Brevet FR2817479A1 — publié le 20020607

Composition d'activation cellulaire, son procédé de fabrication et son utilisation pour le traitement de lésions. La présente invention concerne une composition implantable apte à stimuler physiologiquement des cellules renfermant des substances actives, en vue du traitement, par lesdites substances actives de lésions du corps humain ou animal ainsi qu'un procédé de fabrication d'une telle composition et l'utilisation d'une matrice biopolymérique déshydratée pour la fabrication d'une telle composition. De nombreuses cellules sont aujourd'hui connues pour leur aptitude à libérer des substances actives, telles que des facteurs de croissance, utiles pour le traitement du corps humain ou animal. Tel est le cas des thrombocytes encore appelés plaquettes qui libèrent des facteurs tels que le PAF (facteur d'activation des plaquettes), le PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes), le TFG (facteur de croissance tumoral), l'EGF (facteur de croissance épidermique). Il en est de même des macrophages monocytes qui libèrent le PDGF, le FGF (facteur de croissance des fibroblastes), le FAF (facteur d'activation des fibroblastes), le TGF. Toutefois, pour permettre cette libération, ces cellules sont activées par un activateur cellulaire. Les activateurs cellulaires des thrombocytes utilisés aujourd'hui sont classiquement le collagène, la thrombine, la trypsine, l'ADP, la sérotonine ou l'adrénaline. Ces activateurs présentent toutefois, du fait de leur nature et de leur origine, des risques d'immunisation et des risques biologiques. En effet, l'utilisation de protéines telles que la thrombine peut générer, lors d'un contact ultérieur avec la même substance, une réaction anaphylactique mettant en jeu le pronostic vital. Par ailleurs, il existe des risques de transmission virale (hépatite, HIV, prion) lors de l'utilisation de protéines d'origine animale. Sur cette base, plusieurs voies ont été explorées à ce jour. La première voie consiste à activer les cellules in vitro en vue de permettre la libération des facteurs de croissance puis à utiliser directement les substances actives libérées sur les lésions à traiter. Cette voie est notamment décrite dans le brevet EP-A-0202298. Toutefois, cette première voie ne permet pas d'obtenir une libération contrôlée et dans le temps de substances actives dans l'organisme. Par ailleurs, cette voie nécessite la mise en oeuvre d'étapes complexes pour l'isolement et la collecte des substances actives libérées. Une autre voie, basée sur le même principe que précédemment, consiste à incorporer ces substances actives dans une composition comprenant de la fibrine et/ou au moins un précurseur de celle-ci et au moins un autre polymère et/ou au moins un précurseur de celui-ci comme cela est décrit dans la demande internationale WO 00/15248. Une telle solution présente les mêmes inconvénients que ceux cités précédemment. Enfin, une autre voie consiste à réaliser une composition contenant d'une part des cellules lyophilisées et soumises à un traitement d'inactivation ou de destruction des virus d'autre part un biomatériau constitué d'une colle tissulaire ou de collagène comme l'illustre la demande internationale WO 99/24044. Dans ce cas, les cellules sont soumises à un traitement qui ne leur permet pas toujours de retrouver l'ensemble de leurs aptitudes fonctionnelles après reconstitution du lyophilisat. En outre, à nouveau le choix du biopolymère présente des risques d'immunisation et des risques biologiques tels que des risques de transmission virale, en particulier dans le cas du collagène ou de la thrombine, protéines d'origine animale. Enfin, un activateur classique, la thrombine, est à nouveau utilisé. Cette composition, bien qu'intéressante car permettant une libération progressive de substances actives, ne donne pas satisfaction du fait des problèmes évoqués ci-dessus. Le but de la présente invention est donc de proposer une composition dont la conception permet l'obtention d'une composition prête à l'emploi autorisant la mise en oeuvre de traitements autologues. Un autre but de la présente invention est de proposer une composition renfermant un activateur de type universel adaptable à tout type de cellules, cette composition permettant une libération prolongée dans le temps de substances actives contenues dans des cellules susceptibles d'être prélevées sur l'organisme à traiter. Un autre but de la présente invention est de proposer un procédé de fabrication d'une composition du type précité dont la mise en oeuvre est particulièrement aisée de manière à obtenir une composition prête à l'emploi directement incorporable à un prélèvement cellulaire. A cet effet, l'invention a pour objet une composition implantable apte à stimuler physiologiquement des cellules renfermant au moins une substance active en vue du traitement par lesdites substances actives de lésions du corps humain ou animal, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'au moins une matrice biopolymérique stérile déshydratée renfermant un activateur cellulaire nonenzymatique provoquant, au contact de cellules renfermant au moins une substance active, une libération par lesdites cellules de leur (s) substance (s) active (s), cet activateur cellulaire étant libérable à l'état hydraté de la matrice biopolymérique par solubilisation dans le milieu d'hydratation du biopolymère de manière à provoquer, au contact de cellules éventuellement présentes dans le milieu d'hydratation de la matrice biopolymérique, une libération des substances actives contenues dans lesdites cellules. Grâce à cette composition, les performances d'activation des cellules résultent de la synergie entre l'activité du biopolymère et l'activité de l'activateur cellulaire. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, l'activateur cellulaire est constitué d'une charge calcique. Cet activateur, qui peut être qualifié d'universel du fait de sa nature, peut être introduit soit par voie passive dans la cellule du fait de la surconcentration extra-cellulaire générant une diffusion calcique passive dans lesdites cellules, soit par l'intermédiaire du biopolymère interagissant avec la membrane de la cellule et favorisant l'entrée d'ions calcium dans ladite cellule. L'invention a encore pour objet un procédé de fabrication d'une composition implantable apte à la stimulation physiologique de cellules renfermant des substances actives en vue notamment du traitement par lesdites substances actives de lésions du corps humain ou animal, caractérisé en ce qu'on fixe un activateur cellulaire sur une matrice biopolymèrique stérile et en ce qu'on déshydrate le biopolymère par lyophilisation. L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une matrice biopolymérique stérile déshydratée renfermant un activateur cellulaire provoquant, au contact des cellules renfermant au moins une substance active, une libération par lesdites cellules de leur (s) substance (s) active (s) pour la fabrication d'une composition implantable de traitement des lésions du corps humain ou animal, cette composition étant du type précité. L'invention sera bien comprise à la lecture de la description suivante d'exemples de réalisation de l'invention. Conformément à l'invention, la composition, objet de l'invention, est constituée d'au moins une matrice biopolymérique stérile déshydratée renfermant un activateur cellulaire non-enzymatique provoquant, au contact des cellules renfermant au moins une substance active, une libération par lesdites cellules de leur (s) substance (s) active (s). La stérilisation de la matrice biopolymérique peut être obtenue de diverses manières, notamment par traitement par rayonnements, par la vapeur humide ou par microfiltration. Cette dernière méthode est préférée. Cette méthode permet en outre, lorsqu'elle s'accompagne d'une ultrafiltration, de purifier le polymère de manière à améliorer la biocompatibilité suivant la norme ISO/EN 10993, notamment le caractère non-pyrogène. La microfiltration s'effectue en milieu dilué et de préférence en mode tangentiel. Il en est de même de l'ultrafiltration qui permet en outre de reconcentrer le biopolymère. A titre d'exemple, la purification d'un polymère polysaccharidique peut s'effectuer comme suit. Le matériel nécessaire est constitué d'une pompe péristaltique fonctionnant en boucle sur une cartouche de filtration tangentielle sartocon microsart (marques déposées) de chez SARTORIUS à membrane en polysulfone. Cette pompe est équipée d'une cartouche de microfiltration à 0,2 Mm et d'une cartouche d'ultrafiltration 100000D. La solution de polymère choisie est une solution de pectine LM (fabricant DANISCO) à 0,5%. Le débit de la pompe est choisi à 125 ml/mn, la température est de 250C et le temps de circulation de cinq heures. La pression de rétentat est de 7 psig. La microfiltration permet d'obtenir à partir d'une solution opalescente une solution transparente pratiquement incolore et dépourvue de germes. L'ultrafiltration permet d'obtenir une solution cristalline, décolorée et dépyrogénée puisque le dosage des endotoxines par la méthode LAL montre un dosage d'endotoxines réduit de 2,5 UI endotoxines/mg à 0,06 UI/mg. De plus, le polymère voit sa concentration en solution augmentée puisque, après filtration, elle est égale à 4, 5 %. De préférence, la matrice telle que décrite ci-desssus est constituée d'au moins un biopolymère polysaccharidique. Ce biopolymère polysaccharidique peut être constitué d'au moins un polysaccharide neutre choisi parmi l'agarose, la cyclodextrine, l'amidon, l'hydroxyéthylamidon , la cellulose, les dérivés éther de cellulose, les dérivés acétate de cellulose, les dérivés acyle de cellulose, le glucomanne, le guar. Le biopolymère polysaccharidique peut encore être constitué d'au moins un dérivé de polysaccharide aminé choisi parmi la chitine, le chitosan, le glucane, la polygalactosamine. Ce biopolymère polysaccharidique peut encore être constitué d'au moins un polysaccharide carboxylé choisi dans le groupe de la pectine, la gomme arabique, la gomme ghutte, le karaya, la gellane, la xanthane, le beijerane, le hyaluronane et la cellulose carboxyméthylée. Ce biopolymère peut encore être constitué d'au moins un polysaccharide choisi dans le groupe des polysaccharides sulfatés incluant les carragenanes, les furcellaranes, les sulfates de cellulose et le sulfate de dextran. Enfin ce biopolymère peut être choisi dans le groupe constitué par l'alcool polyvinylique, le polyvinylacétate, le polyvinylpyrolidone et les polyesters. L'avantage d'un biopolymère polysaccharidique est en outre de favoriser la conservation des cellules, en particulier lorsque celles-ci seront soumises, après mise en contact avec le biopolymère, à un traitement de conservation tel qu'une congélation. L'activateur cellulaire est quant à lui constitué d'une charge calcique, généralement sous forme d'un sel soluble par exemple (chlorure, acétate, sulfate). Pour permettre l'incorporation à la matrice de cet activateur, au moins l'un des biopolymères constitutif de la matrice comporte des groupements électro-attractifs tels que des groupements carboxyle ou hydroxyle auxquels l'activateur cellulaire est lié par liaison ionique ou dative. Ainsi, dans un premier mode de réalisation de l'invention, la fabrication de la composition s'effectue comme suit. Trois grammes de hyaluronane de sodium sont soumis à une étape de microfiltration et d'ultrafiltration conformément à ce qui a été décrit ci-dessus puis introduits de manière aseptique sous hotte dans une poche souple. 0, 45g de chlorure de calcium en solution dans 30 ml d'eau distillée sont également introduits dans ladite poche de manière aseptique. La quantité de calcium introduite au cours de cette étape est choisie de telle sorte que la charge calcique libérée dans le milieu d'hydratation du polymère après réhydratation de ce polymère est au moins égale à 3 % (m/m) de la masse de polymère déshydraté. L'ensemble est mélangé dans un homogénéisateur de type péristaltique, tel qu'un stomacher, puis lyophilisé dans des conditions telles que suit. La poche est congelée dans une position à plat pour en minimiser l'épaisseur puis séchée par lyophilisation sur un plateau après ouverture de la poche pour permettre la sublimation de l'eau. Dans ce cas, la liaison entre le biopolymère et l'activateur cellulaire est une liaison qui s'effectue par l'intermédiaire des groupements carboxyle. Dans un autre mode de réalisation de la composition, le biopolymère est un biopolymère poreux tel que de l'amidon et l'activateur cellulaire est à nouveau une solution d'un sel calcique telle que du chlorure de calcium mélangée au biopolymère de la matrice avant déshydratation de la matrice biopolymérique. Le dépôt de sel calcique s'effectue dans ce cas dans les pores du biopolymère avec un léger effet dipôle des groupements hydroxyles. La préparation de la composition s'effectue alors comme suit. lg d'amidon est mélangé à 0,125 g de chlorure de calcium (CaC12) en solution dans 5 ml d'eau distillée. Ce mélange introduit de manière stérile dans une poche est soumis à un séchage par lyophilisation ou sous hotte à flux laminaire. De manière analogue, lg de PVA (polyvinylacétate) peut être mélangé à 0, 150g d'acétate de calcium en solution dans 10 ml d'eau distillée. L'ensemble, introduit de manière stérile dans une poche, est ensuite séché sous hotte à flux laminaire. Au moment de l'utilisation de la composition, il est nécessaire de procéder à la réhydratation de la composition et de la mettre en contact avec des cellules à activer. La réhydration permet la libération par solubilisation de l'activateur dans le milieu d'hydratation. Du fait de la nature du polymère, la matrice biopolymérique, de préférence résorbable, se présente à l'état hydraté sous forme d'un gel ou d'une pâte. La résorption de la matrice peut être obtenue par différents moyens en fonction de la nature du polymère. En effet, pour être résorbé, le polymère est dégradé soit physiquement par érosion, soit chimiquement par hydrolyse, soit par une combinaison des deux modes de dégradation. Certains polymères sont ainsi érodés, désintégrés et solubilisés puis éliminés par l'organisme, sans modification, par voie urinaire comme cela est le cas pour le dextrane. D'autres, tels que les polyalkanoates, à l'inverse, subissent des hydrolyses chimiques entraînant la formation de molécules métabolisables. D'autres enfin, sont métabolisés après hydrolyse enzymatique comme cela est le cas pour la chitine, le hyaluronane et les glucanes. Cette résorption est plus particulièrement importante dans le cas d'une application de la composition au traitement de lésions internes du corps humain ou animal. Le milieu d'hydratation est quant à lui fonction du type de cellules utilisées. Ces cellules peuvent être des monocytes ou des thrombocytes. Ainsi, dans le cas où les cellules contenant des substances actives libérables sous l'action de l'activateur cellulaire sont des thrombocytes incorporant des facteurs de croissance et/ou d'angiogénèse, on utilise de préférence comme milieu d'hydratation le plasma contenant ces thrombocytes. Ce plasma, appelé plasma riche en plaquettes (PRP), est obtenu à partir d'un prélèvement de sang constitué de préférence par le sang du patient à traiter. Ainsi, 60 millilitres de sang et 6 millilitres d'une solution de citrate et de dextrose sont soumis à une centrifugation à 140 g pendant vingt minutes à 40C. A l'issue de cette centrifugation, on obtient 50 ml de plasma riche en plaquettes. Ce plasma riche en plaquettes est directement introduit, de manière aseptique, dans la poche contenant la matrice biopolymérique stérile, puis soumis à une agitation au moyen d'un appareil tel qu'un stomacher pour permettre l'absorption du plasma par la matrice biopolymérique. Cette absorption est facilitée par le fait qu'au moins un des biopolymères constitutifs de la matrice est amphiphile. Il est également possible d'utiliser, dans le cas où le plasma riche en plaquettes est soumis à une nouvelle centrifugation, uniquement le culot plaquettaire et de le mélanger avec une solution physiologique aqueuse, telle qu'une solution de Ringer stérile, renfermant des cations, de préférence monovalents, tels que du sodium, aptes à être échangés avec les ions calcium de la matrice biopolymérique au cours de son hydratation. On constate en effet que la solution de Ringer utilisée notamment dans le milieu chirurgical présente une composition sensiblement similaire à celle du plasma sanguin, notamment en ce qui concerne la présence du type d'ions présents dans ladite solution à savoir des ions sodium, calcium, potassium et chlorure. Pour confirmer l'efficacité de la composition ci-dessus, une étude a été effectuée portant sur un gel de pectate placé dans un milieu biologique reconstitué. Ainsi, 3g de pectate de sodium LM ont été mélangés avec 0, 83g de chlorure de calcium (CaCl2) en solution dans 30 ml de milieu biologique reconstitué. Par milieu biologique reconstitué, on entend ici un milieu constitué de 500 ml de sérum physiologique Aguettant (marque déposée) additionné de 0,13 g de chlorure de calcium sec. Ce milieu est soumis à une microfiltration sur membrane de 0,2 Mm avant d'être mélangé au pectate de sodium LM. L'ensemble pectate/chlorure de calcium en solution est introduit dans une poche puis soumis à un mélange au moyen d'un stomacher comme décrit ci-dessus avant d'être lyophilisé. Environ 3g de pectate de calcium du lyophilisat ci-dessus sont ensuite mis en contact avec 50 ml de plasma riche en plaquettes. Le mélange est homogénéisé. Ce mélange est placé dans le compartiment supérieur d'un insert, ce compartiment supérieur étant séparé d'un compartiment inférieur par une membrane. Le compartiment inférieur contient le milieu biologique reconstitué décrit ci-dessus. La membrane laisse diffuser le PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes permettant la prolifération cellulaire) qui est dosé à des temps déterminés dans le liquide biologique du compartiment inférieur de l'insert. Ce dosage du PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes) est effectué sur vingt-quatre heures par mesure de la concentration de ce facteur de croissance par millilitre de solution. Les résultats sont fournis dans le tableau ci-après. Concentration To To + lh To + 5h To + 12h To + 24h cumulée de PDGF dans la 0 32 187 260 284 solution en mg/ml Ces résultats montrent clairement une libération progressive du facteur de croissance dans le milieu d'hydratation du polymère. REVENDICATIONS 1. Composition implantable apte à stimuler physiologiquement des cellules renfermant au moins une substance active en vue du traitement par lesdites substances actives de lésions du corps humain ou animal, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'au moins une matrice biopolymérique stérile déshydratée renfermant un activateur cellulaire non-enzymatique provoquant, au contact de cellules renfermant au moins une substance active, une libération par lesdites cellules de leur (s) substance (s) active (s), cet activateur cellulaire étant libérable à l'état hydraté de la matrice biopolymérique par solubilisation dans le milieu d'hydratation du biopolymère de manière à provoquer, au contact de cellules éventuellement présentes dans le milieu d'hydratation de la matrice biopolymérique, une libération des substances actives contenues dans lesdites cellules. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'activateur cellulaire est constitué d'une charge calcique. 3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'activateur cellulaire est une solution d'un sel calcique tel que du chlorure de calcium mélangée à au moins un biopolymère de la matrice avant déshydratation de la matrice biopolymérique, le biopolymère étant de préférence poreux. 4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'au moins l'un des biopolymères constitutifs de la matrice comporte des groupements électro-attractifs tels que des groupements carboxyles ou hydroxyles auxquels l'activateur cellulaire est lié par liaison ionique ou dative. 5. Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'au moins l'un des biopolymères constitutifs de la matrice est amphiphile. 6. Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la matrice biopolymérique, de préférence résorbable, se présente à l'état hydraté sous forme d'un gel ou d'une pâte. 7. Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la matrice biopolymérique est constituée d'au moins un biopolymère polysaccharidique, cette matrice étant de préférence stockée avant hydratation dans une poche souple stérile. 8. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que le biopolymère polysaccharidique est constitué d'au moins un polysaccharide neutre choisi parmi l'agarose, la cyclodextrine, l'amidon, l'hydroxyéthylamidon, la cellulose, les dérivés éther de cellulose, les dérivés acétate de cellulose, les dérivés acyle de cellulose, le glucomanne, le guar. 9. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que le biopolymère polysaccharidique est constitué d'au moins un dérivé de polysaccharide aminé choisi parmi la chitine, le chitosan, le glucane, la polygalactosamine. 10. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que le biopolymère polysaccharidique est constitué d'au moins un polysaccharide carboxylé choisi parmi la pectine, la gomme arabique, la gomme ghutte, le karaya, la gellane, le xanthane, le beijerane, le hyaluronane et la cellulose carboxyméthylée. 11. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que le biopolymère est constitué d'au moins un polysaccharide choisi dans le groupe des polysaccharides sulfatés incluant les carragenanes, les furcellaranes, les sulfates de celluloses et le sulfate de dextran. 12. Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'au moins l'un des biopolymères de la matrice est choisi dans le groupe constitué par l'alcool polyvinylique, le polyvinylacétate, le polyvinylpyrolidone, les polyesters. 13. Composition selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que la charge calcique libérée dans le milieu d'hydratation après réhydratation du biopolymère est au moins égale à 3% (masse/masse) de la masse de polymère déshydraté. 14. Composition selon l'une des revendications 2 à 13, caractérisée en ce que le milieu d'hydratation de la matrice biopolymérique est une solution physiologique aqueuse telle qu'une solution de Ringer, ou du plasma sanguin renfermant des cations, de préférence monovalents, tels que du sodium, aptes à être échangés avec les ions calcium de la matrice biopolymérique au cours de son hydratation. 15. Composition selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que les cellules contenant des substances actives libérables sous l'action de l'activateur cellulaire sont des thrombocytes ou des monocytes incorporant des facteurs de croissance et/ou d'angiogénèse. 16. Procédé de fabrication d'une composition implantable apte à la stimulation physiologique de cellules renfermant des substances actives en vue notamment du traitement par lesdites substances actives de lésions du corps humain ou animal selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce qu'on fixe un activateur cellulaire sur une matrice biopolymèrique stérile et en ce qu'on déshydrate le biopolymère par lyophilisation. 17. Procédé de fabrication selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'on réhydrate la matrice biopolymérique par mise en contact avec un milieu d'hydratation de manière à provoquer une libération par solubilisation de l'activateur cellulaire dans le milieu d'hydratation du biopolymère et en ce qu'on incorpore dans le milieu d'hydratation du biopolymère des cellules contenant des substances actives libérables sous l'action dudit activateur cellulaire. 18. Utilisation d'une matrice biopolymérique stérile déshydratée renfermant un activateur cellulaire provoquant au contact de cellules renfermant des substances actives une libération par lesdites cellules de leurs substances actives pour la fabrication d'une composition implantable de traitement des lésions du corps humain ou animal conforme à l'une des revendications 1 à 16.