Brevet FR2810338A1 — publié le 20011221

La présente invention concerne un polypeptide ascorbate peroxydase peroxysomique, un gène codant ce peptide issu de l'orge, dont l'expression est induite par une agression thermique, un procédé de transgenèse pour conférer à une plante une résistance aux agressions thermiques qui comprend l'incorporation de ce gène dans une plante et une plante transgénique ainsi obtenue. On prévoit qu'une crise alimentaire se produira dans le futur proche du fait de l'augmentation de la population et de la détérioration de l'environnement. Pour éviter une telle crise, il est nécessaire de développer des techniques agricoles permettant la production efficace de récoltes. Toutefois, la production agricole est soumise à l'influence de différentes agressions environnementales, ce qui constitue un grave problème dans le domaine de l'agriculture. De ce fait, il est nécessaire de disposer de plantes présentant une résistance à différentes agressions environnementales. En particulier, le réchauffement de la terre nécessite de disposer de plantes ayant une plus grande thermotolérance. Jusqu'à maintenant, pour produire des plantes transgéniques ayant une thermotolérance accrue par des techniques de génie génétique, on a utilisé un gène codant une protéine de choc thermique dont l'expression est induite par une agression thermique. On a également biosynthétisé dans une plante de petites quantités de glycine bétaïne qui permet d'empêcher la dénaturation enzymatique dans des conditions d'agression thermique. Par ailleurs, on sait que les gènes impliqués dans la décomposition des molécules d'oxygène actif ont un rôle important dans la résistance aux agressions thermiques. En introduisant de tels gènes dans des plantes, il est possible de conférer à celles-ci une résistance aux agressions par photo-oxydation, aux agressions salines ou aux agressions dues à l'aridité. Toutefois, l'introduction dans des plantes de gènes impliqués dans la décomposition de molécules d'oxyde actif pour conférer à des plantes une thermotolérance n'a pas été décrite. Compte tenu de l'importance des gènes impliqués dans la décomposition des molécules d'oxygène actif, la demanderesse a tenté de conférer à une plante une thermotolérance en introduisant un tel gène par des techniques différentes des techniques conventionnelles utilisées pour introduire un gène codant une protéine de choc thermique. Ainsi, la présente invention a pour but de développer une technique permettant de conférer à une plante une thermotolérance par introduction dans cette plante d'un gène impliqué dans la défense contre les agressions oxydatives, d'obtenir un gène utilisable à cet effet et de déterminer la séquence de bases de ce gène. Les agressions thermiques sont l'un des principaux facteurs limitant la croissance et la productivité des plantes. Les organismes vivants réagissent rapidement aux hautes températures par des modifications métaboliques qui mettent en jeu une réorganisation complexe des activités cellulaires. Ces modifications ont pour but de protéger les structures et fonctions essentielles des cellules contre les lésions dues à l'agression. On sait qu'un choc thermique peut entraîner une agression oxydative qui induit l'expression de gènes impliqués dans la défense contre les agressions oxydatives. Dans des conditions d'agression thermique, il se forme un excès d'espèces d'oxygène actif, comme les radicaux superoxyde, le peroxyde d'hydrogène et les radicaux hydroxyles, qui provoquent des lésions oxydatives dans les constituants cellulaires. Le cycle appelé cycle de l'ascorbate glutathion, dans lequel les ascorbate peroxydases (APX) sont des enzymes clé, constitue un système majeur de détoxification du peroxyde hydrogène dans les chloroplastes et le cytosol des plantes. On pense que les APX jouent un rôle dans la détoxification du peroxyde d'hydrogène synthétisé. On a montré que l'activité APX augmente en réponse à un certain nombre de conditions agressives comme la sécheresse, la pollution de l'air, une intensité lumineuse élevée combinée avec un refroidissement, la lumière UV et un défaut de microéléments. Actuellement, on connaît plusieurs isoformes différentes de ces protéines, à savoir deux formes cytosoliques solubles et deux formes chloroplastiques dont l'une est liée au stroma et l'autre au thylakoïde. Récemment, plusieurs isoformes liées aux membranes des glyoxysomes et des peroxysomes ont été décrites. L'ascorbate peroxydase de type peroxysomique a récemment été clonée à partir du coton (Bunkelmann & Trelease (1996) Plant Physiology 110, 589-598), de Arabidopsis (Zhang et al. (1997) Plant Molecular Biology 34, 967-971) et de l'épinard (Ishikawa et al. (1998) Plant and Cell Physiology 39, 23-34). Il est à noter que le gène selon la présente invention a été obtenu indépendamment des séquences connues codant les enzymes décrites ci-dessus. Le peroxysome, comme le glyoxysome, est un micro-organite dont une fonction spécialisée met en jeu une action oxydative utilisant l'oxygène moléculaire. Ces organites peuvent être qualifiés globalement de microcorps. L'appellation peroxysome provient de la production de peroxyde d'hydrogène catalysée par une enzyme localisée dans cet organite. Au cours de la réaction enzymatique, des atomes d'hydrogène sont prélevés sur le substrat, qui est un composé organique, au moyen d'oxygène moléculaire. En outre, le peroxysome contient aussi une catalase. Le peroxyde d'hydrogène qui est produit dans la réaction ci-dessus est utilisé pour l'oxydation de composés comme des phénols, le formaldéhyde et des alcools par une réaction appelée réaction peroxydative. Une telle réaction est impliquée dans la détoxification de molécules toxiques et présente donc une grande importance, en particulier dans les cellules du foie ou du rein. Dans différentes conditions agressives, la production de peroxyde d'hydrogène augmente dans les microcorps et le peroxyde d'hydrogène ainsi formé diffuse dans le cytosol. On suppose que l'ascorbate peroxydase de type peroxysomique selon la présente invention est fixée du côté extérieur de la membrane peroxysomique et protège les cellules contre les agressions en décomposant le peroxyde d'hydrogène. De ce fait, cette ascorbate peroxydase permet la disparition rapide des espèces d'oxygène actif produites dans les peroxysomes avant leur transfert dans le cytosol, ce qui ne peut pas être obtenu par les ascorbate peroxydases cytosoliques ou chloroplastiques conventionnelles. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront mieux à la lecture de la description qui suit et se réfère aux dessins annexés, dans lesquels : la figure 1 est un schéma représentant la construction d'un vecteur de surexpression d'ascorbate peroxydase peroxysomique (pAPX) utilisé pour transformer la plante Arabidopsis thaliana (Arabette des dames) ; la figure 2 représente la séquence de bases et la séquence d'acides aminés déduite de l'ascorbate peroxydase peroxysomique de l'orge ; la figure 3 montre une comparaison des séquences d'acides aminés des ascorbate peroxydases peroxysomiques de l'orge, du coton et de Arabidopsis ; la figure 4 est une photographie montrant une analyse par transfert de Southern pour la pAPX de l'orge au moyen d'une sonde constituée par une séquence d'ADN spécifique de la pAPX de l'orge ; la figure 5 est une photographie montrant une analyse par transfert de Northern pour l'expression de pAPX dans l'orge induite par la chaleur et d'autres traitements, au moyen d'une sonde constituée par une séquence d'ADN spécifique de pAPX de l'orge ; la figure 6 est une photographie montrant une analyse par PCR (amplification en chaîne par polymérase) de plantes de type sauvage et transgéniques concernant la présence d'un transgène de pAPX ; la figure 7 est une photographie montrant une analyse par transfert de Northern de plantes de type sauvage et de plantes transgéniques de génération T2 surexprimant le gène de pAPX; la figure 8 est un graphique montrant une comparaison de la résistance aux agressions thermiques de plantes de type sauvage et de plantes transgéniques surexprimant le gène de pAPX dans laquelle le rapport du poids frais des parties vertes au poids frais des feuilles totales est utilisé comme indice ; et la figure 9 est une photographie montrant une comparaison de la croissance d'une plante de type sauvage et de plantes transgéniques surexprimant le gène de pAPX après exposition à une agression thermique. La demanderesse a isolé le gène de l'ascorbate peroxydase peroxysomique à partir d'une banque d'ADNc préparée à partir de feuilles d'orge, par la technique de visualisation différentielle. De plus, la demanderesse a déterminé la séquence de bases du gène. Ainsi qu'on l'a indiqué ci-dessus, toutes les ascorbate peroxydases peroxysomiques clonées jusqu'à maintenant sont issues de plantes dicotylédones comme le coton, Arabidopsis et l'épinard. L'ascorbate peroxydase peroxysomique selon la présente invention fournit le premier exemple de clonage d'une ascorbate peroxydase peroxysomique issue d'une plante monocotylédone. Le procédé de visualisation différentielle utilisé selon la présente invention comprend les étapes de RT-PCR (PCR à transcription inverse) au moyen d'une courte amorce, de séparation sur un gel de séquence puis d'analyse de la séquence obtenue. La courte amorce consiste en une séquence arbitraire présentant une expression à haute fréquence dans le génome de cellules eucaryotes. Il est à noter que ce procédé permet une détection à haute sensibilité, ce qui constitue son avantage. On a ainsi déterminé la séquence de bases du gène selon la présente invention. De plus, il est apparu que l'expression du gène était induite par les agressions thermiques. Par ailleurs, une thermotolérance accrue apparaît également quand le gène est surexprimé dans Arabidopsis thaliana. Ainsi, la présente invention concerne un gène d'ascorbate peroxydase peroxysomique issu de l'orge, consistant en la séquence de bases qui s'étend des bases n 1 à 1089 représentée dans SEQ ID NO : 2 de la liste de séquences annexée. Ce gène intervient dans la thermotolérance d'une plante et son expression est induite par les agressions thermiques. Selon la technique de recombinaison génique, il est possible d'obtenir à un site spécifique d'un ADN de base une modification artificielle sans altération ou avec amélioration des caractéristiques de bases de cet ADN. Dans le cas d'un gène ayant une séquence native selon la présente invention ou une séquence modifiée différente de cette séquence native, il est possible aussi de réaliser une modification artificielle telle qu'une insertion, une délétion ou une substitution pour obtenir un gène ayant des caractéristiques équivalentes ou améliorées par rapport au gène natif. Un tel gène muté es aussi inclus dans le cadre de la présente invention. Autrement dit, un gène consistant en une séquence de bases qui s'hybride avec la séquence de bases selon SEQ ID NO : 2 de la liste de séquences dans des conditions stringentes est un gène dans lequel 20 bases ou moins, de préférence 10 bases ou moins, et de préférence encore 5 bases ou moins sont délétées, substituées ou ajoutées à la séquence de base de SEQ ID NO : 2. Par ailleurs, un tel gène présente 70 % d'homologie ou plus, de préférence 80 % d'homologie ou plus et de préférence encore 90 % d'homologie ou plus avec la séquence de bases montrée dans SEQ ID NO : 2. En outre, un tel gène s'hybride avec la séquence de bases montrée dans SEQ ID NO : 2 dans des conditions stringentes. Un tel gène est inclus lui aussi dans le cadre de la présente invention à condition qu'il présente la caractéristique du gène de l'ascorbate peroxydase peroxysomique d'être induit par une agression thermique. Par ailleurs, la présente invention concerne un polypeptide ascorbate peroxydase peroxysomique issu de l'orge, consistant en la séquence d'acides aminés qui s'étend des acides aminés n : 1 à 291 montrée dans SEQ ID NO : 1 de la liste de séquences en annexe. Ce polypeptide est codé par la partie à cadre de lecture ouvert de la séquence de bases représentée par SEQ ID NO : 2 évoquée cidessus. Un polypeptide dont la séquence d'acides aminés diffère de la séquence montrée dans SEQ ID NO : 1 par le fait qu'une partie de cette séquence est délétée, substituée ou additionnée d'une autre séquence d'acides aminés est un polypeptide dans lequel 20 acides aminés ou moins, de préférence 10 acides aminés ou moins, et de préférence encore 5 acides aminés ou moins sont délaités, substitués ou ajoutés à la séquence d'acides aminés montrée dans SEQ ID NO : 1 de la liste de séquences annexée. De plus, un tel polypeptide présente 70 % d'homologie ou plus, de préférence 80 % d'homologie ou plus et de préférence encore 90 % d'homologie ou plus avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1. Un tel polypeptide est inclus lui aussi dans le cadre de cette invention à condition qu'il présente la caractéristique d'un polypeptide d'ascorbate peroxydase peroxysomique d'être codé par un gène dont l'expression est induite par une agression thermique. La présente invention concerne aussi un procédé pour transformer une plante par incorporation dans cette plante d'un gène d'ascorbate peroxydase peroxysomique, et une plante transgénique obtenue par une telle incorporation. Le gène d'ascorbate peroxydase peroxysomique selon la présente invention est un gène dont l'expression est induite par une agression thermique et qui joue un rôle dans les mécanismes d'autodéfense d'une plante contre les agressions. De ce fait, il est possible de conférer à une plante une résistance aux agressions thermiques en incorporant ce gène dans la plante. Les plantes qui peuvent faire l'objet d'une telle transgenèse comprennent les plantes monocotylédones comme l'orge, le blé, le lis, le riz, le maïs et l'asperge ainsi que les plantes dicotylédones comme Arabidopsis, le tabac, la carotte, le soja, la tomate et la pomme de terre. Pour réaliser cette transgenèse, il est possible d'utiliser un procédé conventionnel connu dans ce domaine, utilisant par exemple un vecteur tel qu'un vecteur plasmidique comme pBI121 ou pBI221. Un tel vecteur peut être incorporé dans une souche d'Agrobacterium après quoi la plante cible peut être infectée par cet Agrobacterium pour produire une plante transgénique. De plus, les individus transformés peuvent être sélectionnés grâce à un gène de résistance à la kanamycine incorporé dans le plasmide à titre de marqueur de sélection. Il est possible en outre d'obtenir une graine à partir d'une telle plante transgénique. Le procédé d'incorporation du gène selon la présente invention n'est pas limité au procédé utilisant Agrobacterium, et il est possible d'utiliser d'autres procédés comme le procédé utilisant un canon à particules et le procédé d'électroporation. On va maintenant décrire un exemple non limitatif illustrant la présente invention. Matériel végétal On a cultivé des plants d'orge (Hordeum vulgare L. Haruna-nijyo) en culture hydroponique avec du milieu nutritif Hyponex dilué 1000 fois dans l'eau du robinet, dans une chambre de culture, dans les conditions suivantes : période lumineuse de 13 h à 25 C et à 100 mol m-2s-1,et période sombre de 11h à 23 C à 70% d'humidité pendant 2 à 3 semaines. Pour réaliser des conditions d'agression saline, on a augmenté la concentration en NaCl du milieu de culture par pas de 100 mM un jour sur deux jusqu'à une concentration de 300 mM, et on a maintenu la concentration à cette valeur pendant 2 jours. On a réalisé une agression thermique à la lumière en exposant les plantes entières à 37 C et 70 % d'humidité dans une chambre pendant 24 h. On a ajouté de l'acide abscissique (ABA) directement à la solution de culture à raison de 50 M et du peroxyde d'hydrogène à raison de 1,5 % (approximativement 440 mM). Visualisation différentielle On a isolé de l'ARN poly(A+) au moyen d'une colonne d'oligo (dT)cellulose (Pharmacia). On a synthétisé un ADNc monocaténaire avec une transcriptase inverse et en utilisant des amorces aléatoires (6-mères). On a conduit les réactions de PCR de la manière décrite antérieurement par Muramoto et al. (Photosynthesis Mechanisms and Effects volume IV (ed. Garab), pages 3043- 3046. Académie Publishers). On a cloné dans un vecteur pGEM-T (Promega) les fragments de PCR induits par l'agression saline. On a déterminé les séquences d'ADN par le procédé de séquençage avec une amorce conjuguée à un colorant sur un séquenceur d'ADN (ABI : 373A). On a obtenu ainsi un fragment partiel codant une partie de APX d'après la recherche d'homologie BLAST. Clonage et séquençage du gène de pAPX de l'orge On a préparé une banque d'ADNc à partir de feuilles d'orge soumises à une agression saline, de manière décrite antérieurement (Ishitani et al. (1995) Plant Molecular Biology 37,307-315). On a criblé cette banque avec un fragment de PCR marqué avec [a-32P] dCTP au moyen d'un système de marquage d'ADN Megaprime (Amersham). On a excisé les clones positifs du vecteur ZAPII pour les introduire dans le plasmide pBluescript selon le protocole du fabricant. On a déterminé les séquences d'ADN de la manière décrite ci-dessus. Analyse par transfert de Southem et transfert de Northern On a isolé de l'ADN génomique de feuilles d'orge selon le procédé conventionnel puis on l'a soumis à une digestion avec les enzymes de restriction BamHI, BglII, EcoRI, EcoRV et HindIII, et on l'a séparé sur un gel d'agarose à 0,8 %. Après avoir transféré le produit de digestion sur une membrane de Nylon (Hybond-N+, Amersham), on a réalisé une hybridation dans une solution contenant 6XSSC, 5X solution de Denhardt, 0,1 % de SDS et 0,1 mg/ml d'ADN de sperme de hareng dénaturé. On lavé la membrane dans 2XSSC, 0,1 % de SDS puis dans 1XSSC, 0,1 % de SDS et en outre dans 0,1XSSC, 0,1 % de SDS. On a réalisé l'hybridation et les lavages à 65 C. On a exposé des plantes de 20 jours à des conditions agressives comme décrit ci-dessus, puis on les a récoltées et conservées à -80 C pour l'extraction de l'ARN. On a isolé l'ARN en utilisant le procédé à l'ATA (acide aurinetricarboxylique). On a séparé 20 g d'ARN total sur un gel d'agarose à 1,2 % contenant 0,66 M de formaldéhyde et on a transféré sur une membrane de Nylon (Hybond-N, Amersham). On a réalisé l'hybridation et tous les lavages à 65 C. On a analysé les signaux avec un appareil BAS2000 Bioimage Analyzer (Fuji). Construction d'un plasmide d'expression et transformation On a ligaturé la séquence pAPX codant la protéine pAPX de longueur intégrale dans le vecteur binaire pBI121 avec remplacement du fragment GUS et sous le contrôle du promoteur de CaMV 35S (figure 1). Sur la figure 1, RB et LB désignent respectivement la séquence encadrante de droite et la séquence encadrante de gauche. Puis on a introduit le plasmide dans Agrobacterium tumefaciens par électroporation. On a introduit pAPX dans l'écotype Columbia de Arabidopsis thaliana par le biais de Agrobacterium, par transformation dans la plante (Shimamoto K. et Okada K. ed. Expérimental Protocol for Model Plants : Rice and Arabidopsis, SYUJUNSYA Co., Ltd., Tokyo, 1996). Après la récolte, on a placé les graines sur du milieu MS (Murashige & Skoog) contenant de la kanamycine et on a recueilli les plantes résistantes à la kanamycine (Tl). On a transféré les plantules transformées dans des pots contenant de la vermiculite et on a arrosé avec du milieu Hyponex dilué 1000 fois dans l'eau du robinet, puis on a cultivé dans des conditions de routine pour récolter les graines T2. Test de thermotolérance avec des plantes transgéniques On a semé sur de la vermiculite les graines de type sauvage et les graines des lignées transgéniques T3 totalement homozygotes en arrosant avec du milieu Hyponex dilué 1000 fois dans l'eau du robinet, et on a cultivé dans une chambre de culture dans les conditions suivantes : période lumineuse de 16 h, 23 C, 100 mol m-2s-1 et période sombre de 8 h à 23 C et 50 % d'humidité pendant 3 semaines. On a exposé les plantes à 35 C et 70 % d'humidité dans la chambre de culture pendant 5 jours puis on les a soumises à des conditions de routine pour la récupération. Au bout de 5 jours, on a récolté les plantes et on a pesé séparément le poids frais des parties vertes et le poids frais des parties jaunes. On a réalisé chaque expérience en 5 exemplaires. Clonage et séquençage de pAPX Par DDRT-PCR (PCR à transcription inverse et visualisation différentielle) avec une amorce RAPD (amorce d'ADN polymorphe amplifiée de manière aléatoire) (5'-CTTGAGCGTATT-3'), on a détecté un fragment d'ADN qui était amplifié préférentiellement à partir des ARNm préparés à partir des feuilles soumises à une agression saline. Après avoir séquence, on a constaté que ce fragment présentait une grande homologie avec les gènes de APX d'après la recherche d'homologie BLAST. En utilisant ce fragment comme sonde, on a ensuite isolé le clone d'ADNc de longueur intégrale à partir d'une banque d'ADNc préparée à partir des feuilles d'orge soumis à une agression saline. Cet ADNc avait une longueur de 1089 pb et contenait un cadre de lecture ouvert codant un polypeptide prévu de 291 acides aminés (figure 2). Sur la figure 2, la région transmembranaire est soulignée et la longue partie C-terminale caractéristique est indiquée en italique. La séquence d'acides aminés déduite de cet ADNc présentait 75,3 % d'homologie avec celle de l'APX glyoxysomique (gAPX) de Gossypium hirsutum et 72,1 % d'homologie avec celle de APX3 de Arabidopsis thaliana (figure 3). La longue partie C-terminale caractéristique et le domaine transmembranaire étaient présents et conservés. Ainsi, le clone isolé code l'ascorbate peroxydase peroxysomique et est désigné par pAPX. Analyse par transfert de Southern Pour évaluer le nombre de copies du gène, nous avons réalisé une analyse par transfert de Southern en utilisant la 3'-UTR (région non traduite en 3') plus 150 paires de bases de la région codante C-terminale comme sonde. L'ADNc de pAPX a un site de restriction HindIII interne mais aucun site pour les enzymes de restriction BamHI, BglII, EcoRI et EcoRV. Sur la figure 4, les pistes 1,2, 3, 4 et 5 indiquent les résultats de la digestion par BamHI, BglII, EcoRI, EcoRV et HindIII, respectivement. Comme le montre cette figure, dans des conditions très stringentes, on a détecté une seule bande dans les produits de digestion par BamHI, BglII, EcoRI et EcoRV et 2 bandes dans le produit de digestion par HindIII. Ceci indique que pAPX est codée par un gène à copie unique dans le génome de l'orge. Expression de gènes pAPX dans des conditions d'agression thermique et d'autres agressions. La figure 5 montre le résultat de l'analyse par transfert de Northern de pAPX dans différentes conditions agressives. On a préparé les échantillons de la figure 5 à partir de plantes qui se sont développées dans des conditions normales (C) salines (NaCl 300 mM), et de traitement avec ABA (50 M), et dans des conditions d'agression thermique (37 C, 24 h). Dans la partie supérieure A de la figure 5, on a réalisé la détection en utilisant 3'-UTR de l'ADNc de pAPX plus 150 pb de la région codante C-terminale comme sonde. Dans la partie inférieure B de la figure 5, on a visualisé l'ARNr 25S par coloration au bromure d'éthidium, à titre de contrôle. L'analyse par transfert de Northern (transfert d'ARN) à titre de contrôle (figure 5) indiquait que le niveau de transcription de pAPX était manifestement augmenté dans des conditions d'agression thermique et d'agression saline. L'addition d'ABA entraînait une induction encore plus importante de l'expression du gène de pAPX. Toutefois, l'addition de peroxyde d'hydrogène directement au milieu de culture n'induisait pas l'expression de ce gène. Thermotolérance de Arabidopsis transgénique surexprimant pAPX A partir du groupe de graines TO (récoltées sur des plants d'Arabidopsis infectés par Agrobacterium tumefaciens), on a sélectionné au total 8 lignées transgéniques (Tl) indépendantes sur du milieu contenant de la kanamycine. Après autopollinisation, on a étalé la descendance T2 sur du milieu contenant de la kanamycine pour une analyse de ségrégation. Selon cette analyse, on a constaté que 6 lignées avaient une seule insertion d'ADN-T (plasmide de Agrobacterium tumefaciens). On a isolé les ADN génomiques de la lignée de type sauvage et de 6 lignées transgéniques T2 puis on les a analysés par PCR en utilisant deux séries d'amorces de pAPX représentant 131-511 pb et 131-916 pb. Le résultat obtenu est montré sur la figure 6. Sur la figure 6, les produits de PCR représentant la séquence de 131-916 pb de pAPX sont montrés à gauche et les produits de PCR représentant la séquence de 131-511 pb de pAPX sont représentés à droite. De plus, pAPXl, pAPX2, pAPX3, pAPX5, pAPX7 et pAPX8 désignent des souches de Arabidopsis indépendantes. Aucun fragment d'ADN n'a pu être amplifié à partir des plantes de type sauvage tandis qu'un fragment de 380 pb ou 785 pb prévu a été amplifié à partir des ADN de toutes les lignées transgéniques testées (figure 6), ce qui indique que ces lignées contiennent le transgène pAPX. On a produit des lignées transgéniques T3 par autopollinisation de T2. Parmi ces lignées, on a étalé 50 à 60 graines sur du milieu MS contenant de la kanamycine pour sélectionner les lignées homozygotes qui présentaient toutes une résistance à la kanamycine. On a utilisé uniquement ces lignées homozygotes pour des analyses supplémentaires et un test de thermotolérance. On a vérifié le niveau de transcription de pAPX par analyse par transfert de Northern dans les plantules de type sauvage (WT) et les plantules de Arabidopsis thaliana transgéniques. La figure 7 montre le résultat de l'analyse par transfert de Northern de plantes du type sauvage et de plantes transgéniques surexprimant pAPX de la génération T2, avec comme sonde pAPX de longueur intégrale. Dans la partie supérieure A de la figure, on a détecté les transcrits qui s'hybrident avec la sonde spécifique de pAPX de l'orge sur pAPXl, pAPX2, pAPX3, pAPX5, pAPX7 et pAPX8. Dans la partie inférieure B de la figure, on a visualisé l'ARNr 25S par coloration au bromure d'éthydium, à titre de contrôle. Comme le montre la figure 7, les plantes de type sauvage ne contiennent pas de transcrits qui s'hybrident avec la sonde de pAPX, mais toutes les lignes transgéniques contiennent une quantité abondante de transcrits de pAPX. Parmi ces lignées transgéniques, les lignées pAPXl, pAPX2 et pAPX3 présentaient le plus haut niveau, tandis que pAPX5 et pAPX7 présentaient un niveau relativement plus faible et que l'expression de pAPX était très faible dans la lignée pAPX8. Quand on a exposé à une agression thermique des plantes de 3 semaines, toutes les lignées transgéniques avaient tendance à être plus tolérantes à l'agression thermique que les plantes de type sauvage. Le pourcentage de parties vertes par rapport au total était sensiblement plus élevé dans les lignées pAPX5 et pAPXl (P par rapport à la plante de type sauvage dont la croissance était dégradée comme le montre cette figure. Liste de séquences Président de l'Université de Nagoya Ascorbate peroxydase, gène la codant, procédé de transgenèse l'utilisant et plante transgénique obtenue par ce procédé 2 1 291 Acide aminé Hordeum vulgare L. Haruna-nijyo 1 MAAPVVDAEY LRQVDRARRA FRALIASKGC APIMLRLAWH DAGTYDVNTR TGGANGSIRY 60 EEEYTI IGSNA GLKIAIDLLE PIKAKHPKIT YADLHQLAGV VAVEVTGGPT VEFIPGRRDS 120 SVCPREGRLP DAKKGAPHLR DIFYRMGLTD KDIVALSGGH SLGKAHPERS GFDGAWTRDP 180 LKFDNS YFLE LLKGESEGLL KLPTDKALLD DPEFRRYVEL YAKDEDVFFK DYAESHKKLS 240 ELGFTPRSSG PASTKSDVST cIVVLAQSA'SrG VAVAAAW1A GYLYEASKRS K 291 2 1089 Acide nucléique Hordeum vulgare L. Haruna-nijyo 2 CTTCTAGGGT CGTCCGCGAT GGCGGCTCCG GTGGTGGACG CCGAGTACCT GCGCCAGGTC 60 GACAGGGCGC GCCGCGCCTT CCGTGCCCTC ATCGCCTCCA AGGGATGCGC CCCCATCATG 120 CTCCGCCTCG CATGGCATGA TGCTGGCACC TATGATGTGA ACACAAGAAC TGGTGGTGCA 180 AATGGTTCAA TTAGATACGA GGAAGAGTAC ACCCATGGTT CAAATGCTGG CTTAAAAATT 240 GCTATTGATC TCCTTGAGCC TATTAAAGCG AAGCATCCAA AGATTACATA TGCAGACCTT 300 CATCAGCTTG CCGGAGTAGT TGCAGTTGAA GTCACCGGGG GTCCAACCGT TGAGTTCATC 360 CCTGGAAGAC GTGATTCGTC AGTTTGTCCC CGTGAAGGAC GCCTTCCTGA TGCTAAGAAA 420 GGTGCACCAC ATCTAAGGGA CATCTTTTAT CGAATGGGGT TAACAGACAA AGATATTGTA 480 GCACTATCTG GGGGGCACAG CCTGGGAAAG GCGCATCCTG AAAGGTCTGG GTTTGACGGT 540 GCATGGACTC GTGACCCTCT GAAATTTGAC AACTCATACT TTCTTGAGCT ACTGAAGGGG 600 GAATCTGAGG GTCTTCTGAA GCTCCCTACT G ATAAGGCAT TGTTGGATGA TCCTGAATTT 660 CGACGCTATG TGGAGCTTTA TGCAAAGGAT GAGGATGTTT TCTTCAAGGA CTACGCTGAA 720 TCACACAAAA AACTTTCTGA ACTTGGCTTC ACACCACGGA GCAGTGGCCC AGCATCTACA 780 AAATCAGATG TTTCAACTGC TGTTGTACTT GCACAGAGTG CAGTCGGGGT AGCAGTTGCT 840 GCAGCTGTAG TTATCGCGGG CTACCTGTAC GAAGCTTCCA AGAGGAGCAA GTAAGGGGTT 900 CGTGAGTTCT TGGATGACAT TCCCTTATTT AGTAAGTATC AAGTT A TI AT TCTAAAAAAA 960 TAAGTGCCAA GTGCAAATAA CAGAACTCTA GTGATGAACA ACCAACAGTA GTCTCAAAAT 1020 ATTTCATACA TTCTTGAGGA CATCTCCTTC ATATATATAC ATCATACTTG AATAAAAAAA 1080 AAAAAAAAA 1089 REVENDICATIONS 1. Polypeptide caractérisé en ce qu'il consiste en l'une des séquences d'acides aminés (a) et (b) suivantes : (a) une séquence d'acides aminés s'étendant des acides aminés n 1 à 291 de SEQ ID NO : 1 de la liste de séquences, (b) une séquence d'acides aminés dans laquelle une partie de ladite séquence d'acides aminés (a) est délétée ou une autre séquence d'acides aminés est ajoutée à ladite séquence d'acides aminés (a) ou une partie de ladite séquence d'acides aminés (a) est remplacée par une autre séquence d'acides aminés, la séquence d'acides aminés (b) étant codée par un gène dont l'expression est induite par une agression thermique et qui provient de l'orge. 2. Polypeptide caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence d'acides aminés présentant une homologie d'au moins 70 % avec la séquence d'acides aminés s'étendant des acides aminés n 1 à 291 de SEQ ID NO : 1 dans la liste de séquences. 3. Gène caractérisé en ce qu'il code le polypeptide selon la revendication 1. 4. Gène caractérisé en ce qu'il code le polypeptide selon la revendication 2. 5. Gène caractérisé en ce qu'il consiste en l'une des séquences de bases (c), (d) ou (e) suivantes : (c) une séquence de bases qui s'étend des bases n 1 à 1089 de SEQ ID NO : 2 dans ladite de séquences, (d) une séquence de bases dans laquelle une partie de ladite séquence de bases (c) est délétée ou une autre séquence de bases est ajoutée à ladite séquence de bases (c) ou une partie de ladite séquence de bases (c) est remplacée par une autre séquence de bases, la séquence de bases (d) étant induite par une agression thermique et provenant de l'orge, (e) une séquence de bases qui s'hybride avec ladite séquence de bases (c) dans des conditions stringentes, la séquence de bases (e) étant induite par une agression thermique et provenant de l'orge. 6. Gène caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence de bases présentant une homologie d'au moins 70 % avec une séquence de bases s'étendant des bases n 1 à 1089 de SEQ ID NO : 2 dans la liste de séquences. 7. Procédé pour conférer à une plante une résistance aux agressions thermiques caractérisé en ce qu'il comprend l'incorporation dans ladite plante d'un gène selon l'une quelconque des revendications 3 à 6. 8. Plante transgénique présentant une résistance aux agressions thermiques caractérisée en ce qu'elle est obtenue par introduction dans ladite plante d'un gène selon l'une quelconque des revendications 3 à 6. 9. Plante transgénique selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'il s'agit de Arabidopsis thaliana.