bactériennes 'extraction organique # centrifugation # ultrafiltration a séchage La structure chimique d'un analogue du RU 41740 est majoritairement composée de : # hydrate de carbone =70% 12 . protéines = 20% 6. Des lipides, nucléosides et acides aminés sont présents à l'état de traces. Le RU 41470 ou un analogue de celui-ci présentent un taux d'endotoxines bactériennes négatif (à 10 pg/ml). Le RU 41740 est actif dans tous les procédés utilisant les monocytes, des précurseurs des monocytes, ou les cellules souches hématopoïétiques chez l'homme et l'animal. De plus, le RU 41740 permet d'obtenir en même temps des macrophages activés à partir des mêmes cellules de départ. La maturation des cellules dendritiques par leur mise en présence de RU 41740 peut être attestée par leurs propriétés phénotypiques ou par leurs propriétés fonctionnelles. Ainsi, l'invention porte sur un procédé d'obtention de cellules dendritiques matures (Monocyte Dendritic Cells, ou MODC) ou de macrophages activés à partir de monocytes, de précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques, caractérisé en ce que lesdits monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec le RU 41740 ou un composé analogue de celui-ci, ce composé étant choisi de telle sorte que la mise en contact de cellules dendritiques immatures avec ledit composé permette la maturation fonctionnelle des cellules dendritiques, attestée par leur capacité à : - déclencher in vitro une réponse primaire contre un antigène infectieux ou tumoral mis en contact avec les cellules dendritiques préalablement et/ou au cours de leur culture avec les lymphocytes T ; - induire la prolifération de lymphocytes T en culture mixte autologue ou allogénique. Les exemples 6 à 9 sont une illustration de ce procédé. L'invention porte également sur un procédé d'obtention de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés à partir de monocytes, de précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques, caractérisé en ce que lesdits monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec le RU 41740 ou un composé analogue de celui-ci, ce composé étant choisi de telle sorte que la mise en contact de cellules dendritiques immatures avec ledit composé permette la maturation phénotypique des cellules dendritiques, attestée par une augmentation significative de l'expression des molécules CD40, CD83, CD86, et HLA-DR et une diminution très marquée de l'expression des molécules CD14 et CD1a par lesdites cellules dendritiques. Les exemples 1 à 3 sont une illustration de ce procédé. Par ailleurs, les propriétés physico-chimiques naturelles du RU 41740 permettent d'y adsorber des molécules, en particulier des molécules antigéniques. Ceci permet donc de réaliser de façon simple un couplage non covalent entre le RU41740 et des molécules antigéniques. Il sera alors possible d'obtenir des cellules dendritiques matures spécifiques des antigènes adsorbés au RU 41740 ou à un analogue de celui-ci, en incubant des cellules dendritiques immatures avec un produit de couplage entre le RU 41740 ou son analogue et les molécules antigéniques choisies. Le couplage entre le RU 41740 ou un analogue de celui-ci et les molécules antigéniques peut être réalisé par n'importe quel procédé connu de l'homme du métier. De façon préférée, les antigènes seront adsorbés à la surface du RU 41740 ou de son analogue, mais d'autres moyens de couplage (liaison covalente, affinité, etc...) peuvent aussi être envisagés. Le procédé de couplage le plus simple, par adsorption à la surface du RU41740, présente en outre l'avantage de permettre un couplage avec des molécules antigéniques essentiellement non protéiques. Le produit de couplage entre le RU 41470 ou un analogue de celui-ci et des molécules antigéniques, pour induire la maturation de cellules dendritiques ou l'activation de macrophages, fait partie de la présente invention. Dans une réalisation préférée des produits de couplage de l'invention, le couplage est assuré par une liaison non covalente. Un produit de couplage particulier est celui du RU41740 ou d'un analogue de celui-ci, avec une molécule antigénique de nature essentiellement non protéique. L'invention porte aussi sur un procédé d'obtention de cellules dendritiques matures présentant des antigènes choisis, à partir de monocytes, précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques, caractérisé en ce que lesdits monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec le RU 41740 ou un analogue de celui-ci, couplé à des molécules comportant lesdits antigènes. Dans une réalisation préférée de l'invention, les procédés décrits ci-dessus permettent d'obtenir des cellules dendritiques matures ou des macrophages activés par la mise en contact de monocytes, précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques avec le RU 41740, couplé ou non à des molécules antigéniques. Dans une mise en oeuvre préférée des procédés de l'invention, le RU 41740 est ajouté au milieu de culture des cellules à une concentration finale comprise entre 1 ng/ml et 1 mg/ml, préférentiellement entre 100 ng/ml et 10 ug/mi. Dans les procédés de l'invention, la durée d'incubation des monocytes, précurseurs des monocytes, ou des cellules souches hématopoïétiques en présence de RU 41740 ou d'un composé analogue de celui-ci est préférentiellement de 1 à 15 jours. La thérapie cellulaire est une approche récente consistant à administrer à un patient des cellules modifiées ex vivo de façon à leur conférer des propriétés susceptibles d'avoir un effet bénéfique pour le patient. Les propriétés naturelles des cellules dendritiques en font un excellent candidat pour des approches de thérapie cellulaire dans plusieurs domaines de pathologie, de par leur capacité à induire une réponse immunitaire primaire à partir des lymphocytes T. En particulier, l'immunothérapie anti-tumorale par administration de cellules dendritiques présentant un ou plusieurs antigènes tumoraux, est une approche de thérapie cellulaire particulièrement prometteuse. Le principe de cette approche est de présenter au système immunitaire des antigènes tumoraux, de façon particulièrement efficace, afin de stimuler une réponse contre les cellules présentant ces antigènes. Cette approche est illustrée dans l'exemple 8 ci-après. L'exemple 9 présenté ci-après démontre que l'administration de cellules dendritiques présentant des antigènes de micro-organismes permet d'obtenir une immunisation primaire vis-à-vis de ces micro-organismes, et peut donc être utilisée dans la lutte anti-infectieuse. Une autre approche de thérapie cellulaire utilisant des cellules dendritiques consiste à orienter les cellules dendritiques vers une réaction de tolérance de l'hôte vis-à-vis d'antigènes particuliers. Ceci peut être utile par exemple pour induire une tolérance vis-à-vis d'alloantigènes lors d'une greffe allogénique, d'autoantigènes lors d'une maladie autoimmune, ou d'allergènes lors d'une maladie allergique. En effet, les cellules dendritiques, dans certaines conditions de culture, peuvent provoquer une réaction d'anergie, c'est-à-dire l'inactivation fonctionnelle des lymphocytes T au lieu de leur activation. La culture des cellules dendritiques en présence d'immunosuppresseurs comme la cyclosporin ou l'histamine, entraîne une modification des antigènes de membrane, qui va induire une réponse de tolérance et non une réponse cytotoxique. Cette constatation pourrait avoir des implications importantes dans le cadre des greffes d'organes d'une part, et des traitements des maladies auto-immunes d'autre part, comme la polyarthrite rhumatoïde, la myasthénie, le diabète insulinodépendant, la sclérose en plaques, l'eczéma, le psoriasis, etc. et les maladies allergiques. L'exemple 10 illustre cette approche en montrant l'influence de la cyclosporin A en présence de RU 41740 sur la maturation des cellules dendritiques. Quel que soit le type de pathologie concerné, la thérapie cellulaire peut être réalisée en administrant au patient humain ou animal des cellules autologues, homologues ou xénologues après leur modification ex vivo. La présente invention porte ainsi sur un procédé tel que ceux décrits ci-dessus, dans lequel les cellules dendritiques sont traitées ex vivo et administrées après maturation à un patient, humain ou animal, de façon autologue, homologue ou xénologue, pour la prophylaxie, l'atténuation ou le traitement de maladies cancéreuses, infectieuses, allergiques, ou auto-immunes. L'utilisation du RU 41740 ou d'un analogue de celui-ci, pour la préparation d'une composition comprenant des cellules dendritiques matures et/ou des macrophages activés et/ou des cellules de Langerhans de la peau, entre aussi dans le cadre de la présente invention. Les inventeurs ont montré que le RU 41740 permettait d'induire in vitro la maturation des cellules de Langerhans (exemple 4). Cette propriété pourrait donc être avantageusement utilisée pour favoriser une réponse immunitaire au niveau de la peau ou des muqueuses, par administration topique d'une composition comportant du RU 41740. Des exemples d'indication d'une telle composition sont notamment les gingivites et les parodontites. L'utilisation du RU 41740 ou d'un analogue de celui-ci, pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour une administration topique ou systématique, fait donc également partie de cette invention. Dans un autre aspect de l'invention, le RU 41740 ou un analogue de celui-ci est couplé à un ou plusieurs antigènes d'intérêts, puis administré directement in vivo pour induire la production par l'organisme de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés présentant lesdits antigènes. Dans cette réalisation de l'invention, le RU 41740 ou son analogue sert en fait de vecteur pour les antigènes d'intérêt, et permet la présentation de ces antigènes au système immunitaire d'une façon telle qu'il induit la production de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés présentant lesdits antigènes. L'invention porte donc sur un procédé tel que ceux décrits ci-dessus, dans lequel les cellules dendritiques matures ou les macrophages activés sont produits directement in vivo. L'utilisation d'un produit de couplage entre le RU 41470 ou un analogue de celuici et un ou plusieurs antigènes, pour la préparation d'une composition apte à induire la production de cellules dendritiques mature ou de macrophages activés présentant lesdits antigènes, entre aussi dans le cadre de cette invention. Les cellules dendritiques matures obtenues par des procédés tels que ceux décrits ci-dessus peuvent être utilisées dans le traitement de divers types de pathologies, notamment en immunothérapie anti-tumorale, dans la lutte antiinfectieuse, ou pour augmenter la tolérance de l'organisme vis-à-vis de certains antigènes particuliers. Dans une mise en oeuvre préférée de l'invention, les cellules dendritiques obtenues par un procédé tel que décrit ci-dessus sont utilisées dans la fabrication d'une composition apte à favoriser une réponse immunitaire antitumorale. De même, l'utilisation de cellules dendritiques obtenues par un procédé de la présente invention, dans la fabrication d'une composition apte à favoriser une réponse immunitaire contre une infection par un micro-organisme, est partie intégrante de l'invention. Dans une autre réalisation préférée de l'invention, les cellules dendritiques obtenues par un procédé tel que décrit ci-dessus sont incubées en présence d'un immunosuppresseur, et utilisées dans la fabrication d'une composition apte à modifier la réponse immunitaire dans le sens d'une tolérance. Les cellules dendritiques matures produites par les procédés de l'invention peuvent aussi être utilisées pour identifier des antigènes mineurs d'histocompatibilité. Cette technique consiste à récupérer les monocytes en les faisant différencier en cellules dendritiques matures, puis en les utilisant comme des cellules stimulantes dans une réaction de culture mixte Iymphocytaire entre individus de la même famille HLA compatible. Ce système permet de détecter des disparités concernant les antigènes mineurs d'histocompatibilité et de pouvoir approfondir la compatibilité ou les incompatibilités entre personnes d'une même famille, ce qui présente des avantages certains dans le domaine des greffes de tissus et d'organes en intra familial ou même extra familial. L'utilisation de cellules dendritiques obtenues par un procédé de l'invention, pour la détection et/ou la caractérisation des antigènes d'histocompatibilité, fait aussi partie de la présente invention. Les exemples et figures présentés ci-dessous à titre non limitatif permettront de mettre en évidence certains avantages et caractéristiques de la présente invention. Legende des figures La figure 1 représente l'évolution des marqueurs cellulaires au cours de la différenciation des monocytes en cellules dendritiques à JO (courbes en pointillés = marqueurs monocytaires avant traitement), J6 (courbes en traits fins = cellules dendritiques immatures), et J8 (courbes en traits gras = cellules dendritiques matures), après ajout du RU 41740 à 25 ug/mi à partir de J6. La figure 2 illustre la génération de lignées T cytotoxiques spécifiques du peptide de la thyrocalcitonine. En abscisse est indiqué le ratio effecteur/cible utilisé, tandis qu'en ordonnée est indiqué le pourcentage de lyse des cellules cibles. La figure 3 démontre la présentation de la toxine tétanique par les cellules dendritiques dérivées de monocytes humains cultivés en présence de GM-CSF, IL-4 et RU 41740. L'ordonnée indique l'incorporation de thymidine tritiée, mesurée en coups par minutes (cpm) La figure 4 illustre l'influence de la cyclosporin A (CsA) sur la maturation des cellules dendritiques dérivées de monocytes cultivés en présence de GM-CSF, d'IL-4 et de RU 41740. Les courbes, obtenues en cytométrie de flux, montrent l'expression du CD83 en absence de CsA (4A) et en présence de CsA à 5 ug/ml (4B). Les figures 4C et 4D montrent les mêmes courbes pour un autre marqueur des cellules dendritiques, l'antigène DC Lamp. Les courbes en pointillé ont été obtenues avec un anticorps primaire anti-KLH, non pertinent pour les cellules dendritiques. La figure 5 montre l'orientation de la réponse immune vers une réponse immune de type Th2 par des cellules dendritiques dérivées de monocytes et traitées par la cyclosporin A (CsA). L'ordonnée représente respectivement la sécrétion d'IL-12 (figure 5A) et le rapport de sécrétion de cytokines IFN-y/IL-10 (Th1/Th2) (Figure 5B) par des cellules dendritiques dérivées de monocytes cultivées en présence de GM-CSF, IL-4 et RU 41740, et traitées par la cylosporine A à 5 ug/ml (colonne noires) ou non (colonnes blanches). Trois expériences sont représentées pour chaque condition. Les résultats sont présentés en pourcentage par rapport aux cellules monocytaires~non traitées par la cyclosporin, dont les mesures ont été ramenées à 100. L'ensemble des techniques de culture cellulaire, de marquage de cellules, de phénotypage par fluorométrie, etc.... ainsi que les réactifs (anticorps, toxine tétanique,...) utilisés dans les expériences décrites dans les exemples suivants, ont été détaillés dans un article de Karine Duperrier et al., Journal of Immunological Methods 238 (2000), p. 119-131. Exemple 1 : Procédé de production des cellules dendritiques à partir des monocytes humains avec le RU 41740 Le sang périphérique est prélevé chez le sujet concerné. Ce sang est ensuite centrifugé 20 minutes à 200 g de façon à diminuer la contamination des cellules du sang périphérique par les plaquettes. La partie supérieure contenant la plupart des plaquettes et le plasma est éliminée soigneusement avant de purifier les cellules mononuclées en les centrifugeant sur un gradient de séparation de Ficoll dont la densité est de 1,077. La couche de cellules mononuclées est récupérée puis lavée deux fois dans un tampon PBS et déposée sur un gradient contenant 4 densités discontinues de Percoll pour isoler les monocytes. Ce gradient est constitué par des dilutions d'une solution isotonique de percoll à raison de 75 % (6,5 ml), 50.5 % (15 ml), 40 % (3,5 ml) et 30 % (3 ml) dans un milieu de Dulbecco sans magnésium ni calcium et contenant 5 % de sérum humain. 75 à 100 million de cellules sont ainsi déposées sur chaque tube et centrifugées à 1000 g pendant 25 minutes à 4 cm. Les cellules de faible densité, principalement les monocytes, sont récoltées à l'interface entre la dilution 40 % et 50.5 %, et lavées deux fois dans du PBS. Elles sont ensuite resuspendues dans un milieu de culture, puis déposées dans des plaques à culture contenant 6 puits à une densité de 5 x 106 cellules par puits dans un volume final de 3 ml et laissées adhérer pendant 1 heure à 37 C. On peut substituer cette étape d'adhérence par une purification complémentaire des monocytes en utilisant un système de purification négatif utilisant un mélange d'anticorps monoclonaux associant un anti-CD3, CD7, CD19, CD45A, CD56 et anti-lgG à l'aide d'un système de microbilles de type Macs (Miltenyi Biotec). Cette purification complémentaire permet d'obtenir des concentrations de monocytes ayant une pureté supérieure à 90 %. Les cellules sont ensuite mises en culture dans des puits de culture à 37 C sous 5 % de CO2. Le milieu qui comporte du RPMI, contient 200 UI/ml de GM-CSF humain recombinant, 500 UI/mi de IL-4 humaine recombinante dans un volume final de 6 ml. Au jour 3 et au jour 5, les cultures sont renouvelées en éliminant 3 ml et en ajoutant 3 ml de milieu frais avec les cytokines. Au 6ème jour, les cellules sont transférées dans des pots en Teflon et cultivées à une densité de 5 x 105 cellules par pots sous 3 ml en présence de RU 41740 à différentes concentrations ou de TNF-a humain recombinant à raison de 200 UI/ml pendant 2 jours. Les cellules sont récoltées au 8ème jour, lavées et cultivées en l'absence de stimulation pendant 3 jours supplémentaires. Au terme de la culture, la qualité de la maturation est évaluée par l'expression des molécules CD80,83, 86,14, 1a, HLA-DR à la surface des cellules. Les marquages révèlent que plus de 80 % des monocytes viables ont maturé en cellules dendritiques caractérisées par le phénotype suivant : CD83+, CD86++, CD80++, HLA-DR+++, CD1a-, CD14-, CD40+++, CD54++, ce qui les place dans le groupe des cellules dendritiques tissulaires très différenciées. La figure n 1 montre en effet que les molécules HLA-DR, HLA-DQ, CD40, CD54, CD80, et CD86 sont présentes sur la majorité des cellules à J8, après ajout du RU 41740 à 25 ug/mL alors que la molécule CD14 n'est quasiment plus exprimée. Afin d'étudier l'action du RU 41740 sur la maturation des cellules dendritiques (DC), différentes concentrations de la molécule ont été testées et comparées à l'action du TNF. Les 3 expériences suivantes (a, b, c) ont été réalisées à partir de monocytes d'un même donneur. a) Les concentrations de RU 41740 testées ici sont 0. tug/ml, 1ug/ml, et 10ug/ml. Le tableau 2 présente les résultats obtenus, en ce qui concerne le pourcentage de cellules marquées et l'intensité moyenne de fluorescence (IFM). J0 J6 J8 Cellules TNF-alpha Monocytes dendritiques 0,1 g/ml 1 g/ml 10 g/ml 200 Ul/ml indifférenciées % % IFM HLA-DR 1225 CD 40 1603 CD54 295 CD86 326 CD83 173 HLA-DQ 157 CD 129 CD 14 nd Tableau 2 : Pourcentage (%) de cellules marquées et intensité moyenne de fluorescence (IFM) du marqueur considéré. Ces résultats sont exprimés avec une marge d'erreur de +/-2, 5 %. Après 8 jours de culture, l'expression de la molécule CD14 a disparu (pourcentage inférieur à 1,5 %), quelles que soient les conditions de culture. L'intensité moyenne de fluorescence (IFM) des marquages des molécules HLADR, CD40, CD54 et CD86 apparaît plus faible en présence des doses de RU 41740 utilisées qu'en présence du TNF-a. En revanche, les molécules CD83 et HLA-DQ sont légèrement plus exprimées en présence d'une concentration de RU 41740 de 10 ug/mt qu'avec le TNF-a. De plus, l'IFM de la molécule CD80 apparaît toujours supérieure en présence de RU 41740. D'après ces résultats, on voit que le RU 41740 induit la maturation des cellules dendritiques, même à de faibles concentrations. L'IFM des différents marqueurs apparaît cependant augmentée pour les plus fortes concentrations de RU 41740 testées, avoisinant les résultats obtenus en présence de TNF-a. L'action du RU 41740 sur les cellules dendritiques à de plus fortes concentrations a donc été investiguée dans une deuxième série d'expériences. b) Les concentrations de RU 41740 testées pour cela sont 5ug/mi, 10ug/ml, et 50ug/ml. Les résultats sont présentés dans le tableau n 3. L'IFM des différentes molécules d'adhésion, de costimulation, molécules HLA de classe Il apparaît augmentée de façon dépendante de la concentration de RU 41740 ajoutée au milieu de culture. La molécule CD40 présente toujours une IFM inférieure en présence de RU 41740 par rapport à la concentration obtenue en présence de TNF-alpha. Le CD83, qui est le marqueur spécifique de la maturation, a un pourcentage et une intensité de fluorescence qui augmentent également en fonction de la quantité de RU 41740. La molécule HLA-DQ présente un maximum d'expression avec 10 ug/mt de RU 41740. JO J6 J8 Monocytes Cellules RU 41740 RU 41740 RU 41740 TNF-alpha dendritiques 5pg/ml 10 (jg/ml 50) jg/ml 200 Ul/ml indifférenciées % IFM % IFM % IFM % IFM % IFM % IFM HLA-DR 99,2 275 98,3 552 98,9 1207 99,1 nd 99,3 nd 99,1 946 CD 40 97,8 128 97,5 464 99,8 1417 99,4 1441 99,8 1507 99,6 1728 CD54 255 CD86 273 CD83 0,2 325 5,5 119 67,9 132 74,6 147 84,8 159 89,5 196 HLA-DQ 24,2 48 63,2 61 68, 5 189 85,9 191 80,3 143 84, 2 183 CD 80 0,1 46 3,1 112 63 86, 7 64,6 101 76,1 95, 8 70,5 93, 5 CD 14 96,2 5395 1,9 199 0,47 nc 1,1 n 0,66 nd 0,61 nd CD 1a nd Tableau n03 : Pourcentage (%) de cellules marquées et intensité moyenne de fluorescence (IFM) de ce marqueur (nd = non déterminable). Ces résultats comportent une marge d'erreur de +/-2,5 %. Avec une concentration plus importante (50 pg/ml) de RU 41740, par rapport à l'expérience du tableau 2, ! FM des molécules CD40 et CD54 a augmenté, alors que d'autres IFM ont diminué (molécules CD86 et HLA-DQ). Quelques marqueurs, comme le CD80 et CD54, sont exprimés avec la même intensité après une maturation avec 50 pg/ml de RU 41740 ou avec le TNF-a. Des concentrations de RU 41740 encadrant 50 ug/ml ont alors été testées, dans une troisième série d'expériences. c) Les concentrations de RU 41740 testées sont 25 pg/ml, 50 ug/ml, et 100 ug/mf. Les résultats sont présentés dans le tableau no4. JO J6 J8 Monocytes Cellules RU 41740 RU 41740 RU 41740 TNF-alpha dendritiques 25 g/ml 50 g/ml 100 g/ml 200 Ul/ml indifférenciées % IFM % IFM % IFM % IFM % IFM % IFM HLA-DR 99, 2 275 98, 3 552 98,5 630 97, 5 823 99,4 682 99, 4 694 CD 40 97, 8 128 97,5 464 99, 7 1592 99, 1 1958 99, 8 2088 99, 3 1480 CD54 98,6 41 95,6 85 98, 5 280 97, 2 321 98,9 361 98, 2 249 CD86 96, 5 52 69, 9 77 99, 3 284 98, 3 291 99, 6 295 99, 5 284 CD83 0, 2 325 5,5 119 86, 6 192 91, 2 227 92, 8 213 89 166 HLA-DQ 24,2 48 63,2 61 79 109 84, 8 123 78,8 118 nd nd CD 80 0, 1 46 3,1 112 74 128 82,4 165 90,8 196 nd nd CD 14 96,2 5395 1, 9 199 1,03 nd 4,07 nd 1,75 nd 3,27 nd Tableau n04 : Pourcentage (%) de cellules marquées et intensité moyenne de fluorescence (IFM) de ce marqueur (nd = non déterminable). Ces résultats comportent une marge d'erreur de +/-2,5 %. Les molécules CD40, CD54, CD86 et HLA-DR sont présentes sur plus de 97 % des cellules avec les trois concentrations. RU 41740. Leurs IFM sont comparables à celles obtenues avec du TNF-a, pour une concentration de 25 ug/m ! de RU 41740. Cependant, dans cette expérience, elles continuent d'augmenter avec des concentrations supérieures de RU 41740. Le CD 83 est présent sur un pourcentage très élevé de cellules à 100 ug/ml et à 50 ug/m !, supérieur aux résultats obtenus avec du TNF-a. Son IFM apparaît plus importante avec 50 pg/mI. A 100 pg/ml de RU 41740, les intensités de fluorescence des molécules HLA- classe II ont tendance à diminuer, ce qui peut suggérer que cette concentration est une concentration limite de RU 41740. L'ensemble des expériences suggère que la dose optimale de RU 41740 se situe entre 10 et 50 pg/ml. Exemple 2 : Procédé de production des cellules dendritiques à partir des cellules souches CD34+ hématopoïétiques humaines avec le RU 41740 . Conditions expérimentales : Purification : Après ficoll, les CD34+ représentaient 4.2 % des cellules mono nucléées (CMN). Après purification par sélection positive avec le procédé MAC System (Miltenyi Biotec) avec des billes recouvertes d'un anticorps anti CD34,90 % des cellules sont CD34+. Mise en culture : milieu de culture : RPMI contenant 10 % de SVF, 2 % de pénicilline/streptomycine, 1 % de glutamin, et 1 % de bicarbonate de sodium. Culture dans des puits de 2 ml avec 5. 105 cellules par puits. - cytokines présentes dans le milieu de culture : de J0 à J5 : SCF à 25 ng/ml, GM-CSF à 100 ng/ml et soit du TNF-a à 2.5 ng/ml, soit du RU 41740 à 6. 25ng/ml, de J5 à J14 : GM-CSF à 100 ng/ml. Dédoublement des cultures :-les cellules sont homogénéisées dans le puits, puis 1 ml est prélevé et déposé dans un nouveau puits. 1 ml de milieu de culture est ensuite ajouté dans le nouveau puits et dans l'ancien, ainsi que du GM-CSF en fonction du milieu ajouté. Marqueurs : CD34-CD45-CD14-HLA-DR-CD40-CD54-CD83-CD86- CD1a. Un anticorps primaire anti-KLH marqué à la fluorescence, a été utilisé comme contrôle pour soustraire la fluorescence non spécifique des signaux obtenus. e Résultats : J8 J12 J14 TNF-&alpha; 41740 CD14 52,5 CD34 0,7 17 CD45 96 CD83 1 CD86 13 11 7,4 10,8 2,2 4,7 CD1a 8,7 17 8,4 17,5 10,3 28,9 CD40 59,4 CD54 57,9 HLA DR 88 69,54 HLA DQ 54,1 52,3 CD80 5,3 16 Tableau n"5 : pourcentage de cellules exprimant un marqueur cellulaire à différents temps de culture. Le CD1a est plus exprimé avec le RU 41740 (17.5% de cellules à J12) qu'avec le TNF-a, à l'inverse du CD14, qui est plus exprimé avec le TNF-a à la surface cellulaire. Les niveaux d'expression en présence de RU 41740 du CD40, CD54 ou HLA-DR sont quasiment identiques aux niveaux d'expressions en présence de TNF-a. Le CD83 n'est pas exprimé quelles que soient les conditions. Exemple 3 : Procédé de production des cellules dendritiques à partir des cellules CD34+ du sang de cordon humain avec le RU 41740 Les conditions expérimentales sont similaires à l'exemple 2, hormis le fait que les cellules sont issues de sang de cordon : Purification : Après ficoll, les cellules CD34+ représentent 0.83 % des cellules mononucléées (CMN). Après purification par sélection positive, on obtient 18. 1 % de CD34+. 2. 106 cellules ont été obtenues. Dédoublement : à J6, J7, J8, J10 et J12 e Résultats : Les résultats sont présentés dans le tableau nu 6. J7 J9 J10 J12 J13 J14 TNF-a RU 41740 TNF-a RU 41740 TNF-a RU 41740 TNF-a RU 41740 TNF-a RU 41740 TNF-a RU 41740 (200 Ul/ml) (10 g/ml) CD14 32 20, 39 59,6 43,52 60 50,05 66,77 59, 23 57,73 52,28 46,77 30,88 CD34 19, 79 19,92 2,53 2, 94 2,26 2,08 0,69 1,25 0,45 0,61 0,38 0,57 CD45 99,84 97,57 99,96 99,76 99,97 99, 86 99,85 99,92 99,69 99,82 99,93 99,91 CD16 2,24 3,68 2,16 2,78 2,11 4,89 CD83 1,09 0,39 4,24 4, 9 2,46 1, 19 0,71 1,35 3,19 3,41 1,22 0,83 CD86 11,61 11,97 22,23 13,69 9, 23 7, 48 13,94 11, 91 12,78 17, 1 19,33 10, 56 CD1a 4,41 13,95 23,75 20,32 20,63 22,68 27,9 20,14 36,13 23,67 34,2 16,63 CD40 75,91 55,23 63,35 56, 02 64,56 41, N3 # cm CD54 74, 66 65,62 61,7 58,57 64,4 41, IN m HLA DR 81, 34 73,8 73,04 63,28 57, 84 37,69 Tableau n 6 POURCENTAGE DE CELLULE MARQUEES cellules CD34+ de sang de cordon mises en culture jusqu'à J6 avec du GM-CSF, SCF et du RU 41740 (10 pg/ml) ou du TNF-a (200 Ul/ml), puis de J6 à J14 avec du GM-CSF Dans les deux protocoles de culture, l'expression des molécules de surface évolue avec les mêmes tendances : - augmentation du CD 14 jusqu'à J 12 puis diminution - diminution puis disparition de la molécule CD34 à J12 - très faible expression du CD83 et CD16 qui reste stable. Le CD1a est exprimé précocement à J7 sur les cellules avec le RU 41740 puis se stabilise autour de 23 % à J14, ce qui révèle une cinétique plus rapide avec le RU 41740 qu'avec le TNF-a. Après J12, les molécules CD40, CD54 et HLA-DR sont moins exprimées en présence de RU 41740 qu'en présence de TNF-a. Exemple 4 : Procédé de différenciation des cellules de Langerhans. Les cellules souches sont obtenues après un passage à travers un gradient de ficoll du sang de cordon. Les cellules mononuclées CD34+ sont purifiées par sélection positive avec un anticorps monoclonal anti CD34 (Immu 133. 3, Immunotech Marseille, France). Après purification, les cellules sont à plus de 90% CD34+. Ces cellules CD 34+ sont ensuite cultivées en présence de GM-CSF (100 ng/ml), et de TNF-a (2. 5ng/ml) ou de RU 41740 (10 ug/m)) durant 12 jours dans un milieu RPMI-SVF 10 %-pénicilline streptomycine 2 %, glutamin 1 %-bicarbonate de sodium 1 % et 10 mM d'HEPES. Au terme de la culture à J12, les cellules sont marquées avec les anticorps anti CD1a, CD14, Lag, E-Cadherin, DR et DQ de façon à identifier les cellules de Langerhans qui sont Lag+, CD1a+, CD14-, DR+ et DQ+. Les résultats, présentés dans le tableau no 7, montrent une meilleure efficacité du RU 41740 par rapport au TNF-a pour la différenciation des cellules de Langerhans. TNF-a RU 41740 CD1a+ DR+ 8% 17% Lag+DR+ 5, 2% 8, 6% Tableaun 7 Exemple 5 : Procédé de production des cellules dendritiques matures à partir des cellules mononuclées de chien avec le RU 41740 Un élutriateur est un appareil qui permet de soumettre des cellules à deux forces opposées, l'une centrifuge et l'autre centripète, en milieu liquide. Ceci permet de séparer les cellules suivant leur taille et leur densité, tout en les maintenant dans leur milieu physiologique. Ce procédé est particulièrement avantageux pour séparer les cellules de chien (monocytes/lympocytes) qui forment des agrégats dans des gradients de type ficoll. MILIEU D'ELUTRIATION : PBS 1X-SVF 2%-EDTA 0. 01% PREPARATION DES CELLULES MONONUCLEES : La poche de sang est prélevée sur CPD (citrate phosphate dextrose), le sang est dilué avec du chlorure de sodium, centrifugé à 800 tr/min pendant 15 min sans frein pour éliminer un maximum de plaquettes. On réalise un ficoll à 1600 tr/min pendant 25 min sans frein. Les CMN sont récupérées, et lavées deux fois au PBS (la première pour déplaquetter). La concentration cellulaire est de 5. 10 cettutes/mt dans du PBS ou dans le milieu d'élutriation. PROTOCOLE D'OBTENTION DES MONOCYTES : Débit : 25 ml/min (réglage à la pompe selon la droite de calibration) Faire varier la vitesse de centrifugation : chargement des cellules à 3200 tr/min à 300 ml 3000 tr/min à 250 ml 2700 tr/min à 200 ml 2500 tr/min à 200 ml 2300 tr/min à 200 ml 2100 tr/min à 200 ml Rotor off à 200 ml RESULTATS La fraction obtenue à 2700 tr/min contient des monocytes avec une pureté supérieure à 80 %. CULTURE Les monocytes de chien sont cultivés de la même façon que les monocytes humains et avec les mêmes facteurs de différenciation humains : GM-CSF, TNF ou RU 41740. En revanche, L4 est spécifique de l'espèce canine. Les cellules dendritiques ainsi obtenues possèdent la même morphologie avec des dendrites, mais les marqueurs de surface ne sont pas comparables à ceux de l'homme bien qu'elles soient CD14-, DR+ et DQ+, car nous ne disposons pas des anticorps spécifiques dans cette espèce. Le RU 41740 a les mêmes effets que le TNFa. Exemple 6 : Utilisation des cellules dendritiques matures dans l'émergence d'une réponse antitumorale. La thyrocalcitonine est un antigène tumoral relativement peu immunogène s'exprimant fortement dans les cancers médullaires de la thyroïde. Dans le système utilisé, les inventeurs ont pu faire produire des clones Iymphocytaires T dirigés contre la thyrocalcitonine. Il s'agit de clones cytotoxiques susceptibles d'avoir une activité antitumorale dans les cancers à thyrocalcitonine. La figure 2 illustre la génération de lignées T cytotoxiques spécifiques du peptide de la thyrocalcitonine. Des cellules dendritiques dérivées de monocytes après culture en présence de GM-CSF, IL-4 et RU 41740, sont incubées avec le peptide de la thyrocalcitonine, puis mises en culture en présence de ymphocytes T autologues afin d'induire l'activation de lymphocytes T spécifiques du peptide. Après plusieurs stimulations des lymphocytes T à l'aide de cellules dendritiques puis de cellules EBV incubées avec le peptide, des lignées de cellules T cytotoxiques (H10 et B7) capables de Iyser spécifiquement des cellules EBV cibles incubées avec le peptide de la thyrocalcitonine, ont pu être générées. Exemple 7 : Utilisation des DC matures dans les activités anti-infectieuses En utilisant l'anatoxine tétanique comme antigène présenté par les MODC (Monocyte Dentritic Cells), il a été possible de générer des lignées cytotoxiques anti-anatoxines tétaniques, ce qui démontre à l'évidence que ce système permet d'avoir une immunisation primaire vis-à-vis d'antigènes de type infectieux. La figure 3 représente une réponse secondaire des lignées anti-toxine tétanique par les cellules dendritiques dérivées de monocytes humains cultivés en présence de GM-CSF, IL-4 et RU 41740. Exemple 8 : Utilisation des cellules dendritiques matures dans l'induction d'une réponse de tolérance. Les cellules dendritiques, dans certaines conditions de culture, peuvent provoquer une réaction d'anergie. La culture de ces cellules en présence d'immunosuppresseurs comme la cyclosporin ou l'histamine, entraîne une modification des antigènes de membrane qui va induire une réponse de tolérance et non une réponse cytotoxique. De cette façon, il est donc possible d'éduquer les cellules dendritiques pour les orienter vers une réaction de tolérance. A titre d'exemple nous donnons l'influence de la Cyclosporine A (CsA) sur la maturation des cellules dendritiques. Des monocytes purifiés ont été cultivés en présence de GM-CSF et d'IL-4 pendant 6 jours et en présence de RU 41740 pendant 2 jours de plus, dans un milieu contenant 10% de sérum humain type AB. 1 g/ml ou 5 ug/m ! de CsA ont été ajoutés ou non dès le début de la culture. L'expression des molécules HLA- DR, CD83, CD86, CD80, CD40 et CD1a a été analyse par cytométrie en flux (tableau nu 8). sans CsA CsA (1) Jg/ml) CsA (5 g/ml) % ~ SD IFM % SD) FM % SD ! FM HLA-DR 99~0. 8 1605 98.8 ~0. 9 1504 99.2 ~0. 7 1101 CD40 98.9 ~0. 6 1697 98.4 ~0. 8 1314 99 ~0. 6 1278 CD86 97.7 ~1. 8 373 98.6 ~1. 2 318 96.4 ~3. 3 253 CD83 77.1 ~8. 5 169 64. 2 20 170 49. 9~6. 2 132 CD80 78.1 ~5. 6 216 68.9 ~2. 6 162 58.3 ~17 143 CD1a 14. 3~9. 5 45.5 27~7 74 25.9 ~6. 5 78 Tableaun 8 Cette étude démontre que la cyclosporine provoque une diminution nette de l'expression des molécules CD83 et CD80 ainsi qu'une augmentation de l'expression du CD1a. Une analyse graphique (figure 4) révèle en réalité l'existence de deux populations cellulaires, l'une CD83+ et l'autre CD83-qui est douée de propriétés immunorégulatrices. En effet les cellules dendritiques en présence de CsA (CsA-MODC) sont capables d'orienter la réponse des lymphocytes T vers une réponse de type TH2 qui favorise une réaction commune suppressive. La figure 5 illustre cette polarisation de la réponse immune vers une réponse de type Th2 par des cellules dendritiques dérivées de monocytes et traitées par la cyclosporin A. Les cellules dendritiques dérivées de monocytes cultivées en présence de GMCSF, IL-4 et RU 41740, et traitées par la cylosporine A, sécrètent moins d'IL-12 que les cellules dendritiques non traitées (figure 5A). De plus, le rapport de sécrétion de cytokines IFN-y/IL-10 (Th1/Th2) par des cellules T est diminué lorsque les cellules T sont stimulées par des cellules dendritiques traitées par cyclosporin A (Figure 5B). Exemple 9 : Utilisation des DC matures pour induire une culture mixte Iymphocytaire allogénique ou autologue. En présence de MODC matures, les lymphocytes T allogéniques, au 6ème et même au 8ème jour, sont doués d'une prolifération extrêmement importante, très largement supérieure à ce que l'on constate avec l'utilisation des lymphocytes T allogéniques et des monocytes allogéniques. Il en est de même pour une culture mixte autologue. Des cultures mixtes ymphocytaires autologues ont donc été induites par des cellules dérivées de monocytes (MODCs) générées en présence de GM-CSF (200 UI/ml), d'IL-4 (500 UI/ml) et de RU 41740 (10 pg/ml) Dix mille MODCs, irradiées à 30 Grays, sont cultivées avec différentes souspopulation Iymphocytaires triées soit par billes magnétiques Dynal (CD4+ et bright bnght CD8+), soit avec le module de tri du FACS Calibur (CD8, CD28-, et CD8 CD28+ autos). Dans le tableau 8, les valeurs indiquées représentent l'incorporation de Thymidine tritiée après culture mixte autologue, sauf (**). Les expériences sont réalisées en triplicate, sauf (*), en duplicate. Condition Valeurs Test Student par rapport au contrôle négatif P= (100.000 CD4+ autos) + 7898 10720 8613 (35.000 CD4+ autos) (100.000 CD4+ allos) + 119066 193392 206319 3, 827E-03 (35.000 CD4+ allos) (**) (100.000 CD4+ autos) + 37808 45223 42027 1, 458E-04 (35.000 CD28-autos) (100.000 CD4+ autos) + 32990 54800 2, 394E-02 (35.000 CD28+ autos) (100.000 CD4+ autos) + 13985 12941 13573 3, 978E-03 (100.000 CD8+ autos) (*) Tableau no 9 Condition Moyenne Ecart-type (100.000 CD4+ autos) + 9077 692 (35.000 CD4+ autos) (100.000 CD4+ allos) + 172926 22198 (35.000 CD4+ allos) (**) (100.000 CD4+ autos) + 41686 1753 (35.000 CD8bright CD28autos) (100.000 CD4+ autos) + 43895 7711 (35.000 CD8bright CD28+ autos) (*) (100.000 CD4+ autos) + 13500 248 (100.000 CD8+ autos) REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés à partir de monocytes, de précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques, caractérisé en ce que lesdits monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec le RU 41740 ou un composé analogue de celui-ci, ce composé étant choisi de telle sorte que la mise en contact de cellules dendritiques immatures avec ledit composé permette la maturation fonctionnelle des cellules dendritiques, attestée par leur capacité à - déclencher in vitro une réponse primaire contre un antigène infectieux ou tumoral mis en contact avec les cellules dendritiques préalablement et/ou au cours de leur culture avec les lymphocytes T ; - induire la prolifération de lymphocytes T en culture mixte autologue ou allogénique. 2. Procédé d'obtention de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés à partir de monocytes, de précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques, caractérisé en ce que lesdits monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec le RU 41740 ou un composé analogue de celui-ci, ce composé étant choisi de telle sorte que la mise en contact de cellules dendritiques immatures avec ledit composé permette la maturation phénotypique des cellules dendritiques, attestée par une augmentation significative de l'expression des molécules CD40, CD83, CD86, et HLA-DR et une diminution très marquée de l'expression des molécules CD14 et CD1a par lesdites cellules dendritiques. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec un analogue du RU 41740 obtenu à partir de la souche 01 K2 NCTC 5055 de Klebsiella pneumonie. 4. Procédé d'obtention de cellules dendritiques matures présentant des antigènes choisis, à partir de monocytes, précurseurs des monocytes, ou cellules souches hématopoïétiques, caractérisé en ce que lesdits précurseurs sont mis en contact avec le RU 41740 ou un analogue de celui-ci, couplé à des molécules comportant lesdits antigènes. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le couplage entre le RU41740 ou son analogue et les antigènes est non covalent. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel le composé mis au contact des monocytes, précurseurs des monocytes, ou cellules souches hématopoïétiques est le RU 41740, couplé ou non à des molécules antigéniques. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel le RU 41740 est ajouté au milieu de culture des monocytes, précurseurs des monocytes, ou cellules souches hématopoïétiques, à une concentration finale comprise entre 1 ng/ml et 1 mg/ml, préférentiellement entre 100 ng/ml et 10 g/mi. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel les cellules dendritiques sont traitées ex vivo, pour la préparation d'un médicament destiné à la prophylaxe, l'atténuation ou le traitement de maladies cancéreuses, infectieuses, allergiques ou auto-immunes. 9. Utilisation du RU 41740 ou d'un analogue de celui-ci, pour la préparation d'une composition comprenant des cellules dendritiques matures et/ou des macrophages activés. 10. Utilisation du RU 41740 ou d'un analogue de celui-ci, pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour une administration topique, destinée à favoriser la maturation des cellules de Langerhans de la peau. 11. Utilisation d'un produit de couplage entre le RU 41470 ou un analogue de celui-ci et un ou plusieurs antigènes, pour la préparation d'une composition apte à induire la production de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés présentant lesdits antigènes. 12. Utilisation de cellules dendritiques obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans la fabrication d'une composition apte à favoriser une réponse immunitaire antitumorale. 13. Utilisation de cellules dendritiques obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans la fabrication d'une composition apte à favoriser une réponse immunitaire contre une infection par un micro-organisme. 14. Utilisation de cellules dendritiques obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 8 et incubées en présence d'un immunosuppresseur, dans la fabrication d'une composition apte à modifier la réponse immunitaire dans le sens d'une tolérance. 15. Utilisation de cellules dendritiques obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 8, pour la détection et/ou la caractérisation des antigènes d'histocompatibilité. 16. Produit de couplage entre le RU 41740 ou un analogue de celui-ci et des molécules antigéniques, pour induire la maturation de cellules dendritiques ou l'activation de macrophages. 17. Produit de couplage selon la revendication 16, caractérisé en ce que le RU41740 ou son analogue est lié aux molécules antigéniques par des liaisons non covalente. 18. Produit de couplage selon la revendication 16 ou 17, caractérisé en ce que les molécules antigéniques sont de nature non protéique.