Brevet FR2818660A1 — publié le 20020628

L'invention est relative à l'obtention de levures résistantes au stress, et notamment à un stress froid. On utilise de plus en plus fréquemment, en boulangerie ou en pâtisserie, des pâtons qui sont préalablement ensemencés par des levures vivantes et subissent généralement un début de fermentation. Ils sont ensuite congelés et stockés sous cette forme jusqu'à leur utilisation. Or, le stress froid, provoqué par la congélation et la conservation à des températures négatives, entraîne une importante perte du pouvoir fermentatif de la levure dans ces pâtons. Dans le cas de pâtes contenant des levures vivantes, il est important de disposer de levures capables de s'adapter au stress froid, provoqué par la congélation et la conservation à des températures négatives. Toutes les cellules vivantes disposent naturellement de systèmes d'adaptation aux différents stress, qui ont pour but d'assurer la protection de la cellule, sa survie en condition de stress, et la réparation des dégâts causés par le stress. Ces systèmes dépendent d'un ensemble de mécanismes complexes, qui agissent parfois séparément, parfois conjointement, pour permettre l'adaptation à un ou plusieurs types de stress. Les levures possèdent ainsi un ensemble de mécanismes complexes (pour revue cf. ATTFIELD, Nature Biotech., 15,1351-1357, 1997) qui agissent parfois séparément, parfois conjointement, pour permettre l'adaptation aux différents types de stress. Le stress froid implique plusieurs composantes : une composante osmotique et une composante ionique, liées à la déshydratation qui intervient lors de la congélation, et une composante liée à l'abaissement de la température, qui ralentit l'ensemble du métabolisme et notamment les échanges transmembranaires, et par la formation de cristaux de glace, peut endommager les structures cellulaires. Les facteurs impliqués dans la tolérance au stress froid chez la levure sont encore mal connus. La plupart des recherches effectuées pour augmenter la tolérance des levures au stress, et en particulier au stress froid, ont visé à l'augmentation de leur teneur en tréhalose. Il a ainsi été proposé d'augmenter la synthèse du tréhalose en surexprimant dans des souches de levure des gènes codant des tréhalose synthases (LONDESBOROUGH et al., Brevet US 5 422 254), ou bien de limiter son catabolisme en inactivant le gène ATH1 qui code une tréhalase (KLIONSKY et al., Brevet US 5 587 290 ; KIM et al., Appl. Environ. Microbiol., 62,1563-1569, 1996). De nombreux gènes potentiellement impliqués dans la résistance au stress ont été mis en évidence chez les végétaux supérieurs, et il a été proposé de les utiliser pour transformer des levures afin d'augmenter leur tolérance au stress. Parmi ces gènes on citera notamment les gènes codant pour les protéines de la famille des LEA (Late Embryogenesis Abundant) qui sont fortement exprimés chez les végétaux au cours de la maturation de l'embryon. Ces gènes joueraient notamment un rôle dans la tolérance de l'embryon à la dessiccation. Différents groupes de LEA ont été distingués, selon leur structure, et selon leur fonction potentielle (BRAY, Plant Physiology, 103,1035-1040, 1993) : - les LEA du groupe 1 pourraient par leur forte capacité de liaison de l'eau, prévenir la fuite de celle-ci lors de la dessiccation ; les LEA du groupe 2, également dénommées déhydrines, joueraient un rôle de protéines chaperonnes, contribuant au maintien de l'intégrité de la structure d'autres protéines ; - les LEA du groupe 3 et du groupe 5 assureraient la séquestration des ions ; les LEA du groupe 4 auraient un rôle osmoprotecteur, et contribueraient au maintien de l'intégrité des membranes. IMAI et al. (Gene, 170,243-248, 1996) rapportent que l'expression de la protéine LE25 (LEA du groupe 4) de tomate améliore la tolérance de S. cerevisiae au stress ionique et au stress froid (congélation). La même équipe ZHANG et al. (J. Biochem., 127, 611-616, 2000), rapportent également que l'expression chez S. cerevisiae des protéines LE4 de tomate (groupe 2) et HVA1 d'orge (groupe 3) confère également une protection vis-à-vis d'un stress froid, mais à un degré moindre que LE25. SWIRE-CLARK et al. (Plant Mol. Biol., 39,117- 128,1999) ont observé que l'expression de la protéine Em (LEA du groupe 1) de blé améliore la résistance de S. cerevisiae au stress osmotique, mais n'a aucun effet sur la résistance au stress froid. Les Inventeurs ont isolé et cloné différents ADNc correspondant à des gènes induits chez le blé dur (Triticum durum) en conditions de stress abiotique (stress ionique, osmotique, froid ou thermique). Ils ont étudié l'expression de ces gènes chez S. cerevisiae et ont constaté que certains d'entre eux pouvaient améliorer la tolérance de S. cerevisiae à différents stress abiotiques. Parmi ceux-ci, certains apportaient en particulier une amélioration très significative de la tolérance au stress froid. Ainsi, parmi les ADNc testés, ils ont sélectionné : un ADNc, dénommé pTd38, codant pour une protéine LEA du groupe 2, décrite précédemment comme étant induite chez le blé dur par la dessiccation (LABHILLI et al., Plant Sci., 112, 219-230, 1995) ; la séquence nucléotidique de l'ADNc pTd38 est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1, la séquence peptidique correspondante est représentée sous le numéro SEQ ID NO : 2. - un ADNc dénommé pTd64 codant pour une protéine WALI (pour : Wheat ALuminum Induced ), très proche de la protéine WALI7 de blé tendre (Triticum aestivum), décrite par RICHARDS et al., (Plant Physiol., 105,1455-1456, 1994 ; GenBank) ; l'expression des gènes wali a été initialement observée dans les racines de blé tendre en réponse à un stress à l'aluminium. Leur rôle potentiel dans la réponse à d'autres types de stress n'est pas connu. La séquence nucléotidique de l'ADNc pTd64 de blé dur est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 3, la séquence peptidique correspondante est représentée sous le numéro SEQ ID NO : 4. - un ADNc dénommé pTd6.48, codant une protéine de transfert de lipides de la famille des LTPs (pour : lipid transfer protein ) de 9 kDa. Les LTP de 9 kDa ont la propriété de transférer in vitro des lipides chargés entre deux membranes. Leur rôle in vivo est encore mal connu. Il a été observé que leur expression était induite en conditions de stress (abiotique ou biotique) ; elles inhibent la croissance de différents microorganismes pathogènes, et pourraient ainsi jouer un rôle dans la réponse au stress biotique (attaque microbiennes). Elles pourraient également intervenir dans la formation de la cuticule cireuse des végétaux. La séquence nucléotidique de l'ADNc pTd6.48 de blé dur est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 5 ; les séquences peptidiques du précurseur de la protéine, codé par cet ADNc, et de la LTP6.48 mature sont représentées sous les numéros SEQ ID NO : 6, et SEQ ID NO : 7. La présente invention a pour objet l'utilisation d'au moins une molécule d'acide nucléique choisie parmi : a) une molécule d'acide nucléique codant pour une protéine LEA du groupe 2 dont la séquence polypeptidique possède au moins 70% d'identité ou 75% de similitude, de préférence au moins 80% d'identité ou 85% de similitude, avantageusement au moins 90% d'identité ou 95% de similitude, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité ou 98% de similitude, avec la séquence SEQ ID NO : 2 ; b) une molécule d'acide nucléique codant pour une protéine WALI dont la séquence polypeptidique possède au moins 70% d'identité ou 75% de similitude, de préférence au moins 80% d'identité ou 85% de similitude, avantageusement au moins 90% d'identité ou 95% de similitude, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité ou 98% de similitude, avec la séquence SEQ ID NO : 4 ; c) une molécule d'acide nucléique codant pour un précurseur de LTP ou pour une LTP mature, dont la séquence polypeptidique possède au moins 70% d'identité ou 75% de similitude, de préférence au moins 80% d'identité ou 85% de similitude, avantageusement au moins 90% d'identité ou 95% de similitude, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité ou 98% de similitude, avec, respectivement, la séquence SEQ ID NO : 6 ou la séquence SEQ ID NO : 7 ; pour transformer une levure afin d'améliorer sa tolérance au stress froid. Les pourcentages d'identité ou de similitude entre deux séquences polypeptidique peuvent être déterminés selon des méthodes connues en elles-mêmes de l'homme de l'art ; notamment, ils peuvent être déterminés à l'aide du programme BLASTP (ALTSCHUL et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402,1997). Ces molécules d'acide nucléique peuvent être utilisées séparément. Elles peuvent également être associées dans une même cellule de levure, pour augmenter encore sa tolérance au stress froid, en combinant différents mécanismes participant à cette tolérance ; elles peuvent également être associées à des molécules d'acide nucléique codant pour des protéines impliquées dans des mécanismes de tolérance à des stress autres que le stress froid. Par exemple, pour améliorer la tolérance d'une cellule de levure au stress ionique, on peut exprimer dans cette cellule une molécule d'acide nucléique codant pour une LEA du groupe 2 dont la séquence polypeptidique possède au moins 70% d'identité ou 75% de similitude, de préférence au moins 80% d'identité ou 85% de similitude, avantageusement au moins 90% d'identité ou 95% de similitude, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité ou 98% de similitude, avec la séquence SEQ ID NO : 9. Les Inventeurs ont en effet constaté que la LEA du groupe 2, dénommée Td27e, qui est représentée par la séquence SEQ ID NO : 9, n'a pas d'effet sur la tolérance des levures au stress froid, mais augmente leur tolérance au stress ionique. De même, pour améliorer la tolérance d'une cellule de levure au stress osmotique, on peut exprimer dans ladite cellule une molécule d'acide nucléique choisie parmi : - une molécule d'acide nucléique codant pour une protéine WALI dont la séquence polypeptidique possède au moins 70% d'identité ou 75% de similitude, de préférence au moins 80% d'identité ou 85% de similitude, avantageusement au moins 90% d'identité ou 95% de similitude, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité ou 98% de similitude, avec la séquence SEQ ID NO : 11 ; - une molécule d'acide nucléique codant pour un précurseur de LTP ou une LTP mature dont la séquence polypeptidique possède au moins 70% d'identité ou 75% de similitude, de préférence au moins 80% d'identité ou 85% de similitude, avantageusement au moins 90% d'identité ou 95% de similitude, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité ou 98% de similitude, avec, respectivement, la séquence SEQ ID NO : 13 ou la séquence SEQ ID NO : 14. Les Inventeurs ont en effet constaté que la protéine WALI1 de blé dur, qui est représentée par la séquence SEQ ID Nu : 11, ainsi que la LTP dénommée TdD2 qui est représentée par la séquence SEQ ID NO : 14, ou son précurseur, représenté par la séquence SEQ ID NO : 13 n'ont aucun effet sur la tolérance des levures au stress froid, mais augmentent leur tolérance au stress osmotique. La présente invention a également pour objet une levure transformée par au moins une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus. Des levures transformées conformes à l'invention peuvent être obtenues à partir de souches de levures de différentes espèces. A titre d'exemples non limitatifs, on citera des espèces des genres Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora, Pichia, Hansenula, Yarrowia, Candida, Geotrichum, etc. Avantageusement, ladite levure appartient à une espèce utilisable en boulangerie ou en pâtisserie pour la fabrication de pâtes levées. Il s'agit en général d'une espèce du genre Saccharomyces, telle que Saccharomyces cerevisiae. Ladite levure peut ainsi être transformée par une molécule d'acide nucléique a) et/ou une molécule d'acide nucléique b) et/ou une molécule d'acide nucléique c) telles que définies ci-dessus, éventuellement associées, comme indiqué ci-dessus, à une ou plusieurs autres molécules d'acides nucléique permettant de lui conférer une résistance à des stress autres que le stress froid. Des levures transformées conformes à l'invention peuvent être obtenues par les méthodes habituelles, connues en elles-mêmes de l'homme du métier. De manière classique, la séquence d'ADN codant pour la protéine que l'on souhaite exprimer est insérée dans un vecteur d'expression approprié, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur actif dans une cellule de levure. Le vecteur ainsi chargé est ensuite introduit dans la cellule de levure, par toute méthode appropriée, par exemple par électroporation ou transformation à l'acétate de lithium. On peut utiliser des vecteurs réplicatifs extrachromosomiques ; à d'exemples non limitatifs on citera les vecteurs de la série Yep (MYERS et al., Gene, 45, 299-310,1986) qui possèdent l'origine de réplication du plasmide 2 jn endogène, les vecteurs Yrp qui possèdent comme origine de réplication une séquence ARS chromosomique, etc. On peut également utiliser des vecteurs intégratifs tels que les vecteurs Yip, (MYERS et al., 1986), ou Yiplac (GIETZ et SUGINO, Gene 74,527-534, 1988), qui ne possèdent pas d'origine de réplication fonctionnelle dans la levure. A titre d'exemple, on citera des systèmes d'expression tels que ceux décrits par BITTER et al. (Methods Enzymol., 153,516-544, 1989) ou TUITE (Expression of heterologous genes, 169-212, In M. F. TUITE, and S. G. OLIVER (ed.), Biotechnology Handbooks, Vol. 4, Saccharomyces., Plenum Press, New York, 1991). Le gène choisi peut par exemple être placé sous contrôle d'éléments de régulation de la transcription chez la levure tels que ceux des gènes alcool déhydrogénase ADH1 (RUOHONEN et al., J. Biotechnol, 39,193-203, 1995), phosphoglycérate kinase PGK1 (HITZEMAN et al., Nucl. Acids Res., 10,7791-7808, 1982), glyceraldéhyde-3-phosphate déhydrogénase TDH1 (BITTER et EGAN, Gene, 32,263-274, 1984), actine ACT1 (GALLWITZ et al., Nucl. Acids Res., 8, 1043-1059, 1980), etc. Les levures transformées conformes à l'invention présentent une meilleure tolérance au stress froid, qui se traduit par un taux de survie après congélation et stockage à - 20 C, supérieur à celui de la souche sauvage dont elles sont issues. Avantageusement, leur taux de survie après congélation et stockage à-20 C, est au moins double de celui de la souche sauvage dont elles sont issues. Les levures transformées exprimant une LEA du groupe 2 telle que définie en a) ci-dessus présentent en outre une meilleure tolérance au stress ionique ainsi qu'au stress thermique, que la souche sauvage dont elles sont issues les levures transformées exprimant une protéine WALI7 telle que définie en b) ci-dessus présentent en outre une meilleure tolérance au stress thermique, que la souche sauvage dont elles sont lssues ; les levures transformées exprimant une LTP de 9 kDa telle que définie en c) ci-dessus présentent en outre une meilleure tolérance au stress ionique, ainsi qu'au stress thermique, que la souche sauvage dont elles sont issues. Des levures transformées conformes à l'invention sont utilisables notamment pour la fabrication de levains de panification. La présente invention a également pour objet des levains de panification comprenant lesdites levures. La présente invention englobe également les produits de boulangerie ou de pâtisserie, et notamment les pâtes boulangères ou pâtissières comprenant lesdites levures. La présente invention a en outre pour objet une protéine de transfert de lipides choisie parmi : - un précurseur de LTP ou une LTP mature dont la séquence polypeptidique possède au moins 90% d'identité ou 95% de similitude, et de manière préférée au moins 95% d'identité ou 98% de similitude, avec, respectivement, la séquence SEQ ID NO : 6 ou la séquence SEQ ID NO : 7 - un précurseur de LTP ou une LTP mature dont la séquence polypeptidique possède au moins 70% d'identité ou 75% de similitude, de préférence au moins 80% d'identité ou 85% de similitude, avantageusement au moins 90% d'identité ou 95% de similitude, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité ou 98% de similitude, avec, respectivement, la séquence SEQ ID NO : 13 ou la séquence SEQ ID NO : 14. La présente invention englobe également toute séquence d'acide nucléique codant pour l'une desdites protéines de transfert de lipides. Une protéine de transfert de lipides conforme à l'invention peut, comme indiqué ci-dessus, être exprimée dans des levures afin d'augmenter leur tolérance au choc froid. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples décrivant l'obtention de souches de levures transformées conformes à l'invention. EXEMPLE 1 : CONSTRUCTION DES VECTEURS D'EXPRESSION ET SELECTION DES LEVURES RECOMBINANTES. Les ADNc codant pour la LEA du groupe 2 Td38, la protéine WALI7 de blé dur, et la LTP Td6.48 ont été isolés à partir d'une banque d'ADNc de racines de plantules de blé dur, obtenue après induction par dessiccation. Les séquences de ces ADNc sont respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 3, et SEQ ID NO : 5. Des vecteurs permettant l'expression de ces gènes chez S. cerevisiae ont été construits à partir du vecteur d'expression navette E. coli/5'. cerevisiae pYES2 (InVitrogen) possédant le gène ura3, et l'origine de réplication 2je., par insertion sous contrôle transcriptionnel du promoteur gall inductible par le galactose et réprimé par le glucose, et de la séquence de terminaison de transcription cycl. Construction d'un vecteur d'expression d'une LEA du groupe 2 La séquence complète de l'ADNc pTd38 (SEQ ID Nu.-1) codant la protéine Td38 (SEQ ID NO : 2) a été insérée dans le vecteur pYES2, préalablement digéré avec les enzymes NotI et KpnI et déphosphorylé. La séquence complète de l'ADNc dénommé pTd27e (SEQ ID NO : 8) codant pour une autre protéine LEA du groupe 2, dénommée Td27e (SEQ ID NO : 9) dont l'expression dans les racines de plantules de blé dur est également induite par dessiccation, et dont la séquence peptidique possède 58,1% et 66,7% de similitude avec la séquence de la protéine Td38, a également été cloné entre les sites NotI et KpnI de pYES2. Construction d'un vecteur d'expression d'une protéine WALI La séquence codante complète de l'ADNc pTdt64 (SEQ ID NO : 3) codant pour une protéine similaire à la protéine WALI7 de blé tendre a été insérée dans le vecteur pYES2, préalablement digéré avec les enzymes SacI et SphI et déphosphorylé. La séquence codante complète de l'ADNc dénommé pTd79b (SEQ ID NO : 10), codant pour une protéine WALI1, identique à la protéine WALI1 de blé tendre (SNOWDEN et GARDNER, Plant Physiol., 103,855-861, 1993), et dont l'expression dans les racines de plantules de blé dur est également induite par la dessiccation, a été cloné dans pYES2 entre les sites NotI et KpnI. Construction d'un vecteur d'expression d'une LTP de 9kDa La séquence codante complète de l'ADNc pTd6.48 (SEQ ID NO : 5) codant pour le précurseur de la LTP6.48 (SEQ ID NO : 6) a été insérée dans le vecteur pYES2, préalablement digéré avec les enzymes EcoRI et SphI et déphosphorylé. A titre de comparaison, un ADNc dénommé pTdD2 (SEQ ID NO : 12), codant pour le précurseur de la LTPD2 (SEQ ID NO : 13), qui présente 50% d'identité et 69% de similarité avec le précurseur de la LTP6.48, et dont l'expression dans les racines de plantules de blé dur est également induite par la dessiccation, a été cloné dans pYES2 entre les sites NotI et KpnI. Les vecteurs ainsi obtenus ont été utilisés pour transformer la souche de Saccharomyces cerevisiae INVScl (souche haploïde de génotype MATa, his3-Al, leu2, trpl-289, ura3-52). Cette souche est cultivée sur milieu YNB-Gal composé de 1,7 g de YNB-AA/AS (DIFCO LABORATORIES), 5 g de (NH4) 2SO4, 20 g de galactose, 20 mg d'uracile, 20 mg de Lhistidine, 60 mg de L-leucine, 40 mg de L-tryptophane pour 1 litre. Pour la sélection des levures recombinantes on utilise le même milieu sans uracil. Après sélection des levures, la présence des transcrits correspondant aux ADNc est vérifiée par hybridation avec des sondes spécifiques après induction par le galactose. EXEMPLE 2 : TOLERANCE AU STRESS DES LEVURES RECOMBINANTES. La tolérance au stress froid a été étudiée chez la souche sauvage INVScl, chez la souche INVScl transformée avec le plasmide pYES vide, et chez les souches recombinantes exprimant une LEA de type 2, une protéine Wali, ou une LTP de 9kDa obtenues comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus. Stress froid : Conditions de stress La tolérance au stress froid est évaluée en mesurant la survie des levures après application du stress froid (congélation à-20 C, conservation à cette température pendant 24 heures, et décongélation). Les conditions décrites par IMAI et al. (1996, publication précltée) ont été utilisées. Chacune des souches est cultivée en milieu YNBGalactose (50 ml). Au milieu de la phase exponentielle de croissance (Absorbance à 600 nm = 1), on prélève 1 ml de culture. Après centrifugation (3500 g, 3 min, 4 C) le culot cellulaire est remis en suspension dans 1 ml de milieu complet YPD. Des aliquotes de 100 Ml sont séparées dans des microtubes. Une partie des aliquotes est conservée sans traitement, et l'autre est congelée dans un bain d'éthanol absolu préalablement refroidi et conservée à-20 C pendant 24 h. Les cellules sont décongelées rapidement en plaçant les tubes à 30 C quelques secondes avant étalement. Les cellules non-traitées ou les cellules décongelées sont ensuite diluées dans du milieu complet YPD (dilution 1/10000 et 1/20000 pour les témoins, et 1/400 et 1/2000 pour les cellules ayant subi le stress froid). Les dilutions ainsi obtenues sont étalées sur milieu complet gélosé (YPD agar) et les boîtes incubées à 30 C pendant 48 h. Les colonies formées sur chaque boîte sont comptées, et le nombre d'UFC (unités formant colonies) est calculé en tenant compte de la dilution. La survie de chaque souche est évaluée par le pourcentage d'UFC survivantes, c'est-à-dire le nombre d'UFC après stress divisé par le nombre d'UFC témoins. Pour chaque expérimentation, le nombre d'UFC correspond à la moyenne de 4 étalements. Les résultats sont résumés dans le Tableau I ciaprès : Tableau 1 Souche Taux de survie pYES2 6, 8 levure sauvage 5. 5 pYES2-Td27e 6 pYES2-Td38 20 pYES2-Td79b 3, 5 pYES2-Tdt64 27 pYES2-ltp6. 48 28 pYES2-ltpD2 1, 8 Dans le cas de la souche sauvage INVSd, le taux de survie est de 5,5% ; la souche recombinante INVScl-pYES2 présente un taux de survie similaire de 6,8%. Levures recombinantes exprimant une LEA protéine de groupe 2 La levure recombinante INVScl-pYES2-Td27e présente un taux de survie au stress froid de 6%, qui est donc similaire à ceux observés avec la souche sauvage INVScl ou la souche INVScl-pYES2. En revanche, la levure recombinante INVScl-pYES2- Td38 présente un taux de survie au stress froid de 20%. Levures recombinantes exprimant une protéine WALI La levure recombinante INVScl-pYES2-Td79b présente un taux de survie au stress froid de 3,5%, comparable à ceux de la souche sauvage INVScl ou de la souche INVScl-pYES2. En revanche, la levure recombinante INVScl-pYES2- Tdt64 présente un taux de survie au stress froid de 27%. Levures recombinantes exprimant une LTP La levure recombinante INVScl-pYES2-1tpD2 présente un taux de survie au stress froid de 1,8%. L'expression de cette LTP n'induit donc aucune amélioration de la survie au stress froid. La levure recombinante INVScl-pYES2-ltp6. 48 présente en revanche un taux de survie au stress froid de 28%. Stress thermique : Conditions de stress La tolérance au stress thermique est évaluée selon le même protocole que pour le stress froid : au lieu d'un stress par congélation, les cellules subissent une incubation pendant 10 minutes à 50 C. Les cellules ayant subi le stress thermique sont diluées au 1/4000 et au 1/10000 avant étalement. Le taux de survie est calculé comme décrit ci-dessus pour le stress froid. Les résultats sont illustrés dans le Tableau II ci-après. Tableau Il Souche Taux de survie pYES2 24 levure sauvage 27, 5 pYES2-Td27e 77,5 pYES2-Td38 91 pYES2-Td79b 46 pYES2-Tdt64 56 pYES2-ltp6. 48 100 pYES2-ltpD2 34, 5 Dans le cas de la souche sauvage INVScl, le taux de survie est de 27,5% ; il est de 24% pour la souche recombinante INVScl-pYES2. Toutes les protéines exprimées induisent une augmentation du taux de survie. Cette augmentation est particulièrement importante dans le cas de Td38 et de LTP6.48. Elle est également importante dans le cas de Td27e. Stress ionique et stress osmotique : Conditions de stress La tolérance au stress ionique ou au stress osmotique est évaluée en comparant les cinétiques de croissance à 300C en conditions normales (milieu YNBgalactose), et en conditions de stress ionique (milieu YNBgalactose + 1,5 M Nacl), ou de stress osmotique (milieu YNBgalactose + 2,5 M sorbitol). Dans le cas de la souche sauvage INVScl, ou de la souche recombinante INVScl-pYES2, la durée de la phase de latence (définie ici comme le temps entre la mise en culture et le moment où l'absorbance à 600 nm atteint une valeur de 0,2), est de 3 h en conditions normales de culture. En présence de 1,5 M de NaCl, la durée de la phase de latence est de 87 h. En présence de 2,5 M de sorbitol, la phase de latence est de 182 h. Levures recombinantes exprimant une LEA protéine de groupe 2 . INVScl-pYES2-Td27e En présence de NaCl 1,5 M, la phase de latence de la cinétique de croissance de la levure INVScl-pYES2-Td27e est inférieure de 70 h à celle des levures témoin (souche sauvage INVScl, ou souche recombinante INVScl-pYES2) dans les mêmes conditions. En revanche, en présence de sorbitol 2,5 M, la phase de latence de la levure transformée est supérieure de 48 h à celle des levures témoins. 'INVScl-pYES2-Td38 En présence de NaCl 1,5 M, la phase de latence de la cinétique de croissance de la levure INVScl-pYES2-Td38 est inférieure de 44 h à celle des levures témoin. En présence de sorbitol 2,5 M, on n'observe aucune diminution de la phase de latence par rapport aux levures témoins. Il apparaît donc que la levure INVScl-pYES2- Td27e, et dans une moindre mesure la levure INVScl-pYES2- Td38, présentent une tolérance accrue à un stress ionique. En revanche, aucune de ces levures transformées ne présente d'amélioration de la tolérance à un stress osmotique. La levure INVScl-pYES2-Td27e apparaît même plus sensible que les souches témoins. Levures recombinantes exprimant une protéine WALI 'INVScl-pYES2-Tdt64 En conditions de stress osmotique la cinétique de croissance de la levure INVScl-pYES2-Tdt64 n'est pas modifiée. On n'observe qu'une légère diminution (10 h) de la phase de latence en présence de NaCl 1, 5 M. 'INVScl-pYES2-Td79b Par rapport aux levures témoins, la phase de latence de la levure transformée INVScl-pYES2-Td79b est diminuée de 10 h dans le milieu YNB-Galactose additionné de NaCl 1, 5 M et de 107 h dans le milieu YNB-Galactose additionné de sorbitol 2,5 M. Il apparaît donc que l'expression de la protéine Td79b (WALI1), confère une tolérance accrue à un stress osmotique, et une faible augmentation de la tolérance à un stress ionique. L'expression de la protéine (WALI7) ne confère qu'une légère augmentation de la tolérance à un stress ionique. Levures recombinantes exprimant une LTP e INVScl-pYES2-ltpD2 Par rapport à celle des levures témoins, la phase de latence de la levure INVScl-pYES2-ltpD2 est écourtée de 50 h dans le milieu YNB-Galactose additionné de NaCl 1,5 M, et de 25 h en présence de sorbitol 2,5 M. 'INVScl-pYES2-ltp6. 48 La phase de latence de la levure INVScl-pYES2Jtp6\48 est écourtée de 50 h, par rapport à celle des levures témoins, en présence de NaCl 1,5 M. Elle ne diffère pas de celles des levures témoin en présence de sorbitol 2,5 M. Il apparaît donc que la tolérance au stress ionique est améliorée par l'expression de la protéine LTPD2 ou de la protéine LTP6.48. En revanche, seule l'expression de la LTPD2 confère une tolérance accrue à un stress osmotique. REVENDICATIONS 1) Utilisation d'au moins une molécule d'acide nucléique choisie parmi : a) une molécule d'acide nucléique codant pour une protéine LEA du groupe 2 dont la séquence polypeptidique possède au moins 70% d'identité ou 75% de similitude avec la séquence SEQ ID NO : 2 ; b) une molécule d'acide nucléique codant pour une protéine WALI dont la séquence polypeptidique possède au moins 70% d'identité ou 75% de similitude avec la séquence SEQ ID NO : 4 ; c) une molécule d'acide nucléique codant pour un précurseur de LTP ou une LTP mature dont la séquence polypeptidique possède au moins 70% d'identité ou 75% de similitude avec, respectivement, la séquence SEQ ID NO : 6 ou la séquence SEQ ID NO : 7 ; pour transformer une levure afin d'améliorer sa tolérance au stress froid. 2) Levure transformée par au moins une molécule d'acide nucléique telle que définie dans la revendication 1. 3) Levure transformée selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est en outre transformée par au moins une molécule d'acide nucléique choisie parmi : - une molécule d'acide nucléique codant pour une LEA du groupe 2 dont la séquence polypeptidique possède au moins 70% d'identité ou 75% de similitude avec la séquence SEQ ID NO : 9 ; - une molécule d'acide nucléique codant pour une protéine WALI dont la séquence polypeptidique possède au moins 70% d'identité ou 75% de similitude avec la séquence SEQ ID NO : 11 ; - une molécule d'acide nucléique codant pour un précurseur de LTP ou une LTP mature dont la séquence polypeptidique possède au moins 70% d'identité ou 75% de similitude avec, respectivement, la séquence SEQ ID NO : 13 ou la séquence SEQ ID NO : 14. 4) Levure transformée selon une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisée en ce que ladite levure appartient au genre Saccharomyces. 5) Levure transformée selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite levure appartient à l'espèce Saccharomyces cerevisiae. 6) Levain de panification, comprenant une levure transformée selon une quelconque des revendications 2 à 5. 7) Produit de boulangerie ou. de pâtisserie comprenant des levures transformées selon une quelconque des revendications 2 à 5.