Brevet FR2814239A1 — publié le 20020322

TEST DE DOSAGE ENZYMATIQUE A VISEE DIAGNOSTIQUE A LECTURE OPTIQUE La présente invention concerne un test de dosage enzymatique à visée diagnostique et à lecture optique Par lecture optique on comprend toute technologie permettant une mesure ou une analyse plus communément appelée lecture par un faisceau optique. Une telle lecture optique peut être effectuée par colorimétrie ou toute autre technique adaptée. De tels tests sont d'un usage courant en hématologie. Ces tests s'effectuent par utilisation de réactifs, enzyme et substrat, par exemple présentés dans le commerce en flacons en verre bouchés contenant un millilitre à vingt millilitres d'enzyme ou de substrat. Une gamme étalon et un contrôle qualité devant être établis. Les étalons sont présentés sous forme de flacons en verre bouchés contenant généralement un millilitre de plasma. Il en est de même pour les produits de contrôle. Lorsqu'un laboratoire médical doit faire un test unique de dosage il est obligé de reconstituer au minimum un flacon, soit de un à vingt millilitres, d'enzyme et de substrat et au moins un flacon, soit un millilitre d étalon et un flacon de contrôle La quantité des produits reconstitués est nécessairement supérieure à la quantité utilisée Il en résulte des pertes importantes de produits, d'une part parce que ceux-ci ont une durée de vie limitée (15 jours en moyenne pour l'enzyme et le substrat et en général vingt quatre heures pour les étalons et le contrôle) et d'autre part parce que l'utilisateur préfère reconstituer les réactifs et étalons et contrôle au moment pour être certain des dosages et de la qualité. Ces pratiques génèrent un coût important. La technique connue nécessite pour la réalisation des tests un nombre important de manipulations préalables même si ultérieurement la lecture du test par colorimétrie ou autres moyens optiques est simplifiée. Ces manipulations préalables avec les variations de dosage et/ou de qualité des produits qu'elles supposent, s'opposent à une Intégration du système de test dans une méthodologie de lecture automatisée qui est réservée aux unités ayant quotidiennement un nombre important de tests à réaliser. Les règles de bonne exécution des tests imposent un étalonnage et un contrôle des composants. L'étalonnage s'effectue par ajout d'enzyme et de substrat reconstitué par apport d'eau à du plasma dilué suivant une proportion prédéterminée dans le mode d'emploi du test prévu par le fabriquant. Dans les tests connus, la gamme d'étalonnage est préétabbie et mentionne sur ce mode d'emploi fourni avec le test. L'obtention des valeurs de cet étalonnage préétabli n'est pas significative dans la mesure où enzyme et substrat ont des variations de réaction importantes en fonction des conditions de température que dans un laboratoire, sont souvent hors normes La présente invention vise à obvier à ces inconvénients en proposant un test qui soit constant aussi bien qualitativement que quantitativement et qui soit validé à la fois au stade de la fabrication et de l'utilisation, indépendamment de la date de fabrication et qui soit parfaitement intégrable dans une chaîne automatisée d'analyse tout en étant susceptible d'être produit à un coût sensiblement inférieur à ceux de la technique connue. A cet effet, le test de dosage enzymatique à but diagnostique et à lecture optique selon l'invention, ledit test étant établi à partir d'un ou de plusieurs réactifs et d'un ou plusieurs substrats se caractérise essentiellement en ce qu'il comprend sur un même support destiné à réaliser ce test et à être lu par des moyens optiques, l'ensemble des composants du test, enzyme et substrat en doses préétablies et séparées, une ou plusieurs doses de produits d'étalonnage et une ou plusieurs doses de produits de contrôle, chaque dose des produits respectifs ou du même produit étant séparée des autres, chacune dans un des contenants du dit support, leur dosage étant établi à la valeur nécessaire et suffisante pour la réalisation d'un test unique et étant dans leurs contenants respectifs dudit support lyophilisé avant obturation et hydraté après ouverture simultanée dudit contenant. Suivant une autre caractéristique de l'invention, le support comprend une pluralité de micro cuves alignées et de même contenance dont au moins une contient une dose de réactif enzymatique lyophilisé, dont au moins une contient une dose d'un substrat lyophilisé, plusieurs d'entre elles comprenant respectivement une dose d'un produit d'étalonnage redilué et d'une concentration différente ou une dose d'un produit d'étalonnage ou une dose d'un produit de contrôle, les dits produits étant lyophilisés avant obturation des micro cuves et étant hydratés après ouverture des micro cuves. Suivant une autre caractéristique de l'invention l'obturation des micro cuves est effectuée par des bouchons reliés entre eux, chacun d'eux présentant une jupe de diamètre adapté pour pénétrer dans la cuve et un couvercle supérieur avec épaulement de blocage sur la cuve, les jupes étant dotées d'au moins une lumière verticale sur une partie de leur hauteur ce qui permet après mise en place des bouchons et avant enfoncement des jupes dans les micro cuves de réaliser une opération de lyophilisation des produits contenus dans les micro cuves l'intérieur de la micro cuve étant en contact avec l'extérieur par la lumière. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description ci-après d'une forme de réalisation de l'invention donnée à titre d'exemple non limitatif et illustré par les dessins joints dans lesquels : la figure 1 est une vue du contenant utilisé pour la réalisation d'un test. La figure 2 est une vue en coupe d'une des micro cuves avec son système d'obturation La figure 3 est une vue en coupe selon la figure 2 avec obturation. Le test de dosage selon l'invention tel que représenté aux dessins annexés, est destiné à la réalisation d'un dosage enzymatique unique destiné à être lu par des moyens optiques, par exemple par colorimétrie. Le dosage enzymatique par exemple en hématologie fait appel à des enzymes et à des réactifs et nécessite le recours à des procédures d'étalonnage et de contrôle. Le test selon l'invention comprend sur un même support 1 destiné à réaliser ces tests et à être lu, par des moyens optiques, l'ensemble des produits ou composants utilisés pour ces tests : enzyme et substrat, en doses préétablies et séparées, une ou plusieurs doses de produits d'étalonnage et une ou plusieurs doses de produits de contrôle en dose préétablie et séparée. Chacune des doses des différents composants et/ou du même composant ou produit, lorsque c'est le cas, est établie à la valeur quantitative et qualitative qui est nécessaire et suffisante pour la réalisation d'un test unique. Selon l'invention ces doses sont disposées dans des contenants séparés et elles sont dans leurs contenants du support 1 lyophilisées avant obturation du contenant et hydratées seulement au moment de l'ouverture simultanée des dits contenants lors de la réalisation des tests. Comme illustré, le support 1 du test selon l'invention comprend une pluralité de micro cuves 2. Les micro cuves 2 sont présentées alignées en une barrette, toute autre configuration de support étant possible, de celles adaptées pour la lecture des tests par des moyens colorimétriques connus. Les micro cuves 2 sont chacune constituées d'un puits à paroi cylindrique obturé par un fond horizontal inférieur et elles présentent une ouverture supérieure. Les micro cuves sont séparées les unes des autres par un intervalle 3. La barrette ainsi constituée est réalisée en une seule pièce venant de moulage en un matériau transparent aux rayons lumineux visibles ou infrarouge. En figure 1 est représentée une barrette comprenant huit micro cuves 2 répertoriée de 2/1 à 2/8. Au moins une micro cuve 2/1 contient une dose de l'enzyme utilisé. De préférence l'enzyme est contenue dans la première micro cuve de la succession des micro cuves de la barrette Au moins une micro cuve 2/8 contient une dose du substrat réactif utilisé. De préférence la dose de substrat est contenue dans la dernière micro cuve 2/8 de la succession de micro cuves de la barrette Une ou plusieurs micro cuves contiennent selon l'invention des produits d'étalonnage et de contrôle Trois micro cuves 2/2-2/3-2/4 l'une derrière l'autre à la suite de la micro cuve contenant l'enzyme contiennent les produits d'étalonnage. Au moins une micro cuve 2/5 contient un produit de contrôle, cette micro cuve de contrôle est placée à la suite des micro cuves d'étalonnage Entre la ou les micro cuves 2/8 de substrat réactif et ou sont intercalées une ou plusieurs micro cuves intercalaires qui sont libres de toutes substances et donc utilisables pour réaliser, les étapes de test complémentaire. Selon l'invention, les composants sont distribués dans les micro cuves en doses parfaitement régulières en quantité nécessaire et suffisante pour la réalisation du test Les doses distribuées dans les micro cuves sont, avant obturation de celles-ci, lyophilisées par tous moyens connus et elles sont hydratées après débouchage des micro cuves L'obturation des micro cuves 2 peut être obtenue par apposition et soudage sur les parois de leurs orifices d'une feuille en un complexe thermo soudable ou thermo coulable qui peut être constitué d'une feuille d'aluminium insérée entre deux feuilles de matière synthétique. Suivant une autre forme de réalisation de l'invention, il est fait usage de bouchons 4 qui sont reliés entre eux en barrettes avec pour chaque barrette autant de bouchons que de micro cuves. Les bouchons présentent une jupe élastique 5 de diamètre adapté pour pénétrer en frottement dans la micro cuve, et un couvercle 6 supérieur avec épaulement 7 de blocage sur la paroi de la cuve. La jupe 5 peut être tubulaire et évidée intérieurement ou elle peut être constituée par une portion cylindrique pleine. La jupe 5 présente sur sa paroi, si elle est évidée ou transversalement si elle est pleine, au moins une lumière verticale 8 débouchant à l'extrémité inférieure de la jupe et interrompue à distance du couvercle 6 avec épaulement 7 La jupe verticale 8 est de hauteur inférieure à celle de la jupe. Cette disposition permet, comme représentée aux figures 2 et 3, après remplissage par le produit et mise en place non définitive du bouchon (figure 2) de procéder à l'opération de lyophilisation Le bouchon est positionné avant la lyophilisation en sorte que la jupe ne pénètre dans la cuve en frottement contre sa paroi intérieure que partiellement et que la lumière soit en partie au-dessus de la paroi de l'orifice de la cuve ce qui permet la mise en communication de la micro cuve avec l'extérieur. Le remplissage et la lyophilisation s'effectuent sous atmosphère neutre ce qui permet de garantir la stabilité dans le temps des composants lyophilisés. Après cette opération le ou les bouchons sont enfoncés jusqu'au contact de l'épaulement du couvercle avec la paroi de la ou des micro cuves ce qui obture la lumière (figure 3). La fabrication du test est effectuée par remplissage successif des micro cuves avec chacun des produits, enzyme, substrat réactif produit d'étalonnage et de contrôle dans les micro cuves qui leur sont dédiées. L'affectation de la première micro cuve 2/1 à l'enzyme et de la dernière micro cuve au substrat réactif et la séparation qui en résulte permet d'éviter lors des manipulations de remplissage la pollution de l'un des produits par l'autre. Les micro cuves 2/2, 2/3 et 2/4 reçoivent chacune une dose de produit d'étalonnage Le produit d'étalonnage et du plasma en quantité et en qualité déterminées pour réaliser le test. Le plasma de chacune des micros cuves est pré dilué à une concentration et valeur déterminée et différente de celles des autres micro cuves de produit étalon constituant ainsi une gamme d'étalonnage définissant sur un graphique d'étalonnage trois points par lesquels passe une droite, ce qui valide la méthode à la fabrication et comme expliqué plus loin, à l'utilisation. La cuve 2/5 reçoit une dose d'un plasma pré dilué de contrôle dont les valeurs, quantité et taux de dilution, et de concentration sont calculées pour que lors du contrôle soient retrouvées les valeurs d'étalonnage. Les micro cuves 2/6 et 2/7 restent vides Après remplissage des micro cuves les doses de produits sont lyophilisés en atmosphère neutre et les micro cuves conjointement à la lyophilisation et simultanément sont bouchées. Le test est prêt à l'emploi, les composants sont bloqués par la lyophilisation dans les valeurs qui ont été choses pour la mise en oeuvre sans qu'ris subissent des dérives dues à la température ou au vieillissement Par ces dispositions, la validation de la méthode de test s'effectue à la fois à la fabrication et ultérieurement à l'utilisation. Le test ainsi réalisé est fourni à l'utilisateur avec un tube plastique contenant la quantité voulue de tampon de dilution. Le dosage par le test selon l'invention s'effectue comme suit - débouchage avec désoperculation des micro cuves en un seul mouvement, - dilution du plasma échantillon à tester (celui du malade) avec le tampon de dilution prêt à l'emploi fourni avec le test ce qui permet d'obtenir une bonne dilution puisque déterminée en fabrication, - hydrolisation par addition d'un volume d'eau déterminé (370fou11) dans la micro cuve d'enzyme et dans la micro-cuve de substrat, - hydrolisation par addition d'un volume d'eau déterminé (100u11) dans les micro cuves des étalons et de contrôle, - 100/11 du plasma échantillon pré dilué par le tampon de dilution et placé dans ces puits vides. Après une attente de quelques minutes (5 minutes en principe), - une dose d'enzyme reconstitué est distribuée dans les micro cuves 2/2 à 2/7, d'étalon de contrôle et les cuves échantillon malade. - la dose d'enzyme pour les doses d'autres produits énoncés et compte - tenu de la contenance de chaque micro cuve qui est de 400 ut est de l'ordre de 50/ut. - après une attente pouvant varier selon les méthodes de 30 secondes à 5 minutes, une dose de substrat équivalente à celle d'enzyme est distribuée dans les micro cuves 2/2 à 2/7. - Après une attente variable, une dose (50/pal) d'acide acétique est distribuée dans chacune des micro cuves 2/2 à 2/7 pour bloquer la réaction. Les quantités et volumes sont donnés à titre indicatifs et peuvent varier selon les souhaits du fabricant. La lecture est alors possible dans un appareil optique adapté tel que colorimétrie, spectro photométrie, ou autre. La lecture s'effectue généralement par mesure de la densité optique de la solution (méthode colorimétrique) elle peut également s'effectuer par méthode chronométrique, dans ce cas, le substrat employé vise à la formation d'un caillot REVENDICATIONS : 1/Test de dosage enzymatique avec visé et à lecture colorimétrique, le dit test étant établi à partir d'un ou plusieurs réactifs et d'un ou plusieurs substrats caractérisé en ce qu'il comprend sur un même support destiné à réaliser le test et à être lu par des moyens optiques l'ensemble des composants du test, enzyme et substrat en doses séparées, une ou plusieurs doses de produit d'étalonnage et une ou plusieurs doses de produits de contrôle, les dites doses des produits respectifs ou du même produit étant séparées sur le support dans des contenants du dit support, leur dosage étant établi à la valeur nécessaire et suffisante pour la réalisation d'un test unique et étant dans leurs contenants respectifs du dit support lyophilisées avant obturation des contenants et hydraté après ouverture simultanée des dits contenants du dit support. 2/Test de dosage selon la revendication 1 caractérisé en ce que le support comprend une pluralité de micro cuves alignées et de même contenance dont au moins une contient une dose de réactif enzymatique lyophilisé, dont au moins une contient une dose d'un substrat réactif lyophilisé, une ou plusieurs d'entre elles comprenant respectivement une dose d'un produit d'étalonnage ou une dose d'un produit de contrôle, les dits produits étant lyophilisés avant obturation des micro cuves et étant hydratés après ouverture des micro cuves. 3/Test de dosage selon la revendication 1 et la revendication 2 caractérisé en ce qu'il comprend une micro cuve recevant une dose de réactif enzymatique, une micro cuve recevant une dose de substrat, une micro cuve recevant une dose de contrôle, une ou plusieurs micro cuves recevant une dose d'étalonnage et une ou plusieurs micro cuves vides 4/Test de dosage selon la revendication 1 et l'une quelconque des revendications 2 et 3 caractérisé en ce que la micro cuve 2/1 recevant l'enzyme et la micro cuve 2/2 recevant le substrat réactif 2/3 sont chacune à une extrémité du support. 5/test de dosage selon la revendication 1 et l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comporte une gamme d'étalonnage constituée de trois micro cuves 2/2, 2/3, 2/4 dans lesquelles le plasma étalon est pré-dilué avant lyophilisation suivant des proportions différentes, une jupe 5 qui obture par frottement contre la paroi interne de la micro cuve, la dite jupe présentant sur une partie de sa hauteur une lumière 8 verticale débouchant à l'extrémité inférieure de la jupe.