Brevet FR2802549A1 — publié le 20010622

LIGNÉES IMMORTALISÉES DE CELLULES ENDOTHÉLIALES DE MAMMIFÈRE ET PLUS PARTICULIÈREMENT HUMAINES, LEUR PROCÉDÉ DE PRÉPARATION ET LEURS APPLICATIONS. La présente invention concerne des lignées immortalisées de cellules endothéliales de différents tissus humains établies à partir de biopsies de tissus inflammés ou provenant de sujets atteints de cancer. L'invention se rapporte aussi au procédé de préparation de ces lignées et à leur application en tant que modèle pour l'étude moléculaire de l'adhérence intercellulaire qui est la condition première menant à la domiciliation des lymphocytes et à l'invasion métastasique. L'invention concerne donc aussi le criblage de substances anti-cancéreuses, anti-inflammatoires, immunomodulatrices, antivirales, etc ... Les études portant sur la domiciliation des lymphocytes ont montré que les cellules clés, responsables de la sélection des cellules circulantes en vue de leur entrée dans les organes lymphoïdes, sont les cellules endothéliales de forme haute des veinules post capillaires (1). Il est donc indispensable de disposer de cellules endothéliales ad'hoc pour élucider les processus moléculaires de l'invasion. En outre, il est admis que l'adhérence primaire qui mène à l'invasion, est due à une reconnaissance de type lectine/glycoconjugués. En effet, les glycoconjugués ont leurs motifs osidiques synthétisés de façon post traductionnelle et qui sont caractéristiques des individus, des tissus et des cellules qui les produisent. L'étude de l'interaction lectine / glycoconjugués nécessite donc des conditions expérimentales où les glycoconjugués présentent les motifs osidiques adéquats, c'est à dire les plus proches possibles de ce qu'ils sont dans les conditions physiologiques. La présente invention vise précisément à offrir des lignées de cellules endothéliales permettant ces études. Les cellules endothéliales sont aptes à être mises en culture primaire dans certaines conditions de milieu riche en facteurs de croissance, comme le FGFb par exemple. La plupart des travaux réalisés dans ce domaine ont concernés des cellules provenant de cordon ombilical et ont permis de montrer que les cellules endothéliales sont très facilement activables et expriment des molécules d'adhérence, en particulier les sélectines qui permettent d'arrêter les leucocytes circulants (2). Ces travaux ont donc mis en évidence l'importance des sélectines et de leurs ligands dans la reconnaissance intercellulaire menant à l'adhérence et l'extravasation (3). Il apparaît que les trois sélectines connues et leurs différents ligands qui ont pour motif le groupe Lewis X et Lewis A et les Sialyl Lewis X et Sialyl Lewis A n'expliquent pas la spécificité de la localisation et du recrutement des lymphocytes parmi les organes lymphoïdes associés aux muqueuses et les divers tissus où doit s'opérer le recrutement leucocytaire (4). Les Inventeurs ont donc considéré que les cellules endothéliales étaient responsables de ce filtrage et ont préparé les lignées de cellules endothéliales de mammifère et plus particulièrement humaines de l'invention pour vérifier cette hypothèse. Les Inventeurs ont mis au point un procédé permettant d'obtenir ces lignées et ont confirmé que les cellules obtenues en culture primaire sont bien de nature endothéliale. Elles sont caractérisées par leurs antigènes comme le facteur de von Willebrand, l'enzyme de conversion de l'angiotensine, les récepteurs des acétyls LDL qui sont des marqueurs généraux pour les cellules endothéliales de vaisseaux. Les marqueurs plus spécifiques de l'endothélium de micro-capillaires et des cellules endothéliales de forme haute qui se trouvent dans les veinules post capillaires des organes lymphoïdes secondaires sont les diverses molécules d'adhérence de type CAMs appartenant à la superfamille des immunoglobulines et à la superfamille des intégrines, mais surtout les molécules d'adhérence de type lectine. Plus particulièrement, il s'agit des sélectine-E (endothéliale) et sélectine-P (plaquettaire) et les adressines qui sont des ligands pour les lectines présentes à la surface des cellules circulantes. Il a été démontré une spécificité d'organe, à l'aide d'anticorps monoclonaux (5), pour : - GlyCAM-1 adressine sélective des ganglions lymphatiques périphériques, - MAdCAM-1 : adressine sélective des organes lymphoïdes associés aux muqueuses. La distribution qui a été constatée est la suivante : sur les cellules endothéliales Sélectines (E-sélectine et P-sélectine), les ligands des L-sélectines étant : GlyCAM-1, PNAd, MadCAM-1, CD34, CLA. - sur les leucocytes : L-sélectine (Homing receptor), les ligands des sélectines (E-sélectine et P-sélectine) étant : PSGL-1, ESL-1, CLA. Les sélectines étant des lectines et leurs ligands des glycoconjugués, les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention confirment l'hypothèse d'une double reconnaissance de type lectine glycoconjugués entre la cellule circulante et la cellule endothéliale (6). Les lectines sont donc responsables du premier signal de reconnaissance qui induit l'expression en cascade des autres molécules d'adhérence, ce qui a pour résultat de permettre le passage de la cellule du flux vers le tissu sous-jacent à la barrière endothéliale. Les cellules endothéliales ont des lectines membranaires différentes selon leur origine et ceci participe à établir la spécificité de la localisation. La vérification de cette hypothèse (7) a conduit les inventeurs à établir des lignées immortalisées de cellules endothéliales de diverses origines afin de disposer des outils cellulaires permettant un diagnostic de localisation et la recherche de substances influant sur l'adhérence et donc le recrutement, et par conséquent susceptible de jouer un rôle dans l'inflammation et l'invasion, comme par exemple dans les métastase et le rejet de greffe. L'invention est en outre fondée sur l'observation de la haute spécificité qui caractérise la localisation des cellules circulantes dans le sang ou la lymphe lorsqu'elles se domicilient dans les organes lymphoïdes pour opérer une réponse immune ou inflammatoire. Le mécanisme est identique pour les cellules cancéreuses qui métastasent et envahissent un tissu sous-jacent de l'endothélium. Le signal d'arrêt vient de l'interaction entre cellules circulantes et cellules endothéliales. L'étude de ces phénomènes nécessitent donc de connaître les molécules responsables de ces signaux, qui diffèrent selon l'origine de la cellule endothéliales. Les lignées immortalisées de cellules endothéliales humaines de l'invention visent précisément à offrir les moyens permettant l'étude moléculaire de l'adhérence intercellulaire et permettent de déterminer des molécules d'adhérence qui sont responsables du premier signal d'arrêt des cellules circulantes vis-à-vis de l'endothélium : - cellules normales dans la réponse immune, - cellules cancéreuses dans la formation de métastase. Les lignées immortalisées de cellules endothéliales humaines de l'invention miment la barrière de l'endothélium des capillaires in vivo et un constituent donc une système performant d'étude de ces phénomènes. En outre, afin d'être le plus proche possible de la situation in vivo, il est nécessaire de disposer de cellules provenant de divers endothélia capillaires, représentatifs des lieux où les tissus subissent l'invasion des cellules inflammatoires, lymphoïdes et autres cellules circulantes normales ou malignes. Le procédé selon l'invention est remarquable en ce qu'il permet précisément de préparer des lignées immortalisées de cellules endothéliales humaines de tissus et organes humains très divers. De plus, ce procédé offre l'avantage de pouvoir préparer des quantités suffisantes de lignées cellulaires immortalisées stables dans leurs caractères physiologiques de manière à réaliser des expériences reproductibles. De nombreux travaux ont été réalisés dans l'art antérieur pour obtenir des lignées de cellules endothéliales qui soient stables et proches de la situation in vivo. Ces lignées sont, pour la plupart, des lignées obtenues par transformation spontanée (8), après activation (9). Mais on a également décrit dans l'art antérieur des lignées cellulaires immortalisées par transfection avec un plasmide contenant un fragment immortalisant d'un oncogène viral, comme l' oncogène T de SV40, avantageusement associé à un gène de sélection, comme le gène néo de résistance à la néomycine. Ainsi, la demande de brevet internationale PCT publiée sous le numéro WO 97/40139 décrit des lignées immortalisées de cellules rétiniennes, et la demande de brevet internationale PCT publiée sous le numéro WO 93/06222 décrit des lignées de cellules endothéliales cérébrales immortalisées. Mais ces travaux ne concernent pas des lignées cellulaires endothéliales immortalisées humaines, qui seules permettent de se rapprocher de la situation de l'endothélium humain in vivo. La présente invention concerne donc des lignées immortalisées de cellules endothéliales de mammifère caractérisées en ce qu'elles comprennent un premier acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire avantageusement associé à au moins un gène de sélection, et un second acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire différent du premier avantageusement associé à au moins un gène de sélection. Des lignées immortalisées de cellules endothéliales de mammifère préférées selon l'invention sont caractérisées en ce que le premier acide nucléique contient un fragment immortalisant de l'oncogène T de SV40, avantageusement associé à un gène de sélection, et le second acide nucléique contient un fragment immortalisant de l'oncogène ras, avantageusement associé à un gène de sélection. Les gènes de sélection sont par exemple, le gène de résistance à la génétycine ou le gène de résistance à l'hygromycine. Les lignées immortalisées de cellules endothéliales selon l'invention dérivent de culture primaire de cellules de veinules post capillaires de tissus lymphoïdes, de capillaires de tissus non lymphoïdes et de vaisseaux. Les lignées humaines sont de préférences établies à partir de tissus inflammés ou provenant de sujets atteints de cancer. Les lignées suivantes conformes à l'invention ont été obtenues et caractérisées : - lignée de cellules endothéliales humaines immortalisées, dénommées HPLNEC. B3, provenant de ganglions cervicaux, déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur le 17 Décembre 1998 sous le No. 1-2102, - lignée de cellules endothéliales humaines immortalisées, dénommées HPLNEC.S1R1, provenant de ganglions inguinaux déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur le 22 Juin 1999 sous le No. 1-2104, - lignée de cellules endothéliales humaines immortalisées, dénommées HPLNEC. J6B, provenant de ganglions périphériques (cancer ovarien) déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur le 17 Décembre 1998 sous le No. 1-2103, - lignée de cellules endothéliales humaines immortalisées, dénommées HPLNEC. Mel, provenant de ganglions mésentériques (patient porteur d'un mélanome), déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur le 17 Décembre 1998 sous le No. 1-2101, - lignée de cellules endothéliales humaines immortalisées, dénommées HAPEC-S1, provenant d'un appendice inflammé, déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l' Institut Pasteur le 22 Juin 1999 sous le No. 1-2100, - lignée de cellules endothéliales humaines immortalisées, dénommées HLMEC, provenant d'un tissu pulmonaire inflammé, déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur le 22 Juin 1999 1998 sous le No. 1-2241. - lignée de cellules endothéliales humaines immortalisées, dénommées HSKMEC.1, provenant de la peau, déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur le 16 Juillet 1999 sous le No. 1-2250, lignée de cellules de cerveau humain immortalisées, dénommées HPLNEC. B3, provenant d'un patient porteur d'un glioblastome, déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur le 16 Juillet 1999 sous le No. 1-2249. Mais l'invention concerne des lignées de cellules endothéliales immortalisées de tout tissu humain ou animal, permettant de disposer d'outils représentatifs d'organes très différents (poumon, peau, intestin, cerveau, utérus, foie, rate, etc...) rendant possibles des comparaisons entre tissus et mammifères différents. Les travaux de recherche réalisés par les inventeurs chez la souris ont permis de comprendre l'importance de l'état inflammatoire pour obtenir des cultures en croissance. Il a ensuite été possible de mettre au point une méthode de transfection avec un plasmide contenant le gène T de SV40. Cette technique a été appliquée aux cellules endothéliales humaines en croissance et la phase de crise de croissance a été dépassée en réalisant une seconde transfection à l'aide d'un plasmide contenant l'oncogène ras. L'invention concerne aussi un procédé de préparation d'une lignée immortalisée de cellules endothéliales de mammifère par transfection, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on isole des cellules endothéliales en culture primaire dans un état inflammatoire dû à une réaction inflammatoire aiguë ou chronique ou à un état pathologique immun ou cancéreux, b) on transfecte les cellules de l'étape (a) en culture et en croissance active avec un premier acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire avantageusement associé à au moins un gène de sélection, c) on transfecte les cellules de l'étape (b) en croissance avec un second acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire différent du premier avantageusement associé à au moins un gène de sélection, d) on sélectionne les cellules transfectées par tout moyen approprié, comme des milieux de sélection correspondant aux gènes de sélection du premier et du second acides nucléiques, e) on isole et on clone les colonies doublement transformées. Un second procédé de préparation d'une lignée immortalisée de cellules endothéliales de mammifère par transfection selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on isole des cellules endothéliales en culture primaire dans un état inflammatoire, b) on transfecte les cellules de l'étape (a) en culture et en croissance active avec un premier acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire avantageusement associé à au moins un gène de sélection, c) on sélectionne les cellules transfectées à l'étape (b) par tout moyen approprié, comme des milieux de sélection correspondant au gène de sélection du premier acide nucléique, d) on transfecte les cellules de l'étape (c) en croissance avec un second acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire différent du premier avantageusement associé à au moins un gène de sélection, e) on sélectionne les cellules transfectées à l'étape (d) par tout moyen approprié, comme des milieux de sélection correspondant au gène de sélection du second acide nucléique, f) on isole et on clone les colonies doublement transformées. Les gènes de sélection sont par exemple, le gène de résistance à la génétycine pour le premier acide nucléique et le gène de résistance à l'hygromycine pour le second acide nucléique. Le procédé de l'invention est adapté à tout type de culture primaire, notamment, de cellules de veinules post capillaires de tissus lymphoïdes, de capillaires de tissus non lymphoïdes et de vaisseaux. Mais le procédé de l'invention est tout particulièrement adapté aux cellules humaines de préférence établies à partir de tissus inflammés ou provenant de sujets atteints de cancer. Une forme de mise en oeuvre préférée du procédé de l'invention consiste à réaliser la transfection de l'étape (b) après un temps court après mise en culture primaire avec un premier acide nucléique contenant un fragment immortalisant de l'oncogène T de SV40, avantageusement associé à un gène de sélection, et la seconde transfection avec un second acide nucléique contenant un fragment immortalisant de l'oncogène ras (10), avantageusement associé à un gène de sélection. Cette mise en oeuvre du procédé de l'invention permet tout particulièrement d'obtenir des lignées de cellules endothéliales immortalisées ne présentant pas le phénomène de crise et en conséquence dont la durée de vie est remarquable. De plus les lignées de cellules endothéliales immortalisées présentent une stabilité phénotypique accrue par rapport aux cellules mises en culture primaire qui perdent rapidement leurs antigènes de surface. L'invention concerne aussi les lignées de cellules endothéliales immortalisées de mammifère et de préférence humaine susceptibles d'être obtenues par le procédé ci-dessus. L'invention a également pour objet un modèle d'étude et de diagnostic de l'adhérence intercellulaire caractérisé en ce qu'il comprend au moins une lignée cellulaire endothéliale selon l'invention. Le modèle de l'invention permet l'étude des phénomènes invasifs et plus particulièrement : - des métastases, comme la prédiction de la localisation de métastases ou l'estimation du caractère invasif d'une tumeur, - de l'inflammation en phase aiguë et dans les pathologies chroniques, comme le recrutement des leucocytes ou le chimiotactisme, - du passage de la barrière hémato-céphalée, - de l'angiogénèse tumorale et des rejets de greffe, - des infections par des agents pathogènes et/ou des cellules déjà infectées. Le modèle de l'invention est utile pour l'étude des phénomènes ci-dessus et donc aussi pour le criblage de substances utile pour le traitement et/ou la prévention des maladies impliquant des phénomènes d'adhérence intercellulaire, tels que les cancers, les inflammations ou les infections virales. Le modèle de l'invention peut être mis en oeuvre selon des méthodes très diverses, comme celle utilisée pour l'adhérence des cellules normales ou transformées dans les conditions de flux (11), consistant à faire pousser les cellules des lignées cellulaires endothéliales de l'invention dans un flux établi par le dessin d'une chambre de flux, où la pression et le débit du flux sont contrôlés par un ensemble de pompes de précision. Un système de caméra et d'analyse d'images permet d'estimer le mouvement et la vitesse de passage des cellules ainsi que la force de l'interaction. Il est ainsi possible d'évaluer très facilement l'effet de substances injectées dans le flux sur l'interaction entre cellules circulantes et cellules endothéliales mais aussi sur l'état biologique des cellules endothéliales, comme l'activation des molécules de surface. Une autre technique susceptible d'être mise en oeuvre conformément au modèle de l'invention consiste à estimer l'adhérence cellulaire par cytométrie en flux (12). Cette technique est basée sur une étape d'adhérence statique et fournit des renseignements différents et complémentaires de la technique précédente, comme : la caractérisation phénotypique des populations cellulaires adhérentes, en particulier l'identification des antigènes caractéristiques des cellules circulantes ayant adhéré, la mesure des molécules induites à la surface des deux types cellulaires. Ces techniques peuvent ouvrir la voie au développement de molécules jouant un rôle inhibiteur dans chacune étape de l'invasion cellulaire. Enfin, la cytométrie donne un moyen de quantification rapide et surtout statistique de la reconnaissance cellule-cellule car elle permet une mesure efficace du nombre de cellules circulantes ayant adhéré par cellule endothéliale. L'invention concerne encore les procédés de criblage de substances capables de traiter et/ou prévenir des maladies impliquant des phénomènes d'adhérence intercellulaire, tels que les cancers, les inflammation ou les infections virales, consistant à mettre en contact lesdites substances avec une ou plusieurs lignées selon l'invention et à mesurer et/ou observer par tout moyen approprié les effets de ces substances sur le comportement et/ou les propriétés des dites lignées. L'invention se rapporte donc à un kit pour l'étude de l'adhérence intercellulaire comme les phénomènes invasifs cités ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend des compartiments contenant au moins une lignée cellulaire endothéliale selon l'invention, ainsi que les réactifs adéquats, comme les milieux marqueurs et fixateurs utiles pour les comptages ultérieurs. L'invention concerne enfin l'utilisation d'une substance influant l'adhérence et donc le recrutement cellulaire identifié avec le modèle ou le kit de l'invention ou encore selon le procédé de criblage selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des maladies impliquant des phénomènes d'adhérence intercellulaire, tels que les cancers, les inflammations ou les infections virales. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans la description qui suit concernant des exemples de préparation et d'utilisation des lignées de cellules endothéliales immortalisées de l'invention et qui se réfèrent aux dessins en annexe dans lesquels : La figure 1 représente la détection du facteur de von Willebrand dans des lignées de cellules endothéliales par cytométrie de flux. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 30 minutes à 37 C avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-facteur de von Willebrand humain. La liaison par incubation est détectée en présence d'anticorps de chèvre anti-immunoglobuline de lapin marqué à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC). Des histogrammes témoins sont obtenus en utilisant du sérum de lapin non immun dans la première étape. Les données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément. La figure 2 montre la détection de la production d'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE) dans des lignées de cellules endothéliales immortalisées. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 30 minutes à 37 C (a) soit en présence d'anticorps polyclonaux de chèvre anti-enzyme de conversion de l'angiotensine pulmonaire de lapin, soit, pour obtenir des histogrammes témoins en présence de sérum de chèvre non immun inactivé ; (b) après fixation, la liaison est détectée par une deuxième incubation en présence d'anticorps de lapin antiimmunoglobuline de chèvre marqué au FITC. Les données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément. La figure 3 représente la détection de la sélectine E intracellulaire dans des lignées de cellules endothéliales immortalisées. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 1 heure à 37 C (a) soit en présence d'anticorps de rat antiCD62 E (IgG2a de rat), soit, à titre de témoins isotypiques, en présence d'IgG2a de rat ; (b) la liaison est détectée par une deuxième incubation pendant 30 minutes à 4 C en présence d'anticorps de chèvre antiimmunoglobuline de rat marqué au FITC. Les données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément. La figure 4 représente des cellules endothéliales typant pour l'expression en surface de l'antigène CD34. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 45 minutes à 37 C en présence (1) d'anticorps monoclonal de souris antiCD34 ou d'IgGl en tant que témoin isotypique puis, après fixation, la liaison est détectée par une incubation de 30 minutes à 4 C en présence (2) d'anticorps de rat anti-immunoglobuline de souris marqué au FITC. Les données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément. La figure 5 représente des cellules endothéliales typant pour l'expression en surface de l'antigène CDl5s sialyl-Lewis X. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 45 minutes à 37 C en présence (1) d'anticorps monoclonal de souris anti-CD15s ou d'IgGl en tant que témoin isotypique puis, après fixation, la liaison est détectée par une incubation de 30 minutes à 4 C en présence (2) d'anticorps de rat anti-immunoglobuline de souris marqué au FITC. Les données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément. La figure 6 représente des cellules endothéliales typant pour l'expression en surface de l'antigène PNAd.JGl. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 45 minutes à 37 C en présence (1) d'anticorps monoclonal de rat anti-PNAd ou d'IgGl en tant que témoin isotypique puis, après fixation, la liaison est détectée par une incubation de 30 minutes à 4 C en présence (2) d'anticorps de souris anti-immunoglobuline de rat marqué au FITC. Les données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément. La figure 7 représente des cellules endothéliales typant pour l'expression en surface de l'antigène MECA 79- GlyCAM-1. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 45 minutes à 37 C en présence (1) d'anticorps monoclonal de rat anti-MECA 79 ou d'IgM de rat en tant que témoin isotypique puis, après fixation, la liaison est détectée par une incubation de 30 minutes à 4 C en présence (2) d'anticorps de souris anti-immunoglobuline de rat marqué au FITC. Les données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément. La figure 8 représente des cellules endothéliales typant pour l'expression en surface de l'antigène MECA 367- MadCAM-1. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 45 minutes à 37 C en présence (1) d'anticorps monoclonal de rat anti-MECA 367 ou d'IgGl de rat en tant que témoin isotypique puis, après fixation, la liaison est détectée par une incubation de 30 minutes à 4 C en présence (2) d'anticorps de souris anti-immunoglobuline de rat marqué au FITC. Les données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément. La figure 9 représente des cellules endothéliales typant pour l'expression en surface de l'antigène HECA452 - CLA. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 45 minutes à 37 C en présence (1) d'anticorps monoclonal de rat anti-HECA452 ou d'IgM de rat en tant que témoin isotypique puis, après fixation, la liaison est détectée par une incubation de 30 minutes à 4 C en présence (2) d'anticorps de souris anti-immunoglobuline de rat marqué au FITC. Les données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément. La figure 10 représente des cellules endothéliales typant pour l'expression en surface de l'antigène CD54 ICAM-1. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 45 minutes à 37 C en présence (1) d'anticorps monoclonal de souris anti-CD54 ou d'IgGl de souris en tant que témoin isotypique puis, après fixation, la liaison est détectée par une incubation de 30 minutes à 4 C en présence (2) d'anticorps de rat anti-immunoglobuline de souris marqué au FITC . Les données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément. I - MATERIELS ET METHODES. 1) Isolement et culture des cellules endothéliales microvasculaires. Les cellules endothéliales microvasculaires provenant de ganglions périphériques (Ager, 1987) ont été isolées selon la technique établie mise au point par Bizouarne ( Bizouarne, 1993 a-b). Cette technique consiste à désinfecter les ganglions de patients néoplasiques avec de la Bétadine (ASTA Médica, Mérignac, France) diluée au 1/10 (V/V) dans du PBSc (solution saline tamponnée phosphate (PBS) supplémentée avec du CaCl2 1 mM et du MgCl2 0,5 mM) pendant 10 minutes à la température ambiante (Tamb). Ensuite, le tissu est découpé en petits morceaux au moyen d'un scalpel, et lavé soigneusement avec du PBSc puis soumis pendant 1 à 2 heures à 37 C à une digestion enzymatique par un mélange de collagénase type I (1 mg/ml, Gibco BRL) et de dispase (1 mg/ml, Gibco BRL) dans du PBSc. Après traitement enzymatique, les cellules sont lavées à deux reprises avec du PBSc. Les cultures cellulaires sont démarrées dans des boîtes Primaria (Falcon, Becton Dickinson, Grenoble, France) dans du milieu OptiMEM (Gibco BRL) en présence de sérum de veau f#tal (SVF) à 3 % (fourni par Dutscher, France). Au bout de 1 à 2 heures, les cellules non adhérentes sont éliminées et soumises à une deuxième étape d'adhérence dans les mêmes conditions. Au bout de 5 à 7 jours, le milieu est supplémenté avec 5 % de SVF. Avant que les cultures primaires atteignent un stade de confluence monocouche, elles sont transférees dans des boîtes de culture tissulaire en vue de leur transfection. Dans le cas de la lignée HOMEC.J6B, les cellules provenant de l'épanchement pleural sont directement ensemencées dans les boîtes Primaria et la procédure d'adhérence évoquée plus haut leur est appliquée. 2) Immortalisation et sélection des cellules endothéliales. Les cultures de cellules endothéliales microvasculaires d'origine humaine provenant de tissus enflammés (Bizouarne et al., 1993b ; Gerritsen et al., 1996) sont plaquées dans des boîtes Primaria, le cas échéant passées une fois pour s'occuper des cellules à croissance exponentielle et transfectées avec le plasmide pSV3-néo (ATCC, Rockville, MD, USA) contenant la région précoce SV40 complète et le gène de résistance à la généticine et, simultanément ou successivement, avec un plasmide pBM6ras contenant l'oncogène ras et le gène de résistance à l'hygromycine (Uemura et al., 1992), aimablement fourni par le Pr. E. Hébert (CBM, Orléans, France). La transfection est réalisée de la manière décrite ci-dessus en utilisant une technique à base de liposomes cationiques avec du réactif lipofectine (Gibco BRL, Gaithersburg, USA) et les plasmides précités (Bizouarne et al., 1993a). La lipofectine (1 à 10 ug/ml) et les plasmides (1 à 6 ug/ml) sont mélangés dans du milieu de croissance OptiMEM exempt de sérum et d'antibiotique et puis laissés au repos pendant 15 minutes à la température ambiante afin de former des complexes. Chaque lignée est le résultat de l'étude de différentes concentrations de la lipofectine et des plasmides et de différents rapports entre eux. Ensuite, des des cultures de cellules endothéliales préalablement lavées avec du milieu OptiMEM exempt de sérum et incubées pendant 1 heure avant lavage sont incubées dans la solution contenant le complexe. Après 24 heures d'incubation, 5 % de SVF (V/V) sont ajoutés et la culture est poursuivie pendant 24 heures. Le mimieu est alors remplacé par du milieu OptiMEM complet contenant du SVF à 5 % et des antibiotiques. On laisse la culture croître pendant 7 à 14 jours jusqu'à l'apparition de colonies de cellules proliférant rapidement. La sélection des cellules transfectées par la généticine (Gibco BRL, Gaithersburg, USA) commence avec des doses d'antibiotique faibles (20 à 50 ug/ml) qui sont augmentées ensuite progressivement à 500-600 ug/ml. La sélection par l'hygromycine (Gibco) est alors mise en #uvre en ajoutant une concentration d'antibiotique de 20 ug/ml qui est augmentée jusqu'à la concentration nécessaire pour tuer les cellules témoins (normalement voisine de 100 ug/ml). Une fois sélectionnées, les cellules sont clonées en utilisant la méthode de dilution limitante, le pool cellulaire de travail étant conservé par stockage dans de l'azote liquide. On teste les lignées transformées pour rechercher la présence du gène SV40 T et un niveau élevé d'oncogène ras par une analyse Northern Blot de la manière décrite (Bizouarne et al., 1993a). On les teste également pour rechercher l'expression d'antigène anti-T par les anticorps anti-T (fournis par le Dr M. Nachtigal, Université de Caroline du Nord, USA) et la liaison protéine/anticorps anti-ras. Des taux élevés d'oncogène ras indiquent, conjointement avec la résistance à l'hygromycine, que la transfection par le plasmide correspondant est stable. 3) Caractérisation des lignées de cellules endothéliales humaines. a) Marqueurs de cellules endothéliales exprimés par des lignées de cellules endothéliales humaines:maraueurs généraux. - Facteur de von Willebrand (vWf) : Des cellules de la boîte de culture sont détachées avec de la collagénase (1 mg/ml) dans du PBSc contenant 1 % (m/V) de sérum albumine bovine (SAB) (Sepracor, France), du PBSc, de la SAB, pendant 15 à 30 minutes à 37 C puis les cellules sont lavées avec du PBSc-SAB, fixées et perméabilisées pendant 45 à 60 minutes à la température ambiante avec du paraformaldéhyde à 1,0 % (m/V) (Merck, Darmstadt, Allemagne) et une solution de saponine à 0,1 % (m/V) (Gibco BRL) dans du PBSc. Après un lavage soigneux dans du PBSc, un anticorps polyclonal de lapin anti-vWf humain V5899 (aimablement fourni par le Dr C. Mazurier du Centre de Transfusion Sanguine de Lille, France) est ajouté dilué dans du PBSc à la concentration de 2,0 à 10 mg/ml. Les cellules sont incubées pendant 30 minutes à la température ambiante. Comme témoin, du sérum de lapin normal à 3 % inactivé par la chaleur est utilisé. Après lavage, de l'anticorps secondaire de chèvre antiimmunoglobulines de lapin fluorescéiné (Institut Pasteur, Marnes-la-Coquette, France) est ajouté dilué au 1/50 dans du PBSc-SAB. Les cellules sont alors incubées pendant 30 minutes de plus à la température ambiante, lavées et remises en suspension pour analyse par cytométrie de flux. - Détection de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE) : L'anticorps polyclonal de chèvre anti-enzyme de conversion de l'angiotensine pulmonaire de lapin (anti-ACE) a été fourni par le Dr R. L. Soffer (Cornell University, NY, USA). Les cellules endothéliales sont incubées pendant 30 minutes à 37 C avec de l'anticorps anti-ACE dilué au 1/50 dans du PBSc-SAB. Après incubation, les cellules sont fixées pendant 15 minutes au moyen d' une solution de paraformaldéhyde à 1 % (m/V) dans du PBSc. Les groupes aldéhyde libres sont neutralisés par une incubation de 10 minutes au minimum dans une solution d'urée 0,2 M (Merck) dans du PBSc et les cellules sont lavées une nouvelle fois. Comme anticorps secondaire, un anticorps de lapin antiimmunoglobuline de chèvre (Sigma) dilué au 1/50 dans du PBSc-SAB est utilisé. - Détection de la sélectine E et P : Des cellules endothéliales détachées à la collagénase sont fixées et perméabilisées pendant 60 minutes dans du paraformaldéhyde à 1,0 % (m/V) et une solution de saponine à 0,1 % (m/V) dans du PBSc à la température ambiante. Après un lavage soigneux avec du PBSc, les cellules sont incubées pendant 1 heure à 37 C avec de l'anticorps monoclonal de rat anti-CD62E 4D10 (IgG2a, Immunotech, Marseille, France) dilué au 1/10 dans du PBSc-SAB. Comme témoin idiotypique, on utilise de l'IgG2a de rat (Rockland, Gilbertsville, PA, USA). Après incubation et lavage, les cellules sont exposées pendant 30 minutes à 4 C à l'anticorps de chèvre antirat marqué au FTC (fragment Fab) (Cappel, Durham, Royaume-Uni) dilué au 1/100 dans du PBSc-SAB. Pour le marquage de la sélectine P, des cellules fixées et perméabilisées avec l'anticorps antiGMP 140 humaine CLB-Thromb./6 (IgGl de souris, Immunotech) sont utilisées à la concentration de 10 ug/ml avec un témoin isotypique approprié. Le deuxième réactif est un anticorps de rat anti-immunoglobuline de souris marqué au FTC (fragment Fab, Becton Dickinson, Grenoble, France) dilué au 1/100 dans du PBSc-SAB. b) Marqueurs de cellules endothéliales exprimés par les lignées de cellules endothéliales humaines : marqueurs spécifiques au site. Détection des principales adressines vasculaires : Pour détecter les adressines membranaires, des cellules endothéliales sont détachées par traitement à la collagénase pendant 5 à 10 minutes à 37 C suivi d'un lavage soigneux avec du PBSc-SAB contenant 0,01 % (m/V) de NaN3. Ensuite, les cellules endothéliales sont incubées pendant 45 minutes à 37 C avec des anticorps monoclonaux, aimablement fournis par le Dr E. G. Butcher (Stanford, CA, USA) : MECA 79, HECA 452 (IgM de rat), MECA 367, PNAd JG1 (IgG2a de rat), et des témoins isotypiques de rat correspondants, c'est-à-dire des IgM de rat (Immunotech) et des IgG2a de rat (Sigma). Ensuite, les cellules sont incubées avec une solution de paraformaldéhyde à 1 % (m/V) dans du PBSc pendant 15 minutes à la température ambiante, puis lavées avec de l'urée 0,2 mM dans du PBSc avant d'être incubées pendant 30 minutes à 4 C avec le deuxième réactif, c'est-à-dire un anticorps de chèvre anti-immunoglobuline de rat marqué au FTC (fragment Fab, Cappel) dilué au 1/100 dans du PBSc-SAB. De manière similaire, une coloration membranaire des cellules endothéliales est effectuée en utilisant un anticorps anti-CD34 (IgGl de souris, Immunotech) et anti-CD15s (anti-sialyl-Lewis X, IgM de souris fourni par Becton Dickinson) ainsi qu'un anticorps anti-CD54 (ICAM-1) (IgGl de souris, Novocastra Laboratories, Newcastle/ Tyne, Royaume-Uni), un anticorps anti-CD43 (leucosialine) (IgG2 de souris fourni par R&D Systems, Abingdon, Royaume-Uni) et un anticorps monoclonal anti-antigène Ll (Ebeling et al., 1996) (IgGl de souris, aimablement fourni par le Dr P. Altevogt du Centre de Cancérologie Allemand, Heidelberg, Allemagne). Des témoins sont réalisés en incubant en parallèle des cellules testées en présence des immunoglobulines normales IgG ou IgM de souris (R&D Systems). Le deuxième réactif utilisé est un anticorps de rat anti-immunoglobuline de souris marqué au FTC (fragment Fab, Becton Dickinson) dilué au 1/100 dans du PBSc-SAB. - Analyse par cytométrie de flux. Après coloration, les cellules sont lavées une fois avec du PBSc-SAB et analysées par cytométrie de flux au moyen d'un FACS 440 ou d'un FACSort (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA). Cinq mille cellules sont mesurées (avec déclenchement par diffusion directe et latérale). Les résultats sont présentés sous la forme d'histogrammes avec en abscisses les valeurs de fluorescence moyennes correspondant à Fl-1 et en ordonnées le nombre de cellules pour une fluorescence donnée. Les tranches moyennes d'intensité de fluorescence sont calculées en utilisant PC Lysis ou le logiciel CellQuest (Becton Dickinson), respectivement. Les valeurs de tranches de fluorescence moyennes pour les cellules témoins appropriées sont fixées en dessous de 10 (généralement à une valeur de 3 à 4). Sur les histogrammes présentés, une seule expérience typique est décrite sur un total de cinq. c) Origine des lignées de cellules endothéliales humaines établies dans l'étude : HPLNEC. B3 Cellules endothéliales provenant d'un ganglion cervical (périphérique) d'un patient présentant un lymphome de Hodgkin. - HPLNEC.2S1R1 : Cellules endothéliales provenant d'un ganglion inguinal d'un patient présentant un lymphome de type non hodgkinien. HOMEC.J6B Cellules endothéliales microvasculaires provenant d'un épanchement pleural d'une patiente présentant un carcinome des ovaires. HPLNEC. Mel Cellules endothéliales isolées à partir d'un ganglion iléal métastatique d'un patient présentant un mélanome malin. - HAPEC.S1 : Cellules endothéliales provenant d'un échantillon chirurgical d'appendice enflammé. - HLMEC : Cellules HS888Lu endothéliales provenant d'une région de tissu pulmonaire normal d'un patient présentant un ostéosarcome avec métastases en direction du poumon (acheté à la collection européenne ECACC : European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, Royaume-Uni). Les cellules ont pu supporter environ 11 duplications avant de cesser (voir la référence : ATCC CCL 211). Etablie comme lignée cellulaire in vitro et clonée de la manière décrite cidessus. - HIMEC-1 : Cellules endothéliales microvasculaires isolées à partir d'un intestin normal (isolées et envoyées à notre attention sous la forme de cultures primaires par G. Haraldsen, Institut de Pathologie, Rikshospitalet, Oslo, Norvège, Haraldsen et al., 1996). - HSMEC : Cellules endothéliales microvasculaires isolées à partir de peau (fournies sous la forme d'une lignée immortalisée de vecteurs pSVT par E. W. Ades, National Center for Infectious Diseases, Atlanta, USA, Ades et; al., 1992 ; Bosse et al., 1993). Reclonées ainsi que décrit ci-dessus. - ECV304 : Lignée cellulaire d'endothélium de cordon ombilical transformée spontanément in vitro, fournie par le Dr J. Fantini (Ingénierie des Protéines, URA 1455 CNRS, Marseille). Cette lignée cellulaire a été obtenue à partir d'un nouveau-né japonais de sexe féminin par le Dr K. Takahashi (In Vitro 26,265, 1990) et déposé à la collection ECACC sous le numéro 92091712. - HspEC : Cellules endothéliales de rate enflammée. - HLiMEC : Cellules endothéliales provenant de microvaisseaux de foie enflammé. HBrMEC Cellules endothéliales microvasculaires de cerveau humain provenant d'un patient atteint d'une tumeur. II - RESULTATS. 1) Caractéristiques générales des lignées de cellules endothéliales. Des marqueurs généraux pour les cellules endothéliales ont été évalués en premier. Les composés suivants ont été choisis comme marqueur spécifique pour les cellules endothéliales : (i) l'antigène de von Willebrand, (ii) l'enzyme de conversion de l'angiotensine et enfin (iii) la sélectine E intracellulaire. Les résultats des lignées de sélection avec les marqueurs précités sont présentés sur les figures 1 à 3. La figure 1 illustre le marquage de cellules perméabilisées avec l'anticorps spécifique anti-facteur de von Willebrand. Toutes les lignées ont été marquées avec l'anticorps, la moyenne allant de 12 pour les cellules HPLNEC.Mel à marquage minimal à 37 pour les cellules HOMEC.J6B à marquage maximal. Etant donné que les témoins sont inférieurs à 10 (en général de 3 à 4), toutes les lignées sont classées positives. Certaines lignées présentent un marquage informe, par exemple HPLNEC.2S1R1, HPLNEC. Mel, HIMEC-1, HSMEC-1 et HAPEC.S1 tandis que d'autres présentent un schéma de marquage bimodal, comme par exemple HPLNEC.B3, HLMEC-1 et surtout ECV304 (témoin). La figure 2 présente les données de marquage des lignées cellulaires avec un anticorps polyclonal anti-ACE. Comme dans l'exemple précédent, toutes les lignées cellulaires sont positives, avec des valeur moyennes de FL1 allant de 55 pour les cellules HPLNEC.Mel à marquage minimal à 190 pour les cellules HOMEC.6JB à marquage maximal. Les graphiques montrent que toutes les cellules ont été marquées positivement dans n'importe laquelle des lignées analysées pour rechercher l'enzyme de conversion de l'angiotensine. Comme le montre la figure 3, qui présente les histogrammes de données, le marquage pour déterminer la présence intracellulaire de sélectine E (Bevilacqua et al., 1991) en conditions de repos est également positif pour toutes les lignées cellulaires et les valeurs de marquage moyennes sont respectivement de 20 pour les cellules HLMEC à marquage minimal et de 75 pour les cellules HPLNEC.Mel à marquage maximal. Compte tenu de l'expression de marqueurs typiques des cellules endothéliales, toutes les lignées cellulaires peuvent être classées comme étant des lignées endothéliales. La détection de la sélectine P conduit à une première distinction entre cellules endothéliales d'origines différentes. La sélectine P n'a pas pu être détectée à l'intérieur de cellules provenant de ganglions périphériques et des poumons alors qu'elle est détectée dans les cellules issues de l'appendice (type muqueuse) et d'autres cellules (micro)vasculaires telles que les HIMEC, HSMEC et ECV304 (témoins). Ces données sont récapitulées dans le tableau 1 ci-dessus. Tableau 1 : Marqueurs généraux des cellules endothéliales tels que détectés après perméabilisation. vWf ACE CD62E CD62P HPLNEC. B3 + + + HPLNEC.2S1R1 + + + HOMEC.J6B + + +HPLNEC.Mel + + + HAPEC.S1 + + + + HLMEC + + +HIMEC-1 + + + + HSMEC-1 + + + + ECV304 + + + + 2) Ligands de cellules endothéliales microvasculaires pour la détection des molécules d'adhérence. Deux anticorps monoclonaux spécifiques d'antigènes à large distribution intervenant comme ligands pour la molécule d'adhérence de la sélectine L : anti-CD34 (voir Lasky, 1995 et Whelan, 1996) comme ligand de la sélectine L et anti-CDl5s (sialyl-Lewis X) (Skurk et al., 1994) comme épitope des ligands de la sélectine L, ont été testés en immunofluorescence indirecte sur nos lignées de cellules endothéliales. L'un et l'autre expriment des schémas de liaison similaires, dont les données établies par cytométrie de flux sont présentées sur les figures 4 et 5. Trois lignées cellulaires, à savoir HPLNEC.B3, HPLNEC.2S1R1 et HOMEC.J6B, réagissent positivement avec les deux anticorps. Les six autres lignées sont négatives vis-àvis de l'anticorps anti-CD34. On observe une faible positivité pour les HLMEC, HPLNEC.Mel et HSMEC-1 colorées avec l'anticorps anti-CDl5s, les trois lignées restantes étant négatives. 3) Expression des adressines endothéliales spécifiques au site. La réactivité de lignées a été étuduée vis- à-vis des anticorps monoclonaux dirigés contre les antigènes membranaires appelés adressines. Les données correspondantes sont présentées sur les figures 6 à 9. La réactivité de l'anticorps PNAd JG1 (adressine de ganglion périphérique, anticorps JG1) vis- à-vis des différentes lignées est présentée sur la figure 6. Le schéma de liaison est similaire à celui obtenu avec les anticorps anti-CD34 et anti-CD15s : seules les lignées HPLNEC.B3, HPLNEC.2S1R1 et HOMEC.J6B sont nettement positives dans la réaction avec cet anticorps qui a été dirigé pour détecter une molécule d'adressine typique d'un ganglion périphérique humain. Cette série a ensuite été comparée au schéma de marquage obtenu avec l'anticorps MECA 79 (Michie et al., 1993) et l'anticorps MECA 367 (Streeter et al., 1988). Ils ont été dirigés pour le typage d'adressines de souris spécifiquement pour des ganglions périphériques (GlyCAM- 1) (Michie et al., 1993) et pour des organes lymphoïdes de muqueuses (MadCAM-1) (Streeter et al., 1988) mais leur expression est dépendante du micro-environnement (Denis et al., 1996) ; ils présentent des réactions croisées dans le système humain. Après incubation avec l'anticorps monoclonal dirigé contre l'adressine de ganglion périphérique MECA 79 (figure 7), une sous-population de cellules s'est révélée positive dans les lignées HPLNEC. B3, HOMEC.J6B, HPLNEC.2S1R1 et pulmonaire. La population de cellules positives la plus importante est trouvée dans HPLNEC.B3, environ 50 %, et dans HOMEC. J6B, 40 %. Les lignées HPLNEC.2S1R1 et HLMEC présentent environ 25 à 30 % de cellules positives. Les cinq autres lignées sont négatives dans cette réaction. Enfin, la liaison de l'anticorps monoclonal dirigé contre l'adressine de muqueuse de souris MadCAM-1 (Nakache et al., 1989), appelée MECA 367, a été évaluée. Comme le montre la figure 8, les mêmes quatre lignées se sont révélées positives comme dans les expériences précédentes. Dans le cas de cet anticorps, les histogrammes sont nettement bimodaux, avec une proportion de cellules qui n'expriment pas l'antigène et une proportion de HPLNEC. B3 (75 %) fortement positive. Cette proportion de cellules fortement marquées est légèrement moindre (65 %) pour la lignée HOMEC.J6B et elle descend jusqu'à 20 % pour HPLNEC.2S1R1 et HLMEC. Les cellules HAPEC.S1 présentent un seul marquage homogène par le MECA 367. La totalité de la population réagit positivement, ce qui démontre clairement qu'il s'agit de cellules endothéliales de type muqueuses. Les autres lignées sont négatives, c'est-à-dire que les adressines de ganglion ne sont pas détectables dans les lignées HPLNEC.Mel, HIMEC, HSMEC et ECV. Des résultats tout à fait comparables sont obtenus lorsque les cellules sont colorées avec l'anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène HECA 452 (Berg et al., 1991), qui colore un épitope glycosylation-dépendant du ligand de la sélectine E, l'antigène CLA (antigène de lymphocyte cutané). La figure 9 indique que l'anticorps anti-HECA 452 marque principalement les lignées présentant une liaison positive vis-à-vis des adressine de ganglions, à savoir HPLNEC.B3 (60 %), HPLNEC.2S1R1 (30 %) et HOMEC.J6B (40 %). Il lie également faiblement les lignées HLMEC, HIMEC-1 (15 %) et les quatre autres lignées, notamment HSMEC, lignée pour laquelle toutes les cellules sont faiblement marquées. Ces résultats indiquent que les cellules endothéliales provenant de différents tissus qui composent le jeu que nous nous sommes procuré diffèrent en fait par les antigènes qu'elles présentent à leur surface. 4) Expression des antigènes ICAM-1 (CD54) et leucosialine (CD43) et distribution sur les lignées de cellules endothéliales. L'antigène CD43, la leucosialine (Carlson et Fukuda, 1986) suit une répartition bimodale sur les lignées cellulaires qui ont présenté jusqu'à présent une réaction positive avec les antigènes typiques des ganglions périphériques, principalement HPLNEC.B3, HPLNEC.2S1R1 et HOMEC.J6B. Une réaction plus faible est observée avec HLMEC et aucune réaction avec les cellules endothéliales provenant de tissus microvasculaires telles que HIMEC-1 et HSMEC-1. Le témoin ECV304 présente également une faible réaction. L'antigène CD54, ICAM-1 (voir Springer, 1995) présente une distribution à l'opposé de celle des molécules précédemment étudiées. La figure 10 montre en effet que l'ICAM-1 n'est pas détecté dans la plupart des cellules provenant d'organes lymphoïdes alors qu'il est clairement mis en évidence dans les cellules endothéliales provenant de tissus microvasculaires, c'est-à-dire HIMEC-1 et HSMEC-1 et aussi, quoique dans une moindre mesure, HLMEC. La distribution différentielle du CD54 confirme le caractère spécifique de l'origine tissulaire des cellules endothéliales qui a été mis en lumière par les marqueurs précédents. Ces données sont récapitulées dans le tableau 2 qui permet de comparer l'expression du CD54 par rapport au CD34, CD15s, PNAd, puis au MadCAM-1 et au Ll. L'ICAM-1 (CD54) se comporte (à l'instar de la sélectine P) comme une molécule d'adhérence d'organe lymphoïde non périphérique. Le CD34, le CDl5s et le PNAd sont en effet des marqueurs des tissus lymphoïdes périphériques pour les cellules endothéliales humaines et ils se lient aux lignées dérivées de ces organes. Le MadCAM-1 est exprimé de manière particulièrement intense et sur la totalité de la population de cellules endothéliales provenant de l'appendice, ce qui confirme qu'il s'agit de cellules endothéliales de type muqueuse. L'expression de Ll type clairement des cellules endothéliales de grands vaisseaux. Tableau 2 : Distribution des adressines de cellules endothéliales sur les lignées de cellules endothéliales CD54 CD34 CDl5s PNAd MECA367 Ll HPLNEC.B3 + + + + HPLNEC.2S1R1 - + + + + HOMEC.J6B - + + + + HPLNEC. Mel - - - - - HAPEC.S1 ± + HLMEC HIMEC-1 + HSMEC-1 + ECV304 + + Références bibliographiques 1) Ades E. W., F. J. Candal, R. A. Swerlick, V. G. George, S. Summers, D. C. Bosse et T.J. Lawley, 1992. HMEC-1 : Etablissement d'une lignée de cellules endothéliales microvasculaires humaines immortalisées. J. Invest. Dermatol. 99 :683-690. 2) Ager, A. 1987. Isolation et culture de cellules endothéliales supérieures provenant de ganglions de rat. J. Cell Sci. 87 :133-193. 3) Berg E. L., T. Yoshino, L. S. Rott, M.K. Robinson, R.A. Warnock, T.K. Kishimoto, L.J. Picker et E. C. Butcher, 1991. L'antigène de lymphocyte cutané est un récepteur de ciblage des lymphocytes de la peau pour la molécule d'adhérence cellule endothéliale de lectine vasculaire/lymphocyte. J. Exp. 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Acquisition de l'indépendance à l'interleukine 3 chez des cellules FDC-P2 après transfection avec le gène c-H-ras en utilisant un vecteur plasmidique à base de papillomavirus bovin. Blood 80 :3198-3204. 20) Whelan J., 1996. Synthèse de la sélectine et inflammation. TIBS 21 :65-69. REVENDICATIONS 1) Lignées immortalisées de cellules endothéliales de mammifère, caractérisées en ce qu'elles comprennent un premier acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire avantageusement associé à au moins un gène de sélection, et un second acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire différent du premier avantageusement associé à au moins un gène de sélection. 2) Lignées immortalisées de cellules endothéliales de mammifère selon la revendication 1, caractérisées en ce que le premier acide nucléique contient un fragment immortalisant de l'oncogène T de SV40, avantageusement associé à un gène de sélection, et le second acide nucléique contient un fragment immortalisant de l'oncogène ras, avantageusement associé à un gène de sélection. 3) Lignées immortalisées de cellules endothéliales de mammifère selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisées en ce qu'elles dérivent de culture primaire de cellules de veinules post capillaires de tissus lymphoïdes, de capillaires de tissus non lymphoïdes et de vaisseaux. 4) Lignées immortalisées de cellules endothéliales de mammifère selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce qu'elles sont établies à partir de tissus inflammés ou provenant de sujets atteints de cancer, ou dans un état permettant la croissance de l'endothélium. 5) Lignée de cellules endothéliales humaines immortalisées choisie parmi celle provenant : - de ganglions cervicaux, déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur le 17 Décembre 1998 sous le No. 1-2102, - de ganglions inguinaux déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur le 22 Juin 1999 sous le No. 1-2104, - de ganglions périphériques déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur le 17 Décembre 1998 sous le No. 1-2103, - de ganglions mésentériques déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur le 17 Décembre 1998 sous le No. 1-2101, - d'un appendice inflammé déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur le 22 Juin 1999 sous le No. 1-2100, - d'un tissu pulmonaire inflammé, déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur le 22 Juin 1999 1998 sous le No. 1-2241. de la peau, déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur le 16 Juillet 1999 sous le No. 1-2250, - d'un patient porteur d'un glioblastome, déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur le 16 Juillet 1999 sous le No. 1-2249. 6) Procédé de préparation d'une lignée immortalisée de cellules endothéliales de mammifère par transfection, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on isole des cellules endothéliales en culture primaire dans un état inflammatoire dû à une réaction inflammatoire aigüe ou chronique ou à un état pathologique immun ou cancéreux, b) on transfecte les cellules de l'étape (a) en culture et en croissance active avec un premier acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire avantageusement associé à au moins un gène de sélection, c) on transfecte les cellules de l'étape (b) avec un second acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire différent du premier avantageusement associé à au moins un gène de sélection, d) on sélectionne les cellules transfectées par tout moyen approprié, comme des milieux de sélection correspondant aux gènes de sélection du premier et du second acides nucléiques, e) on isole et on clone les colonies doublement transformées. 7) Procédé de préparation d'une lignée immortalisée de cellules endothéliales de mammifère par transfection, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on isole des cellules endothéliales en culture primaire dans un état inflammatoire, b) on transfecte les cellules de l'étape (a) en culture et en croissance active avec un premier acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire avantageusement associé à au moins un gène de sélection, c) on sélectionne les cellules transfectées à l'étape (b) par tout moyen approprié, comme des milieux de sélection correspondant au gène de sélection du premier acide nucléique, d) on transfecte les cellules de l'étape (c) en croissance avec un second acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire différent du premier avantageusement associé à au moins un gène de sélection, e) on sélectionne les cellules transfectées à l'étape (d) par tout moyen approprié, comme des milieux de sélection correspondant au gène de sélection du second acide nucléique, f) on isole et on clone les colonies doublement transformées. 8) Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'on réalise la transfection de l'étape (b) avec un premier acide nucléique contenant un fragment immortalisant de l'oncogène T de SV40, avantageusement associé à un gène de sélection, et la seconde transfection avec un second acide nucléique contenant un fragment immortalisant de l'oncogène ras, avantageusement associé à un gène de sélection. 9) Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que les gènes de sélection sont le gène de résistance à la génétycine pour le premier acide nucléique et le gène de résistance à l'hygromycine pour le second acide nucléique. 10) Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que les cellules endothéliales en culture primaire de l'étape (a) sont choisies parmi des cellules de veinules post capillaires de tissus lymphoïdes, des cellules de capillaires de tissus non lymphoïdes et des cellules de vaisseaux. 11) Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisé en ce que les cellules endothéliales en culture primaire de l'étape (a) sont des cellules humaines de tissus inflammés ou provenant de sujets atteints de cancer. 12) Lignée immortalisée de cellules endothéliales de mammifère obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 11. 13) Modèle d'étude et de diagnostic de l'adhérence intercellulaire, caractérisé en qu'il comprend au moins une lignée cellulaire endothéliale immortalisée selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou selon la revendication 12. 14) Utilisation d'un modèle d'étude selon la revendication 13 pour l'étude des phénomènes invasifs et plus particulièrement : - des métastases, comme la prédiction de la localisation de métastases ou l'estimation du caractère invasif d'une tumeur, - de l'inflammation en phase aiguë et dans les pathologies chroniques, comme le recrutement des leucocytes ou le chimiotactisme, - du passage de la barrière hémato-céphalée, - de l'angiogénèse tumorale et des rejets de greffe, - des infections par des agents pathogènes et/ou des cellules déjà infectées. 15) Utilisation d'un modèle selon la revendication 13 pour le criblage de substances utiles pour le traitement et/ou la prévention des maladies impliquant des phénomènes d'adhérence intercellulaire, tels que les cancers, les inflammations ou les infections virales. 16) Kit pour l'étude de l'adhérence intercellulaire et/ou pour le criblage de substances utiles pour le traitement et/ou la prévention des maladies impliquant des phénomènes d'adhérence intercellulaire, tels que les cancers, les inflammations ou les infections virales, caractérisé en ce qu'il comprend des compartiments contenant au moins une lignée cellulaire endothéliale selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou selon la revendication 12. 17) Procédé de criblage de substances capables de traiter et/ou prévenir des maladies impliquant des phénomènes d'adhérence intercellulaire, tels que les cancers, les inflammations ou les infections virales, caractériser en ce qu'il comprend la mise en contact desdites substances avec une ou plusieurs lignées selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou selon la revendication 12, puis la mesure et/ou l'observation, par tout moyen approprié, des effets de ces substances sur le comportement et/ou les propriétés des dites lignées. 18) Utilisation d'une substance influant l'adhérence et donc le recrutement cellulaire identifiée avec le modèle selon la revendication 13 ou le kit selon la revendication 16 ou encore selon le procédé de criblage selon la revendication 17, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des maladies impliquant des phénomènes d'adhérence intercellulaire, tels que les cancers, les inflammations ou les infections virales.