Brevet FR2816322A1 — publié le 20020510

METHODE DE SEPARATION D'ACIDE NUCLEIQUE DIFFEREMMENT EXPRIME ENTRE UNE CELLULE CIBLE ET UNE CELLULE DE REFERENCE La présente invention a pour objet une méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible, notamment à caractère tumorale, et une cellule de référence. La présente invention concerne également une méthode d'identification desdits acides nucléiques différemment exprimés ainsi qu'une méthode de quantification de cesdits acides nucléiques. L'invention comprend enfin une méthode d'identification de gène susceptible d'être impliqué dans le processus tumoral de cellules de mammifère, notamment humaines. La physiologie cellulaire, telle que les cycles de régulation, la différenciation ou le développement d'une cellule, est dépendant du patrimoine génétique de la cellule et de l'expression de ses gènes. Ainsi tout changement dans l'expression de gène pour une cellule peut aboutir directement à la modification de sa physiologie et lui conférer un caractère responsable en particulier d'une régulation, d'une différenciation ou d'un développement anormal de cette cellule. Ainsi, la mise en évidence et la caractérisation de gène (s) différemment exprimé (s) entre une cellule présentant un caractère anormal et une cellule ne présentant pas ce caractère anormal apporteraient sans aucun doute des éléments déterminants pour la compréhension de ces mécanismes de dérégulation, ou de différenciation ou de développement anormal d'une cellule, notamment des processus de cancérisation, et accéléreraient la mise au point et la commercialisation de composés efficaces à l'encontre des pathologies induites par ces gènes différemment exprimés. Parmi les méthodes permettant de mettre en évidence une différence d'expression d'un ou de plusieurs gènes entre deux cellules, on peut citer par exemple la Méthode DSD d'analyse par soustraction différentielle (Differential Substraction Display Method) pour l'isolement d'ADNc de gènes différemment exprimés entre deux cellules (Pardinas et al., Anal. Biochem., 257,161-168, 1998). Dans cette méthode, décrite ici brièvement, l'ADNc monocaténaire obtenu à partir d'un échantillon d'ARNm totaux purifiés de cellule cible ou de référence, est amplifié par PCR combinatoire au moyen d'amorces de séquence arbitraire et en présence de nucléotides marqués, puis, après dénaturation, séparé par taille par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et autoradiographié. Après comparaison des gels obtenus pour chacun des échantillons cellulaires testés, les ADNc contenus dans une bande (-) de gel correspondant à des ARNs non-ou sous-exprimés, comparée à la bande équivalente de l'autre échantillon, sont prélevés, ré-amplifiés, marqués et utilisés comme matrice pour l'étape d'hybridation soustractive des ADNc prélevés sur la bande (+) équivalente de l'autre échantillon et ré-amplifiés. Les ADNc non soustraits, correspondant ainsi à des ARNs seulement ou surexprimés par un des échantillons sont séparés, de nouveau ré-amplifiés par PCR combinatoire puis clonés et/ou caractérisés. Si cette méthode soustractive permet d'éliminer une partie non négligeable des gènes dont l'expression est redondante dans les échantillons comparés, les étapes d'amplification et de ré-amplication par PCR combinatoire préalables à l'étape d'hybridation soustractive sont fastidieuses et ont tendance à privilégier l'amplification des ADNc initialement présents en grande quantité, en général redondants, dans les échantillons testés, au détriment des ADNc correspondant à des ARNs peu exprimés et rares qui peuvent être à la source du caractère anormale de l'échantillon étudié (cf. également Wan et al., Methods in Molecular Biology, Vol. 85, Chapt. 5, pp 45-68, 1997, Humana Press Inc., Edited by Liang, P. and Pardee, A. B. ). D'autre part, les étapes d'amplification et de ré-amplication par PCR combinatoire, préalables à l'étape d'hybridation soustractive, apportent généralement la génération de fragments d'ADNc de type faux-positifs. Parmi les méthodes permettant de mettre en évidence une différence d'expression de gènes, on peut citer également le document brevet américain publié sous le numéro US 5,882, 874 (Fisher ; Paul. B. ) qui décrit une méthode RDSD d'analyse par soustraction différentielle réciproque (Reciprocal Differential Substraction Display method, ) pour l'isolement d'ADNc de gènes différemment exprimés entre deux cellules à partir de deux banques phagiques d'ADNc (vecteur Lambda ZAP, Stratagene) représentatives des ARNs exprimées par ces deux cellules. Dans cette méthode, les deux banques phagiques d'ADNc sont soustraites réciproquement et sont ensuite transformées sous forme de deux banques de plasmides bactériens contenant les ADNc soustraits (excisés in vivo selon le protocole du fournisseur Stratagene). Ces ADNc plasmidiques, après purification, sont amplifiés par PCR combinatoire et les produits PCR obtenus sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel. Après comparaison des bandes obtenues pour et entre chacun des deux échantillons, les ADNc correspondant à des bandes différentes sont prélevés sur le gel, puis analysés et clonés. La méthode décrite dans ce document brevet comprend très certainement une étape de clonage des ADNc dans un vecteur phagique qui sera ensuite propagée pour obtenir une banque d'ADNc stable, puis, après soustraction réciproque de ces banques, une nouvelle étape de clonage des inserts d'ADNc excisés dans un vecteur plasmidique qui sera également propagée pour obtenir la banque d'ADNc soustraits. Une telle méthode, même si elle ne comprend pas d'étape de PCR combinatoire avant l'étape soustractive, comprend néanmoins une étape préalable de clonage et d'amplification (propagation) qui ne permet pas de s'assurer avec un minimum de précision de la quantité et de l'intégrité de l'ADNc issu des deux banques phagiques qui sera utilisé lors de l'étape soustractive, paramètres déterminants pour effectuer une étape soustractive pertinente quelles que soient la nature et la quantité des ARNs différemment exprimés que l'on désire séparer et caractériser. Ainsi, il existe aujourd'hui un grand besoin de disposer d'une méthode soustractive fiable et efficace de séparation et d'identification d'acides nucléiques différemment exprimés entre une cellule cible et une cellule de référence qui permet d'éviter toute étape préalable d'amplification par PCR ou par propagation in vivo des ADNc correspondant aux ARNs extraits de l'échantillon avant l'étape soustractive proprement dite. Il est souhaitable qu'une telle nouvelle méthode élimine également toute étape de manipulation préalable des ARN/ADNc telle que par hydrolyse en présence d'endonucléases de restriction suivie d'introduction artificielle (par ligation) d'adaptateurs compatibles avec le bout cohésif ou non cohésif des sites de coupure enzymatique. En effet de tels types d'adaptateur peuvent introduire des petites séquences oligonucléotidiques connues qui sont en générale utilisées pour hybrider des amorces pour les étapes d'amplification par PCR. L'utilisation de ces types d'adaptateurs caractérise de nombreux kits sur le marché (tel le kit AFLP Amplification Fragment Lenght Polymorphism commercialisé par la société Applied Biosystems ou les kits SMART commercialisés par la société CLONTECH). L"utilisation de ces enzymes de restriction est basée sur l'hypothèse que les ARNm contiennent tous le site de coupure enzymatique respectif Néanmoins, si cette hypothèse n'est exacte qu'à 90 %, 80 %, 70% ou moins, une telle manipulation préalable des ARN/ADNc introduirait un biais analytique de présélection qui écarterait une fraction non négligeable d'ARN de l'ensemble des ARNs cellulaires, et ainsi une méthode comprenant de telles manipulations préalables des ARN/ADNc ne refléterait pas la réalité de l'ensemble des ARNs exprimés. Une telle méthode devrait permettre d'aboutir à l'identification de gène impliqué dans des pathologies associées à l'expression anormale d'un gène, notamment les cancers, et à identifier ainsi des cibles thérapeutiques potentielles pour la recherche de nouveaux médicaments efficaces pour la prévention et/ou le traitement de ces pathologies. Ceci est justement l'objet de la présente invention. La présente invention a ainsi pour objet une méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence, caractérisée en ce ladite méthode comprend les étapes suivantes : a) la sélection d'un premier échantillon cible et d'un second échantillon de référence, lesquels échantillons contiennent respectivement un répertoire d'ARN issu de ladite cellule cible et de ladite cellule de référence ; b) la formation d'hétéroduplex de type ARN-ADNc (de type ARNm référence-ADNc référence) à partir d'une quantité donnée d'ARN contenu dans ledit échantillon de référence par polymérisation au moyen d'une réverse transcriptase ; c) l'élimination de l'ARN desdits hétéroduplex ARN-ADNc formés à l'étape b) ; d) la formation d'hétéroduplex de type ARN-ADNc (de type ARNm cible-ADNc référence) à partir de l'ADNc obtenu à l'étape c) par addition d'une quantité d'ARN de l'échantillon cible sélectionné à l'étape a) équivalente à la quantité donnée d'ARN de l'échantillon de référence utilisée à l'étape b) ; e) la séparation de l'ARN additionné à l'étape d) non hybridé des hétéroduplex de type ARN-ADNc obtenus à l'étape d) ; les ARNs non hybridés isolés à l'étape e) contenant les ARNs différemment exprimés entre ladite cellule cible et ladite cellule de référence. A l'étape b) de la présente méthode de l'invention, la formation d'hétéroduplex de type ARN-ADNc à partir d'une quantité donnée d'ARN de référence sera de préférence réalisée sur un aliquote de volume et de concentration connus (ou de quantité connue) en ARN, prélevé sur ledit échantillon de référence. Par acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence , on entend désigner un acide nucléique de type ARN, de préférence ARNm, dont la quantité exprimée par l'une desdites cellules est significativement différente de la quantité exprimée par l'autre desdites cellules, cette quantité pouvant être supérieure ou inférieure. Par acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence , on entend également désigner un acide nucléique de type ARN dont l'expression est mise en évidence uniquement pour l'une desdites cellules, notamment un ARN exprimé par l'une desdites cellules dont la séquence nucléique ne permet pas son hybridation sous forme d'hétéroduplex avec les ADNc correspondant aux ARNs de l'autre desdites cellules. Ledit ARN exprimé par l'une desdites cellules non hybridée sous forme d'un hétéroduplex peut correspondre à un ARN dont le gène n'est pas exprimé dans l'autre desdites cellules ou dont le gène comporte dans sa séquence une variation par rapport au gène correspondant dans l'autre desdites cellules, ladite variation étant suffisante pour empêcher l'hybridation. Par échantillon cible ou échantillon de référence , on entend désigner tout échantillon issu d'un prélèvement biologique susceptible de contenir des acides nucléiques de type ARN d'origine animale ou végétale, ou issus de micro-organisme (parasite, bactérie, levure, champignon ou virus), de préférence susceptible de contenir des ARNs de cellules eucaryotes, notamment de mammifère tel que l'Homme. On préférera en particulier les échantillons issus de fluide biologique (sang total, liquide amniotique, moelle osseuse,...), de tissu biologique ou biopsie, ou de cellules, notamment eucaryotes, prélevés directement sur l'organisme dont ils sont issus ou obtenus à partir de culture in vitro desdits tissus ou cellules (lignée cellulaire par exemple). De préférence, lesdits échantillon cible et échantillon de référence seront issus d'une fraction enrichie en ARN de ces prélèvements biologiques, de manière préférée d'une fraction contenant de l'ARN purifié, de préférence de l'ARN messager, à une concentration suffisante pour permettre de quantifier avec précision, de préférence avec une précision d'au moins 5 %, 2,5 %, 1 % ou 0,5 %, la quantité d'ARN contenue dans lesdits échantillons à l'étape a) et additionnée à l'étape d) de la méthode selon la présente invention, de manière préférée d'au moins 2 % soit 20 ng pour un échantillon contenant 1 ug d'ARN. Parmi les méthodes permettant de purifier à un taux ou à une concentration suffisant les ARNs, notamment les ARNs messagers (ou ARNm), à partir d'un échantillon biologique pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, on peut citer, mais sans s'y limiter, les méthodes d'extraction d'ARNs totaux suivies d'une méthode de purification par chromatographie d'affinité sur colonne oligo (dT)-cellulose (ou oligo (dU)-sephadex&commat;) pour les ARNm de mammifères ou suivies d'une méthode de purification par centrifugation sur gradient de chlorure de césium, comme par exemple celles décrites dans le document Sambrook et al. (Molecular cloning, A Laboratory Manual, Vol. 1, pages 7.3 à 7.29, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). D'une manière courante, on utilise des kits de séparation d'ARNm tels commercialisés par la société Qiagen (billes oligo (dT)). Parmi les méthodes permettant de quantifier à une précision suffisante la concentration d'ARN présente dans un aliquote d'une préparation d'échantillon d'ARN purifié, on peut citer, mais sans s'y limiter, la méthode de quantification d'ARN basée sur la lecture de la densité optique à 260 nm telle que décrite par exemple page 7.17 du document Sambrook et al. cité précédemment. Cependant, pour une précision plus grande l'on préfère utiliser la quantification des ARNs à l'aide de la technologie TaqMan (R) (PCR quantitative en temps réel). Cette technologie permet de mesurer avec une précision de l'ordre d'au moins 1 ng d'une part les ARNs totaux (constitués d'ARNs ribosomaux, d'ARNs messagers et d'ARNs de transport) et d'autre part les ARNm. La différence entre la valeur mesurée (pour un gène donné tel la p2 microglobuline) entre l'ARN total et l'ARNm témoigne de l'enrichissement en ARNm au détriment des ARNs ribosomaux. Les méthodes d'extraction et de purification d'ARN à partir d'échantillon biologique, ainsi que les méthodes de quantification d'ARN sont connues de l'homme de l'art qui saura choisir parmi ces méthodes d'extraction et de purification celles qui sont le mieux adaptées au type ou à la nature du prélèvement biologique dont seront issus les échantillons cibles et de référence, et choisir parmi ces méthodes de quantification d'ARN celle qui permettra d'obtenir la précision souhaitée pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention. Pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, il sera de préférence nécessaire de contrôler la qualité, telle que l'intégrité, des ARNs ainsi extraits et purifiés. Habituellement, après préparation des ARNs totaux ou messagers, le rendement quantitatif de ces préparations est obtenu par spectrophotométrie alors que le rapport d'absorbance optique à 260 et 280 nanomètres permet de juger de la qualité de ces préparations. Les méthodes usuelles employées pour contrôler l'intégrité des ARNs obtenus, pourront reposer sur une séparation de ces ARNs par électrophorèse sur gel d'agarose et sur l'inspection visuelle des bandes correspondant aux ARNs ribosomaux 28S et 18S. On peut également citer la technique permettant de contrôler l'intégrité des ARNm basée sur une séparation par électrophorèse sur gel telle que décrite pages 8.3 et 8.4 du document Sambrook et al. (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989). Par addition d'une quantité d'ARN équivalente à une quantité donnée d'ARN, on entend désigner l'addition d'une quantité égale à une quantité donnée d'ARN avec les incertitudes liées à la précision sur la concentration d'ARN déterminée par la méthode de quantification choisie, et celles liées à la précision sur la quantité d'ARN (en volume) prélevée et/ou additionnée. L'homme de l'art saura choisir parmi ces méthodes de quantification d'ARN et parmi les systèmes de manipulation de liquide ceux permettant d'obtenir la précision, la fiabilité et la reproductibilité voulues, à partir des notices techniques fournies par les fabricants ou à partir de tests d'étalonnage, de courbes comparatives et/ou de calculs statistiques qu'il effectuera si nécessaire. L'invention concerne de préférence une méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence selon l'invention, caractérisée en ce que lesdits ARNs non hybridés isolés à l'étape d) contiennent des ARNs surexprimés ou des ARNs dont l'expression est seulement détectable (ou mise en évidence) dans la cellule cible par rapport à la cellule de référence (gène seulement exprimé dans l'échantillon cible ou exprimé sous une forme différente telle qu'une séquence présentant un fragment tronqué ou supplémentaire, ou présentant un nombre de mutations ponctuelles important). Dans un mode de réalisation particulièrement préféré et pour obtenir à la fois les ARNm sur-exprimés et sous-exprimés dans une cellule cible par rapport à une cellule de référence, l'invention concerne une méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence selon l'invention, caractérisée en ce que ladite méthode comprend les étapes suivantes : a) la sélection d'un premier échantillon cible et d'un second échantillon de référence, lesquels échantillons contiennent respectivement un répertoire d'ARNm cible et d'ARNm référence issu de ladite cellule cible et de ladite cellule de référence ; b) la formation d'hétéroduplex de type ARNm référence-ADNc référence à partir d'une quantité donnée d'ARNm référence contenu dans ledit échantillon de référence et la formation d'hétéroduplex de type ARNm cible-ADNc cible à partir d'une quantité donnée d'ARNm cible contenu dans ledit échantillon cible par polymérisation au moyen d'une réverse transcriptase ; c) l'élimination de l'ARNm desdits hétéroduplex ARNm-ADNc formés à l'étape b) pour chacun des échantillons obtenus à l'étape b) ; d) la formation d'hétéroduplex de type ARNm-ADNc à partir de l'ADNc contenu dans l'échantillon pour chacun desdits échantillons obtenus à l'étape c) par addition : - dans l'échantillon obtenu à l'étape c) contenant l'ADNc correspondant à l'ARNm de l'échantillon cible, d'une quantité d'ARNm de l'échantillon de référence sélectionné à l'étape a) équivalente à la quantité donnée d'ARNm de l'échantillon cible utilisée à l'étape b), et - dans l'échantillon obtenu à l'étape c) contenant l'ADNc correspondant à l'ARNm de l'échantillon de référence, d'une quantité d'ARNm de l'échantillon cible sélectionné à l'étape a) équivalente à la quantité donnée d'ARNm de l'échantillon de référence utilisée à l'étape b) ; e) la séparation pour chacun des échantillons obtenus à l'étape d) de l'ARNm additionné à l'étape d) non hybridé des hétéroduplex de type ARNm-ADNc obtenus à l'étape d) ; les ARNm non hybridés isolés dans chacun des échantillons à l'étape e) contenant les ARNm différemment exprimés (sur-exprimés et sous-exprimés) entre ladite cellule cible et ladite cellule de référence. A l'étape b) de la méthode ci-avant selon l'invention, on entend désigner par l'expression la formation d'hétéroduplex de type ARN-ADNc pour chacun desdits échantillons la formation d'hétéroduplex de type ARN-ADNc dans un premier aliquote contenant une quantité donnée d'ARN issu dudit échantillon de référence et la formation d'hétéroduplex de type ARN-ADNc dans un deuxième aliquote contenant une quantité donnée d'ARN issu dudit échantillon cible, de préférence les quantités données d'ARN contenues dans les deux aliquotes sont égales. A l'étape b) de la méthode ci-avant selon l'invention, la formation des dits hétéroduplex est effectuée par polymérisation au moyen d'une réverse transcriptase et de préférence à l'aide d'amorces de type oligo dT, qui ne présélectionne aucun type particulier d'ARNm. Ainsi, ces hétéroduplex sont représentatifs de et reflètent la réalité biologique des échantillons considérés. A l'étape c), l'élimination de l'ARNm desdits hétéroduplex ARNm-ADNc formés à l'étape b), est de préférence réalisée par hydrolyse en présence de l'enzyme RNAse H, enzyme qui ne présélectionne aucun type particulier d'ARNm. Ainsi, on obtient des populations d'ADNc référence et d'ADNc cible représentatifs de l'état physiologique des cellules de référence et des cellules cibles. A l'étape d), la formation d'hétéroduplex de type ARNm référence-ADNc cible et ARNm cible-ADNc référence à partir de l'ADNc cible et de référence obtenus à l'étape c), est obtenue par addition croisée d'une quantité d'ARNm cible et d'ARNm de référence sélectionné à l'étape a), strictement équivalente à la quantité donnée d'ARNm de l'échantillon de référence/cible utilisée à l'étape b). L'invention concerne de préférence une méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence selon l'invention, caractérisée en ce que lesdits ARNs non hybridés isolés à l'étape e) contiennent : - dans les ARNs non hybridés isolés à partir de l'échantillon ayant contenu l'ARN de l'échantillon de référence à l'étape b), des ARNs surexprimés ou des ARNs dont l'expression est seulement détectable (ou mise en évidence) dans la cellule cible par rapport à la cellule de référence et, en outre - dans les ARNs non hybridés isolés à partir de l'échantillon ayant contenu l'ARN de l'échantillon cible à l'étape b), des ARNs surexprimés ou des ARNs dont l'expression est seulement détectable (ou mise en évidence) dans la cellule de référence par rapport à la cellule cible. Ainsi, dans la méthode ci-avant décrite, la succession des étapes a) jusqu'à l'étape e) aboutit à produire, à partir des deux échantillons ARNm référence et ARNm cible respectivement, quatre échantillons physiquement distincts : 1. un échantillon contenant les ARNm en excès dans la cible par rapport à la référence, 2. un échantillon contenant les ARNm en excès dans la référence par rapport à la cible, 3. un échantillon contenant les hybrides ARNm cible-ADNc référence, 4. un échantillon contenant les hybrides ARNm référence-ADN cible. Cette séparation physique des différents types d'ARNm dans les échantillons 1 à 4 présente les avantages suivants : i) les échantillons 1 et 2 contiennent l'ensemble des ARNm qui sont différemment exprimés entre une cellule cible et une cellule de référence, ii) les échantillons 3 et 4 contiennent l'ensemble des ARNm qui sont également exprimés dans la cellule cible et cellule de référence. La présente méthode ci-avant décrite qui constitue l'objet principal de l'invention présente l'avantage de sélectionner l'ensemble des acides nucléiques différemment exprimés dans un couple référence/cible. Plus particulièrement, la sélection desdits acides nucléiques différemment exprimés sont physiquement isolés, sans aucune étape préalable d'amplification par PCR, clonage, expression dans des phages, et sans aucune présélection telle quune hydrolyse par endonucléases de restriction. De plus, pour opérer une identification des gènes différemment exprimés, il apparaît logique de focaliser l'effort sur les échantillons 1 et 2 issus de ladite méthode selon l'invention (dénommée aussi GPI pour Gene Profil Identification ), et ceci indépendamment de la technologie utilisée pour l'identification (differential display PCR, utilisation des microarrays (telle la technologie Gene ChipTM commercialisée par la société Affymetrix)). L'invention concerne de préférence une méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence selon l'invention, caractérisée en outre en ce que lesdits ARNs hybridés sous la forme d'hétéroduplex de type ARN-ADNc isolés à l'étape e) contiennent des ARNs exprimés de manière similaire entre la cellule cible et la cellule de référence. Par ARNs exprimés de manière similaire , on entend désigner l'ensemble des ARNs exprimés par les deuxdites cellules et communs à ces deuxdites cellules. L'invention concerne de préférence une méthode de séparation selon l'invention, caractérisée en ce que à l'étape b), la formation desdits hétéroduplex de type ARNADNc par polymérisation au moyen d'une réverse transcriptase est initiée par des oligonucléotides de type oligo (dT), de manière plus préférée par des oligonucléotides de type oligo (dT) préalablement marqués à la biotine. L'invention concerne de préférence une méthode de séparation selon l'invention, caractérisée en ce qu'à l'étape b), l'ADNc desdits hétéroduplex de type ARN-ADNc est marqué. Parmi les marqueurs susceptibles d'être utilisés pour le marquage dudit ADNc des hétéroduplex de type ARN-ADNc, on peut citer en particulier, mais sans s'y limiter, la biotine. L'invention concerne de préférence une méthode de séparation selon l'invention, caractérisée en ce qu'à l'étape b), l'ADNc desdits hétéroduplex de type ARN-ADNc est marqué par la biotine. L'invention concerne de préférence une méthode de séparation selon l'invention, caractérisée en ce qu'à l'étape c), l'élimination dudit ARN desdits hétéroduplex ARNADNc formés est réalisée par digestion en présence de RNAse ou par traitement alcalin. Parmi les RNAse, on peut citer en particulier, mais sans s'y limiter : - la RNAse H. De préférence, l'élimination dudit ARN desdits hétéroduplex ARN-ADNc formés est réalisée à l'étape c) par digestion en présence de la RNAse H. L'invention concerne de préférence une méthode de séparation selon l'invention, caractérisée en ce qu'à l'étape e), la séparation dudit ARN non hybridé desdits hétéroduplex de type ARN-ADNc est réalisée en présence d'une phase solide capable de fixer spécifiquement lesdits hétéroduplex ARN-ADNc et le cas échéant les ADNc non hybridés à de l'ARN. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une méthode de séparation selon l'invention, caractérisée en ce qu'à l'étape e), la séparation dudit ARN non hybridé desdits hétéroduplex de type ARN-ADNc est réalisée par séparation magnétique au moyen de billes magnétique revêtues d'un composé capable de fixer spécifiquement lesdits hétéroduplex ARN-ADNc et le cas échéant les ADNc non hybridés à de l'ARN, de préférence ledit composé est capable de fixer la biotine et est choisi parmi les dérivés de l'avidine tels que la streptavidine. L'invention concerne de préférence une méthode de séparation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit répertoire d'ARN issu de ladite cellule cible et de ladite cellule de référence est une fraction purifiée d'ARN de cellule eucaryote ou procaryote. Par fraction purifiée d'ARN, on entend désigner une fraction comprenant essentiellement de l'ARN, dépourvue en particulier de protéines, d'ADN ou d'activité ARNasique susceptibles d'interférer sur la performance de la méthode selon l'invention. De préférence, ladite fraction purifiée sera à une concentration en ARN supérieure ou égale à la concentration obtenue pour une densité optique lue à 260 nm de 1, soit supérieure ou égale à environ 40 ug par ml, cette fraction pouvant être ensuite diluée à la concentration voulue pour obtenir la quantité donnée d'ARN utilisée à l'étape b) de la méthode selon l'invention. De préférence, lesdits échantillons cibles et de référence choisis sont des fractions purifiées à au moins 90 %, de manière plus préférée à au moins 95 % et 99 % en ARN. L'invention concerne de préférence une méthode de séparation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit répertoire d'ARN issu de ladite cellule cible et de ladite cellule de référence est une fraction purifiée d'ARNm. L'invention concerne de préférence une méthode de séparation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit répertoire d'ARN issu de ladite cellule cible et de ladite cellule de référence est une fraction purifiée d'ARN de cellule de mammifère ou de cellule de lignée cellulaire de mammifère. L'invention concerne de préférence une méthode de séparation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit répertoire d'ARN issu de ladite cellule cible et de ladite cellule de référence est une fraction purifiée d'ARN de cellule humaine ou de cellule de lignée cellulaire d'origine humaine. L'invention concerne de préférence une méthode de séparation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit répertoire d'ARN issu de ladite cellule cible est un répertoire d'ARN d'une cellule tumorale et en ce que ledit répertoire d'ARN issu de ladite cellule cible est un répertoire d'ARN d'une cellule normale. Sous un autre aspect, l'invention concerne également une méthode de séparation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit répertoire d'ARN issu de ladite cellule cible est un répertoire d'ARN d'une cellule présentant au moins un caractère tumoral non présenté par ladite cellule de référence. De préférence, ledit au moins caractère tumoral présenté par ladite cellule cible est choisi parmi le caractère migratoire, invasif ou prolifératif d'une cellule. L'invention concerne de préférence une méthode de séparation selon l'invention, caractérisée en ce que ladite cellule cible présentant au moins un caractère tumoral est choisie parmi une cellule de métastase, une cellule de tissu tumoral primaire, une cellule positive pour le marqueur CG117 ou une cellule de trophoblaste précoce. L'invention concerne de préférence une méthode de séparation selon l'invention, caractérisée en ce que ladite cellule de référence ne présentant pas au moins un caractère tumoral présenté par ladite cellule cible est choisie parmi une cellule normale, une cellule de tissu tumoral, une cellule négative pour le marqueur CG117 ou une cellule de trophoblaste tardif. Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet une méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence selon l'invention, caractérisée en ce que ledit acide nucléique différemment exprimé est obtenu, pour chacun des échantillons, sous forme d'ADNc et en ce que ladite méthode comprend en outre l'étape suivante : f) l'obtention d'ADNc correspondant auxdits ARNs non hybridés isolés à l'étape e) par polymérisation au moyen d'une réverse transcriptase en présence, de préférence, d'oligo (dT). L'invention concerne de préférence une méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence selon l'invention, caractérisée en ce que ladite méthode comprend en outre l'étape suivante : g) l'élimination de l'ARN de l'hétéroduplex de type ARN-ADNc obtenu à l'étape f). L'invention concerne de préférence une méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence selon l'invention, caractérisée en ce que ledit acide nucléique différemment exprimé est obtenu sous forme d'ADN bicaténaire et en ce que ladite méthode comprend en outre une étape de polymérisation de l'ADNc obtenu à l'étape f) ou g) en présence d'une ADN polymérase. Sous un autre aspect, l'invention a pour objet une méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence selon l'invention, caractérisée en ce que ladite méthode comprend en outre une étape h) d'amplification de l'ADNc obtenu à l'étape f) ou g) par réaction en chaîne en présence d'une ADN polymérase. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence, caractérisée en ce que ladite étape h) d'amplification de l'ADNc obtenu à l'étape f) ou g) est réalisée par une méthode de polymérisation en chaîne à la polymérase de type combinatoire (PCR combinatoire) ou par une méthode apparentée à la PCR combinatoire en présence d'amorces oligonucléotidiques aléatoires de type : Xi-X2-X3-...-Xn-oIigo (dN) ou oligo dégénéré pour les amorces sens ; et de type : Yi-Y2-Y3-...-Ym-oligo (dT) pour les amorces retours, dans lesquelles amorces, Xl, X2, X3,..., Xn, YI, Y2, Y3, et Ym représentent de manière indépendante un nucléotide choisi parmi A, T, G ou C, et les nombres n et m étant des entiers supérieurs à zéro, de préférence compris entre 1 et 15. De préférence, ledit nombre n est égal à 10 et m est égal à 2 ou 3. De préférence, les amorces oligonucléotidiques utilisées pour ladite PCR combinatoire sont marquées, de manière plus préférée en position 5'terminale, notamment en position 5'terminale des amorces retours des oligo (dt) de type combinatoire. Parmi les marqueurs que l'on pourra utiliser pour le marquage desdits oligonucléotides aléatoires, on préfère les marqueurs capables d'être détectés et/ou quantifiés directement ou indirectement par une méthode et/ou appareillage permettant de transformer la quantité de signal émis ou induit par ledit marqueur en un signal numérique représentatif de la quantité dudit produit d'amplification obtenu, de préférence par un marqueur de type radioactif, tels que le 32p, ou de type fluorophore (marqueur fluorescent) tels que par exemple les amidites fluorescentes 6F AM, TET, HEX, NED et VIC, les marqueurs fluorescents TAMRA, ROX, Cy3 et Cy5, ou tout autre marqueur connu de l'homme de l'art. Sous un autre aspect, l'invention comprend également une méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence selon l'invention, caractérisée en ce que ladite méthode comprend en outre à la fin de l'étape h) une étape i) de séparation des produits d'amplification obtenus pour chacun desdits échantillons, de préférence par électrophorèse sur gel de polyacrylamide ou d'agarose. De préférence, ladite étape i) de séparation des produits d'amplification sera suivie d'une étape j) de comparaison des bandes d'acides nucléiques ainsi séparées pour chacun desdits échantillons et d'identification d'une bande d'acide nucléique de nature et/ou d'intensité différente entre chacun desdits échantillons. Dans un mode de réalisation préféré, la séparation par électrophorèse et l'analyse des bandes ou fractions d'acides nucléiques ainsi séparées sera réalisée à l'aide d'un scanner de type FMBiolI (HITACHI) si les amorces oligonucléotidiques combinatoires sont marquées à l'aide de marqueur flourescent. De préférence, ladite étape j) de comparaison des bandes d'acides nucléiques et d'identification sera suivie d'une étape k) de ré-amplification des produits PCR contenus dans ladite bande d'acide nucléique de nature et/ou d'intensité différente ainsi identifiée. De préférence, l'étape k) de ré-amplification des produits PCR contenus dans ladite bande d'acide nucléique de nature et/ou d'intensité différente ainsi identifiée sera réalisée par PCR combinatoire, notamment en utilisant les couples d'amorces combinatoires de type : Xi-X2-X3-...-Xn-oligo (dN) ou oligo dégénéré pour les amorces sens ; et de type : YI-Y2-Y3-Y.-oligo (dt) pour les amorces retours, dans lesquelles amorces, Xl, X2, X3,..., Xn, YI, Y2, Y3, et Ym représentent de manière indépendante un nucléotide choisi parmi A, T, G ou C, et les nombres n et m étant des entiers supérieurs à zéro, de préférence compris entre 1 et 15. De préférence, ledit nombre n est égal à 10 et m est égal à 2 ou 3. De préférence également, ladite étape k) de ré-amplification des produits PCR contenus dans ladite bande d'acide nucléique de nature et/ou d'intensité différente ainsi identifiée pourra être réalisée par une méthode de type PCR en présence d'amorce dessinée à partir de la séquence au moins partielle de cesdits produits PCR. Ainsi, une telle méthode selon la présente invention comprendra après l'étape j) une étape de séquençage au moins partiel desdits produits PCR préalable à l'étape de réamplification de ces produits PCR. Sous un autre aspect, l'invention a pour objet une méthode de clonage et/ou d'expression d'un acide acide nucléique, ou d'un de ses fragments, différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence, caractérisée en ce que la méthode comprend les étapes suivantes : - l'obtention d'un ADNc, monocaténaire ou bicaténaire, différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence par une méthode de séparation selon la présente invention ; et - le clonage et/ou l'expression dudit ADNc dans une cellule procaryote ou eucaryote. Les méthodes clonage et/ou l'expression d'un ADNc dans une cellule sont aujourd'hui bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas développées ici. On pourra par exemple, mais sans s'y limiter, utiliser les méthodes standards explicitées dans l'ouvrage de Sambrook et A. (1989) cité précédemment. Sous un autre aspect, l'invention a pour objet une méthode d'identification de la séquence d'un acide nucléique, ou d'un de ses fragments, différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence, caractérisée en ce que la méthode comprend les étapes suivantes : A) la séparation et l'amplification d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence par une méthode selon la présente invention ; et B) e séquençage de la séquence du produit d'amplification obtenu à la fin de l'étape A). Les méthodes de séquençage sont aujourd'hui bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas développées ici. Parmi ces méthodes de séquençage d'acide nucléique, on peut citer, mais sans s'y limiter, la méthode de Sanger. L'invention concerne également une méthode d'identification de la séquence d'un acide nucléique, ou d'un de ses fragments, différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence, caractérisée en ce que la méthode comprend les étapes suivantes : A) la séparation et l'amplification d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence par une méthode selon la présente invention ; B) le séquençage d'au moins un fragment spécifique de la séquence du produit d'amplification obtenu à la fin de l'étape A) ; et C) la recherche dans des banques de données d'une séquence nucléique comprenant la séquence dudit au moins fragment spécifique identifié à l'étape B), ou comprenant une séquence présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 %, avec la séquence ou la séquence complémentaire dudit au moins fragment spécifique acide identifié à l'étape B). Par fragment spécifique de la séquence du produit d'amplification obtenu à l'étape A) , on entend désigner un fragment de ladite séquence de longueur suffisante pour permettre la recherche et l'identification de la séquence complète dont il est issu, et le cas échéant de sa fonction, dans des banques de données de séquences nucléiques. De préférence, lesdits fragments spécifiques auront une longueur d'au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence du produit d'amplification obtenu à l'étape A) de la méthode selon la présente invention, de manière plus préférée d'au moins 25,30, 35, 40,50, 75 ou 100 nucléotides consécutifs de ladite séquence. Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2 : 482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48 : 443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Nut !. Acad. Sci. USA 85 : 2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P). Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, BLAST 2 sequences (Tatusova et al.,"Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174 : 247-250) disponible sur le site http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/bl2. html, les paramètres utilisés étant ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres open gap penaltie : 5, et extension gap penaltie : 2 ; la matrice choisie étant par exemple la matrice BLOSUM 62 proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme. La présente invention comprend également une méthode d'identification d'une protéine, ou l'un de ses fragments, codé par un acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence, caractérisée en ce que la méthode comprend les étapes suivantes : - l'identification dudit acide nucléique, ou d'un de ses fragments, par une méthode selon l'invention ; - l'identification de ladite protéine, ou de l'un de ses fragments, par décodage dudit acide nucléique identifié à l'étape précédente. La présente invention comprend également une méthode d'identification d'un gène codant pour une protéine, ou un de ses fragments, différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence, caractérisée en ce que la séquence génomique dudit gène comprend la séquence de l'acide nucléique identifié par une méthode d'identification selon l'invention. De préférence, ledit gène ainsi identifié est un gène codant pour une protéine impliquée dans le caractère migratoire, invasif et/ou prolifératif d'une cellule telle qu'une cellule tumorale. Sous un dernier aspect, la présente invention a pour objet une méthode de quantification du produit de transcription, ou l'un de ses fragments, d'un gène différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence dans une cellule donnée, caractérisée en ce que la méthode comprend les étapes suivantes : A) l'identification d'un acide nucléique, ou d'un de ses fragments, différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence par une méthode selon la présente invention ; B) la sélection et, le cas échéant, la préparation d'un couple d'amorces ou d'une sonde dessinées à partir de ladite séquence identifiée à l'étape A) ; et C) la quantification dudit produit de transcription dans ladite cellule donnée par une méthode de quantification d'acide nucléique. Parmi les méthodes de quantification, on préfère les méthodes dites de PCR quantitative, notamment les méthodes dites de PCR quantitative en temps réel, ou par toute technique de PCR quantitative ou semi-quantitative bien connues de l'homme de l'art. Parmi les appareillages reposant sur lesdites méthodes de détection, on préfère en particulier les appareillages basés sur les technologies dites de PCR quantitative en temps réel, telles que la méthode dite Taqman. Deux sociétés fournissent à l'heure actuelle ce type d'appareillages : la société PE Biosystems (Poster City CA) pour les automates SDS 7700 et SDS 5700 et la société Roche pour l'automate (LIGHT CYCLER). Ces automates, en égale mesure, sont susceptibles d'effectuer la détection des marqueurs fluorescents tels que décrits précédemment. Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Légendes des figures : Figure 1 : Courbes TaqMan de contrôle de qualité TaqMan ARN total versus ARNm. Nombre de cycles d'amplification CT en fonction de la quantité en acide nucléique ARNm contenu dans un échantillon biologique. La figure 1 montre 4 courbes Taqman&commat; pour 4 échantillons notés ARN total 1, ARN total 2, ARN messager 1 et ARN messager 2 (les ARNm 1 et 2 ont été préparés à partir des ARN totaux 1 et 2), comme décrit dans l'exemple 1)). Pour chacun des 4 échantillons testés, la courbe représente la quantité de produit PCR marqué obtenu pour un fragment de 2 microglobuline, exprimée en quantité de signal de fluorescence détecté, en fonction du nombre CT de cycles d'amplification réalisés au moment de la détection. Figures 2A et 2B. Nombre de cycles d'amplification CT en fonction de la quantité en acide nucléique contenu dans un aliquote représentatif des diverses étapes de la méthode d'hybridation soustractive. La courbe CI représente la quantité relative d'ADNc sous forme d'hétéroduplex obtenue à la fin de l'étape b) de la méthode selon la présente invention. La courbe C2 représente la quantité relative d'ADNc monobrin obtenue à l'étape c). La courbe C3 représente la quantité relative d'ADNc non soustrait présent dans le surnageant après séparation magnétique à l'étape e). La courbe C4 représente la quantité relative d'ADNc non soustrait présent dans le surnageant à l'étape e) après RT-PCR. Ainsi, C4 inclut la quantité relative d'ADNc correspondant à C3 ainsi que la quantité relative d'ADNc issu d'ARNm non soustrait. La courbe C5 représente la quantité relative d'ADNc soustrait présent sur la phase solide magnétique après séparation magnétique à l'étape e). Figure 3. Image d'un film d'autoradiographie obtenu après le déroulement complet de la méthode d'hybridation soustractive, PCR combinatoire, séparation électrophorétique en gel d'acrylamide de 5 % et autoradiographie. Les bandes de migration électrophorétique verticales sont regroupées par paires T/NT (cellules Traitées (T) pour cellules cibles, cellules Non Traitées (NT) pour cellule de référence). Il y a plusieurs couples T/NT correspondant à des amplifications par PCR combinatoire avec des amorces distinctes Oligo N10 (dégénérées)-SC1, Oligo N10-SC2..... Oligo N10-SC16, selon la description matériels et méthodes. La figure 3 montre de nombreuses bandes distinctes (indiquées par des flèches) correspondant à des ARNm différemment exprimés entre les cellules cibles et les cellules de référence. EXEMPLE 1 : Matériels et méthodes A Préparation des extraits d'ARNs à partir d'un échantillon de cellules ou de tissu Al. Préparation des extraits d'ARNs totaux Les échantillons d'ARNs totaux sont préparés par la méthode basée sur la lyse des cellules avec l'isothiocianate de guanidine et une extraction des ARNs au phénol acide, comme décrit par Chormczinsky et Sachi (Chomczynski, P., et Sacchi, N. Single- step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem., 162 : 156-159, 1987) à l'aide de la solution RNA PLUS&commat; de la société Qbiogene (Appligene). a) A partir d'un échantillon de tissu On ajoute la solution de lyse RNA PLUS&commat; (2 ml pour 100 mg de tissu), dans chaque tube et l'on termine la lyse en broyant au Thurax pendant quelques secondes. b) A partir d'un échantillon de cellules Les cellules en suspension sont culottées (par centrifugation), puis lysées par addition de 2 ml de RNA PLUS&commat; pour 10 cellules. Pour les échantillons de tissu ou de cellules, on ajoute ensuite 200 u. I de chloroforme dans chaque tube contenant 2 ml de solution de lyse. Puis, on agite énergiquement les tubes (bouchon fermé) au vortex et on les laisse reposer 5 minutes sur la glace pilée Les étapes suivantes de centrifugation, récupération de la phase aqueuse, précipitation de l'ARN avec 1 volume d'alcool isopropylique et de rinçage à l'éthanol 70 %, sont réalisées selon le protocole RNA PLUS&commat; du fabricant Qbiogene. Le culot d'ARN total sec est repris dans 30 ul d'eau exempte de nucléase. Le tube est stocké dans un congélateur à la température de-20 C D'autres possibilités de préparation de l'ARN total peuvent être également utilisées ici comme, mais sans s'y limiter, les méthodes mettant en oeuvre des colonnes de résines échangeuses d'ions (Qiagen) ou des colonnes comprenant une matrice de silicates (Sigma-Genosys). A2. Préparation des extraits d'ARNs messagers Cette préparation se fait à partir des ARNs totaux obtenus en utilisant le kit Oligotexfg) mRNA Mini kit contenant les tampons OBB, OW2 et OEB, une solution d'Oligotex&commat;, des mini-colonnes, des tubes collecteurs. On applique le protocole du fabricant comme décrit ci-après brièvement : On préchauffe la solution d'Oligotex et le tampon OBB à 37 C, et le tampon OEB à 70 C. L'extraction est réalisée pour une quantité maximale d'ARNs totaux de 0,25 mg par colonne. Dans un tube de 2 ml sont ajoutés : - 0, 25 mg d'ARN total dans 250 ul d'eau exempte de nucléase ; - 250 gel de tampon OBB ; - 15 gel d'une solution d'Oligotex&commat; préalablement vortexée (agitée au moyen d'un vortex), pour mettre les billes en suspension. Le tube est mélangé par retournement et incubé pendant trois minutes à 70 C, puis laissé à température ambiante pendant dix minutes. Le tube est ensuite centrifugé pendant deux minutes à 14 000 trs/mn à la température de 20C Le surnageant est éliminé à l'aide d'une pipette Gilson Ph 000. Les billes sont remises en suspension dans 400 ul de tampon OW2. Le mélange billes plus tampon OW2, est déposé dans une mini-colonne du kit Oligotex&commat;, posée dans un tube collecteur de 1, 5 ml. On centrifuge pendant deux minutes à 14 000 trs/mn à la température de 20C Le tube collecteur est jeté et remplacé par un nouveau. Dans la colonne, les billes sont lavées avec 400 ul de tampon OW2 sous agitation. On centrifuge la colonne pendant deux minutes à 14 000 trs/mn à la température de 20 C, le tube collecteur est jeté et remplacé par un nouveau. Cette étape de lavage est répétée une deuxième fois. Les ARNs messagers sont élués de la colonne dans un tube collecteur propre avec 40 ul de tampon OEB comme suit : - 20 oil de tampon OEB (préchauffé à 70 C) sont déposés dans la colonne. Les billes sont remises en suspension à l'aide d'une pipette. La colonne est centrifugée pendant deux minutes à 14 000 trs/mn à la température de 20 C. Cette étape est répétée une fois ; - les 40ul d'éluat sont récupérés et déposés à nouveau dans la colonne. Les billes sont remises en suspension à l'aide d'une pipette. La colonne est centrifugée pendant deux minutes à 14 000 trs/mn à la température de 20 C. B Dosage de la pureté et de la quantité d'ARNs dans les échantillons B 1 Quantité et qualité de l'ARN total Après 24 heures de remise en suspension à-20 C, on mesure la concentration d'un aliquote d'ARN total sur un spectrophotomètre UV à 260 nm. (Absorbance = elc), en prenant comme référence de l'eau exempte de nucléase. D'autre part, on dépose 500 ng d'échantillon dans un gel d'agarose à 1 % en présence de bromure d'éthidium. Après migration, la qualité de l'ARN total est appréciée par la visualisation en illumination UV des bandes correspondant aux ARNs ribosomiques 18S et 28S. La solution d'ARN total, après aliquotage, est conservée à - 80 C. B2. Quantité et qualité de l'ARN messager : La concentration d'un aliquote d'ARN messager est déterminée par une mesure au spectrophotomètre UV à 260 nm en utilisant le tampon OEB pour référence. D'autre part, des quantités similaires d'ARN total et d'ARN messager (250 ng) sont déposées sur un gel d'agarose à 1 %, en présence de bromure d'éthidium. La qualité et la quantité de l'ARN messager sont appréciées par la visualisation en illumination UV. Les solutions d'ARNm sont conservées à-20 C. Un contrôle de qualité supplémentaire est réalisé au moyen de la technologie TaqMan (PCR quantitative en temps réel). Une quantité similaire (exprimée en ng/gl) d'ARN total et d'ARNm (250 ng ARN total et 250 ng ARNm) est utilisée pour une réaction de réverse transcription. L'ADNc complémentaire obtenu est utilisé pour une réaction PCR quantitative en temps réel, et à l'utilisation de la sonde Taqman ss2 microglobuline. On mesure l'enrichissement en ARNm, qui s'exprime par la différence dCT entre le nombre de cycles d'amplification cycle obtenu pour une valeur seuil de quantité de signal, CT treshold pour la courbe correspondant aux ARNt et celle correspondant aux ARNm (voir figure 1). B3 Prélèvement de l'aliquote d'ARN Les ARNs messagers des deux échantillons à étudier (référence et cible) sont ajustés à la même concentration. Chaque type d'ARN messager est aliquoté en deux exemplaires de volume égal, l'un utilisé pour la réverse transcription, l'autre (conservé à-80 C) pour l'hybridation réalisée ultérieurement. C) Formation des hétéroduplex ARN-ADNc Les deux ARNs messagers sont transcrits avec une enzyme réverse transcriptase et des oligo d (T) marqués à la biotine. En zone pré-PCR, sous une hotte à flux vertical, 20 ni de mélange réactionnel RT sont préparés, dans des tubes exempts de nucléases de 1, 5 ml à vis. Ce mélange réactionnel est composé par tube de : - 2 ul de dNTP à 10 mM (Pharmacia) ; - 8 gel de tampon 5X (Gibco BRL) ; - 4 oil de DTT à 0. 1 M (Gibco BRL) ; - 4 teil d'oligo d (T) marqués à la biotine à 29 uM (Genset) ; -2 ph d'enzyme Reverse Transcriptase Super Script II à 200 U/pl (Gibco BRL). Ce mélange réactionnel est utilisé pour transcrire 20 ul d'ARN messager. Un témoin négatif de réverse transcription est obtenu en remplaçant l'ARN messager par de l'eau exempte de nucléase. Les ARNs messagers sont ajoutés en dehors de la hotte, en zone pré-PCR. La synthèse est réalisée en incubant les tubes dix minutes à 23 C et une heure à 42 C. D) Elimination de l'ARN des hétéroduplex ARN-ADNc Une fois la synthèse d'ADNc terminée, 2 ul d'enzyme RNase H+ à 3,4 U/ l sont ajoutés au mélange réactionnel afin de dégrader les ARNs messagers et incubés pendant trente minutes à 37 C. L'enzyme RNase H+ est ensuite dénaturée par chauffage à 85 C pendant dix minutes. A cette étape, un prélèvement (Contrôle 1) est effectué pour suivre l'évolution des échantillons et déterminer la qualité de la manipulation : 1 um die chaque ADNc (cible et référence) est dilué dans 19 gel d'eau exempte de nucléase. Les tubes Contrôle 1 ADNc cible et Contrôle 1 ADNc référence sont stockés à-20 C. La purification de la réverse transcription n 1 est effectuée dans des tubes 2 ml à fond rond. Les ADNc cibles et de référence sont précipités pour éliminer les oligo d (T) en excès avec 1/lOème de volume d'une solution d'acétate de sodium 3M, pH 4,8 et 2,5 volumes d'éthanol absolu, dans les conditions suivantes : - incubation trente minutes à-20 C, puis centrifugation à 14 000 trs/mn (à +4 C) pendant trente minutes ; - les surnageants sont éliminés par aspiration et les culots sont rincés avec 500 ul d'éthanol à 70 % (refroidi à-20 C) en centrifugeant à 14 000 trs/mn (à +4 C) pendant dix minutes ; - les surnageants sont éliminés par aspiration et les culots sèchent à l'air libre pendant 2 minutes. E) Formation des hétéroduplex ARN-ADNc à partir des ADNc obtenus en D) Les hybridations sont réalisées en mélangeant l'ADNc obtenu précédemment avec l'ARN messager conservé issu de l'autre échantillon (mélange croisé). Les ARNs messagers cible et référence conservés à-80 C sont décongelés. Les culots d'ADNc cible et référence issus de la purification de la reverse transcription n 1 sont repris dans 20 al de tampon d'hybridation et 2 ul de RNase inhibitor sont ajoutés. L'ADNc resuspendu est transféré dans un tube PCR de 0,2 ml puis : - aux 20 ul de l'ADNc cible sont ajoutés 20 ul d'ARN messager référence, - aux 20 ul de l'ADNc référence sont ajoutés 20 ul d'ARN messager cible. Les hybridations sont réalisées dans un thermocycler qui permet d'obtenir un gradient régulier de température entre 70 C et 4 C, la température baissant de 5, 5 C toutes les heures pendant 12 heures. A la fin des hybridations un deuxième prélèvement (Contrôle 2) est effectué pour suivre l'évolution des échantillons et déterminer la qualité de la manipulation : 1 gel de chaque hétéroduplex est dilué dans 19 ul d'eau exempte de nucléase. Les tubes Contrôle 2 ADNc cible et Contrôle 2 ADNc référence sont stockés à-20 C. F) Séparation de l'ARN non hybridé des hétéroduplex ARN-ADNc obtenus en E) Les solutions d'hétéroduplex obtenes en E) contiennent un mélange composé d'ADNc en excès marqué à la biotine, de complexes ARNm-ADNc (marqué à la biotine), et d'ARNm en excès. La séparation est effectuée à l'aide de microbilles magnétiques porteuses de streptavidine, qui présente une affinité pour la biotine. L'accrochage aux billes streptavidine de tout matériel marqué à la biotine permet de récupérer dans le surnageant uniquement l'ARNm en excès. Le mode opératoire est le suivant : 150 III de billes streptavidine sont distribués dans quatre tubes de 1,5 ml. Les billes sont dans un premier temps lavées dans un tampon B & W (2X) et la solution de stockage des billes est éliminée par pipettage, les billes magnétiques étant retenues dans le tube par l'action d'un aimant (ce qui permet la séparation billes/surnageant), puis 150 III de tampon B & W (2X) sont ajoutés aux billes. Ce tampon est éliminé de la même façon. L'étape soustractive est réalisée en tampon B & W (IX). Un deuxième lavage des billes est effectué avec ce tampon, en diluant au demi le tampon B & W (2X) par de l'eau exempte de nucléase (75 III d'eau exempte de nucléase pour 75 III de tampon B & W (2X)). Dans un premier tube contenant les billes lavées, on ajoute : - 40 al de la solution d'hybridation contenant les hétéroduplex, -40 ph de tampon B & W (2X). Le tube est ensuite incubé 10 mn à température ambiante, puis 20 mn à 37 C. Dans un deuxième tube contenant les billes lavées, on ajoute les 80 III de surnageant récupéré à partir de ce premier tube à l'aide d'un aimant. Ce deuxième tube est incubé 10 mn à température ambiante, puis 20 mn à 37 C. Le surnageant contenant l'ARNm en excès est prélevé à l'aide d'un aimant et transféré dans des tubes de 2 ml. Les billes ayant fixé les hétéroduplex et l'ADNc en excès sont remises en suspension dans 40 ni de tampon. Sur les surnageants des deux échantillons, un troisième prélèvement (Contrôle 3) est effectué pour suivre l'évolution des échantillons et déterminer la qualité de la manipulation de la manière suivante : - 2 III de chaque soustraction sont dilués dans 18 ul d'eau exempte de nucléase. Les tubes Contrôle 3 ADNc cible (ARNm excès référence) et Contrôle 3 ADNc référence (ARNm excès cible) sont stockés à-20 C. L'ARNm contenu dans les surnageants des deux soustractions est précipité avec 1/lOème d'une solution d'acétate de sodium 3M, pH 4,8 et de 2,5 fois le volume en éthanol absolu, dans les conditions suivantes : - incubation trente minutes à-20 C, puis centrifugation à 14 000 trs/mn (à +4 C) pendant trente minutes ; - les surnageants sont éliminés par aspiration et les culots sont rincés avec 500 ul d'éthanol à 70 %, refroidi à-20 C en centrifugeant à 14 000 trs/mn (à +4 C) pendant dix minutes ; - les surnageants sont éliminés et les culots sèchent à l'air libre pendant 2 minutes. Puis le culot d'ARNm cible en excès et le culot d'ARNm référence en excès sont repris dans 20 u) de mélange réactionnel RT (Reverse Transcriptase) : - 2 gl de dNTP à 10 mM (Pharmacia) ; - 8 gel de tampon 5X (Gibco BRL) ; - 4 gel de DTT à 0,1 M (Gibco BRL) ; - 2 al d'une solution d'hexamère aléatoire ( random hexamer ) à 50 uM (PE Biosystems) ; - 1 al d'enzyme RNase inhibitor à 20 U/lll (PE Biosystems) ; d'enzyme Reverse Transcriptase à 200 U/ (Gibco BRL) ; - 2 ul d'eau exempte de nucléase. Ce mélange réactionnel est préparé dans un tube 1, 5 ml à vis sous la hotte et ajouté aux deux culots secs d'ARNm en excès. La transcription réverse est réalisée en incubant les tubes dix minutes à température ambiante et une heure à 42 C, puis les enzymes sont dénaturées à 100 C (ébullition) pendant dix minutes. A cette étape, un quatrième prélèvement (Contrôle 4) est effectué pour suivre l'évolution des échantillons et déterminer la qualité de la manipulation de la manière suivante : 1 um die chaque mélange réactionnel de la réverse transcription est dilué dans 19 gel d'eau exempte de nucléase. Les tubes Contrôle 4 ADNc des ARNm excès référence et Contrôle 4 ADNc des ARNm excès cible sont stockés à-20 C. Les billes streptavidine remises en suspension après la soustraction dans 40 gel de tampon, sont incubées à 100 C pendant 1 heure. C'est à partir du surnageant que le cinquième et dernier contrôle est effectué (Contrôle 5) de la manière suivante : - 1 pol de surnageant est dilué dans 19 ul d'eau exempte de nucléase. Les tubes Contrôle 5 ADNc référence et Contrôle 5 ADNc cible sont stockés à-20 C. G) PCR combinatoire Les ADNc en excès référence et cible à amplifier sont dilués au 1/5 avec de l'eau exempte de nucléase pour réaliser la PCR combinatoire. Le mélange réactionnel de 17, 5 ul est composé par tube de : - 9, 25 ul d'eau exempte de nucléase ; - 2 l de tampon Hot Start 10X ; - 2 l de dNTP (A, T, C, G) 2 mM ; - 0, 25 ul d'enzyme Hot Start à 5 U/ - 2 oil amorce F (sens) (deglO) à 10 pmol/ - 2 al amorce R (retour) (SC1 à 16 marqués au y33 P) à 10 pmol/ul. Les amorces SC1 à SC16 correspondent à la formule Y1-Y2-18 dT. 17, 5 ul de ce mélange réactionnel sont utilisés pour amplifier 2, 5 til d'ADNc en excès dilué au 1/5. Chaque ADNc est amplifié avec les 16 couples d'amorces. Un témoin négatif de PCR est ajouté, dans lequel les 2,5 al d'ADNc sont remplacés par le même volume d'eau exempte de nucléase. Le programme du thermocycler est le suivant : - 96C pendant 10 minutes ; - 95C pendant 1 minute, 46 C pendant 1 minute, 72 C pendant 1 minute : 40 cycles ; - 72C pendant 10 minutes. H) Electrophorèse en gel de polyacrylamide (Differential Display) pour la mise en évidence des bandes d'ADNc correspondant aux ARNs différemment exprimés On prépare un gel d'électrophorèse d'acrylamide 5 % entre 2 plaques de verre. Les plaques sont installées dans la chambre d'électrophorèse verticale, du tampon de migration (TBE IX) est ajouté dans les cuves supérieures et inférieures. Un préchauffage à 45 C du gel est nécessaire avant d'effectuer les dépôts. Les échantillons sont préparés pour le dépôt dans une plaque à 96 puits avec par puits : - 0, 4 ul de bleu 10X ; - 1, 2 ul de formamide ; - 2 l d'échantillon. La totalité du mélange est déposée sur le gel. On dépose côte à côte les amplicons provenant des deux échantillons à comparer réalisés avec le même couple d'amorce. La migration se fait à 3000 V (74 W) pendant 3 heures. Le gel est transféré sur papier Whatman, et séché. Puis le gel recouvert d'un film est posé en cassette d'autoradiographie. Sur le film et sur le papier avec le gel, on trace des marques, afin de permettre le repérage du film après le développement, après 24 h d'autoradiographie. Après le développement, on superpose le film et le gel, puis on découpe des portions de gel correspondantes à des bandes de PCR visualisées sur le film. Les bandes de gel sont dissoutes dans 50 u. l d'eau. La faible quantité de matériel ainsi prélevée est amplifiée par PCR à l'aide de la paire d'amorces utilisée lors de la première PCR combinatoire. I) PCR combinatoire et/ou séquençage des ADNc correspondant aux ARNs différemment exprimés mis en évidence par l'électrophorèse en gel (Differential Display) En zone pré-PCR, sous une hotte à flux vertical, 17 l de mélange réactionnel est réalisé, dans des tubes de 0,2 ml : -8,75 l d'eau nucléase free ; - 2 ul de tampon Hot Start 10X ; - 2 ul de dNTP (T) à 2 mM ; - 0, 25 ul d'enzyme Hot Start à 5 U/, ul ; - 2 gel amorce F (deglO) à 10 pmol/ul ; - 2 ni amorce SC à 10 pol/ Ce mélange réactionnel est utilisé pour amplifier les 3 ul d'ADN prélevé dans la bande d'intérêt. Un témoin négatif de PCR est ajouté, où les 3 ul d'ADN sont remplacés par le même volume d'eau exempte de nucléase. Les tubes sont déposés sur le bloc thermostatique du thermocycler. Le programme du thermocycler est le suivant : - 96C pendant 10 minutes ; - (95 C pendant 1 minute, 46 C pendant 1 minute) : 40 cycles ; - 72C pendant 10 minutes. J) PCR quantitative réalisée pour évaluer les quantités relatives d'ADNc présentes pour chacune des étapes testées (Courbes Cl, C2, C3, C4 et C5) Récapitulatif des échantillons : - Contrôle 1 ADNc cible ; - Contrôle 1 ADNc référence ; - Contrôle 2 ADNc cible ; - Contrôle 2 ADNc référence ; - Contrôle 3 ADNc cible (ARNm excès référence) ; - Contrôle 3 ADNc référence (ARNm excès cible) ; - Contrôle 4 ADNc des ARNm excès référence ; - Contrôle 4 ADNc des ARNm excès cible ; - Contrôle 5 ADNc cible ; et - Contrôle 5 ADNc référence. Les échantillons ne nécessitent pas de préparation particulière, aucune dilution n'est nécessaire. 1 oil de chaque contrôle seront utilisées pour la RT-PCR quantitative. Les échantillons sont quantifiés, en utilisant la sonde ss2 microglobuline, proportionnelle à la quantité d'ARNm présente dans l'échantillon. En zone pré-PCR, sous une hotte à flux vertical, 20 ul de mélange réactionnel RT-PCR sont préparés à partir du kit"TaqMan PCR Universal Master Mix", dans des tubes Optical de 0, 2 ml"TaqMan" (PE Biosystems). Le mélange réactionnel de 20 ul est composé par tube de : - 5 gel d'eau exempte de nucléase ; - 12, 5 ul d'Universal Master Mix ; - 0, 5 ul sonde ss2 microglobuline 10 mM ; - 1 l amorce F ss2 microglobuline 10 mM ; et - 1 l amorce R ss2 microglobuline 10 mM Ce mélange réactionnel est utilisé pour quantifier l'ADNc présent dans 5 ul de chaque contrôle. Les tubes sont fermés avec des bouchons en barrettes de type Optical "TaqMan", et sont déposés sur le bloc thermostatique de l'appareil"7700 Sequence Detector System" (PE Biosystems). Le programme du thermocycler est le suivant : - 50C pendant 2 minutes ; - 95C pendant 10 minutes ; - (95 C pendant 15 secondes, 60 C pendant 1 minute) x 40 cycles. On compare les données de chaque contrôle, ce qui permet de suivre l'évolution des concentrations d'ARNm au cours du processus analytique. EXEMPLE 2 : Résultats et interprétation 1 Les résultats à la figure 1 représentent la quantité de signal obtenue en fonction du nombre de cycles d'amplification CT pour les 4 échantillons testés notés ARN total 1, ARN total 2, ARN messager 1 et ARN messager 2 (les ARNm 1 et 2 ont été préparés à partir des ARNs totaux 1 et 2 respectivement) et permettent ainsi, pour une quantité de signal seuil déterminée, de comparer ici les quantités d'ARN (totaux et/ou messagers) contenus initialement dans les échantillons testés. La valeur dCT1 représentant la différence, exprimée en nombre de cycles d'amplification pour une quantité seuil de signal, entre la quantité d'ARN messager ss2 microglobuline contenue dans 1 lag d'ARN total 1 et celle contenue dans 1 u. g d'une préparation d'ARN messager 1 obtenue à partir de l'échantillon ARN total 1, est ici de 7,6. La valeur dCT2 représentant la différence entre la quantité d'ARN messager ss2 microglobuline contenue dans 1 u. g ARN total 2 et celle contenue dans 1 log une préparation d'ARN messager 2 obtenue à partir de l'échantillon ARN total 2, est ici de 7,56. La sonde ss2 microblobuline peut être considérée comme représentative pour l'ensemble des ARNm dans l'échantillon biologique. Les 2 échantillons d'ARNm sont de qualité très similaire (même enrichissement en ARNm à partir de l'extrait total, dCT1 = dCT2). D'autre part les échantillons ARN total 1 et 2, supposés avoir la même concentration en ARN, déterminée par exemple par densitométrie optique et l'absorbance à 260 nm, peuvent être si nécessaire rééquilibrés strictement à la même concentration à partir de la présente technique Taqman&commat; (pour obtenir deux courbes parfaitement superposables), technique qui est beaucoup plus précise et permettra ainsi d'équilibrer parfaitement les quantités d'ARN total 1 et 2, et ARN messager 1 et 2, pour les étapes suivantes de la méthode selon la présente invention. II La Figure 2A représente la quantité de signal obtenue en fonction du nombre de cycles d'amplification CT pour les 5 échantillons contrôle CI à C5 dans lesquels l'échantillon cible et de référence initial présente une quantité similaire d'ARNm de ss2 microglobuline. L'équation CI = C2 (très similaires, courbes pratiquement superposables)) et C3 = C4 (très similaires également) démontrent l'efficacité de la méthode soustractive. La Figure 2B représente la quantité de signal obtenue en fonction du nombre de cycles d'amplification CT pour les 5 échantillons contrôle CI à C5 dans lesquels l'échantillon cible contient un excès d'ARNm ss2 microglobuline par rapport à la référence. L'équation CI = C2 (très similaires) et C4 C3 (C4 très supérieur à C3) démontrent également l'efficacité de la méthode. L'échantillon C4 ainsi sélectionné et séparé contient les ARNm différemment exprimés entre l'échantillon cible et de référence. III La Figure 3 représente l'image du film d'autoradiographie obtenu après le déroulement complet de la méthode d'hybridation soustractive, PCR combinatoire, séparation électrophorétique en gel d'acrylamide de 5 % et autoradiographie. Les bandes de migration électrophorétique regroupées par paires T/NT (cellules Traitées (T) pour cellules cibles, cellules Non Traitées (NT) pour cellule de référence) montrent de nombreuses bandes distinctes (plus de 86 bandes distinctes sur le gel original), bandes distinctes correspondant à des ARNm différemment exprimés entre les cellules cibles et les cellules de référence. REVENDICATIONS 1/Méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence, caractérisée en ce que ladite méthode comprend les étapes suivantes : a) la sélection d'un premier échantillon cible et d'un second échantillon de référence, lesquels échantillons contiennent respectivement un répertoire d'ARN issu de ladite cellule cible et de ladite cellule de référence ; b) la formation d'hétéroduplex de type ARN-ADNc à partir d'une quantité donnée d'ARN contenu dans ledit échantillon de référence par polymérisation au moyen d'une réverse transcriptase ; c) l'élimination de l'ARN desdits hétéroduplex ARN-ADNc formés à l'étape b) ; d) la formation d'hétéroduplex de type ARN-ADNc à partir de l'ADNc obtenu à l'étape c) par addition d'une quantité d'ARN de l'échantillon cible sélectionné à l'étape a) équivalente à la quantité donnée d'ARN de l'échantillon de référence utilisée à l'étape b) ; e) la séparation de l'ARN additionné à l'étape d) non hybridé des hétéroduplex de type ARN-ADNc obtenus à l'étape d) ; les ARNs non hybridés isolés à l'étape e) contenant les ARNs différemment exprimés entre ladite cellule cible et ladite cellule de référence. 2/Méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdits ARNs non hybridés isolés à l'étape d) contiennent des ARNs surexprimés ou des ARNs dont l'expression est seulement détectable dans la cellule cible par rapport à la cellule de référence. 3/Méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite méthode comprend les étapes suivantes : a) la sélection d'un premier échantillon cible et d'un second échantillon de référence, lesquels échantillons contiennent respectivement un répertoire d'ARNm cible et d'ARNm référence issu de ladite cellule cible et de ladite cellule de référence ; b) la formation d'hétéroduplex de type ARNm référence-ADNc référence à partir d'une quantité donnée d'ARNm référence contenu dans ledit échantillon de référence et la formation d'hétéroduplex de type ARNm cible-ADNc cible à partir d'une quantité donnée d'ARNm cible contenu dans ledit échantillon cible par polymérisation au moyen d'une réverse transcriptase ; c) l'élimination de l'ARNm desdits hétéroduplex ARNm-ADNc formés à l'étape b) pour chacun des échantillons obtenus à l'étape b) ; d) la formation d'hétéroduplex de type ARNm-ADNc à partir de l'ADNc contenu dans l'échantillon pour chacun desdits échantillons obtenus à l'étape c) par addition : - dans l'échantillon obtenu à l'étape c) contenant l'ADNc correspondant à l'ARNm de l'échantillon cible, d'une quantité d'ARNm de l'échantillon de référence sélectionné à l'étape a) équivalente à la quantité donnée d'ARNm de l'échantillon cible utilisée à l'étape b), et - dans l'échantillon obtenu à l'étape c) contenant l'ADNc correspondant à l'ARNm de l'échantillon de référence, d'une quantité d'ARNm de l'échantillon cible sélectionné à l'étape a) équivalente à la quantité donnée d'ARNm de l'échantillon de référence utilisée à l'étape b) ; e) la séparation pour chacun des échantillons obtenus à l'étape d) de l'ARNm additionné à l'étape d) non hybridé des hétéroduplex de type ARNm-ADNc obtenus à l'étape d) ; les ARNm non hybridés isolés dans chacun des échantillons à l'étape e) contenant les ARNm différemment exprimés entre ladite cellule cible et ladite cellule de référence. 4/Méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence selon la revendication 3, caractérisée en ce que lesdits ARNs non hybridés isolés à l'étape e) contiennent : - dans les ARNs non hybridés isolés à partir de l'échantillon ayant contenu l'ARN de l'échantillon de référence à l'étape b), des ARNs surexprimés ou des ARNs dont l'expression est seulement détectable dans la cellule cible par rapport à la cellule de référence et, en outre - dans les ARNs non hybridés isolés à partir de l'échantillon ayant contenu l'ARN de l'échantillon cible à l'étape b), des ARNs surexprimés ou des ARNs dont l'expression est seulement détectable dans la cellule de référence par rapport à la cellule cible. 5/Méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en outre en ce que lesdits ARNs hybridés sous la forme d'hétéroduplex de type ARNADNc isolés à l'étape e) contiennent des ARNs exprimés de manière similaire entre la cellule cible et la cellule de référence. 6/Méthode de séparation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que à l'étape b), la formation desdits hétéroduplex de type ARN-ADNc par polymérisation au moyen d'une réverse transcriptase est initiée par des oligonucléotides de type oligo (dT). 7/Méthode de séparation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'à l'étape b), l'ADNc desdits hétéroduplex de type ARN-ADNc est marqué 8/Méthode de séparation selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'à l'étape b), l'ADNc desdits hétéroduplex de type ARN-ADNc est marqué par la biotine. 9/Méthode de séparation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'à l'étape c), l'élimination dudit ARN desdits hétéroduplex ARN-ADNc formés est réalisée par digestion en présence de RNAse ou par traitement alcalin. 10/Méthode de séparation selon la revendication 9, caractérisée en ce que la RNAse est une RNAse H. 11/Méthode de séparation selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'à l'étape e), la séparation dudit ARN non hybridé desdits hétéroduplex de type ARN-ADNc est réalisée en présence d'une phase solide capable de fixer spécifiquement lesdits hétéroduplex ARN-ADNc et le cas échéant les ADNc non hybridés à de l'ARN 12/Méthode de séparation selon la revendication 11, caractérisée en ce que à l'étape e), la séparation dudit ARN non hybridé desdits hétéroduplex de type ARNADNc est réalisée par séparation magnétique au moyen de billes magnétique revêtues d'un composé capable de fixer spécifiquement lesdits hétéroduplex ARN-ADNc et le cas échéant les ADNc non hybridés à de l'ARN 13/Méthode de séparation selon la revendication 12, caractérisée en ce que lesdites billes magnétiques sont revêtues d'un composé capable de fixer la biotine, de préférence la streptavidine. 14/Méthode de séparation selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que ledit répertoire d'ARN issu de ladite cellule cible et de ladite cellule de référence est une fraction purifiée d'ARN de cellule eucaryote ou procaryote. 15/Méthode de séparation selon la revendication 14, caractérisée en ce que ledit répertoire d'ARN issu de ladite cellule cible et de ladite cellule de référence est une fraction purifiée d'ARNm. 16/Méthode de séparation selon l'une des revendications 14 et 15, caractérisée en ce que ledit répertoire d'ARN issu de ladite cellule cible et de ladite cellule de référence est une fraction purifiée d'ARN de cellule de mammifère ou de cellule de lignée cellulaire de mammifère. 17/Méthode de séparation selon la revendication 16, caractérisée en ce que ledit répertoire d'ARN issu de ladite cellule cible et de ladite cellule de référence est une fraction purifiée d'ARN de cellule humaine ou de cellule de lignée cellulaire d'origine humaine. 18/Méthode de séparation selon l'une des revendications 16 et 17, caractérisée en ce que ledit répertoire d'ARN issu de ladite cellule cible est un répertoire d'ARN d'une cellule tumorale et en ce que ledit répertoire d'ARN issu de ladite cellule de référence est un répertoire d'ARN d'une cellule normale. 19/Méthode de séparation selon l'une des revendications 16 et 17, caractérisée en ce que ledit répertoire d'ARN issu de ladite cellule cible est un répertoire d'ARN d'une cellule tumorale présentant au moins un caractère tumoral non présenté par ladite cellule de référence. 20/Méthode de séparation selon la revendication 19, caractérisée en ce que ledit au moins caractère tumoral présenté par ladite cellule cible est choisi parmi le caractère migratoire, invasif ou prolifératif d'une cellule. 21/Méthode de séparation selon la revendication 20, caractérisée en ce que ladite cellule cible présentant au moins un caractère tumoral est choisie parmi une cellule de métastase, une cellule de tissu tumoral, une cellule positive pour le marqueur CG117 ou une cellule de trophoblaste précoce. 22/Méthode de séparation selon l'une des revendications 19 à 21, caractérisée en ce que ladite cellule de référence ne présentant pas au moins un caractère tumoral présenté par ladite cellule cible est choisie parmi une cellule normale, une cellule de tissu tumoral, une cellule négative pour le marqueur CG117 ou une cellule de trophoblaste tardif 23/Méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence selon l'une des revendications 1 à 22, caractérisée en ce que ledit acide nucléique différemment exprimé est obtenu sous forme d'ADNc et en ce que ladite méthode comprend en outre l'étape suivante : f) l'obtention d'ADNc correspondant auxdits ARNs non hybridés isolés à l'étape e) pour ledit ou chacun desdits échantillons, par polymérisation au moyen d'une réverse transcriptase, de préférence en présence d'oligo (dT). 24/Méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence selon la revendication 23, caractérisée en ce que ladite méthode comprend en outre l'étape suivante : g) l'élimination de l'ARN de l'hétéroduplex de type ARN-ADNc obtenu à l'étape f) pour ledit ou chacun desdits échantillons. 25/Méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence selon la revendication 23 ou 24, caractérisée en ce que ladite méthode comprend en outre une étape h) d'amplification de l'ADNc obtenu à l'étape f) ou g) par réaction en chaîne en présence d'une ADN polymérase pour ledit ou chacun desdits échantillons. 26/Méthode de séparation d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence selon la revendication 25, caractérisée en ce que ladite étape h) d'amplification de l'ADNc est réalisée par une méthode de polymérisation en chaîne à la polymérase de type combinatoire (PCR combinatoire), ou par une méthode apparentée à la PCR combinatoire, en présence d'amorces oligonucléotidiques aléatoires de type : Xi-X2-X3-...-Xn-oIigo (dN) ou oligo dégénéré pour les amorces sens ; et de type : YI-Y2-Y3-...-y m-oligo (dT) pour les amorces retours, dans lesquelles amorces, Xl, X2, X3,.., Xn, YI, Y2, Y3, et Ym représentent de manière indépendante un nucléotide choisi parmi A, T, G ou C, et les nombres n et m étant des entiers supérieurs à zéro, de préférence compris entre 1 et 15. 27/Méthode de séparation d'acide nucléique selon la revendication 26, caractérisée en ce que ledit nombre n est égal à 10 et m est égal à 2 ou 3. 28/Méthode de séparation d'acide nucléique selon la revendication 26 ou 27, caractérisée en ce que ladite méthode comprend en outre à la fin de l'étape h) une étape i) de séparation par électrophorèse sur gel des produits d'amplification obtenus pour chacun desdits échantillons. 29/Méthode de séparation d'acide nucléique selon la revendication 28, caractérisée en ce que ladite méthode comprend en outre à la fin de l'étape i), une étape j) de comparaison des bandes d'acides nucléiques ainsi séparées pour chacun desdits échantillons et d'identification d'une bande d'acide nucléique de nature et/ou d'intensité différente entre chacun desdits échantillons. 30/Méthode de séparation d'acide nucléique selon la revendication 29, caractérisée en ce que ladite méthode comprend en outre à la fin de l'étape j), une étape k) de ré-amplification des produits PCR contenus dans ladite bande d'acide nucléique de nature et/ou d'intensité différente ainsi identifiée. 31/Méthode d'identification de la séquence d'un acide nucléique, ou d'un de ses fragments, différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence, caractérisée en ce que la méthode comprend les étapes suivantes : A) la séparation et l'amplification d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence par une méthode selon l'une des revendications 25 à 30 ; et B) le séquençage de la séquence du produit d'amplification obtenu à la fin de l'étape A). 32/Méthode d'identification de la séquence d'un acide nucléique, ou d'un de ses fragments, différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence, caractérisée en ce que la méthode comprend les étapes suivantes : A) la séparation et l'amplification d'acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence par une méthode selon l'une des revendications 25 à 27 ; B) le séquençage d'au moins un fragment spécifique de la séquence du produit d'amplification obtenu à la fin de l'étape A) ; et C) la recherche dans des banques de données d'une séquence nucléique comprenant la séquence dudit au moins fragment spécifique identifié à l'étape B), ou comprenant une séquence présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec la séquence ou la séquence complémentaire dudit au moins fragment spécifique identifié à l'étape B). 33/Méthode d'identification d'une protéine, ou l'un de ses fragments, codé par un acide nucléique différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence, caractérisée en ce que la méthode comprend les étapes suivantes : - l'identification dudit acide nucléique, ou d'un de ses fragments, par une méthode selon la revendication 31 ou 32 ; - l'identification de ladite protéine, ou de l'un de ses fragments, par décodage dudit acide nucléique identifié à l'étape précédente. 34/Méthode d'identification d'un gène codant pour une protéine, ou un de ses fragments, différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence, caractérisée en ce que la séquence génomique dudit gène comprend la séquence de l'acide nucléique identifié par une méthode selon l'une des revendications 31 et 32. 35/Méthode de quantification du produit de transcription, ou l'un de ses fragments, d'un gène différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence dans une cellule donnée, caractérisée en ce que la méthode comprend les étapes suivantes : A) l'identification d'un acide nucléique, ou d'un de ses fragments, différemment exprimé entre une cellule cible et une cellule de référence par une méthode selon la revendication 31 ou 32 ; B) la sélection et, le cas échéant, la préparation d'un couple d'amorces ou d'une sonde dessinées à partir de ladite séquence identifiée à l'étape A) ; et C) la quantification dudit produit de transcription dans ladite cellule donnée par une méthode de quantification d'acide nucléique.