Brevet FR2811332A1 — publié le 20020111

METHODE D'IDENTIFICATION DE SUBSTANCES IMPLIQUEES DANS LES MALADIES MUSCULAIRES DEGENERATIVES METTANT EN OEUVRE UN NEMATODE MODELE. La présente invention se rapporte au domaine de l'étude de maladies musculaires dégénératives. Elle vise à offrir un modèle expérimental animal peu onéreux et facile à mettre en oeuvre présentant un phénotype de maladie musculaire dégénérative prononcée. L'invention concerne l'utilisation de ce modèle pour l'identification de substances, y compris de gènes, susceptibles d'interférer avec ledit phénotype et éventuellement utiles pour le traitement de maladies musculaires dégénératives chez l' homme . La dystrophine est une protéine naturellement présente chez l'homme dans le muscle strié, le coeur, et le système digestif. Elle est codée par le gène Dys situé sur le bras court du chromosome X (X p21). La fonction de cette protéine de 3685 acides aminés localisée sous le sarcolème n'est pas connue. (Michalak, M. & Opas, M. Current Opinion in neurology. 10,436-442 (1997), Blake, D. & Kroger, S. TINS, 92-99 (2000)). Les mutations ou délétions au niveau du gène dys se traduisent par un déficit en dystrophine ou par la production d'une dystrophine non fonctionnelle et sont responsables des dystrophies musculaires de Duchenne (DMD) et de Becker (DMB), deux maladies neuromusculaires progressives qui affectent approximativement 1 garçon sur 3500 à la naissance (Emery, A. E.H. Neuromuscular disorders 1, 19-29 (1990) ). Il s'agit d'une maladie génétique à transmission récessive liée au chromosome X : seuls les hommes sont atteints, les femmes sont porteuses. Il existe peu d'organismes pouvant être utilisés comme modèles expérimentaux pour l'étude des anomalies génétiques liées à la dystrophine. Chez les mammifères, l'utrophine est une protéine ubiquitaire homologue à la dystrophine(Tinsley, J. M., et al. (1996) Nature 384,349-353. Une troisième protéine homologue à la Dystrophine, DRP2 est seulement exprimée dans le système nerveux (Roberts, R. G., et al. (1996) Nature Genetics 13,223-226.). Certes, le chien présente un phénotype comparable au phénotype humain, et le modèle canin pour la DMD connu comme GRMD (Golden retriever muscular dystrophy) est proche de la pathologie humaine (Valentine, B., Cooper, B., de Lahunta, A., O'Quinn, R. & Blue, J. (1988) J. Neurol. Sci. 88, 69-81). Cependant il est difficilement utilisable en recherche pour des raisons éthiques. Le modèle murin pour les myopathies dont le gène codant pour la dystrophine porte la mutation (mdx) ne montre que des dégénérescences musculaires faibles en comparaison avec celles observées chez l'homme.(Sicinski, P., et al. (1989) Science 244, 1578-1580. ) . Ces observations indiquent que les humains et les souris ne compensent pas de la même manière l'absence de dystrophine. Aussi, les souris portant des mutations sur deux gènes, celui de la dystrophine et celui de l'utrophine présentent des myopathies sévères (Deconinck, A. E., et al. (1997) Cell 90,717-727 ; Grady, R., et al. (1997) Cell 90,729-738.), mais la pertinence de ce modèle pour la DMD reste incertaine. Les recherches sur les maladies musculaires dégénératives et en particulier sur celles liées à la dystrophine sont donc difficiles du fait du manque de bons modèles animaux expérimentaux. Il est connu que les animaux invertébrés possèdent un seul gène homologue de celui de la dystrophine (Roberts, R. G. & Bobrow, M. (1998) Human Molecular Genetics 7, 589-595. La présence de ce gène homologue chez des invertébrés tels que C. elegans ou Drosophila permettrait d'envisager la préparation d'un modèle animal pour élucider la question de la fonction de la dystrophine chez les humains. Il s'agit d'une approche qui s'est avérée intéressante pour d'autres pathologies humaines. (Roberts, R. G. & Bobrow, M. (1998) Human Molecular Genetics 7,589- 595 ; Kazemi-Esfarjani, P. & Benzer, S. (2000) Science 287, 1837-1840.). Cette approche est basée essentiellement sur le criblage de gènes suppresseurs, dans lesquels les mutations sont choisies pour leur capacité à corriger un défaut génétique initial. Cependant, les nématodes C. elegans qui portent de mutations sur le gène homologue au gène dys-1 développent une défaillance comportementale spécifique mais faible. De plus, ils ne manifestent pas de signes de dégénérescence musculaire (Bessou, C., Giugia, J., Franks, C., Holden-Dye, L. & Segalat, L. (1998) Neurogenetics 2, 61-72.). Pour ces raisons, le nématode C. elegans n'a pas été considéré, sur la base du seul phénotype lié aux mutations sur le gène dys, comme un bon modèle pour l'analyse de maladies musculaires dégénératives. Les recherches menées dans le cadre de la présente invention visent la préparation d'un nouveau modèle expérimental chez le nématode C. elegans ne présentant pas les inconvénients ci-dessus énumérés, permettant néanmoins l'étude des phénotypes liés au gène de la dystrophine et notamment l'analyse des gènes susceptibles d'interférer avec ledit phénotype. Ce but est atteint grâce à la préparation d'un nématode double mutant présentant un phénotype comparable à l'absence de dystrophine chez le chien ou chez l'homme. Il est connu que chez la souris l'absence combinée de deux gènes, celui codant pour la dystrophine et celui codant pour le Facteur Myogénique MYO-D entraîne le développement d'une myopathie sévère, par comparaison aux souris portant la seule mutation mdx (Megeney, L., Kablar, B., Garrett, K., Anderson, J. & Rudnicki, M. (1996) Genes Dev. 10,1173-1183) Ainsi, les expériences conduites dans le cadre de la présente invention ont permis d'une part, de vérifier les conditions dans lesquelles la mutation dys-1 du gène de la dystrophine induit une dégénération musculaire chez C. elegans et d'autre part d'identifier des mutations additionnelles conduisant à un phénotype homologue à celui de dys-1. Les inventeurs ont préparé un modèle expérimentale chez C. elegans présentant un phénotype homologue à celui qui est induit chez la souris par les mutations simultanées mdx et Myo-D. Le gène homologue de Myo-D chez C. elegans est le gène hlh-1 également appelé CeMyoD, (Chen, L., Krause, M., Draper, B., Weintraub, H. & Fire, A. (1992) Scien ce 256,240-243 ; Chen, L., Krause, M., Sepanski, M. & Fire, A. (1994) Development 120,1631-1641.) L'invention a donc pour objet un procédé d'identification de substances capables de traiter ou prévenir une maladie musculaire dégénérative, du type mettant en oeuvre un modèle animal de nématode mutant, caractérisé en ce que : a) on prépare un nématode mutant dont le génome comporte au moins une double mutation responsable d'un phénotype de maladie musculaire dégénérative prononcée, et b) on administre audit nématode au moins une substance et l'on détermine par tout moyen approprié l'action de ladite substance sur la dégénérescence musculaire dudit nématode. Avantageusement, le nématode double mutant de l'étape (a) comprend la double mutation hlh-l(cc561ts);dys- 1(cx18). Il s'agit : - D' une part d'un allèle thermosensible, hlh- 1(cc561ts), du gène hlh-1, cet allèle hypomorphique est viable à 15 C. (Harfe, B., Branda, C., Krause, M., Stern, M. & Fire, A. (1998) Development 125, 2479-2488.). - D'autre part de l' allèle dys-1 (cxl8) qui est un allèle putatif nul du gène dys-1. (Bessou, C., Giugia, J., Franks, C., Holden-Dye, L. & Segalat, L. (1998) Neurogenetics 2,61-72). Ces doubles mutants peuvent être obtenus par croisement des simples mutants dys-l(cxl8) et hlh- 1(cc561ts). Les nématodes doubles mutants sont obtenus en croisant des mâles d'une souche, portant la première mutation avec des hermaphrodites de l'autre souche, portant la deuxième mutation, suivant des protocoles connus de l'homme du métier et qui sont notamment décrits dans le livre de référence The nematode Caenorhabditis elegans , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1988) page 591. La sélection des mutants souhaités, parmi tous les génotypes obtenus, s'effectue en fonction du phénotype observé. Parmi les descendants du croisement, on sélectionne les doubles mutants (homozygotes) comme étant les animaux portant les traits de chacun des parents (létalité a 23 c pour hlh-l(cc561ts) et comportement hyperactif pour dys-l(cxl8). La vérification est réalisée par séquençage du génome des mutants qui ont intégré les séquences des allèles des deux parents. hlh-l(cc561ts) introduit un codon stop a l' acide amine 222 (CAG devient TAG); et dys-l(cxl8) introduit un codon stop a l'acide amine 2721 (TGG devient TGA). Les simples mutants dys-l(cxl8) et hlh- 1(cc561ts) peuvent être obtenus par mutation chimique au moyen de l' éthyl méthyl sulfonate (EMS) et sélectionnés en fonction de leur phénotype. La substance capable de traiter ou prévenir une maladie musculaire dégénérative susceptible d'être identifiée selon le procédé selon l'invention peut être toute substance chimique ou biologique. Dans une forme de mise en oeuvre préféré, cette substance est une construction d'acide nucléique constitué par ou comprenant un gène d'intérêt. Il peut s'agir d'un gène susceptible d'exprimer une protéine directement utile pour traiter ou prévenir une dégénérescence musculaire ou interférant avec d'autres gènes impliqués dans l'apparition et/ou le développement d'une telle dégénérescence musculaire. Avantageusement, la construction d'acide nucléique est un plasmide de type TU61 (Chalfie et Coll, Science, Vol 263, pp802-805 (1994) ) ou derivés dans lequel le gène d'intérêt est placé sous le contrôle de séquences de régulation ou comprenant des séquences permettant des recombinaisons dans le génome du nématode ou encore tout système capable de diminuer la production de gènes endogènes par interférence ARN (RNAi). Le procédé de l'invention est remarquable en ce qu'il permet par la simple observation du nématode obtenu à l'étape (b) de déterminer si la substance modifie ou pas le comportement du nématode. Cette observation peut, par exemple, comporter l'évaluation du degré de locomotion, ou encore de la capacité à pondre des oeufs du nématode mutant obtenu après l'étape (b). Selon une mise en oeuvre particulière du procédé de l'invention, l'observation des nématodes mutants après l'étape (b) est effectuée au moyen d'une révélation directe ou indirecte de la structure de leurs cellules musculaires. Parmi les révélations susceptibles d'être utilisées, on peut citer celles effectuées par marquage direct des cellules musculaires, plus particulièrement, au moyen d'une phalloïdine marquée avec un marqueur fluorescent, tel que la Rhodamine, ou encore celles effectuées indirectement au moyen de techniques immunologiques comme par exemple des anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre un marqueur des cellules musculaires, eux-mêmes susceptibles d'être mis en évidence par toute méthode fluorométrique, colorimétrique ou enzymatique connue en soi. L'invention a également pour objet la préparation d'un nématode mutant constituant un animal transgénique obtenu par le procédé de l'invention lorsque la substance à analyser est une construction d'acide nucléique constituée par ou comprenant un gène d'intérêt. Un tel procédé comprend les étapes suivantes : a) on prépare un nématode mutant dont le génome comporte au moins une double mutation responsable d'un phénotype de maladie musculaire dégénérative prononcée, et b) on incorpore dans le génome dudit nématode au moins une construction d'acide nucléique constituée par ou comprenant un gène d'intérêt. Les méthode d'incorporation de la construction d'acide nucléique dans le génome du nématode double mutant peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier comme la micro-injection dans la gonade de l'hermaphrodite Selon la méthode employée, le procédé de l'invention peut comprendre une étape de sélection des nématodes transgéniques ayant incorporé ladite construction d'acide nucléique. L'invention se rapporte également à un nématode transgénique susceptible d'être obtenu par le procédé cidessus. Un tel animal transgénique est caractérisé par la fait que son génome comporte au moins un double mutation responsable d'un phénotype de maladie musculaire dégénérative prononcée et au moins un gène d'intérêt comme définis précédemment. L'invention a donc aussi pour objet une cellule musculaire dudit nématode transgénique dont le génome comporte au moins un double mutation responsable d'un phénotype de maladie musculaire dégénérative prononcée et au moins un gène d'intérêt comme définis précédemment. L'invention se rapporte encore à un animal modèle de maladie musculaire dégénérative prononcée constitué par un nématode double mutant. Avantageusement, il s'agit d'un nématode double mutant comprenant au moins la double mutation hlh-1 (cc561ts);dys-1(cx18). L' invention a donc aussi pour objet une cellule musculaire dudit nématode double mutant dont le génome comporte au moins la double mutation hlh-1(cc561ts);dys-1(cx18). D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent et dans lesquels il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquelles : La figure 1 représente Les doubles mutants dys- 1 ;hlh-1 qui deviennent progressivement non-coordonnés. Les animaux dys-l(cxl8) (cercles pleins) sont non non-coordonnées (unc) Les animaux hlh-l(cc561ts) sont non non-coordonnés sauf une faible proportion qui n'a pas été allongé de manière adéquate et sont courts et mal formés). Les animaux dys-1 (cxl8) ; ;hlh-l(cc561ts) présentent une locomotion normal au stade larvaire mais deviennent non-coordonnés au stade adulte. (carrés pleins). Ce phénotype est inversé chez les doubles mutants portant un transgène hlh-1 de type sauvage (carrés vides). Les jours indiquent les jours après la ponte. Le stade adulte débute au jour 5. Les souches se sont développées à 15 C. La noncoordination est définie comme l'incapacité présentée par les animaux observés à se déplacer selon trois vagues sinusoïdales consécutives. Plus de cent animaux ont été observés pour chaque point. La figure 2 illustre l'amélioration du comportement locomoteur des mutants dys-1;hlh-1(cc561ts) par surexpression de dyc-l. Piste (a) nématodes de type sauvage, (b) simple mutant hlh-1(cc561ts), (c) ) simple mutant dys-l(cxl8), (d) double mutant dys-l(cxl8);hlh-l(cc561ts), et (e) double mutant avec surexpression de dyc-1 : dys-l(cxl8);hlh- 1(cc561ts)Ex(dyc-1), des animaux adultes. L'image irrégulière formée par le déplacement des mutants dys- 1 (cxl8) ; hlh-1 (cc561ts) (d) est partiellement corrigée en (e). Les animaux ont été placés dans les plaques 48 heures après les stade L4. La figure 3 montre les anomalies réduites de la structure musculaire des animaux lorsque leur génome comporte une surexpression de dyc-1. Cette figure illustre la microscopie de fluorescence des animaux adultes colorés à la phalloïdine: (a) type sauvage, (b) dys-1 (cx18), (c) hlh - 1 (xx561ts), (d, e) dys-1 (cxl8) ;hlhl(cc561ts) et (f) dys- 1 (cx18) h1h-1 (cc56Z ts) Ex (dyc-1) . Un quadrant de muscle squelettique est visible sur chaque panel. Dans chaque quadrant les cellules musculaires présentent un configuration régulière avec des structures striées en forme de diamant (flèche noire). Cette configuration est sévèrement perturbée chez les animaux dys-1 (cxl8) ;hlhl (cc561ts) (d, e) chez lesquels, des nombreuses cellules sont absentes ou présentent un patron anormal (flèches blanches). Une structure plus régulière est observée chez les animaux qui présentent une surexpression de dyc-1 (figure f , flèche noire). La figure 4 illustre que le phénotype musculaire de dys-1; hlh-1 évolue dans le temps. Les barres indiquent le pourcentage de cellules des muscles squelettiques qui présentent une structure anormale de F-actine. Les barres d'erreur indiquent la déviation standard. Les animaux ont grandi à 15 C et ont été colorés avec de la phalloïdine rhodamine. Les animaux adultes ont été analysés 48 heures après le stade L4. Plus de 30 animaux ont été comptabilisés pour chaque point. La figure 5 représente la structure du gène dyc-1. La figure 5a est une représentation schématique du chromosome X de C. elegans (Carte génétique). Dyc-1 est localisé entre les marqueurs phénotypiques unc-9 et unc-3. les numéros indiquent les coordonnées des cartes génétiques. La figure 5b est une représentation du cosmide C33G3 et de la délétion utilisée pour cartographier le gène dans C33G3. La figure 5c représente l'organisation génomique du gène dyc-1. les boîtes représentent les exons; les bo"tes blanches représentent les séquences codantes. Les boîtes ombrées représentent les régions 5' et 3' UTR. La séquence d'acides aminés des régions présentant une similarité avec CAPON est indiquée dans la partie inférieure. La figure 6. montre que Dyc est exprimé dans les muscles. Les figures 6a et 6b représentent des vues dorsale de la tête et de la partie antérieure du corps. La coloration est restreinte au tissu musculaire. Les muscles de la tête (flèches blanches) et les muscles squelettiques (têtes de flèche blanches) sont colorés. Le pharynx n'exprime pas dyc-1 (têtes de flèches noires). La figure 6c montre la coloration des muscles squelettiques. Les muscles squelettiques forment quatre bandes longitudinales (quadrants), deux d'entre elles sont visibles sur ce panel. Deux cylindres de cellules en forme de diamant (flèches blanches)constituent chacune des bandes. La figure 6d représente une vue centrale de la région vulvaire du corps. Les muscles en forme de croix formant la vulve sont colorés. Les muscles squelettiques sont visibles de chaque coté du corps (têtes de flèche). Il n'est pas observé de coloration ailleurs que sur les muscles. L'invention sera aussi mieux comprise à la lecture des exemples donnés dans les matériels et méthodes décrits ci-dessous : Méthodes 1) Observation des phénotypes Les photographies des traces laissées par les nématodes ont été effectuées en plaçant des plaques dans un microscope à dissection Zeiss Stemi avec un grossissement x50. Pour l'observation de la musculature, une coloration à la phalloïdine a été effectuée selon Waterston (Waterston, R. H., Hirsh, D. & Lane, T. R. (1984)J. Mol. Biol. 180, 473-496) sur des animaux adultes. Afin de synchroniser les animaux, on a laissé grandir des larves L4 à 15 C, on les a ensuite repiqués dans des nouvelles plaques et laissé grandir durant 48 heures à 15 C avant de les colorer. Pour la quantification de la structure des muscles squelettiques, seules les 20 cellules les plus proches du centre des deux quadrants en face de l'objectif ont été observées (40 cellules/animal). Les données ont été comparée par un test de t-Student. Les photographies ont été prises avec un microscope de fluorescence Zeiss Axiovert en utilisant un objectif 40X. 2) Construction des nématodes double mutants dys-l(cxl8);hlh-l(cc561ts).- Les doubles mutants sont obtenus par croisement des simples mutants dys-l(cxl8)et hlh-1(cc561ts). La sélection des mutants souhaités, parmi tous les génotypes obtenus s'effectue en fonction du phénotype observé. La vérification s'effectué par séquençage du génome des mutants qui ont intégré les séquences des allèles des deux parents. 3) Isolation et caractérisation de l'allèle dyc-l. Les allèles dyc-1 cx5 et cx32 ont été obtenus par mutagenèse standard des animaux N2 de type sauvage avec de l'éthyl méthylsulfonate (EMS). (Anderson, P. (1995) in Caenorhabditis elegans, eds. Epstein, H.F. & Shakes, D.C. (Académie Press, San Diego), pp. 31-58.). La mutation dyc-1 a été cartographiée sur le chromosome X et localisée ultérieurement sur la carte génétique, entre les marqueurs unc-9 et unc-3. L'injection du cosmide C33G3 restaure complètement les allèles dyc-1. Les délétions internes dans C33G3 indiquent qu dyc-1 correspond au gène prédit C33G3.1. la structure du gène dyc-1 et la séquence en acides aminés de DYC-1 a été déterminée par séquençage du clone de cADN yk259a5, fourni par le dr. Y. Kohara (NIG Japon). La séquence codante a été déposée dans les bases de données publiques sous le numéro d'accès AJ133838. L'allèle dyc-1(cx5) introduit un codon stop dans la position 378 de la séquence d'acides aminés. L' allèle dyc-1(cx32) est une insertion de deux paires de bases qui introduit un déplacement du cadre après l'acide aminé 279. 4) Construction du transgène dyc-1 :gfp et surexpression de dyc-1. Afin de déterminer l'expression de dyc-1, un transgène dyc-1 :gfp a été construit par insertion d'un fragment EcoRV-EcoRV de 3,9 Kb (comprenant les nucléotides 1 à 3865 du cosmide C33G3) dans le plasmide pPD95.75 (A. Fire), et injecté dans des animaux de type sauvage à 50 ug/ml, avec pRF4 a 100 ng/ml. Pour les expériences de restauration, un fragment Sal-Bsu36I de 11 kb (codant pour les acides aminés 1 à 783 de Dyc-1) a été inséré dans le plasmide pPD95.75 et injecté à 1 ng/ml, avec le marqueur de transformation KP13 (Ségalat, L., Elkes, D. A. & Kaplan, J. M. (1995) Science 267, 1648-51.). à 100 ng/ul, dans dyc- 1 (cx5). Pour les expériences de surexpression, le même plasmide a été injecté à 20ng/ul, dans des animaux hlh- 1 (cc561ts);dys(cx18). La surexpression du transgène a été vérifiée par Western blott, trois pistes sur six montrent une réduction consistante des phénotypes hl h- 1 (cc561ts) ;dys(cxl8. 5) Coloration des muscles à la phalloïdine. La coloration à la phalloïdine est effectuée selon la méthode de Waterston sur les animaux adultes. Afin de synchroniser la croissance des animaux, des larves L4 ont été repiquées sur de nouvelles plaques et laissées grandir pendant 48 heures à 15 C avant la coloration. Pour la quantification de la structure des muscles squelettiques, seules les 18 cellules occupant le centre des deux quadrants supérieurs ont été observées (36 cellules/animal). Les données ont été comparées selon le test de t-Student. Tableau 1 La surexpression de dyc-1 supprime partiellement les phénotypes hlh-1(cc561ts) ;dys-l(cxl8). Génotype % non Nombre Nombre de coordonnées d'oeufs in muscles utero anormaux Souche sauvage N2 0% 10,2 +/- 0 +/- 0 1,6 Dys-1(cx18) 0% 7, 5 +/-2,9 0 +/- 0 hlh-l(cc561ts) 7% 14, 0 +/- 1,5 +/-1,5 3, 5 hlh-1(cc561ts);Dys- 80% 24,1 +/- 5 13,9 +/- 4,5 1 (cx18) hlh-l(cc561ts);Dys- 45% (**) 18,7 +/- 5 7, 2 +/-2,5 1(cx18) Ex(dyc-l) (**) L'effet synergique des mutations Dys-1(cx18) et Hlh-1 (cc561ts) induit une locomotion non coordonnée et une défaillance de la ponte chez les animaux adultes, due à une désorganisation de la structure musculaire. Ces phénotypes sont partiellement inversés par le gène dyc-1 en rapport avec CAPON. Les animaux adultes ont été observés 48 heures après le stade L4. Les nombres sont données en +/- s.d. (**) différent de hlh-l(cc561ts)et Dys-1 (cxl8) p 6) Résultats Les animaux portant la mutation simple hlh- 1 (cc561ts) se comportent comme des animaux de type sauvage et présentent une locomotion normale, sauf pour une faible proportion (5-10%) d'entre eux qui sont courts et mal formés Les animaux portant la mutation simple dys-1 (cxl8) sont légèrement hyperactifs mais, à l'égal des mutants simples hlh-1 (cc561ts) ci-dessus, ils laissent des traces régulières ressemblant à des vagues, lorsque l'on observe leur déplacement sur des plaques. Par contre les animaux double-mutants hlh- 1(cc561ts);dys-1(cx18) obtenus dans le cadre de l' invention manifestent, aux stades adultes, une paralysie progressive qui rend difficile leur déplacement et la ponte.(Tableau 1 et Figures 1 et 2). Ces travaux expérimentaux ont aussi permis de vérifier que le phénotype observé est d aux effets de synergie de deux mutations et non à une mutation occulte rétroactive. L'injection d'une copie sauvage soit du gène hlh-1 (cc561ts), soit du gène dys-l(cxl8) (données non montrées) dans le double mutant restaure les comportements de locomotion et ponte correspondants aux spécimens simple mutants.(Figure 1). De plus, la musculature des animaux mutants observée par coloration des animaux avec une phalloïdine portant le marqueur F-actine révèle l'organisation sarcomérale des muscles squelettiques La plupart des muscles squelettiques présentent un patron normal strié tant chez les mutants dys-1(cx18) que chez les mutants hlh-1(cc561ts) qui se sont développés à 15 C. Par contre, chez les spécimens adultes double mutants hlh-1 (cc561ts) ;dys-1 (cx18) développés à 15 C, jusqu'à 50% des cellules des muscles squelettiques présentent des structures fortement désorganisées qui sont responsables des anomalies de locomotion de ces animaux. (Figure 3). L'altération de la structure de la F-actine musculaire est moins fréquente au stade larvaire (données non montrées). Il est ainsi prouvé que l'introduction d'un allèle putatif nul de C. elegans tel que d ys-1 conjointement à hlh-1 (cc561ts) conduit à une dégénération sévère et progressive de la musculature. Des travaux précédents de la demanderesse ont montré que le gène dyc-1 code pour une nouvelle protéine qui n'a pas d'homologue dans les bases de données publiques. Cependant, DYC-1 présente deux régions de similitude avec la protéine CAPON du rat, qui a été identifiée comme une protéine synthéase se liant à l'oxyde nitrique (nNOS) (Figure 4) (Brenman J E ; D S ; H; Aldape K ; D S. CELL,) 82 (5) 743-752 (1995)). Corrélativement, DYC-1 est la protéine la plus proche de C.elegans par rapport à CAPON. Comme illustré sur le Tableau 1, la surexpression du gène dyc-1 réduit partiellement la défaillance de la locomotion et de la ponte des doubles mutants hlh-1 (cc56ts) ;dys-1 (cxl8) (Tableau 1, Figure 2). La proportion des muscles anormaux est également réduite chez les lignées s avec une surexpression de dyc-1 (Tableau 1 et Figure 3). Les tests d'expression de dyc-1 par analyse des gènes rapporteurs ont révélé que l'expression de DYC-1 est restreinte aux muscles des tissus, muscles squelettiques, muscles de la tête et muscles de la vulve (Figure 6). 7) Conclusion La méthode d'analyse de gènes selon l'invention a permis d'identifier une protéine homologue de CAPON lors de l'analyse des gènes ayant un rapport fonctionnel avec la dystrophine. Il a été prouvé que la protéine CAPON entre en compétition avec PSD95 pour l'interaction avec nNOS, mais sa fonction in vivo n'a pas encore été élucidée. La perte de la fonction liée à dyc-1 produit un phénotype homologue de dys-1 et la surexpression de dyc-1 supprime partiellement les phénotypes hlh-1(cc561ts);dsy-1(cx18). Ces deux constatations indiquent que dyc-1 et dys-1 participent à une fonction physiologique commune. Ces travaux établissent le fait que, transposées au contexte des mammifères, les protéines CAPON ou homologues interagissent fonctionnellement avec le complexe dystrophine. Il est ainsi prouvé que le modèle de C.elegans portant sur une myopathie progressive dystrophinedépendante permet d'analyser systématiquement des mutations génétiques qui inversent ledit phénotype. Ce modèle permet ainsi l'identification de gènes et éventuellement de médicaments dont la modulation réduit la dégénération musculaire chez les humains. REVENDICATIONS 1) Procédé d'identification de substances capables de traiter ou prévenir une maladie musculaire dégénérative mettant en oeuvre un modèle animal de nématode mutant caractérisé en ce que : a) on prépare un nématode mutant dont le génome comporte au moins une double mutation responsable d'un phénotype de maladie musculaire dégénérative prononcée, et b) on administre audit nématode au moins une substance et l'on détermine par tout moyen approprié l'action de ladite substance sur la dégénérescence musculaire dudit nématode. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le nématode double mutant de l'étape (a) comprend la double mutation hlh- 1 (cc561ts);dys-1(cx18). 3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite substance est une substance chimique ou biologique. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite substance est une construction d'acide nucléique constituée par ou comprenant un gène d'intérêt. 5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le gène d'intérêt est un gène susceptible d'exprimer une protéine directement utile pour traiter ou prévenir une dégénérescence musculaire ou interférant avec d'autres gènes impliqués dans l'apparition et/ou le développement d'une telle dégénérescence musculaire. 6) Procédé selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que la construction d'acide nucléique est un plasmide. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'à l'étape (b) on détermine l'action de ladite substance en observant le comportement du nématode. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'à l'étape (b) on détermine l'action de ladite substance au moyen d'une révélation directe ou indirecte de la structure de leurs cellules musculaires. 9) Procédé de préparation d'un nématode transgénique, caractérisé en ce que: a) on prépare un nématode mutant dont le génome comporte au moins une double mutation responsable d'un phénotype de maladie musculaire dégénérative prononcée, et b) on incorpore dans le génome dudit nématode au moins une construction d'acide nucléique constituée par ou comprenant un gène d'intérêt. 10) Un nématode transgénique obtenu par le procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que son génome comporte au moins un double mutation responsable d'un phénotype de maladie musculaire dégénérative prononcée et au moins un gène intérêt. 11) Une cellule musculaire d'un animal transgénique selon la revendication 10, caractérisé en ce que son génome comporte au moins une double mutation responsable d'un phénotype de maladie musculaire dégénérative prononcée et au moins un gène d'intérêt. 12) Un animal modèle de maladie musculaire dégénérative prononcée constitué par un nématode double mutant dont le génome comprend au moins la double mutation hlh-1(cc561ts);dys-1(cx18). 13) Une cellule musculaire d'un animal modèle selon la revendication 12, caractérisé en ce que son génome comporte au moins la double mutation hlh- 1 (cc561ts)dys-1 (cxl8) .