Brevet FR2802768A1 — publié le 20010629

PROCEDE DE DETERMINATION DU POURCENTAGE DE SEMENCES PORTEUSES D'AU MOINS UN GENE D'INTERET L'invention a pour objet un procédé pour la détermination du pourcentage de semences portant au moins un gène d'intérêt par rapport aux semences ne portant pas ce(s) gène(s), au sein d'un lot de semences hybrides, et son application à la sélection de lots de semences de lignées parentales appartenant à des générations précédant celle de plantes hybrides déterminées, notamment de semences de lignées fixées, de pré-base, ou de base, de qualité en vue de la production de lots de semences hybrides, ou à la sélection de lots de semences hybrides en vue de leur commercialisation. Idéalement, dans le cas où la plante femelle apporte le gène d'intérêt, pour que 100% des semences hybrides portent le gène d'intérêt, il faut - que 100% des lignées fixées soient homozygotes pour le gène d'intérêt, - que pendant les autofécondations, aucun pollen étranger ne pénètre dans la parcelle, - qu'aucun grain non porteur du gène d'intérêt ne reste dans les contenants (semoirs, bennes, stockages...) Idéalement encore, dans le cas où le mâle apporte le gène d'intérêt, pour que 100% des semences hybrides portent le gène d'intérêt, il faut - que 100% des lignées fixées soient homozygotes pour le gène d'intérêt, - que pendant les autofécondations et l'hybridation, aucun pollen étranger ne pénètre dans la parcelle - qu'aucun grain non porteur du gène d'intérêt ne reste dans les contenants (semoirs, bennes, stockages...) Une parcelle n'est jamais isolée à 100% ; il entre toujours du pollen non désiré, que ce soit en autofécondation ou en hybridation. Dans une population de semences de pré-base ou de base il y a donc des semences homozygotes pour le gène d'intérêt mais aussi des semences hétérozygotes voire certaines semences ne portant pas le gène d'intérêt. La présence d'hétérozygotes dans les parents a un effet négatif sur la qualité des semences hybrides portant le gène d'intérêt. Il est donc important de pouvoir identifier et quantifier ces hétérozygotes dans les lignées fixées, les semences de base ou pré-base pour améliorer la qualité des semences hybrides portant le gène d'intérêt. Les flux de pollen ont également un effet sur le taux de présence du gène d'intérêt dans les semences hybrides. Les semenciers maîtrisent et connaissent des méthodes d'analyses permettant de connaître les entrées de pollen extérieur par des mesures de pureté variétale. Ces analyses de pureté variétale sont réalisées en contrôle qualité depuis de nombreuses années et sont reconnues par les organismes de certification de la profession. Ces méthodes peuvent être des électrophorèses, des tests phénotypiques sur plantules ou à posteriori... La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs du fait que si l'on connaît le pourcentage d'homozygotes / hétérozygotes dans les lignées fixées, les semences de pré-base ou de base, et si on connaît les flux de pollen, il est alors possible de déduire la qualité des semences hybrides. La présente invention a pour but de fournir un nouveau procédé permettant - d'éliminer l'étape lourde et coûteuse de la vérification de la présence du gène d'intérêt dans les semences hybrides. - d'anticiper le déclassement des lots de semences non conformes, - d'accroître la qualité des semences hybrides portant un gène d'intérêt en sélectionnant les lots de semences de base les meilleurs, - de simplifier le contrôle qualité des semences portant un gène d'intérêt (méthodes moins lourdes à mettre en oeuvre et plus rapides en utilisant des méthodes moléculaires), - de faciliter la gestion des contrôles des semences portant un gène d'intérêt (il est plus facile de travailler sur des petites quantités comme les semences de base ou de pré-base, que sur des grandes quantités après production des hybrides), - de réduire les temps d'analyses en utilisant des méthodes moléculaires (intérêt essentiel pour les productions de contre-saison), - de diminuer le nombre de plantes à contrôler par une gestion appropriée de ces contrôles, - de réduire les coûts de contrôles OGM et les coûts de non qualité (analyses en mélange et non individu par individu, déclassement anticipé des lots à risques). L'invention a pour objet un procédé de détermination du pourcentage de semences portant au moins un gène d'intérêt par rapport aux semences ne portant pas ce(s) gène(s), au sein d'un lot de semences hybrides obtenues par croisement de lignées parentales de base, à savoir d'une lignée parentale femelle de base et d'une lignée parentale mâle de base, l'une desdites lignées parentales femelle ou mâle de base étant homozygote pour le(s) gène(s) d'intérêt, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend - une étape de quantification des semences homozygotes et hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt, et, le cas échéant des semences non porteuses de ce(s) gène(s) d'intérêt, cette étape de quantification étant effectuée sur au moins une lignée appartenant à l'une des lignées parentales des générations précédentes de celle desdites semences hybrides, - et une étape de contrôle de pureté variétale, permettant de déterminer le pourcentage de pollen non désiré contaminant les étapes d'autofécondation desdites lignées parentales des générations précédentes, ou contaminant l'étape de croisement desdites lignées parentales de base, cette étape de contrôle de pureté variétale étant effectuée sur les plantes ou semences d'au moins une desdites lignées parentales des générations précédentes et/ou sur les semences hybrides susmentionnées, ou les plantes issues de ces dernières. Par plantes ou semences portant au moins un gène d'intérêt, on entend, dans ce qui précède et ce qui suit, les plantes ou semences génétiquement modifiées par insertion dans leur génome d'un ou plusieurs gènes "externes" d'intérêt, ou les plantes ou semences sélectionnées pour leur propriété à contenir dans leur génome un ou plusieurs gènes "internes ou naturels" d'intérêt. L'invention a pour plus particulièrement pour objet un procédé de détermination du pourcentage de semences portant au moins un gène d'intérêt par rapport aux semences ne portant pas ce(s) gène(s), au sein d'un lot de semences hybrides obtenues par croisement de lignées parentales de base, à savoir d'une lignée parentale femelle de base et d'une lignée parentale mâle de base, l'une desdites lignées parentales femelle ou mâle de base étant homozygote pour le(s) gène(s) d'intérêt, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend - une étape de quantification des semences homozygotes et hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt, et, le cas échéant des semences non porteuses de ce(s) gène(s) d'intérêt, lesdites semences étant récoltées à partir de celles des plantes mâles ou femelles qui sont supposées homozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt et appartenant aux lignées parentales fixées, et/ou aux lignées parentales de pré-base obtenues par autofécondation des lignées parentales fixées susmentionnées, et/ou aux lignées parentales de base obtenues par autofécondation des lignées de pré-base futées susmentionnées, - et une étape de contrôle de pureté variétale, permettant de déterminer le pourcentage de pollen non désiré contaminant les étapes susmentionnées d'autofécondation des lignées parentales ou de production des semences hybrides, ledit contrôle étant effectué sur des plantes ou semences hybrides obtenues par croisement des lignées parentales de base susmentionnées, et/ou sur des plantes ou semences obtenues par autofécondation des lignées parentales fixées, et/ou des lignées parentales de pré-base, lesdites étapes de quantification et/ou de contrôle étant effectuées sur des plantes ou semences hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt appartenant aux plantes et semences hybrides susmentionnées, et/ou sur des plantes ou semences homozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt appartenant à des lignées parentales de même stade, à savoir au stade de lignées fixées ou de pré-base ou de base, ou sont effectuées sur des plantes ou semences homozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt appartenant à des lignées parentales de stade différent. Avantageusement, le procédé susmentionné de l'invention est tel que - l'étape susmentionnée de quantification des semences homozygotes et hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt est effectuée sur des plantes ou semences supposées homozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt appartenant à des lignées parentales de même stade, lesdites lignées étant des lignées de pré-base ou de base, de préférence des lignées de pré-base, - et l'étape de contrôle de pureté variétale est effectuée sur les plantes ou semences supposées homozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt appartenant aux mêmes lignées parentales que celles sur lesquelles l'étape susmentionnée de quantification des semences homozygotes et hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt est effectuée, et/ou est effectuée sur les plantes ou semences supposées hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt appartenant aux plantes et semences hybrides susmentionnées. Avantageusement encore, l'étape de quantification des semences homozygotes et hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt, et, le cas échéant des semences ne portant pas ce(s) gène(s), est effectuée par la technique PCR à l'aide d'amorces appropriées (notamment par PCR quantitative selon les méthodes décrites dans les demandes internationales W09924619 et W09221780), lesdites amorces étant choisies de manière à ce qu'elles soient marquées, notamment par fluorescence, et en ce qu'elles s'hybrident - avec le gène d'intérêt, permettant ainsi l'amplification spécifique de ce dernier, lorsque le gène d'intérêt est intégré dans la séquence nucléotidique amplifiée, suivie de la détection et le cas échéant de la quantification d'amplicons produits au cours des cycles PCR, et par conséquent du nombre de semences homozygotes ou hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt, - et/ou avec des séquences nucléotidiques situées de part et d'autre du site d'insertion du gène d'intérêt, dans le génome desdites semences, en présence de réactifs permettant l'amplification d'un fragment d'ADN de taille inférieure à celle du gène d'intérêt, en l'absence de celui-ci, notamment d'un fragment d'une taille d'environ 50 paires de bases à environ 1 kb, la taille du gène d'intérêt étant d'au moins environ 2 kb, mais ne permettant pas cette amplification lorsque le gène d'intérêt est intégré dans le génome desdites semences, l'amplification dudit fragment d'ADN du génome desdites semences, ce fragment comprenant le site d'insertion du gène d'intérêt mais pas ce dernier, ayant par contre lieu dans le cas où le gène d'intérêt n'est pas intégré dans le génome desdites semences, suivie de la détection et le cas échéant de la quantification du nombre d'amplicons produits aux cours des cycles PCR et donc du nombre de semences homozygotes ou hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt, et, le cas échéant, des semences ne portant pas ce(s) gène(s) d'intérêt. Selon d'autres modes avantageux de réalisation du procédé de l'invention, l'étape de quantification des semences homozygotes et hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt, et, le cas échéant, des semences ne portant pas ce(s) gène(s), est effectuée par la technique "DNA Chips", ou la technique de détection de protéines (également connue sous le nom de "BIO KIT") . Avantageusement, l'étape de contrôle de pureté variétale faite à partir des plantes ou semences obtenues par croisement des lignées parentales de base susmentionnées, ou de celles obtenues par autofécondation des lignées parentales des générations précédentes, notamment des lignées fixées, et/ou des lignées parentales de pré-base susmentionnées, est effectuée - par une méthode de contrôle en plein champ (ou à posteriori) qui consiste en une observation de tous les stades de développement de la plante, - et/ou ou par un test "plantule", à savoir par l'observation sur plantules, au stade deux feuilles, obtenues dans des conditions de température et d'éclairement contrôlées (notamment dans les conditions décrites dans le brevet français déposé le 16 mai 1988 sous le numéro 88 06541), de caractères phénotypiques caractéristiques des plantes homozygotes ou hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt, ou des plantes ne portant ce(s) gène(s) d'intérêt, - et/ou par électrophorése de protéines, et plus particulièrement d' isoenzymes, caractéristiques des plantes homozygotes ou hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt, ou des plantes ne portant ce(s) gène(s) d'intérêt. L'invention a plus particulièrement pour objet tout procédé tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce que le pourcentage de semences hybrides portant au moins un gène d'intérêt par rapport aux semences hybrides ne portant pas ce gène, au sein d'un lot de semences hybrides provenant du croisement de plantes mâles ou femelles d'une lignée parentale de base, cette dernière provenant de l'autofécondation de lignées parentales des générations précédentes, et plus particulièrement d'une lignée de pré-base, cette dernière provenant de l'autofécondation d'une lignée fixée, est calculé, en application des lois de Mendel, à partir - d'une part des résultats de l'étape susmentionnée de quantification des semences homozygotes et hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt, et, le cas échéant, des semences ne portant pas ce(s) gène(s), dans les lignées parentales de base, ou des générations précédentes, notamment des lignées fixées, ou de pré-base susmentionnées, - et, d'autre part, du pourcentage de pollen non désiré, mesuré lors de l'étape de contrôle de pureté variétale susmentionnée, après croisement desdites lignées parentales de base, et/ou après autofécondation des lignées parentales des générations précédentes susmentionnées. L'invention a plus particulièrement pour objet l'application du procédé tel que défini ci-dessus, à la sélection de lots de semences de lignées fixées, de pré-base, ou de base, de qualité en vue de la production de lots de semences hybrides, ou à la sélection de lots de semences hybrides en vue de leur commercialisation, et plus particulièrement à la sélection de lots de semences - de lignées fixées, dans lesquelles le pourcentage de semences hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt est inférieur à environ 1 %, et celui des semences ne portant pas ce(s) gène(s) d'intérêt est inférieur à environ 1 %, - ou de lignées de pré-base, dans lesquelles le pourcentage de semences hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt est inférieur à environ 1 %, et celui des semences non génétiquement transformées par le(s) gène(s) d'intérêt est inférieur â environ 1 %, - ou de lignées de base, dans lesquelles le pourcentage de semences hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt est inférieur à environ 2%, et celui des semences ne portant pas ce(s) gène(s) d'intérêt est inférieur à environ I %, - ou hybrides, dans lesquelles le pourcentage de semences ne portant pas ce(s) gène(s) d'intérêt est inférieur à environ 4 %, le pourcentage de pollen extérieur lors de l'autofécondation, ou du croisement, des lignées susmentionnées n'excédant pas environ 5 %. REVENDICATIONS 1. Procédé de détermination du pourcentage de semences portant au moins un gène d'intérêt par rapport aux semences ne portant pas ce(s) gène(s), au sein d'un lot de semences hybrides obtenues par croisement de lignées parentales de base, à savoir d'une lignée parentale femelle de base et d'une lignée parentale mâle de base, l'une desdites lignées parentales femelle ou mâle de base étant homozygote pour le(s) gène(s) d'intérêt, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend - une étape de quantification des semences homozygotes et hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt, et, le cas échéant des semences ne portant pas ce(s) gène(s) d'intérêt, cette étape de quantification étant effectuée sur au moins une lignée appartenant à l'une des lignées parentales des générations précédentes de celle desdites semences hybrides, - et une étape de contrôle de pureté variétale, permettant de déterminer le pourcentage de pollen non désiré contaminant les étapes d'autofécondation desdites lignées parentales des générations précédentes, ou contaminant l'étape de croisement desdites lignées parentales de base, cette étape de contrôle de pureté variétale étant effectuée sur les plantes ou semences d'au moins une desdites lignées parentales des générations précédentes et/ou sur les semences hybrides susmentionnées, ou les plantes issues de ces dernières. 2. Procédé selon la revendicationl, de détermination du pourcentage de semences portant au moins un gène d'intérêt par rapport aux semences ne portant pas ce(s) gène(s), au sein d'un lot de semences hybrides obtenues par croisement de lignées parentales de base, à savoir d'une lignée parentale femelle de base et d'une lignée parentale mâle de base, l'une desdites lignées parentales femelle ou mâle de base étant homozygote pour le(s) gène(s) d'intérêt, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: - une étape de quantification des semences homozygotes et hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt, et, le cas échéant des semences non porteuses de ce(s) gène(s) d'intérêt, lesdites semences étant récoltées à partir de celles des plantes mâles ou femelles qui sont supposées homozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt et appartenant aux lignées parentales fixées, et/ou aux lignées parentales de pré-base obtenues par autofécondation des lignées parentales fixées susmentionnées, et/ou aux lignées parentales de base obtenues par autofécondation des lignées de pré-base fixées susmentionnées, - et une étape de contrôle de pureté variétale, permettant de déterminer le pourcentage de pollen non désiré contaminant les étapes susmentionnées d'autofécondation des lignées parentales ou de production des semences hybrides, ledit contrôle étant effectué sur des plantes ou semences hybrides obtenues par croisement des lignées parentales de base susmentionnées, et/ou sur des plantes ou semences obtenues par autofécondation des lignées parentales fixées, et/ou des lignées parentales de pré-base, lesdites étapes de quantification et/ou de contrôle étant effectuées sur des plantes ou semences hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt appartenant aux plantes et semences hybrides susmentionnées, et/ou sur des plantes ou semences homozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt appartenant à des lignées parentales de même stade, à savoir au stade de lignées fixées ou de pré-base ou de base, ou sont effectuées sur des plantes ou semences homozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt appartenant à des lignées parentales de stade différent. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que - l'étape susmentionnée de quantification des semences homozygotes et hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt est effectuée sur des plantes ou semences supposées homozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt appartenant à des lignées parentales de même stade, lesdites lignées étant des lignées de pré-base ou de base, de préférence des lignées de pré-base, - et l'étape de contrôle de pureté variétale est effectuée sur les plantes ou semences supposées homozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt appartenant aux mêmes lignées parentales que celles sur lesquelles l'étape susmentionnée de quantification des semences homozygotes et hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt est effectuée, et/ou est effectuée sur les plantes ou semences supposées hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt appartenant aux plantes et semences hybrides susmentionnées. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape de quantification des semences homozygotes et hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt, et, le cas échéant des semences ne portant pas ce(s) gène(s), est effectuée par la technique PCR à l'aide d'amorces appropriées, lesdites amorces étant choisies de manière à ce qu'elles soient marquées, notamment par fluorescence, et en ce qu'elles s'hybrident - avec le gène d'intérêt, permettant ainsi l'amplification spécifique de ce dernier, lorsque le gène d'intérêt est intégré dans la séquence nucléotidique amplifiée, suivie de la détection et le cas échéant de la quantification d' amplicons produits au cours des cycles PCR, et par conséquent du nombre de semences homozygotes ou hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt, - et/ou avec des séquences nucléotidiques situées de part et d'autre du site d'insertion du gène d'intérêt, dans le génome desdites semences, en présence de réactifs permettant l'amplification d'un fragment d'ADN de taille inférieure à celle du gène d'intérêt, en l'absence de celui-ci, mais ne permettant pas cette amplification lorsque le gène d'intérêt est intégré dans le génome desdites semences, l'amplification dudit fragment d'ADN du génome desdites semences, ce fragment comprenant le site d'insertion du gène d'intérêt mais pas ce dernier, ayant par contre lieu dans le cas où le gène d'intérêt n'est pas intégré dans le génome desdites semences, suivie de la détection et le cas échéant de la quantification du nombre d' amplicons produits aux cours des cycles PCR et donc du nombre de semences homozygotes ou hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt, et, le cas échéant, des semences ne portant pas ce(s) gène(s) d'intérêt. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape de contrôle de pureté variétale faite à partir des plantes ou semences obtenues par croisement des lignées parentales de base, ou de celles obtenues par autofécondation des lignées parentales des générations précédentes, notamment des lignées fixées, et/ou des lignées parentales de pré-base, est effectuée - par une méthode de contrôle en plein champ (ou à posteriori) qui consiste en une observation de tous les stades de développement de la plante, - et/ou ou par un test "plantule", à savoir par l'observation sur plantules, au stade deux feuilles, obtenues dans des conditions de température et d'éclairement contrôlées, de caractères phénotypiques caractéristiques des plantes homozygotes ou hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt, ou des plantes ne portant ce(s) gène(s) d'intérêt, - et/ou par électrophorèse de protéines, et plus particulièrement d'isoenzymes, caractéristiques des plantes homozygotes ou hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt, ou des plantes ne portant ce(s) gène(s) d'intérêt. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le pourcentage de semences hybrides portant au moins un gène d'intérêt par rapport aux semences hybrides ne portant pas ce gène, au sein d'un lot de semences hybrides provenant du croisement de plantes mâles ou femelles d'une lignée parentale de base, cette dernière provenant de l'autofécondation de lignées parentales des générations précédentes, et plus particulièrement d'une lignée de pré-base, cette dernière provenant de l'autofécondation d'une lignée fixée, est calculé, en application des lois de Mendel, à partir - d'une part des résultats de l'étape de quantification des semences homozygotes et hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt, et, le cas échéant, des semences ne portant pas ce(s) gène(s), dans les lignées parentales de base, ou des générations précédentes, notamment des lignées fixées, ou de pré-base susmentionnées, - et, d'autre part, du pourcentage de pollen non désiré, mesuré lors de l'étape de contrôle de pureté variétale, après croisement desdites lignées parentales de base, et/ou après autofécondation des lignées parentales des générations précédentes susmentionnées. 7. Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 6, à la sélection de lots de semences de lignées parentales appartenant à des générations précédentes de plantes hybrides déterminées, notamment de semences de lignées fixées, de pré-base, ou de base, de qualité en vue de la production de lots de semences hybrides, ou à la sélection de lots de semences hybrides en vue de leur commercialisation, et plus particulièrement à la sélection de lots de semences - de lignées fixées, dans lesquelles le pourcentage de semences hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt est inférieur à environ 1 %, et celui des semences ne portant pas ce(s) gène(s) d'intérêt est inférieur à environ 1 %, - ou de lignées de pré-base, dans lesquelles le pourcentage de semences hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt est inférieur à environ 1 %, et celui des semences non génétiquement transformées par le(s) gène(s) d'intérêt est inférieur à environ 1 %, - ou de lignées de base, dans lesquelles le pourcentage de semences hétérozygotes pour le(s) gène(s) d'intérêt est inférieur à environ 2%, et celui des semences ne portant pas ce(s) gène(s) d'intérêt est inférieur à environ 1 %, - ou hybrides, dans lesquelles le pourcentage de semences ne portant pas ce(s) gène(s) d'intérêt est inférieur à environ 4%, le pourcentage de pollen extérieur lors de l'autofécondation, ou du croisement, des lignées susmentionnées n'excédant pas environ 5% .