Brevet FR2809014A1 — publié le 20011123

L'invention concerne l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie ou l'un de ses fragments, notamment de Klebsiella pneumoniae, pour la préparation d'une composition pharmaceutique antimicrobienne destinée à être administrée par voie mucosale. L'invention concerne en outre les compositions ainsi préparées, de préférence exemptes d'antigène, ainsi qu'un dispositif adapté pour une administration par voie mucosale caractérisé en ce qu'il contient une composition selon l'invention. De nombreux candidats vaccins composés de ribosomes ou d'ARN ribosomaux et de protéoglycanes de bactéries à Gram négatifs ont déjà été décrits comme adjuvant de l'immunité ou comme agent immunogène pour le traitement prophylactique d'infection. Parmi ces documents, on peut citer les demandes de brevets européens EP 0 238 407 et EP 0 035 429 ainsi que les demandes de brevets français FR 78 35 649 et FR 73 46 957 qui mentionnent que les souches dont sont issues les fractions ribosomales constituant ces vaccins correspondent aux souches responsables de l'infection à traiter, ces ribosomes ou ARN ribosomaux constituant la fraction antigénique de ces vaccins. Parmi ces documents, on peut citer en particulier la demande de brevet français FR 78 35 649 qui décrit une composition vaccinale pour le traitement prophylactique des infections bronchiques et de la sphère ORL comprenant des protéoglycanes de Klebsiella pneumoniae et des ARN ribosomaux de Klebsiella pneumoniae, de Streptococcus pneumoniae, de Streptococcus pyogenes et d'Haemophillus influenzae, telle que la composition vaccinale dénommée D53. Le système immunitaire et en particulier les cellules de l'immunité innée se sont adaptés afin de reconnaître des molécules exprimées par des groupes de pathogènes. Ces molécules reconnues présentent entre autres les caractéristiques suivantes : être exprimées de façon importante par un ensemble des pathogènes et ne pas être semblables à des composants du soi. La liaison de ces molécules à des cellules de l'immunité innée entraînent généralement l'activation de ces cellules. Lors de l'introduction d'un agent microbien dans l'organisme, les cellules de l'immunité innée telles que les polynucléaires neutrophiles, macrophages et lymphocytes NK (NK pour Natural Killer ) sont activés et produisent des médiateurs proinflammatoires et des chémokines qui vont favoriser la migration et l'activation des leucocytes au niveau du site où est localisé l'agent pathogène. De plus, les neutrophiles et les macrophages présentent des propriétés phagocytaires et vont participer directement à l'élimination du pathogène par phagocytose et le détruire. Les cellules phagocytaires et en particulier les macrophages présents localement vont donc jouer un rôle essentiel en éliminant le pathogène et en attirant localement d'autres cellules immunitaires. Outre un rôle antipathogène par elle-même, la réponse inflammatoire médiée par les cellules de l'immunité innée va contribuer à activer les cellules présentatrices d'antigène (CPAg) et par la même à induire le développement d'une réponse spécifique par les lymphocytes B et T. Parmi les cytokines produites par les macrophages qui vont participer au développement d'une réponse de défense de l'organisme vis-à-vis de l'agent pathogène, on peut citer les médiateurs proinflammatoires comme par exemple l'interleukine 1 (IL-1), le facteur alpha de nécrose de tumeur TNFa (TNF pour Tumor Necrosis Factor ), l'oxyde nitrique (NO), l'IL-12 ou les chémokines. Il a aussi été constaté que d'autres cellules présentes localement (au niveau de l'agent pathogène), par exemple les cellules épithéliales (telles que les cellules d'épithélium de poumons), ou les polynucléaires neutrophiles produisaient également des cytokines, telles que celles mentionnées ci-avant et vont ainsi également provoquer un effet antipathogène. L'IL-1 et le TNFa ont un effet antipathogène direct par activation des neutrophiles et des macrophages et un effet indirecte en favorisant l'expression par de nombreuses cellules de molécules d'adhésion qui vont favoriser le recrutement des leukocytes. De plus, ces cytokines proinflammatoires contribuent à l'activation des CPAg et au développement de la réponse spécifique qui fera suite à la réponse inflammatoire. Le NO module également la migration des leukocytes ainsi que leur activation, augmente les capacités phagocytiques des neutrophiles et des macrophages, et possède en plus un rôle puissant et direct antipathogène. L'IL-12 est produite essentiellement par les CPAg, et en particulier par les macrophages. Elle induit la production d'interféron gamma (IFNy) et contribue à l'activation des lymphocytes T et des cellules NK. Par ce biais l'IL-12 joue un rôle crucial dans le développement d'une réponse lymphocytaire non spécifique (dépendante des cellules NK) et spécifiques (dépendante des lymphocytes T). Ainsi, il existe un besoin de disposer de composés qui se fixent sur les macrophages et induisent leur activation. Les macrophages activés produisent de l'IL- 1, du TNFa, du NO et de l'IL-12. Ces composés activent donc des cellules de l'immunité innée et en particulier les macrophages et par ce biais jouent un rôle essentiel pour favoriser et/ou augmenter la réponse de l'organisme contre les pathogènes. De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence qu'une protéine OmpA d'entérobactérie, notamment la protéine OmpA de Klebsiella pneumoniae, est capable de se lier aux macrophages et d'induire la sécrétion d'IL-1, de TNFa, de NO et d'IL-12, et ainsi être utilisée comme agent antimicrobien. La présente invention est donc relative à l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie ou un de ses fragments comme agent antimicrobien ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique antimicrobienne destinée à être administrée par voie mucosale. La présente invention a ainsi pour objet principal l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées, comme agent antimicrobien ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique antimicrobienne. Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme protéine également les peptides ou les polypeptides et par le terme OmpA (pour Outer Membrane Protein ), les protéines de la membrane externe de type A. Par fragment d'une protéine OmpA, on entend désigner en particulier tout fragment de séquence d'acides aminés compris dans la séquence d'acides aminés de la protéine OmpA dont il est issu, et qui est capable de générer ou accroître une réponse antimicrobienne, ledit fragment de la protéine OmpA comprenant au moins 5 acides aminés, de préférence au moins 10 acides aminés ou de manière plus préférée au moins 15, 20,25, 30,40, 50,75 et 100 acides aminés consécutifs de la séquence de ladite protéine OmpA dont il est issu. L'utilisation comme agent antimicrobien ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique antimicrobienne de protéines dérivées de ladite protéine OmpA dont la séquence d'acides aminés présente une homologie, telle que définie ciaprès, d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 99 %, après alignement optimal avec la séquence de la protéine OmpA de référence et qui sont capables de générer ou accroître une réponse antimicrobienne, est également comprise dans la présente invention. Par séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés présentant une homologie d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés déterminée, on entend désigner une séquence qui après alignement optimal avec ladite séquence déterminée comprend un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec ladite séquence déterminée. Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2 :482], moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48 :443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P). Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, BLAST 2 sequences , disponible sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, les paramètres utilisés étant ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres open gap penaltie : 5, et extension gap penaltie : 2 ; la matrice choisie étant par exemple la matrice BLOSUM 62 proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme. De manière plus préférée, par fragment ou protéine dérivée de protéine OmpA capable de générer ou accroître une réponse antimicrobienne, on entendra désigner en particulier un fragment ou une protéine dérivée de protéine OmpA capable d'induire ou d'accroître la sécrétion d'IL-1, de TNFa, de NO et/ou d'IL-12, de préférence en quantité au moins égale à 25 %, de manière plus préférée au moins égale à 50 %, 75 % et 90 % de la quantité obtenue et telle que mesurée dans les exemples 2 et 3 avec la protéine OmpA de séquence SEQ ID NO. 1, dénommée P40, de Klebsiella pneumoniae. Par agent antimicrobien ou composition pharmaceutique antimicrobienne, on entend désigner un agent ou une composition pharmaceutique qui après administration, de préférence chez l'Homme, est capable de générer ou accroître une réponse immune permettant de prévenir ou de traiter, partiellement ou totalement, une infection par une bactérie, une levure, un champignon, un virus ou un parasite, de préférence sans nécessité d'adjonction d'antigènes issus du micro-organisme infectieux dont on cherche à prévenir ou à traiter l'infection. Ainsi, par agent antimicrobien ou composition pharmaceutique antimicrobienne, on préfère les agents antimicrobiens ou compositions pharmaceutiques antibactériens, antilevures, antifongiques, antiviraux ou antiparasitaires. Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées, pour, ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à induire l'activation des macrophages, notamment induire ou accroître la sécrétion d'IL-1, de TNFa, de NO et/ou d'IL-12 par lesdits macrophages. L'invention concerne encore l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées, pour, ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à induire l'activation des lymphocytes NK, des cellules épithéliales et/ou des polynucléaires neutrophiles. Dans un mode de réalisation particulier, la protéine OmpA d'entérobactérie ou l'un de ses fragments, est obtenue par un procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie. Les procédés d'extraction de protéines de membranes bactériennes sont connus de l'homme de l'art et ne seront pas développés dans la présente description. On peut citer par exemple, mais sans s'y limiter le procédé d'extraction décrit par Haeuw J.H. et al. (Eur. J. Biochem, 255,446-454, 1998). Dans un autre mode de réalisation préféré, l'invention comprend également l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées selon l'invention, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ledit fragment ou ladite protéine dérivée, est obtenue par voie recombinante. Les méthodes de préparation de protéines recombinantes sont aujourd'hui bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas développées dans la présente description, on pourra néanmoins se référer à la méthode décrite dans les exemples. Parmi les cellules utilisables pour la production de ces protéines recombinantes, il faut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins P. O. et Lee S. C., 1993, Recent advances in heterologous gene expression in E. coli. Cuir. Op. Biotechnology 4 :520-525), également les cellules de levure (Buckholz R. G., 1993, Yeast Systems for the Expression of Heterologous Gene Products. Curr. Op. Biotechnology 4 :538-542), même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifère (Edwards C. P. et Aruffo A., 1993, Current applications of COS cell based transient expression systems. Curr. Op. Biotechnology 4 :558-563) également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre par exemple des baculovirus (Luckow V.A., 1993, Baculovirus systems for the expression of human gene products. Curr. Op. Biotechnology 4:564-572). De manière tout à fait préférée, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que ladite entérobactérie est Klebsiella pneumoniae. En particulier, l'invention est relative à l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la séquence d'acides aminés de ladite protéine OmpA de Klebsiella pneumoniae, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées, comprend : a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID No. 1 ; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant une homologie d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 99 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 1 ; c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 5 acides aminés, de préférence 10, 15, 20,25, 30,40, 50,75 et 100 acides aminés consécutifs, d'une séquence telle que définie en a). L'invention comprend également l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie, l'un de ses fragments ou l'une des protéines dérivées telles que définies précédemment, pour la préparation d'une composition pharmaceutique antimicrobienne destinée à être administrée par voie mucosale, de préférence par voie orale, nasale, anale ou vaginale, de manière plus préférée par voie orale ou par voie nasale. Ces compositions sont notamment destinées au traitement prophylactique ou thérapeutique, préférentiellement prophylactique, des infections virales, bactériennes, parasitaires, fongiques ou par des levures. Dans une forme de réalisation particulièrement préférée, les compositions selon l'invention ne comprennent pas d'antigènes en particulier d'antigènes issus du microorganisme infectieux dont on cherche à prévenir ou à traiter l'infection. La présente invention a également pour objet l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'assurer et/ou d'améliorer sa stabilité ou son efficacité. L'invention concerne en particulier l'utilisation selon l'invention caractérisée en ce ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme de vecteur permettant d'assurer et/ou d'améliorer la stabilité et/ou l'efficacité de la protéine OmpA, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées, en particulier les vecteurs choisis parmi les liposomes, les virosomes, les nanosphères, les microsphères ou les microcapsules. L'invention concerne en outre l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique contient un milieu pharmaceutiquement acceptable, de préférence choisi parmi les milieux pharmaceutiquement acceptables pour une administration par voie mucosale chez l'homme, notamment constitué, mais sans s'y limiter, d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et/ou de glycérol. Les concentrations de la protéine OmpA d'entérobactérie, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées utilisées selon l'invention sont celles permettant d'obtenir un effet antimicrobien. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne en outre l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique contient en outre un détergent. Parmi lesdits détergents, on préfère tout type de tensioactif pharmaceutiquement acceptable, en particulier des tensioactifs anioniques, cationiques, non-ioniques ou amphotères. On utilise préférentiellement les détergents Zwittergent 3-12 et l'octylglucopyrannoside et encore plus préférentiellement le Zwittergent 3-14. L'invention concerne en outre l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique se présente sous une forme telle que sous forme de poudre, de suppositoire ou d'ovule, ou encore sous forme d'aérosol, en suspension, etc., de préférence sous une forme adaptée à une administration par voie mucosale, en particulier par voie nasale. L'invention concerne encore une composition telle que définie précédemment dans les utilisations selon l'invention, en particulier les compositions ne contenant pas d'antigènes, notamment issues du micro-organisme infectieux dont on cherche à prévenir ou à traiter l'infection. Sous un dernier aspect, l'invention a pour objet un dispositif adapté pour une administration par voie mucosale, caractérisé en ce qu'il contient une composition selon l'invention telle que définie ci-dessus. Comme exemples de dispositifs au sens de l'invention on peut notamment citer un dispositif aérosol comprenant ou non un agent propulseur. Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Légendes des figures : Figures 1A et 1B : Fixation de la protéine P40 aux macrophages Figure 1A : Des macrophages humains ont été incubés avec 0,5 M de protéine P40 ou de glycophorine A marqué à Alexa488 puis ont été analysés par FACS. Les résultats sont exprimés en nombre relatif de cellules. Figure 1B : Des macrophages humains ont été incubés avec différentes concentrations de P40 ou de glycophorine A marqué à Alexa488 puis ont été analysés par FACS. Les résultats sont exprimés en intensité moyenne de fluorescence (MFI). Figures 2A, 2B et 2C : Intemalisation de la protéine P40 par les macrophages Figures 2A et 2B : macrophages humains sont incubés à 4 C avec 0,5 M de P40 marqué avec de l'Alexa488, lavés puis cytospinés et observés avec un microscope confocal avant (Figure 2A) ou après une incubation à 37 C (Figures 2B). Figure 2C : macrophages humains sont incubés à 4 C avec 0,5 M de protéine P40 marqué avec de l'Alexa488, lavés puis incubés à 37 C avant d'être observé avec un microscope confocal. Du diméthyl amiloride (DMA) a été ajouté 10 minutes avant ajout de protéine P40 ainsi que dans le tampon FACS utilisé. Figure 3 : de l'expression de l'ARNm codant pour l'IL-10, l'IL-8, l'IL-12 et le TNFa par les macrophages humains en présence de la protéine P40 Séparation sur gel d'agarose des produits obtenus après RT-PCR pour chacun des ARNm ciblés transcrit en présence d'un témoin de validation de la RT-PCR (GAPDH). Ligne 0 : non stimulés ; Ligne LPS : macrophages stimulés par 10 ng/ml LPS ; Ligne P40 : macrophages stimulés par 1 M de protéine P40. Figures 4A, 4B, 4C, 4D, 4E et 4F : de médiateurs proinflammatoires et d'IL-8 par les macrophages en présence de la protéine P40 en agissant en synergie avec le LPS et l'IFNy Figures 4A, 4B, 4C, 4D et 4E : de TNFa (Figure 4A), d'IL-1(3 (Figure 4B), d'IL-8 (Figure 4C), d'IL-12 (Figure 4D) et d'IL-10 (Figure 4E) par les macrophages humains. Les macrophages ont été stimulés par la protéine P40 seule (#) à différentes concentrations ou : - soit par P40 à différentes concentrations en présence de 0,2 ng/ml de LPS (#) ; - soit par P40 à différentes concentrations, les macrophages ayant été préalablement stimulés par de l'IFNy humain avant d'être stimulés par P40 (@). Les cytokines ont été dosées dans les surnageants par ELISA. Les résultats obtenus sont issus d'une expérience représentative de plusieurs expériences réalisées. Figure 4F : de NO par les cellules murines RAW 264. 7 Les macrophages ont été stimulés par la protéine P40 à différentes concentrations : - soit avec addition simultanée de 0,2 ng/ml de LPS cas avec 0,2 ng/ml de LPS (#) ; - soit les cellules RAW ont été primées (préalablement stimulées) 6 heures avec 5 ng/ml d'IFNy murin (@). Exemple 1 : et intemalisation de la P40 par les macrophages Matériel et méthode Obtention des cellules Les macrophages humains sont différenciés à partir de monocytes selon la méthode ci-après décrite. Les cellules mononucléées (CMN) du sang périphérique de sujets volontaires sains ont été purifiées sur un gradient de Ficoll. Les monocytes sont ensuite purifiés des CMN par sélection positive avec un séparateur cellulaire magnétique (Milteny Biotex, Bergisch Gladbach, Germany). Les monocytes sont cultivés de 5 à 7 jours avec 10 ng/ml de GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor), (R & D Systems, Abingdon, UK) à 5 x 106 cellules/5 ml/puits de plaque de culture 6 puits dans du milieu de culture RPMI contenant 10 % de sérum de veau foetal, 50 U/ml de pénicilline, 2 mM de glutamine, 50 mg/ml de streptomycine, tampon HEPES 10 mM, et 0,1 mM d'acides aminés non essentiels (cRPMI). Toutes les lignées cellulaires utilisées proviennent de l'ATCC. Etude de la fixation de la protéine P40 par la méthode FACS - Sur les macrophages différenciés à partir de monocytes Les macrophages ainsi générés sont incubés dans du tampon FACS (RPMI contenant 0,1 % de sérum albumine bovine) à 2 x 105 cellules par puits de plaque de culture 96 puits fond pointu pendant 20 minutes en présence de différentes concentrations de protéine P40 marquée avec de l'Alexa488 ou avec de la glycophorine A marquée par de l'Alexa488. La protéine P40 est la protéine de séquence SEQ ID No. 1 obtenue par voie recombinante, telle que décrite dans la demande internationale de brevet publiée le 17 mai 1996 sous le numéro WO 96/14415. Le marquage à l'Alexa488 est réalisé comme décrit par la fiche technique du produit commercialisé par Molecular Probes. Les cellules sont alors lavées en tampon FACS et analysées en utilisant l'appareil FACSvantage cytofluoromètre. - Sur différents types de cellules Différentes lignées cellulaires ainsi que des monocytes et des macrophages humains et des macrophages péritonéaux de souris ont été incubés avec 0,5 M de protéine P40 marquée à Alexa488 puis ont été analysés par FACS. Les résultats sont exprimés en index relatif de moyenne d'intensité de fluorescence (-, +, + + et + + +) correspondant à une intensité de fixation allant de non détectable à importante (cf. Tableau 1 ci-après). Tableau 1 : Etude de la fixation de la protéine P40 par la méthode FACS sur différents types de cellules. Cellules et lysées cellulaires Liaison de P40 Monocyte humain + + + HL-60 (promyélocyte)UB37 (promocyte) + THP-1 (monocyte) + + Macrophage murine + + + RAW 264,7 (magrophage) + + + F815 (myéloïde) - Etude de l'internalisation de la protéine P40 par microscopie confocale Les macrophages humains sont incubés dans du tampon FACS (RPMI contenant 0,1% de sérum albumine bovine) à 2 x 105 cellules par puits de plaque de culture 96 puits fond pointu pendant 20 minutes en présence de 0,5 mM de protéine P40 marquée avec de l'Alexa488, lavés puis incubés ou non à 37 C. Les macrophages sont finalement cytospinés et observés avec un microscope confocal en utilisant un microscope inversé LSM510 commercialisé par Zeiss muni d'un objectif apochromat plan 63 X. Dans certaines expériences, 150 mM de diméthyl amiloride (DMA) ont été ajoutés 10 minutes avant ajout de la protéine P40 ainsi que dans le tampon FACS utilisé. La fluorescence de l'Alexa488 a été mesurée avec un filtre 530-30 nm après excitation avec un laser à ion argon a 488 nm. Résultats Les résultats obtenus montrent que : - après incubation à 4 C, les macrophages humains lient la protéine P40 et ne lient pas la glycophorine A utilisée comme protéine contrôle (cf. Figure 1A) ; - les macrophages humains lient la protéine P40 de façon dose-dépendante (cf. Figure 1B) ; - certaines lignées myéloïdes et en particulier la lignée de macrophages murins RAW 267. 4 lient également la protéine P40 (cf. Tableau 1) ; - les macrophages internalisent la protéine P40 à 37 C. Après incubation à 4 C en présence d'azide, la protéine P40 reste localisée à la surface de la cellule (cf. Figure 2A). Une incubation à 37 C montre que la protéine P40 est retrouvée à l'intérieur de la cellule (cf. Figure 2B). Le DMA prévient partiellement cette internalisation ce qui suggère que l'internalisation de la protéine P40 pourrait se faire par macropinocytose (cf. Figure 2C). Exemple 2 : de la production de médiateurs proinflammatoires par les macrophages en présence de la protéine P40 Matériel et méthode Les macrophages générés à partir de monocytes du sang périphérique comme précédemment décrit sont incubés à 5 x 105/ml dans du cRPMI en présence de différentes concentrations de protéine P40 ou en présence de lipopolysacharide (LPS), utilisé comme témoin positif (cf. Tableau 2). Certaines expériences ont été réalisées en présence de 10 ng/ml de polymixine B sulfate. Les cytokines ont été dosées dans le surnageant par méthode ELISA. L'IL-1(3, l'IL-8, et l'IL-12 biologiquement active (IL- 12 p40 / IL-12 p35) ont été mesurées en utilisant des kits commerciaux (commercialisés par R & D Systems). L'IL-10 et l'IL-8 ont été dosées à 24 heures. L'IL-12 a été dosée à 48 heures. Le TNFa a été dosé en utilisant des anticorps de capture et de détection commercialisés par R & D Systems. Tableau 2 : de médiateurs proinflammatoires par les macrophages en présence de la protéine P40. Cytokines Stimulus (concentration) non P40 0,2 M P40 1 M LPS (10 ng/ml) TNF[alpha] (ng/ml) 0,3 ~ 0,05 0,9 0,2 4 ~ 1 TNFa (ng/ml)* 0,3 ~ 0,07 1,1 ~ 0,2 0,16 ~ 0,1 IL-1ss (ng/ml) 0,35 0,08 0,5 0,1 0,9 0,1 IL-8(ng/ml) 10 ~ 8 80 il 95 15 n. d. IL-12(pg/ml) 1 ~ 0,2 2 ~ 0,3 6 ~ 0,8 * : Expérience réalisée en présence de 10 ng/ml de polymixine B sulfate ; Transcription des ARNm codant pour le TNFa, l'IL-1ss, l'IL-8, et l'IL-12 biologiquement active IL-12 p40 et IL-12 p35 (cf. Figure 3). L'expression des ARNm codant pour les cytokines TNFa, IL-1(3, IL-8, IL-12 p35 et IL-12 p40 a été évaluée par RT-PCR. Les séquences des amorces utilisées ont été rapportées précédemment dans la littérature (De Saint-Vis et al., J. Immunol. (1998) 160-166). Brièvement, 8 heures après stimulation, les culots cellulaires sont repris dans un tampon d'extraction contenant de l'isothiocyanate de guanidium (Trizol ; Life technologies) à raison de 1 ml pour 10 x 106 cellules. Après deux extractions au phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25/24/1), les ARNs totaux sont précipités par ajout d'un volume égal d'isopropanol (18 heures à - 20 C) puis collectés par centrifugation (13000 rpm, 30 min., 4 C). Le culot est rincé avec de l'éthanol 70 %. L'ARN total est resuspendu dans de l'eau contenant un inhibiteur de RNAse (RNAsin ; Promega, Madison, WI), dénaturé par chauffage (5 min. à 65 C) puis quantifié par spectrophotométrie (# = 260 nm). Les ADN complémentaires (ADNc) sont synthétisés à l'aide d'un kit commercial (First strand cDNA synthesis, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suède). La transcription réverse (2 mg d'ARN total) est réalisée dans le tampon Tris-HCl 10 mM pH 8,3 contenant 300 mg/ml d'amorce oligo-dT (5'-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAA(T)18- 3'), 10 M de dithiothréitol, 5 mM des quatre nucléotides et 1 U/ml de réverse transcriptase recombinante. Le mélange réactionnel est incubé pendant 1 heure à 37 C et la réaction est stoppée par chauffage à 65 C pendant 5 minutes. Le mélange réactionnel pour le RT-PCR est le suivant : 1 l d'ADNc (correspondant à 25 ng d'ARN total), 25 pmoles d'amorce, dNTP 200 M, MgCl2 1,5 mM, Tris-HCl 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM et 0,4 unité de Taq polymérase (Perkin Elmer). Les conditions de PCR sont les suivantes : 5 min. à 95 C, 30 cycles : 1 min. à 94 C, 1 min. à 55 C et 1 min. à 72 C, une extension finale de 5 min. à 72 C. Les échantillons sont repris dans le tampon d'échantillon (bleu de bromophénol 0,25 %, sucrose 40 %) et analysés par électrophorèse en gel d'agarose 1 % contenant du bromure d'éthidium. Après migration, les échantillons sont visualisés par illumination du gel aux UV. L'intégrité de l'ARN est analysée en évaluant l'expression de l'ADNc codant pour la molécule actine ss à l'aide des amorces suivantes : 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' et 5'ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'. Résultats Les résultats obtenus (cf. Tableau 2 et Figure 3) qui sont issus d'une expérience représentative de 5 expériences réalisées, montrent que : - la protéine P40 induit la production d'IL-lp, de IL-8, d'IL-12 et de TNFa par les macrophages humains (cf. Figure 3) ; - l'induction de TNFa induit par la protéine P40 n'est pas inhibée par la polymixine B sulfate (cf. Tableau 1). Ceci montre que l'effet de la protéine P40 n'est pas médié par des endotoxines contaminantes. Confirmant ces résultats, nous avons également observé que la production de TNFa murin induit par la protéine P40 est semblable chez des souris normales/mutées au niveau de toll récepteur 4 (souris C3H/HeN versus C3H/HeJ) (données non présentées) ; - la protéine P40 agit au niveau de la transcription et augmente l'expression de l'ARNm codant pour l'IL-10, IL-8, IL-12 et le TNFa (cf. Figure 3). Exemple 3 : protéine P40 augmente la production de médiateurs proinflammatoires et d'IL-8 par les macrophages en agissant en synergie avec le LPS et l'IFNy Matériel et méthode Les macrophages ont été obtenus et stimulés comme décrit ci-dessus avec les modifications suivantes pour étudier la synergie avec le LPS et l'IFNy : - soit par addition de 0,2 ng/ml de LPS au moment de la stimulation par la protéine P40 ; - soit les macrophages utilisés ont été préalablement stimulés (primés) 6 heures par 5 ng/ml d'IFNy humain avant la stimulation par la protéine P40 (cf. Figures 4A, 4B, 4C, 4D et 4E). Des cellules RAW 264. 7 (macrophages murins) provenant de l'ATCC ont été stimulées par la protéine P40 et après 24 heures les nitrites ont été dosés dans les surnageants par la méthode de Griess en utilisant du NaNO2 comme standard. Dans certains cas les cellules RAW ont été primées 6 heures avec 5 ng/ml d'IFNy murin, et dans d'autres cas avec 0,2 ng/ml de LPS ajoutés en même temps que la protéine P40 (cf figure 4F). Résultats Les résultats montrent que : # la protéine P40 agit en synergie avec le LPS et l'IFNy pour induire la production de médiateurs proinflammatoires, de l'IL-8 par les macrophages (cf. Figures 4A, 4B, 4C, 4D et 4E) ; # la protéine P40 induit la production de NO par les macrophages murins et agit en synergie avec l'IFNy (cf. Figure 4F). Ces résultats montrent en particulier que la protéine OmpA d'entérobactérie, notamment l'OmpA de Klebsiella pneumoniae, induit la production de cytokines par les macrophages et est capable d'agir en synergie avec le LPS et l'IFNy. L'IFNy est produit par les lymphocytes T et les cellules NK. Ainsi, l'effet de l'OmpA sera très probablement amplifié lors d'une agression par des bactéries gram-négative par le LPS. En présence d'OmpA, de faibles quantités de bactéries sont alors suffisantes pour stimuler les cellules de l'innée. De plus, les lymphocytes présents localement peuvent également être activés par les cytokines produites par les macrophages stimulés par l'OmpA et amplifier son effet par un rétrocontrôle positif, en produisant de l'IFNy. Ainsi, l'OmpA se comporte comme un signal de stress qui va agir en synergie avec d'autres signaux endogènes ou exogènes pour augmenter les réponses de défense du système immunitaire. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées, pour la préparation d'une composition pharmaceutique antimicrobienne. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique antimicrobienne est une composition pharmaceutique antibactérienne, antilevure, antifongique, antivirale ou antiparasitaire. 3. Utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie selon la revendication 1 ou 2, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à induire l'activation des macrophages. 4. Utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie selon l'une des revendications 1 à 3, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à induire l'activation des lymphocytes NK, des cellules épithéliales et/ou des polynucléaires neutrophiles. 5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, est obtenue par un procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie. 6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées, est obtenue par voie recombinante. 7 Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite entérobactérie est Klebsiella pneumoniae. 8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que la séquence d'acides aminés de ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, comprend : a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID No. 1 ; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID No. 1 ; c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 5 acides aminés d'une séquence telle que définie en a). 9. Utilisation d'une protéine OmpA, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées telle que définie dans l'une quelconque des revendications 5 à 8, pour la préparation d'une composition pharmaceutique antimicrobienne destinée à être administrée par voie mucosale. 10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique est destinée à être administrée par voie orale, nasale, anale ou vaginale. 11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 10, destinée au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires, fongiques ou par des levures. 12. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que ladite composition ne contient pas d'antigène, de préférence d'antigène issu du microorganisme infectieux. 13. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son efficacité. 14. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique contient un milieu pharmaceutiquement acceptable. 15. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que ladite composition contient en outre un détergent. 16. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que la composition se présente sous forme de poudre, de suppositoire ou d'ovule. 17. Composition telle que définie dans l'une quelconque des revendications là 16. 18. Dispositif adapté pour une administration par voie mucosale d'une composition telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi un dispositif aérosol comprenant ou non un agent propulseur.