Brevet FR2804127A1 — publié le 20010727

La présente invention a trait à un nouveau gène, appelé SRN1, qui code pour une protéine impliquée dans le syndrome néphrotique corticorésistant. Le syndrome néphrotique idiopathique est une pathologie qui apparaît principalement chez l'enfant, et qui se caractérise par une protéinurie massive, et des changement histologiques non spécifiques du rein incluant parfois une sclérose glomérulaire segmentaire et focale (FSGS). Ces caractéristiques sont associées avec un effacement diffus des pédicelles des podocytes observé en microscopie électronique (Broyer et al., 1998), révélateur des syndromes néphrotiques quelle que soit leur cause. La plupart des cas répondent à une thérapie à base de stéroïdes et ont un bon pronostic, mais environ 20% sont résistants aux stéroïdes et évoluent vers l'insuffisance rénale terminale, conduisant à une sclérose glomérulaire complète. On parle alors de syndrome néphrotique cortico-résistant. L'ultrafiltration des macromolécules du plasma durant la formation de l'urine primaire dans le glomérule est l'une des fonctions centrales du rein humain. La paroi capillaire structurellement complexe qui est responsable de cette fonction est composée d'une membrane basale recouverte d'un endothélium fenestré sur sa surface interne et par des cellules épithéliales spécialisées (podocytes) qui forment des pédicelles sur la surface externe. On observe dans un grand nombre de maladies acquises ou héréditaires un dysfonctionnement du filtre glomérulaire résultant en une perte excessive des protéines plasmatiques, menant à un syndrome néphrotique, puis éventuellement à une insuffisance rénale terminale. L'étude des maladies génétiques affectant la barrière de filtration fournit des modèles utiles pour comprendre la physiopathologie du processus de filtration glomérulaire. Plusieurs de ces affections héréditaires avec protéinurie et syndrome néphrotique ont été décrites. Le plus sévère est le syndrome néphrotique congénital de type finlandais (CNF), qui est une maladie récessive autosomique avec une forte protéinurie in utero, un syndrome néphrotique à la naissance conduisant habituellement à une insuffisance rénale terminale durant les deux premières années de la vie. Le CNF est provoqué par des mutations dans le gène NPHS1 (Kestilâ, 1998). Par ailleurs, des cas de protéinurie familiale ou de syndrome néphrotique avec des lésions histologiques de sclérose glomérulaire segmentaire ou focale (FSGS) ont été décrits chez des patients plus âgés, en particulier à l'âge adulte. Deux locus génétiques pour la FSGS dominante autosomique ont été cartographiés respectivement sur le locus 19q13 proche du locus du gène NPHS1 (Mathis et al., 1998) et sur le locus 11q21-q22 (Winn et al., 1999). En 1995, une nouvelle entité de syndrome néphrotique corticorésistant de transmission autosomique récessive a été caractérisée selon les critères suivants : début précoce entre trois mois et cinq ans, résistance à une thérapie à base de stéroïdes, évolution vers l'insuffisance rénale terminale avant l'âge de dix ans, absence de récidive après transplantation rénale et absence de quelconque désordre extra-rénal. Histologiquement, on n'observe que des modifications minimes dans les biopsies précoces mais une FSGS est généralement présente à des stades ultérieurs. Un locus génétique impliqué dans ce syndrome néphrotique corticorésistant, a été cartographie dans la région 1 q25-q31 entre les marqueurs D1S452 et D1S466, cette région s'étendant sur environ 12 cM (Fuchshuber, 1995). Cette localisation a été confirmée par une autre équipe (Lench et al., 1998) et plus récemment, une liaison à cette région a également été démontrée dans une famille présentant une FSGS débutant à l'âge adulte (Tsukaguchi et al., 1999). Les auteurs de la présente invention sont maintenant parvenus à identifier de manière précise un nouveau gène impliqué dans l'entité de syndrome néphrotique cortico-résistant décrite ci-dessus, qu'ils ont appelé gène SRN1. En annexe se trouve une liste de séquences, dans laquelle la séquence SEQ ID n 1 représente le fragment d'ADNc du gène SRN1 chez l'homme correspondant au cadre de lecture ouvert (ORF). Cet ORF contient 1149 bases et code pour une protéine de 383 acides aminés, dénommée podocine, dont la séquence est présentée SEQ ID n 2. Les séquences SEQ ID n 3 à SEQ ID n 10 représentent des fragments de l'ADN génomique du gène SRN1 humain incluant respectivement 8 exons (en caractères gras dans le listing annexé), comme suit : SEQ ID n 3 : Il y a 683 paires de bases avant l'ATG. Les clones d'ADNc obtenus par criblage d'une banque d'ADNc de rein foetal humain (banque Clontech clonée dans le phage #gt11) commencent généralement entre les bases 615 et 619. Il y a 274 paires de bases de l'ATG au site d'épissage (exon 1), puis 147 paires de bases de séquences introniques. SEQ ID n 4 : Il y a 151 paires de bases d'intron, puis 104 paires de bases de codant (exon 2), puis 123 paires de bases d'intron. SEQ ID n 5: Il y a 336 paires de bases d'intron, puis 73 paires de bases de codant (exon 3), puis 291 paires de bases d'intron. SEQ ID n 6 : Il y a 187 paires de bases d'intron, puis 83 paires de bases de codant (exon 4), puis 90 pb d'intron. SEQ ID n 7: Il y a 250 paires de bases d'intron, puis 204 paires de bases de codant (exon 5), puis 195 paires de bases d'intron. SEQ ID n 8 : Il y a 367 paires de bases d'intron, puis 56 paires de bases de codant (exon 6), puis 169 paires de bases d'intron. SEQ ID n 9 : Il y a 327 pb d'intron, puis 79 paires de bases de codant (exon 7), puis 310 paires de bases d'intron. SEQ ID n 10 . Il y a 285 paires de bases d'intron, puis 911 paires de bases de séquence d'ADNc jusqu'au site de polyadénylation utilisé (exon 8). Le codon stop est en position 562, puis 109 paires de bases de séquences génomiques supplémentaires couvrant les autres sites potentiels de polyadénylation. La présente invention a donc pour objet un acide nucléique isolé, dont la séquence est choisie parmi SEQ ID n 3 à SEQ ID n 10, ou une séquence homologue, définie comme i) une séquence identique à au moins 70% de la séquence SEQ ID n 3 à SEQ ID n 10 ; ou ii) une séquence hybridant avec la séquence SEQ ID n 3 à SEQ ID n 10 ou leurs séquences complémentaires, dans des conditions stringentes d'hybridation. La présente invention a également pour objet un acide nucléique isolé, comprenant la séquence SEQ ID n 1, ou une séquence homologue, définie comme i) une séquence identique à au moins 70% de la séquence SEQ ID n 1 ; ou ii) une séquence hybridant avec la séquence SEQ ID n 1 ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation, ou iii) une séquence codant pour le polypeptide, dénommé podocine, tel que défini précédemment. De préférence, une séquence nucléotidique homologue selon l'invention est identique à au moins 75 % des séquences SEQ ID n 1 ou SEQ ID n 3 à 10, de préférence encore au moins 85 %, ou au moins 90 %. De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement aux séquences complémentaires des séquences SEQ ID n 1 et 3 à 10, dans des conditions stringentes. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm). Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm=81,5+0,41(%G+C)+16,6Log(concentration en cations) - 0,63(%formamide) -(600/nombre de bases) (Sambrook et al., 1989). Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm= 4 (G+C) 2 (A+T). Dans des conditions de stringence appropriées, auxquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30 C, de préférence de 5 à 10 C en dessous de Tm, et les tampons d'hybridation utilisés sont de préférence des solutions de force ionique élevée telle qu'une solution 6xSSC par exemple. Une séquence nucléotidique homologue à l'ORF représentée à la SEQ ID n 1 inclut toute séquence nucléotidique qui diffère de la séquence SEQ ID n 1 par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases, ou par la dégénérescence du code génétique, pour autant qu'elle code pour un polypeptide présentant l'activité biologique de la podocine, comme définie plus bas. Parmi de telles séquences homologues, sont comprises les séquences des gènes de mammifères autres que l'homme, codant pour la podicine, de préférence d'un primate, d'un bovin, ovin ou porc, ou encore d'un rongeur, ainsi que les variants alléliques. La présente invention a également pour objet un polypeptide isolé, dénommé podocine, comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n 2, ou une séquence homologue, définie comme i) une séquence identique à au moins 70% de la séquence SEQ ID n 2;ou ii) une séquence codée par une séquence d'acide nucléique homologue telle que définie dans la revendication 2 ii), c'est-à-dire une séquence d'acide nucléique hybridant avec la séquence SEQ ID n 2 ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation. Plus généralement, par séquence d'acides aminés homologue , on entend toute séquence d'acides aminés qui diffère de la séquence SEQ ID n 2 par substitution, délétion et/ou insertion d'un acide aminé ou d'un nombre réduit d'acides aminés, notamment par substitution d'acides aminés naturels par des acides aminés non naturels ou pseudoacides aminés à des positions telles que ces modifications ne portent pas significativement atteinte à l'activité biologique de la podocine. Lesdites substitutions sont de préférence des substitutions conservatives, c'est-à-dire des substitutions d'acides aminés de même classe, telles que des substitutions d'acides aminés aux chaînes latérales non chargées (tels que l'asparagine, la glutamine, la serine, la thréonine, et la tyrosine), d'acides aminés aux chaînes latérales basiques (tels que la lysine, l'arginine, et l'histidine), d'acides aminés aux chaînes latérales acides (tels que l'acide aspartique et l'acide glutamique) ; d'acides aminés aux chaînes latérales apolaires (tels que la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, et la cystéine). De préférence, une telle séquence d'acides aminés homologue est identique à au moins 85 % de la séquence SEQ ID n 2, de préférence au moins 95%. L'homologie est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de séquence (par exemple, Séquence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705). Des séquences d'acides aminés similaires sont alignées pour obtenir le maximum de degré d'homologie (i.e. identité). A cette fin, il peut être nécessaire d'introduire de manière artificielle des espaces ( gaps ) dans la séquence. Une fois l'alignement optimal réalisé, le degré d'homologie (i.e. identité) est établi par enregistrement de toutes les positions pour lesquelles les acides aminés des deux séquences comparées sont identiques, par rapport au nombre total de positions. "L'activité biologique de la podocine" se réfère au maintien de l'intégrité du filtre glomérulaire. L'absence ou l'altération de la podocine provoque la fuite de protéines au niveau du glomérule et par conséquent l'apparition d'une protéinurie. Le polypeptide de la présente invention peut être synthétisé par toutes les méthodes bien connues de l'homme du métier. Le polypeptide de l'invention peut par exemple être synthétisé par les techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour des raisons de pureté, de spécificité antigénique, d'absence de produits secondaires non désirés et pour sa facilité de production. Une podocine recombinante peut également être produite par un procédé, dans lequel un vecteur contenant un acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID n 1 ou une séquence homologue est transféré dans une cellule hôte qui est mise en culture dans des conditions permettant l'expression du polypeptide correspondant. La podocine produite peut ensuite être récupérée et purifiée. Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant obtenu peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono- ou polyclonaux spécifiques, etc. La séquence d'acide nucléique d'intérêt, codant pour la podocine, peut être insérée dans un vecteur d'expression, dans lequel elle est liée de manière opérante à des éléments permettant la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs, activateurs et/ou terminateurs de transcription. Les signaux contrôlant l'expression des séquences nucléotidiques (promoteurs, activateurs, séquences de terminaison...) sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple l'électroporation ou la précipitation au phosphate de calcium. Les vecteurs de clonage et/ou d'expression tels que décrits cidessus, contenant une des séquences nucléotidiques définies selon l'invention font également partie de la présente invention. L'invention vise en outre les cellules hôtes transfectées, de manière transitoire ou stable, par ces vecteurs d'expression. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes, procaryotes ou eucaryotes, d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée. Des exemples de cellules hôtes incluent notamment des cellules de mammifères, telles que les cellules COS-7, 293, MDCK, des cellules d'insectes telles que les cellules SF9, des bactéries telles que E. coli et des souches de levures telles que YRG2. Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences d'ADN ou d'ARN, obtenues par criblage de banques de séquences au moyen de sondes élaborées sur la base des séquences SEQ ID n 1 et 3 à 10. De telles banques peuvent être préparées par des techniques classiques de biologie moléculaire, connues de l'homme de l'art. Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage des banques. Ces séquences nucléotidiques permettent la réalisation de sondes ou amorces, hybridant spécifiquement avec une séquence SEQ ID n 1, ou 3 à 10, selon l'invention, ou son brin complémentaire. Les conditions d'hybridation appropriées correspondent aux conditions de température et de force ionique usuellement utilisées par l'homme du métier, de préférence dans des conditions stringentes telles que définies précédemment. Ces sondes peuvent être utilisées comme outil de diagnostic in vitro pour la détection, par des expériences d'hybridation, notamment d'hybridation "in situ", de transcrits spécifiques du polypeptide de l'invention dans des échantillons biologiques ou pour la mise en évidence de synthèses aberrantes ou d'anomalies génétiques résultant d'un polymorphisme, de mutations ou d'un mauvais épissage. Les acides nucléiques de l'invention utiles comme sondes comportent au minimum 10 nucléotides, préférentiellement au moins 20 nucléotides, préférentiellement encore au moins 100 nucléotides. Les acides nucléiques utiles comme amorces comportent au minimum 10 nucléotides, de préférence au moins 14 nucléotides, et préférentiellement moins de 40 nucléotides. Plus précisément, la présente invention a pour objet un acide nucléique ayant au moins 10 nucléotides, qui hybride spécifiquement avec l'une des séquences d'acide nucléique SEQ ID n 1, ou 3 à 10 ou son complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation. De manière avantageuse, on peut utiliser comme sonde l'acide nucléique constitué de la séquence SEQ ID n 11, qui couvre une partie de l'exon 5, les exons 6 et 7 et une grande partie de l'exon 8 (de la base 728 à la base 1792 de l'ADNc). On peut par ailleurs utiliser comme amorce, pour une amplification (par exemple par PCR), les acides nucléiques constitués des séquences SEQ ID n 12 à SEQ ID n 27. Préférentiellement, les sondes ou amorces de l'invention sont marquées, préalablement à leur utilisation. Pour cela, plusieurs techniques sont à la portée de l'homme du métier comme par exemple le marquage fluorescent, radioactif, chimioluminescent ou enzymatique. Les méthodes de diagnostic in vitro dans lesquelles ces oligonucléotides sont mis en oeuvre pour la détection de mutations ou de remaniements génomiques, au niveau du gène SRN1, sont incluses dans la présente invention. L'homme du métier connaît bien les méthodes standard pour analyser l'ADN contenu dans un échantillon biologique et pour diagnostiquer un désordre génétique. De nombreuses stratégies d'analyse génotypique sont disponibles (Antonarakis et al., 1989 ; Cooper et al., 1991). De préférence, on peut utiliser la méthode DGGE (Electrophorèse sur gel de gradient dénaturant), la méthode SSCP (Polymorphisme de conformation simple brin) ou la méthode DHPLC (Chromatographie liquide haute performance dénaturante ; Kuklin et al., 1997 ; Huber et al., 1995) pour détecter une anomalie dans le gène SRN1. De telles méthodes sont de préférence suivies par un séquençage direct. Le procédé de RT-PCR peut être avantageusement mis en #uvre pour détecter des anomalies dans le transcript de SRN1, car il permet de visualiser les conséquences d'une mutation d'épissage provoquant la perte d'un ou plusieurs exons au niveau du transcrit, ou un épissage aberrant dû à l'activation d'un site cryptique. Ce procédé est également de préférence suivi d'un séquençage direct. Les procédés plus récemment développés utilisant des puces à ADN peuvent également être mis en #uvre pour détecter une anomalie dans le gène SRN1 (Bellis et al., 1997). Le clonage du gène SRN1 ainsi que l'identification de diverses mutations responsables du syndrome néphrotique cortico-résistant permettent d'envisager des diagnostics directs. La spécificité et la fiabilité de telles méthodes de diagnostic sont particulièrement appréciables pour un diagnostic prénatal. Les séquences d'acides nucléiques de la présente invention représentent donc un outil particulièrement intéressant pour le conseil génétique. La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'au moins un acide nucléique tel que défini précédemment, pour la détection d'une anomalie dans le gène SRN1, défini comme comprenant une séquence d'acide nucléique SEQ ID n 3 à 10 ou, dans son transcrit, défini comme comprenant une séquence d'acide nucléique complémentaire de la séquence SEQ ID n 1. L'invention a, par suite, pour objet un procédé de diagnostic in vitro d'un syndrome néphrotique cortico-résistant lié à une mutation du gène SRN1, comprenant les étapes consistant à : al) mettre en présence un échantillon biologique contenant de l'ADN avec des oligonucléotides spécifiques permettant l'amplification de tout ou partie du gène SRN1, défini comme comprenant une séquence d'acide nucléique choisie parmi SEQ ID n 3 à 10 ou une séquence homologue ; b1) amplifier ledit ADN ; c1) détecter les produits d'amplification ; d1) comparer les produits d'amplification obtenus à ceux obtenus avec un échantillon contrôle, et détecter de cette manière une éventuelle anomalie dans ledit gène SRN1, indicatrice d'un syndrome néphrotique corticorésistant lié à une mutation du gène SRN1 ; ou, selon une alternative, a2) mettre en présence un échantillon biologique contenant de l'ARN avec des oligonucléotides spécifiques permettant l'amplification de tout ou partie du transcrit du gène SRN1, défini comme comprenant une séquence d'acide nucléique complémentaire de la séquence SEQ ID n 1 ou une séquence homologue ; b2) amplifier ledit ADN ; c2) détecter les produits d'amplification ; d2) comparer les produits d'amplification obtenus à ceux obtenus avec un échantillon contrôle, et détecter de cette manière une éventuelle anomalie dans ledit transcrit du gène SRN1, indicatrice d'un syndrome néphrotique cortico-résistant lié à une mutation du gène SRN1. Parmi les mutations déjà identifiées, on relève notamment les suivantes, présentées dans le tableau 1. Tableau 1 : dans le gène SRN1 Type de mutation' Changement de Effet sur la séquence Exon n d'identification de Statut de la mutationb Position sur SEQ ID nucléotide codante la famille concernée n 1 Non-sens CT à 412 R138X 3 8 H 481 Délétion/Insertion Insertion de G à 104/5 Décalage 1 14 h 173/174 Délétion de G à 419 Décalage 3 14 hc 488 Délétion de AA à 855/6 Décalage 7 9 h 924/925 C#T à 59 P20L 1 15 H 128 Faux-sens G#T à 274 G92C 1 3 hc,d 343 G#A à 413 R138Q 3 4 hc 482 6 H 7 H 11 H 12 h 13 H A#G à 479 D160G 4 16 H 548 GA à 538 V180M 5 10 H 607 C- Tà871 R291W 12 h 940 C#T à 871 R291W 7 2 hc a : la position des mutations est indiquée en prenant pour base 1, le A du codon ATG et selon la nomenclature de Antonarakis et al b : H = mutation homozygote ; h = mutation hétérozygote c: uniquement la mutation paternelle détectée d : implique le dernier nucléotide de l'exon 1 et donc probablement altère aussi l'épissage Les mutations n'ont pas été retrouvées chez 40 contrôles Ces tests peuvent être notamment mis à profit dans les familles qui ont déjà un enfant atteint, pour le diagnostic présymptomatique (en particulier, diagnostic prénatal). Dans les cas sporadiques, la détection d'une mutation du gène SRN1 permet de modifier le traitement (et en particulier d'éviter des traitements immunosuppresseurs qui seront inefficaces) et de prédire l'absence de récidive après transplantation rénale. Ce test diagnostic peut également servir à rechercher l'association de certains variants polymorphes de la podocine dans d'autres pathologies impliquant secondairement des anomalies du filtre glomérulaire (néphropathie diabétique, néphropathie du SIDA, réduction néphronique, hypertension artérielle). Ces variants pourraient représenter des facteurs de susceptibilité au déclenchement ou à la progression de la néphropathie dans ces maladies. L'invention a également pour objet des anticorps dirigés contre le polypeptide podocine tel que défini précédemment. Il peut s'agir d'anticorps poly- ou monoclonaux ou de leurs fragments, d'anticorps chimériques, notamment humanisés ou immunoconjugués. Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre un polypeptide selon les modes opératoires usuels. Selon un mode de réalisation de l'invention, on peut utiliser comme antigène un fragment peptidique approprié, pouvant être couplé par l'intermédiaire d'un résidu réactif à une protéine ou un autre peptide. Des lapins sont immunisés avec l'équivalent de 1 mg de l'antigène peptidique selon la procédure décrite par Benoit et al. (1982). A des intervalles de quatre semaines, les animaux sont traités par des injections de 200 g d'antigène et saignés 10 à 14 jours plus tard. Après la troisième injection, l'anti-sérum est examiné pour déterminer sa capacité à se lier au peptide antigène radiomarqué à l'iode, préparé par la méthode chloramine-T et est ensuite purifié par une chromatographie sur colonne échangeuse d'ion carboxyméthyl cellulose (CMC). Les molécules d'anticorps sont ensuite recueillies dans les mammifères et isolées jusqu'à la concentration souhaitée par les méthodes bien connues de l'homme de l'art, par exemple, en utilisant DEAE Sephadex pour obtenir la fraction IgG. Afin d'augmenter la spécificité du sérum polyclonal, les anticorps peuvent être purifiés par une chromatographie d'immuno-affinité en utilisant des polypeptides immunisant en phase solide. L'anticorps est mis en contact avec le polypeptide immunisant en phase solide pendant une durée suffisante de façon à faire immuno-réagir le polypeptide avec la molécule d'anticorps afin de former un complexe immunologique en phase solide. Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kôhler et Milstein (1975). Les anticorps ou fragments d'anticorps de l'invention peuvent être par exemple des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab et F(ab')2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués. Les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux, peuvent notamment être utilisés pour l'analyse par immunohistochimie de la podocine sur des coupes de tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoperoxydase... Les anticorps ainsi produits peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression de la podocine doit être observée. L'invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un anticorps ainsi produit pour la détection ou la purification d'un polypeptide tel que défini précédemment dans un échantillon biologique. Plus précisément, l'invention concerne une méthode in vitro pour la détection ou la mesure du taux d'expression de la podocine dans un prélèvement biologique comprenant la mise en contact d'au moins un anticorps tel que défini précédemment avec ledit prélèvement biologique dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre la podocine et le ou lesdits anticorps et la détection des complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés. La mise au point d'un tel test (de type ELISA par exemple) pourrait être en particulier utile pour rechercher le développement d'anticorps anti-podocine après transplantation rénale, dans certaines maladies rénales auto-immunes, voire dans le syndrome néphrotique cortico-sensible. L'invention a également pour objet un kit pour la mise en #uvre de cette méthode comprenant : - au moins un anticorps spécifique de la podocine, éventuellement fixé sur un support ; - des moyens de révélation de la formation de complexes antigènes/anticorps spécifiques entre la podocine et ledit anticorps et/ou des moyens de quantification de ces complexes. L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un polypeptide podocine tel que défini précédemment ou un acide nucléique codant pour ledit polypeptide, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques des compositions pharmaceutiques selon l'invention, contenant au moins un polypeptide, peuvent être déterminées de manière usuelle par l'homme du métier, notamment selon les critères généralement pris en compte pour l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient, comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, et les effets secondaires constatés, etc. De manière générale, une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace variant d'environ 0,1 g à environ 1 mg peut être administrée à des adultes humains. L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique tel que défini précédemment, codant pour un polypeptide à activité de podocine et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, ladite composition étant destinée à être utilisée en thérapie génique. L'acide nucléique de préférence inséré dans un vecteur généralement viral (tels que les adénovirus et les rétrovirus) peut être administré sous forme nue, exempt de tout véhicule favorisant le transfert à la cellule cible, tels que des liposomes anioniques, des lipides cationiques, des microparticules, par exemple des microparticules d'or, des agents de précipitation, par exemple du phosphate de calcium, ou tout autre agent facilitant la transtection. Dans ce cas, le polynucléotide peut être simplement dilué dans une solution physiologiquement acceptable, telle qu'une solution stérile ou une solution stérile tampon, en présence ou en l'absence d'un véhicule. De manière alternative, un acide nucléique de l'invention peut être associé à des agents qui facilitent la transfection. Il peut être, entre autres , (i) associé à un agent chimique qui modifie la perméabilité cellulaire tel que la bupivacaïne ; (ii) encapsulé dans des liposomes, éventuellement en présence de substances supplémentaires facilitant la transfection ; ou (iii) associé à des lipides cationiques ou des microparticules de silice, d'or ou de tungstène. Lorsque les constructions d'acide nucléique de l'invention recouvrent des microparticules, celles-ci peuvent être injectées par voie intradermique ou intraépidermique par la technique du canon à gènes, "gene gun" (WO 94/24263). La quantité à utiliser comme médicament dépend notamment de la construction d'acide nucléique elle-même, de l'individu auquel cet acide nucléique est administré, du mode d'administration et du type de formulation, et de la pathologie. De manière générale, une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace variant d'environ 0,1 g à environ 1 mg, de préférence d'environ 1 g à environ 800 g et, de manière préférentielle d'environ 25 g à environ 250 g, peut être administrée à des adultes humains . Les constructions d'acides nucléiques de l'invention peuvent être administrées par toute voie d'administration conventionnelle telle que notamment par voie parentérale. Le choix de la voie d'administration dépend en particulier de la formulation choisie. Une administration ciblée au tissu rénal, en particulier aux glomérules, peut être particulièrement avantageuse. Le polypeptide de l'invention ou l'acide nucléique codant pour ce polypeptide sont utiles à titre de médicament, notamment pour le traitement d'une maladie rénale, en particulier pour le traitement d'un syndrome néphrotique cortico-résistant lié à une mutation du gène SRN1 ou survenant dans le cadre d'une maladie générale (SIDA, diabète...). L'invention a donc enfin pour objet une méthode de traitement thérapeutique, dans laquelle on administre à un patient nécessitant un tel traitement, une quantité efficace d'un polypeptide podocine tel que défini précédemment ou un acide nucléique codant pour ce polypeptide. Le patient visé est généralement un être humain, mais l'application peut également être étendue à tout mammifère le cas échéant. Les exemples suivants ainsi que la figure annexée illustrent l'invention sans en limiter sa portée. LEGENDE DE LA FIGURE La figure annexée est une carte de la région SRN1. La région candidate de 2,5 Mb est délimitée par les marqueurs D1S1640 et 183f10-CA. La position sur la carte des marqueurs polymorphes et des séquences STS (en caractères gras et italiques) et des séquences EST uniques et des clusters UniGene de EST (en caractère normal) est indiquée. Les YAC, PAC et cosmides sont représentés par des lignes. Les gènes sont indiqués par des cadres hachurés. NGAP est représenté par deux cadres séparés par une ligne horizontale qui symbolise la présence des exons épissés de manière alternative en position 5' probablement due à un promoteur alternatif. RPS14P, un pseudogène de la protéine ribosomale S14, est localisé à l'intérieur de l'intron de NGAP. EXEMPLES EXEMPLE 1 - Identification du gène SRN1 L'approche utilisée par les auteurs de la présente invention pour identifier le gène SRN1, a été de définir l'intervalle génétique minimal où se situait le gène, puis d'établir la carte physique de la région en construisant un contig de PAC couvrant la région, de faire l'inventaire des gènes connus et des EST de la région et de caractériser les EST (par RACE-PCR et criblage de banque d'ADNc de rein foetal). 1. Cartographie physique de la région candidate et localisation du gèneSRNI: Une analyse de liaison à l'aide de marqueurs microsatellite (Dib et al., 1996) ainsi que de nouvelles familles de patients, a permis de localiser le locus SRN1 entre les marqueurs D1S480 et D1S2883. Un contig de YAC (20 clones) couvrant la région entre ces deux marqueurs a été construit. Un contig de chromosomes artificiels P1 (PAC) a également été construit pour couvrir cette région estimée à environ 3 Mb. D'autres marqueurs microsatellites ont alors pu être caractérisés dans ce contig. Deux familles présentant des événements de recombinaison ont permis de localiser précisément le locus de la maladie entre D1S1640 et 183F10CA, nouveau marqueur microsatellite identifié par séquençage de sous-clones de la région. Le contig de 35 PAC entre ces deux marqueurs couvre environ 2 à 2,5 Mb, mais contient 5 trous partiellement remplis par 14 cosmides. Les auteurs de l'invention ont alors localisé sur ce contig, en recherchant dans les banques de données les séquences potentiellement localisées dans la région et en séquençant les extrémités des YAC, des PAC et des cosmides ainsi que des sous-clones de différents PAC contenant potentiellement des îlots CpG, des gènes déjà connus, des clusters d'EST (UniGene) et des EST indépendants. 2. Identification du gène SRN1 En consultant la base de données du Sanger Centre, il a été trouvé que le PAC 545A16 contenait le marqueur D1S215 localisé près de la borne télomérique de la région d'intérêt, ainsi que l'EST AA398634, qui provenait d'une banque de testicule et contenait de courtes séquences faiblement homologues au gène de la stomatine, mais curieusement a priori dans le sens opposé à l'EST. Les auteurs de l'invention ont alors localisé cet EST sur le cosmide 28e17 et sur le PAC 302d13 et montré par RT-PCR qu'il était exprimé dans le rein. De multiples essais de RACE-PCR ont ensuite été nécessaires pour obtenir un ADNc à partir de cet EST. En effet, les produits obtenus correspondaient, dans la plupart des expériences, à des ADN génomiques qui paraissaient non épissés. Toutefois, l'un des produits obtenu correspondait à un transcrit contenant une courte phase ouverte de lecture et homologue à six EST (cluster Unigene Hs. 192657), provenant tous d'une banque de rein humain, mais qui n'avaient pas été localisés sur le génome. Il s'avère en fait que les EST du cluster Unigene Hs. 254975 auquel appartient l'EST AA398634 semblent appartenir à un autre gène ou pseudogène dont le sens de la transcription est opposé à SRN1 et qui chevauche partiellement la séquence 3' de SRN1, ce qui explique les données fournies par les banques de données concernant l'EST AA398634. En utilisant ce produit de RACE-PCR décrit ci-dessus comme sonde pour hybrider un Northern blot contenant des ARN de différents tissus, il a été montré que ce transcrit d'environ 2 kb était exprimé seulement dans le rein. Ces résultats ont été confirmés en hybridant un dot blot contenant des ARN de 50 tissus différents (Clontech). Un fort signal a été obtenu seulement avec le rein adulte et le rein foetal. La localisation de ce gène sur le contig et son expression quasi-exclusive dans le rein faisaient de ce gène un excellent gène candidat, hypothèse renforcée par la quasi-absence de produit d'amplification par RT-PCR, en utilisant des amorces situées à la fois dans la partie 5' et dans la partie 3' de l'ADNc, avec l'ARN extrait du rein terminal d'un patient. L'ADNc complet du gène SRN1 a été cloné par criblage d'une banque d'ADNc de rein f#tal humain avec la sonde utilisée pour hybrider le Northern Blot (séquence ID n 11). Les jonctions introns-exons et les séquences génomiques en amont de l'exon 1 ont été obtenues par séquençage direct du PAC 302d13 et du cosmide 28e17. EXEMPLE 2 : Identification de mutations chez des familles de patients Les auteurs de l'invention ayant caractérisé la structure intron-exon du gène, ils ont ensuite recherché par SSCP ("Single Strand Conformation Polymorphism") des mutations chez 16 patients non apparentés présentant un syndrome néphrotique cortico-résistant familial tel que décrit précédemment (début précoce, évolution rapide vers l'insuffisance rénale terminale, pas de récidive après transplantation et lésions de sclérose glomérulaire segmentaire et focale sur les biopsies rénales) et appartenant à des familles dans lesquelles l'étude des haplotypes était compatible avec une liaison au locus SRN1. Pour cette analyse SSCP, les exons ont été amplifiées par PCR en utilisant des amorces introniques flanquantes. Les conditions de PCR et les amorces ont été choisies en utilisant le programme Oligo 5. 0 (NBI) et étaient les suivantes : exon 1, 5'-GCA GCG ACT CCA CAG GGA CT-3' (SEQ ID n 12) et 5'-TCA GTG GGT CTC GTG GGG AT-3' (SEQ ID n 13) ; exon 2,5'-AGG CAG TGA ATA CAG TGA AG-3' (SEQ ID n 14) et 5'-GGC CTC AGG AAA TTA CCT A-3' (SEQ ID n 15) ; exon 3,5'-TTC TGG GAG TGA TTT GAA AG-3' (SEQ ID n 16) et 5'-TGA AGA AAT TGG CAA GTC AG-3' (SEQ ID n 17) ; exon 4, 5'- AAG GTG AAA CCC AAA CAG C-3' (SEQ ID n 18) et 5'-CGG TAG GTA GAC CAT GGA AA-3' (SEQ ID n 19) ; exon 5,5'-CAT AGG AAA GGA GCC CAA GA-3' (SEQ ID n 20) et 5'-TTT CAG CAT ATT GGC CAT TA-3' (SEQ ID n 21 ) ; exon 6,5'-CTC CCA CTG ACA TCT GA-3' (SEQ ID n 22) et 5'-AAT TTA AAA TGA AAC CAG AA-3' (SEQ ID n 23) ; exon 7,5'-CTA AAT CAT GGC TGC ACA CC-3' (SEQ ID n 24) et 5'-CTT CCT AAA GGG CAG TCT GG-3' (SEQ ID n 25) ; exon 8,5'-GGT GAA GCC TTC AGG GAA TG-3' (SEQ ID n 26) et 5'-TTC TAT GGC AGG CCC CTT TA-3' (SEQ ID n 27); à des températures d'hybridation de 50 C (exon 6), 55 C (exons 2,3, 4 et 5), 60 C (exons 1,7 et 8). En raison de la forte teneur en GC de l'exon 1, la PCR a été effectuée en utilisant la Taq polymérase de Qiagen et la solution -Q selon les instructions du fabricant. De plus, à cause de sa taille, le produit de PCR de l'exon 1 a dû être digéré par l'enzyme Smal en deux fragments avant l'électrophorèse sur gel. La migration a été menée pendant deux heures à 600 V, 25 mA et 15 W avec le Genephor Electrophoresis Unit, en utilisant le kit GeneGel Excel 12.5/24 (Pharmacia). La coloration a été réalisée avec un colorateur "GeneStain Automated Gel Stainer" en utilisant le kit PlusOne Silver Staining (Pharmacia). Résultats Dix mutations différentes ont été observées. Certaines aboutissent à un décalage du cadre de lecture ou à l'apparition d'un codon stop prématuré et sont donc des mutations inactivatrices, ce qui prouve que le gène identifié est bien le gène SRN1. D'autres sont des mutations faux-sens survenant dans des régions très conservées de la protéine, ségregeant dans les familles avec la maladie, et non retrouvées dans 80 chromosomes témoins, ce qui suggère fortement que ces mutations sont bien responsables du phénotype chez les enfants atteints. Une des mutations faux-sens (R138Q) a été retrouvée chez six individus non apparentés mais provenant de la même partie de l'Europe, suggérant la possibilité d'un effet fondateur pour cette mutation. EXEMPLE 3 - Etude de l'expression du gène SRN1 dans le rein par hybridation in situ Méthode Des sections de rein de 6 m recouvertes de paraffine ont été débarrassées de leur paraffine et réhydratées puis traitées aux micro-ondes dans du tampon de citrate de sodium (0,01 M, pH 6) pour augmenter le signal d'hybridation. Les ribosondes de SRN1 ont été synthétisées à partir du produit de PCR de 1065 paires de bases (position 728 à 1792 de l'ADNc de SRN1, SEQ ID n 1) sous-cloné dans le vecteur PGEM-Teasy. La sonde antisens a été synthétisée après digestion avec Sa/) en utilisant la polymérase T7 et la sonde sens après digestion avec Sacll en utilisant la polymérase Sp6. Les ribosondes ont été marquées avec soit de la digoxigénine-11-UTP (Boehringer Mannheim) selon les instructions du fabricant ou avec la [35S]UTP comme décrit dans Sibony et al, 1995. Des expériences d'hybridation in situ ont été réalisées comme décrit dans Kalatzis et al. (1998) et Heidet et al. (1997) pour des sondes de digoxigénine-11-UTP et [35S]UTP, respectivement. Résultats Ces expériences d'hybridation in situ ont permis de montrer que le gène SRN1 était exprimé uniquement au niveau des podocytes dans le rein mature. Dans les reins f#taux, aucun signal n'a été observé aux stades précoces du développement du néphron. En revanche, des signaux intenses ont été détectés dans le segment inférieur du corps en S, dans la région correspondant aux futurs podocytes. Cette expression persiste dans les glomérules immatures et dans les glomérules matures du cortex profond. Ces résultats qui montrent l'expression exclusive du gène SRN1 dans les podocytes, à la fois précocement au cours du développement et dans les glomérules matures, sont tout à fait en accord avec la pathologie observée et justifient la dénomination de "podocine" pour la protéine codée par le gène SRN1. BIBLIOGRAPHIE - Antonarakis S. E., Diagnosis of genetic disorders at the DNA level. N Engl J. Med. 320 :153-163 -Antonarakis, S. E., Recommendations for a nomenclature system for human gene mutations. Nomenclature Working Group. Hum. Mut. 11,1-3 (1998). - Bellis et al., médecine/sciences, 13 :1317-24, (1997). - Benoit et al., PNAS USA, 79, 917-921 51982). - Broyer M., Meyrier A., Niaudet P. & Habib R. 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Polypeptide isolé, dénommé podocine, comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n 2, ou une séquence homologue, définie comme i) une séquence identique à au moins 70% de la séquence SEQ ID n 2;ou ii) une séquence codée par une séquence d'acide nucléique hybridant avec la séquence SEQ ID n 1 ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation. 3. Acide nucléique isolé, comprenant une séquence différant de la séquence SEQ ID n 1 par une mutation, insertion ou délétion, notamment dans l'une au moins des positions des nucléotides 481, 173/174, 488,924/925, 128, 343, 482, 548,607 et 940. 4. Acide nucléique isolé, comprenant la séquence SEQ ID n 1, ou une séquence homologue, définie comme i) une séquence identique à au moins 70 % de la séquence SEQ ID n 1 ;ou ii) une séquence hybridant avec la séquence SEQ ID n 1 ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation, ou iii) une séquence codant pour le polypeptide, dénommé podocine, tel que défini à la revendication 2. 5. Vecteur de clonage et/ou d'expression contenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1,3 ou 4. 6. Cellule hôte transfectée par un vecteur selon la revendication 5. 7. Acide nucléique ayant au moins 10 nucléotides, qui hybride spécifiquement avec l'une des séquences d'acide nucléique de la revendication 1,3 ou 4 ou son complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation. 8. Acide nucléique selon la revendication 7, constitué d'une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID n 11à SEQ ID n 27. 9. Procédé de production d'un polypeptide podocine recombinant, dans laquelle un vecteur contenant un acide nucléique selon la revendication 4 est transféré dans une cellule hôte, qui est mise en culture dans des conditions permettant l'expression du polypeptide selon la revendication 2. 10. Anticorps dirigé contre le polypeptide tel que défini dans la revendication 2. 11. Utilisation d'au moins un anticorps selon la revendication 10 pour la détection ou la purification d'un polypeptide tel que défini dans la revendication 4 dans un échantillon biologique. 12. Utilisation d'au moins un acide nucléique selon la revendication 1,3 ou 4, ou 7 ou 8, pour la détection d'une anomalie dans le gène SRN1, défini comme comprenant une séquence d'acide nucléique selon la revendication 1 ou, dans son transcrit, défini comme comprenant une séquence d'acide nucléique complémentaire de la séquence de la revendication 4. 13. Procédé de diagnostic in vitro d'un syndrome néphrotique cortico-résistant, comprenant les étapes consistant à : a1) mettre en présence un échantillon biologique contenant de l'ADN avec des oligonucléotides spécifiques permettant l'amplification de tout ou partie du gène SRN1, défini comme comprenant une séquence d'acide nucléique selon la revendication 1; b1) amplifier ledit ADN ; c1) détecter les produits d'amplification ; d1) comparer les produits d'amplification obtenus à ceux obtenus avec un échantillon contrôle, et détecter de cette manière une éventuelle anomalie dans ledit gène SRN1, indicatrice d'un syndrome néphrotique corticorésistant ; ou, selon une alternative, a2) mettre en présence un échantillon biologique contenant de l'ARN avec des oligonucléotides spécifiques permettant l'amplification de tout ou partie du transcrit du gène SRN1, défini comme comprenant une séquence d'acide nucléique complémentaire de la séquence de la revendication 4 ; b2) amplifier ledit ADN ; c2) détecter les produits d'amplification ; d2) comparer les produits d'amplification obtenus à ceux obtenus avec un échantillon contrôle, et détecter de cette manière une éventuelle anomalie dans ledit transcrit du gène SRN1, indicatrice d'un syndrome néphrotique cortico-résistant. 14. Composition pharmaceutique comprenant un polypeptide selon la revendication 2, ou un acide nucléique codant pour ledit polypeptide, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 15. Utilisation d'un polypeptide selon la revendication 2, ou d'un acide nucléique codant pour ledit polypeptide, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de maladies rénales, notamment d'un syndrome néphrotique cortico-résistant.