Brevet FR2817875A1 — publié le 20020614

PROCEDE DE PREPARATION D'UN ANTICORPS MONOCLONAL HUMAIN, DE FRAGMENTS DE CELUI-CI OU D'ANTICORPS COMPRENANT DE TELS FRAGMENTS, LES ANTICORPS AINSI OBTENUS ET LEUR UTILISATION. La présente invention concerne un procédé de préparation d'un anticorps monoclonal humain, de fragments de celui-ci ou d'anticorps comprenant de tels fragments. L'invention a également pour objet les hybridomes et les anticorps ainsi obtenus et leurs utilisations dans des compositions de diagnostic et thérapeutiques. Les anticorps monoclonaux dirigés contre un déterminant antigénique sont produits par un grand nombre de laboratoires depuis l'introduction de la technique de fusion cellulaire entre une cellule myélomateuse et une cellule lymphoïde d'un animal immunisé. Le premier modèle d'hybridomes sécrétant des anticorps monoclonaux développé par Köhler et Milstein (1975, Nature, vol. 256, page 495) fut un modèle murin. Les anticorps monoclonaux produits par des hybridomes présentent des intérêts multiples qui ont été décrits de manière exhaustive dans plusieurs ouvrages (Bazin, Rat hybridomas and rat monoclonal antibodies , CRC Press, 1990, 515 pages ; Goding, Monoclonal antibodies : principles and practise , 3""* édition, Academic Press, 1996, 492 pages ; Shepherd et Dean, Monoclonal antibodies , Oxford university press, 2000, 479 pages). Ces anticorps sont utiles à des emplois aussi bien de diagnostic que de thérapeutiques préventives et/ou curatives. La présente invention concerne un procédé de préparation d'anticorps monoclonaux présentant l'avantage de ne pas nécessiter l'immortalisation préalable des lymphocytes B comme par exemple par le virus E. B. V. tel que proposé dans l'art antérieur. Le procédé de l'invention est remarquable en ce qu'il est basé sur l'utilisation successive et combinée de diverses cytokines à des temps définis et d'un système activateur non spécifique. Plus particulièrement, le procédé de préparation d'anticorps monoclonaux humains ou de fragments de ceux-ci ou d'anticorps comprenant un tel fragment, à partir de lymphocytes B, comprend les étapes suivantes : a) l'isolement de lymphocytes B à partir d'un prélèvement provenant d'un individu de l'espèce humaine, b) la différenciation desdits lymphocytes B en cellules plasmocytaires avec au moins un système activateur non spécifique et au moins une cytokine, c) l'immortalisation desdites cellules plasmocytaires par fusion cellulaire avec une lignée de fusion, d) la culture in vitro des cellules fusionnées jusqu'à l'obtention d'hybridomes, et avantageusement le criblage des clones spécifiques, e) la purification des anticorps monoclonaux produits par les hybridomes, f) éventuellement le clivage desdits anticorps en fragments, et la purification d'un ou plusieurs desdits fragments, g) éventuellement l'association d'un ou plusieurs des fragments obtenu (s) à l'étape (f) avec des fragments d'autres anticorps. Ainsi, l'invention se rapporte tant aux anticorps obtenus à l'étape (e) qu'à des fragments de ceuxci obtenus à l'étape (f) libres ou associés à d'autres molécules ou substances, de n'importe quel isotype, humains ou cherchant à s'en approcher. Comme par exemple, des anticorps monoclonaux de mammifères proches de l'homme (singes supérieurs), soit chimérisés avec des parties constantes d'immunoglobulines humaines, soit humanisés, modifiés artificiellement ou non dans le but d'obtenir des propriétés similaires à ceux de l'espèce humaine dans leur forme membranaire, circulante ou sécrétée. Le procédé de l'invention peut éventuellement comporter une étape supplémentaire (h) caractérisée par le transfert du matériel génétique des hybridomes codant pour tout ou partie des anticorps dans tout autre système d'expression décrit dans la littérature spécialisée. A l'étape (a) du procédé selon l'invention, les lymphocytes B sont isolés à partir d'un prélèvement d'un individu de l'espèce humaine ou de toute autre origine ayant les mêmes caractéristiques. Avantageusement, les lymphocytes B sont isolés à l'étape (a) du procédé selon l'invention à partir de sang humain. On entend par cellules plasmocytaires à l'étape (b) des lymphocytes B modifiés produisant des immunoglobulines et aptes à être fusionnés avec une autre cellule pour donner un hybridome sécrétant des immunoglobulines. Ce type de lymphocytes B modifiés peut être parfois appelé lymphocytes B activés . Avantageusement, l'étape (b) de différenciation des lymphocytes B comprend les étapes suivantes : i) le mélange d'une suspension de lymphocytes B avec de 0,01 à 1 % d'un système activateur non spécifique et de 1 à 8,5 ng/ml d'IL2, puis l'incubation du mélange pendant 24 heures à 11 jours à une température comprise entre 36,5 et 37, 8 C, ii) la centrifugation de la suspension obtenue en (i) de 600 à 3500 rpm pendant 2 à 12 minutes, puis le retrait du surnageant et la remise en suspension du culot cellulaire, iii) le mélange de la suspension obtenue en (ii) avec de 1 à 8,5 ng/ml d'IL2 et de 10 à 350 ng/ml d'IL10, puis l'incubation du mélange pendant 48 heures à 15 jours à une température comprise entre 36, 5 et 37, 8 C. Ainsi, à titre d'exemple préféré, l'étape (b) de différenciation des lymphocytes B comprend les étapes suivantes : i) le mélange d'une suspension de lymphocytes B avec 0,04 % d'un système activateur non spécifique et 2,5 ng/ml d'IL2, puis l'incubation du mélange pendant 3 jours à une température de 37 C sous 5% de CO2, ii) la centrifugation de la suspension obtenue en (i) à 1300 rpm pendant 6 minutes, puis le retrait du surnageant et la remise en suspension du culot cellulaire, iii) le mélange de la suspension obtenu en (ii) avec 2,5 ng/ml d'IL2 et 100 ng/ml d'IL10, puis l'incubation du mélange pendant 5 jours à une température de 37 C sous 5% de CO2. Le système activateur non spécifique est choisi parmi un lipopolysaccharide ou toute substance susceptible d'avoir une action identique en tout ou partie, la pansorbine, la phytohémagglutinine, le muramyldipeptide utilisés seuls ou en association. La lignée de fusion utilisée pour l'immortalisation des cellules plasmocytaires à l'étape (c) est une lignée myélomateuse de rongeur, de préférence une lignée myélomateuse de rat et tout préférentiellement une lignée myélomateuse de rat de souche LOU. Selon une forme de réalisation toute particulière du procédé de l'invention, la lignée de fusion utilisée pour l'immortalisation des cellules plasmocytaires à l'étape (c) est la lignée myélomateuse de rat LOU IR 983 FI TEC déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes à l'Institut Pasteur (Paris) sous le No. 1-2584, le 29 novembre 2000, ce dépôt ayant été réalisé dans le cadre du Traité de Budapest. Selon une première forme de mise en oeuvre préférée du procédé de l'invention, l'étape (b) de différenciation des lymphocytes B en cellules plasmocytaires est effectuée en présence d'un antigène spécifique d'un agent infectieux. Selon une seconde forme de mise en oeuvre préférée du procédé de l'invention, à l'étape (a) les lymphocytes B sont isolés de sang d'un organisme vacciné contre un agent infectieux ou en convalescence d'une infection par ledit agent infectieux. Avantageusement, à l'étape (a), les lymphocytes B sont isolés de sang d'un sujet vacciné contre la grippe. Le procédé de l'invention permet de produire des anticorps monoclonaux ou des fragments de ceux-ci ou des anticorps comprenant un tel fragment à partir de lymphocytes B de mammifères ou de toute espèce animale susceptible de montrer une réponse immune humorale spécifique, mais de préférence ceux-ci sont isolés à partir de sang humain ou de mammifères proches de l'homme. L'invention concerne bien entendu tout particulièrement la préparation d'anticorps monoclonaux humains à partir de lymphocytes B humains. Ainsi, le procédé de l'invention permet la préparation d'anticorps monoclonaux humains ou de fragments de ceux-ci ou d'anticorps comprenant un tel fragment dirigés contre tout type d'agent infectieux, comme par exemple de manière non exhaustive le virus grippal, les agents classiquement objectivés dans la guerre biologique comme le charbon, la variole, la tularémie, le virus Ebola etc... et tout agent pathogène de l'homme, des animaux et en fait du règne animal et végétal. L'invention concerne aussi un hybridome susceptible d'être obtenu après les étapes (a) à (d) d'un procédé décrit précédemment, ainsi que les anticorps monoclonaux susceptibles d'être produits par ces hybridomes, ou un fragment de celui-ci, et plus particulièrement les fragments Fab incluant les parties du site anticorps qui peut se fixer à l'antigène. Ces anticorps et leurs fragments peuvent être identifiés par un test ELISA. La spécificité des anticorps monoclonaux vis-à-vis de l'agent infectieux peut être évaluée : - par un test ELISA de spécificité vis-à-vis de l'agent infectieux ; - par un test d'inhibition d'hémagglutination avec les antigènes de l'agent infectieux ; - ou par un test in vivo sur un modèle animal de protection vis-à-vis de l'agent infectieux. Ces anticorps monoclonaux appartiennent à la classe des IgG, IgM, IgE, IgD ou IgA, mais ils peuvent être aussi modifiés, quelle que soit leur classe, en anticorps d'une autre classe d'immunoglobulines par exemple par des techniques décrites de biologie moléculaire (Lewis et al., 1992, Hum. Antibodies Hybridomas, vol. 3, pages 146-52 ; Lewis et al., 1993, J. Immunol., vol. 151, pages 2829-38 ; Hall et al., 1994, Cancer Res., vol. 54, pages 5178-85 ; Shepherd et Dean, Monoclonal antibodies , Oxford university press, 2000,479 pages). Ainsi, l'invention se rapporte à un anticorps monoclonal susceptible d'être obtenu par les étapes (a) à (e) du procédé précédemment, ou un fragment de celui-ci obtenu par les étapes (a) à (f) dudit procédé. Un tel anticorps monoclonal ou fragment de celui-ci peut appartenir à la classe des IgG, IgM, IgE, IgD ou IgA. L'invention concerne aussi un anticorps ou fragment d'anticorps comprenant au moins un fragment d'anticorps ci-dessus. De tels anticorps peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme du métier pour associer des fragments d'anticorps différents. L'invention se rapporte encore à des compositions pharmaceutiques comprenant à titre d'agent actif une quantité efficace d'au moins un anticorps ou fragment d'anticorps comprenant au moins un fragment d'anticorps obtenu selon le procédé de l'invention. Ces compositions sont utiles pour le diagnostic et pour le traitement curatif ou préventif d'infections par les agents infectieux contre lesquels les anticorps et fragments d'anticorps ont été préparés selon le procédé décrit précédemment. Ainsi, l'invention a pour objet un kit de détection d'une infection par un agent infectieux, comprenant au moins un anticorps ou au moins un fragment d'anticorps contre ledit agent infectieux obtenus comme décrit précédemment. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront de la description qui suit rapportant des exemples de préparation d'anticorps monoclonaux et leur propriété. I-Isolement des lymphocytes B humains. 1) Matériel. Tubes EDTA (CML, réf : T200QS) Seringues 20 ml (Fisher Sci., réf : A14669625) Filtres Minisart 0, 22 uM (CML, réf : 17597K) Plaques de culture 96 puits (Life Technologies, réf : 167008A) Flacons de culture à bouchons ventilés (Fisher Sci., réf : A12078050) Pipettes stériles 10 ml (CML, réf : P1051 B) Tubes à centrifugation 50 ml (Fisher Sci., réf : A12832506) Tubes centrifugeurs 15 ml (Fisher Sci., réf : A12832163) Tubes 12 ml stériles ml (Fisher Sci., réf : A12926183) Cellule à numération (CML, réf : KOVAS) Bleu de trypan (Sigma, réf : T-8154) Milieu de culture DMEM (Biowhittaker, réf : M12914F) Milieu de culture RPMI 1640 (Biowhittaker, réf : M12115F) Sérum de veau foetal (Labconsul, réf : P30-0702) Sérum de cheval (Labconsul, réf : 17-905C) L-glutamine 200 mM (Biowhittaker, réf : 17-905C) Gentamicine 50 mg/ml (Life Technologies, réf : 15750-045) NEAA 100X (Biowhittaker, réf : BE13-114E) Pyruvate de sodium 100 mM (Biowhittaker, réf : 13-115E) 2-mercaptoéthanol (Sigma, réf. : M7522) Milieu de séparation des lymphocytes (Biowhittaker, réf. : MI 7829E) Sang de mouton défibriné (Eurobio, réf. : 905705) HBSS (Life Technology, réf. : 14025-050) PBS (Biowhittaker, réf. : MI 7512F) AET : 2-Aminoethylisothiouroniumbromide (Sigma, réf. : A5879) Eau distillée NaOH (Fisher Sci., réf : A43211977) IL2 : Interleukine 2 humaine recombinante (R et D, réf. : 202 IL050) IL6 : Interleukine 6 humaine recombinante (R et D, réf. : 206 IL050) IL10 : Interleukine 10 humaine recombinante (R et D, réf. : 217 IL025) Pansorbine (France Biochem SA, réf. : 507851) Milieu de fusion MEM REGA 3 (Life Technology, réf. : 19993- 013) HEPES 1M (Life Technology, réf. : 15630-056) PEG : Polyéthylène glycol 4000 (Fisher Sci., réf : A48691512) DMSO : Diméthylsulfoxyde (Fisher Sci., réf : A43320281) Aminoptérine 100X (Life Technology, réf. : 11362-019) Supplément d'hypoxantine thymidine 50X (Life Technology, réf. : 41065-012) 2) Méthode. a) Première étape. Le sang a été prélevé sur des volontaires vaccinés par un vaccin antigrippal ou en convalescence d'une infection grippale. Les prélèvements sont réalisés à 0,8, 15 ou 21 jours après la vaccination. Le sang humain provenant de tubes EDTA est dilué dans le même volume de PBS. Le sang dilué est déposé dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant le milieu de séparation des lymphocytes (1/3 de milieu pour 2/3 de sang). Après une centrifugation à 3000 rpm sans frein pendant 20 min, l'anneau de lymphocytes est récupéré à l'interface à l'aide d'une pipette de 10 ml. La pipette est vidée dans un tube à centrifuger de 15 ml et du milieu de culture complet RPMI, milieu de culture RPMI contenant 1% de L-glutamine, 0,1% de gentamicine, 50, uM de 2mercaptoéthanol et 10% de sérum de veau foetal, est ajouté qsp 15 ml. Après une centrifugation à 1300 rpm avec frein pendant 6 min, le surnageant est enlevé. Le culot cellulaire est remis en suspension dans 10 ml de milieu de culture complet RPMI. Après une centrifugation à 1300 rpm avec frein pendant 6 min, le surnageant est enlevé. Le culot cellulaire est remis en suspension dans du milieu complet RPMI de façon à avoir de 1 à 2. 106 cellules par ml. La suspension cellulaire est mise dans des flacons de culture à raison de 10 ml par flacon de 50 ml. Les monocytes sont enlevés par adhérence en incubant les flacons à l'horizontale dans une étuve à 37 C et 5% de CO2 pendant une nuit. Une solution à 0,4 g de AET, pH 9 ajusté avec NaOH, est préparée pour 10 ml d'eau distillée. La solution est filtrée sur filtre 0, 22 um dans un tube de 10 ml. Douze ml de sang de mouton défibriné sont mis dans un tube à centrifuger de 15 ml. Après une centrifugation à 2100 rpm pendant 10 min, le surnageant est enlevé et le culot de globules rouges est remis en suspension dans 10 ml de HBSS. Après une centrifugation à 2100 rpm pendant 10 min, le surnageant est enlevé. Deux ml de globules rouges et 8 ml de solution d'AET sont mélangés dans un tube à centrifuger de 15 ml. Après une incubation d'une heure à 37OC, 5 ml de PBS sont ajoutés. Le surnageant est enlevé après une centrifugation de 10 min à 1300 rpm. Deux ml du culot constitué de globules rouges et d'AET sont mis dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant 48 ml de milieu complet RPMI. Une incubation est réalisée toute une nuit à 4 C. b) Deuxième étape. La suspension cellulaire des flacons est récupérée. Un volume égal de suspension cellulaire et de solution à 4% de globules rouges de mouton-AET sont mis dans un tube de 50 ml. Un demi volume de sérum de veau foetal est ajouté. Le tout est mélangé doucement et centrifugé 5 min à 800 rpmi/min. Le mélange avec le surnageant est incubé 1 heure dans la glace. Le surnageant est enlevé et le culot est remis en suspension puis déposé dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant le milieu de séparation des lymphocytes, 1/3 de milieu pour 2/3 de culot. Après une centrifugation à 3000 rpm sans frein pendant 20 min, l'anneau de lymphocytes est récupéré à l'interface à l'aide d'une pipette. La pipette est vidée dans un tube à centrifuger de 15 ml et du milieu de culture complet RPMI est ajouté qsp 15 ml. Après une centrifugation à 1300 rpm avec frein pendant 6 min, le surnageant est enlevé. Le culot cellulaire est remis en suspension dans 10 ml de milieu de culture complet RPMI. Après une centrifugation à 1300 rpm avec frein pendant 6 min, le surnageant est enlevé. Le culot cellulaire est remis en suspension dans du milieu complet RPMI et la suspension cellulaire est mise dans des flacons de culture à raison de 10 ml par flacon de 50 ml. II-Différenciation en cellules plasmocytaires. Sont ajoutés à la suspension cellulaire 0,04% de pansorbine et 2,5 ng/ml d'IL2. La suspension cellulaire est incubée pendant 3 jours dans une étuve à 37 C et 5% de C02 avant d'être centrifugée 6 min à 1300 rpm. Le surnageant est enlevé et le culot cellulaire est remis en suspension dans du milieu complet RPMI. La suspension cellulaire est mise dans des flacons de culture à raison de 10 ml par flacon de 50 ml. Sont ajoutés à la suspension cellulaire 2,5 ng/ml d'IL2 et 100 ng/ml d'IL10. La suspension cellulaire est incubée pendant 5 jours dans une étuve à 37 C et 5% de COz. III-Fusion cellulaire. La suspension cellulaire est mise dans un tube à centrifuger de 15 ml et les cellules IR 983 F/TEC dans un autre tube. Les tubes sont centrifugés pendant 6 min à 1200 rpm. Les surnageants sont enlevés et les cellules sont remises en suspension dans 10 ml de milieu MEM REGA 3 complet, milieu MEM REGA 3 contenant 1% d'HEPES et 0,1% de gentamicine, à 37OC. Après une centrifugation à 1200 rpm pendant 6 min, les surnageants sont enlevés et les cellules sont remises en suspension dans 10 ml de milieu MEM REGA 3 complet à 37OC. Un comptage des deux types cellulaires est effectué. Les tubes sont centrifugés pendant 6 min à 1200 rpm. Les surnageants sont enlevés et les cellules sont remises en suspension dans 10 ml de milieu MEM REGA 3 complet à 37OC. Les cellules sont mélangées dans un tube à centrifuger de 50 ml suivant un rapport de 1 IR 983 FI TEC pour une cellule plasmocytaire. Après une centrifugation à 1200 rpm pendant 6 min, les surnageants sont enlevés et le culot est remis en suspension dans la dernière goutte. Une solution de PEG est obtenue en chauffant à 50 C 5 g de PEG 4000 dans 7 ml de PBS et 1 ml de DMSO puis en filtrant la solution sur filtre 0, 2 uM. Un ml de solution de PEG est ajouté au culot en 1 min 30 sec en agitant le tube. On laisse reposer 30 sec. Sont ajoutés 1 ml de MEM REGA 3 à 37 C en 1 min 30 sec en agitant le tube puis 20 ml de MEM REGA 3 à 37 C en 4 min en agitant le tube. Après une centrifugation à 1200 rpm pendant 6 min, les surnageants sont enlevés et le culot est remis en suspension dans du milieu complet DMEM avec 1% d'aminoptérine et 2% d'hypoxantine-thymidine de façon à avoir 1. 106 cellules par ml. Le milieu complet DMEM contient 1% de L-glutamine, 1% de NEAA, 1% de pyruvate de sodium, 0,1% de gentamicine, 50 uM de 2-mercaptoethanol, 5% de sérum de veau foetal et 5% de sérum de cheval. La suspension cellulaire est répartie sur des plaques de culture 96 puits contenant 100 pl de cellules péritonéales, la suspension est répartie à raison de 100 pl par puits. Les plaques sont incubées 7 jours dans une étuve à 37 oC et 5% de CO2. IV-Entretien des plaques de fusion. Sept jours après la fusion, le milieu de culture des plaques est enlevé. Par puits, sont ajoutés 200 pl de milieu complet DMEM contenant 1% d'aminoptérine et 1% d'hypoxanthine-thymidine. Les plaques sont incubées pendant 5 jours dans une étuve à 37 C et 5% de eo2. Le milieu de culture des plaques est enlevé puis sont mis, par puits, 200 ul de milieu complet DMEM contenant 2% d'hypoxanthinethymidine. Après une incubation de 4 jours dans une étuve à 37 C et 5% de CQ, le milieu de culture des plaques est enlevé puis sont mis, par puits, 200 pi de milieu complet DMEM contenant 2% d'hypoxanthine-thymidine et 2, 5 ng/ml d'IL6. Après une incubation de 4 jours dans une étuve à 37 C et 5% de CQ, le milieu de culture des plaques est enlevé puis sont mis, par puits, 200 pi de milieu complet DMEM contenant 2,5 ng/ml d'IL6. les plaques sont mises à incuber dans une étuve à 37 C et 5% de eo2, le milieu de culture est changé de la même manière jusqu'à l'apparition des clones. V-Résultats des différentes fusions réalisées. Les lymphocytes B (LcB) provenant de volontaires vaccinés par un vaccin anti-grippal et prélevés 0,8, 15 ou 21 jours après la vaccination ont été fusionnés avec la lignée IR 983 F/TEC suivant le protocole décrit ci-dessus. Les lymphocytes B d'un donneur X ont servi de contrôle. Les hybridomes obtenus sont testés pour la production d'immunoglobulines (Ig) humaines par la technique ELISA en utilisant des anticorps de rats anti-Ig G et anti-Ig M humaines. Le tableau 1 récapitule les résultats obtenus (nombre de clones et production d'Ig). Tableau 1 : Résultats obtenus pour chaque fusion. Nom Origine des LcB Lignée Clones Production fusionnante obtenus d'Ig FAL 7 LcB vaccin grippe à J0 IR 983 F/TEC 0 FAL 8 LcB donneur X IR 983 F/TEC 1 + FAL 9 LcB vaccin grippe à J7 IR 983 FI TEC 0 FAL 10 LcB vaccin grippe à IR 983 FI TEC 1 J15 FAL 11 LcB vaccin grippe à IR 983 FI TEC 9 + J21 VI-Purification des immunoglobulines. Les immunoglobulines sont récupérées à partir des surnageants de culture des 9 clones FAL 11 et du clone FAL 8. Elles sont purifiées par chromatographie d'affinité sur une colonne de Sépharose couplée à des anticorps antiIg humaines qui sont l'anticorps LO-hK-3 (anti-Ig humaines Kappa, réf : TEC 146, Technopharm-France) et l'anticorps LO-hL-2 (anti-Ig humaines lambda, réf : TEC 147, Technopharm-France). La concentration en immunoglobulines est évaluée par un test ELISA en comparaison avec un étalon (IgM humaine à 1 mg/ml, réf : 18260, Sigma). VII-Activité des anticorps. 1) Test ELISA de spécificité. i) Matériel. - Antigènes viraux du virus Influenza : A/Sidney/5/97 (H3N2) -like lot : HVR 13-1, A/Beijing/262/95 (HlNl)-like lot : HXH 19-4, B/Beijing/184/93 (H3N2) -like lot : HHA 06-5, Hémagglutinine Influenza (réf : 12149, Sigma) - Anticorps monoclonaux LO-HK-3 lot : 5330 et LO-HL-2 lot : 4451 marqués à la péroxydase. ii) Protocole. Les antigènes dilués à une concentration de 5 à 10 pg/ml dans du tampon carbonate bicarbonate au pH de 9, 5 sont répartis à raison de 100 pi par puits dans des plaques 96 puits. Ces plaques sont incubées une nuit à 4 C. Les plaques sont ensuite lavées 3 fois avec du PBS contenant 2% de Tween 20. Les plaques sont saturées avec du PBS contenant 2% de Tween 20 et 5% de lait écrémé à raison de 200 pi par puits et incubées une heure à 37OC. Les plaques sont ensuite lavées 3 fois avec du PBS contenant 2% de Tween 20. Les échantillons d'immunoglobulines à différentes dilutions sont répartis dans les plaques à raison de 10 pi par puits. Ces plaques sont incubées 2 heures à 37OC. Les plaques sont ensuite lavées 6 fois avec du PBS contenant 2% de Tween 20. Les anticorps couplés à la péroxydase sont dilués dans du PBS contenant 2% de Tween 20 (0, 5 ul/ml) et déposés dans les plaques à raison de 100 pi par puits. Les plaques sont incubées une heure à 37OC. Les plaques sont lavées 6 fois avec du PBS contenant 2% de Tween 20. Une pastille d'OPD (0 Phénylenediamine, réf : P8787, Sigma) est dissoute dans le tampon de révélation (tampon citrate phosphate au pH de 5,5) avec du peroxyde d'oxygène. La solution est déposée sur les plaques à raison de 100 pi par puits. Les plaques sont incubées de 10 à 20 minutes à l'obscurité. La réaction enzymatique est arrêtée par l'ajout de 50 pi par puits de H2SO4 à 2M. Les résultats sont lus à 490 nm au lecteur de plaques. iii) Résultats. Des tests ELISA sont donc réalisés afin de tester la spécificité des immunoglobulines sur les antigènes viraux A (H3N2), A (HlNl) et B des souches de l'hiver 1998/99 (Tableau 2). Les tests se sont révélés positifs pour 2 clones FAL 11 (3D2 et 2C3) et pour le clone FAL 8 (lG4). L'absence de spécificité étroite pour une des 3 souches de virus est particulièrement intéressante sur le plan thérapeutique dans le sens où les anticorps seraient capables d'être actifs sur différentes souches de virus. Tableau 2 : Résultat du Test ELISA de spécificité sur les différents clones. Clone Code Isotype ELISA sur antigènes viraux + sur A (H3N2) FAL 11 AB9 Ig M + sur A (HlNl) 3D2 + sur B + sur Hémagglutinine - sur A (H3N2) FAL 11 AB4 Ig M K-sur A (HlNl) 3Bl-sur B - sur Hémagglutinine - sur A (H3N2) FAL 11 AB5 Ig M K-sur A (HIN1) 1G8 - sur B - sur Hémagglutinine - sur A (H3N2) FAL 11 AB6 IgM K-sur A (HlNl) 1D8 - sur B - sur Hémagglutinine - sur A (H3N2) FAL 11 AB3 Ig M K-sur A (HlNl) lA9-sur B - sur Hémagglutinine - sur A (H3N2) FAL 11 AB7 Ig M K-sur A (HlNl) 1H2 - sur B - sur Hémagglutinine - sur A (H3N2) FAL 11 AB8 IgM K-sur A (HlNl) 1H4 - sur B - sur Hémagglutinine + sur A (H3N2) FAL 11 AB2 Ig M + sur A (HlNl) 2C3 + sur B - sur Hémagglutinine - sur A (H3N2) FAL 11 AB1 Ig M K-sur A (HlNl) 2G7-sur B - sur Hémagglutinine + sur A (H3N2) FAL 8 AB10 Ig M + sur A (HlNl) 1G4 + sur B - sur Hémagglutinine 2) Test de protection d'une infection virale chez la souris à l'aide d'anticorps humains. i) Matériel. - Souris : Des souris BALB/c femelles de 5 semaines sont groupées par lot de 6. Elles sont hébergées dans une enceinte autonome dans des cages recouvertes d'une cape filtrante. - Virus : Le virus Influenza A souche Scotland [A/Scotland/74 (H3N2)] est adapté à la souris par passages pulmonaires successifs. Le stock viral est conservé en broyats pulmonaires à-80 C. La dilution en tampon PBS pour l'infection expérimentale est effectuée extemporanément. - Anticorps : Des immunoglobulines totales humaines (IvIg) conservées à-80 C puis diluées à la concentration souhaitée extemporanément (500 pg/50 pl) sont utilisées comme contrôle. Les anticorps purifiés AB1, AB2, AB9 et AB10 conservés à 4 C sont ajustés à une concentration équivalente pour chaque anticorps (1 pg/50 nul). ii) Protocole. Les souris sont anesthésiées légèrement suivant un protocole décrit dans les ouvrages spécialisés et reçoivent par voie intra-nasale 50 pl de suspension d'anticorps (AB1, AB2, AB9, AB10 ou d'Ig totales humaines : IvIg) ou de sérum physiologique (Témoins). Le lendemain, après anesthésie, elles reçoivent 50 pi de la suspension virale létale en 10 jours. Les souris sont surveillées chaque jour. L'efficacité de la protection est mesurée en survie/ létalité. iii) Résultats. Les résultats (Tableau 3) montrent : que les souris recevant le sérum physiologique sont mortes dès J11 ; - que les souris recevant des anticorps de type Ig M lambda du lot AB2 sont toutes vivantes à J15 ; - que les souris recevant des anticorps de type Ig M lambda du lot AB9 sont toutes mortes à J11 ; - que 5 des 6 souris recevant des anticorps de type Ig M Kappa du lot AB1 sont mortes à J15 ; - que les souris recevant les immunoglobulines totales à la dose de 500 g sont toutes vivantes à J15. Les résultats montrent que les anticorps monoclonaux IgM lambda sécrétés par le clone FAL 11 2C3 protègent les souris de l'infection mortelle par le virus A/Scotland/74 (H3N2) de la grippe à la dose de 1 ug dans 50 pi de PBS comparativement à des immunoglobulines humaines totales à la dose de 500 pg dans 50 pi de PBS qui protègent également les souris de l'infection respiratoire mortelle par le même virus de la grippe Tableau 3 : Test de protection d'une infection virale chez la souris à l'aide d'anticorps humains (exprimé en nombre de survivants par groupe de 6). Témoins IvIg ABl AB2 AB9 AB10 JO 6 6 6 6 6 6 J7 6 6 4 6 6 6 J8 6 6 2 6 2 4 J9 4 6 2 6 2 2 J10 2 6 2 6 2 2 Jll 0 6 1 6 0 2 J12 0 6 1 6 0 1 J13 0 6 1 6 0 1 J14 0 6 1 6 0 0 J15 0 6 1 6 0 0 REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation d'anticorps monoclonaux humains ou de fragments de ceux-ci ou d'anticorps comprenant un tel fragment, à partir de lymphocytes B, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'isolement de lymphocytes B à partir d'un prélèvement provenant d'un individu de l'espèce humaine, b) la différenciation desdits lymphocytes B en cellules plasmocytaires avec au moins un système activateur non spécifique et au moins une cytokine, c) l'immortalisation desdites cellules plasmocytaires par fusion cellulaire avec une lignée de fusion, d) la culture in vitro des cellules fusionnées jusqu'à l'obtention d'hybridomes, e) la purification des anticorps monoclonaux produits par les hybridomes, f) éventuellement le clivage desdits anticorps en fragments, et la purification d'un ou plusieurs desdits fragments, g) éventuellement l'association d'un ou plusieurs des fragments obtenu (s) à l'étape (f) avec des fragments d'autres anticorps. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (b) de différenciation des lymphocytes B comprend les étapes suivantes : i) le mélange d'une suspension de lymphocytes B avec de 0, 01 à 1 % d'un système activateur non spécifique et de 1 à 8,5 ng/ml d'IL2, puis l'incubation du mélange pendant 24 heures à 11 jours à une température comprise entre 36,5 et 37, 8 C, ii) la centrifugation de la suspension obtenue en (i) de 600 à 3500 rpm pendant 2 à 12 minutes, puis le retrait du surnageant et la remise en suspension du culot cellulaire, iii) le mélange de la suspension obtenue en (ii) avec de 1 à 8,5 ng/ml d'IL2 et de 10 à 350 ng/ml d'IL10, puis l'incubation du mélange pendant 48 heures à 15 jours à une température comprise entre 36,5 et 37, 8 C. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'étape (b) de différenciation des lymphocytes B comprend les étapes suivantes : i) le mélange d'une suspension de lymphocytes B avec 0,04 % de système activateur non spécifique et 2,5 ng/ml d'IL2, puis l'incubation du mélange pendant 3 jours à une température de 370C sous 5% de CO2, ii) la centrifugation de la suspension obtenue en (i) à 1300 rpm pendant 6 minutes, puis le retrait du surnageant et la remise en suspension du culot cellulaire, iii) le mélange de la suspension obtenue en (ii) avec 2,5 ng/ml d'IL2 et 100 ng/ml d'IL10, puis l'incubation du mélange pendant 5 jours à une température de 37 C sous 5% de CO2. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le système activateur non spécifique est choisi parmi un lipopolysaccharide ou toute substance susceptible d'avoir une action identique en tout ou partie, la pansorbine, la phytohémagglutinine, le muramyldipeptide utilisés seuls ou en association. 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la lignée de fusion utilisée pour l'immortalisation des plasmocytes à l'étape (c) est une lignée myélomateuse de rongeur. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la lignée de fusion utilisée pour l'immortalisation des plasmocytes à l'étape (c) est une lignée myélomateuse de rat. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la lignée de fusion utilisée pour l'immortalisation des plasmocytes à l'étape (c) est une lignée myélomateuse de rat de souche LOU. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la lignée de fusion utilisée pour l'immortalisation des plasmocytes à l'étape (c) est la lignée myélomateuse de rat LOU IR 983 F/ TEC déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes à l'Institut Pasteur (Paris) sous le No. 1-2584. 9) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'à l'étape (b) la différenciation des lymphocytes B en cellules plasmocytaires est effectuée en présence d'un antigène spécifique d'un agent infectieux. 10) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'à l'étape (a) les lymphocytes B sont isolés de sang d'un individu vacciné contre un agent infectieux ou en convalescence d'une infection par ledit agent infectieux. 11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'à l'étape (a) les lymphocytes B sont isolés de sang d'un sujet vacciné contre la grippe. 12) Un hybridome susceptible d'être obtenu après les étapes (a) à (d) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 13) Un anticorps monoclonal susceptible d'être obtenu par les étapes (a) à (e) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, ou un fragment de celui-ci obtenu par les étapes (a) à (f) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 14) Un anticorps monoclonal ou un fragment de celui-ci selon la revendication 13, appartenant à la classe des IgG, IgM, IgE, IgD ou IgA. 15) Un anticorps ou fragment d'anticorps comprenant au moins un fragment d'anticorps selon l'une des revendications 13 ou 14. 16) Composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent actif une quantité efficace d'au moins un anticorps monoclonal ou d'un fragment d'anticorps selon l'une des revendications 13 à 15. 17) Un kit de détection d'une infection par un agent infectieux, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps selon l'une des revendications 13 à 15.