Brevet FR2809415A1 — publié le 20011130

CLONAGE ET SEQUENÇAGE DE L'ALLERGENE DAC G1 DU POLLEN DE DACTILYS GLOMERATA, SA PREPARATION ET SON UTILISATION. La présente invention a pour objet le clonage et le séquençage d'allergènes de pollen de Dactilys glomerata et plus particulièrement de l'allergène Dac g1. La présente a également pour objet la production de cet allergène recombinant pour être incorporé dans des préparations utiles pour le diagnostic ou le traitement des allergies. Les allergènes sont les protéines les plus abondantes du pollen et constituent la cause majeure d'allergies dans les climats tempérés. L'allergène objet de la présente invention est Dac g1 du pollen de Dactylis glomerata. Certains individus prédisposés génétiquement deviennent hypersensibles (allergiques) à des antigènes provenant de sources environnementales très variées. Les antigènes capables d'induire une réaction d'hypersensibilisation immédiate ou retardée sont appelés allergènes. Les allergènes peuvent notamment avoir pour origine des arbres, des plantes herbacées, des insectes, des mammifères, de la nourriture, des médicaments ou des produits chimiques. Les allergènes sont classés en groupes de I à V selon leurs propriétés immunochimiques. L'allergène Dac g1 de Dactylis glomerata fait partie du groupe I, comme l' allergène Lol p1 de Lolium perenne. Les anticorps impliqués dans l'allergie appartiennent à la classe des immunoglobulines de type IgE. En présence d'un allergène, les IgE se lient aux mastocytes et aux basophiles, ce qui conduit au relargage par ces cellules de différents médiateurs chimiques et à la manifestation de l'allergie. Celle-ci peut prendre différentes formes, comme par exemple un choc anaphylactique, de l'asthme, une rhinite ou une dermatite atopique. Lorsque le diagnostic de l'allergie à un composé particulier a été établi, la désensibilisation du patient vis-à-vis de l'allergène en cause est l'approche thérapeutique la plus fréquente, notamment lorsque la présence de l'allergène ne peut être évitée comme dans le cas du pollen et des acariens. Ce type de traitement a prouvé son efficacité mais il nécessite de disposer d'un produit efficace et sûr. En effet, le traitement présente un risque de choc anaphylactique, de plus le produit administré doit être dépourvu de toute impureté qui pourrait constituer un autre allergène potentiel. Or, aujourd'hui, on ne sait utiliser que des mélanges complexes d'allergènes et pas de produit pur. I1 est donc nécessaire de pouvoir disposer d'allergènes sous une forme structurale la plus proche possible de l'allergène natif et présentant le plus grand degré de pureté possible. L'un des moyens possibles pour atteindre ce but est la production d'allergènes recombinants dans un organisme hôte (Laffer, S. et al., J. Allergy Clin. Immunol., Septembre 1996, volume 98, no. 3, pages 652 658). A titre d'exemples, on peut citer, la demande de brevet publiée sous le No. 819 763 qui décrit la production de l'allergène Der fII modifié. Le brevet européen publié sous le No. 406 286 décrit le clonage d'un allergène majeur du pollen de l'ivraie, Lol p1, et l'expression de ce gène. La demande de brevet publiée sous le No. 473 111 rapporte également la production d'allergènes d'acariens recombinants utilisés pour la désensibilisation. La demande de brevet publiée sous le No. 463 059 concerne des allergènes tirés de l'ambroisie et l'utilisation de ces protéines. Ces documents présentent l'expression des gènes et la production des protéines dans E. coli. Ce système d'expression présente l'inconvénient de ne pas assurer les modifications post- traductionnelles des protéines qui peuvent être réalisées dans les cellules eucaryotes. Par exemple, les protéines produites ne sont pas glycosylées, or la glycosylation de certaines protéines allergènes peut être importante pour leur capacité de fixation aux IgE (Petersen, A. et al., Clinical and Expérimental Allergy, 1998, volume 28, pages 315-321 ; Van Ree et al., J. Biol. Chem., 2000, volume 275, pages 11451-11458). La présente invention concerne le clonage, le séquençage et la préparation d'une molécule d'acide nucléique purifiée comprenant une séquence nucléotidique codant pour la protéine constituant l'allergène Dac g1 ou pour un dérivé de celle-ci. La présente invention concerne encore l'insertion de cet acide nucléique dans un vecteur d'expression et la production de la protéine recombinante dans un organisme hôte, en particulier dans des levures, dans des végétaux ou partie de végétaux comme des cellules végétales, et de préférence dans des suspensions cellulaires et des plants de tabac. Cet allergène est produit en vue de son utilisation en diagnostic et en immunothérapie. La production des allergènes dans des cellules végétales, comme par exemple le tabac, présente l'avantage de permettre la production de protéines recombinantes glycosylées. Ce moyen de production n'a jusqu'à présent jamais été utilisé pour la production d'allergènes. Les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention ont concerné - le clonage de l'ADNc de Dac g1, - l'insertion de la molécule d'acide nucléique clonée dans un vecteur d'expression approprié, - la production de Dac g1 recombinant dans des systèmes biologiques, - les tests immunologiques de l'allergène purifié. Dac g1 est une glycoprotéine de 30-35 kDa, de 241 acides aminés, reconnue par au moins 90 s des sujets allergiques au pollen de graminées. L'allergène Dac g1 de Dactylis glomerata appartient aux allergènes du groupe I. Des séquences nucléotidiques codant pour des allergènes homologues à Dac g1 ont été décrites dans l'art antérieur. Les inventeurs ont défini des oligonucléotides dégénérés à partir de ces séquences afin d'amplifier spécifiquement par la technique de RT-PCR un ADNc codant Dac g1. Un fragment d'ADNc de taille attendue a été cloné à partir d'une population d'ARN totaux de pollen de Dactylis glomerata puis séquencé. Ce fragment a été utilisé pour définir des amorces spécifiques pour les protocoles 5' et 3' RACE-PCR. Ces protocoles ont permis de compléter les extrémités 5' et 3' du fragment. Après amplification des extrémités 5' et 3', l'ADNc complet codant pour Dac g1 a été séquencé. Les séquences obtenues ont permis de définir de nouvelles amorces spécifiques de Dac g1, ces amorces ont été utilisées pour cloner l'ADNc de la pro-forme et de la forme mature de l'allergène. Les séquences nucléotidiques des amorces utilisées pour les réactions de PCR sont les suivantes - amorce sens (pro-forme), représentée à la figure 2A (amorce F1) et sous le numéro SEQ ID N0.5 dans la liste de séquences en annexe 5'GGG CTC GAG AAA ATG GCT TCC TCT TCT TCA TCG 3' - amorce sens (forme mature), représentée à la figure 2A (amorce F2) sous le numéro SEQ ID N0.6 dans la liste de séquences en annexe 5'AGG CTC GAG AAA AGA ATC CCA AAG GTA CCC 3' - amorce antisens, représentée à la figure 2A (amorce R1) sous le numéro SEQ ID N0.7 dans la liste de séquences en annexe 5'GGG GGC GGC CGC TCA CTT GGC CTC GTA GGA 3' Les clones ADNc ont été séquencés, la séquence en acides aminés correspondant à chaque séquence nucléotidique a été déterminée. La figure 1 représente la séquence nucléotidique et peptidique de la pro-forme l'allergène Dac g1 où le séquence soulignée correspond à la séquence signal absente de la protéine mature. La figure 2 représente en A la séquence des amorces, et en B la séquence de la pro-forme de l'allergène Dac g1 et le positionnement des amorces sur cette séquence. Les inventeurs sont donc maintenant parvenus à cloner et séquencer l'acide nucléique codant pour l'allergène Dac g1 du pollen de Dactylis glomerata. En conséquence, l'invention concerne une molécule d'acide nucléique purifiée constituée par ou comprenant une séquence codant pour l'allergène Dac g1, un dérivé ou un fragment de celle-ci. La séquence en acide aminé de la pro-forme de l'allergène Dac g1 est représentée à la figure 1 et sous le numéro SEQ ID N0.2 dans la liste de séquence en annexe. Un fragment de cette séquence délimité par les acides aminés en position 25 à 265 constitue la protéine mature Dac g1. La séquence en acide aminé de la forme mature de l'allergène Dac g1 est représentée sous le numéro SEQ ID N0.4 dans la liste de séquences en annexe. On entend par dérivé de la protéine constituant l'allergène Dac g1, une protéine dont la séquence en acides aminés diffère par la modification, la suppression ou l'addition d'un ou plusieurs acides aminés dès lors que cette protéine est fonctionnellement et/ou immunologiquement équivalente à Dac g1. L'invention envisage donc également les isoformes de la protéine constituant l'allergène Dac g1 et présentant une homologie de séquences en acides aminés supérieure à 50%, de préférence supérieure à 70% et tout préférentiellement supérieure à 90 % avec la séquence représentée sous le numéro SEQ ID N0.2 en annexe. De telles modifications peuvent résulter de la dégénérescence du code génétique ou de modifications de la séquence en acide nucléique par toute technique de biologie moléculaire. L'homme du métier est à même de déterminer parmi ces séquences celles qui présentent des propriétés fonctionnelles et immunologiques identiques à Dac g1 par exemple à l'aide d'anticorps. On entend aussi par fragment de la protéine constituant l'allergène Dac g1, tout peptide ou polypeptide issue de la protéine, et tout particulièrement utile pour le diagnostic de l'allergie. Une molécule d'acide nucléique purifiée comprenant ou constituée par une séquence nucléotidique (ADNc) codant pour la pro-forme de l'allergène Dac g1 est représentée sous le numéro SEQ ID N0.1 dans la liste de séquences en annexe. L'invention concerne donc aussi un dérivé ou un fragment de celle-ci, et plus particulièrement une molécule d'acide nucléique codant pour la protéine mature qui est délimitée par les nucléotides en position 73 à 795 de la séquence nucléotidique représentée sous le numéro SEQ ID N0.1 dans la liste de séquences en annexe. Cette séquence est représentée sous le numéro SEQ ID N0.3 dans la liste de séquences en annexe. A partir de la séquence nucléotidique codant pour Dac g1, l'homme du métier peut définir des séquences nucléotidiques codant pour des protéines ou polypeptides correspondant à un fragment de Dac g1 et possédant par exemple au moins un épitope de Dac g1. Il peut également définir une séquence nucléotidique codant pour des protéines équivalentes fonctionnellement à Dac g1 mais dont la séquence en acides aminés n'est pas identique à celle de Dac g1. Il peut enfin définir une séquence nucléotidique codant pour des protéines équivalentes à Dac g1 sur le plan immunologique. Ces protéines sont, par exemple, capables de se lier à des anticorps anti-Dac g1, mais ne possèdent pas la fonction enzymatique de l'allergène Dac g1 natif. On entend plus particulièrement par dérivé d'une molécule d'acide nucléique selon l'invention, une molécule d'acide nucléique capable de s'hybrider dans des conditions d'hybridation standards avec l'une des séquences nucléotidiques représentées sous les numéros SEQ ID N0.1 ou SEQ ID N0.3 dans la liste de séquences en annexe. L'invention inclut également la mutagenèse de la protéine permettant d'introduire en certaines positions définies de la protéine un ou plusieurs sites portant une fonction particulière. Il peut s'agir par exemple d'introduire un site de N-glycosylation supplémentaire sur l'allergène. L'invention se rapporte aussi à une molécule d'acide nucléique recombinante comprenant une séquence polynucléotidique codant pour l'allergène Dac g1 ou un dérivé de celui-ci comme un fragment ou un équivalent fonctionnel et/ou immunologique de la protéine Dac g1, un promoteur lié de manière fonctionnelle à ladite séquence polynucléotidique, éventuellement un gène de sélection placé sous le contrôle de son propre promoteur ou du même promoteur que ladite séquence polynucléotidique, et avantageusement une séquence de terminaison placée en aval de ladite séquence polynucléotidique. I1 peut s'agir d'une cassette ou de préférence d'un vecteur d'expression comprenant notamment une origine de réplication eucaryote ou procaryote, une séquence promotrice adaptée, un marqueur de sélection et une séquence nucléotidique codant pour l'allergène Dac g1 ou un dérivé de celui-ci placé sous le contrôle desdites séquences de régulation. L'homme du métier choisira sans difficulté parmi les vecteurs d'expression connus dans l'art antérieur le vecteur le mieux adapté à l'organisme hôte dans lequel il envisage de faire produire la protéine. L'invention envisage tout particulièrement pour la production de la protéine constituant l'allergène Dac g1, un vecteur permettant l'expression de l'acide nucléique dans des cellules eucaryotes, et de préférence dans des cellules végétales ou des levures. Le vecteur d'expression peut également être construit de manière à permettre la production de la protéine recombinante définie précédemment sous la forme d'une protéine de fusion. Le polypeptide fusionné à la protéine d'intérêt peut notamment être utile pour permettre ou faciliter la purification de celle-ci. Ce polypeptide peut en particulier être une séquence constituée de plusieurs histidines ou Histidine-Tag ajoutée dans une région variable non critique pour l'activité et la conformation de la molécule, il peut s'agir d'une région interne ou d'une extrémité N- ou C- terminale. L'adjonction d'une séquence "Histidine-Tag" permet de purifier la protéine recombinante par chromatographie d'affinité sur une colonne de métal chélaté. L'invention se rapporte aussi à un hôte, eucaryote ou procaryote, transformé par un vecteur d'expression comme défini ci-dessus. Cet hôte peut par exemple être E. coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia Pastoris, ou une cellule végétale notamment une cellule de ZVicotiana tabacum dans le génome de laquelle est incorporée de façon stable la molécule d'acide nucléique codant pour l'allergène Dac g1 ou un dérivé de celui-ci. La présente invention concerne encore un organisme ou micro-organisme, de préférence une plante ou une cellule de plante, tout préférentiellement de tabac, ayant incorporé dans son génome, avantageusement de manière stable, une molécule d'acide nucléique de l'invention placée sous le contrôle de séquences de régulation de manière à exprimer l'allergène Dac g1 dans ces cellules, dans une plante ou une partie déterminée de la plante. Des plantes transgéniques selon l'invention peuvent être préparées en transformant une cellule végétale avec ladite molécule d'acide nucléique puis en régénérant une plante à partir de la cellule transformée. L'invention concerne un procédé d'obtention de la protéine Dac g1 recombinante, ou d'un fragment polypeptidique de Dac g1 ou d'un équivalent fonctionnel ou immunologique de Dac g1. Ce procédé comprend la culture d'un organisme, procaryote ou eucaryote, transformé par un vecteur d'expression tel que défini précédemment, dans des conditions et pendant un temps suffisant pour permettre l'expression de ladite protéine. Ce procédé comprend également l'isolement des protéines produites à partir de la culture des organismes transformés. Dans le cas particulier de l'expression de protéines recombinantes dans des cellules de tabac, les cals exprimant l'allergène d'intérêt sont sélectionnés. Les allergènes sont localisés par fractionnement cellulaire, puis ils sont purifiés à partir d'extraits protéiques issus de cellules transgéniques. Le procédé selon l'invention comprend également l'analyse structurale et immunologique de la ou des protéines produites. L'invention se rapporte donc aussi à l'allergène Dac g1 ou un dérivé de celui-ci recombinant obtenu par ledit procédé. L'invention concerne la; pro- forme et la forme mature de Dac g1. Elle concerne aussi des fragments peptidiques ou polypeptidiques de Dac g1, ainsi que des protéines fonctionnellement ou immunologiquement équivalentes à Dac g1. Les protéines équivalentes à Dac g1 peuvent être obtenues notamment par mutagenèse dirigée appliquée à la molécule d'ADN codant pour Dac g1. L'invention concerne également une protéine de fusion recombinante comprenant la protéine Dac g1, un fragment de la protéine ou un équivalent fonctionnel ou immunologique. Cet allergène recombinant, un dérivé de celui-ci ou l'allergène naturel, peuvent être utilisés pour préparer des anticorps monoclonaux ou polyclonaux. Les anticorps monoclonaux sont préparés selon des techniques classiques, bien connues de l'homme du métier. Des anticorps polyclonaux peuvent être obtenus en immunisant des animaux avec l'allergène Dac g1 à l'aide d'un adjuvant adapté, les anticorps sont ensuite purifiés du sérum des animaux immunisés. Ces anticorps peuvent notamment servir à détecter la présence de l'allergène Dac g1, d'un fragment peptidique de la protéine ou d'un équivalent immunologique de celle-ci, dans un milieu particulier comme par exemple un milieu de culture. L'invention concerne en outre les compositions pharmaceutiques destinées au traitement et/ou au diagnostic d'une allergie et comprenant comme principe actif une quantité efficace de Dac g1, d'un fragment de la protéine ou d'un équivalent fonctionnel ou immunologique de celle-ci, ou encore un anticorps dirigé contre celle-ci. Dans ces compositions, le principe actif est associé à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Les compositions destinées au traitement de l'allergie sont formulées selon des principes adaptés et connus de l'homme du métier afin d'être injectées par voie sous cutanée ou par toutes autres voies d'administration. L'invention concerne également un procédé de détection de la sensibilité manifestée par un individu au pollen d'herbacées et en particulier au pollen de Dactilys glomerata. Ce procédé comprend la détection de la présence d'anticorps liant la protéine recombinante Dac g1, un fragment ou un équivalent fonctionnel et/ou immunologique de celle-ci, ou un anticorps spécifique de celle-ci. Ce procédé comprend notamment une étape pendant laquelle un échantillon provenant de l'individu est mis en contact avec la protéine recombinante Dac g1 un dérivé de celle-ci ou un anticorps dirigée contre ceux-ci, dans des conditions permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps, puis la détection dudit complexe. L'invention concerne enfin un réactif de diagnostic d'une allergie caractérisé en ce qu'il comprend une préparation contenant la protéine recombinante Dac g1 et/ou un fragment et/ou un dérivé de Dac g1, ou un anticorps dirigé contre celle-ci. REVENDICATIONS 1) Une molécule d'acide nucléique purifiée comprenant ou constituée par une séquence nucléotidique codant pour l'allergène Dac g1 dont la séquence en acides aminés est représentée sous le numéro SEQ ID N0.2 dans la liste de séquences en annexe, un dérivé ou un fragment de celle-ci. 2) Une molécule d'acide nucléique purifiée selon la revendication 1, comprenant ou constituée par une séquence nucléotidique codant pour la forme mature de l'allergène Dac g1 dont la séquence en acides aminés est représentée sous le numéro SEQ ID N0.4 dans la liste de séquences en annexe, un dérivé ou un fragment de celle-ci. 3) Une molécule d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par la séquence nucléotidique représentée sous le numéro SEQ ID NO.1 ou sous le numéro SEQ ID N0.3 dans la liste de séquences en annexe, un dérivé ou un fragment de celle-ci. 4) Une molécule d'acide nucléique recombinant, caractérisée en ce qu'elle comprend une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, un promoteur lié de manière fonctionnelle à ladite molécule d'acide nucléique, éventuellement un gène de sélection placé sous le contrôle de son propre promoteur ou du même promoteur que ladite molécule d'acide nucléique, et avantageusement une séquence de terminaison placée en aval de ladite molécule d'acide nucléique. 5) Un vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend une origine de réplication eucaryote ou procaryote, une séquence promotrice adaptée, un marqueur de sélection et une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 placée sous le contrôle desdites séquences de régulation. 6) Un hôte eucaryote ou procaryote transformé par une molécule d'acide nucléique selon la revendication 4, ou par un vecteur d'expression selon la revendication 5. 7) Un hôte selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est constitué par une cellule de tabac dans le génome de laquelle est incorporée, avantageusement de façon stable, une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 8) Une plante et tout préférentiellement une plante de tabac, ayant incorporé de manière stable dans son génome une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 placée sous le contrôle de séquence de régulation de manière à exprimer l'allergène Dac g1 dans une partie déterminée de la plante. 9) Une suspension cellulaire, tout préférentiellement de tabac, dont les cellules ont incorporé de manière stable dans leur génome une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 placée sous le contrôle de séquence de régulation de manière à exprimer l'allergène Dac g1 dans lesdites cellules. 10) Une levure ayant incorporé de manière stable dans son génome une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 placée sous le contrôle de séquence de régulation de manière à exprimer l'allergène Dac g1. 11) Un procédé d'obtention de la protéine Dac g1 recombinante, d'un fragment ou d'un équivalent fonctionnel ou immunologique de celle-ci, caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'un organisme, procaryote ou eucaryote, transformé par une molécule d'acide nucléique selon la revendication 4, ou par un vecteur d'expression selon la revendication 5, dans des conditions et pendant un temps suffisant pour permettre l'expression de ladite protéine, puis l'isolement des protéines produites à partir de la culture des organismes transformés. 12) Une protéine recombinante comprenant ou constituée par l'allergène Dac g1 ou un dérivé de celui- ci obtenu par le procédé selon la revendication 11. 13) Une composition pharmaceutique pour le traitement ou le diagnostic d'une allergie, caractérisée en ce qu'elle comprend comme principe une quantité efficace d'une protéine selon la revendication 12 ou d'un anticorps dirigé contre cette protéine. 14) Un procédé de détection de la sensibilité manifestée par un individu au pollen d'herbacées et en particulier au pollen de Dactilys glomerata, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un individu avec une protéine selon la revendication 12 ou un anticorps dirigé contre cette protéine, dans des conditions permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps, puis la détection dudit complexe. 15) Un réactif de diagnostic d'une allergie, caractérisé en ce qu'il comprend une protéine selon la revendication 12 ou un anticorps dirigé contre cette protéine,