Brevet FR2814753A1 — publié le 20020405

Utilisations du gène GJB6 dans le traitement de certaines alopécies dont le syndrome de Clouston, et pour le criblage de composés susceptibles d'être efficaces dans le traitement d'alopécies avec prédisposition génétique. La présente invention résulte de l'identification de mutations dans le gène GJB6, responsables du syndrome de Clouston. La symptomatologie de ce syndrome suggère que GJB6, codant pour la connexine 30 (Cx-30), est très probablement impliqué aussi dans d'autres alopécies avec prédisposition génétique, notamment non pathologiques. L'invention porte donc sur l'utilisation de constructions comportant le gène GJB6, tant pour la préparation de compositions pharmaceutiques destinées au traitement du syndrome de Clouston et/ou de certaines alopécies, que pour le criblage de molécules susceptibles d'avoir un effet bénéfique dans le traitement des alopécies. L'invention porte aussi sur des méthodes de diagnostic du syndrome de Clouston. Le Syndrome de Clouston, ou Dysplasie Ectodermale Hydrotique (HED, OMIM 129500), est une maladie génétique monogénique rare à transmission autosomique dominante. Les personnes atteintes de ce syndrome présentent principalement une hypotrichose et une alopécie pathologique, associée à une dystrophie des ongles ainsi qu'une hyperkératose de la paume des mains et de la plante des pieds. Dans certains cas, les patients peuvent présenter d'autres signes cliniques tels que surdité, retard mental, hyperpigmentation de la peau ainsi que des anomalies oculaires et du squelette. Cette pathologie atteint l'épiderme, qui est un épithélium stratifié d'origine ectodermique. Cet épithélium est constitué de la couche basale, qui repose sur la jonction dermo-épidermique des couches granuleuse et épineuse et de la couche cornée la plus superficielle. Ce tissu, qui se renouvelle en deux semaines, doit cette propriété aux kératinocytes, qui sont le constituant cellulaire principal de l'épiderme. Les kératinocytes de la couche basale ont la capacité de se renouveler, de se différencier et de commencer leur migration dans les couches plus supérieures de l'épiderme pour atteindre la couche épineuse et enfin perdre leur noyau au niveau de la couche cornée. La capacité de renouvellement des kératinocytes est due à la présence de cellules souches qui, outre leur capacité d'auto-renouvellement, donnent naissance à des cellules filles à fort potentiel de division et des cellules entrant en différenciation. Ces trois populations de kératinocytes sont situées à la base de l'épiderme. De plus, il a été montré que des cellules souches sont aussi localisées dans le follicule pileux (Rochat, Kobayashi et al. 1994). Ces cellules souches pluripotentes donneraient naissance à diverses cellules telles que les cellules de la gaine externe, les cellules de gaine interne, du bulbe ou encore la glande sébacée du follicule pileux, et enfin les kératinocytes inter-folliculaires. Le locus responsable du syndrome de Clouston, identifié en 1996, est situé sur le chromosome 13, en 13q11 (Kibar, Der Kaloustian et al. 1996). L'identification d'événements de recombinaison chez des personnes atteintes de ce syndrome a permis de délimiter la région chromosomique d'intérêt par les marqueurs micro-satellites centromérique D13S1830 et télomérique D13S1380 (Kibar, Dube et al. 2000 ; Lamartine, Laoudj et al. 2000). Par la suite, un contig de BACs couvrant la région chromosomique d'intérêt a été obtenu et un ensemble de gènes et d'ESTs a été localisé dans ce contig (Lamartine, Pitaval et al. 2000). Parmi les gènes connus présents dans la région HED se trouvent les gènes GJB2 et GJB6, qui codent pour deux protéines (connexine 26 et connexine 30, respectivement). La famille des connexines comprend une quinzaine de membres. Ces protéines s'associent au niveau de la membrane plasmique pour former des hexamères homomériques ou hétéromériques, appelés connexons. Deux connexons forment un canal reliant deux cellules, appelé jonction communicante ("gap junction"en anglais). Plusieurs jonctions communicantes forment des plaques jonctionnelles et sont impliquées dans le transport de petites molécules telles que l'IP3, les sucres, les acides aminés ou encore les ions tels que le calcium. Ainsi est assurée une réponse adaptative et coordonnée d'un ensemble de cellules au cours du développement ou aux changements de l'environnement. Des mutations dans les gènes des connexines sont responsables de différentes pathologies héréditaires, telles que des pathologies dermatologiques et de surdité, la neuropathie de Charcot Marie Tooth et des cataractes. Plusieurs exemples illustrent en particulier l'implication des connexines dans des pathologies dermatologiques et de surdité héréditaires. Par exemple, il a été démontré que des mutations dans le gène GJB2, codant la connexine Cx-26, sont responsables d'une forme génétique de surdité telles que la surdité DNFB1, dont le mode de transmission autosomique récessif n'est en l'état des connaissances associé à aucun signe clinique dermatologique. Par ailleurs, d'autres mutations dans le gène codant la connexine Cx-26 sont responsables d'une kératodermie palmo-plantaire associée à une surdité. Des mutations du gène GJB3, codant la connexine Cx-31, sont aussi responsables d'une forme génétique de surdité. Il s'agit de la surdité neurosensorielle non syndromique à transmission autosomique récessive. En outre, des mutations de ce gène sont responsables d'une dermatose héréditaire : l'érythrokératodermie variable. Enfin, il est connu qu'une mutation du gène GJB6 codant la connexine Cx-30 est responsable d'une forme de surdité d'origine génétique. Il s'agit de surdité sensorineurale autosomal dominante non syndromique (NSRD3). Une mutation de la thréonine en position 5 en méthionine est responsable de cette pathologie. Des mutations du même gène sont par ailleurs responsables de la dysplasie ectodermale hydrotique, ou syndrome de Clouston. Les auteurs de la présente invention ont identifié le gène et les mutations à l'origine du syndrome de Clouston. Initialement, GJB2 était un très bon gène candidat puisqu'il a été montré que des mutations dans ce gène sont responsables de surdités non-syndromiques d'origine génétique et que la surdité peut être un symptôme associé au Syndrome de Clouston. Pourtant, aucune mutation dans ce gène n'a été trouvée chez les individus atteints des familles HED. Plus récemment, une autre connexine (connexine 30) codée par le gène GJB6 a été localisée dans la région 13q11, proche de GJB2 (Kelley, Abe es al 1999). GJB6 est un gène sans intron de 786 paires de base qui est exprimé en particulier dans l'épiderme murin (Dahl, Manthey et al. 1996). Des mutations dans la connexine 30 humaine sont responsables d'une surdité autosomique dominante (Grifa, Wagner et al. 1999). Par conséquent, GJB6 était aussi un très bon candidat pour le Syndrome de Clouston. Le séquençage de ce gène, qui ne possède qu'un seul exon, a permis d'identifier des mutations dans la partie codante du gène GJB6 associées au syndrome de Clouston. Deux types de mutations ont été identifiées chez des malades qui sont d'origines géographiques diverses. La mutation 31 (G > A) entraîne le changement de la glycine en position 11 par une arginine. Une autre mutation, 263 (C > T), provoque le remplacement de l'alanine en position 88 par une valine. Ces mutations ne sont pas retrouvées chez des sujets normaux des familles étudiées et dans la population générale (118 individus ont été étudiés). Un premier aspect de l'invention est donc la séquence du gène humain GJB6, et les formes mutées de cette séquence impliquées dans le syndrome de Clouston. L'invention porte notamment sur des constructions d'ADN portant la séquence du gène humain GJB6 muté ou non, des vecteurs portant ces constructions, des cellules transformées par ces vecteurs, ainsi que des animaux transgéniques exprimant la connexine 30 humaine, sauvage ou mutée. L'invention porte également sur des oligonucléotides antisens dirigés contre les allèles mutés 31 (G > A) et 263 (C > T) et sur des vecteurs de transfert de gène destinés au traitement par thérapie génique du syndrome de Clouston, ainsi que sur une méthode de diagnostic de ce syndrome, des amorces PCR permettant la détection des mutations 31 (G > A) et 263 (C > T), et des kits de diagnostic du syndrome de Clouston. Les inventeurs ont donc démontré l'implication directe de la connexine 30 dans le syndrome de Clouston. Une des manifestations cliniques majeures du syndrome de Clouston, ou HED, est une hypotrichose. Cette hypotrichose atteint notamment le cuir chevelu et les cheveux peuvent être rares et très fins, voire absents. Il faut de plus noter que, par la consultation de la base de données OMIM (Online Medelian Inheritance in Man), le terme alopécie donne accès à 117 rubriques dont HED qui, par une des manifestations cliniques de la maladies, fait partie des alopécies. Il est remarquable que la connexine 30 soit la seule connexine identifiée à ce jour comme responsable d'une pathologie dermatologique pour laquelle les patients sont atteints d'alopécie. Il est donc probable que la connexine 30 soit aussi un des facteurs impliqués dans au moins certaines autres formes d'alopécies à prédisposition génétique. Il est possible de concevoir deux types de mutations du gène GJB6 responsables au moins partiellement d'alopécies indépendantes du syndrome de Clouston. Un premier type de mutation peut affecter les séquences régulatrices de l'expression du gène GJB6 et pourrait être à l'origine d'alopécie, notamment chez le sujet masculin. La présence dans les régions régulatrices du gène GJB6 de séquences nucléotidiques fixant les facteurs répondant aux androgènes pourrait être responsable d'alopécie androgénétique. Il ne faut toutefois pas exclure d'autres types de séquences dans les régions régulatrices, qui pourraient être impliquées dans l'expression de ce gène. Des molécules ou des facteurs protéiques intervenant dans la régulation de l'expression de GJB6 pourraient agir comme agents pharmacologiques, voire comme médicaments ou produits cosmétiques intervenant dans la croissance des poils. De telles molécules ou facteurs protéiques sont compris dans un groupe comprenant : . des molécules inhibant ou neutralisant des facteurs de transcription inhibiteurs de la transcription du gène GJB6, . des molécules activatrices de facteurs de transcription activant l'expression du gène GJB6, les facteurs de transcription impliqués dans la répression ou l'activation de l'expression du gène GJB6. L'action au niveau du gène GJB6 peut être directe, c'est-à-dire sur les facteurs de transcription ou d'inhibition de ceux-ci, ou indirecte, c'est-à-dire au niveau de la synthèse de substances ou de métabolites susceptibles d'interagir au niveau de ces facteurs. Un deuxième type de mutations du gène GJB6 susceptibles de favoriser une alopécie avec prédisposition génétique concerne des mutations dans la région codante du gène, qui entraîneraient une perte fonctionnelle au niveau de la protéine Cx-30. En effet, une des hypothèses pour expliquer le caractère dominant du syndrome de Clouston est que les mutations 31 (G > A) et 263 (C > T) rendent le produit du gène GJB6 inactif en empêchant, par exemple, son transport à la membrane plasmique (comme décrit pour des mutants de la Connexine 32 (VanSlyke, Deschenes et al. 2000)), ou sa capacité à former des connexons. Dans ce cas, la maladie pourrait être due à un phénomène d'haploinsuffisance. On peut émettre aussi l'hypothèse que ces mutants sont dominants négatifs et que la présence d'une ou plusieurs sous-unités non fonctionnelles dans un connexon soit suffisante pour altérer ou empêcher son fonctionnement. On peut donc imaginer que d'autres mutations dans le gène GJB6 puissent altérer partiellement la fonctionnalité des connexons, de manière moins drastique que les mutations impliquées dans le syndrome de Clouston, et que cette altération partielle soit seulement un facteur inhibant la croissance des cheveux et/ou favorisant leur chute. Il convient de noter que les alopécies avec prédispositions génétiques autres que le syndrome de Clouston sont peut-être d'origine multifactorielle, et en particulier polygénique. Toutefois, il est probable que certaines mutations du gène GJB6, situées dans la séquence codante ou dans les séquences régulatrices de l'expression de ce gène, soient associées à des alopécies à prédisposition génétique. Les considérations ci-dessus quant à l'implication du gène GJB6 dans les alopécies en général ont donc permis aux inventeurs de déterminer plusieurs applications liées à ce gène. La présente invention porte notamment sur des constructions d'acide nucléique comprenant le gène GJB6, le cas échéant portant une ou plusieurs mutations observées chez des patients ayant une alopécie congénitale ou impliquant manifestement des facteurs génétiques. Des cellules transformées et des animaux transgéniques portant l'une de ces constructions font également partie de l'invention. De tels cellules ou animaux transgéniques peuvent être utilisés pour cribler des molécules susceptibles d'avoir une effet bénéfique sur l'alopécie. En effet, il est possible de cribler des molécules en les mettant au contact de cellules portant une construction telle que celles décrites ci-dessus, et d'analyser ensuite l'effet desdites molécules sur l'expression de la connexine 30 et/ou sur sa fonctionnalité. L'expression de la connexine 30 peut être déterminée par exemple grâce à une puce à ADN, et sa fonctionnalité peut être testée par exemple par mesure de l'activité électrophysiologique des connexons, dans un système tel que l'oeuf de Xénope. De telles méthodes de criblage font également partie de l'invention. Par ailleurs, le caractère dominant du syndrome de Clouston suggère que la présence d'un allèle du gène GJB6 portant la mutation 31 (G > A) ou la mutation 263 (C > T) exprimé dans les cellules des follicules pileux est suffisante pour altérer les cycles anagène, catagène ou télogène du follicule pileux. Cette constatation permet d'imaginer des nouvelles stratégies destinées à corriger certaines anomalies liées à une hyper-pilosité (hirsutisme), ou plus généralement, à limiter la pilosité de certaines régions du corps, en transférant localement, dans les cellules épidermiques de la région dont on souhaite réduire la pilosité, un allèle muté du gène GJB6. En particulier, le transfert d'une molécule d'acide nucléique codant pour une forme de la connexine 30 portant une mutation non conservative au niveau du résidu 11 et/ou du résidu 88, entraînera une alopécie au niveau de la région traitée. Il est probable que d'autres mutations de la connexine 30 entraînent le même résultat. L'invention porte donc aussi sur l'utilisation d'un acide nucléique permettant l'expression d'une forme mutée non fonctionnelle de la connexine 30, pour la préparation de compositions pharmaceutiques et/ou cosmétiques destinées à réduire la pilosité des régions traitées. Les auteurs de la présente invention ont donc identifié et séquencé le gène responsable du syndrome de Clouston, qui est le gène GJB6, codant pour la connexine 30. Ils ont montré qu'un individu portant l'une des mutations 31 (G > A) ou 263 (C > T) dans ce gène est affecté du syndrome de Clouston. L'invention porte donc, en premier lieu, sur la séquence codante du gène humain de la connexine 30 (Seq ID non), ainsi que sur une molécule d'acide nucléique recombinant portant cette séquence, le cas échéant mutée de telle sorte que la mutation entraîne une substitution non conservative de l'acide aminé situé en position 11 et/ou de l'acide aminé situé en position 88. Dans l'ensemble de ce texte, le terme séquence désigne d'une part, l'information sur une succession de nucléotides, et d'autre part, le support de cette information, c'est- à-dire une molécule d'acide nucléique (ADN ou ARN) portant ladite succession de nucléotides. Dans une réalisation préférée des molécules d'acide nucléique de l'invention, la séquence codante du gène humain de la connexine 30 est placée sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans des cellules eucaryotes, notamment celles de l'épiderme ; de manière préférée, ce promoteur est le promoteur naturel du gène humain GJB6, le cas échéant muté. Des molécules d'acide nucléique comprenant une version du gène humain de la connexine 30 portant au moins une mutation fréquemment observée chez des sujets ayant une alopécie avec prédisposition génétique font également partie de l'invention, que la ou les mutation (s) en question soient situées dans la séquence codante du gène GJB6 ou dans les séquences régulatrices de l'expression de ce gène. L'identification de mutations à l'origine du syndrome de Clouston permet d'envisager une thérapie de cette pathologie. Ainsi, une réalisation particulière de l'invention porte sur un oligonucléotide antisens d'une région de la séquence codante de la connexine 30 comportant l'une des mutations 31 (G > A) ou 263 (C > T). Bien entendu, l'invention porte aussi sur des vecteurs de transfert de gène comportant un acide nucléique tel que ceux décrits ci-dessus. Ces vecteurs peuvent être des vecteurs viraux, par exemple dérivés d'un virus sélectionné dans le groupe constitué des adénovirus, des rétrovirus, des lentivirus, des virus associés à l'adénovirus (AAV), des virus herpès (HSV), du virus de la vaccine, des alphavirus, des baculovirus, du virus SV40, et du virus d'Ebstein-Barr. Il peut aussi s'agir de chimères comportant des éléments de plusieurs virus, ou de vecteurs non viraux, éventuellement synthétiques. Un des aspects de la présente invention est l'utilisation d'un acide nucléique ou d'un vecteur tel que ceux décrits ci-dessus, pour la préparation d'une composition destinée au traitement du syndrome de Clouston ou au traitement d'alopécies avec prédispositions génétiques. Un autre aspect de l'invention porte sur des couples d'amorces permettant de détecter les mutations 31 (G > A) ou 263 (C > T), et des méthodes de détection de ces mutations. Comme décrit dans l'exemple 2 ci-dessous, la mutation 31 (G > A) ne touche pas un site de restriction. En revanche, il est possible d'en créer un si l'on modifie une base proche du nucléotide 31. Pour cela, on peut réaliser une amplification mutagène, par exemple par PCR en utilisant des oligonucléotides qui modifieront, lors de la PCR, un nucléotide proche du nucléotide 31. Cette technologie permet de créer un site de restriction qui comprend ledit nucléotide 31. L'exemple 2 décrit une PCR mutagène permettant de créer le site de restriction Bcll à partir de l'allèle portant la mutation 31 (G > A), mais ne créant pas de site de restriction à partir de l'allèle non muté en position 31. Les deux allèles peuvent alors être identifiés par migration sur gel d'agarose après coupure par Ball. L'invention porte donc sur des couples d'amorces permettant l'amplification mutagène d'un fragment du gène GJB6 comportant le nucléotide en position 31, tel que les produits de l'amplification mutagène réalisée à partir d'un allèle GJB6 portant ou non la mutation 31 (G > A) soient discernables par digestion par une enzyme de restriction choisie. Dans une réalisation particulière de cet aspect de l'invention, l'enzyme de restriction est Ball, les amorces contiennent les séquences suivantes : 5'-ATGGATTGGGGGACGCTGCAC-3'et 5'-GCAGCCACCACTAGGATCATGACTCGGAAA-3'. L'invention porte aussi sur une méthode de recherche de la mutation 31 (G > A) pour le diagnostic du syndrome de Clouston, comportant les étapes suivantes : amplification d'un fragment du gène GJB6 avec un couple d'amorces tel que ceux décrits ci-dessus, . digestion du produit de l'amplification par l'enzyme de restriction appropriée, qui est Bcil dans le cas particulier où l'amplification a conduit à la création d'un site de restriction Bcil à partir de l'allèle portant la mutation 31 (G > A), analyse du produit de la digestion. La mutation 263 (C > T) supprime un site de restriction Haell existant sur l'allèle sauvage. La mutation peut donc être mise en évidence par amplification de la région contenant la mutation, suivie de la coupure du produit d'amplification par l'enzyme de restriction Haell. Les deux allèles peuvent alors être séparés par migration sur gel d'agarose. L'invention porte donc sur des couples d'amorces permettant l'amplification d'un fragment du gène GJB6 comportant le nucléotide en position 263, choisis de telle façon que la digestion par Haell du fragment amplifié permette de distinguer la présence ou non du site de restriction Haell entre les nucléotides 260 et 270. En particulier, l'invention porte sur un couple d'amorces de 20 à 50 nucléotides comprenant les séquences suivantes : 5'-CTTTGCCCACTTTTGTCTGT-3'et 5'-TGACGCAGCTACATTTTACCTT-3'. Ces couples d'amorces peuvent être utilisés dans une méthode de recherche de la mutation 263 (C > T) pour le diagnostic du syndrome de Clouston, comportant les étapes suivantes : amplification d'un fragment du gène GJB6 avec un couple d'amorces tel que ceux décrits ci-dessus, digestion du produit de l'amplification par l'enzyme Haell, . analyse du produit de la digestion, la présence de l'allèle muté conduisant à une bande non coupée par Haell. Les couples d'amorces décrits ci-dessus peuvent être inclus dans un kit de diagnostic du syndrome de Clouston, qui fait également partie de l'invention. Un tel kit peut contenir un ou plusieurs couples d'amorces. Il peut en outre comporter les enzymes de restriction Bcil et Haell et des tampons adaptés à l'activité de ces enzymes. La connaissance de mutations impliquées dans une pathologie monogénique dominante dont un des symptômes est une alopécie peut avoir d'autres applications. Ainsi, un acide nucléique ou un vecteur tel que ceux décrits cidessus et portant une version mutée du gène GJB6, conduisant par exemple à une mutation non conservative du résidu 11 ou du résidu 88, peut aussi être utilisé, suivant la présente invention, pour la préparation d'une composition destinée à limiter la pousse des poils et/ou à en favoriser la chute. D'autres mutations conduisant à une perte de fonctionnalité de la connexine 30 peuvent aussi être envisagées dans cet aspect de l'invention. La présente invention comprend donc aussi toute composition pharmaceutique et/ou cosmétique comportant une molécule d'acide nucléique et/ou un vecteur tel que ceux décrits ci-dessus. Suivant les cas, cette composition est destinée au traitement du syndrome de Clouston, au traitement d'autres alopécies avec prédisposition génétique, ou à la réduction de la pilosité de certaines régions du corps. La présente invention porte aussi sur les protéines recombinantes codées par les acides nucléiques et les vecteurs décrits ci-dessus, ainsi que sur toute composition pharmaceutique et/ou cosmétique comportant une ou plusieurs de ces protéines recombinates. Le cas échéant, ces protéines peuvent être tronquées. Une composition de l'invention peut aussi contenir seulement des fragments des protéines recombinantes décrites ci-dessus. De façon préférée, les compositions de l'invention sont administrables en application externe et locale. Il peut s'agir par exemple d'une crème, d'un gel ou d'un spray. Un autre aspect de l'invention concerne des cellules eucaryotes comportant une construction d'ADN recombinant telle que celles décrites ci-dessus. Dans ces cellules, la construction d'ADN recombinant permettant l'expression du gène humain de la connexine 30 peut être présente sous forme extrachromosomique ou être intégrée dans le génome desdites cellules. Dans une réalisation particulière de cet aspect de l'invention, les cellules comportant une construction d'ADN recombinant permettant l'expression du gène humain de la connexine 30 sont des cellules HeLa ou d'oeuf de Xénope. Dans les cellules de l'invention, l'expression de la connexine 30 humaine peut être stable ou transitoire, constitutive ou inductible. L'invention porte également sur un animal transgénique comportant des cellules exprimant le gène humain de la connexine 30, sous sa forme sauvage ou sous une forme mutée, telles que les cellules décrites ci-dessus. L'expression du gène humain de la connexine 30 dans un animal de l'invention peut être tissusspécifique ou non, et constitutive, inductible ou répressible. Les cellules et animaux transgéniques de l'invention peuvent notamment servir pour cribler des molécules efficaces dans le traitement de certaines alopécies. Fait donc également partie de l'invention, une méthode de criblage de molécules efficaces dans le traitement de certaines alopécies, comportant les étapes suivantes : - mise en contact de la molécule candidate et d'une cellule ou d'un animal selon l'invention, - détermination de l'effet de la molécule candidate sur le niveau d'expression du gène GJB6 et/ou sur l'activité de la connexine 30. Dans cette méthode, l'étape de détermination de l'effet de la molécule candidate sur le niveau d'expression du gène GJB6 peut être réalisée grâce à l'utilisation d'une puce à ADN. Dans une mise en oeuvre particulière de la méthode de la présente invention, la cellule portant un allèle du gène humain de la connexine 30 est un oeuf de Xénope, et l'étape de détermination de l'effet de la molécule candidate sur l'activité de la connexine 30 est réalisée par mesure de l'activité électrophysiologique des connexons. Les exemples et figures présentés ci-après, à titre non limitatif, illustrent et précisent certains aspects de la présente invention. Légende des figures : Figure 1 : Arbre généalogique des familles françaises (HED1 et HED2) et de la famille galloise analysées dans cette étude. Les numéros en gris représentent les individus dont l'ADN a été analysé. Figure 2 : Séquence du gène GJB6 avec le positionnement des différentes amorces utilisées. La partie codante est représentée en majuscules. Figure 3 : Génotypage d'individus malades et sains issus de deux familles porteuses de la mutation 31 (G > A). Le produit d'amplification par PCR mutagène de l'allèle mutant est coupé par Bcil et donne deux fragments (80 pb et 39 pb, qui n'est pas visible sur la photo). Le produit d'amplification par PCR mutagène de l'allèle sauvage n'est pas coupé (119 pb). Figure 4 : Génotypage d'individus issus de familles porteuses de la mutation 263 (C > T). Le produit d'amplification par PCR de l'allèle mutant (non coupé) a une longueur de 854 pb. Le produit d'amplification par PCR de l'allèle sauvage est coupé par Haell et donne deux fragments (304 pb et 550 pb). Exemple 1 : La recherche de mutations dans GJB6 Matériel génétique utilisé : Des échantillons d'ADN d'individus sains et atteints, d'origines géographiques diverses, on été utilisés (voir Tableau 1). Cette collection comporte notamment des échantillons provenant de deux familles françaises (HED1 et HED2) nonapparentées et porteuses de la maladie (voir Figure 1). Les individus non apparentés ayant servi de témoin négatif proviennent de plusieurs familles indépendantes du CEPH (Centre d'Étude du Polymorphisme Humain). Echantillon Statut Origine X1111 A Inde X1234 A Ecosse/Irlande X1239 S Ecosse/Irlande X1794 A Afrique du Sud Rou6206 S Canada (Québec) 1 Rou6209 A Canada (Québec) 1 Rou7571 S Canada (Québec) 2 Rou7572 A Canada (Québec) 2 Rou8946 A Espagne Rou8950 S Espagne Rou9387 S France Rou9455 A France Rou11442 A Canada (Québec) 3 Rou11444 S Canada (Québec) 3 Rou12862 A Pays de Galles Rou12866 S Pays de Galles Rou12863 S Pays de Galles Rou12864 A Pays de Galles Rou12865 A Pays de Galles X1089 A Pays de Galles X1798 A Malaisie Tableau 1 : Echantillons provenant d'individus sains (S) ou atteints (A) obtenus grâce à plusieurs collaborations. Séquençage du gène GJB6 : La recherche initiale de mutations dans le gène GJB6 a été faite par séquençage de trois fragments de PCR qui recouvrent la totalité du gène sans intron (couples F1/OPL2, S2/S6 et S3/R1 ; voir Figure 2 et Tableau 2). Les ADN d'un individu sain et d'un individu malade de chacune des deux familles étudiées ainsi que ceux des individus Rou12866 et Rou12862 (voir tableau 1) ont été séquencés. Ce travail a été effectué en collaboration avec le service de séquençage de Généthon. Amorce Séquence Cx30-F1 5'-CTTTGCCCACTTTTGTCTGT-3' Cx30-R1 5'-TGACGCAGCTACATTTTACCTT-3' Cx30-S2 5'-AACCGGGATGCAAAAATGTG-3' Cx30-S3 5'-TTCAGGCGAGGAGAGAAGAG-3' Cx30-S6 5'-GCTTGGGAAACCTGTGATTG-3' Cx30-OPL-2 5'-GACCCCTCTATCCGAACCTT-3' Tableau 2 : Séquences des différentes amorces utilisées pour séquencer le gène GJB6. Résultats : L'analyse des séquences des ADN provenant des individus V. 1 (malade) et 111. 15 (sain) de la famille HED1 (voir Figure 1) a permis de montrer que le premier est hétérozygote pour une mutation ponctuelle 31 (G > A) qui touche la première base du codon 11 de la séquence et entraîne une substitution d'un résidu glycine par un résidu arginine. Par ailleurs, le séquençage de la totalité de la séquence codante du gène GJB6 provenant d'un individu atteint (Rou12862) et d'un individu sain (Rou12866) d'une famille ne présentant pas la mutation 31 (G > A), a permis d'identifier, dans cette famille, une nouvelle mutation, 263 (C > T), dans ce même gène. Cette mutation touche la deuxième base du codon 89 de la séquence et entraîne une substitution d'un résidu alanine par un résidu valine. Exemple 2 : La confirmation des mutations dans GJB6 Principe de génotypage d'un grand nombre d'individus pour ces mutations : Le génotypage d'un grand nombre d'individus doit être effectué grâce à une technique simple permettant la détection de mutations déjà connues. La méthode utilisée ici consiste à mettre en évidence la création ou la disparition d'un site de restriction dans la séquence mutée. Deux techniques ont été utilisées : . Mutation 263 (C > T) : la mutation supprime un site de restriction Haell existant sur l'allèle sauvage. La mise en évidence de la mutation est effectuée par amplification par PCR de la région contenant la mutation puis par coupure du produit d'amplification par l'enzyme de restriction appropriée. Les deux allèles peuvent alors être séparés par migration sur gel d'agarose . Mutation 31 (G > A) : la mutation ne touche pas un site de restriction. En revanche, il est possible d'en créer un si l'on modifie également une base proche du site muté. On a utilisé ici des oligonucléotides mutagènes pour modifier, lors de la PCR, un nucléotide proche de la mutation, de façon à créer le site de restriction Ball. Les deux allèles peuvent alors être identifiés par migration sur gel d'agarose après coupure par l'enzyme appropriée. Mutation 31 (G > A) : Une fois la mutation 31 (G > A) identifiée, les mutations chez les autres individus ont été recherchées grâce à une PCR mutagène (Cx30-Bcll/Cx30-30mer-R ; voir tableau 3), qui crée un site de restriction Ben dans l'allèle muté. Le produit de PCR est alors digéré par l'enzyme Bcll. La migration sur gel (2% agarose + 2% Nusieveo) permet de distinguer l'allèle muté de l'allèle sauvage grâce à une différence de taille de 39 paires de bases. Amorce Séquence Cx30-Bcll 5'-ATGGATTGGGGGACGCTGCAC-3' Cx30-30mer-R 5'GCAGCCACCACTAGGATCATGACTCGGAA A-3' Cx30-F1 BglIl 5'-GGAAGA TCTTTTGCCCACTTT -3' Cx30-R1 BglIl 5'-GGAAGA TCTTGACGCAGCT AC-3' Cx30-F1 Hindlll 5'-GCAAGCTTCTTTGCCCACTTT-3' Cx30-R1 Hindlll 5'-GCAAGCTTGACGCAGCTACAT-3' Tableau 3 : Séquence des différentes amorces utilisées pour amplifier le gène GJB6 ou des fragments de ce gène Tous les échantillons disponibles des deux familles HED françaises ont été testés par cette PCR mutagène. Tous les individus atteints se sont avérés hétérozygotes alors que les individus sains sont homozygotes (voir Figure 3). Cette même méthode a permis de détecter la mutation 31 (G > A) chez d'autres malades d'origines géographiques diverses. (Voir Tableau 4). Mutation 263 (C > T) : Après sa découverte chez l'individu Rou12862, la mutation 263 (C > T) a été recherchée chez les autres individus selon la technique décrite ci-dessus. La mutation supprime un site de restriction Haell existant sur l'allèle sauvage. La distinction entre les deux allèles se fait après PCR (Cx30-F1/Cx30-R1 ; voir Tableau 3), et coupure enzymatique par Haell. Les individus hétérozygotes présentent une bande correspondant au produit de PCR non digéré en plus des bandes plus petites correspondant à l'allèle sauvage. La simple coupure des produits de PCR Cx30-F1/Cx30-R1 par l'enzyme Haell (voir Figure 4) a donc permis de vérifier que la totalité des individus atteints qui ne portaient pas la mutation 31 (G > A) présentent la mutation 263 (C > T) et que celle-ci est absente chez les individus sains (voir Tableau 4). Génotypage des témoins Afin de vérifier que ces deux mutations ne correspondent pas à du polymorphisme, l'ADN d'un grand nombre d'individus sains indépendants a été étudié par les deux stratégies décrites précédemment. Les 93 individus testés sont les grands-parents de 24 familles du CEPH. Les individus testés ne présentent aucune des deux mutations. Puisque la mutation 263 (C > T) a été identifiée dans une famille d'origine indienne, 21 indiens sains indépendants ont été testés. Ces individus ne présentent aucune des deux mutations. Echantillon Statut Mutation Origine X1111 A 263 (OT) hde X1234 A 31(G > A) Ecosse / Irlande X1239 S - Ecosse / Irlande X1794 A 31(G > A) Afrique du Sud Rou6206 S - Canada (Québec) 1 Rou6209 A 31 (G > A) Canada (Québec) 1 Rou7571 S - Canada (Québec) 2 Rou7572 A 31 (G > A) Canada (Québec) 2 Rou8946 A 31 (G > A) Espagne Rou8950 S - Espagne Rou9387 S - France Rou9455 A 31 (G > A) France Rou11442 A 31 (G > A) Canada (Québec) 3 Rou11444 S - Canada (Québec) 3 Rou12862 A 263 (C > T) Pays de Galles Rou12866 S - Pays de Galles Rou12863 S - Pays de Galles Rou12864 A 263 (C > T) Pays de Galles Rou12865 A 263 (C > T) Pays de Galles X1089 A 263 (C > T) Pays de Galles X1798 A 263 (C > T) Malaisie Tableau 4 : Génotypage des ADN obtenus grâce aux collaborations A = atteint. S = sain. Exemple 3 : Clonaae des allèles sauvage et mutants de la Connexine 30 Dans le but de procéder à des études fonctionnelles des connexines 30 sauvage et mutées dans divers systèmes cellulaires eucaryotes, les différents allèles du gène GJB6 ont été clonés dans le vecteur pUC19, flanqués des sites de restriction Bglll ou ti. Dans une première étape, le gène a été amplifié par PCR en utilisant des amorces contenant des sites de restriction 8gel ou Hindlll proches des extrémités 5' (Cx30-F1BgIII / Cx30-R1BgIII ou Cx30-F1HindIII / Cx30-R1HindIII, voir Tableau 3). Une fois le gène amplifié (à partir d'ADN génomique provenant d'individus malades, hétérozygotes, porteurs de chacune des deux mutations), les extrémités du produit d'amplification ont été rendues franches par action du fragment de Klenow de l'ADN Polymérase 1. Le produit de PCR a été cloné dans le vecteur pUC19 (linéarisé par une enzyme donnant des extrémités franches). Après ligation et transformation dans la souche de E. coli JM109, les recombinants ont été identifés par PCR en utilisant les amorces M13-21 et M13-40 du vecteur. La nature de l'insert (muté ou sauvage) a été déterminée par les techniques décrites dans l'exemple 2. Six clones différents ont été obtenus, correspondant à la forme sauvage et aux formes mutées 31 (G > A) et 263 (C > T), bordées de sites Bgill ou HindIII. Références : Dahl, E., D. Manthey, e/a/. (1996)."Moiecuiar doning and functional expression of mouse connexin-30, a gap junction gene highly expressed in adult brain and skin [published erratum appears in J Biol Chem 1996 Oct 18 ; 271 (42) : 26444]." J Biol Chem 271 (30) : 17903-10. Grifa, A., C. A. Wagner, et al. (1999)."Mutations in GJB6 cause nonsyndromic autosomal dominant deafness at DFNA3 locus [letter]."Nat Genet 23 (1) : 16-8. Kelley, P. M., S. Abe, et al. (1999)."Human connexin 30 (GJB6), a candidate gene for nonsyndromic hearing loss : molecular cloning, tissue-specific expression, and assignment to chromosome 13q12."Genomics 62 (2) : 172-6. Kibar, Z., V. M. Der Kaloustian, et al. (1996). "The gene responsible for Clouston hidrotic ectodermai dysplasia maps to the pericentromeric region of chromosome 13q."Hum Mol Genet 5 (4) : 543-7. Kibar, Z., M. P. Dube, et al. (2000). "Clouston hidrotic ectodermal dysplasia (HED) : genetic homogeneity, presence of a founder effect in the French Canadian population and fine genetic mapping [In Process Citation]."EurJ Hum Genet 8 (5) : 372-80. Lamartine, J., D. Laoudj, et al. (2000)."Refined localization of the gene for Clouston syndrome (hidrotic ectodermal dyspiasia) in a large French family."Br J Dermatol 142 (2) : 248-52. Lamartine, J., A. Pitaval, et al. (2000)."A 1. 5-Mb physical map of the hidrotic ectodermal dysplasia (Clouston syndrome) gene region on human chromosome 13q11."Genomics 67 (2) : 232-6. Rochat, A., K. Kobayashi, et al. (1994)."Location of stem cells of human hair follicles by clonal analysis." Cell 76 (6) : 1063-73. VanSlyke, J. K., S. M. Deschenes, et al. (2000). 1ntracellular transport, assembly, and degradation of wild-type and disease-linked mutant gap junction proteins. " Mol Biol Cell11 (6) : 1933-46. Revendications : 1. Acide nucléique recombinant codant le gène humain de la connexine 30 (Seq ID nu1), caractérisé en ce qu'un individu portant la mutation 31 (G > A) et/ou la mutation 263 (C > T) dans ce gène est affecté du syndrome de Clouston. 2. Acide nucléique recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence codante de la connexine 30 est mutée de telle sorte que la mutation entraîne une substitution non conservative de l'acide aminé situé en position 11 et/ou de l'acide aminé situé en position 88. 3. Acide nucléique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence codante du gène humain de la connexine 30 est placée sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans des cellules eucaryotes. 4. Acide nucléique selon la revendication 3, caractérisé en ce que le promoteur contrôlant l'expression du gène humain de la connexine 30 est le promoteur naturel du gène humain GJB6, le cas échéant muté. 5. Acide nucléique selon la revendication 4, caractérisé en ce que la mutation du gène humain de la connexine 30 est située dans la séquence codante du gène GJB6. 6. Acide nucléique selon la revendication 4, caractérisé en ce que la mutation du gène humain de la connexine 30 est située dans les séquences régulatrices de l'expression du gène GJB6. 7. Oligonucléotide antisens d'une région de la séquence de l'acide nucléique de la revendication 1 comportant l'une des mutations 31 (G > A) ou 263 (C > T). 8. Vecteur de transfert de gène comportant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9. Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus recombinant. 10. Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur non viral pour le transfert de gène. 11. Utilisation d'un vecteur selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, pour la préparation d'une composition destinée au traitement du syndrome de Clouston. 12. Utilisation d'un vecteur selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'alopécies avec prédisposition génétique. 13. Utilisation d'un vecteur selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, pour la préparation d'une composition destinée à limiter la pousse des poils et/ou à en favoriser la chute. 14. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1,3, 4 ou 7, pour la préparation d'une composition destinée au traitement du syndrome de Clouston. 15. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1,3, 4 ou 7, pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'alopécies avec prédisposition génétique. 16. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, pour la préparation d'une composition destinée à réduire la pilosité. 17. Cellule eucaryote comportant une construction d'ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 18. Cellule selon la revendication 17, telle que la construction d'ADN recombinant permettant l'expression du gène humain de la connexine 30 est présente sous forme extra-chromosomique. 19. Cellule selon la revendication 17, telle que la construction d'ADN recombinant permettant l'expression du gène humain de la connexine 30 est intégrée dans le génome de ladite cellule. 20. Cellule selon les revendications 17 à 19, caractérisée en ce qu'il s'agit de cellule HeLa ou d'oeuf de Xénope. 21. Animal transgénique comportant des cellules suivant l'une quelconque des revendications 17 à 19. 22. Méthode de criblage de molécules efficaces dans le traitement de certaines alopécies, comportant les étapes suivantes : - mise en contact de la molécule candidate et d'une cellule selon l'une quelconque des revendications 17 à 20 ou d'un animal selon la revendication 21, - détermination de l'effet de la molécule candidate sur le niveau d'expression du gène GJB6 et/ou sur l'activité de la connexine 30. 23. Méthode selon la revendication 22, dans laquelle l'étape de détermination de l'effet de la molécule candidate sur le niveau d'expression du gène GJB6 est réalisée grâce à l'utilisation d'une puce à ADN. 24. Méthode selon la revendication 22, dans laquelle la cellule portant un allèle du gène humain de la connexine 30 est un oeuf de Xénope, et l'étape de détermination de l'effet de la molécule candidate sur l'activité de la connexine 30 est réalisée par mesure de l'activité électrophysiologique des connexons. 25. Couple d'amorces permettant l'amplification mutagène d'un fragment du gène GJB6 comportant le nucléotide en position 31, tel que les produits de l'amplification mutagène réalisée à partir d'un allèle GJB6 portant ou non la mutation 31 (G > A) soient discernables par digestion par une enzyme de restriction choisie. 26. Couple d'amorces selon la revendication 25, caractérisé en ce que l'enzyme de restriction est Ball, et par les séquences suivantes : 5'-ATGGATTGGGGGACGCTGCAC-3'et 5'-GCAGCCACCACTAGGATCATGACTCGGAAA-3'. 27. Couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment du gène GJB6 comportant le nucléotide en position 263, caractérisé en ce que la digestion par Haell du fragment amplifié permette de distinguer la présence ou non du site de restriction Haell entre les nucléotides 260 et 270. 28. Couple d'amorces selon la revendication 27, caractérisé par les séquences suivantes : 5'-CTTTGCCCACTTTTGTCTGT-3'et 5'-TGACGCAGCTACATTTTACCTT-3'. 29. Méthode de recherche de la mutation 31 (G > A) pour le diagnostic du syndrome de Clouston, comportant les étapes suivantes : * amplification d'un fragment du gène GJB6 avec un couple d'amorces selon la revendication 25, . digestion du produit de l'amplification par l'enzyme de restriction appropriée, . analyse du produit de la digestion. 30. Méthode de recherche de la mutation 31 (G > A) selon la revendication 29, dans laquelle # l'amplification d'un fragment du gène GJB6 est réalisée avec un couple d'amorces selon la revendication 26, * le produit de l'amplification est digéré par l'enzyme Bcil, 'la présence de l'allèle muté conduit à une différence de 39 paires de bases. 31. Méthode de recherche de la mutation 263 (C > T) pour le diagnostic du syndrome de Clouston, comportant les étapes suivantes : * amplification d'un fragment du gène GJB6 avec un couple d'amorces suivant la revendication 27 ou 28, * digestion du produit de l'amplification par l'enzyme Haell, analyse du produit de la digestion, la présence de l'allèle muté conduisant à une bande non coupée par Haell. 32. Kit de diagnostic du syndrome de Clouston, comportant un ou plusieurs couples d'amorces suivant une ou plusieurs des revendications 25 à 28. 33. Kit de diagnostic selon la revendication 32, comportant en outre les enzymes de restriction Bcil et Haell et des tampons adaptés à l'activité de ces enzymes. 34. Protéine recombinante codée par une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou par un vecteur selon l'une quelconque des revendications 8 à 10. 35. Composition pharmaceutique et/ou cosmétique pour la prévention et/ou le traitement de désordres du système pileux, comportant une protéine recombinante selon la revendication 34 ou un fragment de celle-ci. 36. Composition pharmaceutique et/ou cosmétique pour la prévention et/ou le traitement de désordres du système pileux, comportant une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, et/ou un vecteur selon l'une quelconque des revendications 8 à 10. 37. Composition selon l'une quelconque des revendications 35 ou 36, caractérisée en ce qu'elle est administrable en application externe et locale.