Brevet FR2813525A1 — publié le 20020308

PROCEDE D'EXTRACTION D'UN PRINCIPE ACTIF A PARTIR DE FEUILLES D'OLEA EUROPAEA POUR FAVORISER LA SYNTHESE DE PROTEINES DE STRESS, PRINCIPE ACTIF OBTENU La présente invention concerne un procédé d'extraction d'un principe actif à partir d'Olea Europaea pour favoriser la synthèse de protéines de stress ainsi que le principe actif obtenu et les compositions cosmétiques incluant ce principe actif. Dans le domaine de la cosmétique notamment, on s'intéresse à tous les principes actifs susceptibles d'engendrer une activité réparatrice des cellules. Plus particulièrement en ce qui concerne la peau, on sait qu'il convient de rechercher des principes actifs qui permettent d'agir sur les cellules de la peau lorsque celles-ci sont endommagées par les rayonnements UV. Les protéines de stress connues sous le nom de HSP (Heat-Shock Proteins), sont des protéines naturellement présentes dans les cellules des organismes vivants. Ces protéines sont produites en réponse à des stress causés par la chaleur, certains métabolites toxiques, le stress oxydatif, les radiations UV. Ces protéines sont également appelées molécules chaperonnes par le fait qu'elle ont un rôle de protection des autres protéines autour de la cellule. Si l'on expose une cellule à un stress, la cellule répond en augmentant sa production de molécules chaperonnes pour protéger les protéines vitales. C'est ainsi qu'une des premières fonctions attribuées à ces molécules chaperonnes est la protection des cellules cutanées soumises à des irradiations solaires. Les protéines de stress permettent ainsi de supprimer les radicaux délétères et surtout permettent le maintien des fonctions cellulaires et de ramener les fonctions métaboliques à des valeurs basiques. Ces protéines de stress ont des effets bénéfiques mais il convient de limiter leur production face à un stress qui perdure pour permettre d'atteindre un équilibre au sein de la cellule car un excès de telles protéines engendre aussi la mort de ladite cellule. Dans les familles de protéines telles qu'elles ont été classées suivant leurs poids moléculaires et/ou leurs séquences, les essais permettant la caractérisation du principe actif ont porté sur les protéines de stress dites HSP70 et HSP32. L'invention est maintenant décrite ci-après, à partir d'un principe actif extrait de feuilles d'Olea Europaea, en regard des dessins annexés qui représentent - figure 1, tableau récapitulatif des effets de la température sur la production de protéines de stress HSP 70, - figure 2, tableau des effets du principe actif selon la présente invention sur la production de protéines de stress HSP 70 dans des cultures de kératinocytes et de fibroblastes humains avec et sans traitement thermique, - figure 3, tableau des effets-doses du principe actif sur l'induction de protéines de stress HSP 70, - figure 4, tableau récapitulatif des effets de la température sur la production de protéines de stress HSP 32, - figure 5, tableau des effets du principe actif selon la présente invention sur la production de protéines de stress HSP 32 dans des cultures de kératinocytes et de fibroblastes humains avec et sans traitement thermique, et - figure 6, tableau des effets-doses du principe actif sur l'induction de protéines de stress HSP 32, 1 / Procédé d'extraction. Le principe actif selon la présente invention est obtenu à partir de feuilles d'Olea Europaea dont le protocole d'extraction comprend la succession des étapes suivantes - solubilisation de poudre de feuilles d'Olea Europaea séchées, dans de l'eau pendant 2 heures à 60 C, - décantation, et - filtration afin de séparer la phase active, concentration, et - filtration stérilisante sur membrane afin de limiter la présence de microorganismes, de flore mésophile totale, de levures, et de moisissures. 2/ Caractérisation du principe actif Le principe actif ainsi obtenu est caractérisé par les paramètres analytiques suivants Matière sèche - Taux de matière sèche : compris entre 10 et 50 g/) plus particulièrement entre 20 et 40 g/1 principalement entre 25 et 35 g/1. Ce taux est obtenu par passage à l'étuve à 105 C jusqu'à obtention d'un poids constant, pH La valeur du pH est comprise entre 3,0 et 10,0 plus particulièrement entre 4,0 et 7,0, notamment entre 4,5 et 5,5, obtenue par la méthode pote ntiométrique, à température ambiante. Polyphénols totaux Les composés phénoliques forment des complexes colorés en présence de ferricyanure de potassium, dont l'intensité peut-être détectée à 715 nm. Ceci permet de déterminer la quantité de composés phénoliques sur une courbe étalon. Cette courbe est obtenue à partir d'une gamme étalon d'acide gallique allant de 40 à 120 mg/l. La teneur en composés phénoliques est ainsi exprimée en mg d'acide gallique par litre d'actif. La valeur obtenue est comprise entre 500 et 5 000 mg/I, plus particulièrement entre 500 et 3 000 mg/I, notamment entre 500 et 2 000 mg/I. Sucres totaux La méthode utilisée pour la détermination de la teneur en sucres totaux est la méthode de DUBOIS (DUBOIS, M et al, (1956) Analytical chemistry, 28, N 3 p 350-356). En présence de phénol et d'acide sulfurique concentré, les sucres réducteurs donnent un composé coloré jaune-orangé et la lecture au spectrophotomètre donne une valeur qui, à partir de la courbe DO=f(conc) obtenue pour des étalons (comprenant 1/3 de mannose, 1/3 de glucose et 1/3 de galactose), permet de déduire une valeur de sucres totaux pour le principe actif à partir de feuilles d'Olea Europaea supérieure à 2 g/1 et plus précisément comprise entre 2 et 30 g/1, notamment entre 6 et 15 g/1. L'analyse bactériologique doit montrer que la flore mésophile totale est inférieure à 100 germes/g et l'absence de levures et de moisissures. 3/ Expérimentations et détermination des effets sur la production des protéines de stress Les protéines de stress sont exprimées notamment par des cultures de cellules cutanées telles que les fibroblastes et les kératinocytes et les études qui vont suivre permettent de déterminer les effets du principe actif selon la présente invention sur la synthèse de protéines de stress induite par divers stress. Les deux familles de protéines de stress retenues pour les études sont - HSP 70 : cette protéine majeure de la famille des HSP70 est la plus facilement induite par un stress, et elle est engagée dans les processus de thermorésistance et de thermoprotection ainsi que dans les mécanismes de protection contre les dommages UVB induits. Le taux cutané de cette protéine diminue avec l'àge si bien que la capacité de réponse aux agressions environnementales s'affaiblit. - HSP 32 : cette enzyme est l'hème-oxygénase-1 qui clive oxydativement l'hème qui est une molécule pro-oxydante en monoxyde de carbone et biliverdine. La forme inductible de cette enzyme est assimilée à une protéine de stress et la masse moléculaire sur électrophorèse lui a donné son appellation de HSP 32. Ces deux protéines de stress jouent un rôle important dans la protection solaire et dans la réparation des dommages provoqués par les rayons UV. HSP 70 1` essai avec traitement thermique A J0, on ensemence des cellules cutanées, fibroblastes et/ou kératinocytes. A J4, on ajoute 3% de principe actif et après une incubation de 30 min, on procède à un traitement thermique de 1 heure à 39 C. Le témoin positif est traité pendant 1 heure à 44 I C# Les ARN totaux sont extraits. Les ARN sont réverse-transcrits et les ADN complémentaires sont analysés en utilisant les oligonucléotides complémentaires d'une séquence codante des gènes des protéines étudiées. Les ARNm de la (3-actine sont analysés pour chaque condition expérimentale. Par analyse d'image, en utilisant par exemple le système commercialisé sous la dénomination BIO-PROFIL, on détermine des intensités de bandes. 2 é"'' essai sans traitement thermique A J0, on ensemence des cellules cutanées, fibroblastes et/ou kératinocytes. A J3, on ajoute 3% de principe actif et on laisse incuber pendant 24 heures à 37 C. A J4, à la fin de cette incubation, les cellules sont récupérées. Les ARN totaux sont extraits. Les ARN sont réverse-transcrits et les ADN complémentaires sont analysés en utilisant les oligonucléotides complémentaire d'une séquence codante des gènes des protéines étudiées. Les ARNm de la @-actine sont analysés pour chaque condition expérimentale. De la même façon que précédemment, par analyse d'image, on détermine des intensités de bandes. Les pourcentages sont exprimés en rapport d'intensité avec Les résultats des traitements thermiques sur le témoin sont indiqués dans le tableau de la figure 1, en prenant comme 100% le taux d'ARNm de HSP 70 après incubation à 37 C d'un échantillon témoin. On note qu'il faut atteindre 44 C pour obtenir une production intracellulaire des HSP 70 significative de 138%. Dans le tableau de la figure 2, on peut comparer les résultats obtenus avec l'échantillon d'essai dans le cas d'un Traitement Thermique TT et Sans Traitement Thermique STT et avec 3 % de principe actif. On remarque que les résultats obtenus même sans traitement thermique sont significatifs car sensiblement identiques à ceux obtenus à partir du témoin ayant subi un traitement thermique à 44 C. On a également cherché à montrer l'effet-dose de la synthèse de HPS 70 sur les fibroblastes ainsi que le récapitule le tableau de la figure 3. Pour compléter l'analyse, on a réalisé des tests avec de l'Oleuropéine à 1,5 g/1 et un dérivé basique d'oleuropéine, le Dihydroxytyrosol, également à 1,5 g/1. On constate que l'Oleuropéine et son dérivé basique sont très actifs, ce qui explique l'action du principe actif complet. L'action du principe actif est optimale dès 3 %. HSP 32 Le même protocole opératoire est mis en oeuvre mais on mesure cette fois-ci le taux d'ARNm de HSP 32. Les résultats sont regroupés dans les figures 4, 5 et 6. Dans le cas de HSP 32, on constate que le taux d'induction est amélioré par le traitement thermique (126 % pour un traitement thermique à 44 C). Le taux d'induction est par contre fortement augmenté en présence du principe actif puisque l'on atteint 165 % dans le cas des kératinocytes sans aucun traitement thermique. De même l'effet-dose montre que 3 % permet d'atteindre un maximum d'induction, ce qui montre la quantité limitée nécessaire pour que les effets du principe actif soient optimum. L'invention couvre aussi une composition cosmétique qui inclut le principe actif selon la présente invention et qui permet d'augmenter la production de protéines de stress et lutter contre les effets des rayonnements ultraviolets. Cette composition comprend au moins le principe actif de la présente invention, ou une part du principe actif concentré ou séché, associé à toute forme galénique adaptée. L'invention couvre aussi le procédé de production de protéines de stress, qui consiste à disposer préventivement sur la peau cette composition cosmétique à raison d'au moins 0,1 % de principe actif, préférentiellement de 1 à 5%. REVENDICATIONS 1. Procédé d'extraction d'un principe actif en vue d'une amélioration de la production de protéines de stress notamment pour lutter contre les effets des rayons ultraviolets, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - solubilisation de poudres de feuilles d'Olea Europaea séchées, dans de l'eau pendant 2 heures à 60 C, - décantation, et - filtration afin de séparer la phase active, concentration, et - filtration stérilisante sur membrane afin de limiter la présence de microorganismes, de flore mésophile totale, de levures, et de moisissures. 2. Principe actif obtenu par le procédé la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend - taux de matière sèche : compris entre 10 et 50 g/1 plus particulièrement entre 20 et 40 g/1 principalement entre 25 et 35 g/1. - pH compris entre 3,0 et 10,0 plus particulièrement entre 4,0 et 7,0, notamment entre 4,5 et 5,5. - polyphénols totaux : taux compris entre 500 et 5 000 mg/l, plus particulièrement entre 500 et 3 000 mg/I, notamment entre 500 et 2 000 mg/I, exprimé en mg d'acide gallique. - sucres totaux : taux supérieur à 2 g/1 et plus précisément compris entre 2 et 30 g/1, notamment entre 6 et 15 g/1. 3. Composition cosmétique pour augmenter la production de protéines de stress et lutter contre les effets des rayonnements ultraviolets, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins pour une part du principe actif selon la revendication 2, concentré ou séché, associée à toute forme galénique adaptée. 4. Procédé pour augmenter la production de protéines de stress, caractérisé en ce que l'on dispose préventivement sur la peau une composition cosmétique selon la revendication 3 à raison d'au moins 0,1 % de principe actif. 5. Procédé pour augmenter la production de protéines de stress selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on dispose entre 1 et 5% de principe actif.