Brevet FR2817265A1 — publié le 20020531

Domaine de l'invention La présente invention concerne un procédé pour inhiber l'expression d'un gène cible dans des tissus ou des cellules eucaryotiques. Elle englobe aussi une cellule dans laquelle l'inhibition de l'expression d'un gène cible est spécifique et enfin elle concerne une trousse comprenant des réactifs pour inhiber la transcription d'un gêne cible dans une cellule. Arrière-plan de l'invention L'inhibition spécifique de l'expression génétique a un large impact sur la recherche thérapeutique. Plus précisément, elle serait utile pour développer une technique pour inhiber plus précisément la fonction des gènes individuels. En particulier, elle serait utile pour éviter la progression de maladies particulières comme les cancers, les maladies infectieuses ou les troubles neurologiques, en inhibant la fonction de gènes particuliers par exemple. Elle serait aussi utile pour permettre d'analyser les différences entre des tissus normaux et atteints. En outre, elle serait avantageuse pour l'étude de la prolifération cellulaire, pour l'analyse de la fonction génétique ou de l'altération fonctionnelle de l'expression génétique. Certains gènes peuvent être nécessaires pour la viabilité des cellules ou de l'organisme seulement à des stades particuliers de développement. On a utilisé les techniques génétiques classiques pour caractériser les mutations dans des organismes avec l'expression réduite de gènes sélectionnés. Ces techniques nécessitent des programmes laborieux de triage et ont été limitées à des organismes dans lesquels la manipulation génétique a déjà été établie. Ces difficultés peuvent être surmontées grâce à un procédé qui utilise l'interférence de l'ARN (ds) double-brin ou bicaténaire pour inhiber l'expression génétique dans les cellules mammifères. La technique est basée sur la délivrance d'ARNds dans des cellules où l'interférence avec des molécules d'ARNds messagers (ARNm) particulières se produira pour inhiber l'expression génétique. Dans la Demande de Brevet International WO 99/32619, on trouve la description d'un procédé pour inhiber plus précisément l'expression génétique dans un organisme de modèle invertébré. Ce procédé est basé sur l'utilisation d'ARNds et leur introduction dans une cellule vivante pour inhiber l'expression génétique d'un gène cible dans cette cellule. Les ARNds sont introduits dans la cellule, c'est-à-dire intracellulairement, ou extracellulairement, c'est-àdire dans une cavité du corps. Dans la Demande de Brevet International WO 99/32619, l'utilisation d'un produit de recombinaison viral empaqueté dans une particule virale peut être efficace pour l'introduction d'un produit de recombinaison d'expression dans la cellule et la transcription de l'ARN encodé par le produit de recombinaison d'expression. Les produits de recombinaison avec à la fois des séquences sens et antisens dans le même vecteur viral n'inhibent pas avec succès l'expression génétique, plus vraisemblablement du fait de l'interaction inefficace avec l'ARNm cible. On a émis le postulat que lorsque les ARN sens et antisens sont encodés par un produit de recombinaison, la formation d'ARN duplex (bicaténaire) se produit immédiatement et aucune interaction avec les ARNm n'est possible. Plus récemment, dans une publication scientifique (F. Wianny et M. Zernicka-Goetz, Interférence spécifique avec la fonction génétique par l'ARN double-brin dans le développement précoce de la souris, "Nature Cell Biology", vol. 2, Février 2000, pages 70-75), il est décrit que des ARNds synthétiques ont été introduits dans des oocytes de souris et la préimplantation des embryons effectuée par micro-injection et, l'inhibition spécifique de l'expression génétique est obtenue. Une difficulté majeure, à présent, est la délivrance des ARN ds dans les cellules de manière efficace. Aucune technique génétique dans ce domaine n'a été développée pour l'introduction directe d'ARN ds dans des cellules. En clair, la possibilité d'introduire des ARN ds biologiquement et non pas mécaniquement dans des cellules serait intéressante. Cette introduction réduit les manipulations et supprime la production de dommages mécaniques des cellules. En outre, la possibilité d'inhiber un gène cible particulier sans affecter d'autres gènes de la cellule serait d'une grande importance. Enfin, l'aptitude à inhiber un gène cible particulier à un temps déterminé et dans un lieu défini dans un tissu ou des organismes sans introduction de mutations permanentes dans le génome cible serait d'un intérêt important. Résumé de l'invention La présente invention fournit un procédé pour inhiber l'expression d'un gène cible dans des cellules ou un tissu comprenant l'infection desdites cellules ou dudit tissu avec (a) des particules virales contenant de l'acide ribonucléique simple brin ou monocaténaire (ARN ss) exprimant un brin d'ARN sens et (b) des particules virales contenant de l'acide ribonucléïque simple brin ou monocaténaire (ARN ss) exprimant un brin d'ARN antisens, dans lequel les brins d'ARN sens et antisens comprennent des séquences nucléotidiques homologues à une portion dudit gène cible. La présente invention concerne aussi une cellule dans laquelle deux brins d'ARN complémentaires interfèrent avec l'expression d'un gène cible, elle concerne une trousse comprenant des réactifs pour inhiber la transcription d'un gène cible dans des cellules ou un tissu et enfin l'utilisation du procédé revendiqué pour le traitement et la prévention de maladies et une composition pharmaceutique. Description détaillée de l'invention L'expression"ARN ds"telle qu'elle est utilisée ici désigne l'ARN double-brin ou bicaténaire. L'expression"ARN ss"telle qu'utilisée ici désigne l'ARN simple brin ou monocaténaire. Le terme"sens"tel qu'il est utilisé ici désigne une séquence d'ARN correspondant au brin de l'ARN m. Le terme"antisens"tel qu'il est utilisé ici désigne une séquence d'ARN complémentaire au brin sens de l'ARN m. L'expression"séquence spécifique pour"telle qu'elle est utilisée ici signifie que la séquence des brins d'ARN sens et antisens possède au moins 90 %, de préférence 95 %, plus particulièrement 99 % et encore mieux 100 %, de bases identiques audit gène cible. Le procédé de la présente invention pour inhiber l'expression d'un gène cible dans des cellules ou un tissu comprend l'infection desdites cellules ou dudit tissu avec (a) des particules virales contenant de l'acide ribonucléique simple brin (ARN ss) exprimant un brin d'ARN sens et (b) des particules virales contenant de l'acide ribonucléique simple brin (ARN ss) exprimant un brin d'ARN antisens, les brins d'ARN sens et antisens comprenant des séquences nucléotidiques homologues à une portion dudit gène cible. La présente invention est utile pour l'inhibition sélective de fonctions génétiques spécifiques par la production biologique d'ARN ds dans les cellules contrairement à l'introduction mécanique d'ARN ds dans les cellules ou le tissu. En particulier, elle sera utile pour le traitement ou la prévention de maladies ou pathologies particulières pour inhiber la sur-expression spécifique de gènes, qui est nécessaire pour l'initiation ou le maintien desdites maladies ou desdites pathologies. Le traitement comprendra l'amélioration de tout symptôme associé à la maladie ou les indications cliniques associées à la pathologie. Par exemple, la présente invention peut être utile pour le traitement ou la prévention de malades souffrant de tumeurs par inhibition de fonctions génétiques particulières. Les tumeurs englobent les cancers des ovaires, de la prostate, du sein, du colon, du foie, de l'estomac, du cerveau, du crâne et de la nuque et des poumons. Une autre utilisation de la présente invention peut concerner un procédé pour identifier une fonction génétique dans un organisme par l'inhibition spécifique de l'expression. En outre, la présente invention peut être utile pour l'analyse et la prévention du mécanisme pour la croissance, le développement, le métabolisme, la résistance aux maladies et d'autres procédés biologiques. L'avantage de la présente invention englobe : la facilité de la reproduction biologique des ARN ds dans les cellules ou le tissu, l'amplification hautement efficace des ARN ss introduits, la stabilité des ARN ds dans les cellules et le tissu et l'efficacité de l'inhibition et de la sûreté biologique. Le terme"alphavirus"possède sa signification classique dans la technique et il englobe les diverses espèces d'alphavirus comme le virus de l'encéphalite équine de l'Est (EEE), le virus de l'encéphalite équine du Venezuela (VEE), le virus des Everglades, le virus Mucambo, le virus Pixuna, le virus de l'encéphalite équine de l'Ouest (WEE), le virus Sindbis, l'arbovirus d'Afrique du Sud NO86, le virus de la Forêt de Semliki, le virus de Middelburg, le virus de Chikungunya, le virus de 0'nyong-nyong, le virus de la rivière Ross, le virus de la Forêt de Barmah, le virus de Getah, le virus Sagiyama, le virus Bebaru, le virus Mayaro, le virus Una, le virus Aura, le virus Whataroa, le virus Babanki, le virus Kyzylagach, le virus de Highlands J., le virus Fort Morgan, le virus Ndumu et le virus Buggy Creek. Le terme"alphavirus"englobe aussi les vecteurs qui en dérivent. Les alphavirus préférés englobent le virus de la Forêt de Semliki (SFV) (Liljeström et Garoff, 1991) ; une nouvelle génération de vecteurs d'expression cellulaire animale basée sur le replicon du virus de la Forêt de Semliki, Bio/Technology 9 ; 1356-1631), le virus Sindbis (SIN) (Xiong et coll., 1989, virus Sindbis : un vecteur efficace à large spectre d'activité pour l'expression génétique dans les cellules animales, "Science 243", 1188-1191) et le virus de l'encéphalite équine du Venezuela (VEE) (Davis et coll., 1989, "Synthèse in vitro de l'ARN du virus infectieux de l'encéphalite équine du Venezuela à partir d'un clone d'ADN c : analyse d'un mutant viable de délétion,"Virology", 171, 189-204) par exemple. Les alphavirus et les vecteurs qui en dérivent sont bien connus dans la technique et disponibles dans le commerce. Dans le procédé de la présente invention, lesdites cellules ou ledit tissu sont infectés avec une quantité de particules virales contenant de l'ARN ss, qui permet la délivrance d'au moins une copie par cellule. Telle que décrite ici, l'infection est réalisée avec un nombre supérieur ou égal à 10 particules virales par cellule. Le mode opératoire d'infection est bien connu dans le domaine. L'infection in vitro dans des lignées cellulaires et des cultures de cellules primaires, comme les fibroblastes, les hépatocytes, les neurones par exemple, s'effectue par l'addition de particules de SVF directement aux cultures de cellules. Les particules virales reconnaîtront les récepteurs sur la surface des cellules, pénétreront la membrane cellulaire soit par fusion soit par endocytose (en fonction du type de cellule), où après les molécules d'ARN seront libérées dans le cytoplaste ("The alphaviruses : Gene Expression, Replication, and Evolution", Strauss, J. H. et Strauss, E. G., 1994, Micriobiological Reviews 58,491-562). L'infection in vivo nécessite l'injection des particules de SVF dans le tissu cible. L'injection des particules de SFV ("Efficient in vivo expression of a reporter gene in rat brain after injection of recombinant replication-deficient Semliki Forest Virus", Lundstrom, K. Grayson J. R., Pink J. R. and Jenck, F., 1999,"Gene Therapy & Molecular Biology"3,15-23) conduira à un mode opératoire d'infection similaire à celui décrit pour la situation in vitro cidessus. Les cellules ou le tissu dans le présent procédé sont infectés avec des particules virales distinctes exprimant des brins complémentaires, des brins d'ARN sens et des brins d'ARN antisens. Comme décrit ici, les cellules ou le tissu dans le présent procédé peuvent être co-infectés avec des quantités égales de particules virales contenant un brin d'ARN sens et de particules virales contenant un brin d'ARN antisens respectivement, pour permettre la formation d'ARN ds capable d'interférer avec l'expression génétique. Des doses plus élevées d'ARN ds peuvent donner une inhibition plus efficace. Dans la présente invention, les particules virales contiennent le brin d'ARN ss comprenant des séquences nucléotidiques homologues à une portion dudit gène cible et ce brin d'ARNss est cloné dans le vecteur de l'alphavirus. Le brin d'ARN ss peut être cloné soit dans une orientation sens soit dans une orientation antisens dans ledit vecteur. Les autres gènes présents dans le vecteur sont les gènes de l'alphavirus non structuraux en particulier les gènes nsP-1-4 ("The Alphaviruses : Gene Expression, Replication, and Evolution", Strauss, J. H. et Strauss, E. G., 1994, "Microbiological reviews"58,491-562), responsables de la réplication de l'ARN dans les cellules hôtes. L'expression de nsPl-4 conduit à la formation du complexe de réplication, qui amorcera la réplication importante d'ARN, c'est-à-dire la production d'un grand nombre d'ARN sens et antisens capables de formation d'ARN ds efficace. Le procédé décrit ici permet en général l'inhibition de nombreux types différents de gènes cibles dans des cellules eucaryotiques ou des tissus. Le gène cible peut être un gène eucaryotique, un gène viral, un gène d'un agent pathogène ou un gène synthétique. En résumé, le gène cible peut être un gène dérivé de la cellule, c'est-à-dire un gène cellulaire, un transgène, c'est-à-dire un produit de recombinaison génétique inséré au niveau d'un site ectopique dans le génome de la cellule ou un gène provenant d'un agent pathogène, capable d'infecter un organisme d'où la cellule provient. Les gènes cibles peuvent être n'importe quels gènes intéressants avec déjà un nombre important de protéines intéressantes identifiées et isolées. Le gène cible peut être un gène développemental, comme les inhibiteurs de cycline kinase, des facteurs de croissance/différenciation et leurs récepteurs, la transcriptase inverse télomérase (TERT), un oncogène, un gène suppresseur de tumeur ou une enzyme par exemple. Un gène dérivé d'un agent pathogène quelconque peut être la cible de l'inhibition. Puisque l'inhibition dans la présente invention est spécifique de la séquence, les brins d'ARN sens et antisens introduits dans les cellules ou le tissu comprennent une séquence nucléotidique complémentaire d'une portion du gène cible. Une homologie complète entre l'ARN et le gène cible n'est pas nécessaire à la pratique de la présente invention. Comme décrit ici, des variations de séquences dues à des mutations génétiques, des polymorphismes ou des divergences d'évolutions par exemple sont tolérées. On a trouvé que des brins d'ARN avec des insertions, des délétions, et des mutations à point unique sur le gène cible sont efficaces pour les inhibitions. La longueur de ladite séquence nucléotidique homologue doit être d'au moins 50 bases, de préférence 75,100 ou 125 bases. Dans le procédé de la présente invention, l'inhibition de l'expression du gène cible démontre une perte de phénotype. En fonction du gène cible et de la dose intracellulaire d'ARNds, le procédé de la présente invention peut conduire à une perte partielle ou complète de la fonction du gène cible dans les cellules ou le tissu de l'organisme. L'inhibition de l'expression génétique désigne l'absence ou la diminution dans le niveau de protéines et/ou d'ARNm à partir d'un gène cible. Les conséquences de l'inhibition peuvent être analysées pour les propriétés de la cellule ou de l'organisme par des procédés de biologie moléculaire comme l'hybridation de solution d'ARN, l'hybridation de Northern (Sambrook et coll.,"Molecular Cloning", volume 1,7. 37 et 7.39) et des dosages biochimiques comme le dosage par immuno-absorbant lié à une enzyme (ELISA), le dosage de Western (Towbin et coll. 1979 ; Bunette 1981 ou Sambrook et coll., "Molecular Cloning"volume 3,18. 60) ou un dosage radio-immunologique (RIA) (Sambrook et coll.,"Molecular Cloning", volume 3, 18-. 19- 18. 20) par exemple. On peut estimer le degré d'inhibition en comparant les valeurs provenant de cellules non traitées à celles obtenues à partir de cellules traitées selon le procédé de la présente invention. La présente invention concerne aussi n'importe quelle cellule contenant deux brins d'ARN complémentaires, un brin d'ARN sens et un brin d'ARN antisens, qui forment un ARN double brin à l'intérieur de ladite cellule et à cause de l'homologie de séquence nucléotidique à une portion d'un gène cible spécifique, sont capables d'interférer avec l'expression dudit gène cible. Comme décrit ici, le tissu ou les cellules eucaryotiques avec le gène cible peuvent être n'importe quels types de tissus ou de cellules qui peuvent être infectés par un alphavirus. Ils peuvent être de la circulation vasculaire ou extravasculaire, du système sanguin ou lymphatique, du muscle, du foie, du cerveau, ou du fluide cérébro-spinal par exemple. Les cellules eucaryotiques ou le tissu peuvent être contenues dans n'importe quel organisme englobant les poissons, les amphibiens, les reptiles, les insectes ou les mammifères comme le bétail, le cochon, le hamster, la souris, le rat, le primate et l'humain par exemple. De plus, la présente invention revendique une trousse comprenant des réactifs pour inhiber l'expression d'un gène cible, ladite trousse comprenant au moins une quantité suffisante de particules virales à ARN monocaténaires exprimant soit un brin d'ARN sens soit un brin d'ARN antisens, qui sont complémentaires l'un de l'autre et forment un ARNds comprenant une séquence nucléotidique homologue à une portion dudit gène cible et sont capables d'interférer avec l'expression de ladite cible. Une telle trousse peut comprendre les réactifs nécessaires pour réaliser la délivrance in vivo ou in vitro d'ARN à des sujets ou des échantillons d'essais. Une telle trousse peut également comprendre des instructions pour permettre à l'utilisateur de la trousse de mettre en pratique l'invention. L'utilisation du procédé de la présente invention est également revendiquée pour le traitement ou la prévention de maladies. Pour traiter une maladie ou un état pathologique, on peut sélectionner un gène cible qui est exprimé au cours du développement de la maladie ou qui est la cause de l'état pathologique. Pour éviter une maladie ou un état pathologique, on peut sélectionner un gène cible qui est nécessaire pour amorcer et/ou maintenir la maladie ou l'état pathologique. On peut utiliser la présente invention pour le traitement ou la prévention des cancers y compris les tumeurs solides ou les leucémies, par co-infection des tumeurs avec des vecteurs viraux portant les ARN sens et antisens dans le but de produire de l'ARN ds pour l'inhibition de la traduction de l'ARN m d'un gène nécessaire pour le maintien du phénotype carcinogène/tumorigène. On peut utiliser la présente invention pour le traitement ou la prévention des maladies infectieuses dues à un agent pathogène par exemple. Les cellules ou le tissu infectés ou qui peuvent être infectés par le virus du syndrome immunodéficitaire acquis (virus HIV) peuvent être ciblés conformément à la présente invention afin d'inhiber l'expression d'un gène spécifique responsable ou nécessaire pour commencer et/ou maintenir ladite infection. La présente invention concerne aussi l'utilisation (a) de particules virales contenant de l'acide ribonucléïque simple brin (ARN ss) exprimant le brin d'ARN sens et (b) de particules virales contenant de l'acide ribonucléique simple brin (ARN ss) exprimant le brin d'ARN antisens, les brins d'ARN sens et antisens comprenant des séquences nucléotidiques homologues d'une portion du gène cible pour la préparation d'un médicament pour traiter les maladies. En outre, la présente invention concerne des particules virales contenant (a) de l'acide ribonucléique simple brin (ARN ss) exprimant le brin d'ARN sens et des particules virales contenant (b) de l'acide ribonucléique monocaténaire ou simple brin (ARN ss) exprimant le brin d'ARN antisens, les brins d'ARN sens et antisens comprenant des séquences nucléotidiques homologues d'une portion d'un gène cible, à utiliser comme substance thérapeutique active pour le traitement ou la prévention de maladies, en particulier comme substance anticancéreuse. Enfin, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant (a) des particules virales contenant de l'acide ribonucléique simple brin ou monocaténaire (ARN ss) exprimant le brin d'ARN sens et (b) des particules virales contenant de l'acide ribonucléique simple brin (ARN ss) exprimant le brin d'ARN antisens, où les brins d'ARN sens et antisens ont des séquences nucléotidiques homologues d'une portion d'un gène cible, et éventuellement des excipients pharmaceutiquement acceptables, pour l'inhibition de l'expression dudit gène cible dans les cellules ou le tissu. On comprendra mieux la présente invention sur la base des exemples suivants, offerts à titre d'illustration et non pas de limitation. Les exemples ci-dessous sont en relation avec les figures suivantes. FIGURES Figure 1 : inhibition de l'expression de l'aldolase A avec des réserves en blocs. Panneau A : représentation schématique du gène humain d'aldolase A et de sondes utilisées pour l'analyse de l'expression. A et B sont des fragments utilisés pour sonder les transferts de Northern (figure 2). V et G sont des paires d'amorces qui amplifient soit l'ARN exprimé par les réserves virales soit aussi sélectivement des produits de transcription chrosomiques. Panneau B : détection de soit l'ARNm d'aldolase encodée viralement avec VA/VB (deux premières images à partir du haut) soit l'ARNm encodé de manière endogène en utilisant GA/GB (panneaux inférieurs). Co sont des cellules témoins non infectées, s est infecté avec le virus à brin sens et as avec le virus antisens et ds représente un mélange 1 : 1 de l'ensemble des réserves de virus (réserve en bloc). Figure 2 : analyse de l'ARN d'aldolase par les transferts de Northern. Panneau du haut : on sépare l'ARN total des cellules infectées (voir figure 1) par analyse de gel transféré à une membrane et exploré soit avec A marqué qui couvre la région à expression virale soit avec B qui est spécifique pour les copies chromosomiques de l'ARN de l'aldolase A. La sonde A nécessite 1,5 heures d'exposition et B une exposition toute la nuit au film radiographique. En bas, on représente une image de l'autoradiographie du transfert de la sonde B. Figure 3 : corrélation entre l'inhibition de la transcription du gène et le titrage du virus. On infecte des cellules avec une M. O. I. (multiplicité d'infections) de 0,5 à 50 avec des réserves en blocs de virus s/as et on les incube pendant 24 heures. On isole l'ARN total et on le transforme en ADNc. On réalise PCR pendant 25 cycles soit avec des amorces spécifiques de GAPDH (témoins) soit de l'aldolase. On visualise les amplicons par électrophorèse classique sur agarose. On représente les résultats avec deux réserves en blocs de virus indépendantes (1/3 et 4/5). Figure 4 : cinétique de l'inhibition par des réserves de virus as/s. On infecte des cellules HEK (rein embryonnaire humain) avec les réserves en bloc 1/3 ou les réserves individuelles s et as. On incube les cellules pendant les temps indiqués et on poursuit par l'analyse de PCR des niveaux de transcription. Figure 5 : mesure de l'activité de l'enzyme d'aldolase A Co indique le niveau d'enzyme dans les cellules non infectées et B est un témoin négatif tampon, as, s et les réserves en bloc (ds) sont utilisés pour infecter les cellules à une MOI de 25 pendant 24 heures. Les cellules sont récoltées, lysées et l'activité enzymatique est mesurée en utilisant un dosage du commerce et un lysat de 3 ou 5 pl. Figure 6 : arrêt du cycle cellulaire par régulation négative à la cycline. De gauche à droite : 1 contrôle du milieu ; 2 : cellules non infectées (prolifération maximale) ; cellules infectées avec un virus exprimant une protéine fluorescente verte (GFP, témoin d'infection) ; 4 et 5 témoins de dosage avec les antibiotiques G418 et zéocine ; ARN ds d'aldolase A humaine (témoin d'inhibition) ; 7 SFV sens cycline A ; 8 SFV antisens cycline A ; 9 SFV (ds) sens et antisens cycline A 11 SFV antisens cycline B ; 12 SFV (ds) sens et antisens cycline B ; 13 SFV (ds) sens et antisens cycline A et cycline B. Figure 7 : image microscopique de la culture des cellules infectées avec le virus exprimant GFP et de la culture de SFV sens et antisens cycline A et cycline B. Dans les exemples ci-dessous, les méthodes et les techniques nécessaires sont connues dans la littérature et sont décrites par exemple dans Sambrook et coll., 1989. Dans les exemples ci-dessous, le vecteur de SFV utilisé est une version non cytopathogène avec deux mutations ponctuelles dans le gène non structural de SFV nsP2 (Ser 259 Pro et Arg 650 Asp) décrit par Lundstrom K., Schweitzer C., Richards J. G., Ehrengruber M. U., Jenck F. et Muelhardt C., 1999, "vecteur du virus de la Forêt de Semliki pour des applications in vitro et in vivo,"Gene Therapy and Molecular Biology", 4,23-31. Ce vecteur modifié de SFV n'inhibe pas l'expression du gène endogène dans les cellules hôtes infectées ce qui permet l'inhibition du gène ciblé et particulier par la technologie de l'ARN ds. EXEMPLES Exemple 1 Inhibition de l'expression de l'aldolase A dans des cellules de BHK (rein de hamster bébé) (ATCC numéro enregistré : CCL- 10) (figure 1). Sur la base du gène humain de l'aldolase A (M. Sakakibara, T. Mukai & K. Hori,"Nucleotide sequence of a cDNA clone for human aldolase : a messenger RNA in the liver", "Biochem Biophys. Res. Commun. ", 30,413-420, 1985), on choisit trois paires d'amorces oligonucléotidiques pour amplifier les régions requises du gène. VA (nt 210-240 comme décrit par M. Sakakibara, T. Mukai & K. Hori, "Nucleotide sequence of a cDNA clone for human aldolase : a messenger RNA in the liver", "Biochem. Biophys. Res. Commun. ", 30,413-420, 1985) et VB (nt 740-710 comme décrit par M. Sakakibara, T. Mukai & K. Hori, "Nucleotide sequence of a cDNA clone for human aldolase : a messenger RNA in the liver", "Biochem. Biophys. Res. Commun. ", 30, 413-420,1985) amplifient une région d'environ 600 nucléotides utilisés pour la construction de réserves de virus sens et antisens. GA (nt 170-200 comme décrit par M. Sakakibara, T. Mukai & K. Hori, "Nucleotide sequence of a cDNA clone for human aldolase : a messenger RNA in the liver", "Biochem. Biophys. Res. Commun. ", 30,413-420, 1985) et GB (nt 780-750 comme décrit par M. SaKakibara, T. Mukai & K. Hori, "Nucleotide sequence of a cDNA clone for human aldolase : a messenger RNA in the liver","Biochem. Biophys. Res. Commun. ", 30, 413-420,1985) amplifient une région chromosomique du gène de l'aldolase. La sonde A de Northern est produite en utilisant les amorces VA et VB et la sonde B est amplifiée avec une paire d'amorces de la région en amont (nt 951-980 et nt 1330-1301 comme décrit par M. Sakakibara, T. Mukai & K. Hori,"Nucleotide sequence of a cDNA clone for human aldolase : a messenger RNA in the liver", "Biochem. Biophys. Res. Commun. ", 30,413-420, 1985). Les cellules sont infectées et développées pendant 24 heures. On isole l'ARN et on le transforme en ADNc selon les modes opératoires classiques. Tous les produits de PCR sont sous-clonés dans des vecteurs classiques de clonage pour le séquençage. VA/VB est encore cloné dans le vecteur de SFV pour produire des particules infectieuses de SFV. L'ARNm de l'aldolase encodé viralement est abondant et détecté après 15 cycles de PCR dans des cellules infectées de virus. On n'obtient aucun signal dans les cellules sans virus. En utilisant les amorces génomiques pour l'ARNm de l'aldolase, on amplifie une bande de la taille attendue dans les cellules non infectées et les cellules infectées avec les virus à production sens ou antisens. Le mélange des deux virus sens et antisens est un puissant inhibiteur de l'expression du gène de l'aldolase chromosomique tandis que l'expression du gène viral reste non affectée. Exemple 2 Analyse de l'ARN de l'aldolase par des transferts de Northern (figure 2) L'ARN total des cellules non infectées ou des cellules infectées avec les réserves de virus indiquées est séparé sur un gel classique de formamide, transféré après électrophorèse à une membrane de nitrocellulose et ensuite exploré avec le fragment A ou B radiomarqué (voir exemple 1). La sonde A détecte presque exclusivement l'ARN de l'aldolase dérivé du virus du fait du bref temps d'exposition de 45 minutes. La sonde B détecte seulement l'ARNm de l'aldolase encodé chrosomosiquement après 16 heures d'exposition du transfert hybridé au film. On utilise un gel coloré avec l'ARN ribosomal pour contrôler la charge (au-dessous de la sonde B). En particulier dans l'image du gel, il est évident que les niveaux d'ARNm de l'aldolase sont les plus bas dans les cellules infectées avec les deux virus. Exemple 3 L'inhibition de la transcription du gène dépend des titres de virus Comme on peut le constater sur la figure 3, par rapport au témoin, les niveaux d'ARNm de l'aldolase commencent à diminuer à une M. O. 1. de 12,5 et à 50 on ne peut pratiquement pas détecter d'ARNm en utilisant ce dosage de sensibilité. Les niveaux d'un autre gène témoin chromosomique (GAPDH) ne sont pas altérés avec une M. O. I. croissante. Exemple 4 Cinétique de l'inhibition par des réserves de virus as/s On infecte des cellules BHK (no enregistré à l'ATCC : CCL-10) avec as ou s ou un mélange as/s de stock ou réserve de virus à ARN d'aldolase. Aux points chronologiques indiqués sur la figure, on isole l'ARN et on le transforme en ADNc. Après PCR, on analyse les produits par électrophorèse sur gel d'agarose. Au bout de 8 heures, la destruction marginale de l'ARN de l'aldonase génomique est évidente et l'activité la plus élevée se détecte au bout de 48 heures. Dans cette expérience particulière, le virus à expression sens aussi influence la stabilité de l'ARN. L'ARN de GAPDH reste inaltéré sauf dans les échantillons à 48 et 72 heures dans lesquels une réduction des niveaux d'ARN est évidente dans les cellules infectées avec le mélange de virus s/as. Ceci est probablement lié à la mort cellulaire parce que l'aldolase est une enzyme essentielle. Exemple 5 Réduction de l'activité de l'enzyme aldolase par les stocks de virus à aldolase s/as On infecte des cellules BHK (numéro d'enregistrement ATCC : CCL-10) avec les stocks indiqués et on les cultive pendant 24 heures dans conditions classiques de cultures de cellules. On récolte les cellules et on les lyse dans un 1 x PBS contenant 0,2 % de Triton X-100. Après 10 minutes de centrifugation à 16.000 g et à 4 oc, on récupère la portion surnageante et on dose soit 3 pl (barres grises) soit 5 ul (barres noires) en utilisant une trousse du commerce (SIGMA, catalogue # : 752-A) et le protocole fourni. La réduction la plus significative de l'activité enzymatique est telle qu'attendue dans l'échantillon infecté avec à la fois les stocks de virus s et as. Exemple 6 Résultats de"descente"de la cycline dans l'arrêt du cycle cellulaire Arrêt du cycle cellulaire par la régulation négative de la cycline. On infecte des cellules de reins embryonnaires humaines (HEK 293) (numéro d'enregistrement ATCC : CRL-1573) avec des particules de virus SVF indiquées au point de temps zéro et on dose la prolifération après 20 (barres gris clair) et 40 heures (barres gris foncé) dans la culture en utilisant un dosage en couleur du commerce (Promega G5421 d'après le bulletin technique TB245). Le mélange des stocks de virus en bloc cycline A et B est le plus efficace et même plus puissant que l'inhibition de la croissance cellulaire par des antibiotiques (néomycine et zéocine). La séquence de la cycline A est celle décrite dans ("Hepatitis B virus integration in a cyclin A gene in a hepatocellular carcinoma", Wang, Chenevisse X., Henglein B., Brechot C., "Nature"343 : 555-557 (1990) ) et la séquence de la cycline B est celle décrite par"Kim D. G., Choi S. S., Kang Y. S., Lee K. H., Kim U. J., Shin H. S., soumise (06 Mai 1997) aux bases de données EMBL/ GenBank/DDBJ, no d'accès AF002822,"Life Science", Université de Science et de technologie de Pohang, SAn 31, Pohang, Kyungbuk 790- 784, Corée). Exemple 7 Culture de cellules infectées avec le sens et l'antisens dans un vecteur Les fragments sens et antisens des gènes de la cycline A et de la cycline B sont clonés dans un vecteur de SFV unique par l'introduction d'un second promoteur subgénomique 26S. Les produits de recombinaison sont les suivants : SFV 26S-cycline A sens-SFV 26S-cycline A antisens et SFV 26S-cycline B sens-SFV 26S-cycline B antisens. Les infections des cellules HEK293 avec SFV-cycline A ou SFV-cyline B seul, ou ensemble, ne conduisent à aucun arrêt de la prolifération cellulaire. Ceci indique que les produits de recombinaison avec à la fois des fragments sens et antisens dans le même vecteur ne sont pas capables d'inhiber l'expression des gènes de cycline chromosomiques. REVENDICATIONS 1. Procédé pour inhiber l'expression d'un gène cible dans des cellules ou un tissu qui comprend l'infection desdites cellules ou dudit tissu avec (a) des particules virales contenant de l'acide ribonucléique simple brin (ARN ss) exprimant un brin d'ARN sens et (b) des particules virales contenant de l'acide ribonucléique simple brin (ARN ss) exprimant un brin d'ARN antisens, dans lequel les brins d'ARN sens et antisens comprennent des séquences nucléotidiques homologues à une portion dudit gène cible. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les particules virales sont des alphavirus. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel pour l'infection, les particules virales contenant l'ARN ss exprimant le brin d'ARN sens sont en quantité égale à celles contenant l'ARN ss exprimant le brin d'ARN antisens. 4. Procédé selon les revendications 1 à 3, dans lequel ledit ARN simple brin est cloné soit dans l'orientation sens soit dans l'orientation antisens dans le vecteur de ladite particule virale. 5. Procédé selon les revendications 1 à 4, dans lequel ledit gène cible est un gène eucaryotique, un gène viral ou un gène synthétique. 6. Procédé selon les revendications 1 à 5, dans lequel ledit gène cible est un gène du développement, un oncogène, un gène supresseur de tumeur ou une enzyme. 7. Procédé selon les revendications 1 à 6, dans lequel ladite séquence nucléotidique homologue est spécifique pour ledit gène cible et d'une longueur d'au moins 50 bases. 8. Procédé selon les revendications 1 à 7, dans lequel les cellules ou le tissu sont présents dans un organisme et dans lequel l'inhibition de l'expression du gène cible démontre une perte de fonction phénotypique. 9. Trousse comprenant des réactifs pour inhiber l'expression d'un gène cible dans des cellules ou un tissu, laquelle trousse comprend au moins une quantité suffisante de particules virales à ARN simple brin (ARN ss) exprimant soit le brin d'ARN sens soit le brin d'ARN antisens qui sont complémentaires et forment à l'intérieur desdites cellules ou dudit tissu un ARN ds comprenant une séquence nucléotidique homologue à une portion dudit gène cible et capable d'interférer avec l'expression de ladite cible. 10. Utilisation (a) de particules virales contenant de l'acide ribonucléique simple brin (ARN ss) exprimant un brin d'ARN sens et (b) de particules virales contenant de l'acide ribonucléique simple brin (ARN ss) exprimant un brin d'ARN antisens, dans laquelle les brins d'ARN sens et antisens comprennent des séquences nucléotidiques homologues d'une portion d'un gène cible pour la préparation d'un médicament pour traiter des maladies. 11. Utilisation des particules virales selon la revendication 10 pour la préparation d'un médicament pour traiter le cancer, de préférence des tumeurs solides ou des leucémies. 12. Composition pharmaceutique comprenant (a) des particules virales contenant de l'acide ribonucléique simple brin (ARN ss) exprimant un brin d'ARN sens et (b) des particules virales contenant de l'acide ribonucléique simple brin (ARN ss) exprimant un brin d'ARN antisens, dans laquelle les brins d'ARN sens et antisens comprennent des séquences nucléotidiques homologues d'une portion d'un gène cible, et éventuellement des excipients pharmaceutiquement acceptables. 13. Composition pharmaceutique selon la revendication 12, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention du cancer, de préférence des tumeurs solides ou des leucémies. 14. Particules virales contenant (a) de l'acide ribonucléique simple brin (ARN ss) exprimant un brin d'ARN sens et des particules virales contenant (b) de l'acide ribonucléique simple brin (ARN ss) exprimant le brin d'ARN antisens, dans lesquelles les brins d'ARN sens et antisens comprennent des séquences nucléotidiques homologues d'une portion d'un gène cible destinées à être utilisées comme substance thérapeutique active pour le traitement ou la prévention des maladies. 15. Particules virales selon la revendication 14 destinées à être utilisées comme substance thérapeutique active, en particulier comme substance anticancéreuse.