Brevet FR2813080A1 — publié le 20020222

La présente invention concerne un composé présentant une activité anti-héparine, de la formule Z - Bm - (AXA)X - Bn - (AXA)y - Bo - (AXA)Z - Bp, les réactifs de diagnostic le comprenant et l'utilisation dudit composé dans un test de diagnostic in vitro ou pour la fabrication d'un médicament à visée anti-héparine. L'héparine non fractionnée (HNF) est un polysaccharide sulfaté naturel, de la famille des glycosaminoglycanes. On l'extrait essentiellement de la muqueuse intestinale de porc ou de b#uf. C'est un produit hétérogène par la composition de ses unités saccharidiques ; ce fait, la charge ionique de la molécule est également hétérogène : de sulfatation différent des unités glucosamine sulfate et nombre de fonctions carboxyliques différentes au niveau des unités acide iduronique et glucuronique [l, 2]. Les caractères physiques essentiels de l'héparine sont : polyanionicité et sa forte densité de charges. En effet, chaque disaccharide porte 3 à 4 charges négatives (sulfates et carboxylates). Un arrangement particulier des différentes unités de l'héparine forme le pentasaccharide de manière reproductible tout au long de la séquence. Ce pentasaccharide est connu comme étant le site de reconnaissance de l'héparine à l'antithrombine III, générant entre ces deux entités une forte affinité et par voie de conséquence une activité anticoagulante élevée [3]. Les chaînes ne contenant pas de pentasaccharide sont pratiquement dépourvues d'activité anticoagulante (seulement 1/3 de la molécule d'héparine présente cette affinité pour l'ATIII) [4]. L'héparine non fractionnée (HNF) est une macromolécule polydisperse : les préparations commerciales à base d'HNF ont un poids moléculaire compris entre 12000 et 18000 Da. Ces préparations sont utilisées principalement dans le but d'une action préventive ou curative vis-à-vis des thromboses. Il est possible de fractionner l'HNF par la taille (après traitement chimique), ce qui conduit à la famille des HBPM (héparines de bas poids moléculaire) [5]. L'HNF a une activité équivalente sur les facteurs lia et Xa. Par contre, les HBPM gardent une activité anti-Xa élevée et une activité anti-IIa qui diminue avec la taille de la molécule d'HBPM. Une activité anti-IIa élevée pouvant présenter des effets secondaires hémorragiques, les HBPM peuvent être utilisés de façon avantageuse comme anticoagulant à la place des HNF. Cependant, l'utilisation des héparines HNF ou HBPM en thérapie peut requérir l'administration de composés neutralisant leurs effets anti-coagulants, notamment à la fin des interventions sur le système circulatoire, telles que par exemple la circulation extra-corporelle. Par ailleurs, dans certains tests de diagnostic in vitro, la présence d'héparine dans les échantillons peut conduire à des interprétations erronées des résultats. Il s'avère donc nécessaire de disposer également de composés aux propriétés anti-héparine pour le diagnostic. La Protamine sulfate est le seul composé connu capable de neutraliser in vivo les effets anti-coagulants de l'héparine. La protamine appartient à la famille des protéines basiques riches en résidus arginine, est purifiée à partir du sperme de saumon [6 - 7] et neutralise l'héparine grâce à ses charges positives [8 - 10]. Toutefois, la protamine provoque des effets secondaires hémodynamiques et hématologiques tels que l'hypotension, la bradycardie, la thrombocytopénie et la leucopénie [11 - 15]. En fait, il a été démontré que les charges positives de la protamine sont directement proportionnelles à l'efficacité de neutralisation de l'héparine, mais aussi à la toxicité de la molécule [16]. La Poly L-Lysine et le Polybrène sont d'autres composés connus pour neutraliser l'héparine. Toutefois, ces polycations apparaissent également trop toxiques pour une utilisation clinique. Wakefield et al. (WO 95/13083) décrivent des variants de la protamine qui seraient moins toxiques. Il s'agit de peptides possédant une séquence de 20 à 40 acides aminés, avec une charge positive comprise entre +14 et +18 et dont la structure correspond à des clusters de résidus positifs entrecoupés d'acides aminés neutres. Harris et al. (EP 999219) décrivent des peptides anti-héparine linéaires ou branchés comprenant une succession de clusters d'Arginine et d'Alanine. Cependant, les documents précités ne comportent aucun enseignement sur la nécessité de posséder des agents anti-héparine en diagnostic. La présente invention a pour objet de nouvelles molécules synthétiques utiles en tant qu'agents neutralisant l'héparine. Les propriétés des molécules de la présente invention ont été plus particulièrement étudiées dans des réactifs de diagnostic in vitro. Outre leur capacité à être insensibles aux effets de l'héparine éventuellement présente dans les échantillons sanguins testés, il peut être également nécessaire pour certains de ces réactifs de diagnostic de présenter une faible turbidité. Cette propriété est particulièrement importante dans le cas des réactifs contenant de la thromboplastine pour la détermination du temps de Quick, notamment sur des automates à détection optique. Les molécules dont la formule générale 1 est explicitée ci-dessous permettent de répondre à ces deux critères. Elles se montrent donc particulièrement utiles pour neutraliser les éventuelles interférences liées à la présence d'héparine tant à des fins diagnostiques que thérapeutiques. Ainsi, la présente invention se rapporte à un composé présentant une activité antihéparine, de formule générale 1 suivante: Z - B. - (AXA), - Bn - (AXA)y - Bo - (AXA). - Bp dans laquelle * Z a pour formule générale: -N-Cx-CH-C02H avec Cy = - liaison covalente -CH2Cy-Cx - CO - - CO - S - -(CH2)n-Xavec Parmi les composés préférés de l'invention, on note plus particulièrement les composés dans lesquels m, n, o sont égaux à 4 et p égal à 2. * AXA représente une chaîne hydrocarbonée correspondant à la formule: - NH - (CH2)n - CO - , n étant un nombre entier compris entre 2 et 6; x, y et z représentent indépendamment les uns des autres un nombre entier compris entre 1 et 6. Avantageusement, Z est sélectionné parmi les composés suivants: H2N, Apc Acide 4-amino-pyrolidine-2- #N #CO2H carboxylique CO2H Aze Acide azetidine-2-carboxylique / \ Cop Acide 2-carboxymorpholine H-N C02H Disc Acide 1,3-dihydro-2H-isoindole carboxylique Hyp Hydroxyproline H-N-CH CO2H Hyp CH Acide 4-hydroxypyrolidine-2- OH carboxylique Inc Acide indoline-2-carboxylique @ N @ CO2H H Inp Acide isonipecotique H N / \ C02H Acide pyroglutamique H-N-CH-CO2H PGlu Acide 2-pyrolidone-5-carboxylique Pip Acide pipecolique-2-carboxylique H Proline H-N-CH-CO2H Pro Acide pyrolidine-2-carboxylique H-N-CH-C02H THC Acide 2-oxothiazolidine-4-carboxylique c Thioproline H-N-CH-CO2H Thi # Acide Thiazolidin carboxylique Tiq Acide tetrahydroisoquinoline-2carboxylique CO2H De préférence, Z est l'acide pyroglutamique (PGlu). Parmi les composés préférés de l'invention, on note plus particulièrement les composés dans lesquels AHA correspond à NH - (CH2)5 - CO - c'est à dire acide amino hexanoïque, avec x égal à 2 et y, z égaux à 1. Avantageusement, l'invention vise le composé répondant à la formule suivante: PGlu - K4 - (AHA) 2 - K4 - AHA - K4 - AHA - K2 Les composés décrits ci-dessus présentent un pouvoir anti-héparine, déterminé par le A temps de coagulation relatif entre un plasma hépariné et un plasma non-hépariné, inférieur à 10 %, de préférence inférieur à 5 %. La présente invention a donc également pour objet l'utilisation d'un composé répondant à la formule 1 indiquée ci-dessus dans un réactif de diagnostic in vitro, notamment les réactifs pour le calcul du temps de coagulation d'un échantillon de sang ou la détection ou le dosage de différents éléments de la cascade de la coagulation, indépendamment de la présence ou l'absence d'héparine dans ledit échantillon. Lesdits réactifs, en particulier les réactifs de type TP (temps de prothrombine), présentent avantageusement une turbidité mesurée par une DO à 630 nm, inférieure à 0,5, de préférence inférieure à 0,1. Selon un autre aspect, l'invention concerne un réactif de diagnostic in vitro comprenant un composé tel que défini par la formule générale 1 ci-dessus, de préférence un composé dans lequel AXA correspond à NH - (CH2)S - CO - c'est à dire acide amino hexanoïque, avec x égal à 2 et y, z égaux à 1, et plus préférentiellement le composé cidessous de formule: PGlu - K4 - (AHA)2 - K4 - AHA - K4 - AHA - K2 Un tel réactif de diagnostic permet ainsi la réalisation de tests ou de dosages dans des échantillons sanguins, indépendamment de la présence ou de l'absence d'héparine dans lesdits échantillons. Un réactif selon l'invention correspond avantageusement aux tests de coagulation classiques, c'est à dire les tests permettant de déterminer le temps de coagulation d'un échantillon de sang ou aux tests permettant la détection ou le dosage de différents éléments de la cascade de coagulation, comme par exemple le dosage du facteur VIIa, du fibrinogène, des protéines C et S, le test TP. Ces tests sont utilisés de façon courante par l'homme du métier. Un réactif de diagnostic in vitro préféré selon l'invention est un réactif comprenant de la Thromboplastine, permettant de réaliser un test TP (Temps de Prothrombine ou temps de Quick) La concentration finale dans de tels réactifs du composé selon l'invention défini ci- dessus, est avantageusement comprise entre 2 et lOug/ml. De préférence cette concentration est de 5ug/ml. L'invention se rapporte également à l'utilisation d'un composé de formule générale 1 défini ci-dessus, comme agent anti-héparine pour la préparation d'un médicament. Exemple 1: Protocole de synthèse du composé préféré de l'invention: Le tableau synoptique de la figure 1 résume les différentes étapes de la synthèse. L'enchaînement structural est synthétisé par chimie sur support solide, utilisant un automate approprié (Applied Biosystems 433A). De manière à parfaire les rendements de synthèse, les bras écarteurs hydrophobes (AXA) ont été ajoutés en double couplage. La résine utilisée est une résine MBHA (méthyl benzydrylamine), de façon à récupérer une structure C-terminale amide neutre après clivage de la résine. La chimie mise en oeuvre ici est une chimie Fmoc, utilisant la pipéridine en déprotection à chaque étape. Les chaînes latérales sont protégées par des groupements Boc. L'échelle de synthèse sur le synthétiseur est de 0.1nmole, conduisant à environ 100 mg de produit brut. Le produit est clivé de la résine et déprotégé sur les chaînes latérales par un traitement au TFA (acide trifluoroacétique à 55%). Après concentration de la solution de clivage des 2/3 du volume, le produit est précipité dans l'éther. Le produit brut est ensuite lyophilisé puis purifié par HPLC en phase inverse, en utilisant une colonne CI8 Kromasil 5 m (20 mm * 250 mm) avec un gradient eau acétonitrile 0.1% de TFA (de 0 à 60% d'acétonitrile en 30 min à 15 ml / minute). La détection est faite à 214 nm et les fractions sont collectées manuellement. La quantité de produit purifié récupérée est de 50 mg. La structure du produit final est confirmée par analyse de la séquence après hydrolyse avec HCI 6N, 120 C, 24h; l'hydrolysat est ensuite analysé par HPLC phase inverse (colonne Kromasil C18, 5 m, 250 mm * 4.6 mm), après dérivatisation au PITC (phénylthioisocyanate). Exemple 2 : Test d'agents anti-héparine selon l'invention sur un test TP: L'objectif est d'analyser les performances (pouvoir anti-héparine et turbidité) d'agents anti-héparine incorporés dans un réactif Thromboplastine Diagnostica Stago. Analyse du pouvoir anti-héparine: Il s'agit de la capacité de l'agent anti-héparine à insensibiliser le réactif vis-à-vis de l'héparine contenue dans l'échantillon de sang: Les échantillons à tester sont préparés à partir d'un pool de plasma normal surchargé ou non en héparine (Plasma hépariné à 1 UI/ml en HNF (Calciparine 25000 UI/ml, Sanofi)). Remarque: un réactif servant de témoin négatif, c'est-à-dire sans agent anti-héparine, est utile pour vérifier l'héparinisation du plasma. Pour la détermination du Temps de Quick, l'automate (STA Diagnostica Stago - brevet EP0325874) prélève 50 l de plasma échantillon, qu'il laisse incuber 240 sec. à 37 C dans une cupule contenant une bille ; puis il transfère la cupule dans la zone de mesure et ajoute à l'échantillon 100 l de réactif Thromboplastine. Le temps de coagulation est déterminé de la façon suivante : A viscosité constante, l'amplitude d'oscillation de la bille dans la cupule (oscillation entretenue grâce à un champ électromagnétique) est constante. Quand la viscosité augmente (phénomène de coagulation), l'amplitude d'oscillation de la bille diminue. Un algorithme utilise cette variation d'amplitude pour déterminer le temps de coagulation. Le pouvoir anti-héparine est calculé de la manière suivante : détermination du delta temps relatif entre un plasma hépariné et non hépariné, c'est-à-dire : [{TC (plasma héparine) - TC (plasma non héparine)} / TC (plasma non héparine) * 100]. avec TC= Temps de Coagulation Le pouvoir anti-héparine des composés selon l'invention est estimé significatif lorsque ce delta temps est inférieur à 10%. Analyse de la turbidité : La turbidité doit être la plus faible possible pour une application en diagnostic et plus particulièrement dans un test Thromboplastine (TP). Cette turbidité est déterminée avec la mesure de la DO à 630 nm sur un spectrophotomètre (Uvikon 940, Kontron). Remarque : un réactif servant de témoin négatif, c'est-à-dire sans agent anti-héparine, est utile pour mesurer l'influence de cet agent anti-héparine sur la turbidité du réactif. Exemple 3: Analyse des performances (pouvoir anti-héparine et turbidité) de différents agents anti-héparine selon l'invention, introduits dans un réactif de type Thromboplastine (résultats comparés au contrôle (C) ne possédant pas d'agent anti-héparine): Agent anti-héparine à 5 g/ml Pouvoir anti-HNF Turbidité Delta temps 0/1 DO 630 nm (en%) (en %) 992 0.047 1415-5 PGlu - K4 - (AHA)2 - K4 - AHA - K4 - AHA - K2 4 5 0.069 1415-4 THC - K4 - (AHA)2 - K4 - AHA - K4 - AHA - K2 5. 9 0. 148 1415-3 Hyp-K4-(AHA)2-K4-AHA-K4-AHA-K2 34 0.134 1415-2 Thi - K4 - (AHA)2 - K4 - AHA - K4 - AHA - K2 5. 7 0. 104 1394 Pro-K4-AHA-K4-APA-K3-APA-K2 6.4 0.399 1401 Pro-K4-AHA-K4-APA-K4-APA-KZ 81 0488 1403P Pro-K2-AHA-K4-APA-K4-APA-K2 7 1 0.205 1403PK Pro-K3-AHA-K4-APA-K4-APA-K2 87 0 283 1404 Pro-K4-AHA-K3-APA-K3-APA-K2 7.6 0.147 1405 Pro - K4 - (AHA)2-K4- AHA - K4 - AHA - K2 4 0323 1408-2 Pro-K4-AHA-K3-APA-K4-APA-K2 6. 9 0. 040 1411 Pro-K4-(AHA)2-K4-AHA-K3-AHA-K2 6 5 0 086 avec APA correspondant à l'acide ammo propanoique, de formule - (CH2)2 - CO - REFERENCES 1. 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Composé présentant une activité anti-héparine de la formule générale 1: Z-Bm- (AXA), - B, - (AXA)y - Bo - (AXA)Z - Bp dans laquelle: * Z a pour formule générale : #N# Cx# CH# CO2H avec Cy = = liaison covalente Cy-Cx - CH2 Cy-Cx -CO- -co-s- -(CH2)n-Xavec * AXA représente une chaîne hydrocarbonée correspondant à la formule : NH - (CH2)n - CO - , n étant un nombre entier compris entre 2 et 6; x, y et z représentent indépendamment les uns des autres un nombre entier compris entre 1 et 6. 2. Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que Z est sélectionné parmi les composés suivants: - acide 4-amino-pyrolidine-2 carboxylique - acide azetidine-2-carboxylique - acide 2-carboxymorpholine - acide 1,3-dihydro-2H-isoindole carboxylique - acide 4-hydroxypyrolidine 2-carboxylique - acide indoline-2-carboxylique - acide isonipecotique - acide pyroglutamique - acide pipecolique-2-carboxylique - acide pyrolidine 2-carboxylique - acide 2-oxothiazolidine 4-carboxylique - acide thiazolidin carboxylique - acide tetrahydroisoquinoline 2-carboxylique 3. Composé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que Z est l'acide pyroglutamique (PGlu), de formule: 4. Composé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que B est sélectionné parmi la Lysine, l'Arginine, l'Ornithine, l'Histidine, l'Homolysine et l'Homoarginine. 5. Composé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que B est la Lysine. 6. Composé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que m, n, o sont égaux à 4 et p est égal à 2. 7. Composé selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que AXA correspond à la formule NH - (CH2)s - CO - (acide amino hexanoïque). 8. Composé selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que x est égal à 2 et y, z sont égaux à 1. 9. Composé selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce qu'il répond à la formule : PGlu - K4 - (AHA)2 - K4 - AHA - K4 - AHA - K2 10. Composé selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé en ce qu'il présente un pouvoir anti-héparine, déterminé par le A temps de coagulation relatif entre un plasma hépariné et un plasma non hépariné inférieur à 10%, de préférence inférieur à 5% dans un test de coagulation. 11. Réactif de diagnostic in vitro comprenant un composé selon l'une des revendications 1 à 10. 12. Réactif selon la revendication 11, permettant de calculer le temps de coagulation d'un échantillon de sang, indépendamment de la présence ou de l'absence d'héparine dans ledit échantillon. 13. Réactif selon la revendication 11, permettant la détection ou le dosage de différents éléments de la cascade de la coagulation, indépendamment de la présence ou de l'absence d'héparine dans ledit échantillon. 14. Réactif selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un réactif de TP. 15. Réactif selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend le composé de formule : PGlu - K4 - (AHA)2 -K4 - AHA - K4 - AHA - K2 16. Réactif selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il présente une turbidité, mesurée par une DO à 630 nm, inférieure à 0,5, de préférence inférieure à 0,1. 17. Réactif selon la revendication 11, comprenant un composé de formule générale 1 à une concentration finale comprise entre 2 et 10 ug/ml. 18. Réactif selon la revendication 11, caractérisé en ce que la concentration finale du composé dans ledit réactif est de 5 ug/ml. 19. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 10 dans un réactif de diagnostic in vitro pour calculer le temps de coagulation d'un échantillon de sang, ou détecter ou doser dans un échantillon de sang différents éléments de la cascade de coagulation, indépendamment de la présence ou de l'absence d'héparine dans ledit échantillon. 20. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 10 comme agent antihéparine pour la préparation d'un médicament.