Brevet FR2820756A1 — publié le 20020816

Incubateur et procédé d'incubation ménageant l'organisme mis à incuber La présente invention se rapporte aux incubateurs et aux procédés d'incubation d'organismes. Elle s'applique tout particulièrement pour mettre des embryons en culture et les surveiller dans des conditions de température et atmosphérique de développement les meilleures possibles. Les cultures embryonnaires sont exposées à de nombreux problèmes : - les chocs thermiques de 37 C à 20oC, - l'altération des propriétés nutritives, par les variations de température des milieux et acquisition de produits toxiques pour l'embryon, - les manipulations embryonnaires traumatiques, - les risques de contaminations bactériennes et mycologiques, - le changement tardif de milieux ce qui entraîne l'augmentation de la concentration de radicaux libres, - les erreurs de manipulation avec perte d'embryons. L'invention remédie à ces inconvénients par un incubateur et par un procédé d'incubation qui supprime les chocs thermiques et les risques de contaminations bactériennes et mycologiques tout en facilitant le changement de milieux et en l'automatisant de manière à diminuer les erreurs de manipulation et les manipulations traumatiques. L'invention a donc pour objet un incubateur comprenant une étuve étanche munie d'une porte, des moyens, commandés de l'extérieur de l'étuve, de déplacement pas à pas dans l'étuve d'une boîte de culture à plusieurs puits, une pipette, et des moyens, commandés de l'extérieur de l'étuve, destinés à faire pénétrer la pipette dans un puits en un emplacement donné et à l'en retirer. Suivant l'invention, un microscope est monté à l'intérieur de l'étuve de manière à observer l'emplacement, le microscope étant relié à un écran de visualisation se trouvant à l'extérieur de l'étuve. On n'a plus ainsi à sortir la boîte de culture pour sortir l'organisme, et notamment l'embryon, de son puits, en remplacer le milieu de culture et replacer l'embryon dans le puits. On peut maintenant, sans sortir l'embryon de l'incubateur, le sortir du puits dans lequel il se trouve pour le mettre dans un puits suivant empli d'un milieu de culture qui n'a pas encore été en contact avec un embryon et qui est donc exempt de toxines. Le passage de l'embryon d'un puits de culture au suivant peut s'effectuer d'une manière précise, bien que l'étuve reste fermée, grâce au microscope qui permet de surveiller les opérations sur l'écran de visualisation. On peut suivre l'évolution de l'organisme aussi souvent qu'on le souhaite sans que les opérations impliquées par ce suivi lui soient néfastes. On peut prévoir d'emplir à l'avance tous les puits de l'étuve de milieu de culture. Mais pour empêcher que le milieu de culture ne s'évapore ou ne se contamine avant même que l'embryon ait été placé dans le puits, on préfère que l'incubateur comprenne une source de milieu de culture communiquant avec un conduit à vanne débouchant au dessus d'un puits et des moyens de commande de la vanne de manière à déverser dans le puits une quantité prescrite du milieu de culture. La source de milieu peut être à l'extérieur de l'incubateur ou peut être prévue dans celui-ci. Juste avant que le puits en question doive recevoir l'embryon, on l'emplit du milieu de culture. De préférence, le conduit débouche au dessus du puits se trouvant audit emplacement, ce qui permet là encore de surveiller les opérations à l'aide du microscope. Suivant un autre mode de réalisation préféré également, le conduit débouche au dessus du puits juste en amont du puits se trouvant audit emplacement. On peut ainsi effectuer simultanément le remplissage de ce puits en amont et sortir l'embryon du puits se trouvant audit emplacement en l'aspirant à l'aide de la pipette. On dispose également de plus de place pour faire arriver le conduit au dessus du puits. L'invention vise également un procédé d'incubation d'un organisme qui consiste à mettre l'organisme dans un incubateur à incuber dans un puits de culture empli d'un milieu de culture et à changer n fois le milieu de culture, n étant un nombre entier supérieur à 1. On met l'organisme dans l'un d'une série de n + 1 puits enfermés dans l'incubateur, alors que les n autres puits de la série sont exempts de tout organisme mais emplis d'un milieu de culture et, sans sortir l'organisme de l'incubateur, on fait sortir successivement l'organisme du puits dans lequel il se trouve pour le mettre dans le puits suivant de la série. Toutes les opérations se font à l'intérieur de l'incubateur sous la surveillance du microscope et peuvent être commandées automatiquement par un ordinateur. Pour sortir l'embryon, on met la pipette dans le puits se trouvant à l'emplacement qu'observe le microscope, on aspire l'organisme, on sort la pipette du puits, on fait venir le puits suivant audit emplacement, on plonge la pipette dans ce nouveau puits, on relâche l'embryon de la pipette dans le puits et on retire la pipette du puits. La manipulation de l'embryon est ainsi très ménagée, assistée et voire automatisée, ce qui diminue beaucoup les dangers d'accidents et de traumatismes. Suivant une variante, on observe, de préférence souvent ou en continu, au microscope le virage de couleur du milieu de culture auquel on a ajouté un indicateur coloré, notamment de pH, par exemple du rouge phénol. On est ainsi averti du moment exact où il convient de changer de puits. On peut aussi, à l'effet de surveiller le virage de couleur, prévoir dans l'étuve un densitomètre optique à l'intérieur de l'étuve et des moyens pour amener le signal fourni par le densitomètre à l'extérieur de l'étuve, notamment des moyens acoustiques par une alerte. La figure unique du dessin annexé illustre l'invention uniquement à titre d'exemple. La vue schématique en coupe de l'incubateur suivant l'invention, représenté à la figure 1, montre qu'il comporte une étuve 1 étanche munie d'une porte 2 pouvant être fermée de manière étanche. A l'intérieur de l'étuve 1 est montée une bande 3 convoyeuse sans fin entraînée par un rouleau 4 moteur et passant sur un rouleau 5 de renvoi. Le rouleau 4 moteur est entraîné en rotation par un moteur 6 se trouvant à l'extérieur de l'étuve 1, mais pouvant être également prévu à l'intérieur de celle-ci, et qui, en l'espèce, est relié au rouleau 4 moteur par une ligne 7. Le moteur 6 pas à pas est commandé par un ordinateur 8 par l'intermédiaire d'une ligne 9 de commande. Sur le brin supérieur du convoyeur 3, est placé une boîte 10 de culture comprenant trois puits 11a, 11b et 11c. Le puits 11 a est en amont du puits 11 b dans le sens de déplacement F du convoyeur, tandis que le puits 11c est en aval. La boîte 10 est maintenue sur le convoyeur 3 par des contreforts 12 qui l'empêche de se déplacer de manière intempestive. Au dessus de l'emplacement où se trouve à la figure le puits 11 b, est monté fixe un microscope 13 qui est relié par une ligne 14 à un dispositif 15 de visualisation permettant de voir le puits 11 b se trouvant à cet emplacement. A ce même emplacement arrive également une pipette 16 commandée par l'ordinateur 8 par l'intermédiaire d'une ligne 17. L'ordinateur 8 est relié par une ligne 18 à une manette 19 permettant de commander la pipette et notamment de la descendre dans le puits se trouvant audit emplacement, en l'occurrence à la figure dans le puits 11b, ou de l'en faire sortir et permettant d'aspirer une partie du contenu du puits 11b ou de relâcher une partie de la pipette dans le puits qui se trouvera à cet emplacement. Sur une console 20 prévue à l'intérieur de l'étuve 2 est portée une bouteille 21 de milieu de culture qui, par un conduit 22 muni d'une vanne 23, débouche au dessus du puits 11 a ou, suivant une variante qui est représentée également à la figure, au dessus du puits 11b étant entendu que l'on utilise l'une de ces variantes, mais non pas les deux en même temps. Un densitomètre 24 optique à sonnerie de seuil permet de suivre la densité optique du milieu de culture du puits 11b. Pour mettre l'embryon en culture, on ouvre la porte 2 de l'étuve 1 et on le met dans le puits 11 c, empli de milieu de culture, dans l'étuve 1, alors que les puits 11 a et 11 b sont vides, étant entendu qu'ils pourraient aussi être déjà emplis de milieu de culture. On a donc une série de trois puits 11 a, 11 b et 11 c dont un seul contient un embryon. On referme la porte 2. On ne l'ouvrira plus jusqu'à ce que la culture soit terminée. On laisse l'embryon croître dans le puits 11c qui se trouve alors en dessous du microscope 13 avec possibilité, grâce à ce microscope et éventuellement au densitomètre 24, d'observer ce qui s'y passe et, le cas échéant, de décider du meilleur moment où il convient de changer le milieu de culture. On peut également décider de changer de milieu de culture après une durée déterminée. Lorsque l'on décide de changer de milieu de culture, on abaisse la pipette 16 dans le puits 11c, on fait passer par aspiration l'embryon du puits 11 c dans la pipette 16, on retire la pipette 16 du puits 11c et on fait avancer d'un pas le convoyeur 3 pour amener maintenant le puits 11b en regard du microscope 13 à l'emplacement où se trouvait auparavant le puits 11c. On abaisse ensuite la pipette 16 dans le puits 11 b pour obtenir la position représentée à la figure. On emplit le puits 11 b de milieu de culture à l'aide de la bouteille 21 du conduit 22 et de la vanne 23, si l'on n'avait pas déjà effectué cette opération auparavant, puis on abaisse la pipette 16 et on relâche l'embryon dans le puits 11b en observant sur le dispositif 15 de visualisation que ces opérations s'effectuent correctement. On retire ensuite la pipette 16 du puits 11b. On recommence ensuite les opérations qui viennent d'être indiquées, mais le puits 11 a prenant la place du puits 11 b et le puits 11 b jouant le rôle qu'avait joué auparavant le puits 11 c. Bien entendu, il est possible de modifier le dispositif de déplacement des puits en vue de les mettre à l'emplacement se trouvant sous le microscope 13, par exemple à l'aide d'un tourniquet ou autre. Et il est également possible de prévoir plusieurs séries de puits 11a, 11b et 11c avec un plus grand nombre de puits par série et un moyen propre de déplacement de chaque série de puits. REVENDICATIONS 1. Incubateur comprenant une étuve (1) étanche munie d'une porte (2), des moyens (3 à 6), commandés de l'extérieur de l'étuve (1), de déplacement dans l'étuve (1) d'une boîte (10) de culture à plusieurs puits (11a, 11b, 11c), une pipette (16) et des moyens (17 à 19), commandés de l'extérieur de l'étuve (1), destinés à faire pénétrer la pipette (16) dans un puits en un emplacement donné et à l'en retirer, caractérisé par un microscope (13) monté fixe à l'intérieur de l'étuve (1) et de manière à observer l'emplacement, le microscope (13) étant relié à un écran (15) de visualisation se trouvant à l'extérieur de l'étuve (1). 2. Incubateur suivant la revendication 1, comprenant une source (21) de milieu de culture communiquant avec un conduit (22) à vanne (23) débouchant au dessus d'un puits (11a) et des moyens (24) de commande de la vanne (23) de manière à déverser dans le puits une quantité prescrite du milieu de culture. 3. Incubateur suivant la revendication 2, caractérisé en ce que le conduit débouche au dessus du puits (11 b) se trouvant audit emplacement. 4. Incubateur suivant la revendication 2, caractérisé en ce que le conduit débouche au dessus du puits (11a) juste en amont du puits (11b) se trouvant audit emplacement. 5. Incubateur suivant l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend un densitomètre optique à l'intérieur de l'étuve et des moyens pour amener le signal fourni par le densitomètre, notamment des moyens acoustiques par une alerte, à l'extérieur de l'étuve. 6. Procédé d'incubation d'un organisme, qui consiste à mettre l'organisme dans un incubateur à incuber dans un puits de culture empli d'un milieu de culture et à changer n fois le milieu de culture, n étant un nombre entier supérieur à 1, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre l'organisme dans l'un d'une série de (n+1) puits enfermés dans l'incubateur, alors que les n autres puits de la série sont exempts de tout organisme mais emplis d'un milieu de culture et, sans sortir l'organisme de l'incubateur, à sortir successivement l'organisme du puits dans lequel il se trouve pour le mettre dans le puits suivant de la série. 7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce qu'il consiste à observer au microscope le virage de couleur du milieu de culture contenant un indicateur et contenu dans ledit un d'une série de (n+1) puits coloré et à changer de puits lors de ce virage. 8. Procédé suivant la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'il consiste à surveiller la densité optique dans l'incubateur et à changer de puits lorsque la densité optique dépasse un seuil prescrit.