Brevet FR2798998A1 — publié le 20010330

MARQUEUR MOLECULAIRE DU STADE DE PREGERMINATION DES SEMENCES VEGETALES ET SON UTILISATION DANS DES TESTS ELISA La présente invention concerne une protéine, des anticorps dirigés contre cette dernière, et les séquences nucléotidiques codant pour ces dernières, utilisables comme marqueurs moléculaires du stade de prégermination des semences végétales et son utilisation dans des tests ELISA. Les semences sont d'une extrême importance pour l'alimentation humaine et animale car non seulement elles y entrent en proportions considérables mais, de plus, elles constituent le matériel de base de toutes nos cultures. Il est donc capital d'obtenir les meilleurs rendements possibles et des plantes vigoureuses pouvant résister aux agressions extérieures. Or, le rendement des cultures dépend de la capacité des semences à germer, et toutes n'ont pas la même vigueur germinative, du fait de l'hétérogénéité intrinsèque des lots de semences, même s'il s'agit d'une variété pure. Cette hétérogénéité provient le plus souvent d'événements antérieurs au semis. La récolte, par exemple, intervient à un moment où le niveau de maturation des semences sur la plante mère peut être variable. A ce défaut de synchronisme peut s'ajouter une altération de la capacité germinative des semences lors de leur stockage. La germination est un processus de différenciation dans lequel les cellules de l'embryon passent d'un état de repos caractéristique de la semence mature sèche à un état métabolique intense caractérisant l'émergence et le développement de la plantule. Elle se met en place essentiellement au cours de la phase d'imbibition, et se termine au sens physiologique par la percée radiculaire au travers des enveloppes de la semence. La germination comprend trois phases : la première est la phase d'imbibition, qui correspond à une prise d'eau des tissus ; elle n'affecte pas la dormance ou l'activité cellulaire. Dès la fin de cette phase, les réserves de l'albumen ou des cotylédons sont mobilisées et les enzymes nécessaires à cette mobilisation sont alors synthétisées en abondance. Lui succède la phase de germination sensu stricto, durant laquelle le poids frais des semences est constant et qui est caractérisée par une activité métabolique intense pour aboutir à la percée radiculaire. Durant cette phase, la graine peut être réversiblement déshydratée ou réhydratée sans dommages apparents pour sa viabilité. La dernière phase ou phase de croissance est caractérisée par une reprise de l'absorption d'eau et une élévation de la consommation d'oxygène. Cette croissance affecte la radicule puis la tigelle (Bewley et Black, 1994). Pour résoudre les problèmes posés par l'hétérogénéité germinative des semences individuelles constituant un lot, les firmes semencières pratiquent des conditionnements de semences dits physiologiques nommés prégermination ( priming en anglais), qui permettent d'amener les semences au même stade physiologique vis-à-vis du moment de la levée (Heydecker et al., 1973 ; Heydecker, 1978 ; Taylor et al., 1998). Ces procédés de prégermination doivent tenir compte de plusieurs paramètres pouvant influer sur le développement de la semence, tels que : l'état physiologique de la semence, la quantité d'eau utilisée pour le traitement (quantité suffisante pour déclencher un certain nombre de transformations biochimiques et moléculaires, mais insuffisante pour que la radicule perce les téguments), la durée du traitement, la température à laquelle est conduite le traitement, ou la nature de la méthode utilisée pour prégermer les semences (osmo- ou hydro-prégermination par exemple) (Ôzbingol et al., 1998). L'utilité de tels traitements pour améliorer le rendement des cultures est bien connue (Bradford, 1986). Ces techniques sont basées sur le fait que la germination peut être divisée en plusieurs étapes et qu'elle peut être interrompue par divers procédés juste avant l'émergence radiculaire au travers des téguments de la semence. La méthode la plus utilisée consiste en une hydratation contrôlée des semences, réalisée grâce à des agents osmotiques tels que le polyéthylène glycol (PEG) ou les sels (KNO3) [pour une revue, voir Bradford (1986) ], avec de l'eau simplement (Tarquis et Bradford, 1992 ; Job C. et al., 1997) ou bien avec une atmosphère humide ( drum priming ) (Rowse, 1996). A un certain seuil d'hydratation de l'embryon, le traitement engendrerait les phénomènes prégerminatifs requis pour la percée radiculaire ultérieure, lors du semis. Le traitement se termine par une déshydratation pour ramener les semences à leur taux d'humidité initial, ce qui permet de les stocker à nouveau (Heydecker et al., 1973 ; Heydecker, 1978 ; Taylor et al., 1998). Ce traitement s'avère efficace dans de nombreux cas, mais le problème majeur de la technique est de savoir comment contrôler précisément l'hydratation de l'embryon au cours de la prégermination. En effet, le point critique consiste à stopper le traitement avant la percée radiculaire, car si celui-ci est trop poussé, la déshydratation ultérieure des semences, nécessaire pour leur conservation, entraînera la mort des semences traitées. En effet, dès que la radicule apparaît, la plantule n'est plus tolérante à la déshydratation (Bewley et Black, 1994 ; Kermode, 1997). Si, au contraire, le traitement n'est pas assez intense, la reprise de l'activité métabolique cellulaire ne sera pas amorcée et, par conséquent, la faculté germinative des semences ne sera pas significativement améliorée. Actuellement, la seule technique utilisée pour mettre au point les conditions de prégermination des semences compatibles avec leur stockage repose sur la conduite de tests de germination nécessitant plusieurs jours d'expérimentation. De nombreuses publications traitent des méthodes d'amélioration des cultures et des applications concernant la prégermination, mais peu de documents décrivent le rôle que tient la prégermination au niveau cellulaire et moléculaire [pour une revue, voir Bradford (1986) ]. Ce traitement semble avoir des conséquences quant à la synthèse d'ADN, d'ARN et de protéines (Dell'Aquila et Bewley, 1989 ; Karssen et al., 1989 ; Davison et Bray, 1991 ; Fujikura et Karssen, 1992 ; Bray, 1995). Toutefois, les phénomènes biochimiques et physiologiques intervenant au cours de la prégermination restent peu connus. Des études récentes montrent cependant qu'il existe des marqueurs moléculaires qui permettraient de définir la prégermination et d'en assurer le contrôle. Ces marqueurs se manifestent à plusieurs niveaux : au cours de la mobilisation des réserves, lors de l'altération physique des tissus entourant la pointe racinaire, ou au cours de la reprise de l'activité cellulaire. La disponibilité de marqueurs moléculaires permettrait de définir plus facilement les conditions optimales de la prégermination des semences et de suivre en continu le déroulement du procédé. Quelques marqueurs ont été récemment décrits : - la P-tubuline, un marqueur de la reprise du cycle cellulaire chez la tomate susceptible de caractériser la prégermination des semences de tomate (De Castro et al., 1995). Cette protéine entre dans la composition des microtubules liant les centromères et intervient donc dans la division cellulaire. Dans le cas de la semence de tomate, la néosynthèse de cette protéine est détectée principalement dans l'apex racinaire des cellules embryonnaires lors d'un traitement de prégermination. L'utilisation d'anticorps anti-tubuline commerciaux permet de distinguer par méthode ELISA ou test immunoblot les semences de tomate prégermées des semences témoins. Mais la mesure des variations quantitatives de p-tubuline au cours de la prégermination des semences nécessite la dissection des semences et la récupération des pointes racinaires. La reprise du cycle cellulaire peut également être caractérisée par la technique de cytométrie en flux, mesurant le doublement de la quantité d'ADN des cellules de l'apex racinaire (phase replicative allant de G, à G2 du cycle cellulaire) durant la prégermination (Bino et al., 1992). Là encore, cette technique exige l'isolement des pointes racinaires, car le phénomène de reprise de l'activité du cycle cellulaire se manifeste principalement dans cet organe. - l'endo-ss-mannanase, un marqueur de germination précoce lié à la dégradation localisée de l'albumen lors de la percée racinaire (Still et Bradford, 1997 ; Toorop et al., 1998). La résistance mécanique de l'albumen englobant la pointe racinaire serait, chez les semences de tomate, un facteur limitant de la germination. L'endo-p-mannanase est synthétisée au moment de l'imbibition ; des tests enzymatiques mesurant l'activité enzymatique ont été utilisés pour caractériser la cinétique des premières étapes de la germination des semences de tomate et pour suivre la prégermination de ces semences. - une nouvelle protéine susceptible d'être biotinylée chez les semences matures de plantes appartenant à des espèces de légumineuses, de carotte et de betterave et son utilisation comme marqueur moléculaire de la germination de ces semences (Duval et al., 1994 ;EP 0658625A2). - un marqueur correspondant à un événement précoce mobilisant une protéine de réserve (globuline 11S) chez les semences de betterave sucrière, nommée SIP (pour Seed Imbibition Protein), et permettant de caractériser biochimiquement (méthode immunoenzymatique) la prégermination à partir de semences entières (Job et al., 1997 ; WO 97/43418 ; Chareyre et al., 1998). C'est une protéine spécifique des semences, localisée dans tous les territoires de l'embryon, c'est-à-dire les cotylédons, l'apex racinaire et la tige ; elle n'est jamais détectée dans les organes végétatifs de la plante. Cette protéine présente le même profil d'expression dans diverses variétés de semences. Il a été montré par ailleurs que sa solubilisation représente l'événement primaire de la mobilisation de la globuline qui s'achève par sa dégradation complète alors qu'elle sert de source de carbone et d'azote à la plantule naissante (WO 97/43418). Les globulines 11 S sont des complexes protéiques hexamériques de 320 à 400 kDa composés de six sous-unités différentes (52-65 kDa). Chaque sous-unité renferme un polypeptide acide de 33 à 44 kDa (également nommé sous-unité A) et un polypeptide basique de 19 à 23 kDa (également nommé sous-unité B). A l'intérieur de chaque sous-unité, les deux polypeptides acide et basique sont reliés par un pont disulfure. Les polypeptides A et B proviennent de la protéolyse (lors de la maturation de la graine sur la plante mère et de l'adressage des globulines dans les corps protéiques) d'une forme précurseur contenant en position N-terminale la sous-unité A et en position C-terminale la sous-unité B (Bewley et Black, 1994 ; Shewry et al., 1995). Par définition, les globulines sont insolubles dans l'eau (Bewley et Black, 1994 ; Shewry et al., 1995). Lors de la prégermination des semences de betterave sucrière, la sous-unité A de la globuline 11 S subit une attaque protéolytique, ce qui libère un complexe composé d'un fragment de sous-unité A et de la sous-unité B, complexe qui devient soluble dans l'eau ou les solutions tampons de faible force ionique (Job C. et al., 1997). La prégermination des semences de betterave sucrière est ainsi quantifiable par un test ELISA reposant sur l'utilisation d'anticorps spécifiquement dressés contre la sous-unité B de la globuline Ils de betterave sucrière (Job C. et al., 1997; WO 97/43418). Finalement, peu de marqueurs existent pour caractériser la prégermination des semences. L'un correspond à un événement précoce mobilisant une protéine de réserve (globuline 11 S) chez la betterave sucrière, un autre correspond à la reprise du cycle cellulaire caractérisée chez la tomate (synthèse de P-tubuline). Le dernier concerne l'activité endo-p- mannanase qui, en dégradant les parois de l'albumen, relâche les contraintes imposées sur la pointe racinaire. Il convient d'insister sur le fait que ces deux derniers types de marqueurs, contrairement au premier, exigent pour leur détection une dissection de la semence : les phénomènes d'induction de la ss-tubuline, de reprise de l'activité du cycle cellulaire et d'induction de l'activité endo-p-mannanase ne se manifestent en effet majoritairement que dans la pointe racinaire lors de la prégermination. Aucun marqueur moléculaire n'a été détecté jusqu'à ce jour permettant d'analyser sur semences entières de tomate les techniques de prégermination. La présente invention a pour but de fournir des sondes moléculaires protéiques ou nucléiques, et plus particulièrement des anticorps, permettant la détection ou la quantification de la sous-unité A chez de plantes avant la prégermination des semences, ou au cours de la prégermination, ainsi que la détection ou la quantification d'un polypeptide spécifique des semences prégermées. La présente invention a également pour but de fournir de nouveaux procédés de suivi de la prégermination des semences à l'aide des sondes moléculaires protéiques ou nucléiques susmentionnés, ainsi que les semences obtenues ces procédés, et les kits pour la mise en oeuvre de ces procédés. La présente invention a pour objet l'utilisation : * d'une protéine comprenant le polypeptide ayant un poids moléculaire d'environ 23 kDa, ledit polypeptide étant caractérisé en ce qu'il : - est présent dans les semences prégermées de plantes, mais pas dans les semences témoins avant prégermination, - est soluble dans l'eau, et est retrouvé dans la fraction des protéines solubles extraites dans l'eau à partir des semences prégermées, * ou d'un fragment peptidique de la protéine susmentionnée, * ou d'anticorps dirigés contre la protéine ou un fragment peptidique susmentionnés, * ou d'une séquence nucléotidique codant pour la protéine ou un fragment peptidique susmentionnés, en tant que sondes moléculaires protéiques ou nucléiques utilisables comme marqueurs pour la détection de la sous-unité A de la globuline 11 S chez les plantes, ou de fragments polypeptidiques de cette dernière, notamment dans le cadre de la mise en #uvre de procédés de suivi de la phase de prégermination de semences. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation des sondes moléculaires susmentionnées, pour la mise en #uvre de procédés de détection, et, le cas échéant, d'extraction de la sous-unité A de la globuline 11 S chez les plantes, ou de fragments peptidiques de cette dernière, tel que le polypeptide d'environ 23 kDa susmentionné sous forme soluble dans les semences prégermées, notamment dans le cadre de la mise en #uvre de méthodes permettant de déterminer si des semences sont en phase de prégermination ou non, et le cas échéant, le suivi de la prégermination de semences par détermination du stade de prégermination et de la capacité germinative de ces dernières. Avantageusement la protéine définie ci-dessus dans le cadre de l'utilisation susmentionnée est une protéine comprenant les séquences peptidiques internes suivantes : IQAEAGVTELWDK, QGDEAFPAGAAH et GFYGIMNSGCPETFQ, et est notamment la protéine de 23 kDa susmentionnée. Parmi les fragments peptidiques susmentionnés utilisés dans le cadre de la présente invention, on peut citer les séquences peptidiques internes décrites ci-dessus. Avantageusement encore, la protéine définie ci-dessus est une protéine issue de la tomate, et plus particulièrement de Lycopersicon esculentum. L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée de sondes moléculaires définies ci-dessus, pour la détection de la sous-unité A de la globuline 11 S, ou de fragments polypeptidiques de cette dernière, tel que le polypeptide d'environ 23 kDa susmentionné, chez les solanacées, les cucurbitacées, les ombellifères, les valérianacées et les composées, et plus particulièrement chez la tomate, notamment chez Lycopersicon esculentum. L'invention a également pour objet l'utilisation susmentionnée de sondes moléculaires définies ci-dessus, pour la détection d'un fragment polypeptidique de la sous-unité A de la globuline 11S caractéristique des semences prégermées, tel que le fragment correspondant au polypeptide d'environ 23 kDa susmentionné, ledit fragment étant avantageusement présent dans la fraction des protéines solubles extraites dans l'eau à partir des semences prégermées. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de sondes moléculaires choisies parmi les anticorps définis ci-dessus ou ci-après, pour la détection de la sous-unité A de la globuline 11 S, ou de fragments de cette dernière caractéristiques des semences prégermées, dans le cadre de tests enzymatiques de type ELISA (Enzyme Linked Sorbent Assay), notamment parmi les anticorps dirigés contre le polypeptide d'environ 23 kDa susmentionné pour détecter ce dernier dans la fraction des protéines solubles extraites dans l'eau à partir des semences prégermées à l'aide d'un test ELISA. L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée de sondes moléculaires définies ci-dessus, pour la mise en #uvre des procédés de détection, et le cas échéant d'extraction, de la sous-unité A de la globuline 11S chez les plantes, et des procédés de suivi de la prégermination des semences définis ci-après. A ce titre, l'invention a pour objet un procédé de détection, et le cas échéant d'extraction, de la sous-unité A de la globuline 11 S chez les plantes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'extraction des protéines des semences de ces plantes, suivie d'une étape de détection de la sous-unité A de la globuline 11 S effectuée au moyen de sondes moléculaires définies cidessus, et, le cas échéant, l'extraction et la purification de ladite sous-unité A ainsi détectée. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé de suivi de la phase de prégermination de semences de plantes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de détection de la sous-unité A de la globuline 11 S chez les plantes, ou de fragments polypeptidiques de cette sous-unité, notamment du polypeptide de 23 kDa susmentionné, dans les semences au cours de la phase de prégermination de ces dernières, à l'aide d'un marqueur moléculaire défini ci-dessus. L'invention concerne plus particulièrement le procédé susmentionné, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de détection du polypeptide d'environ 23 kDa décrit ci-dessus, ledit polypeptide étant présent dans la fraction des protéines solubles extraites dans l'eau à partir des semences prégermées. Avantageusement les procédés susmentionnés permettent de déterminer si des semences sont en phase de prégermination ou non, et le cas échéant, le suivi de la prégermination de semences par détermination du stade de prégermination et de la capacité germinative de ces dernières. Un procédé particulièrement avantageux dans le cadre de la présente invention, est caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'extraction en phase aqueuse des protéines des semences des plantes, suivie d'une étape de détection de la présence éventuelle du polypeptide d'environ 23 kDa de la sous-unité A de la globuline 11 S dans la phase aqueuse d'extraction susmentionnée, et, le cas échéant, de quantification dudit polypeptide par rapport à la quantité totale de ladite sous-unité A présente dans lesdites semences, ladite détection ou quantification étant effectuée au moyen de sondes moléculaires définies ci-dessus. Un procédé préféré selon la présente invention, est caractérisé en ce que la détection, et le cas échéant, la quantification de la sous-unité A de la globuline 11 S, ou du fragment peptidique de cette dernière, notamment du polypeptide d'environ 23 kDa susmentionné, sont effectuées au moyen d'anticorps tels que définis ci-dessus ou ci-après, dans le cadre d'un test ELISA. L'invention a également pour objet un procédé de préparation de semences prégermées, ledit procédé comprenant la mise en #uvre d'un procédé de prégermination de semences, selon les méthodes classiques dans ce domaine mentionnées ci-dessus, en association avec un procédé de suivi de la phase de prégermination tel que décrit ci-dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé de préparation de semences prégermées tel que décrit ci-dessus, dans lequel le procédé de prégermination des semences est arrêté, notamment par déshydratation des semences, lorsque l'on détecte, dans le cadre du procédé de suivi de la phase de prégermination, une quantité de fragments polypeptidiques de la sous-unité A de la globuline 11S solubles en phase aqueuse, notamment une quantité du polypeptide de 23 kDa susmentionné, représentant environ 25% à environ 30% de la quantité de sous-unité A susmentionnée initialement présente dans les semences avant prégermination. L'invention concerne également les procédés tels que décrits ci-dessus, mis en #uvre à partir de semences de plantes listées ci-dessus, et plus particulièrement à partir de semences de tomate, notamment de Lycopersicon esculentum. L'invention a également pour objet les semences prégermées telles qu'obtenues par un procédé décrit ci-dessus. A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet un lot homogène de semences prégermées à un stade déterminé tel qu'obtenu par mise en #uvre d'un procédé susmentionné, dans lequel la prégermination est arrêtée à un stade déterminé, notamment au stade où la quantité de fragments polypeptidiques de la sous-unité A de la globuline 11S solubles en phase aqueuse, notamment la quantité du polypeptide de 23 kDa susmentionné, représente environ 25% à environ 30% de la quantité de sous-unité A susmentionnée initialement présente dans les semences avant prégermination, le lot étant caractérisé en ce que lesdites semences sont à un même stade déterminé de prégermination. L'invention concerne plus particulièrement les semences prégermées susmentionnées, notamment sous forme déshydratée, telles qu'obtenues selon les procédés susmentionnés mis en #uvre à partir de semences de plantes listées ci-dessus, et plus particulièrement à partir de semences de tomate, notamment de Lycopersicon esculentum. L'invention a plus particulièrement pour objet les anticorps polyclonaux ou monoclonaux reconnaissant une protéine telle que définie ci-dessus, à savoir la sous-unité A de la globuline 11 S chez les plantes, notamment une protéine comprenant le polypeptide ayant un poids moléculaire d'environ 23 kDa, ledit polypeptide étant caractérisé en ce qu'il : - est présent dans les semences prégermées de plantes, mais pas dans les semences témoins avant prégermination, - est soluble dans l'eau, et est retrouvé dans la fraction des protéines solubles extraites dans l'eau à partir des semences prégermées, telle que la protéine d'environ 23 kDa comprenant les séquences peptidiques internes suivantes : IQAEAGVTELWDK, QGDHAFPAGAAH et GFYGIMNSGCPETFQ, lesdits anticorps étant tels qu'obtenus par immunisation d'un animal approprié à l'aide d'une protéine telle que définie ci-dessus, ou à l'aide d'une séquence peptidique dérivée de cette dernière par substitution, élimination ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ou à l'aide d'un fragment de ces dernières séquences, notamment à l'aide d'un fragment correspondant à l'une des séquences peptidiques internes susmentionnées. Avantageusement, les anticorps polyclonaux susmentionnés sont obtenus par immunisation d'un animal avec une protéine, ou une séquence peptidique dérivée de cette dernière, ou un fragment de ces dernières séquences, tels que définis ci-dessus, suivie de la récupération des anticorps recherchés sous forme purifiée, par prélèvement du sérum dudit animal, et séparation desdits anticorps des autres constituants du sérum, notamment par chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle est fixée un antigène spécifiquement reconnu par les anticorps, notamment une protéine, ou une séquence peptidique dérivée de cette dernière, ou un fragment de ces dernières séquences, tels que définis ci-dessus selon l'invention. Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être obtenus par la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-après. Dans un premier temps, on immunise un animal, généralement une souris (ou des cellules en culture dans le cadre d'immunisations in vitro), avec une protéine, ou une séquence peptidique dérivée de cette dernière, ou un fragment de ces dernières séquences, tels que définis ci-dessus selon l'invention, contre lesquels les lymphocytes B de l'animal sont alors capables de produire des anticorps. Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" (notamment murines) pour donner lieu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, on effectue alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clones, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis d'une protéine, ou d'une séquence peptidique dérivée de cette dernière, ou d'un fragment de ces dernières séquences, tels que définis ci-dessus, pourront être testées par exemple en ELISA, par immunotransfert en une ou deux dimensions, en immunofluorescence, ou à l'aide d'un biocapteur. Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés, sont par la suite purifiés notamment selon la technique de chromatographie d'affinité décrite ci-dessus. L'invention a également pour objet une trousse ou kit pour la mise en #uvre d'un procédé tel que défini ci-dessus, contenant : * une protéine comprenant le polypeptide ayant un poids moléculaire d'environ 23 kDa, ledit polypeptide étant caractérisé en ce qu'il : - est présent dans les semences prégermées de plantes, mais pas dans les semences témoins avant prégermination, - est soluble dans l'eau, et est retrouvé dans la fraction des protéines solubles extraites dans l'eau à partir des semences prégermées, telle que la protéine d'environ 23 kDa comprenant les séquences peptidiques internes suivantes : IQAEAGVTELWDK, QGDIIAFPAGAAH et GFYGIMNSGCPETFQ, * et/ou un fragment peptidique de la protéine susmentionnée, notamment un fragment correspondant à l'une des séquences peptidiques internes susmentionnées, * et/ou des anticorps tels que définis ci-dessus, * et/ou une séquence nucléotidique codant pour la protéine ou un fragment peptidique susmentionnés, en association avec un ou plusieurs réactifs nécessaires à la mise en #uvre dudit procédé. L'invention concerne également une protéine comprenant le polypeptide ayant un poids moléculaire d'environ 23 kDa, ledit polypeptide étant caractérisé en ce qu'il : - est présent dans les semences prégermées de plantes, notamment des plantes listées cidessus, mais pas dans les semences témoins avant prégermination, - est soluble dans l'eau, et est retrouvé dans la fraction des protéines solubles extraites dans l'eau à partir de semences prégermées de plantes. L'invention a plus particulièrement pour objet la protéine telle que décrite ci-dessus, comprenant le polypeptide ayant un poids moléculaire d'environ 23 kDa, ledit polypeptide étant caractérisé en ce qu'il : - est présent dans les semences prégermées de la tomate, notamment de Lycopersicon esculentum, mais pas dans les semences de tomate témoins avant prégermination, - est soluble dans l'eau, et est retrouvé dans la fraction des protéines solubles extraites dans l'eau à partir de semences prégermées de tomate. L'invention a également pour objet la protéine telle que décrite ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle correspond à la sous-unité A de la globuline 11S chez les plantes, et plus particulièrement chez la tomate, ladite sous-unité étant caractérisée en ce qu'elle est présente sous forme du fragment polypeptidique ayant un poids moléculaire d'environ 23 kDa dans les semences prégermées, plus particulièrement à raison d'environ 25% à environ 30% par rapport à la quantité totale de sous-unité A initialement présente dans les semences avant prégermination, ledit polypeptide d'environ 23 kDa étant retrouvé dans la fraction des protéines solubles extraites dans l'eau à partir de semences prégermées. L'invention concerne également toute protéine telle que décrite ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend les séquences peptidiques internes suivantes : IQAEAGVTELWDK, QGDIIAFPAGAAH et GFYGIMNSGCPETFQ. L'invention a également pour objet les fragments d'une protéine définie ci-dessus, choisis parmi l'une des séquences peptidiques suivantes : IQAEAGVTELWDK, QGDIIAFPAGAAH et GFYGIMNSGCPETFQ, ou toute séquence dérivée des séquences précédentes par substitution, élimination ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence dérivée étant susceptible d'engendrer la formation d'anticorps reconnaissant une protéine telle que définie ci-dessus. L'invention concerne également toute séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie ci-dessus, ou pour un fragment peptidique susmentionné. L'invention sera davantage illustrée à l'aide des exemples qui suivent de détection de la sous-unité A de la globuline 11 S de la tomate, ainsi que du polypeptide d'environ 23 kDa issu de cette dernière, et à l'aide des figures suivantes.0 LEGENDE DES FIGURES Figure 1 : des semences de tomate témoins et prégermées. Les expériences de germination sont conduites avec cent semences témoins et cent semences prégermées, comme indiqué dans le texte, à une température de 15 C et à l'obscurité. Trois répétitions sont réalisées. Semences témoins semences prégermées (#). Figure 2 : par électrophorèse SDS-PAGE des protéines solubles extraites dans l'eau des semences de tomate témoins et prégermées. La séparation des protéines solubles dans l'eau est effectuée en gel homogène (15% d'acrylamide). Les extraits déposés dans les pistes correspondent à une quantité fixe de semences (7 l d'extrait correspondant à 0,41 semence). Les flèches indiquent la migration de la protéine de tomate de 23 kDa environ. Les pistes M correspondent à la migration des marqueurs moléculaires Bio-Rad précolorés dont les poids moléculaires sont indiqués au centre en kDa. Pistes 1, semences témoins. Pistes 2, semences prégermées. (A) Révélation des protéines au bleu de Coomassie. (B) Immunoblot du gel présenté en (A) et révélation avec les anticorps dirigés contre la protéine de tomate de 23 kDa environ. Figure 3 : TestELISA utilisant les anticorps dirigés contre la protéine de tomate de 23 kDa environ pour caractériser les extraits de protéines solubles dans l'eau des semences de tomate témoins et prégermées. Figure 3A : Analyse de la variété Elko. Les tests ELISA sont réalisés comme indiqué dans le texte en présence de dilutions successives des extraits protéiques de semences de tomate cv Elko (indiquées sur la figure sur la base du nombre de semences utilisé), des anticorps primaires de cobaye dirigés contre la protéine de tomate de 23 kDa environ et des anticorps secondaires (anticorps antiimmunoglobulines de cobaye faits dans la chèvre) couplés à la peroxydase. La révélation de l'antigène est suivie à 405 nm après ajout des substrats de la peroxydase. Semences témoins () ; semences prégermées (#). Figure 3B : Test de présence de la protéine de 23 kDa environ, par méthode ELISA, sur 8 lots de semences de tomate (nommés lots A, B, C, D, E, F, G, H), tous de variétés différentes. Les tests ELISA sont conduits comme indiqué en (A), mais en utilisant une quantité fixe d'extrait de protéines solubles dans l'eau correspondant à 0,00125 semence. Semences témoins (#); semences prégermées (#). Figure 4 : par test ELISA, de l'évolution de la quantité de protéine de tomate de 23 kDa environ en fonction de la durée de prégermination. Les semences de tomate analysées correspondent à un des lots présentés en Figure 3B (c'est-à-dire les semences du lot D). Elles sont soumises au traitement de prégermination décrit dans le texte pendant 1, 2, 3 et 4 jours. Les semences au temps zéro sont les semences contrôles non traitées. (8)Test ELISA utilisant les anticorps dirigés contre la protéine de 23 kDa environ. Les tests sont conduits comme indiqué dans le texte et dans la Figure 3, en utilisant une quantité fixe d'extrait de protéines solubles dans l'eau correspondant à 0,00125 semence. (#) Vitesse de germination. Les semences contrôles et traitées sont mises à germer comme indiqué dans le texte à une température de 15 C. La vitesse de germination est exprimée sur la base du pourcentage de semences germées après 6 jours. (0) Germes de taille supérieure à 1 cm dénombrés à 6 jours de germination à 15 C des semences contrôles et traitées. Figure 5 : Test ELISA utilisant les anticorps dirigés contre la sous-unité B de la globuline 11S de betterave sucrière pour caractériser les extraits de protéines solubles extraites des semences de betterave sucrière témoins et prégermées et de semences de tomate témoins et prégermées. Les tests ELISA sont réalisés comme indiqué dans le texte en présence de dilutions successives des extraits protéiques (indiquées sur la figure sur la base du nombre de semences utilisé), des anticorps primaires de lapin dirigés contre sous-unité B de la globuline Ils de betterave sucrière (Job C. et al., 1997 ; WO 97/43418) et des anticorps secondaires (anticorps anti-immunoglobulines de lapin faits dans la chèvre) couplés à la peroxydase. La révélation de l'antigène dans les extraits est suivie à 405 nm après ajout des substrats de la peroxydase. Semences de betterave sucrière témoins (CI) semences de betterave sucrière prégermées (#); semences de tomate témoins (#); semences de tomate prégermées (#). Figure 6 : Test ELISA utilisant les anticorps dirigés contre la protéine de tomate de 23 kDa environ pour caractériser les extraits de protéines totales extraites en présence de SDS des semences de tomate témoins et prégermées. Les tests ELISA sont réalisés comme indiqué dans le texte en présence de dilutions successives des extraits protéiques (indiquées sur la figure sur la base du nombre de semences utilisé), des anticorps primaires de cobaye dirigés contre la protéine de tomate de 23 kDa et des anticorps secondaires (anticorps anti-immunoglobulines de cobaye faits dans la chèvre) couplés à la peroxydase. La révélation de l'antigène dans les extraits est suivie à 405 nm après ajout des substrats de la peroxydase. Semences témoins (#); semences prégermées (#). EXEMPLES 1. MISE EN EVIDENCE D'UNE PROTEINE MARQUEUR DE PREGERMINATION CHEZ LA SEMENCE DE TOMATE 1. 1 Matériel végétal Les semences témoins et prégermées de tomate (cv Elko) ont été utilisées. La qualité de ces semences est appréciée par des expériences de germination, conduites en boîtes de Pétri carrées de 12 cm (trois répétitions de cent semences par boîte). Dans chaque boîte, les cent semences sont posées sur trois épaisseurs de papier absorbant, imbibées par 8 ml d'eau déminéralisée, et recouvertes d'une quatrième épaisseur de papier absorbant. Puis les boîtes sont recouvertes d'un papier d'aluminium et sont placées en armoire de germination, à l'obscurité, dans une atmosphère à humidité constante de 80% et à une température de 15 C. Dans ces conditions, les semences témoins et les semences prégermées ont germé à plus de 98% après 6 jours. Les différences observées entre ces deux types de semences portent sur leur profil de germination (Fig.l) : les semences prégermées germent beaucoup plus rapidement (85% au bout de 67 h) que les semences témoins (1,7% au bout de 67 h). Ce gain de temps traduit l'efficacité du traitement de prégermination utilisé, et représente l'effet physiologique recherché par les semenciers et les agriculteurs. 1. 2 Extraction protéique et analyse Des extractions protéiques sont réalisées sur les semences sèches témoins et prégermées (les semences sont prégermées par une méthode classique, connues par l'homme du métier) : semences (environ 0,34 g) sont broyées le plus finement possible à l'aide d'un broyeur Retsch ISO-9001 pendant 1 minute. La poudre est reprise dans 1,7 ml d'eau distillée (c'est-à-dire cinq fois le poids des semences au départ) et mise sous agitation à 4 C pendant 15 minutes. Ceci permet d'extraire les protéines solubles dans l'eau. L'échantillon est ensuite centrifugé à 9000 g pendant 10 minutes à la température de 5 C. Le surnageant, qui contient les protéines solubles est récupéré, clarifié par une nouvelle centrifugation de 10 minutes à 35 000 g et à 5 C, puis conservé sous forme de fractions aliquotes à -20 C. La réalisation d'une extraction dans les mêmes conditions mais en présence de SDS 2% (agent dénaturant des protéines et des macromolécules) permet d'obtenir les protéines totales. La quantité de protéines contenues dans les extraits solubles est dosée suivant la méthode colorimétrique de Bradford (1976). Les protéines sont séparées par électrophorèse SDS-PAGE selon la méthode de Laemli (1970) avec appareillage Mighty Small II SE250 (Hoefer Scientific Instruments, San Fransisco). Les échantillons sont mélangés avec le tampon de charge [Tris-HCl 10 mM, pH 7,8, EDTA 1 mM , 2. 5% (v/v) SDS, dithiothreitiol (DTT) 50 mM et bleu de bromophénol 0.01% (p/v)], chauffés à 100 C pendant 5 minutes et chargés sur les gels de polyacrylamide (gels homogènes à 15% de polyacrylamide). Les résultats obtenus sont les suivants : l'analyse de ces extraits protéiques par électrophorèse SDS-PAGE montre une protéine de 23 kDa environ présente en plus grande quantité dans les extraits de semences prégermées (Fig. 2A). Ces données ont été vérifiées sur plusieurs variétés de semences de tomate, pour confirmation. 1. 3 Prégermination des semences en présence de PEG La méthode utilisée est celle de Bino et al. (1992). Elle est réalisée en utilisant une solution de polyéthylène glycol (PEG-6000) à un potentiel osmotique de - 1,0 MPa (Michel et Kaufinann, 1973). Deux cents semences de tomate sont placées dans deux boîtes de Pétri (12 x 12 cm x 1,2 cm) sur trois épaisseurs de papier absorbant imbibées de 8 ml de la solution de PEG-6000. Les semences sont recouvertes par une quatrième épaisseur de papier absorbant, puis quatre ml de solution de la solution de PEG-6000 sont rajoutés. Les boîtes sont fermées hermétiquement, entourées d'un papier d'aluminium et placées en armoire climatique à 20 C et à l'obscurité pendant 4 jours. Après le traitement, les semences sont rincées rapidement à l'eau déminéralisée puis pesées. Enfin, elles sont mises à sécher à température ambiante pendant 24 heures. Les tests de germination réalisés sur les semences de tomate témoins et prégermées par l'imbibition en présence de PEG ont montré d'une part que les semences ont toutes une bonne capacité germinative (98% de germination à 6 jours) et d'autre part que les semences prégermées avec le PEG ont germé plus rapidement (au bout de 67 heures : 85%) que les semences témoins (1,7% au bout de 67 h) (Fig. 1). En conclusion, ce procédé de prégermination des semences de tomate a mis en évidence la présence d'une protéine de 23 kDa environ soluble dans l'eau, caractéristique des semences prégermées ; cet événement est concomitant d'une augmentation nette de la vigueur germinative, effet biologique de la prégermination. 2. PURIFICATION DE LA PROTEINE ET OBTENTION D'ANTICORPS SPECIFIQUES La préparation d'un extrait protéique soluble dans l'eau est réalisée à partir de 20 g de semences de tomate prégermées comme précédemment décrit. L'extrait protéique obtenu est ensuite résolu sur gel de polyacrylamide 15% en conditions dénaturantes, selon la technique de Laemli (1970), avec appareillage d'électrophorèse Bio-Rad Protean (Bio-Rad). L'extrait est déposé dans un puits unique du gel en positionnant de part et d'autre du dépôt des marqueurs de poids moléculaire précolorés (Bio-Rad). La migration est effectuée à 50 mA pendant 5 heures. La bande de gel contenant la protéine d'intérêt, repérée à l'aide des marqueurs moléculaires, est découpée ; la protéine est ensuite électro-éluée du gel à l'aide d'un tampon Tris 50 mM, glycine 384 mM, SDS 0,1% pendant 4 heures à 10 mA. Après analyse SDSPAGE sur gel 15% de la pureté de la protéine, les phases de résolution sur gel de polyacrylamide et d'électro-élution sont réitérées jusqu'à l'obtention d'une quantité suffisante la protéine cible pure. Des anticorps de cobaye anti-protéine de tomate de 23 kDa environ ont été obtenus selon un protocole standard (Roitt et al., 1985), à partir de 600 g de cette protéine de tomate. Après trois injections successives et récupération du sérum, des tests ELISA (qualité et détermination du titre) ainsi qu'un test immunoblot (spécificité vis-à-vis de la protéine de tomate) ont été réalisés. Le sérum pré-immun sert de contrôle. La détermination du titre anticorps utilise un test ELISA, dans lequel la protéine de 23 kDa environ de tomate est déposée en quantité constante de l'ordre de 10 ng dans chaque cupule de la plaque de microtitration ; la première incubation est réalisée en présence de sérum immun à une dilution initiale de 1/50 puis à des dilutions successives en cascade au 1/2 à partir de cette solution initiale ; viennent ensuite la deuxième incubation en présence de l'anticorps de chèvre antiimmunoglobuline de cobaye couplé à la peroxydase et la révélation de l'antigène en présence des substrats de la peroxydase [1.8 mM d'acide 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonique) (ABTS ; Aldrich), et 3x10-3% (v/v) d'H202 (Sigma) dans un tampon citratephosphate 0,1 M, pH 4,0]. Le sérum pré-immun (témoin) ne reconnaît pas la protéine d'intérêt et le titre anticorps correspond à une dilution du sérum de 1/10000 . L'analyse Western blot est effectuée après transfert des protéines contenues dans le gel SDS-PAGE sur une membrane de nitrocellulose (Gelman Sciences), par élecrotransfert semisec à 300 mA pendant deux heures. Les membranes sont rincées deux fois pendant 5 minutes dans du tampon TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5), puis incubées pendant 1 heure à 25 C dans du TBS contenant 1% (v/v) de la Blocking Solution (Boehringer Mannheim). Après incubation pendant 1 heure avec les anticorps dirigés contre la protéine de tomate de 23 kDa environ (dilution 1:100000 dans du TBS contenant 0. 5% de Blocking Solution), les membranes sont rincées deux fois pendant 10 minutes dans du TBS contenant 0.1% de Tween 20 et deux fois pendant 10 minutes dans du TBS contenant 0. 5% de Blocking Solution , puis incubées pendant 30 minutes avec les anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort [anticorps anti-immunoglobulines de cobaye faits dans la chèvre (Sigma) ; dilution 1:5000 dans du TBS contenant 0. 5% de Blocking Solution ]. Après quatre lavages comme décrit ci-dessus, les membranes sont incubées avec le kit BM chemiluminescence de Boehringer Mannheim selon les instructions du fabricant, ce qui permet la révélation de l'antigène. L'analyse des résultats (Fig. 2B) a bien montré la spécificité de l'anticorps pour sa protéine cible, présente en plus forte quantité dans les semences prégermées que dans les semences témoins. 3. DEVELOPPEMENT D'UN TEST ELISA Le but recherché est de mesurer et comparer le niveau de la protéine dans les semences témoins et les semences prégermées en utilisant un test immunoenzymatique de type ELISA. A cet effet, l'extrait protéique obtenu dans l'eau de chaque lot de semences est dilué de la façon suivante : l'extrait le plus concentré correspond à un nombre de semences donné (0,029 semence) dilué dans 250 l de PBS (tampon phosphate de sodium 10 mM, NaCI 150 mM). Ensuite, 10 dilutions successives au demi sont préparées à partir de l'extrait le plus concentré, et 100 fil de chacune sont transférés dans des plaques de microtitration ELISA 96 puits (plaques ELISA Microlon Greiner). Les puits de la 12ècolonne contiennent uniquement du PBS (témoin). Les étapes de l'immunomarquage sont les suivantes : 5 lavages en PBS, 0,05% Tween 20 (Sigma) ; incubation 20 minutes à 35 C avec la solution d'anticorps primaire diluée au 1/10000 dans du PBS ; lavages en PBS Tween 0,05% ; 20 minutes à 35 C avec la solution d'anticorps secondaires (anticorps de chèvre anti- immunoglobulines de cobaye couplés à la peroxydase, Sigma) diluée au 1/5000 ; 5 lavages en PBS Tween 0,05%. La microplaque est révélée par l'addition d'une solution contenant les substrats de la peroxydase susmentionnés. La reconnaissance spécifique antigène-anticorps primaires se traduit par l'apparition d'une coloration verte (métabolisation de l'ABTS par la peroxydase en présence d'H2O2) dont l'intensité est proportionnelle à la quantité d'antigène dans l'extrait. Les valeurs d'absorbance sont mesurées à 405 nm (A4os) avec un lecteur de microplaques (EL340 ; Bio-Tek Instruments) et analysées sur ordinateur Macintosh LC III. Les valeurs d'absorbance mesurées pour les extraits protéiques solubles des semences prégermées sont très supérieures à celles des semences témoins (Fig. 3A), ce qui confirme bien les résultats obtenus avec l'analyse des protéines sur gel de polyacrylamide (Fig. 2B). Le test ELISA mis en place a donc permis de distinguer les semences témoins des semences prégermées de tomate, lorsque les extractions sont réalisées dans de l'eau distillée. D'autres mesures ont été effectuées sur des lots de semences de tomate supplémentaires, afin de valider le test et la quantification des résultats a montré que, dans tous les cas, les valeurs d'absorbance mesurée à 405 nm pour les semences prégermées sont supérieures à celles mesurées pour les semences témoins (Fig. 3B). Enfin, le test ELISA a été utilisé pour suivre, en fonction de la durée du traitement de prégermination, l'accumulation de la protéine de 23 kDa environ dans les extraits de protéines solubles. Les résultats de la Figure 4 montrent bien que cette accumulation est étroitement corrélée avec l'augmentation de la vigueur germinative des semences. 4. IDENTIFICATION DE LA PROTEINE DE 23 kDa ENVIRON La protéine de 23 kDa environ est purifiée à partir d'un extrait de semences de tomate prégermées (protéines solubles dans l'eau) par électrophorèse SDS-PAGE, ainsi qu'indiqué ci-dessus. La protéine est révélée par coloration au noir amido. La portion de gel contenant la protéine est découpée et la protéine est extraite en présence d'un tampon contenant du Tris- HC1 50 mM (pH 8,6) et du Tween 20 à 0.01%. La protéine est digérée par ajout de 0,2 g de trypsine coupant après les résidus de lysine et d'arginine. Le mélange de peptides obtenus est séparé par chromatographie HPLC sur colonne de DEAE C18de 2. 1 mm de diamètre. Le gradient de séparation est un gradient d'acétonitrile (2-45%) dans de l'acide trifluoroacétique (TFA) 0. 1%. Les peptides présentant un profil d'élution symétrique (critère de pureté) sont sélectionnés arbitrairement et analysés par séquençage des acides aminés selon la dégradation d'Edman (Edman, 1956) au moyen d'un séquenceur PE Applied Biosystem piloté par un ordinateur Macintosh. La recherche d'homologies de séquence est effectuée sur Internet par criblage de banques de données de séquences protéiques avec les programmes FASTA et BLAST. Les résultats obtenus sont les suivants. Trois peptides internes, nommés peptides 1, 2 et 3, ont respectivement pour séquence IQAEAGVTELWDK, QGDIIAFPAGAAH et GFYGIMNSGCPETFQ. Le criblage de banques de données de séquences avec les programmes FASTA et BLAST indique que les peptides 1,2 et 3 issus de la protéine de 23 kDa environ de semences de tomate prégermées sont homologues de motifs rencontrés chez les globulines 11 S de plusieurs espèces. Ces homologies sont rencontrées dans la partie correspondant au polypeptide acide (sous-unité A) des précurseurs des globulines 11S. Ce résultat est donc différent de celui obtenu pour la prégermination des semences de betterave sucrière, puisque dans ce dernier cas seule la solubilisation de la sous-unité B de la globuline 11S avait été mise en évidence (Job C. et al., 1997 ; WO 97/43418). D'ailleurs, les anticorps dirigés contre la sous-unité B de la globuline 11S de betterave sucrière ne montrent aucune réactivité croisée avec les extraits de protéines solubles de semences de tomates, qu'elles soient témoins ou prégermées (Fig. 5). Des contrôles sont effectués en parallèle avec les extraits de protéines solubles de semences témoins et prégermées de semences de betterave sucrière, obtenus tel que décrit précédemment (Job C. et al., 1997 ; WO 97/43418). L'analyse des résultats (Fig. 5) a bien montré l'efficacité des anticorps anti-sous-unité B de la globuline 11S pour différencier les semences témoins et prégermées de betterave sucrière et leur inadéquation pour caractériser la prégermination des semences de tomate. En conclusion, la protéine de 23 kDa environ isolée de semences de tomate prégermées correspond à la sous-unité A de la globuline 11S de tomate. Seules les semences prégermées montrent cette sous-unité dans la fraction des protéines solubles, extraites dans l'eau. Par contre, les tests ELISA réalisés sur les protéines totales (c'est-à-dire extraites en présence de SDS) ont montré que cette sous-unité était présente en égale quantité dans les semences de tomate témoins et prégermées (Fig. 6). La réalisation de tests ELISA simultanés sur les protéines solubles et totales de semences de tomate permet d'estimer que, dans les conditions de prégermination utilisées dans ce travail (osmoconditionnement en présence de PEG-1,0 MPa pendant 4 jours à 20 C), environ 25 à 30% de la totalité de la sous-unité A de la globuline 11 S de tomate est solubilisée pendant la prégermination. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Bewley JD et Black M (1994) Seeds. Physiology of development and germination. Second edition. Plenum Press, New York Bino, R. J., De Vries, J. N., Kraak, H. L. et Van Pijlen, J. G. (1992) Flow cytometric détermination of nuclear replication stages in tomato seeds during priming and germination. Annals ofBotany 69, 231-236. Bradford, M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein using the principle of protein dye binding. Analytical Biochemistry 72, 248-254. Bradford, K.J. (1986) Manipulation of seed water relations via osmotic priming to improve germination under stress conditions. HortScience 21, 1105-1112. Bray, C.M. (1995) Biochemical processes during the osmopriming of seeds. pp. 767- 789 in: Kigel, J.; Galili, G. (Eds) Seed development and germination. Marcel Dekker, Inc., New York. Chareyre, S., Kersulec, A., Job, D. et Job, C. (1998) The use of an ELISA to quantitate the extent of 11S globulin mobilization in untreated and primed sugar beet seed lots. Comptes-Rendus de l'Académie des Sciences, Paris 321, 705-711. Davison, P.A. et Bray, C.M. (1991) Protein synthesis during osmopriming of leek (Allium porrum L. ) seeds. Seed Science Research 1, 29-35. De Castro, R., Zheng, X., Bergervoet, J. H.W., De Vos, C.H.R. et Bino, R. J. (1995) ss-Tubulin accumulation and DNA replication in imbibing tomato seeds. Plant Physiology 109, 499-504. Dell'Aquila, A. et Bewley, J. D. (1989) Protein synthesis in the axes of polyethylene glycol-treated-pea seeds and during subséquent germination. Journal of Experimental Botany 40, 1001-1007. Duval, M., Job, C., Alban, C., Douce, R. et Job, D. (1994) Developmental patterns of free and protein-bound biotin during maturation and germination of seeds of Pisum sativum. Characterization of a novel seed-specific biotinylated protein. Biochemical Journal 299, 141- 150. Duval, M., Job, C., DeRose, R., Douce, M. et Job, D. (1994) Brevet EP 0658625A2 protéines biotinylées de semences. Edman, P. (1956) A protein sequanator. European Journal of Biochemistry 1, 80-81. Fujikura, Y. et Karssen, C.M. (1992) Effects of controlled détérioration and osmopriming on protein synthesis of cauliflower seeds during early germination. Seed Science Research 2, 23-31. Heydecker, W. (1978) "Primed" seeds for better crop establishment? Span 21, 12-14. Heydecker, W., Higgins, J. et Gulliver, R. L. (1973) Accelerated germination by osmotic seed treatment. Nature 246, 42-44. Job, C., Kersulec, A., Ravasio, L., Chareyre, S., Pépin, R. et Job, D. (1997) The solubilization of the basic subunit of sugarbeet seed 11-S globulin during priming and early germination. Seed Science Research 7,225-243. Job, D., Kersulec, A. et Job, C. (1997) WO 97/43418. Karssen, C.M., Haigh, A., Van der Toorn, P. et Weges, R. (1989) Physiological mechanisms involved in seed priming. pp 269-280 in Taylorson, R. B. (Ed) Recent advances in the development and germination of seeds. New York, Plenum Press. Kermode, A. R. (1997) Approaches to elucidate the basis of desiccation-tolerance in seeds. Seed Science Research 7,75-95. Laemli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227,680-685. Michel, B. E. et Kaufmann, M. R. (1973) The osmotic potential of polyethylene glycol 6000. Plant Physiology 51, 914-916. Ôzbingol, N., Corbineau, F. et Côme, D. (1998) Responses of tomato seeds to osmoconditioning as related to température and oxygen. Seed Science Research 8, 377-384. Roitt, I., Brostoff, J. et Mâle, E. (1985) Immunologie fondamentale et appliquée. Médecine et sciences internationales ; Paris. Rowse, H. R. (1996) Drum priming - a non-osmotic method of priming seeds. Seed Science and Technology 24, 281-294. Shewry, P. R., Napier, J. A. et Tatham, A. S. (1995) Seed storage proteins : and biosynthesis. Plant Cell 7, 945-956. Still, D. W., Dahal, P. et Bradford, K. J. (1997) A single-seed assay for endo-ssmannanase activity from tomato endosperm and radicle tissues. Plant Physiology 113, 13-20. Tarquis, A. M. et Bradford, K. J. (1992) Prehydration and priming treatments that advance germination also increase the rate of détérioration of lettuce seeds. Journal of Experimental Botany 43,307-317. Taylor, A.G., Allen, P. S., Bennett, M. A., Bradford, K. J., Burris, J.S. et Misra, M. K. (1998) Seed enhancements. Seed Science Research 8,245-256. Toorop, P. E., van Aelst, A. C. et Hilhorst, H. W.M. (1998) Endosperm cap weakening and endo-ss-mannanase activity during priming of tomato (Lycopersicon esculentum cv. Moneymaker) seeds are initiated upon crossing a threshold water potential. Seed Science Research 8,483-491. REVENDICATIONS 1. Utilisation: * d'une protéine comprenant le polypeptide ayant un poids moléculaire d'environ 23 kDa, ledit polypeptide étant caractérisé en ce qu'il : - est présent dans les semences prégermées de plantes, mais pas dans les semences témoins avant prégermination, - est soluble dans l'eau, et est retrouvé dans la fraction des protéines solubles extraites dans l'eau à partir des semences prégermées, * ou d'un fragment peptidique de la protéine susmentionnée, * ou d'anticorps dirigés contre la protéine ou un fragment peptidique susmentionnés, * ou d'une séquence nucléotidique codant pour la protéine ou un fragment peptidique susmentionnés, en tant que sondes moléculaires protéiques ou nucléiques utilisables comme marqueurs pour la détection de la sous-unité A de la globuline 11 S chez les plantes, ou de fragments polypeptidiques de cette dernière, dans le cadre de la mise en #uvre de procédés de suivi de la phase de prégermination de semences. 2. Utilisation selon la revendication 1, d'une protéine comprenant les séquences peptidiques internes suivantes IQAEAGVTELWDK, QGDIIAFPAGAAH et GFYGIMNSGCPETFQ. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, pour la détection de la sous-unité A de la globuline 11S, ou de fragments polypeptidiques de cette dernière, chez les solanacées, les cucurbitacées, les ombellifères, les valérianacées et les composées. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, pour la détection d'un fragment polypeptidique de la sous-unité A de la globuline 11 S caractéristique des semences prégermées, ce fragment correspondant au polypeptide d'environ 23 kDa présent dans la fraction des protéines solubles extraites dans l'eau à partir des semences prégermées. 5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, d'anticorps dirigés contre le polypeptide d'environ 23 kDa pour détecter ce dernier dans la fraction des protéines solubles extraites dans l'eau à partir des semences prégermées à l'aide d'un test ELISA. 6. Procédé de suivi de la phase de prégermination de semences, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de détection de la sous-unité A de la globuline 11 S chez les plantes, ou de fragments polypeptidiques de cette dernière, dans les semences au cours de la phase de prégermination de ces dernières, à l'aide d'un marqueur moléculaire défini dans la revendication 1. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de détection du polypeptide d'environ 23 kDa présent dans la fraction des protéines solubles extraites dans l'eau à partir des semences prégermées. 8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que la détection, et le cas échéant, la quantification de la sous-unité A de la globuline 11 S ou du polypeptide d'environ 23 kDa sont effectuées au moyen d'anticorps dirigés contre ce polypeptide d'environ 23 kDa dans le cadre d'un test ELISA. 9. Procédé de préparation de semences prégermées comprenant la mise en #uvre d'un procédé de prégermination de semences, en association avec un procédé de suivi de la phase de prégermination selon l'une des revendications 6 à 8. 10. Semences prégermées telles qu'obtenues par un procédé selon la revendication 9. 11. Lot homogène de semences prégermées à un stade déterminé tel qu'obtenu par mise en #uvre d'un procédé selon la revendication 9, dans lequel la prégermination est arrêtée à un stade déterminé, le lot étant caractérisé en ce que lesdites semences sont à un même stade déterminé de prégermination. 12. Anticorps polyclonaux ou monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent une protéine comprenant le polypeptide ayant un poids moléculaire d'environ 23 kDa, ledit polypeptide étant caractérisé en ce qu'il : - est présent dans les semences prégermées de plantes, mais pas dans les semences témoins avant prégermination, - est soluble dans l'eau, et est retrouvé dans la fraction des protéines solubles extraites dans l'eau à partir des semences prégermées, telle que la protéine d'environ 23 kDa comprenant les séquences peptidiques internes suivantes : IQAEAGVTELWDK, QGDIIAFPAGAAH et GFYGIMNSGCPETFQ, lesdits anticorps étant tels qu'obtenus par immunisation d'un animal approprié à l'aide d'une protéine telle que définie ci-dessus, ou à l'aide d'une séquence peptidique dérivée de cette dernière par substitution, élimination ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ou à l'aide d'un fragment de ces dernières séquences, notamment à l'aide d'un fragment correspondant à l'une des séquences peptidiques internes susmentionnées. 13. Trousse ou kit pour la mise en #uvre d'un procédé selon l'une des revendications 6 à 9, contenant : * une protéine comprenant le polypeptide ayant un poids moléculaire d'environ 23 kDa, ledit polypeptide étant caractérisé en ce qu'il : - est présent dans les semences prégermées de plantes, mais pas dans les semences témoins avant prégermination, - est soluble dans l'eau, et est retrouvé dans la fraction des protéines solubles extraites dans l'eau à partir des semences prégermées, telle que la protéine d'environ 23 kDa comprenant les séquences peptidiques internes suivantes : IQAEAGVTELWDK, QGDIIAFPAGAAH et GFYGIMNSGCPETFQ, * et/ou un fragment peptidique de la protéine susmentionnée, notamment un fragment correspondant à l'une des séquences peptidiques internes susmentionnées, * et/ou des anticorps selon la revendication 12, * et/ou une séquence nucléotidique codant pour la protéine ou un fragment peptidiques susmentionnés, en association avec un ou plusieurs réactifs nécessaires à la mise en #uvre dudit procédé. 14. Protéine comprenant le polypeptide ayant un poids moléculaire d'environ 23 kDa, ledit polypeptide étant caractérisé en ce qu'il : - est présent dans les semences prégermées de la tomate, mais pas dans les semences de tomate témoins avant prégermination, - est soluble dans l'eau, et est retrouvé dans la fraction des protéines solubles extraites dans l'eau à partir de semences prégermées de tomate. 15. Protéine selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle correspond à la sousunité A de la globuline 11S chez la tomate, ladite sous-unité étant caractérisée en ce qu'elle est présente sous forme du fragment polypeptidique ayant un poids moléculaire d'environ 23 kDa dans les semences prégermées. 16. Protéine selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce qu'elle comprend les séquences peptidiques internes suivantes : IQAEAGVTELWDK, QGDIIAFPAGAAH et GFYGIMNSGCPETFQ. 17. Fragments d'une protéine définie dans l'une des revendications 14 à 16, choisis parmi l'une des séquences peptidiques suivantes : IQAEAGVTELWDK, QGDIIAFPAGAAH et GFYGIMNSGCPETFQ, ou toute séquence dérivée des séquences précédentes par substitution, élimination ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence dérivée étant susceptible d'engendrer la formation d'anticorps reconnaissant une protéine selon l'une des revendications 14 à 16. 18. Séquence nucléotidique codant pour une protéine selon l'une des revendications 14 à 16, ou pour un fragment peptidique selon la revendication 17.