Brevet FR2806727A1 — publié le 20010928

La présente invention a pour objet une molécule d'intérêt pharmaceutique, de préférence un ligand du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH), comportant un acide glutamique ou une glutamine à son extrémité N-terminale, qui se présente sous forme de sel d'addition d'acide fort physiologiquement acceptable, ainsi qu'un vaccin comprenant un tel ligand. La vaccination est un moyen efficace de prévenir ou de réduire les infections virales ou bactériennes. Les antigènes vaccinaux administrés seuls chez l'hôte ne sont souvent pas assez immunogéniques pour induire une réponse immunitaire, et doivent donc être associés à un adjuvant ou couplés à une protéine porteuse pour induire (ou augmenter) leur immunogénicité. Dans ces conditions, seules une réponse immune de type humorale peut être induite. Or, dans le cadre d'une thérapie antivirale, la génération de lymphocytes T cytotoxique (CTL) capables de reconnaître et de détruire le virus est de toute importance (Bachmann et al., Eur. J. Immunol., 1994,24, 2228-2236; Borrow P., J. Virol. Hepat., 1997, 4, 16-24), comme l'attestent de nombreuses études montrant in vivo, le rôle protecteur des réponses dirigées contre les épitopes viraux (Arvin AM, J. Inf. Dis., 1992,166, S35S41 ; Koszinowski et al., Immunol. Lett., 1987,16, 185-192). L'importance des réponses CTL et T auxiliaire a également été bien décrite pour des vaccins contre les parasites comme Plasmodium falciparum, l'agent responsable de la Malaria (Le et al, Vaccine, 1998, 16, 305-312). Le rôle primordial des réponses CTL a aussi été fortement documenté dans les réponses antitumorales notamment celles dirigées contre les cellules de mélanome (revue dans Rivoltini et al., Crit. Rev. Immunol., 1998, 18, 55-63). Le ou les épitopes CTL (séquences peptidiques interagissant avec les molécules de classe 1 et présentés aux lymphocytes T CD8+) ont été définis pour plusieurs antigènes. Cependant, la difficulté réside dans la génération de CTL in vivo, due à la faible immunogénicité de ces peptides (Melief, Adv. Cancer Res., 1992,58, 143-175 ; Nandaz et Sercaz, Cell, 1995,82, 13-17). De nombreux ligands du CMH (Classe 1 et II) et notamment des peptides épitopes CTL ont été identifiés (HG Rammensee et al, Immunogenetics, 1999,50, 213) et certaines de leurs séquences sont accessibles sur internet dans des bases de données publiques. On peut citer notamment les bases SYFPEITHI (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) et MHCPEP (http://wehih.wehi.edu.au/mhcpep/). De même, des super-types des principaux HLA ont été décrits (Sette et al, Immunogenetics, 1999, 50, 201-212). L'intérêt de ces ligands du CMH est confirmé par le nombre croissant d'études cliniques chez l'homme de ces composés en tant que candidats vaccins contre différentes pathologies et notamment comme vaccins anti-mélanome (épitopes m27-25 MART 1, g209-217, g280-288, gplOO, MAGE 3), comme vaccin anti-HIV (Klinguer et al, Vaccine, 2000, 18, 259-267) ou encore comme vaccins anti-HBV de types lipopeptides anti-HBV (Livingston et al, J. Immunol., 1999, 162, 3088-3095). Toutefois, la difficulté de ces études réside dans le fait que les peptides utilisés sont difficiles à conserver avant leur administration aux patients, ce qui peut mener à une réduction de leur pouvoir vaccinal, et à une dégradation plus rapide in vivo. Pour stabiliser un peptide à usage pharmaceutique ayant un acide glutamique ou une glutamine en N-terminal sous une forme de sel compatible avec une administration chez l'homme, la stratégie habituellement utilisée par l'homme du métier est de synthétiser le dérivé pyroglutamique de ce peptide, comme l'illustrent les deux exemples ci-dessous de la Buséréline et de la Gonadoréline (analogues du LH-RH, Pharmacopée européenne, 1999) : Buséréline Gonadoréline Ceci permet par ailleurs d'augmenter la demi-vie du peptide en limitant sa dégradation protéolytique par des N-aminopeptidases. Toutefois, lorsque cette méthode est utilisée pour stabiliser un ligand du CMH comme le décapeptide ELA (épitope CTL de séquence ELAGIGILTV et de formule C45H80N10O14 = 985 Da), le dérivé PyrELA obtenu (de séquence PyrELAGIGILTV et de formule C45H78N10O13 = 967 Da), ne présente plus l'activité vaccinale recherchée et est notamment quasiment inactif d'un point de vue réponse CTL. Cette modification de structure est pourtant mineure : il s'agit de la cyclisation de la fonction a-amino N-terminale de l'acide glutamique avec sa propre fonction y-carboxylique et perte d'une molécule d'eau. En effet, les peptides présentant un acide aminé de type acide glutamique (Glu, E) ou glutamine (Gln, Q) à leur extrémité N-terminale se cyclisent avec la fonction acide y-carboxylique libre pour former un pyroglutamate selon la réaction définie ci-dessous : Acide glutamique : X = OH pyroglutamate Glutamine : X=NH2 L'absence d'activité vaccinale pour ces peptides est d'autant surprenante que la diminution de masse entre le décapeptide ELA et le dérivé PyrELA obtenu est de 18Daltons seulement, tout le reste de la structure demeurant inchangé : Il a aussi été constaté que la synthèse d'un autre dérivé du peptide ELA acétylé sur la fonction amine de l'acide glutamique de manière à empêcher la cyclisation en pyroglutamate (peptide AcELA, de séquence AcELAGIGILTV et de formule C47H82N10O15 = 1027 Da, voir ci-dessus) permet de résoudre le problème de stabilité mais fait perdre toute activité vaccinale, et notamment les activités de génération de cellules CTL, au dérivé AcELA ainsi obtenu. Cette réaction d'acétylation est pourtant une modification mineure de la structure du peptide classiquement utilisé par l'homme du métier pour améliorer la stabilité d'un peptide (Brinckerhoff et al, Int. J Cancer, 1999,83, 326) : il s'agit du remplacement d'un des protons de la fonction NH2 N-terminale par un groupe acétyle CH3CO avec une faible augmentation de masse (42 Da sur 985 Da), tout le reste de la structure demeurant inchangé. De même, Elliott et al (Vaccine, 1999, 17, 2009-2019)) ont décrit des problèmes de stabilité d'épitopes CTL contenant des méthionines (oxydation en sulfoxide) ou des acides glutamiques en position N-terminale (peptide EEGAIVGEI, dérivé de la protéine Influenza NSP-1 du virus de la grippe (acides aminés 152-160) et correspondant à un épitope CTL de souris H-2Kk restreint). Il a été constaté que ce peptide se cyclise spontanément en pyroglutamate (30 % en 2 mois) lorsque qu'il est formulé avec une solution adjuvante de type Montanide ISA 720. Les auteurs soulèvent le problème que cette dégradation pose par rapport à l'activité vaccinale recherchée, sans y apporter de solution. En outre, la quasi totalité des peptides obtenus par synthèse chimique sont purifiés par HPLC en phase inverse à l'aide d'éluants contenant de l'acide trifluoroacétique (TFA) avant d'être lyophilisées. Les peptides purifiés obtenus sont chargés positivement et se trouvent sous forme de sel de trifluoroacétate (RNH3+,CF3C02-). La quantité de trifluoroacétate et d'acide trifluoroacétique résiduel est en général proportionnelle au nombre d'acides aminés basiques (Lysine, Arginine et Histidine) contenus dans la séquence ainsi que de la fonction amine de l'acide aminé N-terminal. Les peptides sous forme de trifluoroacétate sont couramment utilisés pour des expérimentations pré-cliniques in vitro et in vivo chez l'animal. Pour un usage pharmaceutique chez l'homme, cette forme de sel n'est toutefois pas acceptée en particulier lors des dernières étapes de purifications parce que l'acide trifluoroacétique fait partie d'une classe de solvant (classe IV) dont la toxicologie n'est pas parfaitement documentée (Leblanc et al, STP Pharma, 1999, 9,334-341). Ainsi, aucun des peptides ayant obtenu une autorisation de mise sur le marché (Somatostatine, Tétracoside, Desmopressine, Calcitonine, Buséréline, Gonadoreline, etc...) ne l'a été sous forme de trifluoroacétate, comme on peut le constater dans les monographies de la pharmacopée européenne (Ph. Eur. 1999), mais plutôt sous forme d'acétate. La quantité d'acide trifluoroacétique résiduel tolérée dans ces peptides est d'ailleurs extrêmement limitée. Par ailleurs une étude récente (Comish et al., Am. J Physiol. Endocrinol. Metab., 1999,277, E779-E783) a montré que plusieurs peptides synthétiques (Amyline, Calcitonine) sous forme de trifluoroacétate sont toxiques pour des cellules en culture (ostéoblastes et chondrocytes). Une solution pour résoudre ces différents problèmes de toxicité de l'acide trifluoroacétique a été proposée par Marchand et al (Int. J Cancer, 1999,80, 219- 230), qui rapportent les résultats d'une étude clinique démontrant une régression tumorale chez des patients atteints d'un mélanome. Le principe actif utilisé est le nonapeptide MAGE-3 de séquence EVDPIGHLY (SEQ ID N 273), qui possède un acide glutamique en N-terminal. Le peptide a été utilisé chez les patients sous forme d'acétate qui est la forme utilisée dans la quasi totalité des peptides administrés à l' homme. Néanmoins, l'acide acétique est un acide faible, qui confère une instabilité accrue au peptide. Ceci oblige les investigateurs à conserver le peptide à -80 C (azote liquide) sous forme lyophilisée et à le resolubiliser extemporanément juste avant l'injection, ce qui implique une chaîne du froid très contraignante. La présente invention se propose de résoudre ces problèmes d'instabilité structurelle, de conservation dans le temps, de toxicité et d'activité biologique. En effet, il a été constaté que, de façon surprenante, les molécules d'intérêt pharmaceutique, en particulier les ligands du CMH, possédant un acide glutamique ou une glutamine à leur extrémité N-terminale peuvent être stabilisées sous forme de sel d'addition d'un acide fort, et que ceci permet à la fois de maintenir l'activité biologique, d'obtenir une conservation aisée du peptide ou analogue sous une forme stable, qui permet son utilisation thérapeutique chez l'homme. Par molécule d'intérêt pharmaceutique , on entend en particulier les ligands du CMH, les molécules naturelles ou synthétiques présentant un épitope pour la génération d'anticorps, les molécules dérivées de ligands de récepteurs, et présentant une activité agoniste ou antagoniste par rapport à ces récepteurs, ou possédant une activité antibiotique, antifongique, ou antiviral. Les molécules d'intérêt thérapeutique selon l'invention sont toutes caractérisées en ce qu'elles possèdent un acide glutamique ou une glutamine à leur extrémité N-terminale. Les molécules d'intérêt pharmaceutique préférées selon la présente invention sont les ligands du CMH. La présente invention a ainsi en particulier pour objet un ligand du CMH comportant en son extrémité N-terminale un acide glutamique ou une glutamine, caractérisé en ce qu'il se présente sous forme de sel d'addition d'un acide fort physiologiquement acceptable. Le sel d'addition d'acide fort physiologiquement acceptable peut notamment être choisi parmi les sels d'addition avec les acides forts minéraux ou organiques. Il est préférentiellement choisi parmi le méthanesulfonate (ou mésilate), le chlorhydrate, le bromhydrate, le sulfate, le nitrate et le phosphate et plus préférentiellement parmi le chlorhydrate, le sulfate, le nitrate et le méthanesulfonate. Ces sels d'addition d'acide fort sont physiologiquement acceptables pour une utilisation thérapeutique chez l'homme. Par exemple, la Protamine (obtenue par extraction du sperme ou de la laitance de poisson et qui nécessite un sel d'acide fort pour être solubilisée) est enregistrée sous forme de chlorhydrate d'une part et sous forme de sulfate d'autre part (Ph Eur, 1999). Les ligands du CMH au sens de la présente invention sont notamment les ligands du CMH de classe 1 et II. Le CMH est un groupe important de protéines impliquées dans la présentation des antigènes aux lymphocytes T. Les molécules du CMH de classe 1 sont des protéines membranaires intégrales que l'on trouve sur toutes les cellules nucléées et les plaquettes. Les molécules du CMH de classe II, sont exprimées sur les cellules B, les macrophages, les monocytes, les cellules présentatrices d'antigène et certaines cellules T. Les cellules B sont des lymphocytes, qui sous forme mature présentent à leur surface des immunoglobulines faisant fonction de récepteur pour l'antigène . Les cellules T sont des lymphocytes qui expriment leur récepteur pour l'antigène (TcR) et se différencient en 2 sous-populations : les cellules T auxiliaires (Th ou T helper) et les cellules T cytotoxiques (CTL). Les cellules Th aident les cellules B à se diviser, à se différencier et à produire des anticorps. La majorité des Th sont CD4+ (marqueur de surface spécifique) et reconnaissent l'antigène présenté à la surface des cellules présentant l'antigène, en association avec les molécules de classe II du CMH. Les cellules T cytotoxiques sont capable de détruire les cellules cibles infectées par des virus ou des cellules allogéniques. La majorité sont CD8+ et reconnaissent l'antigène associé avec les molécules du CMH de classe 1 à la surface de la cellule cible. La reconnaissance de l'antigène s'effectue par formation d'un complexe comprenant en particulier la molécule du CMH présentant un ligand du CMH, et le récepteur de la cellule T (TCR). Les molécules d'intérêt pharmaceutiques, en particulier les ligands du CMH selon la présente invention, peuvent être choisies parmi les molécules naturelles ou synthétiques, et entre autres, parmi les protéines, les peptides, les constructions polypeptidiques multi-épitopiques, ou des analogues de peptides du type pseudopeptides, rétro-inverso, peptoïdes, les peptido-mimétiques, les lipopeptides. Ces molécules peuvent également être constituées en partie d'une chaîne peptidique, avec le remplacement de certains acide aminés par des analogues d'acides aminés, ou présentant des ramifications. Ces molécules peuvent également présenter les diverses modifications qui sont observées sur les protéines ou peptides naturels (par exemple 0- ou N-glycosylation). Dans une forme de réalisation préférée de l'invention, les ligands du CMH selon la présente invention sont choisis parmi les épitopes CTL, c'est-à-dire qui permettent la génération de lymphocytes T cytotoxiques et notamment parmi ceux qui se présentent sous forme d'octapeptide, de nonapeptide ou de décapeptide. Le ligand du CMH peut aussi être choisi parmi les ligands décrits dans les bases de données SYFPEITHI ou MHCPEP, précédemment citées, et qui comportent en leur extrémité N-terminale un acide glutamique ou une glutamine. Ce ligand peut notamment être choisi parmi les ligands du CMH (ligands des molécules du CMH de classe 1 ou II) compris dans le groupe constitué des peptides correspondant aux séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 694. Dans une forme de réalisation de l'invention encore plus particulièrement préférée, il est choisi parmi les peptides suivants : Noms Séquences HLA SEQ ID N ELA MART-1 26-35 A27L ELAGIGILTV A2 81 ELA MART-1 26-35 EAAGIGILTV A2 112 MAGE-1 161-169 EADPTGHSY Al 2 MAGE-3 168-176 EVDPIGHLY Al 273 HER-2/neu 950-958 ELVSEFSRM A2 110 HCV-lenvE 66-75 QLRRHIDLLV A2 464 NY-ESO-1 155-163 QLSLLMWIT A2 466 HIV nef 73-82 QVPLRPMTYK A3 567 Influenza NP 380-388 ELRSRYWAI B8 106 HIV gag p24 262-270 EIYKRWIIL B8 10 HIV gag p17 93-101 EIKDTKEAL B8 692 Influenza NP 339-347 EDLRVLSFI B*3701 257 EBNA 6 130-139 EENLLDFVRF B*4403 568 Les ligands selon l'invention peuvent aussi être choisis parmi les constructions polypeptidiques multiépitopiques présentant un acide aminé de type acide glutamique (Glu, E) ou glutamine (Gln, Q) à l'extrémité N-terminale tel que le peptide suivant (SEQ ID N 695) : NEF 117 EWRFDSRLAFHHVAREHPEYFNKNK(Palm)NH2 (lipopeptide anti-HIV en phase clinique 1 : Klinguer, et al, Vaccine, 1999, 18, 259-267). Les analogues de peptides peuvent être choisis parmi ceux décrits dans la demande FR276307 qui comportent en leur extrémité N-terminale un acide glutamique ou une glutamine. De façon la plus préférée, l'invention concerne le ligand du CMH de séquence ELAGIGILTV, sous forme sulfate ou, de façon encore plus préférée, sous forme chlorhydrate. L'invention concerne encore une composition pharmaceutique comprenant au moins une molécule d'intérêt pharmaceutique selon l'invention. Cette composition pharmaceutique peut notamment être destinée au traitement de différentes immunopathologies : les maladies auto-immunes, les hypersensibilités, les allergies ou pour éviter les rejets de greffes. Selon la molécule utilisée, une composition selon l' invention peut également être utilisée dans un but antibiotique, antiviral ou antifongique, ou peut être destinée au traitement de maladies liées à des dérèglements hormonaux, ou à des maladies du système nerveux central. Les compositions selon l'invention peuvent aussi être utilisées dans le domaine vétérinaire. En effet, les mêmes problèmes d'instabilité structurelle, de conservation dans le temps, de toxicité et d'activité qui se posent pour la préparation de préparations vétérinaires comprenant un peptide ou une molécule possédant un acide glutamique ou une glutamine à leur extrémité N-terminale, peuvent être résolus en utilisant des sels d'addition d'acides forts pour stabiliser lesdits peptides ou molécules. Parmi les compositions pharmaceutiques selon l'invention, une composition préférée consiste en un vaccin caractérisé en ce qu'il comprend au moins un ligand du CMH selon l'invention, se présentant sous la forme de sel d'addition d'acide fort physiologiquement acceptable, tel que défini ci-dessus. Ce vaccin peut comprendre en outre au moins un adjuvant, notamment choisi parmi les sels d'Aluminium (Alum) ou de Calcium, les protéines OmpA d'entérobactérie, le toxoïde tétanique (TT), le toxoïde diphtérique (DT), le CRM 197 (matériel à réactivité croisée), PLGA, ISCOM, Montanide ISA 720, les ammoniums quaternaires aliphatiques, le MPL-A, le Quil-A, les CpG, la Leif, la toxine cholérique (CT), la LT (LT pour Heat labile enterotoxin entérotoxine labile à la chaleur) ou les versions détoxifiées de la CT ou la LT. Dans une forme préférée de l'invention, le vaccin comprend en outre, un composé porteur mélangé ou couplé audit ligand. De préférence, ledit composé porteur est choisi dans le groupe de peptide comprenant les anatoxines, notamment le toxoïde diphtérique (DT) ou le toxoïde tétanique (TT), les protéines dérivées du streptocoque (comme la protéine de liaison à la séralbumine humaine, appelée "BB" décrite dans W096/14415), les protéines membranaires OmpA (pour "Outer Membrane Protein de type A") et les complexes de protéines de membranes externes (OMPC), les vésicules de membranes externes (OMV) ou les protéines de choc thermique ( Heat Shock Protein ou HSP). Avantageusement, ledit composé porteur est couplé de façon covalente avec le ligand. On entend désigner par couplage , aussi bien un couplage effectué par voie chimique entre les deux composés, qu'un couplage biologique, par recombinaison génétique, tel que défini ci-dessous. Ainsi, selon l'invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs éléments de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre le composé porteur et l'antigène ou l'haptène, en particulier lorsqu'ils sont de nature peptidique, le couplage covalent de l'antigène ou l'haptène pouvant être réalisé à l'extrémité N ou C terminale du composé porteur. Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage sont déterminés en fonction de l'extrémité du composé porteur choisi et de la nature de l'antigène ou l'haptène à coupler. Ces techniques de couplage sont bien connues de l'homme du métier. Les conjugués issus d'un couplage de peptides peuvent être également préparés par recombinaison génétique. Le peptide hybride (conjugué) peut en effet être produit par des techniques d'ADN recombinant par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour le composé porteur, d'une séquence codant pour le ou les peptides antigènes, immunogènes ou haptènes. Ces techniques de préparation de peptide hybride par recombinaison génétique sont bien connues de l'homme du métier (cf. par exemple Makrides, 1996, Microbiologicals Reviews, 60, 512-538). De préférence, ledit composé porteur est une protéine dérivée du streptocoque ou une protéine de membrane OmpA d'entérobactérie, notamment de Klebsiella pneumoniae, ou l'un de ses fragments. Le ligand selon l'invention associé éventuellement à un composé porteur peut être incorporé dans des vecteurs choisis parmi les liposomes, les virosomes, les nanosphères, les microsphères, les microcapsules ou les biovecteurs. L'homme du métier sait choisir le vecteur approprié en fonction du but recherché (protection du ligand éventuellement associé à un composé porteur ou un adjuvant de la dégradation, ciblage de cellules d'intérêt, recherche d'une pénétration du matériel contenu dans le vecteur à l'intérieur de cellules cibles...). Une forme de réalisation de l'invention concerne notamment un vaccin antimélanome caractérisé en ce qu'il comprend au moins un peptide ELAGIGILTV (SEQ ID N 81) sous forme de chlorhydrate ou de sulfate. Une autre forme a pour objet un vaccin anti-mélanome caractérisé en ce qu'il comprend au moins un peptide ELAGIGILTV (SEQ ID N 81) sous forme de chlorhydrate ou de sulfate et en outre une protéine OmpA d'entérobactérie. On peut également développer des vaccins selon l'invention pour une utilisation dans le domaine vétérinaire, les problèmes identiques d'instabilité structurelle, de conservation dans le temps, de toxicité et d'activité pouvant être résolus de la même façon. L'invention a encore pour objet, une méthode de diagnostic in vitro de pathologies associées à la présence dans l'organisme d'un patient, de ligands du CMH pouvant interagir avec des molécules du CMH, et susceptibles d'être directement ou indirectement impliqués dans le processus de développement de ces pathologies chez l'homme ou l'animal, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes de : - mise en contact d'un échantillon biologique provenant d'un patient, notamment du sang ou tout échantillon biologique susceptible de contenir des lymphocytes, avec un ligand du CMH selon l'invention, dans des conditions permettant la formation d'un complexe binaire entre ledit ligand du CMH et les molécules de CMH présentes dans ledit échantillon, et la réaction entre ledit complexe binaire et les récepteurs des cellules T susceptibles d'être présentes dans ledit échantillon biologique. - détection in vitro du complexe ternaire CMH - ligand du CMH - récepteur T, susceptible d'être formé à l'étape précédente. Les méthodes de diagnostic selon l'invention sont avantageusement réalisées de la façon suivante : - incubation dudit échantillon biologique avec des ligands de CMH selon l'invention, lesdits ligands de CMH étant fixés sur un support solide, notamment à l'intérieur de puits de plaques de microtitration de type de celles habituellement utilisées pour la mise en #uvre de techniques de détection ou dosage bien connues sous le nom d'ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), - incubation des éléments fixés sur le support solide, après une éventuelle étape de rinçage, avec un milieu contenant des anticorps, notamment des anticorps anti-complexe ternaire selon l'invention, marqués (notamment de manière radioactive, enzymatique ou fluorescente), ou susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, - détection des anticorps marqués restés respectivement liés aux complexes ternaires lors de l'étape d'incubation précédente. Des étapes de rinçage sont avantageusement effectuées entre les différentes étapes de ce procédé. L'homme du métier sait définir les différentes conditions d'incubation, ainsi que les méthodes de détection des complexes CMH - ligand du CMH - récepteur T, l'utilisation d'anticorps n'étant qu'une méthode parmi d'autres. L'invention a également pour objet les nécessaires ou kits pour la mise en #uvre de méthodes de diagnostic in vitro telles que décrites ci-dessus, comprenant : - un ligand du CMH selon l'invention ; - éventuellement des réactifs pour permettre la formation d'une réaction immunologique entre ledit ligand, les molécules du CMH et les récepteurs des cellules T éventuellement présents dans l'échantillon biologique ; - éventuellement des réactifs permettant de détecter le complexe ternaire selon l'invention, qui a été produit à l'issue de la réaction immunologique, lesdits réactifs contenant éventuellement un marqueur ou étant susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où l'analogue peptidique n'est pas marqué. En particulier, on préfère l'utilisation des peptides ELAGIGILTV (SEQ ID N 81), EAAGIGILTV (SEQ ID N 112), EADPTGHSY (SEQ ID N 2), ou EVDPIGHLY (SEQ ID N 273) dans une méthode de diagnostic d'un mélanome. Les peptides QVPLRPMTYK (SEQ ID N 567), EIYKRWIIL (SEQ ID N 10), et EIKDTKEAL (SEQ ID N 692) peuvent être utilisés dans une méthode de diagnostic d'une infection par le VIH. L'utilisation d'un ligand selon l'invention, pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques est un autre objet de l'invention. L'invention concerne encore l'utilisation d'un ligand selon l'invention, pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers et préférentiellement pour inhiber la croissance de tumeurs. La présente invention concerne aussi l'utilisation d'un acide fort physiologiquement acceptable pour stabiliser et maintenir l'activité biologique d'une molécule d'intérêt pharmaceutique comportant un acide glutamique ou une glutamine à son extrémité N-terminale. Dans le cas préféré où la molécule d'intérêt pharmaceutique est un ligand du CMH, l'activité que l'on cherche à maintenir est une activité de stimulation et d'interaction avec les cellules du système immunitaire. L'invention concerne également l'utilisation d'un acide fort pour diminuer et/ou supprimer la formation du dérivé pyroglutamique d'une molécule d'intérêt pharmaceutique comportant un acide glutamique ou une glutamine à son extrémité N-terminale. De même, la présente invention concerne un procédé pour la stabilisation d'une molécule d'intérêt pharmaceutique comportant un acide glutamique ou une glutamine à son extrémité N-terminale, caractérisé en ce que l'on fait réagir ladite molécule avec un acide fort dans des conditions permettant d'obtenir ladite molécule sous la forme d'un sel d'addition d'acide fort physiologiquement acceptable. La réaction avec l'acide fort est effectuée en particulier selon un procédé tel que défini ci-dessous. En effet, l'invention concerne aussi un procédé de préparation comportant un acide glutamique ou une glutamine à son extrémité N-terminale sous forme de sel d'addition d'acide fort physiologiquement acceptable selon l'invention. Ce procédé peut notamment comprendre une étape de purification par RPHPLC de ladite molécule à partir du sel de trifluoroacétate correspondant en utilisant un éluant à base dudit acide fort, suivie de façon optionnelle d'une étape de lyophilisation de la solution ainsi obtenue. Un procédé alternatif comporte une étape de dissolution d'un sel de trifluoroacétate de ladite molécule dans une solution en excès dudit acide fort, suivie de façon optionnelle d'une étape de lyophilisation de la solution ainsi obtenue. On peut également mettre en #uvre le un procédé selon l'invention qui comporte une étape de chromatographie par échange ion à partir du sel de trifluoroacétate correspondant de ladite molécule d'intérêt pharmaceutique, après dissolution dudit sel dans une solution contenant ledit acide fort. La lyophilisation du produit obtenu est également optionnelle. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer certains modes de réalisation de l'invention et ne doivent pas être considérés comme limitant le champ de l' invention. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Différence de lyse cellulaire des cellules EL-4 A2/Kb prépulsées avec le peptide ELA, par des lymphocytes obtenus après immunisation de souris avec les peptides ELA (losanges) ou AcELA (carrés) en présence de la protéine adjuvante rP40, selon le protocole de l'exemple III.. Figure 2: Génération de CTL après immunisation par les peptides ELA (trifluoroacétate, 2. A), ELA (chlorhydrate, 2. B) ou PyrELA (trifluoroacétate, 2.C) en présence de la protéine adjuvante rP40, selon le protocole de l'exmple IV. Figure 3: Chromatogramme du peptide ELA sous forme acétate (3.A) ou chlorhydrate (3. B) conservé à 37 C pendant deux mois. Figure 4 : Chromatogramme du peptide ELA sous forme chlorhydrate initialement (4.A) ou après un mois de conservation à 4 C (4. B). EXEMPLES Exemple 1 : Synthèse des peptides ELA, PyrELA et AcELA Peptide ELA : le peptide ELA (SEQ ID N 81) est synthétisé en phase solide à partir de l'acide aminé C-terminale vers l'acide aminé N-terminal (acide glutamique) en chimie FMOC ou tBOC. Après clivage de la résine et des groupes protecteurs des chaîne latérales réactives, le peptide est purifié de façon classique avec des éluants à base d'acide trifluoroacétique/eau et d'acide trifluoroacétique/acétonitrile avant d'être lyophilisé. Le pureté du peptide est vérifiée par chromatographie liquide en phase inverse. La composition en acide aminés est vérifiée après hydrolyse et dosage des acides aminés dérivés obtenus. La masse exacte est mesurée par spectrométrie de masse. Peptide PyrELA : le peptide PyrELA est synthétisé de la même manière que le peptide ELA à la seule différence du couplage du dernier acide aminé Nterminal : l'acide glutamique est remplacé par un acide pyroglutamique. Peptide AcELA : le peptide AcELA est synthétisé de la même manière que le peptide ELA à la seule différence d'un recouvrement (capping) de l'acide glutamique à l'aide d'anhydride acétique. Exemple II : Préparation d'un sel de chlorhydrate II. A : méthode A A partir du sel de trifluoroacétate correspondant, on effectue une purification par RP-HPLC à l'aide d'un éluant A composé d'eau à 0.1% d'HCl et d'un éluant B composé de 80% d'acétonitrile et de 20 % d'eau à 0.1% d'HCl. On procède ensuite à une étape classique de lyophilisation. II. B : méthode B A partir du sel de trifluoroacétate correspondant, on dissout dans une solution en excès d'HCl et on laisse agiter pendant 2 heures. On peut utiliser également une solution aqueuse organique du peptide dans laquelle on fait buller de l'HCl sous forme gazeuse. On procède ensuite à une étape classique de lyophilisation. II. C : méthode C On effectue cette réaction à partir du sel de trifluoroacétate correspondant, à l'aide d'une chromatographie par échange d'ion. On utilise des résines échangeuses d'ions disponibles commercialement sous forme de chlorhydrate (Résine Dowex 1X4, Amberlite IRA 416), utilisables telles quelles une fois régénérées. a) Régénération de la résine : la résine à régénérer est introduite dans une colonne large équipée d'un fritté de grande porosité (1 ou 2). La résine est lavée ensuite successivement à l'eau ultra pure (pH 5-6), à la soude IN (pH 14), à l'eau ultra pure (pH 7), à l'HCI IN (pH 1) et une nouvelle fois à l'eau ultra pure (pH 5-6). La résine est conservée dans un mélange acétonitrile/ HC1 10-4 N (20/80) à température ambiante pendant au moins un an. b) Echange d'anion (trifluoroacétate => chlorure) : le peptide est dissous dans une solution d'HCl 10-4 N/ acétonitrile, avec une proportion en acétonitrile pouvant varier de 0 à 80%). La solution est injectée en tête de colonne. Le peptide est élué avec la solution de dissolution. Les fractions contenant le produit sont rassemblées avant d'être lyophilisé. La quantité de chlorhydrate peut être dosée par une chromatographie d'échange anionique. La quantité d'acide trifluoroacétique peut être dosée par chromatographie en phase gazeuse. Exemple III : Génération de CTL anti-Melan-A après immunisation par rP40 mélangée à ELA ou AcELA Des souris transgéniques HLA-A* 0201/Kb (A2/Kb) de souche C57B1/6 x BDA/2 ont été utilisées dans cette étude (Vitiello et al., 1991, J. Exp. Med., 173, 1007). La molécule MHC de classe 1 exprimée chez ces souris est une molécule chimérique formée des domaines al et a2 de la molécule humaine HLA-A0201 (allotype le plus fréquemment retrouvé) et du domaine a3 de la molécule murine Kb Des souris A2/Kb ont reçu 300 g de rP40 mélangée à 50 g de ELA ou 300ug de rP40 mélangée à 50 g de AcELA. a) Génération de cellules cytotoxiques effectrices : 10 jours après l'immunisation, les souris sont sacrifiées et les lymphocytes des ganglions drainant sont récupérés pour être stimulés in vitro avec le peptide relevant. Ces lymphocytes (4-5 106) sont cultivés en plaque 24 puits en DMEM plus 10mM HEPES, 10% SVF et 50 M (3-2-mercaptoethanol avec 2-5 105 cellules EL- 4 A2/Kb (cellules murines transfectées avec le gène HLA-A* 0201/Kb) irradiées (10 kRads) pré-pulsées 1 h à 37 C avec 1 M du peptide relevant. Après deux stimulations hebdomadaires, les cellules sont testées pour leur activité cytotoxique. b) Mesure de l'activité cytotoxique : Les cellules EL-4 A2/Kb sont incubées 1 h avec du 51Cr en présence ou non de ELA, lavées puis co-incubées avec les cellules effectrices à différents ratio en plaque 96 puits dans un volume de 200ul pendant 4 à 6h à 37 C. Les cellules sont ensuite centrifugées et le relargage de 51Cr est mesuré dans 100 l de surnageant. Le pourcentage de lyse spécifique est calculé comme suit : % lyse = (relargage expérimental - relargage spontané) / (relargage total relargage spontané) x 100 % lyse spécifique = % lyse avec cellules pulsées par le peptide - % lyse avec cellules non pulsées par le peptide. La différence de lyse cellulaire observée pour les peptides ELA (losanges) et AcELA (carrés) en présence de la protéine adjuvante rP40 (I. Rauly et al, Infect. Immun., 1999, 67, 5547) est représentée par la figure 1. c) conclusion : Alors qu'une activité CTL anti-ELA est observée après immunisation de souris avec P40/ELA, aucune activité CTL n'est mesurée lorsque les souris ont été immunisées par P40/AcELA. Ces résultats indiquent que les CTL générées par AcELA ne reconnaissent pas le peptide natif ELA. Exemple comparatif IV : Activité CTL des peptides ELA, PyrELA et AcELA Des souris A2/Kb ont reçu : - 300 g de rP40 mélangée à 50 g de ELA (Trifluoroacétate) - 300 g de rP40 mélangée à 50 ug de ELA (Chlorhydrate) - 300 g de rP40 mélangée à 50 g de PyrELA (Trifluoroacétate) a) Génération de cellules cytotoxiques effectrices : 10 jours après l'immunisation, les souris sont sacrifiées et les lymphocytes des ganglions drainant sont récupérés pour être stimulés in vitro avec le peptide relevant. Ces lymphocytes (4-5 106) sont cultivés en plaque 24 puits en DMEM plus 10mM HEPES, 10% SVF et 50 M p-2-mercaptoethanol avec 2-5 105 cellules EL- 4 A2/Kb (cellules murines transfectées avec le gène HLA-A* 0201/Kb) irradiées (10 kRads) pré-pulsées 1 h à 37 C avec 1 M du peptide relevant. Après deux stimulations hebdomadaires, les cellules sont testées pour leur activité cytotoxique. b) Mesure de l'activité cytotoxique : Les cellules EL-4 A2/Kb sont incubées 1 h avec du 51Cr en présence ou non de ELA, lavées puis co-incubées avec les cellules effectrices à différents ratio en plaque 96 puits dans un volume de 200 l pendant 4 à 6h à 37 C. Les cellules sont ensuite centrifugées et le relargage de 51Cr est mesuré dans 100 l de surnageant. Le pourcentage de lyse spécifique est calculé comme suit : % lyse = (relargage expérimental-relargage spontané)/ (relargage total relargage spontané) X 100 % lyse spécifique = %lyse avec cellules pulsées par le peptide - % lyse avec cellules non pulsées par le peptide ELA. c) La génération de CTL anti-Melan-A après immunisation par rP40 mélangée avec les peptides ELA (Trifluoroacétate), ELA (Chlorydrate) ou PyrELA (Trifluoacétate) est représentée par la figure 2. d) Conclusions : 1. Alors qu'une activité CTL anti-ELA est observée après immunisation de souris avec P40/ELA (Trifluoroacétate), aucune activité CTL n'est mesurée lorsque les souris ont été immunisées par P40/PyrELA (Trifluoroacétate). Ces résultats indiquent que les CTL générées par PyrELA ne reconnaissent pas le peptide natif ELA. 2. De manière surprenante, l'immunisation par P40/ELA (Chlorhydrate) est aussi efficace que celle par P40/ELA (Trifluoroacétate) pour générer une réponse CTL anti-ELA. Exemple V : Etudes de stabilité accélérée des formes acétate et chlorhydrate du peptide ELA. Les peptides sont analysés par HPLC en phase inverse à l'aide d'un éluant A composé d'eau à 0.1% de TFA et d'un éluant B composé de 80% d'acétonitrile et de 20 % d'eau à 0.1% de TFA. La figure 3 montre les chromatogrammes du peptide ELA sous forme d'acétate (3.A) ou de chlorhydrate (3. B) conservé à 37 C pendant 2 mois. Conclusion : Sous forme d'acétate, la dégradation du peptide ELA en peptide cyclisé PyrELA inactif après 2 mois à 37 C est de 53%. De façon surprenante, sous forme de Chlorhydrate, elle n'est que de 10 %. Exemple VI : Stabilité du peptide ELA sous forme de chlorhydrate conservé à 4 C. La figure 4 montre un chromatogramme du peptide ELA sous forme de chlorhydrate à t=0 : (98,9 % d'ELA et 0,4 % de PyrELA ; figure 4.A) et après un mois de conservation à 4 C (98,8 % d'ELA et 0,5 % de PyrELA ; figure4.B). Conclusion : De façon surprenante, le peptide ELA sous forme de Chlorhydrate est extrêmement stable à 4 C. Il peut donc être facilement manipulé et conservé à une température de 4 ou -20 C. Ce n'est pas le cas d'un peptide équivalent (MART 3), préparé sous forme d'acétate qui doit être conservé à -80 C (M. Marchand et al, Int. J Cancer, 1999, 80, 219). La forme saline acide fort permet donc une conservation beaucoup plus facile à 4 C (réfrigérateur) ou à -20 C (congélateur) avec une stabilité physicochimique totale, comme le montrent les exemples ci-dessus. REVENDICATIONS 1. Molécule d'intérêt pharmaceutique comportant en son extrémité N-terminale un acide glutamique ou une glutamine, caractérisé en ce qu'elle se présente sous forme de sel d'addition d'acide fort physiologiquement acceptable. 2. Molécule d'intérêt pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un ligand du CMH comportant en son extrémité N-terminale un acide glutan@ique une glutamine. 3. Molécule d'intérêt pharmaceutique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le sel d'addition d'acide fort physiologiquement acceptable est choisi parmi les sels d'addition avec les acides minéraux ou organiques préférentiellement parmi les méthanesulfonate, chlorhydrate, bromhydrate, sulfate, nitrate et phosphate. 4. Molécule d'intérêt pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est choisi parmi les molécules naturelles ou synthétiques. 5. Molécule d'intérêt pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'elle est choisie dans le groupe constitué des protéines, peptides, constructions polypeptidiques multi-épitopiques, pseudopeptides, rétro-inverso, peptoïdes, peptido-mimétiques et lipopeptides. 6. Ligand du MHC selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les épitopes CTL. 7. Ligand du MHC selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les épitopes CTL se présentant sous forme d'octapeptide, de nonapeptide ou de décapeptide. 8. Ligand du MHC selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les ligands décrits dans les bases de données SYFPEITHI ou MHCPEP comportant un acide glutamique ou une glutamine à leur extrémité N- terminale. 9. Ligand du MHC selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les peptides SEQ ID N 1 à SEQ ID N 695. 10. Ligand du CMH selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe des peptides correspondant à SEQ ID N 81, SEQ ID N 112, SEQ ID N 2, SEQ ID N 273, SEQ ID N 110, SEQ ID N 106, SEQ ID N 10, SEQ ID N 692, SEQ ID N 257, SEQ ID N 568, SEQ ID N 464, SEQ ID N 466, SEQ ID N 567 et SEQ ID N 695. 11. Ligand du CMH selon l'une la revendication 10, caractérisé en ce qu'il s'agit du peptide correspondant à SEQ ID N 81, sous forme de chlorhydrate ou de sulfate. 12. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une molécule d'intérêt pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 11. 13. Vaccin caractérisé en ce qu'il comprend au moins un ligand du CMH selon l'une des revendications 2 à 11. 14. Vaccin selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un adjuvant. 15. Vaccin selon la revendication 13 ou 14 caractérisé en ce que l'adjuvant est choisi parmi les sels d'Aluminium (Alum) ou de Calcium, les protéines OmpA d'entérobactérie, TT, DT, CRM197, PLGA, ISCOM, Montanide ISA 720, les ammoniums quaternaires aliphatiques, le MPL-A, le Quil-A, les CpG, la Leif, la CT, la LT ou les versions détoxifiées de la CT ou la LT. 16. Vaccin selon l'une des revendications 13 à 15 caractérisé en ce qu'il comprend en outre, un composé porteur mélangé ou couplé audit ligand. 17. Vaccin selon la revendication 15 caractérisé en ce que ledit composé porteur est choisi parmi les anatoxines, dont le toxoïde diphtérique ou le toxoïde tétanique, les protéines dérivées du streptocoque, les protéines de membranes externes bactériennes de type Omp A, les complexes de protéines de membranes externes (OMPC), les vésicules de membranes externes (OMV) ou les HSP. 18. Vaccin selon l'une des revendications 13 à 17 caractérisé en ce que ledit ligand associé éventuellement à un composé porteur est incorporé dans un vecteur choisi dans le groupe comprenant les liposomes, virosomes, nanosphères, microsphères, microcapsules ou biovecteurs. 19. Vaccin anti-mélanome caractérisé en ce qu'il comprend au moins un peptide selon la revendication 11. 20. Vaccin anti-mélanome selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une protéine OmpA d'entérobactérie. 21. Méthode de diagnostic in vitro de pathologies associées à la présence dans l'organisme d'un patient de ligand de CMH, et susceptibles d'être directement ou indirectement impliqués dans le processus de développement de ces pathologies chez l'homme ou l'animal, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes de : - mise en contact d'un échantillon biologique provenant d'un patient, notamment du sang ou tout échantillon biologique susceptible de contenir des lymphocytes, avec un ligand du CMH selon l'invention, dans des conditions permettant la formation d'un complexe binaire entre ledit ligand du CMH et les molécules de CMH présentes dans ledit échantillon, et la réaction entre ledit complexe binaire et les récepteurs des cellules T susceptibles d'être présentes dans ledit échantillon biologique. - détection in vitro du complexe ternaire CMH - ligand du CMH - récepteur T, susceptible d'être formé à l'étape précédente. 22. Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic in vitro selon la revendication 21, comprenant : - un ligand du CMH selon l'une des revendications 2 à 11 ; - éventuellement des réactifs pour permettre la formation d'une réaction immunologique entre ledit ligand, les molécules du CMH et les récepteurs des cellules T éventuellement présents dans l'échantillon biologique ; - éventuellement des réactifs permettant de détecter le complexe ternaire selon l'invention, qui a été produit à l'issue de la réaction immunologique, lesdits réactifs contenant éventuellement un marqueur ou étant susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué. 23. Utilisation d'un ligand selon l'une des revendications 2 à 10, pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques. 24. Utilisation d'un ligand selon l'une des revendications 2 à 11, pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers et préférentiellement à inhiber la croissance des tumeurs. 25. Utilisation d'un acide fort physiologiquement acceptable pour stabiliser et maintenir l'activité biologique d'une molécule à activité pharmaceutique comportant un acide glutamique ou une glutamine à son extrémité N-terminale. 26. Utilisation d'un acide fort pour diminuer et/ou supprimer la formation du dérivé pyroglutamique d'une molécule à activité pharmaceutique comportant un acide glutamique ou une glutamine à son extrémité N-terminale. 27. Procédé de préparation d'une molécule d'intérêt pharmaceutique comportant un acide glutamique ou une glutamine à son extrémité N-terminale sous forme de sel d'addition d'acide fort physiologiquement acceptable selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu' il comporte une étape de purification par RP-HPLC de ladite molécule à partir du sel de trifluoroacétate correspondant en utilisant un éluant à base dudit acide fort, suivie de façon optionnelle d'une é tape de lyophilisation de la solution ainsi obtenue. 28. Procédé de préparation d'une molécule d'intérêt pharmaceutique comportant un acide glutamique ou une glutamine à son extrémité N-terminale sous forme de sel d'addition d'acide fort physiologiquement acceptable selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de dissolution d'un sel de trifluoroacétate de ladite molécule dans une solution en excès dudit acide fort, suivie de façon optionnelle d'une étape de lyophilisation de la solution ainsi obtenue. 29. Procédé de préparation d'une molécule d'intérêt pharmaceutique comportant un acide glutamique ou une glutamine à son extrémité N-terminale sous forme de sel d'addition d'acide fort physiologiquement acceptable selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de chromatographie par échange ion à partir du sel de trifluoroacétate correspondant de ladite molécule d'intérêt pharmaceutique, après dissolution dudit sel dans une solution contenant ledit acide fort. 30. Procédé pour la stabilisation d'une molécule d'intérêt pharmaceutique comportant un acide glutamique ou une glutamine à son extrémité N-terminale, caractérisé en ce que l'on fait réagir ladite molécule avec un acide fort dans des conditions permettant d'obtenir ladite molécule sous la forme d'un sel d'addition d'acide fort physiologiquement acceptable, en particulier selon un procédé selon l'une des revendications 27 à 29.