Brevet FR2804026A1 — publié le 20010727

La présente invention concerne la vaccination contre l'herpèsvirus canin. Elle a notamment trait à une méthode de vaccination, à des vaccins appropriés et à l'utilisation de vaccins dans le cadre de cette méthode de vaccination. L'herpèsvirus canin (en anglais Canine Herpesvirus ou CHV) a été décrit pour la première fois en 1965.(L. E. Carmichael, Am. J. Vet. Res., 1..965, 26,,803- 814). L'infection par l'herpèsvirus canin a ensuite été identifiée dans de nombreux pays (U.S.A., France, Royaume-Uni, Suisse, Italie, Japon, Australie, Nouvelle-Zélande...). Le CHV est responsable de problèmes de reproduction dans les élevages canins et tout particulièrement de mortalité chez les chiots nouveau-nés qui peut occasionner des pertes importantes dans certaines collectivités. II est également responsable d'avortements et de mortinatalité. L'infection par le CHV est par ailleurs suspectée de diminuer la fertilité des chiennes. La transmission du CHV se fait par voie vénérienne, par voie oronasale ou par voie trans-placentaire. Le CHV appartient à la famille des Herpesviridae et à la sous-famille des Alphaherpesvirinae. A ce jour; un seul type de CHV a été identifié. II s'agit d'un virus enveloppé contenant une molécule d'ADN double brin. L'enveloppe présente plusieurs glycoprotéines d'origine virale. Les glycoprotéines gB, gC et gD sont responsables de l'induction d'anticorps neutralisants chez la souris. Le CHV est antigéniquement proche de l'herpèsvirus félin (J.A. Lincumpao et al., Arch. Virol., 1990, 111, 165-176) mais sans neutralisation croisée significative (X. Xuan et al., Arch. Virol., 1992, 122, 359-365). Le CHV est fortement dépendant de son hôte et ne se multiplie que sur des cellules d'origine canine (Pierson et al., recueil de Médecine Vétérinaire, mars/avril 1998, 174 n 3/4, 87-94). Les chiots nouveau-nés sont très sensibles à l'infection par le CHV lors des 3 premières semaines de vie. La contamination intervient lors de la naissance ou dans les premiers jours de vie. La vaccination des chiots n'est en conséquence pas possible. Les seuls moyens de protection disponibles sont les mesures sanitaires comme le réchauffement des chiots avec une lampe à infra- rouges et la sérothérapie. Le CHV est cependant peu immunogène et il est difficile de préparer un bon sérum (L. E. Carmichael, J. Am. Vet. Med. Assoc., 1970, 156, 1714-1721). Dans les conditions naturelles, le chiot peut être protégé par les anticorps neutralisant le CHV présents dans le colostrum des chiennes séropositives : en l'absence de ces anticorps, le chiot est très sensible à l'infection par. le C_HV (D. L. Huxsoll et I. E. Hemelt, J. Am. Vet. Med. Assoc., 1970, 156, 1706-1713). Les animaux à risque sont les chiots nés de chiennes non infectées en contact d'animaux excréteurs, et les chiots nés de chiennes infectées latentes mais séronégatives ou faiblement séropositives. Les anticorps neutralisants le CHV persistent peu de temps, et un animal peut être infecté et séronégatif. Le CHV provoque chez les chiots de moins de 3 semaines d'âge une herpèsvirose néonatale souvent fatale. L'incubation est rapide et les chiots meurent en quelques jours le plus souvent sans autres symptômes qu'une hypothermie brutale et des troubles nerveux foudroyants, dans la grande majorité des cas avant l'âge de 5 jours. Dans les formes moins aiguës, l'hypothermie est suivie de symptômes tels qu'anorexie, dépression, bradycardie, hypoglycémie, cedème sous-cutané, érythème et papules ventrales, selles molles gris-jaunâtre, douleurs abdominales, vomissements, plaintes incessantes, pédalage et mort en 24 à 72 heures en opisthotonos. L'examen nécropsique peut révéler une splénomégalie, un épanchement séreux dans les cavités pleurales et péritonéale et des pétéchies viscérales (Pierson et al., recueil de Médecine Vétérinaire, mars/avril 1998, 174 n 314, 87-94). Cet article rappelle qu'aucun vaccin contre l'herpèsvirose canine n'est actuellement commercialisé et suggère qu'il serait utile de pouvoir vacciner les reproducteurs infectés latents afin d'atténuer la ré-excrétion du virus sauvage. Delisle F., dans son article (Rec. Med. Vet., 1982, 158, 669-676), propose en revanche de vacciner les chiennes avant la gestation avec un vaccin inactivé ou d'injecter un sérum aux chiots dès la naissance. Elle rappelle toutefois qu'aucun vaccin commercial n'est disponible. Voir aussi L. E. Carmichael, J. Am. Vet. Med. Assoc., 1970, 156, 1714-1721. De son coté Appel A., dans son article ( Canine Herpesvirus dans Virus Infections of Vertébrales, vol.1, MC Horzinek, Ed. MJ Appel Elsevier Science Publisher, 1987, 5-15), propose de vacciner des chiennes avant ou au tout début de la gestation avec un vaccin inactivé. H. Poulet et P. Dubourget (Point Vét., 1993, 25, 69-75) ont quant à eux suggéré en 1992 en termes généraux la vaccination de la mère avec un -rappel en fin de gestation. Les auteurs rappellent aussi que des essais à partir de virus inactivés par le formaldéhyde ou de variants atténués ont été effectués (L. E. Carmichael et al., Infection and Immunity, 1978, 20(1), 108-114 ; US-A- 4,213,965 : vaccin vivant atténué, composé d'un variant thermosensible du virus CHV, dit de petites plages ), mais que ces essais n'ont pas eu de résultats probants et n'ont pas donné lieu à la commercialisation de vaccins. Anvik J. O., dans son article (Vet. Med., April 1991, 4, 394-403), précise que la production d'anticorps neutralisants chez la mère et en conséquence la protection de la portée est imprédictible en raison de la faible immunogénicité du virus CHV. Devant la difficulté de vaccination, Pierson et al. (recueil de Médecine Vétérinaire, mars/avril 1998, 174 n 314, 87-94) sont même allés jusqu'à proposer de vacciner la mère avec un vaccin inactivé contre le coryza du chat (FHV) ou d'administrer des anticorps anti-FHV aux chiots dès la naissance. A ce jour aucune des hypothèses de vaccination n'a été confirmée, aucun vaccin n'est disponible dans le commerce et aucune publication ne fait état de résultats de vaccination convaincants annonciateurs de la commercialisation prochaine d'un tel vaccin. En outre chez les femelles gestantes, l'infection au CHV peut conduire à une résorption embryonnaire, une momification foetale, un avortement ou une mise bas prématurée, une mortinatalité, une mortalité néonatale. Des lésions placentaires peuvent apparaître. Alors que des vaccins contre différents herpèsvirus existent chez d'autres espèces animales dont le chat, la vaccination efficace contre l'herpèsvirose canine n'a jamais pu être proposée. La présente invention a pour objectif la mise au point d'une méthode de vaccination contre l'herpèsvirose canine permettant de protéger les chiots. Un autre objectif de l'invention est l'élaboration de vaccins, efficaces et pharmaceutiquement acceptables, utilisables dans le cadre de cette méthode de vaccination. _ La déposante a trouvé de façon surprenante qu'il est possible de vacciner les chiennes gestantes et les nouveaux-nés en administrant un vaccin pendant la période de gestation et en particulier le plus près possible de la mise bas de façon à avoir un taux d'anticorps anti-CHV élevé chez la femelle gestante au moment de la mise bas, ce taux assurant la protection du chiot à la naissance par transmission des anticorps maternels lors de l'allaitement. En outre ces anticorps se maintiennent substantiellement chez le chiot pendant les premières semaines de sa vie, période où il est sensible à la maladie (3 à 4 semaines). Un titre en anticorps neutralisant chez la chienne égal ou supérieur à 0,9 log10 est préféré et plus particulièrement un titre égal ou supérieur à 1,2 log10. Les titres indiqués sont calculés d'après la méthode- décrite* dans l'exemple 7. La vaccination chez la chienne amène d'autre part une réduction de la pression d'infection chez le chiot. La déposante a observé par ailleurs chez les chiennes vaccinées en milieu contaminé un poids des chiots supérieur à la naissance et une tendance à un taux de gestation plus élevé. Ces phénomènes peuvent s'expliquer par une réduction ou une absence de lésions placentaires chez les chiennes vaccinées (A. Hashimoto et al., Am. J. Vet. Res., 1979, 40(9), 1236 1240 ; A. Hashimoto et al., Am. J. Vet. Res., 1982, 43(5), 844-850). Les objectifs de l'invention déjà mentionnés, ainsi que d'autres, sont obtenus à l'aide d'une méthode de vaccination de la chienne gestante comprenant l'administration d'un vaccin chez une femelle gestante le plus près possible de la mise bas, notamment pendant le dernier tiers de gestation (la durée moyenne de gestation chez la chienne est d'environ 63 jours), de préférence de 5 à 15 jours avant la date présumée de mise bas, notamment environ 10 jours avant, de façon à avoir un taux d'anticorps anti-CHV élevé chez la femelle gestante à la mise bas, induisant une protection des chiots par transfert des anticorps maternels lors de l'allaitement. Ces anticorps se maintiennent substantiellement pendant les premières semaines de vie du chiot, période où il est sensible à la maladie (3 à 4 semaines). Par définition, un antigène, en quantité efficace dans le vaccin selon l'invention, permet d'induire un titre élevé et protecteur d'anticorps dans les conditions du protocole chez la femelle gestante et le nouveau-né. II peut s'agir d'antigène comprenant du virus CHV inactivé, du virus CHV atténué, une ou plusieurs sous-unités du virus CHV, un ou plusieurs antigènes exprimés par des recombinants. De préférence, le vaccin est destiné à produire chez la femelle gestante, au moment de la mise bas, un taux d'anticorps anti-CHV supérieur ou égal à 0,9 log10, de préférence supérieur ou égal à 1,2 log10. Notamment dans le cas d'un animal n'ayant jamais été vacciné contre le CHV, on procède de préférence à une (ou plusieurs) autre administration de vaccin anti-CHV avant l'administration décrite ci-dessus afin d'induire la réponse immunitaire chez l'animal. L'intervalle entre ces deux administrations doit être suffisant pour induire un effet rappel, ce qui en général demande au moins de 2 à 3 semaines. En pratique la première administration se fait de préférence pendant le premier tiers de la gestation .ou avant la saillie. Si l'animal a déjà été vacciné contre le CHV, une seule administration proche de la mise bas peut suffire. L'administration, ou l'une au moins des administrations supplémentaires peuvent aussi être réalisés avec un vaccin ayant une composition différente de celle intervenant au plus près de la mise bas, la différence pouvant toucher l'antigène et/ou la formulation du vaccin. L'administration du vaccin peut se faire notamment par la voie parentérale, de préférence par la voie sous-cutanée ou intramusculaire. Les volumes de dose peuvent être notamment compris entre 0,2 et 2 ml, de préférence de l'ordre de 1 ml. L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'antigène CHV pour la préparation d'un vaccin contre l'herpèsvirose canine destiné à être administré selon le protocole décrit ci-dessus. L'homme de l'art possède les compétences nécessaires pour définir précisément les doses de chaque vaccin en fonction du type de vaccin. Lorsque plusieurs administrations sont pratiquées chez l'animal, les vaccins utilisés peuvent être de différents types, choisis notamment. parmi -ce.ux précédemment cités. L'invention a aussi pour objet des vaccins inactivés ou des vaccins de sous-unités, utilisables notamment dans le cadre de cette méthode de vaccination. L'utilisation de sous-unités CHV n'a été décrite que chez la souris (J. A. Limcumpao et al., J. Vet. Med. Sci., 1991, 53 ( 3), 423-432). Les données obtenues chez la souris ne peuvent cependant pas être extrapolées à l'espèce canine comme le précise ce document. Bien que les titres en anticorps obtenus avec les glycoprotéines gp1451112, gp80 et gp47 purifiées induisent une réponse en anticorps détectable, il n'est pas toutefois possible de déterminer si ce titre en anticorps peut se traduire par une protection car la souris n'étant pas sensible au virus CHV il n'est pas possible de développer un modèle d'épreuve virulente chez cette espèce. Egalement aucune donnée n'est disponible concernant l'immunité cellulaire induite par CHV. Par ailleurs la relation entre le titre en anticorps obtenu chez la souris et celui obtenu chez le chien n'est pas connue et ces titres peuvent se révéler différents. Ainsi il a été publié que des lapins immunisés avec la glycoprotéine g1 d'herpès bovin de type 1 ont un titre neutralisant plus élevé que les lapins immunisés avec g111, alors que chez le bovin la glycoprotéine gIV induit le titre neutralisant le plus élevé et que la glycoprotéine g1 est la moins immunogène. Ces données montrent la difficulté de transposition des résultats des animaux de laboratoire à l'espèce destinataire. Conformément à l'invention, l'utilisation d'un vaccin inactivé ou de sous- unités permet la vaccination de la chienne pendant la phase de gestation sans risque pour la chienne et sa progéniture. La vaccination avec rappel en fin de gestation est le moyen d'assurer un titre optimal en anticorps neutralisants à la naissance. Ce titre conditionne la protection obtenue par transfert des anticorps neutralisants de la chienne à ses chiots en début d'allaitement. La culture et la propagation du virus CHV se fait de préférence sur des cellules canines primaires ou de lignée, plus particulièrement sur cellules rénales canines de lignée de type MDCK (en anglais Madin-Darby Canine. Kidney ou MDCK accessible auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC) sous le numéro CCL-34) notamment avec une multiplicité d'infection (moi) de 0,1 à 0,001 doses infectantes 50 % en culture de cellules (DICC5o) par cellule, de préférence 0,01 DICC5o/cellule. La récolte du virus CHV a lieu 3 à 4 jours plus tard. On obtient un titre viral d'environ 106 à 10$ DICC5o/ml et en général de 106'5 à 10'5 DICC5olml. Pour obtenir un vaccin inactivé, le virus CHV est inactivé après récolte et clarification par un traitement chimique (e.g. formol ou formaldéhyde, 5 propiolactone, éthylèneimine, éthylèneimine binaire (BEI)) et/ou thermique. De préférence, le virus selon l'invention est inactivé par action de l'éthylèneimine. Les particules virales peuvent être concentrées par des techniques classiques de concentration, notamment par ultrafiltration et/ou ensuite purifiées par des moyens de purification classiques, notamment les techniques de gel-filtration, d'ultracentrifugation sur gradient de saccharose ou de précipitations sélectives en particulier en présence de polyéthylène glycol (PEG). Pour obtenir un vaccin de sous-unités, contenant principalement les glycoprotéines d'enveloppe, la suspension de particules virales, de préférence inactivées obtenue précédemment, est soumise à l'action d'un détergent approprié, notamment non ionique, de préférence un alcool éthoxylé ayant un HLB compris entre 12 et 15. Les capsides virales sont ensuite éliminées notamment par ultracentrifugation. D'autres méthodes équivalentes, permettant d'éliminer les capsides et de recueillir les glycoprotéines d'enveloppe sont à la disposition de l'homme du métier. Pour l'élaboration d'un vaccin inactivé ou d'un vaccin de sous-unité, l'antigène est repris dans un véhicule ou excipient acceptable au plan vétérinaire et de préférence additionné d'un adjuvant. La quantité d'antigène équivaut notamment à un équivalent titre avant inactivation d'environ 105 à environ 109 DICC5o par dose, de préférence d'environ 106 à environ 108 DICC5o par dose. Les vaccins selon l'invention sont conservés et stockés soit sous forme formulée à 5 C, soit sous forme lyophilisée, de préférence avec un stabilisateur-, notamment du SPGA (saccharose, phosphate, glutamate, albumine, EP-B1- 0,008,255) et repris ultérieurement en solvant (adjuvant). Pour adjuver les vaccins selon l'invention, on peut utiliser (1) de l'hydroxyde d'alumine, (2) un polymère de l'acide acrylique ou méthacrylique, un polymère d'anhydride maléique et de dérivé alcényle, ou (3) formuler la préparation immunogène ou vaccin sous forme d'une émulsion huile-dans-l'eau en particulier l'émulsion SPT décrite à la page 147 de Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach edited by M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, et l'émulsion MF59 décrite à la page 183 du même ouvrage. L'émulsion huile-dans-l'eau peut notamment être à base d'huile de paraffine liquide légère (type Pharmacopée européenne) ; d'huile isoprénoide telle que le squalane, le squalène ; d'huile résultant de l'oligomérisation d'alcènes, en particulier d'isobutène ou de decène ; des esters d'acides ou d'alcools à groupement alkyle linéaire, plus particulièrement les huiles végétales, l'oléate d'éthyle, le di(caprylate I caprate) de propylène glycol, le tri(caprylate I caprate) de glycérol, le dioléate de propylène glycol ; des esters d'acides ou d'alcools gras ramifiés, en particulier des esters de l'acide isostéarique. L'huile est utilisée en association avec des émulsifiants pour former l'émulsion. Les émulsifiants sont de préférence des tensioactifs non ioniques en particulier les esters de sorbitan, de mannide (e.g. oléate d'anhydroman nitol), de glycérol, de polyglycérol, de propylène glycol et d'acide oléique, isostéarique, ricinoléique, hydroxystéarique, éventuellement éthoxylés, les blocs copolymères polyoxypropylène-polyoxyéthylène en particulier les Pluronic0, notamment L121. Les polymères de l'acide acrylique ou méthacrylique sont réticulés notamment par des éthers polyalcényliques de sucres ou de polyalcools. Ces composés sont connus sous le terme carbomère (Pharmeuropa vol. 8, n 2, juin 1996). L'homme de l'art peut aussi se référer à US-A-2,909,462 (incorporé par référence) décrivant de tels polymères acryliques réticulés par un composé polyhydroxylé ayant au moins 3 groupes hydroxyle, de préférence pas plus de 8, les atomes d'hydrogène d'au. moins trois hydroxyles étant remplacés par des radicaux aliphatiques insaturés ayant au moins 2 atomes de carbone. Les radicaux préférés sont ceux contenant de 2 à 4 atomes de carbone, e.g. vinyles, allyles et autres groupes éthyléniquement insaturés. Les radicaux insaturés peuvent eux-mêmes contenir d'autres substituants, tel que méthyi. Les produits vendus sous la dénomination Carbopol (BF Goodrich, Ohio, USA) sont particulièrement appropriés. Ils sont réticulés par un allyl saccharose ou par de l'allylpentaérythritol. Parmi eux, on peut citer les Carbopol 974P, 934P et 971 P. Parmi les copolymères d'anhydride maléique et de dérivé alcényle, on préfère les EMAO (Monsanto) qui sont des copolymères d'anhydride maléique et d'éthylène, linéaires ou réticulés, par exemple réticulés par du divinyléther. On peut se référer à J. Fields et al., Nature, 186, 778-780, 4 juin 1960 (incorporé par référence). Sur le plan de leur structure, les polymères d'acide acrylique ou méthacrylique et les EMAO sont formés de préférence de motifs de base de formule suivante : - dans laquelle - R1 et R2, identiques ou différents, représentent H ou CH3 - x = 0 ou 1, de préférence x = 1 -y=1 ou 2, avecx+y=2 Pour les EMA , x = 0 et y = 2. Pour les carbomères, x = y = 1. La concentration en polymère dans la composition vaccinale finale sera de 0,01 % à 1,5 % P/V, plus particulièrement de 0,05 à 1 % PIV, de préférence de 0,1 à 0,4 % P/V. Une forme de vaccin particulièrement préférée comprend un vaccin inactivé ou de sous-unités formulé sous forme d'une émulsion huile dans l'eau comprenant de l'oléate d'anhydromannitol, de l'acide oléique éthoxylé_ et de l'huile de paraffine liquide légère. En particulier, une méthode d'immunisation des chiennes gestantes selon l'invention comprend l'administration d'un tel vaccin. Deux injections de préférence sous-cutanées sont réalisées, avec notamment la première pendant le premier tiers de la gestation de préférence environ 10 jours après la date de la saillie et notamment la deuxième pendant le dernier tiers de préférence environ 10 jours avant la date présumée de la mise bas. L'invention a aussi pour objet le procédé de préparation du vaccin inactivé ou de sous-unités décrit. L'invention a aussi pour objet des vaccins multivalents comprenant la valence herpèsvirus canin inactivée ou de sous-unités, et au moins une valence pour au moins un autre pathogène canin, dans un véhicule ou excipient acceptable au plan vétérinaire et de préférence avec un adjuvant, notamment l'un de ceux décrits précédemment. _ Lesdits pathogènes canins sont notamment choisis parmi le groupe comprenant le virus de la maladie de Carré, le parvovirus canin et l'adénovirus canin, mais d'autres valences peuvent aussi être associées. Les vaccins CHV inactivés ou de sous-unités selon l'invention peuvent être administrés simultanément dans la même préparation ou successivement dans des préparations différentes avec la ou les autres valences canines qui peuvent être sous forme de vaccins vivants atténués, inactivés, sous-unitaires, recombinés ou polynucléotidiques. L'invention a donc également pour objet un kit ou ensemble de vaccin multivalent comprenant, conditionnées séparément, une valence CHV selon l'invention dans un véhicule ou excipient acceptable au plan vétérinaire, et de préférence avec un adjuvant, notamment ceux décrits précédemment, et au moins une valence d'au moins un autre pathogène canin. La valence CHV selon l'invention peut servir de solvant pour l'autre valence canine, notamment pour une valence atténuée, recombinée ou polynucléotidique se présentant sous forme lyophilisée. L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide de modes de réalisation pris à titre d'exemples non limitatifs. Exemples Exemple 1 : Souche virale La souche d'herpèsvirus canin utilisée est la souche F205 (L. E. Carmichael, Am. J. Vet. Res., 1965, 26, 803-814), disponible auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC) sous le numéro VR-647. Exemple 2 : Amplification de l'herpèsvirus canin Des cellules de lignée canine (Madin-Darby Canine Kidney ou MDCK disponible auprès de l'ATCC sous le numéro CCL-34) sont mises en culture en flacons roulants de 2 litres (850 cm2) avec du milieu Dulbecco modified Eagle's minimum essential medium (DMEM - Gibco BRL) supplémenté de 5 % de sérum de veau foetal (Bayer Diagnostic) et de gentamicine à 50 mg/1 à raison de 200 000 cellules par ml sous un volume de 350 ml. Les cellules sont cultivées à +37 C en atmosphère contenant 5% de C02. Après 3 ou 4 jours la couche cellulaire arrive à confluence. Le milieu de culture est alors remplacé par du milieu DMEM sans sérum mais toujours additionné de 50 mg/1 de gentamicine et les cellules sont inoculées avec l'herpèsvirus canin (exemple 1) avec une multiplicité d'infection (moi) de 0,01 DICCSO/cellule. La culture virale est maintenue à 37 C. Lorsque l'effet cytopathique (ECP) est complet (environ 96 heures après le début de la mise en culture), la suspension virale est récoltée et congelée à - 70 C. Plusieurs passages d'amplification cellulaire peuvent être réalisés préalablement à l'inoculation virale en fonction de la quantité de virus souhaitée. Les passages cellulaires et la culture virale peuvent également être réalisés en cultivant les cellules sur microporteurs en biogénérateur. Le virus est conservé jusqu'aux étapes suivantes à 5 C. Le titre du virus CHV à la récolte est 10',2 DICC5o par ml. Exemple 3 : Titrage du virus CHV Le titrage du virus CHV est réalisé en microplaques de 96 cupules en milieu F15 additionné de 5% de sérum de. veau foetal et de gentamicine 50 mg/l. Les dilutions avec une raison d'ordre 3 de la suspension virale sont mélangées à une suspension de cellules MDCK dans la microplaque à raison de 0,10 ml de dilution de virus pour 100 000 cellules sous 0,15 ml par cupule. Après de 4 à 5 jours d'incubation à 37 C avec 5% de C02, les cupules présentant un ECP généralisé sont comptabilisées et le titre est calculé en doses infectieuses pour culture de cellules 50 % (DICCso) par la méthode de Kàrber. Exemple 4 : Inactivation du virus Le virus CHV amplifié comme cela est décrit dans l'exemple 2 est inactivé par l'éthylèneimine à la concentration d'environ 12 mM à 37 C pendant 6 heures. L'éthylèneimine est préparée extemporanément en dissolvant 28,0 g de soude en pastille dans 200 ml d'eau distillée et en ajoutant 68,1 g de bromoéthylamine (BEA) correspondant à une solution d'éthylèneimine 1,2 M (H. Bahnemann, Arch. Virol., 1975, 47, 47-56). La suspension virale inactivée est concentrée 100 fois sur cassette d'ultrafiltration type Ultrasette avec un seuil de coupure de 300 kDa (Filtron). Le virus inactivé concentré peut être congelé et stocké à -40 C. Exemple 5 : Extraction des glycoprotéines virales Le virus inactivé (exemple 4) est clarifié par centrifugation à 2500 g pendant 30 min. Le liquide surnageant est ensuite concentré 50 fois sur cassette d'ultrafiltration type Ultrasette avec un seuil de coupure de 300 kDa (Filtron). Le concentrat est additionné de polyéthylène glycol 8000 (PEG 8000) à 8% P/V et de chlorure de sodium 4% P/V. Après un contact de 16 heures à 4 C, le virus précipité est sédimenté par centrifugation à 2500 g pendant 60 min, puis repris en tampon phosphate (PBS : NaCI 8 g/1 ; KCI 0,2 g/1 ; KH2P04 0,2 g/1 ; Na2HP04, 2 H20 1,44 g/1). Puis repris en tampon phosphate isotonique à raison d'un centième du volume initial. Le concentré viral subit ensuite une ultracentrifugation zonale sur coussin de saccharose (35 % et 60 % P/P en PBS, pendant 60 min, à 200 000 g) avec un rotor zonal ou un rotor à angle fixe Ti45. Le virus est récolté à l'interface et est dilué environ au quart en PBS. Puis ajouter un alcool cétylique 10 OE (alcool éthoxylé d'HLB 13) à la concentration de 1,5% P/V, incuber une heure à 37 C. Les capsides sont ensuite sédimentées par ultracentrifugation pendant une heure -à-230 000 g avec un rotor Ti45. Le surnageant contenant les glycoprotéines est recueilli. La solution de glycoprotéines peut éventuellement être concentrée par ultrafiltration. La solution de glycoprotéines purifiées est conservées à -40 C jusqu'à formulation du vaccin. Exemple 6 : Formulation des vaccins L'antigène inactivé concentré (exemple 4) ou la solution de sous-unités (exemple 5), après décongélation, est dilué(e) en tampon PBS en fonction de la quantité requise d'antigènes par dose. Le vaccin adjuvé est préparé de la manière suivante : 167 ml de phase aqueuse constituée de 8 ml d'antigène viral inactivé ou sous-unité et de 159 ml de PBS sont émulsionnés dans 83 ml de phase huileuse contenant 7% p/v d'oléate d'an hydromannitol, 8% p/v d'acide oléique éthoxylé à 11 OE (oxyde d'éthylène) et 85% v/v d'huile de paraffine liquide légère (type Pharmacopée européenne) à l'aide d'un émulseur à turbine Silverson à 32 C .pendant -2 minutes. Le vaccin formulé sous forme d'émulsion huile-dans-eau est ensuite stocké à 5 C. Une méthode alternative pour préparer le vaccin consiste à mettre en émulsion par trois passages à travers un homogénéiseur haute pression modèle Y110 (Microfluidics Corp.) à une pression de 600 bars et une température comprise entre 30 et 40 C le mélange 5% p/v squalane, 2,5% p/v Pluronic L121, 0,2% p/v d'un ester d'acide oléique et d'un hydrosorbitol éthoxylé à 20 OE, 92,3% v/v de l'antigène viral dilué au 1/30ème en tampon PBS après décongélation. Le vaccin formulé sous forme d'émulsion huile-dans-eau est ensuite stocké à 5 C. Une autre méthode alternative consiste à réaliser une solution à 0,4% plv de Carbopol0 974P en eau physiologique @NaCl 9 g/1). Le pH est ajusté à 7,3-7,4 avec de la soude. Cette solution de Carbopol est ensuite mélangée à partie égale à l'antigène viral dilué au 1/16eme après décongélation. Le vaccin formulé sous d'une suspension est ensuite conservé à 5 C. 0,5 ml d'une solution de sous-unités (exemple 5), après décongélation, diluée en tampon PBS au 1/15ème est ajoutée à 0,5 ml de substrat de lyophilisation SPGA (saccharose, phosphate, glutamate, albumine, EP-B1- 0,008,255). Ce mélange est réparti en flacon et lyophilisé puis conservé à 5 C. Le diluant est constitué par les adjuvants précédemment décrit en incorporant uniquement du tampon PBS dans la phase aqueuse. Exemple 7: Titrage des anticorps neutralisants anti-CHV. Les sérums à titrer sont testés pour leur aptitude à neutraliser le virus CHV. Les sérums prélevés sur les animaux sont dilués en cascade au tiers avec du milieu DMEM additionné de 5% de sérum de veau foetal dans des plaques à 96 puits pour culture cellulaire. A 0,05 ml du sérum dilué sont ajoutés 0,05 ml de milieu de culture contenant approximativement 200 DICCSdml de CHV. Ce mélange est incubé pendant 2 heures à 37 C en étuve en atmosphère contenant 5% C02- 0,15 ml d'une suspension de cellules MDCK contenant environ 100 000 cellules par ml est ensuite ajoutée à chaque mélange. L'effet cytopathique (ECP) est observé par microscopie à contraste de phase après 5 jours de culture à 37 C en atmosphère contenant 5% C02. Les titres neutralisants de chaque sérum sont calculés d'après la méthode de Kârber. Les titres sont donnés sous la forme de la dilution la plus importante inhibant l'effet cytopathique pour 50 % des cupules. Les titres sont exprimés en log10 VN50. Chaque sérum est titré au moins deux fois, de préférence quatre fois. Exemple 8 : Efficacité 12 chiennes Beagle EOPS non vaccinées ont été incluses dans l'étude et réparties par randomisation en 2 groupes de 6 animaux. Les chiennes du premier groupe sont vaccinées avec le vaccin CHV de sous-unités adjuvé avec l'émulsion huile-dans-eau à base d'huile de paraffine (exemple 6), les chiennes de l'autre groupe avec un vaccin placebo. Les chiennes ont été vaccinées à 2 reprises par voie sous-cutanée environ 10 jours après saillie, puis environ 10 jours avant la date présumée de la mise-bas. Le lyophilisat repris par 1 ml de solvant huileux est administré aux chiennes. Ceci correspond à un équivalent titre de 10''' DICC5o avant inactivation. Après la mise-bas, les chiots nouveau-nés sont éprouvés à l'âge de 3 jours avec 50 à 100 DICC5o d'une souche virulente de CHV, par exemple F205 isolée par L. E. Carmichael (Am. J. Vet. Res., 1965, 26, 803-814) ou CHV 270 (H. Hill, Am. J. Vet. Res.,1974, 35, 669-673) ou CHV C4012SE, par voie oronasale (0,5 ml par voie orale et 0,25 ml dans chaque narine). Les chiots sont ensuite observés pendant 3 semaines. Les signes cliniques et la mortalité sont relevés. Après leur décès, . tous les chiots sont autopsiés. - Les lésions macroscopiques caractéristiques de l'herpèsvirose canine sont recherchées au niveau des reins, rate, foie, poumons, tractus digestif, coeur et ganglions mésentériques, et des prélèvements sont réalisés pour un isolement de CHV sur cellules MDCK. Le diagnostic d'herpesvirose canine est basé sur la mort du chiot, la présence de lésions macroscopiques caractéristiques et confirmé par un isolement viral. Toutes les chiennes vaccinées ont séroconverti et ont un titre élevé en anticorps neutralisants au moment de la mise bas. Ces titres sont mesurés par la méthode décrite dans l'exemple 6 et sont exprimés en log10 VN50. Titres SN moyens Jour de la primo- Jour du rappel Jour de l'épreuve 3 semaines après anti-CHV chez les vaccination épreuve chiennes groupe contrôle 0,24 +I- 0,00 0,24 +I- 0,00 0,29 +I- 0,13 1,36 +I- 0,65 groupe vacciné 0,35 +I- 0,17 1,04 +I- 0,34 1,76 +/-0,20 2,11 +I- 0,51 Parmi les chiots nés des mères vaccinées, aucun n'est mort d'herpesvirose canine (0/27). Aucun virus CHV n'a été ré-isolé de ces chiots. Parmi les chiots nés de mère non vaccinées (groupe placebo), un taux de mortalité due au CHV de 62% (18/29) a été observé. De l'isolement viral est également observé chez 55% de ces chiots (16/29) : les prélèvements provenant de 2 chiots ont été contaminés par des bactéries et n'ont pu être testés pour l'isolement viral de CHV. La différence du taux de mortalité entre les 2 groupes est hautement significative (test exact de Fisher ; p Des chiennes Yorkshire réparties par randomisation en 2 groupes sont maintenues en milieu infecté. Les 14 chiennes du premier groupe sont vaccinées avec le vaccin CHV de sous-unités adjuvé avec une émulsion huile-dans-eau à base d'huile de paraffine (exemple 6), les 6 chiennes de l'autre groupe avec -un vaccin placebo. Le protocole de vaccination est identique à ce qui est décrit plus haut. A leur naissance, le poids des chiots est mesuré. Le poids des 28 chiots nés d'une mère vaccinée est sensiblement plus élevé (poids moyen de 141,8 g) que celui des 14 chiots nés d'une mère non vacciné (poids moyen de 85,0 g), soit un gain pondéral de 166,8%. La différence est significative (Kruskal-Wallis, p Les résultats montrent en milieu contaminé une tendance à augmenter le taux de gestation chez les chiennes vaccinées. Le taux de gestation est de 82% chez les chiennes vaccinées (50I61) et de 68% chez les chiennes non vaccinées (groupe placebo) (19/28) (test exact de Fisher, p=0,11). II doit être bien compris que l'invention définie par les revendications annexées n'est pas limitée aux modes de réalisation particuliers indiqués dans la description ci-dessus, mais englobe les variantes qui ne sortent ni du cadre ni de l'esprit de la présente invention. Revendications 1. Utilisation d'antigène de CHV pour la préparation d'un vaccin permettant de protéger les chiots contre l'herpèsvirose canine, destiné à être administré chez la chienne gestante de 5 à 15 jours avant la date présumée de mise bas, de préférence environ 10 jours avant cette date, et produisant un taux d'anticorps anti-CHV élevé chez la chienne gestante au moment de la mise bas, induisant une protection chez les chiots par transfert d'anticorps lors de l'allaitement. 2. Utilisation d'antigène de CHV pour la préparation d'un vaccin permettant de vacciner les chiots contre l'herpèsvirose canine, destiné à être administré chez la chienne gestante le plus près possible de la mise bas, notamment pendant le dernier tiers de la gestation, et produisant chez la femelle gestante, au moment de la mise bas, un taux d'anticorps anti-CHV supérieur ou égal à 0,9 log10, de préférence supérieur ou égal à 1,2 log10, induisant une protection chez les chiots par transfert d'anticorps lors de l'allaitement. 3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le vaccin est destiné à produire chez la femelle gestante, au moment de la mise bas, un taux d'anticorps anti-CHV supérieur ou égal à 0,9 log10, de préférence supérieur ou égal à 1,2 logl 0. 4. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le vaccin est destiné à être administré de 5 à 15 jours avant la date présumée de mise bas, de préférence environ 10 jours avant cette date. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, le vaccin étant destiné à être administré à une femelle préalablement vaccinée avec un vaccin contre CHV. 6. Utilisation selon la-revendication 5, caractérisée en ce que les vaccinations sont séparées par un intervalle d'au moins deux à trois semaines et de préférence l'administration du premier vaccin a lieu pendant le premier tiers de la gestation ou avant la saillie. 7. Utilisation selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce les vaccins sont identiques ou différents. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le vaccin comprend un antigène choisi dans le groupe constitué de virus CHV inactivé, virus CHV atténué, sous-unité du virus CHV, antigène exprimé par un recombinant. 9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le vaccin comporte des sous-unités du virus CHV. 10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que le vaccin comprend des glycoprotéines d'enveloppe du virus CHV. 11. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le vaccin comprend du virus CHV inactivé. 12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que le vaccin comporte un véhicule ou excipient acceptable au plan vétérinaire et un adjuvant. 13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisée en ce que le vaccin comprend une quantité d'antigène correspondant à un équivalent en titre avant inactivation d'environ 105 à environ 109 DICC5o par dose, de préférence d'environ 106 à environ 108 DICC5o par dose. 14. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisée en ce que le vaccin est formulé sous forme d'une émulsion huile-dans-eau ou sous forme de suspension avec du carbomère et est de préférence destiné à être administré en au moins deux injections, de préférence sous-cutanées, la première pendant le premier tiers de la gestation, de préférence environ 10 jours après la date de la saillie, la deuxième pendant le dernier tiers de la gestation, de préférence environ 10 jours avant la date présumée de mise bas. 15. Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que le vaccin est formulé sous forme d'une émulsion comprenant soit de l'oléate d'an hydromannitol, de l'acide oléique éthôxylé et de l'huile de paraffine liquide légère, soit du Pluronic , de l'ester de sorbitan et d'acide oléique éthoxylé et du squalane, ou sous forme d'une suspension de Carbopol0. 16. Vaccin anti-CHV comportant du virus CHV inactivé ou des sous-unités du virus CHV, dans un véhicule ou excipient acceptable au plan vétérinaire. 17. Vaccin selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un adjuvant. 18. Vaccin selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'antigène est sous forme lyophilisé et pouvant être repris avant utilisation par l'adjuvant. 19. Vaccin- selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce que l'adjuvant est de l'hydroxyde d'alumine. 20. Vaccin selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce que l'adjuvant est un polymère de l'acide acrylique ou méthacrylique ou un polymère d'anhydride maléique et de dérivé alcényle, de préférence du Carbopol0. 21. Vaccin selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce qu'il est formulé sous forme d'une émulsion l'huile-dans-eau. 22. Vaccin selon la revendication 21, caractérisé en ce que l'émulsion huile dans l'eau comprend soit de l'oléate d'anhydromannitol, de l'acide oléique éthoxylé et de l'huile de paraffine liquide légère, soit du Pluronic ; de l'ester de sorbitan et d'acide oléique éthoxylé et du squalane. 23. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 16 à 22, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'un virus CHV inactivé par un traitement chimique et/ou thermique. 24. Vaccin selon la revendication 23, caractérisé en ce que le virus CHV est inactivé par le formol, la P-propiolactone, l'éthylèneimine, ou l'éthylèneimine binaire. 25. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 16 à 24, caractérisé en ce que le vaccin est un vaccin de sous-unités susceptible d'être obtenu en soumettant une suspension de particules virales CHV, de préférence inactivées, à l'action d'un détergent approprié. 26. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 16 à 25, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité d'antigène qui équivaut à un équivalent en titre avant inactivation d'environ 105 à environ 109 DICC5o par dose, de préférence d'environ 106 à environ 108 DICC5o par dose. 27. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 16 à 26, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un antigène d'au moins un autre pathogène canin. 28. Vaccin selon la revendication 27, caractérisé en ce que le pathogène canin est choisi dans le groupe consistant en virus de la maladie de Carré, parvovirus canin, adénovirus canin et leurs associations. 29. Ensemble de vaccin multivalent comprenant, conditionnés séparément, un vaccin CHV selon l'une quelconque des revendications 16 à 28 et un vaccin contre un autre pathogène canin, notamment choisi dans le groupe consistant virus de la maladie de Carré, parvovirus canin, adénovirus canin et leurs associations.