Brevet FR2816956A1 — publié le 20020524

Le domaine de l'invention est celui de l'analyse microbiologique par voie biochimique, et en particulier de la détection et de l'identification de souches bactériennes par ensemencement de milieux réactionnels, en particulier des milieux nutritifs. Ces derniers comprennent des substrats chromogènes ou fluorogènes susceptibles de réagir avec les enzymes spécifiques des souches recherchées, en produisant une coloration ou une fluorescence de chaque colonie concernée. On s'intéresse plus particulièrement dans le cadre du présent exposé à la détection/identification de bactéries à activité estérasique, et plus spécialement de bactéries du genre Salmonella. Ce genre Salmonella est le plus important de la famille des entérobactéries responsables chez l'homme de diverses infections (fièvre typhoïde, intoxication alimentaire). Les salmonelles possèdent des estérases non spécifiques capables d'hydrolyser des substrats synthétiques chromogènes, par exemple indigogéniques. La détection/identification de salmonelles, et plus généralement de bactéries à activité estérasique est classiquement réalisée sur des milieux gélosés ou liquides d'isolement, qui permettent la détection/identification des colonies suspectes de bactéries à activité estérase, notamment les salmonelles. L'ensemencement de tels milieux s'opère par trempage dudit milieu dans l'échantillon analysé ou par mise en contact de l'échantillon avec le milieu. Les bactéries à activité estérasique, en particulier les salmonelles, possèdent dans leur patrimoine enzymatique des estérases qui clivent les liaisons ester des substrats présents dans le milieu et qui libèrent ainsi la partie chromogène ou fluorogène activée desdits substrats. Il en résulte une coloration ou une fluorescence qui révèle l'hydrolyse, et donc la présence de bactéries ou de colonies de bactéries cibles. Pour pouvoir réaliser des tests de routine à grande envergure, il est nécessaire que les milieux de détection/identification soient stables et permettent de simplifier au maximum les procédés de détection/identification correspondant, en limitant les manipulations. En outre, il importe que les procédés offrent une haute sensibilité (intensité de coloration), ainsi qu'une spécificité de premier ordre. La vitesse de révélation des colonies suspectes est également un paramètre fondamental de ces types de milieux et procédés de détection/identification de bactéries à activité estérasique. Or, il est connu que les substrats d'estérase posent des problèmes de compatibilité avec les milieux de culture pour bactéries à activité estérase. De plus, de tels substrats d'estérase ne sont pas stables dans le temps, ce qui induit une diminution de la sensibilité vis-à-vis de l'activité estérase avec l'allongement du temps de conservation. Dans ce contexte, on connaît au travers de l'article scientifique intitulé"Synthèse de substrats indigogéniques. Mise en évidence de l'activité estérasique des salmonelles" : A. Agban et al., des milieux de culture gélosés comprenant des substrats indigogéniques, à savoir notamment le Pélargonate (C9) de Bromo-5-indoxyle et un sel biliaire, à savoir le Déoxycholate de Sodium. De tels milieux de culture souffrent des mêmes inconvénients que ceux évoqués ci-dessous en référence au document FR-2 697 028. Le brevet FR-2 697 028 divulgue un milieu de culture pour la mise en évidence de salmonelles comprenant un substrat d'estérase chromogène constitué par un ester de l'acide caprylique avec un reste indole (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-caprylate), ainsi qu'un détergent choisi parmi les sels biliaires (Désoxycholate de Sodium). Ce chromogène et ce sel biliaire sont contenus dans un milieu nutritif permettant la croissance des salmonelles. Selon l'enseignement du FR-2 697 028, le sel biliaire est ajouté directement au milieu sélectif dans lequel se trouve déjà inclus le substrat d'estérase. Un autre inconvénient lié à l'emploi de sels biliaires tient au fait que ces derniers sont des matières premières d'origine animale, ce qui sous-tend une certaine variabilité de la qualité. De plus, les résultats en termes d'activité biologique sont perfectibles. Ce milieu de culture n'offre pas toutes les garanties souhaitables en termes de stabilité du substrat d'estérase. En outre, il s'avère que ce dernier n'est pas complètement miscible avec le milieu de culture. Il est clair que cela nuit à la qualité des résultats obtenus sur le plan de la sensibilité, de la rapidité et de la stabilité. Il doit également être noté que le milieu de culture selon le FR-2 697 028 se présente sous forme de poudre. Cela oblige l'utilisateur à exécuter une opération de reconstitution préalable du milieu liquide ou gélifié. Cette contrainte résulte du manque de stabilité des substrats d'estérase mis en oeuvre. De plus, le milieu gélosé préparé selon l'enseignement du FR-2 697 028 n'est pas translucide. Ceci risque de compromettre la lecture des colorations associées aux éventuelles colonies de bactéries cibles. La demande de brevet PCT WO-92/17607 concerne un milieu de détection pour salmonelles contenant du TERGITOL-40 (sulfate hydrogéné de 7-éthyl-2-méthyl-4undécanonate ou son sel de sodium). Cet additif est sensé améliorer la sélectivité du milieu de détection vis-à-vis des salmonelles-cibles. La concentration en TERGITOL- 40 peut varier de 2 à 30 mil/1 dans le milieu de culture à base de gélose agar-xylose- lysine. Selon ce document, la détection de salmonelles repose uniquement sur un principe de croissance sélective par compétition. La demande PCT WO-99/41409 concerne des substrats d'estérase chromogènes pour la détection de salmonelles. Il est proposé selon ce document de mettre en oeuvre un composé chromogène qui réagit avec une estérase/lipase spécifique du genre Salmonella et ayant une affinité pour les esters d'acide gras en C8. Le composé chromogène dont il s'agit, comprend un anion et un cation de formule : [4- [2- (4-octanoyloxy-3, 5-diméthoxyphényl)-vinyl]- quinolinium-l- (propan-3-yle) carboxylate] +,' [bromure ou chlorure]. Plus précisément, les substrats mis en oeuvre sont des esters en C8 par exemple, du cation carboxylate. En outre, le procédé selon le WO-99/41409 décrit la mise en oeuvre d'ester de Sorbitan et d'acides gras (en particulier : acide monolaurique : TWEEN&commat; 20). Ces produits sont employés à titre de détergent à raison de 2 g par litre de milieu. En outre, le substrat spécifique selon l'enseignement de cette demande PCT peut être introduit dans le milieu de culture nutritif en mélange avec du Méthanol, de l'Ethanol ou de la N, N-Diméthylformamide (DMF). Le détergent éventuel n'est pas introduit conjointement au substrat et au solvant, mais séparément. En tout état de cause, les moyens divulgués dans le WO-99/41409 ne sont pas présentés comme procurant une amélioration de la stabilité des substrats enzymatiques contenus dans le milieu de détection. Les Esters de Sorbitan et d'Acides Gras (ESAG) sont des tensioactifs connus, largement utilisés dans les préparations alimentaires et pharmaceutiques notamment. A titre illustratif, on peut citer l'article de DICKINSON et al. :"J Colloid interface Sci 1999 Apr 15 ; 212 (2) : 466-473"concernant la stabilisation d'émulsions contenant du Casénate de Sodium et un Monolauréate de Sorbitan polyoxyéthyléné comprenant 20 motifs oxyde d'éthylène (TWEEN 20). Les émulsions considérées sont des émulsions huile dans eau (30% volumique de n-tétradécane à pH 6,8). Ce domaine technique est relativement éloigné de celui de la détection de bactéries à activité estérasique par réaction colorée sur milieu de culture sélectif. Dans l'article GRAM et al :"Clin Chem 1985 Oct ; 31 (10) : 1683-8", il est question de mise en oeuvre de Monooléate de Sorbitan polyoxyéthyléné (TWEEN 80) dans un milieu de dosage de l'antitrombine-III, ce milieu comportant également du Polyéthylène Glycol, une solution de trombine et des substrats peptidiques chromogènes synthétiques. Les additifs mis en oeuvre sont présentés comme permettant l'augmentation de la concentration de thrombine active, de manière à garantir la bonne marche de l'analyse. Une fois de plus, force est de constater que ce genre de préoccupations techniques sont très distinctes de celles propres au milieu de détection de bactéries à activité estérasique, à l'aide de milieu de culture sélectif contenant des substrats chromogènes. Dans un tel environnement technique, l'un des objectifs essentiels de la présente invention est de fournir un milieu de détection/identification de bactéries à activité estérasique, qui soit constitué de telle sorte que la sensibilité de l'analyse soit optimisée, c'est-à-dire que l'intensité de la coloration ou de la fluorescence révélant la présence de bactéries-cibles soit la plus forte possible. Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir un milieu de détection/identification de bactéries à activité estérasique, qui soit parfaitement translucide avant ensemencement par l'échantillon à analyser. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un milieu de détection/identification de bactéries à activité estérasique, qui comporte un substrat d'estérase chromogène ou fluorogène et qui soit stable à la conservation (intensité de la coloration ou de la fluorescence de révélation maintenue à un niveau maximum au moins pendant plusieurs semaines). Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un milieu de détection/identification de bactéries à activité estérasique, qui ne se présente pas sous forme de poudre sèche à régénérer avec un liquide pour reconstituer un milieu liquide ou gélifié, mais qui existe directement sous des formes prêtes à l'emploi. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un milieu de détection/identification de bactéries à activité estérasique, en particulier de salmonelles, qui soit économique, notamment du fait qu'il comprend des quantités réduites de substrat d'estérase chromogène ou fluorogène, lequel a la particularité d'être coûteux. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un procédé d'obtention du milieu de détection/identification sus visé qui soit simple à mettre en oeuvre et économique. Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir un procédé de détection/identification de souches à activité estérasique qui soit facile à mettre en oeuvre (tests de routine), qui soit économique (quantité de réactif, manipulation, main d'oeuvre, vitesse...) qui soit fiable, sensible, spécifique et reproductible. Un autre objectif essentiel de la présente invention est de proposer l'utilisation d'un nouvel additif stabilisant dans des milieux de détection/identification de bactéries à activité estérasique (en particulier les salmonelles) par révélation résultant d'une réaction d'hydrolyse libérant un colorant ou un produit fluorescent. Ces objectifs, parmi d'autres, sont atteints par la présente invention qui concerne tout d'abord un milieu de détection/identification de bactéries à activité estérasique, du type de ceux comprenant notamment un milieu réactionnel, en particulier un milieu de culture, et au moins un substrat d'estérase chromogène ou fluorogène, à l'exclusion des substrats comprenant un cation de 4- [2- (4-octanoyloxy-3, 5-diméthoxyphényl)-vinyl]quinolinium-l- (propan-3-yle-acide carboxylique) et un anion, cette détection/identification reposant essentiellement sur la mise en évidence de l'activité estérase, caractérisé en ce que : * il est sous forme stable liquide ou gel prêt à l'emploi ; * il comporte : - au moins un Ester de Sorbitan et d'Acide (s) Gras (ESAG) ou au moins un Acide Gras (AG) ou un mélange ESAG/AG (comprenant au moins un Ester de Sorbitan et d'Acide (s) Gras et au moins un Acide Gras), à titre d'agent stabilisant-émulsifiant, - et éventuellement au moins un Solvant (S). Le milieu selon l'invention présente l'avantage d'être un milieu prêt à l'emploi se présentant sous forme liquide ou semi-liquide (gel) sans que cela ne pose de problème quant à la stabilité. En effet, les substrats d'estérase présents dans ce milieu et pourtant connus pour leur tendance à la dégradation relativement rapide, sont stabilisés grâce à la présence de l'additif stabilisant-émulsifiant ESAG, AG ou ESAG/AG. Cet additif, éventuellement associé au solvant S, induit un autre avantage qui est de permettre une excellente dissolution des substrats d'estérase traditionnellement récalcitrant à la mise en solution. Cela permet d'obtenir des milieux de détection/identification translucides avant l'ensemencement. La lecture des résultats colorés ou fluorescents s'en trouve ainsi facilitée. Cet additif ESAG, AG ou ESAG/AG est peu onéreux et permet une simplification de la mise en oeuvre et une diminution de la quantité des substrats d'estérase utilisée (stabilisation). Il en résulte un gain économique certain. Enfin, les moyens selon l'invention sont à l'origine d'une meilleure activité biologique des substrats d'estérase, ce qui se traduit par une coloration plus intense des colonies cibles et par une meilleure spécificité. Il est du mérite des inventeurs d'avoir sélectionné cette classe particulière d'agents stabilisant-émulsifiant, en particulier les ESAG, qui procurent de manière surprenante et inattendue des propriétés de stabilité, de translucidité, d'activité biologique, de sensibilité, de fiabilité et de spécificité, tout à fait bienvenues dans l'analyse microbiologique par voie biochimique selon l'invention. Suivant une caractéristique remarquable de l'invention, le milieu de détection/identification qu'elle concerne est obtenu par mélange d'au moins une solution mère de substrat dans le solvant S et de l'ESAG ou AG ou mélange ESAG/AG, ajouté à au moins une partie des constituants du milieu de culture. Il est en effet apparu important conformément à l'invention de solubiliser le substrat d'estérase dans le solvant S en présence d'un ou plusieurs ESAG, AG ou d'un mélange ESAG/AG répondant à la définition donnée ci-dessus. Ce mélange substrat ESAG, AG, ESAG/AG et solvant S est ensuite incorporé dans au moins une partie du milieu de culture, qui se présente, de préférence, sous forme gélifiée en surfusion. Il a pu être constaté que cette caractéristique opératoire permet une optimisation des résultats avantageux produits par les moyens selon l'invention. De préférence, l'ESAG est sélectionné dans le groupe comprenant : * Monolaurate de Sorbitan polyoxyéthylèné comprenant 20 motifs oxyde d'éthylène (O. E),-TWEEN&commat; 20- ; * Monopalmitate de Sorbitan polyoxyéthylèné (20 O. E),-TWEEN&commat; 40- ; Monostéarate de Sorbitan polyoxyéthylèné (20 O. E),-TWEEN&commat; 60- ; Tristéarate de Sorbitan polyoxyéthylèné (20 O. E),-TWEEN&commat; 65- ; * Monooléate de Sorbitan polyoxyéthylèné (20 O. E),-TWEEN&commat; 80- ; Sesquioléate de Sorbitan polyoxyéthylèné (20 O. E),-TWEEN&commat; 83- ; trioleate de Sorbitan polyoxyéthylèné (20 O. E),-TWEEN&commat; 85- ; . et leurs mélanges ; et l'AG est sélectionné dans le groupe comprenant les acides gras saturés ou insaturés en C4-C20, préférentiellement les acides gras saturés ou insaturés en C6-C11 et plus préférentiellement les acides gras en C8-C9, et leurs mélanges. Les produits particulièrement sélectionnés, conformément à l'invention, sont des esters de Sorbitan largement utilisés dans l'industrie alimentaire et dans l'industrie cosmétique comme émulsifiants non ioniques, mais jusqu'alors ils n'avaient jamais été employés dans des milieux de détection/identification microbiologiques, à titre de stabilisants vis-à-vis de substrats d'estérase. Les"Hydorphile-Lipophile-Balances" (HLB) des ESAG sus-mentionnés sont yd respectivement : 8, 6 ; 6, 7 ; 4, 7 ; 2, 1 ; 4, 3 ; 3, 7 ; 1, 8. Selon une variante intéressante de l'invention, le ou les agents stabilisant- émulsifiant décrits ci-dessus, en particulier le ou les ESAG, peuvent être associés à au moins un co-agent synergique, de préférence, au moins un tensioactif anionique, de préférence le 7-Ethyl-2-méthyl-4-undécylhydrogénosulfate ou ses sels et plus particulièrement ses sels de sodium (TERGITOL--4&commat;). L'utilisation d'un tel co-agent synergique facilite la mise en évidence de l'activité estérase dans les bactéries-cibles. Il s'agit d'un excellent complément du ou des agents stabilisant-émulsifiant et en particulier des ESAG. Il permet d'améliorer la sélectivité et la détection de l'activité estérase des bactéries-cibles (en particulier des salmonelles), sans nuire à l'expression d'autres activités enzymatiques qui pourraient être éventuellement utilisées pour la mise en évidence des bactéries-cibles considérées. Sans vouloir être lié par la théorie, il est supposé que le co-agent synergique TERGITOLa une action qui favorise la pénétration des substrats d'estérase chromogènes ou fluorogène ou l'excrétion des enzymes au travers des membranes des cellules des bactéries-cibles, par exemple des salmonelles, optimisant ainsi l'accessibilité de ces substrats vis-à-vis des estérases. Cela permet de diminuer la quantité de substrats mis en oeuvre, d'où un avantage économique certain. De manière plus préférée encore, l'association TWEEN&commat; et TERGITOLapparaît comme étant tout à fait performante dans le milieu de détection/identification selon l'invention. S'agissant du substrat d'estérase, il est sélectionné avantageusement dans le groupe des substrats d'estérase chromogènes ou fluorogènes comportant : les esters d'acide (s) gras et d'Indoxyle et dérivés, de préférence les esters d'acide (s) gras en C6-Cll et d'Indoxyle, et plus préférentiellement encore les esters d'acide (s) gras en C8-C9 et d'Indoxyle, éventuellement halogénés ; - les esters d'acide (s) gras et de Quinone/Anthraquinone et dérivés, de préférence les esters d'acide (s) gras en C6-Cll et d'Anthraquinone, et plus préférentiellement encore les esters d'acide (s) gras en C8-C9 et de Dihydroxyanthraquinone (Alizarine) ; - les esters d'acide (s) gras et d'Hydroxycoumarine et dérivés ; - les esters d'acides gras et de Fluorescéine et dérivés ; - et leurs mélanges. Comme exemples de substrats esters chromogènes dérivés d'Indole, on peut citer le 5-Bromo-3-indolyl nonanoate, le 6-Chloro-3-indolyl nonaoate ou le 5-Bromo-3indolyl décanoate. A titre d'exemples de substrats d'estérase chromogènes dérivés de l'Anthraquinone, on peut citer, l'Alizarine et le 2-Alizarine octanoate. Le solvant S est un auxiliaire de solubilisation du substrat d'estérase, en particulier chromogène. Il complète également l'action de l'agent stabilisant émulsifiant ESAG, AG ou ESAG/AG. Il s'agit donc de préférence d'un constituant du milieu selon l'invention. Selon une disposition avantageuse de cette dernière, le solvant S est sélectionné dans le groupe comprenant : - les alcools, de préférence le Méthanol, l'Ethanol, le Méthoxyéthanol, - les amides, de préférence le DiMéthylFormamide (DMF), - les solvants soufrés, de préférence le DiMéthylSulfOxyde (DMSO), - et leurs mélanges. En pratique, les solvants préférentiellement utilisés sont le méthanol, le DMF et le DMSO. Sur le plan pondéral, il s'est avéré tout à fait avantageux, conformément à l'invention, que la proportion Ester de Sorbitan et d'Acide (s) Gras (ESAG) : Solvant (S) soit comprise entre 20 : 80 et 80 : 20, de préférence est comprise entre 30 : 70 et 70 : 30, et plus préférentiellement encore correspond à 40 : 60 ou à 60 : 40. Toujours sur le plan quantitatif, il est préférable que la concentration en [ESAG] dans le milieu soit définie comme suit (en % en poids) : 0,1 [ESAG] 10, de préférence 0,5 s [ESAG] s 5, et plus préférentiellement encore 1,5 # [ESAG] # 3, 5. S'agissant du substrat d'estérase chromogène, les quantités mises en oeuvre sont telles que sa concentration dans le milieu est définie comme suit (en mg/1) : 50 # [substrat] # 1000, de préférence 100 s [substrat] s 800, et plus préférentiellement encore 200 Concernant le substrat dans la solution d'ESAG et de solvants S, les quantités mises en oeuvre sont telles que sa concentration dans le milieu est définie comme suit (eng/1) : 0, substrat dans la solution mères 2000, de préférence 1 substrat dans la solution mère] A propos du milieu de culture présent dans le milieu détection/identification, il peut être précisé qu'on le sélectionne dans le groupe comprenant : - les milieux séléctifs de type : Mac Conkey, Columbia ANC, PALCAM, Sabouraud Gentamycine-Chloramphénicol, de préférence le milieu Mac Conkey, - les milieux non sélectifs de type Columbia +/-sang, Trypcase Soja, Gélose nutritive, Sabouraud, de préférence le milieu Columbia. En pratique, l'homme de l'art choisira le milieu de culture en fonction des bactéries-cibles, selon des critères parfaitement connus et à la portée de cet homme de l'art. Sans que cela ne soit limitatif, il s'avère que le milieu selon l'invention est particulièrement adapté à la détection/identification de bactéries du genre Salmonella. Dans ce cas, on choisira par exemple, le milieu de Mac Conkey à titre de milieu de culture. Par ailleurs, le milieu selon l'invention peut contenir d'éventuels autres additifs comme par exemple : un ou plusieurs autres substrats enzymatiques par exemple chromogènes ou fluorogènes, des peptones, un ou plusieurs facteurs de croissance, des hydrates de carbone, un ou plusieurs agents sélectifs, des tampons, et un ou plusieurs gélifiants. Le milieu selon l'invention se présente sous forme de liquide ou de gel prêt à l'emploi, c'est-à-dire prêt à l'ensemencement en tube, flacon ou sur des boîtes de pétri. Le milieu selon l'invention peut se conserver plusieurs semaines à 4 C dans ses conteneurs et sous forme liquide ou gel. Selon un autre de ses aspects, la présente invention vise également un procédé d'obtention du milieu tel que défini ci-dessus caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement : - à préparer au moins une solution-mère du substrat d'estérase chromogène dans le solvant S et d'au moins un ESAG, AG ou mélange ESAG/AG, - à ajouter cette solution et d'éventuels autres additifs dans le milieu de culture, et - à homogénéiser l'ensemble. La préparation de la solution mère s'effectue de manière séparée en incorporant successivement le substrat, le solvant S et le ESAG, AG ou mélange ESAG/AG, éventuellement co-additivé. Les produits et les quantités utilisés sont tels que définis cidessus. Après homogénéisation, la solution mère est ajoutée au milieu de culture gélifié mis en surfusion et préalablement régénéré dans l'eau. Il peut s'agir également d'un milieu liquide non gélifié, comme par exemple un bouillon nutritif. Après mélange du milieu de culture et de la solution mère, on obtient le milieu de détection liquide ou gélifié prêt à être ensemencé. Selon encore un autre de ses aspects, l'invention a également pour objet un procédé de détection/identification de souches à activité estérasique (par exemple des salmonelles) consistant à : - ensemencer le milieu de détection/identification tel que défini ci-dessus en tant que produit per se ou en tant que produit obtenu par le procédé également décrit ci-dessus, avec l'échantillon contenant les bactéries cibles à analyser ; - incuber le milieu ensemencé dans des conditions appropriées connues de l'homme de l'art ; - et lire/interpréter les colorations ou fluorescences des colonies qui se sont développées après incubation, par exemple à l'étuve à 37 C ; ces colorations révélant l'hydrolyse du substrat d'estérase chromogène ou fluorogène par les bactéries-cibles. Enfin, l'invention concerne également l'utilisation d'Ester (s) de Sorbitan et d'Acide (s) Gras (ESAG), d'Acides Gras (AG) ou d'un mélange ESAG/AG, à titre d'agent stabilisant-émulsifiant de milieu (liquide ou gel) de détection/identification de bactéries à activité estérasique, ce milieu comprenant notamment un milieu réactionnel et au moins un substrat d'estérase chromogène ou fluorogène, à l'exclusion des substrats comprenant un carboxylate de 4- [2- (4-octanoyloxy-3, 5-diméthoxyphényl)vinyl]-quinolinium-l- (propan-3-yle) et un anion, éventuellement en association avec au moins un solvant S du substrat d'estérase chromogène ou fluorogène présent dans le milieu. Les exemples qui suivent permettront de mieux comprendre l'invention et d'appréhender tous ses avantages ainsi que ses diverses variantes de réalisation et de mise en oeuvre. EXEMPLES : Exemple 1 : essai de solubilité d'un substrat d'estérase à base d'Indoxyle, le 5-Bromo-3-indolyl nonanoate (substrat d'estérase chromogène) dans un milieu gélifié. Différentes solutions mères de substrat sont réalisées dans le Méthanol en présence de sels biliaires n 3 (bioMérieux). Ensuite, différents volumes de ces solutions sont ajoutés dans un milieu gélifié en surfusion : le milieu Mac Conkey (régénéré dans l'eau à une concentration de 50 g/l). Le protocole et l'observation de l'aspect des milieux sont répertoriés dans le tableau 1 ci-après. TABLEAU 1 Milieu 1'2'3'4'5 Concentration de la 100 g/1 50g/l 25g/l 12,5 g/1 6, 25 g/1 solution mère en substrat Concentration finale en 500 mg/1 substrat dans le milieu Concentration en sels 5 g/1 2, 5 g/1 biliaires dans la solution mère Concentration totale en 7,5 g/l'4 g/l sels biliaires dans le milieu Concentration en 0, 5 % 1 % 2 % 4 % 8 % méthanol mlieu Observation mileiu coulé en boîtes sous forme sous forme précipité : laiteux laiteux de gros de grains milieu grains plus petits laiteux que dans le milieu 1 Les milieux les plus optiquement homogènes sont les milieux 3,4 et 5 : milieux où la concentration en méthanol est la plus élevée. Cependant, l'aspect de ces milieux est laiteux : il semblerait donc que le substrat d'estérase soit sous forme d'émulsion. Exemple 2 : amélioration de la solubilisation du substrat d'estérase par ajout de Tween (D20 (ESAG). Deux solutions mères de substrat différentes sont réalisées dans le solvant S : Méthanol l'une en présence de sels biliaires nO 3, l'autre en présence de sels biliaires n 3 et de Tween &commat;20 [monolaurate de sorbitan polyoxyéthylèné comprenant 20 motifs oxyde d'éthylène (O. E)]. Ensuite un volume correspondant à une concentration finale de 500 mg/1 de substrat est ajouté dans un milieu de culture gélifié en surfusion : le milieu Mac Conkey. Le protocole et l'observation de l'aspect des milieux sont répertoriés dans le tableau 2 ci-après. TABLEAU 2 Milieu 1 2 Concentration de la solution mère en substrat 100 g/l 40 g/l Concentration finale en substrat dans le milieu 500 mg/1 500 mg/1 Concentration en sels biliaires dans la solution 5 g/l 5 g/l mère Concentration totale en sels biliaires dans le milieu 6, 5 g/1 6, 5 g/l Concentration de Tween #20 apporté à la solution 0 % 60 % mère de substrat Concentration de Tween &commat;20 apporté au milieu0 % 2, 5 % Observation du milieu coulé en boîtes milieu laiteux milieu translucide Le milieu 2 présente une meilleure homogénéité optique que le milieu 1. Soit le substrat d'estérase est complètement dissous soit il est sous la forme d'une émulsion dont les particules micellaires ne sont plus visibles à l'oeil. Exemple 3 : test biologique des deux milieux décrits dans l'exemple précédent. Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés sur chacun des deux milieux précédemment décrits par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 et 48 heures d'incubation. La coloration de ces colonies ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées. Les résultats sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous. TABLEAU 3 temps milieu 1 milieu 2 Souches d'incubation couleur intensité couleur intensité Salmonella typhimurium 24 h Gris 1, 5 gris 3 10 48 h Gris 1, 5 gris 3, 5 Salmonella paratyphi A 24 h Gris 1 gris 3 152 48 h Gris 1,5 gris 3,5 Proteus vulgaris 24 h - - - - 15 48h Serratia marcescent 24 h Gris 1, 5 gris 3 13 48 h Gris 1 1 gris 1 4 intensité de coloration : échelle arbitraire ;- : absence de coloration et d'intensité Le milieu contenant le Tween OE) 20 permet donc d'obtenir des colorations plus intenses pour les souches de micro-organismes présentant une activité estérase. Le substrat est donc plus utilisé soit parce qu'il est mieux dissous, soit parce qu'il est plus disponible. Vu la différence d'intensité entre les deux milieux, il semble possible, en présence de Tween#20, de diminuer la concentration en substrat utilisé et donc de réduire le coût engendré par l'utilisation de ce type de substrat. Exemple 4 : test de ce mode de dissolution pour un autre dérivé d'indoxyl (substrat d'estérase chromogène) sur des espèces bactériennes à Gram positif et Gram négatif et sur des levures. Une solution mère à 40 g/l de 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl octanoate (substrat d'estérase chromogène) a été réalisée dans un mélange Méthanol (40%) Tween#20 (60%). Ensuite un volume correspondant à une concentration finale de 500 mg/1 de substrat a été ajouté dans un milieu gélifié en surfusion : un milieu type Columbia. Ce milieu a été coulé en boîtes de Pétri. Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont ensuite été incubées à 37 oC pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 et 48 heures d'incubation. La coloration de ces colonies ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées. Les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous. TABLEAU 4 Temps 1 Souches d'incubation couleur intensité Listeria monocytogenes turquoise 2,5 023 48 h turquoise 2,5 Listeria innocua 24 h - 029 48 h turquoise 0,5 Staphylococcus turquoise 2,5 276 48 h turquoise 3 Candida albicans turquoise 0,5 033 48 h turquoise 3 Staphylococcus epidermidis 24 h turquoise 2 009 48 h turquoise 2 Salmonella 2 017 48 h turquoise 3 Proteus vulgaris 24 h - - 015 48 h - - intensité de coloration : échelle arbitraire ;- : absence de coloration et d'intensité En présence de Tween 20, il est donc possible de révéler l'expression d'une activité estérase chez tous les micro-organismes la possédant indépendamment du groupe auquel ils appartiennent. D'autre part, ce mode d'utilisation est indépendant du dérivé d'Indoxyle (substrat d'estérase chromogène) étudié. Exemple 5 : remplacement du Méthanol par d'autres solvants en présence de Tween 20 et en absence ou présence de sels biliaires. Le méthanol utilisé dans les exemples précédents a été remplacé par deux autres solvants le Diméthylsulfoxide (DMSO) et le Diméthylformamide (DMF). Les trois solvants ont été testés en présence de Tween 20 et en présence ou absence de sels biliaires à une concentration finale dans le milieu de 6,5 g/1. Le tableau 5 suivant montre la composition des six milieux testés. TABLEAU 5 Milieu 1 2 3 4 5 6 solvant S de la solution mère Méthanol DMSO DMF Méthanol DMSO DMF (SM) % de solvant S dans la SM 40% % de Tween &commat;20 apporté à la 60% SM substrat Concentration 6,5 g/l 0 g/l dans le milieu Concentration finale en substrat 500 mg/1 dans le milieu L'activité du substrat a été vérifiée de la même façon que l'exemple précédent c'est à dire en présence de micro-organismes ensemencés sur un milieu gélose Mac Conkey contenant le substrat d'estérase dissous dans un des solvants précédemment cités. Les résultats sont présentés dans le tableau 6 ci-dessous. TABLEAU 6 milieu 1 2 3 4 ; 56 Souches TI C I C I C I C I C I C I Salmonella 24 gris 2 gris 2 gris 2 gris 2 gris 2 gris 2 Thyphimurium 10 48 gris 2,5 gris 2,5 gris 2,5 gris 2,5 gris 2,5 gris 2,5 Salmonella gris 2 arizonae 15 48 gris 2,5 gris 3 gris 2,5 gris 2,5 gris 3 gris 2,5 Pseudomonas 24 gris 2 gris 2 gris 1 gris 2 gris 2 gris 1 aeruginosa 15 48 gris 2,5 gris 4 gris 3,5 gris 3 gris 4 gris 4 Proteus 24 - - - - - - - - - - - vulgaris 15 48 - - - - - - - - - - - Serratia 24 gris 2,5 gris 2 gris 2 gris 2, 5 gris 2 gris 2 marcescens 38 48 gris 2,5 gris 2 gris 2 gris 2,5 gris 2 gris 2 1 : intensité de coloration (échelle arbitraire) ; C : couleur ; TI : temps d'incubation en heures - : incolore Il est donc possible d'utiliser des solvants différents pour dissoudre le substrat d'estérase lorsque le Tween 20 est présent. D'autre part, l'ajout de Sels biliaires n'apporte rien que ce soit en terme de solubilité ou en terme de résultats biologiques et ceci quel que soit le solvant testé. Conclusion, le mode de dissolution le plus simple est le mélange d'un solvant et de Tween &commat;20 sans apport supplémentaire de sels biliaires. Exemple 6 : test de différents ratios solvant S/Tween 20. Différentes solutions mères de substrat sont réalisées dans du DMSO en présence de Tween (E) 20. Chaque solution mère correspond à un ratio DMSO/Tween 8 20 différents. Ensuite un volume correspondant à une concentration finale de 500 mg/1 de substrat est ajouté dans un milieu gélifié en surfusion : le milieu Mac Conkey. Le tableau 7suivant montre la composition des six milieux testés. TABLEAU 7 Milieu 1 2 3 4 5 6 % de DMSO dans la solution 10% 20% 30% 40% 50% 60% mère % Tween 020 de apporté à la 90% 80% 70% 60% 50% 40% solution mère de substrat Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés sur chacun des six milieux précédemment décrits par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 et 48 heures d'incubation. La coloration de ces colonies ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées. Les résultats sont présentés dans le tableau 8 ci-après. TABLEAU 8 Mileu 1 2 3 4 5 6 Souches TI C I C I C I C I C I C I Salmonella 2,5 gris 2,5 gris 2 gris 3 gris 3 gris 3 typhimurium 10 48 gris 3 gris 3 gris 2,5 gris 3,5 gris 3 gris 3,5 Salmonella 24 gris 2,5 gris 2,5 gris 3 gris 3,5 gris 3 gris 3,5 arizonae 15 48 gris 2,5 gris 2,5 gris 3 gris 3,5 gris 3 gris 3,5 Serratia 24 gris 3 gris 3 gris 3 gris 4 gris 3,5 gris 3,5 marcesscens 48 gris 4 gris 4 gris 4 gris 4 gris 4 gris 4 Hafnia 24 - - - - - - - - - - - alvei 025 48 - - - - - - - - - - - Pseudomonas 24 gris 2 gris 2 gris 3 gris 3 gris 3 gris 3 aeruginosa 165 48 gris 2 gris 2 gris 2 gris 3 gris 3 gris 3 Salmonella gris 3 paratyphi a 006 48 gris 2 gris 2 gris 2 gris 3 gris 3 gris 3 Salmonella 24 gris 2 gris 2 gris 2 gris 3 gris 2 gris 3 typhi 118 2 gris 2 gris 2 gris 3 gris 2 gris 3 1 : intensité de coloration (échelle arbitraire) ; C : couleur ; TI : temps d'incubation en heures - : incolore Les six ratios testés permettent d'obtenir une bonne solubilité des substrats et la révélation de l'hydrolyse du substrat avec des intensités de coloration très convenables. Des intensités de coloration maximales sont obtenues entre les ratios 40 % DMSO/60 % Tween 820 et 60 % DMSO/40 % Tween (E) 20. Exemple 7 : test du procédé de solubilisation sur un substrat d'estérase avant une partie marqueur autre qu'un Indoxyl. Le substrat testé est le 1, 2-Dihydroxyanthraquinone octanoate (2-Alizarine octanoate). Différentes solutions mères de substrat sont réalisées avec comme solvant le DMF ou le DMSO ou le méthanol ou le Méthoxyéthanol et dans tous les cas en présence de Tween&commat; 20. Le tableau 9 suivant montre l'aspect des solutions mères en fonction de leur composition. TABLEAU 9 solvant de mère Méthanol DMSO DMF Méthoxyéthanol % mère 40% % #20 apporté à la 60 % solution substrat aspect précipité dissolution dissolution totale totale Ensuite un volume correspondant à une concentration finale de 100 mgll de substrat est ajouté dans un milieu gélifié en surfusion : le milieu Mac Conkey. Du Citrate de fer à une concentration finale de 50 mg/l a été aussi ajouté dans le milieu ceci afin de permettre la révélation de l'activité estérase en présence d'un substrat à base d'Alizarine. Seule une des solutions mères présentant une dissolution totale du substrat a été testée (solution mère dans le DMF). Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés sur chacun des deux milieux précédemment décrits par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0, 5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 oC pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 et 48 heures d'incubation. La coloration de ces colonies ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées. Les résultats sont présentés dans le tableau 10. TABLEAU 10 Temps DMF Souches d'incubation intensité Salmonella typhimurium 24 h mauve 1 190 h mauve 2 Salmonella enteritidis 24 h mauve 1 036 3 Salmonella arizonae 24 h mauve 1 018 2 Escherichia coli 24 h - -0 002 48 h - Serratia marcescens 24 h mauve 3,5 045 48 h mauve 3,5 Staphylococcus aureus 24 h mauve 3 033 48 h mauve 4 Pseudomonas aeruginosa 24 h mauve 2 165 48 h mauve 2 Salmonella gallinarum 24 h mauve 0,5 500 48 h mauve 3 intensité de coloration : échelle arbitraire ;- : absence de coloration et d'intensité. Ce mode de dissolution n'est donc pas spécifique des esters d'indoxyl mais peut être utilisés notamment avec d'autres familles de substrats enzymatiques. Exemple 8 : test de différents ESAG dérivés de Tween&commat; 20 pour la solubilisation d'un substrat d'estérase, le 5-Bromo-3-indolyl nonanoate. Différentes solutions mères de substrat sont réalisées dans du DMSO en présence de Tween&commat; 20 ou Tween&commat; 80 (Polyoxyéthylène sorbitan monooléate) ou Tween&commat; 60 (Polyoxyethyléne sorbitan monostéarate) ou Tween&commat; 65 (Polyoxyéthylène sorbitan tristéarate). Ensuite un volume correspondant à une concentration finale de 500 mg/1 de substrat est ajouté dans un milieu gélifié en surfusion : le milieu Mac Conkey. Le tableau 11 montre la composition des milieux testés. TABELAU11 Milieu 1 2 3 4 % de DMSO dans la solution mère 40% 40% 40% 40% % de Tween 20 apporté à la solution mère de substrat 60%--- % de Tween 60 apporté à la solution mère de substrat - 60 % % de Tween 65 apporté à la solution mère de substrat--60%- % de Tween 80 apporté à la solution mère de substrat---60% Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés sur chacun des six milieux précédemment décrits par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 oc pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 et 48 heures d'incubation. La coloration de ces colonies ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées. Les résultats sont présentés dans le tableau 12. TABLEAU 12 Milieu 1 2 3 4 Souches TI C I C I C I C I Salmonella typhimurium 24 h gris 2,5 gris 2 - - gris 2 10 48 h gris 3 gris 2 - - gris 2 Salmonella arizonae 24 h gris 2,5 gris 1 - - gris 1 15 48 h gris 3 gris 2 - - gris 3 Salmonella paratyphi a 24 h gris 1,5 gris 1 - - gris 1 006 48 h gris 3,5 gris 2 - - gris 3 Salmonella typhi 24 h gris 2 gris 1 - - gris 1 118 48 h gris 2,5 gris 2 - - gris 2 pseudomonas 3 gris 0,5 - - gris 4 165 48 h gris 3 gris 2 - - gris 4 Hafnia alvei 24 h - - - - - - - - 025 48 h - - - - - - - - 1 : intensité de coloration (échelle arbitraire) ; C : couleur ; TI : temps d'incubation - : incolore Remarque : Différents ratio Tween &commat;/solvant ont été réalisés pour chaque Tween&commat;testés. Cependant, seul un ratio est répertorié dans cet exemple car les résultats étaient très similaires quel que soit le ratio étudié. Le Tween&commat; 20, le Tween&commat; 80 et le Tween&commat; 60 permettent d'obtenir une bonne solubilité des substrats et la révélation de l'hydrolyse du substrat avec des intensités de coloration très convenables. Exemple 9 : stabilité comparée de milieux gélifiés contenant un substrat d'estérase, le S-Bromo-3-indolvl nonanoate. solubilisé ou non en présence de Tween&commat; 20. Deux solutions mères de substrat ont été réalisées : l'une à 40 g/1 dans le méthanol en présence de 6, 5 g/l de sels biliaires nO 3, l'autre à 40 g/1 dans un mélange DMSO (40%) Tween&commat; 20 (60%). Ensuite un volume correspondant à une concentration finale de 500 mg/1 de substrat a été ajouté dans un milieu gélifié en surfusion, le milieu Mac Conkey. Ces deux milieux ont été coulés en boîtes de Pétri d'un diamètre de 90 mm et conservés à +4 C pendant 8 semaines. Après une semaine, deux semaines, quatre semaines et huit semaines, deux milieux comme ceux décrits cidessus ont été réalisés extemporanément. Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland sur les deux milieux préparés extemporanément et les deux milieux conservés à +4 oc. Les boîtes ont été incubées à 37 oC pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 et 48 heures d'incubation. La coloration de ces colonies ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées. Les résultats sont présentés dans les tableaux ci-après. TABLEAU 13 Milieu Frais conservé 1 frais conservé 1 semaine semaine méthanol méthanol DMSO DMSO sels sels biliaires Tween 20 Tween 20 biliaires Souches TI C I C I C I C I Salmonella typhimurium 24 h gris 0,5 gris 0,5 gris 3 gris 3 10 48 h gris 1,5 gris 1,5 gris 4 gris 4 Salmonella arizonae 1 gris 1 gris 3 gris 3 15 48 h gris 1,5 gris 1,5 gris 4 gris 4 Salmonella paratyphi A 24 h - - - - gris 2 gris 2 006 48 h gris 0,5 gris 0,5 gris 4 gris 4 Salmonella typhi 24 h gris 0,5 gris 0,5 gris 3 gris 3 118 48h gris 1, 5 gris 1, 5 gris 4 gris 4 Pseudomonas aeruginosa 24 h gris 1 gris 1 gris 2 gris 2 165 48h gris 1 gris 1 gris 3 gris 3 Hafnia alvei 24 h 025 48h TABLEAU 14 Milieu Frais conservé 2 frais conservé 2 semaines semaines méthanol Méthanol DMSO DMSO sels sels biliaires Tween 20 Tween 20 biliaires Souches TI C I C I C I C I Salmonella typhimurium 24 h gris 0,5 gris 0,5 gris 3 Gris 3 10 48 h gris 1,5 gris 1,5 gris 4 Gris 4 Salmonella arizonae 24 h gris 1 gris 1 gris 3 Gris 3 15 48 h gris 1,5 gris 1,5 gris 4 Gris 4 Salmonella paratyphi A 24 h - - - - gris 2 Gris 2 006 48 h gris 0,5 gris 0,5 gris 4 Gris 4 Salmonella typhi 24h gris 0,5 - - gris 3 gris 3 118 48 h gris 1,5 gris 0,5 gris 4 gris 4 Pseudomonas aeruginosa 24 h gris 1 gris 1 gris 2 gris 2 165 48 h gris 1 gris 1 gris 3 gris 3 Hafni alvel 24 h - - - - - - - - 025 48 h - - - - - - - - TABLEAU 15 Milieu Frais conservé 4 frais conservé 4 semaines semaines méthanol Méthanol DMSO DMSO sels biliaires sels biliaires Tween 20 Tween 20 Souches TI C I C I C I C I Salmonella typhimurium 24 h gris 0,5 gris 0,5 gris 3 gris 3 10 48 h gris 1,5 gris 1,5 gris 4 gris 4 Salmonella arizonae 24 h gris 1 gris 1 gris 3 gris 3 15 48 h gris 1,5 gris 1,5 gris 4 gris 4 Salmonella paratyphi A 24 h - - - - gris 2 gris 2 006 48 h gris 0,5 gris 0,5 gris 4 gris 4 Salmonella typhi 24 h gris 0,5 - - gris 3 gris 3 118 48 h gris 1,5 gris 0,5 gris 4 gris 4 Pseudomonas aeruginosa 24 h gris 1 gris 0, 5 gris 2 gris 2 165 48h gris 1 gris 1 gris 3 gris 3 Hafnia alvei 24 h 025 48 ha- TABLEAU 16 Milieu Frais conservé 8 frais conservé 8 semaines semaines méthanol Méthanol DMSO DMSO sels biliaires sels biliaires Tween 20 Tween 20 Souches TI C I C I C I C I Salmonella typhimurium 24 h gris 0,5 gris 0,5 gris 3 gris 3 10 48 h gris 1,5 gris 1,5 gris 4 gris 4 Salmonella arizonae 24 h gris 1 gris 1 gris 3 gris 3 15 48 h gris 1,5 gris 1,5 gris 4 gris 4 Salmonella paratyphi A 24 h - - - - gris 2 gris 1, 5 006 48 h gris 0,5 - - gris 4 gris 3 Salmonella typhi 24 h gris 0,5 - - gris 3 gris 2 118 48 h gris 1,5 gris 0,5 gris 4 gris 3 Pseudomonas aeruginosa 24 h gris 1 gris 0,5 gris 2 gris9 2 165 48h gris 1 gris 1 gris 3 gris 3 Hafnia alvei 24 h 025 48 h 1 : intensité de coloration (échelle arbitraire) ; C : couleur ; TI : temps d'incubation - : incolore Le milieu contenant le substrat dissous dans un mélange Méthanol sels biliaires présente une baisse très importante d'expression de l'activité estérase dès 2 semaines de conservation. Cette baisse est amplifiée dans le temps. Le milieu contenant le substrat dissous dans le mélange DMSO et Tween 20 présente une expression de l'activité estérase constante dans le temps jusqu'à au moins six semaines. A huit semaines, il y a une légère baisse de l'expression de l'activité estérase mais qui n'est pas rédhibitoire. Le Tween 20 permet donc de stabiliser le substrat d'estérase et facilite la conservation et l'utilisation de milieux de culture contenant ce type de substrats. Note : Dans les exemples ci-dessus, les numéros annexés aux souches correspondent au numéro de chaque souche référencée dans la collection de la Demanderesse. L'intensité de coloration correspond à une échelle arbitraire dont la signification est la suivante : 0 pas d'activité 0,1 trace de coloration 0,5 coloration très pâle 1 coloration nette de faible intensité 2 coloration franche d'intensité moyenne 3 coloration intense 4 coloration très intense REVENDICATIONS - 1-Milieu de détection/identification de bactéries à activité estérasique, du type de ceux comprenant notamment un milieu réactionnel et au moins un substrat d'estérase chromogène ou fluorogène, à l'exclusion des substrats comprenant un cation de 4- [2- (4-octanoyloxy-3, 5-diméthoxyphényl)-vinyl]-quinolinium-l- (propan-3-yle- acide carboxylique) et un anion, cette détection/identification reposant essentiellement sur la mise en évidence de l'activité estérase, caractérisé en ce que : * il est sous forme stable liquide ou gel prêt à l'emploi ; * il comporte : - au moins un Ester de Sorbitan et d'Acide (s) Gras (ESAG), ou au moins un Acide Gras (AG) ou un mélange ESAG/AG, à titre d'agent stabilisant- émulsifiant, - et éventuellement au moins un Solvant (S). - 2-Milieu selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est obtenu par mélange d'au moins une solution-mère de substrat dans le solvant S et de l'ESAG, AG ou mélange ESAG/AG, avec au moins une partie des constituants du milieu de culture. - 3-Milieu selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'ESAG est sélectionné dans le groupe comprenant : 'Monolaurate de Sorbitan polyoxyéthylèné comprenant 20 motifs oxyde d'éthylène (O. E),-TWEEN&commat; 20- ; . Monopalmitate de Sorbitan polyoxyéthylèné (20 O. E), -TWEEN# 40- ; 'Monostéarate de Sorbitan polyoxyéthylèné (20 O. E), -TWEEN# 60- ; . Tristéarate de Sorbitan polyoxyéthylèné (20 O. E), -TWEEN# 65- ; . Monooléate de Sorbitan polyoxyéthylèné (20 O. E), -TWEEN# 80- ; . Sesquioléate de Sorbitan polyoxyéthylèné (20 O. E), -TWEEN# 83- ; . Trioléate de Sorbitan polyoxyéthylèné (20 O. E),-TWEEN 85- ; 'et leurs mélanges. - 4-Milieu selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'AG est sélectionné dans le groupe comprenant les acides gras saturés ou insaturés en C4-C20, préférentiellement les acides gras saturés ou insaturés en C6-C11 et plus préférentiellement les acides gras en C8-C9 ; et leurs mélanges. - 5-Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend également au moins un tensioactif anionique, de préférence le 7-Ethyl- 2-méthyl-4-undécylhydrogénosulfate ou ses sels et plus particulièrement ses sels de sodium (TERGITOL-4 &commat;). - 6-Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le substrat d'estérase chromogènes ou fluorogènes est sélectionné dans le groupe comportant : - les esters d'acide (s) gras et d'Indoxyle et dérivés, de préférence les esters d'acide (s) gras en C6-C11 et d'Indoxyle, et plus préférentiellement encore les esters d'acide (s) gras en C8-C9 et d'Indoxyle éventuellement halogénés ; - les esters d'acide (s) gras et de Quinone/Anthraquinone et dérivés, de préférence les esters d'acide (s) gras en C6-C11 et d'Anthraquinone, et plus préférentiellement encore les esters d'acide (s) gras en C8-C9 et de Dihydroxyanthraquinone (Alizarine) ; - les esters d'acide (s) gras et d'Hydroxycoumarine et dérivés ; - les esters d'acides gras et de Fluorescéine et dérivés ; - et leurs mélanges. - 7-Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le solvant S est sélectionné dans le groupe comprenant : - les alcools, de préférence le Méthanol, l'Ethanol, le Méthoxyéthanol ; - les amides, de préférence le DiMéthylFormamide (DMF) ; - les solvants soufrés, de préférence le DiMéthylSulfOxyde (DMSO) ; - et leurs mélanges. - 8-Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la proportion pondérale Ester de Sorbitan et d'Acide (s) Gras (ESAG) : solvant (S) est comprise entre 20 : 80 et 80 : 20, de préférence est comprise entre 30 : 70 et 70 : 30, et plus préférentiellement encore correspond à 40 : 60 ou à 60 : 40. - 9-Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la concentration en [ESAG] dans le milieu est définie comme suit (en % en poids) : 0,1 # [ESAG] # 10, de préférence 0,5 [ESAG] 5, et plus préférentiellement encore 1,5 [ESAG] 3, 5. - 10-Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la concentration en [substrat] dans le milieu est définie comme suit (en mg/1) : 50 - 11-Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le milieu de culture qu'il comprend est sélectionné dans le groupe comprenant : - les milieux sélectifs de type Mac Conkey, Columbia ANC, PALCAM, Sabouraud gentamycine-chloramphénicol, de préférence le milieu Mac Conkey, - les milieux non sélectifs de type Columbia +/-sang, Trypcase Soja, Gélose nutritive, Sabouraud, de préférence le milieu Columbia. - 12-Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que les bactéries à détecter/identifier sont des salmonelles. - 13-Procédé d'obtention du milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement : - à préparer au moins une solution-mère du substrat d'estérase chromogène dans le solvant S et d'au moins un ESAG, AG ou ESAG/AG, - à ajouter cette solution et d'éventuels autres additifs dans le milieu de culture, - et à homogénéiser l'ensemble. - 14-Procédé détection/identification de souches à activité estérasique caractérisé en ce qu'il consiste : - à ensemencer le milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 ou le milieu obtenu par le procédé selon la revendication 13, avec les bactéries à analyser ; - à incuber le milieu ensemencé dans des conditions appropriées, - et à lire et interpréter les colorations autour des colonies, lesquelles colorations révélant l'hydrolyse du substrat par les bactéries. - 15-Utilisation d'Ester (s) de Sorbitan et d'Acide (s) Gras (ESAG), d'Acide (s) Gras (AG) ou de ESAG/AG, à titre d'agent stabilisant-émulsifiant de milieu (liquide ou gel) de détection/identification de bactéries à activité estérasique, ce milieu comprenant notamment un milieu de culture et au moins un substrat d'estérase chromogène ou fluorogène, à l'exclusion des substrats comprenant un carboxylate de 4- [2- (4octanoyloxy-3, 5-diméthoxyphényl)-vinyl]-quinolinium-l- (propan-3-yle) et un anion, éventuellement en association avec au moins un solvant S du substrat d'estérase chromogène ou fluorogène présent dans le milieu.