Brevet FR2800387A1 — publié le 20010504

La présente invention est relative à un procédé de production d'une banque ou collection de mutants aptes à permettre l'étude de la fonction de chaque gène, fragment d'ADN ou séquence définie d'une espèce de plante donnée et à ses applications : banques de mutants et procédé de sélection d'un mutant d'un gène. Le séquençage systématique des génomes d'espèces modèles (homme, bactéries, levure, Caenorhabditis elegans, Arabidopsis thaliana, riz) fournit une quantité d'informations qui, au-delà de l'aspect fondamental, permet l'identification chez l'Homme et certains animaux, de gènes impliqués dans des pathologies et peut déboucher sur de nouvelles thérapies, tandis que chez les végétaux, la caractérisation de gènes responsables de traits agronomiques permettra d'accélérer l'amélioration des espèces cultivées. Avec l'analyse globale de l'expression du génome (transcriptome et protéome) l'autre axe essentiel à développer en biologie est l'analyse fonctionnelle systématique du génome. Il s'agit dans ce cas, de disposer pour chaque gène d'allèles mutants (nuls ou partiels), de façon à en évaluer le rôle dans le développement et la physiologie de l'organisme. Les outils d'analyse fonctionnelle globale du génome actuellement utilisés chez les modèles d'étude végétaux ou animaux reposent essentiellement : - sur la mutagenèse insertionnelle : les mutagènes insertionnels (transposons ou T-DNA chez les plantes) peuvent être facilement détectés par PCR en prenant une amorce de l'agent insertionnel et une amorce spécifique du gène (Martienssen, 1998). Cette approche a été développée entre autres chez la drosophile (Kaiser et al., 1990), la levure (Smith et al., 1995) le nématode Caenorhabditis elegans (Zwaal et al., 1993), et Arabidopsis thaliana (Azpiroz-Leehan et al., 1997 ; Bouchez et al., 1998). Toutefois, les banques de mutants insertionnels sont difficiles à constituer et lourdes à mettre en place ; elles ont en outre l'inconvénient d'être soumises aux contraintes de confinement des organismes génétiquement modifiés ; elles ne sont en outre pas facilement transférables à des espèces cultivées, - sur le remplacement ciblé par recombinaison homologue (knockout), qui n'est pas praticable en routine chez les végétaux supérieurs et - sur les réarrangements suffisamment importants comme des délétions pour pouvoir être détectés par PCR. Cette approche a été utilisée chez le poisson zèbre avec les rayons gamma (Fritz et al., 1996) et chez le nématode par mutagenèse chimique (Jansen et al., 1997). Chacune de ces deux espèces présente des particularités qui y ont rendu possible ce type d'approche. En effet : . chez le poisson zèbre d'abord, il a été tiré parti de la possibilité de produire des organismes haploïdes par parthénogenèse. Ainsi, les délétions chez un organisme haploïde peuvent être mises en évidence par l'absence de produit de PCR, puisque l'allèle sauvage est absent, à condition toutefois que l'ADN soit analysé individu par individu. Cela est peu efficace lorsque l'on doit analyser des milliers de mutants. . le nématode Caenorhabditis elegans est un organisme hermaphrodite dont on peut facilement cultiver des dizaines de milliers d'individus. C'est par une mutagenèse chimique produisant des délétions à faible fréquence (15 %) et sur une collection de plus de 100 000 individus que les études sur cet animal ont été menées. Les délétions sont repérées par l'apparition de produits PCR de taille inférieure à celle de l'allèle sauvage. L'ADN des mutants est extrait non pas individuellement mais en lots de taille variable, de manière à pouvoir minimiser le nombre de PCR à effectuer. Ainsi, les premières réactions sont faites sur des lots de 1000 individus, puis sur des sous-lots de 10, et enfin sur des individus. De telles méthodes ne sont donc pas utilisables pour des organismes ne présentant pas les particularités précitées. Les Inventeurs ont maintenant mis au point un procédé qui répond mieux aux besoins de la pratique, notamment en ce qu'il met en #uvre des rayonnements ionisants et en ce qu' il est adapté à l' étude fonctionnelle de la totalité du génome d'une plante. Les rayonnements ionisants (RI) (rayons X, gamma, neutrons rapides, ions lourds) sont de puissants mutagènes qui induisent majoritairement des réarrangements importants, essentiellement des délétions (> 75 %). Ils ont été utilisés chez un certain nombre d'organismes animaux dont la drosophile (Kelley et al., 1985), le poisson medaka (Kubota et al., 1995), le poisson zèbre (Chakrabarti et al, 1983), la souris (Cattanach et al., 1993 ; Turker et al., 1997), les cellules de hamster ou humaines (Schwartz et al., 1991 ; Giver et al., 1995), et également chez de nombreux végétaux, dont le maïs (Fujii, 1978), le riz (Purushothaman, 1969), la légumineuse Medicago truncatula (Sagan et al., 1995) et la plante modèle Arabidopsis thaliana (Redei, 1974 ; Shirley et al., 1992 ; Sun et al., 1992). La nature moléculaire des mutations induites par les RI a été analy- sée chez certains de ces organismes essentiellement par l'étude des mutants obtenus pour des gènes déjà connus (Bruggemann et al., 1996 ; Fuscoe et al., 1992). Les types de mutations observés sont les suivants : délétions, translocations, inversions, insertions et mutations ponctuelles. Ces types ne sont pas nécessairement exclusifs. Par exemple, une délétion peut être accompagnée d'une insertion, ou d'une inversion (Shirley et al., 1992). Quel que soit l'organisme eucaryote étudié, les délétions sont le type dominant avec des fréquences autour de 70 % (Fuscoe et al., 1992 ; Bruggeman et al., 1996 ; Cecchini et al., 1998). La taille des délétions est variable mais les délétions totales du gène représentent la majorité (environ 50 %) des mutations et les délétions partielles de 10 à 25 %. Le gène HY4 d'Arabidopsis thaliana (Bruggeman et al., 1996), par exemple, couvre environ 4 kb. Sur les 20 mutants hy4 isolés, 11(55 %) présentent une délétion totale excédant 8 kb, 1 (5 %) une délétion totale inférieure à 8 kb, 3 (15 %) des délétions avec une borne dans le gène et l' autre à l' extérieur du gène, 2 (10 %) des délétions aux bornes contenues dans le gène. Le reste, 3 (15 %), ne présente pas d' altérations détectables par hybridation génomique. Toutefois, l'utilisation des rayonnements ionisants, telle que décrite à ce jour, s'est limitée à la caractérisation de mutations pour des gènes connus (Bruggeman et al., 1996 ; Cecchini et al. 1998) ou au clonage par hybridation soustractive de gènes mutés (Sun et al., 1992). C'est pourquoi les Inventeurs se sont donnés pour but de fournir un procédé pour l'établissement de collections optimales de mutants de plantes induits par les radiations ionisantes, afin de permettre l' étude de la fonction de chaque gène ou fragment d'ADN et ce, quelle que soit l'espèce considérée. La présente invention a pour objet un procédé de production d'une collection ou banque de mutants pour l'étude de la fonction de chaque gène d'une plante A sélectionnée, caractérisé en ce qu'il comprend : (a) une estimation théorique du nombre n de mutations, induites par les rayonnements ionisants, nécessaires et suffisantes pour que chaque gène du génome de ladite plante A soit affecté par au moins l'une d'entre elles, à partir de la formule : pn = 1 -((N-1)/N)n (formule 1), dans laquelle : pn représente la probabilité qu'un gène donné soit muté et N représente le nombre total estimé de gènes d'un organisme donné On a qn = 1-pn. Pour une mutation donnée, qi = (N-1)/N. Si l'on suppose que les mutations sont indépendantes les unes des autres, pour n mutations, on a donc qn = ((N-1)/N)n . Les valeurs pour des génomes fictifs de 20 000,25 000 et 30 000 gènes sont présentées au Tableau I. Tableau I : Nombre de Mutations n Nécessaires pour Obtenir un Mutant Donné avec une Probabilité pna Pn Nombre de Gènes N 20000 25000 30000 0,90 46050 57563 69076 0,95 59913 74892 89870 0,99 92101 115127 138153 apn = 1-((N-1)/N)n (b) l' irradiation de graines sauvages par une dose d'irradiation x, choisie de manière à obtenir une densité de mutation par plante m et une fréquence de mutation dans un gène yx souhaitées, la relation entre x, m et yx étant représentée par les formules 2 et 3 suivantes : m=n/yx (formule 2), dans laquelle n a la même signification qu'à la formule 1 et m est le nombre de mutations par plante ; yx = ax +fs (formule 3), dans laquelle : a est le facteur de mutagenèse et fs est la fréquence de mutation spontanée et l'obtention de graines mutées de génération Ml. Les graines mutées et les plantes qui en dérivent sont désignées génération Ml. La densité de mutation désirée par plante dépend donc de la dose d'irradiation appliquée. Le choix de cette dose, puisqu'il détermine le nombre de mutations par plante, détermine également la complexité (= nombre total d'individus) de la banque et reflète l'efficacité de mutagenèse par le rayonnement utilisé. La relation entre x et yx est considérée comme linéaire et reflète l'efficacité de mutagenèse par le rayonnement utilisé. Pour les valeurs de yx considérées, fs est considérée comme négligeable. La valeur de a est déterminée expérimentalement. La taille de la banque, correspondant au nombre total de mutations n(t), doit être telle que chaque région du génome soit mutée au moins une fois. On a donc n (t)=R.n R exprime la redondance de la collection et est supérieur ou égal à 1 et n a la même signification que ci-dessus. Par redondance, on entend le nombre moyen de mutations présentes dans la collection pour un gène donné. En effet, la caractérisation d'un phénotype mutant a d'autant plus de valeur qu'elle est confirmée par des allèles indépendants. Une collection représentant au moins une fois et de préférence 5 à 10 fois le génome (5#R#10) est donc réaliste pour disposer d'une diversité d'allèles suffisante. (c) l'obtention des plantes de génération Ml, issues des graines mutées (irradiées) Ml obtenues en (b), par germination et culture. Les graines et plantes des générations suivantes dérivées par autofécondation, dans le cas d'Arabidopsis, par exemple, sont appelées M2, M3, ..., Mn. Les graines ou plantes issues d'un même parent sont groupées sous le terme de famille et sont décrites comme s#urs. (d) la récolte des graines s#urs M2 pour chaque plante Ml, de préférence mise en pot individuellement, l'extraction de l'ADN à partir de plantules s#urs M2 cultivées en milieu solide (terreau ou milieu gélosé) ou en milieu liquide, et le regroupement dudit ADN en lots correspondant à plusieurs familles M2 qui servent de matrice pour la recherche des réarrangements génétiques ; la collection de mutants est donc représentée à la fois par les graines des familles M2 et par l'ADN extrait de ces familles ; et (e) la détection des familles M2 portant une mutation dans un gène donné, effectuée sur l'ADN obtenu en d), par un criblage reposant sur des techniques de PCR aptes à détecter des réarrangements génétiques, réalisé sur des lots d'ADN de taille décroissante (recherche pyramidale desdits réarrangements) ; taille et le type de réarrangement détectés dépendent de la technique utilisée et de la position des amorces. Par conséquent, il est possible de détecter des réarrangements affectant une partie ou la totalité d'un gène ou de plusieurs gènes. En variante, ledit procédé comprend : (a) une estimation théorique du nombre n de mutations, induites par les rayonnements ionisants, nécessaires et suffisantes pour que chaque gène du génome de ladite plante A soit affecté par au moins l'une d'entre elles, à partir de la formule : pn = 1 -((N-1)/N)n (formule 1), dans laquelle : pn représente la probabilité qu'un gène donné soit muté et, N représente le nombre total estimé de gènes d'un organisme donné, (b) l'irradiation de graines sauvages, par une dose d'irradiation x, choisie, de manière à obtenir une densité de mutation par plante m et une fréquence de mutation dans un gène yx souhaitées, la relation entre x, m et yx étant représentée par les formules 2 et 3 suivantes : m=n/yx (formule 2), dans laquelle n a la même signification qu'à la formule 1 et m est le nombre de mutations par plante ; yx = ax +fs (formule 3), dans laquelle : a est le facteur de mutagenèse et fs est la fréquence de mutation spontanée et l'obtention de graines mutées de génération Ml mutées. (c) l'obtention des plantes de génération Ml, issues des graines mutées Ml obtenues en (b), par germination et culture. (d) la récolte des graines s#urs M2 pour chaque plante Ml, l'obtention des plantes de génération M2 par germination et culture, et l'extraction de l'ADN de plantes M2 individuelles ; l'ADN d'un échantillon représentatif de plantes M2, est extrait et analysé par plante ; et (e) la détection et la localisation des réarrangements portés par ces plantes par marquage et hybridation de chaque ADN obtenu en (d) avec une puce de génotypage à oligonucléotides. Conformément à l'invention, ladite étape (e) de détection est mise en #uvre sur des puces à ADN : l'utilisation de puces à ADN sur des mutants induits par les rayonnements ionisants facilite considérablement la mise en #uvre du procédé selon l'invention. En effet, la majorité des mutations induites par les rayonnements ionisants étant des délétions, l'hybridation de l'ADN d'un mutant de génération Mi (i2) sur une puce à ADN couvrant l'ensemble du génome, conduit à une perte ou à une diminution du signal par rapport à l'ADN sauvage sur les domaines de la puce correspondant à la délétion. Ainsi une seule hybridation permet de déterminer avec précision la localisation des mutations présentes et détectées chez le mutant en question. Ainsi l'application de ce procédé à un ensemble de plantes de génération Mi (i2) appartenant à la collection permettra de constituer une base de données contenant les informations pertinentes concernant le nombre, la localisation et éventuellement l'étendue, des mutations présentes et détectées chez les plantes dudit ensemble. La recherche de plantes de la collection portant une ou plusieurs mutations dans un gène donné pourra donc se faire par consultation de ladite base de données. (figure 3). Au sens de la présente invention, le terme gène inclut aussi bien les séquences codantes que des séquences non codantes. Également au sens de la présente invention, les mutants par réarrangement génétique sont des mutants de délétion, d'inversion, d'insertion ou de translocation ; toutefois, les mutants de délétion sont les plus fréquents. Afin d'assurer un spectre de délétions le plus large possible, les rayonnements gamma et neutrons rapides seront utilisés préférentiellement comme agents mutagènes. D'autres agents physiques, tels que les ions lourds, provoquant majoritairement des délétions pourront également être utilisées comme mutagènes. Les avantages d'une collection de mutants induits par les rayonnements ionisants, dans les conditions exposées ci-dessus, sont les suivants : - le type de mutagène utilisé assure une couverture complète du génome, accompagnée d'une grande diversité des allèles produits qui vont de petites délétions permettant d'éliminer une partie d'un gène ou de ses séquences régulatrices, jusqu'à de grandes délétions permettant d'éliminer des clusters de gènes ou des domaines chromosomiques. L'analyse fonctionnelle de domaines chromosomiques chez les plantes n'est envisageable que grâce à ce type de mutations ; de plus, les délétions rendent accessibles une analyse du rôle de l'ADN non-codant. - le développement de cette banque ne fait pas appel à la transgenèse ; il en découle une facilité de mise en place et une rapidité de constitution. Une collection qui couvre plusieurs fois le génome peut être rassemblée en moins d'un an chez Arabidopsis. En comparaison, les banques de mutants insertionnels ne seront saturantes, de manière opérationnelles qu'à moyen terme (5 ans). Par ailleurs, les mutants radio-induits ne sont pas soumis aux contraintes de confinement des organismes génétiquement modifiés ; ils peuvent être cultivés en plein champ et dans les laboratoires non équipés pour les OGM. En outre, la technique selon la présente invention est directement utilisable dans des espèces cultivées pour lesquelles la transgenèse est encore difficile. A ce titre le riz représente une cible privilégiée. Selon un mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, préalablement à l'étape (b) la sélection de la dose d'irradiation x comprend : - l'irradiation d'un échantillon de graines Ml à une dose comprise entre 0,05 Gy et 2 kGy ; les doses appliquées dépendent du type de mutagène et de l'espèce considérée. Par exemple, les neutrons rapides à dose identique sont 5 à 10 fois plus efficaces que les rayons gamma du 60Co. - la germination desdites graines, dans un milieu convenable (solide ou liquide) ; - l'extraction, de l'ADN à partir des plantes en lots regroupant au moins 50 plantes, et la récolte des graines M2 desdites plantes en lots correspondant aux lots d'ADN ; - l'amplification desdits ADN, dans les conditions exposées à l'étape (e) et la détection des séquences amplifiées pour identifier la présence de mutations dans un gène et la répétition de ces étapes d'amplification et de détection pour plusieurs gènes, ci-après dénommés gènes témoins ; - la détermination du nombre de mutations moyen m par plante, à partir du nombre de mutations obtenues pour les gènes témoins en utilisant les formules 1, 2 et 3 et - optionnellement l'obtention d'une courbe dose/nombre de mutations m par plante. Ainsi, il est possible de tracer une courbe dose/nombre de mutations m par plante, qui servira de référence pour le choix de la dose. Selon un autre mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, le nombre moyen de mutations par gène yx présentes dans la collection (calculé conformément aux étapes (a) et (b) dudit procédé) est avantageusement au moins égal à 2, ceci afin de disposer d'un nombre d'allèles suffisants pour chaque gène. Selon encore un autre mode de mise en #uvre avantageux dudit procédé, pour réduire le nombre de PCR à effectuer à l'étape (e) de criblage des réarrangement génétiques, les ADN des lots de graines M2 issues de plantes Ml sont euxmêmes regroupés en super-lots. De manière avantageuse la méthode selon l' invention, qui présente un certain nombre d'avantages par rapport à la transgenèse, est applicable à n'importe quelle plante, notamment, les espèces pour lesquelles la transgenèse est difficile ou pas encore possible : - en particulier, la collection de mutants obtenue est suffisamment représentative, dans la mesure où elle contient effectivement au moins un mutant pour chaque gène du génome de la plante étudiée ; le nombre de mutants à obtenir, évalué conformément aux étapes (a) et (b) du procédé selon l'invention, dépend du nombre total de gènes dans la plante étudiée et du nombre de mutations par individu, qui dépend lui-même du mutagène et de la dose de mutagène utilisés. - le type de mutagène utilisé (irradiation), permet un repérage aisé des mutants par PCR (délétions) et permet d'isoler les mutants repérés de la collection pour les étudier. Le procédé ci-dessus est notamment applicable à Arabidopsis dont le nombre de gènes est estimé à 20 000 (Bouchez et Hofte, 1998) ; dans ce cas, il faut environ 60 000 mutations pour une probabilité de 0,95 d'avoir une mutation dans un gène donné. Pour ce qui concerne les autres espèces, si l' espèce est hermaphrodite et auto-compatible, le procédé à mettre en #uvre est le même que celui exposé cidessus, à l'exception de la dose d'irradiation qui dépend de la taille du génome, exprimée en nombre de gènes et de la fréquence de mutations induites pour un gène donné. Cette fréquence est évaluée selon le même protocole que celui décrit ci-dessus. Si l'espèce est auto-incompatible, les plantes de génération Ml sont croisées avec des plantes compatibles de la même espèce, pour produire les graines M2. Cette opération sera répétée pour obtenir les graines de générations suivantes. La présente invention a également pour objet une collection de mutants, issus d'une plante A, caractérisée en ce que chaque mutant la constituant comprend au moins une mutation de délétion dans un gène du génome de ladite plante A, l'ensemble desdits mutants formant une population dont chaque élément comprend au moins une mutation pour un gène du génome de ladite plante A, ladite collection (graines ou ADN) représentant au moins une fois et de préférence 5 à 10 fois le génome. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite collection, elle est susceptible d'être obtenue à l'aide d'un procédé de production d'une collection de mutants tel que défini ci-dessus. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite collection, elle est constituée de graines de génération M2 et/ou de l'ADN extrait de ces graines, à partir d'une fraction représentative desdites graines. Pour chaque famille M2, l'ADN est extrait d'une fraction représentative des graines de cette famille. Outres les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre le principe de la détection de délétions par PCR suivi d'électrophorèse ; - la figure 2 illustre la recherche pyramidale de délétions dans la collection de mutants. Les amplifications du type décrit en figure 1 sont appliquées à des lots de taille décroissante jusqu'à identifier un individu portant la délétion recherchée. - la figure 3 est un schéma illustrant l'utilisation des puces à oligonucléotides pour la détection et la localisation de délétions et de réarrangements chromosomiques chez des mutants issus de la collection. Ceci permettra d'une part d'accélérer le clonage de gènes affectés chez des mutants isolés sur la base d'un phénotype et d'autre part, d'envisager la localisation systématique des délétions chez les mutants de la collection. Ces informations seront consignées dans une base de données et la consultation de cette base autorisera un accès direct aux mutants dans un gène donné, sans passer par l'étape de criblage par PCR décrite ci-dessus. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : Courbe dose/nombre de mutations induites par plante. - l'irradiation d'un échantillon d'au moins 1000 graines sauvages à une dose comprise entre 0,05 Gy et 2 kGy ; - la germination desdites graines sur un substrat approprié (terreau, par exemple) ; - l'extraction de l'ADN des plantes issues de la germination des graines, par lots de 100, à partir soit des feuilles, soit des inflorescences selon le protocole suivant : 1) Prélever les tissus frais, feuilles ou inflorescences et les congeler dans de l'azote liquide. 2) Broyer les tissus congelés dans un broyeur planétaire (modèle PM400, marque RETSCH, Allemagne) et transférer le broyat dans des tubes de taille adéquate. 3) Ajouter du tampon d'extraction à raison de 5 ml par g de tissus frais. Agiter pendant 15 min à 37 C. 4) Ajouter un volume équivalent de mélange phénol-chloroforme-alcool isoamylique (25: 24:1). Le phénol est tamponné par du Tris 50 mM, pH 8. Agiter pendant 10 min à 37 C. 5) Centrifuger le mélange à 2 500 g pendant 5 min. 6) Récupérer la phase aqueuse et la transférer dans-un tube propre. Ajouter 1/10 du volume d'une solution 3 M d'acétate de sodium pH 5,2, puis 1 volume d'isopropanol. Agiter brièvement pour homogénéiser et centrifuger le tout à 10 000 g pendant 3 min. 7) Eliminer le surnageant et reprendre le culot dans un volume de TE (tampon 10 mM Tris HC1 pH 8,0 ; 5 mM EDTA). Ajouter 1/10 du volume d'une solution d'acétate de sodium 3 M pH 5,2. Puis 1 volume d'éthanol 100 %. Agiter et centri- fuger pendant 5 min à 10 000 g. 8) Eliminer le surnageant et reprendre le culot dans 1/10 du volume de tampon TE. La concentration obtenue varie entre 100 et 500 ng/ l. - l'amplification par PCR dudit ADN, à l'aide d'amorces convenables, c'est-à-dire aptes à détecter des réarrangements génétiques, dans l'intervalle compris entre lesdites amorces, dans des conditions standards, suivie de la détection des séquences amplifiées par électrophorèse (figure 1) pour identifier la présence de mutations dans un gène et la répétition de cette étape d'amplification pour plusieurs gènes (1à 10) et - la détermination du nombre de mutations moyen m par plante, à partir du nombre de mutations obtenues pour les gènes témoins en utilisant les formules 1, 2 et 3 et - optionnellement l'obtention d'une courbe dose/nombre de mutations m par plante. Les conditions de PCR sont les suivantes : les réactions sont effectuées dans un volume de 25 à 50 l contenant 1 à 2 unités de polymérase Taq, 10 mM Tris HC1 pH 8,3,50 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 0,001 % gélatine, 0,2 mM de chaque nucléotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 0,2 M de chaque amorce et de 10 à 20 ng d'ADN servant de matrice. Après une dénaturation initiale de 2 min à 94 C, suivent 30 cycles avec chacun une étape de dénaturation de 30 s à 94 C, une étape d'appariement des amorces de 30 s à une température variant de 45 C à 65 C selon les amorces, et une étape d'extension à 72 C pour une durée de30 s à 4 min selon la taille du fragment à amplifier. Pour les fragments de grande taille (supérieure à 4 kb), la polymérase Taq est remplacée par un mélange de polymérase Pwo et de polymérase Taq dans un rapport de 1:100 en unités. Dans ce cas, la température d'élongation est de 68 C et la durée portée à 5 min ou plus si nécessaire. EXEMPLE 2 : Etablissement d'une banque chezArabidopsis thaliana Pour Arabidopsis thaliana, l'exemple 1 permet de sélectionner, comme dose d'irradiation x, 300 Gy. Par une source de 60Co (irradiateur CIGAL). Afin d'assurer un spectre de délétions le plus large possible, les rayonnements gamma et neutrons rapides seront utilisés préférentiellement comme agents mutagènes. La taille de la banque (correspondant au nombre total de mutations n) doit être telle (voir formules 1, 2 et 3) que chaque région du génome soit mutée plusieurs fois. En effet, la caractérisation d'un phénotype mutant a d'autant plus de valeur qu'elle est confirmée par des allèles indépendants. Une collection représentant 5 à 10 fois le génome est donc à réaliser pour disposer d'une diversité d'allèles suffisante. Chez Arabidopsis par exemple, le nombre total de gènes étant estimé à 20- 25 000 et le nombre moyen de mutations dans une graine irradiée à 300 Gy (gamma) étant d'environ 100, la collection de mutants devra comporter 5-10 000 plantes. Conformément au procédé selon l'invention, pn=0,95 et 20 000 N # 25 000. Les graines M2 sont récoltées pour chaque plante Ml individuellement (=M2i. gr). L'ADN est extrait selon le protocole décrit à l'Exemple 1, à partir de plantules M2 poussant en milieu liquide, à raison de 100 graines par plante Ml et en regroupant les graines issues de 10 plantes Ml (=10M2i.ADN). Pour réduire le nombre de PCR à effectuer à l'étape (e) de criblage des réarrangement génétiques (délétions), les ADN des lots de graines M2 issues de 10 plantes Ml (=10M2i.ADN) sont eux même regroupés en super-lots de 10 (=100 M2i.ADN) (figure 2), en mélangeant en quantités égales les ADN des lots contribuant à un super-lot. En outre, les graines M2 sont organisées en matrice 10x10 où chaque case de la matrice correspond aux graines M2 issues d'une plante Ml et les ADN sont extraits pour les deux dimensions (colonnes et lignes) de ces matrices. Ainsi les lots 10M2LADN correspondent à une colonne ou une ligne de ces matrices et les super-lots 100M2i.ADN correspondent à l'ensemble d'une matrice. Ainsi, pour une collection faite à partir de 10 000 plantes Ml, il y a 100 super-lots 100M2i.ADN. Il faudra donc effectuer 100 PCR (1par super-lot), de manière à cribler la totalité de la banque. Sur les super-lots positifs, 2x10 PCR correspondant aux 10 colonnes et 10 lignes des matrices, seront effectués pour identifier les graines M2i issues d'une plantes Ml portant une mutation détectée. Pour identifier au moins une plante individuelle portant la mutation trouvée, il faut semer 50-100 graines M2i, extraire l'ADN des plantes individuellement et effectuer la PCR avec les mêmes amorces. EXEMPLE 3 : PCR sélectionnés pour Arabidopsis thaliana. Un crible a été effectué sur un gène d'Arabidopsis thaliana homologue du gène humain ATM (Ataxia telangiectasia mutated) ; le gène est inclus dans la séquence du clone BAC T24C20 n EMBL AL096856. La collection utilisée repose sur 5 000 lignées Ml, obtenues dans les conditions décrites selon l'exemple 2. Les amorces utilisées ont les séquences suivantes : ATM29 : 5'-GATTGATTAGATAGACAGAGC-3' ATM40 : 5'AAAAAATTGGAAGCATATAGAAGGTTGGTTACA-3' Les réactions d'amplification ont été réalisées dans les conditions décrites plus haut, avec le mélange de polymérases Taq et Pwo, à une température d'appariement des amorces de 55 C, un temps d'élongation de 5 min et sur 30 cycles. La taille du fragment amplifié à partir d'ADN génomique sauvage est de 5714 pb. Deux délétions de 2 300 et 1 600 pb respectivement ont pu être détectées dans deux lots différents, et les plantes portant ces délétions ont été isolées. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. Références bibliographiques - Azpiroz-Leehan R et al. (1997) T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis : going back and forth. Trends Genet. 13 : 152-156. - Bouchez D et al. (1998) Functional genomics in plants. Plant Phys. 118 : 725-732. - Bruggeman E et al. (1996) Analysis of fast neutron-generated mutants at the Arabidopsis thaliana HY4 locus. The Plant Journal 10 : 755-760. - Cattanach BM et al. (1993). Large deletions and other gross forms of chromosome imbalance compatible with viability and fertility in the mouse. Nat. Genet. 3 : 56-61. - Cecchini E et al. 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REVENDICATIONS 1 ) Procédé de production d'une collection ou banque de mutants pour l'étude de la fonction de chaque gène d'une plante A sélectionnée, caractérisé en ce qu'il comprend : (a) une estimation théorique du nombre n de mutations, induites par les rayonnements ionisants, nécessaires et suffisantes pour que chaque gène du génome de ladite plante A soit affecté par au moins l'une d'entre elles, à partir de la formule : pn = 1 -((N-1)/N)n (formule 1), dans laquelle : pn représente la probabilité qu'un gène donné soit muté et, N représente le nombre total estimé de gènes d'un organisme donné ; (b) l'irradiation de graines sauvages, par une dose d'irradiation x, choisie, de manière à obtenir une densité de mutation par plante m et une fréquence de mutation dans un gène yx souhaitées, la relation entre x, m et yx étant représentée par les formules 2 et 3 suivantes : m=n/yx (formule 2), dans laquelle n a la même signification qu'à la formule 1 et m est le nombre de mutations par plante ; yx = ax +fs (formule 3), dans laquelle : a est le facteur de mutagenèse et fs est la fréquence de mutation spontanée et l' obtention de graines mutées de génération Mlmutées ; (c) l'obtention des plantes de génération Ml, issues des graines mutées Ml obtenues en (b), par germination et culture ; (d) la récolte des graines s#urs M2 pour chaque plante Ml, l'extraction de l'ADN à partir de plantules s#urs M2 et le regroupement dudit ADN en lots correspondant à plusieurs familles M2 qui servent de matrice pour la recherche des réarrangements génétiques ; et (e) la détection des familles M2 portant une mutation dans un gène donné, effectuée sur l'ADN obtenu en d), par un criblage reposant sur des techniques de PCR aptes à détecter des réarrangements génétiques, réalisé sur des lots d'ADN de taille décroissante. 2 ) Procédé de production d'une collection ou banque de mutants pour l'étude de la fonction de chaque gène d'une plante A sélectionnée, caractérisé en ce qu' il comprend : (a) une estimation théorique du nombre n de mutations, induites par les rayonnements ionisants, nécessaires et suffisantes pour que chaque gène du génome de ladite plante A soit affecté par au moins l'une d'entre elles, à partir de la formule : pn = 1 -((N-1)/N)n (formule 1), dans laquelle : pn représente la probabilité qu'un gène donné soit muté et, N représente le nombre total estimé de gènes d'un organisme donné ; (b) l'irradiation de graines sauvages, par une dose d'irradiation x, choisie, de manière à obtenir une densité de mutation par plante m et une fréquence de mutation dans un gène yx souhaitées, la relation entre x, m et yx étant représentée par les formules 2 et 3 suivantes : m=n/yx (formule 2), dans laquelle n a la même signification qu'à la formule 1 et m est le nombre de mutations par plante ; yx = ax +fs (formule 3), dans laquelle : a est le facteur de mutagenèse et fs est la fréquence de mutation spontanée et l'obtention de graines mutées de génération Ml mutées ; (c) l'obtention des plantes de génération Ml, issues des graines mutées Ml obtenues en (b), par germination et culture ; (d) la récolte des graines s#urs M2 pour chaque plante Ml, l'obtention des plantes de génération M2 par germination et culture, et l'extraction de l'ADN de plantes M2 individuelles ; et (e) la détection et la localisation des réarrangements portés par ces plantes par marquage et hybridation de chaque ADN obtenu en (d) avec une puce de génotypage à oligonucléotides. 3 ) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que, préalablement à l'étape (b), la sélection de la dose d'irradiation x, comprend : - l'irradiation d'un échantillon de graines Ml à une dose comprise entre 0,05 Gy et 2 kGy, les doses appliquées dépendant du type de mutagène et de l'espèce considérée ; - la germination desdites graines en milieu convenable ; - l'extraction de l'ADN à partir des plantes en lots regroupant au moins 50 plantes, et la récolte des graines M2 desdites plantes en lots correspondant aux lots d'ADN ; - l'amplification desdits ADN, dans les conditions exposées à l'étape (e) et la détection des séquences amplifiées pour identifier la présence de mutations dans un gène et la répétition de ces étapes d'amplification et de détection pour plusieurs gènes ; - la détermination du nombre de mutations moyen m par plante, à partir du nombre de mutations obtenues pour les gènes témoins en utilisant les formules 1, 2 et 3 et - optionnellement l'obtention d'une courbe dose/nombre de mutations m par plante. 4 ) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que le nombre moyen de mutations par gène yx, présentes dans la collection, calculé conformément aux étapes (a) et (b) dudit procédé, est avantageusement au moins égal à 2. 5 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que pour réduire le nombre de PCR à effectuer à l'étape (e) de criblage des réarrangements génétiques, les ADN des lots de graines M2 issues de plantes sont eux-mêmes regroupés en super-lots. 6 ) Collection de mutants, issus d'une plante A, caractérisée en ce que chaque mutant la constituant comprend au moins une mutation de délétion dans un gène du génome de ladite plante A, l'ensemble desdits mutants formant une population dont chaque élément comprend au moins une mutation pour un gène du génome de ladite plante A, ladite collection représentant au moins une fois et de préférence 5 à 10 fois le génome. 7 ) Collection selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue à l'aide d'un procédé de production d'une collection de mutants selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 8 ) Collection selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle est constituée de graines de génération M2 et/ou de l'ADN extrait de ces graines, à partir d'une fraction représentative desdites graines.