Brevet FR2809413A1 — publié le 20011130

PRODUCTION D'ALLERGENES RECOMBINANTS DANS DES CELLULES VEGETALES. La présente invention concerne la production d'allergènes dans des cellules végétales. L'invention concerne aussi des plantes transgéniques ou partie de ces plantes et plus particulièrement des cellules végétales transformées exprimant au moins un allergène recombinant. L'immunothérapie est basée sur une application de doses croissantes d'allergènes auxquels le patient est sensibilisé. Le principe est de réduire les réactions allergiques à ces allergènes qui sont reconnus par les anticorps IgE du patient (Bousquet et al., 1998, Ann. Allergy Asthma Immunol., 81,401-5). A l'heure actuelle, l'immunothérapie est couramment réalisée avec des extraits quasi bruts d'allergènes. La composition des extraits bruts utilisés pour la désensibilisation peut varier d'un lot à l'autre et de plus ces lots contiennent éventuellement des composés allergènes et non-allergènes qui pourraient même entraîner une sensibilisation de novo (van Ree et al., 1997, Clin. Exp. Allergy, 27, 68-74). Par conséquent, la spécificité de l'immunothérapie nécessite d'être améliorée en utilisant des produits purs de composition connue constituée d'un seul ou d'un mélange d'allergène(s) majeurs grandement purifié(s) selon le profil de réactivité des IgE du patient. Le clonage d'un grand nombre d'ADNc d'allergènes provenant de différents organismes a été rapporté ces dernières années. Pour améliorer la spécificité de l'immunothérapie et le diagnostic des allergies, plusieurs allergènes recombinants ont été produits dans des hôtes hétérologues tels que des bactéries, des levures ou des cellules d'insectes (Valenta et al., 1998, Allergy, 53,552- 61). Plusieurs allergènes recombinants ont été produits mais leur capacité de liaison aux IgE est souvent plus faible que celle observée avec les allergènes naturels correspondant (Heiss et al., 1996, FEBS Lett., 381,217-21 ; Shoji et al., 1996, Biosci. Biotech. Biochem., 60,621-5 ; Vrtala et al., 1996, Biochem. Biophy. Res. Communications, 226,42-50 ; van Ree et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol., 102, 184-90 ; van Ree et al.,1999, Clin. Exp. Allergy, 29,848-55). Ceci peut s'expliquer par l'existence de plusieurs isoformes pour un même allergène, chaque isoforme ayant une capacité de liaison aux IgE différente, ou par une conformation incorrecte de la protéine recombinante ou par des différences dans les modifications post-traductionnelles survenant sur l'allergène recombinant produits dans les hôtes hétérologues tels que Escherichia coli ou Saccharomyces cerevisiae. Aussi, pour surmonter les limites des systèmes d'expression utilisés actuellement tels que les bactéries et les levures, les Inventeurs ont étudié dans le cadre de la présente invention, la production d'allergènes recombinants dans les cellules végétales et plus particulièrement dans un système de culture de cellules végétales en suspension ou des plantes transgéniques. En effet, le faible coût corrélé à une production à grande échelle a rendu ce système attrayant pour la production moléculaire. De plus, les cellules de plantes sont capables de réaliser des phosphorylations, des glycosylations et d'autres modifications post-traductionnelles des protéines nécessaires pour l'activité biologique de certaines protéines eucaryotes. En outre, la production à grande échelle dans les plantes de protéines thérapeutiques peut être réalisée sans contamination avec des particules virales ou pseudo-virales capables d'infecter les humains. En conséquence, la présente invention a pour objet un procédé de production d'un allergène comprenant : (i) la transformation de cellules végétales avec une molécule d'ADN comprenant une séquence codant un allergène hétérologue à la plante liée de manière opérationelle à un promoteur, (ii) la culture desdites cellules transformées, (iii) l'isolement de l'allergène exprimé dans lesdites cellules. Le procédé de l'invention est remarquable en ce qu'il permet d'utiliser des cellules végétales qui ont la capacité de synthétiser et de maturer correctement des allergènes biologiquement actifs et parfaitement conformes pour leurs caractéristiques physicochimiques. Le procédé de l'invention admet plusieurs modes de réalisation comprenant ou non à l'étape (ii) la régénération de plante ou partie de plantes génétiquement transformées pour exprimer un allergène. Un mode préféré de production d'allergènes recombinants selon l'invention consiste à l'étape (i) à transformer des cellules végétales issues de suspensions cellulaires, et à l'étape (ii) à sélectionner les cals transformés, puis à initier des suspensions cellulaires à partir desdits cals transformés et cultiver ces suspensions, et à l'étape (iii) à purifier l'allergène à partir d'extraits protéiques issus des suspensions cellulaires transgéniques, en particulier du milieu de culture. Dans ce mode de réalisation, l'allergène recombinant est isolé à l'étape (iii) par purification à partir d'extraits protéiques issus de suspensions cellulaires transgéniques dans des conditions non dénaturantes via un procédé de purification pouvant être une chromatographie d'affinité sur une colonne de métal chélaté et/ou une chromatographie de tamisage moléculaire. Plus particulièrement, ce procédé permet d'obtenir à partir de cellules de plantes cultivées en suspension, donc dans un environnement confiné, des allergènes recombinants utiles dans des applications de diagnostic ou thérapeutiques. Un autre mode de production d'allergènes recombinants selon l'invention consiste à l'étape (i) à régénérer sur un milieu de sélection, à partir desdites cellules, des plantes ou parties de plantes génétiquement transformées pour exprimer un allergène, puis éventuellement à obtenir de semences par autofécondation de la plante régénérée, et enfin facultativement, à produire des plantes à partir des semences. L'allergène recombinant est alors obtenu à l'étape (iii) à partir de cellules végétales cultivées en suspension ou partie de plantes par extraction puis purification. La sélection des cellules, tissus ou parties de plantes transformées par la molécule d'ADN comprenant une séquence codant un allergène hétérologue est avantageusement réalisée, à l'étape (ii) grâce à la présence dans ladite molécule d'ADN d'un gène exprimant une résistance à un agent de sélection présent dans le milieu de culture. De tels gènes sont bien connus de l'homme du métier, il s'agit notamment de ceux conférant une résistance à un antibiotique comme la kanamycine, la ripamycine, etc.... La molécule d'ADN comprenant une séquence codant un allergène hétérologue à la plante placée sous le contrôle d'un promoteur, comprend avantageusement, outre le gène de sélection : 1) une ou plusieurs séquences de régulation de l'expression, comme une séquence de terminaison, 2) une séquence codant un peptide ou polypeptide fusionné à l'allergène permettant son adressage dans la cellule végétale, 3) une séquence codant un peptide ou polypeptide fusionné à l'allergène et facilitant sa purification, comme, par exemple, une séquence " tag histidine ". La transformation des cellules à l'étape (i) du procédé de l'invention peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier : directement par électroporation ou bombardement de microparticules avec la molécule d'ADN formant un vecteur d'expression, ou indirectement à l'aide d'un micro-organisme apte à transformer les cellules de plantes, lui-même préalablement transformé par ledit vecteur d'expression, comme, par exemple, Agrobacterium tumefaciens. L'invention concerne aussi des cellules végétales dans le génome desquelles est incorporée de façon stable une molécule d'acide nucléique recombinant codant un allergène, lesdites cellules végétales ayant été obtenues par les étapes (i) et (ii) du procédé de l'invention. L'invention concerne encore des plantes obtenues par les étapes (i) et (ii) du procédé de l'invention ainsi que des parties ou descendants desdites plantes. Le procédé de l'invention peut être appliqué à toute plante, mono ou dicotylédone, comme le tabac, le blé, le maïs, etc... Le procédé de l'invention permet de produire tout allergène dont le gène est accessible, comme, par exemple, Der p 2. L'invention se rapporte donc également aux allergènes recombinants obtenus par le procédé de l'invention, ainsi qu'aux compositions de diagnostic ou thérapeutique le contenant. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent décrivant la production hétérologue de l'allergène Der p 2 dans une suspension de cellules de tabac BY2 en culture. L'allergène de groupe 2 d'acarien Dermatophagoides spp. (Der p 2) a été utilisé comme modèle d'allergène. Les réactions d'hypersensibilité immédiate aux acariens surviennent chez 10 à 20 % de la population et sont une cause commune d'asthme et d'autres maladies allergiques. L'ADNc codant Der p 2 a été cloné (Chua et al., 1990, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 91,118-23 ; Chua et al., 1996, Clin. Exp. Allergy, 26,829-37) et l'immunoréactivité du Der p 2 recombinant exprimé dans les bactéries ou les levures a été analysée en détail (Chua et al., 1990, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 91, 124-9 ; Lynch et al., 1994, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 105, 70-4 ; Hakkaart et al., 1998, Clin. Exp. Allergy, 28,45- 52 ; Hakkaart et al., 1998, Clin. Exp. Allergy, 28,169-74). Deuxièmement, la structure tertiaire du Der p 2 mature (14 kDa) a également été rapportée (Mueller et al., 1998, Biochemistry, 37, 12707-14) et inclut trois ponts disulfures qui ont été montrés comme essentiels pour l'immunoréactivité de l'allergène (Lombardero et al., 1990, J. Immunol., 144, 1353-60 ; Nishyama et al., 1993, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 101, 159-66 ; Smith et Chapman, 199, Molecular Immunology, 33, 399-405). Les exemples ci-après se rapportent plus particulièrement à la production d'un allergène d'acariens recombinant Der p 2 (rDer p 2) et une forme fusionnée en partie C-terminale avec une étiquette de purification hexahistidine (rDer p 2-His). Il sera fait référence dans ce qui suit aux dessins en annexe dans lesquels : la figure 1 représente l'expression de l'allergène d'acariens dans les cellules transgéniques de tabac BY2. La figure 1A montre un diagramme schématique des cassettes utilisées pour transformer les cellules de tabac. L'ADNc complet de Der p 2 ou l'ADNc de Der p 2 fusionnée en partie C-terminale avec un " tag histidine " ont été insérés en aval du promoteur 35S CaMV dans un vecteur binaire. La figure 1B montre la détection par Western blot de Der p 2 dans les cals de tabac transgénique. Les protéines totales extraites à partir de cals transformés par les constructions pBLTI121/Der p 2 (rDer p 2) ou par pBLTI121/Der p 2-His (rDer p 2-His) ont été séparées sur un gel SDS-PAGE à 18% de polyacrylamide, transférées sur une membrane qui a été incubée avec un anticorps dirigé contre Der p 2. La piste C+ correspond à 2 g de rDer p 2 produit chez E. coli. la figure 2 représente la purification de l'allergène recombinant rDer p 2-His à partir de cultures en suspension de cellules BY2 de tabac. La figure 2A montre l'analyse par SDS-PAGE des fractions purifiées et la coloration à l'argent des protéines. A partir de 25 ml de milieu de culture des cellules de tabac transgéniques en suspension, les protéines ont été fractionnées par précipitation sélective à 50 puis 100% de saturation en sulfate d'ammonium. A partir de la fraction protéique précipitée à 100% de sulfate d'ammonium (TF), le rDer p 2His a été purifié par chromatographie, d'abord sur une colonne d'affinité de nickel chélaté suivie d'une colonne de gel filtration Superdex 75. La figure 2B représente l'analyse par Western blot des fractions purifiées. Les fractions purifiées correspondent à 125 ml de milieu de culture des cellules de tabac transgéniques en suspension, à partir duquel les protéines ont été fractionnées à 50-100% de sulfate d'ammonium. Les fractions purifiées ont été séparées sur un gel SDS-PAGE, transférées sur une membrane de nitrocellulose et révélées avec un anticorps dirigé contre Der p 2 produit chez E. coli. La piste FNR correspond à la fraction non retenue, la piste FEl à la fraction éluée de la colonne de nickel, la piste FE2 à la fraction éluée de la colonne Superdex 75 correspondant à rDer p 2-His. La piste C+ correspond à 2 pg de rDer p 2 produit chez E. coli. la figure 3 représente les spectres en dichroïsme circulaire de l'allergène naturel (nDer p 2) et de rDer p 2-His. Les mesures d'ellipticité ont été réalisées soit avec 100 mg/ml de nDer p 2, soit avec 150 mg/ml de rDer p 2-His, les deux échantillons ont été dissouts dans de l'eau. - la figure 4 représente la réactivité de nDer p 2 et de rDer p 2-His avec des IgE humaines. Pour 14 patients, un RAST a été réalisé sur les deux allergènes. Les résultats sont exprimés en unités internationales (IU) d'IgE avec 1 IU équivalent à 2,4 ng. - la figure 5 représente l'essai de libération d'histamine avec nDer p 2 et de rDer p 2-His. Les cellules basophiles ont été partiellement purifiées à partir d'un donneur sain, débarrassés de leurs IgE et resensibilisés avec des sérums positifs pour Der p 2. Ces cellules ont été testées pour un essai de libération d'histamine avec le rDer p 2-His ou le nDer p 2 purifiés. Les résultats sont exprimés en pourcentage de libération du contenu total en histamine des cellules mesurée par une méthode fluorimétrique. La figure 5A représente un contrôle négatif utilisant des cellules débarrassées de leurs IgE mais non resensibilisées. Les figures 5B et 5C montrent les résultats obtenus avec les cellules resensibilisées avec les IgE à partir de sérum 1 ou 2 respectivement. Exemple 1 Production de l'alleraène recombinant Der p 2 dans une suspension de cellules de tabac en culture. I - Expression de l'allergène recombinant Der p 2 dans des cellules de tabac BY2. 1) Construction des plasmides. Les vecteurs pBLTI221 et pBLTI121 sont respectivement des plasmides dérivés de pBI221 et pBI121 (Clontech, Palo Alto, USA) dans lesquels une cassette GUS a été substitué avec une séquence lieur multisite. Ces plasmides contiennent le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) et a la séquence de terminaison de la nopaline synthétase (Pagny et al., 2000, Plant Cell, 12,739-56). L'ADNc de Der p 2 a été fourni par le Dr Wayne Thomas (Perth, Australia) dans un vecteur pUC 19. Deux substitutions ont été identifiées (Arg en Ala en position-1, et Lys en Ile en position 82) par rapport à la séquence de Der p 2 publiées par Chua et al. (1996, Clin. Exp. Allergy, 26,829-37). Cet ADNc a été digéré par l'endonucléase de restriction Eco RI, les extrémités générées ont ensuite été traitées par l'ADN polymérase I (Fragment de Klenow) afin de synthétiser des extrémités à bouts francs. L'ADNc a été ensuite inséré dans pBLTI221 linéarisé par l'endonucléase de restriction Sma I. Une étiquette composée de 6 histidines a été fusionnée par PCR à l'extrémité 3' de l'ADNc codant pour Der p 2. Le programme " PCR " utilisé est composé d'un cycle à 94 C pendant 4 min, 25 cycles à 94 C pendant 1 min, 55 C pendant 80 s, et 72 C pendant 1 min, suivis d'un cycle à 72 C pendant 10 min. Le fragment Der p 2 a été amplifié avec les sondes suivantes : 5'ATCCCACTATCCTTCGC3' (complémentaire aux nucléotides 796 à 812 dans le promoteur 35S se reportant à pBLTI221) et 5'GGACTAGTGGATCCTCAGTGATGGTGATGGTGATGATCGATCTTGT CATCGTCATCGCGAATTTTAGCATGAGT3'. La séquence en gras est complémentaire aux nucléotides 418 à 438 dans la séquence Der p 2 (Chua et al., 1990, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 91,118-23) et les 6 résidus histidine sont soulignés. Le fragment EcoRI/HindIII de pBLTI221/Der p 2His correspondant au promoteur 35S, à la séquence de Der p 2 et à la séquence de terminaison nos a été inséré dans le vecteur binaire pBLTI121 digéré préalablement avec EcoRI et HindIII . 2) Transformation de la culture en suspension de cellules de tabac. Les constructions pBLTI221/Der p 2 et pBLTI221/Der p 2-His ont été transférées dans Agrobacterium tumefaciens (LBA4404) (Hôfgen et Willmitzer, 1988, Nucl. Acids Res., 16, 9877). Les agrobactéries transformées ont été utilisées pour transformer les cellules cultivées en suspension de Nicotiana Tabacum L. (cv Bright yellow 2) comme déjà décrit par Gomord et al. (1998, Methods in Biotechnology, 3, 155-64). Les transformants ont été sélectionnés en présence de kanamycine à 100 g.ml-1. Les cals transformés ont été criblés pour l'expression de Der p 2 par une analyse en Western blot. Les cals transgéniques sélectionnés exprimant une protéine d'intérêt ont été ensuite utilisés pour initier une culture en suspension des cellules transgéniques, comme décrit par Gomord et al. (1998, Methods in Biotechnology, 3, 155-64). 3) Les conditions de culture. Les cultures sont maintenues dans des flasques Erlenmeyer contenant 150 ml de milieu sur un agitateur orbital à 150 rpm à 25 C à l'obscurité. 4) L'extraction des protéines pour l'analyse par SDS-PAGE et en immunoblot. La totalité des protéines ont été extraites des cals transgéniques dans deux volumes de tampon préchauffé IX contenant 20 mM de Tris pH 6. 8, 1% de SDS, 10% de glycérol et 2% de ss-mercaptoéthanol, puis ont été incubées à 100 C pendant 5 min puis centrifugées pendant 15 min à 10000g. Le surnageant a été analysé par une électrophorèse SDS-PAGE dans un gel à 18% de polyacrylamide dans des conditions réductrices selon Laemmli (1970, Nature, 227, 680-5). Pour l'immunodétection, les protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose et immunodétectées en utilisant un anticorps polyclonal dirigé contre le nDEr p 2 purifié (mAb ocDpx) (van der Zee et al., 1988, J. Allergy Clin. Immunol., 81,884-96) à une dilution de 1 :800. Les IgG anti-lapin produites chez la chèvre et couplées à la péroxidase de raifort ont été utilisés à une dilution de 1 : 3000 en tant qu'anticorps secondaire. 5) Résultats. Pour produire Der p 2 dans des cellules de tabac, deux constructions différentes ont été préparées. La totalité de l'ADNc codant les 146 acides aminés constitutifs de Der p 2 incluant le peptide signal de 17 acides aminés a été cloné dans un vecteur binaire pBLTI121 sous le contrôle du promoteur 35S, générant la construction pBLTI121/Der p 2 (Fig. 1A). Le vecteur binaire porte également le gène de la néomycine phosphotransférase de type II conférant la résistance à la kanamycine. Pour la seconde construction pBLTI121/Der p 2-His, une séquence nucléotidique codant six résidus histidine a été fusionnée par PCR à l'extrémité 3' de la séquence Der p 2 (Fig. 1A). Les constructions pBLTI121/Der p 2 et pBLTI121/Der p 2-His ont alors été utilisées pour transformer des cellules de tabac BY2 via Agrobacterium tumefaciens. Les cals transformés ont été sélectionnés sur milieu contenant l'agent de sélection et analysés pour l'expression Der p 2 par Western blot en utilisant un anticorps spécifique anti-nDer p 2 obtenu par des techniques d'immunisation standards. Les données montrent que à la fois rDer p 2 et rDer p 2-His sont efficacement exprimés dans les cellules de tabac (Fig. 1B). Il s'agit là des premiers résultats présentant l'expression d'un allergène d'acariens chez les plantes. Les expériences de fractionnements cellulaires ont montré que rDer p 2 est sécrétée et s'accumule principalement dans le milieu de culture des cellules de tabac en suspension. II - Purification de rDer p 2-His à partir d'une suspension de cellules de tabac BY2 en culture. 1) Technique de purification de rDer p 2-His. Le milieu de culture (MC) a été recueilli par filtration de la culture en suspension et une première étape de purification a été réalisée à pH 7 par précipitation des protéines en présence de sulfate d'ammonium (50% de saturation). L'allergène rDer p 2 présent dans le surnageant est ensuite précipité en ajustant la concentration de sulfate d'ammonium à 100% de saturation. Les protéines précipitées à partir de 750 ml de MC ont été resolubilisées dans 5 ml du tampon A contenant 25 mM de Tris pH 7 et 0, 5 M NaCl et la solution protéique a été déposée sur une colonne d'affinité contenant 3 ml de résine chargée avec du nickel (Ni-NTA agarose, Qiagen). Les protéines et la résine ont été incubées pendant 1 h à 4 C sur un agitateur rotatif. Cinq étapes successives de lavage ont été réalisées avec 5 ml de tampon A pendant 15 min à 4 C, puis les protéines présentant une forte affinité pour la résine ont été éluées avec 5 ml de tampon A complété par 250 mM d'imidazole. Les protéines éluées ont été ensuite désalées sur une colonne de gel filtration PD-10 (Pharmacia) et analysées par SDS-PAGE et immunoblotting. Les contaminants de haut poids moléculaire ont été ensuite séparés de rDer p 2-His par une étape de purification sur une colonne Superdex 75 HR 10/30 (Pharmacia) en utilisant un système de chromatographie BioCad (Perspective Biosystems). Environ 100 g de rDer p 2-His purifié par affinité ont été chargés sur la colonne Superdex 75 HR qui avait été équilibrée avec le tampon B contenant 0,05 M Na2HP04 et 0,15 M NaCl à pH 7. Les protéines ont été éluées avec 18 ml de tampon B au débit de 0,4 ml/min. Des fractions de 0,5 ml ont été recueillies et analysées pour leur contenu en protéine par une électrophorèse SDS-PAGE et immunoblotting. Les fractions contenant rDer p 2-His ont été rassemblées, désalées sur une colonne Nanosep (Pall Filtron) et analysées par SDS-PAGE et coloration des protéines à l'argent. La concentration des protéines a été déterminée par l'absorbance à 280 nm en utilisant un coefficient d'extinction de 9890 exprimé en M-1 cm-1. 2) Résultats. Un procédé de purification a été mis au point sur l'allergène recombinant Der p 2-His produit dans les cellules de tabac. Un cal de tabac transgénique exprimant le rDer p 2-His sélectionné pour son niveau d'expression élevé a été utilisé pour induire une suspension cellulaire. Les expériences de fractionnement cellulaire ont montré que le rDer p 2-His est sécrété et s'accumule principalement dans le milieu de culture des cellules de tabac. Le milieu de culture collecté par filtration des cellules transgéniques cultivées en suspension est fractionné par précipitation sélective au sulfate d'ammonium. Les protéines précipitées ont été resolubilisées dans un tampon contenant 0,5 M NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7,0 puis appliquées sur une colonne de nickel immobilisé. Après liaison à la colonne, l'allergène rDer p 2-His a été élué sous des conditions natives par 250 mM imidazole (Fig. 2A, 2B, FEl). Cette étape de purification par chromatographie sur colonne de nickel immobilisé (IMAC) a été très efficace, cependant quelques contaminants mineurs co-éluent avec le rDer p 2-His (Fig. 2A, FEl) . Par conséquent, une seconde étape de purification par chromatographie d'exclusion de taille a été réalisée. Les échantillons de rDer p 2-His partiellemnt purifiés (FEl) obtenus après IMAC ont été désalés sur une colonne de gel filtration PD-10 (Pharmacia) puis soumis à une chromatographie sur une colonne Superdex 75 HR 10/30 avec un tampon d'élution phosphate contenant 0, 15 M NaCl, 0, 05 M Na2HP04, pH 7,0. Une analyse par SDS-PAGE et immunoblot de chaque fraction démontre que le rDer p 2His est exclusivement contenu dans le pic FE2 (Fig. 2B). La pureté de rDer p 2-His a été analysée par électrophorèse SDS-PAGE et coloration à l'argent (Fig. 2A, FE2). La concentration en protéines a été déterminée en mesurant l'absorbance à 280 nm et en utilisant un coefficient d'extinction de 9890 exprimé en M-1cm-1. Le niveau d'expression de rDer p 2-His est d'environ 0,25 ug/ml de milieu de culture de cellules transgéniques en suspension. En utilisant ce procédé de purification en deux étapes, nous avons été capables de purifier l'allergène Der p 2-His recombinant à homogénéité avec un rendement final de 0,1 ug/ml de milieu de culture de tabac transgénique. Le rendement final de purification de l'allergène recombinant est d'environ 40%. III - Analyse physico-chimique du rDer p 2-His. 1) La séquence en acides aminés N-terminale du rDer p 2-His. a) Le séquençage des acides aminés N-terminaux. La séquence protéique N-terminale de l'allergène purifié, dilué à 70 pmole/ul a été déterminée en utilisant un séquenceur de protéines automatisé Applied Biosystems 492. La technique classique de dégradation de Edman a été réalisée avec 18 cycles de chimie liquide pulsée. b) Résultats du séquençage. La séquence en acides aminés N-terminale de l'allergène rDer p 2-His produit dans les cellules de tabac a été déterminée et comparée à celle de nDer p 2 immunopurifié à partir d'extraits protéiques d'acariens. Comme montré dans le tableau I, la séquence en acides aminés N-terminale de rDer p 2-His est identique à celle de nDer p 2 excepté pour les deux premiers acides aminés de nDer p 2 absents de l'allergène recombinant. Comme déduit à partir de la séquence nucléique publiée de nDer p 2, l'acide aminé non-affecté en position 8 (Tableau I) est une cystéine impliquée dans un pont disulfure. Les données de la séquence obtenue pour le rDer p 2-His indique que le résidu nonaffecté en position 6 est une cystéine certainement impliquée dans un pont disulfure comme pour l'allergène naturel. Tableau I : Séquences en acides aminés N-terminales de rDer p 2-His et nDer p 2. Der p 2 Séquence N-terminale nDer p 2 DQVDVKDXANHEIKKV rDer p 2-His VDVKDXANHEIKKV Les acides aminés sont représentés par le code à une lettre et X représente un acide aminé non identifié. 2) La masse moléculaire du rDer p 2-His. a) La spectrométrie de masse MALDI-TOF. Les spectres de Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF) des protéines ont été enregistrés sur un spectromètre de masse Micromass Tof spec E (Manchester, UK). Cet instrument a été utilisé à un voltage accélérant de 25 kV en mode linéaire. L'appareil a été soumis à une pression de 10-7 mbar dans la source et 10-6 mbar dans l'analyseur. La longueur d'onde du laser à azote est de 337 nm, ayant une largeur d'impulsion de 4 ns. Les spectres de masse MALDI-TOF réalisés en mode ion positif ont été obtenus en utilisant un détecteur de post-accélération de 15 keV. Ils ont été lissés une fois et calibrés de façon externe avec de l'apomyoglobine (16952 Da) et du cytochrome c (12361 Da). Les lasers ont été sommés pour chaque spectre de masse pour obtenir un signal acceptable par rapport au bruit de fond. Deux ul de chaque échantillon à une concentration d'environ 10 pmol/pl ont été dissouts dans un même volume de solution matrice contenant 2 mg d'acide sinapinique dilué dans de l'acétonitrile/eau-TFA 0,1% dans un rapport 40/60. Le mélange échantillon-matrice a été homogénéisé et 1 pl a été déposé sur la cible et laissé séché. b) Résultats. Les masses moléculaires de rDer p 2-His purifié et de nDer p 2 ont été ensuite déterminées par une analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Une masse moléculaire (MW) de 14250 150 Da a été obtenue pour nDer p 2 qui est en parfait accord avec le MW attendue calculée : Da. La masse moléculaire théorique attendue pour rDer p 2-His, incluant l'étiquette de 6 résidus histidine et la délétion des deux acides aminés N-terminaux, est de 15351 Da. Le spectre de masse par MALDI-TOF de rDer p 2-His montre un ion à 15118 200 Da qui est en accord avec la MW calculée. 3) Conformation de Der p 2-His. a) Le dichroïsme circulaire. Dans les expériences de dichroïsme circulaire (CD), les mesures du caractère elliptique ont été réalisées soit avec le nDer p 2 (100 mg/ml) soit avec rDer p 2-His (150 mg/ml) les deux allergènes ont été dissouts dans de l'eau. Les spectres ont été enregistrés sur un dichrographe (Jobin Yvon) dans des cuves de quartz de 1 ou 0,1 mm (Hellma). L'instrument a été calibré en utilisant de l'acide (+)-10-camphorsulfonique. La moyenne des données expérimentales après soustraction des contrôles a été faite pour 10 cycles avant d'estimer les contenus conformationnels (Chang et al., 1978, Anal. Biochem., 91,13-31 ; Sreeama et Woody, 1998, Anal. Biochem., 209,32-44). b) Résultats. Pour comparer la conformation des formes recombinante et naturelle de Der p 2, les spectres de dichroïsme circulaire ont été enregistrés sur les deux échantillons. Comme montré sur la figure 3, des spectres identiques ont été obtenus indiquant que nDer p 2 et rDer p 2-His ont une conformation tri-dimensionnelle similaire. Plus précisément, l'analyse des spectres indique que 15% des acides aminés participent à des hélices alpha, 53% à des feuillets bêta et 15% à des boucles pour à la fois nDer p 2 et rDer p 2-His. Prises ensemble, ces données physicochimiques indiquent que rDer p 2-His présente une conformation et des propriétés spectroscopiques indifférenciables de celles de nDer p 2 naturel. IV - Capacité de liaison aux anticorps du rDer p 2 recombinant. 1) Les mesures de l'activité de liaison aux IqE. Les capacités de liaison aux IgE des allergènes ont été comparées par une analyse RAST comme décrit antérieurement par Hakkaart et al. (1998, Clin. Exp. Allergy, 28,45-52 ; 1998, Clin. Exp. Allergy, 28,169-74). Cent ug de nDer p 2 ou de rDer p 2-His ont été couplés à 100 mg de Sépharose 4B activé par le CNBr (Pharmacia). Les échantillons de sérum (50 l) des patients avec une réactivité aux IgE connue pour Der p 2 ont été incubés toute la nuit avec 0,5 mg de Sépharose couplé à l'une ou l'autre forme de l'allergène dans un volume final de 300 l de PBS-Tween. Après lavage avec du PBS-Tween, les IgE liées ont été détectées avec des anticorps radiomarqués de mouton contre les IgE humaines. Les résultats sont exprimés en unités internationales (IU) de IgE avec 1 IU équivalent à 2,4 ng. 2) Résultats. Les capacités de liaison aux IgE de rDer p 2-His et nDer p 2 ont été comparées par une analyse RAST. Les résultats sont illustrés sur la figure 4. La corrélation entre les réactivités des IgE a été analysée par le coefficient de corrélation de rang de Spearman et a été trouvée excellente (Rspearman = 0,99 ; p tabac a la même conformation que l'allergène naturel d'acariens. De façon intéressante, l'analyse en régression linéaire montre une corrélation plus proche de la réactivité des IgE avec le rDer p 2-His produit dans les cellules de tabac (Rspearman = 0,99 ; Allergy, 28, 45-52). V - Essai de libération d'histamine. 1) Technique utilisée. Les basophiles d'un donneur non-allergique ont été partiellement purifiés par centrifugation sur Percoll. Les cellules ont été dépouillées de leur IgE par un traitement à l'acide lactique puis re-sensibilisées par addition de deux sérum positifs pour le Der p 2. Les cellules ont été ensuite incubées avec nDer p 2 ou avec rDer p 2-His à 37 C pendant 45 min. Les cellules ont été centrifugées et la libération d'histamine dans le surnageant a été mesurée par une méthode fluorométrique (Siraganian). Les résultats sont exprimés en pourcentage de libération du contenu total en histamine des cellules. 2) Résultats. Les tests de libération d'histamine ont alors été réalisés pour comparer la capacité du nDer p 2 et du rDer p 2-His à stimuler la capacité de libération de l'histamine à partir des basophiles. Comme pour la réactivité des IgE ci-dessus, les résultats démontrent que le nDer p 2 et le rDer p 2-His sont indifférenciables dans leur capacité à libérer l'histamine (Fig. 5). EXEMPLE 2 : Production d'un allergène Der p2 recombinant par une plante de tabac à faible teneur en alcaloïdes. I - Obtention de plantes transaéniques exprimant l'alleraène Der p2. Le vecteur plasmidique contenant la séquence Der p2 est identique à celui réalisé dans le cadre de l'exemple 1 (1-1). La méthode de transformation par Agrobacterium tumefaciens est décrite ci-dessous. Trois variétés de tabac ont été retenues dans le cadre de la transformation. PB D6, variété de type Brun (Schiltz, 1967, Thèse de Doctorat d'Etat, Université de Bordeaux) utilisée comme référence de transformation, Bright Yellow variété de type Virginie, déjà utilisée dans le cadre de l'expression de Der p 2 dans des suspensions cellulaires, et LAP 57-48 (Schiltz et al., 1983, A ; du Tabac. Sect. 2, 18, 93-100). Cette dernière lignée a comme avantage de présenter une faible teneur en alcaloïdes totaux après écimage (max 0,2%) et une faible teneur en polyphénols. Cette caractéristique est particulièrement intéressante dans le cadre de la production d'allergènes recombinants et plus particulièrement ici de Der p2, car le risque de présence d'alcaloïdes dans la protéine purifiée s'en trouve réduit. Le limbe foliaire de tabac est découpé en petits fragments d'environ 1 cm2. Ces fragments sont trempés, face interne dirigée vers le haut, dans du milieu B liquide (Tableau II) contenant les agrobactéries souche LBA 4404 (Hoekema et: al., 1983, Nature, 311,763-4) (une culture d'une nuit de 2 ml d'agrobactéries dans du milieu LB, centrifugée 10 min à 6000 rpm en mini centrifugeuse et reprise dans 10 ml de milieu B liquide). Après 10 min, les fragments sont disposés sur du milieu R4 (Tableau II) et incubés deux jours à l'obscurité à 28 C. Les disques sont enfin placés sur du milieu R4 contenant 50 mg/1 de kanamycine et 100 mg/1 de céfotaxime et cultivés en chambre de culture. Au bout d'un mois, les bourgeons formés à la périphérie des disques sont transférés sur milieu B en 100 mg/1 de kanamycine et 100 mg/1 de céfotaxime. Tableau II : Milieux utilisés en culture cellulaire. Milieux Milieu B de Milieu R4 bouturage et de régénération semis de bourgeons Constituants Macroéléments mg/l mg/l NH4NO3 825 825 KNO3 950 950 CaCl2, 2H2O 220 220 MgSO4, 7H2O 185 185 KH2PO4 85 85 Microéléments mail Fer citrate 50 50 ZnSO4, 7H2O 1 1 H3BO3 1 1 MnSO4, 4H2O 0 1 0 01 CuSO4, 5H2O 0,03 0 03 AlCl3 0 03 0 03 NiCl2, 6H2O 0 03 0 03 KI 0,01 0 01 Vitamines mail Inositol 100 100 Panthoténate de 1 1 Biotine 0 01 0 01 Nicotinamide 1 1 Pvridoxine 1 1 Thiamine 1 1 Substances de mail AIA - 0.5 BA - 1 Autres éléments mail Saccharose 10000 5000 Bactoaaar 7000 7000 Indicateur de mail BCP 8 8 Tampon mg/1 MES 700 700 II - Multiplication véaétative. Les clones utilisés lors des travaux de biologie cellulaire ont été entretenus in vitro, et multipliés par repiquage de fragments de tige comportant au moins un bourgeon axillaire sur milieu B gélosé contenant 100 mg/1 de kanamycine et 100 mg/1 de céfotaxime. Ceux-ci ont été cultivés dans des tubes à essai placés en chambre de culture, 16 h à la lumière (25 C), le degré d'hygrométrie étant maintenu à 65% ; de ces chambres étant assuré par des tubes fluorescents type "blanc industrie" Philips 40W, assurant une intensité lumineuse de 70 uE/m2/s. 38 plantes ont ainsi été obtenues à partir de lignée PB D6, et 29 à partir de Bright Yellow et LAP 57-48. Après trois semaines, les plantules ont été acclimatées en serre. Ces plantes présentent un développement et un phénotype conformes aux plantes d'origine. III - Autofécondations contrôlées. Afin d'obtenir la génération suivante Tl, des autofécondations ont été réalisées sur chacun des transformants primaires cultivés en serre. Pour éviter les risques de contamination par du pollen de plantes voisines, les autofécondations ont été effectuées en recouvrant par un sachet en voile non tissé les inflorescences dont les fleurs n'étaient pas encore développées. IV - Tests sur graines. Les capsules florales ont été récoltées sur des plantes en serre. Les lots de graines ont été stérilisés en surface pendant 40 min dans une solution composée de 800 ml d'eau, d'un comprimé de Bayrochlor (dichloro isocyanurate de sodium) et de 2 ml d'agent mouillant Teepol. Les graines ont ensuite été rincées trois fois avec 800 ml d'eau stérile. Les graines ont enfin été séchées et stockées stérilement au froid. Les semis ont été réalisés en boite de Pétri sur du milieu B en présence de 200 mg/1 de kanamycine. Les boites de semis ont ensuite été scellées avec du parafilm, puis placées en chambre de culture pendant trois semaines. Dix plantules résistantes à l'antibiotique ont alors été cultivées en serre afin de mener les études d'expression du transgène. V - Analyse de l'expression du gène chimère par Western blot. L'étude de l'expression du gène chimère a été réalisée selon le protocole décrit dans l'exemple I (1-4), à l'exception du fait que les protéines totales solubles ont été préparées à partir de 3 g de feuilles fraîches de tabac ou de 15 g de racines, et que d'autre part, la révélation a été réalisée à l'aide d'un second anticorps conjugué à la phosphatase alcaline. Après analyse par Western blot, il est apparu que l'expression du gène chimère est similaire chez les trois variétés de tabac étudiées. Cinq lignées transgéniques issues de LAP 57-48 ont plus particulièrement été étudiées (3', 22C, 25B, 25C et 25D) . Il apparaît que l'expression du gène chimère s'effectue dans les feuilles a un niveau élevé, quel que soit l'étage foliaire et le stade de développement. Le rendement estimé pour la 8ème feuille de la lignée 25D est de 900 ng de rDer p 2/ mg de matière fraîche. D'autre part, le caractère est transmissible à la descendance (Tl). Le gène introduit s'exprime dans les feuilles, mais aussi dans les racines principales et les racines fines. REVENDICATIONS 1) Procédé de production d'un allergène comprenant : (i) la transformation de cellules végétales avec une molécule d'ADN comprenant une séquence codant un allergène hétérologue à la plante liée de manière opérationnelle à un promoteur, (ii) la culture desdites cellules transformées, (iii) l'isolement de l'allergène exprimé dans lesdites cellules. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que qu'il comprend ou non à l'étape (ii) la régénération de plante ou partie de plantes génétiquement transformées pour exprimer un allergène. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste à l'étape (i) à transformer des suspensions cellulaires végétales, à l'étape (ii) à cultiver les suspensions cellulaires, à sélectionner les cals transformés, puis à initier des suspensions cellulaires à partir desdits cals transformés et cultiver ces suspensions, et à l'étape (iii) à purifier l'allergène à partir du milieu de culture des suspensions cellulaires transgéniques. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'allergène recombinant est isolé à l'étape (iii) par purification à partir du milieu de culture des suspensions cellulaires transgéniques dans des conditions non dénaturantes via un procédé de purification en deux étapes incluant une chromatographie d'affinité sur une colonne de métal chélaté suivie d'une chromatographie d'exclusion de taille. 5) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste à l'étape (ii) à régénérer sur un milieu de sélection, à partir des dites cellules, des plantes ou parties de plantes génétiquement transformées pour exprimer un allergène, puis éventuellement à obtenir des semences par autofécondation de la plante régénérée, et enfin facultativement, à produire des plantes à partir des semences. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'allergène recombinant est obtenu à l'étape (iii) à partir des cellules de plantes ou partie de plantes par extraction puis purification. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'étape (ii) comprend la sélection des cellules, tissus ou parties de plantes transformées par la molécule d'ADN comprenant une séquence codant un allergène hétérologue, ladite sélection étant avantageusement réalisée grâce à la présence dans ladite molécule d'ADN d'un gène exprimant une résistance à un agent de sélection présent dans le milieu de culture. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la molécule d'ADN comprenant une séquence codant un allergène hétérologue à la plante placée sous le contrôle d'un promoteur, comprend avantageusement, outre le gène de sélection : - une ou plusieurs séquences de régulation de l'expression, - une séquence codant un peptide ou polypeptide fusionné à l'allergène permettant son adressage dans la cellule végétale, - une séquence codant un peptide ou polypeptide fusionné à l'allergène et facilitant sa purification. 9) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la transformation des cellules à l'étape (i) est réalisée : directement par électroporation ou bombardement de microparticules avec la molécule d'ADN formant un vecteur d'expression, ou indirectement à l'aide d'un micro-organisme apte à transformer les cellules de plantes, lui-même préalablement transformé par ledit vecteur d'expression. 10) Une cellule de plante dans le génome de laquelle est incorporée de façon stable une molécule d'acide nucléique recombinant codant un allergène, ladite cellule ayant été obtenue par les étape (i) et (ii) du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 11) Une plante obtenue par les étapes (i) et (ii) du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, une partie ou descendant de celle-ci.