Brevet FR2800094A1 — publié le 20010427

PROCÉDÉ ET KIT POUR L'ÉVALUATION DE MUTATIONS DE VIH ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION 5 La technique de test génétique pour la détermination de la présence de ou d'une sensibilité à un état maladif procure d'incroyables opportunités pour l'amélioration des soins médicaux, et le potentiel pour de telles techniques de test augmente presque chaque jour, car des nombres toujours plus grands de gènes et/ou de mutations associés à des affections sont 10 identifiés. Un obstacle important qu'il faut cependant vaincre pour mettre ce potentiel en pratique est le coût élevé des techniques de test. Cela est particulièrement vrai dans le cas des gènes fortement polymorphes pour lesquels le besoin de tester un grand nombre de variations peut amener la technique de test à apparaître si coûteuse que l'on ne puisse jamais effectuer 15 des tests de routine. Les tests de modifications de séquence d'ADN peuvent être effectués par séquençage complet d'une molécule d'acide nucléique cible, bien que de nombreuses personnes dans la technique concernée pensent qu'un tel test est trop coûteux pour devenir un jour un test de routine. Des modifications de la 20 séquence d'ADN peuvent également être détectées par une technique dénommée "polymorphisme conformationnel monobrin" (en anglais "single- stranded conformational polymorphism", abrégé en "SSCP"), décrit par Orita et al., Genomics 5 :874-879 (1989), ou par une modification de cette séquence dénommée méthode par empreinte didésoxy (abrégé en "ddF") décrite par 25 Sarkar et al., Genomics 13:441-443 (1992). Le SSCP et le ddF évaluent le profil de bandes créé lorsque des fragments d'ADN sont séparés par électrophorèse sur un gel d'électrophorèse non-dénaturant. Ce profil dépend d'une combinaison de la taille des fragments et de la conformation tridimensionnelle des fragments non-dénaturés. Ainsi, le profil ne peut pas 30 être utilisé pour le séquençage, étant donné que l'espacement théorique des bandes des fragments n'est pas égal. La présente demande de brevet concerne un test particulier qui peut être utile en tant que partie d'un protocole de test pour la détection et la caractérisation du virus de l'immunodéficience humaine (VIH). RÉSUMÉ DE L'INVENTION Le procédé selon l'invention procure un procédé pour l'obtention d'information sur le type allélique d'un matériel génétique dérivé d'un échantillon infecté par le VIH. Un test est réalisé, dans lequel la séquence est déterminée dans la direction 3' pour l'ensemble des quatre bases. Ce test identifie pratiquement la totalité des échantillons, dans lesquels la séquence de l'échantillon est déterminée dans les deux directions 3' et 5' pour la totalité des quatre bases. Pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, les réactifs appropriés pour les tests sont conditionnés de façon convenable dans un ensemble ou kit. Le kit contient des réactifs pour la mise en oeuvre d'une détermination de séquence à quatre bases sur l'un des brins ou les deux de l'ADN cible. La détermination de séquence monobrin peut être effectuée en totalité dans la direction 3', en totalité dans la direction 5', ou sous la forme d'une combinaison des deux brins. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS Fig. 1 montre une représentation schématique de l'invention. DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION Bien que la terminologie utilisée dans la présente demande soit classique dans la technique concernée, les définitions suivantes de certains termes sont fournies pour garantir la clarté. 1. "Allèle" désigne une version spécifique d'une séquence nucléotidique sur un locus génétique polymorphique. 2. "Site polymorphe" désigne une position de nucléotide donné dans un locus génétique, qui est variable dans une population. 3. "Gène" ou "locus génétique" désigne une séquence nucléotidique spécifique dans un génome donné. 4. La "localisation" ou "position" d'un nucléotide dans un locus génétique signifie le nombre assigné au nucléotide dans le gène, généralement obtenu à partir de la séquence d'ADNc ou de la séquence génomique du gène. 5. Les nucléotides Adénine, Cytosine, Guanine et Thymine sont parfois représentés par leurs désignations A, C, G ou T, respectivement. Les didésoxynucléotides qui sont utilisés comme terminateurs de chaîne sont abrégés en ddA, ddC, ddG et ddT. Bien qu'il soit apparu depuis longtemps à l'homme de l'art que la connaissance de l'identité de la base sur une localisation ou emplacement particulier dans un locus génétique polymorphe puisse être suffisante pour la détermination du type allélique de ce locus, cette connaissance n'a conduit à aucune modification des modes opératoires de séquençage. Au contraire, ladite connaissance a stimulé le développement de techniques telles que les essais d'hybridation spécifiques d'un allèle, et les essais de ligature spécifiques d'un allèle. Toutefois, bien qu'on n'en ait pas reconnu la possibilité dans la technique, il n'est pas toujours nécessaire de déterminer la séquence de tous les quatre nucléotides d'un locus génétique polymorphe afin de déterminer quel allèle est présent dans un échantillon de patient spécifique. Comme décrit de manière générale dans la publication de demande internationale No. WO 97/23650, certains allèles d'un locus générique peuvent être aptes à être distingués sur la base de l'identification de la localisation de moins de quatre, et souvent de seulement un nucléotide. Cette constatation permet le développement du présent procédé pour une identification d'allèle améliorée dans le génome de VIH fortement polymorphe. Classiquement, si l'on en venait à utiliser le séquençage pour évaluer le type allélique d'un gène polymorphe, quatre réactions de "séquençage" de didésoxy nucléotides du type décrit par Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467 (1977)) devaient être effectuées concurremment sur l'échantillon, et les produits des quatre réactions devaient ensuite être analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. (voir Chap. 7.6, Current Protocols in Molecular Biology, éds. Ausubel, F. M. et al., (John Wiley & Sons; 1995)). Dans cette technique bien connue, chacune des quatre réactions de séquençage génère une pluralité de produits d'extension d'amorce, dont tous finissent par un type spécifique de didésoxynucléotides. Chaque piste sur le gel d'électrophorèse reflète ainsi les positions d'un type de base dans le produit d'extension, mais ne révèle pas l'ordre et le type de nucléotides intervenant entre les bases de ce type spécifique. L'information procurée par les quatre pistes est par conséquent combinée dans des procédures de séquençage connues, pour que l'on parvienne à une représentation composite de la séquence dans son ensemble. Dans le procédé selon l'invention, la séquence d'une bonne portion des gènes de protéase et de réverse transcriptase ayant une importance en diagnostic est obtenue en trois étapes: 1) De l'ADNc est généré à partir de l'ARN présent dans l'échantillon, et amplifié, de préférence sur une région s'étendant de 6 codons avant la protéase jusqu'au codon 335 de la réverse transcriptase de VIH-1 (les régions d'amorce ne sont pas comprises dans cet intervalle). 2) Des réactions de séquençage sont effectuées. 3) Enfin, les échelons de séquençage sont analysés, de préférence au moyen du système OpenGeneTM: les séquenceurs d'ADN MicroGene ClipperTM ou Long-Read TowerTM, le logiciel GeneObjectsTM et GeneLibrarianTM. Fig. 1 représente une forme de réalisation du procédé selon l'invention sous forme schématique. Comme indiqué, un échantillon d'ARN est obtenu et traité par ACP de réverse transcriptase (RT-ACP) pour produire un amplicon d'approximativement 1,3 kpaires de bases couvrant les gènes de protéase et de réverse tanscriptase du génome de VIH d'une cellule cible. Cette réaction peut être mise en oeuvre au moyen, par exemple, du système de RT-ACP à un tube TITANTM de Boehringer Mannheim (No. de cat. 1 855 476 ou 1 882 382) avec les amorces suivantes: lot d'amorces avant: \AGCAGGAGC CGATAGACAA GG SEQ ID No. 1 AGCAGGAGC HGAWAGACAR GG SEQ ID No. 2 :AGCAGGAAC CGAGGGACAA GG SEQ ID No. 3 lot d'amorces réverse: @TAYTARGTC TTTTGWTGGG TCATA SEQ ID No. 4 ;CTATTAAGT CTTTTGATGG GTCA SEQ ID No. 5 Cet amplicon est ensuite combiné avec un mélange de séquençage maître contenant du tampon (Tris-HCI 260 mM, pH 8,3; MgCl2 32,5 mM à 25 C) et une enzyme polymérase telle que la Taq FS (Perkin-Elmer/Applied Biosystems, No. de cat. 402070). Cette polymérase a une vitesse élevée ou un taux élevé d'incorporation de didésoxynucléotide par rapport à la vitesse ou au taux d'incorporation, par exemple, de Taq polymérase classique. Ce mélange est utilisé comme réserve dans les réactions subséquentes. La réaction de séquençage est effectuée sur le gène de protéase au moyen des amorces suivantes: amorces avant: AGCCRATAG ACAAGGAAYT RTAT SEQ ID No. ;AGMCGATAG ACAAGGRVCT GTAT SEQ ID No. amorces réverse: CTTTTGGGC CATCCATTCC T SEQ ID No. D'autres amorces avant qui pourraient être utilisées dans cette étape sont notamment: GAGCCGATAG ACAAGGAACT ATATCC SEQ ID No. GAGCCGATAG ACAAGGAAGT ATATCC SEQ ID No. GAGCCGATAG ACAAGGAAAT ATATCC SEQ ID No. GAGCCGATAG ACAAGGAACT GTATCC SEQ ID No. GAGCCGATAG ACAAGGAAGT GTATCC SEQ ID No. GAGCCGATAG ACAAGGAAAT GTATCC SEQ ID No. GAGCCGATAG ACAAGGGACT GTATCC SEQ ID No. GAGCCGATAG ACAAGGACCT GTATCC SEQ ID No. GAGCCGATAG ACAAGGGCCT GTATCC SEQ ID No. GAGCCGATAG ACAAGGAGCT GTATCC SEQ ID No. GAGCCGATAG ACAAGGGGCT GTATCC SEQ ID No. Pour le gène de réverse transcriptase, trois groupes d'amorces sont utilisés comme suit: Amorces de RT1 avant : TTAAACAAT GGCCATTGAC AGAAGA SEQ ID No. réverse : 3GAATATTGC TGGTGATCCT TTCC SEQ ID No. avant alternée: GTTAAACAAT GGCCATTGAC AG SEQ ID No. Amorces de RT2 avant: GAAGTATACT GCATTTACCA TACCTAG SEQ ID No. 23 GAAGTATACT GCATTTACTA TACCTAG SEQ ID No. 24 AAAGTATACT GCATTCACCA TACCTAG SEQ ID No. 25 GAAATATACC GCATTTACCA TAYCTAG SEQ ID No. 26 réverse : TCTGTATGTC ATTGACAGTC CAGC SEQ ID No. 27 réverse alternée: TCTGTATATC ATTGACAGTC CAGT SEQ ID No. 28 TCTGTATATC ATTGACAGTC CAGC SEQ ID No. 29 TTCTGTATGT CATTGACAGT CCAGC SEQ ID No. 30 Amorces de P2 avant: TTCCCTCAGA TCACTCTTTG G SEQ ID No. 31 TTCCCTCAAA TCACTCTTTG G SEQ ID No. 32 réverse : ACTTTTGGGC CATCCATTCC T SEQ ID No. 33 Les amorces avant de P2 sont nichées ou forment des îlots dans les amorces avant de PR pour séquencer des échantillons qui ne se séquencent pas avec les amorces de PR. Lorsqu'on emploie un dispositif de séquençage qui est capable de détecter et de distinguer deux colorants fluorescents différents (tels que, par exemple, les séquenceurs MicroGene Clipper ou Long-Read Tower de Visible Genetics Inc., les amorces aussi bien avant que réverse sont de préférence marquées chacune avec l'un des deux colorants. Les fragments réverse sont ensuite générés par application de cycles thermiques à l'échantillon par l'intermédiaire de cycles thermiques multiples en présence de l'une quelconque des ddA, ddT, ddC et ddG. L'analyse des fragments de séquençage produits au moyen d'une électrophorèse sur gel permet la détermination des positions de la totalité des 4 bases. Enfin, si le test intermédiaire ne parvient pas à procurer une identification sans ambiguïté du type d'ADN, un séquençage des deux brins peut être effectué. Là encore, les mêmes amorces de séquençage que celles identifiées plus haut peuvent être utilisées. On peut produire des fragments de séquençage avant et réverse dans une seule réaction en utilisant des amorces avant et réverse marquées de façon distinctive, ou dans des réactions séparées selon la nature du système de détection qui est employé. Les réactifs convenant pour la mise en pratique du procédé selon l'invention sont avantageusement conditionnés sous la forme d'ensemble ou kit. Ainsi, l'invention procure un kit ou ensemble pour l'analyse du type génétique d'un gène de VIH-1 dans un échantillon, comprenant : kit pour la réalisation d'un séquençage de quatre bases sur du VIH-1 comprenant une pluralité de mélanges de terminaisons A, C, G et T, chacun des dits mélanges de terminaison comprenant une paire d'amorces parmi une pluralité, chaque paire encadrant une région différente du génome de VIH-1, les paires encadrant ensemble pratiquement la totalité des gènes de protéase et de réverse transcriptase, et au moins un membre de chaque paire étant marqué avec un marqueur détectable. Des sous-kits additionnels pour la réalisation du séquençage de quatre bases peuvent être inclus lorsque l'on souhaite des déterminations intermédiaires et finales sur un brin et sur les deux brins. Telle qu'elle est utilisée ici, l'expression "mélange de terminaison" désigne un mélange contenant un mélange des quatre désoxynucléotide triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dTTP), une espèce de didésoxynucléotide de terminaison de chaîne (ddATP, ddCTP, ddGTP ou ddTTP) et les amorces de séquençage appropriées. Le sous-ensemble pour la réalisation d'un séquençage A et T de VIH-1 peut également être fourni séparément pour la réalisation de la détermination initiale seulement des nucléotides A et T. Un kit préféré de ce type, qu'il soit procuré séparément ou en tant que partie d'un kit pour la réalisation d'un test hiérarchique possède des paires d'amorces dans lesquelles chaque amorce est marquée avec un colorant fluorescent différent et apte à être distingué par spectroscopie, tel que Cy5. 0 et Cy5. 5 et comporte seulement l'un des deux types possibles de mélanges de terminaison, par exemple uniquement le mélange de terminaison T. Les exemples qui suivent sont inclus pour illustrer des aspects de la présente invention et ne doivent en aucune manière être considérés comme limitant l'invention. EXEMPLE 1 La RT-ACP a été effectuée sur l'ARN de VIH-1 au moyen d'un mélange d'enzymes formant des mélanges maîtres de RT-ACP (en anglais RT-PCR Master Mixes) décrits plus loin pour la réalisation de six réactions de RT-ACP. Cette RT-ACP a été mise en oeuvre sur la préparation d'ARN obtenue avec le kit d'ARN dénommé QIAmp Viral RNA kit de Qiagen. Elle peut également être réalisée sur l'extrait d'ARN pour la charge virale de VIH NucliSenseTM (précédemment connue sous la dénomination de NASBA) de Organon Teknica. Tous les réactifs, tubes, embouts et autres matériels doivent être exempts de RNase. La formule est préparée pour 8 réactions (une bande de 8 tubes); y compris 10% d'extra. On a décongelé l'échantillon d'ARN provenant du test de contrôle de VIH dénommé Amplicor HIV Monitor Test et on l'a maintenu sur de la glace. C'était le matériel obtenu à l'étape 14 de la section B "Préparation de spécimen". Si l'on utilise de l'ARN préparé pour l'essai NucliSense, il convient de procéder de la même manière : décongeler et le maintenir sur de la glace. On a pris un tube à centrifuger de 0,2 ml stérile, exempt de RNase (ribonucléase), en l'absence de RNase, et on a préparé le mélange maître I de RT-ACP (suffisamment pour 6 tubes, c'est-à-dire 6 prises d'essai ou échantillons) en ajoutant les constituants suivants dans l'ordre indiqué: MÉLANGE MAÎTRE I DE RT-ACP 7 l de dTT 80 mM 10,5 l de dNTP exempt de RNase à 10 mM pour chaque dNTP 21 ul d'amorce avant d'ACP à 28 uM 21 ul d'amorce réverse d'ACP à 28 M 3,5 l d'inhibiteur de RNase provenant de Roche Molecular Biochemicals, No. de catalogue 799 025 (10.000 U) On a pris un tube à centrifuger de 0,2 ml stérile, exempt de RNase, en l'absence de RNase, et on a préparé le mélange maître II de RT-ACP (suffisamment pour 6 tubes) en ajoutant les constituants suivants dans l'ordre indiqué: MÉLANGE MAÎTRE II DE RT-ACP 70 l de 4x tampon de RT-ACP (Tris HCl 280 mM, MgCl2 9,2 mM, (NH4)2S04 60 mM, 100 g/ml d'ASB acétylée provenant de Life Tech, CA, USA, pH 8,60 à 25 C) 3,5 l d'inhibiteur de RNase à 40U/ l 7 l de Superscript II 8,75 l de mélange d'enzymes dénommé Expand High Fidelity Enzyme System Enzyme Mix provenant de Roche Molecular Biochemicals, No. de catalogue 17333 818 8,75 [il d'AmpliTaq provenant de Roche Molecular Systems. On a pris une bande de 6 tubes à paroi mince. On a ajouté 9 (il de MÉLANGE MAÎTRE II dans chaque tube. On a ajouté 17 l d'échantillon (ARN) dans chaque tube. On peut souhaiter ajouter un témoin négatif par expérience. On a chauffé l'échantillon d'ARN à 90 C pendant 2 min en utilisant le programme ci-dessous ; a refroidi à 50 C et ajouté 14 l du MÉLANGE MAÎTRE II dans chaque tube (étape 3 du programme cidessous). Il convient de veiller à ne pas provoquer une contamination croisée des échantillons. On a débuté la RT-ACP. On a utilisé le couvercle chauffé. Lors de l'utilisation des plaques MJ, il faut indiquer que des tubes sont utilisés lorsque le PTC-200 le demande. La programmation pour le PTC-200 est indiquée ci-après: Calculé 1= 90,0 en permanence 2= 90,0 pendant 2:00 (c'est-à-dire 2 h) 3= 50,0 pendant 1:00:00 4= 94,0 pendant 2:00 5= 1,0 /s jusqu'à 94,0 6= 94,0 pendant 0:30 7= l,0 /s jusqu'à 57,0 8= 57,0 pendant 0:30 9= l,0 /s jusqu'à 68,0 10= 68,0 pendant 2:00 11= aller à 5, 19 fois 12= l,0 /s jusqu'à 94,0 13= 94,0 pendant 0:30 14= 1,0 /s jusqu'à 60,0 15= 60,0 pendant 0:30 16= l,0 /s jusqu'à 68,0 17= 68,0 pendant 2:30 18= aller à 12, 16 fois 19= 68,0 pendant 7:00 20= 4,0 en permanence 21= fin EXEMPLE 2 Pour déterminer la séquence de l'amplicon, on a combiné 7 l de chaque mélange terminateur (16 lorsqu'on utilisait un instrument à deux colorants) avec une quantité de 5 l d'un mélange maître comme suit: MÉLANGE MAÎTRE (système à deux colorants) pour 6 tubes, c'est-à-dire pour 6 échantillons: 10 l de tampon (Tris-HCl 260 mM, pH 8,3 à 25 C, MgCl2 32,5 mM) 475 l d'eau stérile 22,5 l de mélange d'enzymes AmpliTaq FS de Roche Molecular Systems à 15U/ l et de pyrophosphatase à 27 U/ l 5 l du produit d'ACP de l'exemple 1 par tube. Les deux mélanges ont été mélangés doucement avec une extrémité de pipette, et la réaction à cycles thermiques ou thermocyclage a été démarrée. La programmation du PTC-200 était la suivante : Calculé 1= 94,0 pendnt 5:00 2= l,0 /s jusqu'à 94,0 3= 94,0 pendant 0:20 4= l,0 /s jusqu'à 56,0 5= 56,0 pendant 0:20 6= l,0 /s jusqu'à 70,0 7= 70,0 pendant 1:30 8= aller à 2, 29 fois 9= 70,0 pendant 5:00 10= 4,0 en permanence 11= fin Mélanges de terminaison pour systèmes à deux colorants Protéase Mélange-A: ddATP 1,07 aM, dATP 643 ltM, dCTP 643 hum, dGTP 643 m, dTTP 643 M, 330 nM de total d'amorces avant et 330 nM de total d'amorces réverse, Tris-HCl 1 mM, pH 8,0 à 25 C, EDTA 0,1 mM. Mélange-C: ddCTP 2,14 nM, dATP 643 tM, dCTP 643 )M, dGTP 643 M, dTTP 643 M, 330 nM de total d'amorces avant et 330 nM de total d'amorces réverse, Tris-HCl 1 mM, pH 8,0 à 25 C, EDTA 0,1 mM. Mélange-G: ddGTP 2,14 .M, dATP 643 M, dCTP 643 M, dGTP 643 )M, dTTP 643 M, 330 nM de total d'amorces avant et 330 nM de total d'amorces réverse, Tris-HCl 1 mM, pH 8,0 à 25 C, EDTA 0,1 mM. Mélange-T : ddTTP 2,14 M, dATP 643 M, dCTP 643 M, dGTP 643 M, dTTP 643 M, 330 nM de total d'amorces avant et 330 nM de total d'amorces réverse, Tris-HCI 1 mM, pH 8,0 à 25 C, EDTA 0,1 mM. Les amorces ont toutes été marquées, par exemple avec Cy5. 0 et Cy5.5, respectivement. Première région de RT Mélange-A : ddATP 1,07 M, dATP 643 M, dCTP 643 M, dGTP 643 M, dTTP 643 M, 330 nM de total d'amorces avant et 330 nM de total d'amorces réverse, Tris-HCl 1 mM, pH 8,0 à 25 C, EDTA 0,1 mM. Mélange-C : ddCTP 2,14 M, dATP 643 M, dCTP 643 M, dGTP 643 M, dTTP 643 M, 330 nM de total d'amorces avant et 330 nM de total d'amorces réverse, Tris-HCl 1 mM, pH 8,0 à 25 C, EDTA 0,1 mM. Mélange-G : ddGTP 2,14 M, dATP 643 M, dCTP 643 M, dGTP 643 M, dTTP 643 M, 330 nM de total d'amorces avant et 330 nM de total d'amorces réverse, Tris-HCI 1 mM, pH 8,0 à 25 C, EDTA 0,1 mM. Mélange-T : ddTTP 2,14 M, dATP 643 M, dCTP 643 M, dGTP 643 M, dTTP 643 M, 330 nM de total d'amorces avant et 330 nM de total d'amorces réverse. Les amorces ont toutes été marquées, par exemple avec Cy5.0 et Cy5.5, respectivement. Seconde région de réverse transcriptase Mélange-A: ddATP 1,07 M, dATP 643 M, dCTP 643 M, dGTP 643 M, dTTP 643 M, 330 nM de total d'amorces avant et 330 nM de total d'amorces réverse Mélange-C : ddCTP 2,14 M, dATP 643 M, dCTP 643 M, dGTP 643 M, dTTP 643 M, 330 nM de total d'amorces avant et 330 nM de total d'amorces réverse Mélange-G: ddGTP 2,14 M, dATP 643 M, dCTP 643 M, dGTP 643 M, dTTP 643 M, 330 nM de total d'amorces avant et 330 nM de total d'amorces réverse Mélange-T: ddTTP 2,14 M, dATP 643 M, dCTP 643 M, dGTP 643 M, dTTP 643 M, 330 nM de total d'amorces avant et 330 nM de total d'amorces réverse. Les amorces ont toutes été marquées, par exemple avec Cy5.0 et Cy5.5, respectivement. Région de protéase P2 Mélange-A : ddATP 1,07 M, dATP 643 M, dCTP 643 M, dGTP 643 M, dTTP 643 M, 330 nM de total d'amorces avant et 330 nM de total d'amorces réverse Mélange-C: ddCTP 2,14 aM, dATP 643 aM, dCTP 643 M, dGTP 643 rum, dTTP 643 M, 330 nM de total d'amorces avant et 330 nM de total d'amorces réverse Mélange-G : ddGTP 2,14 M, dATP 643 M, dCTP 643 M, dGTP 643 M, dTTP 643 M, 330 nM de total d'amorces avant et 330 nM de total d'amorces réverse Mélange-T: ddTTP 2,14 M, dATP 643 M, dCTP 643 M, dGTP 643 M, dTTP 643 M, 330 nM de total d'amorces avant et 330 nM de total d'amorces réverse. Les amorces ont toutes été marquées, par exemple avec Cy5.0 et Cy5.5, respectivement. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la détermination du type génétique de VIH-1 présent dans un échantillon contenant du VIH-1, comprenant la détermination des positions des nucléotides dans les gènes de protéase et de réverse transcriptase et la comparaison de ces positions aux positions de nucléotides dans des types génétiques connus, utilisant au moins une amorce choisie dans le groupe consistant en SEQ ID Nos. 6, 7, 23, 34, 35, 36, 31, 32 et 33. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les positions des nucléotides sont déterminées par la mise en oeuvre d'une réaction à cycles qui produit des fragments de séquençage aussi bien avant qu'inverses avec utilisation de deux amorces, chaque amorce étant marquée avec un marqueur détectable, différent et apte à être distingué. 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le marqueur est un marqueur fluorescent. 4. Kit pour la mise en oeuvre de séquençage sur un génome de VIH-1, comprenant une pluralité de mélanges de terminaison, chacun des dits mélanges de terminaison comprenant une parmi une pluralité de paires d'amorces, chaque paire encadrant une région différente du génome de VIH- 1, les paires encadrant ensemble pratiquement tous les gènes de protéase et de réverse transcriptase, et au moins un membre de chaque paire étant marqué avec un marqueur détectable, tandis que les amorces sont choisies dans le groupe consistant en: (a) une paire d'amorces pour le séquençage d'une portion du gène de protéase comprenant une amorce avant choisie dans le groupe consistant en SEQ ID Nos. 6,7, 9, 1, 11, 12,13, 14,15, 16, 17,18 et 19, et une amorce inverse ayant la séquence de SEQ ID No. 8; (b) une paire d'amorces pour le séquençage d'une portion du gène de protéase comprenant une amorce avant choisie dans le groupe consistant en SEQ ID Nos. 31 et 32, et une amorce inverse ayant la séquence de SEQ ID No. 33; (c) une paire d'amorces pour le séquençage d'une portion du gène de réverse transcriptase comprenant une amorce avant choisie dans le groupe consistant en SEQ ID Nos. 23 ? 25 et 26, et une amorce inverse choisie dans le groupe consistant en SEQ ID Nos. 27, 28, 29 et 30 ; et(d) des combinaisons des paires d'amorces indiquées dans les paragraphes (a) - (c). 5. Kit selon la revendication 4, dans lequel les amorces dans chaque paire d'amorces sont marquées avec des marqueurs fluorescents différents et pouvant être distingués par spectroscopie.