Brevet FR2800747A1 — publié le 20010511

Nouvelles bactéries symbiotiques et leurs applications L'invention a pour objet de nouvelles bactéries symbiotiques et leurs applications, notamment, pour la dépollution de l'environnement. On sait que les bactéries symbiotiques, communément appelées rhizobia, jouent un rôle important dans l'environnement et l'agriculture. En formant des symbioses avec les légumineuses, elles sont en effet responsables, en grande partie, de la fixation de l'azote atmosphérique sur terre. Ces micro-organismes sont des bactéries du sol et développent, sur la plupart de 18000 espèces de la famille des légumineuses, des organes spécialisés, appelés nodules, dans lesquels elles réduisent l'azote atmosphérique en ammoniac au bénéfice de la plante-hôte. La formation de ces nodules résulte d'un échange de signaux symbiotiques entre la plante et les bactéries. Cet échange démarre par l'exsudation par la plante de composés inducteurs (généralement des flavonoides) des gènes de nodulation. Les bactéries produisent alors des signaux de nodulation, les facteurs Nod, qui induisent la formation de nodules sur les racines, ou, plus rarement, sur les tiges, et permettent l'infection de la plante-hôte par les bactéries. On notera également que la présence d'une légumineuse dans un sol permet l'enrichissement du sol en rhizobium : en effet, d'une part la multiplication du rhizobium est favorisée par rapport aux autres bactéries dans la rhizosphère d'une légumineuse, d'autre part, à la sénescence des nodules, les rhizobiums spécifiques de la légumineuse sont relargués dans le sol. Trois branches de rhizobia ont été identifiées à ce jour, à savoir la branche des Rhizobium/ Mesorhizobium/ Sinorhizobium Allorhizobium, celle d'Azorhizobium et celle de Bradyrhizobium. De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que les légumineuses peuvent établir une symbiose fixatrice d'azote avec des bactéries n'appartenant pas aux branches pré-citées. L'isolement et la caractérisation de ces bactéries permettent de disposer de souches d'intérêt et d'exploiter leurs gènes ou les caractères particuliers de ces souches pour des applications de dépollution. Il est également possible de disposer de séquences nucléotidiques qui peuvent être transférées à des bactéries pour leur conférer de telles propriétés dépolluantes. L'invention a donc pour but de fournir de nouvelles bactéries capables de former des associations symbiotiques avec des légumineuses. Elle vise également l'obtention et la culture de ces souches bactériennes. L'invention vise en outre la mise à profit des propriétés de ces bactéries pour former des associations utilisables pour la dépollution du sol, de l'air et de l'eau, en permettant le maintien et le développement dans l'environnement à traiter d'une bactérie symbiotique à propriétés dépolluantes. Les bactéries selon l'invention sont des bactéries isolées de leur environnement naturel et purifiées. Elles sont caractérisées en ce qu' il s'agit de bactéries méthylotrophes capables de former des nodules racinaires et de fixer l'azote avec des plantes de la famille des légumineuses. Le caractère méthylotrophe facultatif des souches de l'invention les rend capables de croître rapidement sur milieu minimum synthétique ne contenant que du méthanol comme seule source de carbone et d'énergie. Cette croissance est similaire à celle observée avec des substrats carbonés classiques comme les pyruvates, succinates et autres. Les souches de l'invention présentent les propriétés méthylotrophes et de nodulation de souches comprenant des séquences d'ARN16S correspondant à SEQ ID N 1. Elles présentent plus spécialement le caractère méthylotrophe de souches comprenant des séquences de nucléotides capables de coder pour la grande sous-unité de la méthanol-déshydrogénase (MDH) dont la séquence codante de la position 260 à 2000 dans le gène mxaF correspond à SEQ ID N 2. L'invention vise en particulier les souches du genre Methylobacterium. Des souches de ce type sont des Methylobacterium nodulans telles qu'isolées et purifiées à partir de nodules de Crotalaria et, notamment, la souche Methylobacterium nodulans ORS2060, déposée sous le n I 2342 le 27 octobre 1999 à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Micro-organismes) Institut Pasteur, 28 rue du Dr Roux, Paris, France. Les mutants des souches définies ci-dessus, et notamment de la souche ORS2060, entrent également dans le cadre de l'invention dès lors qu'ils ont les propriétés de croître sur des composés monocarbonés comme seule source de carbone et de former des nodules sur des légumineuses. Conformément à l'invention, les souches bactériennes peuvent être isolées à partir de nodules racinaires de légumineuses en suivant par exemple le protocole décrit dans les exemples. En variante, on a recours à des rhizobia dont le caractère de méthylotrophie a été modifié, par exemple par simple mutagénèse, afin de le rendre exploitable. Selon encore une autre variante, on confère par transgénèse à une bactérie le caractère de méthylotrophie et les propriétés de nodulation recherchées, dont elle est naturellement dépourvue. La croissance rapide sur méthanol telle qu'illustrée par les exemples, les profils SDS-PAGE et/ou le séquençage permettent de vérifier que les souches produites sont bien conformes à l'invention. Grâce à leur capacité à former des associations symbiotiques avec des légumineuses, les bactéries méthylotrophes selon l'invention sont particulièrement utiles pour des applications concernant la dépollution des compartiments sol/air/eau, et notamment en pollution automobile. L'invention vise ainsi la culture de légumineuses associées aux bactéries définies ci-dessus dans des zones de pollution. On procédera ainsi avantageusement à de telles cultures le long des zones de trafic en milieu urbain ou rural. Les cultures de légumineuses seront inoculées par les bactéries possédant des propriétés méthylotrophiques et de nodulation conformément à l'invention. Dans ces applications à la dépollution, on utilisera avec avantage comme légumineuse des crotalaires et le lotononis en zone tropicale et méditerranéenne, et des plantes fourragères, notamment les luzernes en zone tempérée et méditerranéenne. Les bactéries se présentent avantageusement sous forme d'inoculum. Il peut s'agir d'inoculum formé d'une suspension bactérienne destinée à être pulvérisée sur une culture de légumineuse, ou encore de billes, par exemple d'alginate, renfermant des bactéries. Dans d'autres formes de réalisation, l'inoculum bactérien enrobe la graine de légumineuse, répandue alors en semis sur le lieu à traiter. Ces inoculums en tant que tels font également partie de l'invention. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés dans les exemples qui suivent, fournis à titre purement illustratif, dans lesquels il est fait référence aux figures 1 à 3 qui représentent les courbes de croissance de la souche ORS2060 - sur M 72 contenant au méthanol comme seule source de carbone (figure 1), - sur M 72 avec des substrats monocarbonés comme seule source de carbone (figure 2), - sur M 72 avec des substrats carbonés et du méthanol (figure 3) . . Milieu et conditions de culture Milieu M 72 : composition en g/1 : K2HP04 1, 2 g Cac122H20 34 mg MgS047H20 0,2 g Nacl 0,1 g Fecl36H20 1 mg (NH4)2SO4 0,5 g oligo-éléments 1 ml Agar 15 g pH7 Isolement de Methylobacterium nodulans ORS2060 La souche ORS2060 a été isolée d'un nodule racinaire prélevé sur un plant de Crotalaria podocarpa (famille des légumineuses, tribu Crotalariae) récolté au Sénégal. L'isolement des bactéries présentes à l'intérieur du nodule a été fait selon le protocole décrit dans l'article de Lajudie et al., 1994, Int. J. Syst. Bacteriol., 44 715-733. Les bactéries ont ensuite été purifiées par plusieurs repiquages successifs d'une colonie isolée sur milieu YM (Vincent J.M., 1970, A manual for the practical study of root nodule bacteria. International Biological Program, Handbook n 15, p 3, Blackwell Scientific Publications, Ltd. Oxford) à 28 C. La culture pure obtenue a été inoculée sur un plant de Crotalaria podocarpa cultivé dans des conditions de laboratoire, puis les bactéries ont été ré-isolées d'un nodule racinaire prélevé sur le plant selon le protocole décrit. Les bactéries ont été purifiées et la culture pure obtenue (souche ORS2060) est conservée à -80 C en milieu YM additionné de glycérol 20 % final. . Résistance aux antibiotiques (concentration en g/ml de milieu YMA) Contrôle positif : milieu YMA culture + Carbénicilline 100 R Ampicilline : 100 R Néomycine 100 S Gentamycine 100 S 50 S 30 R Spectinomycine 100 S Kanamycine 50 S Cloramphénicol 100 S/R Tétracycline 10 S/R 20 S 30 S Ac. Nalidixique 100 R Streptomycine 100 S Légende : R : résistance, S : sensible, S/R : non déterminé. On rapporte, sur les figures 1 à 3, les courbes de croissance sur M 72 de ORS 2060. La figure 1 donne en fonction du temps (en h) la densité optique (DO) à 620nm de la culture bactérienne et la concentration en méthanol mM. Les résultats obtenus montrent que le méthanol est pratiquement totalement consommé après 24 h de culture et que les souches poussent sur méthanol comme seule source de carbone. Sur la figure 2, on a rapporté les courbes de croissance (DO à 620 nm en fonction du temps en h) de la souche ORS2060 avec comme seule source de carbone du formate (10 mM), du formaldéhyde (lmM),et méthylamine (10mM). Les résultats obtenus montrent le caractère méthylotrophe de la souche. Sur la figure 3, on a rapporté les courbes de croissance (DO à 620 nm en fonction du temps en h) , avec différents substrats carbonés à lOmM fructose, arabinose, glucose, succinate, pyruvate, glutamate, galactose, lactose, saccharose, citrate et du méthanol 50 mM. Ces résultats confirment la forte croissance de la souche sur méthanol comparée aux autres substrats. Gène de nodulation nodA d'une souche de Methylobacterium nodulans La séquence partielle du gène nodA d'une Methylobacterium nodulans correspond à SEQ ID N 3. Utilisation d'associations de luzerne avec des Methylobacterium nodulans comme agents anti-pollution On procède à la culture de luzerne le long d'autoroutes dans le Sud de la France. On pulvérise sur les plants un inoculum d'une souche de Methylobacterium nodulans en suspension dans un milieu inerte vis-à-vis des bactéries et la luzerne. Les mesures de pollution dans l'environnement de ces cultures, comparées à celles dans des zones avec des cultures traditionnelles comme les lauriers roses, montre l'effet bénéfique des associations suivant l'invention sur la diminution du taux de produits toxiques polluants dans l'environnement. REVENDICATIONS 1/ Bactéries symbiotiques, isolées et purifiées, caractérisées en ce qu'il s'agit de bactéries méthylotrophes capables de former des nodules racinaires et de fixer l'azote avec des plantes de la famille des légumineuses. 2/ Bactéries symbiotiques selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles présentent les propriétés méthylotrophes et de nodulation de souches comprenant des séquences d'ARN16S correspondant à SEQ ID N 1. 3/ Bactéries symbiotiques selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce qu'elles présentent le caractère méthylotrophe de souches comprenant des séquences de nucléotides capables de coder pour la grande sous-unité de la méthanol-déshydrogénase dont la séquence de la position 260 à 2000 dans le gène mxaF correspond à SEQ ID N 2. 4/ Bactéries symbiotiques selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées en ce qu'elles appartiennent au genre Methylobacterium. 5/ Bactéries symbiotiques selon la revendication 4, caractérisées en ce qu'il s'agit de Methylobacterium nodulans telles qu'isolées et purifiées à partir de nodules de Crotalaria. 6/ Souche de Methylobacterium nodulans déposée le 27 octobre 1999 à la CNCM sous le n I 2342 et mutants de cette souche. 7/ Application des bactéries symbiotiques selon l'une quelconque des revendications précédentes pour la dépollution des compartiments sol/ air/ eau, notamment en pollution automobile. 8/ Application selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comprend la culture de légumineuses comme les crotalaires et le lotononis en zone tropicale et méditerranéenne, et comme les plantes fourragères, notamment la luzerne, en zone tempérée et méditerranéenne. 9/ Application selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce que les bactéries sont utilisées sous forme d'inoculum. 10/ Inoculum bactérien, caractérisé en ce qu'il se présente sous forme d'une suspension de bactéries selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ou encore de billes ou d'un enrobage autour de la graine de légumineuse.