Brevet FR2818991A1 — publié le 20020705

SOUCHES DE MICRO-ORGANISMES POUR LA MISE EN (EUVRE D'UN PROCEDE DE SURPRODUCTION DE METABOLITES, NOTAMMENT A ACTIVITE ANTIBIOTIQUE OU ENZYMATIQUE La présente invention a pour objet l'utilisation de souches de micro-organismes modifiés de telle sorte que lesdites souches ne produisent plus de polyphosphate kinase fonctionnelle, ainsi que leur utilisation dans le cadre de la mise en oeuvre de procédés de surproduction de métabolites normalement produits par lesdites souches non modifiées, tels que des antibiotiques ou des enzymes. Les streptomyces sont des bactéries filamenteuses qui produisent plus de 75% des antibiotiques utilisés en médecine humaine ou vétérinaire. La production d'antibiotiques est soumise à nombre de régulations complexes non totalement élucidées, parmi lesquelles on peut citer une répression par des sources de carbone, d'azote ou de phosphate facilement assimilables. Chez Streptomyces, il est connu de longue date que le phosphate inorganique (Pi) exogène, à savoir le phosphate inorganique présent dans le milieu de culture, a un très fort effet inhibiteur sur la biosynthèse des antibiotiques. De nombreuses espèces bactériennes, et notamment les souches de Streptomyces, sont capables de constituer des réserves de phosphate inorganique sous forme de polymères de phosphate, les polyphosphates (polyP), constitués de quelques dizaines à plusieurs centaines de résidus phosphates liés par liaison phospho-anhydride. Chez E. coli, la principale enzyme responsable de la biosynthèse de ce polymère (polyP) est la polyphosphate kinase codée par le gène ppk. Cette enzyme catalyse la synthèse des polyP à partir de FATP généré à l'intérieur de la cellule. Les polyP peuvent ensuite être dégradés en Pi par des polyP phosphatases. Les polyphosphates constituent donc une source de Pi endogène. Le mécanisme de synthèse et de dégradation des polyP peut être résumé par le schéma ci-dessous : ppk polyP phosphatases nATP------. polyPn +nADP---------. nPi Le métabolisme des polyPs a été tout d'abord essentiellement étudié chez E. coli par deux laboratoires américains, celui d'A. Komberg (A. Komberg et al., 1999, Annu. Rev. Biochem., 68 : 89-125) à Standford, et celui de Keasling (Van Dien and Keasling, 1999, Biotechnol. Prog., 15 : 587-593) à Berkeley. Puis l'intérêt s'est porté sur l'étude de ce métabolisme chez des bactéries impliquées dans les processus de dépollution d'eaux chargées en Pi telles qu'Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella aerogenes, Propionibacterium shermanii. Chez les différentes espèces bactériennes mentionnées ci-dessus, les gènes responsables de la synthèse (polyP kinase, Ppk) et de la dégradation (polyP phosphatase, Ppx) des polyPs ont été clonés. L'interruption ou la modulation du niveau d'expression de ces gènes ont permis l'étude du rôle des polyPs dans divers phénomènes biologiques. Les polyPs ont été trouvé impliqués : - dans le métabolisme du Pi (chez la levure et E. coli). La capacité de synthèse des polyPs à partir du Pi chez certaines bactéries (mentionnées ci-dessus) est utilisée pour réduire la pollution en Pi des eaux usées (Kortstee and van Veen, 1999, Progress in Molecular and Subcellular Biology, 23,275-97), - dans la régénération de NTP à partir de NDP grâce à l'activité nucléoside diphosphate kinase de Ppk (Tzeng and Komberg, 2000, J. of Biol. Chem. 275 : 3977-3983), - dans diverses réactions métaboliques catalysées par des kinases comme substitut de l'ATP (Phillips et al., 1999, Progress in Molecular and Subcellular Biology, 23 : 101-25), - dans la mobilité et donc la virulence de certaines souches pathogènes (Rashid et al., 2000, J. Bacteriol., 182 : 225-227), - dans le stockage et la tolérance (chélation/détoxification) aux métaux lourds (Keasling and Van Dien, 1998, Biotechnol. Bioeng., 58 : 231-9). Du fait de leur capacité à chélater les cations divalents souvent nécessaires à la vie bactérienne les polyPs ont un certaine action antibactérienne (Maier et al., 1999, Appl. Env. Microbiol., 65 : 3942-3949), - comme système tampon pour les alcalis chez l'algue verte Dunaliella salina (Pick and Weiss, 1991, Plant. Physiol., 97 : 1234-1240), en association avec le polyhydroxybutyrate et le Ca dans des pores membranaires qui joueraient un rôle dans l'entrée d'ADN (compétence) ou d'ions dans la cellule (R. N. Reusch, 2000, Biochemistry (Moscow), 65 : 335-352), dans la résistance à différents stresses (nutritionnel, osmotique, thermique, oxydatif) et dans la survie à la phase stationnaire chez E. coli. Les polyPs joueraient le rôle d'alarmone signalant un état de stress ou de carence (Ault-Riché et al., 1998, J. Bacteriol., 180 : 1841-1847), - dans la régulation du développement chez différentes bactéries ou champignons. Bien qu'aucun lien n'ait jamais été établi entre le métabolisme des polyphosphates et la production d'antibiotiques que cela soit chez la bactérie Streptomyces ou chez d'autres bactéries, on pouvait supposer que quelque soit son origine (exogène ou endogène à partir de l'hydrolyse des polyP), le Pi se retrouvant à l'intérieur de la cellule, il y exercerait son effet répresseur sur la biosynthèse d'antibiotiques. Les inventeurs, par la présente invention ont démontré que le phosphate inorganique (Pi), produit de façon interne par la souche de Streptomyces lividans à partir de l'hydrolyse des polyP, a un fort effet inhibiteur sur la biosynthèse d'antibiotiques. Les Inventeurs sont partis de l'hypothèse selon laquelle, après épuisement en Pi du milieu de culture, c'est l'hydrolyse des polyP qui fournit le Pi nécessaire à la vie de la cellule. Une souche mutante pour le gène ppk serait donc incapable de synthétiser des polyP et donc de constituer des réserves de Pi. Les Inventeurs ont mis en évidence que lors de l'épuisement du milieu extérieur en Pi, la souche mutante susmentionnée (en l'occurrence une souche de Streptomyces lividans chez laquelle le gène ppk, codant une polyphosphate kinase, est interrompu) est très précocement et gravement carencée en Pi, et cette carence extrême entraîne une induction massive de la biosynthèse d'antibiotique (jusqu'à 20 à 30 fois plus d'antibiotique que la souche sauvage sur un milieu approprié, tel que le milieu solide R2YE). Ce résultat est corroboré par le fait que les Inventeurs ont également mis en évidence que le phénotype surproducteur du mutant d'interruption de ppk est atténué en présence d'une forte concentration de Pi dans le milieu, et est inversement accentué quand le milieu est carencé en Pi. La présente invention a pour objet l'utilisation de souches de micro-organismes producteurs d'un ou plusieurs composés d'intérêt, et dont la biosynthèse est susceptible d'être inhibée par le phosphate inorganique d'origine endogène et/ou exogène, lesdits microorganismes étant modifiés de manière à ce que le gène ppk codant la polyphosphate kinase soit inactivé, pour la mise en oeuvre d'un procédé de stimulation de la production de ces composés d'intérêt par lesdites souches de micro-organismes ainsi modifiées. Avantageusement, lesdites souches de micro-organismes sont modifiées par inactivation du gène ppk, de manière à ce qu'elles ne synthétisent plus de polyP, et donc qu'indirectement elles ne produisent plus de phosphate inorganique (Pi) interne, ou en produisent dans des quantités inférieures à celles des souches identiques aux précédentes mais dont le gène ppk n'est pas inactivé, de sorte que la production de composés d'intérêt par lesdites souches modifiées soit supérieure à celle des souches non modifiées (notamment d'un facteur d'environ 20% à 50% ou plus). Par procédé de stimulation de la production de composés d'intérêt, tel que mentionné ci-dessus, on entend tout procédé selon lequel la production de ces composés est augmentée, notamment dans des proportions d'environ 20% à 50% ou plus, par rapport à la production de ces mêmes composés dans des souches identiques aux précédentes mais dont le gène ppk n'a pas été inactivé. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de microorganismes producteurs de composés d'intérêt choisis parmi les métabolites à activité antibiotique, anticancéreuse, antihelmintique, antifongique, herbicide, insecticide, ou de micro-organismes producteurs d'enzymes. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée, de souches de micro-organismes de l'ordre des Actinomycétales, notamment ceux producteurs de métabolites à activité antibiotique. A ce titre, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de souches d'Actinomyces producteurs de métabolites à activité antibiotique choisies parmi les souches de Streptomyces, de Bacillus, de Micromonospora, de Saccharopolyspora, de Streptoverticillium, de Nocardia, de Cephalosporium, de Penicillium, de Corynebacterium, d'Actinoplanes, d'Actinomadura, de Dactylosporangium, et de Mycobacterium. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de souches listées dans le tableau 1 ci-après dans le cadre de la stimulation de la production des antibiotiques également listés dans ce tableau I. Avantageusement encore, les souches de micro-organismes utilisées dans le cadre de l'invention, sont des souches de micro-organismes producteurs d'enzymes. La production d'enzymes telles que celle des protéases, cellulases, endoglucanases, . béta. -glucanases, hemicellulases, lipases, peroxidases, laccases,. alpha. -amylases, glucoamylases, chitinase, cutinases, agarase, ligninase, nucléase, pectinases, reductases, oxidases, phenoloxidases, ligninases, pullulanases, arabinosidases, mannanases, xyloglucanases, xylanases, pectin acetyl esterases, polygalacturonases, rhamnogalacturonases, galactanases, pectin lyases, pectin methylesterases, cellobiohydrolases, transglutaminases produites par différents genres bactériens tels qu'ErniKM, Pseudomonas, Klebsiella, Xanthomonas, et par différentes espèces de Bacilles, de champignons, de levures ou d'Actinomycètales, sont susceptibles d'être produites en plus grande quantité par les microorganismes modifiés selon l'invention, dans la mesure où la synthèse de ces enzymes est régulée par le phosphate inorganique. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de souches de micro-organismes dont le gène ppk codant pour la polyphosphate kinase est modifié par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide, de telle sorte que le gène ppk ainsi modifié ne code plus pour une polyphosphate kinase active. L'invention concerne également l'utilisation de séquences nucléotidiques recombinantes comprenant tout ou partie du gène ppk codant pour la polyphosphate kinase chez les micro-organismes producteurs de composés d'intérêt, tels que ceux définis cidessus, ledit gène étant modifié par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide, pour la transformation de souches desdits micro-organismes, en vue de l'obtention de souches de ces micro-organismes ne produisant plus de polyphosphate kinase active. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de séquences nucléotidiques recombinantes telles que définies ci-dessus, comprenant un fragment du gène ppk, la taille de ce fragment représentant avantageusement au moins environ 50% de la taille du gène ppk entier, ledit fragment étant modifié par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide. L'invention a également pour objet l'utilisation susmentionnée de séquences nucléotidiques dérivées des séquences recombinantes telles que définies ci-dessus, ayant avantageusement un pourcentage d'homologie avec ces séquences recombinantes d'au moins environ 70% (à savoir un pourcentage susceptible de permettre une recombinaison homologue). L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de séquences nucléotidiques recombinantes telles que définies ci-dessus comprenant tout ou partie du gène ppk de Streptomyces coelicolor, ledit gène étant délimité par les nucléotides situés aux positions 1001 et 3325 de la séquence représentée sur la figure 1 (encore désignée SEQ ID NO : 1), ou comprenant tout ou partie de toute séquence ayant un pourcentage d'homologie avec le gène susmentionné d'au moins environ 70%. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique recombinante délimitée par les nucléotides situés aux positions 744 et 2869 de la séquence représentée sur la figure 1, et modifiée de la manière indiquée cidessus. Avantageusement, les séquences nucléotidiques recombinantes comprenant tout ou partie du gène ppk de Streptomyces coelicolor, telles que définies ci-dessus, sont utilisées pour la transformation de toute souche de micro-organismes dont le gène ppk possède un pourcentage d'homologie avec le gène ppk de Streptomyces coelicolor d'au moins environ 70%. A ce titre, les séquences nucléotidiques recombinantes comprenant tout ou partie du gène ppk de Streptomyces coelicolor, telles que définies ci-dessus, sont utilisées non seulement pour la transformation de la souche S. coelicolor elle-même, mais également pour la transformation de toute souche de Streptomyces, et plus particulièrement de Streptomyces lividans, S. actuosus, S. bikiniensis, S. glaucesens, S. graminofaciens, S. griseofuscus, S. lincolnensis, S. parvulus, S. pristinaespiralis, S. tendae, S. venezuelae, S. violaceoniger, S. wadayamensis, S. ambofaciens ATCC 23877 et S. ambofaciens ATCC 15154. L'invention a également pour objet toute séquence nucléotidique recombinante comprenant tout ou partie du gène ppk codant pour la polyphosphate kinase chez les microorganismes producteurs de métabolites ou d'enzymes, tels que ceux définis dans le tableau I, ledit gène étant modifié par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide. L'invention a plus particulièrement pour objet toute séquence nucléotidique recombinante telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend un fragment du gène ppk, la taille de ce fragment représentant avantageusement au moins environ 50% de la taille du gène ppk entier, ledit fragment étant modifié par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide. L'invention concerne plus particulièrement toute séquence nucléotidique recombinante telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que le gène ppk est modifié par insertion d'une séquence hétérogène au niveau d'un site de restriction déterminé dans la séquence du gène. L'invention a également pour objet toute séquence nucléotidique recombinante telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique codant pour la polyphosphate kinase est modifiée par insertion au niveau d'un site de restriction déterminé de ladite séquence, d'une cassette contenant un marqueur, tel qu'un marqueur de résistance à un antibiotique, notamment l'hygromycine. L'invention concerne également toute séquence nucléotidique telle que définie cidessus, comprenant tout ou partie du gène ppk de Streptomyces coelicolor, ledit gène étant délimité par les nucléotides situés aux positions 1001 et 3325 de la séquence représentée sur la figure 1, ou comprenant tout ou partie de toute séquence ayant un pourcentage d'homologie avec le gène susmentionné d'au moins environ 70%. L'invention a plus particulièrement pour objet toute séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, délimitée par les nucléotides situés aux positions 744 et 2869 de la séquence représentée sur la figure 1. L'invention concerne également toute séquence nucléotidique telle que définie cidessus, caractérisée en ce que le gène ou le fragment du gène ppk, est modifié par insertion au niveau du site StuI délimité par les positions 1352 et 1357 de la séquence représentée sur la figure 1, d'une séquence hétérogène, telle qu'une cassette contenant un marqueur, notamment un marqueur de résistance à un antibiotique, telle que l'hygromycine (notamment de la cassette de 2300 nucléotides comprenant un marqueur de résistance à l'hygromycine telle que décrite dans Blondelet-Rouault etal., 1997). L'invention a également pour objet tout vecteur, notamment tout plasmide, le cas échéant à réplication thermosensible, contenant une séquence nucléotidique recombinante telle que définie ci-dessus. L'invention concerne également les souches de micro-organismes producteurs de métabolites ou d'enzymes, lesdits micro-organismes étant modifiés de manière à ce que le gène ppk codant pour la polyphosphate kinase soit inactivé. L'invention concerne plus particulièrement les souches de micro-organismes modifiés telles que définies ci-dessus, lesdites souches étant productrices de composés d'intérêt tels que définis ci-dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet les souches de micro-organismes modifiés telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles sont choisies parmi les souches de l'ordre des Actinomycétales, telles que celles définies dans le tableau I. L'invention concerne également les souches de micro-organismes modifiés telles que définies ci-dessus, lesdites souches étant productrices d'enzymes, et étant avantageusement choisies parmi les souches mentionnées ci-dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet les souches de micro-organismes susmentionnées, telles qu'obtenues par transformation desdits micro-organismes avec un vecteur défini ci-dessus. L'invention a également pour objet un procédé de préparation de souches de microorganismes telles que définies ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - le cas échéant, le clonage de tout ou partie du gène ppk de la souche de microorganisme que l'on souhaite modifier, et l'amplification d'une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus contenant tout ou partie du gène ppk de ladite souche, à l'aide de deux amorces oligonucléotidiques choisies à partir de séquences connues situées dans le gène ppk, ou situées de part et d'autre de ce gène, - modification de la séquence nucléotidique contenant tout ou partie du gène ppk de souches de micro-organismes, telle que celle obtenue lors de l'étape précédente, par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide, - transformation de souches de micro-organismes à l'aide de vecteurs contenant la séquence nucléotidique recombinante obtenue lors de l'étape précédente, - sélection des souches de micro-organismes transformées ayant intégré dans leur génome la séquence nucléotidique recombinante susmentionnée en lieu et place de la séquence nucléotidique du gène ppk originel. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé de l'invention, la séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus contenant tout ou partie du gène ppk, est modifiée par insertion d'une cassette comportant un marqueur, notamment un marqueur de résistance à un antibiotique, afin de sélectionner les souches modifiées obtenues. La séquence recombinante ainsi obtenue est ensuite clonée dans un vecteur approprié, notamment dans un plasmide capable de transfert interspécifique et capable ou non de se répliquer de façon thermosensible dans la souche du micro-organisme à modifier. Après transformation des souches avec le vecteur susmentionné, la sélection des souches modifiées se fait directement par observation de la présence ou non du marqueur porté par la cassette dans le génome des souches modifiées, après un passage ou non à haute température selon que le plasmide est à réplication thermosensible, ou n'est pas réplicatif. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé de l'invention, la séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus contenant tout ou partie du gène ppk, est modifiée par addition ou délétion d'au moins un nucléotide. Dans ce cas, il est préférable d'utiliser un vecteur à réplication thermosensible, et, après passage à haute température, on repère les colonies ayant perdu le plasmide (colonies sensibles à l'antibiotique auquel le plasmide confère d'ordinaire la résistance) et qui surproduisent l'antibiotique sur un milieu approprié. Ces colonies pourront être repérées sur boîte de milieu de culture approprié en les faisant pousser en présence d'une souche sensible à l'antibiotique produit. En variante, ce dernier procédé peut également être effectué en deux étapes. Dans un premier temps, la séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus contenant tout ou partie du gène ppk, est modifiée par insertion d'une cassette susmentionnée conférant une résistance à un antibiotique, puis cette séquence modifiée par insertion est remplacée par une version délétée de cette séquence. Dans ce cas, on repère les colonies redevenues sensibles à l'antibiotique auquel la cassette confère d'ordinaire la résistance. L'invention a également pour objet un procédé de stimulation de la production de métabolites, notamment de métabolites à activité antibiotique ou autre, ou d'enzymes, par des micro-organismes utilisés pour la production de ces composés, ledit procédé comprenant la mise en culture de souches de micro-organismes modifiés telles que définies ci-dessus, dans un milieu de culture approprié. Avantageusement, le procédé susmentionné de l'invention est caractérisé en ce que la culture est effectuée dans un milieu riche (à savoir un milieu contenant des acides aminés comme source de carbone et d'azote) avec une pression osmotique équivalente à celle conférée par 103 g/1 de saccharose et sans ajout de phosphate inorganique exogène. Tableau 1 Liste des organismes producteurs d'antibiotiques I) Organismes producteurs d'aminocyclitols ORGANISME ANTIBIOTIQUE Bacillus (espèces variées) Ammocyclitols Mjtromonospora (espèces variées) Gentamycines Saccharopolyspora (espèces variées) Aminocyclitols Streptomyces albogriseolus Neomycines albus var. metamycinus Metamycine aquacanus N-methyl hygromycine B atrofaciens Hygromycines bikiniensis Streptomycine bluensis var. bluensis bluensis var. bluensis Bluensomycine canus Ribosyl paromamine catenulae Catenuline chrestomyceticus aminosidine crystallinus hygromycine A erythrochromogenes streptomycine var. narutoensis eurocidicus A16316-C fradiae hybrimycines et neomycine fradiae var. italicus aminosidine galbus streptomycine griseus streptomycine griseoflavus MA 1267 hofuensis seldomycine complexe hygroscopicus hygromycinse hyg-roscopicusforma leucanicidine et hygrolidine glebosus glebomycine hygroscopicus var. limoneus validamycines hygroscopicus var. sagamiensis spectinomycine kanamyceticus kanamycine A et B kasuqaensis kasugamycines kasugaspinus kasugamycins lavendulae neomycine lavendulae neomvome lividus lividus lividomycines mashuensis rnashuensis streptomycine microsporeus SF-767 netropsis LL-AM31 noboritoensis hygromycines olzvaceus olivaceus streptomycine olivoreticuli var. cellulophilus destomycine A poolensis poolensis streptomycine rameus streptomycine ribosidificus SF733 rimofaciens rimofaciens destomycine A rimosus forma paromomycinus paromomycines, catenuline spectabilis spectinomycine tenebrarius tenebrarius tobramycine et apramycine Streptoverticilliumflavopersieus spectinomycine II) Organismes producteurs d'Ansamycine ORGANISME ANTIBIOTIQUE Micromonospora (espèces variées) ansamycmes Nocardia mediterranei rifamycine Streptomyces collinus ansatrienes, napthomycines diastochromogenes ansatrienes, napthomycines galbus subsp. griseosporeus napthomycine B hygroscopicus herbimycine hygroscopicus var. geldanus geldamycine var. nova nigellus 21-hydroxy-25-demethyl 25-methylthioprotostreptovaricine rishiriensis mycotrienes sp. E/784 actamycin and mycotriene sp. E88 mycotrienes spectabilis streptovaricines tolypophorous tolypomycine III) Organismes producteurs d'Anthracycline et de Quinone ORGANISME ANTIBIOTIQUE Streptomyces caespitosus mitomycines A, B, et C coelicolor actmorllodme coelicolor actinorhodine coeruleorubidicus daunomycine cyaneus cyan eus ditrisarubicine flavogriseus cyanocycline A galilaeus aclacinomycine A, auramycines, sulfurmycines lusitanus napthyridinomycine peuceticus daunomycine, adriamycine violochromoqenes arugomycine IV) Organismes producteurs de Beta Lactame ORGANISME ANTIBIOTIQUE Cephalosporium (espèces variées) beta-lactames Nocardia lactamadurans cephamycine C Penicillium (espèces variées) beta-lactames Streptomyces antibioticus acide clavulanique argenteolus asparenomycine A, MM 4550, MM 13902 cattleya thienamycine chartreusis SF 1623, cephamycine A and B cinnamonensis cephamycine A and B clavuligerus PA-32413-1, cephamycine C, A16886A, acide clavulanique, et autres clavames fimbriatus cephamycine A and B flavovirens MM 4550 et MM 13902 flavus MM 4550 et MM 13902 fulvoviridis MM 4550 et MM 13902 griseus cephamycine A et B halstedi cephamycine A et B heteromorphus C2081X, cephamycine A, B hygroscopicus deacetoxycephalosporine C lipmanii penicilline N, 7-methoxycephalosporine C, Al 6884, MM 4550, et MM 13902 olivaceus (MM 17880) epithienamycine F, MM 4550, et MM 13902 panayensis C2081X, cephamycine A, B pluracidomyceticus pluracidomycine A rochei cephamycine A et B sioyaensis MM 4550 et MM 13902 sp. OA-6129 OA-6129A sp. KC-6643 carpetimycine A tokunomensis asparenomycine A viridochromogenes cephamycine A et B wadayamensis WS-3442-D V) Organismes producteurs de Macrolide, Lincosamide, et Streptogramine ORGANISME ANTIBIOTIQUE Micromonospora rosaria rosaramicine Streptomyces albireticuli carbomycine aoMeo mikonomycine albus albomycetine 17 mlkonomyome albus var. coilmyceticus coleimycine ambofaczens ambofaciens spiramycine, foromacidine D antibioticus antibiotieus oleandomycine avermitilis avermitilis avermectines 6'nM chalcomycine bruneogriseus albocycline cae/eM M188, celesticetme cinerochromogenes cmeromycine B cirratus cirramycine deltae deltamycines dyakartensis djakartensis niddamycine erythreus erythromycines eurocidicus methymycine eurythermus angolamycine fasciculus amaromycine felleus argomycine et picromycine amaromycine flavochromogenes amaromycine, et shincomycines fradiae tylosine fungicidicus NA-181 fungicidicus var. espinomyceticus espinomycetines furdicidicus furdicidicus mydecamycine goshikiensis bandamycine griseofaciens PA133A et B griseoflavus acumycme griseofuscus bundline griseolus griseomycine griseospiralis relomycine griseus borrelidine griseus ssp. sulphurus bafilomycines halstedi carbomycine, leucanicidine hygroscopicus tylosine hygroscopicus subsp aureolacrimosus milbemycines oeM leucomycine A. sub. 3, etjosamycine lavendulae aldgamycine Izncolnensis lincolnensis lincomycine loidensis vemamycine A et B macrosporeus carbomycine maizeus ingrainycine mycarofaciens acetyl-leukomycine, et espinomycine narbonensis josamycine et narbomycine narbonensis var. josamyceticus leucornycine A, josamycine olivochromogenes oleandomycine platensis platenomycine rimosus tylosine et neutramycine rochei lankacidine et borrelidine rocheivar. volubilis T2636 roseochromogenes albocyline roseocitreus albocycline spinichromoenes var. suragaoensis kujirnycines tendae carbomycine thermotolerans carbomycine venezuelae methymycines violaceoniger lankacidines, lankamycine VI) Espèces de Streptomyces producteurs d'antibiotiques variés a) Analogues d'aminoacides Streptomyces sp. Cycloserine b) Contenant des noyaux cyclopentanes Streptomyces coelicolor methylenomycine A erythrochromogenes sarkomycine violaceoruber methylenomycine A c) Containing de l'azote Streptomyces venezuelae chloramphenicol d) Polyènes Streptomyces griseus candicidine nodosus amphotericine B noursei nystatine e) Tétracyclines Streptomyces aureofaciens tetracycline, chlortetracycline, demethyltetracycline, et demethylchlortetra-cycline rimosus oxytetracycline VII) Organismes producteurs de Nucléosides ORGANISME ANTIBIOTIQUE Corynebacterium michiganese pv. rathayi analogues de tunicamycine Nocardia candidus pyrazofurine Streptomyces antibioticus ara-A chartreusis tunicamycine griseoflavus var. streptoviridans thuringiensis griseolus sinefungine VIII) Organismes producteurs de Peptides ORGANISME ANTIBIOTIQUE Actinoplanes missouriensis actaplanine teichomyceticus teicoplanine Bacillus (espèces variées) bacitracine, polymixine, et colistine Nocardia candidus A-35512 et avoparcine lurida ristocetine orientalis vancomycme Streptomyces antibioticus actinomycine aureus thiostreptone canus amphomycine eburosporeus LL-AM374 haranomachiensis vancomycine pristinaespiralis pristinamycine roseosporus lipopeptides, tel A21978C toyocaensis A47934 virginiae A1030 IX) Organismes producteurs d'Antibiotiques ORGANISME ANTIBIOTIQUE Actinomadura (espèces variées) polyéthers variés Dactylosporangium (espèces variées) polyéthers variés Nocardia (espèces variées) polyéthers variés Stre Streptomyces albus A204, A28695A et B, et salinomycine aureofaciens narasine cacaoi var. asoensis lysocelline chartreusis A23187 cmnamonensis monensine conglobatus ioilomycine eurocidicus var. asterocidicus laidlomycine flaveolus CP38936 gallinarius RP 30504 griseus grisorixine hygroscopicus A218, emericide, DE3936, A120A, A28695A et B, etheromycine, dianemycine lasaliensis lasalocide longwoodensis lysocelline mutabilis S-1173 a ribosidificus lonomycine violaceoniger nigericine Streptoverticillium (espèces variées) polyéthers variés L'invention sera davantage détaillée à l'aide de la description qui suit du clonage et de l'interruption du gène ppk de Streptomyces lividans : - Un gène codant une protéine possédant 57% d'identité avec la polyphosphate kinase d'E. coli (Akiyama et al., 1992) a été trouvé dans le génome en cours de séquençage de Streptomyces coelicolor, espèce très voisine de S. lividans. Ce gène code pour une protéïne putative de 774 acides aminés. - Un site unique StuI (enzyme donnant des bords francs) situé au premier tiers du gène a été repéré (il est souligné sur la séquence représentée sur la figure 1) et considéré comme étant bien situé pour servir de site d'insertion à une cassette d'interruption. - Deux oligos A et B (respectivement représentés par les nucléotides situés aux positions 744 et 763, et ceux situés aux positions 2850 et 2869 de la séquence représentée sur la figure 1) ont alors été conçus de façon à ce que le site StuI soit situé au centre d'un fragment de 2106 bp après amplification par PCR. - Le fragment amplifié à l'aide de ces oligos a ensuite été cloné dans le site SmaI du plasmide pIJ2925 (Janssen and Bibb, 1993) pour donner pHCl. - pHCl a été digéré par StuI (site unique dans le plasmide) et la cassette Q Hygro qui confère la résistance à l'hygromycine (Blondelet-Rouault et al., 1997) a été cloné dans ce site, sous forme d'un fragment BamHI klenowté pour donner pHC2. - L'insert de pHC2 a été transféré sous forme d'un fragment B. g711 dans le site BamHI de pGM160 (Muth et al., 1989). pGM160 est un vecteur navette E. coli/S. lividans à réplication thermosensible chez S. lividans. Il porte les gènes bla et tsr qui confèrent la résistance à l'ampicilline chez E. coli et au nosiheptide chez S. lividans respectivement, ainsi que le gène aacC7 qui confère la résistance à l'apramycine à E. coli et S. lividgns. Ce nouveau plasmide pHC3 a été introduit chez S. lividans par les techniques de transformation habituelles (Hopwood et al., 1985). Les colonies transformées ont été sélectionnées en présence de nosiheptide. Afin de procéder à un remplacement du gène ppk sauvage par son allèle interrompu, une colonie de S. lividans TK24 contenant pHC3 et donc résistante au nosiheptide a été broyée et mise à pousser pendant 24 h à 30 C dans 2 ml de milieu TSB (Hopwood et al., 1985 contenant du nosiheptide à 20 ng/ml. - Le mycélium ainsi produit a ensuite été potterisé et le broyat a servi à inoculer à faible densité 2 ml de milieu TSB contenant de l'hygromycine à 50 ag/ml. - La culture a ensuite été mise à pousser à 41 C pendant 48 heures afin de permettre l'élimination du plasmide réplicatif. - Le mycélium a ensuite été récolté, broyé, et soniqué de façon à avoir des fragments mycéliens correspondant à une seule cellule. Ces derniers ont été étalés en dilution sur des boîtes de milieu HT agar (Hopwood et al., 1985) contenant de l'hygromycine à 50 Jlglml afin d'avoir des colonies bien séparées. - Les colonies sporulées ont ensuite été répliquées sur milieu HT et milieu HT contenant du nosiheptide à 20 Jlglml afin de repérer les colonies sensibles au nosiheptide. Environ 33% des colonies résistantes à l'hygromycine étaient sensibles au nosiheptide. Ces dernières avaient perdu le plasmide réplicatif. La structure de l'ADN chromosomique de quatre colonies indépendantes résistantes à l'hygromycine et sensibles au nosiheptide a ensuite été déterminée par la technique du transfert à la Southem (Hopwood et al., 1985). De l'ADN chromosomique a été préparé à partir de ces quatre colonies, a été digéré par XhoI (qui ne coupe pas dans la cassette Qhygro), mis à migrer sur gel d'agarose à 1%, transféré sur membrane Hybond et hybridé avec le fragmentppk amplifié par PCR. Les résultats montrent (figure 2) que chez la colonie n 4, la taille du fragment chromosomique XhoI initial de 1.8kb portant le gène ppk est augmentée de 2.3kb (taille de la cassette Q2ro), il fait donc 4. 1kb. On a bien eu dans ce cas là, le remplacement du gène ppk sauvage par l'allèle interrompu. QUANTIFICATION Nous avons quantifié la production d'actinorhodine (composé bleu) de la façon suivante : Environ 106 spores de la souche sauvage de référence et de la souche interrompue pour le gène ppk ont été étalées sur une boîte de milieu gelosé riche standard R2YE à la surface duquel avaient été déposée une membrane cellophane laissant passer les nutriments. Ces boîtes ont été mises à pousser pendant environ deux semaines à 30 C. En soulevant la membrane cellophane, des carottes de milieu gelosé ont été prélevées à partir de chacun des deux types de boîtes à l'aide d'un emporte-pièce adéquat. Chacune de deux types de carottes a été dissoute dans lml d'H2O par chauffage pendant 1 Omnà 90 C. L'absorbance des solutions ainsi obtenues a été déterminée à 600nm (longueur d'onde à laquelle l'antibiotique actinorhodine, composé bleu, absorbe) à l'aide d'un spectrophotomètre contre un blanc constitué d'H20. Les solutions où les carottes provenaient du milieu où la souche inactivée pour le gène ppk avait poussé présentaient une absorption 20 à 30 fois supérieure à celles des carottes provenant du milieu où la souche sauvage avait poussé. Cette méthode de détection est valable dans ce cas car nous avons à faire à un antibiotique coloré mais cette situation est peu fréquente. Dans la plupart des cas, le repérage des souches surproductrices s'effectuera en présence d'une souche de micro-organisme (dite souche indicatrice) sensible à l'antibiotique produit. MILIEU R2YE Composition du milieu R2YE (Hopwood et al., 1985) utilisé pour le test du phénotype d'hyper-production d'actinorhoddine du mutant d'interruption du gène ppk de Streptomyces lividans (P9) Pour 1 litre : sucrose : 103g K2SO4 : 0. 25g MgCl2. 6H20 : 10. 12g Glucose : 10g Casaminoacids Difco : O. lag Solution d'éléments minéraux* : 2ml Extrait de levure Difco : 5g Tampon TES : 5. 73g Agar : 22g Autoclaver et ajouter après autoclavage : KH2P04à0. 5% : 10ml CaCl2. 2H20 à 5M : 4ml L-prolineà 20% : 15ml NaOh à 1M : 7ml Solution d'éléments minéraux pour 1 litre : # -ZnCl2 : 40mg .-FeCl3. 6H20 : 200mg .-CuCl2. 2H20 : 10mg '-MnCl2. 4H20 : 10mg *-Na2B407. 10H20 : 10mg *- (NH4) 6Mo7024. 4H20 : 10mg REFERENCES : 1. Akiyama, M., E. Crooke, and A. Kornberg. 1992. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. JBiol Chem. 267 (31) : 22556-61. 2. Blondelet-Rouault, M. H., J. Weiser, A. Lebrihi, P. Branny, and J. L. Pernodet. 1997. Antibiotic resistance gene cassettes derived from the omega interposon for use in E. coli and Streptomyces. Gene. 190 (2) : 315-7. 3. Hopwood DA, B. M., Chater KF, Kieser T, Bruton CJ, Kieser HM, Lydiate DJ, Smith CP, Ward JM and schrempf H. 1985. Genetic Manipulation of Streptomyces : a laboratory Manual., Norwich : John Innes Foundation. 4. Janssen, G. R., and M. J. Bibb. 1993. Derivatives of pUC18 that have BglII sites flanking a modified multiple cloning site and that retain the ability to identify recombinant clones by visual screening of Escherichia coli colonies. Gene. 124 (1) : 133-4. 5. Muth, G., B. Nussbaumer, W. Wohlleben, and A. Pülher. 1989. A vector system with temperature-sensitive replication for gene disruption and mutational cloning in streptomycetes. Mol Gen Genet. 219 : 341-348. LEGENDE DES FIGURES Figure 1 : Séquence nucléotidique d'un fragment de 3780bp de S. coelicolor contenant le gène ppk codant la polyphosphate kinase. Les codons de début et de fin de traduction sont en caractères gras. Les oligonucléotides A et B utilisés pour l'amplification par PCR du fragment d'ADN qui a servi à l'interruption du gène ppk de S. lividans sont en caractères gras et italiques. Le site StuI et les deux sites XhoI internes à ppk sont respectivement souligné et doublement soulignés. Figure 2 : Les ADNs chromosomiques de la souche sauvage TK24 (puit TK24) et de 4 colonies dérivées de cette souche (puits 1,2, 3 et 4) mais ayant subit une procédure standard de remplacement de gène décrite ci-dessus ont été digérés par XhoI, mis à migrer sur gel d'agarose à 1 %, transférés sur membrane Hybond et hybridés avec le fragmentppk amplifié par PCR. Le puit kb contient une échelle de marqueurs de taille. REVENDICATIONS 1. Utilisation de souches de micro-organismes producteurs de composés d'intérêt, dont le gène ppk codant la polyphosphate kinase est inactivé, pour la mise en oeuvre d'un procédé de stimulation de la production de ces composés d'intérêt par lesdites souches transformées. 2. Utilisation selon la revendication 1, de souches de micro-organismes producteurs de composés d'intérêt choisis parmi les métabolites à activité antibiotique, anticancéreuse, antihelmintique, antifongique, herbicide, insecticide, ou enzymatique. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, de souches d'Actinomycètes producteurs de métabolites à activité antibiotique choisies parmi les souches de Streptomyces, de Bacillus, de Micromonospora, de Saccharopolyspora, de Streptoverticillium, de Nocardia, de Cephalosporium, de Penicillium, de Corynebacterium, d'Actinoplanes, d'Actinomadura, de Dactylosporangium, et de Mycobacterium. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, de souches de micro-organismes dont le gène ppk codant pour la polyphosphate kinase est modifié par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide, de telle sorte que le gène ppk ainsi modifié ne code plus pour une polyphosphate kinase active. 5. Utilisation de séquences nucléotidiques recombinantes comprenant tout ou partie du gène ppk codant pour la polyphosphate kinase chez les micro-organismes producteurs de composés d'intérêt, tels que ceux définis dans la revendication 2 ou 3, ledit gène étant modifié par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide, pour la transformation de souches desdits micro-organismes, en vue de l'obtention de souches de ces microorganismes ne produisant plus de polyphosphate kinase active. 6. Utilisation selon la revendication 5, de séquences nucléotidiques recombinantes comprenant un fragment du gène ppk, la taille de ce fragment représentant au moins environ 50% de la taille du gène ppk entier, ledit fragment étant modifié par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide. 7. Utilisation selon la revendication 5 ou 6, de séquences nucléotidiques dérivées des séquences recombinantes telles que définies dans les revendications 5 et 6, ayant avantageusement un pourcentage d'homologie avec ces séquences recombinantes d'au moins environ 70%. 8. Utilisation selon l'une des revendications 5 à 7, de séquences nucléotidiques recombinantes comprenant tout ou partie du gène ppk de Streptomyces coelicolor, ledit gène étant délimité par les nucléotides situés aux positions 1001 et 3325 de la séquence représentée sur la figure 1, ou comprenant tout ou partie de toute séquence ayant un pourcentage d'homologie avec le gène susmentionné d'au moins environ 70%. 9. Utilisation selon l'une des revendications 5 à 8, de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 744 et 2869 de la séquence représentée sur la figure 1. 10. Séquence nucléotidique recombinante comprenant tout ou partie du gène ppk codant pour la polyphosphate kinase chez les micro-organismes producteurs de composés d'intérêt, tels que ceux définis dans la revendication 2 ou 3, ledit gène étant modifié par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide. 11. Séquence nucléotidique recombinante selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend un fragment du gène ppk, la taille de ce fragment représentant au moins environ 50% de la taille du gène ppk entier, ledit fragment étant modifié par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide. 12. Séquence nucléotidique recombinante selon la revendication 10 ou 11, caractérisée en ce que le gène ppk est modifié par insertion d'une séquence hétérogène au niveau d'un site de restriction déterminé dans la séquence du gène. 13. Séquence nucléotidique recombinante selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique codant pour la polyphosphate kinase est modifiée par insertion au niveau d'un site de restriction déterminé de ladite séquence, d'une cassette contenant un marqueur, tel qu'un marqueur de résistance à un antibiotique, notamment l'hygromycine. 14. Séquences nucléotidiques recombinantes selon l'une des revendications 10 à 13, comprenant tout ou partie du gène ppk de Streptomyces coelicolor, ledit gène étant délimité par les nucléotides situés aux positions 1001 et 3325 de la séquence représentée sur la figure 1, ou comprenant tout ou partie de toute séquence ayant un pourcentage d'homologie avec le gène susmentionné d'au moins environ 70%. 15. Séquence nucléotidique recombinante selon l'une des revendications 10 à 14, délimitée par les nucléotides situés aux positions 744 et 2869 de la séquence représentée sur la figure 1. 16. Séquence nucléotidique recombinante selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce que le gène ou le fragment du gène ppk, est modifié par insertion au niveau du site Stuhl délimité par les positions 1352 et 1357 de séquence représentée sur la figure 1, d'une séquence hétérogène, telle qu'une cassette contenant un marqueur, notamment un marqueur de résistance à un antibiotique, telle que l'hygromycine. 17. Vecteur contenant une séquence nucléotidique recombinante selon l'une des revendications 10 à 16. 18. Souches de micro-organismes producteurs de composés d'intérêt, lesdits microorganismes étant modifiés de manière à ce que le gène ppk codant pour la polyphosphate kinase soit inactivé. 19. Souches de micro-organismes selon la revendication 18, lesdites souches étant productrices de composés d'intérêt définis dans la revendication 2. 20. Souches de micro-organismes selon la revendication 18 ou 19, caractérisées en ce qu'elles sont choisies parmi les souches de l'ordre des Actinomycétales, telles que celles définies dans la revendication 3. 21. Souches de micro-organismes selon l'une des revendications 18 à 20, telles qu'obtenues par transformation desdits micro-organismes avec un vecteur selon la revendication 17. 22. Procédé de stimulation de la production de composés d'intérêt, notamment de composés définis dans la revendication 2, par des micro-organismes habituellement utilisés pour la production de ces composés, ledit procédé comprenant la mise en culture de souches de ces micro-organismes transformés telles que définies dans l'une des revendications 18 à 21 dans un milieu de culture approprié.