Brevet FR2817962A1 — publié le 20020614

L'invention se rapporte à un procédé de caractérisation d'une surface. Ce procédé permet également une mesure qualitative et quantitative d'interactions moléculaires. Il permet notamment de suivre en temps réel, et sans marqueurs, plusieurs centaines d'interactions moléculaires à la fois. Le procédé selon l'invention est notamment utilisé pour l'analyse de fragments d'ADN. La plupart des procédés existants utilisent des marqueurs fluorescents pour révéler les interactions moléculaires, ce qui nécessite de travailler dans des conditions spécifiques. Ces conditions spécifiques ne permettent pas d'analyser plusieurs types d'interaction simultanément. Le procédé selon l'invention vise à résoudre ce problème en n'utilisant pas de marqueurs fixés sur les molécules à étudier. La mesure est réalisée dans des conditions non spécifiques, de sorte que plusieurs types d'interactions peuvent être étudiées simultanément qualitativement et quantitativement. A cet effet, l'invention décrit un procédé caractérisation de surface utilisant un dispositif d'imagerie d'une surface métallique comportant une source lumineuse, un système de collimation du faisceau lumineux incident, une cellule de détection comprenant au moins un prisme, un système d'imagerie et de détection du faisceau réfléchi par la base du prisme. Le procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - balayage en angle de la surface d'une lame de verre recouverte d'une couche d'or et d'une couche à caractériser ; - détermination de l'angle d'incidence pour lequel la sensibilité du système d'imagerie et de détection est maximale pour l'ensemble de la lame ; - positionnement du dispositif à l'angle déterminé à l'étape précédente ; - mesure de la réflectivité par le système d'imagerie et de détection en fonction du temps. Un autre objet de l'invention est une application dudit procédé et un dispositif d'imagerie d'une surface métallique mettant en oeuvre ledit procédé, les éléments à caractériser étant disposés sur ladite surface métallique. D'autres objets et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la description suivante en référence aux dessins annexés donnés à titre d'exemple non limitatif, dans lesquels : - la figure 1 représente un schéma du dispositif selon l'invention ; - la figure 2 représente un schéma de la cellule de détection selon l'invention. Le dispositif selon l'invention comprend : - une source lumineuse non cohérente 1 ; - un système de collimation 2 du faisceau lumineux incident émis par la source lumineuse ; - une cellule de détection 3 comprenant au moins un prisme 4 ; - un système d'imagerie et de détection 5 du faisceau réfléchi par la base du prisme. La source lumineuse 1 non cohérente est par exemple une diode électroluminescente de longueur d'onde prédéterminée et de largueur spectrale étroite. Il peut s'agir par exemple d'une diode électroluminescente de longueur d'onde 660 nanomètres et de largueur spectrale 30 nanomètres. Le faisceau émis par la source lumineuse 1 est colimaté par un système de collimation 2. Ce système de collimation 2 est par exemple un système de deux objectifs de microscope permettant de rendre le faisceau lumineux parallèle. La lumière est ensuite polarisée parallèlement au plan d'incidence par un polariseur 6 afin de pouvoir exciter le plasmon de surface. Cette lumière polarisée éclaire la face d'entrée d'un prisme en verre 4 de la cellule de détection 3. Dans un mode de réalisation, la lumière polarisée est réfléchie par un miroir galvanométrique oscillant 7 vers la face d'entrée du prisme 4 tel que représenté sur la figure 1. Le miroir oscillant 7 est conjugué sur la base du prisme à l'aide de deux lentilles 8 et 9. On peut ainsi faire varier l'angle d'incidence du faisceau sur le prisme par la rotation du miroir oscillant 7. Le miroir oscillant 7 subit une rotation partielle, contrôlée par exemple par un générateur basse fréquence. Le mouvement de rotation du dispositif de rotation du miroir oscillant 7 doit pouvoir être discrétisé à l'aide d'une composante continue afin de pouvoir fixer l'angle auquel on souhaite réaliser les expériences. Le diamètre du miroir 7 est tel qu'il permet de réfléchir la totalité du faisceau incident sur le prisme 4. Dans le mode de réalisation considéré, ce diamètre doit être au moins de 10 mm. La course totale du miroir 7 est alors de 160 pour une fréquence de 300 mégahertz. Les lentilles 8,9 utilisées pour conjuguer le miroir 7 avec le prisme 4 peuvent être des lentilles de focale F'=75mm avec un diamètre de 35mm pour une excursion de 19 , ou des lentilles de focale F'=50mm avec un diamètre de 25mm pour une excursion de 170. Lors de sa rotation, le miroir oscillant 7 a une course continue à fréquence fixe. L'angle d'incidence du faisceau réfléchi par le miroir 7 sur le prisme 4 peut être déterminé de deux manières différentes. Dans une première variante, la partie du faisceau réfléchie par la face d'entrée du prisme est recueillie par une barrette de circuits à couplage de charge CCD 10 de longueur suffisante. Cette barrette CCD 10 permet de détecter l'incidence du faisceau. Le faisceau ainsi réfléchi par la face d'entrée du prisme est focalisé sur la barrette CCD 10 à l'aide d'une lentille 11 dont la focale est choisie de façon à utiliser toute la surface de la barrette 10. Pour une barrette CCD 10 de longueur L=12, 7mm composée de 512 pixels, on peut par exemple utiliser une lentille 11 de focale F'=48mm et de diamètre 30mm. Dans une autre variante, non représentée, la rotation du miroir oscillant 7 est assurée par un moteur permettant de déterminer la position d'incidence pour chaque position du miroir. On peut par exemple utiliser un moteur à pas variable. La cellule de détection 3 comprend au moins un prisme 4 en verre dont la géométrie et l'indice sont tels que l'image intermédiaire du plan objet dans le prisme 4 est quasiment parallèle au plan de détection du système d'imagerie et de détection 5. Dans une variante, le prisme est en verre d'indice 1,8 et a pour caractéristique un angle au sommet de 40 , une base de 10mm de largeur et 25mm de hauteur. La distance entre les deux faces parallèles du prisme est alors de 8mm. Une lame de verre 12 de même indice que le prisme 4 est fixée sur la base du prisme au moyen d'une huile d'adaptation d'indice. Sur cette lame de verre 12, sont déposées successivement une couche mince de chrome 13, une couche mince d'or 14, et une couche à caractériser 15. Pour une application à une mesure qualitative et quantitative d'interactions moléculaires, la couche à caractériser est, par exemple, une couche organique 15. La couche organique 15 peut comprendre des capteurs. On entend par capteur, une zone géographique de la couche organique 15 qui peut comprendre plusieurs milliers de sondes qui vont pouvoir réagir avec des molécules. La couche de chrome 13 permet d'assurer l'adhésion de la couche d'or 14 sur la lame de verre 12 en présence d'un milieu aqueux. L'épaisseur de la couche mince de chrome 13 est comprise entre 1,5 et 2 nanomètres. L'épaisseur de la couche mince d'or 14 est comprise entre 40 et 50 nanomètres et de préférence de l'ordre de 45 nanomètres. Dans le cadre de l'étude d'interactions entre oligonucléotides et des fragments d'ADN simple-brin à étudier, la couche organique 15 consiste en la fixation d'oligonucléotides sur la couche d'or 14 par l'intermédiaire d'un polymère tel que par exemple le polypyrrol. Les oligonucléotides étant greffés sur le polypyrrol. Ladite couche organique 15 ne comporte pas de marqueurs. Ce polymère présente l'avantage d'être très stable, ce qui permet de réutiliser plusieurs fois la couche organique 15 comprenant les sondes. La réalisation et le dépôt d'une telle couche de polypyrrol greffé sur une couche d'or sont par exemple décrits dans les brevets EP 0 691 978 et FR 2 789 401. Une fois la lame de verre 12 fixée sur la base du prisme 4, elle est recouverte hermétiquement d'une cuve 16. Cette cuve 16 est par exemple en Téflon et permet de faire passer les solutions organiques à l'aide d'un ou plusieurs tuyaux 17. Une pompe péristaltique 18 à débit variable peut alors être utilisée pour faire circuler ces solutions. Afin d'optimiser l'introduction des solutions, la pompe péristaltique 18 répond aux critères suivants : - être commandable à distance ; - être capable de générer des débits compris entre quelques micro litres par minute et quelques centaines de micro litres par minute (de l'ordre de 300 à 400 micro litres/min) ; - permettre une commande entrée/sortie de la vitesse de rotation du début et de la fin de l'injection. L'ensemble de la cellule de détection 3 (prisme 4 et cuve 16) peut être enfermé dans une enceinte adiabatique 19 représentée figure 2, afin de contrôler et de fixer la température du système et des produits injectés. La température sera par exemple maintenue à 370 afin de permettre la détection de tout type de molécules biologiques. L'enceinte adiabatique 19 comprend de préférence une ouverture (non représentée) permettant d'accéder facilement à la cellule de détection 3. Elle peut comporter notamment un socle 20 chauffant, tel que par exemple une résistance en cuivre, sur laquelle sera fixée la cuve de réaction en Téflon 16. Ce socle 20 est recouvert d'un couvercle 21 englobant l'ensemble de la cellule de détection 3. Des hublots latéraux 22,23 sont prévus dans le couvercle 21 afin de laisser passer les faisceaux lumineux de part et d'autre du prisme. Ils sont par exemple en verre ou tout autre matériau laissant passer les faisceaux sans les perturber. Un bobinage non représenté enroulé autour du tuyau 17 de la cuve 16 permet de maintenir les produits injectés à la température de la cellule. Un système d'imagerie et de détection 5 est disposé du côté de la face de sortie du prisme 4 afin de récupérer le faisceau réfléchi par la base de ce dernier. Ce système comprend un système afocal de grandissement 24 et une caméra CCD 25. Le système afocal de grandissement 24 permet d'agrandir l'image de la zone utile de la lame d'or 14 sur l'ensemble de la caméra CCD 25. La zone utile de la lame d'or 14 est en effet de faible dimension, de l'ordre de 25mm2 environ. Dans le mode de réalisation représenté, un agrandissement G=1,6 est réalisé et un système d'ouverture numérique O. N. =1,6 est utilisé pour conjuguer l'image sur le plan de la caméra CCD 25. Le système afocal 24 peut par exemple comprendre une lentille 26de focale F'=50mm et de diamètre 35mm, puis une autre lentille 27 de focale F'=80mm et de diamètre 40mm. La caméra CCD 25 (ou simplement une matrice CCD) peut par exemple présenter une surface sensible de 6, 4mm x 5, 8mm composée de 768 x 576 pixels. Tous les éléments du dispositif selon l'invention sont contrôlés automatiquement au moyen d'une chaîne informatique non représentée. Le procédé d'utilisation dudit dispositif comprend les étapes suivantes : - balayage en angle de la surface de la lame de verre 12 recouverte de la couche d'or 14 et de la couche à caractériser 15 ; - détermination de l'angle d'incidence pour lequel la sensibilité du système d'imagerie et de détection 5 est maximale pour l'ensemble de la lame 12 ; - positionnement du miroir oscillant 7 pour obtenir cet angle d'incidence ; - mesure de la réflectivité par le système d'imagerie et de détection 5 en fonction du temps. Le dispositif est alors utilisé pour caractériser la surface de la couche à caractériser 15. Le dispositif peut être appliqué à l'étude d'interactions moléculaires. La couche à caractériser 15 est alors, par exemple, une couche organique. Afin de mesurer les interactions entre la couche organique 15 et des molécules, l'étape de mesure de la réflectivité est réalisée simultanément à l'introduction dans la cellule de détection 3 de molécules exemptes de marqueurs dont les interactions avec la couche organique 15 sont à analyser. On mesure ainsi l'évolution des interactions entre la couche organique 15 et les molécules introduites. Ces mesures peuvent être réalisées dans des conditions non sélectives, de sorte que toutes les interactions peuvent se produire et être étudiées. Le système d'imagerie et de détection 5 permet de mesurer l'épaisseur optique, produit de l'épaisseur géométrique et de l'indice de réfraction du milieu, en tout point de la couche d'or 14. Il est ainsi possible de visualiser topologiquement les zones d'égale épaisseur optique et de caractériser la surface. Ainsi, lors du balayage en angle de la surface de la lame de verre 12 couverte de la couche d'or 14, le système 5 permet de déterminer l'épaisseur géométrique de chaque point de la couche 14 et donc de vérifier l'état de surface de celle-ci. Le contraste mesuré lors du balayage sert par ailleurs de niveau de référence pour la mesure en temps réel. Lors de la mesure en temps réel, le système d'imagerie et de détection 5 mesure la variation de la réflectivité par rapport au niveau de référence enregistré lors du balayage angulaire. Cette mesure de la variation de la réflectivité est réalisée en tout point de la couche d'or 14. La réflectivité variant en fonction des molécules présentes en surface, cette mesure permet une analyse qualitative en déterminant les différentes interactions entre la couche organique 15/la couche d'or 14 et les molécules introduites. Ainsi, lorsque l'on se place à l'angle optimisant la sensibilité du dispositif, une variation positive de la réflectivité signifie la présence de molécules en interaction avec la couche organique 15, une variation nulle signifiant l'absence de molécules. Une variation négative représente alors au contraire une perte de matière, c'est-à-dire une dégradation de la couche à caractériser 15, organique ou non. La mesure de l'amplitude de la variation de la réflectivité en temps réel permet quant à elle d'accéder au nombre de molécules par unité de surface et donc à la concentration en chaque point de la couche d'or 14 des molécules introduites. Le dispositif selon l'invention permet donc également une analyse quantitative des molécules ayant interagi avec la couche organique 15. Selon la force de la liaison entre la couche organique 15 et la couche d'or 14 et la nature des interactions étudiées, il sera possible en fin de mesure de régénérer la couche organique 15 en éliminant toutes les molécules ayant réagi avec elle. Il est alors possible de réutiliser la couche organique 15 pour étudier des interactions avec de nouvelles molécules. Afin d'optimiser la sensibilité de la mesure, on peut également optimiser la répartition des capteurs fixés sur la couche organique 15. Il est en effet nécessaire que le nombre de sondes par capteur soit suffisamment élevé pour se distinguer du bruit de fond du signal mesuré sans pour autant que les sondes soient trop proches les uns des autres. En effet, un nombre important de sondes entraîne un encombrement stérique important et gêne l'interaction de molécules avec des sondes voisines. Dans le cadre de l'étude d'interactions entre oligonucléotides et des fragments d'ADN simple-brin à étudier le procédé selon l'invention présente de nombreux avantages. Les interactions sont étudiées dans des conditions d'hybridation non sélectives, soit à une température de l'ordre de 37OC, de sorte que toutes les interactions entre molécules pourront être observées simultanément. Le dispositif permet de suivre en même temps et sans marqueurs plusieurs centaines d'interactions moléculaires à la fois. Il est capable de discriminer la présence d'une mutation ponctuelle au sein d'un fragment d'ADN. La technique de discrimination repose sur le fait que l'association moléculaire peut être soit totale si la séquence de l'ADN est strictement complémentaire à celle de l'oligonucléotide, soit partielle si la séquence d'ADN possède une base mutée. La thermodynamique appliquée à l'ADN stipule que suivant le type de mutation, pour une localisation fixe dans la séquence, l'épaisseur optique varie. Il s'ensuit que le dispositif peut déterminer précisément le type de mutation. Dans des conditions non sélectives, si une séquence normale et les trois séquences portant la mutation d'une des bases de ladite séquence, c'est-à-dire les quatre séquences dont l'une des bases a été mutée, sont déposées sur la couche d'or 14, le dispositif peut mesurer un signal différent pour chacune des séquences immobilisées. En effet, quelle que soit la séquence du fragment à analyser, le dispositif mesure une interaction totale et trois interactions partielles. En fonction des séquences immobilisées, il suffit alors de se reporter aux tables existant donnant la force d'interaction entre bases pour remonter à la nature exacte de la séquence d'ADN. Dès lors, si le système de détection est calibré, par exemple par rapport à la valeur d'un signal totalement complémentaire, il n'est plus nécessaire d'immobiliser la séquence normale et les trois séquences mutées : l'immobilisation d'une seule séquence est suffisante. La capacité d'adresser des séquences d'ADN sur un substrat solide est donc multipliée par quatre. Le dispositif selon l'invention suivant en temps réel et directement les interactions moléculaires, il n'est pas nécessaire de réaliser la mesure à une température favorisant une seule interaction comme dans le cas des méthodes utilisant des marqueurs fluorescents. En effet, ces méthodes ne permettent de révéler qu'une seule interaction visible à une température donnée. Si ces méthodes étaient employées à température ambiante, tous les marqueurs émettraient de la fluorescence en même temps et ne pourraient donc être différenciés. Par ailleurs, dans le cas d'étude d'oligonucléotides, ces méthodes nécessitent l'immobilisation sur un support de toutes les séquences relatives à un gène et des conditions sélectives. Il va de soi que cette méthode peut être appliquée à l'étude de tout type d'interactions entre molécules. REVENDICATIONS 1. Procédé de caractérisation d'une surface utilisant un dispositif d'imagerie d'une surface métallique comportant une source lumineuse (1), un système de collimation (2) du faisceau lumineux incident, une cellule de détection (3) comprenant au moins un prisme (4), un système d'imagerie et de détection (5) du faisceau réfléchi par la base du prisme, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - balayage en angle de la surface d'une lame de verre (12) recouverte d'une couche d'or (14) et d'une couche organique (15) ; - détermination de l'angle d'incidence pour lequel la sensibilité du système d'imagerie et de détection (5) est maximale pour l'ensemble de la lame (12) ; - positionnement du dispositif à l'angle déterminé à l'étape précédente ; - mesure de la réflectivité par le système d'imagerie et de détection (5) en fonction du temps. 2. Application du procédé selon la revendication 1 à la mesure qualitative et quantitative d'interactions moléculaires. 3. Procédé de caractérisation utilisé pour l'application selon la revendication 2 dans lequel la couche à caractériser (15) est une couche organique portant des sondes. 4. Procédé selon la revendication 3 dans lequel l'introduction dans la cellule de détection (3) des molécules exemptes de marqueurs dont les interactions avec les sondes de la couche organique (15) sont à analyser est simultanée à la mesure de la réflectivité par le système d'imagerie et de détection (5) en fonction du temps. 5. Procédé selon l'une des revendications 1, 3 ou 4, ou utilisé pour l'application selon la revendication 2, dans lequel les mesures en fonction du temps sont réalisées dans des conditions non sélectives. 6. Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4, ou selon la revendication 5 lorsqu'elle dépend des revendications 3 ou 4, dans lequel en fin de mesure, on régénère les sondes de la couche organique (15) en éliminant toutes les molécules ayant interagi. 7. Procédé selon l'une des revendications 3,4 ou 6, ou selon la revendication 5 lorsqu'elle dépend des revendications 3 ou 4, dans lequel on choisit le nombre de sondes fixées sur la couche organique (15) de façon à optimiser la sensibilité de détection du signal tout en limitant l'encombrement stérique. 8. Dispositif d'imagerie d'une surface métallique mettant en oeuvre) le procédé selon les revendications 1 et 3 à 7, ledit dispositif comportant une source lumineuse (1), un système de collimation (2) du faisceau lumineux incident, une cellule de détection (3) comprenant au moins un prisme (4), un système d'imagerie et de détection (5) du faisceau réfléchi par la base du prisme, caractérisé en ce que la source lumineuse (1) est une source non cohérente et en ce que le prisme (4) est un prisme en verre dont la géométrie et l'indice sont tels que l'image intermédiaire du plan objet dans le prisme (4) est quasiment parallèle au plan de détection du système d'imagerie et de détection (5). 9. Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend un miroir galvanométrique (7) oscillant réfléchissant le faisceau émis par la source lumineuse (1) sur la face d'entrée du prisme (4) et apte à faire varier l'angle d'incidence dudit faisceau. 10. Dispositif selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'un moteur à pas variable permet de déterminer la position d'incidence du miroir oscillant (7).- 11. Dispositif selon la revendication 9 caractérisé en ce que la position d'incidence du miroir oscillant (7) est déterminée au moyen d'une caméra CCD (10) sur laquelle on recueille la partie du faisceau qui est réfléchie par la face d'entrée du prisme (4). 12. Dispositif selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que la cellule de détection (5) comporte au moins le prisme en verre (4) sur la base duquel une lame de verre (12) de même indice est fixée, cette lame (12) étant recouverte d'une couche mince (14) d'or, et d'une couche (15) de molécules organiques dont les interactions sont à analyser. 13. Dispositif selon l'une des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que la source lumineuse est une diode électroluminescente émettant à une longueur d'onde donnée. 14. Dispositif selon l'une des revendications 8 à 13, caractérisé en ce que le prisme (4) est en verre d'indice 1,8 et comporte un angle au sommet de 40 , une base de 10 mm et une hauteur de 25 mm. 15. Dispositif selon l'une des revendications 8 à 14, caractérisé en ce que la cellule de détection (5) comporte une cuve en Téflon (16) couvrant hermétiquement la couche mince d'or (14) recouverte de la couche de molécules (15). 16. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé par le fait qu'il comprend une pompe péristaltique (18) et un ou plusieurs tuyaux (17) reliant la pompe à la cuve (16) pour faire circuler des liquides dans la cuve (16). 17. Dispositif selon l'une des revendications 8 à 16 caractérisé en ce que le système d'imagerie et de détection (5) comprend un système afocal de grandissement (24) et une caméra CCD (25-)- 18. Dispositif selon la revendication 17, caractérisé en ce que le système afocal (24) de grandissement comprend deux lentilles focales (26), (27) pour agrandir l'image de la zone à analyser. 19. Dispositif selon l'une des revendications 8 à 18, caractérisé en ce qu'il comporte une chaîne informatique pour piloter les différents éléments.