Brevet FR2810241A1 — publié le 20011221

La présente invention concerne les préparations cosmétiques ou dermo-pharmaceutiques à usage externe, d'hygiène ou de soins de la peau et des cheveux, caractérisées en ce qu'elles renferment un extrait de zooplancton qui contient et induit des Heat Shock Proteins (HSP). Les HSP appartiennent à une ou à plusieurs des familles de HSP : HSP (10-30 kDa), HSP40, HSP60, HSP70, HSP90, HSP 100-110. La conservation des HSP au cours de l'évolution est importante. La plupart des propriétés fonctionnelles et structurelles des protéines très conservées de procaryotes se retrouvent chez leurs homologues eucaryotes. Les HSP sont en effet parmi les plus anciennes et les plus conservées des protéines. Il en existe des homologues dans toutes les espèces et dans tous les règnes vivants. Par exemple, dnaK, un seul gène chez la bactérie, est devenu le complexe multigénique de la famille des HSP70 chez Saccharomyces, chez la drosophile et l'homme. Si les HSP sont apparues très tôt au cours de l'évolution, c'est en raison des conditions environnementales extrêmes auxquelles étaient confrontés les organismes. Au cours de l'évolution, les protéines HSP ont conservé leur rôle vital de protection contre le stress, elles ont également pris en charge de nouvelles fonctions, comme, par exemple, le transport des protéines à l'intérieur de la cellule. Les protéines HSP sont, à l'origine, des protéines anti-stress. Le mécanisme essentiel de défense de tout organisme est la conservation de son matériel génétique, protéique et membranaire. Pour cela, les protéines HSP dites protéines de stress ou Heat Shock Proteins (HSP) ont pour rôle de protéger ou de réparer le matériel génétique, les peptides et protéines détériorés lors d'un stress. La synthèse des HSP est donc un moyen de défense généralisé, développé par la cellule pour lutter contre la grande diversité des agressions possibles. Afin de faire face au stress, les organismes vivants ont développé plusieurs mécanismes de réponse, en fonction d'une part du type de choc subit, et d'autre part des dégâts susceptibles d'être occasionnés. Les différents types de stress et leurs conséquences biologiques Tous les organismes vivants doivent faire face, à un moment de leur existence, à des variations de leurs conditions environnementales. Selon la nature et l'ampleur de ces modifications, elles peuvent être perçues par l'organisme ou la cellule comme une agression, un stress. Ce stress sera d'ordre physique, chimique ou biologique. Les principaux stress sont les chocs thermiques, l'exposition aux radicaux libres de l'oxygène, les ultraviolets, les métaux lourds, les chocs osmotiques, les chocs de pression, mais aussi les états pathologiques tels fièvre, inflammation, infection virale... Suite à un stress, il y a, en général, diminution, au niveau cellulaire, de l'expression des ARN messagers, de la synthèse des protéines cellulaires normales et de certaines activités enzymatiques, ainsi que des altérations morphologiques. Face à cela, la cellule met en place un système de protection en induisant la transcription d'une famille de gènes spécifiques qui aboutit à la synthèse et l'accumulation intracellulaire de HSP. Les protéines HSP sont également des protéines impliquées dans l'homéostasie cellulaire En l'absence d'agression, les cellules contiennent un taux constitutif d'HSP induit par le cycle cellulaire, le développement et la différentiation, l'oncogenèse et la proto-oncogenèse. L'expression constitutive de la plupart des HSP indique qu'elles jouent un rôle essentiel dans le bon fonctionnement de la cellule en participant, entre autres, à la biosynthèse des protéines, à la transmission des signaux ou à la prolifération cellulaire. Les HSP sont aussi appelées molécules chaperonnes car elles s'associent à d'autres molécules, soit dénaturées soit en cours de biosynthèse. Ces interactions moléculaires ont pour but de prévenir l'agrégation de protéines altérées ou en cours de biosynthèse, d'éliminer les protéines anormales, de participer au transport des protéines du cytoplasme vers la membrane plasmique ou vers des organites tels que les mitochondries, le réticulum endoplasmique, les lysosomes ou le noyau. En interagissant avec d'autres protéines, les HSP vont minimiser la probabilité pour ces protéines d'interagir avec d'autres de façon inappropriée. Les HSP reconnaissent et se lient aux molécules qui ne sont pas dans une conformation native, soit après un stress dénaturant, soit sur les protéines en cours de synthèse, de repliement, d'assemblage, soit encore car elles ne sont pas localisées dans le bon compartiment subcellulaire. Les classes de HSP Les HSP humaines sont habituellement classées en familles, en fonction de leur poids moléculaire apparent sur gel d'électrophorèse en polyacrylamide, leurs principaux agents inducteurs et leurs fonctions. Les petites HSP (HSP10, HSP27,...) Les HSP10 sont des protéines qui agissent en coopération avec les HSP60 (voir plus loin) pour assurer un environnement favorable au repliement des protéines. La famille des HSP10 est encore appelée HSP E. La localisation de la protéine est mitochondriale. Les HSP27 confèrent une protection contre la mort cellulaire induite par le TNF, le stress oxydatif et plusieurs agents anticancéreux. De ce fait, la combinaison des HSP27 et HSP70 devrait protéger la cellule de beaucoup de stimuli parfois mortels. La famille des HSP27 est encore appelée famille HSP B et comporte trois protéines chez l'homme : HSP B1, B2 et B3. Ces petites protéines sont impliquées dans la thermotolérance cellulaire. Les HSP40 Elles ont un rôle protecteur des chaînes protéiques en cours d'élongation. La famille des HSP40, qui contient les HSP47, est encore appelée famille HSP F. Les HSP60 Elles présentent une structure caractéristique qui apporte un environnement favorable pour le repliement des protéines nouvellement synthétisées ou dépliées par le stress. La famille des HSP60 est encore appelée famille HSP D. Ce sont des protéines mitochondriales. Les HSP70 Cette famille contient des protéines constitutives (Heat Shock Cognate, HSC), des protéines inductibles et des protéines contrôlées par le taux de glucose (Glucose Regulated Proteins, GRP). Chez l'homme, la famille des protéines HSP70 est encore appelée famille HSP A. La famille des protéines HSP70 comporte quelques 13 membres chez l'homme (voir tableau ci-dessous). Les gènes HSP A 1 A (ou HSP70-1), HSP A 1 B (ou HSP70-2), HSP AIL (ou HSP70-HOM), HSP A2, HSP A3, HSP A4 (ou HSP70-RY), HSP A5 (ou GRP 78, BiP), HSP A6 (ou HSP70B), HSP A7 (ou HSP70B), HSP A8 (ou HSP73, HSC 70), HSP A9A (ou Mortaline 1) et HSP A9B (ou Mortaline 2, PBP74, GRP75), HSP A10 (ou HSC 71). HSP A taille synonyme chromosome remarques HSP AIA 641 aa HSP70-1 6p213 -Induction par la température HSP A1B 641 aa HSP70-2 6p21 3-Induction par la température HSPA1L 641 aa HSP70-HOM 6p21 3 3-Pas d'induction par la température HSP A2 639 aa- 14q24.1 HSP A3 - - 21 HSP A4 840 aa HSP70-RY 5q31 1-2 HSPA5 654 aa GRP 78 9q34-Régulation par le glucose BiP -Immunoglobulin heavy chainbinding protein HSP A6 643 aa. HSP70B' lq -Induction par la température HSP A7 639 aa. HSP70B lq -95 % d'homologies avec HSP A6 HSP A8 646 aa. HSP73 11q22 3-5 -Expression constitutive HSC 70-Participe au folding des protéines HSP A9A 679 aa. Mortaline 1- -forme cytosolique HSP A9B 679 aa Mortaline 2 5q31 1-forme péri-nucléaire PBP74-Localisation mitochondriale GRP75-Régulation par le glucose HSP A10 646 aa HSC 71- -Expression constitutive Tableau 1 : Lafamille des HSP70 chez l'homme Dans des conditions de vie normale, les HSP70 fonctionnent comme des molécules chaperonnes ATP-dépendantes en assistant le repliement de polypeptides nouvellement synthétisés, l'assemblage de complexes multi-protéiques et le transport de protéines à travers la membrane cellulaire. Sous des conditions de stress, la synthèse de HSP A1A et A1B augmente la faculté des cellules stressées à faire face à l'augmentation des protéines dénaturées ou dépliées. Les HSP70 peuvent sauver des cellules à un stade bien plus avancé de l'apoptose que les autres médicaments ou protéines comme le montre l'étude de Jââttelâ et coll. (EMBO J, 1998). Les HSP70 jouent aussi un rôle dans l'apprêtement et la présentation de l'antigène. C'est le cas des HSP A5. Des études ont montré que les HSP70 sont également impliquées dans les mécanismes de thermotolérance. Elles confèrent à la cellule une résistance à la chaleur (HSP AIA, A1B, A6). - Les HSP90 Cette famille de HSP est abondamment exprimée dans les cellules de mammifères, même en l'absence de stress. Ces protéines se lient par exemple aux récepteurs des hormones stéroïdes (oestrogènes, progestérone, testostérone, glucocorticoïdes) et les stabilise. On pense que les HSP90 permettent une augmentation de l'affinité de liaison des récepteurs pour ces hormones. L'homologue chez la levure est nommée HSP82. La famille des HSP90 est encore appelée famille HSP C. - Les HSP100-110 La HSP 104 est l'homologue, chez la levure, de la HSP110 humaine. Les HSP100 sont impliquées dans les mécanismes de réparation postérieurs au stress : une fois le stress produit, les HSP 100 permettent de replier correctement les protéines et de leur redonner leur entière activité. Des études ont montré que les HSP 110 sont impliquées dans les mécanismes de thermotolérance : elles confèrent à la cellule, une résistance à la chaleur. HSP et peau A ce jour, plusieurs familles de HSP ont été décrites dans la peau. Une étude récente réalisée sur des biopsies de peau humaine, montre, par western blot et immunohistochimie, la présence au niveau cutané des HSP27, HSP60, HSP72, HSP90, HSP110 et HSC70 (Wilson et coll., 2000). D'autres recherches mettent en évidence l'expression de la HSP47 dans la peau (Kuroda et coll., 1998). Des études immunohistologiques sur des biopsies de peau humaine ont permis d'observer l'expression de la HSP27 au niveau des couches supérieures de l'épiderme, avec une localisation cellulaire cytoplasmique. La HSP27 n'est pas exprimée au niveau de la couche épidermique basale. Ces données permettent de penser que la HSP27 peut être considérée comme un marqueur de différentiation dans les kératinocytes épidermiques (Trautinger et coll., 1995). Sur des fibroblastes de peau humaine, les auteurs ont mis en évidence la présence des ARNm et de la protéine HSP47, ainsi que leur augmentation sous l'influence de l'interleukine 4, et leur diminution après application d'interféron gamma (Kuroda et coll., 1998). Au niveau cutané, l'expression de la HSP60 est principalement observée au niveau de l'épiderme et après une hyperthermie, cette expression est augmentée, avec un maximum d'expression 24 heures après le choc thermique (Wilson et coll., 2000). Au niveau de biopsies de peau humaine, avant stress thermique, la HSP72 a été observée principalement dans l'épiderme et la HSC70 dans le derme. 4 heures après le choc thermique, l'expression de la HSP72 est observable, avec un maximum 24 heures après le choc. La HSC70 n'est pas inductible par la chaleur (Wilson et coll., 2000). Ces données suggèrent que les HSP peuvent protéger d'un stress jusqu'à 24 heures au moins après leur induction, mais pas dans les premières heures suivant l'induction. Aussi bien sur des biopsies de peau humaine que sur des kératinocytes en culture (Maytin, 1992), il a été montré que la HSP72, pouvant être induite par la chaleur, est déjà présente dans les peaux et cellules non stressées. Après un choc thermique, l'expression de la protéine augmente au niveau épidermique. Au niveau du derme, l'expression de la protéine n'est observée au niveau du derme qu'après un choc thermique (Trautinger et coll., 1993). Deux études, complémentaires l'une de l'autre, montrent l'influence de l'âge sur l'expression des HSP70. Au niveau de la peau humaine, les auteurs montrent que chez le sujet âgé, la peau répond moins bien à un choc thermique, et que l'expression de la HSP72 est fortement diminuée par rapport à un sujet plus jeune. Ce dysfonctionnement semble se produire après 50 ans (Muramatsu et coll., 1996). Une étude plus récente sur des fibroblastes et des mélanocytes épidermiques humains a montré que l'induction de l'expression des HSP70 est significativement réduite dans les cellules sénescentes in vitro par rapport aux cellules jeunes (stress thermique). De plus, les cellules de donneurs jeunes et âgées expriment moins de HSP70 lors des passages cellulaires tardifs, que lors des premiers passages. L'expression des HSP70 commence après 2 heures et est maximale 7 heures après le choc (Gutsmann-Conrad et coll., 1998). L'expression de la HSC70 a été décrite au niveau épidermique suprabasal (Boehncke et coll., 1994). Des études montrent clairement l'expression de la HSP90 dans la peau : En effet, la HSP90 est exprimée dans la peau normale, et suite à un stress thermique, l'expression de la HSP90 au niveau cutané est augmentée avec un maximum après 24 heures (Wilson et coll., 2000). Au niveau cutané, l'expression de la HSP110 a été mise en évidence. Dans le cas d'un choc thermique, son expression n'est pas augmentée (Wilson et coll., 2000). Cependant, au niveau des kératinocytes, une étude antérieure a montré que la HSP110 est inductible par la chaleur et les UVB (Maytin, 1992). Exemple de diminution ou absence de réponse au stress En vieillissant, la peau accumule progressivement les protéines endommagées, et sa capacité d'exprimer des HSP diminue, ainsi que sa résistance aux stress. D'autre part, lorsque la synthèse de protéines est particulièrement intense, comme par exemple, durant les périodes précoces de l'embryogenèse, la plupart des espèces animales ne montrent pas de capacité à répondre à un choc thermique. Ceci peut s'expliquer par le fait que la synthèse et la dégradation de HSP pourrait consommer une grande partie des nutriments et des ressources énergétiques de la cellule, ou alors occuper une part trop grande de l'appareil de synthèse/catabolisme qui manquerait alors aux autres biomolécules essentielles. Il apparaît donc clairement, d'après cette étude, que les HSP jouent un rôle central dans la protection cellulaire, d'où l'intérêt de renforcer la capacité de réponse des cellules face à un stress. L'utilisation d'extraits riches en HSP et inducteurs d'HSP, comme ceux décrits dans la présente invention, permet de fournir directement aux cellules une partie de ces HSP dont elles ont besoin, et d'améliorer leur réponse face à différents stress. L'objectif de la présente invention est donc de montrer l'effet protecteur de ces HSP sur des cellules soumises à un stress. L'extrait de zooplancton va permettre d'augmenter la teneur en HSP au niveau cellulaire. Zooplancton et dormance Artemia sp. est un petit crustacé vivant dans les étangs saumâtres et dont l'origine repose sur des mécanismes adaptatifs uniques lui permettant de vivre dans des conditions vitales critiques (déshydratation, augmentation de la pression osmotique, etc....). Pour cette raison, ce type d'organisme planctonique microscopique est souvent utilisé comme modèle d'étude biochimique et moléculaire de la différentiation cellulaire. La particularité d'Artemia réside dans sa capacité à résister à diverses conditions environnementales sévères telles que la déshydratation, l'augmentation de la pression osmotique... En effet, dès l'apparition de changements dans l'habitat, Artemia forme un cyste et la quasi totalité de l'eau interne est éliminée, et les fonctions biochimiques et physiologiques de ce crustacé entrent dans un état de DORMANCE. Cet état est caractérisé par la mise en veille de l'ensemble des fonctions métaboliques, destiné à l'isoler du milieu extérieur. Ces oeufs d'Artemia sont susceptibles de rester dormants pendant plusieurs années, voire plusieurs dizaines d'années. Lorsque les conditions environnementales redeviennent favorables (dès l'immersion dans un nouveau milieu favorable), Artemia se réhydrate et les différentes activités métaboliques reprennent successivement. Artemia poursuit alors sa croissance et retrouve un développement harmonieux. Un autre petit crustacé a les mêmes propriétés d'entrer en dormance, Daphnia sp. Soumis à ces multiples stress environnementaux, ces organismes ont développé des systèmes de protection forts de leur matériel génétique et protéique. Entre autre, sous leur forme enkystée (dormance), ils sont riches en HSP. Lors de la réhydratation de l'organisme, ces HSP permettront aux protéines de ne pas être dénaturées par les stress subits. Parallèlement, ils contiennent une concentration importante de facteurs inducteurs de HSP, qui permettront, quelques heures après le réveil du crustacé, l'expression de nouvelles HSP. Ces phases de redémarrage des cycles vitaux sont capitales pour l'organisme, et tous les mécanismes de protection doivent montrer une activité maximale. La présente invention concerne l'utilisation d'un extrait de zooplancton, dans des préparations cosmétiques ou dermo-pharmaceutiques caractérisées en ce que le zooplancton est choisi parmi les espèces Artemia sp. ou Daphnia sp., dans un état de dormance. CONCLUSION Les extraits de zooplancton de la présente invention seront employés dans les préparations caractérisées en ce qu'elles sont utilisées pour la protection des cellules et de la peau envers les différents types de stress: chocs physiques (thermiques, rayonnement solaire, osmotiques... ), chimiques (agents cytotoxiques tels les métaux lourds, les solvants...) ou biologiques (agents viraux, bactériens... ), pour la protection des composants cellulaires tels que les protéines, le matériel génétique (ADN, ARN) et les membranes cellulaires et enfin pour renforcer l'homéostasie via les processus vitaux de transcription, de synthèse protéique, de transports intracellulaires et de division cellulaire. Exemple 1 : Procédé d'obtention de l'extrait d'Artemia Extraction Des #ufs d'Artemia sont réhydratés de 30 minutes à 6 heures à une température de 30 C à 65 C, dans un milieu adapté, principalement constitué d'eau, et à un pH compris entre 4 et 7. Ensuite, ces #ufs sont broyés. L'extrait obtenu est centrifugé et filtré. Stabilisation L'extrait est traité et stérilisé pour se conformer aux exigences cosmétiques (couleur, odeur, aspect, stérilité...). Une concentration variable de glycérol est ajoutée afin de stabiliser les protéines. De ce fait, l'extrait de zooplancton contient de 0 à 15 % de glycérol. Utilisation L'extrait sera utilisé dans des préparations caractérisées en ce que en ce qu'elles contiennent de 0,1% à 15 % de l'extrait de zooplancton. Exemple 2 : Mise en évidence des HSP70 dans l'extrait d'Artemia Voir figure 1 20 l d'extrait d'Artemia (piste 1) ont été analysés afin de mettre en évidence, à l'aide d'un anticorps anti HSP70 humaine, une forte augmentation de l'expression des HSP70. En parallèle, un extrait de cellules en culture préalablement stressées par la chaleur (piste 2) ainsi qu'une protéine HSP70 recombinante humaine a été analysée (piste 3). Dans la piste 2, on observe aussi l'expression de HSP90 (l'anticorps anti HSP70 humaine croisant avec la HSP90). Exemple 3 : Etude de l'induction des HSP70 sur des fibroblastes humains par l'extrait d'Artemia . Voir figure 2 Objectif Cette étude a pour but d'évaluer l'effet d'un extrait d'Artemia sur l'induction des HSP70 sur des fibroblastes humains. Méthode Les fibroblastes humains ont été cultivés dans des plaques de 24 puits pendant 48 heures à 37 C et 5 % de CO2 dans une étuve humide. Les traitements des cellules sont les suivants : - Contrôle : les cellules sont incubées 24 h avec le milieu de culture. - Extrait d'Artemia : les cellules sont incubées 24 h avec 3% de l'extrait d'Artemia. Ensuite, les protéines cellulaires ont été isolées et analysées sur un gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes. Après migration des protéines sur le gel, les protéines ont été transférées sur membrane de nitrocellulose. La mise en évidence des protéines HSP70 a été effectuée avec un anticorps anti HSP70 humaine. Conclusion Ces résultats indiquent que l'extrait d'Artemia à 3 % augmente l'expression des HSP70 au niveau des fibroblastes. Exemple 4 : de la viabilité de fibroblastes humains soumis à un choc thermique. Voir figure 3 Objectif Cette étude a pour but d'évaluer l'effet d'un extrait d'Artemia, sur la viabilité de fibroblastes humains soumis à un choc thermique. La viabilité cellulaire est mesurée directement après marquage par un colorant vital, le MTT (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Le système MTT mesure l'activité déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes. Les déshydrogénases mitochondriales des cellules vivantes coupent le cycle tétrazolium, induisant la formation de cristaux pourpres MTT formazan, insolubles dans les solutions aqueuses. Les cellules vivantes sont donc colorées par le MTT. Méthode Les fibroblastes humains ont été cultivés dans des plaques de 24 puits pendant 48 heures à 37 C et 5 % de CO2 dans une étuve humide. Les traitements des cellules sont les suivants : - Contrôle : les cellules sont incubées 24 h avec le milieu de culture. - Arseniate de sodium : les cellules sont incubées pendant 21 h avec le milieu de culture, puis 1 h avec 150 g/ml d'arséniate de sodium (Na2HAs04). De nombreuses références bibliographiques montrent en effet que l'arséniate de sodium, à cette concentration, est capable d'induire l'expression des HSP qui vont ensuite pouvoir aider la cellule face au stress. Les cellules sont rincées deux fois avec du milieu de culture. - Extrait d'Artemia : les cellules sont incubées 24 h avec 3 % de l'extrait d'Artemia. Induction du stress thermique Après les 24 h d'incubation, toutes les cellules sont soumises à une température de 47 C pendant 1 h Marquage Le milieu de culture est retiré et remplacé par la solution de MTT 0.5 mg/ml dans un tampon phosphate (PBS) pendant 4 heures à 37 C. Enfin, le MTT est retiré et 1 ml d'isopropanol / 0,04 N HCl est placé dans chaque puits. La lecture de la Densité Optique de chaque puits est réalisée par spectrophotométrie à 540 nm. Résultats Les résultats montrent que les fibroblastes traités avec l'extrait présentent un taux de viabilité nettement plus important que les cellules témoins, et s'approchant de celui des cellules traitées en présence d'arséniate de sodium, agent connu pour induire l'expression des HSP. Conclusion Les résultats de cette étude indiquent que l'extrait d'Artemia apporte une protection significative des cellules humaines face à un choc thermique. REVENDICATIONS 1. Préparations cosmétiques ou dermo-pharmaceutiques à usage externe, d'hygiène ou de soins de la peau et des cheveux, caractérisées en ce qu'elles renferment un extrait de zooplancton qui contient et induit des Heat Shock Proteins (HSP). 2. Préparations selon la revendication 1 caractérisées en ce que les HSP appartiennent à une ou à plusieurs des familles de HSP : HSP (10-30 kDa), HSP40, HSP60, HSP70, HSP90, HSP100-110. 3. Préparations selon les revendications 1 et 2 caractérisées en ce que l'extrait de zooplancton va permettre d'augmenter la teneur en HSP au niveau cellulaire. 4. Préparations selon les revendications 1, 2 et 3 caractérisées en ce que le zooplancton est choisi parmi les espèces Artemia sp. ou Daphnia sp. dans un état de dormance. 5. Préparations selon les revendications 1, 2,3 et 4 caractérisées en ce qu'elles contiennent de 0,1% à 15 % de l'extrait de zooplancton. 6. Préparations selon les revendications 1,2, 3,4 et 5 caractérisées en ce que l'extrait de zooplancton contient de 0 à 15 % de glycérol. 7. Préparations selon les revendications 1, 2, 3, 4, 5 et 6 caractérisées en ce qu'elles sont utilisées pour la protection des cellules et de la peau envers les différents types de stress : chocs physiques (thermiques, rayonnement solaire, osmotiques), chimiques (agents cytotoxiques tels les métaux lourds, les solvants) ou biologiques (agents viraux, bactériens), pour la protection des composants cellulaires tels que les protéines, le matériel génétique (ADN, ARN) et les membranes cellulaires et enfin pour renforcer l'homéostasie via les processus vitaux de transcription, de synthèse protéique, de transports intracellulaires et de division cellulaire.