Brevet FR2819814A1 — publié le 20020726

La présente invention concerne la formulation et la mise en forme de compositions gélifiables biocompatibles permettant de réaliser des implants Dans le domaine de la cicatrisation des tissus comme les cartilages ou les tissus osseux, il est souvent nécessaire de recourir à des greffes de chondrocytes. Ces greffes de chondrocytes utilisent à ce jour des suspensions cellulaires parfois difficiles à utiliser, il en résulte un besoin de produit ou de moyen permettant de réaliser ces greffes de chondrocytes par la mise en oeuvre de matériaux solides, présentant des caractéristiques mécaniques permettant une manipulation aisée. On connaît les matériaux biodégradables que sont par exemple les polymères naturels comme les celluloses, les méthylcelluloses, les gélatines, les caséines, les chitosanes, les polylysines et les polysaccharides. On connaît également les propriétés par exemple de gélification de certains de ces biomatériaux comme les polysaccharides permettant la réalisation de produits solides, et leur biocompatibilité suffisante pour maintenir la viabilité de cellules. Il est ainsi connu de maintenir en vie des cellules dans des milieux contenant des polysaccharides naturels et l'inclusion de matériel vivant ou de principes actifs pharmaceutiques dans des gels constitués de polysaccharides est donc possible. Différents moyens et procédés ont été mis en oeuvre pour obtenir des gels d'alginates utilisables comme matériau implantable susceptible de contenir ou non des extraits tissulaires vivants et/ou des principes actifs pharmaceutiques. On connaît par exemple de W09825053, un gel d'alginate composé d'une suspension de particules d'hydrogel ayant un diamètre compris entre 30 et 500/im. On connaît de GB2201966 un matériau composite constitué de deux composés gélifiables dont une partie de l'un deux composés gélifiables est éliminée permettant ainsi de former un gel composite poreux présentant des cavités contenant par exemple des cellules. La présente invention, permet la réalisation d'implants présentant des propriétés mécaniques compatibles avec leur utilisation notamment lors de gestes chirurgicaux et permettant la greffe de chondrocytes. La présente invention concerne une composition aqueuse de polysaccharides, gélifiable et biocompatible caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange d'au moins deux polysaccharides dont l'un est gélifiable par voie chimique et l'autre par voie thermique. Les polysaccharides naturels macromoléculaires sont composés de molécules de saccharides non hydrolysées liées entre elles pour former des chaînes longues. Les macromolécules peuvent être composées d'environ 3 000 molécules de saccharides et de préférence de 300 à 1 200 molécules. Les deux polysaccharides préférés selon l'invention sont l'agarose et l'alginate. L'agarose est dérivé de l'agar qui est extrait de différentes sortes d'algues rouges appartenant au groupe des rhodophyceae c'est un un galactane hydrocolloïde linéaire. L'agar et les agaroses ont la propriété de former des gels par refroidissement ; ces gels présentent des propriétés physiques variables en fonction de l'origine des agars ou des agaroses. Ces polysaccharides sont facilement mis en forme grâce à leurs propriétés de gélification en fonction de la température, par exemple par moulage à chaud. Ils peuvent également en travaillant à partir de solution être moulés à une température supérieure à la température de gélification puis après refroidissement être démoulables. Ces agars ou agaroses ont également la particularité de présenter des températures de gélification inférieures à 40oC, compatibles avec la vie cellulaire et inférieures aux températures de dégradation de nombreux principes actifs pharmaceutiques. Cependant les caractéristiques mécaniques de ces gels sont insuffisantes car ils sont friables et cassants et ne résistent pas aux contraintes imposées lors de la réalisation de gestes chirurgicaux. Les alginates sont des dérivés de l'algine, qui est un polysaccharide complexe présent dans les parois cellulaires d'une algue brune appartenant au groupe des phaetophyceae. L'alginate est extrait des algues sous forme d'une solution sel de sodium. Les alginates présentent notamment la propriété de former des gels par réaction avec des cations divalents. Ces gels sont en général constitués d'environ 97,5 à 99% d'eau et de 0,3 à 2,5% de polymères. L'inclusion de matériel vivant ou de principes actifs pharmaceutiques est également possible, notamment, il est connu d'utiliser les gels d'alginate pour maintenir en suspension des cellules. Ces dernières peuvent par exemple être dispersées dans une solution d'alginate qui sera polymérisée au contact d'une solution de sel de calcium ou de barium. Cependant ce mode de polymérisation ne permet pas de former un bloc de gel pouvant être mis en forme, ni le moulage. On obtient des billes indépendantes d'un gel qui présente néanmoins des caractéristiques mécaniques intéressantes, car il n'est pas friable, il est manipulable et même découpable. Les chitosanes sont constitués de résidus N-acétylglucosamine unis par des liaisons béta-1,4, dérivés par désacétylation de la chitine qui forme de longues chaînes. La chitine est le constituant principal de l'exosquelette des crustacés. Un polysaccharide gélifiable sera ainsi un polysaccharide présentant la propriété de former un gel, par réticulation comme les alginates, les agaroses, les chitosanes. La réticulation pourra être effectuée, en fonction de la nature des polysaccharides mis en oeuvre, par abaissement de la température ou par addition d'une solution saline, par exemple contenant des ions calcium ou barium ou modification du pH. On entend ici par gélifiable par voie thermique l'aptitude pour une composition à former un gel par abaissement de la température. On entend ici par gélifiable par voie chimique, l'aptitude pour une composition à former un gel par réaction par exemple avec des cations métalliques qui provoquent une réticulation et donc une formation de gel ou par modification du pH de la solution de polysaccharide. Les polysaccharides gélifiables par voie chimique selon l'invention sont les alginates, les chitosanes et le collagène. Les polysaccharides gélifiables par voie thermique selon l'invention sont l'agar ou l'agarose. Les compositions aqueuses de polysaccharides selon l'inventions contiennent entre 0.5 et 10 % de polysaccharide gélifiable chimiquement et entre 0,5 et 10 % de polysaccharide gélifiable thermiquement. La présente invention concerne une composition aqueuse de polysaccharides, gélifiable et biocompatible dont l'un est gélifiable chimiquement et l'autre thermiquement ; ce mélange permettant par formation du gel par réticulation par abaissement de la température de créer une structure moulable et solide permettant ensuite par réticulation chimique du deuxième polysaccharide d'améliorer les propriétés mécaniques. La présente invention concerne une composition aqueuse de polysaccharides, gélifiable et biocompatible dont l'un est gélifiable chimiquement et l'autre thermiquement, caractérisée en ce qu'elle comprend des extraits tissulaires biologiques vivants ou des cellules autologues, allogéniques ou xénogéniques Les cellules susceptibles d'être mise en oeuvre dans une composition selon l'invention appartiennent au groupe des chondrocytes et autres cellules constitutives du cartilage, au groupe des ostéoplastes où autres cellules constitutives des os, au groupe des cellules musculaires ou fibroblastes. Ces cellules seront de préférence choisies parmi les cellules capables de stimuler la régénération des tissus osseux ou cartilagineux. Les cellules capables de stimuler la régénération des tissus cartilagineux sont par exemple des chondrocytes isolés et multipliés par culture cellulaire à partie de biopsie de cartilage Les compositions gélifiables biocompatibles préparées selon l'invention peuvent contenir également des agents susceptibles de traiter ou de prévenir des pathologies ou des complications. Ces agents sont par exemple des principes actifs pharmaceutiques comme par exemple des agents antiviraux ou des agents antibactériens. Ces agents peuvent être présents dans les compositions gélifiables biocompatibles selon l'invention seuls ou en mélanges. Les compositions selon l'invention sont préparées par le procédé comprenant les étapes suivantes : - solubilisation dans l'eau du polymère gélifiable par voie chimique, - addition du polysaccharide gélifiable par voie thermique et mise en solution par chauffage - stérilisation et refroidissement. On obtient un gel intermédiaire, partiellement réticulé qui éventuellement, est remis en solution par chauffage avant addition des suspensions cellulaires ou des principes actifs pharmaceutiques. - refroidissement du mélange obtenu pour gélification par voie thermique et moulage, on obtient donc une forme intermédiaire qui ne présente pas les propriétés mécaniques requises pour l'utilisation. - démoulage puis gélification par réticulation chimique par mise en contact avec une solution saline. Ce procédé permet en outre d'obtenir si nécessaire des gels intermédiaires stérilisables, prêts à l'emploi pour l'incorporation de principes actifs et/ou de suspensions cellulaires. Dans une variante de préparation, la gélification par voie chimique peut être réalisée in situ au moment de l'implantation ou après l'implantation par addition d'une solution saline. Les solutions salines selon l'invention sont de préférence des solutions de sels de calcium ou de barium. Exemples d'application : 1. Implant contenant des chondrocytes destiné à la réparation du cartilage articulaire Fabrication d'un implant contenant des chondrocytes L'implant est formé de chondrocytes cultivés, d'un gel composite et éventuellement, d'os spongieux déminéralisé humain. Préparation des chondrocytes Les chondrocytes proviennent d'une biopsie de cartilage réalisée sur un patient atteint de lésions chondrales ou ostéo-chondrales. Après isolement grâce à un traitement enzymatique approprié, les chondrocytes sont multipliés en culture cellulaire jusqu'à obtention d'un nombre suffisant. L'ensemble des étapes d'obtention des chondrocytes est réalisé en milieu aseptique. Ces cellules sont alors récupérées et mises en suspension dans du milieu de culture avant la fabrication de l'implant. Préparation de l'os spongieux déminéralisé : Le tissu osseux humain provient d'une banque de tissus. Il subit une étape de dévitalisation et de viro-inactivation par action chimique et physique. Le tissu osseux est ajusté à la forme désirée puis déminéralisé en milieu acide à 4 C. L'état stérile est obtenu par rayonnement gamma. Préparation du gel composite : 1 Dissoudre de l'alginate dans une solution de Hank's à température ambiante à une concentration généralement comprise entre 1 et 10%. 2 Suspendre de l'agarose de type gelling" dans le mélange précédent à une concentration généralement comprise entre 1 et 10% 3 Après homogénéisation, chauffer immédiatement l'ensemble à 90 C afin de dissoudre l'agarose en suspension. 4 Stériliser par autoclavage à 121 in pendant 20 minutes la solution d'alginate et d'agarose. 5 Le gel composite se forme après refroidissement à température de gélification de l'agarose. Préparation de l'implant L'ensemble des opérations se déroule dans des conditions aseptiques. 1 liquéfier le gel composite par chauffage à 90 C puis le maintenir à 37 C pour son utilisation. 2 Ajouter la suspension cellulaire. 3 Après homogénéisation, couler le mélange dans un moule. 4 Pour les implants avec phase osseuse, l'os spongieux déminéralisé est alors rajouté selon les besoins. 5 Porter ensuite le moule à 4 C pendant 10 minutes pour permettre à l'implant de gélifier. 6 Démouler l'implant puis le plonger 10 minutes dans une solution de Cacti2 25 mM pour transformer l'alginate de sodium en alginate de calcium. 7 Incuber l'implant à 37OC, 5% de CO2 dans du milieu DMEM ajusté en CaCI2 à 3 mM jusqu'à utilisation. Variante de préparation Lorsque l'implant ne contient pas d'os déminéralisé, il est possible de transformer l'alginate de sodium en alginate de calcium seulement in situ au moment de l'implantation. L'implant est alors utilisé comme une pâte qui est mise en forme dans la lésion à traiter. Par aspersion d'une solution contenant 25 mM de chlorure de calcium, l'implant se solidifie in situ en adoptant la forme de la lésion Il. Obturateur fémoral destiné à faciliter la mise sous pression du ciment chirurgical et à limiter sa progression dans le canal diaphysaire du fût fémoral lors de la pose de prothèses de hanche Les obturateurs habituellement utilisés sont soit en matériaux synthétiques biodégradables (polymère d'acide lactique ou glycolique), soit à base de gélatine d'origine animale (porcine en général). Dans le premier cas, la lyse du polymère entraîne des phénomènes inflammatoires qui ne sont pas souhaitables. Dans le deuxième cas, l'utilisation de produit d'origine animale représente une risque potentiel de transmission de maladies infectieuses (prions). Fabrication d'un obturateur fémoral 1 Dissoudre de l'alginate à une concentration généralement comprise entre 1 et 10% dans de l'eau pour préparation injectable. 2 Mettre en suspension de l'agarose"Hight gelling"à une concentration généralement comprise entre 1 et 10%. 3 Dans un mélangeur, porter immédiatement le mélange à une température supérieure à la température de fusion de l'agarose tout en homogénéisant. 4 Couler le gel dans les moules pour obturateur préchauffés à 50 C 5 Laisser refroidir les moules 30 minutes à 4 C puis démouler. 6 Plonger les obturateurs 12 heures dans une solution de Cacti2 100 mM 7 Rincer deux fois une heure les obturateurs dans du soluté physiologique de qualité injectable. REVENDICATIONS 1. Composition aqueuse de polysaccharides gélifiable et biocompatible caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange d'au moins deux polysaccharides dont l'un est gélifiable par voie chimique et l'autre par voie thermique. 2. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que le polysaccharide gélifiable par voie chimique est choisi parmi les alginates, les chitosanes et les collagènes. 3. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que le polysaccharide gélifiable par voie thermique est choisi parmi l'agarose et l'agar. 4. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle contient des extraits tissulaires biologiques 5. Composition selon la revendication 4 caractérisée en ce qu'elle contient des cellules autologues, allogéniques ou xenogéniques. 6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que les cellules appartiennent au groupe des chondrocytes et autres cellules constitutives du cartilage, au groupe des ostéoblastes ou autres cellules constitutives des os, au groupe des cellules musculaires ou des fibroblastes. 7. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle contient un principe actif pharmaceutique seul ou en mélange. 8. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que les polysaccharides sont présents respectivement dans le gel à une concentration comprise entre 0,5 et 10 %. 9. Composition gélifiée susceptible d'être obtenue par gélification thermique d'une composition selon l'une quelconque des revendications précédentes. 10. Implant caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par gélification d'un composé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6. 11. Utilisation d'une composition gélifiable selon l'un quelconque des revendications 1 à 8 pour la préparation d'implant. 12. Utilisation d'une composition gélifiable selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour la réalisation d'obturateur fémoral. 13. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisée en ce qu'elle contient en outre de l'os spongieux déminéralisé. 14. Procédé de préparation d'une composition aqueuse de polysaccharides, gélifiable et biocompatible, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : - solubilisation dans l'eau du polysacharide gélifiable par voie chimique, - addition du polysaccharide gélifiable par voie thermique et mise en solution par chauffage - stérilisation et refroidissement, obtention d'un gel intermédiaire partiellement réticulé, - solubilisation du gel intermédiaire par chauffage, addition des principes actifs pharmaceutiques et/ou des extraits tissulaires biologiques, - refroidissement du mélange obtenu pour gélification par voie thermique et moulage, - démoulage puis gélification par réticulation chimique par mise en contact avec une solution saline. 15. Procédé de préparation d'une composition aqueuse de polysaccharides, gélifiable et biocompatible, caractérisé en ce qu'il comporte au moins les étapes suivantes : - solubilisation dans l'eau du polymère gélifiable par voie chimique, - addition du polysaccharide gélifiable par voie thermique et mise en solution par chauffage - refroidissement du mélange obtenu pour gélification par voie thermique et moulage, - démoulage puis gélification par réticulation chimique par mise en contact avec une solution saline.