Brevet FR2820434A1 — publié le 20020809

La présente invention est relative à l'utilisation d'oligonucléotides pour améliorer la transfection de gènes dans des cellules, in vitro et in vivo, ainsi qu'au procédé et au un mélange de transfection correspondants. La thérapie génique est fondée sur l'administration thérapeutique d'acides nucléiques ; elle nécessite l'utilisation de vecteurs efficaces et sûrs pour le transfert des gènes thérapeutiques et son succès dépend donc de l'efficacité du transfert des gènes d'intérêt dans les cellules souhaitées. De nombreuses compositions aptes à transfecter des cellules eucaryotes avec un matériel génétique sélectionné ont déjà été décrites et appartiennent essentiellement à deux grands types de vecteurs de transfection : - les vecteurs de transfection viraux, sont des outils puissants en terme d'efficacité de transfection, cependant ils présentent des limites d'utilisation : non-spécificité tissulaire, nécessité d'obtenir des constructions pour chaque gène d'intérêt, risques potentiels pour l'environnement qui conduisent à la mise en place d'infrastructures cliniques coûteuses et contraignantes pour le malade et pour le personnel (Briand et al., Pathol. Biol., 1993, 41 (8), 663-671 ; Roessler BJ et al., Hum. Gene Ther., 1995, 6 (3), 307-316), problèmes de réponse immunitaire (Wagner E et al., Curr. Opin. Biotechnol., 1993, 4, 705-710 ; Curiel D. T., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1994, 716, 36-56), de production par recombinaison homologue de particules virales et d'effets oncogènes potentiels ; - les vecteurs de transfection non-viraux (vecteurs synthétiques), capables de promouvoir le transfert et l'expression de substances chimiques telles que l'ADN dans les cellules eucaryotes. Les vecteurs synthétiques sont donc proposés comme une alternative aux vecteurs viraux. Ces vecteurs synthétiques doivent avoir essentiellement deux fonctions : condenser l'ADN à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et éventuellement les membranes nucléaires ; pour être efficaces, de tels vecteurs doivent donc mimer le fonctionnement des virus. A ce titre, différents types de composés chargés positivement, capables d'interagir de façon électrostatique avec l'ADN chargé négativement, peuvent être utilisés. C'est ainsi que l'on a déjà proposé d'utiliser : - des polymères cationiques linéaires tels que la poly (L-lysine) et ses conjugués (Curiel et al., pré-cité ; Wagner E et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1991,88 (10), 4255-4259 ; Stankovics J. et al., Hum. Gene Ther., 1994,5 (9), 1095- 1104), - des polymères ramifiés tels que les dendrimères de type polyamidoamine, les dendrimères phosphorés (Haensler J et al., Bioconjug. Chem., 1993, 4 (5), 372-379 ; Kang SH et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 1999,9 (6), 497-505 ; Bielinska A et al., Nucleic Acids Res., 1996, 24 (11), 2176-2182 ; Tang et al., Bioconjug. Chem., 1996, 7 (6), 703-714 ; Loup et al., Chem. Eur. J., 1999, 5, 3644-3650) ou le polyéthylèneimine (Boussif 0 et al., Proc. Natl. Acad Sci. U. S. A., 1995, 92 (16), 7297-7301), - des lipides cationiques (Bielinska et al., pré-cité ; Felgner PL et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1995, 772, 126-139 ; Vigneron JP et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1996, 93 (18), 9682-9686 ; Byk et al., J. Med. Chem., 1998, 41 (2), 229-235), ou bien encore -des liposomes (Miller et al., Chem., 1998, 11, 1882-1884 ; Hara T et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1997, 94 (26), 14547-14552 ; Koltover J et al., Science, 1998,281 (5373), 78-81). Parmi ces composés cationiques, les dendrimères de type polyamidoamine (PAMAM) et les dendrimères phosphorés tels que ceux décrits par Loup C. et al. (pré-cité) sont les plus efficaces en terme de niveau de transfection vis- à-vis d'une large variété de cellules en culture (Haensler J et al., pré-cité) et sont intéressants, à efficacité égale, pour leur toxicité moindre par rapport à celle des systèmes lipidiques. Le terme dendrimère provient des mots dendrite et polymère, le premier évoquant la structure ramifiée des dendrimères, le second la répétition d'un motif. Les dendrimères présentent en effet une structure fractale, constituée d'un coeur, de branches, de cavités internes résultant des ramifications de la molécule, et de fonctions terminales. L'ensemble des points de jonctions des branches situés à une égale distance du coeur correspond à une génération. Le nombre de générations pour un dendrimère donné n'est pas limité et dépend de la structure et de la longueur des branches. Les dendrimères sont synthétisés par répétition d'une même séquence réactionnelle permettant l'obtention d'une nouvelle génération-à la fin de chaque cycle de synthèse et par conséquent d'un nombre croissant de branches et de fonctions périphériques toutes identiques (Frechet JM, Science, 1994,263 (5154), 1710-1715). L'efficacité des dendrimères comme vecteurs synthétiques dépend de leur charge de surface, de leur solubilité, de leur taille et de la modification chimique de leur structure initiale par traitement thermique (Bielinska A et al., pré- cité ; Tang et al., pré-cité ; Kukowska-Latallo JF et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1996,93 (10), 4897-4902). En particulier, les traitements thermiques des dendrimères conduisent à une population de composés hétérodispersés. Bien que présentant certains avantages par rapport à l'utilisation de vecteurs viraux, notamment du point de vue immunologique, l'utilisation des dendrimères à titre de vecteur synthétique est très onéreuse compte tenu de la quantité de dendrimères à utiliser lors de l'étape de transfection des cellules. En effet à l'heure actuelle, pour réaliser la transfection d'environ 10 6 cellules, il est nécessaire d'utiliser environ 20 ug de dendrimères et 2 u. g de plasmide. Cependant, dans ces conditions, et au bout de 16 heures de réaction, seulement 20 % des cellules cibles sont transfectées par le plasmide, ce qui n'est pas satisfaisant tant du point de vue du taux de transfection (pourcentage de cellules transfectées) que du rendement de transfection (quantité de mélange de transfection à utiliser par rapport à un nombre de cellules cible donné). D'autre part, une telle dose de dendrimères (20ug) est généralement toxique vis-à-vis des cellules à transfecter. C'est afin de remédier à l'ensemble de ces problèmes que les Inventeurs ont mis au point ce qui fait l'objet de l'invention. La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'au moins un oligonucléotide à liaison phosphodiester, linéaire, comprenant de 20 à 60 bases, dans un procédé de transfection de cellules eucaryotes par une séquence d'acide nucléique d'intérêt, lequel procédé mettant en oeuvre au moins un dendrimère et au moins un acide nucléique d'intérêt, pour améliorer la transfection desdites cellules. Les Inventeurs ont en effet démontré, de manière surprenante, que l'utilisation d'un tel oligonucléotide permet, pour un nombre identique de cellules cibles, non seulement d'améliorer le taux de transfection (environ 100 % des cellules cibles sont transfectées au bout de 16 heures de réaction), mais également le rendement de transfection puisqu'il permet de réduire de plus de trois fois la quantité nécessaire de dendrimère à utiliser. Les dendrimères permettant de réaliser l'opération de transfection des cellules peuvent être sphériques ou dénaturés (cassés) par un traitement thermique (thermolyse). Parmi les dendrimères dénaturés thermiquement, on peut notamment citer les dendrimères de type polyamidoamine (PAMAM), de cinquième à dixième génération (G5-Glo), dans lesquels le noyau central (à partir duquel le processus de polymérisation est initié) est un ammonium ou une éthylènediamine (EDA). Ces dendrimères PAMAM contiennent un nombre défini de groupes tD aminés à leur surface et sont chargés positivement à pH physiologique. rz > ID De tels dendrimères sont notamment décrits dans l'article de Tang et al. (pré-cité) et doivent être dénaturés par traitement thermique pour donner des composés actifs en transfection. Parmi ceux-ci, on peut notamment citer les dendrimères vendus sous la dénomination SuperFect Parmi les dendrimère sphériques, on peut notamment citer les dendrimères phosphorés polycationiques tels que ceux décrits dans l'article de Loup et al. (pré-cité) ainsi que dans la demande de brevet français 99 14864, constitués : - d'une couche centrale sous la forme d'un noyau central Po comprenant de 2 à 8 groupements fonctionnalisés, - de n couches intermédiaires, identiques ou différentes, chacune desdites couches intermédiaires étant constituée d'unités P répondant à la formule (I) suivante : dans laquelle : L est un atome d'oxygène, de phosphore ou de soufre, M représente l'un des groupes suivants : un groupe aromatique di-, tri-ou tétrasubstitué par des groupes alkyles, des groupes alcoxy, des groupement insaturés du type oléfinique en CI-CI2, azoïques, acétylénique, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, ou . un groupe alkyle ou alcoxy comportant plusieurs substituants tels que définis lorsque M est un groupe aromatique, RI et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, de soufre, d'azote ou des halogènes avec RI étant le plus souvent différent de RI, n est un nombre entier compris entre 1 et 11, E est un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote, ledit atome d'azote pouvant être lié à un groupe alkyle, alcoxy ou aryle, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, - une couche externe constituée d'unités P2, identiques ou différentes, et répondant à la formule II suivante : dans laquelle : Rs représente un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, W représente l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, tous ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, R3 et R4, identiques ou différents, représentent un groupe alkyle en CI-C5, X représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci-5 ou est absent, et Z représente un ion halogénure, un groupe alkylCOO'ou tout autre groupement anionique comportant des atomes de carbone, d'oxygène, de soufre, d'azote, de phosphore ou d'halogène, ou est absent. De façon préférentielle, le noyau central Po de ces dendrimères est sélectionné dans le groupe constitué par le groupement de formule générale Illa : t > ID et le groupement de formule générale lllb : 1 la formule 1 représente le groupe suivant : et le groupe de formule II est notamment le groupe suivant : lm avec p = 1 à 5. On peut obtenir plusieurs types de produits désignés de manière générale par la formule A-[Gn], dans laquelle A définit le type d'unité terminale et Gn définit le nombre de couches d'unités intermédiaires Pl correspondant au nombre de générations : - la série des composés 2-[Gn] présente des unités terminales de formule II, dans lesquelles X représente un atome d'hydrogène, p est égal à 2, R. 3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyles, Z est un ion chlorure et n est un nombre entier compris entre 1 et 11, de préférence entre 1 et 10 ; - la série des composés 3- [Gn] présente des unités terminales de formule II, dans lesquelles X est vide, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyles, Z est vide et n est un nombre entier compris entre 1 et 11, de préférence entre 1 et 10 ; - la série des composés 4- [Gn] présente des unités terminales de formule II, dans lesquelles X représente un groupe méthyle, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyles, Z est un ion iodure et n est un nombre entier compris entre 1 et 11, de préférence entre 1 et 10 ; - la série des composés 5- [Gn] présente des unités terminales de formule II, dans lesquelles X représente un groupe méthyle, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyles, Z est un groupe CH3COO-et n est un nombre entier compris entre 1 et 11, de préférence entre 1 et 10 ; Parmi ces dendrimères, les composés 2- [G3-5] ayant respectivement 48 (2- [G3]), 96 (2- [G4]) et 192 (2- [G5]) charges positives de surface (ammonium quaternaires), sont particulièrement préférés selon l'invention. Ces dendrimères sont représentés sur les figures 1 à 3 annexées. Selon une forme de réalisation de l'invention, et lorsque le dendrimère utilisé est sphérique, c'est-à-dire qu'il n'a subi aucune dénaturation par traitement thermique, alors l'ON comprend de préférence de 20 à 40 bases. Dans ce cas de figure, on préfère utiliser tout particulièrement des ON comprenant 36 bases. Selon une autre forme de réalisation de l'invention, et lorsque le dendrimère utilisé a été dénaturé thermiquement, alors l'ON comprend de préférence de 45 à 55 bases. Selon l'invention et de manière générale, le rapport pondéral acide nucléique/oligonucléotide (ON) /dendrimère à utiliser, varie de préférence entre 0, 5/2/10 et 1/6/14. Lorsque le dendrimère utilisé est sphérique, pour 1 u. g d'acide nucléique à transfecter, il est préférable d'utiliser de 2 à 6 ig d'ON et de 10 à 14 u. g de dendrimère. Lorsque le dendrimère utilisé est dénaturé thermiquement, la quantité d'ON à utiliser dépend de la quantité de mélange acide nucléique/dendrimère utilisée et est de préférence de : - 2, 5 u. g d'oligonucléotide et 12 u. g de dendrimère pour 1 u. g d'acide nucléique ou bien -3 lug d'oligonucléotide et 6 g de dendrimère pour 0,5 u. g d'acide nucléique. Les cellules eucaryotes pouvant être transfectées selon l'utilisation conforme à l'invention sont les cellules humaines à traiter en fonction de la pathologie. Un autre objet de l'invention est un mélange de transfection de cellules eucaryotes par une séquence d'acide nucléique d'intérêt caractérisé par le fait qu'il comprend, dans un milieu physiologiquement acceptable : - au moins un dendrimère, - au moins un oligonucléotide à liaison phosphodiester, linéaire, comprenant de 20 à 60 bases, et - au moins ledit acide nucléique d'intérêt. Selon une variante de l'invention, ce mélange de transfection peut résulter du mélange : - d'au moins une composition A contenant des dendrimères en solution dans un milieu physiologiquement acceptable, et - d'au moins une composition B contenant les oligonucléotides et les acides nucléiques d'intérêt en solution dans un milieu physiologiquement acceptable. Selon cette variante, le mélange des compositions A et B devra être effectué 10 à 30 minutes avant l'emploi du mélange de transfection résultant. Selon l'invention, le milieu physiologiquement acceptable est de préférence constitué par une solution de chlorure de sodium à la concentration physiologique de 150 mM. Parmi ces mélanges de transfection, et lorsque les dendrimères utilisés sont sphériques, on préfère les mélanges comprenant de : a) de 5 à 7 ig de dendrimères, b) de 1 à 3 ug d'oligonucléotides, et c) de 0, 4 à 0, 6 ig d'acides nucléiques. Un mélange de transfection tout particulièrement préféré est constitué par une solution de : a) 6 pig de dendrimères sphériques, b) 1,5 g d'oligonucléotides, et c) 0,5 ug d'acides nucléiques, dans 150 u. l de chlorure de sodium 150 mM. Selon une autre forme de réalisation préférée de l'invention, et lorsque les dendrimères utilisés sont dénaturés thermiquement, on préfère les mélanges de transfection comprenant : a) 12 g de dendrimères, b) 2,5 ug d'oligonucléotides et c) 1 g d'acides nucléiques ; ou bien a) 6 g de dendrimères, b) 3 ug d'oligonucléotides et ZD c) 0, 5 ug d'acides nucléiques. Enfin l'invention a pour objet un procédé de transfection de cellules eucaryotes caractérisé par le fait qu'il consiste à mettre en contact lesdites cellules avec un mélange de transfection conforme à l'invention et tel que défini précédemment. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de transfection de cellules HeLa par un complexe plasmide/dendrimère en présence ou en l'absence d'oligonucléotide, ainsi qu'aux figures 1 à 5 qui représentent : - Figure 1 : le dendrimère 2- [G3] utilisé à l'exemple 1, - Figure 2 : le dendrimère 2- (G4) utilisé à l'exemple 1, - Figure 3 : le dendrimère 2 [G5] utilisé à l'exemple 1, - Figure 4a : l'activité ss-galactosidase (Unités Relatives de Luminescence : URL/g de protéine) exprimée en fonction des rapports plasmide/dendrimère, - Figure 4b : l'activité ss-galactosidase (URL/g de protéine) exprimée en fonction de la quantité d'ON36L en u. g, - Figure 5a : l'activité ss-galactosidase (URL/g de protéine) exprimée en fonction de différentes quantités de mélanges p ! asmide/ON36L/dendrimère, - la figure 5b : l'activité ss-galactosidase (URL/g de protéine) exprimée en fonction de différentes quantités de mélanges plasmide/dendrimère (sans oligonucléotide). Il doit être bien entendu toutefois que cet exemple est donné uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont il ne constitue en aucune manière une limitation. EXEMPLE : ÉTUDE COMPARATIVE DE LA TRANSFECTION DES CELLULES HeLa PAR LE PLASMIDE pCMVÇ-gal AVEC OU SANS OLIGONUCLÉOTIDE A) Matériel et méthode A-1) Produits chimiques Dendrimères utilisés : - le dendrimère dénaturé thermiquement vendu sous la dénomination SuperFect&commat; (3mg/ml) par la société Qiagen (Allemagne), (ou SU) ; - le dendrimère 2-[G3] tel que représenté à la figure 1, présentant ZD une masse moléculaire de 16 285, 041 g. mol'' (ou PG3) ; - le dendrimère 2-[G4] tel que représenté à la figure 2, présentant une masse moléculaire de 33 702, 337 g. mol'' (ou PG4) ; - le dendrimère 2-[G5] tel que représenté à la figure 3, présentant une masse moléculaire de 68 536,93 g. mol'' (ou PG5). Autre produit : - CPRG (rouge de chlorophénol-ss-D-galactopyranoside) vendu par la société Boeringher Mannheim A-2) Plasmide et oligonucléotides - plasmide pCMVp-gaI (Clontech) codant pour le gène de la ss-galactosidase, - oligonucléotide linéaire comprenant 36 bases (ON36L), correspondant à la SEQ ID n l : ACATCTTGACACCTTGACTCCCTATTGCCACTCCAC. Cet oligonucléotide a été synthétisé et purifié par Eurogentech. A-3) Lignée cellulaire et conditions de culture Des cellules HeLa (Human epitheloid carcinoma cells ; Institut Pasteur, Paris) ont été cultivées dans un milieu DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) contenant 10% de sérum de veau foetal (SVF) inactivé par un traitement à la chaleur à 57 C pendant 30 minutes (Gibco-BRL, Allemagne), de la streptomycine (100 g/ml) et de la pénicilline (100 U/ml). Les cellules ont été maintenues à 37 C en atmosphère humide à 5 % de COl. A 80 % de confluence, les cellules ont été détachées par traitement à la trypsine-EDTA (Gibco-BRL, Allemagne), puis cultivées à nouveau dans de nouveaux flacons de culture après une dilution au 115. A-4) Préparation des complexes dendrimères/plasmide Les quantités désirées de plasmide (à partir d'une solution aqueuse stock initiale à 0,4 mg/ml) et de dendrimères SU, PG3, PG4 et PGs (à partir de solution stock dans l'eau stérile) ont été diluées dans chacune 50 u. l d'une solution de NaCl 150 mM, vortexées doucement et centrifugées. La même procédure a été utilisée pour la préparation de solutions de 100 nul de l'ON 36L dans du NaCl 150 mM. Ont ainsi été préparées : des solutions de plasmide dans 50 ul de NaCl 150 mM, des solutions de chacun des dendrimères dans 50 u. l de NaCI 150 mM et des solutions identiques de l'ON 36L dans 100 nul de Nach 150 mM. Au bout de 5 minutes, les solutions contenant le plasmide ont été mélangées avec les solutions d'ON 36L. Au bout de 10 minutes, les solutions de dendrimères ont été ajoutées à chacun des mélanges plasmide/ON36L préparées précédemment, vortexées et incubées pendant 15 minutes à température ambiante. Ces solutions finales, renfermant le mélange plasmide/ON36L/dendrimère ont ensuite été immédiatement utilisées pour la transfection des cellules. A titre de comparatif, des solutions ne contenant pas d'ON36L, mais contenant seulement un mélange plasmide/dendrimère ont été préparées dans les mêmes conditions. A-5) Préparation des complexes dendrimères/plasmide Les cellules adhérentes ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits (TPP, Suisse), la veille de la transfection, de façon à atteindre 60-70 % de confluence le jour de la transfection. Toutes les expériences ont été réalisées en triple. Une demi-heure avant la transfection, les cellules ont été rincées avec 2 ml par puits de tampon phosphate (PBS) et 850 ul de milieu neuf ont été ajoutés dans chaque puits. 150 ul de solution contenant le mélange de transfection plasmide/ON36L/dendrimère ou le mélange plasmide/dendrimère à tester est ensuite ajouté dans chacun des puits. i Après 20 heures d'incubation à 37OC, les cellules ont été lavées deux fois avec 2 ml de PBS, puis l'expression du gène rapporteur a été testée. A-6) Mesure de l'activité ss-galactosidase 400 ul d'un tampon de lyse cellulaire (Promega) a été ajouté dans chacun des puits. Au bout de 20-25 minutes, le lysat cellulaire a été récolté et centrifugé à 14 000 tours par minute pendant 15 minutes à 4 cl. Pour effectuer la mesure de l'activité ss-galactosidase, 10-15nul de surnageant ont été mélangés avec 100 ni de tampon de réaction CPRG (4,5 ml/ml de CPRG, 80 mM de tampon phosphate à pH 7,4, 0,7 % de ss-mercaptoéthanol et 9 mM de MgCl2) dans des plaques de 96 puits qui ont été incubées pendant 20 à 40 minutes à 37Oc. La mesure de l'activité ss-galactosidase a été réalisée par lecture de l'absorption à 570 nm à l'aide d'un spectrophotomètre automatique (Dynatech Laboratories). La concentration en protéine totale de chaque lysat a été quantifiée par rapport à une courbe étalon effectuée pour la sérum albumine bovine (BSA). B) Résultats B-1) Détermination du rapport optimal plasmide/dendrimère Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 4a sur laquelle l'activité ss-galactosidase (URL/g de protéine) est exprimée en fonction des rapports plasmide/dendrimère. Différents rapports plasmide/dendrimère allant de 1/1 à 1/50 ont été testés, afin de déterminer quel était le rapport conduisant, en l'absence d'ON36L, aux meilleurs résultats de transfection. Ainsi que cela apparaît sur la figure 4a, le rapport optimal plasmide/dendrimère est compris entre 1/5 et 1/20. Toutes les expériences suivantes ont donc été réalisées dans un rapport d'environ 1/10 (0, 5 ig de plasmide pour 6 ug de ZD dendrimère). B-2) Détermination du rapport optimal plasmide/ON36L/dendrimère Les résultats obtenus sont reportés à la figure 4b sur laquelle l'activité ss-galactosidase (URL/g de protéine) est exprimée en fonction de la quantité d'ON36L en ug. Ces résultats montrent qu'avec un rapport plasmide/dendrimère d'environ 1/10, l'activité ss-galactosidase est fortement améliorée pour des quantités d'ON36L comprises entre 1 et 3 lug avec les dendrimères PG3 à Pug5, avec une activité maximale pour 1,5 jug d'ON36L. Ces résultats montrent également que la quantité optimale de plasmide à utiliser lorsque le dendrimère est le SuperFect&commat; est de l'ordre deter Ces résultats permettent donc de conclure que les quantités optimales d'ON36L et de dendrimère à utiliser pour 1 ag de plasmide sont respectivement de 1-3 u. g et de 12 g. B-3) Rôle de l'ON36L lors de la transfection L'activité ss-galactosidase de cellules transfectées par le complexe plasmide/dendrimère, en présence ou en l'absence de l'oligonucléotide, a été étudiée. Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 5a sur laquelle l'activité ss-galactosidase (URL/g de protéine) est exprimée en fonction des différentes quantités de plasmide, d'ON36L et de dendrimère utilisées, ainsi que sur la figure 5b sur laquelle l'activité ss-galactosidase (URL/g de protéine) est exprimée en fonction des différentes quantités de plasmide et de dendrimère utilisées. Ces résultats montrent que pour une quantité égale de plasmide et de dendrimère utilisée, la présence d'un oligonucléotide (dans les proportions relatives déterminées précédemment) permet de multiplier le rendement de transfection par un facteur variant entre 10 et plus de 100 environ. La même expérience réalisée sur des cellules NIH 3T3 a conduit à des résultats similaires. Par conséquent, l'utilisation d'oligonucléotides tels que définis selon la présente invention permet d'augmenter de manière très importante la capacité (ou rendement) qu'ont les complexes dendrimère/plasmide à transfecter des cellules cibles. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'au moins un oligonucléotide à liaison phosphodiester, linéaire, comprenant de 20 à 60 bases, dans un procédé de transfection de cellules eucaryotes in vitro par une séquence d'acide nucléique d'intérêt, lequel procédé mettant en oeuvre au moins un dendrimère et au moins un acide nucléique d'intérêt, pour améliorer la transfection desdites cellules. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que les dendrimères sont sphériques ou dénaturés par un traitement thermique. 3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée par le fait que les dendrimères dénaturés thermiquement sont choisis parmi les dendrimères de type polyamidoamine, de cinquième à dixième génération, dans lesquels le noyau central est un ammonium ou une éthylènediamine. 4. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée par le fait que les dendrimères sphériques sont choisis parmi les dendrimères phosphorés polycationiques constitués : - d'une couche centrale sous la forme d'un noyau central Po comprenant de 2 à 8 groupements fonctionnalisés, - de n couches intermédiaires, identiques ou différentes, chacune desdites couches intermédiaires étant constituée d'unités PI répondant à la formule (I) suivante : dans laquelle : L est un atome d'oxygène, de phosphore ou de soufre, M représente l'un des groupes suivants : . un groupe aromatique di-, tri-ou tétrasubstitué par des groupes alkyles, des groupes alcoxy, des groupement insaturés du type oléfinique en CI-CI2, azoïques, c acétylénique, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de c phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, ou . un groupe alkyle ou alcoxy comportant plusieurs substituants tels que définis lorsque M est un groupe aromatique, RI et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, de soufre, d'azote ou des halogènes avec R2 étant le plus souvent différent de RI, n est un nombre entier compris entre 1 et 11, E est un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote, ledit atome d'azote pouvant être lié à un groupe alkyle, alcoxy ou aryle, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, - une couche externe constituée d'unités P2, identiques ou différentes, et répondant à la formule II suivante : dans laquelle : Rs représente un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, W représente l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, tous ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, R3 et R4, identiques ou différents, représentent un groupe alkyle en C.-C5, X représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en CI-C5 ou est absent, et Z représente un ion halogénure, un groupe alkylCOO'ou tout autre groupement anionique comportant des atomes de carbone, d'oxygène, de soufre, d'azote, de phosphore ou d'halogène ou est absent. 5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée par le fait que le noyau central Po de ces dendrimères est sélectionné dans le groupe constitué par le ZD groupement de formule générale ma : zz et le groupement de formule générale IIIb : la formule 1 représente le groupe suivant : ZD R2 1 0 CH=N-N-P X \ : y s S et le groupe de formule II est notamment le groupe suivant : avecp= 1 à 5. 6. Utilisation selon la revendication 4 ou 5, caractérisée par le fait que les dendrimères sont choisis parmi les composés contenant : - des unités terminales de formule II, dans lesquelles X représente un atome d'hydrogène, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyles, Z est un ion chlorure et n est un nombre entier compris entre 1 et 11 ; ou bien - des unités terminales de formule II, dans lesquelles X est vide, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyles, Z est vide et n est un nombre entier compris entre 1 et 11 ; ou bien - des unités terminales de formule II, dans lesquelles X représente un groupe méthyle, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyles, Z est un ion iodure et n est un nombre entier compris entre 1 et 11 ; ou bien - des unités terminales de formule II, dans lesquelles X représente un groupe méthyle, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyles, Z est un groupe CH3COO-et n est un nombre entier compris entre 1 et 11. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée par le fait que les dendrimères sont choisis parmi les composés contenant des unités terminales de formule II, dans lesquelles X représente un atome d'hydrogène, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyles, Z est un ion chlorure et n est un nombre entier compris entre 1 et 11. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que les dendrimères sont sphériques et que l'oligonucléotide comprend de 20 à 40 bases. 9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée par le fait que l'oligonucléotide comprend 36 bases. 10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée par le fait que les dendrimères sont dénaturés thermiquement et que l'oligonucléotide comprend de 45 à 55 bases. Il. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que le rapport pondéral acide nucléique/oligonucléotide/dendrimère varie entre 0, 5/2/10 et 1/6/14. 12. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée par le fait que le dendrimère utilisé est sphérique et que pour 1 ig d'acide nucléique à transfecter, on utilise de 2 à 6 ig d'ON et de 10 à 14 ig de dendrimère. 13. Utilisation selon la revendication 11, caractérisé par le fait que le dendrimère utilisé est dénaturé thermiquement, et que l'on utilise : - 2, 5 ig d'oligonucléotide pour 1 ug d'acide nucléique et 12 ug de dendrimère ou bien - 3 u. g d'oligonucléotide pour 0, 5 ug d'acide nucléique et 6 ig de dendrimère. 14. Mélange de transfection de cellules eucaryotes par une séquence d'acide nucléique d'intérêt, caractérisé par le fait qu'il comprend, dans un milieu physiologiquement acceptable : - au moins un dendrimère, - au moins un oligonucléotide à liaison phosphodiester, linéaire, comprenant de 20 à 60 bases, et - au moins ledit acide nucléique d'intérêt. 15. Mélange de transfection selon la revendication 14, caractérisé par le fait qu'il résulte du mélange : - d'au moins une composition A contenant des dendrimères en solution dans un milieu physiologiquement acceptable, et - d'au moins une composition B contenant lesdits oligonucléotides et les acides nucléiques d'intérêt en solution dans un milieu physiologiquement acceptable. 16. Mélange de transfection selon la revendication 14 ou 15, caractérisé par le fait que le milieu physiologiquement acceptable est constitué par une solution de chlorure de sodium à la concentration physiologique de 150 mM. 17. Mélange de transfection selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisé par le fait qu'il comprend : a) de 5 à 7 u. g de dendrimères sphériques, b) de 1 à 3 ug d'oligonuclëotides, et c) de 0, 4 à 0, 6 pig d'acides nucléiques. 18. Mélange de transfection selon la revendication 17, caractérisé par le fait qu'il est constitué par une solution de : a) 6 g de dendrimères sphériques, b) 1, 5 ug d'oligonucléotides, et c) 0,5 ug d'acides nucléiques, dans 150 u. I de chlorure de sodium 150 mM. 19. Mélange de transfection selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisé par le fait qu'il comprend : a) 12 ug de dendrimères dénaturés thermiquement, b) 2, 5 ig d'oligonucléotides et c) 1 ug d'acides nucléiques ; ou bien a) 6 ig de dendrimères dénaturés thermiquement, b) 3 ug d'oiigonucléotides et c) 0,5 g d'acides nucléiques. 20. Procédé de transfection de cellules eucaryotes in vitro caractérisé par le fait qu'il consiste à mettre en contact lesdites cellules avec un mélange de transfection tel que défini à l'une quelconque des revendications 14 à 19.