Brevet FR2804692A1 — publié le 20010810

Procédé de détection et de quantification d'adénovirus. La présente invention est relative à un procédé de détection et de quantification dans divers milieux biologiques d'acides nucléiques d'adénovirus par la mesure en temps réel de l'amplification en chaîne par polymérase (PCR). Elle a en outre pour objet des oligonucléotides pour la mise en oeuvre de ce procédé. La thérapie génique connaît actuellement un développement important. Les adénovirus, qui sont naturellement responsables d'infection généralement bénignes, figurent parmi les vecteurs utilisés du fait de leurs nombreux avantages. L'extension du développement clinique de ces vecteurs adénoviraux, à des phases tardives II et III aux fins d'enregistrement et d'autorisation de mise sur le marché, rend nécessaire le développement, la validation et la mise en #uvre de techniques spécifiques et sensibles permettant la mesure de la biodistribution quantitative et qualitative des adénovecteurs dans les divers compartiments biologiques et la détection de l'émergence à faible charge virale d'infection par des contaminants de la production d'adénovecteurs (en particulier adénovecteurs recombinant compétents pour la réplication). Il est en outre nécessaire de détecter les infections intercurrentes adénovirales dues à des virus sauvages de différents sérotypes, responsables de la vaste majorité de l'incidence de ces infections naturelles, que ces infections soient florides ou latentes cliniquement, et de déterminer la cinétique virologique de ces infections sauvages, et la signification clinique dans diverses situations, au sein de la population générale ou chez des patients à risques (patients souffrant de cancer, transplantés, immunosupprimés ou immunodéprimés, etc.). La présence d'un adénovirus en culture cellulaire permissive est visualisée, dans les techniques de détection utilisées jusqu'à présent en routine, par un effet cytopathique dans la couche cellulaire. Pour démontrer que cet effet cytopathique est bien dû à un adénovirus, on détecte par méthode ELISA un antigène spécifique de l'adénovirus. Des techniques d'amplification d'acides nucléiques extraits d'adénovirus par PCR ont été en outre décrites. Ainsi la demande de brevet japonais JP 07327700 décrit une méthode de type PCR dans laquelle des parties de l'ADN codant pour l'hexon, une protéine de la capside des adénovirus, sont amplifiées. Les produits d'amplification sont mis en dot blot puis hybridés avec des sondes spécifiques de chaques sérotypes. Cette méthode est donc destinée à identifier les sous groupes et les sérotypes et non à détecter et à quantifier l'ensemble des adénovirus présents dans un échantillon. En outre la sensibilité de cette méthode est faible et donc peu adaptée à des dosages précis, tels que ceux requis lors du suivi de patients traités par thérapie génique. Pring-Akerblom et al. (Journal of Medical Virology, 1999, Vol. 58 , pp. 87-92) ont également décrit une méthode mettant en oeuvre six couples d'amorces dans une même réaction PCR (PCR dite multiplex). L'identification du sous-groupe est faite en déposant les produits de PCR sur gel d'électrophorèse puis en déterminant la taille des produits de PCR. Crawford-Miksza et al. (Journal of Clinical Microbiology 1999, Vol. 37, pp. 1107-1112) ont décrit une PCR hexon détectant spécifiquement les adénovirus de types 4,7 et 21 utilisant des amorces consensus comprenant de l'inosine comme base nucléique en cas de mésappariement sur certaine position variable. Dans ce document neuf amorces distinctes sont décrites. Ces techniques antérieures mettent en oeuvre une PCR standard et une méthode d'analyse classique généralement sur gel d'électrophorèse avec ou sans hybridation. Aucune de ces techniques ne permet à la fois de détecter de façon large les adénovirus provenant de la majorité des sérotypes connus et d'en quantifier les charges virales avec une sensibilité en adéquation avec les besoins de la thérapie génique notamment. La présente invention a donc pour but de résoudre ces problèmes en fournissant une technique sensible et permettant de détecter la majorité des sérotypes d'adénovirus. Les demandeurs ont montré de manière surprenante que de tels avantages sont obtenus en amplifiant en temps réel une séquence déterminée de l'ADN codant pour l'hexon, à l'aide d'amorces présentant une dégénérescence limitée, et en mettant en évidence le produit d'amplification à l'aide d'une sonde non dégénérée. La présente invention est tout d'abord relative à un procédé de détection et / ou de quantification d'acides nucléiques d'adénovirus dans un échantillon biologique dans lequel : - une séquence nucléotidique d'adénovirus est amplifié par PCR en temps réel à l'aide d'un couple d'amorces sens et anti-sens dégénérées, constituées de mélanges d'oligonucléotides présentant une homologie d'au moins 80% avec une séquence comprise entre les nucléotides 21000 et 22000 de la séquence de l'adénovirus de type 5, correspondant à la séquence SEQ ID N 4, ou avec sa séquence complémentaire, et - le produit de la réaction d'amplification est détecté à l'aide d'une sonde non dégénérée, constituée d'un ou plusieurs oligonucléotides présentant une homologie d'au moins 80% avec une séquence comprise entre les nucléotides 21000 et 22000 de la séquence de l'adénovirus de type 5, correspondant à la séquence SEQ ID N 4, ou avec sa séquence complémentaire, durant un nombre de cycles suffisant pour permettre l'obtention d'une quantité mesurable de produit d'amplification. On entend par PCR en temps réel toute technique d'amplification permettant de suivre l'évolution de la réaction d'amplification en cours. Avantageusement les séquences des amorces et/ou de la sonde présentent une homologie d'au moins 80% avec une séquence comprise entre les nucléotides 540 et 780 de la séquence SEQ ID N 4, ou avec sa séquence complémentaire. Les deux amorces sont respectivement choisies sur les brins sens et anti-sens, et de manière à permettre l'amplification d'un fragment d'ADN. La sonde est quant à elle choisie de manière à s'hybrider avec le fragment d'ADN résultant de l'amplification. Les amorces de PCR conformes à la présente invention utilisées pour amplifier l'acide nucléique d'adénovirus cible d'un échantillon se situent dans une zone constante pour le gène hexon des adénovirus humains et le site d'hybridation de la sonde conforme à la présente invention se situe entre les deux amorces. Préférentiellement les adénovirus sont à tropisme humain. De manière avantageuse lesdits oligonucléotides comprennent au moins 15 nucléotides et la sonde présente une température de fusion Tm théorique supérieure d'environ 10 C 0,5 aux Tm théoriques des amorces. Un tel procédé est appelée méthode PCR hexon en abrégé dans la suite du texte. Il comprend en substance une répétition du cycle comprenant les étapes suivantes : - séparation des brins à amplifier par chauffage de l'ADN extrait de l'échantillon, - hybridation de la sonde, - hybridation avec des amorces telles que définies ci-dessus, et - élongation avec une polymérase. Il est préférentiellement mis en oeuvre à l'aide des amorces sens et anti-sens HEX1 et HEX2 décrites ci-dessous et le produit d'amplification est préférentiellement hybridé à la sonde HEX décrite ci-dessous. La présente invention a notamment pour objet un oligonucléotide caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N 1 suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80 %, et préférentiellement de 90 % et encore plus préférentiellement de 95 %, avec ladite séquence : 5' - YCC CAT GGA YGA GCC CAC MCT - 3' dans laquelle Y représente C ou T et M représente A ou C. De manière préférentielle ledit oligonucléotide comprend entre 15 et 30 nucléotides. La présente invention a en outre pour objet une amorce sens HEX1 constituée par un mélange d'oligonucléotides répondant à cette définition. Ainsi l'amorce HEX1 présente trois dégénérescences en position 1,10 et 19 permettant de couvrir la majorité des sérotypes. La présente invention a encore pour objet un deuxième oligonucléotide caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N 2 suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80 %, et préférentiellement de 90 % et encore plus préférentiellement de 95 %, avec ladite séquence : 5' - GAG AAS GGB GTG CGC AGG TAS AC - 3' dans laquelle S représente G ou C et B représente C, G ou T. De manière préférentielle ledit oligonucléotide comprend entre 15 et 30 nucléotides. La présente invention a en outre pour objet une amorce anti-sens HEX2 constituée par un mélange d'oligonucléotides répondant à cette définition. Ainsi l'amorce HEX2 présente trois dégénérescences en position 6,9 et 21 permettant de couvrir la majorité des sérotypes séquences. Préférentiellement lesdites amorces comprennent au moins deux oligonucléotides, et encore plus préférentiellement trois ou quatre oligonucléotides. Les positions des séquences SEQ ID N 1 et 2, localisées dans la partie 3' de l'ORF codant la protéine Hexon, sont, en prenant comme référence la séquence complète de l'adénovirus de type 5 (n de dépôt M73260), respectivement 21565 (HEX1) et 21656 (HEX2). Elles correspondent aux positions 21048 et 21139 de la séquence Ad5CMVp53 (longueur 35308 pb). Les demandeurs ont montré que la concentration des amorces est un paramètre critique de la PCR en temps réel. En conséquence, la dégénérescence des amorces HEX et HEX2 a été limitée. La présente invention a en outre pour objet un troisième oligonucléotide caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N 3 suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80 %, et préférentiellement de 90 % et encore plus préférentiellement de 95 %, avec ladite séquence, ou avec une séquence complémentaire de ladite séquence : 5' - CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA - 3'. De manière préférentielle ledit oligonucléotide comprend entre 20 et 35 nucléotides. La présente invention a en outre pour objet une sonde HEX comprenant au moins un oligonucléotide présentant cette séquence. Elle est en outre relative à des oligonucléotides présentant une séquence complémentaire de celles des oligonucléotides mentionnés ci dessus. Selon un mode de mise en oeuvre préférentiel de la présente invention la sonde comporte une molécule ou un système de molécules révélateur. Ledit système révélateur est constitué de préférence par un colorant reporteur et un colorant extincteur de fluorescence, respectivement fixés aux extrémités 5' et 3'de la sonde. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux le système révélateur est constitué par la paire reporter / quencher représentée par la 6-carboxyfluorescéine (FAM) et la 6carboxytétraméthylrhodamine (TAMRA) respectivement fixé en 5' et en 3' de la sonde. L'une des amorces peut être marquée de cette manière et avoir le rôle de sonde. Une sonde particulièrement préférée selon l'invention est constituée par : 5' FAM- CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA -TAMRA 3'. Un tel système révélateur peut aussi être un système révélateur dit de tailing . Le tailing consiste à inclure à une des extrémités de la sonde une queue (tail) qui peut s'autoapparier. Cet autoappariement est mis en évidence à l'aide d'un marqueur qui se fixe spécifiquement sur la séquence dans cette configuration. En présence de cible il y a désappariement et un signal est émis. En absence de cible le signal n'est pas émis. D'autres systèmes révélateur peuvent aussi être utilisés. En variante, les amorces sens et anti-sens peuvent comporter une molécule ou un système de molécules révélateur. Le produit de PCR obtenu par le procédé objet de la présente invention en utilisant les amorces de séquences SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2 a préférentiellement une taille de 114 pb et présente un %GC d'environ 58.8 %. La polymérase préférentiellement utilisée dans la présente invention est la Taq polymérase, mais elle peut être toute autre enzyme présentant une activité polymérase et utilisable dans les conditions opératoires de la PCR. La présente invention a encore pour objet un kit de réactifs pour réaction d'amplification de type PCR en temps réel pour détection d'adénovirus caractérisé en ce qu'il comprend une paire d'amorces sens et anti-sens et une sonde telles que décrites cidessus. Ledit kit comprend avantageusement en outre deux témoins négatifs et deux témoins positifs. La présente invention a en outre pour objet une méthode PCR pour la détection et / ou la quantification d'adénovirus dans un échantillon à doser susceptible d'en contenir caractérisée en ce qu'elle consiste en une PCR en temps réel mettant en oeuvre un kit selon l'invention. Selon un aspect particulièrement avantageux de la méthode selon l'invention, lesdits deux témoins positifs sont extraits en parallèle à une série d'échantillons à doser et consistent en un standard constitué d'une solution d'adénovirus purifiée et titrée et un calibrateur adapté au type d'échantillon à doser. La méthode conforme à l'invention trouve une application avantageuse à la détection et/ ou à la quantification d'adénovirus présents dans les échantillons de type suspension ou surnageant de culture, plasma, urines, lavages oropharyngés, lymphocytes, liquides séminaux, biopsies tumorales ou non, écouvillons rectaux, fèces, ascites. La présente invention a également trait à une méthode de sélection d'adénovirus utiles comme candidats vecteurs par évaluation des performances réplicatives des adénovirus par application d'une méthode de détection et / ou de quantification selon l'invention au suivi de cinétiques de multiplication adénovirale. La présente invention a également trait à une méthode de diagnostic du sérotype d'adénovirus présents dans un échantillon à tester consistant à mettre en oeuvre une méthode de l'invention puis à séquencer le produit PCR obtenu. Les séquences nucléotidiques des différents sérotypes codant la protéine Hexon ont été obtenues à partir de banques de données ou ont été séquencées. Les sérotypes Ad3, Ad7, Adl2, Adl4, Adl6 et Ad21 présentent en position 9 de la sonde HEX un résidu A. Les sérotypes Ad5, Adl, Ad2, Ad6, Ad 13, Ad40 et Ad48 présentent à cette même position un résidu G alors que les sérotypes Ad4 et Ad41 présentent un résidu C. La séquence présentant un résidu A a été choisie, car la séquence de type G, à l'opposé des séquences de type A ou de type C, présente une structure secondaire de très haute stabilité (DG =-7.1 kcal/mol) susceptible de perturber son hybridation et/ou son déplacement et/ou sa dégradation lors de la polymérisation. D'autre part, la séquence de type A est plus fréquente que la séquence de type C. Les mésappariements A/C (Ad5CMVp53 et sérotypes 5, 1, 2, 6. 13, 40 et 48) ou A/G (sérotypes 4 et 41 ) se traduisent par une diminution du delta Rn sans modification significative du Ct (delta Rn est la différence de fluorescence détectée entre la fluorescence mesurée du bruit de fond et la fluorescence détectée de l'échantillon à tester ; Ct est défini comme le nombre de cycles fractionnels dans lequel la fluorescence générée par clivage de la sonde dépasse significativement - en général de 10 fois - le bruit de fond). Les sérotypes Ad5, Ad4, Adl2 et Adl4 et l'Ad5CMVp53 présentent des différences supplémentaires en position #5 pour le sérotype Ad5 et l'Ad5CMVp53 #24 pour les sérotypes Ad4 et Ad 12 #3, 12 et 19 pour le sérotype Adl4 Malgré ces différences il est possible, de manière surprenante, de détecter les séquences nucléotidiques codant pour les protéines hexons de ces sérotypes. L'un des avantages de la présente méthode de détection et/ ou de quantification d'adénovirus humains par rapport aux méthodes décrites dans l'état de la technique est une sensibilité de détection remarquable avec un seuil de détection de 10 particules ou 1 pfu (unité formant plage) par réaction PCR. Un autre avantage réside dans l'universalité de la méthode puisque 17 sérotypes différents d'adénovirus humains, représentatifs de l'ensemble des sous-groupes A à F, ont pu être détectés et quantifiés. En outre l'analyse des produits de PCR se fait directement à la fin des cycles de PCR par la lecture de la fluorescence obtenue au cours des cycles. Il n'est donc pas nécessaire de travailler avec les produits de PCR qui sont à risque de contamination pour les analyses ultérieures. De plus la traçabilité des données brutes est totale. En effet, chaque analyse PCR est conservée dans des fichiers informatiques que l'on peut archiver sur une longue période sans altération. Les données brutes peuvent être à tout moment ré-analysées si les critères d'analyses évoluent. La conservation des données brutes est essentielle lorsqu'on doit travailler aux normes de Bonnes Pratiques de Laboratoire. En outre la quantification du nombre de cibles mis au départ dans la réaction est très fiable et reproductible. La détection du produit de PCR se fait au cours des cycles PCR à l'aide d'une sonde fluorescente. Celle-ci est nécessaire pour détecter le produit de PCR et a lieu en pleine phase exponentielle de PCR et non en point final ; ce principe de détection est donc plus sensible et plus spécifique. Un autre avantage réside dans le fait que les amplifications non spécifiques sont évitées, grâce au principe du hot start , la PCR en temps réel étant réalisée en présence d'une ADN polymérase thermostable s'activant à la première dénaturation. Pour mettre en oeuvre la présente invention on peut éventuellement se référer à une revue générale des techniques PCR, et en particulier à la notice explicative intitulée Quantitation of DNA/RNA Using Real-Time PCR Détection publiée par Perkin Elmer Applied Biosystems (1999) et au PCR Protocols (Academic Press New-York 1989). La présente invention est illustrée par des exemples non limitatifs et en référence à la figure annexée qui représente une courbe standard d'une méthode PCR hexon conforme à l'invention. Matériel et méthodes Collection d'adénovirus, surnageants de culture et lignées cellulaires : # La plupart des surnageants de culture de différents sérotypes d'adénovirus humains proviennent du laboratoire du Pr. Freymuth (service de Virologie, CHU, Caen). # Certains adénovirus sauvages titrés (Ad2 et Ad5) proviennent de l'UMR n 1592 (Emmanuelle Vigne, Unité de Vectorologie et de Transfert de Gènes, Institut Gustave-Roussy). #L'AdSCMVp.i3 titré provient de l'Unité de Production de RPR Gencell, Vitry (Didier Faucher). Les titres sont fournis en nombre de pfu ( plaque forming unit , unités formant plages). Cette unité restera l'unité de référence pour la quantification. # La lignée cellulaire 293 provient de l'ATCC (CRL 1573). # La lignée cellulaire A549 (ATCC: CCL 185) a aimablement été fournie par E. Vigne et A. Fallourd, RPR Gencell. # La lignée cellulaire MRC5 provient de chez bioMérieux (réf. 84002, France). Echantillons cliniques : # Les échantillons cliniques (plasma, urines, lavages oropharyngés, fèces) proviennent soit de volontaires sains, soit de patients hospitalisés à l'Institut Gustave-Roussy. # Certains plasmas proviennent du Centre de Transfusion, soit par l'achat d'une poche provenant d'environ 200 donneurs, soit des poches ne pouvant plus être utilisées pour un usage médical. Conditions de stockage : # Les collections d'adénovirus et les prélèvements cliniques sont transportés en carboglace et, dès réception, stockés à -80 C. # Les différentes étapes de réception, d'aliquotage et d'analyse nécessitent un certain nombre de congélations et décongélations (adénovirus ou prélèvements cliniques). Pour être dans les mêmes conditions, les témoins (standard et calibrateurs) subissent le même nombre de congélations et décongélations que les prélèvements cliniques à diagnostiquer. Témoins et standard : # II y a deux types de témoins négatifs : Un témoin négatif PCR ou NTC ("non template control") qui est constitué du tampon PCR avec de l'eau distillée (sans cible). La valeur de Ct doit être de 50 puisque l'on fait 50 cycles PCR. Le deuxième type de témoin négatif est le témoin négatif d'extraction qui est mis en place dès l'étape d'extraction. En général, il est constitué de 200 ul d'eau physiologique et il est extrait en parallèle avec une série d'extractions (en général 1 pour 10). La valeur de Ct doit également être de 50. . Il y a deux types de "témoins" positifs : Le standard qui est constitué d'une solution d'adénovirus purifiée.et titrée (# 5.105 pfu), est extrait en parallèle à une série d'échantillons à doser. L'extrait d'acides nucléiques est dilué (en général de 10 en 10) pour constituer les différents points de standard pour la construction de la courbe standard (Figure). Le deuxième type de témoins positifs est le calibrateur. Il existe différents types de calibrateurs suivant le type d'échantillons à diagnostiquer. Il est constitué de 200 l de milieu le plus proche de l'échantillon et d'une quantité connue d'adénovirus se situant au milieu de la gamme standard (en général 5.103 pfu). Les milieux utilisés pour la fabrication des calibrateurs sont de l'eau physiologique pour les lavages oropharyngés, d'un "pool" de plasma de 200 donneurs sains pour les plasmas, d'urines de sujets sains pour les urines et du milieu de culture frais pour les surnageants de culture. Ces calibrateurs vérifient que la technique d'extraction est correcte. La valeur de quantification par rapport à la valeur théorique attendue va permettre, par simple règle de trois, de réajuster la quantification finale obtenue avec les échantillons à tester. Appareil et quantification Toutes les réactions PCR sont faites à l'aide de l'appareil ABI Prism 7700 (PerkinElmer Applied Biosystem) lequel détecte le signal à l'aide d'une sonde fluorescente (Sonde TaqManTM) pendant les cycles PCR. Le système 7700 est un thermocycleur où chaque puits (n = 96) est relié à une fibre optique laquelle est connectée à un laser. Une caméra CDD collecte les émissions de fluorescence à peu près toutes les 6 secondes pour chaque puits. Le logiciel S.D.S. (Sequence Detector SystemTM) analyse les données de fluorescence et détermine le nombre de copies de cible dans un échantillon. La quantification est basée sur le principe de la PCR en temps réel ("real-time PCR"). En effet, le produit de PCR est caractérisé par le moment de cycle PCR où l'amplification est détectable par la dégradation de la sonde liée à l'accumulation de produits de PCR. Plus le nombre de copies de départ de cible est élevé, moins il faudra de cycles PCR pour détecter une élévation significative de fluorescence. Le nombre de copies de cible d'un échantillon est quantifié en mesurant la valeur de Ct et en utilisant une courbe standard (Figure). En théorie, si la PCR fonctionne à 100%, il faut 3,22 cycles PCR (Ct) pour multiplier par 10 le nombre de cibles. En général, un facteur 10 du nombre de cibles donne une différence de valeurs de Ct entre 3,4 à 3,6. Le deuxième paramètre (Delta Rn) est important à vérifier pour confirmer la positivité du signal PCR. Le delta de Rn est la différence de fluorescence détectée entre la fluorescence mesurée du bruit de fond (en général mesurée entre le cycle 3 et le cycle 15 de la PCR sur la totalité de la plaque) et la fluorescence détectée de l'échantillon à analyser. EXEMPLES Exemple 1 : d'adénovirus provenant d'un échantillon d'urines 1.1. Préparation de l'échantillon d'urines à tester. Tous les réactifs utilisés pour cette préparation proviennent de la trousse dénommée High Pure RNA Isolation Kit, et commercialisée par Boehringer / Roche. Pour préparer cet échantillon procéder comme suit : A 200 l d'urines préalablement chauffées 10 min. à 37 C ainsi que sur chacun des témoins (d'un volume de 200 fil), ajouter 400 [il du tampon de lyse. Vortexer immédiatement. Incuber 15min. à température ambiante. Placer chaque colonne sur un tube de 2,0 ml et déposer la totalité de la préparation au centre de la colonne. Centrifuger 1 min. à 8. 000 tours/min. (Eppendorf 5417R) à 20 C. Placer la colonne sur un deuxième tube de 2,0 ml. Ajouter 500 l du tampon de lavage I et centrifuger 1 min. à 8. 000 tours/min. (Eppendorf 5417R) à 20 C. Placer la colonne sur un troisième tube de 2,0 ml. Ajouter 500 l du tampon de lavage II et centrifuger 1 min. à 8.000 tours/min. (Eppendorf 5417R) à 20 C. Placer la colonne sur un quatrième tube de 2,0 ml. Ajouter 200 l du tampon de lavage II et centrifuger 3 min. à 14. 000 tours/min (Eppendorf 5417R) à 20 C. Placer la colonne sur tube Eppendorf de 1,5 ml (cinquième tube) et identifier le tube Eppendorf qui va collecter l'éluat final d'extraction d'acides nucléiques. Ajouter 50 l d'eau distillée préchauffée. Incuber 3 min. à 70 C (bain sec). Centrifuger 1 min. à 8. 000 tours/min. (Eppendorf 5417R) à 20 C. Les extraits d'acide nucléique sont conservés à 4 C jusqu'à l'étape de PCR. Les témoins et standard sont préparés comme décrit ci-dessus (section matériel et méthodes ). Pour la préparation d'autres types d'échantillons, se reporter au tableau n 1 illustrant les techniques d'extraction optimisées pour la détection d'adénovirus provenant de différents types d'échantillons dont celui du présent exemple. 1.2. Conditions de détection selon la méthode PCR hexon conforme à l'invention Les concentrations de l'ensemble des réactifs mis en oeuvre dans les réactions d'amplification notamment les concentrations d'amorces sens HEXI , anti-sens HEX2 , de sonde HEX , et de MgCl2 et autres réactifs du TaqManTM PCR Core Reagents Kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems) sont données dans le tableau 2. 1. 3 Résultats La courbe standard d'une méthode de détection PCR conforme à l'invention est représentée sur la figure. Exemple 2 : de la méthode conforme à l'invention Une des applications de la méthode PCR hexon selon l'invention est la détection d'adénovirus dans les surnageants de culture. Selon les techniques de l'art antérieur, la présence d'un adénovirus en culture cellulaire (permissive) est classiquement visualisée par un effet cytopathique dans la couche cellulaire. Pour démontrer que cet effet cytopathique est bien dû à un adénovirus on détecte un antigène spécifique de l'adénovirus (par ELISA, ex. Réf. K6021, Dako Diagnostic LTD, Denmark House, Angleterre). Des extraits d'acides nucléiques provenant des principales lignées cellulaires (Hep2, MRC5, 293 et A549, décrites ci-dessus dans la section matériel et méthodes ) utilisés pour le diagnostic cellulaire des adénovirus humains ont été testés pour vérifier la négativité en PCR hexon selon la présente invention. Tous les extraits d'ADN évalués ont été négatifs démontrant la spécificité de détection. Pour la méthode PCR hexon de l'invention, il est très important de démontrer le caractère "universel" de la détection avec différents sérotypes d'adénovirus humains. 17 sérotypes différents ont été évalués (tableau n 3), tous les sous groupes (A, B1, B2, C, D, E, F) sont représentés. La collection de 17 sérotypes a été testée sur deux lignées cellulaires MRC5 (réf. 84002, bioMérieux, France) et A549 (ATCC: CCL 185) donnant des résultats similaires. Les résultats obtenus sur A549 sont présentés dans le tableau 3. On peut observer que les valeurs de Ct sont similaires excepté pour les sérotypes 12,18 et 40. Ces 3 sérotypes correspondent aux adénovirus ayant les titres les plus faibles. Mais cette grande différence de Ct est surtout due au choix des amorces et de la sonde TaqManTM conformes à la présente invention. En effet, l'Adl2 présente deux mésappariements pour l'amorce sens HEX1 de l'invention et un mésappariement pour la sonde HEX de l'invention. De même, l'Ad40 présente un désappariement pour l'amorce anti-sens HEX2 de l'invention et un désappariement pour la sonde HEX de l'invention. La séquence du gène hexon pour le sérotype 18 n'est pas disponible. Il est probable que ces résultats obtenus avec l'Adl8 sont dus également à des mésappariements. Il est à noter que malgré ces désappariements (deux ou trois) de séquences nucléotidiques, les surnageants de culture restent largement positifs. Ces résultats confirment bien le caractère "universel" de la PCR hexon si l'on considère que les 17 sérotypes testés sont représentatifs de l'ensemble des 51sérotypes connus. Exemple 3 : de la méthode conforme à l'invention 3.1. Estimation du seuil de détection en nombre de particules. Le tableau 3 présente les résultats des 17 sérotypes d'adénovirus avec des valeurs de Ct obtenues en fonction du nombre de particules par ml mesurées par la technique HPLC. A l'exception des 3 sérotypes ayant des titres faibles (Adl2, Adl8 et Ad40), les valeurs de Ct sont dans une fourchette de 8,1 à 9,1 pour un nombre de particules de 1,1 à 8,5.10' /ml. Si on considère que la valeur de Ct pour la limite de positivité est aux environs de 40 et que l'on prend une différence de 3,5 Ct pour un facteur 10 du nombre de cibles, cela représente un écart possible de la valeur de Ct de 31unités. Cet écart représente environ 9 logarithmes de base 10. Par conséquent, suivant les sérotypes, le seuil de détection peut être estimé de 10 à 80 particules par réaction PCR. 3.2 : Bilan de 101gammes standard. Sur une période de 18 mois, 10.1 gammes standards ont été testées à l'aide de 101 extractions indépendantes d'un standard contenant 5.105 pfu d'AdSCMVp53 dans 200 gel. Le volume final d'élution est de 50 (il. 10 l d'extrait de ce standard avec une gamme de dilution de 10 en 10 (pur, 10-', 10-2@ 10"\ 10', 10-5) sont analysés pour construire une gamme standard. La dernière dilution testée correspond en théorie à 1 pfu d'AdSCMVp53 dans le tube PCR. Tous les points de gamme sont testés en double en PCR (Ctl et Ct2, tableau 5). Les valeurs Ct obtenues avec tous les points contenant 1 pfu d'Ad5CMVp53 sont présentées dans le tableau 5. Sur 202 réactions PCR, 8 réactions sont négatives (Ct = 50) ce qui ne représente que 4%. Dans la grande majorité des cas, la quantité de 1 pfu d'Ad5CMVp53 est positive en PCR hexon. Ces résultats confirment bien la bonne sensibilité de détection. Suivant les lots de fabrication d'Ad5CMVp53, l'équivalent 1 pfu correspond à 10 à 40 particules virales (# cible) ce qui confirme le seuil de détection estimé à l'aide de la collection d'adénovirus sauvages. Exemple 4 : Cinétique de culture adénovirale Deux expériences ont démontré qu'il était possible de suivre une cinétique de multiplication adénovirale à l'aide de la méthode PCR hexon de l'invention. Ces deux expériences ont utilisé soit de l'Ad5 sur la lignée MRC5, soit de l'Ad2 sur la lignée A549 (tableau n 4). Les résultats obtenus pour les deux expériences étaient similaires. Des flacons de culture de 25 cm2 de cellules ont été infectés avec des dilutions d'adénovirus comprises entre 105 et 1 pfu. Le milieu de culture (5 ml) a été retiré, les cellules ont été infectées avec différentes concentrations de virus sous un volume de 2 ml pendant 2 heures (à 37 C). Au bout des deux heures, le milieu a été changé. Après l'infection, tous les jours (JO à Jl 1), les flacons de culture ont été prélevés : 250 l pour le test ELISA (détection d'antigène Hexon) et 200 l pour la détection PCR selon l'invention. 450 l de milieu frais étaient réintroduits dans la flacon de culture. L'apparition de l'ECP (effet cytopathique) (tableau n 4), est comprise entre 4 jours pour le point 105 et 8 jours pour le point 10 pfu. Il existe une relation entre la quantité de virus inoculée dans la flacon de culture et le délai de positivité. Le seuil de positivité est de 10 pfu/flacon de culture. L'apparition de l'ECP est simultanée à celle de l'antigène Hexon (Test ELISA). Pour aucune des dilutions étudiées, la positivité de l'ELISA ne précède celle de l'ECP. Pour la PCR hexon (tableau n 4), les valeurs de Ct pour les témoins négatifs (T) sont légèrement positifs (37,6-37,8). Ce résultat peut s'expliquer, soit par une légère contamination par aérosols au moment de l'inoculation des flacons de culture, soit par une légère contamination au moment de l'extraction. La première hypothèse semble être plus probable puisque à J10, les valeurs de Ct sont passées à 31,2 (différence de 6,5 Ct) ce qui représente une augmentation d'un facteur 100 du nombre de copies d'adénovirus. La méthode PCR hexon de l'invention montre l'existence d'une multiplication virale (diminution significative du Ct) en l'absence d'ECP et de détection de l'antigène Hexon. Suivant les dilutions testées, la méthode PCR hexon de l'invention met en évidence de manière tout à fait surprenante de 2 à 4 "vagues" de multiplication virale. Clairement ces résultats démontrent que la méthode PCR hexon de l'invention se positive plus tôt que l'ECP ou l'ELISA hexon. Aussi, la méthode PCR hexon conforme à la présente invention est au minimum 10 fois plus sensible que les tests de culture cellulaire classiques (culture de 10 jours + test ELISA). Ces résultats pour le moins inattendus obtenus avec la méthode PCR hexon de l'invention peuvent être mis à profit notamment pour connaître de manière aisée et rapide le temps d'un cycle viral et son niveau d'amplification. Ces deux derniers paramètres sont très importants pour évaluer les performances réplicatives d'un virus. En conséquence, la méthode PCR hexon selon l'invention peut contribuer avantageusement à la sélection de candidats vecteurs en vue d'applications biotechnologiques, notamment dans l'expression et/ ou la thérapie génique. Exemple 5 : et reproductibilité de la méthode selon l'invention. Les résultats des 101 standards évalués en PCR hexon (tableau n 5) permet de déterminer à la fois la répétabilité (répétition intra-tests) et la reproductibilité (répétition inter-tests). La moyenne des valeurs Ct pour 1 pfu est de 37,2 1,8. Ce niveau de variation est relativement faible surtout qu'il est le résultat de la variation de deux étapes : l'extraction et la PCR hexon. Pour les valeurs de Ct pour 10 pfu (non montrées) la moyenne est de 33,7 1,7. Le niveau de variation est très similaire puisque les écarts obtenus sont très proches. On peut noter que la différence de Ct entre les 2 moyennes obtenues avec 1 pfu et 10 pfu est de 3,5 Ct. Cette différence correspond effectivement à un écart d'un facteur 10 en nombre de cibles. Exemple 6 : Prélèvements cliniques Des prélèvements cliniques ont été testés, avec des extractions indépendantes et dans des séries de PCR hexon différentes. Les résultats de la PCR hexon (valeurs Ct) de 8 plasmas et 20 urines sont présentés dans le tableau n 6. En général lorsque les valeurs de Ct sont inférieures ou égales à 36, les variations de Ct pour un même extrait d'acides nucléiques (Ctl et Ct2) dépassent rarement la valeur de 1 Ct (facteur 2 pour la quantification). C'est pour cette raison que tous les prélèvements avec des valeurs de Ct# à 36 sont considérés comme quantifiables (statut positif-quantifiable) et entre 36 et 43 les prélèvements sont considérés comme positifs mais non quantifiables (statut positif-détectable). Pour les plasmas (tableau n 6), au sein d'un même extrait d'acides nucléiques, il y a rarement un écart de plus de 1 Ct excepté pour l'extrait n 1 du plasma n 3289 et l'extrait n 3 du plasma n 3579. Dans ce dernier cas, la valeur de 44,6 pour le Ctl est aberrante. Bien entendu, au sein des différents extraits d'acides nucléiques, la variation de Ct est plus importante mais dépasse rarement une valeur de 2 Ct (facteur 4 pour la quantification). Pour les urines (tableau n 6), au sein d'un même extrait d'acides nucléiques, il n'y a pas plus de 1 Ct d'écart excepté lorsque les valeurs de Ct sont supérieures à 36. En effet, pour des valeurs de Ct supérieures à 36, le niveau de positivité est assez faible ce qui explique un niveau de variation plus élevé. Au sein des différents extraits d'acides nucléiques, la variation de Ct est également plus importante ne dépassant que rarement une valeur de 2 Ct entre deux extraits différents excepté pour l'urine n 2403 qui a une différence de 3 Ct (facteur 8 en quantification). Bien entendu, certaines urines (n 2029,2626, 3736, 3763, 3765 et 5399) ont des valeurs de Ct très élevées (en général > à 40) démontrant une très faible positivité. Dans ces derniers cas, on comprend qu'il est possible de passer facilement d'un signal positif à un signal négatif(Ct = 50). Globalement, les résultats sur les prélèvements cliniques de la méthode de détection PCR hexon conforme à l'invention, montrent une très bonne reproductibilité (pour les valeurs de Ct) lorsque la positivité est assez élevée (Ct# à 36, statut positifquantifiable ). Pour les valeurs de Ct > à 36 et jusqu'à 43, on peut considérer que la cible est bien présente (positive) mais le niveau de variation est trop élevé pour donner une valeur de quantification fiable. Exemple 7 : Linéarité de la quantification La courbe standard est générée habituellement à l'aide de 12 points de 1 à 105 pfu par réaction PCR testés en double. Pour chaque répétition, les courbes d'amplification et les valeurs de cycle PCR sont très reproductibles (voir figure). Par contre, en point final, les signaux de fluorescence sont très variables (jusqu'à un facteur 10), d'où l'intérêt d'analyser les produits de PCR au moment de l'apparition du signal (cycle PCR : et non en point final comme en PCR "classique". La courbe standard obtenue avec ces points standards est présentée sur la figure. Le coefficient de corrélation de 0,999 indique une excellente linéarité. Dans l'immense majorité des cas, ce coefficient se situe entre 0,98 et 1. Des manipulations utilisant une gamme standard plus large (0,5 à 106 pfu) ont montré des coefficients de corrélation similaires (non montrés) confirmant ainsi les informations du fournisseur décrivant une linéarité de quantification sur plus de 6 logarithmes. La valeur "Y-intercept" représente le nombre de cycles PCR déduit par la courbe standard pour détecter un pfu d'Ad5CMVp53. Suivant les courbes standards, cette valeur Ct se trouve entre 35 et 39. La valeur de la pente (Slope) est en liaison avec le rendement de la PCR. On rappelle que pour une PCR à 100% de rendement, cette valeur doit être de - 3,22. Pour la méthode PCR hexon conforme à l'invention, la valeur de la pente se situe entre - 3,4 à - 3,9 représentant un rendement moyen de 90%. Exemple 8 : Quantification sur prélèvements cliniques : Les exemples de quantification obtenue avec la PCR hexon sur les prélèvements cliniques (tableau 7) ont été sélectionnés sur deux principaux critères. Le premier critère est que le prélèvement a été analysé par deux extractions en série de PCR totalement indépendantes (voir tableau 6). Le deuxième critère est que les résultats de PCR ont des valeurs de Ct inférieures ou égales à 36 correspondant bien à un statut quantifiable pour le prélèvement. Six prélèvements cliniques répondent à ces deux critères (tableau 7). Les résultats de quantification sont très reproductibles et le niveau de variation dépasse rarement un facteur 2 pour un même prélèvement (tableau 7). Il est particulièrement intéressant de noter pour l'urine n 2403 qu'une différence de 3 Ct (en théorie cela représente un facteur 8 pour la quantification) entre les deux extractions ne se répercute pratiquement pas sur les valeurs de quantification déterminées par la PCR hexon. Cet exemple démontre l'intérêt des calibrateurs extraits en parallèle qui permettent de réajuster la quantification en fonction des petites fluctuations des PCR (seuil de détection légèrement différent, conditions d'extraction légèrement différentes...). Tableau n 1 : Techniques d'extraction optimisées pour la détection d'adénovirus provenant de différents types d'échantillons. Type d'échantillon Kit utilisé Commentaires Suspension High Pure RNA Isolation > 200 l de solution extrait. d'adénovirus ou Kit (Boehringer/Roche) > Sans étape de DNase. surnageant de culture # 50 l d'eau distillée stérile (élution). Plasma High Pure RNA Isolation > 200 l de solution extrait. Kit (Boehringer/Roche) > Sans étape de DNase. >50 (il d'eau distillée stérile (élution). Urines High Pure RNA Isolation #Les urines sont préalablement Kit (Boehringer/Roche) chauffées 10 minutes à 37 C. >200 l de solution extrait. >Sans étape de DNase. ~~~~ > 50 l d'eau distillée stérile (élution). Lavages oropharyngés High Pure RNA Isolation > 200 pl de solution extrait. Kit (Boehringer/Roche) > Sans étape de DNase. ~~~~~~~ ~~~ > 50 ul d'eau distillée stérile (élution). Lymphocytes High Pure PCR Template > Les culots lymphocytaires ( 2.106 Préparation Kit cellules) sont resuspendus (Boehringer/Roche) préalablement dans 200 l d'eau physiologique (NaCI 9%o . Une étape de centrifugation supplémentaire a été ajoutée avant l'élution ~~~~~~~~~ ~~~ ~~~ finale. Liquides séminaux QIAmp Tissue Kit > 100 l de liquides séminaux sont (Qiagen) lysés avec 100 }il de tampon SP et 40 l de protéinase K (pendant lh à55 C). >L'élution finale se fait avec 60 l ~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~ d'eau distillée. Biopsies (tumorales ou QIAmp Tissue Kit > L'étape de lyse se fait sur la nuit à non) (Qiagen) 56 C. >L'élution finale se fait avec 120 (il ~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~~ d'eau distillée. Tableau 1 (suite) Ecouvillons rectaux High Pure RNA Isolation Les écouvillons rectaux sont Kit (Boehringer/Roche) resuspendus dans 5 ml de milieu M4 (Micro Test Inc., USA). >200 l de suspension sont utilisés pour l'extraction. Même remarque que surnageants de culture. Fèces QIAmp Tissue Kit ## 100 mg de fèces sont (Qiagen) resuspendus dans 1 ml de sérum physiologique. Après centrifugation, le surnageant est filtré sur 0,22 m. 200 fil de suspension sont utilisés pour l'extraction. >L'élution finale de fait avec 1201 d'eau distillée. >10 l dilués au 10e sont utilisés pour la PCR. Ascites High Pure RNA Isolation > 200 [il de solution extrait. Kit (Boehringer/Roche) # Sans étape de DNase. ~~~~~~ ~~~ > 50 l d'eau distillée stérile (élution). Tableau 2 : Conditions de mise en oeuvre de la réaction Réactifs Volumes Concentrations finales Tp PCR TaqManTM 10X 5 pl 1 X MgCl2 25 mM 10 tl 5mM dNTP (dA, dG, dC 2mM 5 l (dA, dG, dC 200M chaque, chaque, dUTP 4 mM) dUTP 400 M) Amorce HEX1 (50 pmol/ l) 0. 3 ul 300 mM Amorce HEX2 (50 pmol/ l) 0. 3 ul 300 mM Sonde HEX (10 pmol/1) 0. 75 l 150 mM AmpErase UNG (1 U/tl) 0.5 l 0.5 unité AmpliTaq Gold (5 U/ul) 0. 25 l 1.25 unité Extrait d'échantillon 10 ul d'urines H20 17.9 l qsp 50 l Tableau 3 : d'apparition de l'ECP (jours), valeur de la DO en Elisa, valeur de Ct (PCR hexon) et du titre en HPLC après inoculation sur cellules A549 d'un surnageant de cellules MRC5 récolté après infection avec des adénovirus sauvages de la collection. Sérotype Groupe Délai ECP DO Elisa PCR Hexon HPLC (jours) (Ct) (particules/ml) 1 C #3 1,385 8,5 1,2 1010 2 C #3 1,120 8,1 2,3 1010 3 B1 #3 0,732 8,5 4,8 1010 4 E #3 1,222 9,0 3,9 1010 5 C #3 1,211 8,5 6,6 1010 6 C #3 1,428 8,1 6,6 1010 7 B1 #3 1,344 9,0 4,4 1010 11 B2 #3 1,648 8,5 3,8 1010 12 A #3 2,759 21,6 109 13 D #3 2,343 8,1 4,6 1010 14 B2 #3 0,992 8,4 1,1 1010 18 A 4 >3 19 2,3 109 20 D #3 1,229 9,15 8,5 1010 21 B1 #3 1,442 8,2 2,7 1010 34 B2 #3 1,960 8,6 4,7 1010 36 D #3 2,759 8,3 2,9 1010 40 F 5 0,537 19,5 109 ECP : Effet cytopathique. Elisa + si DO > 0,171. Tableau 4 : Cinétique de culture Ad2 sur A549. Délais d'apparition de l'ECP (jours), valeur de la DO en ELISA et valeurs de Ct de la PCR hexon. Nb pfu/ JO J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 flasque 30/01 31/01 01/02 02/02 03/02 04/02 05/02 06/02 07/02 08/02 09/02 09/02 D.O et Ct 105 neg neg neg neg + + + + DO 0,072 0,103 >3 2,745 Ctl 31,91 Ct2 32,17 104 neg neg neg neg +/- + + + DO 0,071 0,187 0,655 >3 Ctl 35,24 31,65 22,06 14,77 Ct2 35,38 31,81 22,09 14,76 103 neg neg neg neg +/- + + + + + DO 0,073 0,134 0,116 >3 2,446 Ctl 37,21 40,96 25,77 15,74 14,62 Ct2 37,67 40,49 25,70 15,76 14,65 102 neg neg neg neg neg neg + + + + DO ND 0,082 ND 1,107 >3 Ctl 39,44 39,39 28,84 19,59 14,91 Ct2 40,52 41,15 29,04 19,64 15,15 Tableau 4 (suite) 10 neg neg neg neg neg neg neg neg + + + + DO ND ND 0,086 0,101 1,716 >3 Ctl 42,52 38,44 37,97 25,41 18,08 14,98 Ct2 40,95 39,55 37,25 25,36 18,14 14,96 1 neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg DO ND ND 0,081 0,091 0,310 Ctl 35,34 35,57 32,13 28,71 Ct2 35,19 35,45 31,88 28,75 T neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg DO 0,073 0,082 ND 0,288 0,117 0,159 Ctl 37,61 31,25 Ct2 37,77 31,25 1 en: ligne ECP : Effet cytopathique 2ème ligne Elisa (Elisa+ si DO>0,171) 3eme et 4eme lignes Ct 1 et Ct2 PCR hexon ND : Not Done (non fait) ; T :témoin Tableau 5 : Valeurs Ct obtenues avec 1 pfu d'Ad5CMVp53 dans la réaction PCR (101 tests). N de test N de série dans le test Ctl Ct2 P199812702 41 35,8 36,3 P 199814602 41 36,8 36,9 P199814902 30 41,2 39,5 P199815602 41 37,3 39,1 P199817403 35 39,4 38,1 P199817702 34 37,2 36,8 P199818802 41 37,1 37,4 P199819802 41 35,7 37,5 P199820302 41 37,2 36,5 P199820502 41 38,6 40,3 P199821602 41 38,9 38,3 P199822302 41 39,6 38,3 P199823102 41 43,6 40 P199823702 40 41,7 39,3 P199824002 41 36,4 37,8 P199824702 41 40,8 38,1 P199825103 41 37,4 39,1 P199826101 41 36,8 37 P199826501 41 NEGa 39,8 P199826801 41 36,6 37,1 P199828201 41 40 40,8 P199829302 41 36,4 36,9 P199829601 41 36,2 36,8 P 199830301 41 40,9 NEG P199830701 41 39,9 39,4 P199831001 41 36,8 37,3 P199831401 41 NEG 40,5 P199832101 39 39,4 40 P199833501 41 44,4 39,6 P199833801 41 37,9 38,8 P199834201 41 NEG NEG P199834901 41 38,2 38,2 Tableau 5 (suite) P199835101 41 38,1 38 P199835601 41 38,5 40.7 P199836301 41 41,1 NEG P199900501 41 38,5 38 P199900801 41 37,8 37.7 P199901401 41 39 40,3 P199902201 41 39,9 38,4 P199902901 41 37,5 37,7 P199906101 41 38,6 37.2 P199906301 41 37,9 37.2 P199906401 41 41 41,3 P 199906901 34 37,9 38,2 P 199907001 40 37,5 37,3 P199907101 41 37,2 38,6 P199907701 41 37,8 36,9 P199907801 41 39,3 41,2 P199908201 41 36,8 37,4 P199908301 41 38,7 38,1 P199908401 41 37,9 38 P199908901 41 NEG NEG P199909101 41 37,6 36,8 P199909801 41 39,2 38 P199909901 41 37,5 38,1 P199910401 41 39,2 38,5 P199911101 41 35,5 35,5 P199911701 41 37,9 36,4 P199911801 33 34,5 35 P199912501 41 36,3 36,4 P199913101 41 36,8 37,1 P199914601 41 35,4 36,2 P199914801 41 35,4 35,2 Tableau 5 (suite) P199915401 40 38 NDb P199915501 39 37 36,2 P199916001 41 36,2 35,7 P199916101 41 35,7 36,5 P199916201 25 36,3 35,4 P199917301 41 37,1 36 P199917501 41 37,3 .36,5 P199918001 41 37,3 37,1 P199918201 41 36,8 36,7 P199919001 41 35,3 35,2 P199919703 41 34,7 34,3 P199920101 41 36,1 35 P199920201 41 34 34,9 P199920801 32 39,6 36 P199921501 41 36,5 35,5 P199922201 41 34,4 34,4 P199922401 29 35,5 36,3 P199924301 41 34,9 34,7 P199924501 22 36,6 35,6 P199925001 41 34,5 35 P199925201 32 35,5 36,1 P199925901 41 35,9 36,2 P199926401 36 36,7 35,7 P199926601 25 36,7 36,3 P199927801 29 35,6 35,9 P199927901 10 34,6 34 P199928101 31 35,2 34,7 P199928501 41 36,1 35,9 P199929301 32 34,7 34,4 P199929901 39 35,1 35,1 P199930101 36 35,3 35,5 P199932001 41 36,2 36,4 P199932801 40 35,6 35,3 P199933001 33 35,5 36,2 P199933501 19 36 35,9 P199934401 25 36,9 37 a : NEG : Négatif, Ct = 50. b : ND : Not Done (non fait). Tableau 6 : de la PCR hexon avec deux collections de prélèvements cliniques (plasma et urines) ayant eu deux ou trois extractions indépendantes. PCR hexon (Ct) N de Type série d'échantillon Ext 1 Ext 2 Ext 3 Ctld Ct2 Ctld Ct2 Ctld Ct2 1518 Plasma 35,37 35,29 37,28 37,46 NAb NA 3289 38,31 36,76 36,95 37,57 NA NA 3579 35,81 36,24 36,35 36,22 44,60 35,98 4823 36,00 35,74 35,07 35,25 NA NA 5593 37,06 36,88 35,46 34,79 NA NA 5686 36,87 37,92 35,68 36,12 NA NA 5870 36,81 37,50 35,73 36,01 NA NA 2025 Urines 33,72 33,32 33,60 33,03 NA NA 2029 43,02 50,00 40,59 44,82 43,05 41,21 2041 39,00 40,46 38,24 39,30 NA NA 2045 37,85 38,45 38,50 36,36 NA NA 2049 35,75 34,75 35,74 34,66 36,08 36,14 2097 37,50 36,13 37,03 35,63 NA NA 2384 37,40 35,80 34,58 34,55 NA NA 2392 40,95 38,72 38,08 40,29 NA NA 2397 38,27 36,08 36,02 36,36 NA NA 2400 35,56 35,45 36,63 35,45 NA NA 2403 32,62 32,04 29,36 29,41 NA NA 2406 35,36 34,42 34,08 33,37 NA NA 2626 50,00' 40,13 50,00 42,67 NA NA 3277 38,38 38,22 39,52 41,02 NA NA 3736 40,05 41,80 45,08 43,52 NA NA 3763 38,48 40,63 50,00 43,68 NA NA 3765 40,40 41,84 43,41 43,30 NA NA 5399 50,00 41,29 43,29 43,73 NA NA 5400 37,60 37,18 39,96 38,64 NA NA a : Ext : Extraction. Le chiffre indique le nombre d'extractions faites sur le même prélèvement. b : NA : Non Applicable ; c : Ct = 50 : PCR négative. d : Chaque extrait est testé dans 2 réactions PCR, Ct 1 pour l'essai 1 PCR et Ct 2 pour l'essai 2 PCR. Tableau 7 : Quantification à l'aide de la PCR hexon avec des prélèvements cliniques quantifiables. Extraction n 1 Extraction n 2 N de série Type d'échantillon Quantification Quantification Moyenne de C (équivalent pfu Moyenne de C (équivalent pfu d'AdSCMVp53lml) d'AdSCMVp53lm1 ) 4823 Plasma 35,87 1,1.10' 35,16 1,8. 10 2 2925 Urines 35,52 2,6.10' 33,31 2,8.103 2049 35,25 8,5.10' 35,20 8,4.102 2400 35,50 6,5.10' 36,04 7,4.102 2403 32,33 2,3.104 29,38 3,8.104 2406 34,89 5,1.103 33,72 2,2.103 a : La moyenne a été calculée à partir des valeurs de Ct indiquées dans le tableau 6. b : Le standard utilisé est connu en nombre de pfu d'Ad5CMVp53. Cette quantification est rapportée par millilitre de prélèvements cliniques de départ. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection et/ ou de quantification d'acides nucléiques d'adénovirus dans un échantillon biologique dans lequel : - une séquence nucléotidique d'adénovirus est amplifiée par PCR en temps réel à l'aide d'un couple d'amorces sens et anti-sens dégénérées, constituées de mélanges d'oligonucléotides présentant une homologie d'au moins 80% avec une séquence comprise entre les nucléotides 21000 et 22000 de la séquence de l'adénovirus de type 5, et - le produit de la réaction d'amplification est détecté à l'aide d'une sonde non dégénérée, constituée d'au moins un oligonucléotide présentant une homologie d'au moins 80% avec une séquence comprise entre les nucléotides 21000 et 22000 de la séquence de l'adénovirus de type 5, durant un nombre de cycles suffisant pour permettre l'obtention d'une quantité mesurable de produit d'amplification. 2. Oligonucléotide caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N 1suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80 %, avec ladite séquence : 5' - YCC CAT GGA YGA GCC CAC MCT - 3' dans laquelle Y représente C ou T et M représente A ou C. 3. Amorce HEX1 caractérisé en ce qu'elle comprend au moins deux oligonucléotides selon la revendication 2. 4. Oligonucléotide caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N 2 suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80 % avec ladite séquence : 5' - GAG AAS GGB GTG CGC AGG TAS AC - 3' dans laquelle S représente G ou C et B représente C, G ou T. 5. Amorce HEX2 caractérisé en ce qu'elle comprend au moins deux oligonucléotides selon la revendication 4. 6. Amorce selon l'une des revendications 3 et 5 caractérisé en ce qu'elle comprend au moins trois oligonucléotides. 7. Oligonucléotide selon l'une des revendications 2 et 4 caractérisé en ce qu'il comprend entre 15 et 30 nucléotides. 8. Oligonucléotide caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N 3 suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80 % avec ladite séquence : 5' - CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA - 3'. 9. Oligonucléotide selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il comprend 20 et 35 nucléotides. 10. Sonde HEX caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un oligonucléotide selon la revendication 9. 11. Sonde selon la revendication 10 caractérisée en ce qu'elle comporte une molécule ou un système de molécules révélateur. 12. Sonde constituée par la molécule suivante : 5' FAM- CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA -TAMRA 3'. 13. Oligonucléotides présentant une séquence complémentaire de celles des oligonucléotides selon l'une des revendications 2, 4 et 7 à 9. 14. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre à l'aide d'amorces sens et anti-sens respectivement selon l'une des revendications 3,5 et 6. 15. Procédé selon l'une des revendications 1 et 14 caractérisé en ce qu'il comprend une répétition du cycle comprenant les étapes suivantes : - séparation des brins à amplifier par chauffage de l'ADN extrait de l'échantillon, - hybridation de la sonde, - hybridation avec les amorces, et - élongation avec une polymérase. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,14 et 15 caractérisé en ce que la produit d'amplification est détecté par hybridation avec la sonde selon l'une des revendications 10 à 12. 17. Kit de réactifs pour réaction d'amplification de type PCR en temps réel pour détection d'adénovirus caractérisé en ce qu'il comprend une paire d'amorces selon l'une des revendications 3 et 5 et une sonde selon l'une. quelconque des revendications 10 à 12. 18. Procédé de diagnostic du sérotype d'adénovirus présent dans un échantillon à tester consistant à mettre en oeuvre une procédé selon l'une des revendications 1, 14 et 15 puis à séquencer le produit PCR obtenu. 19. Procédé de sélection d'adénovirus utiles comme candidats vecteurs comprenant la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 14 et 15.