Brevet FR2812305A1 — publié le 20020201

ELEMENT D'ADN PROMOTEUR DE L'ACTIVITE DE TRANSCRIPTION, ACTIF DANS LES CELLULES HUMAINES ET METHODE GENERALE POUR EN AJUSTER L'ACTIVITE La présente invention concerne une séquence d'ADN ayant une capacité d'activation de la transcription équivalente à celle d'un système promoteur viral fort. Le deuxième aspect de l'invention concerne l'ajustement de l'activité de ce promoteur ou de tout autre promoteur, par l'insertion d'un fragment d'ADN de taille variable entre le fragment promoteur et la séquence d'intérêt à transcrire. Au sein de la cellule, le niveau d'expression des protéines est régulé à de nombreuses étapes, et tout particulièrement par l'intermédiaire du niveau de transcription de l'ADN codant pour une protéine d'intérêt. La transcription de l'ADN en ARN est réalisée par des ARNpolymérases dont l'activité est initiée au niveau des promoteurs et peut être modulée par des facteurs de transcription. A l'heure actuelle, les modes de fonctionnement des promoteurs eucaryotes (et tout particulièrement humains) sont très mal connus. De ce fait, les promoteurs utilisés dans les vecteurs d'expression sont essentiellement des promoteurs forts d'origine virale. On entend généralement par promoteur fort un promoteur dont la présence permet de multiplier la transcription du gène par au moins 100 par rapport à la transcription du gène en l'absence de toute séquence promotrice. Une majorité de ces promoteurs nécessite la présence de séquence amplificatrice ( enhancer ) supplémentaire pour que le facteur multiplicatif soit-optimal. Enfin, les possibilités de contrôle à façon du niveau de transcription des gènes d'un vecteur d'expression n'existent pas. Seul un contrôle binaire est envisageable par l'état de la technique ; l'introduction de certains facteurs exogènes ou substances chimiques permettant d'activer ou de désactiver le promoteur. Cependant, quand on introduit une séquence hétérologue dans un organisme, l'adaptation de la force du promoteur pour optimiser l'expression de cette séquence est parfois essentielle. C'est le cas si la surexpression de la protéine codée par la séquence hétérologue est toxique. C'est aussi le cas si l'on veut ajuster l'expression de la protéine à un taux requis dans un tissu particulier ou selon les objectifs thérapeutiques. Par exemple, étant donné que les mitochondries sont plus nombreuses dans les cellules du muscle que dans d'autres tissus, il faut donc adapter la quantité d'une protéine mitochondriale que l'on voudrait exprimer dans le muscle par rapport à un autre tissu qui fait appel à un fonctionnement mitochondrial moindre. Un des moyens de contrôler le niveau d'expression d'une protéine est d'en contrôler le niveau de transcription et donc par voie de conséquence le niveau de synthèse de cette protéine. Si l'on veut obtenir différents niveaux de transcription d'un gène, la solution antérieure consiste à créer des vecteurs d'expression avec différents promoteurs de forces inégales. Mais le choix de promoteurs reste limité. De plus, cette solution complique les aspects pratiques du clonage de fragments de gène à exprimer. Enfin, il est difficile de comparer a posteriori les différences d'efficacité des vecteurs, dans la mesure où après transfection cellulaire, l'on n'est plus tout-à-fait sûr des réponses individuelles de chaque promoteur dans le contexte physiologique particulier de la cellule transfectée. Au niveau de la cellule eucaryote, il a été montré que de nombreux facteurs de transcription se fixaient sur l'ADN et permettaient in vivo de moduler le niveau de transcription. De manière plus récente, des éléments de régulation transcriptionnelle ont été mis en évidence non seulement dans la partie 5' en amont des gènes, mais aussi dans leurs introns. Ces séquences peuvent jouer le rôle d'activateurs de transcription ou bien elles peuvent servir pour l'expression spécifique au sein d'un tissu ou d'un type cellulaire. Des éléments intragéniques de régulation négative ont aussi été caractérisés dans des gènes eucaryotes. Dans tous les cas, les éléments de régulation transcriptionnelle concernent une séquence nucléotidique spécifique, responsable de la fixation de facteurs de transcription. L'influence de ces séquences dépend fortement du type cellulaire considéré. Le problème à l'heure actuelle est donc double. Non seulement il s'agit d'exprimer des protéines dans les cellules humaines en s'affranchissant du risque sanitaire encouru par l'introduction d'un promoteur d'origine virale. Mais il s'agit de plus, de réussir à moduler aisément le niveau d'expression de la protéine d'intérêt, sur une échelle très large, pour l'adapter au niveau requis dans la cellule-hôte. C'est un des objectifs de la présente invention de fournir un promoteur actif dans les cellules humaines et qui ne soit pas d'origine virale. Le promoteur du gène NDUFS8 appartenant au chromosome humain n 11 répond à cet objectif. La figure 1 illustre une séquence comprenant ce promoteur. L'invention selon un premier aspect concerne ce promoteur, ou un promoteur ayant une séquence homologue, partageant au moins 70% d'identité avec le promoteur cité et/ou partageant avec celui-ci des motifs CCAAT. Un promoteur selon le premier aspect de l'invention sera dénommé promoteur NDUFS8 . Selon un second aspect, l'invention fournit une séquence promotrice incluant le promoteur précédent, également active dans les cellules humaines et d'origine non-virale, mais qui de plus présente une activité promotrice aussi forte que le promoteur viral SV40. Nous la désignerons par la suite par séquence promotrice NDUFS8 . Selon un troisième aspect de l'invention, la force dudit promoteur peut être ajustée en introduisant une séquence d'ADN, appelée stuffer, entre le promoteur et la séquence à transcrire et qui agit comme variateur. L'activité de transcription du promoteur décroît linéairement en fonction de la taille du stuffer. Un quatrième aspect de l'invention permet d'atténuer l'activité de transcription d'une séquence promotrice, elle peut être ajustée en introduisant une séquence d'ADN (stuffer) entre cette séquence promotrice et la séquence à transcrire, ce stuffer agissant comme variateur. La présente invention possède donc de nombreux avantages. Tout d'abord, le promoteur NDUFS8 est un promoteur fonctionnel dans les cellules humaines. L'origine humaine de ce promoteur est un atout supplémentaire de l'invention. De plus, la séquence promotrice selon le second aspect de l'invention est active en tant que promoteur sans nécessiter la présence de séquence amplificatrice ( enhancer ) supplémentaire et elle a une activité promotrice parmi les plus fortes connues à l'heure actuelle. Le troisième aspect de l'invention permet de moduler le taux de transcription induit par la séquence promotrice NDUFS8. Il est de ce fait possible de créer une gamme de promoteurs ayant la même séquence de base selon le premier aspect et ne différant que par la longueur du stuffer, donc une gamme très homogène dont les éléments ne diffèrent les uns des autres que par une seule caractéristique. L'homogénéité des promoteurs rend la stratégie de clonage nettement plus simple que pour des promoteurs d'origine diverse comme c'était le cas dans les solutions antérieures où il fallait repenser la stratégie de clonage et le choix des sites de restriction pour toutes les différentes constructions envisagées. L'invention selon son quatrième aspect élargit la possibilité de régulation de l'activité de transcription à d'autres promoteurs. Il est donc ainsi possible à partir d'un promoteur adapté donné de créer une gamme de promoteurs ayant la même séquence promotrice de base et ne différant que par la longueur du stuffer, donc une gamme très homogène dont les éléments ne diffèrent les uns des autres que par une seule caractéristique. L'homogénéité des promoteurs rend la stratégie de clonage nettement plus simple. Dans le contexte de la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante : - Gène : Molécule d'acides nucléiques codant pour un polypeptide fonctionnel ou une molécule d'ARN, contenant des séquences de régulation de la transcription. Le gène peut aussi comprendre des séquences non codantes. Des introns peuvent être présents. - Séquence codante : Fragment d'ADN codant pour un polypeptide fonctionnel ou une molécule d'ARN. - Promoteur : Région de l'initiation de la transcription. Cette région comprend les éléments de séquence nécessaires pour l'initiation de la transcription par l'ARN polymérase appropriée. En général, cette région, -située en amont de la séquence codante, est en 5' par rapport au site d'initiation de la transcription. Séquence promotrice : Séquence comprenant un promoteur et des éléments de régulation de transcription. Activité de transcription engendrée par une séquence promotrice : elle se définit généralement par le nombre de molécules d'ARN initiées par unité de temps. Elément de régulation de transcription : Elément quelconque dans une séquence d'acides nucléiques qui a la capacité, seul ou bien associé à d'autres composants cellulaires (tels que des protéines), d'initier, de favoriser, de réprimer, d'induire ou de terminer la transcription d'ADN génomique en ARN. Dans la plupart des cas, l'ADN génomique dont la transcription est régulée par cet élément, est située à proximité de lui, en 3' ou en 5' . Le terme facteur de régulation de transcription inclut les promoteurs, les amplificateurs ( enhancers ), les répresseurs et les signaux de terminaison de transcription. Facteur de transcription : Composant cellulaire (tel qu'une protéine) capable d'interagir avec un élément de régulation de transcription sur une séquence d'ADN et de participer à la régulation de la transcription. Gène chimère : Gène comprenant des sous-parties de différentes origines, par exemple une séquence codante provenant d'une première espèce et un promoteur venant d'une deuxième espèce. Un gène est également considéré comme un gène chimère s'il comprend des sous-parties provenant de différents gènes d'une même espèce, ou bien d'un même gène de différentes espèces. Hétérologue . Deux entités sont hétérologues l'une vis-à-vis de l'autre quand il n'existe pas naturellement d'association de ces deux séquences. Par exemple, deux séquence d'acides nucléiques sont hétérologues l'une par rapport à l'autre si les séquences ne proviennent pas du même organisme ou bien ne proviennent pas du même gène pour un organisme donné. % d'identité d'acides nucléiques : Ce pourcentage indique le degré d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques le long des séquences dans leur entier. Si les séquences considérées sont de taille différente, le % d'identité est exprimé en fonction de la longueur totale de la plus courte séquence. Pour calculer le % d'identité, les deux séquences sont superposées de façon à maximiser le nombre de bases identiques en autorisant des intervalles, puis le nombre de bases identiques est divisé par le nombre total de bases de la plus courte séquence. Fragment : Partie d'une entité n'incluant pas l'entité dans son entier. Par exemple, un fragment de séquence d'acides nucléiques se réfère à des parties ou segments de cette séquence mais n'inclut pas la séquence dans son intégralité. Stuffer : Fragment d'ADN qui se place entre le promoteur (ou la séquence promotrice) et la séquence codante, dont la principale caractéristique fonctionnelle est d'éloigner ces deux éléments. Un stuffer peut comprendre de zéro paire de bases à quelques milliers de paires de bases, par exemple de 0 à 2000 paires de bases, particulièrement de 0 à 1500. Le stuffer ne contient pas d'éléments de régulation de transcription reconnus comme tels par la cellule en question et il n'interagit pas avec le promoteur ou la séquence promotrice. Site de fixation NRF1 : Séquence d'acides nucléiques sur laquelle se fixe le facteur de transcription NRF1 (nuclear respiratory factor 1) qui agit en cis. Transcrit fonctionnel : ARN obtenu par la transcription d'un fragment d'ADN, gène ou gène chimère, initiée au niveau d'une séquence promotrice et dont la qualité et la taille lui confèrent l'intégralité des fonctions codées par ledit fragment d'ADN, c'est-à-dire ARN anti-sens capable d'hybrider avec un ARN messager spécifique, ou ARN messager comportant tous les signaux permettant sa traduction en une protéine ou un polypeptide codés par la séquence codante du fragment d'ADN transcrit. L'invention va maintenant être décrite plus en détails. Un premier aspect selon la présente invention concerne un promoteur de petite taille actif dans les cellules humaines. Les inventeurs ont mis en évidence la très forte activité promotrice d'un fragment de séquence du chromosome 11q13 situé en amont du gène humain NDUFS8. Ce gène code pour la sous-unité 23kDa (encore appelée TYKY ou sous-unité NDUFS8) du complexe I (NADH-ubiquinone oxydoréductase-EC 1. 6.5.3) de la chaîne respiratoire mitochondriale. L'élément promoteur de l'activité de transcription de l'ARN polymérase pour ce gène est compris dans la région séparant l'extrémité 3' du gène ALDH7 en amont sur le chromosome et le début du premier exon du gène NDUFS8. Cette région est illustrée dans la figure 2. L'élément promoteur est situé plus particulièrement dans les 241 paires de bases précédent le début de ce premier exon et représenté dans la figure 1 entre les positions 1630 et 1870. Cette région en amont du premier exon est caractérisée par la présence de trois motifs CCAAT-like aux positions-153, -92 et-39 par rapport au nucléotide C1871 qui définit vraisemblablement le début du premier exon. Aucune TATA box consensuelle n'est présente en aval du second et du troisième motif CCAAT. En amont des sites CCAAT se trouve un motif qui correspond à un site de fixation pour Ets , un facteur ayant un rôle général dans l'activation de la transcription. Le rôle des motifs CCAAT est important dans l'activité promotrice. Des fragments d'ADN tronqués en 5' et donc ne contenant qu'un ou deux des trois motifs CCAAT présentent une activité promotrice affaiblie par rapport à la séquence de 241 paires de bases décrite mais conservent néanmoins une activité. Un promoteur NDUFS8 selon l'invention recouvre une séquence d'ADN présentant un pourcentage d'identité de plus de 70% avec la séquence décrite plus haut de 241 paires de bases et qui comprend au moins l'un des trois motifs CCAAT, de préférence deux de ces motifs et au mieux les trois. De préférence, la séquence présente un pourcentage d'identité avec la séquence de la figure 1 de plus de 80%, par exemple plus de 90%. Une séquence promotrice selon le deuxième aspect de l'invention, appelée séquence promotrice NDUFS8, contient le promoteur NDUFS8 précédemment décrit suivi d'au moins une partie de l'exon I du gène NDUFS8 et d'au moins une partie de l'intron I de ce même gène. De préférence, l'exon I est présent dans sa totalité (base C1871 à base G1962 dans la figure 1) et l'intron I est présent en partie, cette partie ayant au moins 500 à 1000 paires de bases. En effet, cette région contient des sites de fixation pour le facteur de transcription Spl et pour le facteur nucléaire respiratoire NRF1. Une variante préférée de l'invention contient une forme tronquée en 3' de l'intron I. De préférence, la séquence correspond à la forme tronquée en 3' au site de restriction BamHl au G2081. Cette séquence fait 452 paires de bases et est encadrée par les sites de restriction de Apal en 5' et BamHI en 3'. L'activité promotrice de la séquence décrite est comparable à celle de SV40. Elle a en effet été clonée dans le vecteur d'expression pGL-3basic de Promega, contenant le gène luc+ pour la luciférase de luciole. Le niveau de production de la luciférase a été comparé au niveau de production dans une construction similaire mais contenant le promoteur viral SV40 et l'amplificateur ( enhancer ) SV40. Les inventeurs ont montré que les niveaux de transcription induits par ces deux promoteurs sont comparables. Or le promoteur SV40 est réputé ayant une capacité d'activation de la transcription parmi les plus fortes. Les inventeurs ont donc mis en évidence une courte séquence d'ADN génomique humain dotée d'une très forte capacité d'activation transcriptionnelle, sans nécessiter de séquence amplificatrice ( enhancer ) supplémentaire comme c'est le cas pour le promoteur SV40. Comme elle provient d'un chromosome d'une cellule eucaryote, cette séquence selon l'invention a une activité promotrice dans les cellules eucaryotes. De plus, l'origine plus particulièrement humaine de la séquence lui confère une activité dans les cellules animales, particulièrement des cellules mammifères telles que les cellules murines, simiennes, bovines, de préférence elle est aussi active dans les cellules humaines. La séquence promotrice NDUFS8 selon l'invention possède de plus une capacité d'activation transcriptionnelle ajustable. L'activité de transcription engendrée par une séquence promotrice se définit généralement par le nombre de molécules d'ARN initiées par unité de temps. De fait, plusieurs façons de modifier l'activité transcriptionnelle d'une séquence promotrice sont envisageables. Un premier moyen consisterait à changer les propriétés de la séquence promotrice en elle-même, c'est-à-dire changer son efficacité ou la vitesse d'initiation de la transcription. Ces modifications peuvent être réalisées en modifiant la séquence ou en ajoutant des sites de fixation pour des amplificateurs ( enhancers ) ou des silencers. Un autre moyen consiste à intervenir plus en aval, une fois que la transcription est initiée, en modifiant le nombre de transcrits fonctionnels par rapport au nombre de transcrits initiés. Selon cette deuxième possibilité, l'activité promotrice proprement dite n'est pas affectée, mais en revanche le taux de transcrits fonctionnels est modulé. C'est cette seconde possibilité que les inventeurs ont exploitée. Pour augmenter le nombre de transcrits correctement initiés mais non aboutis (tronqués en 3' avant le site de terminaison de transcription de la séquence à transcrire), c'est-à-dire le taux d'échec de l'ARN polymérase, les inventeurs ont inséré un fragment d'ADN appelé stuffer entre la séquence promotrice et la séquence à transcrire. Bien que le mécanisme d'action de ce système n'ait pas encore été complètement élucidé, les inventeurs postulent que, du fait de la présence de ce fragment, la probabilité que l'ARN polymérase se décroche du brin d'ADN avant le signal de fin de transcription est augmentée. La fusion du stuffer juste, en aval de la séquence promotrice permet donc de modifier le taux de transcrits fonctionnels obtenus. Le stuffer allonge en 3' la séquence promotrice. Cet allongement par rapport à la construction de base du promoteur conduit à la modulation de l'activité transcriptionnelle. Normalement, le stuffer s'insère en aval du site d'initiation de la transcription. La caractéristique essentielle du stuffer est sa taille en nombre de paires de bases. L'atténuation de l'activité transcriptionnelle par rapport à la séquence de base est une fonction linéaire croissante de la taille du stuffer, donc l'activité transcriptionnelle diminue au fur et à mesure de l'allongement du stuffer. Selon une construction préférée, la séquence promotrice considérée est la séquence de 452 paires de bases située en amont du gène NDUFS8, contenant le promoteur du gène, le premier exon et un fragment du premier intron du gène NDUFS8, correspondant à la séquence représentée dans la figure 1 entre les positions 1630 et 2081. Le stuffer ne contient pas de site de fixation pour des facteurs de transcription, il n'est pas un élément de régulation de la transcription selon la définition donnée plus haut. En particulier, il ne contient pas de sites pour des amplificateurs ( enhancers ) ou des silencers. Il est indépendant de la séquence promotrice, il n'appartient pas à cette séquence dans le sens où il ne modifie pas son activité promotrice. En effet, comme spécifié ci-dessus, le stuffer atténue l'activité de transcription du montage sans pour autant affecter l'efficacité ou la vitesse d'initiation de la transcription par le promoteur. Un stuffer selon l'invention ne contient pas de signal de terminaison de transcription afin que l'ARN-polymérase puisse donc transcrire la séquence placée en 3' par rapport au stuffer. La séquence à transcrire peut être une séquence codant pour un polypeptide fonctionnel. La séquence à transcrire peut aussi servir de matrice pour synthétiser de l'ARN antisens. Comme exemples de séquence stuffer selon l'invention, l'on peut citer toute ou partie de la séquence du gène NDUFSB s'étendant du nucléotide 2082 au nucléotide 3319, des fragments de PCR issus de l'amplification de régions quelconques des gènes NDUFS2 du chromosome lq23-25 et du gène NDUFS7 du chromosome 19pl3 . Un stuffer selon l'invention peut être une séquence d'acides nucléiques parfaitement aléatoire, par exemple une séquence synthétique avec une équiprobabilité pour les quatre bases A, T, C, G. Un autre exemple de stuffer selon l'invention est issu de la digestion enzymatique d'ADN génomique, à condition que les cellules fournissant l'ADN à digérer et celles dans lesquelles le stuffer doit être inséré soient d'espèces très différentes, par exemple de règnes différents. Des fragments issus de la digestion enzymatique d'organismes procaryotes peuvent servir de stuffer dans des cellules eucaryotes. Selon un autre exemple, des fragments d'ADN bactérien ou de levure obtenus par digestion enzymatique sont des candidats potentiels pour être utilisés comme stuffer dans des cellules humaines. La présente invention concerne aussi les gènes chimères contenant une séquence promotrice, un fragment d'ADN appelé stuffer dont la taille permet de moduler l'activité de la séquence promotrice et une séquence à transcrire. La séquence promotrice est ou bien un promoteur NDUFS8, ou bien une séquence promotrice NDUFS8 (promoteur NDUFS8 complété par le premier exon et un fragment du premier intron du gène NDUFSB). Dans les gènes chimères, la séquence à transcrire est hétérologue par rapport à la séquence promotrice. Dans le cas particulier où la séquence promotrice est composée du promoteur, de l'exon I et d'une partie de l'intron I du gène NDUFS8, la séquence à transcrire n'est donc pas celle codant pour la sous-unité NDUFS8. La modulation permise par le stuffer est une diminution de l'activité de transcription de la séquence promotrice placée en amont. Cette diminution est une fonction linéaire croissante de la longueur du stuffer (figure 9a et 9b). Le facteur de modulation ainsi permis est très important. Dans le cas particulier où la séquence promotrice correspond à la séquence de 452 paires de base du gène NDUFS8 illustrée dans la figure 1 et où la séquence à exprimer, située en aval de la fusion entre séquence promotrice et stuffer, est celle du gène luc+ dans le vecteur d'expression pGL-3basic, un stuffer de 1200-1500 paires de bases entraîne une activité transcriptionnelle d'environ 2 à 5 fois celle du gène en l'absence de toute séquence promotrice. Par contre, si le stuffer est réduit à quelques bases ou réduit à néant, on observe une activité transcriptionnelle égale à 200 fois celle observée en l'absence de toute séquence promotrice. Entre les deux situations, on a de ce fait un facteur de 40 à 100. La gamme de promoteurs présentant des forces d'expression variables est donc particulièrement étendue. Un stuffer selon l'invention n'est pas un élément de régulation de la transcription donc il ne contient pas de signal de terminaison de transcription. L'addition du stuffer ne doit pas non plus perturber la traduction de la séquence à transcrire placée en aval. De ce fait, un stuffer préféré selon l'invention ne contient pas la séquence ATG qui pourrait entraîner sa traduction après la transcription. Un tel stuffer ne contient pas non plus tout autre signal qui pourrait conduire à sa traduction. Pour que l'influence du stuffer reste limitée au sein de la cellule et pour éviter des interactions ou interférences non désirables dans la cellule-hôte, une variante de l'invention consiste à considérer le stuffer comme un premier intron vis-à-vis de la séquence placée en aval dans le gène chimère. De ce fait, un stuffer selon l'invention contiendrait les signaux nécessaires à son épissage après transcription. L'ARNm produit par la cellulehôte correspond alors à celui qui aurait été généré après la transcription uniquement de la séquence à transcrire d'intérêt. Selon une variante de l'invention, la séquence à transcrire, qui se trouve au sein du gène chimère, n'est pas traduite. En particulier, la construction du gène chimère peut être réalisée afin de synthétiser des ARN anti-sens pour bloquer par exemple la synthèse d'autres protéines de la cellule-hôte, elle peut aussi être réalisée pour synthétiser des ribozymes. Selon une autre variante de l'invention, la séquence à transcrire est traduite. Cette séquence d'intérêt à traduire, placée dans la partie 3' du gène chimère, contient un ATG qui peut être reconnu par les ribosomes pour permettre la traduction du cadre de lecture. De ce fait, après la transcription de la fusion entre stuffer et séquence d'intérêt, la traduction débutera exactement à l'endroit voulu au début de la séquence codante d'intérêt placée en aval de l'ATG. Comme exemple de séquence à transcrire, l'on peut citer des séquences codant pour des agents de sélection, des marqueurs, des hormones, des récepteurs, des protéines reporters telles que la luciférase. Cette séquence à transcrire, une fois traduite en polypeptide, peut servir à déclencher chez l'hôte la production d'anticorps contre le polypeptide codé par ladite séquence. La présente invention concerne aussi des vecteurs contenant des gènes chimères comme décrits précédemment. Ces vecteurs permettent l'introduction et éventuellement l'expression du gène chimère dans une cellule-hôte. Comme exemple de vecteurs, on peut citer les vecteurs d'expression plasmidiques, les vecteurs viraux, les vecteurs intégratifs, les vecteurs autosomaux. La présente invention touche aussi une famille de vecteurs d'expression. En effet, à partir d'un promoteur NDUFS8 selon l'invention, ou bien d'une séquence promotrice NDUFS8 selon l'invention, il est possible de générer une gamme de vecteurs d'expression qui ne diffèrent les uns des autres que par la taille du stuffer fusionné en aval du promoteur ou de la séquence promotrice. On obtient de cette manière des vecteurs d'expression présentant une gamme d'activité transcriptionnelle. Il est alors possible de classer les vecteurs selon une relation d'ordre basée sur l'activité transcriptionnelle. Cette relation d'ordre entre eux en fonction de l'activité transcriptionnelle ne dépend pas du type cellulaire. A partir d'un échantillon de cette famille de vecteurs d'expression, il est possible d'obtenir différents niveaux d'expression d'une protéine hétérologue. En fonction des résultats, le taux d'expression peut donc être optimisé pour ne pas être toxique, ou bien il peut être ajusté à un taux requis dans un tissu particulier ou selon les objectifs thérapeutiques. La présente invention concerne des cellules transformées par un gène chimère. Selon une variante de l'invention, les cellules transformées le sont de manière stable. Selon une autre variante, les cellules sont transformées de manière transitoire. Des cellules préférées selon l'invention sont d'origine mammifère et tout spécialement des cellules d'origine humaine. L'invention concerne aussi des organismes non humains transformés par un gène chimère défini ci-dessus, par exemple des mammifères transgéniques tels que des souris, des singes, des bovins. Les procédés employés pour introduire les gènes chimères de l'invention dans les cellules sont ceux décrits habituellement dans les manuels. Les techniques classiques pour l'introduction de vecteurs dans des cellules végétales ou bactériennes sont l'électroporation, les traitements chimiques accompagnés de cycles thermiques, le bombardement avec des billes de verre ou métalliques, notamment pour l'introduction de plasmides. Pour les cellules animales, les techniques d'infection et transfection sont aussi celles classiquement décrites dans les manuels ; par exemple l'infection de cellules Sf9 par un baculovirus. Dans un aspect supplémentaire, l'invention rend compte d'un procédé pour la production d'une protéine hétérologue. Une telle production suppose la construction d'un gène chimère comme décrit précédemment. Dans ce cas, le promoteur est choisi entre le promoteur NDUFS8 de l'invention, ou la séquence promotrice NDUFS8 de l'invention. Le stuffer est défini en fonction du taux souhaité d'expression de la protéine d'intérêt hétérologue. La séquence à transcrire placée en aval du stuffer est la séquence codante à traduire correspondant à la protéine d'intérêt. Cette séquence contient un ATG qui peut être reconnu par les ribosomes pour permettre la traduction du cadre de lecture. La cellule-hôte choisie est transformée avec le gène chimère construit. On applique ensuite à la cellule-hôte des conditions permettant l'expression de gènes chimères. Le procédé selon l'invention peut comprendre dans une dernière étape l'extraction de la protéine hétérologue produite. Cette extraction peut avoir lieu directement sur les cellules, après lyse cellulaire, ou bien à partir du surnageant de culture. Selon un quatrième aspect, la présente invention définit un moyen d'atténuer l'activité de transcription d'un promoteur ou d'une séquence promotrice. Selon cet aspect, l'invention est une généralisation à d'autres promoteurs de la construction permettant d'ajuster l'activité de transcription d'un promoteur NDUFS8 ou d'une séquence promotrice NDUFS8. L'invention selon cet aspect concerne des gènes chimères construits à partir d'une séquence promotrice donnée. Ces gènes chimères contiennent une séquence promotrice, un fragment d'ADN appelé stuffer dont la taille permet de moduler l'activité de la séquence promotrice et une séquence à transcrire. La fusion du stuffer juste en aval de la séquence promotrice permet d'atténuer le taux de transcrits fonctionnels. Cette atténuation par rapport à la séquence de base est une fonction linéaire croissante de la taille du stuffer. Le stuffer selon ce quatrième aspect de l'invention est utilisé de la même manière que dans le troisième aspect où il est associé à la séquence promotrice NDUFS8. Le stuffer possède de plus les mêmes caractéristiques que celles présentées ci-dessus, notamment il modifie le taux de transcrits fonctionnels sans modifier à proprement parler l'activité promotrice de la séquence promotrice placée en amont. Selon une variante de l'invention, la séquence à transcrire n'est pas traduite. En particulier, la construction du gène chimère peut être réalisée afin de synthétiser des ARN anti-sens pour bloquer par exemple la synthèse d'autres protéines de la cellule-hôte. Selon une autre variante de l'invention, la séquence à transcrire est traduite. Cette séquence d'intérêt à traduire, placée dans la partie 3' du gène chimère, contient un ATG qui peut être reconnu par les ribosomes pour permettre la traduction du cadre de lecture. De ce fait, après la transcription de la fusion entre stuffer et séquence d'intérêt, la traduction débutera exactement à l'endroit voulu au début de la séquence codante d'intérêt placée en aval de l'ATG. Un gène chimère possible selon l'invention serait constitué du promoteur SV 40 fusionné avec un stuffer. Cette construction permet de diminuer la force d'activation de la transcription du promoteur SV40 qui est particulièrement forte. Selon une autre possibilité offerte par l'invention, la séquence promotrice est constituée d'un promoteur, d'un exon et d'un fragment d'intron. Par exemple, la séquence promotrice comprend le fragment de-500 à +1400 paires de bases du gène humain COL1A1 correspondant au promoteur, au premier exon et à une partie du premier intron du gène de la chaîne al du procollagène de type I. Un autre exemple de séquence promotrice est la séquence-734 à +85 paires de bases par rapport au signal de traduction du gène humain NDUFS3. Un autre exemple de séquence promotrice est le fragment de-436 à +49 paires de bases du gène humain de la succinate déshydrogénase gène b. La présente invention concerne aussi des vecteurs contenant des gènes chimères comme décrits précédemment. Ces vecteurs sont utilisés de manière comparable à celle décrite précédemment pour la séquence promotrice NDUFS8. La présente invention concerne aussi une famille de vecteurs d'expression. En effet, à partir d'un promoteur NDUFS8 selon l'invention, ou d'une séquence promotrice NDUFS8 selon l'invention, ou bien de tout autre promoteur ou séquence promotrice, il est possible de générer une gamme de vecteurs d'expression qui ne diffèrent les uns des autres que par la taille du stuffer fusionné en aval du promoteur ou de la séquence promotrice. On obtient de cette manière des vecteurs d'expression présentant une gamme d'activité transcriptionnelle. Il est alors possible de classer les vecteurs selon une relation d'ordre basée sur l'activité transcriptionnelle. Cette relation d'ordre entre eux en fonction de l'activité transcriptionnelle ne dépend pas du type cellulaire. A partir d'un échantillon de cette famille de vecteurs d'expression, il est possible d'obtenir différents niveaux d'expression d'une protéine hétérologue. En fonction des résultats, le taux d'expression peut donc être optimisé pour ne pas être toxique, ou bien il peut être ajusté à un taux requis dans un tissu particulier ou selon les objectifs thérapeutiques. Parmi les applications de l'invention, on peut citer l'exploitation de la séquence promotrice NDUFS8 pour exprimer des protéines endogènes ou hétérologues dans des cellules eucaryotes, en particulier des cellules humaines. Il est aussi possible en insérant de manière tête-bêche un ADNc en aval de la séquence promotrice NDUFS8 de produire dans la cellule des ARN anti-sens. De plus, la forte efficacité promotrice de cette séquence permettrait d'inonder la cellule avec des quantités massives d'un ARN anti-sens spécifique qui bloquera l'expression du gène dont on a cloné l'ADNc en sens inverse, en aval de la séquence promotrice. Parmi les applications plus spécifiques de la présente invention, on peut citer l'utilisation du promoteur NDUFS8 ou/et de la séquence promotrice NDUFS8, avec ou sans stuffer, comme outils dans les stratégies de thérapie génique. Des promoteurs actifs dans les cellules humaines y sont particulièrement précieux. Pour une protéine donnée à produire par thérapie génique, l'invention fournit un promoteur permettant non seulement d'exprimer cette protéine dans des cellules humaines, mais aussi d'ajuster cette expression à un niveau requis en modulant la taille du stuffer. Enfin, il est envisageable, avec cette invention, d'utiliser des montages (promoteur, stuffer, fragment à transcrire et traduire) pour les procédés de vaccination par l'ADN nu (l'injection en l'état du gène chimère dans une cellule conduisant à la production d'anticorps du fait de la synthèse endogène de la protéine codée par la séquence à transcrire). Légende des figures Figure 1 (Figure la se poursuivant sur la Figure 1b) : Séquence de la région du gène NDUFS8 analysée par transfection transitoire comprenant 3403 paires de bases, l'extrémité 3' de l'exon terminal du gène ALDH7 est représentée. Les principaux sites de restriction pertinents sont annotés. AP2, CCAAT, Ets, NRF1, Spl sont des séquences homologues de sites de fixation de facteurs de transcription. ApaI correspond aux sites de restriction utilisés pour la construction de certains montages d'expression présentés dans les figures 3a à 3e ; SacI et BamHI sont les sites de restriction utilisés pour le sousclonage de la séquence analysée. Le fragment de restriction enzymatique obtenu après digestion au niveau du site SacI et du 21ème site BamHI comprend 3319 paires de bases. L'ATG à l'extrémité 3' du fragment est le codon d'initiation de la traduction servant à l'expression de la forme prémature de la sous-unité 23kDa. La numérotation commence au nucléotide marqué 1 correspondant à une cytosine. Figure 2 : Représentation de la région du gène NDUFS8 analysée par transfection transitoire ; AP2, CCAAT, Ets, NRF1, Spl sont des séquences homologues de sites de fixation de facteurs de transcription. L'extrémité 3' de l'exon terminal du gène ALDH7 est indiquée. SacI et BamHI sont les sites de restriction utilisés pour le sous-clonage de la séquence analysée ; l'ATG à l'extrémité 3' du fragment est le codon d'initiation de la traduction servant à l'expression de la forme prémature de la sous-unité 23kDa. L'exon 1 (représenté par une boîte hachurée) correspond à l'extrémité 5' du transcrit du gène NDUFS8 ; cette partie n'est pas codante. Figure 3 : Représentation des inserts des constructions réalisées dans le vecteur pGL3-basic. Alu Jb et Alu Sx sont des séquences intergéniques correspondant à des motifs répertoriés dites séquence alu de type Jb ou Sx. S, B et A correspondent respectivement aux sites de restriction Sacl, BamHI et ApaI. # figure 3a : Représentation des inserts des clones 1, 3 et 9 # figure 3b : Représentation des inserts des clones 5, 7 et 26 # figure 3c : Représentation des inserts des clones 14,15 et 16 # figure 3d : Représentation des inserts des clones 42,31 et 43 # figure 3e : Représentation des inserts des clones 46,33, 29 Figure 4 : Activités transcriptionnelles relatives des constructions 1,3 et du vecteur pGL3-control (promoteur SV40+ enhancer). Les données du graphique représentent la force promotrice relative des différents inserts intégrés dans le vecteur pGL3-basic. Ces valeurs correspondent aux activités Firefly luciférase mesurées pour les différentes constructions et corrigées par les activités Renilla luciférase mesurées pour le vecteur contrôle pRL-TK. Ces valeurs sont rapportées pour une activité du clone 1 fixée arbitrairement à une valeur de 1. Activité transcriptionnelle relative = [(Activité Firefly luciférase du clone) - (Activité Firefly luciférase de pGL3-basic)] / (Activité Renilla luciférase de pRL-TK). Les activités transcriptionnelles sont montrées pour des expériences d'expression transitoire dans les cellules humaines 143B et murines C2C12 en culture. Figure 5 : Activités transcriptionnelles relatives des constructions 1,7, 3,5, 26 et 9. Les données du graphique représentent la force promotrice relative des différents inserts intégrés dans le vecteur pGL3-basic. Ces valeurs correspondent aux activités Firefly luciférase mesurées pour les différentes constructions et corrigées par les activités Renilla luciférase mesurées pour le vecteur contrôle pRL-TK. Ces valeurs sont rapportées pour une activité du clone 1 fixée arbitrairement à une valeur de 1. Activité transcriptionnelle relative = [(Activité Firefly luciférase du clone) - (Activité Firefly luciférase de pGL3-basic)] / (Activité Renilla .luciférase de pRL-TK). Figure 6 : Activités transcriptionnelles relatives des constructions 1,3, 26,46, 33 et 29. Les données du graphique représentent la force promotrice relative des différents inserts intégrés dans le vecteur pGL3-basic. Ces valeurs correspondent aux activités Firefly luciférase mesurées pour les différentes constructions et corrigées par les activités Renilla luciférase mesurées pour le vecteur contrôle pRL-TK. Ces valeurs sont rapportées pour une activité du clone 1 fixée arbitrairement à une valeur de 1. Activité transcriptionnelle relative = [ (Activité Firefly luciférase du clone) - (Activité Firefly luciférase de pGL3-basic)]/(Activité Renilla luciférase de pRL-TK). Figure 7 : Activités transcriptionnelles relatives des constructions 3,1, 14,5, 7,15 et 16. Les données du graphique représentent la force promotrice relative des différents inserts intégrés dans le vecteur pGL3-basic. Ces valeurs correspondent aux activités Firefly luciférase mesurées pour les différentes constructions et corrigées par les activités Renilla luciférase mesurées pour le vecteur contrôle pRL-TK. Ces valeurs sont rapportées pour une activité du clone 1 fixée arbitrairement à une valeur de 1. Activité transcriptionnelle relative = [(Activité Firefly luciférase du clone) - (Activité Firefly luciférase de pGL3-basic)]/(Activité Renilla luciférase de pRL-TK). Figure 8 : Activités transcriptionnelles relatives des constructions 5,26, 42,31, 43,7 et 1. Les données du graphique représentent la force promotrice relative des différents inserts intégrés dans le vecteur pGL3-basic. Ces valeurs correspondent aux activités Firefly luciférase mesurées pour les différentes constructions et corrigées par les activités Renilla luciférase mesurées pour le vecteur contrôle pRL-TK. Ces valeurs sont rapportées pour une activité du clone 1 fixée arbitrairement à une valeur de 1. Activité transcriptionnelle relative = [(Activité Firefly luciférase du clone) - (Activité Firefly luciférase de pGL3-basic)] / (Activité Renilla luciférase de pRL-TK). Figure 9 : Variation de l'activité transcriptionnelle en fonction de l'addition du stuffer. L'activité transcriptionnelle relative des constructions est représentée en fonction de la taille (en nombre de paires de bases) de la séquence d'ADN comprise entre le début de l'exon 1 et le début du fragment d'ADN luc+ codant pour la Firefly luciférase. L''activité transcriptionnelle est mesurée par le système Dual-Luciférase (Promega). L'activité du clone 3 est choisie comme référence 100%. # figure 9a :transfection dans des cellules humaines 143B # figure 9b :transfection dans des cellules murines C2C12 Figure 10 : Amplification par RT-PCR de l'ARNm du gène luc+. Les ARN de cellules 143B transfectées par le clone 1 ou par le clone 3 ont été extraits et utilisés comme matrice afin de réaliser une réaction de RT-PCR dans les conditions décrites dans la section matériel et méthodes. Les amorces utilisées pour la réaction de PCR sont spécifiques de la séquence du gène luc+. Les amplifiats sont visualisés sous UV par coloration au bromure d'éthidium après électrophorèse sur un gel d'agarose 1,5%. L'intensité des bandes est estimée en utilisant le logiciel Gel Analyst (Iconix). Pour chaque clone, 5 dilutions du produit de RT ont été amplifiées par PCR : 1/10,1/50, 1/100,1/250, 1/500. M signifie marqueurs de taille de fragments d'ADN (1 Kb ladder, Life Technologies) ; Te- signifie témoin négatif de la réaction PCR (PCR réalisée en l'absence d'ARN). EXEMPLE L'objectif a consisté à étudier la régulation transcriptionnelle du gène humain NDUFS8 codant pour la sous-unité 23 kDa (encore appelée TYKY ou sous-unité NDUFS8) du complexe I (NADH-ubiquinone oxydoréductase - EC 1.6.5.3) de la chaîne respiratoire mitochondriale. La caractérisation de ce gène (De Sury et al., 1998) a permis de montrer la présence du gène codant pour l'ALDH7, en amont de NDUFS8, et l'existence d'un premier exon non codant pour le gène NDUFSB. La séquence étudiée (figure 1) correspond à un fragment de 3319 paires de bases (pb) compris entre un fragment de la partie 3' terminale du gène ALDH7 et l'extrémité 3' du premier intron du gène NDUFSB. Ce fragment est délimité par les sites de restriction Sacl (côté 5') et BamHI (côté 3'). L'extrémité 3' de cette séquence est située 76 pb en amont du codon d'initiation de la traduction du gène NDUFS8. Des expériences de transfection transitoire utilisant un vecteur contenant un fragment d'acides nucléiques codant pour la luciférase de luciole (Firefly luciferase - gène luc+) ont été réalisées pour identifier la présence, dans la séquence présentée dans la figure 1, d'une région capable de fonctionner comme promoteur de l'expression d'un gène d'une part et d'éléments ayant une activité de régulation de la transcription d'autre part. Ces expériences ont permis de délimiter une région de 452 pb, englobant le premier exon (voir clone 26 de la figure 3b), stimulant très fortement la transcription du gène luc+. D'autre part, l'allongement de la séquence située en 3' par rapport à cette construction de base (voir clone 26 de la figure 3b) et en amont du fragment luc+ codant la Firefly luciférase conduit à une décroissance progressive et linéaire de l'activité transcriptionnelle. L'invention permet donc de disposer: # d'une courte séquence d'ADN génomique humain dotée d'une très forte capacité d'activation de la transcription; # de plus, cette activité transcriptionnelle peut être modulée en fonction de la taille du fragment d'ADN inséré dans un vecteur d'expression entre cette séquence et le gène à exprimer. Matériel et méthodes : Constructions : Toutes les constructions ont été réalisées dans le vecteur pGL3-basic (Promega). Ces constructions sont présentées dans les figures 3a à 3e. Le clone 1 contient la totalité de la région étudiée. Il a été préparé à partir de deux inserts : un fragment SacI/BamHI de 2081 pb (partie 5') et un fragment BamHI/BamHI de 1238 pb (partie 3') (Figure 1 et 2). Ces inserts proviennent d'ADN génomique humain digéré (partiellement) par BamHI et sous-cloné dans le plasmide pUC18. Le clone 3 contient le fragment SacI/BamHI de 2081 pb (partie 5' ) et le clone 9, le fragment BamHI/BamHI de 1238 pb (partie 3'). Les clones 5 et 7 ont été préparés respectivement à partir des clones 3 et 1 en éliminant un fragment de restriction Apal/Apal correspondant aux bases 194 à 1629 de la séquence étudiée. Le clone 26 contient la région 1630-2081. Pour réaliser le clone 14, les deux mêmes inserts que pour le clone 1 ont été utilisés mais le fragment BamHI/BamHI de 1238 pb (en 3') a été intégré dans l'orientation inverse. Dans le clone 15, les 1238pb de l'extrémité 3' de la séquence ont été introduites dans le clone 5, en position 194. Dans le clone 16, cette séquence a été insérée à la même position mais en orientation inverse. Les inserts des clones 42,31, 43,46, 33 et 29 ont été obtenus par PCR et correspondent respectivement aux segments 1630-2423,1630-2586, 1630-2915,1695-2081, 1761-2081 et 1791-2081 de la séquence étudiée. Dans les clones 37,38, 39 et 40, des séquences d'ADN étrangères au gène NDUFSB ont été intégrées en 3' de l'insert du clone 3. Dans le clone 37et 40, il s'agit de séquences d'ADN aléatoires de 1 kilobase (kb). Dans les clones 38 et 39, c'est une séquence aléatoire de 1,5 kb dans les deux orientations. Culture de cellules : Les cellules d'ostéosarcome humain de la lignée 143B (ATCC, CRL-8303) sont cultivées dans du milieu DMEM supplémenté avec 10 % de sérum foetal de veau et 0,1 mg/ml de 5-bromo-2'-dêoxyuridine. Les cultures primaires de fibroblastes normaux humains (cellules sans origine identifiée) sont réalisées dans du milieu DMEM supplémenté avec 10 % de sérum foetal de veau. Les myoblastes murins de la lignée C2C12 (ATCC, CRL- 1772) sont cultivés dans du milieu DMEM supplémenté avec 10 % de sérum foetal de veau. Les cultures de cellules sont effectuées par mise en incubation à 37 C dans une atmosphère à 5 % de C02. Transfections : Vingt-quatre heures avant transfection, les cellules (143B ou C2C12) sont mises en culture dans une plaque 24 puits à raison de 2.104 cellules par puits. Le FuGENE 6 (Roche) est employé comme agent transfectant. Ce réactif est utilisé selon les instructions du fabricant. Pour chaque puits, 975 ng d'une construction réalisée dans le vecteur pGL3-basic (Promega) et 25 ng du vecteur pRL-TK (Promega) sont transfectés, soit une quantité totale d'ADN de 1 g. Le vecteur pRL-TK exprime une luciférase d'oursin (Renilla luciferase) sous le contrôle du promoteur de la thymidine kinase du virus Herpes simplex. L'expression constitutive de cette luciférase sert de contrôle interne de l'efficacité de la transfection. Trois microlitres (/il) de FuGENE 6 sont utilisés par puits. Les cellules sont ensuite incubées 48 heures avant d'être lysées pour la mesure des activités luciférase. Dosage Dual-Luciferase (Promega) Les cellules transfectées sont lysées dans 100 ou 500 fil de Passive Lysis Buffer IX en fonction de l'activité des constructions transfectées. Les mesures de luminescence sont réalisées sur 5,10 ou 20 /il de lysat cellulaire en fonction de l'activité des constructions transfectées. Dans un premier temps, la Firefly luciferase, correspondant aux constructions dans le vecteur pGL3-basic, est dosée par l'ajout de 100 /il de Luciferase Assay Reagent II. Puis 100 fil de réactif Stop & Glo sont ajoutés pour la mesure de l'activité Renilla luciferase correspondant au vecteur contrôle pRL-TK. Le calcul du rapport des activités mesurées pour les 2 enzymes permet de s'affranchir des variations liées au rendement de la transfection. De plus, la valeur de l'activité obtenue avec le vecteur pGL3-basic (ie, ne contenant aucun insert en amont du gène luc+) est soustraite des valeurs obtenues avec les différentes constructions. Quantification de l'ARNm du crène luc+ : Un plaque 6 puits est ensemencée avec 105 cellules 143B par puits. Après 24 heures de culture, les cellules contenues dans chaque puits sont transfectées en utilisant 3 g d'ADN et 9 /il de FuGENE 6. Le clone 1 et le clone 3 sont transfectés chacun dans 3 puits. Les cellules des 3 puits correspondant à chaque ADN transfecté sont réunies après 48 heures d'incubation. Chaque culot cellulaire est lysé par 600 /il de tampon RLT (Promega) plus 6 /il de ssmercaptoéthanol. Les ARN sont extraits sur des colonnes RNeasy Mini Kit (Promega) suivant les instructions fournies par le fabricant. Pour la transcription inverse, 3 g d'ARN sont traités par la DNaseI (DNaseI amplification grade, Life Technologies) pendant 15 minutes à 30 C puis l'enzyme est inactivée pendant 10 minutes à 65 C en présence d'EDTA. L'efficacité du traitement à la DNase (à détruire l'ADN) est contrôlée par l'absence d'amplification d'un fragment à l'aide d'une PCR réalisée sur 1 /il du produit de la réaction. Les amorces utilisées sont les mêmes que celles employées pour la RT-PCR et sont spécifiques de la séquence du gène luc+. La réaction de transcription inverse est ensuite réalisée dans un volume total de 30 /il en présence 0,1 millimolaire (mM) d'oligo(dT). Après une incubation de 10 minutes à 70 C, le mélange est placé 2 minutes dans la glace puis 200 unités de transcriptase inverse Superscript II RNase H- (Life Technologies) sont ajoutées. L'ensemble est incubé 50 minutes à 42 C puis pendant 10 minutes à 70 C. Les ADNc sont alors amplifiés par PCR en utilisant des amorces s'hybridant dans la séquence codante du gène luc+ (bases 123 à 445 de la séquence du vecteur pGL3-basic) . La réaction est réalisée dans un volume total de 25 /il contenant 1 /il d'une dilution au 1/10,1/50, 1/100,1/250 ou 1/500 du produit de la transcription inverse, 25 pmoles de chaque amorce, 200 mM de chaque désoxyribonucléotide triphosphate et 1 unité de Taq polymérase (Promega) . Les conditions d'incubation sont les suivantes . 5 minutes de dénaturation à 95 C, 30 cycles constitués de 30 secondes de dénaturation à 94 C, 30secondes d'hybridation à 58 C et 1 minute d'élongation à 72 C puis, après les 30 cycles, 5 minutes d'élongation finale à 72 C. Les amplifiats sont visualisés sous lumière UV après électrophorèse sur un gel d'agarose 1,5% dans du tampon TAE 1X (Tris acétate 0,04 M, EDTA 2 mM) et coloration au bromure d'éthidium. L'intensité des bandes est estimée en utilisant le logiciel de quantification Gel Analyst (Iconix). Résultats : Mesure des activités transcriptionnelles : Les valeurs du rapport : activité luciférase des constructions (Firefly luciferase) sur activité luciférase du vecteur contrôle pRL-TK (Renilla luciférase) , permettent de comparer la capacité d'activation de la transcription par les différents fragments d'ADN testés. Une valeur de référence de 1 est attribuée au rapport mesuré pour le clone 1 qui correspond à la totalité de la séquence étudiée. Les valeurs correspondant aux activités transcriptionnelles relatives déterminées dans les cellules 143B (origine humaine) et C2C12 (origine murine) sont présentées dans les figures 4,5, 6,7 et 8. Les résultats obtenus avec des fibroblastes humains normaux sont qualitativement identiques à ceux obtenus avec les cellules 143B, mais ne sont pas présentés dans ce document. La comparaison des clones 1 et 3 (figure 4) fait apparaître deux données importantes : d'une part la présence de puissants activateurs de la transcription dans la région 5' constituée par les 2081 premières pb, d'autre part la présence d'un ou plusieurs éléments inhibiteurs dans la partie 3' (1238 pb). En effet, dans les cellules humaines, l'activité mesurée avec le clone 3 est environ 30 fois supérieure à celle mesurée avec le clone 1 (environ 40fois supérieure dans les cellules murines). La force promotrice de l'insert du clone 3 est très importante puisqu'elle est comparable à celle mesurée pour le vecteur pGL3-control (Promega) dans lequel la transcription du gène luc+ est contrôlée par le promoteur viral SV40 associé à un élément amplificateur ( enhancer ) SV40. L'insert du clone 3 est constitué par l'extrémité 3' du gène de l'ALDH7, la région intergénique, le premier exon du gène NDUFS8 et les 119 premières bases du premier intron. L'analyse du clone 9 (figure 5) montre que la région 3' de 1238 pb n'est pas capable d'activer la transcription du gène luc+. Ce résultat s'explique par le fait que dans cette construction le site d'initiation de transcription du gène NDUFS8, localisé dans les inserts des clones 5 et 26, est absent. Par ailleurs, la similitude des données obtenues entre le clone 1 et le clone 7 d'une part, et de celles obtenues entre le clone 3 et les clones 5 et 26 d'autre part (figure 5) semble indiquer l'absence d'éléments possédant une activité de régulation de la transcription dans les 1629 nucléotides situés en 5' de la séquence étudiée, c'est à dire entre l'extrémité du gène de l'ALDH7 et le site Apal localisé 241 pb en amont de l'exon 1 du gène NDUFS8. Cette séquence représente la plus grande partie de la région dite intergénique située entre la fin du gène ALDH7 et le début du gène NDUFS8. Les résultats obtenus avec les clones 46,33 et 29 (figure 6) montrent à l'inverse la présence dans les 241 pb en amont de l'exon 1 de séquences activatrices puissantes. Le raccourcissement progressif de cette région entraîne en effet une diminution très nette de la force promotrice. Dans le but d'étudier l'impact inhibiteur de la région 3' sur l'activité promotrice du fragment actif mis en évidence dans les clones 5 et 26, une série de constructions a été réalisée. La comparaison des activités des clones 1, 3 et 14 d'une part et des clones 5 et 7 (figure 7) d'autre part montre clairement que la partie 3' des constructions, constituée par le fragment BamHI/BamHI de 1238pb, réduit de manière considérable l'activité de la région promotrice minimale localisée dans les clones 5 et 26. Les activités mesurées pour les clones 14,15 et 16 (figure 7) montrent ensuite que cet effet inhibiteur n'est pas dépendant de l'orientation du fragment de 1238 pb mais qu'il est dépendant de sa position par rapport à la région promoteur. En effet, lorsque ce fragment est placé en amont de la structure minimale la plus active déterminée dans le clone 26 sa capacité d'inhibition de la transcription est supprimée (voir clones 15 et 16 vs clone 5). Des constructions ont été réalisées afin de prolonger l'extrémité 3' en aval de la région minimale active pour déterminer quels éléments étaient responsables de la diminution de l'activité promotrice entre le clone 3 (très actif) et le clone 1 (peu actif). L'allongement de la région 3' conduit à une diminution progressive de l'activité transcriptionnelle (figure 8) Comme le montrent les graphes des figures 9a et 9b, la diminution de l'activité luciférase mesurée avec les clones 42,31, 43,7 et 1 est linéaire et proportionnelle à la taille de la séquence en 3' de l'exon 1. Pour déterminer si cette diminution de l'activité transcriptionnelle est spécifique de la séquence de l'intron 1, plusieurs constructions ont été testées en introduisant en 3' de l'insert du clone 3 des fragments d'ADN non apparentés au gène NDUFS8. Ces fragments présentent des longueurs et des origines variées. Dans le cas des cellules 143B, les valeurs mesurées avec les clones 37 et 40, contenant des fragments d'environ 1 kb, s'intègrent raisonnablement bien dans le graphique obtenu avec les clones 42,31, 43 et 1. Les clones 38et 39 ont également des activités luciférase faibles mais dans ce cas la taille du fragment d'ADN ajouté (1,5kb) est supérieure à la taille de la séquence présente dans le clone 1 (1,25 kb). Quantification de l'ARNm du gène luc+ : Cet essai a été réalisé afin de contrôler que les activités enzymatiques mesurées étaient bien corrélées avec l'aptitude des séquences étudiées à activer la transcription. En effet, il pourrait être envisagé que la présence de fragments d'une séquence intronique dans certaines constructions pourrait être à l'origine d'un phénomène d'épissage alternatif impliquant le gène luc+ et perturbant le fonctionnement de l'enzyme plutôt que l'activité de transcription. Un phénomène de ce type pourrait expliquer la décroissance de l'activité mesurée lors de l'augmentation de la taille de la séquence intronique. Il était donc important de vérifier si la production des ARNm par les constructions était bien stimulée ou réduite suivant les activités mesurées afin d'éliminer des artéfacts liés à la perturbation de la traduction. Les ARNm ont été amplifiés par RT-PCR en utilisant des amorces s'hybridant dans la séquence du gène luc+. Ces amplifications ont été réalisées à partir de cellules transfectées soit par le clone 1, soit par le clone 3. Les produits des réactions de RT-PCR sont visualisés sous lumière UV après migration électrophorétique dans un gel d'agarose en présence de bromure d'éthidium. L'intensité des bandes est estimée en utilisant un logiciel de quantification. Les résultats sont présentés dans la figure 10. En considérant des bandes d'intensité voisine (dilution 1/10 du clone 1 et dilution 1/100 du clone 3 ou dilution 1/50 du clone 1 et dilution 1/500 du clone 3), il est possible de déterminer qu'il y a environ 10 fois plus d'ARNm luc+ synthétisé avec le clone 3 qu'avec le clone 1. Parallèlement à la quantification des ARNm, des échantillons des cellules transfectées dans cette expérience ont été prélevés pour le dosage des activités enzymatiques. Le rapport entre les activités mesurées pour le clone 3 et le clone 1 est de 25. Compte tenu des limites de la technique PCR, ce résultat est cohérent avec le rapport d'environ 10 obtenu par la quantification des transcrits. La variation de la taille de l'insert en 3' de la structure promoteur de base la plus active n'affecte pas la traduction de la luciférase, mais bien l'efficacité de la transcription du gène. Conclusions Les résultats obtenus lors des expériences de transfection transitoire suggèrent que la séquence étudiée possède 3 caractéristiques fondamentales : - l'absence d'éléments de régulation de la transcription dans les 1629 paires de bases situées en 5' du fragment génomique complet étudié, - l'existence d'une courte région de 452 pb, englobant l'exon 1, dotée d'une force promotrice très importante, - la décroissance linéaire de l'activité transcriptionnelle lors de l'augmentation de la taille du fragment d'ADN en 3' du fragment de 452 pb présentant l'activité promotrice maximale. Les résultats présentent donc deux aspects particulièrement intéressants. Le premier correspond à la mise en évidence d'une séquence d'ADN génomique humain de taille réduite ayant une capacité d'activation de la transcription équivalente à celle d'un système promoteur viral fort constitué par le promoteur du virus SV40 associé à un élément amplificateur ( enhancer ) SV40 (vecteur pGL3-control, Promega). Le deuxième est la possibilité de réduire l'activité de ce promoteur, quasiment à volonté, en fonction de la taille du fragment d'ADN positionné entre le fragment promoteur et le gène d'intérêt à exprimer. Ces deux éléments pourraient être utilisés pour construire une famille de vecteurs d'expression dans lesquels le taux de transcription du gène d'intérêt serait déterminé par la taille du fragment d'ADN inséré. De plus, ces caractéristiques ont été confirmées dans deux types cellulaires provenant d'organismes différents (homme et souris). Enfin, la corrélation entre les mesures enzymatiques effectuées lors des expériences de transfection transitoire et l'activité transcriptionnelle des inserts testés a été confirmée avec la quantification par RT-PCR de l'ARNm du gène luc+ codant pour la luciférase du vecteur pGL3-basic. REFERENCE De Sury, et al ; 1998. Genomic structure of the human NDUFSB gene coding for the iron-sulfur TYKY subunit of the mitochondrial NADH :ubiquinone oxidoreductase. Gène 215 (1998), 1-10 REVENDICATIONS 1- Elément promoteur de l'activité de transcription de l'ARN polymérase caractérisé en ce qu'il comprend i) les 241 nucléotides, s'étendant de la position 1630 à la position 1870 de la séquence illustrée dans la figure 1 (SEQ ID N 1) ou ii) une partie de la séquence i) comprenant au moins l'un des trois motifs CCAAT représentés dans la figure 1 ou iii) une séquence ayant au moins 70% d'identité avec la séquence de la figure 1(SEQ ID N 1) le dit élément contenant au plus un site de fixation NRF1. 2- Promoteur selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend une partie de la séquence (i) contenant au moins deux des motifs CCAAT représentés dans la figure 1. 3- Promoteur selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend une partie de la séquence (i) contenant les trois motifs CCAAT représentés dans la figure 1. 4- Séquence promotrice selon la revendication 1 comprenant en outre : i) tout ou partie du premier exon du gène NDUFSB illustré dans la figure 1 et ii) le premier intron du gène NDUFS8 illustré dans la figure 1 et tronqué dans sa partie 3'. 5- Séquence promotrice selon la revendication 4 caractérisée en ce que le premier intron est tronqué dans sa partie 3' au niveau du premier site de restriction BamHl en position 2081 et illustré sur la figure 1. 6- Séquence promotrice selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce qu'elle a une activité promotrice comparable à celle de l'association du promoteur SV40 et de l'amplificateur ( enhancer ) SV40. 7- Séquence promotrice selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce qu'elle ne requiert pas de séquence amplificatrice ( enhancer ) supplémentaire pour avoir une force comparable à celle du promoteur SV40. 8- Séquence promotrice selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce qu'elle a une activité promotrice de transcription dans les cellules humaines. 9- Séquence promotrice de l'activité de transcription de l'ARN polymérase possédant une activité de transcription ajustable caractérisée en ce qu'elle comprend i) un promoteur selon l'une des revendications 1 à 8 et ii) un fragment d'ADN appelé stuffer placé en aval du promoteur, dont la taille permet d'atténuer l'activité de transcription de l'élément (i), ce stuffer étant lui-même dépourvu d'élément de régulation de transcription. 10- Séquence promotrice selon la revendication 9 caractérisée en ce que ledit stuffer ne contient pas de signal de terminaison de la transcription. 11- Gène chimère caractérisé en ce qu'il comprend : i) Un promoteur choisi parmi les trois suivants : a- les 241 nucléotides s'étendant de la position 1630 à la position 1870 de la séquence illustrée dans la figure 1 (SEQ ID N 1), b- une partie de la séquence (a) comprenant au moins l'un des trois motifs CCAAT représentés dans la figure 1 c- une séquence ayant au moins 70% d'identité avec la séquence de la figure 1 ii) éventuellement un fragment d'ADN appelé stuffer permettant d'atténuer l'activité de transcription de la séquence promotrice, ce stuffer étant lui- même dépourvu d'élément de régulation de transcription, iii) une séquence à transcrire, hétérologue par rapport au promoteur. 12- Gène chimère selon la revendication 11 caractérisé en ce que l'élément (i) est complété en outre par : a- tout ou partie du premier exon du gène NDUFS8 illustré dans la figure 1 et b- tout ou partie du premier intron du gène NDUFS8 illustré dans la figure 1. 13- Gène chimère selon la revendication 11 caractérisé en ce que l'atténuation de l'activité de transcription de la séquence promotrice est une diminution linéaire en fonction de la taille du stuffer. 14- Gène chimère selon la revendication 11 caractérisé en ce que le fragment d'ADN appelé stuffer ne contient pas de signal de terminaison de la transcription. 15- Gène chimère selon la revendication 11 caractérisé en ce que le fragment d'ADN appelé stuffer ne contient pas la séquence nucléique ATG ou tout autre signal qui, après transcription, entraînerait la traduction dudit fragment. 16- Gène chimère selon la revendication 11 caractérisé en ce que le fragment d'ADN appelé stuffer contient un signal entraînant son épissage après transcription. 17- Gène chimère selon la revendication 11 caractérisé en ce que la séquence à transcrire n'est pas traduite. 18- Gène chimère selon la revendication 11 caractérisé en ce que la séquence à transcrire code pour un polypeptide et qu'elle comprend un ATG reconnaissable par les ribosomes pour permettre la traduction du cadre de lecture représenté par la séquence codante située immédiatement en aval de l'ATG. 19- Vecteur d'expression contenant un promoteur tel que décrit dans l'une des revendications 1 à 18. 20- Classe de vecteurs d'expression comprenant une série de vecteurs d'expression selon la revendication 19 se distinguant les uns des autres par la seule différence de taille du stuffer. 21- Cellules transformées par un gène chimère selon l'une des revendications 11 à 18. 22- Cellules selon la revendication 21 caractérisées en ce que la transformation est stable. 23- Cellules selon la revendication 21 caractérisées en ce qu'elles sont d'origine mammifère non humaine. 24- Cellules selon la revendication 21 caractérisées en ce qu'elles sont d'origine humaine. 25- Organismes transgéniques non humains comprenant des cellules selon l'une des revendications 21 à 23. 26- Procédé pour la transformation de cellules mammifères caractérisé par l'introduction dans les cellules d'un gène chimère selon l'une des revendications 11 à 18. 27- Procédé pour la production d'une protéine hétérologue dans une cellule caractérisé par i) l'introduction dans la cellule d'un gène chimère selon l'une des revendications 11 à 18 ou d'un vecteur selon la revendication 19, puis ii) l'application à la cellule de conditions permettant l'expression stable de gènes chimères iii) éventuellement l'extraction de la protéine hétérologue des cellules ou du surnageant. 28- Gène chimère caractérisée en ce qu'il comprend : i) une séquence promotrice ii) un fragment d'ADN appelé stuffer placé en aval de l'élément (i) permettant d'atténuer l'activité de transcription de la séquence promotrice, ce stuffer étant lui-même dépourvu d'élément de régulation de transcription, iii) une séquence à transcrire le promoteur étant éventuellement complété par iv) tout ou partie de l'exon 1 d'un gène v) l'intron 1 du même gène, éventuellement tronqué dans sa partie 3'. 29- Gène chimère selon la revendication 28 caractérisé en ce que l'atténuation de l'activité de transcription de la séquence promotrice est une diminution linéaire en fonction de la taille du stuffer. 30- Gène chimère selon la revendication 28 caractérisé en ce que le fragment d'ADN appelé stuffer ne contient pas de signal de terminaison de transcription. 31- Gène chimère selon la revendication 28 caractérisé en ce que le fragment d'ADN appelé stuffer ne contient pas la séquence ATG ou tout autre signal qui, après transcription, entraînerait la traduction dudit fragment. 32- Gène chimère selon la revendication 28 caractérisé en ce que le fragment d'ADN appelé stuffer contient un signal entraînant son épissage après transcription. 33- Gène chimère selon la revendication 28 caractérisé en ce que le promoteur, l'exon et l'intron mentionnés sont ceux décrits dans la revendication 4. 34- Gène chimère selon la revendication 28 caractérisé en ce que le dit promoteur est le promoteur viral SV40. 35- Gène chimère selon la revendication 28 caractérisé en ce que la séquence à transcrire n'est pas traduite. 36- Gène chimère selon la revendication 28 caractérisé en ce que la séquence à transcrire code pour un polypeptide et qu'elle comprend un ATG reconnaissable par les ribosomes pour permettre la traduction du cadre de lecture représenté par la séquence codante située immédiatement en aval de l'ATG. 37- Gène chimère selon la revendication 28 caractérisé en ce que la séquence à transcrire comprend en outre des séquences de terminaison de transcription. 38- Vecteur d'expression contenant un gène chimère selon l'une des revendications 28 à 37. 39- Classe de vecteurs d'expression comprenant une série de vecteurs d'expression selon la revendication 38 se distinguant les uns des autres par la seule différence de taille du stuffer. 40- Cellules transformées par un gène chimère selon l'une des revendications 28 à 37. 41- Cellules selon la revendication 40 caractérisées en ce que la transformation est stable. 42- Procédé pour rendre ajustable le taux de transcription d'une séquence d'ADN à partir d'une séquence promotrice comprenant les étapes suivantes : i) la fusion en aval d'une séquence promotrice d'un fragment d'ADN appelé stuffer permettant d'atténuer l'activité de transcription de ladite séquence promotrice, ce stuffer étant lui-même dépourvu d'élément de régulation de transcription, ii) la fusion du fragment résultant de l'étape (i) à une séquence d'ADN à transcrire. 43- Procédé selon la revendication 42 caractérisé en ce que l'atténuation de l'activité de transcription de la séquence promotrice est une diminution linéaire en fonction de la taille du stuffer. 44- Procédé pour la production d'une protéine hétérologue dans une cellule caractérisé par i) l'introduction dans la cellule d'un gène chimère selon l'une des revendications 28 à 37 ou d'un vecteur selon la revendication 38, puis ii) l'application à la cellule de conditions permettant l'expression stable de gènes chimères iii) éventuellement l'extraction de la protéine hétérologue des cellules ou du surnageant.