Brevet FR2818987A1 — publié le 20020705

La présente invention concerne des colorants à base de squaraïnes substituées par des atomes d'halogène lourds répondant à la formule 1 ci-dessous Formule 1 où X est un atome d'halogène lourd, et leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables, qui peuvent être utilisés dans des applications photodynamiques, thérapeutiques et industrielles. La présente invention concerne aussi un procédé de préparation de ses colorants et l'utilisation de ces colorants comme sensibilisateurs pour des applications photodynamiques, thérapeutiques et industrielles. Dans les colorants squaraïnes selon la présente invention, X peut être le brome ou l'iode et, dans ce cas, ces colorants ou leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables peuvent être utilisés comme photosensibilisateurs dans des applications photodynamiques pour le diagnostic et le traitement du cancer et d'autres maladies chez l'homme et l'animal. Les colorants du type squaraïne de la présente invention où X est un atome d'halogène lourd, ou leurs dérivés, peuvent aussi être utilisés comme photosensibilisateurs dans des applications industrielles photodynamiques pour la stérilisation de l'eau. La thérapie photodynamique est une thérapie récente pour le diagnostic et le traitement du cancer et de différentes maladies. De nombreux indices suggèrent que la thérapie photodynamique représente une approche appropriée et efficace pour traiter différents cancers. Elle met en #uvre une inactivation de cellules vivantes par l'action combinée de la lumière et d'une substance chimique (photosensibilisateur). Après injection intraveineuse, le photosensibilisateur est retenu sélectivement par les cellules tumorales, de sorte qu'il est présent en plus grande concentration dans le tissu tumoral que dans les tissus normaux. Quand il est irradié avec une lumière de longueur d'onde spécifique ou un faisceau laser, le sensibilisateur produit des espèces très réactives qui modifient le tissu biologique et provoquent la destruction sélective des cellules cancéreuses. Le seul sensibilisateur qui a été étudié de manière approfondie est le Photofrin (porfime sodique), un dérivé de l'hématoporphyrine (HpD), qualifié également de photosensibilisateur de première génération. Le Photofrin et ses variantes commerciales Photosan et Photogen, ont été les premiers photosensibilisateurs à être acceptés en utilisation clinique pour lesquels les premières autorisations réglementaires ont été obtenues. Cependant, le Photofrin présente l'inconvénient d'être un mélange de produits dont la composition est très sensible à la méthodologie de synthèse adoptée. On sait qu'il provoque une photosensibilité cutanée faite de sa libération lente par l'organisme. Dans ces circonstances, un patient traité avec le Photofrin doit demeurer à l'obscurité pendant une longue durée jusqu'à ce que le Photofrin soit éliminé par l'organisme. Le Photofrin possède seulement une faible absorption dans la région rouge du spectre (son coefficient d'absorption molaire est aussi faible que 3 000 M-1cm-1 à 630 nm), ce qui conduit à des difficultés pour fournir de la lumière à certains sites tumoraux et, en outre, de la lumière peut être de manière incomplète dans les tumeurs de grande taille. De ce fait, une thérapie photodynamique avec le Photofrin n'est indiquée que pour les cancers occupant des couches superficielles d'une profondeur inférieure à 10 mm. Voir Dougherty, T. J. Photochem. Photobiol. 1987, 45, 879 ; Kessel, D. ; Dougherty, T. J. Phorphyrin Photosensibilization ; Plenum Publishing Corp. : New York, 1983 ; Brown, S .B. ; Truscott, T. G. Chem. Ber, 1993,29, 955 ; Andreoni, A. ; Cubeddu, R. Phorphyrins in Tumor Phototherapy ; Plenum Publishing Corp. :New York, 1984 ; Brasseur, N. ; A. ; Langlois, R. ; Wagner, J. R. ; J. ; van Lier, J. E. Photochem. Photobiol. 1987, 45, 581 ; Spikes, J. D., Photochem. Photobiol. 1986, 43, 691 ; Firey, P. A. ; W. E. ; Sounik, J. R. ; Kenney, M. E. ; Rodgers, M. A. J. J. Am. Chem. Soc. 1988,110, 7626 ; Moan, J. Cancer Lett. 1986,33, 45 ; Tralau, C.J. ; Young, A. R. ; Walker, N. P. J. ; Vernon, D. I. ; MacRobert, A. J. ; Brown, S. B. ; Brown, S. G. Photochem. Photobiol. 1989, 49, 305. Pour éliminer les inconvénients des sensibilisateurs de première génération, on a synthétisé des photosensibilisateurs de seconde génération qui présentent de fortes absorptions dans la région des grandes longueurs d'onde. Ces sensibilisateurs de seconde génération qui sont en cours d'évaluation à différentes phases cliniques de thérapie photodynamique comprennent les chlorines, les porphycènes, les benzoporphyrines, les phtalocyanines, les purpurines et les porphyrines par médiation par l'acide aminolévulinique. Les purpurines possèdent des propriétés optiques et des configurations de biodistribution favorables mais exigent une solubilisation ou des agents émulsifiants comme les liposomes ou les lipoprotéines pour leurs applications photodynamiques. Les chlorines ont une forte absorption dans les régions rouge et infrarouge du spectre et entrent en compétition de manière favorable avec le Photofrin, et leur photosensibilité cutanée constitue un problème majeur. Les phtalocyanines et les métallophtalocyanines ont une forte absorption dans la région de 600-700 nm, et les détails concernant l'étendue de la sulfonation en fonction de l'activité photodynamique ne sont pas élucidés. Voir les brevets US N 5965598 ; N 5889181 ; N 586035 ; N 5789586 ; Kostenich, G. A. ; Zuravkin, I. N. ; Zhavrid, E. A. J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1994,22, 211 ; Leach, M. W. ; Higgins, R. J. ; S. A. ; Boggan, J. E. ; Lee, S. -J. H. ; Smith, K. M. Photochem. Photobiol., Bai, S. ; Liu,C. ; Guo, Z. Proc. SPIE 1993, 1616, 275 ; Vogel, E. ; M. ; Schmickler,H. ; Lex, J. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1986, 25, 197 ; Leunig, M. ; Richert, C. ; F. ; W. ; Legnoff, C. C. ; Vanheir, J. E. Br. J. Cancer, 1993, 68, 1177 ; Wohrl, D. ; Shopova, M. ; S. ; A. D. ; Mantereva, V.N. ; Krastev, K. K. J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1993, 21, 155 ; Morgan, A. R. ; G. M. ; Keck, R. W. ; Ericksen, L. D. ; S. H. Photochem. Photobiol. 1990, 51, 589. Pour ces raisons, il est souhaitable de développer des photosensibilisateurs qui ont de fortes absorptions dans la région des grandes longueurs d'onde du spectre, qui soient non toxiques pour les tissus normaux, qui soient solubles dans du tampon au pH physiologique, qui puissent être blanchis pendant le traitement photodynamique et qui présentent une grande efficacité thérapeutique. Les squaraïnes constituent une classe de colorants possédant des bandes d'absorption nettes et intenses dans la région du spectre qui s'étend du rouge au proche infrarouge. Les coefficients d'absorption molaire de ces colorants sont normalement dans le domaine de 500 000 M-1cm-1. Les squaraïnes trouvent des applications industrielles dans les photorécepteurs xérographiques, les cellules solaires et les dispositifs d'enregistrement optique. Toutefois, du fait qu'elles ont une très faible efficacité pour traverser les systèmes, leur potentiel en tant que photosensibilisateurs dans les applications thérapeutiques photodynamiques n'a pas encore été explorée. Voir les brevets US N 6001523 ; N 5552253 ; N 5444463 ; Law, K.-Y. Chem. Rev. 1993, 93, 449 ; Piechowski, A. P. ; G. R. ; Morel, D. L. ; Stogryn, E. L. J. Phy. Chem. 1984, 88, 934. Ainsi, l'utilisation de colorants à base de squaraïnes a été étudiée pour observer si les problèmes vu l'état de la technique pouvaient être surmontés. La présente invention a pour but de fournir un photosensibilisateur approprié pour les applications thérapeutiques photodynamiques basé sur l'entité squaraïne. Les études préliminaires indiquaient que l'halogénation de l'entité squaraïne conduisait à une solubilité dans l'eau accrue et à une plus grande efficacité de traversée des systèmes par rapport au colorant squaraïne non substitué initial. Ces colorants halogénés présentent de fortes absorptions dans la région du proche infrarouge (> à 600 nm) et des déplacements bathochromes sensibles en présence de milieux microhétérogènes. Les états excités triplets étaient les états transitoires principaux impliqués dans ces systèmes, qui interagissent efficacement avec l'oxygène moléculaire pour produire de l'oxygène singulet hautement réactif biologiquement avec des rendements quantitatifs, ce qui en fait des candidats potentiels dans les applications photothérapeutiques. Voir Ramaiah, D. ; A. ; Chandrasekhar, N. ; Eldho, N. V. ; S. ; M. V. Photochem. Photobiol. 1997, 65, 783. Cependant, les rendements de ces colorants de type squaraïne halogéné étaient relativement bas dans les conditions établies et leur efficacité dans la production d'oxygène singulet (agent cytotoxique) dans les systèmes de modélisation de membranes et de supports de médicaments comme les polymères n'est pas connue. En outre, la littérature ne décrit pas les propriétés biologiques ni les applications thérapeutiques photodynamiques des colorants à base de squaraïnes. Les propriétés biologiques qui sont importantes à déterminer pour l'utilisation de sensibilisateurs dans les applications thérapeutiques photodynamiques comprennent la stabilité des sensibilisateurs au pH physiologique et dans les conditions d'irradiation, à toxicité cellulaire, les aspects pharmacologiques, la toxicité génétique et l'efficacité de leur activité photodynamique in vivo. Dans le cadre de la présente invention, en modifiant les conditions du procédé il a été possible d'obtenir de plus grands rendements en colorants à base de squaraïnes modifiées avec des atomes d'halogènes lourds. Les propriétés biologiques de photosensibilisateurs à base de squaraïnes représentatifs ont été étudiées, y compris la stabilité de ces sensibilisateurs dans des conditions de pertes physiologiques, leur cytotoxicité et leur mutagénicité à l'obscurité et dans des conditions d'irradiation. Ont été examinés aussi leur efficacité et leur mécanisme d'activité photodynamique in vivo et in vitro. Ainsi, le but principal de la présente invention consiste à fournir des colorants à base de squaraïnes efficaces et leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables qui peuvent être utilisés comme sensibilisateurs dans des applications thérapeutiques photodynamiques, y compris le traitement du cancer. La présente invention a également pour but de fournir des colorants à base de squaraïnes et leurs dérivés pharmaceutiques qui peuvent être utilisés comme capteurs fluorescents pour le diagnostic du cancer du fait de leurs rendements quantiques de fluorescence sensibles dans des milieux microhétérogènes. La présente invention a également pour but de fournir des colorants à base de squaraïnes et leurs dérivés qui peuvent être utilisés pour des applications industrielles photodynamiques comme la stérilisation de l'eau. La présente invention a également pour but de lier ou introduire des colorants à base de squaraïnes dans des dispositifs chimiques de manière à obtenir une spécificité biologique pour délivrer ou cibler de telles substances à des types définis de cellules vivantes, afin de développer des photosensibilisateurs de troisième génération efficaces. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui suit et se réfère aux dessins annexés, dans lesquels : la figure 1 représente un graphique montrant l'efficacité de destruction des cellules de colorants de type squaraïne de formule 1 en présence et en l'absence de lumière ; la figure 2 représente un graphique montrant l'induction de mutants par la bis(3,5-dibromo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne en présence et en l'absence de lumière ; la figure 3 représente un graphique montrant l'induction de mutants par la bis (3,5-diiodo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne en présence et en l'absence de lumière ; et la figure 4 représente un graphique montrant l'induction de micro-noyaux par la bis(3,5-dibromo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne en présence et en l'absence de lumière ; et la figure 5 représente un graphique montrant l'induction de micro-noyaux par la bis(3,5-diiodo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne en présence et en l'absence de lumière. Ainsi, la présente invention concerne un colorant de type squaraïne substituée par des atomes d'halogènes lourds de formule générale 1 où X est un atome d'halogène lourd, et ses dérivés pharmaceutiquement acceptables. Formule 1 De préférence, X est choisi parmi le brome et l'iode. Le composé de formule 1 peut être la bis(3,5-dibromo-2,4,6trihydroxyphényl)squaraïne ou la bis(3,5-diiodo-2,4,6-trihydroxyphényl)- squaraïne. La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un colorant de type squaraïne substituée par des atomes d'halogènes lourds de formule 1 où X est un atome d'halogène lourd, ou de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables, qui comprend la réaction de la bis(2,4,6-dihydroxyphényl)squaraïne avec une solution d'halogène ou d'un sel d'halogène dans un acide organique sous agitation, à une température de 50-80 C pendant une durée de 1 à 5 h, le refroidissement du mélange réactionnel ci-dessus, la filtration et le lavage du composé résultant, puis sa recristallisation pour obtenir le composé souhaité. L'halogénure est de préférence un monochlorure, et l'acide organique est de préférence l'acide acétique glacial. De l'eau peut être ajoutée au mélange réactionnel avant les étapes de filtration et de lavage. De préférence, l'atome d'halogène est choisi parmi le brome et l'iode. La présente invention concerne aussi l'utilisation de composés de formule 1 comme photosensibilisateurs dans des applications thérapeutiques photodynamiques. Les composés de formule 1 peuvent être utilisés aussi comme détecteurs fluorescents de tumeurs et dans le traitement photodynamique du cancer et d'autres maladies. Par ailleurs, les composés de formule 1 peuvent être utilisés également comme sensibilisateurs dans la stérilisation de l'eau. La présente invention concerne également l'utilisation des composés de formule 1 pour obtenir des photosensibilisateurs de troisième génération efficaces par l'introduction de ces composés dans des dispositifs chimiques pour diriger de manière ciblée les médicaments vers des cellules vivantes définies. Dans la préparation des composés de formule 1, le cycle aromatique de la bis(2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne est modifié avec halogènes lourds comme le brome pour obtenir la bis(3,5-dibromo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne et comme l'iode pour obtenir la bis(3,5-diiodo-2,4,6trihydroxyphényl)squaraïne. On observe que les composés tels que la bis(3,5-dibromo-2,4,6trihydroxyphényl)squaraïne et la bis(3,5-diiodo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne qui comportent une entité squaraïne et leurs dérivés pharmaceutiques possèdent une bonne solubilité au pH physiologique et présentent de fortes absorptions dans le domaine photodynamique (> à 600 nm). Ces colorants sont stables et non toxiques à l'obscurité et présentent une bonne efficacité de destruction des cellules quand ils sont exposés à la lumière. Ils subissent un photoblanchiment rapide et leurs produits de photodégradation ne sont pas toxiques en présence et en l'absence de lumière. Ils ne sont sensiblement pas mutagènes. Comme les colorants à base de squaraïnes décrits ci-dessus possèdent des propriétés photophysiques et biologiques favorables, ils sont très appropriés comme photosensibilisateurs pour des applications thérapeutiques industrielles photodynamiques. Les exemples non limitatifs suivants sont destinés à illustrer la présente invention de manière plus précise. Exemple 1 On a dissous de la bis(2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne (Triebs, A. ; Jacob, K. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1965, 4, 694) dans de l'acide acétique glacial (1:4,7 x 103) en agitant la solution à 50-60 C pendant 1 à 3 h. Après avoir refroidi, on a ajouté goutte à goutte en 1 à 2 h, une solution de brome dans l'acide acétique (1:1,7 x 102). On a chauffé le mélange réactionnel à 50-60 C pendant 1 à 2 h puis on l'a maintenu au réfrigérateur pendant 10 à 12 h. On a filtré le précipité formé et on l'a lavé avec 75 à 100 ml d'eau. Puis on l'a recristallisé dans un mélange d'eau et d'isopropanol (3: 1) pour obtenir 75 à 85 % de bis(3,5-dibromo- 2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne. Présentant les propriétés physiques suivantes : point de fusion 314- 315 C ; IR (KBr) vmax 3413, 1622, 726 et 519cm-1 ; masse moléculaire : calculée 642.6874 ; trouvée 642.6879 (HRMS) ; [20 % v/v méthanol-eau] #max 610 nm (s 47000 M-1cm-1), [méthanol] #max 612 nm (# 210000 M-1cm-1) ; poudre bleu marine. Exemple 2 On a dissous de la bis(2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne (Triebs, A. ; Jacob, K. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1965, 4, 694) dans l'acide acétique glacial (1:4,7 x 103) en agitant la solution à 60-70 C pendant 1 à 2 h. Après avoir refroidi, on a ajouté goutte à goutte en 1 à 2 h du monochlorure d'iode dans l'acide acétique glacial (1:1,7 x 102). Puis on a chauffé le mélange réactionnel à 50-60 C pendant 1 à 2 h. On lui a ajouté 15 ml d'eau et on a maintenu au réfrigérateur pendant 10 à 12 h. On a filtré le précipité formé, on l'a lavé à l'eau (75 à 100 ml) et on l'a recristallisé dans un mélange de méthanol et d'isopropanol (3: 1) pour obtenir 65-75 % de bis(3,5-diiodo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne ayant les propriétés physico-chimiques suivantes : point de fusion 270-271 C ; IR (KBr) #max 3383,1603, 726 et 568 cm-1 ; masse moléculaire : 834.6320 ; trouvée 642.6879(HRMS) ; UV [20 % v/v méthanol-eau] #max 617 nm (# 63000 M-1cm-1), [méthanol] #max 620 nm (# 249000 M-1cm-1) ; poudre bleu marine. Exemple 3 Du fait que les états excités triplets sont les états transitoires principaux obtenus lors des études de photolyse par éclair laser de 532 nm de la bis(3,5-dibromo-2,4,6-trihydrophényl)squaraïne et de la bis(3,5-diiodo-2,4,6trihydroxy-phényl)squaraïne, on a examiné l'efficacité de production d'oxygène singulet photosensibilisé par ces systèmes, car l'oxygène singulet est le principal agent cytotoxique des réactions de type II en thérapie photodynamique. Comme les formes déprotonés une fois de la bis(3,5-dibromo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne et de la bis (3,5-diiodo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne ont des rendements en triplets significatifs et ont de grandes durées de vie (Ramaiah, D ; Joy, A ; Chandrasekhar, N. ; Edho, N. V. ; S. ; M. V. Photochem. Photobiol. 1997, 65, 783), on s'attend à ce que ce soit les formes qui constituent les espèces prédominantes dans les conditions de pH biologique (au voisinage de 7,4). A titre de premier niveau de caractérisation de ces colorants sous l'angle de leur utilisation comme sensibilisateurs en thérapie photodynamique, on a examiné leur efficacité de production d'oxygène singulet en présence de supports de médicaments, de systèmes imitant les membranes biologiques et de milieux microhétérogènes. Les résultats obtenus en présence de polyvinylpyrrolidone (PVP) avec la bis(3,5-dibromo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne et la bis(3,5diiodo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne sont présentés dans le tableau 1 cidessous. Le tableau 1 montre l'efficacité de production d'oxygène singulet par la bis(3,5-dibromo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne et la bis(3,5-diiodo-2,4,6trihydroxyphényl)squaraïne en présence et en l'absence de polyvinylpyrrolidone. Tableau 1 Composé PVP, mM rendements quantiques d'oxygène singulet bis(3,5-dibromo-2,4,6- 0 0,13 0,005 trihydroxyphényl)squaraïne 14 0,29 0,001 bis(3,5-diiodo-2,4,6- 0 0,47 0,017 trihydroxyphényl)squaraïne ~~~~~~ 14 0,62 0,007 Ces résultats révèlent une augmentation significative des rendements quantiques de production d'oxygène singulet en présence de PVP sensibilisée par la bis(3,5-dibromo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne et par la bis(3,5-diiodo- 2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne. Dans le cas de la bis(3,5-diiodo-2,4,6trihydroxyphényl)squaraïne, le rendement de production d'oxygène singulet est 15 fois plus élevé dans les milieux microhétérogènes que dans le méthanol. De plus, ces études indiquent que les atomes d'halogènes lourds constituant des substituants peuvent jouer le rôle de photosensibilisateurs efficaces pour les applications thérapeutiques photodynamiques. Exemple 4 On a évalué en détail le mécanisme de l'activité photodynamique des squaraïnes en utilisant un ADN plasmidique (ADN PM2) et en examinant le clivage de l'ADN dans différentes conditions. On a suivi le clivage de l'ADN en surveillant la conversion de l'ADN super-enroulé (Forme I) en ADN circulaire ouvert (Forme II) et en ADN linéaire (Forme III). L'induction de la rupture d'un seul brin par un composé ou agent convertit la Forme I en la Forme II et la quantification de ces formes par un essai de relaxation d'ADN décrit antérieurement (Epe, B ; Hegler, J. J. Methods Enzymol. 1994, 234, 122) indique son efficacité pour le clivage d'ADN. Le clivage d'ADN plasmidique est une technique très sensible qui peut être utilisée pour tester les différentes propriétés de sensibilisateurs et les profils de détérioration d'ADN obtenues au moyen de piégeurs et d'activateurs peut servir d'empreintes digitales pour les espèces directement responsables des détériorations et aussi pour obtenir des informations sur le mécanisme de l'activité photodynamique in vitro. On a exposé de l'ADN PM2 (10 000 poste de base, 10 g/ml) à des colorants de type squaraïne et à la lumière d'une lampe halogène de 1000 W (Philips PF811) à une distance de 33 cm dans du tampon phosphate (KH2PO4 5 mM, NaCl 50 mM, pH 7,4) sur la glace. On a précipité l'ADN modifié avec de l'éthanol/acétate de sodium et on a quantifié les ruptures d'un simple brin (RSB) par un dosage de relaxation d'ADN. On a ajouté de la superoxyde dismutase (SOD) (20 ug/ml), de la catalase (315 U/ml) ou bien on a remplacé l'eau dans le tampon par D20 (la pureté isotopique finale était supérieure à 96 %) pour mieux discerner les espèces actives mises en jeu. Les résultats de ces études avec des colorants à base de squaraïnes représentatifs bis(3,5-dibromo-2,4,6trihydroxyphényl)squaraïne et bis(3,5-diiodo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous. Le tableau 2 montre l'efficacité du clivage d'ADN plasmidique par la bis(3,5-dibromo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne et par la bis(3,5-diiodo-2,4,6- trihydroxyphényl)squaraïne en présence et en l'absence d'additifs. Les résultats montrés dans le tableau 2 indiquent que ni la superoxyde dismutase ni la catalase n'ont un effet un effet significatif sur l'efficacité du clivage de l'ADN induit par la bis(3,5-dibromo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne et par la bis(3,5-diiodo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne. Tableau 2 Nombre relatif de rupture de simple brin ( %) en présence dea Composé pH 7,0 pH 7,8 Tampon SOD Catalase avec D20 (20 g/ml) (315 U/ml) bis(3,5-dibromo- 127 ~ 12 105 4 526 28 109 5 115 ~ 5 2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne bis(3,5-diiodo- 134 9 109 ~ 22 614 97 100 2 92 6 2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne a un nombre de rupture d'un simple brin (SRB) observées dans du tampon phosphate (pH 7,4) en l'absence d'additif est défini comme étant égal à 100%. Il en résulte que la réaction de Fenton de ces espèces n'est pas impliquée dans le clivage d'ADN. Une augmentation d'environ 5 à 6 fois du clivage d'ADN induit par la bis(3,5-dibromo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne et par la bis(3,5-diiodo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne dans D20 constitue une forte indication de l'activité photodynamique in vitro est due principalement à l'oxygène singulet dans ces cas. Exemple 5 Les informations concernant la stabilité d'un sensibilisateur en présence et en l'absence de lumière sont importantes pour son utilisation pratique. De ce fait, on a étudié la stabilité de ces colorants en présence et en l'absence de lumière dans l'éthanol et dans du tampon phosphate dans des conditions de pH physiologique (pH 7,4) à 25 C en suivant la variation d'absorbance en spectrophotométrie. Ces résultats concernant les réactions d'absorbance en fonction du temps à l'obscurité avec les colorants à base de squaraïnes représentatifs bis(3,5-dibromo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne et bis(3,5-diiodo- 2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous. Le tableau 3 présente la stabilité de ces colorants dans l'éthanol et dans du tampon (pH 7,4) à l'obscurité. Tableau 3 Absorbance Durée ~~~ ~~~~~~~~~~~~~~~~ à l'obscurité, min bis(3,5-dibromo- bis(3,5-dibromo- bis(3,5-diiodo- 2,4,6-trihydroxy- 2,4,6-trihydroxy- 2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne phényl)squaraïne phényl)squaraïne (éthanol) (tampon) (tampon) 0 1,90 1,84 1,75 30 1,88 1,72 1,47 60 1,88 1,65 1,38 90 1,88 1,61 1,36 Les résultats obtenus à l'obscurité montrent que les colorants bis(3,5dibromo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne et bis(3,5-diiodo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne sont très stables dans l'éthanol mais subissent un léger blanchiment dans les solutions tampons à pH 7,4 pendant une longue durée de 90 min. Les résultats obtenus avec ces colorants dans du tampon à pH 7,4 dans des conditions d'irradiation sont montrés dans le tableau 4 ci-dessous. Le tableau 4 montre la stabilité de la bis(3,5-dibromo-2,4,6trihydroxy-phényl)squaraïne et de la bis(3,5-diiodo-2,4,6trihydroxyphényl)squaraïne dans du tampon (pH 7,4) dans des conditions d'irradiation. Tableau 4 Durée Absorbance d'irradiation, min bis(3,5-dibromo-2,4,6- bis(3,5-diiodo-2,4,6trihydroxy- trihydroxyphényl)squaraïne phényl)squaraïne 0 1,8 1,72 5 1,35 0,87 10 1,30 0,74 15 1,25 0,65 20 1,17 0,58 30 1,10 0,47 Les résultats obtenus dans des conditions d'irradiation (lampe halogène de 1000 W (Philipps PF811) à une distance de 33 cm) montrent que ces colorants présent un photoblanchiment significatif. Le composé bis(3,5-diiodo- 2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne subit un photoblanchiment très rapide (sensiblement 50 % en 5 min d'irradiation) par rapport à la bis(3,5-dibromo-2,4,6trihydroxy-phényl)squaraïne (25 %). Dans les deux cas, le photoblanchiment augmente avec la durée d'irradiation. Bien que l'on pourrait considérer que ce photoblanchiment est une propriété désavantageuse pour un photosensibilisateur tumoral, elle présente des avantages potentiels car le dosage peut être ajusté pour maintenir le photosensibilisateur dans une tumeur à des niveaux efficaces. De plus, du fait du photoblanchiment rapide, il n'est pas nécessaire qu'un patient ayant subi un traitement photodynamique reste à l'obscurité pendant de longues durées et, si nécessaire, la thérapie peut être répétée fréquemment à des intervalles courts. Exemple 6 Pour mesurer l'efficacité de destruction des cellules (cytotoxicité) des sensibilisateurs à base de squaraïnes avec et sans lumière, on a exposé des cellules AS52 à différentes concentrations de sensibilisateurs. On a réalisé l'exposition à la lumière avec une lampe halogène de 1000 W à une distance de 33 cm et dans PBS (solution salée et tamponnée au phosphate) (NaCl 140 mM, KC1 3 mM, Na2HP04 8 mM, pH 7,4) sans ions Ca2+ et Mg2+ sur la glace (106 cellules/ml). Une illumination pendant 10 min correspond à 225 kJ/m2entre 400 et 800 nm. On a mis les cellules sous forme d'un culot par centrifugation et on les a remises en suspension dans PBS trois fois. Puis on a remis les cellules en suspension à raison de 3 x 104 cellules/ml dans du milieu frais à 37 C, et on a compté de manière répétée le nombre des cellules pendant 60 h . En utilisant la partie exponentielle des courbes de croissance (entre 24 et 60 h), on a calculé par extrapolation le nombre de cellules proliférantes au moment de la remise en suspension. On a défini la survie des cellules comme étant le rapport entre les cellules proliférantes et les cellules remises en suspension. Les résultats obtenus avec les colorants représentatifs bis(3,5-dibromo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne et bis(3,5-diiodo- 2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne sont présentés sur la figure 1. Les résultats obtenus montrent que le pourcentage de survie des cellules diminue quand la concentration de bis(3,5-dibromo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne et de bis(3,5-diiodo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne augmente dans des conditions d'illumination, ce qui indique la grande efficacité de destruction des cellules de ces colorants dans ces conditions. En même temps, ces colorants ne présentent pas d'effet significatif à l'obscurité, ce qui indique qu'ils ne sont pas toxiques en l'absence de lumière. Ces résultats montrent clairement les possibilités d'application thérapeutiques photodynamiques des colorants de type squaraïne substituées par des atomes d'halogènes lourds. Exemple 7 On a mesuré les propriétés mutagènes de sensibilisateurs à base de squaraïnes sur des cellules AS52 qui contiennent le gène de guanine phosphoribosyltransférase (gpt) bactérien à titre de marqueur de sélection conférant une sensibilité à la 6-thioguanine. On a cultivé des cellules AS52 dans du milieu de nettoyage (contenant 11 g/ml de xanthine, 219 ug/ml de xanthine, 22 g/ml d'adénine, 1,2 g/ml d'aminoptérine et 8,8 ug/ml d'acide mycophénolique) pendant une semaine pour éliminer les mutants gpt spontanés. On a incubé les cellules (0,5 x 106) dans du milieu de récupération (contenant 1,2 g/ml de thymidine, 11,5 ug/ml de xanthine, 3 ug/ml d'adénine) pendant 48 h, puis on les a exposées à la bis(3,5-dibromo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne et à la bis(3,5-diiodo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne en présence et en l'absence de lumière comme décrit ci-dessus, après quoi on les a cultivées pendant une semaine (durée d'expression). Pendant ce temps, la croissance exponentielle des cellules a été maintenue. On a dilué 2 x 105 cellules dans 10 ml de milieu de culture et on les a étalées sur des boîtes de Petri (94 mm). Au bout de 2 h, on a ajouté à chaque boîte de la 6-thioguanine (concentration finale 2,5 ug/ml) pour la sélection. On a ajouté 200 cellules à 5 ml de milieu de culture et on les a étalées dans des boîtes de Petri (60 mm) pour déterminer les efficacités de clonage. On a incubé les boîtes pendant 7 à 9 jours. On a remplacé le milieu par une solution de NaCl (à 0,9 % v/v), on a fixé les colonies de cellules avec du méthanol (- 20 C) pendant 15 min et on les a colorées avec du colorant de Giemsa (à 10 % dans l'eau) pendant 15 min. Puis on a déterminé quantitativement les cellules résistant à la 6thioguanine et on a déterminé la cytotoxicité (rapport des efficacités d'étalement des cellules traitées et des cellules non traitées) juste après l'exposition à des colorants de type squaraïne et à la lumière selon le protocole connu (Tindall, K. R. ; Stankowski, Jr. L. F. ; Machanoff, R. ; Hsie, A. W. Mutât. Res. 1986, 160, 121-131). Les résultats ainsi obtenus sont présentés sur les figures 2 et 3 qui montrent que la bis(3,5-dibromo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne et la bis(3,5diiodo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne n'induisent pas des mutations immédiates en présence et en l'absence de lumière. Bien que l'on ait observé une cytotoxicité marquée en présence de lumière, on a observé aucune augmentation significative des fréquences de mutation spontanée, par rapport aux valeurs à l'obscurité et aux valeurs témoins. Exemple 8 Pour mieux comprendre les effets génétiques, on a quantifié aussi les micro-noyaux induits par la bis(3,5-dibromo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne et la bis(3,5-diiodo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne dans des cellules AS52. On a exposé des cellules AS52 aux colorants ci-dessus et on les a remises en suspension dans du milieu complet. Après avoir incubé pendant 24 h à 39 C, on a fixé approximativement 1 x 105 cellules sur une lame de microscope par centrifugation de type cytospin et un traitement avec du méthanol pendant 1 h à - 21 C. Après avoir coloré avec du bisbenzimide pendant 3 min dans PBS (sans ions Ca2+ et Mg2+), on a examiné 2000 cellules concernant la présence de micronoyaux avec un microscope à fluorescence. Les résultats obtenus sont présentés sur les figures 4 et 5 qui indiquent que ces colorants n'induisent pas des quantités significatives de micro-noyaux. Il ressort de ce qui précède que les colorants à base de squaraïnes selon la présente invention possèdent des propriétés satisfaisantes comme photosensibilisateurs pour des applications thérapeutiques et industrielles photodynamiques. Leurs principales caractéristiques avantageuses sont les suivantes : 1. Les sensibilisateurs à base de squaraïnes de type bis(3,5-dibromo- 2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne et bis(3,5-diiodo-2,4,6-trihydroxy-phényl)- squaraïne sont des substances pures. 2. Leur procédé de synthèse est économique. 3. Ils sont stables à l'obscurité et leur stabilité augmente en présence de modèles de membranes et de systèmes supports. 4. Ils ont une très bonne solubilité dans du tampon au pH physiologique ce qui permet d'obtenir des préparations pharmaceutiques par des protocoles conventionnels et d'éviter l'utilisation d'additifs et de supports. 5. Ils possèdent de bonnes propriétés d'absorption (> à 600 nm) avec des coefficients d'absorption significatifs (au voisinage de 100 00 M-1/cm-1). 6. Ils ont de bons rendements en triplets avec des durées de vie significatives et ils produisent de l'oxygène singulet avec des rendements quantitatifs dans des modèles de membranes et des systèmes supports. 7. Ils ne sont pas toxiques à l'obscurité mais ils présentent de bonnes propriétés de destruction des cellules quand ils sont exposés à la lumière. 8. Ils subissent un photoblanchiment rapide de sorte qu'un patient subissant un traitement photodynamique n'est pas contraint de demeurer à l'obscurité pendant de longues durées et, si nécessaire, la thérapie peut être répétée fréquemment à de courts intervalles. 9. Les sous-produits de photodégradation de ces colorants ne sont pas toxiques en présence et en l'absence de lumière. 10. L'activité photodynamique de ces colorants est maximum en 5 min d'exposition à la lumière de sorte que de très courts intervalles d'irradiation sont nécessaires pour le traitement. 11. Ces colorants ne sont pas mutagènes. 12. Ils peuvent être utilisés efficacement dans la synthèse de photosensibilisateurs de troisième génération pour le ciblage d'organites cellulaires définis. REVENDICATIONS 1. Colorant de type squaraïne substituée par des atomes d'halogènes lourds caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale 1 Formule 1 où X est un atome d'halogène lourd, et ses dérivés pharmaceutiquement acceptables. 2. Colorant selon la revendication 1, caractérisé en ce que X est choisi par le brome et l'iode et qu'il s'agit de la bis(3,5-dibromo-2,4,6trihydroxyphényl)squaraïne et de la bis(3,5-diiodo-2,4,6-trihydroxyphényl)squaraïne. 3. Procédé de préparation d'un colorant selon l'une quelconque des revendications précédentes, ou de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables, caractérisé en ce qu'il comprend la réaction de la bis(2,4,6trihydroxyphényl)squaraïne avec une solution d'halogène ou d'un sel d'halogène dans un acide organique sous agitation à une température de 50 à 80 C pendant une durée de 1 à 5 h, le refroidissement du mélange réactionnel ci-dessus, sa filtration et le lavage du composé résultant puis sa recristallisation pour obtenir le composé voulu. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le sel d'halogène est un monochlorure d'halogène. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que l'acide organique est l'acide acétique glacial 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que de l'eau est ajoutée au mélange réactionnel avant les étapes de filtration et de lavage. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que l'atome d'halogène est choisi parmi le brome et l'iode. 8. Utilisation du colorant selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 comme photosensibilisateur dans des applications thérapeutiques photodynamiques. 9. Utilisation du colorant selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 comme détecteur fluorescent de tumeurs et dans le traitement photodynamique du cancer et d'autres maladies. 10. Utilisation du colorant selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 comme sensibilisateur dans la stérilisation de l'eau. 11. Utilisation du colorant selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 pour la conception de photosensibilisateurs de troisième génération efficaces par l'introduction dudit colorant dans des dispositifs chimiques pour cibler les médicaments vers des cellules vivantes définies.