Brevet FR2813315A1 — publié le 20020301

PROCÉDÉ D'IDENTIFICATION DE SUBSTANCES UTILES POUR LE TRAITEMENT DE L'INFLAMMATION METTANT EN #UVRE L'ÉLÉMENT DE RÉPONSE DU RÉCEPTEUR ROR DU GÈNE I#B[alpha]. La présente invention concerne l'utilisation de l'élément de réponse du récepteur ROR du gène I#B[alpha], et tout spécialement de la séquence-910/-898 du promoteur de ce gène, pour le criblage de substances utiles dans le traitement ou la prévention de l'inflammation. Dans une forme de mise en oeuvre particulière, l'invention concerne l'utilisation d'un récepteur ROR et/ou d'au moins un élément de réponse de celui-ci ou d'un équivalent fonctionnel de ceux-ci pour le criblage de substances utiles dans le traitement ou la prévention de l'inflammation. Le complexe NF-KB est constitué d'une importante variété de dimères de protéines de la famille NF-KB/Rel. Cinq protéines de cette famille ont été identifiées chez les mammifères : NF-KB1 (p50 et son précurseur p105), NF-KB2 (p52 et son précurseur plOO), c-Rel, ReIA/p65 et ReIB (Ghosh, S. et al., Annu. Rev. Immunol. 1998,16: 225-60). Toutes ces protéines comportent un domaine hautement conservé, appelé RHD pour (Rel homology domain), composé d'environ 300 acides aminés avec deux domaines Ig-Like . Ce domaine RHD est impliqué dans la dimérisation des protéines NF-KB, la fixation à l'ADN, l'interaction avec les protéines IKBs et possède un signal de localisation nucléaire (NLS). Les dimères NF-KB reconnaissent avec une affinité différentielle la séquence consensus GGGRNNYYCC, où R représente un base purique, Y représente une base pyrimidique et N représente une base quelconque (Miyamoto, S. Verma, I.M., Adv. Cancer Res. 1995, 66 : 255-92). Les protéines de la famille ReI/NF-KB diffèrent également dans leur capacité à activer la transcription ; seules les protéines p65 et c-Rel en sont capables, bien que ReIB active la transcription dans certains types cellulaires. L'invalidation des gènes codant pour les différentes protéines de cette famille a révélé des fonctions différentes spécifiques de chacun de ses membres. L'hétérodimère p50/p65 a été le premier dimère identifié et il est le plus abondant dans la plupart des types cellulaires. La voie NF-KB régule la transcription d'un grand nombre de gènes impliqués dans les réponses immunes et inflammatoires (Bauerle, P.A. et Baichwal, V. R., Adv. Immunol. 1997,65:111-37 ; Barnes, P. J. et Karin, M., N. Engl. J. Med. 1997, Ap 10,336 (15):1066-71 ; Siebenlist, U. et al., Annu. Rev. Cell Biol. 1994, 10:405-55). Une dérégulation de cette voie de signalisation conduit à de multiples pathologies, comme des cancers, des maladies neurodégénératives, l'arthrite et l'asthme. La voie de signalisation NF-KB est activée par un large spectre de stimuli : les cytokines (TNFa, IL-1), les mitogènes, le lipopolysaccharide, les virus, les protéines virales, l'ARN double brin, les stress physiques et chimiques (Ghosh, S. et al., Annu. Rev. Immunol. 1998, 16 : 225-60 ; Siebenlist, U. et al., Annu. Rev. Cell Biol. 1994, 10:405-55). Dans la plupart des cellules inactivées, NF-KB se trouve sous forme d'un complexe cytoplasmique inactif, par liaison avec une protéine inhibitrice IKB (Forman B.M. et Baltimore, D. Science 1998,242 : 540-546). L'activation de NF-KB se fait via l'activation d'une IKB kinase (IKK) qui phosphoryle la protéine I#B[alpha] sur la sérine 32 et la sérine 36, ce qui conduit à la dégradation d'iKBa et à la libération des protéines NF-KB p52 et p65 (Bauerle, P.A. et Baltimore D., Cell 1996,87:13-20 ; Verma, I.M. Stevenson, J. K. Schwartz, E. M., Van Antwerp, D. et Miyamoto, S., Genes & development 1995,9 :2723-2735). Les dimères NF-KB ainsi libérés migrent jusqu'au noyau où ils régulent la transcription. La famille I#B regroupe les protéines I#B[alpha], IKB3, IKBy, IKBE, BcI-3, NF-KB1, NF-KB2 (Whiteside, S.T. et Israel, A., Semin. Cancer Biol. 1997, Apr 8(2) :75-82). Les protéines IKBs sont impliquées dans le processus terminal de la voie de signalisation NF-KB puisque ces protéines néosynthétisées transloquent dans le noyau et interagissent avec les complexes NF-KB fixés à l'ADN, entraînant le détachement du site de fixation et leur réexportation dans le cytoplasme (Arenzana-Seeisdedos, F. et al., J. Cell Sci. 1997, Feb. 110 :369-78). L'expression de la protéine I#B[alpha] est contrôlée par la voie NF-KB ce qui assure un rétrocontrôle de cette voie de signalisation (Sun, S. C. et al., Science 1993, Mar 26, 259(5103) :1912-5). Par ailleurs, les glucocorticoïdes semblent également contrôler l'expression I#B[alpha] (Auphan, N. et al. 1995, Oct. 13,270(5234) : 286-90 ; Scheinman, R.I., 1995, Oct. 13,270(5234) : 283-6), alors que les oestrogènes réduisent son expression (Sun S. C. et al., Science 1993, Mar. 26, 259(5103) :1912-5). Enfin, l'analyse fonctionnelle du promoteur I#B[alpha] a montré le rôle crucial d'un site de liaison au facteur AP-1 (Kralova, J. et al., Oncogene 1996, Jun. 20, 12(12) :2595-604) et d'un site de liaison au facteur SP1 (Algarte, M. et al., Mol. Cell Biol., 1999, Sep. 19(9) :64140-53). Le récepteur RORa (Retinoid-related orphan receptor alpha) (NR1F) est un membre de la famille des récepteurs nucléaires qui se lie sous forme de monomère, via un élément de réponse RORE composé de 6 paires de bases de motif hémipalyndromique AGGTCA précédé d'une région riche en A/T (Giguère, V., McBroom, L. B.D. & Flock, G. Molecular Cellular Biology, 1995,15, 2517-2526 ; McBroom, L. D.B., Flock, G. & Giguère, V. Molecular Cellular Biology, 1995,15, 796-808). Dans certaines conditions RORa se lie à l'ADN sous forme d'homodimère via un élément de réponse composé d'une répétition de deux motifs hémipalindromiques AGGTCA espacés de deux nucléotides et précédés d'une région riche en A/T (Harding, H.P. et al., Mol. Endocrinol. 1997, Oct 11(11):1737-46). Les sites RORE sont des éléments de réponse de ROR sur lesquels le récepteur ROR se fixe pour moduler l'activité transcriptionnelle du gène placé en aval. Ces sites peuvent être utilisés pour conférer une sensibilité pour ROR à un promoteur hétérologue. Le gène RORa possède quatre isoformes ayant un domaine de liaison à l'ADN (DNA-binding domains DBD) commun et un domaine de liaison de ligands (Ligand-binding domains LBD) également commun. Ces isoformes diffèrent par leur domaine amino-terminal (Giguère, V. et al. Genes & Development 8,538-553 (1994)). Les souris déficientes en RORa présentent les déficiences cérébrales (ataxie) caractéristiques des souris staggerer, qui portent une délétion au niveau du gène de RORa, cette délétion empêche la traduction du LBD (Hamilton, B. A. et al. Nature 1996, 379, 736-739t; D'Ambrosio, D. et al. Journal of Clinical Investigation 1998,101, 252-262 ; Dussault, I., Fawcett, D., Mathyssen, A., Bader, J.-A. et GiguËre, V., Mechanisms of Development 1998,70, 147-153 ; Steinmayr, M. et al. Journal of Biological Chemistry 1998,95, 3960-3965). De plus, ces souris souffrent d'une hyperproduction de l'IL-1 (Kopmels, B., et al. Journal of Neurochemistry 1992 58, 192-199). Il a été montré dans l'art antérieur que la souris staggerer qui porte une mutation du gène RORa (mutation qui empêche la traduction du domaine LBD) révèle des anomalies immunes comme l'hyperproduction d'IL-la dans les macrophages (Kopmels, B., et al. Journal of Neurochemistry 1992 58, 192-199 ; Kopmels, B., et al. Journal of Neurochemistry 1990,55 1980-1985). Une autre étude a rapporté que le récepteur ROR[alpha], qui appartient à la famille des récepteurs nucléaires orphelins, est activé par le CGP 52608, dérivé apparenté aux thiazolidinediones, dans les cellules SL3 de drosophile (Wiesenberg, I. et al. Molecular Pharmacology 1998,53, 1131-1138). Cette étude a aussi montré que le CGP 52608 possède des activités anti-arthritiques in vivo. Elle n'apporte cependant aucun Élément prouvant que l'activité anti-inflammatoire de CGP 52608 dépend de ROR dans les cellules de mammifère. Il a par ailleurs été suggéré, sur la base de la présence d'un élément de réponse à ROR dans son promoteur, que le gène codant pour la 5-lipoxygénase, enzyme importante impliquée dans le contrôle des réactions inflammatoires et allergiques, constituait une cible de ROR[alpha] (Steinhilber et al. JBC 270 (13) :7037-7040). Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont montré une nouvelle fonction du récepteur RORal. De manière surprenante, la Demanderesse a prouvé pour la première fois que ROR[alpha]1 régule de façon négative la réponse inflammatoire en interférant avec la voie NF-KB. En effet, il est maintenant démontré que la transcription d'iKBa, principale protéine inhibitrice de la voie NF-KB, est activée par RORal via un nouvel élément de réponse RORE, identifié dans le promoteur du gène I#B[alpha]. Cet élément de réponse correspond à un site RORE consensus parfait et se situe entre les positions -910/-898 du promoteur I#B[alpha], la séquence du site étant gagcacAATGTAGGTCAgatag (Ito, C. Y., Kazantsev, A.G. et Baldwin, A.S., Nucleic Acid Research, 1994 22,3787-3792). Par ailleurs, la demanderesse a démontré que la mutation de cette séquence se traduit par une perte de l'effet de RORal, ce qui illustre son importance fonctionnelle. Tout autre récepteur nucléaire ou toute autre substance qui se lierait à cette séquence est donc susceptible de moduler l'expression d'IKBa. Or, la protéine I#B[alpha] en se liant au facteur nucléaire NF-KB forme un complexe inactif (IKBa-NF-KB) qui empêche l'activation de l'expression de gènes proinflammatoires comme les gènes de certaines cytokines ou le gène COX-2. Ces données prouvent que RORal ou tout autre facteur nucléaire qui se lie à la séquence -910/-898 du promoteur I#B[alpha] est une cible potentielle pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques. La figure 1 en annexe est une représentation schématique des mécanismes mis en jeu dans la voie de régulation de la réponse inflammatoire identifiés dans le cadre de la présente invention. La mise en évidence du rôle de la séquence -910/-898 a donc permis de mettre au point de nouvelles méthodes d'identification de substances utiles pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques humaines comme l'athérosclérose et l'arthrite rhumatoïde. Il est entendu que la séquence identifiée par la demanderesse peut également être utilisée pour identifier des nouveaux facteurs nucléaires qui affectent l'activité du promoteur IKB via cette séquence et par conséquent, peuvent être utiles pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques humaines comme l'athérosclérose et l'arthrite rhumatoïde. La mise en évidence d'IKBa en tant que cible de RORal a donc également permis de mettre au point de nouvelles méthodes d'identification de substances utiles pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques humaines, comme l'athérosclérose et l'arthrite rhumatoïde. La présente invention a donc pour objet un procédé d'identification de substances utiles pour le traitement de l'inflammation, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact de ladite substance avec une construction d'acide nucléique comprenant l'élément de réponse au récepteur ROR du promoteur du gène I#B[alpha], dans des conditions susceptibles de permettre à ladite substance de se fixer sur ledit élément de réponse, b) la mesure de la fixation éventuelle de ladite substance sur l'élément de réponse ou de l'activité transcriptionnelle de l'élément de réponse ou d'un promoteur le contenant, c) éventuellement la comparaison de la mesure de l'étape (b) avec une mesure réalisée dans les mêmes conditions qu'aux étapes (a) et (b) mais avec une construction d'acide nucléique comprenant l'élément de réponse muté. De préférence l'élément de réponse est l'élément de réponse au récepteur RORa et de préférence au récepteur hRORa. Selon une forme particulière de réalisation du procédé de l'invention, les conditions susceptibles de permettre à ladite substance de se fixer sur ledit élément de réponse comprennent la présence du récepteur ROR ou un équivalent fonctionnel de celui-ci. Ainsi, le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact de ladite substance avec le récepteur ROR ou un équivalent fonctionnel de celui-ci et une construction d'acide nucléique comprenant l'élément de réponse audit récepteur du promoteur du gène I#B [alpha], dans des conditions susceptibles de permettre au dit récepteur ou son équivalent fonctionnel, à ladite substance ou au complexe formé du récepteur ou de son équivalent fonctionnel et de ladite substance de se fixer sur ledit élément de réponse, b) la mesure de la fixation éventuelle du récepteur ROR ou de son équivalent fonctionnel, de la substance ou d'un complexe formé du récepteur ROR ou de son équivalent fonctionnel et de ladite substance sur l'élément de réponse ou de l'activité transcriptionnelle de l'élément de réponse ou d'un promoteur le contenant, c) éventuellement la comparaison de la mesure de l'étape (b) avec une mesure réalisée dans les mêmes conditions qu'aux étapes (a) et (b) mais avec une construction d'acide nucléique comprenant l'élément de réponse muté. On entend par équivalent fonctionnel du récepteur ROR, tout facteur nucléaire capable de se lier à l'élément de réponse au récepteur ROR du promoteur du gène I#B[alpha]. Il s'agit donc de toute protéine possédant à la fois : - un site de fixation possédant une sélectivité comparable à celle de ROR pour un ligand donné de celui-ci et, - un site de fixation sur l'ADN reconnaissant le même élément de réponse que ROR ou un Élément de réponse possédant une séquence d'acides nucléiques proche. Il peut avantageusement s'agir d'un facteur nucléaire identifié par le procédé de l'invention décrit ci-dessus. Au sens de la présente invention, on désigne aussi par récepteur ROR, l'ensemble des isoformes a, p et y de la famille ROR. On préfère plus particulièrement le récepteur ROR a et tout préférentiellement le récepteur hROR a. Une forme avantageuse de réalisation du procédé de l'invention, consiste à mettre en #uvre à l'étape (a) une construction d'acide nucléique qui comprend plusieurs copies de l'élément de réponse au récepteur RORa et de préférence hRORa du promoteur du gène IKBa. Une forme avantageuse de mise en oeuvre de l'invention consiste à utiliser à l'étape (a) une construction d'acide nucléique comprenant tout ou partie du promoteur du gène I#B[alpha] contenant l' élément de réponse au récepteur ROR. Un exemple préféré de construction d'acide nucléique selon l'étape (a) comprend ou est constituée par la séquence entre les positions -910/-898 du promoteur I#B[alpha], répondant à la formule suivante : GAGCACAATGTAGGTCAGATAG (SEQ ID No : 1) ou un fragment de celle-ci contenant mais pas limité à la séquence consensus de 6 paires de bases. Cette séquence présente l'avantage, par rapport à la seule séquence consensus de 6 paires de bases, soulignée dans SEQ ID No : 1 ci-dessus, de couvrir une ou plusieurs régions impliquées dans les interactions avec les facteurs nucléaires. La mesure de la fixation éventuelle de la substance, du récepteur ROR ou d'un complexe formé du récepteur ROR et de ladite substance sur l'élément de réponse peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme du métier par exemple en détectant un signal produit par L'élément de réponse suite à ladite fixation. Il peut s'agir de toutes méthodes directes ou indirectes, comme celles utilisant un gène rapporteur, des tests de liaison, etc. Ainsi, une forme préférée de mise en #uvre de l'invention consiste à utiliser une construction d'acide nucléique combinant l'élément de réponse du gène I#B[alpha], avec un gène rapporteur. Avantageusement, ledit gène rapporteur est placé sous le contrôle d'un promoteur comprenant au moins une copie dudit élément de réponse, tout préférentiellement le gène rapporteur est placé sous le contrôle du promoteur du gène IKBa. Tout gène rapporteur permettant de mesurer l'activité de récepteurs nucléaires sur la séquence comprenant leur élément de réponse peut être utilisé dans le procédé de criblage selon l'invention. Parmi ceux-ci, on peut citer par exemple le gène de la chloramphénicol acétyltransférase (CAT), le gène de la luciférase de luciole (Luc) ou de Renilla (Ren), le gène de la phosphatase alcaline sécrétée (PAS) ou celui de la bêtagalactosidase (-Gal). L'activité des protéines codées par ces gènes peut être facilement mesurée par des méthodes classiques et permet de connaître l'effet des récepteurs nucléaires sur l'expression des gènes en mesurant la quantité de protéines produites et/ou leur activité enzymatique. Selon une forme de réalisation toute particulière de l'invention, le gène rapporteur est le gène I#B[alpha]. Dans ce cas, l'accumulation de la protéine I#B[alpha] peut être mesurée par sa capacité à lier NF-KB ou à empêcher son action par exemple en utilisant un vecteur rapporteur qui comporte plusieurs éléments de réponse à NF-KB cloné en amont d'un gène rapporteur. La mise en #uvre d'un gène rapporteur présente l'avantage de vérifier si le récepteur ou un équivalent fonctionnel de celui-ci ou ladite substance est capable non seulement de se fixer, seule ou complexée avec le récepteur ROR, sur ledit élément de réponse, mais aussi d'activer l'activité transcriptionnelle de L'élément de réponse ou d'un promoteur comprenant ledit élément de réponse. Il est ainsi possible de confirmer le rôle de ladite substance dans l'inhibition de la réponse inflammatoire. Avantageusement cette capacité d'activation de l'activité transcriptionnelle peut être évaluée à l'étape (b) et éventuellement (c) sur le gène IKB par toutes méthodes directes ou indirectes connues de l'homme du métier, comme une transfection, une analyse des ARNm ou de la protéine in vitro et sur des modèles in vitro et in vivo. Un exemple de procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact de ladite substance avec un hôte cellulaire transformée par une construction d'acide nucléique comprenant au moins un gène rapporteur combiné de manière fonctionnelle à l'élément de réponse au récepteur ROR du promoteur du gène I#B[alpha] comme défini précédemment, b) la mesure de l'expression du gène rapporteur par tout moyen approprié, c) éventuellement la comparaison de la mesure de l'étape (b) avec une mesure réalisée dans les mêmes conditions qu'aux étapes (a) et (b) mais avec une construction d'acide nucléique comprenant L'élément de réponse muté. Selon une forme de réalisation particulière du procédé ci-dessus, l'hôte cellulaire de l'étape (a) exprime un récepteur ROR ou un équivalent fonctionnel de celui-ci comme défini précédemment. À l'étape (c), la comparaison de la mesure de l'étape (b) est avantageusement effectuée avec une mesure réalisée dans les mêmes conditions qu'aux étapes (a) et (b) mais avec une construction d'acide nucléique comprenant l'élément de réponse muté répondant à la séquence suivante : GAGCACAATGTXXXXXXGATAG, dans laquelle X est choisi parmi A, T, C, G. A titre d'exemple, on préfère les séquences mutées suivantes : GAGCACAATGTATTTCAGATAG GAGCACAATGTAAATCAGATAG GAGCACAATGTACATCAGATAG GAGCACAATGTAACTCAGATAG GAGCACAATGTATATCAGATAG GAGCACAATGTAATTCAGATAG GAGCACAATGTACCTCAGATAG Les substances susceptibles d'être identifiées par le procédé selon l'invention peuvent être des composés chimiques ou biologiques. Il peut ainsi s'agir de facteurs nucléaires. En outre, les méthodes classiques pour identifier des clones codant pour des protéines qui lient l'ADN peuvent être utilisées dans le procédé de l'invention. Par exemple, il est possible d'utiliser le criblage d'une banque d'expression dans #gt11 (Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.1997), la purification par chromatographie d'affinité suivie du séquençage de la protéine (Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.1997), la méthode dite de one hybrid (Wang, M.M., Nature 1993, Jul. 8, 364(6433) :121-6), ou encore la méthode dite de phage display (Smith, G.P. et Scott, J. K., Methods Enzymol. 1993, 217t:228-57 ; O'Neil, K. T. et Hoess, R.T., Curr. Opin. Struct. Biol., 1995, Aug. 5 (4) # : 443-9). L'invention concerne aussi un vecteur comprenant au moins une construction d'acide nucléique comprenant au moins une copie de l'élément de réponse du gène I#B[alpha] muté ou non, susceptible d'être utilisé dans un procédé d'identification de substances décrit précédemment. L'invention se rapporte aussi aux hôtes cellulaires comprenant un tel vecteur. On entend par hôte cellulaire, tout type cellulaire adapté à l'expression des gènes ci-dessus, comme notamment des cellules de mammifères, des bactéries ou des levures ou encore des cellules d'insectes. Les vecteurs utilisés sont, bien entendu, adaptés au type cellulaire transfecté, on peut citer des plasmides, des virus ou des chromosomes artificiels. L'invention concerne donc également les substances identifiées grâce au procédé de l'invention à l'exception du récepteur ROR lui-même. L'invention a donc aussi pour objet une composition pharmaceutique pour prévenir ou traiter les maladies inflammatoires, comprenant comme agent actif au moins une substance autre que le récepteur ROR capable de se fixer, seul ou complexé avec le récepteur ROR ou un équivalent fonctionnel de celui-ci, sur l'élément de réponse au récepteur ROR du gène I#B[alpha]. L'invention concerne tout particulièrement, l'utilisation d'un activateur de la transcription du gène I#B[alpha] pour la préparation d'un médicament destiné à traiter ou à prévenir les maladies inflammatoires. Selon un mode de réalisation particulier de réalisation de l'utilisation selon l'invention, l'activateur de la transcription du gène I#B[alpha] est un composé capable de se fixer seul ou complexé au récepteur ROR sur l'élément de réponse dudit récepteur ROR du gène I#B[alpha]. L'activateur de la transcription du gène I#B[alpha] peut donc être un activateur de la liaison de RORa sur l' élément de réponse du promoteur du gène I#B[alpha] ou de son activité transcriptionnelle. L'invention concerne donc tout particulièrement l'utilisation d'une substance capable de se fixer, seule ou complexée au récepteur ROR ou à un équivalent fonctionnel de celui-ci, sur l'élément de réponse du promoteur du gène I#B[alpha] et d'augmenter l'expression d'IkBa pour la préparation d'un médicament destiné à traiter ou à prévenir les maladies inflammatoires. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et qui se réfèrent aux dessins en annexe dans lesquels : Les figures 2A et 2B illustrent l'expression de RORa dans différents types cellulaires de la paroi vasculaire selon une analyse par RT-PCR (35 cycles) de l'ARNm de ROROC (Figure 2A) et de GAPDH (Figure 2B) (C-PCR et C-RT sont les contrôles négatifs pour la PCR et la RT respectivement). La figure 2C montre l'analyse par RT-PCR de l'ARNm de RORa dans les cellules musculaires lisses infectées par Ad-RORal ou Ad-GFP pendant 24 heures. La figure 2D montre l'analyse de l'expression de la protéine RORa où les cellules musculaires lisses infectées pendant 24 heures avec ou sans Ad-RORal. Les expériences d'immunocytochimie sont conduites comme décrit précédemment (Chinetti, G. et al. Journal of Biological Chemistry, 1980,273, 25573-25580) par utilisation d'un anticorps RORa polyclonal de lapin contre Aa 163-225. Les figures 3A et 3B montrent que RORal inhibe la sécrétion de IL-6 (figure 3A) et IL-8 (figure 3B) et l'expression de COX-2 induites par TNFa dans les cellules musculaires lisses. Les cellules musculaires lisses primaires sont infectées avec Ad-RORal et Ad-GFP pendant 16 heures, puis stimulées par 24 heures par du TNFa (10 ng/ml). À la fin du traitement les concentrations en IL-6 et IL-8 dans le milieu sont déterminées par ELISA (R&D systems UK). Les figures 3C et 3D illustrent l'expression des protéines COX2 et ROR[alpha] mesurée par analyse par Western blot. Les niveaux de protéine COX2 sont normalisés vis-àvis du contenu cellulaire en protéine B-actine (NS = non spécifique). Les figure 4A à 4C illustrent l'inhibition de l'activation de NF-KB par ROR[alpha]2. La figure 4A montre des cellules PAC1A transfectées par le gène reporteur (NF-KB)3-Luc (100 ng) en présence d'un vecteur qui permet la surexpression de RORal PSG5-ROR[alpha]1, 50 ng) ou d'un vecteur vide (PSG5 contrôle). Deux heures après la transfection, les cellules sont nourries avec du DMEM complété par 0,2 % de FCS en présence ou non de LPS (10 mg/ml) pendant 24 heures. La figure 4B montre des cellules musculaires lisses primaires infectées avec Ad-RORal et Ad-GFP pendant 16 heures, puis stimulées pendant 0,15, 30 et 60 minutes avec TNFa (10 ng/ml). Les extraits protéiques total (T; gel inférieur) et nucléaire (N; gel supérieur) sont préparés et analysés par Western blot utilisant un anticorps p65 (Santa Cruz). La figure 4C montre des cellules musculaires lisses primaires infectées avec Ad-RORal et Ad-GFP pendant 16 heures, puis stimulées pendant 30 minutes avec TNFa (10 ng/ml). Les extraits protéiques nucléaires (5 mg) sont préparés et analysés par EMSA utilisant des sondes marquées NF-KB et Spl (Promega). Les complexes ayant migré sont indiqués par une flèche. La double flèche indique la sonde libre. Les figures 5A et 5B illustrent l'activation de la transcription d'IKBa induite par le récepteur RORal dans un vecteur qui permet la surexpression de ROR[alpha] (PSG5- RORal) . La figure 5A montre les cellules musculaires lisses primaires infectées avec Ad-ROROCl et Ad-GFP pendant 16 heures. L'ARN total est préparé, les niveaux en ARNm d'iKBa et GAPDH sont mesurés par Northern blot. La figure 5B montre les cellules PAC1A transfectées avec des fragments du promoteur d'IKBa (100 ng) en présence de PSG5-$ROR[alpha]1 ou du vecteur vide (PSG5 50 ng). Les figures 6A à 6C illustrent l'activation spécifique de la transcription d'IKBa par RORal. RORal se lie à un site RORE à l' intérieur du promoteur d'IKBa mais pas RORa2 ni RORa3. La figure 6A montre les cellules PCAI1 transfectées avec le vecteur reporteur (IKBOC-RORE)2-TK-Luc (100 ng) en présence de RORal, de RORa2 ou de RORa3 (50 ng) ou du vecteur vide PSG5 (50 ng). La figure 6B montre les cellules PCAI1 transfectées avec le vecteur reporteur (IKBOC-RORE)2-TK-Luc (100 ng) en présence de RORal (50 ng) et de RORalA235 ou du vecteur vide (50 ng) La figure 6C illustre des expériences EMSA conduites par utilisation de la protéine traduite in vitro RORal (TNT-T7 Promega) et une sonde marquée iKBa-RORE. Des concentrations croissantes (lx, 10x et 100x) du compétiteur oligonucléotidique natif (AGGTCA) ou muté (ACCTCA) sont utilisées pour démontrer la spécificité du complexe migrant. Afin d'augmenter la mobilité du complexe, un l de l'anticorps RORa est ajouté à la réaction de liaison. (S : migration du complexe ; SS : super-migration du complexe ; FP : sonde libre). I - Matériel et méthodes. 1) Culture cellulaire. Des cellules musculaires lisses d'aorte humaine (PromoCell, Heidelberg, Allemagne) et des cellules endothéliales d'artère coronaire humaine (Clonetics) ont été maintenues en culture primaire dans des conditions habituelles. Les cellules ont été utilisées entre les passages 5 à 8. Des monocytes et des macrophages humains ont été préparés et maintenus en culture primaire comme décrit précédemment. 2) Analyses de ARNs. La préparation et l'analyse par Northern Blot des ARNs ont été réalisés comme décrit précédemment à l'aide des fragments des cDNA I#B[alpha] et GAPDH utilisés comme sondes. Pour l'analyse de l'expression de RORa par RT-PCR, l'ARN total a été transcrit par la transcriptase inverse et ensuite amplifié par PCR à l'aide des amorces suivantes : - pour RORa, 5'-GTCAGCAGCTTCTACCTGGAC-3' (SEQ ID No : 2) et 5'-GTGTTGTTCTGAGAGTGAAAGGCACG-3' (SEQ ID No : 3) (taille du fragment : 482 pb); p o u r GAPDH, 5 ' ATGCAGCCCCGAATGCTCCTCATCGTGGCC-3' (SEQ ID No : 4) et 5'TTCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3' (SEQ ID No : 5) (taille du fragment : 239pb). 3) Production des adénovirus. Les adénovirus recombinants Ad-GFP et Ad-RORal ont été obtenus par recombinaison homologue dans E. Coli après insertion des cDNAs dans le vecteur pADCMV2. Les stocks de particules virales ont été obtenus comme décrit précédemment. Le titre de la suspension a été déterminé par comptage des plages de lyse après infection de cellules 293 et défini comme pfu/ml. Les cellules ont été infectées à un multiplicité d'infection de 100 particules virales par cellules en ajoutant les stocks viraux directement dans le milieu de culture des cellules musculaires lisses. 4) Plasmides et transfection transitoire. Les vecteurs d'expression pSG5-hRORal, -hRORa2, -hRORa3 et -$ROR[alpha]#235 ont été dérivés des vecteurs pCMX précédemment décrits. Un fragment correspondant à la région -929/+22 du promoteur I#B[alpha] a été amplifié au départ d'ADN génomique humain et inséré dans le plasmide pGL2 basique de Promega pour donner la construction p(-922/+22) I#B[alpha] Luc. La mutation du site ROR présent dans ce fragment (AGGTCA muté en ACCTCA) a été introduite par mutagenèse dirigée (Stratagène). Le vecteur rapporteur p(-385/+22) I#B[alpha] a été offert par le Dr. Israël (Institut Pasteur de Paris). Le vecteur rapporteur (IKBOC-RORE)2-Tk-Luc a été créé par l'insertion de deux copies du site RORE du promoteur I#B[alpha] en amont du promoteur minimal de la thymidine kinase du virus de l'Herpes Simplex. La construction (NF-KB) 3-Luc a été obtenues auprès de Stratagène. Les cellules PAC1A (une lignée de cellules musculaires lisse d'aorte de rat) ont été transfectées à l'aide d'un lipide cationique comme décrit précédemment. II - Résultats. Compte tenu du fait que l'inflammation chronique est une caractéristique de l'athérosclérose (Ross, R. New England Journal of Medicine 340,115-126 (1999)) et que les souris staggerer présentent un profil pro-inflammatoire, les inventeurs ont déterminé l'expression de ROR dans différents types cellulaires de la paroi vasculaire par RT-PCR. L'expression de RORa a été détectée dans les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses (CML) et les monocytes (figure 2A). Par contre, il a été mis en évidence que l'expression de RORa est beaucoup plus basse dans les macrophages issus de monocytes. Afin de regarder le rôle potentiel de RORa dans le contrôle de la réponse inflammatoire, les inventeurs ont généré par recombinaison homologue un adénovirus codant pour l'isoforme RORal, qui est prépondérante (Forman, B.M et al. Molecular Endocrinology 8,1253-1261 (1994) ). L'infection des CML primaires par Ad-$ROR[alpha]1 induit l'expression de RORa, alors que l'infection par Ad-GFP utilisé comme contrôle négatif n'affecte pas les niveaux endogènes (figure 2C). Les expériences d'immunocytochimie utilisant les anticorps polyclonaux dirigés contre RORa (Aa 163-225) ont confirmé ces résultats au niveau de la protéine et ont de plus démontré qu'à la fois RORa endogène et RORa exogène sont principalement localisés dans le noyau (Figure 2D). Ensuite, l'influence de RORal sur les différents marqueurs de la réponse inflammatoire vasculaire induite par TNFa a été évaluée. En absence de stimulation, à la fois IL-6 et IL-8 ont été détectés dans les cellules infectées par AdGFP, ce qui est dû à l'immunogénicité de la construction. Cette faible induction est, de façon significative, réprimée par l'infection par RORal (figures 3A et 3B) . Le traitement par TNFa (24 h) des cellules infectées par AdGFP conduit à une induction marquée des deux cytokines qui peut être réprimée de façon significative par l'infection par RORal (figures 3A et 3B). Dans les cellules Ad-GFP nous n'avons pas détecté de protéines endogènes RORa ce qui est certainement dû à la faible affinité de l'anticorps utilisé. Cependant, dans les cellules infectées par AdRORal, une expression accrue de RORa a été détectée, dont le niveau n'a pas été affecté par la stimulation par le TNFa (figure 3C). Dans les mêmes expériences, les niveaux en protéines COX-2 ont été contrôlés. Le TNFa induit fortement l'expression de COX-2, effet qui est complètement diminué dans les cellules Ad-RORal (figure 3D). Ces données prouvent que RORal régule de façon négative la réponse inflammatoire induite par le TNFa dans les cellules musculaires lisses primaires aortiques. Dans le cadre des recherches ayant conduit à la mise en #uvre de l'invention, les inventeurs ont transfecté transitoirement des cellules PAC1A (lignée de cellules musculaires lisses de rats) par un promoteur sous le contrôle de la voie NF-KB, en présence ou non de RORal. Compte tenu du fait que ces cellules ne répondent pas à la stimulation par TNFa, les inventeurs ont utilisé le LPS comme inducteur de la voie NF-KB. Le traitement par le LPS augmente de façon significative (plus de 3 fois) l'activité du promoteur sous le contrôle de NF-KB. Cette induction est réduite lors de la co-transfection par RORal. L'activité promotrice de base n'est pas affectée de façon significative dans ces conditions (figure 4A). Ces résultats confirment que RORal exerce son activité antiinflammatoire par inhibition de l'activité transcriptionnelle de NFkB. Les inventeurs ont ensuite testé l'influence de la surexpression de RORal sur la translocation nucléaire de p65 par western blot. Ils ont constaté que le traitement par TNFa conduit à une translocation nucléaire transitoire du p65 dans les cellules Ad-GFP. Cette translocation est moins prononcée dans les cellules infectées par Ad-$ROR[alpha]1, ce qui indique que ROR[alpha]1 contrôle la translocation de p65 sans réguler l'expression totale de la protéine p65 (figure 4B). Des expériences de retard sur gel (EMSA) ont été conduites afin de regarder les conséquences de cette réduction de migration. Vingt-quatre heures après l'infection des cellules, du TNF est ajouté pendant 30 minutes. À la fin de cette période de traitement, des extraits nucléaires sont préparés et utilisés pour évaluer la présence des protéines NF-KB p52 et p65 par des expériences de retard sur gel qui utilisent des sondes marquées dont les séquences correspondent au site consensus de NF-KB. Les cellules Ad-GFP révèlent une activité de liaison sur le site NF-KB qui est significativement plus basse que dans les cellules infectées par Ad-RORCXl, ce qui va dans le sens des résultats précédents (Figures 3A et 3B). Les inventeurs ont constaté que la stimulation par du TNFa conduit à une forte augmentation de la liaison de NFKB à son élément de réponse, liaison qui est fortement réduite dans les cellules Ad-RORal. Ni le TNFa, ni la surexpression de ROR[alpha]1 n'affectent la liaison de facteurs nucléaires sur une sonde qui correspond au site Spl (figure 4C) , ce qui indique que l'action de RORal est spécifique de la voie NF-aB. Par ailleurs, il est connu que nombre de récepteurs nucléaires inhibent les transcriptions contrôlées par NF-KB et la liaison au site NF-KB, par interaction avec la sous-unité p65 (Gôttlicher, M. Heck, S. & Herrlich, P. Journal of Molecular Medicine 76,480-489 (1998)). Il a ainsi été montré que la cotransfection par p65 conduit à une forte induction du promoteur contrôlé par NF-KB dans les cellules PAC1A (données non fournies). Cette induction n'est pas affectée par la cotransfection par RORal, ce qui indique que, contrairement à d'autres récepteurs nucléaires, RORal interfère de façon négative avec la voie NF-KB sans s'associer à p65. Dans les cellules au repos, la protéine I#Ba séquestre l'hétérodimère p50/p65 sous forme d'un complexe cytoplasmique inactif. Etant donné que ROR[alpha] inhibe la translocation de p65 et sa liaison consécutive au site NFKB, les niveaux d'expression de IKBOC ont été analysés à la fois dans les cellules infectées par Ad-GFP ou Ad-RORal. Les cellules Ad-GFP expriment des niveaux bas d'ARNm d'IKBa (figure 5A). Les niveaux en transcrit I#B[alpha] sont augmentés de façon importante dans les cellules infectées par Ad- RORal (figure 5A) . Ceci indique que RORal inhibe la voie NF-KB par induction de l'expression du gène I#B[alpha]. Le fragment du promoteur du gène I#B[alpha] compris entre les positions-929 et +22 a été amplifié par PCR et inséré en amont du gène rapporteur luciférase (Ito,C.Y., Kazantsev, A.G. & Baldwin, A.S. Nucleics Acid Research 22, 3787-3792 (1994) ) est à la base de la présente invention. La cotransfection de ce vecteur avec un vecteur d'expression de RORal induit une augmentation de l'activité luciférase dirigée par le promoteur-929/+22 mais pas par le promoteur -385/+22. Ceci indique que la région de régulation par RORal se situe entre les positions-929 et-385 (figure 5B). Une analyse de séquence de cette région montre la présence d'un élément de réponse (RORE) dans cette région. La mutation de cet élément de réponse RORE bloque l'effet de RORa (figure 5B). Cette expérience démontre de façon univoque le rôle de ce site dans l'induction de la transcription d'IKBa par RORal. Compte tenu du fait que le gène RORa possède plusieurs isoformes (Giguère, V. et al. Genes & Development 8,538-553 (1994), la Demanderesse a cherché à évaluer l'influence des isoformes RORal, RORa2 et RORa3 sur des constructions sous le contrôle de deux copies de l'élément de réponse à RORa présent au niveau du promoteur du gène IKBa-RORE clonées en amont d'un promoteur hétérologue (promoteur TK). RORal induit fortement l'activité du gène reporteur, ce qui démontre que IKBa-RORE peut fonctionner de façon indépendante du promoteur. Contrairement, RORa2 et RORa3 ne peuvent pas induire la transcription de la construction précédemment citée (figure 6A), ce qui indique que l'induction de la transcription de I#B[alpha] est spécifique à l'isoforme RORal. Il a été montré que le dominant négatif RORA235 auquel il manque le domaine LBD inhibe la transcription de RORal par compétition avec le même domaine de liaison à l'ADN (Mc Broom, L. D.B., Flock, G. & Giguère, V. Molecular Cellular Biology 15,796-808, (1995) ). L'effet de ce mutant sur le promoteur sous contrôle du RORE du gène I#B[alpha] induit par RORal a été testé. La cotransfection par RORaA235 abolit l'effet de RORal (figure 6B) . Ceci démontre que la liaison de RORa au promoteur est essentielle à l'induction de la transcription. Enfin, la liaison de RORal à son élément de réponse RORE a été vérifiée par retard sur gel, en utilisant des protéines RORal traduites in vitro. Des expériences de compétition utilisant des sondes froides, natives ou mutées, ou des expériences de superdéplacement ont montré de façon univoque que RORal se liait fortement au site RORE présent dans le promoteur du gène I#B[alpha]. Ainsi, lors des recherches effectuées dans le cadre de la présente invention, la demanderesse a établi pour la première fois que la surexpression de ROR[alpha]1 dans les cellules musculaires lisses aortiques prévient l'expression de COX-2, de IL-6 et IL-8 induite par TNFa. Tous ces gènes sont des marqueurs majeurs de l'inflammation dans les lésions athérosclérotiques (Ross, R. New England Journal of Medicine 340,115-126 (1999). Les résultats issus de ces recherches montrent que ROR[alpha] joue un rôle protecteur contre l'athérosclérose via un effet vasculaire direct en plus de son rôle modulateur du métabolisme des lipoprotéines (rôle qui passe par son action sur l'expression du gène de l'apolipoprotéine Al (Mamontova, A. et al. Circulation 98,2738-2743 (1998) ). En régulant de façon négative l'IL-8, une chimiokine clé fortement impliquée dans le recrutement des monocytes en cours des phases initiales de l'athérosclérose (Ross, R. New England Journal of Medicine 340, 115-126 (1999), RORal peut réduire l'initiation et la progression des lésions athérosclérotiques. REVENDICATIONS 1) Procédé d'identification de substances utiles pour le traitement de l'inflammation, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact de ladite substance avec une construction d'acide nucléique comprenant l'élément de réponse au récepteur ROR du promoteur du gène $I#B[alpha], dans des conditions susceptibles de permettre à ladite substance de se fixer sur ledit élément de réponse, b) la mesure de la fixation éventuelle de ladite substance sur l'élément de réponse ou de l'activité transcriptionnelle de l'élément de réponse ou d'un promoteur le contenant, c) éventuellement la comparaison de la mesure de l'étape (b) avec une mesure réalisée dans les mêmes conditions qu'aux étapes (a) et (b) mais avec une construction d'acide nucléique comprenant l'élément de réponse muté. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact de ladite substance avec le récepteur ROR ou un équivalent fonctionnel de celui-ci et une construction d'acide nucléique comprenant l'élément de réponse audit récepteur du promoteur du gène I#B [alpha] dans des conditions susceptibles de permettre au dit récepteur ou son équivalent fonctionnel, à ladite substance ou au complexe formé du récepteur ou de son équivalent fonctionnel et de ladite substance de se fixer sur ledit élément de réponse, b) la mesure de la fixation éventuelle du récepteur ROR ou de son équivalent fonctionnel, de la substance ou d'un complexe formé du récepteur ROR ou de son équivalent fonctionnel et de ladite substance sur l'élément de réponse ou de l'activité transcriptionnelle de l'élément de réponse ou d'un promoteur le contenant, c) éventuellement la comparaison de la mesure de l'étape (b) avec une mesure réalisée dans les mêmes conditions qu'aux étapes (a) et (b) mais avec une construction d'acide nucléique comprenant l'élément de réponse muté. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'à l'étape (a) la construction d'acide nucléique comprend au moins une copie de l'élément de réponse au récepteur ROR du promoteur du gène I#B[alpha]. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que l'élément de réponse est l'élément de réponse RORa et de préférence hRORa du promoteur du gène I#B[alpha]. 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la construction d'acide nucléique de l'étape (a) comprend tout ou partie du promoteur du gène IKBOC contenant l'élément de réponse au récepteur ROR. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la construction d'acide nucléique de l'étape (a) comprend ou est constituée par la séquence suivante : GAGCACAATGTAGGTCAGATAG (SEQ ID No : 1) ou un fragment de celle-ci. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'à l'étape (a), la construction d'acide nucléique comprend un gène rapporteur placé sous le contrôle du promoteur comprenant au moins un élément de réponse du récepteur ROR du gène IKBa. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'à l'étape (a), la construction d'acide nucléique comprend un gène rapporteur placé sous le contrôle du promoteur du gène IKBa. 9) Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que le gène rapporteur est choisi parmi le gène IKBa, le gène de la chloramphénicol acétyltransférase, le gène de la luciférase de luciole ou de Renilla, le gène de la phosphatase alcaline secrétée ou le gène de la bêta-galactosidase. 10) Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact de ladite substance avec un hôte cellulaire transformée par une construction d'acide nucléique comprenant au moins un gène rapporteur combiné de manière fonctionnelle à l'élément de réponse au récepteur ROR du promoteur du gène I#B[alpha], b) la mesure de l'expression du gène rapporteur par tout moyen approprié, c) éventuellement la comparaison de la mesure de l'étape (b) avec une mesure réalisée dans les mêmes conditions qu'aux étapes (a) et (b) mais avec une construction d'acide nucléique comprenant L'élément de réponse muté. 11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'hôte cellulaire de l'étape (a) exprime un récepteur ROR ou un équivalent fonctionnel de celui-ci. 12) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'à l'étape (c), la comparaison de la mesure de l'étape (b) est avantageusement effectuée avec une mesure réalisée dans les mêmes conditions qu'aux étapes (a) et (b) mais avec une construction d'acide nucléique comprenant l'élément de réponse muté répondant à la séquence suivante : GAGCACAATGTXXXXXXGATAG, dans laquelle X est choisi parmi A, T, C, G. 13) Un vecteur comprenant au moins une construction d'acide nucléique comprenant au moins une copie de l'élément de réponse au récepteur ROR du gène IKBP, muté ou non. 14) Un hôte cellulaire comprenant un vecteur selon la revendication 13.