Brevet FR2807767A1 — publié le 20011019

La présente invention concerne un procédé d'obtention et de sélection d'anticorps monoclonaux par un test de type ADCC, lesdits anticorps pouvant activer les récepteurs Fcy de type III. L'invention vise également des anticorps monoclonaux présentant une structure glycannique particulière, les cellules produisant lesdits anticorps, les méthodes de préparation des cellules productrices, ainsi que les compositions pharmaceutiques ou les tests diagnostiques comprenant lesdits anticorps. Les anticorps anti-D selon l'invention peuvent être utilisés pour la prévention de l'isoimmunisation Rhésus d'individus Rh négatifs, notamment de la maladie hémolytique du nouveau-né (MHNN) ou dans des applications comme le Purpura Thrombocytopénique Idiopathique (PTI). L'immunothérapie passive à l'aide d'anticorps polyclonaux est réalisée depuis les années 1970. Cependant, la fabrication des immunoglobulines polyclonales pose plusieurs problèmes : L'immunisation de sujets volontaires a été interrompue en France en 1997, en raison des problèmes éthiques que présentent de tels actes. En France, comme en Europe, le nombre de donneurs immunisés est trop faible pour assurer un approvisionnement suffisant en certains anticorps si bien qu'il s'avère nécessaire d'importer du plasma hyperimmunisé des Etats-Unis par exemple. Ainsi, cette pénurie d'immunoglobuline ne permet pas d'envisager une administration antenatale pour la prévention de la MHNN. Divers travaux ont abouti à la production d'anticorps monoclonaux humains dans le but de remplacer les anticorps polyclonaux obtenus à partir du fractionnement de plasmas de donneurs volontaires. Les anticorps monoclonaux présentent plusieurs avantages : ils peuvent être obtenus en grande quantité à des prix raisonnables, chaque lot d'anticorps est homogène et la qualité des différents lots est reproductible car ils sont produits par la même lignée cellulaire qui est cryopréservée dans l'azote liquide. La sécurité du produit peut être assurée quant à l'absence de contamination virale. Plusieurs publications décrivent l'obtention de lignées cellulaires productrices d'anticorps monoclonaux humains anti-Rh D de classe IgG, à partir de cellules B de donneurs immunisés. Boylston et al. 1980 ; Koskimies1980 ; Crawford et al. 1983 ; Doyle et al. 1985 ; et al. 1987 ; et al. 1989 (a) etMc Cann-Carter et al. 1993 décrivent l'obtention de lignées de lymphocytes B transformés par le virus EBV. Melamed et al. 1985 ; et al. 1986 et Me Cann-Carter et al. 1993 concernent des hétérohybrides résultant de la fusion lymphocytes B (transformés par EBV) x myélome murin. Goossens et al. 1987 porte sur des hétérohybrides résultant de la fusion lymphocytes B (transformés par EBV) x myélome humain. Bron et al. 1984 et Foung et al. 1987 décrivent des hétérohybrides résultant de la fusion lymphocytes B (transformés par EBV) x hétéromyélome homme-souris et enfin, Edelman et al. 1997 porte sur des cellules d'insectes transfectées avec le gène codant pour un anti-Rh (D) l'aide du système baculovirus. Parmi les brevets et demandes de brevet concernant de tels anticorps monoclonaux et leurs lignées sécrétrices, on peut citer : EP 576093 (AETS (FR), Biotest Pharma GmbH (Germany) ; Composition for prophylaxis of the haemolytic disease of the new-born comprises two human monoclonal antibodies of sub-class IgG and IgG3, which are active against the Rhesus D antigen), RU 2094462, WO 85/02413 (Board of Trustees of the Leland Stanford Jr. University, Human Monoclonal Antibody against Rh (D) Antigen and its Uses), GB 86-10106 (Central Blood Laboratories Authority, Production of heterohybridomas for manufacture of human monoclonal antibodies to Rhesus D antigen), EP 0 251 440 (Central Blood Laboratories Authority, Human Anti-Rhesus D Producing Heterohybridomas), WO 89/02442, WO 89/02600 et WO 89/024443 (Central Blood Laboratories Authority, Human Anti-Rh (D) Monoclonal Antibodies), WO 8607740 (Institut Pasteur, Protein Performance SA, Paris, FR, Obtention d'un anticorps monoclonal recombinant à partir d'un anticorps monoclonal human antirhésus D, sa production en cellules d'insecte et ses utilisations), JP 88-50710 (International Reagents Corp., Japan, Reagents for Determination of Blood Group Substance Rh (D) Factor), JP 83-248865 (Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd., Japan, Preparation of Monoclonal Antibody to Rh (D) positive Antigen), CA 82- 406033 (Queens University at Kingston, Human Monoclonal Antibodies) et GB 8226513(University College London, Human Monoclonal Antibody against Rhesus D Antigen). Si l'utilisation d'anticorps monoclonaux présente de nombreux avantages par rapport à l'utilisation de pools d'anticorps polyclonaux, il peut en revanche s'avérer difficile d'obtenir un anticorps monoclonal efficace. En effet, on a trouvé dans le cadre de l'invention que le fragment Fcy de l'immunoglobuline obtenue doit posséder des propriétés bien particulières afin de pouvoir interagir et activer les récepteurs des cellules effectrices (macrophage, lymphocyte T H et NK). L'activité biologique de certaines immunoglobulines G est dépendante de la structure des oligosaccharides présents sur la molécule, et notamment sur sa partie Fc. Les molécules IgG de toutes les sous-classes humaines et murines possèdent un Noligosaccharide fixé au domaine CH2 de chaque chaîne lourde (au résidu Asn 297 pour les IgG humaines). L'influence de ce résidu glycannique sur la capacité de l'anticorps à interagir avec des molécules effectrices (Fc récepteurs et complément) a été démontrée. L'inhibition de glycosylation d'une IgGl humaine, par culture en présence de Tunicamycine, provoque par exemple une diminution de 50 fois de l'affinité de cet anticorps pour le récepteur FcyRI présent sur les monocytes et macrophages (Leatherbarrow et al, 1985). La fixation au récepteur FcyRIII est également affectée par la perte de carbohydrates sur l'IgG, puisqu'il a été décrit qu'une IgG3 non glycosylée est incapable d'induire une lyse de type ADCC par l'intermédiaire du récepteur FcyRIII des cellules NK (Lund et al, 1990). Mais, au-delà de la présence nécessaire de ces résidus glycanniques, c'est plus précisément l'hétérogénéité de leur structure qui peut aboutir à des différences dans la capacité à engager des fonctions effectrices. Des profils de galactosylation variables en fonction des individus (IgGl humaines sériques) ont été observés. Ces différences reflètent probablement des disparités dans l'activité des galactosyltransférases et autres enzymes entre les clones cellulaires de ces individus (Jefferis et al, 1990). Alors que cette hétérogénéité normale des processus post-traductionnels génère différentes glycoformes (même dans le cas d'anticorps monoclonaux), elle peut conduire à des structures atypiques associées à certains états pathologiques comme l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, pour lesquelles une proportion importante de résidus agalactosylés a été mise en évidence (Parekh et al, 1985). Le profil de glycosylation de la molécule purifiée est la conséquence d'effets multiples dont certains paramètres ont déjà été étudiés. Le squelette protéique des IgG et notamment les acides aminés en contact avec les résidus N-acétylglucosamine (GIcNAc) et galactose terminaux du bras mannose a 1-6 (aa 246 et 258 des IgG) peuvent expliquer l'existence de structures préférentielles (galactosylation) comme le montre l'étude réalisée sur les IgG murines et chimériques de différents isotypes (Lund et al, 1993). Les différences observées mettent également en évidence des spécificités liées à l'espèce et au type cellulaire utilisés pour la production de la molécule. Ainsi, la structure classique des N-glycannes des IgG humaines révèle une proportion significative de types biantennés avec un résidu GIcNAc en position bissectrice, structure absente au niveau des anticorps produits par des cellules murines. De même, les résidus d'acides sialiques synthétisés par la lignée CHO (Chinese Hamster Ovary) sont exclusivement de type a 2-3 alors qu'ils sont de type a 2-3 et a 2-6 avec les cellules murines et humaines (Yu Ip et al, 1994). La production d'immunoglobulines dans des systèmes d'expression autres que ceux issus de mammifères peut introduire des modifications beaucoup plus importantes comme la présence de résidus xylose fabriqués par les cellules d'insectes ou par les plantes (Ma et al, 1995). D'autres facteurs comme les conditions de culture cellulaire (incluant la composition du milieu de culture, la densité cellulaire, le pH, l'oxygénation) semblent intervenir sur l'activité des glycosyltransférases de la cellule et par conséquent sur la structure glycannique de la molécule (Monica et al, 1993 ; et al, 1994 b). Or, on a trouvé dans le cadre de la présente invention qu'une structure de type biantennée, avec des chaînes courtes, une faible sialylation et des mannoses et GIcNAc terminaux est le dénominateur commun des structures glycanniques conférant une forte activité ADCC aux anticorps monoclonaux. On a également mis au point un procédé de préparation de tels anticorps capables d'activer les cellules effectrices par l'intermédiaire du FcyRIII, notamment d'anticorps anti-Rh(D). Les antigènes de groupes sanguins sont classés en plusieurs systèmes en fonction de la nature des molécules membranaires exprimées à la surface des hématies. Le système Rhésus (Rh) comprend 5 molécules ou antigènes : D, C, c, E et e (ISSITT, 1988). L'antigène D est la plus importante de ces molécules parce qu'elle est la plus immunogène, c'est-à-dire qu'elle peut induire la production d'anticorps anti-D si des globules rouges Rh D positif sont transfusés à des sujets Rh négatif. L'antigène D est normalement exprimé chez 85 % des sujets caucasoïdes, ces personnes sont dites Rh positif ; 25 % des ces sujets sont donc Rh négatif c'est-à-dire que leurs hématies ne présentent pas d'antigène D. L'expression des antigènes D présente certaines variantes qui peuvent être liées soit à une faible densité antigénique, on parlera alors d'antigènes D faibles, soit à une antigénicité différente ou partielle, on parlera alors d'antigènes D partiels. Le caractère D faible est caractérisé par le fait qu'il s'agit d'un antigène normal mais dont le nombre de sites par hématie est diminué de manière plus ou moins importante ; ce caractère est transmissible selon les lois mendéliennes. Les phénotypes D partiels ont été découverts chez des sujets Rh D positif qui possédaient des anticorps anti-D sériques ; ces antigènes D partiels peuvent donc être caractérisés comme ne possédant qu'une partie de la mosaïque. Des études réalisées avec des anticorps polyclonaux et monoclonaux ont permis de définir 7 catégories d'antigènes D partiels avec la description d'au moins 8 épitopes constitutifs de l'antigène D (LOMAS et al. 1989 ; TIPETT 1988). L'importance des anticorps anti-Rh D est apparue avec la découverte des mécanismes entraînant la maladie hémolytique du nouveau-né (MHNN). Celle-ci correspond aux différents états pathologiques observés chez certains foetus ou chez certains nouveaunés lorsqu'il y a une incompatibilité foeto-maternelle de groupe sanguin qui est responsable de la formation d'anticorps maternels anti-Rh D capables de traverser la barrière placentaire. En effet, le passage d'hématies f#tales Rh positif chez une mère Rh négatifpeut entraîner la formation d'anticorps anti-D. Après immunisation de la mère Rh négatif, les anticorps anti-D de classe IgG sont capables de traverser la barrière placentaire et de se fixer sur les hématies f#tales Rh positif. Cette fixation entraîne l'activation de cellules immunocompétentes via leurs récepteurs Fc de surface induisant ainsi une hémolyse des hématies f#tales sensibilisées. En fonction de l'intensité de la réaction, plusieurs degrés de gravité de la MHNN peuvent être observés. Un diagnostic de la MHNN peut être réalisé avant et après la naissance. Le diagnostic prénatal est basé sur l'évolution du taux des anticorps anti-D chez la mère en utilisant plusieurs techniques immunohématologiques. Le diagnostic post-partum peut être fait à partir d'un prélèvement de sang de cordon en analysant les paramètres suivants : détermination des groupes sanguins du f#tus et du père ; recherche d'anticorps anti-D ; dosages de l'hémoglobine et de la bilirubine. Une prophylaxie de la MHNN est actuellement systématiquement réalisée chez toutes les femmes de groupe sanguin Rh négatif ayant mis au monde un enfant Rh positif avec des injections d'immunoglobulines humaines anti-D. Les premiers essais réels d'immunoprophylaxie ont débuté en 1964. Pour que la prévention soit efficace, il faut que les immunoglobulines soient injectées avant l'immunisation c'est-à-dire dans les 72 heures qui suivent l'accouchement et que les doses d'anticorps soient suffisantes (10 g d'anticorps anti-D pour 0,5 ml d'hématies Rh+). Plusieurs anticorps monoclonaux anti-D ont fait l'objet d'une évaluation thérapeutique : BROSSARD/FNTS 1990 (non publié) ; THOMSON/IBGRL 1990 ; KUMPEL/IBGRL 1994 ; BELKINA/Institut d'hématologie Moscou 1996 ; 1997 (non publié). L'efficacité clinique des anticorps à induire la clairance de globules rouges Rh (D) positif a été évaluée chez des volontaires Rh (D) Un seul anticorps de type IgGl a montré une efficacité équivalente à celle des immunoglobulines polyclonales anti-D mais seulement sur quelques patients (KUMPEL et al, 1995). L'invention propose de fournir des anticorps monoclonaux répondant aux problèmes susmentionnés, c'est-à-dire des anticorps sélectionnés par un test du type ADCC et/ou des anticorps possédant une structure glycannique nécessaire à l'obtention d'une bonne efficacité. Description Ainsi, la présente invention se rapporte à un procédé de préparation d'un anticorps monoclonal capable d'activer les cellules effectrices exprimant le FcyRIII caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) purification d'anticorps monoclonaux obtenus à partir de différents clones provenant de lignées cellulaires sélectionnées parmi les hybridomes, notamment les hétérohybridomes, et les lignées cellulaires animales ou humaines transfectées à l'aide d'un vecteur comportant le gène codant pour ledit anticorps ; b) addition de chaque anticorps obtenu à l'étape a) dans un mélange réactionnel distinct comprenant : - les cellules cibles desdits anticorps, - des cellules effectrices comprenant des cellules exprimant le FcyRIII, - des IgG polyvalentes, c) détermination du pourcentage de lyse des cellules cibles et sélection des anticorps monoclonaux qui activent les cellules effectrices provoquant une lyse significative des cellules cibles (activité ADCC de type FcyRIII). Les clones peuvent provenir de lignées cellulaires hétérohybrides obtenues par fusion de lymphocytes B humains (provenant de sujets immunisés) avec des cellules de myélome murin, humain ou hétérohybride, notamment le myélome K6H6-B5 (ATCC n CRL 1823) ; ou encore de lignées cellulaires animales ou humaines transfectées à l'aide d'un vecteur contenant le gène codant pour une immunoglobuline humaine de type IgG, lesdites lignées pouvant être sélectionnées notamment parmi les lignées CHO-K, CHO-LeclO, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7,293-HEK, YB2/0, BHK, K6H6 et NSO. Les IgG polyvalentes sont utilisées pour inhiber le mécanisme de lyse des cellules effectrices via le FcyRIII. Dans ce procédé, on sélectionne les anticorps présentant un taux ADCC de type FcyRIII supérieur à 60 %, 70%, 80 % ou de préférence supérieur à 90 %. Les cellules cibles peuvent être des hématies traitées à la papaïne. Dans ce cas, on dépose par puits : - lOOul d'anticorps monoclonaux purifiés à environ 200 ng/ml, - 25 l d'hématies papaïnées, soit environ 1x106 cellules, - 25 ul de cellules effectrices, soit environ 2x106 cellules, - et 50 l d'IgG polyvalentes, notamment de TEGELINETM (LFB, France), à une concentration comprise entre 1 et 20 mg/ml. On peut ainsi comparer la quantité de lyse des cellules cibles à deux témoins positifs consistant en un composé chimique tel que du NH4CI et un anticorps de référence actif in vivo et à un témoin négatif consistant en un anticorps inactif in vivo. On peut également utiliser les anticorps polyclonaux d'origine commerciale comme témoins positifs et un anticorps monoclonal inapte à induire une clairance in vivo comme témoin négatif. Avantageusement, ce procédé permet de préparer des anticorps monoclonaux antiRh (D), comme indiqué précédemment. On utilise alors comme cellules cibles des hématies rhésus D. L'invention repose donc sur la mise au point d'un test d'activité biologique in vitro dans lequel les activités mesurées sont en corrélation avec l'activité biologique in vivo des anticorps monoclonaux ou polyclonaux déjà évalués du point de vue clinique quant à leur potentialité à induire la clairance d'hématies Rh (D) positives chez des sujets volontaires Rh (D) négatifs. Ce test permet d'évaluer l'activité lytique dépendante de l'anticorps = ADCC (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity) induite essentiellement par les récepteurs Fcy de type III (CD 16), les récepteurs Fcy de type I (CD64) étant saturés par l'addition d'immunoglobulines humaines de type IgG (sous la forme d'IgG polyvalentes thérapeutiques). La spécificité FcyRIII de ce test ADCC a été confirmée par inhibition en présence d'anticorps monoclonal anti-FcyRIII. Des cellules mononucléées de sujets sains sont utilisées comme cellules effectrices dans un ratio effecteur/cible (E/C) proche des conditions physiologiques in vivo. Dans ces conditions les activités lytiques des immunoglobulines polyclonales et des anticorps monoclonaux anti-D inefficaces in vivo (anticorps DF5 Goossens et al, 1987 et les anticorps AD1+AD3, FR 9207893 LFB/Biotest et FOG-1, GB 2189506) sont respectivement fortes et faibles. La sélection des anticorps décrits dans la présente invention a donc été réalisée par évaluation de leur activité biologique dans ce test de type ADCC (voir exemple 1). Dans un autre aspect, l'invention concerne les anticorps susceptibles d'être obtenus à partir du procédé décrit ci-dessus, lesdits anticorps présentant des taux ADCC de type FcyRIII supérieurs à 60 %, 70%, 80 % ou de préférence supérieur à 90 % par rapport au polyclonal de référence. Les anticorps monoclonaux de l'invention, dirigés contre un antigène donné, activent les cellules effectrices exprimant le FcyRIII provoquant une lyse supérieure à 60 %, 70 %, 80 %, de préférence supérieure à 90 % de la lyse provoquée par des anticorps polyclonaux dirigés contre ledit antigène. Avantageusement, lesdits anticorps monoclonaux sont dirigés contre le rhésus D. Il peuvent de préférence être produit par des clones dérivés des lignées Vero (ATCC n CCL 81) ou YB2/0 (ATCC n CRL 1662) et peuvent appartenir à la classe IgG 1 ou IgG3 . L'invention concerne également des anticorps ayant une structure glycannique particulière conférant une activité effectrice dépendante du FcyRIII. De tels anticorps peuvent être obtenus à partir d'un procédé explicité ci-dessus et possèdent sur leur site de glycosylation (Asn 297) du Fcy des structures glycanniques de type biantennées, avec des chaînes courtes et une faible sialylation. De préférence, leur structure glycannique présente des mannoses et GIcNAc terminaux. Ainsi, l'invention vise un anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il possède sur son site de glycosylation (Asn 297) du Fcy des structures glycanniques de type biantennées, avec des chaînes courtes, une faible sialylation, des mannoses et GlcNAc du point d'attache terminaux. Lesdits anticorps, dirigés contre un antigène donné, activent les cellules effectrices exprimant le FcyRIII provoquant une lyse supérieure à 60 %, 70 %, 80 %, de préférence supérieure à 90 % de la lyse provoquée par des anticorps polyclonaux dirigés contre ledit antigène. Dans un autre aspect, l'invention a trait à une cellule produisant un anticorps mentionné ci-dessus. Il peut s'agir d'un hybridome, notamment d'un hétérohybridome obtenu avec le partenaire de fusion K6H6-B5 (ATCC n CRL 1823) ; ou d'une cellule animale ou humaine transfectée à l'aide d'un vecteur comportant le gène codant pour ledit anticorps, notamment une cellule dérivée des lignées Vero (ATCC n CCL 81) ou YB2/0 (ATCC n CRL 1662). Ces cellules correspondent aux lignées cellulaires sélectionnés par le procédé selon l'invention, lesdites cellules produisant des anticorps possédant les caractéristiques évoquées précédemment. Un anticorps préféré selon l'invention montre une activité biologique importante (supérieure ou égale à celle de l'anticorps polyclonal anti-Rh (D) référence) dans le test ADCC utilisant des cellules effectrices FcyRIII positives. Son aptitude à l'activation des récepteurs FcyRIII (après fixation) est confirmée sur des modèles in vitro qui mettent en évidence la modification du flux calcique intracellulaire, la phosphorylation de molécules de transduction du signal d'activation ou la libération de médiateurs chimiques. Ces propriétés sont associées à une stucture particulière des oligosaccharides du site de N-glycosylation de la partie Fc de l'anticorps : présence de chaînes courtes, faiblement galactosylées, peu sialylées, et possédant des mannoses et GIcNAc terminaux par exemple. Cet anticorps présente des applications thérapeutiques : prévention de la MHNN, traitement du PTI chez les individus Rh (D) et toute autre application concernée par l'utilisation d'immunoglobulines polyclonales anti-D. Un anticorps préféré selon l'invention peut également avoir une spécificité autre que anti-Rh (D) (anti-cellule cancéreuse par exemple). Il peut posséder les propriétés décrites précédemment (activité fonctionnelle dépendante d'un mécanisme de fixation/activation au niveau des récepteurs FcyRIII, structure particulière des oligosaccharides) et être utilisé dans l'immunothérapie de cancers ou de toute autre pathologie pour laquelle peut être effectué un traitement curatif ou préventif à l'aide d'un anticorps monoclonal dont le mécanisme d'action correspond à une activité fonctionnelle par l'intermédiaire du récepteur FcyRIII. Un autre aspect porte sur une composition pharmaceutique comprenant un anticorps selon l'invention et sur l'utilisation dudit anticorps pour la fabrication d'un médicament. De préférence, l'invention concerne l'utilisation d'un anticorps anti-Rh (D) ci- dessus pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention de l'alloimmunisation Rhésus d'individus Rh négatif. Le mode d'action des immunoglobulines anti-D in vivo est une fixation spécifique des anticorps sur l'antigène D des globules rouges Rh (D) suivie d'une élimination de ces globules rouges de la circulation essentiellement au niveau de la rate. Cette clairance est associée à un mécanisme dynamique de suppression de la réponse immune primaire chez les individus et prévient donc l'immunisation. Ainsi, on peut utiliser un anticorps de l'invention de manière prophylactique pour la prévention de l'alloimmunisation de femme Rhésus négatif, immédiatement après la naissance d'un enfant Rhésus positif, et pour prévenir, lors des grossesses ultérieures, la maladie hémolytique du nouveau-né (MHNN) ; lors d'avortements, de grossesses extra-utérines en situation d'incompatibilité Rhésus D ou encore lors d'hémorragies transplacentaires résultant d'amniocentèse, de biopsies chorioniques, ou de manipulations obstétriques traumatisantes en situation d'incompatibilité Rhésus D. En outre, on peut utiliser un anticorps de l'invention dans le cas de transfusions Rh incompatibles avec du sang ou des dérivés sanguins labiles. L'invention porte également sur l'utilisation d'un anticorps de l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné à une utilisation thérapeutique dans le Purpura Thrombocytopénique Idiopathique (PTI). Les anticorps de l'invention sont également utiles pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de cancers par immunothérapie ou pour le traitement d'infections causées par des agents pathogènes viraux ou bactériens. Un aspect complémentaire de l'invention porte sur l'utilisation desdits anticorps pour le diagnostic, notamment pour le diagnostic. L'invention vise donc un kit comprenant un anticorps décrit ci-dessus. Pour la suite de la description, on se référera aux légendes des figures présentées ciaprès. Légendes Figure 1 : ADCC de F60 et T125 YB2/0 (R270) Cette figure représente le pourcentage de lyse obtenue en fonction de la concentration en anticorps en présence de 100 et 500 g/puits de TEGELINE TM (LFB, France). On obtient un pourcentage de lyse élevé pour les anticorps selon l'invention F60 et T125. Figure 2 : des anti-D au récepteur (FcyRIII) On obtient un fort indice de fixation pour les anticorps selon l'invention F60 et T125. Figure 3 : construction du vecteur d'expression T125-H26 pour l'expression de la chaîne H de T125. Figure 4 : du vecteur d'expression T125-K47 pour l'expression de la chaîne L de T125 Figure 5 : construction du vecteur d'expression T125-IG24 pour l'expression de l'anticorps entier T125. EXEMPLE 1 : D'UNE LIGNEE CELLULAIRE HETEROHYBRIDE PRODUCTRICE D'UN ANTICORPS ANTI- RH (D) 1- Obtention de clones lymphoblastoïdes et d'hétérohybrides : 1.1- Source de lymphocytes : Le donneur de lymphocytes B est sélectionné parmi les donneurs d'anti-Rh (D) plasmaphérèse, sur l'activité de ses anticorps anti-Rh (D) dans le test d'activité ADCC décrit au 33. Après un don de sang total en 1998, la fraction buffy coat (concentré de leucocytes) est récupérée. 1.2-Immortalisation des lymphocytes B du donneur Les cellules mononucléées du sang périphérique sont séparées des autres éléments par centrifugation sur Ficoll Plus (Pharmacia). Elles sont ensuite diluées à 106 cellules/ml en IMDM contenant 20% (v/v) de sérum de veau foetal (SVF), auquel sont ajoutés 20% de surnageant de culture de la lignée B95-8 (ATCC-CRL1612), 0,1 g/ml de cyclosporine A (Sandoz), 50 ig/ml de sulfate de gentamycine (Life Technologies), et réparties en plaques de 24 puits (P24 Greiner) ou en plaques de 96 puits à fond rond. Elle sont ensuite placées en incubateur à 37 C, 7% C02. Après 3 semaines, la présence d'anticorps anti-Rh (D) recherchée par ADCC # Chacun des 16 micropuits d'un puits de plaque P24 positif est transféré dans un nouveau puits de P24. Cet enrichissement est répété après 10 à 15 jours de culture et chaque micropuits est amplifié en P96 puis en P24. # Les puits de P96 positifs sont repris et amplifiés en P24 à fond plat (Nunc). Après quelques jours de culture, la présence d'anticorps anti-Rh (D) recherchée par ADCC. 1.3- Enrichissement par rosettes immunes (RI) : Les cellules issues d'un ou plusieurs puits de P24 sont enrichies en cellules spécifiques par formation et séparation de rosettes avec des hématies Rh (D) positivespapaïnées : 1 volume d'hématies lavées en NaCI 0,9% est incubé 10 minutes à 37 C avec 1 volume de solution de papaïne (Merck) au 1/1000ème (m/v), puis lavé 3 fois en NaCI 0,9 %. Les cellules sont ensuite lavées une fois en solution de Hanks, mises en suspension en SVF et mélangées aux hématies papaïnées dans le rapport 1 cellule pour 33 hématies. Le mélange est placé dans un tube à centrifuger à fond conique, centrifugé 5 minutes à 80g et incubé une heure dans la glace fondante. Le mélange est ensuite délicatement agité et le Ficoll déposé au fond du tube pour séparation 20 minutes à 900g. Le culot contenant les rosettes est hémolysé en solution de NH4CI pendant 5 minutes et les cellules remises en culture en P24 contenant des cellules mononucléées humaines irradiées. Après environ 1 semaine, les surnageants sont évalués en tests CELA (paragraphe 3. 2) et ADCC pour la présence d'anticorps anti-Rh (D) une bonne activité. Un nouveau cycle d'enrichissement est réalisé si le pourcentage de cellules formant rosettes augmente significativement par rapport au cycle précédent. 1.4-Clonages des cellules lymphoblastoïdes : Les cellules enrichies par RI sont réparties à 5 et 0,5 cellules par puits dans des plaques de 96 puits à fond rond contenant des cellules mononucléées humaines irradiées. Après environ 4 semaines de culture, les surnageants des puits contenant des amas cellulaires sont évalués par test ADCC. 1.5- Hétérofusion : Les puits de clonages des cellules transformées par EBV présentant une activité ADCC intéressante sont amplifiés en culture puis fusionnés avec l'hétéromyelome K6H6-B5 (ATCC CRL-1823) selon la technique standard au PEG. Après fusion, les cellules sont réparties à raison de 2 104 cellules/puits en P96 à fond plat contenant des macrophages intrapéritonéaux murins et dans un milieu sélectif contenant de l'aminoptérine et de la ouabaïne (Sigma). Après 3 à 4 semaines de culture, les surnageants des puits contenant des amas cellulaires sont évalués par test ADCC. 1.6- clonages des hétérohybridomes : Le clonage par dilution limite est effectué à 4,2 et 1 cellules/puits dans des P96 à fond plat. Après 2 semaines, l'aspect microscopique des puits est examiné pour identifier les clones uniques puis le milieu est renouvelé. Au bout de 2 semaines environ, les surnageants des puits contenant des amas cellulaires sont évalués par test ADCC. 2- Historique des clones retenus : 2.1- clone producteur d'une IgG1 La transformation par EBV des cellules du donneur dl3 a permis la sélection d'un puits, désigné T125 2A2 sur lequel ont été réalisés successivement : 2 enrichissements, 3 cycles de RI, et un clonage à 5 cellules/puits pour donner 2 clones : 1) T125 2A2 (5/1)A2 à partir duquel a été extrait l'ADN pour la préparation du vecteur recombinant ; 2) T125 (5/1)A2 qui a été fusionné avec K6H6-B5 pour donner F60 2F6 puis après 5 clonages F60 2F6 (5) 4C4, clone retenu pour la constitution d'un stock cellulaire préalable à la préparation de banques. Il s'agit d'une IgGl possédant une chaîne légère Kappa. Cellules Donneur 1 Transformation EBV T125 2A2 -US Enrichissement en P24 T125 2A2 (2)E6 3 cycles de Rosettes Immunes clonage T1 2A2 (2)E6 RI(3) % clonage 1 clonage / clonage T125 2A2 (5/1)A2 T125 2A2 (511)1C5 JH' 1 fusion ADN pour vecteur recombinant F60 2F6 5 clonages F60 2F6 (5)4C4 2. 2- clone producteur d'une IgG3 Selon le même procédé que celui utilisé pour la préparation de l'anticorps d'isotype IgGl, une lignée productrice d'une IgG3 a été préparée. Les cellules d'origine proviennent d'un don de sang total, d'un autre donneur désigné, dont la fraction buffy coat (concentré de leucocytes) a été récupérée. Il s'agit d'une IgG3 possédant une chaîne légère Kappa. Cellules Donneur -9 Transformation EBV T151 4H1 -9 2 cycles de Rosettes Immunes T151 4H1RI(2) ,& Fusion (x K6H6/B5) F41 1DII 5 clonages F41 1D11 (5)3A3 3- Méthodes d'évaluation des anticorps anti-Rh (D) : Après purification par chromatographie d'affinité sur protéine A Sépharose (Pharmacia) et dialyse en tampon Tris 25mM, NaCl 150mM, pH 7,4 , la concentration de l'anticorps T125 est déterminée par technique ELISA. L'activité biologique in vitro est ensuite mesurée par la technique ADCC. 3.1- Détermination du taux d'IgG et des isotypes par technique ELISA : # IgG totales Coating : anti-IgG (Calbiochem) à 2ug/ml en tampon carbonate 0,05M pH 9.5, 1 nuit à 4 C. Saturation : tampon de dilution (PBS + 1% BSA+ 0,05% Tween 20, pH 7.2) lh à température ambiante. Lavage (à renouveler à chaque étape) : H20 + NaCl 150mM + 0,05% Tween 20. Dilution des échantillons en tampon de dilution à environ 100ng/ml et de la gamme témoin constituée à partir d'IgG humaine polyvalentes LFB prédiluées à 100ng/ml. Incubation 2h à température ambiante. Conjugué : anti-IgG (Diagnostic Pasteur) dilué au 1/5000, 2heures à température ambiante. Substrat : OPD à 0,5mg/ml (sigma) en tampon phosphate citrate, perborate de Na (Sigma), 10 minutes à l'oscurité. Arrêt de la réaction par HCL 1N, et lecture à 492 nm. # Dosage chaine Kappa. Coating : anti-Kappa (Caltag Lab) à 5 g/ml en tampon carbonate 0,05M pH 9.5,1 nuit à 4 C. Saturation : tampon de dilution (PBS + 1% BSA+ 0,05% Tween 20, pH 7.2) lh à température ambiante. Lavage (à renouveler à chaque étape) : H20 + NaCl 150mM + 0,05% Tween 20. Dilution des échantillons en tampon de dilution à environ 100ng/ml et de la gamme témoin constituée à partir de l'anticorps monoclonal AD3T1 LFB (Kappa/gamma 3) prédilué à lOOng/ml. Incubation 2 h à température ambiante Conjugué : anti-kappa biotinylé (Pierce) dilué au 1/1000 en présence de Streptavidineperoxidase (Pierce) dilué au 1/1500, 2 heures à température ambiante. Substrat : OPD à 0,5mg/ml (sigma) en tampon phosphate citrate, perborate de Na (Sigma), 10 minutes à l'obscurité. Arrêt de la réaction par HCL IN, et lecture à 492 nm. 3. 2- Dosage spécifique anti-D par technique CELA (Cellular Enzyme Linked Assay): Cette méthode est utilisée pour le dosage spécifique des anticorps anti-D notamment lorsqu'il s'agit de surnageant de culture à des stades de culture où d'autres immunoglobulines non anti-D sont présentes dans la solution (étapes précoces après transformation EBV). Principe : l'anticorps anti-D est incubé avec des hématies Rhésus positif puis révélé par une anti-Ig humaine marquée à la phosphatase alcaline. 100 l d'hématies Rh+ à 10% diluées en tampon de dilution Liss-BSA 1%. Dilution des échantillons en tampon de dilution à environ 500ng/ml et de la gamme témoin constituée à partir d'une IgG anti-D humaine monoclonale purifiée (DF5, LFB) prédiluée à 500ng/ml. Incubation 45 min à température ambiante. Lavage (à renouveler à chaque étape) : H20 + NaCl 150mM. Conjugué : anti-IgG phosphatase alcaline (Jackson) dilué au 1/4000 en PBS+1% BSA, 1h30 à température ambiante. Substrat : PNPP à lmg/ml (sigma) en diéthanolamine 1M, MgC12 0,5mM ; PH 9,8. Arrêt de la réaction par NaOH IN et lecture à 405 nm. 3. 3- Technique ADCC La technique ADCC (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity) permet d'évaluer la capacité des anticorps (anti-D) à induire la lyse des hématies Rh positif, en présence de cellules effectrices (cellules mononucléées ou lymphocytes). Brièvement, les hématies d'un concentré globulaire Rh positif sont traitées à la papaïne (1 mg/ml, 10 min à 37 C) puis lavées en NaCL 0,9%. Les cellules effectrices sont isolées à partir d'un pool d'au moins 3 buffy-coat, par centrifugation sur Ficoll (Pharmacia), suivi d'une étape d'adhérence en présence de 25% de SVF, de façon à obtenir un ratio lymphocytes/monocytes de l'ordre de 9. Dans une plaque de microtitration (96 puits) on dépose par puits : 100 l d'anticorps anti-D purifié à 200 ng/ml, 25 ul d'hématies papaïnées Rh+ ( soit 1x106), 25 l de cellules effectrices (soit 2x106) et 50 l d'IgG polyvalentes (Tégéline LFB par exemple) aux concentrations usuelles de 10 et 2 mg/ml. Les dilutions sont faites en IMDM 0,25% SVF. Après incubation Inuit à 37 C, les plaques sont centrifugées, puis l'hémoglobine libérée dans le surnageant est mesurée en présence d'un substrat spécifique de l'activité peroxydasique (2,7 diaminofluorène, DAF). Les résultats sont exprimés en pourcentage de lyse, 100% correspondant à la lyse totale des hématies en NH4CI (témoin 100%), et 0% au mélange réactionnel sans anticorps (témoin 0%). La lyse spécifique est calculée en pourcentage selon la formule suivante : (DO échantillon - DO témoin 0% ) x 100 = % ADCC DO témoin 100% - DO témoin 0% Les résultats présentés à la figure 1 montrent l'activité de l'anticorps produit par l'hétérohybride F60 comparée à celles des anticorps de référence : - les anticorps polyclonaux anti-Rh(D) POLY-D LFB 51 et WinRhO W03 (Cangene) = témoins positifs - l'anticorps monoclonal DF5 (inactif in vivo sur la clairance d'hématies Rh(D) positives (BROSSARD/FNTS, 1990, non publié)) = témoin négatif - les IgGl purifiées (séparées des IgG3) à partir du polyclonal WinRhO W03. Deux concentrations d'IgG humaines (Tégéline LFB) sont utilisées pour montrer que l'inhibition d'activité du témoin négatif est liée à la fixation des IgG compétitrices sur les récepteurs Fcy de type I. 3.4- Technique de fixation au FcyRIII(CD16) Ce test permet d'apprécier la fixation des anticorps anti-Rh (D) d'isotypeIgG1 sur le FcyRIII et notamment de différencier des anticorps IgG3. Compte tenu de la faible affinité de ce récepteur pour les IgG monomériques, la fixation préalable des anticorps sur l'antigène D est nécessaire. Principe : sur des membranes d'hématies Rh+ coatées en plaque de microtitration, on ajoute l'anticorps à tester (anti-D) puis des cellules Jurkat transfectées exprimant à leur surface le récepteur FcyRIII. Après centrifugation, l'interaction membrane Rh+/antiD/Jurkat CD16 se visualise par un étalement homogène des Jurkat CD16 dans le puits. Au contraire, les cellules se regroupent au centre du puits en absence d'interaction. L'intensité de la réaction est exprimée en nombres de +. Méthode : 1) Incubation lh à 37 C de l'anticorps anti-D (50 III à lug/ml en IMDM) sur plaque de Capture R (Immunochim), puis lavages en eau + NaCl 0,9%. Ajout de Jurkat CD16 (2.106 cellules/ml) en IMDM + 10 %SVF. Incubation 20 min à 37 C puis centrifugation et évaluation de l'adhérence des cellules (contre une gamme témoin). 2) Révélation de l'anti-D fixé sur les plaques de Capture R par technique de type ELISA à l'aide d'anti IgG humaines-Péroxydase au 1/5000 (Sanofi Diagnostics Pasteur) après avoir lysé les cellules Jurkat CD16 au Tris -HC1 0,2M, Urée 6M, pH 5,3-5,5. Révélation OPD puis lecture de la densité optique (D. O.)à 492 nm. Expression des résultats : on affecte une valeur arbitraire de 0 à 3 en fonction de la fixation et de l'étalement des cellules Jurkat CD16. Ces valeurs sont affectées à chaque intervalle de DO défini (de 0,1 en 0,1). On trace : * soit une courbe : adhérence des cellules Jurkat (Y) en fonction de la quantité d'anti-D fixée sur les membranes d'hématies (X). * soit un histogramme des indices de fixation correspondant pour chaque anticorps, à la somme de chaque valeur de fixation des cellules Jurkat (0 à 3) affectée par intervalle de DO (sur une portion commune à l'ensemble des anticorps testés). Un exemple d'histogramme est présenté à la figure 2. Les anticorps anti-Rh(D) d'isotype IgG1 (F60 et T 125 YB2/0) montrent un indice de fixation proche de celui des IgG1 polyclonales (WinRho), alors que les anticorps témoins négatifs DF5 et AD1ne se fixent pas. De la même façon, l'anticorps d'isotype IgG3 (F41) présente un bon indice de fixation, légèrement inférieur à celui des IgG3 purifiées à partir du polyclonal Winrho et supérieur à celui de l'anticorps AD3 (autre IgG3 testée et inefficace en essai clinique, en mélange avec AD1 (Biotest/LFB, 1997, non publié). EXEMPLE 2 : PRODUCTION D'UN ANTICORPS (Ac) ANTI-D RECOMBINANT : 1- Isolement et amplification des ADNc codant pour les chaînes lourde et légère de l'anticorps 1.1- Extraction des ARN et synthèse d'ADNc Les ARN totaux ont été extraits d'un clone producteur d'Ac anti-D (IgG Gl/Kappa) obtenu par transformation EBV : T125 A2 (5/1) A2 (voir paragraphe 2, exemple 1). Les ADNc correspondants ont été synthétisés par transcription reverse des ARN totaux à l'aide d'amorces oligo dT. 1.2- Amplification de la région variable de la chaîne lourde de T125-A2 : séquence VH/T125-A2 La séquence VH/T125-A2 est obtenue par amplification des ADNc de T125-A2 à l'aide des amorces suivantes : - amorce A2VH5 localisée en 5' de la région leader du gène VH de T125-A2, introduit une séquence leader consensus (en gras) déduite de séquences leader déjà publiées et associées à des gènes VH appartenant à la même famille VH3-30 que le gène VH de T125-A2 ; séquence comporte également un site de restriction Eco RI (en italique) et une séquence de Kozak (soulignée) : A2VH5(SEQIDN 1): 5'- CTCTCCGAATTCGCCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGT -3' - amorce antisens GSP2ANP située en 5' de la région constante (CH) de T125-A2 : GSP2ANP (SEQ ID N 2) : 5'- GGAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG -3'. 1.3-Amplification de la région constante de T125-A2 : séquence CH/T125-A2 La séquence CH/T125-A2 est obtenue par amplification des ADNc de T125-A2 à l'aide des amorces suivantes : - amorce Gl localisée en 5' de la région CH de T125-A2 : Gl (SEQ ID N 3) : 5'- CCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC-3' - amorce antisens H3'Xba située en 3' du CH de T125-A2, introduit un site Xba I (souligné) en 3' de la séquence amplifiée : H3'Xba(SEQIDN 4): 5'- GAGAGGTCTAGACTATTTACCCGGAGACAGGGAGAG -3' 1.4-Amplification de la chaîne légère Kappa : séquence K/T125-A2 La chaîne Kappa entière de T125-A2 (séquence K/T125-A2) est amplifiée à partir des ADNc de T125-A2 en utilisant les amorces suivantes : - amorce A2VK3 située en 5' région leader du gène VK de T125-A2, introduit une séquence consensus (en gras) déduite de la séquence de plusieurs régions leader de gènes VK VH appartenant au même sous-groupe VK1 que le gène VK de T125- A2 ; cette séquence comporte également un site de restriction Eco RI (en italique) et une séquence de Kozak (soulignée) : A2VK3 (SEQ ID N 5) : 5'- CCTACCGAATTCGCCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCA -3' - amorce antisens KSE1 localisée en 3' de Kappa, introduit un site Eco RI (souligné) : KSE1 (SEQ ID N 6) : 5'- GGTGGTGAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT -3'. La figure 3 schématise les stratégies d'amplification des chaînes lourde et légère de T125-A2. 2- Construction des vecteurs d'expression 2.1- Vecteur d'expression chaîne lourde de T125-A2 : T125-H26 La construction de T125-H26 est résumée Figure 3. Elle s'effectue en deux temps : tout d'abord construction du vecteur intermédiaire V51-CH/T125-A2 par insertion de la région constante de T125-A2 dans le vecteur d'expression V51 dérivé de pCI-néo (Fig. 3) puis clonage de la région variable dans V51-CH/T125-A2. 2.1.1clonage de la région constante de T125-A2 La séquence CH/T125-A2 amplifiée est insérée après phosphorylation au niveau du site Eco RI du vecteur V51 (Fig. 3). La ligation s'effectue après traitement préalable à la polymérase Klenow des extrémités cohésives Eco RI de V51afin de les rendre bout franc . L'amorce Gl utilisée pour l'amplification de CH/T125-A2 permet de recréer après son insertion dans V51un site Eco RI en 5' de CH/T125-A2. 2.1.2 clonage de région variable de T125-A2 La séquence VH/T125-A2 obtenue par amplification est digérée par Eco RI et Apa 1 puis insérée au niveau des sites Eco RI et Apa 1 du vecteur V51-G1/T125-A2. 2. 2- Vecteur chaîne légère de T125-A2 : T125-K47 La construction de T125-K47 est présentée Fig.4. La séquence K/T125-A2 obtenue par PCR est digérée par Eco RI et insérée au niveau du site Eco RI du vecteur d'expression V47 dérivé de pCI-néo (Fig. 4). 2.3- Vecteur chaînes lourde et légère de T125-A2 : T125-IG24 La construction de T125-IG24 est schématisée Fig.5. Ce vecteur qui contient les deux unités de transcription des chaînes lourdes et kappa de T125-A2 est obtenu par insertion du fragment Xho 1 - SalI de T125-K47 contenant la séquence K/T125-A2 au niveau des sites Xho 1 et Sal 1 de T125-H26. 2.4- Vecteur leader spécifique chaînes lourde et légère de T125-A2 : T125-LS4 Un second vecteur d'expression de T125-A2 est également construit dans lequel la séquence leader consensus de la chaîne Kappa est remplacée par la séquence réelle de la région leader de T125-A2 préalablement déterminée par séquençage de produits de PCR 5'-RACE (Rapid Amplification of ADNc 5' Ends). La construction de ce vecteur T125-LS4 s'effectue en deux étapes : tout d'abord la construction d'un nouveau vecteur d'expression de la chaîne Kappa de T125-A2, T125-KLS18, puis l'assemblage du vecteur d'expression final, T125-LS4, contenant les deux unités de transcription chaîne légère modifiée et chaîne lourde. 2.4.1 construction du vecteur T125-KLS18 La partie 5' de la séquence leader consensus Kappa du vecteur T125-K47 est remplacée par la séquence leader spécifique de T125 (KLS/T125-A2) au cours d'une étape d'amplification de la séquence K/T125-A2 réalisée à l'aide des amorces suivantes : - amorce A2VK9 , modifie la partie 5' de la région leader (en gras) et introduit un site Eco RI (souligné) ainsi qu'une séquence de Kozak (en italique) : A2VK9 (SEQ ID N 7) : 5'- CCTACCGAATTCGCCGCCACCATGAGGGTCCCCGCTCAGCTC - 3' - amorce KSEI (décrite ci-dessus) Le vecteur T125-KLS18 est ensuite obtenu en remplaçant le fragment Eco RI de T125K47 contenant la séquence K/T125-A2 d'origine par la nouvelle séquence KLS/T125A2 digérée par Eco RI. 2.4.2 construction du vecteur final T125-LS4 Le fragment Xho 1 - Sal 1 de T125-KLS18 contenant la séquence modifiée KLS/T125A2 est inséré dans T125-H26 au niveau des sites Xho 1 et Sal I. 3- Production d'Ac anti-D dans la lignée YB2/0 3.1- Sans amplification génique Les deux vecteurs d'expression T125-IG24 et T125-LS4 ont été utilisés pour la transfection de cellules de la lignée YB2/0 (myélome de rat, lignée ATCC n 1662). Après transfection par électroporation et sélection des transformants en présence de G418 (sélection néo) plusieurs clones ont été isolés. La production en Ac anti-D recombinants est d'environ 5 g/106 cellules/24h (valeur obtenue pour le clone 5A11 de R290: transfection avec T125-LS4). L'activité ADCC de cet Ac recombinant est supérieure ou égale à celle des témoins poly-D (figure 1). Les Ac produits à l'aide des deux vecteurs d'expression ne sont pas significativement différents en terme de niveau de production ou d'activité ADCC. 3.2- Avec amplification génique Le système d'amplification génique mis en #uvre repose sur la sélection de transformants résistant au méthotrexate (MTX). Il nécessite l'introduction préalable d'une unité de transcription codant pour l'enzyme DHFR (dihydrofolate réductase) dans le vecteur d'expression de l'Ac recombinant (SHITARI et al, 1994) 3.2.1 construction du vecteur d'expression T125-dhfr 13 Le vecteur d'expression de T125-A2 contient le gène dhfr murin. Un premier vecteur (V64) a été construit à partir d'un vecteur dérivé de pCI-néo, V43, en remplaçant, en 5' du promoteur SV40 et en 3' d'une séquence de polyadénylation synthétique, le gène néo (fragment Hind III- Csp 45 I) par le ADNc du gène dhfr murin (obtenu par amplification à partir du plasmide pMT2). Ce vecteur est ensuite modifié de façon à créer un site Cla 1 en 5' de l'unité de transcription dhfr. Le fragment Cla 1 contenant l'unité de transcription dhfr est ensuite inséré au niveau du site Cla I de T125-LS4. 3.2.2 sélection en présence de MTX # 1 ère stratégie : Les cellules YB2/0 transfectées par électroporation avec vecteur T125-dhfrl3 sont sélectionnées en présence de G418. Les transformants producteurs d'Ac recombinant sont ensuite soumis à une sélection en présence de doses croissantes de MTX. L'évolution de la production d'Ac recombinants, témoin du processus d'amplification génique, est suivie au cours des étapes de sélection en MTX. Les transformants résistants au MTX sont ensuite clonés par dilution limite. Le niveau et la stabilité de la production d'Ac recombinants sont évalués pour chaque clone obtenu. # 2ème stratégie : Les cellules YB2/0 transfectées par électroporation avec vecteur T125-dhfrl3 sont sélectionnées en présence de G418. Les meilleurs transformants producteurs d'Ac recombinant sont clonés par dilution limite avant sélection en présence de doses croissantes de MTX. L'évolution de la production de chaque clone, témoin du processus d'amplification génique, est suivie au cours des étapes de sélection en MTX. Le niveau et la stabilité de la production d'Ac recombinants sont évalués pour chaque clone MTX-résistant obtenu. 4- Evaluation de l'activité de l'anticorps T125 exprimé dans YB2/0 Après purification par chromatographie d'affinité sur protéine A Sépharose (Pharmacia) et dialyse en tampon Tris 25mM, NaCl 150mM, pH 7,4 , la concentration de l'anticorps T125 est déterminée par technique ELISA. L'activité biologique in vitro est ensuite mesurée par le test ADCC précédemment décrit. Les résultats sont présentés à la figure 1. EXEMPLE 3 : MISE EN EVIDENCE DE LA RELATION ENTRE STRUCTURE GLYCANNIQUE ET ACTIVITE DEPENDANTE DU FCyRIII : 1- Culture cellulaire en présence de Deoxymannojirimycine (DMM). Plusieurs travaux décrivent l'effet d'inhibiteurs enzymatiques sur la glycosylation des immunoglobulines et sur leur activité biologique. Une augmentation de l'activité ADCC est rapportée par ROTHMAN et al. 1989, augmentation non attribuable à une amélioration de l'affinité de l'anticorps pour sa cible. La modification de glycosylation provoquée par l'addition de DMM consiste en une inhibition de l'a 1,2 mannosidase 1 présente dans le Golgi. Elle conduit à la production d'une proportion plus importante de structures polymannosylées, non fucosylées. Différentes lignées productrices d'anticorps anti-Rh (D) été mises en présence de DMM et l'activité fonctionelle des anticorps monoclonaux produits a été évaluée sous forme de surnageants de culture ou après purification. Les cellules (hétérohybrides ou lymphoblastoïdes) sont ensemencées entre 1 et 3xlO5 cellules/ml, et cultivées en milieu de culture IMDM (Life Technologies) avec 10% de SVF et en présence de 20g/ml de DMM (Sigma , Boehringer). Après 3 renouvellements de milieu, les surnageants de culture sont testés par ELISA IgG humaines puis par ADCC. Tableau 1 : de la culture en présence de DMM sur l'activité ADCC de différents anti-Rh (D) Activité ADCC @ {Lt;:;'0" EndeI'aéde'poly-DIB31. Do 'j,'!'- /l **#* 116 ons .1111... WwipWwJT l' J,>,,\') ?# .J.lî-.yl.....M..M.M.I.-'... M |îCJ\ H;;v?>:>' > " "' "'-'''- '-.'- nëcessà'ië''a Culture sans DMM Culture en présence de g/ml DMM F60 109 113 NT D31 19 87 10 DF5 26 62 20 T125 RI(3) 3 72 20 T125-CHO 0 105 5 NT= non testé # La culture en présence de Deoxymannojirimycine (DMM) apporte une amélioration significative des résultats ADCC pour les anticorps faiblement actifs auparavant produits par : Un hybridome homme-souris D31 Une lignée lymphoblastoïde humaine DF5 Une lignée murine transfectée T125 dans CHO # L'addition de DMM peut permettre de restaurer l'activité ADCC d'un anticorps issu du cloïde T 125 = T125 RI (3) en exemple 1) et qui a perdu cette activité par une culture prolongée. # L'activité forte de l'anticorps produit par l'hétérohybridome F60 (dont l'obtention est décrite en exemple 1) n'est pas modifiée par culture en présence de DMM. 2- Production d'anticorps anti-D recombinants par différentes lignées cellulaires : 2.1- Préparation d'un vecteur d'expression pour l'anticorps DF5 : La séquence nucléotidique de l'anticorps DF5, témoin négatif dans le test ADCC, est utilisée pour étudier la transfection de cet anticorps dans quelques lignées, parallèlement à la transfection de l'anticorps T125. Les séquences codant pour l'Ac DF5 sont isolées et amplifiées selon les mêmes techniques mises en #uvre pour l'Ac recombinant T125-A2. # Les ADNc correspondants sont tout d'abord synthétisés à partir d'ARN totaux extraits du clone producteur d'Ac anti-D (IgG Gl/Lambda) 2MDF5 obtenu par transformation EBV. # L'amplification des chaînes lourde et légère est ensuite réalisée à partir de ces ADNc en utilisant les amorces présentées ci-dessous. # Amplification de la région variable de la chaîne lourde de DF5 (séquence VH/DF5) : - amorce DF5VH1 localisée en 5' de la région leader (en gras) du gène VH de DF5 (séquence publiée : Chouchane L et al.) ; cette amorce comporte également un site de restriction Eco RI (en italique) et une séquence de Kozak (soulignée) : DF5VH1 (SEQ ID N 8) : 5'CTCTCCGAATTCGCCGCCACCATGGACTGGACCTGGAGGATCCTCTTTT TGGTGG-3' - amorce antisens GSP2ANP située en 5' de la région constante (CH) déjà décrite au paragraphe 1.2 (exemple 2) # Amplification de la région constante CH de DF5 (séquence CH/DF5) : amorces Gl et H3'Xba déjà décrites au paragraphe 1.3 (exemple 2). # Amplification de la chaîne légère Lambda de DF5 (séquence LBD/DF5) : - amorce DF5VLBD1 située en 5' région leader du gène VL de DF5, introduit une séquence consensus (en gras) déduite de la séquence de plusieurs régions leader de gènes VL appartenant au même sous-groupe VL1 que le gène VL de 2MDF5 ; séquence comporte également un site de restriction Eco RI (en italique) et une séquence de Kozak (soulignée) : DF5VLBD1(SEQIDN 9): 5 'CCTACCG 7TCGCCGCCACCATGGCCTGGTCTCCTCTCCTCCTCAC -3 ' - amorce antisens LSEI localisée en 3' de Lambda, introduit un site Eco RI (souligné) : LSE1 (SEQ ID N 10): 5'- GAGGAGGAATTCACTATGAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTT -3'. # La construction des vecteurs d'expression chaîne lourde (DF5-H31), chaîne légère ( DF5-L10) et chaînes lourde et légère (DF5-IG1) de l'Ac DF5 est effectuée selon un schéma de construction en tous points identiques aux vecteurs exprimant l'Ac T125-A2. Toutes les séquences Leader d'origine (introduites au niveau des amorces d'amplification) sont conservées dans ces différents vecteurs. 2. 2- Transfection de différentes lignées cellulaires avec les anticorps T125 et DF5 Les deux vecteurs d'expression T125-IG24 et DF5-IgGl sont utilisés pour la transfection de cellules de différentes lignées : Des transfections stables ou transitoires sont réalisées par électroporation. Tableau 2 : cellulaires utilisées pour la transfection d'anticorps anti-Rh(D) Référence ATCC n Type cellulaire CHO-Kl CCL 61 Ovaire de hamster chinois (epithelium like) CHO-LeclO NA Ovaire de hamster chinois (epithelium like) Jurkat TIB-152 Lymphocyte T humain (Leucémie T) Molt-4 CRL 1582 Lymphocyte T humain (Leucémie lymphoblastique aiguë) WIL2-NS CRL 8155 Lymphocyte B humain transformé EBV Vero CCL 81 Rein de singe vert africain (fibroblaste like) COS-7 CRL 1651 Rein de singe vert africain transformé SV40 (fibroblaste like) 293-HEK CRL 1573 Rein embryonnaire humain primaire transformé par ADN adénovirus 5 défectif YB2/0 CRL 1662 Myélome de rat non sécréteur BHK-21 ATCC CCL 10 Rein de hamster nouveau-né (fibroblaste like) K6H6-B5 ATCC CRL hétéromyélome homme-souris non sécréteur 1823 NSO ECACC myélome souris non sécréteur (lymphoblate like) 85110503 Après sélection des transformants en présence de G418 (sélection néo) plusieurs clones ont été isolés. La modification d'activité effectrice d'un anticorps monoclonal humanisé en fonction de la cellule d'expression a été décrite par CROWE et al (1992), avec les lignées cellulaires CHO, NSO, YB2/0. Les résultats obtenus ici confirment l'importance de la lignée cellulaire d'expression vis à vis des caractéristiques fonctionnelles de l'anticorps à produire. Parmi les cellules testées, seules les lignées Vero et YB2/0 permettent d'exprimer des anticorps monoclonaux anti-Rh (D) avec une activité lytique forte dans le test ADCC (voir exemple 1 et tableau 3). Tableau 3 :Activité ADCC des anticorps DF5 et T125 obtenus par transfection dans différentes lignées cellulaires. Les résultats sont exprimés en pourcentage de l'activité de l'anticorps polyclonal de référence : Poly-D LFB 51 Lignées cellulaires transfectées CHO-K1 CHO-LeclO Wil-2 Jurkat Vero Molt-4 COS-7 293-HEK YB2/0 T125 7 22 3 6 90 0 13 16 114 +/-8 +/-6 +/-5 +/-8 +/-21 n=1 +/-2 +/-13 +/-28 n=13 n=11 n=12 n=7 n=5 n=4 n=12 n=54 0 ant DF5 NT 51 NT NT 72 NT 21 12 94 +/-19 +/-17 +/-4 +/-14 +/-15 n=3 n=5 n=4 n=12 n=15 3- Etude structurale de glycosylation des anticorps : Une étude de la structure des oligosaccharides présents sur les anticorps monoclonaux anti-Rh (D) obtenus en exemples 1 et 2 a été entreprise : 1. Comparaison de la composition en monosaccharides des différentes préparations Méthanolyse + chromatographie phase gaz. 2. Etude de reconnaissance par des lectines. 3. Cartographie des glycannes : + dérivation par fluorophore + électrophorèse FACE. 4. Caractérisation structurale : Elution des glycannes à partir des gels + spectrométrie de masse sur Maldi-MS. Les caractéristiques communes aux anticorps F60 (anti-Rh(D) selon l'exemple 1) et T125 YB2/0 (anti-Rh(D) selon l'exemple 2) concernant le site de glycosylation de la chaîne lourde (Asn 297) sont les suivantes : # Structures glycanniques de type biantennées, avec des chaînes courtes, # Sialylation faible, # Galactosylation faible, # Présence de mannoses et GIcNAc terminaux, Par ailleurs , les anticorps DF5 (témoin négatif ADCC) et D31(autre anticorps négatif en ADCC produit par un hétérohybridome) présentent des structures différentes : type biantenné galactosylé, avec acides sialiques. 4- Etude d'activation des récepteurs Fcy: L'étude sur FcyR a pour objectif d'analyser : * La capacité des anticorps à inhiber les interactions entre des GR-IgG ou des billes fluorescentes-IgG et des cellules exprimant les FcyRII ou RIII. * La capacité des complexes Ac-GR à induire des modifications : flux calcique, phosphorylation au niveau de cellules FcyRII+ ou FcyRIII+. * La capacité des complexes Ac-GR à être phagocytés par des macrophages ou cellules dendritiques. * La capacité des Ac à établir un pontage entre GR et cellules B et à induire des modifications (flux calcique, libération IL2). 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Procédé de préparation d'un anticorps monoclonal capable d'activer les cellules effectrices exprimant le FcyRIII caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) purification d'anticorps monoclonaux obtenus à partir de différents clones provenant de lignées cellulaires sélectionnées parmi les hybridomes, notamment les hétérohybridomes et les lignées cellulaires animales ou humaines transfectées à l'aide d'un vecteur comportant le gène codant pour ledit anticorps ; b) addition de chaque anticorps obtenu à l'étape a) dans un mélange réactionnel distinct comprenant : - les cellules cibles desdits anticorps, - des cellules effectrices comprenant des cellules exprimant le FcyRIII, - des IgG polyvalentes, c) détermination du pourcentage de lyse des cellules cibles et sélection des anticorps monoclonaux qui activent les cellules effectrices provoquant une lyse significative des cellules cibles (activité ADCC de type FcyRIII). 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les clones proviennent de lignées cellulaires hétérohybrides obtenues par fusion de lymphocytes B humains provenant de sujets immunisés avec des cellules de myélome murin, humain ou hétérohybride, notamment le myélome K6H6-B5 (ATCC n CRL 1823). 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les clones proviennent de lignées cellulaires animales ou humaines transfectées à l'aide d'un vecteur contenant le gène codant pour une immunoglobuline humaine de type IgG, lesdites lignées pouvant être sélectionnées notamment parmi les lignées CHO-K, CHO-LeclO, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK,YB2/0, BHK, K6H6 et NSO. 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les IgG polyvalentes inhibent le mécanisme de lyse des cellules effectrices via le récepteur FcyRIII. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'on sélectionne les anticorps présentant un taux ADCC de type FcyRIII supérieur à 60 %, 70%, 80 % ou de préférence supérieur à 90 %. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les cellules cibles sont des hématies traitées à la papaïne. 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'on dépose par puits : - 100 l d'anticorps monoclonaux purifiés à des concentrations de 20 à 200 ng/ml, - 25 l d'hématies papaïnées, soit environ 1x106 cellules, - 25 l de cellules effectrices, soit environ 2x106 cellules - et 50 l d'IgG polyvalentes, notamment de TEGELINETM , à une concentration comprise entre 1 et 20 mg/ml. 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'on compare la quantité de lyse des cellules cibles à deux témoins positifs consistant en un composé chimique tel que du NH4Cl et un anticorps de référence actif in vivo et à un témoin négatif consistant en un anticorps inactif in vivo. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les anticorps monoclonaux sont des anti-Rh (D) les cellules cibles sont des hématies rhésus D. 10. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'on utilise les anticorps polyclonaux d'origine commerciale comme témoins positifs et un anticorps monoclonal inapte à induire une clairance in vivo comme témoin négatif. 11. Anticorps susceptibles d'être obtenus à partir d'un procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'ils présentent des taux ADCC de type FcyRIII supérieurs à 60 %, 70%, 80 % ou de préférence supérieur à 90 % par rapport au polyclonal de référence. 12. Anticorps monoclonal dirigé contre un antigène donné caractérisé en ce qu'il active les cellules effectrices exprimant le FcyRIII provoquant une lyse supérieure à 60 %, 70 %, 80 %, de préférence supérieure à 90 % de la lyse provoquée par des anticorps polyclonaux dirigés contre ledit antigène. 13. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 11 et 12 caractérisé en ce qu'il est dirigé contre l'antigène rhésus D. 14. Anticorps monoclonal selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il est produit par des clones dérivés des lignées Vero (ATCC n CCL 81) ou YB2/0 (ATCC n CRL 1662). 15. Anticorps selon l'une des revendications 12 à 14 caractérisé en qu'il s'agit d'une IgG1 ou une IgG3. 16. Anticorps susceptibles d'être obtenus à partir d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisés en ce qu'ils possèdent sur leur site de glycosylation (Asn 297) du Fcy des structures glycanniques de type biantennées, avec des chaînes courtes, et une faible sialylation. 17. Anticorps selon la revendication 16 caractérisé en ce que leur structure glycannique présente des mannoses et N-Acétylglucosamines terminaux. 18. Anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il possède sur son site de glycosylation (Asn 297) du Fcy des structures glycanniques de type biantennées, avec des chaînes courtes, une faible sialylation, des mannoses et GlcNAc terminaux. 19. Anticorps monoclonal selon la revendication 18 dirigé contre un antigène donné caractérisé en ce qu'il active les cellules effectrices FcyRIII+ provoquant une lyse supérieure à 60 %, 70 %, 80 %, de préférence supérieure à 90 % de la lyse provoquée par des anticorps polyclonaux dirigés contre ledit antigène. 20. Cellules produisant un anticorps selon l'une des revendications 11 à 19. 21. Cellules selon la revendication 20 caractérisées en ce qu'il s'agit d'un hybridome, notamment d'un hétérohybridome obtenu par fusion avec myélome K6H6-B5 (ATCC n CRL 1823) ou d'une cellule animale ou humaine transfectée à l'aide d'un vecteur comportant le gène codant pour ledit anticorps, notamment une cellule dérivée des lignées Vero (ATCC n CCL 81) ou YB2/0 (ATCC n CRL 1662). 22. Composition pharmaceutique comprenant un anticorps selon l'une des revendications 11 à 19. 23. Utilisation d'un anticorps selon l'une des revendications 11à 19 pour la fabrication d'un médicament. 24. Utilisation d'un anticorps anti-Rh (D) l'une des revendications 11 à 19 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention de l'allo-immunisation Rhésus d'individus Rh négatifs. 25. Utilisation selon la revendication 24 de manière prophylactique pour la protection de femme Rhésus négatif, immédiatement après la naissance d'un enfant Rhésus positif, pour prévenir, lors des grossesses ultérieures, la maladie hémolytique du nouveau-né (MHNN). 26. Utilisation selon la revendication 23 lors d'avortements, de grossesses extra utérines en situation d'incompatibilité Rhésus D. 27. Utilisation selon la revendication 23 lors d'hémorragies transplacentaires résultant d'amniocentèses, de biopsies chorioniques, ou de manipulations obstétriques traumatisantes en situation d'incompatibilité Rhésus D. 28. Utilisation selon la revendication 23 dans le cas de transfusions Rh incompatibles avec du sang ou des dérivés sanguins labiles. 29. Utilisation selon la revendication 23 pour la fabrication d'un médicament destiné à une utilisation thérapeutique dans le Purpura Thrombocytopénique Idiopathique (PTI). 30. Utilisation selon la revendication 23 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de cancers par immunothérapie. 31. Utilisation selon la revendication 23 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'infections causées par des agents pathogènes viraux ou bactériens. 32. Kit de diagnostic comprenant un anticorps selon l'une des revendications 11 à 19.