Brevet FR2816214A1 — publié le 20020510

Domaine de l'invention La présente invention se rapporte au domaine de la prévention et/ou du traitement des cancers. Etat de la technique En dépit des énormes investissements économiques et humains, le cancer reste l'une des causes majeures de décès. Le cancer est fréquemment une maladie liée à des déficits dans le système de signalisation intracellulaire. Les cellules normales répondent à de nombreux signaux extracellulaires en proliférant, en se différenciant ou plus généralement en altérant leur activité métabolique. De tels signaux sont reçus à la surface des cellules et convertis par un système de protéines de transduction du signal en un message reconnu par la cellule. Ce message est responsable de phénomènes de régulation cellulaire ultérieure. La métastase est la formation d'une colonie tumorale secondaire a un site distant de la tumeur initiale. Il s'agit d'un processus multi-étapes pour lequel l'invasion tumorale est un événement précoce. Les cellules tumorales s'échappent localement à travers des barrières tissulaires, telles que la membrane basale de l'épithélium, et atteignent le stroma interstitiel, à partir duquel elles accèdent aux vaisseaux sanguins ou aux canaux lymphatiques avant dissémination ultérieure. Après avoir envahi la couche endothéliale de la paroi vasculaire, les cellules tumorales circulantes sont entraînées dans la circulation sanguine et sont stoppées dans les veinules précapillaires de l'organe cible par adhérence aux surfaces du lumen de la cellule endothéliale, ou sont exposées aux membranes basales. Les cellules tumorales sortent de la paroi vasculaire et entrent dans le parenchyme de l'organe. Enfin, la cellule tumorale, après extravasation, se multiple dans un tissu différent de celui dont elle est originaire. Il est démontré qu'un certain nombre de cancers sont provoqués par des défauts associés à des gènes responsables de la transduction du signal. De tels gènes sont appelés encogènes. Les oncogènes peuvent conduire à une surexpression d'une ou plusieurs protéines de transduction du signal induisant une prolifération cellulaire anormale. Les signaux défectifs peuvent être liés à des mécanismes divers. Certaines thérapies anticancéreuses visent à inhiber l'expression ou la biodisponibilité de protéines oncogènes responsables de la prolifération des cellules cancéreuses, telles que les protéines de la famille des MAP kinases ou des produits de certains oncogènes tels que c-myc. La protéine ESM-1 est un polypeptide de 184 acides aminés sécrétée par les cellules endothéliales et qui a été décrite pour la première fois par LASSALLE et al. (1996). Les ARNs messagers codant pour la protéine ESM-1 sont principalement retrouvés au niveau des cellules endothéliales et des tissus pulmonaires et rénaux. L'expression du gène codant pour ESM-1 est régulée par des cytokines. Le TNF-a et L'IL-1p induisent une augmentation de l'expression du gène ESM-1 dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine, alors que t'tnterféron- y diminue son expression. On a retrouvé une grande quantité de protéine ESM-1 circulante chez des patients présentant un syndrome inflammatoire systémique, tel qu'un choc septique (BECHARD et al., (2000). Aujourd'hui, le traitement hospitalier du cancer a majoritairement recours à l'utilisation de radiations et/ou d'agents chimiothérapeutiques, tels que la vinblastine ou l'adriamycine. Cependant, les effets indésirables largement reconnus de tels traitements rendent ces stratégies thérapeutiques difficiles à supporter pour le patient. La présente invention a pour objet de fournir des composés anticancéreux qui permettraient de surmonter les inconvénients des méthodes de traitement thérapeutique du cancer de l'état de la technique. SOMMAIRE DE L'INVENTION Un premier objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un composé antagoniste de la protéine ESM-1 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement d'un cancer. Selon un premier aspect, un composé antagoniste de l'invention est un anticorps se liant spécifiquement à la protéine ESM-1. Selon un second aspect, un composé antagoniste mis en oeuvre dans le cadre de l'invention est un peptide d'au moins 10 acides aminés de la protéine ESM-1 modifiée et qui comprend l'enchaînement d'acides aminés Ala (134)-A ! a (135). Selon un troisième aspect, un composé antagoniste de la protéine ESM-1 consiste en un oligonucléotide antisens hybridant avec l'ADNc codant pour ESM-1. Un autre objet de l'invention consiste en un composé antagoniste de la protéine ESM-1, choisi parmi les composés antagonistes définis cidessus. L'invention est également relative à une composition pharmaceutique destinée au traitement du cancer comprenant un composé antagoniste de la protéine ESM-1. Un autre objet de l'invention consiste en une méthode de prévention d'un cancer comportant une étape au cours de laquelle on administre un composé antagoniste de la protéine ESM-1. L'invention concerne aussi une méthode de traitement thérapeutique du cancer comportant une étape au cours de laquelle on administre à un patient un composé antagoniste de la protéine ESM-1. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Il a été montré pour la première fois selon l'invention que la protéine ESM-1 est sécrétée chez l'homme sous la forme d'un protéoglycane du type chondroïtine/dermatane sulfate et que la protéine ESM-1 sécrétée est capable de stimuler in vitro l'activité mitogène du facteur HGF/SF (pour Hépatocyte growth factor/scatter factor ). Le HGF/SF est un facteur important dans l'apparition des dysplasies multicystiques rénales et dans l'apparition d'hyperprolifération des tubules rénaux et a été également associé au développement de carcinomes du sein, des reins et du poumon mais aussi dans le développement de mélanomes malins. Il a également été montré selon l'invention que des cellules épithéliales rénales humaines transfectées exprimant la protéine ESM-1 avaient un fort potentiel tumoral et provoquaient l'apparition d'un carcinome rénal in vivo chez la souris. Il a également été montré que des anticorps dirigés contre la protéine ESM-1 étaient capables d'inhiber le développement d'une tumeur rénale in vivo et qu'un peptide antagoniste de la protéine ESM-1 possédait la même activité anti-tumorale. De plus, il a été montré selon l'invention une augmentation du taux sérique de la protéine ESM-1 chez des patients présentant un carcinome broncho-pulmonaire. En conséquence, un premier objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un composé antagoniste de la protéine ESM-1 pour la fabrication d'un médicament pour la prévention et/ou le traitement d'un cancer. DEFINITION GENERALES Les expressions protéine ESM-1 ou polypeptide ESM-1 , au sens de l'invention, englobent un polypeptide de 184 acides aminés référencé comme la séquence SEQ ID N 1 du listage de séquences, ainsi qu'un polypeptide de 165 acides aminés identique au polypeptide de séquence SEQ ID N 1 dans lequel les 19 acides aminés de l'extrémité Nterminale correspondant aux peptides signal sont absents, ce polypeptide de 165 acides aminés constituant la forme sécrétée du polypeptide de séquence SEQ ID Nl. Sont également englobés dans la définition de protéine ESM-1 polypeptide ESM-1 un glycopeptide respectivement de 184 acides aminés de séquence SEQ ID N 1 et un polypeptide de 165 acides aminés correspondant à la séquence allant de l'acide aminé en position 20 à l'acide aminé en position 184 de la séquence SEQ ID ? 1 dont le résidu sérine en position 137 est modifié par O-glycosylation, les formes O-glycosylées de la protéine ESM-1 étant également désignées glycopeptides dans la présente description. De préférence, le glycopeptide ESM-1 possède le résidu sérine en position 137 qui est 0glycosylé par un motif chondroïtine/dermatane sulfate. Par composé antagoniste de la protéine ESM-1, on entend selon l'invention un composé capable de réduire significativement la biodisponiblité de la protéine ESM-1 vis-à-vis de molécules cibles sur laquelle ou lesquelles la protéine ESM-1 se fixe naturellement. Un composé antagoniste de la protéine ESM-1 peut réduire la biodisponibilité de ces protéines en réduisant la probabilité de liaison de la protéine ESM-1 aux molécules cibles de l'organisme sur lesquelles elle se fixe naturellement. Un composé antagoniste selon l'invention peut réduire la biodisponibilité de la protéine ESM-1 en inhibant ou bloquant la transcription du gène codant pour ESM-1, en inhibant ou bloquant la traduction de l'ARN messager correspondant, en altérant la maturation intracellulaire de la protéine ESM- 1, par exemple en affectant le processus enzymatique conduisant à sa glycosylation, ou encore en inhibant ou en bloquant la sécrétion de la protéine ESM-1 mature. Un premier objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un composé antagoniste de la protéine ESM-1 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement d'un cancer. Un composé antagoniste de la protéine ESM-1 peut être de toute nature, polypeptide, saccharidique, ou encore tout composé organique ou minérale permettant de réduire la biodisponibilité de la protéine ESM-1 vis- à-vis des molécules cibles sur laquelle cette protéine se fixe. COMPOSES ANTAGONISTES DE LA PROTEINE ESM-1 DU TYPE ANTICORPS Une première famille de composés antagonistes de ESM-1 préférée selon l'invention est constituée par des anticorps se liant spécifiquement à la protéine ESM-1. Il est montré selon l'invention que des anticorps dirigés spécifiquement contre la protéine ESM-1 sont capables d'inhiber ou de bloquer le pouvoir tumorigène de cette protéine. Des anticorps anti-ESM-1 constituent donc des composés antagonistes d'une grande valeur thérapeutique. Par anticorps au sens de l'invention, on entend notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments (par exemple les fragments Fab ou F (ab) '2 ou encore tout polypeptide comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant la protéine ESM-1. Des anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir d'hybridome selon la technique décrite par KOHLER et MIELSTEIN (1975). JI peut s'agir aussi des anticorps dirigés contre ESM-1 ou un fragment de cette protéine produits par la technique du trioma ou encore la technique d'hybridome décrite par KOZBOR et al. (1983). Il peut s'agir également de fragments d'anticorps simple chaîne Fv (ScFv) tels que ceux décrits dans le brevet US ? 4, 9476,778 ou encore par MARTINEAU et al. (1998). Des anticorps anti-ESM-1 selon l'invention comprennent également des fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages telles que décrites par RIDDER et al. (1995) ou encore des anticorps humanisés tels que décrits par REINMANN et al. (1997) ou encore par LEGER OJ, et al., 1997. Il peut s'agir également des anticorps anti-ESM-1 produits selon les techniques décrites par BECHARD et al. (2000). Les anticorps décrits par BECHARD et al. (2000) sont des anticorps monoclonaux sécrétés par des lignées d'hybridome préparées à partir de cellules spléniques de souris préalablement immunisées contre le fragment C-terminal de poids moléculaire de 14 kD de ESM-1 qui a été produit dans Escherichia coli, c'est-à-dire un fragment non glycosylé de la protéine ESM-1. Par cartographie d'épitopes, BECHARD et al. (2000) ont pu classer les anticorps monoclonaux produits par les différentes lignées d'hybridome selon la région de la protéine ESM-1 reconnue par ceux-ci. Une première famille d'anticorps préférée selon l'invention qui constitue des composés antagonistes de la protéine ESM-1 sont les anticorps monoclonaux reconnaissant spécifiquement la région allant du résidu proline en position 79 jusqu'au résidu cystéine en position 99 de la séquence SEQ ID N'l, cette région représentant le déterminant antigénique Dz. in s'agit de préférence des anticorps monoclonaux produits par la lignée d'hybridome déposée le 19 Novembre 1997 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes de t'tnstitut Pasteur (CNCM) sous le n d'accès N1-1944, encore appelé anticorps MEP21. D'autres anticorps monoclonaux préférés sont eux se liant spécifiquement à la partie de la protéine ESM-1 comprise entre le résidu glycine en position 159 et le résidu arginine en position 184 de la séquence SEQ ID N 1 qui est la région constituant le déterminant antigénique D3. Des anticorps monoclonaux préférés spécifiques du déterminant antigénique D3 peuvent être obtenus à partir des lignées d'hybridome 1- 1942 (MEP14) et 1-1943 (MEP19), déposées le 19 Novembre 1997 auprès de la Collection Nationale de Cultures des Micro-organismes de l'Institut Pasteur (CNCM). D'autres anticorps monoclonaux préférés selon l'invention sont les anticorps monoclonaux se liant spécifiquement avec la région comprise entre le résidu sérine en position 119 et le résidu valine en position 139 de la protéine ESM-1 de séquence SEQ ID ? 1, cette région étant définie comme le déterminant antigénique D2 de la protéine ESM-1. Les anticorps monoclonaux préférés se liant spécifiquement au déterminant antigénique D2 de ESM-1 peuvent être obtenus à partir de la lignée d'hybridome MEP08 déposée le 19 Novembre 1997 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes de l'Institut Pasteur (CNCM) sous le n d'accès Nu 1-1941. D'autres anticorps monoclonaux d'intérêt constituant des composés antagonistes de la protéine ESM-1, au sens de l'invention, sont les anticorps monoclonaux dirigés spécifiquement contre la partie Nterminale de la protéine ESM-1. Les anticorps monoclonaux préférés dirigés contre la partie N-terminale de la protéine ESM-1 peuvent être obtenus à partir de la lignée d'hybridome MEC15 déposée à la Collection Nationale de Cultures des Micro-organismes de l'INSTITUT PASTEUR (CNCM) le 17 Octobre 2000 sous le numéro d'accès 1-2572. JI a été montré selon l'invention que l'anticorps monoclonal MEP08 était capable d'inhiber l'activité pro-tumorale de la protéine ESM-1 sur la formation de tumeurs provoquées par la prolifération de cellules humaines d'origine rénale chez la souris. POLYPEPTIDE ANTAGONISTES DE LA PROTEINE ESM-1 JI a été montré selon l'invention que la région recouvrant le déterminant antigénique D2 de la protéine ESM-1 était importante pour l'activité pro-tumorale de la protéine ESM-1. En particulier, le demandeur a synthétisé un polypeptide dérivé de la protéine ESM-1 dans lequel les résidus phénylalanine en positions 134 et 135 de la séquence SEQ ID Nol, c'est-à-dire les résidus en positions 115 et 116 de la protéine ESM-1 sécrétée, ont été remplacés par deux résidus alanin. Le demandeur a montré que ce polypeptide modifié était incapable d'induire des tumeurs chez la souris. Un tel polypeptide modifié peut donc entrer en compétition avec la protéine ESM-1 produite à haut niveau chez des patients cancéreux pour son action potentialisatrice avec des facteurs de croissance comme le HGF/SF ou encore les facteurs de croissance FGF-2 et FGF-7. Les composés antagonistes de la protéine ESM-1 englobent des polypeptides ayant une longueur d'au moins 10 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID ? 1, qui comprennent une séquence d'acides aminés allant de l'acide aminé en position 119 jusqu'à l'acide aminé en position 139 de la séquence SEQ ID N'l, un tel polypeptide antagoniste de ESM-1 comprenant au moins une substitution d'un acide aminé, par rapport à la séquence correspondante de la protéine ESM-1. De préférence, un polypeptide antagoniste de la protéine ESM-1 tel que défini ci-dessus possède au plus 11,12, 13,14, 15,16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID N 1 et au moins une substitution d'acides aminés, par rapport à la séquence SEQ ID n 1. Un polypeptide antagoniste de la protéine ESM-1, tel que défini cidessus, comprend au plus 1,2, 3,4, 5,6, 7,8, 9 ou 10 substitutions d'un acide aminé, par rapport à la séquence SEQ ID N'l, le nombre de substitutions d'acides aminés étant adapté en fonction de la longueur du polypeptide, étant entendu que le nombre de substitutions d'acides aminés par rapport à la séquence SEQ ID N 1 dans un polypeptide antagoniste selon l'invention est d'au plus 25% des acides aminés compris dans la séquence de ce polypeptide antagoniste, de préférence au plus 20%, 15% et de manière préférée d'au plus 10% du nombre des acides aminés compris dans la séquence du polypeptide antagoniste de ESM-1. De manière préférée, une substitution d'acides aminés, par rapport à la séquence SEQ ID N'l, dans un polypeptide antagoniste selon l'invention est une substitution dite non conservative . Par substitution non conservative , on entend la substitution d'un résidu d'acide aminé par un acide aminé d'une classe distincte. Les acides aminés sont classiquement rangés selon les classes suivantes : - acides aminés non polaires (hydrophobes) : alanin, leucin, isoleucin, valine, proline, phénylalanine, tryptophane et méthionine ; - acides aminés contenant des cycles aromatiques : phénylalanine, tryptophane et tyrosine ; - acides aminés neutres polaires : glycine, sérine, thréonine, cystéine, tyrosine, asparagine et glutamin ; - acides aminés chargés positivement (basiques) : arginine, lysin et histidine) ; - acides aminés chargés négativement (acides) : acide aspartique et acide glutamique. Un type de substitution d'acides aminés préféré pour la préparation d'un polypeptide antagoniste de la protéine ESM-1 selon l'invention est la substitution d'un acide aminé contenant un cycle aromatique par un acide aminé ne contenant pas de cycle aromatique. De manière tout à fait préférée, un polypeptide antagoniste de la protéine ESM-1 selon l'invention comprend une substitution des résidus phénylalanines en positions 134 et 135 de la SEQ ID D ? 1 par deux résidus d'acides aminés, identiques ou différents, ne contenant pas de cycle aromatique. Un tel polypeptide antagoniste de la protéine ESM-1 préféré est un polypeptide d'au moins 10 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID N 1, telle que définie ci-dessus, dans lequel les résidus phénylalanine en positions 134 et 135 ont été remplacés par deux résidus alanin. Selon un premier aspect, un polypeptide antagoniste de la protéine ESM-1 selon l'invention peut être préparé par les techniques classiques de synthèse chimique, indifféremment en solution homogène ou en phase solide. A titre illustratif, un polypeptide antagoniste de la protéine ESM-1 peut être préparé par la technique en solution homogène décrite par HOBEN WEIL (1974) ou encore la technique de synthèse en phase solide décrite par MERRIFIELD (1965a ; 1965b) et MERRIFIELD 1965b. Un polypeptide antagoniste de la protéine ESM-1 selon l'invention peut être aussi préparé par recombinaison génétique. Pour produire un polypeptide antagoniste de la protéine ESM-1 tel que défini ci-dessus, on peut mettre en oeuvre un procédé comprenant les étapes de : a) insérer un acide nucléique codant pour le polypeptide antagoniste de la protéine ESM-1 dans un vecteur d'expression approprié ; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfectée avec le vecteur d'expression recombinante de l'étape a) ; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou loser la cellule hôte, par exemple par sonication ou par choc osmotique ; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir des Iysats cellulaires obtenus à l'étape c), ledit polypeptide antagoniste ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide antagoniste recombinant ainsi produit. Les polypeptides antagonistes selon l'invention peuvent être caractérisés par fixation sur une colonne de chromatographie d'immunoaffinité sur laquelle les anticorps dirigés contre ce polypeptide ou contre un fragment de ce dernier ont été préalablement immobilisés. Selon un autre aspect, un polypeptide antagoniste de ESM-1 peut- être purifié par passage sur une série appropriée de colonnes de chromatographie, selon les méthodes connues de l'homme de l'art est décrit par exemple dans AUSUBEL F. et al. (1989). COMPOSES ANTAGONISTES DE LA PROTEINE ESM-1 DU TYPE OLIGONUCLEOTIDE ANTISENS. Une autre famille préférée de composés antagonistes de la protéine ESM-1 visant à réduire la biodisponibilité de la protéine ESM-1 sécrétée chez des patients à risque ou chez des patients ayant déjà développé des tumeurs sont des composés capables d'inhiber ou de bloquer l'expression du gène codant pour ESM-1 chez l'homme. De tels composés antagonistes de la protéine ESM-1 peuvent être des polynucléotides antisens. Les composés antagonistes de la protéine ESM-1 selon l'invention englobent ainsi un polynucléotide antisens capable de s'hybrider spécifiquement à une région déterminée du gène codant pour la protéine ESM-1 et capable d'inhiber ou de bloquer sa transcription et/ou sa traduction. La séquence du gène humain ESM-1 est référencée sous le numéro d'accès AJ401 1091 et AJ401 1092 dans la base de données Genbank. De préférence, un polynucléotide antisens selon l'invention comprend une séquence complémentaire d'une séquence localisée dans la région de l'extrémité 5'de l'ADN du gène ESM-1, et de manière tout à fait préférée la proximité du codon d'initiation de la traduction (ATG) du gène ESM-1. Selon un second mode de réalisation préférentiel, un polynucléotide antisens selon l'invention comprend une séquence complémentaire à l'une des séquences localisées au niveau des jonctions exon/intron du gène ESM-1 et de manière préférée des séquences correspondant à un site d'épissage. Un polynucléotide antisens préféré selon l'invention comprend au moins 15 nucléotides consécutifs de l'ADNc codant pour ESM-1 ayant la séquence nucléotidique SEQ ID ? 2. Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant complémentaire d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G. De manière générale, un polynucléotide antisens selon l'invention possède au moins 20,25, 30,35, 40,50, 75,100, 150,200, 300,400, 500, 1000 ou 2000 nucléotides consécutifs de l'ADNc de ESM-1 de séquence SEQ ID ? 2. A titre illustratif, un polynucléotide antisens préféré selon l'invention consiste en un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique de l'ADNc de ESM-1 de séquence SEQ ID N 2. Un polynucléotide antisens constituant un composé antagoniste de la protéine ESM-1 selon l'invention peut être préparé par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzyme de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de NARANG et al. (1979) ou de BROWN et al. (1979), la méthode au diéthylphosphoramidites de BEAUCAGE et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet européen n EP-0 707 592. De manière générale, les polynucléotides antisens doivent avoir une longueur et une température de fusion suffisante pour permettre la formation d'un hybride duplex intracellulaire ayant une stabilité suffisante pour inhiber l'expression de l'ARNm de ESM-1. Des stratégies pour construire les polynucléotides antisens sont notamment décrites par GREEN et al. (1986) et IZANT et WEINTRAUB (1984). Des méthodes de construction de polynucléotides antisens sont également décrites par ROSSI et al (1991) ainsi que dans les demandes PCT NOWO 947/23. 026, WO 95/04141, WO 92/L18. 522 et dans la demande de brevet européen n EP 0 572 287. D'autres méthodes de mise en oeuvre de polynucléotides antisens sont par exemple celles décrites par SCZAKIEL et al. (1995) ou encore celles décrites dans la demande PCT N WO 95/24.223. L'homme du métier peut avantageusement se référer aux méthodes de production et d'utilisation de polynucléotides antisens inhibant ou bloquant l'expression de gènes associés au développement de cancers, telles que les techniques décrites dans le brevet US N05, 582,986 qui divulgue des oligonucléotides antisens pour l'inhibition du gène ras, la technique décrite par HOLT et al. (1988) qui décrit des oligonucléotides antisens s'hybridant spécifiquement avec les ARNs messagers l'oncogène c-myb ou encore la technique décrite par WICKSTRON et al. (1988) qui décrit des oligonucléotides antisens hybridant spécifiquement avec l'ARN messager du gène c-myc. D'autres techniques d'utilisation de polynucléotides antisens utilisables par l'homme du métier sont celles de SALE et al. (1995) ainsi que celle de GAO et al. (1996). PROCEDE DE SELECTION D'UN COMPOSE ANTAGONISTE DE LA PROTEINE ESM-1 Un composé antagoniste de la protéine ESM-1 selon l'invention peut être sélectionné par l'homme du métier pour sa capacité à inhiber le développement d'une tumeur induite par la protéine ESM-1 in vivo. Selon un premier aspect, un procédé de sélection d'un composé antagoniste de la protéine ESM-1 comprend les étapes suivantes : a) injecter à un animal des cellules capables de former des tumeurs en présence de la protéine ESM-1, lesdites cellules étant transfectées ou transformées par un acide nucléique capable d'exprimer la protéine ESM-1 in vivo ; b) administrer à cet animal un composé candidat antagoniste de la protéine ESM-1 ; c) comparer la formation de tumeurs chez un premier animal tel qu'obtenu à la fin de l'étape b) et chez un second animal tel qu'obtenu à la fin de l'étape a) ; et d) sélectionner le composé candidat capable d'inhiber ou de bloquer la formation de tumeurs chez le premier animal. De préférence, l'animal mis en oeuvre dans le procédé de sélection ci-dessus est un mammifère non humain, avantageusement un rongeur, et de manière tout à fait préférée un rat, un cobaye, un cochon diode ou une souris. Avantageusement, la lignée cellulaire capable de former des tumeurs chez l'animal en présence de la protéine ESM-1 est la lignée HEK 293 (ATCC NOCRL 1573). Selon un autre aspect, un composé antagoniste de la protéine ESM-1 selon l'invention peut être sélectionné selon un procédé permettant de mettre en évidence la fixation d'un composé candidat sur la protéine ESM-1. Un tel procédé de sélection d'un composé candidat antagoniste de la protéine ESM-1 comprend les étapes suivantes : a) fournir un polypeptide consistant en la protéine ESM-1 ou un fragment peptidique de cette protéine ; b) mettre en contact ledit polypeptide avec le composé candidat à tester ; c) détecter les complexes formés entre ledit polypeptide et le composé candidat ; d) sélectionner les composés candidats se fixant sur le polypeptide constitué de la protéine ESM-1 ou d'un fragment de cette protéine. Par fragment de la protéine ESM-1, on entend un polypeptide comprenant au moins 20, de préférence au moins 30,35, 40,50, 55,60, 65,70, 75, 80,85, 90,95, 100, 110, 120, 130,140 ou 150 acides aminés consécutifs du polypeptide ESM-1 de séquence SEQ ID N 1 et comprenant la séquence allant du résidu proline en position 133 jusqu'au résidu valine en position 138 de la SEQ ID ? 1. L'invention est également relative à une trousse ou kit pour la sélection d'un composé candidat antagoniste de la protéine ESM-1, cette trousse ou kit comprenant : a) une préparation purifiée d'un polypeptide constitué de la protéine ESM-1 ou d'un fragment de cette protéine ; b) le cas échéant, des moyens de détection d'un complexe formé entre le polypeptide et le composé candidat à tester. Le procédé de détection d'un complexe formé entre le polypeptide dérivé de la protéine ESM-1 et le composé candidat peut-être réalisé par diverses techniques, telles que par microdialyse couplée à une méthode HPLC comme décrit par WANG et al. (1997) ou l'électrophorèse capillaire d'affinité comme décrit par BOUSH et al. (1997). Un composé candidat peut être de toute nature, et notamment le produit final d'un procédé de chimie combinatoire. A. COMPOSES CANDIDATS OBTENUS A PARTIR DE BANQUES DE PEPTIDES Un composé candidat antagoniste de la protéine ESM-1 peut être sélectionné selon le procédé ci-dessus en tant que produit d'expression d'un insert d'ADN contenu dans un vecteur de phage selon la technique décrite par PARMLEY & SMITH (1988). Dans ce type de banques peptidiques, les inserts d'ADN codent pour des peptides de 8 à 20 acides aminés de longueur, comme cela est décrit par OLDENBURG KR et al. (1992), VALADON P et al. (1996), LUCAS AH (1994), WESTERINK (1995), FELICI et al. (1991). Selon ce mode de réalisation particulier, les phages recombinants exprimant une protéine capable de se fixer sur le polypeptide constitué de la protéine ESM-1 ou un fragment de celle-ci est retenu et le complexe formé entre la protéine ESM-1 ou un fragment de celle-ci et le phage recombinant peut être ultérieurement immunoprécipité par un anticorps monoclonal ou polyclonal anti-ESM-1. B. COMPOSE CANDIDA OBTENU PAR DES EXPERIENCES DE COMPETITION Les composés candidats antagonistes de la protéine ESM-1 peuvent être également sélectionnés en ce qu'ils se fixent sur la protéine ESM-1, ou sur un fragment polypeptidique de celle-ci, en compétition avec un composé antagoniste de la protéine ESM-1 sélectionné antérieurement tels que l'un des anticorps anti-ESM-1 décrits ci-dessus, et tout particulièrement l'anticorps monoclonal sécrété par la lignée d'hybridome MEP08 déposée le 19 Novembre 1997 auprès de la CNCM sous le no d'accès 1-1941. De telles expériences de compétition sont par exemple décrites dans l'article de BECHARD et al. (2000). C. COMPOSES CANDIDATS ANTAGONISTES DE LA PROTEINE ESM-1 SELECTIONNES PAR CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE. Des protéines ou d'autres molécules de toute nature capables de se fixer sur la protéine ESM-1, ou un fragment polypeptidique de cette protéine, peuvent être sélectionnées en utilisant des colonnes d'affinité sur lesquelles ont été immobilisées la protéine ESM-1 ou un fragment de cette dernière, par exemple en utilisant des techniques classiques, incluant un couplage chimique de la protéine ESM-1 ou d'un fragment de cette dernière à la matrice d'une colonne telle que de l'agarose, ou de l'AffiGelo. Une solution contenant le composé candidat à tester est mis en contact avec le support chromatographique sur lequel est immobilisée la protéine ESM-1 ou un fragment peptidique de celle-ci. Les composés retenus sur la colonne d'affinité sont sélectionnés positivement. D. COMPOSES CANDIDATS SELECTIONNES PAR DES TECHNIQUES DE BIOCAPTEURS OPTIQUES Un composé candidat antagoniste de la protéine ESM-1 peut également être sélectionné en utilisant un biocapteur optique tel que décrit par EDWARDS et LEATHERBARROW (1997). Cette technique permet la détection d'interactions entre des molécules en temps réel sans nécessiter l'utilisation de molécules marquées. Cette technique est basée sur la résonance de surface du plasmon (SPR pour Surface Plasmon Resonance ). Brièvement, le composé candidat à tester est fixé sur une surface, telle qu'une matrice de carboxyméthyldextran. Un rayon lumineux est dirigé sur l'extrémité de la surface qui ne contient pas l'échantillon à tester et est réfléchi par cette surface. Le phénomène SPR provoque une réduction d'intensité de la lumière réfléchie avec une association spécifique entre l'angle de la lumière réfléchie et la longueur d'onde du rayon lumineux. La fixation du composé candidat provoque un changement dans l'indice de réfraction de la surface, le changement d'indice de réfraction étant détecté comme une modification du signal SPR. Un tel procédé de détection par biocapteur optique peut permettre également de sélectionner les composés candidats qui entrent en compétition avec un autre ligand pour la fixation sur la protéine ESM-1 ou un fragment peptidique de ce dernier. Par exemple, un composé candidat antagoniste de la protéine ESM-1 englobe les composés capables d'inhiber la fixation d'un anticorps anti-ESM-1 sur la protéine ESM-1, d'inhiber la fixation du facteur HGF-SF ou encore des facteurs FGF-2 et FGF-7 sur la protéine ESM-1 ou un fragment peptidique de cette dernière. Ainsi, selon encore un autre aspect, l'invention a trait à un procédé de sélection d'un composé antagoniste de la protéine ESM-1 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact la protéine ESM-1 ou un fragment peptidique de cette dernière en présence de : (i) un composé antagoniste de la protéine ESM-1 se fixant sur la protéine ESM-1 ; et (ii) un composé candidat à tester ; b) dans une étape séparée de l'étape a), mais éventuellement simultanée à cette dernière, mettre en contact la protéine ESM-1 ou un fragment peptidique de cette dernière avec un composé antagoniste de la protéine ESM-1 se fixant sur la protéine ESM-1 ; c) détecter la quantité respective du composé antagoniste de la protéine ESM-1 fixée à l'issue de chacune des étapes a) et b) ; et d) sélectionner le composé candidat qui entre en compétition avec le composé antagoniste pour la fixation sur la protéine ESM-1. De préférence, un composé antagoniste de ESM-1 pour la mise en oeuvre du procédé de sélection ci-dessus est un anticorps anti-ESM-1 ou encore un composé antagoniste peptidique tel que défini ci-avant dans la présente description. Dans un premier mode de réalisation particulier d'un procédé pour sélectionner un composé antagoniste de ESM-1 à partir d'un composé candidat, ledit procédé comprend les étapes suivantes : 1) sélectionner, parmi les composés candidats, les composés qui se fixent sur la protéine ESM-1 ou sur un fragment peptidique de cette protéine ; 2) administrer un composé sélectionné à l'étape 1) à un animal et déterminer la capacité de ce composé à inhiber, chez cet animal, le développement de tumeurs induites par la protéine ESM-1 ; 3) sélectionner les composés inhibiteurs du développement des tumeurs déterminéas à l'étape 2) comme des composés antagonistes de la protéine ESM-1. L'étape 1) consiste préférentiellement en la mise en oeuvre d'un procédé de sélection d'un composé candidat se fixant sur la protéine ESM- 1 ou sur un fragment de celle-ci, choisi parmi les procédés détaillés dans la présente description. L'étape 2) consiste préférentiellement en la mise en oeuvre d'un procédé de sélection d'un composé candidat in vivo tel que détaillé dans la description. Composition pharmaceutique de l'invention. Un autre objet de l'invention consiste en une composition pharmaceutique pour le traitement et/ou la prévention d'un cancer comprenant un composé antagoniste de la protéine ESM-1. Composition pharmaceutique comprenant un composé antagoniste du type anticorps ou du type peptide selon l'invention. Selon un premier aspect, une composition pharmaceutique selon l'invention comprend une quantité thérapeutiquement efficace d'un anticorps anti-ESM-1 ou d'un composé antagoniste peptidique dérivé de ESM-1, en association avec un ou plusieurs véhicules pharmaceutiquement compatibles. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention incluent celles adaptées pour une administration topique, orale, rectale, nasale ou parentérale (y compris intramusculaire, souscutanée et intraveineuse) ou encore sous une forme adaptée pour une administration par inhalation ou insufflation. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être présentées sous forme d'unités de dosage et peuvent être préparées par toute méthode bien connue de l'homme du métier du domaine de la galénique pharmaceutique. Toutes les méthodes comprennent une étape consistant à associer le composé agoniste constituant le principe actif de la composition avec un véhicule liquide ou un véhicule solide finement divisé et, si nécessaire, mettre en forme le produit, par exemple sous forme de comprimés ou de gélules. Pour une administration orale, une composition pharmaceutique selon l'invention est de préférence présentée sous la forme d'unités de dosages telles que des capsules, des comprimés ou des gélules. Lorsqu'elles se présentent sous une forme incluse dans un conteneur pressurisé, la composition pharmaceutique peut comprendre un agent propulseur tel que le dichlorodifluorométhane, le trichlorofluorométhane, le dichlorotétrafluoroéthane, le dioxyde de carbone ou d'autres gaz appropriés. Dans le cas d'un aérosol pressurisé, l'unité de dosage peut être pourvue d'une soupape capable de libérer une quantité donnée de la composition pharmaceutique. Selon un autre aspect, la composition pharmaceutique selon l'invention peut être sous la forme d'une composition de poudre sèche pour l'administration par inhalation ou insufflation, par exemple sous la forme d'un mélange de poudre du composé antagoniste et d'une poudre base adaptée, telle que le lactose ou l'amidon. La composition de poudre peut être présentée en unité de dosage, par exemple sous la forme de gélules ou de cartouches à partir desquelles la poudre peut être administrée à l'aide d'un dispositif inhalateur ou insufflateur. Un véhicule solide pharmaceutiquement compatible d'une composition pharmaceutique selon l'invention englobe des substances telles que les agents de saveur, les lubrifiants, les solubilisants, les agents de suspension, les agents de charge, les auxiliaires de compression, les liants ou des agents désintégrants ainsi que les matériaux d'encapsulation. Dans les poudres, le véhicule est un solide finement divisé qui est en mélange avec le composé antagoniste de ESM-1 également sous la forme finement divisée. Dans les comprimés, le principe actif antagoniste de ESM-1 est mélangé avec un véhicule ayant des propriétés de compression adaptées et compactées sous la forme et la taille désirées. Les poudres et les comprimés contiennent de préférence moins de 99% du principe actif. Des véhicules solides préférés sont par exemple le phosphate de calcium, le stéarate de magnésium, le talc, les sucres, le lactose, la dextrine, l'amidon, la gélatine, la cellulose, la polyvinylpyrrolidone et les résines d'échange d'ions. Des véhicules liquides sont utilisés pour préparer une composition pharmaceutique selon l'invention sous la forme d'une solution, une suspension, d'une émulsion, d'un sirop, d'un elixir et d'une composition pressurisée. Le principe actif antagoniste de la protéine ESM-1 peut être dissous ou suspendu dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable tel que de l'eau, d'un solvant organique, d'un mélange des deux ou des huiles ou matières grasses pharmaceutiquement acceptables. Le véhicule liquide peut contenir d'autres additifs pharmaceutiquement acceptables tels que des agents solubilisants, des émulsifiants, des tampons, des conservateurs, des édulcorants, des agents aromatiques, des agents de suspension, des agents épaississants, des agents colorants, des régulateurs de viscosité, des stabilisants ou des osmo-régulateurs. Des exemples illustratifs de véhicules liquides pour administration orale et parentérale comprennent l'eau, les alcools (y compris les alcools monohydriques et polyhydriques comme les glycols), les huiles telles que l'huile de coco ou l'huile d'arachide fractionnée. Pour l'administration parentérale, le véhicule peut aussi être un ester tel que l'oléate d'éthyle et le myristate d'isopropyle. Les compositions pharmaceutiques liquides sous la forme de solutions ou suspensions stériles peuvent être utilisées pour une injection intramusculaire, intrapéritonéale ou sous-cutanée. De préférence, une composition pharmaceutique selon l'invention comprend de 1 à 1000 mg de composés antagonistes de la protéine ESM- 1 par unité de dosage, et de préférence de 10 à 500 mg du composé antagoniste de la protéine ESM-1 par unité de dosage. La présente invention concerne aussi une méthode de traitement et/ou de prévention d'un cancer comprenant une étape au cours de laquelle on administre à un patient ayant besoin d'un tel traitement une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus. Composition pharmaceutique comprenant un composé antagoniste de la protéine ESM-1 du type polynucléotide antisens. Font également partie de l'invention des compositions pharmaceutiques contenant une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé antagoniste de la protéine ESM-1 du type polynucléotide antisens tel que défini dans la présente description ainsi que des méthodes de traitement et/ou de prévention d'un cancer comprenant l'administration à un patient ayant besoin d'un tel traitement d'une composition pharmaceutique comprenant un polynucléotide antisens tel que défini ci-dessus. Un oligonucléotide antisens selon l'invention peut être administré par tout moyen, qu'il soit local ou systémique. L'administration locale d'un polynucléotide antisens de l'invention, par exemple au niveau d'une tumeur, peut être réalisée par l'administration du polynucléotide antisens directement au niveau de la tumeur ou au niveau du tissu entourant la tumeur et permettant à l'oligonucléotide de migrer et, le cas échéant d'entrer, dans les cellules tumorales. Par exemple, les polynucléotides antisens peuvent être injectés à l'aide d'une seringue. L'injection peut être intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée. Le polynucléotide antisens peut être administré au foie par l'intermédiaire du système de la veine porte hépatique. De même, le polynucléotide antisens peut être administré au poumon à l'aide d'un dispositif d'inhalation. D'autres modes d'administration d'un polynucléotide antisens peuvent être utilisés. Par exemple, les polynucléotides antisens peuvent être administrés de manière systémique après leur insertion dans un vecteur d'expression. Le terme vecteur d'expression , englobe un plasmide, un virus ou un autre véhicule connu dans l'état de la technique pour assurer l'expression d'un polynucléotide antisens. Pour la mise en oeuvre de vecteurs adaptés pour l'expression recombinante d'un polynucléotide antisens, l'homme du métier pourra avantageusement utiliser des vecteurs pMSXND décrits par LEE et NATHANS (1988), des vecteurs viraux eucaryotes, tels que ceux décrits par GLUZMAN (1982), ou encore des adénovirus et des virus adénoassociés tels que ceux décrits dans les brevets US no5, 173,414 et 5,354, 678 ou encore un système d'expression incluant le vecteur d'expression décrit par MOXHAM et al. (1993). De préférence, le vecteur d'expression contient un promoteur permettant la production du polynucléotide antisens chez un animal, de préférence un mammifère, et de manière préférée chez l'homme, tel que le promoteur de la polyhédrine. Le vecteur d'expression peut être adapté à l'expression ciblée du polynucléotide antisens au site de la tumeur, par exemple en plaçant l'acide nucléique codant pour les polynucléotides antisens sous le contrôle d'un promoteur spécifique de certaines cellules, telles que les cellules épithéliales ou les cellules endothéliales. Un exemple d'un tel promoteur est le promoteur viral désigné NuNTV qui est utile spécifiquement dans le traitement des cancers du sein. D'autres exemples de tels promoteurs spécifiques sont des promoteurs de protéine du lait telle que la lactoglobuline, de la caséine-a et de la caséine-p. La quantité thérapeutiquement efficace d'un polynucléotide antisens de l'invention peut être déterminée comme la quantité nécessaire à une réduction significative de la traduction de la protéine ESM-1 au niveau systémique ou local. Il apparaîtra clairement à l'homme du métier que la concentration du polynucléotide antisens thérapeutiquement efficace varie avec le choix de la forme d'administration. Par exemple, si le polynucléotide antisens est administré par injection à un mammifère, l'unité de dosage constituée d'une séringue contenant une quantité efficace du polynucléotide antisens. Une quantité efficace du polynucléotide antisens pour une administration systémique est comprise entre 0,01 mg/kg à 50 mg/kg administrée une fois ou deux fois par jour. Une quantité thérapeutiquement efficace d'un polynucléotide antisens selon l'invention inclue dans une composition pharmaceutique est comprise généralement entre 104 et 1011 molécules de polynucléotide antisens par administration et de préférence entre 105 et 101 molécules d'ADN par administration. Cependant, différents protocoles de dosage peuvent être utilisés selon (i) la capacité individuelle du polynucléotide antisens à inhiber l'expression de la protéine ESM-1, (ii) la gravité ou l'étendue de la maladie, ou (iii) le comportement pharmacocinétique du polynucléotide antisens utilisé. Le polynucléotide antisens peut être associé à un véhicule pharmaceutiquement compatible ou à un excipient. Des exemples d'excipients comprennent les agents de charge, les liants, les agents désintégrants, les lubrifiants, selon la nature de l'administration et les formes de dosage. Des formes de dosage préférées consistent en des solutions liquides, avantageusement des tampons physiologiquement compatibles telles que des solutions de HANK's ou de RINGER. De plus, les polynucléotides antisens selon l'invention peuvent être formulés sous forme solide puis redissous ou resuspendus immédiatement avant usage. Selon englobe les formes lyophilisées et les liposomes contenant de tels polynucléotides antisens. Un polynucléotide antisens de l'invention peut aussi être administré de manière systémique par les voies transmuqueuses, transdermiques ou orales. Pour les voies d'administration transmuqueuses ou transdermiques, des agents pénétrant peuvent être utilisés dans la formulation tels que des sels biliaires ou des dérivés de l'acide fusidique. La présente invention est également relative à une méthode de traitement et/ou de prévention d'un cancer comprenant une étape d'administration à un patient, ayant besoin d'un tel traitement, une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus comprenant un composé antagoniste de ESM-1 du type polynucléotide antisens. De manière générale, l'une quelconque des compositions pharmaceutiques de l'invention telles que définies ci-dessus et comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé antagoniste de la protéine ESM-1 est utile dans la prévention et/ou le traitement d'un cancer. A titre illustratif, mais non limitatif, une composition pharmaceutique selon l'invention est utile pour la prévention et/ou le traitement de cancers tels que les cancers des voies respiratoires, les cancers broncho-pulmonaires, les cancers du sein, les cancers du colon et les cancers rénaux ainsi que les cancers des voies digestives. La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants. FIGURES La figure 1 illustre des gels d'immuno-empreinte ( WesternBlot ) et des colorations de ESM-1 sur gel SDS-PAGE. Chaque gel d'immuno-empreinte a été révélé avec l'anticorps monoclonal anti-ESM-1 MEP14. Le second anticorps anti-souris marqué à la peroxydase de raifort a été purifié par affinité et donne des résultats négatifs lorsqu'il est utilisé seul. Figure 1A. Gel d'immuno-empreinte de la protéine ESM-1 de différents types cellulaires exprimant cette protéine. L'immuno-précipitation de ESM-1 à partir des surnageants de culture des cellules SVI (1), 293-ESM (2) et CHO-ESM (3) a été réalisée avec l'anticorps MEP19 lorsque cela est indiqué, ou avec un anticorps témoin. Les flèches indiquent la bande spécifique de ESM-1. La forme native de ESM-1 est représentée par une bande diffuse aux alentours de 50 kD. Figure 1B. Absence de détection de la protéine purifiée ESM-1 avec le bleu de coomassie. 5 ug de protéine ESM-1 purifiée à partir des cellules SVI ont été chargés sur un gel SDS-PAGE à 15% et colorés au bleu de coomassie afin de détecter le corps peptidique de la molécule. Les flèches indiquent l'absence de détection de ESM-1. Figure 1C. Détection de la protéine ESM-1 purifiée avec le bleu alcian. 5 ug de protéine ESM-1 purifiée à partir des cellules SVI ont été chargés sur un gel SDS-PAGE à 15% et ont été révélés par coloration au bleu alcian afin de détecter le corps glycanique de la molécule. La flèche indique la protéine ESM-1. La figure 2 illustre le poids moléculaire apparent des corps peptidique et glycanique de ESM-1. Figure 2A. Analyse par mutation du site de fixation de 0glycosylation. Deux sites putatifs de O-glycosylation (tréonine 120 et sérine 137) ont été substitués par un résidu alanine par mutagénèse dirigée. La protéine ESM-1 sauvage (WT pour WHd-Type ), tes mutants de ESM-1 T120A et S137A) ainsi que les témoins négatifs (MOCK) ont été transfectés dans les cellules 293 et les surnageants de culture cellulaire ainsi que les Iysats cellulaires ont été analysés par immuno-empreinte (Western-Biot) à l'aide de l'anticorps monoclonal MEP14. Les flèches indiquent les bandes spécifiques. Figure 2B. Effet d'un traitement à la protéinase K sur ESM-1. La protéine ESM-1 purifiée à partir des cellules SVI (1) et 293-ESM (2) a été digérée par la protéinase K et chargée sur un gel SDS-PAGE 15%. La flèche supérieure indique la forme sauvage de la protéine ESM-1 non traitée et la flèche inférieure indique la protéine ESM-1 digérée par la protéinase K. La figure 3 illustre les effets de chondroïtinases spécifiques sur ESM-1. Figure 3A. Traitement de la protéine ESM-1 sauvage purifiée avec la chondroïtinase ABC. La protéine ESM-1 sécrétée a été purifiée par chromatographie d'échanges d'ions, suivie d'une chromatographie d'immuno-affinité à partir de surnageants de cultures de cellules SVI (1), 293-ESM (2) et à partir de plasma humain (3), puis digérée ou non par la chondroïtinase ABC. 50 ng de la protéine digérée ont été chargés sur un gel SDS-PAGE à 15% puis analysés par immuno-empreinte (Western-Blot). La flèche supérieure indique les formes non digérées de ESM-1 et la flèche inférieure indique les formes digérées de ESM-1. Figure 3B. Traitement de la protéine ESM-1 sauvage purifiée avec la chondroïtinase B. La protéine ESM-1 purifiée à partir de surnageants de culture des cellules SVI (1) et 293-ESM (2) ont été digérés ou non par la chondroïtinase. Les protéines ont été chargées sur un gel SDS-PAGE à 15%. La flèche supérieure indique les différentes formes de ESM-1 non digérées autour de 50 kD et la flèche inférieure indique les différentes formes de la protéine ESM-1 digérée, autour de 22 kD. Figure 3C. Traitement de la protéine ESM-1 sauvage purifiée avec la chondroïtinase AC. La protéine ESM-1 purifiée à partir de surnageants de culture des cellules HUVEC (1) et 293-ESM (2) ont été virées ? ? ? par la chondroïtinase AC et ont été chargées sur un gel SDS-PAGE à 15%. La flèche supérieure indique les différentes formes de ESM-1 non digérées autour de 502 kD et la flèche inférieure indique les différentes formes digérées de la protéine ESM-1 autour de 22 kD. Figure 3D. Traitement de la protéine ESM-1 sauvage purifiée avec la chondroitinase C. La protéine ESM-1 purifiée à partir de surnageants de cultures des cellules HUVEC (1) et 293-ESM (2) ont été digérées ou non par la chondroïtinase C et ont été chargées sur un gel SDS-PAGE à 15%. La flèche supérieure indique les différentes formes non digérées de ESM-14 autour de 50 kD et la flèche inférieure indique les différentes formes digérées de la protéine ESM-1 autour de 22 kD. La figure 4 illustre les effets de la protéine ESM-1 sauvage purifiée sur le temps de coagulation en présence de thrombine. On peut noter le retard et la réduction dans la formation de thrombine pour le plasma hépariné ainsi que pour les quatre autres courbes (plasma riche en plaquette ou PRP : losange vide ; plasma riche en plaquette + ESM-1 à 0,2 mg/ml : carré plein ; plasma riche en plaquette + ESM-1 0 0, 5 mg/ml : triangle plein ; plasma riche en plaquette + ESM-1 à 1 mg/ml : cercle plein ; plasma riche en plaquette + héparine : cercle vide). La figure 5 illustre l'activité biologique du protéoglycane ESM-1 sur la prolifération des cellules 293 induites par le facteur HGF/SF. La stimulation de l'incorporation de 3H-thymidine par les cellules 293 induites par le facteur HGF/SF a été étudiée. Les cellules ont été ensemencées à 1 x 104 cellules par puits dans du milieu DMEM additionnées de transférine et d'insuline et de HGF/SF à 50 ng par ml avant addition de différentes molécules. Les barres représentent le pourcentage d'augmentation de l'incorporation de 3H-thymidine (moyenne +/-S. E. M. d'échantillons en triple d'une expérience représentative) en présence des additions indiquées de sérum, des différentes formes de ESM-1 à 2,5 mg/ml et de décorine à 2,5 mg/ml. Le bruit de fond d'incorporation de 3H-thymidine en présence de HGF/SF a été généralement compris entre 7. 000 et 8. 000 cpm par puits. Les résultats présentés sont similaires à ceux obtenus dans trois autres expériences séparées. La figure 6 illustre une étude de douze réponses des différentes formes de ESM-1 et de décorine sur l'activité mitogène induite par le facteur HGF/SF. On a étudié la simulation de la synthèse d'ADN par les cellules 293 en présence de HGF/SF à 50 nanogrammes par ml seule ou en présence de différentes concentrations de la protéine sauvage ESM- 1/WT (carré vide), de la protéine mutée non glycosylée ESM/S137A (cercle plein), de la chaîne GAG dérivée de la protéine ESMNVT (carré plein) ou de la décorine (cercle vide). Les valeurs moyennes de mesure en triple d'incorporation de 3H-thymidine obtenues dans une expérience parmi trois expériences indépendantes sont représentées à la figure 6. Les résultats sont exprimés en cpm. Les déviations standard sont approximativement de 10%. La figure 7 illustre le pouvoir tumorigène de la protéine ESM-1. Deux lots de plus de 10 souris ont reçu des cellules HEK témoins ou des cellules HEK transfectées avec un vecteur codant pour l'ADNc de la protéine ESM-1 sauvage (ESM/WT). Sur la figure 7A, le pourcentage de tumeurs macroscopiquement visibles à la huitième semaine au point d'injection et dont le volume tumoral est supérieur à 1 cm3 est représenté en ordonnée. La figure 7B illustre la cinétique d'apparition des tumeurs chez des souris ayant reçu les cellules HEK transfectées exprimant la protéine ESM-1 glycosylée (ESMANT). Le nombre de semaines après l'injection des cellules est représenté en abscisse. En ordonnée est représenté le volume tumoral moyen, exprimé en cm3. La figure 8 illustre la production de ESM-1 par les tumeurs induites chez la souris. La figure 8A représente le taux sérique de protéine ESM-1 retrouvé chez les deux lots de souris, à la huitième semaine suivant l'injection des cellules. En abscisses sont représentés respectivement le lot de souris ayant reçu les cellules HEK témoins et le lot de souris ayant reçu les cellules HEK exprimant la protéine ESM-1 glycosylée (ESMNVT). Le taux sérique de ESM-1 retrouvé, exprimé en nanogramme/ml, est représenté en ordonnées. La figure 8B illustre la cinétique des taux sériques de ESM-1 mesurées par ELISA, pour les souris du lot ayant reçu les cellules HEK transfectées avec un ADN codant pour la protéine ESM-1 glycosylée (ESM/WT). En abscisses sont représentés le nombre de semaines suivant l'injection des cellules transfectées. Le taux sérique de protéine ESM-1, et exprimé en nanogrammelmi, est représenté en ordonnées. La figure 9 illustre l'activité tumorigène de différentes formes de la protéine ESM-1. La figure 9A illustre l'apparition de tumeurs chez différents lots de souris, les souris ayant reçu respectivement les cellules HEK témoins, les cellules HEK transfectées avec un ADNc codant pour la protéine ESM-1 glycosylée (ESM/WT), les cellules transfectées avec la protéine ESM-1 non glycosylées (ESM/S137A) et les cellules HEK transfectées avec un ADNc codant pour la protéine ESM-1 mutée en positions 134 et 135 (ESM/F115A, F116A). En ordonnées est représenté le pourcentage de tumeurs macroscopiquement visibles à la huitième semaine au point d'injection dont le volume tumoral est supérieur à 1 cm3. La figure 9B illustre le taux sérique de ESM-1 chez les différents lots identiques de souris. Le taux sérique de ESM-1, exprimé en nanogramme/m), est représenté en ordonnées. EXEMPLES : EXEMPLE 1 Modification post-traductionnelle de la forme sécrétée de la protéine ESM-1. A. Matériels et Méthodes A. 1 Culture cellulaire et matériels Les cellules CHO ont été cultivées dans un milieu de culture MAMa (Gibco BRL, Life Technologies, France) additionné de 10% de sérum de veau foetal. Les cellules endothéliales humaines transfectées par le virus SV40, les cellules SV1 décrites par LASSALLE P et al. (1992) ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 contenant 2mM de L-glutamine et 10% de sérum de veau foetal. Les cellules de reins embryonnaire humaine, les cellules de la lignée 293, ont été cultivées dans du milieu DMEM de Dulbecco avec 10% de sérum de veau foetal. Les cellules rénales embryonnaires humaines, cellules de la lignée 293, utilisées pour le test de prolifération ont été cultivées dans du milieu de EAGLE modifié de Dulbecco (Gibco BRL) complémenté avec de l'insuline à 10 mg/ml et de la transférine à 10mg/ml. La protéinase et la chondroïtinase ABC sont commercialisée par Boehringer Mannheim. Les chondroïtinases B, AC et C sont commercialisées par Sigma Le facteur HGF/SF humaine est commercialisé par R & D et la décorine est commercialisée par Sigma. Des anticorps monoclonaux anti-ESM-1 ont été produits et purifiés comme décrit par BECHARD et al. (2000). A. 2 Développement de lignées cellulaires exprimant ESM-1. L'ADNc complet codant pour ESM-1 a été dirigé, purifié et inséré dans le vecteur d'expression pcDNA3 (commercialisé par Invitrogen) entre les sites Xhol et Hindlill. La constructions de vecteurs a été transfectée dans des lignées cellulaires CHO et 293 en présence de lipofectamine (GIBCO BRL), puis sélectionnées sur G418 (1000 ug/mt pour la lignée CHO et 300 ug/ml pour la lignée 293). Les lignées cellulaires transfecfées de manière stable ont été obtenues par dilution limite et les cellules ainsi sélectionnées ont été désignées respectivement CHO-ESM et 2936-ESM A. 3 Détermination du site de o-qlycosylation de ESM-1 par analyse par mutation. 2 sites potentiels de O-glycosylation ont été prédits à l'aide du logiciel NET 0 glyc : O Prediction Serveur. On a substitué le résidu sérine en position 137 (SEQ ID Nol) et la thréonine en position 120 (SEQ ID N"1) par un résidu alanin. Les mutants de O-glycosylation ont été produits par PCR à l'aide du kit Quick Change de mutagénèse dirigé selon les recommandations du fabriquant (Stratagene). Les ADNc mutés ont été confirmés par séquençage (séquenceur ABI prism 377 de la Société Applied Biosystems. Puis les cellules 293 ont été transfectées avec les vecteurs dans lesquels ont été insérés les ADNc mutants pour obtenir des transfectants transitoires et des transfectants stables, respectivement les lignées 293-ESM/S 137A et 293-ESM/T120A. A. 4. Purification du protéoalvcane ESM-1 chondroïtine/dermatane sulfate. Les surnageants de culture cellulaire ont été ajustés à pH8, puis passés sur une colonne de DEAE-Sepharose (Pharmacia), lavés avec un tampon 50 mM Tris (pH8), 0,2 MNACI, puis élués dans un tampon 50 mM Tris (pH8), 0,8 M Nacl. Les éluats ont été ajustés à 50 mM Tris (pH8), 0,5 MNaCI et passés sur une colonne d'affinité. La colonne d'affinité est constituée d'anticorps monoclonaux anti-ESM-1 (produits par la lignée d'hybridome MEC4) immobilisés sur un gel Affigel Hz hydrazide, selon les recommandations du fabricant (Biorad). Après une étape de lavage avec un tampon 50 mM Tris (pH8), MNaCI 0,5, la protéine ESM-1 a été éluée avec une solution de 3M de MgCI2, concentrée et dialysée contre le même tampon sur un dispositif ultrafree 30 (millipore). Le matériau élué a ensuite été quantifié par immunodétection avec des anticorps anti-ESM-1, et contrôlés sur SDS-PAGE à l'aide d'une coloration au bleu de coomassie ou bleu alcian. La purification de la protéine ESM-1 à partir du plasma humain a été réalisée selon le protocole suivant. 800 ml de plasma fourni par l'établissement de transfusion sanguine (Lille, France) ont été précipités avec une solution à 60% de sulfate d'ammonium et dialysés contre un tampon 50 mM Tris (pH 8), 0,5 MNAcl. L'extrait de plasma précipité et dialysé a ensuite été passé sur une pré-colonne de 50 ml du type Affigel (Biorad) avant un passage sur la colonne d'immunoaffinité anti-ESM-1. La protéine ESM-1 fixée sur la colonne d'immunoaffinité a été récupérée comme décrit ci-dessus. La forme non glycosylée de ESM-1 (ESM/S137A) a été purifiée en une seule étape par chromatographie et d'immunoaffinité. Le degré de pureté de la protéine ESM-1 glycosylée (ESM/WT) et de la protéine non glycosylée mutée sur la sérine 137 (ESM/S137A) a été contrôlée par FPLC. Le matériau purifié est exempt d'endotoxines, comme en témoigne les résultats du test de Iysat de limulus amebocyte (BlOwhitaker). A. 5 Immunoprécipitation, immuno-empreinte et séquençage. La taille des différentes formes de ESM-1 a été déterminée par immunoprécipitation et immuno-emprente à partir des surnageants de cultures cellulaires et des ysats cellulaires. Les cellules ont été Iysées dans un tampon contenant 0,5% de NP40, un cocktail d'anti-protéases (Boehringer Mannheim, Allemagne) dans du PBS pendant 30 minutes à 4 C en agitation. Puis, les Iysats ont été centrifugés à 10. 000g pendant 15 min afin d'obtenir des Iysats cellulaires clarifiés. Les surnageants de culture ont été filtrés sur un filtre ayant un diamètre de pore de 0,45 mm. 1 ug de l'anticorps monoclonal ESM-1 produit par la lignée d'hybridome MEP19 ou 1 ug d'anticorps monoclonal anti-ICAM-1 (clone 164B) a été ajouté au Iysat clarifié ou au surnageant de culture cellulaire et incubé pendant une nuit à 4 C sous agitation. 50 ut d'une immunoglobulin anti-souris conjugué à des billes d'agarose (sigma) ont été ajoutés à 4 C pendant 90 min, avant centrifugation et de lavage avec un tampon de lyse et de lavage dans du PBS. Les billes ont été resuspendues dans 20 et 40 ut de tampon SDSPAGE pendant 5 min, centrifugées, et les surnageants ont été analysés. Les échantillons ont été soumis à une électrophorèse sur gel SDS-PAGE, puis transférés sur une membrane de nitrocellulose selon des procédures standard. Après une étape de blocage, les membranes ont été incubées pendant une heure avec un anticorps monoclonal ESM-1 produit par la lignée d'hybridome MEP14 à 1 ut, lavées puis incubées pendant 1 heure avec un anticorps secondaire anti-Fc de souris conjugué à la peroxydase de raifort ( Horse Radish peroxydase ) (commercialisé par la Société SIGMA). On a réalisé plusieurs lavages avant révélation en utilisant le kit de détection ECL commercialisé par la Société Amersham. Pour l'analyse de la séquence d'aminoacides, la protéine ESM-1 purifiée a été soumise à une électrophorèse sur un gel SDS-PAGE, puis électrotransférée sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) commercialisée par la Société MILLIPORE, puis colorée à l'aide de 0, 1% de bleu de coomassie. La bande protéine a 50 kD a été excisée de la membrane et la séquence N-terminale a été effectuée par dégradation d'EDMAN automatisée sur un séquenceur de protéine du type ABI 473A. A. 6 Digestion du corps peptidique de ESM-1 par la protéinase K Afin de déterminer la taille du glycosaminoglycane, la protéine ESM-1 purifiée a été digérée avec la protéinase K avec un rapport enzyme : ESM-1 égal à 1 : 50 (poids : poids) dans un tampon Tris 10mM, pH8, en présence ou en absence de 0,1% SDS à 56 C pendant 3 heures. Une quantité 10 supérieure de sérum albumine bovine (BSA) à la protéine ESM- 1 a été digérée par la protéinase K afin de vérifier sa dégradation complète. Les échantillons ont été analysés sur un gel de 12 % SDS-PAGE, suivi par une coloration au bleu de coomassie et au bleu alcian. A. 7 Digestion de ESM-1 par les chondroïtinases ABC. B, AC et C Afin d'analyser la nature de la substitution de glycosaminoglycane, la protéine ESM-1 purifiée a été digérée avec plusieurs chondroïtinases : chondroïtinases ABC (0, 5 unité/mg dans un tampon 100 mM TrisHCI, pH 8, 30 mM d'acétate de sodium, pH 5, 2 à 37 C pendant 45 min), chondroïtinase B (200 unités/mg dans un tampon 20 mM Tris-HCI, 50 mM Nacl, 4 mM Ca12, 0,01% BSA, pH 7, 5 à 25 C pendant deux heures), des chondroïtinase AC (une unité par ml dans un tampon 250 mM Tris Hcl, 75 mM acétate de sodium, pH 7,3 à 37 C pendant deux heures) des chondroïtinases C (80-120 unités/ml dans un tampon 50 mM Tris HCI, pH 8 à 25 C pendant 3 heures). Les échantillons ont été analysés par immunoempreinte. A. 8 Activité anti-coaqulante. Le plasma témoin pauvre en plaquette (PPP) a été préparé à partir de sang en présence de l'anticoagulant citrate de sodium (30mM), par centrifugation à 2500 g pendant 15 min. Tous les réactifs sont commercialisés par la Société STAGO Diagnostica (France). Trois paramètres ont été évalués, en ajoutant la protéine ESM-1, du tampon ou de l'héparine au plasma pauvre en plaquette : a) APTT (pour Activated Partial Thromboplastin Time ) : ce paramètre explore la voie intrinsèque de la coagulation sanguine (FI, Fit, FV, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII). Le déficit ou l'inhibition de l'un de ces facteurs augmente le temps de coagulation du mélange réactif PPP, céphaline, activateur, CAC12. b) TCT (pour Thrombin Clotting Time ) : ce paramètre est analysé sur un mélange de plasma pauvre en plaquette (PPP) en présence de thrombine. Avec une concentration standard de thrombine, le temps de coagulation du plasma est constant. Des défauts dans la formation de fibrine induisent une augmentation du temps de coagulation. c) activité anti-Xa : l'activité anti-Xa de l'héparine ou d'autres inhibiteurs agissant sur le facteur FXa est détectée par un test compétitif. L'échantillon étudié (PPP + ESM-1, + tampon ou + héparine) est mélangé avec le facteur Fxa et un substrat chromogène spécifique du facteur Fxa. La coloration finale est inversement proportionnelle à la concentration d'inhibiteur. A. 9 Test de génération de la thrombine Ce test global sensible peut détecter des défauts plasmatiques ou dans les plaquettes induisant un retard ou une réduction dans la génération de thrombine. A partir de sang, un plasma riche en plaquettes (PRP) a été préparé à partir de sang en présence de citrate de sodium par centrifugation à 150 g pendant 10 min. Le test de génération de la thrombine a été réalisé, pour chacun des sujets, dans des échantillons en l'absence de ESM-1, avec de l'héparinate de calcium non fractionnée (0, 5 Ul de anti-Xa/ml) ou avec 0, 2mg/ml, 0,5 mg/ml et 1 mg/ml de ESM-1 (concentration final). La protéine ESM-1 a été ajoutée 10 min avant le test. A 37 C, 1 ml de plasma a été mélangé avec 1 ml de Ca ! 2 et le chronomètre a été déclenché. Des fractions aliquotes de 0,1 ml ont été reprises du mélange réactif chaque minute pendant 1 min. Le caillot formé dans le mélange réactif est régulièrement éliminé. Les fractions aliquotes ont été mélangées avec 0,2 ml de fibrinogène (Sigma, 4/1000 dans du tampon Owren à 37 C et le temps de coagulation a été mesurée pour chacune des fractions aliquote). La thrombine formée dans le mélange réactif agit sur les forminogènes, induisant la formation de fibrine. L'activité de coagulation était maximale entre 4 et 8 min puis a diminué du fait de la neutralisation de la thrombine par l'anti-thrombine. A. 10 Chromatographie analytique par filtration sur gel 50 pg de ESM-1 glycosylée (ESMIWT) purifiée et de ESM-1 non glycosylée (ESM/S137A) purifiée dans du tampon 50 mM Tris, pH 8,5, 0,5 MNAcl ont été séparées par chromatographie liquide sur une colonne Superdex 200 (pour ESMIWT) ou Superdex 75 (pour ESM/S137A) commercialisée par Pharmacia, en utilisant le système de chromatographie Biorad Biologie Chromatography System avec un débit de 1 ml/min. Comme standard, on a utilisé le kit de calibration de haut et bas poids moléculaire (Pharmacia Biotech) suivant : ribonucléase A (de pancréas bovin, 13,7 kD), ovalbumine (43 kD) albumine (sérum bovin, 67 kd), aldolase (muscle de lapin, 158 kD), ferritine (rate de cheval, 440 kD), thiroglobuline (thyroïde bovine, 669 kD). Les standards de poids moléculaire ont été séparés en utilisant un tampon identique à celui utilisé pour les protéines ESM-1 et la séparation a été réalisée immédiatement après la séparation des protéines ESMIWT et ESM/S137A. Le temps d'élution des protéines standard a été utilisé pour construire une courbe linéaire standard, Kav = f (log MR) afin de déterminer le poids moléculaire apparent respectif des protéines ESMIWT et ESM/S137A. Des fractions de 1 ml ont été recueillies et la protéine ESM-1 a été détectée à l'aide d'un test immunoenzymatique (ELISA) spécifique. B. RESULTATS B. 1 Modifications post-traductionnelles de la forme sécrétée de la protéine ESM-1 produite par les cellules endothéliales et par des lignées cellulaires établies. Afin de déterminer si ESM-1 était maturée comme une molécule sécrétée, comme cela a été suggéré par la présence d'une séquence d'aminoacides N-terminale prédite comme un peptide signal, la protéine ESM-1 a été purifiée à partir de la lignée cellulaire 293-ESM. La séquence N-terminale de la forme de 50 kD a indiqué que le peptide signal de 19 acides aminés était clivé au site prédit, résultant en un polypeptide ESM-1 mature de 165 acides aminés commençant au résidu tryptophane en position 20 de la séquence SEQ ID N'l, la séquence Nterminale étant WSNNYAVD-P . ESM-1 a été immunoprécipité à partir des surnageants de cultures cellulaires des cellules HUVEC, SV1,293-ESM et CHO-ESM, puis analysés par immuno-empreinte. Dans les surnageants des cellules HUVEC, il a été montré précédemment que ESM-1 migrait sous la forme d'une bande diffuse à environ 50 kD. Une bande similaire en taille a été observée avec les surnageants des cellules SV1,293-ESM et CHO-ESM (figure 1A). Le poids moléculaire retrouvé est plus important que le poids moléculaire prédit. Ce résultat a suggéré que la forme sécrétée de ESM-1 avait subi des modifications post-traductionnelles. Le fait que la protéine ESM-1 purifiée était mieux colorée sur le gel SDS-PAGE avec le bleu alcian qu'avec le bleu de coomassie a suggéré que ESM-1 était glycosylée (figures 1 B, 1 C) plutôt que oligomérisée au travers de pont disulfure, du fait que des conditions réductrices ne modifient pas le poids moléculaire apparent de ESM-1. B. 2. Le résidu sérine en position 137 (SEQ ID NO1) est le site de 0glycosylation de ESM-1. Une analyse par ordinateur des sites de glycosylation potentielle a permis d'identifier trois sites putatifs de O-glycosylation, respectivement pour la sérine en position 16, sur la thréonine en position 120 et sur la sérine en position 127, mais aucun site de N-glycosylation. Le résidu thréonine en position 120 et le résidu sérine en position 137 ont été mutés et remplacés par un résidu alanin. Ces mutants ont été exprimés de manière transitoire dans les cellules 293. La protéine ESM-1 a ensuite été immunoprécipitée à partir des Iysats cellulaires et des surnageants de culture, et analysés par immunoempreinte. La protéine ESM/T120A migre à 50 kD, à une position similaire au poids moléculaire apparent de la forme sauvage de ESM-1 (ESMIWT), comme cela est montré à la figure 2A. Au contraire, la protéine ESM/S137A migre à 22 kD correspondant à la forme intra-cellulaire de ESM-1 (figure 2A), un poids moléculaire compatible avec le poids moléculaire prédit de ESM-1. Les immunoprécipitations réalisées à partir des cellules COS et CHO transfectées transitoirement ont donné les mêmes résultats, indiquant que seul le résidu sérine en position 137 constituait un site de glycoconjuguaison dans tous les modèles cellulaires étudiés. Afin de déterminer la longueur du glycosaminoglycane (GAG) de ESM-1, le corps peptidique de ESM-1 a été complètement digéré par la protéinase K. Le traitement par la protéinase K induit un changement dans le poids moléculaire de 50 kD à 25-30 kD (figure 2B). Ces résultats montrent que la bande de poids moléculaire apparent à 50 kD est compatible avec la présence d'un polypeptide de 22 kD qui est glycoconjuguée sur la sérine en position 137 par une chaîne GAG d'une taille moyenne de 25-30 kD. B. 3 La chaîne GAG DE ESM-1 est sensible à la chondroitinase ABC Afin de caractériser la chaîne GAG de ESM-1, la protéine ESM-1 a été tout d'abord digérée par ! a chondroïtinase ABC. Le traitement par la chondroïtinase ABC a réduit le poids moléculaire de la protéine ESM-1 sécrétée à 22 kD (figure 3A), suggérant que le carbohydrate de ESM-1 est une chaîne du type chondroitin. Le profil est similaire avec la protéine ESM-1 purifiée à partir des cellules 293-ESM ainsi qu'à partir de la lignée cellulaire endothéliale humaine SVI. Du fait que la protéine ESM-1 circule dans le sang, non a également étudié le comportement de la protéine ESM-1 purifiée à partir de plasma humain. Les résultats permettent d'observer une bande unique principale de 50 kD, qui a un poids moléculaire de 22 kD après traitement avec la chondroïtinase ABC, comme pour l'ensemble des autres lignées cellulaires étudiées (figure 3A). Ainsi, la protéine ESM-1 est un protéoglycane soluble contenant une chaîne unique de sulfate de chondroïtine. B. 4 La chaîne GAG de ESM-1 est une chaîne hétérogène de chondroïtine/dermatane sulfate. Afin de mieux déterminer le type de motif dit saccharidiques qui constitue la chaîne GAG de ESM-1, on a utilisé plusieurs enzymes spécifiques, telles que les chondroïtinases B, AC et C. Le traitement à la chondroïtinase B réduit le poids moléculaire apparent de 50 kD à 22 kD (figure 3B). Un profil similaire a été observé après traitement de l'ESM-1 par les chondroïtinases AC et C (figures 3C, D). Ces traitements enzymatiques différents indiquent que la chaîne GAG de ESM-1 contient différents motifs composites contenant un type de sucre aminé, la N-acétylgalactosamine, couplée à l'acide iduronique ou glucuronique différemment sulfatée. Ces différents motifs seraient pris en alternance dans la chaîne, et seraient présents au début de la chaîne, à proximité des dissacharides sulfatés N-terminaux qui persistent sur le corps protéique après digestion à la chondrottinase, du fait que tous les traitements à la chondroïtinase conduisent aux mêmes poids moléculaire apparents réduits de 22 kD. B. 5. Activité biologique du protéoglycane soluble ESM-1 sur la coagulation Du fait que la protéine ESM-1 est sécrétée comme un protéoglycane du type chondroïtine/dermatane sulfate par les cellules endothéliales et du fait que le sulfate de dermatane présente des effets sur la génération de thrombine in vitro DELORME et al., (1996) et sur la coagulation, l'activité anticoagulante potentielle de ESM-1 a été vérifiée sur les paramètres APTT, TCT, l'activité anti-Xa et sur la génération de thrombine. Les résultats sont représentés dans le tableau 1 ci-après. *TABLEAU 1 Activité biologique du protéoglvcane ESM-1 sur la coagulation APTT (sec) TCT (sec) Activité Anti-Xa (Ul/ml) PPP + tampon 30,6 16, 5 0 PPP + ESM-1 (0, 2, ug/ml) 30,8 17, 50 PPP + ESM-1 (0, 5 jg/ml) 31 18, 80 PPP + ESM-1 (1pg/ml) 31,8 20, 70 PPP+ héparine 89 39 0, 45 Les résultats du tableau 1 montrent que la protéine ESM-1 aux différentes doses importantes de 0,2 mg/ml à 1 mg/ml ne modifient pas les différents paramètres testés. Les paramètres APTT, TCT et activité anti-Xz sont similaires pour le plasma pauvre en plaquettes (PPP) avec le tampon ou avec la protéine ESM-1. Dans les témoins positifs, les activités APTT, TCT et anti-Xa sont plus grandes pour le PPP en présence d'héparine. De plus, la protéine ESM-1 n'a pas d'effet inhibiteur sur le test de génération de la thrombine : on observe aucune différence selon les concentrations de 0, 2 mg/ml, 0, 5 mg/ml et 1 mg/ml de ESM-1 par rapport au témoin tampon, alors que l'héparine induit un retard dans la formation de thrombine (figure 4). EXEMPLE 2 : Effet de la protéine ESM-1 sur l'activité mitogène du facteur HGF/SF A. Matériels et Méthodes L'activité de stimulation de la prolifération a été déterminée en mesurant l'incorporation de 3H thymidine par les cellules 293. Les cellules 293 ont été ensemencées à la concentration de 1 x 104 cellules par puits dans des microplaques à 96 puits du type TPP et ont été maintenues pendant 24 heures dans le milieu de culture DMEM additionnées de transférine et d'insuline. Le HGF/SF recombinant humain a été dilué dans du PBS contenant 0, 1% de sérum albumine bovine et ajouté par l'eau de 3 puits identiques afin d'obtenir une concentration finale de 50 ng/ml. Les protéines recombinantes ESM/WT, ESM/S137A, la chaîne GAG purifiée dérivée de ESM-1 et la décorine ont été ajoutées seules ou en association avec le facteur HGF/SF à des doses allant de 1 ng/mt à 2, 5 ug/ml, simultanément à l'addition de HGF/SF. Après 96 heures de culture, les cellules ont été incubées avec 0,5 pCi de 3H thymidine par puits pendant 16 heures et l'incorporation de 3H thymidine a été déterminée à l'aide d'un compteur à scintillation du type Topcount Microplate Scintillation Counter (Packard). Les tests ont été réalisés sur des lots de trois puits identiques. La viabilité cellulaire a été mesurée à l'aide du test de réduction de MTT. B. RESULTATS L'effet de la protéine ESM-1 sur l'activité du facteur HGF/SF a été étudié. L'incorporation de 3H-thymidine par les cellules 293 a été mesurée en présence de HGFSF à 50 ng/ml seule ou en association avec différentes quantités de ESMIWT. Dans un premier lot d'expériences, on a observé que le HGF/SF seul à 50 ng/ml induisait une prolifération des cellules 293 à un niveau égal à environ 45% de la prolifération induite par le sérum, alors que la protéine ESMIWT seule ne stimulait pas la prolifération des cellules 293. En revanche, lorsqu'elle est combinée au facteur HGF/SF, la protéine ESMIWT augmente considérablement la prolifération des cellules 293 induites par HGF/SF avec une augmentation de 162,3%, lorsque'la protéine est testée à la concentration de 2, 5 ug/ml (figure 5). Cet effet d'augmentation de la protéine ESM-1 sur l'activité HGF/SF est dépendant de la dose ESM-1 et commence a être significative à la dose de 10 ng/ml (figure 6). De plus, on a comparé l'effet de la protéine ESMIWT à l'effet de la décorine, un autre protéoglycane du type chondroïtine sutfate/dermatane sulfate, sur l'activité mitogène du facteur HGF/SF. Au contraire de la protéine ESMNVT, la décorine ne présente aucune activité d'augmentation de la prolifération des cellules 293 induites par le facteur HGF/SF (figures 5,6). Ces résultats indiquent que la protéine ESM-1 a un effet spécifique sur l'activité mitogène du facteur HGF/SF. Afin d'examiner l'implication respective du corps protéique de ESM-1 et de la chaîne GAG sur l'activité d'augmentation de l'effet mitogène, on a mesuré l'incorporation de 3H-thymidine par les cellules 293 en présence de HGF/SF additionnées de différentes concentrations de ESM/S137A non glycosylée et de la chaîne GAG dérivée de ESM-1. La forme non glycosylée de ESM-1 est incapable d'induire une prolifération des cellules 293, que ce soit en présence ou en l'absence du facteur HGFSF (figure 5), même lorsque elle est utilisée à haute concentration. Au contraire, la chaîne GAG purifiée à partir de ESM-1 augmente considérablement la prolifération des cellules 293 induites par le facteur HGF/SF, avec un facteur d'augmentation proche de 96,6%, comparée au facteur HGF/SF seul (figure 5). L'effet pro-mitogène de la chaîne GAG est moindre que celui observé avec la forme sauvage de la protéine ESM-1, mais cet effet est néanmoins dépendant de la dose de chaîne GAG ajoutée (figure 6). Les résultats détaillés ci-dessus démontrent clairement que la protéine ESMIWT augmente la prolifération des cellules 293 induites par le facteur HGF/SF et que cette activité pro-mitogène est spécifique et due à la chaîne GAG du type chondroïtine sulfate/dermatane sulfate de ESM-1. De manière générale, le facteur HGF/SF est exprimé durant les critiques périodes précoces de l'organogénèse humaine de 6 à 13 semaines de gestation. Les organes qui expriment le gène de HGF/SF sont notamment le foie, le rein métanéphrique, l'intestin et le poumon, chacun de ces organes se développant par interaction inductive entre le mesenchyme et l'épithélium. De plus, le facteur HGF/SF est un facteur important dans la dysplasie multicystique rénale humaine (TAKAYAMA et al., 1997) ainsi que dans l'apparition de malformation et d'hyperprolifération dans les tubules. Les résultats présentés ci-dessus indiquent que la protéine ESM-1 augmente significativement la prolifération des cellules du rein embryonnaire en présence de HGF/SF alors que la forme non glycosylée et de la protéine ESM-1 n'a pas d'effet. De plus, la chaîne GAG isolée à partir de la protéine ESM-1 est capable de mimer les effets de la protéine glycosylée ESMNVT. Ces résultats démontrent clairement que l'activité biologique de ESM-1 sur la fonction du facteur HGF/SF est médiée principalement par sa chaîne GAG. On peut noter que la décorine, un autre protéoglycane du type chondrd (tine sulfateldermatane sulfate sécrété par les cellules endothéliales et qui est capable de se fixer sur le facteur HGF/SF (CELLA et al., 1992) n'a pas d'effet sur l'activité de HGFSF. Ces comparaisons indiquent une spécificité d'action de la protéine ESM-1 sur l'activité du facteur HGF/SF requérant une composition de la chaîne GAG différente de la chaîne GAG des protéoglycanes appartenant à la famille des protéoglycanes à petites répétitions riches en leucine ( smatt teucine reach repeats ). Dans le rein, la protéine ESM-1 est détectée sélectivement dans les tubules distaux, le résultat qui peut être associé à l'observation de la localisation préférentielle du facteur HGF/SF dans la même partie du néphron dans des situations de dysplasies multicystique rénale humaine (WEIDNER et al., 1993). Ces résultats indiquent une application de la protéine ESM-1 dans des troubles pathologiques dépendant du facteur HGF/SF, qui a également été montré comme étant associé dans le développement de cancers du sein (RAHIMI et al., 1998), du rein (NATALI et al, (1996)) et du poumon (OTSUKA et al., 1998) mais aussi dans les mélanomes malins (SIEGFRIED et al., 1998). Ainsi, le facteur HGF/SF est susceptible de favoriser l'extension de l'hyperplasie et d'engendrer des cellules avec un phénotype invasif. La protéine ESM-1 est susceptible d'être impliquée dans ces phénomènes d'activités mitogènes dérégulés du facteur HGF/SF. EXEMPLE 3 : Préparation d'un composé antagoniste de la protéine ESM-1 du type anticorps. Afin d'obtenir des anticorps monoclonaux anti-ESM-1 dirigés contre la région N-terminale de la protéine ESM-1 riche en résidus cystéine, la forme native de la protéine ESM-1 produite par la lignée cellulaire CHO transfectée par un vecteur d'expression contenant un insert d'ADN codant pour la protéine ESM-1 a été purifiée. L'ADNc de ESM-1 est inséré dans le vecteur d'expression eucaryote pcDNA3 (In vitrogen) puis transfecté dans les cellules CHO avec la lipofectamine (GIBCO) selon les recommandations du fabricant. 48 heures après la transfection les cellules sont repiquées en présence d'un agent de sélection (G418, Gibco) à la dose de 1000 microgramme/ml). Après deux semaines de sélection, les cellules CHO résistantes au G418 sont clonnées par dilution limite. Des clones exprimant ESM-1 sont ensuite sélectionnés et appelés CHO-ESM (déposé à la CNCM). Pour la production, les cellules CHO-ESM sont cultivées en suspension dans un milieu conditionné sans sérum de veau foetal (milieu CHO SFM Il, Gibco). Le surnageant est ajusté à pH 8 et paessé sur une colonne de DEAE-sépharose (Pharmacia). La colonne est lavée avec un tampon 50 mM Tris, pH 8, 0, 2 M NaCI. La molécule ESM-1 est éluée dans un tampon 50 mM Tris, pH 8, 1 M NaCI. L'éluat est ensuite dilué au 1 : 4 dans un tampon 50 mM Tris, pH 8 et incubé en présence d'anticorps monoclonal anti-ESM-1 (MEC4) immobilisé sur agarose (Biorad). Après une nuit d'incubation à 4 C sous agitation les billes d'agarose sont lavées avec le tampon 50 mM Tris, pH 8,0, 2 M NaCI. ESM-1 est élué avec 3 M MgCts. L'éluat est concentré et dialysé dans le tampon 50 mM Tris, pH 8, 0.5 M NaCI et stocké à-70 C. Des souris Balb/C ont été immunisées par injection de 10 um de protéine ESM-1 recombinante purifiée par souris, selon un protocole d'immunisation standard en présence d'adjuvant de Freund. Les cellules d'hybridome sécrétant les anticorps monoclonaux anti-ESM-1 ont été obtenues par fusion, criblage et sous-clonage selon la technique décrite par BECHARD et al. (2000). Cinq clones cellulaires d'hybridome ont été obtenus et ont été désignés génériquement MEC ( Mouse Monoclonal Antibody to ESM-1 produced by CHO Cells ). Quatre des hybridomes sélectionnés sont des isotypes IgG1, k respectivement les hybridomes désignés MEC4, MEC5, MEC15 et MEC36. L'un des hybridomes est l'isotype IgM, k, t'hybridome MEC11. Les clones cellulaires d'hybridomes ont été cultivés dans du milieu de culture en l'absence de sérum et les anticorps anti-ESM-1 ont été purifiés par chromatographie sur colonne de protéine G-Sépharose commercialisée par la Société Pharmacia (UPSALA, Suède). EXEMPLE 4 : Préparation d'un composé antagoniste de la protéine ESM-1 du type polypeptide La mutagenèse dirigée a été réalisée avec le kit commercialisé par la Société STRATAGENE sous la référence Site-directed quick mutagenesis kit , qui a été utilisé selon les recommandations du fabricant. Brièvement, un couple d'amorces aller et retour de séquences strictement complémentaire sont synthétisées, ces amorces comprenant les nucléotides codant pour le ou les acides aminés mutés, ou les nucléotides complémentaires, ces nucléotides étant localisés au centre de la séquence des amorces qui comprennent aussi environ 10 à 15 nucléotides consécutifs complémentaires de la séquence à amplifier à la fois en 5'et en 3'des nucléotides centraux. Après amplification par PCR, les polynucléotides amplifiés codant pour la protéine ESM-1 mutée sont insérés dans le vecteur pCDNA3. On a utilisé respectivement les couples d'amorces suivants : a) Pour la protéine ESM-1 F115A Amorce aller : 5'-GCC TGA AAT TCC CCG CCT TCC AAT ATT CAG-3' (SEQ ID Nu3). Amorce retour : 5'-CTG AAT ATT GGA AGG CGG GGA ATT TCA GGC-3' (SEQ ID Nu4). b) Pour la protéine ESM-1 F116A Amorce aller : 5'-CCT GAA ATT CCC CTT CGC CCA ATA TTC AGT AAC C-3' (SEQ ID Nu5). Amorce retour : 5'-GGT TAC TGA ATA TTG CGC GAA GGG GAA TTT CAGT G-3' (SEQ ID Nu6). c) Pour la protéine ESM-1 F115 F116A Amorce aller : 5'-CCT GAA ATT CGC CGC CGC CCA ATA TTC AGT AAC C-3' (SEQ ID Nu7). Amorce retour : 5'-GGT TAC TGA ATA TTG GGC GGC GGG GM TTT CAG G-3'- (SEQ ID N 8). EXEMPLE 5 : Activité pro-tumorigène de la protéine ESM-1 g ! ycosy) ée. A. MATERIELS et METHODES A. 1. Lignées cellulaires : HEK T. HEK ESMIWT, HEK ESM/S137A, HEK ESM/69, HEK ESM/71, HEK ESM/73. On a utilisé la lignée cellulaire nommée HEK ESM/WT transfectée de façon stable avec l'ADNc codant pour la forme sauvage de ESM-1 (ESM/WT). Quatre autres lignées cellulaires sont obtenues par transfection avec de l'ADNc codant pour des formes purifiées de ESM-1 obtenues par mutagenèse dirigée à partir de la forme sauvage. La première d'entre elle, appelée HEK ESM/S137A, exprime la protéine ESM-1 mutée, non glycosylée, où une alanine est substituée à la sérine 137, site majeur de 0- glycosylation. Les trois autres lignées exprimant une forme glycosylée de ESM-1 dont la partie protéique est mutée. II s'agit des lignées HEK ESM/F115A (remplacement de la phénylalanine en position 134, HEK ESM/71 (remplacement de la phénylalanine en position 135) et HEK ESM/F115A, F116A (double délétion remplacement 134-135). Ainsi, six lignées cellules produisant différentes formes de ESM-1 sont utilisées : - HEK témoin, ne sécrétant pas de ESM-1 ; - Forme sauvage de ESM-1 : HEK ESM/WT ; - Forme déglycosylée de ESM-1 : HEK ESM/S137A ; - Formes glycosylées dont la partie protéique est mutée au niveau de la région 115-116 ; HEK-ESM/69, HEK-ESM/71, HEK ESM/73. A2. Modèle murin de tumeurs xénoqéniques Les souris utilisées sont de type SCID (Severe Combined IMMUNO Deficience). Il s'agit plus précisément de souris C. B. 17 Scid/scid fournies par l'animalerie de l'Institut Pasteur de Lille. Ces souris présentent une mutation autosomal récessive au niveau de leur système de recombinaison (Blunt., 1995). Cette mutation a pour conséquence la production d'immunoglobulines et de récepteurs de cellules T (TcR) et B 5BcR) non fonctionnels. De ce fait, elles ne possèdent pas de lymphocytes T et B fonctionnels ; ces souris tolèrent donc le non-soi et représentent un modèle de choix pour le développement de tumeurs xénogéniques. Les souris SCID utilisées sont des souris mâles et jeunes puisque âgées de 3 à 5 semaines. Pour chacune d'entre-elles, une injection intra-péritonéale d'anticorps anti-ascialo GM-1 (100 Zug par souris dilué dans 200 pt de RPMI) est réalisée 24 heures avant l'injection des différentes lignées cellulaires. Il s'agit d'anticorps polyclonaux de lapin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd) dirigés spécifiquement contre l'antigène asialo GM-1 exprimé par les cellules NK. Des travaux ont montré que l'utilisation de ces anticorps dans des modèles murins permet de neutraliser l'effet cytotoxique de cellules NK et de favoriser la greffe tumorale (Mather G et al. (1994). Quatre lots de souris (10 à 15 souris par groupe) anesthésiées à l'éther, sont ensuite injectés, par voie sous-cutanée au niveau du dos. Chaque souris reçoit 1 million de cellules diluées dans 200 pl de RPMI. L'injection de ces cellules définit le premier jour de l'expérience (Jo). Pour chaque souris, une surveillance macroscopique du point d'injection à la recherche de l'apparition d'une éventuelle tumeur ainsi qu'une mesure du poids corporel sont réalisées de façon hebdomadaire. A partir de la 5ème semaine, les souris sont saignées (environ 500 ut par souris), une fois par semaine, afin de doser les taux sériques de ESM-1 par un test ELISA (BECHARD D et aL, 2000). Pour chaque souris, un examen anatomopathologique est réalisé. B. RESULTATS B. l. 1nduction de tumeurs chez la souris par la protéine ESM-1 givcosvlée. Des cellules HEK ont été transfectées par un vecteur possédant un insert contenant l'ADNc codant pour la protéine ESM-1 sauvage glycosylée, désignée ESMIWT. Les cellules HEK sont injectées par voie sous-cutanée à des souris SCID âgées de 5 semaines. Chaque souris reçoit préalablement une injection d'anticorps anti-asialo GN-1 par voie intrapéritonéale. On a analysé le pourcentage de tumeurs ayant un volume supérieur à 1 cm3 observé chez les souris à la huitième semaine suivant l'injection des cellules HEK transfectées. Les résultats sont représentés sur la figure 7. A la figure 7A, on observe que l'injection de cellules HEK témoins n'induit pas l'apparition de tumeurs chez la souris. En revanche, les cellules HEK transfectées avec un ADN codant pour la protéine ESM-1 glycosylée induisent de nombreuses tumeurs macroscopiquement visibles, dont approximativement 95% d'entre elles ont un volume tumoral supérieur à 1 3 cm. La figure 7B illustre la cinétique d'apparition des tumeurs chez des souris qui ont reçu les cellules HEK transfectées avec un ADN codant pour la protéine ESM-1 glycosylée. On peut observer que le volume tumoral moyen, exprimé en cm3, croît continuellement dès la quatrième semaine suivant l'injection des cellules HEK transfectées. Les résultats expérimentaux présentés à la figure 7 démontrent clairement que la protéine ESM-1 glycosylée a une activité pro-tumorale. On a également mesuré les taux sériques de protéine ESM-1 chez des souris ayant reçu les cellules HEK témoins et chez les souris ayant reçu les cellules HEK transfectées par l'ADNc codant pour la protéine ESM- 1. Les résultats sont représentés sur la figure 8. Les résultats illustrés à la figure 8A montrent que la protéine ESM- 1 n'est pas retrouvée dans les sérums des souris ayant reçu les cellules HEK témoins. Au contraire, un taux sérique de 40 à 50 nanogrammes par ml est retrouvé chez les souris ayant reçu les cellules HEK transfectées avec l'ADNc codant pour la protéine ESM-1 à la huitième semaine suivant l'injection des cellules. On a aussi analysé la cinétique des taux sériques de ESM-1 chez les souris ayant reçu la cellule HEK transfectée exprimant la protéine ESM- 1 glycosylée (ESM/WT). Les résultats sont représentés à la figure 8B. On peut observer qu'une quantité détectable de protéine ESM-1 est retrouvée dans le sérum des souris dès la cinquième semaine suivant l'injection des cellules et que le taux sérique s'accroît rapidement et continuellement de la cinquième à la douzième semaine suivant l'injection des cellules. Les résultats expérimentaux illustrés à la figure 8 montrent que les tumeurs qui se sont développées chez les souris ayant reçu les cellules HEK transfectées produisent la protéine ESM-1. De plus, la quantité de protéine ESM-1 produite dans la circulation suit la cinétique de développement des tumeurs chez les souris. EXEMPLE 6 : Activité pro-tumoriqène de différentes formes de la protéine ESM-1. A. MATERIELS ET METHODES Les matériels et méthodes utilisés dans cet exemple sont identiques à ceux décrits pour l'exemple X1. B. RESULTATS Les cellules HEK ont été transfectées respectivement par des vecteurs possédant un insert d'ADN codant respectivement pour la forme sauvage de ESM-1 (ESMNVT), une forme non glycosylée de ESM-1 (ESM/S137A) et une forme glycosylée de ESM-1 mutée au niveau des résidus phénylalanine en positions 134 et 135 qui ont été remplacés chacun par un résidu alanine (ESM/73). Les différentes cellules transfectées ont été injectées par voie sous-cutanée à des souris SCID âgées de 5 semaines et ayant préalablement reçues des anticorps anti- asialo GM-1. On a analysé le pourcentage de tumeurs macroscopiquement visible ayant un volume tumorale supérieur à 1 cm3 chez les différents lots de souris. Les résultats sont représentés à la figure 9A. Les résultats de la figure 9A montrent que seule la protéine ESM-1 glycosylée est capable d'induire des tumeurs chez la souris. Ni la protéine ESM-1 non glycosylée, ni la protéine ESM-1 glycosylée mais mutée sur les résidus phénylalanine en positions 134 et 135 ne sont capables d'induire le développement de tumeurs chez les souris SCID. On a également analysé le taux sérique de protéine ESM-1 circulante dans les différents lots de souris. Les résultats sont représentés à la figure 9B. Les résultats de la figure 9B montrent que des taux détectables de protéine ESM-1 sérique ne peuvent être mesurés, à la huitième semaine suivant l'injection des cellules, que chez les souris ayant reçu les cellules HEK exprimant la protéine ESM-1 glycosylée (ESM/WT). Ni les souris injectées avec des cellules exprimant la protéine ESM-1 non glycosylée (ESM/S137A), ni les souris ayant reçu les cellules HEK exprimant la protéine ESM-1 glycosylée et mutée HEK-ESM/F115A, F116A) ne produisent de protéine ESM-1. L'ensemble des résultats présentés dans cet exemple confirme le pouvoir pro-tumorigène de la protéine ESM-1 glycosylée. Les résultats montrent aussi que des formes non glycosylées de la protéine ESM-1 ou encore des formes mutées de la protéine ESM-1 peuvent se comporter comme des antagonistes de cette protéine et posséder un pouvoir préventif et/ou curatif à l'égard de pathologies cancéreuses. EXEMPLE 7 : Dosage de la protéine ESM-1 circulante chez des patients atteints de cancers bronchopulmonaires à différents stades de développement. A. Matériels et méthode. Le test d'immuno-détection consiste en un test immunoenzymatique du type sandwich dont les caractéristiques générales sont identiques à celui décrit par BECHARD et al. (2000). L'anticorps monoclonal anti-ESM-1 produit par la lignée d'hybridomes MEP14 (CNCM N I-1942) a été dilué à la concentration de 5ug/ml dans un tampon carbonate 0,1 M, pH 9,5, et adsorbé pendant une nuit à +4 C sur une plaque 96 puits (plaque E. I. A./RI. A., Costar, Cambridge, MA, USA). La plaque a été saturée pendant une heure à la température du laboratoire avec un volume de 200 ut/puits de tampon PBS contenant 0, 1% de sérum albumine bovine et 5mM de EDTA, puis lavée deux fois avec un tampon ELISA (le tampon PBS ci-dessus additionné de 0,1% de Tween 20). Un calibrage a été réalisé avec la protéine ESM-1 purifiée selon la technique décrite par BECHARD et al. (2000). Les échantillons de sang ont été dilués en série (1 : 2 à 1 : 128), dans un tampon ELISA et incubés sur une plaque ELISA pendant une heure à la température du laboratoire. Les puits ont été lavés trois fois avec un tampon ELISA puis incubés pendant 1 heure à la température du laboratoire avec un second anticorps monoclonal dirigé contre ESM-1, l'anticorps MEC15 (CNCM NOI- 2572) à la concentration de 0, 1ug/ml dans 100 ul de tampon par puits. Après trois lavages, on a ajouté un anticorps monoclonal de rat biotinylé dirigé contre les IgG1 de souris (commercialisé par PHARMINGEN) dilué dans un tampon ELISA et laissé incuber ce second anticorps pendant une heure. Après trois lavages dans le tampon ELISA, les puits ont été incubés avec un conjugué de streptavidine-peroxydase à la dilution 1 : 10. 000 v/v (commercialisé par la Société ZYMED). Après 30 minutes d'incubation avec le conjugué streptavidine- peroxydase, on réalise trois lavages de chaque puits dans un tampon ELISA puis deux lavages dans un tampon PBS. Le conjugué streptavidine-peroxydase est révélé avec le substrat TMB commercialisé par la Société SIGMA (Saint-Louis, MO, USA) en présence de 255 ! JI de H202 pendant 30'. La réaction de révélation est stoppée par l'addition d'un volume de 100 de H2S04 2N. La plaque est lue à l'aide d'un spectrophotomètre (anthos labtec LP40, France) à la longueur d'onde de 405 nanomètres. La concentration de la protéine ESM-1 plasmatique ou sérique est calculée à partir des mesures de densité optique et exprimée en nanogrammes par ml. B. RESULTATS On a mesuré la concentration de protéine ESM-1 circulante dans le sérum de différents patients porteurs d'un cancer broncho-pulmonaire à différents stades de développement, respectivement au stade 1, Il, IIIA, IIIB et IV selon la classification internationale TNM qui est définie ci-après : T = taille de la tumeur (T1 : 3 cm. N = nodule ganglionnaire (NO si non envahi ; N1 si envahi). M = métastase à distance (MO si pas de méastase ; M si métastase). Les patients atteints d'un cancer au stade 1 présentent une concentration sérique de protéine ESM-1 de 1, 43 +/-0, 76 nanogrammes/ml (n = 3). Les patients atteints d'un cancer bronchopulmonaire au stade Il présentent une concentration sérique de la protéine ESM-1 de 0, 72 +/-0, 39 nanogrammes/ml (n = 3). Les patients atteints d'un cancer bronchopulomonaire au stade Illa présentent une concentration de protéine ESM-1 circulante de 0, 9 +/- 0,53 nanogrammes/ml (n= 2). Les patients atteints d'un cancer bronchopulmonaire au stade IIIB présentent une concentration de protéine ESM-1 circulante de 3,1 +/-2, 17 nanogrammes/ml (n = 3). Les patients atteints d'un cancer bronchopulmonaire au stade IV présentent une concentration de protéine ESM-1 circulante de 3,1 +/-1, 91 nanogrammesd/ml (n = 11). Les résultats présentés ci-dessus montrent que le taux sérique de protéine ESM-1 augmente en fonction du stade d'évolution du cancer. Une relation claire est donc démontrée entre le niveau de production de la protéine ESM-1 dans la circulation sanguine et la sévérité d'un cancer chez un patient. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES : * ANFOSSI et al. (1989), Acad. Sei., vol. 86 : 3379-3383 # AUSUBEL F. et al. 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Cell Biol. vol. 121 : 145-154 REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un composé antagoniste de la protéine ESM-1 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement d'un cancer. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé antagoniste de la protéine ESM-1 consiste en un anticorps se liant spécifiquement à la protéine ESM-1. 3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le composé antagoniste du type anticorps se lie spécifiquement à l'un des déterminants antigéniques AgD1, AgD2 ou AgD3 de la protéine ESM-1. 4. Utilisation selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisée en ce que le composé antagoniste du type anticorps est choisi parmi les anticorps monoclonaux sécrétés par les lignées d'hybridome suivantes : - l'hybridome MEP21 déposé le 19 Novembre 1997 auprès de la Collection Nationale de Cultures des Micro-organismes de t'tnstitut Pasteur (CNCM) sous le n d'accès t-1944 ; - l'hybridome MEP14 déposé le 19 Novembre 1997 auprès de la CNCM sous le n d'accès n @-1942 ; - l'hybridome MEP19 déposé le 19 Novembre 1997 auprès de la CNCM sous le n d'accès n l-1943 ; - l'hybridome MEP08 déposé le 19 Novembre 1997 auprès de la CNCM sous le NO d'accès nO 1-1941. 5. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le composé antagoniste du type anticorps est l'anticorps produit par la lignée d'hybridome MEC15 déposée le 17 Octobre 2000 auprès de la CNCM sous le n d'accès n t-2572. 6. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé antagoniste de la protéine ESM-1 est un polypeptide ayant une longueur d'au moins 10 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID n 1 et comprenant la séquence d'acides aminés allant de l'acide aminé en position 119 jusqu'à l'acide aminé en position 139 de la séquence SEQ ID n 1 et comprenant au moins une substitution d'un acide aminé, par rapport à la séquence correspondante de la séquence SEQ ID ? 1. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que le composé antagoniste de la protéine ESM-1 comprend une ou plusieurs substitutions d'un acide aminé contenant un cycle aromatique retrouvé dans la séquence SEQ ID n 1 par un acide aminé ne contenant pas de cycle aromatique. 8. Utilisation selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce que le composé antagoniste de la protéine ESM-1 comprend, par rapport à la séquence SEQ ID N'l, une substitution des résidus phénylalanine en positions 134 et 135 de la séquence SEQ ID N 1 par deux résidus d'acides aminés, identiques ou différents, ne contenant pas de cycle aromatique. 9. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé antagoniste de la protéine ESM-1 consiste en un oligonucléotide antisens. 10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que le composé antagoniste de la protéine ESM-1 du type oligonucléotide antisens consiste en un polynucléotide comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs de l'ADNc de ESM-1 de séquence SEQ ID ? 2. 11. Composé antagoniste de la protéine ESM-1, caractérisé en ce qu'il consiste en l'anticorps monoclonal produit par la lignée d'hybridome MEC15 déposée auprès de la CNCM le 17 Octobre 2000 sous le no d'accès non-2572. 12. Procédé de sélection d'un composé antagoniste de la protéine ESM-1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) injecter à un animal des cellules capables de former des tumeurs en présence de la protéine ESM-1, lesdites cellules étant transfectées ou transformées par un acide nucléique capable d'exprimer la protéine ESM-1 in vivo ; b) administrer à cet animal un composé candidat antagoniste de la protéine ESM-1 ; c) comparer la formation de tumeurs chez un premier animal tel qu'obtenu à la fin de l'étape b) et chez un second animal tel qu'obtenu à la fin de l'étape a) ; d) sélectionner le composé candidat capable d'inhiber ou de bloquer la formation de tumeurs chez le premier animal et sacrifier l'animal. 13. Procédé de sélection d'un composé candidat antagoniste de la protéine ESM-1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) fournir un polypeptide consistant en la protéine ESM-1 ou un fragment peptidique de cette protéine ; b) mettre en contact ledit polypeptide avec le composé candidat à tester ; c) détecter les complexes formés entre ledit polypeptide et le composé candidat ; d) sélectionner les composés candidats se fixant sur le polypeptide constitué de la protéine ESM-1 ou d'un fragment de cette protéine. 14. Procédé de sélection d'un composé antagoniste de la protéine ESM-1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact la protéine ESM-1 ou un fragment peptidique de cette dernière en présence de : (i) un composé antagoniste de la protéine ESM-1 se fixant sur la protéine ESM-1 ; et (ii) un composé candidat à tester ; b) dans une étape séparée de l'étape a), mais éventuellement simultanée à cette dernière, mettre en contact la protéine ESM-1 ou un fragment peptidique de cette dernière avec un composé antagoniste de la protéine ESM-1 se fixant sur la protéine ESM-1 ; c) détecter la quantité respective du composé antagoniste de la protéine ESM-1 fixée à l'issue de chacune des étapes a) et b) ; et d) sélectionner le composé candidat qui entre en compétition avec le composé antagoniste pour la fixation sur la protéine ESM-1. 15. Procédé pour sélectionner un composé antagoniste de la protéine ESM-1 à partir d'un composé candidat, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) sélectionner, parmi les composés candidats, les composés qui se fixent sur la protéine ESM-1 ou sur un fragment peptidique de cette protéine ; b) administrer un composé sélectionné à l'étape a) à un animal et déterminer la capacité de ce composé à inhiber, chez cet animal, le développement de tumeurs induites par la protéine ESM-1 ; c) sélectionner les composés inhibiteurs du développement des tumeurs déterminés à l'étape b) comme des composés antagonistes de la protéine ESM-1. ; et sacrifier l'animal. 16. Composition pharmaceutique pour le traitement et/ou la prévention d'un cancer comprenant un composé antagoniste de la protéine ESM-1. 17. Composition pharmaceutique selon la revendication 16, caractérisée en ce que le composé antagoniste de la protéine ESM-1 est un anticorps se liant spécifiquement à la protéine ESM-1. 18. Composition pharmaceutique selon la revendication 17, caractérisée en ce que le composé antagoniste de la protéine ESM-1 est l'anticorps produit par la lignée d'hybridome MEP08 déposée auprès de la CNCM le 19 Novembre 1997 sous le no d'accès 1-1941 ou l'anticorps produit par la lignée d'hybridome MEC15 déposée auprès de la CNCM le 17 Octobre 2000 sous le ? d'accès 1-2572. 19. Composition pharmaceutique selon la revendication 16, caractérisée en ce que le composé antagoniste de la protéine ESM-1 est un polypeptide comprenant au moins 10 acides aminés consécutifs de la protéine ESM-1 de séquence SEQ ID Nol, comprenant une séquence d'acides aminés allant de l'acide aminé en position 119 jusqu'à l'acide aminé en position 139 de la séquence SEQ ID N 1 et comprenant au moins, par rapport à la séquence SEQ ID ? 1, une substitution d'un acide aminé. 20. Composition pharmaceutique selon la revendication 16, caractérisée en ce que le composé antagoniste de la protéine ESM-1 consiste en un polynucléotide antisens.