Brevet FR2811679A1 — publié le 20020118

SEQUENCES D'ADN CODANT POUR UN TRANSPORTEUR DE POLYOLS ET LEUR UTILISATION, NOTAMMENT POUR LA PREPARATION DE PLANTES TRANSGENIQUES L'invention concerne des séquences d'ADN codant pour un transporteur de polyols et leur utilisation, notamment pour la préparation de plantes transgéniques. Les plantes sont capables de synthétiser, par l'intermédiaire de la photosynthèse, des composés primaires comme les glucides en utilisant l'énergie lumineuse. Seuls certains organes de la plante, principalement les feuilles adultes, sont aptes à fabriquer et à exporter les glucides vers les organes de réserve, comme les tubercules, les graines et les fruits, utilisés dans l'alimentation humaine et animale. Chez la plupart des plantes, le principal glucide transporté est le saccharose, mais chez de très nombreux végétaux, d'autres composés sont également transportés comme les polyols dont le mannitol est un exemple. Les polyols sont, comme le saccharose, des produits primaires de la photosynthèse. On a d'ailleurs estimé qu'environ 30% de la production globale de carbone primaire était utilisé pour la synthèse des polyols. Les polyols, cycliques ou non, sont très répandus chez les plantes ; ce sont des composés de faible poids moléculaire, très solubles et non réducteurs. Les trois polyols non cycliques (alditols) les plus répandus chez les Angiospermes sont le galactitol, le sorbitol et le mannitol. Le sorbitol est le produit photosynthétique principal chez plusieurs espèces de Rosacées telles que la pomme, la poire, la pêche et la prune. Le mannitol, le plus répandu des alditols, est présent chez plus de 100 espèces de végétaux supérieurs, en particulier chez les Rubiacées (café), les Oléacées (troène, frêne, olive) et les Apiacées (céleri, carotte, persil) (Lewis, 1984). Il est produit dans les cellules de mésophylle (cellules contenant la chlorophylle). Pour circuler, il doit rentrer dans les tubes criblés (nervures). Cependant, il n'y a pas de continuité entre les cellules mésophylles et les tubes criblés : on a donc besoin d'un transporteur de mannitol. Ainsi, le mannitol sort des cellules mésophylles et utilise le transporteur pour pénétrer dans les tubes criblés. Les composés synthétisés dans les feuilles adultes sont transportés vers les organes de réserve et traversent un certain nombre de membranes à l'aide des protéines spécialisées que sont les transporteurs. Ces transporteurs jouent un rôle considérable dans la plante car ils sont indispensables à sa croissance. L'existence d'un transporteur de mannitol chez une plante telle que le céleri a été démontrée par différentes expériences biochimiques (Salmon et al., 1995). Cette publication a démontré qu'il existait un transporteur de mannitol chez le céleri et que l'expression de ce transporteur était très importante dans les tissus du phloème. Cependant, rien n'est dit quant à l'identification du transporteur de mannitol. Si de nombreux transporteurs de sucres, comme le saccharose et les hexoses ont été clonés au cours des dernières années, aucun de ceux-ci n'est capable de transporter de polyol. A l'heure actuelle, aucun transporteur de polyol n'a été identifié chez un organisme vivant. Chez les bactéries, un système multienzymatique capable de transporter et de phosphoryler à la fois le mannitol a été décrit (Boer et al., 1994). Toutefois, de tels systèmes n'ont jamais été décrits chez les organismes supérieurs. L'invention a pour objet des transporteurs de polyols chez les plantes et les champignons, et leur s séquences d'ADN. L'invention a également pour objet l'utilisation des séquences d'ADN de transporteur de polyol pour l'obtention de plantes transgéniques. L'invention a également pour objet l'utilisation de séquences d'ADN de transporteur de polyol, notamment dans le cadre de l'obtention de plantes résistantes aux pathogènes ou de plantes résistantes au stress salin. L'invention a également pour objet l'utilisation de séquences d'ADN de transporteur de polyol dans le cadre d'une méthode de criblage de plantes génétiquement modifiées. L'invention concerne l'utilisation d'une séquence d'ADN codant pour un transporteur de polyols, chez les plantes et les champignons, tels que des polyols ayant une chaîne principale contenant 5 à 8 atomes de carbone, notamment 5 à 7 atomes de carbone, en particulier 6 atomes de carbone, lesquels polyols étant avantageusement choisis parmi le mannitol, le sorbitol, le dulcitol, le galactitol, l'inositol, le myo-inositol, le ribitol et le xylitol, et étant notamment le mannitol, pour la préparation de plantes transgéniques. Dans l'expression "plantes et champignons", on englobe les algues, les mousses (Bryophytes), les fougères (Ptéridophytes), les plantes supérieures (Gymnospermes et Angiospermes) et les champignons. On rappelle que, par définition, un polyol est un "polyalcool" contenant autant de fonctions alcool que d'atomes de carbone. On précise également que les termes polyol, polyalcool et sucre alcool sont équivalents. Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation, pour la préparation de plantes transgéniques, d'une séquence d'ADN choisie parmi l'une des séquences suivantes : SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10. SEQ ID NO : 1 est une nouvelle séquence d'acide nucléique identifiée chez le céleri (Apium graveolens L. ), codant pour un transporteur de mannitol, représentée sur la figure 1. SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO :9 et SEQ ID NO : 10 sont des séquences d'acides nucléiques codant pour des protéines de fonction jusqu'à ce jour inconnue. SEQ ID NO : 3 (Beet 1) est représentée sur la figure 2. SEQ ID NO : 4 (Beet 2) est représentée sur la figure 3. SEQ ID NO : 5 (Pst 1) est représentée sur la figure 4. SEQ ID NO : 6 (Pst 2) est représentée sur la figure 5. SEQ ID NO : 7 (Pst 3) est représentée sur la figure 6. SEQ ID NO : 8 (Pst 4) est représentée sur la figure 7. SEQ ID NO : 9 (Pst 5) est représentée sur la figure 8. SEQ ID NO : 10 (Bs) est représentée sur la figure 9. Beet 1 et Beet 2 proviennent de la Betterave (Beta vulgaris). Pst 1, Pst 2, Pst 3, Pst 4 et Pst 5 proviennent d'Arabidopsis thaliana. Bs provient de Bacillus subtilis. L'invention concerne également une nouvelle protéine, caractérisée par le fait qu'elle comprend ou est constituée par : - la séquence SEQ ID NO : 2, - ou toute séquence dérivée de SEQ ID NO: 2, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ayant la propriété de transporter, chez les plantes et les champignons, des polyols, tels que des polyols ayant une chaîne principale contenant 5 à 8 atomes de carbone, notamment 5 à 7 atomes de carbone, en particulier 6 atomes de carbone, lesquels polyols étant avantageusement choisis parmi le mannitol, le sorbitol, le dulcitol, le galactitol, l'inositol, le myo-inositol, le ribitol et le xylitol, et étant notamment le mannitol, - toute séquence homologue de SEQ ID NO : 2, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 50% avec la séquence SEQ ID NO : 2 et possédant la propriété de transporter, chez les plantes et les champignons, des polyols tels que définis ci-dessus, - ou tout fragment d'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve qu'il possède la propriété de transporter, chez les plantes et les champignons, des polyols tels que définis ci-dessus, notamment tout fragment étant constitué d'au moins environ 10 acides aminés contigus dans la séquence SEQ ID NO : 2. La propriété de transport de polyols présentée par un transporteur de polyols peut être vérifiée par l'un ou l'autre des tests suivants : - l'utilisation de levure Scerevisiae ou - l'utilisation de membrane plasmique purifiée de vésicules du phloème. L'utilisation de la levure Saccharomyces cerevisiae (Noiraud et al., 2000) comprend la transformation des levures avec la séquence nucléotidique à tester, lesquelles levures sont capables de croître sur ledit polyol. Pour vérifier que le polyol est transporté dans ces levures, on peut utiliser du polyol marqué radioactivement. Pour chaque expérience, un contrôle est mis au point avec une souche de levure incapable de pousser sur le polyol, et qui ne transporte pas ledit polyol. Le test ayant recours à une membrane plasmique purifiée de vésicules du phloème est celui décrit par Salmon et al. (1995). Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la protéine de l'invention, telle que définie ci-dessus, est caractérisée en ce qu'elle est constituée par la séquence SEQ ID NO : 2, représentée sur la figure 1. L'invention concerne également les fragments de protéine telle que définie cidessus, choisis parmi les séquences suivantes : - Ala Cys Ala Leu Leu Ala Ser Met Asn Ser Ile Leu Leu Gly Tyr Asp Thr Gly Val Leu Ser Gly Ala Ser Ile (SEQ ID NO : 11) délimitée de l'acide aminé en position (26) à l'acide aminé en position (50) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Gln Ile Glu Ile Ile Ile Gly Ile Ile Asn Ile Tyr Ser Leu Leu Gly Ser Ala Ile Ala Gly (SEQ ID NO : 12) délimitée de l'acide aminé en position (62) à l'acide aminé en position (82) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Tyr Thr Met Val Leu Ala Gly Ile Ile Phe Phe Leu Gly Ala Ile Phe Met Gly Leu Ala (SEQ ID NO : 13) délimitée de l'acide aminé en position (92) à l'acide aminé en position (111) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Phe Leu Met Phe Gly Arg Phe Val Ala Gly Ile Gly Val Gly Tyr Ala Met Met Ile Ala Pro Val Tyr Thr Ala (SEQ ID NO : 14) délimitée de l'acide aminé en position (116) à l'acide aminé en position (140) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Phe Leu Thr Ser Phe Pro Glu Val Phe Ile Asn Ser Gly Val Leu Leu Gly Tyr Val Ser Asn Phe Ala Phe Ala (SEQ ID NO : 15) délimitée de l'acide aminé en position (150) à l'acide aminé en position (174) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Ile Met Leu Gly Ile Gly Ala Phe Pro Ser Val Ala Leu Ala Ile Ile Val Leu Tyr Met (SEQ ID NO :16) délimitée de l'acide aminé en position (184) à l'acide aminé en position (203) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Ala Ala Ile Thr Gly Ile Gly Ile His Phe Phe Gln Gln Ala Cys Gly Ile Asp Ala Val Val Leu (SEQ ID NO : 17) délimitée de l'acide aminé en position (281) à l'acide aminé en position (302) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Leu Leu Ala Thr Ile Ala Val Gly Val Cys Lys Thr Val Phe Ile Leu Ile Ser Thr Phe (SEQ ID NO : 18) délimitée de l'acide aminé en position (320) à l'acide aminé en position (339) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Leu Met Leu Thr Ser Met Gly Gly Met Val Ile Ala Leu Phe Val Leu Ala Gly Ser Leu Thr Val (SEQ ID NO : 19) délimitée de l'acide aminé en position (349) à l'acide aminé en position (370) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Gly Gly Leu Ala Ile Phe Thr Val Tyr Ala Phe Val Ser Ile Phe Ser Ser Gly Met Gly Pro Ile Ala Trp Val Tyr (SEQ ID NO : 20) délimitée de l'acide aminé en position (382) à l'acide aminé en position (407) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Cys Ser Ile Gly Val Ala Val Asn Arg Gly Met Ser Gly Ile Ile Gly Met Thr Phe Ile Ser (SEQ ID NO : 21) délimitée de l'acide aminé en position (421) à l'acide aminé en position (441) de la séquence SEQ ID NO : 2, et - Ala Phe Leu Leu Phe Ala Val Val Ala Ser Ile Gly Trp Val Phe Met Tyr Thr Met Phe (SEQ ID NO : 22) délimitée de l'acide aminé en position (451) à l'acide aminé en position (470) de la séquence SEQ ID NO : 2, L'invention concerne également une séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie ci-dessus. Une séquence d'ADN avantageuse de l'invention comprend ou est constituée par : - la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1, - ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de la séquence SEQ ID NO :1codant pour une protéine représentée par SEQ ID NO : 2, - ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de la séquence SEQ ID NO : 1 codant pour une protéine dérivée de SEQ ID NO : 2, telle que définie ci-dessus, - ou toute séquence nucléotidique homologue de SEQ ID NO : 1, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 35% avec la séquence SEQ ID NO : 1 codant pour une protéine homologue de SEQ ID NO : 2, telle que définie ci-dessus, - ou tout fragment de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 ou des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 30 nucléotides contigus dans ladite séquence, - ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences ou fragments susmentionnés, - ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences ou d'un des fragments susmentionnés. Par conditions stringentes d'hybridation on entend : - température d'hybridation : 65 C, - milieu d'hybridation : tampon phosphate de sodium 250 mM, pH 7,2 ; 6,6% (p/v) de SDS ; mM EDTA ; 1% (p/v) d'albumine sérine de boeuf, - température de lavage : 65 C, - milieux de rinçage successifs : 2x SSC (1,75% NaCI ; 0,88% citrate de sodium), SDS 0,1% lx SSC (0,875% NaCI ; 0,44% citrate de sodium), SDS 0,1% 0,5x SSC (0,44% NaCl ; 0,22% citrate de sodium), SDS 0,1%. L'invention concerne également les fragments de séquences nucléotidiques telle que définies ci-dessus, choisis parmi les séquences suivantes : - GCT TGT GCT CTT TTA GCT TCC ATG AAT TCC ATC TTA CTC GGC TAT GAC ACC GGA GTG TTG AGT GGA GCA TCA ATA (SEQ ID NO : 23) délimitée du nucléotide en position (92) au nucléotide en position (166) de la séquence SEQ ID NO : 1, - CAA ATC GAA ATA ATC ATC GGA ATC ATC AAC ATC TAC TCT CTT CTT GGT TCG GCC ATA GCC GGA (SEQ ID NO : 24) délimitée du nucléotide en position (200) au nucléotide en position (262) de la séquence SEQ ID NO : 1, - TAC ACC ATG GTA CTA GCT GGT ATC ATA TTT TTT CTA GGA GCC ATT TTC ATG GGG CTT GCT (SEQ ID NO : 25) délimitée du nucléotide en position (290) au nucléotide en position (349) de la séquence SEQ ID NO : 1, - TTT CTC ATG TTT GGT CGC TTT GTT GCT GGA ATT GGT GTC GGT TAT GCC ATG ATG ATC GCT CCC GTC TAC ACT GCC (SEQ ID NO : 26) délimitée du nucléotide en position (362) au nucléotide en position (436) de la séquence SEQ ID NO : 1, - TTC CTC ACT TCT TTT CCT GAG GTT TTC ATT AAT TCT GGT GTG TTG CTC GGG TAT GTA TCC AAC TTT GCA TTT GCC (SEQ ID NO : 27) délimitée du nucléotide en position (464) au nucléotide en position (538) de la séquence SEQ ID NO : 1, - ATT ATG CTG GGA ATT GGA GCA TTT CCT TCA GTT GCC TTG GCC ATA ATT GTG TTA TAT ATG (SEQ ID NO : 28) délimitée du nucléotide en position (566) au nucléotide en position (625) de la séquence SEQ ID NO : 1, - GCT GCA ATT ACG GGT ATT GGT ATT CAT TTC TTC CAA CAG GCT TGT GGT ATT GAT GCT GTT GTT TTA (SEQ ID NO : 29) délimitée du nucléotide en position (857) au nucléotide en position (922) de la séquence SEQ ID NO : 1, - CTC CTT GCG ACA ATT GCT GTT GGA GTC TGC AAA ACA GTC TTT ATT CTG ATA TCA ACG TTT (SEQ ID NO : 30) délimitée du nucléotide en position (974) au nucléotide en position (1033) de la séquence SEQ ID NO : 1, - CTG ATG CTA ACA AGT ATG GGG GGT ATG GTT ATT GCT CTA TTT GTA CTG GCA GGC TCA TTG ACG GTT (SEQ ID NO : 31) délimitée du nucléotide en position (1061) au nucléotide en position (1126) de la séquence SEQ ID NO :1, - GGT GGT TTG GCA ATA TTT ACA GTG TAT GCT TTT GTG TCG ATA TTT TCA AGT GGC ATG GGT CCA ATT GCT TGG GTC TAT (SEQ ID NO : 32) délimitée du nucléotide en position (1160) au nucléotide en position (1237) de la séquence SEQ ID NO : 1, - TGT AGT ATC GGA GTG GCA GTT AAC CGT GGC ATG AGT GGC ATA ATT GGA ATG ACA TTT ATA TCG (SEQ ID NO : 33) délimitée du nucléotide en position (1277) au nucléotide en position (1339) de la séquence SEQ ID NO : 1, - GCA TTC CTT TTA TTT GCT GTG GTT GCA TCT ATC GGA TGG GTC TTT ATG TAC ACA ATG TTC (SEQ ID NO : 34) délimitée du nucléotide en position (1367) au nucléotide en position (1426) de la séquence SEQ ID NO : 1, La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 23 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 11. La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 24 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 12. La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 25 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 13. La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 26 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 14. La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 27 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 15. La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 28 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 16. La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 29 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 17. La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 30 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 18. La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 31code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 19. La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 32 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 20. La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 33 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 21. La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 23 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 11. L'invention concerne également un vecteur recombinant, notamment plasmide, cosmide, phage ou ADN de virus, contenant une séquence nucléotidique telle que mentionnée ci-dessus. L'invention concerne également un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus, contenant les éléments nécessaires à l'expression dans une cellule hôte des polypeptides codés par les acides nucléiques tels que définis ci-dessus, insérés dans ledit vecteur. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le vecteur recombinant défini ci-dessus contient notamment un promoteur reconnu par l'ARN polymérase de la cellule hôte, en particulier un promoteur inductible et éventuellement une séquence de transcription, de terminaison, et éventuellement une séquence signal et/ou d'ancrage. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le vecteur recombinant, tel que défini ci-dessus, contient les éléments qui permettent l'expression d'une séquence nucléotidique, telle que définie ci-dessus, en tant que protéine mature ou protéine de fusion. L'invention concerne également une cellule hôte, choisie notamment parmi les bactéries, les virus, les levures, les champignons, les plantes ou les cellules de mammifères, ladite cellule hôte étant transformée, notamment à l'aide d'un vecteur recombinant tels que définis ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la cellule hôte, telle que définie ci-dessus, contient les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus. L'invention concerne également le produit de l'expression d'un acide nucléique exprimé par une cellule hôte transformée telle que définie ci-dessus. L'invention concerne également un anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé de manière spécifique contre une protéine de l'invention. On ne se limite pas aux anticorps polyclonaux ; l'invention concerne également tout anticorps monoclonal produit par tout hybridome susceptible d'être formé selon les méthodes classiques à partir, d'une part, de cellules de rate d'animaux, en particulier de souris ou de rat, les cellules de l'animal étant immunisées contre la protéine de l'invention, et d'autre part de cellules d'une lignée cellulaire de myélome, ledit hybridome étant susceptible d'être choisi selon la capacité de la lignée cellulaire à produire des anticorps monoclonaux reconnaissant la protéine utilisée au préalable pour l'immunisation des animaux. L'invention concerne également une sonde nucléotidique capable d'hybrider avec l'une quelconque des séquences nucléiques de l'invention. L'invention concerne également les oligonucléotides antisens ou ARN messager antisens dérivés des séquences nucléotidiques tels que définis ci-dessus. Par modification de l'expression du transporteur de mannitol, en utilisant des oligonucléotides antisens, on peut alors déterminer si une diminution de l'expression du transporteur de mannitol a pour conséquence une diminution de la tolérance au stress salin. L'invention concerne également les cellules de plantes contenant dans leur génome une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus. L'invention concerne également les plantes transgéniques, parties de plantes, semences de plantes ou matériel de propagation de plantes contenant des cellules telles que définies ci-dessus. L'invention concerne en particulier les plantes transgéniques qui, à l'état natif, ne contiennent pas ou n'expriment pas le gène du transporteur de mannitol, dans le génome desquelles est introduit ladite séquence nucléotidique. L'invention concerne en particulier les plantes transgéniques qui, à l'état natif, contiennent ou expriment le gène du transporteur de mannitol, dans le génome desquelles est introduit ladite séquence nucléotidique. L'invention concerne également un procédé de préparation d'une protéine recombinante telle que définie ci-dessus, comprenant les étapes suivantes : - la culture dans un milieu approprié d'une cellule hôte qui a été auparavant transformée par un vecteur approprié contenant un acide nucléique de l'invention, et - la récupération de la protéine produite par la susdite cellule hôte transformée à partir du susdit milieu de culture ou à partir de la cellule hôte. Par exemple, un procédé de préparation d'un céleri transgénique tel que défini cidessus, comprend les étapes suivantes : - l'inoculation des tissus de Céleri, - la coculture des segments de Céleri et des bactéries A. tumefaciens, - l'élimination des bactéries A.tumefaciens, - la régénération des plants de Céleri transformés (Nadel et al., 1989). Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être introduites dans des plasmides et être combinées avec des éléments de régulation pour l'expression dans des cellules eucaryotes. Ces éléments de régulation sont d'une part des promoteurs de transcription et d'autre part des terminateurs de transcription. Avec les séquences nucléotidiques de l'invention contenues dans les plasmides, on peut transformer les cellules eucaryotes dans l'intention d'exprimer un ARNm traduisible qui rend possible la synthèse d'un transporteur de polyol dans les cellules ou dans l'intention d'exprimer un ARNm non traduisible, qui empêche la synthèse d'un transporteur de polyol endogène dans les cellules. Les procédés de modification génétique des dicotylédones et monocotylédones sont déjà connus (Gasser et al., 1989). Pour l'expression dans les plantes, les séquences nucléotidiques de l'invention doivent être couplées avec des éléments de régulation de la transcription. De tels éléments, appelés promoteurs, sont déjà connus (EP 375091). De plus, il faut fournir les régions codantes avec les signaux de terminaison de la transcription avec lesquels ils peuvent être correctement transcrits. De tels éléments sont également décrits (Gielen et al., 1989). La région d'initiation de la transcription peut être native et/ou homologue de même qu'étrangère et/ou hétérologue à la plante hôte. Si on le souhaite, les régions de terminaison sont interchangeables entre elles. La séquence d'ADN des régions d'initiation et de terminaison de la transcription peut être préparée synthétiquement ou obtenue naturellement, ou obtenue à partir d'un mélange de constituants d'ADN naturel ou synthétique. Pour introduire des gènes étrangers dans des plantes supérieures, un grand nombre de vecteurs de clonage sont disponibles qui incluent un signal de réplication pour E. coli et un marqueur qui permet une sélection des cellules transformées. Pour l'introduction des séquences nucléotidiques de l'invention dans un hôte cellulaire de plante, en plus de la transformation utilisant Agrobacteria, il existe beaucoup d'autres techniques. Ces techniques incluent la fusion de protoplastes, la microinjection d'ADN et l'électroporation, ainsi que des méthodes balistiques et l'infection de virus. A partir du matériel de plante transformé, les plantes entières peuvent être régénérées dans un milieu adapté, contenant des antibiotiques ou des biocides pour la sélection. Les plantes résultantes peuvent ensuite être testées pour la présence de l'ADN introduit. Il n'y a pas d'exigence particulière pour les plasmides en ce qui concerne l'injection et l'électroporation. On peut utiliser de simples plasmides tels que les dérivés pUC. La présence d'un gène marqueur est nécessaire pour la régénération de plantes entières à partir de telles cellules transformées. Les cellules transformées se développent dans les plantes de manière usuelle (McCormick et al., 1986). Ces plantes peuvent se développer normalement et être croisées avec des plantes qui possèdent les mêmes gènes transformés ou des gènes différents. Les hybrides résultants ont les propriété phénotypiques correspondantes. Les séquences d'ADN de l'invention peuvent également être introduites dans des plasmides et être combinées avec des éléments de régulation pour une expression dans des cellules procaryotes. Les séquences d'ADN de l'invention peuvent également être introduites dans des plasmides qui permettent une mutagenèse ou une modification de séquence au moyen d'une recombinaison des séquences d'ADN dans les systèmes procaryotes ou eucaryotes. Les plantes transgéniques de l'invention sont notamment caractérisées par une augmentation de la capacité à transporter un polyol de l'invention et à l'accumuler dans les organes à partir desquels il est extrait. Elles peuvent être utilisées pour orienter les flux dudit polyol à l'aide dudit transporteur vers les organes qui accumulent peu de sel, facilitant ainsi l'extraction. L'invention concerne également un procédé de criblage de plantes génétiquement modifiées avec au moins une séquence nucléotidique d'intérêt qui comprend les étapes suivantes : - la transformation de cellules végétales avec un vecteur contenant une séquence d'insertion, ladite séquence d'insertion comprenant la séquence nucléotidique d'intérêt et une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol tel que défini ci-dessus, - la mise en culture des cellules ainsi transformées sur un milieu contenant ledit polyol comme unique source de carbone, pour l'obtention de plantes ou de fragments de plantes transgéniques contenant ladite séquence d'insertion. Ce procédé concerne les plantes ne synthétisant pas de polyol ou les plantes qui le synthétisent. Il s'agit, plus particulièrement, de transformer des fragments ou des cellules de plantes avec une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol, notamment de mannitol. Le criblage s'opère ensuite sur un milieu contenant ledit polyol comme seule source de carbone. Les plantes exprimant le transporteur de polyol ont ainsi un avantage de croissance sur les plantes non transformées. A ce stade, on peut supposer que toute plante est capable d'utiliser ledit polyol comme source de carbone. Toutefois, il peut s'avérer nécessaire de faire une co-transformation avec un gène codant une protéine capable de dégrader ledit polyol. L'utilisation d'un promoteur actif uniquement dans les phases initiales de régénération ou inductible par un composé simple permet de restreindre l'expression du transporteur de polyol aux phases de sélection. Il s'agit donc d'un système de sélection simple basé sur un gène de plante qui n'est plus nécessaire une fois la sélection terminée et sur l'utilisation d'un produit naturel comme agent de sélection. Ce système évite d'avoir recours à l'utilisation de produits susceptibles d'être toxiques, tels que des antibiotiques. L'invention concerne également un procédé d'obtention de plantes transgéniques résistantes aux pathogènes, qui comprend les étapes suivantes : - la transformation de cellules végétales avec une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol tel que défini ci-dessus, - la mise en culture des cellules ainsi transformées pour l'obtention de plantes ou de fragments de plantes transgéniques. Ce procédé concerne la transformation de plantes ne synthétisant pas de polyol ou de plantes qui le synthétisent, avec une séquence nucléotidique d'un transporteur de polyol, notamment de mannitol, placé soit sous le contrôle d'un promoteur ubiquiste (type CaMV 35S) soit sous le contrôle d'un promoteur inductible en réponse à l'attaque du pathogène. L'intérêt réside en ce que la plante, en transportant vers ses propres cellules davantage de polyol, émis par le pathogène, supprime un des moyens de défense mis en place par le pathogène pour lutter contre l'oxygène activé libéré par la plante en réponse à cette attaque. On peut, pour augmenter l'efficacité du procédé, coupler l'expression du transporteur de polyol avec une enzyme dégradant ledit polyol. L'invention concerne un procédé d'obtention de plantes transgéniques résistantes au stress salin, qui comprend les étapes suivantes : - la transformation de cellules végétales avec une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol tel que défini ci-dessus, - la mise en culture des cellules ainsi transformées pour l'obtention de plantes ou de fragments de plantes transgéniques. Ce procédé concerne la transformation de plantes ne synthétisant pas de polyol ou de plantes qui le synthétisent avec une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol placé sous contrôle d'un promoteur spécifique du phloème (ou du promoteur du transporteur de polyol). Si la plante synthétise ledit polyol, l'augmentation du transport dudit polyol pourrait conduire à une tolérance accrue au stress salin. Dans le cas contraire, il convient également d'introduire des gènes permettant la synthèse dudit polyol, mais en limitant cette synthèse aux feuilles afin d'éviter des effets néfastes sur la croissance de la plante. DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 représente la séquence nucléotidique de céleri codant la protéine AgMaTl et ladite protéine AgMaTl. La Figure 2 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 3. La Figure 3 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4. La Figure 4 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5. La Figure 5 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 6. La Figure 6 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7. La Figure 7 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8. La Figure 8 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 9. La Figure 9 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 10. La Figure 10 représente le test de croissance de la levure MaDH4 exprimant la séquence protéique AgMaTl. L'ADNc de AgMaTl, sous contrôle du promoteur ADH1, a été introduit dans les cellules de la souche MaDH4, et la croissance des cellules transformées sur mannitol a été étudiée. Les cellules transformées ont été cultivées sur du milieu SC (synthétique complet) liquide sans tryptophane contenant soit du glucose 2% (SC-glu) soit du mannitol 2% (SC-mann). MaDH4-YEP 112A 1 XE : MaDH4 contenant le plasmide vide ; MaDH4-AgMaTl : MaDH4 contenant le plasmide avec l'acide nucléique de AgMaTl. Les carrés blancs correspondent à des levures MaDH4 transformées avec le plasmide vide YEP112A1XE (défini ci-après) et cultivées sur du milieu SC-glucose. Les carrés noirs correspondent à des levures MaDH4 transformées avec le plasmide vide YEP112A1XE (défini ci-après) et cultivées sur du milieu SC-mannitol. Les cercles blancs correspondent à des levures MaDH4 transformées avec AgMaT1/YEP112A1XE (plasmide YEP112A1XE contenant l'acide nucléique de AgMaTl) et cultivées sur du milieu SC-glucose. Les cercles noirs correspondent à des levures MaDH4 transformées avec AgMaT1/YEP112A1XE (plasmide YEP112A1XE contenant l'acide nucléique de AgMaTl) et cultivées sur du milieu SC-mannitol. Les courbes représentent l'évolution en fonction du temps de l'absorbance (à 600 nm) des cultures de levure. Cette augmentation de l'absorbance correspond en fait à une augmentation du nombre de levures dans le milieu de culture et est représentative de la vitesse de croissance des levures. Ainsi les levures transformées avec les plasmides YEP112A1XE et AgMaTl/YEP112AlXE poussent sur du glucose mais seules les levures transformées avec le plasmide AgMaTl/YEP112AlXE sont capables de pousser sur du mannitol. Il s'agit donc d'une preuve que AgMaTl code un transporteur de mannitol. La Figure 11représente l'absorption de mannitol dans des cellules de S. cerevisiae. La concentration externe en mannitol 3H est de 500 M et le pH de 4,5. Les carrés représentent l'absorption dans des cellules transformées avec l'acide nucléique de AgMaTl tandis que les cercles représentent l'absorption dans des cellules témoins transformées avec le plasmide YEP112A1XE vide. Seules les cellules transformées avec le plasmide AgMaT1/YEP112A1XE sont capables d'absorber le mannitol 3H placé dans le milieu externe. MATERIEL ET METHODES Matériel végétal Des plants de Céleri (Apium graveolens L. variété dulce, cultivar Vert d'Elne) ont été cultivés en serres selon les conditions décrites par Davis et al. (1988). Les faisceaux phloémiens ont été isolés à partir de pétioles adultes selon la technique décrite par Daie (1987). Souches bactériennes et de levures Les souches suivantes ont été utilisées dans cette étude : Escherichia coli souches DH5a (supE44, #lacU169 (#80, lacZM15), hsdRl7, recA, endAl, gyrA96, thi-1, relAl) (souches commercialisées par Clontech). XLIBlue MRF' (Stratagene) et SOLR (Stratagene) ont été cultivées selon les techniques standard (Sambrook et al., 1989). La souche de Saccharomyces cerevisiae MaDH4 (ura3, trpl , LEU2, gap1-1, put4-1, uga4- 1), dont la préparation est indiquée ci-après, exprime le gène de la mannitol déshydrogénase de levure et a été utilisée pour la caractérisation fonctionnelle de l'ADNc de AgMaTl. La souche 2a a été obtenue par croisement entre les souches #[alpha] (MATa, ura3, trpl , leu2) (Marcireau et al., 1992) et E22574d (MATa, ura3-1, gapl-1, put4-I , uga4-1) (Jauniaux et al., 1987) Vecteur d'expression dans les levures On a utilisé le plasmide YIP 128A1, décrit dans Riesmeier et al (1992). Le gène de la mannitol déshydrogénase de levure (YEL070) a été amplifié par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) en utilisant les oligonucléotides MDHPST5 (5GACTCGAGATGACAAAATCAGACGAAACAAC-3) et MDHBGL3 (5- GAAGATCTTCACACTTGGTCTAAAATTTCC-3) sur l'ADN génomique de la souche de Saccharomyces #[alpha]. Le produit de la PCR a été cloné dans le vecteur pBluescript SK digéré préalablement par Pstl et BamHl. Après séquençage pour confirmer la séquence du gène amplifié, le produit de PCR a été digéré par Pstl et Xbal et cloné dans les sites Pstl/Xbal de YIP128A1. La construction a été intégrée dans le génome de & cerevisiae par le site EcoV dans le gène leu2 pour obtenir la souche MaDH4. 5'RACE-PCR (Amplification rapide des extrémités dADNc par PCR), Des ARN totaux de feuilles de céleri ont été isolés selon la méthode de Kay et al. (1987). Le premier brin d'ADNc à été inversement transcrit à partir de l'ARN total avec l'amorce dégénérée (5'-CCNACNCC(G/A)AANGGNA(G/A)NA(G/A)-3) dérivée de la séquence LLGFGVG en utilisant la transcriptase inverse SuperScriptTM II (Stratagène). Après dégradation de la matrice ARN par la RNaseH (Eurogentec), une amorce d'accrochage (dC)16 a été créée à l'extrémité 3' de l'ADNc simple brin par une déoxynucleotydil transférase (GibcoBRL). Une amplification PCR a été réalisée en utilisant les amorces (dG)16 et LLGFGVG dans les conditions suivantes : 2 min à 95 C puis 30 cycles comprenant une dénaturation de 2 min à 95 C, une fixation de 2 min à 55 C et une élongation de 2 min à 72 C. Les produits de la PCR ont été analysés par électrophorèse en gel d'agarose puis clonés dans le plasmide pGEM-T Easy (Promega). Construction et criblage d'une banque d'ADNc de phloème de céleri Les ARN totaux des faisceaux de phloème ont été isolés selon la méthode décrite par Kay et al. (1987). Les ARN polyA+ ont été purifiés avec le système PolyATtract mRNA isolation (Promega). Une banque unidirectionnelle EcoRl/XhoI a été construite dans le phage Uni-ZapXR (Stratagene). Les phages recombinants (900 000) ont été criblés avec comme sonde, le produit de 5'RACE-PCR marqué radioactivement, en accord avec le protocole du fabricant (Stratagene). Les filtres en nylon HybondTM-N (Amersham) ont été hybridés pendant une nuit à 42 C selon les conditions standard (Stratagene). Les filtres ont ensuite été rincés pendant 15 min à 42 C dans du SSC 2x (SSC lx = 0,15 M NaCl ; 0,015 M citrate de sodium) avec du SDS à 0,1%, puis 15 min dans le même milieu mais à 50 C et 30 min à 50 C dans du SSC lx et du SDS à 0,1%. L'excision in vivo a été réalisée sur les 24 clones qui avaient donné un signal positif lors des 3 tours successifs de criblage. Les ADNc identifiés ont été partiellement séquences. Les comparaisons de séquence ont été réalisées sur le site du National Center for Biotechnology Information. Les régions transmembranaires ont été prédites avec le programme Tmpred (Hofmann et Stoffel, 1993). Expression d'AgMaTl dans Saccharomyces cerevisiae L'ADNc de AgMaTl a été ligué dans les sites PstI-XhoI du vecteur de levure YEP112A1XE (Riesmeier et al., 1992). Ce vecteur permet l'expression des ADNc sous le contrôle du promoteur de levure ADH1. Les cellules de levures MaDH4 ont été rendues compétentes et transformées selon le protocole décrit par Dohmen et al. (1991). Détermination de la vitesse de croissance Les cultures de levures ont poussé sur du milieu SC comprenant soit du glucose à 2%, soit du mannitol à 2%. Des fractions aliquotes ont été prélevées régulièrement dans les cultures et leur absorbance a été mesurée à 600 nm. Détermination de l'activité mannitol déshydrogénase Les cellules ont été cultivées jusqu'en phase de croissance logarithmique, rincées dans de l'eau distillée et remises en suspension à 80% (poids/volume) dans du tampon d'extraction (phosphate de potassium 50 mM pH 7,5, DTT 1 mM et Triton X100 à 0,5%). Les cellules ont été cassées par vortex avec des billes de verre. Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation et l'extrait brut utilisé pour le dosage enzymatique. L'activité mannitol déshydrogénase a été mesurée à 30 C selon Quain et Boulton (1987). Mesure de transport de mannitol radiomarqué Les cellules ont été cultivées jusqu'en début de phase logarithmique (correspondant à une absorbance de 0,6 à 600 nm), lavées dans de l'eau distillée et resuspendues à 1% (poids/volume) dans du milieu SC tamponné à pH 4,5 avec du MES 25 mM. Une fraction aliquote de 100 l de la suspension cellulaire a été incubée pendant 60,120, 180 et 300 s dans 100 l d'une solution contenant du [3H]-mannitol 500 M. La réaction a été arrêtée par addition de 8 ml d'eau à 4 C et par filtration sur des filtres en fibres de verre (Sartorius). La radioactivité incorporée dans les cellules de levure a été déterminée par comptage en scintillation liquide (Packard). Pour les expériences avec des inhibiteurs ou des compétiteurs, le produit a été ajouté 30s avant le mannitol radioactif. RESULTATS Clonage moléculaire de AgMaT1 Un certain nombre de protéines qui transportent des sucres ou des métabolites font preuve de similitudes dans leurs séquences. Il a été suggéré que ces protéines de transport ont évolué à partir de la duplication d'une protéine ancestrale avec 6 régions transmembranaires (Maiden et al., 1987). Plusieurs régions d'acides aminés conservés ont été identifiées telles que les séquences d'acides aminés aux extrémités des 6eet 12e domaines transmembranaires, respectivement PESPR et PETKG (Griffith et al., 1992). Une comparaison entre les différents transporteurs de glucose (MST1, STP1, STP4, HUP1, HUP3, GLUT1), le transporteur de D-xylose de L.brevis, le transporteur d'arabinose d'E.coli (ARAE), le transporteur de galactose d'E.coli (GALP) et les transporteurs de myo-inositol de levure (gènes ITR1 et ITR2) indique une région conservée LLGFGVG. On a choisi cette séquence comme matrice pour concevoir l'amorce dégénérée 5'RACE pour la PCR. Le premier brin d'ADNc a été transcrit inversement à partir de l'ARN entier des feuilles de céleri mature, amorcé avec une amorce dégénérée LLGFGVG. Après amplification, on a observé une bande de 1 kb sur le gel d'agarose. On a cloné tous les fragments de cette réaction de PCR dans un vecteur pGEM-T Easy (Promega), et on a obtenu plusieurs clones. Pour obtenir un clone entier, on a construit une bibliothèque d'ADNc provenant de faisceaux de phloème isolés à partir de pétioles de céleri mature et on a criblé cette bibliothèque avec le clone 5'RACE-PCR. Après avoir criblé 900 000 transformants, on a identifié 24 clones positifs. Des transformants positifs avec des inserts d'approximativement 1,8-2,0 kb ont été choisis et partiellement séquences. L'un de ces clones, nommé AgMaTl, a été choisi pour une analyse détaillée. Il contient 1778 pb avec un cadre ouvert de lecture qui code pour une protéine contenant 513 acides aminés avec une masse moléculaire estimée à 56 kDa. L'analyse hydropathique de la séquence déduite d'acides aminés indique que AgMaTI contient 12 domaines transmembranaires et une région centrale hydrophile longue de 77 résidus acides aminés. La séquence d'acides aminés de AgMaTl a été comparée avec celles des bases de données et on a trouvé que cette séquence était apparentée aux transporteurs de sucres dans de nombreux organismes. Le pourcentage d'identité des acides aminés est approximativement égal à 50%. Cependant, on a trouvé un plus grand pourcentage d'identité (65%) avec deux éventuels transporteurs de sucre de Beta vulgaris (Beet 1 et Beet 2). Un résidu d'asparagine, qui est une partie d'une séquence consensus de Nglycosylation (Asn372), est situé sur le côté externe et devrait ainsi être glycosylé. De plus, les séquences consensus, qui sont les caractéristiques communes du sous-groupe des transporteurs de sucre de la MFS, sont présentes dans AgMaTl (en caractères gras dans la Figure 1). Nous avons trouvé les séquences de PESPRXL et PETQGRXXXE respectivement aux extrémités des 6eet 12e domaines transmembranaires, ou le motif (R/K) XGR(R/K) entre le 2eet le 3e et également les 8e et 9e hélices transmembranaires (Griffith et al., 1992). Remarque : La principale difficulté rencontrée au cours du clonage a été l'absence totale de caractérisation d'un tel transporteur chez aucun organisme vivant. En effet le seul transporteur de mannitol est une mannitol-phospho-transférase de bactérie (Boer et al., 1994) qui effectue à la fois le transport et la phosphorylation du mannitol. Ce système combiné est présent chez les bactéries pour de nombreux substrats mais il n'existe pas chez les organismes Eucaryotes. Toutefois, selon une première stratégie, un premier criblage de la banque d'ADNc a été effectué avec la partie du gène de la mannitolphospho-transférase correspondant au domaine transmembranaire. Ce criblage n'a pas permis d'obtenir de résultat, ce qui se justifie a posteriori par l'absence d'homologie significative entre AgMaTl et la mannitol-phospho-transférase. Une seconde stratégie, qui s'est révélée inopérationnelle, s'est inspirée de celle utilisée pour identifier le transporteur d'oligosaccharides chez les végétaux (brevet EP 0 647 273). Il s'agissait de complémenter des cellules de Saccharomyces cerevisiae avec une banque d'ADNc dans un vecteur d'expression. Les levures sont en effet capables d'utiliser le mannitol comme source de carbone, mais elles nécessitent une période d'induction assez longue sur mannitol. Comme il a déjà été précisé, aucun transporteur de mannitol n'a été identifié chez la levure. Le raisonnement était que si une levure exprimait un transporteur de mannitol végétal, cela lui conférerait un avantage de croissance et que donc, elle pousserait plus vite sur un milieu contenant du mannitol. On a procédé ainsi mais aucun des ADNc obtenus ne présentait aucunes des caractéristiques de protéines membranaires et ressemblaient en fait à des facteurs de transcription. Le système de sélection permettait en fait d'identifier des ADNc qui intervenaient sur l'expression des gènes de la levure et non pas des transporteurs. Devant les difficultés rencontrées, les Inventeurs ont formulé une hypothèse a priori peu probable selon laquelle le transporteur de mannitol ferait partie de la super famille des transporteurs de glucides décrite par Marger et Saier (1993). Pour ce faire, on a utilisé une espèce, le céleri, chez laquelle l'existence d'un transporteur de mannitol avait été démontrée (Salmon et al., 1995) et à construire une banque d'ADNc à partir du tissu (le phloème) dans lequel le transporteur est le plus exprimé. La seconde étape a été la sélection des ADNc obtenus sur leur capacité à conférer à des levures la possibilité de transporter du mannitol. Dans ces expériences le témoin était la souche de levure transformée avec le plasmide d'expression vide. C'est ainsi que la fonction de transporteur de mannitol de l'ADNc de AgMaTl a été démontrée. Lors de cette expérience, on a identifié d'autres séquences : on a en tout obtenu 24 clones. Parmi tous ces clones, on en a séquence deux qui présentaient des profils d'hydropathie de transporteurs. Le premier, M22 (AgMaTl), conférait à des levures la capacité de transporter du mannitol alors que le second, M7, ne la conférait pas. Construction d'une souche de levure susceptible de métaboliser le mannitol intracellulaire Des études initiales ont été réalisées afin de caractériser la capacité d'une levure à absorber et à métaboliser le mannitol (Quain et Boulton, 1987). Sur les 40 souches polyploïdes de S. cerevisiae criblées, la moitié d'entre elles ont fait preuve d'une bonne croissance sur du mannitol 5% après une adaptation à long terme (Quain et Boulton, 1987). Par conséquent, on a décidé de tester différentes souches de levures pour leur capacité à transporter et à métaboliser le mannitol et on a retenu 2 souches. Cela a d'abord été effectué en analysant les caractéristiques de croissance sur un milieu contenant du mannitol comme unique source de carbone. E22574d, en général déficiente en transporteur général d'acides aminés et en transporteur de proline, est incapable de croître sur un milieu contenant du mannitol comme unique source de carbone. Au contraire, #[alpha] était capable de croître sur du mannitol après une adaptation à long terme. Après adaptation, la souche pouvait être maintenue avec succès sur un milieu solide contenant du mannitol 5%. Mais le maintien de la souche adaptée #[alpha] sur un milieu solide contenant seulement du glucose a conduit à la perte totale de la croissance adaptée. Une telle adaptation de la croissance sur du mannitol est probablement due à l'induction des enzymes clés de dégradation ou des perméases de transport. En accord avec les observations précédentes, on a pu détecter une D-mannitol déshydrogénase dépendante de NAD+ chez les levures #[alpha] (Tableau 1). TABLEAU 1 : de mannitol déshydrogénase dans différentes souches de levures. Les souches se sont développées dans un milieu liquide contenant soit de glucose 2% soit du mannitol 2%. Les résultats sont les moyennes SD des trois expériences indépendantes. ND, non détecté. Souche Activité ( mol de mannitol oxydé.(mg de protéine)-1.min-1) glucose mannitol #[alpha] 0,011 0,003 0,240 0,007 E22574d 0,006 ~ 0,002 ND 2a 0,001 0,001 ND MaDH4 0,410 0,011 ND Pour obtenir une auxotrophie au tryptophane, on a croisé la souche !la (Trp-) avec la souche E22574d (Trp+). On a choisi la levure 2a qui ne peut pas croître sur un milieu contenant du mannitol, avec une auxotrophie au tryptophane et à la leucine. Aucune activité de mannitol déshydrogénase n'a été détectée dans les cellules 2a (Tableau 1). Il a fallu introduire une activité d'hydrolyse du mannitol limitée à l'intérieur de la levure. On a cloné l'ADNc du gène de la mannitol déshydrogénase de la levure dans YIP128A1 sous le contrôle du promoteur ADHI et on l'a intégré de manière stable dans le gène leu2 de 2a. Plusieurs transformants ont fait preuve d'une activité mannitol déshydrogénase. La souche avec l'activité la plus importante, nommée MaDH4, a été utilisée pour des analyses ultérieures (Tableau 1). Expression hétérologue de la protéine AgMaTI Pour une caractérisation ultérieure de la fonction de la protéine AgMaTl, il a été nécessaire d'exprimer le transporteur de manière fonctionnelle dans un système hétérologue comme des cellules de levure. L'ADNc de AgMaTl a été souscloné dans les sites PstI/XhoI du vecteur navette YEP 112A1XE qui a une boîte promoteur/terminateur du gène de l'alcool déshydrogénase ADHI de S. cerevisiae (Riesmeier et al., 1992). Les cellules de MaDH4 compétentes ont été transformées avec cette construction et YEP 112A1XE a été utilisé comme témoin. Toutes les constructions ont d'abord été testées pour leur capacité à croître sur du mannitol comme unique source de carbone. Comme indiqué dans la Figure 10, la souche MaDH4, transformée avec le plasmide vide YEP 112A1XE n'est pas capable de croître sur le mannitol. Les cellules exprimant AgMaTl pouvaient très bien croître sur ce polyol. Afin de tester directement la capacité des cellules transformées à transporter le mannitol, les cellules de levure ont été incubées dans un milieu contenant du [3H]mannitol pendant quelques secondes à plusieurs minutes, les cellules ont été lavées et la radioactivité absorbée a été mesurée par comptage en scintillation électrique. La Figure 11indique que le transport du mannitol dans les cellules témoins de S. cerevisiae est négligeable. Cependant, les souches de levure MaDH4, exprimant AgMaTl, transportent le [3H]-mannitol à des vitesses élevées lorsqu'elles croissent sur un milieu contenant du mannitol. On a obtenu le même résultat avec des cellules de levure transformées croissant sur du glycérol (donnée non indiquée). D'autres polyols comme le dulcitol, le sorbitol, le xylitol, le myo-inositol semblent être capables d'inhiber de moitié l'absorption du mannitol. La forme oside du mannitol, le mannose, semble être reconnue par AgMaTl. PROTOCOLE DE TRANSFORMATION DE PETIOLES OU DE FEUILLES DE CELERI BRANCHE Des plants de Céleri branche (environ 10 cm de hauteur) régénérés à partir de cellules embryogènes sont utilisés comme matériel végétal pour la transformation. Inoculation des tissus de Céleri Des bactéries Agrobacterium tumefaciens sont cultivées pendant 24 h à 28 C sous agitation dans du milieu LB (Liquid Broth : tryptone1%, extrait autolytique de levure 0,5%, NaCl 0,5%)) avec l'antibiotique approprié. Les pétioles des plants de Céleri sont fragmentés en section de 0,5 cm environ. Pour chaque fragment, une section longitudinale est faite. Les segments de Céleri sont incubés dans du milieu MS (Murashige & Skoog) 1 X (concentration normale, c'est-àdire pas de dilution) liquide contenant 1/25ème de la culture de bactéries Agrobacterium tumefaciens pendant 60 min à température ambiante. Composition du milieu MS Macro-éléments Vitamines CaCl2 2,99 mM Glycine 26,64 mM KH2PO4 1,25 mM Myo-inositol 0,56 mM KN03 18,79 mM Acide nicotinique 4,06 M MgS04 1,50 mM Pyridoxine-HCl 2,43 M NH4N03 20,61 mM Thiamine-HCl 0,30 M Micro-éléments ~~~~~~~~ CoCl2, 6 H20 0,11 M CuS04, 5 H20 0,10 M FeNaEDTA 0,10 M H3Bo3 0,10 M KI 5,00 M MnS04, H20 0,10 mM Na2Mo04, 2 H20 1,03 M ZnS04, 7 H20 29,91 M L'excès de bactéries est ensuite enlevé des segments de Céleri en les déposant sur du papier absorbant pendant 2-3 min. Coculture des segments de Céleri et des bactéries A. tumefaciens La face cambiale des segments de Céleri est déposée en contact du milieu de régénération RM gélosé. Durant 48 h, les boîtes de Pétri sont placées dans une chambre climatisée à 25 C et soumises à des cycles lumière/obscurité 16 h/ 8 h. Elimination des bactéries A. tumefaciens Après 48 h de coculture, les segments de Céleri sont prélevés des boîtes de milieu RM et transférés dans du MS 1 X liquide supplémenté avec de la céfotaxime à une concentration finale de 250 ug/mL. Après une incubation de 60 min, les segments de Céleri sont séchés sur du papier absorbant pendant 2-3 min. Régénération de plants de Céleri transformés La face cambiale des segments de Céleri est déposée en contact du milieu d'initiation de la callogenèse CIM gélosé. Les boîtes de Pétri CIM sont placées dans une chambre climatisée à 25 C et soumises à des cycles lumière/obscurité 16 h/8 h jusqu'au développement de cals (2-3 semaines). Les segments de Céleri sont alors transférés sur un milieu d'induction de l'organogenèse OIM gélosé (2-3 semaines). Après l'apparition des bourgeons, ceux-ci sont prélevés et placés sur le milieu d'enracinement EM gélosé. Quelques semaines (3-4 semaines) sont nécessaires pour le développement de jeunes pousses de Céleri. Composition des milieux Milieu de régénération RM MS 1 X Mannitol 3,0 % Saccharose 1,5 % Hydrolysat de caséine 100,0 mg/L 6-Benzylaminopurine (BAP) 1,0 mg/L Acide a-naphtylacétique (NAA) 0,1 mg/L Acide gibbérellique (GA3) 0, 1 mg/L Agar 0,8 % Milieu d'initiation de la callogenèse (CIM) MS 1 X Mannitol 3,0 % Saccharose 1,5 % Hydrolysat de caséine 100,0 mg/L 6-Benzylaminopurine (BAP) 1,0 mg/L Acide a-naphtylacétique (NAA) 0,1 mg/L Acide gibbérellique (GA3) 0,1 mg/L Kanamycine 125,0 mg/L Céfotaxime 200,0 mg/L Agar 0,8 % Milieu d'induction de l'organogénèse (OIM) MS 1 X Mannitol 3,0 % Saccharose 1,5 % Hydrolysat de caséine 100,0 mg/L 6-Benzylaminopurine (BAP) 1,0 mg/L Acide gibbérellique (GA3) 0,1 mg/L Kanamycine 75,0 mg/L Céfotaxime 200,0 mg/L Agar 0,8 % Milieu d'enracinement (EM) MS 1 X Mannitol 3,0 % Saccharose 1,5 % Hydrolysat de caséine 100,0 mg/L Acide a-indolyacétique (IAA) 0,1 mg/L Kanamycine 75,0 mg/L Céfotaxime 200,0 mg/L Agar 0,8 % REFERENCES - Lewis DH (1984) Physiology and metabolism of alditols. 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Utilisation d'une séquence d'ADN codant pour un transporteur de polyols, chez les plantes et les champignons, tels que des polyols ayant une chaîne principale contenant 5 à 8 atomes de carbone, notamment 5 à 7 atomes de carbone, en particulier 6 atomes de carbone, lesquels polyols étant avantageusement choisis parmi le mannitol, le sorbitol, le dulcitol, le galactitol, l'inositol, le myo-inositol, le ribitol et le xylitol, et étant notamment le mannitol, pour la préparation de plantes transgéniques. 2. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle la séquence d'ADN est choisie parmi l'une des séquences suivantes : SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO: 10. 3. Protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par : - la séquence SEQ ID NO : 2, - ou toute séquence dérivée de SEQ ID NO: 2, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ayant la propriété de transporter, chez les plantes et les champignons, des polyols, tels que des polyols ayant une chaîne principale contenant 5 à 8 atomes de carbone, notamment 5 à 7 atomes de carbone, en particulier 6 atomes de carbone, lesquels polyols étant avantageusement choisis parmi le mannitol, le sorbitol, le dulcitol, le galactitol, l'inositol, le myo-inositol, le ribitol et le xylitol, et étant notamment le mannitol, - toute séquence homologue de SEQ ID NO : 2, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 50% avec la séquence SEQ ID NO : 2 et possédant la propriété de transporter, chez les plantes et les champignons, des polyols tels que définis ci-dessus, - ou tout fragment d'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve qu'il possède la propriété de transporter, chez les plantes et les champignons, des polyols tels que définis ci-dessus, notamment tout fragment étant constitué d'au moins environ 10 acides aminés contigus dans la séquence SEQ ID NO : 2. 4. Séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie dans la revendication 3. 5. Séquence d'ADN qui comprend ou est constituée par : - la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1, - ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de la séquence SEQ ID NO : 1 codant pour une protéine représentée par SEQ ID NO :2, - ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de la séquence SEQ ID NO : 1 codant pour une protéine dérivée de SEQ ID NO: 2, telle que définie dans la revendication 3, - ou toute séquence nucléotidique homologue de SEQ ID NO : 1, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 35% avec la séquence SEQ ID NO : 1 codant pour une protéine homologue de SEQ ID NO : 2, telle que définie dans la revendication 3, - ou tout fragment de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 ou des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 30 nucléotides contigus dans ladite séquence, - ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences ou fragments susmentionnés, - ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences ou d'un des fragments susmentionnés. 6. Vecteur recombinant, notamment plasmide, cosmide, phage ou ADN de virus, contenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 4 ou 5. 7. Vecteur recombinant selon la revendication 6, contenant les éléments nécessaires à l'expression dans une cellule hôte des polypeptides codés par les acides nucléiques selon l'une des revendications 4 ou 5, insérés dans ledit vecteur. 8. Cellule hôte, choisie notamment parmi les bactéries, les levures, les champignons, les plantes ou les cellules de mammifères, ladite cellule hôte étant transformée, notamment à l'aide d'un vecteur recombinant selon l'une des revendications 6 ou 7. 9. Oligonucléotides antisens ou ARN messager antisens dérivés des séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 4 ou 5. 10. Cellules de plantes contenant dans leur génome une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 4 ou 5. 11. Plantes transgéniques, parties de plantes ou semences de plantes contenant des cellules selon la revendication 10. 12. Plante transgénique selon la revendication 11, qui, à l'état natif, ne contient pas ou n'exprime pas le gène du transporteur de mannitol, dans le génome de laquelle est introduit une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 4 ou 5. 13. Plante transgénique selon la revendication 11, qui, à l'état natif, contient ou exprime le gène du transporteur de mannitol, dans le génome de laquelle est introduit une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 4 ou 5. 14. Procédé de criblage de plantes génétiquement modifiées avec au moins une séquence nucléotidique d'intérêt qui comprend les étapes suivantes : - la transformation de cellules végétales avec un vecteur contenant une séquence d'insertion, ladite séquence d'insertion comprenant la séquence nucléotidique d'intérêt et une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol tel que défini dans l'une des revendications 1, 2, 4 et 5, - la mise en culture des cellules ainsi transformées sur un milieu contenant ledit polyol comme unique source de carbone, pour l'obtention de plantes ou de fragments de plantes transgéniques contenant ladite séquence d'insertion. 15. Procédé d'obtention de plantes transgéniques résistantes aux pathogènes, qui comprend les étapes suivantes : - la transformation de cellules végétales avec une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol tel que défini dans l'une des revendications 1,2, 4 et 5, - la mise en culture des cellules ainsi transformées pour l'obtention de plantes ou de fragments de plantes transgéniques. 16. Procédé d'obtention de plantes transgéniques résistantes au stress salin, qui comprend les étapes suivantes : - la transformation de cellules végétales avec une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol tel que défini dans l'une des revendications 1, 2, 4 et 5, - la mise en culture des cellules ainsi transformées pour l'obtention de plantes ou de fragments de plantes transgéniques.