Brevet FR2796961A1 — publié le 20010202

La présente invention concerne le domaine de l'immunothérapie et plus particulièrement celui des cellules dendritiques et de leur utilisation à titre d'agent d'immunothérapie. Les cellules dendritiques (DC) jouent un rôle clé dans l'initiation de la réponse immunitaire primaire et des études cliniques pilotes ont mis en évidence leur capacité à induire une immunité anti-tumorale efficace. Les cellules dendritiques, qui sont présentent dans la peau (cellules de Langerhans), dans les muqueuses, le sang périphérique et la moelle osseuse, sont les cellules présentant des antigènes (Antigen-presenting cells ou APC) les plus puissantes dans le système immunitaire. Elles sont caractérisées par une morphologie unique et un phénotype de surface spécifique. En particulier, elles expriment l'antigène CD83 et sont capables d'exprimer des quantités importantes de MHC classes 1 et II et d'initier des réactions mixtes avec les leucocytes (MLR). En revanche, elles sont dépourvues de certains marqueurs myéloides, notamment du marqueur CD14. Etant donné leurs propriétés spécifiques, ces cellules ont été proposées comme éléments essentiels dans les thérapies cellulaires qui nécessitent la présentation d'antigènes aux lymphocytes T. Les cellules dendritiques (DC) ont un mode de différenciation spécifique qui comprend deux stades importants, le stade immature et le stade mature, selon un ensemble de caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles (1,2). Les DC immatures obtenues in vitro à partir de monocytes par culture avec un facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) et une interleukine bloquant la différentiation vers la voie macrophagique (IL-4 ou IL-13) sont analogues aux DC du tissu périphérique, c'est-à-dire aux cellules de Langerhans et aux cellules dendritiques interstitielles. Ces DC immatures sont capables de capturer les antigènes avec une grande efficacité en utilisant des récepteurs spécialisés, tels que les récepteurs pour le fragment Fc des immunoglobulines (FcR) (3,4), le récepteur au mannose (MR) (5) et les récepteurs phagocytaires, en particulier CD36 et l'intégrine [alpha]vss5 (6). Elles peuvent ainsi internaliser les protéines, les lysats de cellules entières, l'ARN et les cellules apoptotiques. En revanche, elles expriment seulement de faibles taux de molécules costimulatrices nécessaires pour l'activation des lymphocytes T. Lorsqu'elles sont exposées à des signaux de maturation, donnés principalement par les antigènes, les cytokines inflammatoires ou les produits bactériens, les DC perdent leurs capacités phagocytaires et endocytaires (5,6) mais accroissent l'expression du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I, du CMH de classe II, l'expression de CD80 et CD86 et deviennent de très puissantes cellules présentant des antigènes (APC). Le passage du stade immature au stade mature est associé à l'expression des récepteurs des chémokines. Les DC matures ont une expression diminuée de CCR1 et CCR5, qui sont les récepteurs des chémokines inflammatoires, les protéines inflammatoires de macrophages MIP-1a, MIP-1ss et RANTES, et de façon concomitante, elles ont une expression augmentée de CCR7, qui est le récepteur pour le ligand E1B (ELC)/MIP-3, lequel est exprimé de façon constitutive dans les organes lymphoïdes secondaires (7-9). Ces changements dans l'expression des récepteurs des chémokines sont importants pour la circulation in vivo des DC. Les DC immatures sont recrutées par les chémokines inflammatoires dans les sites d'entrée des antigènes. Après activation par les antigènes et stimuli inflammatoires, elles perdent les récepteurs CCR1 et CCR5 et acquièrent l'expression de CCR7. Les DC matures peuvent ensuite entrer dans les vaisseaux lymphatiques et migrer vers les ganglions lymphatiques afférents où elles présentent des épitopes dérivés d'antigènes pour les lymphocytes naïfs et les lymphocytes mémoires présents dans ces ganglions. Ainsi, on a déjà proposé de les utiliser en tant que vecteurs pour des vaccinations anti-tumorales (10). Récemment, Nestle et al. ont montré que l'injection intralymphatique de DC immatures activées avec des peptides tumoraux ou des lysats cellulaires tumoraux ont pu provoquer une réponse immunitaire anti-mélanome (11). L'utilisation de cellules dendritiques à des fins d'immunothérapie nécessite plusieurs millions de cellules à plusieurs reprises. De plus, ces cellules doivent être capables de circuler dans le corps humain de manière sélective vers les ganglions pour que le traitement soit efficace. Il importe également de disposer de cellules engagées de façon irréversible dans la voie de différentiation dendritique, c'est-à-dire de cellules matures qui ne soient pas susceptibles de se transformer dans l'organisme en macrophages. Plusieurs études concernant la modulation des récepteurs des chémokines ont été réalisées avec des DC obtenues par culture dans un milieu contenant du sérum de veau fétal (FCS). Or, les antigènes xénogènes peuvent être immunodominants et peuvent gêner le développement de l'immunité antitumorale spécifique. Différentes équipes de chercheurs se sont donc concentrées sur la production de DC dérivées de monocytes dans des milieux exempts de FCS en utilisant des milieux complémentés avec 1 à 10 % de plasma autologue (12-17), de sérum autologue (18) ou d'un pool de sérums humains AB (13,19-22,31). Toutefois, même le sérum autologue peut poser un problème puisqu'il contient de nombreuses protéines, en particulier des anticorps (23) qui peuvent modifier la voie de fixation et de modification intracellulaire des antigènes. De plus, certains antigènes tumoraux de type MUC-1 dans plusieurs cancers ou l'immunoglobuline monoclonale dans le myélome multiple, sont présents dans le sérum à des taux élevés et variables, ce qui peut affecter une présentation reproductible par les DC. Pour toutes ces raisons, des procédés d'obtention de DC capables d'activer les lymphocytes T dans des milieux exempts de sérum ont été proposés (24-26). Les demandes internationales W098/23728, W098/06823 et W098/06826 décrivent également des procédés d'obtention des cellules dendritiques dans des milieux exempts de sérum. La demande internationale W098/06826 décrit entre autre l'utilisation d'un milieu exempt de sérum, le milieu X-VIVO 15 complémenté avec 1% d'albumine humaine (HA). Il est précisé dans cette demande que l'utilisation de 1% de HA n'améliore pas de façon significative la croissance des cellules, leur phénotype ou leur capacité stimulante. De plus, l'expression de CD86 est augmentée au bout de 14 jours de culture dans un tel milieu. On a maintenant trouvé, de façon surprenante, que l'on peut obtenir des quantités importantes de cellules dendritiques, qui peuvent être utilisées en immunothérapie par culture de cellules mononuclées particulières dans un milieu exempt de sérum convenablement complémenté avec de l'albumine humaine en présence d'un facteur stimulant la formation de colonies de granulocytes macrophages (GM-CSF) et d'une cytokine, en particulier l'interleukine-4 (IL-4) ou l'interleukine-13 (IL-13) puis en présence d'au moins un médiateur inflammatoire, tel que par exemple le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-a). Ainsi le procédé de l'invention consiste : 1) à cultiver pendant 4 à 6 jours, de préférence 5 jours des cellules mononuclées issues de cytaphérèse après mobilisation dans un milieu exempt de sérum complémenté avec de l'albumine humaine en présence d'un facteur stimulant les colonies de granulocyte-macrophage (GM-CSF) et d'une interleukine (IL) bloquant la différentiation vers la voie macrophagique ; 2) à ajouter au milieu de culture du TNF-a et éventuellement un médiateur inflammatoire et à poursuivre la culture pendant environ 1 à 4 jours, de préférence 2 jours supplémentaires ; 3) à récupérer les cellules dendritiques ainsi formées. Avantageusement, on peut ajouter au milieu de culture, les deuxième et quatrième jours, du milieu frais contenant du GM-CSF et une interleukine. Selon une variante de mise en oeuvre du procédé de l'invention, on peut utiliser de la prostaglandine E2 (PGE2) conjointement avec le TNF-a. Par "milieu de culture sans sérum" on désigne tout milieu de culture couramment utilisé pour la culture des cellules à des fins cliniques, qui contient les substances nutritives essentielles pour la croissance des cellules hématopoïétiques notamment une source de carbone, d'azote, de la transferrine. Ces milieux sont exempts de sérum humain ou de sérum animal. Des exemples de milieux de culture exempts de sérum appropriés aux fins de l'invention sont décrits par exemple dans W095/00632 et US5 405 772. Des exemples particuliers de tels milieux sont les milieux X-VIVO 10 ou X-VIVO 15 commercialisés par la société Biowhittaker, Walkersville, MD, USA. Le milieu X-VIVO 15 est particulièrement préféré pour la mise en #uvre de l'invention. Le milieu de culture doit être complémenté avec de l'albumine humaine à raison de 1 à 2 % (poids/volume), de préférence 2 %. Par "cellules mononuclées" on désigne les cellules mononuclées (MNC) provenant du sang périphérique de sujets normaux ou de patients présentant un cancer ou toute autre maladie dans laquelle le système immunitaire est impliqué, telle que les maladies infectieuses, virales ou parasitaires, par exemple le Sida ou les maladies dysimmunitaires, telles que par exemple la polyarthrite rhumatoïde, le lupus, etc. Les cellules mononuclées (MNC) utilisées comme produit de départ dans le procédé selon l'invention sont des cellules mononuclées obtenues par cytaphérèse après mobilisation par chimiothérapie et/ou par au moins un facteur de croissance cellulaire. Ainsi, les cellules mononuclées utilisées dans le procédé de l'invention proviennent soit de sujets normaux ou de patients présentant un cancer qui ont été soumis à une chimiothérapie, à savoir à un traitement spécifique à l'aide d'un agent chimiothérapeutique et éventuellement d'un facteur de croissance cellulaire, soit de patients présentant une maladie infectieuse, virale ou parasitaire qui ont été traités avec un facteur de croissance cellulaire, tel que les cytokines, y compris les facteurs de croissance hématopoïétiques. A titre d'exemple de facteur de croissance qui peuvent être utilisés pour la mobilisation des cellules mononuclées, on peut citer : - les facteurs stimulants les colonies de granulocytes (G-CSF), tels que les produits connus sous les dénominations commerciales filgrastim NEUPOGEN de Amgen-Roche, Lenograstim GRANOCYTE de RhônePoulenc/Chugai ; - les facteurs stimulant les colonies de granulocytes-macrophages (GMCSF), tel que les produits connus sous les dénominations commerciales LEUCOMAX de Schering Plough ou le facteur de croissance des cellules souches (SCF) de Amgen. Les cellules mononuclées mobilisées qui sont mises en #uvre selon l'invention comprennent notamment les monocytes, les lymphocytes, les cellules souches hématopoïétiques. La mobilisation par chimiothérapie est réalisée à l'aide de l'agent chimiothérapeutique approprié au type de cancer présenté par le patient, donneur des cellules à utiliser dans le procédé de l'invention. On peut utiliser un agent chimiothérapeutique quelconque, tel que par exemple le cyclophosphamide. Les quantités de GM-CSF, d'interleukine, de TNF-a et de PGE2 à utiliser dans le procédé de l'invention sont celles qui sont habituellement utilisées pour les cultures cellulaires. On précisera que le GM-CSF peut être utilisé à raison de 1 ng/ml à 1 000 ng/ml, de préférence 50 à 500 ng/ml, avantageusement 100 ng/ml de milieu. L'interleukine est généralement utilisée en des quantités allant de 1 ng/ml à 1 000 ng/ml, de préférence 10 à 50 ng/ml, avantageusement 25 ng/ml de milieu. On peut également utiliser le TNF-a à raison de 1 ng/ml à 1 000 ng/ml et la PGE2 à raison de 10 ng/ml à 10 g/ml, avantageusement de 20 ng/ml à 1 g/ml La culture des cellules précurseurs de cellules dendritiques est réalisée dans des récipients en plastique couramment utilisées dans ce domaine, tels que les flacons ou sacs de cultures cellulaires permettant l'adhérence des cellules. La culture est avantageusement réalisée dans des incubateurs dans les conditions normales de culture de cellules (stérilité ; CO2 environ 5 % ; humidité environ 95 % et température environ 37 C). Selon un autre aspect, l'invention a pour objet des cellules dendritiques qui sont [alpha]vss3-; [alpha]vss5+; CCR5- et CCR7+, c'est-à-dire qu'elles sont dépourvues des récepteurs [alpha]vss3- et CCR5 et pourvues des récepteurs [alpha]vss5 et CCR7. Ces cellules dendritiques, qui peuvent être obtenues par le procédé défini précédemment, sont des cellules matures irréversibles. Elles sont utilisables comme agent d'immunothérapie dans toutes les thérapies cellulaires, telles que par exemple le traitement des cancers ou des maladies infectieuses, virales ou parasitaires. Ainsi l'invention a également pour objet l'utilisation des cellules dendritiques [alpha]vss3-; av5+ ; CCR5- et CCR7+ pour la fabrication d'un agent d'immunothérapie utile pour le traitement de toute maladie impliquant le système immunitaire. En effet, avec les cellules dendritiques selon l'invention on peut réduire l'internalisation et la présentation de protéines xénogènes, allogènes ou autologues non identifiées et limiter ainsi les réponses immunitaires qui ne sont pas spécifiques aux antigènes tumoraux. Les DC selon l'invention sont capables de capturer in vivo des antigènes tumoraux soit par endocytose des protéines soit par phagocytose des cellules apoptotiques. Ces DC sont capables de migrer vers les ganglions lymphatiques afin de présenter les peptides dérivés d'antigènes dirigés contre les lymphocytes T. Elles sont également capables de produire l'interleukine-12 favorisant une différenciation des cellules CD8+ naïves en des lymphocytes T cytotoxiques. Elles présentent un phénotype stable après retrait des cytokines utilisées lors des cultures ex vivo. Le procédé de l'invention permet d'obtenir des cellules dendritiques immatures et des cellules dendritiques matures. En présence de GM-CSF et d'une interleukine, on obtient des cellules dendritiques immatures CD83- CD14faible. Ces DC expriment HLA-DR, CD80 et CD86 ainsi que des récepteurs endocytaires et phagocytaires, à savoir MR, CD36 et [alpha]vss5. De plus, ces DC immatures sont capables de phagocyter des cellules tumorales apoptotiques par la phagocytose des monocytes apoptotiques. Une stimulation de ces DC immatures avec du TNF-a plus GM-CSF et IL-4 pendant 2 jours supplémentaires conduit à l'obtention de cellules correspondant de façon phénotypique et fonctionnelle à des cellules dendritiques matures. Ces cellules matures ont exprimé CD83 et des quantités plus élevées de HLA-DR, CD80 et CD86 par rapport aux DC immatures GM/IL-4. Elles sont capables d'activer les lymphocytes T allogènes avec la même efficacité que les DC matures obtenues en présence de FCS. De plus, ces DC matures expriment également des récepteurs endocytaires comme les récepteurs au mannose ou les récepteurs à la phagocytose de type av5 et CD36. Ces DC matures ont toutefois une capacité pour endocyter le dextrane ou phagocyter les cellules tumorales apoptotiques plus faibles que les DC immatures dont elles sont issues. La réponse aux chémokines pour les DC obtenues selon l'invention, a été modulée de façon similaire à celle des DC obtenues dans du milieu contenant du FCS. En fait, les DC immatures obtenues selon l'invention ont exprimé CCR5 et n'ont pas répondu à MIP-3. Ainsi, après injection in vivo, ces cellules devraient être piégées de préférence dans des sites inflammatoires où MIP-1 a, MIP-1 ou RANTES sont produits (25). Après traitement avec du TNF-a, les DC selon l'invention ont perdu l'expression de CCR5 et ont acquis la capacité de répondre à MIP-3. On peut penser qu'une proportion élevée de ces DC matures sera capable d'être piégée dans des zones de ganglions lymphatiques de cellules T où le MIP-3 est produit et d'initier une réponse immunitaire efficace. De plus, on a montré que la PGE2 qui est connue pour accroître la maturation des DC dans des milieux sans FCS (14,21), peut jouer un rôle sur la migration des DC. Dans les conditions de culture selon l'invention, la PGE2 n'a pas largement modifié le phénotype des DC produites avec GM/IL-4 et TNF, à l'exception d'un accroissement de l'expression de CD83, et n'a pas d'effet additif supplémentaire avec TNF-a pour l'activation des cellules T. Toutefois, la PGE2 a accru la migration des DC en réponse à MIP-3. La migration des DC dans les organes lymphoïdes peut donc être sélective. Afin d'induire la production des cellules T cytotoxiques anti-tumorales, les DC doivent être capables de diriger la différenciation des cellules T naïves vis-à- vis du sous-ensemble de type 1 exprimant IFN-y et IL-2. L'IL-12 constitue la cytokine principale impliquée dans la polarisation de cellules TCD4+ vis-à-vis des cellules Th1. Dans le modèle de réponse des cellules T anti-EBV, il a été mis en évidence que l'expression de IL-10 par des lignées cellulaires lymphoblastoïdes est associée avec l'émergence des cellules T CD8+ de type 2 (32) qui produisent IL-4 et IL-10 et qui ne sont pas cytotoxiques (33). Au contraire, les cellules CD8+ de type 1 produisent de l'IFN-y et de l'IL-2 et sont cytotoxiques. Ainsi, des DC produites in vitro à des fins de vaccination anti-tumorale doivent idéalement produire IL-12 et non IL-10. En effet, IL-10 possède un effet nocif supplémentaire sur la maturation des DC. En fait, les DC traitées avec IL-10 pendant la phase de maturation induisent l'anergie spécifique aux antigènes des cellules T CD4+ et CD8+ (25,34). Les DC obtenues selon l'invention, différentes de celles obtenues en présence de FCS (35,36), ont produit uniquement de faibles quantités de IL-12 mais des quantités importantes de IL-10 en réponse à la ligature à CD40, en accord avec les études montrant que les DC myéloïdes étaient capables de produire IL-10, en particulier en suivant la stimulation par CD40 (37,38). Toutefois, on a montré que la maturation des DC induites par TNF-a a entraîné l'induction de la production de IL-12 et une inhibition dramatique de la synthèse de IL-10 après activation par CD40. Ainsi, les DC matures selon l'invention sont capables de déclencher la différenciation des lymphocytes T naïfs en lymphocytes T de type 1. L'addition de PGE2 a de plus inhibé la production de IL-10 mais également la production de IL-12 matures obtenues. L'invention a également pour objet un procédé de traitement immunothérapeutique qui consiste à prélever à un patient à traiter des cellules mononuclées par cytaphérèse après mobilisation par chimiothérapie et/ou un facteur de croissance cellulaire et éventuellement congélation/décongélation, à traiter lesdites cellules selon le procédé défini ci-dessus et ensuite à réinjecter les cellules DC obtenues audit patient. Les DC selon l'invention conviennent en particulier pour les traitements par allogreffes ou autogreffes. L'invention va être illustrée plus en détail par les exemples ci-après donnés à titre non limitatifs et par les figures qui représentent ci-après : - la Figure 1 montre l'effet de la maturation des DC sur l'endocytose de FITC-dextran : A) avec des DC obtenues par culture sur milieu X-VIVO 15-2 % HA en présence de GM-CSF et IL-4 ; B) avec des DC obtenues par culture sur milieu X-VIVO 15-2 % HA en présence de GM-CSF, IL-4 et TNF-a ; C) avec des DC obtenues par culture sur milieu X-VIVO 15-2 % HA en présence de GM-CSF, IL-4 et PGE 2. Les courbes en pointillés correspondent au temps d'incubation des DC avec FITC-dextran de 7 minutes, les courbes en traits pleins à l'incubation pendant 15 minutes et les courbes en traits gras à l'incubation pendant 30 minutes ; sur l'axe des abscisses sont indiquées l'intensité de fluorescence et sur l'axe des ordonnées le nombre d'évènements ; - la Figure 2 montre l'apoptose de cellules XG-1 par le cycloheximide (CHX) par mesure de la fluorescence des cellules colorées par l'Annexin-V FITC et par l'iodure de propidium (PI) ; - la Figure 3 montre la phagocytose des cellules tumorales apoptotiques par les DC immatures et l'absence de phagocytose par les DC matures ; - la Figure 4 montre l'effet de la maturation des DC sur l'expression de CCR5. - la Figure 5 montre la migration des DC matures et la non-migration des cellules immatures en réponse à (ELC)/MIP-3. - la Figure 6 montre l'activation des cellules T allogènes par les DC matures. EXEMPLE 1 : Production des cellules dendritiques (DC) On a recueilli des cellules de cytaphérèse (AC) provenant de quatre patients présentant différents cancers pendant la mobilisation des précurseurs hématopoïétiques avec le cyclophosphamide et le facteur humain de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF, filgrastim ; NEUPOGEN, Amgen-Roche, Neuilly-sur-Seine, France). Chaque lot de cellules AC recueillies a été congelé dans de l'azote liquide puis décongelé et lavé à deux reprises en présence d'un chélateur du calcium et du magnésium. Chaque lot de cellules a ensuite été mis dans un flacon de culture cellulaire contenant du milieu X-VIVO 15 complémenté avec 2 % d'albumine humaine (X-VIVO-2% HA) et on a laissé les cellules adhérer sur la surface du flacon de culture pendant 2 h. On a éliminé les cellules qui n'ont pas adhéré et on a cultivé les cellules qui ont adhéré en présence de 100 ng/ml de GM-CSF (Leucomax, Sandoz, Basel, Suisse) et 25 ng/ml de IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) pendant 7 jours dans du milieu X-VIVO 15 complémenté avec 2 % de HA. A des fins de comparaison, on a également cultivé des cellules qui ont adhéré en présence de 100 ng/ml de GM-CSF et 25 ng/ml de IL-4 soit dans du milieu RPMI 1640 complémenté avec 10 % de FCS (milieu de référence), soit dans du milieu X-VIVO 15 seul ou dans du milieu XVIVO 15 complémenté avec 5 % de SAB, 5 % de sérum autologue ou 5 % de plasma autologue. Dans chaque cas, on a ajouté les deuxième et quatrième jours du milieu frais contenant GM-CSF et IL-4. Après 5 jours de culture, on a ajouté du milieu contenant GM-CSF et IL-4 avec du TNF-a (R&D Systems) à 20 ng/ml ou du TNF-a à 20 ng/ml et du PGE2 (Sigma Chemical, St Louis, MO) à 1 g/ml. Après 48 h, on a recueilli les cellules et on les a comptées. Le rendement en cellules est donné dans le tableau 1 où on constate que le rendement en cellules obtenu en présence de GM-CSF et de IL-4 a atteint 12 % avec du sérum AB, 18 % avec du plasma autologue, 22 % avec du sérum autologue et 16 % avec du HA. Le milieu X-VIVO 15-2 % de HA complémenté avec GM-CSF et IL-4 est le milieu le plus efficace pour obtenir des DC immatures de qualité clinique CD14-/faible CD83- HLA-DR+' exprimant de grandes quantités de CD80 et CD86. Comme le montrent également les résultats du tableau I, le sérum AB, le plasma autologue et le sérum autologue ont été moins actifs que HA pour l'obtention in vitro des DC matures. Etant donné qu'une cytaphérèse de 5 heures permet en général de récupérer 40 à 50 x 109 cellules mononuclées, on a donc pu obtenir dans les conditions opératoires de l'invention 6 à 8 x 109 DC de façon reproductible. Cette quantité de cellules est suffisante pour permettre au moins 6 vaccinations avec 109 DC. La culture de cellules sur milieu X-VIVO 15 seul a été réalisée à partir des cellules de cytaphérèse de 8 donneurs mobilisées par le facteur de croissance hématopoïétique (G-CSF) ou par le cyclophosphamide et le facteur de croissance hématopoïétique. Pour 5 des 8 donneurs, les cellules cultivées en milieu X-VIVO 15 en présence de GM-CSF et d'IL-4 pendant 7 jours avaient une viabilité inférieure à 65% ce qui n'a pas permis d'analyser leur phénotype et leurs fonctions contrairement aux cellules des mêmes donneurs cultivées en présence de XVIVO 15-2% d'albumine humaine, GM-CSF et IL-4 pendant 7 jours. Le milieu X-VIVO 15 seul ne permet pas de générer de façon reproductible des cellules dendritiques immatures. L'addition de 2% d'albumine humaine a permis dans tous les cas une génération de cellules dendritiques parfaitement viables et fonctionnelles et irréversibles. EXEMPLE 2 : Analyse phénotypique par cvtométrie de flux des cellules DC Pour caractériser le phénotype des DC obtenues selon l'exemple 1, on a déterminé le pourcentage de cellules exprimant CD14, HLADR, CD83, CD80 et CD86 par cytométrie de flux (FACS) en utilisant les anticorps monoclonaux suivants : CD1 a-PE, CD14-PE, CD36-FITC, CD80-PE, CD83-PE, HLA-DR-FITC (Immunotech, Marseille, France) ; les anticorps monoclonaux CCR5-PE, CD51/CD61-FITC, CD86-FITC, MR-PE (Pharmingen, San Diego, CA) et les anticorps murins IgG appariés suivant l'isotype (Immunotech). Le phénotype total des DC obtenus selon l'exemple 1 est similaire à celui des DC immatures obtenues par culture dans le milieu RPMI en présence de FCS (tableau 1). En utilisant le milieu X-VIVO 15 complémenté avec du sérum AB, du plasma autologue ou du sérum autologue, le pourcentage des cellules CD14+ a été grandement augmenté (jusqu'à 80 % dans du X-VIVO 15-sérum AB) et les cellules résultantes ont exprimé une densité plus faible de HLA classe Il et de molécules costimulatrices. En revanche, selon le procédé de l'invention, c'est-à-dire avec le milieu X-VIVO 15-2 % de HA, on a pu obtenir un nombre élevé de DC (CD14-, HLA-DR++, CD80++, CD86++) sans addition de protéines xénogènes, de protéines allogènes, d'anticorps humains ou d'antigènes tumoraux autologues non identifiés. Des résultats similaires ont été obtenus avec des AC provenant de quinze donneurs, cultivées dans les conditions opératoires de l'invention, c'est-à-dire dans un milieu X-VIVO 15 complémenté avec 2 % d'albumine humaine en présence de GM-CSF, IL-4 et TNF-a avec ou sans PGE2. Ces résultats figurent dans le tableau II. Le CD83, marqueur spécifique des DC matures, a pu être détecté après 24 h de culture en présence de TNF-a et a atteint un maximum d'expression en 48 h. La combinaison de PGE2 et TNF-a a induit l'expression de CD83 jusqu'à 83 % de cellules par rapport à 64 % avec du TNF-a seul (p = 0,007) (tableau Il). Les PGE2 ont également coopéré avec le TNF-a pour la régulation en amont de CD80 et CD86 sur les DC (tableau 1 et tableau Il). Dans une autre série d'expériences, on a opéré dans les mêmes conditions que ci-dessus sauf que le cinquième jour, on a ajouté la PGE2 sans TNF-a. Le pourcentage des cellules CD14+ obtenues en présence de GM-CSF + IL-4 + PGE2 était supérieur à celui obtenu en présence de GM-CSF et IL-4 seuls, ce qui suggère que le PGE2, lorsqu'il est utilisé sans TNF-a induit la réversion d'au moins certaines DC immatures en cellules de type macrophage bien que le GM-CSF et IL-4 étaient continuellement présents dans le milieu de la culture. De la même façon, quand les DC immatures, obtenues dans du X-VIVO 15-2 % de HA complémenté avec GM-CSF et IL-4, ont été récoltées le septième jour, lavées de façon extensive et cultivées dans le milieu de culture sans cytokine pendant 3 jours supplémentaires, elles ont de nouveau adhéré au sac de culture et ont exprimé CD14. Il s'agit là d'une réversion de ces DC immatures en cellules de type macrophage. En revanche, la morphologie cellulaire et le phénotype cellulaire des DC matures, produites par addition de TNF-a seul ou de TNF-a + PGE2, n'ont pas été affectés de façon marquée après retrait des cytokines, ce qui indique que la maturation a eu lieu de manière irréversible. EXEMPLE 3 : Endocvtose par MR On a étudié l'endocytose au niveau cellulaire des DC obtenues par culture de cellules AC mobilisées selon le traitement indiqué dans l'exemple 1 dans du milieu X-VIVO 15 - 2 % HA en présence de GM-CSF et d'IL-4 pendant cinq jours. Le cinquième jour, on a ajouté du milieu frais contenant GM-CSF et IL-4, ou GM-CSF, IL-4 et TNF-a ou GM-CSF et IL-4, TNF-a et PGE2. Le septième jour, on a déterminé l'expression de MR, CD36, av3 et av5 par la méthode d'analyse FACS. Pour déterminer l'expression du marqueur MR on a opéré selon la méthode décrite par Tarte et al. (27) en utilisant du FITC-dextran pouvant fixer la lysine, MM = 40 000 (Molecular Probes Inc., Eugene, OR). On a recueilli les DC immatures et matures le septième jour et on les incubées à 37 C pendant 7, 15 et 30 min ou à 4 C pendant 30 min (fixation de fond) avec 1 mg/ml de FITC- dextran. On a ensuite lavé les DC avec du PBS froid complémenté avec 1 % de FCS et 0,02 de NaN3 et on a analysé la fluorescence avec un appareil FACScan. La moyenne du pourcentage de cellules positives obtenues par culture des AC de six donneurs est indiquée dans le tableau III. Ces résultats montrent que les DC immatures obtenues dans du XVIVO 15-2 % de HA par culture de 7 jours avec GM-CSF et IL-4 ont largement exprimé des MR et cette expression a significativement diminué de plus de 50 % lors de la maturation des DC induite soit par TNF-a seul (p = 0,03), soit par TNFa + PGE2 (p = 0,03). L'endocytose du FITC-dextran par les cellules matures obtenues selon l'invention avec du TNF-a ou du TNF-a + PGE 2 a profondément diminué par rapport aux DC immatures comme cela est montré par la Figure 1. EXEMPLE 4 : Induction de l'apoptose dans les cellules plasmatiques malignes Pour tester le potentiel phagocytaire des DC obtenues selon le procédé de l'invention, on a utilisé des cellules tumorales apoptotiques. XG-1 est une lignée cellulaire de myélome multiple dont les caractéristiques ont été décrites en détail par Zhang et al. (28). On a incubé des cellules XG-1 (2,5 # 105/ml) avec 4 m/ml de cycloheximide (CHX) dans du milieu RPMI 1640-10 % de FCS complémenté avec 3 ng/ml de IL-6 à 37 C. On a enregistré la cinétique de l'apoptose cellulaire en utilisant une double coloration avec le colorant connu sous la dénomination Annexin-V FITC (Boehringer Mannheim, Meylan, France) et de l'iodure de propidium (PI) (Sigma). Dans un premier temps, les cellules apoptotiques ont été colorées uniquement par l'Annexin-V (Annexin-V+/PI-) tandis que dans un deuxième temps, les cellules nécrotiques ont incorporé également du PI en raison d'une perte de l'intégrité de leur membrane (Annexin-V+/PI+). Après traitement avec le CHX, on a lavé les cellules tumorales à trois reprises dans du X-VIVO 15-2 % de HA avant de les mettre en coculture avec des DC obtenues selon le mode opératoire décrit à l'exemple 1. Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 2. Ces résultats montrent qu'après 6 h de culture avec 4 g/ml de CHX, 60 % des cellules de myélome XG-1 ont montré des caractéristiques de mort cellulaire apoptotique précoce, c'est-à-dire une liaison de Annexin-V mais une non-incorporation de PI. EXEMPLE 5 : Phagocytose des cellules apoptotiques La phagocytose des cellules apoptiques constitue un autre mode d'entrée des antigènes et joue un rôle majeur dans le phénomène d'amorçage croisé. Récemment, plusieurs récepteurs phagocytaires ont été identifiés sur les DC obtenues en présence des sérums humains et il a été montré qu'un milieu conditionné pour des monocytes (MCM), qui conduit à une maturation des DC irréversible, régule en aval leur expression (6). On a teinté en vert les DC immatures et matures en utilisant du PKH67-GL (Sigma) et on les a cultivées pendant 2 h pour permettre la libération du colorant non lié. On a teinté en rouge des cellules XG-1 en utilisant du PKH26-GL (Sigma) selon les instructions du fabricant avant leur induction pour subir l'apoptose par CHX pendant 6 à 8 h. Ensuite, on a cocultivé les cellules XG-1 teintées en rouge avec des DC immatures ou matures teintées en vert dans un rapport de 1:1 dans du X-VIVO 15-2 % de HA selon le protocole décrit par Albert et al. (6) . Après 90 min à 37 C, on a analysé les fluorescences vertes et rouges avec un appareil FACScan. Dans les expériences de blocage, on a co-incubé les cellules XG-1 et les DC à 4 C. Les marqueurs CD36, [alpha]vss3 et [alpha]vss5 ont été déterminés selon la méthode par marquage par anticorps monoclonaux et cytométrie de flux. Pour la coloration de [alpha]vss5, on a tout d'abord incubé les cellules avec un anticorps mAb primaire av5 (Chemicon Int, Temecula, CA), puis avec un anticorps de chèvre anti-Ig de souris conjugué à FITC (Immunotech). On a réalisé les analyses avec un appareil FACScan (Becton Dickinson). Les données provenant d'une expérience représentative parmi 3 sont représentées sur la figure 3. Plus d'un tiers des DC immatures ont englouti des XG-1 apoptotiques après 90 min de coculture. Seuls 10 à 12 % des DC immatures ont été teintées deux fois après coculture avec des cellules XG-1 non-apoptotiques. La phacocytose des cellules tumorales par des DC immatures a été confirmée visuellement sur des cytospines de cocultures teintées. La phagocytose a été complètement bloquée à basse température (figure 3). L'induction de la maturation des DC a produit une diminution de l'activité phagocytaire. En effet, seuls 12 % des DC matures obtenues après addition de TNF-a ont internalisé les XG-1 apoptotiques après 90 min de coculture (figure 3). Une même diminution de la phagocytose a été obtenue avec des DC matures obtenues avec TNF-a + PGE2 (figure 3). Dans les conditions de l'invention, les DC immatures ont exprimé des quantités élevées de CD36 et d'intégrine avp5; en revanche l'intégrine av3 n'a pas été détectée comme le montrent les résultats consignés dans le tableau III. Ces résultats montrent également qu'en présence de TNF-a, les expressions de CD36 et [alpha]vss5 ont été significativement diminuées respectivement de plus d'un demi (p - 0,002) et de 20-35 % (p = 0,03). Le PGE2 n'a pas eu d'effet supplémentaire avec le TNF-a pour la diminution de l'expression des récepteurs phagocytaires. EXEMPLE 6 : Réponse aux chémokines des DC On a répété l'opération avec six donneurs différents et on a mesuré l'intensité moyenne de fluorescence (MFI). Les résultats obtenus figurent dans le tableau 4. 1) détection du récepteur CCR5 Dans ce test, on a utilisé l'anticorps monoclonal anti-CCR5 (Pharmingen, San Diego, CA, USA) pour détecter le récepteur CCR5 qui est un récepteur pour les chémokines inflammatoires. On a incubé les cellules DC matures ou immatures obtenues dans le milieu X-VIVO 15 - 2 % HA avec ledit anticorps marqué et on a mesuré l'expression de CCR5 pour un donneur. Les résultats sont rassemblés dans les figures 4a, 4b et 4c. Dans cet exemple, on a recherché la présence du CCR5 sur les DC immatures et les DC matures produites dans du milieu X-VIVO 15 - 2 % HA. Le CCR5, a été détectable sur les DC immatures produites dans du milieu X-VIVO 15-2 % HA mais son expression a été significativement réduite par une incubation de 48 h avec du TNF-a (p = 0,03). Le PGE2 n'a pas induit de diminution significative supplémentaire (figure 4) (p = 0,25). 2) détection du récepteur CCR7 Comme aucun anticorps monoclonal n'était disponible pour mesurer l'expression de CCR7, on a testé la réponse des DC à MIP-3 dans un essai de chimiotactisme. On a introduit les DC immatures et matures (2 x 105 cellules) dans 100 l de RPMI-1 % de HA dans la chambre supérieure d'un dispositif de séparation de cellules constitué de deux chambres de culture cellulaire (une chambre inférieure et une chambre supérieure séparées par un filtre ayant des pores de 5 m permettant le passage des cellules migratrices (dispositif Transwell de Costar, Cambridge, MA). Dans la chambre inférieure, on a introduit 600 NI de ELC/MIP-3 dilués à 100 ng/ml dans le même milieu. Après une incubation de 4 h à 37 C, on a recueilli les cellules qui ont migré dans la chambre inférieure et on a comptées au microscope. On a exprimé les résultats par le pourcentage des cellules d'entrée qui ont migré dans la chambre inférieure (pourcentage des cellules migratrices). La migration des DC provenant d'un donneur en l'absence et en présence de MIP-3ss est représentée sur la figure 5A et les résultats obtenus avec les DC issues d'AC de 6 donneurs avec MIP-3 sont consignées sur la figure 5B. Les DC immatures cultivées avec GM-CSF et IL-4 n'ont pas répondu à MIP-3 (pourcentage moyen de cellules qui ont migré : 0,7 %, n=6). L'addition de TNF-a au cinquième jour a accru significativement la réponse des DC (p = 0,002) avec une moyenne de 14,2 % de cellules en migration (n = 6). Le PGE2 a agi de façon synergique avec TNF-a puisque 31 à 67 % (moyenne : 48,8 %, n = 6) des DC maturées avec TNF-a + PGE2 ont migré jusqu'à la chambre inférieure du dispositif transwell pendant une durée d'incubation de 4 h à 37 C (p = 0,002) par rapport aux DC maturées avec du TNF-a. Ceci a été associé à une légère augmentation de la migration spontanée des DC (une moyenne de 7 % des DC d'entrée a été trouvée dans la chambre inférieure en l'absence de MIP-3ss). EXEMPLE 7 : Analyse des cytokines On a récolté les DC immatures et matures obtenues après 7 jours de culture dans du X-VIVO 15-2 % de HA, on les a lavées et on les a étalées à raison de 4 x 105/ml dans du RPMI 1640-5 % de FCS avec ou sans cellules L transfectées par 105/ml de CD40L, (fourni par le Docteur Sem Saeland, Schering-Plough, Dardilly, France). Lorsque cela était indiqué, on a ajouté de l'IFN-y humain recombinant (1000 U/ml, R&D Systems). On a recueilli les surnageants 24 h à 30 h après stimulation et on les a stockés à -70 C. On a mesuré les quantités de IL-10 et p70 IL-12 par ELISA selon le mode opératoire du fabricant (R&D Systems). Les DC immatures obtenues avec du GM-CSF/IL-4 n'ont pas produit p70 IL-12 mais ont produit des quantités très élevées de IL-10 après déclenchement par CD40 (tableau 5). L'addition de IFN-y avec la stimulation par CD40 a entraîné une diminution de 30 fois de la production d'IL-10 par des DC immatures activées par CD40. L'induction de la maturation des DC avec du TNF-a a entraîné une diminution dramatique de la production de IL-10 induite par CD40 (réduction moyenne de 10 fois) en association avec l'induction de l'expression de IL-12. L'addition de IFN-y a encore inhibé la production de IL-10 par des DC matures. Ceci est en accord avec les rapports précédents montrant que l'IFN-y pouvait être un cofacteur pour la production de IL-12 induite par CD40 (29,30). Toutefois, pour l'échantillon testé des trois autres patients, l'IFN-y a réduit la production de IL-12 par DC obtenue en présence de GM-CSF/IL-4 et TNF-a. Enfin, l'induction d'une DC totalement mature avec du TNF-a et PGE2 a entraîné une production réduite de IL-10 et IL-12 après stimulation par CD40 par rapport à TNF-a seul. EXEMPLE 8 : Réaction des lymphocytes mixtes allogènes (MLR) On a purifié des lymphocytes T non activés (HLA DR-) à partir de sang périphérique de volontaires en bonne santé par deux cycles de sélection négative en utilisant des microbilles revêtues de CD14 et de CD19 (Dynal, Oslo, Norvège), suivi par un cocktail d'anticorps mAbs CD16, CD56 et HLA-DR (Immunotech) et de microbilles d'anti-lg de souris de chèvre (Dynal). La pureté des cellules T CD3+ était supérieure à 97 %. On a ajouté des nombres progressifs de DC traitées par de la mitomycine (50 g/ml) à 1,5 x 105 cellules T allogènes dans 200 NI de RPMI-5 % de SAB. Après 5 jours de culture, on a mesuré la prolifération des cellules T par incorporation de thymidine tritiée (1 pCi/puits) pendant les 12 dernières heures. On a exprimé les résultats par les coûts moyens par minute (cpm) l'écart type déterminé dans des puits de culture sextuplés. Les résultats de la figure 6 montrent que la maturation des DC obtenues dans du X-VIVO 15-2 % de HA les a transformées en stimulateurs des cellules T allogèniques aussi puissants que les DC matures produites dans du RPMI-10 % de FCS. Le TNF-a seul a donné les mêmes résultats que l'association de TNF-a et PGE2. Références 1. Hart, D. N. J. 1998. Dendritic cells: unique leukocyte populations which control the primary immune response. Blood 90:3245. 2. Banchereau, J. and R. M. Steinman. 1998. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392:245. 3. Fanger, N. A., D. Voigtlaender, C. Liu, S. Swink, K. Wardwell, J. Fisher, R. F. Graziano, L. C. Pfefferkorn, and P. M. Guyre. 1997. Characterization of expression, cytokine regulation, and effector function of the high affinity IgG receptor Fc gamma RI (CD64) expressed on human blood dendritic cells. J. Immunol. 158:3090. 4. Fanger, N. A., K. Wardwell, L. Shen, T. F. Tedder, and P. M. Guyre. 1996. Type I (CD64) and type Il (CD32) Fc gamma receptor-mediated phagocytosis by human blood dendritic cells. J. Immunol. 157:541. 5. Sallusto, F., M. Cella, C. Danieli, and A. Lanzavecchia. 1995. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class Il compartment: downregulation by cytokines and bacterial products [see comments]. J Exp. Med. 182:389. 6. Albert, M. L., S. F. A. Pearce, L. M. Francisco, B. Sauter, P. Roy, R. L. Silverstein, and N. Bhardwaj. 1998. Immature dendritic cells phagocytose apoptotic cells via alphavbeta5 and CD36, and cross-present antigens to cytotoxic T lymphocytes [In Process Citation]. J. Exp. Med. 188:1359. 7. Sozzani, S., P. Allavena, G. D'Amico, W. Luini, G. Bianchi, M. Kataura, T. Imai, O. Yoshie, R. Bonecchi, and A. Mantovani. 1998. Differential regulation of chemokine receptors during dendritic cell maturation : a model for their trafficking properties. J. 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Tableau I Analyse phénotypique des DC Milieu Cytokines Rendement (%) Moyenne des pourcentages de cellules positives (IMF) CD14 HLA-DR CD83 CD80 CD86 RPMI-FCS GM/IL-4 9 10 (32) 100 (180) 3 80(72) 82(53) GM/IL-4/TNF 10 4 100 (465) 86(47) 98 (120) 90 (126) GM/IL-4/TNF/PGE2 10 3 100 (417) 94 (65) 98 (190) 100 (188) XV-sérum AB GM/IL-4 12 80(52) 100 (115) 0 77(32) 90 (22) GM/IL-4/TNF 14 25(69) 100 (224) 25(40) 95(60) 85(50) GM/IL-4/TNF/PGE2 13 40 (50) 100 (173) 52 (80) 90 (60) 100 (95) XV-plasma autologue GM/IL-4 18 40 (35) 100 (90) 0 25 (30) 90 (65) GM/IL-4/TNF 19 20 (29) 100 (125) 20(55) 35(42) 90 (110) GM/IL-4/TNF/PGE2 23 12 (60) 100 (145) 80 (65) 80 (58) 110 (160) XV-sérum autologue GM/IL-4 22 50(35) 100 (95) 9 (12) 28(26) 85(68) GM/IL-4/TNF 25 26 (66) 100 (120) 17 (25) 39(33) 90(92) GM/IL-4/TNF/PGE2 23 40 (70) 100 (115) 59 (66) 72 (68) 95 (150) XV-HA GM/IL-4 16 21 (13) 100 (172) 0 82(46) 85(80) GM/IL-4/TNF 16 5 100 (270) 55(43) 100 (110) 95(97) GM/IL-4/TNF/PGE2 20 3 100 (251) 85(66) 100 (136) 100 (133) XV-HA = milieu X-VIVO 15-2 % d'albumine humaine GM = facteur GM-CSF Tableau Il Analyse phénolytique de DC obtenues par culture dans du milieu XV-HA complémenté avec GM-CSF, IL-4 et TNF-a avec ou sans PGE2 Cytokines CD14 HLA-DR CD83 CD80 CD86 GM/IL-4/TNF 2,6 8,2 100 64 19 100 100 Moyenne des %*** SD - 299 183 44 7 140 49 251 211 GM/IL-4/TNF/PGE2 1,5 4 100 83 12** 100 100 Moyenne des %*** SD - 265 124 61 25* 190 85 345 271 * p Tableau III Profil des récepteurs des DC Conditions de culture Moyenne des % de cellules positives (IFM) MR CD36 [alpha]vb3 avb5 XV-HA GM/IL-4 98 (233) 88(89) 0 87(43) XV-HA GM/IL-4/TNF 80 (95)* 37 (47)** 0 68 (32)* XV-HA GM/IL-4/TNF /PGE2 74 (91)* 25 (33)** 0 58 (36)* XV-HA = milieu X-VIVO 15 - 2 % HA * p Tableau IV : CCR5 Conditions de culture GM+IL-4 GM+IL-4+TNF GM+IL-4+TNF+PGE2 Donneur 1 8 4 3 Donneur 2 12 6 5 Donneur 3 14 6 5 Donneur 4 10 5 5 Donneur 5 10 4 4 Donneur 6 11 6 6 IFM 10,8 5,2 4,7 p = 0,03 p = 0,25 Tableau V Production de cytokines par les DC Conditions de culture Production de cytokines (pg/ml) sans stimulation stimulation avec CD40 stimulation avec CD 40 + IFN-y IL-10 IL-12 IL-10 IL-12 IL-10 IL-12 XV-HA GM/IL-4 25 9 0 1619 529 5,5 6,3 50 57 158 ~ 274 (16-35) (1105-2360) (0-11) (14-115) (0-476) XV-HA GM/IL-4/TNF 0 0 137 104 84 23 7 7 299 518 (62-285) (55-105) (0-21) (0-898) XV-HA GM/IL-4/TNF/PGE2 0 0 64 61 7,2 ~ 8,8 0 16 ~ 29 (0-145) (0-18) (0-50) REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'obtention de cellules dendritiques, caractérisé en ce qu'il consiste : 1) à cultiver, pendant 4 à 6 jours, de préférence 5 jours, des cellules mononuclées issues de cytaphérèse après mobilisation, dans un milieu exempt de sérum complémenté avec de l'albumine humaine en présence d'un facteur stimulant les colonies de granulocytes- macrophages (GM-CSF) et d'une interleukine (IL) bloquant la différentiation vers la voie macrophagique ; 2) à ajouter au milieu de culture du TNF-a et éventuellement un médiateur inflammatoire et à poursuivre la culture pendant environ 1 à 4 jours, de préférence 2 jours supplémentaires ; 3) à récupérer les cellules dendritiques ainsi formées. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'interleukine est l'interleukine-4 ou l'interleukine-13. 3. Procédé selon l'une des revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le médiateur inflammatoire est le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-a). 4 Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le médiateur inflammatoire est le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-a) et la prostaglandine E2 (PGE2). 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les cellules mononuclées sont des cellules mononuclées obtenues par cytaphérèse après mobilisation par chimiothérapie et/ou par au moins un facteur de croissance cellulaire. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le GM-CSF, l'interleukine et le TNF-a sont chacun utilisés à raison de 1 à 1000 ng/ml de milieu. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'albumine humaine est utilisée à raison de 1 à 2 % (poids/volume de milieu), de préférence 2 %. 8. Cellules dendritiques irréversibles caractérisées en ce qu'elles sont [alpha]vss3-, [alpha]vss5+, CCR5- et CCR7+. Utilisation des cellules dendritiques irréversibles [alpha]vss3-, avp5+, CCR5' et CCR7+ pour la préparation d'un agent d'immunothérapie utile pour le traitement de toute maladie impliquant le système immunitaire.