Brevet FR2814077A1 — publié le 20020322

L'invention est relative à l'utilisation de modulateurs des récepteurs à l'adénosine pour l'étude et la régulation des interactions entre les nétrines et leurs récepteurs. Les nétrlnes constituent une famille de protéines secrétées présentant des similitudes de structure avec la laminine. Elles interviennent dans la croissance et le guidage des axones. Des membres de la famille des nétrines ont été identifiés chez différents échelons du règne animal, des Invertébrés aux Vertébrés supérieurs. On citera notamment la protéine UNC6 de Caenorhabditis elegans, les nétrines A et B de Drosophila melanogaster, les nétrines 1 et 2 isolées à partir de cerveau embryonnaire de poulet, et la nétrine 1 humaine [SERAFINI et al., Cell, 78,409-424, (1994) ; HARRIS et al., Neuron., 17,217-228, (1996) ; TESSIER-LAVIGNE et al., Brevet US 6 096 866 ; MEYERHARDT et al., Cell Growth Differ., 10,35-42, (1999)]. L'effet des nétrines sur la croissance et le guidage des axones implique leur interaction avec des récepteurs de la membrane cellulaire. Les récepteurs des nétrines identifiés jusqu'à présent appartiennent à la superfamille des immunoglobulines. Le plus étudié est la protéine DCC (pour : Deleted in Colorectal Cancer ), qui interviendrait dans l'induction de la croissance des axones, et leur attraction par la nétrine. Il a été montré que : (i) des cellules exprimant DCC fixent la nétrine-1 [KEINO-MASU et al., Cell, 87, 175-185, (1996)], (ii) chez les Vertébrés, une hybridation in situ montre que DCC est exprimé par les axones répondant à la nétrine-1 [KEINO-MASU et al., 1996, publication précitée], (iii) des anticorps monoclonaux dirigés contre le domaine extracellulaire de DCC bloquent la croissance des axones commissuraux induite par un gradient de nétrine-1 [KEINO-MASU et al., 1996, publication précitée ; DEINER et al., Neuron., 19,575, 589, (1997) ; DE LA TORRE et al., Neuron., 19,1211-1224, (1997)], (iv) des souris knockout pour DCC ou pour la nétrine-1 [SERAFINI et al., 1996, publication précitée ; FAZELI et al., Nature, 386,796-804, (1997)] présentent des anomalies similaires au niveau du système nerveux. La protéine DCC, et ses homologues, la protéine UNC40 de Caenorhabditis elegans, et la protéine frazzled de Drosophila melanogaster [HARRIS et al., 1996, publication précitée], sont des protéines transmembranaires, dont la partie extracellulaire comprend quatre domaines de type immunoglobuline et six domaines répétés de type fibronectine III. DCC a été initialement identifié comme suppresseur de tumeurs, une altération ou une suppression de son expression ayant été observée dans certains cancers, notamment des cancers colorectaux [FEARON, Biochem. Biophys. Acta., 1288, M17-M23, (1996)]. Après la mise en évidence de son rôle potentiel en tant que récepteur de la nétrine impliqué dans les mécanismes de guidage axonal, il a été suggéré que DCC serait un récepteur à dépendance [MEHLEN et al., Nature, 395,801-804, (1998)]. En présence de ligand, il induirait un signal de survie, conduisant par exemple à la prolifération cellulaire ou à la croissance axonale. En l'absence de ligand il induirait au contraire un signal provoquant la mort des cellules par apoptose. D'autres récepteurs des nétrines sont constitués par des protéines de la famille UNC-5. Ces protéines appartiennent également à la superfamille des immunoglobulines ; leur région extracellulaire comprend deux domaines de type immunoglobuline, et 2 domaines de type thrombospondine de type 1. Elles interviendraient dans un mécanisme de répulsion des axones par la nétrine [Brevet US 5,939, 271, TESSIER-LAVIGNE et al.]. Il a été suggéré d'agir sur l'interaction entre la nétrine et le récepteur DCC ou le récepteur UNC-5 dans le but de réguler la croissance et le guidage des axones. Des méthodes de criblage in vitro de produits potentiellement utilisables pour le traitement des maladies neurodégénératives, basées sur la mesure des effets de l'une ou l'autre de ces interactions en présence de substances à tester ont été proposées (cf. par exemple HINCK et al., Brevet US 6, 087, 326 ; TESSIER-LAVIGNE et al., Brevet US 5, 939, 271 et Brevet US 6, 017, 714). Toutefois, jusqu'à présent, mis à part certains anticorps anti-DCC, aucune substance effectivement capable d'agir sur l'une ou l'autre de ces interactions n'a été identifiée. Par ailleurs, l'existence d'une interaction directe nétrine/DCC ou nétrine/UNC-5 n'a jamais été clairement démontrée. La présence d'éventuels co-récepteurs a été envisagée [KEINO-MASU et al., 1996, publication précitée ; MEYERHARDT et al., 1999, publication précitée], mais leur nature est restée hypothétique. D'autre part, la voie de signalisation par laquelle l'interaction nétrine/récepteur conduit à l'élongation et au guidage des axones demeure mal connue. Les seules données rapportées concernent l'induction par la nétrine-l d'une modulation du taux de calcium [HONG et al., Nature, 403,93-98, (2000) ; SONG et al., Nature, 388,275-279, (1997)] et d'AMPc intracellulaires [SONG et al., 1997, publication précitée], conduisant à l'activation de la protéine kinase A (PKA) [MING et al., Neuron., 19,1225-1235, (1997)]. Dans le but d'élucider le mécanisme de transduction du signal généré par l'interaction nétrine/récepteur, et notamment du signal nétrine-1/DCC, compte tenu du rôle pro-apoptotique joué dans la cellule par ce récepteur en l'absence de son ligand, les Inventeurs ont recherché les partenaires potentiels d'interaction avec le domaine intracellulaire de DCC, par la méthode du doublehybride. Ils ont ainsi mis en évidence une interaction de DCC avec un fragment de 23 acides aminés, correspondant aux 23 derniers acides aminés du domaine intracellulaire du récepteur à l'adénosine A2b. Ils ont constaté que cette interaction est considérablement renforcée par la présence de nétrine-1. Les Inventeurs ont mis en évidence une interaction entre la nétrine-1 et le récepteur A2b, et ce même en l'absence de DCC. Ils ont montré que cette interaction directe nétrine-l/A2b induisait une augmentation de la concentration d'AMPc dans les cellules, comparable à celle induite par un agoniste du récepteur A2b. Cet effet de l'interaction nétrine-1/A2b sur la concentration d'AMPc est renforcé par l'addition d'agonistes du récepteur A2b, et inhibé par l'addition d'antagonistes de ce récepteur. Enfin, ils ont montré que l'activation d'A2b était nécessaire à la croissance des axones commissuraux nétrine-dépendants. A2b est une protéine d'environ 37kDa, membre de la famille des récepteurs à l'adénosine. Cette famille, qui fait partie de la super-famille des récepteurs à sept domaines transmembranaires, est divisée en quatre types, les récepteurs Al, A2a, A2b et A3, en fonction notamment de leur capacité à inhiber (via Al ou A3) ou à stimuler (via A2a ou A2b) l'activité de l'adénylate cyclase en réponse à l'interaction avec l'adénosine [RALEVIC et al., Pharmacol. Rev., 50, 413-492, (1998)]. Ce récepteur est connu pour activer deux voies de signalisation intracellulaire : une voie impliquant l'AMPc où A2b est couplé à l'adénylate cyclase via une Gs protéine, et une voie impliquant le calcium, dans laquelle A2b est couplé à la phosphatidylinositol-spécifique phospholipase C via une Gq protéine [FEOKISTOV et BIAGGIONI, Pharmacol. Rev., 49,381-402, (1997)]. Les résultats obtenus par les Inventeurs mettent en évidence l'existence d'une interaction DCC/A2b, et d'une interaction nétrine/A2b, ainsi que le rôle primordial joué par ces interactions dans l'activité de la nétrine vis-à-vis du récepteur DCC. Ils mettent aussi en évidence le rôle de ces interactions dans la régulation du récepteur A2b par la nétrine et/ou le récepteur DCC. Ces résultats permettent donc de proposer de nouveaux moyens de régulation des effets de récepteurs membranaires appartenant à la superfamille des immunoglobulines, tels que le récepteur DCC ou le récepteur UNC5, et/ou de leurs ligands tels que la nétrine, sur les fonctions cellulaires, telles que la prolifération, la différenciation, la migration cellulaire, et plus particulièrement la croissance et le guidage axonal, ou bien sur l'apoptose cellulaire. Ils permettent aussi de proposer de nouvelles utilisations des moyens de régulation connus des récepteurs à l'adénosine, et notamment du récepteur A2b, pour influer sur la croissance et le guidage axonal, ou bien sur l'apoptose cellulaire. Enfin, ils permettent également de proposer de nouveaux moyens de régulation des récepteurs à l'adénosine, et notamment du récepteur A2b, par l'intermédiaire de récepteurs membranaires appartenant à la superfamille des immunoglobulines, tels que le récepteur DCC ou le récepteur UNC5, et/ou de leurs ligands tels que la nétrine. La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'un modulateur d'un récepteur à l'adénosine, pour l'obtention d'un médicament régulateur des effets d'une nétrine et/ou d'un récepteur des nétrines. On entend ici par récepteur des nétrines un récepteur membranaire dont la portion extra-cellulaire comprend au moins un domaine de type immunoglobuline. Ceci englobe notamment les récepteurs DCC et UNC5 mentionnés cidessus. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur d'un récepteur à l'adénosine, pour la régulation in vitro, par l'intermédiaire dudit récepteur à l'adénosine, de l'activité d'une nétrine et/ou d'un récepteur des nétrines. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, ledit récepteur à l'adénosine est un récepteur A2, de préférence le récepteur A2b. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, la nétrine est la nétrine-1. Les modulateurs de récepteurs à l'adénosine utilisables conformément à la présente invention, comprennent les agonistes et les antagonistes de ces récepteurs, et notamment ceux actifs sur le récepteur A2b. Des agonistes et antagonistes des récepteurs à l'adénosine sont connus en eux-mêmes. Les agonistes résultent généralement de la modification des positions N6 ou C2 du cycle adénine, ou de la position 5'de la partie ribose de l'adénosine. Les antagonistes sont principalement des xanthines ou des dérivés de xanthine. A titre d'exemples non-limitatifs d'agonistes des récepteurs à l'adénosine, actifs notamment sur le récepteur A2b, on citera NECA (5'-N-éthylcarboxamidoadénosine), R-PIA (R-N6-phénylisopropyladénosine), IB-MECA (N- (3-iodobenzyl)-N méthyl-5'-carbamoyladénosine), CGS 21680 (4- [ (N-éthyl-5'carbamoyladénos-2-yl)-aminoéthyl]-phênylpropionic acid). A titre d'exemples d'antagonistes des récepteurs à l'adénosine, on citera l'enprofylline (3-propylxanthine), qui est plus particulièrement actif sur le récepteur A2b, ou le DPCPX (l, 3-dipropyl-8-cyclopentylxanthine). De nombreux autres exemples d'agonistes ou antagonistes des récepteurs à l'adénosine, également utilisables pour la mise en oeuvre de la présente invention, sont décrits dans la littérature [pour revue cf. par exemple RALEVIC et al., 1998, précité]. Des agonistes ou antagonistes d'un récepteur à l'adénosine également utilisables pour la mise en oeuvre de la présente invention, peuvent également être constitués par des anticorps dirigés contre ledit récepteur, notamment contre le site d'interaction avec l'adénosine, ou contre son site d'interaction avec la nétrine. La présente invention peut être mise en oeuvre dans le cadre du traitement de toute pathologie impliquant une fonction cellulaire dépendant de l'activité d'une nétrine et/ou d'un récepteur des nétrines. On choisira le modulateur du récepteur à l'adénosine en fonction des effets que l'on souhaite obtenir. Dans le cas où l'on souhaite obtenir une augmentation des effets d'une nétrine, ou simuler ces effets, on utilisera un agoniste d'un récepteur à l'adénosine, de préférence un agoniste actif sur le récepteur A2b. Par exemple, dans le cas des cellules nerveuses, on peut utiliser un agoniste d'un récepteur à l'adénosine dans le cadre du traitement de pathologies dans lesquelles il est souhaitable d'améliorer la croissance et le guidage axonal, notamment de maladies neurodégénératives, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaque etc., ou dans le cadre du traitement de lésions du système nerveux, d'origine traumatique, ou découlant d'un état pathologique tel qu'accident vasculaire cérébral, ischémie, épilepsie, etc. Dans le cas d'autres organes que le système nerveux, par exemple dans le cas du colon, du poumon ou du cerveau, on peut utiliser un agoniste d'un récepteur à l'adénosine afin de modifier la tumorogénèse, ce qui est utile dans le traitement de maladies impliquant une délétion 18q. Un agoniste d'un récepteur à l'adénosine peut également être utilisé, conformément à l'invention, dans des cultures de neurones in vitro pour promouvoir la croissance et le guidage axonal, ou bien la survie neuronale ou gliale. Pour inhiber les effets d'une nétrine, on utilisera un antagoniste d'un récepteur à l'adénosine, de préférence un antagoniste du récepteur A2b. Par exemple on peut ainsi simuler les effets d'une déplétion en ligand du récepteur DCC, et induire de la sorte une apoptose cellulaire. Cette induction de l'apoptose trouve notamment des applications dans le cadre du traitement des cancers, pour détruire les cellules tumorales. On peut également utiliser un antagoniste d'un récepteur à l'adénosine, et notamment du récepteur A2b pour inhiber la croissance et/ou le guidage axonal. Pour la mise en oeuvre de la présente invention, les agonistes ou antagonistes des récepteurs à l'adénosine peuvent être formulés et administrés selon les méthodes classiques de formulation et d'administration de ces composés, qui sont connues en elles-mêmes de l'homme de l'art. Ils peuvent par exemple être administrés de façon systémique, par exemple par voie orale ou par voie parentérale, notamment intra-veineuse, intra-musculaire, intra-dermique, sous-cutanée, transdermique, transmucosale, etc.. Dans le cas d'une utilisation par voie systémique dans le cadre du traitement de pathologies du système nerveux, on choisira un agoniste ou un antagoniste capable de franchir la barrière hémato-encéphalique (c'est à dire de préférence liposoluble), et/ou une formulation et/ou une méthode d'administration facilitant le passage de cette barrière (pour revue de différentes formulations ou méthodes d'administration permettant de franchir la barrière hématoménlngée, cf. par exemple PARDRIDGE, Pharmaceutical Science and Technology Today, Vol. 2, No. 2, 49-59, 1999). On peut également choisir une administration locale, par exemple, dans le cadre du traitement de pathologies du système nerveux, par injection intraventriculaire, ou dans un implant intracérébral, ou, dans le cadre d'un traitement anti-cancéreux, par injection ou implantation intra-tumorales. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une nétrine pour activer la production d'AMPc médiée par un récepteur à l'adénosine, et notamment par le récepteur A2b. Avantageusement, on utilise ladite nétrine en association avec un agoniste d'un récepteur à l'adénosine. La présente invention a également pour objet une composition comprenant un agoniste d'un récepteur à l'adénosine et une nétrine. On peut ainsi utiliser une nétrine ou une composition conforme à l'invention associant ladite nétrine à un agoniste d'un récepteur à l'adénosine, pour l'obtention de médicaments utilisables dans les indications usuelles des agonistes des récepteurs à l'adénosine, et notamment du récepteur A2b. Une composition conforme à l'invention peut également être utilisée in vitro par exemple dans des cultures de neurones, pour promouvoir la croissance et le guidage axonal, ou bien la survie neuronale ou gliale. La présente invention a également pour objet aussi l'utilisation d'agonistes ou d'antagonistes de DCC (par exemple des anticorps anti-DCC) pour bloquer la fonction d'A2b, dans les pathologies connues (Asthme, etc) impliquant les récepteurs à l'adénosine. La présente invention a aussi pour objet un procédé de criblage in vitro de produits capables de réguler la fonction d'une nétrine, et/ou d'un récepteur des nétrines, caractérisé en ce qu'il comprend : a) l'incubation d'une nétrine et d'un récepteur à l'adénosine, en l'absence du produit à tester et la détermination de l'affinité de la liaison entre ladite nétrine et ledit récepteur ; b) l'incubation d'une nétrine et d'un récepteur à l'adénosine, en présence du produit à tester, et la détermination de l'affinité de la liaison entre ladite nétrine et ledit récepteur ; c) la sélection des produits pour lesquels on observe une différence entre l'affinité mesurée à l'étape a) et l'affinité mesurée à l'étape b). Le sens de cette différence, permet de déterminer si le produit testé est susceptible de réguler positivement ou négativement, les effets de la nétrine et/ou du récepteur de ladite nétrine. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la mise en évidence du rôle du récepteur à l'adénosine A2b, ainsi que d'agonistes et d'antagonistes de ce récepteur, dans la régulation des effets de la nétrine. EXEMPLE 1 : IDENTIFICATION DE PARTENAIRES INTRACELLULAIRES DE DCC Les partenaires intracellulaires de DC ont été identifiés par criblage d'une banque d'ADNc de cerveau humain par la technique du double hybride (système MATCHMAKER II, CLONTECH). Les vecteurs suivants ont été utilisées : (i) pAS2-1-DCCIC : Ce plasmide est dérivé de pAS2-1 (CLONTECH) par introduction dans celui-ci de la séquence codant pour le domaine intracellulaire de DCC (acides aminés 1121 à 1447), en fusion avec le domaine de fixation ("Binding Domain"ou BD) de GAL4. La séquence codant le domaine intracellulaire de DCC, a été extraite du vecteur pSVK-HA-DCCIC (MEHLEN et al., 1998) par double digestion NdeI-SalI, un site NdeI ayant préalablement été créé par mutagenèse dirigée. Cet insert DCCIC a ensuite été introduit entre les sites SalI et NdeI du vecteur pAS2-1. (il) une banque d'ADNc construite dans le vecteur pACT2, chaque plasmide contenant le domaine d'activation transcriptionnelle (AD) de GAL4 fusionné à un ADNc d'une 8 banque (titre : 3. 10 cfu/ml). La souche Y190 de levure subit une première transformation avec le plasmide pAS2-1-DCCIC. Les levures recombinantes sont alors sélectionnées sur un milieu déplété en tryptophane. Puis la levure Y190/pAS2-1-DCCIC subit une seconde transformation avec les plasmides pACT2. A l'issue de cette double transformation, la sélection s'effectue sur un milieu déplété en tryptophane, en leucine, et en histidine, en présence de 55mM de 3-amino-1, 2,4-triazole. Ce criblage permet de mettre en évidence une interaction de DCCIC avec des protéines du cytosquelette ('a-tubuline, la ss-actine, la dynactine), la protéine MSS1 (GTPase mitochondriale, composant du protéasome 26S), la "phosphatidyl éthanolamin binding protein", la caspase 3 (confirmant ainsi des observations précédentes de MEHLEN et al., 1998), et avec le récepteur à l'adénosine A2b. Dans le cas du récepteur A2b, l'interaction observée avec DCC s'effectue au niveau d'un fragment de 23 acides aminés correspondant aux 23 derniers acides aminés (310-333) situés en C-terminal du domaine intracellulaire d'A2b). L'interaction DCC/A2b observée en double hybride a été confirmée par coimmunoprécipitation. Un lysat de cellules 293T co-transfectées avec des plasmides codant pour DCC et A2b est incubé avec un anticorps anti-A2b (flagM2) ; une éventuelle interaction DCC/A2b est révélée par transfert de Western à l'aide d'un anticorps dirigé contre le domaine extracellulaire de DCC. Des expérimentations ont été effectuées en présence ou en absence de nétrine-1. Culture des cellules : La lignée cellulaire 293T de cellules humaines de rein immortalisées est utilisée. Cette lignée est cultivée dans un milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM, LIFE TECHNOLOGIES) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (LIFE TECHNOLOGIES) décomplémenté, 1% de pénicilline/streptomycine (5000 unités/5000ug, LIFE TECHNOLOGIES) et 0, 4% de fungizone à 250g/ml (LIFE TECHNOLOGIES), à 37 C en présence de 5% de CO2 et 85% d'humidité. Plasmides utilisés : - PRc/CMV-A2b-Flag contient une séquence codant pour une protéine A2b possédant dans sa partie N-terminale un épitope flag. Ce plasmide a été construit à partir du plasmide PRc/CMV-A2b, contenant la séquence codante du gène A2b humain sous le contrôle du promoteur CMV. Un motif "flag" (DYKDDDK) a été introduit par mutagenèse dirigée en aval du codon initiateur ATG de la protéine A2b. - pDCC-CMV-S contient la séquence codante du gène DCC humain sous le contrôle du promoteur CMV. - pGNET1myc contient la séquence codant pour la nétrine-1 de poulet. Transfection : 18 heures avant transfection, des cellules 293T sont ensemencées à raison de 0, 7. 105 cellules/ml pour la mesure de l'AMPc intracellulaire ou à raison de 1, 8. 105 cellules/ml pour les immunoprécipitations et Western Blot. Les transfections d'ADN dans ces cellules sont ensuite réalisées selon la méthode au phosphate de calcium modifiée par JORDAN et al. [Nucleic Acids Res., 24,596-601, (1996)]. Ainsi, l'ADN (5 zu d'ADN total par 9 cm2 ou 30 g d'ADN total par 78 cm2) est précipité avec du chlorure de calcium 2M pendant 10 minutes à température ambiante, puis mélangé à la solution de transfection HBS concentrée 2 fois (Hepes Buffered Saline de chez FLUKA). Le mélange est incubé 2 minutes à 37OC, et réparti sur les cellules à transfecter. Le milieu de transfection est enlevé au bout de 24 heures et les cellules sont récupérées 48 heures après la transfection. Co-immunoprécupitations Les coimmunoprécipitations sont réalisées à partir de cellules 293T transfectées depuis 48 heures. Les cellules sont lysées dans un tampon de lyse froid contenant 50 mM d'Hepès pH 7,4, 150 mM de NaCl, 5 mM d'EDTA supplémenté avec 0,1% de NP40 et 0,25% d'un cocktail d'inhibiteurs de protéases (SIGMA). La protéine A2b est immunoprécipitée en présence de l'anticorps flagM2 (SIGMA) pendant 2 heures à 4 C. Puis le complexe protéine-anticorps est incubé, pendant 1 heure à 4 oC, avec de la protéine A SEPHAROSE (SIGMA). Finalement, le complexe protéine-anticorps-protéine ASépharose issu de la double incubation est lavé avec du tampon de lyse froid, puis dénaturé à 100OC pendant 5 minutes dans du SB 1X ("Sample Buffer"concentré 1 fois : 40 mM de Tris-HCl, pH 6,8 ; 1% de SDS ; 0,5% de ss-mercaptoéthanol ; 7,5% de glycérol ; 0,003% de Bleu de Bromophénol). L'immunorévélation est ensuite réalisée avec un anticorps anti-DCC (ONCOGENE RESEARCH PRODUCTS). On observe que DCC peut effectivement coimmunoprécipiter avec A2b, en présence de nétrine-1. En revanche, aucune interaction DCC/A2b n'est détectable par co- immunoprêcipitation, en absence de nétrine-1. Les résultats de ces expérimentations confirment l'existence de l'interaction DCC/A2b observée en double hybride, et montrent que cette interaction est favorisée par la présence de nétrine-1. EXEMPLE 2 : CARACTERISATION DES INTERACTIONS ENTRE LES PROTEINES DU COMPLEXE DCC-A2b-NETRINE-1 Les effets potentiels du récepteur A2b sur l'interaction éventuelle de DCC avec la nétrine-1, ont été étudiés par co-immunoprécipitation selon le protocole décrit à l'exemple 1 ci-dessus. Le lysat de cellules 293T co-transfectées avec des plasmides codant pour DCC et la nétrine-1 est incubé avec un anticorps anti-nétrine 1 c-myc 9E10 (SIGMA) ; une éventuelle interaction DCC/nétrine-lA2b est révélée par transfert de Western à l'aide d'un anticorps dirigé contre le domaine extracellulaire de DCC (ONCOGENE RESEARCH PRODUCTS). Des expérimentations ont été effectuées en présence ou en absence d'A2b. Dans ces conditions on observe, en absence d'A2b, une faible interaction de DCC avec la nétrine-1 (contrairement à des observations précédemment rapportées [MEYERHARDT et al., 1999, publication précitée], qui suggéraient une absence d'interaction directe DCC-nétrine). En présence du récepteur A2b, on observe une interaction de DCC avec la nétrine-1 environ cinq fois plus importante, montrant ainsi l'importance d'A2b pour cette interaction DCC- nétrine-1. Pour déterminer si A2b agissait en tant que corécepteur de DCC en potentialisant l'interaction de celui-ci avec la nétrine-1, ou bien s'il interagissait directement avec la nétrine-1, des expérience complémentaires d'immunoprécipitation ont été effectuées, comme décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus, mais en utilisant, à la place du plasmide pDCC-CMV-S le plasmide pCHA-FK-DCCIC [MEHLEN et al., 1998, publication précitée] qui contient une séquence codant un récepteur DCC délété de sa partie extracellulaire (DCCIC) et donc incapable de fixer directement la nétrine-1. L'immunorévélation est alors effectuée avec un anticorps dirigé contre le domaine intracellulaire de DCC. Dans ces conditions on observe, en présence de nétrine-1, une interaction entre DCCIC et A2b similaire à celle observée avec la protéine DCC entière. Ces résultats montrent que DCC paraît principalement interagir indirectement avec la nétrine-1 via le récepteur A2b, et surtout que le récepteur A2b parait capable de lier directement la nétrine-1. EXEMPLE 3 : CARACTERISATION D'UNE INTERACTION A2b/NETRINE-l L'existence d'une interaction directe A2b/nétrine-1 a été confirmée par un test de liaison à la membrane. La technique utilisée est celle décrite par KEINO-MASU et al. [1996, publication précitée]. Des cellules 293T transfectées ou non avec le plasmide PRc/CMV-A2b sont mises, pendant 1 heure, en présence de 2 g/ml de nétrine-1 purifiée, en absence d'héparine. Après trois lavages au PBS, les cellules sont fixées sur lame avec du paraformaldéhyde, puis elles sont incubées avec un anticorps anti-c-myc 9E10 (SIGMA). Un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome (FITC) est ensuite utilisé pour détecter la nétrine-1. La nétrine-1 liée aux membranes est alors visualisée par microscopie à fluorescence (ZEISS AXIOSKOP photomicroscope). Dans ces conditions on observe une fluorescence dans le cas des cellules transfectées avec le plasmide PRc/CMV-A2b, mais pas dans le cas des cellules contrôle nontransfectées. Les résultats du test de liaison à la membrane ont été confirmés par coimmunoprécipitatlon. Des cellules 293T ont été co-transfectées avec et contient la séquence codant pour la nétrine-l de poulet. Le lysat de cellules 293T co-transfectées avec les plasmides PRc/CMV-A2b-Flag (A2b) et pGNETlmyc (nétrine-1) est incubé avec l'anticorps anti-A2b flagM2 ; une éventuelle interaction A2b/nétrine-l est révélée par transfert de Western et révélation à l'aide de l'anticorps anti-nétrine 1 c-myc 9E10. Des expérimentations ont été effectuées en présence ou en l'absence de DCC. On observe, dans ces conditions, une interaction entre la nétrine-1 et le récepteur A2b dans des cellules 293T. Cette interaction A2b/nétrine-1 n'est pas modulée par l'expression de DCC. Il apparaît donc que le récepteur A2b est un récepteur de la nétrine-1. Mesure de la constante de dissociation nétrine/A2b La technique utilisée est celle décrite par KEINO-MASU et al. [1996, publication précitée]. La nétrine-1 i c est marquée à 1'11251 avec la chloramine T en utilisant des billes absorbantes (PIERCE), puis elle est purifiée par gel filtration (colonne D SALT DEXTRAN DESALTING, PIERCE). Cette étape permet de récupérer 84% de nétrine-1 marquée et active. Puis, 2. 105 cellules 293T transfectées avec soit un plasmide codant pour A2b, soit un plasmide contrôle, sont alors incubées pendant 3 heures à 4 C dans du PBS contenant 2 g/ml d'héparine et 1 mg/ml de BSA (Sigma), avec une série de 125 dilutions '1I-nétrine-l. La liaison spécifique de la nétrine-1 correspond à la différence mesurée entre les cellules exprimant A2b et les cellules contrôles. La i o c concentration '1I-nétrine-l liée et la concentration 125 d'1-nétrine-l libre sont déterminées respectivement en mesurant la radioactivité du culot cellulaire après lavages et celle des surnageants. La constante de dissociation, ou Kd, correspond 125 alors à la concentration d'1-nétrine-l requise pour occuper la moitié des récepteurs présents. Le Kd ainsi obtenu est de llnM. De manière intéressante, cette valeur apparaît compatible avec la concentration physiologique de nétrine-1 requise pour orienter la croissance axonale (0,5 nM à 5 nM ; SERAFINI et al., Cell, 78,409-424, (1994)]. Effet de la nétrine sur la liaison spécifique d'un agoniste de l'adénosine au récepteur A2b Pour tester la compétition éventuelle entre les deux ligands, adénosine et nétrine-1, sur le récepteur A2b. Pour cela, l'effet de la nétrine-1 sur la liaison spécifique d'un agoniste radioactif de l'adénosine H-NECA) au récepteur A2b a été étudié. Des cellules transfectées avec A2b sont homogénéisées dans un potter contenant 10 ml de Tris-HCl 50 mM pH 7,4 [LINDEN et al., Mol. Pharmacol., 56,705-713, (1999)]. Après centrifugation 5 minutes à 300 g, le surnageant, débarrassé des noyaux et des débris, est centrifugé 20 minutes à 17000 g à 4 C ; le culot est resuspendu dans le Tris-HCl 50mM pH 7,4. Cette suspension de membranes semi-purifiées est préincubée 30 minutes à 37 C avec l'adénosine déaminase 2 U/ml (Boehringer) pour éliminer l'adénosine endogène. La suspension membranaire (40 Mg de protéines/100 Ml) est alors incubée 3 heures à température ambiante avec 50 nM de 3H-NECA (activité spécifique 26 Ci/mmol, Amersham) dans le tampon Tris-HCl 50mM pH7,4, MgCl2 10 mM, adénosine déaminase 1 U/ml, en absence (liaison totale) ou en présence de différentes concentrations de nétrine-1 purifiée (0,1 nM à 2 M). L'incubation est arrêtée en ajoutant 1 ml de tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,4 à 4 C ; les membranes sont immédiatement séparées du milieu réactionnel par filtration sous vide sur des filtres WHATMAN GF/C prétrempés. Les filtres sont rincés sous vide avec 10 ml de tampon froid, puis transférés dans des fioles de comptage pour mesure de la radioactivité dans un compteur à scintillation (BECKMANN). Les résultats sont illustrés par la Figure 1. On constate que la nétrine-1 provoque une augmentation dose- dépendante de la liaison du 3H-NECA aux membranes de cellules transfectées avec A2b. Ces résultats suggèrent que la nétrine-1 interagit avec le récepteur A2b sur un site différent du site de liaison de l'adénosine, et qu'en outre, elle potentialise la fixation de l'adénosine sur A2b. EXEMPLE 4 : TRANSDUCTION DU SIGNAL NETRINE-1 VIA A2B Des études in vitro ont établi que la réponse du cône de croissance à un gradient de nétrine-1 dépend du taux d'AMPc [MING et al., 1997, publication précitée], et il a été montré que la nétrine-l induit une augmentation du taux d'AMPc dans le cône de croissance [HOPKER et al., Nature 401, 69-73, (1999)]. Il a donc été recherché si l'interaction nétrine 1/A2b induisait un effet sur le taux d'AMPc. Des cellules 293T ont été transfectées avec le plasmide PRc/CMV-A2b, le plasmide pGNETlmyc, ou avec un plasmide contrôle. La production d'AMPc par ces cellules a été déterminé. Ces expérimentations ont également été effectuées en présence d'enprofylline (300 M) un antagoniste spécifique mais peu puissant de l'A2b, ou de DPCPX (1 pM) antagoniste puissant des récepteurs à l'adénosine, mais peu spécifique, ou de NECA (100 M). Le taux d'AMPc dans les cellules 293T est mesuré grâce au kit BIOTRAK cAMP Enzymeimmunoassay System (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH), selon les instructions du fabricant. Le taux d'AMPc intracellulaire des cellules 293T est calculé grâce à une courbe étalon échelonnée de 12, 5 à 3200 fmol d'AMPc. Les résultats sont illustrés par la Figure 2a. Les cellules 293T exprimant le récepteur A2b accusent une augmentation importante du taux d'AMPc en présence de nétrine-1 (quatre fois plus). On constate aussi que l'addition d'enprofylline à 300 pom, ou celle de DPCPX à 1 jLtM., bloque totalement la production d'AMPc induite par la nétrine-1. Il apparaît donc que la nétrine-1 induit une production d'AMPc via le récepteur A2b. En outre, la présence simultanée de la nétrine-l et du NECA induit une forte augmentation de l'AMPc, ce qui confirme les résultats des tests de compétition rapportés à l'Exemple 3. Afin de vérifier que les concentrations de nétrine-1 induisant la production d'AMPc correspondaient à celles permettant de stimuler la croissance axonale in vivo (0, 5-5nM) une courbe dose réponse nétrine/A2b a été effectuée. En outre, pour vérifier que la production d'AMPc observée est indépendante de l'adénosine ou de l'ATP endogène que la nétrine-1 aurait pu générer indépendamment d'A2b, les expériences ont été réalisées en présence d'apyrase (1 U/ml) ou d'adénosine déaminase (1 U/ml) (Fig. 7b), qui sont des enzymes qui dégradent respectivement l'ATP et l'adénosine endogènes. Les résultats sont illustrés par la Figure 2b. On constate qu'une quantité de 0,5 nM de nétrine-1 est largement suffisante pour induire une augmentation de deux fois de l'AMPc intracellulaire, et que la présence d'apyrase ou d'adénosine déaminase n'induit pas de variation significative. Il apparaît donc que la nétrine-1 induit donc bien une stimulation directe de la production d'AMPc via le récepteur A2b. Le rôle de DCC sur la production d'AMPc induite par la nétrine-1 via le récepteur A2b a également été étudié sur des cellules transfectées avec le plasmide PRc/CMV-A2b, le plasmide pGNETImyc, le plasmide pDCC-CMV-S, ou avec un plasmide contrôle. Les résultats sont illustrés par la Figure 2c. Ils montrent que la présence de DCC bloque la production d'AMPc induite par la nétrine-1. Il apparaît donc que le récepteur DCC pourrait jouer un rôle de modulateur dans la production d'AMPc. DCC pourrait alors représenter un co-récepteur d'A2b pour la nétrine. EXEMPLE 5 : IMPLICATION DU RECEPTEUR A2B DANS LE GUIDAGE AXONAL Il a été vérifié si le récepteur A2b était impliqué dans l'effet de la nétrine 1 sur la croissance des axones. Le modèle classique pour étudier la croissance des axones en réponse à un gradient de nétrine-1 est celui des axones commissuraux, qui poussent de la ME (moelle épinière) dorsale jusqu'à la ME ventrale, à partir du stade EU. Cette attraction est médiée par la nétrine-1 produite ventralement par les cellules de la plaque du plancher. La technique utilisée est celle décrite par TESSIER-LAVIGNE et al. [Nature, 336-775-778, (1988)]. Des embryons de rat de 11 jours EU (E0=début de la gestation) sont prélevés et placés dans du milieu L15 (GIBCO). Les embryons sont alors disséqués de manière à récupérer la région de la ME comprise entre les somites 24 à 27. Le tronçon de ME est alors incubé dans du L15 contenant de la dispase 1 mg/ml (BOEHRINGER) pendant 30 minutes à température ambiante. La ME dorsale est récupérée et placée dans une matrice de gel de collagène (80% de collagène, 10% de MEM 10X, 8% de bicarbonate de sodium 7,5%, 2% L15 et 0,2% de NaOH ION) en présence de cellules COS transfectées 24 heures auparavant avec le plasmide pGNETImyc comme source de nétrine-1 [SERAFINI et al., 1994, publication précitée], ou non transfectées. Les expérimentations ont été effectuées en absence ou en présence d'enprofylline (300 pLM). La quantification de l'effet de l'enprofylline se fait par la mesure de la longueur moyenne des axones après 36-40 heures de culture. Les résultats sont illustrés par la Figure 3. On constate que l'addition d'enprofylline (300 M) bloque de manière significative la croissance des axones induite par la nétrine-1. les mêmes résultats ont été observés à d'autres concentrations d'emprofylline (100-600 M), ainsi qu'avec un autre antagoniste, le DPCPX 1 juM. L'ensemble des résultats rapportés ci-dessus montre donc qu'A2b représente un récepteur pour la nétrine-1, et que la présence de ce récepteur est nécessaire pour l'élongation axonale induite par la nétrine 1. EtJ. t TtQ'. S 1) Utilisation d'un modulateur d'un récepteur à l'adénosine pour l'obtention d'un médicament régulateur des effets d'une nétrine et/ou d'un récepteur des nétrines. 2) Utilisation d'un modulateur d'un récepteur à l'adénosine pour la régulation in vitro, par l'intermédiaire dudit récepteur à l'adénosine, de l'activité d'une nétrine et/ou d'un récepteur des nétrlnes. 3) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit récepteur à l'adénosine est le récepteur A2b. 4) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit modulateur est un agoniste dudit récepteur à l'adénosine. 5) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit modulateur est un antagoniste dudit récepteur à l'adénosine. 6) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'on utilise un modulateur d'un récepteur à l'adénosine pour l'obtention d'un médicament permettant de réguler la croissance et/ou le guidage axonal. 7) Utilisation d'une nétrine choisie parmi : - l'utilisation de ladite nétrine pour activer in vitro la production d'AMPc médiée par un récepteur à l'adénosine ; l'utilisation de ladite nétrine pour l'obtention d'un médicament activateur de la production d'AMPc médiée par un récepteur à l'adénosine. 8) Composition comprenant un agoniste d'un récepteur à l'adénosine, et une nétrine. 9) Procédé de criblage in vitro de produits capables de réguler la fonction d'une nétrine, et/ou d'un récepteur des nétrines, caractérisé en ce qu'il comprend : a) l'incubation d'une nétrine et d'un récepteur à l'adénosine, en l'absence du produit à tester et la détermination de l'affinité de la liaison entre ladite nétrine et ledit récepteur à l'adénosine b) l'incubation d'une nétrine et d'un récepteur à l'adénosine, en présence du produit à tester, et la détermination de l'affinité de la liaison entre ladite nétrine et ledit récepteur à l'adénosine ; c) la sélection des produits pour lesquels on observe une différence entre l'affinité mesurée à l'étape a) et l'affinité mesurée à l'étape b).