Brevet FR2810985A1 — publié le 20020104

PEPTIDES LINEAIRES AMPHIPATHIQUES ET LES COMPOSITIONS LES CONTENANT. La présente invention concerne des peptides linéaires et leur utilisation pour vectoriser des substances actives. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à des peptides linéaires fortement amphipatiques dérivés de peptides antibiotiques ou de leurs analogues. L'invention a aussi pour objet de nouveaux composés formés d'un peptide linéaire amphipathique lié à au moins une substance active, ainsi que la préparation de ces composés et les compositions les contenant. Le problème de l'entrée dans les cellules vivantes de différentes substances dotées de propriétés pharmacologiques revêt un grand intérêt tant pour la recherche que pour des utilisations thérapeutiques ou diagnostiques. Une des priorités des travaux dans ce domaine est de trouver des moyens efficaces pour augmenter l'efficacité de pénétration des substances actives, qu'il s'agisse de molécules conventionnelles, que de peptides, protéines, ou encore acides nucléiques comme les oligonucléotides dans les cellules vivantes. Plusieurs stratégies sont proposées pour permettre ou augmenter le passage de ces substances à travers la membrane des cellules. Parmi celles-ci, la Demanderesse a développé un système de transport de substances actives à travers la membrane des cellules mettant en oeuvre des peptides vecteurs. Cette stratégie de vectorisation offre de nombreux avantages, car le peptide vecteur peut être synthétisé par voie chimique, et la plupart des substances actives citées ci-dessus peuvent être couplées au vecteur de façon simple et efficace. Les protégrine et tachyplésine sont des peptides naturels dont la structure est de type épingle à cheveux maintenue par des ponts disulfures. Ces ponts jouent un rôle important dans l'activité cytolytique observée sur cellules humaines. Les travaux de recherche réalisées par la Demanderesse sur ces peptides lui ont permis de découvrir qu'une réduction irréversible de ces ponts disulfures permet de générer des peptides linéaires qui ont la propriété de passer rapidement au travers des membranes cellulaires. Ces peptides linéaires et leur utilisation comme vecteur pour des substances actives sont décrits dans la demande de brevet internationale PCT publiée sous le No. W099/07728. La Demanderesse a maintenant cherché à définir de nouvelles séquences d'acides aminés capables de servir de vecteur d'internalisation et d'adressage de substances actives, et dans ce but plusieurs peptides présentant des propriétés physico-chimiques améliorées ont été synthétisés. L'invention a donc pour objet un peptide linéaire contenant ou constitué par un dérivé d'un peptide antibiotique par : - modification des résidus cystéines de façon à ce que ledit peptide soit dépourvu de pont disulfure, - substitution de 1 à 18 et de préférence de 1 à 6 acides aminés, et/ou permutation d'au moins une paire d'acide aminé, lesdites substitutions et/ou permutation étant telles que ledit peptide présente un caractère amphipatique. On entend par peptides antibiotiques, des peptides de plus de 5 à 7 acides aminés présentant une activité cytolytique sur des cellules humaines ou animales. Il s'agit de peptides d'origine naturelle ou de peptides de synthèse et de fragments de ceux-ci. L'invention envisage tout particulièrement des peptides dérivés de protégrine et de tachyplésine, un analogue ou un fragment de ceux-ci. Les peptides de l'invention sont dépourvus de pont disulfure comme ceux décrits par exemple dans la demande de brevet internationale PCT publiée sous le No. W099/07728. L'absence de ponts disulfures dans les peptides de l'invention peut être obtenue par toute technique connue de l'homme du métier et notamment en supprimant ou en remplaçant par d'autres acides aminés les résidus de cystéines ou en bloquant les groupes-SH de façon à ce qu'ils ne forment plus de pont disulfure. Le caractère amphiphatique des peptides de l'invention a été exprimé par la valeur de l'hydrophobicité moyenne par résidu et le moment d'hydrophobicité hélicoïdal [alpha]. Avantageusement, les peptides de l'invention présentent : - une hydrophobicité moyenne par résidu comprise entre 0,15 et 0,7 ; - un moment d'hydrophobicité hélicoïdal [alpha] supérieur à 0,15 ; - un moment d' hydrophobicité bêta ss supérieur à 0. Les travaux de recherche effectués dans le cadre de la présente invention ont en effet concerné trois paramètres permettant d'orienter la conception de séquences primaires à partir de séquences de référence (Eisenberg et al., 1982 ; The helical hydrophobic moment : a mesure of the amphilicity of helix. Nature 299, 371-374). Les trois paramètres choisis ont été les suivants : - l'hydrophobicité moyenne par résidu, - le moment d'hydrophobicité hélicoïdale, - le moment d'hydrophobicité bêta. L'hydrophobicité moyenne par résidu est une mesure du caractère apolaire d'un peptide. La quantification de l'hydrophobicité d'un peptide s'effectue par sommation de la contribution de chaque résidu à cette hydrophobicité suivant la formule : dans laquelle, H correspond à l'hydrophobicité moyenne par résidu, N représente le nombre de résidu, Hn représente l'indice d'hydrophobicité du résidu n. L'échelle d'hydrophobicité utilisée est celle de Fauchète et Pliska (1983, Eur. J. Med. Chem 18. 369-375). La sommation s'effectue sur tous les résidus de l'hélice (de n = 1 à N). Le moment d'hydrophobicité hélicoïdale a permet de quantifier le caractère plus ou moins amphiphile d'une l'hélice a suivant la formule : dans laquelle, H correspond à l'indice d'hydrophobicité du résidu n, et 8 correspond à l'angle entre 2 résidus successifs (100 pour une hélice a) . A chaque acide aminé, il est assigné un vecteur dont la direction correspond à la droite reliant le centre de la roue à sa position sur cette roue. La norme de ce vecteur est égale à l'indice d'hydrophobicité de l'acide aminé. Le sens du vecteur va du centre vers l'acide aminé si l'acide aminé est hydrophobe (valeur positive dans l'échelle d'hydrophobicité) et de l'acide aminé vers le centre si l'acide aminé est polaire (valeur négative dans l'échelle d'hydrophobicité). Le moment d'hydrophobicité par acide aminé de l'hélice amphiphile est égal à la norme du vecteur résultant de la sommation de tous ces vecteurs, divisés par le nombre d'acides aminés de l'hélice. La sommation s'effectue sur tous les résidus de l'hélice (de n = 1 à N). Le vecteur résultant pointe dans la direction de la zone la plus hydrophobe de la roue. Le moment d'hydrophobicité bêta ss correspond au moment d'hydrophobicité d'un peptide qui adopterait une structure en feuillet ss. Le moment d'hydrophobicité bêta est calculé comme le paramètre amais avec dans ce cas, #, qui correspond à l'angle entre 2 résidus successifs, est égal à 180 . L'étude des trois paramètres ci-dessus a été appliqué à trois peptides de référence : - deux peptides dérivés de protégrine désignés SynBl et SynB3, - un peptide dérivé de tachyplésine désigné SynB4. Les substitutions d'acides aminés réalisées sur les peptides SynBl, SynB3 et SynB4 rapportés ci-après ont permis d'identifier les modifications de séquences conduisant à des peptides fortement amphipatiques. L'invention se rapporte tout particulièrement à un peptide comprenant ou constitué par un dérivé d'un peptide dont la séquence en acides aminés est : 1 5 10 15 18 -RGGRLSYSRRRFSTSTGR 1 5 10 -RRLSYSRRRF 1 5 10 15 17 -AWSFRVSYRGISYRRSR - ou un fragment de celles-ci constitué d'au moins cinq et de préférence d'au moins sept acides aminés successifs, par substitution de 1 à 18 et de préférence de 1 à 6 acides aminés, et/ou permutation d'au moins une paire d'acide aminé, lesdites substitutions et/ou permutation étant telles que ledit peptide présente un caractère amphipatique. Dans les séquences peptidiques rapportées ciaprès, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre, mais ils peuvent être aussi représentés par leur code à trois lettres selon la nomenclature ci-dessous. A Ala alanine C Cys cystéine D Asp acide aspartique E Glu acide glutamique F Phe phénylalanine G Gly glycine H His histidine I Ile isoleucine K Lys lysine L Leu leucine M Met méthionine N Asn ' asparagine P Pro proline Q Gln glutamine R Arg arginine S Ser sérine T Thr thréonine V Val valine W Trp tryptophane Y Tyr tyrosine 1) Mutation du peptide SynBl. 1. 1) Augmentation de l'hydrophobicité de SynB1. Les mutations suivantes augmentent le paramètre , c'est à dire l'hydrophobicité moyenne par résidus : - la mutation d'au moins un des résidus en position 6,8, 13,14, 15,16 par un acide aminé hydrophobe, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Trp, - éventuellement la mutation d'au moins un autre résidu, de préférence le résidu Phe en position 12, par un résidu Tyr ou Trp donnant un signal spectroscopique et permettant le dosage du peptide. Le tableau 1 ci-dessous rapporte des mutations permettant d'augmenter l'hydrophobicité de SynBl et donne des exemples de peptides selon l'invention dérivés de SynBl. Tableau 1 [alpha] SynBl R G G R L S Y S R R R F S T S T G R -0, 069 0, 18 A A W A A A A I I I I I I L L L L L L V V V V V V F F F F F F W W W W W W SM3979 R G G R L A Y L R R R W A V L V G R 0, 295 0,27 SM3980 R G G R L V Y V R R R W V V V V G R 0,343 0,25 PG-4L R G G R L L Y L R R R W L V L V G R 0,45 0,27 PG-4A R G G R L A Y A R R R F A V A V G R 0,115 0,2 PG-AFL1 R G G R L V Y L R R R F A F L I G R 0,384 0, 23 1. 2) Augmentation de l'amphipathicité de SynBl. Les mutations ci-dessous augmentent les paramètres et a, c'est à dire l'hydrophobicité moyenne par résidu et l'amphipathicité hélicoïdale moyenne par résidu : la permutation d'au moins une paire des résidus en position 3 et 5, en position 10 et 12, et en position 16 et 17, - la mutation d'au moins un des résidus en position 6,13, 14 et 16 par un acide aminé hydrophobe, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Trp, - éventuellement la mutation d'au moins un autre résidu, de préférence le résidu Phe en position 12, par un résidu Tyr ou Trp donnant un signal spectroscopique et permettant le dosage du peptide, - éventuellement la mutation du résidu en position 3 par un acide aminé hydrophobe, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ile, Leu, Val, Phe, Trp. Le tableau 2 ci-dessous rapporte les mutations permettant d'augmenter l'amphipathicité de SynBl et donne des exemples de peptides selon l'invention dérivés de SynBl. Tableau 2 [alpha] SynBl R G G R L S Y S R R R F S T S T G R -0, 069 0,18 A-Synbl R G L R G S Y S R F R R S T S T G R -0, 069 0,37 V A W A A A I V V V V FI III W L L L L F F F F W W W W A-PG-3L R G L R G L Y L R F R R L V S V G R 0, 327 0,43 A-PG-IL R G L R G L Y F R F R R I L S V G R 0,364 0,45 A-PG-4LF R G I R G L Y L R W R R L L S F G R 0, 417 0,47 A-PG-3-LF R G F R G L Y L R W R R L V S V G R 0,359 0,46 Dans le tableau 2 ci-dessus, le peptide A-Synbl est un dérivé de SynBl dans lequel les paires d'acides aminés en position 3 et 5, en position 10 et 12 et en position 16 et 17 ont été permutées. 2) Mutation du peptide SvnB3. 2. 1) Augmentation de l'hydrophobicité de SynB3. Les mutations suivantes augmentent le paramètre , c'est à dire l'hydrophobicité moyenne par résidus : - la mutation simultanée des résidus en position 4 et 6 ou la mutation simultanée des résidus en position 4,5 et 6 par des acides aminés hydrophobes, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, lieu, Leu, Val, Phe, Trp, - éventuellement, la mutation d'un moins un autre résidu, de préférence le résidu Phe en position 10, par un résidu Tyr ou Trp donnant un signal spectroscopique et permettant le dosage du peptide. Le tableau 3 ci-dessous rapporte des mutations permettant d'augmenter l'hydrophobicité de SynB3 et donne des exemples de peptides selon l'invention dérivés de SynB3. Tableau 3 [alpha] $ ss S B3 R R L S Y S R R R F -0,068 0,42 0 01 A A A III L L L V V V F F F W W W SM4287 R R L W Y L R R R F 0,335 0,46 0,40 SM4288 R R L W L L R R R F 0,409 0,39 0,34 2. 2) Augmentation de l'amphipathicité hélicoïdale par résidu a de SynB3. Les mutations suivantes permettent d'augmenter le paramètre et oc du peptide SynB3, c'est à dire l'hydrophobicité moyenne par résidu et l'amphipathicité hélicoïdale moyenne par résidu de ce peptide : - la permutation des résidus en position 5 et 7 et la mutation simultanée, sur la séquence résultant de la permutation, des résidus en position 4 et 6 ou des résidus en position 4,6 et 7 par des acides aminés hydrophobes de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, Ileu, Leu, Val, Phe et Trp, - éventuellement, la mutation d'un moins un autre résidu, de préférence le résidu Phe en position 10, par un résidu Tyr ou Trp donnant un signal spectroscopique et permettant le dosage du peptide. Le tableau 4 ci-dessous rapporte des mutations permettant d'augmenter l'hydrophobicité moyenne par résidu et l'amphipathicité hélicoïdale moyenne par résidu de SynB3 et donne des exemples de peptides selon l'invention dérivés de SynB3. Tableau 4 [alpha] ss SynB3 R R L S Y S R R R F -0, 068 0,42 0,01 A A A I I I L L L V V V F F F w ww w~~~~~~~~~~~~~~~~~ SM4289 R R L W R L Y R R F 0,335 0,82 0,4 SM4290 R R L W R L L R R F 0,409 0,88 0,34 2.3) Augmentation de l'amphipathicité bêta ss de SvnB3. Les mutations suivantes permettent d'augmenter le paramètre et ss du peptide SynB3, c'est à dire l'hydrophobicité moyenne par résidus et l'amphipathicité bêta moyenne par résidu ss de ce peptide : - la permutation des résidus en position 2 et 3 et la permutation des résidus en position 5 et 8, et sur la séquence résultant de la permutation, la mutation simultanée des résidus en position 4 et 6 ou la mutation simultanée des résidus en position 4,6 et 8 par des acides aminés hydrophobes de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, Ileu, Leu, Val, Phe et Trp, éventuellement, la mutation d'un moins un autre résidu, de préférence le résidu Phe en position 10, par un résidu Tyr ou Trp donnant un signal spectroscopique et permettant le dosage du peptide. Le tableau 5 ci-dessous rapporte des mutations permettant d'augmenter le paramètre et ss du peptide SynB3 et donne des exemples de peptides selon l'invention dérivés de SynB3. Tableau 5 [alpha] ss SynB3 R R L S Y S R R R F -0,068 0,42 0,01 R L R S R S R Y R F A A A I I I L L L V V V F F F W W W SM4291 R L R W R L R Y R F 0,335 0,35 1,1 SM4292 R L R W R L R L R F 0,409 0 36 1,1 3) Mutation du peptide SynB4. 3.1) Augmentation de l'hydrophobicité de SynB3. Les mutations suivantes augmentent le paramètre , c'est à dire l'hydrophobicité moyenne par résidus : - la mutation simultanée des résidus en position 3,7,12,16 par des acides aminés hydrophobes de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, lieu, Leu, Val, Phe et Trp. Le tableau 6 ci-dessous rapporte des mutations permettant d'augmenter l'hydrophobicité de SynB4 et donne des exemples de peptides selon l'invention dérivés de SynB4. Tableau 6 [alpha] SynB4 A W S F R V S Y R G I S Y R R S R 0,24 0,047 A A A A I I I I L L L L V V V V F F F F W W W W SynB4-4A A W A F R V A Y R G I A Y R R A R 0, 32 0, 047 SynB4-2AL A W L F R V A Y R G I L Y R R A R 0,49 0,047 SynB4-FALF A W F F R V A Y R G I L Y R R F R 0,58 0,086 3. 2) Auamentation de l'amphipathicité de SynB4. Les mutations ci-dessous augmentent les paramètres et [alpha], c'est à dire l'hydrophobicité moyenne par résidu et l'amphipathicité hélicoïdale moyenne par résidu : - une permutation des résidus en position 12 et 14, des résidus en position 16 et 17 et une mutation simultanée des résidus en position 3,7, 14 et 17 par des acides aminés hydrophobes de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, lieu, Leu, Val, Phe et Trp. Le tableau 7 ci-dessous rapporte des mutations permettant d'augmenter les paramètres et (X, c'est à dire l'hydrophobicité moyenne par résidus et l'amphipathicité hélicoïdale moyenne par résidu, de SynB4 et donne des exemples de peptides selon l'invention dérivés de SynB4. Tableau 7 [alpha] SynB4 A W S F R V S Y R G I S Y R R S R 0,24 0, 047 aSynB4~~~~~,AW S F RVSYR G 1 R Y S RR S 0, 24 0, 18 A A A A V V V V I I I I L L L L F F F F W W W W aSynB4-2AL A W A F R V L Y R G I R Y L R R A, 0, 49 0, 41 aSynB4-IVFA A W I F R V V Y R G I R Y F R R A 0,55 0,48 aSynB4-FIIL A W F F R V I Y R G I R Y I R R L 0,67 0, 55 Dans le tableau 7, aSynB4 est un peptide obtenu par une permutation des résidus en position 12 et 14 et des résidus en position 16 et 17 L'invention concerne aussi un peptide linéaire contenant ou constitué par un dérivé d'un peptide antibiotique par : - modification des résidus cystéines de façon à ce que ledit peptide soit dépourvu de pont disulfure, - substitution d'une ou plusieurs arginines par la citrulline ou l'ornithine. En effet, la substitution des arginines par des citrullines ou des ornithines permet de diminuer la toxicité éventuelle du peptide résultant du caractère cationique de l'arginine. Il est ainsi possible d'utiliser une plus grande quantité de vecteur peptidique. Toutefois, avantageusement selon la taille et le nombre d'arginine dans le peptide antibiotique d'origine, les peptides de l'invention comprennent au mois encore une, de préférence au moins encore deux et tout préférentiellement au moins encore trois arginines. A titre d'exemple, de peptide selon l'invention dont une ou plusieurs arginines sont remplacés par des citrullines (Cit), on peut citer les dérivés de SynBl, SynB3 et SynB4 du tableau 8 ci-dessous. Tableau 8 SynBl R G G R L S Y S R R R F S T S T G R SynB1/2Cit R G G R L S Y S Cit Cit R F S T S T G R synB1/3Cit R G G R L S Y S Cit Cit Cit F S T S T G R SM3979 R G G R L A Y L R R R W A V L V G R SM3979/2Cit R G G R L A Y L Cit Cit R W A V L V G R SM3979/3Cit R G G R L A Y L Cit Cit Cit W A V L V G R SM3980 R G G R L V Y V R R R W V V V V G R SM3980/2Cit R G G R L V Y V Cit Cit R W V V V V G R SM3980/3Cit R G G R L V Y V Cit Cit Cit W V V V V G R SynB3 R R L S Y S R R R F SynB3/2Cit R R L S Y S Cit Cit R F SynB3/3CitA R R L S Y S Cit Cit Cit F SynB3/3CitB 'R Cit L S Y S Cit Cit R F SM4289 R R L W R L Y R R F SM4289/2Cit R R L W R L Y Cit Cit F SM4289/3Cit R Cit L W R L Y Cit Cit F SM4290 R R L W R L L R R F SM4290/2Cit R R L W R L L Cit Cit F SM4290/3Cit R Cit L W R L L Cit Cit F SynB4 A W S F R V S Y R G I S Y R R S R SynB4/2Cit A W S F R V S Y R G I S Y Cit Cit S R SynB4/3Cit A W S F Cit V S Y R G I S Y Cit Cit S R SynB4-FALF A W F F R V A Y R G I L Y R R F R SynB4-FALF/2Cit A W F F R V A Y R G I L Y Cit Cit F R SynB4-FALF/3Cit A W F F Cit V A Y R G I L Y Cit Cit F R Les peptides de l'invention peuvent être préparés par synthèse chimique ou par génie génétique, ils peuvent être sous forme rétro et comprendre des acides aminés sous forme D. L'invention concerne aussi des fragments de ces peptides constitués d'au moins cinq et de préférence d'au moins sept acides aminés successifs des séquences ci-dessus. L'invention a aussi pour objet l'utilisation de ces peptides linéaires amphipathiques ou d'analogues de ceux-ci, pour la vectorisation à travers la membrane des cellules in vivo ou in vitro d'une ou plusieurs substances actives tant pour des applications thérapeutiques que de diagnostic. Par vectorisation, on entend selon l'invention, un processus capable de traverser la ou les membranes cellulaires et d'amener ladite substance active jusqu'à une cible située dans un compartiment cellulaire tel que le cytoplasme ou le noyau. Ainsi, l'invention a pour objet des composés formés d'au moins un peptide linéaire amphipathique de décrit précédemment lié directement ou indirectement à au moins une substance active. Ces composés peuvent être représentés par la formule (I) suivante : A B (I) dans laquelle : - A représente un peptide amphipathique de l'invention, - B représente une substance active, et - le trait horizontal représente la liaison entre la substance active et le peptide linéaire amphiphatique. A titre de substance active, l'invention envisage notamment des protéines, comme des polypeptides ou peptides, des anticorps ou partie d'anticorps, des acides nucléiques et oligonucléotides ou des ribozymes, ou encore, bien entendu des molécules chimiques actives pour le traitement ou la prévention de pathologies humaines ou animales, comme par exemple et de manière non limitative des antitumoraux, des antiviraux, etc... Dans le domaine du diagnostic, la substance active peut être un marqueur radioactif, un marqueur coloré, ou tout autre moyen ou substance capable de révéler un métabolisme ou une pathologie. Le couplage entre le peptide vecteur et la substance active, symbolisé par les traits horizontaux dans la formule (I), peut être réalisé par tout moyen de liaison acceptable compte tenu de la nature chimique et de l'encombrement dans les composés de la formule (I). Les liaisons peuvent être covalentes, hydrophobes ou ioniques, clivables ou non-clivables dans les milieux physiologiques ou à l'intérieur de la cellules. La liaison peut comprendre un ou plusieurs composés intermédiaires (linker). Le couplage peut être effectué en n'importe quel site du peptide (A), dans lequel des groupements fonctionnels tels que-OH, -SH,-COOH, -NH2 sont naturellement présents ou ont été introduits. Les positions de couplage pour la substance active peuvent être au niveau des extrémités N-terminale ou C-terminale ou bien au niveau des chaînes latérales du peptide. De même, le couplage peut être effectué en n'importe quel site de la substance active (B), dans laquelle des groupements fonctionnels tels que-OH, -SH, -COOH,-NH2 sont naturellement présents ou ont été introduits. L'invention concerne donc aussi des compositions pharmaceutiques comprenant à titre d'agent actif une quantité efficace d'au moins un composé de formule (I) dans un véhicule acceptable. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant la préparation de peptides linéaires amphipatiques, leur couplage à une substance active et la pénétration de ce conjugué dans les cellules. 1) Synthèse des peptides marqué au groupe fluorescent NBD. Les peptides ont été synthétisés par la stratégie Fmoc-tBu en utilisant un AMS 422 (ABIMED, Allemagne). Les séquences des peptides sont indiquées dans le tableau I. Le marquage du N-terminal par un groupe fluorescent NBD a été effectué selon la procédure décrite par [Gazit, E. et al. (1995) Biochemistry 34, 11479-11488]. Le peptide sur résine est d'abord traité avec pipéridine [20% (v/v) dans du DMF] pour enlever le groupe protégeant Fmoc du N-terminal. Du NBD-Cl dans du DMF sec (excès de 5 fois) est ensuite rajouté en présence du DIEA (excès de 2 fois) pendant 6 hr à l'ombre avec agitation pour sélectivement marquer le groupe N-terminal. La résine est ensuite enlevée avec du DMF et traitée avec un mélange déprotégeant pour décrocher les peptides de la résine et déprotéger les chaînes latérales. Le peptide a été ensuite purifié par HPLC (reverse phase high performance liquid chromatography) (Water-prep LC 40, Water) avec un gradient TFA 0,01%/ acetonitrile. La pureté des peptides a été mesurée par des critères d'absorbance UV à 220 nm et 460 nm et était de 95%. 2) Préparation des peptides couplés à la doxorubicine. Le couplage de la doxorubicine sur un peptide par l'intermédiaire du maillon succinique est effectué en 3 étapes. Au chlorhydrate de doxorubicine (1 eq), solubilisé dans diméthylformamide (DMF) en présence de Disopropyléthylamine (DIEA, 2 eq) est ajouté l'anhydride succinique (1,1 eq, dans dissous dans DMF). Après une incubation de 20 min à température ambiante, l'hémisuccinate de doxorubicine ainsi formé est ensuite activé par addition de PyBOP (Benzotriazol-1-yl-oxopyrrolidinephosphonium Hexafluorophosphate l,leq dans DMF) et DIEA (2 eq). Ce second mélange réactionnel est incubé 20 min. Le peptide (1,2 eq dans DMF) est ensuite ajouté au mélange réactionnel, et se couple spontanément sur l'hémisuccinate de doxorubicine activé au cours d'une incubation supplémentaire de 20 min. Le produit de couplage est ensuite purifié sur HPLC (Chromatographie liquide haute pression) préparative, puis lyophilisé. Chacune des étapes, ainsi que le produit final sont contrôlés par HPLC analytique et spectrométrie de masse. Les peptides testés sont donnés dans le tableau 9 ci-dessous. Tableau 9 Peptide Séquence SynBl RGGRLSYSRRRFSTSTGR SM3979 RGGRLAYLRRRWAVLVGR SM3980 RGGRLVYVRRRWVVVVGR SM3505 (SynB3) RRLSYSRRRF SM4287 RRLWYLRRRF SM4288 RRLWLLRRRF SM4289 RRLWRLYRRF SM4290 RRLWRLLRRF SM4291 RLRWRLRYRF SM4292 RLRWRLRLRF SM4293 RKLWYLRKRF 3) Pénétration Cellulaire. La pénétration cellulaire des peptides a été étudié par cytométrie de flux. Les cellules K562 sont cultivées dans du milieu RPMI avec 10% de sérum de veau f#tal. Les cellules sont diluées à 0,3 x 106 cellules par ml 24 heures avant l'expérience. La pénétration cellulaire a été mesurés par cytométrie de flux en utilisant un FACScan (Becton Dickinson, USA). Les peptides marqués au NBD (concentration finale 1 uM) sont incubés avec les cellules K562 (5 x 105 cellules par ml) dans un milieu Optimem à 37 C pendant des temps variables (Le volume final était de 0,5 ml). Après l'incubation, les cellules sont lavées deux fois et ensuite resuspendues dans 0,5 ml de PBS froid. La pénétration a été ensuite analysée par FACS. Les fluorophores sont excités à 488 nm et la fluorescence est mesurée à 525 nm. Un histogramme de l'intensité de fluorescence (pour 1 x 104 cellules) est obtenu et la moyenne de distribution était considérée comme représentative de la quantité de peptide associé aux cellules. 4) Résultats. Les résultats d'internalisation sont rapportés dans les tableaux ci-dessous. Le tableau 10 montre la pénétration du peptide SM2363 par rapport à celle de deux de ces analogues qui sont plus amphipathiques. Tableau 10 Temps (min) SynBl SM3979 SM3980 0 4 4 4 5 7 75 34 10 7 95 42 30 8 100 54 60 12 114 62 Les résultats du Tableau 10 montrent que les analogues amphipathiques (SM3979 et SM3980) pénètrent avec beaucoup plus d'efficacité, et ceci quel que soit le temps considéré. Ainsi au temps 60 min, la pénétration du SM3979 et du SM3980 est respectivement 9 et 5 fois plus supérieure que celle du SynBl. Le même design a été réalisé chez des peptides plus courts. Le peptide SynB3 a été pris comme référence et son amphipathie a été augmentée. La comparaison de pénétration du peptide SynB3 avec ces analogues est représentée dans les tableaux 11 et 12 ci-dessous. Tableau 11 Temps (min) SynB3 SM4287 SM4288 SM4289 SM4290 0 4 4 4 4 4 5 9,5 29 33 63 147 10 10 34 38 80 168 30 12 50 53 107 366 60 16 60 61 135 371 Tableau 12 Temps (min) SynB3 SM4291 SM4292 SM4293 0 4, 5 4, 5 4.5 4,5 10 12 91 140 20 20 13 99 140 23 30 15 107 141 29 60 23 118 146 31 Les résultats des Tableaux 11 et 12 montrent aussi que les analogues amphipathiques pénètrent avec beaucoup plus d'efficacité, et ceci quel que soit le temps considéré. REVENDICATIONS 1) Peptide contenant ou constitué par un dérivé d'un peptide antibiotique par : - modification des résidus cystéines de façon à ce que ledit peptide soit dépourvu de pont disulfure, - substitution de 1 à 18 et de préférence de 1 à 6 acides aminés, et/ou permutation d'au moins une paire d'acide aminé, lesdites substitutions et/ou permutation étant telles que ledit peptide présente un caractère amphipathique. 2) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente une hydrophobicité moyenne par résidu comprise entre 0,15 et 0,7. 3) Peptide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il présente un moment d'hydrophobicité hélicoïdal [alpha] supérieur à 0,15. 4) Peptide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il présente un moment d'hydrophobicité bêta ss supérieur à 0. 5) Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est dérivé de protégrine ou de tachyplésine, d'un analogue ou d'un fragment de ceux-ci. 6) Peptide comprenant ou constitué par un dérivé d'un peptide dont la séquence en acides aminés est choisi parmi : 1 5 10 15 18 - SEQ ID N0:1 . R G G R L S Y S R R R F S T S T G R 1 5 10 - SEQ ID NO:2 : R R L S Y S R R R F 1 5 10 15 17 - SEQ ID NO:3 : A W S F R V S Y R G I S Y R R S R ou un fragment de celles-ci constitué d'au moins cinq et de préférence d'au moins sept acides aminés successifs, par substitution de 1 à 18 et de préférence de 1 à 6 acides aminés, et/ou permutation d'au moins une paire d'acide aminé, lesdites substitutions et/ou permutation étant telles que ledit peptide présente un caractère amphipatique. 7) Peptide selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il dérive d'un peptide dont la séquence en acides aminés est SEQ ID N0:1 par mutation d'au moins un des résidus en position 6,8, 13,14, 15,16 par un acide aminé hydrophobe, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Trp, et éventuellement mutation d'au moins un autre réidu, de préférence le résidu Phe en position 12, par un résidu tyr ou Trp. 8) Peptide selon la revendication 7, caractérisé par l'un des séquences en acides aminés suivantes : - SEQ ID NO:4 : R G G R L A Y L R R R W A V L V G R, - SEQ ID NO:5 : R G G R L V Y V R R R W V V V V G R, - SEQ ID N0:6 . R G G R L L Y L R R R W L V L V G R, - SEQ ID NO:7 : R G G R L A Y A R R R F A V A V G R, - SEQ ID NO:8 : R G G R L V Y L R R R F A F L I G R. 9) Peptide selon l'une des revendication 6 à 8, caractérisé en ce qu'il dérive d'un peptide dont la séquence en acides aminés est SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 4 , SEQ ID N0:5,SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8 par permutation d'au moins une paire des résidus en position 3 et 5, en position 10 et 12, et en position 16 et 17. 10) Peptide selon l'une des revendication 6 à 9, caractérisé en ce qu'il dérive d'un peptide dont la séquence en acides aminés est SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8 par : - permutation d'au moins une paire des résidus en position 3 et 5, en position 10 et 12, et en position 16 et 17, - mutation d'au moins un des résidus en position 6, 13,14 et 16 par un acide aminé hydrophobe, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Trp, et éventuellement mutation d'au moin sun autre résidu, de préférence le résidu Phe en position 12, par un résidu Tyr ou Trp donnant un signal spectroscopique et permettant le dosage du peptide, éventuellement mutation du résidu en position 3 par un acide aminé hydrophobe, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ile, Leu, Val, Phe, Trp. 11) Peptide selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé par l'une des séquence en acides aminés suivantes : - SEQ ID N0:9 . R G L R G S Y S R F R R S T S T G R, - SEQ ID N0:10 . R G L R G L Y L R F R R L V S V G R, - SEQ ID N0:11 . R G L R G L Y F R F R R I L S V G R, - SEQ ID N0:12 . R G 1 R G L Y L R W R R L L S F G R, - SEQ ID NO:13 R G F R G L Y L R W R R L V S V G R. 12) Peptide selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il dérive d'un peptide dont la séquence en acides aminés est SEQ ID NO: 2 par mutation simultanée des résidus en position 4 et 6 ou la mutation simultanée des résidus en position 4,5 et 6 par des acides aminés hydrophobes, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, lieu, Leu, Val, Phe, Trp, et éventuellement, la mutation d'un moins un autre résidu, de préférence le résidu Phe en position 10, par un résidu Tyr ou Trp donnant un signal spectroscopique et permettant le dosage du peptide. 13) Peptide selon la revendication 12, caractérisé par l'un des séquences en acides aminés suivantes : - SEQ ID N0:14 . R R L W Y L R R R F - SEQ ID N0:15 . R R L W L L R R R F 14) Peptide selon l'une quelconque des revendication 6,12 ou 13, caractérisé en ce qu'il dérive d'un peptide dont la séquence en acides aminés est SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15 par permutation des résidus en position 5 et 7 et la mutation simultanée, sur la séquence résultant de la permutation, des résidus en position 4 et 6 ou des résidus en position 4,6 et 7 par des acides aminés hydrophobes de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, lieu, Leu, Val, Phe et Trp, et éventuellement, mutation d'un moins un autre résidu, de préférence le résidu Phe en position 10, par un résidu Tyr ou Trp donnant un signal spectroscopique et permettant le dosage du peptide. 15) Peptide selon la revendication 14, caractérisé par l'un des séquences en acides aminés suivantes : - SEQ ID NO:16 : R R L W R L Y R R F - SEQ ID NO:17 : R R L W R L L R R F 16) Peptide selon l'une quelconque des revendication 6,12, 13,14 ou 15, caractérisé en ce qu'il dérive d'un peptide dont la séquence en acides aminés est SEQ ID NO: 2, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16 ou SEQ ID NO: 17 par permutation des résidus en position 2 et 3 et la permutation des résidus en position 5 et 8, et sur la séquence résultant de la permutation, la mutation simultanée des résidus en position 4 et 6 ou la mutation simultanée des résidus en position 4,6 et 8 par des acides aminés hydrophobes de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, lieu, Leu, Val, Phe et Trp, et éventuellement, mutation d'un moins un autre résidu, de préférence le résidu Phe en position 10, par un résidu Tyr ou Trp donnant un signal spectroscopique et permettant le dosage du peptide. 17) Peptide selon la revendication 16, caractérisé par l'un des séquences en acides aminés suivantes : - SEQ ID N0:18 . R L R W R L R Y R F - SEQ ID N0:19 . R L R W R L R L R F 18) Peptide selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il dérive d'un peptide dont la séquence en acides aminés est SEQ ID NO: 3 par mutation simultanée des résidus en position 3,7, 12,16 par des acides aminés hydrophobes de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, Ileu, Leu, Val, Phe et Trp. 19) Peptide selon la revendication 18, caractérisé par l'une des séquences en acides aminés suivantes : - SEQ ID NO : 20 : A W A F R V A Y R G I A Y R R A R - SEQ ID N0: 21 :A W L F R V A Y R G I L Y R R A R - SEQ ID N0: 22 : A W F F R V A Y R G I L Y R R F R 20) Peptide selon l'une quelconque des revendication 6 ou 19, caractérisé en ce qu'il dérive d'un peptide dont la séquence en acides aminés est SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21 ou SEQ ID N0:22 par permutation des résidus en position 12 et 14, des résidus en position 16 et 17 et une mutation simultanée des résidus en position 3, 7,14 et 17 par des acides aminés hydrophobes de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, lieu, Leu, Val, Phe et Trp. 21) Peptide selon la revendication 20, caractérisé par l'une des séquences en acides aminés suivantes : - SEQ ID NO : 23 :A W A F R V L Y R G I R Y L R R A - SEQ ID NO : 24 :A W I F R V V Y R G I R Y F R R A - SEQ ID NO : 25 :A W F F R V I Y R G I R Y I R R L 22) Peptides selon l'une quelconques des revendications 1 à 21, caractérisé en ce que la substitution d'une ou plusieurs arginines par la citrulline ou l'ornithine. 23) Peptide selon la revendication 22, caractérisé par l'une des séquences en acides aminés suivantes : - SEQ ID NO: 26 : R G G R L S Y S Cit Cit R F S T S T G R - SEQ ID NO: 27 : R G G R L S Y S Cit Cit Cit F S T S T G R - SEQ ID NO: 28 : R G G R L A Y L Cit Cit R W A V L V G R - SEQ ID NO: 29 : R G G R L A Y L Cit Cit Cit W A V L V G R - SEQ ID NO: 30 : R G G R L V Y V Cit Cit R W V V V V G R - SEQ ID NO: 31 : R G G R L V Y V Cit Cit Cit W V V V V G R - SEQ ID NO: 32 : R R L S Y S Cit Cit R F - SEQ ID NO: 33 : R R L S Y S Cit Cit Cit F - SEQ ID NO: 34 : R Cit L S Y S Cit Cit R F - SEQ ID NO: 35 : R R L W R L Y Cit Cit F - SEQ ID NO: 36 : R Cit L W R L Y Cit Cit F - SEQ ID NO: 37 : R R L W R L L Cit Cit F - SEQ ID NO: 38 : R Cit L W R L L Cit Cit F - SEQ ID NO: 39 A W S F R V S Y R G I S Y Cit Cit S R - SEQ ID NO: 40 : A W S F Cit V S Y R G I S Y Cit Cit S R - SEQ ID NO: 41 A W F F R V A Y R G I L Y Cit Cit F R - SEQ ID NO: 42 : A W F F Cit V A Y R G I L Y Cit Cit F R 24) Un composé formé d'au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 23 lié directement ou indirectement à au moins une substance active. 25) Un composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent actif une quantité efficace d'au moins un composé selon la revendication 24 dans un véhicule acceptable.