Brevet FR2812004A1 — publié le 20020125

MILIEUX DE CULTURE POUR FECONDATION IN VITRO, OU POUR LA CULTURE DE FOLLICULES, CELLULES GERMINALES MALES OU EMBRYONS La présente invention a pour objet des compositions utilisables en tant que milieux de culture pour follicules en cours de développement ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ainsi que pour la fécondation in vitro et le développement d'embryons, et plus particulièrement d'embryons de mammifères, notamment d'embryons humains, éventuellement congelés. Après maturation du follicule de De Graaf, l'ovulation permet à l'ovocyte de passer dans la trompe de Fallope pour y être éventuellement fécondé. L'embryon qui en résulte y demeure 3 à 5 jours pour se développer et atteindre les stades morula, puis blastocyste. Dans la trompe, les gamètes, l'embryon, la morula, puis le blastocyste sont environnés par le fluide tubaire. La composition de ce dernier est complexe : elle associe les composants fondamentaux du milieu intérieur de la mère à ceux du liquide folliculaire, et elle ne semble pas subir d'importants changements qualitatifs au cours des premiers jours de la phase post-ovulatoire. Parvenu au stade blastocyste, l'embryon passe dans l'utérus dont la muqueuse a alors atteint un état de développement favorable pour l'implantation et la nidation de l'#uf. Le passage de l'embryon dans l'utérus ne s'effectue que lorsque l'un et l'autre sont parvenus au niveau de développement physiologique compatible avec l'implantation et la nidation : stade blastocyste pour l'embryon, endomètre proche de sa phase sécrétoire pour l'utérus. Dans le cas de l'assistance médicale à la procréation, ces conditions physiologiques suggèrent un milieu de culture unique et constant, et non pas séquentiel comme il en existe actuellement, associant tous les éléments nécessaires au développement, de la fécondation in vitro, éventuellement consécutive à l'ICSI (intra cytoplasmic sperm injection, ou injection intracytoplasmique de spermatozoïdes), jusqu'au transfert de l'embryon. La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs de compositions constantes utilisables aussi bien pour la culture de follicules ou de cellules de la lignée germinale mâle, que pour la fécondation de l'ovocyte et le développement de l'embryon jusqu'au stade blastocyste, et ce avec des rendements comparables, voire supérieurs, à ceux obtenus avec les compositions actuellement sur le marché. La présente invention a pour objet des compositions pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdites compositions étant caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins deux facteurs de croissance (encore désignés GF, growth factors), tels que des facteurs de croissance humains recombinants, avantageusement en association avec au moins un composé de la famille des corticoïdes impliqués dans la production énergétique chez les mammifères, et plus particulièrement de la famille des glucocorticoïdes, tel que l'hydrocortisone ou un dérivé de la même famille, de préférence sous une forme soluble en milieu aqueux, et, le cas échéant, en association avec au moins un coenzyme clé du métabolisme énergétique, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH. Avantageusement, les facteurs de croissance contenus dans les compositions de l'invention appartiennent à la famille des cytokines. Les hormones et les facteurs de croissance sont présents à des concentrations équilibrées, compatibles avec les conditions physiologiques. Les compositions de l'invention apportent aux cellules en croissance et en différenciation les molécules régulatrices dont elles ont impérativement besoin. Ainsi, ces compositions sont susceptibles de permettre la maturation des ovocytes humains immatures cultivés en présence de cellules folliculaires, ainsi que la maturation des cellules de la lignée germinale mâle. Elles peuvent aussi assurer le développement de l'embryon humain jusqu'au stade blastocyste. Or, ce stade a un plus fort pourcentage d'implantation dans l'utérus que lorsque le transfert de l'embryon a lieu à un stade moins avancé, notamment aux stades de deux à environ huit cellules. L'invention a plus particulièrement pour objet les compositions susmentionnées comprenant au moins deux facteurs de croissance choisis parmi : - le facteur de croissance hépatique, encore désigné HGF (hepatocyte growth factor), - le facteur de croissance de transformation a, encore désigné TGFa (transforming growth factor), - le facteur de stimulation de colonies de granulocytes et de macrophages, encore désigné GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor), - le facteur épidermique de croissance, encore désigné EGF (epidermal growth factor) et/ou HB-EGF (heparin-binding epidermal growth factor), - les facteurs de croissance et de différenciation, encore désignés GDF (growth differenciationfactors), tels que le GDF-9, - les facteurs de croissance semblables-à-l'insuline, encore désignés IGF (insulinelike growth factors), tels que l'IGF-1et/ou l'IGF-2. Avantageusement, les compositions de l'invention contiennent au moins trois facteurs de croissance choisis parmi ceux listés ci-dessus. Des compositions particulièrement préférées contiennent au moins de l'IGF-1 et/ou de l'IGF-2. De préférence encore, les compositions susmentionnées de l'invention comprennent tous les facteurs de croissance susmentionnés. De préférence, les concentrations en facteurs de croissance et de différenciation dans les compositions susmentionnées de l'invention sont comprises entre environ 0,25 g/L et environ 60 g/L, notamment entre environ 0,5 g/L et environ 50 g/L. Avantageusement les concentrations des facteurs de croissance et de différenciation contenus dans les compositions de l'invention sont telles que : - la concentration d'EGF est d'environ 40 g/L à environ 60 g/L, notamment d'environ 50 g/L, - la concentration de TGFa est d'environ 20 g/L à environ 30 g/L, notamment d'environ 25 ug/L, - la concentration d'HGF est d'environ 40 g/L à environ 60 g/L, notamment d'environ 50 g/L, - la concentration de GM-CSF est d'environ 0,25 g/L à environ 0,75 g/L, notamment d'environ 0,5 g/L, - la concentration de GDF-9 est d'environ 4 g/L à environ 6 g/L, notamment d'environ 5 g/L, - la concentration de IGF-1 est d'environ 0,25 g/L à environ 0,75 g/L, notamment d'environ 0,5 g/L, - la concentration de IGF-2 est d'environ 0,5 g/L à environ 1,5 g/L, notamment d'environ 1 g/L. L'invention a également pour objet les compositions susmentionnées pour culture in vitro, comprenant un composé de la famille des corticoïdes tel que défini ci-dessus, et de préférence de l'hydrocortisone. Avantageusement, l'hydrocortisone susmentionnée se présente sous forme de sel hydrosoluble, notamment sous forme d'hémisuccinate d'hydrocortisone. De préférence, la concentration du sel d'hydrocortisone dans les compositions susmentionnées, est comprise entre environ 5 x 10-7 M et environ 10-6 M, et est notamment d'environ 7 x 10-7 M, soit environ 350 g/L pour l'hémisuccinate d'hydrocortisone. Avantageusement, les compositions définies ci-dessus contiennent des coenzymes clé du métabolisme énergétique susmentionnés, notamment à des concentrations telles que : - la concentration de NAD/NADH soit d'environ 1 mg/L, - la concentration de NADP/NADPH soit d'environ 1 mg/L. L'invention concerne également les compositions définies ci-dessus se présentant sous forme de lyophilisât, à savoir sous forme de compositions dont les différents constituants sont amenés à l'état sec, et sont susceptibles d'être remis en solution en gardant leurs propriétés physico-chimiques et biologiques. A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet les lyophilisats susmentionnés, contenant : - au moins deux facteurs de croissance tels que définis ci-dessus, ou la totalité de ces facteurs, - au moins un composé de la famille des corticoïdes défini ci-dessus, tel que l'hémisuccinate d'hydrocortisone, - et, le cas échéant, au moins un coenzyme clé du métabolisme énergétique défini ci-dessus, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH. L'invention a également pour objet l'application des compositions ou lyophilisats susmentionnés, en tant qu'adjuvants effecteurs pour la préparation de milieux de culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits milieux de culture in vitro comprenant une composition telle que définie ci-dessus, en association avec les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant choisis notamment parmi la sérum albumine humaine, ou bovine, le cas échéant recombinantes, et/ou les sels minéraux, et/ou les molécules énergétiques telles que le glucose, le pyruvate, et le lactate, et/ou les aminoacides pour la biosynthèse des protéines, et/ou les bases puriques et pyrimidiques pour la biosynthèse des acides nucléiques, et/ou des phospholipides ou du cholestérol pour la formation des membranes cellulaires, et/ou des vitamines, telles que des vitamines du groupe B, notamment la vitamine B5 (pantothènate), la vitamine B8 (biotine), la vitamine B1 (thiamine) et/ou de la vitamine C. L'invention concerne également un procédé de préparation de milieux de culture in vitro définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mélange d'une composition telle que définie ci-dessus, le cas échéant après dissolution dans un volume approprié d'une composition susmentionnée sous forme de lyophilisat, avec une solution contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant tels que définis ci-dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet les milieux de culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits milieux étant tels qu'obtenus par mise en #uvre d'un procédé susmentionné, et étant caractérisés en ce qu'ils comprennent une composition telle que définie ci-dessus, en association avec les éléments susmentionnés utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons. L'invention concerne également un procédé de développement d'embryons de mammifères, et plus particulièrement d'embryons humains, le cas échéant après décongélation d'embryons préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro desdits embryons, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, de préférence pendant les 6 premiers jours suivant la fécondation in vitro, le cas échéant après décongélation, avantageusement de manière à obtenir des embryons au stade de blastocystes. L'invention a également pour objet un procédé de maturation des follicules de mammifères en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, et plus particulièrement de follicules humains, le cas échéant après décongélation de follicules préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro de follicules prélevés chez la femelle, et plus particulièrement chez la femme, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, avantageusement pendant environ 3 jours à environ 6 jours. L'invention concerne également un procédé de maturation de cellules de la lignée germinale mâle de mammifères, et plus particulièrement humaines, le cas échéant après décongélation de cellules préalablement congelées, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro desdites cellules, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, avantageusement pendant environ 3 jours à environ 5 jours. L'invention a également pour objet un procédé de fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, et plus particulièrement d'ovocytes et de spermatozoïdes d'origine humaine, le cas échéant après décongélation des spermatozoïdes préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro des ovocytes et spermatozoïdes susmentionnés, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, avantageusement pendant environ 2 jours à environ 6 jours. Avantageusement, les compositions de l'invention peuvent être utilisées à la fois pour la maturation des ovocytes ou celle des cellules de la lignée germinale mâle, la fécondation in vitro des ovocytes, et la maturation des embryons issus de ladite fécondation, notamment jusqu'au stade de blastocyste, éventuellement après décongélation des follicules, des cellules mâles, ou des embryons. L'invention a également pour objet un kit (ou trousse) pour la préparation extemporanée d'un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, notamment dans le cadre de la mise en #uvre d'un procédé susmentionné, ce kit comprenant : - une composition sous forme de lyophilisat, telle que décrite ci-dessus, - et, le cas échéant, une solution aqueuse contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, tels que les éléments définis ci-dessus, notamment un milieu commercial tel que le milieu Upgraded B9 de CCD. La présente invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit d'exemples de milieux de culture selon l'invention. A titre de solution aqueuse telle que définie ci-dessus, le milieu de culture Upgraded B9 CCD disponible commercialement comprend principalement les composés suivants : - des sels minéraux : KCI, NaCl, MgS04, NaHC03, Na2HP04, KH2P04, - les acides aminés essentiels, ainsi que d'autres acides aminés tels que l'acide glutamique, la glycine, la taurine, la cystéine et la glutamine, - des oses et dérivés métaboliques, tels que glucose, pyruvate, lactate, acétate, - des vitamines, notamment des vitamines du groupe B et de la vitamine C, - des bases puriques et pyrimidiques, - des antibiotiques : pénicilline G, streptomycine. Formule n l Dans cette formule, le milieu de culture Upgraded B9 CCD correspondant à la solution aqueuse définie ci-dessus, éventuellement additionné d'insuline humaine (notamment d'insuline recombinante à raison de 5 mg/L, sur la base de 1mg = 25 U), est complété par le lyophilisat contenant : - de l'hémisuccinate d'hydrocortisone (7 x 10-7 M, soit 350 g/L), - des facteurs de croissance humains recombinants : EGF (50 g/L), TGFa (25 ug/L), HGF (50 ug/L), GM-CSF (5 g/L), GDF-9 (5 g/L), - du NAD/NADH (lmg/L) et du NADP/NADPH (lmg/L). Formule n 2 Dans cette formule, le milieu de culture Upgraded B9 CCD, contenant éventuellement de l'insuline humaine, est complété par le lyophilisat contenant : - de l'hémisuccinate d'hydrocortisone (7 x 10-7 M, soit 350 g/L), - des facteurs de croissance humains recombinants : EGF (50 ug/L), TGFa (25 ug/L), HGF (50 g/L), GM-CSF (5 ug/L), GDF-9 (5 g/L), - IGF-1 (0,5 g/L), IGF-2 (1 g/L), - et du NAD/NADH (Img/L) et du NADP/NADPH (Img/L). A) PREPARATION D'UN MILIEU DE CULTURE POUR LES APPLICATIONS SUSMENTIONNEES SELON LA FORMULE N l Le milieu de culture doit être préparé extemporanément par mélange de deux flacons : - un flacon A, qui se présente sous la forme d'une solution d'un volume de 10 ml et qui contient le milieu Upgraded B9 dans lequel est éventuellement dissoute l'insuline; - un flacon B, qui se présente sous la forme d'un lyophilisat et qui contient l'hémisuccinate d'hydrocortisone et les facteurs de croissance, le NAD/NADH et le NADP/NADPH. Au moment de l'emploi, reprendre le lyophilisat du flacon B par un faible volume ( 0,5 ml) de la solution du flacon A. Transférer le contenu du flacon B ainsi dissous dans le flacon A. Homogénéiser. Cette opération dilue donc au dixième la concentration initiale des constituants du flacon B. Fabrication du flacon A Dans le cas de l'addition d'insuline, il convient de préciser qu'à l'état cristallin, les molécules d'insuline sont unies entre elles par des forces intermoléculaires qui ne se rompent qu'en milieu acide. Pour être mise en solution aqueuse, l'insuline doit donc être dissoute à pH 3 (HCI 0,1 N). Le pH de la solution est ensuite amené à 7,5 (NaOH O,1N); cette opération doit être effectuée le plus rapidement possible, afin d'éviter des altérations de la molécule. Un léger précipité peut apparaître à pH5 ; se redissout ensuite. Préparer une solution à 100 U/ml. Ajouter la solution d'insuline au milieu Upgraded B9, dans les proportions de 1,25 ml pour 1 L, respectivement. Répartir en flacons de 10 ml qui seront fermés. Conserver la solution à +4 C. Le bulletin analytique de l'insuline, comportant, entre autres, l'activité et, éventuellement, les tests de sécurité, doit être joint ; celui-ci doit être communiqué par le fournisseur de l'insuline. Fabrication du flacon B Une solution aqueuse préparée extemporanément contenant l'hémisuccinate d'hydrocortisone et les facteurs de croissance est répartie dans des flacons de 1ml, de telle façon que chaque flacon contienne 3,5 g d'hémisuccinate d'hydrocortisone, 500 ng d'EGF, 250 ng de TGFa, 500 ng d'HGF, 50 ng de GM-CSF, 50 ng de GDF-9, 10 g de NAD/NADH et 10 g de NADP/NADPH. Les flacons sont immédiatement lyophilisés. Conserver le lyophilisat à + 4 C. Conditions de fabrication Toutes les opérations sont effectuées avec des matières premières stériles et en milieu stérile. B) PREPARATION D'UN MILIEU DE CULTURE POUR LES APPLICATIONS SUSMENTIONNEES SELON LA FORMULE N 2 IGF-1 et IGF-2 sont ajoutés à la solution initiale contenant les autres constituants du flacon B, pour obtenir 5 et 10 ng par flacon, respectivement, puis l'ensemble est lyophilisé. Les conditions de fabrication et de conservation sont les mêmes que celles du milieu préparé selon la formule n 1. C) PREPARATION D'UN MILIEU CONTENANT DE L'HYDROCORTISONE ET DES FACTEURS DE CROISSANCE Dans une première étape, un lot expérimental de milieu contenant le glucocorticoïde et des facteurs de croissance a été préparé. Ce milieu de culture était constitué de milieu Upgraded B9 complété seulement par de l'insuline humaine, de l'hémisuccinate d'hydrocortisone, de l'EGF, du TGFa, et de l'IGF-1 humains. Pour compléter un flacon de 10 ml de milieu Upgraded B9, appelé flacon A, nous avons utilisé : - 12,5 l d'une solution aqueuse d'insuline humaine à 100 U/ml. Cette solution était présentée sous la forme d'un flacon de 10 ml, appelé ici flacon B. Les tests de sécurité (virus et prions) avaient été préalablement effectués. - un flacon de lyophilisat d'une capacité de 1,2 ml, appelé ici flacon C, contenant l'hémisuccinate d'hydrocortisone (3,5 g) et les facteurs de croissance et de différenciation humains recombinants EGF (500 ng), TGFa (250 ng), et IGF-1 (5ng). Pour la préparation de ce flacon, l'hémisuccinate d'hydrocortisone (1,4 mg), l'EGF (200 g), le TGFa (100 g), et l'IGF-1 (2g) ont été dissous dans 400 ml d'une solution aqueuse d'albumine humaine sécurisée (1 g/L). Cette solution a été passée sur filtre de 0,2 m, puis répartie dans 393 flacons de 5 ml, à raison de lml par flacon. Ces derniers ont été lyophilisés. Toutes ces opérations ont été effectuées en milieu stérile. REVENDICATIONS 1. Composition pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdites compositions étant caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins deux facteurs de croissance en association avec au moins un composé de la famille des corticoïdes impliqués dans la production énergétique chez les mammifères, et, le cas échéant, avec au moins un coenzyme clé du métabolisme énergétique, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux facteurs de croissance choisis parmi : - le facteur de croissance hépatique, encore désigné HGF, - le facteur de croissance de transformation a, encore désigné TGF[alpha], - le facteur de stimulation de colonies de granulocytes et de macrophages, encore désigné GM-CSF, - le facteur épidermique de croissance, encore désigné EGF et/ou HB-EGF, - les facteurs de croissance et de différenciation, encore désignés GDF, tels que le GDF-9, - les facteurs de croissance semblables-à-l'insuline, encore désignés IGF, tels que l'IGF-1 et/ou l'IGF-2. 3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle contient au moins trois facteurs de croissance, ou tous les facteurs listés dans la revendication 2. 4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les concentrations en facteurs de croissance sont comprises entre environ 0,25 g/L et environ 60 g/L, notamment entre environ 0,5 g/L et environ 50 g/L. 5. Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le composé de la famille des corticoïdes impliqués dans la production énergétique chez les mammifères, est un composé de la famille des glucocorticoïdes, tel que l'hydrocortisone ou un dérivé de la même famille, sous forme hydrosoluble. 6. Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle comprend de l'hydrocortisone sous forme de sel tel qu'un hémisuccinate. 7. Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de lyophilisat. 8. Lyophilisats définis dans la revendication 7, contenant : - au moins deux facteurs de croissance définis dans l'une des revendications 1 à 4, ou la totalité de ces facteurs, - un composé de la famille des corticoïdes définis dans la revendication 5 ou 6, tel que l'hémisuccinate d'hydrocortisone, - et, le cas échéant, du NAD/NADH et du NADP/NADPH. 9. Application des compositions ou lyophilisats selon l'une des revendications 1 à 8, en tant qu'adjuvants effecteurs pour la préparation de milieux de culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits milieux de culture in vitro comprenant une composition selon l'une des revendications 1 à 6, en association avec les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant choisis notamment parmi la sérum albumine humaine, ou bovine, le cas échéant recombinantes, et/ou les sels minéraux, et/ou les molécules énergétiques telles que le glucose, le pyruvate, et le lactate, et/ou les aminoacides pour la biosynthèse des protéines, et/ou les bases puriques et pyrimidiques pour la biosynthèse des acides nucléiques, et/ou des phospholipides ou du cholestérol pour la formation des membranes cellulaires, et/ou des vitamines, telles que des vitamines du groupe B et/ou de la vitamine C. 10. Procédé de préparation de milieux de culture in vitro définis dans la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mélange d'une composition selon l'une des revendications 1 à 6, le cas échéant après dissolution dans un volume approprié d'une composition susmentionnée sous forme de lyophilisat selon les revendications 7 ou 8, avec une solution contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant tels que définis dans la revendication 9. 11. Milieux de culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits milieux étant tels qu'obtenus par mise en #uvre d'un procédé selon la revendication 10, et étant caractérisés en ce qu'ils comprennent une composition selon l'une des revendications 1 à 6, en association avec les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant tels que définis dans la revendication 9. 12. Procédé de développement d'embryons de mammifères, et plus particulièrement d'embryons humains, le cas échéant après décongélation d'embryons préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro desdits embryons, dans un milieu de culture selon la revendication 11, notamment pendant les 6 premiers jours suivant la fécondation in vitro, avantageusement de manière à obtenir des embryons au stade de blastocystes. 13. Procédé de maturation des follicules de mammifères en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, et plus particulièrement de follicules humains, le cas échéant après décongélation de follicules préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro de follicules prélevés chez la femelle, et plus particulièrement chez la femme, dans un milieu de culture selon la revendication 11, avantageusement pendant environ 3 jours à environ 6 jours. 14. Procédé de maturation de cellules de la lignée germinale mâle de mammifères, et plus particulièrement humaines, le cas échéant après décongélation de cellules préalablement congelées, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro desdites cellules, dans un milieu de culture selon la revendication 11, avantageusement pendant environ 3 jours à environ 4 jours. 15. Procédé de fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, et plus particulièrement d'ovocytes et de spermatozoïdes d'origine humaine, le cas échéant après décongélation des spermatozoïdes préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro des ovocytes et spermatozoïdes susmentionnés, dans un milieu de culture selon la revendication 11, avantageusement pendant environ 2 jours à environ 6 jours. 16. Kit pour la préparation extemporanée d'un milieu selon la revendication 11, notamment dans le cadre de la mise en #uvre d'un procédé selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend : - une composition sous forme de lyophilisat selon les revendications 7 ou 8, - et, le cas échéant, une solution aqueuse contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, tels que définis dans la revendication 9.