Brevet FR2799766A1 — publié le 20010420

BACTERIES LACTIQUES MUTANTES CAPABLES DE SUREXPRIMER AU MOINS UNE PEPTIDASE. La présente invention concerne des mutants de bactéries lactiques, comme Lactoccocus lactis, capables de surexprimer au moins une et de préférence plusieurs peptidases. Ces mutants présentent des activités peptidolytiques fortes qui permettent d'accélérer la dégradation de la caséine en acides aminés. Ces mutants sont donc tout particulièrement utiles pour augmenter la vitesse d'affinage des fromages car les acides aminés sont des précurseurs dans la synthèse d'arômes. L'invention concerne également une méthode d'identification de ces mutants et les constructions génétiques pour la mise en #uvre de cette méthode. Lactococcus Jadis possède un système protéolytique complexe pour dégrader les protéines du lait et en particulier la caséine. La caséine est la protéine majoritaire du lait qui fournit tous les acides aminés nécessaires à sa croissance (12). La caséine est dégradée en oligopeptides par une protéase de paroi. Ces oligopeptides entrent dans la cellule par des systèmes de transport spécifique puis sont hydrolysés en acides aminés à l'intérieur de la cellule par des peptidases (14). En plus de leur rôle dans la nutrition azotée de L. lactis, les peptidases pourraient avoir également un rôle important dans le développement des flaveurs lors de l'affinage de certains fromages. Dix gènes de peptidase ont été clonés et leurs produits caractérisés biochimiquement chez L. lactis. Elles sont regroupées dans différentes classes suivant la position et la nature de la liaison peptidique qu'elles hydrolysent et ont souvent une spécificité large (14). A l'heure actuelle, peu d'études sur la régulation de l'expression de ces peptidases chez L. lactis ont été menées et seule la régulation de la protéase de paroi a été étudiée de manière approfondie (18, 19). Or, l'expression de certains gènes chez Lactococcus lactis peut être critique lors de procédés de fabrication. Aussi, les Inventeurs ont considéré que l'évaluation du niveau d'expression de ces gènes peut se faire en déterminant l'efficacité de leurs promoteurs car la transcription est un des paramètres qui contrôle l'expression des gènes. Les Inventeurs ont donc développé dans le cadre de la présente invention des outils basés sur l'utilisation de gènes rapporteurs. Ils ont construit des vecteurs adaptés à l'étude systématique de nombreux promoteurs dans différents contextes cellulaires et environnementaux et qui peuvent être transférés aisément dans un grand nombre de souches de L. lactis. Ces vecteurs ont été utilisés pour étudier la variabilité de l'expression des enzymes du système protéolytique de L. lactis. L'expression de seize gènes codant pour des enzymes impliquées dans la protéolyse de la souche de L. lactis subsp. cremoris MG1363 ainsi que les deux gènes de la protéase de paroi des souches WG2 et SK11 a pu ainsi être caractérisée, soit grâce aux vecteurs développés par les Inventeurs, soit grâce à la détection des ARN messagers par la technique de Northern-blot (8). Les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention sur la caractérisation de l'expression des gènes codant pour des peptidases, des protéases et des protéines de transport de L. lactis ont permis de mettre en évidence une régulation coordonnée de leur expression et ainsi de déterminer les facteurs pouvant affecter cette expression. Les Inventeurs ont notamment réalisé une étude systématique de la transcription des seize gènes ci-dessus impliqués dans la protéolyse. Il a ainsi été montré que la transcription de 8 des seize gènes testés est régulée et réprimée simultanément par des dipeptides via le pool intracellulaire d'acides aminés branchés : isoleucine, leucine et valine. Il s'agit des promoteurs des gènes des peptidases suivants : - prtP, qui est la protéase de paroi (14), et plus particulièrement prtPWG qui est une protéase de paroi isolée de la souche WG2, et prtPSKll, qui est une protéase de paroi isolée de la souche SK11, - pepN et pepC, qui sont les aminopeptidases de spécificité générale majeure dans la cellule (14), - pepO, qui est une endopeptidase impliquée dans la dégradation des oligopeptides (14), - opp, qui est l'opéron codant pour le système d'entrée des oligopeptides (14), - dtpt, qui code pour une protéine de transport des di et tripeptides hydrophiles (14), - p ep DA 2, qui code pour une dipeptidase générale. Il a aussi montré dans le cadre des travaux ayant conduit à la présente invention que le produit du gène codY constituait le régulateur central réprimant la transcription des gènes du système protéolytique chez L. lactis. Les Inventeurs ont mis en #uvre une stratégie de mutagenèse aléatoire, appliquée à la souche MG1363 (21), pour trouver des régulateurs de la transcription de ces peptidases. La fusion du second promoteur de l'opéron opppepO (PpepOA) au gène de la -galactosidase a servi de rapporteur pour visualiser des mutants dont la transcription de ce promoteur est dérégulée. Les inventeurs ont ainsi isolé des mutants de L. lactis, obtenus par insertion d'un transposon. La présente invention a donc pour objet des mutants de bactéries lactiques capables de surexprimer une ou plusieurs peptidases, caractérisés en ce que l'un au moins des facteurs de régulation négative de l'un au moins des gènes des peptidases desdites bactéries est inactivé. A titre de bactérie lactique mutée selon l'invention, on peut citer plus particulièrement des mutants de L. lactis et de S. thermophilus. On entend tout particulièrement par mutants de bactéries lactiques selon l'invention, des bactéries génétiquement modifiées de façon à ce que l'un au moins des facteurs de régulation négative de l'un au moins des gènes desdites peptidases est inactivé. Ainsi, on entend par inactivation, la modification d'un ou plusieurs gènes codant pour des protéines constituant un ou plusieurs facteurs de régulation négative des gènes des peptidases, comme par exemple CODY, ou la modification d'un ou plusieurs gènes codant pour des protéines nécessaire auxdits facteurs de régulation négative des gènes des peptidases, comme par exemple les éléments de transport des acides aminés branchés ou une protéine nécessaire à l'activité de CODY. Les mutants de bactéries lactiques selon l'invention sont donc avantageusement obtenus par mutagénèse. L'invention se rapporte plus particulièrement à des mutants de bactérie lactiques capables de surexprimer une ou plusieurs peptidases, caractérisés en ce que l'un au moins des facteurs de régulation négative commun à plusieurs gènes desdites peptidases est inactivé. L'invention concerne plus particulièrement des mutants de de bactérie lactiques et notamment de Lactoccocus lactis dont l'un au moins des facteurs de régulation négative de la transcription, commun à deux au moins et de préférence trois des promoteurs des gènes de peptidases, est inactivé. Les promoteurs des gènes de peptidases dont l'un au moins des facteurs de régulation négative de la transcription est inactivé, sont par exemple choisis parmi les gènes prtP, pepN, pepC, pepX, pepO, pepDA2, dtpT et l'opéron opp. Il sera fait référence dans ce qui suit à la liste de séquence en annexe dans laquelle : - SEQ ID N0:1 représente la séquence du gène codY de L. lactis MG1363. - SEQ ID NO:2 représente la séquence du gène dtpT L. lactis MG1363. - SEQ ID NO:3 représente la séquence du gène secA de L. lactis IL1403. - SEQ ID NO:4 représente la séquence du gène secY de L. lactis IL1403. - SEQ ID NO:5 représente la séquence de l'opéron lev de L. lactis IL1403. - SEQ ID NO:6 représente un fragment de séquence d'un gène de L. lactis MG1363 dont le produit est homologue à une p-glucosidase. - SEQ ID NO:7 représente la séquence du gène de L. lactis MG1363 dont le produit est homologue à une formate deshydrogénase. - SEQ ID NO: 8 représente la séquence du gène codY de S. thermophilus. Un premier facteur de régulation négative des peptidases de bactéries lactiques notamment de L. lactis identifié par les Inventeurs est constitué par le pool intracellulaire d'acides aminés branchés qui répriment la transcription de plusieurs gènes de peptidase. Un premier type de mutants selon l'invention est donc caractérisé par la modification de ce pool intracellulaire d'acides aminés branchés. On entend de préférence par modification, une diminution de la quantité d'acides aminés branchés. Un exemple de modification du pool d'acides aminés branchés consiste à modifier sélectivement leur entrée dans la cellule, notamment en bloquant l'un au moins des systèmes de transport : - des acides aminés - des di- et tri-peptides - des oligopeptides. Des mutants de L. lactis selon l'invention dont l'un au moins des systèmes de transport des acides aminés branché, des di- et tri-peptides ou des oligopeptides sont bloqués sont des mutants dans lesquels l'un au moins des gènes codant pour un élément de ces systèmes de transport est inactivé. Des mutants d'un système de transport des dipeptides et tripeptides ont été obtenus par mutagenèse aléatoire dans le gène dtpT (10) de L. lactis dont la séquence est donnée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO:2. Les travaux réalisés dans l'art antérieur sur ce gène n'ont jamais mis en évidence qu'il pouvait s'agir de mutants de Lactoccocus lactis capables de surexprimer une ou plusieurs peptidases. Un exemple de gène dtpT mofifié dans un mutant selon l'invention est caractérisée par l'insertion par exemple du plasmide pGhost-IIS1 après les nucléotides en positions 280 et 470 dans la séquence SEQ ID NO:2. La répression de la transcription des gènes codant pour les peptidases est levée chez les mutants de l'invention et peut résulter comme indiqué précédemment de la variation du pool intracellulaire des acides aminés branchés. La variation du pool intracellulaire des acides aminés branchés peut également provenir de la variation de la dégradation desdits peptides (di, tri ou oligopeptides). En conséquence, l'invention concerne des mutants de bactéries lactiques et plus particulièrement de L. lactis dont l'un au moins des gènes codant les peptidases responsables de la dégradation de ces dipeptides, tripeptides ou oligopeptides est inactivé. Un second facteur de régulation négative identifié par les inventeurs est le produit du gène codY qui se fixe sur les promoteurs de plusieurs peptidases et qui réprime leur expression. En effet, les inventeurs ont obtenu par mutagenèse des mutants de L. lactis inactivés dans un gène qui est homologue au gène codY de Bacillus subtillis. Chez un mutant cod Y reconstruit par les inventeurs par mutagenèse dirigée, il a été observé que la transcription du gène pepOA et la transcription d'au moins trois gènes de peptidases ne sont plus réprimés par les dipeptides. Ainsi, l'inactivation du gène codY chez L. lactis permet d'augmenter l'expression des gènes de plusieurs peptidases d'un facteur 4 à 55 dans un milieu contenant une source de peptide qui normalement les réprime dans la souche sauvage. La séquence d'ADN du gène codY de L. lactis et de la séquence de la protéine codY pour lequel il code sont représentées dans SEQ ID No. 1 en annexe. Les inventeurs ont également mis en évidence la présence du gène codY chez S. thermophilus, qui est comme L. Lactis une bactérie lactique. La séquence d'ADN du gène codY de S. thermophilus et de la séquence de la protéine pour lequel il code sont représentées dans SEQ ID No. 8 en annexe. L'inactivation du gène codY chez S. thermophilus déréprime également les gènes du système protéolytique. En conséquence, un second type de mutant de bactéries lactiques selon l'invention et plus particulièrement de L. lactis est caractérisé par l'inactivation du gène codY. Un premier exemple d'une telle inactivation consiste en une modification de la séquence d'ADN du gène codY ou d'une séquence impliquée dans l'expression ou la régulation de ce gène. Un second exemple d'une telle inactivation consiste en une modification d'un gène codant pour une protéine cofacteur nécessaire à l'activité du gène codY et/ou la modification d'un gène impliqué dans l'expression ou la régulation de cette protéine cofacteur. Comme indiqué précédemment, dans les bactéries mutantes pour codY de l'invention l'expression d'au moins 3 peptidases est augmentée de 4 à 55 fois dans un milieu contenant une source de peptide qui normalement réprime leur expression. Une bactérie mutante pour codY selon l'invention interrompt la cascade de régulation qui conduit à la répression des peptidases via le pool de peptides du milieu extérieur. Un changement de la séquence d'ADN dans le gène codY ou dans sa séquence de régulation consiste par exemple en une mutation ou une délétion qui peuvent être réalisées par des méthodes bien connues de mutagenèse. Ainsi les inventeurs ont répertorié 13 mutants de codY avec une insertion du plamside pGhost-IIS1 après les nucléotides en positions 87,112, 122,289, 313,409, 575,604, 641, 693,821, 877 et 882 dans la séquence SEQ ID NO:1. D'autres mutants de bactéries lactiques selon l'invention et notamment de L. lactis capables de surexprimer une ou plusieurs peptidases ont été caractérisés par les Inventeurs. Il s'agit de mutants dans lesquels l'un au moins des facteurs de régulation négative de la transcription d'un ou plusieurs gènes desdites peptidases est inactivé. A titre d'exemples de tels mutants, on peut citer : - Les mutants dans lesquels un gène codant pour des protéines impliquées dans la sécrétion des protéines de transport des dipeptides ou tripeptides est inactivé. Il s'agit plus particulièrement de mutants dont l'un au moins des gènes secA (3) et secY (13) est modifié. Les protéines codées par ces gènes pourraient intervenir dans la translocation de la protéine DtpT qui est impliquée dans le transport des di et tripeptides. Les séquences des gènes secA et secY de L. lactis sont données dans la liste de séquence en annexe respectivement sous les numéros SEQ ID NO:3 et SEQ ID NO:4. Des mutants pour secA selon l'invention ont été préparés par insertion du plamside pGhost-IIS1 après les nucléotides en positions 1689 et 1698 dans la séquence SEQ ID NO:3. Des mutants pour secY selon l'invention ont été préparés par insertion du plamside pGhost-IISl après les nucléotides en positions 1273 et 1281 dans la séquence SEQ ID NO:4. - Les mutants dans lesquels l'un des gènes de l'opéron lev est inactivé (17). Les gènes de l'opéron lev codent pour un système de transport des sucres. La séquence de l'opéron lev de L. lactis est donnée dans la liste de séquence en annexe sous les numéros SEQ ID NO:5. Des mutants pour l'opéron lev selon l'invention ont été préparés par insertion du plamside pGhost-IISl après les nucléotides en positions 40,108, 1075,1140, 1145 et 2735 dans la séquence SEQ ID NO:5. - Les mutants dans lesquels l'un au moins des gènes présentant une homologie avec un gène codant une ssglucosidase et/ou une formate deshydrogénase est inactivé. La séquence d'un gène codant une p-glucosidase est donnée dans la liste de séquence en annexe sous les numéros SEQ ID NO:6. La séquence d'un gène codant une formate deshydrogénase est donnée dans la liste de séquence en annexe sous les numéros SEQ ID NO:7. Comme précédemment, on entend par un gène inactivé un gène dont la séquence, ou une séquence impliquée dans son expression ou sa régulation, est modifiée. Les mutants selon l'invention peuvent également être caractérisés par plusieurs des mutations décrites cidessus. Comme indiqué précédemment les Inventeurs ont développé dans le cadre de la présente invention des outils basés sur l'utilisation de gènes rapporteurs comme la luciférase de Vibrio harveyi. L'expression de la luciférase qui se détecte par une émission de lumière, permet de mesurer facilement l'activité des promoteurs y compris dans des milieux complexes (4). Les vecteurs pVar construits par les Inventeurs contiennent une origine de réplication inactivée après intégration, un marqueur d'antibiotique et une partie du gène cluA (6). Ce dernier fragment permet au plasmide de s'intégrer par recombinaison homologue dans le facteur sexuel. Celui-ci est un élément conjugatif de 60 kb présent sous forme intégrée dans le chromosome de certaines souches de L. lactis. Les constructions intégrées dans le facteur sexuel au niveau du gène cluA dans une souche peuvent donc être transférées dans de nombreuses souches de L. lactis par conjugaison. L'invention concerne donc aussi, un vecteur recombinant pour identifier ou sélectionner les bactéries mutantes selon l'invention. Ce vecteur est caractérisé en ce qu'il comprend un gène marqueur fusionné à un gène de peptidase ou un promoteur de de gène, une origine de réplication inactivée après intégration dans la bactérie, un marqueur antibiotique, et une partie du gène cluA. Un tel vecteur permet de distinguer une souche mutante selon l'invention d'une souche sauvage incapable de surexprimer une ou plusieurs peptidases. Une méthode permettant de distinguer ces souches est par exemple la suivante. Pour connaître le niveau d'expression des peptidases dans des souches, un vecteur pVar contenant le promoteur PpepOA de l' opéron opp-pepO, fusionné au gène de la luciférase, est transféré dans les souches par conjugaison. Les mesures de l'activité luciférase sous le contrôle du PpepOA indiquent si la transcription au moins du gène pepO est déréprimée dans ces souches. Les constructions avec les autres promoteurs permettent de vérifier le nombre de gènes de peptidases dont la transcription est déréprimée. Les activités luciférases de référence de la souche sauvage qui reflètent la répression de la transcription des gènes de peptidases lors de croissance en présence de peptides, via le pool d'acides aminés branchés, sont répertoriés dans la figure 1. En conséquence, l'invention concerne également une méthode d'identification ou de sélection d'une bactérie lactique mutante selon l'invention, caractérisée en ce ce que l'on transfère un gène de peptidase ou un promoteur de ce gène dans une bactérie par conjugaison avec le vecteur défini ci-dessus, puis l'on cultive la dite bactérie en présence de peptides et l'on mesure par tout moyen approprié l'activité du gène rapporteur qui reflètent la répression de la transcription des gènes de peptidases. Avantageusement le gène rapporteur est le gène de la luciférase. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent. Ces exemples concernent l'obtention par mutagenèse de mutants de L. lactis selon l'invention, et se réfèrent aux figures en annexe dans lesquelles : - la figure 1 représente l'activité luciférase de différentes fusions transcriptionnelles à D.O. 0,4 en milieu chimiquement défini (CDM) acides aminés (AA) et CDM casitone (Cas), - la figure 2 représente la répression de la transcription en A des promoteurs régulés, et en B des promoteurs non régulés. Ces résultats ont été obtenus à partir de l'extraction des ARNm totaux de la souche sauvage cultivée en CDM + acides aminés (AA) et CDM + casitone (Cas) à différentes densités optiques (0,2; 0,6 ; 1,2). Les hybridations ont été effectuées avec différentes sondes spécifiques des promoteurs de peptidases. Les promoteurs régulés correspondent à une diminution de l'ARN dans les conditions de croissance en présence de casitone, ce qui est le reflet d'une répression de la transcription. La figure 3 est une représentation schématique des différents facteurs intervenant sur l'expression des peptidases de L. lactis et ayant permis de concevoir les différents mutants de l'invention. - La figure 4 est un alignement des séquences des gènes codY de L. lactis et de Bacillus subtillis. I - Matériel et Méthodes. 1) Souches bactériennes, milieux, vecteurs et manipulations d'ADN. La souche de L. lactis MG1363 a été cultivée à 30 C en milieu M17 glucose. Au besoin, 5g/ml d'érythromycine sont ajoutés au milieu de culture. Les promoteurs de peptidases à étudier (PepP, PepA, PepF2, PepDAl, PepOA, PepQ, PepX, PepOD, PepM, PepT, PepN et PepC) et les deux promoteurs de l'opéron opp (pepOA/pepOD) ont été amplifiés par PCR à l'aide d'amorces spécifiques à partir du chromosome de la souche de L. lactis subsp. crem oris MG1363. Une série de vecteurs à réplication conditionnelle, contenant les gènes rapporteurs de la luciférase de Vibro harveyi et un fragment du facteur sexuel (gène cluA), a été construite. Le pVar-1 a été utilisé pour fusionner aux gènes luciférase, les fragments d'ADN obtenus par PCR et correspondant aux différents promoteurs. 2) Intégration des fusions transcriptionnelles sur le chromosome de MG1363 et conjugaison. Après transformation de la souche MG1363 par les plasmides pVar-1 contenant les promoteurs de peptidases, les fusions sont intégrées dans le chromosome par recombinaison homologue, soit au locus promoteur peptidase, soit au locus du facteur sexuel (dans le gène cluA). L'identification du locus d'intégration se fait grâce à des amorces appropriées par amplification PCR et par hybridation d'un gel Southern. Le transfert du facteur sexuel se fait par conjugaison entre deux souches (5). 3) Détermination de l'activité luciférase chez L. lactis. Les mesures d'activité luciférase sont effectuées sur le luminomètre Bertold Lumat LB9501. Un millilitre de culture de L. lactis est mélangé avec 5 l de nonaldehyde et l'émission de lumière est directement mesurée. La valeur du pic est ramenée à la D0600nm de la culture et l'activité luciférase est mesurée tout au long de la croissance. L'activité luciférase reportée dans la figure 1 est mesurée à DO600nm = 0. 4 et exprimée en 103 lux/DO. 4) Milieu Chimiquement Défini (CDM). Ce milieu chimiquement défini (CDM) est décrit dans Sissler et al.,(22). La source d' azote de ce milieu est un mélange d'acides aminés. Dans le "CDM cas" est ajouté un extrait de casitones (caséines du lait dégradée par des enzymes pancréatiques) qui est une source de petits peptides. 5) Constructions: PpepOA-ssgal. Le second promoteur de l'opéron opp-pepO (PpepOA) de la souche MG1363 a été amplifié par les oligonucléotides suivant (GGGAATTCTTTGGGAACAATGATAA et CGGGATCCGTTACTTCTGAACCA) et le fragment amplifié de 500pb a été cloné dans le plasmide pJIM762 au sites EcoRI-BamHI en amont du gène de la P-galactosidase de Escherichia coli (E. Guédon, résultats non encore publiés). Ce plasmide, dont le gène de la P-galactosidase est sous le contrôle des signaux d'expressions de PpepOA, a été intégré dans le chromosome de la MG1363 par recombinaison homologue au locus promoteur. La transcription à PpepOA est réprimée par les dipeptides contenu dans la casitone du milieu et la souche contenant la fusion est blanche sur un milieu chimiquement défini (CDM) contenant des casitones. La transcription à PpepOA est déréprimée sur un milieu CDM contenant des acides aminés comme source d'azote et la souche contenant la fusion est bleue [dans les deux cas la souche est cultivée avec du phospho-ss-galactoside (P-ss-gal). 6) Plasmide Pghost8-ISS1. Ce plasmide à réplication conditionnelle (protéine de réplication thermosensible) possède un marqueur d'antibiotique tétracycline et une séquence d'insertion ISS1 (16). L'augmentation de la température de 30 C à 37 C inhibe la réplication de ce plasmide et les souches résistantes à la tétracycline obtenues contiennent le plasmide intégré dans le chromosome. Il s'intègre de façon aléatoire dans le chromosome de L. lactis par transposition réplicative (16). 7) Mutagenèse par transposition. Une mutagenèse aléatoire est effectuée avec le plasmide thermosensible pGhost8-ISS1 dans la souche MG1363 contenant la fusion promoteur PpepOA--gal. En milieu MCD casitone, en présence de P-(3-gal, sur 50000 clones blancs isolés, 46 présentent un phénotype de couleur bleue. Dans ces mutants l'expression de la fusion (3-gal est déréprimée. Le plasmide pGhost8-ISS1 est donc inséré dans un gène dont le produit est un répresseur direct ou indirect de l'expression de PpepOA. 8) Identification des mutants par clonage des jonctions. La transposition par ISS1 dans le chromosome donne une insertion du pGhost8 entouré d'une copie dupliquée de 1SS1 . Les jonctions ont été clonées, en utilisant des sites uniques de restriction (EcoRI et HindIII) présent sur le pGhost8. La digestion du chromosome par ces enzymes permet d'obtenir le plasmide pGhost8 contenant les régions flanquantes. Le site de transposition est ainsi caractérisé par séquençage des jonctions avec les oligonucléotides suivants (pour la jonction EcoRI : TCACCTCATATAAATTCCCCA et AAATGGAACGCTCTTCGG) (pour la jonction HindIII : CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC et ACCAACAGCGACAATAATCACA). 9) Mutant codY. Une mutagenèse aléatoire a permis d'obtenir entre autre, des mutants codY pour lequel la transcription de plusieurs gènes codant pour des enzymes protéolytiques est dérégulée. L'inactivation de ce gène chez L. lactis augmente l'expression des gènes opp-pepO, pepN et pepC respectivement d'un facteur 55,14 et 4 en milieu CDM avec casitones où l'expression est normalement réprimée par la source de peptides. 10) Inactivation de codY par simple crossingover. Un fragment PCR de 540 pb a été amplifié par les oligonucléotides suivants (CAGTATGACTGAACGCTTGGC et GCGATAACATGCCCTTCTTCA) et cloné dans le plasmide pJIM2242. Ce plasmide est intégré dans le gène codY par simple crossing-over et un mutant codY est vérifié par une hybridation Southern. Ce mutant a le même phénotype que les mutants codY obtenus par mutagenèse. 11) Autres mutants. La mutagenèse aléatoire a permis d'identifier plusieurs mutants autre que codY. Des mutations des gènes dtpT, de l'opéron lev, secA, secY, et des gènes codant pour une hélicase, une P-glucosidase et une enzyme homologue à une formate déshydrogénase ont également conduit à des mutants surexprimant au moins pepO ou plusieurs peptidases. II - Résultats. 1) Construction du vecteur pVar-1. Des vecteurs intégratifs permettant de suivre l'expression d'un gène rapporteur sous le contrôle d'un promoteur sur le chromosome ont été construits. Les gènes de la luciférase de Vibrio harveyi ont été utilisés comme gène rapporteur. L'activité luciférase des fusions transcriptionnelles avec les promoteurs de gènes de peptidases est le reflet de l'expression des gènes de peptidases (11, 20). Un vecteur qui se réplique de façon conditionnelle a été utilisé pour intégrer les fusions transcriptionnelles sur le chromosome (15). Ce vecteur a été conçu pour être facilement transférable par conjugaison, en particulier dans des souches industrielles difficilement transformables. Un fragment (gène cluA) de l'élément chromosomique de 60kb nommé le facteur sexuel, que possèdent certaines souches de lactocoques, a été introduit dans ce vecteur. Cet élément est capable de s'auto-transférer à une haute fréquence par conjugaison dans l'espèce L. lactis (7). En intégrant nos fusions transcriptionnelles dans ce facteur sexuel, celles-ci sont alors transférables à d'autres souches de lactocoques par conjugaison du facteur sexuel. Parmi différents vecteurs construits, le pVar-1 utilisé dans cette étude contient, en plus des composants décrits ci dessus un gène de résistance à l'érythromycine. Il a été vérifié que les fusions transcriptionnelles intégrées au locus promoteur ou dans le gène cluA avec le pVar-1 avaient des activités luciférases identiques (9). 2) Expression de fusions avec les promoteurs des gènes codant pour des peptidases. Les promoteurs de 11 gènes codant pour des peptidases (pep) de L. lactis MG1363 : pepA, pepC, pepDA1, pepF2, pepM, pepN, pepP, pepQ, pepT, pepX ; et les deux promoteurs de l'opéron opp-pepO (PpepOA et PpepOD) dans lequel se trouve le gène pepO, ont été clonés, fusionnés au gène lux dans le vecteur pVar-1 et intégrés par recombinaison homologue dans le chromosome de L. lactis MG1363 au locus des différents promoteurs. Les deux promoteurs de protéase (prt des souches WG2 et SK11) sont fusionnés au gène luciférase sur un plasmide. L'expression de ces fusions a été déterminée en milieu CDM et CDM cas et les valeurs des mesures luciférases sont rapportées dans la figure 1. En milieu CDM, selon le taux de luciférase mesuré, les fusions ont été regroupées en différentes classes. La plus forte activité luciférase est obtenue avec les fusions plasmidiques contenant les promoteurs des gènes prt (10.103 lux/DO (103)).Pour les fusions chromosomiques, la plus forte activité luciférase est obtenue avec les promoteurs PpepN, PpepC, PpepOA et PpepOD (1 à 5 10.103 lux/DO (103),une activité moyenne est obtenue avec les promoteurs des gènes pepQ, pepX, pepM et pepT (200 à 300 lux/DO (103)) et une activité faible est obtenue avec les promoteurs des gènes pepP, pepA, pepF2 et pepDA1 (20 à 80 lux/DO (103)).Il est à remarquer que les niveaux d'expression les plus élevés sont obtenus avec des fusions contenant les promoteurs des gènes codant pour les peptidases de très large spécificité (pepC, pepN, pepO) et pour un système de transport des oligopeptides (Opp) qui est essentiel à la croissance des lactocoques en milieu lait. L'expression des gènes de peptidases est diminuée en milieu CDM cas qui contient une source d'azote constituée d'acides aminés et de peptides (figure 1). La force des promoteurs PpepP, PpepA, PpepF2, PpepDA1, PpepQ, PpepT et PpepM est diminuée de 2 à 3 fois en CDM cas tandis que celle des promoteurs PpepX, PpepC, PpepN, PprtPWG2, PprtPSKll, pepO, et l'opéron opp-pepO est réprimée respectivement 5,7, 13,21, 12 et 153 fois par les dipeptides du milieu de culture via le pool d'acides aminés branchés dans la cellule. L'analyse des transcrits par Northern Blot a permis de confirmer les résultats obtenus avec les fusions transcriptionnelles et de montrer que la transcription des gènes pepDA2 et dtpT, mais non celle de dtpP, était réprimée par les peptides de la casitone (figure 2). 3) Obtention et caractérisation de mutants déréprimés. Sur un milieu riche en peptides et en présence de P-gal, la souche sauvage contenant la fusion PpepQA-pgal donne des colonies blanches car l'expression de la fusion est réprimée. Les mutants obtenus donnent des colonies bleues car la fusion fusion PpepOA-ssgal est déréprimée. Différents gènes des mutants dans lesquels le pGhost s'est inséré ont été identifiés (codY, dtpT, l'opéron lev, secA, secY, et les gènes codant pour une p-glucosidase et une enzyme homologue à une formate deshydrogénase (fdh)). L'analyse des ARNm par Northern Blot d'une souche mutante cultivée dans un milieu riche en peptides, a confirmé que la transcription du gène pepO n'est plus réprimée dans les mutants des gènes codY, dtpT, fdh et l'opéron lev. La dérepression de pepO dans les mutants des gènes codant pour SecA, SecY et la P-glucosidase reste à être confirmé. 4) Caractérisation de l'expression des peptidases dans les mutants dérégulés. La transcription des gènes de peptidases a été caractérisée dans les mutants par mesure d'activité. Deux classes de mutants peuvent être obtenues, l'une pour laquelle la transcription de plusieurs peptidases est déréprimée (mutants pléiotropes) et l'autre où seule la transcription du gène pepO est déréprimée. Mutants des gènes codY, dtpT : dans un milieu riche M17 qui contient des peptides répresseurs, les activités luciférases ont été mesurées dans une souche sauvage et dans un mutant codY pour les promoteurs PpepOD, PpepC et PpepN, et dans un mutant dtpT pour le promoteur PpepOD. Dans un mutant codY, la répression de la transcription est diminuée d'un facteur 35,4 et 14 respectivement pour les gènes pepOD, pepC et pepN. Dans un mutant dtpT, la répression de la transcription est diminuée d'un facteur 15 pour le gène pepOD. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1) BOUTROU R., SEPULCHRE A., GRIPON J.C., MONNET V., 1998. Simple test for predicting the lytic behavior and proteolytic activity of lactococcal strains in cheese. J. Dairy Sci., 81,2321-2328. 2) DELORME C., EHRLICH S.D., RENAULT P., 1999. Régulation of expression of the Lactococcus lactis histidine operon. J. Bacteriol., 181,2026-2037. 3) Driessen A., Fekkes P., van der Wolk JP, "The Sec system" 1998, Curr. Opin. 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LISTE DE SÉQUENCES INFORMATION POUR LA SEQUENCE ID NO:1 i) CARACTÉRISTIQUE DE LA SÉQUENCE ID NO:1 A) LONGUEUR : B) TYPE : ADN C) NOMBRE DE BRIN : double D) CONFIGURATION : linéaire xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE ID NO:1 AGAGTAATTT TTCTGACAAT TTTTTATTGT TTTTCCATAT GCTTTTTTAT GTTATACTGA 60 TTATGAAAAA TTTTGTATAA AAACAAGAAT ATAAAAAAAT AGGAGAACAA AGTGGCTACA 120 TTA CTT GAA AAA ACA CGT AAA ATC ACC GCG ATT TTG CAA GAT GGA GTG 168 Leu Leu Glu Lys Thr Arg Lys Ile Thr Ala Ile Leu Gln Asp Gly Val 1 5 10 15 ACC GAT TTG CAA CAA GAG TTG CCA TAC AAC AGT ATG ACT GAA CGC TTG 216 Thr Asp Leu Gln Gln Glu Leu Pro Tyr Asn Ser Met Thr Glu Arg Leu 20 25 30 GCA AAC GTC ATT GAT TGC AAC GCC TGC GTG ATT AAT ACG AAG GGC GAG 264 Ala Asn Val Ile Asp Cys Asn Ala Cys val Ile Asn Thr Lys Gly Glu 35 40 45 TTG CTT GGT TAC TCA TTG CCT TAC AAT ACA AAC AAT GAT CGC GTT GAC 312 Leu Leu Gly Tyr Ser Leu Pro Tyr Asn Thr Asn Asn Asp Arg Val Asp 50 55 60 CAA TTT TTC TAC GAT CGT AAA TTG CCT GAC GAA TAC GTT CGT GCA GCA 360 Gln Phe Phe Tyr Asp Arg Lys Leu Pro Asp Glu Tyr Val Arg Ala Ala 65 70 75 80 GTA CGT ATT TAC GAT ACA ATG GCA AAC GTT CCT GTT GAT CGT CCT TTA 408 Val Arg Ile Tyr Asp Thr Met Ala Asn Val Pro Val Asp Arg Pro Leu 85 90 95 GCA ATT TTC CCA GAA GAA AGT CTT AGC GAT TTT CCA AAA GGT GTA ACA 456 Ala Ile Phe Pro Glu Glu Ser Leu Ser Asp Phe Pro Lys Gly Val Thr 100 105 110 ACT TTA GCG CCT ATC TAT GGT TCT GGA ATG CGT CTT GGA ACA TTT ATT 504 Thr Leu Ala Pro Ile Tyr Gly Ser Gly Met Arg Leu Gly Thr Phe Ile 115 120 125 ATG TGG CGT GAA GAT GGT GAA TTT ACA GAT GAC GAT CTT GTT TTG GTT 552 Met Trp Arg Glu Asp Gly Glu Phe Thr Asp Asp Asp Leu Val Leu Val 130 135 140 GAG CTT GCA ACA ACA GTA ATC GGT GTA CAA CTC TCA AAC CTT AAA CTT 600 Glu Leu Ala Thr Thr Val Ile Gly Val Gln Leu Ser Asn Leu Lys Leu 145 150 155 160 GAA CAA ATG GAA GAA AAT ATC CGT AAA GAC ACT ATG GCA ACA ATG GCT 648 Glu Gln Met Glu Glu Asn Ile Arg Lys Asp Thr Met Ala Thr Met Ala 165 170 175 GTT AAT ACA CTT TCT TAC TCA GAA ATG AAA GCT GTC AAA GCA ATT ATT 696 Val Asn Thr Leu Ser Tyr Ser Glu Met Lys Ala Val Lys Ala Ile Ile 180 185 190 GAA GAA CTT GAT GGT GAA GAA GGG CAT GTT ATT GCC TCT GTC ATT GCT 744 Glu Glu Leu Asp Gly Glu Glu Gly His Val Ile Ala Ser Val Ile Ala 195 200 205 GAC AAG ATT GGT ATT ACA CGT TCA GTG ATT GTT AAT GCT TTA CGT AAA 792 Asp Lys Ile Gly Ile Thr Arg Ser Val Ile Val Asn Ala Leu Arg Lys 210 215 220 CTT GAA TCT GCT GGT GTT ATT GAA TCA CGT TCA CTT GGT ATG AAA GGA 840 Leu Glu Ser Ala Gly Val Ile Glu Ser Arg Ser Leu Gly Met Lys Gly 225 230 235 240 ACT TAT CTT AAA GTT CTT AAT ACT GGT TTG TTT GAT AAA CTT GCT GGA 888 Thr Tyr Leu Lys Val Leu Asn Thr Gly Leu Phe Asp Lys Leu Ala Gly 245 250 255 CGT AAT TTC TAAAAGTCAG AGCTTAACGC TTGTTCTTTT ATCATTTGTT 937 Arg Asn Phe 259 INFORMATION POUR LA SEQUENCE ID NO:2 i) CARACTÉRISTIQUE DE LA SÉQUENCE ID NO:2 A) LONGUEUR : B) TYPE : ADN C) NOMBRE DE BRIN : double D) CONFIGURATION : linéaire xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE ID NO:2 ATG CGT GCC ATT CTG GTT TAT TAC CTC TAT GCA TTG ACA ACT GCA GAT 48 Met Arg Ala Ile Leu Val Tyr Tyr Leu Tyr Ala Leu Thr Thr Ala Asp 1 10 15 AAC GCA GGT TTA GGA CTT CCT AAA GCT CAG GCA ATG GCG ATT GTA AGT 96 Asn Ala Gly Leu Gly Leu Pro Lys Ala Gln Ala Met Ala Ile Val Ser 20 25 30 ATT TAT GGT GCA CTT GTC TAT CTT TCA ACA ATT GTT GGG GGA TGG GTT 144 Ile Tyr Gly Ala Leu Val Tyr Leu Ser Thr Ile Val Gly Gly Trp Val 35 40 45 GCT GAC CGG TTG TTG GGC GCT TCG CGC ACA ATC TTC TTG GGT GGT ATT 192 Ala Asp Arg Leu Leu Gly Ala Ser Arg Thr Ile Phe Leu Gly Gly Ile 50 55 60 TTA ATC ACT TTA GGA CAC GTC GCT TTA GCA ACA CCA TTT GGT TTA TCT 240 Leu Ile Thr Leu Gly His Val Ala Leu Ala Thr Pro Phe Gly Leu Ser 70 75 80 85 TCA CTC TTC GTG GCA TTA TTC TTG ATT ATC TTA GGA ACA GGG ATG CTT 288 Ser Leu Phe Val Ala Leu Phe Leu Ile Ile Leu Gly Thr Gly Met Leu 90 95 100 AAA CCC AAT ATT TCT AAC ATG GTT GGG CAT CTA TAT TCA AAA GAT GAC 336 Lys Pro Asn Ile Ser Asn Met Val Gly His Leu Tyr Ser Lys Asp Asp 105 110 115 TCA CGT CGT GAT ACT GGA TTT AAT ATC TTT GTA GTC GGA ATT AAT ATG 384 Ser Arg Arg Asp Thr Gly Phe Asn Ile Phe Val Val Gly Ile Asn Met 120 125 130 GGT TCT CTG ATT GCT CCA TTG ATT GTT GGG ACA GTT GGA CAA GGC GTG 432 Gly Ser Leu Ile Ala Pro Leu Ile Val Gly Thr Val Gly Gin Gly Val 135 140 145 150 AAC TAC CAC TTA GGT TTC TCA CTT GCC GCA ATC GGA ATG ATT TTT GCA 480 Asn Tyr His Leu Gly Phe Ser Leu Ala Ala Ile Gly Met Ile Phe Ala 155 160 165 TTA TTT GCT TAT TGG TAT GGA CGT CTT CGT CAT TTC CCA GAA ATT GGA 528 Leu Phe Ala Tyr Trp Tyr Gly Arg Leu Arg His Phe Pro Glu Ile Gly 170 175 180 CGT GAA CCA TCT AAT CCA ATG GAT GCA AAA GCA AAA CGT AAT TTT ATT 576 Arg Glu Pro Ser Asn Pro Met Asp Ala Lys Ala Lys Arg Asn Phe Ile 190 195 200 ATT ACA TTA ACG ATT GTT CTT ATC GTT GCT TTA ATC GGA TTT TTC TTA 624 Ile Thr Leu Thr Ile Val Leu Ile Val Ala Leu Ile Gly Phe Phe Leu 205 210 215 ATT TAT CAA GCA AGT CCT GCG AAT TTC ATC AAT AAT TTC ATT AAC GTT 672 Ile Tyr Gin Ala Ser Pro Ala Asn Phe Ile Asn Asn Phe Ile Asn Val 220 225 230 235 TTA TCA ATT ATC GGT ATT GTT GTT CCA ATT ATT TAT TTC GTA ATG ATG 720 Leu Ser Ile Ile Gly Ile Val Val Pro Ile Ile Tyr Phe Val Met Met 240 245 250 TTT ACC TCT AAA AAG GTA GAA TCA GAC GAA CGT CGT AAA TTA ACG GCT 768 Phe Thr Ser Lys Lys Val Glu Ser Asp Glu Arg Arg Lys Leu Thr Ala 255 260 265 TAT ATT CCT TTG TTC CTT TCT GCT ATT GTC TTT TGG GCA ATT GAA GAA 816 Tyr Ile Pro Leu Phe Leu Ser Ala Ile Val Phe Trp Ala Ile Glu Glu 270 275 280 CAA AGT TCT ACG ATT ATT GCG GTT TGG GGA GAA TCA CGT TCT AAC TTA 864 Gln Ser Ser Thr Ile Ile Ala Val Trp Gly Glu Ser Arg Ser Asn Leu 285 290 295 AAT CCT ACT TGG TTT GGA TTT ACT TTC CAT ATT GAC CCA TCT TGG TAC 912 Asn Pro Thr Trp Phe Gly Phe Thr Phe His Ile Asp Pro Ser Trp Tyr 300 305 310 315 CAA TTG TTG AAC CCA CTC TTC ATC GTT CTC TTG TCA CCT ATC TTT GTA 960 Gin Leu Leu Asn Pro Leu Phe Ile Val Leu Leu Ser Pro Ile Phe Val 320 325 330 CGA ATT TGG AAC AAA TTA GGA GAT CGT CAA CCA TCA ACC ATC GTT AAA 1008 Arg Ile Trp Asn Lys Leu Gly Asp Arg Gln Pro Ser Thr Ile Val Lys 335 340 345 TTT GGT CTT GGA CTG ATG TTG ACC GGA GCT TCT TAT TTG ATT ATG ACA 1056 Phe Gly Leu Gly Leu Met Leu Thr Gly Ala Ser Tyr Leu Ile Met Thr 350 355 360 CTT CCT GGA CTC TTG AAT GGG ACT TCT GGA CGT GCG AGT GCT CTT TGG 1104 Leu Pro Gly Leu Leu Asn Gly Thr Ser Gly Arg Ala Ser Ala Leu Trp 365 370 375 CTA GTA TTG ATG TTT GCT GTT CAA ATG GCA GGT GAA TTA CTT GTT TCA 1152 Leu Val Leu Met Phe Ala Val Gln Met Ala Gly Glu Leu Leu Val Ser 380 385 390 395 CCA GTT GGT TTA TCA GTT TCA ACA AAA TTA GCG CCA GTA GCA TTC CAA 1200 Pro Val Gly Leu Ser Val Ser Thr Lys Leu Ala Pro Val Ala Phe Gln 400 405 410 TCT CAA ATG ATG GCA ATG TGG TTC TTG GCA GAC TCA ACT TCA CAA GCG 1248 Ser Gln Met Met Ala Met Trp Phe Leu Ala Asp Ser Thr Ser Gln Ala 415 420 425 ATT AAT GCC CAA ATT ACA CCT ATC TTT AAA GCA GCA ACA GAA GTT CAC 1296 Ile Asn Ala Gln Ile Thr Pro Ile Phe Lys Ala Ala Thr Glu Val His 430 435 440 TTC TTT GCA ATT ACA GGG ATT ATC GGT ATT ATC GTT GGA ATC ATC CTC 1344 Phe Phe Ala Ile Thr Gly Ile Ile Gly Ile Ile Val Gly Ile Ile Leu 445 450 455 CTT ATT ATC AAA AAA CCT ATT TTG AAA TTA ATG GGA GAT GTT CGT 1389 Leu Ile Ile Lys Lys Pro Ile Leu Lys Leu Met Gly Asp Val Arg 460 465 470 479 INFORMATION POUR LA SEQUENCE ID NO:3 i) CARACTÉRISTIQUE DE LA SÉQUENCE ID NO:3 A) LONGUEUR : B) TYPE : ADN C) NOMBRE DE BRIN : double D) CONFIGURATION : linéaire xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE ID NO:3 ATG GAA AAT GTT GCC TTA ACT CAC TTT GTA GAT AAT GCT TTA CGT GCC 48 Met Glu Asn Val Ala Leu Thr His Phe Val Asp Asn Ala Leu Arg Ala 1 10 15 AAC TTT ATC ATG CTT CAC GAC ATC GAC TAT ATG GTT GAT GAA AAC CAA 96 Asn Phe Ile Met Leu His Asp Ile Asp Tyr Met Val Asp Glu Asn Gln 20 25 30 GAA GTT TTG ATT ATT GAC CAA TTT ACT GGA CGT ACG ATG CCT GGA CGT 144 Glu Val Leu Ile Ile Asp Gln Phe Thr Gly Arg Thr Met Pro Gly Arg 35 40 45 CGC TAT TCT GAT GGT CTT CAC CAA GCA ATT GAA GCT AAA GAA GCT GTG 192 Arg Tyr Ser Asp Gly Leu His Gln Ala Ile Glu Ala Lys Glu Ala Val 50 55 60 CCA ATT CAA GAT GAA TCA AAA ACA ATG GCT TCA ATT ACG ATT CAA AAC 240 Pro Ile Gln Asp Glu Ser Lys Thr Met Ala Ser Ile Thr Ile Gln Asn 65 70 75 80 TAC TTC CGG ATG TAT AAA AAA CTG TCA GGG ATG ACA GGG ACT GCT AAA 288 Tyr Phe Arg Met Tyr Lys Lys Leu Ser Gly Met Thr Gly Thr Ala Lys 85 90 95 ACC GAA GAA GAA GAA TTC CGT GAG ATT TAT AAC ATT CAA ATC ACA CCA 336 Thr Glu Glu Glu Glu Phe Arg Glu Ile Tyr Asn Ile Gln Ile Thr Pro 100 105 110 ATT CCA ACC AAC CGT CCT GTT CAA CGT TTA GAT CAT CCA GAT TTA CTT 384 Ile Pro Thr Asn Arg Pro Val Gln Arg Leu Asp His Pro Asp Leu Leu 115 120 125 TAC CCA ACT TTG GAA GCT AAA TTT AAA GCA GTT ATT GAT GAT ATT AAA 432 Tyr Pro Thr Leu Glu Ala Lys Phe Lys Ala Val Ile Asp Asp Ile Lys 130 135 140 CGT CGT CAT GCT GAA GGT CAA CCA ATA TTG ATT GGT ACT GTT GCT GTC 480 Arg Arg His Ala Glu Gly Gln Pro Ile Leu Ile Gly Thr Val Ala Val 145 150 155 160 GAA ACT TCC GAA TTG ATT TCT AAG AAA TTG GTT GAA GCA AAA ATT CCT 528 Glu Thr Ser Glu Leu Ile Ser Lys Lys Leu Val Glu Ala Lys Ile Pro 165 170 175 CAC GAA GTT TTG AAT GCG AAA AAT CAC TTC CGT GAA GCA CAA ATC ATC 576 His Glu Val Leu Asn Ala Lys Asn His Phe Arg Glu Ala Gln Ile Ile 180 185 190 ATG AAT GCG GGT CAA CAA GGA GCA GTA ACG ATT GCG ACC AAC ATG GCC 624 Met Asn Ala Gly Gln Gln Gly Ala Val Thr Ile Ala Thr Asn Met Ala 195 200 205 GGT CGT GGG ACT GAT ATC AAG CTT GGG CCT GGT GTA ATT GAT CAT GTA 672 Gly Arg Gly Thr Asp Ile Lys Leu Gly Pro Gly Val Ile Asp His Val 210 215 220 GAC CCT GAA TTC CGA GGT CTT GCT GTT ATT GGT ACT GAG CGT CAT GAA 720 Asp Pro Glu Phe Arg Gly Leu Ala Val Ile Gly Thr Glu Arg His Glu 225 230 235 240 TCT CGT CGT ATT GAT AAT CAA TTA CGT GGT CGT TCT GGA CGT CAA GGT 768 Ser Arg Arg Ile Asp Asn Gln Leu Arg Gly Arg Ser Gly Arg Gln Gly 245 250 255 GAC CCA GGG GTT TCA CAA TTC TAT CTT TCT CTT GAA GAT GAA TTA ATG 816 Asp Pro Gly Val Ser Gln Phe Tyr Leu Ser Leu Glu Asp Glu Leu Met 260 265 270 AAA CGT TTT GGT TCG GAA CGT GTT TCA GCT TTC CTA GAT AGA ATG CGT 864 Lys Arg Phe Gly Ser Glu Arg Val Ser Ala Phe Leu Asp Arg Met Arg 275 280 285 ATT TCT GGT GAA GAT GCT GTC ATC AAA TCT GGC TTG ATT ACT CGT CAG 912 Ile Ser Gly Glu Asp Ala Val Ile Lys Ser Gly Leu Ile Thr Arg Gln 290 295 300 ATT GAA AGT TCA CAA AAA CGT GTC GAA GGA AAT AAC TAC GAT TCT CGT 960 Ile Glu Ser Ser Gln Lys Arg Val Glu Gly Asn Asn Tyr Asp Ser Arg 305 310 315 320 AAA CAA GTC TTG CAA TAT GAT GAT GTC ATC CGT GAG CAA CGT GAA GTT 1008 Lys Gln Val Leu Gln Tyr Asp Asp Val Ile Arg Glu Gln Arg Glu Val 325 330 335 ATT TAT GCG CAA CGT CAG GAA GTT ATC TTG GCT ACA GAA GAT ATG ACT 1056 Ile Tyr Ala Gln Arg Gln Glu Val Ile Leu Ala Thr Glu Asp Met Thr 340 345 350 CCT GTT TTG ATG GGC ATG TTC AAG CGA ACA ATT GAT CGT CAA GTG GAT 1104 Pro Val Leu Met Gly Met Phe Lys Arg Thr Ile Asp Arg Gln Val Asp 355 360 365 GGT CAT GAA CTT GCA GGA AGT CTT AAA GAT GAA GAA AAT GTC AAA AAT 1152 Gly His Glu Leu Ala Gly Ser Leu Lys Asp Glu Glu Asn Val Lys Asn 370 375 380 CTC TTG CAA ACA TTA CAC AAT ACA ATG TTG CCA GAA GAT GGC ATT GAA 1200 Leu Leu Gln Thr Leu His Asn Thr Met Leu Pro Glu Asp Gly Ile Glu 385 390 395 400 TTG TCT GAA CTG ACA GGT TTG TCA GTA CAA GCA ATG AAA GAT TTG ATT 1248 Leu Ser Glu Leu Thr Gly Leu Ser Val Gln Ala Met Lys Asp Leu Ile 405 410 415 TTT GAT AAA GTC AAA GCT CGT TAT GCT TCA CAA ATG GAA AAA TTA TCT 1296 Phe Asp Lys Val Lys Ala Arg Tyr Ala Ser Gln Met Glu Lys Leu Ser 420 425 430 GAC CCA GAA CGT CAG TTG GAA TTC CAA CGT GCA GTT ATC TTA CGA GTT 1344 Asp Pro Glu Arg Gln Leu Glu Phe Gln Arg Ala Val Ile Leu Arg Val 435 440 445 GTT GAT AAT AAC TGG TCA GAA CAC ATT GAT GCG CTT GAC CAA ATG CGT 1392 Val Asp Asn Asn Trp Ser Glu His Ile Asp Ala Leu Asp Gln Met Arg 450 455 460 CAA TCA GTA GGA CTT CGT GGT TAT GCC CAA AAT AAC CCT ATT GTT GAA 1440 Gln Ser Val Gly Leu Arg Gly Tyr Ala Gln Asn Asn Pro Ile Val Glu 465 470 475 480 TAT CAA GAA GAA TCA TAT AAA ATG TAC AAT AAT ATG ATT GGT GCG ATT 1488 Tyr Gln Glu Glu Ser Tyr Lys Met Tyr Asn Asn Met Ile Gly Ala Ile 485 490 495 GAA TTT GAA GTG ACT CGT TTG ATG ATG AAA GCT CAA ATT CAA CCA CAA 1536 Glu Phe Glu Val Thr Arg Leu Met Met Lys Ala Gln Ile Gln Pro Gln 500 505 510 ACG GCA ATC CGT CAG GAA GCG CCA AGA ATG ACA ACC ACA GCT TCA CAA 1584 Thr Ala Ile Arg Gln Glu Ala Pro Arg Met Thr Thr Thr Ala Ser Gln 515 520 525 GAA AAT ATT ACA AAT GTT GAT ACT GAA CAT TCT GTC AGT GAA GAA ATT 1632 Glu Asn Ile Thr Asn Val Asp Thr Glu His Ser Val Ser Glu Glu Ile 530 535 540 TCA TTT GAA AAT GTT GGT CGT AAC GAC CTT TGT CCT TGT GGT TCT GGT 1680 Ser Phe Glu Asn Val Gly Arg Asn Asp Leu Cys Pro Cys Gly Ser Gly 545 550 555 560 AAG AAG TTT AAA AAT TGT CAC GGA CGT ACA CAT ATT GCC 1719 Lys Lys Phe Lys Asn Cys His Gly Arg Thr His Ile Ala 565 570 573 INFORMATION POUR LA SEQUENCE ID NO:4 i) CARACTÉRISTIQUE DE LA SÉQUENCE ID NO:4 A) LONGUEUR . B) TYPE : ADN C) NOMBRE DE BRIN : double D) CONFIGURATION : linéaire xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE ID NO:4 ATG TTT TTT AAG ACG CTT AAG GAA GCC TTT AAG GTC AAA GAC GTC CGA 48 Met Phe Phe Lys Thr Leu Lys Glu Ala Phe Lys Val Lys Asp Val Arg 1 5 10 15 GCA AGA ATT CTC TTT ACG ATT TTC ATC CTT TTT GTT TTC CGC TTA GGT 96 Ala Arg Ile Leu Phe Thr Ile Phe Ile Leu Phe Val Phe Arg Leu Gly 20 25 30 GCT CAT ATT ACG GTA CCT GGC GTC AAC GTT CAA AAC TTA ACA GAA GTA 144 Ala His Ile Thr Val Pro Gly Val Asn Val Gln Asn Leu Thr Glu Val 35 40 45 AGT AAT CTT CCT TTC TTG AAC ATG ATG AAC TTG GTT TCT GGT AAT GCC 192 Ser Asn Leu Pro Phe Leu Asn Met Met Asn Leu Val Ser Gly Asn Ala 50 55 60 ATG CAA AAC TAC TCA CTC TTT GCA ATG GGA GTT TCG CCT TAT ATC ACT 240 Met Gln Asn Tyr Ser Leu Phe Ala Met Gly Val Ser Pro Tyr Ile Thr 65 70 75 80 GCT TCA ATC ATT GTT CAA TTG TTG CAA ATG GAT ATT TTA CCA AAA TTT 288 Ala Ser Ile Ile Val Gln Leu Leu Gln Met Asp Ile Leu Pro Lys Phe 85 90 95 GTT GAG TGG TCA AAA CAA GGG GAA ATT GGA CGT CGT AAA CTG AAT CAA 336 Val Glu Trp Ser Lys Gln Gly Glu Ile Gly Arg Arg Lys Leu Asn Gln 100 105 110 GCG ACA CGT TAC ATT ACC TTA GTG CTT GCT ATG GCA CAA TCT ATC GGG 384 Ala Thr Arg Tyr Ile Thr Leu Val Leu Ala Met Ala Gln Ser Ile Gly 115 120 125 ATT ACT GCT GGT TTC CAA GCC ATG AGC TCG TTA AAT ATT GTG CAA AAT 432 Ile Thr Ala Gly Phe Gln Ala Met Ser Ser Leu Asn Ile Val Gln Asn 130 135 140 CCA AAT TGG CAA AGC TAT TTG ATG ATT GGT GCA ATT TTG ACC ACT GGT 480 Pro Asn Trp Gln Ser Tyr Leu Met Ile Gly Ala Ile Leu Thr Thr Gly 145 150 155 160 TCA ATG GTT GTC ACT TGG ATG GGT GAA CAA ATT AAT GAC CAA GGT TTT 528 Ser Met Val Val Thr Trp Met Gly Glu Gln Ile Asn Asp Gln Gly Phe 165 170 175 GGC TCA GGT GTT TCA GTA ATC ATC TTT GCT GGG ATT GTC TCT AGT ATT 576 Gly Ser Gly Val Ser Val Ile Ile PheAla Gly Ile Val Ser Ser Ile 180 185 190 CCA TCA GCC ATC AAA TCT GTT TAT GAT GAA AAA TTC TTA AAC GTA AGA 624 Pro Ser Ala Ile Lys Ser Val Tyr Asp Glu Lys Phe Leu Asn Val Arg 195 200 205 CCA TCT GAA ATT CCT ATG TCT TGG ATA TTT GTT ATT GGA TTG ATT TTG 672 Pro Ser Glu Ile Pro Met Ser Trp Ile Phe Val Ile Gly Leu Ile Leu 210 215 220 TCA GCA ATT GTC ATT ATT TAT GTT ACA ACA TTT GTT CAA CAA GCG GAA 720 Ser Ala Ile Val Ile Ile Tyr Val Thr Thr Phe Val Gln Gln Ala Glu 225 230 235 240 CGT AAA GTA CCA ATT CAA TAC ACT AAG TTG ACT CAA GGC GCA CCA ACA 768 Arg Lys Val Pro Ile Gln Tyr Thr Lys Leu Thr Gln Gly Ala Pro Thr 245 250 255 AGT TCG TAC TTT CCA CTT CGT GTC AAT CCA GCT GGT GTT ATC CCA GTT 816 Ser Ser Tyr Phe Pro Leu Arg Val Asn Pro Ala Gly Val Ile Pro Val 260 265 270 ATC TTT GCT GGT TCA ATT ACA ACT GCT CCT GCT ACG ATC TTG CAA TTC 864 Ile Phe Ala Gly Ser Ile Thr Thr Ala Pro Ala Thr Ile Leu Gln Phe 275 280 285 TTG CAA CGT TCA CAA GGT AGC AAT GTA GGT TGG TTA TCA ACC TTA CAA 912 Leu Gln Arg Ser Gln Gly Ser Asn Val Gly Trp Leu Ser Thr Leu Gln 290 295 300 AAC GCC TTG TCA TAT ACG ACT TGG ACA GGA ATG CTC TTC TAC GCA TTA 960 Asn Ala Leu Ser Tyr Thr Thr Trp Thr Gly Met Leu Phe Tyr Ala Leu 305 310 315 320 TTG ATT GTT CTC TTT ACT TTC TTC TAC TCA TTC GTT CAG GTC AAT CCT 1008 Leu Ile Val Leu Phe Thr Phe Phe Tyr Ser Phe Val Gln Val Asn Pro 325 330 335 GAA AAG ATG GCT GAA AAC CTT CAA AAA CAA GGC TCT TAC ATT CCA TCT 1056 Glu Lys Met Ala Glu Asn Leu Gln Lys Gln Gly Ser Tyr Ile Pro Ser 340 345 350 GTT CGT CCG GGT AAA GGA ACC GAA AAG TAT GTT TCT CGT CTC TTA ATG 1104 Val Arg Pro Gly Lys Gly Thr Glu Lys Tyr Val Ser Arg Leu Leu Met 355 360 365 CGT CTT GCA ACG GTT GGT TCG CTC TTC CTT GGA TTG ATT TCA ATC ATT 1152 Arg Leu Ala Thr Val Gly Ser Leu Phe Leu Gly Leu Ile Ser Ile Ile 370 375 380 CCA ATT GCG GCC CAA AAC GTT TGG GGA CTT CCA AAA ATC GTC GCT CTT 1200 Pro Ile Ala Ala Gln Asn Val Trp Gly Leu Pro Lys Ile Val Ala Leu 385 390 395 400 GGA GGG ACA TCA TTA TTA ATC TTG ATT CAA GTT GCG ATT CAA GCA GTT 1248 Gly Gly Thr Ser Leu Leu Ile Leu Ile Gln Val Ala Ile Gln Ala Val 405 410 415 AAA CAA CTT GAA GGA TAT TTA CTT AAA CGT AAA TAT GCA GGA TTT ATG 1296 Lys Gln Leu Glu Gly Tyr Leu Leu Lys Arg Lys Tyr Ala Gly Phe Met 420 425 430 GAT AAT CCA CTT GAA ACA AAA 1317 Asp Asn Pro Leu Glu Thr Lys 435 439 INFORMATION POUR LA SEQUENCE ID NO:5 i) CARACTÉRISTIQUE DE LA SÉQUENCE ID NO:5 A) LONGUEUR : B) TYPE : ADN C) NOMBRE DE BRIN : double D) CONFIGURATION : linéaire xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE ID NO:5 GTAATATTTT TATGAAAACA TTTGCAAATA TCGATTTGAA GTAGTATAAT AACTAAGTAA 60 TAATTTTTAT TATAATCTTA TATAGGAGGT TACTCACATT GAGTATCGGA ATTGTTATTG 120 CGAGCC ATG GTG AAT TCG CCG CAG ATC AAA CAA TCT GGT TCT ATG 165 Met Val Asn Ser Pro Gln Ile Lys Gln Ser Gly Ser Met 1 5 10 ATT TTC GGA GAG CAA GAA AAA GTA CAA GTT GTT ACT TTT ATG CCT AGC 213 Ile Phe Gly Glu Gln Glu Lys Val Gln Val Val Thr Phe Met Pro Ser 15 20 25 GAA GGA CCA ACT GAT TTG CAT GCT AAA ATC GAA GCT GCC ATC GCA ACA 261 Glu Gly Pro Thr Asp Leu His Ala Lys Ile Glu Ala Ala Ile Ala Thr 30 35 40 45 TTT GAT GCT GAA GAT GAA GTA CTT GTC CTT GCT GAC TTA TGG AGC GGT 309 Phe Asp Ala Glu Asp Glu Val Leu Val Leu Ala Asp Leu Trp Ser Gly 50 55 60 TCT CCA TTT AAT CAA GCA AGT GCA GTG ATG GGT GAA AAT CCA GAG CGC 357 Ser Pro Phe Asn Gln Ala Ser Ala Val Met Gly Glu Asn Pro Glu Arg 65 70 75 AAG ATT GCT ATC ATC ACA GGC CTC AAC CTG CCT ATG CTT ATC CAA GCC 405 Lys Ile Ala Ile Ile Thr Gly Leu Asn Leu Pro Met Leu Ile Gln Ala 75 80 85 TAC ACA GAA CGC ATG ATG GAT GCG TCT GCC GGG GTG GAT AAA GTC GTA 453 Tyr Thr Glu Arg Met Met Asp Ala Ser Ala Gly Val Asp Lys Val Val 90 95 100 GCA AAT ATT ATG AAA GAA GCC AAA GGC GGT ATT AAA GTA CTA CCT GAA 501 Ala Asn Ile Met Lys Glu Ala Lys Gly Gly Ile Lys Val Leu Pro Glu 105 110 115 120 GAA CTT CAA CCT GCT GAA GAA ACT GCT GTT GCA GCT GCT CCG GCT GCT 549 Glu Leu Gln Pro Ala Glu Glu Thr Ala Val Ala Ala Ala Pro Ala Ala 125 130 135 GTT CAA GGT GCG ATT CCT GAA GGA ACA GTC ATC GGT GAT GGT AAA ATT 597 Val Gln Gly Ala Ile Pro Glu Gly Thr Val Ile Gly Asp Gly Lys Ile 140 145 150 AAA ATT AAC CTC GCT CGT ATT GAC TCA CGT TTG CTT CAC GGA CAA GTT 645 Lys Ile Asn Leu Ala Arg Ile Asp Ser Arg Leu Leu His Gly Gln Val 155 160 165 GCA ACT GCT TGG ACT CCA GAC TCA AGA GCA AAC CGC ATC ATC GTT GTT 693 Ala Thr Ala Trp Thr Pro Asp Ser Arg Ala Asn Arg Ile Ile Val Val 170 175 180 ll. 1 Vtll, fiL - % 1 1 l l. 1 t1lLS Vtl1 VLt1 l.1 1 L.V 1 C1llV C1C1V \. C11 1 VL'1C1 I Ser Asp Thr Val Ser Lys Asp Glu Leu Arg Lys Lys Leu Ile Glu Gln 185 190 195 200 GCG GCT CCA ACT GGT GTA AAA GCT AAC GTT ATA CCA ATT AAG AAA ATG 789 Ala Ala Pro Thr Gly Val Lys Ala Asn Val Ile Pro Ile Lys Lys Met 205 210 215 ATT GAA GTT GCT AAA GAC CCA CGT TTT GGT GAC ACT AAA GCC CTT CTT 837 Ile Glu Val Ala Lys Asp Pro Arg Phe Gly Asp Thr Lys Ala Leu Leu 220 225 230 CTT TTC GAA ACG CCA CAA GAC GCT CTT GCA ACA ATC GAA GGT GGC GTA 885 Leu Phe Glu Thr Pro Gln Asp Ala Leu Ala Thr Ile Glu Gly Gly Val 235 240 245 CCA ATT GAA ACA TTG AAC GTT GGT TCT ATG GCT CAC TCA ACT GGT AAA 933 Pro Ile Glu Thr Leu Asn Val Gly Ser Met Ala His Ser Thr Gly Lys 250 255 260 ACA ATG CTC AAC AAA GTT CTT TCT ATG GAC AAA GAT GAC GTT GCT ACT 981 Thr Met Leu Asn Lys Val Leu Ser Met Asp Lys Asp Asp Val Ala Thr 265 270 275 TTT GAA AAA TTG CGT GAC CTC GGA GTT AAA TTC GAC GTA CGT AAA GTT 1029 Phe Glu Lys Leu Arg Asp Leu Gly Val Lys Phe Asp Val Arg Lys Val 280 285 290 295 CCA GCT GAC TCT AAA TCT GAC CTC TTT GGT TTG ATT AAC AAA GCT GAC 1077 Pro Ala Asp Ser Lys Ser Asp Leu Phe Gly Leu Ile Asn Lys Ala Asp 300 305 310 GTA CAA TAATCAGAAT ATGCTCGTAT GATATTCTGA TTACTAAAAT TGAATATTAG 1133 Val Gln 313 GCAGCCAAAT AATTAAGGAG ATATAAAAAA C ATG GAA TAC GGT GTT TTA TCT 1185 Met Glu Tyr Gly Val Leu Ser 314 315 320 GTA ATC TTG GTC ATT GTT GTT GCC TTC CTT GCT GGT CTT GAA GGT ATC 1233 Val Ile Leu Val Ile Val Val Ala Phe Leu Ala Gly Leu Glu Gly Ile 325 330 335 CTT GAC CAA TGG CAA TTC CAC CAA CCA ATT ATC GCG TGC TCG CTC ATC 1281 Leu Asp Gln Trp Gln Phe His Gln Pro Ile Ile Ala Cys Ser Leu Ile 340 345 350 GGT ATT GTT ACC GGT CAT GCT TCT GCA GGG ATT ATC CTC GGT GGT TCA 1329 Gly Ile Val Thr Gly His Ala Ser Ala Gly Ile Ile Leu Gly Gly Ser 355 360 365 CTT CAA TTG ATC GCT CTT GGT TGG GCT AAC GTT GGT GCC GCT GTC GCA 1377 Leu Gln Leu Ile Ala Leu Gly Trp Ala Asn Val Gly Ala Ala Val Ala 370 375 380 CCC GAT GCT GCC CTT GCC TCT ATC GCA TCA TCT ATC TTG ATG GTT CAA 1425 Pro Asp Ala Ala Leu Ala Ser Ile Ala Ser Ser Ile Leu Met Val Gln 385 390 395 400 TCA AAT AAC TTT GAC TTG ACT CAC ATC ATG GGT ACT ATC GTT CCT GCT 1473 Ser Asn Asn Phe Asp Leu Thr His Ile Met Gly Thr Ile Val Pro Ala 405 410 415 GCT ATC TTG CTT GCA ACT GCT GGT CTT GTA TTG ACT ACT CTT GTA CGT 1521 Ala Ile Leu Leu Ala Thr Ala Gly Leu Val Leu Thr Thr Leu Val Arg 420 425 430 ATG CTT TCA GTT GTG CTC GTT CAC CAA GCT GAC CGT GCT GCT GAA AAT 1569 Met Leu Ser Val Val Leu Val His Gln Ala Asp Arg Ala Ala Glu Asn 435 440 445 GGT TCA TAC TCA GGT GTT GAA ATG TGG CAC TTC ATC GCG CTT ATC TGT 1617 Gly Ser Tyr Ser Gly Val Glu Met Trp His Phe Ile Ala Leu Ile Cys 450 455 460 CAA GGT TTG CGT ATT GCT ATC CCT GCT GGA CTT CTT TTG GTT ATC TCA 1665 Gln Gly Leu Arg Ile Ala Ile Pro Ala Gly Leu Leu Leu Val Ile Ser 465 470 475 480 CCA GAT GCT ATC CAA AAA GCA CTT GCT GCT ATT CCT CCA GTT ATC TCT 1713 Pro Asp Ala Ile Gln Lys Ala Leu Ala Ala Ile Pro Pro Val Ile Ser 485 490 495 GGC GGT CTT GCT GTC GGT GGT GGG ATG GTT GTT GCC GTT GGT TAT GCA 1761 Gly Gly Leu Ala Val Gly Gly Gly Met Val Val Ala Val Gly Tyr Ala 500 505 510 ATG GTT ATC AAC CTT ATG GCT ACT CGT GAA GTA TGG CCA TTC TTC TTC 1809 Met Val Ile Asn Leu Met Ala Thr Arg Glu Val Trp Pro Phe Phe Phe 515 520 525 CTT GGT TTC GCT CTC GCA CCA ATC TCT GAA TTA ACA TTG ATT GCA ACT 1857 Leu Gly Phe Ala Leu Ala Pro Ile Ser Glu Leu Thr Leu Ile Ala Thr 530 535 540 GGT GTC CTC GGT GTT GTT ATC GCT ATC GTT TAC CTT AAC CTC CAA GCT 1905 Gly Val Leu Gly Val Val Ile Ala Ile Val Tyr Leu Asn Leu Gln Ala 545 550 555 560 TCT GGT GGT TCT GGA AAT GGT ACT GCA TCT TCA TCA GGT GAC CCA ATT 1953 Ser Gly Gly Ser Gly Asn Gly Thr Ala Ser Ser Ser Gly Asp Pro Ile 565 570 575 GGC GAC ATC TTG AAC GAC TAC TAAGAAAGGA GGATCTAAAA A ATG TCT GAA 2004 Gly Asp Ile Leu Asn Asp Tyr Met Ser Glu 580 583 584 585 AAT AAA GTA ACT CTT GAT AAG AAA ATC CGT CGT AGC GTT ATG TGG CGT 2052 Asn Lys Val Thr Leu Asp Lys Lys Ile Arg Arg Ser Val Met Trp Arg 590 595 600 TCA ATG TTC CTC CAA GGT TCT TGG AAC TAC GAA CGT ATG CAA AAT GGT 2100 Ser Met Phe Leu Gln Gly Ser Trp Asn Tyr Glu Arg Met Gln Asn Gly 605 610 615 GGT TGG GCT TAC TCG CTC ATT CCA GCA TTG AAA AAA CTC TAC CCT TCT 2148 Gly Trp Ala Tyr Ser Leu Ile Pro Ala Leu Lys Lys Leu Tyr Pro Ser 620 625 630 GGC GAA GAA GCT AAA GAA GCT TTG AAA CGT CAC TTG GAA TTC TTT AAT 2196 Gly Glu Glu Ala Lys Glu Ala Leu Lys Arg His Leu Glu Phe Phe Asn 635 640 645 650 ACT CAC CCA TAC GTT GCC GCT CCT ATC ATC GGT GTA ACT CTT GCC CTT 2244 Thr His Pro Tyr Val Ala Ala Pro Ile Ile Gly Val Thr Leu Ala Leu 655 660 665 GAA GAA GAA CGT GCT AAC GGT GCT GAT ATC GAT GAT GCC GCT ATT CAA 2292 Glu Glu Glu Arg Ala Asn Gly Ala Asp Ile Asp Asp Ala Ala Ile Gln 670 675 680 GGG GTT AAA GTT GGT ATG ATG GGT CCT CTT GCC GGT ATC GGT GAC CCT 2340 Gly Val Lys Val Gly Met Met Gly Pro Leu Ala Gly Ile Gly Asp Pro 685 690 695 GTC TTC TGG TTT ACA GTA CGT CCT ATC GTT GGT GCG ATT GCA GCT TCA 2388 Val Phe Trp Phe Thr Val Arg Pro Ile Val Gly Ala Ile Ala Ala Ser 700 705 710 TTG GCT ACT GGT GGA TCA ATT ATC GCT CCA CTC TTC TTC TTC ATC GTG 2436 Leu Ala Thr Gly Gly Ser Ile Ile Ala Pro Leu Phe Phe Phe Ile Val 715 720 725 730 TGG AAC GCT ATC CGT ATC GCT TTC TTG TGG TAC ACT CAA GAA TTT GGT 2484 Trp Asn Ala Ile Arg Ile Ala Phe Leu Trp Tyr Thr Gln Glu Phe Gly 735 740 745 TAT AAA TCA GGT TCT GCA ATC ACT AAA GAC CTT GGT GGA GGA CTT CTC 2532 Tyr Lys Ser Gly Ser Ala Ile Thr Lys Asp Leu Gly Gly Gly Leu Leu 750 755 760 CAA ACT GTT ACT AAA GGT GCA TCT ATC CTT GGT ATG TTC GTC CTT GGT 2580 Gln Thr Val Thr Lys Gly Ala Ser Ile Leu Gly Met Phe Val Leu Gly 765 770 775 GTA TTG ATT CAA CGT TGG GTA ACA ATT AAC TTT AAT GGT CCT AAC GCT 2628 Val Leu Ile Gln Arg Trp Val Thr Ile Asn Phe Asn Gly Pro Asn Ala 780 785 790 GTT GTT TCA AAA ATT CCT TTA CAA AAA GGT GCT TAT CTA GAA TTC CCT 2676 Val Val Ser Lys Ile Pro Leu Gln Lys Gly Ala Tyr Leu Glu Phe Pro 795 800 805 810 AAA GGT TCT GTA TCT GGT ACA CAA CTT CAT GAT ATT CTT GGT CAA GTT 2724 Lys Gly Ser Val Ser Gly Thr Gln Leu His Asp Ile Leu Gly Gln Val 815 820 825 GGT AAC AAA CTT TCT CTT GAT CCT ACA AAA GTA ACT TAC CTT CAA GAT 2772 Gly Asn Lys Leu Ser Leu Asp Pro Thr Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asp 830 835 840 AAC TTG AAT CAA TTG ATT CCT GGT CTT GCT GGT TTG CTT ATC ACA TTC 2820 Asn Leu Asn Gln Leu Ile Pro Gly Leu Ala Gly Leu Leu Ile Thr Phe 845 850 855 CTT TGC ATG TGG TTG CTT AAG AAA AAA GTT TCT CCA ATC GTT ATT ATC 2868 Leu Cys Met Trp Leu Leu Lys Lys Lys Val Ser Pro Ile Val Ile Ile 860 865 870 TTT GGT CTC TTC GTC GTG GGT ATC CTC GGT CGA TGG GCT CAA ATC ATG 2916 Phe Gly Leu Phe Val Val Gly Ile Leu Gly Arg Trp Ala Gln Ile Met 875 880 885 890 INFORMATION POUR LA SEQUENCE ID NO:6 i) CARACTÉRISTIQUE DE LA SÉQUENCE ID NO:6 A) LONGUEUR . B) TYPE : ADN C) NOMBRE DE BRIN : double D) CONFIGURATION : linéaire xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE ID NO:6 GACTTTATTA TCTTTCAAAA GTTGATAGGT GTTTTTATTT CATCTGTTAA AATTATTGTT 60 TACTTCTAGT TCAGAAGTAA GATTTTTTAT AAAATCTGTT AAGGAAATTT CTTAGTAACT 120 TAAATCTTCT CCGTTTGTCG AAATCACTTT TTTGTACCAG TCAAAGCCCC GTTTTTTGAT 180 ACGTTTATAA TCTTTATCTA TATAAACAAA ACCATAACGT TTTTCAAAAC CTTCACGAGT 240 AGAGTAAAGG TCCGTTGCAG ACCATGTAAG ATAACCAATC ATTTCTACTC CCTCTTCAAC 300 CGCTTCTTTC ATACGAGCAA TATGGTCTGC TAAATACTTA ATTCTGTAAT CATCATTAAC 360 CGTTCCG 367 INFORMATION POUR LA SEQUENCE ID NO:7 i) CARACTÉRISTIQUE DE LA SÉQUENCE ID NO:7 A) LONGUEUR . B) TYPE : ADN C) NOMBRE DE BRIN : double D) CONFIGURATION : linéaire xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE ID NO:7 TTCATTTTAT ACAAAGGAGT CCCA ATG ATA AAA GCA ATT GCC TTA GAA AAT 51 Met Ile Lys Ala Ile Ala Leu Glu Asn 1 5 GTT TGG TTA AAT TTT TCA GAT GAA ACA AAA GCG GCT TTC AAG AAA AAT 99 Val Trp Leu Asn Phe Ser Asp Glu Thr Lys Ala Ala Phe Lys Lys Asn 10 15 20 25 AAA GCT TAC CAG TTT CAA TTT AAA AAA GAA GAA GAG CTG ACA GAA TCA 147 Lys Ala Tyr Gln Phe Gln Phe Lys Lys Glu Glu Glu Leu Thr Glu Ser 30 35 40 GAT TTT CTG GAA ACA GAA GTA TTA GTT GGT CTG CCA AAG CCT GAT TTA 195 Asp Phe Leu Glu Thr Glu Val Leu Val Gly Leu Pro Lys Pro Asp Leu 45 50 55 TTA GCA AAA TAT AAA AAT TTA AAA TGG CTC CAA CTT TTA TCA GCT GGG 243 Leu Ala Lys Tyr Lys Asn Leu Lys Trp Leu Gln Leu Leu Ser Ala Gly 60 65 70 ACC AAT GGT TAT ACT CAA GGA GCA AAT TTT CCT CAA GAG GTA GTT TTG 291 Thr Asn Gly Tyr Thr Gln Gly Ala Asn Phe Pro Gln Glu Val Val Leu 75 80 85 ACA AAT GCA ACA GGA ACT TAT GGA CTT ACG ATT TCT GAG CAT TTA CTA 339 Thr Asn Ala Thr Gly Thr Tyr Gly Leu Thr Ile Ser Glu His Leu Leu 90 95 100 105 ACA ATG GCT TTC GTT CTT CTA AGA AAA TTT GAC CTT TAT CAA AAA CAA 387 Thr Met Ala Phe Val Leu Leu Arg Lys Phe Asp Leu Tyr Gln Lys Gln 110 115 120 CAA GAA AAA GAA ATC TGG GAA AAT ATT GGT CAG ATT CAA TCT ATT TAT 435 Gln Glu Lys Glu Ile Trp Glu Asn Ile Gly Gln Ile Gln Ser Ile Tyr 125 130 135 GGC TCA ACA GTA TTG GTT CAT GGT TTA GGT GAT ATT GGA AGT CAC TTT 483 Gly Ser Thr Val Leu Val His Gly Leu Gly Asp Ile Gly Ser His Phe 140 145 150 GCA CAA AAG ATT CAA GCT TTG GGA GGT CAT GTC ATT GCA GTC AAA CGA 531 Ala Gln Lys Ile Gln Ala Leu Gly Gly His Val Ile Ala Val Lys Arg 155 160 165 ACT GTT TAT GGT GAT GAA GAA TTT GCT GAT GAA GTC TAT GCC GAA ACT 579 Thr Val Tyr Gly Asp Glu Glu Phe Ala Asp Glu Val Tyr Ala Glu Thr 170 175 180 185 GAC CTA GAC AAA GTT TTA CCG AGA GCT GAT ATT ATT GCT TCA AGT GTC 627 Asp Leu Asp Lys Val Leu Pro Arg Ala Asp Ile Ile Ala Ser Ser Val 190 195 200 CCT GGG ACC CAT GAA ACT TAT AAA TTA TTT AAT CAA GAA AAA TTT GAT 675 Pro Gly Thr His Glu Thr Tyr Lys Leu Phe Asn Gln Glu Lys Phe Asp 205 210 215 TTA ATG AAA GAA AAT GCT ATT TTC CTA AAT GTT GGT CGG GGA ACA AAT 723 Leu Met Lys Glu Asn Ala Ile Phe Leu Asn Val Gly Arg Gly Thr Asn 220 225 230 GTC GAT TTA GAA GCC TTG TGT GAT GCT CTT GAG TCT AAA AAA ATT GCT 771 Val Asp Leu Glu Ala Leu Cys Asp Ala Leu Glu Ser Lys Lys Ile Ala 235 240 245 GGG GCA GGA ATT GAC GTG ACC GAC CCA GAA CCA TTG CCT AAA GGT CAC 819 Gly Ala Gly Ile Asp Val Thr Asp Pro Glu Pro Leu Pro Lys Gly His 250 255 260 265 CGG GCT TGG CAT ACA GAA AGA CTA TTA ATC ACT CCT CAT GCT TCT GGC 867 Arg Ala Trp His Thr Glu Arg Leu Leu Ile Thr Pro His Ala Ser Gly 270 275 280 GGT TAT ACT CTT CCT GAA ACA TGG CGT CGC TTT ATG AAA ATA TTG GAA 915 Gly Tyr Thr Leu Pro Glu Thr Trp Arg Arg Phe Met Lys Ile Leu Glu 285 290 295 AAA AAT CTC GAT GCC TAT GCA AAT GGT AAG GAA TTG ACA AAT ATT GTT 963 Lys Asn Leu Asp Ala Tyr Ala Asn Gly Lys Glu Leu Thr Asn Ile Val 300 305 310 GAT ATG AAA ACA GGA TAT AAA CGA AAT GCT CAC AAA 999 Asp Met Lys Thr Gly Tyr Lys Arg Asn Ala His Lys 315 320 325 INFORMATION POUR LA SEQUENCE ID NO:8 i) CARACTÉRISTIQUE DE LA SÉQUENCE ID NO:8 A) LONGUEUR : B) TYPE : ADN C) NOMBRE DE BRIN : double D) CONFIGURATION : linéaire xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE ID NO:8 GAT ATT ATT GAT TGT AAT GCT GCT ATT GTA AAT GGT GGA GGT GCT CTC 48 Asp Ile Ile Asp Cys Asn Ala Ala Ile Val Asn Gly Gly Gly Ala Leu 1 5 10 15 CTT GGT TTT GCT ATG AAA TAC AAA ACC AAC AAT GAC CGT GTG GAA AAG 96 Leu Gly Phe Ala Met Lys Tyr Lys Thr Asn Asn Asp Arg Val Glu Lys 20 25 30 TTT TTT AAA GCT AAA CAA CTT CCA GAG GAA TAC ATA CGT GGT ATC AGC 144 Phe Phe Lys Ala Lys Gln Leu Pro Glu Glu Tyr Ile Arg Gly Ile Ser 35 40 45 CGT GTT TAT GAT ACT CAA GAA AAT ATC GGT ATT GAC AGT GAC TTG ACC 192 Arg Val Tyr Asp Thr Gln Glu Asn Ile Gly Ile Asp Ser Asp Leu Thr 50 55 60 ATC TTC CCA GTG GAA TTA AAA GAT GAT TTC CCT GAC GGT TTG ACT ACA 240 Ile Phe Pro Val Glu Leu Lys Asp Asp Phe Pro Asp Gly Leu Thr Thr 65 70 75 80 ATT GCA CCA ATC TAT GGT GGT GGT ATG CGT CTT GGT TCT TTC ATT ATT 288 Ile Ala Pro Ile Tyr Gly Gly Gly Met Arg Leu Gly Ser Phe Ile Ile 85 90 95 TGG CGT AAC GAC CAT GAT TTT GTG GAC GAC GAC CTT ATC TTG GTT GAG 336 Trp Arg Asn Asp His Asp Phe Val Asp Asp Asp Leu Ile Leu Val Glu 100 105 110 ATT GCA TCT ACA GTA GTT GGT TTG CAA TTG TTG CAT CTT CAA ACA GAA 384 Ile Ala Ser Thr Val Val Gly Leu Gln Leu Leu His Leu Gln Thr Glu 115 120 125 AAC TTG GAA GAA ACG ATT CGT AAA CAA ACA GCT ATT AAT ATG GCT ATT 432 Asn Leu Glu Glu Thr Ile Arg Lys Gin Thr Ala Ile Asn Met Ala Ile 130 135 140 AAT ACC TTG TCT TAC TCA GAA ATC AAG GCA GTT TCA GCT ATC TTG AAT 480 Asn Thr Leu Ser Tyr Ser Glu Ile Lys Ala Val Ser Ala Ile Leu Asn 145 150 155 160 GAG TTG GAC GGT TTA GAA GGT CGT TTG ACA GCC TCT GTT ATC GCG GAC 528 Glu Leu Asp Gly Leu Glu Gly Arg Leu Thr Ala Ser Val Ile Ala Asp 165 170 175 CGT ATC GGA ATT ACT CGT TCT GTT ATT GTT AAT GCT CTT CGT AAA TTA 576 Arg Ile Gly Ile Thr Arg Ser Val Ile Val Asn Ala Leu Arg Lys Leu 180 185 190 GAA TCA GCT GGT ATT ATT GAA AGT CGT TCG CTT GGT ATG AAA GGC ACT 624 Glu Ser Ala Gly Ile Ile Glu Ser Arg Ser Leu Gly Met Lys Gly Thr 195 200 205 TAC CTC AAA 633 Tyr Leu Lys 210 211 REVENDICATIONS 1) Mutant de bactérie lactique capable de surexprimer une ou plusieurs peptidases, caractérisé en ce que l'un au moins des facteurs de régulation négative de l'un au moins des gènes des peptidases de la dite bactérie est inactivé. 2) Mutant de bactérie lactique selon la revendication 1, caractérisée en ce quela bactérie lactique est choisie parmi L. lactis et de S. thermophilus. 3) Mutant de bactérie lactique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'un au moins des facteurs de régulation négative commun à plusieurs gènes desdites peptidases est inactivé. 4) Mutant de bactérie lactique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'un au moins des facteurs de régulation négative de la transcription, commun à deux au moins et de préférence trois des promoteurs des gènes de peptidases, est inactivé. 5) Mutant de bactérie lactique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les promoteurs des gènes de peptidases dont l'un au moins des facteurs de régulation négative de la transcription est inactivé, sont choisis parmi les gènes prtP, pepN, pepC, pepX, pepO, pepDA2, dtpT et l'opéron opp. 6) Mutant de bactérie lactique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'un au moins des systèmes de transport des acides aminés branché, des di- et tri-peptides ou des oligopeptides est bloqué. 7) Mutant de bactérie lactique selon la revendication 6, caractérisé en ce que le gène gène dtpT est modifié. 8) Mutant de bactérie lactique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'un au moins des gènes codant les peptidases responsables de la dégradation des dipeptides, tripeptides ou oligopeptides est inactivé. 9) Mutant de bactérie lactique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que son gène codY est inactivé. 10) Mutant de bactérie lactique selon la revendication 9, caratérisé en ce que le gène codY ou une séquence impliquée dans l'expression ou la régulation de ce gène est modifié. 11) Mutant de bactérie lactique selon la revendication 9, caratérisé en ce que un gène codant pour une protéine cofacteur nécessaire à l'activité du gène codY et/ou un gène impliqué dans l'expression ou la régulation de cette protéine cofacteur est modifié. 12) Mutant de bactérie lactique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que un gène codant pour des protéines impliquées dans la sécrétion des protéines de transport des dipeptides ou tripeptides est inactivé. 13) Mutant de bactérie lactique selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'un au moins des gènes secA et secY est modifié. 14) Mutant de bactérie lactique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'un des gènes de l'opéron lev est inactivé. 15) Mutant de bactérie lactique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'un au moins des gènes présentant une homologie avec un gène codant une p-glucosidase et/ou une formate deshydrogénase est inactivé. 16) Vecteur recombinant utile pour identifier ou sélectionner des bactéries lactiques mutantes selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un gène marqueur fusionné à un un gène de peptidase ou un promoteur de celui-ci, une origine de réplication inactivée après intégration dans la bactérie, un marqueur antibiotique, et une partie du gène cluA. 17) Méthode d'identification ou de sélection d'une bactérie lactique mutante selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce ce que l'on transfère un gène de peptidase ou un promoteur de ce gène dans une bactérie par conjugaison avec le vecteur selon la revendication 16, puis l'on cultive la dite bactérie en présence de peptides et l'on mesure par tout moyen approprié l'activité du gène rapporteur.