Brevet FR2815043A1 — publié le 20020412

La présente invention concerne les méthodes de détection et plus particulièrement une méthode de détection d'organismes dans un échantillon. Notre société est de plus en plus sensible aux problèmes de contamination des produits naturels et plus particulièrement des aliments. Les cas de listériose et de salmonellose d'origine alimentaire en sont des illustrations très actuelles. A ces problèmes de santé publique majeurs se greffent des cas de contaminations plus ponctuels, principalement dues à un manque d'hygiène ou à une mauvaise conservation, notamment dans les restaurants ou les cantines. Quelle que soit la nature de la contamination, il est aujourd'hui primordial, d'une part, de pouvoir détecter rapidement la présence de l'agent pathogène et d'autre part de déterminer l'origine de la contamination. Ainsi, la traçabilité des produits naturels tout au long de la chaîne de distribution est devenue un souci majeur tant pour les pouvoirs publics que pour les sociétés qui souhaitent ne plus être tenues pour responsables des problèmes de contamination. En effet, un système de traçabilité permet non seulement de pouvoir détecter rapidement la présence d'un agent infectieux, mais également de déterminer à quel maillon de la chaîne de production est intervenue la contamination afin de l'enrayer. Afin de mettre en évidence la présence d'agents pathogènes, des contrôles qualité sont mis en place tout au long de la chaîne de production. Ces contrôles sont généralement basés sur des analyses microbiologiques des matières premières ou des produits finis lorsqu'il s'agit des produits de confection. Des contrôles de l'environnement de production peuvent également être réalisés. Relativement efficaces pour des produits alimentaires confectionnés, ces contrôles n'ont que peu d'efficacité pour des produits de l'agriculture, qu'il s'agisse de l'élevage ou de la culture. En effet, la nécessité d'obtenir des résultats rapides est souvent peu compatible avec le temps nécessaire à la recherche de microorganismes. Les maladies telles que les parasitoses, les bactérioses, les viroses ou les mycoses peuvent être prévenues par des techniques vaccinales et sont donc contrôlables. Cependant, chez certains animaux d'élevage, les traitements préventifs sont, à ce jour, trop complexes ou coûteux. En outre, ils ne sont pas envisageables chez les invertébrés car ce type d'animaux ne possède pas de système de défense autorisant la vaccination. Par exemple, les viroses sont fréquemment observées dans des élevages de crustacés et elles peuvent avoir des effets dévastateurs puisqu'elles se propagent rapidement et à grande échelle. L'élimination des sujets infectés est donc souvent la seule solution pour éradiquer les contaminations dans certains élevages. Cependant, depuis quelques années, le développement de la génétique et des outils de biologie moléculaire ont permis l'élaboration de nouveaux outils de diagnostic. Ces nouvelles techniques sont principalement basées sur la détection des acides nucléiques des agents pathogènes et en particulier de leur ADN. En effet, l'ADN est la seule macromolécule biologique qui puisse être amplifiée in vitro de façon exponentielle, par réaction en chaîne de l'ADN polymérase (PCR), conférant aux méthodes de détection basées sur cette réaction une sensibilité inégalée. L'ADN étant présent dans tous les organismes, il est primordial de s'assurer de la spécificité du fragment amplifié par PCR (amplicon). Dans les méthodes classiques, celle-ci est assurée par la spécificité des amorces de PCR, oligonucléotides synthétiques qui, en s'hybridant de part et d'autre du segment d'ADN recherché, vont garantir son identification. Néanmoins, ce seul critère n'est pas suffisant. En général, une électrophorèse de l'amplicon permet à la fois de le visualiser et d'estimer sa taille, apportant ainsi un critère supplémentaire. Cette méthode, couramment employée dans les laboratoires de recherche, est également proposée dans certains kits de diagnostic. Cependant, elle est souvent trop peu sensible et demande une intervention manuelle difficilement automatisable. L'hybridation d'une sonde spécifique s'associant sélectivement à l'ADN recherché est souvent nécessaire pour préciser le diagnostic. Une première méthode est l'hybridation in situ. Il s'agit d'une méthode précise et très utile pour localiser les cibles cellulaires, par exemple d'un virus. Elle consiste à utiliser les tissus fixés d'un animal pris dans la cire, coupés en fines sections et placés sur une lame microscopique. La lame portant le tissu et la sonde de détection sont ensuite chauffées, de façon à séparer les doubles brins d'ADN. Le tissu est ensuite mis en contact avec la sonde de détection. Il s'agit d'une sonde ADN, marquée avec une molécule spécifique telle que la digoxigénine (DIG). La sonde marquée à la DIG s'hybride (se lie) très spécifiquement à la cible ADN de l'organisme recherché si celui-ci est présent dans l'échantillon. Des anticorps spécifiques de la DIG couplés à une enzyme sont ajoutés à la lame. Les anticorps conjugués se lient à la DIG et lorsque le substrat de l'enzyme est ajouté, un changement de couleur se produit. Ce précipité coloré est alors visible dans les tissus spécifiquement infectés par l'organisme. Le précipité est visible au microscope. Cette méthode possède différents inconvénients. Elle consiste tout d'abord en un procédé long, demandant plusieurs jours de préparation du tissu, afin de pouvoir le couper. Elle nécessite également de pouvoir accéder à un laboratoire d'histologie sophistiqué, dans lequel il est possible de trouver les outils nécessaires à la préparation et à l'observation de sections de tissus. Il existe de plus un risque important de faux négatifs dans le cas où le niveau de contamination du produit ou de l'organisme est faible. La deuxième méthode basée sur l'utilisation de sondes génomiques est la méthode"Dot Blot". Il s'agit d'une méthode qui comporte la même procédure de base que l'hybridation In Situ (Khandjian, 1987). Cependant, la détection ne se fait pas sur des tissus fixés, mais sur des tissus macérés ou un échantillon de sang, appliqué sur une membrane. La"cible", correspondant à l'échantillon d'ADN à tester, est fixée en premier sur la membrane et la"sonde", correspondant à l'ADN de l'organisme recherché, est marquée et est présente dans la solution d'hybridation. Avant leur application sur la membrane, les échantillons sont tout d'abord chauffés pour séparer les brins d'ADN de l'organisme recherché, si celui-ci est présent. De même, la sonde d'ADN, marquée à la DIG, doit être chauffée pour séparer les brins d'ADN, avant d'être ajoutée sur la membrane. Le système de révélation à la DIG permet de visualiser une tache sombre, indicatrice de l'infection des échantillons. L'intensité de la tache est proportionnelle à la quantité d'organismes présents dans l'échantillon. En effet, plus la tache est sombre et plus l'infection est importante. Cette méthode possède également des inconvénients. L'inconvénient majeur est qu'il est parfois difficile de distinguer les réactions positives du bruit de fond. Il est donc nécessaire d'introduire des contrôles appropriés sur la membrane test. Toutefois, l'interprétation des résultats reste subjective. De plus, cette méthode n'est pas assez sensible pour pouvoir détecter les faibles niveaux de contamination. De nouveaux outils, appelés"puces à ADN", ont été développés dans les cinq dernières années. Les"puces à ADN" sont des supports de plastique, de verre, de silicium ou autre, d'une taille avoisinant le centimètre carré, sur lesquels sont greffés ou synthétisés des sondes d'ADN complémentaires du produit recherché d'une longueur de 0, 5 à 2 kilobases (kb), ou de courts oligonucléotides, avec lesquels peuvent s'hybrider des séquences d'ADN que l'on cherche à identifier. Grâce à des procédés robotisés, des dizaines de milliers de ces sondes sont disposées, sous forme de"spots", le long d'un réseau régulier gravé à la surface de la puce. Chaque"spot"contient de nombreux exemplaires d'une séquence d'ADN correspondant à un gène unique. Les sondes de la puce sont ensuite hybridées avec des échantillons, c'est à dire l'ensemble des ADN complémentaires (ADNc) correspondant aux ARN messagers extraits de tissus d'origine biologique. Ces échantillons sont marqués, généralement à l'aide d'un fluorochrome. Après lavage, les spots où s'est produite l'hybridation peuvent être révélés par le marquage fluorescent. Les mesures les plus courantes sont effectuées afin d'évaluer l'expression différentielle de gènes de deux échantillons (M. Schena et al. (1995). Science, 270,467). Elles sont réalisées par hybridation compétitive en utilisant un marquage par fluorescence en deux couleurs. La lecture optique par des faisceaux laser capables d'exciter les fluorochromes permet de récolter les données qui seront ensuite traitées par un logiciel permettant d'obtenir une image où est représenté un ensemble de taches colorées d'intensité variable et correspondant aux ADNc des échantillons hybridés aux sondes. Les"puces à ADN"portent aujourd'hui les noms d'oligonucleotide chips (Affymetrix), de macroarrays (Gress, T. M., Hoheisel, J. D., Lennon, G. G., Zehetner, G. ; Lehrach, H. (1992)-Mamm. Genome, 3, 609) et (Piétu G., Alibert, A., Guichard, V., Lamy, B., Bois, F., et al. (1996)-Genome Research, 6,492) et de microarrays (DeRisi, J. L., Vishwanath, R. Y. and Brown, P. O. (1997). Science, 278,680) et (Wodicka, L., Dong, H., Mittmann, M., Ho, M. H., and Lockhart, D. J. (1997). Nature Biotechnology, 15,1359) selon la taille des dépôts. Les macroarrays représentent des puces de quelques dizaines de sondes par cm2 contrairement aux microarrays ou aux oligonucleotide chips qui contiennent plusieurs milliers de sondes au cm2. Les Macroarrays, issus de travaux de l'équipe de B. Jordan publiés en 1995 (Technique de Multiple Messenger Assay (MMA) (C. Nguyen, D. Rocha, S. Granjeaud, M. Baldit, K. Bernard, P. Naquet, and B. R. Jordan,"Differential gene expression in the murine thymus assayed by quantitative hybridization of arrayed cDNA clones,"Genomics, vol. 29, pp. 207-216,1995), concernent des"membranes à haute densité" : des clones d'ADNc (issus d'une banque) ou leurs produits de PCR sont disposés régulièrement sur des membranes de Nylon, lesquelles sont hybridées avec des sondes complexes radioactives produites par rétrotranscription d'une préparation d'ARN messager ou total. Après hybridation, l'ensemble des données est acquis de manière quantitative, généralement par un système à écran phosphore, et le niveau d'expression de chacun des gènes représentés est ainsi mesuré (plus précisément l'abondance relative de chacun des ARN messagers dans le mélange de départ). Plusieurs fabricants commercialisent des membranes prêtes à l'emploi portant quelques centaines ou quelques milliers de gènes. Sous sa forme la plus répandue, cette technique utilise des membranes d'assez grandes dimensions, avec une densité de quelques dizaines de dépôts par cm2 et un espacement entre les spots supérieur à un millimètre, compatible avec une détection par des sondes marquées à la radioactivité telles que des sondes marquées au phosphore 32 (32p) ou au phosphore 33 (33p). Les microarrays, quant à eux, comportent quelques milliers de gènes représentés par des produits de PCR déposés sur une lame de verre traitée. L'hybridation est effectuée avec une sonde (ADNc) complexe obtenue par rétrotranscription du mélange d'ARN en présence de nucléotides substitués autorisant une détection ultérieure (directe ou non) par fluorescence. L'acquisition des résultats est généralement effectuée par un système de balayage laser équipé d'une optique confocale, les signaux étant mesurés par un photomultiplicateur. Un autre système consiste à synthétiser directement les sondes sur un support de silice. Il s'agit du procédé de synthèse in situ d'oligonucléotides (adressage photochimique) (G. McGall, J. Labadie, P. Brock, G. Wallraff, T. Nguyen, and W. Hinsberg,"Light-directed synthesis of high-density oligonucleotide arrays using semiconductor photoresists,"Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 93, pp. 13555-60,1996) exploité par la société Affymetrix. L'hybridation de la sonde et de la cible est suivie par fluorescence. Différents types de marquage sont actuellement proposés : le radiomarquage par des méthodes classiques au phosphore 32 ou 33. La lecture de l'hybridation obtenue est saisie par autoradiographie ou grâce à un appareil tel que le PhosphoImager (Molecular Dynamics) qui permet une quantification précise des signaux, - la fluorescence qui permet d'atteindre un seuil de détection très bas par l'utilisation, par exemple, du microscope à confocale. De plus, de part la multitude de fluorochromes disponibles sur le marché, un large choix s'offre aux équipes de recherche afin d'affiner la lecture des signaux émis, - la détection colorimétrique (enzymatique). Les puces à ADN possèdent toutefois plusieurs inconvénients majeurs. En effet, elles permettent théoriquement l'hybridation simultanée d'un nombre de sondes considérable. Or, réaliser en parallèle des milliers de réactions d'hybridation impliquant des compositions de bases différentes (donc de stabilité différente) représente une difficulté technique importante. Il est primordial de trouver l'équilibre optimal d'hybridation pour chacun des duplex sonde-cible. Un autre inconvénient concerne les difficultés de mise en oeuvre de ces techniques. Les puces à ADN à"haute densité"sont d'une très haute sophistication, sont très coûteuses et demandent des équipements pour la lecture et l'interprétation des résultats qui sont lourds, coûteux et complexes à utiliser. La mise au point de nouvelles puces permettant la détection de micro-organismes nécessite de multiples compétences dans des domaines aussi variés que l'électronique, la chimie des nucléotides, la micromécanique, la micro-optique, ou encore la micro-chimie, ce qui complique fortement le développement de tels outils. Le but de l'invention est de pallier ces inconvénients en fournissant une méthode rapide de détection de contamination par des organismes, chez un homme, un animal, dans un tissu ou une cellule facile à mettre en oeuvre, nécessitant peu de moyens techniques, possédant une sensibilité suffisante pour détecter tant les faibles niveaux de contamination que les contaminations importantes et permettant également de déterminer la quantité d'organismes en présence d'un appareillage spécifique. L'invention concerne donc une méthode rapide de détection des ADN d'un ou de plusieurs organismes dans un échantillon consistant à : - préparer au moins une sonde spécifique du ou des organismes, - immobiliser la sonde sur un support approprié, saturer le support avec des fragments d'ADN ne réagissant pas avec les produits recherchés pour éviter toute interaction non spécifique des produits avec le support lui-même, - prélever l'échantillon sur un produit ou un sujet, extraire l'ADN du ou des organismes contenu dans l'échantillon, amplifier le ou les ADN du ou des organismes simultanément, afin d'obtenir un ou plusieurs amplicons, marquer lesdits amplicons, - hybrider le ou les ADN amplifiés et marqués avec la ou les sondes immobilisées sur le support, - révéler le marquage et, examiner directement le résultat, ou obtenir une image numérique de la membrane colorée. Un autre objet de l'invention est un kit permettant de mettre en oeuvre le procédé de détection selon l'invention. Selon un mode de réalisation, la méthode selon l'invention est spécialement utilisée pour détecter la présence de microorganismes pathogènes et notamment de virus, dans des populations de crustacés. Les buts, objets et caractéristiques ressortiront mieux à la lecture de la description qui suit faite en référence aux dessins joints dans lesquels : La figure 1A représente les résultats des tests concernant les témoins internes positifs de PCR, avec dépôt d'un échantillon à trois concentrations différentes. La figure 1B représente les résultats des tests concernant les témoins internes positifs de PCR, avec différents échantillons. La figure 2 représente les résultats des tests de détection du virus WSSV, en fonction de différentes conditions d'hybridation. La figure 3 représente les résultats des tests de sensibilité de la méthode selon l'invention en fonction de la concentration de virions WSSV et le nombre de cycles de PCR. La figure 4A représente les résultats des tests de détection du virus WSSV en fonction de la variation de la quantité de sondes et de la quantité de cibles. La figure 4B correspond au graphique représentant l'intensité des taches obtenues lors des tests représentés à la figure 4A. La figure 5 représente les résultats de la quantification de charge virale par la méthode selon l'invention. La figure 6 représente les résultats obtenus lors de l'évaluation du seuil de détection de la méthode selon l'invention et la comparaison avec la méthode Dot Blot et la méthode PCR. La figure 7 représente les résultats de l'analyse par la méthode selon l'invention, de trois tissus dont le tropisme pour le virus WSSV est le plus élevé. Exemple 1 : Préparation de la sonde du virus WSSV (White Spot Syndrome Virus) : La souche de White Spot Syndrome Virus (WSSV) utilisée provient de la crevette Panaeus monodon et a été fournie par l'Aquaculture Pathology Group (Arizona, USA). La sonde spécifique du virus WSSV est obtenue par amplification génique, grâce à la technique de polymérisation en chaîne (PCR). Les amorces oligonucléotidiques spécifiques sont choisies pour amplifier un fragment de 500 paires de bases (pb) du clone plasmidique L46. Ce clone, issu d'une banque génomique, contient un fragment du génome du virus WSSV (2200pb) provenant de la crevette Penaeus chinensis qui a été montré par hybridation in situ et par Dot Blot comme étant une séquence signature spécifique du virus WSS (Shi et al., 1998). Le clone L46 est mis en culture à 37 C toute une nuit sous agitation dans 3 millilitres (ml) de milieu LB liquide contenant 300 microgrammes (rug) d'ampicilline. L'extraction de l'ADN plasmidique avec l'insert se fait par minipréparation. L'ADN plasmidique sert ensuite de matrice pour la synthèse de la sonde L46. Le principe consiste à utiliser des amorces spécifiques de l'ADN viral (insert) afin d'obtenir par la technique PCR, un fragment spécifique du génome viral. Dans la solution de réaction sont mélangés 0,5 micromolaires (pM) de chacune des deux amorces (sL46 ; 3'CCAAGTACGTAGTGGGTG-5'et asL46 ; 3'-GTATTGCTCACCTCTTCC-5'), 2,5 mM de MgCl2, du tampon d'enzyme (TE) IX, 4 unités de Taq polymérase, 100 uM de dATP, dCTP, dGTP, dTTP et 1 pl de l'ADN plasmidique dilué au 1/20e (3-4 nanogrammes (ng) ). Le volume final est ajusté à 100 pl avec de l'eau stérile. L'amplification est réalisée dans les conditions suivantes : - premier cycle une fois : 2 min à 95OC ; - deuxième cycle 40 fois : 30 sec à 95 cl, 30 sec à 58OC, 1 min à 72 C ; - troisième cycle une fois : 2 min à 72 C puis à 4 C sans limitation de temps. Le produit de PCR est purifié sur colonne afin d'enlever les amorces, précipité avec 2,5 volume d'éthanol 100% froid et 0,1 volume d'acétate de sodium 3 M, pH 5, congelé 30 min à - 80oC puis centrifugé à 10000 g pendant 30 min. Le surnageant est éliminé et le culot repris dans 500 pl d'éthanol 70% froid. Après une centrifugation de 10 min à 10000 g, le culot est séché et resuspendu 10 min à 65 C dans du TE IX, pH 8. Le produit de PCR purifié et concentré est vérifié sur gel d'agarose 1 % et, après mesure de la densité optique au spectrophotomètre, la sonde est ramenée à la concentration voulue par dilution dans du TE IX, pH 8. Par approximation, 1 ng d'ADN double brin (db) mesuré au spectrophotomètre correspond à 4. 109 molécules d'ADN simple brin (sb). Exemple 2 : Préparation de la sonde spécifique au témoin interne de PCR La sonde correspondant au témoin positif est obtenue par PCR sur un plasmide issu d'une banque SAGE. Ces plasmides contiennent des concatémères formés d'un grand nombre de fragments d'ADN agencés au hasard. Ce caractère aléatoire réduit de manière radicale les risques d'interférence avec le produit recherché. En outre, étant donné qu'une banque de plasmides SAGE contient plusieurs dizaines de milliers de telles séquences aléatoires, il est possible d'en sélectionner une qui ne réagira pas avec le produit recherché, quel qu'il soit. Avec les amorces oligonucléotidiques M13as et M13s, spécifiques du plasmide, un fragment de l'insert de 300 à 500 pb est amplifié dans les mêmes conditions PCR que celles décrites à l'exemple 1. Sans risque de croisement avec l'ADN du microorganisme recherché, ce type de sonde est donc idéal pour constituer un témoin positif. Ce plasmide SAGE correspondant au témoin positif de PCR est nécessaire pour"valider"le bon déroulement de la PCR et de l'hybridation. Il évite le risque de faux négatifs dus à une inhibition de la PCR causée par l'échantillon à tester ou encore des erreurs de manipulation lors de l'étape de PCR ou d'hybridation. En cas d'inhibition ou d'erreur, le plasmide témoin, présent dans le tube de PCR avec l'échantillon n'est pas amplifié au cours de la PCR multiplex ou ne s'hybride pas avec sa propre sonde. La validation du résultat d'une membrane n'est donc possible que lorsque la tache colorée du témoin apparaît à l'endroit où est déposée la sonde spécifique au témoin interne. Dans l'invention, il est préférable de déposer à une extrémité de la membrane, des échantillons correspondant au témoin positif de PCR (2,5. 1011 molécules d'ADN sb). A côté de ces dépôts de témoins positifs, on réalise un dépôt de témoin négatif d'hybridation (produit de PCR exogène, issu d'un plasmide autre que les plasmides SAGE et L46) et pour lequel aucun spot ne doit apparaître après la révélation colorimétrique. Les résultats sont représentés à la figure 1A représentant la membrane sur laquelle ont été faits les dépôts. A la figure 1A, 10 représente les deux dépôts de témoin positif de PCR, 12 correspond au dépôt du témoin négatif d'hybridation et 14 correspond aux dépôts des trois concentrations décroissantes de la sonde spécifique du microorganisme pathogène. La figure 1B représente d'autres résultats de PCR avec différents échantillons, permettant de voir l'intérêt des témoins interne PCR, dans laquelle Te correspond au résultat de PCR avec un témoin négatif (hémolymphe non infectée) ; S, 2 et 1000 correspondent aux résultats de PCR avec des concentrations de cible respectivement égales au seuil de détection, soit 0,2. 103 virions/pl, à 2. 103 virions/pl et 1000. 103 virions/pl d'hémolymphe ;-1 correspond à un résultat faux négatif, dont l'absence de témoins PCR est due à une erreur de manipulation (absence de Taq polymérase) et - 2 correspond à un résultat faux négatif, dont l'absence de témoins PCR est due à une mauvaise clarification (pas de centrifugation après l'étape de chauffage). Les témoins positifs PCR permettent donc d'être certain que l'absence de taches au niveau des dépôts de cibles n'est pas due à une mauvaise PCR. Exemple 3 : Immobilisation de la sonde sur membrane de Nylon La sonde est dénaturée 3 min à 95 C et fixée immédiatement dans la glace avant de déposer des échantillons de 1 pl sur 1 cm2 de membrane de Nylon chargée positivement. Dans le cas de membranes placées dans une plaque de 24 puits, la densité peut aller jusqu'à 9 dépôts par membrane avec un espacement entre les dépôts de 2 mm. Après 10 min de séchage à température ambiante la membrane est préhybridée pendant 30 min, toujours à température ambiante, dans du tampon d'hybridation (6X SSC, 0,1 % Nlauroylsarcosine, 0,02 % SDS, 1 % lait écrémé, 1 % tween 20) puis séchée à l'air libre pour être déposée au fond d'un puit de la plaque à 24 puits. Les membranes sont ainsi conservées et stables à l'abri de la lumière à 4 C. Les sondes correspondant aux témoins positif et négatif de PCR sont déposée, selon le même protocole que ci-dessus, sur la membrane de Nylon, à côté de la sonde spécifique de l'ADN du WSSV. - Résultat de l'hybridation de la sonde : Les résultats de l'hybridation de la sonde sont représentés à la figure 2, dans laquelle Te représente l'échantillon sain (témoin négatif), I l'échantillon infecté, (a), (b), (c) et (d) les différentes conditions d'hybridations : Sonde Cible (a) Par PCR à partir de 20 ng Volume d'hybridation de 0,5 ml de matrice plasmidique (b) 80 ng de plasmide L46 Dépôt direct sur la membrane (c) Par PCR à partir de 20 ng Dépôt direct sur la membrane de matrice plasmidique (d) Par PCR à partir de 2 ng Dépôt direct sur la membrane de matrice plasmidique Lors la condition (a), le dépôt est effectué directement sur la membrane, ce qui a pour effet de favoriser l'interaction moléculaire entre la sonde et la cible et donc d'augmenter la sensibilité et la rapidité de la méthode. Avec la condition (b), on peut voir que la fixation sur la membrane du plasmide L46 et non d'un produit de PCR issu du même plasmide augmente de façon importante le bruit de fond par des hybridations non spécifiques. De plus, en comparant les conditions (c) et (d), on peut voir que, lors de l'étape de fabrication de la sonde par amplification génique, la quantité de matrice plasmidique dans le mélange réactionnel de PCR doit être la plus faible possible pour réduire le bruit de fond au maximum. Pour réduire le bruit de fond, la préparation de la sonde est une étape tout aussi critique que celle du lavage. Une fois ces deux étapes optimisées, le bruit de fond est quasi inexistant. Cependant, il peut arriver que ce dernier apparaisse plus élevé, en particulier si l'étape du brassage de la membrane ne s'est pas faite correctement. Exemple 4 : Préparation de la cible - Clarification à partir de tissus de crustacés dont la contamination est recherchée : Les pléopodes ou les branchies des crustacés, ici les crevettes Panaeus monodon, sont broyés dans du tampon TN IX (20 mM Tris-HCl, 0, 4 M NaCl, pH 7, 4) à raison de 0, 1 g de tissus pour 1 g de tampon (dilution au 1/10e). De force ionique élevée, ce tampon est isotonique au milieu intérieur des crustacés marins et limite donc les chocs osmotiques. L'homogénat est centrifugé à 10000 g pendant 10 min afin de précipiter les débris de tissus. Le surnageant est ensuite chauffé 10 min à 100 C, vortexé puis centrifugé à 10000g pendant 10 min. Pour éliminer tous les agglomérats de tissus et donc prévenir une inhibition de la PCR, le surnageant est centrifugé de nouveau 10 min dans les mêmes conditions. - Clarification à partir de l'hémolymphe de crustacés dont la contamination est recherchée : L'hémolymphe, prélevée à l'aide d'une seringue, est immédiatement déposée dans la glace pour éviter toute coagulation. Contrairement aux tissus, l'hémolymphe ne nécessite pas de broyage et donc n'a pas besoin d'être diluée dans du tampon mais est directement centrifugée à 10000 g pendant 10 min pour enlever les débris cellulaires. La suite du protocole de clarification est la même que celle utilisée pour les tissus. - Evaluation du seuil de détection : Afin de définir le nombre de cycles de PCR nécessaires pour que la réaction de marquage de la cible soit efficace, un seuil de détection a été déterminé en effectuant des dilutions d'une suspension virale pure dans de l'hémolymphe non infectée. Cette suspension virale a été obtenue par purification du virus à partir de l'hémolymphe infectée provenant d'une étrille Liocarcinus vernales. Après mesure au spectrophotomètre, la charge virale de la suspension virale est estimée à 2 millions de virions par ul. La dilution de cette suspension virale pure dans de l'hémolymphe non infectée a permis de définir un plateau d'amplification à 40 cycles de PCR et un seuil de détection de la méthode de 200 virions par pl d'hémolymphe. La suspension de virus purifiés observée en microscopie électronique à transmission est composée essentiellement de nucléocapsides, les enveloppes étant dégradées au cours de la purification. Après mesure au spectrophotomètre, la charge virale de cette suspension est estimée à 2 millions de virions par ul. La dilution de cette suspension virale pure dans de l'hémolymphe non infectée a permis de définir le nombre de cycles de PCR nécessaires pour que la réaction de marquage de la cible soit efficace. D'autre part, nous avons pu déterminer un seuil de détection. Les résultats sont représentés à la figure 3.16 correspond au nombre de cycles de PCR, 18 correspond au nombre de virions par pl d'hémolyse déposés sur la membrane, Te correspondant au témoin négatif (hémolymphe non infectée). Les résultats montrent que le plateau d'amplification est atteint dès 38 cycles de PCR et le seuil de détection de la méthode est de 200 virions par pl d'hémolymphe. - Gamme de variation Sonde/Cible étudiée par la méthode selon l'invention (avec marquage par 40 cycles de PCR) : Une gamme de variation sonde/cible a été réalisée. Le nombre de sondes ADN sb déposées sur la membrane varie entre 0,004. 1011 et 16. 1011. La quantité de cibles varie entre 0,002. 103 et 2000. 103 virions/pl d'hémolymphe. Les résultats obtenus sur la membrane, sont représentés à la figure 4A, dans laquelle 20 représente le nombre de sondes ADN sb (x 10), 22 représente le nombre de virions/pl d'hémolymphe (x103), Te correspondant au témoin négatif (hémolymphe non infectée). La figure 4B correspond à un graphique représentant l'intensité des taches obtenues sur la membrane en fonction des quantités de sondes et de cibles utilisées. 24 correspond à l'intensité des taches mesurée par le programme ImageTool, 26 représente le nombre de sondes ADN sb (x 1011) et 28 représente le nombre de virions/pl d'hémolymphe (x103), Te correspondant au témoin négatif (hémolymphe non infectée). Les résultats montrent que, lorsqu'un nombre de sondes inférieur à 0.04 1011 molécules d'ADN sb (1 ng) est déposé sur la membrane de Nylon, aucune tache n'apparaît, même avec de fortes concentrations en cibles marquées. Au-delà de 4. 1011 molécules d'ADN sb (long) déposées, l'intensité des tache atteint un plateau avec les fortes concentrations en cibles et du bruit de fond apparaît sur les membranes pour les témoins négatifs. Avec la fraction contenant 2. 106 virions/ul, une inhibition partielle de la PCR est observée. Cela suggère que la charge virale est trop élevée : l'excès de protéines virales et/ou d'inhibiteurs viraux ralentissent l'amplification mais ne l'inhibent jamais complètement. Cette observation montre à quel point il est important de tester une gamme de dilutions à partir des clarifications. Exemple 5 : Amplification PCR de la cible et marquage à la Digoxygénine Le marquage de l'ADN cible, issu des crustacés à diagnostiquer, est réalisé par amplification génique où une partie des molécules de dTTP est remplacée par le dUTP marqué à la Digoxygénine. L'amplification par PCR du génome viral permet de tester des échantillons faiblement infectés. Dans la solution de réaction sont mélangés 0,5 uM de chacune des deux amorces (sL46 ; 3'-CCAAGTACGTAGTGGGTG-5'et asL46 ; 3'-GTATTGCTCACCTCTTCC-5'), 0, 1 uM de chacune des deux amorces M13s et M13as, 10 picogrammes (pg) du plasmide correspondant au témoin interne de PCR, 2,5 mM de MgCl2, du tampon d'enzyme IX, 2 unités de Taq polymérase, 200 uM de dATP, dCTP, dGTP, 190 uM de dTTP, 10 uM de digoxygénine-11dUTP et lui de la clarification à tester. L'amplification est réalisée dans les conditions suivantes : - premier cycle une fois : 2 min à 95 C ; - deuxième cycle 40 fois : 30 sec à 95OC, 30 sec à 62OC, 1min à 72 C ; - troisième cycle une fois : 2 min à 72 C ; - quatrième cycle une fois : 2min à 95 C puis à 4 C sans limitation de temps. Exemple 6 : Hybridation de la cible sur la membrane de Nylon Les 50 pl du produit de PCR correspondant à la cible sont déposés sur la membrane pour une hybridation de 30min à température ambiante. Ensuite, le filtre est lavé brièvement à température ambiante dans lml de 2X SSC contenant 0,1 % de SDS, puis deux fois 5 min à température ambiante dans 1 ml de cette même solution et enfin trois fois 10 min dans lml d'une solution chauffée entre 40 et 50oC, composée de O, lX SSC contenant 0,1 % de SDS. Afin de décrocher les cibles mésappariées, les lavages se font sous agitation continue et forte stringence. L'étape d'hybridation diffère des techniques habituellement utilisées en ce que l'hybridation elle-même se fait à faible stringence. La contrainte intervient lors des lavages. Généralement, l'hybridation se fait à forte stringence et ce sont les lavages qui sont classiques. Cette nouvelle façon de procéder permet d'augmenter fortement la sensibilité de la méthode selon l'invention. Exemple 7 : Révélation colorimétrique et analyse d'image Après l'hybridation, la membrane est bloquée à température ambiante pendant 15 min dans 0,5 ml d'une solution TBS IX (10 mM Tris Hic1, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,3 % BSA), 1 % lait écrémé, 2 % sulfate de dextran. La membrane est ensuite rincée brièvement au TBS IX. L'anticorps anti-digoxigénine conjugué à la phosphatase alkaline, est employé pour détecter les spots sur la membrane. Pour cela, le filtre est incubé 30 min à température ambiante avec 0, 5 ml du tampon TBS IX contenant une dilution au 1/5000 de l'anticorps (soit une activité enzymatique de 150 mU/ml). La membrane est ensuite lavée sous agitation à température ambiante quatre fois 10 min dans 1 ml de TBS IX puis équilibrée 2 min dans 0, 5 ml d'une solution composée de 100 mM Tris Hic1, pH 9, 5 (20oC), 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2. Puis, le filtre est incubé avec 0,5 ml de cette même solution contenant 100 pg de NitroBlueTetrazolium (NBT) et 100 ug de 5 Bromo-4 Chloro-3 Indolyl Phosphate (BCIP). Après 10 min de révélation, le développement colorimétrique est stoppé en incubant la membrane 5 min dans du PBS IX contenant 20 mM EDTA. La membrane est conservée dans cette solution à l'abri de la lumière. L'image peut ensuite être numérisée grâce à un scanner, puis l'intensité des taches est mesurée par un logiciel calculant le niveau de gris moyen par tache. Les valeurs mesurées sont ensuite inversées pour avoir des intensités comprises entre 0 (blanc) et 255 (noir). L'image peut également être facilement analysée à l'oeil nu. Résultats : - Quantification de l'infection : Les résultats de la quantification de la charge virale par la méthode selon l'invention sont représentés à la figure 5, dans laquelle Te, faible, moyen-fort et très fort représentent les niveaux d'infections, Te correspondant à l'échantillon non-infecté, et 1 et 10, les dilutions dans l'eau stérile de l'échantillon analysé (hémolymphe), 1 correspondant à l'échantillon non dilué et 10 à l'échantillon dilué au 1/10me. L'analyse de l'intensité des taches sur deux membranes par animal contaminé à différents stades de l'infection permet d'appréhender le niveau de l'infection. Pour un animal sain (Te), aucune tache spécifique de l'organisme pathogène ne doit apparaître sur les deux membranes. Pour un animal faiblement infecté, les taches de faible intensité se révèlent uniquement sur la première membrane. Pour les échantillons moyennement à fortement infectés, l'intensité des taches est élevée sur les deux membranes. Enfin, si un animal est fortement infecté, il y aura inhibition partielle de la PCR avec la fraction non diluée de l'hémolymphe et l'intensité des taches est élevée uniquement sur la deuxième membrane. - Les contrôles : Pour valider un résultat positif à la détection du WSSV, l'agent pathogène, dans un échantillon (apparition d'une spot colorée), il est important de réserver sur la plaque, deux membranes pour le seuil de détection préalablement déterminé (200 virions/ul). Ce seuil peut être obtenu avec un mélange de PCR contenant le plasmide L46 calibré et donnant l'équivalant du seuil de détection. Pour qu'un échantillon soit WSSV positif, les membranes devront avoir une intensité des taches proche ou supérieure au seuil. Ainsi, les risques de faux positifs dus à un bruit de fond trop élevé (mauvais lavages) sont totalement écartés. Afin d'effectuer les contrôles négatifs, deux membranes sont hybridées à partir d'un mélange de PCR contenant uniquement le plasmide"témoin interne de PCR". L'analyse d'un échantillon se fait sur deux membranes : la première est testée avec la fraction non diluée de l'échantillon de tissu de l'animal testé et la seconde avec la fraction diluée au 1/10ère. Avec deux membranes pour témoins négatifs et deux autres pour le seuil de détection, 20 membranes soit 10 échantillons par plaque de 24 puits peuvent être analysés. Exemple 8 : Comparaison des sensibilités des méthodes Dot Blot et la méthode de détection selon l'invention - Le Dot blot : Dans la méthode Dot Blot, la"cible"correspond à l'échantillon d'ADN à tester fixé sur la membrane et la "sonde"fait référence aux molécules d'ADN marquées et présentes dans la solution d'hybridation. - Préparation de la cible Les clarifications des échantillons sont obtenues selon les mêmes protocoles développés dans la méthode selon l'invention. Après dénaturation 3 min à 95 Oc et fixation dans la glace, des échantillons de 1 pl de ces clarifications sont déposés sur la membrane de Nylon. Après 10 min de séchage à température ambiante, la membrane est préhybridée 1 h à 68 C dans 2 ml de tampon d'hybridation (5X SSC, 0, 1% N-lauroylsarcosine, 0, 02 % SDS, 0, 5 % Bloking reagent, Roche Diagnostic). - Préparation de la sonde et hybridation sur la membrane de Nylon L'ADN plasmidique du clone L46 sert de matrice pour la synthèse de la sonde par PCR. Le protocole est le même que celui utilisé dans la méthode selon l'invention, à ceci près que la sonde est marquée en incorporant dans la solution de réaction 200 uM de dATP, dCTP, dGTP, 190uM de dTTP, 10 uM de digoxygénine-11-dUTP. La sonde est ajoutée dans la solution de préhybridation à la concentration finale de 800 ng/pl pour une incubation d'une nuit à 68OC. Le lendemain, quatre lavages à TA sont effectués pour éliminer les sondes non hybridées ; deux lavages de 5 min dans 50 ml de tampon 2X SSC contenant 0,1 % de SDS puis deux lavages de 15 min dans 50 ml de tampon 0, 1X SSC contenant 0,1 % de SDS. - Révélation colorimétrique et analyse d'image Après l'hybridation, la membrane est bloquée à TA pendant 30 min Odans 50 ml d'une solution TBS IX, 0,5 % Bloking reagent. Le filtre est ensuite incubé 30 min à température ambiante dans 2 ml de tampon TBS IX contenant une dilution au 1/5000 de l'anticorps. Le filtre est ensuite lavé deux fois 15 min avec 50 ml de tampon TBS IX puis incubé dans le noir avec 2 ml de la solution de révélation contenant 200 pg de NBT et 200 pg de BCIP. Le développement colorimétrique est stoppé après 2 h de révélation par incubation dans une solution PBS IX, 20 mM EDTA. Le plasmide, qui possède la séquence L46, est déposé sur la membrane et sert de témoin positif. Un témoin négatif, constitué d'hémolymphe non infectée, est également déposé sur la membrane. Comparaison de la sensibilité de la méthode selon l'invention et du Dot Blot - Purification du virus à partir de l'hémolymphe : L'hémolymphe infectée (6 ml) provenant de Liocarcinus vernalis (étrille) est broyée dans du tampon TN IX (0,02 M Tris-HCl, 0,4 M NaCl, pH 7,4) puis clarifiée à 1400 g pendant 10 min pour enlever les débris cellulaires. Le surnageant est centrifugé à 113000 g pendant 1 h (L7 Beckman). Puis, le culot de cette deuxième centrifugation est remis en suspension dans 1 ml de tampon TN IX et déposé sur un gradient continu, préformé de sucrose 20-50 % préparé à l'aide d'un générateur de gradient (Autodensiflow, Bücher). Après une centrifugation d'une heure à 150000 g, la bande virale est collectée à l'aide d'un fractionneur de gradient (Gilson, Fc203) et analysée en continu à la longueur d'onde de 254 nm avec un spectrophotomètre UV (ISCO UA6). Pour éliminer le sucrose, la fraction contenant les virus est diluée dans du tampon TN IX et centrifugée à 113000 g pendant lh. Le culot final est repris dans 500 ul de tampon TN IX. La suspension de virus purifiée est ensuite déposée sur des grilles collodionnées-carbonées et contrastées négativement avec l'acide phosphotungstique (APT) à 2 %, pH 7 et la qualité de la purification est contrôlée en microscopie électronique à transmission (Hitachi HU11C). Le même protocole est réalisé sur de l'hémolymphe saine, prélevée chez un crabe de la même espèce. Cette hémolymphe contrôlée en microscopie électronique sert de blanc pour la quantification de la charge virale. - Extraction de l'acide nucléique viral : La suspension de virus purifiée (300 pl des 500 pl) est traitée à la protéinase K (200 pg/ml) en incubant 2 h à 37OC, puis au SDS (0, 5 %) en incubant 1 h à 50oC. La déprotéinisation se fait ensuite par une extraction avec 1 volume de Phénol/Chloroforme/Alcool isoamylique (25 : 24 : 1). Après centrifugation à 10000 g pendant 5 min, l'acide nucléique contenu dans la phase aqueuse est précipité avec 2, 5 volumes d'éthanol 100 % froid et 1 volume composé au zende la phase aqueuse et au 1/10 d'acétate de sodium, 3 M. Après 30 min à -80oC et une centrifugation à 10000g de 30 min, le culot est lavé à l'éthanol 70 % froid, séché à 37 C puis resuspendu 10 min à 65 C dans 100 pl de TE IX, pH 8. - Quantification de la charge virale : La suspension d'ADN est analysée dans le proche UV (220-320 nm) à l'aide d'un spectrophotomètre enregistreur à double faisceaux (Safas 190 DES). La lecture de l' Absorbance à 260 nm (A26o) permet de déterminer la concentration de l'ADN présent dans l'échantillon par l'équation suivante : pour de l'ADNdb : C (pg/ml) = A260/0, 02 Le bruit de fond est enlevé par soustraction de lIA260 sur de l'hémolymphe saine. Un virion contient une seule molécule d'ADNdb circulaire, dont la taille est de 305000 pb (Xu, 2000). En fixant 327 daltons (Da) par XMP de l'acide nucléique 1 ng d'ADNdb/pl, mesuré au spectrophotomètre, est estimé correspondre à 3 millions de virions/pl de la suspension virale pure. Une fois la charge virale calculée, le reste de la suspension de virus purifiés est ensuite diluée de façon logarithmique dans de l'hémolymphe non infectée, contrôlée en microscopie électronique. La sensibilité de la méthode de détection selon l'invention est alors comparée à celle du Dot Blot selon les protocoles vus précédemment. Résultats : Les résultats sont représentés à la figure 6. Sur cette figure, on peut voir les résultats obtenus avec la méthode de détection selon l'invention (M), la méthode Dot Blot (Db) et la technique PCR. Pour cette dernière, les résultats sont observés après 40 cycles et migration par électrophorèse sur gel d'agarose. Les résultats de la méthode selon l'invention sont obtenus pour un nombre de sondes égal à 4. 1011 molécules d'ADN sb et 40 cycles de PCR pour le marquage. 30 correspond au nombre de virions/ul d'hémolymphe (x103), T+ correspondant au témoin positif (plasmide L46 pour les méthodes Dot Blot et PCR et témoin interne SAGE pour la méthode selon l'invention avec un nombre de sondes égal à 2,5. 1011 molécules sb). Au vu de ces résultats, on constate que la sensibilité de la méthode selon l'invention) est quatre ordres de grandeur (4 logs) supérieure à celle du Dot Blot et deux ordres de grandeur (2 logs) supérieure à l'observation d'un produit de PCR après migration sur gel d'électrophorèse. Ces résultats, vérifiés à deux reprises font de la méthode selon l'invention, une technique très efficace pour la détection du WSSV. - Autres facteurs favorisant la sensibilité : La séquence cible à amplifier contient 65 % de A-T, ce qui favorise l'incorporation du dUTP marqué à la Digoxygénine lors de la préparation de la cible. L'hybridation du produit de PCR marqué se fait sur un autre produit d'amplification, ce qui favorise la fixation d'un maximum de molécules cibles sur les sondes. Un grand nombre de molécules d'anticorps peut alors se fixer à la Digoxygénine. Il en résulte que l'action catalytique de la phosphatase alkaline est favorisée, la sensibilité de la méthode est alors très élevée et le temps de révélation très court. Les premières taches apparaissent quelques secondes après le début de l'étape de révélation. Le temps de développement colorimétrique a été fié à 10 min afin de pouvoir comparer toutes les membranes lors des différents tests. Ce temps permet d'obtenir une gamme d'intensité des taches en corrélation avec le degré de l'infection, au-delà, un bruit de fond trop élevé apparaît, pour un échantillon sain. Le développement est stoppé en lavant la membrane dans une solution contenant de l'EDTA. Exemple 10 : Choix du tissu à analyser lors d'un diagnostic de contamination virale chez des crustacés La détection du WSSV a été étudiée avec la méthode selon l'invention à partir des trois principaux tissus dont le tropisme (c'est à dire là où le virus se développe le mieux) pour le WSSV est le plus élevé, soit l'hémolymphe, les branchies et les pléopodes (Lo et al., 1997). Ces différents tissus ont été prélevés sur un même animal (cigale de mer, Scyllarus arctus) infecté et mort suite au WSS (White Spot Syndrome). Les protocoles de clarification à partir de ces trois tissus sont décrits dans l'exemple 4. Résultats : La figure 7 montre les résultats d'analyse, par la méthode selon l'invention, sur les trois tissus décrits cidessus. Les références Te, Hé, Pl et Br correspondent respectivement au témoin négatif, c'est à dire de l'hémolymphe non infectée prélevée avant l'inoculation du virus, à l'hémolymphe infectée, aux pléopodes infectés et aux branchies infectées. Les références 1, 10, 100 et 1000 correspondent au facteur de dilution de l'échantillon testé, soit respectivement non dilué, dilué au 1/10ème, dilué au 1/100, et dilué au 1/1000e. Conformément à l'explication de la présentation des résultats de la figure 1B, on constate que le virus WSSV peut être détecté, par la méthode selon l'invention, dans les trois tissus analysés. L'hémolymphe est le tissu possédant le tropisme le plus élevé pour le virus (Lo et al., 1997). Le WSSV y est essentiellement présent sous forme extracellulaire, ce qui évite une étape de broyage du tissu prélevé chez l'animal, rendant ainsi le protocole plus simple et prévenant les contaminations inter-échantillons. De plus, chez les animaux adultes présents dans les bassins, l'hémolymphe peut être analysée sans dilution ce qui permet de tester des animaux faiblement infectés. Les branchies et les pléopodes nécessitant un broyage dans du tampon de clarification, il n'est possible de les tester que dilués au 1/10e. Ce problème n'est pas rencontré avec l'hémolymphe, ce qui fait de ce tissu une source idéale pour tester des animaux faiblement infectés ou en latence virale. La fraction diluée au 1/lOème présente des taches plus intenses que la fraction non diluée de l'hémolymphe. Cette observation montre l'importance d'effectuer une gamme de dilutions à partir de la clarification. Enfin, l'analyse de l'hémolymphe d'un animal permet d'écarter tout risque de faux positifs dus à une contamination d'un autre animal. En effet, l'hémolymphe est le sang du crustacé et le virus se trouve donc dans le milieu intérieur du crustacé. D'autres tissus, tels que les branchies ou les pléopodes, peuvent être porteurs de virus provenant d'une contamination de l'eau du bassin sans que l'animal lui-même soit infecté. Le prélèvement de l'hémolymphe est effectué via une seringue afin de ne pas sacrifier l'animal testé. Ainsi, une des applications de la méthode pourrait être dans la sélection des animaux géniteurs sains ou résistants (permettrait d'éliminer systématiquement les animaux porteurs du virus). Pour éviter sa coagulation, l'hémolymphe prélevée est simplement placée dans un bac à glace (pas de traitement par un anticoagulant risquant d'inhiber la PCR de marquage). De plus, il n'est pas possible de mettre plus d'l pl de la clarification issue d'un broyage (des branchies ou des pléopodes) dans les 50 pl de mélange réactionnel de PCR sans inhiber totalement la réaction de polymérisation. En effet, il semble que, suite au broyage de ces tissus, un excès d'inhibiteurs soit dégagé. La présente invention comprend également un kit de mise en oeuvre de la méthode de détection de microorganismes. Ce kit comprend : - une plaque 24 puits contenant les membranes prêtes à l'emploi, - un mélange de PCR, - une solution seuil pour la PCR, - des solutions pour l'hybridation, les lavages et la révélation colorimétrique. Le mélange de PCR utilisé dans le kit selon l'invention possède la composition suivante : eau 313.2 l Tampon 10x 135 l (Proméga)----------------------- (lx) MgCl2 135ul (Proméga)------------------------- (2. 5mM) DNTP-digoxygénine 135ul (Roche Diagnostic) : (200uM dATP, dCTP, dGTP, 190uM dTTP, lOuM dUTP-Dig) Amorce sens WSSV 135ul---------------------- (0. 5uM) Amorce anti-sens WSSV 135 l------------------- (0. 5uM) Amorce sens Témoin interne 27ul-------------- (O. 1 M) Amorce anti-sens Témoin interne 27nul---------- (O. lpM) Plasmide Témoin interne 27ul------------------ (lOpg) La solution seuil utilisé dans le kit comprend de l'eau stérile et le plasmide WSSV calibré. Le kit comprend également 6 solutions tampons utilisés pour l'hybridation, les lavages et la révélation colorimétrique. : - Solution 1 (78ml) : 2X SSC, 0.1% SDS - Solution 2 (78ml) : O.1X SSC, 0.1% SDS - Solution 3 (13ml) : TBS IX (10mM Tris Hic1, pH 7.4 (4OC), 150mM NaCl, 0.3% BSA) 1% Lait écrémé 2% Sulfate de Dextran - Solution 4 (117ml) : TBS IX - Solution 5 (26ml) : 100 mM Tris HCl, pH 9. 5 (20 C), 100mM NaCl, 50mM MgCl2 - Solution 6 (26ml) : PBS IX 20mM EDTA - Solution de révélation (dans un tube de 15ml) : 2.6mg de NitroBlueTetrazolium (NBT) 2.6mg de 5 Bromo-4 Chloro-3 Indolyl Phosphate (BCIP). L'utilisateur du kit selon l'invention doit se procurer, avant toute utilisation, la taq polymérase à 5 unités/41 ainsi que les anticorps anti-digoxigénine (fragment Fab), bien connus de l'homme du métier et classiquement utilisés dans les laboratoires. Il doit également posséder l'appareillage nécessaire soit une centrifugeuse, une plaque chauffante, un thermocycleur pour les réactions de PCR et un agitateur rotatif. Toutefois, selon un autre mode de réalisation, le kit selon l'invention comprend également une solution contenant la taq polymérase à 5unités/pl et une solution d'anticorps anti-digoxigénine (fragment Fab). La méthode de détection selon l'invention possède une sensibilité accrue, en comparaison des méthodes courantes d'analyse des ADN amplifiés par PCR, notamment par le fait que lors de l'étape d'hybridation entre la cible et la sonde, la contrainte se fait lors des lavages et non pas pendant l'hybridation proprement dite. Cette méthode utilise les avantages d'une réaction d'hybridation réalisée sur support microporeux, inerte vis à vis des réactions chimiques et enzymatiques mises en oeuvre pour révéler le produit recherché, sans pour autant utiliser un appareil pour lire le résultat de l'analyse. Elle permet de réduire la durée de l'analyse en concentrant les réactifs dans un faible volume réactionnel. De plus, l'échantillon est déposé directement sur le support, afin de réaliser la réaction d'hybridation dans le volume délimité par les dimensions du support poreux. Un autre avantage de la méthode selon l'invention est qu'elle comporte une moyen de contrôle de la réaction d'amplification, utilisant un fragment d'ADN et des amorces de polymérisation choisies pour n'avoir aucune capacité d'hybridation avec l'ADN de l'organisme recherché ou avec les amorces utilisées pour amplifier ledit ADN. Le marquage peut être réalisé par incorporation d'un adduct à l'ADN amplifié capable de lier une enzyme qui catalyse la formation du produit coloré visible à l'oeil nu. La méthode comporte également une étape de dilution sérielle du produit recherché et/ou des sondes d'ADN utilisées pour l'identifier, permettant d'évaluer la quantité de produit recherché et de déterminer le seuil de sensibilité de la méthode rapide de détection telle que précédemment décrite. Enfin, toute les étapes de cette méthode sont réalisées à température ambiante, ce qui facilite fortement sa mise en oeuvre. REVENDICATIONS 1. Méthode rapide de détection des ADN d'un ou de plusieurs organismes différents dans un échantillon, caractérisé en ce qu'elle consiste à : - préparer au moins une sonde spécifique dudit ou desdits organismes, - immobiliser ladite sonde sur un support approprié, saturer le support avec des fragments d'ADN ne réagissant pas avec les produits recherchés pour éviter toute interaction non spécifique desdits produits avec le support lui-même. - prélever l'échantillon sur un produit ou un sujet, extraire l'ADN dudit ou desdits organismes contenus dans ledit échantillon, amplifier ledit ou lesdits ADN du ou des organismes simultanément, afin d'obtenir un ou plusieurs amplicons, - marquer lesdits amplicons, - hybrider l'ADN amplifié et marqué avec la sonde immobilisée sur le support, - révéler le marquage et, examiner directement le résultat, ou obtenir une image numérique de la membrane colorée. 2. Méthode de détection selon la revendication 1, comprenant également une étape de préparation d'une sonde témoin d'amplification ne présentant aucune interaction avec les autres fragments d'ADN recherchés. 3. Méthode de détection selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'amplification est une polymérisation en chaîne (PCR). 4. Méthode de détection selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle la ou lesdites sondes spécifiques reproduisent un ou plusieurs fragments d'ADN dudit organisme à détecter. 5. Méthode de détection selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'étape d'hybridation est réalisée de manière non contraignante. 6. Méthode de détection selon la revendication 5, dans laquelle ladite étape d'hybridation se fait à température ambiante et dans laquelle les lavages sont réalisés dans des conditions rigoureuses afin d'éliminer les produits associés de façon non spécifique et ne retenir que les hybrides stables réagissant de manière significative. 7. Méthode de détection selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle ledit support est un support microporeux doté de capacité d'adsorption de l'ADN. 8. Méthode de détection selon la revendication 7, dans laquelle ledit support est inerte vis à vis des réactions chimiques et enzymatiques mises en oeuvre pour révéler le produit recherché. 9. Méthode de détection selon la revendication 8, dans laquelle ledit support est une membrane de nylon. 10. Méthode de détection selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle ledit marquage consiste à obtenir un produit coloré stable détectable par examen visuel direct et/ou grâce à un dispositif d'analyse d'image. 11. Méthode de détection selon la revendication 10, dans laquelle ledit marquage est un marquage par un adduct incorporé à l'ADN amplifié capable de lier une enzyme qui catalyse la formation du produit coloré visible à l'oeil nu. 12. Application de la méthode de détection selon l'une des revendications 1 à 11, pour la détermination de la contamination de crustacés par le virus WSSV. 13. Kit de mise en oeuvre de la méthode de détection selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisé en ce qu'il comprend : une plaque multipuits ou tout autre plaque de microcupules contenant les membranes prêtes à l'emploi, - un mélange de PCR, - une solution seuil pour la PCR, - des solutions pour l'hybridation, les lavages et la révélation colorimétrique. 14. Kit selon la revendication 13, dans lequel ledit mélange de PCR possède la composition suivante : eau 313.2 l Tampon 10x 135 l (Proméga)----------------------- (1x) MgCl2 1351 (Proméga)------------------------- (2.5mM) DNTP - digoxygénine 135 l (Roche Diagnostic) : (200MM dATP, dCTP, dGTP, 190MM dTTP, 10MM dUTP-Dig) Amorce sens WSSV 135l------------------------ (0. 5MM) Amorce anti-sens WSSV 135l------------------- (0. 5MM) Amorce sens Témoin interne 27pl-------------- (0. 1M) Amorce anti-sens Témoin interne 27il---------- (0. 1MM) Plasmide Témoin interne 27pl------------------ (10pg) 15. Kit selon la revendication 13 ou 14, dans lequel ladite solution seuil comprend de l'eau stérile et le plasmide WSSV calibré. 16. Kit selon l'une des revendications 13 à 15, dans lequel lesdites solutions pour l'hybridation, les lavages et la révélation colorimétrique sont les suivantes : - Solution 1 (78ml) : 2X SSC, 0.1% SDS - Solution 2 (78ml) : O. 1X SSC, 0. 1% SDS - Solution 3 (13ml) : TBS IX (10mM Tris Hic1, pH 7.4 (4OC), 150mM NaCl, 0.3% BSA) 1% Lait écrémé 2% Sulfate de Dextran - Solution 4 (117ml) : TBS IX - Solution 5 (26ml) : 100 mM Tris HCl, pH 9. 5 (20oC), lOOmM NaCl, 50mM MgCl2 - Solution 6 (26ml) : PBS IX 20mM EDTA - Solution de révélation (dans un tube de 15ml) : 2.6mg de NitroBlueTetrazolium (NBT) 2.6mg de 5 Bromo-4 Chloro-3 Indolyl Phosphate (BCIP). 17. Kit selon l'une des revendications 13 à 16, comprenant également une solution contenant la taq polymérase et une solution d'anticorps antidigoxigénine.