Brevet FR2805825A1 — publié le 20010907

L'invention est relative à une nouvelle méthode de transformation génétique des plantes. Les techniques de transformation génétique des végétaux sont aujourd'hui largement employées, et trouvent des applications dans de nombreux domaines, par exemple pour améliorer les qualités agronomiques des plantes, ou pour leur faire produire des molécules d'intérêt. Classiquement, la transformation génétique des plantes comprend le transfert d'ADN de façon stable dans une cellule végétale, et la régénération à partir de cette cellule d'une plante entière dont toutes les cellules portent le transgène, par organogenèse ou embryogenèse. Le succès de la transformation est toutefois largement dépendant de l'espèce concernée. Une des techniques les plus employées pour transférer de l'ADN dans une plante, utilise comme vecteurs les plasmides Ti hébergés par certaines agrobactéries (notamment Agrobacterium tumefaciens et Agrobacterium rhizogenes), qui sont capables d'insérer une séquence exogène dans le génome des cellules-hôtes infectées par ces bactéries. Cependant cette approche est limitée par le spectre d'hôte relativement restreint des souches connues d'Agrobacterium, qui se limite aux dicotylédones, et à quelques espèces de monocotylédones et de gymnospermes. Le développement des techniques de transfert direct d'ADN dans les cellules végétales (électroporation, biolistique, micro injection, etc. ) permet d'éviter les problèmes de limitation de spectre d'hôte, mais le taux de transformation stable obtenu par ces méthodes reste très faible. Des travaux effectués depuis quelques années ont montré que de nombreuses monocotylédones sont des hôtes potentiels de certaines agrobactéries ; sensibilité est principalement observée lors de l'infection de tissus méristématiques [SMITH et HOOD, Crop. Sci., 35,301-309, (1995)]. Ces résultats permettent de supposer que la plupart des espèces végétales sont susceptibles d'être transformées par l'intermédiaire d'Agrobacterium. Toutefois, même si l'on parvient à effectuer le transfert de gènes dans les cellules de maïs, un obstacle majeur persiste dans certaines espèces, dites réfractaires : la régénération de plantes à partir des cellules transformées. Pour remédier à ce problème, il a été proposé d'intégrer la transformation dans le développement normal de la plante. La première mise en application de cette idée a consisté à mettre des agrobactéries en contact avec des graines et à faire germer celles-ci [FELDMAN et MARKS, Mol. Gen. Genet., 208,1-9, (1987) ]. Toutefois, les plantules ainsi obtenues étaient soit non-transformées, soit des chimères. Il a également été proposé de transformer in vitro du pollen, des zygotes, ou des embryons isolés à un stade précoce de leur développement ; toutefois, la transformation du pollen nécessite au préalable sa culture et sa germination in vitro [cf. par exemple BURKE et al., Demande PCT WO 99/03326], et la transformation des zygotes ou des embryons, qui s'effectue par micro-injection, est suivie d'une étape de régénération in vitro de la plante entière [cf. par exemple CASS et al., Demande PCT WO 98/01575]. BECHTOLD et al. [C. R. Acad. Sci. Paris, 316, 1194-1199, (1993) ] décrivent une méthode de transformation in planta par immersion des plantes dans une culture d'Agrobactérium et infiltration sous vide (104 Pa) ; transformants sont observés dans la descendance des plantes ainsi traitées. Cette méthode n'a toutefois été mise en #uvre que dans le cas d'Arabidopsis thaliana. Les Inventeurs ont maintenant découvert que, de manière surprenante, il était possible de transformer efficacement des plantes, et notamment des plantes considérées comme réfractaires à la transformation, par simple mise en contact de leurs organes reproducteurs femelles et/ou de leurs organes reproducteurs males avec une culture d'Agrobacterium, sans qu'il soit nécessaire de procéder à l'un des traitements par micro-injection ou par infiltration de l'art antérieur. La présente invention a pour objet un procédé de transfert d'un gène d'intérêt dans les organes reproducteurs d'une plante, comprenant la mise en contact des fleurs de ladite plante avec une suspension de cellules d'Agrobacterium qui contiennent le gène d'intérêt que l'on souhaite transférer, lequel procédé est caractérisé en ce que ladite mise en contact est effectuée à pression atmosphérique, et en ce que ladite suspension d'Agrobacterium comprend au moins un agent mouillant. On rappellera que la pression atmosphérique est de l'ordre de 105 Pa, cette valeur pouvant bien entendu varier dans les limites habituelles résultant des conditions météorologiques. L'introduction chez Agrobacterium d'un ou plusieurs gène(s) d'intérêt, éventuellement associé(s) à un ou plusieurs gène(s) marqueur ainsi que la culture de et la sélection de bactéries transformées sont effectuées par les techniques classiques, connues en elles-mêmes de l'homme de l'art [cf. par exemple GRUBER et al., "Vectors for Plant Transformation" In: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, GLICK and THOMPSON, Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pages 89-119, (1993)]. Pour la mise en #uvre du procédé conforme à l'invention, la suspension d'Agrobacterium est utilisée, de préférence, à une concentration bactérienne correspondant à une D06oo de l'ordre de 0,5 à 0,8. Pour la préparation de cette suspension, on effectue, de manière connue en elle-même, une culture d'Agrobacterium, par exemple en ensemençant un milieu de culture classique avec un inoculat issu d'une culture d'Agrobacterium contenant le gène d'intérêt souhaité, et en cultivant à une température de l'ordre de 25 à 30 C, de préférence 28 C pendant 20 à 28 h, généralement 24 h. Les bactéries sont, de préférence, récoltées lorsque la D06oo atteint une valeur comprise entre 0,5 et 0,8. Avantageusement, la suspension d'Agrobacterium utilisée pour la mise en #uvre du procédé conforme à l'invention comprend en outre au moins un sucre assimilable par Agrobacterium et/ou au moins un composé capable de stimuler les gènes de virulence chez Agrobacterium. Cette suspension peut être obtenue par mise en suspension du culot bactérien obtenu à partir d'une culture d'Agrobacterium préparée comme décrit ci-dessus, dans un milieu aqueux approprié, de préférence un milieu convenant à la culture d'Agrobacterium, et contenant au moins un agent mouillant et éventuellement au moins un sucre assimilable par Agrobacterium et/ou un composé capable de stimuler les gènes de virulence chez Agrobacterium. De manière avantageuse, la suspension d'Agrobacterium peut également être obtenue en effectuant la culture d'Agrobacterium contenant le gène d'intérêt dans un milieu contenant au moins un agent mouillant et éventuellement un sucre assimilable par Agrobacterium et/ou un composé capable de stimuler les gènes de virulence chez Agrobacterium, et en appliquant directement la culture ainsi obtenue sur les fleurs à traiter. Par agent mouillant on désigne toute substance capable d'augmenter les propriétés d'étalement d'un liquide sur une surface avec laquelle il est mis en contact, et son adhérence à ladite surface. Des agents mouillants utilisables pour la mise en #uvre de la présente invention sont de préférence des tensio-actifs non-ioniques, ou bien des tensio-actifs dérivés de silicones, ou leurs mélanges. A titre d'exemples non limitatifs on citera notamment le monolaurate de polyoxyéthylène sorbitane, commercialisé notamment sous la dénomination TWEEN 20, le SILWET L-77, etc. Des sucres assimilables utilisables pour la mise en #uvre de la présente invention sont par exemple le fructose, le glucose, ou avantageusement, le saccharose. Des composés capables de stimuler les gènes de virulence utilisables pour la mise en #uvre de la présente invention sont notamment des composés phénoliques habituellement produits par les plantes après une blessure, tels que l'acétosyringone. De préférence, la concentration en agent mouillant dans la suspension d'Agrobacterium est de l'ordre de 5 x 10-6 à 5 x 10-4 M, de manière préférée de l' ordre de 10-5 à 10-4 M, et avantageusement de 3 x 10-5 à 7 x 10-5 M ; par exemple, dans le cas du TWEEN@ 20, on peut utiliser une concentration de 10 à 100 mg/1, avantageusement de 40 à 60 mg/1. La concentration en sucre assimilable est de préférence de 0,05 à 0,5 M, avantageusement de 0,1 à 0,2 M ; par exemple, dans le cas du saccharose, on peut utiliser une concentration de 20 à 80 g/1, avantageusement de 40 à 60 g/1 ; la concentration en composé capable de stimuler les gènes de virulence, tel que l'acétosyringone, est de préférence comprise entre 10 et 100 M, avantageusement entre 40 et 60 uM. Selon un mode de mise en #uvre préféré du procédé conforme à l'invention, on effectue au moins une application de la suspension d'Agrobacterium avant l'épanouissement de la fleur, sur le bouton floral formé. Cette application peut être effectuée, par exemple, pendant les 10 jours, de préférence pendant les 5 jours, et de manière tout a fait préférée, pendant les 48 heures précédant l'ouverture du bouton floral. Cette première application peut être suivie, d'au moins une et éventuellement de plusieurs autres applications de la suspension d'Agrobacterium, pendant toute la durée de la floraison. Les applications peuvent être espacées de 12 à 96 heures, de préférence de 24 à 72 heures environ. L'application de la suspension peut s'effectuer par trempage des fleurs de la plante à traiter dans ladite suspension. Dans ce cas le trempage est effectué pendant 5 à 60 secondes environ, de préférence pendant 10 à 30 secondes. Toutefois, notamment dans le cas des plantes de taille importante, il est préférable d'appliquer la suspension d'Agrobacterium par pulvérisation sur les fleurs. Les Inventeurs ont en effet observé que ce mode d'application permettait d'obtenir un taux de transformation aussi bon que l'application par trempage. Dans les 2 cas, après application, on laisse la plante traitée à l'air libre, afin de permettre le séchage de la suspension appliquée. Dans le cas de fleurs groupées en inflorescence, on effectuera avantageusement plusieurs applications successives, pendant toute la durée de l'inflorescence, de quelques jours à plusieurs semaines selon la plante considérée. Dans le cas de plantes dioïques on peut soit traiter les plants males et les plants femelles, soit traiter un seul types de plants ; dans ce dernier cas, on traitera préférentiellement traiter les plants femelles. Dans les cas où il n'est pas possible de mettre en #uvre le procédé conforme à l'invention sur la plante entière, notamment dans le cas de plantes de très grande taille, par exemple des arbres, on peut appliquer la suspension d'Agrobacterium sur les fleurs préalablement prélevées sur la plante, et maintenues en culture par des techniques telles que celles décrites par LARDON et al. [Sexual Plant Reprod., 6,52-56, (1993) ]. Le procédé conforme à l'invention peut également être utilisé pour effectuer la co-transformation de plantes par deux ou plusieurs populations d'Agrobacterium contenant des gènes d'intérêt et/ou des gènes marqueurs différents. Dans ce cas on peut appliquer une suspension bactérienne comprenant un mélange de cellules de deux ou plusieurs populations d'Agrobacterium ; on peut également appliquer séparément une suspension de chaque population d'Agrobactérium. Dans ce dernier cas, l'intervalle de temps séparant l'application des suspensions peut varier de quelques minutes à quelques dizaines d'heures ; toutefois, comme indiqué ci-dessus, il est préférable qu'au moins une application de chacune des suspensions utilisée soit effectuée avant l'ouverture du bouton floral. La mise en #uvre du procédé conforme à l'invention aboutit à l'introduction d'ADN par l'intermédiaire d'Agrobacterium, soit dans les gamètes, permettant ainsi la fécondation naturelle et un processus d'embryogenèse normal, soit dans le génome du zygote avant embryogenèse. Les plantes ou les fleurs isolées traitées conformément à l'invention sont ensuite cultivées normalement jusqu'à maturation des graines. La conservation, l'ensemencement, et la germination des graines récoltées sont effectuées dans les conditions appropriées à l'espèce concernée. Les plantes transformées contenant un gène d'intérêt sont sélectionnées parmi les plantes issues de ces graines, par les techniques classiques, connues en ellesmêmes de l'homme de l'art. On peut par exemple détecter la présence de séquences du gène d'intérêt à l'aide de sondes d'acide nucléique, et/ou détecter les modifications phénotypiques résultant de l'expression du gène d'intérêt et/ou d'un gène marqueur qui lui est associé. Le taux de transformation (défini par le pourcentage de graines donnant naissance à des plantes exprimant le gène d'intérêt) obtenu grâce à la mise en #uvre de la présente invention, est supérieur à 1%, y compris chez les plantes réfractaires. Par exemple, chez le tournesol, les Inventeurs ont observé un taux de transformation de l'ordre de 1 à 5%. La présente invention a également pour objet les graines transgéniques produites par des fleurs traitées conformément à l'invention, les plantes issues de ces graines et leur descendance, ainsi que les semences obtenues à partir desdites plantes. La présente invention peut être mise en #uvre pour la transformation de plantes appartenant à des espèces très diverses, et notamment de plantes considérées auparavant comme réfractaires à la transformation par Agrobacterium. Il ressort en effet des observations faites par les Inventeurs que les gamètes et le zygote apparaissent comme des organes particulièrement sensibles à l'infection, même chez les plantes qui ne font pas partie des hôtes naturels des agrobactéries. D'autre part, la présente invention permet d'éviter les problèmes posés chez certaines plantes par la régénération d'une plante entière à partir de tissus transformés. En particulier la présente invention peut être mise en #uvre pour effectuer la transformation : - parmi les dicotylédones : de plantes de la famille des Composées, parmi lesquelles on citera notamment le tournesol, la laitue, l'endive ; de plantes de la famille de solanacées, notamment du genre Capsicum, telles que le poivron, ou d'autres genres telles que la tomate, le tabac ; des plantes de la famille de Cucurbitacées, telles que la courgette, de la famille des Chenopodiacea, telle que la betterave, ; de la famille des légumineuses, telle que la luzerne, le haricot, le pois ; des plantes ligneuses telles que l'eucalyptus. - parmi les monocotylédones : de céréales, notamment blé, mais, riz, orge ; - parmi les gymnospermes, des conifères tels que le sapin, le cèdre. Outre les avantages mentionnés ci-dessus, qui permettent l'application des méthodes du génie génétique à des plantes chez lesquelles ces méthodes étaient jusqu'à présent très difficiles voire impossibles à mettre en #uvre, la présente invention présente l'avantage d'être très simple à mettre en #uvre, sans nécessiter de techniques compliquées, ni d'équipement encombrant et coûteux. La présente invention permet en outre de réduire d'une génération le temps nécessaire à l'obtention des premiers transformants ; en effet, les plantes étant transformées au stade floral, les graines obtenues donneront les transformants primaires. La présente invention présente également l'avantage, du fait du fait de la suppression de l'étape de régénération in vitro à partir de cellules transformés, de ne pas nécessiter l'utilisation d'un gène de résistance aux antibiotiques comme gène marqueur permettant de sélectionner ces cellules transformées. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs de mise en #uvre du procédé conforme à l'invention. EXEMPLE 1 : TRANSFORMATION DU TOURNESOL Culture des plantes Des plantes de tournesol (lignée Proléic, INRA) sont cultivées dans des chambres de cultures de l'UMR 5546 CNRS/UPS (Température jour : 27 C ; température nuit : 23 C ; photopériode 16/8 ; humidité 70%), jusqu'à l'apparition du capitule. Préparation d'une culture d'Agrobactéries transformées Le vecteur binaire pBIN19 (12 kd) [BEVAN, Nucl. Acid. Res., 12,22, (1984)] portant le gène nptll de résistance à la kanamycine est utilisé pour la transformation de la souche C58CI RifR (pMP90) [KONCZ et SCHELL, (1986)] d'Agrobacterium tumefaciens. Le vecteur est digéré par SmaI pour créer des extrémités franches. Le fragment NcoI-NcoI de 612 pb contenant le promoteur du gène Ap40 [SCHEER et al., Plant Mol. Biol., 35,905-913, (1996)] fusionné au gène GUS sont purifiés. De manière à obtenir des bouts francs, compatibles avec les extrémités du vecteur digéré par SmaI, les fragments sont réparés avec l'enzyme de Klenow. La ligation des fragments avec le vecteur pBIN19 est réalisée en présence de ligase. Le vecteur contenant le gène GUS est finalement introduit dans les agrobactéries par la méthode de congélation-décongélation. Les bactéries C58/pMP90 sont cultivées sur milieu LB contenant de la rifampicine et la gentamicine jusqu'à l'obtention d'une DO 600 nm comprise entre 0,5 et 1. La culture est alors centrifugée à 1500 g à 4 C. Le culot est repris par 300 ul de CaClz 20 mM froid. Les bactéries sont réparties par fractions de 100 l dans des tubes Eppendorf. 1 ug d'ADN plasmidique est ajouté directement dans chaque tube qui est congelé immédiatement dans l'azote liquide. Après décongélation (4 min à 37 C), 1 ml de milieu LB est ajouté et l'ensemble est mis à incuber à 28 C. Après culture, les transformants sont analysés par isolement de l'ADN bactérien. La présence du pBIN19GUS est confirmé par PCR. Transformation des plantes : Les agrobactéries transformées sont cultivées pendant 24 h à 28 C dans un milieu MS pH 5,7 contenant 50 g/1 de saccharose stérile, 50 ul/1 de TWEEN 20, et 50 uM d'acétosyringone. Cette suspension d'agrobactéries est utilisée pour la transformation des fleurs par pulvérisation, ou bien alternativement par immersion (30 secondes). Dès l'apparition du capitule, la suspension d'agrobactéries, fraîchement obtenue, est pulvérisée. Les fleurs peuvent également être plongées dans la solution d'agrobactéries pendant 30 secondes. Dans le cas de plantes ayant une floraison étalée dans le temps, comme le tournesol, la pulvérisation ou l'immersion des fleurs doit être effectuée touts les trois jours du début à la fin de la période de floraison, soit pendant 15 jours environ dans le cas du tournesol. Les plantes traitées sont cultivées soit dans des salles de culture, soit en serre jusqu'à la maturation et dessiccation des graines. Les graines sont ensuite prélevées et stockées à 4 C. Les graines sont stérilisées pendant 20 minutes dans une solution d'hypochlorite de sodium à 5%, puis rincées abondamment 5 fois avec de l'eau distillée stérile. Les graines sont ensemencées dans du sable stérile, maintenues en chambre de culture et arrosées régulièrement avec une solution nutritive standard. La sélection des plantules transformées a été réalisée par deux méthodes : a) Par analyse histochimique de l'activité GUS. Des plantules de 8 jours sont récoltées et mises en contact à l'obscurité avec le tampon suivant, stérilisé par filtration : Na2 EDTA 10 mM ; ferricyanure de K 0,1 mM ; ferrocyanure de K 0,1 mM ; phosphate pH 7,0 50 mM ; Gluc 2 mM. Les explants sont incubés soit 18 h à 37 C, soit 48 h à température ambiante. Les extraits sont ensuite incubés 1 h dans la solution de fixation suivante : formaldéhyde 5%, acide acétique 5%, éthanol 95 45% et décolorés par plusieurs bains d'éthanol 70%, éthanol 80% et éthanol 95% sous agitation. Les plantules présentant une coloration bleue sont considérées comme transformées. Sur 500 plantules examinées avec cette méthode, 20 plantules présentant une coloration bleue ont été observées. b) Par PCR en utilisant des amorces spécifiques du gène nptll. L'ADN est extrait à partir de 2 à 3 feuilles prélevées sur des plantules âgées de 20 jours. Après broyage dans l'azote liquide, 15 ml de tampon d'extraction (Tris-HCl 100 mM ; EDTA 50 mM ; NaCl 500 mM ; Bêta mercaptoéthanol 7 mM) pour 2 g de matériel de départ et 2 ml de SDS 10% sont ajoutés et incubés 10 minutes à 65 C. 5 ml d'acétate de potassium 5 M sont ajoutés et l'ensemble est incubé 20 minutes dans la glace. Après centrifugation 20 minutes à 27 000 g, le surnageant est filtré sur papier WHATMAN 3 MM stérile et l'ADN est précipité par 10 ml d'isopropanol pendant 30 minutes à -20 C. Après centrifugation 15 minutes à 27 000 g, le culot est repris dans 0,7ml de tampon TE et centrifugé 15 minutes à 15 000 g. Le surnageant est récupéré et l'ADN est précipité par 75 microlitres d'acétate de sodium 3 M pH 8,0 et 500 microlitres d'isopropanol. Après centrifugation 30 minutes à 15 000 g, le culot obtenu est rincé par de l'éthanol à 70%, séché et repris par un volume minimal d'eau stérile. La quantité d'ADN est mesuré au spectrophotomètre et la qualité est estimée après électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8%. Une première analyse par PCR a été réalisée à partir de pools d'ADN regroupant chacun l'ADN extrait de 10 plantes indépendantes. 50 nanogrammes d'ADN sont utilisés pour la PCR en utilisant les amorces suivantes : 5' GAGGCTATTCGGCTATGACTG 3' et 5' ATCGGGAGCGGCGATACCGTA 3' permettant l'amplification d'un fragment de 698 pb. Les conditions PCR utilisées sont : 5 minutes à 95 C ; 40 X (1 minute à 95 C ; 1 minute à 51 C ; 1 minute 30 à 72 C) ; 5 minutes à 72 C. Les produits PCR sont analysés sur gel d'électrophorèse à 0,8% d'agarose et visualisés sous U.V. après coloration au bromure d'éthidium. Les pools d'ADN présentant une amplification à 698 pb sont alors retenus et l'ADN de chaque plante est réanalysé par PCR afin d'identifier le(s) individu(s) transformé(s). Sur 120 plantules examinées avec cette méthode, 5 plantules donnant le produit d'amplification attendu ont été observées. REVENDICATIONS 1) Procédé de transfert d'un gène d'intérêt dans les organes reproducteurs d'une plante, comprenant la mise en contact des fleurs de ladite plante avec une suspension de cellules d'Agrobacterium qui contiennent le gène d'intérêt que l'on souhaite transférer, caractérisé en ce que ladite mise en contact est effectuée à pression atmosphérique, et en ce que ladite suspension d'Agrobacterium comprend au moins un agent mouillant. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite suspension d'Agrobacterium comprend en outre au moins un sucre assimilable par Agrobacterium et/ou au moins un composé capable de stimuler les gènes de virulence chez Agrobacterium. 3) Procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite suspension d'Agrobacterium est utilisée à une concentration bactérienne correspondant à une DO600 de l'ordre de 0,5 à 0,8. 4) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'agent mouillant est choisi parmi les tensio-actifs non-ioniques, ou bien les tensio-actifs dérivés de silicones, et leurs mélanges. 5) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la concentration en agent mouillant dans la suspension d'Agrobacterium est de 5 x 10-6 à 5 x10-4 M. 6) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la concentration en sucre assimilable dans la suspension d'Agrobacterium est de 0, 05 à 0,5 M 7) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la concentration en composé capable de stimuler les gènes de virulence dans la suspension d'Agrobacterium est comprise entre 10 et 100 M. 8) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que : - l'agent mouillant est du monolaurate de polyoxyéthylène sorbitane, - le sucre assimilable par Agrobacterium est choisi parmi le saccharose, le fructose, et le glucose, - le composé capable de stimuler les gènes de virulence est l'acétosyringone. 9) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la mise en contact avec la suspension d'Agrobacterium comprend au moins une application de ladite suspension sur un bouton floral avant l'épanouissement de la fleur. 10) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'application de la suspension d'Agrobacterium s'effectue par pulvérisation. 11) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la culture de la plante traitée jusqu'à maturation des graines, et la récolte desdites graines. 12) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'obtention de plantes parmi les graines récoltées, et la sélection parmi lesdites plantes, des plantes transformées contenant le gène d'intérêt. 13) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il est mis en #uvre pour la transformation d'une plante choisie parmi : - des dicotylédones de la famille des Composées, de la famille des Solanacées, notamment du genre Capsicum, ou de la famille des Cucurbitacées; - des monocotylédones, notamment des céréales ; - des gymnospermes de la famille des Conifères.