Brevet FR2807164A1 — publié le 20011005

La présente invention concerne un nouveau procédé permettant la détection et le dosage immunochimique des protéines de réserve de céréales dans une matière premiere ou dans un produit transformé. La détection ou dosage des protéines de réserve de céréales dans un substrat présente un intérêt dans de nombreux secteurs techniques, et même dans le domaine médical. Ce dosage présente particulier de l'intérêt pour les personnes atteintes de la maladie coeliaque, puisque les symptômes de cette maladie (nausées, diarrhées, pertes de poids ... ) sont liés à l'ingestion de protéines de réserve (appelées prolamines) certaines céréales, notamment de protéines de blé, d'orge, de seigle ou d'avoine. Parmi les prolamines de blé (gluten) on distingue les gliadines qui sont des protéines monomériques et les gluténines qui forment des polymères. Les prolamines des autres céréales comportent des types homologues. Le dosage des prolamines de céréales peut être réalisé par des techniques de type immunochimique, en particulier des dosages de type ELISA ( Enzyme Linked Immunosorbent Assay , voir par exemple le Guide pratique d'analyses dans les industries des céréales; B.GODON et W.LOISEL coordonnateurs - collection Sciences et Techniques Agroalimentaires - Editeur Lavoisier Paris - 1997 pages 488 à 518). On peut aussi mettre en ceuvre des techniques de dosage biochimique, en particulier par chromatographie HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Les dosages ELISA des protéines de céréales présentent de nombreux avantages par rapport aux dosages biochimiques ; en particulier ils assurent - une spécificité de la détection, qui évite une extraction sélective des différentes classes de prolamines avant le dosage, et qui permet un dosage à partir de matrices complexes (par exemple des aliments) ; - une rapidité et une simplicité opératoires qui rendent possible le traitement de nombreux échantillons simultanément; - une bonne sensibilité. Les principaux problèmes pour le dosage immunochimique des gliadines et/ou des gluténines dans les farines ou les produits dérivés sont liés aux difficultés d'extraction des protéines et à l'obtention d'anticorps de spécificité adaptée. Les gluténines de la farine ou les gliadines agrégées par chauffage (dans un aliment par exemple) ne sont extractibles qu'en présence d'agents réducteurs ou dissociants ; cependant ces agents affectent la réactivité des anticorps et ils ne sont pas compatibles avec la réalisation de dosages ELISA type compétitif ou sandwich. Les gliadines de la farine sont facilement extractibles dans les solutions alcooliques (éthanol en particulier). Mais la fiabilité du protocole d'extraction éthanolique est pas optimale, en particulier cette fiabilité est fortement affectée le chauffage des aliments ; d'autre part, en fonction du pourcentage éthanol de la solution d'extraction (qui peut varier selon le protocole ' oeuvre et selon les manipulateurs), l'extraction des gliadines est plus moins quantitative et sélective, ce qui entraîne par la suite une variabilité du dosage. A titre indicatif, un test de dosage immunochimique des gliadines a été développé par SKERRITT et HILL (Monoclonal antibody sandwich enzyme immunoassays for determination of gluten in foods. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1990, 38, 1771-1778; et: Enzyme immunoassay for determination of gluten in foods : collaborative study, Journal of the Association of Official Analytical Chemistry 1991, 74, 257-264) pour le controle des aliments destinés aux malades cceliaques. Le test correspondant est basé sur la détection des w-gliadines des anticorps monoclonaux, après extraction éthanolique. Comme les c0-gliadines sont des protéines thermostables le dosage peut être réalisé non seulement à partir de produits crus, mais également à partir de produits transformés ayant subi une cuisson. Ce test présente cependant différents inconvénients. En effet, comme on vient de le voir ci-dessus, le protocole d'extraction éthanolique présente des défauts de fiabilité relativement importants. En outre même si les co-gliadines présentent des propriétés de thermostabilité, leur extractibilité peut être affectée par l'insolubilisation des autres protéines présentes dans l'aliment. Egalement, les co-gliadines ne représentent qu'un faible pourcentage gliadines totales et leur teneur varie beaucoup d'une variété à l'autre (de 6 à des gliadines totales) ; ainsi, selon la composition du produit par rapport a celle du témoin de calibration, il existe un risque de sur ou de sous-évaluation de la teneur en gliadines totales du produit. D'autre l'anticorps monoclonal anti-co-gliadines donne des réactions croisées avec les gluténines et son affinité diffère pour les prolamines de ble, du seigle de l'orge, ce qui entraîne des différences importantes dans dosage protéines non tolérés par les malades coeliaques (en particulier, l'anticorps anti-co-gliadines ne détecte que faiblement les prolamines de l'orge). présente invention propose une nouvelle méthode pour détecter et doser les protéines de réserve des céréales dans un substrat cru ou ayant subi une cuisson, et ceci de manière plus fiable que les techniques actuelles. procédé conforme à la présente invention consiste à soumettre substrat base dispersé dans un milieu liquide à une opération d'hydrolyse partielle adaptée pour fragmenter les protéines en éléments peptidiques polypeptidiques, puis à effectuer un dosage immunochimique au moyen d'au moins anticorps sur la fraction soluble de l'hydrolysat obtenu. L'hydrolyse partielle est menée dans des conditions adaptées pour découper les prolamines en fragments de plus petite taille solubles dans des solutions compatibles avec la réalisation du dosage immunochimique choisi. Les conditions correspondantes d'hydrolyse partielle doivent aussi être adaptées pour conserver intacts les épitopes reconnus par le ou les anticorps utilisés dans le de dosage immunochimique choisi. La méthode d'extraction peut recouvrir tous types de clivage mais on utilise préférence une technique d'hydrolyse de type enzymatique. méthode de dosage immunochimique utilisée est de préférence une méthode ELISA de type compétitif ou sandwich utilisant des anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-peptide (anticorps obtenus contre des peptides synthetiques ou contre des peptides issus d'une hydrolyse des prolamines), capables de reconnaître les fragments générés par l'extraction préalable des prolamines. La solution d'extraction sera alors choisie compatible avec la réalisation dosage de type ELISA ; on peut utiliser de l'eau ou des solutions salines pH neutre ou faiblement acide ou basique, ne contenant pas, ou en très faible quantité, de solvant organique, d'agent réducteur ou dissociant. L'originalité du procédé conforme à la présente invention est de combiner l'hydrolyse partielle des prolamines et l'utilisation d'anticorps capables de reconnaître les prolamines hydrolysées. L'hydrolyse partielle prolamines permet de maîtriser leur extraction ; on utilise de préférence anticorps anti-peptide afin de maîtriser la reconnaissance de ces protéines. L'hydrolyse ménagée des prolamines natives ou cuites, en peptides ou poly-peptides plus petite taille permet d'augmenter la solubilité des protéines. L'extraction de l'ensemble des prolamines (gliadines et gluténines) est réalisée de façon quantitative ce qui assure une bonne fiabilité du dosage. L'utilisation d'anticorps anti-peptide améliore la spécificité des anticorps. En effet, cette stratégie permet de sélectionner, parmi les séquences protéiques disponibles dans les bases de données, les peptides ou les régions utilisées pour les immunisations et donc de mieux maîtriser la réaction anticorps vis-à-vis des différentes prolamines. Une sélection judicieuse des épitopes reconnus par les anticorps permet conséquence de développer un dosage plus fiable de la ou des protéines recherchées. Dans le cadre de la maladie coeliaque notamment, on peut sélectionner les séquences repétitives présentes dans toutes les céréales non tolérées (blé, seigle, orge ...) il est possible d'obtenir des anticorps dirigés spécifiquement contre ces peptides répétitifs, qui ne reconnaissent pas les prolamines des céréales tolérées (maïs, riz ... ). La méthodologie de dosage conforme à la présente invention peut présenter un intérêt dans différents secteurs, notamment la sélection variétale, le contrôle qualité en industrie alimentaire, ou les analyses spécialisées. Diverses applications sont envisageables telles que - la détection et dosage du gluten dans les aliments destinés aux malades coeliaques (et dans certains cas aux personnes allergiques à la farine de blé). - le contrôle des matières premières et des produits finis destinés à l'alimentation infantile (mélange de farines de différentes céréales ... ). - contrôle des protéines résiduelles en amidonnerie. - contrôle de la composition des produits et de l'étiquetage (par exemple pour produits carnés, contrôle de la substitution des protéines animales par du gluten pour des raisons de coût, pour ses propriétés texturantes ou autre ... ). - le dosage des différentes classes de prolamines (gliadines, sous unités gluténines) dans les grains (sélection variétale) ou la farine pour estimer la qualité technologique des blés. Les exemples ci-après permettent de mettre en évidence l'intérêt du procédé conforme à la présente invention. Exemple 1 Préparation de l'hydrolysat Un gluten industriel sous forme de poudre (500 mg) est disperse dans solution d'acide acétique (10 ml) à l'aide d'un homogénéisateur 2000 tours/min. pendant 1 minute) ; le pH de la dispersion est ajusté au pH optimum l'enzyme utilisée (à savoir pH 2 pour la pepsine) et la dispersion est placée dans un bain-marie à 38 C. La pepsine (2 FIP Ulmg) est rajoutée dans un rapport enzyme/substrat de 1I100 masse pour masse. Après 2 à 3 heures d'hydrolyse sous agitation continue l'enzyme est inactivée par chauffage (3 minutes au bain-marie à 100 C) puis l'hydrolysat est lyophilisé. L'hydrolysat est ensuite solubilisé à 1 mg/ml dans un tampon basique contenant 0,1 % de SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) et la solution est agitée pendant une nuit. Après centrifugation (2400 g pendant 15 minutes) la fraction soluble est utilisée pour le dosage. Dosage ELISA = préparation d'une courbe de calibration Les protéines de réserve présentes dans l'échantillon sont dosées par un ELISA de type compétitif. Dans ce test l'antigène à doser est en competition pour la liaison à l'anticorps avec un antigène immobilisé sur la plaque de microtitration. La réponse observée est inversement proportionnelle à la quantité d'antigène à doser. L'antigène immobilisé sur la plaque de microtitration est un hydrolysat de gluten obtenu avec pepsine (voir a)) ; l'hydrolysat est adsorbé sur la plaque à une concentration 1 #tglml pendant 2 heures à 37 C. Après trois lavages, les sites libres la plaque de microtitration sont saturés avec une solution protéique (lait ecrémé en poudre à 2 %) pendant 1 heure à 37 C puis la plaque est de nouveau lavée trois fois. Pour obtenir une courbe de calibration l'échantillon (hydrolysat de gluten) est dilué dans un tampon salin de 200 à 50.000 fois. L'hydrolysat à différentes dilutions est ensuite préincubé avec les anticorps 1 heure à 37 C, puis ce mélange est rajouté dans puits de la plaque (incubation 1 heure à 37 C). Les anticorps utilisés dans exemple sont des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre un peptide synthétique correspondant à un motif répétitif de la séquence des aa-gliadines, à savoir PQQPYPQQPC ; les anticorps sont dilués au 1/1000'ème. Après trois lavages, la réaction des anticorps avec les antigènes immobilisés est révélée par ajout d'un second type d'anticorps polyclonaux dirigés contre les anticorps de lapin et marqués à phosphatase alcaline (dilution 1I3000, incubation d'une heure à 37 C). Apres trois lavages, le substrat de la phosphatase alcaline (para nitrophenylphosphate) est rajouté et l'absorbance est lue ' 405 nm après 30 minutes d'incubation. Les résultats sont exprimés pourcentage d'inhibition : (1- A/Ao) x 100 où A correspond à l'absorbance mesurée pour une dilution donnée de l'antigène à doser et Ao à l'absorbance mesurée en absence de l'antigène à doser. On obtient la courbe d'étalonnage illustrée sur la figure 1. c) Résultats Un dosage la méthode classique de Kjeldahl des protéines totales sur le substrat de base et sur la fraction soluble de l'hydrolysat préparé selon a) montre l'hydrolyse ménagée du gluten permet d'obtenir une solubilité de 95 % du gluten dans le tampon basique contenant 0,1 % de SDS. Avant hydrolyse le gluten n'était soluble qu'à 70 % dans ce tampon. La courbe d'étalonnage illustrée sur la figure 1 présente une zone de linéarité qui se situe entre 0,1 1 pglml de gluten. On peut donc en tirer la conclusion qu'un dosage par ELISA compétitif est possible. Remarque : L'étape de lyophilisation de l'hydrolysat n'est pas obligatoire ; les mêmes résultats ont été obtenus sans lyophilisation, dans ce cas l'hydrolysat est dilué directement dans le tampon basique. Exemple 2 Cet exemple s'applique au même gluten industriel que dans l'exemple 1 mais soumis en plus à une cuisson d'une heure au bain-marie (100 C), apres dispersion dans l'eau. Après lyophilisation, le gluten cuit (500 mg) est dispersé dans une solution d'acide acétique (10 ml) à l'aide d'un homogénéisateur; pH de la dispersion est ajusté à pH 2 et la dispersion est placée dans un bain- marie. La pepsine est rajoutée dans un rapport enzyme/substrat de 1/1 masse pour masse. Après 2 à 3 heures d'hydrolyse sous agitation continue pepsine inactivée par chauffage (3 minutes au bain-marie à 100 C) puis l'hydrolysat lyophilisé. L'hydrolysat est solubilisé à 1 mg/ml dans un tampon basique contenant 0,1 % de SDS et la solution est agitée pendant une nuit. Après centrifugation (2400 g pendant 15 minutes) la fraction soluble est utilisée pour le dosage. Les protéines de réserve présentes dans l'échantillon sont dosées par un ELISA compétitif avec des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre un peptide synthétique correspondant à un motif répétitif de la séquence des ap- gliadines (ici : PQQPYPQQPC), selon le même protocole que celui décrit dans l'exemple 1. Résultats : Un dosage par la méthode de Kjeldahl des protéines totales sur substrat de base et sur la fraction soluble de l'hydrolysat préparé montre l'hydrolyse ménagée du gluten cuit permet d'obtenir une solubilité de 94 % du gluten dans le tampon basique contenant 0,1 % de SDS, alors qu'avant hydrolyse solubilité dans ce tampon est de 37 %. La même solubilité est obtenue pour le gluten cuit et pour le gluten natif (Voir exemple 1). La figure présente la comparaison de la réponse obtenue vis-à-vis échantillon gluten natif (exemple 1) et d'un échantillon de gluten cuit (selon exemple 2) dans un ELISA compétitif, après hydrolyse ménagée de échantillons. remarque que les courbes de dosage ELISA obtenues pour gluten natif gluten cuit sont superposées. Ces résultats indiquent que cuisson du gluten n'a pas d'influence sur l'extraction et la reconnaissance prolamines, constitue un progrès important par rapport aux methodes déjà existantes, et ce qui permet l'application de cette méthode aux produits soumis à traitement thermique (cuisson, stérilisation ...). Exemple 3 Cet exemple montre la faisabilité du dosage des protéines de réserve du blé lorsqu'elles sont incorporées dans une matrice alimentaire contenant des protéines de viande. 0,16 % masse à masse du gluten industriel de l'exemple 1 été incorporés dans un plat cuisiné industriel lyophilisé à base de carottes de poulet destiné à l'alimentation infantile. L'échantillon (1 est dispersé dans 15 ml de solution d'acide acétique à l'aide d'un homogéneisateur (12000 tours/min. pendant 2 minutes) ; le pH de la dispersion est ajusté ' pH 2 et la dispersion est placée dans un bain-marie. La pepsine (2 FIP Ulmg) est ajoutée dans un rapport enzyme/substrat 1I100 calculé en masse d'enzyme par masse de protéines totales du produit. Après deux heures d'hydrolyse sous agitation continue l'enzyme est inactivée par chauffage dans un micro-ondes (1 min. 600 w, puis 1 min. 440 w, puis 1 min. 100 w). L'hydrolysat est ensuite dilué par 2 dans un tampon basique contenant 0,1 % de SDS et la solution est agitée pendant une nuit. Après centrifugation (2400 g pendant 15 minutes) la fraction soluble est utilisée pour le dosage. Les protéines de réserve présentes dans l'échantillon sont dosées par un ELISA compétitif avec des anticorps polyclonaux de lapin diriges contre un peptide synthétique correspondant à un motif répétitif de la séquence des ap- gliadines, selon le même protocole que celui décrit dans l'exemple 1, avec des dilutions de l'échantillon allant du 20'èn'e au 5000'ème. Res u ltats figure 3 présente la comparaison de la réponse obtenue vis-à- ' du gluten temoin (exemple 1) et d'un produit alimentaire enrichi en gluten dans un test ELISA compétitif, après hydrolyse enzymatique ménagée de ces échantillons. Les courbes obtenues pour le gluten natif et le gluten contenu dans le plat carottes-poulet sont superposées ce qui montre que l'incorporation du gluten dans une matrice alimentaire complexe n'a pas d'influence sur l'hydrolyse du gluten, son extraction et son dosage par le test ELISA. Exemple 4 Cet exemple s'applique au même gluten industriel que dans l'exemple Le même traitement d'hydrolyse ménagée que dans l'exemple 1 est utilise. L'hydrolysat est mis en solution à 1 mg/ml dans un tampon basique contenant 0,1 % de SDS et la solution est agitée pendant une nuit. Après centrifugation (2400 g pendant 15 minutes) la fraction soluble est utilisée pour le dosage. Les protéines de réserve présentes dans l'échantillon sont dosées par un ELISA compétitif selon un protocole similaire à celui décrit dans l'exemple L'antigène immobilisé sur la plaque de microtitration est un hydrolysat de gluten obtenu avec pepsine (adsorbé sur la plaque de microtitration à concentration 0,5 pglml). L'échantillon est dilué du 50'eme au 1000'eme. L'anticorps utilise pour ce dosage est un anticorps monoclonal dirigé contre peptide synthétique correspondant au motif répétitif de la séquence des gliadines (ici : PQQPFPQGC) ; le surnageant de culture est dilué au 10'ème. La fixation des anticorps à l'antigène immobilisé est révélée par l'ajout d'anticorps dirigés contre les anticorps de souris et marqués à la phosphatase alcaline (dilution 1I3000). Résultats : La courbe de dosage obtenue est représentée sur la figure 4. Un dosage par ELISA compétitif est possible avec l'anticorps monoclonal correspondant puisque cette courbe de dosage présente une zone de linéarité (située entre 1 et 20 pg/ml de gluten). - REVENDICATIONS - 1.- Procédé pour détecter et doser les protéines de réserve céréales dans un substrat, caractérisé en ce qu'il consiste - à soumettre le substrat dispersé dans un milieu liquide à opération d'hydrolyse partielle adaptée pour fragmenter les protéines éléments peptidiques ou polypeptidiques, puis - à effectuer un dosage immunochimique au moyen d'au moins un anticorps sur la fraction soluble de l'hydrolysat obtenu, l'hydrolyse partielle étant menée dans des conditions adaptées pour libérer des fragments peptidiques ou polypeptidiques qui sont solubles dans solutions compatibles avec le type de dosage immunochimique utilisé et conservent intacts les épitopes reconnus par le ou les anticorps utilisés. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer le dosage immunochimique au moyen d'au moins un anticorps anti- peptide. 3.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre le substrat à une opération d'hydrolyse de type enzymatique. 4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il consiste à disperser le substrat dans un milieu liquide adapté à l'enzyme utilisé, avant de soumettre ledit substrat à l'opération d'hydrolyse enzymatique. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer un dosage immunochimique de type ELISA après l'opération d'hydrolyse partielle du substrat. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre le substrat à une opération d'hydrolyse enzymatique par la pepsine, puis à effectuer un dosage immunochimique de type ELISA au moyen d'anticorps dirigés contre un peptide correspondant à un motif repétitif de la séquence des #P-gliadines. - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce 'il consiste à soumettre le substrat à une opération d'hydrolyse enzymatique par la pepsine, puis à effectuer un dosage immunochimique de type ELISA au moyen d'anticorps dirigés contre un peptide correspondant à un motif répétitif de la séquence des y-gliadines.