Brevet FR2801677A1 — publié le 20010601

PROCEDE D'ANALYSE D'UN ECHANTILLON POUR LA PRESENCE EVENTUELLE DE LEGIONELLES COMPRENANT UNE ETAPE D'IMMUNOCAPTURE. La présente invention se rapporte au domaine de l'analyse de l'eau et plus particulièrement à la détection de légionnelles. Elle a pour objet de fournir un nouveau procédé d'analyse d'un échantillon pour la présence éventuelle de légionelles, facile à mettre en #uvre, rapide et sure, susceptible d'être utilisée sur des eaux d'origine très diverse. Les légionelles sont des bactéries Gram négatif en bâtonnets, ubiquitaires des milieux hydriques et telluriques. Elles se diffusent et prolifèrent via les systèmes de distribution et d'utilisation de l'eau chaude, et via les systèmes de climatisation. Ainsi, les sites à risques sont les douches, les climatiseurs, et les bassins utilisés pour la détente. Les lieux d'expositions sont les établissements de soins, les stations thermales, les hôtels et campings, et par extension toutes les collectivités. De plus certaines amibes et autres protozoaires ciliés entrent en symbiose avec les légionelles. Ces amibes sont alors de véritable réservoirs pouvant contenir de 1 à 1000 légionelles. Les légionelles libres ou intra-amibienne se transmettent à l'homme par voie aérienne via de fines gouttelettes d'aérosols. Suivant l'état immunitaire de la personne contaminée et la souche de légionelles, deux tableaux cliniques sont décrits. La fièvre de Pontiac qui est un syndrome grippal bénin et la légionellose, pneumopathie aiguë pouvant être mortelle (80% de létalité chez les immuno-déprimés et 15% chez les immuno-compétants). Le sérogroupe Legionella peumophila 1 est responsable de la plupart des cas de légionelloses. On désigne sous le terme de Legion ella, les bactéries en batonnets, non sporogènes, Gram-, aérobies, flagéllées ou non, exigeantes en L-cystéine, caractérisées par leur richesse en acides gras ramifiés, qui est une propriété très inhabituelle pour des germes Gram-. Comme indiqué ci-dessus, certaines souches de cette bactérie pathogène opportuniste peuvent causer des infections chez l'homme (légionellose ou fièvre de Pontiac). On désigne sous le terme de Legionella pneumophila, les Legionella répondant à la définition ci-avant, donnant une réaction positive en présence d'un sérum anti-L. pneumophila, et responsable, comme indiqué ci-dessus, de la plupart des cas de légionelloses. Par commodité, Legionella pneumophila et Legionella, seront aussi désignés conjointement ci-après légionelles. Il existe une méthode normalisée de recherche et dénombrement du genre Legion ella et de l'espèce L. pneumophila (Norme NF T 90-431). Cette méthode de détection quantitative de référence utilise des milieux sélectifs et repose sur une caractérisation immunologique de L. pneumophila. Basée sur des milieux sélectifs, elle peut être appliquée à tous les types d'eaux, et génère un résultat définitif en 10 à 15 jours. Le taux moyen de recouvrement de cette méthode est d'environ 40%. Ce taux peut s'expliquer par le stress que constitue les étapes de concentration et de traitement de l'échantillon de milieux de culture très sélectifs. En présence d'une flore bactérienne interférente dense (Pseudomonas, Xanthomonas, Bacillus, etc...) et en dépit des étapes de pré-traitement de l'échantillon destinées à éliminer plus ou moins spécifiquement cette flore, la méthode normalisée ne permet pas toujours la détection des Legionella. En effet, dans ce cas, la culture est envahie par ces autres bactéries. En outre, les légionelles intra-amibienne ne sont pas toujours détectées par cette méthode. Lorsqu'elles le sont, une amibe, qui peut contenir 1000 légionelles, ne générera qu'un colonie sur le milieu de culture. Dans ces cas précis, les résultats issus de la méthode normalisée sousestime la concentration en légionelles et donc le risque sanitaire. Cette lacune est particulièrement, lorsqu'il s'agit d'apprécier l'efficacité d'une désinfection par exemple d'une canalisation par un choc au chlore. En effet, le traitement par le chlore est sans effet sur les légionelles intra-amibiennes, et, dans ce cas, la mise en #uvre de la méthode normalisée conduit à un résultat faussement négatif. Il a également été proposé une méthode alternative basée sur la détection semi-quantitive par PCR d'une séquence d'ARN 5S spécifique du genre Legionella et d'une séquence du gène mip spécifique de l'espèce L. pneumophila. La demande de brevet européen publiée sous le numéro 533 854 décrit cette méthode et les séquences des amorces mises en oeuvre pour les étapes d'amplification par PCR. Des kits pour la mise en #uvre de cette méthode ont été commercialisés sous les dénominations "EnviroAmp sample prep kit", "EnviroAmp Legionella PCR amplification kit" et "EnviroAmp Legionella PCR detecion kit" par la Société Perkin-Elmer. L'analyse d'un liquide mettant en #uvre cette méthode comprend une concentration des bactéries par filtration de 10 à 100 ml d'eau, puis extraction de l'ADN par une lyse à la chaleur, suivie d'une amplification simultanée des deux séquences cibles citées ci-dessus. La détection est réalisée par hybridation immuno-enzymatique et les résultats sont rendus en 24 à 48 heures. La méthode de détection par PCR permet de détecter comme Legionella : L. anisa, birminghamensi, bozemanii, cherii, cincinnatiensis, erythra, dumoffi, feelii, gormanii, gratiana, jamestowniensis, jordanis, longbeachae, maceachernii, micdadei, moravica, oakridgensis, parisiensis, tucsonesis, wadsworthii, et si >10E4/mL spiritensis, quinvanii, sainthelensi, Altermonas rubra, et comme Legionella pneumophila : L. pneumophilla sérogroupes 1 à 15 et L. hackelia. Le principal intérêt de détecter et de semiquantifier les Legionella et L. pneumophila par PCR est de largement diminuer la durée de l'analyse. En effet, la méthode normalisée de détection des légionelles par culture sur milieux, nécessite 10 à 15 jours afin d'obtenir un résultat, contre 24 à 48 h si l'analyse est réalisée par PCR. Cette rapidité de résultat permet la mise en place immédiate de protocole de désinfection et le contrôle de leur efficacité. En outre, la méthode par PCR permet de déceler la présence de toutes les légionelles de l'échantillon analysé, qu'elles soient libres ou intraamibiennes. Cette analyse donne donc des résultats plus proches de l'état sanitaire réel que la méthode normalisée. Toutefois, cet avantage est aussi un inconvénient dans la mesure où les résultats de la méthode par PCR ne sont pas comparables à ceux de la méthode de référence qui demeure la méthode normalisée décrite précédemment. En outre, la méthode par PCR présente l'inconvénient de ne pas être toujours applicable à des eaux non traitées, comme les eaux thermales, qui contiennent souvent des inhibiteurs de la polymérase nécessaire aux amplifictions PCR. Les inhibiteurs de la polymérase sont nombreux. Dans les échantillons de l'environnement, on retrouve par exemple, des acides humiques qui sont des complexants du magnésium. Il apparaît donc utile de disposer d'une méthode adaptée à l'ensemble des eaux, offrant des résultats équivalents à ceux de la méthode normalisée mais plus rapide. Ce but est atteint grâce à un procédé d'analyse d'un échantillon de liquide pour la présence éventuelle de légionelles, du type comprenant éventuellement une filtration de l'échantillon puis une détection des légionelles dans ledit échantillon, caractérisé en ce qu'après filtration éventuelle, l'échantillon est soumis à une étape d'immunocapture des légionelles éventuellement présentes et en ce que l'on détecte par tout moyen approprié les légionelles immunocapturés. La filtration n'est en effet pas nécessaire pour l'analyse d'échantillons fortemant contaminés (par exemple supérieur à 100 000 légionelles/L). La méthode de l'invention est remarquable en ce qu'elle peut être mise en #uvre avec toute méthode de détection qualitative ou quantitative connue dans l'art antérieur. En effet, l'étape d'immuncapture après filtration de l'échantillon est adaptée à une détection : - par culture sur milieux sélectifs et caractérisation immunologique, ou - par PCR et caractérisation par électrophorèse, hybridation ou par toute autre technique de détection instantanée des amplicons, par exemple du type "Taqman", ou encore - par utilisation d'anticorps marqués. Dans le cadre d'une détection par PCR, l'étape d'immuncapture du procédé de l'invention permet d'éliminer les inhibiteur de polymérase et confère donc à l'analyse une meilleur répétabilité et une meilleur robustesse notamment par rapport à la nature des eaux analysées (réseau, surface, thermales...). Le seuil de détection est maintenue à 50-100 L. pneumophila/litre quelque soit la nature de l'eau analysée. Par ailleurs, l'étape d'immunocapture, élimine les légionelles intra-amibiennes et permet d'obtenir avec le procédé d'analyse de l'invention mis en #uvre avec une détection par PCR, des résultats qui peuvent être comparés avec ceux obtenus par la méthode normalisée. Il est aussi possible de réaliser dans le cadre du procédé de l'invention comprenant une détection par PCR, une analyse différentielle, c'est à dire avec et sans immuno-capture, de façon à mettre en évidence la présence les légionelles intra-amibiennes qui ne sont pas détectées pas la méthode normalisées utilisant des milieux de culture. Dans le cadre d'une détection sur milieux de culture et caractérisation immunologique, l'étape d'immuncapture du procédé de l'invention permet d'éviter les risques d'envahissement des cultures par d'autres bactéries, risques que l'on rencontre avec la méthode normalisée de l'art antérieur. Les étapes de pré-traitement peuvent alors être évitées, ce qui permet un gain de temps important et rend l'étape de concentration moins stressante pour les légionelles. L'étape d'immunocapture peut être mise en #uvre sur tout type de support sur lequel est fixé des anticorps ou parties d'anticorps, identiques ou différents, spécifiques de tout ou partie des bactéries du genre Legionella, puis l'on lave ledit support pour éliminer les composés de l'échantillon non fixés spécifiquement sur ledit support. Le support mis en #uvre pour l'étape d'immunocapture est avantageusement constitué de billes paramagnétique, mais peut être aussi une membrane, une colonne, une microplaque ou tout autre support permettant la fixation des anticorps avant ou après la formation du complexe avec les légionelles. Il est ainsi possible d'éliminer par lavage ou rinçage tous les composés non fixés présents dans l'échantillon. Des anticorps spécifiques de nombreuses espèces dont l'espèce L. pneumophila sont disponibles dans le commerce, mais peuvent aussi être préparés par les techniques d'immunisation et/ou de fusion connue de l'homme du métier à partir d'un antigène portant un épitope commun l'espèce L. pneumophila ou au genre Legionella. Toutefois, le procédé d'analyse selon l'invention rapporté dans les exemples ci-après est tout particulièrement adapté à l'espèce L. pneumophila. L'échantillon liquide sur lequel est pratiqué le procédé d'analyse de l'invention est par exemple un échantillon d'eau, thermale, de consommation, de récréation (piscines, baignades, bains à remous, etc...), de process (eau chaude sanitaire, condensats de climatisation ou de tours aéroréfrigérantes, etc...), à usage médical (assistance respiratoire, etc...) et de surface (lacs, rivières, etc...). La mise en oeuvre du procédé d'analyse selon l'invention comprenant une détection par PCR est basée comme proposée dans l'art antérieur sur la détection d'une séquence d'ARN 5S spécifique du genre Legionella et d'une séquence du gène mip spécifique de l'espèce L. pneumophila dont les amorces spécifiques sont décrites dans les brevets US No. 5 491 225 et 5 614 388. Le principe général du procédé de l'invention comprenant une détection par PCR et caractérisation des amplicons par électrophorèse comprend les étapes suivantes: - filtration de l'échantillon de liquide, et décrochage des légionelles éventuellement présente du filtre, - centrifugation de la suspension obtenue à l'étape précédente et remise en suspension du culot afin de réaliser l'immunocapture, - concentration et lyse des légionelles éventuellement présentes afin de libérer leur ADN, - à partir de cet ADN extrait, amplification par PCR de gènes spécifiques du genre Legionella et de l'espèce L. pneumophila, simultanément à la détection des gènes spécifiques de l'étape ci-dessus, amplification d'un ADN synthétique constituant un contrôle interne calibré, - détection et quantification des produits d'amplification par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide ou hybridation avec des sondes spécifiques. Ce procédé peut être détaillé de la façon suivante : - Après filtration d'un litre d'eau, les légionelles sont décrochées du filtre par ultrasons et vortex. - La suspension est alors centrifugée et le culot remis en suspension dans 1 ml d'eau afin de réaliser l'immuno-capture. - Les légionelles concentrées dans un volume minimale sont ensuite lysées afin de libérer leur ADN. - A partir de cet ADN extrait, une amplification par PCR de gènes spécifiques du genre Legionella (ARNr 5S) et de l'espèce L. pneumophila (mip), est réalisée. - Simultanément à la détection des gènes spécifiques, un contrôle interne calibré (ADN synthétique) est amplifié afin de valider les résultats et de déterminer de manière semi-quantitative la concentration en légionelles dans l'échantillon. - La détection et la semi-quantification des produits d'amplification est réalisée par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide ou hybridation avec des sondes spécifiques. Comme indiqué précédemment, il est aussi possible de réaliser dans le cadre du procédé de l'invention comprenant une détection par PCR, une analyse différentielle, c'est à dire avec et sans immuno-capture, de façon à mettre en évidence la présence les légionelles intra-amibiennes qui ne sont pas détectées pas la méthode normalisées utilisant des milieux de culture. L'invention se rapporte donc aussi à un procédé caractérisé en ce que l'on réalise une première analyse avec détection par PCR comprenant une étape d'immunocapture et une seconde analyse avec détection par PCR ne comprenant pas d'étape d'immunocapture, et en ce que l'on compare les résultats des deux analyses pour mettre en évidence la présence des légionelles intra-parasitaires, plus particulièrement intra-amibiennes. L'invention concerne aussi un kit pour la mise en #uvre du procédé ci-dessus comprenant une étape d'immunocapture et une détection par PCR. Un tel kit comprend : - les éventuelles membranes de filtration, - le système de fixation des anticorps à un support tel que défini précédemment et les tampons correspondant, - les réactifs nécessaires à la lyse bactérienne et à l'extraction et éventuellement purification de l'ADN, - les réactifs d'amplification PCR (tampon, amorces, UNG, Taq polymérase, ADN synthétique servant de contrôle interne calibré, éventuellement les composés nécessaires à la détection instantanée des amplicons), - les réactifs nécessaires aux contrôles négatifs et positifs, - éventuellement, un système de révélation par hybridation. La mise en oeuvre du procédé d'analyse selon l'invention comprenant une détection par culture sur milieux sélectifs et caractérisation immunologique est basée comme proposée dans l'art antérieur sur la détection de colonies caractéristiques de légionelles capables de cultiver sur le milieu GVPC ou équivalent, suivi d'une caractérisation biochimique sommaire basée sur la capacité de culture sur milieu BCYE sans cystéine et gélose au sang ou équivalent. Les colonies reconnues alors comme appartenant au genre Legionella sont caractérisées par immunofluorescence afin de déterminer si elles possèdent des épitopes spécifiques de l'espèce L. pneumophila. Le principe général du procédé de l'invention comprenant une détection par culture sur milieux sélectifs et caractérisation immunologique comprend les étapes suivantes : - filtration de l'échantillon de liquide, et décrochage des légionelles éventuellement présentes sur le filtre, - centrifugation de la suspension obtenue à l'étape précédente et remise en suspension du culot afin de réaliser l'immunocapture, - le concentrat est étalé sur milieu GVPC ou équivalents ; ce milieu est incubé à 37 C, 2,5% de CO2, - après 3,5 et 10 jours d'incubation les colonies caractéristiques sont dénombrées et repiquées sur milieu BCYE, BCYE sans cystéine et gélose au sang ou équivalents, - après 3 jours d' incubation à 37 C, 2,5% CO2, les colonies cultvant uniquement sur le milieu BCYE sont considérées comme appartenant au genre Legionella, - un test d'immunofluorescence est réalisée sur ces colonies de Legionella afin de déterminer leur appartenance à l'espèces L. pneumophila. Ce procédé peut être détaillé de la façon suivante : - Après filtration d'un litre d'eau, les légionelles sont décrochées du filtre par ultrasons. - La suspension est alors centrifugée et le culot remis en suspension dans 1 ml d'eau afin de réaliser l'immuno-capture. - Les légionelles concentrées dans un volume minimale de 100 (IL sont ensuite ensemencées par étalement sur milieu GVPC ou équivalent ; milieu est incubé à 37 C, 2,5% de CO2, - après 4,7 et 10 jours d'incubation les colonies caractéristiques sont dénombrées et repiquées sur milieu BCYE, BCYE sans cystéine et gélose au sang ou équivalents, - après 3 jours d' incubation à 37 C, 2,5% CO2, les colonies cultvant uniquement sur le milieu BCYE sont considérées comme appartenant au genre Legionella, - un test d'immunofluorescence est réalisée sur ces colonies de Legionella afin de déterminer leur appartenance à l'espèces L. pneumophila. L'invention concerne aussi un kit pour la mise en #uvre du procédé ci-dessus comprenant une détection par culture sur milieux sélectifs et caractérisation immunologique. Un tel kit comprend : - les éventuelles membranes de filtraton, - les systèmes de fixation des anticorps à un support comme défini précédemment. La mise en oeuvre du procédé d'analyse de l'invention comprenant une détection par l'utilisation d'anticorps marquée est basée, comme proposée dans l'art antérieur, sur la détection d'épitopes spécifiques du genre Legionella, de l'espèce L. pneumophila ou de tout autre espèce ou ensemble d'espèce caractérisé par un épitope spécifique commun. Le principe général du procédé de l'invention comprenant une détection par des anticorps marqués comprend les étapes suivantes : filtration éventuelle de l'échantillon de liquide et décrochage des légionelles éventuellement présentes sur le filtre, centrifugation de la suspension obtenue à l'étape précédente et remise en suspension du culot afin de réaliser l'immunocapture, - application sur le concentrat d'anticorps couplés à un composé fluorescent, à une enzyme ou à tout autre système permettant la détection spécifique des légionelles par observation microscopique, absorptiométrie ou colorimétrie. Cette technique a pour avantage d'être extrêmement facile à mettre en #uvre et très rapide. Cependant son seuil de détection est élevée ( L'invention concerne aussi un kit pour la mise en oeuvre du procédé de détection par des anticorps marqués ci-dessus. Un tel kit comprend : - les éventuelles membranes de filtration, - le système de fixation des anticorps à un support comme défini précédemment, et les tampons correspondant, - les anticorps marqués permettant la détection spécifique des bactéries du genre Legionella, de l'espèce L. pneumophila ou de tout autre espèce ou ensemble d'espèces caractérisé par un épitope commun, - les réactifs nécessaires au contrôles négatifs et positifs. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent qui se rapportent à la mise en #uvre d'un procédé d'analyse d'un échantillon d'eau pour la présence éventuelle de légionelles selon le procédé de l'invention comprenant une étape d'immunocapture et avec une détection par PCR (exemple 1). EXEMPLE 1. I - Équipement et matériel requis. 1) Filtration de l'échantillon et extraction de l'ADN. - Filtration : . bouteille à usage unique d'1 L (contenant du thiosulfate de sodium 20 mg) . entonnoirs en plastiques (Pack Microfil 100 ml) (Millipore MZ HAWG 101) filtres Millipore 0,45 m HV (Durapore Membrane Filters) rampe de filtration reliée au système d'aspiration (pompe péristaltique) 2 pinces stériles une paire de petits ciseaux stériles - Immuno-capture : L'immunocapture est décrite ci-après dans la section mode opératoire. - Extraction : une série de tubes Eppendorf 2 ml une série de tubes Eppendorf 1,5 ml . un lot de Pipetman et cônes stériles à filtre deux blocs chauffants à 100 C et à 70 C (Bioblock) un vortex Heildolph Top-Mix 94323 (Bioblock Scientific) une centrifugeuse "Sigma 2MK" (Bioblock Scientific) système d'aspiration comportant : fiole à vide, tuyau, bouchon, pompe à vide et pipettes Pasteur 2) Amplification génique. . un lot de Pipetman avec les cônes stériles adéquats . une série de tubes 0. 2 ml (autoclavables) MicroAmpReaction (Perkin-Elmer : Part. No. 801-0540) un thermocycler Gene Amp PCR system 9700 (Perkin-Elmer Applied Biosystems 3) Montage du gel. - une petite et une grande plaque en verre - un support à vis - deux spacers - un joint (caoutchouc) - un socle pour fixer les supports à vis et pour couler les gels (Bio-Rad) - un peigne (10 puits) - une cuve de migration avec son support de migration (où se trouvent les électrodes) (Bio-Rad Miniprotean II) - un générateur pour électrophorèse (Bio-Rad Power/Pac 300) 4) Coloration et révélation. cuve de coloration en plastique (avec couvercle) - agitateur (Heildorf VIBRAMAX 100) gel doc 1000 avec le programme Molecular Analyst pour la lecture du gel aux UV. II - Préparation des réactifs. 1) Réactifs nécessaires à l'immuno-capture. L'immunocapture est décrite ci-après dans la section mode opératoire. 2) Réactifs nécessaires à l'extraction de l'ADN. - Réactif de lyse: . 50 mM Tris pH 7,7 . Thyocyanate de guanidine 4,75 M . EDTA.Na2 (H20) 25 mM . Tween 20: 1% qsp au volume avec de l'eau PCR Soit pour 80 ml de réactif de lyse: . 132,8 mg de Trizma Base . 457,6 mg de Trizma HCl . 44,916 g de Thyocyanate de Guanidine . 744,4 mg de EDTA.Na2 (H20) . 800 l de Tween 20 Conservation de -20 C à 30 C. - Isopropanol 75% (V/V). Dilution dans de l'eau PCR. Conserver à température ambiante, pendant au maximum 4 mois. - Réactif transporteur : RNA 4 mg/ml. Dissoudre dans du PBS stérile, et stériliser par filtration. Conservation de -20 à température ambiante. - Solution de BSA à 0.03%. Dissoudre dans de l'eau de PCR, faire une solution stock à 3%, et stériliser par filtration.Diluer la solution stock à 0,03% dans de l'eau PCR. 3) Préparation des premix d'amplification. - Diluer les IPC dans de l'eau de PCR, de façon à obtenir une quantité d'ADN cible (IPC), qui après amplification génère un signal sur gel d'électrophorèse équivalent à celui obtenu suite à l'analyse, selon la même procédure, d'un échantillon contenant 100 Legionella pneumophila par litre. - Mise en solution et dilution des amorces dans de l'eau de PCR: pour pT69 et pT70 : 38.5 M. pour pTl81, 87,161, 163, et pT165 : 19 M. - Tous les réactifs PCR sont conservés à -20 C, les placer dans la glace après décongélation. Pour la préparation des premix PCR, introduire dans un tube Eppendorf stérile les réactifs dans l'ordre décrit ci-dessous. - Préparer les prémix en mix-commun, puis aliquoter dans des microtubes de 0. 2 ml ; volume final d'un premix est de 50 {IL. Conserver ces microtubes à -20 C jusqu'au moment de leurs utilisations. Si cette solution est correctement conservée, elle sera valable jusqu'à la première date de péremption d'un des réactifs du premix. Premix de détection du genre Legionella . . 2,52 fil d'eau PCR . 10 [il de Tampon xlO 10 l IPC genre Legionella dilution équivalente à 100 Leg/L. . 2 l d' amorce pT 161 . 2 l d'amorce pT 163 . 2 {il d'amorce pT 165 . 2 l d' amorce pT 87 . 4 , 6 {il dATP . 4 , 6 fil dGTP . 4,6 l dCTP . 2,3 l dUTP . 2 l Uracyl N-glycosylase (UNG) . 1,38 (il amplitaq Premix de détection de l'espèce Legionella pneumophila . 4,52 l d'eau PCR . 10 l de Tampon xlO 10 l IPC l'espèce Legionella pneumophila dilution équivalente à 100Lp/L. . 2 (il d'amorce pT 69 2 )il d'amorce pT 70 . 2 l d'amorce pT 181 . 4 , 6 fil dATP . 4 ,(il dGTP . 4,6 l dCTP 2.3 {il dUTP . 2 (il Uracyl N-glycosylase (UNG) . 1,38 l AmpliTaq 4) Préparation des réactifs nécessaire à la détection. - Tampon TBE 1x Diluer avec de l'eau milliQ+. Conserver à température ambiante. - APS 10% Diluer dans de l'eau PCR. - Solution de bleu de bromophénol-xylène de cyanol : . 4 ml de glycérol . 6 ml d'eau PCR 25 mg de Bleu de bromophénol . 15 mg xylène de cyanol Aliquoter et conserver à 4 C. - Solution de largage 50% de glycérol dans du TBE lx. Conserver à +4 C . III - Mode opératoire. 1) Protocole de préparation de l'échantillon. - Allumer le bloc chauffant à 99 C +/-5 C dans la salle d'extraction. - Mettre le réactif de lyse à température ambiante, afin d'éliminer les cristaux. Préparer les tubes stériles de 2 ml et 1,5 ml. 1. 1) Concentration par filtration couplée ou non à l'immuno-capture. 1. 1.1) Concentration des légionelles par filtration et immuno-capture. a) Préparation de l'échantillon. - filtrer l'échantillon sur filtre en polycarbonate de 0,22 m de porosité. - récupérer le filtre dans un flacon carré contenant 5 ml d'échantillon - soniquer pendant 3 min - vortexer pendant 2 min transférer le liquide dans un tube de 15 ml - bien rincer le flacon avec 5 ml d'eau stérile et mettre le liquide de lavage dans le tube falcon - centrifuger 10 min à 5000 rpm - retirer le surnageant jusqu'à ce qu'il en reste 1 ml - resuspendre le culot - transférer les cellules dans un eppendorf 1,5 ml. b) Préparation des billes. Lavage : i) resuspendre les billes en vortexant doucement ii) transférer la quantité de billes nécessaire dans un tube de lavage (2 5[il - 1,65.107) iii) ajouter 1001 de tampon de lavage (PBS/BSA) iv) placer le tube 2 min sur le Dynal MPC et pipetter le liquide v) enlever le tube du Dynal MPC et resuspendre les billes dans 100(il de PBS/BSA vi) répéter l'opération 1 fois à partir de (iv) Traitement : i) ajouter 5 g d'anticorps (11) ii) vortexer brièvement iii) incuber pendant 30 min à température ambiante avec une légère rotation constante iv) placer le tube dans le Dynal MPC pendant 2 min. v) Pipetter le surnageant sans déranger les billes vi) enlever le tube du Dynal MPC et resuspendre les billes dans du PBS/BSA (100 l) vii) répéter 5 à 6 fois l'opération à partir de (iv) c) Isolement. i) ajouter les billes à la suspension bactérienne (lml) : volume final : 1,1 ml ; en billes : 1,5.107 billes/ ml ii) incuber 20 min à 4 C en agitant doucement iii) placer le tube dans le Dynal MPC et le laisser pendant 2 min iv) retirer le surnageant alors que les cellules cibles sont collées à la paroi du tube v) Enlever le tube du Dynal MPC et laver les cellules en les mettant en suspension dans 1 ml tampon d'isolement (PBS/Tween 20) vi) Reprendre 2 fois à partir de (iii) et reprendre les cellules dans 400 l de réactif de lyse pour la PCR 1. 1.2) Concentration de l'échantillon par filtration uniquement. Placer les entonnoirs sur les frittés. Laisser une sortie libre pour pouvoir rétablir une pression normale. - Placer, avec une pince stérile, un filtre HVLP (Millipore) de 0,45 m de porositée, sur chaque fritté utilisé. - Filtrer 1 litre de chaque échantillon d'eau, puis environ 100 ml d'eau osmosée stérile. - Placer à proximité les tubes Eppendorf stériles de 2 ml contenant 600 {il de réactif de lyse sans cristaux. - Manipuler le filtre en évitant de toucher la partie où les bactéries ont été recueillies. Il faut alors tenir la membrane avec les pinces uniquement sur sa partie périphérique. - Découper en deux le filtre. Enrouler la première moitié, côté bactéries à l'intérieur, et le placer dans son tube. Puis enrouler la seconde partie du filtre de façon très serrée, et la placer à l'intérieur du filtre, au centre du tube. 1.2) Extraction de l'ADN. i) Transférer les concentrats dans leur réactif de lyse dans la salle d'extraction. ii) Vortexer 2 min. iii) Incuber 20 min à 99 C +/- 5 C dans le bloc chauffant. iv) Centrifuger 30 sec à 12000 g, soit environ 10000 tours/min. v) Dans un Eppendorf de 1,5 ml stérile, contenant 400 (il d'isopropanol à 100 %, ajouter 400 )il de réactif de lyse en contact avec le filtre (ADN bactérien). vi) Ajouter 10 (il de réactif transporteur ("carrier reagent"). vii) Mélanger le contenu des tubes par plusieurs inversions. viii) Incuber 10 min à température ambiante. ix) Centrifuger 10 min à 12000 g, en orientant les tubes afin de repérer le culot. x) Retirer le surnageant de chaque tube , avec le système d'aspiration . Il n'est pas nécessaire de changer de pipette pasteur entre chaque échantillon, si l'on aspire à la surface uniquement. Après aspiration de la série d'échantillon, aspirer quelques ml d'eau de javel. xi) Ajouter 500 l d'isopropanol à 75 %. xii) Vortexer doucement. xiii) Répéter l'opération à partir de (ix), en mettant 160 l d'une solution de BSA 0,03% à la place de l'isopropanol. xiv) Vortexer 10 sec, vérifier que le culot soit bien resuspendu. xv) Incuber les échantillons à 70 C +/-2 C pendant 3 min. xvi) Diluer 1/10 l'ADN de chaque échantillon dans la solution de BSA 0,03%, si l'amplification a déjà été inhibé. Si on ne peut pas amplifier l'ADN directement, les échantillons doivent être conservé à 2-8 C durant 5 jours maximum, ou à -20 C durant 2 semaines maximum. 2) Protocole d'amplification par PCR. - Dégeler un nombre suffisant de tubes de 0,2 ml contenant les prémix, pour les échantillons et les contrôles. - Faire un plan des tubes sur la feuille prévue à cet effet . - Il faut débuter la PCR dans les 30 minutes après avoir ajouté la solution de MgCl2. - Vortexer vigoureusement la solution de MgCl2. - Ajouter 15 l de MgCl2 25 mM dans chaque tubes de 0,2 ml. - Ajouter 35 l du tube contenant l'ADN de l'échantillon, dans les tubes contenant 0,2 ml de prémix. - Pour le contrôle négatif : ajouter 35 fil d'eau de PCR (gene amp PCR water ). - Fermer les tubes hermétiquement. - Les placer dans le bloc de PCR, avec la roulette passer sur les tubes pour les fermer. - Lancer le programme d'amplification sur le thermocycleur 9700 de Perkin-Elmer, et réaliser le cycle suivant : 10 min 45 C ; 10 min à 95 C ; 35 fois : 15s à 95 C à 63 C ; puis 7 min à 72 C et maintenir autant de temps que nécessaire à 4 C . La PCR dure environ 2 heures. Mais l'ADN peut être conservé 4h de plus dans le bloc avec le programme 23 (4 C) . - Sortir les tubes du bloc. - Si on ne peut pas réaliser le protocole de détection immédiatement, on peut conserver les échantillons amplifiés à -20 C. Mais éviter de les mettre dans le compartiment des réactifs d'amplification. 3) Séparation et révélation des séquences spécifiques des Legionella ou des Legionella pneumophila par migration en gel de polyacrylamide. 3.1) Montage du support à vis nécessaire à la polymérisation du gel. -Orienter le support à vis de façon à ce que les pointes soient vers le haut et les vis vers l'arrière. -Glisser ensuite la grande plaque dans l'espace prévu, puis, glisser la petite plaque (devant la grande). -Placer, à chaque extrémité, les spacers de manière à obtenir l'espace nécessaire pour couler le gel. -Serrer d'abord les vis du haut, puis, après avoir vérifié que tout est droit en bas, serrer celles du bas. -Sceller ensuite le tout sur le socle à l'aide du joint. 3. 2) Préparation du gel de polyacrylamide à 10% (w/v) 29:1(B/A) 3. 3% de C. Dans un petit tube de 15ml , mettre pour un gel : 4,875 ml de TBE lx . 1,625 ml de polyacrylamide 40%(w/v) 29:1(B/A) 3,3% de C. (cette solution, conservée à +4 C, est à homogénéiser avant utilisation) - 32,5 {il d'APS à 10%. - ajouter extemporanément 6,5 [il de TEMED - Bien homogénéiser le mélange par plusieurs retournements du tube. - Couler rapidement le gel. Mettre en place, sans attendre, le peigne en évitant la formation de bulles. - Laisser polymériser 30 à 45 min. - Après polymérisation, enlever le peigne, rincer 2x les puits à l'eau osmosée et lx au TBE lx (afin d'enlever les restes de gel qui n'ont pas polymérisé). - Préparer ensuite la chambre en "U" comme suit. 3. 3) Préparation de la chambre en "U". - La préparation de cette chambre consiste à placer, de part et d'autre du socle de migration, un support à vis. - Pour fixer les supports à vis: - placer les supports sur le socle de le cuve : la petite plaque vers le joint étant bloquée par l'encoche. - pour enclencher : pousser de part et d'autre avec les pouces et tirer avec les indexs. - Remarque : Si la manipulation ne nécessite qu'un gel : on disposera : - d'un support à vis avec le gel polymérisé - d'un support à vis avec une petite plaque uniquement Les deux supports seront fixés de la même manière que précédemment. - Immerger ensuite le haut et le bas du gel dans du TBE lx Il faut toujours utiliser le même TBE lx pour la migration et la préparation du gel. 3. 4) Dépôt des échantillons et migration. Le volume maximal de chargement d'un puits est de 30 l. - Prélever 221 d'ADN amplifié (de l'échantillon voulu) et ajouter 10 l de solution de largage (=SL= glycérol 50% dans du TBE lx). - On dépose également, par gel, un marqueur moléculaire (=MM= mass ruler) et un marqueur de migration préparés comme suit : - 6 (il de marqueur de migration + 5 [il de SL - 1 (il de MM + 10 (il de SL MM, marqueur de migration et SL sont conservés à +4 C . - Remarques : En général, lorsqu'il n'y a qu'un seul gel, le marqueur de migration est déposé à une extrémité du gel et le MM au centre. Si toute fois, il y a plusieurs gels, on fait varier la position du MM afin de reconnaître les gels, lors de la lecture. - La migration s'effectue à environ 200 V jusqu'à ce que le bleu de xylène de cyanol se situe en bas du gel. 3. 5) Coloration et lecture du gel. - Lorsque la migration est finie, verser le tampon de migration (TBE lx) dans le bac de coloration (200 ml environ). - Démouler le gel en utilisant les spacers comme levier. Placer ensuite le gel dans le bac de coloration et ajouter 10 (il de BET (Bromure d'éthidium) (port des gants obligatoire). Laisser en contact 15 mn à température ambiante et sous agitation. - La lecture du gel s'effectue sous UV dans l'appareil Gel doc 1000 avec le programme Molecular analyst. Ce logiciel permet de comparer l'intensité des bandes d'ADN spécifiques des produits d'amplification et donc de déterminer à un facteur de 10 près la concentration en Legionella dans l'échantillon. REVENDICATIONS 1) Procédé d'analyse d'un échantillon de liquide pour la présence éventuelle de légionelles, du type comprenant éventuellement une filtration de l'échantillon puis une détection des légionelles dans ledit échantillon, caractérisé en ce qu'après une éventuelle filtration, on soumet l'échantillon à une étape d'immunocapture des légionelles éventuellement présentes, puis l'on détecte les légionelles immunocapturés. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détection des légionelles retenues lors de l'étape d'immunocapture est une détection : - par culture sur milieux sélectifs et caractérisation immunologique, ou - par PCR et caractérisation par électrophorèse, hybridation ou par toute autre technique de détection instantanée des amplicons, - par utilisation d'anticorps marqués. 3) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'étape d'immunocapture est réalisé sur un support sur lequel peut être fixé des anticorps ou parties d'anticorps avant ou après la formation du complexe avec les légionelles, puis l'on lave ledit support pour éliminer les composés de l'écgantillon non fixés spécifiquement sur ledit support. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape d'immunocapture est réalisé sur un support choisi parmi : des billes paramagnétique, une membrane, une colonne, une microplaque ou tout autre support 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les légionelles sont du genre Legionella et/ou de l'espèce L pneumophila. et/ou de toute espèce ou ensemble d'espèces appartenant au genre Legionella. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon liquide est un échantillon d'eau, thermale, de consommation, de récréation, de process, à usage médical ou de surface. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant une détection par PCR, caractérisé en ce que l'on détecte une séquence d'ARN 5S spécifique du genre Legionella et une séquence du gène mip spécifique de l'espèce L. pneumophila. 8) Procédé selon l'une des quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes : - filtration de l'échantillon de liquide, et décrochage des légionelles éventuellement présente du filtre, - centrifugation de la suspension obtenue à l'étape précédente et remise en suspension du culot afin de réaliser l'immunocapture, - concentration et lyse des légionelles éventuellement présentes afin de libérer leur ADN, - à partir de cet ADN extrait, amplification par PCR de gènes spécifiques du genre Legionella et de l'espèce L. pneumophila, - simultanément à la détection des gènes spécifiques de l'étape ci-dessus, amplification d'un ADN synthétique constituant un contrôle interne calibré, détection et quantification des produits d'amplification par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide ou hybridation avec des sondes spécifiques. 9) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédente, caractérisé en ce que l'on réalise une première analyse avec détection par PCR comprenant une étape d'immunocapture et une seconde analyse avec détection par PCR ne comprenant pas d'étape d'immunocapture, et en ce que l'on compare les résultats des deux analyses pour mettre en évidence la présence des légionelles intra-parasitaires et plus particulièrement intra-amibiennes. 10) Un kit pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend : - les éventuelles membranes de filtration, le système de fixation des anticorps ou parties d'anticorps, identiques ou différents, spécifiques de tout ou partie des bactéries du genre Legionella à un support et les tampons correspondant, - les réactifs nécessaires à la lyse bactérienne et à l'extraction et éventuellement purification de l'ADN, - les réactifs d'amplification PCR (tampon, amorces, UNG, Taq polymérase, ADN synthétique servant de contrôle interne calibré, éventuellement les composés nécessaires à la détection instantanée des amplicons), - les réactifs nécessaires aux contrôles négatifs et positifs, - éventuellement, un système de révélation par hybridation. 11) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant une détection par culture sur milieux sélectifs et caractérisation immunologique, caractérisé en ce que l'on détecte des colonies caractéristiques de légionelles capables de cultiver sur le milieu GVPC ou équivalent, suivi d'une caractérisation biochimique sommaire basée sur la capacité de culture sur milieu BCYE sans cystéine et gélose au sang ou équivalent, puis en ce que les colonies reconnues alors comme appartenant au genre Legionella sont caractérisées par immunofluorescence afin de déterminer si elles possèdent des épitopes spécifiques de l'espèce L. pneumophila. 12) Un kit pour la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend : - les éventuelles membranes de filtraton, - le système de fixation des anticorps ou parties d'anticorps, identiques ou différents, spécifiques de tout ou partie des bactéries du genre Legionella à un support et les tampons correspondant, 13) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant une détection par des anticorps marqués caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - la filtration éventuelle de l'échantillon de liquide et décrochage des légionelles éventuellement présentes sur le filtre, - la centrifugation de la suspension obtenue à l'étape précédente et remise en suspension du culot afin de réaliser l'immunocapture, - l'application sur le concentrat d'anticorps couplés à un composé fluorescent, à une enzyme ou à tout autre système permettant la détection spécifique des légionelles par observation microscopique, absorptiométrie ou colorimétrie. 14) Un kit pour la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend : - les éventuelles membranse de filtration, - le système de fixation des anticorps ou parties d'anticorps, identiques ou différents, spécifiques de tout ou partie des bactéries du genre Legionella à un support et les tampons correspondant, - les anticorps marqués permettant la détection spécifique des bactéries du genre Legionella, de l'espèce L. pneumophila ou de tout autre espèce ou ensemble d'espèces caractérisé par un épitope commun, - les réactifs nécessaires au contrôles négatifs et positifs.