Brevet FR2810048A1 — publié le 20011214

L'invention a trait à une construction d'acide nucléique utile pour l'expression de transgènes notamment dans les cellules souches embryonnaires. La culture de cellules souches embryonnaires (aussi appelées cellules ES) a ouvert la voie à de nombreuses applications dans le domaine de la biologie et de la médecine : transplantations cellulaires ou tissulaires dans le cadre d'une médecine dite "régénérative", obtention de modèles animaux à partir de ces cellules pour l'étude de pathologies et la mise au point de médicaments, etc. Ces cellules peuvent être génétiquement modifiées in vitro puis réimplantées dans un embryon receveur afin d'obtenir un animal transgénique. En particulier, des gènes peuvent être mutés ou délétés par recombinaison homologue. Toutefois, l'inactivation d'un gène, s'il est essentiel pour le développement de l'embryon, provoquera le plus souvent l'arrêt de ce développement. Pour pallier ces problèmes, des systèmes de recombinaison inductibles ont été mis au point. Feil et al (1996) et Zhang et al (1996) ont en particulier proposé d'utiliser un vecteur comprenant la séquence de la recombinase Cre fusionnée à un domaine de liaison aux #strogènes muté de manière à se lier uniquement au tamoxifène, l'ensemble étant sous le contrôle d'un promoteur fort (promoteur CMV). Cependant, les résultats obtenus par Zhang et al sont décevants, à la fois en terme de bruit de fond et de pourcentage d'induction. Ainsi, l'induction de la recombinase survient dans moins de 60% des cellules alors que le bruit de fond augmente constamment au cours du temps. Après 8 semaines de culture toutes les cellules sont induites en absence d'inducteur. Les informations fonctionnelles apportées par l'invalidation génique sont parfois complétées par une autre technique qui consiste, à l'inverse, à surexprimer un gène. Cette stratégie expérimentale est généralement mise en #uvre par l'obtention d'animaux (comme des souris) transgéniques, grâce à la microinjection d'un plasmide d'expression dans les ovocytes. Cependant, comme dans le cas de l'invalidation génique, l'obtention d'un animal transgénique pour un gène donné nécessite que son expression reste compatible avec un développement embryonnaire harmonieux. Dans le cas contraire, le développement des embryons transgéniques est interrompu. Plusieurs stratégies expérimentales utilisant soit des promoteurs dont les activités sont spécifiques de tissus ou d'organes, soit des systèmes d'expression inductible (système inductible par le zinc, par la tétracycline ou par la doxicycline), ont été développés. Mais la mise en #uvre de ces systèmes d'expression inductible est lourde compte tenu de la faible efficacité de fabrication des animaux transgéniques par la technique de microinjection d'ADN dans l'ovocyte. En outre, l'intégration "au hasard" des transgènes dans le génome de l'ovocyte compromet souvent leur expression selon les critères exigés par l'expérimentateur. Parallèlement, une approche qualifiée de "piège à promoteur" ("promoter trap") avait été envisagée pour identifier et muter des gènes du développement chez la souris (Friedrich et Soriano, 1991). Selon cette approche, l'expression d'un gène rapporteur était initiée à l'aide d'un promoteur endogène, le gène rapporteur lui-même n'ayant pas son propre promoteur. Cette approche a été reprise par exemple dans le brevet US 5,922,601 ou la demande de brevet WO 98/14 614, toujours pour identifier et muter des gènes présents dans le génome des cellules. Par ailleurs, à titre incident, un vecteur exempt de promoteur, destiné à l'expression de transactivateur dépendant de la tétracycline tTA, a été décrit par Bôger et Gruss, 1999. Les auteurs de la présente invention ont maintenant mis au point un système d'expression qui résout l'ensemble des problèmes évoqués cidessus. L'invention a plus précisément pour objet une construction d'acide nucléique avec au moins deux séquences codantes, l'une de sélection, l'autre qui code pour une protéine d'intérêt. Cette construction comprend : i) un site accepteur d'épissage en position 5', ii) une séquence de sélection, éventuellement précédée en amont par une séquence permettant sa traduction par les ribosomes, iii) une séquence codant pour une protéine d'intérêt distincte de la séquence de sélection, ladite séquence codante étant précédée en amont par une séquence permettant sa traduction par les ribosomes, iv) une séquence de terminaison de la transcription en position 3', ladite construction étant exempte de tout promoteur de la transcription de ladite séquence de sélection ou de ladite séquence codant pour une protéine d'intérêt, étant en outre entendu que ladite protéine d'intérêt n'est pas la protéine transactivatrice tTA. Par "construction d'acide nucléique", on entend notamment un acide nucléique tel qu'ADN ou ARN, linéaire ou circulaire. La construction d'acide nucléique de l'invention peut comprendre d'amont en aval, le site accepteur d'épissage, la séquence de sélection, éventuellement précédée par une séquence permettant sa traduction par les ribosomes, la séquence codant pour une protéine d'intérêt, précédée par une séquence permettant sa traduction par les ribosomes, et la séquence de terminaison de la transcription. Ce type de construction est préféré. De manière alternative, la construction d'acide nucléique de l'invention peut toutefois comprendre, d'amont en aval, le site accepteur d'épissage, la séquence codant pour une protéine d'intérêt, précédée par une séquence permettant sa traduction par les ribosomes, la séquence de sélection, préférentiellement précédée par une séquence permettant sa traduction par les ribosomes, et la séquence de terminaison de la transcription. Par "séquence permettant la traduction par les ribosomes", on entend par exemple une séquence IRES (site interne d'entrée des ribosomes, ou "internal ribosomal entry site"). Il peut s'agir notamment d'une séquence IRES de mammifère, comme le site interne d'entrée des ribosomes du gène codant pour la protéine GRP79, également dénommée Bip, qui fixe la chaîne lourde des immunoglobulines. On peut également utiliser une séquence IRES de picornavirus, telle que la séquence IRES du virus de l'encéphalomyocardite (EMCV), (Jackson et al, 1990 ; Kaminski et al, 1990), de préférence les nucléotides 163 à 746 de cette séquence, du poliovirus, de préférence les nucléotides 18 à 640, ou du virus de la fièvre aphteuse ("foot and mouth disease virus" ou FMDV), de préférence les nucléotides 369 à 804. On peut également utiliser des IRES issus de rétrovirus comme le virus Moloney de souris (MoMLV). On peut par ailleurs utiliser toutes séquences permettant la traduction de plusieurs protéines à partir d'un ARNm unique dont la transcription est initiée par un seul promoteur. Par exemple, ces séquences peuvent simplement permettre la continuité de la lecture des ribosomes entre deux cistrons codant pour deux protéines distinctes. Par "séquence de sélection", on entend une séquence qui permet de trier entre les cellules qui auront intégré la construction d'acide nucléique de l'invention et celles chez qui la transfection aura échoué. Ces séquences de sélection peuvent être "positives" ou "négatives" et dominantes ou récessives. Une séquence de sélection "positive" se réfère à un gène codant pour un produit qui permet seulement aux cellules qui portent ce gène de survivre et/ou se multiplier dans certaines conditions. Parmi ces séquences de sélection "positives", on peut citer notamment les séquences de gènes de résistance à un antibiotique, comme par exemple la néomycine (neo), l'hygromycine, la puromycine, la zéoycine, la blasticidine ou la phléomycine. Une autre séquence de sélection possible est l'hypoxanthine phosphoribosyl transférase (HPRT). Les cellules qui portent le gène HPRT peuvent pousser sur un milieu HAT (contenant aminoptérine, hypoxanthine et thymidine), alors que les cellules HPRT-négatives meurent sur le milieu HAT. A l'inverse, une séquence de sélection "négative" se réfère à un gène codant pour un produit qui peut être induit pour tuer de manière sélective les cellules qui portent le gène. Des exemples non limitatifs de ce type de séquences de sélection incluent la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (HSV-tk) et HPRT. Les cellules qui portent le gène HSV-tk sont tuées en présence de gancyclovir ou de FIAU (1(1,2-désoxy-2-fluoro-p-D- rabinofuranosyl)-5-iodouracile). Les cellules qui portent le gène HPRT peuvent être tuées sélectivement par de la 6-thioguanine (6TG). D'autres exemples de séquences de sélection "positives" ou "négatives" sont bien connus de l'homme du métier. De manière avantageuse, la construction d'acide nucléique de l'invention peut comprendre également une séquence de détection. Par "séquence de détection", on entend une séquence codant pour une protéine détectable, utile comme marqueur pour évaluer facilement le niveau d'expression de la protéine d'intérêt. On parle également dans ce cas de "gène rapporteur". Il peut par exemple s'agir d'une séquence codant pour une enzyme comme la ss-galactosidase (p-GAL), l'alcool déshydrogénase (ADH), la phosphatase alcaline telle que la Phosphatase Alcaline humaine (Aph), la protéine fluorescente verte (GFP), et la chloramphenicol acétyltransférase (CAT), la luciférase, ou tout autre marqueur détectable bien connu de l'homme du métier. De manière préférentielle, ladite séquence de détection peut être couplée à la séquence de sélection. Ce couplage peut être effectué par le biais d'une séquence permettant la traduction par les ribosomes, telle que définie précédemment, ou par fusion entre la séquence de détection et la séquence de sélection. On peut en particulier utiliser l'élément ssgeo qui code pour la protéine de fusion ss-galactosidase-neor (Friedrich et Soriano, 1991). Par "séquence de terminaison de la transcription", on entend toute séquence qui permet d'arrêter la transcription, notamment un site STOP contenu dans une séquence de polyadénylation (polyA). Il peut s'agir d'une polyA provenant de virus, en particulier la polyA du "Simian Virus 40" (SV 40), ou d'une polyA provenant d'un gène eukaryote, en particulier la polyA du gène codant pour la Phosphoglycérate Kinase (pgk-1), ou de la polyA du gène codant pour la globine de lapin. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, ladite protéine d'intérêt peut être une recombinase inductible. De manière préférentielle, on peut utiliser la recombinase Cre du bactériophase P1 (Abremski et al, 1983), ou par exemple la recombinase Flp de levure (Logie et al, 1995). Ces recombinases sont modifiées ou liées de manière opérante (en particulier par fusion) à une séquence leur apportant la propriété d'induction. On peut ainsi utiliser une recombinase fusionnée au domaine de fixation du ligand du récepteur aux #strogènes (ER), lequel a été préalablement muté pour ne plus fixer les #strogènes endogènes. En revanche, il peut être activé par le tamoxifène ou par l'un de ses analogues (Feil et al, 1996). On peut également utiliser une recombinase fusionnée à d'autres domaines comme le domaine de fixation du ligand du récepteur à la progestérone (PR) (Kellendonk et al, 1996) ou le domaine de fixation du ligand du récepteur aux glucocorticoïdes (GR) (Brocard et al, 1998). Ces domaines sont préalablement mutés pour ne plus être activés par leur ligand naturel mais uniquement par des molécules synthétiques comme le dexamethasone ou le RU486 . De manière avantageuse, on peut utiliser la séquence Cre ER T2 (Feil et al, 1997) qui est une séquence codant pour une protéine dont l'activité recombinase est très facilement inductible par le tamoxifène ou par ses analogues. Plus particulièrement, la présente invention fournit une construction d'acide nucléique telle que définie précédemment, comprenant, d'amont en aval : i) un site accepteur d'épissage, ii) une séquence de sélection de résistance à la néomycine, précédée en amont d'une séquence de détection, codant pour la p-galactosidase, l'ensemble étant désigné P-geo, iii) une séquence Cre-ERT2,précédée en amont par une séquence IRES permettant sa traduction par les ribosomes, iv) au moins une séquence polyA contenant au moins un site STOP, de terminaison de la transcription. Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention, ladite protéine d'intérêt peut être une protéine d'intérêt thérapeutique ou un facteur de différenciation. On peut notamment citer comme protéine d'intérêt les protéines du sang, des hormones, des facteurs de croissance, des cytokines, des neurotransmetteurs, des enzymes, des anticorps, des facteurs impliqués dans la réparation de l'ADN, des protéines de structure de l'ADN, des facteurs de transcription, des co-activateurs ou des co-répresseurs de la transcription, des protéines du système HLA, des protéines du système immunitaire, des récepteurs membranaires, des protéines impliquées dans la division cellulaire, des oncogènes, des suppresseurs de tumeur, des récepteurs d'hormone, des facteurs impliqués dans la mort cellulaire programmée, des protéines intervenant dans la migration cellulaire, des protéines du cytosquelette, des protéines virales, des protéines provenant d'organisme prokaryote, etc. Selon un troisième mode de réalisation de l'invention, on peut remplacer ladite séquence codant pour une protéine d'intérêt par une séquence antisens, de manière à bloquer la traduction d'une protéine d'intérêt. L'invention a également pour objet une construction d'acide nucléique telle que définie précédemment, dans laquelle des séquences de reconnaissance d'une recombinase, telles que les séquences LoxP, encadrent la cassette formée par ladite séquence de sélection, éventuellement précédée en amont par une séquence permettant sa traduction par les ribosomes, et suivie en aval par au moins une séquence supplémentaire de terminaison de la transcription, ladite cassette étant placée en amont de ladite séquence codant pour la protéine d'intérêt. Dans ce cas, ladite protéine d'intérêt peut être une protéine marqueur détectable (utile dans le cadre de protocoles de recherches), ou de manière avantageuse, une protéine d'intérêt thérapeutique ou un facteur de différenciation. Une séquence de détection, codant pour une protéine marqueur détectable, et éventuellement précédée par une séquence permettant sa traduction par les ribosomes, peut être alors insérée dans ladite cassette. Cette séquence de détection, comme la séquence de sélection, n'est sous le contrôle d'aucun promoteur dans la construction d'acide nucléique de l'invention. Un objet de l'invention concerne plus particulièrement une construction d'acide nucléique telle que définie précédemment, comprenant d'amont en aval : i) un site accepteur d'épissage, ii) une cassette formée d'amont en aval par éventuellement une séquence, telle qu'une séquence IRES, permettant la traduction par les ribosomes de la séquence de sélection qui suit, une séquence de sélection, telle qu'une séquence de résistance à l'hygromycine, éventuellement une séquence codant pour une protéine marqueur détectable, telle qu'une séquence codant pour la phosphatase alcaline humaine (Aph), précédée par une séquence, permettant sa traduction par les ribosomes, une séquence de terminaison de la transcription, comprenant plusieurs sites STOP dans plusieurs polyA, ladite cassette étant encadrée par des séquences LoxP, iii) une séquence codant pour une protéine d'intérêt, ladite séquence codante étant précédée en amont par une séquence, telle qu'une séquence IRES, permettant sa traduction par les ribosomes, iv) une séquence de terminaison de la transcription. L'invention a également pour objet un vecteur dans lequel est insérée une construction d'acide nucléique telle que définie précédemment. Il peut s'agir d'un vecteur plasmidique d'origine bactérienne ou d'un vecteur viral recombinant, tel qu'un vecteur d'adénovirus ou de rétrovirus modifié comme le vecteur ROSA ss GEO (Friedrich et al, 1991). De manière avantageuse, on peut utiliser le plasmide bactérien pBSK ou le plasmide bactérien plresHyg (Clontech référence 6061). L'invention a également pour objet une cellule hôte dans laquelle au moins un tel vecteur a été transféré de manière stable. Le terme "cellule hôte" comprend toute cellule de mammifère ou autre cellule eucaryote, en culture ou in vivo, en tant que partie d'un organisme, ladite cellule pouvant être préalablement fusionnée ou génétiquement modifiée. Il peut s'agir par exemple de cellules ES ("embryonic stem cells"), de lignées de cellules EG ("embryonic germ cells"), de lignées de cellules souches de tétracarcinomes comme les cellules F9, de lignées de fibroblastes immortalisés comme les NIH 3T3, de lignées de cellules lymphoblastiques comme les cellules Jurkat, etc Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on transfert dans la cellule hôte au moins une construction d'acide nucléique telle que définie précédemment comprenant une séquence codant pour une recombinase inductible, et au moins une construction d'acide nucléique comprenant des séquences de reconnaissance de ladite recombinase et une séquence codant pour une protéine d'intérêt, de manière à ce que ces deux constructions soient cointégrées dans le génome de ladite cellule. Le transfert du vecteur dans la cellule hôte peut être réalisé au moyen des techniques standard connues de l'homme du métier, par exemple par électroporation, précipitation au phosphate de calcium (Sambrook et al, 1989), ou lipofection. De manière générale, le vecteur nucléotidique de l'invention peut être libéré sous forme nue, c'est-à-dire exempt de tout agent facilitant la transfection ou bien en association avec un tel agent, qu'il s'agisse par exemple d'un agent chimique qui modifie la perméabilité cellulaire (tel que la bupivacaïne), de liposomes, de lipides cationiques ou de microparticules par exemple d'or, de silice ou de tungstène. Le mode de transfert choisi dépend principalement de la cellule hôte, comme cela est bien connu de l'homme du métier. Plus particulièrement la présente invention vise le cas où la cellule hôte est une cellule souche, de manière préférentielle une cellule souche embryonnaire (cellule ES). Les cellules ES sont des cellules obtenues à partir de la masse cellulaire composant un embryon au stade blastocyste. Elles sont capables de se différencier dans tous les types cellulaires d'un organisme adulte, notamment en cellules germinales. Ces cellules peuvent être cultivées de manière à développer des populations cellulaires qui soient totipotentes, c'est- à-dire capables de donner tous les types de cellules différenciées possibles, ou pluripotentes, c'est-à-dire capables de donner certains types de lignées cellulaires (cellules hématopoïétiques notamment), ou qui soient différenciées ou en voie de différenciation, selon les conditions de culture choisies (Fraichard et al, 1995 ; Takahashi et al, 2000 ;Reubinoff et al, 2000). Les cellules ES de l'invention peuvent être des cellules humaines ou provenir d'un animal non humain, de préférence un mammifère. L'invention a également pour objet une banque de lignées de cellules obtenues à partir des cellules hôtes telles que définies précédemment, dans le génome desquelles le ou lesdits vecteurs tels que définis précédemment se sont intégrés de manière fonctionnelle. En particulier, les auteurs de l'invention ont développé une banque de lignées de cellules ES ayant intégré de manière fonctionnelle dans leur génome un vecteur tel que décrit précédemment permettant l'expression d'une recombinase Cre inductible par le tamoxifène, telle que la Cre-ERT2. Ils ont sélectionné les lignées de cellules ES caractérisées par trois critères : - Chacune de ces lignées possède un niveau d'expression très élevé de la recombinase inductible. - Aucune activité recombinase n'est détectable dans ces lignées en absence de tamoxifène ou de l'un de ses dérivés. Par contre l'activité recombinase de la Cre est facilement induite par le tamoxifène ou de l'un de ses dérivés. - L'expression de la recombinase inductible est stable au cours du développement embryonnaire, mais elle peut être soit ubiquitaire soit tissu spécifique. Les cellules ainsi caractérisées sont utilisées pour construire de nouvelles banques de lignées de cellules ES dans le génome desquelles est intégré un second vecteur tel que décrit précédemment permettant l'expression d'une protéine d'intérêt par la recombinase Cre inductible. Les cellules ES issues de ces différentes banques, et donc porteuses des constructions d'acide nucléique de l'invention, peuvent être utilisées pour obtenir des animaux modifiés génétiquement (également appelés animaux transgéniques). Les techniques classiquement utilisées pour obtenir des animaux transgéniques à partir des cellules ES sont la technique d'injection dans le blastocyste et la technique d'agrégation (Hogan et al, 1994, Manipulating The Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Ces techniques consistent soit à injecter les cellules ES dans un embryon receveur au stade blastocyste (technique d'injection dans le blastocyste) soit à agréger les cellules ES avec un embryon receveur au stade morula (technique de l'agrégation). Les embryons chimères obtenus sont réimplantés dans l'utérus d'une femelle porteuse. Les animaux chimères obtenus sont constitués d'un mélange de cellules sauvages et de cellules portant la modification génétique. Pour obtenir des animaux transgéniques, il convient alors de croiser les souris chimères avec des souris sauvages. La fécondation se produit soit avec une cellule sauvage, soit avec une cellule modifiée génétiquement. Ainsi, l'invention fournit des moyens pour générer des animaux transgéniques capables de surexprimer de manière inductible ou non une protéine d'intérêt. L'utilisation des vecteurs d'acide nucléique tels que décrits précédemment dans les cellules ES présente en outre de nombreux avantages par rapport à la technique de micro-injection d'ADN dans l'ovocyte. Avec la technique de micro-injection dans l'ovocyte, l'insertion du transgène dans le génome receveur se fait au hasard et sans aucun moyen de sélection. Ainsi son expression est influencée, en général négativement, par l'environnement chromosomique du site d'insertion. Cette influence négative se traduit souvent par une extinction de l'expression ou un mosaïsme de cette expression. Dans de nombreux cas, le niveau d'expression du transgène s'avère insuffisant, ou l'activité du promoteur qui contrôle son expression est perturbée par des éléments de régulation endogènes qui en modifient la spécificité tissulaire. Au contraire, l'application du système de l'invention aux cellules ES permet à l'expérimentateur de sélectionner in vitro la lignée de cellule ES qui permet d'obtenir un animal transgénique surexprimant la protéine d'intérêt dans les tissus attendus. La sélection des clones est réalisée a posteriori en fonction du niveau d'expression et des domaines d'expression de la protéine d'intérêt. L'absence de promoteur dans les vecteurs tels que décrits précédemment implique que leur fonctionnement est strictement dépendant du site du génome hôte dans lequel ils s'insèrent. Les vecteurs de l'invention s'approprient les propriétés d'expression naturelle du site dans lequel ils s'intègrent. Cette capacité permet de réduire considérablement tous les problèmes d'extinction d'expression et de mosaïsme qui sont fréquents avec les systèmes d'expression classiquement utilisés comme les promoteurs viraux : promoteur du Cyto-Mégalo Virus (CMV) promoteur du SV40. Le système de l'invention fournit donc des moyens plus simples et plus économiques pour générer des animaux transgéniques. La présente invention a donc pour objet des animaux non humains transgéniques susceptibles d'être obtenus à partir d'une cellule ES telle que définie précédemment. Les animaux transgéniques ainsi générés peuvent être particulièrement utiles pour produire des protéines recombinantes d'intérêt, telles que des protéines d'intérêt thérapeutique citées plus haut. Il est également possible de faire surexprimer par ces animaux des protéines fonctionnellement défectueuses, comme protéines recombinantes d'intérêt. Les animaux transgéniques obtenus sont alors utiles comme modèles expérimentaux de pathologies provoquées par l'expression de ces protéines non fonctionnelles, par exemple des protéines tronquées ou mutées. C'est le cas notamment de la protéine CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator) dont la mutation est à l'origine de la mucoviscidose chez l'être humain. On peut également faire surexprimer par ces animaux certains oncogènes comme les protéines ras, jun, fos ou la ss-catenin. De même, on peut exprimer des dominants négatifs de certaines protéines anti-oncogénique comme p53 ou pRb. Les cellules ES incorporant les constructions d'acide nucléique de l'invention peuvent également être mises à profit dans le cadre d'une stratégie de transplantation cellulaire. Le principe général de cette stratégie repose sur la différenciation in vitro des cellules ES en cellules souches neurales, hématopoïétiques, etc ..., puis l'injection de ces cellules "prédéterminées" dans un animal ou un humain. On parle également à ce propos de réparation tissulaire (Watt et Hogan, Science, 2000). L'invention s'étend donc à un procédé de préparation de cellules différenciées, dans lequel on cultive des cellules ES totipotentes telles que mentionnées précédemment, en présence d'agents de différenciation, et le cas échéant, d'un agent d'induction de recombinase. Le système d'expression inductible à l'aide d'une recombinase, tel que décrit plus haut, permet plus particulièrement d'induire l'expression contrôlée de gènes dont l'activité est responsable de l'engagement de la cellule souche dans une voie de différenciation spécifique. Lesdits "agents de différenciation" sont bien connus de l'homme du métier. On peut citer en particulier l'acide rétinoïque (RA) (Renoncourt et al, 1998) , le dimethyl sulfoxyde (DMSO) et l'acide gamma-aminobutyrique (GABA) (Dinsmore et al, 1996). De même, les conditions de culture des cellules ES sont maintenant bien établies (Dinsmore et al, 1998 ; Dinsmore et al, 1996). Sont également comprises dans l'invention les cellules susceptibles d'être obtenues par ce procédé. Les cellules différenciées ainsi obtenues peuvent servir de modèle cellulaire pour remplacer l'expérimentation animale. En effet, le procédé décrit précédemment permet de produire une grande quantité de cellules différenciées dans un type cellulaire donné. On peut alors tester facilement la toxicité de molécules à potentiel thérapeutique sur ces cellules au lieu de la tester directement sur l'animal. L'invention a également pour objet une méthode de traitement thérapeutique dans laquelle on implante dans un organisme receveur nécessitant un tel traitement des cellules préalablement modifiées et différenciées in vitro. Cette technologie de transplantation cellulaire utilisant des cellules prédéterminées ou des cellules différenciées in vitro à partir des cellules ES rend alors possibles des stratégies de corrections métaboliques très spécifiques. Par exemple, dans le traitement de maladie neuro- dégénératives, la transplantation de cellules neuronales productrices de neuromédiateurs est d'un intérêt clinique évident. Grâce en particulier au système d'expression inductible dans les cellules ES, on peut introduire un gène inactif codant pour un neuro-transmetteur ou stimulant sa synthèse, puis induire la différenciation des cellules ES en cellules neurales, et activer l'expression du gène au moment de réimplanter les cellules dans l'organisme receveur. De manière générale, l'invention vise également une méthode de traitement thérapeutique dans laquelle on implante dans un organisme receveur nécessitant un tel traitement des cellules préalablement modifiées et différenciées in vitro, intégrant une construction d'acide nucléique qui comporte une séquence codant pour une recombinase inductible, et une construction d'acide nucléique d'intérêt et des séquences de reconnaissance de la recombinase, et on administre audit organisme receveur une quantité d'agent inducteur suffisante pour permettre l'expression de la protéine d'intérêt. L'invention a également pour objet un procédé in vitro de production de protéines recombinantes d'intérêt, dans lequel on cultive des cellules ES dans le génome desquelles a été intégrée une construction d'acide nucléique telle que définie précédemment comprenant une séquence codant pour une protéine recombinante d'intérêt, dans des conditions permettant l'expression de ladite protéine d'intérêt, et on recueille la protéine ainsi produite. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les cellules ES mises en oeuvre sont des cellules souches embryonnaires, dans le génome desquelles on cointègre au moins une construction d'acide nucléique telle que définie précédemment comprenant une séquence codant pour une recombinase inductible et au moins une construction d'acide nucléique comprenant des séquences de reconnaissance de ladite recombinase, et une séquence codant pour une protéine d'intérêt, lesdites cellules étant cultivées en présence d'agents de différenciations, les cellules différenciées ainsi obtenues étant ensuite mises en présence d'un agent inducteur de ladite recombinase, de manière à permettre l'expression de ladite protéine d'intérêt. Ce procédé est alors particulièrement avantageux pour produire une protéine in vitro dans le type cellulaire qui la fabrique naturellement. En effet, pour être fonctionnelles, ces molécules requièrent souvent des modifications post-traductionnelles qui ne s'opèrent pas dans les microorganismes habituellement utilisés pour les produire, mais qui sont parfois seulement réalisées dans les types cellulaires qui fabriquent naturellement ces molécules, ce qui est le cas des cellules différenciées cidessus. L'invention concerne également le développement de modèles animaux pour l'étude de gènes impliqués dans une pathologie ou des gènes impliqués dans des processus de différenciation. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé d'obtention d'un animal transgénique non humain notamment utile comme modèle pour l'étude de gènes impliqués dans une pathologie, dans lequel on croise un animal non humain dans le génome duquel a été intégrée au moins une construction d'acide nucléotidique telle que définie précédemment comprenant une séquence codant pour une recombinase inductible, avec un animal non humain dans le génome duquel un gène d'intérêt est encadré par deux sites reconnus par la recombinase inductible, de manière à obtenir un animal transgénique non humain qui, lorsqu'il est soumis à un agent inducteur de ladite recombinase, subit une délétion dudit gène d'intérêt. Le gène encadré par deux sites reconnus par la recombinase inductible est dénommé gène "floxé". L'animal non humain possède un phénotype sauvage, ce qui laisse penser que le gène "floxé" est fonctionnel, les sites reconnus par la recombinase inductible étant introduits de manière à ne pas perturber son fonctionnement. Une partie des animaux issus de ce croisement possède dans leur génome les deux modifications génétiques précédemment citées. On peut alors détruire le gène floxé en induisant l'activité de la recombinase par un agent inducteur. L'animal acquiert ainsi un phénotype mutant si le gène détruit possède une fonction importante. Ce procédé de délétion de gène inductible permet de détruire n'importe quel gène à n'importe quel âge de l'animal, ce qui est actuellement impossible avec les techniques existantes. Les animaux transgéniques non humains, tels que notamment souris ou autre animal cité précédemment, susceptibles d'être obtenus par ce procédé, sont également compris dans l'invention. Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. LEGENDE DES FIGURES : La figure 1 représente un schéma de principe du fonctionnement d'un vecteur selon l'invention conçu pour surexprimer la recombinase inductible Cre-ERT2 :le plasmide pGTEV-Cre-ERT2. La figure 2 représente une carte de restriction du vecteur pGTEVCre-ERT2. La figure 3A représente un schéma du vecteur pIGTE2-Aph, la figure 3B représente un schéma du vecteur pIGTE3, la figure 3C représente un schéma du vecteur plGTE4, la figure 3D représente un schéma du vecteur pIGTE5. La figure 4 représente une carte de restriction du vecteur pIGTE2- Aph. La figure 5 représente une schéma de principe du fonctionnement d'un vecteur selon l'invention conçu pour surexprimer de manière inductible l'Aph : le plasmide pIGTE2-Aph. La figure 6 est une photographie d'embryons transgéniques de souris âgés de 8,5 jours après fécondation. Ces embryons ont été obtenus en utilisant des cellules ES Cre ERT2 ayant intégré dans leur génome le vecteur pIGTE2-Aph. L'activité Aph est détectée par coloration histochimique. Ainsi les cellules qui expriment l'Aph sont colorées en marron alors que les cellules qui n'expriment pas l'Aph restent blanches. Comme on peut le voir sur cette figure, les embryons induits in vivo avec de l'hydroxy-tamoxifène (à droite et à gauche) expriment fortement l'Aph dans tous les tissus alors que le témoin négatif (embryon au centre) exprime l'Aph que dans quelques cellules. Les figures 7A et 7B représentent des diagrammes montrant l'induction de l'eGFP dans les clones ES-Cre-ERT2, par l'hydroxy-tamoxifène (OHT). La figure 7A rapporte le pourcentage de cellules qui expriment l'eGFP en présence ou en absence d'hydroxy-tamoxifène, tandis que la figure 7B met en valeur le niveau d'induction. La figure 8A est un diagramme représentant le résultat d'un test d'induction de l'activité Aph dans différentes lignées de souris ES-CreERT2/pIGTE2-Aph, en présence ou en l'absence d'hydroxy-tamoxifène (OHT). La figure 8B est une photographie présentant une induction de l'expression de la ss-galactosidase en utilisant un système classique d'expression dans les cellules ES. La figure 9 est un ensemble de photographies représentant des cellules des lignées ES-Cre-ERT2/pIGTE2-Aph après une coloration histochimique pour détecter la ss-galactosidase (figure 9A), après une coloration histochimique pour détecter l'activité Aph, en l'absence d'hydroxy-tamoxifène (figure 9B), et après une coloration histochimique pour détecter l'activité Aph en présence d'hydroxy-tamoxifène (figure 9C). EXEMPLES : EXEMPLE 1 : du vecteur.pGTEV-Cre ERT2 Les auteurs de l'invention ont construit un vecteur d'expression de la recombinase Cre ERT2 inductible par le tamoxifène (Feil et al, 1997). Ce vecteur ne comporte pas de promoteur. La transcription ne peut être initiée qu'à partir d'un promoteur cellulaire situé à proximité du site d'intégration. Le site accepteur d'épissage (SA) permet un épissage correct du messager et la formation d'une protéine de fusion lorsque l'intégration s'est produite au sein d'un intron. Le vecteur exprime également la protéine de fusion ss-galactosidase-neor (gène pgeo). L'expression de la recombinase Cre-ER T2 est couplée à celle de la p- galactosidase grâce à l'utilisation d'une séquence IRES (séquence interne d'entrée des ribosomes). Ce vecteur pGTEV (cf figures 1 et 2) a été construit comme suit : La séquence SA (3 geo a été amplifiée par PCR à partir du vecteur ROSA geo (Friedrich et al, 1991) en utilisant les oligonucléotides suivants 5'AGA ACC AAT GCA TGC TGA TCA GCG AGG TTT A 3' (SEQ ID n 1) et 5' AAG GAA AAA AGG GGG CGC CTA TGG CTC GTA CTC TAT AG 3' (SEQ ID n 2). Le fragment de 3,7 kilobases (kb) ainsi amplifié a été digéré par les enzymes Spe # et Nsi # puis introduit par ligature cohésive dans le vecteur CMV Ires-Cre-ERT2 préalablement digéré par les mêmes enzymes. Le vecteur CMV Ires-Cre-ERT2 a été obtenu en insérant la cassette Cre ERT2 provenant du vecteur pCre-ERT2 (Feil et al, 1997) digéré par EcoR I. Les extrémités du fragment ainsi obtenu ont été rendues franches en utilisant la T4 DNA polymérase. Le fragment a été introduit par ligature dans le vecteur plresNeo (Clontech référence catalogue 6060-1 ) digéré par Sma 1 et Xbal et dont les extrémités ont également été rendues franches en utilisant la T4 DNA polymérase. On obtient ainsi le vecteur pGTEV. EXEMPLE 2 : Expression de la recombinase Cre-ERT2 dans des cellules ES de souris 2. 1 Electroporation des cellules ES : Les cellules ES sont soumises à un traitement par la trypsine puis rincées deux fois dans du milieu GMEM. Elles sont finalement resuspendues dans du GMEM à une concentration de 6,25 x 106 cellules/ml. Pour une expression stable, 40 g de plasmide sont digérés par Sspl puis ajoutés dans une cuvette d'électroporation (Biorad) à 0,8 ml de la solution de cellules ES. Les cellules sont ensuite soumises à une électroporation à un voltage de 250V pour une capacité de 500 F. Après l'électroporation, les cellules sont placées sur des cellules nourricières préalablement irradiées. 48 heures après l'électroporation, les cellules sont mises en présence d'antibiotique G418. 2. 2. Evaluation du niveau d'expression de la recombinase : Les cellules ayant intégré le vecteur à proximité d'un promoteur cellulaire actif sont résistantes au G418 et synthétisent la p-galactosidase, ce qui permet de les sélectionner facilement. La production de la recombinase étant en outre proportionnelle à celle de la p-galactosidase, les auteurs de l'invention ont pu évaluer facilement le niveau d'expression de la recombinase. L'utilisation de ce vecteur permet d'obtenir un niveau d'expression de la p-galactosidase et de la recombinase Cre-ERT2 jamais atteint avec les vecteurs d'expression habituels. Un tel niveau d'expression est nécessaire pour obtenir une activité recombinase élevée en présence de concentration non toxique d'hydroxy-tamoxifène (figures 7A et 7B). EXEMPLE 3 : Sélection de lignées de cellules ES-Cre-ERT2 Les auteurs de l'invention ont fabriqué une banque de 110 lignées de cellules ES, chaque élément de la banque étant caractérisé par un site d'intégration spécifique du vecteur PGTEV-Cre ERT2. Le niveau d'expression ainsi que les domaines d'expression de la recombinase Cre-ERT2 varient donc pour chaque lignée en fonction du site d'intégration du vecteur. Dans un premier temps, les auteurs de l'invention ont sélectionné des lignées caractérisées par un niveau d'expression très élevé de la recombinase, afin que son activité soit facilement induite par l'hydroxy-tamoxifène. Pour cela, les auteurs de l'invention ont défini trois critères permettant de sélectionner les lignées a priori les plus performantes : 1) le niveau d'expression de la recombinase Cre-ERT2 doit être très élevé, aussi bien dans les cellules ES que dans les cellules différenciées (différenciation induite in vitro par formation de corps embryoïdes). Le niveau d'expression de la recombinase a été évalué d'après le niveau d'expression de la p-galactosidase (coloration histochimique). 2) l'activité de la recombinase Cre-ERT2 doit être nulle en absence d'hydroxy-tamoxifène (absence de bruit de fond) et rapidement induite lorsque l'hydroxy-tamoxifène est ajouté au milieu de culture. Pour évaluer ce paramètre, un vecteur rapporteur de l'activité de la recombinase Cre-ER T2 été construit. Ce vecteur, appelé pCAAG-loxP-STOP-loxP-ADH comprend, d'amont en aval, (1) un promoteur CAAG qui est un promoteur très puissant fonctionnant dans les cellules ES, (2) un gène de résistance à l'hygromycine et un signal de polyadénylation (polyA) permettant d'arrêter la transcription, l'ensemble formé par le gène de résistance et la séquence polyA étant encadré par des séquences loxP, (3) une séquence codant pour l'alcool déshydrogénase (ADH), qui confère une couleur grise aux cellules après coloration histochimique, et, pour finir, (4) une séquence polyA. Le vecteur pCAAG-loxP-STOP-loxP-ADH a été construit comme suit: Le vecteur pPHCAAG-BstXl (Niwa et al, 1991) a été digéré par les enzymes Sal et Xhol. Le fragment de 4 Kilo bases ainsi obtenu correspond au promoteur pCAAG. Ce fragment a été introduit par ligature cohésive dans le vecteur pBSK préalablement digéré par Sal I. Le nouveau vecteur obtenu est nommé pBSK pCAGG. Le vecteur pT102 a été digéré par les enzymes Hind IIINot I. Le fragment ainsi obtenu correspond à une cassette loxP-STOP-loxP qui a été introduite par ligature cohésive dans le vecteur pBSK pCAAG lui même digéré par les enzymes Hind III- Not I. Le nouveau vecteur obtenu est appelé pCAAG loxP-STOP-loxP. Le vecteur pRc/CMV-ADH (Gautier et al, 1996) a été digéré par l'enzyme BamHl . Les extrémités du fragment ainsi obtenu ont été rendues franches en utilisant la T4 DNA polymérase. Le fragment a été introduit par ligature dans le vecteur pCAAG loxP-STOP-loxP digéré par Not # et dont les extrémités ont également été rendues franches en utilisant la T4 DNA polymérase. On obtient ainsi le vecteur pCAAG-loxP-STOP-loxP-ADH. Le gène rapporteur ADH de l'alcool déshydrogénase ne fonctionne que si la recombinase Cre-ERT2 est active car un signal d'arrêt de transcription encadrée par deux sites loxP empêche sa transcription. L'activation de la recombinase par l'hydroxy-tamoxifène doit faire disparaître le signal d'arrêt de transcription par excision au niveau des sites loxP pour permettre l'expression du gène rapporteur ADH. Les auteurs de l'invention ont ainsi pu sélectionner les lignées répondant aux deux critères définis précédemment (activité recombinase nulle en absence d'hydroxy-tamoxifène, activité maximale en présence d'hydroxy-tamoxifène). 3) l'expression de la recombinase Cre-ER T2 doit être conservée après différenciation in vivo dans les embryons en développement. Les lignées de cellules ES qui remplissaient les deux premiers critères ont été injectées dans des embryons receveurs au stade blastocyste (Hogan et al, 1994). Les embryons chimères ainsi obtenus ont été reimplantés dans l'utérus d'une souris porteuse, puis disséqués à différents stades du développement afin de déterminer les domaines d'expression de la ss-galactosidase. Pour chacune des lignées testées, le caractère ubiquitaire ou tissulaire de l'expression de la recombinase a ainsi pu être défini. Ces trois critères ont permis de sélectionner 15 lignées de cellules ES : (i) qui permettent l'expression de la recombinase dans tous les tissus de l'embryon au cours des premiers stades du développement ; (ii) dont l'activité de la recombinase est très étroitement régulée par l'hydroxytamoxifène in vitro. Ces lignées appelées ES-Cre-ERT2 ont pu être isolées grâce à l'utilisation d'un nouveau type de vecteur, le pGTEV-Cre ERT2 qui permet une expression du transgène à un niveau très élevé et avec une stabilité remarquable. Notons ici que les plasmides d'expression habituellement utilisés pour surexprimer des gènes (plasmides utilisant des promoteurs viraux puissants) ne permettent pas d'obtenir une telle efficacité dans les cellules ES. EXEMPLE 4 : Fabrication de cellules ES permettant l'expression inductible d'un transgène d'intérêt L'une des utilisations des cellules ES-Cre-ERT2 est la fabrication d'un système d'expression inductible de transgènes dans ces cellules. Pour cela, les auteurs de l'invention ont construit un autre vecteur, appelé pIGTE2Aph (cf fig. 3A et fig. 4), qui comprend comme transgène d'intérêt le gène Aph codant pour l'alcaline phosphatase humaine. Le gène ne peut être exprimé que si le vecteur est intégré à proximité d'un promoteur cellulaire puissant. En outre, sa transcription est bloquée par une cassette loxP-STOP-loxP qui arrête la synthèse d'ARNm. En présence d'hydroxy-tamoxifène, la recombinase Cre- ER T2 est activée, la cassette loxP-STOP-loxP est excisée et le gène Aph peut être exprimé. Les auteurs de l'invention ont isolé des sous-clones de cellules ES-Cre-ERT2 contenant également une copie de ce vecteur pIGTE2-Aph intégré dans leur génome. Ces sous-clones ont été mis en présence d'hydroxytamoxifène (OHT), 1 M, pour induire l'expression de l'Aph. Après 48 heures, l'activité de l'Aph a été mesuré en suivant le protocole Biolabs (Ref 172-1063). Les auteurs de l'invention ont pu observer une expression de l'alcaline phosphatase étroitement dépendante de la présence d'hydroxytamoxifène dans le milieu de culture. Ainsi, dans certains clones, l'induction de l'expression de l'alcaline phosphatase en présence d'hydroxy-tamoxifène atteint un facteur 80 alors que le bruit de fond est nul (fig. 8). Pour une comparaison avec le système d'expression de l'invention, les auteurs ont également établi, en suivant le protocole de Zhanc et al, 1996, des lignées de cellules ES exprimant la Cre-ERT2 à l'aide d'ur système d'expression classique basé sur le promoteur pgk du gène codan pour la Phosphoglycérate Kinase (pgk-1). Un vecteur d'expression de la ss galactosidase inductible par la Cre dont le fonctionnement est également base sur le promoteur pgk a été introduit également. Ainsi, en présence d'hydroxy- tamoxifène ou de l'un de ses dérivés, l'expression de la ss-galactosidase es induite par la Cre-ERT2. Différents clones de cellules ES pgk Cre ERT2/pgk ss galactosidase ont été mis en présence d'hydroxy-tamoxifène (OHT) pou induire l'expression de l'Aph. Après 48 heures, l'activité ss-galactosidase a étÉ visualisée par coloration histochimique. Le meilleur clone obtenu est présenté sur la figure 8B. On peu voir sur cette photographie que seulement une minorité de cellules exprime lé ss-galactosidase (environ 40% des cellules du clone sont colorées en bleues) Ce résultat est très inférieur à celui obtenu dans les mêmes condition: d'induction avec les lignées de cellules ES-Cre ERT2/pIGTE-Aph obtenue: grâce à la technique selon l'invention de "gene trap expression" (Figure 9), 100 % des cellules étant alors induites. La figure 9A représente une lignée ES-Cre-ERT2/pIGTE2-Aph après une coloration histochimique pour détecter l'activité ss-galactosidase. La coloration bleue provient de cette activité. On peut remarquer que toutes les cellules sont très foncées, ce qui indique une très forte activité p-galactosidase et donc une forte expression de la Cre-ERT2. La figure 9B représente une lignée ES-Cre-ERT2/pIGTE2-Aph cultivée en absence d'hydroxy-tamoxifène. Après coloration histochimique pour détecter l'activité alcaline phosphatase (Aph), aucune cellule ne montre une coloration noire caractéristique d'une activité Aph. Il n'y a donc pas d'induction de l'expression de l'Aph en absence d'hydroxy-tamoxifène ou de l'un de ses dérivés. La figure 9C représente une lignée ES-Cre-ERT2/pIGTE2-Aph cultivée en présence de 1 M d'hydroxy-tamoxifène pendant 48 heures. Après coloration histochimique pour détecter l'activité alcaline phosphatase (Aph), 100 % des cellules montrent une coloration noire caractéristique d'une activité Aph. Il y a donc induction de l'expression de l'Aph dans toutes les cellules en présence d'inducteur. Ces résultats sont donc largement supérieurs à ceux obtenus avec les autres systèmes de surexpression inductibles dans les cellules ES (Saez et al, 1997). Les auteurs de l'invention ont ensuite construit des vecteurs inductibles par la Cre-ERT2 dont le fonctionnement est basé sur celui du pIGTE2-Aph. Néanmoins, ces vecteurs désignés pIGTE3, pIGTE4 et pIGTE5 (cf figure 3B à 3D), ont été conçus pour surexprimer de manière inductible d'autres protéines d'intérêt que l'Aph. Ainsi les auteurs ont inséré dans ces vecteurs les séquences codant pour la cycline D1 (pIGTE4-D1), la cycline D2 (pIGTE4-D2), les inhibiteurs de la prolifération p18ink4c (pIGTE4-p18 ink4c) et p21cip1 (pIGTE4-p21 ap1). Après électroporation, les auteurs ont isolé des sousclones de cellules ES-Cre ERT2 ayant incorporé au moins une copie d'un des vecteurs cités précédemment. Les auteurs ont ainsi établi des lignées de cellules ES capables de surexprimer de manière inductible la cycline D1, la cycline D2, p18ink4c, ou p21 cip1. Le vecteur pIGTE 2 Aph a été construit comme suit : Le vecteur ROSA p Geo (Friedrich et al, 1991) a été digéré par les enzymes Spe 1 et Hind III. Le fragment de 300 pb ainsi obtenu correspond au site accepteur d'épissage. Ce fragment a été inséré par ligature cohésive dans le vecteur CMV Ires-Cre-ERT2 digéré par Spe 1 et Hind III. Le nouveau vecteur ainsi obtenu est appelé pSA . Le vecteur pT102 a été digéré par les enzymes EcoR # et BSTE Il puis religaturé sur lui-même. Cette opération a permis d'éliminer le fragment PGK TK du PT102. Le nouveau vecteur ainsi obtenu est appelé pT102-TK. Ce vecteur a été digéré par l'enzyme Ndel. Le fragment obtenu correspond à une cassette loxP-PGK Neo PolyA PolyA-loxP. Les extrémités de ce fragment ont été rendues franches par la T4 DNA polymérase. Le fragment a ensuite été inséré par ligature dans le vecteur pSA digéré par les enzymes EcoR # et Xho # et dont les extrémités ont été rendues franches par la T4 DNA polymérase. Le nouveau vecteur ainsi obtenu est appelé pSA loxP-STOP-loxP. Le vecteur pHygEGFP (Clontech référence catalogue 6014-1) a été digéré par l'enzyme BamH I. Le fragment de 2 Kb ainsi obtenu correspond à la séquence codant pour la protéine fusion HYGROeGFP. Les extrémités de ce fragment ont été rendues franches en utilisant la T4 DNA polymérase. Le fragment a ensuite été inséré par ligature dans le vecteur pSA loxP-STOP-loxP digéré par les enzymes Apa # et Nco # et dont les extrémités ont été rendues franches par la T4 DNA polymérase. Le nouveau vecteur ainsi obtenu est appelé pIGTE2. Le vecteur PHW3 (Torrent et al, 1996) a été digéré par les enzymes Sal 1 et Spe I. Le fragment ainsi obtenu correspond à la séquence Ires Aph. Les extrémités de ce fragment ont été rendues franches par la T4 DNA polymérase. Le fragment a ensuite été inséré par ligature dans le vecteur PlresHyg (Clontech) digéré par l'enzyme Xba # et dont les extrémités ont été rendues franches par la T4 DNA polymérase. Le nouveau vecteur ainsi obtenu a été appelé plresHyg Ires Aph. Le vecteur plresHyg Ires Aph a été digéré par les enzymes Bgl II et Xho I. Le fragment ainsi obtenu correspond à la séquence Ires Aph polyA. Les extrémités de ce fragment ont été rendues franches par la T4 DNA polymérase. Le fragment a ensuite été inséré par ligature dans le vecteur pIGTE2 digéré par l'enzyme Xba 1 et dont les extrémités ont été rendues franches par la T4 DNA polymérase. Le nouveau vecteur ainsi obtenu a été appelé pIGTE 2 Aph. Le vecteur pIGTE3 a été construit comme suit: Le vecteur pEGFP-N1 (Clontech référence catalogue 6085-1) a été digéré par les enzymes BamH 1 et Not I. Le fragment de 1 kb ainsi obtenu correspond à la séquence codant pour la protéine eGFP. Les extrémités de ce fragment ont été rendues franches en utilisant la T4 DNA polymérase. Le fragment a ensuite été inséré par ligature dans le vecteur PlresHyg digéré par les enzymes BstX # et Not # et dont les extrémités ont été rendues franches par la T4 DNA polymérase. Le nouveau vecteur ainsi obtenu est appelé pEGFP Ires HYGRO. Le vecteur pEGFP Ires HYGRO a été digéré par les enzymes BamH # et Xba I. Le fragment de 3 kb ainsi obtenu correspond à la séquence EGFP Ires HYGRO. Les extrémités de ce fragment ont été rendues franches en utilisant la T4 DNA polymérase. Le fragment a ensuite été inséré par ligature dans le vecteur pSA loxP-STOP-loxP digéré par les enzymes Apa 1 et Nco # et dont les extrémités ont été rendues franches par la T4 DNA polymérase. Le nouveau vecteur ainsi obtenu est appelé pIGTE3. Le vecteur pIGTE4 a été construit comme suit : Le vecteur pSA loxP-STOP-loxP a été digéré par les enzymes Xho # et Spe I. Le fragment ainsi obtenu correspond à la séquence SA loxP. Ce fragment a ensuite été inséré par ligature dans le vecteur plresHyg Ires Aph digéré par les enzymes Spe 1 et Hind III. Les extrémités du vecteur et de l'insert non cohésives ont été rendues franches par la T4 DNA polymérase. Le nouveau vecteur ainsi obtenu est appelé pSA HYGRO Ires Aph. Le vecteur pSA loxP-STOP-loxP a été digéré par l'enzyme cla I. Le fragment ainsi obtenu correspond à la séquence polyApolyA-loxP. Les extrémités de ce fragment ont été rendues franches par la T4 DNA polymérase. Le fragment a ensuite été inséré par ligature dans le vecteur pSA HYGRO Ires Aph digéré par l'enzyme Xho # dont les extrémités ont été rendues franches par la T4 DNA polymérase. Le nouveau vecteur ainsi obtenu est appelé pIGTE 4. EXEMPLE 5 : Fabrication de souris transgéniques à partir de lignées de cellules ES-Cre-ERT2 sélectionnées Les lignées de cellules ES-Cre-ERT2 ayant intégré dans leur génome le vecteur pIGTE2-Aph ont été utilisées pour fabriquer des souris transgéniques, par injection dans des blastocystes selon le protocole de Hogan et al, 1994. Les cellules ES-Cre-ERT2/pIGTE-Aph ont été agrégées à des embryons hôtes au stade morula (Hogan et al, 1994, Manipulating The Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Les embryons chimères ainsi obtenus ont été réimplantés dans une souris receveuse. L'expression de l'Aph a ensuite été induite par une injection intra-péritonéale d'hydroxy-tamoxifène (1 mg) à 6,5 jours dpc (day post coïtum). Après dissection à 8,5 jours dpc, l'activité Aph a été détectée par coloration histochimique. Ainsi les cellules qui expriment l'Aph sont colorées en marron alors que les cellules qui n'expriment pas l'Aph restent blanches. Un protocole identique a été suivi avec les témoins négatifs, à la différence que l'injection à 6,5 jours dpc a été réalisée avec un placebo. Comme on peut le voir sur la figure 6, les embryons induits in vivo avec de l'hydroxy-tamoxifène (à droite et à gauche) expriment fortement l'Aph dans tous les tissus alors que le témoin négatif (embryon au centre) exprime l'Aph que dans quelques cellules... EXEMPLE 6 : Utilisation des souris transgéniques Cre ERT2 selon l'invention dans un système d'invalidation de gène inductible. 6. 1. Principe Les souris obtenues à l'exemple 5 sont croisées avec des souris porteuses d'un gène encadré par deux sites loxP (gène floxé ). Le gène floxé est fonctionnel car les sites loxP ont été introduits de manière à ne pas perturber son fonctionnement. Ainsi la souris floxée possède un phénotype sauvage. En deuxième génération, 12,5 % des animaux ont hérité des deux allèles du gène "floxé" et du gène de la recombinase Cre ERT2. Ce procédé permet d'induire la disparition d'un gène à n'importe quel stade du développement de la souris. On injecte alors l'hydroxy-tamoxifène par voie intra-péritonéale, afin d'activer la recombinase et induire la délétion du gène. 6.2.Applications à l'étude des cancers Chez l'homme, la délétion du gène Rb-1 est impliquée dans l'apparition de plusieurs types de cancers à forte composante héréditaire, notamment les rétinoblastomes. Chez la souris, la mutation d'un allèle du gène Rb-1 n'augmente que très faiblement la fréquence des tumeurs. La mutation des deux allèles est par contre léthale dès les premiers stades embryonnaires. Grâce aux souris exprimant la recombinase Cre-ERT2, on peut induire l'inactivation conditionnelle des deux allèles du gène Rb-1 chez la souris postnatale et étudier l'apparition des tumeurs dans les différents tissus. D'autres gènes codant pour des facteurs supresseurs de tumeurs peuvent être inactivés selon ce protocole : le gène APC impliqué dans les cancers du colon, le gène BRCA1 impliqué dans les cancers du sein et de l'ovaire. 6. 3. Applications à l'étude de la pancréatite aiguë Le gène p48 code pour un facteur de transcription nécessaire à la différenciation et au fonctionnement du pancréas exocrin. L'inactivation du gène p48 interrompt le développement embryonnaire. Grâce aux souris exprimant la recombinase Cre-ERT2,on peut induire l'inactivation conditionnelle des deux allèles du gène p48 chez la souris adulte, induisant ainsi une dégénérescence pancréatique. Ces souris constituent alors un modèle de pancréatite aiguë. EXEMPLE 7 : Production de cellules différenciées utiles pour une transplantation cellulaire 7. 1. Différenciation de cellules ES-Cre-ERT2 L'activité des gènes codant pour les facteurs de transcription pdx- 1 et p48 semble être nécessaire et suffisante à l'induction de la différenciation de l'endoderme en cellules pancréatiques de type ss. Mais la surexpression constitutive de ces gènes dans les cellules ES n'est pas tolérée par la cellule. Les auteurs de l'invention ont proposé de les introduire en configuration "éteinte" dans les cellules Cre-ERT2, d'induire la différenciation en cellules de l'endoderme, puis d'activer l'expression des gènes pdx-1 et p48 pour promouvoir la différenciation pancréatique in vitro. Des lignées de cellules ES-Cre-ERT2 obtenues à l'exemple 4 comprenant, comme transgènes d'intérêt dont l'expression est inductible par la recombinase Cre-ERT2, les gènes pdx-1 et p48 sont donc soumises à une différenciation, selon un protocole rapporté par J Odorico et al, Pancreatic gege expression in differentiating embryonic stem cell. Poster 324. Keystone symposia. Stem cells, asymétrie division and cell fate. 17-22 Janvier 2000, Keystone colorado USA. Les cellules souches embryonnaires sont cultivées en suspension en présence de 5% de C02 dans un milieu de culture GMEM (milieu essentiel minimum avec modification de Glasgow) contenant uniquement 10% de sérum de veau foetal. Ces conditions de cultures induisent la différenciation des cellules ES en corps embryoïdes. Après 7 jours, les corps embryoïdes ainsi obtenus sont mis à adhérer puis cultivés pendant 15 jours toujours dans le même milieu de culture. Une partie des cellules ainsi différenciées exprime des marqueurs spécifiques des cellules pancréatiques comme pdx-1, l'insuline I, l'insuline II, le glucagon, ou l'a-amylase. 7. 2. Transplantation cellulaire Ces cellules peuvent être greffées dans le pancréas de l'animal, dans une perspective de thérapie cellulaire de remplacement (Dinsmore et al, 1996). BIBLIOGRAPHIE - Abremski et al, Studies on the properties of P1 site-specific recombination : évidence for topologically unlinked products following recombination. cell 1983,32 : 1301-1311 - Bôger et al (1999), Mechanisms of Development 83 : 141-153 - Brocard et al, A chimeric Cre recombinase inducible by synthetic, but not by natural ligands of the glucocorticoid receptor. Nucleic Acids Res. 1998 Sep 1;26(17):4086-90 - Dinsmore et al, Embryonic stem cells as a model for studying regulation of cellular differentiation. 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Construction d'acide nucléique selon la revendication 1, dans laquelle ladite séquence codant pour une protéine d'intérêt est une séquence codant pour une recombinase inductible. 3. Construction d'acide nucléique selon la revendication 2, dans laquelle ladite séquence codant pour une protéine d'intérêt est une séquence codant pour la recombinase CRE modifiée de manière à être inductible par le tamoxifène, ladite séquence étant désignée Cre-ERT2. 4. Construction d'acide nucléique selon la revendication 2, comprenant, d'amont en aval, i) un site accepteur d'épissage, ii) une séquence de sélection de résistance à la néomycine, précédée en amont d'une séquence de détection, codant pour la ss-galactosidase, l'ensemble étant désigné ss-geo, iii) une séquence Cre-ERT2, précédée en amont par une séquence IRES permettant sa traduction par les ribosomes, iv) au moins une séquence polyA contenant au moins un STOP de terminaison de la transcription. 5. Construction d'acide nucléique selon la revendication 1, dans laquelle ladite séquence codant pour une protéine d'intérêt est une séquence codant pour une protéine d'intérêt thérapeutique ou un facteur de différenciation. 6. Construction d'acide nucléique selon la revendication 1, dans laquelle ladite séquence codant pour une protéine d'intérêt est remplacée par une séquence antisens. 7. Construction d'acide nucléique selon la revendication 1, dans laquelle des séquences de reconnaissance d'une recombinase, telles que les séquences LoxP, encadrent la cassette formée par ladite séquence de sélection, éventuellement précédée en amont par au moins une séquence permettant sa traduction par les ribosomes, et suivie en aval par une séquence supplémentaire de terminaison de la transcription, ladite cassette étant placée en amont de ladite séquence codant pour la protéine d'intérêt. 8. Construction d'acide nucléique selon la revendication 7, comprenant, d'amont en aval, i) un site accepteur d'épissage, ii) une cassette formée d'amont en aval par - éventuellement une séquence, telle qu'une séquence IRES, permettant la traduction par les ribosomes de la séquence de sélection qui suit, - une séquence de sélection, telle qu'une séquence de résistance à l'hygromycine, - éventuellement une séquence codant pour une protéine marqueur détectable, telle qu'une séquence codant pour la phosphatase alcaline humaine (Aph), précédée par une séquence, permettant sa traduction par les ribosomes, - une séquence de terminaison de la transcription comprenant plusieurs sites STOP dans plusieurs polyA, ladite cassette étant encadrée par des séquences LoxP, iii) une séquence codant pour une protéine d'intérêt, ladite séquence codante étant précédée en amont par une séquence, telle qu'une séquence IRES, permettant sa traduction par les ribosomes, iv) une séquence de terminaison de la transcription. 9. Vecteur dans lequel est insérée une construction d'acide nucléique selon l'une des revendications précédentes. 10.Cellule hôte dans laquelle au moins un vecteur selon la revendication 9 a été transféré de manière stable. 11. Cellule selon la revendication 10, dans le génome de laquelle sont cointégrées au moins une construction d'acide nucléique selon l'une des revendications 2 à 4 comprenant une séquence codant pour une recombinase inductible et au moins une construction d'acide nucléique selon l'une des revendications 7 ou 8, comprenant des séquences de reconnaissance de ladite recombinase et une séquence codant pour une protéine d'intérêt. 12.Cellule selon l'une des revendications 10 ou 11, qui est une cellule souche embryonnaire (cellule ES) ou une cellule souche germinale embryonnaire (cellule EG). 13. Cellule selon la revendication 12, qui est une cellule ES ou une cellule EG d'un animal non humain, tel que notamment une souris. 14. Banque de cellules comprenant des lignées de cellules selon l'une des revendications 10 à 13 dans le génome desquelles le ou lesdits vecteur (s) se sont intégrés de manière spécifique. 15.Animal transgénique non humain, tel que notamment souris, susceptible d'être obtenu à partir d'une cellule souche selon la revendication 13. 16. Procédé de préparation de cellules différenciées, dans lequel on cultive des cellules totipotentes selon la revendication 12 en présence d'agents de différenciation, et le cas échéant d'un agent d'induction de recombinase. 17. Cellules différenciées susceptibles d'être obtenues par le procédé de la revendication 16, et utiles notamment pour une transplantation cellulaire. 18. Procédé in vitro de production d'une protéine recombinante d'intérêt, dans lequel on cultive des cellules selon l'une des revendications 10 à 13 ou 17, dans le génome desquelles a été intégrée une construction d'acide nucléique comprenant une séquence codant pour une protéine recombinante d'intérêt, dans des conditions l'expression de ladite protéine d'intérêt, et on recueille la protéine ainsi produite. 19. Procédé selon la revendication 18, dans lequel lesdites cellules sont des cellules souches embryonnaires dans le génome desquelles sont cointégrées au moins une construction d'acide nucléique selon l'une des revendications 2 à 4 comprenant une séquence codant pour une recombinase inductible et au moins une construction d'acide nucléique selon l'une des revendications 7 ou 8, comprenant des séquences de reconnaissance de ladite recombinase et une séquence codant pour une protéine d'intérêt, lesdites cellules étant cultivées en présence d'agents de différenciation, les cellules différenciées ainsi obtenues étant ensuite mises en présence d'un agent inducteur de ladite recombinase, de manière à permettre l'expression de ladite protéine d'intérêt. 20. Procédé d'obtention d'un animal transgénique non humain notamment utile comme modèle pour l'étude de gènes impliqués dans une pathologie, dans lequel (a) on intègre dans le génome d'un animal non humain au moins une construction d'acide nucléique selon l'une des revendications 2 à 4 comprenant une séquence codant pour une recombinase inductible, et (b) on croise l'animal non humain ainsi obtenu avec un animal non humain dans le génome duquel un gène d'intérêt est encadré par deux sites reconnus par la recombinase inductible, de manière à obtenir un animal transgénique non humain qui, lorsqu'il est soumis à un agent inducteur de ladite recombinase, subit une délétion dudit gène d'intérêt. 21. Animal transgénique non humain, tel que notamment souris, susceptible d'être obtenu par le procédé selon la revendication 20.