Brevet FR2821431A1 — publié le 20020830

REACTIF DESTINE AU DESPITAGE ANTE-MORTEM D'ATNC L'invention concerne un réactif destiné au dépistage ante-mortem d'ATNC. Elle se rapporte également au procédé de dépistage ante-mortem d'ATNC mettant en oeuvre ledit réactif. Elle a enfin pour objet un procédé de dosage antemortem d'ATNC dans un échantillon biologique. Les agents transmissibles non conventionnels (ATNC) encore appelés prion , provoquent chez l'homme et l'animal des maladies appelées encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles (ESST) . Parmi cellesci, on relève essentiellement la maladie de Creutzfeld-Jakob chez l'homme, la tremblante chez le mouton et la chèvre, et l'encéphalopathie spongiforme bovine chez les bovins (ESB). Le dépistage de ces maladies, dont l'évolution est constamment fatale puisqu'aucun traitement efficace n'est encore proposé, ne peut être effectué que par le biais d'échantillons biologiques, essentiellement de matière cérébrale, prélevée puis analysée en post-mortem. La biopsie cérébrale, possible chez l'homme pour le diagnostic ante-mortem, n'est plus faite aujourd'hui pour le risque de contamination que le geste fait courir aux acteurs. Il n'est donc pas possible à l'heure actuelle de dépister un individu atteint d'une ESST pendant sa vie durant, sans risque de contamination. Dès lors, le problème que se propose de résoudre l'invention est de proposer un réactif destiné au dépistage ante-mortem d'ATNC, qui ne présente aucun risque de contamination. On connaît de par l'article HSICH et coll. publié dans le NEJM en date du 26 septembre 1996, 335, volume 13, pages 924-930 The 14-3-3 brain protein in cerebrospinal fluid as a marker for transmissible spongiform encephalopathies , que l'on retrouve systématiquement dans un certain nombre de liquides biologiques, tels que le LCR, le sang (sérum, plasma, concentré leucocytaire), la lymphe, l'urine ou encore le lait d'individus atteints d'une ESST, un marqueur protéique d'antigène, identifié sous la dénomination protéine 14-3-3 . Pour résoudre le problème précédemment décrit, l'invention propose donc un réactif destiné au dépistage ante-mortem d'ATNC comprenant des supports sur lesquels sont fixés, par le biais d'un agent de couplage, les anticorps anti-protéine 14-3-3 ou des protéines 14-3-3, aptes à dépister par inhibition d'agglutination et/ou agglutination directe la présence respectivement des protéines 14-3-3 ou des anticorps anti-protéine 14-3-3 dans un échantillon biologique. En d'autres termes, l'invention consiste en un réactif constitué pour l'essentiel de supports sur lesquels sont fixés soit des anticorps anti-protéine 14-3-3 ou des protéines 14-3-3, disponibles aujourd'hui dans le commerce et synthétisés artificiellement. En pratique, les supports destinés à supporter soit les anticorps anti-protéines 14-3-3 soit les protéines 14-3-3, sont des globules rouges, notamment aviaires ou encore des membranes artificielles. De même, l'agent de couplage utilisé en pratique est le glutaraldehyd. L'invention concerne également le procédé de dépistage ante-mortem d'ATNC dans un échantillon biologique. Ce procédé consiste à mettre en présence d'un échantillon biologique le réactif tel que décrit ci-avant, puis à détecter par agglutination et/ou inhibition d'agglutination, la présence ou l'absence d'anticorps anti-protéine 14-3-3 ou de protéines 14-3-3 dans ledit échantillon. Comme déjà dit, l'échantillon biologique est avantageusement choisi parmi les liquides biologiques choisis dans le groupe comprenant le LCR, le sang (sérum, plasma, concentré leucocytaire), la lymphe, l'urine, et le lait. Dans le mode de réalisation selon lequel les supports ou membranes artificielles sont sensibilisés aux marqueurs, c'est-à-dire à la protéine 14-3-3, la présence d'une agglutination par des anticorps anti-protéine 14-3-3, après mise au contact avec le produit biologique, signe l'absence d'antigène dans le sang, c'est- à-dire l'absence d'infection. Au contraire, l'absence d'une agglutination signe la présence d'antigènes dans l'échantillon biologique, et donc celle de l'infection. Dans le mode de réalisation selon lequel les supports sont sensibilisés avec un anticorps anti-protéine 14-3-3, l'agglutination directe desdits supports avec la protéine 14-3-3, signe la présence de l'antigène dans l'échantillon biologique, et donc celle de l'infection. L'absence d'agglutination peut être due au fait que le marqueur n'est pas en quantité suffisante dans l'échantillon. Dans ce cas, on ajoute un excès de protéines 14-3-3 dans l'échantillon biologique. L'absence d'agglutination signe alors la présence d'antigènes. Au contraire, la présence d'une agglutination témoigne de l'absence d'antigène. L'invention concerne également un procédé de dosage ante-mortem d'ATNC dans un échantillon biologique, selon lequel on mélange ledit échantillon à étudier à différentes dilutions avec le réactif ci-avant décrit, on observe ensuite à quelle dilution il y a agglutination et/ou inhibition d'agglutination, puis on détermine la concentration de l'échantillon en protéines 14-3-3 ou en anticorps anti-protéine 14- 3-3 en se référant à un étalon. L'invention et les avantages qui en découlent ressortent bien de la description qui précède. On note en particulier la possibilité de procéder à un diagnostic des maladies prioniques chez l'homme et chez l'animal en ante-mortem par le biais d'un test simple à mettre en oeuvre et fiable, et sans risque de contamination. REVENDICATIONS 1/Réactif destiné au dépistage ante-mortem d'ATNC comprenant des supports sur lesquels sont fixés, par le biais d'un agent de couplage, des anticorps anti-protéine 14-3-3 ou des protéines 14-3-3, aptes à dépister par inhibition d'agglutination et/ou agglutination la présence respectivement des protéines 14-3-3 ou des anticorps anti-protéine 14-3-3 dans un échantillon biologique. 2/Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les supports sont des globules rouges aviaires ou des membranes artificielles. 3/Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de couplage est le glutaraldehyd. 4/Procédé de dépistage ante-mortem d'ATNC consistant à mettre en présence le réactif objet de la revendication 1 avec un échantillon biologique, puis à détecter par agglutination et/ou inhibition d'agglutination la présence ou l'absence d'anticorps anti-protéine 14-3-3 ou de protéines 14-3-3 dans ledit échantillon biologique. 5/Procédé de dépistage selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est un liquide biologique choisi dans le groupe comprenant le LCR, le sang (sérum, plasma, concentré leucocytaire), la lymphe, l'urine, et le lait. 6/Procédé de dosage ante-mortem d'ATNC selon lequel on mélange l'échantillon biologique à étudier à différentes dilutions avec le réactif de la revendication 1, on observe ensuite pour quelle dilution il y a agglutination ou inhibition d'agglutination, et on détermine alors la concentration de l'échantillon en anticorps anti-protéine 14-3-3 ou en protéines 14-3-3 en se référant à un étalon. DEPOSANT : Louis LERY/Jacques MA YET MANDATAIRE : Cabinet LAURENT et CHARRAS