Brevet FR2805994A1 — publié le 20010914

MÉTHODE DE DÉTECTION DE LA GUANYLYL CYCLASE-C ET SON UTILISATION POUR LE DIAGNOSTIC DES TUMEURS COLORECTALES MÉTASTATIQUES. La présente invention concerne la détection de la Guanylyl Cyclase-C (GC-C) qui est le récepteur transmembranaire de l'entérotoxine thermostable (STa) produite par les Escherichia coli. La Guanylyl Cyclase-C a été décrite comme un marqueur spécifique des métastases provenant de cancers colorectaux (Carithers, S. L. et al., 1996, PNAS, USA, 93 : Carithers, S. L. et al., 1996, Dis. Colon Rectum., 39 : En effet, il a été montré que la GC-C est exprimée dans les cellules saines de la muqueuse intestinale et dans les cellules cancéreuses métastasées colorectales, mais pas dans les tissus sains extra-intestinaux ou dans des cellules cancéreuses métastasées non-colorectales, ce qui permet d'envisager son utilisation comme marqueur spécifique des métastases colorectales (Waldman, S. A. et al., 1998, Cancer epidemiology, biomarkers & prevention, 7 : 505-514 ; Waldman, S. A. et al., 1998, Dis. Colon Rectum., 41 : 315). L'invention concerne donc aussi le dépistage des métastases d'origine colorectale pour le diagnostic des tumeurs colorectales métastatiques. La survenue de métastases constitue la cause majeure de décès de patient présentant un cancer colique. Aussi, la recherche de cellules tumorales circulantes avec des méthodes très sensibles et très spécifiques constitue un moyen intéressant de dépistage et de suivi des malades cancéreux (Le Maire, V. et al., 1998, Ann. Pharm. Fr., 56: 9-17). A ce jour, il n'existe pas de technologies simples, à la fois sensibles et spécifiques pour ce type de dépistage. Les méthodes immunologiques conventionnelles qui font appel à une variété d'anticorps monoclonaux dirigés contre des marqueurs usuels comme ACE, CEA, CA19-9 17-1-A, CA50, CA195, CA72-4, CA242, TAG 72, TPA, villine, LAP, prolactine plasmatique et les cytokératines CK19 et CK20, se sont révélés insuffisantes en raison de leur manque de spécificité et de sensibilité (Wyld, D. K. et al., 1998, Int. J. Cancer (Pred. Oncol. ), 79 : En effet, un des problèmes majeurs réside dans l'accessibilité des cellules tumorales aux anticorps. Aujourd'hui, il est possible de détecter facilement les foyers secondaires métastasiques par des méthodes lourdes et coûteuses comme le résonance magnétique ou la scintigraphie osseuse. Par contre, les techniques de dépistage au niveau hématogène comme la cytométrie de flux ou l'immunohistochimie, ont une sensibilité et une spécificité limitée. Récemment, des techniques de biologie moléculaire fondées sur la PCR pour détecter des ARNm codant pour des antigènes spécifiques de la cellule colique, CGM2, CK19 et CK20 (Le Maire, V. et al., 1998, Ann. Pharm. Fr., 56 : 9-17) ont permis de détecter la présence de cellules circulantes dans le sang avec une sensibilité très supérieure aux méthodes immunologiques conventionnelles.. Cependant, la forte fréquence de détection, de 30% à 100%, de ces antigènes dans le sang de sujets sains, due à une transcription illégitime des gènes tissus-spécifiques, dénote une faible spécificité de l'outil moléculaire qui, pour le moment, ne peut être utilisé en routine pour mettre en évidence la dissémination hématogène de cellules coliques. Le choix du récepteur GC-C comme cible moléculaire présente de nombreux avantages : - Seulement 5% des patients sains ont été montrés présentant des ARNm de GC-C dans le sang (Bustin, S. A. et al. 1999, British J. Cancer, 79 : - A l'inverse des antigènes cités précédemment qui ne sont que tissus-spécifiques, et alors que de rares antigènes sont réellement spécifiques de cellules tumorales, le récepteur GC-C est un marqueur spécifique des métastases colorectales. - L'affinité de la toxine STa pour son récepteur est très grande et du fait de sa petite taille (2 Kd), la toxine STa peut accéder facilement aux cellules tumorales via son récepteur GC-C. Les inventeurs ont envisagé une méthode de détection du récepteur GC-C qui ne présente pas les inconvénients des techniques basées sur la détection des ARNm de GC-C par RT-PCR proposées dans l'art antérieur. Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont conduit les inventeurs a développé une méthode de détection du récepteur GC-C par son ligand exogène la toxine STa. Or une telle approche présente des difficultés car : - La toxine STa est dépourvue de propriétés immunologiques. En conséquence, il est difficile de produire des anticorps spécifiques anti-toxine STa par immunisation avec la toxine STa seule. - La toxine STa est faiblement antigénique ce qui limite l'utilisation de tous les anticorps anti-toxine STa obtenus avec STa conjuguée à un facteur immunogène pour cibler la toxine STa liée à son récepteur. Les inventeurs sont maintenant parvenus à préparer des protéines hybrides comprenant le peptide constituant la toxine STa et une protéine porteuse immunogène dans lesquels la structure conformationelle de la toxine STa demeure compatible avec sa fixation sur le récepteur GC-C. La toxine STa est un peptide extracellulaire produit par les E. coli entérotoxinogènes (ETEC) responsables de diarrhées sévères et de la "maladie des voyageurs (tourista)". La toxine sécrétée par les bactéries dans le tractus gastrointestinal se lie à son récepteur GCC, l'active et pénètre par endocytose dans les cellules entérocytaires pour induire une accumulation de fluide intestinal. Le peptide constituant la toxine STa, ci-après désigné également le peptide STa, comprend 18 à 19 acides aminés et possède trois ponts disulfures nécessaires à son activité entérotoxique. En effet, l'intégrité de la structure tridimentionnelle de la toxine STa est essentielle pour sa liaison avec le récepteur GC-C. L'invention se rapporte donc à l'utilisation d'un conjugué du peptide STa et d'une molécule active dans lequel ledit peptide STa présente une structure conformationelle permettant sa fixation sur le récepteur GC-C pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou au diagnostic des tumeurs colorectales métastatiques. Avantageusement la molécule active est une protéine et le conjugué est une protéine de fusion, aussi désignée ci-après protéine chimère ou protéine hybride, produite par fusion des gènes codant pour le peptide STa et ladite protéine active. Une composition pharmaceutique selon l'invention comprend une ou plusieurs protéines chimères dans un véhicule compatible avec ladite protéine chimère et acceptable pour une utilisation thérapeutique ou diagnostic chez l'homme ou l'animal. Les protéines chimères selon l'invention sont tout particulièrement utiles pour la détection des récepteurs GC-C et le diagnostic des tumeurs colorectales métastatiques. Dans ce cas, la protéine active entrant la constitution de la protéine chimère selon l'invention est avantageusement une protéine porteuse immunogène capable de conférer à la protéine chimère des propriétés immunogènes sans modifier la structure conformationelle du peptide STa permettant sa fixation sur le récepteur GC-C et donc la détection de la protéine de fusion fixée au récepteur GC-C. Les inventeurs disposent de connaissances particulières et d'un savoir-faire en matière d'expression de protéine et peptides hétérologues dans la sous-unité protéique majeure ClpG des fimbriae CS31A sans affecter la formation de ces fimbriae à la surface d'E. Coli. Ainsi, la demande de brevet internationale publiée sous le No. W094/14967 rapporte les travaux des inventeurs pour définir des régions de la protéine ClpG dans lesquelles des peptides hétérologues peuvent être introduits sans perturber la biogénèse de la capsule protéique CS31A. Les inventeurs ont mis à profit leurs travaux antérieurs sur les fimbriae CS31A pour utiliser la sousunité ClpG comme protéine conjuguée au peptide STa. Les inventeurs sont parvenus à induire des anticorps neutralisant et protecteurs dirigés contre la toxine STa par immunisation avec des protéines chimères résultant de fusions génétiques entre le peptide STh (Sta d'origine humaine) et la protéine ClpG. Quatre protéines chimères distinctes comprenant une séquence hétérologue de 17 à 28 acides aminés ont été préparées comme décrit par exemple dans la demande de brevet PCT W094/14967, l'une présentant le peptide STh à l'extrémité N-terminale de la protéine ClpG et les trois autres possédant le peptide STh à l'extrémité C-terminale de la protéine ClpG. La caractérisation des quatre hybrides montre que, de façon surprenante, les fusions N et Cterminales sont sécrétées dans le milieu extracellulaire sous une forme monomérique libre et non pas sous une forme polymérique fimbriale exposée à la surface des bactéries. Les résultats de ces travaux sont remarquables en ce sens que toutes les protéines chimères ClpG-STh sont associées à une forte activité entérotoxique comparable à celle de la toxine naturelle STa. Or, comme indiqué précédemment, on sait que cette activité, évaluée in vivo à l'aide du test sur souriceau nouveau-né, dépend de la structure native de la toxine STa stabilisée par l'existence de trois ponts disulfures, également présents dans la toxine STh. Ces résultats montrent pour la première fois que la partie STa de ces protéines hybrides conserve ses caractéristiques naturelles lui permettant de reconnaître son récepteur GC-C et donc de garder sa toxicité en induisant une accumulation de fluides intestinaux caractéristique de la diarrhée. L'invention se rapporte donc tout particulièrement à une protéine chimère formée par une protéine ClpG et le peptide STa où le peptide STa est introduit au niveau d'une région permissive de la protéine ClpG, et son utilisation pour détecter in vitro les récepteurs GC-C. En effet, le caractère antigénique de la partie ClpG des protéines chimères, permet d'utiliser les anticorps anti-ClpG pour la détection in vitro ou in situ des récepteurs GC-C et donc pour le dépistage des métastases colorectales. L'homme du métier est capable de préparer de telles protéines chimères à partir de l'enseignement des travaux antérieurs des Inventeurs sur la protéine ClpG et ses régions permissives de même que sur la base des résultats expérimentaux rapportés dans la partie expérimentale rapportée ci-après. Une forme simple et rapide de diagnostic des tumeurs colorectales métastatiques selon l'invention consiste en une détection immunologique des récepteurs GC-C dans un échantillon biologique d'un patient, basée sur l'utilisation d'une protéine chimère formée par une protéine ClpG et le peptide STa et d'anticorps spécifiques dirigés contre la protéine ClpG ou contre la protéine chimère. Il peut s'agir d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux préparés par des techniques classiques bien connues de l'homme du métier du type décrit dans la partie expérimentale ci-après. Une méthode de diagnostic selon l'invention comprend les étapes suivantes : - la mise en contact dudit échantillon avec une protéine chimère formée par une protéine ClpG et le peptide STa dans des conditions permettant la fixation de la protéine chimère sur les récepteurs GC-C, lesquels sont fortement exprimés par les cellules métastatiques, par le biais de la partie STa de la protéine chimère, puis - la détection des protéines chimères fixées sur les récepteurs GC-C à l'aide d'anticorps dirigés contre la partie ClpG de la protéine chimère, ou contre la protéine chimère elle-même. Les anticorps spécifiques anti-ClpG ou antiprotéine chimère peuvent être avantageusement couplés à des chromophores enzymatiques ou fluorescents. L'échantillon biologique d'un patient sur lequel est pratiquée la méthode de diagnostic de l'invention est par exemple des cellules coliques circulant dans le sang ou provenant de biopsie. La méthode de l'invention peut donc être réalisée à partir de sang (méthode ELISA) ou de biopsie (méthode immunohistochimique) . A titre d'exemple de mise en #uvre de la détection du récepteur GC-C de la toxine thermo-stable STh dans un extrait biologique selon l'invention, on peut donc citer : la technique ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) par compétition à partir d'extraits sanguins ou de matériels tissulaires, ou les techniques d'immunohistochimie à partir de biopsie de tissus extaintestinaux. Comme un exemple, dans le cas d'un test basé sur une technique ELISA par compétition en plaques de microtitration, les puits sont sensibilisés avec tout ou une partie (naturelle ou synthétique) du récepteur semipurifié ou purifié à partir des lignées cellulaires intestinales T84 ou Caco 2 en culture ; si on utilise une partie du récepteur (partie extracellulaire) elle devra contenir le site de reconnaissance de la toxine. Les puits inoccupés peuvent être saturés avec des agents bloquants tels que la BSA (bovine serum albumine). Les récepteurs immobilisés sont mis en contact avec des dilutions du plasma sanguin (le plasma pourrait contenir le domaine extracellulaire du récepteur) ou avec des dilutions de récepteurs obtenus après homogénéisation mécanique de matériels tissulaires et solubilisation des membranes. On ajoute alors les protéines de fusion ClpG-STh purifiées dans les puits. Une autre possibilité est que les récepteurs immobilisés soient mis en contact avec le mélange échantillon + protéine ClpG-STh préalablement préincubé à 37 C/30 min. Après incubation et lavage, des anticorps primaires spécifiques (IgG sériques polyclonaux [purifiés ou semi-purifiés], ou monoclonaux d'un type ou un mélange de plusieurs types) obtenus à partir soit de la protéine ClpG purifiée, et, donc, dirigés uniquement contre la partie ClpG de la protéine hybride, soit de la protéine chimère ClpG-STh, et, donc dirigés à la fois contre les parties ClpG et STh. La fixation de la partie STh des hybrides au récepteur immobilisé est détectée indirectement par l'utilisation d'anticorps secondaires, par exemple, marqués à la péroxydase, et capables de se fixer aux anticorps primaires. Une autre possibilité est que les anticorps primaires soient directement conjugués à la péroxydase, évitant ainsi l'utilisation des anticorps secondaires. La réaction est alors révélée par colorimétrie à travers une activité enzymatique qui peut être amplifiée si nécessaire. L'intensité de la réaction colorée est inversement proportionnelle à la quantité de récepteur dans l'échantillon. La lecture des densités optiques à une certaine longueur d'onde de standards (différentes concentrations de récepteurs purifiés) servira à la construction d'une courbe étalon permettant de mesurer la quantité de récepteurs dans les échantillons. Si les extraits sanguins contiennent du récepteurs GC-C, celui-ci fixera les protéines ClpG-STh et l'ensemble ne pourra donc pas se fixer sur les récepteurs immobilisés car il se produira un phénomène de compétition entre GC-C immobilisé et GC-C libres dans les extraits biologiques, vis à vis des protéines ClpG-STh : pour une forte concentration de récepteurs (résultats positif), une réaction colorée très pâle ou une absence de coloration sera observée. Si les extraits ne contiennent pas de récepteurs (résultat négatif), les hybrides ClpG-STh se lient au récepteur fixé sur la phase solide des plaques de microtitration. Lors de la révélation colorimétrique, la réaction sera colorée. L'invention concerne donc également un kit pour la mise en #uvre de cette méthode, caractérisé en ce qu'il comprend : - une plaque de microtitration où chaque puits est sensibilisé avec tout ou une partie du récepteur GC-C (naturel ou synthétique) conservant le site de fixation de la toxine, - au moins un contrôle positif contenant du récepteur GC-C purifié. - la protéine chimère ClpG-STh purifiée, - des anticorps primaires concentrés en solution contenant des IgG sériques polyclonaux ou monoclonaux (souris) anti-ClpG ou anti-hybride ClpG-STh, - des anticorps secondaires marqués, - des tampons. A titre d'exemple détaillé, un tel kit comprend : - Des plaques de microtitration secables : 6 barrettes de 16 puits sur un support. Chaque puits est sensibilisé avec tout ou une partie du récepteur GC-C conservant le site de fixation de la toxine et contient un stabilisateur. - Un contrôle positif : standard lyophilisé contenant du récepteur GC-C purifié à une concentration donnée qui sera dilué avec de l'eau avant emploi. - La protéine chimère ClpG-STh purifiée, lyophilisée et quantifiée. - Des anticorps primaires concentrés en solution contenant des IgG sériques polyclonaux (lapin, chèvre ou autres) ou monoclonaux (souris) anti-ClpG ou anti-hybride ClpG-STh qui seront dilués avec du tampon anticorps au dernier moment. - Des anticorps secondaires concentrés en solution contenant des IgG polyclonaux (l'origine animale dépendant de celle des anticorps primaires) conjugués à la péroxydase. - Un tampon de blocage : tampon Tris HCI avec BSA ou sérum normal (lapin, chèvre, souris ou autres suivant l'origine de l'anticorps primaire et secondaire utilisés dans la suite du test). - Un tampon de lavage. - Un Tampon anticorps. - Un tampon stop : 0,3 M acide sulfurique. - La péroxydase substrat A : ophenylenediamine ou diaminobenzidine déshydraté. - La péroxydase substrat B : solution de péroxyde d'hydrogène. Mais l'invention permet aussi d'envisager l'utilisation des protéines de fusion ClpG-STh en immunohistochimie sur coupes congelées ou sur coupes en paraffine de tissus d'organes extraintestinaux (ganglions, foie, rein, rate,....) chez des malades atteints de cancer colorectal afin de mettre en évidence le récepteur GC-C à l'intérieur ou à la surface des cellules tumorales métastatiques. A l'aide des anticorps primaires polyclonaux ou monoclonaux anti-ClpG ou anti-hybride ClpG-STh préalablement marqués (Péroxydase, fluorochromes, biotine, etc...) soit directement soit indirectement par des anticorps secondaires anti-corps primaires, il est possible de visualiser en microscopie électronique la présence de cellules tumorales, d'estimer leur proportion, et ainsi d'évaluer le degré de prolifération cellulaire (degré de malignité et extension). L'avantage de ce système s'appuie sur la reconnaissance Toxine STh/Récepteur GC-C qui est plus sensible que la reconnaissance Récepteur GCC/Anticorps anti-récepteur habituellement mise à profit dans ce genre d'approche immunohistochimique. L'invention trouve principalement son application dans le domaine du diagnostic, mais elle présente également des applications thérapeutiques en matière de traitement des métastases d'origine colique. En effet, comme indiqué précédemment, la toxine STa pénètre dans les entérocytes après s'être fixée sur son récepteur GC-C (Urbanski, R. et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1245 : 29-36), et l'on peut donc utiliser le peptide STa comme véhicule pour internaliser le conjugué de l'invention. Dans ce cas, la molécule active, plus particulièrement une protéine active, est un agent thérapeutique anti-cancéreux ayant avantageusement une activité : - anti-cancéreuse spécifique des cellules tumorales, c'est à dire capable de les tuer sans affecter les cellules saines, - uniquement sur les cellules en cours de multiplication, - capable de diffuser à distance à partir d'une cellule tumorale réceptrice sur d'autres cellules cancéreuses périphériques n'ayant pas incorporé l'agent thérapeutique. Un exemple d'un tel agent thérapeutique est la thymidine kinase du type 1 du virus herpès. La protéine chimère peut être administrée par voie systémique de façon à cibler sélectivement les cellules rectocoliques tumorales extra-intestinales et de les éliminer sélectivement après internalisation de la protéine chimère via le récepteur GCC. C'est donc le caractère toxique déterminé par la structure tridimensionnelle du peptide STa qui va permettre cette action sélective. La très petite taille du peptide STa, son absence d'immunogénicité et sa grande sélectivité pour son récepteur confère au peptide STa un intérêt tout particulier pour vectoriser des agents actifs dans les métastases colorectales. L'existence de souches Smad3 de souris transgéniques capables de développer spécifiquement un cancer colorectal permet de disposer d'un outil complémentaire pour l'étude expérimentale des applications thérapeutiques de l'invention (Zhu, Y. et al., 1998, Cell., 94 : 703-14). D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant la préparation de protéines chimères formées par une protéine ClpG et le peptide STa et la mise en évidence que les protéines chimères ClpG-STh sont associées à une forte activité entérotoxique comparable à celle de la toxine naturelle STa. A - MATÉRIEL ET MÉTHODES. 1) Souches bactériennes et plasmides. Les différentes souches bactériennes utilisées au cours de ce travail sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 Souches Génotypes/Caractéristiques DH5a F- supE44, (argF-lacZYA) U169 (#80 lacz#M15), hsdR17 (rk-, mk+) , recAl, endAl, gyrA96 (Nalr) , thil, relAl B41 Souche d'ETEC d'origine bovine (0101:K-:H-, K99, F41) produisant STa. JCB570 AraD139# (araABC-Leu) 7679, galU, galK, # (lac) X74, rpsL, thi, phoR, zih 12::TnlO JCB571 JCB570 dsbA::kan1 JCB819 JCB570 (malF-lacZ102) dsbB::kan1 JCB818 JCB570 (malF-lacZ102) dsbA::kanl, dsbB::kanl La souche B41 est une souche sauvage de référence productrice de toxine STp. Les souches JCB571, JCB818, JCB819 dérivées de JCB570 sont mutées dans le système Dsb impliqué dans la formation des ponts disulfures. Les bactéries sont cultivées à 37 C en milieu LB (Luria Bertani) liquide ou gélosé supplémenté avec les antibiotiques appropriés : ampicilline (Ap), 50 ug/ml ; chloramphénicol (Cm), 25 ug/ml ; tétracycline (Tc), 12,5 ug/ml ; streptomycine (Sm) 50 ug/ml. Les différents plasmides utilisés dans ce travail sont décrits dans le tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 Plasmides Génotype/Caractéristiques pHSG575 Vecteur de clonage à faible nombre de copies ; origine de réplication pSC101, CmR pEH524 pHSG575 avec l'opéron clp codant pour les fimbriae CS31A pDSPH524 pEH524 délété du gène clpG pSK+ Vecteur de clonage pBluescript SK(+) ; origine de réplication pColEl, ApR pDEV41155 pSK+ avec clpG entre EcoRV et XbaI pHPCOH838 pDEV41155 avec un codon GTT juste avant le dernier codon de clpG pSTN24 pHPCOH838 avec STh dans SphI pSTC22 pHPCOH838 avec STh entre les sites HpaI de clpG et XbaI du vecteur pProSTC28 pSTC22 avec STh entre les sites HpaI et SmaI pSTC17 pSTC22 délété du fragment HpaI/SmaI pEHSTN24 pEH524 avec clpG-STh de pSTN24 à la place de clpG pEHSTC22 pEH524 avec clpG-STh de pSTC22 à la place de clpG pEHProSTC28 pEH524 avec clpG-STh de pProSTC28 à la place de clpG pSelect-1 Vecteur de clonage ; origine de réplication pColEl, TcR pSXIOS pSelect-1 avec clpG dans lequel les sites SpeI et BglII ont été créés pSTVIOS pSXIOS avec STh inséré dans SpeI pSTVD41 pSTVIOS délété du fragment BamHI/BglII pEHSTVD41 pEH524 avec clpG-STh de pSTVD10S à la place de clpG pTrc99A Vecteur d'expression possédant le promoteur inductible Ptrc ; origine de réplication pColEl, ApR, LacIq, rrnB pTrcSTN24 pTrc99A avec clpG-STh de pSTN24 pTrcProSTC28 pTrc99A avec clpG-STh de pProSTC28 pSTCDMl pHPC0838 avec STh mutée pour l'entérotoxicité entre les sites HpaI de clpG et XbaI du vecteur pSPGST1 pHPC0838 avec STh entre Sphl et HpaI pSTE531 pSTN24 avec l'ADN duplex E531/E351 (Tableau 10) dans PstI pSTDG17 pSTE531 délété du fragment SnaBI/HpaI pSTDG126 pHPC0838 avec STh entre SphI et HpaI pGMSTC7 pSTC22 avec l'ADN duplex GMCST3/GMCST5 (Tableau 10) entre SphI et HpaI pGMSTC71 pGMSTC7 délété du fragment HpaI/HpaI pGMSTC710 pGMSTC7 délété du fragment Hpal/Smal PGMSTC13 pProSTC28 avec l'ADN duplex GMCST3/GMCST5 (Tableau 10) entre SphI et HpaI pGMTSTC13/19 pGMSTC13 délété du fragment HpaI/HpaI GMSTC13/28 GMSTC13 délété du fra ent EcoRIlEcoRI Le plasmide pEH524 portant l'opéron clp contient tous les gènes nécessaires à la biogénèse de CS31A. Le plasmide pDSPH524 est un dérivé de pEH524 dans lequel le gène clpG a été entièrement délété. Les plasmides pDEV41155 et pSXlOS dérivent respectivement des vecteurs pBluescript SK (Stratagene) et pSelect 1 (Promega) dans lesquels seul le gène clpG a été cloné. Le plasmide pSX10S possède un site de restriction unique SpeI créé par mutagénèse dirigée. L'asparagine 203 de ClpG est ainsi substituée par une thréonine. Le plasmide pHPC0838 dérive de pDEV41155 par substitution du site de restriction unique AflIII en un site unique BglII, par création d'un site unique HpaI et par addition d'un résidu valine entre les deux derniers résidus (tyrosine et asparagine) C-terminaux de ClpG. Afin de pouvoir contrôler l'expression des différentes protéines hybrides, les gènes de fusion ont été placés en aval du promoteur Ptrc inductible par l'IPTG (isopropyl-i3-D-thiogalactopyranoside) dans le vecteur d'expression pTrc99A. L'induction est réalisée avec 2 mM d'IPTG. 2) Purification des plasmides (kit Qiagen). Cent millilitres de milieu LB liquide contenant les antibiotiques appropriés sont ensemencés avec 500 l d'une préculture bactérienne et incubés pendant une nuit à 37 C sous agitation. Après centrifugation, le culot est repris par 4 ml de tampon P1. Puis 4 ml de tampon de lyse P2 sont ajoutés et l'ensemble est incubé pendant 5 min à température ambiante. Quatre millilitres de tampon P3 sont alors ajoutés et l'ensemble est laissé pendant 5 min dans la glace, puis centrifugé 30 min à 15000 g à 4 C. Le surnageant est déposé sur une colonne QIAGEN-100 préalablement équilibrée avec 3 ml de tampon QBT. La colonne est ensuite lavée avec 10 ml de tampon QC puis l'ADN est élué avec 5 ml de tampon QF. L'éluat est additionné de deux volumes d'éthanol absolu et incubé pendant 5 min dans la glace. Après centrifugation (30 min, 15000 g, 4 C), le culot d'ADN est séché pendant 5 min sous vide et repris dans de l'eau bidistillée stérile. La quantité et la pureté de l'ADN obtenu sont estimées par mesure des DO à 260 nm et à 280 nm. L'ADN recombinant ainsi purifié est alors analysé par séquençage. 3) Purification des fragments d'ADN en gel d'agarose. Les digestions enzymatiques de l'ADN sont effectuées conformément aux indications données par les fournisseurs. Les échantillons, en solution dans du tampon de charge, sont déposés sur un gel d'agarose 0,7 % à 1,4 %, contenant du bromure d'éthidium à une concentration finale de 0,5 pg/ml. Après migration dans du tampon d'électrophorèse TBE, les fragments d'ADN sont visualisés sous ultraviolets (UV). L'échelle de marqueurs 1 kb (GibcoBRL) permet de repérer la taille des fragments d'ADN. Ces derniers sont ensuite directement découpés dans le gel d'agarose puis purifiés à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) selon les instructions du fournisseur. Le bloc d'agarose contenant l'ADN est dissous à 50 C pendant 10 min dans trois volumes de tampon QX1. L'échantillon est chargé sur une colonne QIAquick qui est centrifugée à 10000 g pendant 1 min. Puis 750 l de tampon de lavage PE sont déposés sur la colonne qui est incubée pendant 5 min à température ambiante, avant d'être centrifugée à 10000 g pendant 1 min. Une centrifugation supplémentaire (10000 g, 1 min. ) permet d'éliminer les traces résiduelles de tampon PE. La colonne est placée dans un tube Eppendorf neuf et l'ADN est élué par ajout de 50 l d'H20 et centrifugation à 10000 g pendant 1 min. 4) Duplex d'oligonucléotides de synthèse. Tous les oligonucléotides de synthèse purifiés par HPLC (Eurogentec) utilisés pour réaliser les différentes constructions, sont représentés dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 Oligos Séquences (5'~ 3') Sth72N3 AGGATCTGCAGGGTAACATCCTGTACAGGCAGGATTACAACAAAGTTCA CAGCAGTACAGATCTGCCGCATG Sth72N5 CGGCAGATCTGTACTGCTGTGAACTTTGTTGTAATCCTGCCTGTACAGG ATGTTACCCTGCAGATCCTCATG Sth73C3 CTAGTTAGTAACATCCTGTACAGGCAGGATTACAACAAAGTTCACAGCA GTAGTTCCCGGGGTTATCAGGGTT Sth69C5 AACCCTGATAACCCCGGGAACTACTGCTGTGAACTTTGTTGTAATCCTG CC TGTACAGGATGTTACTAA Sth33PC3 GCTAGAATTCATCGATTCAGGACCACTTTTGTT Sth33PC5 AACAAAAGTGGTCCTGAATCGATGAATTCTAGC Sth69V3 CTAGGATCCCCGTAACATCCTGTACAGGCAGGATTACAACAAAGTTCAC AGCAGTAGTTAGAAGAATTC Sth69V5 CTAGGAATTCTTCTAACTACTGCTGTGAACTTTGTTGTAATCCTGCCTG TACAGGATGTTACGGGGATC E3 51 TTATACGTAATTAATTAAGCTTGCA E531 AGCTTAATTAATTACGTATAATGCA SPGST3 AACTTAGTAACATCCTGTACAGGCAGGATTACAACAAAGTTCACAGCAG TAGTTAGAAGAATTGCATG SPGST5 CGAATTCTTCTAACTACTGCTGTGAACTTTGTTGTAATCCTGCCTGTAC AGGATGTTACTAAGTT GMCST3 AACTGCAGAATTCATGTTAACCGCATG GMCST5 CGGTTAACATGAATTCTGCAGTT STNDG2 AACTTAGTAACATCCTGTACAGGCAGGATTACAACAAAGTTCACAGCAG TACAGATCTGCCGCATG STNDG1 CGGCAGATCTGTACTGCTGTGAACTTTGTTGTAATCCTGCCTGTACAGG ATGTTACTAAGTT STGL673 CTAGATC7TAATAACAACCAGTACACAG STGL635 ACCATTACAACACAGTTCACAACAATAATTACTCGAGTT AACTCGAGTAATTATTGTTGTGAACTGTGTTGTAATGGT CTGTGTACTGGTTGTTATTAAGAT Dans le tableau 3 ci-dessus, les séquences codant pour tout ou partie de la toxine STh sont indiquées en caractères gras. Les sites de restriction des enzymes BglII (AGATCT dans Sth72N3, Sth72N5 ; STNDG1, STNDG2 ; GMCST3, GMCST5 ; STGL673, STGL635), HpaI (GTTAAC dans GMCST3, GMCST5), PstI (CTGCAG dans Sth72N3, Sth72N5), SmaI (CCCGGG dans Sth73C3, Sth69C5), ClaI (ATCGAT dans Sth33PC3, Sth33PC5), EcoRI (GAATTC dans Sth33PC3, Sth33PC5 ; Sth69V3,Sth69V5), BamHI (GCATCC dans Sth69V3, Sth69V5), BsrGI (TGTACA dans Sth72N3, Sth72N5 ; Sth73C3,Sth69C5 ; SPGST3, SPGST5 ; STNDG1, STNDG2), XhoI (CTCGAG dans STGL673, STGL635) et PacI (TTAATTAA) et SnaBI (TACGTA) dans E531 et E351 sont en italique. Les codons modifiés par rapport à la séquence de la toxine STh originelle sont soulignés. Les oligonucléotides complémentaires monocaténaires sont mélangés dans du tampon TE à une concentration finale de 2 ug/ul. Ils sont chauffés à 80 C pendant 1 min puis à 65 C pendant 5 min et refroidis dans la glace jusqu'à ce que la température atteigne environ 25 C. Les duplex d'oligonucléotides ainsi formés sont conservés à -20 C. 5) Clonage, transformation et sélection des clones recombinants. L'ADN passager et l'ADN vecteur sont mélangés dans un rapport molaire 1:1 ou 3:1 à une concentration d'ADN total comprise entre 15 et 50 ng/ul. Les fragments sont ligaturés dans un volume final de 20 ul de tampon ligase (BRL) contenant 1 à 5 U de T4 DNA ligase pendant 18 h à 16 C ou une nuit à 4 C. Les cellules bactériennes réceptrices, préalablement traitées au CaCl2, sont alors ajoutées (200 ul) puis incubées pendant 40 min dans la glace. Après un choc thermique (2 min à 42 C puis 5 min dans la glace), 800 ul de milieu LB liquide stérile préchauffé à 37 C sont ajoutés. L'ensemble est incubé pendant 45 min à 37 C sous agitation. Puis 100 l du mélange de transformation sont étalés sur milieu sélectif gélosé et incubés pendant une nuit à 37 C. Le criblage individuel des colonies a été réalisé par analyse des fragments de restriction et par séquençage des gènes de fusion. Les fragments de restriction sont obtenus à partir d'une minipréparation d'ADN plasmidique partiellement purifié. Pour ce faire, une colonie bactérienne est prélevée et cultivée pendant une nuit à 37 C sous agitation dans du milieu LB liquide additionné des antibiotiques appropriés. Puis 1,5 ml de la suspension bactérienne sont centrifugés (5 min, 15000 g, 4 C) et le culot est repris avec 150 l de tampon P1 et 200 l de tampon de lyse P2. Après incubation pendant 5 min dans la glace, les membranes bactériennes, les protéines et l'ADN chromosomique sont précipités par addition de 150 l de tampon P3 et laissés 10 min dans la glace. Après centrifugation (15 min, 15000 g, 4 C), deux volumes d'éthanol absolu sont ajoutés au surnageant. La solution est placée dans la glace pendant 15 min, puis centrifugée (15 min, 15000 g, 4 C). Le culot d'ADN est séché sous vide pendant 5 min et repris dans 50 l d'eau bidistillée stérile. Cet ADN (5 à 10 l) est ensuite analysé après digestion endonucléasique et migration électrophorétique. 6) Anticorps. L'antisérum anti-ClpG spécifique de la sousunité majeure des fimbriae CS31A a été obtenu chez le lapin après trois injections intra-dermiques effectuées à vingt jours d'intervalle avec 250 g de protéine CS31A native en présence d'adjuvant incomplet de Freund. 7) Préparation des extraits protéiques. Les extraits provenant de cultures solides sont obtenus de la façon suivante : 1 ml d'une préculture réalisée en milieu LB liquide est versé à la surface d'une gélose LB contenant les antibiotiques appropriés. Les boîtes de Pétri sont placées pendant une nuit à 37 C (couvercle en haut) dans une atmosphère humide. Le tapis bactérien est récolté dans du tampon PBS, soumis à une agitation à l'aide d'un vortex et centrifugé pendant 10 min à 12000 g. Le surnageant est alors immédiatement analysé ou conservé à -20 C. Quarante boîtes de Pétri par souche ont été ainsi préparées afin de récupérer suffisamment de surnageant pour assurer toutes les expérimentations entreprises au cours de ce travail. Les surnageants de cultures liquides d'une nuit à 37 C sont récupérés après centrifugation (10 min, 12000 g). Ils sont ensuite concentrés à l'aide d'un microconcentrateur NANOSEP (Pall Filtron Laboratories) qui retient les protéines de masse moléculaire supérieure à 10 kDa. La sous-unité ClpG native est extraite à partir de la souche DH5a (pEH524) cultivée en milieu LB solide comme décrit ci-dessus. La concentration protéique de l'extrait est estimée par la méthode colorimétrique ESL (Exact, Sensitive, Low interférence) à l'aide du kit Protein Assay ESL (Boehringer). Les protéines ClpG sont visualisées sur un gel de polyacrylamide à 15 % après coloration au nitrate d'argent. 8) Immunodétection des hybrides. a) Sur colonies. Les colonies obtenues après transformation sont cultivées de manière ordonnée sur boîtes LB gélosées et incubées pendant une nuit à 37 C. La réplique s'effectue en appliquant directement une membrane de nitrocellulose sur la surface de la gélose. La membrane est saturée pendant 1 h à température ambiante dans du tampon de blocage, avant d'être incubée pendant 2 h avec le premier anticorps dilué au 1/500 dans du tampon TBS, 0,1 % Tween 20. Après trois lavages de 5 min dans du tampon TBS, 0,05 % Tween 20, la membrane est incubée pendant 1 h avec un anticorps secondaire approprié conjugué à la péroxydase (Nordic Immunological Laboratories) dilué au 1/1000 dans du tampon TBS, 0,1 % Tween 20 . Après deux lavages de 5 min avec du tampon TBS, 0,05 % Tween 20 et un lavage de 5 min avec du tampon TBS, la membrane est incubée dans une solution contenant de l'H2O2 et du 4-chloro-1-naphtol. La réaction colorimétrique est arrêtée par rinçage de la membrane dans plusieurs bains d'eau bidistillée. b) Microscopie électronique. Les souches bactériennes sont cultivées sur milieu LB solide pendant une nuit à 37 C. Le tapis bactérien est récupéré puis immergé dans du paraformaldéhyde 4 %, glutaraldéhyde 0,1 %, PBS 0,2 M (pH 7,4). Après centrifugation, le culot est rincé trois fois pendant 15 min dans du tampon phosphate et déshydraté dans de l'éthanol 50 %, 75 % puis 85 % (3 x 15 min). Il est ensuite placé dans un mélange 1 :1 résine LR White médium : éthanol 85 % pendant 1 h et imprégné dans de la résine LR White pure (3 x 1 h) avant d'être inclus dans une capsule de gélatine. Après polymérisation, des coupes ultrafines (70 nm d'épaisseur) sont réalisées à l'aide d'un ultramicrotome (Ultracut E. Reichert) et disposées sur des grilles de nickel. Ces dernières sont saturées pendant 20 min par du PBS, 1 % BSA puis rincées trois fois avec du PBS. Elles sont alors placées sur une goutte d'anticorps anti-ClpG dilué au 1/10 pendant 1 h à température ambiante. Après trois rinçages au PBS, les grilles sont déposées sur une goutte d'IgG de chèvre anti-IgG de lapin marquées à l'or colloïdal (10 nm) (Sigma) et diluées au 1/50 dans du PBS. Elles sont rincées trois fois dans du PBS puis dans de l'eau distillée et contrastées à l'acétate d'uranyl pendant 5 min. Les observations sont réalisées sur un microscope électronique à transmission Philips EM400 à 80 KV. c) Western immunomarquage. Les surnageants contenant les hybrides ClpG-STh sont chauffés pendant 5 min à 100 C dans du tampon Laemmli, avant d'être déposés sur un gel de polyacrylamide à 15 % en conditions dénaturantes. Une échelle de marqueurs SDS-PAGE colorée (Low Range, Biorad) permet de suivre la migration au cours de l'électrophorèse. Le gel, une membrane de nitrocellulose 0,2 um (Biorad Trans Blot) et deux papiers filtre (Biorad) sont incubés pendant 15 min dans du tampon de transfert en présence de méthanol 15 %. Le gel est déposé sur la membrane et l'ensemble est mis en sandwich entre les deux papiers filtre. Les protéines sont alors transférées sur la membrane de nitrocellulose par électrotransfert semi-sec (SemiPhor TE 70, Hoeffer Scientific Instruments) pendant 1 h sous une intensité de 1 mA/cm2. La membrane est ensuite saturée pendant 1 h dans du tampon de blocage et incubée pendant une nuit avec le premier anticorps spécifique dilué au 1/500 dans du tampon TBS, 0,1 % Tween 20. La membrane est colorée selon la procédure décrite pour l'immunodétection in situ sur colonies. Afin d'amplifier la réponse, un anticorps secondaire spécifique couplé à la biotine (Sigma) (dilution au 1/1000) a été utilisé. Dans ce cas, après incubation pendant 1 h, la membrane est lavée trois fois pendant 5 min dans du tampon TBS, 0,05 % Tween 20 et incubée pendant 30 min avec une dilution au 1/100 de streptavidine conjuguée à la péroxydaxe (250 ug/ml, Sigma) dans du tampon TBS, 0,05 % Tween 20. Après trois nouveaux lavages de 5 min chacun, la réaction est arrêtée par rinçage de la membrane dans plusieurs bains d'eau distillée. 9) ELISA. Des plaques de microtitration 96 puits (Immulon 2, Dynatech) ont été recouvertes par 100 ul/puits d'anticorps ou d'antigènes dilués dans du tampon carbonate 50 mM (pH = 9,6) et incubés pendant une nuit à 4 C. Après aspiration du contenu des puits, 10 ul de tampon de saturation sont déposés et les plaques sont à nouveau incubées pendant une nuit à 4 C. Après trois lavages avec du PBS, 0,05 % Tween 20 et deux lavages avec du PBS, les plaques sont utilisées immédiatement ou conservées à - 20 C. Trois types de test ELISA ont été réalisés : - ELISA "classique" : la quantification des protéines hybrides présentes dans les surnageants obtenus à partir de cultures bactériennes en milieu LB gélosé est déterminée par dépôt de différentes dilutions des extraits dans du tampon anticorps sur des plaques recouvertes d'un antisérum de lapin anti-ClpG. Parallèlement, afin d'établir une courbe étalon, différentes concentrations de protéines ClpG ont également été déposées. Les plaques sont alors incubées pendant 2 h à 37 C, lavées deux fois avec du tampon PBS, 0,05 % Tween 20 et une fois avec du tampon PBS. Après l'addition de 100 l par puits d'un antisérum de souris anti-ClpG et une incubation de 90 min à 37 C suivie de plusieurs lavages, 100 l d'IgG de chèvre anti-IgG de souris couplées à la péroxydase et diluées au 1/1000 sont alors ajoutés. Après une incubation de 2 h à 37 C et plusieurs lavages, 100 l par puits d'une solution de coloration préparée extemporanément sont ajoutés. Les plaques sont ensuite placées à l'obscurité à température ambiante pendant 20 min avant la lecture des résultats à une absorbance de 405 nm sur un lecteur Dynatech MR 5000. Pour mesurer les réactions non spécifiques, les absorbances à 405 nm obtenues avec le surnageant de la souche DH5[alpha] (pDSPH524) sont déduites des valeurs obtenues avec les hybrides ClpG-STh. - ELISA "double sandwich" : les surnageants obtenus à partir de cultures bactériennes réalisées en milieu LB gélosé sont dilués dans du tampon anticorps et répartis sur des plaques recouvertes par l'anticorps monoclonal 11C anti-STa (8 ug/puits). Les plaques sont incubées pendant 2 h à 37 C, puis lavées. L'anticorps antiClpG dilué au 1/500 dans du tampon anticorps est alors déposé à raison de 100 l par puits. Après incubation pendant 90 min à 37 C et plusieurs lavages, 100 l d'IgG de chèvre anti-IgG de lapin couplées à la péroxydase et diluées au 1/1000 sont ajoutés. Après une incubation de 2 h à 37 C et après plusieurs lavages, la coloration des plaques est effectuée selon la procédure décrite ci-dessus. L'utilisation du surnageant de la souche DH5a (pEH524) permet de mesurer les réactions aspécifiques. - ELISA "compétition" : le kit E. coli ST EIA (Oxoid) incluant une plaque de 96 puits recouverts par la toxine synthétique STp est utilisé pour détecter la présence de toxines STa dans les extraits protéiques et pour quantifier les hybrides. Ce kit repose sur une réaction compétitive entre la toxine fixée sur la plaque et la toxine exogène contenue dans les échantillons en présence d'une quantité d'anticorps anti-STa donnée. Les extraits protéiques dilués dans du tampon PBS sont répartis à raison de 100 l par puits. Un surnageant bactérien fourni par le kit sert de contrôle positif. Différentes quantités connues de toxine STp purifiée (Calbiochem) sont également déposées pour établir une courbe étalon. Une solution d'anticorps monoclonal anti-STa incluse dans le kit (10 l) est ajoutée dans chaque puits. Après une incubation de 90 min à 37 C, les plaques sont alors lavées deux fois avec du tampon PBS, 0,05 % Tween 20 et une fois avec du tampon PBS. Cent l d'une solution de substrat incluse dans le kit est alors ajoutée dans chaque puits et les plaques sont placées pendant 30 min à l'abri de la lumière. La réaction colorimétrique est quantifiée par la lecture de l'absorbance à 490 nm, après l'addition d'acide sulfurique 1,5 N. 10) Adhésion in vitro sur cultures cellulaires. Les cellules Caco-2 sont des cellules dérivées de carcinome de côlon humain. Elles conservent les caractéristiques des entérocytes de l'intestin grêle lorsqu'elles sont différenciées. Cette lignée de cellules exprime le récepteur de ClpG et celui de la STa (GC-C). Les cellules Intestine-407 (Flow Laboratories Inc. ), dérivées de jéjunum et d'iléon embryonnaire humain, expriment aussi le récepteur de ClpG. Les cellules Intestine-407 et Caco-2 sont cultivées sous une pression partielle de 5 % de CO2 à 37 C, dans des flacons (boîtes Falcon 3084, Becton Dickinson Lalware, Oxnard, Calif. ) contenant respectivement 25 ml de milieu minimum de Eagle modifié (MEM) et 25 ml de milieu minimum de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) (Flow Laboratories Inc.). Les milieux sont supplémentés avec 10 % à 20 % de sérum de veau foetal (SVF), 1 % d'acides aminés non essentiels, 200 u/l de pénicilline et 50 mg/1 de streptomycine. Après confluence, les cellules sont lavées deux fois avec du PBS sans Ca2+ ni Mg2+ puis trypsinisées pendant 5 min à 37 C. Les cellules, ainsi récupérées, sont rapidement diluées dans 20 ml de milieu de culture, puis centrifugées pendant 5 min à 1200 g. Le culot est repris avec 4 ml de milieu de culture. Après comptage sur cellule de Malassez, une boîte Falcon 24 puits (Becton Dickinson Lalware, Oxnard, Calif. ), avec une lamelle au fond de chaque puits, est ensemencée avec 1 ml de milieu de culture contenant 2.105 à 4.105 cellules par puits. Les cellules Intestine-407 sont utilisées à confluence alors que les cellules Caco-2 sont utilisées 15 jours après, délai nécessaire à leur différentiation. Avant le test d'adhésion, les cellules sont lavées une fois avec du PBS (pH = 7,2) sans Ca2' ni Mg2+. Une suspension de 108 bactéries/ml de milieu de culture contenant 1 % (poids/volume) de D-mannose est ajoutée à la culture de cellules et l'ensemble est incubé pendant 3 h à 37 C. Après trois lavages au PBS, les cellules sont fixées pendant 10 min dans le méthanol et colorées pendant 20 min avec une solution de Giemsa 20 %. Les lamelles sont alors collées sur une lame, cellules Caco-2 vers le haut, et cellules Intestine-407 entre lame et lamelle. Après séchage pendant 1 h à température ambiante, les lames sont examinées au microscope photonique à l'objectif x 100, en immersion. 11) Entérotoxicité. Les souches bactériennes, contenant les différents plasmides recombinants, sont cultivées pendant une nuit à 37 C sur boîtes LB gélosées. Après centrifugation (10 min, 1600 g), le surnageant est séparé du culot bactérien et conservé. Le culot est suspendu dans du PBS, centrifugé (10 min, 1600 g) et lavé une deuxième fois avec du PBS. Le culot lavé est finalement repris dans un volume de PBS correspondant au volume de départ. La numération des bactéries est déterminée après une nuit à 37 C par étalement de différentes dilutions de la suspension bactérienne sur milieu sélectif MacConkey lactose gélosé (DIFCO) contenant les antibiotiques appropriés. Une moitié de la suspension de bactéries entières lavées est conservée. L'autre moitié est soniquée puis centrifugée à 12000 g pendant 5 min. Le surnageant récupéré correspond au lysat cellulaire contenant les protéines intracellulaires. L'activité entérotoxique des surnageants, des bactéries entières lavées et des lysats, est examinée chez le souriceau nouveau-né. Des souriceaux Swiss OF1 de trois jours, provenant de différentes portées, sont séparés de leur mère immédiatement avant leur utilisation, mélangés et séparés au hasard en groupes d'au moins trois souriceaux. Un aliquot de 0,1 ml de chaque échantillon est délivré directement dans l'estomac des souriceaux à l'aide d'un tube plastique flexible de 3 cm de long et de 0,3 mm de diamètre interne relié à une seringue de 1 ml munie d'une aiguille 26 G. Trois heures après injection, les souriceaux sont asphyxiés par une exposition prolongée aux vapeurs de chloroforme. L'intestin entier est retiré de l'abdomen, pesé, et le rapport poids de l'intestin/poids de la carcasse (I/C) est alors calculé pour chaque souriceau (Figure 18). Un rapport I/C > 0,09, correspondant à une accumulation significative de fluides intestinaux, est interprété comme une entérotoxicité positive. 12) Mesure de l'activité ss-galactosidase. L'activité S-galactosidase présente dans le milieu extracellulaire a été déterminée par l'emploi du kit 6-galactosidase Enzyme Assay System (Promega) selon les recommandations du fournisseur. Les cultures bactériennes sont réalisées sur milieu gélosé. Le tapis bactérien suspendu dans du tampon PBS est ajusté à 5.1010 bactéries/ml. Cette suspension bactérienne est centrifugée (1600 g, 5 min) et 200 l de surnageant sont mélangés à 100 ul de tampon de lyse (kit). Puis 150 l du mélange sont additionnés à 150 l de tampon de dosage 2X (annexe 11) qui contient le substrat ONPG (O-nitrophenyl-ss-Dgalactopyranoside). Le mélange réactionnel est incubé pendant 30 min à 37 C. La réaction est arrêtée par addition de 500 ul de carbonate de sodium 1M. Après mélange, l'absorbance est mesurée à 420 nm. Pour la réalisation du contrôle positif, 200 l de culture contenant 5.1010 bactéries/ml sont directement mélangés à 100 l de tampon de lyse avant centrifugation (1600 g, 5 min). Le surnageant est ensuite traité comme décrit ci-dessus. 13) Quantification des groupements thiols. La méthode de quantification des groupements thiols libres dans les surnageants obtenus à partir de cultures bactériennes réalisées en milieu gélosé contenant 5 mM de S-mercaptoéthanol est basée sur l'utilisation d'un test commercialisé (kitThiol and Sulfide Quantitation ", Molecular Probes , Netherlands) permettant de quantifier lès groupements sulfhydryls. Les groupements thiols réduisent un dérivé disulfide inactif de la papaïne (papaïne-SSCH3) libérant stoechiométriquement l'enzyme active (papaïne-SH). L'activité de cette enzyme est alors évaluée en présence du substrat chromogénique de la papaïne, le N-benzoyl-L-arginine p-nitroanilide (L-BAPNA), après la libération du chromophore p-nitroanilide qui est détecté par mesure de l'absorbance à 410 nm. Ce test colorimétrique est 100 fois plus sensible que celui réalisé avec le réactif d'Ellman et peut détecter jusqu'à 0,2 uM de thiols. Différentes concentrations d'une solution de Lcystéine (0,1 mM) ont été utilisées pour établir une courbe étalon. 14) Détermination de l'état d'oxydoréduction des protéines de fusion. Afin de détecter la formation des ponts disulfures dans la portion STh de l'hybride, l'état d'oxydoréduction des protéines de fusion a été déterminé dans les compartiments intracellulaire et extracellulaire des bactéries recombinantes. L'état d'oxydoréduction des protéines dans le milieu extracellulaire a été évalué de la façon suivante : 25 ml de milieu LB liquide sont ensemencés à DO550nm = 0,05 à partir d'une préculture d'une nuit et incubés à 37 C sous agitation (225-240 rpm) . A DOssonm = 0,5 la culture est centrifugée 10 min à 1600 g. Un millitre de surnageant est prélevé et conservé à -20 C pour détecter une éventuelle entérotoxicité dans le test du souriceau nouveau-né. Le reste du surnageant est traité immédiatement au TCA (acide trichloroacétique) à une concentration finale de 5 % pour concentrer les protéines et pour éviter toute oxydation des cystéines durant la manipulation des échantillons. Si nécessaire, les surnageants sont incubés pendant 15 min à 37 C en présence de 100 mM de dithiothréitol (DTT) qui réduit tous les ponts disulfures de la STa avant précipitation par le TCA. La détermination de l'état d'oxydoréduction des protéines dans le milieu intracellulaire a été réalisée en précipitant, au TCA 5 % final, 25 ml d'une culture bactérienne en phase exponentielle. Le témoin réduit du milieu intracellulaire a été obtenu en cultivant directement la souche en présence de 5 mM de DTT. Après incubation pendant 1 h dans la glace et centrifugation pendant 10 min à 16000 g à 4 C, les culots sont lavés avec 1 ml d'acétone froid et centrifugés. Le culot protéique est alors séché à l'air libre et repris dans 200 l de solution contenant l'AMS (4-acétamide-4'-maléimidylstilbène-2,2'acide disulfonique, sels disodiques) préparée extemporanément. L'AMS se lie chimiquement aux groupes sulfhydryls libérés après l'action réductrice du DTT sur les cystéines oxydées. La fixation de chaque molécule d'AMS sur les protéines réduites permet d'augmenter leur poids moléculaire de 490 daltons et de les séparer sur un gel SDS-PAGE à 12 % en absence d'agents réducteurs et de dénaturation thermique. Les formes oxydées et réduites sont visualisées par "Western" immunomarquage. Les surnageants (500 l), obtenus en phase stationnaire à partir de cultures réalisées sur milieu gélosé, ont été traités suivant la même procédure que celle utilisée pour les surnageants provenant de cultures, en phase exponentielle, effectuées en milieu liquide. 16) Test de réduction de l'insuline. Ce test permet de vérifier les capacités de la STa réduite à échanger ses groupements thiols avec l'insuline oxydée et repose sur la mesure de l'apparition d'un précipité blanc dû à la libération de la chaine B de l'insuline après réduction de ses ponts disulfures. Une solution mère d'insuline (Sigma) est préparée à une concentration de 10 mg/ml (1,67 mM) en diluant 50 mg d'insuline dans 4 ml de tampon TrisHCl 0,05 M pH = 8, puis en ajustant le pH une première fois à 2 ou 3 avec HC1 1 M et une deuxième fois à 8 avec NaOH 1 M. Le volume est alors ajusté à 5 ml avec de l'eau bidistillée. La solution d'insuline doit être parfaitement claire avant d'être stockée à -20 C. Une solution d'insuline à 1 mg/ml (0,167 mM) est alors préparée extemporanément dans du tampon phosphate 0,1 M, 2 mM EDTA à partir de la solution mère d'insuline. Puis 450 l de cette solution sont mélangés dans une cuve spectrophotométrique avec l'échantillon à tester dans un volume final de 600 l. La réaction démarre dès l'ajout de 2 l de 100 mM DTT. L'ensemble est mélangé vigoureusement puis la cuve est placée dans le spectrophotomètre. Le moment où apparaît la précipitation, défini par l'augmentation de l'absorbance à 650 nm (A650nm) de 0,02 au-dessus de la ligne de base, et le taux de précipitation à 650 nm, défini comme l'augmentation maximale de l'absorbance à 650 nm pendant l'intervalle de temps d'une minute (#A650nm x min-1) pour des absorbances comprises entre 0 et 1, sont alors déterminés. 16) Immunogénicité des hybrides. Les surnageants ont été préparés comme décrit ci-dessus. Les bactéries vivantes recombinantes sont préparées de la même manière avant chaque série d'inoculation : après centrifugation du tapis bactérien (5 min, 1600 g), le culot bactérien est repris dans du PBS. Les bactéries sont énumérées sur milieu sélectif MacConkey lactose gélosé avant immunisation des animaux. a) Production d'anticorps chez les lapins. Un lapin de race néo-zélandaise âgé d'environ 11 semaines est utilisé pour chaque type d'antigène. Les protocoles d'inoculation sont déterminés selon la nature de cet antigène. Ainsi, chaque lapin reçoit soit 500 l de surnageant en présence d'adjuvant incomplet de Freund (v/v) par voie intra-dermique aux jours Jo, J21, J28 et J35, soit quatre injections à une semaine d'intervalle d'une suspension de 5.108 bactéries vivantes (= 500 l) par voie intra-veineuse. La récupération du sang s'effectue par section de la veine jugulaire dix jours après le dernier rappel. b) Production d'anticorps chez les souris et test de protection. - Voie intra-péritonéale : 200 l d'une suspension contenant 2 à 4.108 bactéries vivantes diluées dans du tampon PBS ou 200 l de surnageant sont inoculés à des groupes de 5 souris non consanguines Swiss OF1 (If fa Credo, France) âgées de huit à douze semaines aux jours Jo, J2 et J14. Le sérum de chaque souris est collecté individuellement une semaine après le dernier rappel par ponction intra-cardiaque sous anesthésie générale (Vétranquil + Imalgène, Rhône Mérieux). - Voie orale : des groupes de quatre souris femelles, privées d'eau pendant au moins 5 h, reçoivent un inoculum de 1010 bactéries vivantes en présence de 3 % NaHC03 aux jours Jo, J1, J2 avant d'être accouplées au jour J14 puis réimmunisées aux ours J28, J29, J30. Après la mise bas, le sang, l'intestin entier et les fécès sont prélevés. Les souriceaux nouveau-nés âgés de trois jours sont alors éprouvés avec de la toxine pour évaluer la protection vaccinale. Pour cela, chaque portée de souriceaux est divisée en deux groupes. Le premier groupe reçoit 12,5 ng (1,6 U) de toxine STp purifiée (Calbiochem) et le deuxième groupe, 2 U de surnageants contenant les hybrides homologues produits par les bactéries recombinantes qui ont été utilisées durant l'immunisation primaire. c) Préparation des extraits et détection des anticorps anti-ClpG et anti-STa. - Sérum : le sang immun est incubé pendant au moins 4 h à 37 C puis centrifugé pendant 10 min à 3000 g. Le sérum est conservé à - 20 C. - Contenu intestinal : l'intestin entier est ligaturé à une extrémité, puis 200 l de tampon de lavage sont introduits par l'autre extrémité. Après ligature de cette dernière, et par pression légère le long de l'intestin, le tampon est transféré plusieurs fois d'une extrémité à l'autre. Le contenu intestinal est récupéré, centrifugé (10 min, 16000 g) et le surnageant est conservé à - 20 C. - Fécès : ils sont écrasés dans le tampon de lavage (200 ul/100 mg fécès) puis centrifugés pendant 10 min à 16000 g. Le surnageant est conservé à - 20 C. Des dilutions sérielles des différents échantillons à tester sont réalisées dans du tampon anticorps et réparties à raison de 100 ul/puits sur les plaques ELISA recouvertes soit avec l'antigène ClpG (lug), soit avec la toxine STa (kit E. coli ST EIA) pour détecter respectivement les anticorps anti-ClpG et les anticorps anti-STa. Les complexes antigènes-anticorps sont détectés selon la procédure dite "classique" décrite au paragraphe 9 ci-dessus, après incubation des plaques avec des immunoglobulines de chèvre anti-IgG de lapin ou anti-Ig(A ou G) de souris (Nordic Immunological Laboratories) couplées à la péroxydase. Les titres anticorps, exprimés en loglo de l'inverse de la dilution, sont calculés à partir des valeurs d'absorbance lues à 405 nm déduites des valeurs obtenues après immunisation des animaux soit avec les bactéries DH5a (pDSPH524) vivantes, soit avec le surnageant correspondant. 17) Test de neutralisation. Chaque sérum immun est incubé pendant 18 h à 4 C en présence, soit de la toxine STp purifiée (Calbiochem), soit des hybrides ClpG-STh (surnageants), soit des bactéries vivantes E. coli B41 productrices de STp. Puis 100 l du mélange sont administrés intragastriquement à des souriceaux nouveau-nés âgés de 3 jours. Après 3 h d'incubation, le rapport poids intestin/poids carcasse est alors calculé (cf. Matériel et Méthodes, ≈11). Des anticorps anti-STa décrits dans la littérature comme étant neutralisants ont été utilisés comme témoins positifs. Ces anticorps sont : les anticorps polyclonaux G108-8 et G104-6 et les anticorps monoclonaux ST1 :3, ST :G8 et 11C. B - RÉSULTATS. I - Construction et caractérisation des hybrides ClpG-STh. 1) Choix des régions et insertion de STh dans ClpG. Des travaux récents ont prouvé que certaines régions de la sous-unité majeure ClpG pouvaient être modifiées sans que cela nuise à la biogénèse du polymère CS31A. Ainsi, des épitopes de nature et de tailles différentes, fusionnés à l'extrémité NH2-terminale ou insérés dans la région centrale variable V3 de ClpG (acides aminés 186 à 221), sont exposés à la surface de la bactérie. Ces sites ont donc été choisis pour introduire l'entérotoxine STh dans ClpG. L'extrémité C-terminale de ClpG nous a également paru intéressante car de nombreux travaux ont montré que le blocage de l'extrémité Cterminale de STa pouvait être dommageable à la fois pour la sécrétion et l'antigénicité des hybrides. Il a été fait le choix d'insérer différents "linkers" entre ClpG et STh pour avoir le maximum de chance d'obtenir des protéines hybrides qui soient exprimées et sécrétées à la surface bactérienne. En effet, différentes études ont montré que l'introduction de certains acides aminés, en particulier des résidus prolines, entre STa et la protéine porteuse augmentait la flexibilité et l'accessibilité de STa dans la molécule hybride. Les plasmides et oligonucléotides utilisés dans ce travail sont présentés respectivement, dans les tableaux 2 et 3 et les différentes constructions décrites en détail ci-dessous sont schématisées dans la figure 1. La figure 1 représente la structure des protéines de fusion ClpG-STh. Dans la figure 1, les acides aminés sont numérotés à partir de l'extrémité N-terminale de la protéine mature ClpG. Les séquences nucléotidiques et peptidiques relatives à ClpG sont en caractères gras. La portion STh de la protéine de fusion est représentée par un cadre coloré ST15 (YCCELCCNPACTGCY), ST16 (NYCCELCCNPACTGCY) et ST19 (NSSNYCCELCCNPACTGCY) correspondent respectivement aux 15,16 et 19 derniers acides aminés de la toxine mature STh. Les sites de restriction sont soulignés et ceux perdus après clonage sont entre parenthèses. Les astérisques dénotent les sites de restriction créés par mutagénèse dirigée. La flèche verticale représente le site de clivage par la peptidase signal. La séquence nucléotidique de clpG est schématisée par un cadre et les vecteurs de clonage par un autre cadre. Pour assurer une meilleure flexibilité de l'hybride au niveau de la jointure ClpG-STh, la toxine STh a été insérée à l'extrémité N-terminale de ClpG et séparée de la protéine porteuse par un "linker" de 6 acides aminés (PADPHA). Ainsi, le plasmide pSTN24 a été obtenu par insertion, dans le site SphI de pHPC0838, de l'oligonucléotide double brin Sth72N5/Sth72N3. Ce duplex code pour les quinze derniers acides aminés de l'entérotoxine STh. Après clonage, seul le site SphI en 5' est préservé. Le site de clivage initial (AHA:WT) du peptide signal a été converti en un site (AHA:AD) plus fréquemment présent chez E. coli. Pour les mêmes raisons que celles explicitées au-dessus, un "linker" contenant deux prolines et une glycine (NPDNPG) a été placé entre ClpG et STh. Le plasmide pSTC22 a alors été réalisé par clonage de l'oligonucléotide double brin Sth69C5/Sth73C3 codant pour les 16 derniers acides aminés de STh entre les sites HpaI et Xbal de pHPC0838. Le site XbaI a été perdu lors du clonage. La toxine STh est ainsi introduite après le résidu Tyr256 de ClpG. Afin de confirmer l'importance d'un tel " linker " entre la protéine porteuse et la toxine STa dans la sécrétion et l'antigénicité de l'hybride, le plasmide pSTCD17 a été réalisé par délétion du fragment HpaI/SmaI de pSTC22. Dans ce cas, ClpG et STh ne sont plus séparées que par un résidu glycine. Il a été considéré que le choix du peptide comprenant les acides aminés 46 à 56 (NKSGPESMNSS) de la pro-STh naturelle comme jonction entre ClpG et STh pouvait représenter la meilleure articulation pour favoriser un repliement conformationnel proche de celui de la toxine libre. Pour cela, le plasmide pProSTC28 a été obtenu en insérant entre les sites HpaI et SmaI de pSTC22 un oligonucléotide double brin (Sth33PC5/Sth33PC3) codant pour les acides aminés 46 à 53 (NKSGPESM) de la protéine ProSTa3 suivis des trois premiers acides aminés (NSS) de la toxine STh mature. Un résidu glycine sépare le tripeptide NSS et le reste de la séquence STh. STh a également été introduite dans la région centrale variable V3 de la protéine ClpG. Pour cela, le plasmide pSTVIOS a été créé par insertion de l'oligonucléotide de synthèse double brin Sth69V3/Sth69V5, codant pour la toxine mature STh entière, dans le site SpeI de pSXlOS. Un autre type d'insertion dans V3, représenté par le plasmide pSTVD41, a été obtenu par délétion du fragment BamHI/BglII de pSTVIOS codant pour les acides aminés 204 à 215 de ClpG (Figure 1). Six hybrides différents comprenant une séquence étrangère de 17 à 28 acides aminés ont été ainsi génétiquement construits. Une chimère possède STh à l'extrémité N-terminale de ClpG, deux chimères possèdent STh dans la région centrale V3, et trois autres, à l'extrémité C-terminale. Pour pallier une éventuelle instabilité ou toxicité des constructions génétiques dues à un niveau d'expression trop élevé lié au nombre de copies multiples des plasmides, il a été essayé de réintroduire dans l'opéron clp porté par le plasmide pEH524 les gènes de fusion clpG-sth à la place du gène clpG sauvage. La figure 2 représente le sous clonage des différents gènes de fusion de l'opéron clp. Dans la figure 2, les blocs représentent les différents gènes de l'opéron clp contenus dans le fragment HindIII/EcoRI de 8,5 kb. La partie noircie de chaque bloc désigne la séquence signal. La flèche horizontale indique le sens de la transcription. Les noms des gènes sont indiqués en dessous de chaque bloc. Le gène clpG a été remplacé dans l'opéron clp par les différents gènes de fusion provenant des plasmides pSTN24 (1), pSTC22 (2), pProSTC28 (3) et pSTVD41 (4). Ainsi, les plasmides pEHSTN24 et pEHSTC22 ont été obtenus en remplaçant le fragment SwaI/HpaI de pEH524 respectivement par les fragments EcoRV/Ec1136II de pSTN24 et pSTC22. Les plasmides pEHProSTC28 et pEHSTVD41 ont été construits en substituant le fragment MunI/HpaI de pEH524 respectivement par les fragments MunI/Ecl136II de pProSTC28 et pSTVD41. De nombreuses tentatives pour placer les gènes de fusion portés par pSTCl7 et pSTVIOS dans l'opéron clp sont restées vaines. Par conséquent, ces deux plasmides ont été les seuls à être transcomplémentés avec le plasmide pDSPH524 (Tableau 2). Toutes les constructions génétiques ont été vérifiées par séquençage après purification des ADN recombinants. 2) Détection des hybrides dans le milieu extracellulaire. La présence des protéines hybrides dans le milieu extracellulaire a été étudiée à partir de surnageants issus de cultures en milieu solide ou liquide des bactéries DH5[alpha] recombinantes hébergeant les plasmides présentés dans le tableau 2. La figure 3 représente l'analyse réalisée par "Western" immunomarquage en conditions dénaturantes (SDSPAGE), en utilisant l'antisérum anti-ClpG (Figure 3A et B) et différents anticorps monoclonaux (11C, 20C1) dirigés contre la toxine STa (Figure 3C et D). L'antigénicité des protéines de fusion a été analysée à partir des surnageants des bactéries DH5a recombinantes cultivées en milieu liquide (A) ou gélosé (B, C, D). Les surnageants de culture liquide sont concentrés dix fois (A) et le surnageant des bactéries DH5a (pEH524) obtenu sur milieu gélosé est dilué cinq fois (B piste 1). L'immunodétection est réalisée après migration sur gel de polyacrylamide à 15 % en conditions dénaturantes soit avec l'anticorps polyclonal anti-ClpG (A, B) soit avec les anticorps monoclonaux anti-STa 11C (C) ou 20C1 (D). Dans ces derniers cas (C,D), la réaction colorimétrique est amplifiée à l'aide d'un anticorps secondaire couplé à la biotine qui est reconnue par la streptavidine conjuguée à la péroxydase. La flèche horizontale indique la position de la protéine ClpG (- 29 kDa). Les profils électrophorétiques des protéines issues de cultures sur milieu gélosé (Figure 3B) ou liquide (Figure 3A) sont identiques. Cependant, la comparaison de la production d'hybrides dans différentes conditions de culture montre que, pour un même volume de surnageant, la quantité de protéines recombinantes recueillies en conditions de cultures liquides (Figure 3A) est plus faible qu'en conditions de cultures sur milieu gélosé (Figure 3B). Par conséquent, les surnageants obtenus à partir de cultures sur milieu gélosé ont donc été préférentiellement utilisés pour la suite de cette étude. Toutes les protéines chimères possédant STh insérée à l'extrémité N-terminale (Figure 3B, piste 2) ou C-terminale (Figure 3B, piste 3 à 5) de la protéine ClpG, sont sécrétées dans le milieu extracellulaire. Les hybrides exprimés par pEHSTN24 (piste 2) et pEHSTC22 (piste 3) migrent sous forme d'une seule protéine de masse moléculaire supérieure à celle de ClpG (environ 29 kDa, piste 1), résultant, probablement, de la présence de STh. Par contre, le profil électrophorétique des constructions pEHProSTC28 (piste 4) et [pSTCl7 + pDSPH524] (piste 5) montre deux bandes réagissant avec l'antisérum anti-ClpG (Figure 3B). La bande supérieure correspondrait à l'hybride entier alors que la bande inférieure, située au niveau de la sous-unité ClpG native, représenterait un dérivé clivé des hybrides (Figure 3A et B, pistes 4 et 5) . Il n'a pas été observé d'hybrides correspondant aux insertions de STh dans deux sites (acides aminés 202-204 et 204-215) de la région centrale variable V3 de ClpG ([pSTVlOS+pDSPH524] et pEHSTVD41) ce qui indique que ces deux sites ne sont pas compatibles avec la production et/ou la sécrétion des hybrides (pas montré). Pour cette raison, ces constructions n'ont pas fait l'objet d'autres études au cours de ce travail. Les surnageants ont ensuite été testés pour leur réactivité envers les anticorps monoclonaux 11C et 20C1 dirigés contre la toxine STa (Figure 3C et D). L'hybride exprimé par pEHSTN24 (piste 2) ne réagit avec aucun de ces anticorps ce qui suggère une faible accessibilité de STh à ces anticorps probablement suite à un changement de conformation de la toxine après fusion avec la protéine porteuse. Au contraire, la protéine codée par pEHSTC22 (piste 3) et la protéine non clivée exprimée par pEHProSTC28 (piste 4) sont reconnues par les deux anticorps anti-STa. Par contre, le produit de dégradation de pEHProSTC28 (piste 4) n'est pas détecté avec les anticorps anti-STa ce qui laisse supposer qu'une partie de l'hybride codé par ce plasmide est clivée du côté Cterminal de ClpG libérant ainsi la portion STh. Par contre, les deux protéines exprimées par [pSTC17+pDSPH524] réagissent avec les deux anticorps anti-STa (piste 5). Le clivage de cet hybride pourrait donc se produire dans la région N-terminale de ClpG. Les protéines non clivées exprimées par pEHSTC22, pEHProSTC28 et [pSTC17+pDSPH524] représentent donc les hybrides entiers puisqu'elles sont reconnues à la fois par les anticorps anti-ClpG et par les anticorps anti-STa. La figure 4 rapporte la présence des hybrides dans les surnageants de culture déterminée par ELISA "double sandwich". Les hybrides dans les surnageants de cultures réalisées sur milieu gélose sont détectés à l'aide des anticorps anti-ClpG et 11C dirigés respectivement contre les portions ClpG et STh de l'hybride. Le surnageant DH5[alpha] (pEH524) contenant du ClpG mais pas de toxine STh est utilisé comme témoin négatif et permet de mesurer les réactions aspécifiques. Dans un premier temps, les protéines recombinantes sont fixées par la portion STh de l'hybride aux anticorps anti-11C de souris fixés sur la plaque de microtitration. La partie ClpG libre de l'hybride est alors reconnue par l'antisérum de lapin anti-ClpG utilisé comme anticorps secondaire. La présence des hybrides ClpG-STh dans les échantillons est détectée après l'addition d'un antisérum de chèvre anti-IgG de lapin couplé à la péroxydase. Les résultats montrent la présence des protéines recombinantes dans tous les surnageants puisqu'elles sont reconnues à la fois par les anticorps anti-STa et anti-ClpG. Ces résultats confirment ceux observés par "Western" immunomarquage (Figure 3) et prouvent que le manque de réactivité de l'hybride exprimé par pEHSTN24 vis-à-vis des anticorps monoclonaux 11C et 20C1 (Figure 3) n'est pas dû à l'absence de la portion STh. En effet, ces hybrides sont détectés par ELISA dans les échantillons peu dilués ce qui suggère une faible affinité des anticorps pour la protéine. La présence des protéines recombinantes dans les surnageants pourrait résulter d'une lyse des bactéries. Pour s'assurer que cela n'était pas le cas, nous avons mesuré l'activité S-galactosidase dans les surnageants de cultures et les lysats de E. coli DH5[alpha] hébergeant à la fois le vecteur pSK+ exprimant la S-galactosidase et l'un des plasmides recombinants dérivés de pEH524. L'activité ssgalactosidase était surtout associée aux lysats cellulaires et négligeable dans les surnageants. L'ensemble de ces résultats met en évidence la grande permissivité des extrémités N- et C-terminales de la protéine ClpG pour l'expression et la sécrétion de STh dans le milieu extracellulaire. A l'inverse, aucune protéine recombinante n'a pu être détectée dans les surnageants de culture correspondant à des constructions possédant une molécule ST dans la région interne V3 de ClpG. Ces données suggèrent que STh fusionnée à ClpG doit avoir une de ses extrémités libre pour être sécrétée dans le milieu extracellulaire. Par conséquent, les constructions non permissives n'ont pas été utilisées pour la suite du travail. Ces résultats montrent aussi que le couplage de la toxine en C-terminal de ClpG permet de conserver l'antigénicité de STh dans son nouvel environnement moléculaire et ceci indépendamment du "linker" placé entre ClpG et STh. Par contre, bien que la fusion de STh à l'extrémité N-terminale de ClpG n'affecte pas la sécrétion de l'hybride, elle diminue ses propriétés antigéniques. 3) Quantification des hybrides. Dans un premier temps, la quantification des hybrides a été réalisée par ELISA sur des plaques de microtitration recouvertes avec l'antisérum anti-ClpG. La figure 5 rapporte la quantification par ELISA des protéines de fusion à partir de leur portion ClpG : - 5A : La quantité d'hybrides présents dans chaque surnageant est estimée par référence à la courbe étalon représentant l'absorbance à 405 nm (A405nm) en fonction de différentes concentrations de ClpG. En incrustation : concentration et production de ClpG. La numération des bactéries est déterminée sur géloses sélectives MacConkey lactose contenant les antibiotiques appropriés. - 5B : Les surnageants proviennent des cultures sur milieu gélosé à partir de la souche DH5[alpha] hébergeant les plasmides indiqués. La figure 6 rapporte la quantification par ELISA des protéines de fusion à partir de leur portion STh. - 6A : La quantité d'hybrides présents dans chaque surnageant est estimée par référence à la courbe étalon représentant l'absorbance à 490 nm (A490nm) en fonction de différentes concentrations de toxine STa purifiée (Calbiochem). Seules les A490nm comprises entre 0,2 et 1,2 permettent la quantification de la toxine. En incrustation : concentration et production de STa. La numération des bactéries est déterminée sur géloses sélectives MacConkey lactose contenant les antibiotiques appropriés. La souche B41 est utilisée comme souche de référence productrice de la toxine STp naturelle. na, non applicable : dénote un manque d'affinité des anticorps anti-ST. - 6B : Les surnageants sont issus de cultures en milieu gélosé de la souche DH5oc hébergeant les plasmides indiqués. La quantité de toxine STa présente dans l'échantillon est inversement proportionnelle à l'absorbance à 490 nm. Les mesures d'absorbance à 405 nm (a405nm)de différents dépôts contenant des quantités connues de ClpG ont permis d'établir une courbe étalon (Figure 5A). Par référence à cette courbe, la valeur de A405nm correspondant aux échantillons non dilués (Figure 5B) a permis d'exprimer la quantité d'hybrides présents dans les surnageants en ug/ml et en g/1010 bactéries (Figure 5A). La mesure enregistrée avec le surnageant non dilué de la souche DH5[alpha] (pDSPH524) (témoin négatif) permet d'évaluer les réactions non spécifiques. Cette valeur est déduite des valeurs obtenues pour les différents échantillons testés. Ces données indiquent que la quantité de ClpG produite par les bactéries recombinantes apparaît beaucoup plus faible (10 à 200 fois moins) que la quantité de ClpG produite par DH5a (pEH524). Ceci est d'autant plus vrai que certaines valeurs obtenues sont probablement surestimées du fait du clivage des hybrides (Figure 3). Ainsi, la fusion de STh à la sousunité ClpG diminue la production et/ou la sécrétion de ClpG. Dans un deuxième temps, la quantification des hybrides a été réalisée par compétition, pour une quantité donnée d'un anticorps anti-STa, entre la toxine STa fixée sur la plaque de microtitration (kit E. coli ST EIA, Oxoid) et la toxine STa présente dans l'échantillon à tester. Par conséquent, plus la quantité de toxine STa est élevée, plus elle fixera les anticorps anti-STa qui, de ce fait, ne peuvent plus interagir avec la STa fixée sur la plaque ELISA. La réaction colorimétrique liée à la quantité d'anticorps anti-STa fixés sur la plaque de microtitration est alors faible. Inversement, une forte valeur de l'absorbance à 490 nm (A490nm) est représentative d'une faible quantité de toxine présente dans l'échantillon. Des quantités connues de toxine STp purifiée (Calbiochem) ont été utilisées pour établir une courbe étalon (Figure 5A). Des valeurs de l'absorbance à 490 nm supérieures ou égales à 1,2 indiquent soit l'absence de STh (et par conséquent des hybrides ClpG-STh) soit le manque d'affinité de la partie STh vis-à-vis des anticorps anti-STa. Les valeurs des A940nm, obtenues avec différentes dilutions de surnageants contenant les hybrides, sont représentées sur la figure 6B. Seules les A490nm obtenues avec le surnageant de DH5a (pEHSTN24) restent invariablement élevées indépendamment de la dilution de l'échantillon. Ce manque de réactivité traduit un manque d'affinité des anticorps anti-STa plutôt qu'une absence de l'hybride dans le surnageant puisqu'on observe une réponse positive en "Western" immunomarquage (Figure 3) et en ELISA (Figure 4). La technique de quantification sur des plaques ELISA recouvertes par la toxine STa semble plus fiable et plus représentative de la quantité réelle d'hybrides sécrétés. En effet, la toxine STa est une petite molécule très résistante à différentes protéases et donc peu sujette à une coupure protéolytique. Par conséquent, le nombre de molécules de toxine STa détectées est directement proportionnel au nombre de molécules d'hybrides exportées dans le milieu extracellulaire, même si un clivage dans la partie ClpG de l'hybride survient après la sécrétion. Néanmoins, comme cela a été montré précédemment (Figures 3, 4 et 6), l'existence d'une différence d'affinité de la portion STh des hybrides vis-à-vis de l'anticorps monoclonal anti-STa utilisé ne peut être exclue. Si l'on considère les valeurs ainsi obtenues, nous pouvons constater que seul l'hybride exprimé par [pSTC17+pDSPH524] est sécrété en quantité plus faible que la toxine produite par la souche sauvage B41 (Figure 6A). Les données obtenues par quantification à partir de la portion ClpG (Figure 4A) font apparaître un rapport 1/3 entre les quantités d'hybrides exprimés respectivement par pEHSTN24 et pEHSTC2. Puisque ces deux hybrides ne sont pas clivés (Figure 3), et si l'on suppose que ce rapport est conservé après la quantification basée sur la portion STh, l'hybride exprimé par pEHSTN24 serait alors sécrété à raison de 0,1 g/1010 bactéries soit 0,8 ug/ml. 4) Production des hybrides à la surface bactérienne. La présence des fimbriae CS31A hybrides à la surface des bactéries recombinantes a été analysée in situ par la capacité des bactéries à adhérer aux cellules Caco-2 et Intestine-407 en culture et par immunomarquage à l'or colloïdal. Les souches bactériennes DH5(X (pEH524) et DH5[alpha] (pDSPH524) ont été utilisées respectivement comme témoin positif et témoin négatif. Aucune des souches chimères n'est capable d'adhérer aux cellules intestinales in vitro ni de fixer les anticorps polyclonaux anti-ClpG. A la vue de ces données, il est clair que les protéines de fusion ClpG-STh ne sont pas assemblées sous forme de polymères à la surface des bactéries recombinantes, mais qu'elles sont directement sécrétées dans le milieu extracellulaire sous forme de monomères libres. De surcroît, nous n'avons jamais pu mettre en évidence de formes multimériques en SDS-PAGE en conditions non dénaturantes comme dans le cas des fimbriae CS31A natifs. Ainsi, le couplage de STh aux extrémités de ClpG empêche la formation des fimbriae CS31A hybrides, ce qui explique l'incapacité des bactéries recombinantes à adhérer aux cellules Caco-2 et Intestine- 407. Cependant, ceci n'écarte pas la possibilité que les formes monomériques modifiées de ClpG puissent toujours reconnaître leurs récepteurs et de ce fait adhérer à ces cellules in vitro. 5) Entérotoxicité. Une unité entérotoxique (U) correspond à la plus petite quantité de toxine STa nécessaire pour entraîner une accumulation de fluides intestinaux. Cette dose effective minimale (DEM) est évaluée chez le souriceau nouveau-né de trois jours par la mesure du rapport poids de l'intestin/poids de la carcasse (I/C) après inoculation de différentes dilutions de chaque échantillon à tester. La figure 7 rapporte la détermination de la dose effective minimale (DEM) des cellules vivantes (A) et des surnageants (B, C) de culture de souches E. coli cultivées en milieu solide (A, B) ou liquide (C). La ligne en pointillés représente le seuil de toxicité. Le seuil inférieur de toxicité a été fixé par expérience à un rapport I/C égal à 0,09 en injectant intragastriquement différentes quantités de toxine STa purifiée (Calbiochem). La figure 8 rapporte la détermination de la dose effective minimale (DEM) de toxine nécessaire pour produire une réponse positive dans le test du souriceau nouveau-né. Des groupes de 3 à 10 souriceaux sont inoculés avec 100 l de PBS contenant 1 à 100 ng de toxine STp purifiée et commercialisée (Calbiochem). Les points représentent la valeur du rapport du poids de l'intestin/poids de la carcasse (I/C) pour chaque souriceau. Les traits horizontaux indiquent la moyenne des rapports I/C de chaque lot de souriceaux. Les valeurs des rapports I/C # 0,09 (ligne en pointillés) sont considérées comme positives . La dose minimale de toxine produisant une accumulation de fluides intestinaux est de 8 ng de toxine STp pure. Le tableau 4 ci-dessous rapporte l'activité entérotoxique. L'activité biologique des bactéries recombinantes vivantes et des surnageants correspondants obtenus en milieu liquide ou gélosé a été étudiée in vivo chez les souriceaux nouveau-nés, et comparée à l'activité de la toxine STp naturelle sécrétée par la souche B41. Tableau 4 Milieu solide Surnageants Cellules entières lav es Souche I/Ca %b U/1010e U/ml I/C % U/1010 Plasmide bactéries bactéries E. coli B41d 0,130 100 7,5 27 0,130 100 22,2 0,005 0,018 E. coli DH5[alpha] pEH524e 0,059 0 ndf nd 0,076 0 nd ~ 0,003 0,008 pEHSTN24 0,124 100 8,8 73 0,145 100 14,7 0,018 0,019 pEHSTC22 0,152 100 8,4 185 0,140 100 5,9 ~ 0,027 0,020 pEHProSTC28 0,145 100 18,5 126 0,152 100 25 ~ 0,013 0,006 pSTC17 + 0,157 100 6,4 35 0,128 100 1,1 pDSPH524 0,019 ~ 0,013 ~~~~~~~~~~~ Milieu liquide Surnageants Souche Plasmide I/C % U/1010 bactéries E. coli B41d 0,138 0,016 100 384 E. coli DH5a: pEH524e 0,054 0,006 0 nd pEHSTN24 0,138 0,019 100 463 pEHSTC22 0,134 0,070 89 357 pEHProSTC28 0,127 0,050 75 455 PSTC17 + pDSPH524 0,109 0,043 75 223 I/C, rapport du poids de l'intestin/poids de la carcasse. Chaque valeur représente la moyenne des rapports I/C de 3 à 15 souriceaux ( écart type). Une réponse > à 0,090 est considérée comme positive. b %, pourcentage déterminé par le rapport du nombre de souriceaux malades/nombre total de souriceaux testés. c U, unité entérotoxique qui est définie comme étant l'activité entérotoxique correspondant à la dose effective minimale (DEM) donnant un rapport I/C égal à 0,090. Pour les surnageants, la DEM correspond à la plus grande dilution donnant un rapport I/C égal à 0,090. L'inverse de cette dilution représente le titre des surnageants en unités entérotoxiques. Pour les cellules entières, la DEM est le nombre minimal de bactéries donnant un rapport I/C égal à 0,090. Le calcul des DEM est explicité par la Figure 7. témoin positif de toxicité témoin négatif de toxicité fnd, non détectable. L'ensemble des rapports I/C obtenus avec les surnageants de cultures liquides ou solides et avec les bactéries vivantes préalablement lavées avec du PBS montre que tous les hybrides sont libérés in vitro et in vivo dans le milieu extracellulaire avec une forte activité entérotoxique. L'activité biologique des cellules entières est variable selon les constructions avec, peut-être, une légère supériorité pour DH5a (pEHProSTC28) dont la réponse est similaire à celle de la souche B41. Les surnageants provenant des bactéries recombinantes présentent une activité entérotoxique comparable à celle des surnageants issus de la souche B41 indépendamment des conditions de culture (Tableau 4). Cependant, les hybrides produits en culture liquide apparaissent 25 à 50 fois plus toxiques que les hybrides homologues synthétisés en milieu gélosé. Comme nous le verrons plus loin, il est vraisemblable que cette différence de toxicité reflète une différence d'oxygénation des cultures bactériennes. L'ensemble de ces résultats désigne les protéines de fusion codées par pEHSTN24 et pEHProSTC28 comme étant les plus toxiques. Ces données sont en accord avec les valeurs des taux de production (pg ST/1010 bactéries) mesurés en ELISA compétition à partir des surnageants de cultures réalisées sur milieu gélosé (Figure 5A). Cette corrélation confirme que l'activité entérotoxique est proportionnelle à la quantité de toxine ST détectée dans les échantillons et que l'activité spécifique des hybrides (8 ng/U à 35 ng/U) n'est pas très différente de celle de la toxine STa produite par la souche B41 (16 ng/U). Afin d'apprécier la thermostabilité de l'activité biologique de ces hybrides, chaque surnageant récolté sur milieu solide a été ajusté à 2 U entérotoxiques et chauffé entre 90 C et 110 C pendant 15 min. Les résultats du tableau 5 ci-dessous indiquent que les hybrides sont au moins aussi résistants à la chaleur que la toxine STp. Tableau 5 Echantillon I/C (%)a toxique (2 U) Non Chauffé pendant 15 min chauffé Contrôle 90 C 95 C 100 C 105 C 110 C STp 0,151 0,144 0,067 0,081 NTb 0,056 (100) (100) (25) (25) (0) Surnageant de: E. coli DH5[alpha] 0,141 0,105 0,094 0,079 0,061 0,068 [pEHSTN24] (100) (62,5) (50) (25) (0) (0) E. coli DH5[alpha] 0,127 0,099 0,089 0,078 0,067 0,057 [pEHSTC22] (100) (57) (50) (25) (0) (0) E. coli DH5[alpha] 0,154 0,107 0,095 0,076 NT 0,054 [pEHProSTC28] (100) (62,5) (50) (20) (0) E. coli DH5[alpha] 0,134 NT 0,143 0,102 0,104 NT [pSTC17+ (100) (100) (100) (67) pDSPH524] Les surnageants ont été préparés à partir de milieu solide et titrés à 2 U comme indiqué dans la Figure 7. La toxine STp purifiée (2 U) (Calbiochem) est utilisée comme témoin positif. a Chaque valeur représente la moyenne des rapports I/C de trois à huit souriceaux. %, la valeur exprimée en pourcentage désigne le rapport du nombre de souriceaux malades/ nombre total d'animaux testés. Un rapport I/C # 0,09 et un pourcentage de souriceaux malades supérieur à 50% sont considérés comme positifs. b NT, non testés. Les données sur l'entérotoxicité des hybrides ClpG-STh démontrent que ni le couplage avec ClpG, ni l'environnement gastro-intestinal n'altèrent l'activité biologique de la portion STh, et que celle-ci adopte une conformation spatiale proche de celle de l'entérotoxine naturelle libre. L'accumulation de fluides intestinaux chez les souriceaux nouveau-nés, après inoculation des bactéries vivantes préalablement lavées avec du PBS, suggère l'existence d'une sécrétion in vivo des hybrides puisque les résultats précédents soulignaient l'absence de polymères ClpG-STh à la surface des bactéries et l'absence de toxicité des lysats cellulaires obtenus à partir de bactéries vivantes lavées au PBS. 6) Rôle de l'opéron clp dans la sécrétion et l'entérotoxicité des hybrides. L'absence de fimbriae hybrides à la surface bactérienne laisse supposer que le système de biogénèse de CS31A n'est pas nécessaire à la sécrétion des protéines chimères dans le milieu extracellulaire. Cependant, la libération des hybrides ClpG-STh, in vitro et in vivo, sous une forme biologiquement active est inattendue au regard des résultats décrits par d'autres travaux qui soulignent la très faible exportation de STa couplée à une protéine porteuse hétérologue. Nos observations pourraient alors être expliquées par la présence, dans l'opéron clp, de gènes autres que clpG susceptibles de coder des protéines capables d'intervenir dans la sécrétion et la toxicité (formation des ponts disulfures) des hybrides. Afin de vérifier cette hypothèse, l'activité toxique de différents extraits cellulaires provenant de bactéries hébergeant des plasmides contenant uniquement les gènes de fusion clpG-sth a été mesurée et est rapportée dans le tableau 6 cidessous. Tableau 6 Milieu solide Surnageants Cellules Lysats entières lavées ~~~~~~~~ Souche I/Ca %b U/1010 c I/C % I/C % Plasmide bactéries ~~~~ E.coli DH5[alpha] : pHPC0838d 0,063 0 nde 0,076 0 0,062 0 ~ 0,006 ~ 0,007 ~ 0,016 pSTN24 0,099 67 1,7 0,078 0 0,062 0 ~ 0,037 ~ 0,008 ~ 0,007 pSTC22 0,078 30 nd 0,084 27 0,066 0 ~ 0,054 ~ 0,023 ~ 0,008 pProSTC28 0,133 81 3,6 0,103 64 0,087 17 ~ 0,056 ~ 0,043 ~ 0,033 PSTC17 0,060 0 nd 0,077 0 0,066 0 ~ 0,014 0,009 ~ 0,006 Milieu liquide Surnageants Souche Plasmide I/C % U/1010 bactéries E. coli DH5[alpha] : pHPO838d ntf nt nt pSTN24 0,070 0 nd ~ 0,017 pSTC22 0,053 0 nd ~ 0,006 pProSTC28 0,110 100 120 ~ 0,022 PSTC17 0,050 0 nd ~ 0,004 a, b, idem tableau 4. Les titres ont été calculés par la même procédure que celle explicitée par la figure 7. témoin négatif de toxicité. e nd, non détectable. f nt, non testé. Les surnageants de DH5[alpha] (pSTN24) et DH5a (pProSTC28) provenant de cultures en milieu gélosé montrent une entérotoxicité non négligeable qui est cependant inférieure à celle des surnageants homologues obtenus avec les bactéries contenant tous les gènes de l'opéron clp (Tableau 4). De même, les bactéries DH5a (pProSTC28) entières préalablement lavées avec du PBS et le surnageant de culture liquide correspondant à ce même recombinant sont les seuls à présenter une activité entérotoxique notable (Tableau 6). Cependant, leur entérotoxicité s'avère inférieure à celle des échantillons homologues possédant le système CS31A fonctionnel. De plus, aucune activité toxique significative n'a été détectée dans les lysats des bactéries recombinantes préalablement lavées dans du PBS. Ces résultats indiquent que le reste de l'opéron clp ne semble pas nécessaire pour la sécrétion et l'entérotoxicité des hybrides ClpG-STh. Cependant, ils suggèrent que le processus de transport lié au système CS31A contribue à une meilleure production ou maturation des hybrides puisqu'en présence de ce système tous les extraits cellulaires présentent une activité entérotoxique (Tableau 4) alors qu'en son absence, seuls quelques extraits se révèlent toxiques (Tableau 6). 7) Formation et rôle des ponts disulfures. Afin de confirmer que l'entérotoxicité des hybrides est liée à la présence des ponts disulfures dans la portion STh, les différentes souches recombinantes ont été cultivées sur milieu gélosé avec ou sans ssmercaptoéthanol (5 mM). Cet agent réducteur empêche la formation des ponts disulfures. La figure 9 rapporte l'effet des conditions oxydoréductrices sur l'activité entérotoxique. (A) Entérotoxicité des surnageants de culture des E. coli DH5[alpha] recombinants cultivés sur milieu gélosé en absence (a) ou en présence (b) de ss-mercaptoéthanol (5 mM). Dans ce dernier cas, une moitié de surnageant est testée immédiatement (b) et l'autre moitié est soumise à l'action de l'oxygène de l'air pendant une nuit à température ambiante (c). (B) Entérotoxicité des bactéries vivantes (2.1010 bactéries) préalablement lavées au PBS après culture sur milieu gélosé contenant 5 mM de ssmercaptoéthanol. n = nombre de souriceaux testés pour chaque échantillon. Contrairement aux surnageants issus de cultures réalisées en absence de ss-mercaptoéthanol (Figure 9A,a), les surnageants provenant de cultures contenant cet agent réducteur (Figure 9A, b) ne révèlent aucune activité entérotoxique et ceci quelle que soit la bactérie recombinante testée. Lorsque les surnageants sont exposés pendant une nuit à l'air, ils retrouvent leur pouvoir toxique (Figure 9A,c). Ceci indique que l'abolition de la toxicité par le ss-mercaptoéthanol n'est pas due à l'effet direct de cet agent réducteur sur les cellules mais probablement à l'absence des ponts disulfures. La présence de ces ponts disulfures n'est donc pas nécessaire pour le passage des hybrides à travers la membrane externe. De plus, les ponts disulfures, préalablement rompus en présence de P-mercaptoéthanol, peuvent être reformés sous l'action de l'oxygène de l'air. En effet, le calcul de la concentration des groupements thiols présents dans ces surnageants laissés à l'air et prélevés à différents temps rapporté dans le tableau 7 ci-dessus fait apparaître une diminution de la quantité de thiols libres et une augmentation de l'entérotoxicité en fonction de la durée d'exposition à l'air. Tableau 7 Plasmide Quantification des groupements thiols au temps (heure) TO T18 T42 Thiols Entéroto- Thiols Entéroto- Oxyda- Thiols Oxyda M xicité M xicité tion M -tion IC % IC % % % pEHSTN24 4,3 0,065 0 2,4 0,115 83 45 0,9 79 0,005 0,026 pEHSTC22 9 0,065 0 2,6 0,144 100 72 1,3 85 0,005 0,015 pEHProST 11,4 0,069 ~ 9 3 0,129 62,5 73 2,8 75 C28 0,021 0,055 pSTC17 + 11,2 0,063 ~ 0 6,1 0,086 ~ 25 46 1,5 87 pDSPH524 0,009 0,020 Le tableau 7 ci-dessus rapporte l'effet de l'oxydation par l'air sur l'activité entérotoxique des surnageants. Les surnageants des bactéries DH5[alpha] recombinantes sont récoltés à partir de cultures réalisées sur milieu gélosé contenant 5 mM de ss-mercaptoéthanol et soumis à l'action de l'air pendant 0,18 et 42 heures. La quantité de groupements thiols est déterminée par rapport à la courbe étalon. Chaque valeur représente la moyenne des rapports I/c de 4 à 12 souriceaux ( écart type). Un rapport G/C 0,09 est considéré comme positif. Le pourcentage d'activité entérotoxique est déterminé par le rapport du nombre de souriceaux malades/ nombre total de souriceaux inoculés. Le pourcentage d'oxydation au temps T18 et T42 est calculé par rapport à la quantité de thiols libres au temps T0. * Ainsi, il y a une corrélation directe entre l'apparition de l'activité entérotoxique des hybrides et l'oxydation par l'air des groupements sulfhydryls libres créés préalablement en conditions réductrices. Par contre, les bactéries recombinantes cultivées en présence de ssmercaptoéthanol puis lavées avec du PBS induisent une accumulation de fluides intestinaux chez les souriceaux nouveau-nés (Figure 9B). Ceci suggère fortement qu'une synthèse de novo des protéines hybrides peut se faire in vivo ou qu'il existe in vivo des conditions environnementales propices à la formation des ponts disulfures. Afin de vérifier plus précisément si la formation des ponts disulfures avait bien lieu au niveau de la portion STh de l'hybride, nous avons déterminé in vitro l'état d'oxydoréduction des protéines hybrides dans les surnageants de cultures prélevés en phase stationnaire et présentant une activité entérotoxique. La migration sur gel de polyacrylamide en conditions non réductrices de ces surnageants traités avec des combinaisons différentes de DTT et d'AMS permet de visualiser distinctement les protéines hybrides sous forme réduite et sous forme oxydée après immunomarquage avec les anticorps anti-ClpG. La figure 10 représente l'état d'oxydoréduction des protéines hybrides. Les bactéries recombinantes ont été cultivées sur milieu gélosée. Les surnageants sont (+) ou non (-) traités avec 100 mM de DTT avant précipitation au TCA 5% final. Le culot est repris dans un tampon contenant (+) ou non (-) 10 mM d'AMS. Après migration sur gel de polyacrylamide à 12 % en conditions non réductrices, les protéines sont révélées avec l'anticorps anti-ClpG (A et B, a) ou avec le mélange d'anticorps anti-ST 11C+ 20C1 (B, b). La réaction colorimétrique est révélée après l'utilisation des anticorps anti-IgG de lapin ou des anticorps anti-IgG de souris couplés à la biotine et de la streptavidine conjuguée à la peroxydase. Red signifie forme réduite et ox forme oxydée. La fixation de chaque molécule d'AMS sur les protéines réduites retarde leur migration et les formes oxydées, qui ne réagissent pas avec l'AMS, migrent plus rapidement (cf. Matériel et Méthodes, 14). L'analyse des surnageants traités seulement avec l'AMS (piste 3) ou additionnellement avec le DTT (piste 2) montre clairement que les hybrides présents dans le milieu extracellulaire sont oxydés (piste 4) . Ceci est confirmé par les profils électrophorétiques des formes réduites non couplées à l'AMS (piste 1) qui sont indiscernables des formes oxydées (pistes 3 et 4). En effet, tous les hybrides, traités simultanément avec le DTT et l'AMS, sont retardés dans leur migration alors qu'aucun changement n'est observable en présence d'AMS sans DTT. En sachant que la protéine ClpG est dépourvue de résidus cystéines, ces résultats indiquent que l'AMS s'est lié chimiquement aux groupes sulfhydryls de la STh. Afin de vérifier que la forme oxydée des hybrides possède la portion STh, nous avons analysé la réactivité d'un seul surnageant, qui a été choisi comme exemple, vis- à-vis d'un mélange d'anticorps monoclonaux anti-STa (Figure 10 B,b). Les résultats confirment que la forme oxydée contient la portion STh et, par conséquent, que les ponts disulfures sont formés au niveau de STh. Par contre, la forme réduite ne réagit pas avec les anticorps anti-STa, probablement par perte des propriétés antigéniques de STh provoquée par un changement sévère de la structure conformationnelle de la toxine. Il apparaît donc que la fusion génétique de STh aux extrémités permissives N- et C-terminales de la protéine porteuse ClpG a permis d'obtenir quatre hybrides ClpG-STh qui sont sécrétés in vitro et in vivo dans le milieu extracellulaire sous forme de monomères biologiquement actifs. La portion STh des hybrides est affectée dans ses propriétés antigéniques lorsqu'elle est fusionnée à l'extrémité N-terminale de ClpG ou lorsqu'elle est soumise à un environnement défavorable à la formation de ses ponts disulfures. Ces derniers se sont révélés indispensables à l'activité entérotoxique, mais pas au passage des hybrides à travers la membrane externe des bactéries. II - Mécanisme de sécrétion des hybrides. 1) Rôle des protéines DsbA et DsbB. Tableau 8 Souche Milieu Solide Milieu liquide plasmide CS31Aa I/Cb %c U/1010 I/C % U/1010 bactéries bactéries JCB570dsbA+dsbB+ pEH524d + 0,062 ~ 0,020 0 nte nt nt nt pEHSTN24 + 0,102 0,019 75 0,8 0,065 0,008 0 ndf pEHSTC22 + 0,124 0,021 100 1,0 0,061 0,008 0 nd pEHProSTC28 + 0,142 0,010 100 3,6 0,066 0,030 0 nd pSTC17+pDSPH524 + 0,129 0,041 75 2,7 0,096 0,033 25 216 pSTN24- 0,131 0,031 100 3,5 0,166 0,033 75 233 pSTC22- 0,149 0,008 100 3,6 0,150 ~ 0,012 100 1082 pProSTC28- 0,154 0,012 100 8,3 0,153 0,019 100 1082 pSTC17 - 0,1610,009 100 5,3 0,161 0,019 100 900 JCB571dsA-dsbB+ pEH524 + 0,059 0,003 0 nt nt nt nt pEHSTN24 + 0,122 0,029 100 1,0 0,074 0,010 0 nd pEHSTC22 + 0,1270,038 90 2,0 0,066 0,012 0 nd pEHProSTC28 + 0,135 0,033 100 7,9 0,081 0,018 25 nd pSTC17+pDSPH524 + 0,137 0,030 100 5,8 0,156 0,049 75 800 pSTN24 - 0,143 0,012 100 5,3 0,1500,013 100 847 pSTC22- 0,126 0,008 100 18,2 0,148 0,037 100 1165 pProSTC28- 0,141 0,011 100 13,7 0,136 0,025 100 2041 pSTC17 - 0,133 0,020 100 11,9 0,151 ~ 0,020 100 1429 JCB819dsbA+dsbBpEH524 + 0,061 0,001 0 nt nt nt nt pEHSTN24 + 0,164 0,009 100 3,7 0,073 ~ 0,003 0 nd , pEHSTC22 + 0,139 0,036 100 1,1 0,0640,004 0 nd pEHProSTC28 + 0,134 0,020 100 2,4 0,058 0,002 0 nd pSTC17+pDSPH524 + 0,139 0,037 100 1,4 0,144 0,004 100 139 pSTN24- 0,1500,025 100 3,4 0,131 0,028 100 694 pSTC22- 0,141 0,017 100 9,1 0,170 0,010 100 723 pProSTC28 - 0,134 0,023 100 16,9 0,140 0,029 100 1136 , pSTC17 - 0,137 ~ 0,024 100 17,0 0,1510,026 100 1037 JCB818dsbA-dsb BpEH524 + 0,061 ~ 0,007 0 nt nt nt nt pEHSTN24 + 0,113 0,036 75 2,9 0,065 0,011 0 nd pEHSTC22 + 0,134 0,043 75 6,3 0,070 0,027 25 nd pEHProSTC28 + 0,115 0,021 100 2,1 0,075 0,015 12 nd pSTC17+pDSPH524 + 0,092 0,025 75 nd 0,085 0,021 37 505 pSTN24 - 0,167 ~ 0,006 100 10,0 0,157 0,073 100 806 pSTC22 - 0,143 t 0,026 100 10,1 0,161 t 0,007 100 1364 pProSTC28- 0,166 0,014 100 15,6 0,157 0,039 100 2263 pSTC17 - 0,160 0,008 100 16,7 0,145 ~ 0,025 100 614 a + ou -, présence ou absence des gènes annexes de l'opéron clp b I/C, rapport du poids de l'intestin/poids de la carcasse. Chaque valeur représente la moyenne des rapports I/C de 3 à 14 souriceaux ( écart type). Une réponse ? 0,09 est considérée comme positive. c %, pourcentage déterminé par le rapport du nombre de souriceaux malades/nombre total de souriceaux testés. d témoin négatif de toxicité e nt, non testé. f nd, non détectable. Le tableau 8 ci-dessus rapporte l'effet des mutations dsbA et dsbB sur l'activité entérotoxique des protéines recombinantes. Le système Dsb est fréquemment impliqué dans la formation des ponts disulfures de nombreuses protéines bactériennes dont la toxine STa. Afin de déterminer son rôle dans la formation des ponts disulfures de la portion STh présente dans les hybrides, les différents plasmides recombinants ont été transférés dans la souche JCB570 (dsbA+dsbB+) et dans les souches dérivées JCB571 (dsbA- dsbB+), JCB819 (dsbA+dsbB-) et JCB 818 (dsbA- dsbB-) (Tableau 8). L'activité entérotoxique des surnageants obtenus à partir de cultures réalisées en milieu liquide ou gélosé a alors été déterminée (Tableau 8). Les résultats indiquent que tous les surnageants provenant de cultures en milieu gélosé de souches dsb+ ou dsb-, avec ou sans les gènes annexes de l'opéron clp, induisent une accumulation de fluides intestinaux chez les souriceaux nouveau-nés et présentent une activité entérotoxique comparable. Cependant, excepté pour les extraits correspondant à la construction [pSTC17 + pDSPH524], aucune activité entérotoxique n'est détectée dans les surnageants de culture en milieu liquide des souches possédant les gènes clp annexes. Ceci pourrait être attribuable à une production et/ou sécrétion différentielles de ces hybrides, résultant à la fois : - des caractéristiques du plasmide vecteur transportant les gènes de fusion - des propriétés de la souche bactérienne hôte hébergeant le plasmide recombinant - de l'influence ou non des gènes clp annexes selon le plasmide et la souche hôte utilisée. Avec les souches dsb+ ou dsb- dérivées de la souche de E. coli JCB570 cultivée en milieu liquide, l'activité entérotoxique (ou la sécrétion) est plus importante en absence qu'en présence des gènes clp annexes. Les résultats sont inversés avec la souche DH5[alpha] cultivée dans les mêmes conditions. Il est clair aussi que tous les surnageants provenant de cultures en milieu liquide des souches dsb+ ou dsb- présentent une activité entérotoxique 40 à 300 fois supérieure aux surnageants homologues issus de cultures en milieu solide. Cette différence peut s'expliquer par une meilleure oxygénation des cultures liquides soumises à une agitation continue. Une autre donnée intéressante est que les mutants dsb- révèlent une entérotoxicité au moins aussi élevée que la souche dsb+ isogénique. En résumé, l'ensemble de ces résultats met en évidence les conclusions suivantes : - les gènes clp autres que clpG ne semblent pas intervenir dans la sécrétion et l'entérotoxicité des hybrides ClpG-STh produits par les souches dsb+ et dsb-. - le système Dsb responsable de la formation périplasmique des ponts disulfures de la toxine STa naturelle n'est pas impliqué dans celle des ponts disulfures de nos hybrides. 2) Rôle de ClpG. Le monomère ClpG non modifié ne peut être exporté à la surface de la bactérie qu'en présence des protéines annexes impliquées dans la biogénèse des fimbriae CS31A. Cependant, les hybrides ClpG-STh issus de bactéries dépourvues d'un système CS31A fonctionnel passent à travers la membrane externe pour être libérés dans le milieu extracellulaire sous une forme biologiquement active. Afin de déterminer le rôle de ClpG dans ce processus, différentes constructions possédant l'oligonucléotide codant pour STh fusionné en phase directement après la séquence signal de ClpG ont été réalisées (Figure 11). Ces dernières ont pour but d'obtenir des plasmides recombinants qui diffèrent des plasmides pSTN24, pSTC22, pProSTC28 et pSTC17 (Figure 1) seulement par l'absence du gène clpG. La figure 11 représente la structure des fusions entre la séquence signal de clpG et différentes portions de sth. Les séquences nucléotidiques issues des constructions présentées dans la figure 1 sont en caractères gras. La portion STh de la protéine de fusion est colorée en bleu : ST15 (YCCELCCNPACTGCY), ST16 (NYCCELCCNPACTGCY) et ST19 (NSSNYCCELCCNPACTGCY) correspondent respectivement aux 15,16 et 19 acides aminés C-terminaux de la toxine STh mature. Les sites de restrictions des enzymes sont soulignés. SSc1pG, séquence signal de clpG. Le plasmide pSPGST1 a été obtenu par insertion de l'oligonucléotide double brin SPGST3/SPGST5 entre les sites SphI et HpaI du plasmide pHPC0838 (Figure 1). Ce plasmide, ainsi dépourvu du gène c1pG, porte l'oligonucléotide codant pour la toxine STh mature placé immédiatement après la séquence signal de clpG. Une autre construction appelée pSTE531 a été réalisée par insertion de l'oligonucléotide double brin E351/E531 dans le site PstI du plasmide pSTN24. Les sites HindIII, PacI et SnaBI nouvellement introduits changent les acides aminés PADPHA présents entre STh et ClpG dans pSTN24 en PASLINYV. La délétion du fragment SnaBI/HpaI de pSTE531 conduit au plasmide pSTDG17 qui correspond au plasmide pSTN24 sans le gène clpG et avec l'hexapeptide PASLIN au lieu de PADPHA en C-terminal de STh. Après vérification du clonage par séquençage, il s'est avéré que l'enzyme de restriction SnaBI n'avait pas coupé au site TAC/GTA mais au site TA/CGTA. Cette modification a entraîné un décalage du cadre de lecture générant ainsi un codon stop TAA prématuré. La substitution du fragment SphI/HpaI de pHPC0838 par l'ADN duplex synthétique STNDG2/STNDG1 aboutissant au plasmide pSTDG126 permet d'avoir l'équivalent de pSTN24 délété de clpG avec l'extrémité C-terminale libre de la toxine. Les plasmides pGMSTC7 et pGMSTC13 dérivent respectivement des plasmides pSTC22 et pProSTC28. Dans ces cas, l'oligonucléotide double brin GMCST3/GMCST5 a été introduit entre les sites SphI et HpaI de pSTC22 et de pProSTC28. Dans le but d'éliminer progressivement les acides aminés présents entre le peptide signal de ClpG et la toxine STh, les fragments HpaI/HpaI et HpaI/SmaI de pGMSTC7 ont été délétés pour aboutir respectivement aux plasmides pGMSTC71 et pGMSTC710. Finalement, les plasmides pGMSTC71 et pGMSTC710 diffèrent respectivement de pSTC22 et pSTC17 uniquement par l'absence du gène c1pG. De même, les constructions pGMSCT13/19 et pGMSTC13/28 ont été obtenues respectivement après délétion du fragment HpaI/HpaI ou EcoRI/EcoRI de pGMSTC13. Seul pGMSTC13/19 correspond au plasmide pProSTC28 délété du gène clpG. Ces différentes constructions ont été vérifiées par séquençage et introduites dans les différentes souches mutées pour les protéines DsbA et/ou DsbB, avant d'être testées pour leur activité entérotoxique et leur sécrétion dans le milieu extracellulaire. La figure 12 représente la sécrétion et la toxicité des hybrides correspondant aux différentes fusions entre le peptide signal de ClpG et STh. Sur la figure 12, on observe l'accumulation du fluide intestinal par les surnageants non dilués provenant de cultures en milieu solide des bactéries recombinantes. La sécrétion des hybrides a été déterminée par lecture de l'absorbance à 490 nm des plaques ELISA recouvertes par la toxine ST (kit E. coli ST EIA, Oxoid) comme indiqué dans la figure 6. + ou-, présence ou absence de sécrétion. I/C, moyenne établie à partir d'un groupe de 3 à 9 souriceaux par échantillon. Un I/C > 0,09 est considéré comme positif. Les résultats montrent que la toxine STh mature précédée par la séquence signal de ClpG suffit à induire, dans la majorité des cas, la sécrétion de la toxine biologiquement active et ceci indépendamment du système Dsb. Seule la protéine de fusion codée par pSTDG17 n'est pas détectée dans le milieu extracellulaire, contrairement à celle codée par pSTN24 qui diffère de la précédente essentiellement par la présence de ClpG et de l'hexapeptide PADPHA au lieu de PASLIN à l'extrémité C-terminale de STh. La présence de cet hexapeptide (PASLIN) en aval de STh (pSTDG17) semble donc inhiber la sécrétion de la toxine puisque sa suppression (pSTDGl26) rétablit la fonction sécrétoire (Figure 12). Cependant, lorsque la protéine ClpG (257 acides aminés) et les six acides aminés (PADPHA) entre ClpG et STh sont présents à l'extrémité C-terminale de STh (pSTN24), l'hybride est sécrété. Ceci suggère que le couplage de ClpG à l'extrémité C-terminale de STh favoriserait le passage de STh à travers la membrane externe. Par contre, toutes les protéines hybrides présentant la partie C-terminale de STh libre sont sécrétées dans le milieu extracellulaire sous une forme biologiquement active, quelle que soit la séquence peptidique placée entre la séquence signal de ClpG et la toxine STh. Ces résultats indiquent que - Un peptide signal hétérologue tel que celui de ClpG peut être suffisant pour exporter la toxine STh seule jusqu'au périplasme de E. coli . Ceci suggère que STh, une fois dans cet espace cellulaire, est capable par elle-même de transloquer à travers la membrane externe. - La sécrétion de la toxine STh seule est influencée par la nature de la séquence peptidique hétérologue présente à son extrémité C-terminale, mais pas à son extrémité N-terminale. - ClpG n'est pas nécessaire à la sécrétion de STh quand l'extrémité C-terminale de celle-ci est libre. - ClpG n'est pas impliquée dans la formation des ponts disulfures, ni dans les souches dsb+, ni dans les souches dsb-, puisque la toxine STh seule fusionnée au peptide signal de ClpG demeure biologiquement active lorsqu'elle est sécrétée. 3) Etat d'oxydoréduction des protéines hybrides. La figure 13 présente l'état d'oxydoréduction d'une protéine hybride produite par les souches dsb+ et dsb- dans les compartiments extracellulaires (A) et intracellulaires (B). Les surnageants issus de cultures liquides (25 ml) en phase stationnaire (A) ou exponentielle (B) traités (+) ou non (-) avec 100 mM de DTT avant précipitation au TCA 5% final. Le culot est repris dans un tampon contenant (+) ou non (-) 10 mM d'AMS. Après migration sur gel de polyacrylamide (12%) en conditions non réductrices, les protéines sont révélées par Western immunomarquage en utilisant l'anticorps de lapin anti-ClpG, des anticorps de chèvre anti-IgG de lapin couplés à la biotine et la strptavidine conjuguée à la peroxydase. Red signifie forme réduite et ox forme oxydée. Cox est le témoin d'oxydation correspondant à l'hybride extracellulaire produit par une souche dsb+ hébergeant le plasmide pEHProSTC28. L'état d'oxydoréduction de l'hybride ClpG-STh extracellulaire sécrété par les mutants dsbA' et dsbB hébergeant le plasmide pProSTC28 a été analysé à partir de surnageants de cultures liquides en phase stationnaire (figure 13A). Le traitement des surnageants avec le DTT et l'AMS (piste 1) permet de positionner la forme réduite de l'hybride sur les immuno-empreintes. L'analyse du surnageant traité uniquement avec l'AMS (piste 2) montre clairement que l'hybride présent dans le milieu extracellulaire (piste 3) est oxydé puisqu'il ne se lie pas à l'AMS. Ces résultats sont en accord avec ceux relatifs à la toxicité des hybrides (Tableau 8). L'état d'oxydoréduction de la même protéine de fusion dans le compartiment intracellulaire des souches dsbA+ dsbB+ et dsbA- dsbB' a aussi été déterminé après avoir précipité au TCA 25 ml d'une culture fraîche prélevée à DO550nm = 0,5 (figure 13B) . Le témoin réduit (piste 2) correspond à une culture réalisée en présence de 5 mM de DTT. La migration sur gel de polyacrylamide des échantillons non chauffés exempts d'agents réducteurs indique que la protéine hybride se présente sous une forme réduite indépendamment de la mutation dsb (pistes 1 et 3). Toutes ces observations sont en défaveur de la formation des ponts disulfures dans le compartiment intracellulaire des cellules Dsb+ ou Dsb-, mais suggèrent que ceux-ci sont vraisemblablement créés au fur et à mesure de l'exportation des hybrides vers le milieu extracellulaire. Ceci expliquerait le pouvoir toxique des surnageants provenant des souches Dsb-et la non toxicité des lysats cellulaires provenant des souches Dsb+. Afin de confirmer cette hypothèse, le fragment KpnI/BglII de pProSTC28 (figure 1) a été inséré entre les sites KpnI/BamHI du plasmide pTrc99A (Tableau 2). Ainsi, le gène de fusion porté par pProSTC28 a été placé sous le contrôle du promoteur Ptrc inductible par l'IPTG. Le plasmide ainsi obtenu, pTrcProSTC28, a été introduit dans les souches dsbA+ (JCB570) et dsbA' (JCB571). Ces deux souches ont été cultivées en milieu LB liquide jusqu'à DO550 nm = 0,5. La culture est ensuite divisée en deux. Une moitié contient 2 mM d'IPTG pour permettre l'induction du promoteur Ptrc contrôlant la production de l'hybride. L'autre moitié, sans IPTG, est utilisée comme témoin négatif d'expression et de sécrétion de l'hybride. Du surnageant de culture (25 ml) est récolté à différents temps. Deux millilitres ont été conservés pour tester leur entérotoxicité dans le test du souriceau nouveau-né. Le reste a été précipité au TCA et additionné d'AMS. La figure 14 présente la maturation des protéines hybrides au cours de leur sécrétion par des souches dsb+ et dsb-. Les bactéries dsbA' (A) ou dsbA+ (B) contenant le plasmide pTrcProSTC28 sont cultivées en milieu liquide avec (+) ou sans (-) 2 mM d'IPTG. Un aliquot (2 ml) de surnageant est prélevé à différents temps pour analyser son activité entérotoxique (A,a et B, a). Chaque histogramme représente la moyenne des rapports I/C de 3 à 5 souriceaux. Une réponse > 0,09 est considérée comme positive. A chaque temps et pour chaque condition, 25 ml de surnageant sont traités (+) ou non (-) avec 100 mM de DTT avant précipitaion au TCA (5% final). Le culot est repris dans un tampon contenant (+) ou non (-) 10 mM d'AMS. Après migration sur gel de polyacrylamide à 12% en conditions non réductrices, les protéines sont révélées par Western immunomarquage avec l'anticorps anti-ClpG (A, b ; B, b etc) ou avec un mélange d'anticorps monoclonaux anti-Sta 11C + 20C1 (A,c). La figure B,b ne permettant pas de voir clairement les différents profils protéiques, une deuxième série d'expériences analogues a été réalisée uniquement pour les temps de croissance compris entre 90 et 115 minutes (B,c). Les immuno-empreintes sont visualisées par l'utilisation d'anticorps secondaires couplés à la biotine et de la streptavidine conjuguée à la péroxydase. Les étoiles (#) et (#) indiquent respectivement la forme réduite et la forme oxydée de l'hybride. Le rond (#) désigne probablement une autre forme oxydée de l'hybride. Red signifie forme réduite et ox forme oxydée. Cox est le témoin d'oxydation correspondant à l'hybride extracellulaire produit par une souche dsb+ hébergeant le plasmide pEHProSTC18. O.n. signifie culture overnight . Dans la souche JCB571, une bande située au niveau de la forme réduite et une autre située au niveau de la forme oxydée de la protéine hybride sont observées avec l'antisérum anti-ClpG dès 15 min de culture en présence d'IPTG (figure 14A, b, piste 1). Aucune bande n'est détectée sans induction par l'IPTG, même après 115 min de culture (figure 14A, b, piste 7). Seule la forme oxydée est révélée après traitement avec l'AMS d'une culture d'une nuit en présence d'IPTG (figure 14A, b, piste 9) et seules ces formes sont détectées par les anticorps monoclonaux anti-ST 11C et 20C1 (figure 14A, c) comme cela a déj à été montré antérieurement (Figure 10B). L'hybride détecté après 15 à 20 min de culture en présence d'IPTG est toxique (figure 14A, a). Aucune activité toxique n'est décelée dans les surnageants des cultures non induites. Dans la souche JCB570 (figure 14B), les formes réduites et oxydées de l'hybride apparaissent respectivement 15 min et 90 min après l'ajout de l'IPTG (figure 14B, b, piste 4 et c, piste 1). L'apparition de la forme oxydée, qui traduit la présence des ponts disulfures, est corrélée avec l'acquisition du pouvoir toxique du surnageant (figure 14B, a). La bande intermédiaire (figure 14B, b et c) pourrait correspondre à une deuxième forme oxydée de la protéine comme le laissent suggérer les doublets protéiques réagissant avec les anticorps anti-STa (figure 14A, c, piste 4) et l'absence de cette bande en présence de DTT et d'AMS (figure 14B, c, piste 3). L'ensemble de ces résultats démontre que l'hybride passe à travers la membrane externe de la bactérie Dsb+ ou Dsb- sous forme réduite. Les ponts disulfures se forment alors progressivement au fur et à mesure de la sécrétion des hybrides réduits dans le milieu extracellulaire, probablement par l'action de l'oxygène de l'air, comme cela a été démontré précédemment (Figure 9). Le système Dsb périplasmique n'est donc pas impliqué dans la formation des ponts disulfures de la portion STh des hybrides. 4) Réduction de l'insuline par la toxine STa. Les résultats rapportés précédemment désignent l'oxygène de l'air comme l'un des candidats possibles responsables de l'oxydation des hybrides ClpG-STh in vitro, et par conséquent de la formation des ponts disulfures dans le milieu extracellulaire. Cependant, la teneur en oxygène dans la lumière intestinale est faible. Il est donc concevable qu'un système plus efficace puisse intervenir in vivo pour oxyder les groupements thiols de la portion STh des hybrides à l'extérieur de la cellule bactérienne. La séquence peptidique de STh contient deux fois le motif CysX-X-Cys connu pour être un site actif caractéristique des protéines ayant une activité oxydoréductase impliquée dans les échanges thiols-ponts disulfures. La portion STh des hybrides pourrait donc être capable d'échanger des ponts disulfures avec d'autres protéines. Cette hypothèse a été vérifiée en testant la capacité de la STh libre ou couplée à ClpG à catalyser in vitro la réduction des ponts disulfures de l'insuline par le DTT. La figure 15 représente la réduction de l'insuline catalysée par différentes protéines en présence de DTT. Les surnageants sont obtenus à partir de cultures sur milieu solide en phase stationnaire. La souche JCB818 (pTrcSTN24) a été cultivée en présence (+) ou en absence (-) de 2 mM d'IPTG. Le DTT réduit la toxine STh qui à son tour réduit l'insuline à travers une réaction d'échanges de ponts disulfures. La libération de la chaîne B de l'insuline induit alors la formation d'un précipité blanc. La thioredoxine de Spirulina sp (Sigma) a été utilisée comme témoin positif. L'insuline (1 mg/ml) incubée dans le tampon phosphate de potassium 0,lM, EDTA 2 mM contenant uniquement du DTT 0,33 mM correspond au témoin négatif. La protéine DsbA purifiée (Calbiochem) a servi de témoin positif comme oxydoréductase du système Dsb. Le moment où apparaît la précipitation, et le taux de précipitation de la chaîne B de l'insuline sont les paramètres quantitatifs pris en considération pour mesurer la réduction de l'insuline. Les résultats sont répertoriés dans le tableau 9. Tableau 9 Echantillon Début de précipitation Taux de précipitation (minutes) (#A650nm X min-1) Thioredoxine 12 0,078 Contrôle négatif 91 0,012 Toxine STp 44 0,030 Protéine DsbA 24 0,042 Surnageant B41 27 0,028 Surnageant ' JCB818(pTrcSTN24)(+IPTG) 34 0,037 Surnageant JCB818 (pTrcSTN24) (-IIPTG) 59 0,011 Le tableau 9 ci-dessus rapporte la réduction de l'insuline par la toxine STa libre ou couplée à ClpG. Le temps d'apparition de la précipitation est déterminé par l'augmentation de l' absorbance à 650 nm (A650nm) de 0,02 au dessus de la ligne de base. Le taux de précipitation représente l'augmentation maximale de l'absorbance à 650 nm pendant l'intervalle de temps d'une minute pour des valeurs de A650nm comprise entre 0 et 1. Les valeurs quasi similaires obtenues avec la toxine STp pure, la toxine STp naturelle de E. coli B41 et DsbA, sont inférieures à celles obtenues avec la thiorédoxine mais supérieures à celles observées avec le contrôle négatif. Afin de vérifier si la toxine conserve les mêmes propriétés sous sa forme conjuguée, le gène de fusion porté par pSTN24 a été placé sous le contrôle du promoteur Ptrc par insertion du fragment KpnI/XbaI de pSTN24 entre les sites KpnI/XbaI du plasmide pTrc99A avant d'être transféré dans la souche JCB818 dsbA- dsbB' . Après induction par l'IPTG, le surnageant de culture provenant de la souche JCB818 (pTrcSTN24) ainsi obtenue s'avère capable de précipiter l'insuline à une vitesse et à un taux semblables à ceux de la protéine DsbA et de la toxine STp. En absence d'induction, la précipitation apparaît plus tardivement qu'en présence d'IPTG et le taux de précipitation de l'insuline est identique à celui du contrôle négatif (figure 15 et Tableau 9). La toxine STp et les hybrides ClpG-STh possèdent donc des propriétés analogues à la protéine DsbA qui leur permettent de catalyser la réduction de l'insuline par l'intermédiaire du DTT. Ainsi, la toxine STa, couplée ou non à ClpG, est active in vitro dans les échanges de ponts disulfures. Un modèle de maturation de la toxine STa libre ou couplée à ClpG : (1) la toxine STa seule ou associée à ClpG est synthétisée sous forme réduite dans le milieu intracellulaire des bactéries Dsb+ ou Dsb-, (2) elle traverse ensuite la membrane externe de la bactérie sous cette forme et, (3) une fois dans le milieu extracellulaire, les ponts disulfures intramoléculaires seraient créés progressivement par l'action de l'oxygène et/ou à travers une réaction d'échanges avec des protéines oxydées autres que DsbA et DsbB. III - Immunogénicité des protéines hybrides. 1) Production d'anticorps dirigés contre les protéines recombinantes. Malgré leur toxicité, les bactéries DH5a hébergeant différents plasmides recombinants (Tableau 2) ou les surnageants de culture correspondants ont été injectés à des animaux (souris, lapins) par différentes voies d'inoculation (intra-dermique, intra-veineuse, intrapéritonéale, orale) dans le but d'évaluer leur capacité à produire des anticorps dirigés contre la protéine porteuse ClpG et surtout contre la partie STh de l'hybride. Selon les résultats obtenus, leurs potentialités neutralisantes voire protectrices ont aussi été estimées dans la perspective de l'utilisation de ces anticorps en immunothérapie. Dans cette étude, nous avons inclus un hybride " détoxifié " par modification génétique de la séquence STh en vue d'une vaccination active chez l'homme ou l'animal. Cet hybride non toxique a été construit en insérant entre les sites HpaI et XbaI de pHPC0838 (figure 1) l'oligonucléotide de synthèse STGL673/STGL635 codant pour la toxine STh dont les acides aminés Prou et Ala14, impliqués dans la reconnaissance au récepteur GC-C, ont été remplacés respectivement par une glycine et une leucine. La figure 14 représente la structure de la fusion ClpG-STh "détoxifiée". Les acides aminés sont numérotés à partir de l'extrémité N-terminale de la protéine mature ClpG. Les séquences se rapportant à ClpG sont en caractères gras. Les acides aminés correspondant à l'oligonucléotide de synthèse codant pour la toxine STh modifiée sont encadrés en bleu. Les sites de restriction sont soulignés. La flèche verticale représente le site de clivage par la peptidase signal. Les astérisques indiquent les acides aminés modifiés : les résidus glycine et leucine remplacent respectivement les résidus proline et alanine dans la séquence normale de STh. pSK+, pBluescript (SK+). Le plasmide pSTCDM1 ainsi obtenu (Figure 16), exprime une protéine hybride ClpG-STh extracellulaire qui est reconnue en " Western " immunomarquage par les anticorps polyclonaux anti-ClpG, mais faiblement par les anticorps monoclonaux anti-STa 11C et 20C1. Après quantification par ELISA compétition, l'hybride " détoxifié " contenu dans la préparation vaccinale est estimé à 10 ng/1010 bactéries soit à 80 ng/ml. L'utilisation des hybrides toxiques et non toxiques comme antigènes vaccinaux a aussi pour objectif de dégager une éventuelle relation entre entérotoxicité et immunogénicité. Pour chaque type d'antigène, les bactéries recombinantes vivantes ont été inoculées à un groupe de cinq souris et un seul lapin respectivement par voie intrapéritonéale et par voie intra-veineuse (figure 17) suivant les modalités décrites dans le chapitre Matériel et Méthodes. La figure 17 représente l'immunogénicité des bactéries recombinantes. Titres IgG anti-ClpG (A) et titres IgG anti-ST (B) après inoculation des bactéries DH5ahébergeant les plasmides indiqués. Les souris ont été immunisées avec 2 à 4.108 bactéries et les lapins avec 5.108 bactéries. Les sérums de chaque groupe de souris ont été mélangés avant le dosage ELISA. Les titres anticorps exprimés en logio de l'inverse de la dilution des sérums sont calculés après avoir déduit le signal obtenu avec le sérum des animaux immunisés avec la souche DH5a(pDSPH524) utilisée comme témoin négatif. IV, voie intra-veineuse ; IP, voie intra-péritonéale. Après récupération des sérums, les titres des IgG anti-ClpG et anti-STh ont été mesurés par ELISA sur des plaques de microtitration recouvertes respectivement avec la protéine ClpG (1 ug) et avec la toxine STp (kit E. coli ST EIA, Oxoid). Les sérums de chaque groupe de souris ont été mélangés avant d'être analysés. Des réponses IgG sériques anti-ClpG ont été obtenues dans tous les cas et les titres, compris entre loglo= 4 et loglo= 6, sont similaires à celui du témoin positif (pEH524) (Figure 17A). Les réponses IgG sériques anti-STh sont plus faibles puisque les titres varient de loglo= 0 (hybride " détoxifié ") à loglo= 4,3 (hybrides pSTCl7 + pDSPH524) (Figure 17B). Il pourrait donc exister une certaine relation entre toxicité et immunogénicité de la STh couplée à ClpG. Cette relation suggère que la conformation tridimentionnelle native de la toxine à l'intérieur de la structure hybride est importante pour la production d'anticorps anti-STh. Ces titres apparaissent plus importants chez le lapin que chez la souris. Les bactéries hébergeant le plasmide pEHSTC22 ou [pSTCl7 + pDSPH524] ont permis d'obtenir les meilleurs titres anti-STh chez le lapin. L'ensemble des inoculations démontre que toutes les bactéries sont fortement immunogènes car elles sont capables, dans la plupart des cas, d'induire à la fois la production d'anticorps antiClpG et anti-STh. La réponse dirigée contre la protéine ClpG est élevée dans tous les cas et est assez homogène d'une bactérie à l'autre à l'intérieur d'une même espèce animale. Par contre, les réponses anti-STh sont beaucoup plus variables selon l'espèce animale et les bactéries recombinantes. Pour chaque type d'hybride, des surnageants de cultures ont aussi été inoculés à des groupes de cinq souris et un lapin respectivement par voie intrapéritonéale et intra-dermique, comme indiqué dans le chapitre Matériel et Méthodes. La figure 18 représente l'immunogénicité des surnageants. Les animaux ont reçu un inoculum de 200 ul (souris) et 500 ul (lapins) de surnageants provenant des souches DH5a recombinantes cultivées sur milieu gélosé. Les titres anticorps anti-ClpG (A) et anti-STh (B) exprimés en logio de l'inverse de la dilution des sérums sont calculés après avoir déduit le signal obtenu avec le sérum des animaux immunisés avec la souche DH5[alpha] (pDSPH524) utilisée comme témoin négatif. La concentration approximative dans les surnageants est de 0,08 ug eq. STh/ml pour l'hybride non toxique et varie entre 0,25 à 6,3 ug eq. STh/ml pour les hybrides toxiques (Figure 6). IP, voie intra-péritonéale ; ID, voie intra-dermique ; AIF, adjuvant incomplet de Freund. Le titre d'IgG sériques anti-ClpG est de loglo= 1,6 chez le lapin immunisé avec le surnageant " détoxifié ". Dans le cas des surnageants toxiques, il varie entre log10= 3,8 et log10= 5,6 selon l'espèce animale et l'hybride utilisé (Figure 18A) et le titre des IgG sériques anti-STa entre loglo= 1, 7 et log10= 2, 2 chez la souris, et entre loglo= 1, 8 et loglo= 3, 5 chez le lapin (Figure 18B). Les hybrides codés par les plasmides pEHProSTC28 et pEHSTC22 ont permis d'obtenir les titres anti-STa les plus élevés chez les lapins. Comme précédemment, l'hybride " détoxifié " n'induit aucune réponse anti-ST. Cependant, le fait que le titre d'IgG anti-ClpG sériques correspondant soit très faible (log10= 1,6) est probablement dû à la faible quantité d'hybrides inoculés (40 ng eq. STh) et pourrait expliquer l'absence d'anticorps dirigés contre la toxine. 2) Neutralisation de l'activité entérotoxique. La première étape de cette expérience visait à établir un protocole de neutralisation. Pour cela, 500 l de différents anticorps anti-STa polyclonaux et monoclonaux décrits dans la littérature comme étant neutralisants, ont été incubés en présence de 80 ng (10 U) de toxine STp pure, dans les conditions de neutralisation préconisées par les différents auteurs, et injectés à des souriceaux nouveaunés. Un seul de ces anticorps, l'anticorps G104-6, s'est avéré capable de neutraliser la toxine STp. Par conséquent, dans la suite de notre étude, nous avons choisi les conditions de neutralisation correspondant à cet anticorps qui a donc été choisi comme témoin positif. Nous avons incubé pendant 18 heures à 4 C nos différents sérums en présence de toxine pour tester leur pouvoir neutralisant. Comme prévu, le sérum G104-6 neutralise les surnageants contenant les différents hybrides ClpG-STh et celui correspondant à la souche sauvage B41. Les résultats obtenus avec nos sérums de lapins et de souris après inoculation des surnageants ou des bactéries recombinantes vivantes, ont montré que seul le sérum du lapin immunisé par voie intra-dermique avec le surnageant correspondant à la souche DH5a (pEHProSTC28) neutralisait l'effet de la toxine STp pure. Le tableau 10 ci-dessous rapporte la séroneutralisation de l'activité entérotoxique. Tableau 10 Inoculais Sérums G104-6 SL28a + I/C % I/C % I/C % Toxine pure (1,25 U)b:STp 0,071 ~ 0,019 1/11 Surnageant (2 U)b: DH5apEHSTN24 0,076 0,010 0/5 0,093 ~ 0,030 4/5 DH5apEHSTC22 0,058 0,005 0/5 0,056 0,009 0/5 DH5apEHProSTC28 0,058 0,005 0/5 0,057 0,003 0/4 DHSa pSTCl7 + pDSPH524 0,071 t 0,008 0/5 0,064 0,007 0/5 B41 0,059 0,001 0/5 0,081 0,019 2/6 Bactéries B41c: 5.109/ml 0,056 0,004 0/5 0,093 0,020 3/5 1010/ml 0,062 0,008 0/5 0,115 0,012 5/5 2,5.101 /ml 0,086 0,017 1/5 0,128 0,032 4/4 5.1010/ml 0,115 ~ 0,037 4/5 0,129 0,024 5/5 a SL28, sérum du lapin immunisé par voie intradermique avec le surnageant correspondant à l'hybride exprimé par pEHProSTC28 en présence d'adjuvant incomplet de Freund. (+) et (-), en présence ou en absence du sérum SL28. I/C, moyenne établie à partir d'un groupe de 4 à 11 souriceaux par échantillon. Un I/C : 0,090 est considéré comme positif. Le pourcentage (%) est déterminé par le rapport du nombre de souriceaux malades/nombre total de souriceaux testés. b Les inoculats sont incubés pendant 18 heures à + 4 C en présence de différents antisérums. Les bactéries vivantes B41 lavées avec du PBS sont mises en présence ou en absence de SL28 et administrées immédiatement chez les souriceaux. La numérotation des bactéries est réalisée sur boîtes sélectives MacConkey lactose. Par conséquent, seul ce sérum, nommé SL28, a été testé pour sa capacité à neutraliser les surnageants homologues ou hétérologues (Tableau 10). SL28 inhibe l'activité entérotoxique des hybrides exprimés par pEHSTC22, pEHProSTC28 et pSTC17 mais pas celle de l'hybride exprimé par pEHSTN24. Dans ce dernier cas, le résultat n'est pas surprenant puisque les tests ELISA (figures 4 et 6B) et les " Western " immuno-empreintes (figure 3) ont toujours montré un manque d'affinité des anticorps monoclonaux spécifiques de STa pour cet hybride. SL28 est également efficace contre la toxine STp naturelle sécrétée par la souche B41. Afin de se rapprocher le plus possible des conditions naturelles d'infection, différentes quantités de bactéries B41 vivantes lavées avec du PBS ont été administrées, sans période d'incubation préalable avec le sérum SL28, à des souriceaux nouveau-nés (Tableau 10). Alors que les bactéries B41 inoculées seules à une concentration de 5.109 à 5.1010 bactéries/ml induisent une accumulation de fluides intestinaux, les bactéries administrées en présence du sérum SL28 conservent leur entérotoxicité à une concentration de 5.1010 bact~ries/ml mais pas entre 5 . 109 bactéries/ml et 2,5.1010 bactéries/ml . Pour avoir la certitude que ces données résultaient bien d'un effet neutralisant et non d'un effet bactéricide du sérum, des quantités identiques de bactéries B41, diluées dans 90 % de tampon PBS (témoin négatif) ou dans 90 % de sérum SL28, ont été incubées pendant une nuit à température ambiante, puis dénombrées. Aucune différence n'a été observée en présence ou en absence de sérum, ce qui écarte un effet bactéricide du sérum. 3) Protection. L'inoculation par voie orale de 1010 bactéries recombinantes vivantes à des souris adultes a été réalisée pendant trois jours consécutifs. Quelle que soit la souche de E. coli DH5[alpha], environ 105 à 106 bactéries étaient encore présentes dans l'intestin grêle trois heures après la dernière inoculation, et un jour après dans le caecum et les fécès. Nous avons également montré précédemment (Tableaux 4 et 10) que ces bactéries vivantes injectées par voie intragastrique à des souriceaux nouveau-nés sont capables de déclencher l'accumulation de fluides intestinaux 3 h après leur inoculation. Par conséquent, rien ne s'oppose à l'utilisation des bactéries E. coli DH5a recombinantes vivantes pour stimuler l'immunité mucosale puisqu'elles peuvent se maintenir dans l'intestin et y sécréter les hybrides ClpG-STh. Les différentes bactéries DH5a recombinantes ont alors été administrées à des groupes de quatre souris femelles gestantes par voie orale, comme décrit dans le chapitre Matériel et Méthodes. Chaque portée de souriceaux provenant de ces mères a été séparée en deux lots à l'âge de 3 jours. Le premier lot a été éprouvé avec 1,6 U de toxine STp purifiée, et l'autre, avec 2 U d'hybrides ayant servi à immuniser les souris gestantes. Le groupe de souriceaux issus des mères immunisées avec la souche DH5a (pEH524) a été utilisé comme groupe témoin négatif pour la protection. Dans la majorité des cas, les souriceaux ne sont pas protégés contre une dose de 1,6 U de toxine STp pure. Seuls les groupes de souriceaux issus des trois mères immunisées avec les bactéries recombinantes DH5a (pEHSTC22), un groupe de souriceaux issus d'une mère (souris N 3) immunisée avec la bactérie DH5[alpha] [pSTC17+pDSPH524] et un groupe de souriceaux issus d'une mère (souris N 2) immunisée avec la bactérie " détoxifiée " DH5a [pSTCDM1 + pDSPH524] semblent partiellement protégés. En effet, dans tous ces cas, 40 % à 50 % des souriceaux résistent à 1,6 U de toxine. Certains souriceaux provenant des mères immunisées avec les bactéries DH5a (pEHProSTC28) ou DH5[alpha] [pSTC17+pDSPH524] paraissent également protégés contre 2 U d'hybrides homologues puisque seulement 20 % à 50 % des souriceaux développent une accumulation de fluides intestinaux. Cependant, les protections obtenues avec les hybrides homologues peuvent être dues à des anticorps dirigés seulement contre la partie ClpG de l'hybride. Dans l'ensemble, ces résultats sont plutôt décevants et ne permettent pas de conclure sur l'existence d'une protection des souriceaux issus des mères vaccinées par voie orale. La présence d'anticorps anti-ClpG et anti-STh dans le sérum, le contenu intestinal et les fécès de chaque souris, a été mesurée trois jours après la mise bas. Les IgG et IgA anti-ClpG des différents prélèvements ont été quantifiées sur des plaques de microtitration recouvertes par 1 ug d'antigène ClpG/puits. La recherche des anticorps anti-STa a été effectuée sur une plaque ELISA sensibilisée avec la toxine STa (kit E. coli ST EIA, Oxoid). Des IgG anti-ClpG ont ainsi pu être mises en évidence dans le sérum d'une seule souris immunisée avec le témoin positif DH5a (pEH524) (titre log1= 1,7) et dans le sérum de deux souris immunisées avec les bactéries " détoxifiées (titres log10= 1, 2 et 2,6). Un bruit de fond élevé avec tous les extraits correspondant aux contenus intestinaux n'a pas permis de détecter la présence d'anticorps dirigés contre la protéine ClpG et la toxine ST. L'analyse à partir des fécès s'est avérée alors le seul moyen d'évaluer la production d'anticorps au niveau de la muqueuse intestinale. Des anticorps IgG anti-ClpG (titres loglo= 1,5 et 1,2) et IgA anti-ClpG (titres loglo= 2,0 et 1,3) ont été décelés dans les fécès de deux souris immunisées avec les bactéries DH5[alpha] [pSTCDM1 + pDSPH524]. Aucune réponse IgG ou IgA anti-ST n'a été détectée dans les différents échantillons. En résumé, l'immunisation des animaux par voie parentérale avec différentes préparations vaccinales (surnageants et bactéries vivantes) a permis, dans la majorité des cas, d'induire des titres élevés d'anticorps sériques spécifiques dirigés contre la protéine porteuse ClpG et la toxine STh. Au vu de ce travail, il est probable qu'il existe une relation directe entre l'immunogénicité et la structure spatiale de la molécule STh des hybrides puisque seuls ceux présentant une activité entérotoxique induisent la production d'anticorps IgG sériques anti-STa. Seul le sérum (SL28) d'un lapin immunisé par voie intradermique avec le surnageant de culture de DH5a (pEHProSTC28) en présence d'adjuvant incomplet de Freund est capable de neutraliser l'activité entérotoxique de la toxine STa naturelle. Cependant, ces résultats encourageants demandent à être reproduits sur un plus grand nombre de lapins. Les résultats sur la protection des souriceaux ne sont pas probants. Le faible niveau d'anticorps IgG ou IgA anti-ClpG et anti-STa obtenus dans le sérum et les fécès des mères 3 jours après la mise bas permet de penser qu'il en est de même pour le lait devant assurer la protection dans l'intestin des souriceaux. REVENDICATIONS 1) Utilisation d'un conjugué du peptide STa et d'une molécule active dans lequel ledit peptide STa présente une structure conformationelle permettant sa fixation sur le récepteur GC-C pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou au diagnostic des tumeurs colorectales métastatiques. 2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la molécule active est une protéine active et le conjugué est une protéine chimère. 3) Utilisation selon la revendication 1 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au diagnostic des tumeurs colorectales métastatiques, caractérisée en ce que la protéine active est une protéine porteuse immunogène capable de conférer à la protéine chimère des propriétés immunogènes sans modifier la structure conformationelle du peptide STa. 4) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que la protéine porteuse immunogène est une protéine ClpG. 5) Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que la protéine chimère comprend le peptide STa à l'extrémité N ou C-terminale d'une protéine ClpG. 6) Méthode de diagnostic des tumeurs colorectales métastatiques dans un échantillon biologique d'un patient, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : - la mise en contact dudit échantillon avec une protéine chimère formée par une protéine ClpG et le peptide STa dans des conditions permettant la fixation de la protéine chimère sur les récepteurs GC-C par le biais de la partie STa de la protéine chimère, puis - la détection des protéines chimères fixées sur les récepteurs GC-C à l'aide d'anticorps dirigés contre la protéine ClpG ou contre la protéine chimère. 7) Méthode de diagnostic selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle consiste en une technique ELISA par compétition à partir d'extraits sanguins ou de matériels tissulaires. 8) Un kit de diagnostic pour la mise en #uvre de la méthode selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend : - une plaque de microtitration où chaque puits est sensibilisé avec tout ou une partie du récepteur GC-C conservant le site de fixation de la toxine, - au moins un contrôle positif contenant du récepteur GC-C purifié. - la protéine chimère ClpG-STh purifiée, des anticorps primaires concentrés en solution contenant des IgG sériques polyclonaux ou monoclonaux (souris) anti-ClpG ou anti-hybride ClpG-STh, - des anticorps secondaires marqués, - des tampons. 9) Méthode de diagnostic selon la revendications 6, caractérisée en ce qu'elle consiste en une technique immunohistochimique à partir de biopsie de tissus extra-intestinaux.