Brevet FR2812641A1 — publié le 20020208

MOYENS POUR CIBLER DES REGIONS REPETEES D'ACIDES NUCLEIQUES L'invention a pour objet des moyens, à savoir des outils et des méthodes, pour amplifier et/ou détecter des régions répétées d'acides nucléiques. Elle vise en particulier des moyens pour amplifier et/ou cibler des centromères ou des télomères de chromosomes. En ce qui concerne, par exemple, les centromères de chromosomes, on sait qu'ils sont constitués de régions hautement répétées, appelées alphasatellites. Le nombre de répétitions est de l'ordre de 5000 à 50 000 (Cytogenet Cell Genet 51 : 1028, 1989). Ces régions répétées sont formées de monomères dont la taille avoisine 170 nucléotides (nt en abrégé) 20 nt. Leur homologie moyenne est le plus généralement supérieure à 85%, avec toutefois des variations individuelles importantes. Pour étudier la région centromérique d'un chromosome donné, par exemple aux fins de diagnostic, il est alors nécessaire de disposer d'outils spécifiques de ces régions, ne donnant pas lieu à des réactions croisées avec des régions homologues à d'autres chromosomes. Or dans le cas, par exemple, du chromosome 21, la seule sonde centromérique décrite, à savoir celle de Warburton et al (Genomics, 11, 324-333,1991) présente une réaction croisée à 100% entre les chromosomes 21 et 13, quelle que soit la stringence des hybridations et des lavages. On rappelle que cette sonde est obtenue par PCR à l'aide du couple d'amorces suivant: CTTCTGTCTAGATTTTAGA (5'-3') CATAGAGATGAACATGG (5'-3'), respectivement SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2. L'amplification obtenue en utilisant les amorces de Warburton et al conduit à deux produits de 640 et 820 nt. Il est précisé dans la publication citée plus haut que : - le fragment de 640 nucléotides a pour origine le chromosome 21 et le chromosome 13, et - celui de 820 nucléotides a pour origine unique le chromosome 13. En utilisant, comme sonde, le fragment de 640 nt et/ou de 820 nt dans des hybridations in situ, les inventeurs ont observé que : - chacun des deux fragments s'hybride à la fois sur le chromosome 21 et sur le chromosome 13, bien qu'ils aient pour origine un chromosome différent, - les amorces de Warburton et al amplifient des régions différentes sur le chromosome 21 et sur le chromosome 13, - compte tenu de la grande homologie présente dans les régions répétées, les hybridations croisent entre les deux chromosomes. Ces résultats montrent donc qu'il n'est pas suffisant de disposer : - de produits d'amplification ayant pour origine les chromosomes 21 ou 13 séparément, ou - de produits d'amplification de tailles différentes en fonction des chromosomes 21 ou 13, pour avoir une sonde spécifique du chromosome 21, sans réactions croisées sur le chromosome 13. Les inventeurs de la présente demande ont constaté qu'ils pouvaient disposer de fragments nucléotidiques hautement spécifiques d'une région répétée d'un acide nucléique cible, en appliquant une logique floue probabiliste pour leur construction. De manière inattendue, de tels fragments se sont révélés capables de reconnaître un grand nombre de monomères de la région répétée, tout en étant spécifique de cette région. L'invention vise donc un procédé de construction de tels fragments. Elle vise également ces fragments en tant que nouveaux produits et leur utilisation comme amorces d'amplification ou comme sondes de détection. Selon, un autre aspect, l'invention vise également un procédé d'amplification de familles de régions répétées d'acide nucléique. L'invention a également pour but des banques de telles régions et les produits d'amplification en tant que nouveaux produits. Le procédé, selon l'invention, d'élaboration de fragments nucléotidiques spécifiques d'une famille de régions répétées d'acides nucléiques, ou famille cible, ces régions présentant entre elles de fortes homologies, est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes : - d'alignement, les unes en dessous des autres, d'au moins 10 séquences monomères de la famille cible d'au moins 20 nucléotides de longueur, - de définition, sur chacune des séquences monomères, d'une ou plusieurs zones en correspondance, sur chacun des monomères, - d'évaluation du pourcentage d'occurrence, dans chaque alignement vertical, de chacun des nucléotides de la zone retenue, - d'élaboration statistique de fragments nucléotidiques, selon une logique floue probabiliste, en retenant pour chaque position, en fonction du pourcentage établi ci-dessus, et en comparant avec les pourcentages obtenus, selon le même procédé, avec d'autres acides nucléiques de familles différentes, soit le nucléotide le plus probable, afin de conférer un caractère polymorphe au fragment, soit le nucléotide le plus spécifique par rapport à la famille cible. Par "nucléotide probable", on entend, pour une position donnée de ladite zone, un nucléotide dont le pourcentage d'occurence est le plus fréquent à l'intérieur d'une famille ou à l'intérieur des familles différentes, par rapport à un autre nucléotide pouvant occuper la position considérée. Le choix d'un tel nucléotide permet de disposer d'un "fragment polymorphe", c'est-à-dire capable de reconnaître la continuité ou homogénéité présente au sein de la famille cible et donc le plus possible de monomères différents. Par "nucléotide spécifique", on entend le nucléotide prédominant pour la position considérée de la famille cible. Ainsi, selon le procédé d'élaboration de fragments selon l'invention, on écarte les nucléotides n'appartenant pas à la famille cible, et parmi ceux de cette famille, on choisit pour chaque position le nucléotide le plus probable, de manière à assurer une polyvalence de reconnaissance du fragment, ou le nucléotide le plus spécifique à des fins de reconnaissance de la seule famille cible. L'invention fournit ainsi des moyens pour définir des fragments globalement représentatifs des séquences des familles cibles, mais à spécificité élevée. Pour conférer un caractère global au fragment, on choisit, de manière générale, le nucléotide le plus commun, dont l'occurence est supérieure à au moins 20%, notamment à au moins 50%, en recommençant le même schéma pour chaque position suivante de l'alignement. Le caractère spécifique du fragment est obtenu en choisissant le nucléotide le plus spécifique de la famille ciblée. Dans des modes de réalisation du procédé de l'invention, on définit à l'intérieur d'une même zone, selon un gradient, une partie globale et une partie spécifique, c'est-à-dire avec une variation graduelle de la globalité ou de la spécificité. On établit ainsi, dans le fragment, par rapport aux données statistiques, des parties d'homologie formées des nucléotides majoritairement présents et des parties divergentes formées de nucléotides différents de ceux majoritairement présents dans un alignement vertical donné. Par "homologie", on entend une identité en monomères d'au moins 70% lorsqu'on compare les alignements des séquences homologues. Dans un mode de réalisation de l'invention, les régions répétées sont issues des centromères de chromosomes. Il s'agit notamment des centromères des chromosomes 21, 13, 14 ou 22. Pour l'élaboration de fragments de nucléotides capables de reconnaître spécifiquement les centromères de ces chromosomes, on utilisera avantageusement les données statistiques rapportées sur la figure 2 et/ou la figure 3. Des choix préférés effectués sur la base de ces données pour construire des fragments capables de reconnaître spécifiquement le chromosome 21 conduisent à élaborer les enchaînements suivants ( respectivement SEQ ID N 3 et SEQ ID N 4): CAAGGAGTGGAACATC (5'#3') CTTCTGTCTAGATTTTAGG (5'->3'). D'autres choix préférés pour construire des fragments capables de reconnaître spécifiquement les chromosomes 14 et 22 conduisent à à élaborer les enchaînements suivants ( respectivement SEQ ID N 5 et SEQ ID N 6): CACAGAGGAGGATCTTG (5'->3') TTTCTGTCGAGTTGTGATA (5'#3'). Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les régions répétées sont des télomères de chromosomes, notamment des télomères des chromosomes 21,13, 14 ou 22. L'élaboration de fragments spécifiques de ces régions est réalisée selon les conditions décrites plus haut. L'invention a également pour objet les fragments nucléotidiques tels qu'obtenus par le procédé défini ci-dessus. Ces fragments sont caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître une pluralité de monomères cibles différents au sein de familles de régions répétées. Ils correspondent à un ensemble aléatoire mais représentatif de la variation interindividuelle des monomères et/ou familiale. Conformément à l'invention, ces fragments nucléotidiques sont utilisables comme amorces d'amplification ou comme sondes de détection. Les amorces selon l'invention sont en particulier caractérisées en ce qu'elles autorisent des amplifications multiples en parallèle et concomitantes, lors d'un seul cycle d'amplification, d'au moins une dizaine de monomères différents, voire de plusieurs centaines. Il s'agit donc d'amorces polyvalentes. L'invention vise notamment des couples d'amorces pour l'amplification spécifique du centromère du chromosome 21 parmi les chromosomes 21 et 13, et/ou 14, et/ou 22, ces couples d'amorces correspondant respectivement aux enchaînements définis par les données statistiques selon le procédé décrit plus haut. Des couples d'amorces pour l'amplification spécifique du centromère du chromosome 21 sont caractérisés en ce qu'ils correspondent aux enchaînements SEQ ID N 3 et SEQ ID N 4 donnés ci-dessus. Des couples d'amorces pour l'amplification des centromères des chromosomes 14 et 22 sont caractérisés en ce qu'ils répondent aux séquences SEQ ID N 5 et SEQ ID N 6. Selon un autre aspect, l'invention vise un procédé d'amplification de familles de régions répétées d'acides nucléiques. Ce procédé est caractérisé par des amplifications multiples concomitantes lors d'un seul cycle, desdites familles des régions répétées par utilisation d'un couple d'amorces élaborées à partir de fragments nucléotidiques tels que définis ci-dessus. De telles amplifications sont obtenues grâce à l'utilisation des amorces de l'invention avec des régions répétées d'acide nucléique. Selon une disposition de ce procédé, le produit final d'amplification est soumis à une dénaturation et à une renaturation par choc thermique, chimique ou enzymatique. Pour un choc thermique, on applique par exemple au mélange d'amplification une température de l'ordre de 80 à 110 C, pendant 5 à 15 minutes, d'environ 95 C, notamment pendant environ 10 minutes, puis un refroidissement brusque à une température inférieure à 5 C, notamment de l'ordre de 0 C, puis on procède à une électrophorèse. Selon une autre disposition de l'invention, mise en oeuvre le cas échéant avec l'une au moins des dispositions précédentes, l'amplification est réalisée avec un déficit d'amorce, ce qui conduit à un allongement, par la polymérase, d'un brin amplifié jusqu'à l'amorce suivante rencontrée, et ainsi à la formation de multimères formés de motifs consécutifs. L'amplification est conduite de manière à obtenir un épuisement des amorces au cours des cycles, cet épuisement étant rendu possible par la répétition des régions cibles. En variante, le déficit d'amorces peut être créé dès le départ. On observera que les produits d'amplification formés au cours des premiers cycles peuvent servir d'amorces pour la synthèse de fragments de plus grande taille (phénomène de PCR priming). Conformément à l'invention, l'amplification est alors réalisée de manière à obtenir au cours de l'amplification une réassociation des produits d'amplification de taille différentes, ce qui conduit à la formation d'hétéroduplex, et/ou une réassociation de produits d'amplification de tailles identiques, afin d'obtenir des homoduplex. Lorsqu'on souhaite séparer les hétéroduplex les plus hétérogènes des homoduplex, on soumet avantageusement les produits finaux d'amplification à un choc thermique, en opérant notamment comme défini ci-dessus. On peut également soumettre le mélange à un choc chimique, en modifiant le pH ou la concentration saline. Dans une autre variante on applique un choc enzymatique avec par exemple une girase, une hélicase ou une topoisomérase. Les hétéroduplex donnent lieu à une auto-amplification (phénomène d'auto PCR) lorsqu'ils présentent des extrémités monobrin et une partie double brin suffisamment longue pour ne pas être dissociée, la partie double brin servant d'amorce et la partie monobrin de matrice. Ce processus d'auto-amplification peut être répété en cascade au cours des différents cycles, conduisant à des fragments de plusieurs dizaines de kb avec des conditions de PCR standard. On observera que l'invention permet d'obtenir de tels fragments avec des conditions standards d'amplification, notamment par PCR, sans recours à des polymérases particulières. Le phénomène d'auto-amplification permettant d'allonger les hétéroduplex peut être tronqué à tout moment et à n'importe quel endroit de l'hétéroduplex. Cet arrêt aléatoire, lié aux conditions expérimentales utilisées, est à l'origine de la continuité d'un smear de 1 à 8 kb observé en électrophorèse comme exposé dans les exemples. On observera, par ailleurs, que lorsque des monomères au sein du même brin sont anticomplémentaires et/ou anti-parallèles, un brin d'ADN peut se replier sur lui-même en formant localement une double hélice stable. Dans ces conditions particulières d'orientation de quelques monomères, un même brin d'ADN s'auto-hybride sur lui-même en servant à la fois d'amorce et de matrice dans un phénomène d'auto-PCR directe. Lorsque la séquence polymérique constituée de monomères de composition voisine et relativement proche les unes des autres comporte des monomères disposés de manière anticomplémentaire et/ou antiparallèle, une seule amorce suffit pour l'amplification. Cette amorce se fixe sur des monomères directs et sur des monomères anticomplémentaires et/ou antiparallèles pour réaliser à elle seule des amplifications. Il est fait alors référence à une PCR mono priming. Dans le cadre de toute forme d'auto PCR (suite à hétéroduplex ou directe) et si la partie double brin est suffisamment longue pour ne pas être dénaturée lorsqu'on applique les conditions de température pour l'élongation des chaînes par la polymérase, on réalise une auto-amplification, la partie double brin servant d'amorce et la partie monobrin de matrice. L'élongation s'effectue à partir de la région double brin (sens 5'3') jusqu'à la fin de la région monobrin. Cette réaction ne nécessite aucune amorce et s'amplifie au fur et à mesure des cycles d'amplification. Le cas échéant, avant l'étape d'amplification, on soumet les acides nucléiques à un traitement pour séparer sélectivement certains acides nucléiques du mélange. A cet effet, on peut opérer un choc thermique afin de dénaturer spécifiquement les séquences les plus sensibles à la température, ou un choc chimique ou enzymatique comme évoqué plus haut. Selon un aspect de grand intérêt, cette étape discriminante permet par exemple, à partir d'un mélange de centromères de chromosomes 21 et 13, de dénaturer sélectivement le centromère du chromosome 21, sans altérer celui du chromosome 13, ou d'obtenir une spécificité d'amplification du centromère du chromosome 22 versus celui du chromosome 14. Le procédé d'amplification est réalisé sur de l'ADN génomique, des fragments d'ADN ou des banques (par exemple banque YAC). Il s'agit d'ADN de tout organisme, humain, animal, bactérien, végétal. L'invention vise également les banques de régions répétées d'acides nucléiques, à forte homologie, en particulier les banques de centromères ou de télomères. Ces banques sont caractérisées en ce qu'elles comprennent une pluralité d'enchaînements de monomères essentiellement différents les uns des autres, tels qu'obtenus par amplification des régions répétées à forte homologie selon le procédé défini plus haut. L'invention vise en particulier une banque essentiellement constituée par des fragments d'amplification du centromère du chromosome 21, correspondant à un ensemble aléatoire mais représentatif de la variation individuelle des 5000 à 50000 monomères constituant le chromosome 21. Elle vise également une banque essentiellement constituée par des fragments d'amplification du centromère des chromosomes 21 et 13, ou 14 et 22. Les produits obtenus par le procédé d'amplification défini ci-dessus entrent également dans le champ de l'invention. Ces produits sont caractérisés en ce qu'ils correspondent à des monomères et/ou des multimères de régions répétées d'acides nucléiques à forte homologie. Il s'agit avantageusement de produits stables. L'invention vise en particulier les monomères consécutifs desdites régions, à savoir les dimères, trimères, tetramères, pentamères, hexamères ou heptamères et suivants. On notera que les fragments de 1 à 2 kb présentent un intérêt au regard d'au moins - la spécificité vis-à-vis de la région ciblée, - la facilité d'hybridation, - l'augmentation de la capacité à porter des marqueurs dans des applications des fragments comme sondes. Ces avantages sont obtenus sans rencontrer les inconvénients des mégasondes classiquement utilisées de 50 000 nucléotides (cosmides, YAC). En variante, les produits d'amplification selon l'invention sont des homoduplex et/ou des hétéroduplex formés par des fragments réassociés, respectivement de même taille ou de taille différente. De tels produits correspondent notamment à des fragments nucléotidiques de plusieurs dizaines de nucléotides, voire de plusieurs centaines de nucléotides. Les produits synthétisés selon l'invention grâce à la formation d'hétéroduplex présentent des propriétés intéressantes: - ils peuvent très largement dépasser la taille conventionnelle d'un produit PCR, - les juxtapositions de séquences résultent d'un mécanisme aléatoire, - ils sont localement identiques au génome d'origine, - leur intégralité n'existe pas dans le génome d'origine, - ils sont donc nouveaux par la création d'une séquence nucléotidique, - ils sont toujours représentatifs de la région d'origine. De manière remarquable, l'invention fournit des produits d'amplification correspondant à un brassage génétique, tout en restant fidèle à la région d'origine. On mesure l'intérêt de tels produits comme réactifs biologiques pour des études comparatives au laboratoire et notamment dans des applications mettant en jeu les études de polymorphisme pour effectuer par exemple des tests d'identité. Selon encore un autre aspect, l'invention vise également des sondes de détection de régions répétées d'acides nucléiques à forte homologie, caractérisées en ce qu'elles sont élaborées à partir des fragments nucléotidiques ou des produits d'amplification tels que définis ci-dessus et qu'elles comportent un marqueur. De telles sondes présentent l'avantage d'être représentatives d'un ensemble de centromères différents les uns des autres. Il s'agit donc de sondes polymorphes qui se distinguent ainsi des sondes de détection actuelles qui sont monomorphes. L'invention vise spécialement les sondes élaborées à partir d'un fragment nucléotidique spécifique du chromosome 21 ou d'un produit d'amplification obtenu avec le couple d'amorces de séquence SEQ ID N 3 et SEQ ID N 4. On notera avec intérêt que cette sonde ne donne pas lieu à des croisements avec le chromosome 13, contrairement aux sondes de l'art antérieur. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent et en se référant aux figures 1 à 8, qui représentent, respectivement - la figure 1, des alignements de séquences monomères de régions répétées des chromosomes 13, 22, 21 et 14, - les figures 2 et 3, les pourcentages d'occurence de chaque nucléotide dans une zone donnée conformément au procédé de l'invention, - la figure 4, une photo d'électrophorèse montrant le résultat d'une amplification avec des amorces selon l'invention, correspondant au tableau 1 de l'exemple 3 : observe 3 puits très voisins avec de nombreuses bandes hétéroduplex et homoduplex mélangées, et un 4ième puits correspondant aux marqueurs de poids moléculaires, - la figure 5, une photo d'électrophorèse montrant le résultat après choc thermique avant électrophorèse (cf. tableau 3) : puits 9,10, 11, 12,17, 18 correspondent aux monomères, dimères, tétramères, pentamères en homoduplex ; puits 13,14, 15,16, aux témoins négatifs, le puits PM, aux marqueurs de poids moléculaires, - la figure 6, une photo d'électrophorèse d'auto-amorçage (auto-priming), soit 4 puits : puits 1) témoin positif : une bande avec 2 amorces ; puits 2) témoin négatif ; puits 3) le phénomène d'auto-amorçage caractérisé par un smear de 300 nt à quelques kb, avec une seule amorce). - les figures 7 et 8, des photos montrant la spécificité de la sonde issue de la banque polymorphique centromérique 21 en hybridation in situ sur noyaux cellulaires normaux (figure 7), sur noyaux cellulaires avec syndrome de Down (figure 8). Exemple 1 : Elaboration d'amorces statistiques pour l'amplification du centromère du chromosome 21 On procède aux alignements de 16 séquences monomères du centromère du chromosome 21, obtenues à partir de banques de données du domaine public. Les alignements sont effectués en plaçant les séquences les unes en dessous des autres, et en démarrant au premier nucléotide de chacune d'entre elles (voir fig.l). On procède de même avec 16 séquences monomères des chromosomes 13 et 14 et 24 séquences du chromosome 22. On définit deux zones a) et b), correspondant à des régions reconnues par les amorces de Warburton et al. On évalue le pourcentage d'occurrence de chaque nucléotide dans les zones a) d'une part et b) d'autre part dans chaque alignement vertical. Les résultats sont donnés sur les figures 2 et 3. En opérant selon une logique floue probabiliste, sur la base de ces pourcentages, et en comparant avec les résultats obtenus pour chaque chromosome, on retient pour chaque nucléotide soit le nucléotide le plus probable, soit le nucléotide le plus spécifique par rapport à la cible constituée par les régions répétées du centromère du chromosome 21(voir dernière colonne des figures 2 et 3). Les séquences retenues pour les amorces, respectivement, sens et antisens sont SEQ ID N 3 et SEQ ID N 4. Exemple 2 : Elaboration d'amorces statistiques pour l'amplification du centromère des chromosomes 14 et 22 En appliquant la démarche de l'exemple 1, on retient les séquences SEQ ID N 5 et SEQ ID N 6 pour construire les amorces respectivement sens et antisens. Exemple 3 : par PCR à l'aide du couple d'amorces de l'exemple 1 spécifique du centromère du chromosome 21. On utilise 300 ng d'ADN génomique humain/ 100 III de mélange PCR. L'ADN concentré est conservé sous forme d'aliquots. Avant d'être utilisé en PCR, l'ADN doit être : * décongelé, ramené à température ambiante * vortexé * chauffé 5 minutes à 55 C * ramené à température ambiante * vortexé Les amorces 1 et 2 sont utilisées à raison de 3 l chacune (concentration 15 M). .Protocole PCR (on opère dans une pièce climatisée entre 18-20 C) - 96 C, 5 min : princeps - 96 C, 1 min 30 : dénaturation intra-cycle - 47 C, 1 min 30 : des amorces (anneling) (cette étape peut être effectuée de 45 à 55 C) - 72 C, 2 min : élongation par la Taq polymérase Selon les conditions expérimentales, différents types de produits PCR ont été observés à l'electrophorèse. Pour un monomère moyen de 170nt, le produit amplifié présente une taille de 132 nt. . Smear continu de 150 à 190nt L'electrophorèse dénaturante après PCR montre une disparition des fragments de 170nt au fur et à mesure des cycles effectués et un smear continu intense de 150 à 190 nt, accompagné de bandes multiples discontinues, ce qui confirme que le couple d'amorces élaboré selon l'invention reconnaît un ensemble relativement varié de monomères et non un monomère précis. La photo de la figure 1 présente l'électrophorèse correspondante. Chaque monomère reconnu est amplifié en même temps et indépendamment du monomère voisin. Ainsi, à la différence d'une PCR classique, où généralement un seul fragment est amplifié, les amorces de l'invention permettent l'amplification en parallèle de nombreux monomères. Pour déterminer le nombre de monomères différents amplifiés en parallèle, une électrophorèse discriminante et dénaturante pour les poids moléculaires inférieurs à 200 nt a été réalisée. Un smear continu, sans interruption de 150 à 190 nt a à nouveau été obtenu. Chaque monomère amplifié ayant une taille précise, il apparaît donc que chaque fragment du smear est issu d'un monomère différent. Ainsi, la présence d'un continuum à l'électrophorèse montre que pour chaque taille de monomères, de 150 à 190 nt, au moins un certain nombre de monomères a été amplifié. Un centromère étant constitué d'environ 5000 à 50 000 monomères présentant des variations interindividuelles certaines dans les limites de 150 à 190 nucléotides, l'obtention après amplification d'un profil continu permet d'établir que le couple d'amorces utilisé permet d'amplifier de manière concomittante au moins une centaine de monomères différents indépendamment les uns des autres, et même plusieurs centaines. . présence de multiples bandes discontinues de 300nt à lkb Après avoir dénaturé et renaturé le produit PCR (traitement 10 minutes à 95 C, puis glace), on observe à l'électrophorèse "dénaturante" la présence de multiples bandes intenses et discontinues qui s'échelonnent de 300 nt à 1 Kb. Les bandes obtenues ont des tailles de 300 nt, 630 nt, 820 nt. On donne dans le tableau 1 suivant la taille des produits d'amplification à l'électrophorèse sans choc thermique ou après choc thermique. TABLEAU Taille Electrophorèse Electrophorèse "dénaturante" après sans choc choc thermique du produit PCR thermique 130 nt + 242 nt ++ 250 nt ++ 300 nt +++ ++++ 350 nt traces 400 nt traces 500 nt ++ 630 nt +++ ++++ 720 nt ++ 820 nt ++ (+++) ++ (+++) 920 nt ++ 1130 nt + + Légende : + : visible franc ++ :intense +++ : très intense ++++ : Saturation . déficit d'amorces Les PCR classiques amplifient généralement un fragment unique pour une seule paire d'amorces et la réaction se fait toujours avec un excès d'amorces. Les amorces de l'invention amplifiant de manière concomitante un ensemble relativement important de monomères différents pouvant aller jusqu'à quelques centaines monomères, la réaction PCR ne s'effectue plus en excès d'amorce. Lors des premiers cycles de PCR, l'ensemble des sites d'amplification sont saturés d'amorces et la réaction n'amplifie que la région intra-amorces des monomères soit 130 nt. Au fur et à mesure des cycles suivants d'amplification, la réaction s'appauvrit en amorces et tous les monomères ne sont plus saturés en amorces. La polymérase est obligée d'allonger le brin amplifié jusqu'à l'amorce suivante qu'elle rencontre (mise en jeu du caractère répété des régions cibles). Ainsi, par ce phénomène, à partir de la région intra-amorces de 130 nt, la polymérase peut ajouter le monomère complet suivant de 170 nt soit 300 nt (130 + 170) avec formation au total d'un double monomère appelé dimère. Ce phénomène peut être généralisé, car la polymérase peut continuer son chemin sur un certain nombre de monomères consécutifs avec formation : - d'un "monomère" soit 130 nt - d'un dimère soit 300 nt (130 nt + 1 x 170 nt) - d'un trimère soit 470 nt (130 nt + 2 x 170 nt) - d'un tétramère soit 640 nt (130 nt + 3 x 170 nt) - d'un pentamère soit 810 nt (130 nt + 4 x 170 nt) - d'un hexamère soit 980 nt (130 nt + 5 x 170 nt) - d'un heptamère soit 1 150 nt (130 nt + 6 x 170 nt) - d'un octamère soit 1 320 nt (130 nt + 7x 170 nt) Les tailles des bandes intenses obtenues à l'électrophorèse "dénaturante" sont données dans le tableau 2 suivant : TABLEAU 2 Taille Electrophorèse Electrophorèse Origine classique "dénaturante" 130 nt + "Monomère" 242 nt ++ 250 nt ++ 300 nt +++ ++++ Dimère 350 nt traces 400 nt traces 500 nt ++ 630 nt +++ ++++ Tétramère 720 nt ++ 820 nt ++ (+++) ++ (+++) Pentamère 920 nt ++ 1130 nt + + Heptamère Ces bandes de l'électrophorèse dénaturante correspondent bien aux différents multimères décrits ci-dessus. La formation par PCR de dimères, de trimères, de tétramères, de pentamères résulte ainsi d'un épuisement des amorces lié à la multi-amplification concomitante des régions répétées. . auto-amorçage (PCR priming) Au cours des cycles d'amplification PCR (cycles 25 à 35), on observe une disparition progressive du fragment monomèrique de 130 nt. Comme les produits d'amplification PCR ne sont pas auto-dégradables, ce résultat suggère que les fragments monomèriques de 130 nt ont dû être consommés par la réaction PCR, ce qui apparaît lié de la même manière que précédemment, à la disparition progressive des amorces au cours des cycles d'amplification. En effet, toujours dans le cadre de la multi-amplification concomitante des régions répétées, on considère qu'à partir du cycle 25, les amorces ne sont plus en concentration suffisante, et lors de l'anneling des primers, les fragments monomèriques peuvent se fixer sur des fragments de plus grande taille (des dimères, des trimères, des tétramères, des pentamères...). Les produits d'amplification PCR servent alors de primers, grâce à la forte homologie des régions répétées. . Réassociation des produits PCR entre eux - Homoduplex : obtient des homoduplex lorsque deux produits PCR identiques se réassocient entre eux. - Hétéroduplex : revanche la réassociation entre eux de deux produits PCR de tailles différentes, grâce aux homologies fortes existant entre les différents monomères, conduit à des hétéroduplex. Dans le cas par exemple de l'hybridation hétéroduplex classique existant entre un pentamère et un dimère, le produit PCR est localement double brin et localement monobrin. Cet hétéroduplex présente à l'électrophorèse un poids moléculaire apparent qui correspond à la moyenne de ses deux constituants. Lors d'une électrophorèse classique, on peut observer la présence d'homoduplex et d'hétéroduplex, mais il n'est pas possible de les séparer. L'électrophorèse "dénaturante" permet, en revanche, après choc thermique (ou enzymatique, ou chimique) des produits PCR, de faire disparaître les hétéroduplex les plus inhomogènes, et de conserver les homoduplex. Ainsi dans les expérimentations rapportées plus haut, l'électrophorèse dénaturante conserve les monomères, les dimères, les tétramères, les pentamères et les heptamères qui sont par définition des régions homoduplex. En revanche, les bandes de 242 nt, 500 nt, 720 nt et 920 nt peuvent être considérées comme des hétéroduplex puisqu'elle disparaissent à l'électrophorèse dénaturante. Le tableau 3 ci-après donne les précisions correspondantes : TABLEAU 3 Taille Electrophorèse Electrophorèse Origine classique "dénaturante" 130 nt + "Monomère" 242 nt ++ Monomère/Dimère 250 nt ++ Contamination par le centromère du chromosome 13 300 nt +++ ++++ Dimère 350 nt traces 400 nt traces 500 nt ++ Dimère/Tétramère 630 nt +++ ++++ Tétramère 720 nt ++ Tétramère/Pentamère 820 nt ++ (+++) ++ (+++) Pentamère 920 nt ++ Pentamère 1130 nt + + Heptamère La bande à 242 nt est un hétéroduplex entre le monomère et le dimère (moyenne de 300+170). La bande à 500 nt est un hétéroduplex entre le tetramère et le dimère (moyenne de 300 + 630). Le poids moléculaire apparent de cette association est légèrement décalé (500 nt au lieu de 475, du fait que cet hétéroduplex présente une grande région monobrin. La bande à 720 nt correspond à un hétéroduplex entre le tetramère et le pentamère (moyenne de 820 + 630) et celle à 920 nt à un hétéroduplex entre le pentamère et le hexamère (moyenne de 820 + 990). On observera que l'hexamère n'apparaît pas à l'électrophorèse dénaturante, étant donné sa faible concentration pour être visible directement. Seule son interaction avec le pentamère laisse une trace de son existence. Phénomène d'auto-PCR Comme montré ci-dessus, lors de l'anneling et grâce à la forte homologie existant entre les différents monomères, des fragments PCR de tailles différentes peuvent se réassocier entre eux en formant des hétéroduplex. Ces hétéroduplex sont constitués d'une partie double brin et d'extrémités qui peuvent être monobrin. Si la partie double brin et suffisamment longue pour ne pas être dissociée (dénaturée) lors du passage à 72 C, on assiste à un phénomène d'auto PCR : partie double brin sert d'amorce et la partie monobrin sert de matrice. L'élongation PCR s'effectue à partir de la région double brin (sens 5'# 3') jusqu'à la fin de la région monobrin. Ce phénomène se suffit à lui-même car il ne nécessite aucune amorce et s'amplifie au fur et à mesure des cycles. . Création de séquences Les hétéroduplex sont formés conformément à l'invention par l'association aléatoire de deux fragments PCR qui ont en commun la région double brin formée. La région qui est ajoutée (par élongation à la région double brin) est aléatoire et dépend uniquement du processus alors aléatoire de formation de l'hétéroduplex. Localement chaque région constituant le produit formé est identique au génome d'origine, mais l'intégralité du produit formé n'existe pas dans le génome d'origine. Le produit d'amplification correspondant est donc nouveau. Ce phénomène de création de séquence existe aussi lors d'une élongation à la suite : - d'un phénomène d'auto-PCR suite à hétéroduplex, - d'un phénomène d'auto-PCR directe, - d'un phénomène de PCR priming. . Présence d'un smear allant de lkb à 8kb Lors de l'électrophorèse des produits PCR, on observe un smear allant jusqu'à 8 Kb. Ce smear a été mis en évidence par une coloration au nitrate d'argent, plus sensible que le bromure d'éthidium. Ce résultat apparaît être la conséquence du phénomène d'auto PCR au fur et à mesure des cycles. Lors de l'élongation d'un hétéro-duplex l'extrémité 3' de la région double brin est allongée jusqu'à la fin du monobrin matrice. À chaque cycle, l'élongation d'un hétéro-duplex peut se faire sur quelques monomères (de 180 nt à 1160 nt environ). Lors du cycle suivant, ce brin néo-synthétisé peut former à son tour un hétéro-duplex qui sera allongé jusqu'à l'extrémité du monobrin matrice. La répétition d'un tel phénomène en cascade lors de 35 cycles de PCR explique aisément la formation d'un smear pouvant aller jusqu'à une dizaine de Kb. Le smear ainsi obtenu est théoriquement discontinu et doit présenter des bandes toutes multiples de monomères, c'est-à-dire de 170 nt. Or, expérimentalement, le smear observé de 1 à 8 Kb est continu sur toute sa longueur. Au fur et à mesure des différents cycles, la concentration en dNTP diminue progressivement, ralentissant parallèlement l'activité de la Taq polymérase. En outre, le temps d'élongation utilisé est relativement court et la polymérase n'a pas forcément le temps d'aller jusqu'au bout de l'hétéroduplex (surtout si l'allongement est supérieur à 1 Kb). Ainsi, le phénomène d'auto PCR permettant d'allonger les hétéroduplex peut être tronqué à tout moment et à n'importe quel endroit de l'hétéroduplex. Ce phénomène d'arrêt aléatoire, lié aux conditions expérimentales mises en oeuvre, est à l'origine de la continuité du smear de 1 Kb à8Kb. .brassage génétique Les produits synthétisés par la PCR, en opérant conformément à l'invention, suite à la formation d'hétéroduplex, présentent es propriétés intéressantes - ils peuvent très largement dépasser la taille conventionnelle d'un produit PCR, - leur "juxtaposition" résulte d'un mécanisme aléatoire, - ils sont localement identiques au génome d'origine, - leur intégralité n'existe pas dans le génome d'origine, - ils sont donc nouveaux par la création d'une séquence nucléotidique, - ils sont toujours représentatifs de la région d'origine. Exemple 4 : Banque centromérique 21/13 obtenue selon l'exemple 3. Ce produit PCR utilisé en hybridation in situ hybride les centromères 21 et 13. Exemple 5 : centromérique 21 Les figures 7 et 8 représentent les photos montrant la spécificité de la sonde issue de la banque polymorphique centromérique 21en hybridation in situ - la photo de la figure 7 : noyaux cellulaires normaux (deux points : deux chromosomes 21) - la photo de la figure 8 : sur noyaux cellulaires avec syndrome de Down (trois points : chromosomes 21). A 96 C le centromère du chromosome 21 et le centromère du chromosome 13 sont dénaturés et donc accessibles tous les deux à la PCR. A une température inférieure (entre 80 C et 94 C) seul le centromère du chromosome 21 est accessible à la PCR, ce qui permet de renforcer la spécificité de la sonde. Le chromosome 21 contient au moins des gènes que le chromosome 13, et présente donc un taux de GC plus faible. Le centromère du chromosome 21 se dénature donc à une température inférieure que le centromère du chromosome 13. REVENDICATIONS 1/ Procédé d'élaboration de fragments nucléotidiques spécifiques d'une famille de régions répétées d'acides nucléiques, ou famille cible, ces régions présentant entre elles de fortes homologies, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes : - d'alignement, les unes en dessous des autres, d'au moins 10 séquences monomères de la famille cible d'au moins 20 nucléotides de longueur, - de définition, sur chacune des séquences monomères, d'une ou plusieurs zones en correspondance, sur chacun des monomères, - d'évaluation du pourcentage d'occurrence, dans chaque alignement vertical, de chacun des nucléotides de la zone retenue, - d'élaboration statistique de fragments nucléotidiques, selon une logique floue probabiliste, en retenant pour chaque position, en fonction du pourcentage établi ci-dessus, et en comparant avec les pourcentages obtenus, selon le même procédé, avec d'autres acides nucléiques de familles différentes, soit le nucléotide le plus probable, afin de conférer un caractère polymorphe au fragment, soit le nucléotide le plus spécifique par rapport à la famille cible. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que pour conférer un caractère global au fragment, on choisit le nucléotide le plus commun dont l'occurence est supérieure à au moins 20%, notamment à au moins 50%, en recommençant le même schéma pour chaque position suivante de l'alignement, le caractère spécifique du fragment étant obtenu en choisissant le nucléotide le plus spécifique de la famille ciblée. 3/ Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on établit dans le fragment, par rapport aux données statistiques, des parties d'homologie formées des nucléotides majoritairement présents et des parties divergentes formées de nucléotides différents de ceux majoritairement présents dans un alignement vertical donné. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on définit à l'intérieur d'une même zone, selon un gradient une partie globale et une partie spécifique. 5/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les régions répétées sont issues des centromères de chromosomes. 6/ Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il s'agit des centromères des chromosomes 21, 13, 14 ou 22. 7/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les régions répétées sont issues des télomères de chromosomes. 8/ Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il s'agit des télomères des chromosomes 21, 13, 14 ou 22. 9/ Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on élabore un fragment de nucléotides capable de reconnaître spécifiquement le chromosome 21 sur la base des données statistiques de la figure 2 et/ou de la figure 3. 10/ Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que, pour disposer de fragments capables de reconnaître spécifiquement le chromosome 21, on élabore les enchaînements suivants ( respectivement SEQ ID N 3 et SEQ ID N 4): CAAGGAGTGGAACATC (5'->3') CTTCTGTCTAGATTTTAGG (5'-3'), et pour reconnaître spécifiquement les chromosomes 14 et 22, on élabore les enchaînements suivants ( respectivement SEQ ID N 5 et SEQ ID N 6): CACAGAGGAGGATCTTG (5'->3') TTTCTGTCGAGTTGTGATA (5'->3') 11/Fragments nucléotidiques tels qu'obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisés en ce qu'ils correspondent à un ensemble aléatoire mais représentatif de la variation interindividuelle des monomères et/ou familiale et sont capables de reconnaître une pluralité de monomères cibles différents au sein de familles de régions répétées. 12/ Utilisation des fragments nucléotidiques selon la revendication 10 comme sondes de détection ou comme amorces d'amplification. 13/ Amorces selon la revendication 12, caractérisées en ce qu'elles autorisent des amplifications multiples en parallèle et concomitantes, lors d'un seul cycle d'amplification, d'au moins une dizaine de monomères différents, voire de plusieurs centaines. 14/ Couples d'amorces pour l'amplification spécifique du centromère du chromosome 21 parmi les chromosomes 21 et 13 et/ou 14, et/ou 22, ces couples d'amorces correspondant respectivement aux enchaînements définis par les données statistiques selon le procédé de la revendication 6,9 ou 10. 15/ Couples d'amorces pour l'amplification spécifique du centromère du chromosome 21, caractérisés en ce qu'ils correspondent respectivement aux enchaînements SEQ ID N 3 et SEQ ID N 4: CAAGGAGTGGAACATC (5'#3') CTTCTGTCTAGATTTTAGG (5'-3') 16/ Procédé d'amplification de familles de régions répétées d'acide nucléique, caractérisé par des amplifications multiples concomitantes et, lors d'un seul cycle, desdites familles des régions répétées par utilisation d'un couple d'amorces élaborées à partir de fragments nucléotidiques selon la revendication 11. 17/ Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend la dénaturation et la renaturation du produit final d'amplification par choc thermique. 18/ Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'on soumet le mélange d'amplification à une température de l'ordre de 80 à 110 C, pendant 5 à 15 minutes, notamment d'environ 95 C, notamment pendant environ 10 minutes, puis à un refroidissement brusque à une température inférieure à 5 C, notamment de l'ordre de 0 C, puis à une électrophorèse. 19/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisé en ce que l'amplification est réalisée avec un déficit d'amorce, ce qui conduit à un allongement par la polymérase d'un brin amplifié jusqu'à l'amorce suivante rencontrée, et ainsi à la formation de multimères formés de motifs consécutifs. 20/ Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'amplification est conduite de manière à obtenir un épuisement des amorces au cours des cycles en raison de la répétition des régions cibles, ou, en variante, le déficit est créé dès le départ. 21/ Procédé selon la revendication 19 ou 20, caractérisé en ce que les produits d'amplification formés au cours des premiers cycles servent d'amorces pour la synthèse de fragments de plus grande taille. 22/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 21, caractérisé par la réassociation, au cours de l'amplification, de produits d'amplification de taille différentes conduisant à la formation d'hétéroduplex et/ou de produits d'amplification de tailles identiques conduisant à la formation d'homoduplex. 23/ Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'on sépare les hétéroduplex les plus hétérogènes des homoduplex, par exemple par choc thermique, selon la revendication 17 ou 18, chimique ou enzymatique, des produits finaux d'amplification. 24/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 23, caractérisé en ce que les hétéroduplex donnent lieu à une auto-amplification (auto-PCR) lorsqu'ils présentent des extrémités monobrin et une partie double brin suffisamment longue pour ne pas être dissociée, la partie double brin servant d'amorce et la partie monobrin de matrice, ce processus d'auto-amplification pouvant être répété en cascade au cours des différents cycles, conduisant à des fragments de plusieurs dizaines de kb avec des conditions de PCR standard. 25/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 23, caractérisé par une auto-PCR directe, avec auto-hybridation d'un brin d'ADN sur lui-même, lorsque les monomères au sein du même brin sont anticomplémentaires et/ou antiparallèles. 26/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 23, caractérisé par une PCR mono priming ,ou monoamorçage, dans laquelle, lorsque la séquence polymérique constituée de monomères de composition voisine et relativement proche les unes des autres comporte des monomères disposés de manière anticomplémentaire et/ou antiparallèle, une seule amorce est mise en jeu pour l'amplification et se fixe sur des monomères directs et sur des monomères anticomplémentairs et/ou antiparallèles pour réaliser à elle seule des amplifications. 27/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 26, caractérisé en ce que préalablement à l'étape d'amplification, on opère un choc thermique, chimique ou enzymatique afin de dénaturer spécifiquement les séquences les plus sensibles à ces facteurs. 28/ Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce qu'il est appliqué à l'obtention d'une spécificité d'amplification du centromère du chromosome 21 versus celui du chromosome 13, ou du chromosome 22 versus celui du chromosome 14. 29/ Banques de régions répétées d'acides nucléiques, à forte homologie, en particulier de centromères ou de télomères, caractérisées en ce qu'elles comprennent une pluralité d'enchaînements de monomères essentiellement différents les uns des autres tels qu'obtenus par amplification des régions répétées à forte homologie selon le procédé de l'une quelconque des revendications 16 à 28. 30/ Banque selon la revendication 29, caractérisée en ce qu'elle est essentiellement constituée par des fragments d'amplification du centromère du chromosome 21. 31/Banque selon la revendication 29, caractérisée en ce qu'elle est essentiellement constituée par des fragments d'amplification du centromère des chromosomes 21 et 13. 32/ Produits tels qu'obtenus par le procédé d'amplification selon l'une quelconque des revendications 16 à 28. 33/ Produits obtenus par le procédé d'amplification selon la revendication 16, caractérisés en ce qu'ils correspondent à des monomères et/ou des multimères de régions répétées d'acides nucléiques à forte homologie. 34/ Produits selon la revendication 33, caractérisés en ce qu'il s'agit de monomères consécutifs desdites régions, notamment de dimères, trimères, tetramères, pentamères, hexamères ou heptamères. 35/ Produits selon l'une quelconque de revendications 31 à 34, caractérisés en ce qu'il s'agit d'homoduplex et/ou d'hétéroduplex formés par des fragments réassociés respectivement de même taille ou de taille différente, pouvant atteindre plusieurs dizaines de kb. 36/ Sondes de détection de régions répétées d'acides nucléiques à forte homologie, caractérisées en ce qu'elles sont élaborées à partir des fragments selon la revendication 11 et/ou des produits d'amplification selon l'une quelconque des revendications 31 à 34 et qu'elles comportent un marqueur. 37/ Sondes selon la revendication 36, caractérisées en que les fragments nucléotidiques sont spécifiques du chromosome 21.