Brevet FR2810244A1 — publié le 20011221

La présente invention est relative à des agents immunosuppresseurs dérivés de morbillivirus. Le genre morbillivirus, de la famille des Paramyxoviridae, comprend notamment le virus de la rougeole (VR), le virus de la Maladie de Carré (VMC), le virus de la peste bovine, et le virus de la peste des petits ruminants (VPPR). Ils présentent un tropisme infectieux étroit. Par exemple, le virus de la rougeole n'infecte que l'homme et quelques espèces de grands singes. Les morbillivirus sont des virus enveloppés. L'enveloppe virale, de nature lipoprotéique comprend deux glycoprotéines, l'hémagglutinine (HA) et la protéine de fusion (F) composée de deux sous-unités F1 et F2. La protéine HA intervient dans la fixation du virus sur le récepteur des cellules de l'hôte. Chez l'homme, le récepteur du VR a été identifié, du moins dans le cas des souches vaccinales, comme étant la glycoprotéine membranaire CD46, exprimée sur toutes les cellules à l'exception des érythrocytes. Le génome viral, constitué d'un ARN simple brin de polarité négative, est protégé par une nucléocapside, particule ribonucléoprotéique de forme hélicoïdale. La nucléocapside est composée de trois protéines : la nucléoprotéine (NP) directement associée à l'ARN viral et deux autres protéines, également associées à l'ARN, la phosphoprotéine (P) et la protéine L, impliquées dans la réplication et la transcription du génome viral. La cohésion de l'ensemble enveloppe-nucléocapside est assurée par la protéine de matrice (M) localisée à l'interface de la nucléocapside et de l'enveloppe virale. L'existence d'effets immunosuppresseurs résultant d'une infection par le VR est connue depuis longtemps. Elle a été décrite pour la première fois en 1908 par VON PIRQUET qui a rapporté que la majorité des patients atteints de rougeole présentait une diminution transitoire de l'intensité de la réaction d'hypersensibilité retardée cutanée aux tests tuberculiniques [VON PIRQUET, Dtsch. Med. Wochenschr., 30, 1297-1300, (1908)]. Ces effets immunosuppresseurs ont depuis été confirmés par d'autres chercheurs [TAMASHIRO et al. ; Pediatr. Infect. Dis., 6,451-454, (1987) ; BECKFORD et al., S. Afr. Med. J., 68, no. 12,858-863, (1985) ; HIRSCH et al., Clin. Immunol. Immunopath., 31,1-12, (1984) ], et il est reconnu qu'en favorisant le développement d'infections secondaires, ils constituent une cause majeure des décès consécutifs aux infections par le VR. En outre, cette immunosuppression a également été observée, bien qu'à un degré moindre, dans le cas de la vaccination anti-rougeoleuse, où l'on utilise des souches vivantes atténuées du virus de la rougeole [FIREMAN et al., Pediatrics, 43,264-272, (1969) ; WEISS, Science, 258,546- 547, (1992) ; HUSSEY et al., J. Infect. Dis., 173, 1320-1326, (1996) ; BOUCHAUD et MOUAS, Ann. Med. Interne, 149, no. 6, 351-360, (1998)]. Il a été observé que les lymphocytes T issus du sang circulant de patients infectés par une souche pathogène ou par une souche vaccinale de VR, présentent une réduction de la capacité à proliférer en réponse à des mitogènes, des allergènes ou des antigènes de rappel [COOVADIA et al., Arch. Dis. Child, 53, no. 11, 861-867, (1978) ; HIRSCH et al., cf. supra ; BORROW et OLDSTONE, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 191,85-100, (1995) ; HUSSEY et al., cf. supra]. Les mécanismes régissant les effets immunosuppresseurs des morbillivirus, et notamment du VR, sont encore mal connus. En effet, faute de modèle expérimental animal facile à étudier, la plupart des observations concernant ces mécanismes ont été effectuées in vitro. Il a ainsi été observé que le VR induisait une mort par apoptose de cellules immunitaires infectées, telles que les macrophages [ESOLEN et al., J. Virol., 69, no. 6, 3955-3958, (1995) ], les cellules épithéliales thymiques [VALENTIN et al., J. Virol. 73, no. 3,2212-2221, (1999) ], et les cellules dendritiques dérivées de monocytes [FUGIERVIVIER et al., J. Exp. Med., 186, no. 6,813-823, (1997) ; SCHNORR et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, no. 10,5326- 53331, (1997) ] ou de sang de cordon ombilical [GROSJEAN et al., J. Exp. Med., 186, no. 6,801-812, (1997) ], ainsi qu'une perte de la réponse lymphoproliférative aux mitogènes et un arrêt du cycle cellulaire des lymphocytes T en phase G0/G1 [McCHESNEY et al., J. Immunol., 140, no. 4, 1269-1273, (1988) ; NANICHE et al., J. Virol., 73, no. 3, 1894-1901, (1999) ]. Une inhibition de la production d'anticorps par les lymphocytes B infectés in vitro a également été observée [GALAMA et al., Cell Immuno., 50, no. 2, 405-415, (1980) ; CASALI et al., J. Exp. Med., 159, no. 5, 1322-1337, (1984)], ainsi qu'une perturbation de la production de cytokines par les lymphocytes T et les cellules présentatrices d'antigène [GRIFFIN, Curr. Top Microbiol. Immunol., 191,117-134, (1995) ; LEOPARDI et al., J. Immunol., 149, no. 7,2397-2401, (1992) . Les composants viraux impliqués dans ces différents effets restent encore mal connus. SCHLENDER et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, no. 23,13194-13199, (1996) ] et NIEWIESK et al. [J. Virol., 71,7214-7219, (1997) ] rapportent que le VR ou le VR inactivé aux UV (VR-UV), induit in vitro une perte de la prolifération des lymphocytes T induite par un mitogène ; cet effet impliquerait les protéines d'enveloppe H et F. Il a également été observé que l'interaction du VR inactivé aux UV avec la molécule CD46 inhibait la sécrétion d'IL-12 par les monocytes [KARP et al., Science, 273, no. 5272, 228231, (1996)]. Enfin, RAVANEL et al., [J. Exp. Med., 186,269- 278, (1997) ] rapportent que la protéine NP affecte les fonctions des lymphocytes B en inhibant leur production d'immunoglobuline [RAVANEL et al., J. Exp. Med., 186, no. 2, 269-278, (1997)]. Il apparaît donc que les connaissances actuellement disponibles sur les effets immunosuppresseurs des morbillivirus sont encore très fragmentaires. En outre, les résultats disponibles résultant principalement d'études in vitro sur des populations cellulaires isolées ne reflètent qu'imparfaitement la complexité des interactions physiologiques aboutissant à la réponse immunitaire. Une meilleure connaissance du ou des mécanisme(s) impliqué(s) dans l'immunosuppression induite par les morbillivirus peut notamment permettre d'obtenir de nouveaux traitements immunosuppresseurs, ou bien de préparer des vaccins anti-morbillivirus dépourvus d'effets immunosuppresseurs ou ne présentant que des effets immunosuppresseurs atténués. Les Inventeurs ont maintenant développé un modèle expérimental murin permettant l'étude de l'immunosuppression induite par les morbillivirus. Ils ont ainsi pu observer que, même en l'absence de toute réplication virale, les protéines de morbillivirus induisaient une inhibition de la réponse immunitaire à médiation cellulaire (réactions de type IV selon la classification de GELL et COOMBS), selon 2 modalités différentes : 1) une inhibition de l'hypersensibilité de contact, CD8 dépendante ; 2) une inhibition de l'hypersensibilité retardée de type tuberculinique, CD4 dépendante. Ils ont également constaté que, de façon surprenante, cette inhibition de la réponse immunitaire à médiation cellulaire impliquait principalement la protéine NP, et plus particulièrement une région correspondant à environ 125 acides aminés C-terminaux de cette protéine, et qu'elle ne nécessitait pas l'intervention du récepteur cellulaire CD46. Les glycoprotéines d'enveloppe F et H ainsi que le récepteur CD46 augmentent toutefois l'effet immunosuppresseur. Les Inventeurs ont également observé que les morbillivirus pouvaient induire une immunosuppression chez un hôte différent de leur hôte naturel, ce qui montre une nonspécificité d'espèce des mécanismes régissant l'immunosuppression induite par ces virus. La présente invention a pour objet l'utilisation d'une préparation de protéines comprenant au moins une nucléoprotéine de morbillivirus ou un fragment de celle-ci comprenant tout ou partie de la région C-terminale d'environ 100 à 130 acides aminés de ladite nucléoprotéine, pour l'obtention d'un médicament inhibiteur de la réponse immunitaire à médiation cellulaire. Selon un mode de réalisation de la présente invention, ledit fragment comprend au moins une séquence de ladite région C-terminale qui est conservée entre les nucléoprotéines de différents morbillivirus, et notamment entre les nucléoprotéines des morbillivirus VR, VMC, et VPPR. Bien que ladite région C-terminale représente la portion de la nucléoprotéine dont la séquence diverge le plus d'un morbillivirus à l'autre, il existe quand même au sein de cette région, plusieurs portions très conservées (cf. par exemple DIALLO et al. [J. Gen. Virol., 75,233-237, (1994) ]. Parmi les fragments de ladite région C-terminale correspondant à des portions conservées, et utilisables conformément à l'invention, on citera notamment : - un fragment comprenant les acides aminés 411- 421 de la séquence peptidique de la nucléoprotéine du virus de la rougeole, ou la séquence correspondante de la nucléoprotéine d'un autre morbillivirus ; - un fragment comprenant les acides aminés 489- 506 de la séquence peptidique de la nucléoprotéine du virus de la rougeole, ou la séquence correspondante de la nucléoprotéine d'un autre morbillivirus ; - un fragment comprenant les acides aminés 516- 625 de la séquence peptidique de la nucléoprotéine du virus de la rougeole, ou la séquence correspondante de la nucléoprotéine d'un autre morbillivirus. Les positions indiquées ci-dessus se réfèrent à la numérotation des acides aminés dans les séquences publiées par DIALLO et al. [cf. supra]. Avantageusement, une préparation de protéines utilisables conformément à l'invention comprend en outre les glycoprotéines d'enveloppe F et H d'un morbillivirus. Une préparation utilisable conformément à l'invention peut par exemple être obtenue par inactivation d'un morbillivirus, notamment par un traitement par rayons ultra-violets ; elle peut également être obtenue à partir des protéines, ou de leurs fragments, mentionnés ci-dessus. Les protéines de morbillivirus ainsi que leurs fragments, utilisables conformément à l'invention, sont connus en eux-mêmes ; ils peuvent être préparés par des méthodes classiques, par exemple par purification à partir de cultures virales, ou avantageusement, par génie génétique, ou par synthèse peptidique. L'inhibition de l'immunité à médiation cellulaire induite par les préparations de protéines de morbillivirus est comparable à celle obtenue lors d'un traitement à forte dose d' anti-inflammatoires, ou à base d' immunosuppresseurs puissants, comme la dexaméthasone. La présente invention peut être mise en #uvre dans le cadre de la prévention ou du traitement de toutes les pathologies où il est souhaitable d'inhiber la réponse immunitaire à médiation cellulaire. On citera par exemple les pathologies inflammatoires, résultant notamment d'une infection par un agent pathogène (lèpre, tuberculose, leishmaniose, listériose, candidose, etc. ) ou les dermites allergiques de contact induites par différents agents sensibilisants. Elle peut également être mise en #uvre dans la prévention ou le traitement du rejet de greffe, ou de la maladie du greffon contre l'hôte. La présente invention peut également être utilisée dans le cadre de la mise au point de nouveaux vaccins, notamment de vaccins anti-rougeoleux, dépourvus d'effets immunosuppresseurs ou possédant des effets immunosuppresseurs atténués. Ces vaccins peuvent notamment être obtenus à partir de morbillivirus dans lesquels tout ou partie de la nucléoprotéine, et en particulier la région Cterminale de 110 à 130 acides aminés environ de ladite nucléoprotéine a été délétée ou altérée. Elle peut être altérée notamment par une ou plusieurs modifications au niveau d'au moins une des séquences conservées entre les différents morbillivirus et/ou par délétion d'une ou plusieurs desdites séquences conservées. Avantageusement, ladite modification ou ladite délétion concerne au moins une des séquences 411-421,489-506, ou 516-625, mentionnées cidessus. La présente invention a également pour objet des procédés permettant d'évaluer le potentiel immunosuppresseur d'une préparation d'un morbillivirus, par exemple d'un vaccin anti-morbillivirus, ou d'une préparation utilisable comme immunosuppresseur conformément à l'invention. Selon une première variante de la présente invention, ledit potentiel immunosuppresseur est évalué par détermination de la quantité de protéine NP dudit morbillivirus présente dans ladite préparation. Selon un mode de mise en #uvre préféré de cette première variante, ledit procédé comprend la mise en contact de ladite préparation avec au moins un anticorps dirigé contre ladite protéine NP, et de préférence, au moins un anticorps dirigé contre un épitope porté par la région Cterminale d'environ 110 acides aminés de ladite protéine NP, et la quantification du complexe anticorps/antigène formé, par tous moyens appropriés, connus en eux même de l'homme de l'art. Selon une première variante de la présente invention, ledit potentiel immunosuppresseur est évalué par l'utilisation de souris sensibilisées au DNFB ou au KLH. Avantageusement, et en particulier pour évaluer le potentiel immunosuppresseur d'une préparation comprenant les protéines d'enveloppe H et F de morbillivus, lesdites souris sont des souris transgéniques exprimant le récepteur CD46. Des souris transgéniques exprimant le récepteur CD46 sont connues en elles-mêmes ; elles peuvent par exemple être obtenues comme décrit par THORLEY et al. [Eur. J. Immunol., 27,726-734, (1997) ] ou par EVLASHEV et al. [J. Virol., 74, 1373-1382, (2000)]. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant les effets inhibiteurs in vivo dans un modèle murin, de différentes préparations de morbillivirus sur les réactions d'hypersensibilité retardée. EXEMPLE 1 : INHIBITION DES REACTIONS D'HYPERSENSIBILITE RETARDEE CHEZ LA SOURIS PAR LE VIRUS DE LA ROUGEOLE INACTIVE AUX UV. L'effet du virus de la rougeole inactivé aux UV sur la réponse immunitaire à médiation cellulaire a été testé in vivo, chez la souris, en utilisant des modèles représentatifs des 2 aspects de l'hypersensibilité de type retardé : l'hypersensibilité de contact au DNFB, et l'hypersensibilité retardée au KLH, représentatif de l'hypersensibilité de type tuberculinique. Des souris C57BL/6 (IFFA CREDO), âgées de 7 à 11 semaines, ont été utilisées pour ces expérimentations. Le VR Edmonston (ATCC VR-24), et, à titre de témoin, un autre paramyxovirus, le virus respiratoire syncitial (VRS, groupe A souche Long), ont été utilisés. Les virus ont été propagés séparément sur des cellules rénales fibroblastiques de singe (Vero). Après lyse mécanique des cellules, effectuée lorsque 50% d'entre elles présentent un aspect cytopathique, le lysat cellulaire contenant les particules virales infectieuses a été congelé à -80 C et décongelé, puis centrifugé et enfin stocké à -80 C. Chaque lot de virus a été inactivé par une exposition aux UV (254 nm) pendant 45 min à 4 C. La perte du caractère infectieux a été testée sur des cellules Vero. Une préparation factice constituée par le surnageant de cultures de cellules Vero non-infectées a été utilisée à titre de contrôle. Des injections intra-péritonéales de VR ont été réalisées soit sur des souris de type sauvage, soit sur des souris transgéniques exprimant la molécule CD46. Les différentes préparations ont été injectées (volume d'une injection : 500 l) dans la cavité péritonéale (IP) des souris, à raison de 5x106 particules virales pour le VRS inactivé par une exposition aux UV (VRS-UV), de 106 ou 5x106 particules virales pour le VR inactivé par une exposition aux UV (VR-UV). Test d'hypersensibilité de contact au DNFB Le DNFB (2,4-dinitrofluorobenzène, SIGMA) a été dilué dans de l'acétone huile d'olive (4:1) immédiatement avant usage. La réaction d'hypersensibilité de contact au DNFB (HSC) a été réalisée comme décrite d'après GARRIGUE et al., [Contact Dermatitis, 30, no. 4,231-237, (1994)]. Six heures après l'injection de la préparation virale ou de la préparation factice, 25 ul d'une solution à 0,5% de DNFB ont été appliqués sur 2 cm2 de peau ventrale préalablement rasée. Après 5 jours les animaux sensibilisés, et les animaux d'un groupe contrôle, non-sensibilisés, ont reçu 10 l de solution non irritante de DNFB répartie sur chacune des faces de l'oreille droite, et 10 l de solution d'acétone-huile d'olive sur l'oreille gauche. L'épaisseur des oreilles a été mesurée avec un micromètre (J15; Bell SA, France) avant et chaque jour suivant l'application. L'#dème de l'oreille est calculé par la formule suivante : [(T-To) oreille droite] - [(T-To) oreille gauche], ou T et To sont respectivement les valeurs de l'épaisseur de l'oreille avant et après élicitation. Les résultats sont illustrés par la Figure l(a), qui représente la taille moyenne de l'#dème de l'oreille à différents temps suivant l'application. Légende de la Figure l(a) : # : VRS-UV # : VR-UV 5x106 # : VR-UV 106 # : préparation factice # : souris non-sensibilisées Test d'hypersensibilité retardée au KLH L'hypersensibilité retardée a été mesurée par un test conventionnel de mesure de 1'oedème des coussinets des pattes. Six heures après l'injection de la préparation virale ou de la préparation factice, les souris ont été sensibilisées par injection sous-cutanée de 300 g de KLH (keyhole limpet hemocyanin, SIGMA) émulsifié dans de l'adjuvant complet de Freund. 7 jours plus tard, une seconde injection (150 g de KLH dans du tampon PBS) a été effectuée dans les coussinets de la patte gauche des animaux sensibilisés, et des animaux non sensibilisés d'un groupe contrôle ; du PBS seul a été injecté dans la patte droite. L'épaisseur des coussinets a été mesurée 24 heures avant et 48 heures après l'injection de rappel. L'#dème des coussinets est calculé par la formule suivante : [(T-To) coussinet droit]- [(T-To) coussinet gauche], ou T et To sont respectivement les valeurs de l'épaisseur du coussinet avant et après l'injection de rappel. Les résultats sont illustrés par la Figure 1 (b), qui représente la taille moyenne de l'oedème des coussinets à 24 heures après l'injection de rappel. Légende de la Figure 1 (b) : Barres hachurées : préparation factice Barres noires : VR-UV 5x106 Barres grises : VR-UV 106 Barres blanches : souris non-sensibilisées Ces résultats montrent que les souris injectées avec du VR-UV développent une réponse d'hypersensibilité retardée, qu'il s'agisse d'hypersensibilité de contact, ou d'hypersensibilité de type tuberculinique, environ deux fois moins importante que les souris contrôle injectées avec une préparation factice. Dans les mêmes conditions des souris témoin injectées avec du VRS-UV développent une réponse d'hypersensibilité retardée, équivalente à celle des souris contrôle injectées avec la préparation factice. Le VR induit donc une immunosuppression in vivo, et ce, en l'absence de toute réplication virale. EXEMPLE 2 : ROLE DE LA NUCLEOPROTEINE (NP) DU VIRUS DE LA ROUGEOLE DANS L'INHIBITION DES REACTIONS D'HYPERSENSIBILITE RETARDEE CHEZ LA SOURIS. Pour étudier la contribution de la NP dans l'effet immunosuppresseur induit par le VR-UV chez la souris, il a été procédé à des injections intra-péritonéales de NP recombinante purifiée sur des souris C57BL/6, ou sur des souris dépourvues du récepteur FcyR (Fc[gamma]RII-/- x Fc[gamma]R-/- ; 0005856MM ; TACONIC, USA). La nucléoprotéine recombinante a été préparée selon le protocole suivant : Des cellules Sf-9 de Spodoptera frugiperda ont été infectées à raison de 1 PFU par cellule, par un baculovirus recombinant (AcNPVNP), comportant la séquence codante de la NP du VR. Après trois jours de culture, les cellules ont recueillies par centrifugation (200 g, 5 min, 4 C) et le culot cellulaire lavé en tampon PBS. Les cellules ont ensuite été placées dans un tampon hypotonique (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 ; 10 mM NaCl) et lysées par l'ajout d'un détergent non ionique, le Nonidet P-40 1%. Afin d'éviter des problèmes de dégradation, des inhibiteurs de protéases ont été ajoutés au moment de la lyse des cellules et les lysats ont été maintenus à 4 C. Afin d'éliminer les noyaux, les lysats ont été centrifugés à 1000 g, puis une ultracentrifugation (1000 g, 10 min) en présence de EDTA 10 mM a été réalisée, éliminant ainsi les débris cellulaires. Le surnageant récupéré a été centrifugé en CsCl pendant 2 heures à 36000 rpm à 12 C, rotor SW41 (BECKMAN). Ce gradient est composé de paliers de 2 ml de 40% CsCl (P/V), 2 ml de 30% CsCl, 2 ml de 25% CsCl et de 2 ml de 5% saccharose (P/V). La NP qui forme une bande visible à la densité de 30% CsCl a été récupérée par aspiration, diluée dans du PBS et centrifugée 2 heures à 36000 rpm. Le culot final est resuspendu dans du PBS. Chaque lot a été testé, par dosage des protéines (Kit BCA PIERCE), par gel d'acrylamide et en western blot. Pour chaque expérience, 100 g de NP, 5x106 particules de VR-UV, ou 500 (il de la préparation factice ont été injectés dans la cavité péritonéale des souris, selon le protocole décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus. Ces animaux ont été ensuite sensibilisés au DNFB, ou au KLH, comme décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus. Les résultats sont illustrés par les Figures 2(a) à 2 (d) . Figure 2 (a) : Test d'hypersensibilité au DNFB chez les souris C57BL/6 # : VR-UV 5x106 # : NP recombinante # : préparation factice # : souris non-sensibilisées Figure 2(b) : Test d'hypersensibilité au DNFB chez les souris Fc[gamma]R-/- # : VR-UV 5x106 # : NP recombinante # : préparation factice # : souris non-sensibilisées Figure 2(c) : Test d'hypersensibilité au KLH chez les souris C57BL/6 Figure 2(d) : Test d'hypersensibilité au KLH chez les souris Fc[gamma]R-/- Alors que les souris injectées avec la préparation factice présentent un #dème caractéristique de la réaction d'hypersensibilité au DNFB, la NP induit chez les souris C57BL/6 une inhibition de la réaction d'hypersensibilité similaire au DNFB à celle engendrée par le VR-UV. Des expérimentations complémentaires effectuées avec des concentrations plus faibles de NP montrent que cet effet est dose-dépendant ; l'inhibition induite par l'injection de 40 g de NP est légèrement plus faible que celle observée après injection de 100 g, et aucune inhibition n'est observée après injection de 4 g de NP. Dans le cas de la réaction d' hypersensibilité au KLH, l'inhibition induite par la NP est comparable à celle induite par le VR-UV, bien qu'un peu plus forte . En revanche, chez les souris dépourvues du récepteur FcyR, aucun effet immunosuppresseur de la NP ou du VR-UV n'est observé dans le cas de la réaction d'hypersensibilité au DNFB. Dans le cas de la réaction d'hypersensibilité au KLH, on n'observe aucun effet immunosuppresseur de la NP, et un faible effet immunosuppresseur du VR-UV. EXEMPLE 3 : ROLE DES GLYCOPROTEINES HA ET F DE L'ENVELOPPE DU VIRUS DE LA ROUGEOLE DANS L'INHIBITION DES REACTIONS D'HYPERSENSIBILITE RETARDEE CHEZ LA SOURIS Pour analyser le rôle des protéines de l'enveloppe du VR dans l'immunosuppression induite chez la souris, un virus de la rougeole recombinant dépourvu des glycoprotéines HA et F de l'enveloppe a été utilisé, soit sur des souris C57BL/6, soit sur des souris transgéniques exprimant la molécule CD46. Les souris transgéniques pour CD46 ont été réalisées par l'injection, dans des ovocytes de souris, de l'ADNc du gène humain codant pour l'isoforme moléculaire CD46 BC Cyt-1 sous le contrôle du promoteur de CD46. Ces souris expriment de façon ubiquitaire la molécule CD46 dans le fond génétique H-2b [THORLEY et al., Eur. J. Immunol., 27,726- 734, (1997)]. Le VR Edmonston tag (EDtag) est un VR recombinant dérivé de la souche Edmonston par clonage moléculaire de la totalité du génome [TOBER et al., J. Virol., 72, no. 10, 8124-8132, (1998) ]. Le VR MGV est un VR recombinant dépourvu des glycoprotéines de l'enveloppe HA et F [SPIELHOFER et al., J. Virol., 72, no. 3,2150-2159, (1998) ]. Les souches de VR ont été propagées, récoltées, et inactivées aux UV selon le protocole décrit à l'Exemple 1 ci-dessus. Pour chaque expérience, 5x106 particules de VRUV, de EDtag-UV, de MGV-UV, ou 500 l de préparation factice ont été injectés dans la cavité péritonéale des souris, selon le protocole décrit dans l'Exemple 1. Les animaux ont été ensuite sensibilisés au DNFB comme décrit dans l'Exemple 1. Les résultats sont illustrés par la Figure 3(a), pour les souris C57BL/6 et 3(b) pour les souris transgéniques pour CD46. Légende des Figures 3(a) et 3(b) : # : VR-UV # : EDtag-UV # : MGV-UV # : préparation factice # : souris non-sensibilisées Chez les souris C57BL/6, ou chez les souris transgéniques pour CD46 ayant reçu une injection de MGV-UV, on observe un effet inhibiteur d'intensité équivalente. Dans les 2 cas cet effet est comparable à celui résultant de l'injection de 100 g de NP purifiée (résultats non illustrés). Chez les souris C57BL/6, l'effet inhibiteur de MGV-UV est également comparable à celui engendré par le VR-UV ou le virus recombinant contrôle EDtag-UV. En revanche, chez les souris transgéniques pour CD46, l'effet inhibiteur de VR-UV et de EDtag-UV est plus important que celui de MGV-UV dans l'inhibition de réaction d'HSC au DNFB. L'injection de MGV-UV n'induit qu'une inhibition partielle de la formation de l'#dème alors que l'injection de VR-UV ou de EDtag-UV inhibe complètement la formation de l'#dème. Ces résultats montrent que bien que les glycoprotéines H et F de l'enveloppe virale ne soient pas essentielles pour l'induction d'une inhibition de la réaction d'hypersensibilité, elles permettent, en présence du récepteur CD46, d'augmenter l'effet immunosuppresseur, jusqu'à inhiber totalement cette réaction. Des expérimentations complémentaires, dans lesquelles la sensibilisation par le DNFB a été effectuée 2 semaines après l'injection de préparation virale, ont été effectuées. Dans ces conditions un effet inhibiteur de la réaction d'hypersensibilité a été observé, pour les préparations virales contenant les glycoprotéines H et F, dans le cas les souris transgéniques pour CD46, ce qui indique que l'expression de ce récepteur peut permettre d'augmenter la durée de l'effet immunosuppresseur des protéines virales. EXEMPLE 4 : EFFET DU VIRUS DE LA ROUGEOLE INACTIVE AUX UV SUR L'ACTIVITE CYTOTOXIQUE DES LYMPHOCYTES (CTL) SPECIFIQUES DE L'HAPTENE. Afin d'analyser l'activité cytotoxique induite après sensibilisation, les cellules spléniques de souris C57BL/6, transgéniques pour CD46, injectées ou non avec du VR-UV ou de la NP et sensibilisées au DNFB, ont été testées pour leur capacité à lyser les cellules cibles EL-4 couplées au DNBS (acide 2,4-dinitrobenzène sulfonique ; SIGMA). Pour chaque expérience, 100 ug de NP, 5x106 particules de VR-UV, ou 500 l de préparation factice ont été injectés dans la cavité péritonéale des souris, et les animaux ont été ensuite sensibilisés au DNFB, selon le protocole décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus. La rate de chaque animal a été prélevée et une suspension cellulaire a été réalisée par broyage des organes entre lames de verre fritté. Les splénocytes ont été lavés et les globules rouges lysés en présence de NH4C1 0,83% pendant 5 minutes à 37 C. Des splénocytes ont été isolés de la même façon à partir de rates de souris naïves, puis irradiés à 1500 rad et chargés en haptène par une incubation dans une solution de DNBS 4 mM afin de jouer le rôle de CPAg. Les splénocytes des souris sensibilisées et les splénocytes chargés en haptène ont été co-cultivés en RPMI 1640,10% SVF à raison de 2x106 cellules par ml. Après 5 jours de culture, les splénocytes restimulés par la culture en présence des CPAg constituent la population effectrice du test. Des cellules EL-4 (106 cellules par ml), faisant office de cellules-cibles ont été cultivées en RPMI 1640, 10% SVF et en présence de thymidine tritiée (10 uCi par ml de milieu de culture pendant 3 heures à 37 C), puis lavées deux fois en RPMI 1640 10% SVF. Une partie des cellules EL-4 marquée au tritium a été chargée ensuite en DNBS comme décrit ci-dessus. Les cellules cibles ont été réparties dans des plaques de 96 puits à raison de 2x104 cellules par puits. Les cellules effectrices ont également été réparties dans les mêmes puits selon un rapport cible/effecteur décroissant. Les puits témoin (lyse spontanée) contiennent uniquement des cellules cibles. sans Après 4 heures de co-culture, les cellules ont été transférées sur filtres, et le nombre de coups par minute a été compté en présence de liquide à scintillation (compteur WALLAC). Le pourcentage de cytotoxicité est déterminé par la formule : % de cytotoxicité =100(S-E)/S où S correspond à la lyse spontanée (EL-4 tritiées et hapténisées sans cellules effectrices), E correspond à la lyse expérimentale (EL-4 tritiées et hapténisées en présence de cellules effectrices). Les résultats sont illustrés par les Figures 4(a) à 4 (c) . Figure 4 (a) : Activité cytotoxique des cellules de souris C57BL/6 injectées avec VR-UV # : VR-UV # : préparation factice Figure 4(b) : Test d'hypersensibilité au DNFB chez les souris C57BL/6 injectées avec NP recombinante # : NP recombinante # : préparation factice Figure 4(c) : Test d'hypersensibilité au KLH chez les souris CD46 injectées avec VR-UV # : VR-UV # : préparation factice Comme le montrent les Figures 4A et 4B, l'injection à des souris C57BL/6 de VR-UV ou de NP n'affecte pas l'activité CTL par rapport à celle des souris contrôle (préparation factice). En revanche, l'injection de VR-UV inhibe de façon significative l'activité CTL des lymphocytes provenant de souris CD46 transgéniques (p Ce défaut d'activité CTL apparaît donc dépendant de l'expression de la molécule CD46. EXEMPLE 5 : EFFETS DU VIRUS DE LA ROUGEOLE INACTIVE AUX UV ET DE LA NP SUR LA PROLIFERATION DES LYMPHOCYTES T CD8 SPECIFIQUES DE L'HAPTENE Les lymphocytes T CD8 (LTCD8) constituant la population effectrice impliquée dans l'hypersensibilité de contact au DNFB [KEHREN et al., J. Exp. Med., 189, no. 5, 779-786, (1999)], il a été recherché si l'inhibition de la réaction d'HSC au DNFB induite par le VR-UV et la NP relevait d'un défaut d'activation des LTCD8 au cours de la phase de sensibilisation. Les expérimentations ont été effectuées sur des souris C57BL/6, sur des souris transgéniques exprimant la molécule CD46, ou sur des souris dépourvues du récepteur FcyR. Pour chaque expérience, 100 ug de NP, 5x106 particules de VR-UV, 500 l de préparation factice, ou 500 l de tampon PBS ont été injectés dans la cavité péritonéale des souris, et les animaux ont été ensuite sensibilisés au DNFB, selon le protocole décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus. Les LTCD8 de chaque souris, issus des ganglions lymphatiques drainant la zone d'application du DNFB, ont été isolés selon le protocole suivant : Les ganglions drainant la zone d'application de l'haptène (inguinaux, sous brachiaux et axillaires) de chaque animal ont été prélevés 4 jours après sensibilisation des animaux, et placés dans du RPMI 1640, 10% SVF. Les ganglions ont été broyés entre lames de verre fritté et les cellules extraites lavées, puis placés deux heures dans un incubateur à 37 C afin d'éliminer les macrophages par adhésion sur plastique. Les cellules ont été ensuite incubées 30 min à 37 C en présence d'anticorps monoclonaux de rat : GK1. 5 (anti-CD4), Ml/70 (anti-macrophage), RA3-6B2 (anti-B220), M5/114 (anti-classe II), RB6-8C5 (anti-granulocytes). Afin d'éliminer l'excès d'anticorps non liés aux cellules, les cellules ont été lavées en RPMI 1640 10% SVF. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 30 min à 4 C sous agitation en présence de billes magnétiques couplées à une immunoglobuline dirigée contre les anticorps de rat (BIOMAG). Les cellules liées aux anticorps, reconnues par les immunoglobulines présentes à la surface des billes ont été éliminées par passage de la suspension sur un aimant. La purification des lymphocytes a été vérifiée par un marquage des cellules sélectionnées négativement avec un anticorps anti-CD8 et une analyse en cytométrie de flux. La population cellulaire ainsi sélectionnée négativement était constituée de plus de 95% de lymphocytes T CD8. Les LT CD8 ainsi isolés ont été co-cultivés pendant trois jours en présence soit de CPAg préparées à partir de splénocytes de souris naïves, couplées au DNBS, ou couplées avec un haptène contrôle, le TNBS (acide 2,4,6trinitrobenzène sulfonique, SIGMA), soit de CPAg couplées au DNBS préparées à partir de splénocytes de souris ayant reçu 100 pg de NP, 5x106 particules de VR-UV, 500 ]il de préparation factice, ou 500 l de tampon PBS par injection dans la cavité péritonéale. Les CPAg ont été préparées selon le protocole décrit à l'Exemple 4 ci-dessus. Les cultures cellulaires ont été réalisées en RPMI 1640, 10% SVF dans des plaques de 96 puits. Les lymphocytes T CD8 (LT CD8) ont été cultivés à raison de 5x105 cellules par puits en présence de 106 CPAg couplées ou non avec un haptène. Pour chaque condition, les LT CD8 et les CPAg ont été mis en culture séparément permettant de s'assurer de l'absence de prolifération spontanée des LT CD8 et d'une irradiation correcte des CPAg. La culture cellulaire a été réalisée pendant 90 heures. Au bout de 72 heures 0,5 uCi de thymidine tritiée ont été rajoutés dans chaque puits. les cellules ont été transférées sur filtres, et le nombre de coups par minute a été compté en présence de liquide à scintillation (compteur WALLAC). Les index de prolifération spécifique d'haptène ont été calculés d'après la formule suivante : [Cpm(LTCD8+CPAg coupléesà l'haptène)]/[Cpm(LTCD8+CPAg non-coupléesàl'haptène)] Les valeurs des index moyens de prolifération spécifique de l'antigène sont représentées par les Figures 5 (a) (CPAg de souris naïves) et 5 (b) (CPAg de souris ayant reçu le même traitement que les donneurs de LTCD8). Les résultats illustrés par la Figure 5 (a) montent que les LTCD8 de souris injectées avec la préparation factice et sensibilisées répondent fortement aux CPAg de souris naïves couplées au DNBS, mais pas aux CPAg de souris naïves couplées avec un haptène contrôle, ce qui montre le caractère antigène-spécifique de la réponse. En revanche, dans le cas des souris injectées avec la préparation de VR-UV ou de NP, on observe une inhibition de la réponse des LTCD8 des souris C57BL/6 ou des souris CD46 aux CPAg de souris naïves couplées au DNBS. Cette inhibition n'est pas observée dans le cas des LTCD8 des souris dépourvues du récepteur FcyR. Les résultats illustrés par la Figure 5 (b) montent qu'en présence de CPAg provenant de souris injectées avec du VR-UV, ou de la NP la prolifération antigène spécifique des lymphocytes T CD8 de souris C57BL/6 ou transgéniques pour CD46, sensibilisées au DNFB est inhibée. Cette inhibition n'est pas observée dans le cas des LTCD8 des souris dépourvues du récepteur FcyR. Les lymphocytes T CD8 issus de souris sensibilisées ayant reçu une injection de VR-UV ou de NP présentent un défaut de prolifération des lymphocytes T CD8. En outre, les CPAg issues de souris injectées avec du VR-UV ou de la NP, sont incapables d'activer in vitro des lymphocytes T CD8. Ces phénomènes sont indépendants de l'expression de la molécule CD46, mais ne sont pas observés chez des souris déficientes pour le récepteur FcyR, ce qui indique que le VR-UV ainsi que la NP peuvent altérer la fonction des CPAg par l'intermédiaire de ce récepteur, en agissant non seulement au niveau de la phase de sensibilisation des lymphocytes CD8 naïfs, mais également au niveau de la phase effectrice, suivant le contact secondaire avec l'antigène. EXEMPLE 6 : EFFET DU VIRUS DE LA ROUGEOLE INACTIVE AUX UV OU DE LA NUCLEOPROTEINE NP SUR LA PHASE EFFECTRICE DE LA REACTION D'HYPERSENSIBILITE DE CONTACT. Cet effet a été testé sur des souris C57BL/6, ou sur des souris transgéniques exprimant la molécule CD46. Les animaux ont été sensibilisés au DNFB comme décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus. 5 jours plus tard, 100 ug de NP, 5xlO6 particules de VR-UV, ou 500 (il de préparation factice ont été injectés dans la cavité péritonéale des souris, et l'application de DNFB a été effectuée 6 heures plus tard, selon le protocole décrit dans l'Exemple 1 cidessus. L'épaisseur de l'#dème à différents temps suivant l'application de DNFB a été mesurée, et les résultats sont illustrés par les Figures 6 (a) pour les souris C57BL/6 et 6 (b) pour les souris transgéniques pour CD46. Légende des Figures 6(a) et 6(b) : # : VR-UV 5x106 # : NP recombinante # : préparation factice # : souris non-sensibilisées Chez les souris C57BL/6, on observe un effet inhibiteur important de VR-UV ou de NP, analogue à celui observé dans le cas d'une injection effectuée avant la sensibilisation au DNFB (cf. Exemple 2). Chez les souris transgéniques pour CD46, l'effet inhibiteur de VR-UV est également analogue à celui observé dans le cas d'une injection effectuée avant la sensibilisation au DNFB (cf. Exemple 3). On observe une inhibition complète de la formation de l'#dème. Ces résultats montrent que les protéines de VR sont efficaces non seulement dans la prévention, mais également dans le traitement d' une réponse inflammatoire, et que, dans ce cas également, l'expression du récepteur CD46 augmente l'effet immunosuppresseur. EXEMPLE 7 : DOSAGE DE LA NUCLEOPROTEINE NP DU VR PAR ELISA La quantité de nucléoprotéine dans les préparations de virus a été mesurée par ELISA. Des plaques de 96 puits ont été recouvertes d'anticorps anti-NP 33. 4 [LIBEAU et al., Vet. Rec., 134,300- 304, (1994) ] dans du tampon carbonate (dilution au 1/600 des liquides d'ascites). Après incubation 1 nuit à 4 C, les plaques sont bloquées avec du tampon PBS dans 5% de lait écrémé, et incubées à nouveau 1 nuit à 4 C avec des surnageants de VRUV. Après addition de 1 g/ml d'anticorps biotinylé anti-NP cl.120 [GIRAUDON et WILD, J. Gen. Virol., 54,325-332, (1981)], les plaques sont incubées avec un conjugué ExtrAvidine-peroxydase dilué au 1/1000 (SIGMA) . Après addition du substrat (ABTS ; SIGMA), et incubation pendant 45 mn la DO est lue à 400 nm. Une courbe étalon est établie avec une série de dilutions de NP purifiée à partir de cellules Vero infectées par le VR. EXEMPLE 8 : INHIBITION DES REACTIONS D'HYPERSENSIBILITE RETARDEE PAR DES PROTEINES DE DIFFERENTS MORBILLIVIRUS Inhibition de la réaction d'hypersensibilité de contact au DNFB par le Virus de la Maladie de Carré inactivé aux UV. Des souris C57BL/6, ou des souris dépourvues du récepteur FcyR ont reçu des injections intra-péritonéales de 5x106 particules de Virus de la Maladie de Carré inactivé aux UV (MCV-UV), de 100 ug de NP de VR, de 5x106 particules de VR-UV, ou 500 l de PBS, et ont été ensuite sensibilisés au DNFB, selon le protocole décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus. L'épaisseur de l'#dème à différents temps suivant l'application de DNFB a été mesurée. Les résultats sont illustrés par les Figures 7 (a) et 7 (b) : Figure 7 (a) : Test d'hypersensibilité au DNFB chez les souris C57BL/6 # : VR-UV # : CDV-UV # : NP recombinante # : PBS X : souris non-sensibilisées Figure 7(b) : Test d'hypersensibilité au DNFB chez les souris Fc[gamma]R-/- # : VR-UV # : CDV-UV . NP recombinante # : PBS X : souris non-sensibilisées Ces résultats montrent que la réaction d'hypersensibilité de contact est bloquée de façon significative par le virus CDV inactivé aux UV (CDV-UV) (autant qu'avec la nucléoprotéine NP) dans les souris normales C57BL/6 (Figure 7a). Par contre, ni le virus, ni la NP ne sont efficaces dans les souris déficientes pour le récepteur FcR (Figure 7b), indiquant la nécessité de FcR pour l'effet immunosuppresseur des morbillivirus. Inhibition de la réaction d'hypersensibilité retardée au KLH par la NP Des préparations recombinantes de nucléoprotéine du virus de la peste des petits ruminants (PPRVNP obtenue à partir de la séquence publiée par DIALLO et al.) ou des 125 acides aminés C-terminaux de nucléoprotéine du virus de la rougeole (VR-NPc) ont été obtenues comme décrit dans l'Exemple 2. Pour la production de NPc, la construction codant pour 125 acides aminés C-terminaux de nucléoprotéine du virus de la rougeole a été clonée dans le secteur pQE-32 (QIAGEN), contenant un Tag Histidine. La partie de NPc + Tag His a été ensuite clonée dans un baculovirus, qui a été utilisé pour infecter des cellules Sf-9, comme décrite dans l'Exemple 2. Après trois jours de culture, les cellules ont été recueillies. La NPc a été purifiée à partir du culot cellulaire QIAexpressionist@ de QIAGEN, selon le protocole indiqué par fabricant. Des souris C57BL/6, ont reçu des injections intra-péritonéales de 100 ug de PPRVNP, de 100 ug de VR-NPc, de 1 mg de dexaméthasone ou de 500 l de PBS, et ont été ensuite sensibilisés au KLH, selon le protocole décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus. Les résultats sont illustrés par la Figure 8, qui représente la taille moyenne de l'oedème des coussinets à 24 heures et 48 heures après l'injection de rappel. Légende de la Figure 8 : Barres gris moyen : PBS Barres gris foncé : PPRVNP Barres gris clair : dexaméthasone Barres blanches : VR-NPc Barres noires : souris non-sensibilisées Ces résultats montrent que les souris injectées avec la PPRVNP, la VR-NPc, ou la dexaméthasone VR-UV développent une réponse d'hypersensibilité retardée moins importante que les souris contrôle injectées avec le PBS. L'effet inhibiteur le plus important est observé avec la VR-NPc. L'effet inhibiteur de la PPRVNP est similaire à celui de la dexaméthasone. EXEMPLE 9 : INHIBITION DE LA REACTION LYMPHOCYTAIRE MIXTE PAR LE VIRUS DE LA ROUGEOLE INACTIVE AUX UV. La réaction lymphocytaire mixte constitue un modèle in vitro du rejet d'allogreffe. Des souris BALB/c ont été injectées par voie intrapéritonéale avec 105 particules de VR-UV, ou 500 l de préparation factice. 48 heures plus tard, des splénocytes ont été préparés à partir des rates de ces souris, et stimulés, en culture mixte, avec des splénocytes obtenus de souris C57BL/6 irradiés à 1500 rad. Des cellules répondeuses de souris BALB/c (5x106/ml)ont été cultivées avec le même nombre de cellules stimulatrices C57BL/6 dans du milieu RPMI supplémenté avec 10% SVF, 10 Mm HEPES, 2 Mm glutamine, 5x106 M 2ssmercaptoethanol, et 50 g/ml de gentamicyne pendant 3 jours à 37 C, 7% CO2 La prolifération cellulaire a été évaluée le 3èmejour, par incorporation de thymidine3H (1 Ci/puits) pendant 16 heures. Les résultats sont illustrés par la Figure 9. Ces résultats montrent une inhibition, par le VR-UV de la réaction des lymphocytes de souris BALB/c en réponse à la stimulation par les cellules des souris C57BL/6. Légende de la Figure 9 : # : Préparation factice # : VR-UV REVENDICATIONS 1) Utilisation d'une préparation de protéines comprenant au moins une nucléoprotéine de morbillivirus ou un fragment de celle-ci comprenant tout ou partie de la région C-terminale d'environ 100 à 130 acides aminés de ladite nucléoprotéine, pour l'obtention d'un médicament inhibiteur de la réponse immunitaire à médiation cellulaire. 2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit fragment comprend au moins une séquence de ladite région C-terminale conservée entre les nucléoprotéines de différents morbillivirus. 3) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit fragment est choisi parmi : - un fragment comprenant les acides aminés 411- 421 de la séquence peptidique de la nucléoprotéine du virus de la rougeole, ou la séquence correspondante de la nucléoprotéine d'un autre morbillivirus ; - un fragment comprenant les acides aminés 489- 506 de la séquence peptidique de la nucléoprotéine du virus de la rougeole, ou la séquence correspondante de la nucléoprotéine d'un autre morbillivirus ; - un fragment comprenant les acides aminés 516- 625 de la séquence peptidique de la nucléoprotéine du virus de la rougeole, ou la séquence correspondante de la nucléoprotéine d'un autre morbillivirus. 4) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite préparation de protéines comprend en outre les glycoprotéines d'enveloppe F et H d'un morbillivirus. 5) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné à la prévention ou au traitement d'une pathologie inflammatoire. 6) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné à la prévention ou au traitement d'une dermite allergique de contact. 7) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné à la prévention ou au traitement du rejet de greffe, ou de la maladie du greffon contre l'hôte. 8) Procédé permettant d'évaluer le potentiel immunosuppresseur d'une préparation d'un morbillivirus, caractérisé en ce qu'il comprend la détermination de la quantité de protéine NP dudit morbillivirus présente dans ladite préparation. 9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact de ladite préparation avec au moins un anticorps dirigé contre ladite protéine NP, et de préférence, au moins un anticorps dirigé contre un épitope porté par la région C-terminale d'environ 110 acides aminés de ladite protéine, et la quantification du complexe anticorps/antigène formé. 10) Utilisation de souris sensibilisées au DNFB ou au KLH pour évaluer le potentiel immunosuppresseur d'une préparation de protéines d'un morbillivirus. 11) Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que lesdites souris sont des souris transgéniques exprimant le récepteur CD46. 12) Utilisation d'un morbillivirus dans lequel la région C-terminale de 110 à 130 acides aminés de la nucléoprotéine a été délétée ou altérée, au niveau d'au moins une séquence de ladite région N-terminale conservée entre les différents morbillivirus, pour l'obtention d'un vaccin.