Brevet FR2809412A1 — publié le 20011130

L'invention concerne essentiellement l'utilisation de collagène d'origine aquatique pour la réalisation de supports destinés à l'ingénierie tissulaire, ainsi que de tels supports et des biomatériaux. collagène constitue un substrat particulièrement favorable pour le développement cellulaire. C'est pourquoi, cette protéine est très utilisée sous plusieurs formes : matrices, gels, ou films pour réaliser des tissus reconstruits comportant cellules vivantes. Dans le domaine de l'ingénierie tissulaire, technique promise à un grand avenir, collagène a conduit en particulier à la réalisation peaux ou de cartilages artificiels. Pour parvenir à un résultat satisfaisant, le collagène doit être protégé de la dégradation enzymatique provenant du métabolisme cellulaire soit par des procéder de réticulation physiques ou chimiques soit par présence de macromolécules naturelles ayant de fortes interactions avec la proteine soit enfin par une combinaison des deux systèmes. Jusqu'à maintenant, pour ces applications d'ingénierie tissulaire, le collagène utilisé dans les supports destinés à recevoir les cellules etait extrait de mammifères et le plus souvent de la peau de bovin. Le choix de cette source était dû aux bonnes propriétés mécaniques de la protéine obtenue après extraction, à sa résistance à la dégradation enzymatique et enfin à sa composition en acides aminés très proche de celle du collagène humain. Pour toutes ces raisons, il était légitime de penser que ce collagène était le seul qui pouvait convenir à la culture de cellules humaines. Or les inventeurs se sont aperçus de façon inattendue que les cellules humaines se développaient très bien sur ou à l'intérieur de certains supports constitués de collagène de poisson, de préférence réticulé. De plus, les inventeurs ont pu mettre en évidence que les cellules humaines cultivees dans ces biomatériaux conservaient un métabolisme normal. Ces biomatériaux peuvent être soit des films, soit des éponges comprimées, soit des matrices poreuses qui seront décrits ainsi que leurs modes de préparation dans les exemples donnes ci-dessous. La présente invention a pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture de nouveaux supports destinés à l'ingénierie tissulaire apte à former de nouveaux biomatériaux, c'est-à-dire apte à permettre une bonne prolifération des cellules vivantes, normales ou modifiées génétiquement, ou malignes à cultiver sur ledit support et à utiliser dans le cadre de ces nouveaux biomatériaux contenant lesdites cellules vivantes, pour une prolifération ultérieure in vitro ou in vivo. La présente invention a encore pour but de résoudre nouveau problème technique consistant en la fourniture de nouveaux supports destinés à l'ingénierie tissulaire, à un faible coût de fabrication et, en outre, à faible risque de contamination, les rendant ainsi particulièrement aptes à fournir nouveaux biomatériaux. La présente invention a encore pour but principal de resoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture de nouveaux supports destinés à l'ingénierie tissulaire, particulièrement bien adaptés à permettre la multiplication cellulaire de cellules vivantes, normales ou modifiées genétiquement, ou malignes, in vitro ou in vivo, et dont la structure est suffisamment compatible avec une utilisation in vivo chez un mammifère, en particulier un animal ou mieux un être humain, tout en étant différent de la constitution des tissus d'un tel mammifère, tel qu'un animal, ou mieux et de préférence un être humain, afin de permettre ultérieurement une différenciation entre les tissus nouvellement synthétisés, et les tissus anciens dudit mammifère, de préférence un être humain. L'ensemble de ces problèmes techniques est résolu pour première fois avec la présente invention d'une manière satisfaisante, à faible coût, à faible risque de contamination ou sans contamination, tout en permettant une mise en évidence aisée des tissus nouvellement synthétisés, ce qui est particulièrement non évidente et inattendu pour un homme de l'art. Ainsi, la présente invention, selon un premier aspect, concerne l'utilisation de collagène d'origine aquatique pour la réalisation de supports destinés à l'ingénierie tissulaire. Par l'expression "collagène d'origine aquatique" on entend un collagène issu de tissus contenant du collagène d'êtres vivants d'origine aquatique, êtres vivants sont bien connus à l'homme de l'art et comprennent par exemple, sans limitation, les mammifères aquatiques, en particulier les mammifères marins, les méduses et les poissons de mer ou d'eaux douces. L'homme de l'art sait, par ailleurs, que ces êtres vivants ont une peau qui contient essentiellement le collagène. Selon un mode de réalisation avantageux, le collagène est obtenu à partir de la peau de poisson, de préférence sous sa forme native. Selon encore un mode de réalisation avantageux de l'invention, le collagene a sa résistance mécanique renforcée où sa résistance à la digestion enzymatique augmentée soit par une réticulation chimique et/ou physique, soit par adjonction d'une macromolécule naturelle ayant de fortes interactions avec le collagene, soit par une combinaison des deux procédés. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le collagène est utilisé sous forme d'une matrice poreuse préparee à partir d'un gel de collagène soumis de préférence à une étape de lyophilisation. Selon encore une autre variante de réalisation avantageuse, la matrice poreuse précitée est réticulée par une réticulation physique, préférence par déshydratation hydrothermique ou DHT. Selon encore une autre variante de réalisation avantageuse, la matrice poreuse précitée est réticulée par une réticulation chimique, préférence au diphénylphosphorylazide ou DPPA ou par un carbodiimide et/ou le N- hydroxysuccinimide ou par le glutaraldéhyde. Selon un mode de réalisation avantageux, le collagène précité peut se présenter sous forme d'une matrice poreuse préparée à partir de collagène marin de préférence natif, mélangé avec chitosane et éventuellement au moins un glycosaminoglycanne de préférence le chondroïtine sulfate. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le collagène précité peut se présenter sous forme d'une matrice poreuse préparée à partir gel de collagène, ladite matrice poreuse étant revêtue sur au moins une face d'une membrane essentiellement compacte collagénique réalisée soit par un film collagénique préparé par séchage, de préférence à l'air ou dans un fluide gazeux, gel de collagène, soit par une éponge collagénique très fortement comprimée. Selon une variante de réalisation également avantageuse, la compression précitée de l'éponge collagénique très fortement comprimée est réalisee à une pression minimum égale à environ 50 bars (environ 50.105 Pascal (Pa)), de préférence comprise entre 50 bars (50.l05 Pa) et 200 bars (200.105 Pa), cette compression ayant éventuellement été réalisée à une température comprise entre et 80 C, encore mieux entre 40 C et 60 C. Selon encore une autre caractéristique avantageuse de l'invention, au moins une des deux couches, respectivement la couche poreuse et la membrane essentiellement compacte, comprend des cellules vivantes, normales ou modifiées génétiquement, ou malignes, en particulier provenant de sujets jeunes ou âgés. Selon un mode de réalisation avantageux, les cellules vivantes sont choisies parmi le groupe consistant de fibroblastes, kératinocytes, mélanocytes, cellules langerhans d'origine sanguine, cellules endothéliales d'origine sanguine, cellules sanguines, en particulier macrophages ou lymphocytes, cellules de langerhans d'origine sanguine, cellules endotéliales d'origine sanguine, cellules sanguines, adipocytes, sébocytes, des chondrocytes, des cellules osseuses, des ostéoblastes, cellules de Merkel d'origine sanguine, normales génétiquement modifiées malignes. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, la couche poreuse contient des fibroblastes normaux, génétiquement modifiés ou malins, et la membrane essentiellement compacte contient des cellules vivantes normales ou génétiquement modifiées ou malignes, en particulier choisies parmi des kératinocytes, des mélanocytes, des cellules de Merkel d'origine sanguine, des cellules langerhans d'origine sanguine, des sébocytes, des cellules d'origine sanguine, des cellules nerveuses. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux l'invention, il peut être particulièrement intéressant de préparer soit des peaux reconstruites "jeunes" en utilisant des cellules prélevées sur des sujets jeunes, soit des peaux reconstruites "âgées" obtenues à partir de cellules prélevées sur sujets âgés. Grâce à ces modèles, il sera possible d'améliorer les connaissances sur le processus du vieillissement cutané et d'étudier l'influence d'actifs sur ce processus. Selon encore un mode de réalisation particulièrement avantageux, la membrane essentiellement compacte précitée est préparée préalablement à la combinaison avec la couche poreuse, de préférence comprenant une éponge collagénique, en particulier en préparant la membrane et en la deposant sur un gel collagénique avant que l'ensemble ne soit congelé et lyophilisé. Selon un deuxième aspect, la présente invention couvre aussi un support destiné à l'ingénierie tissulaire, caractérisé en ce 'il comprend du collagène d'origine aquatique tel que défini précédemment ou tel qu'il résulte de la description suivante prise dans son ensemble, et intégrant les exemples qui font partie intégrante de la présente invention dans leur généralité et pour ce qui concerne toute caractéristique qui apparaît être nouvelle par rapport à un état de la technique quelconque, cette caractéristique étant prise dans sa fonction et dans sa généralité indépendamment du contexte de l'exemple. Selon un troisième aspect, la présente invention couvre aussi un biomatériau, par exemple sous la forme d'un tissu conjonctif reconstitué, ou de peau reconstituée, caractérisé en ce qu'il a été préparé à partir du collagène d'origine aquatique tel que précédemment défini dans tous ces aspects et tel résulte aussi de la description suivante comme pour le support du deuxième aspect ci-dessus. Dans le cadre de la présente description et des revendications, l'expression "supports destinés à l'ingénierie tissulaire" signifie un support qui sera utilisé pour réaliser la culture et la prolifération de cellules vivantes, normales modifiées genétiquement, ou malignes, que ce soit in vitro ou in vivo, cette prolifération étant de préférence appliquée in vivo sur un mammifère, comprenant un animal, mieux et de préférence un être humain. On comprend que l'invention trouve une utilisation particulièrement préférée dans le cadre de l'ingénierie tissulaire pour la fabrication de biomatériaux, par exemple sous la forme de tissus conjonctifs reconstitués ou de peaux reconstituées. Dans ce cadre, une premiere étape sera genéralement une culture du support avec lesdites cellules vivantes in vitro pour aboutir à un biomatériau, par exemple sous la forme d'un tissu conjonctif reconstitué ou de peau reconstituée, puis, dans une deuxième étape, l'utilisation ce biomatériau en tant que tissu conjonctif reconstitué ou de peau reconstituée in vivo sur un mammifère, par exemple animal et de préférence et mieux un être humain, afin de reconstituer un tissu conjonctif endommagé ou supprimé par chirurgie, ou de même pour une peau reconstituée remplaçant une zone de peau endommagée ou éliminée par voie chirurgicale pour une raison médicale quelconque. Avantageusement, le support destiné à l'ingénierie tissulaire, ou mieux le biomatériau, qui se présente par exemple sous la forme d'un tissu conjonctif reconstitué, ou de peaux reconstituées, comprend des cellules soit obtenues sensiblement exclusivement à partir de sujets jeunes, soit obtenues sensiblement exclusivement à partir de sujets âgés, en particulier pour étudier le processus du vieillissement tissulaire et en particulier cutané et éventuellement tester l'efficacité d'ingrédients ou principes actifs sur ce processus. On comprend ainsi que l'invention perniet de résoudre dans l'ensemble de nouveaux problèmes techniques énoncés précédemment d'une manière particulièrement simple, à faible coût, à faible risque de contamination et avec une capacité de différenciation du collagène aquatique relativement au collagène du mammifère, et de préférence du collagène d'un être humain, nouvellement synthétisé lors de l'utilisation in vivo. En effet, la mise en oeuvre de collagène de poisson dans la réalisation tissus artificiels vivants apporte trois avantages essentiels rapport à la source mammifère peau de poisson matière première généralement utilisée, peut etre obtenue en abondance dans des conditions de grande propreté. danger de contamination infectieuse est très faible. En particulier le risque de transmission d'agents de type prion est inconnu à ce jour. Enfin, le collagène de poisson ayant une composition en acides aminés relativement éloignée de celle du collagène humain les deux protéines peuvent etre différenciées de façon relativement aisée grâce à des anticorps spécifiques. Cette méthodologie sera très précieuse en particulier dans les tests in vitro ou dans les études de cicatrisation in vivo . En outre, l'emploi de collagène marin va rendre l'immunomarquage très efficace et permettre la différenciation du collagène marin relativement au collagène nouvellement synthétisé. Le collagène de poisson a une structure native qui protège de la dégradation enzymatique due aux protéases et qui lui confère une grande partie de propriétés mécaniques. Il sera donc très important lors des opérations de l'extraction et de la purification que les traitements utilisés altèrent le moins possible la structure de la protéine. Cela signifie que la structure hélicoïdale ainsi que les réticulations inter et intramoléculaires soient le plus possible préservées. Pour cela, les inventeurs ont plus particulièrement mis en oeuvre le procédé décrit dans le brevet US N 5331092 délivré le 19 juillet 1994. Néanmoins, pour des applications particulières, l'emploi de collagène partiellement déréticulé pourra etre envisagé, par exemple de l'atélocollagène, c'est-à-dire du collagène ayant perdu une partie de ses télopeptides. Ensuite, pour la plupart des applications d'ingénierie tissulaire les propriétés mécaniques du collagène seront renforcées et sa résistance à la digestion enzymatique augmentée soit par des techniques de réticulation chimiques et/ou physiques, soit par adjonction de macromolécules naturelles ayant fortes interactions avec la protéine soit enfin par une combinaison des deux procédés. La protection du collagène de poisson sera d'autant plus importante que sa stabilité naturelle est plus faible que celle du collagène de mammifère. Cette dernière caractéristique est due à un taux plus faible d'hydroxyproline. Les biomateriaux précédemment décrits pourront être ensemences avec des cellules vivantes et donneront ainsi naissance à des tissus artificiels vivants qui pourront être utilisés soit dans le domaine des tests in vitro soit dans le domaine pharmaceutique pour la réparation des tissus lésés. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à lumière de la description explicative qui va suivre faite référence aux exemples de réalisation de forme de collagène d'origine aquatique pouvant être utilisé dans le cadre de l'invention pour la réalisation des supports destinés à l'ingenierie tissulaire, et constituant ainsi de tels supports ainsi que des biomatériaux, donnés simplement à titre d'illustration et qui ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'invention. Dans les exemples, la température est donnée en degré Celsius, pression est la pression atmosphérique, et les pourcentages sont donnés en poids sauf indication contraire. Les exemples 1 à 13 constituent bien entendu des exemples préparation de collagène utilisable comme support d'ingénierie tissulaire selon l'invention. Les exemples 14 à 16 constituent des essais notamment comparatifs, dans le cadre de l'utilisation de ce collagène d'origine aquatique, sous les formes préparées dans certains des exemples 1 à 13, dans le cadre de la réalisation de supports destinés à l'ingénierie tissulaire. Dans les figures annexées - figure 1 représente la prolifération des fibroblastes humains normaux en derme équivalent, avec le temps exprimé en jour et en abscisse et la densité optique x 1000 en ordonnées avec des unités augmentant de 100 ; la courbe avec losanges est celle qui est obtenue en utilisant comme support une matrice poreuse de collagène aquatique, ici de poissons, et la courbe avec des carrés est obtenue avec du collagène bovin ; et - figure 2 représente une courbe de prolifération similaire de fibroblastes en derme équivalent avec en abscisse le temps exprimé en jour et en ordonnées la fluorescence exprimée en unité internationale, commençant à 15.000 avec des unités augmentant de 10.000 ; la courbe avec les losanges pleins représente la fluorescence obtenue dans le cadre de l'essai 1 ; la courbe avec le carré celle obtenue avec l'essai 2 ; la courbe avec les triangles vides étant obtenue avec l'essai 3 et enfin la courbe avec les croix étant celle obtenue avec l'essai 4. EXEMPLE I Préparation d'une matrice poreuse en collas natif aquatique Le collagène étant obtenu selon la technique du brevet US 5331092 accordé le 19 juillet 1994 A - Obtention du collagène natif aquatique Un gel de collagène est préparé à partir de peaux ventrales de sole broyées puis lavées avec un tampon phosphate pH 7.8 dont la composition est 0.78 g/1 de dihydrogénophosphate de potassium et 21.7 g/1 de monohydrogénophosphate disodique. Le lavage s'effectue sous agitation pendant une heure à raison de 5 1 de tampon pour 1 kg de broyat. Le phosphate est ensuite éliminé par deux lavages successifs à l'eau permutée, puis par une centrifugation en continu à 4000 t/mn (décanteur Rousselet), à raison de 5 1 d'eau pour 1 kg de broyat. Le broyat est alors acidifié par une solution d'acide acétique 0.25 M à raison de 1 kg de broyat pour 10 1 de solution. Le gel est alors centrifugé à 4000 t/mn pendant 5rnn. Le gel qui sera utilisé est constitué par le surnageant obtenu dont la concentration en collagène est comprise entre 0.5 et 2 %. B - Préparation de la matrice poreuse partir du gel de collagène obtenu précédemment Ce gel est coulé dans un plateau de lyophilisation à raison de 20 g/cm2. Il est alors lyophilisé après congélation à -30 C et chauffage à + 32 C. La lyophilisation dure au total 16 heures sous une pression de 400 microbars. La matrice obtenue est alors réticulée par déshydratation hydrothermique (DHT). Celle-ci consiste en un chauffage dans une étuve à 110 C sous un vide de 400 microbars pendant 16 heures. EXEMPLE 2 Préparation d'une matrice poreuse réticulée grâce au diphénylphosphorylazide (DPPA) selon la technique décrite dans le brevet européen N 466 829 du 24 juillet 1996 La matrice de collagène de l'exemple 1 est incubée 24 h dans une solution renfermant 5 à 250 f1 de DPPA/g de collagène contenu dans 100 ml de diméthylformamide (DMF). Le collagène est ensuite débarrassé du DPPA par rinçage dans 100 ml de DMF. Le DMF est ensuite eliminé par rinçage dans 100 ml d'une solution de tampon borate pH 8.9 (tétraborate de sodium 0.04 M, acide borique 0.04 M). Le collagène est finalement incubé pour une nuit dans le même tampon borate. Enfin le tampon borate est éliminé par rinçage ' l'eau permutée en continu pendant 6 h. EXEMPLE 3 'paration d'une matrice poreuse réticulée par le carbodiimide et le N- h dy roxysuccinimide La matrice de collagène aquatique de l'exemple 1 est réticulée avec de PEDC (Ethyldimethylaminopropyl carbodiimide) à la concentration de 0.23 à 0.69 g/g de collagène, et avec du NHS (N-hydroxysuccinimide) à la concentration de 0.42 g/g de collagène. Après rinçage à l'eau permutée, le collagène est à nouveau lyophilisé. EXEMPLE 4 Preparation d'une matrice poreuse réticulée par le glutaraldéhyde La matrice poreuse de collagène aquatique de l'exemple 1 est réticulée pendant 24 à 96 h dans une solution contenant 0.6 à 1 % de GTA à 20 C. Après rinçage avec l'eau permutée, le collagène est à nouveau lyophilisé. EXEMPLE 5 Matrice poreuse préparée avec le collagène natif aguatique de l'exemple 1 en association avec du chitosane et un glycosaminoglycaiine comme décrit dans le brevet européen du 29 mai 1991 N 296078 A 600 g de gel à 1.5 % de collagène, sont ajoutés 2.5 g de chitosane dissous dans 356 ml d'eau et 1.9 ml d'acide acétique, puis une solution renfermant 1 g de chondroïtine 4 sulfate contenu dans 400 ml d'eau permutée. Le mélange dont le pH est d'environ 4.0 est ensuite agité puis lyophilisé. L'éponge obtenue est réticulée par DHT. EXEMPLE 6 Matrice poreuse décrite dans l'exemple 1 surfacée avec un film de collagène A - Préparation du film Le de collagène dont la matière sèche est comprise entre 0.3 et 0. % est séché dans une étuve à 30 C ou sous hotte à raison de 0.5 g de gel/cm' de plateau. Dans gel de collagène il est possible d'ajouter de 10 à 40 % de glycerol. Le collagène séché dans ces conditions forme un film transparent. B - Association du film avec la matrice poreuse décrite plus haut Le gel de collagène aquatique natif de 0.5% à 2% en matière sèche, est déposé à raison de 0.5g par cm2 dans un plateau de lyophilisation, puis le film de collagène est déposé sur ce gel et l'ensemble est lyophilisé. Le lyophilisat obtenu est réticulé par DHT. EXEMPLE 7 Matrice poreuse préparée avec un jeel de collagène acido-soluble surfacée avec un film de collagène Le procédé est celui indiqué dans l'exemple 6, la seule différence étant constituée par la nature du gel coulé sur le film qui est constitué de collagène acido-soluble préparé selon une technique bien connue de l'homme de l'art. EXEMPLE 8 Matrice poreuse préparée avec un gel d'atélocollagène ou surfacée avec un film de collagène Le procédé est celui indiqué dans l'exemple 6, la seule différence étant constituée par la nature du gel coulé sur le film qui est constitué d'atélocollagène c'est-à-dire de collagène sans télopeptide préparé selon une technique bien connue de l'homme de l'art. EXEMPLE 9 Matrice poreuse constituée de collagène associé avec du chitosane et un alycosaminoglycanne surfacée avec un film de collagène. Le procédé est celui indiqué dans l'exemple 6, mais dans ce cas le coulé sur film du collagène est constitué de collagène, de chitosane d'un glycosaminoglycanne. La préparation de ce gel est décrite dans l'exemple 5. EXEMPLE 10 Toutes matrices poreuses surfacées avec un film de collagène décrites précédemment peuvent être réticulées selon les techniques décrites dans les exemples 3 et 4. EXEMPLE 11 Matrice poreuse en collagène seul décrite dans l'exemple 1 surfacée avec une éponge de collagène comprimée. A - Préparation de l'éponge comprimée Le de collagène préparé comme dans l'exemple 1 et ayant une matière sèche comprise entre 0.3 et 1.5 % est lyophilisé de façon à obtenir une éponge ayant un poids compris entre 0.5 et 2 g/cm2. Le lyophilisat est comprimé pendant 5 à 60 secondes, à une temperature comprise entre 20 et 60 C et une pression située entre 50 et 200 bars (50 à 200.105 Pa). B - Association de l'éponge comprimée avec la matrice poreuse Le de collagène décrit dans l'exemple 1 est déposé à raison de 0 g par cm 2 dans un plateau de lyophilisation. L'éponge comprimée alors déposée sur ce gel et l'ensemble est lyophilisé. Une éponge poreuse de collagène surfacée avec une éponge comprimée de collagène ainsi obtenue. L'ensemble est réticulé par DHT comme décrit dans l'exemple 1. EXEMPLE 12 Matrice poreuse constituée de collagène de chitosane et de glycosaminoglycanne telle ue décrite dans l'exem le 5 et surfacée avec 1'é on e coin rimée. Le gel de collagène, de chitosane et de glycosaminoglycanne, préparé selon le procédé de l'exemple 5 est déposé à raison de 0.5 g par dans un plateau lyophilisation, puis l'éponge comprimée est déposée ce gel et l'ensemble est lyophilisé. Le lyophilisat est alors réticulé par comme décrit dans l'exemple 1. EXEMPLE Toutes les matrices poreuses surfacées avec une éponge de collagène comprimée décrites plus haut peuvent être réticulées selon les techniques décrites dans les exemples 2, 3 et 4. EXEMPLES 14 A 16 : Essais de comparaison du métabolisme cellulaire entre les matrices collap-énigues bovines et aquatiques EXEMPLE : ESSAI DE VIABILITE CELLULAIRE DE FIBROBLASTE 1- Préparation des dermes équivalents Pour cet essai de comparaison, on fabrique d'une part une matrice poreuse aquatique réticulée au DPPA, selon l'exemple 2. titre de comparaison, une fabrique une matrice poreuse comparative avec du collagène d'origine bovine, dite matrice bovine, également reticulée au DPPA, dans mêmes conditions que celles de l'exemple 2. On prend des fibroblastes humains normaux issus pool de donneurs jeunes utilisé au 7en,e passage et que l'on ensemence dans chacune des matrices aquatique et bovine, à raison de 250 000 cellules par cm 2 dans le cas de l'étude de prolifération et de synthèse protéique, et que l'on ensemence à raison de 300 000 cellules par cm 2 pour les matrices aquatique et bovine destinées aux études d'histologie. On effectue la culture de ces matrices respectivement aquatique et bovine dans du milieu composé de DMEM/HAM F 12 dans un rapport 50/50 (v/v) additionné 10 % de sérum de veau foetal, 100 UI/ml de pénicilline, 25 pg/ml de gentamycine, 1 pg/ml d'amphotéricine B, 50 ug/ml de vitamine C. réalise cette culture pendant 1 mois en changeant le milieu de culture 3 fois par semaine. II - Analyses réalisées 1) Mesure de la viabilité cellulaire par réaction au MTT On ajoute 1 % en poids de MTT (c'est-à-dire le 3-(4-(diméthylthiazol yl)2,5-diphényltétrazolium bromure) dans le milieu de culture. On réalise une incubation pendant 2,5 heures à 37 C. Après incubation pendant cette durée, la densité optique du produit transformation (bleu fonnazan) est lue à 550 nm après solubilisation dans DMSO. La densité optique obtenue est proportionnelle à l'activité succinate-déshydrogénases qui sont capables d'effectuer la transformation du sel tétrazolium MTT jaune clair en cristaux bleus de formazan. La viabilité cellulaire a été réalisée après 1, 5, 7, 22 jours et un mois culture. Pour déterminer les valeurs moyennes, on a réalisé 6 échantillons pour chaque matrice. TABLEAU I DE RESULTATS Jours Matrice Déviation au Matrice Déviation standard aquatique standard moyenne bovine moyenne 1 487 24 403 40 5 604 19 393 59 7 520 56 398 64 22 608 30 680 40 Ces résultats font également l'objet des courbes de la figure 1 annexée. On notera que la courbe avec les losanges est celle obtenue avec la matrice aquatique et la courbe avec les carrés est celle obtenue avec la matrice bovine. On observe à partir des résultats que de manière totalement surprenante, la matrice aquatique non seulement constitue un support permettant survie de fibroblastes humains normaux mais aussi la prolifération cellulaire de ces fibroblastes humains normaux, tout en constituant même un support de culture bien meilleur pendant les trois premières semaines. Il peut donc être conclu de ces essais que le collagène aquatique est, de manière surprenante, particulièrement adapté pour réaliser un support d'ingénierie tissulaire en particulier pour des applications in vitro et même et surtout in vivo pour constituer des biomatériaux contenant des cellules vivantes et en particulier et de préférence des cellules vivantes d'êtres humains. 2) Mesure des synthèses protéiques La synthèse des protéines sécrétées pendant 3 jours dans un milieu de culture sans serum de veau foetal a été évaluée après un mois maturation des dermes équivalents, tels qu'obtenus après le mois de culture dans les conditions rapportées ci-dessus dans la préparation des dermes équivalents. dosage est réalisé par la méthode du microBCA Pierce. Parallèlement, la densité cellulaire a été évaluée par test au MTT dans les conditions décrites ci-dessus. teneur en protéines relative correspond à la teneur protéique ramenée à 1 unité de densité cellulaire exprimée en densité optique DO, afin de raisonner à concentration cellulaire équivalente. Les résultats obtenus sont répertoriés au tableau II ci-après TABLEAU II RÉSULTATS DE SYNTHESE PROTEIOUE Collagène du support Matrice Matrice bovine a uati ue Moyenne Moyenne Densité cellulaire 2,12 0,09 1,91 0,13 (DO) Protéines ( /ml) 494 48 499 32 Teneur en protéines 233 18 262 23 relative * : Déviation standard moyenne Comme pour le tableau I, la moyenne résulte d'une moyenne réalisée sur 6 échantillons. 3) Histologie Les dermes équivalents obtenus après culture pendant 21 jours de culture à partir des matrices en collagène aquatique et bovin sont fixés dans une solution à 2 % en paraformaldéhyde puis post-fixés dans une solution de tétroxide d'osmium, déshydratés, inclus en Epon, coupés et observés en microscopie électronique à transmission (Jeol 1200) au CMEABG (Lyon, France). Conclusions Ces résultats indique une très bonne colonisation matrices tridimensionnelles qu'elles soient aquatiques ou bovines. Après trois semaines de culture, la densité cellulaire est équivalente dans les deux types matrices. Toutefois, il semble que la matrice aquatique permette une meilleure adhésion cellulaire en début d'expérimentation comme l'indique l'étude de prolifération lors de la première semaine de culture et ainsi une meilleure colonisation pour des temps courts de culture. En ce qui concerne les synthèses protéiques, après un mois de culture les capacités de synthèse des fibroblastes (teneur en protéines relative) sont également équivalentes. Ces résultats indiquent que les matrices de collagène aquatique mises au point ont permis la préparation de dermes équivalents de bonne qualité ; les résultats obtenus avec ces matrices étant comparables à ceux obtenus avec des matrices de collagène bovin. En microscopie électronique à transmission, les fibroblastes ont pu être observés dans les matrices d'origine bovine et aquatique. Dans deux types de matrices, on note la présence d'une abondante matrice extracellulaire néosynthétisée. On peut différencier la matrice extracellulaire neosynthétisée grâce à la striation périodique des fibres de collagène déposé comparativement aux amas collagéniques formant la matrice tridimensionnelle l'éponge de départ. EXEMPLE 15 Influence des différents types de réticulation des matrices collagénigues aquatiques sur la viabilité cellulaire Pour étudier l'influence des différents types de reticulation des matrices collagéniques aquatiques sur la viabilité cellulaire, on procède aux essais suivants 1) Préparation dermes équivalents a) Support ou matrice utilisé prépare divers supports ou matrices de collagene en utilisant diverses proportions de collagène dans le gel de collagène servant à fabriquer la couche ou matrice poreuse et en utilisant éventuellement un agent de réticulation différent, comme suit Essai 1 Pour cet essai, on fabrique une matrice poreuse sous forme d'éponge poreuse à partir d'un gel de collagène aquatique préparé à partir 1,3 % en poids en collagène aquatique, que l'on congèle à -80 C et que soumet à une lyophilisation standard conforme à l'exemple 2 et que l'on soumet ensuite à une réticulation au DPPA à une proportion de 250 #tl/g d'éponge à l'etat sec. 2) Essai 2 Pour cet essai, on prépare un support poreux sous forme d'éponge aquatique à partir d'un gel de collagène aquatique comprenant 7 % en poids de collagène aquatique, que l'on soumet à une congélation à -80 C, puis à une lyophilisation standard et une réticulation au DPPA à 250 ul/g comme dans l'essai 1. 3) Essai 3 Pour cet essai, on procède comme pour l'essai 1, ce n'est que la réticulation a lieu avec l'EDC, selon l'exemple 2, à une proportion de 0,46 g/g d'éponge sèche. 4) Essai 4 prépare un support poreux comprenant une éponge de collagène aquatique obtenu à partir d'un gel de collagène aquatique comprenant 1,1 % en poids de collagene aquatique, que l'on soumet à une congélation à -80 C, puis à une lyophilisation standard et à une réticulation au DPPA à 250 pl/g sec comme dans l'essai différence résidant dans une proportion de 1,1 % en poids de collagène aquatique. Dans l'ensemble de ces essais, le collagène aquatique est issu, comme dans l'exemple 2, de la peau ventrale de sole. b) Culture des fibroblastes sur ces matrices On utilise, comme dans l'exemple 14, des fibroblastes humains normaux mais qui sont prélevés au 8e` passage. On réalise un ensemencement à raison de 275 000 cellules par cm2. Le milieu culture est composé de DMEM/HAM F 12 50/50 (v/v) additionné de 10 % en poids de sérum de veau foetal, 100 UI/ml de pénicilline, 25 ug/ml de gentamycine, 1 #tg/ml d'amphotéricine B, 50 pg/ml de vitamine C. On réalise la culture pendant 1 mois en changeant de milieu 3 fois par semaine. Pour chaque essai, on utilise 4 matrices afin d'effectuer moyenne pour chaque type d'essai et mesurer la déviation standard moyenne. II) Analyses réalisées Mesure de viabilité cellulaire par réaction à l'Alamar Blue (marqueur d'oxydoréduction) L'Alamar Blue est ajouté à raison de 2 % en poids milieu de culture utilise, au moment où l'on souhaite mesurer la viabilité cellulaire sur un prélèvement réalisé sur le milieu culture. Après incubation à 2 h 20 à 37 C, on lit la fluorescence, sur la base d'une excitation à 530 nm et une émission à 590 nm). L'intensité de la fluorescence obtenue est proportionnelle à l'activité métabolique des cellules. On effectue la mesure de la viabilité cellulaire sur 10 échantillons après 1, 4 6, 11 17 jours de culture. Les résultats sont exprimés au tableau III ci-après. Les résultats sont indiqués en unité internationale de fluorescence en fonction du temps. TABLEAU III VIABILITE CELLULAIRE (u I fluorescence) Temps ESSAII ESSAI2 ESSAI3 ESSAI4 'ours) Mo SD* Moyenne SD* Moyenne SD* Moyenne SD* 1 21 1184 30535 1888 25528 6820 28461 3805 4 31611 920 35623 3544 36404 3570 45l26 2930 6 43l44 2500 35244 2095 37819 4l70 l254 3396 11 42808 1481 38532 2537 42442 3112 44508 2329 17 45484 2426 45094 1470 43963 8285 43939 4521 Ordre 2 3 4 * : Déviation standard résultats du tableau 3 font aussi l'objet de la figure annexée. Ils montrent les courbes de prolifération fibroblastique en derme équivalent. La courbe en losange plein est celle réalisée avec l'essai 1 ; la courbe en carré plein est celle réalisée avec l'essai 2 ; la courbe en triangle est celle réalisée avec l'essai 3 et la courbe avec les croix est celle réalisée avec l'essai 4. Le temps est exprimé en jour en abscisse et la fluorescence en UI avec une échelle démarrant à 15 000 et augmentant par unité de 10 000 jusqu'à 55 000. Les résultats permettent d'aboutir aux conclusions suivants. Conclusions Les résultats indiquent les différentes matrices préparées peuvent permettre bonne croissance fibroblastique après 17 jours de culture. Quelle que soit préparation des matrices collagéniques aquatiques, fibroblastes adhèrent bien ' leur support tridimensionnel et se divisent très rapidement afin de coloniser la matrice. Le profil de prolifération est très légèrement variable d'un type de matrice à l'autre mais après 17 jours de culture, la densité fibroblastique est comparable quel que soit le procédé de fabrication. différents types de réticulation employés réalisés soit avec le DPPA ou avec l'EDC ne semblent pas influencer le renouvellement cellulaire. Après pratiquement 3 semaines de culture, la stabilité des matrices est excellente, à savoir peu digestion, peu de contraction. EXEMPLE Essai démontrant les avantages du collagène aquatique pour la mise en évidence et le dosage du collagène humain néosynthétisé Cet essai est similaire à celui de l'exemple 14, si ce n'est que l'on effectue une histologie avec immuno-marquage. L'essai a lieu de la manière suivante 1) Préparation des dermes équivalents Il s'agit de dermes équivalents de l'exemple 14, la culture étant réalisée dans les conditions de l'exemple 14. Cette culture est donc effectuée pendant trois semaines en changeant le milieu trois fois par semaine, l'ensemencement des fibroblastes humains normaux ayant eu lieu à 300.000 cellules par cm' comme cela était indiqué dans l'exemple 2) Histologie a) Histologie classique réalise la fixation avec le paraformaldéhyde à une teneur de 4 % en poids , on réalise ensuite une déshydratation et une inclusion en paraffine. effectue ensuite des coupes à 7 pm et une coloration Mallory Haidenhain après déparaffinage et réhydratation. b) Immunomarquage fixe également avec le paraformaldéhyde à 4 en poids, on réalise une inclusion en Tissue Tek OCT compound, c'est ' dire un liquide d'inclusion fourni par Miles, Elkhart, Indiana, USA, et une coupe a froid à 7 pm. L'immunomarquage est effectué de la manière suivante i. Avec un premier anticorps anti-collagène de type 1 humain de lapin (dilution 1/40) ii. Un deuxieme anticorps anti-lapin conjugué FITC (Fluorescéine Iso ThioCyanate) (dilution 1I160) Contre coloration avec DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole, dilactate). 3) Résultats constate que les support constitués respectivement par une matrice aquatique et une matrice bovine forment des pores plus ou moins laches dans lesquels viennent adhérer les fibroblastes. surface, on note une proportion plus importante de fibroblastes formant un surfaçage favorable du derme équivalent pour la réalisation d'une peau reconstruite. répartition des fibroblastes est homogène dans éponges aquatique et bovine. immunomarquage, on constate que la matrice formée collagène bovin est marquée par l'anticorps anti-collagène de type I humain (croisement). contre, la matrice d'origine aquatique n'est que très faiblement marquée par l'anticorps anti-collagène humain. L'utilisation des éponges composées de collagène aquatique est donc favorable à la mise en évidence de la matrice extracellulaire néosynthétisée. résultats s'expliquent par les travaux du Professeur Hartmann sur les réactions des différents antigènes par rapport aux différents anticorps déterminés les mesures des densités optiques après immunomarquage données au tableau IV dit de Hartmann ci-après TABLEAU IV Réaction croisée humain bovin poisson (test Elisa) Antigènes Collagène Collagène Collagène Anticorps 1 sole 1 humain I bovin 20111 (225) 1I25 190 > 815 1/50 210 > 548 1/l00 73 1233 234 1I200 43 605 136 1/400 56 326 l65 50121 (03) 1/25 180 1550 > l/50 130 1094 > 1/100 158 536 > 1I200 96 305 967 1/400 109 215 728 50171 (01) 1/25 1880 64 73 1/50 1043 193 32 1/l00 571 51 33 1/200 523 51 87 densité optique supérieure à 2000) Les résultats sont exprimés en D.O. x 103 (densité optique a - 450 nm) Le eg ndes : 20111 (225) : anti-collagène I humain 50121 (03) : anti-collagène 1 bovin 50171 (01) : anti-collagène 1 poisson (sole) De ce tableau de résultats, il ressort que quel que soit l'anticorps (anti collagène type 1 humain, anti-collagène type I bovin, anti-collagène type I de sole), en immunomarquage, la différence est beaucoup plus importante entre collagène humain et le collagène de sole qu'entre le collagène humain et le collagène bovin. Il en résulte que dans une matrice de collagène de poisson, collagène synthetisé par les fibroblastes humains pourra être mis en évidence beaucoup plus aisément. Ceci confirme les résultats décrits précédemment obtenus par un immunomarquage par l'anticorps anti-collagène de type I humain collagène synthetisé dans la matrice de collagène de poisson, ce qui constitue un résultat particulièrement inattendu et avantageux de l'invention. REVENDICATIONS 1. Utilisation de collagène d'origine aquatique pour la réalisation de supports destinés à l'ingénierie tissulaire. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée ce que le collagene est obtenu à partir de la peau de poisson, de préférence sous sa forme native. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée ce que le collagene a sa résistance mécanique renforcée ou sa résistance à la digestion enzymatique augmentée soit par une réticulation chimique et/ou physique, soit par adjonction d'une macromolécule naturelle ayant de fortes interactions avec le collagene, soit par une combinaison des deux procédés. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le collagène est utilisé sous forme d'une matrice poreuse préparée à partir d'un gel de collagène soumis de préférence à une étape de lyophilisation. 5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que la matrice poreuse précitée est réticulée par une réticulation physique, préférence par déshydratation hydrothermique ou DHT. 6. Utilisation selon la revendication 4 ou 5, caractérisée ce que la matrice poreuse précitée est réticulée par une réticulation chimique, de préférence au diphénylphosphorylazide ou DPPA ou par un carbodiimide ou le N- hydroxysuccinimide ou par le glutaraldéhyde. 7. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le collagène précité se présente sous forme d'une matrice poreuse préparée à partir de collagène aquatique de préférence natif, mélangé avec du chitosane et éventuellement au moins un glycosaminoglycanne de préférence le chondroïtine sulfate. 8. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le collagène précité se présente sous forme d'une matrice poreuse préparée à partir d'un gel de collagène, ladite matrice poreuse étant revêtue sur au moins une face d'une membrane essentiellement compacte collagénique réalisée soit par un film collagénique préparé par séchage, de préférence à l'air ou dans un fluide gazeux, d'un gel de collagène, soit par une éponge collagénique très fortement comprimée. 9. Utilisation selon la revendication 6, 7 ou 8, caractérisée en ce qu'au moins une des deux couches, respectivement la couche poreuse et la membrane essentiellement compacte, comprend cellules vivantes, normales ou modifiées génétiquement, ou malignes, en particulier provenant de sujets jeunes ou de sujets âgés. 10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que les cellules vivantes sont choisies parmi le groupe consistant de fibroblastes, kératinocytes, mélanocytes, cellules langerhans d'origine sanguine, cellules endothéliales d'origine sanguine, cellules sanguines, en particulier macrophages ou lymphocytes, cellules de langerhans d'origine sanguine, cellules endotéliales d'origine sanguine, cellules sanguines, adipocytes, sébocytes, des chondrocytes, des cellules osseuses, des ostéoblastes, cellules de Merkel d'origine sanguine, normales ou génétiquement modifiées malignes. 11. Utilisation selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que la couche poreuse contient des fibroblastes normaux, génétiquement modifiés ou malins, et la membrane sensiblement compacte contient des cellules vivantes normales ou génétiquement modifiées ou malignes, en particulier choisies parmi des kératinocytes, des mélanocytes, cellules de Merkel d'origine sanguine, des cellules de langerhans d'origine sanguine, des sébocytes, des cellules d'origine sanguine, des cellules nerveuses. 12. Utilisation selon l'une revendications 8 à 11, caractérisée en ce que la compression précitée de l'éponge collagénique très fortement comprimée est réalisée à une pression minimum égale à environ 50 bars (50.105 Pa), de préférence comprise entre 50 bars (50.105 Pa) et 200 bars (200.105 Pa), cette compression ayant éventuellement été réalisée à une température comprise entre 20 C et 80 C, encore mieux entre 40 C et 60 C. 13. Utilisation selon l'une revendications 8 à 12, caractérisée en ce que la membrane sensiblement compacte est préparée préalablement à la combinaison avec la couche poreuse, de préférence comprenant une éponge collagénique, en particulier en préparant membrane et en la déposant sur un gel collagénique avant que l'ensemble ne soit congelé et lyophilisé. 14. Support destiné à l'ingénierie tissulaire, caractérisé en ce qu'il comprend du collagène tel que défini a l'une quelconque des revendications précédentes. 15. Biomatériau, par exemple sous la forme d'un tissu conjonctif reconstitué, ou de peau reconstituée, caractérisé en ce qu'il a été préparé à partir du collagène tel que défini à l'une quelconque des revendications précédentes, avantageusement ce biomatériau comprenant des cellules soit obtenues sensiblement exclusivement à partir de sujets jeunes, soit obtenues sensiblement exclusivement à partir de sujets âgés, en particulier pour étudier le processus du vieillissement tissulaire et en particulier cutané et éventuellement tester l'efficacité d'ingrédients actifs sur ce processus.