Brevet FR2801056A1 — publié le 20010518

La présente invention est relative à une protéine présente à la surface des cellules souches hématopo'étiques de la lignée lymphoïde (cellules pré-T, cellules pré-B et cellules pré- NK) et des cellules NK matures, à la séquence isolée d'ADNc correspondante ainsi qu'à leurs applications en tant que marqueur desdites cellules et pour la préparation d'anticorps dirigés contre ladite protéine; la présente invention est également relative aux applications desdits anticorps dans la sélection de cellules exprimant à leur surface ladite protéine. De tels anticorps sont notamment utiles dans la déplétion de la moelle osseuse ou du sang de cordon ombilical en cellules NK, avant une greffe de moelle osseuse, en vue de réduire le rejet de cette dernière et la GVHD. Les cellules NK représentent 10 à 15 % des cellules mononucléées du sang périphérique. On admet qu'elles constituent une troisième lignée lymphocy- taire à côté des cellules B et T; elles ont été définies comme de gros lymphocytes à grains (LGL) qui n'expriment à leur surface ni le complexe moléculaire CD3, ni les chaînes cx, 3, y du récepteur T, portent les marqueurs CD16 et CD56 chez l'homme, NK.1/NK2.1 chez la souris et exercent une action cytolytique qui ne requiert pas l'expression d'antigènes de classe I ou II du CMH à la surface des cellules cibles. On ne connaît pas d'antigène de surface exprimé uniquement par les progéniteurs de la lignée lymphoide (cellules pré-T, pré-B et pré-NK) et les cellules NK matures. Deux marqueurs sont utilisés pour distinguer opérationnellement les cellules NK des autres populations Iymphocytaires. Il s'agit de l'antigène CD56 et du récepteur de basse affinité pour le fragment Fc des immunoglobulines ou CD 16. Bien que la plupart des cellules NK puissent être considérées comme CD3-, CD16+, CD56+, il existe une grande hétérogénéité phénotypique et fonction- nelle dans cette population de cellules; la plupart des lymphocytes CD56+ du sang périphérique expriment aussi la molécule CD16; environ 10% des cellules NK du sang périphérique sont CD16-, tout en exprimant à haute densité le CD56. Il a été suggéré que les lymphocytes CD16- CD56f " pourraient être les précurseurs des faible lymphocytes NK CD 16+ CD56aibl. Toutefois, dans la mesure o certaines cellules T expriment à la fois la molécule CD 16 et la molécule CD56, ces deux molécules ne sont pas spécifiques de la population des cellules NK du sang périphérique. Les cellules NK présentent une activité cytolytique naturelle qui s'exerce directement, sans nécessiter d'immunisation préalable et ne requiert pas la présence sur la cellule cible d'antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité et une cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). L'ADCC est initiée par la liaison de l'anticorps fixé sur la cellule cible avec le récepteur Fc (CD16) de la cellule effectrice. Les cellules NK jouent donc un rôle important dans la défense de l'hôte contre les infections virales et dans la surveillance immune vis-à-vis des cellules tumorales. Les cellules NK peuvent induire une forme primitive d'alloreconnaissance qui contribue au rejet de la greffe lors d'une transplantation allo- génique ainsi qu'à une maladie du greffon contre l'hôte (GVHD ou " graft versus host disease "). Pour ces raisons une identification fiable des cellules NK dans la popula- tion de cellules mononucléées ainsi que de l'ensemble des cellules précurseurs de la lignée lymphoïde est importante. Un certain nombre de documents proposent des méthodes de déplé- tion de la moelle osseuse en cellules NK; dans ces différentes méthodes, les cellules NK sont sélectionnées au moyen des marqueurs tels que CD56, CD 16, PEN5, NKB I: * la Demande Internationale PCT WO 95/20604 décrit un antigène présent sur les cellules NK et les cellules T. Cet antigène a été dénommé NKB 1. Un anticorps monoclonal dirigé contre cet antigène est également décrit (anticorps DX9). Ce marqueur NKB 1 présente les propriétés suivantes: - il se lie spécifiquement à l'anticorps DX9, - il présente un poids moléculaire de l'ordre de 50 kDa, - il s'agit d'une protéine glycosylée; le poids moléculaire de la protéine glycosylée est d'environ 70 kDa, - la forme naturelle de la protéine contient des résidus d'acide sialique et est notamment phosphorylée, - les marqueurs NKB1 sont exprimés par un sousensemble de cellules NK et par un sous-ensemble de cellules T. * la Demande Internationale PCT WO 95/06247 décrit un antigène spécifique des cellules NK sous la forme d'une paire de glycoprotéines, désignées PEN5c et PEN53, ayant respectivement un poids moléculaire apparent de 120-150 et 210-245 kDa. Les épitopes uniques de la paire de glycoprotéines PEN5a/PEN5[3 sont exprimés de préférence par une sous-population de cellules NK du sang périphé- rique de phénotype CD16+ CD56dim; ils ne sont pas présents sur les lymphocytes T CD3+ ou les lymphocytes B CD20+. Ces méthodes aboutissent à la déplétion des cellules NK matures CD56+ CD16+ ou prématures PEN5 NKBI1, mais ne déplètent pas les progéniteurs, lesquels, après la greffe peuvent se différencier en cellules matures qui vont provoquer le rejet des greffes. D'autres documents confirment cette absence de marqueurs spéci- fiques; par exemple, dans l'article au nom de E. Dominguez et al. (Immunol., 1998, 94, 109-114), il est précisé qu'aucun marqueur unique des cellules NK n'a encore été identifié et qu'on les distingue, de manière habituelle par le fait qu'elles expriment CD56. Il ressort de l'ensemble de ces documents qu'il n'existe pas de marqueurs spécifiques des cellules NK d'une part, ni de l'ensemble des progéniteurs de la lignée lymphoïde d'autre part. La Demanderesse s'est donc donné pour but de pourvoir à un marqueur spécifique des cellules NK matures ainsi que de l'ensemble des cellules non différenciées de la lignée lymphoïde, afin de permettre la déplétion notamment de la moelle osseuse en cellules précurseurs de la lignée lymphoïde (pré NK, pré T et pré B) et en cellules NK matures, en particulier avant une greffe de moelle osseuse, en vue de réduire le rejet de cette dernière et la GVHD. En effet, de manière surprenante, les Inventeurs ont maintenant trouvé qu'il existe un marqueur spécifique à la fois de l'ensemble des lignées progé- nitrices lymphoïdes (pré-T, pré-B et pré-NK) et des cellules NK matures. La présente invention a pour objet une protéine isolée, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence en acides aminés ayant au moins 70 % d'identité ou au moins 85% de similarité et de préférence au moins 95 % d'identité ou au moins 99 % de similarité avec la séquence SEQ ID NO:2. ( rence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont iden- tiques, lorsque les deux séquences sont alignées de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % d'identité avec une séquence de référence est définie, dans la présente invention comme une protéine dont la séquence peut inclure jusqu'à 100-X altérations pour 100 acides aminés de la séquence de référence. Au sens de la présente invention, le terme altérations inclut les délétions, les substitutions ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. " La similarité " d'une séquence par rapport à une séquence de réfé- rence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont iden- tiques ou qui different par des substitutions conservatives, lorsque les deux séquences sont alignées de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. Au sens de la présente invention, on entend par substitution conservative, la substitution d'un acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques similaires (taille, charge ou polarité), qui généralement ne modifie pas les propriétés fonctionnelles de la protéine. Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % de similarité avec une séquence de référence est définie, dans la présente inven- tion comme une protéine dont la séquence peut inclure jusqu'à 1 00-X altérations non- conservatives pour 100 acides aminés de la séquence de référence. Au sens de la présente invention, le terme altérations non-conservatives inclut les délétions, les substitutions non-conservatives ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. Par exemple, dans les banques de données (GeneBank/EMBL), aucune séquence identique ou similaire n'a été trouvée. Cette protéine présente les propriétés suivantes: - elle est présente à la surface des cellules de la lignée de différen- ciation des cellules NK, des progéniteurs très précoces aux cellules matures cyto- toxiques et des autres progéniteurs précoces de la lignée lymphoïde (préB et pré-T), - elle présente un poids moléculaire apparent d'environ 38 kDa, mesuré par électrophorèse SDS-PAGE à 12% dans des conditions réductrices, - elle comprend un domaine extracellulaire qui présente au moins la séquence SEQ ID NO:4, 6 ou 7, et - elle présente une structure du type comprenant un domaine extra- cellulaire, cinq domaines transmembranaires et un domaine cytoplasmique; elle correspond de préférence à la séquence de formule SEQ ID NO:2 humaine, qui comprend 350 acides aminés. Ladite protéine ou molécule de surface, dénommée antigène KLIP-1 est donc spécifiquement présente sur la lignée de différenciation des cellules NK, des progéniteurs très précoces aux cellules matures cytotoxiques, ainsi que sur les autres progéniteurs précoces de la lignée lymphoïde (pré-B et pré-T). En référence à la SEQ ID NO:2 humaine, les acides aminés 1-20 correspondent à la séquence signal; les acides aminés 21-152 (SEQ ID NO:7 humaine; SEQ ID NO:4 murine; SEQ ID NO:6 porcine) correspondent au domaine extracellulaire; les acides aminés 153-295 (SEQ ID NO:8) correspondent aux cinq domaines transmembranaires (143 acides aminés) et les acides aminés 296-350 (SEQ ID NO:9) correspondent au domaine cytoplasmique (54 acides aminés). Les cellules suivantes sont KLIP- I +: 20. des progéniteurs hématopoïétiques précoces CD34+ CD38- de la moelle osseuse, de cordon ombilical et de foie foetal des progéniteurs différenciés CD34+ CD38+ des progéniteurs pré-T (thymus néonatal) CD4+ CD8+ des progéniteurs pré-B CD 19+, CD 10-, CD20- 25. des cellules NK matures CD56+ CD16+ CDl9- CD3- CD33-. Le fait que cet antigène KLIP- I soit présent aussi bien sur les progé- niteurs les plus précoces que sur les progéniteurs différenciés et les cellules NK matures permet d'obtenir une déplétion de la moelle osseuse en cellules NK en pré- sence d'anticorps anti-KLIP-1, ce qui constitue une meilleure prévention du rejet des greffes et un traitement potentiel des maladies auto-immunes. L'antigène KLIP-1 tel que décrit ci-dessus peut être considéré comme un marqueur spécifique des cellules NK (précoces et matures) et notamment un marqueur des cellules matures, dans la mesure o dans le sang périphérique, aucune autre cellule de la lignée lymphoïde (cellules B et cellules T matures) ne présente un tel antigène. La présente invention a également pour objet des fragments de ladite protéine comprenant au moins 7 acides aminés et notamment les fragments correspondant aux zones précitées (domaine extra-cellulaire, domaines transmembranaires et domaine cytoplasmique); parmi lesdits fragments, on peut citer les séquences SEQ ID NO:4, 6, 7, 8 et 9. La présente invention a également pour objet les séquences d'acides nucléiques (notamment d'ADNc) isolées codant pour ladite protéine ou ses fragments, tels que définis ci-dessus, d'origine humaine ou animale ainsi que les séquences d'acides nucléiques complémentaires. Parmi ces séquences, on peut citer: - I'ADNc codant pour l'antigène KLIPI humain, qui présente la séquence SEQ ID NO:1 et comprend 1501 pb; il est obtenu à partir du gène klip-l, localisé sur le chromosome 6, dans la région 6p21.2-6p2.1; - la séquence codant pour la protéine KLIP-1I humaine, qui est comprise entre la base 116 et la base 1165 de la séquence SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO:10); - la séquence codant pour le. domaine extracellulaire de la protéine KLIP1 humaine (SEQ ID NO:11), murine (SEQ ID NO:3) ou porcine (SEQ ID NO:5); - la séquence codant pour les domaines transmembranaires de la protéine KLIP-1 humaine (SEQ ID NO:12); les positions des 5 hélices transmembranaires sont les suivantes: 153-169, 181-209, 218-237, 243-261, 275- 295; et - la séquence codant pour le domaine cytoplasmique de la protéine KLIP-1 humaine (SEQ ID NO:13). La présente invention a également pour objet des fragments d'acide nucléique, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins 8 pb des séquences d'ADNc telles que définies ci-dessus. De tels fragments peuvent notamment être utilisés comme sondes ou comme amorces d'amplification ou de transcription inverse, par exemple les séquences SEQ ID NO: 16-20. La présente invention a également pour objet des anticorps, caracté- risés en ce qu'ils reconnaissent de manière spécifique de l'antigène de surface KLIP- 1 selon l'invention, spécifique de la lignée de différenciation des cellules NK, des pro- géniteurs très précoces aux cellules matures cytotoxiques et des autres progéniteurs précoces de la lignée lymphoïde (pré-B et pré-T) ou un fragment de celuici. Selon un mode de réalisation avantageux desdits anticorps, ils sont dirigés contre l'une des zones précitées de l'antigène KLIP-1, de préférence contre le domaine extracellulaire de la protéine KLIP-1. Conformément à l'invention, lesdits anticorps sont soient des anticorps polyclonaux, soient des anticorps monoclonaux. De plus, les anticorps anti-KLIP-1 permettent également d'obtenir une déplétion en cellules progénitrices lymphoïdes (pré-B et pré-T). Dans la transplantation de moelle osseuse, les anticorps, fragments et dérivés selon l'invention peuvent être utilisés pour dépléter la moelle osseuse en cellules KLIP-1+ ex vivo, avant la transplantation de la moelle du donneur dans la moelle du receveur. A l'heure actuelle, il n'existe pas de marqueur des cellules précoces NK: KLIP-l constitue ainsi le premier marqueur présent à la fois sur toute la lignée de la différenciation des cellules NK et sur les autres lignées lymphoïdes précoces. La présente invention a également pour objet une méthode d'élimination sélective des cellules KLIP-I+ à partir d'un échantillon biologique comprenant une population hétérogène de cellules, laquelle méthode comprend: - la mise en contact dudit échantillon biologique avec un anticorps dirigé contre une molécule de surface selon l'invention, spécifique de la lignée de différenciation des cellules NK, des progéniteurs très précoces aux cellules matures cytotoxiques et des autres progéniteurs précoces de la lignée lymphoïde (pré-B et pré- T) ou un fragment de celle-ci et - l'élimination des cellules qui se lient audit anticorps. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ledit anticorps est fixé sur un support solide tel que des billes magnétiques ou d'autres supports immunoadsorbants (Sepharose CNBr, par exemple). Conformément audit mode de mise en oeuvre, pour dépléter l'échantillon biologique et notamment la moelle osseuse, le sang de cordon ou le foie foetal, en cellules comportant l'antigène KLIP-1 à leur surface, ces cellules sont fixées sur des billes immunomagnétiques, recouvertes d'anticorps anti-KLIP-l, de préfé- rence des anticorps dirigés contre le domaine extracellulaire de la protéine KLIP-1. Avantageusement, ladite méthode peut être mise en oeuvre pour enrichir un échantillon biologique en cellules NK humaines progénitrices ou matures à partir de mélanges de cellules humaines provenant de foie foetal, de sang de cordon ombilical, de moelle osseuse foetale, néonatale ou adulte ou de sang périphérique. La présente invention a en outre pour objet l'utilisation des cellules de la moelle osseuse ou du sang de cordon ombilical déplétées en cellules NK et en progéniteurs lymphoïdes, obtenues à l'aide du procédé tel que défini ci-dessus pour la préparation d'un produit apte à être transplanté. La présente invention a également pour objet une méthode de détec- tion et/ou de quantification et/ou d'isolement des cellules NK et/ou des progéniteurs des cellules lymphoïdes (pré-B, pré-T et pré-NK) dans une population hétérogène de cellules, laquelle méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend: - la mise en contact d'un échantillon biologique comprenant une population hétérogène de cellules avec un anticorps dirigé contre la protéine KLIP-1 ou un fragment de celle-ci, selon l'invention, et - la détection de la formation du complexe cellules-anticorps, notamment par une méthode immunologique standard. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode, lorsque ledit échantillon est constitué de moelle osseuse ou de sang de cordon ombili- cal, il peut comprendre en outre la mise en contact des cellules ayant formé un complexe avec ledit anticorps avec un anticorps spécifique des cellules pré-B (anti- corps anti-CD19 ou anticorps anti-CDO10) et/ou des cellules pré-T (anticorps anti-CD3, anticorps anti-CD4 ou anticorps anti-CD8). La présente invention a également pour objet l'utilisation des anti- corps tels que définis ci-dessus, dans le traitement des maladies autoimmunes. La présente invention a également pour objet une méthode de diagnostic des hémopathies malignes et bénignes, caractérisée en ce qu'elle comprend la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléique telle que définie ci-dessus. En effet, la détermination de la modulation de l'expression du gène KLIP-1 et/ou des mutations de la séquence dudit gène permettent de diagnostiquer une hémopathie. O10 La présente invention a de plus pour objet une trousse de détection et/ou de quantification et/ou d'isolement des cellules NK et/ou des progéniteurs des cellules lymphoïdes (pré-B, pré-T et pré-NK), caractérisée en ce qu'elle comprend outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection, des doses appropriées d'un anticorps dirigé contre l'antigène KLIP-1 ou un fragment de celui-ci selon l'invention, éventuellement conjugué à un support solide immunoadsorbant et des doses appropriées d'un réactif de révélation du complexe cellules-anticorps éventuellement formé. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfèere à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels: - la figure 1 représente une analyse différentielle de transcrits sur gel (RNA diffJerential display (RDD)); à cette figure, les pistes I correspondent au sac vitellin, les pistes 2-5 correspondent au foie fcetal et la piste 6 correspond à un contrôle; - la figure 2 représente les séquences nucléotidique et protéique humaines de KLIP-1; la figure 2' représente un modèle pour la partie transmembra- naire; - la figure 3 représente la localisation chromosomique du gène KLIP-I; - la figure 4 illustre l'induction d'expression d'une protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire de la protéine KLIP-1 humaine (12 kDa); - la figure 5 illustre un Western blot sur les populations KLIP-1+ et KLIP- 1-; - la figure 6 illustre une immunoprécipitation de la protéine trans- crite et traduite in vitro; - la figure 7 représente la répartition des cellules KLIP-I+ dans du sang périphérique, contenant uniquement des cellules sanguines matures; - la figure 8 représente la répartition des cellules KLIP-I+ dans du sang de cordon ombilical, contenant en majorité des cellules sanguines matures mais aussi une faible fraction des cellules immatures - la figure 9 représente la répartition des cellules KLIP-I+ dans de la moelle osseuse, un site d'hématopoïèse o s'effectue la différenciation des cellules sanguines; - la figure 10 représente la répartition des cellules KLIP-I+ dans le foie embryonnaire (6 semaines); la figure 1 1 représente la répartition des cellules KLIP-I+ dans le thymus néo-natal; - la figure 12 illustre les propriétés de cytolyse des cellules NK et de la population NK purifiée par KLIP-1 + (cellules cibles) ; - la figure 13 illustre la répartition des cellules KLIP-1+ dans le sang périphérique du porc; et - la figure 14 illustre la répartition des cellules KLIP-I+ dans les splénocytes de souris considérées comme des cellules NK (formation de complexes avec des anticorps NK 1.1 (Pharmingen)). Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE: - Procédés cellulaires et tissulaires Les tissus embryonnaires humains ont été obtenus à partir d'interruptions volontaires de grossesses, en accord avec la législation française. Le projet a été approuvé par le comité d'éthique local, et le consentement informé et pré- alable a été obtenu de toutes les mères. Le stade de développement (de gestation) de chaque embryon a été déterminé par des critères anatomiques. Le sac vitellin, l'aorte dorsale avec la splanchnopleure (région AGM) et le foie ont été disséqués sous une loupe binoculaire et immédiatement préparés pour l'extraction de l'ARN ou ont été congelés dans l'azote liquide et stockés à -80 C. En raison des différences de stade de développement des embryons, les tissus disséqués ont été traités séparément et non mélangés. Le sang du cordon ombilical a été collecté à partir de nouveaux nés en bonne santé (sains) et à terme, immédiatement après l'accouchement avec l'accord delamère. La moelle osseuse et le sang périphérique ont été collectés à partir de donneurs adultes normaux, en accord avec les lignes directrices institutionnelles. Les cellules mononucléées ont été obtenues par centrifugation en gradient Ficoll- Hypaque dans des conditions standards. Les thymocytes postnatals normaux ont été isolés par élution à partir de morceaux de thymus prélevés lors d'opérations correc- trices du coeur. Pour l'analyse cytofluoromérique, les cellules mononucléées ont été utilisées fraîches ou congelées. - Analyse différentielle de transcrits sur gel (RDD ou RNA differential display), clonage et séquençage L'ARNm total a été extrait des tissus examinés (frais ou congelés) en utilisant le réactif RNA NOW (Ozyme, France), en accord avec les recommanda- tions du fabricant et traité avec de la DNAase I sans RNAses (Boehringer Mannheim, Meylan, France) pendant 1 heure à 37 C puis précipité à l'éthanol. La qualité de l'ARN a été contrôlée par électrophorèse en gel dénaturant d'agarose 1,5 %. Les ADNc ont été préparés à partir de 5 [tg d'ARN total, en présence de 5'T1 1XY(X=A, G ou C; Y=A, T, G ou C) (SEQ ID NO:14) comme amorce 3' d'ancrage et de transcriptase inverse M-MLV (GIBCOBRL, Life Technologies, Cergy, France), à 42 C pendant 1 heure. Les amplifications par PCR inverse ont été effectuées avec la même amorce 3' d'ancrage (amorce anti-sens) et 10 nucléotides arbitraires en 5' (amorce sens), en présence de 5 iCi d'[act32p]-dCTP (Amersham France, Les Ulis, France). Les résultats illustrés à la figure 1 ont été obtenus avec les amorces suivantes: 5'-TIIGG (SEQ ID NO:14) et 5'-GTTGCGATCC (SEQ ID NO:15) . Les produits PCR ont été dénaturés par la chaleur 3 minutes à 80 C dans un tampon d'arrêt de séquençage et séparés par électrophorèse en gel dénaturant de poly- acrylamide 6 %. Les gels ont été séchés sans fixation sur du papier filtre Whatman 3MM et exposés pendant 16 heures sur des films Kodak Biomax (Amrnersham France, Les Ulis, France). Les bandes qui sont régulièrement apparues comme étant différen- tielles dans deux amplifications indépendantes, ont été excisées, éluées du gel, réam- plifiées dans les mêmes conditions de réaction (35 cycles), analysées sur gel d'agarose 2% et clonées dans un vecteur pCRII (TA Cloning Kit, Invitrogen, Leek, The Netherlands). Un minimum de 40 colonies individuelles recombinantes (blanches) ont été récupérées et la présence des inserts a été testée par PCR avec des amorces flanquantes du vecteur. Plusieurs plasmides recombinants ont été amplifiés par mini- prep, purifiés par kit Qiagen (Qiagen, Courtaboeuf, France) puis radiomarqués avec du [i32P]-dCTP. Ces plasmides ont servi de sondes pour éliminer les clones simi- laires. Les clones non redondants ont été séquences manuellement en utilisant la méthode enzymatique par les di-désoxynucléotides (méthode de Sanger) en présence de Séquanase 2,0 et des amorces flanquantes du vecteur, en suivant les protocoles du fabricant (US Biochemicals, Cleveland, OH). Les recherches d'homologies de séquences ont été effectuées par l'intermédiaire d'INFOBIOGEN/BLAST (http://www.infobiogen.fr) sur la GenBank et sur les banques de données de l'EMBL. - Isolement de l'ADNc de KLIP-1 (clone n 36-16) à partir de tissus hématopoïétiques embryonnaires par PCR-RDD Le profil d'expression du gène pendant l'embryogénèse humaine a été étudié. Les transcrits exprimés de manière différentielle au jour 32 YS (Sac Vitellin), et du jour 27 au jour 49 FL (foie foetal) en utilisant la technique de la PCR- RDD ont été examinés. Le clone 36-16 a été isolé du gel RDD et son expression diffé- rentielle a été confirmée par la forte expression au jour 25 (sac vitellin), faible expres- sion au jour 32 (sac vitellin), forte expression au jour 28 [AGM (région aorte-gonade- mésonéphros)], comme au jour 28 (foie fcetal) suivi par la diminution de l'expression aux stades tardifs (foie foetal). - Clonage de l'ADNc entier et analyse de la protéine déduite Une banque d'ADNc de poumon humain (Plasmid MATCHMAKER Library, Clontech, Paris, France) dans le vecteur pACT2 a été utili- sée. Les clones d'ADNc 36-16 ont été obtenus par criblage de 1x106 colonies de la banque d'ADNc, en utilisant un insert de 36-16 de 255 pb marqué au 32p comme sonde pour l'hybridation sur des membranes Hybond N+ Nylon. Les clones positifs ont été testés par PCR avec les amorces flanquantes du vecteur et ont été confirmés par hybridation avec l'insert de 36-16 radiomarqué. Deux clones ont présenté un signal d'hybridation positif et une taille appropriée d'environ 1600 pb, en accord avec les résultats du Northern blot. L'un d'eux a été séquence par la méthode deSanger, mettant en ceuvre des terminateurs fluorescents et un séquenceur ABI Applied Biosystems (Pharmacia, Orsay, France). - Caractérisation de l'ADNc entier de KLIP-1 (36-16) et protéine déduite L'ADNc entier comprend 1501 pb et présente un seul cadre ouvert de lecture de 1050 pb avec un UTR 5' de 115 pb et un UTR 3' de 333 pb, ce qui prédit une protéine appelée KLIP-1 de 350 acides aminés avec un poids moléculaire de 38.2 kDa (Figure 2). L'analyse de l'hydrophobicité de la séquence de KLIP-1 suggère 5 hélices TM fortes (Figure 2'). Ainsi, la protéine KLIP-1 présente un peptide signal de l'acide aminé (aa) 1 à 20, un domaine extracellulaire de 132 aa (aa 21 à 152), 5 domaines TM de 143 aa (aa 153-295), et une queue cytoplasmique C-terminale de 54 aa (aa 296 à 350). - Cartographie chromosomique RH (Radiation hybrids) Les clones d'ADNc ont été criblés par PCR, contre le panel d'hybrides irradiés (RH) du génome complet de GeneBridge4 (Research Genetics, Huntsvill, AL), qui contient 93 clones de chimères hamster-humain. Chaque clone a été testé individuellement dans deux amplifications PCR indépendantes avec deux amorces spécifiques de l'UTR 3': 1265F (5'-ACCCCACCTGAAATTCTTGG) (SEQ ID NO:16) et 1522R (5'-GAGATAAAGAGGAAGGAAGG) (SEQ ID NO:17) dans les conditions suivantes: 94 C 45 sec, 61 C I min, 72 C 45 sec pour 10 cycles, puis 94 C 45 sec, 58 C 1 min, 72 C 45 sec pour 30 cycles, terminés par une incubation 10 min à 72 C. Les Southern blots contenant les produits PCR et les ADN contrôles humains (positifs) ou hamster (négatifs) ont été hybridés avec une sonde spécifique interne, marquée au 32p, et lavés dans des conditions rigoureuses SSC 0,2X + SDS 0,2% à 60 C, puis ont été exposés pendant 16 heures à des films Kodak Biomax. Une seule bande spécifique humaine a été observée à la taille attendue de 257 pb. Les données d'hybridation dérivées du profil de criblage ont été soumises au Whitehead Institute/MIT Centre for Genome Research RH Mapper Server (http://wvwvw.genome.wi.mit.edu) et le gène KLIP-1 a été lié à des marqueurs physiques. La carte physique GeneMap'98 (http://.i\nv.ncbi.nlm. inih.gov!genemap) a été utilisée pour en déduire la localisation cytogénétique de la bande correspondant aux résultats de la cartographie RH. Afin de confirmer la localisation du gène KLIP-1, des amplifications PCR avec les amorces 1265F (SEQ ID NO:16) et 1522R (SEQ ID NO:17), spécifiques de l'UTR 3' de KLIP-I, hybridées avec la sonde interne 5'- CTGTGGGCACTTCTGAAAGG (SEQ ID NO: 18) marquée au 32P, ont été effectuées sur des clones YAC 907_H_2 et 939_E_12 (Centre d'Etudes du Polymorphisme Humain, Paris, France) contenant respectivement les marqueurs D6S271 et D6S459. Ces marqueurs cernent la région de KLIP-1 sur le chromosome 6 et le marqueur AFM136YD12. L'ADN génomique et le clone YAC 979_B_3, localisé sur le chromosome I (Dl S444), ont été utilisés respectivement en tant que contrôle positif et négatif. - Localisation chromosomique du gène KLIP-1 (36-16) par typage du panel de chimères RH L'analyse cartographique positionne la séquence de KLIP-1 entre les marqueurs structuraux D6S271 et AFM165YD12 de GeneBridge4, respectivement 5.66 cR de D6S271 et 2.84 cR de AFM65YD12 à LOD 1.08. La carte physique GeneMap'98, liée à la localisation de bande cyto- génique, a localisé le gène KLIP-1 en 6p21.1-6p21.2 du chromosome 6. L'amplification PCR, avec les amorces utilisées pour les chimères RH, des clones YACs du CEPH n 907_h_2 et n 939_e_12, contenant respectivement les marqueurs D6S271 et AFM165YD12, confirme cette localisation. (Figure 3) Génération de la protéine recombinante KLIP-1 L'ADNc, obtenu après amplification par PCR avec les amorces F: 5'-TCGAAGAAAACATCCAGGGC (SEQ ID NO:19) et 556R: 5'- AGAGGTCCATAGAGTTCCACC (SEQ ID NO:20), code pour une protéine extracellulaire de 134 aa des positions 22 à 156. Le produit PCR a été ligué au vecteur d'expression pQE-3 I marqué His6X (QIAexpress System, Qiagen, Courtaboeuf, France), puis a été transformé dans la souche Ml15 portant le plasmide répresseur pREP 4. La construction et le transformant positif ont été criblés par séquençage direct pour une insertion correcte et une conservation en phase. La protéine de 12kDa marquée-His6X, induite à l'IPTG (Figure 4A), a été purifiée sur agarose Ni-NTA dans des conditions dénaturantes et a été visualisée par coloration au bleu de Coomassie sur un gel 12% SDS/PAGE (Figure 4B). - Génération et purification de l'anticorps polyclonal de KLIP-I Les anticorps (Ab) ont été générés par immunisation mensuelle de lapins White New Zeland avec 100 pil de protéine recombinante extracellulaire de 12 kDa purifiée dans un adjuvant incomplet de Freund. Apres 3 injections, le sérum a été collecté puis toutes les IgG ont été purifiées en utilisant les colonnes d'affinité à la protéine G Hitrap (Pharmacia Biotech, Orsay, France) et les anticorps non spécifiques de lapin anti-E. coli ont été éliminés en utilisant un lysat d'E. coli immobilisées (Pierce, Rockford, IL). - Révélation par Western Blot La moelle osseuse totale ou enrichie en cellules KLIP-I+ et les cellules mononucléées du sang du cordon ont été lysées pendant 10 minutes à 100 C dans du tampon contenant Tris (pH 6,8) 50 mM, glycérol 10%, SDS 2%, 2-mer- captoéthanol 5%, et bleu de bromophénol 0,02%. Les protéines (équivalent de 3x105 cellules) ont été séparées par SDS-PAGE 12%, et électrotransférées sur des membranes de nitrocellulose Hybond C-Extra (Amersham, Les Ulis, France). Les membranes ont été bloquées avec du lait en poudre allégé dans du PBS IX, Tween 20 0,2% pendant 1 heure à température ambiante et ont été incubées avec l'anticorps anti- KLIP-1 1:5000 dans le PBS, Tween 20 0,2%. Après lavage, les blots ont été incubés avec des anticorps de chèvre anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifort; la colo- ration est obtenue en utilisant un système ECL (Amersham, Les Ulis, France), en accord avec les recommandations du fabricant. Les résultats présentés sur la Figure 5 montrent la présence de la bande de la molécule KLIP à 38 kDa dans la fraction des cellules du sang de cordon KLIP+. - Transcription et traduction in vitro de la protéine KLIP-1 et immunoprécipitation. 1. Préparation de la matrice La matrice traduite provient de l'amplification par PCR de l'ADNc du gène KLIP-1 obtenue par Transcription Inverse (MMLV RT, Gibco BRL, France) d'ARN (RNA NOW, Biogentex, France) de cellules mononucléées de sang de cordon. La PCR est effectuée sur un volume total de 100 pl, dans les conditions suivantes: - 300 nM d'amorce sens +T7 (5 AgATCCTAATACGACTCACTATAgggAgAgggACATggCCAACTAAgC-3 ') (SEQ ID NO:21) et 300 nM anti-sens ou d'amorce inverse (5' AAgAggAAggAAggggTAgg 3') (SEQ ID NO:22). - Amplification PCR sur 35 cycles (thermocycler 9600, PERKIN ELMER), 94 C I minute, 55 C 1 minute, 72 C 2 minutes. Elongation finale 72 C 10 minutes. Le produit d'amplification a été purifié par centrifugation (500 g pendant 20 minutes) sur MICROCON 100 (AMICON, USA), puis repris dans H20. 2. Transcription et traduction in vitro La transcription et la traduction de la matrice in vitro sont effectuées à partir de: - I pg de matrice il de TnT Quick Maste Mix (Promega Biotech, France) - 2 ffl de 35S méthionine 10 mCi/ml (Amersham, France) - QSP 50 pil en H20 - Les réactifs sont incubés 90 minutes à 30 C. 3. Immunoprécipitation Incubation dans 50 gl de PBS 1X, 5 pi1 du produit de traduction et 2 pI de l'anticorps polyclonal de lapin anti-KLIP- 1, I heure à 4 C en agitation. Ajout de 60 pil de protéine A-sépharose et incubation sur roue 30 minutes à 4 C. Lavage avec tampon: NP 40 0,1%, Tris-HCI pH 7,5 20 mM, NaCI mM, Na azide 0,05%. Les échantillons sont analysés par électrophorèse sur un gel 12% SDS-PAGE; le résultat est visualisé par autoradiographie. La Figure 6 montre la pré- sence d'une bande correspondant à la molécule KLIP d'environ 38 kDa, détectée par l'anticorps anti-KLIP, alors que le sérum pré-immun témoin ne détecte pas la protéine KLIP. Ceci montre la spécificité de l'anticorps anti-KLIP. - Immunosélection de cellules KLIP-1+ Environ 2,5x108 cellules mononucléées du sang périphérique ou du cordon ombilical, de moelle osseuse ou de thymus et du foie foetal, sont incubées dans du sérum humain AB 20% en PBS, 30 minutes à température ambiante. Après lavage en PBS, SVF 2%, les cellules sont incubées avec 90 gtl de sérum de lapin anti-KLIP- l(conforme à l'invention) 30 minutes à 4 C, puis incubées avec 50 ffl anti-IgG de lapin anti-porc marqué au FITC (Dako, France) 30 minutes à 4 C, puis incubées avec 200 ffl de microbilles magnétiques anti-FITC (Miltenyi-Biotech, Paris,France) 30 minutes à 4 C. Par la suite, les cellules KLIP-I+ sont isolées par des passages successifs sur les colonnes magnétiques LS+ (Miltenyi-Biotech, Paris, France) puis RS+ dans un champ magnétique à l'aide de l'appareil VarioMACS (Miltenyi-Biotech, Paris, France). Les populations résultantes ont été analysées par FACS-Vantage (Becton Dickinson, France) et la pureté des populations utilisées dans cette étude a varié entre 90 et 99%. - Immunophénotypage par FACS Une analyse par immunofluorescence à 1-, 2-, et 3 couleurs de la population des cellules KLIP-I+ a été effectuée en utilisant un FACS-Vantage (Becton Dickinson, France). Des fluorochromes conjugués appropriés, sans rapport avec les Igs de contrôle adaptés à l'isotype, ont aussi été utilisés dans toutes les expériences. Les résultats sont présentés par tissus hématopoïétiques: Figures 7-11 (cellules humaines): Fig. 7: Sang périphérique contenant uniquement des cellules *sanguines matures. Dans le sang total, 4% des cellules mononucléées sont KLIP-1+ S Dans la fraction triée KLIP-I+ avec une pureté de 99%, on trouve 0% CD34+, 95% CD56+ (cellules NK matures), 1,5% CD19+ (cellules B), 0,5% CD3+ (cellules T). Ces deux dernières valeurs étant dues au bruit de fond. Fig. 8: Sang de cordon ombilical, contient en maiorité des cellules sanguines matures mais aussi une faible fraction des cellules immatures. Dans le sang de cordon total, 5% des cellules mononucléées sont KLIP-I+. Dans la fraction triée KLIP-1+ avec une pureté de 98,5%, on trouve 0,5 % CD34+, 76% CD56+ (cellules NK matures), 1,5% CD19+ (cellules B), 0,3% CD3+t (cellules T). Fig. 9: Moelle osseuse: site d'hématopoïèse o s'effectue la diffé- renciation des cellules sanguines; elle contient donc l'ensemble des cellules sanguines immatures Dans la moelle osseuse totale, 8% des cellules mononucléées sont KLIP- 1 +. Dans la fraction triée KLIP-I+ avec une pureté de 99%, on trouve deux sous-populations "( faible intensité et haute intensité " soit 17% KLIP-1 faible + 82% KLIP-1 haute +, et 32% CD19 KLIP-1 faible (cellules B), 19% CD3 KLIP-1 faible (cellules pré-T), 31 % CD56+ KLIP-1 haute + (NK). Fig. 10: Foie embryonnaire (6 semaines) Dans les cellules mononucléées du foie total, 3% des cellules sont KLIP- 1 +. Dans la mesure o l'on obtient peu de cellules, le rendement a été privilégié par rapport à la pureté. Des 47% des cellules KLIP-I+, 35% sont CD34+ (progéniteurs hématopo'étiques très précoces). Fig. 11: Thymus néo-natal Le thymus est un organe de maturation immunologique des cellules T. Dans le thymus total, 2% des cellules mononucléées sont KLIP-1+. Dans la fraction triée KLIP-1+ avec une pureté de 98%, on trouve 1,5% CD34+, 2% CD56+, 0,8% CDl9+ (cellules B), 70% CD3+ (cellules T ou à ce stade de maturation cellules T/NK). Cependant la population KLIP-1+ CD3+ est composée à plus de 91 % des cellules CD4+CD8+ (pré-T). Ces résultats montrent clairement que le marqueur (antigène ou molécule) KLIP-1 est spécifiquement présent sur les cellules NK tout au long de leur différenciation hématopoïétique, puisqu'il est présent sur les progéniteurs précoces CD34+ de la moelle et de cordon. Il est toujours présent sur les cellules NK imma- tures CD56- et matures CD56+ et sur les cellules pré-B et pré-T immatures. Dans le thymus néo-natal, la présence de l'antigène KLIP est observée sur les cellules CD3+CD4+CD8+, qui sont des cellules T immatures, car les cellules T matures qui sont CD3+CD4-CD8+ ou CD3+CD4+CD8- sont KLIP-1-. Figures 13-14 (cellules animales) Figure 13 (porc): dans le sang total, 7% des cellules mononucléées sont KLIP-I+: différence entre le contrôle négatif (figure 13A) obtenu par incubation du sang total de porc avec un sérum de lapin non immunisé et le contrôle positif obtenu avec un sérum de lapin immunisé. Figure 14 (souris): figure 14A: dans la fraction triée KLIP-1+: pureté de 98% (bruit de fond 9 %); figure 14B: en présence d'anticorps anticellules NK murines (NKl.l), on constate que 40 % des cellules KLIP-1+ sont des cellules NK. - Cytotoxicité transmise par les cellules La cytotoxicité spontanée et la cytotoxicité transmise par cellule dépendante d'anticorps (ADCC) ont été mesurées dans une expérience standard de 4 heures de libération du radioisotope 51Cr. Des cellules érythroleucémiques K562 sensibles aux NK (American Type Culture Collection, Rockville, MD) ont été utili- sées comme cible. Les cellules ciblées ont été marquées avec 200 LCi de chromate- 51Cr de sodium (Amersham, Les Ulis, France) pendant 2h. Des cellules effectrices en nombre variable, non mélangées et provenant de différents donneurs ( 1il, ont été ajoutées aux cellules cibles, et incubées pendant 4h à 37 C. Pour mesu- rer l'ADCC, les cellules ont été préincubées avec le récepteur I:50 porc anti-lapin anti-Fc. Toutes les déterminations ont été effectuées en triple. Les résultats obtenus, présentés sur la Figure 12, montrent que 1. l'anticorps anti-KLIP-1 n'a pas d'effet sur la cytotoxicité des cellules NK, donc l'antigène KLIP n'est ni inhibiteur ni activateur des NK. 2. Le tri (séparation ou sélection) des cellules KLIP-I+ augmente la cytotoxicité probablement par effet de concentration, cela prouve néanmoins que les cellules triées par anti-KLIP-1 dans le sang périphérique sont bien des cellules NK aux fonctions cytotoxiques. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 ) Protéine isolée, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence en acides aminés ayant au moins 70 % d'identité ou au moins 85% de similarité et de préférence au moins 95 % d'identité ou au moins 99 % de similarité avec la séquence SEQIDNO:2. 2 ) Protéine isolée selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente de préférence la séquence de formule SEQ ID NO:2. 3 ) Fragments de protéine, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins 7 acides aminés de la protéine selon la revendication 1 ou la revendication 2. 4 ) Fragments de protéine selon la revendication 3, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:4, 6,7,8 et9. ) Anticorps, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre une pro- téine ou un fragment de celle-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 6 ) Anticorps selon la revendication 5, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre l'un des fragments selon la revendication 3 ou la revendication 4, de préférence contre le fragment de séquence SEQ ID NO:7. 7 ) Anticorps selon la revendication 5 ou la revendication 6, caractérisé en ce qu'ils sont sélectionnés parmi les anticorps monoclonaux et les anticorps polyclonaux. 8 ) ADNc isolé et purifié, caractérisé en ce qu'il code pour une pro- téine ou un fragment de protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 9 ) ADNc isolé et purifié selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il présente la séquence SEQ ID NO:1, 3, 5, 10, 11, 12 ou 13. 10 ) Fragments d'acide nucléique, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins 8 pb de la séquence d'ADNc selon la revendication 8 ou la revendication 9. 11 ) Fragment selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:16-20. 12 ) Méthode d'élimination sélective des cellules KLIP-I+ à partir d'un échantillon biologique comprenant une population hétérogène de cellules, laquelle méthode comprend: - la mise en contact dudit échantillon biologique avec un anticorps selon l'une quelconque des revendications 5 à 7 et - l'élimination des cellules qui se lient audit anticorps. 13 ) Méthode d'élimination selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit anticorps est fixé sur un support solide. 14 ) Méthode de détection et/ou de quantification et/ou d'isolement des cellules NK et/ou des progéniteurs des cellules lymphoïdes dans une population hétérogène de cellules, laquelle méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend: - la mise en contact d'un échantillon comprenant une population hétérogène de cellules avec un anticorps selon l'une quelconque des revendications 5 à 7 et - la détection de la formation du complexe cellules-anticorps. ) Méthode selon la revendication 14, caractérisée en ce que lorsque ledit échantillon est constitué de moelle osseuse ou de sang de cordon ombili- cal, il peut comprendre en outre la mise en contact des cellules ayant formé un complexe avec ledit anticorps avec un anticorps spécifique des cellules préB (anti- corps anti-cD19ou anticorps anti-CDO10) et/ou des cellules préT (anticorps anti-CD3, anticorps anti-CD4 ou anticorps anti-CD8). 16 ) Anticorps selon l'une quelconque des revendications 5 à 7 pour une utilisation comme médicament, notamment dans le traitement des maladies auto- immunes. 17 ) Utilisation des cellules de la moelle osseuse ou du sang de cordon ombilical déplétées en cellules NK et en progéniteurs lymphoïdes, obtenues à l'aide de la méthode selon la revendication 12 ou la revendication 13, pour la prépara- tion d'un produit apte à être transplanté. 18 ) Méthode de diagnostic des hémopathies malignes et bénignes, caractérisée en ce qu'elle comprend la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléique selon l'une quelconque des revendications 8 à 11. 19 ) Trousse de détection et/ou de quantification et/ou d'isolement des cellules NK et/ou des progéniteurs des cellules lymphoïdes (pré-B. pré-T et pré- NK), caractérisée en ce qu'elle comprend outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection, des doses appropriées d'un5 anticorps dirigé contre l'antigène KLIP-1 ou un fragment de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, éventuellement conjugué à un support solide immunoadsorbant et des doses appropriées d'un réactif de révélation du complexe cellules-anticorps éventuellement formé.