Brevet FR2819266A1 — publié le 20020712

La présente invention concerne un milieu de culture chromogène destiné à mettre en évidence les bactéries du genre Listeria, notamment Listeria monocytogenes. Tant dans le domaine clinique que dans le domaine agro-alimentaire, la recherche de Listeria, et en particulier de Listeria monocytogenes est de plus en plus importante, car ces bactéries sont souvent disséminées dans des produits agroalimentaires et conduisent à des infections graves chez les patients sensibles (femmes enceintes, personnes âgées, etc...). De fait, depuis quelques années, les gouvernements mettent en place des réseaux de surveillance de plus en plus stricts, notamment pour les produits de l'industrie agro-alimentaire. Ainsi, on observe une généralisation de la surveillance épidémiologique de Listeria monocytogenes. Il est donc important de disposer d'un test fiable et rapide permettant de détecter les contaminations par ces bactéries, lequel test devant être à la fois sensible et spécifique. Il existe aujourd'hui certains milieux de culture pour la détection de Listeria tels le PALCAM ou le milieu OXFORD plus ou moins sélectifs qui permettent de détecter la présence de Listeria dans des échantillons. Les résultats obtenus en utilisant ces milieux peuvent présenter certaines imprécisions impliquant la nécessité d'effectuer d'autres tests pour confirmer la présence de L. monocytogenes. Ces milieux reposent en effet sur une combinaison d'antimicrobiens apportant une sélectivité et la détection d'enzymes apportant une spécificité. Toutefois, à la fois la sélectivité et la spécificité de ces milieux peuvent être améliorées, car ils conduisent en particulier à la présence de nombreux faux positifs ou faux négatifs. Un désavantage de ces milieux est qu'ils ne permettent pas la distinction de l'espèce L. monocytogenes. Il existe aussi des milieux qui incluent un test reposant sur la détection de phospholipases pour détecter directement L. monocytogenes par une coloration spécifique de la colonie ou par un halo spécifique entourant la colonie. Toutefois, ces tests sont aussi positifs pour L. ivanovii, qui présente également un caractère phospholipase +. Il était suggéré de différentier L. monocytogenes de L. ivanovii dans une étape d'identification suivant l'étape d'isolement, en utilisant notamment un test basé sur une différence dans un phénotype aminopeptidase . Aux fins de différentiation de L. monocytogenes de L. ivanovii, la présente invention se base sur la détection de l'alpha mannosidase, un caractère positif pour L. monocytogenes et négatif pour L. ivanovii. Ce caractère peut par exemple être révélé sur des cultures pures à l'aide du substrat enzymatique nitrophényl-a- mannoside, qui est incolore et qui libère un nitrophényl coloré en jaune lorsque le test est positif. La présente invention démontre que l'on peut révéler l'a-mannosidase au niveau des colonies sur milieu solide en détectant l'a-mannosidase, avec un substrat chromogène ou fluorogène dans le milieu solide. L'utilisation d'un substrat de l'amannosidase dans un milieu solide, décrite pour la première fois dans la présente demande, présente notamment l'avantage de préparer des milieux solides où l'on peut différentier dès l'isolement, sans avoir à effectuer de tests supplémentaires, L. monocytogenes de L. ivanovii. Ainsi, la présente invention concerne un nouveau milieu de culture, pour la détection et/ou la discrimination de bactéries du genre Listeria, caractérisé en ce qu'il comporte, dans un milieu de culture de Listeria, au moins un agent spécifique d'identification de l'a-mannosidase utilisable en milieu solide. Ledit agent spécifique d'identification de l'a-mannosidase utilisable en milieu solide est de préférence un agent chromogène ou fluorogène choisi parmi les substrats de l'a- mannosidase. L'agent chromogène substrat de l'a-mannosidase comprend de préférence un chromophore précipitable, qui est libéré par l'hydrolyse du substrat par son enzyme. Ainsi, la colonie bactérienne se colore en fonction du chromophore libéré, le chromophore libéré étant solide dans le milieu de culture, et restant donc localisé au niveau de la colonie où il a été libéré. De façon préférée, ledit chromophore est choisi parmi les dérivés indoxyle, halogéno-indoxyle (bromo-indoxyle, chloro-indoxyle, fluoro-indoxyle, iodoindoxyle, dichloro-indoxyle, chloro-bromo-indoxyle, tri-chloro-indoxyle), le méthyl-indoxyle, ou hydroxy-quinoline. Des dérivés préférés sont choisis en particulier parmi les dérivés suivants : 6-chloro-indoxyle, 5-bromo-indoxyle, 3bromo-indoxyle, 6-fluoro-indoxyle, 5-iodo-indoxyle, 4, 6-dichloro-indoxyle, 6, 7- dichloro-indoxyle, 5-bromo-4-chloro-indoxyle, 5-bromo-6-chloro-indoxyle, 4,6, 7trichloro-indoxyle, N-méthyl-indoxyle et 8-hydroxy-quinoline. Lorsque l'on couple ledit substrat de l'a-mannosidase à un fluorophore, on utilise de préférence le 4-méthyl umbelliféryl. De façon préférée, le substrat de da-mannosidase est l'indoxyl-amannoside. La concentration de l'agent chromogène dans le milieu est comprise entre environ 0, 01 et 0,5 g/1. Une concentration préférée est 0,05 g/l. Il peut également être intéressant de rajouter un activateur de réaction colorée, dans le milieu, afin d'améliorer la qualité de la réaction observée. Un activateur approprié pour un tel usage est le méthyl-a-mannoside, qui est intégré au milieu à une concentration comprise entre environ 0, 01 et 0,5 g/l, de préférence 0,25 g/l. Le milieu selon la présente invention permet ainsi de détecter L. monocytogenes, et de discriminer cette bactérie par rapport à L. ivanovii, sans effectuer de test supplémentaire. Afin d'optimiser les résultats donnés par le milieu selon l'invention, il peut être intéressant de rajouter des facteurs sélectifs pour Listeria, ainsi qu'utilisée dans les milieux de l'art antérieur. On obtient donc un milieu spécifique pour L. monocytogenes. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un milieu milieu de culture selon l'invention pour la détection et/ou la discrimination des bactéries du genre Listeria, notamment L. monocytogenes. La présente invention a également pour objet un procédé de détection et/ou de discrimination des bactéries du genre Listeria dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. inoculer un milieu de culture selon l'invention avec ledit échantillon ou un inoculum dérivé de l'échantillon, b. détecter la présence de bactéries du genre Listeria sur ledit milieu de culture, c. de façon optionnelle, différentier L. monocytogenes, de L. ivanovii et des autres Listeria présentes sur ledit milieu de culture. EXEMPLES Exemple 1 Un milieu préféré pour la mise en oeuvre de l'invention comprend (pour un litre) : Agar log - Infusion de cervelle de veau 12,5 g - Protéose peptone lOg - Infusion de coeur de boeuf 5 g - Chlorure de sodium 5 g - Na2HP04 4 g - KH2PO4 2 g - Glucose 2 g - Chlorure de Lithium 7,5 g - Lécithine 3 g - Ofloxacine 0,0004 g - Colistine 0, 015 g - Ceftazidime 0, 0134 g - Méthyl-a-mannoside 0,25 g - Indoxyl-o.-mannoside 0,05 g Exemple 2 L'étalement de bactéries le milieu selon l'invention a donné les résultats suivants (24 heures d'incubation à 37 C). Halo Centre des colonies L. monocytogenes blanc bleu L. ivanovii blanc incolore Autres Listeria pas de halt-- L'utilisation du milieu selon l'invention permet donc de détecter et discriminer L. monocytogenes, L. ivanovii, et les autres espèces de Listeria. Revendications 1. Milieu de culture pour la détection et/ou la discrimination de bactéries du genre Listeria, caractérisé en ce qu'il comporte, dans un milieu de culture de Listeria, au moins un agent spécifique d'identification de l'a-mannosidase utilisable en milieu solide. 2. Milieu de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce ledit agent spécifique d'identification de l'a-mannosidase utilisable en milieu solide est un agent chromogène ou fluorogène choisi parmi les substrats de l'a-mannosidase. 3. Milieu de culture selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit agent chromogène libère, par hydrolyse, un chromophore précipitable choisi parmi les dérivés indoxyle, halogéno-indoxyle (bromo-indoxyle, chloro-indoxyle, fluoro- indoxyle, iodo-indoxyle, dichloro-indoxyle, chloro-bromo-indoxyle, tri-chloro- indoxyle), méthyl-indoxyle, ou hydroxy-quinoline, en particulier les dérivés suivants : 6-chloro-indoxyle, 5-bromo-indoxyle, 3-bromo-indoxyle, 6-fluoro- indoxyle, 5-iodo-indoxyle, 4,6-dichloro-indoxyle, 6,7-dichloro-indoxyle, 5- bromo-4-chloro-indoxyle, 5-bromo-6-chloro-indoxyle, 4,6, 7-trichloro-indoxyle, N-méthyl-indoxyle ou 8-hydoxy-quinoline. 4. Milieu de culture selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent fluorophore lié au substrat de l'a-mannosidase est le 4-méthyl umbelliféryl. 5. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit milieu contient également un activateur de réaction colorée. 6. Milieu de culture selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit activateur est le méthyl-a-mannoside. 7. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte en outre des facteurs sélectifs pour Listeria. 8. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le substrat de l'a-mannosidase est l'indoxyl-a-mannoside. 9. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend (pour un litre) : - Agar 10 g - Infusion de cervelle de veau 12,5 g - Protéose peptone 10g - Infusion de coeur de boeuf 5 g - Chlorure de sodium 5 g - Na2HP04 4 g - KH2PO4 2 g - Glucose 2 g - Chlorure de Lithium 7,5 g - Lécithine 3 g - Ofloxacine 0,0004 g - Colistine 0, 015 g - Ceftazidime 0, 0134 g - Méthyl-a-mannoside 0,25 g - Indoxyl- (x-mannoside 0,05 g 10. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il est spécifique de L. monocytogenes. 11. Utilisation d'un milieu de culture tel que défini dans l'une des revendications 1 à 10 pour la détection et/ou la discrimination des bactéries du genre Listeria. 12. Procédé de détection et/ou discrimination des bactéries du genre Listeria dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : a. inoculer un milieu de culture tel que défini dans l'une des revendications 1 à 10 avec ledit échantillon ou un inoculum dérivé de l'échantillon, b. détecter la présence de bactéries du genre Listeria sur ledit milieu de culture, c. de façon optionnelle, différentier L. monocytogenes de L. ivanovii et des autres Listeria présentes sur ledit milieu de culture.