Brevet FR2809118A1 — publié le 20011123

La présente invention concerne un procédé pour analyser la lignée phylétique des coquilles SaintJacques, et en particulier un procédé pour analyser cette lignée par séquençage d'une région non codante trouvée dans la séquence de bases nucléotidiques de l'ADN mitochondrial (ADNmt) de la coquille Saint-Jacques. Dans le passé, on récoltait et produisait les coquilles Saint-Jacques directement à partir des domaines de pêche naturels, mais les récentes demandes croissantes ont conduit à la culture artificielle de coquilles SaintJacques pour la production en masse. En conséquence, certaines techniques artificielles ont été développées pour contrôler les écloseries pour naissains de coquilles Saint-Jacques, qui toutefois ont pour inconvénient d'affecter négativement la structure génétique d'organismes entiers, sans parler des coquilles SaintJacques. Ce contrôle artificiel de la naissance et de l'élevage va conduire à une diminution du patrimoine génétique et à une diminution de la variété des lignées phylétiques des coquilles Saint-Jacques. Ceci signifie que, dans un futur proche, une population de coquilles Saint-Jacques particulières verra sa variété de lignées réduite et ne sera plus en mesure de s'adapter à différents changements des conditions environnantes pour conserver sa descendance, ce qui provoquera de graves conséquences inattendues. Par conséquent, il est maintenant nécessaire que la structure génétique spécifique des coquilles Saint-Jacques soit analysée pour déterminer leur polymorphisme d'ADN ou leurs régions de séquences de nucléotides hypervariables qui sont des facteurs clés pour sauvegarder des lignées variées de coquilles Saint-Jacques. En particulier, les coquilles Saint-Jacques japonaises (Patinopecten yessoensis), qui vivent surtout près des côtes froides des îles du nord du Japon, de la partie nord de la péninsule coréenne, de Sakhaline et des îles Kuril, font partie des coquilles Saint-Jacques les plus attractives pour les produits alimentaires et la transformation alimentaire. La conservation des lignées phylétiques les plus larges possibles de ces coquilles Saint-Jacques japonaises est aussi grandement nécessaire, au vu des problèmes de culture artificielle susmentionnés. Les procédés conventionnels pour analyser la structure génétique d'une population de coquilles SaintJacques se basent sur l'utilisation d'isozymes ou d'allozymes. Mais un tel procédé enzymatique s'est avéré avoir une médiocre sensibilité et être insuffisant en tant qu'outil pour déterminer et classifier spécifiquement la lignée de chaque population de coquilles Saint-Jacques japonaises dans une zone marine locale particulière du Japon. En outre, le problème de ce procédés conventionnel est qu'il requiert une grande quantité d'échantillons à analyser, ainsi que des étapes inefficaces et demandant du temps pour les protocoles d'analyse. De plus, il n'y a aucun rapport qui analyse complètement les caractéristiques génétiques de chaque population différente de coquilles Saint-Jacques japonaises ainsi que la séquence de bases spécifique d'ADNmt de la coquille Saint-Jacques japonaise. Ainsi, aucune donnée n'est disponible, ces données étant nécessaires pour maintenir la lignée des coquilles SaintJacques japonaises. Au vu des inconvénients indiqués ci-dessus, un but principal de la présente invention est de proposer un procédé qui permet l'analyse d'une lignée phylétique de coquille Saint-Jacques avec une précision et une fiabilité élevées. A cette fin, un procédé conformément à la présente invention comprend fondamentalement l'étape de séquençage d'un ADN mitochondrial (ADNmt) de la coquille SaintJacques pour déterminer une séquence de bases nucléotidiques de l'ADNmt, la séquence de bases nucléotidiques comprenant une région non codante contenant un locus (encore dénommé site ou lieu) de substitution de base nucléotidique, qui présente un polymorphisme de séquence indicatif d'une lignée particulière de coquille Saint-Jacques, et ladite région non codante étant séquencée de façon à localiser ainsi ledit site de substitution de base nucléotidique dans celle-ci. Dans un aspect de la présente invention, le procédé peut comprendre les étapes consistant à : extraire un ADN total sous forme d'ADN de matrice à partir d'un muscle adducteur de la coquille Saint-Jacques ; amplifier l'ADNmt provenant de l'ADN de matrice au moyen d'une amplification en chaîne par polymérase, en utilisant un jeu d'amorces approprié conçu sur la base des séquences de bases nucléotidiques conservées parmi les gènes d'ARNr 16S et les gènes d'ARNr 12S mitochondriaux de mollusques connus ; séquencer l'ADNmt ainsi amplifié avec détermination d'une région non codante dans celui-ci ; ensuite, séquencer la région non codante, en utilisant des amorces appropriées conçues sur la base des séquences de bases nucléotidiques déterminées de l'ADNmt ; et localiser un site de substitution de séquence nucléotidique dans la région non codante, ce qui permet ainsi de déterminer une lignée particulière de la coquille Saint-Jacques, notamment par détermination, d'un polymorphisme de séquence à partir dudit site de substitution de base nucléotidique. On notera que l'ADN mitochondrial amplifié peut être cloné par E. coli, en utilisant un vecteur, et ensuite séquence par un procédé utilisant un terminateur colorant ou il peut être directement séquence par un procédé utilisant un terminateur colorant, sans être cloné. Par ailleurs, l'ADN mitochondrial amplifié et ladite région non codante peuvent tous deux être séquences par un procédé utilisant un terminateur colorant. Selon une variante, le procédé ci-dessus se caractérise en ce que la coquille Saint-Jacques est mise en #uvre en nombre pour donner une pluralité de coquilles Saint-Jacques différentes, et en ce que chacun des ADN mitochondriaux respectifs de ladite pluralité de différentes coquilles Saint-Jacques est amplifié par ladite amplification en chaîne par polymérase, en utilisant ledit jeu d'amorces approprié, après quoi, les régions non codantes des ADN mitochondriaux sont directement séquencées, sans être clonées, par un procédé à terminateur colorant en utilisant lesdites amorces appropriées, de façon à localiser ainsi plusieurs sites de substitution de base nucléotidique différents dans lesdites régions non codantes parmi ladite pluralité de coquilles Saint-Jacques différentes. On analyse sur la coquille Saint-Jacques japonaise Patinopecten yessoensis la séquence de bases nucléotidiques de son ADN mitochondrial, le jeu d'amorces approprié susmentionné comprenant l'amorce Pyso 16S BF (5'-CGGCGAAGCCAGGTCAGTTTCTATC-3') et l'amorce Pyso 12S BR (5'-AGAGCGACGGGCGATGTGTACAC-3'), tout en localisant une région non codante dans la séquence de bases, et ensuite la région non codante de l'ADNmt est séquencée, les amorces appropriées susmentionnées comprenant l'amorce Pyso 16S BF (5'-CGGCGAAGCCAGGTCAGTTTCTATC-3'), l'amorce Pyso NcR (5'-AGGTAACCAGAACCAAACTACC-3') et l'amorce Pyso 12S AR (5'-ACTGCTGGCACCTGGTTGGA-3'). Un procédé faisant utilisation du jeu d'amorces et des amorces particuliers ci-dessus peut être caractérisé en ce que ladite coquille Saint-Jacques japonaise est utilisée en nombre pour donner une pluralité de coquilles Saint-Jacques japonaises, en ce que ladite pluralité de coquilles Saint-Jacques japonaises est regroupée en au moins une population de coquilles Saint-Jacques, en ce que, lors de ladite étape d'amplification d'ADN mitochondrial, les ADN mitochondriaux respectifs de ladite ou desdites population(s) de coquilles SaintJacques sont amplifiés, par utilisation d'un ensemble desdites amorces Pyso 16S BF et Pyso 12S BR, grâce à quoi un ADN mitochondrial d'environ 1,3 kpb est déterminé dans ladite population ou chacune desdites populations de coquilles Saint-Jacques, en ce que, lors de ladite étape de séquençage de l'ADN mitochondrial ainsi amplifié, une séquence de bases nucléotidiques dudit ADN mitochondrial d'environ 1,3 kpb est déterminée, une région non codante y étant également déterminée, et en ce que, lors de ladite étape de séquençage de la région non codante, ladite région non codante est séquencée, par utilisation desdites amorces Pyso 16S BF, Pyso NcR et Pyso 12S AR, de façon qu'un site de substitution de base nucléotidique soit localisé dans la région non codante en ce qui concerne ladite population ou chacune desdites populations de coquilles Saint-Jacques, afin de déterminer ainsi le polymorphisme de séquence à partir de celle-ci et de classifier la pluralité de coquilles Saint-Jacques japonaises en lignées particulières dans ladite ou lesdites population(s) de coquilles SaintJacques. Dans un tel procédé, ladite ou lesdites population(s) de coquilles Saint-Jacques comprendra avantageusement une population de coquilles Saint-Jacques qui vivent dans le lac Saroma, Hokkaido, Japon et une autre population de coquilles Saint-Jacques qui vivent sur un littoral d'Aomori, Japon ; en outre, ladite séquence de bases nucléotidiques de l'ADN mitochondrial d'environ 1,3 kpb est avantageusement codée comme montré sur la Figure 4 (B) des dessins annexés. Dans un autre aspect de la présente invention, plusieurs ADNmt amplifiés différents d'échantillons de coquilles Saint-Jacques différents, obtenus par l'amplification en chaîne par polymérase ci-dessus en utilisant le jeu d'amorces approprié susmentionné, peuvent être groupés en différents groupes correspondant chacun à des populations de coquilles Saint-Jacques différentes respectives, et chacun de ces ADNmt amplifiés est séquence avec détermination d'une région non codante dans celui-ci. Ensuite, la région non codante est séquencée, au moyen des amorces appropriées susmentionnées, de façon qu'un locus de substitution de séquence de nucléotides soit localisé dans la région non codante pour chacun des différents groupes, ce qui permet ainsi de déterminer le polymorphisme de séquence de chacun des groupes, le polymorphisme de séquence étant indicatif d'une lignée particulière de chaque coquille Saint-Jacques, de façon à classifier les différentes coquilles Saint-Jacques en lignées particulières. Dans ces étapes, on peut incorporer les étapes consistant à : comparer entre eux les locus de substitution de séquence de bases nucléotidiques des différents échantillons de coquilles Saint-Jacques, sélectionner des échantillons de coquilles Saint-Jacques particuliers à partir des différents échantillons de coquilles Saint-Jacques, ces échantillons particuliers ayant des locus de substitution de séquence de bases nucléotidiques mutuellement identiques ; obtenir une fréquence de population élevée parmi ces échantillons particuliers ; et déterminer l'identité de l'ancêtre parmi les échantillons particuliers sur la base de la fréquence de population élevée de façon à trouver des ancêtres identiques parmi les différentes populations de coquilles Saint-Jacques. Dans encore un autre aspect de l'invention, pour une analyse très efficace de plusieurs échantillons de coquilles Saint-Jacques, après l'amplification d'ADNmt de plusieurs échantillons de coquilles Saint-Jacques, les régions non codantes des ADNmt peuvent être séquencées directement, par utilisation des amorces Pyso 16S BF, Pyso NcR et Pyso 12S AR, pour localiser les locus de substitution de séquence nucléotidique dans les régions non codantes pour une analyse rapide de la lignée de chacun de la pluralité d'échantillons de coquilles SaintJacques sur la base des populations de coquilles SaintJacques différentes. Selon un autre aspect encore, le procédé selon l'invention se caractérise en que ladite coquille Saint- Jacques est une coquille Saint-Jacques japonaise, et en ce que le procédé comprend en outre un procédé de détermination d'un ADN mitochondrial de coquille SaintJacques japonaise en ce qui concerne ladite coquille Saint-Jacques japonaise, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : se procurer une première coquille Saint-Jacques étrangère ; extraire un ADN total en tant qu'ADN de matrice à partir d'un muscle adducteur de chacune desdites coquille Saint-Jacques japonaise et première coquille SaintJacques étrangère ; amplifier un fragment d'ADN cible à partir dudit ADN total dans une amplification en chaîne par polymérase, en utilisant des ensembles d'amorces adaptés pour lesdites coquilles Saint-Jacques japonaise et première coquille Saint-Jacques étrangère, pour obtenir des premiers fragments d'ADN amplifiés provenant de la coquille SaintJacques japonaise et des deuxièmes fragments d'ADN amplifiés provenant de la première coquille Saint-Jacques étrangère, lesdits ensembles d'amorces étant conçus sur la base des séquences de nucléotides conservées parmi les gènes d'ARNr 12S et d'ARNr 16S mitochondriaux de mollusques connus ; séquencer lesdits premiers et deuxièmes fragments d'ADN amplifiés ; confirmer une différence de longueur en paires de bases entre lesdits premiers et deuxièmes fragments d'ADN amplifiés, de façon à faire une distinction entre la structure génomique de la coquille Saint-Jacques japonaise et celle de la coquille Saint-Jacques étrangère ; localiser les gènes d'ARNr 16S et d'ARNr 12S dans lesdits premiers fragments d'ADN amplifiés ; comparer lesdits gènes d'ARNr 16S et d'ARNr 12S desdits premiers fragments d'ADN amplifiés avec ceux d'un ADN mitochondrial d'une deuxième coquille Saint-Jacques étrangère, Pecten maximus, ayant une séquence de bases nucléotidiques enregistrée sous le numéro d'accès Genbank X92688 ; et découvrir une homologie entre ladite deuxième coquille Saint-Jacques étrangère et ladite coquille Saint-Jacques japonaise, lesdits premiers fragments d'ADN amplifiés étant ainsi déterminés comme étant l'ADN mitochondrial de coquille Saint-Jacques japonaise. La présente invention concerne en outre un procédé pour analyser les lignées d'une pluralité de coquilles Saint-Jacques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : se procurer différents échantillons de coquilles Saint-Jacques collectés à partir de différentes populations de ladite pluralité de coquilles SaintJacques ; extraire les ADN totaux en tant qu'ADN de matrice à partir des muscles adducteurs respectifs desdits différents échantillons de coquilles Saint-Jacques ; amplifier des fragments d'ADN mitochondriaux provenant de chacun desdits ADN de matrice par une amplification en chaîne par polymérase, en utilisant un jeu d'amorces approprié conçu sur la base de séquences de bases nucléotidiques conservées parmi les gènes d'ARNr 16S et d'ARNr 12S mitochondriaux de mollusques connus ; regrouper les fragments d'ADN mitochondriaux ainsi amplifiés pour lesdits différents échantillons de coquilles Saint-Jacques respectifs, de façon à réaliser différents groupes correspondant chacun auxdites différentes populations de coquilles Saint-Jacques respectives ; séquencer lesdits fragments d'ADN mitochondriaux amplifiés pour chacun desdits différents groupes, tout en déterminant une région non codante dans ceux-ci, de façon à déterminer une séquence de bases nucléotidiques des fragments d'ADN mitochondriaux ; ensuite, séquencer ladite région non codante, par utilisation d'amorces appropriées conçues sur la base de la séquence de bases nucléotidiques desdits fragments d'ADN mitochondriaux de façon qu'un site de substitution de base nucléotidique soit localisé dans ladite région non codante en ce qui concerne chacun desdits différents groupes, afin de déterminer ainsi le polymorphisme de séquence à partir de ceux-ci dans chacun desdits différents groupes ; et classifier lesdits différents échantillons de coquilles Saint-Jacques en leurs lignées particulières respectives dans chacune desdites différentes populations de coquilles Saint-Jacques. Ce dernier procédé peut en outre être caractérisé en ce que lesdits fragments d'ADN mitochondriaux amplifiés et ladite région non codante sont séquences au moyen d'un procédé utilisant un terminateur colorant et/ou en ce qu'il comprend en outre les étapes consistant à : comparer entre eux les sites de substitution de base nucléotidique desdits différents échantillons de coquilles Saint-Jacques ; sélectionner des échantillons de coquilles SaintJacques particuliers à partir desdits différents échantillons de coquilles Saint-Jacques, lesdits échantillons particuliers étant mutuellement identiques en ce qui concerne lesdits sites de substitution de base nucléotidique ; obtenir une fréquence de population élevée parmi lesdits échantillons de coquilles Saint-Jacques particuliers ; et déterminer l'identité de l'ancêtre parmi lesdits échantillons particuliers sur la base de ladite fréquence de population élevée de façon à trouver des ancêtres identiques parmi lesdites différentes populations de coquilles Saint-Jacques. Divers autres avantages et caractéristiques de la présente invention seront évidents à la lecture de la description qui suit, avec référence aux dessins annexés, sur lesquels : la Figure 1 est un tableau indiquant toutes les amorces utilisées pour l'amplification et le séquençage de régions d'ADN pertinentes des coquilles SaintJacques ; la Figure 2 est un tableau montrant le polymorphisme de séquence de régions non codantes d'ADN mitochondrial de coquille Saint-Jacques japonaise dans chacune des populations SAROMA et AOMORI ; la Figure 3 est une photographie montrant un motif d'électrophorèse d'ADN mitochondrial amplifié dans chacun des échantillons de coquilles Saint-Jacques SAROMA, AOMORI et U. S. qui ont subi une amplification LA-ACP ; la Figure 4 (A) est un diagramme qui montre schématiquement la séquence de bases nucléotidiques d'ADN mitochondrial commune aux échantillons SAROMA et AOMORI ; et la Figure 4 (B) est un diagramme montrant les codes de séquences de bases de la séquence de bases nucléotidiques complète d'ADN mitochondrial représentée sur la Figure 4 (A). Dans la mesure où les ADN mitochondriaux chez les vertébrés et les mollusques sont concernés, leurs séquences de bases nucléotidiques complètes ont été déterminées dans certains cas d'espèce (comme indiqué par exemple par Hoffmann et al., Genetics 131 : 397-412,1992 et Hatzoglou et al., Genetics 140 : 1353-1366,1995). Il est indiqué que l'ADN mitochondrial (ADNmt) des vertébrés comprend des régions non codantes dans sa structure génomique, qui présente une grande diversité de bases nucléotidiques, c'est-à-dire une séquence de bases hypervariable, indicative de certaines mutations s'y produisant (Wilding et al., J. Mol. Evol. 48 : 348-359, 1999 et Kurabayashi et al., Mol. Biol. Evol. 17 : 266- 277, 2000). Par conséquent, les régions non codantes ont été acceptées en tant que critère pour l'analyse de lignée et les études phylogénétiques ainsi que les études génétiques sur une population. Egalement, l'ADNmt est héréditaire de façon maternelle et on sait qu'il présente un fort taux de mutation chez les vertébrés. En ce qui concerne les coquilles Saint-Jacques, Sellos et al. indiquent qu'un segment d'ADNmt de 5,5 kpb provenant d'une coquille Saint-Jacques (Pecten maximus) a été cloné et séquence, et ont trouvé que ce segment d'ADNmt contient les gènes pour deux polypeptides, deux ARNr et 5 ARNt, et des séquences intergéniques ayant une longueur de 8 à 125 pb (numéro d'accès Genbank X92688, 1997). Mais ils n'ont réalisé aucune étude plus poussée. La Roche et al. et Rigaa et al. ont caractérisé un élément répétitif dans l'ADNmt des coquilles SaintJacques Placopecten magellanicus et Pecten maximus (Mol. Biol. Evol. 7 : 45-64,1990 et J. Mol. Evol. 41 : 189- 195, 1995). Selon Fuller et Zouros, 1993, il s'avère que cet élément répétitif est responsable de la variation de longueur inter- et intraindividuelle de l'ADNmt dans la coquille Saint-Jacques Placopecten magellanicus (Curr. Genet. 23 : 365-369,1993). Au vu des découvertes antérieures ci-dessus concernant l'ADNmt d'espèces non japonaises de coquilles Saint-Jacques, les inventeurs ont réalisé une analyse spécifique pour déterminer la séquence de bases nucléotidiques de l'ADNmt de la coquille Saint-Jacques japonaise (Patinopecten yessoensis) et ont trouvé que la séquence du fragment d'ADNmt provenant de cette coquille Saint-Jacques japonaise contient une région non codante qui présente un polymorphisme de séquence dans chacune des différentes populations de coquilles Saint-Jacques. On va ci-après présenter une description détaillée d'un exemple préféré de procédés que l'on peut mettre en oeuvre pour analyser les ADNmt de coquilles Saint-Jacques japonaises dans deux populations différentes typiques, conjointement avec une analyse comparative avec une coquille Saint-Jacques étrangère et pour déterminer la lignée phylétique détaillée de chaque population de coquilles Saint-Jacques japonaises. 1. Extraction d'ADN Dans le présent exemple, on utilise les trois types différents de coquilles Saint-Jacques suivants : deux coquilles Saint-Jacques japonaises différentes, l'une cultivée dans le lac Saroma, Hokkaido, Japon, comprenant plusieurs individus de la même population de coquilles Saint-Jacques (ci-après, "SAROMA") et une autre cultivée sur le littoral d'Aomori, Japon, comprenant plusieurs individus de la même population de coquilles SaintJacques (ci-après, "AOMORI"), et des coquilles SaintJacques étrangères (Agropecten irradians) cultivées en Amérique du Nord (ci-après, "échantillon US"). On note que la description de cette section va être consacrée uniquement à un seul échantillon d'individu de chaque coquille Saint-Jacques individuelle des populations SAROMA et AOMORI ainsi qu'à un échantillon US, dans un but de simplicité. On prépare environ 50 à 100 mg de petits fragments de muscle adducteur de chacun des trois échantillons différents susmentionnés, de façon à obtenir trois échantillons de coquille Saint-Jacques d'environ 50 à 100 mg pour les étapes d'extraction d'ADN qui vont être réalisées ci-dessous. A chacun de ces trois échantillons, on ajoute 500 fil de solution tampon TNES-urée contenant 20 mg/ml de protéinase K, et ensuite on incube les échantillons à 37 C pendant 2 heures. Après l'incubation, on extrait le lysat deux fois avec du phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25/24/1) (appelé "traitement au phénol/chloroforme"), après quoi on récupère un ADN total par précipitation à l'éthanol, que l'on dissout dans 50 fil d'eau distillée. On réalise cette extraction d'ADN en se basant sur les protocoles de Asahida et al. (comme décrits dans Fisheries Sci. 62 : 727-730, 1996). Pour le traitement de plusieurs échantillons selon ce procédé, on récupère les ADN à partir du lysat après l'incubation en utilisant les plaques de filtration à 96 puits à tamis multiples FB (Millipore), et on les purifie par précipitation à l'isopropanol, en utilisant le kit de précipitation d'ADN à 96 puits HL (Edge Bio Systems). 2. Amplification de fragment d'ADNmt Afin d'amplifier un ADNmt cible à partir de chacun des ADN totaux ainsi extraits (ADN de matrice), on emploie une amplification en chaîne par polymérase longue et précise (ci-après, LA-ACP) (le kit de LA-ACP est disponible auprès de Takara Shuzo), et les amorces à utiliser dans la LA-ACP sont conçues, comme indiqué sur la Figure 1, sur la base de séquences de nucléotides conservées parmi les gènes d'ARNr 16S et les gènes d'ARNr 12S mitochondriaux de mollusques connus. De façon plus spécifique, on prépare tout d'abord 50 l de solution réactionnelle en mélangeant approximativement 5 à 10 ng de l'ADN de matrice avec les matériaux indiqués cidessous : LA-Tag polymérase : 5 unités, tampon LA-ACP : lx, MgCl2 : 2, 5 mM, dNTP : chacun 400 M, amorces : chacune 0,2 M On réalise la LA-ACP dans la solution réactionnelle ci-dessus, en utilisant plusieurs combinaisons des huit amorces suivantes : Pyso 16S AF, Pyso 16S AR, Pyso 16S BF, Pyso 16S BR, Pyso 12S AF, Pyso 12S AR, Pyso 12S BF et Pyso 12S BR. Les séquences de bases de ces amorces sont présentées sur la Figure 1. Les étapes de la LA-ACP comprennent la réalisation d'une dénaturation initiale à 94 C pendant 7 minutes et ensuite la réalisation de 35 cycles de la série suivante de réactions : dénaturation à 98 C pendant 20 secondes, hybridation à 55 C pendant 1 minute et extension à 72 C pendant 10 minutes. On soumet les produits d'ACP à une électrophorèse sur un gel d'agarose à 0,7 % et on les visualise par coloration au bromure d'éthidium. Après l'électrophorèse, on excise les ADN amplifiés du gel d'agarose et on les purifie à l'aide des kits de purification GFX PCR DNA et Gel Band (Ameraham). Puis on clone les ADN amplifiés ainsi traités en utilisant E. coli XL1-1 Blue, au moyen du vecteur pGEM-T Easy (Promega). On détermine la séquence de bases nucléotidiques de chacun des fragments d'ADN amplifiés au moyen d'un procédé à terminateur colorant (par exemple à l'aide du kit de séquençage BigDye Terminator Cycle produit par PE Biosystems), en utilisant l'amorce T7, l'amorce SP6 ou des amorces appropriées choisies parmi les amorces indiquées sur la Figure 1. En variante, les fragments d'ADN amplifiés, après la purification comme indiquée ci-dessus, peuvent être directement séquencés sans le clonage ci-dessus au moyen du procédé à terminateur colorant. On visualise les fragments d'ADN amplifiés, sur les motifs d'électrophorèse montrés sur la Figure 3, où on observe que les deux échantillons SAROMA et AOMORI présentent leurs bandes distinctives respectives à une valeur de 1,3 kpb, tandis que l'échantillon US présente sa bande distinctive à la valeur de 1,5 kpb, par rapport aux bandes de référence du marqueur (M) dans le milieu de gel. Cette différence de paires de bases indique sans aucun doute que les coquilles Saint-Jacques japonaises ont une structure mitochondriale différente de celle de la coquille Saint-Jacques US. En outre, l'expérience montre que ces deux coquilles Saint-Jacques peuvent être facilement différenciées l'une de l'autre par ACP en termes d'espèce et d'habitat. De plus, ce résultat conduit à confirmer que les bandes à 1,3 kpb des deux échantillons japonais sont détectées par le jeu d'amorces suivant : Pyso 16S BF et Pyso 12S BR, tandis que la bande à 1,5 kpb de l'échantillon US est détectée par le jeu d'amorces suivant : Pyso 12S BF et Pyso 16S BR. On soumet l'ADN à 1,3 kpb provenant des échantillons SAROMA et AOMORI à un séquençage, en utilisant un séquenceur approprié. On trouve ainsi que la bande à 1,3 kpb de l'échantillon SAROMA a une séquence de bases identique à celle de l'échantillon AOMORI, à l'exception de deux bases seulement. On analyse les données résultantes des séquences de bases nucléotidiques pour ces deux échantillons par recherche d'homologie, en utilisant le serveur NCBI BLAST ou le serveur de recherche tRNAscan-SE (http://www.genetics.wustl.edu/eddy/tRNAscan-SE). En résultat de cette analyse, les séquences de bases des deux échantillons japonais s'avèrent contenir les trois gènes particuliers suivants : gène d'ARNr 16S, gène d'ARNt et gène d'ARNr 12S, et contenir en outre les première et deuxième régions non codantes suivantes : NcRl et NcR2 (voir les Figures 4 (A) et 4 (B)). On a aussi trouvé que les régions de gènes d'ARNr 16S et d'ARNr 12S présentent chacune l'homologie maximale vis-àvis des régions de gènes d'ARNr 16S et d'ARNr 12S respectives de l'ADNmt de la coquille Saint-Jacques Pecten maximus (séquencées par Sellos et al., 1997), et on en est arrivé à la conclusion que l'ADN à 1,3 kpb en question est issu d'ADN mitochondrial et non d'un ADN nucléaire. Ainsi, on a maintenant déterminé que l'ADN à 1,3 kpb est un ADNmt des coquilles Saint-Jacques japonaises (Patinopecten yessoensis), dont la séquence de bases schématique est représentée sur la Figure 4 (A). On se réfère également à la Figure 4 (B) qui décrit spécifiquement une séquence de bases nucléotidiques codée entière de l'ADNmt à 1,3 kpb de la coquille Saint-Jacques japonaise. Sur la base de la détermination de séquence de l'ADNmt à 1,3 kpb provenant de certains individus, on a déterminé que les régions non codantes NcRl et NcR2 s'avèrent présenter de façon intensive une variation de séquence et un fort taux de mutation. Ces deux régions non codantes NcRl, NcR2 sont considérées comme étant les régions où il se produit une mutation ou une substitution de bases spécifique parmi des individus des populations de coquilles Saint-Jacques Saroma et Aomori. 3. Analyse des régions non codantes d'ADNmt Au vu du fait que l'ADNmt est hérité par voie maternelle et a un taux de mutation élevé, les ADNmt des coquilles Saint-Jacques japonaises, et en particulier les régions non codantes (NcRl et NcR2) qui s'y trouvent, sont également hérités par voie maternelle et sont considérés avoir un taux de mutation élevé, comme suggéré ci-dessus. Ainsi, on analyse la séquence de bases de ces régions non codantes, en prenant un total de 19 échantillons de fragments d'ADNmt à 1,3 kpb de coquilles Saint-Jacques SAROMA (c'est-à-dire 19 coquilles SaintJacques individuelles de la population SAROMA) et en prenant un total de 20 échantillons de fragments d'ADNmt à 1,3 kpb de coquilles Saint-Jacques AOMORI (c'est-à-dire 20 coquilles Saint-Jacques individuelles de la population AOMORI). Bien entendu, ces multiples échantillons ont déjà été soumis à tous les traitements et procédés décrits ci-dessus, y compris la LA-ACP, avec regroupement approprié des fragments d'ADNmt à 1,3 kpb amplifiés en différents groupes avec des marqueurs correspondants appropriés, et ensuite soumis à un séquençage dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. Les régions non codantes (NcRl et NcR2) trouvées dans l'ADNmt pour chaque échantillon peuvent être séquencées par n'importe quel procédé approprié. Dans le présent exemple, on réalise le procédé utilisant un terminateur colorant susmentionné, en utilisant les trois amorces suivantes : Pyso 16S BF, Pyso NcR et Pyso 12S AR, pour déterminer la séquence de bases nucléotidiques spécifique des régions non codantes pour chaque échantillon de SAROMA (19 échantillons) et d'AOMORI (20 échantillons). En variante, à la place du procédé utilisant un terminateur colorant, on peut employer à cette fin une électrophorèse à gradient de gel dénaturant, en utilisant un quelconque jeu d'amorces approprié. Enfin, après détermination de la séquence de bases des régions non codantes pour chacun des échantillons SAROMA et AOMORI, il s'avère que plusieurs sites de substitution de base nucléotidique différentes sont localisés dans les régions non codantes (en particulier dans la deuxième région non codante NcR2), comme le montrent les deux Figures 2 et 4 (B) , ce qui indique un polymorphisme de séquence dans les ADNmt parmi les coquilles Saint-Jacques individuelles. Il ressort de la Figure 2 que la population SAROMA comprend 10 lignées maternelles différentes (Gs-1 à Gs-10) classifiées, tandis que, d'autre part, la population AOMORI comprend 5 lignées maternelles différentes (Ga-1 à Ga-5) classifiées. Les résultats de l'analyse ci-dessus montrent en outre que les haplotypes Gs-1 et Gs-8 de la population SAROMA correspondent, tant du point de vue de séquence de bases nucléotidiques que du point de vue des sites de substitution de séquence, aux haplotypes Ga-1 et Ga-4 de la population AOMORI, respectivement, dans la plage de séquence de bases nucléotidiques N 126 à 378 comme sur la Figure 2, et suggèrent que le total des fréquences de populations à lignée maternelle pour chacun de ces haplotypes de SAROMA et AOMORI peut représenter une valeur aussi élevée que 42,11 et 80 %, respectivement. Cette fréquence de population élevée des haplotypes communs dans les deux populations suggère que les deux haplotypes de SAROMA Gs-1 et Gs-8, qui correspondent aux deux haplotypes d'AOMORI Ga-1, Ga-4, respectivement, sont des ancêtres de lignée maternelle dans la population de coquilles Saint-Jacques japonaises. A ce sujet, on peut toutefois supposer, à partir de ce résultat, qu'il pourrait y avoir une certaine migration artificielle de la population SAROMA à la population AOMORI, ou réciproquement, mais cette supposition est moins réaliste au vu des données de la Figure 2 montrant la variété de coquilles Saint-Jacques individuelles spécifiques à chacune des populations SAROMA et AOMORI. De plus, d'après les résultats de cette analyse, en ce qui concerne les séquences N 229 à 449, on calcule une diversité de bases nucléotidiques de 0,80 % pour la population SAROMA et une diversité de bases nucléotidiques de 0,38 % pour la population AOMORI. En d'autres termes, on trouve que la diversité de bases nucléotidiques de la population SAROMA est environ double de celle de la population AOMORI, ce qui montre que la première a un réservoir de gènes plus important par rapport à la seconde. A partir de la description ainsi faite, conformément à la présente invention, on notera ce qui suit : (i) L'ADNmt des coquilles Saint-Jacques japonaises est analysé en ce qui concerne sa séquence de bases nucléotidiques au moyen d'une ACP. La séquence de bases nucléotidiques est codée comme représenté sur la Figure 4 (B). Les régions non codantes de l'ADNmt, qui présentent un polymorphisme de séquence, sont encore séquencées pour localiser les sites de substitution de base nucléotidique dans celles-ci, afin de déterminer de façon comparative une fréquence de population dans chaque coquille SaintJacques individuelle d'une population de coquilles SaintJacques particulière et de trouver des séquences de bases nucléotidiques identiques parmi différentes populations de coquilles Saint-Jacques. Sur la base de cette fréquence de population et de ces séquences identiques de bases nucléotidiques, il est facilement possible de classifier les individus de chaque population de coquilles Saint-Jacques en différentes lignées, et donc la détermination des séquences de bases nucléotidiques identiques parmi différentes populations de coquilles Saint-Jacques conduit à la détermination du fait que certaines d'entre elles appartiennent à une population homogène de lignée maternelle. Par conséquent, il est possible, avec une telle analyse, d'élucider les lignées phylétiques de coquilles Saint-Jacques et de classer les coquilles Saint-Jacques en différentes lignées, et (ii) Contrairement au procédé conventionnel d'analyse enzymatique, la combinaison des procédés ACP et de ceux utilisant un terminateur colorant dans la présente invention non seulement confère une sensibilité et une précision fortement améliorées de l'analyse de l'ADNmt de la coquille Saint-Jacques, mais également fournit un procédé d'analyse rapide pour ce faire, puisqu'il ne nécessite pas une grande quantité d'échantillons et de quelconques autres étapes compliquées comme on en trouve dans le procédé enzymatique. On peut aussi analyser de nombreux échantillons de façon très précise et rapide. Dans l'analyse décrite ci-dessus, il a paru nécessaire de faire une recherche comparative, en ce qui concerne la structure génomique, entre une population de coquilles Saint-Jacques naturelles et une population de coquilles Saint-Jacques cultivées artificiellement sur une base régionale. La présente invention ayant été décrite, on doit cependant comprendre que l'invention n'est pas limitée aux exemples et modes de réalisation illustrés, mais que de quelconques autres modifications, remplacements et additions peuvent y être apportés sans s'écarter du cadre des revendications annexées. Fondamentalement, les procédés décrits ci-dessus dans la présente invention peuvent aussi être appliqués à des types de coquilles Saint-Jacques autres que les coquilles Saint-Jacques japonaises, avec certains ajustements dans la conception des amorces à utiliser, des conditions de l'ACP et ainsi de suite, dans le but d'une analyse de lignée phylétique. REVENDICATIONS 1. Procédé pour analyser la lignée d'une coquille SaintJacques, caractérisé en ce qu'il comprend le séquençage d'ADN mitochondrial de la coquille Saint-Jacques pour déterminer une séquence de bases nucléotidiques de l'ADN mitochondrial. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite séquence de bases nucléotidiques comprend une région non codante contenant un site de substitution de base nucléotidique, ledit site de substitution de base nucléotidique présentant un polymorphisme de séquence indicatif d'une lignée particulière de ladite coquille Saint-Jacques, et en ce que ladite région non codante est séquencée de façon à localiser ainsi ledit site de substitution de base nucléotidique dans celle-ci. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : extraire un ADN total sous la forme d'un ADN de matrice à partir d'un muscle adducteur de ladite coquille SaintJacques ; amplifier l'ADN mitochondrial provenant dudit ADN de matrice par une amplification en chaîne par polymérase, en utilisant un jeu d'amorces approprié conçu sur la base des séquences de bases nucléotidiques conservées parmi les gènes d'ARNr 16S et les gènes d'ARNr 12S mitochondriaux de mollusques connus ; séquencer l'ADN mitochondrial ainsi amplifié avec détermination d'une région non codante dans celui-ci de façon à déterminer une séquence de bases nucléotidiques de l'ADN mitochondrial ; ensuite, séquencer ladite région non codante, en utilisant des amorces appropriées conçues sur la base de la séquence de bases nucléotidiques dudit ADN mitochondrial amplifié ; localiser un site de substitution de base nucléotidique dans ladite région non codante ; et déterminer un polymorphisme de séquence à partir dudit site de substitution de base nucléotidique de façon à analyser ainsi une lignée particulière de ladite coquille Saint-Jacques. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit ADN mitochondrial amplifié est cloné par E. coli, en utilisant un vecteur, et ensuite séquence par un procédé utilisant un terminateur colorant. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit ADN mitochondrial amplifié est directement séquence par un procédé utilisant un terminateur colorant, sans être cloné. 6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit ADN mitochondrial amplifié et ladite région non codante sont tous deux séquencés par un procédé utilisant un terminateur colorant. 7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite coquille Saint-Jacques est mise en #uvre en nombre pour donner une pluralité de coquilles SaintJacques différentes, et en ce que chacun des ADN mitochondriaux respectifs de ladite pluralité de différentes coquilles Saint-Jacques est amplifié par ladite amplification en chaîne par polymérase, en utilisant ledit jeu d'amorces approprié, après quoi, les régions non codantes des ADN mitochondriaux sont directement séquencées, sans être clonées, par un procédé à terminateur colorant en utilisant lesdites amorces appropriées, de façon à localiser ainsi plusieurs sites de substitution de base nucléotidique différents dans lesdites régions non codantes parmi ladite pluralité de coquilles Saint-Jacques différentes. 8. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite coquille Saint-Jacques est la coquille SaintJacques japonaise Patinopecten yessoensis, en ce que ledit jeu d'amorces approprié comprend l'amorce Pyso 16S BF (5'-CGGCGAAGCCAGGTCAGTTTCTATC-3') et l'amorce Pyso 12S BR (5'-AGAGCGACGGGCGATGTGTACAC-3'), et en ce que lesdites amorces appropriées comprennent l'amorce Pyso 16S BF (5'CGGCGAAGCCAGGTCAGTTTCTATC-3'), l'amorce Pyso NcR (5'AGGTAACCAGAACCAAACTACC-3') et l'amorce Pyso 12S AR (5'ACTGCTGGCACCTGGTTGGA-3'). 9. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite coquille Saint-Jacques est la coquille SaintJacques japonaise Patinopecten yessoensis, en ce que ledit jeu d'amorces approprié comprend l'amorce Pyso 16S BF (5'-CGGCGAAGCCAGGTCAGTTTCTATC-3') et l'amorce Pyso 12S BR (5'-AGAGCGACGGGCGATGTGTACAC-3'), en ce que lesdites amorces appropriées comprennent l'amorce Pyso 16S BF (5'CGGCGAAGCCAGGTCAGTTTCTATC-3'), l'amorce Pyso NcR (5'AGGTAACCAGAACCAAACTACC-3') et l'amorce Pyso 12S AR (5'ACTGCTGGCACCTGGTTGGA-3'), en ce que ladite coquille Saint-Jacques japonaise est utilisée en nombre pour donner une pluralité de coquilles Saint-Jacques japonaises, en ce que ladite pluralité de coquilles Saint-Jacques japonaises est regroupée en au moins une population de coquilles Saint-Jacques, en ce que, lors de ladite étape d'amplification d'ADN mitochondrial, les ADN mitochondriaux respectifs de ladite ou desdites population(s) de coquilles Saint-Jacques sont amplifiés, par utilisation d'un ensemble desdites amorces Pyso 16S BF et Pyso 12S BR, grâce à quoi un ADN mitochondrial d'environ 1,3 kpb est déterminé dans ladite population ou chacune desdites populations de coquilles Saint-Jacques, en ce que, lors de ladite étape de séquençage de l'ADN mitochondrial ainsi amplifié, une séquence de bases nucléotidiques dudit ADN mitochondrial d'environ 1,3 kpb est déterminée, une région non codante y étant également déterminée, et en ce que, lors de ladite étape de séquençage de la région non codante, ladite région non codante est séquencée, par utilisation desdites amorces Pyso 16S BF, Pyso NcR et Pyso 12S AR, de façon qu'un site de substitution de base nucléotidique soit localisé dans la région non codante en ce qui concerne ladite population ou chacune desdites populations de coquilles Saint-Jacques, afin de déterminer ainsi le polymorphisme de séquence à partir de celle-ci et de classifier la pluralité de coquilles Saint-Jacques japonaises en lignées particulières dans ladite ou lesdites population(s) de coquilles Saint-Jacques. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite ou lesdites population(s) de coquilles SaintJacques comprend une population de coquilles Saint- Jacques qui vivent dans le lac Saroma, Hokkaido, Japon et une autre population de coquilles Saint-Jacques qui vivent sur un littoral d'Aomori, Japon. 11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite séquence de bases nucléotidiques de l'ADN mitochondrial d'environ 1,3 kpb est conforme à l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 11. 12. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite coquille Saint-Jacques est une coquille SaintJacques japonaise, et en ce que le procédé comprend en outre un procédé de détermination d'un ADN mitochondrial de coquille Saint-Jacques japonaise en ce qui concerne ladite coquille Saint-Jacques japonaise, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : se procurer une première coquille Saint-Jacques étrangère ; extraire un ADN total en tant qu'ADN de matrice à partir d'un muscle adducteur de chacune desdites coquille Saint-Jacques japonaise et première coquille SaintJacques étrangère ; amplifier un fragment d'ADN cible à partir dudit ADN total dans une amplification en chaîne par polymérase, en utilisant des ensembles d'amorces adaptés pour lesdites coquilles Saint-Jacques japonaise et première coquille Saint-Jacques étrangère, pour obtenir des premiers fragments d'ADN amplifiés provenant de la coquille SaintJacques japonaise et des deuxièmes fragments d'ADN amplifiés provenant de la première coquille Saint-Jacques étrangère, lesdits ensembles d'amorces étant conçus sur la base des séquences de nucléotides conservées parmi les gènes d'ARNr 12S et d'ARNr 16S mitochondriaux de mollusques connus ; séquencer lesdits premiers et deuxièmes fragments d'ADN amplifiés ; confirmer une différence de longueur en paires de bases entre lesdits premiers et deuxièmes fragments d'ADN amplifiés, de façon à faire une distinction entre la structure génomique de la coquille Saint-Jacques japonaise et celle de la coquille Saint-Jacques étrangère ; localiser les gènes d'ARNr 16S et d'ARNr 12S dans lesdits premiers fragments d'ADN amplifiés ; comparer lesdits gènes d'ARNr 16S et d'ARNr 12S desdits premiers fragments d'ADN amplifiés avec ceux d'un ADN mitochondrial d'une deuxième coquille Saint-Jacques étrangère, Pecten maximus, ayant une séquence de bases nucléotidiques enregistrée sous le numéro d'accès Genbank X92688 ; et découvrir une homologie entre ladite deuxième coquille Saint-Jacques étrangère et ladite coquille Saint-Jacques japonaise, lesdits premiers fragments d'ADN amplifiés étant ainsi déterminés comme étant l'ADN mitochondrial de coquille Saint-Jacques japonaise. 13. Procédé pour analyser les lignées d'une pluralité de coquilles Saint-Jacques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : se procurer différents échantillons de coquilles Saint-Jacques collectés à partir de différentes populations de ladite pluralité de coquilles SaintJacques ; extraire les ADN totaux en tant qu'ADN de matrice à partir des muscles adducteurs respectifs desdits différents échantillons de coquilles Saint-Jacques ; amplifier des fragments d'ADN mitochondriaux provenant de chacun desdits ADN de matrice par une amplification en chaîne par polymérase, en utilisant un jeu d'amorces approprié conçu sur la base de séquences de bases nucléotidiques conservées parmi les gènes d'ARNr 16S et d'ARNr 12S mitochondriaux de mollusques connus ; regrouper les fragments d'ADN mitochondriaux ainsi amplifiés pour lesdits différents échantillons de coquilles Saint-Jacques respectifs, de façon à réaliser différents groupes correspondant chacun auxdites différentes populations de coquilles Saint-Jacques respectives ; séquencer lesdits fragments d'ADN mitochondriaux amplifiés pour chacun desdits différents groupes, tout en déterminant une région non codante dans ceux-ci, de façon à déterminer une séquence de bases nucléotidiques des fragments d'ADN mitochondriaux ; ensuite, séquencer ladite région non codante, par utilisation d'amorces appropriées conçues sur la base de la séquence de bases nucléotidiques desdits fragments d'ADN mitochondriaux de façon qu'un site de substitution de base nucléotidique soit localisé dans ladite région non codante en ce qui concerne chacun desdits différents groupes, afin de déterminer ainsi le polymorphisme de séquence à partir de ceux-ci dans chacun desdits différents groupes ; et classifier lesdits différents échantillons de coquilles Saint-Jacques en leurs lignées particulières respectives dans chacune desdites différentes populations de coquilles Saint-Jacques. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que lesdits fragments d'ADN mitochondriaux amplifiés et ladite région non codante sont séquences au moyen d'un procédé utilisant un terminateur colorant. 15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes consistant à : comparer entre eux les sites de substitution de base nucléotidique desdits différents échantillons de coquilles Saint-Jacques ; sélectionner des échantillons de coquilles SaintJacques particuliers à partir desdits différents échantillons de coquilles Saint-Jacques, lesdits échantillons particuliers étant mutuellement identiques en ce qui concerne lesdits sites de substitution de base nucléotidique ; obtenir une fréquence de population élevée parmi lesdits échantillons de coquilles Saint-Jacques particuliers ; et déterminer l'identité de l'ancêtre parmi lesdits échantillons particuliers sur la base de ladite fréquence de population élevée de façon à trouver des ancêtres identiques parmi lesdites différentes populations de coquilles Saint-Jacques.