Brevet FR2816058A1 — publié le 20020503

*1 METHODE ET DISPOSITIF DE DETERMINATION DE LA CONCENTRATION DE DIOXINES La présente invention concerne une méthode et un dispositif pour la détermination de la concentration de dioxines présentes dans un échantillon. Plus particulièrement, cette invention concerne une méthode et un dispositif qui permettent une détermination hautement sensible et hautement sélective de la concentration des dibenzo-p-dioxines polychlorées (PCDD), y compris la 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p- dioxine (T4CDD) extrêmement toxique et les dibenzofurannes polychlorés (PCDF) également extrêmement toxiques, qui sont générés pendant l'incinération des déchets d'origine générale et des déchets industriels. Les dioxines sont générées à concentration élevée lors de l'incinération des déchets et cet état de fait a récemment constitué un grave problème. En conséquence, on a été obligé de contrôler la concentration en dioxines incluse dans le gaz effluent généré pendant l'incinération desdits déchets jusqu'à un niveau non supérieur à 0,1 ng/Nm3, exprimé en termes de quantité totale de dioxines et d'homologues et isomères de ces dernières ainsi que d'homologues et isomères du dibenzofuranne polychloré, car les dioxines sont extrêmement toxiques. Il est donc nécessaire de détecter les dioxines présentes à une concentration tellement basse qu'elle est inférieure à la limite de détection des méthodes d'analyse courantes, à cause de la grande toxicité des dioxines et du fait que le gaz effluent à analyser contient une grande variété d'impuretés et de contaminants tels que de la poussière et du brouillard en grande quantité. Pour cette raison, la détermination et/ou la quantification directes et précises des dioxines exigent un pré-traitement compliqué du gaz effluent et l'utilisation d'un dispositif d'analyse spécialement conçu à cet effet. Une méthode d'analyse quantitative typique comprend les étapes d'extraction d'un gaz effluent avec un solvant tel que le toluène ou l'éthylène glycol pendant 72 heures au moyen d'un extracteur Soxhlet, purification de l'extrait, concentration de ce dernier suivie de son analyse par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse. Cette méthode comprend l'utilisation d'étapes compliquées requises pour l'analyse, telles qu'une étape de concentration. Par conséquent, il faut deux à trois semaines pour que l'analyse soit terminée ou que les résultats souhaités soient obtenus et, en outre, cette analyse est très coûteuse. La publication de brevet non examinée japonaise (appelée simplement ciaprès "J.P.KOKAI") n Hei 11-326222 propose une méthode indirecte pour l'analyse quantitative des dioxines, qui peut éviter la pratique de toute opération de o10 concentration d'un échantillon contenant des dioxines et qui emploie un dispositif relativement peu coûteux, laquelle méthode comprend les étapes de mélange d'un solvant organique contenant un atome d'halogène, de complexes de métaux de 8- oxyquinoléine et d'un échantillon dont la concentration en dioxines doit être déterminée; d'irradiation du mélange résultant avec des rayons lumineux excités pour déterminer l'intensité des rayons de lumière fluorescente émis et ainsi analyser quantitativement les halophénols, dont la concentration est en bonne corrélation avec celle des dioxines présentes dans l'échantillon; et d'estimation de la concentration des dioxines sur la base de la concentration des halophénols ainsi déterminée. Dans cette méthode, cependant, (1) le liquide à analyser peut entrer en interaction avec les complexes fluorescents et par conséquent, toute influence des composants présents dans le liquide, qui peuvent être en concurrence avec les halophénols, devrait être examinée à l'avance et (2) la corrélation entre les concentrations et des halophénols et des dioxines doit être examinée à l'avance. Les résultats obtenus par cette méthode peuvent être grandement influencés par les facteurs concernant les types de dioxines. En conséquence, cette méthode peut être un moyen d'une précision considérablement inférieure car la concentration des dioxines présentes dans le liquide est évaluée indirectement. En outre, la méthode par fluorescence est très sensible, mais elle est très susceptible vis-à-vis de substances co-existantes et les rayons lumineux excités arrivent inévitablement sur le système d'observation (ou un système de détection) et par conséquent, cette méthode ne garantit pas toujours la sensibilité élevée désirée. A ce sujet, JP. KOKAI N0 Hei 11-79719 divulgue une méthode pour l'absorption et la désorption réversibles d'un gaz sans utilisation d'absorbant conventionnel tel que le charbon activé et le gel de silice. Cette méthode comprend la mise en contact d'une paire d'électrodes avec une solution contenant un complexe de ruthénium capable d'absorber et de libérer de l'azote moléculaire et le contrôle simultané de la tension électrique appliquée aux électrodes pour absorber et désorber l'azote et par conséquent, cette méthode permet (1) le contrôle de l'absorption et de la désorption du gaz à une température et une pression ordinaires sans application de chaleur; (2) le contrôle de l'absorption et de la désorption du gaz simplement en réglant la tension électrique à appliquer aux électrodes; et (3) l'absorption et la désorption réversibles et répétées du gaz. Dans cette méthode, qui fait usage d'une solution contenant un complexe de ruthénium capable d'absorber et de libérer de l'azote moléculaire, certains problèmes restent cependant non résolus, par exemple le problème concernant la question de savoir si cette méthode permet ou non l'absorption et la désorption de substances présentant des structures planes telles que les dioxines et les homologues et isomères de ces dernières ainsi que les homologues et isomères du dibenzofuranne polychloré. Les auteurs de la présente invention ont constaté que l'utilisation d'un complexe de ruthénium permet la détermination hautement sélective des dioxines tout en prenant en considération les problèmes précédemment évoqués, associés aux techniques conventionnelles. En conséquence, un objet de la présente invention est de proposer une méthode et un dispositif pour la détermination de la concentration de dioxines présentes dans un échantillon, qui fait usage d'un système de mesure nouveau utilisant une émission de lumière électrolytique, pour garantir ainsi une analyse hautement sensible des dioxines, qui ne nécessite pas l'utilisation d'un réactif tel que le peroxyde d'hydrogène nécessaire pour la luminescence chimique, qui permet la miniaturisation du dispositif et qui peut augmenter la sensibilité de l'analyse. Les inventeurs ont conduit différentes études pour résoudre les problèmes précédemment évoqués, ce qui les a amenés à mettre au point la présente invention. Selon un premier aspect de l'invention, il est proposé une méthode de détermination de la concentration de dioxines présentes dans un échantillon, qui comprend les étapes de fixation chimique d'un haptène ayant une structure imitant une partie des structures des dioxines avec un complexe de ruthénium pour former ainsi un antigène; d'incubation de l'antigène résultant avec un anticorps fixé à, ou immobilisé sur, une électrode pour induire une réaction antigène-anticorps; d'oxydation ou de réduction du complexe de ruthénium par application d'une tension électrique au produit de réaction par l'intermédiaire de l'électrode pour induire une émission de lumière électrolytique; et d'observation des rayons lumineux électrolytiquement émis pour déterminer quantitativement la quantité de l'antigène et ainsi évaluer la concentration des dioxines présentes dans l'échantillon. Selon un second aspect de la présente invention, il est proposé une méthode pour déterminer la concentration d'une dioxine présente dans un échantillon, qui comprend les étapes consistant à se munir d'une première électrode sur laquelle un anticorps contre la dioxine est immobilisé; d'immerger la première électrode dans un premier liquide contenant l'échantillon et un antigène, ledit antigène étant formé par liaison chimique d'un haptène ayant une structure imitant une partie d'une structure de dioxine avec un complexe de ruthénium; de faire incuber le liquide avec la première électrode pour induire ainsi une réaction antigène-anticorps de compétition entre l'anticorps et l'antigène (dioxine) et l'haptène; de sortir la première électrode et de la laver pour éliminer l'antigène et l'haptène qui n'ont pas réagi avec l'anticorps; d'immerger la première électrode et une seconde électrode dans un second liquide contenant un agent réducteur et un électrolyte; d'appliquer au second liquide une tension électrique par l'intermédiaire des première et seconde électrodes pour oxyder le complexe de ruthénium; de permettre au complexe de ruthénium oxydé d'être réduit par l'agent réducteur pour induire une émission de lumière électrolytique; de détecter les rayons lumineux électrolytiquement émis; et d'obtenir la quantité de dioxine présente dans l'échantillon grâce à l'utilisation d'une courbe d'étalonnage. Selon un troisième aspect de la présente invention, il est proposé un dispositif de mesure utilisable dans la méthode qui précède pour déterminer la concentration de dioxines présente dans un échantillon, qui comprend un liquide de mesure préparé en dissolvant un complexe de ruthénium et de la triméthylamine dans une solution aqueuse tamponnée au phosphate; une électrode en or par l'intermédiaire de laquelle une tension électrique est appliquée au liquide; un anticorps fixé à ou immobilisé sur l'électrode en or; un détecteur de lumière émise pour déterminer l'intensité des rayons lumineux électrolytiquement émis; et une unité arithmétique pour déterminer quantitativement la concentration des dioxines présente dans l'échantillon sur la base de l'intensité de la lumière émise, détectée par le détecteur de lumière émise. La présente invention va être décrite ci-après plus en détail avec référence aux figures annexées, dans lesquelles: La figure 1 est un schéma illustrant la situation dans laquelle la dioxine et le site dioxine-haptène d'un réactif émettant électrolytiquement de la lumière sont liés de façon compétitive avec un anticorps anti-dioxine. La figure 2 est un schéma montrant comment émettre électrolytiquement de la lumière au niveau du site de l'haptène. La figure 3 est un schéma montrant un dispositif de détection pour l'observation des rayons lumineux électrolytiquement émis. La figure 4 est un graphique (courbe d'étalonnage) montrant la corrélation entre la concentration en dioxines et l'intensité de la lumière émise. Concernant les fonctions des dioxines, on sait que si une substance chimique (telle qu'une dioxine, le dibenzofuranne et le PCB coplanaire) ayant une structure plane est incorporée dans des cellules, la substance présente une affinité élevée pour une protéine appelée récepteur Ah et se lie à celle-ci. Par conséquent, la présente invention fait le meilleur usage de ces propriétés de la dioxine. Plus spécifiquement, selon l'invention on forme d'abord une substance étrangère de faible poids moléculaire dont la structure imite seulement une partie de la structure de la dioxine et on fait plein usage des propriétés caractéristiques de la molécule de faible poids moléculaire telle qu'un haptène, qui peut former un antigène spécifique lorsque la molécule est liée à un polymère. Ainsi, l'haptène imitant seulement une partie de la structure de dioxine est chimiquement lié avec un complexe de ruthénium pour former de la sorte un antigène. L'antigène peut initier une réaction d'émission de lumière électrolytique simplement par oxydo-réduction. L'antigène résultant est mis en incubation avec un anticorps immobilisé sur une électrode pour induire une réaction antigène-anticorps. Une tension électrique est appliquée au produit de réaction par l'intermédiaire des électrodes pour induire l'émission électrolytique de lumière. L'antigène peut alors être analysé quantitativement par l'observation de l'intensité des rayons lumineux émis, de manière à déterminer ainsi la concentration de dioxines. Ainsi, la présente invention permet l'analyse de dioxines présentes dans un échantillon sans utiliser de réactif nécessaire pour provoquer la luminescence chimique, tel que le peroxyde d'hydrogène, permet la miniaturisation d'un dispositif de mesure à utiliser dans cette analyse et permet également l'amélioration de la sensibilité de l'analyse. On explique ci-après la formation d'un antigène 1 (voir figure 1) servant de réactif émettant électrolytiquement de la lumière par liaison chimique d'un site dioxine-haptène 2 (voir figure 1) avec un complexe de ruthénium 3 (voir figure 1). Premièrement, le dioxine-haptène peut être préparé, par exemple, selon le schéma réactionnel suivant (1): (Schéma réactionnel 1) o.PaN ci0H2N COOH (B) o o CI[ (A) o ci N COOH (c)(D)O (C) (D) Le composé (A) sur le côté gauche du schéma chimique est, par exemple, un ester d'acide phtalique: l'anhydride de l'acide 4,5-dichlorophtalique ayant une partie de la structure de la 2,3-dibenzodioxine. Ce composé (A) est mis à réagir avec un composé (B): l'acide 4-(p-aminophényl) butanoique servant d'espaceur lorsque l'haptène est lié à un anticorps pour former ainsi un composé (C): l'acide N-(4',5'- dichlorophthaloyl)-4-(p-aminophényl)butanoïque. A cet égard, la partie (C) est le site haptêne et ce dernier est lié à un complexe de ruthénium par l'intermédiaire du groupe carboxyle présent sur la partie (D). Par ailleurs, il est également nécessaire d'ajouter un réactif, qui peut servir d'espaceur lorsque l'antigène résultant est lié avec l'anticorps, au complexe de ruthénium 3. La préparation d'un tel complexe de ruthénium 3 sera expliquée en détail ci-dessous avec référence aux schémas réactionnels 2 à 6 suivants: (Schéma réactionnel 2) O o N + ------- N s (2) A) o(B) C Selon le schéma réactionnel (2), on fait réagir le phtalimide de potassium (A) avec du 1,3-dibromopropane (B) pour donner le 1-(N-phthaloylamino)-3- bromopropane (C) servant d'espaceur lorsque l'antigène résultant est lié avec un anticorps. (Schéma réactionnel 3) O N (B) t(LA) N'L. x C Ensuite, selon le schéma réactionnel 3, on fait réagir de la 4,4'diméthyl-2,2'- bipyridine (A) avec du l-(N-phthaloylamino)-3-bromopropane (B) préparé selon le schéma réactionnel 2 pour donner la 4-(4-(N-phthaloylamino)butyl)-4'méthyl-2,2'- bipyridine (C). (Schéma réactionnel 4) N NiHNH (4) N - (A) (e) En outre, la 4-(4-(N-phthaloylamino)butyl)-4'-méthyl-2,2'bipyridine (A) est réduite avec de l'hydrazine H2NNH2 pour donner la 4-(4-aminobutyl)-4'méthyl-2,2'- bipyridine (B), selon le schéma réactionnel 4. (Schéma réactionnel 5) -N N,,N 2 X + RuC13 ^\ c. (5) N N. NS (B) (A) (C) Ensuite, on fait réagir la 2,2'-bipyridine (A) avec du trichlorure de ruthénium pour donner le dichlorobis (2,2'-bipyridine)ruthénium (C), selon le schéma réactionnel 5. (Schéma réactionnel 6) NH2 -([1 CI2+ tH (A)B(C) Selon le schéma réactionnel 6, on fait réagir du dichlorobis (2,2'- bipyridine)ruthénium (A), préparé selon le schéma réactionnel 5, avec la 4-(4- aminobutyl)-4'-méthyl-2,2'bipyridine (B), préparée selon le schéma réactionnel 4, pour former finalement le complexe bis (2,2'-bipyridyl) [4-(4-aminobutyl)-4'méthyl-2,2'- bipyridine]ruthénium (C) portant un espaceur utilisé lorsque l'haptène est lié à un anticorps. Ensuite, on fait réagir l'acide N-(4',5'dichlorophthaloyl)-4-(p-aminophényl) butanoique du schéma réactionnel 1 ayant un espaceur avec le complexe de bis (2,2'-bipyridyl) [4-(4aminobutyl)-4'-méthyl-2,2'-bipyridine]ruthénium du schéma réactionnel 6, ayant de même un espaceur pour obtenir ainsi l'antigène 1 servant de réactif émettant électrolytiquement de la lumière, qui comprend un haptène de dioxines chimiquement lié avec un complexe de ruthénium. (Schéma réactionnel 7) 1- NNHC I N N I'. A ce stade, si la quantité du complexe (4-(4-aminobutyl)-4'-méthyl-2,2'- bipyridine)ruthénium peut être quantitativement déterminée, les sites haptènes de dioxines peuvent de la même façon être déterminés quantitativement. La figure 1 est un schéma illustrant la situation dans laquelle une dioxine 20 et le site dioxine-haptène 2 d'un antigène 1 comprenant un complexe de ruthénium 3 lié à ce dernier, sont liés de façon compétitive avec un anticorps anti-dioxine 4. La réaction antigène-anticorps intervenant dans l'analyse quantitative de la présente invention sera décrite plus en détail, avec référence à la figure 1. Le site dioxinehaptène 2 dont la structure imite une partie de la structure de dioxine 20 est chimiquement lié avec un complexe de ruthénium 3 pour former un antigène 1 (voir les schémas réactionnels précédents 1 à 7) et l'antigène résultant 1 sert ainsi de réactif émettant électrolytiquement de la lumière. L'antigène 1 et les dioxines 20 sont mis en incubation avec un anticorps 4 immobilisé sur la surface d'une électrode 5 pour induire ainsi une réaction antigène-anticorps. A cet égard, cependant, aucune liaison chimique l1 n'intervient dans cette réaction antigène-anticorps mais la réaction a lieu via une interaction faible entre eux, y compris, par exemple, des liaisons hydrogène. Il y a un grand nombre de sites intervenant dans cette interaction sur l'anticorps 4 et par conséquent, l'anticorps 4 a une aptitude élevée à reconnaître le site dioxine-haptène 2 et les dioxines 20, et en conséquence, il est fortement lié au site dioxine-haptène 2 et aux dioxines 20. On peut imaginer que l'anticorps 4 comprend un espace 4' présentant une forme semblable à celle du site dioxine-haptène 2 et des dioxines 20 et que ces dernières sont complètement logées dans l'espace comme on le verra à la figure 1. Le mécanisme de la réaction antigène-anticorps sera présenté en détail ci- dessous. Premièrement, l'anticorps 4 est immobilisé sur la surface d'une électrode en or par l'intermédiaire d'une liaison chimique. Plus spécifiquement, l'électrode en or 5 est traitée avec un acide tel que l'acide sulfurique pour rendre sa surface propre et ladite électrode 5 est ensuite plongée dans une solution d'acide 3,3'- dithiodipropanoique (HOOCCH2CH2S-SCH2CH2COOH) (10mM) pendant 30 minutes pour adsorber chimiquement les molécules d'acide 3,3'dithiodipropanoïque sur la surface de l'électrode en or 5 (liaison chimique formée par l'interaction entre l'atome de soufre (S) de l'acide 3,3'dithiodipropanoïque et l'atome d'or (Au) dont est construite l'électrode 5). Ensuite, l'électrode en or 5 est sortie de la solution et lavée avec un alcool tel que le méthanol. En outre, l'électrode en or 5 est trempée dans 20 ml d'une solution aqueuse de dioxane à 90% complétée avec 30 mg d'hydroxy succinimide et 50 mg d'un carbodiimide hydrosoluble (chlorhydrate de l-éthyl-3-diméthylaminopropyl carbodiimide) pendant 15 minutes en vue d'activer le groupe carboxyle de l'acide 3,3'- dithiodipropanoique immobilisé sur la surface de l'électrode en or 5. Ensuite, l'électrode en or 5 portant les molécules d'acide 3, 3'dithiodipropanoïque est immergée dans une solution contenant l'anticorps 4 à la température ambiante pendant 1 à 10 minutes, pour former ainsi des liaisons amido (-CONH-) par réaction entre des groupes amino (NH2-) de l'anticorps 4 et les groupes carboxyles des molécules d'acide 3,3'- dithiodipropanoïque. Ainsi, l'anticorps 4 est solidement immobilisé sur l'électrode en or 5. Ensuite, l'électrode en or 5 est lavée avec un tampon phosphate pour éliminer les molécules d'anticorps 4 qui ne sont pas chimiquement liées à l'électrode 5 par l'intermédiaire des espaceurs. Par ailleurs, une quantité prédéterminée de l'antigène 1, obtenue en liant chimiquement le site dioxine-haptène 2 et le complexe de ruthénium 3, est ajoutée à un liquide de mesure préparé à partir d'un tampon phosphate complété avec 3% de DMSO (diméthylsulfoxyde). Le DMSO est utilisé pour dissoudre complètement les dioxines dans le liquide. Si un liquide préparé à partir d'une solution de tampon phosphate 0,2M (pH=7,0) contenant 3% de DMSO est utilisé comme échantillon à analyser ou si seulement une petite quantité de DMSO est ajoutée à un échantillon, des dioxines peuvent être dissoutes dans la solution d'échantillon jusqu'à une teneur de l'ordre de ppb. Ensuite, l'électrode en or 5, sur laquelle l'anticorps 4 est immobilisé, est plongée dans ce liquide de mesure, opération suivie par l'incubation de celui-ci pendant 10 minutes pour provoquer une réaction antigène-anticorps. Ensuite, l'électrode en or 5 est enlevée du liquide de mesure puis légèrement lavée avec un tampon phosphate (pH=7,0). La figure 2 est un schéma montrant le mécanisme de l'émission électrolytique de lumière par l'antigène 1 formé à partir du site dioxine-haptène 2 chimiquement lié et du complexe de ruthénium 3. Comme le montre la figure 2, l'électrode 5 (anode), une cathode telle qu'une électrode en acier inoxydable (non représentée) et une électrode de référence telle qu'une électrode argent/chlorure d'argent (non représentée) sont immergées dans un tampon phosphate contenant un agent réducteur tel qu'une alkylamine inférieure tertiaire comme la triméthylamine (TMA), la triéthylamine, la tripropylamine, la tributylamine, un amino acide tel que la proline ou un acide organique tel que l'acide oxalique. Une tension électrique (0,9 à 1,3V) est appliquée à l'électrode 5 à une température de 15 à 30 C pendant 20 secondes à 2 minutes pour induire une émission électrolytique de lumière et l'intensité des rayons lumineux électrolytiquement émis est ensuite déterminée. Les procédures ci-dessus sont mises en oeuvre avec plusieurs échantillons contenant une dioxine à diverses concentrations et l'antigène 1 à une concentration donnée, par exemple de 20 gg/L. Les données sont enregistrées pour préparer une courbe d'étalonnage, telle que représentée dans la figure 4. Les matériaux nécessaires pour l'émission électrolytique de lumière, dont il vient d'être fait état, sont un complexe de ruthénium 3 et un tampon phosphate contenant un agent réducteur tel que la triméthylamine (TMA) 6. L'électrode en or 5 oxyde le complexe de ruthénium 3 ou la valence du complexe 3 (ou du ruthénium) est modifiée de 2 à 3 et, de la sorte, le complexe est converti en un réactif activé. On fait ensuite réagir le complexe activé 3 avec de la triméthylamine (TMA) 6 qui est oxydée pour donner TMAox 7 (un produit d'oxydation de la TMA) ou la TMA réduit le complexe activé (dont la valence est réduite de 3 à 2) pour émettre des rayons lumineux. Le tampon phosphate est important pour optimiser les conditions requises pour l'émission de lumière. Plus spécifiquement, le tampon sert d'électrolyte ou peut assurer la conductivité requise pour l'électrolyse et peut contrôler le pH (pH= 7,0) de l'environnement nécessaire pour l'électrolyse. Le complexe de ruthénium 3 est lié à l'anticorps 4 immobilisé sur la surface de l'électrode en or 5 en proportion inverse de la concentration en dioxines de la solution aqueuse, mais la quantité du complexe de ruthénium liée à l'anticorps est réduite lorsque la concentration en dioxines de la solution aqueuse est élevée. Ensuite, l'électrode en or 5 portant le complexe de ruthénium 3 lié à cette dernière est légèrement lavée pour éliminer l'influence de toute substance inhibitrice éventuellement présente dans la solution de dioxines, de manière à ce qu'elle soit la plus faible possible, et est introduite dans une solution aqueuse tamponnée au phosphate contenant de la triméthylamine (TMA) 6 préparée séparément. Ensuite, on observe et on quantifie la lumière électrolytiquement émise. La lumière électrolytiquement émise est détectée de préférence au moyen d'un dispositif de détection tel que celui représenté dans la figure 3, qui comprend une lentille condenseur 8, un miroir 9, un filtre optique 10 et un détecteur 11. La quantité du complexe de ruthénium présente dans un échantillon peut être déterminée quantitativement en mesurant l'intensité de la lumière émise et la durée d'émission de lumière détectée par le détecteur 11. En outre, la relation entre les quantités du complexe de ruthénium et le site dioxine-haptène a été déterminée à l'avance et, par conséquent, la quantité de dioxines présente dans l'échantillon peut être déterminée quantitativement. A cet égard, il est souhaitable d'utiliser une unité arithmétique (non représentée) telle qu'un ordinateur personnel, de manière à ce qu'une courbe d'étalonnage telle que celle représenté dans la figure 4 soit introduite dans la mémoire dudit ordinateur, à l'avance, pour permettre de la sorte la détermination quantitative de la quantité de dioxines présente dans l'échantillon, sur la base de l'intensité de la lumière émise. Comme on le voit d'après l'explication qui précède, selon la présente invention, un échantillon contenant des dioxines est ajouté à un premier liquide contenant une quantité donnée de l'antigène 1. Dans le liquide, l'électrode (anode) 5, sur laquelle l'anticorps 4 est immobilisé, est immergée pour provoquer une réaction antigène- anticorps entre l'anticorps 4 immobilisé sur l'électrode 5 et l'antigène 1 et les dioxines 20. Cela veut dire que les dioxines présentes dans l'échantillon et l'antigène 1 réagissent de manière compétitive avec l'anticorps 4. Si la concentration des dioxines dans l'échantillon est élevée, le rapport réactionnel des dioxines à l'anticorps 4 est élevé, tandis que le rapport réactionnel de l'antigène 1 à l'anticorps 4 est faible. Il en résulte que l'intensité de la lumière émise est faible. Par ailleurs, si la concentration des dioxines dans l'échantillon est faible, le rapport réactionnel des dioxines à l'anticorps 4 est faible tandis que le rapport réactionnel de l'antigène 1 à l'anticorps 4 est élevé. Ensuite, l'électrode (anode) 5 sur laquelle l'anticorps 4 est immobilisé, l'anticorps 4 étant lié à l'antigène 1 ou aux dioxines dans l'échantillon, est immergée dans un second liquide contenant un agent réducteur et un électrolyte tel qu'un tampon phosphate. Une cathode, telle qu'une cathode en acier inoxydable et une électrode de référence telle qu'une électrode Ag/AgCl sont également immergées dans le second liquide. Une tension électrique est ensuite appliquée au second liquide par l'intermédiaire des électrodes pour oxyder le complexe de ruthénium 3. Le complexe de ruthénium 3 oxydé est alors réduit par l'agent réducteur pour émettre une lumière. La lumière émise est détectée par le détecteur. L'intensité de la lumière émise est en proportion de la quantité de complexe de ruthénium 3. Ainsi, si l'intensité de la lumière émise est détectée, la concentration des dioxines dans l'échantillon peut être obtenue à partir de la courbe d'étalonnage préparée à l'avance. La présente invention va maintenant être décrite plus en détail sur la base de l'exemple suivant, qui n'est en rien limitatif. Exemple On a déterminé, à titre d'exemple de la présente invention, la corrélation entre la concentration en dioxines et l'intensité de la lumière émise (courbe d'étalonnage). On a préparé un liquide contenant de la 2,3,7,8-tétrachloro-pdibenzodioxine à la concentration de 0,02, 0,06, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 ou 3, 0 tg/L dans un tampon phosphate 0,2 M contenant 3% de DMSO (diméthylsulfoxyde). On a ajouté au liquide l'antigène 1 préparé selon la méthode mentionnée ci-dessus et de la triméthylamine à la concentration de 20 glg/L et 1 m mole/L, respectivement. L'électrode en or 5 (anode) sur laquelle l'anticorps (EWVATITGGGTYTYYPDSVRGC) a été immobilisé, et qui a été préparée selon la méthode ci-dessus mentionnée, une électrode en acier inoxydable (cathode) et une électrode de référence (argent/chlorure d'argent), ont été immergées dans le liquide contenant l'antigène et on fait incuber à la température ambiante pendant 2 minutes. Une tension électrique de 1,1 V a été appliquée aux électrodes à la température ambiante pendant une minute et la lumière émise a été détectée au moyen du dispositif détecteur représenté dans la figure 3. Les résultats ainsi observés sont représentés graphiquement à la figure 4. Les données de la figure 4 indiquent clairement que l'intensité des rayons lumineux électrolytiquement émis peut être reconnue par la méthode et au moyen de l'appareil de la présente invention, même si la concentration en dioxines est très faible (par exemple 0,01 à 0,1 ppb) et que la sensibilité de la détermination de la concentration en dioxines peut facilement et considérablement être améliorée. Comme cela a été décrit ci-dessus dans le détail, la présente invention détermine la concentration de dioxines présente dans un échantillon, en liant chimiquement un haptène présentant une structure imitant une partie des structures de dioxines avec un complexe de ruthénium pour former un antigène; en faisant incuber l'antigène résultant avec un anticorps fixé à ou immobilisé sur une électrode pour induire une réaction antigèneanticorps; en oxydant ou en réduisant le complexe de ruthénium par application d'une tension électrique au produit de réaction, par l'intermédiaire de l'électrode, pour induire une émission électrolytique de lumière; et en observant les rayons lumineux électrolytiquement émis pour déterminer quantitativement la quantité de l'antigène et donc évaluer la concentration des dioxines présentes dans l'échantillon. En conséquence, la présente invention ne nécessite pas l'utilisation d'un réactif tel que le peroxyde d'hydrogène nécessaire pour la luminescence chimique et peut garantir une analyse hautement sensible des dioxines tout en permettant la miniaturisation du dispositif à utiliser dans l'analyse des dioxines. REVENDICATIONS 1. Une méthode de détermination de la concentration de dioxines présentes dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à lier chimiquement un haptène (2) ayant une structure imitant une partie d'une structure de dioxine avec un complexe de ruthénium (3) pour former ainsi un antigène (1); faire incuber l'antigène résultant avec un anticorps (4) fixé à ou immobilisé sur une électrode (5) pour induire une réaction antigèneanticorps; oxyder ou réduire le complexe de ruthénium en appliquant une tension électrique au produit de réaction par l'intermédiaire de l'électrode pour induire une émission électrolytique de lumière; et observer les rayons lumineux électrolytiquement émis pour déterminer quantitativement la quantité de l'antigène et évaluer ainsi la concentration des dioxines présente dans l'échantillon. 2. La méthode de la revendication 1, dans laquelle l'émission électrolytique de lumière du complexe de ruthénium utilise une réaction d'oxydation dans laquelle le complexe de ruthénium reçoit une charge électrique ou la valence de celui-ci est changée de 2 à 3, et une réaction de réduction avec une solution tamponnée avec un phosphate contenant de la triméthylamine dans laquelle la valence est réduite de 3 à 2. 3. La méthode de la revendication 1 ou 2, dans laquelle l'antigène est mis en incubation avec l'anticorps immobilisé sur l'électrode en utilisant un liquide de mesure préparé à partir d'un tampon phosphate contenant 3% de diméthylsulfoxyde pour provoquer ainsi une réaction antigène-anticorps. 4. Une méthode de détermination de la concentration d'une dioxine présente dans un échantillon, qui comprend les étapes consistant à préparer une première électrode (5) sur laquelle un anticorps (4) dirigé contre la dioxine est immobilisé; immerger la première électrode (5) dans un premier liquide contenant l'échantillon et un antigène (1), ledit antigène étant formé en liant chimiquement un haptène (2) ayant une structure imitant une partie d'une structure de dioxine avec un complexe de ruthénium (3); faire incuber le liquide avec la première électrode pour induire ainsi une réaction antigène-anticorps compétitive entre l'anticorps et l'antigène et l'haptène; sortir la première électrode et la laver pour éliminer l'antigène et l'haptène qui n'ont pas réagi avec l'anticorps; immerger la première électrode et une seconde électrode dans un second liquide contenant un agent réducteur et un électrolyte; appliquer une tension électrique au second liquide par l'intermédiaire des première et seconde électrodes pour oxyder le complexe de ruthénium; permettre au complexe de ruthénium oxydé d'être réduit par l'agent réducteur pour induire ainsi une émission électrolytique de lumière; détecter les rayons lumineux électrolytiquement émis; et obtenir la quantité de dioxines présente dans l'échantillon en utilisant une courbe d'étalonnage. 5. La méthode de la revendication 4, dans laquelle la première électrode est une électrode en or. 6. La méthode de la revendication 4, dans laquelle l'agent réducteur est choisi dans le groupe constitué de la triméthylamine, la triéthylamine, la tripropylamine, la tributylamine, la proline et l'acide oxalique. 7. Un dispositif utilisable dans une méthode de détermination de la concentration de dioxines, comprenant un liquide de mesure préparé en dissolvant un complexe de ruthénium et de la triméthylamine dans une solution aqueuse tamponnée au phosphate; une électrode en or (5) par l'intermédiaire de laquelle une tension électrique est appliquée au liquide; un anticorps (4) immobilisé sur l'électrode en or; un détecteur de lumière émise pour déterminer l'intensité des rayons lumineux électrolytiquement émis; et une unité arithmétique pour déterminer quantitativement la concentration des dioxines présentes dans l'échantillon sur la base de l'intensité de la lumière émise détectée par le détecteur de lumière émise.