Brevet FR2797186A1 — publié le 20010209

PROCEDE D'EXTRACTION D'UN PRINCIPE ACTIF A PARTIR DE LEVURES, NOTAMMENT POUR LE TRAITEMENT DES RIDES, PRINCIPE ACTIF OBTENU, COMPOSITIONS COSMETIQUES ET TRAITEMENT ADAPTES La présente invention concerne un procédé d'extraction d'un principe actif à partir d'au moins une levure en vue d'un traitement contre le vieillissement de la peau et notamment pour lutter contre l'apparition des rides. L'invention couvre aussi le principe actif obtenu, les compositions cosmétiques qui l'intègrent ainsi que le traitement envisagé avec ce principe actif. II existe une zone dite jonction dermo-épidermique qui constitue une interface entre le derme et l'épiderme. Cette région est très complexe et assure plusieurs fonctions élaborées qui se trouvent concernées lors de divers processus biologiques comme la réparation tissulaire, l'attachement ou la différentiation des cellules épidermiques. En effet, la jonction dermo-épidermique favorise les échanges du derme vers l'épiderme, et participe activement à la communication épidermique. Cette jonction dermo-épidermique joue aussi un rôle très important dans la cohésion "mécanique" entre le derme et l'épiderme, ceci grâce à des molécules spécifiques d'ancrage notamment - les collagènes IV et VII - les intégrines, - la fibronectine, En effet, la jonction dermo-épidermique comprend essentiellement la membrane basale épidermique, les fibrilles d'ancrage et les hémidesmosomes. Or cette membrane basale présente une résistance mécanique élevée, due notamment à la polymérisation de cette protéine fibreuse qu'est le collagène IV, présente sous forme de dimères et de tétramères. Le collagène VII quant à lui est le composant majeur des fibrilles d'ancrage. Le collagène VII peut se lier aux extrémités N-terminales du collagène IV et de la fibronectine pour former un réseau. Les intégrines sont des glycoprotéines de surface constituées de deux sous-unités a et P. Ces intégrines sont spécifiques en fonction du type cellulaire qui les expriment. Les cellules en culture expriment notamment les intégrines a23,, a.33, et a5(3,. Les intégrines a23,, exprimées par les kératinocytes et les fibroblastes représentent des récepteurs cellulaires pour les collagènes de type IV ainsi que la fibronectine. Ces intégrines jouent un rôle important dans le maintien de l'organisation spatiale de la jonction dermo-épidermique et dans ses phénomènes de réparation/cicatrisation. De la qualité des ancrages et donc des liaisons à la jonction dermo- épidermique dépend l'état de surface de la peau. En effet, si la jonction dermo-épidermique est forte, avec des plis assurant une excellente cohésion entre derme et épiderme, la peau est faiblement ridée, tandis que tout relâchement dû à une synthèse en plus faible quantité des molécules d'ancrage provoque un aplanissement de l'interface avec une perte de fermeté et de régularité de la surface de la peau. Aussi la présente invention a pour but de proposer un principe actif qui permet de lutter contre les effets du vieillissement cutané par une action en profondeur, en stimulant la synthèse des molécules d'ancrage telles que les intégrines, la fibronectine et les collagènes IV et VII, ce qui favorise le maintien de la cohésion dermo-épidermique et la réparation tissulaire. De ce fait, la profondeur des rides diminue et le microrelief de la peau est lissé. L'invention a aussi pour objet le procédé d'extraction ainsi que les traitements cosmétiques qui consiste à appliquer ce principe actif dans une composition cosmétique. Les différents tableaux de résultats et les vues au microscope sont indiqués dans les figures qui représentent - figure 1, évaluation de l'expression des ARN messagers des molécules d'ancrage par rapport à un témoin, - figure 2, évaluation de l'expression des intégrines, - figure 3, effets du principe actif sur la migration des fibroblastes - figures 4A,4B et 4C, vues au microscope des effets du principe actif sur la migration des fibroblastes - figure 5, résultats concernant la complexité du microrelief - figure 6, résultats concernant la complexité de la surface, - figure 7, résultats de l'évolution de la profondeur des rides, et - figure 8, résultats de l'évolution du volume des rides. Le principe actif selon la présente invention est maintenant décrit en commençant par son procédé d'extraction et ses caractéristiques, en montrant les effets obtenus sur les différents mécanismes intervenant à la jonction dermo-épidermique. Le procédé d'extraction du principe actif selon la présente invention consiste à utiliser de la levure du type Saccharomyces Cerevisiae Ce procédé comprend les étapes suivantes - solubilisation des levures en milieu aqueux légèrement basique à raison d'au moins 20% avec éventuellement l'ajout d'un alcool afin de favoriser la solubilisation des levures, - hydrolyse des protéines en milieu basique, - agitation de 8 à 52 heures, - première filtration afin de séparer les phases soluble et insoluble, - lavage contre eau afin de purifier la fraction active, - concentrations et filtrations successives afin d'augmenter la fraction active, et - filtration stérilisante. Le principe actif ainsi obtenu est caractérisé par les paramètres analytiques suivants - Taux de matière sèche : compris entre 10 g/1 et 200 g/1 plus particulièrement entre 10 et 100 g/1, principalement entre 20 et 50 g/1. Ce taux est obtenu par passage à l'étuve à 105 C jusqu'à obtention d'un poids constant - Sucres totaux : compris entre 10 g/1 et 100 g/1, plus particulièrement entre 10 et 70 g/1, principalement entre 20 et 50 g/1. La détermination des sucres totaux est réalisée selon la méthode de DUBOIS. On ajoute au principe actif 400 NI de phénol à 5% et 2000 NI d'acide sulfurique. La densité optique de la solution est ensuite lue au spectrophotomètre à 490 nm. On effectue le même expérience avec une gamme étalon allant de 25 à 100 Ng/ml d'une solution mannose, glucose et galactose - pH compris entre 4 et 10, plus particulièrement 6 à 7. Ce paramètre est mesuré par la méthode potentiométrique à température ambiante. 1 / EVALUATION DE L'EXPRESSION DES ARN MESSAGERS DES MOLECULES D'ANCRAGE L'action du principe actif obtenu est étudiée sur des cultures de fibroblastes humains. On incube ces fibroblastes pendant 72 heures à 37 C dans une atmosphère contenant 5% de C02, ceci en présence du produit. A la fin de l'incubation, les cellules sont récupérées et les ARN totaux sont extraits. Les ARN ont été reverses-transcripts et les ADN complémentaires obtenus ont été analysés par la technique polymérase chaîne. Parallèlement, les ARNm de la 0-actine sont également analysés dans les mêmes conditions expérimentales à titre de témoin. On mesure l'intensité des bandes des amplicons sur des gels d'agarose, à l'aide d'un analyseur d'images. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'expression de l'ARN étudié pour chaque essai par rapport au témoin selon le ratio suivant %ARNm/témoin = (R.E./R.T.) x 100 R.E. = Intensité de la bande ARNm de la protéine testée / Intensité de la bande ARNm de la (3-actine R.T. = Intensité de la bande ARNm de la protéine témoin / Intensité de la bande ARNm de la P-actine On obtient les résultats récapitulés dans le tableau de la figure 1, obtenus avec 2% de principe actif. On constate une augmentation de l'expression des ARNm des collagènes IV et VII et de la fibronectine dans les cultures de fibroblastes humains. On constate que le principe actif induit la sécrétion de protéines d'ancrage de la jonction dermo-épidermique, notamment les collagènes IV et VII ainsi que la fibronectine. 2/ MESURE DE L'EXPRESSION MEMBRANAIRE DES INTEGRINES On cherche à évaluer en cytométrie de flux, l'expression membranaire des intégrines a23, sur des cultures de fibroblastes humain après 24 et 48 heures d'incubation en présence de 3% du principe actif. Les cellules sont marquées par des anticorps monoclonaux dirigés spécifiquement contre les intégrines de type a2 ou P,. Ces anticorps sont marqués par un deuxième anticorps fluorescent marqué. Le niveau d'expression membranaire est déterminé par la mesure de fluorescence et analysé en cytométrie de flux. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'augmentation du nombre de sites fluorescents par rapport à un témoin non traité. Ils sont récapitulés dans le tableau de la figure 2. On constate que 3% de principe actif favorise la synthèse des intégrines #2P, responsables de la cohésion de la jonction dermo-épidermique et des interactions cellulaires. 3/ EVALUATION DES EFFETS DU PRINCIPE ACTIF SUR LA MIGRATION DES FIBROBLASTES On incube des fibroblastes humains dans un milieu de culture de fibroblastes auquel on additionne de la mitomycine C dont le rôle est de bloquer la division cellulaire en sorte de n'étudier que la capacité de ces cellules à migrer. Ce test est conduit sur une culture monocouche de fibroblastes humains sur une lame de verre, couche dans laquelle on a effectué une coupure par exemple au scalpel, en sorte de générer une zone linéaire dans laquelle il n'y a plus de cellules. Cette coupure au moment TO est exempte de cellules. On détermine au microscope l'évolution du nombre de cellules présentes dans la zone coupée, au cours du temps jusqu'à réparation. Le principe actif est introduit dans le milieu de culture à des taux de 0,5%, 1 % et 2%. Les résultats des comptages sont indiqués dans le tableau de la figure 3, à T1 = 24, T2 = 48 et T3 = 72heures. Les figures 4A, 4B et 4C montrent des vues au microscope de la zone coupée et de la densité croissante des cellules au cours du temps TO à T3. On note que le principe actif stimule la migration des fibroblastes. On constate que l'action du principe actif est immédiate même à faible taux. 4/ ETUDES DES EFFETS SUR DES VOLONTAIRES Le test est conduit sur 15 volontaires, de sexe féminin et de 48 ans d'âge moyen. Ce test est réalisé avec une émulsion contenant 5 % de principe actif contre placebo. On réalise des empreintes au niveau des deux pattes d'oie, c'est à dire la zone latérale extérieure autour de l'oeil qui comporte des rides et ridules engendrées par le plissement des yeux. Ces empreintes sont effectuées à JO (début du test) et à 28 jours. Les paramètres étudiés sur les rides sont les suivants - pour un effet lissant : complexité du microrelief cutané - pour un effet antirides : - complexité de la surface, - profondeur maximale de la ride (en mm),et - volume de la ride (en mm 3) L'analyse statistique des données permet de déterminer l'effet significatif des variations obtenues. Le test utilisé est le test de Student sur données appariées. On note par les différences suivantes les variations des différents paramètres du relief cutané dans les zones retenues traitées avec le principe actif Pr et avec le placebo PI. or = Pr,28 - Pr,, AI = P128 - PlJo les variations entre les deux zones sont donc Ar - 01 = (Pr.28 - Prjo) - (P1,,28 - PIA A partir des moyennes, on utilise la formule suivante les résultats concernant la complexité du microrelief sont récapitulés dans le tableau de la figure 5. On constate une diminution de 20 % de la complexité du microrelief cutané. Cet effet lissant est observé chez 80 % des volontaires. Les résultats concernant l'étude des rides est récapitulé dans les tableaux des figures 6, 7 et 8. On constate une diminution de 38 % de la complexité de la surface. Cet effet a été observé sur 73 % des volontaires. On constate une diminution de 21 % de la profondeur des rides. Cet effet a été observé sur 67 % des volontaires. On constate enfin une diminution de 19 % du volume des rides sur 60% des volontaires. Ainsi, le principe actif selon la présente invention améliore de façon très sensible les qualités de la jonction dermo-épidermique, ce qui a des effets significatifs sur l'état de surface de la peau. Le principe actif peut être utilisé par introduction dans toute préparation cosmétique, quelle que soit sa forme galénique, crème, émulsion, solution. Afin de permettre de lutter contre les dégradations de l'état de surface de la peau, la présente invention propose une application d'un produit contenant une quantité de 2 à 7 % de principe actif sur les zones affectées, pendant des périodes de l'ordre de 28 jours. REVENDICATIONS 1. Procédé d'extraction d'un principe actif en vue de lutter contre la dégradation de la jonction dermo-épidermique pour améliorer l'état de surface de la peau, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes - solubilisation des levures en milieu aqueux légèrement basique à raison d'au moins 20 %, - hydrolyse des protéines en milieu basique, - agitation de 8 à 52 heures, - première filtration afin de séparer les phases soluble et insoluble, - lavage contre eau afin de purifier la fraction active des sels, - concentrations et filtrations successives afin de concentrer la préparation en fraction active, et - filtration stérilisante. 2. Principe actif obtenu par le procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir de levure de type Saccharomyces Cerevisiae et en ce que - le taux de matière sèche est compris entre 10 et 200 g/1, - la quantité de sucres totaux est comprise entre 10 et 100 gh, et - le pH est compris entre 4,0 et 10,0. 3. Principe actif obtenu par le procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que - le taux de matière sèche est compris entre 10 et 100 g/1, - la quantité de sucres totaux est comprise entre 10 et 70 g/1, - le pH est compris entre 6,0 et 7,0. 4. Principe actif obtenu par le procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que - le taux de matière sèche est compris entre 20 et 50 g/1, - la quantité de sucres totaux est comprise entre 20 et 50 g/1, - le pH est compris entre 6,0 et 7,0. 5. Composition cosmétique mettant en oeuvre le principe actif selon la revendication 2, 3 ou 4 extrait selon le procédé de la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de crème, d'émulsion ou de solution. 6. Traitement cosmétologique pour lutter contre la dégradation de l'état de la peau en améliorant les qualités de la jonction dermo-épidermique, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact avec la peau, une composition selon la revendication 5.