Brevet FR2805264A1 — publié le 20010824

OLIGONUCLEOTIDES IMMUNOSTIMULANTS La présente invention est relative au domaine des immunostimulants. Plus particulièrement, l'invention concerne des oligonucléotides capables de stimuler cellules humaines intervenant dans le système immunitaire, et à leur utilisation comme adjuvant vaccinal. Un grand nombre d'oligonucléotides ont déjà été décrits dans l'art antérieur, relation avec leurs propriétés immunostimulantes. Ainsi, la demande EP 0 468 520 décrit des polynucléotides immunostimulants constitués par un simple brin d'ADN linéaire comprenant de 10 à 100 nucléotides s'enchaînant selon une séquence palindromique. Selon demande WO 96/02 555, l'activité immunostimulatrice d'oligonucléotides liée à présence d'une séquence dinucléotique 5' CG 3', dans laquelle C n'est méthylee, l'activité immunostimulante étant plus forte si le motif CG est précédé en 5'du dinucléotide GA et / ou suivi en 3'du dinucléotide TC ou encore TT. Au contraire, selon la demande de brevet WO 98/52 962, il n'est pas nécessaire la séquence de l'oligonucléotide soit un palindrome, ni qu'elle comprenne dinucléotide CG ; en effet, les 3 nucléotides décrits dans cette demande pour une utilisation en tant qu'adjuvant vaccinal ont les séquences suivantes : 5' GACGTT 3', 5'GAGCTT 3', ainsi que 5'TCCGGA 3'. Selon brevet US 5,663,153, l'activité immunostimulante d'oligonucléotides n'est pas liee à la séquence des nucléotides, mais à la nature de la liaison entre nucléotides, la présence d'au moins une liaison phosphorothioate permettant d'induire une réponse locale du système immunitaire. La plupart des tests de l'art antérieur pour évaluer l'activité immunostimulante des oligonucléotides proposés, sont effectués soit in vitro sur des cellules animales (essentiellement des cellules murines), soit in vivo sur des souris. Cependant, les différences existant entre le système immunitaire de la souris et celui de l'être humain, ont conduit à des différences entre les résultats obtenus des cellules murines et ceux obtenus sur des cellules humaines. Or l'industrie pharmaceutique a un grand besoin d'immunostimulants pouvant être administrés à l'homme, notamment dans le domaine des vaccins. La présente invention a donc pour but de proposer des oligonucléotides capables de stimuler des cellules du système immunitaire de l'être humain. Pour atteindre ce but l'invention a pour objet un oligonucléotide capable de stimuler des cellules humaines du système immunitaire caractérisé en ce comprend au moins une séquence 51 GCATGATTTTGAGCT 31 dans laquelle T est la Thymine, A est l'Adénine, C est la Cytosine, et G la Guanine, en ce qu'il est dépourvu de dinucléotide CG dans lequel la Cytosine C ne serait méthylée. Selon une caractéristique de l'invention, Voligonucléotide comprend de 15 à 100 nucléotides. Selon une autre caractéristique, l'oligonucléotide selon l'invention est capable d'induire la prolifération des lymphocytes humains. Selon une autre caractéristique, Voligonucléotide selon l'invention est capable d'accroître l'expression des marqueurs d'activation CD25, CD69 et CD86 sur les lymphocytes B humains. L'invention concerne egalement l'utilisation d'un tel oligonucléotide pour la fabrication d'un médicament. L'invention a également pour objet un adjuvant vaccinal caractérisé en ce qu'il comprend au moins oligonucléotide capable de stimuler des cellules humaines du système immunitaire possédant au moins une séquence 51 GCATGATTTTGAGCT 3' dans laquelle T est la Thymine, A est l'Adénine, C est la Cytosine, et G la Guanine, et en ce qu'il est dépourvu de dinucléotide CG dans lequel la Cytosine C ne serait pas méthylée. L'invention a également pour objet une composition vaccinale à usage humain comprenant au moins un antigène vaccinal caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un oligonucléotide capable de stimuler des cellules humaines système immunitaire possédant au moins une séquence 51 GCATGATTTTGAGCT 3' dans laquelle T est la Thymine, A l'Adénine, C est la Cytosine, et G la Guanine, et en ce qu'il est dépourvu dinucléotide CG dans lequel la Cytosine C ne serait pas méthylée. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suivre, en référence aux figures 1 et 2 qui illustrent les résultats obtenus lors des tests décrits aux exemples 1 et 2. Par oligonucléotide au sens de la présente invention, on entend un polynucléotide comprenant au moins 15 nucléotides. La limite supérieure de la taille des oligonucléotides n'est pas vraiment déterminée. On peut cependant noter que, plus Voligonucléotide sera long, plus sa purification sera difficile à effectuer lors étapes de synthèse et plus le prix de revient en sera élevé. D'autre part, il probable qu'un oligonucléotide de grande longueur aura plus de difficultés à pénétrer dans les cellules. Aussi, pour les besoins de la présente invention, on considere qu'une limitation de taille de l'oligonucléotide à 100 nucléotides est appropriée. oligonucléotide est préférence un oligonucléotide simple brin; il peut s'agir oligodésoxyribonucleotide ou d'un oligoribonucléotide. On a obtenu particulièrement bons résultats en utilisant un oligodésoxyribonucléotide. oligonucléotides convenant aux fins de l'invention peuvent se présenter sous forme de phosphodiester afin d'être plus stables, sous forme de phosphorothioates d'hybrides phosphodiester phosphorothioates. Les oligonucléotides phosphorothioates sont ceux préférés. L'oligonucléotide selon l'invention est capable de stimuler des cellules humaines du système immunitaire telles que les lymphocytes B, les lymphocytes T, les monocytes et les cellules dendritiques. Cette stimulation est appréciée notamment par la lymphoprolifération ou par l'expression de marqueurs d'activation, tels que marqueurs CD25 , CD69 et CD86 sur les lymphocytes B. Il est possible sélectionner les oligonucléotides d'intérêt au moyen de tests différents ceux proposés dans la présente demande, à condition cependant qu'il s'agisse tests évaluant la capacité de stimulation de cellules humaines, et non pas comme dans la plupart des documents de l'art antérieur, de tests évaluant la capacite de la stimulation de cellules murines. Il serait notamment possible de tester l'expression d'autres marqueurs d'activation des lymphocytes, ou l'expression de-marqueurs de prolifération tels que le marqueur K167; des tests relatifs à l'augmentation des marqueurs d'activation et de maturation des cellules dendritiques pourraient également être utilisés. De même, des tests permettant l'appréciation de l'augmentation de production de certaines cytokines peuvent également être utilisés. Selon une caractéristique de l'invention, l'oligonucléotide comprend au moins une séquence nucléotidique 5GCATGATTTTGAGCT 3' dans laquelle T signifie Thymine, Cytosine, G Guanine, et A Adénine. Cette séquence peut etre 5' terminale, terminale ou être entourée par d'autres nucléotides. Elle peut être unique ou repétée plusieurs fois à l'identique à l'intérieur d'un même oligonucleotide Selon l'invention, l'oligonucléotide ne comporte pas forcément de séquence palindromique. Malgré cette absence de séquence palindromique, tel oligonucléotide est capable de stimuler des cellules humaines du système immunitaire. Selon une caractéristique, l'oligonucléotide selon l'invention est dépourvu de dinucléotide CG dans lequel la Cytosine ne serait pas méthylée. La capacité des oligonucléotides de l'art antérieur à être immunostimulants a presque toujours été interprétée comme liée à la présence de motifs CpG non méthylés (Cf. notamment l'article de Krieg et al dans Nature d'avril 1995 cité ci-dessus), cette interprétation étant en cohérence avec l'observation selon laquelle la fréquence de ce dinucléotide était environ 4 fois plus importante dans le génome des bactéries que dans celui des vertébrés. De façon surprenante, on a maintenant trouvé que des oligonucleotides entièrement dépourvus de ce motif dinucléotidique étaient cependant parfaitement capables de stimuler les cellules du système immunitaire humain. Selon une caractéristique particulière, Voligonucléotide selon l'invention est dépourvu ou appauvri en séquence nucléotidique capable d'inhiber les cellules du système immunitaire humain. En effet, afin d'obtenir un effet global immunostimulant, si des motifs inhibiteurs ou neutralisants tels que, par exemple, ceux décrits dans la demande 98/52 581 sont présents, il faut que leur effet soit supprimé ou réduit, grâce à présence d'une séquence à effet immunostimulant plus prononcé, ou grâce à présence d'un plus grand n'ombre de séquences selon l'invention. La présente invention a également pour objet un adjuvant vaccinal comprenant au moins oligonucléotide immunostimulant ayant au moins un motif 5'GCATGATTTTGAGCT 3' tel que mentionné ci-dessus. Par adjuvant vaccinal on entend un produit qui permet d'accroître ou de modifier la réponse du système immunitaire d'un organisme vis à vis de l'administration d'un antigène. En particulier, il peut s'agir d'une augmentation de la réponse humorale ou de la réponse cellulaire. L'action adjuvant vaccinal peut également être, non pas une augmentation de réponse se produirait en l'absence d'adjuvant, mais une orientation différente la réponse produite : par exemple, orientation vers une réponse cellulaire plutot qu'une réponse humorale, production de certaines cytokines plutôt que d'autres production certains types ou sous-types d'anticorps plutôt que d'autres stimulation certaines cellules plutôt que d'autres, etc... L'oligonucléotide immunostimulant de la présente invention peut être utilisé comme adjuvant vaccinal quelle que soit la nature de l'antigène administré et quel que soit nombre valences utilisées. Il peut être le seul adjuvant utilisé ou, au contraire, être un élement d'une combinaison adjuvante. L'action adjuvante de l'oligonucléotide selon l'invention peut être obtenue, soit lorsqu'il est associé à l'antigène ou aux antigènes lors de leur administration, i.e. lorsqu'ils font partie de la même composition vaccinale, soit lorsqu'il est administre séparément de l'antigène ou des antigènes. On préfère cependant l'utiliser dans même composition vaccinale que l'antigène ou les antigènes à administrer. L'oligonucleotide selon l'invention peut avantageusement être administré par toutes les voies susceptibles d'être utilisées pour une composition vaccinale: voie muqueuse voie systémique. L'un des objets de l'invention est une composition vaccinale comprenant au moins un oligonucléotide immunostimulant ayant une séquence 5'GCATGATTTTGAGCT 3' telle que décrite ci-dessus. Une composition vaccinale selon l'invention peut être destinée à -l'immunisation contre une seule maladie, ou destinée à l'immunisation contre plusieurs maladies. Il peut s'agir d'une composition vaccinale liquide ou lyophilisée. Elle peut comprendre, outre les antigènes, tout ou partie des composants habituellement présents dans un vaccin : tampons, stabilisants, conservateurs, ... Elle peut egalement comprendre un ou plusieurs adjuvant(s) autre(s) que ceux objets de la presente invention. Elle peut également comprendre plusieurs adjuvants objets la présente invention, constitués soit par des oligonucléotides ayant tous le même motif 5'GCATGATTTTGAGCT 3' mais se différenciant par nucléotides en 5' et/ou en S, soit par des oligonucléotides ayant des motifs 5' GCATGATTTTGAGCT 3' différents, dont les séquences en Fet en 3'sont identiques ou différentes. La composition vaccinale selon l'invention peut être destinée à une administration prophylactique ou à une administration thérapeutique. La composition vaccinale selon l'invention peut être formulée de manière à optimiser l'action adjuvante de l'oligonucléotide objet de l'invention. Ainsi, l'oligonucléotide peut être couplé à un lipide, tel que le cholestérol ; il peut être intégré dans une émulsion de type huile / eau ou formulé sous forme de liposomes. Les exemples qui suivent illustrent des modes de realisation particuliers de la présente invention. Exemple 1 : Synthese des oli-gonucléotides On prepare un oligonucléotide dont la séquence est la suivante: 5'GCATGATTTTGAGCT 3'. La synthèse est réalisée au moyen d'un automate synthétiseur fourni Applied Biosystems qui met en #uvre la méthode chimique standard au phosphoramidite et qui comporte à chaque cycle une étape d'oxydation, qui est réalisée au moyen d'une solution tétraéthylthiuram / acétonitrile pour obtenir une liaison phosphorothioate. On prepare en outre, de la même façon, un oligonucléotide Al 5(S) qui comprend que A et qui est phosphorothioate sur toute sa longueur. Cet oligonucléotide est un temoin négatif car il n'entraîne ni prolifération ni augmentation de l'expression des marqueurs d'activation sur les lymphocytes B. On prépare également un oligonucléotide ld(S) dont la séquence est identifiée dans la demande de brevet W096/02555 et est la suivante:5'GCATGACGTTGAGCT 3'; cet oligonucléotide comporte des liaisons phosphorothioates sur toute sa longueur et est utilisé comme témoin positif. Tous les oligonucléotides sont maintenus en solution dans du tampon PBS Exemple 2: Test Lymphoprolifération On isole des lymphocytes à partir du sang périphérique d'un donneur, en procédant à centrifugation sur un gradient de Ficoll. Ces lymphocytes sont ajustés à 4. cellules / ml dans du milieu de culture AIMV additionné de Glutamine, de Streptomycine et de Pénicilline. Les cellules sont distribuées en plaques 96 puits (fond rond) sous Pl, soit 2 cellules par puits. On ajoute ensuite 100pl d'une solution (ou d'une solution 0.8pM, ou encore d'une solution 0.16pM) des oligonucléotides à tester produits à l'exemple 1 (Il seul type d'oligonucléotide par puits) afin d'obtenir une concentration finale soit de 2 pM, soit de 0.4pM,soit de 0.08pM. Après incubation 3 jours d'incubation à 370C en atmosphère humide à 5% de C02,on ajoute de la thymidine tritiée (Amersham TRK 120) préalablement diluée dans du milieu de culture , à raison de 1 pCi par puits sous pl. Après 7 à 8 heures d'incubation à l'étuve (5% C02, 37'C), les plaques peuvent etre congelées à -800C et traitées plus tard. A l'aide du "Harveste#', on récolte le contenu des puits des plaques Unifilter GF/C et on réalise 6 lavages en eau distillée puis un lavage éthanol 70% afin de précipiter l'ADN. Après séchage des plaques, 25 pl de liquide scintillant (Microscint-40, Packard) sont distribués dans chaque puits et permettent de quantifier la radioactivité (rayonnements émis par le tritium) en mesurant le nombre de coups / minute (cpm) émis par chaque puits sur le compteur Top Count (Packard). Les résultats obtenus pour chacun des oligonucléotides testés sont représentés sur la figure 1, qui indique, pour chaque oligonucléotide testé l'indice de stimulation IS. Cet indice IS est calculé de la façon suivante: IS= (CPM de l'oligonucléotide testé - CPM du contrôle milieu)/ CPM contrôle milieu. On remarque que l'oligonucléotide selon l'invention (ldTT) ne comprend pas de dinucléotide CG est capable d'induire une prolifération lymphocytes humains identique à celle mesurée pour l'oligonucléotide de l'art anterieur (1d) comprenant un dinucléotide CG. Par contre, les résultats du contrôle négatif (Al5) sont bien négatifs. Exemple 3: Test relatif aux marqueurs d'activation Le test est effectué à partir de lymphocytes isolés d 'un donneur comme décrit à l'exemple précédent, et ajustés à 2.106 cellules/ml dans le même milieu de culture. Les lymphocytes sont ensuite incubés dans des tubes en polypropylène de 14mi à raison de 2mi/tube. On ajoute dans chaque puits une quantité d'oligonucléotides à tester préparés à l'exemple 1 (1 oligonucléotide 1 tube) suffisante pour obtenir une concentration en oligonucléotide 2 pM. Après 3 jours d'incubation, les cellules sont réparties en 3 tubes micronic à raison de 1 Or' cellules par tube. Apres centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans 100pl tampon IF (ImmunoFluorescence) composé de PBS 0.1% BSA 0.01% Azide sodium. On procède ensuite au marquage des cellules en ajoutant 5 pl de chacun anticorps fluorescents suivants: tube : CD20 PEI CD69 FITC tube CD20 PEI CD25 FITC tube CD20 PEI CD86 FITC Le CD20 un marqueur des lymphocytes B. Le CD69 un marqueur d'activation précoce des lymphocytes B et T. Le CD25 un récepteur de l'interleukine 2. Le CD86 une molécule de costimulation 137-2. Après Y2 heure d'incubation à 4'C; les cellules sont lavées et remises en suspension en tampon IF additionné de 0.5% de formol. Les cellules sont analysées sur un cytofluorimètre (FACScan) en double marquage, avec une fenêtre d'étude sur 5000 cellules CID20+ (lymphocytes B). Les résutats obtenus sont illustrés sur la Figure 2 qui indique, pour chaque oligonucléotide testé, le %age de lymphocytes B exprimant l'un des marqueurs testés. On constate que l'oligonucléotide selon l'invention ne contenant pas de motif CG est capable d'induire une augmentation de l'expression de certains marqueurs d'activation CD25, CD69, CD86) sur les lymphoctes B identique à celle mesurée pour l'oligonucléotide de l'art antérieur comprenant un tel dinucléotide CG. En effet, le pourcentage de lymphocytes B exprimant de tels marqueurs est du même ordre dans les 2 Par contre, la séquence composée de 15 A a un pourcentage de lymphocytes B activés nettement plus faible. Revendications 1. Oligonucléotide immunostimulant , caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique ayant la formule suivante 5' GCATGATTTTGAGCT 3, dans laquelle T signifie Thymine, -A Adénine, C Cytosine , G Guanine, et en ce qu'il est dépourvu de dinucléotide CG dans lequel la Cytosine C ne serait méthylée. 2. Oligonucléotide selon revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend de 15 à 100 nucléotides. 3. Oligonucléotide selon des revendications précédentes, caractérisé en ce que le motif 5' GCATGATTTTGAGCT 3'est répété au moins 1 fois. 4. Oligonucléotide selon une revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est capable d'induire la proliferation des lymphocytes B humains. 5. Oligonucléotide selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est capable d'accroître l'expression des marqueurs d'activation CD25 , du marqueur CD86, ou du marqueur CD69 sur les lymphocytes B humains. 6. Utilisation d'un oligonucléotide selon une des revendications précédentes pour la fabrication d'un médicament. 7. Utilisation d'un oligonucléotide selon une des revendications 1 à 5, pour la fabrication d'un immunostimulant humain. 8. Utilisation d'un oligonucléotide selon une des revendications 1 à 5, pour la fabrication d'un adjuvant vaccinal. 9. Utilisation d'un oligonucléotide selon une des revendications 1 à 5, pour la fabrication d'une composition vaccinale. IO.Composition vaccinale ' usage humain, comprenant au moins un antigène vaccinai, caractérisée ce qu'elle comprend en outre au moins un oligonucléotide selon une des revendications 1 à 5