Brevet FR2819896A1 — publié le 20020726

Microscope confocal rapide Domaine technique L'invention concerne un microscope confocal rapide, plus particulièrement un microscope confocal en fluorescence destiné à fonctionner en temps réel. Technique antérieure. Le microscope confocal à disque de Nipkow permet une imagerie en temps réel, mais l'intensité du faisceau issu de cet appareil est insuffisante pour permettre l'imagerie en fluorescence. Le microscope confocal à balayage laser permet l'imagerie en fluorescence, mais ne permet pas l'imagerie en temps réel. Description de l'invention L'invention a pour objet principal un microscope en fluorescence rapide permettant d'améliorer la rapidité de l'acquisition d'images en fluorescence. Dans le cas d'un microscope confocal à balayage laser, chaque point de l'image doit être éclairé pendant un temps supérieur au temps caractéristique de la désexcitation par fluorescence. De plus, si l'intensité du laser est trop élevée, la fluorescence est saturée. Un rapport signal sur bruit suffisant ne peut pas être obtenu en augmentant l'intensité du faisceau laser au-delà de la limite de saturation. L'obtention de ce rapport signal sur bruit nécessite alors d'augmenter le temps pendant lequel un point donné est éclairé, ce qui ralentit la procédure d'imagerie. Selon l'invention, ces problèmes sont résolus au moyen d'un Microscope confocal comportant un éclairage par un faisceau laser, caractérisé par le fait qu'il comprend un moyen pour diviser le faisceau laser d'éclairage en plusieurs sous-faisceaux, chacun de ces sous-faisceaux étant focalisé sur un point différent du plan observé. En effet, dans ce cas, l'image de l'ensemble des points éclairés peut être obtenue en parallèle. Si une puissance laser suffisante est disponible et si la division en sous-faisceaux se fait sans perte d'énergie laser, la vitesse d'imagerie est multipliée par le nombre de sous-faisceaux. Une application directe à un système laser du principe du microscope confocal à disque de Nipkow consisterait à éclairer le disque de Nipkow à l'aide d'un faisceau laser remplaçant l'éclairage incohérent normalement utilisé. Un microscope ainsi constitué permettrait la génération de sous-faisceaux laser, toutefois ces sous-faisceaux seraient générés avec une perte d'intensité considérable qui rendrait le système inutilisable. Selon une version de l'invention, ce problème est réglé au moyen d'un microscope confocal dans lequel le moyen pour diviser le faisceau laser d'éclairage en plusieurs sous-faisceaux est composé de plusieurs lentilles interceptant chacune une partie distincte du faisceau d'éclairage. Typiquement, il peut s'agir d'un réseau de micro-lentilles. Les sous-faisceaux obtenus au moyen d'un réseau de micro-lentilles ne sont pas parfaitement dépourvus d'aberrations et focalisés chacun sur un point. Selon l'invention, la qualité de ces sous-faisceaux est améliorée au moyen d'un ensemble de trous microscopiques plaçés chacun au point de focalisation d'un sous-faisceau. Les sous-faisceaux obtenus à partir d'un faisceau laser sont cohérents entre eux. Ceci génère dans l'objet observé des interférences qui peuvent perturber le processus d'imagerie. Selon une version de l'invention, ce problème est réglé en utilisant un moyen pour modifier la phase de chaque sous-faisceau. En modifiant rapidement la phase de chaque sous-faisceau, par exemple de manière pseudo-aléatoire, on peut décorréler les sous-faisceaux et supprimer les perturbations dûes aux interférences. Le moyen pour modifier la phase de chaque sous-faisceau peut par exemple être une vitre mobile portant des surépaisseurs différentes dans les zones ou elle est traversée par des sous-faisceaux différents. En déplaçant rapidement cette vitre dans la zone ou elle est traversée par les sous-faisceaux, on génère des décalages de phase variables de chaque sous-faisceau. L'ensemble du système de division en sous-faisceaux du faisceau d'éclairage, y compris les trous microscopiques, peut être mobile de manière à ce que l'ensemble de l'échantillon soit scanné. Un tel système est analogue au microscope confocal à disque de Nipkow. Toutefois les erreurs de position angulaires du système comprenant les micro-lentilles et les trous microscopiques peuvent perturber ou détruire l'image. Suivant une version de l'invention, ce problème est réglé en utilisant un système fixe pour la génération des sous-faisceaux, mais en utilisant des miroirs mobiles pour déplacer l'image de ces trous sur l'échantillon. Ces miroirs mobiles peuvent également être utilisés pour réfléchir le faisceau issu de l'échantillon vers un ensemble de trous microscopiques servant au filtrage de l'onde venant de l'échantillon, comme dans un microscope confocal classique ce faisceau est réfléchi par les miroirs galvanométriques vers un trou microscopique unique. Le faisceau provenant de l'échantillon et filtré par un ensemble de trous microscopiques peut ensuite être acquis par un ensemble de capteurs. On peut par exemple utiliser un capteur matriciel positionné de manière à ce l'onde ayant traversé chacun des trous micoscopiques parvienne à un élément correspondant du capteur. En synchronisant l'acquisition avec le mouvement des miroirs galvanométriques, on peut reconstituer ultérieurement, de manière informatique, une coupe de l'objet observé. Une telle méthode est une transposition directe de la méthode utilisée avec les microscopes confocaux à balayage laser connus, dans lesquels l'onde ayant traversé le trou microscopique est acquise sur un capteur correspondant, l'acquisition étant synchronisée avec le mouvement des miroirs galvanométriques. Cette méthode présente toutefois le défaut de nécessiter un système d'acquisition très spécifique et de ne pas permettre l'observation directe de l'image confocale. Selon une version de l'invention, ces deux problèmes sont résolus au moyen de miroirs mobiles permettant de déplacer, dans un plan image ou se forme l'image confocale, l'image des trous microscopiques. Ce déplacement doit être effectué de manière à ce que le déplacement de l'image d'un trou microscopique dans le plan ou se fonne l'image confocale soit proportionnel au déplacement du point de l'objet dont ce trou est l'image. La commande de ces miroirs doit donc être très précise, ce qui implique un système de commande coûteux. Selon une version de l'invention, ce problème est résolu en utilisant pour ce déplacement les mêmes miroirs mobiles qui sont utilisés pour déplacer le point d'éclairage. On peut utiliser l'une ou l'autre face des miroirs, cependant il est préférable d'utiliser la face opposée à celle utilisée pour diriger le faisceau d'éclairage. En effet cette solution minimise les problèmes dûs aux réflexions parasites sur les surfaces optiques. Description rapide des figures. La figure 1 représente le mode de réalisation préféré. La figure 2 représente un second mode de réalisation. La figure 3 représente l'image sur un capteur d'un réseau de trous microscopiques utilisé dans le mode préféré de réalisation, et la trajectoire d'un point de cette image. La figure 4 représente une variante du mode de réalisation préféré. Mode de réalisation l) référé. Ce mode de réalisation est représenté par la figure 1. Le faisceau issu d'un laser 100 traverse un élargisseur de faisceau comportant par exemple les lentilles 101 et 102. Le faisceau traverse ensuite un réseau de microlentilles 103. On a représenté en traits pleins le sous-faisceau issu d'une de ces microlentilles et en pointillés le sous-faisceau issu d'une autre microlentille. Le faiceau issu du réseau de microlentilles traverse un miroir dichroïque 104 et un réseau de trous microscopiques 105. Le réseau de trous microscopiques 105 peut être constitué par dépôt d'une couche réfléchissante sur une vitre transparente par une méthode de type"litographique", les trous étant alors des interruptions de la couche réfléchissante. Dans ce cas un filtre neutre plaçé en sortie du laser peut être utilisé pour atténuer les effets de retour de la lumière laser. Le réseau de trous microscopiques peut également être constitué d'une plaque métallique dépolie dans laquelle les trous sont percés au moyen d'un laser. Cette solution évite les problèmes de retour du faisceau laser. La partie du faisceau qui traverse une microlentille du réseau 103 constitue un sousfaisceau focalisé sur un trou microscopique du réseau 105. Le faisceau ayant traversé le réseau de trous microscopiques 105 traverse ensuite une vitre 106 mobile en rotation autour d'un axe 107. La surface de cette vitre est divisée en un ensemble de sous-surfaces, par exemple les sous-surfaces 120 et 121. La moitié de ces sous-surfaces portent une surépaisseur générant un décalage de phase de 180 degrés du faisceau laser les traversant. Les sous-surfaces portant des surépaisseurs sont réparties de manière pseudo-aléatoire dans l'ensemble des sous-surfaces. Chaque sous-surface est approximativement carrée. La largeur du coté du carré est égale à la distance entre deux trous microscopiques adjacents du réseau 105. La vitre 106 est positionnée de manière à ce que chaque trou microscopique du réseau 105 soit placé au-dessus d'une soussurface distincte. La rotation rapide de la vitre 106 permet de générer des décalages de phase pseudoaléatoires de l'ensemble des sous-faisceaux, de sorte que la cohérence spatiale du faisceau soit rompue après traversée de la vitre 106. Le faisceau ayant traversé la vitre 106 traverse ensuite la lentille de tube 108 puis est réfléchi par un miroir 109. Il est ensuite réfléchi par un miroir galvanométrique 110 mobile en rotation autour d'un axe situé dans le plan de la figure, par un miroir 111, et par un miroir galvanométrique 112 mobile en rotation autour d'un axe orthogonal au plan de la figure. Il traverse l'objectif de microscope 113 et parvient à l'échantillon 114. L'objectif 113 est un objectif formant à l'infini une image de l'échantillon observé. Le réseau de trous microscopiques 105 est dans le plan image (plan ou se forme une image stigmatique de l'objet observé). De préférence, le plan focal image de l'objectif 113 est dans le plan focal objet de la lentille 108 et le réseau de trous 105 est dans le plan focal image de la lentille 108. Ceci permet de maximiser l'ouverture utile de chaque sous-faisceau. L'échantillon éclairé émet en retour un faisceau lumineux non cohérent. Ce faisceau traverse l'objectif 113, est réfléchi par le miroir gatvanométrique 112, le miroir 111, le miroir galvanométrique 110, le miroir 109. Il traverse la lentille de tube 108, la vitre 106, le réseau de trous microscopiques 105. Il est réfléchi par le miroir dichroïque 104 puis par le miroir 115. Il traverse la lentille 116 identique à la lentille de tube 108 et dont le plan focal objet est sur le réseau de trous microscopiques 105. Il est réfléchi par la seconde face du miroir gatvanométrique 110, par le miroir 117, par la seconde face du miroir galvanométrique 112. Il traverse ensuite la lentille 118 qui forme dans son plan focal image l'image du réseau 105, et donc de l'échantillon observé. Un capteur CCD 119 peut être placé dans ce plan, toutefois il est également possible d'observer directement l'image formée dans ce plan, à l'aide d'un oculaire. Â F La largeur d'un trou microscopique du réseau 105 est par exemple --'-ou 78 est la 2ouv F, 13 distance focale de la lentille 108. F ; 13 est la distance focale de l'objectif 113, ouv est l'ouverture numérique de l'objectif 113, Â est la longueur d'onde du laser. La distance D entre deux trous microscopiques adjacents est de préférence au moins 10 fois la largeur de chaque trou. Le diamètre de chaque lentille du réseau de lentilles 103 est égal à la distance D entre deux trous microscopiques adjacents. La distance focale F de chaque lentille du réseau de lentilles 103 et son diamètre D sont en outre liés par la D FI relation---= 0 ?/--. Par exemple on peut avoir : 2F F 103 FI = 2 mm OMV=1, 25 F ; O8 = 200 mm D = 2 mm F = 80 mm Les miroirs galvanométriqucs 110 et 112 sont commandés de manière à déplacer l'image du réseau 105 sur le capteur 119, de la manière indiquée sur la figure 3. La figure 3 montre l'image du réseau 105 sur le capteur 119, pour une position de référence des miroirs galvanométriques. Le trait 301 superposé au dessin montre la trajectoire suivie par l'image d'un point 300 du réseau lorsque les miroirs galvanométriques sont commandés. Cette trajectoire est parcourue alternativement dans les deux sens. Afin d'éviter des inhomogénéités d'éclairage le laser peut être éteint au moyen d'un commutateur électro-optique lorsque le miroir oscillant le plus rapidement est proche de sa déviation angulaire maximale ou minimale. En effet, les parties correspondantes de la trajectoire sont parcourues plus lentement que les autres, ce qui génère des inhomogénéités. Lorsque cette trajectoire est suivie, l'image d'un trou du réseau 105 balaye une petite partie du plan image, et l'ensemble des images des trous du réseau balaye l'ensemble du plan image. Une image confocale est donc générée dans l'ensemble du plan image. Le contour 302 montre la limite de la zone utile, dans laquelle une image confocale de bonne qualité est générée. Cette image confocale est peu sensible aux imprécisions de mouvement des miroirs galvanométriques. De nombreuses variantes de la trajectoire parcourue peuvent être utilisées, la contrainte essentielle étant que l'ensemble des points images des trous du réseau 105 balaye l'ensemble du plan image. Il est possible de modifier la position du miroir dichroïque 104 de la manière indiquée sur la figure 4. Dans ce cas un second réseau de trous microscopiques 130 doit être utilisé pour filtrer l'onde provenant de l'objet. Cette solution est toutefois plus difficile à mettre en oeuvre, les réseaux 105 et 130 devant être parfaitement identiques et correctement positionnés. Second mode de réalisation. Ce second mode de réalisation est plus proche du fonctionnement classique d'un microscope à disque de Nipkow. La configuration physique est plus simple que précédemment, mais le fonctionnement de l'appareil présente des difficultés de réglage qui en limitent l'utilité pratique. Le faisceau issu d'un laser 200 traverse un élargisseur de faisceau composé des lentilles 201 et 202 puis traverse un disque 203 portant un réseau de microlentilles, mobile en rotation autour de l'axe 204. Le faisceau parvient ensuite au disque 205 mobile en rotation autour du même axe 204 et portant un réseau de trous microscopiques. Il traverse ensuite la lentille de tube 207 et l'objectif 208, et parvient à l'échantillon 209. Le faisceau émis par fluorescence par l'échantillon 209 traverse l'objectif 208 et la lentille de tube 207, puis le disque 205. Il est alors réfléchi par le miroir dichroïque 206, traverse la lentille 210 et parvient dans un plan image du réseau 205. Dans ce plan image on place un capteur 211. Il est également possible d'observer l'image directement à l'aide d'un oculaire. Le disque 205 est un disque de Nipkow classique. Le disque 203 porte une microlentille correspondant à chaque trou du disque 205. Le faisceau traversant une microlentille du disque 203 est focalisé par cette microlentille sur un trou du disque 205. Les disques 203 et 205 sont solidaires l'un de l'autre et sont entraînés en rotation autour de l'axe 204. Du fait de cette rotation, les trous du disque 205 balayent l'ensemble du plan focal, suivant le principe du microscope à disque de Nipkow, tout en restant illuminés par les sous-faisceaux issus des microlentilles. L'angle entre l'axe de rotation des disques et l'axe optique doit être nul. Le système est très sensible aux erreurs affectant cet angle. Il est difficile d'entraîner les disques en rotation rapide tout en maintenant la valeur de cet angle. Ceci peut être facilité par une mesure en continu de cet angle et une rétroaction, par exemple sur la position de la lentille 201, qui permet d'adapter la direction du laser pour compenser les modifications de l'angle entre axe de rotation et axe optique. Il est également possible d'utiliser une construction mécanique très soignée et donc coûteuse. Applications industrielles Le présent microscope peut être utilisé pour l'imagerie en temps réel d'objets biologiques. Revendications (1/1) 1-Microscope confocal comportant un éclairage par un faisceau laser, caractérisé par le fait qu'il comprend un moyen pour diviser le faisceau laser d'éclairage en plusieurs sous-faisceaux, chacun de ces sous-faisceaux étant focalisé sur un point différent du plan observé. 2-Microscope selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comporte un moyen pour modifier la phase de chaque sous-faisceau. 3-Microscope selon une des revendications 1 à 2, caractérisé par le fait qu'il comprend un réseau de trous microscopiques, chacun desdits trous microscopiques étant traversé par un desdits sous-faisceaux. 4-Microscope selon une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que ledit moyen pour diviser le faisceau laser d'éclairage en plusieurs sous-faisceaux est composé de plusieurs lentilles interceptant chacune une partie distincte du faisceau d'éclairage. 5-Microscope selon une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il comprend des miroirs mobiles permettant de déplacer dans le plan observé le point image de chaque sous-faisceau, et sur lesquels se réfléchit en retour le faisceau issu de l'échantillon. 6-Microscope selon une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait qu'il comprend : - des trous microscopiques placés chacun en un point image d'un point de l'objet sur lequel un des sousfaisceaux est focalisé, - des miroirs mobiles permettant de déplacer, dans le plan ou se forme l'image confocale, l'image desdits trous microscopiques.