Brevet FR2812658A1 — publié le 20020208

PROCEDE D'ANALYSE D'ACIDES NUCLEIQUES La présente invention concerne des compositions et méthodes pour l'analyse, la séparation ou le séquençage d'acides nucléiques. Elle concerne plus particulièrement des méthodes d'analyse, de séparation ou de séquençage d'acides nucléiques par électrophorèse, notamment capillaire, plus préférentiellement sans gel. La présente invention concerne également des méthodes de traitement des acides nucléiques, ou de séparation d'acides nucléiques, applicables au séquençage rapide et efficace. L'invention réside également dans des produits, compositions et kits pour la mise en #uvre de ces méthodes. L'invention est applicable à l'analyse, la séparation ou le séquençage d'acides nucléiques de nature et d'origine variées, dans le domaine expérimental, diagnostic, médical, etc., notamment le génotypage et le séquençage de novo. Les techniques et outils de séquençage, d'analyse ou de séparation des acides nucléiques présentent de nombreuses applications, par exemple dans l'analyse de génomes, la recherche de gènes, l'identification de polymorphismes (notamment de SNP), etc. Les techniques actuelles de séquençage de l'ADN comprennent essentiellement trois étapes principales, à savoir (i) la réaction de séquençage (ou la chimie), (ii) la séparation et (iii) la détection. L'étape ou la réaction de séquençage consiste essentiellement à réaliser des copies de l'acide nucléique à séquencer, copies arrêtées au hasard par l'incorporation d'un nucléotide terminateur (typiquement un didéoxynucléotide). Le principe et les conditions de cette réaction sont décrits par exemple dans l'article de Sanger et al (Ref. 1). Typiquement, la réaction de séquençage est réalisée, à partir d'un échantillon de l'acide nucléique à séquencer, en présence d'une amorce nucléotidique et d'une quantité appropriée de nucléotides terminateurs A, C, T ou G. La réaction de séquençage peut être réalisée de manière combinée en utilisant quatre nucléotides terminateurs A, C, T ou G marqués différentiellement ou, de manière parallèle, en utilisant dans chacune de ces réactions un des quatre nucléotides terminateurs A, C, T ou G et une amorce nucléotidique marquée différentiellement, les produits obtenus par ces quatre réactions pouvant ensuite être mélangés entre eux. Le produit de la réaction de séquençage est donc constitué d'un mélange d'acides nucléiques, de longueur variable, dont les extrémités 3' représentent chacune des bases de la molécule à séquencer. L'étape de séparation consiste, de manière générale, à séparer les espèces présentes dans le produit de la réaction de séquençage, de manière à déterminer la séquence de l'acide nucléique de départ. Généralement, cette séparation est réalisée sur la base de la charge et/ou de la masse de chaque espèce. Dans les techniques décrites dans l'art antérieur, cette séparation est essentiellement réalisée par électrophorèse dans des gels réticulés ou des milieux visqueux (généralement de polyacrylamide). La présence du gel permet de ralentir la migration des espèces, et donc autorise la résolution de la séparation induite par l'application d'un champs électrique. La détection ou l'analyse des espèces présentes peut être réalisée par des techniques classiques d'électrophorèse, en fonction notamment du type de marquage utilisé (radioactif, fluorescent, etc. ). Ainsi, les produits de la réaction de séquençage sont typiquement marqués en utilisant des nucléotides terminateurs marqués, chaque espèce portant alors un nucléotide terminal marqué identifiable. Les techniques de séquençage (ou d'analyse) décrites dans l'art antérieur présentent toutefois des inconvénients ou des limitations. En particulier, l'étape de séparation est souvent limitante, et ne permet pas d'analyser (ou de séquencer) des acides nucléiques de longueur très élevée, ou avec une sensibilité ou une rapidité suffisante. De manière à améliorer l'efficacité de l'étape de séparation, il a été proposé de recourir à une électrophorèse capillaire, permettant de travailler à haut débit et de manière automatisée. En particulier, l'électrophorèse capillaire permet l'application de champs électriques intenses (200 à 500 V/cm, contre 40 en électrophorèse classique) et l'automatisation du coulage des gels et du dépôt des échantillons d'acides nucléiques sur le gel. Cependant, ces techniques se heurtent à des obstacles importants. Ainsi, la présence indispensable de gels hautement visqueux rend difficile le chargement des capillaires, en raison de leur viscosité et des interactions de celui-ci avec les parois du capillaire, et induit un vieillissement du capillaire rempli de gel, qu'il faut changer au bout d'un certain nombre de séparations. Pour tenter de remédier à cet inconvénient, différents laboratoires cherchent à modifier la composition des gels, pour obtenir une bonne résolution avec une viscosité faible, permettant de remplir rapidement le capillaire et, si possible, d'éviter un traitement de surface anti-électroosmose préalable du capillaire. Toutefois, aucun gel satisfaisant ces exigences n'est actuellement disponible. Une autre approche proposée pour tenter de remédier à cet inconvénient consiste à greffer les acides nucléiques sur des molécules neutres, agissant comme agent freinant de la molécule d'ADN en milieu liquide (ref. 12). Cependant, cette technique ne permet pas de résoudre de manière satisfaisante les problèmes décrits ci-dessus et ci-après. D'autre part, la limite de lecture (résolution) accessible par toutes ces techniques antérieures est de l'ordre de 600 à 1100 nucléotides, dans les conditions optimales, en raison du compromis nécessaire entre vitesse, champs et sensibilité (ref. 6,7). D'autres approches pour tenter d'améliorer la séparation résident dans l'électrophorèse miniature au moyen de micro-canaux. Ainsi, les progrès de la micro-fabrication dans différents matériaux permettent d'envisager des microcanaux usinés (technologie dénommée micro-chip). Cependant, si cette approche permet de produire des cassettes de dimension réduite, intégrables dans des systèmes de détection plus complexes, elle ne résout pas les problèmes liés au gel et n'a pas fourni à ce jour de performances supérieures (Ref. 8,9, 10). Il existe donc un besoin pour des méthodes améliorées d'analyse d'acides nucléiques, notamment de séparation d'acides nucléiques, en particulier dans le contexte de réaction de séquençage. La présente invention propose désormais un nouveau concept de séparation d'acides nucléiques, efficace, sensible et automatisable, permettant d'analyser ou de séquencer des acides nucléiques de longueur importante sur des supports aussi variés que l'électrophorèse de type slab-gel et l'électrophorèse capillaire (support capillaire ou chips). Plus particulièrement, la présente invention décrit une méthode d'analyse ou de séparation d'acides nucléiques utilisable en milieu dépourvu de gel. La présente invention concerne notamment une méthode d'analyse ou de séparation d'acides nucléiques utilisant une molécule porteuse chargée positivement. La présente invention montre préférentiellement qu'il est possible d'obtenir une résolution importante des acides nucléiques, sans gel, basée non pas sur de simples forces de friction mais sur une combinaison de celles-ci avec une charge électrique ajoutée. La présente invention propose donc un nouveau concept pour la séparation d'acides nucléiques contenus dans un échantillon, basé sur l'emploi d'une molécule porteuse chargée positivement ( Drag ). Cette nouvelle approche va dans le sens opposé de ce qui était considéré comme acquis par l'homme du métier, à savoir que la molécule d'ADN possédant une charge globale négative, la migration des produits de séquençage ne peut se faire que dans le sens cathode(-) #anode(+). Ce préjugé guide en effet toutes les approches actuelles de séparation d'acides nucléiques décrites dans l'art antérieur. Or, sous l'action du champs électrique, les molécules d'ADN de grande taille tendent à s'orienter le long des lignes de champs électrique, et présentent alors une taille apparente à peu près identique, ce qui rend vaine toute méthode de séparation. De plus, en raison du rapport constant charge/masse, seule l'utilisation de milieux séparatifs appropriés (gels réticulés ou micellaires) permet de résoudre les fragments de séquences à la base près, sur des molécules composées uniquement d'ADN. La présente invention propose à présent une stratégie nouvelle, consistant à modifier la charge des acides nucléiques, pour orienter différemment leur migration et assurer leur meilleure résolution. Plus particulièrement, l'invention propose, pour la première fois, de traiter les acides nucléiques à analyser pour leur associer une molécule porteuse chargée positivement (Cf. Figure 1). La présence de cette charge positive (Q) permet d'inverser la charge globale de l'objet (du complexe) à séparer, et ainsi le sens de la migration. De ce fait, le phénomène décrit ci-avant avec les fragments d'ADN longs est fortement minimisé, et cette approche permet d'envisager le séquençage d'acides nucléiques de longueur supérieure à 2000 bases, par exemple jusqu'à 5000 bases. De plus, selon la présente invention, c'est la molécule d'acide nucléique qui freine la migration de la molécule porteuse chargée positivement et non l'inverse. De ce fait, les plus petits fragments sont analysés en premiers et les plus longs en dernier, la séquence obtenue étant donc directement dans la bonne orientation, contrairement aux systèmes de l'art antérieur. D'autre part, la masse de la molécule porteuse, permet d'améliorer, par des forces de friction, la résolution de la méthode, et de s'affranchir de l'emploi de milieux gélifiés ou réticulés. Un objet de la présente invention réside donc plus spécifiquement dans un procédé de séparation d'acides nucléiques par électrophorèse, comprenant (i) une étape de mise en contact des acides nucléiques avec une quantité suffisante d'une molécule porteuse chargée positivement dans des conditions assurant la formation de complexes entre la molécule porteuse et tout ou une partie des acides nucléiques, les complexes formés étant composés essentiellement d'une molécule porteuse et d'une molécule d'acide nucléique, et (ii) la séparation des complexes formés par électrophorèse. Un autre objet de l'invention réside dans un procédé d'analyse d'un échantillon d'acides nucléiques, caractérisé en ce qu'il comprend (i) la mise en contact de l'échantillon avec une quantité suffisante d'une molécule porteuse chargée positivement, dans des conditions assurant la formation de complexes entre la molécule porteuse et tout ou une partie des acides nucléiques de l'échantillon, les complexes formés étant composés essentiellement d'une molécule porteuse et d'une molécule d'acide nucléique, et (ii) l'analyse par électrophorèse des complexes formés. L'invention a encore pour objet un procédé de séquençage d'un acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend : (a) une réaction de séquençage de l'acide nucléique en présence de quatre nucléotides terminateurs, éventuellement marqués différentiellement, (b) la mise en contact de tout ou partie du produit de la réaction (a) avec une quantité suffisante d'une molécule porteuse chargée positivement dans des conditions assurant la formation de complexes entre la molécule porteuse et tout ou une partie des acides nucléiques présents dans ledit produit de la réaction (a), les complexes formés étant composés essentiellement d'une molécule porteuse et d'une molécule d'acide nucléique, et (c) la séparation par électrophorèse des complexes formés, permettant la détermination de la séquence de l'acide nucléique. Comme il sera détaillé dans la suite du texte, dans les procédés ci-dessus, les nucléotides et/ou la molécule porteuse sont avantageusement marqués, pour permettre l'analyse de l'échantillon. Ainsi, dans le cas d'un procédé de séquençage, les nucléotides terminateurs sont avantageusement marqués différentiellement, ou l'amorce nucléotidique ou la molécule porteuse. L'invention peut être utilisée pour l'analyse d'acides nucléiques par différents types d'électrophorèse. Ainsi, le terme électrophorèse, lorsqu'il n'est pas défini plus spécifiquement, désigne au sens de l'invention toute méthode d'électrophorèse, telle que par exemple l'électrophorèse capillaire (dans des tubes capillaires ou des micro-canaux ( micro-chips )), l'électrophorèse en Slab Gel (en gel réticulé), l'électrophorèse sans gel ( free-flow electrophoresis ), la magnétophorèse (électrophorèse avec application d'un champs magnétique), etc. L'invention concerne également un procédé de traitement d'un échantillon d'acides nucléiques, comprenant la mise en contact de l'échantillon avec une quantité suffisante d'une molécule porteuse chargée positivement, dans des conditions assurant la formation de complexes entre la molécule porteuse et tout ou une partie des acides nucléiques de l'échantillon, les complexes formés étant composés essentiellement d'une molécule porteuse et d'une molécule d'acide nucléique. Le procédé de l'invention peut être utilisé pour la séparation, l'analyse, le traitement ou le séquençage de tout type d'acides nucléiques. Ainsi, il peut s'agir d'ADN ou d'ARN, simple-brin ou double-brin, notamment d'ADNc, d'ADNg, d'ADN synthétique ou semi-synthétique ou recombinant, d'ARNm, etc. Typiquement, il s'agit d'acides nucléiques simple brin, de préférence d'ADN simple brin. Les acides nucléiques peuvent être d'origine naturelle, synthétique, semi-synthétique, recombinante, etc. Il peut s'agir notamment d'acides nucléiques d'origine mammifère, eucaryote, procaryote, végétale, virale, etc. A titre illustratif, il peut s'agir d'acides nucléiques d'origine animale ou humaine, notamment d'ADN ou d'ARN humain ou animal, en particulier simple-brin. Il peut également s'agir d'acide nucléique viral, bactérien, notamment d'organismes pathogènes. L'acide nucléique peut être de longueur variable, linéaire, circulaire, superenroulé, etc. Il peut s'agir de fragments d'ADN, de produits d'amplification, de mélanges d'acides nucléiques d'origine et/ou de nature variées, etc. De préférence, le procédé de l'invention est utilisé pour analyser ou séparer un échantillon d'acides nucléiques comprenant au moins 100 espèces différentes, plus généralement au moins 500 espèces différentes. Il est entendu que le procédé de l'invention ne saurait être limité à un type particulier d'acide nucléique ou d'échantillon. Comme indiqué ci-avant, un élément important de la présente invention réside dans l'utilisation d'une molécule porteuse, chargée positivement, sur laquelle chaque (ou une partie des) espèce (s) l'échantillon est couplée. Cette molécule porteuse permet la séparation des acides nucléiques dans des solutions liquides, avec une grande efficacité et une sensibilité élevée. En outre, l'emploi d'une molécule porteuse selon l'invention permet une séparation des espèces dans l'ordre de taille croissante. Préférentiellement, pour la mise en #uvre de l'invention, la molécule porteuse répond aux conditions suivantes : . elle possède un poids moléculaire élevé, et/ou . elle possède une charge électrique positive supérieure à la charge négative de la molécule d'acide nucléique la plus grande que l'on désire analyser (e. g., séparer, séquencer). Plus préférentiellement, la molécule porteuse chargée positivement possède un poids moléculaire supérieur ou égale à 100 000 Dalton, de préférence à 200 000 Dalton, plus préférentiellement à 300 000 Dalton. Par ailleurs, de manière préférée, la molécule porteuse chargée positivement possède une charge électrique positive telle que le rapport R de la charge positive de la molécule porteuse sur la charge négative de la molécule d'acide nucléique la plus grande que l'on désire analyser est supérieur à 1, de préférence supérieur ou égal à environ 1,2, plus préférentiellement supérieur ou égal à 1,5, encore plus préférentiellement supérieur ou égal à 2. Ce rapport peut être déterminé selon les techniques conventionnelles connues de l'homme du métier. A cet effet, si nécessaire ou désiré, la charge positive de la molécule porteuse peut être augmentée artificiellement, par exemple par polymérisation ou fonctionnalisation, ou encore par toute modification des paramètres physicochimiques de l'électrophorèse. D'autre part, on utilise avantageusement pour la mise en #uvre de l'invention une composition de molécule porteuse essentiellement monodisperse, c'est à dire constituée d'espèces homogènes, formant de préférence une bande unique en migration électrophorétique. Le caractère monodisperse peut être assuré par une purification des molécules porteuses. Préférentiellement, la molécule porteuse forme une seule bande en isofocalisation en conditions non-dénaturantes, permettant de distinguer des variations de 0. 02 unités de pH. Il est entendu toutefois qu'une variabilité (ou hétérogénéité) peut être tolérée. De manière particulièrement avantageuse, le molécule porteuse est capable de former un complexe avec un acide nucléique de l'échantillon, complexe constitué essentiellement d'une molécule porteuse et d'une molécule d'acide nucléique. En effet, pour permettre une résolution des acides nucléiques, il est important que les espèces d'acide nucléique présentes dans le milieu restent individualisées, et donc que les complexes formés ne portent qu'une seule molécule d'acide nucléique. Il est entendu cependant que la formation, dans un proportion faible (généralement inférieure à 10%, plus préférentiellement inférieure à 5%) de complexes portant plusieurs molécules d'acides nucléiques couplées à une molécule porteuse ne peut être entièrement exclue, sans toutefois perturber l'efficacité de la méthode. L'interaction entre la molécule porteuse et l'acide nucléique peut être covalente ou non-covalente. Il peut notamment s'agir d'une liaison physique ou chimique, notamment électrostatique, hydrogène, van der Waals, etc. Préférentiellement, l'interaction (et la formation des complexes) est assurée par la présence, sur la molécule porteuse, d'un groupe fonctionnel A. Ce groupe fonctionnel permet d'assurer la formation d'un complexe spécifique entre ladite molécule et une molécule d'acide nucléique. Le groupe fonctionnel A peut être choisi par exemple parmi l'avidine, un récepteur, un ligand, un anticorps, ou un fragment ou dérivé de ceux-ci conservant une spécificité, un réactif bifonctionnel, etc. ou tout groupement réactif permettant d'assurer une liaison ou une interaction spécifique avec un partenaire défini. Plus préférentiellement, la molécule porteuse possède un groupe fonctionnel A unique. Le terme unique indique que chaque molécule porteuse ne porte qu'une seule molécule de groupe fonctionnel A. Cette caractéristique est avantageuse car permet la formation de complexes définis entre une seule molécule porteuse et une seule molécule d'acide nucléique. Dans un exemple particulier de mise en #uvre, la molécule porteuse comporte un groupe fonctionnel avidine ou dérivé de l'avidine. Le groupe fonctionnel A peut être naturellement présent ou artificiellement introduit sur la molécule porteuse, selon son origine et sa nature. Comme il sera mentionné dans les exemples, le groupe fonctionnel peut notamment être introduit sur la molécule par liaison chimique ou physique, directe ou au moyen d'un réactif ou d'un bras intermédiaire (Cf. Figure 2). A titre d'exemple, le groupe fonctionnel peut être inséré au moyen d'un agent pontant, capable d'interagir (physiquement ou chimiquement) avec la molécule porteuse d'une part et le groupe fonctionnel A d'autre part. Un tel agent pontant peut être choisi notamment parmi les groupes maléimide, notamment les composés MBS (ref. 22311), sulfo-MBS (ref. 22312), SMPB (ref. 22416), Sulfo-SMPB (ref. 22317), GMBS (ref. 22309), Sulfo-GMBS (ref. 22324), EMCS (ref. 22308) ou SulfoEMCS (ref. 22307) commercialisés par la société Pierce. Typiquement, ces agents pontant peuvent être utilisés pour associer toute groupe fonctionnel A à une molécule porteuse possédant une fonction SH réactive au moins. De ce fait, dans un mode plus préféré de l'invention, la molécule porteuse comporte au moins une fonction SH réactive. Il est entendu que toute autre technique de couplage et/ou tout autre agent pontant peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention. Selon un mode particulièrement avantageux de réalisation, la molécule porteuse possède : . un poids moléculaire élevé, de préférence supérieur ou égale à 100 000 Dalton, de préférence à 200 000 Dalton, plus préférentiellement à 300 000 Dalton, . une charge électrique positive choisie de sorte que le complexe formé avec la molécule d'acide nucléique à analyser la plus longue reste positif, et . un groupe fonctionnel A unique, choisi de préférence parmi l'avidine, un récepteur, un ligand, un anticorps, ou un fragment ou dérivé de ceux-ci conservant une spécificité, ou tout groupement réactif permettant d'assurer une liaison ou une interaction spécifique avec un partenaire défini. Par ailleurs, comme il sera indiqué dans la suite du texte, la molécule porteuse peut également être marquée, pour permettre sa détection. Dans ce contexte, plusieurs marquages peuvent être envisagés, de type enzymatique, radioactif, fluorescent, luminescent, biologique, etc. Le marquage de la molécule porteuse peut permettre, selon les conditions de mise en #uvre des procédés de l'invention, de détecter les acides nucléiques et de réaliser la séquence, ou le génotypage. Un marquage préféré est le marquage fluorescent. La molécule porteuse peut être de nature et d'origine diverses. Ainsi, il peut s'agir d'une molécule synthétique, naturelle, d'origine biologique, chimique, minérale ou organique. Dans un mode particulier de mise en #uvre, la molécule porteuse est essentiellement polypeptidique ou d'origine polypeptidique (c'est-àdire comprend un enchaînement de plusieurs acides aminés). Comme indiqué ciavant, il peut s'agir d'un polypeptide d'origine naturelle ou synthétique, par exemple recombinante ou produite par synthèse au moyen de synthétiseurs par exemple. Le polypeptide peut également être modifié, par exemple chimiquement, enzymatiquement, etc., pour lui conférer des propriétés supplémentaires ou améliorer ses propriétés (ou sa charge électrique). S'agissant d'un polypeptide d'origine recombinante, il peut être produit dans tout organisme cellulaire approprié, notamment dans une bactérie (sans glycosylation), une levure, une cellule mammifère, insecte, etc. S'agissant d'une molécule synthétique, elle peut être produite par synthèse en plusieurs fragments, qui peuvent être assemblés et éventuellement modifiés selon les techniques classiques. Des exemples particuliers de molécules d'origine polypeptidique utilisables dans le cadre de la présente invention sont l'hémocyanine, l'hémoglobine, l'albumine, l'EIF3 PI 10 (de levure) ou la chaîne beta de l'antigène KW (de ricketsie). Un exemple spécifique et préféré est composé de l'hémocyanine, notamment de la limule L'hémocyanine possède une taille (un poids moléculaire) compris entre 500 000 et 3,5 million de Daltons suivant son origine et sa polymérisation, elle est composée de 6 à 8 chaînes polypeptidiques et présente une charge nette positive dans les tampons d'électrophorèse. En outre, la chaîne alpha (F 1761) porte une seule cystéine ayant un groupe SH libre (Figure 3). Cette chaîne (ou des formes polymérisées de celle-ci) représente un exemple plus particulier de molécule porteuse selon l'invention. Il est entendu que d'autres molécules peuvent être sélectionnées par l'homme du métier, répondant aux paramètres indiqués ci-avant, et utilisables dans le cadre de l'invention. Comme indiqué ci-avant, le procédé de l'invention comprend la mise en contact des acides nucléiques avec la molécule porteuse (monodisperse), dans des conditions assurant la formation de complexes entre cette molécule et tout ou partie des acides nucléiques à analyser ou séparer. Pour assurer une plus grande efficacité de la méthode, il est important que le plus grand nombre (ou pourcentage) de molécules d'acides nucléiques présentes dans l'échantillon soit engagé dans un complexe. En outre, il est également important pour assurer une meilleure résolution, que les complexes possèdent essentiellement une seule molécule porteuse et une seule molécule d'acide nucléique. Enfin, il est également préférable que la molécule porteuse soit monodisperse. Dans ces conditions, pour la mise en contact, on utilise avantageusement un rapport molaire molécule porteuse/acide nucléique supérieur ou égal à 1. Il est en effet particulièrement avantageux d'opérer en présence d'un excès de molécule porteuse, pour que la plus grande proportion des espèces d'acide nucléique présentes soit engagée dans un complexe et puisse donc être analysée. Il est entendu que la présente invention peut être mise en #uvre sans qu'il soit nécessaire que la totalité des acides nucléiques de l'échantillon soit engagée dans des complexes, et sans que chaque complexe formé contienne uniquement 1 acide nucléique. Néanmoins, plus ces conditions sont réunies, plus la qualité de l'analyse (ou la longueur de la séquence déterminée) sera importante. Comme indiqué ci-avant, le couplage peut être de nature covalente ou noncovalente, physique ou chimique. Selon un mode préféré, le couplage est réalisé au moyen d'un groupe fonctionnel A présent sur la molécule porteuse et d'un groupe fonctionnel B présent sur les acides nucléiques. Il est en effet souhaitable que le couplage puisse s'effectuer de manière simple, efficace et spécifique. De ce fait, dans un mode préféré de réalisation, les acides nucléiques à traiter possèdent un groupe fonctionnel B, capable d'interagir de manière spécifique avec le groupe fonctionnel A. Le groupe fonctionnel B est donc constitué d'un partenaire du groupe fonctionnel A, c'est-à-dire par exemple la biotine, un ligand, un récepteur, un antigène (ou épitope), ou un fragment ou dérivé de ceuxci conservant une spécificité, ou tout groupement réactif permettant d'assurer une liaison (ou interaction) spécifique avec le groupe fonctionnel A. On désigne par liaison ou interaction spécifique, une liaison ou interaction entre deux partenaires présentant une affinité respective. Dans un mode de réalisation particulier, les acides nucléiques portent un groupe fonctionnel B constitué d'une molécule de biotine, et le couplage est réalisé par une interaction de type avidine-biotine. Dans un autre mode de réalisation, les acides nucléiques portent un groupe fonctionnel B constitué d'un antigène ou fragment d'un antigène, et le couplage est réalisé par une réaction de type antigène-anticorps. Dans un autre mode de réalisation, le couplage est réalisé par hybridation spécifique au moyen d'un oligonucléotide particulier qui peut être greffé sur la molécule porteuse. Cet oligonucléotide peut être spécifique d'une région des acides nucléiques, et permettre la formation d'un complexe par hybridation spécifique. Un exemple préféré repose sur l'emploi du système (strept)avidine-biotine. Ainsi, les molécules d'acides nucléiques peuvent être fonctionnalisées pour porter une molécule unique de biotine, et la molécule porteuse possède un groupe fonctionnel avidine. La mise en contact conduit à la formation de complexes monodisperses par interaction avidine-biotine. Chaque complexe peut ensuite être séparé par électrophorèse, selon l'invention. La fonctionnalisation des acides nucléiques peut être réalisée de différentes manières. Ainsi, ils peuvent être fonctionnalisés après leur synthèse, par modification chimique terminale selon des techniques connues. Ils peuvent également être fonctionnalisés au cours de leur synthèse, par exemple lors d'une réaction d'amplification. A cet égard, dans le cas d'une réaction de séquençage, la réalisation de copies de l'acide nucléique à séquencer peut être accomplie par amplification en utilisant une amorce oligonucléotidique marquée (par exemple biotinylée). Dans ce cas, chaque copie synthétisée (à partir de l'amorce) portera ledit marquage. Les résultats obtenus montrent que l'utilisation d'une amorce biotinylée n'altère pas la réaction de séquençage, et permet de générer une population d'acides nucléiques marqués par un groupe fonctionnel B. A cet égard, un objet particulier de la présente demande réside dans un procédé de séquençage d'un acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend : (a) une réaction de séquençage de l'acide nucléique en présence de quatre nucléotides terminateurs marqués différentiellement et d'une amorce biotinylée, (b) La mise en contact de tout ou partie du produit de la réaction (a) avec une quantité suffisante d'une molécule porteuse chargée positivement et portant un groupe avidine, pour former des complexes entre la molécule porteuse et tout ou une partie des acides nucléiques présents dans ledit produit de la réaction (a), les complexes formés étant composés essentiellement d'une molécule porteuse et d'une molécule d'acide nucléique, et (c) La séparation par électrophorèse des complexes formés, permettant la détermination de la séquence de l'acide nucléique. Dans une autre variante des procédés l'invention, l'étape (a) de séquençage comprend quatre réactions de séquençage réalisées en parallèle avec chacune un nucléotide terminateur différent choisi parmi A, C, T ou G et une amorce portant un groupe fonctionnel B et marquée différentiellement (i. e., avec un marqueur différent pour chacune des quatre réactions). Selon une autre variante des procédés l'invention, l'étape (a) de séquençage comprend quatre réactions de séquençage réalisées en parallèle avec chacune un nucléotide terminateur différent choisi parmi A, C, T ou G et une amorce portant un groupe fonctionnel B, et, dans l'étape (b), chaque produit des quatre réactions est mis en contact en parallèle avec la molécule porteuse marquée différentiellement (et portant de préférence un groupe fonctionnel A). Dans ce mode de réalisation, l'analyse peut ensuite être réalisée en parallèle ou après avoir combiné les différents complexes formés. La mise en contact de la molécule porteuse et des acides nucléiques peut être réalisée dans tout milieu et dispositif appropriés. Préférentiellement, il s'agit de solutions tampon, par exemple de tampons conventionnels d'électrophorèse. Encore plus préférentiellement, on utilise des solutions dans lesquelles la molécule porteuse possède une charge nette positive. La mise en contact peut être réalisée préalablement ou simultanément à l'introduction des constituants dans le dispositif de séparation. La séparation est ensuite réalisée généralement dans le même tampon convenant à l'électrophorèse, permettant la mise en suspension des complexes formés. Un avantage de la présente invention réside dans la possibilité de réaliser la séparation en milieu dépourvu de gel. Cet aspect est particulièrement avantageux puisqu'il permet de séquencer des acides nucléiques longs (supérieurs à 1500bases), dans des conditions de mise en #uvre aisées, et à un coût réduit. Bien entendu, il est également possible d'ajouter au milieu de séparation des composants de réticulation, comme le polyacrylamide, dans des proportions ajustables par l'homme du métier. De manière préférée, la séparation des complexes est réalisée par électrophorèse capillaire. Dans ce cas, différents dispositifs commerciaux peuvent être utilisés, tels que des capillaires ayant un diamètre inférieur ou égale à environ 200 m, plus préférentiellement inférieur ou égal à environ 100 m, typiquement compris entre environ 10 et environ 50 m, ou par des systèmes d'électrophorèses capillaires réalisés sur des substrats solides, où le capillaire est essentiellement une piste gravée sur ce même substrat. Comme indiqué ci-avant, dans un mode préféré de mise en #uvre, les complexes molécule porteuse-acide nucléique sont marqués, pour permettre leur analyse. Le marquage des espèces à séparer peut être réalisé de différentes façons. Ainsi, il peut s'agir d'un marquage des acides nucléiques ou de la molécule porteuse. D'autre part, dans le cas d'un marquage des acides nucléiques, il peut s'agir d'un marquage terminal ( terminal dye ) ou d'un marquage de l'amorce ( primer dye ), ou encore d'un marquage de la molécule porteuse. Dans le cas d'un marquage terminal, le marquage est obtenu, au cours de la réaction de séquençage, par utilisation de nucléotides terminateurs marqués. Dans ce mode de réalisation, la réaction de séquençage peut être réalisée de manière combinée avec les différents types de nucléotides terminateurs. Dans le cas d'un marquage de l'amorce ou de la molécule porteuse, plusieurs (en général 4) réactions de séquençage sont conduites en parallèle en présence d'un des quatre nucléotides terminateurs, soit avec quatre jeux d'amorces marquées différentiellement, soit en présence de la même amorce, les produits de la réaction étant ensuite mis en contact en parallèle avec quatre jeux de molécules porteuses possédant un marquage différentiel. Les marquages utilisés sont préférentiellement des marquages fluorescents, radioactifs, enzymatiques, luminescents, chimiques, etc. Typiquement, quatre fluorochromes distincts sont utilisés pour marquer (i) les nucléotides terminateurs ou (ii) les amorces ou (iii) la molécule porteuse. L'analyse des complexes résolus par les procédés de l'invention peut ensuite être réalisée par des techniques conventionnelles. Par ailleurs, les procédés de l'invention peuvent être mis en #uvre en utilisant différents types de dispositifs ou appareillages, notamment des séquenceurs, connus de l'homme du métier et/ou disponibles dans le commerce. Ainsi, on peut utiliser avantageusement des séquenceurs "automatiques", qui automatisent en fait la lecture des électrophorèses. Ces séquenceurs ont vu le jour à la fin des années 80. Voir notamment L. Hood et al. réf. n 2, relatif à un séquenceur fonctionnant avec des amorces fluorescentes ;ref. n 3, concernant un séquenceur fonctionnant avec des didéoxynucléotides fluorescents (3) ; et Ansorge et al. (ref. (4)). Des appareils plus récents utilisent des systèmes de détection en slab gel . On peut citer notamment des séquenceurs de la société Perkin Elmer. Dans ces séquenceurs, la fluorescence des ADNs est détectée par balayage en fin du gel d'électrophorèse. La séparation des couleurs était assurée initialement par des filtres placés entre le gel et le détecteur (une couleur était détectée par balayage, et il fallait donc quatre balayages pour détecter les quatre couleurs). Dans les appareils plus récents (Séquenceur 377), un réseau diffracte la lumière émise par le gel, et une Caméra CCD recueille les diverses longueurs d'ondes déjà séparées spatialement. Cela augmente de quatre fois la vitesse de détection, et il a été possible d'augmenter d'autant la vitesse de l'électrophorèse. Ces séquenceurs Perkin Elmer, commercialement disponibles, sont donc capables de détecter quatre fluorophores dans un même couloir d'électrophorèse. D'autres séquenceurs, commercialisés par la société Pharmacia ou LiCor, peuvent être utilisés. En particulier, les séquenceurs Pharmacia ne contiennent aucune pièce mobile. Le gel est éclairé par un laser par la tranche, et des photodiodes sont disposées en face de chaque couloir d'électrophorèse. Ce système de détection offre une grande sensibilité. Le séquenceur LiCor a la particularité de fonctionner en infrarouge (6). Il procède par balayage, mais le bruit de fond très faible en infrarouge en fait un appareil très sensible. Une des versions de ce séquenceur fonctionne avec des gels de 60 cm de long, ce qui permet d'augmenter la longueur de lecture des séquences jusqu'à 800 à 1000 nucléotides. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée à un dispositif ou appareillage particulier, et qu'elle peut être mise en #uvre par tout moyen utile à cet effet. Un autre objet de l'invention réside dans une composition comprenant un acide nucléique couplé à une molécule porteuse chargée positivement, telle que définie ci-avant. Un autre aspect de l'invention concerne des compositions comprenant un mélange d'acides nucléiques complexés à une molécule porteuse chargée positivement, chaque complexe comprenant essentiellement une molécule porteuse et un acide nucléique. Plus préférentiellement, dans les compositions de l'invention, le ou les acides nucléiques sont marqués, par exemple par des marqueurs radioactifs, fluorescents, luminescents, enzymatiques, chimiques, etc. Par ailleurs, selon un autre mode de réalisation, dans les compositions de l'invention, la molécule porteuse est marquée, par exemple par un marquage radioactif, fluorescent, luminescent, enzymatique, chimique, etc.. Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'une molécule porteuse chargée positivement pour la séparation d'acides nucléiques en électrophorèse, notamment capillaire. Il s'agit plus particulièrement d'une molécule porteuse telle que définie ci-avant, portant avantageusement un groupe fonctionnel A et/ou un marqueur. L'invention a également pour objet des trousses ou kits pour l'analyse d'acides nucléiques, comprenant une molécule porteuse chargée positivement, présentant un poids moléculaire élevé et un groupe fonctionnel, et, éventuellement : un capillaire dont le diamètre interne est apte à assurer la séparation des molécules d'acides nucléiques, et/ou les produits nécessaires à la réalisation du tampon dans le quel se feront les séparations, et/ou les conditions instrumentales de séparation, telles que le courrant électrophorètique, la tension, la longueur de capillaire, la nature du capillaire, etc. Des trousses ou kits préférés au sens de l'invention sont destinés au séquençage d'acides nucléiques, et comprennent une molécule porteuse chargée positivement, présentant un poids moléculaire élevé et un groupe fonctionnel A et une amorce nucléotidique pour réaction de séquençage, comprenant un groupe fonctionnel B. Dans les trousses ou kits de l'invention, la molécule porteuse est préférentiellement définie comme ci-avant. En outre, ils peuvent contenir plusieurs jeux d'amorce ou de molécule porteuse, marqués différentiellement. Comme indiqué ci-avant, l'invention peut être utilisée pour l'analyse, la séparation ou le séquençage de tout acide nucléique (ou échantillon d'acide nucléique), et peut être mise en #uvre dans des applications expérimentales, diagnostiques, thérapeutiques, de pharmacogénomique, génotypage, etc. D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Légende des Figures Figure 1 : du couplage avec une molécule porteuse ( DNA-Drag Figure 2 : Schéma de couplage de l'acide nucléique sur la molécule porteuse au moyen du système avidine-biotine. Figure 3 : moléculaire de l'hémocyanine. Exemples Dans cet exemple, la molécule porteuse utilisée est l'hémocyanine de chez Sigma (ref. H 1757). Cette molécule est issue de limulus polyphemus (limule) par purification sur colonne de DEAE-Sephadex. La molécule est repurifiée par électrophorèse en gel d'acrylamide, pour obtenir un produit monodisperse. Le groupe fonctionnel A utilisé est l'avidine. L'Avidine utilisée a été déglycosylée (produit sous le référence 11367 chez Fluka). Cette molécule est extraite du blanc d'#uf. Après reconstitution, la molécule a été repurifiée sur gel d' acrylamide. Les deux molécules purifiées par électrophorèse sont ensuite couplées en utilisant un agent pontant bi-fonctionnel : le Sulfo-BMS (m-MaleimidobenzoylN succinimide ester), produit de chez Pierce Biochemical (ref. 22312). L'avidine est ensuite rendue monomérique en utilisant la technique décrite par ailleurs (Ref. 13). Le couplage est réalisé de la façon suivante : Le Sulfo-BMS est dissous dans l'eau distillée à une concentration fmale de 10 mM, juste avant la réaction. Un tampon de couplage est préparé, comprenant : 83 mM tampon de phosphate de sodium à pH 7,2 ; mM NaCl (PBS). Il est également possible d'utiliser un tampon HEPES, un carbonate/bicarbonate, ou un borate. Préférentiellement, le tampon ne contient pas de groupement amine ou thiol. Les protéines sont dialysées contre ce tampon de façon extensive si elles sont déjà dissoutes, sinon elles sont dissoutes dans ce tampon, en présence de 10 mM EDTA. A 200 l d'une solution d'avidine déglycosylée repurifiée à une concentration de 10 mg/ml, on ajoute 100 l d'une solution de Sulfo-BMS à 2 mg/ml. On laisse agir une heure à température ambiante. Les 300 l sont ensuite déssalés sur une colonne. On recueille 1,5 ml en sortie de colonne après les deux premiers ml d'élution. Ensuite, on ajoute 500 \il d'une solution à 4 mg/ml d'hémocyanine et on laisse agir à température ambiante pendant deux heures. On met fin à la réaction en ajoutant 50 l de tampon TBE IX. La molécule porteuse (comprenant un groupe fonctionnel A) est préférentiellement purifiée par chromatographie d'exclusion ou d'affinité. La molécule est alors prête pour être utilisée pour la séparation d'acides nucléiques. La réaction de séquençage est conduite suivant les protocoles proposés par les différents fabricants. A ce stade, une réaction en dye terminator est réalisée, en utilisant une amorce biotinylée et quatre nucléotides terminateurs marqués au moyen de fluorophores différents. Une fois la réaction de séquençage terminée, la molécule porteuse est ajoutée dans le tube, en quantité appropriée, et la solution est mélangée sous agitation douce. Le mélange obtenu est ensuite chargé dans le séquenceur pour analyse. Il peut également être envisagé de réaliser la réaction de séquençage en dye primer . Pour cela, quatre réactions de séquençage sont réalisées en parallèle avec chacun des nucléotides terminateurs, et quatre réactions de couplage sont effectuées, en utilisant la molécule porteuse marquée par quatre fluorophores différents. Les réactions peuvent ensuite être rassemblées et le mélange obtenu, chargé dans le séquenceur pour analyse. Références 1 F. Sanger, S. Nicklen and A. R. Coulson ; sequencing with chain- terminating inhibitors ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1997; 74; 5463-5467. 2 L. M. Smith, J. Z. Sanders, R. J. Kaiser, P. Hughes, C. Dodd, C. R. Connell, C. Heiner, S. B. H. Kent and L. E. Hood ; Fluorescencedétection in automated DNA séquence analysis ; Nature ; 1986 ; 321 ; 674-678. 3 J. M. Prober, G. L. Trainor, R. J. Dam, F. W. Hobbs, C. W. Robertson, R. J. Zagursky, A. J. Cocuzza, M. A. Jensen and K. Baumeister ; Asystem for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides; Science ; 1987 ; 238 ; 336-341. 4 W. Ansorge, B. S. Sproat, J. Stegemann and C. Schwager ; non- radioactive automated method for DNA séquence determination.; J- Biochem-Biophys-Methods; 1986 ; 13 ; 315-23. 5 L. R. Middendorf, J. C. Bruce, R. C. Bruce, R. D. Eckles, D. L. Grone, S. C. Roemer, G. D. Sloniker, D. L. Steffens, S. L. Sutter, J. A. Brumbaugh and G. Patonay ; on-line DNA sequencing using a versatile infrared laser scanner/electrophoresis apparatus; Electrophoresis; 1992 ; 13 ; 487-494. 6 J. A. Luckey, T. B. Norris and L. M. Smith ; Analysisof resolution in DNA sequencing by capillary gel electrophoresis; J. Phys. Chem.; 1993; 97; 3067-3075. 7 J. A. Luckey and L. M. Smith; Optimization of electric field strength for DNA sequencing in capillary gel electrophoresis ; Chem ; 1993;65; 2841-50. 8 D. J. Harrison, K. Fluri, K. Seiler, Z. Fan, C. S. Effenhauser and A. Manz; Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip; Science; 1993 ; 261 ; 895-897. 9 A. T. Wooley and R. A. Mathies ; DNA fragment séparations using microfabricated capillary array electrophoresis chips; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1994; 91 ; 11348-11352. 10 A. T. Wooley and R. A. Mathies ; DNA sequencing using capillary electrophoresis chips; Anal. Chem.; 1995; 67; 3676-3680. 11 Zahia Djouadi, Séquençage de l'ADN par l'électrophorèse : étude des effets thermiques sur la migration, groupe Interfaces Physique-Biologie, Institut de Physique Nucléaire d'Orsay, THESE soutenue le 12 Juillet 2000 12 Hongji Ren, Achim E. Karger, Frank Oaks, Steve Menchen, Gary W. Slater, Guy Drouin, Separating DNA sequencing fragments without a sieving matrix, Electrophoresis 1999,20 No. 12,2501-2509 13 Michael Green and E John Toms, The properties of subunits of avidin coupled to sepharose, Biochem J.1973, 133, 687-700 REVENDICATIONS 1. Procédé de séparation d'acides nucléiques par électrophorèse, comprenant (i) une étape de mise en contact des acides nucléiques avec une quantité suffisante d'une molécule porteuse chargée positivement dans des conditions assurant la formation de complexes entre la molécule porteuse et les acides nucléiques ou une partie de ceux-ci, les complexes formés étant composés essentiellement d'une molécule porteuse et d'une molécule d'acide nucléique, et (ii) la séparation des complexes formés par électrophorèse. 2. Procédé d'analyse d'un échantillon d'acides nucléiques, caractérisé en ce qu'il comprend (i) la mise en contact de l'échantillon avec une quantité suffisante d'une molécule porteuse chargée positivement, dans des conditions assurant la formation de complexes entre la molécule porteuse et les ou des acides nucléiques de l'échantillon, les complexes formés étant composés essentiellement d'une molécule porteuse et d'une molécule d'acide nucléique, et (ii) l'analyse par électrophorèse des complexes formés. 3. Procédé de séquençage d'un acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend : (a) une réaction de séquençage de l'acide nucléique en présence de quatre nucléotides terminateurs marqués différentiellement, (b) la mise en contact de tout ou partie du produit de la réaction (a) avec une quantité suffisante d'une molécule porteuse chargée positivement dans des conditions assurant la formation de complexes entre la molécule porteuse et les ou des acides nucléiques présents dans ledit produit de la réaction (a), les complexes formés étant composés essentiellement d'une molécule porteuse et d'une molécule d'acide nucléique, et (c) la séparation par électrophorèse des complexes formés, permettant la détermination de la séquence de l'acide nucléique. 4. Procédé de traitement d'un échantillon d'acides nucléiques, comprenant la mise en contact de l'échantillon avec une quantité suffisante d'une molécule porteuse chargée positivement, dans des conditions assurant la formation de complexes entre la molécule porteuse et les ou des acides nucléiques de l'échantillon, les complexes formés étant composés essentiellement d'une molécule porteuse et d'une molécule d'acide nucléique. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la molécule porteuse chargée positivement possède un poids moléculaire élevé et une charge électrique positive supérieure à la charge négative de la molécule d'acide nucléique la plus grande que l'on désire analyser. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la molécule porteuse chargée positivement possède un poids moléculaire supérieur ou égale à 100 000 Dalton, de préférence à 200 000 Dalton, plus préférentiellement à 300 000 Dalton. 7. Procédé selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que la molécule porteuse est essentiellement polypeptidique. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la molécule porteuse chargée positivement est choisie parmi l'hémocyanine, l'hémoglobine, l'albumine et l'EIF3 PI 10. 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la molécule porteuse chargée positivement est d'origine recombinante ou synthétique. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la molécule porteuse chargée positivement comporte un groupe fonctionnel A. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le groupe fonctionnel A est choisi parmi l'avidine, un récepteur, un ligand, un anticorps, ou tout groupement réactif permettant d'assurer une liaison spécifique avec un partenaire défini. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la molécule porteuse possède : . un poids moléculaire élevé, de préférence supérieur ou égale à 100 000 Dalton, de préférence à 200 000 Dalton, plus préférentiellement à 300 000 Dalton, . une charge électrique positive choisie de sorte que le complexe formé avec la molécule d'acide nucléique à analyser la plus longue reste positif, et . un groupe fonctionnel A unique, choisi de préférence parmi l'avidine, un récepteur, un ligand, un anticorps, ou un fragment ou dérivé de ceux-ci conservant une spécificité, ou tout groupement réactif permettant d'assurer une liaison ou une interaction spécifique avec un partenaire défini. 13. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les acides nucléiques possèdent un groupe fonctionnel B. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le groupe fonctionnel B est un partenaire spécifique du groupe fonctionnel A porté par la molécule porteuse. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la molécule porteuse chargée positivement comporte un groupe avidine et en ce que les acides nucléiques comportant un groupe biotine. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'électrophorèse est une électrophorèse capillaire, réalisée de préférence dans des capillaires d'un diamètre inférieur à environ 200 m, ou dans des pistes gravées sur un substrat. 17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que l'acide nucléique est un acide nucléique simple brin, de préférence un ADN simple brin. 18. Composition comprenant un acide nucléique couplé à une molécule porteuse chargée positivement. 19. Composition selon la revendication 18, comprenant un mélange d'acides nucléiques complexés à une molécule porteuse chargée positivement, chaque complexe comprenant essentiellement une molécule porteuse et un acide nucléique. 20. Composition selon la revendication 18 ou 19, caractérisée en ce que le ou les acides nucléiques sont marqués. 21. Composition selon la revendication 18 ou 19, caractérisée en ce que la molécule porteuse est marquée. 22. Utilisation d'une molécule porteuse chargée positivement pour la séparation d'acides nucléiques en électrophorèse. 23. Kit pour l'analyse d'acides nucléiques, comprenant une molécule porteuse chargée positivement, présentant un poids moléculaire élevé et un groupe fonctionnel. 24. Kit pour le séquençage d'acides nucléiques, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule porteuse chargée positivement, présentant un poids moléculaire élevé et un groupe fonctionnel A et une amorce nucléotidique pour réaction de séquençage, comprenant un groupe fonctionnel B.