Brevet FR2818747A1 — publié le 20020628

La présente invention a pour objet des méthodes de détection, identification et/ou criblage de composés pouvant notamment être utilisés pour le traitement des cancers ou de certaines maladies neuro-dégénératives, liés à des dérèglements dans la régulation de la suppression tumorale et/ou de l'apoptose, dans la chaîne biologique de p53. L'apoptose, ou mort cellulaire, est un phénomène complexe qui est régulé par de nombreuses protéines, dont la protéine p53. cette protéine interagit avec de nombreuses autres protéines, et son expression, qui induit les phénomènes de mort cellulaire et de réversion tumorale, peut être corrélée avec l'induction ou la répression de l'expression d'autres gènes cellulaires. Les inventeurs de la présente invention ont ainsi mis en évidence des gènes induits et activés lors de la cascade menant à la répression tumorale et/ou l'apoptose (TSAP pour Tumor Suppressor Activated Pathway ), ou des gènes réprimés (TSIP pour Tumor Suppressor Inhibited Pathway ). Ces gènes ont fait notamment l'objet des demandes de brevets WO 97/22695 ou WO 00/08147. Il est important de pouvoir comprendre précisément les mécanismes de la cascade de p53, afin de pouvoir générer de nouveaux composés ayant une activité antitumorale (pouvant notamment induire l'apoptose ou la suppression tumorale), ou pouvant être utilisés pour le traitement de maladies neuro-dégénératives. En effet, les inventeurs de la présente demande ont démontré que la préséniline 1 (PSI), dont la rôle avait été suggéré dans la maladie d'Alzheimer, était identique à la protéine TSIP 2 décrite dans la demande WO 97/22695. Ainsi, il est légitime de rechercher des médicaments pouvant interférer dans l'apoptose, afin de réduire ce phénomène, et qui pourraient être utilisés dans les maladies neuro-dégénératives. La présente invention se rapporte à des procédés de criblage et d'identification de produits pouvant interférer dans la cascade de p53, et ainsi induire la réversion tumorale et/ou l'apoptose ou inversement, diminuer les phénomènes d'apoptose. La présente invention est basée sur le fait que la protéine TSAP 3, décrite dans la demande de brevet WO 97/22695 se lie à la protéine Numb (telle que décrite dans la base de donnée GenBank, sous le numéro d'accession Aft 15040), qui présente elle-même des interactions avec Mdm2, une protéine impliquée dans les processus de contrôle de p53. La présente invention est également basée sur le fait que la liaison de TSAP 3 (aussi identifiée comme étant la protéine Siah-1, appelée ainsi ou, de façon indifférente, Siah) à Numb induit la dégradation de la protéine Numb, par une voie dépendante du protéasome de l'ubiquitine. Ainsi, dans un premier mode de mise en oeuvre, la présente invention se rapporte à des procédés de criblage et/ou de sélection ou d'identification d'un composé interférant avec, réduisant ou inhibant la liaison de Siah à Numb, présentant les étapes de : a) mise en contact dudit composé avec une cellule mammifère exprimant les protéines Siah et Numb ; b) identification de l'augmentation de la quantité de protéine Numb dans ladite cellule mammifère par rapport à une cellule témoin avec laquelle ledit composé n'a pas été mis en contact. Dans un second mode de mise en oeuvre, l'invention est dirigée vers un procédé de criblage, de sélection ou d'identification d'un composé interférant avec, réduisant ou inhibant la liaison de Siah à Numb, présentant les étapes de : a) mise en contact dudit composé avec un système permettant la détermination in vitro de la liaison entre Siah et Numb ; b) identification de la diminution et/ou l'inhibition de la liaison entre Siah et Numb. Dans un autre mode de mise en oeuvre, les enseignements de la présente invention permettront d'identifier des composés qui, se liant à Numb, éventuellement à la place de Siah, vont induire une dégradation de Numb plus importante que la dégradation induite par la protéine Siah. En conséquence, la diminution de quantité de Numb impliquera une augmentation de la quantité de p53 présente, et une augmentation de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire (apoptose). En conséquence, l'invention est dirigée vers un procédé de criblage, de sélection et/ou d'identification d'un composé pour l'augmentation de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire (apoptose), présentant les étapes de : a) mise en contact dudit composé avec une cellule mammifère exprimant les protéines Siah et Numb ; b) identification de la diminution de la quantité de protéine Numb dans ladite cellule mammifère par rapport à une cellule témoin avec laquelle ledit composé n'a pas été mis en contact. De façon inverse, la présente invention a notamment également pour objet un procédé de criblage, de sélection ou d'identification d'un composé pour la diminution et/ou l'inhibition de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire (apoptose), présentant les étapes de : a) mise en contact de composés avec un système permettant la détermination in vitro de la liaison entre Siah et Numb ; b) identification des composés induisant la diminution et/ou l'inhibition de la liaison entre Siah et Numb ; c) mise en contact des composés identifiés dans l'étape b) avec une cellule mammifère exprimant les protéines Siah et Numb ; d) identification de l'augmentation de la quantité de protéine Numb dans ladite cellule mammifère par rapport à une cellule témoin avec laquelle ledit composé n'a pas été mis en contact. Afin de déterminer des composés permettant l'augmentation de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire (apoptose), il est également possible de combiner différents procédés selon l'invention, il est notamment possible d'obtenir ainsi un procédé de criblage, de sélection ou d'identification de composés ayant pour fonction une augmentation de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire (apoptose), présentant les étapes de : a) mise en contact dudit composé avec un système permettant la détermination in vitro de la liaison entre Siah et Numb ; b) identification des composés induisant la diminution et/ou l'inhibition de la liaison entre Siah et Numb. c) mise en contact des composés sélectionnés dans l'étape b) avec une cellule mammifère exprimant les protéines Siah et Numb ; d) identification de la diminution de la quantité de protéine Numb dans ladite cellule mammifère par rapport à une cellule témoin avec laquelle ledit composé n'a pas été mis en contact. Un tel procédé est donc également un objet de la présente invention. La présente invention utilise donc le fait que les protéines Siah et Numb peuvent se lier l'une à l'autre. Il est donc intéressant d'identifier les domaines de chaque protéine qui sont effectivement en contact avec l'autre protéine. En effet, ceci devrait permettre de pouvoir utiliser les peptides ainsi identifiés en tant que leurres ou agonistes des protéines complètes. Ceci peut ainsi permettre de définir des composés qui interféreront dans la liaison Siah-Numb, et qui pourront soit induire la suppression tumorale et/ou l'apoptose (notamment si ces peptides ont un effet sur la dégradation de Numb (peptides issus de Siah)), soit à l'inverse diminuer ces phénomènes (notamment si ces peptides empêchent la liaison de Siah à Numb (soit qu'ils soient peptides leurres issus de Numb, ou qu'ils soient issus de Siah empêchent la liaison de cette protéine à Numb, notamment par compétition). La présente invention a donc notamment pour objet un procédé d'identification d'une région de Siah active pour l'augmentation de la suppression tumorale et/ou de l'apoptose, comportant les étapes de : a) mise en contact de peptides issus de la protéine Siah avec une cellule mammifère exprimant la protéine Numb ; b) identification de la diminution de la quantité de protéine Numb dans ladite cellule mammifère par comparaison avec la quantité de protéine Numb présente dans une cellule mammifère témoin exprimant les protéines Siah et Numb. Par région de Siah , on entend notamment des peptides de séquence primaire issue de la séquence primaire de la protéine Siah. La présente invention est donc également dirigée vers un procédé d'identification d'une région de Siah active pour la diminution et/ou l'inhibition de la suppression tumorale et/ou de l'apoptose, comportant les étapes de : a) mise en contact de peptides issus de la protéine Siah avec une cellule mammifère exprimant la protéine Numb ; b) identification de l'augmentation de la quantité de protéine Numb dans ladite cellule mammifère par comparaison avec la quantité de protéine Numb présente dans une cellule mammifère témoin exprimant les protéines Siah et Numb. De façon plus générale, la présente invention permet l'identification de régions de Siah impliquées dans la liaison avec la protéine Numb, par un procédé comportant les étapes de : a) mise en contact de peptides issus de la protéine Siah dans un système permettant la détermination in vitro de la liaison entre Siah et Numb ; b) identification des peptides entraînant la diminution de la liaison entre Siah et Numb dans ledit système ; Il est évident que la présente invention permet également la détermination des régions de Numb impliquées dans la liaison avec Siah, selon des procédés semblables aux procédés décrits précédemment que ces régions peuvent notamment être utilisées comme leurres lorsque l'on désire diminuer la répression tumorale et/ou l'apoptose. La présente invention permet donc d'identifier des produits permettant d'interagir avec la liaison Siah-Numb, et donc pouvant avoir un intérêt dans la régulation de l'apoptose et/ou la répression tumorale. Toutefois, il est possible que ces produits, pour pouvoir être utilisés pour un traitement thérapeutique, notamment le cancer ou les maladies neuro-dégénératives, nécessitent d'être optimisés, afin d'avoir une activité supérieure, et/ou une toxicité moindre. En effet, le développement d'un médicament est souvent effectué sur le principe suivant : criblage de composés ayant une activité voulue par une méthode approprié, - sélection des composés répondant au cahier des charges (ici, une action sur les phénomènes d'apoptose et de réversion tumorale), - détermination de la structure (notamment la séquence (éventuellement tertiaire) s'il s'agit de peptides, formule et squelette s'il s'agit de composés chimiques) des composés sélectionnés, - optimisation des composés sélectionnés, par modification de la structure (par exemple par le changement de la conformation stéroéochimique (par exemple passage de L en D des acides aminés dans un peptide), ajout de substituants sur les squelettes peptidiques ou chimiques, notamment par greffage de résidus sur le squelette, modification des peptides (voir notamment Gante ("Peptidomimetics", dans Angewandte Chemie-Intemational Edition Engl. 1994, 33. 1699-1720), passage et criblage des composés ainsi obtenus sur des modèles appropriés qui sont souvent des modèles plus proches de la pathologie étudiée. A ce stade, on utilise notamment souvent des modèles animaux, en général chez les rongeurs (souris, rats...) ou chez des chiens, voire des primates. Les modèles animaux qui peuvent être utilisés sont par exemple, pour le cancer, des modèles basés sur des souris immunodéprimées (par exemple scid/scid), auxquelles on injecte (notamment en sous-cutané) des cellules tumorales, qui vont mener au développement de tumeurs. On étudie l'efficacité des composés potentiellement anti-tumoraux, par exemple par la mesure de la taille des tumeurs formées. On peut, pour l'étude des maladies neuro-dégénératives, utiliser le modèle décrit par Amson et al. (2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,5346-50), qui consiste en des souris déficientes en p53, ou le modèle décrit dans Chen et al., Janus et al., et Morgan et al. (2000, Nature, 408 pp. 975-985) Ainsi, la présente invention a notamment pour objet de permettre l'identification de composés qui pourraient être utilisés pour le traitement du cancer, en ce qu'ils possèdent une activité d'augmentation de la répression tumorale et/ou de l'apoptose. Un des objets de la présente invention est donc un procédé comportant les étapes de : a) mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, permettant d'identifier des composés ayant une certaine activité d'augmentation de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, b) modification du produit sélectionné à l'étape a), c) test du produit modifié dans l'étape b) dans des procédés in vitro et/ou in vivo, sur des modèles pertinents de répression tumorale et/ou d'apoptose, d) identification du produit permettant d'obtenir une activité de répression tumorale et/ou d'apoptose supérieure à l'activité obtenue pour le produit sélectionné à l'étape a). L'étape d) peut être remplacée par une étape d'), qui serait : d') identification du produit permettant d'obtenir l'effet biologique cherché avec une toxicité moindre dans un modèle animal (lorsque un des modèles utilisés dans l'étape c) est in vivo). Lorsque l'on effectue les tests sur des modèles d'apoptose ou de répression tumorale in vitro, on peut par exemple utiliser le modèle K256/KS décrit par Tellerman et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8702-6). On peut également utiliser les cellules Ml-LTR, décrites par Amson et al. (1996, Proc. Natl. Acad. SCI ; USA, 93, 3953-7), ou les cellules U937/US3-US4, décrites par Nemani et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 9039-42). Les essais in vivo peuvent être réalisés en injectant ces cellules des animaux, notamment des souris immunodéprimées et en étudiant les effets des différents composés testés. L'homme du métier saura définir les conditions et les seuils nécessaires pour l'identification d'un produit pouvant être utilisé en tant que médicament, selon les exigences réglementaires (notamment de toxicologie), par rapport au bénéfice apporté par le produit ainsi identifié. De la même façon, l'invention concerne également les procédés d'optimisation des produits réprimant la répression tumorale et/ou l'apoptose, identifiés par les procédés décrits plus haut, et permettant l'identification de produits utilisables comme médicaments. Ainsi l'invention concerne également un procédé d'identification d'un produit ayant une activité de diminution et/ou d'inhibition de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes de : a) mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, permettant d'identifier des composés ayant une certaine activité de diminution de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, b) modification du produit sélectionné à l'étape a) notamment par greffage de résidus sur le squelette chimique, c) test du produit modifié dans l'étape b) dans des procédés in vitro et/ou in vivo, sur des modèles pertinents de répression tumorale et/ou d'apoptose, d) identification du produit permettant d'obtenir une activité de répression tumorale et/ou d'apoptose réduite par rapport à l'activité obtenue pour le produit sélectionné à l'étape a). L'étape d) peut également être remplacée par une étape d'), qui serait : d') identification du produit permettant d'obtenir l'effet biologique cherché avec une toxicité moindre dans un modèle animal (lorsque un des modèles utilisés dans l'étape c) est in vivo). Il s'agit en effet encore de pouvoir obtenir le produit qui présente le meilleur rapport (activité biologique et effet clinique) / (risques potentiels d'utilisation). Les paramètres à mettre enjeu pour obtenir ces résultats sont tous connus et à la portée de l'homme du métier, désirant développer de nouveaux médicaments, et peuvent être trouvés par exemple dans les directives des organismes tels que l'Agence du Médicament, la Commission Européenne, ou la Federal Drug Agency. La mise en oeuvre des procédés selon la présente invention nécessite des modèles permettant de déterminer la liaison entre Siah et Numb, ainsi qu'une mesure aisée des augmentations ou diminution de la quantité de protéine Numb dans une cellule eucaryote. La quantité de protéine Numb peut être étudiée par Western Blot, la révélation s'effectuant par utilisation d'un anticorps dirigé contre ladite protéine. De tels anticorps peuvent notamment être obtenus au Weizmann Institute of Science, Rhovot, Israël, sous la référence WIS 3465, ou chez Transduction Laboratories (référence N80220). Afin de mettre en oeuvre les procédés selon l'invention nécessitant l'étude et le criblage sur des cellules mammifères, il peut être avantageux de surexprimer l'une ou l'autre des protéines Siah et Numb dans lesdites cellules, ou les deux ensemble. Ainsi, il est plus facile de pouvoir étudier les variations dans la quantité de protéine Numb, notamment par comparaison des cellules sur lesquelles on teste les composés d'intérêt avec les mêmes cellules, auxquelles on n'ajoute pas les composés que l'on désire cribler, et des cellules qui expriment Numb, sans exprimer Siah (contrôles positifs). Il est entendu que l'expression des deux protéines Siah et Numb peut être augmentée par introduction des gènes (notamment les ADNc) codant pour ces deux protéines dans les cellules, soit placés sur des vecteurs, soit par introduction dans le chromosome. Lorsque l'on choisit une expression épisomale, ladite cellule mammifère est transfectée par au moins un vecteur choisi parmi un vecteur portant un fragment d'ADN codant pour Siah, un vecteur portant un fragment d'ADN codant pour Numb, un vecteur portant un fragment d'ADN pour Siah et un fragment d'ADN codant pour Numb. Ainsi, le même vecteur peut exprimer les deux protéines, alternativement il est possible d'introduire deux vecteurs. Il est possible d'utiliser des vecteur permettant l'expression et la purification facile des protéines Siah et Numb, par exemple dans des cellules procaryotes (E. coli, B. subtils...) ou eucaryotes (levures telles Saccharomyces, Kluyveromyces..., cellules mammifères (HeLa, Cos, Hep-2...) ou d'insectes (en utilisant un système à Baculovirus). Ainsi, il peut être avantageux que les protéines possèdent une étiquette à leur extrémité N-ou C-terminale, afin de faciliter la purification. On choisit notamment une étiquette Histidine, ou GST. Ces méthodes sont bien connues de l'homme du métier, qui trouve les plasmides appropriés dans les catalogues de sociétés telles Stratagène. Lorsque l'on met en oeuvre les procédés selon l'invention sur des modèles in vitro, pour étudier la liaison entre Numb et Siah, il existe plusieurs façons d'opérer. Un protocole utilisable peut être le suivant : expression et purification des protéines Siah et Numb, par exemple dans des cellules procaryotes (E. coli, B. subtils...) ou eucaryotes (levures telles Saccharomyces, Kluyveromyces..., cellules mammifères (HeLa, Cos, Hep- 2...) ou d'insectes (en utilisant un système à Baculovirus). Il peut être avantageux que les protéines possèdent une étiquette à leur extrémité N-ou C-terminale, afin de faciliter la purification. On choisit notamment une étiquette Histidine, ou GST. Ces méthodes sont bien connues de l'homme du métier, qui trouve les plasmides appropriés dans les catalogues de sociétés telles Stratagène. liaison des protéines à des billes appropriées. Lorsque l'on utilise une étiquette GST, on lie les protéines exprimées à des billes de sépharose présentant de la Gluthathione. - préparation de protéines par traduction in vitro. Ceci peut aisément être effectué en utilisant des vecteurs commerciaux (par exemple disponibles chez Promega), qui permettent de cloner les ADNc sous le contrôle de promoteurs bien connus (T7 ou T3), et d'utiliser les ARN polymérases appropriées pour produire les ARN, puis d'effectuer l'expression des protéines in vitro., en utilisant les trousses disponibles, et en suivant les indications du fabriquant. - co-précipitation des protéines, en ajoutant les protéines obtenues par traduction in vitro aux billes de sépharose-glutathione sur lesquelles sont fixées les protéines de fusion avec la GST. Après un temps de contact suffisant, on lave les billes et on effectue une analyse par gel d'électrophorèse en SDS-PAGE, et autoradiographie. L'apparition des bandes correspondant aux deux protéines montre bien la liaison entre celles-ci. L'utilisation de contrôles appropriés permet ainsi de définir la diminution et/ou l'inhibition de la liaison entre Siah et Numb, par comparaison des quantités de protéines libérées après ajout du composé testé lors de l'étape de coprécipitation avec les quantités de protéines libérées dans les contrôles. On peut aussi étudier la liaison des protéines en utilisant le système FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) qui consiste à marquer chacune des protéines avec un résidu approprié, la liaison des deux protéines induisant une réaction entre chacun des deux résidus et l'émission d'une fluorescence aisément détectable. La présente invention a également pour objet les composé pouvant être obtenu par un procédé selon l'invention, notamment les composés possédant une activité d'augmentation de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, ceux possédant une activité d'inhibition de la liaison Siah-Numb, ainsi que ceux possédant une activité de diminution et/ou d'inhibition de la répression tumorale et/ou de l'apoptose. La présente invention concerne également les séquences peptidiques correspondant à une région de Siah interagissant avec la protéine Numb, qui peuvent notamment être identifiées par un procédé selon l'invention. L'invention concerne aussi les séquences peptidiques correspondant à une région de Numb interagissant avec la protéine Siah, qui peuvent notamment être identifiées par un procédé selon l'invention, le procédé permettant d'identifier les séquences peptidiques de Siah interagissant avec Numb pouvant être adapté pour déterminer les séquences peptidiques de Numb interagissant avec Siah, notamment en adaptant le protocole in vitro développé ci-dessus. L'invention concerne aussi les séquences nucléotidiques codant pour les séquences peptidiques ainsi identifiées. Il est clair que le terme séquence peptidique ou séquence nucléique ou nucléotidique (ces deux derniers termes étant utilisés de façon indifférente) représentent des séquences isolés, c'est-à-dire hors de leur état naturel, et peuvent notamment être modifiés par le remplacement de leurs unités de bases par des unités non-naturelles, ou par la modification des liaisons entre les unités de bases (par exemple les phosphorothioates (acide nucléique) ou les Peptid Nucleic Acids) Il est un objet de l'invention que de permettre l'identification de composés interférant avec la liaison Siah et Numb, certains de ces composés pouvant notamment induire des effets sur la cascade de p53. Ainsi, les composés selon l'invention, les séquences peptidiques selon l'invention, ou les séquences nucléotidiques selon l'invention, à titre de médicament, sont également objets de l'invention. Un composé identifié par une méthode selon l'invention peut être un composé ayant une structure chimique, un lipide, un sucre, une protéine, un peptide, un composé hybride protéine-lipide, protéine-sucre, peptide-lipide, ou peptidesucre, une protéine ou un peptide sur lequel on a ajouté des ramifications chimiques. Parmi les composés chimiques envisagés, ils peuvent contenir un ou plusieurs cycles, aromatique (s) ou non, ainsi que plusieurs résidus de toute sorte (notamment alkyle inférieur, c'est-à-dire présentant entre 1 à 6 atomes de carbones). Ces composés, séquences nucléiques, séquences peptidiques, peuvant ainsi être utilisés pour la préparation d'un médicament, destiné notamment au traitement du cancer, ou d'une maladie neuro-dégénérative, selon l'effet pro-ou antiapoptose/réversion tumorale. Les inventeurs de la présente demande ont, pour la première fois, mis en évidence le fait que la protéine Siah se lie à la protéine Numb. Ainsi, la présente invention concerne également un complexe constitué d'une protéine Siah et d'une protéine Numb. La présente invention concerne également un procédé d'inhibition de la liaison de Siah à Numb dans une cellule, comprenant l'étape de : a) mise en contact de ladite cellule avec un composé identifié par un procédé selon l'invention, inhibant la liaison Siah-Numb. Le composé ainsi envisagé peut également être un peptide leurre issu de la protéine Siah ou de la protéine Numb. Le procédé peut être mis en oeuvre in vitro ou in vivo. La présente invention est également dirigé vers une méthode pour le traitement d'un cancer, caractérisée en ce que l'on administre, à un patient, un composé identifié selon la présente invention et augmentant l'apoptose et/ou la réversion tumorale. Une méthode pour le traitement d'une maladie neuro-dégénérative, consistant à administrer, à un patient, un composé selon la présente invention et diminuant ou inhibant l'apoptose, est également un objet de la présente invention. Ainsi que précisé et démontré dans les exemples, la protéine Siah, non seulement se lie à la protéine Numb, mais induit également sa dégradation selon la voie du protéasome lié à l'ubiquitine. Il est remarquable de noter que la protéine Numb est connue pour se lier à la protéine Mdm2, dont la présence induit une régulation négative de p53. Il est par ailleurs connu que l'expression de Siah dans des cellules induit des phénomènes d'apoptose, ainsi que l'ont précédemment démontré les inventeurs. Ainsi, la présente invention fournit aussi un procédé d'inhibition de la diminution de p53, notamment liée à Mdm2 via Numb dans une cellule, comprenant l'étape de : a) mise en contact de ladite cellule avec un composé selon l'invention, qui augmente l'apoptose et/ou la réversion tumorale. De façon inverse, on peut augmenter la diminution de quantité de protéine p53 dans une cellule, notamment en raison des interactions entre Mdm2 et Numb, comprenant l'étape de : a) mise en contact de ladite cellule avec un composé selon l'invention, qui inhibe ou diminue l'apoptose et/ou la répresson tumorale. Ces deux procédés peuvent être mis en oeuvre in vitro ou in vivo, notamment dans le cadre d'un traitement thérapeutique. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : analyse de l'interaction in vitro entre Siah et Numb. Figure 1. A. Protéines de fusion GST-68 (la protéine 68 étant le fragment Leu 82-Glu 314 de BNIP 2) (colonnes 1 et 2) et GST-Numb (colonnes 3 et 5), observées avec Bleu de Coomassie. Figure 1. B. Autoradiographe des produits de traduction in vitro des protéines AIPI (colonne a), et Siah-1 (colonne b), marquées avec des méthionines 35S. Les colonnes 1 à 4 illustrent la précipitation de AIPI (1 et 3) ou Siah-1 (2 et 4) avec les produits indiqués par les protéines de fusion GST. Figure 2 : analyse de l'effet de l'interaction in vivo entre Siah et Numb, sur les niveaux d'expression des protéines. Figure 2. A. Des cellules 293T ont été cotransféctées par un vecteur d'expression vide (colonne 1), ou exprimant Numb (colonne 2), Siah-1 (colonne 3), Numb et Siah-l (colonne 4), Numb et Mdm2 (colonne 5), Numb, Siah-l et Mdm2 (colonne6). 48 heures après transfection, une analyse a été effectuée par Western Blot, en utilisant un anticorps anti-Numb. Un contrôle a également été effectué en utilisant un anticorps anti-GFP (Green Fluorescent Protein) en tant que standard de charge sur le gel. Figure 2. B. l'analyse Western Blot a été effectuée comme décrit précédemment, en absence ou présence d'un inhibiteur du protéasome de l'ubiquitine (MG 132). Sans MG 132, la quantité de protéine Numb décroît en présence de Siah-l, avec ou sans Mdm2 (lignes 2,3, 4). Avec MG 132, la quantité de protéine Numb reste constante (lignes 6,7 et 8). EXEMPLES Exemple 1 : expression des protéines de fusion GST Préparation d'une préculture à partir d'une colonie isolée de B121 (DE3), transformée avec le plasmide pGEX-P-1-Siah ou pGEX-P-1-Numb, dans un milieu SB avec 100ug/ml d'ampicilline, à 37 C. Le plasmide PGEX-P-1 est disponible chez Amersham Pharmacia Biotech AB. Les protéines sont les protéines humaines, codées par les ADNc complémentaires correspondant aux séquences SEQ ID NO 1 (Siah) et SEQ ID ? 2 (Numb). Les références dans GenBank des différentes protéines sont, pour Siah humain, HSU76247, et pour Numb humain, AF015040. Le lendemain, inoculer 250 ml de SB+Amp avec 5 ml de la préculture. Croissance à 37 C pour GST-Numb, ou 28 C pour GST-Siah, jusqu'à une densité optique entre 0,5 et 0,7. Ajout de 0,1 mM IPTG pour induire la synthèse des protéines. Croissance à à 37 C pour GST-Numb, ou 28 C pour GST-Siah pendant lh30 (GST-Numb) ou Ih (GST-Siah). Centrifugation 3000 rpm pendant 10 min (1800g, à 4 C). Resuspension du précipité dans 10 ml de tampon A NP40 (NP40 1 % ; Tris pH 7, 410 mM ; NaCl 150 mM ; EDTA ImM ; Glycerol 10% ; DTT ImM ; Aprotinin 2ug/ml ; Leupeptin 2u. g/ml ; Pepstatin 2g/ml ; AEBSF ImM). Sonication 3 fois pendant 15 s à puissance 50, sur glace. Centrifugation à 12000 rpm pendant 10 min (18000g à 4 C). Garder le surnageant à-80 C. Exemple 2-Liaison aux billes de sepharose-glutathione Toute la préparation des billes et les incubations s'effectuent à 4 C. Ajout de 2 ml de surnageant à 200 fll de billes (préparées après 3 rinçages dans le PBS, 1 rinçage dans le tampon A NP40, resuspension à 50 % (poids par volume) dans le tampon A NP40, centrifugation à 3000 rpm à chaque fois). On utilise les billes Glutathione-sepharose 4B, fournies par Amersham Pharmacia Biotech AB, sous la référence 17.0756. 01. Remuer doucement pendant au moins 1 heure à 4 De. Rincer les billes 3 fois dans le tampon A NP40 sans inhibiteur de protéase. Resuspendre les billes dans 1 ml de tampon A NP40 avec inhibiteur de protéase. Pour l'analyse par électrophorèse SDS-PAGE, prendre 20 à 40 ni des billes resuspendues, centrifuger pendant 5 min, écarter le surnageant, resuspendre les billes dans 10 ul de tampon de charge de X, chauffer à 97 C pendant 7 min. Charger sur gel et analyser après révélation par bleu de Coomassie, pour normaliser la quantité des protéines de fusion à utiliser. Exemple 3 : Traduction in vitro Le kit TNT Coupled Reticulocyte Lysate System de Promega a été utilisé avec les ARN polymérase T7 ou T3 en fonction du vecteur utilisé pour traduire et exprimer les protéines (T7 pour AIPI et Siah 1, T3 pour Numb). Le kit a été utilisé selon les instructions du fabricant (référence L4610). Les protéines ont incorporé de la méthionine S35 (Amersham Pharmacia). Les produits obtenus in vitro ont été analysés par électrophorèse SDSPAGE. Après électrophorèse, le gel est placé dans du tampon de fixation (5 % de méthanol, 15 % d'acide acétique, 80 % d'eau) pendant une 1/2 heure et le signal est amplifié par immersion du gel dans le produit Amplify de Amersham Pharmacia (référence NAMP 100). Un film Kodak Biomax MR est alors exposé sur le gel séché pendant une durée variant d'une heure à une semaine, puis développé. Exemple 4 : Co-précipitation des protéines 30 ul des billes de sépharose-glutathione couplés aux protéines de fusion GST, après normalisation des quantités, ont été rincés dans le tampon B (NP40 1 %, TrisHCI 50 mM, NaC1150 mM, leupeptine 2 ul/ml, aprotinine 1 %, ABESF 1 mM). On ajoute ensuite 5 à 10 ul du produit de traduction in vitro tel qu'obtenu dans l'exemple 3, en fonction de la quantité du produit observé par autoradiographie. Après une nuit de contact, les billes ont été rincées 10 fois avec du tampon A NP 40, sans antiprotéases. On analyse par SDS-PAGE et autoradiographie. La figure 1B montre donc clairement que la protéine Siah obtenue par traduction in vitro se lie à la protéine de fusion GST-Numb. On peut montrer de la même façon que la protéine Numb obtenue par traduction in vitro se lie à la protéine de fusion de GST-Siah (non montré). Exemple 5 : Cellules et transfections transitoires Les cellules humaines embryonnaires de rein 293T (Référence ATCC : CRL 1573) sont maintenues dans le DMEM supplémenté de 10 % de sérum de veau foetal (FCS) dans une atmosphère à 5 % en Crû2. Les cellules ont subi un nouveau passage le jour précédent la transfection. Les transfections des cellules 293T ont été effectuées par la procédure du phosphate de calcium dans le DMEM plus 10 % FCS en présence de 20 uM de chloroquine. Huit heures après la transfection, le milieu de transfection a été remplacé par du DMEM plus 10 % FCS. Les cellules ont été recueillies 48 heures après la transfection. Pour les tests avec le MG 132, les cellules transfectées ont été traitées pendant 6 heures à 37 C avec du MG132 à 50 uM (Calbiochem-Novabiochem) dans du DMSO, ou avec du DMSO seul, comme contrôle. Les plasmides exprimant la protéine Numb humaine Mdm2 murine et la GFP étaient des plasmides pcDNA3 de chez Invitrogen, San Diego, CA, USA. La protéine Siah-l a été obtenue à partir de l'ADN complémentaire, sousclonée dans le plasmide pBKRSV (Stratagene, La Jolla, CA, USA) Exemple 6 : Western Blot 48 heures après transfection des cellules 293T avec les plasmides, les cellules ont été lysées dans un tampon de lyse TBS-Triton (Tris-buffered saline [TBS], [pH 8, 0] ; 1% Triton X-100, 10 mg/ml de phénylméthylsulfonyl fluoride ; aprotinine 5 mg/ml, leupeptine 5 mg/ml). Les lysats cellulaires ont été séparés par gel d'électrophorèse SDS-PAGE et transférés sur une membrane de nitrocellulose (Biorad), suivis par un analyse par Western Blot avec l'anticorps polyclonal Numb (Institut Weizmann, réf. 3465, ou référence N80220 de la société Transduction Laboratories) et l'anticorps monoclonal anti-GFP (Boehringer, réf. 1814460), afin de vérifier la normalisation des quantités chargées sur le gel. Les signaux ont été détectés en utilisant un anticorps secondaire couplé à une peroxydase et à des réactifs électro chimie luminescents de chez Amersham Pharmacia Biotech AB. La figure 2 montre bien que la quantité de protéine Numb diminue en présence de Siah, de la même façon qu'en présence de Mdm2. Ces effets semblent indépendants, car il existe une addition des effets lorsque les protéines Siah et Mdm2 sont toutes les deux mises en présence de Numb. La figure 2B montre que la dégradation de Numb par la protéine Siah s'effectue par la voie du protéasome de l'ubiquitine, car elle est inhibée par l'utilisation d'un inhibiteur de cette voie. Les résultats présentés dans la présente demande démontrent ainsi la liaison existant entre les protéines Numb et Siah, et le fait que la protéine Siah agit pour dégrader la protéine Numb, par une voie dépendante du protéasome de l'ubuiquitine. On peut également montrer la liaison entre les protéines Siah et Numb, par utilisation d'autres techniques, notamment la technique du double-hybride, dérivé du système développé par Finley et Brent, (Annu Rev Genet 1997 ; 31 : 663-704). La protéine appât peut être clonée dans le plasmide pEG202 connu de l'homme du métier pour une telle application (promoteur 67-1511, lexA 1538-2227, ADH Ter 2209-2522, pBR remnants 2540-2889, 2p ori 2890-4785, YSCNFLP 4923-5729, HIS3 7190-5699, TYIB 7243-7707, RAFpart 7635-7976, squelette pBR 7995-10166, bla 8131-8988). La protéine proie peut être clonée dans le plasmide pJG4-5, également bien connu de l'homme du métier (promoteur GAL 1-528, cassette de fusion 528-849, ADH Ter 867-1315, 2u. ori 1371-3365, TRPI 3365-4250, squelette pUC 4264- 6422, Ap 4412-5274). On utilise également le plasmide rapporteur pst 18-34, également connu de l'homme du métier. Ce plasmide est notamment disponible chez Invitrogen, sous le numéro de référence V611-20, et également déjà transformé dans la souche EGY48 (aussi appelée RFY 231), chez le même fournisseur (référence souche seule : C835- 00, transformée par pSH18-34 : C836-00). La liaison est démontrée dans la souche de levure RFY 231 (décrite dans Finley Jr, et al, 1998, Proc Natl Acad Sci USA, 95,14266-71). Cette souche de levure possède le génotype (MATa t7A : : hisG h s3 ura3-1 leu2 : : 3Lexop-LEU2), et est dérivée de EGY48 (Guris et al., 1993, Cell, 75,791-803). Le gène rapporteur était le gène LacZ. On effectue l'étude sur un milieu contenant du galactose, ne contenant pas de leucine, et on étudie la présence de colonies colorées sur ces boîtes. Exemple 7 : criblage de composés interférant avec la liaison Siah-Numb, et/ou la quantité de protéine Numb On effectue les essais décrits dans les exemples 1 à 6, en ajoutant les composés que l'on désire étudier, et on compare avec les résultats obtenus lorsque les composés ne sont pas ajoutés. Revendications 1. Procédé d'identification d'un composé inhibant la liaison de Siah à Numb, caractérisé en ce qu'il présente les étapes de : a) mise en contact dudit composé avec une cellule mammifère exprimant les protéines Siah et Numb ; b) identification de l'augmentation de la quantité de protéine Numb dans ladite cellule mammifère par rapport à une cellule témoin avec laquelle ledit composé n'a pas été mis en contact. 2. Procédé d'identification d'un composé inhibant la liaison de Siah à Numb, présentant les étapes de : a) mise en contact dudit composé avec un système permettant la détermination in vitro de la liaison entre Siah et Numb ; b) identification de la diminution et/ou l'inhibition de la liaison entre Siah et Numb. 3. Procédé d'identification d'un composé pour l'augmentation de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire (apoptose), caractérisé en ce qu'il présente les étapes de : a) mise en contact dudit composé avec une cellule mammifère exprimant les protéines Siah et Numb ; b) identification de la diminution de la quantité de protéine Numb dans ladite cellule mammifère par rapport à une cellule témoin avec laquelle ledit composé n'a pas été mis en contact. 4. Procédé d'identification d'un composé pour la diminution et/ou l'inhibition de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire (apoptose), présentant les étapes de : a) mise en contact de composés avec un système permettant la détermination in vitro de la liaison entre Siah et Numb ; b) identification des composés induisant la diminution et/ou l'inhibition de la liaison entre Siah et Numb ; c) mise en contact des composés identifiés dans l'étape b) avec une cellule mammifère exprimant les protéines Siah et Numb ; d) identification de l'augmentation de la quantité de protéine Numb dans ladite cellule mammifère par rapport à une cellule témoin avec laquelle ledit composé n'a pas été mis en contact. 5. Procédé d'identification d'un composé pour l'augmentation de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire (apoptose), caractérisé en ce qu'il présente les étapes de : a) identification de composés inhibant la liaison entre Siah et Numb, par un procédé selon la revendication 2 ; b) mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 3 sur lesdits composés identifiés dans l'étape a). 6. Procédé d'identification d'une région de Siah active pour l'augmentation de la suppression tumorale et/ou de l'apoptose, comportant les étapes de : a) mise en contact de peptides issus de la protéine Siah avec une cellule mammifère exprimant la protéine Numb ; b) identification de la diminution de la quantité de protéine Numb dans ladite cellule mammifère par comparaison avec la quantité de protéine Numb présente dans une cellule mammifère témoin exprimant les protéines Siah et Numb. 7. Procédé d'identification d'une région de Siah active pour la diminution et/ou l'inhibition de la suppression tumorale et/ou de l'apoptose, comportant les étapes de : a) mise en contact de peptides issus de la protéine Siah avec une cellule mammifère exprimant la protéine Numb ; b) identification de l'augmentation de la quantité de protéine Numb dans ladite cellule mammifère par comparaison avec la quantité de protéine Numb présente dans une cellule mammifère témoin exprimant les protéines Siah et Numb. 8. Procédé d'identification des régions de Siah impliquées dans la liaison avec la protéine Numb, comportant les étapes de : a) mise en contact de peptides issus de la protéine Siah dans un système permettant la détermination in vitro de la liaison entre Siah et Numb ; b) identification des peptides entraînant la diminution de la liaison entre Siah et Numb dans ledit système ; 9. Procédé d'identification d'un produit ayant une activité d'augmentation de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes de : a) mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 3,5 ou 6, b) modification du produit sélectionné à l'étape a) notamment par greffage de résidus sur le squelette chimique, c) test du produit modifié dans l'étape b) dans des procédés in vitro et/ou in vivo, sur des modèles pertinents de répression tumorale et/ou d'apoptose, d) identification du produit permettant d'obtenir une activité de répression tumorale et/ou d'apoptose supérieure à l'activité obtenue pour le produit sélectionné à l'étape a). 10. Procédé d'identification d'un produit ayant une activité de diminution et/ou d'inhibition de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes de : a) mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1,2, 4 ou 7, b) modification du produit sélectionné à l'étape a) notamment par greffage de résidus sur le squelette chimique, c) test du produit modifié dans l'étape b) dans des procédés in vitro et/ou in vivo, sur des modèles pertinents de répression tumorale et/ou d'apoptose, d) identification du produit permettant d'obtenir une activité de répression tumorale et/ou d'apoptose réduite par rapport à l'activité obtenue pour le produit sélectionné à l'étape a). 11. Procédé selon la revendication 1 ou 4, caractérisé en ce que ladite cellule mammifère est transfectée par au moins un vecteur choisi parmi un vecteur portant un fragment d'ADN codant pour Siah, un vecteur portant un fragment d'ADN codant pour Numb, un vecteur portant un fragment d'ADN pour Siah et un fragment d'ADN codant pour Numb. 12. Procédé selon la revendication 1 ou 4, caractérisé en ce que l'identification de l'augmentation de la quantité de protéine Numb dans ladite cellule mammifère est effectuée par Western Blot. 13. Utilisation d'un composé identifié par un procédé selon l'une des revendications 3,5 ou 9, possédant une activité d'augmentation de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter le cancer. 14. Utilisation d'un composé identifié par un procédé selon l'une des revendications 1,2, 4 ou 10, possédant une activité de diminution et/ou d'inhibition de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter une maladie neuro-dégénérative. 15. Séquence peptidique correspondant à une région de Siah pouvant être identifiée par un procédé selon l'une des revendications 6 à 8. 16. Séquence nucléotidique codant pour une séquence peptidique selon la revendication 15. 17. Séquence peptidique selon la revendication 15, ou séquence nucléotidique selon la revendication 16 à titre de médicament. 18. Utilisation d'une séquence peptidique selon la revendication 15, ou d'une séquence nucléotidique selon la revendication 16 pour la préparation d'un médicament. 19. Complexe constitué d'une protéine Siah et d'une protéine Numb. 20. Procédé d'inhibition de la liaison de Siah à Numb dans une cellule in vitro, comprenant l'étape consistant à : a) mettre en contact de ladite cellule avec un composé identifié par un procédé selon l'une des revendications 1 ou 2. 21. Procédé d'inhibition de la diminution de p53 dans une cellule in vitro, comprenant l'étape consistant à : a) mettre en contact de ladite cellule avec un composé identifié par un procédé selon l'une des revendications 3,5, 6 ou 9. 22. Procédé d'augmentation de la diminution de quantité de p53 dans une cellule in vitro, comprenant l'étape consistant à : a) mettre en contact de ladite cellule avec un composé identifié par un procédé selon l'une des revendications 4,7, ou 10.