Brevet FR2817967A1 — publié le 20020614

L'invention est relative à un procédé de magnétisation de marqueurs chimiques ou biologiques ainsi qu'à l'utilisation desdits marqueurs biologiques dans un test d'analyse biologique. Elle concerne particulièrement la magnétisation de cellule, notamment d'hématies portant sur leur surface des antigènes de groupe sanguin, ou la magnétisation d'anticorps. Les tests d'analyse immunologique concernent alors typiquement la recherche, dans du sang ou dans un composant sanguin, d'antigènes présents à la surface des globules rouges à l'aide d'anticorps anti-érythrocytaires magnétisés (par exemple typage érythrocytaire) ou la recherche d'anticorps anti-érythrocytaires à l'aide d'hématies magnétisées sur lesquelles sont présents et/ou fixés des antigènes spécifiques. On connaît déjà des procédés de magnétisation de marqueurs à l'aide de particules magnétiques dans lesquels les particules sont liées aux marqueurs par des liaisons spécifiques ou covalente. Ce type de procédé utilise des particules magnétiques dont la surface a été fonctionnalisée de sorte à former des liaisons avec un marqueur spécifique. Il présente donc l'inconvénient de nécessiter la préparation de particules magnétiques spécifiques en fonction du marqueur à magnétiser. En outre, ce couplage spécifique ou covalent est quelque fois difficile à réaliser et est conditionné par l'utilisation d'un nombre limité de combinaisons (couple antigène-anticorps, couple avidine-biotine...). Cette technique nécessite donc soit de posséder un certain type d'anticorps ou d'antigène, soit de marquer spécifiquement les molécules effectrices par la biotine. Par ailleurs, la conservation (durée de conservation, température de stockage...) de ces particules fonctionnalisées est en grande partie liée à la fragilité de la molécule fixée à la surface de la particule. L'invention vise donc à remédier à l'ensemble de ces inconvénients en proposant notamment un procédé de magnétisation direct d'éléments articulaires et/ou figurés sans l'intermédiaire de molécules reconnaissant par exemple des structures de type antigène et/ou anticorps et ceci sans masquer et/ou modifier les structures devant être mises en oeuvre par exemple au cours d'un test d'analyse biologique. A cet effet, et selon un premier aspect, l'invention propose un procédé de magnétisation de marqueurs chimiques ou biologiques à l'aide de particules magnétiques, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : - activer les particules magnétiques de sorte à modifier leur état de surface ; - mettre en contact les particules magnétiques activées avec les marqueurs de sorte à créer des liaisons non spécifiques entre eux. Selon un deuxième aspect, l'invention propose une utilisation de marqueurs biologiques magnétisés par la mise en oeuvre d'un tel procédé comme réactifs ou analytes dans un test d'analyse biologique. D'autres objets et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la description qui suit. Le procédé permet de magnétiser des marqueurs à l'aide de particules magnétiques par création de liaisons non spécifiques entre eux. Les marqueurs peuvent être chimiques, par exemple sous forme moléculaire, ou biologique, par exemple sous forme cellulaire, et les particules magnétiques sont par exemple des billes de polymères compatibles qui sont chargées avec un matériau magnétique. Un marqueur est en contact avec son environnement immédiat par l'intermédiaire de sa surface et, dans le cas d'un élément cellulaire, par l'intermédiaire de sa membrane. Celle-ci peut être décrite comme une bicouche de phospholipides dans laquelle surnage une mosaïque fluide de protéines plus ou moins glycosilées. La diversité moléculaire de la membrane ainsi que sa grande fluidité suivant les conditions environnementales, lui autorisent l'établissement d'une multitude de relations avec le milieu extérieur. La cellule possède en quelque sorte un arsenal de liaisons possibles avec diverses structures moléculaires environnantes, telles que les particules magnétiques. Ainsi, la cellule est capable d'établir des liens avec des éléments aussi bien de manière : - spécifique, par exemple lorsqu'une structure réceptrice de la membrane est reconnue par un effecteur qui lui est spécifique (par exemple dans le cas de liaisons hormone-récepteur ou de liaisons antigène-anticorps) ; - non spécifique, par adsorption passive desdites molécules à sa surface ; par exemple dans le cas des antigènes du système Lewis, adsorbés à la surface du globule rouge humain. Cette membrane cellulaire, première structure de rencontre de la cellule, va donc être le siège d'interactions importantes tant pour la cellule que pour le milieu extérieur. Elle porte à sa surface la majorité des structures moléculaires d'identification de la cellule, mais également des structures capables de se lier spécifiquement ou non à des molécules étrangères. Dans un exemple particulier, les marqueurs sont des hématies dont la membrane cellulaire est le support des structures antigéniques définissant les divers groupes sanguins qui sont recherchés avant toute transfusion sanguine. Actuellement de très nombreux systèmes de diagnostic pour la recherche soit des anticorps présents dans un milieu biologique soit de structures antigéniques provoquant une réponse de l'hôte sont basés sur l'utilisation de particules magnétiques fonctionnalisées. Par exemple, pour le tri d'une population de cellules présentant l'antigène CD4 dans un échantillon de sang humain, il est possible de fixer spécifiquement une particule ferromagnétique à la surface de cellules CD4 positives par l'intermédiaire d'un anticorps approprié. Il suffit alors de soumettre l'ensemble de l'échantillon de sang à un champ magnétique, afin d'isoler de la population les cellules ayant interagit avec les particules. Ces techniques sont basées exclusivement sur l'utilisation de particules magnétiques de natures diverses mais présentant une caractéristique fondamentale qui est la fonctionnalisation de leur surface de contact par une molécule de reconnaissance. Autrement dit par fixation de manière covalente des molécules présentant des propriétés de reconnaissance spécifique du marqueur. Par exemple, on peut fixer à la surface de ces particules des protéines de type anticorps qui vont pouvoir reconnaître spécifiquement les antigènes qui leurs correspondent, permettant ainsi la fixation indirecte par leur intermédiaire de la particule magnétique à la structure antigénique (quelle soit articulaire ou soluble). De même, la fixation de molécule de type avidine ou streptavidine permet de créer un pont spécifique entre les particules et tout élément qu'il soit figuré ou soluble présentant à sa surface des molécules de biotine. A contrario, le procédé suivant l'invention utilise les larges zones de phospholipides et/ou de protéines présentes à la surface d'une hématie, lesdites zones n'intervenant pas directement dans la définition des groupes et phénotypes sanguins. En effet, ces zones se révèlent d'un grand intérêt si on les fonctionnalise au travers de liaisons avec des éléments extérieurs, conférant ainsi à l'hématie des propriétés dynamiques, par exemple des propriétés de déplacement dans un environnement particulier. Dans le cas où des particules paramagnétiques sont liées de façon non spécifique sur ces zones, les globules rouges ainsi magnétisés présentent la double propriété d'être attirés sous l'effet d'un champ magnétique et de porter sur leur surface les structures antigéniques mentionnées ci-dessus. On utilise ainsi la propriété des membranes cellulaires à pouvoir établir une multitude d'interactions dites non spécifiques avec des particules de sorte à utiliser la propriété cinématique des particules et ainsi transmettre aux hématies cette faculté de mobilité. L'hématie magnétisée va donc pourvoir conserver ses propriétés d'expression d'une structure antigénique tout en étant mobile. Dans le cadre du procédé, on traite des marqueurs, et notamment des hématies, de telle manière que leur susceptibilité magnétique soit fortement augmentée, leur permettant ainsi de migrer dans un champ magnétique créé par un aimant permanent ou un électro-aimant. Ce marquage magnétique ne se fait pas par l'intermédiaire d'une molécule sonde magnétisée mais par l'utilisation de particules interagissant de façon non spécifique avec la membrane de l'hématie de sorte à créer une multitude de liaisons de faible intensité entre la surface de l'hématie et les particules magnétiques. A cet effet, on utilise des particules magnétiques qui présentent comme caractéristiques d'avoir une très grande homogénéité de taille, notamment inférieure au micron et par exemple d'environ 200 nm, une forte charge en matériau ferromagnétique par exemple environ 75% en masse et un état de surface plutôt hydrophobe. Dans un exemple particulier, la taille des marqueurs est supérieure à celle des particules utilisées pour permettre le transfert dans le champ magnétique. Ces particules sont fixées à la surface de l'hématie par exemple par l'intermédiaire de sérum albumine bovine de sorte à créer de multiples liaisons non spécifiques et de faibles intensités entre la surface de l'hématie et les particules. La nature des interactions dites faibles entre les particules et les marqueurs dont on doit augmenter la susceptibilité magnétique est largement tributaire de l'état de surface des particules. Cet état de surface peut être de type hydrophobe et/ou hydrophile. Il est le résultat de techniques de production adaptées favorisant l'un ou l'autre état de surface. A cet effet, la fixation se déroule en deux étapes, la première consiste en l'activation des particules de sorte à modifier leur état de surface et la deuxième est la mise en présence de ces particules activées avec une suspension d'hématies traitées ou non par des enzymes protéolytiques, de sorte à créer des liaisons non spécifiques entre les particules et les hématies. L'activation peut être réalisée soit extemporanément avant la mise en contact avec le marqueur soit de fabrication. Les hématies ainsi obtenues sont attirées par un champ magnétique et peuvent ainsi être utilisées directement ou, dans une variante, traitées par des solutions d'enzymes généralement rencontrées dans les tests immuno-hématologiques. On décrit ci-dessous un mode de réalisation du procédé pour magnétiser des hématies sans endommager les antigènes qu'elles portent, dans lequel l'activation des particules est réalisée à l'aide d'une substance collante comprenant une solution d'albumine bovine. Première étape : activation des particules ferromagnétiques Des particules de type P201 de la société Ademtech sont mises en présence d'une solution d'albumine bovine à 0,1% (poids/volume) en tampon PBS pH 7,2. Après une incubation de trente minutes à température ambiante et sous agitation (proscrire toute agitation magnétique), les particules en suspension sont attirées par un aimant et le surnageant dépourvu de particules est éliminé. Le culot de particules encollées peut être utilisé directement au cours de la phase de sensibilisation des hématies. Suivant une autre réalisation, l'activation des particules peut être effectuée, éventuellement en plus de l'action d'une substance collante, à l'aide d'agent mouillant ou détergent tel que l'acide colique ou le Tween 200 de sorte à modifier l'état de surface desdites particules. Suivant une réalisation supplémentaire, cette activation peut être effectuée à l'aide d'un rayonnement électromagnétique, tel qu'un rayonnement gamma ou UV, qui sont connus comme modifiant les surfaces de type plastique. Deuxième étape : sensibilisation des hématies Est ajouté, au culot de particules ferromagnétiques encollées, la suspension globulaire mise en tampon LISPS (Low lonic Strenght Solution) à la concentration adéquate (possibilité de travailler avec des suspensions cellulaires comprises entre 0,6 à 10% et préalablement lavées trois fois ou non avec de l'eau physiologique par exemple). Après avoir parfaitement homogénéisé la suspension (vérifier qu'il n'existe plus d'agrégats de particules), celle-ci est incubée trente minutes à température ambiante sous agitation douce mais homogène (l'ensemble du volume réactionnel doit être mis en mouvement). Les hématies sont ensuite lavées avec un tampon PBS pH 7, 4 (deux lavages par centrifugation, trois minutes à 500g). Le culot d'hématies sensibilisées peut être ensuite repris à la concentration de mise en oeuvre de l'analyse à l'aide d'un tampon de LISS Dans un exemple particulier, le rapport entre la quantité de particules mises en oeuvre et la quantité d'hématies est compris entre 600 et 1000 de sorte à obtenir une magnétisation suffisante sans risquer de dégrader) les antigènes présents à la surface de l'hématie. La surface occupée par les particules représente typiquement de l'ordre de 10% de la surface totale de la membrane de l'hématie. L'utilisation de cette méthode permet ainsi d'augmenter la susceptibilité magnétique des hématies sans altérer les antigènes qu'elles portent. Ces hématies sensibilisées par les particules paramagnétiques présentent alors la double propriété d'être attirée par un champ magnétique et également de posséder à leur surface les antigènes sanguins (groupe et phénotype). Elles pourront alors être utilisées comme support de réaction et vecteur de transport du couple antigène-anticorps dans un test d'analyse immunologique. Par exemple, les hématies ainsi obtenues peuvent être utilisées dans des tests de type RAI (Recherche d'Agglutinines Irrégulières) soit directement en tant que réactif ou en tant qu'analyte, soit subir un traitement par des enzymes protéolytiques telle que la papaïne pour effectuer une analyse dite enzymatique. En effet, ces hématies présentant à leur surface des particules ferromagnétiques leur conférant une propriété paramagnétique, peuvent être entraînées sous l'action d'une force magnétique vers la zone réactive d'un dispositif de visualisation de sorte à permettre la détection d'anticorps dirigés contre des déterminants antigéniques présents à la surface des hématies. Il est également possible de traiter directement à l'aide du procédé décrit les globules rouges en tant qu'analyte d'un échantillon de sang pour les rendre paramagnétiques, et ainsi permettre la migration desdits globules rouges vers une zone apte à détecter les antigènes qu'ils supportent. Dans d'autres modes de réalisation, des éléments articulaires, par exemple des anticorps, peuvent être traités de sorte à être rendus paramagnétiques au moyen d'une méthode analogue à celle présentée ci-dessus. Dans le cas d'anticorps magnétisés, ils peuvent être utilisés pour l'entraînement desdites hématies par exemple pour leur groupage. Suivant d'autres modes de réalisation, des marqueurs chimiques peuvent être traités de sorte à être rendus paramagnétiques au moyen d'une méthode analogue à celle présentée ci-dessus. De tels marqueurs magnétisés présentent alors la double propriété d'être attirés sous l'effet d'un champ magnétique et de conserver une surface fonctionnelle pour permettre le couplage de toutes sortes de molécules chimiques ou biologiques. Le procédé de l'invention permet une magnétisation directe de marqueurs, et notamment d'éléments figurés, sans l'utilisation de molécules couplées de manière covalente. Par ailleurs, l'interaction entre les particules et les marqueurs est non définitive. Il existe donc une possibilité de retrouver après désorption des particules les marqueurs dans leur état initial. Cette étape de désorption peut se faire dans des conditions douces n'altérant pas la surface du marqueur. Le procédé présente également l'avantage de la rapidité et de la simplicité de la mise en place de l'interaction entre les marqueurs et les particules, simplement sous l'influence des probabilités de rencontre des éléments devant interagir. En outre, les particules utilisées sont des produits non biologiques dont la durée de conservation est très longue et sans commune mesure avec celle de particules fonctionnalisées avec des produits biologiques qui sont reconnues pour être d'une grande instabilité dans le temps. Enfin, il n'est pas nécessaire de développer un nouveau couple particulemarqueur pour chaque utilisation car un type de particules est utilisable vis-àvis de différents marqueurs (globules rouges, plaquettes sanguines, autres cellules, parasites...) possédant les mêmes caractéristiques de surface (zones hydrophobes et/ou hydrophiles). REVENDICATIONS 1. Procédé de magnétisation de marqueurs chimiques ou biologiques à l'aide de particules magnétiques, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : - activer les particules magnétiques de sorte à modifier leur état de surface ; - mettre en contact les particules magnétiques activées avec les marqueurs de sorte à créer des liaisons non spécifiques entre eux. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'activation des particules magnétiques est réalisée à l'aide d'une substance collante. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la substance collante comprend une solution d'albumine bovine. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'activation des particules magnétiques est réalisée à l'aide d'un agent mouillant ou détergent. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'activation des particules magnétiques est réalisée à l'aide d'un rayonnement électromagnétique. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les marqueurs sont des cellules, par exemple des hématies portant sur leur surface des antigènes de groupe sanguin. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les marqueurs sont des anticorps. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le rapport entre la quantité de particules mises en oeuvre et la quantité de marqueurs est compris entre 600 et 1000. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la taille des particules est inférieure au micron et par exemple d'environ 200 nm. 10. Utilisation de marqueurs biologiques magnétisés par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9 comme réactifs ou analytes dans un test d'analyse biologique.