Brevet FR2804961A1 — publié le 20010817

La présente invention concerne une protéine à activité de phosphosérine phosphatase de corynébactéries et un ADN codant cette protéine qui peut être utilisé dans l'industrie microbiologique, par exemple dans la culture de corynébactéries productrices de L-sérine. Comme procédés conventionnels de production de L-sérine par fermentation, on connaît un procédé selon lequel une souche bactérienne capable de convertir la glycine et le sucre en L-sérine est utilisée dans un milieu contenant 30 g/1 de glycine pour produire au plus 14 g/1 de L-sérine avec un rendement de conversion de 46 % (Kubota, K., Agricultural Biological Chemistry, 49,7-12 (1985)). Au moyen d'une souche bactérienne capable de convertir la glycine et le méthanol en L-sérine, il est possible de produire 53 g/1 de L-sérine à partir de 100 g/1 de glycine (T. Yoshida et al., Journal of Fermentation and Bioengineering, vol. 79, n 2,181-183, 1995). Dans le procédé utilisant Nocardia, on sait que le rendement en L-sérine des bactéries peut être amélioré en cultivant des souches résistant notamment à l'hydroxamate de sérine ou à l'azasérine (demande de brevet japonais publiée n 57-1235). Toutefois, ces procédés mettent en jeu l'utilisation de glycine qui est un précurseur de la L-sérine, comprennent des opérations compliquées et sont désavantageux du point de vue des coûts. Comme souches capables de produire de la L-sérine par fermentation directement à partir d'un sucre et qui ne nécessitent pas l'addition d'un précurseur de L-sérine au milieu, on connaît Corynebacterium glutamicum qui est résistant à la D-sérine, à l'a-méthylsérine, à la o-méthylsérine, à l'isosérine, à l'hydroxamate de sérine et à la 3-chloroaniline. Toutefois, l'accumulation de L-sérine, qui est de 0,8 g/1, est faible (Nogei Kagakukaishi, vol. 48, n 3, pages 201-208,1974). Ainsi, il est nécessaire de disposer de souches encore améliorées pour pouvoir obtenir la L-sérine par fermentation directe à l'échelle industrielle. Par ailleurs, concernant les corynébactéries, il a été décrit un vecteur plasmidique capable de réplication autonome dans les cellules et comportant un gène marqueur de résistance à un médicament (brevet US n 4 514 502) et un procédé d'introduction d'un gène dans une cellule (demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 2-207791). Ces techniques ont été utilisées pour cultiver des bactéries productrices de L-aminoacides. Concernant la L-sérine, on a constaté que le rendement en L-sérine des corynébactéries capables de produire de la L-sérine est amélioré par introduction d'un gène codant la D-3-phosphoglycérate déshydrogénase dont la rétro-inhibition par la L-sérine est désactivée (gène serA) (demande de brevet européen mise à la disposition du public n 943687) ou par amplification d'un gène codant la phosphosérine phosphatase (serB) ou la phosphosérine transaminase (serC) (demande de brevet européen mise à la disposition du public n 931833). On connaît un gène serB de Escherichia coli (GenBank accession X03046, M30784), de la levure (GenBank accession U36473), de Helicobacter pylori (GenBank accession AF006039), mais on ne connaît pas de gène serB de corynébactéries. Compte tenu de ce qui précède, la présente invention a pour but de fournir un ADN codant la phosphosérine phosphatase de corynébactéries. La présente demanderesse a obtenu un fragment d'ADN à partir d'une banque d'ADN chromosomique de Brevibacterium flavum, qui complémentait la déficience en serB de Escherichia coli. Le cadre de lecture ouvert ayant une homologie avec le gène serB connu de Escherichia coli a été sous-cloné à partir du fragment d'ADN et introduit dans une souche mutante déficiente en serB de Escherichia coli mentionnée ci-dessus. Toutefois, la déficience en serB n'a pas été complémentée. On a constaté que la déficience en serB était complémentée avec le cadre de lecture ouvert mentionné ci-dessus qui était exprimé de manière forcée au moyen du promoteur lac. Ainsi, il a été confirmé que le cadre de lecture ouvert mentionné ci-dessus était homologue de Brevibacteriumflavum concernant serB. On a indiqué que le cadre de lecture ouvert mentionné ci-dessus n'avait pas son propre promoteur car il formait un opéron. Ainsi, la présente invention concerne une protéine définie par les points A ou B suivants : (A) Une protéine qui comprend la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO: 2 dans la liste de séquences annexée ; ou (B) Une protéine qui comprend une séquence d'acides aminés comprenant une substitution, une délétion, une insertion, une addition ou une inversion d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO: 2 de la liste de séquences annexée, et qui a une activité de phosphosérine phosphatase, et un ADN codant cette protéine qui est de préférence défini par les points (a) ou (b) suivants : (a) un ADN qui comprend une séquence nucléotidique correspondant aux nucléotides n 210-1547 de la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 1 de la liste de séquences annexée ; ou (b) un ADN qui est hybridable avec une sonde qui comprend la séquence nucléotidique correspondant aux nucléotides n 210-1547 de la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 1 de la liste de séquences ou une séquence nucléotidique partielle dans des conditions stringentes, qui comprennent de préférence un lavage à 60 C et à une concentration en sels correspondant à 1 x SSC et 0,1 % de SDS, et qui code une protéine ayant une activité de phosphosérine phosphatase. La présente invention concerne également un ADN codant une protéine ayant une activité de phosphosérine phosphatase qui s'hybride à une séquence d'ADN codant une protéine qui comprend la séquence selon SEQ ID NO: 2 de la liste de séquences, dans des conditions stringentes qui comprennent de préférence un lavage à 60 C et à une concentration en sels correspondant à 1 x SSC et 0,1 % de SDS. La présente invention concerne aussi un vecteur comprenant l'ADN ci-dessus, une cellule bactérienne dont l'activité de phosphosérine phosphatase codée par l'ADN ci-dessus est augmentée, et un procédé de production de L-sérine comprenant les étapes de culture de la bactérie précédente dans un milieu pour produire et accumuler la L-sérine dans le milieu, et de récupération de la L-sérine à partir du milieu. L'ADN selon la présente invention peut être obtenu par amplification en chaîne par polymérase (PCR) avec l'ADN chromosomique de Brevibacterium flavum, par exemple de la souche ATCC 14067 de Brevibacterium flavum, comme matrice, et avec des amorces ayant les séquences nucléotidiques selon SEQ ID NO: 3 et 4 de la liste de séquences. Du fait que chacune de ces amorces a un site de restriction EcoRI ou Sali dans sa séquence en 5', le produit d'amplification digéré avec ces endonucléases de restriction peut être inséré dans un vecteur digéré avec EcoRI et Sali. Les séquences nucléotidiques des amorces mentionnées précédemment ont été conçues sur la base de la séquence nucléotidique du fragment d'ADN qui complémente la souche mutante déficiente en serB Escherichia coli ME8320 (thi, serB, zhi-1::Tn10) (disponible auprès du National Genetics Institute). Avec ces amorces, il est possible d'obtenir un fragment d'ADN contenant la région codante de l'homologue de serB et ses régions flanquantes (région non traduite en 5' d'environ 200 pb et région non traduite en 3' d'environ 300 pb). La séquence nucléotidique de la région codante de l'ADN selon la présente invention qui est obtenue comme décrit ci-dessus et une séquence d'acides aminés qui peut être codée par cette séquence sont représentées dans SEQ ID NO: 1 de la liste de séquences annexée. La séquence d'acides aminés seule est représentée dans SEQ ID NO: 2. L'homologue de serB mentionné précédemment constitue un cadre de lecture ouvert ayant une homologie avec les gènes serB de Escherichia coli et de la levure (Saccharomyces cerevisiae), qui existait dans le fragment d'ADN complémentant la déficience en serB de la souche ME8320. Un fragment d'ADN de longueur suffisante pour contenir le cadre de lecture ouvert et le promoteur a été obtenu à partir de la souche Brevibacterium flavum ATCC 14067 par PCR avec les amorces mentionnées précédemment ayant les séquences nucléotidiques selon SEQ ID NO: 3 et 4. Il a été introduit dans la souche ME8320 mais la déficience en serB de cette souche n'a pas été complémentée. C'est pourquoi on a pensé d'abord que le cadre de lecture ouvert mentionné précédemment n'était pas homologue de serB. Toutefois, la déficience en serB était complémentée par le cadre de lecture ouvert mentionné précédemment quand il était ligaturé au promoteur lac et exprimé de manière forcée. Ainsi, il a été confirmé que le cadre de lecture ouvert mentionné précédemment était homologue de serB. En outre, un autre cadre de lecture ouvert a été trouvé immédiatement en amont de l'homologue de serB dans le fragment d'ADN qui complémente la déficience en serB. ll en résulte que ces cadres de lecture ouverts forment un opéron et qu'il n'y avait pas de région promotrice immédiatement en amont de l'homologue de serB. On a d'abord tenté d'obtenir un homologue de serB de Brevibacterium f lavum avec la séquence nucléotidique de gènes serB connus. Autrement dit, on a tenté de comparer la séquence nucléotidique et la séquence d'acides aminés de gènes serB connus issus d'autres espèces, pour identifier une région de séquence d'acides aminés hautement conservée parmi différentes espèces, et pour synthétiser des amorces de PCR sur la base de cette séquence nucléotidique, et pour amplifier un homologue de serB avec ces amorces. Toutefois, du fait qu'il y avait très peu de régions conservées, on a estimé qu'il était difficile d'obtenir le gène voulu par PCR. C'est pourquoi on a mis en #uvre un test de complémentation avec une souche mutante déficiente en serB. Bien que l'ADN selon la présente invention ait été obtenu par clonage par un test de complémentation utilisant un mutant déficient en serB et sousclonage par PCR comme décrit ci-dessus, il peut être obtenu aussi à partir d'une banque d'ADN chromosomique de Brevibacterium flavum par hybridation avec une sonde oligonucléotidique préparée sur la base de la séquence nucléotidique de l'ADN selon la présente invention. Des procédés de construction d'une banque d'ADN génomique, d'hybridation, de PCR, de préparation d'ADN plasmidique, de digestion et de ligature d'ADN, et de transformation sont décrits dans Sambrook, J., Fritsch et E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 ( 1989). L'ADN selon la présente invention peut coder une phosphosérine phosphatase incluant une substitution, une délétion, une insertion, une addition ou une inversion d'un ou plusieurs acides aminés à une ou plusieurs positions, à condition que l'activité de la phosphosérine phosphatase ainsi codée ne soit pas détériorée. Bien que le nombre d'acides aminés soumis à une substitution, une délétion, une insertion, une addition ou une inversion diffère en fonction de la position ou du type des résidus d'acides aminés dans la structure tridimensionnelle de la protéine, ce nombre peut être de 2 à 200, de préférence de 2 à 50 et de préférence encore de 2 à 20. Par ailleurs, l'ADN selon la présente invention peut coder une phosphosérine phosphatase ayant une homologie d'au moins 50 %, de préférence d'au moins 60 %, de préférence encore d'au moins 70 %, de préférence encore d'au moins 80 % et de préférence encore d'au moins 90 % avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO: 2, à condition que l'activité de la phosphosérine phosphatase ainsi codée ne soit pas détériorée. Un ADN qui code une protéine sensiblement identique à la phosphosérine phosphatase décrite ci-dessus est obtenu par exemple par modification de la séquence nucléotidique du gène de phosphosérine phosphatase, par exemple par mutagenèse dirigée, pour produire une substitution, une délétion, une insertion, une addition ou une inversion d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés à un site spécifié. L'ADN ainsi modifié peut être obtenu par un traitement mutagène connu de manière conventionnelle, qui peut être un procédé de traitement d'un ADN codant la phosphosérine phosphatase in vitro, par exemple avec l'hydroxylamine, et un procédé de traitement d'un micro-organisme, par exemple une bactérie appartenant au genre Escherichia contenant un ADN codant une phosphosérine phosphatase avec des rayons ultraviolets ou un agent mutagène comme la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) et l'acide nitreux habituellement utilisé pour un traitement mutagène. La substitution, délétion, insertion, addition ou inversion de nucléotides comprend non seulement une mutation artificielle mais aussi une mutation (ou variation) qui apparaît naturellement, par exemple un polymorphisme parmi les souches, ou une diversité parmi les espèces ou les genres de micro-organismes. L'ADN qui code une protéine sensiblement identique à la phosphosérine phosphatase est obtenu par expression d'un ADN comportant une mutation dans une cellule appropriée et par examen de l'activité de phosphosérine phosphatase du produit exprimé. L'ADN qui code une protéine sensiblement identique à la phosphosérine phosphatase est aussi obtenu par isolement d'un ADN qui est hybridable avec une amorce ayant par exemple la séquence nucléotidique comprenant les nucléotides n 210-1547 de la séquence nucléotidique de SEQ ID NO: 1, dans des conditions stringentes, et qui code une protéine ayant une activité de phosphosérine phosphatase, à partir d'un ADN codant une phosphosérine phosphatase ayant une mutation ou à partir d'une cellule le contenant. Les conditions "stringentes" dont il est question ici sont des conditions expérimentales d'hybridation exigeantes (notamment en ce qui concerne la température et la force ionique) dans lesquelles il se forme un hybride appelé spécifique sans formation d'hybride non spécifique. Il est délicat d'exprimer clairement ces conditions au moyen de valeurs numériques, mais, par exemple, les conditions stringentes comprennent des conditions dans lesquelles les ADN ayant une grande homologie, par exemple des ADN ayant une homologie d'au moins 50 %, s'hybrident et dans lesquels les ADN ayant une homologie inférieure à cette valeur ne s'hybrident pas. Ou bien encore, les conditions stringentes peuvent être par exemple des conditions qui comprennent des conditions ordinaires de lavage en hybridation de Southern, par exemple 60 C, 1 x SSC, 0,1 % de SDS, de préférence 0,1 x SSC, 0,1 % de SDS. L'ADN selon la présente invention inclut un ADN qui a une homologie d'au moins 60 %, de préférence d'au moins 70 %, de préférence encore d'au moins 80 % et de préférence encore d'au moins 90 % avec la séquence nucléotidique de SEQ ID NO: 1 et qui code une protéine ayant une activité de phosphosérine phosphatase. Comme sonde, il est possible aussi d'utiliser une séquence partielle de la séquence nucléotidique de SEQ ID NO: 1. Une telle sonde peut être préparée par PCR avec des amorces constituées par des oligonucléotides produits sur la base de la séquence nucléotidique de SEQ ID NO: 1, et avec une matrice constituée par un fragment d'ADN contenant la séquence nucléotidique de SEQ ID NO: 1. Quand un fragment d'ADN d'une longueur d'environ 300 pb est utilisé comme sonde, les conditions du lavage pour l'hybridation sont par exemple 50 C, 2 x SSC et 0,1 % de SDS. Les gènes qui sont hybridables dans les conditions décrites ci-dessus comprennent ceux qui ont un codon stop formé dans le gène et ceux qui n'ont pas d'activité du fait d'une mutation du centre actif. Toutefois, de tels gènes mutants peuvent être aisément retirés par ligature du gène avec un vecteur d'expression d'activité du commerce et par mesure de l'activité de phosphatase, par exemple selon le procédé de Lewis, 1. Pizer (J. Biol. Chem., 238(12), 3934-3944 (1963)). Il est préférable que l'ADN selon la présente invention soit ligaturé avec un ADN vecteur réplicable de manière autonome dans des cellules de Escherichia coli et/ou de corynébactéries pour préparer un ADN recombiné qui est introduit au préalable dans des cellules de Escherichia coli. Une telle mesure facilite les opérations suivantes. Le vecteur réplicable de manière autonome dans des cellules de Escherichia coli est de préférence un vecteur plasmidique qui est de préférence réplicable de manière autonome dans les cellules d'un hôte, et ce vecteur peut être par exemple pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398 ou RSF1010. L'ADN recombiné peut être préparé au moyen d'un transposon (demande WO 02/02627, demande WO 93/18151, demande de brevet européen mise à la disposition du public n 0 445 385, demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 6-46867, Vertes, A.A. et al., Mol. Microbiol., Il, 739-746 (1994), Bonamy, C., et al., Mol. Microbiol., 14, 571-581 (1994), Vertes, A.A. et al., Mol. Gen. Genet., 245,397-405 (1994), Jagar, W. et al., FEMS Microbiology Letters, 126,1-6 (1995), demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 7-107 976, demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 7-327680), de vecteurs phagiques, de la recombinaison de chromosomes (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S. et Mizushima, S., J. Bacteriol., 162,1196 (1985)), notamment. Quand un fragment d'ADN permettant à un plasmide de se répliquer de manière autonome dans des corynébactéries est inséré dans ces vecteurs, ceux-ci peuvent être utilisés sous forme de vecteurs navettes réplicables de manière autonome dans Escherichia coli et dans les corynébactéries, tels que les suivants (les micro-organismes contenant chacun des vecteurs et les numéros de dépôt sont indiqués entre parenthèses) : pHC4 : Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532) pAJ655 : Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136), Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135) pAJ1844 : Escherichia coli AJ11883 (FERMBP-137), Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136) pAJ611 : Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138) pAJ3148 : Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 39137) pAJ440 : Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140) Ces vecteurs peuvent être obtenus à partir de micro-organismes déposés de la manière suivante. On lyse avec le lysozyme et SDS des cellules recueillies au cours de la phase de croissance logarithmique, et on sépare le lysat par centrifugation à 30000 x g pour obtenir un surnageant auquel on ajoute du polyéthylèneglycol, puis on fractionne et on purifie par centrifugation en gradient de densité à l'équilibre chlorure de césium-bromure de d'éthidium. Il est possible de transformer Escherichia coli en introduisant un plasmide, par exemple selon le procédé de D. A. Morrison (Methods in Enzymology, 68,326 (1979)) ou un procédé selon lequel on traite les cellules receveuses avec le chlorure de calcium pour augmenter leur perméabilité à l'ADN (Mandel, M. et Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)). L'introduction de plasmides dans des corynébactéries pour les transformer peut être accomplie au moyen du procédé à impulsions électriques (Sugimoto et al., demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 2-207791). Il est possible de produire de la phosphosérine phosphatase en exprimant l'ADN selon la présente invention au moyen d'un système hôte-vecteur approprié. Comme hôte pour l'expression de l'ADN selon la présente invention, on peut mentionner différentes cellules procaryotiques y compris les bactéries appartenant au genre Corynebacterium comme Brevibacterium flavum, Escherichia coli, Bacillus subtilis, différentes cellules eucaryotiques comprenant Saccharomyces cerevisiae, des cellules animales et des cellules végétales. Parmi celles-ci, on préfère les cellules procaryotiques, en particulier Escherichia coli et Bacillus subtilis. Comme l'ADN selon la présente invention ne comporte pas de promoteur, pour exprimer le gène, il nécessite qu'un promoteur qui est actif dans la cellule hôte, comme lac, trp et PL, soit ligaturé en amont de la séquence d'ADN. En utilisant comme vecteur un vecteur contenant un promoteur, il est possible de réaliser en une étape la ligature du gène avec le vecteur et le promoteur. Comme vecteur de ce type, on peut mentionner pMW219 contenant le promoteur lacZ (disponible auprès de Nippon Gene). Quand l'expression de l'ADN est importante, le plasmide le contenant peut éventuellement devenir instable. Dans ce cas, un vecteur à petit nombre de copies est préférable. Il est possible de réaliser la transformation par exemple au moyen du procédé dans lequel les cellules receveuses sont traitées avec le chlorure de calcium pour augmenter leur perméabilité à l'ADN, ainsi que cela était décrit pour la souche K-12 de Escherichia coli (Mandel, M. et Higa, A., J. Mol. Biol., 53,159 (1970)), ou le procédé dans lequel l'ADN est introduit dans des cellules compétentes au cours d'une phase de croissance, de la manière décrite pour Bacillus subtilis (Duncan, C. H., Wilson, G. A. et Young, F.E., Gene, 1,153 (1977)). Il est possible aussi de mettre les cellules receveuses sous forme de protoplastes ou de sphéroplastes qui incorporent aisément l'ADN et d'introduire l'ADN dans ceux-ci, de la manière connue pour Bacillus subtilis, Actinomycetes et la levure (Changs, S. et Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111(1979) ; Bibb, M. J., Ward, J.M. et Hopwood, O.A., Nature, 274,398 (1978) ; Hinnen, A., Hicks, J. B., et Fink, G. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75,1929 (1978)). Le procédé utilisant des impulsions électriques est efficace aussi pour les corynébactéries (demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 2-207791). Le procédé approprié peut être choisi parmi les procédés précédents, en fonction de la cellule qui doit être utilisée comme hôte. La phosphosérine phosphatase peut être produite par culture de cellules dans lesquelles l'ADN selon la présente invention est introduit de manière que l'ADN puisse être exprimé comme décrit ci-dessus dans un milieu pour produire et accumuler la phosphosérine phosphatase dans la culture, après quoi la phosphosérine phosphatase est récupérée à partir de la culture. Le milieu de culture peut être choisi en fonction de l'hôte qui doit être utilisé. La phosphosérine phosphatase ainsi produite peut être purifiée à partir j'un extrait cellulaire ou du milieu au moyen d'un procédé de purification courant pour les enzymes, par exemple la chromatographie d'échange d'ions, la chromatographie par filtration sur gel, la chromatographie d'adsorption ou la précipitation dans un solvant. En outre, l'ADN selon la présente invention peut être utilisé pour cultiver des bactéries productrices de L-sérine, par exemple des corynébactéries, en conférant et augmentant le rendement en L-sérine de ces bactéries par l'introduction de l'ADN selon la présente invention dans les bactéries afin de conférer ou d'augmenter l'activité de phosphosérine phosphatase. En outre, il est possible aussi d'augmenter l'activité de phosphosérine phosphatase en augmentant le nombre de copies de l'homologue de serB et en modifiant la séquence de contrôle de l'expression pour augmenter l'expression de l'homologue de serB dans le chromosome de Brevibacterium flavum. Il est possible de modifier la séquence de contrôle de l'expression dans l'ADN chromosomique par exemple en remplaçant la séquence de contrôle de l'expression de l'opéron contenant l'homologue de serB par une séquence de contrôle de l'expression forte telle qu'un promoteur (demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 1-215280). Les corynébactéries qui peuvent être utilisées pour la culture de bactéries productrices de L-aminoacides comprennent par exemple les souches de type sauvage suivantes : Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 ; Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 ; Corynebacterium callunae ATCC 15991 ; Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 ; (Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020 ; (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869 ; (Corynebacterium lilium) ATCC 15990 ; Brevibacterium flavum ATCC 14067 ; Corynebacterium melassecola ATCC 17965 ; Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 ; Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 ; Brevibacterium roseum ATCC 13825 ; Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 ; Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 ; Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539). Il est possible aussi d'utiliser comme souche initiale une souche mutante ayant une résistance à l'azasérine ou l'a-(2-phényl)-DL-alanine (demande de brevet européen publiée n 943 687) pour cultiver des bactéries productrices de L-sérine. En outre, l'ADN selon la présente invention peut être introduit dans des bactéries productrices de L-sérine avec d'autres gènes d'enzymes impliquées dans la biosynthèse de la L-sérine. De tels gènes comprennent le gène codant la D-3-phosphoglycérate déshydrogénase (serA) (demande de brevet européen publiée n 943 687), la phosphosérine phosphatase (serB) et la phosphosérine transaminase (serC) (demande de brevet européen publiée n 931 833). Comme gène serA, il est possible d'utiliser un gène mutant codant la D-3-phosphoglycérate déshydrogénase dont la rétro-inhibition par la L-sérine est désactivée (demande de brevet européen publiée n 943 687). La L-sérine peut être produite directement à partir de sucres par culture des micro-organismes dans lesquels l'ADN de la présente invention a été introduit sous une forme telle que l'ADN peut être exprimé et qui sont capables de produire de la L-sérine dans un milieu pour accumuler la L-sérine dans le milieu, et récupération de la L-sérine à partir du milieu. De plus, les micro-organismes dans lesquels l'ADN selon la présente invention a été introduit peuvent être utilisés dans un procédé de production de L-sérine utilisant un précurseur de Lsérine comme la glycine, à condition que la phosphosérine phosphatase soit impliquée dans le procédé. Pour la production de L-sérine au moyen de micro-organismes dans lesquels l'ADN selon la présente invention a été introduit, il est possible d'utiliser des milieux liquides conventionnels contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des sels inorganiques et éventuellement des nutriments organiques à l'état de traces comme des acides aminés et des vitamines, si on le souhaite. Comme sources de carbone, il est possible d'utiliser des sucres comme le glucose, le saccharose, le fructose et le galactose, des solutions d'amidon saccharifié, des mélasses de patate douce, des mélasses de betterave sucrière et des mélasses qui comprennent les sucres énumérés ci-dessus, des acides organiques comme l'acide acétique, des alcools comme l'éthanol, ou le glycérol. Comme sources d'azote, il est possible d'utiliser l'ammoniac gazeux, l'ammoniaque, des sels d'ammonium, l'urée, des nitrates, notamment. De plus, il est possible d'utiliser des sources d'azote organique à titre de complément, par exemple des tourteaux, des liquides d'hydrolysats de soja, la caséine décomposée, d'autres acides aminés, l'eau de trempage, des levures ou des extraits de levure, des peptides comme la peptone, notamment. Il est possible d'ajouter éventuellement des ions inorganiques comme des ions phosphore, des ions magnésium, des ions calcium, des ions fer ou des ions manganèse. Lorsque l'on utilise des micro-organismes qui exigent des nutriments tels que des acides aminés pour leur croissance, ces nutriments doivent être ajoutés. Habituellement, les micro-organismes sont incubés dans des conditions aérobies à un pH de 5 à 8 et à une température de 25 à 40 C. Le pH du milieu de culture est maintenu à une valeur prédéterminée dans les domaines décrits ci-dessus, en fonction de la présence ou de l'absence d'acides inorganiques ou organiques, de substances alcalines, d'urée, de carbonate de calcium ou d'ammoniac. La L-sérine peut être récupérée à partir du liquide de fermentation, par exemple par séparation et retrait des cellules, soumission à un traitement avec un résine échangeuse d'ions, concentration, cristallisation par refroidissement, séparation sur membrane et d'autres procédés connus en toute combinaison appropriée. Pour retirer les impuretés et pour la purification, il est possible d'utiliser l'adsorption sur charbon actif et la recristallisation. La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples non limitatifs suivants. 1. Préparation d'une banque d'ADN chromosomique de Brevibacterium flavum au moyen d'un vecteur à grand nombre de copies On a préparé le chromosome de Brevibacterium flavum ATCC 14067 et on l'a soumis à une digestion partielle en fragments d'approximativement 4 à 6 kb avec l'enzyme de restriction Sau3AI. On a ligaturé les fragments obtenus avec pSAC digéré avec BamHI qui est un vecteur navette de Escherichia coli et des corynébactéries. On a préparé pSAC4 de la manière suivante. Pour rendre le vecteur pHSG399 pour Escherichia coli (Takara Shuzo) réplicable de manière autonome dans des cellules de corynébactéries, on a introduit dans le vecteur l'origine de réplication du plasmide pHM1519 obtenu antérieurement, qui est réplicable de manière autonome dans des cellules de corynébactéries (Miwa, K. et al., Agric. Biol. Chem., 48 (1984) 2901-2903) (demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 5-7491). Plus précisément, on a soumis pHM1519 à une digestion avec les endonucléases de restriction BamHI et Kpnl pour obtenir un fragment de gène contenant l'origine de réplication, et on a rendu franches les extrémités du fragment obtenu au moyen du "Blunting Kit" produit par Takara Shuzo, puis on l'a inséré dans le site Sali de pHSG399 au moyen d'un lieur Sali (produit par Takara Shuzo) pour obtenir pSAC4. On a dissous le réactif de ligature mentionné précédemment dans du tampon TE et on a transformé Escherichia coli DH5a au moyen de la solution, par électroporation. On a ajouté à la solution de transformation du milieu SOC (composition : 20 g/1 de bactotryptone, 5 g/1 d'extrait de levure, 0,5 g/1 de NaCl, 10 g/1 de glucose), on a incubé à 37 C pendant 1 h puis on a ajouté un volume égal de 2 x milieu LB (contenant 40 mg/l de chloramphénicol, composition du milieu LB : 1 % de tryptone, 0,5 % d'extrait de levure, 0,1% de NaCl, 0,1% de glucose, pH 7) et on l'a incubé à 37 C pendant 2 h. On a ajouté au milieu de culture un volume égal de 4 x milieu LB contenant 40 % de glycérol et on a conservé à -80 C. On a inoculé le milieu de culture mentionné précédemment dans du milieu LB et on a recueilli les plasmides à partir des cellules obtenues. On a précipité l'ADN plasmidique avec de l'éthanol et on l'a utilisé pour transformer la souche mutante déficiente en serB ME8320 (thi, serB, zhi-1::Tn10) (obtenue auprès du National Genetics Institute) par électroporation. On a confirmé que la souche ME8320 ne pouvait pas croître sur du milieu M9 contenant 140 mg/1 de vitamine B,mais qu'elle pouvait croître sur le même milieu contenant 40 mg/1 de L-sérine. Après la transformation, on a lavé les cellules, on les a étalées sur du milieu gélosé M9 contenant 40 mg/1 de vitamine Blet du chloramphénicol et on a incubé à 37 C pendant 3 à 4 jours pour former des colonies. A partir de chaque colonie, on a préparé des plasmides et on a examiné leur taille par électrophorèse. On a ainsi constaté une délétion remarquable. On a considéré que la haute expression du gène serB dans les cellules rendait les plasmides instables de sorte qu'il a été nécessaire de préparer de nouveau la banque au moyen d'un vecteur à petit nombre de copies. 2. Préparation d'une banque d'ADN chromosomique de Brevibacterium flavum au moyen d'un vecteur à petit nombre de copies, et clonage du gène serB On a préparé le chromosome de Brevibacterium flavum ATCC 14067 et on l'a digéré avec l'enzyme de restriction Sau3AI. On a contrôlé la réaction pour que le centre de distribution soit situé à approximativement 3 kpb ou plus. On a séparé approximativement 200 g de produit de digestion obtenu par centrifugation en gradient de densité de 10 à 40 % de saccharose et on les a recueillis sous forme de fractions de 1 ml avec les instruments suivants : AUTOMATIC LIQUID CHARG-ER (ADVANTEC) et MICRO TUBE PUMP (EYELA). On a réalisé la centrifugation en gradient de densité de saccharose avec un rotor SW28 (Beckman) à 10 C et 260000 tr/min pendant 26 h. On a précipité à l'éthanol et purifié avec Microcon-50 (Milipore) la fraction contenant les fragments d'ADN dont le centre de distribution était à approximativement 3 à 4 kpb ou plus. On a ligaturé les fragments d'ADN chromosomique obtenus de la manière décrite ci-dessus avec le vecteur à petit nombre de copies pMW219 (Nippon Gene, digéré avec BamHI et déphosphorylé). On a dissous le réactif de ligature dans du tampon TE et on l'a utilisé pour transformer par électroporation Escherichia coli DH5a. On a ajouté du milieu SOC à la solution de transformation, on a incubé à 37 C pendant 1 h puis on a ajouté un volume égal de 2 x milieu LB (contenant 25 mg/1 de kanamycine) et on a incubé à 37 C pendant 2 h. On a ajouté au milieu de culture un volume égal de 4 x milieu LB contenant 40 % de glycérol et on a conservé à -80 C. On a inoculé le milieu de culture mentionné ci-dessus à du milieu LB et on a cultivé. On a recueilli les plasmides à partir des cellules obtenues. On a précipité l'ADN plasmidique à l'éthanol et on l'a utilisé pour transformer la souche mutante déficiente en serB ME8320 par électroporation. Après la transformation, on a lavé les cellules, on les a étalées sur du milieu gélosé M9 contenant 25 mg/1 de vitamine B1et de la kanamycine et on a incubé à 37 C pendant 3 à 4 jours pour former des colonies. On a étalé en boîte chaque colonie sur le même milieu et du milieu LB contenant 25 mg/1 de kanamycine. On a sélectionné les souches qui pouvaient croître sur le milieu et on a préparé des plasmides à partir des souches sélectionnées. Pour déterminer la séquence nucléotidique du fragment inséré du plasmide obtenu, on a initié le séquençage à partir des deux extrémités du site de clonage multiple du vecteur avec des amorces universelles. On a continué le séquençage sur 300 à 400 pb. On a finalement séquence approximativement 5 kpb des deux extrémités du fragment inséré. On a recherché un cadre de lecture ouvert pour la séquence nucléotidique déterminée et on a trouvé un cadre de lecture ouvert ayant une homologie avec la phosphosérine phosphatase (codée par le gène serB) d'autres espèces connues. Il existe plusieurs régions présentant une homologie avec le cadre de lecture ouvert, mais l'homologie entre le cadre de lecture ouvert et le gène serB connu était de 43 % dans la séquence d'acides aminés et de 49,4 % dans la séquence nucléotidique pour Escherichia coli et de 36,6 % dans la séquence d'acides aminés et de 50,9 % dans la séquence nucléotidique pour Saccharomyces cerevisiae, respectivement. On a analysé les séquences nucléotidiques et d'acides aminés avec le programme d'ordinateur Genetyx-Mac (Software Development Co., Tokyo, Japon). On a réalisé l'analyse d'homologie par le procédé développé par Lipman et Peason (Science, 227,1435- 1441, 1985). La séquence nucléotidique du cadre de lecture ouvert présentant une homologie avec un autre gène serB connu et les régions flanquantes (SEQ ID NO: 1), et la séquence d'acides aminés qui peut être codée par cette séquence nucléotidique (SEQ ID NO: 2) sont montrées dans la liste de séquences annexée. 3. Clonage du cadre de lecture ouvert présentant une homologie avec serB On a cloné le fragment d'ADN chromosomique contenant le cadre de lecture ouvert et approximativement 200 à 300 pb de régions amont et aval du cadre de lecture ouvert et on a réalisé un test de complémentation d'une souche déficiente en serB pour confirmer que le cadre de lecture ouvert présentant une homologie avec le gène serB était le gène serB. On a conçu des amorces ayant les séquences nucléotidiques de SEQ ID NO: 3 et 4 pour obtenir l'ADN voulu par PCR. On a réalisé la PCR avec ces amorces et avec une matrice constituée par l'ADN chromosomique préparé à partir de Brevibacterium flavum ATCC 14067. On a accompli la réaction de PCR pendant 30 cycles consistant chacun en une réaction à 98 C pendant 10 s, 55 C pendant 30 s et 72 C pendant 2 min, avec l'ADN polymérase Pyrobest (TaKaRa Shuzo). On a digéré le fragment d'ADN amplifié et le vecteur pMW219 avec EcoRI et Sali et on les a ligaturés l'un à l'autre pour obtenir le plasmide pMW218BSB. On a confirmé par séquençage du fragment amplifié qu'aucun erreur n'avait été introduite par PCR. Le cadre de lecture ouvert mentionné précédemment est inséré dans la direction inverse par rapport au promoteur lacZ du vecteur. On a introduit pMW219BSB dans la souche ME8320 de la manière décrite au point 2 ci-dessus et on a étalé sur du milieu LB contenant 25 mg/1 de kanamycine. On a prélevé les colonies formées et on les a inoculées à du milieu M9 par groupes de dix colonies, on a cultivé mais on n'a pas observé de croissance. 4. Expression forcée du cadre de lecture ouvert présentant une homologie avec serB On a changé l'orientation du fragment inséré dans pMW219BSB pour qu'il soit placé dans la direction directe afin d'être exprimé de manière forcée. On a introduit le plasmide obtenu dans la souche ME8320 que l'on a étalée sur du milieu LB contenant 25 mg/1 de kanamycine. On a constaté que les colonies formées croissaient sur le milieu minimal. Selon le résultat précédent, on a démontré que le cadre de lecture ouvert mentionné précédemment, qui présente une homologie avec le gène serB, est capable de complémenter la déficience en serB de Escherichia coli. De ce fait, on a confirmé que le cadre de lecture ouvert est un homologue de serB de Brevibacterium flavum. On a trouvé un autre cadre de lecture ouvert juste en amont du cadre de lecture ouvert ayant une homologie avec le gène serB dans le fragment cloné obtenu de la manière décrite au point 2 précédent. On a supposé que pMW219BSB ne pouvait pas complémenter la déficience en serB du fait que ces cadres de lecture ouverts formaient un opéron et du fait qu'il n'y avait pas de région promotrice immédiatement en amont du cadre de lecture ouvert présentant une homologie avec le gène serB. REVENDICATIONS 1. Protéine, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une protéine comprenant une séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO: 2 dans la liste de séquences annexée ou d'une protéine qui comprend une séquence d'acides aminés incluant une substitution, une délétion, une insertion, une addition ou une inversion d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO: 2 de la liste de séquences, et qui a une activité de phosphosérine phosphatase. 2. ADN caractérisé en ce qu'il code une protéine selon la revendication 1. 3. ADN selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un ADN qui comprend une séquence nucléotidique comprenant les nucléotides numéro 210-1547 de la séquence nucléotidique selon SEQ ID NO: 1 de la liste de séquences annexée ou d'un ADN qui est hybridable avec une sonde qui comprend la séquence nucléotidique correspondant aux nucléotides n 210-1547 de la séquence nucléotidique selon SEQ ID NO: 1 de la liste de séquences annexée ou une séquence partielle de cette séquence nucléotidique dans des conditions stringentes, et qui code une protéine ayant une activité de phosphosérine phosphatase. 4. ADN selon la revendication 3, caractérisé en ce que les conditions stringentes comprennent un lavage à 60 C et à une concentration de sels correspondant à 1 x SSC et 0,1 % de SDS. 5. ADN caractérisé en ce qu'il code une protéine ayant une activité de phosphosérine phosphatase qui s'hybride dans des conditions stringentes avec une séquence d'ADN codant une protéine qui comprend la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO: 2. 6. ADN selon la revendication 5, caractérisé en ce que les conditions stringentes comprennent un lavage à 60 C et à une concentration de sels correspondant à 1 x SSC et 0,1 % de SDS. 7. Vecteur caractérisé en ce qu'il comprend un ADN selon l'une quelconque des revendications 2 à 6. 8. Cellule bactérienne caractérisée en ce que son activité de phosphosérine phosphatase codée par un ADN selon l'une quelconque des revendications 2 à 6 est augmentée. 9. Procédé de production de L-sérine caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de culture de cellules bactériennes selon la revendication 8 dans un milieu pour produire et accumuler la L-sérine dans le milieu, et de récupération de la L-sérine à partir du milieu.