Brevet FR2801979A1 — publié le 20010608

L'invention a pour objet l'utilisation d'au moins un anticorps spécifique des fibroblastes papillaires comme marqueur de qualité d'une peau, particulièrement d'un équivalent de peau. La peau est constituée de deux compartiments intimement liés, à savoir l'épiderme et le derme. L'épiderme est majoritairement constitué de trois types cellulaires, les kératinocytes eux-mêmes majoritaires parmi les cellules de l'épiderme, les mélanocytes et les cellules de Langerhans. Ces cellules constituent un épithélium kératinisé qui se différencie en couches superposées surmontées d'une couche de cellules mortes formant le stratum corneum. Le derme fournit à l'épiderme un support solide. C'est également son élément nourricier. II est principalement constitué de fibroblastes et d'une matrice extracellulaire composée elle-même principalement de collagène, d'élastine et d'une substance, dite substance fondamentale. L'ensemble de ces composants extracellulaires est synthétisé par le fibroblaste. On y trouve aussi des leucocytes, des mastocytes ou encore des macrophages tissulaires. II est également constitué de vaisseaux sanguins et de fibres nerveuses. Dans une peau normale, c'est à dire ni pathologique ni cicatricielle, le fibroblaste est à l'état quiescent, c'est à dire non prolifératif, peu actif d'un point de vue métabolique et non mobile. En fait le derme se subdivise en deux régions, d'une part un derme superficiel fin appelé papillaire, d'autre part le derme profond appelé réticulaire qui constitue la grande majorité du derme. Le derme papillaire est la partie du derme située au contact de l'épiderme et il contient des fibroblastes dit papillaires. Le derme réticulaire est la région du derme s'étendant ensuite jusqu'à la sous couche cutanée graisseuse et il contient des fbroblastes dits réticulaires. Ces deux régions présentent dans la peau normale des différences. Le derme papillaire est métaboliquement plus actif que la derme réticulaire. Les fibroblastes papillaires et réticulaires en culture présentent des différences dans leur potentiel de croissance. Par immunomarquage il est possible de monter que la décorine, dermatane sulfate protéoglycan (DSPG) de petite taille, est plus abondante dans le derme papillaire que dans le derme réticulaire. Les fibroblastes papillaires sécrètent jusqu'à environ 6 fois plus de décorine que les fibroblastes réticulaires. Donc dans la peau normale le derme est constitué d'au moins deux populations de fibroblastes ce qui ne peut qu'avoir des conséquences essentielles sur la peau elle-même. Dans le domaine des équivalents de peaux (ou peaux reconstruites in vitro), on sait préparer des équivalents de derme avec chacune des populations de fibroblastes préalablement isolées. On sait également préparer des équivalents de derme dans lesquels les deux populations préalablement isolées sont introduites. Mais le problème demeure de l'identification des différentes populations de fibroblastes dans des équivalents de derme reconstruits à partir d'une population aléatoires de fibroblastes. Après établissement en culture de l'équivalent de derme, ce dernier présente-t-il au moins les deux populations de fibroblastes, réticulaire et papillaire, présents dans le derme d'une peau normale ? Or on a vu précédemment que la peau normale présente ces deux populations et l'on comprend qu'une peau reconstruite in vitro sera d'autant plus proche d'une peau normale quand elle présentera au moins les deux populations de fibroblastes. A ce jour à la connaissance de la demanderesse il n'existe pas de moyen simple et efficace, particulièrement de moyen non invalidant pour l'équivalent de peau qui permettent d'établir sans ambiguïté si une peau reconstruite présente ou non au moins les deux populations de fibroblastes papillaire et réticulaire. C'est ce problème que vise à résoudre la présente invention. En effet de manière surprenante et inattendue la demanderesse a maintenant découvert que les fibroblastes papillaires exprime un épitoge spécifique qui n'est pas, ou peu, présent chez les fibroblastes réticulaires. II est alors possible d'effectuer à l'aide d'anticorps, particulièrement d'anticorps monoclonaux, spécifiques de cet épitoge un marquage de cette population particulière de fibroblastes dermiques. Ainsi, il est possible à l'aide de cet anticorps de déterminer si un équivalent de peau présente les deux populations de fibroblastes papillaire et réticulaire. Ainsi, l'invention a pour objet l'utilisation d'au moins un anticorps spécifique des fibroblastes papillaires comme marqueur de qualité d'une peau, particulièrement d'un équivalent de peau. Par marqueur de qualité on entend selon l'invention, tout marqueur qui indique effectivement la présence dans la peau ou dans l'équivalent de peau, d'un élément biologique présent dans la peau normale. Par marqueur on entend selon l'invention, tout élément dont la présence, l'absence, la modification de l'expression ou la modification de la distribution peuvent être mesurées. On peut citer à titre d'exemple de marqueur, et sans limitation, les épitopes, les acides nucléiques (acide ribonucléique ou désoxyribonucléïque), les anticorps, les protéines ou groupe de protéines liées ou non, les ions, les organites cellulaires, les lipides ou les polyosides. Selon l'invention le marqueur est un anticorps. L'anticorps peut être un anticorps polyclonal ou monoclonal. Préférentiellement selon l'invention l'anticorps est monoclonal. L'anticorps peut être un anticorps provenant de toute origine c'est à dire issu de n'importe quel animal comme par exemple le cheval, la chèvre, la souris, le rat, le lapin. Préférentiellement l'anticorps est un anticorps de souris. Encore plus préférentiellement l'anticorps est un anticorps monoclonal de souris. Un anticorps préféré selon l'invention est l'anticorps connu sous le nom de PG4, décrit dans la publication de Sorrell et col. (The Histochemical Journal 31 : 549 558,1999). Cet anticorps monoclonal de souris est décrit comme reconnaissant au niveau de la peau au moins un épitope spécifique des glycosaminoglycans, particulièrement décrit comme un anticorps monoclonal anti-chondroitine sulfate (CS) et antidermatane sulfate (DS). A ce jour cet anticorps n'a pas été décrit comme spécifique d'une population particulière de fibroblates dermiques à savoir les fibroblastes papillaires. Ainsi l'invention a pour objet l'utilisation de l'anticorps monoclonal PG4 comme marqueur des fibroblastes papillaires, particulièrement des fibroblastes papillaires de la peau, très particulièrement fibroblastes papillaires du derme. Un autre objet de l'invention est l'utilisation de l'anticorps monoclonal PG4 comme marqueur de qualité de la peau, particulièrement des équivalents de peau, particulièrement des équivalent de derme obtenus in vitro. Toute méthode de marquage immunologique utilisant au moins un anticorps, connue de l'art antérieur peut être utilisée pour réalisée les marquages avec les anticorps de l'invention. On peut à cet égard citer la méthode décrite par Asselineau et col., (J. 1. D., 86, 181-186, 1986), ou encore par Sorrell et col. (The Histochemical Journal 31 : 549-558, 1999). Un autre objet de l'invention est un procédé de détermination de la qualité d'une peau, particulièrement d'un équivalent de peau obtenu in vitro, caractérisé en ce que l'on effectue sur la peau et/ou l'équivalent de peau un marquage immunologique à l'aide d'au moins un anticorps spécifique des fibroblastes papillaires, particulièrement de l'anticorps PG4. La figure 1 permet de mieux illustrer l'invention, sans toutefois en limiter sa portée. Dans cette figure, la photo montrent un coupe de peau humaine normale après immunomarquage réalisé en immunofluorescence indirecte à l'aide de l'anticorps monoclonal PG4 avec contremarquage des noyaux cellulaires au iodure de propidium. On note la présence d'un marquage intense (zone grisée claire) du derme supérieur au niveau de l'épiderme (reconnaissable au nombreux noyaux cellulaires marqués au iodure de propidium), démontrant la présence dans cette zone de fibroblastes papillaires exprimant l'épitope reconnu spécifiquement par l'anticorps monoclonal PG4. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront mieux des exemples qui suivent, donnés à titre illustratif et non limitatif. Exemple 1 : Marquage immunologique des fibroblastes papillaires dans une peau normale. Des échantillons de peau normale issus de plasties chirurgicales sont inclus dans le Tissue-Tek, congelés en azote liquide et conservés au congélateur à -80 C. Des coupes de 4 microns d'épaisseur sont réalisées au cryostat selon les techniques standards. Les marquages sont réalisés par une technique classique de marquage en immunofluorescence indirecte (voir Asselineau et col., J. I. D., 86, 181-186, 1986) avec 201 par coupe de l'anticorps monoclonal PG4 utilisé pur (surnageant de culture) (voir Sorrell et col. The Histochemical Journal 31 : 549-558, 1999). 20 l,1 par coupe d'un anticorps dirigé contre les anticorps de souris (conjugué de souris) obtenu auprès de la société Dako sont alors déposés sur les coupes et celles-ci sont incubées selon les recommandations du fournisseur. Après rinçage, les coupes sont soumises à une solution de PBS contenant du iodure de propidium à 0,5% puis rincées au PBS et montées pour observation au microscope à fluorescence afin de marquer les noyaux cellulaires. On note la présence d'un marquage intense du derme au niveau de l'épiderme, démontrant la présence dans cette zone de fibroblaste papillaire exprimant l'épitope reconnu spécifiquement par l'anticorps monoclonal PG4. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'au moins un anticorps spécifique des fibroblastes papillaires comme marqueur de qualité d'une peau. 2. Utilisation d'au moins un anticorps spécifique des fibroblastes papillaires comme marqueur de qualité d'un équivalent de peau. 3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée par le fait que l'anticorps est un anticorps monoclonal. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée par le fait que l'anticorps est un anticorps de cheval, de chèvre, de souris, de rat ou de lapin. 5. Utilisation selon la revendication précédente, caractérisée par le fait que l'anticorps est un anticorps de souris. 6. Utilisation de l'anticorps PG4 comme marqueur des fibroblastes papillaires. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée par le fait que les fibroblastes sont des fibroblastes papillaires de peau. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisée par le fait que les fibroblastes sont des fibroblastes papillaires du derme. 9. Utilisation de l'anticorps PG4 comme marqueur de qualité d'une peau ou d'un équivalent de peau. 10. Utilisation de l'anticorps PG4 comme marqueur de qualité d'un derme ou d'un équivalent de derme. 11. Procédé de détermination de la qualité d'une peau ou d'un équivalent de peau obtenu in vitro, caractérisé en ce que l'on effectue sur cette peau ou sur cet équivalent de peau un marquage immunologique à l'aide d'au moins un anticorps spécifique des fibroblastes papillaires. 12. Procédé de détermination de la qualité d'une peau ou d'un équivalent de peau obtenu in vitro, caractérisé en ce que l'on effectue sur cette peau ou sur cet équivalent de peau un marquage immunologique à l'aide de l'anticorps PG4.