Brevet FR2799126A1 — publié le 20010406

DESCRIPTION La présente invention porte sur l'activité d'un sesquiterpène acétylénique, à savoir la caulerpényne (1), extrait des algues Caulerpa prolifera et Caulerpa taxifolia. Comme l'ont montré des analyses in vitro de type courant, la caulerpényne présente des activités antitumorales et antioxydantes. Origine L'invention concerne la méthode d'extraction et de purification de la caulerpényne (abréviation = Cyn) à partir d'algues et son utilisation en tant qu'agent antitumoral et qu'agent antioxydant. Initialement isolée de Caulerpa prolifera (V. Amico et coll., Tetrahedron Letters n 38, pages 3593- 3596, 1978), nous avons isolé la caulerpényne de l'algue méditerranéenne Caulerpa taxifolia. Si cette algue n'est présente que de façon clairsemée dans les régions récifales intertropicales qui correspondent à son biotope d'origine, elle peut recouvrir des zones étendues, de 0 à 50 mètres de profondeur, sur les zones envahies des côtes méditerranéennes, principalement en France, en Italie et en Croatie actuellement. Dans ces zones, une exploitation industrielle peut être envisagée. En effet, ce métabolite secondaire est majoritaire dans l'algue Caulerpa taxifolia, il représente de 2 à 12 %o du poids humide de l'algue soit 2 à 12 % de son poids sec, en fonction de la date de récolte de l'algue puisqu'une variation saisonnière de la concentration de Cyn dans l'algue a été mise en évidence, avec un maximum en été (P. Amade et R. Lemée, Aquatic Toxicology n 43, pages 287-300, 1998). Nous avons eu l'idée d'extraire l'algue par des solvants type R-OH, des solvants chlorés (dichlorométhane, chloroforme, ...), des cétones ou tout autre solvant organique bien connu de l'homme de l'art. Lors de la première extraction, on se débarrasse du NaCI et de l'eau. La Cyn extraite est concentrée et purifiée sur supports chromatographiques comme l'alumine ou la silice (préférentiellement) éluée par le mélange de solvants hexane - acétate d'éthyle. On obtient ainsi une Cyn dont le titre en HPLC sur colonne de silice normale éluée par le mélange de solvants : hexane - acétate d'éthyle 80 : 20, est supérieur à 97 %. La caulerpényne est susceptible d'être utilisée en tant que principe actif base de médicaments testés dans les domaines de l'oncologie et des antioxydants. Extraction et purification de la caulerményne L'extrait acétonique de l'algue fraîche Caulerpa taxifolia est concentré, congelé puis ré-extrait par l'acétate d'éthyle pour éliminer l'eau et le sel. Cet extrait est repris par l'heptane pour être chromatographié sur colonne de silice éluée par le mélange de solvants toluène - heptane - acétone dans les proportions 80 : 20 : 1, avant un lavage au méthanol. On obtient une fraction heptanique (H) dont la caulerpényne représente 88 %. La Cyn est purifiée après chromatographie sur colonne Sephadex LH20 PharmaciaTM éluée par le mélange méthanol -eau 70 : puis finalement en HPLC sur colonne de silice éluée par le mélange hexane-acétate d'éthyle 8 : 2 (voir schéma ci-après). La concentration d'une partie de l'extrait heptanique (H) si elle est suivie d'une reprise dans l'éther diéthylique, qui est lui-même ensuite concentré pour être enfin repris par l'hexane, permet d'obtenir un extrait dans lequel la caulerpényne cristallise à froid sous forme de cristaux orthorhombiques qui ont permis l'étude de la structure de la caulerpényne par diffraction des rayons x (cf. tableau 1 en annexe). Schéma d'obtention de la caulerpényne (Cyn) : Extraction 1120 kg d'algues marines humidel 1) Extraction acétonique 2) Concentration 3) Liq./Liq. avec acétate d'éthyle 4) Evaporation sec # Redissoudre dans n-heptane 51 de C 3011 # (500 ml réservés) 5) Congélation -20 C; Décantation pour éliminer l'eau 6) Liq/ Liq # 7) Evaporation sec Il 080 g de matières sèches Lavage 8) Redissoudre env. 2 1 dans toluène 9) Chromato colonne de 15kg Si02 avec éluant : toluène - heptane - acétone 80:20:1 10) Lavage colonne avec MeOH fraction H (2' 140 L) # 488 Isolement env. 100 g # 388 g au congélateur Il) Colonne Sephadex LH-20, éluant MeOH - H20 70 :30 12) 1er : 900 ml = rien , 2ème : 4. 5 à 5 Huile jaune limpide = 66,5 g de Cyn (5 % acétone, traces impuretés) Bilan 1) 258 g de Cyn dans la fraction Il (488 g) 2) Cyn > 2 %o du poids frais de l'algue~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~. Tests antiprolifératifs Les cellules d'origine humaine ont été cultivées de manière classique dans le milieu DMEM supplémenté par 10 % de sérum de veau foetal. Pour les mesures de cytotoxicité, les cellules sont ensemencées dans des boîtes de microtitration. 24 heures après l'ensemencement, la Cyn est ajoutée et après la durée d'exposition prévue, remplacée par du milieu de culture. L'arrêt de l'expérience se fait 48 heures après l'ensemencement des cellules par la technique au MTT. La lecture des densités optiques (DO) se fait avec un spectrophotomètre multicanaux dont on déduit les courbes de cytotoxicité qui sont de type sigmoïde, ainsi que les Cl50. Trois types cellulaires ont été utilisés : i) des cellules de la peau : cultures primaires de mélanocytes, cultures primaires de kératinocytes et kératinocytes immortalisés (HaCaT, HESV) ; ii) des cellules de la moelle épinière : progéniteurs hématopoïétiques CFU-GM ; etiii) des lignées de cellules tumorales : cancers du cou, de la tête,colorectal, glioblastomes. Le mode d'action de la Cyn et ses effets antiprolifératifs ont été étudiés plus précisément sur le modèle oeuf d'oursin, dont les premiers cycles cellulaires sont très synchrones. Résultats obtenus 1- Cellules de la peau et cellules hématopoïétiques. Les IC50 obtenues par le traitement des mélanocytes et des kératinocytes varient de 10 à 24 M alors que celle concernant les progéniteurs hématopoïétiques est de 6 M (D. Parent-Massin et coll., Journal of Toxicology and Enviromental Health n 47, pages 101-113, 1996). 2- Cellules cancéreuses. Les propriétés cytotoxiques de la Cyn étudiées sur 8 lignées différentes de cellules tumorales d'origine humaine en culture montre que pour la majorité des cellules les CI50 sont inférieures à 10 uM et comparables à celles de certains médicaments anticancéreux de référence, les lignées les plus sensibles étant les lignées issues des glioblastomes, les moins sensibles provenaient de mélanomes malins. En présence de Cyn les cellules en culture présente une accumulation en phase S suivie d'un blocage en phase G2/M (J.L.Fischel et coll., Anticancer Research n 15, pages 2155-2160, 1995). Sur tous les modèles, les effets cytotoxiques de la Cyn étaient diminués par sa pré-incubation dans le milieu de culture cellulaire. L'efficacité cytotoxique de la Cyn est influencée par la teneur en protéines du milieu de culture : CI50 variant de 5 à 31 M. Ces premiers résultats indiquent une plus grande sensibilité des cellules se divisant plus rapidement, comme les cellules cancéreuses ou les cellules hématopoïétiques. 3- Oeuf d'oursin. Dans le modèle #uf d'oursin, la Cyn inhibe la division cellulaire avec une CI 50 de 31 M (Pesando et coll., Aquatic Toxicology n 35, pages 139-155, 1996). De plus, elle bloque le cycle cellulaire en début de métaphase quel que soit le moment où elle est ajoutée après la fécondation, ce qui suggère que les évènements proches de la mitose sont altérés par la Cyn. Ceci a été confirmé par des études d'immunomarquages (Pesando et coll., European Journal of Cell Biology n 77, pages 19-26,1998) et un effet très spécifique de ce produit sur des activités enzymatiques impliquées dans la mitose (MAP kinases) a pu être mis en évidence. Test Antioxydant La caulerpényne est testée sur un modèle permettant de tester certains modulateurs positifs ou négatifs de la NOS2 (Nitric Oxyde Synthase inductible) par les kératinocytes. Il est connu que certains antioxydants ont la capacité d'inhiber l'induction de NOS2 qui produit des radicaux libres NO2 et N03. Le test est réalisé sur une culture de kératinocytes humains normaux, issus de prélèvements. L'induction de la NOS2 a été provoqué par l'addition d'une combinaison de plusieurs cytokines au milieu de culture. Les contrôles négatifs (inhibition) ont été effectués avec un inhibiteur classique de NOS2 : le NMMA, Npi-monométhyl arginine sous sa forme D et L, de façon à vérifier la stéréospécificité de l'inhibition. Le produit testé est évalué selon sa capacité à moduler la quantité de nitrites et nitrates produits par rapport au signal témoin (sans cytokines). Le produit testé a été appliqué aux concentrations de 5, 10, 20 et 50 M. La cytotoxicité des produits a été évaluée selon le protocole décrit pour le kit "Cell proliferation Kit II (XTT)" BoehringerTM. Compte tenu de sa structure photosensible, l'exaltation photochimique de ses propriétés est tout à fait envisageable. Résultats antioxydant Les contrôles internes décrits ci-dessus ont représenté une bonne induction de l'enzyme NOS2, qui a été inhibée par le NMMA de façon spécifique. Il n'y a pas de toxicité aux concentrations testées, bien que la morphologie des cellules montre une souffrance à 50 M. Il a été observé une inhibition dose-dépendante de l'induction NOS2 par la caulerpényne, avec une IC50 de 50 M. Les résultats expérimentaux sont les suivants : Dose de Caulerpényne ( M) Inhibition de l'activité enzymatique (%) 5 19 10 45 20 47 50 100 L'ensemble des résultats montre que la Cyn à une activité cytotoxique sur des cellules cancéreuses avec une remarquable spécificité d'action, mais son instabilité naturelle la rend impropre telle quelle en oncologie. Il n'est pas impensable de la stabiliser dans une préparation galénique judicieuse et ainsi de pouvoir l'utiliser dans cette indication. Le fait que la Cyn s'oxyde facilement nous a donné l'idée de tester son activité anti-oxydante. Les résultats obtenus démontrent que cette molécule est un bon agent antioxydant et que son utilisation comme telle est envisageable en pharmacologie ou en cosmétique, en particulier dans des lotions ou crèmes anti-âge, antivieillissement, par exemple (l'algue tueuse deviendrait l'algue tueuse de rides). ANNEXES Tableau 1. Structure et données cristallographiques sur la caulerpényne : 2 diastéréoisomères possibles : rlptenl et rlpten2. Empirical formula C21 H26 06 Formula weight 374.42 Température 293 (2) K Wavelength 0.71069 A Crystal system, space group Orthorhombic, P212121 Unit cell dimensions a = 9.7306(10) A alpha = 90 deg. b = 12.1119(10) A beta = 90 deg. C = 18.510(2) A gamma = 90 deg. Volume 2181.5(4) AA3 Z, Calculated density 4, 1.140 Mg/m'3 Absorption coefficient 0.083 mm'-l F(OOO) 800 Crystal size 0. 24 x 0. 22 x 0. 22 mm Theta range for data collection 2.01 to 26. 97 deg. Limiting indices -4≤h≤12, -5≤k≤15, -7≤I≤23 Reflections collected / unique 7627 / 4554 [R(int) = 0.02231 Completeness to theta = 26.97 100.0 % Refinement method Full-matrix least-squares on F'^2 Data/ restreints/ parameters 4554 / 0 / 323 Goodness-of-fit on F'2 0.999 Identification code rlptenl Final R indices [I>2sigma(I)# RI = 0. 0473, wR2 = 0.1160 R indices (all data) RI = 0.1197, wR2 = 0.1402 Absolute structure parameter -1.8(14) Extinction coefficient 0.0069 (14) Largest diff. peak and hole 0.176 and -0.166 e.A^-3 Identification code rlpten2 Final R indices [I>2sigma(I)# RI = 0. 0472, wR2 = 0.1160 R indices (alldata) RI = 0.1197, wR2 = 0.1403 Absolute structure parameter 2.8 (14) Extinction coefficient 0.0069 (14) Largest diff. peak and hole 0.178 and -0.169 e.A^-3 REVENDICATIONS 1) Extrait brut de caulerpényne caractérisé en ce qu'il est utilisé dans l'élaboration de préparations médicamenteuses ou cosmétiques. 2) Méthode d'extraction et de purification de l'extrait selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'extrait acétonique de l'algue fraîche Caulerpa taxifolia est concentré, congelé puis réextrait par l'acétate d'éthyle pour éliminer l'eau et le sel, cet extrait est repris par l'heptane pour être chromatographié sur colonne de silice éluée par le mélange de solvants toluène - heptane - acétone dans les proportions 80 : 20 : 1, on obtient ainsi une fraction heptanique (H) dont la caulerpényne représente 88 %. 3) Méthode d'extraction selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'on obtient une cristallisation de la caulerpényne à partir de la fraction heptanique (H) qui est partiellement concentrée sous vide restreint, puis reprise dans l'éther diéthylique, qui est lui-même concentré pour être enfin repris par l'hexane, on obtient ainsi un extrait dans lequel la caulerpényne cristallise à froid sous forme de cristaux orthorhombiques (structure Rx, cf. tableau 1 en annexe). 4) Méthode d'extraction selon la revendication 2 caractérisé en ce que la caulerpényne est purifiée à partir de la fraction heptanique (H) en chromatographie liquide à une échelle industrielle (120 kg d'algue humide fournissant plus de 66 g de caulerpényne) après chromatographie sur colonne Sephadex LH20 PharmaciaTM éluée par le mélange méthanol - eau 70 : 30,on obtient finalement une Caulerpényne dont le titre en HPLC sur colonne de silice normale éluée par le mélange de solvants : hexane - acétate d'éthyle 80 : 20, est supérieur à 97 % (cf. schéma présenté dans la description). 5) Extrait brut de l'algue selon la revendication 1 caractérisé par son activité antioxydante lui permettant de montrer une bonne induction de l'enzyme NOS2, qui a été inhibée par le NMMA (Npi-monométhyl arginine sous sa forme D et L) de façon spécifique, il n'y a pas de toxicité aux concentrations testées bien que la morphologie des cellules montre une souffrance à 50 M, il a été observé une inhibition dose-dépendante de l'induction NOS2 par la caulerpényne, avec une IC50 de 50 uM.