Brevet FR2800077A1 — publié le 20010427

FACTEUR CHIMERIQUE DE TRANSCRIPTION A ACTIVITE CONDITIONNELLE, ET SES UTILISATIONS POUR LA DETECTION D'INTERACTIONS ENTRE PROTEINES. La présente invention est relative à de nouveaux procédés de détection et d'analyse des interactions entre des protéines ou des séquences peptidiques. L'étude des interactions entre les protéines ou des sous-domaines de protéines est une approche essentielle pour la compréhension de mécanismes cellulaires fondamentaux, de mécanismes moléculaires intégrés ou isolés ou pour le criblage de molécules possédant des actions biologiques, etc... Le procédé appelé "méthode double-hybride" permettant de détecter des interactions protéine-protéine a été mis au point par FIELDS & SONG (FIELDS & Song, Nature 340,245-246, 1989 ; Brevet US 5283173). Ce procédé est basé sur la co-expression, dans une cellule de levure : - d'un gène rapporteur, dont le cadre ouvert de lecture est placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur régulé par des régions permettant la fixation du domaine de liaison à l'ADN (dénommé domaine BD, pour Binding Domain ) d'un activateur de la transcription de l'ARN polymérase II (PolII) ; - d'un gène chimérique codant pour une protéine de fusion entre une première protéine test, et un domaine BD capable de se fixer sur les régions de l'ADN contrôlant le gène rapporteur ; - d'un gène chimérique codant pour une protéine de fusion entre une seconde protéine test, et un domaine d'activation (AD pour Activating Domain ) d'un activateur de transcription PolII. Si les deux protéines de fusion interagissent, un activateur de transcription fonctionnel est reconstitué, et on observe l'expression du gène rapporteur. Ce système permet d'étudier les interactions entre deux protéines (ou domaines peptidiques) connues ou bien de rechercher, par criblage de banques de fusion, des protéines pouvant interagir avec une protéine donnée. Initialement, le système double-hybride a été développé chez S. cerevisiae, en plaçant le gène rapporteur sous la dépendance des séquences UASG (Upstream Activating Séquences des gènes GAL). Ces séquences sont reconnues par l'activateur de transcription Gal4p. Dans ce cas, un des gènes chimériques code pour une protéine fusionnée au domaine BD de Gal4p (acides aminés 1-147) alors que l'autre gène code pour une protéine fusionnée au domaine AD de Gal4p (acides aminés 769-881). De nombreuses variations du système double-hybride ont été développées. Cependant, l'utilisation de gènes rapporteurs transcrits par l'ARN polymérase II limite les applications de ce système. Notamment, cette technique ne permet pas, par exemple, d'étudier les interactions impliquant une protéine susceptible d'activer la transcription par l'ARN polymérase II. Pour remédier à cette limitation, un système dénommé ci après double-hybride PolIII a été développé ; ce système est décrit notamment dans la Demande PCT WO/96/37618 au nom du Commissariat à l'Energie Atomique, ainsi que dans la publication de Demande PCT WO/96/376181, ou dans la publication de MARSOLIER et SENTENAC, [Methods in Enzymology, 303,411- 422 (1999)]. Le système double-hybride PolIII est basé sur l'utilisation, en tant que gène rapporteur, d'un gène transcrit par l'ARN polymérase III. Dans ce gène rapporteur, une région permettant la fixation d'un facteur de transcription PolIII est inactivée et remplacée par une région permettant la fixation d'un domaine BD d'un activateur de transcription PolII. Ce gène rapporteur est exprimé dans la même cellule qu'un gène chimérique codant pour une protéine de fusion associant l'une des protéines à tester avec le domaine BD dudit activateur de transcription PolII, et qu'un gène chimérique codant pour une protéine de fusion associant une autre protéine à tester avec une sous-unité dudit facteur de transcription PolIII. En cas d'interaction entre les 2 protéines, un facteur de transcription fonctionnel est reconstitué, et on observe l'expression du gène rapporteur. Ce système a par exemple été mis en #uvre en utilisant en tant que gène rapporteur, le gène SNR6 ; ce gène, qui est transcrit en ARN U6 intervenant dans l'épissage des introns, est indispensable pour la survie des cellules. Une région du gène SNR6 dénommée boîte B (qui permet la fixation à l'ADN de la sous-unité T138 du facteur de transcription PolIII TFIIIC, et est nécessaire à la transcription de ce gène), est inactivée et remplacée par des séquences UASG. Ce gène rapporteur (dénommé UASG-SNR6), est associé à 2 gènes chimériques ; le premier code pour une protéine de fusion associant l'une des protéines-test avec le domaine BD de Gal4p (acides aminés 1-147) ; second code pour une protéine de fusion associant l'autre protéine-test avec la sousunité #138 de l'activateur de transcription PolIII TFIIIC. Lorsque ces constructions sont introduites dans une même souche de levure, le gène UASG-SNR6 n'est transcrit que s'il existe une interaction entre les 2 protéines-test. Cette transcription peut être détectée par quantification des transcrits, ou par un test de survie cellulaire. Dans le premier cas, le gène rapporteur UASGSNR6 est modifié (par exemple par insertion d'un oligonucléotide dans la partie transcrite) de manière à ce que ses transcrits puissent être distingués de ceux du gène SNR6 sauvage présent dans la cellule. Dans le second cas on utilise une souche de levure dont le gène SNR6 chromosomique est inactivé, et dont la survie est assurée par la présence d'un plasmide portant le gène SNR6 sauvage, et le marqueur de sélection URA3. Du fait de la présence de ce marqueur, cette souche ne pousse pas en présence d'acide 5-Fluoro-orotique (5FOA). Lorsque les 3 constructions mentionnées ci-dessus sont introduites dans cette souche cultivée en présence de 5-FOA, celle-ci ne peut pousser que si elle perd le plasmide portant le marqueur URA3 et le gène SNR6 sauvage, c'est à dire s'il existe une interaction entre les 2 protéines test, permettant la transcription du gène UASG-SNR6- Pour faciliter encore l'utilisation du système double-hybride PolIII, notamment dans le cadre du criblage de molécules actives, les Inventeurs ont maintenant développé un nouveau système de sélection conditionnelle des interactions. Ce système est basé sur l'utilisation de cellules de levure transformées, dans lesquelles la ou les copie(s) sauvage(s) d'un gène X transcrit par la polymérase III, et assurant une fonction vitale pour la cellule, a (ont) été inactivée(s). En remplacement du gène X, ces cellules comprennent un gène X' pouvant assurer la même fonction vitale que le gène X, et dérivé de celui-ci par l'inactivation d'une région (qui sera dénommée ci-après région SC) du promoteur PolIII dudit gène, reconnue spécifiquement par un facteur de transcription PolIII et permettant la fixation dudit facteur de transcription, et son remplacement par une région (dénommée ci-après région SC') permettant la fixation d'un autre domaine peptidique de liaison à l'ADN. Dans la même cellule est exprimé un facteur de transcription PolIII chimérique, dont le domaine de liaison à l'ADN est capable de se fixer spécifiquement sur la région SC', et dont la capacité à activer la transcription par la PolIII est conditionnelle. La fonction vitale ne peut être assurée que par l'intermédiaire de la transcription du gène X', qui ne peut s'effectuer qu'en conditions permissives pour l'activité dudit facteur de transcription chimérique. Ces cellules peuvent être transformées par des vecteurs d'un système double-hybride PolIII exprimant des protéines dont on souhaite tester l'interaction. Ces vecteurs sont choisis de manière à ce que, s'il existe une interaction entre les 2 protéines testées, la fonction vitale peut être assurée et les cellules sont viables dans des conditions non-permissives pour l'activité du facteur de transcription chimérique. La présente invention a pour objet un facteur de transcription chimérique constitué par une protéine de fusion comprenant : - un domaine I choisi parmi : les sous-unités d'un facteur de transcription PolIII, et les mutants conditionnels desdites sous- unités, et - un domaine II choisi parmi : les domaines peptidiques de liaison à l'ADN et les mutants conditionnels desdits domaines ; caractérisé en ce qu'au moins l'un des domaines I ou II est un mutant conditionnel. On définit comme mutation conditionnelle une mutation qui se manifeste par un phénotype de type sauvage sous certaines conditions, dites conditions permissives , et par un phénotype mutant sous d'autres conditions, dites conditions non-permissives ou conditions restrictives . Un mutant conditionnel d'une sous-unité d'un facteur de transcription PolIII est un mutant de l'une des sous-unités d'un facteur TFIIIB ou TFIIIC capable de participer à l'activation de la transcription par l'ARN PolIII, en conditions permissives, mais non en conditions restrictives. Un domaine peptidique de liaison à l'ADN est un peptide capable de reconnaître spécifiquement une séquence-cible d'ADN, permettant ainsi la fixation, au niveau de ladite séquence-cible, de toute protéine comprenant ledit peptide. Un mutant conditionnel d'un domaine peptidique de liaison à l'ADN est un mutant capable de se lier, en conditions permissives, mais non en conditions restrictives, à la séquence-cible reconnue par ledit domaine. Pour l'obtention d'un facteur de transcription chimérique conforme à l'invention, on choisira de préférence le domaine I dans le groupe constitué par les sous-unités #138, #131, i95 et r91 du facteur TFIIIC, et les mutants conditionnels desdites sous-unités. Avantageusement, le domaine I est constitué par un mutant thermosensible de #138. Par exemple, le domaine I est constitué par un mutant de #138 obtenu par délétion de tout ou partie du domaine central (acides aminés 330-760), et qui comprend au moins le domaine Cterminal (acides aminés 761-1160) de #138, et de préférence, comprend également le domaine N-terminal (acides aminés 1-329) de #138. Les Inventeurs ont en effet constaté que certaines mutations de #138, et notamment des délétions de tout ou partie du domaine central (acides aminés 330- 760), qui semblaient ne pas affecter l'activation de la transcription de UASG-SNR6 lorsqu'elles sont fusionnées à Gall-147 [MARSOLIER et al., 1997, J. Mol. Biol. 268,243- 249], sont des mutations thermosensibles, dont l'effet se manifeste à partir de 37 C, jusqu'à une inhibition totale de l'activation de la transcription à 38 C. Pour l'obtention d'un facteur de transcription chimérique conforme à l'invention, le domaine II sera choisi parmi les domaines de liaison à l'ADN autres que celui de la sous-unité du facteur de transcription PolIII du domaine I. A titre d'exemples non-limitatifs, il pourra notamment être choisi parmi les domaines de liaison à l'ADN des activateurs de transcription PolII, tels que le domaine 1-147 de l'activateur de transcription GAL4, qui reconnaît spécifiquement les séquences UASG ; le domaine de fixation de LexA [BRENT and PTASHNE, Cell, 43,729-736, (1985) ] ou celui des récepteurs nucléaires d'hormones telles que les oestrogènes [LE DOUARIN et al. Nucleic Acids Research, 23,876-878, (1995) ], les glucocorticoïdes, l'hormone de croissance, et les mutants conditionnels desdits domaines de liaison à l'ADN ; il pourra également être choisi parmi les domaines de liaison à l'ADN de Rapl [GILSON et al. J. Mol. Biol., 231,293-310 (1993) ], de ORC6, [LI et HERSKOWITZ, Science, 262,1870-1874 (1993) ], et leurs mutants conditionnels. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, le domaine II est un mutant thermosensible du domaine de liaison à l'ADN de GAL4 (Gal4BD). Les Inventeurs ont par exemple montré que la mutation P26L de Gal4BD (remplacement de la proline en position 26 par une leucine), dont l'effet précédemment connu était une modification de la capacité de Gal4p à se fixer sur l'ADN en fonction de la concentration en ions Zn2+ [JOHNSTON Nature, 328,353-355, (1987) ; JOHNSTON et DOVER, Genetics, 120,63-74, (1988) ], était également une mutation partiellement thermosensible, dont l'effet se manifeste à partir de 37 C. La présente invention a également pour objet des séquences d'acide nucléique codant des facteurs de transcription chimériques conformes à l'invention, ainsi que des vecteurs recombinants, notamment des vecteurs d'expression comprenant lesdites séquences, et des cellules, notamment des cellules de levure, transformées par lesdites séquences et exprimant un facteur de transcription chimérique conforme à l'invention. Des levures-hôtes utilisables pour la mise en #uvre de la présente invention sont notamment des levures du genre Saccharomyces, en particulier de l'espèce Saccharomyces cerevisiae. On peut toutefois utiliser également des cellules de levures appartenant à d'autres genres, par exemple des cellules de Schizosaccharomyces pombe. Des vecteurs d'expression conformes à l'invention comprennent au moins une séquence d'acide nucléique codant un facteur de transcription chimérique conforme à l'invention, associée à des éléments de contrôle de la transcription actifs chez la levure. Des vecteurs, ainsi que des éléments de contrôle de la transcription, utilisables chez la levure et permettant la construction de vecteurs d'expression conformes à l'invention sont connus en eux-mêmes, et seront choisis notamment en fonction de la levure-hôte que l'on souhaite utiliser. Lorsque le domaine II est un mutant thermosensible du domaine de liaison à l'ADN de GAL4, on placera de préférence une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur faible. A titre d'exemple de promoteur faible utilisable chez Saccharomyces cerevisiae on citera notamment le promoteur CYC1 porté par le vecteur p416CYC1 [ATCC 87384 ; MUMBERG et al., Gene, 156, pll9-122 (1995)]. Des vecteurs d'expression conformes à l'invention comprennent en outre avantageusement un marqueur de sélection, par exemple un marqueur URA3 permettant leur élimination (par exemple par une chasse au 5-FOA dans le cas d'un marqueur URA3). Ceci permet, le cas échéant, d'éliminer l'activateur chimérique pour confirmer qu'il n'est pas fonctionnel en conditions restrictives. Des cellules transformées conformes à l'invention sont de préférence des cellules dans lesquelles un gène X, normalement transcrit par l'ARN polymérase III et indispensable à la viabilité cellulaire a été inactivé, et qui comprennent au moins une copie d'un gène X' dérivé dudit gène X par inactivation d'une région SC du promoteur dudit gène permettant la fixation d'un facteur de transcription par la polymérase III et par insertion d'une région SC' permettant la fixation, en conditions permissives, d'un facteur de transcription chimérique conforme à l'invention. Avantageusement, ladite cellule comprend en outre un gène X'' dérivé du gène X par inactivation de la région SC, et son remplacement par une région SC'', différente de SC', et permettant la fixation d'un domaine peptidique de liaison à l'ADN autre que le domaine II d'un facteur de transcription chimérique conforme à l'invention. A titre d'exemples non limitatifs : - si le gène X est le gène SNR6, la région SC est de préférence le bloc B ; ce cas, le gène X', et s'il y a lieu le gène X'' seront tous deux dérivés de SNR6 par inactivation du bloc B, et addition respective d'une région SC' reconnue en conditions permissives, par le domaine II d'un facteur de transcription chimérique conforme à l'invention, et d'une région SC'' reconnue par un domaine peptidique de liaison à l'ADN autre que ledit domaine II. - si le domaine II d'un facteur de transcription chimérique conforme à l'invention est un mutant conditionnel du domaine BD de GAL4, la région SC' du gène X' comprendra une ou plusieurs séquence(s) UASG dans ce cas, la région' SC' du gène X'' pourra par exemple comprendre un ou plusieurs opérateur(s) LexA, ou un ou plusieurs élément(s) de réponse à un récepteur hormonal nucléaire ; si le domaine II d'un facteur de transcription chimérique conforme à l'invention est un mutant conditionnel du domaine BD de LexA, la région SC' du gène X' comprendra un ou plusieurs opérateur(s) LexA, et la région SC'' du gène X'' pourra par exemple comprendre une ou plusieurs séquence(s) UASG, ou un ou plusieurs élément(s) de réponse à un récepteur hormonal nucléaire. Le gène X' et/ou le gène X'' peuvent être intégrés dans le chromosome de la cellule, ou portés par un ADN extra-chromosomique, par exemple un plasmide. De préférence, au moins une copie du gène X' est intégré dans le chromosome de la cellule, par exemple à l'emplacement du gène X sauvage. Des copies supplémentaires peuvent être portées par des plasmides. La transcription du gène X' dans des cellules conformes à l'invention telles que décrites ci-dessus ne peut s'effectuer que par l'intermédiaire d'un facteur de transcription chimérique à activité conditionnelle conforme à l'invention, et en conditions permissives pour l'activité de celui-ci, et le gène X'' n'est pas transcrit. Des cellules transformées conformes à l'invention peuvent être utilisées, comme cellules-hôtes dans le cadre du système de sélection conditionnelle des interactions entre protéines mentionné ci-dessus. La présente invention a pour objet un procédé de détection des interactions entre deux peptides ou deux domaines peptidiques Ti et T2, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend : i) la co-transformation d'au moins une cellule de levure telle que définie ci-dessus, exprimant un facteur de transcription chimérique conforme à l'invention, et dans laquelle un gène X essentiel a été remplacé par un gène X' comprenant une région SC' permettant la fixation dudit facteur de transcription chimérique, par les séquences d'ADN suivantes : - une séquence d'ADN (a) comprenant une séquence codant pour une protéine de fusion comprenant le peptide ou le domaine peptidique Ti, et une sous- unité d'un facteur de transcription PolIII ; - une séquence d'ADN (b) comprenant une séquence codant pour une protéine de fusion comprenant un domaine peptidique de liaison à l'ADN capable de se fixer sur la région SC' du gène X', et le peptide ou le domaine peptidique T2 ; ii) la détermination de la viabilité de la cellule placée en conditions non-permissives pour le facteur de transcription chimérique exprimé par ladite cellule hôte. Préalablement à leur introduction dans une cellule conforme à l'invention, les séquences (a) et (b) ont été respectivement placées dans des vecteurs appropriés permettant leur expression dans ladite cellule. Des vecteurs utilisables pour l'expression des séquences (a) et (b) sont par exemple ceux, connus en eux-mêmes, qui permettent l'expression d'un gène dans une cellule de levure, et notamment ceux qui sont utilisés dans le cadre de la mise en #uvre des méthodes doublehybride PolII et double-hybride PolIII connues dans l'art antérieur. La sous-unité d'un facteur de transcription PolIII (a), ainsi que le domaine peptidique de liaison à l'ADN codé par la séquence (b) sont, bien entendu, fonctionnels en conditions permissives ou non-permissives pour le facteur de transcription chimérique exprimé par la cellule hôte conforme à l'invention. Lors de la mise en #uvre du procédé conforme à l'invention, lorsque la cellule est placée en conditions non-permissives pour le facteur de transcription chimérique, la transcription du gène X' ne peut s'effectuer, et la cellule ne peut survivre, que s'il y a interaction entre les protéines T1 et T2, par l'intermédiaire du facteur de transcription doublehybride constitué par cette interaction. Selon une variante du procédé conforme à l'invention, la cellule hôte comprend en outre un gène X'' tel que défini ci-dessus : dans ce cas, la séquence (b) comprend au lieu de la séquence codant un domaine peptidique de liaison à l'ADN capable de se fixer sur la région SC' du gène X', une séquence codant un domaine peptidique de liaison à l'ADN capable de se fixer sur la région SC'' du gène X". Lors de la mise en #uvre de cette variante, lorsque la cellule est placée en conditions nonpermissives pour le facteur de transcription chimérique conforme à l'invention, la transcription du gène X' ne peut pas s'effectuer. La cellule ne peut survivre que si la transcription du gène X'' peut s'effectuer par l'intermédiaire du facteur de transcription doublehybride constitué par une interaction entre les protéines T1 et T2. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit facteur de transcription chimérique est thermosensible, et la cellule est placée, à l'étape ii) à une température supérieure ou égale à 37 C, de préférence à une température de l'ordre de 38 C. Selon un mode de mise en #uvre préféré du procédé de la présente invention, lorsque le facteur de transcription chimérique exprimé par la cellule-hôte est codé par un vecteur portant un marqueur de sélection permettant son élimination, ledit procédé peut comprendre le cas échéant une étape supplémentaire d'élimination dudit vecteur, ce qui permet d'éviter d'éventuels fauxpositifs. Par exemple, si le facteur de transcription chimérique exprimé par la cellule-hôte est codé par un plasmide portant un marqueur URA3, les cellules viables sélectionnées à l'issue de l'étape ii) d'un procédé conforme à l'invention sont remises en culture en présence de 5-FOA. Dans ces conditions, les seules cellules capables de pousser sont celles qui peuvent perdre le plasmide portant le marqueur URA3 et la séquence codant pour le facteur de transcription chimérique, c'est à dire celles dans lesquelles la transcription du gène X' est assurée par l'intermédiaire de l'interaction entre les protéines T1 et T2. La présente invention est particulièrement adaptée au criblage de banques, permettant de rechercher des partenaires potentiels d'interaction avec une protéine ou un domaine protéique donné. De telles banques sont par exemple des banques de fusion avec un activateur de transcription, constituées d'une pluralité de séquences différentes mises en fusion aléatoire avec un même domaine protéique d'activation de la transcription. Par exemple, pour la recherche de partenaires potentiels d'interaction avec un polypeptide ou un domaine peptidique T, le procédé conforme à l'invention comprend : i) la co-transformation d'au moins une cellule de levure conforme à l'invention par : - une séquence d'ADN (a) comprenant une séquence codant pour une protéine de fusion comprenant le polypeptide ou le domaine peptidique T et un domaine peptidique de liaison à l'ADN capable de se fixer sur la région SC' du gène X', ou bien un domaine peptidique de liaison à l'ADN capable de se fixer sur la région SC'' du gène X'' ; et, - une séquence d'ADN (b) prise aléatoirement parmi une banque de séquences à tester dont chacune code pour une protéine' de fusion comprenant une sous- unité d'un facteur de transcription PolIII et un polypeptide ou un domaine peptidique Tx candidat à l'interaction avec la protéine T, et ; ii) la sélection des cellules transformées viables en conditions non-permissives pour le facteur de transcription chimérique conforme à l'invention exprimé par ladite cellule ; iii) le séquençage de la séquence d'ADN (b) récupérée à partir des cellules viables, et la détermination de la séquence du polypeptide ou du domaine peptidique Tx. Alternativement, le procédé conforme à l'invention peut aussi être mis en #uvre pour cribler une banque de séquences à tester fusionnées avec un domaine peptidique de liaison à l'ADN capable de se fixer sur la région SC' du gène X', ou bien avec un domaine peptidique de liaison à l'ADN capable de se fixer sur la région SC'' du gène X'', à l'aide d'une séquence T fusionnée avec une sous-unité d'un facteur de transcription PolIII. La présente invention a également pour objet des kits permettant la mise en #uvre du procédé conforme à l'invention. De tels kits comprennent par exemple : - au moins une souche de levure conforme à l'invention, associée à : - au moins un vecteur comprenant une séquence d'ADN codant pour une sous-unité d'un facteur de transcription PolIII et au moins un site permettant l'insertion d'une séquence codant pour un polypeptide fusionné à ladite sous-unité, et/ou à - au moins un vecteur comprenant une séquence d'ADN codant pour une protéine de fusion comprenant un domaine peptidique de liaison à l'ADN capable de se fixer sur la région SC' d'un gène X', et au moins un site permettant l'insertion d'une séquence codant pour un polypeptide fusionné audit domaine, ou bien, - au moins un vecteur comprenant une séquence d'ADN codant pour une protéine de fusion comprenant un domaine peptidique de liaison à l'ADN capable de se fixer sur la région SC " d'un gène X'', et au moins un site permettant l'insertion d'une séquence codant pour un polypeptide fusionné audit domaine. Avantageusement, des kits conformes à l'invention comprennent en outre des vecteurs témoins, notamment des vecteurs témoins d'interactions positives. Il peut par exemple s'agir d'un couple de vecteurs, dont l'un comprend une séquence d'ADN codant pour le domaine BD d'un activateur de transcription PolII, et l'autre comprend une séquence d'ADN codant pour une sous-unité d'un facteur de transcription PolIII, respectivement fusionnées à des séquences codant pour des protéines connues pour interagir entre elles. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre qui se réfère à un exemple d'obtention et de mise en #uvre d'un système conditionnel de détection d'interactions entre protéines conforme à l'invention. EXEMPLE : I-VECTEURS ET SOUCHES: Les vecteurs décrits ci-après ont été construits en choisissant des marqueurs d'auxotrophie compatibles avec le système double-hybride PolII. Notamment, la majeure partie des systèmes double-hybrides PolII existants utilisent généralement des plasmides portant le marqueur TRP1 pour l'expression des protéines fusionnées à Gal4BD (1-147), et des plasmides portant le marqueur LEU2 pour l'expression des protéines fusionnées au domaine d'activation de la transcription. Vecteur permettant l'expression de protéines fusionnées au domaine de liaison à l'ADN de Gal4p : pQBDl Un vecteur permettant l'expression des protéines fusionnées au domaine de liaison à l'ADN de Gal4p (Gal4BD) a été fabriqué en utilisant un multisite de clonage compatible avec les vecteurs double-hybride PolII les plus utilisés. Le vecteur pODB8 (LOUVET 0. et al, 1997, BioTechniques 23 (5), 816-820; GENBANK N U57443) a été digéré par l'endonucléase de restriction NheI. Les extrémités simples brins générées par cette enzyme ont été digérées par la MUNG BEAN NUCLEASE afin d'obtenir des extrémités à bords francs. Le vecteur a ensuite été digéré par l'enzyme EcoRI. L'extrémité cohésive générée par EcoRI a été transformée en bord franc par l'action du fragment de Klenow. Le vecteur a ensuite été religué sur lui-même. Le vecteur est nommé pQBDl (Figure 1). Un oligonucléotide s'hybridant en amont du multisite de clonage du pQBDl a été dessiné et testé afin de permettre une vérification par séquençage d'ADN des clonages réalisés. La séquence de cet oligonucléotide, appelé qbdmcs est la suivante : ATCATCGGAAGAGAGTAG. Le multisite de clonage du pQBDl et sa phase de lecture sont compatibles avec ceux des vecteurs double-hybrides PolII classiques pGBT9 [BARTEL et al., HARTLEY Ed. Oxford University Press, 153-179, (1993)] pAS1, pAS2, pAS2-1 [HARPER et al., Cell, 75,805-816, (1993)] pODB8, pODB80 [LOUVET et al., BioTechniques, 23, 816-820, (1997). Ceci permet de transposer facilement les inserts d'ADN de ces vecteurs vers le pQBDl. De plus, le marqueur d'auxotrophie de ce vecteur (TRP1) est le même que celui utilisé pour les vecteurs du même type dans le système double-hybride PolII. Ainsi, en un seul clonage, une protéine peut être testée dans un système double-hybride PolII, et transférée dans un système double hybride PolIII classique, ou dans un système conditionnel conforme à l'invention. Témoin positif exprimant la protéine de fusion Gal4BD-Tl38 Dans le plasmide pQBDl, la séquence codant pour la protéine T138 a été mise en fusion avec la séquence codant pour Gal4BD. Cette protéine de fusion permet l'activation de la transcription du gène rapporteur UASG-SNR6. Ce vecteur a été réalisé afin de servir de témoin positif au système double hybride PolIII. Pour cela, le vecteur pOL98 (résultant de l'insertion de #138 encadré de sites BamHI dans pBLUESCRIPT) a été digéré par l'enzyme PvuI puis l'enzyme BamHI. Le fragment BamHI-BamHI de 3494 pb correspondant au cadre ouvert de lecture de #138 a été inséré dans le vecteur pQBDl au site BamHI. Le sens d'intégration de l'insert a été vérifié par digestions enzymatiques. Le vecteur est nommé pQBD/tl38 (Figure 2). Vecteur permettant l'expression des protéines fusionnées à la protéine #138 du complexe TFIIIC Un vecteur permettant l'expression des protéines fusionnées à la protéine #138 du complexe TFIIIC a été construit. Le cadre ouvert de lecture codant pour #138 a été placé dans le vecteur multicopie p423GPD (MUMBERG et al., 1995, Gene 156,119-122 ; ATCC N 87355) sous la dépendance du promoteur fort et constitutif GPD de S. cerevisiae. Ce vecteur est sélectionnable grâce au marqueur HIS3. Pour sa réalisation, le vecteur pGEN/T138 (MARSOLIER et al., J. Mol. Biol., 1997, publication précitée) a été digéré par l'enzyme BamHI. Le fragment de 3492 pb correspondant au cadre ouvert de lecture de T138 a été inséré au site BamHI du p423GPD. Le sens d'insertion de #138 dans le vecteur a été vérifié. Le site BamHI en 5' de l'ATG de #138 a été supprimé afin de libérer un site supplémentaire dans le multisite de clonage (MCS) du vecteur. Pour cela le vecteur obtenu a été digéré de façon ménagée par l'enzyme BamHI (digestion partielle : site sur 2). Le produit de la digestion partielle a subi l'action du fragment de Klenow afin de générer des extrémités à bords francs. Le vecteur a ensuite été religué sur lui-même. La disparition du site BamHI en amont de #138 a été vérifiée. Ce vecteur a été nommé pTAUl. Trois codons STOP ont été introduits dans les différents cadres de lecture au niveau du MCS afin de permettre l'arrêt de la traduction des protéines de fusion. De plus, un nouveau site de clonage unique (NotI) a été introduit dans le MCS et le site EcoRI (non-unique) a été supprimé. Pour cela, le pTAUl a été digéré par les enzymes BamHI et XhoI et le MCS a été enlevé. Ce vecteur a ensuite été religué en présence d'un mélange des oligonucléotides linker-3 : TCGATTACTTACTTACTCGAGGTCGACGATATCTGGCGGCCGCCCGGGG et linker+5 : GATCCCCCGGGCGGCCGCCAGATATCGTCGACCTCGAGTAAGTAAGTAA hybridés entre eux. Le vecteur obtenu est nommé pTAU2 (Figure 3). L'oligonucléotide taumcs . AATGGCTCCTAGAAAGAC permet de séquencer les inserts clonés dans le vecteur pTAU2. Souche de levure où le gène SNR6 chromosomique est remplacé par le gène rapporteur UASG-SNR6.: Une souche de levure utilisable pour la mise en #uvre de la présente invention a été obtenue à partir de la souche de Saccharomyces cerevisiae W303-1A [MATa, ura3-1, leu2-3,112, trpl-1, his3-11,15, ade2-1, canl- 100]. Dans la souche W303-1A le gène SNR6 chromosomique a été remplacé par le gène rapporteur UASG- SNR6. Ceci a été réalisé dans le but d'éviter les réversions du locus SNR6::AB-box contenu dans la souche initiale (yMCM616). Pour cela un vecteur intégratif a été construit : il porte le marqueur de sélection URA3 et permet l'insertion de la cassette UASG-SNR6 au locus SNR6. Le vecteur pRS315/UASG-SNR6 (MARSOLIER et al., 1997, JMB, 268,243-249) a été digéré par les endonucléases de restriction SstI et KpnI. Le fragment de 662 pb contenant la cassette UASG-SNR6 (fragment EcoRI-BamHI de 579 pb) a été inséré dans le multisite de clonage du vecteur pRS306 (SIKORSKI et HIETER, 1989, Genetics 122 (1), 19-27; GENBANK N U03438) en remplacement du fragment SstI-KpnI. Le vecteur obtenu est nommé pRS306/UASG-SNR6. Le vecteur pRS306/UASG-SNR6 a été digéré par l'enzyme EcoNI (site unique à l'intérieur de SNR6). Ce plasmide, linéarisé, a servi pour la transformation de la souche W303-1A. Les transformants ont été sélectionnés sur milieu dépourvu d'uracile. L'intégration du vecteur pRS306/UASG-SNR6 au locus SNR6 a été vérifiée par PCR. La souche W303-lA+pRS306/UASG-SNR6 a été alors transformée par le plasmide pAS2/#138 exprimant la fusion Gal4BD-#138, et par le plasmide pRS315/SNR6-UASG (M.C. Marsolier, J. Mol. Biol., 1997, publication précitée). Les transformants ont été sélectionnés sur milieu dépourvu de tryptophane et de leucine. La souche W303lA+pRS306/UASG-SNR6 +pAS2/#138 +pRS315/UASG-SNR6 a été placée sur milieu contenant du 5-FOA afin de sélectionner le réarrangement par excision du pRS306/UASG-SNR6. L'élimination de la copie sauvage du gène SNR6 est vérifiée par PCR sur les clones résistants au 5-FOA. Une souche recombinante ayant perdu le gène SNR6 sauvage a ainsi été isolée. Cette souche W303/UASG-SNR6 +pAS2/#138 +pRS315/UASG-SNR6, qui ne-contient que le gène rapporteur UASG-SNR6, a pour génotype : [MATa, ura3-1, leu2-3,112, trpl-1, his3-11,15, ade2-1, canl-100, SNR6AB- box::UASGx5]. Vecteur exprimant le gène rapporteur UASG-SNR6 La souche W303/UASG-SNR6 +pAS2/#138 +pRS315/UASG-SNR6 a été transformée par le vecteur pRS316/SNR6 (vecteur centromérique, URA3, porteur du gène SNR6 sauvage ; MARSOLIER M. C., 1997, publication précitée). La souche W303/UASG-SNR6 +pAS2/#138 +pRS315/UASG-SNR6 +pRS316/SNR6 a été alors cultivée sur milieu contenant du tryptophane et de la leucine afin d'autoriser la perte des différents vecteurs. Cela a permis d'isoler une souche W303/UASG-SNR6 +pRS316/SNR6 ayant perdu les vecteurs pAS2/#138 et pRS315/UASG-SNR6. Un vecteur multicopie (2 ) portant le gène rapporteur UASG-SNR6 et le marqueur de sélection ADE2 (très peu utilisé par les autres vecteurs levures) a été construit. Le fragment SstI-KpnI de 662 pb du pRS315/UASG-SNR6 contenant la cassette UASG-SNR6 a été inséré dans le vecteur pASZ12 (STOTZ et LINDER P., 1990, Gene 95, p91-98) en remplacement du fragment SstI-KpnI. Le vecteur a été nommé pQARl. Ce plasmide a été introduit dans la souche W303/UASG-SNR6 +pRS316/SNR6. La souche W303/UASG-SNR6 +pRS316/SNR6 +pQARl a été nommée QYN1. Les Inventeurs ont montré que la sensibilité du système rapporteur était augmentée dans cette souche contenant un vecteur multicopie. La souche W303/UASG-SNR6 +pRS316/SNR6, ainsi que la souche QYN1 peuvent être utilisées dans un système double-hybride PolIII classique. Pour les utiliser dans un système conditionnel conforme à l'invention, elles sont préalablement transformées par pQBD/#138, ce qui permet d'éliminer le plasmide pRS316/SNR6. Vecteurs témoins positifs d'interaction Deux vecteurs ont été construits afin de servir de témoins positifs d'interaction. Un couple de protéines, Prp9p et Prp21p, capables d'interagir a été choisi, et les gènes correspondants ont été clonés dans des vecteurs d'expression dessinés à cet effet. Vecteur exprimant la protéine de fusion Gal4BD-Prp9 La construction du vecteur exprimant la protéine de fusion Gal4BD-Prp9 a été réalisée dans le pQBDl. Le vecteur pPL164 (PRP9 dans le plasmide pMA424) a été digéré par l'enzyme SalI puis par l'enzyme SmaI. Le fragment de 1,7 kpb correspondant à PRP9 a été inséré dans le vecteur pQBDl en remplacement du fragment SmaISalI. Le vecteur obtenu a été nommé pQBD/PRP9 (Figure 4). Vecteur exprimant la protéine de fusion #138-Prp21 La construction du vecteur exprimant la protéine de fusion #138-Prp21 a été entrepris dans le vecteur pTAUl. Le vecteur pPL247 (PRP21 dans pBLUESCRIPT SK) a été digéré par les enzymes BamHI et SalI. Le fragment de 873 pb correspondant au cadre ouvert de PRP21 a été inséré dans le vecteur pTAUl en remplacement du fragment BamHI-SalI. Afin de mettre en phase le cadre ouvert de lecture de PRP21 avec celui de #138, le vecteur obtenu a été digéré par l'enzyme BamHI. Les extrémités cohésives générées ont subi l'action du fragment de Klenow afin d'obtenir des extrémités à bords francs. Le vecteur a ensuite été religué sur lui-même. La perte du site BamHI permet la mise en phase des deux cadres ouverts de lecture. Le vecteur obtenu est nommé pTAU/PRP21 (Figure 5). II- SYSTEME DE SELECTION THERMOSENSIBLE : Vecteur permettant l'expression d'un mutant thermosensible de Gal4BD fusionné à la protéine #138 La séquence codant pour une protéine de fusion entre le mutant P26L de Gal4BD et T138 a été réalisée puis clonée sur le vecteur p416CYCl. Le promoteur CYC1 du vecteur centromérique p416CYCl permet une expression quantitativement faible des gènes qu'il contrôle. Ce vecteur a été choisi car la fixation conditionnelle de Gal4P26L à l'ADN a été observée lorsque l'expression du gène correspondant est contrôlée par son propre promoteur (de faible niveau). Pour cette construction, deux PCR ont été effectuées sur GAL4BD afin d'y introduire la mutation P26L en changeant 2 nucléotides du codon pour éviter les réversions (codon Proline CCG changé en codon Leucine CTT). La première amplification PCR a été réalisée à l'aide des oligonucléotides suivants : dbxba : CTCCTTCTAGATGAAGCTACTGTCTTC dblfa : GCGCACTTAAGTTTTTCTTTGGAGCAC L'oligonucléotide dbxba s'hybride au niveau de l'ATG de GAL4BD et introduit en amont du codon d'initiation un site XbaI. L'oligonucléotide dblfa s'hybride sur GAL4BD au niveau du codon 26 et permet le changement des 2 nucléotides. De plus, il introduit un site AflII. La seconde amplification PCR a été réalisée à l'aide des oligonucléotides suivants : dbafl : GAAAAACTTAAGTGCGCCAAGTGTCTG dbbam : GAAAAACTTAAGTGCGCCAAGTGTCTG L'oligonucléotide dbafl s'hybride sur GAL4BD au niveau du codon 26 et permet le changement des 2 nucléotides. De plus, il introduit un site AflII. L'oligonucléotide dbbam s'hybride au niveau du codon 147 de GAL4BD et introduit un site BamHI après celui-ci. Le fragment de 97 pb généré par la première PCR a été digéré par les enzymes XbaI et Afin. Le fragment de 383 pb généré'par la seconde PCR a été digéré par les enzymes AflII et BamHI. Ces deux produits de PCR ont été insérés dans le vecteur pBLUESCRIPT KS en remplacement du fragment XbaI-BamHI. Le vecteur obtenu a été nommé pKS/GAL4BDP26L. Le vecteur pKS/GAL4BDP26L a été digéré par les enzymes XbaI-BamHI et le fragment de 463 pb correspondant à GAL4BDP26L a été inséré dans le vecteur p416CYCl préalablement purifié sur gel après digestion XbaI et BamHI. Le vecteur obtenu a été nommé p416CYCl/GAL4BDP26L. Le vecteur pQBD/#138 a été digéré par l'enzyme BamHI. Le fragment de 3492 pb correspondant à #138 a été inséré dans le p416CYCl/GAL4BDP26L préalablement digéré par BamHI. Le sens d'intégration du fragment a été vérifié et le vecteur obtenu a été nommé p416CYCl/GAL4BDP26L-i138. Le vecteur p4l6CYCl/GAL4BDP26L-Tl38 a été introduit dans la souche W303/UASG-SNR6 +pQARl +pQBD/#138 (obtenue à partir de QYN1 par élimination de pRS316/SNR6). Après avoir éliminé le plasmide pQBD/Tl38, la thermosensibilité de cette souche a été testée. Pour cela, les cellules contenant le vecteur p416CYC1/GAL4BDP26L-T138, ou, à titre de témoin positif, le vecteur pQBD/#138, ont été cultivées pendant la nuit dans un milieu sélectif, diluées à une DO de 0,2 dans le même milieu et mises à pousser 8 heures supplémentaires. Les cultures ont été diluées 10 000 fois et 100 ul des dilutions ont été étalés et incubés à 30 C ou à 38 C. Les boîtes de Pétri ont été examinées après 4 jours. Les résultats sont illustrés par le Tableau I. Tableau I l,;onstructlons Nomore ce colonies a 3U"c Nombre de colonies a 3t"C; GAL4(1-147) " -i138 100 15 GAL4-(1-147)-'t138 110 70 La soucne contenant le vecteur p4l6CYCl/GAL4BDP26L-zl38 est capable de pousser à 30 C mais pousse beaucoup moins bien à 38 C que la souche témoin. Ceci démontre le caractère thermosensible de la mutation Gal4BDP26L. De plus, lorsque les plasmides pQBD/PRP9 et pTAU/PRP21 sont introduits dans la souche contenant le vecteur p4l6CYCl/GAL4BDP26L-Tl38, la croissance normale de cette souche est rétablie à 38 C. En outre, elle pousse alors sur milieu contenant de l'uracile et du 5-FOA. Vecteurs permettant l'expression d'un mutant thermosensible de #138 fusionné à la protéine Gal4BD Des travaux précédents (MARSOLIER et al., J. Mol. Biol., 1997, publication précitée) ont permis de mettre en évidence des domaines de #138 dont la fusion avec Gal4(1-147) permettait l'activation du gène rapporteur UASG-SNR6. Notamment, les deux fusions, #3- Gal4(1-147) et #1-3-Gal4(1-147), comprenant respectivement les acides aminés 761 à 1160 (#3) et 1 à 329 et 676 à 1160 (il-3) de #138, fusionnés à Gal4(1-147), sont capables d'activer la transcription de la matrice UASG-SNR6 pour donner un niveau de transcrits correspondant respectivement à 15% et 45% du niveau de transcrits produit par la construction #138-Ga14(1-147) comprenant la séquence entière de #138. Les Inventeurs ont maintenant observé que la transcription du gène UASG-SNR6 activé par les constructions i3-Gal4(1-147) et Tl-3-Gal4(1-147) était suffisante pour assurer la viabilité cellulaire. Pour cela, la souche yMCM616 (MARSOLIER et al., J. Mol. Biol., 1997, publication précitée), dont le gène SNR6 chromosomique a été inactivé par une délétion de 2 bp dans son bloc B et qui survit grâce à une copie sauvage du gène SNR6 porté par le plasmide pRS316/SNR6 possédant le marqueur URA3, a été transformée par des plasmides portant la construction UASG-SNR6 (pRS315/UASGSNR6) et les fusions T3-GAL4(1-147), il-3-GAL4(1-147) et T138-GAL4(1-147). Les transformants ont été striés sur des boites de Pétri contenant du 5-FOA et incubés à 30 C. Tous les transformants contenant pRS315/UASG-SNR6 et les fusions T3-GAL4(1-147), T1-3-GAL4(1-147) ou #138-GAL4(1- 147) se sont révélés capables de perdre le plasmide portant le marqueur URA3 et la copie sauvage du gène SNR6, et de pousser à 30 C, démontrant que les fusions #3- Gal4(1-147) et Tl-3-Gal4 (1-147) activaient suffisamment le gène UASG-SNR6 pour permettre une croissance normale des cellules. Des transformants isolés contenant pRS315/UASG-SNR6 et T3-GAL4 (1-147) ou #1-3-GAL4(1-147) ou #138-GAL4(1-147), et ayant perdu pRS316/SNR6, ont ensuite été restriés sur milieu sélectif et incubés à différentes températures. Les transformants contenant T138-GAL4(1-147) pouvaient se développer à 34 C et à 38 C, alors que les transformants contenant T3-GAL4(1-147) ou Tl-3-GAL4(1-147) pouvaient pousser à 34 C, mais pas à 38 C. Des cultures de cellules yMCM616 contenant les fusions i3-Gal4(1-147), ou il-3-Gal4(1-147), ou, à titre de témoin, la fusion T138-GAL4-(1-147) ont été cultivées pendant la nuit dans un milieu dépourvu de leucine et de tryptophane, diluées à une DO de 0,2 dans le même milieu et mises à pousser 8 heures supplémentaires. 100 l de culture ont alors été étalés et incubés à 38 C. Par ailleurs, les cultures ont été diluées 10 000 fois et 100 l des dilutions ont été étalés et incubés à 30 C. Les boîtes de Pétri ont été examinées après 4 jours. Les résultats sont illustrés par le Tableau II. ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ Tableau Constructions Nombre de colonies à 30 C Nombre de colonies à 38 C #3-GAL4-(1-147) 83 1 #1-3-GAL4-(1-147) 100 25 t138-GAL4-(1-147) 110 >100 000 Ces résultats montrent que les fusions #3- Gal4(1-147), #1-3-Ga14(1-147) constituent des activateurs thermosensibles du gène UASG-SNR6. Vecteurs permettant l'expression d'un mutant thermosensible de T138 fusionné à un mutant thermosensible de Gal4BD Pour construire le mutant Gal4BDP26L/#1-3, le plasmide p4l6CYCl/GAL4BDP26L-Tl38 a été modifié afin d'éliminer les sites EcoRI et ClaI du MCS. Pour cela, ce plasmide a été digéré par les enzymes SalI et SmaI, et pourvu de bords francs, puis religué sur lui-même. Le plasmide modifié a ensuite été digéré par les enzymes EcoRI et Clal pour éliminer le fragment EcoRI-ClaI correspondant aux acides aminés 329 à 676 de #138. Le plasmide obtenu, dénommé p416CYCl/GAL4DBP26L-Tl-3, a été introduit dans la souche W303/UASG-SNR6 +pQARl +pQBD/#138. Après avoir éliminé le plasmide pQBD/Tl38, la thermosensibilité de cette souche a été testée comme suit Des cultures de cellules contenant le vecteur p416CYC1/GAL4BDP26L-T1-3, ou, à titre de témoin positif, le vecteur pQBD/#138, ont été cultivées pendant la nuit dans un milieu sélectif diluées à une DO de 0,2 dans le même milieu et mises à pousser 4 heures supplémentaires. 100 l de culture ont alors été étalés et incubés à 38 C. Par ailleurs, les cultures ont été diluées 10 000 fois et 100 l des dilutions ont été étalés et incubés à 30 C. Les boîtes de Pétri ont été examinées après 4 jours. Les résultats sont illustrés par le tableau III. Tableau III Constructions l', IIJL~T Nombre de colonies à 30 C Nombre de colonies à 38 C GAL4(1-147)""0L-t1-3 105 2 GAL4(1-147)-#138 110 >100 000 Ces résultats démontrent le caractère hautement thermosensible de la protéine Ga14BDP26L-#1-3. Lorsque les plasmides pQBD/#138 ou (pQBD/PRP9 + pTAU/PRP21) sont introduits, la croissance est rétablie à 38 C, et la souche pousse également sur milieu contenant de l'uracile et du 5-FOA.- REVENDICATIONS 1) Facteur de transcription chimérique constitué par une protéine de fusion comprenant : - un domaine I choisi parmi : les sous-unités d'un facteur de transcription PolIII, et les mutants conditionnels desdites sous- unités, et - un domaine II choisi parmi : les domaines peptidiques de liaison à l'ADN et les mutants conditionnels desdits domaines caractérisé en ce qu'au moins l'un des domaines I ou II est un mutant conditionnel. 2) Facteur de transcription chimérique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le domaine I est choisi parmi les sous-unités #138, #131, #95 et T91 du facteur TFIIIC et les mutants conditionnels desdites sous-unités, et le domaine II est choisi parmi les domaines peptidiques de liaison à l'ADN de facteurs de transcription PolII. 3) Facteur de transcription chimérique selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le domaine I et/ou le domaine II est constitué par un mutant thermosensible. 4) Facteur de transcription chimérique selon la revendication 3, caractérisé en ce que son domaine I est constitué par un mutant de #138 dépourvu de tout ou partie du domaine central, et comprenant au moins le domaine C-terminal. 5) Facteur de transcription chimérique selon une quelconque des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que son domaine II est constitué par le mutant P26L du domaine de liaison à l'ADN de Gal4. 6) Séquence d'acide nucléique codant un facteur de transcription chimérique selon une quelconque des revendications 1 à 5. 7) Vecteur recombinant comprenant une séquence d'acide nucléique selon la revendication 6. 8) Cellule de levure transformée par une séquence d'acide nucléique selon la revendication 6. 9) Cellule de levure transformée selon la revendication 8, dans laquelle un gène X, transcrit par l'ARN polymérase III et indispensable à la viabilité cellulaire a été inactivé, et qui comprend au moins une copie d'un gène X' dérivé dudit gène X par inactivation d'une région SC du promoteur dudit gène permettant la fixation d'un facteur de transcription par la polymérase III et insertion d'une région SC' permettant la fixation, en conditions permissives, d'un facteur de transcription chimérique selon une quelconque des revendications 1 à 5. 10) Cellule de levure selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un gène X'' dérivé du gène X par inactivation de la région SC, et son remplacement par une région SC'', différente de SC', et permettant la fixation d'un domaine peptidique de liaison à l'ADN autre que le domaine II d'un facteur de transcription chimérique conforme à l'invention, et autre qu'un domaine peptidique de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription par la polymérase III. 11) Cellule de levure transformée selon une quelconque des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce que le gène X' est un gène dérivé de SNR6 par inactivation du bloc B et insertion d'une séquence UASG. 12) Procédé de détection des interactions entre deux peptides ou domaines peptidiques T1 et T2, caractérisé en qu'il comprend : i) la co-transformation d'au moins une cellule de levure selon une quelconque des revendications 9 à 11, par les séquences d'ADN suivantes : - une séquence d'ADN (a) codant pour le peptide ou le domaine peptidique T1, fusionné à une sous-unité d'un facteur de transcription PolIII ; une séquence d'ADN (b) comprenant une séquence codant pour une protéine de fusion comprenant un domaine peptidique de liaison à l'ADN capable de se fixer sur la région SC' du gène X', et le peptide ou le domaine peptidique T2 ; ii) la détermination de la viabilité de ladite cellule placée en conditions non-permissives pour le facteur de transcription chimérique hébergé par ladite cellule. 13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'on utilise une cellule-hôte selon la revendication 10, et en ce que la séquence (b) comprend au lieu de la séquence codant un domaine peptidique de liaison à l'ADN capable de se fixer sur la région SC' du gène X', une séquence codant un domaine peptidique de liaison à l'ADN capable de se fixer sur la région SC'' du gène X". 14) Kit pour la mise en #uvre d'un procédé selon une quelconque des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce qu'il comprend : - au moins une souche de cellules de levure transformées selon une quelconque des revendications 9 à 11 ; et - au moins un vecteur comprenant une séquence d'ADN codant pour une sous-unité d'un facteur de transcription PolIII et au moins un site permettant l'insertion d'une séquence codant pour un polypeptide fusionné à ladite sous-unité, et/ou - au moins un vecteur comprenant une séquence d'ADN codant pour une protéine de fusion comprenant un domaine peptidique de liaison à l'ADN capable de se fixer sur la région SC' d'un gène X', et au moins un site permettant l'insertion d'une séquence codant pour un polypeptide fusionné audit domaine, ou, - au moins un vecteur comprenant une séquence d'ADN codant pour une protéine de fusion comprenant un domaine peptidique de liaison à l'ADN capable de se fixer sur la région SC" d'un gène X'', et au moins un site permettant l'insertion d'une séquence codant pour un polypeptide fusionné audit domaine 15) Kit selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'il comprend en outre un couple de vecteurs témoins d'interactions positives, dont l'un comprend une séquence d'ADN codant pour le domaine BD d'un activateur de transcription PolII, et l'autre comprend une séquence d'ADN codant pour une sous-unité d'un facteur de transcription PolIII, respectivement fusionnées à des séquences codant pour des protéines capables d'interagir entre elles. 16) Utilisation d'une cellule de levure selon une quelconque des revendications 9 à 11 pour le criblage d'une banque de fusion permettant la recherche de partenaires d'interaction avec une protéine. 17) Utilisation d'un kit selon une quelconque des revendications 14 ou 15 pour le criblage d'une banque de fusion permettant la recherche de partenaires d'interaction avec une protéine. 18) Procédé de sélection de partenaires d'interactions avec un peptide ou un domaine peptidique T, caractérisé en ce qu'il comprend : i) la co-transformation d'au moins une cellule de levure selon une quelconque des revendications 9 à 11 par : une séquence d'ADN (a) comprenant une séquence codant pour une protéine de fusion comprenant le peptide ou le domaine peptidique T et un domaine de liaison à l'ADN capable de se fixer sur la région SC' du gène X' ou SC " du gène X'' ; et, - une séquence d'ADN (b) prise aléatoirement parmi une banque de séquences à tester dont chacune code pour une protéine de fusion comprenant un peptide ou un domaine- peptidique Tx candidat à l'interaction avec la protéine T, et un activateur de la transcription PolIII ; ii) la sélection des cellules transformées viables en conditions non-permissives pour le facteur de transcription chimérique exprimé par lesdites cellules ; iii) le séquençage de la séquence d'ADN (b) récupérée à partir des cellules viables, et la détermination de la séquence du peptide ou du domaine peptidique Tx.