Brevet FR2799467A1 — publié le 20010413

La présente invention concerne la production d'un anticorps monoclonal murin diriCMlctrnfM4t:ds brévétoxines de type 2 (PbTxs) (toxines responsables de l'intoxication neurologique par les fruits de mer, INFM) et son utilisation pour la détection et le dosage de ces toxines à l'aide d'un anticorps monoclonal spécifique. Elle concerne également toute procédure immunochimique de purification et d'enrichissement (immunopurification par fixation covalente à des microbilles sur colonne ou en suspension) de ces toxines à l'aide d'un anticorps monoclonal spécifique à partir de diverses matrices alimentaires (produits de pêche) et fluides biologiques humains ou animaux (sérum et urine). Son utilisation pouvant être étendue à des expériences de marquage des organes cibles ou de leurs récepteurs sur des préparations ou par injection de brévétoxines in vivo à des animaux de laboratoire. Pour des raisons de santé publique et d'intérêt économique, plusieurs voies de détection des brévétoxines ont été explorées auparavant Actuellement, la surveillance des coquillages est essentiellement assurée par des tests de toxicité aiguë sur animaux sensibles (souris) selon le protocole détaillé par Fernandez et Cembella (1995) dans le guide publié par la Commission Océanographique Intergouvernementale de l'UNESCO. La limite de détection de ce test est estimée à 10 unités souris pour 100 g de chair de coquillage (Fernandez et Cembella, 1995) soit 80 g de brévétoxines pour 100 g de chair de coquillage (Trainer et Baden, 1991). Durant ces dernières années, plusieurs équipes ont travaillé sur la production et l'utilisation d'anticorps polyclonaux spécifiques des brévétoxines (Baden et coll., 1984 ;Poli et Hewetson, 1990 ; Trainer et Baden, 1990,1991 : Levine et Shimizu, 1992 : Melinek et coll., 1994 : Poli, 1995 Baden et coll., 1995). En dépit des recherches il n'existe pas actuellement d'anticorps monoclonaux spécifiques des brévétoxines ni de système de détection, de dosage, d'enrichissement ou de marquage de brévétoxines basé sur l'activité de tels anticorps. La présente invention permet de remédier à l'absence de source inépuisable de réactifs standards pour l'élaboration de systèmes de détection, de dosage, d'enrichissement ou de marquage de brévétoxines basés sur l'activité d'un anticorps monoclonal spécifique des brévétoxines 2 Les étapes réalisées pour l'obtention de ce produit biologique sont les suivantes : 1. Préparation de l'immunogène (conjugué PbTx - protéine porteuse) Les conjugués ont été préparés selon les technologies précédemment décrites (Pauillac et coll., 1998 ;Naar et coll., 1999) 1.1. Synthèse de l'hémisuccinate de PbTx-3 L'hémisuccinate de PbTx-3 a été préparé selon la technique suivante. Cinquante l de solution d'anydride succinique à 27 mg/ml (13,39 pmoles) en pyridine ont été incubés pendant 5 h à 65 C en présence de 400 g de PbTx-3 (0,446 mole L'hémisuccinate de PbTx-3 a été purifié à l'aide d'une chaîne HPLC (Kontron Instruments, Allemagne) munie d'une colonne à polarité inversée (C18 ODP, diamètre interne de 4,6 mm, longueur 250 mm , Asahipak Shodex, Prolabo, France) et sous un débit de 1 ml/mn de phase mobile (mélange CH3CN/H20, 80@20). L'élution a été contrôlée par un détecteur à absorption dans l'UV (# = 210 nm, facteur de sensibilité = 0,1 1.2. Conjugaison en milieu micellaire Le milieu micellaire a été obtenu en mélangeant sous agitation 1 ml de solution de BSA (5 mg/ml en tampon borate pH 10) avec 4 ml de solution d'AOT (0,5 M en heptane). La concentration finale en BSA dans la solution micellaire est de 1 mg/ml. La réaction d'activation de l'hémisuccinate de PbTx-3 a été effectuée dans un volume final de 21 l. L'hémisuccinate de PbTx-3 (0,446 pmoles) a été incubé 15 minutes avec 10,62 l de But3N diluée au 1/1 Oè en dioxanne anhydre (Vm=2381,5 pllmmoles) et 5,85 NI d'IBCC à la même dilution (Vm=1313,25 pllmmoles) ainsi que 5 pi de dioxanne. La conjugaison a été réalisée avec des rapports molaires initiaux haptène activé/protéine de 75. Après activation, 400 l de solution micellaire, soit 400 g de BSA (0,0059 mole, ont été introduits et incubés (12 h à température ambiante) en présence de l'hémisuccinate de PbTx-3. Les conjugués ont été récupérés par des précipitations à l'acétone. Les conjugués ont été repris dans 1 ml d'eau distillée, lyophilisés puis conservés à -20 C avant injection à une souris de laboratoire. Un deuxième conjugué a été produit dans les mêmes conditions expérimentales en remplaçant la BSA par l'OVA 3 2. Immunisation et production d'anticorps Une souris Balb/c a reçu un total de 5 injections intra péritonéales de 50 g de conjugué PbTx-3BSA espacées de 2 semaines et une dernière stimulation par voie intra splénique de 25 g de conjugué. Des saignées régulières ont été effectuées pour apprécier la cinétique de production des anticorps spécifiques par ELISA en utilisant le conjugué cible PbTx-OVA et d'autres conjugués contrôles. En fin d'immunisation, le titre en anticorps (dilution sérique correspondant à un rapport signal/bruit de fond de 3) déterminé par ELISA indirecte en utilisant le conjugué cible PbTx-3-OVA est de 1/16000. Des expériences conduites en ELISA de type compétitif ont révélé une IC50 de 1 x 10 M de PbTx-3. 3. Production d'anticorps monoclonaux Une expérience de fusion des splénocytes de la souris immunisée par le conjugué PbTx-3-BSA avec les cellules du myélome P3-X63-Ag8 653 a été réalisée à l'aide d'un kit canadien (ClonaCell - HY, Stemcell Technologies Inc.) dans un rapport 5 :1. Surles 266 hybridomes obtenus en milieu sélectif semi-solide, la totalité a supporté l'étape de transfert en milieu liquide et 5 d'entre eux ont produit des anticorps reconnaissant spécifiquement le conjugué PbTx-3-OVA. Une étude approfondie de leur spécificité a montré la présence d'anticorps reconnaissant la PBTx-3 libre dans 2 surnageants. Les hybridomes correspondants (3A12 et 1A11) ont été sous-clonés et leur spécificité a été contrôlée. La population d'hybridome1A11pure, secrète l'anticorps le plus affin qui fait l'objet de la présente invention. Le typage immunologique de cet anticorps monoclonal (1A11) réalisé à l'aide du kit Mouse Hybridoma Subtyping (Boehringer-Mannheim) a révélé qu'il s'agissait d'une IgG1,K 4. Spécificité de l'anticorps monoclonal 1A11 La spécificité de cet anticorps monoclonal a été évaluée par ELISA de type compétitif utilisant des concentrations croissantes d'inhibiteurs (brévétoxines de type 2, brévétoxine de type 1, ciguatoxine, acide okadaïque) solubilisées dans différentes matrices. Les puits des plaques de micro-titration ont été sensibilisés par incubation avec la solution OVA-PbTx-3 diluée en PBS à 250 ng/ml Après lavages (PBS), les sites de fixation restés libres ont été saturés par addition de PBSlait à 0,5 % (30 mn) Une nouvelle série de lavages en PBS-Tween 20 à 0,1% (PBS-T) étant effectuée, 25 l de solution d'anticorps en PBS-T contenant 0 5% de gélatine (PGT) mélangés à un volume identique de solution d'inhibiteur sont ajoutés Après lavages (PBS-T), une incribatiurï avec la solution d'anticorps de chèvre anti-Ig de souris couplés à la (i-galactosidase (GAM-a-gal) au 1/2000ème en PGT est réalisée Enfin, après élimination de l'excès de conjugués anticorps-enzyme (PBS-T), la présence d'anticorps spécifiques a été révélée par incubation (20 mn) avec le substrat fluorogénique (MUG ou 4-méthyl umbellyféryl f3-D-galactoside ; le, = 365 nm et le, = 450 nm) à saturation en tampon phosphate 0,1 M, pH 7,2. La réaction a été arrêtée par addition de 50 l de Na2C032 M avant lecture (MicroFLUOR Reader, Dynatech, USA). Dans tous les cas, l'anticorps 1A11a montré une réactivité exclusive pour les brévétoxines de type 2 et n'a réagi avec aucun autre composé. La gamme utile de dosage (20-80% d'inhibition) des PbTxs de type 2 est de 128-2000 ng/ml de solution soit, dans notre format ELISA compétitif (ou autres utilisant des systèmes d'amplification basés sur des principes chromogéniques, fluorogéniques, luminométriques ou radioimmunométriques), de 64-1000 ng de toxine. La limite de détection des PbTxs par le test de référence actuel (test-souris) est de 4000 ng. Cet anticorps monoclonal permet donc de détecter et de doser des quantités de toxine de 4 à 60 fois plus faibles. 1) Comme il va de soi et comme il en résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes notamment celles dans lesquelles les anticorps monoclonaux pourraient être utilisés d'une manière ou d'une autre pour la détection, le dosage, ou l'immunopurification (colonne d'affinité ou autre procédé) à partir de diverses matrices alimentaires (produits de la pêche) ou biologiques (sérum et urine) ou échantillons environnementaux (eau de mer), le marquage d'organe cibles (cellules nerveuses et leurs récepteurs) lors d'intoxications animales, et la préparation d'une composition immunothérapeutique visant à neutraliser l'action des brévétoxines dans les systèmes sanguins. 5 REVENDICATIONS 1) Anticorps murin monoclonal caractérisé en ce qu'il est une immunoglobuline de type IgG1, K, dénommée lA 11, caractérisé en ce qu'il reconnaît spécifiquement les brévétoxines de type 2 et ne réagit pas avec les brévétoxines de type 1, les ciguatoxines, l'acide okadaïque, et caractérisé par son affinité. 2) Utilisation de l'anticorps murin monoclonal 1A11selon la revendication 1 dans une technique immunologique utilisant un anticorps spécifique (technique classique de type ELISA compétitif, direct, sandwich ou autre utilisant des systèmes d'amplification basés sur des principes chromogéniques, fluorogéniques, radioimmunométriques ou luminométriques) qui permet le dosage ou la détection des brévétoxines de type 2. 3) Utilisation de l'anticorps murin monoclonal 1A11 selon la revendication 1 pour réaliser des procédés d'immunopunfication des brévétoxines (par fixation covalente à des microbilles sur colonne ou en suspension) à partir de diverses matrices alimentaires (produits de la pêche) et biologiques (sérum et urine) 4) Utilisation de l'anticorps murin monoclonal 1A11selon la revendication 1 pour le dosage et la détection des brévétoxines dans les échantillons environnementaux (eau de mer). 5) Utilisation de l'anticorps murin monoclonal 1A11selon la revendication 1 pour la détection in vitro des brévétoxines fixées sur les organes cibles ou leurs récepteurs lors d'intoxications animales. 6) Utilisation de l'anticorps munn monoclonal 1A11selon la revendication 1 pour la préparation d'une composition immunothérapeutique visant à neutraliser l'action des brévétoxines dans les systèmes sanguins