Brevet FR2805265A1 — publié le 20010824

OLIGONUCLEOTIDES IMMUNOSTIMULANTS La présente invention est relative au domaine des immunostimulants. Plus particulièrement, l'invention concerne des oligonucléotides capables de stimuler cellules humaines intervenant dans le système immunitaire, et à leur utilisation comme adjuvant vaccinal. Un grand nombre d'oligonucléotides ont déjà été décrits dans l'art antérieur, relation avec leurs propriétés immunostimulantes. Ainsi, la demande EP 0 468 520 décrit des polynucléotides immunostimulants constitués par un simple brin d'ADN linéaire comprenant de 10 à 100 nucléotides s'enchaînant selon une séquence palindromique. Selon la demande WO 96I02 555, l'activité immunostimulatrice d'oligonucléotides liée à la présence d'une séquence dinucléotique 5' CG 3', dans laquelle C n'est méthylée, l'activité immunostimulante étant plus forte si le motif CG est précédé en 5' du dinucléotide GA et I ou suivi en 3' du dinucléotide TC ou encore TT. Au contraire, selon la demande de brevet WO 98l52 962, il n'est pas nécessaire la séquence de l'oligonucléotide soit un palindrome, ni qu'elle comprenne dinucléotide CG ; en effet, les 3 nucléotides décrits dans cette demande pour une utilisation en tant qu'adjuvant vaccinal ont les séquences suivantes : 5' GACGTT 3', 5' GAGCTT 3', ainsi que 5' TCCGGA 3'. Selon le brevet US 5,663,153, l'activité immunostimulante d'oligonucléotides n'est pas liée à la séquence des nucléotides, mais à la nature de la liaison entre nucléotides, présence d'au moins une liaison phosphorothioate permettant d'induire une reponse locale du système immunitaire. La plupart tests de l'art antérieur pour évaluer l'activité immunostimulante des oligonucléotides proposés, sont effectués soit in vitro sur des cellules animales (essentiellement des cellules murines), soit in vivo sur des souris. Cependant, les différences existant entre le système immunitaire de la souris et celui de l'être humain, conduit à des différences entre les résultats obtenus sur des cellules murines ceux obtenus sur des cellules humaines. Or l'industrie pharmaceutique a un grand besoin d'immunostimulants pouvant être administrés à l'homme, notamment dans le domaine des vaccins. La présente invention a donc pour but de proposer des oligonucléotides capables stimuler cellules du système immunitaire de l'être humain. Pour atteindre ce but, l'invention a pour objet un oligonucléotide capable de stimuler des cellules humaines du système immunitaire caractérisé en ce qu'il comprend moins séquence 5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3' dans laquelle T est la Thymine, A est l'Adénine, C est la Cytosine, et G la Guanine, et en ce qu'il est dépourvu de dinucléotide CG dans lequel la Cytosine C ne serait pas méthylée. Selon une caractéristique de l'invention, l'oligonucléotide comprend de 15 à 100 nucléotides. Selon une autre caractéristique, l'oligonucléotide selon l'invention est capable d'induire prolifération des lymphocytes humains. Selon autre caractéristique, l'oligonucléotide selon l'invention est capable d'accroître l'expression des marqueurs d'activation CD25, CD69 et CD86 sur les lymphocytes B humains. L'invention concerne également l'utilisation d'un tel oligonucléotide pour la fabrication d'un médicament. L'invention également pour objet un adjuvant vaccinal caractérisé en ce comprend moins un oligonucléotide capable de stimuler des cellules humaines système immunitaire possédant au moins une séquence 5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3' dans laquelle T est la Thymine, A est l'Adénine, C est la Cytosine, et G la Guanine, et en ce qu'il est dépourvu de dinucléotide CG dans lequel la Cytosine C ne serait pas méthylée. L'invention également pour objet une composition vaccinale à usage humain comprenant moins un antigène vaccinal caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un oligonucléotide capable de stimuler des cellules humaines du système immunitaire possédant au moins une séquence 5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3' dans laquelle T est la Thymine, A est l'Adénine, C est la Cytosine; et G la Guanine, et en ce qu'il est dépourvu de dinucléotide CG dans lequel la Cytosine C ne serait pas méthylée. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, en référence aux figures 1 et 2 qui illustrent les résultats obtenus lors des tests décrits aux exemples 1 et 2. Par oligonucléotide au sens de la présente invention, on entend un polynucléotide comprenant au moins 15 nucléotides. La limite supérieure de la taille des oligonucléotides n'est pas vraiment déterminée. On peut cependant noter que, plus l'oligonucléotide sera long, plus sa purification sera difficile à effectuer lors des étapes de synthèse , et plus le prix de revient en sera élevé. D'autre part, il est probable qu oligonucléotide de grande longueur aura plus de difficultés à pénétrer dans les cellules. Aussi, pour les besoins de la présente invention, on considere qu'une limitation de la taille de l'oligonucléotide à 100 nucléotides est appropriée. oligonucléotide est de préférence un oligonucléotide simple brin; il peut s'agir oligodésoxyribonucléotide ou d'un oligoribonucléotide. On a obtenu particulièrement bons résultats en utilisant un oligodésoxyribonucléotide. oligonucléotides convenant aux fins de l'invention peuvent se présenter sous forme de phosphodiester ou, afin d'être plus stables, sous forme de phosphorothioates d'hybrides phosphodiester I phosphorothioates. Les oligonucléotides phosphorothioates sont ceux préférés. L'oligonucléotide selon l'invention est capable de stimuler des cellules humaines système immunitaire, telles que les lymphocytes B, les lymphocytes T, monocytes et cellules dendritiques. Cette stimulation est appréciée notamment par la lymphoprolifération ou par l'expression de marqueurs d'activation, tels que les marqueurs CD25 , CD69 et CD86 sur les lymphocytes B. II est possible de sélectionner les oligonucléotides d'intérêt au moyen de tests différents de ceux proposés dans la présente demande, à condition cependant s'agisse de tests évaluant capacité de stimulation de cellules humaines, et non comme dans la plupart documents de l'art antérieur, de tests évaluant capacité de la stimulation cellules murines. II serait notamment possible de tester l'expression d'autres marqueurs d'activation des lymphocytes, ou l'expression de- marqueurs de prolifération tels que le marqueur K167; des tests relatifs à l'augmentation des marqueurs d'activation et de maturation des cellules dendritiques pourraient également être utilisés. De même, des tests permettant l'appréciation de l'augmentation de production de certaines cytokines peuvent également être utilisés. Selon une caractéristique de l'invention, l'oligonucléotide comprend au moins une séquence nucléotidique 5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3' dans laquelle T signifie Thymine, C Cytosine, G Guanine, et A Adénine. Cette séquence peut être 5' terminale, 3' terminale ou être entourée par d'autres nucléotides. Elle peut être unique ou répétée plusieurs fois à l'identique à l'intérieur d'un même oligonucléotide Selon l'invention, foligonucléotide ne comporte pas forcément de séquence palindromique. Malgré cette absence de séquence palindromique, un tel oligonucleotide est capable de stimuler des cellules humaines du système immunitaire. Selon caractéristique, l'oligonucléotide selon l'invention est dépourvu de dinucléotide CG dans lequel la Cytosine ne serait pas méthylée. La capacité des oligonucléotides de l'art antérieur à être immunostimulants a presque toujours été interprétée comme liée à la présence de motifs CpG non méthylés (Cf. notamment l'article de Krieg et al dans Nature d'avril 1995 cité ci-dessus), cette interprétation étant en cohérence avec l'observation selon laquelle la fréquence ce dinucléotide était environ 4 fois plus importante dans le génome des bactéries dans celui des vertébrés. De façon surprenante, on a maintenant trouvé que oligonucléotides entièrement dépourvus de ce motif dinucléotidique étaient cependant parfaitement capables de stimuler les cellules du système immunitaire humain. Selon une caractéristique particulière, foligonucléotide selon l'invention est dépourvu ou appauvri en séquence nucléotidique capable d'inhiber les cellules du systeme immunitaire humain. En effet, afin d'obtenir un effet global immunostimulant, si motifs inhibiteurs ou neutralisants tels que, par exemple, ceux décrits dans demande 98l52 581 sont présents, il faut que leur effet soit supprimé ou réduit, grâce à présence d'une séquence à effet immunostimulant plus prononcé, ou grâce à présence d'un plus grand nombre de séquences selon l'invention. La présente invention a également pour objet un adjuvant vaccinal comprenant au moins oligonucléotide immunostimulant ayant au moins un motif 5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3' tel que mentionné ci-dessus. Par adjuvant vaccinal, on entend un produit qui permet d'accroître ou de modifier la réponse du système immunitaire d'un organisme vis à vis de l'administration d'un antigène. En particulier, il peut s'agir d'une augmentation de la réponse humorale ou de la réponse cellulaire. L'action d'un adjuvant vaccinal peut également être, non pas une augmentation de la réponse qui se produirait en l'absence d'adjuvant, mais une orientation différente de la réponse produite : par exemple, orientation vers une réponse cellulaire plutôt qu'une réponse humorale, production de certaines cytokines plutôt que d'autres, production certains types ou sous-types d'anticorps plutôt que d'autres, stimulation certaines cellules plutôt que d'autres, etc... L'oligonucléotide immunostimulant de la présente invention peut être utilisé comme adjuvant vaccinal quelle que soit la nature de l'antigène administré et quel que soit le nombre valences utilisées. Il peut être le seul adjuvant utilisé ou, au contraire, être un élement d'une combinaison adjuvante. L'action adjuvante de l'oligonucléotide selon l'invention peut être obtenue, soit lorsqu'il associé à l'antigène ou aux antigènes lors de leur administration, i.e. lorsqu'ils font partie de la même composition vaccinale, soit lorsqu'il est administré séparément de l'antigène ou des antigènes. On préfère cependant l'utiliser dans la même composition vaccinale que l'antigène ou les antigènes à administrer. L'oligonucleotide selon l'invention peut avantageusement être administré toutes les voies susceptibles d'être utilisées pour une composition vaccinale: voie muqueuse voie systémique. L'un des objets de l'invention est une composition vaccinale comprenant moins un oligonucléotide immunostimulant ayant une séquence . 5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3' telle que décrite ci-dessus. Une composition vaccinale selon l'invention peut être destinée à l'immunisation contre une seule maladie, ou destinée à l'immunisation contre plusieurs maladies. II peut s'agir d'une composition vaccinale liquide ou lyophilisée. Elle peut comprendre, outre les antigènes, tout ou partie des composants habituellement présents dans un vaccin : tampons, stabilisants, conservateurs, ... Elle peut également comprendre un ou plusieurs adjuvant(s) autre(s) que ceux objets de la présente invention. Elle peut également comprendre plusieurs adjuvants objets de la présente invention, constitués soit par des oligonucléotides ayant tous le même motif 5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3' mais se différenciant par les nucléotides en 5' et/ou en 3', soit par des oligonucléotides ayant des motifs 5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3' différents, dont les séquences en 5' et 3' sont identiques ou différentes. La composition vaccinale selon l'invention peut être destinée à une administration prophylactique ou à une administration thérapeutique. La composition vaccinale selon l'invention peut être formulée de manière à optimiser l'action adjuvante de l'oligonucléotide objet de l'invention. Ainsi, l'oligonucléotide peut être couplé à un lipide, tel que le cholestérol ; il peut être intégré dans une émulsion de type huile I eau ou formulé sous forme de liposomes. Les exemples qui suivent illustrent des modes de réalisation particuliers de la présente invention. Exemple 1 Synthese des oliaonucléotides On prepare un oligonucléotide dont la séquence est la suivante: 5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3'. La synthèse est réalisée au moyen d'un automate synthétiseur fourni par Applied Biosystems qui met en ceuvre la méthode chimique standard au phosphoramidite et qui comporte à chaque cycle une étape d'oxydation, qui est réalisée au moyen d'une solution tétraéthylthiuram I acétonitrile pour obtenir une liaison phosphorothioate. On prepare en outre, de la même façon, un oligonucléotide AI 5(S) ne comprend que A et qui est phosphorothioate sur toute sa longueur. Cet oligonucléotide est un temoin négatif car il n'entraîne ni prolifération ni augmentation l'expression des marqueurs d'activation sur les lymphocytes B. On prépare également un oligonucléotide 1d(S) dont la séquence identifiée dans la demande de brevet W096102555 et est la suivante:5' GCATGACGTTGAGCT 3'; cet oligonucléotide comporte des liaisons phosphorothioates sur toute sa longueur et est utilisé comme témoin positif. Tous les oligonucléotides sont maintenus en solution dans du tampon PBS Exemple 2 Test de Lymahoarolifération On isole des lymphocytes à partir du sang périphérique d'un donneur, en procédant à une centrifugation sur un gradient de Ficoll. Ces lymphocytes sont ajustés à 4.106 cellules I ml dans du milieu de culture AIMV additionné Glutamine, de Streptomycine et de Pénicilline. Les cellules sont distribuées en plaques 96 puits (fond rond) sous 100 pl, soit 2.105 cellules par puits. On ajoute ensuite 100pl d'une solution 4pM (ou d'une solution 0.8NM, ou encore d'une solution 0.16NM) des oligonucléotides à tester produits à l'exemple 1 (1 seul type d'oligonucléotide par puits) afin d'obtenir une concentration finale soit de 2 pM, soit de 0.4pM,soit de 0.08pM. Après incubation 3 jours d'incubation à 37 C en atmosphère humide à 5% C02,on ajoute de la thymidine tritiée (Amersham TRK 120) préalablement diluee dans du milieu de culture , à raison de 1 pCi par puits sous 50 pl. Après 7. à 8 heures d'incubation à l'étuve (5% C02, 37 C), les plaques peuvent être congelées à -80 C et traitées plus tard. A l'aide du "Harvester", on récolte le contenu des puits sur des plaques Unifilter GF/C et on réalise 6 lavages en eau distillée puis un lavage en éthanol 70% afin de précipiter l'ADN. Après séchage des plaques, 25 pl de liquide scintillant (Microscint-40, Packard) sont distribués dans chaque puits et permettent de quantifier la radioactivite (rayonnements émis par le tritium) en mesurant le nombre de coups I minute. (cpm) émis par chaque puits sur le compteur Top Count (Packard). résultats obtenus pour chacun des oligonucléotides testés sont représentés figure 1, qui indique, pour chaque oligonucléotide testé l'indice de stimulation IS. indice IS est calculé de la façon suivante: _ (CPM de l'oligonucléotide testé - CPM du contrôle milieu)/ CPM contrôle milieu. remarque que l'oligonucléotide selon l'invention (3DbTT) qui ne comprend pas de dinucléotide CG est capable d'induire une prolifération des lymphocytes humains identique à celle mesurée pour l'oligonucléotide de l'art antérieur (3Db) comprenant dinucléotide CG. Par contre, les résultats du contrôle négatif (A15) sont bien négatifs. Exemple 3 Test relatif aux marqueurs d'activation Le test est effectué à partir de lymphocytes isolés d 'un donneur comme décrit à l'exemple précédent, et ajustés à 2.106 cellules/ml dans le même milieu de culture. Les lymphocytes sont ensuite incubés dans des tubes en polypropylène de 4m1 à raison de 2mlltube. On ajoute dans chaque puits une quantité d'oligonucléotides à tester préparés à l'exemple 1 (1 oligonucléotide I tube) suffisante pour obtenir une concentration en oligonucléotide 2 pM. Après 3 jours d'incubation, les cellules sont réparties en 3 tubes micronic à raison de 106 cellules par tube. Après centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans 100p1 de tampon IF (ImmunoFluorescence) composé de PBS 0.1% BSA 0.01% Azide de sodium. On procède ensuite au marquage des cellules en ajoutant 5 pl de chacun des anticorps fluorescents suivants: - tube : CD20 PE/ CD69 FITC - tube CD20 PE/ CD25 FITC - tube CD20 PE/ CD86 FITC Le CD20 un marqueur des lymphocytes B. Le CD69 un marqueur d'activation précoce des lymphocytes B et T. Le CD25 un récepteur de l'Interleukine 2. Le CD86 une molécule de costimulation B7-2. Après %z heure d'incubation à 4 C; les cellules sont lavées et remises en suspension en tampon IF additionné de 0.5% de formol. Les cellules sont analysées un cytofluorimètre (FACScan) en double marquage, avec une fenêtre d'étude 5000 cellules CD20+ (lymphocytes B). Les résutats obtenus sont illustrés sur la Figure 2 qui indique, pour chaque oligonucléotide testé, le %age de lymphocytes B exprimant l'un des marqueurs testés. On constate que l'oligonucléotide selon l'invention ne contenant pas de motif CG est capable d'induire une augmentation de l'expression de certains marqueurs d'activation CD25, CD69, CD86) sur les lymphoctes B identique à celle mesurée pour l'oligonucléotide de l'art antérieur comprenant un tel dinucléotide CG. En effet, le pourcentage de lymphocytes B exprimant de tels marqueurs est du même ordre dans les 2 Par contre, la séquence composée de 15 A a un pourcentage de lymphocytes B activés nettement plus faible. Revendications 1. Oligonucléotide immunostimulant , caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique ayant la formule suivante GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3', dans laquelle T signifie Thymine,.A Adénine Cytosine , G Guanine, et en ce qu'il est dépourvu de dinucléotide CG dans lequel la Cytosine C ne serait pas méthylée. 2. Oligonucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend de à 100 nucléotides. 3. Oligonucléotide selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le motif 5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3' est répété au moins 1 fois. 4. Oligonucléotide selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est capable d'induire la prolifération des lymphocytes B humains. 5. Oligonucléotide selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce est capable d'accroître l'expression des marqueurs d'activation CD25 , marqueur CD86, ou du marqueur CD69 sur les lymphocytes B humains. 6. Utilisation d'un oligonucléotide selon une des revendications précédentes pour la fabrication d'un médicament. 7. Utilisation d'un oligonucléotide selon une des revendications 1 à 5, pour la fabrication d'un immunostimulant humain. 8. Utilisation d'un oligonucléotide selon une des revendications 1 à 5, pour la fabrication d'un adjuvant vaccinal. 9. Utilisation d'un oligonucléotide selon une des revendications 1 à 5, pour la fabrication d'une composition vaccinale. 10. Composition vaccinale ' usage humain, comprenant au moins un antigène vaccinal, caractérisée ce qu'elle comprend en outre au moins un oligonucléotide selon une des revendications 1 à 5