Brevet FR2812551A1 — publié le 20020208

L'invention concerne une nouvelle forme pharmaceutique comprenant un matériau support et au moins un facteur de régulation cellulaire. Dans la présente description, on entend par le terme matériau support un matériau polymérique biocompatible susceptible de comporter, à sa surface ou au sein de sa structure, au moins un facteur de régulation cellulaire. On entend par facteurs de régulation cellulaire des médiateurs biochimiques sécrétés par les cellules et susceptibles d'intervenir dans des mécanismes cellulaires tels que par exemple le développement, la croissance ou l'activation des cellules , en particulier les cytokines, les chimiokines et les facteurs de croissance, ces derniers étant particulièrement préférés. L'invention trouve une application intéressante dans le domaine du traitement des lésions cutanées ou des plaies dermiques et dermoépidermiques, qui nécessitent la favorisation de la croissance des cellules impliquées dans le processus de cicatrisation, par exemple les brûlures, en particulier les brûlures des second et troisième degrés, les ulcères, les escarres, les ulcères cutanés ou variqueux. Elle trouve également une application intéressante dans une utilisation en tant qu'implant dans laquelle le matériau support, biodégradable, est susceptible de libérer le ou les facteur(s) de régulation cellulaire, en particulier le ou les facteur(s) de croissance au niveau du site d'implantation. La réparation des lésions cutanées met en jeu une série complexe de processus cellulaires comprenant la contraction de la blessure, l'accumulation locale de cellules inflammatoires, la néovascularisation, l'activation et la prolifération de cellules stromales (fibroblastes, histiocytes etc.), la synthèse de composants de la matrice extracellulaire (collagène etc.) et l'épithélialisation. In vivo, ces processus sont régulés par différentes cytokines, chimiokines, et eicosanoïdes. Parmi ceux-ci, la famille des facteurs de croissance des fibroblastes, communément dénommés FGF (pour fibroblast growth factor ), dont on connaît actuellement 7 formes qui différent par leur spécificité vis-à-vis de leurs cellules cibles, présentent l'avantage d'être susceptibles de réguler la croissance de tous les types de cellules impliqués dans la cicatrisation des plaies. Il est donc d'un grand intérêt de disposer d'une forme pharmaceutique permettant leur apport et leur maintien au niveau de la lésion à traiter, tout en préservant leur activité stimulatrice de la croissance cellulaire. L'invention a donc pour objet une forme pharmaceutique comprenant un matériau support et au moins un facteur de régulation cellulaire, caractérisé en ce que le matériau support est constitué, pour au moins 90 % en poids et de préférence pour au moins 95 % en poids, d'une composition à base de méthylidène malonate contenant - de 0 à 10 % en poids d'un ou plusieurs méthylidène malonate de formule (I) dans laquelle - A et B représentent indépendamment un groupe (a) ou (b) dans lesquels RI et RZ représentent indépendamment un groupe alkyle linéaire ou ramifié ayant de 1 à 6 atomes de carbone, et n est un nombre entier compris entre 1 et 5 ; - de 50 à 90 % en poids d'un ou plusieurs oligomère(s) de méthylidène malonate présentant un poids moléculaire inférieur ou égal à 6 000 et constitué(s) d'unités récurrentes de formule (II) dans laquelle A et B sont tels que définis précédemment ; - de 10 à 50 % en poids d'un ou plusieurs polymère(s) de méthylidène malonate présentant un poids moléculaire supérieur à 6 000 et constitué(s) d'unités récurrentes de formule (II). Selon un aspect préféré, dans les formules (I) et (II) précitées - A représente un groupe (a) dans lequel RI représente un groupe éthyle ; et - B représente un groupe (b) dans lequel R2 représente un groupe éthyle et n est un nombre égal à 1. Dans un mode de réalisation préféré, le matériau support est constitué pour au moins 90%, et de préférence pour au moins 95% en poids d'une composition à base de méthylidène malonate contenant - de 50 à 90 % en poids d'un ou plusieurs oligomère(s) de méthylidène malonate présentant un poids moléculaire inférieur ou égal à 6 000 de préférence inférieur ou égal à 3 000 et constitué(s) d'unités récurrentes de formule (II), - de 10 à 50 % en poids d'un ou plusieurs polymères de méthylidène malonate présentant un poids moléculaire supérieur à 6 000. Selon un aspect avantageux, la composition à base de méthylidène malonate contient - de 55 à 65 % en poids d'un ou plusieurs oligomère(s) de méthylidène malonate présentant un poids moléculaire inférieur ou égal à 3 000, notamment compris entre 300 et 1000 et constitué(s) d'unités récurrentes de formule (II), - de 35 à 45 % en poids d'un ou plusieurs polymères de méthylidène malonate présentant un poids moléculaire supérieur à 6 000, de préférence supérieur à 9 000, et plus particulièrement compris entre 12 000 et 25 000. Selon un aspect préféré de l'invention, le facteur de régulation cellulaire utilisable aux fins de l'invention est un facteur de croissance. Avantageusement, le ou les facteur(s) de croissance, peut(vent) être par exemple choisis(s) parmi les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF), le Transforming Growth Factor 5 (TGF(3) , le Nerve Growth Factor (NGF) ou une association de plusieurs d'entre eux. Selon un aspect avantageux, le ou les facteur(s) de croissance est (sont) utilisé(s) seul(s) ou en complexe avec un ligand. En effet, la famille des facteurs de croissance des fibroblastes forment avec leurs ligands naturels habituellement présents dans les tissus tels que l'héparine, l'héparane sulfate ou les protéoglycanes d'héparane sulfate, des complexes très stables dans les conditions physiologiques. De préférence, on utilisera le facteur de croissance des fibroblastes basique, également dénommé FGF-2, en complexe avec l'héparane sulfate ou avec un protéoglycane l'héparane sulfate. Le FGF-2 et l'héparane sulfate peuvent notamment être présents au sein dudit complexe dans un rapport molaire de 1 : 1 à 1 : 20, en particulier de 1:1,5à1:10. Dans le cas d'un complexe avec un protéoglycane d'héparane sulfate, le FGF-2 et le protéoglycane d'héparane sulfate peuvent notamment être présents au sein dudit complexe dans un rapport molaire de 1 : 0,01 à 1 : 0,5. La préparation de la forme pharmaceutique selon l'invention comprend l'incorporation du ou de(s) facteur(s) de régulation cellulaire, en particulier du ou de(s) facteur(s) de croissance, seul(s) ou sous forme de complexe(s) avec un ligand, dans le matériau support. Dans le cas d'un facteur de croissance, on utilise de préférence une solution aqueuse du facteur de croissance qui est incorporée durant l'une des étapes de préparation du matériau support de telle manière que ledit facteur de croissance ne subisse aucune dénaturation, et soit présent à la fois à la surface et dans la structure dudit matériau support. Le matériau support conforme à la présente invention est essentiellement caractérisé par le fait qu'il est constitué majoritairement d'une composition à base de méthylidène malonate, elle-même majoritairement constituée de monomère(s) et/ou d'oligomère(s) de poids moléculaire inférieur ou égal à 6000, de préférence inférieur ou égal à 3000. Une telle composition présente des propriétés de viscosité et de bioadhésion permettant son utilisation dans le traitement des plaies dermiques et dermoépidermiques, seule ou en mélange avec d'autres composants biocompatibles, notamment pour une utilisation de la forme pharmaceutique selon l'invention en tant qu'implant. En outre, les compositions à base de méthylidène malonate utilisables dans le cadre de l'invention, sont biorésorbables, en libérant de l'éthanol et de l'acide glycolique qui sont généralement considérés comme non toxiques pour l'organisme. Cette bio-érosion présente un grand intérêt pour la libération du ou des facteur(s) de croissance contenu(s) notamment dans la structure oligomérique ou polymérique du matériau support au niveau du site de la lésion à traiter. Ces compositions à base de méthylidène malonate pourront être facilement préparées par l'homme de métier, éventuellement par simple mélange dans un solvant approprié de ses constituants (monomériques, oligomériques, polymériques) préparés séparément, et évaporation subséquente du solvant. Ainsi, les monomères de méthylidène malonate pourront être préparés en suivant le procédé décrit dans le brevet EP 0 283 346 correspondant aux brevets US 4 931 584 et US 5 142 098 incorporés ici par référence, après dégazage sous vide de pompe à palettes jusqu'à poids constant pour éliminer l'inhibiteur de polymérisation (S0,). Les oligomères et polymères de méthylidène malonate pourront être synthétisés par voie anionique ou radicalaire à partir des monomères précités. Dans le cas des compositions à base de méthylidène malonate préférées, qui sont formées d'un mélange d'oligomère(s) et de polymère(s) , ces compositions pourront être obtenues également en une seule étape; les proportions relatives des constituants pourront être ajustées en faisant varier la concentration en amorceur anionique ou radicalaire dans le milieu de polymérisation. Les caractéristiques physico-chimiques des compositions à base de méthylidène malonate précitées pourront ainsi être facilement ajustées par l'homme de métier, pour obtenir le matériau support selon l'invention. D'une façon générale, les constituants du matériau de support conforme à l'invention, autres que la composition à base de méthylidène malonate précitée, pourront représenter jusqu'à 10 % en poids de ce matériau. Ces constituants seront bien entendu choisis de manière à former des mélanges intimes avec les compositions à base de méthylidène malonates précitées. Ces constituants pourront être de nature variée, hydrophobes ou hydrophiles, d'origine naturelle ou synthétique. A titre d'exemple de tels constituants, on citera notamment - les polycyanoacrylates, de préférence les polyalkylcyanoacrylates ; - les polyméthacrylates d'alkyle ; - les polyuréthanes biocompatibles ; - les polyoxyalkylènes ; - les polyaminoacides ; - les polyalcoolvinyliques. D'une façon générale, ces constituants seront présents au sein du matériau support sous forme de mélanges avec les compositions à base de méthylidène malonate précitées. Il convient de noter que, sans sortir du cadre de la présente invention, ces constituants pourront également être présents au sein du matériau support sous forme d'unités monomériques dans des copolymères statistiques, multiblocs ou greffés comprenant des unités méthylidène malonate de formule (II), telle que définie précédemment. Ces copolymères à base de méthylidène malonate pourront être préparés par les techniques de polymérisation classiques bien connues de l'homme de métier, parmi lesquelles on citera la polymérisation par voie anionique, la polymérisation par voie radicalaire ou encore, dans le cas des copolymères mutiblocs ou greffés, la technique de couplage des séquences précurseurs du copolymère, ces séquences ayant été au préalable fonctionnalisées en bout de chaîne de façon adéquate. D'une façon générale, les unités monomériques formant les constituants précités seront choisies parmi les unités monomériques constitutives des polyacrylates, des polysaccharides et des polyoxyalkylènes. Parmi les unités monomériques constitutives de polyacrylates susceptibles d'être utilisées dans le cadre de l'invention, on citera les alkylcyanoacrylates, les méthacrylates d'alkyle et les itaconates. D'une façon générale, les copolymères à base de méthylidène malonate utilisés dans le cadre de la présente invention seront constitués, pour au moins 50 % de leurs unités monomériques, par des unités méthylidène malonate. Selon un aspect ultérieur, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une forme pharmaceutique telle que décrite ci-dessus et un excipient pharmaceutiquement acceptable. La forme pharmaceutique selon l'invention ou la composition pharmaceutique la contenant peut être administrée par voie topique ou injectable. L'invention concerne également l'utilisation d'une forme pharmaceutique telle que définie plus haut pour la fabrication d'un implant ou pour l'imprégnation d'un matériau destiné à couvrir une plaie ou encore pour la préparation d'un médicament pour le traitement des lésions cutanées ou des plaies dermiques ou dermoépidermiques, par exemple les brûlures en particulier les brûlures des second et troisième degrés, les ulcères, les escarres, les ulcères cutanés ou variqueux. Selon un aspect ultérieur, l'invention a pour objet un procédé de traitement des lésions cutanées et des plaies dermiques ou dermoépidermiques, en particulier les brûlures, caractérisé en ce qu'il consiste à appliquer sur ladite lésion ou plaie une quantité efficace de la forme pharmaceutique telle que définie plus haut. Les exemples suivants illustrent l'invention de manière non limitative. Exemple 1 : Préparation d'une forme pharmaceutique selon l'invention contenant un complexe FGF-2/ héparane sulfate Dans une fiole de 25 ml, on introduit 40 mg de monomère de méthylidène malonate (1-éthoxycarbonyl-1-éthoxycarbonylméthylèneoxy- carbonyléthène), maintenu sous vide primaire afin d'éliminer l'inhibiteur de polymérisation (dioxyde de soufre) et dissout dans 2 ml d'acétone. L'agitation magnétique est maintenue pendant 15 min. On ajoute ensuite 0,4 ml de NaOH 0,1N en une seule étape toujours sous agitation magnétique. L'agitation magnétique est maintenue pendant 20 min environ. On obtient un volume de 2,4 ml contenant 40 mg de matériau support. Après évaporation sous vide de l'acétone, ledit matériau est amené au 1/5 de son volume et on ajoute à température ambiante un volume égal d'une solution aqueuse contenant un complexe FGF-2/héparane sulfate. Ce complexe est préalablement préparé en mélangeant les 2 composants dans 100 N1 de tampon Tris 5 mM pH 7,6, le mélange étant laissé sous agitation magnétique pendant 2 h à température ambiante. Les différents complexes indiqués dans le tableau 1 ci-dessous ont été préparés en utilisant du FGF-2 recombinant humain (TEBU, France) et de l'héparane sulfate (SIGMA) purifié par électrophorèse, fraction de poids moléculaire 7,5 kD . TABLEAU I No. Complexe FGF-2 hé arane sulfate rapport molaire 1 1 0,8 1 : 1,5 2 1 3,4 1 :6,3 3 1 5,3 1:10 4 1 10,7 1:20 Après l'addition du complexe FGF-2/héparane sulfate, le mélange est soumis à une évaporation rapide jusqu'à l'obtention d'un volume de 0,5 à 0,7 ml, puis à une évaporation sous vide pendant 1 nuit en étuve jusqu'à séchage complet. On obtient ainsi 40 mg de forme pharmaceutique selon l'invention. Exemple 2 : Evaluation de l'activité stimulatrice de la prolifération cellulaire Les formes pharmaceutiques selon l'invention contenant les complexes FGF-2/héparane sulfate de l'exemple 1 ont été mises en contact avec un milieu conditionné, c'est-à-dire un milieu de culture dans lequel les cellules ont été cultivées pendant 2-3 jours et qui contient donc des enzymes secrétées par ces cellules, provenant d'une culture d'entérocytes humains Caco-2 (n ATCC HTB-37 ). Les formes pharmaceutiques sont mises en contact avec ce milieu à raison de 40 mg de forme pharmaceutique par ml de milieu à 37 C pendant 24h. Après centrifugation à 500 g pendant 10 min, le surnageant est introduit dans le milieu de culture des cellules BP-A31 quiescentes, à raison de 2,5% v/v (5p1 pour 200p1) . On a utilisé la lignée cellulaire de fibroblastes de souris BP-A31 (fibroblastes 3T3 chimiquement transformés exprimant une haute teneur en récepteurs au FGF - T.Buchou et al., Exp. Cell. Res ., 1988, l74(2), 411-420). Les cellules sont cultivées pendant 24 h dans des plaques à 24 puits à raison de 40 000 cellules par puits (ou 8 000 cellules par puits dans des plaques à 96 puits) dans du milieu DMEM (GIBCO) contenant 8 lo de sérum de veau foetal et des antibiotiques. Elles sont ensuite cultivées pendant 48 h en milieu dépourvu de sérum afin d'obtenir une culture quiescente et d'augmenter leur sensibilité au FGF exogène, avant l'addition des échantillons à tester, dans le même milieu. Après incubation pendant 24 h à 37 C, le taux de prolifération est estimé en utilisant MTT( T.Mosmann, J.Immunol.Meth.,1983, 65, 55-63). Le MTT (bromure de diméthylthiazol phényl tétrazolium) est un colorant jaune qui, au contact des cellules vivantes, est réduit en MTT formazan, par la chaîne respiratoire mitochondriale des cellules. Le MTT Formozan se présente sous forme de cristaux bleu-violet qui, une fois dissous, donnent une coloration proportionnelle au nombre de cellules vivantes. Le mode opératoire utilisé pour la mesure est le suivant - on met 200 Nl de la suspension cellulaire dans chaque puits (plaques de 96 puits NUNCLON DELTA) - on incube à 37 C, air 95 1o C02 5 l0, pendant un temps déterminé en fonction du protocole expérimental c'est-à-dire 24 h avec sérum, 48 h sans sérum, 24 h avec produits toujours sans sérum. - on ajoute 20 pl d'une solution de MTT à 5 mg/ml dans chaque puits sans éliminer le milieu. La solution mère de MTT à 5 mg/ml est préparée dans du sérum physiologique et filtrée sur 0,22 pm pour stérilisation. - on incube pendant 2h30 à 37 C, air 95% / C02 5% - le surnageant est éliminé par centrifugation à 500 g pendant 10 min puis on élimine le milieu par aspiration. - on ajoute sur les cellules contenues dans chaque puits 200 pl de solution d'extraction préparée selon les proportions suivantes 10g SDS (lauryl sulfate de sodium) 50m1 DMF (diméthyl formamide) 50m1 Eau distillée Le pH est ajusté à 4,7 avec une goutte d'acide acétique. Les boîtes sont agitées pendant 1 heure ou laissées à 37 C pendant une nuit, et on vérifie au microscope que tous les cristaux de méthyl formazan sont dissous. La lecture est effectuée à 570 nm (lecteur de plaque ELISA Labsystems Multiscan MS), en utilisant des blancs de lecture contenant uniquement la solution d'extraction. Les résultats exprimés en pourcentage de prolifération cellulaire pendant 24 h par rapport à une culture témoin sans addition de facteur de croissance, sont rapportés dans le tableau 2 ci-dessous TABLEAU 2 Produit testé % prolifération forme pharmaceutique contenant le 145% complexe n' 1 forme pharmaceutique contenant le 210% complexe n' 2 forme pharmaceutique contenant le 177% complexe n' 3 forme pharmaceutique contenant le 158% complexe n' 4 Les résultats montrent que les formes pharmaceutiques selon l'invention stimulent la prolifération des cellules BP-A31. REVENDICATIONS 1. Forme pharmaceutique comprenant un matériau support et au moins un facteur de régulation cellulaire, caractérisé en ce que le matériau support est constitué, pour au moins 90 % en poids et de préférence pour au moins 95 % en poids, d'une composition à base de méthylidène malonate contenant - de 0 à 10 % en poids d'un ou plusieurs méthylidène malonate de formule (I) dans laquelle - A et B représentent indépendamment un groupe (a) ou (b) dans lesquels R1 et RZ représentent indépendanunent un groupe alkyle linéaire ou ramifié ayant de 1 à 6 atomes de carbone, et n est un nombre entier compris entre 1 et 5 ; - de 50 à 90 % en poids d'un ou plusieurs oligomère(s) de méthylidène malonate présentant un poids moléculaire inférieur ou égal à 6 000 et constitué(s) d'unités récurrentes de formule (II) dans laquelle A et B sont tels que définis précédenunent ; - de 10 à 50 % en poids d'un ou plusieurs polymère(s) de méthylidène malonate présentant un poids moléculaire supérieur à 6 000 et constitué(s) d'unités récurrentes de formule (II). 2. Forme pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que dans les formules (I) et (II) précitées - A représente un groupe (a) dans lequel RI représente un groupe éthyle ; et - B représente un groupe (b) dans lequel Rz représente un groupe éthyle et n est un nombre égal à 1. 3. Forme pharmaceutique selon les revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le matériau support est constitué pour au moins 90%, et de préférence pour au moins 95% en poids d'une composition à base de méthylidène malonate contenant - de 50 à 90 % en poids d'un ou plusieurs oligomère(s) de méthylidène malonate présentant un poids moléculaire inférieur ou égal à 6 000, de préférence inférieur ou égal à 3 000 et constitué(s) d'unités récurrentes de formule (1I), - de 10 à 50 % en poids d'un ou plusieurs polymères de méthylidène malonate présentant un poids moléculaire supérieur à 6 000. 4. Forme pharmaceutique selon la revendication 3, caractérisée en ce que la composition à base de méthylidène malonate précitée contient - de 55 à 65 % en poids d'un ou plusieurs oligomère(s) de méthylidène malonate présentant un poids moléculaire inférieur ou égal à 3 000 et constitué(s) d'unités récurrentes de formule (II), - de 35 à 45 %a en poids d'un ou plusieurs polymères de méthylidène malonate présentant un poids moléculaire supérieur à 6 000, de préférence supérieur à 9 000. 5. Forme pharmaceutique selon la revendication 4, caractérisée en ce que la composition à base de méthylidène malonate précitée contient - de 55 à 65 % en poids d'un ou plusieurs oligomère(s) de méthylidène malonate présentant un poids moléculaire compris entre 300 et 1000 et constitué(s) d'unités récurrentes de formule (II), - de 35 à 45 % en poids d'un ou plusieurs polymères de méthylidène malonate présentant un poids moléculaire compris entre 12 000 et 25 000. 6. Forme pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le matériau support comprend jusqu'à 10% en poids d'un ou plusieurs constituant(s) autres que la composition à base de méthylidène malonate précitée sous forme d'unités monomériques associées à des unités méthylidène malonate de formule (II), dans des copolymères. 7. Forme pharmaceutique selon la revendication 6, caractérisée en ce que lesdits copolymères sont constitués, pour au moins 50% de leurs unités monomériques,par des unités méthylidène malonate. 8. Forme pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le facteur de régulation cellulaire est un facteur de croissance. 9. Forme pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que le facteur de croissance est choisi parmi les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF), le Transforming Growth Factor (3 (TGFP) , le Nerve Growth Factor (NGF) ou une association de plusieurs d'entre eux. 10. Forme pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le ou les facteur(s) de croissance est (sont) utilisé(s) seul(s) ou en complexe avec un ligand. 11. Forme pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ledit facteur de croissance est le facteur de croissance des fibroblastes basique ou FGF-2 et le ligand est l'héparane sulfate ou un protéoglycane d'héparane sulfate. 12. Forme pharmaceutique selon la revendication 11, caractérisée en ce que le facteur de croissance FGF-2 et l'héparane sulfate sont complexés dans un rapport molaire de 1 :1 à 1 :20, en particulier de 1 : 1,5 à 1:10. 13. Forme pharmaceutique selon la revendication 11, caractérisée en ce que le facteur de croissance FGF-2 et le protéoglycane d'héparane sulfate sont complexés dans un rapport molaire de 1 : 0,01 à 1 : 0,5. 14. Composition pharmaceutique contenant une forme pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 et un excipient pharmaceutiquement acceptable. 15. Utilisation d'une forme pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 pour la fabrication d'un implant. 16. Utilisation d'une forme pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 pour l'imprégnation d'un matériau destiné à couvrir une plaie. 17. Utilisation d'une forme pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 pour la préparation d'un médicament pour le traitement des lésions cutanées. 18. Utilisation selon la revendication 17 pour la préparation d'un médicament pour le traitement des brûlures, en particulier les brûlures des second et troisième degrés, des ulcères, des plaies dermiques et dermoépidermiques, des escarres, des ulcères cutanés ou variqueux.