Brevet FR2804759A1 — publié le 20010810

D E S C R 1 P T 10 N La présente invention concerne le domaine des dommages de la peau et des tissus induits par la lumière, et concerne un procédé de dosage et d'évaluation chez les humains des dommages de la peau et des tissus causés par le rayonnement UV (ultra-violet), ainsi qu'un procédé permettant de déterminer l'effet de protection anti-UV de substances actives. La lumière solaire (fraction du rayonnement UV) a tant des effets négatifs que positifs sur la peau. Un excès de rayonnement entraîne tant des dommages aigus (coup de soleil, érythème) que des modifications chroniques (vieillissement de la peau, cancers de la peau). Pour protéger la peau des humains du rayonnement UV, on utilise des substances dites de protection solaire, qui absorbent ou réfléchissent le rayonnement ultraviolet (substances primaires de protection solaire), ou qui provoquent une interruption de la chaîne de réactions photochimiques dans la peau après pénétration du rayonnement (substances secondaires de protection solaire). Dans le cas des agents ou produits cosmétiques de protection solaire, l'indice 'ou facteur de protection solaire joue un rôle central et sert à détecter l'effet photo- protecteur. L'indice de protection solaire correspond au rapport d'apparition de la première rougeur de peau (Erythema solères) ou dose érythémale minimale (minimum erythemal dose, MED) entre peau protégée et non protégée par un agent ou produit de protection solaire. Il s'est cependant avéré qu'avant l'apparition d'un Erythema solare, à savoir en-deçà de la MED, se produisait déjà une destruction cellulaire par le rayonnement UV (Fisher, G.D., Datta S. C., Talwa H. S., "Molecular basis of sun induced premature skin ageing and retinoid antagonism", Nature, 1996, 379, 335-339). Les méthodes utilisées pour déterminer l'endommagement cellulaire par le rayonnement UV reposent sur un examen visuel de la MED. Les dommages se produisant déjà au préalable sur le plan cellulaire sont découverts trop tard en raison de la faible sensibilité de cette méthode de mesure. La peau humaine est formée de trois structures : l'épiderme, le derme et l'hypoderme, ainsi qu'un groupe d'appendices de peaux. L'épiderme constitue la couche cutanée la plus externe, la couche de protection contre l'environnement à proprement parler. Il s'agit d'un épithélium pavimenteux kératinisé formé de couches, qui se compose essentiellement de kératinocytes formant des cornéocytes, ainsi que de mélanocytes, de cellules de Langerhans et de cellules de Merkel. Dans l'épiderme se trouvent, comme dans de nombreuses cellules du tissu conjonctif, de nombreuses jonctions intercellulaires qui permettent une communication intercellulaire. Cette communication intercellulaire s'effectue dans les types de cellules les plus différents. La communication s'effectue par les pores entre deux cellules contiguës, que l'on appelle "gap junction" (jonction lacunaire), et qui est d'une importance capitale pour la défense et la protection contre des dommages résultants. Ces jonctions intercellulaires entre les cellules du tissu humain permettent le passage de substances nutritives et de messagers, d'ions, mais non de macromolécules, et participent par conséquent à la coordination du métabolisme de cellules voisines. Ces "gap junctions" se composent de deux structures presque cylindriques, les connexons ou semi-canaux. Un connexon se compose de six molécules identiques d'une protéine tubulaire, la connexine (masse moléculaire en fonction de sa nature et du tissu, 26 000 à 56 000), et les connexines (Cx) le plus souvent identifiées jusqu'à présent dans les différents types de cellules sont Cx26, Cx30.3, Cx3l, Cx32, Cx4O et Cx43, la connexine 43 et la connexine 26 se rencontrant le plus souvent dans les cellules de la peau et des tissus humains. La connexine 43 est celle qui s'exprime le plus souvent dans l'épiderme. (Salomon D., Masgrau E., Visher S., Ullrich S., "Topography of mammalian Connexins in human skin", J. Invest Dermatoi., 1991, 103, 2, 240-247.) Des études réalisées sur des cultures cellulaires de fibroblastes de tissu conjonctif de hamster ont montré que le rayonnement UV réduisait la communication intercellulaire de ce type de cellules. Ces effets ont pu être documentés par Banrud et al. à l'aide d'un test de transfert de couleur. (Banrud H., Milkisen SO, Berg K., Moan J., "Effect of ultraviolet radiation on intercellular communication in V79 Chinese hamster fibroblasts", Carcinogenesis, 1994, 15, 2, 233-239.) Selon cette méthode de détection, on ne peut cependant que constater si le colorant peut migrer d'une cellule vers une autre. Rien n'a été dit quand à la raison de la réduction de ce transfert après une irradiation au rayonnement UV, ni quels pouvaient être les mécanismes impliqués lors de la communication intercellulaire. L'objet de la présente invention a donc consisté à développer un procédé grâce auquel il soit possible de mesurer un endommagement de la peau/des tissus induit par le rayonnement UV sur des cellules humaines dans une plage de dosage de l'irradiation qui est située dans la zone limite de la MED et qui doit inclure des doses allant de 0,01 à 5 fois la dose de MED. Les mesures devraient être très se'nsibles et tenir compte de la MED de chaque individu, qui diffère d'un individu à l'autre. Elles devraient pouvoir être réalisées sans prendre trop de temps et sans effectuer d'essai sur des animaux. Un autre objet de la présente invention a consisté à développer un procédé permettant de mesurer l'effet de protection contre le rayonnement UV de substances actives dans une plage de dosage de l'irradiation située dans la zone limite de la MED. De façon surprenante, on a découvert qu'il est possible, pour déterminer l'endommagement des cellules humaines de la peau et des tissus par un rayonnement ultraviolet, de quantifier les connexines immunoréactives. L'objet de la présente invention est un procédé de détermination de l'endommagement des cellules humaines de la peau et des tissus par le rayonnement ultraviolet, dans lequel on quantifie les connexines immunoréactives. Le rayonnement ultraviolet, qui entraîne un endommagement des cellules de la peauldu tissu et dont l'effet peut par conséquent être déterminé avec le procédé de l'invention, se situe dans le domaine du rayonnement UVA et UVB et correspond à un domaine de longueurs d'onde comprises entre 280 et 400 nm. Le domaine des longueurs d'onde des UVA entraînant les dommages nommés est compris entre 320 et 400 nm, et en particulier entre 320 et 365 nm. Le domaine des UVB est compris dans la gamme allant de 280 à 320 nm, et est de préférence égal à 297 nm. Une augmentation du rayonnement UV entraîne une diminution des connexines immunoréactives. Cette diminution est une mesure ou indication quantitative de l'endommagement des cellules humaines de la peau et des tissus induit par le rayonnement ultraviolet. Méthodes de détection Il existe différents procédés pour quantifier en accord avec la présente invention les connexines immunoréactives. En principe, sont applicables tous les procédés dans lesquels les connexines immunoréactives peuvent être dosées. Ces procédés se caractérisent par le fait qu'un anticorps spécifique se lie à des connexines déterminées. Sont en principe appropriés tous les anticorps qui subissent une réaction spécifique avec les connexines à quantifier. Les connexines peuvent alors être détectées et quantifiées selon différentes méthodes après l'i mmu no réaction. Les différences entre les différentes méthodes de détermination des substances immunoréactives résident entre autres dans le pré-traitement différent des cellules, dans le traitement différent des protéines après immunoréaction et dans la sensibilité de la détection. Un procédé est la méthode immunochimique dite du "western blot' (transfert de type western). A cet égard, les protéines sont transférées sur une membrane après séparation électrophorétique. Pour la détection sélective de protéines déterminées sur la membrane, celles-ci sont mises à réagir avec des anticorps qui leur sont spécifiques. Cette méthode est par exemple décrite par Salomon et al. pour déterminer les connexines dans la peau humaine. (Salomon D,, Masgrau E., Visher S., Ulirich S., 'Topography of mammalian Connexins in human skin", J. lnvesÉ DermatoL, 1994,103, 2, 240-247.) Un autre procédé est la méthode de l'immunofluorescence. Cette méthode, dans laquelle, après l'immunoréaction entre un anticorps spécifique des connexines et la connexine, un colorant fluorescent est lié à l'anticorps, est plus sensible que le "western blot" et ne nécessite pas de séparation pour détecter les protéines. Cette méthode directe par fluorescence est par exemple décrite par Salomon et al. (Salomon D., Masgrau E., Visher S., UlIrich S., "Topography of mammalian Connexins in human skin", J. Invest. DermatoL, 1994, 103, 2, 240-247.) Dans une forme de réalisation préférée de la présente invention, on utilise pour quantifier les connexines la méthode de l'immunofluorescence avec amplification ou renforcement du signal. Le principe de cette méthode est le renforcement du signal fluorescent. On obtient ainsi une limite de détection plus sensible pour quantifier les connexines. Pour renforcer le signal de fluorescence, après l'immunoréaction, on met à réagir un autre anticorps sur les anticorps déjà liés aux connexines. Celui-ci est lié à un réactif de couplage. Concernant cet autre anticorps, il peut par exemple s'agir d'anticorps de chèvre anti- souris. Ces anticorps sont liés à un réactif de couplage, comme par exemple la biotine. Le réactif de couplage dispose de plusieurs sites de liaison auxquels peut alors respectivement se lier un partenaire de couplage chargé avec le colorant fluorescent. Il peut s'agir concernant ces partenaires de couplage par exemple de complexes d'avidine ou de streptavidine. Le fait que l'avidine, tout comme la streptavidine, lient la biotine par quatre sites de liaison est exploité dans le cas du procédé en accord avec la présente invention en tant que renforcement du signal. On peut utiliser en principe comme colorant tous les colorants fluorescents susceptibles de former avec ce partenaire de couplage le complexe décrit, comme par exemple le FITC, le rouge Texas ou la rhodamine. Dans le cas du procédé en accord avec la présente invention, on utilise de préférence un complexe streptavidine-fluorescéine qui lie les anticorps contenant de la biotine. Pour la quantification, on peut utiliser par exemple un microscope à balayage laser confocal dont les images sont converties au -moyen d'un logiciel standard. Les méthodes par, immunofluorescence représentent une détection particulièrement sensible et rapide des protéines intactes de l'agglomération cellulaire sans que les protéines n'aient besoin d'être isolées de l'agglomération cellulaire et les protéines à quantifier d'être purifiées. Il est possible de quantifier directement, après un traitement in vivo des cellules analysées, les protéines envisagées à l'aide de l'immunoréaction entre protéine et anticorps spécifique. Des éventuelles modifications des protéines après traitement au rayonnement UV peuvent être réalisées sur des cellules encore opérationnelles et les sources d'erreurs éventuelles, comme par exemple la destruction des connexines lors de l'isolation et de la purification, peuvent être exclues. De par l'utilisation du renforcement du signal à l'aide de complexes de colorants fluorescents, on obtient une limite de détection, qui entraîne dans le procédé en accord avec la présente invention le fait que l'effet d'une dose d'irradiation sur la fraction des connexines des cellules humaines de la peau et des tissus peut être quantifiée dans la limite de la MED individuelle. Un autre objet de la présente invention est un procédé de détermination de l'effet de protection anti-UV de substances actives sur les cellules humaines de la peau et des tissus, dans lequel on quantifie les connexines immunoréactives des cellules humaines de la peau et des tissus une fois avant l'irradiation UV et une fois après l'irradiation UV, de préférence avec une des méthodes immunochimiques décrites, en particulier avec la méthode de l'immunofluorescence avec renforcement ou amplification du signal. La différence entre les deux valeurs permet une estimation des connexines immunoréactives restantes. Lors de l'analyse de l'effet de protection anti-UV des substances actives, on utilise un pré-traitement des cellules de la peau et du tissu analysées autre que dans le cas de la détermination décrite de l'endommagement des cellules humaines de la peau et des tissus par rayonnement ultraviolet. Le traitement des cellules de la peau avec les substances actives rend nécessaire une analyse in vitro lorsque les substances actives n'ont pas encore été libérées d'un point de vue toxicologique. Sont en principe appropriés tous les pré-traitements des cellules de la peau et des tissus qui peuvent être utilisés pour une analyse in vitro de l'effet de protection anti-UV des substances actives avec les procédés décrits. Un pré-traitement possible dans le cas'du procédé en accord avec la présente invention consiste d'abord à prélever sur l'humain des cellules de la peau sous la forme d'échantillons de peau d'une taille limite de 1 CM2# par intervention chirurgicale. Le traitement préféré des échantillons de peau jusqu'au traitement avec la substance active correspond alors à une technique décrite par S. Boisnic et ai. (Boisnic S. et al, "Long terrn culture of normal skin to test the efficacy of hydroxy acid- containing cream."; Eur. J. Dermatoi., 1997, 7, 271-273). Les substances actives à examiner sont appliquées en ce qu'on les introduit dans un liant, de préférence celui connu sous la désignation Hydrogel LS de la société Laboratoires Sérobiologiques, pour obtenir un gel qui peut être appliqué et aggloméré sur les échantillons de peau. La concentration de la substance active est comprise entre 0,01 et 1 % en masse - sur la base de la quantité totale de gel. On utilise comme placebo pour déterminer plus précisément l'effet de protection anti-UV des substances actives le gel sans autre additif. Selon des intervalles réguliers, de préférence deux fois par jour, les échantillons de peau sont traités jusqu'à 5 fois avec le placebo ou respectivement la substance active, incorporée dans Hydrogel LS, avant d'être irradiés aux UV. Après une durée définie consécutive au rayonnement, de préférence 24 heures, on quantifie les connexines immunoréactives dans les échantillons de peau selon l'une des méthodes précédemment décrites, de préférence selon la méthode de l'immunofluorescence avec renforcement du signal. On entend essentiellement sous le terme de substances actives au sens de la présente invention toutes les substances et tous les mélanges dont l'effet de protection contre le rayonnement ultraviolet des cellules humaines de la peau et des tissus doit être analysé et testé. Les connexines immunoréactives, qui sont quantifiées avec le procédé en accord avec la présente invention sont des protéines tubulaires qui se trouvent dans les membranes cellulaires et y forment des canaux de 15 à 20 A de diamètre. Le passage d'ions, de substances nutritives et de messagers entre les cellules est rendu possible par ces canaux (gap junctions). Par l'influence extérieure, comme par exemple une baisse de la valeur du pH cytosolique, une augmentation de la concentration intercellulaire en ions ou autre, la conformation des connexines se modifie et elles sont alors en mesure de fermer les canaux. L'influence de cellules traumatisées ou mourantes est ainsi exclue. La masse moléculaire des connexines (Cx) jusqu'alors identifiées varie entre 26 000 (Cx26) et 56 000 (Cx56), et les connexines les plus fréquentes sont Cx26, Cx30.3, Cx32, Cx40 et Cx43. Dans l'épiderme humain, Cx43 s'exprime le plus souvent. Dans une forme de réalisation particulière du procédé en accord avec la présente invention, on quantifie les connexines immunoréactives Cx26 (connexine 26) et/ou Cx43 (connexine 43), la quantification de Cx43 étant particulièrement importante pour détecter l'endommagement cellulaire des cellules humaines de la peau et des tissus. Un autre objet de la présente invention est l'utilisation d'anticorps spécifiques dirigés contre les connexines pour déterminer l'endommagement de cellules humaines de la peau et des tissus par le rayonnement UV, ainsi que l'utilisation d'anticorps spécifiques contre les connexines pour déterminer l'effet de protection anti-UV de substances actives sur des cellules humaines de la peau et des tissus. Sont par principe appropriés pour quantifier les connexines immunoréactives tous les anticorps spécifiques contre les connexines, et on préfère particulièrement les anticorps anti-connexine, en particulier les anticorps monoclonaux anti-connexine 43, pour déterminer les Cx43. Ces anticorps spécifiques sont disponibles dans le commerce, par exemple auprès de la société Amersham. On entend dans la présente invention sous le terme de quantification la détermination, par rapport à une norme définie en fonction du type de procédé utilisé et décrit, de la proportion de connexines immunoréactives. En fonction du procédé, lés connexines immunoréactives sont détectées et quantifiées de façon spécifique. La différence de proportion de connexines immunoréactives entre norme et échantillon irradié aux UV et traité représente la quantification. Dans la méthode de détection préférée par immunofluorescence avec renforcement du signal, on quantifie les connexines immunoréactives en ce que l'on détecte les parties de peau fluorescentes et que l'on détermine la proportion, en pourcentage, de connexines 43 marquées, sur la base de la surface totale d'épiderme de l'échantillon analysé. La réduction de la proportion, en pourcentage, de connexines immunoréactives constitue une mesure de l'endommagement, induit par le rayonnement ultraviolet, des cellules humaines de la peau et des tissus. Les inventeurs sont parvenus à montrer que lorsque la dose d'irradiation augmentait, sur la base de la dose érythémale minimale (MED), la fraction de connexines immunoréactives 43 diminuait. La dose d'irradiation à partir de laquelle une diminution des connexines immunoréactives peut être détectée est comprise dans les gammes suivantes: 1) au-delà d'une MED, 2) entre 1 et 0,01 MED, 3) entre 1 et 0,03, et de préférence dans la gamme allant de 4) 0,75 à 0,50 MED. Le procédé en accord avec la présente invention est approprié de plus pour déterminer l'effet de protection anti-UV de substances actives en ce que l'on montre que la diminution des connexines immunoréactives par le rayonnement UV est faible après traitement avec la substance active en comparaison avec un témoin non traité. La concentration préférée de la substance active est comprise pour des mélanges dans la gamme allant de 0,5 à 1 % en masse et pour des substances dans la gamme allant de 0,01 à 0,2 % en masse - sur la base de la quantité totale de liant. Exemples Exemple 1 : Méthode de détection de la proportion de connexines immunoréactives dans des cellules humaines de la peau et des tissus Pré-traitement des échantillons de tissu à analyse On a sélectionné pour ces études six femmes âgées de moins de 40 ans, sans problème de peau et présentant un phototype Il ou 111. On a d'abord déterminé la MED individuelle (minimal erythema dose). Sur la base de cette valeur, on a irradié avec un simulateur solaire à raison de 0, 0,75, 1 et 2 fois la dose MED, puis on a analysé après 24 heures un échantillon de tissu de la peau irradiée et non irradiée (2 mm d'épaisseur) par analyse immunohistochimique. Les échantillons de tissu ont été stockés dans de l'azote liquide (- 70 OC). Test immunohistochimique On a prélevé de l'échantillon de tissu 10 micromètres que l'on a appliqué sur un support et fixé dans de l'acétone froid pendant 10 min. On a ensuite lavé avec un tampon de phosphate (pH 7,2) et séché à l'air. Les échantillons ont été mis à incuber une heure à 37 'C avec l'anticorps monoclonal anti-connexine 43 (article N': MAB 3068; Société Euromedex) dans une solution diluée 1 à 100 fois. Après lavage avec le tampon de phosphate, on a traité les échantillons de tissu pendant 45 min avec des anticorps biotinylés (anticorps de chèvre anti-souris de la société Amersham) dans une solution diluée 1 à 50 fois, puis 45 min dans une solution diluée 1 à 30 fois du marqueur fluorescent complexe de streptavidine-fluorescéine (société Amersham). On a fabriqué des échantillons témoins ou échantillons standard en ce que l'on a exclu lors de la première étape la réaction des anticorps avec l'anticonnexine 43. Après lavage avec le tampon de phosphate, les échantillons ont été traités 10 min avec du bleu Evans (société BioMérideux) pour obtenir un contraste plus marqué. Les échantillons ont été analysés avec un microscope à balayage laser confocal de la société Zeiss. Quantification de la connexine 43 Les images obtenues par microscope laser à balayage confocal ont été converties en utilisant un logiciel standard (celui connu sous la désignation Quantimet Q500 de la société Leica). Les parties de peau fluorescentes ont été détectées et la proportion, en pourcentage, de connexine 43 marquée déterminée, sur la base de la surface totale d'épiderme de l'échantillon analysé. Résultats Rayonnement UV Surface réactive, Témoin (sans rayonnement UV) 19,78 0,75 MED 16,50 1 MED 15,30 2 MED 3,97 Tableau 1 : effet du rayonnement UV sur la proportion de connexines dans l'épiderme. Valeur moyenne des analyses de peau traitée de six femmes (voir aussi figure 1). On reconnaît à partir des données du tableau 1 et du diagramme de la figure 1 qu'une augmentation de la dose d'irradiation, mesurée en MED individuelle, entraîne une diminution significative de la proportion, en pourcentage, des connexines immunoréactives. Dans le cas des échantillons de tissus témoins, qui ont été analysés sans irradiation, environ 20% de la couche de peau analysée en moyenne étaient fluorescents. Déjà après une dose inférieure à la MED, à 0,75MED, se dessine une réduction importante de la fluorescence, qui passe à 16,5 % de la surface mesurée, en comparaison avec la peau non irradiée. En moyenne, l'augmentation de la dose d'irradiation à 1 MED entraîne une nouvelle baisse de la fluorescence et par conséquent une diminution des connexines immunoréactives. Une diminution de la fluorescence d'environ 16 % à 4 % de la surface examinée dans le cas d'une dose égale à 2 MED accentue la corrélation entre rayonnement UV pénétré et connexines immunoréactives restantes dans l'épiderme. On a pu montrer qu'une augmentation de la dose d'irradiation, sur la base de la MED par individu, réduisait la proportion àe connexine 43 immunoréactive. Exemple 2 : Détection de l'effet de protection anti-UV de substances actives sur la proportion de connexines immunoréactives de cellules humaines de la peau et des tissus Pré-traitement des échantillons de tissu à analyse On a obtenu par intervention chirurgicale sur des humains des échantillons de peau d'une taille de 1 CM2. Ces cellules de peau ont été désinfectées et libérées de la graisse et du derme sous-cutanés. Ces échantillons de peau ont été stockés dans un milieu de culture jusqu'à traitement, et mis à incuber à 37 'C, 5 % de C02 et HR de 95 Traitement des échantillons de peau Les échantillons de peau pré-traités ont été traités avec une substance active à analyser (un extrait de la plante Adansonia digitata, la flavonoïde rutine, obtenu auprès de la société Sigma) ou un placebo. Pour traiter les échantillons de peau, les substances actives ont été incorporées, dans une concentration de 1 % en masse pour l'extrait végétai et de 0,01 % en masse pour la rutine, dans un liant (Hydrogel LS de la société Laboratoires Sérobiologiques LS) puis appliquées en tant que gel (2 Mg/CM2) sur les échantillons de peau et agglomérées. On a utilisé comme placebo le liant sans substance active. Ces échantillons de peau ont chacun été traités deux fois par jour avec le gélène à analyser. Ce traitement a dans l'ensemble été réalisé cinq fois, à savoir sur trois jours au total. 24 h après le dernier traitement avec la substance active, les échantillons de peau ont été irradiés par rayonnement UV et on a quantifié les connexines immunoréactives après 24 heures supplémentaires. Au moyen d'un simulateur solaire (celui connu sous la désignation Suntest CPS+, société Heraeus), on a soumis ces échantillons de peau à irradiation pendant 15 min (7,6 j/CM2 UVA et 432 Mj/CM2 UVB) ou 30 min (15,2 j/CM2 UVA et 864 Mj/CM2 UVB). Comme témoin, on a analysé un échantillon de peau non traité avec la substance active à analyser. Des témoins sans rayonnement mais avec traitement de la substance active ou sans utiliser de substance active mais avec rayonnement UV ont été utilisés comme norme. Test immunohistochimique et quantification de la connexine 43 Parmi les échantillons de peau, on appliqué un échantillon sur un support et on l'a fixé avec de l'acétone froid pendant 10 min. On a ensuite traité les cellules selon le même test immunochimique et quantifié les connexines immunoréactives selon la même méthode que dans l'exemple 1 pour les échantillons de tissu. Résultats Témoins Placebo Extrait Rutine végétal S- 33,48% 15 min S+ 4,12% 1,48% 31,62% 28,41 % 30 min S+ 0,59% 0,64% 27,50% 23,27% Tableau 2 : Effet du rayonnement UV sur la proportion de connexines immunoréactives d'échantillons humains de peau (% de la surface réacfive) (voir aussi figure 2 : S+ avec rayonnement UV, S- = sans rayonnement UV). On reconnaît à partir des données du tableau 2 et du diagramme de la figure 2 qu'une augmentation de la dose d'irradiation d'une part et qu'une durée d'irradiation prolongée d'autre part entraînent une diminution significafive de la proportion, en pourcentage, des connexines 43 immunoréactives. Dans le cas des cultures cellulaires témoin, qui ont été analysées sans irradiation et sans substance active, environ 30 % en moyenne des cellules analysées étaient fluorescentes. Déjà après une dose d'irradiation de 7,6 j/CM2 UVA et de 432 Mj/CM2 UVB, on remarquait une diminution importante de la fluorescence après 15 minutes d'irradiation, à environ 4 % des cellules mesurées en comparaison avec les cellules non irradiées. En moyenne, l'augmentation de la durée d'irradiation à 30 min entraîne un nouveau recul de la fluorescence et par conséquent une diminution des connexines 43 immunoréactives. Lors du traitement des cellules avec un placebo, on a pu observer un effet similaire. La proportion de connexines 43 immunoréactives diminue lorsque la durée d'irradiation augmente. Il en va différemment après incubation des cultures cellulaires avec des extraits de la plante Adansonia digitata. La diminution de la proportion de connexines 43 immunoréactives est plus faible que dans le cas d'échantillons comparables non traités avec l'extrait de plante. On reconnaît le même effet pour le glycoside de flavone rutine. On remarque également alors que la réduction de la proportion de connexines 43 immunoréactives est faible malgré l'irradiation UV en comparaison avec l'échantillon non traité. Par conséquent, le procédé en accord avec la présente invention est approprié pour déterminer l'effet de protection anti-UV de substances actives. Revendications 1. Procédé de détermination de l'endommagement de cellules humaines de la peau et des tissus par le rayonnement UV, caractérisé en ce que l'on quantifie les connexines immunoréactives. 2. Procédé de détermination de l'effet de protection anti-UV de substances actives sur des cellules humaines de la peau et des tissus, caractérisé en ce que l'on quantifie les connexines immunoréactives avant et après l'irradiation aux UV. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que, pour quantifier les connexines immunoréactives, on utilise une méthode d'immunofluorescence avec amplification ou renforcement du signal. 4. Procédé selon au moins l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il s'agit concernant les connexines immunoréactives de la connexine 43 et/ou de la connexine 26. 5. Utilisation d'anticorps spécifiques contre les connexines pour déterminer l'endommagement de cellules humaines de la peau et des tissus par le rayonnement UV. 6. Utilisation d'anticorps spécifiques contre les connexines pour déterminer l'effet de protection anti-UV de substances actives sur des cellules humaines de la peau et des tissus.