Brevet FR2817260A1 — publié le 20020531

PEPTIDES AYANT DES PROPRIÉTÉS ANTIINFLAMMATOIRES, LEURS UTILISATIONS ET LES COMPOSITIONS LES CONTENANT. La présente invention a pour objet de nouveaux peptides ayant des propriétés anti-inflammatoires. L'invention concerne également une composition, notamment pharmaceutique et en particulier vaccinale contenant au moins un desdits peptides utile pour la prévention ou le traitement des désordres inflammatoires et immunitaires. On a décrit, dans l'art antérieur, différentes substances présentant des propriétés anti-inflammatoires pour le traitement des désordres inflammatoires et immunitaires. Les traitements les plus traditionnels incluent des drogues anti-inflammatoires non stéroïdiennes. Les drogues anti-inflammatoires récemment développées sont basées sur des inhibiteurs de métalloproteinase (Metalloproteinase inhibitors : new opportunities for the rheumatoid arthritis and osteoarthritis, Shaw T., Nixon JS, Bottomley KM, Expert Opin Investig Drugs 2000 Jul ; 9 (7) : 1469-1478 ; Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibitors of atherossclerosis, George SJ, Expert Opin Investig Drugs 2000 May ; 9 (5) : 993-1007), ou sur des cytokines (WO 9928965 ; WO 9722289, IL-1 inhibitors : novels agents in the traitement of rheumatoid arthritis, Gabay C., Expert Opin Investig Drugs 2000 Jan ; 9 (1) : 113-27 ; Bocci V., Interleukins. Clinical pharmacokinetics and pratical applications, Clin Pharmacokinet. 1991,274-284 ; Feldmann M., Elliott J. N., Woody and R. N. Maini, Anti-tumor necrosis factor-alpha therapy of rheumatoid arthritis, Adv. Immunol. 64 1997, 283-350). Les désordres inflammatoires et immunitaires sont observés dans de nombreuses pathologies, comme l'arthrite, l'athérosclérose, l'asthme allergique, les inflammations chroniques du tractus digestif (maladie de Crohn, colite ulcéreuse) et le diabète. En santé humaine, on peut rappeler que l'incidence de ces pathologies à caractère chronique a connu une nette progression au cours des dernières années. L'inflammation peut être causée par des agents inflammatoires nombreux et variés comme par exemple les bactéries, les virus et les antigènes environnementaux (pollen, poussières). La réponse inflammatoire devient chronique quand l'antigène est en quantité non limitante et persiste provoquant ainsi la destruction du tissu. Il existe donc un réel besoin de caractériser et de développer de nouvelles classes de substances antiinflammatoires. On connaît de longue date que les insectes ont développé un système de défense efficace contre les microorganismes. Cette réponse immunitaire s'appuie pour une large part sur la synthèse rapide et transitoire de plusieurs familles de peptides antimicrobiens à large spectre d'activité (Bulet et al., 1999, Dev. Comp. Immunol. 23,329-344). La Demanderesse a développé un savoir-faire et dispose de compétences en matière de purification et de caractérisation de substances produites chez les insectes. Parmi les techniques utilisées, la spectrométrie de masse MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation-Time Of Flight) permet d'établir des cartes différentielles précises du contenu peptidique de l'hémolymphe de diptère Drosophila melanogaster immunisé versus non immunisé (Uttenweiler-Joseph S. et al., 1998, Differential display of peptides during the immune system of Drosophila : a matrix assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spestrometry study, Proc. Natl. Acad. Sei. Vol. 95 p. 11342-11347). La mise en oeuvre de cette technique à permis de caractériser des peptides dont certains correspondent à des molécules antimicrobiennes déjà connues, telles que la drosocine, la drosomycine, la metchnikowine, la défensine, la diptéricine et la cécropine (Bulet P., 1999, Les peptides antimicrobiens de la drosophile, Médecine/Sciences n l, Vol. 15,23-29). La Demanderesse a maintenant isolé, purifié et caractérisé de nouvelles séquences peptidiques qui ne présentent aucune homologie avec des peptides ou fragments de peptides déjà décrits. Par homologie, on entend selon l'invention, un degré d'homologie d'au moins 80% par rapport à la séquence de référence, éventuellement supérieure à 90% et jusqu'à plus de 95%. La présente invention a donc pour objet une nouvelle classe de peptides qui seront aussi désignés ciaprès DIMs pour Drosophila Immune-induced Molecules . Les travaux réalisés par la Demanderesse sur les DIMS, lui ont permis de montrer que de manière inattendue, ils ne présentaient pas d'activité antimicrobienne comme l'ensemble des peptides d'insectes isolés jusqu'à présent, mais des propriétés antiinflammatoires. En effet, les peptides de l'invention présentent des propriétés d'inhibition de l'adhésion cellulaire et/ou de la transmigration des leucocytes vers le site d'inflammation, en particulièrement des propriétés d'inhibition de l'expression de molécules d'adhésion cellulaire impliquées dans les désordres inflammatoires et immunitaires, et plus particulièrement des propriétés d'inhibition de l'expression de ICAM-1. La réponse inflammatoire primaire est essentiellement caractérisée par la migration des leucocytes polynucléaires notamment des neutrophiles vers les sites d'inflammation en réponse à des facteurs chemotactiques. Cette migration se déroule en 3 étapes impliquant le glissement des leucocytes le long de l'épithélium endothélial, l'adhésion des leucocytes à l'épithélium endothélial et le passage des leucocytes à travers l'épithélium endothélial vers le tissu inflammé. Chacune des 3 étapes fait intervenir une classe de molécules d'adhésion cellulaires spécifique (Endothelial adhesion molecules in health and disease, Cotran RS, Mayadas-Norton T., pathol Biol, 1998 Mar ; 46 (3) : 164-70). Ainsi, l'étape de glissement est médiée par des sélectines exprimées à la surface des cellules endothéliales et des leucocytes et reconnaissant les carbohydrates sur les autres types cellulaires et les étapes d'adhésion et de transmigration sont médiées par la liaison entre des intégrines exprimées à la surface des leucocytes et des plaquettes sanguines et des membres de la superfamille des immunoglobulines, en particulier des ICAM-1 (exprimés à la surface à la fois des cellules endothéliales et des leucocytes). La molécule d'adhésion intercellulaire ICAM-1 exprimée à la surface des cellules endothéliales joue donc un rôle clé dans la réponse inflammatoire à 2 niveaux : dans un premier temps, son interaction avec une intégrine ss2 exprimée à la surface des leucocytes (Mac-1 pour les neutrophiles, LFA-1 pour les lymphocytes T) va permettre l'adhésion cellule endothéliale-leucocyte et dans un second temps, la transmigration des leucocytes à travers l'endothélium vasculaire vers le site d'inflammation (Inflammatory and immune responses are impaired in mice deficient in intracellular adhesion molecule 1, James E. & al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 90,829-8533). Le rôle prédominant que joue ICAM-1 dans la médiation de l'inflammation a été démontré par de nombreuses expériences de knock-out sur des souris (Reduced susceptibility to collagen-induced arthritis in mice deficient in intercellular adhesion molecule-l, Bullard DC & al., J Immunol 1996 oct 1 ; 157 (7) : 3153-8 ; Deficiency of inflammatory cell adhesion molecules protects against atherosclerosis in mice, Nageh & al. Arterioscler Thromb Vase Biol 1997 aug ; 17 (8) : 1517-20 ; Inflammatory and immune responses are impaired in mice deficient in intracellular adhesion molecule 1, James E. & al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 90,829-8533 ; Endothelial adhesion molecules in health and disease, Cotran RS, Mayadas-Norton T., Pathol Biol, 1998 Mar ; 46 (3) : 164-70). Invariablement, les souris mutantes ICAM-1''présentent une réduction significative de la réaction inflammatoire en comparaison des souris sauvages contrôles. La présente invention a donc pour objet un peptide de formule générale (I) : ll (D2P3 (1) 4 () 5P 60708P9010 (1) 110 1 2 (b 13 0 14 015 () 16 017 (1) 18CY1 9 (52 0 2 1 P2 2 (y2 3 (i) ou un fragment de celui-ci, dans laquelle : ou un fragment de celui-ci, dans laquelle : (D, 0, (y représentent des résidus d'acide aminé, - l'acide aminé LI est choisi dans le groupe comprenant l'acide glutamique, la glutamine et l'acide pyroglutamique, - les acides aminés ss3, ss6, ss9, ss22, identiques ou différents, sont choisis parmi les acides aminés basiques, - les acides aminés les acides aminés chargés négativement ou les acides aminés polaires petits ou les acides aminés polaires larges ou la glycine, l'alanine, la proline, - les acides aminés 619, 620, 623, identiques ou différents, sont choisis parmi l'alanine, la glycine, l'isoleucine, la phénylalanine, la sérine, la tyrosine ou la valine. Par convention, dans la formule (I) ci-dessus, LI représente l'acide aminé N-terminal et 023 représente l'acide aminé C-terminal Parmi les fragments des peptides de formule (I), l'invention envisage plus particulièrement, ceux constitués d'au moins 17 acides aminés successifs et de préférence 23 acides aminés successifs de ladite séquence. A titre d'exemples préférés de tels fragments, on peut citer ceux dont 2 à 6 acides aminés successifs sont supprimés à l'extrémité C-terminale. Ces fragments correspondent à des peptides dont l'acide aminé C-terminal est Cig1 ' ? i9, O20 921 ss22-L'invention envisage plus particulièrement un peptide répondant à l'une des formules générales suivantes : 2486878ss9810118121361466, 7 (II) 2465ss676ss961116113614666, (III) 246667688101161136146156166170190621 (IV) 11 (1) 23 (e4o5P6o7o8P96lO (1) 11012 (1) 13014015016017 (Dl8 (i i i) 111023 (1) 405P60708P9010 (1) 11012 (1) 13014015016017 (l) l8al9cy2Oo2l (IV) Selon la présente invention, on entend plus particulièrement par, - acides aminés basiques, les acides aminés choisis parmi l'arginine, l'histidine ou la lysine, - acides aminés hydrophobes, les acides aminés choisis parmi l'isoleucine, la leucine, la phénylalanine, le tryptophane, la tyrosine ou la valine, acides aminés chargés négativement, les acides aminés choisis parmi l'acide aspartique ou l'acide glutamique, - acides aminés polaires petits, les acides aminés choisis parmi la sérine ou la thréonine, acides aminés polaires larges, les acides aminés choisis parmi l'asparagine ou la glutamine. Des peptides préférés selon l'invention, plus particulièrement de formules (I), (II), (III) ou (IV), sont ceux dans lesquels l'un au moins des acides aminés , 6, 97, 08, 012, 13' 615. is8 - (Y,, est l'alanine, l'isoleucine ou la valine, - G23 est la phénylalanine, la glycine ou la sérine. Dans les séquences rapportées ci-après, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre, mais ils peuvent être aussi représentés par leur code à trois lettres selon la nomenclature ci-dessous, A Ala alanine C Cys cystéine D Asp acide aspartique E Glu acide glutamique F Phe phénylalanine G Gly glycine H His histidine 1 Ile isoleucine K Lys lysine L Leu leucine M Met methionine N Asn asparagine P Pro proline Q Gln glutamine R Arg arginine S Ser sérine T Thr thréonine V Val valine W Trp tryptophane y Tyr tyrosine Z pGlu acide pyrogtutamique Un groupe préféré de peptide selon l'invention est défini par les peptides de séquence suivante : - DIM-13 dont la séquence en acides aminés représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID NO : 1 est la suivante : ZFHVERPDRTVDFGNGGFSAQRF - DIM-12 dont la séquence en acides aminés représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID NO : 2 est la suivante : Z F H V E R P G R T V D V G N G G F Y I Q R G - DIM-10 dont la séquence en acides aminés représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID NO : 3 est la suivante : Z L H V A R P D R T V T I G N G G V Y I Q R S - DIM-8 dont la séquence en acides aminés représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID NO : 4 est la suivante : ZFHVERPDRTVDFGNGGFSAQ - DIM-6 dont la séquence en acides aminés représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID NO : 5 est la suivante : ZFHVERPGRTVDVGNGGF - DIM-5 dont la séquence en acides aminés représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID NO : 6 est la suivante : ZFHVERPDRTVDFGNGG L'invention concerne également des dérivés des peptides de formule (I) ou des fragments de ceux-ci comme les peptides de formules (II), (III) et (IV). De tels dérivés sont ceux dans lesquels les séquences ci-dessus comprennent des délétions, des additions et/ou des modifications au niveau d'un ou plusieurs acides aminés, dès lors que ces délétions, additions et/ou modifications ne modifient pas l'activité anti-inflammatoire du peptide dont elles sont issues. Ces dérivés peuvent alors être considérés comme des équivalents fonctionnels des peptides de l'invention. A titre de dérivés des peptides de l'invention, on peut citer ceux dans lesquels l'acide aminé LI est lié à un groupement protecteur, un groupe acyle, un groupe acétyle ou un groupe méthyle étant entendu que ledit acide aminé Il n'est pas alors l'acide pyroglutamique. Ainsi, ce résidu Il N-terminal peut présenter une modification posttraductionnelle et/ou modification chimique en particulier une acylation, une acétylation ou une méthylation ou porter un groupement protecteur. On entend par groupement protecteur, tout groupement permettant d'éviter la dégradation desdits peptides, en particulier le tert-butyl ester pour LI correspondant à l'acide aspartique et en particulier le trityl pour LI correspondant à l'asparagine. De même le résidu C-terminal peut présenter une modification chimique en particulier une amidation. Comme il est indiqué ci-dessus, l'invention envisage plus particulièrement les fragments des peptides de formules (I) dont les acides aminés O1, C1g, Les équivalents fonctionnels des peptides de l'invention sont aussi lesdits peptides dont un ou plusieurs acides aminés sont des énantiomères, des diastéréoisomères, des acides aminés naturels de conformation D, des acides aminés rares notamment l'hydroxyproline, l'hydroxylysine, la méthylysine, la diméthylysine et de préférence l'acide pyroglutamique, positionnée en particulier au niveau du résidu Ei Nterminale desdits peptides et les acides aminés synthétiques notamment l'ornithine, la norleucine, la cyclohexyl-alanine et les oméga-acides aminés. L'invention couvre également les rétropeptides et les rétro-inversopeptides, de même que les peptides dont la chaîne latérale d'un ou plusieurs des acides aminés est substituée par des groupements qui ne modifient pas l'activité anti-inflammatoire des peptides de l'invention. L'invention concerne aussi des polypeptides constitué par ou comprenant un peptide le formule (I) ou un fragment de celui-ci. Ainsi, l'invention envisage un peptide de formule (I), ou un fragment de celui-ci notamment de formules (II), (III) ou (IV), comprenant à l'une et/ou l'autre de ses extrémités, un résidu peptidique nécessaire, par exemple à son expression et/ou au ciblage dans un organisme hôte. Par organisme hôte, on entend tout organisme comprenant au moins une cellule, qu'il s'agisse de microorganismes en particulier une levure ou une bactérie, ou encore d'une cellule de Mammifère. Les DIMs objet de la présente invention sont remarquables en ce qu'ils présentent des propriétés anti- inflammatoires et peuvent donc à ce titre être utilisés dans des méthode de traitement ou de prévention tant chez l'homme que l'animal contre les désordres inflammatoires et/ou immunitaires. La présente invention concerne donc également une composition, de préférence pharmaceutique et plus particulièrement vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d'agent actif au moins un peptide tel que défini précédemment, avantageusement associé dans ladite composition à un véhicule acceptable. Le véhicule acceptable a pour première qualité de ne pas dégrader de manière substantielle le ou les peptides dans ladite composition et de ne pas diminuer les propriétés anti-inflammatoires. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un peptide pour la préparation d'une composition pour la prévention ou le traitement des troubles inflammatoires et/ou immunitaires chez l'homme ou l'animal. On entend par troubles inflammatoires et/ou immunitaires les désordres inflammatoires et immunitaires observés dans de nombreuses pathologies, comme l'arthrite, l'athérosclérose, l'asthme allergique, les inflammations chroniques du tractus digestif (maladie de Crohn, colite ulcéreuse) et le diabète. L'inflammation peut être causée par des agents inflammatoires nombreux et variés comme par exemple les bactéries, les virus et les antigènes environnementaux (pollen, poussières). La réponse inflammatoire devient chronique quand l'antigène est en quantité non limitante et persiste provoquant ainsi la destruction du tissu. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant la préparation des peptides DIM-13, DIM-12, DIM- 10, DIM-8, DIM-6 et DIM-5 et leur activité antiinflammatoire. Exemple 1 : Isolement des DIM-13, DIM-12, DIM- 10, DIM-8, DIM-6, et DIM-5 à partir du corps entier ou de l'hémolymphe prélevée chez les larves ou les adultes immunisés du diptère Drosophila melanogaster. 1) Induction de la synthèse biologique des DIM-13, DIM-12, DIM-10, DIM-8, DIM-6, et DIM-5 dans l'hémolymphe de Drosophila melanogaster. Les larves (3ème stade de développement) ou les adultes (mâles et/ou femelles) du diptère Drosophila melanogaster ont été immunisées à l'aide d'une injection de 4,6 nl d'une suspension d'un mélange de cellules de Micrococcus luteus (Gram-positif) et de cellules d'Escherichia coli 1106 (Gram-négatif) préparées à partir de cultures réalisées en milieu de Luria-Bertani durant 12 heures à 37OC. L'immunisation peut être réalisée également à partir d'une simple piqûre à l'aide d'une aiguille adaptée pré trempée dans un culot de ces mêmes bactéries. Les animaux ainsi infectés ont été conservés pendant 24 heures dans une chambre maintenue à 25OC. 2) Préparation de l'hémolymphe et extraction desdits peptides. L'hémolymphe (0, 1 pl par drosophile) est prélevée à l'aide d'un nanoinjecteur, et transférée dans une solution d'acide trifluoroacétique à 0,1% (TFA 0,1%). Un échantillon préparé à partir d'une même quantité d'hémolymphe ou d'un même nombre d'animaux n'ayant subis aucune stimulation de leur réponse immunitaire (échantillon dit contrôle) est traité en parallèle afin de mener une étude différentielle (Uttenweiler-Joseph et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 95 p. 11342-11347) 3) Purification des peptides par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) sur colonne de phase inverse. - Première étape : La première étape de purification est commune à l'ensemble des DIMs-13, DIM-12, DIM-10, DIM-8, DIM-6 et DIM-5. Un échantillon correspondant à 180 drosophiles a été analysé par chromatographie sur une colonne microbore de phase inverse (Aquapore RP-300 C8, Brownlee, 100 x 1 mm, 300 ) protégée par un filtre (Ultra-Low Dead-Volume Precolumm Filter, Upchurch Scientific). L'élution a été réalisée par un gradient linéaire d'acétonitrile de 2 à 80% dans le TFA 0,05% pendant 80 minutes à un débit constant de 80 pl/min. Les fractions ont été collectées manuellement dans des tubes Eppendorf à faible adsorption protéique (Low-Binding Eppendorf, Poly Labo), en suivant la variation de l'absorbance à 214 nm. Les fractions recueillies ont été asséchées sous vide ou dans un bloc chauffant à 30 oC, reconstituées avec de l'eau ultra pure et analysées par spectrométrie de masse MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Light). Les étapes de purification suivantes diffèrent selon le DIM considéré. a) Purification de DIM-13. - Seconde et ultime étape de purification : la seconde étape de purification du DIM-13 est réalisée par chromatographie sur une colonne microbore de phase inverse (Aquapore RP-300 C8, Brownlee, 100 x 1 mm, 300 À) protégée par un filtre (Ultra-Low Dead-Volume Precolumm Filter, Upchurch Scientific). L'élution a été réalisée par un gradient linéaire biphasique d'acétonitrile de 2 à 22% dans le TFA 0,05% pendant 10 minutes et de 22% à 37% d'acétonitrile pendant 50 min à un débit constant de 80 pL/min à 35OC. Les fractions ont été collectées manuellement dans des tubes Eppendorf à faible adsorption protéique (Low-Binding Eppendorf, Poly Labo), en suivant la variation de l'absorbance à 214 nm. b) Purification de DIM-12. - Seconde et ultime étape de purification : la seconde étape de purification du DIM-12 est réalisée par chromatographie de phase inverse sur une colonne microbore de phase inverse (Aquapore RP-300 C8, Brownlee, 100 x 1 mm, 300 ) protégée par un filtre (Ultra-Low Dead-Volume Precolumm Filter, Upchurch Scientific). L'élution a été réalisée par un gradient linéaire biphasique d'acétonitrile de 2 à 18% dans le TFA 0,05% pendant 10 minutes et de 18% à 28% d'acétonitrile pendant 50 min à un débit constant de 80 ul/min à 35OC. Les fractions ont été collectées manuellement dans des tubes Eppendorf à faible adsorption protéique (Low-Binding Eppendorf, Poly Labo), en suivant la variation de l'absorbance à 214 nm. c) Purification de DIM-10. - Seconde étape de purification : la seconde étape de purification du DIM-10 est réalisée par chromatographie sur une colonne microbore de phase inverse (Aquapore RP-300 C8, Brownlee, 100 x 1 mm, 300 ) protégée par un filtre (Ultra-Low Dead-Volume Precolumm Filter, Upchurch Scientific). L'élution a été réalisée par un gradient linéaire biphasique d'acétonitrile de 2 à 17% dans le TFA 0,05% pendant 10 minutes et de 17% à 27% d'acétonitrile pendant 50 min à un débit constant de 80 uL/min à 35OC. Les fractions ont été collectées manuellement dans des tubes Eppendorf à faible adsorption protéique (Low-Binding Eppendorf, Poly Labo), en suivant la variation de l'absorbance à 214 nm. - Troisième et ultime étape de purification : cette dernière étape est réalisée dans les mêmes conditions que l'étape de purification précédemment décrite. Les fractions ont été collectées comme précédemment et la présence et pureté du peptide DIM-10 vérifiée par spectrométrie de masse MALDI. Après cette troisième étape de purification, le peptide étant pure, sa caractérisation structurale a été réalisée après traitement enzymatique à la pyroglutamate aminopeptidase et séquençage par la dégradation d'Edman. d) Purification de DIM-8. - Seconde et ultime étape de purification : la seconde étape de purification du DIM-8 est réalisée par chromatographie de phase inverse sur une colonne microbore de phase inverse (Aquapore RP-300 C8, Brownlee, 100 x 1 mm, 300 ) protégée par un filtre (Ultra-Low Dead-Volume Precolumm Filter, Upchurch Scientific). L'élution a été réalisée par un gradient linéaire biphasique d'acétonitrile de 2 à 18% dans le TFA 0,05% pendant 10 minutes et de 18% à 28% d'acétonitrile pendant 50 min à un débit constant de 80 ul/min à 35OC. Les fractions ont été collectées manuellement dans des tubes Eppendorf à faible adsorption protéique (Low-Binding Eppendorf, Poly Labo), en suivant la variation de l'absorbance à 214 nm. e) Purification de DIM-6. - Seconde étape de purification : la seconde étape de purification du DIM-6 est réalisée par chromatographie sur une colonne microbore de phase inverse (Aquapore RP-300 C8, Brownlee, 100 x 1 mm, 300 À) protégée par un filtre (Ultra-Low Dead-Volume Precolumm Filter, Upchurch Scientific). L'élution a été réalisée par un gradient linéaire biphasique d'acétonitrile de 2 à 17% dans le TFA 0,05% pendant 10 minutes et de 17% à 27% d'acétonitrile pendant 50 min à un débit constant de 80 pL/min à 35OC. Les fractions ont été collectées manuellement dans des tubes Eppendorf à faible adsorption protéique (Low-Binding Eppendorf, Poly Labo), en suivant la variation de l'absorbance à 214 nm. - Troisième et ultime étape de purification : cette dernière étape est réalisée dans les mêmes conditions que l'étape de purification précédemment décrite. Les fractions ont été collectées manuellement dans des tubes Eppendorf à faible adsorpion protéique (Low-Binding Eppendorf, Poly Labo). f) Purification de DIM-5. - Seconde et ultime étape de purification : la seconde étape de purification du DIM-5 est réalisée par chromatographie de phase inverse sur une colonne microbore (Aquapore RP-300 C8, Brownlee, 100 x 1 mm, 300 À) protégée par un filtre (Ultra-Low Dead-Volume Precolumm Filter, Upchurch Scientific). L'élution a été réalisée par un gradient linéaire biphasique d'acétonitrile de 2 à 13% dans le TFA 0,05% pendant 10 minutes et de 13% à 23% d'acétonitrile en 50 min à un débit constant de 80 uL/min à 35OC. Les fractions ont été collectées manuellement dans des tubes Eppendorf à faible adsorption protéique (LowBinding Eppendorf, Poly Labo), en suivant la variation de l'absorbance à 214 nm. Exemple 2 : Caractérisation structurale de DIM-13. 1) Vérification de la pureté de DIM-13 par spectrométrie de masse MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation-Time Of Flight). Cette étude a été réalisée sur un spectromètre de masse Bruker (Bremen, Allemagne) BIFLEX III équipé d'une optique haute résolution SCOUT et d'un réflectron. Cet instrument a un potentiel maximum d'accélération de 20kV et peut être utilisé soit en mode linéaire soit en mode réflectron. L'ionisation est réalisée avec un faisceau à 337 nm émis par un laser à azote à une fréquence de 3Hz. Les spectres de masse ont été calibrés de façon externe avec un mélange standard de peptides antimicrobiens de drosophile de masse moléculaire connue, respectivement la drosocine-2199,5 Da, la metchnikowine-3046,4 Da et la drosomycine-4890,5 Da (Bulet P., 1999, Les peptides antimicrobiens de la drosophile, Médecine/Sciences n l, Vol. 15,23-29). Les échantillons à analyser par spectrométrie de masse MALDI-TOF sont préparés par la technique du sandwich exposée comme suit pour le repérage du peptide DIM-13. Les différents produits à analyser (0, 5 pi) ont été déposés sur une fine couche de cristaux d'acide a-cyano-4- hydroxycinnamique (4-HCCA, Sigma) obtenue par une évaporation rapide d'une solution saturée dans l'acétone puis recouvert de 0, 5 pl de seconde matrice, 4-HCCA à saturation dans une solution d'acétonitrile à 50% dans de l'eau. Après séchage sous un léger vide, les échantillons ont été lavés par 1,5 pl de TFA 0,1% avant d'être séchés à nouveau et introduits dans le spectromètre de masse. 2) Séquençage par dégradation d'Edman. Le séquençage automatique par dégradation d'Edman du peptide DIM-13 natif ou des fragments de protéolyse et la détection des dérivés phénylthiohydantoines ont été réalisés sur un séquenceur ABI473A (PEApplied Biosystems division de Perkin Helmer). 3) Séquençage par spectrométrie de masse en tandem par nano-électronébulisation (NanoES-MSn). a) Préparation de DIM-13. Le peptide DIM-13 est solubilisé dans une solution acide et afin d'éliminer le TFA, la solution peptidique est filtrée sur un filtre de phase inverse de type Zip-Tip C18 (MilliporeTM) et concentrée à 20 J. l dans une solution d'eau acétonitrile à 50% acidifiée avec 1% d'acide formique. Toutes les analyses par spectrométrie de masse en tandem sont réalisées avec 2 J. l de DIM-13 concentré et la solution est déposée dans un capillaire de nanonébulisation préalablement rincé. b) Instrumentation. Le séquençage est réalisé sur un spectromètre de masse de type trappe ionique ESQUIRE-LC (Bruker-Franzen Analytik GmbH, Germany) équipé avec une source de type nanonébulisation. Le capillaire recouvert d'or/paladium provient de Protana (Odense, Denmark). Le capillaire ainsi que la contre électrode se trouvent respectivement à 750 et 250 V. Le voltage appliqué à la sortie du capillaire de verre métallisé se trouve à 80 V. La calibration est réalisée avec les 5 peptides suivants : Leu-enképhaline, angiotensine, substance-P, bombésine, et ACTH, avec les masses moléculaires monoisotopiques exprimées en m/z (MH+) suivantes 712,38, 1046,54, 1347,74, 1620,81, et 2465,20. 4) Clivages protéolytiques. a) Digestion à la carboxypeptidase-P pour déterminer et confirmer la séquence de la région Cterminale de DIM-13. Trois gnoles de DIM-13, solubilisées dans du tampon carbonate d'ammonium à 25 mM à pH 8, sont traitées à la carboxypeptidase-P (Boehringer, Mannheim) au ratio enzyme substrat de 1 : 20 (poids/poids). Des fractions aliquotes de 0, 5 gl sont déposées sur la cible MALDI-TOF après 30 s, 2 min, 5 min et 10 min d'incubation à 37OC. Après 10 minutes, une quantité équivalente d'enzyme est ajoutée au milieu réactionnel et une analyse cinétique identique est réalisée. Le séquençage de la région Cterminale par la carboxypeptidase-P est suivi par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Les échantillons sont analysés sur l'équipement précédemment décrit (voir exemple 2-1) et les échantillons sont préparés en utilisant la technique de couche mince selon l'énoncé qui suit : 0, 5 J. l d'acide a-cyano-4-hydroxycinnamique (4-HCCA) à 7 g/l dans l'acétone, est déposé sur la cible MALDI-TOF, 0, 5 jell de TFA à 1% est ajouté à ce lit de matrice cristallisée et 0, 5 J. l de milieu de digestion est ajouté après les différents temps d'incubation. Après séchage sous un vide léger, les sels du milieu réactionnel sont éliminés par lavage (2 pi) avec du TFA à 1%, le tout est séché sous un vide léger et analysé par spectrométrie de masse MALDI-TOF. L'instrumentation est identique à celle précédemment décrite (voir exemple 2-2) et la calibration est réalisée avec les cinq peptides suivants : Leuenképhaline, angiotensine, substance-P, bombésine et l'ACTH, avec des MH+ respectifs (moyenne et monoisotopique) de : 712,82/712, 38 ; 1047, 20/1046, 54 ; 1348,66/1347, 74 ; 1621,86/1620, 81 et 2466, 71/2465, 20. b) Digestion à la trypsine pour vérification de la structure primaire de DIM-13. Dim-13 est dissous dans du tampon carbonate d'ammonium à 25 mM à pH 8, et soumis à la digestion par la trypsine au ratio enzyme : substrat de 1 : 20 (poids/poids). Deux aliquotes de 0,5 ju. 1 sont analysées par spectrométrie de masse MALDI-TOF après une incubation de 2 heures et une incubation de 12 heures à 35OC. Les produits de ces deux digestions à 2 et 12 heures ont été analysés par spectrométrie de masse MALDI-TOF comme décrit précédemment (voir exemple 2-2). L'ensemble de ces techniques a permis d'obtenir la structure complète de DIM-13. Cette identité de séquence a été confirmée par l'analyse des banques de données. La séquence primaire de DIM-13 représenté dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID NO : 1 est la suivante : ZFHVERPDRTVDFGNGGFSAQRF Masse moléculaire mesurée par spectrométrie de masse MALDI-TOF : 2649, 4 Da Masse moléculaire calculée : 2650,8 Da Exemple 3 : Caractérisation structurale de DIM- 12, DIM-10, DIM-6, DIM-8 et DIM-5. 1) Vérification de la pureté des DIM-12, DIM- 10, DIM-6, DIM-8 et DIM-5 par spectrométrie de masse MALDITOF. Cette étude a été réalisée sur un spectromètre de masse Bruker (Bremen, Allemagne) BIFLEXTM III équipé d'une optique haute résolution SCOUTS et d'un réflectron. Cet instrument a un potentiel maximum d'accélération de 20kV et peut être utilisé soit en mode linéaire soit en mode réflectron. L'ionisation est réalisée avec un faisceau à 337 nm émis par un laser à azote à une fréquence de 3Hz. Les spectres de masse ont été calibrés de façon externe avec un mélange standard de peptides antimicrobiens de la drosophile à savoir la drosocine, la metchnikowine et la drosomycine de masse moléculaire connue, respectivement à 2199,5 Da, 3046,4 Da et 4890,5 Da. Les échantillons a analysé par MALDI-TOF sont préparés par la technique du sandwich exposée comme suit, pour le repérage des peptides DIM-12, DIM-10, DIM-6, DIM-8 et DIM-5. Les différents produits à analyser (0,5 pl) ont été déposés sur une fine couche de cristaux d'acide acyano-4-hydroxycinnamique (4-HCCA, Sigma) obtenue par une évaporation rapide d'une solution saturée dans l'acétone puis recouvert de 0, 5 pl de seconde matrice, 4-HCCA à saturation dans une solution d'acétonitrile à 50% dans de l'eau. Après séchage sous un léger vide, les échantillons ont été lavés par 1, 5 pl de TFA 0,1% avant d'être séchés à nouveau et introduits dans le spectromètre de masse. 2) Déblocage de la région N-terminale de DIM- 12,-10 et-6 par un traitement à la pyroglutamate aminopeptidase. L'absence de signal au séquençage par dégradation d'Edman suggère la présence d'un acide aminé Nterminal cyclique de type acide pyroglutamique (Z ou pGlu). De ce fait les peptides purifiés ont été soumis à une digestion par la glutamate aminopeptidase (Boehringer Mannheim) afin de retirer cet acide aminé pGlu inhibiteur de la réaction de séquençage par la technique d'Edman. Les peptides sont mis en solution dans le tampon de protéolyse constitué de 100 mM de tampon phosphate de sodium à pH 8 additionné de 10 mM d'EDTA disodique, de 5 mM de dithioerythritol, et de 5 mM de glycerol en présence de l'enzyme pyroglutamate aminopeptidase au rapport enzyme/substrat de 1 : 10 (poids/poids). Les incubations sont réalisées pendant 18 heures à 4 C. Après cette première incubation, une nouvelle préparation d'enzyme est ajoutée et l'incubation perdure 4 heures à 25OC. Les produits des digestions sont purifiés par chromatographie sur une colonne microbore de phase inverse (Aquapore RP-300 C8, Brownlee, 100 x 1 mm, 300 À) protégée par un filtre (Ultra-Low Dead-Volume Precolumm Filter, Upchurch Scientific). L'élution est réalisée par un gradient linéaire biphasique d'acétonitrile de 2 à 18% dans le TFA 0,05% pendant 10 minutes et de 18% à 28% d'acétonitrile pendant 50 min à un débit constant de 80 ul/min à 35 C pour DIM-12 et de 2 à 17 en 10 min et de 17 à 27% d'acétonitrile pendant 50 min pour les DIM-10 et-6. La masse des produits obtenus est vérifiée par spectrométrie de masse MALDI-TOF et les produits sont séquencés par dégradation d'Edman. 3) Séquençage par dégradation d'Edman de DIM- 12,-10 et-6 dépourvu de l'acide pyroglutamique N- terminal. a) Séquençage de DIM-12. Le séquençage automatique par dégradation d'Edman du peptide DIM-12 et la détection des dérivés phénylthiohydantoines ont été réalisés sur un séquenceur ABI473A (PEApplied Biosystems division de Perkin Helmer). Une séquence partielle de 10 acides aminés a été obtenue (FHVERPGRTV). Ces informations de séquences associées aux résultats de spectrométrie de masse ont permis de définir la structure primaire complète de DIM-12. La séquence primaire de DIM-12 représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID NO : 2 est la suivante : Z F H V E R P G R T V D V G N G G F Y I Q R G Masse moléculaire mesurée par spectrométrie de masse MALDI-TOF : 2573,1 Da Masse moléculaire calculée : 2572,8 Da b) Séquençage de DIM-10. Le séquençage automatique par dégradation d'Edman du peptide DIM-10 et la détection des dérivés phénylthiohydantoines ont été réalisés sur un séquenceur ABI473A (PEApplied Biosystems division de Perkin Helmer). Une séquence partielle de 15 acides aminés a été obtenue (LHVARPDRTVTIGNG). Ces informations de séquences associées aux résultats de spectrométrie de masse ont permis de définir la structure primaire complète de DIM-10. La séquence primaire de DIM-10 représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID NO : 3 est la suivante : Z L H V A R P D R T V T I G N G G V Y I Q R S Masse moléculaire mesurée par spectrométrie de masse MALDI-TOF : 2521,9 Da Masse moléculaire calculée : 2520,9 Da c) Séquençage de DIM-6. Le séquençage automatique par dégradation d'Edman du peptide DIM-6 et la détection des dérivés phénylthiohydantoines ont été réalisés sur un séquenceur ABI473A (PEApplied Biosystems division de Perkin Helmer). Une séquence partielle de 15 acides aminés a été obtenue (FHVERPGRTVDVGNG). Ces informations de séquences associées aux résultats de spectrométrie de masse ont permis de définir la structure primaire complète de DIM-6. DIM-6 correspond ainsi à une forme tronquée de DIM-12. La séquence primaire de DIM-6 représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID NO : 5 est la suivante : ZFHVERPGRTVDVGNGGF Masse moléculaire mesurée par spectrométrie de masse MALDI-TOF : 1954, 9 Da Masse moléculaire calculée : 1955,2 Da 4) Détermination de la structure primaire de DIM-8 et-5 par trypsinolyse et analyse des fragments de trypsinolyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF. DIM-8 et-5 sont mis en solution dans du tampon Tris-HCl à 100 mM à pH 8,5, et soumis à la digestion par la trypsine au ratio enzyme : substrat de 1 : 10 (poids/poids) pendant 4 heures à 37OC. Les produits des digestions sont purifiés par chromatographie sur une colonne microbore de phase inverse (Aquapore RP-300 C8, Brownlee, 100 x 1 mm, 300 À) protégée par un filtre (Ultra-Low Dead-Volume Precolumm Filter, Upchurch Scientific). L'élution a été réalisée par un gradient linéaire d'acétonitrile de 2 à 62% dans le TFA 0,05% pendant 80 min à un débit constant de 80 ul/min à 35 C pour DIM-5 et-8. Les masses des produits obtenus sont vérifiées par spectrométrie de masse MALDITOF. Pour DIM-5, une masse de 1166, 3 MH+ est obtenue correspondant à la masse exacte du fragment N-terminal de DIM-13. La partie C-terminale de DIM-5 correspond au fragment de DIM-13 TVDFGNGG. DIM-5 correspond ainsi à une forme tronquée de DIM-13 ou de DIM-8 (voir ci-dessous). La séquence primaire de DIM-5 représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID NO : 6 est la suivante : ZFHVERPDRTVDFGNGG Masse moléculaire mesurée par spectrométrie de masse MALDI-TOF : 1914,3 Da Masse moléculaire calculée : 1914,0 Da Pour DIM-8, l'analyse des fragments de trypsinolyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF après purification montre une masse à 1164,9 MH+ et une autre masse à 1199,2 MH+. La masse moléculaire mesurée à 1164,9 MH+ correspond exactement à la masse du fragment N-terminal de DIM-13, ZFHVERPDR. La masse mesurée à 1199,2 MH+ correspond au fragment TVDFGNGGFSAQ de DIM-13 soit au fragment C-terminal de DIM-13 dépourvu du dipeptide Cterminal Arg-Phe. DIM-8 correspond ainsi à une forme tronquée de DIM-13. La séquence primaire de DIM-8 représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID NO : 4 est la suivante : ZFHVERPDRTVDFGNGGFSAQ Masse moléculaire mesurée par spectrométrie de masse MALDI-TOF : 2346,0 Da Masse moléculaire calculée : 2346,1 Da Exemple 4 : Test d'inhibition de l'adhésion cellulaire médiée par ICAM-1. L'activité inhibitrice des peptides DIMs sur l'adhésion cellulaire médiée par ICAM-1 a été testée par mesure du % d'inhibition de l'adhésion entre les monocytes sanguins (U-937) et les cellules endothéliales humaines (HUVEC) exprimant la molécule d'adhésion intercellulaire ICAM-1 après stimulation (Cronstein, B. N., and al., 1992, Proct. Antl. Acad. Science, 89,9991-9995 : A Mecanism for the Anti-inflammatory Effects of Corticosteroids : The Glucocorticoid Receptor Regules Leucocytes Adhesion Molecule One and Intercellular Adhesion Molecule I). Les cellules endothéliales (HUVEC) humaines en monocouche dans des plaques de 96 puits sont stimulées pendant 16 à 18 heures à 37 C dans un incubateur à C02 par des lipopolysaccharides, ledit peptide DIM (10) lM) à tester étant ajouté en même temps. Puis, le milieu stimulant contenant les lipopolysaccharides est éliminé et les monocytes humains (U-937) marqués avec un fluorochrome (BCECF) sont ajoutés pour permettre l'adhésion de ces dernières aux cellules endothéliales humaines (HUVEC) stimulées pendant 15 minutes à 37 oc dans un incubateur à C02, toujours en présence dudit peptide DIM à tester. Les cellules sont lysées et des mesures de spectrofluométrie (Â, 485nm et 530nm) sont effectuées à l'aide d'un cytofluor millipore 2350. Un test contrôle a été réalisé en parallèle. Le composé inhibiteur de référence est l'acide nordihydroguaiaretique (NDGA). Une inhibition d'adhésion de 50% (IC50) est obtenue pour 11 LLM. % d'inhibition mesuré pour le peptide DIM- 13 (10 RM) : 58% REVENDICATIONS 1) Peptide de formule générale (I) : 11 (1) 2 P3 (D405 P607 08 901 0 (1) 11012 (1) 13 014 015 016017 (1) 18 (yl 9 (y2 0021 2 2G2 3 (i) ou un fragment de celui-ci, dans laquelle : ou un fragment de celui-ci, dans laquelle : - X, 0, ss, o représentent des résidus d'acide aminé, - l'acide aminé LI est choisi dans le groupe comprenant l'acide glutamique, la glutamineet l'acide pyroglutamique, - les acides aminés (, ss6'ss, ss2, identiques ou différents, sont choisis parmi les acides aminés basiques, les acides aminés 11) 2 1 (D 4 1 (Dl li (Dl3 1a) 1 8 identiques ou différents, sont choisis parmi les acides aminés hydrophobes, - les acides aminés 9s'97, 9s'910'912'914'91s' 916'917'921'identiques ou différents, sont choisis parmi les acides aminés chargés négativement ou les acides aminés polaires petits ou les acides aminés polaires larges ou la glycine, l'alanine, la proline, - les acides aminés 0'19'0'20'0'23'identiques ou différents, sont choisis parmi l'alanine, la glycine, l'isoleucine, la phénylalanine, la sérine, la tyrosine ou la valine. 2) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué d'au moins 17 acides aminés successifs et de préférence 23 acides aminés successifs de la formule (I). 3) Peptide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'acide aminé C-terminal est 4) Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il répond à l'une des formules suivantes : 12ss3405ss60708ss90101101213014015016017 (II) eee. oiAeiAseis (in) xc, e, p, e, e, e, , e, eeee, o,, oe (iv) 5) Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les acides aminés basiques sont choisis parmi l'arginine, l'histidine ou la lysine. 6) Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les acides aminés hydrophobes sont choisis parmi l'isoleucine, la leucine, la phénylalanine, le tryptophane, la tyrosine ou la valine. 7) Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les acides aminés chargés négativement sont choisis parmi l'acide aspartique ou l'acide glutamique. 8) Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les acides aminés polaires petits sont choisis parmi la sérine ou la thréonine. 9) Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les acides aminés polaires larges sont choisis parmi l'asparagine ou la glutamine. 10) Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'un au moins des acides aminés (D2, 05r 071 08, 012, (1) 131 015, (Dl8l CY191 20'23's'il est présent, à la signification suivante : - est la phénylalanine ou la leucine, - 95 est l'acide glutamique ou l'alanine, - 97 est la proline ou la sérine, - 9g est l'acide aspartique ou la glycine, - 912 est l'acide aspartique ou la thréonine, - (Dl. est la phénylalanine, la valine ou l'isoleucine, - #15 est l'asparagine ou la sérine, - cog est la phénylalanine ou la valine, - #19 est la sérine, la tyrosine, la valine ou la phénylalanine, - CY2, est l'alanine, l'isoleucine ou la valine, - cl23 est la phénylalanine, la glycine ou la sérine. 11) Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe comprenant les séquences suivantes : - SEQ ID NO : 1 : ZFHVERPDRTVDFGNGGFSAQRF - SEQ ID NO : 2 : Z F H V E R P G R T V D V G N G G F Y I Q R G - SEQ ID NO : 3 : Z L H V A R P D R T V T I G N G G V Y I Q R S - SEQ ID NO : 4 : ZFHVERPDRTVDFGNGGFSAQ - SEQ ID NO : 5 : ZFHVERPGRTVDVGNGGF - SEQ ID NO : 6 : ZFHVERPDRTVDFGNGG 12) Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'acide aminé LI est lié à un groupement protecteur, un groupe acyle, un groupe acétyle ou un groupe méthyle étant entendu que ledit acide aminé LI n'est pas alors l'acide pyroglutamique. 13) Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'acide aminé C-terminal est modifié chimiquement. 14) Peptide selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'acide aminé C-terminal est amidé. 15) Polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 16) Polypeptide selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 dont l'une et/ou l'autre des extrémités dudit peptide comprend un résidu peptidique nécessaire à son expression et/ou au ciblage dans un organisme hôte. 17) Composition pharmaceutique, notamment vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d'agent actif au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 ou un polypeptide selon l'une des revendications 15 ou 16, avantageusement associé dans ladite composition à un véhicule acceptable. 18) Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 ou d'un polypeptide selon l'une des revendications 15 ou 16, pour la préparation d'une composition pharmaceutique utile pour la prévention ou le traitement des troubles inflammatoires et/ou immunitaires chez l'homme ou l'animal.