Brevet FR2818982A1 — publié le 20020705

Inhibiteur spécifique du système ubiquitine-protéasome et applications thérapeutiques correspondantes. L'invention concerne le domaine de la biochimie, ainsi que le domaine pharmaceutique. Plus précisément, l'invention concerne un nouvel inhibiteur du système ubiquitine-protéasome. La mise en route des principaux progammes cellulaires, comme la reprise de division, la sortie de mitose, l'entrée en apoptose, en meïose, la différenciation cellulaire, la réponse immunitaire, etc., est contrôlée par la dégradation spécifique de protéines cellulaires régulatrices. La dégradation protéique spécifique est principalement assurée dans la cellule par un système multimoléculaire complexe : la voie"ubiquitine-protéasome". Dans ce système, les protéines conjuguées (liées de manière covalente) à des chaînes de polyubiquitine par des enzymes ubiquitine-ligases, sont spécifiquement dégradées par le complexe protéolytique protéasome 26S. Des déréglements de ce système seraient à l'origine de grandes pathologies, comme le cancer ou les dégénérescences tissulaires. Selon l'état de la technique la démonstration la plus simple qu'une protéine donnée est dégradée par le protéasome 26S consiste à vérifier si la concentration de cette protéine augmente dans les cellules traitées par un inhibiteur de protéasome Un tel inhibiteur inhibe l'activité protéolytique de type trypsique ou chymotrypsique du protéasome. Les inhibiteurs de protéasomes connues appartiennent à plusieurs classes de molécules : des di ou tripeptides modifiés, des peptides aldéhydes, N-acétyl-leucyl-leucyl-norleucinal (ALLN), ou des composés non peptidiques naturels issus de micro-organismes comme la lactacystine et ses dérivés, les agents anti-tumoraux contenant de l'époxyketone (epoxomicine, eponemycine) etc... Toutefois, ce test soufre de deux inconvénients majeurs. En premier lieu, il ne prouve pas directement que la protéine en question est une cible de conjugaison d'ubiquitine. En second lieu et surtout, il ne prouve pas vraiment que sa dégradation est assurée par le protéasome car la plupart des drogues appelées"inhibiteurs du protéasome"ne sont en réalité pas complètement spécifiques de cette protéase. On sait par ailleurs que l'introduction d'ubiquitine mutante dépourvue de la lysine 48 permettant sa conjugaison interromp la polymérisation des chaînes d'ubiquitine et ainsi stabilise les substrats. Une telle stabilisation protéique par l'ubiquitine K48-substituée prouve que cette protéine est bien une cible non seulement du protéasome, mais plus précisément du système ubiquitineprotéasome. On notera que la formation de chaînes de polyubiquitine peut impliquer plusieurs résidus lysine de l'ubiquitine (Kl l, K29, K48 et K63), mais que seules les chaînes multiubiquitine liées par la lysine 48 ont été montrées capables d'induire la dégradation protéique par le protéasome. Les substrats du système ubiquitine-protéasome ne sont donc dégradés par le protéasome que s'ils sont conjugués à des chaînes d'ubiquitines associées par des liaisons peptidiques G76K48. La substitution du résidu K48 de l'ubiquitine empêche la ligation d'autres monomères d'ubiquitine par liaison G76-K48, ce qui entraîne la terminaison des chaînes polyubiquitine. Donc, au delà d'une certaine concentration dans les cellules, l'ubiquitine K48-substitutée agit comme un inhibiteur specifique du système ubiquitine-protéasome et entraîne la stabilisation artificielle de ses susbstrats. Toutefois, l'introduction d'ubiquitine mutée dans la cellule pose de nombreux problèmes puisqu'elle fait intervenir des techniques complexes comme l'utilisation de transgène ou la perméabilisation chimique membranaire. En pratique, l'usage de l'ubiquitine K48 substituée à jusqu'ici été réservé à des expériences de transfection cellulaire, ou à des tests d'ubiquitination in vitro ou en cellules perméabilisées par des solvants membranaires. Le principal objectif de la présente invention est de proposer un nouvel inhibiteur du système ubiquitine-protéasome qui soit vraiment spécifique de ce système. Notamment, un objectif de la présente invention est de décrire un tel inhibiteur permettant de prouver qu'une protéine donnée est bien une cible non seulement du protéasome mais plus précisément du système ubiquitineprotéasome. Encore un autre objectif de la présente invention est de proposer un tel inhibiteur qui puisse être utilisée sur cultures primaires et in vivo. Ces objectifs sont atteints grâce à l'invention qui concerne un inhibiteur spécifique du système ubiquitine-protéasome caractérisé en ce qu'il est constitué par la fusion d'au moins une molécule d'ubiquitine mutée présentant un acide aminé en position 48 qui n'est pas la lysine, ladite molécule d'ubiquitine mutée étant destinée à agir comme un terminateur de chaîne de polyubiquitination, et d' au moins un module d'incorporation cellulaire permettant la pénétration dudit inhibiteur dans une cellule. L'inhititeur spécifique du système ubiquitine-proteasome qui constitue l'invention distingue le présent produit des drogues anti-protéasome, qui peuvent inhiber des activités protéolytiques non reliées à l'ubiquitine. Cet inhibiteur constitue un outil pour déterminer si la dégradation d'une protéine donnée est spécifiquement causée par le système ubiquitine-protéasome. La stabilisation expérimentale de protéines par un traitement avec des inhibiteurs de protéasome, est classiquement considérée comme une démonstration que ces protéines sont dégradées par le protéasome. Cependant, ce test n'indique pas si les protéines en question sont effectivement des cibles de ligation de l'ubiquitine. La stabilisation et la conjugaison d'une protéine par le présent produit constituent une démonstration que cette protéine implique bien la voie ubiquitine-protéasome. Le module d'incorporation pourra être constitué différemment selon les modes de réalisation. Il assurera l'introduction de l'inhibiteur à l'intérieur des cellules et permettra de s'affranchir de manipulations compliquées devant être utilisées, selon l'état de la technique, comme l'introduction de transgènes dans les cellules ou la perméabilisation chimique membranaire. On connaît dans l'état de la technique plusieurs molécules susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la présente invention pour constituer le module d'incorporation. Ainsi ce module pourra notamment être constitué par : - un peptide hydrophobe cell-permeable peptide import (CPPI) selon Lin et al. (J. Biol. chem. 270, ppl4255-14258, 1995), - un peptide dérivé du domaine de liaison à l'ADN de facteurs de transcription à homéoboîtes selon Derossi et al. (Trends Cell. Biol. 8, pp84-87, 1998), - la protéine Tat du virus du SIDA (HIV) selon Frankel and Pabo, (Cell 55, ppll89-1193) 1988 ; - la protéine VP22 du virus HSV-1, selon Elliott and O'Hare, 1997). Lorsque le mécanisme d'action moléculaire de ces peptides naturels d'incorporation sera mieux compris, la conception raisonnée de nouveaux petptides de séquences artificielles possédant cette activité pourra également être envisagée. La fusion de l'ubiquitine mutée au module d'incorporation permet à l'inhibiteur selon l'invention d'être utilisé en cellules vivantes non transfectables (cultures primaires) et in vivo. Préférentiellement, ledit polypeptide d'incorporation est un polypeptide tel que la pénétratine-1, appartenant à la famille des homéoboîtes citée ci-dessus. Avantageusement ledit module d'incorporation est greffé à l'extrémité NH2 de ladite molécule d'ubiquitine. Selon une variante de l'invention, ledit inhibiteur comprend de plus au moins un module d'étiquetage. Un tel module d'étiquetage a pour fonction d'assurer deux fonctions, à savoir :-faciliter la purification du substrat, - détecter et/ou faciliter la purification des protéines intracellulaires substrats de ligation de l'ubiquitine, conjuguées au produit. La reconnaissance du produit à travers le module d'étiquetage plutôt que le module ubiquitine lui-même, évite toute confusion avec les molécules d'ubiquitine normales endogènes ainsi qu'avec les "domaines ubiquitine"rencontrés dans de nombreuses protéines cellulaires. Cette propriété offre de nombreuses possibilités expérimentales : comme par exemple vérifier si une protéine candidate est bien ubiquitinée en cellules dans des conditions physiologiques données, ou bien d'identifier tous les substrats de ligation à l'ubiquitine dans des conditions physiologiques données. On notera que l'intégration d'un tel module d'étiquetage dans l'inhibiteur n'est absolument pas obligatoire. Ainsi, si le module d'incorporation choisi est une molécule absente des cellules normales, il peut servir également de module d'étiquetage. Préférentiellement, ce module d'étiquetage est un polypetide tel la polyhistidine. Avantageusement ledit module d'étiquetage est greffé à l'extrémité NH2 de ladite molécule d'ubiquitine. On notera que la place respective des domaines d'incorporation et d'étiquetage n'est pas importante, du moment que le domaine de translocation fonctionne. Le greffage du module d'incorporation cellulaire et du module d'étiquetage à l'extrémité NH2 de l'ubiquitine K48 substituée n'handicape pas son activité de conjugaison. En plus de sa fonction de base d'inhibiteur du système ubiquitineprotéasome, cet inhibiteur constitue un outil très utile pour de nombreux protocoles expérimentaux d'étude de l'ubiquitination in vivo, et la recherche des protéines dégradées par le système ubiquitine-protéasome. Cet inhibiteur pourra notamment être utilisé pour : - rechercher si une protéine candidate X est détruite ou non par le système ubiquitine-protéasome dans des cellules en culture ou dans l'organisme lors de l'induction d'une activité cellulaire particulière ; - rechercher des protéines sur la base de leur ubiquitination lors de l'induction d'une activité cellulaire. Lorsque l'inhibiteur selon l'invention intégrera un module d'incorporation et un module d'étiquetage constitués tous les deux par des polypeptides, cet inhibiteur pourra être synthétisé comme une protéine dans des systèmes d'expression procaryotes ou eucaryotes appropriés. Une molécule similaire mais contenant la version sauvage de l'ubiquitine (K48 non substituée) devra alors être préférentiellement produite en parallèle afin de servir de témoin. L'inhibiteur selon l'invention est applicable sur des cellules pas ou peu transfectables : certaines lignées cellulaires, cellules normales en culture primaire ou dans des organismes vivants. L'action du produit ne nécessite ni modification génétique des cellules, ni perméabilisation membranaire, ce qui élargit son champ d'application. L'inhibiteur selon l'invention peut constituer un outil thérapeutique contre les pathologies liées au système ubiquitine-protéasome. Il est en effet raisonnable de penser que cet inhibiteur peut reproduire les effets cliniques des inhibiteurs avec une spécificité accrue pour le système ubiquitine. De nombreux exemples d'applications possibles des inhibiteurs du système ubiquitine protéasome sont donnés dans la littérature scientifique : agents anti-cancéreux, agents anti-inflammatoires, agents de traitement de la maladie d'Alzheimer ou de la maladie de Parkinson... On notera également que l'inhibiteur selon l'invention permet la détection, la purification et l'identification des protéines cellulaires substrats du système ubiquitine-protéasome dans des conditions physiologiques données, la ligation du présent produit sur des protéines par les ubiquitine-ligases induit à la fois leur stabilisation et leur étiquetage par des molécules exogènes. Ces étiquettes peuvent alors être utilisées comme des hameçons moléculaires pour révéler et/ou purifier sélectivement des protéines substrats. Les protéines ainsi purifiées peuvent ensuite être identifiées par des techniques de protéomique. L'invention, ainsi que les différents avantages qu'elle présente seront plus facilement compris grâce à la description qui va suivre d'une mode de réalisation de celle-ci donnée en référence aux dessins, dans lesquels : - la figure 1 représente schématiquement un inhibiteur spécifique (I) du système ubiquitine protéasome selon la présente invention ; - la figure 2 représente schématiquement une chaîne polyubiquitinique impliquée dans la reconnaissance par le protéasome 26S ; - la figure 3 représente différentes étapes d'un procédé mettant en oeuvre l'inhibiteur spécifique (I) et visant à déterminer si une protéine donnée X est détruite ou non par le système ubiquitine-protéasome ; - la figure 4 représente schématiquement un film radiographique obtenu lors d'un test Western Blot à l'issue d'un tel procédé ; - la figure 5 représente différentes étapes d'un procédé mettant en oeuvre l'inhibiteur spécifique (I) et visant à rechercher des protéines nouvelles sur la base de leur ubiquitination ; et, - la figure 6 représente schématiquement de plaques d'électrophorèse obtenues à l'issue d'un tel procédé Selon le présent mode de réalisation, l'inhibiteur spécifique de système ubiquitine-protéasome (I) représenté schématiquement à la figure 1, est constitué par une protéine résultant de la fusion d'un module d'incorporation constitué par la pénétratine-1 (1), d'un module d'étiquetage constitué par la polyhistidine (2), et d'ubiquitine mutée en position 48 (3). Cette molécule chimérique peut être obtenue par génie génétique à partir de gènes chimériques insérés dans des vecteurs d'expression en système procaryote (par exemple en bactéries) ou eucaryote (par exemple en baculovirus), en utilisant les signaux d'initiation de la transcription et de la traduction appropriés. La purification des protéines recombinantes est ensuite effectuée par affinité pour des ligands de la polyhistidine ou de la pénétratine 1. Une protéine recombinante servant de témoin (T) est réalisée de la même manière mais en utilisant une ubiquitine sauvage possédant une lysine en position 48. Deux exemples de mise en oeuvre de l'inhibiteur spécifique (I) ainsi réalisés sont donnés ci-après. Exemple 1 Dans ce premier exemple, l'inhibiteur décrit ci-dessus (I) est utilisé pour déterminer si une protéine candidate X est détruite par le système ubiquitineprotéasome dans des cellules en culture lors de l'induction d'une activité cellulaire particulière. En référence à la figure 3, on procède pour ce faire en plusieurs étapes. Lors d'une première étape on procède à l'incubation d'une partie A d'une culture cellulaire avec le témoin (T) et à l'incubation d'une autre partie B de cette même culture avec l'inhibiteur spécifique (1). On divise ensuite chaque population cellulaire A et B en deux sous-parties Al, A2 et B 1, B2. On induit l'activité cellulaire étudiée dans les sous-parties A2 et N2 et on ne l'induit pas dans les sous parties Al et B 1. L'induction est symbolisée sur la figure 3 par le signe"+"tandis que l'absence d'induction est symbolisée par le signe"-". Lors d'une troisième étape, on extrait la fraction protéique de chaque souspartie. Enfin, lors d'une quatrième étape, on détecte la protéine X, par exemple par la technique du"western-blot". Une représentation de la plaque chromatographique obtenue à l'issue de la quatrième étape est montrée à la figure 4. Sur cette plaque, on peut voir que : - la protéine X est présente dans les populations Al et BI sur lesquelles l'activité cellulaire étudiée n'a pas été induite ; - la protéine X n'est presque plus présente dans la population A2 où l'activité cellulaire étudiée a été induite en présence du témoin (T) ; - la protéine X et une autre protéine de plus haut poids moléculaire est présente dans la population BI où l'activité cellulaire étudiée a été induite en présence de l'inhibiteur (1). Les résultats obtenus pour la population B2 montrent que l'induction de l'activité cellulaire étudiée s'accompagne bien d'une dégradation de la protéine X par le système ubiquitine-protéasome, et les résultats obtenus pour la population A2 montrent que la conjugaison de la protéine X avec une ubiquitine normale polymérisable en chaînes K48-G76, entraîne sa dégradation. Exemple 2 Dans ce second exemple, l'inhibiteur spécifique (I) a été utilisé pour rechercher des protéines sur la base de leur ubiquitination lors de l'induction d'une activité cellulaire. Il est en effet intéressant de pouvoir identifier les protéines dégradées par le système ubiquitine-protéasome dans de nombreuses situations physiologiques afin de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques. En référence à la figure 5, le procédé proposé comprend les étapes suivantes consistant à administrer l'inhibiteur (I) sur le modèle d'étude sélectionné (cellules en culture, culture organotypique, injection stéréotaxique dans l'organisme), à. induire dans un premier cas naturellement (cas 1) et dans un second cas expérimentalement (cas 2) le changement physiologique étudié, à extraire les protéines cellulaires à partir des deux situations (1 et 2), à comparer et à sélectionner par affinité au module d'étiquetage des protéines conjuguées à l'inhibiteur, à séparer des protéines sélectionnées par électrophorèse en deux dimensions, et à rechercher des spots différentiels entre les deux situations physiologiques à comparer. La figure 6 représente les résultats d'électrophorèse en deux dimensions dans les cas 1 et 2, les spots entourés dans le cas 2 correspondent aux protéines ubiquitinées lors de l'activité cellulaire étudiée. REVENDICATIONS 1. Inhibiteur spécifique du système ubiquitine-protéasome caractérisé en ce qu'il est constitué par la fusion d'au moins une molécule d'ubiquitine mutée présentant un acide aminé en position 48 qui n'est pas la lysine, ladite molécule d'ubiquitine mutée étant destinée à agir comme un terminateur de chaîne de polyubiquitination, et d'au moins un module d'incorporation cellulaire permettant la pénétration dudit inhibiteur dans une cellule. 2. Inhibiteur spécifique selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit module d'incorporation est un polypeptide. 3. Inhibiteur spécifique selon la revendication 2 caractérisé en ce que ledit module d'incorporation est la pénétratine-1. 4. Inhibiteur spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il comprend de plus au moins un module d'étiquetage facilitant sa purification. 5. Inhibiteur spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que ledit module d'étiquetage est un polypeptide. 6. Inhibiteur spécifique selon la revendication 5 caractérisé en ce que ledit module d'étiquetage est la polyhistidine. 7. Utilisation dudit inhibiteur spécifique selon selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement du cancer. 8. Utilisation dudit inhibiteur spécifique selon selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la réalisation d'un médicament anti-inflammatoire. 9. Utilisation dudit inhibiteur spécifique selon selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement de la maladie de Parkinson. 10. Utilisation dudit inhibiteur spécifique selon selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement de la maladie d'Alzheimer. 11. Utilisation de l'inhibiteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour rechercher si une protéine candidate X est détruite ou non par le système ubiquitine-protéasome dans des cellules en culture ou dans l'organisme lors de l'induction d'une activité cellulaire particulière. 12. Utilisation de l'inhibiteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour rechercher des protéines sur la base de leur ubiquitination lors de l'induction d'une activité cellulaire.