Brevet FR2801592A1 — publié le 20010601

La présente invention est relative à des dendrimères phosphores et à leurs applications, comme agents de transfection de gènes, in vitro et in vivo, y compris dans le traitement des maladies humaines et animales. Lesdits agents ou vecteurs sont notamment aptes à dispenser à des cellules cibles convenables, des séquences d'acide nucléique d' intérêt. La thérapie génique est fondée sur l'administration thérapeutique d'acides nucléiques ; elle nécessite l'utilisation de vecteurs efficaces et sûrs pour le transfert des gènes thérapeutiques et son succès dépend donc de l'efficacité du trans- fert des gènes dans les cellules souhaitées. De nombreuses compositions aptes à transfecter des cellules euca- ryotes avec un matériel génétique sélectionné ont déjà été décrites et appartiennent essentiellement à deux grands types de vecteurs de transfection : - les vecteurs de transfection viraux, qui sont efficaces mais qui présentent des limites d'utilisation : non-spécificité tissulaire, nécessité d'obtenir des constructions pour chaque gène d' intérêt, risques potentiels pour l' environnement qui conduisent à la mise en place d'infrastructures cliniques coûteuses et contraignantes pour le malade et le personnel, problèmes de réponse immunitaire, de production par recombinaison homologue de particules virales et d'effets oncogènes potentiels ; - des agents non-viraux (vecteurs synthétiques), capables de promouvoir le transfert et l'expression de substances chimiques telles que l'ADN dans les cellules eucaryotes. Ces vecteurs synthétiques doivent avoir essentiellement deux fonctions : condenser l'ADN à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et éventuellement les membranes nucléaires ; de tels vecteurs doivent donc mimer le fonctionnement des virus, pour être efficaces ; toutefois, il apparaît que les différents vecteurs proposés dans l'art antérieur ne présentent pas ces deux fonctions de manière optimale et peuvent en outre, selon les cas, être toxiques pour les cellules. Parmi ces vecteurs non-viraux, on peut notamment citer les préparations de lipides cationiques, qui sont particulièrement cytotoxiques (15-18), les techniques d'encapsulation de l'ADN dans des liposomes (9-11) et les polymères polycationiques, tels que la poly(L-lysine), la protamine, le polyéthylénimine (12) ou encore les dendrimères cationiques (polyamidoamines) (13, 14), qui s'associent à l'ADN par des interactions électrostatiques multiples engendrant un processus de coopérativité, ce qui produit des particules appelées polyplexes, chacun donnant des efficacités de transfection variable suivant leur structure et le type cellulaire (25). De manière plus précise, les dendrimères de type polyamidoamines (PAMAM) sont des polymères de structure sphérique et branchée ; ils sont solubles en solution aqueuse et présentent à leur surface une couche d'amines primaires ; ils sont isomoléculaires et fortement chargés à leur surface. Les différents dendrimères décrits présentent différents types de noyau central (core) : ammonium ou éthylènediamine (EDA), à partir desquels le processus de polymérisation est initié. Ces dendrimères PAMAM contiennent un nombre défini de groupes aminés à la surface du polymère qui sont chargés positivement à pH physiologique. Il a été montré que de telles molécules interagissent avec des anions tels que les acides nucléiques et que les complexes ADN/dendrimères sont capables de transfecter des cellules d'une manière similaire à celle observée avec les complexes ADN/polylysine, mais avec une efficacité meilleure, liée à leur solubilité et à leur structure. En particulier des dendrimères PAMAM G3-G5, comprenant comme noyau central, soit des groupes NH3, soit des groupes EDA, sont capables de former des complexes stables avec de l'ADN, dans des conditions physiologiques et les dendrimères G5-Glo sont capables de transfecter des gènes. Le fait que la capacité de transfection soit limitée à ce groupe de dendrimères est sans doute liée au nombre de groupes aminés présents à leur surface et à leur forme sphérique. L'efficacité de ces derniers dépend de modifications chimiques de la structure dendrimérique initiale, par un traitement thermique qui conduit à une population de composés hétérodispersés (15, 21). Depuis environ dix ans, la recherche sur les dendrimères, d'un point de vue chimique s'est considérablement développée, du fait de leur structure (polymères polyfonctionnels ordonnés) et de leur propriétés particulières liées à la présence d'un nombre important de fonctionnalités à leurs extrémités, qui fournissent un grand nombre de surfaces et d'interfaces et à la présence de zones vides, qui permettent l'encapsulation de molécules diverses ; cette recherche a conduit à la synthèse d'autre structures correspondant à des dendrimères contenant du phosphore, telles que celles décrites dans C. Galliot et al. (18) ou C. Larré et al. (19). Toutefois, il ressort de la littérature que ces dendrimères phosphorés, non solubles dans l'eau, ne peuvent être utilisés comme agents de transfection. Dans le cadre de leur recherche, les Inventeurs ont maintenant montré que de nouveaux dendrimères contenant du phosphore, qui sont fonctionnalisés au niveau des couches internes et qui comprennent des amines tertiaires protonées comme terminaisons présentent des propriétés particulièrement intéressantes, en tant que vecteurs de transfert d'acides nucléique. La présente invention a pour objet des dendrimères phosphorés polycationiques, caractérisés en ce qu'ils sont constitués : - d'une couche centrale sous la forme d'un noyau Po comprenant 2 à 8 groupements fonctionnalisés et notamment le groupement de formule générale la : W'N - #'\ - ou le groupement de formule générale Ib : -)=r 1-- - de n couches intermédiaires, identiques ou différentes, chacune desdites couches intermédiaires étant constituée d'unités Pl répondant à la formule II : dans laquelle : L est un atome d'oxygène, de phosphore ou de soufre, M représente l'un des groupes suivants : # un groupe aromatique di-, tri- ou tétrasubstitué par des groupes alkyles, des groupes alcoxys, des groupements insaturés du type oléfinique en CI-CI2, azoïque, acétylènique, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, ou # un groupe alkyle ou alcoxy comportant plusieurs substituant tels que définis lorsque M est un groupe aromatique, R1 et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, de soufre, d'azote ou des halogènes avec R2 étant le plus souvent différent de R1, n est un nombre entier compris entre 1 et 11, E est un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote, ledit atome d'azote pouvant être lié à un groupe alkyle, alcoxy ou aryle, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, - une couche externe constituée d'unités P2, identiques ou différentes, et répondant à la formule III : dans laquelle : R5 représente un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, W représente l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, tous ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d' oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, R3 et R4 qui peuvent être identiques ou différents représentent un groupe en C1-C;, X représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en CI-C5 ou est nul et Z représente un ion halogènure, un groupe alkylCOO- ou tout autre groupement anionique comportant des atomes de carbone, d'oxygène, de soufre, d'azote, de phosphore ou d'halogènes, ou est nul. Un groupe de formule II préféré est notamment le groupe suivant : Un groupe de formule III préféré est notamment le groupe suivant : De tels composés représentent des dendrimères et sont notamment représentés aux figures 1 à 3. L'expression alcoxy désigne les radicaux de formule générale R'O- par exemple, les groupements méthoxy, éthoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, tertiobutoxy. L'expression "alkyle" désigne les radicaux à chaîne droite ou ramifiée contenant jusqu'à 8 atomes de carbone. Parmi ces radicaux, on peut citer les radicaux méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, sec-butyle, tertbutyle, pentyle, hexyle. L'expression "aryle" désigne par exemple, un radical phényle éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux alcoyle, alcoxyle ou par un atome de chlore, de brome ou de fluor, ou un radical aromatique hétérocyclique à 5 ou 6 chaînons contenant 1 à 2 hétéroatomes tels que l'azote ou l'oxygène. Parmi ces radicaux aryle, on peut citer les radicaux phényle, (o-, m-, ou p-) méthoxyphényle, (3,4-, 2-6,2,3-) diméthoxyphényle, (o-, m-, ou p-) tolyle, thiényle, pyridyle. On peut obtenir plusieurs types de produits désignés de manière générale par la formule A-[Gn], dans laquelle A définit le type d'unité terminale et Gn définit le nombre de couches d'unités intermédiaires P1 (correspondant au nombre de générations) : - la série des composés 2-[Gn] présente des unités terminales de formule III, dans lesquelles X représente un atome d'hydrogène, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyle, Z est un ion chlorure et n est un nombre entier compris entre 1 et 10 (voir la figure 3) ; - la série des composés 3-[Gn] présente des unités terminales de formule III, dans lesquelles X est vide, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et repré- sentent des groupes éthyle, Z est vide et n est un nombre entier compris entre 1 et 10 (voir la figure 3) ; - la série des composés 4-[Gn] présente des unités terminales de formule III, dans lesquelles X représente un groupe méthyle, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyle, Z est un ion iodure et n est un nombre entier compris entre 1 et 10 (voir la figure 3) ; - la série des composés 5-[Gn] présente des unités terminales de formule III, dans lesquelles X représente un groupe méthyle, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyle, Z est un groupe CH3COO- et n est un nombre entier compris entre 1 et 10 (voir la figure 3). - la série des composés l-[Gn] présente des unités terminales Cl2 et n est un nombre entier compris entre 1 et 10 (voir la figure 3) (produits intermédiaires pour la préparation des dendrimères selon l'invention). Les dendrimères phosphorés polycationiques selon l'invention présentent un certain nombre d'avantages par rapport aux dendrimères de l'art antérieur utilisés comme vecteurs de gènes : - ils sont isomoléculaires et sont de ce fait reproductibles (degré de pureté élevé), - ils sont chargés, ce qui leur confère une affinité particulière vis-àvis des acides nucléiques à transférer et donc une bonne qualité de transporteur, - ils sont fonctionnalisables aussi bien en surface qu'au niveau des couches internes, - ils sont solubles dans l'eau sans dégradation dans une large gamme de pH (3 à 12) (stabilité en solution aqueuse pendant plusieurs mois). Ceci représente un net avantage par rapport aux dendrimères de type PAMAM qui doivent être dégradés thermiquement (étape peu reproductible) pour donner des composés actifs en transfection, - ils sont peu cytotoxiques (viabilité des cellules transfectées supérieure à 80 %). Les dendrimères phosphorés selon l' invention peuvent être obtenus, de manière reproductible, par croissance contrôlée de la structure dendrimérique par ajout de couches successives de motifs ou unités H2N-N(R2)-P(S)Cl2 de formule VIII. Le bloc ou noyau central de formule VII (voir figures 1 et 2) correspond à une unité hexachlorocyclotriphosphazène (N3P3) modifiée par le triéthylammonium de 4hydroxybenzaldéhyde de formule VI. Ce noyau qui comprend 6 fonctions aldéhydes terminales est mis en contact avec un diphosphonoalkylhydrazide de formule VIII H2N-N(Alk)-P(S)Cl2 pour produire un dendron comportant des unités terminales dichlorothiophosphine P(S)C12, qui peuvent être mises en contact à nouveau avec un sel de 4-hydroxybenzaldéhyde de formule VI, pour produire par itération chaque génération de dendrimères. Les lére, 2éme' 3ème, 4ème, et Sème générations de dendrimère comprennent respectivement 6, 12, 24, 48 et 96 unités terminales Cl2, qui peuvent être traitées avec du N,N-dialkyléthylènediamine, pour produire des dendrimères catio- niques après protonation : 2-[Gi] à 2-[Gs], conformément à la figure 3. Ces dendrimères phosphorés polycationiques ont 12,24, 48,96 ou 192 charges positives périphériques respectivement pour les lève, 2ème, z, 4ème, et Sème générations de dendrimère. Les formes méthylées (5-[GI] à 5-[G5]) sont préparées à partir des amines terminales neutres correspondantes (3-[GI] à 3-[G5]) par une méthylation en présence d'iodure de méthyle, suivie d'un échanges iodures/acétates à l'aide d'une résine convenable (voir exemple 1). La pureté et l'intégrité des dendrimères est vérifiées par une analyse spectrale : NMR 1H, 13C et 31P. Seulement 8 à 10 % des branches terminales des dendrimères méthylés (5-[Gi] à 5-[G5] présentent un déficit en groupes méthyles. De manière plus précise, les dendrimères selon l'invention peuvent être préparés de la manière suivante : (1) réaction d'un produit de formule V dans lequel RI représente un groupement comprenant une fonction aldéhyde, de formule VI : (VI) pour obtenir un produit de formule VII N3P3(OC6H4CHO)6 comprenant 6 fonctions aldéhydes (couche centrale constituée d'un noyau Po ; figure 3), (2) réaction du produit de formule VII obtenu en (1) avec un diphosphonoalkylhydrazide de formule VIII H2N-N(R2)-P(S)C12 pour produire un dendron de type l-[Gn] comportant des unités terminales Cl2, (3) réitération des étapes (1) et (2) sur le produit obtenu en (2) pour produire un nombre n de couches intermédiaires ; les 1 ère, 2ème z, 4ème, et Sème géné- rations de dendrimère comprennent respectivement 6,12, 24,48 et 96 unités terminales Cl2 et (4) traitement desdites unités terminales Cl2 avec du N,N-dialkyl- éthylènediamine, pour produire des dendrimères cationiques selon l'invention après protonation. La présente invention a également pour objet une composition capable d'agir comme agent de transfection d'une séquence d'acide nucléique vers une cellule eucaryote, caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique et un dendrimère phosphoré polycationique tel que défini ci-dessus, opérativement couplé audit acide nucléique. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition, elle comprend en outre au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite composi- tion, le rapport N/P, dans lequel N correspond aux groupes cationiques terminaux du dendrimère (amines chargées) et P correspond aux groupes phosphates dudit acide nucléique, est compris entre 5 et 10. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition, elle comprend en outre un agent de perméabilisation de la membrane capable de transporter ledit acide nucléique à travers les membranes cytoplasmiques ou endoso- males de ladite cellule eucaryote. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition, ledit dendrimère phosphoré polycationique est associé de manière noncovalente avec ledit acide nucléique. De manière avantageuse, les dendrimères phosphorés polycationiques selon l'invention, sélectionnés dans la série 2-[Gn] dans laquelle n = 3-5 sont particulièrement intéressants comme vecteurs de transfert d'acide nucléique, alors que les dendrimères de la série 5-[Gn] sont toxiques et relativement inefficaces dans la transfection d'acides nucléiques dans des cellules eucaryotes aussi bien en l'absence qu'en présence de sérum. Ce phénomène est peut-être lié à une forte densité en charges positives stables, qui peuvent entraîner l'éclatement de la membrane cellulaire et conduire ainsi à une mort de la cellule. La diminution de la densité de charge n'est pas possible pour les produits alkylés sans dégradation des dendrimères, tandis que la densité de charge de la série 2-[Gn] peut être modulée par des modifications micro-environnementales du pH au niveau de la membrane cellulaire. De plus, la possibilité de moduler la densité de charge de cette série de dendrimères peut constituer un facteur clé dans la libération du gène transporté dans les endosomes. Ces dendrimères agissent ainsi peut-être comme un réservoir de protons dans les compartiments cellulaires, leur densité de charge étant contrôlée par les pompes à protons dépendant de l'ATPase et par des modifications de la concentration intracellulaire en chlorures. La possibilité de réduire la densité de charge cationique de ces dendrimères à l'extérieur et à l'intérieur des cellules devrait être favorables pour leur utilisation in vivo. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre la structure du noyau central Po (N3P3) et un dendrimère selon l'invention de type 3- [G2] ; - la figure 2 illustre un dendrimère selon l'invention de type 2-[G4] ; - la figure 3 illustre un procédé de préparation des dendrimères selon l' invention ; - la figure 4 illustre les propriétés de transfert de gène des dendrimères de type 2-[Gn], en présence de sérum (parties droites des figures 4A et 4B) ou en l'absence de sérum (parties gauches des figures 4A et 4B) ; - la figure 5 illustre les propriétés de transfert de gène des dendrimères de type 5-[Gn], en présence de sérum (parties droites des figures 5A et 5B) ou en l'absence de sérum (parties gauches des figures 5A et 5B). Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : des dendrimères selon l'invention. - Méthodes générales et produits utilisés Toutes les manipulations ont été réalisées par des techniques courantes dans des conditions sous vide poussé ou sous argon. Les spectres de RMN d"H de 31P et de 13C ont été enregistrés par des spectromètres de marque Brucker (AC80, AC200 et AC250). Les déplacements chimiques en RMN du 31P des réactifs sont exprimées en ppm par rapport à 85% de H3P04. La numérotation utilisée pour la RMN est détaillée sur la figure 1. Les dendrimères l-[Gn] ont été synthétisés selon les protocoles publiés (16,17). Dans l'abréviation l-[Gn], le chiffre 1 correspond à un dendrimère avec des extrémités Cl, 2, 3, 4 ou 5 pour des extrémités -NH(Et)2]+ (Cl-), N(Et)2, -NMe(Et)2]+ (I') ou -NMe(Et)2]+ (OAc-), respectivement et n correspond au nombre de générations du dendrimère (nombre de couches intermédiaires). L'iodure de méthyle et la N, N-diéthyléthylènediamine ont été fournis par Aldrich et la résine AG1-X8, au fort pouvoir échangeur d'anion, par Biorad. - Procédures générales pour la synthèse des produits de type 2-[GnJ De la N, N-diéthyléthylènediamine (n=l, 9')il, 0,66 mmol ; n=2, 71 ni, 0,5 mmol; n=3, 68 ..LI, 0,48 mmol ; n=4, 61 ni, 0,43 mmol, n=5, 60 ni 0,42 mmol) a été ajoutée goutte à goutte, à la seringue, à une solution contenant 100 mg de dendrimère l-[Gn] (n=l, 55 nmol ; n=2, 21 tmol n=3, 10 nmol ; n=4, 4,5 tmol ; n=5, 2,2 nmol) dans 15 ml de THF distillé (THF A), sous forte agitation. Après une nuit d'agitation à température ambiante (RT), le solvant a été éliminé par filtration. La poudre blanche a été lavée deux fois avec 20 ml de THF distillé et séchée par évaporation. Les protons produits pendant la réaction de couplage ont été piégés par les résidus amines tertiaires terminaux, par conséquent les dendrimères 2-[Gn] ont été obtenus sous forme de chlorures. La première génération de dendrimère 2-[Gli est obtenue avec un rendement de 80 %. Les données NMR sont les suivantes : 31p 1H} NMR (CD30D): ô = 7.9 (PO), 69.6 (Pl). 1H NMR (DMSO-d6): 8 = 1.3 (t, 3JHH = 6.3 Hz, 72 H, CH2CH3),3.0-3.5 (m, 114 H, CH3-N-Pl, CH2), 5. 7 (br m, 12 H, N-H), 7. 1 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 12 H, C02-H), 7. 9 (s, 6 H, CH=N), 7. 9 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 12 H, C03-H), 10. 8 (br s, 12 H, +N-H). i3C {IH} NMR (CD30D): 8 = 9.7 (s, CH2CH3), 33.3 (d, 2JCP1 = 10.3 Hz, CH3-NPl), 37.9 (s, CH2-N-Pl), 49.5 (s, CH2CH3), 53.9 (d, 3JCP1 = 6.2 Hz, CH2-CH2-NPl), 122.6 (s, C02), 129.8 (s, C03), 135.0 (s, C04), 139.3 (d, 3jCp, = 11.6 Hz, CH=N), 152. 4 (d, 2JCP0 - 7.3 Hz, C01). UV-vis (H20): #max (s, M-1 x cm-1) 284 nm (1. 2 x 105). Deuxième génération de dendrimère 2-[G2] (rendement = 95% ) : 31p {1 H} NMR (CD30D): ô = 8.5 (PO), 62.0 (Pl), 69.6 (P2). 1H NMR (DMSO-d6): # = 1. 3 (br s, 144 H, CH2CH3), 3.0-3.6 (br m, 246 H, CH3-NP1,2, CH2), 5. 6 (br m, 24 H, N-H), 7. 0-7.4 (br m, 36 H, C02-H, C-H), 7. 7-8.2 (m, 54 H, CH=N, C03-H, C13-H), 10. 7 (br s, 24 H, +N-H). 13C 1 H NMR (CD30D): 8 = 9.6 (s, CH2CH3), 33.0 (d, 2JCP2 = 10.6 Hz, CH3-NP2), 34.2 (d, 2JCP1 = 11.8 Hz, CH3-N-P1), 37.8 (s, CH2-N-P2), 49.2 (s, CH2CH3), 53.9 (d, 3JCP2 = 6.3 Hz, CH2-CH2-N-P2), 122.8 (s, C02), 123.0 (d, 3JCP1 = 3.0 Hz, Ci2), 129.7 (s, Ci3), 130.0 (s, C03), 134.3 (s, C04), 135.0 (s, Ci4), 139.1 (d, 3JCP2 = 12. 5 Hz, CH=N), 141. 3 (d, 3JCP1 = 15.4 Hz, CH=N), 152. 6 (d, 2JCP1 = 7. 3 Hz, CI 1), 152. 6 (s, C01). UV-vis (H20): #max (s, M-1x cm-1) 284 nm (3. 1 x 105). Troisième génération de dendrimère 2-[G3] (rendement = 95%) : 3 il 1H} NMR (CD30D): 8 = 8.6 (PO), 61.5 (Pl), 62.3 (P2), 69.5 (P-). IH NMR (DMSO-d6): = 1.3 (br s, 288 H, CH2CH3), 3.0-3.5 (br m, 510 H, CH3-NPl 23, CH2), 5.7 (br s, 48 H, N-H), 7.0-7.5 (br m, 84 H, C02-H, CI2~H, C22-H), 7. 7-8.2 (br m, 126 H, CH=N, C03-H, C13-H, C23-H), 10. 8 (br s, 48 H, +N-H). 13C {1H}NMR (CD30D): # = 9. 6 (s, CH2CH3), 33.1(d, 2JCP3 = 9. 4 Hz, CH3-NP3), 34.2 (m, CH3-N-P1,2), 37.6 (s, CH2-N-P3), 49. 2 (s, CH2CH3), 53.7 (d, 3JCP3 = 6.3 Hz, CH2-CH2-N-P3), 123.2 (br s, Cp2, Ci 2, C22), 129.6 (br s, Cp3, Ci3, C23), 134.0 (s, C04, C14), 134.8 (s, C24), 139.0 (br s, C24-CH=N), 141. 4 (br s, CH=N), 152.4 (d, 2JCP2 = 7.3 Hz, C21 ), 152.8 (br s, Cp 1, Ci 1). UV-vis (H20): #max (s, M-1 x cm-1) 286 nm (7. 3 x 105). Quatrième génération de dendrimère 2-[G4] (rendement = 95%). 31p {1H} NMR (CD30D): 3 = 8.4 (PO), 62.0 (Pi,2,3), 69.4 (P4). 1H NMR (DMSO-d6): 8 = 1.3 (br s, 576 H, CH2C//3), 3.0-3.5 (m, 1038 H, CH3-NP1,2,3,4 CH2), 5.6 (br s, 96 H, N-H), 7.0-7.5 (br m, 180 H, C02-H, Ci2-H, C22-H, C32-H), 7. 7-8.2 (m, 270 H, CH=N, C03-H, C13-H, C23-H, C33-H), 10. 8 (br s, 96 H, +N-H). 13C {lE} NMR (CD30D): # = 9. 7 (s, CH2CH3), 33.2 (d, 2JCP4 = 9. 2 Hz, CH3-N- P4), 34.3 (d, 2JCp = 10.1 Hz, CH3-N-P2,3), 37.7 (s, CH2-N-P4), 49.2 (s, CH2CH3), 53.8 (d, 3JCP4 = 5.5 Hz, CH2-CH2-N-P4), 123.1 (br s, C02, C 12, C22, C32), 129.7 (br s, C03, C,3, C23, C33), 134.2 (s, C04, C,4, C24), 134.9 (s, C34), 139.2 (br s, C34-CH=N), 141.5 (br s, CH=N), 152.5 (d, 3JCp3 = 7.4 Hz, C31), 153.0 (brs,Co1,Cil,C21). UV-vis (H20): #max (s, M-1 x cm-1) 288 nm (1.7 x 106).. Cinquième génération de dendrimère 2-[G5] (rendement = 95%). 31p {lH} NMR (CD30D): 8 = 62.0 (P1,2,3,4) 69.3 (P5). 1H NMR (DMSO-d6): 8 = 1.3 (br s, 1152 H, CH2CH;), 2.9-3.5 (br m, 2094 H, CH3N-Pl,2,3,4,5' CH2), 5.6 (br s, 192 H, N-H), 7.0-7.5 (m, 372 H, C02-H, C12-H, C2 2H, C32-H, C42-H), 7.7-8.2 (m, 558 H, CH=N, C03-H, C13-H, C23-H, C33-H, C4 3- H), 10. 8 (br s, 192 H, +N-H). 13C {1H} NMR (CD30D): # = 9.7 (s, CH2CH3), 33.2 (br s, CH3-N-P5), 34.3 (br s, CH3-N-P12,3,4), 37.8 (s, CH2-N-P5), 49.2 (s, CH2CH3), 53.8 (s, CH2-CH2-N-P5), 123.1 (br s, C02, C12, C22, C32, C42), 129.7 (br s, C03, C13, C23, C33, C43), 134.2 (s, C04, C14, C24, C34), 134.9 (s, C44), 139. 2 (br s, C44-CH=N), 141. 5 (br s, CH=N), 152.5 (s, C41), 153.0 (br s, COl, C, C21 , C31). UV-vis (H20): #max (s, M-1x cm-1) 286 nm (3.3x 106). - Procédures générales pour la synthèse des produits de type 3-[Gn] Une solution de soude normale (n=l, 372 m, 0,37 mmol; n=2, 312 ml, 0,31 mmol ; n=3, 288 ml, 0,29 mmol ; n=4, 288 ml, 0,28 mol ; n=5, 288 ml, 0,28 mmol) a été ajoutée goutte à goutte à une solution contenant 100 mg de dendrimère 2-[Gn] dans 30 ml d'eau distillée (n=l, 31 mmol ; n=2, 13 mol ; n=6, 6 mmol ; n=', 3 mmol ; n=5, 1,5 mmol), sous agitation forte. Le précipité a été isolé par centrifugation et dissous dans du chloroforme, puis la couche organique a été séchée sur du sulfate de sodium, enfin il a été filtré et séché par évaporation. Dendrimère 3-[Gl] (rendement= 80%). 31 P {IH NMR (CDCI3): 8 = 8.2 (PO), 68.3 (Pi). 1H NMR (CD2C12): 8 = 0.9 (t, 3JHH = 7. 0 Hz, 72 H, CH2CH3), 2.3-2.5 (m, 72 H, CH2-N(CH2-CH3 )2), 2.9 (m, 24 H, CH2-N-P 1 ), 3.1 (d, 3JHpi = 9.4 Hz, 18 H, CH3- N-PI), 4. 0 (m, 12 H, N-H), 6. 9 (d, 3JHH = 8. 5 Hz, 12 H, C02-H), 7. 5 (s, 6 H, CH=N), 7. 5 (d, 3JHH = 8. 5 Hz, 12 H, C03-H). 13C{1H} NMR (CDC13): 8 = 11. 4 (s, CH2CH3), 30.5 (d, 2JCP1 = 10. 7 Hz, CH3-NPl), 38. 4 (s, CH2-N-P1), 46. 3 (s, CH2CH3), 52. 9 (d, 3JCP1 = 7. 8 Hz, CH2-CH2-NPl), 120. 8 (s, C02), 127. 3 (s, C03), 132. 7 (s, C04), 135.4 (d, 3JCP1 = 12. 5 Hz, CH=N), 150. 4 (d, 2jcpo = 5. 1 Hz, C01). Dendrimère 3- [G2] (rendement = 95%). 31p {IHI NMR(CDCl3): 8 = 8.4 (PO), 62.9 (P1), 68.1 (P2). 1H NMR (CD2C12): 8 = 0. 9 (t, 3JHH = 7 Hz, 144 H, CH2CH3), 2. 2-2.5 (m, 144 H, CH2-N(CH2CH3)2), 2. 9 (m, 48 H, CH2-N-P2), 3. 0 (d, 3JHP2 = 9. 2 Hz, 36 H, CH3N-P2), 3.2 (d, 3JHP1= 10 Hz, 18 H, CH3-N-PI), 4. 0 (br m, 24 H, N-H), 6. 9-7.1 (m, 36 H, C02-H, Ci2-H), 7. 4-7.7 (m, 54 H, CH=N, C03-H, C-H). 13C {1H} NMR (CDC13): 8 = 11.4 (s, CH2CH3),30.6 (d, 2JCP2 = 10. 8 Hz, CH3-NP2), 32.9 (d, 2JCP1= 11.8 Hz, CH3-N-P1), 38.3 (s, CH2-N-P2), 46.3 (s, CH2CH3), 52. 9 (d, 3JCP2 = 7.8 Hz, CH2-CH2-N-P2), 121.1 (s, C02, C 1 2), 127. 4 (s, C13), 128. 1 (s, C03), 132. 0 (s, C04), 133. 1 (s, C14), 135. 1 (d, 3JCP2 = 12.4 Hz, CH=N), 138. 6 (d, 3JCp = 15.4 Hz, CH=N), 150.3 (d, 2JCp = 7.3 Hz, C 11 ), 151.1 (s, CO l ). Dendrimère 3-[G3] (rendement = 95%). 31 p { 1 H} NMR (CDCI3): 8 = 8.5 (PO), 62.9 (Plj2), 68.1 (P3). 1H NMR (CD2C12): 8 = 0.9 (t, 3JHH = 6. 4 Hz, 288 H, CH2CH3), 2. 2-2.5 (br m, 288 H, CH2-N(CH2CH3)2), 2. 9 (br m, 96 H, CH2-N-P3), 3.0 (d, 3JHP3 = 9. 2 Hz, 72 H, CH3-N-P3), 3.2-3.4 (br m, 54 H, CH3-N-P 1 2), 4.0 (br s, 48 H, N-H), 6.9-7.3 (br m, 84 H, C02-H, C,2-H, C22-H), 7.4-7.7 (br m, 126 H, CH=N, C03-H, Cj3-H, C23-H). 13C {IHI NMR (CDC13): 8 = 11.4 (s, CH2CH3), 30.6 (d, 2JCp3 = 10.3 Hz, CH3-NP3), 32.5 (d, 2JCp = 12.7 Hz, CH3-N-Plj2), 38.4 (s, CH2-N-P3), 46.4 (s, CH2CH3), 53.0 (d, 3JCP3 = 7.9 Hz, CH2-CH2-N-P3), 121.4 (s, C02, CI 2, C22), 127.5 (s, C23), 128.2 (s, Cp3, Ci3), 132.0 (s, C04), 132.3 (s, C14), 133.1 (s, C24), 135.2 (d, 3JCP3 = 12.1 Hz, CH=N), 138.8 (d, 3JCp = 12.1 Hz, CH=N), 150.4 (d, 2JCp2 = 6.8 Hz, C21), 151.2 (d, 2JCp = 6.3 Hz, CO1, C11). Dendrimère 3-[G4] (rendement = 95%). 31p {lH} NMR (CDC13): 8 = 8.4 (PO), 62.4 (P 1,2,3), 68.0 (P4). 1H NMR (CD2C12): 8 = 0. 8 (br s, 576 H, CH2CH3), 2. 4 (br s, 576 H, CH2N(CH2CH3)2), 2. 6-3.4 (br m, 462 H, CH3-N-P1,2,3,4, CH2-N-P4), 4. 0 (br m, 96 H, N-H), 7. 0-7.7 (m, 450 H, C6H4, CH=N). 13C {1H} NMR (CDC13): 8 = 11. 6 (s, CH2CH3), 30. 6 (d, 2JCP4 = 10. 4 Hz, CH3-N- P4), 33.0 (d, 2JCP = 12.6 Hz, CH3-N-Pij2j3), 38.5 (s, CH2-N-P4), 46.4 (s, CH2CH3), 53.1 (d, 3JCP4 = 7.7 Hz, CH2-CH2-N-P4), 121.5 (s, C2), 121.8 (s, C02, C12, C22), 127.5 (s, C33), 128.3 (s, C 0 3, C13, C23), 132.2 (s, C04, C14, C24), 133.2 (s, C34), 135.1 (d, 3JCP4 = 12.0 Hz, CH=N), 138.7 (br s, CH=N), 150.5 (d, 2JCP2 - 7.4 Hz, C31), 151.3 (br m, CO1, C11, C21). Dendrimère 3-[Gg] (rendement = 95%). 31p { 1H} NMR (CDC13): 8 = 62.4 (P1,2,3,4), 68.0 (P5). 1H NMR (CD2C12): 8 = 1.0 (br s, 1152 H, CH2CH3), 2.4 (br s, 1152 H, CH2N(CH2CH3)2), 2.7-3.5 (br m, 942 H, CH3-N-P1,2,3,4,5 CH2-N-P5), 4.1 (m, 192 H, N-H), 7.0-7.8 (m, 930 H, C6H4, CH=N). 13C {lHl NMR (CDC13): 8 = 11.5 (s, CH2CH3), 30.5 (d, 2JCPS = 11.1 Hz, CH3-N- P5), 33. 0 (d, 2JCP = 12.3 Hz, CH3-N-P1,2,3,4), 38. 4 (s, CH2-N-P5), 49. 4 (s, CH2CH3), 53.0 (d, 3JCP5 = 8. 1 Hz, CH2-CH2-N-P5), 121. 4 (s, C42), 121. 7 (s, C02, C12, C2 2,, C32), 127.4 (s, C43), 128.1 (s, C03, C13, C23, C33), 132.1 (s, Coq C14, C24, C34), 133.1 (s, C44), 135.1 (d, 3JCp5 = 12.1 Hz, CH=N), 138.7 (br s, CH=N), 150.5 (d, 2JCP3 = 6.6 Hz, C4l), 151.2 (d, 2JCp 6.2 Hz, Cq1, C, C2l, C3l). - Procédures générales pour la synthèse des produits de type 4-[Gn] Une solution comprenant 100 mg de dendrimères neutres 3-[Gn] (n=1, 36 mmol ; n=2, 15 mmol ; n=3, 7 mmol ; n=4, 3,3 mol ; n=5, 1,6 mmol) et de l'iodure de méthyle (n=l, 27 (il, 0,43 mmol ; n=2, 22 fll, 0,36 mmol ; n=3, 21 p.l, 0,34 mmol ; n=4, 20 l, 0,32 mmol ; n=5, 19 l, 0,31mmol) dans 15ml de DMF a été agitée toute la nuit à température ambiante. La solution a été séchée par évaporation. La pâte obtenue a été lavée avec 20 ml d'un mélange pentane/éther (1/1, v/v) pour obtenir une poudre jaune de dendrimères méthylés dénommés 4-[Gn]. Dendrimère 4-[G1] (rendement = 90%). 31P{1H} NMR (DMSO-d6): 8 = 7.3 (PO), 68. 1 (Pl). 1H NMR (DMSO- 13C {lH} NMR (DMSO-d6): 8 = 7.8 (s, CH2CH3), 32.6 (d, 2JCP1 = 9.5 Hz, CH3-N- Pl), 34.9 (s, CH2-N-P1), 47. 3 (s, +N-CH3), 56. 4 (s, CH2CH3), 58.8(s, CH2-CH2-NPl), 120. 7 (s, C02), 128.3 (s, C03), 133.2 (s, C04), 137.4 (d, 3JCP1 = 14. 2 Hz, CH=N), 149. 9 (s, C01). Dendrimère 4-[G2] (rendement quantitatif). 31 p f 1 H] NMR (DMSO-d6): 8 = 7.3 (PO), 61.7 (P 1 ), 68.1 (P2). 1H NMR (DMSO-d6): 8 = 1.3 (t, 3JHH = 6.2 Hz, 144 H, CHCH3), 3.1 (s, 72 H, +NCH3), 3.2-3.6 (m, 246 H, CH3-N-P12, CH2), 5.7 (br s, 24 H, N-H), 7.0-7.4 (m, 36 H, C02-H, C 1 2-H), 7.7-8.2 (m, 54 H, CH=N, C03-H, Ci3-H). 13C {1H} NMR (DMSO-d6): 8 = 7. 8 (s, CH2CH3), 32.2 (d, 2JCP2 = 8.9 Hz, CH3-N- P2), 33.5 (d, 2JCP1 = 12. 9 Hz, CH3-N-P1), 34. 9 (s, CH2-N-P2), 47. 3 (s, +N-CH3), 56. 4 (s, CH2CH3), 58. 8 (d, 3JCP2 = 3. 3 Hz, CH2-CH2-N-P2), 121. 3 (s, C12, C02), 128.2 (s, C13), 128.6 (s, C03), 132.3 (s, C04), 133.2 (s, C14), 137.1 (d, 3JCp2 = 12.3 Hz, CH=N), 140.7 (br s, CH=N), 150.1 (d, 2JCP 1 = 6 Hz, C 11 ), 150.5 (s, CO 1 ). Dendrimère 4-[G3] (rendement quantitatif). 31p {lH} NMR (DMSO-d6): 5= 6.9 (PO), 61.9 (P1,2), 68.1 (P3). 1H NMR (DMSO-d6): # = 1.3 (br s, 288 H, CH2CH3), 3.1(s, 144 H, +N-CH3), 3.1- 3.6 (m, 510 H, CH3-N-P2,3, CH2), 5.5 (br s, 48 H, N-H), 7.0-7.4 (m, 84 H, C02-H, C12-H, C22-H), 7.7-8.2 (m, 126 H, CH=N, C03-H, C13-H, C23~H). 13C {lH} NMR (DMSO-d6): 8 = 7. 7 (s, CH2CH3), 32. 2 (d, 2JCP3 = 9. 4 Hz, CH3-NP3), 33. 5 (m, CH3-N-P1,2), 34. 9 (s, CH2-N-P3), 47.3 (s, +N-CH3), 56. 4 (s, #2CH3), 58. 8 (d, 3JCP3 = 4. 8 Hz, CH2-CH2-N-P3), 121. 0 (br s, C02, C12, C22), 128.5 (br s, C03, C13, C23), 132.3 (s, C04, C14), 133.2 (s, C24), 137.1 (d, 3JCP3 = 12. 1 Hz, CH=N), 141. 0 (br s, CH=N), 150. 1 (d, 2JCP2 = 6. 2 Hz, C21), 150. 7 (br s, C01, C11). Dendrimère 4-[G4] (rendement quantitatif). 31p {lH} NMR (DMSO-d6): 8 = 6.3 (PO), 61.6 (Pij2,3), 68.0 (P4). 1H NMR (DMSO-d6): 8 = 1.3 (br s, 576 H, CH2CH3), 3.1 (s, 288 H, +N-CH3), 3.1- 3.6 (m, 1038 H, CH3-N-P1,2,3,4, CH2), 5.5 (br s, 96 H, N-H), 7.1-8.5 (m, 450 H, C6H4, CH=N). 13C {lH} NMR (DMSO-d6): # = 7. 8 (s, CH2CH3), 32. 2 (d, 2JCP4 = 9. 5 Hz, CH3-N- P4), 33.6 (d, 2JCP = 7.6 Hz, CH3-N-P12,3), 34.9 (s, CH2-N-P4), 47.3 (s, +N-CH3), 56. 4 (s, CH2CH3), 58.7 (d, 3JCP4 = 4.8 Hz, CH2-CH2-N-P4), 121. 2 (br s, 02, CI 2@ C22, C32), 128. 2 (br s, C03, Ci3, C23 , C33), 132.2 (s, C04, C14, C24), 133.2 (s, C34), 137.1 (d, 3JCP4 = 9. 4 Hz, CH=N), 140. 8 (br s, CH=N), 150.0 (d, 2JCp2 = 6.2 Hz, C31), 150.7 (br s, Cpl, C11, C21). Dendrimère 4-[G5] (rendement quantitatif). 31p {l} NMR (DMSO-d6): 8 = 61.6 (P1,2,3,4) 68.0 (P5). 1H NMR (DMSO-d6): 8 = 1.3 (br s, 1152 H, CH2CH3), 3.1 (s, 576 H, +N-CH3), 3.1- 3.6 (m, 2094 H, CH3-N-P1,2,3,4,5 CH2), 5.4 (m, 192 H, N-H), 7.2-8.5 (m, 930 H, C6H4 , CH=N). 13C{1H} NMR (DMSO-d6): 8 = 7. 8 (s, CH2CH3),32.3(br s, CH3-N-P5), '33.5 (br s, CH3-N-P1,2,3,4), 34.9 (s, CH2-N-P5), 47.3 (s, +N-CH3), 56.4 (s, CH2CH3), 58.8 (d, 3jcp = 5.0 Hz, CH2-CH2-N-P5), 121.3 (br s, Cp2, C12, C22, Bzz C42), 128.2 (br s, C03, Ci3, C23, C33, C43), 132.2 (s, C04, C14, C24, C34), 133.2 (s, C44), 137.2 (d, 3JCP4 = 9.7 Hz, CH=N), 141.2 (br s, CH=N), 150.1 (d, 2JCP2 = 6.0 Hz, C41), 150.7 (br s, Cpl, C11, C21, C31). - Procédures générales pour la synthèse des produits de type 5-[Gn] La résine à fort pouvoir échangeur d'anions AG1-X8 a été ajoutée à une suspension de 100 mg de dendrimères méthylés 4-[Gn], (sous forme d'iodures), (n=l, 22 umol ; n=2, 10 tmol ; n=3, 4,7 mol ; n=4, 21 umol ; n=5, 1,1 umol) dans l'eau distillée (n=l, 25 ml ; n=2, 23 ml ; n=3, 22 ml ; n=4, 21 ml ; n=5 ; 20 ml), dans les proportions indiquées (n=l, 1,24 g ; n=2, 1,13 g ; n=3, 1,06 g ; n=4, 1,03 g ; n=5, 1 g) et mélangée doucement pendant une heure. La pâte obtenue a été lavée avec 20 ml d'un mélange pentane/ether (1/1, v/v) pour obtenir une poudre blanche de dendrimères méthylés, sous forme acétate, dénommés 5-[Gn]. 8 à 10 % des ramifications terminales sont modifiées lors de l'échange de contre-ions avec la résine et ont été provisoirement attribués à une forme déméthylée puisque les résultats de RMN étaient identiques à ceux des dendrimères neutres portant des amines tertiaires (3-[Gn], (Ces ramifications terminales mineures ont été indiquées par une astérisque dans les résultats de RMN présentés ci-dessous et les rendements correspondent (n=l, 1,24 g ; n=2, 1,13 g ; n=3, 1,06 g ; n=4, 1,03 g ; n=5, 1 g) t à ceux du dendrimère total. Dendrimère 5-[G1] (rendement = 90%). 31 p ( 1 H} NMR (CD30D): 8 = 7.8 (PO), 69.8 (Pl *), 70.3 (PU. 1H NMR (DMSO-d6): 8 = 1.0 (t, 3JHH 6.9 Hz, 6 H, CH2CH3*), 1.3 (t, 3JHH = 6.5 Hz, 66 H, CH2CH3), 1.7 (s, 33 H, CH3COO-), 2.5 (m, 6 H, CH2*-N(CH2*CH3)2), 3.1 (s, 33 H, +N-CH3), 3. 2 (d, 3JHP1 = 8. 3 Hz, 18 H, CH3-N-P1), 3. 3-3.7 (m, 90 H, CH2), 7.1 (d, 3JHH = 8.3 Hz, 12 H, C02-H), 7. 6 (b, 12 H, N-H), 7. 8 (s, 6 H, CH=N), 7. 8 (d, 3JHH = 8. 3 Hz, 12 H, C03-H). 13C {1H} NMR (DMSO-d6): 8 = 7. 6 (s, CH2CH3), 11. 9 (s, CH2C*H3), 25. 6 (s, CH3 COO-), 32. 2 (d, 2JCP = 9. 5 Hz, CH3-N-P1), 38.8 (s, CH2-N-Pi), 46. 6 (s, C*H2CH3), 47. 0 (s, +N-CH3), 54. 5 (s, C*H2-CH2-N-P1), 56. 2 (s, CH2CH3), 59. 1 (d, 3JCP1 = 5.3 Hz, CH2-CH2-N-Pl), 120.6 (s, C02), 127.9 (s, C03), 133.7 (s, C04), 135.8 (d, 2JCP0 = 10.8 Hz, CH=N), 149.8 (s, Col), 173.7 (s, CH3COO-). UV-vis (H20): #max (s, M-1 x cm-1) 284 nm (1. 2 x 105). Dendrimère 5-[G2] (rendement = 95%). 31p {1 H} NMR (CD30D): b = 8.4 (PO), 62.3 (P1), 69.5 (P2*), 70.1 (P2). 1H NMR (DMSO-d6): 8 = 1.0 (br t, 12 H, CH2CH3*), 1.3 (br s, 132 H, CH2CH3), 1.7 (s, 66 H, CH3COO-), 2.5 (br m, 12 H, CH2*-N(CH2*CH3)2), 3.1 (s, 66 H, +NCH3), 3.2-3.6 (m, 234 H, CH3-N-P12, CH2), 7.1-7.3 (br m, 36 H, C02-H, C12-H), 7. 6 (br s, 24 H, N-H), 7. 7 (s, 12 H, CH=N), 7.8-8.1 (br m, 42 H, CH=N, C03-H, CI.) H). 13C {1H} NMR (DMSO-d6): 8 = 7. 6 (s, CH2CH3), 11. 9 (s, CH2C*H3), 25. 6 (s, CH3COO-), 32. 1 (d, 2JCP2 = 9.3 Hz, CH3-N-P2), 33.2 (d, 2JCP1 = 13.4 Hz, CH3-NPl), 35.0 (s, CH2-N-P2), 46. 6 (s, C*H2CH3), 47. 0 (s, +N-CH3), 54. 5 (s, C*H2-CH2N-P2), 56. 2 (s, CH2CH3), 59. 1 (d, 3JCP2 = 5.3 Hz, CH2-CH2-N-P2), 121.3 (s, C02, C12), 127.9 (s, Cl3), 128.5 (s, C03), 132.3 (s, C04), 133.8 (s, C14), 135.7 (br s, CH=N), 149. 8 (d, 2JCP1 = 6-5 Hz, CI 1), 150. 7 (s, C01), 173. 7 (s, CH3COO-). UV-vis (H20): #max (s, M-1 x cm-1) 284 nm (4. 1 x 105). Dendrimère 5-[G3] (rendement = 95%). 31p 1H NMR (CD30D): 8 = 8.4 (PO), 62.3 (P 1,2), 69.5 (P3*), 70.1 (P3). 1H NMR (DMSO-d6): 8 = 1.0 (br t, 30 H, CH2CH3*), 1.3 (br s, 258 H, CH2CH3), 1.7 (s, 129 H, CH3COO-), 2.5 (br m, 30 H, CH2*-N(CH2*CH3)2), 3.1 (s, 129 H, +NCH3), 3.1-3.6 (m, 480 H, CH3-N-P1,2,3 CH2), 7.1-7.5 (br m, 108 H, C02-H, C-H, C22-H, N-H), 7.5-8.1 (br m, 126 H, CH=N, Co3-H, C 13-H, C23-H). 13C {1H} NMR (DMSO-d6): # = 7. 6 (s, CH2CH3), 11. 9 (s, CH2C*H3), 25. 2 (s, CH3COO-), 32.1 (d, 2JCP3 = 9.0 Hz, CH3-N-P3), 33.2 (br m, CH3-N-P1,2), 35.0 (s, CH2-N-P3), 46. 6 (s, C*H2CH3), 47. 1 (s, +N-CH3), 54. 5 (s, C*H2-CH2-N-P3), 56.3 (s, CH2CH3), 59.1 (d, 3JCP3 = 5.7 Hz, CH2-CH2-N-P3), 121.3 (br s, C02, Ci2, C22), 128.0 (s, C23), 128.5 (s, C03, C13), 132.4 (s, C04, C14), 133.8 (s, C24), 136.3 (br d, C24-CH=N), 141. 0 (br m, CH=N), 150.1 (d, 2JCP2 = 6.3 Hz, C21), 151. 0 (d, 2JCp = 7.1 Hz, CO 1, CI 1), 173.7 (s, CH3COO-). UV-vis (H20): #max (s, M-1 x cm-1) 286 nm (7. 4 x 105). Dendrimère 5-[G4J (rendement = 95%). 31 pu 1 H} NMR (CD30D): 3 = 8.2 (Po), 62.2 (P 1 23), 69.9 (P4). 1H NMR (DMSO-d6): 8 = 1.0 (br m, 60 H, CH2CH*), 1.3 (br s, 516 H, CH2CH3), 1.7 (s, 258 H, CH3COO-), 2.5 (m, 60 H, CH2*-N(CH2*CH3)), 3.1 (s, 258 H, +NCH3), 3.1-3.6 (m, 978 H, CH-N-P12,3,4 CH2), 7.0-8.2 (m, 546 H, C6H4, CH=N, N-H). 13C {1H} NMR (DMSO-d6): # = 7. 6 (s, CH2CH3), 11. 9 (s, CH2C*H3), 24. 7 (s, CH3COO-), 32. 1 (d, 2JCP4 = 9. 6 Hz, CH3-N-P4),33.2 (d, 2JCP = 11.2 Hz, CH3-N- P1,2,3) 35.0 (s, CH2-N-P4), 46.6 (s, C*H2CH3), 47.0 (s, +N-CH3), 54.5 (d, 3JCP4 = 3. 9 Hz, C*H2-CH2-N-P4), 56.3 (s, CH2CH3), 59. 2 (d, 3JCP4 = 5.7 Hz, CH2-CH2-N- P4), 121.2 (s, C32), 121.6 (s, C02, C12, C22), 127.9 (s, C33), 128.5 (s, C03, C13, C23), 132.3 (s, C04, C14, C24), 133.7 (s, C4), 135.8 (br s, C34-CH=N), 141.0 (br s, CH=N), 149.9 (d, 2JCp3 = 6.3 Hz, C31), 151.0 (br m, C01,C11, C21), 173.7 (s, CH3COO-). UV-vis (H20): #max (s, M-1x cm-1) 288 nm (1. 6 x 106). Dendrimère 5-[G5] (rendement = 95%). 3 1 p {l H} NMR (DMSO-d6): ô = 62.2 (P1,2,3,4) 69.9 (P5). 1H NMR (DMSO-d6): ô = 1.0 (m, 114 H, CH2CH3*), 1.3 (m, 1038 H, CH2CH3), 1.7 (s, 519 H, CH3COO-), 2.5 (m, 114 H, C#2*-N(C//2*CH3)2), 3.1 (s, 519 H, +NCH3), 3.1-3.6 (m, 1980 H, CH3-N-P1,2,3,4,5 CH2), 7.0-8.2 (m, 1122 H, C6H4, CH=N, N-H). 13C {1H} NMR (DMSO-d6): # = 7. 6 (s, CH2CH3), 11. 9 (s, CH2C*H3), 24. 7 (s, CH3COO-), 32. 1 (d, 2JCP5 = 9. 6 Hz, CH3-N-P5), 33. 2 (d, 2JCp = 11.2 Hz, CH3-N- p1,2,3,4) 35.0 (s, CH2-N-P5), 46.6 (s, C*H2CH3), 47.0 (s, +N-CH3), 54.5 (d, 3JCP5 = 3.9 Hz, C*H2-CH2-N-P5), 56.3 (s, CH2CH3), 59.2 (d, 3JCP5 = 5.7 Hz, CH2-CH2N-PS), 121.2 (s, C02, CI 2, C22, C32, C42), 127.9 (s, C4), 128.5 (s, C03, C 13, C23, C33), 132.3 (s, C04, C,4, C24, C34), 133.7 (s, C44), 135.9 (br s, C44-CH=N), 141.0 (br s, CH=N), 149.9 (d, 2JCP3 = 6.5 Hz, C41 ), 151.0 (br m, CO 1, C 11, C21, C31), 173. 7 (s, CH3COO-). UV-vis (H20): #max (#, M-1 x cm-1) 284 nm (3. 7 x 106). EXEMPLE 2 : Expériences de transfection. Les résultats obtenus avec ces différents dendrimères phosphorés polycationiques ont toujours montré une efficacité optimale avec un rapport de charges N/P compris entre 5 (figure 4) et 10 (figure 5) (rapport N/P=nombre d'atomes d'azote terminaux du dendrimère par phosphate de l'ADN). Ainsi, il a été décidé de façon arbitraire de comparer l'efficacité de transfection de différentes générations de dendrimères phosphorés (P-dendrimères) avec celle du PEI linéaire ExGen 500, possédant 5 à 10 équivalents amines par nucléotide. Avec 5 équivalents de charges positives par phosphate de l'ADN, les 5 différentes générations de dendrimères protonés de type 2-[Gn], testés sous forme de chlorhydrates, ont permis d'obtenir une expression significative du transgène. Une augmentation de 105 à presque 109 unités relatives de luminescence (RLU)/mg de protéine a été observée. L'efficacité de transfection augmente avec la taille du dendrimère (nombre de génération) mais atteint un plateau à partir de la troisième génération, avec des valeurs comprises entre 108et 109RLU (Fig. 4). Par conséquent, 2-[G4] a été choisi pour étudier plus en détail, l'efficacité de transfection de ces nouveaux dendrimères cationiques phosphorés, dont la structure est présentée sur la figure 2. Il faut remarquer que les transfections effectuées en présence de sérum conduisent à une plus faible toxicité. De ce fait un niveau d' expression plus élevé est observé pour les transfections effectuées en présence de sérum par rapport à celles effectuées sans sérum (Fig. 4A et 4B), panneaux droits et gauches, respectivement). Sans essayer d'optimiser davantage leurs conditions de transfection, les dendrimères de la troisième à la cinquième génération se sont révélés aussi efficaces que le PEI linéaire utilisé en conditions optimales. En revanche, les formes méthylées 5-[Gn] se sont montrées plutôt toxiques et peu efficaces pour transfecter des acides nucléiques dans des cellules eucaryotes (Fig 5A et 5B). Ce phénomène peut s'expliquer du fait d'une densité de charge positive stable qui peut perturber la membrane cellulaire et provoquer la mort cellulaire. La diminution de la densité de charge des formes méthylées n'est pas réalisable sans dégrader le dendrimère, en revanche la densité de charge des dérivés chlorures (2-[Gn] peut être modulée par des modifications micro-environnementales du pH lorsqu'ils approchent la membrane cellulaire. De plus, la possibilité de moduler la densité de charge des dérivés chlorures des dendrimères joue peut-être un rôle clé dans le relargage du gène luciférase à partir de l'endosome. Ces dendrimères se comportent peut-être comme des réservoirs à proton dans les compartiments cellu- laires, leur densité de charge étant contrôlée d'une part par des pompes à protons couplées à des ATPases et d'autre part par des modifications intracellulaires de la concentration en chlorures. La possibilité de réduire la densité de charge cationique de ces dendrimères phosphorés, à l'intérieur ou à l'extérieur des cellules, serait un avantage pour la réalisation d'expériences in vivo, comme cité précédemment (26). - Produits chimiques Le PEI linéaire de 22 kDa (ExGen 500) a été fourni par Euromedex (Souffelweyersheim, France). - Lignées et culture cellulaires. Les fibroblastes murins NIH3T proviennent de l'ATCC (Rockville, MA, USA) et sont cultivés en milieu Dulbecco modifié par Eagle (DMEM). Les milieux de culture sont supplémentés avec 10 % de sérum de veau foetal (D. Dutscher, Brunath, France), 2 mM L-glutamine (Gibco-BRL), 100 unités/ml de pénicilline (Gibco-BRL) et 100 g/ml de streptomycine (Gibco-BRL). Les cellules sont maintenues à 37 C, en atmosphère humide contenant 5 %de CO2. Lorsque les cellules atteignent 80 % de confluence, elles sont décollées par une solution saline de trypsineEDTA (Gibco-BRL), diluées d'un facteur dix et cultivées dans un nouveau flacon. - Plasmides PCMV-luc, codant pour la luciférase de Photinus pyralis, sous le contrôle des séquences promoteur/enhanceur du cytomégalovirus ont été gracieusement fournies par le Dr. M. Scarpa (CRIBI, padoue, Italie). Les plasmides ont été purifiés sur des colonnes Qiagen (Rockford, USA), à partir de la souche XL1 d'E. Coli transformée. Transfection des cellules Les cellules adhérentes ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits (Costar, D. Dutscher, France), la veille de la transfection, de façon à atteindre 60 à 70 % de confluence, le jour de la transfection. Toutes les expériences ont été faites en triple. Les cellules ont été rincées avant la transfection et 1 ml de milieu avec ou sans sérum a été ajouté dans chaque puits. 2 g de plasmide (solution à 1,5 mg/ml en tampon 10 mM Tris-1mM EDTA, pH 7,4) ont été dilués dans 50 l de NaCl0,15 M. Le rapport N/P (azote:phosphate) correspond à la quantité de polymère nécessaire pour avoir un résidu amine (43Da=poids moléculaire moyen (Mw) pour le PEI ; pour les dendrimères la molarité en azote des résidus amine a été calculée en divisant le Mw par le nombre de charges pour chaque génération), par phosphate d'acide nucléique (Mw330), (12). La quantité nécessaire de PEI linéaire (ExGen500) et de dendrimères (à partir de solutions stock de PEI et de dendrimères correspondant à 10 mM d'azote, sous forme amine, dans l'eau MilliQ stérile) a été diluée dans 50 l de NaCl 0,15 M, vortexée doucement et centrifugée. Après 15 min, le vecteur cationique a été ajouté en une seule fois, à la solution de plasmide [et pas dans l'ordre inverse, (12) ] puis le mélange a été vortexé et centrifugé. Les quantités et les volumes indiqués ci-dessus correspondent à un puits et ont en fait été multipliés par trois et distribués dans trois puits. Après 10 min, le mélange a été ajouté sur les cellules et le surnageant a été réparti de façon homogène par une légère rotation manuelle horizontale. Tout de suite après, la plaque de culture a été centrifugée (Sigma 3K10, Bioblok, France), pendant 5 min à 1500 rpm (280 g). Après 2 à 3 heures d'incubation, 110 (il de sérum de veau foetal a été ajouté aux puits sans sérum. Les cellules ont été cultivées pendant 24 h puis l'expression du gène rapporteur a été testée. - Mesure de la luciférase L'expression du gène luciférase a été mesurée par luminescence. Le milieu de culture a été enlevé et le lysat cellulaire a été récolté après incubation de 30 min à température ambiante dans le tampon de lyse 1x (Promega, USA). Le lysat a été vortexé doucement et centrifugé à 140000 rpm(17530 g), pendant 5 min, à 4 C. 20 l de lysat ont été dilués dans 100 l de tampon de réaction luciférase (Proméga, USA) et la luminescence a été mesurée pendant 10 sec (Mediators PhL, Vienne, Autriche). Les résultats ont été exprimés en unité de luminescence par mg de protéine (mesuré par le test BCA, Pierce). EXEMPLE 3 : Pourcentages de viabilité des cellules transfectées conformément à l'exemple 2. Dendrimères-N Et2H, CI- Dendrimères-N EhMe, CH3C02- 5 équivalents 10 équivalents 5 équivalents 10 équivalents Gi 95 105 G1 90 88 G2 91 83 G2 91 101 G3 83 -ni 90 G3 87 99 G4 94 91 G4 99 95 G5 90 80 G5 108 92 PE1linéaire : 5 équivalents : 69 ; 10 équivalents : 84 PE1réticulé : 5 équivalents : 102 ; 10 équivalents : 91 RÉFÉRENCES [1] A. D. 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Rev. 1997, 97, 1681-1712. [22] K. W. Pollak, J. W. Leon, J. M. J. Fréchet, M. Maskus, H. D. Abruna, Chem. Mater. 1998, 10, 30-38. [23] E. Wagner, M. Cotten, R. Foisner, M. L. Bimstiel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 4255-4259. [24] E. Wagner, C. Plank, K. Zatloukal, M. Cotten, M. L. Bimstiel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 7934-7938. [25] J. F. Kukowska-Latallo, A. U. Bielinska, J. Johnson, R. Spindler, D. A. Tomalia, J. R. Baker, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 4897-4902. [26] J. S. Remy, A. Kichler, V. Mordinov, F. Schuber, J. P. Behr, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 1744-1748. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en #uvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 ) Dendrimères phosphorés polycationiques, caractérisés en ce qu'ils sont constitués : - d'une couche centrale sous la forme d'un noyau central Po comprenant 2 à 8 groupements fonctionnalisés, - de n couches intermédiaires, identiques ou différentes, chacune desdites couches intermédiaires étant constituée d'unités P1 répondant à la formule II : dans laquelle : L est un atome d'oxygène, de phosphore ou de soufre, M représente l'un des groupes suivants : # un groupe aromatique di-, tri- ou tétrasubstitué par des groupes alkyles, des groupes alcoxys, des groupements insaturés du type oléfinique en C1-C12, azoïque, acétylènique, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, ou # un groupe alkyle ou alcoxy comportant plusieurs substituant tels que définis lorsque M est un groupe aromatique, R1 et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, de soufre, d'azote ou des halogènes avec R2 étant le plus souvent différent de R1, n est un nombre entier compris entre 1 et 11, E est un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote, ledit atome d'azote pouvant être lié à un groupe alkyle, alcoxy ou aryle, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, - une couche externe constituée d'unités R2, identiques ou différentes, et répondant à la formule III : dans laquelle : R5 représente un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, W représente l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, tous ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes. R3 et R4 qui peuvent être identiques ou différents représentent un groupe en C1-C5, X représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C5 ou est nul et Z représente un ion halogènure, un groupe alkylCOO- ou tout autre groupement anionique comportant des atomes de carbone, d'oxygène, de soufre, d'azote, de phosphore ou d'halogènes, ou est nul. 2 ) Dendrimères selon la revendication 1, caractérisés en ce que le noyau central Po est sélectionné dans le groupe constitué par le groupement de formule générale la : N% -N (i) ou le groupement de formule générale Ib : S=P 3 ) Dendrimères selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisés en ce qu'ils présentent des unités terminales de formule III, dans lesquelles X représente un atome d'hydrogène, R5 est un atome d'hydrogène, W représente un groupe (CH2)2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyle, Z est un ion chlorure et n est un nombre entier compris entre 1 et 11. 4 ) Dendrimères selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisés en ce qu'ils présentent des unités terminales de formule III, dans lesquelles X représente un groupe méthyle, R5 est un atome d'hydrogène, W représente un groupe (CH2)2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyle, Z est un groupe CH3COO- et n est un nombre entier compris entre 1 et 11. 5 ) Composition capable d'agir comme agent de transfection d'une séquence d'acide nucléique vers une cellule eucaryote, caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique et un dendrimère phosphoré polycationique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, opérativement couplé audit acide nucléique. 6 ) Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 7 ) Composition selon la revendication 5 ou la revendication 6, caractérisée en ce que le rapport N/P, dans lequel N correspond aux groupes cationiques terminaux du dendrimère (amines chargées) et P correspond aux groupes phosphates dudit acide nucléique, est compris entre5 et 10. 8 ) Composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un agent de perméabilisation de la membrane capable de transporter ledit acide nucléique à travers les membranes cytoplasmiques ou endosomales de ladite cellule eucaryote. 9 ) Composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que ledit dendrimère phosphoré polycationique est associé de manière non-covalente avec ledit acide nucléique.