Brevet FR2814247A1 — publié le 20020322

Microscope confocal à balavase laser avec formation optique de l'imase Domaine technique :. L'invention concerne un microscope confocal à balayage laser comportant des moyens pour former optiquement, dans un plan, une image confocale. Technique antérieure : Dans un microscope confocal laser de type courant. l'échantillon est scanné point par point, dans un plan horizontal, au moyen de miroirs galvanométriques. Le signal issu de chaque point scanné est enregistré sur un photorécepteur placé derrière un trou microscopique. A chaque position des miroirs galvanométriques correspond un point de l'échantillon. La reconstitution d'un plan horizontal de l'échantillon nécessite de connaître exactement la position des miroirs galvanométriques correspondant au signal échantillonné à chaque instant sur le photorécepteur. Le bon fonctionnement du système nécessite un contrôle très précis des miroirs galvanométriques et une synchronisation parfaite entre le mouvement des miroirs galvanométriques et l'échantillonnage du signal provenant du photorécepteur. Ceci limite en particulier la vitesse des miroirs galvanométriques pouvant être utilisés. Un moyen d'éviter cette difficulté consiste à utiliser un microscope confocal à disque de Nipkov. Dans un tel appareil, l'image est enregistrée sur une caméra, ce qui supprime les problèmes de synchronisation. Toutefois le microscope confocal à disque de Nipkov n'utilise qu'une faible partie de la lumière produite par la source d'éclairage, ce qui le rend difficilement utilisable en lumière monochromatique, les éclairages monochromatiques étant généralement peu intenses. Description de l'invention : L'objet de la présente invention est de réaliser un microscope confocal à balayage laser dans lequel les problèmes de synchronisation soient supprimés et/ou dans lequel l'image confocale est directement observable à l'aide d'un oculaire. Ceci permet d'augmenter la vitesse de balayage et donc la vitesse d'imagerie. L'invention consiste en un microscope confocal à balayage laser dans lequel l'image confocale est formée optiquement dans un plan, et non reconstituée informatiquement à partir du signal reçu sur un capteur à un seul élément placé derrière un pinole. Typiquement, une caméra matricielle peut être placée dans ce plan. Toutefois, il est également possible d'observer directement, à l'aide d'un oculaire, l'image formée dans ce plan. Dans un microscope confocal de type usuel, il est possible d'observer directement à l'aide d'un oculaire le plan image ou le faisceau réfléchi par l'objet parvient directement. Toutefois, l'image ainsi observée n'est pas une image confocale car elle n'a pas été filtrée par le trou microscopique, et seule l'image acquise par échantillonnage du signal traversant le trou microscopique est véritablement confocale. Pour obtenir optiquement une image confocale il est nécessaire d'utiliser un moyen équivalent au filtrage par le trou microscopique. Selon une version de l'invention, ceci est réalisé par un microscope confocal à balayage laser - comprenant un ou plusieurs miroirs mobiles permettant le balayage de l'échantillon observé dans un plan, - comprenant un faisceau laser réfléchi par lesdits miroirs mobiles, traversant ensuite l'objectif de microscope, parvenant à l'échantillon, et focalisé en un point de l'échantillon, - construit de telle manière que la lumière provenant du point de l'échantillon sur lequel est focalisé le faisceau laser d'éclairage soit collectée par l'objectif, puis réfléchie par lesdits miroirs mobiles, et focalisée en un point fixe d'un premier plan image, et caractérisé par le fait qu'il comporte : - des moyens pour renvoyer vers lesdits miroirs mobiles la partie du faisceau issu de l'échantillon qui parvient audit point fixe du premier plan image, et pour ne pas renvoyer vers lesdits miroirs mobiles la partie du faisceau qui parvient hors dudit point fixe, -des moyens pour focaliser cette partie du faisceau, après qu'elle ait été à nouveau réfléchie par lesdits miroirs mobiles, sur un second plan image, - des moyens pour observer et/ou enregistrer l'image formée dans ledit second plan image. Le point fixe du premier plan image joue le rôle usuellement dévolu au trou microscopique. Le faisceau issu de ce point fixe est ensuite à nouveau réfléchi sur les miroirs mobiles (par exemple des miroirs galvanométriques), ce qui a pour objet de ramener le point éclairé en un point du second plan image qui est mobile en même temps que le point de l'échantillon sur lequel le faisceau d'éclairage est focalisé, et non fixe comme le point fixe du premier plan image. Le second plan image joue donc le rôle du plan image d'un microscope conventionnel non confocal, c'est-à-dire que chaque point de ce plan est l'image d'un point correspondant de l'échantillon. Mais le passage de l'onde par le point fixe du premier plan image a permi son filtrage, et donc l'effet confocal. L'image formée dans ce second plan image peut typiquement être enregistrée sur un capteur CCD ou observée à l'aide d'un oculaire. Le point fixe du second plan image peut être matérialisé par un trou microscopique, auquel cas l'onde issue de ce point fixe peut être ramenée, par un ensemble de lentilles et de miroirs convenablement dimensionnés. vers l'une ou l'autre face des miroirs mobiles, puis être focalisée sur le second plan image. Toutefois, il est plus simple d'utiliser comme point fixe un point réfléchissant, moyennant quoi l'onde réfléchie par ce point parcourt simplement son trajet aller en sens inverse. Dans ce cas, seule une seule face des miroirs mobiles est utilisée. Pour séparer le faisceau issu du point réfléchissant et ayant retraversé les miroirs mobiles du faisceau provenant de l'objectif et se dingeant vers les miroirs mobiles, il est avantageux de pouvoir distinguer ces faisceaux par leur polarité. Ceci permet également d'atténuer l'effet des réflexions parasites sur divers éléments optiques. Ceci est réalisé par exemple avec : - un moyen pour polariser l'onde issue de l'objet, - une lame quart d'onde placée sur la partie commune au trajet de l'onde parvenant audit point fixe d'un plan image, et au trajet de l'onde provenant dudit point fixe du premier plan image. - un séparateur de faisceau polarisant permettant de réfléchir, vers ledit second plan image, l'onde provenant dudit point fixe du premier plan image. Une autre solution, présentant l'avantage d'une moindre atténuation du faisceau issu de l'objet, consiste à utiliser la seconde face des miroirs mobiles. Le système obtenu est alors un peu plus complexe mais n'est pas affecté par des réflections parasites et utilise la totalité de l'intensité lumineuse disponible. Description rapide des figures : La figure 1 représente un microscope confocal à balayage laser selon l'art antérieur. La figure 2 représente un premier mode de réalisation de l'invention, utilisant une seule face des miroirs mobiles. La figure 3 représente un second mode de réalisation de l'invention, utilisant deux faces des miroirs mobiles. Convention : On appellera"lentille"aussi bien une lentille simple qu'un groupe de lentilles ou un doublet achromatique, généralement calculé pour minimiser les aberrations. Premier mode de réalisation : La figure 1 décrit un microscope confocal en fluorescence à balayage laser selon l'art antérieur Un faisceau issu d'un laser (100) traverse un élargisseur de faisceau ou collimateur formé des lentilles (101) (102) puis est réfléchi par le miroir dichroïque (103) qui réfléchit la longueur d'onde du laser (100) et laisse passer la longueur d'onde réémise par fluorescence. Le faisceau est alors réfléchi sur le miroir galvanométrique (104) mobile en rotation autour d'un axe situé dans le plan de la figure, puis sur le miroir galvanométrique (105) mobile en rotation autour d'un axe orthogonal au plan de la figure. Il traverse l'objectif (106) fonnant à l'infini une image de l'échantillon, et est finalement focalisé en un point de l'échantillon (107). Le faisceau réémis par fluorescence à partir de ce point est collecté par l'objectif, réfléchi successivement par les deux miroirs galvanométriques. traverse le miroir dichroïque, et est focalisé par la lentille (108) sur un trou microscopique (109). La partie du faisceau qui traverse le trou microscopique (109) parvient à un photorécepteur (110). Le signal issu de ce photorécepteur est ensuite échantillonné. L'image d'un plan de l'objet est ensuite obtenue à partir du signal issu de ce photorécepteur, échantillonné de manière synchrone par rapport au mouvement des miroirs galvanométriques. La figure 2 montre un microscope confocal en fluorescence à balayage laser selon un premier mode de réalisation de l'invention. Les éléments communs avec l'art antérieur ont été numérotés comme sur la figure 1. Un faisceau issu d'un laser (100) traverse un élargisseur de faisceau ou collimateur formé des lentilles (101) (102) puis est réfléchi par le miroir dichroïque (103) qui réfléchit la longueur d'onde du laser (100) et laisse passer la longueur d'onde réémise par fluorescence. Le faisceau est alors réfléchi sur le miroir galvanométrique (104) mobile en rotation autour d'un axe situé dans le plan de la figure, puis sur le miroir galvanométrique (105) mobile en rotation autour d'un axe orthogonal au plan de la figure. Il traverse ensuite le séparateur de faisceau polarisant (201) puis l'objectif de microscope (106). Le faisceau réémis par fluorescence à partir de ce point est collecté par l'objectif, réfléchi successivement par les deux miroirs galvanométriques, traverse le miroir dichroïque, et est focalisé par la lentille (108) sur un point réfléchissant (203) situé sur la face arrière d'une lame quart d'onde (202). La partie du faisceau qui traverse la lame quart d'onde parvient ensuite à une cavité absorbante. La partie du faisceau qui est réfléchie par le point (203) retraverse la lame quart d'onde (202). la lentille (108), le miroir dichroïque (103), est réfléchie par les miroirs galvanométriques (104) (105). est réfléchie par le séparateur de faisceau polarisant (204), puis est focalisée par la lentille (205) dans le plan d'un capteur CCD (206) fixé sur la caméra (207). La polarisation du laser (100) est choisie pour que l'onde issue de ce laser traverse le séparateur de faisceau (204). Le polariseur (201) est orienté pour être à son tour traversé par cette onde. La lame quart d'onde (202) a son axe neutre orienté à 45 degrés de l'axe passant du polariseur (201) et est quart d'onde pour l'onde réémise par fluorescence. Dans ces conditions, l'image confocale de l'objet se forme directement sur le capteur CCD (206) lorsque l'objet est balayé au moyen des miroirs galvanométriques. Un contrôle imparfait des miroirs galvanométriques se traduit au pire par des zones sombres sur l'image, mais en aucun cas par un déplacement des points de l'objet ou une quelconque imprécision géométrique. Le balayage de l'objet doit être effectué pendant le temps d'intégration du capteur. Les images peuvent ensuite être transférées du capteur CCD à un échantillonneur et un ordinateur. Le capteur peut aussi être remplacé par un oculaire, éventuellement un ensemble binoculaire, permettant l'observation directe de l'image formée dans le plan ou se trouve sur le schéma le CCD (206). Dans ce cas, le balayage doit se faire suffisamment rapidement pour ne pas être perceptible par l'oeil. Second mode de réalisation : Le second mode de réalisation est représenté par la figure 3, et diffère du premier par le fait que chaque miroir galvanométrique comporte deux faces utilisables, qui sont effectivement utilisées. Le faisceau issu du laser (300) traverse l'élargisseur de faisceau ou collimateur formé des lentilles (301) (302) puis est réfléchi par le miroir dichroïque (303). Il est alors réfléchi par le miroir galvanométrique (304) mobile en rotation autour d'un axe situé dans le plan de la figure, puis par le miroir fixe (305) et par le miroir galvanométrique (306) mobile en rotation autour d'un axe orthogonal au plan de la figure. Il traverse alors l'objectif (307) formant à l'infini une image de l'échantillon, et est focalisé en un pont de l'échantillon observé (308). La lumière réémise par fluorescence depuis ce point retraverse l'objectif (307) en sens inverse, est réfléchie par le miroir galvanométrique (306), le miroir fixe (305), et le miroir galvanométrique (304). Elle traverse le miroir dichroïque (303), et est focalisée par la lentille (309) et le miroir fixe (310) sur le trou microscopique (311). La lumière ayant traversé le trou microscopique (310) est réfléchie par le miroir (312), collimatée par la lentille (313), réfléchie par le miroir (314), puis par la seconde face du miroir galvanométrique (304). Elle est alors réfléchie par le miroir (315) puis par la seconde face du miroir galvanométrique (306). Elle est alors focalisée par la lentille (316) sur un point du plan image dans lequel se trouve le capteur CCD (317) fixé à la caméra (318). Comme précédemment le capteur CCD peut être remplacé par un oculaire. Le fonctionnement de l'ensemble est le même que dans le premier mode de réalisation. Mode"points multiples" Il est possible d'éclairer simultanément plusieurs points de l'objet pour améliorer la vitesse d'imagerie. Le faisceau laser collimaté peut par exemple être divisé en plusieurs faisceau de directions différentes au moyen de prismes biréfringents. Plusieurs points de l'échantillons se trouvent alors éclairés simultanément. Dans le cas du second mode de réalisation, le trou microscopique unique doit être remplaçé par une plaque comprenant plusieurs trous microscopiques, pratiqués chacun au point qui est éclaué par le faisceau issu d'un point de l'objet sur lesquels un des faisceaux d'éclairage est focalisé. De même, dans le cas du premier mode de réalisation, lepoint réfléchissant peut également être remplacé par ensemble de points réfléchissants. Applications industrielles : Le présent microscope est destiné à améliorer la vitesse du microscope confocal en fluorescence et à permettre l'observation directe d'une image confocale à l'aide d'oculaires. Il peut en particulier être appliqué pour l'observation in vivo d'échantillons biologiques. Revendications (1/1) : 1-microscope confocal à balayage laser - comprenant un ou plusieurs miroirs mobiles permettant le balayage de l'échantillon observé dans un plan, - comprenant un faisceau laser réfléchi par lesdits miroirs mobiles, traversant ensuite l'objectif de microscope, parvenant à l'échantillon, et focalisé en un point de l'échantillon, - construit de telle manière que la lumière provenant du point de l'échantillon sur lequel est focalisé le faisceau laser d'éclairage soit collectée par l'objectif, puis réfléchie par lesdits miroirs mobiles, et focalisée en un point fixe d'un premier plan image, et caractérisé par le fait qu'il comporte : - des moyens pour renvoyer vers lesdits miroirs mobiles la partie du faisceau issu de l'échantillon qui parvient audit point fixe du premier plan image, et pour ne pas renvoyer vers lesdits miroirs mobiles la partie du faisceau qui parvient hors dudit point fixe, -des moyens pour focaliser cette partie du faisceau, après qu'elle ait été à nouveau réfléchie par lesdits miroirs mobiles, sur un second plan image, - des moyens pour observer et/ou enregistrer l'image formée dans ledit second plan image. 2-Microscope selon la revendication 1, caractérisé par le fait que seule une face de chaque miroir mobile est utilisée. 3-Microscope selon une des revendications 1 ou 2. caractérisé par le fait que lesdits moyens pour renvoyer une partie du faisceau vers lesdits miroirs galvanométriques sont constitués par un point réfléchissant. 4-Microscope selon une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait qu'il comprend - un moyen pour polariser l'onde issue de l'objet - une lame quart d'onde placée sur la partie commune au trajet de l'onde parvenant audit point fixe d'un plan image, et au trajet de l'onde provenant dudit point fixe du premier plan image. - un séparateur de faisceau polarisant permettant de réfléchir, vers ledit second plan image, l'onde provenant dudit point fixe du premier plan image. 5-Microscope suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le faisceau issu de l'objet observé est réfléchi une première fois sur une première face de chacun desdits miroirs mobiles, puis une seconde fois sur une seconde face de chacun desdits miroirs mobiles, et parvient ensuite audit capteur matriciel.