Brevet FR2801902A1 — publié le 20010608

La présente invention a pour objet des procédés de criblages fonctionnels d'agents aptes à moduler l'activité des complexes ubiquitine-ligases SCF et leurs applications. L'existence de la dégradation contrôlée des protéines est connue depuis plus de trente ans mais les mécanismes moléculaires exacts impliqués dans ce processus n'ont été révélés que ces dernières années. Dans les cellules eucaryotes, la voie principale de dégradation sélective des protéines en dehors des lysosomes, implique une cascade de réactions qui conduisent, dans un premier temps, au marquage des protéines à détruire par un polypeptide, constitué de 76 acides aminés, appelé ubiquitine. L'ajout de plusieurs molécules d'ubiquitine, cible alors la protéine ainsi modifiée vers le protéasome, où elle est détruite. On parle de la voie ubiquitine-protéasome. La dégradation d'une protéine étant par essence un processus irréversible, le système ubiquitine-protéasome est recruté par les nombreuses régulations et voies de signalisation qui ont pour but de modifier à long terme les processus cellulaires, notamment les voies de développement, les régulations du cycle cellulaire et les réponses à la présence d'agents pathogènes. Il est clair que la compatibilité de tels processus avec la vie cellulaire normale nécessite un contrôle étroit de la nature des protéines à détruire. Cette nécessaire sélectivité des processus de dégradation des protéines est assurée par les enzymes qui catalysent l'ajout des molécules d'ubiquitine et qui sont connues sous le nom générique d'ubiquitine-ligases. Le protéasome est un complexe protéique, composé de plusieurs sous-unités, qui reconnaît les protéines lorsqu'elles ont été modifiées par l'attachement d'ubiquitine sur leurs résidus lysine. Cette ubiquitinylation, préalable à la reconnaissance des protéines cibles par le protéasome, fait intervenir au moins trois complexes enzymatiques, appelés El, E2 et E3. El catalyse l'activation de l'ubiquitine par formation d'un thioester entre lui-même et l'ubiquitine, laquelle est ensuite transférée sur l'enzyme E2, enzyme de conjugaison. Finalement, l'ubiquitineligase E3, facilite la reconnaissance de la cible par E2 ou transfère directement l'ubiquitine de E2 sur le substrat (Hochstrasser M. et al., (1996), Annu. Rev. Genet, 30, 405-439). Récemment il a été montré qu'un facteur de conjugaison supplémentaire, appelé E4, était nécessaire (Koegl M. et al., (1999), Cell, 96,635- 644). Alors que le facteur El est commun à toutes les voies de dégradation et ne sert qu'à activer l'ubiquitine, la sélectivité du complexe responsable de l'ubiquitinylation est assurée par l'ubiquitine-ligase E3, qui interagit à la fois avec E2 et avec le substrat (Hershko A. et al., (1983), J Biol. Chern., 258, 8206-8214). On connaît aujourd'hui différentes classes d'ubiquitine-ligases E3, parmi lesquelles la famille des complexes ubiquitine-ligases SCF (S : Skpl ; C : Cdc53 ou Culline ; F : protéine contenant une boîte F), est la plus diversifiée. Les ligases SCF ont été découvertes chez la levure Saccharomyces cerevisiae (Feldman R. M. R. et al., (1997), Cell, 91, 221-230 ; Skowyra D. et al., (1999), Science, 284,662- 665 ; Patton E. E. et al., (1998), Genes Dev., 12, 692-705) et il a été montré récemment qu'elles existent en fait dans tous les organismes eucaryotes, allant du champignon aux mammifères (Koepp D. M. et al., (1999), Cell, 97, 431-434). Les complexes SCF comprennent au moins trois sous-unités communes, la protéine Skpl, une protéine de la famille des cullines (Cdc53 chez la levure et la cullline 1 chez l'homme) et la protéine Hrtl (Rbxl ou Roxl). Elles comprennent également des sousunités réceptrices modulaires, qui confèrent la spécificité vis-à-vis du substrat, et qui sont des protéines contenant une boîte F (Skowyra D. et al., (1999) référence citée ; Patton E. E. et al., (1998), Trends Genet., 14, 236-243). Le domaine F est un motif dégénéré d'environ 40 acides aminés, qui permet à la protéine qui le contient, d'interagir spécifiquement avec Skpl (Bai C. et al., (1996), Cell, 86, 263-274). Les complexes SCF sont très étroitement associés à une enzyme E2 particulière, appelée Cdc34, qui reconnaît un site de fixation indépendant sur Cdc53 (Patton E. E. et al., (1998), Genes dev référence citée). A l'heure actuelle, bien que plus de 15 protéines contenant des boîtes F aient été identifiées, grâce à l'homologie de leur séquence, dans le génome de la levure, seulement trois complexes ont été décrits et caractérisés dans cet organisme, à savoir : SCF""', SCFGrrl et SCF"e3o. Chacun de ces complexes a pour cible un ou plusieurs substrat spécifique qui sera dégradé après ubiquitinylation ; ainsi SCFCdc4 a pour cible les inhibiteurs de CDK (cycline-dependent kinases), Siclp et Farlp, SCFGrrl a pour cible les cyclines Gl, Clnl/Cln2 et SCF M,,3() a pour cible l'inhibiteur de CDK, Swepl(Koepp D. M. et al., (1999), référence citée). Les inventeurs ont montré que le complexe SCFMet3 joue également un rôle dans la régulation négative du métabolisme des acides aminés soufrés (Thomas D. et al., (1995), Apiol. Cell. Biol., 15, 6526-6534). Des homologues du complexe SCFe3 ont été récemment découverts dans d'autres organismes. Ainsi, on a identifié, chez la drosophile, un gène Slimb (Superntrmerarv Limbs) codant pour des protéines à boîte F, qui ont pour cible la protéine inhibitrice IKB, le coactivateur transcriptionnel 3-caténine/Armadillo ((3- cat/Arm) ou la protéine régulatrice Cubitus mterruptais (Ci) (Spencer E. et al., (1999), Gènes. Dev., 13, 284-294). Chez l'homme, un complexe homologue du complexe SCFMet3 , le complexe SCF 0-TCp a également été identifié. La protéine 3-TrCP (j3-transducing repeat contaimng protein) a été décrite, pour la première fois, dans le cadre d'une infection par le virus à VIH-1. C'est une protéine à boîte F, induite par la protéine virale Vpu, (Margottin F. et al., (1998), Mol. Cell., 1, 565-574) qui intervient dans la dégradation des récepteurs cellulaires CD4 présents à la surface des cellules infectées, et est nécessaire à l'obtention de particules virales HIV infectieuses. Des études complémentaires ont permis de montrer qu'en l'absence d'une infection par le virus à VIH-1, la ss-TrCP permet la reconnaissance spécifique et la destruction de cibles telles que I#B[alpha], inhibiteur du facteur de transcription ubiquitaire NF#B, qui régule directement la réponse immune et inflammatoire, la P-caténine, protéine de la voie Wg/Wnt, dont la stabilisation anormale conduit à l'activation de la transcription des gènes oncogéniques et qui est impliquée dans plusieurs types de cancers (Hart M. et al., (1999), Curr. Biol., 9, 207- 210 ; Kroll et al., (1999), J. Biol., Chem., 274,7941-7945). Plus récemment, une protéine homologue de la ss-TrCP, la protéine FWD1 a été identifiée chez les souris (Hatakeyama S. et al., (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96,3859-3863). Les complexes SCF constituent en fait, les prototypes d'une superfamille encore plus large d'ubiquitine-ligases, comprenant également les complexes APC (anaphase promoting complex), qui contrôlent la division cellulaire, et les complexes VCB (P7-/o/!C/Ë7oM.8), en particulier ceux qui interviennent dans certaines formes rares de cancers héréditaires et ceux qui contiennent une boîte SOCS (suppressor of cytokine srgnalling). Dans la plupart des voies de signalisation qui font intervenir le protéasome, la cascade de signalisation qui suit, est conservée : A. activation ou inhibition d'une protéine kinase, sous l'influence d'un stimulus extracellulaire, B. phosphorylation (ou déphosphorylation) de la protéine cible, C . reconnaissance et ubiquitinylation de la protéine cible phosphorylée par le complexe SCF, et D. ciblage de la protéine ubiquitinylée vers le protéasome où elle est finalement dégradée. La protéine déphosphorylée échappe à la dégradation et s'accumule y compris dans le noyau. La caractérisation des voies de signalisation contrôlées par les complexes SCF démontre leur rôle central dans le maintien de l'homéostasie cellulaire. En effet, les inventeurs ont identifié chez la levure, la protéine Met30 comme un facteur impliqué dans la répression transcriptionnelle des gènes impliqués dans la biosynthèse des acides aminés soufrés (cystéine, méthionine et Sadénosylméthionine (AdoMet)) (Thomas D. et al., (1995), Mol. Cell. Biol., 15, 6526- 6534). Cette voie métabolique compte un ensemble d'environ 25 gènes (gènes MET) dont la plupart sont strictement co-régulés, c'est-à-dire qu'en réponse à une augmentation intracellulaire d'AdoMet qui peut-être facilement obtenue par addition de méthionine dans le milieu de croissance des levures, la transcription de ces gènes est bloquée. Des études antérieures ont mis en évidence l'existence d'au moins cinq facteurs transcriptionnels différents, qui sont nécessaires à l'activation transcriptionnelle des gènes MET ; parmi ces facteurs, on peut citer, deux protéines à fermeture de leucine (bZIP), Met4 et Met28, deux protéines à doigt de zinc, Met31 et Met32 et la protéine Cbfl, qui est aussi un composant du kinétochore de la levure (Thomas D. et al. (1997), Microbiol. Mol. Biol. Rev., 61, 503-532). Selon les gènes, différentes combinaisons de facteurs s'associent en complexes qui reconnaissent des séquences spécifiques en amont des gènes MET ; ainsi le complexe Cbfl-Met4-Met28 se fixe sur la séquence TCACGTC en amont du gène MET16 alors que les complexes Met4-Met28-Met31 et Met4-Met28-Met32 reconnaissent le motif AAACTGTG en amont des gènes MET3 et MET28 (Kuras L. et al. (1997), EMBO .L, 16, 2441-2451 ; Blaiseau P. L. et al. (1998), EMBO J., 17,6327-6336). Dans tous ces complexes, l'activation transcriptionnelle des différents gènes MET ne dépend que d'un seul domaine d'activation porté par la sous-unité Met4. Le dysfonctionnement de la voie ubiquitine-protéasome, voie de dégradation des protéines, a été établi dans de nombreuses pathologies de natures extrêmement diverses, notamment les cancers, les maladies génétiques, la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, les syndromes inflammatoires et les infections virales. Ainsi, on sait que toute mutation présente sur les protéines cibles autour des sites de phosphorylation, abolit la reconnaissance des protéines mutées par les complexes SCF et conduit à leur stabilisation. Il a été démontré récemment, que de telles mutations qui affectent la p-caténine et interdisent sa destruction, sont impliquées dans la transformation tumorale dans de nombreux tissus (cancer du colon, mélanome, hépatocarcinome, etc. ). A l'opposé, la dégradation excessive de la p-caténine dans les neurones a été mise en cause dans la maladie d'Alzheimer, et est impliquée dans la mort neuronale par apoptose qui survient dans cette pathologie. Aussi la recherche d'agents aptes à agir sur les pathologies liées à un dysfonctionnement de la cascade de l'ubiquitine et de la dégradation du protéasome, notamment des anticancéreux, des agents anti-inflammatoires et des agents antiviraux (Maniatis T. (1999) référence citée ; F. Margottin et al., (1999), Médecine et Sciences, 15,1008-1014) s'avère hautement souhaitable. Or. poursuivant leurs travaux, les inventeurs ont démontré récemment, de manière inattendue, que le complexe SCFMet30 contrôle la transcription de l'ensemble des gènes de la voie d'assimilation du sulfate et que la répression transcriptionnelle de cette voie, en réponse à une augmentation de la concentration intracellulaire en AdoMet, résulte de la dégradation spécifique de Met4 qui fait intervenir le complexe SCFNec'o. L'existence de ce contrôle, établit pour la première fois le lien direct entre l'activité du complexe SCFMet30 et la régulation du métabolisme des acides aminés soufrés. Tirant partie de l'extrême conservation des mécanismes moléculaires impliqués dans les voies ubiquitine-protéasome de dégradation des protéines chez l'ensemble des cellules eucaryotes, les inventeurs se sont donné pour but de pourvoir à des procédés de criblages cellulaires fonctionnels d'agents aptes à moduler l'activité des complexes SCF, qui soient fiables et rapides. La présente invention a en conséquence pour objet des procédés de criblages cellulaires fonctionnels d'agents aptes à moduler l'activité des complexes SCFMet30, caractérisés en ce qu'ils comprennent les étapes suivantes : (i) la mise en contact du produit à tester avec une souche de levure modifiée, comportant (a) une séquence hybride, comprenant une séquence codant pour une protéine Met4, sous sa forme sauvage ou mutée, fusionnée en phase avec au moms une séquence codant pour un marqueur approprié, ladite séquence hybride étant exprimée sous le contrôle d'un promoteur, actif chez la levure et éventuellement (b) un système transcriptionnel rapporteur, constitué par un gène rapporteur placé sous le contrôle d'une séquence opératrice appropriée ou d'un promoteur de levure approprié, (ii) l'addition de méthionine, à des concentrations répressives, comprises entre 0,03 mM et 20 mM, ou non répressives, et (iii) la détermination du niveau d'expression et de la stabilité de la protéine exprimée à partir de la séquence hybride, soit par visualisation et/ou quantification, soit par détermination de l'activité du gène rapporteur. Dans un mode de mise en #uvre avantageux des procédés selon l'invention, lesdits procédés peuvent comprendre en parallèle les étapes suivantes : (iv) la mise en contact du produit à tester avec une souche de levure modifiée, comportant une séquence hybride, comprenant une séquence codant pour une protéine Met30, sous sa forme sauvage ou mutée, fusionnée en phase avec au moins une séquence codant pour un marqueur approprié, ladite séquence hybride étant exprimée sous le contrôle d'un promoteur, actif chez la levure, (v) l'addition de méthionine, à des concentrations répressives, comprises entre 0,03 mM et 20 mM, ou non répressives, et (vi) la détermination du niveau d'expression et de la stabilité de la protéine exprimée à partir de la séquence hybride, soit par visualisation et/ou quantification, soit par détermination de l'activité du gène rapporteur. Dans un autre mode de mise en #uvre avantageux des procédés selon l'invention, lesdits procédés peuvent comprendre en outre, un moyen supplémentaire mettant en #uvre un système cellulaire de contrôle, qui permettra de s'assurer de la spécificité de réponse des systèmes hybrides ou des systèmes rapporteurs transcriptionnels utilisés dans les étapes (i) à (vi), ledit moyen comprenant les étapes suivantes : (vii) la mise en contact du produit à tester avec une souche de levure modifiée, comportant une séquence hybride, comprenant une séquence codant pour une protéine Met28, sous sa forme sauvage ou mutée, fusionnée en phase avec au moins une séquence codant pour un marqueur approprié, ladite séquence hybride étant exprimée sous le contrôle d'un promoteur, actif chez la levure, (viii) l'addition de méthionine, à des concentrations répressives, comprises entre 0,03 mM et 20 mM, ou non répressives, et (ix) la détermination du niveau d'expression et de la stabilité de la protéine exprimée à partir de la séquence hybride, soit par visualisation et/ou quantification, soit par détermination de l'activité du gène rapporteur. Dans un autre mode de mise en #uvre avantageux des procédés selon l'invention, lesdits procédés peuvent comprendre en outre, un moyen supplémentaire mettant en #uvre un système acellulaire de contrôle qui repose sur la mesure des taux de transcription des séquences hybrides et des gènes métaboliques MET16 et MET25, ledit moyen comprenant les étapes les étapes suivantes : (x) l'extraction des ARNs totaux des souches modifiées utilisées soit à l'étape (i), soit à l'étape (iv), soit à l'étape (vii) et (xi) la mesure des taux de transcription de la séquence hybride et celle des gènes métaboliques METl6 et MET25. La présente invention a également pour objet des procédés de criblages cellulaires fonctionnels d'agents aptes à moduler l'activité des complexes SCFMet30, caractérisés en ce qu'ils comprennent les étapes suivantes : (xii) la mise en contact du produit à tester avec une souche de levure modifiée, comportant un système transcriptionnel rapporteur, constitué par un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur de levure approprié, (xiii) l'addition de méthionine, à des concentrations répressives, comprises entre 0,03 mM et 20 mM, ou non répressives, et (xiv) la détermination de l'activité du gène rapporteur. Au sens de la présente invention, on entend par forme mutée d'une protéine, une protéine modifiée soit par insertion, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés. Au sens de la présente invention, on entend par méthionine, la forme (L) ou la forme (DL) de la méthionine. Dans un mode de mise en #uvre avantageux des procédés selon l'invention, le marqueur utilisé pour la construction de la séquence hybride est choisi dans le groupe constitué par : les peptides antigéniques, par exemple le motif antigénique hémagglutinine (Ha), les protéines à fluorescence intrinsèque, comme par exemple la protéine à fluorescence verte (Green Fluorescence Protem ou GFP), les protéines à activité enzymatique mesurable, et les facteurs de liaison à l'ADN comme par exemple LexA de E. colt. Lorsque le marqueur est le facteur bactérien de liaison à l'ADN, LexA, alors la protéine hybride est exprimée à partir d'un plasmide, comportant également le gène TRP1 ou le gène LEU2 comme gènes de sélection de la levure. Dans un autre mode de mise en #uvre avantageux des procédés selon l'invention, le promoteur permettant l'expression de la protéine hybride peut être soit un promoteur inductible actif chez S. cerevisiae, qui peut être avantageusement choisi dans le groupe constitué par le promoteur du gène GAL1 et le promoteur du gène CUP1, soit un promoteur constitutif, comme par exemple le promoteur du gène ADH1 de S. cerevisiae. Dans un autre mode de mise en #uvre avantageux desdits procédés, le gène rapporteur présent dans le système rapporteur transcriptionnel est choisi dans le groupe constitué par les gènes rapporteurs dont l'activité est visualisable par une méthode colorimétrique, comme par exemple le gène XylE de P. putida et le gène LacZ d'E. coli, et les gènes métaboliques, dont l'activité est mesurable par un test de croissance, notamment les gènes HIS3 et URA3 de S. cerevisiae. Dans un mode de mise en #uvre avantageux des procédés dans lesquels la souche de levure modifiée, comporte seulement un système transcriptionnel rapporteur, alors le promoteur présent dans le système rapporteur transcriptionnel est choisi dans le groupe constitué par les gènes MET, notamment dans le groupe constitué par les gènes MET 16, AIET25 et MET'8. Dans un autre mode de mise en #uvre avantageux des procédés selon l'invention, les souches de levures portent une à plusieurs mutations qui augmentent la perméabilité aux produits à tester (Vidal M et al., (1999). Trends in Biotechnoi., 17, 374-381). Pour la mise en oeuvre des procédés selon l'invention, on peut utiliser des souches de levure possédant le fond génétique de la souche W303 de la levure S. cerevisiae qui est décrite par Bailis A. M. et al., (Genetics, (1990), 126, 535- 547) ou toute autre souche caractérisée de ladite levure. La transformation des cellules de levures par de l'ADN exogène a été réalisée en utilisant des techniques connues de l'homme du métier, notamment la technique décrite par Schiestl R. H. et al. (Curr. Genet., (1989), 16, 339-346), les techniques de génétique (sporulation, dissection et évaluation des marqueurs..) sont également connues et on peut citer notamment celles décrites par Sherman F. et al. (in Methods in Yeast Genetics.- a Laboratory Manual, (1979), Cold Spring Harbor, N. Y. ) et les techniques de génétique inverse décrites par Rothstein R. ( Methods in En:;ymology, (1991), 194, 281-301) ; comme technique d'intégration dirigée au locus par simple recombinaison homologue (crossing over), on peut citer celle qui est décrite dans Orr-Weaver et al. (1983 ; référence citée). Conformément à l'invention, les levures peuvent être transformées par des plasmides construits par des techniques de biologie moléculaires classiques, notamment selon les protocoles décrits par Sambrook J. et al. (in Molecular cloning Laboratory iilantial, 2nd edition, (1989), Cold Spring Harbor, N. Y.) et Ausubel F. M. et al. (in Current Protocols in Molecular Biology, (1990-1999), John Wiley and Sons, Inc. New York). Conformément à l'invention, l'activité des gènes rapporteurs et des gènes MET est mesurée, selon le gène rapporteur et le promoteur utilisés, par des techniques connues en soi, notamment des techniques colorimétriques, enzymatiques, immunologiques, de fluorescence ou de sélection sur un milieu de croissance approprié. Conformément à l'invention, l'activité du complexe SCFMet30 est déterminée par la mesure du niveau d'expression et de la stabilité de la protéine codée par la séquence hybride et/ou par l'activité du système rapporteur transcriptionnel. Ainsi, lorsque le marqueur présent dans la protéine hybride est la protéine GFP, alors l'activité du complexe SCFMet30 est visualisée en observant et en quantifiant la fluorescence de la protéine hybride GFP-Met4 ou GFP-Met30 ; le marqueur présent dans la protéine hybride, est le motif antigénique hémagglutinine (Ha), alors l'activité du complexe SCFMet30 est visualisée par des techniques immunologiques, telles que des techniques de transfert de protéines (Western Blotting), des techniques ELISA ou des techniques d'immunoprécipitation (Harlow E. et al., (1988), Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y.) ; lorsque les cellules contiennent un système rapporteur transcriptionnel contenant le gène XylE, alors l'activité du complexe SCFMet3Oest visualisée par vaporisation, sur les cellules de levure, de catéchol à une concentration comprise entre 50 mM et 1 M, et en mesurant l'apparition d'une coloration jaune (Worsay M. J. et al., (1975), J. Bactet-iol., 124, 7-13) ; lorsque les cellules contiennent un système rapporteur transcriptionnel contenant le gène LacZ d'E. coli, alors l'activité du complexe SCFMet30 est visualisée en mesurant l'apparition d'une coloration bleue, sur un milieu contenant le substrat colorigénique X-Gal (Sambrook J. (1989), référence citée) ; lorsque les cellules contiennent un système rapporteur transcriptionnel contenant le gène HIS3 de S. cerevisiae, alors l'activité du complexe SCFMet30 est visualisée en faisant croître la levure sur un milieu minimum ne contenant pas d'histidine, en présence d'aminotriazole, à des concentrations de 0,5 mM à 200 mM. Les procédés de criblages cellulaires fonctionnels, objets de la présente invention, présentent plusieurs avantages : - simplicité : l'induction est réalisée par addition de méthionine dans le milieu de croissance, - rapidité de développement : les techniques de génétique inverse, la connaissance intégrale du génome de la levure et les méthodes de biologie moléculaires adaptées à cet organisme, assurent une mise en oeuvre rapide de souches stables indicatrices, -rapidité de croissance et de criblage la levure est un microorganisme à croissance rapide et rendement élevé, ce qui autorise l'obtention de cellules modifiées pour un nombre élevé de criblages, - faible coût : la levure est un microorganisme dont la culture, le stockage, la caractérisation sont peu onéreux. Du fait de l'existence de nombreuses sous-unités communes aux différents complexes SCF, lesdites sous-unités étant en équilibre stoechiométrique, le complexe SCFMet30 peut servir de modèle pour cribler des molécules sur leur capacité à moduler soit l'activité des voies de signalisation contrôlées par l'ensemble des complexes SCF, soit celle de la voie ubiquitine-protéasome, voie de dégradation des protéines. Les procédés de criblages selon l'invention, peuvent notamment servir à sélectionner des agents actifs comme anticancéreux, anti-inflammatoires, antiviraux ou des agents actifs dans des maladies génétiques, notamment dans la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer. Au sens de la présente invention on entend par agent, toute molécule issue de procédés de synthèses ou de ressources naturelles. Aussi la présente invention a pour objet, l'utilisation d'agents sélectionnés par les procédés selon la présente invention, pour la préparation de médicaments destinés au traitement des maladies liées à des troubles de l'activité des complexes SCF ou de la voie ubiquitine-protéasome. La présente invention a également pour objet des plasmides, caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence hybride, comprenant une séquence codant pour une protéine Met4, sous sa forme sauvage ou mutée, fusionnée en phase avec au moins une séquence codant pour un marqueur approprié, ladite séquence hybride pouvant être exprimée chez la levure, sous le contrôle d'un promoteur, constitutif ou inductible. La présente invention a également pour objet des plasmides, caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence hybride, comprenant une séquence codant pour une protéine Met28, sous sa forme sauvage ou mutée, fusionnée en phase avec au moins une séquence codant pour un marqueur approprié, ladite séquence hybride pouvant être exprimée chez la levure, sous le contrôle d'un promoteur, constitutif ou inductible. La présente invention a également pour objet des plasmides, caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence hybride, comprenant une séquence codant pour une protéine Met30, sous sa forme sauvage ou mutée, fusionnée en phase avec au moins une séquence codant pour un marqueur approprié, ladite séquence hybride pouvant être exprimée chez la levure, sous le contrôle d'un promoteur, constitutif ou inductible. La présente invention a également pour objet des plasmides, caractérisés en ce qu'ils contiennent un système transcriptionnel rapporteur, constitué par un gène rapporteur placé sous le contrôle d'une séquence opératrice appropriée ou d'un promoteur de levure approprié, pourvu que, quand la protéine hybride codée par la séquence contenue dans le plasmide, est LexAMet4, alors le gène de sélection de la levure est choisi dans le groupe constitué par le gène TRP1 et le gène LEU2. La présente invention a également pour objet des plasmides contenant un système transcriptionnel rapporteur, constitué par un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur de levure approprié, caractérisé en ce que le gène rapporteur est choisi dans le groupe constitué par LacZ et XvIE et le promoteur est AlET16. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux des plasmides selon l'invention, les plasmides comprennent une séquence hybride codant pour Met4 fusionnée avec une séquence codant pour trois motifs antigénique hémagglutinine (Ha) sous le contrôle du promoteur GAL 1. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux des plasmides selon l'invention, les plasmides comprennent une séquence hybride, comprenant une séquence codant pour la protéine Met4 fusionnée avec une séquence codant pour la GFP, sous le contrôle du promoteur MET4 ou du promoteur GAL 1. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux des plasmides selon l'invention, les plasmides comprennent une séquence hybride, comprenant une séquence codant pour Met28 fusionnée avec une séquence codant pour trois motifs antigénique hémagglutinine (Ha) sous le contrôle du promoteur GAL1. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux des plasmides selon l'invention, les plasmides comprennent une séquence hybride, comprenant une séquence codant pour la protéine Met28 fusionnée avec une séquence codant pour la GFP, sous le contrôle du promoteur MET28ou du promoteur GAL 1. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux des plasmides selon l'invention, les plasmides comprennent une séquence hybride, comprenant une séquence codant pour Met30 fusionnée avec une séquence codant pour trois motifs antigénique hémagglutinine (Ha) sous le contrôle du promoteur GAL1. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux des plasmides selon l'invention, les plasmides comprennent une séquence hybride, comprenant une séquence codant pour Met30 fusionnée avec une séquence codant pour trois motifs antigénique hémagglutinine (Ha) et avec une séquence codant pour GFP, sous le contrôle du promoteur GAL1. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux des plasmides selon l'invention, les plasmides comprennent une séquence hybride, comprenant une séquence codant pour Met30 fusionnée avec une séquence codant pour la protéine GFP sous le contrôle du promoteur MET30. La présente invention a également pour objet des souches de levure, caractérisées en ce qu'elles sont modifiées, de façon stable, par un plasmide selon la présente invention. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description et des exemples, illustrés par les figures dans lesquelles : - la figure 1 illustre l'influence de l'addition de méthionine à des concentrations répressives dans le milieu de culture (A) les cellules comportant un plasmide codant pour les protéines marquées par des motifs antigèniques hémagglutinine (Ha) sous le contrôle du promoteur GAL1, et préparé selon le mode opératoire décnt dans les exemples 2 et 4, sont cultivées, selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 12, dans un milieu minimum contenant 2 % de galactose pendant 90 minutes, soit en présence de méthionine à une concentration répressive (+ Met), soit en l'absence de méthionine (- Met) ; et (C) les ARN totaux sont extraits, selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 12 à partir de cellules utilisées en (A) et exprimant soit la protéine hybride Ha-Met4, soit la protéine hybride Ha-Met28. Les cellules sont cultivées dans les conditions décrites en (A) et sont analysées avec .IET, MET16, METIS, iVET28. met4A correspond à une cellule W303 modifiée par une copie chromosomique du gène MET4 inactivé ; met28A correspond à une cellule W303 modifiée par une copie chromosomique du gène MET28 inactivé. - la figure 2 illustre la localisation des protéines hybrides GFP-Met4 et GFP-Met28 dans des cellules sauvages, en l'absence de méthionine (- Met) ou en présence de méthionine à une concentration répressive (+ Met). Les cellules sont cultivées dans les conditions décrites dans l'exemple 12. Hoe correspond à l'indicateur coloré spécifique des noyaux, Hoechst 333-42 ; Nom correspond à l'image obtenue par microscopie interférentielle selon Nomarski. - la figure 3 illustre (A) la localisation de la protéine hybride GFP- Met30 dans des cellules sauvages, en l'absence de méthionine (- Met) ou en présence de méthionine à une concentration répressive (+ Met). Les cellules sont cultivées dans les conditions décrites dans l'exemple 12. Hoe correspond à l'indicateur coloré Hoechst 333-42; Nom correspond à l'image obtenue par microscopie interférentielle selon Nomarski ; (B) stabilité des protéines hybrides Ha-Met30 et Ha-Met30AF dans des souches W303-1A sauvages. - la figure 4 illustre l'activité du gène rapporteur LexAopXylE en l'absence de méthionine (- Met) ou en présence de méthionine à une concentration répressive, à partir d'une souche de levure (C190) exprimant la protéine hybride codée par le plamide pLexMet4-7 ; la visualisation est réalisée par la mesure de la catéchol-oxydase. Exemple 1 : Construction des plasmides de base pGal316Flu, pGal306F]u et pFL39Flu. 1.1. Construction des plasmides pGal3l6FIu et pGal306FIti 1.1.1. Construction des plasmides pGal316 et pGal306 : Un fragment de 900 paires de bases (bp) du plasmide pJNl (Nehlin J. et al., (1990) EMBO J., 9,2891-2898) contenant une fusion entre les promoteurs des gènes de S. cerevisiae, GAL1 et TPK2, est amplifié par PCR (polymerase chain reaction), en utilisant les oligonucléotides olGallO de séquence SEQ ID N 1 : 5' CAAAGAAGCTTAATAATCATATT 3' et olGalTPK de séquence SEQ ID N 2 : 5' TTGACC AACTGGCTGAGCC 3'. Le fragment obtenu est digéré par les enzymes de restrictions HindIII et EcoRI et inséré : (i) dans le plasmide navette S . cerevisiae - E. coli, pRS316 dont la séquence est déposée à la banque de données EMBL, avec l'identificateur PRS316 , et le n U03442, préalablement digéré par les enzymes HindIII et EcoRI, produisant le plasmide pGa1316, (ii) dans le plasmide navette S . cerevisiae - E. coli, pRS306 dont la séquence a été déposée à la banque de données EMBL, avec l'identificateur PRS306 , sous le n U03438, préalablement digéré par les enzymes de restriction HindIII et EcoRI. On produit ainsi le plasmide pGal306 . 1.1.2. Construction des plasmides pGa1316Flu et pGal306Flu : Un fragment d'ADN double brin correspondant à la séquence SEQ ID N 3 et codant pour un répétition de 3 motifs antigéniques hémagglutinine (Ha) est inséré : (i) dans le plasmide pGal316 obtenu au point 1. 1.1, préalablement digéré par l'enzyme de restriction EcoRI et dont les extrémités ont été rendues franches par un traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase d'E. colt, produisant le plasmide pGa1316Flu, (ii) dans le plasmide pGal306 préparé au moint 1.1.1., préalablement digéré par l'enzyme de restriction EcoRI et dont les extrémités ont été rendues franches par un traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase d'E. coli, produisant le plasmide pGal306Flu. 1. 2. Construction du plasmidepFL39Flu : Dans une première étape le site EcoRI présent dans le polylinker du plasmide navette S . cereV1Slae - E. coli pFL39 a été détruit. Pour cela le plasmide pFL39, dont la séquence est celle déposée à la banque de données EMBL, avec l'identificateur CVPFL39 , sous le n X70483, a été digéré par EcoRI, les extrémités rendues franches par un traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase d'E. coli, et le produit ainsi traité a été religaturé sur lui-même produisant le plasmide pFL39E0. Dans une seconde étape, le fragment HmdIII-PstI du plasmide pGal316Flu préparé selon le mode opératoire décrit au point 1.1. et comprenant la région promoteur GAL1 et le fragment codant pour la région antigénique Ha, a été inséré dans le plasmide pFL39EO préalablement digéré par les enzymes HindIII et PstI. On obtient ainsi le plasmide pFL39Flu. Exemple 2: Plasmides permettant l'expression chez la levure de protéines hybrides Ha-Met4 sous le contrôle du promoteur GAL1 Les plasmides qui suivent permettent l'expression chez la levure S. cerevisiae de dérivés de la protéine Met4 comprenant une répétition de trois motifs antigénique hémagglutinine (Ha) à leur extrémité amino terminale. 2.1. Construction du plasmide pGal316FluMet4 : Le fragment d'ADN EcoRI-BamHl du vecteur pLexM4-l (Thomas D. et al., (1992), Mol. Cell. Biol., 12,1719-1727) codant pour les acides aminés 15 à 666 de la protéine Met4 a été cloné dans le plasmide pGal316Flu préalablement digéré par les enzymes EcoRI et BamHI, produisant le plasmide pGa1316FluMet4. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. 2.2. Construction du plasmide pGal316FIuMet4A12 : Le fragment d'ADN EcoRI-Xbal du vecteur pLexM4A12 (Kuras L. et al., (1995), Mol. Cell. Biol., 15,208-216) codant pour un dérivé comprenant les acides aminés 15 à 79 et 180 à 666 de la protéine Met4 a été cloné dans le plasmide pGal316Flu préalablement digéré par les enzymes EcoRI et XbaI, produisant le plasmide pGal316FluMet4A12. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. 2.3. Construction duplasmide pGa1316FluMet4i130 : Le fragment d'ADN EcoRI-Xbal du vecteur pLexM4A30 (Kuras L. et al., (1995) référence citée) codant pour un dérivé comprenant les acides aminés 15 à 211 et 232 à 666 de la protéine Met4 a été cloné dans le plasmide pGal316Flu préalablement digéré par les enzymes EcoRI et Xbal, produisant le plasmide pGal316FluMet4A30. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. 2.4. Construction du plasmide pGa1316FluMet4i137 : Le fragment d'ADN EcoRI-XbaI du vecteur pLexM4A37 (Kuras L. et al., (1995), référence citée) codant pour un dérivé comprenant les acides aminés 15 à 344 et 366 à 666 de la protéine Met4 a été cloné dans le plasmide pGal316Flu préalablement digéré par les enzymes EcoRI et XbaI, produisant le plasmide pGa1316F1uitet437. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. 2.5. Construction du plasmide pGa!316FtuMet4ALZ : Le fragment d'ADN EcoRl-Xbal du vecteur pLexM4-3 (Thomas D. et al., (1992), référence citée) codant pour les acides aminés 15 à 616 de la protéine Met4 a été cloné dans le plasmide pGal316Flu préalablement digéré par les enzymes EcoRI et XbaI, produisant le plasmide pGa1316FluMet4dLZ. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. 2. 6. Construction du plasmide pFL39FluMet4 : Le fragment d'ADN EcoRI-BamHI du vecteur pLexM4-1 (Thomas D. et al., (1992), référence citée) codant pour les acides aminés 15 à 666 de la protéine Met4 a été cloné dans le plasmide pFL39Flu préalablement digéré par les enzymes EcoRI et BamHI, produisant le plasmide pFL39FluMet4. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. Exemple 3 : Construction des plasmides permettant l'expression chez la levure de protéines hybrides GFP-Met4 Les plasmides qui suivent permettent l'expression chez la levure S. cerevisiae de dérivés de la protéine Met4 fusionnés à la protéine à fluorescence verte d'Aequora victoria (Green Fluorescent Protein ou GFP). 3.1. Construction du plasmide pGFPMet4 Un fragment de 710 paires de bases (bp) du plasmide pGFPmut3, codant pour la protéine GFP3 (Green Fluorescent Protein mut3, produit du gène GFP d'Aequora victoria dont la séquence est déposée à la banque EMBL, avec l'identificateur AVU73901 , sous le n U73901) a été amplifié par PCR (polymerase chain reaction) en utilisant les oligonucléotides oIGFPM4-5 de séquence SEQ ID N 4 : 5' ACGCGAATTCATGTCTAAAGGTGAATTA 3' et oIGFPM4-3 de séquence SEQ ID N 5 5' ACGCGAATTCTTTGTACAATTCATCCAT 3'. Le fragment obtenu a été digéré par l'enzyme de restriction EcoRI et inséré dans le plasmide pM4-5 (Kuras L. et al., (1995) référence citée) préalablement digéré par l'enzyme EcoRI, produisant le plasmide pGFPMet4. Ce plasmide permet l'expression sous le contrôle du promoteur MET4 d'une protéine hybride GFP-Met4 comprenant les acides aminés 15 à 666 de Met4, et peut se répliquer de façon autonome chez la levure. 3. 2. Construction du plasmide pGaI316GFPMet4 Le fragment EcoRI-BamHI du plasmide pGFPMet4, codant pour la fusion GFP-Met4, a été inséré dans le plasmide pGal316 préalablement digéré par les enzymes EcoRI et BamHI, produisant le plasmide pGal316GFPMet4. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. 3.3. Construction du plasmidepGa1316GFP:let412 : Le fragment d'ADN EcoRI-EcoRI du vecteur pGa1316GFPMet4 préparé selon le mode opératoire décrit précédemment et codant pour la GFP a été cloné en phase dans le plasmide pGa1316FIuMet412 préalablement digéré par l'enzyme EcoRI, produisant le plasmide pGa1316GFPMet4.12. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. 3.4. Construction du plasmide pGal3l6GFP'vfet4AD'O Le fragment d'ADN EcoRI-EcoRI du vecteur pGal316GFPMet4 préparé selon le mode opératoire décrit au point 3.2 et codant pour la GFP a été cloné en phase dans le plasmide pGa!316FluMet4A30 préalablement digéré par l'enzyme EcoRI, produisant le plasmide pGal316GFPMet4A30. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. 3.5. Construction du plasmide pGa1316GFPylet43 7 : Le fragment d'ADN EcoRI-EcoRI du vecteur pGa1316GFPMet4 préparé selon le mode opératoire décrit au point 3.2 et codant pour la GFP a été cloné en phase dans le plasmide pGal316FluMet4A37 préalablement digéré par l'enzyme EcoRI, produisant le plasmide pGal316GFPMet4A37. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. 3. 6. Construction du plasmide pGal306GFPMet4 : Le fragment d'ADN Notl-Asp718 du vecteur pGal316GFPMet4 préparé selon le mode opératoire décrit au point 3.2 et comprenant l'ensemble du promoteur GAL1 compris dans la séquence déposée à la banque de données EMBL, sous l'identificateur SCGAL10 , sous le n K02115 et de la fusion GFP-Met4 (résidus 15 à 666 de Met4), a été inséré dans le plasmide pRS306 préalablement digéré par les enzymes Notl-Asp718, produisant le plasmide pGal306GFPMet4. 3.7. Construction du plasmide pGa1306GFPMet4112 : Le fragment d'ADN Notl-Asp718 du vecteur pGal316GFPMet4A12 préparé selon le mode opératoire décrit au point 3.3 et comprenant l'ensemble du promoteur GAL1 et de la fusion GFP-Met4A12 (résidus 1579 et 180-666 de Met4), a été inséré dans le plasmide pRS306 préalablement digéré par les enzymes Notl-Asp718, produisant le plasmide pGal306GFPMet4A12. 3.8. Construction du plasmide pGal306GFPMet4A30 : Le fragment d'ADN Notl-Asp718 du vecteur pGal316GFPMet4A30 préparé selon le mode opératoire décrit au point 3.4 et comprenant l'ensemble du promoteur GAL1 et de la fusion GFP-Met4A30 (résidus 15 à 211et 221 à 666 de Met4), a été inséré dans le plasmide pRS306 préalablement digéré par les enzymes Notl-Asp7l8, produisant le plasmide pGa1306GFPMet4130. 3.9. Construction du plasmide pGal306GFPMet4A37 : Le fragment d'ADN Notl-Asp718 du vecteur pGal316GFPMet4A37 préparé selon le mode opératoire décrit au point 3. 5 et comprenant l'ensemble du promoteur G.ALI et de la fusion GFP-Met4A37 (résidus 15 à 352 et 366 à 666 de Met4), a été inséré dans le plasmide pRS306 préalablement digéré par les enzymes Al-718, produisant le plasmide pGal306GFPMet4A37. Exemple 4 : Construction des plasmides permettant l'expression chez la levure de protéines hybrides Ha-Met28 et GFP-Met28 4.1. Construction du plasmide pGal3 l6FluMet28 : Le fragment d'ADN EcoRI-BamHI du vecteur pLexM28-2 (Kuras L. et al., (1996), EMBO J., 15,2519-2529) codant pour les acides aminés 1 à 166 de la protéine Met28 a été cloné dans le plasmide pGal316Flu préalablement digéré par les enzymes EcoRI et BamHI, produisant le plasmide pGa1316FluMet28. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. Il permet l'expression chez la levure d'une protéine Met28 entière comprenant à son extrémité amino-terminale une répétition de 3 motifs antigéniques hémagglutinine (Ha). La protéine hybride Ha- Met28 est exprimée sous le contrôle du promoteur GAL1. 4. 2. Construction du plasmide pFL39FluMet28 : Le fragment d'ADN EcoRI-BgIII du vecteur pLexM28-2 (Kuras L. et al., (1996), référence citée) codant pour les acides aminés 1 à 166 de la protéine Met28 a été cloné dans le plasmide pFL39Flu préalablement digéré par les enzymes EcoRI et BglII, produisant le plasmide pFL39FluMet28. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. Il permet l'expression chez la levure d'une protéine Met28 entière comprenant à son extrémité amino-terminale une répétition de 3 motifs antigéniques hémagglutinine (Ha). La protéine hybride Ha-Met28 est exprimée sous le contrôle du promoteur GAL1. 4.3. Construction du plasmide pGFPMet28 : 4.3.1. construction du plasmide p314Met28 : Le fragment d'ADN XbaI-HpaI du vecteur pMet28-1 (Kuras L. et al., (1996), référence citée) contenant le gène LfET?8, dont la séquence est celle déposée à la banque de données EMBL, sous l'identificateur SC17015 , sous le n U17015 et sa région promoteur a été isolé, ses extrémités ont été rendues franches par un traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase d'E. coli et ce fragment d'ADN a été inséré dans le plasmide pRS314 (Sikorski R. S. et al., (1989), Genetica, 122, 19-27) préalablement digéré par l'enzyme SmaI, produisant le plasmide p314Met28. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. 4. 3.2. construction du plasmide p314GFPMet28 : Un fragment de 710 paires de bases (bp) du plasmide pGFPmut3, codant pour la protéine GFP3 a été amplifié par PCR en utilisant les oligonucléotides olM28GFP5 de séquence SEQ ID N 6 : 5 ' TGAAATTGTTGAATGACATTAAGAGACGGAACATGGGC AGGTCTAAAGGTGAAGAATTATTC 3' et olM28GFP3 de séquence SEQ ID N 7 : 5'AGTCTGTGGAATATAAACGGTCCTTGATCAATGCGGAG TGTTATTTGTACAATTCATCCAT 3'. Le fragment obtenu a été inséré dans le plasmide p314Met28 par la méthode du gap repair selon la technique décrite par Orr-Weaver et al., (Methods in Enzymolop,, (1983), 101, 228-245). Ainsi le fragment obtenu après PCR et le plasmide p314Met28, préalablement digéré par l'enzyme BglII ont été cotransformés dans la souche de levure W303-1A (Bailis A. M. et al., (1990), référence citée), et les clones prototrophes pour le tryptophane ont été sélectionnés. L'ADN plasmidique contenu dans ces clones a été extrait, transformé dans E. coli et le plasmide recombinant p314Met28GFP identifié et caractérisé par digestions enzymatiques et séquence. Ce plasmide permet l'expression d'une protéine Met28 entière fusionnée à son extrémité carboxy-terminale avec la protéine GFP. La protéine hybride Met28-GFP est exprimée sous le contrôle du promoteur MET28. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. Exemple 5 : Construction des plasmides permettant l'expression chez la levure de protéines hybrides Ha-Met30 et GFP-Met30 5.1. Construction du plasmide pGal316FluMet30tlN : Le fragment d'ADN EcoRI-5g/II du vecteur pGadMet30-l (Thomas D. et al., (1995), référence citée) codant pour les acides aminés 158 à 640 de la protéine Met30 a été cloné dans le plasmide pGal3l6FIu préalablement digéré par les enzymes EcoRI et BamHI, produisant le plasmide pGal316FluMet30AN. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. Il permet l'expression chez la levure d'une protéine Met30 tronquée de sa partie amino-terminale mais comprenant à cette extrémité une répétition de 3 motifs antigéniques hémagglutinine (Ha). La protéine hybride Ha-Met30 est exprimée sous le contrôle du promoteur GAL1. 5.2. Construction du plasmide Ga1316F1uMet30:Le fragment d'ADN EcoRI-EcoRI du vecteur pLexMet30-4 (Thomas D. et al., (1995), référence citée) codant pour les 157 premiers acides aminés de la protéine Met30 a été cloné dans le plasmide pGal316FluMet30AN préalablement digéré par l'enzyme EcoRI, produisant le plasmide pGal316FluMet30. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. Il permet l'expression chez la levure d'une protéine Met30 entière comprenant à son extrémité amino-terminale une répétition de 3 motifs antigéniques hémagglutinine (Ha). La protéine hybride Ha-Met30 est exprimée sous le contrôle du promoteur GAL 1. 5. 3. Construction du plasmide pFL39FluMet30AN : Le fragment d'ADN EcoRI-BgIII du vecteur pGadMet30-l (Thomas D. et al., (1995), référence citée) codant pour les acides aminés 158 à 640 de la protéine Met30 a été cloné dans le plasmide pFL39Flu préalablement digéré par les enzymes EcoRI et BamHI, produisant le plasmide pFL39FluMet30AN. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. Il permet l'expression chez la levure d'une protéine d'une protéine Met30 tronquée de sa partie amino-terminale mais comprenant à cette extrémité une répétition de 3 motifs antigéniques hémagglutinine (Ha). La protéine hybride Ha-Met30 est exprimée sous le contrôle du promoteur GAL1. 5.4. Construction du lasmideFL39FluMet300F : Ce plasmide est construit selon le mode opératoire décrit au point 5.3, mais exprime une protéine Met30 mutée qui ne comprend pas les acides aminés 187 à 201. 5. 5. Construction du plasmide pFL39FluMet30 Le fragment d'ADN EcoRI-EcoRI du vecteur pLexMet30-4 (Thomas D. et al., (1995), référence citée) codant pour les 157 premiers acides aminés de la protéine Met30 a été cloné dans le plasmide pFL39FluMet30AN préalablement digéré par l'enzyme EcoRI, produisant le plasmide pFL39FluMet30. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. Il permet l'expression chez la levure d'une protéine Met30 entière comprenant à son extrémité amino-terminale une répétition de 3 motifs antigéniques hémagglutinine (Ha). La protéine hybride HaMet30 est exprimée sous le contrôle du promoteur GAL1. 5.6. Construction du plasmide p316Flu:v1et30GFP . Un fragment de 710 paires de bases (bp) du plasmide pGFPmut3 codant pour la protéine GFP3 a été amplifié par PCR en utilisant les oligonucléotides olVi30GFP5 de SEQ ID N 8 : 5 ' GGGTGCGTAAAAATGTACAAATTCGATCTCAATGATTCT AAAGGTGAAGAATTATTCACT 3' et 0!316GFP,3 de SEQ ID N 9 5'TAGGGCGAATTGGAGCTCCACCGCGGTGGCTTATTTGTA CAATTCATCCCAT 3'. Le fragment obtenu a été inséré dans le plasmide pGa1316F1uMet30 par la méthode du gap repair (Orr Weaver et al., 1983 ; référence déjà citée). Ainsi le fragment obtenu après PCR et le plasmide pGa1316FluMet30, préalablement digéré par l'enzyme XbaI ont été cotransformés dans la souche W303-1A de levure et les clones prototrophes pour l'uracile ont été sélectionnés. L'ADN plasmidique contenu dans ces clones a été extrait, transformé dans E. coli et le plasmide recombinant p316FluMet30GFP identifié et caractérisé par digestions enzymatiques et séquence. Ce plasmide permet l'expression d'une protéine Met30 entière, fusionnée à son extrémité carboxy-terminale, avec la protéine GFP et à son extrémité amino-terminale avec une répétition de 3 motifs antigéniques hémagglutinine (Ha). La protéine hybride Ha-Met30-GFP est exprimée sous le contrôle du promoteur GAL 1. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. 5. 7. Construction duplasmide pMet30GFP 5.7.1. construction du plasmide pMet30-8 : Le fragment d'ADN XbaI-SalI du vecteur pMet30-1 (Thomas D. et al., (1995), référence citée) contenant le gène MET30 dont la séquence est celle déposée à la banque de données EMBL, sous l'identificateur SCMET30A , sous le n L26505 et sa région promoteur a été isolé et inséré dans le plasmide pRS316 préalablement digéré par les enzymes XbaI et Sali, produisant le plasmide pMet30-8. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. 5.7.2. construction du plasmide pMet30GFP : Un fragment de 710 paires de bases (bp) du plasmide pGFPmut3 codant pour la protéine GFP3 a été amplifié par PCR en utilisant les oligonucléotides oIM30GFP5 de séquence SEQ ID N 10 : 5'GGGTGCGTAAAAATGTACAAATTCGATCTCAATGATTCT AAAGGTGAAGAATTATTCACT 3' et olM30GFP3 de séquence SEQ ID N 11 : 5'GAGTAATAGCATCTAATGGTCAAGAGTTTTATCGAGAC GATTATTTGTACAATTCATCCAT 3'. Le fragment obtenu a été inséré dans le plasmide pMet30-8 par la méthode du gap repair (Orr Weaver et al., 1983, référence déjà citée). Ainsi, le fragment obtenu après PCR et le plasmide pMet30-8. préalablement digéré par l'enzyme NheI ont été cotransformés dans la souche W303-1A de levure et les clones prototrophes pour l'uracile ont été sélectionnés. L'ADN plasmidique contenu dans ces clones a été extrait, transformé dans E. coli et le plasmide recombinant pMet30GFP identifié et caractérisé par digestions enzymatiques et séquence. Ce plasmide permet l'expression d'une protéine Met30 entière fusionnée à son extrémité carboxy-terminale, avec la protéine GFP. La protéine hybride Met30-GFP est exprimée sous le contrôle du promoteur MET30. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. Exemple 6 : Construction des plasmides pYi39XyLex, pYi44XyLex, pLexM4-7, pLexM4A239, pM16Z1 et pM16Xyl1 permettant de visualiser l'activité transcriptionnelle des gènes MET de levure 6.1. Construction du plasmide pYi39XvLex : L'intégration de ce plasmide dans le génome de la levure au locus 7'RP7 peut être dirigée en linéarisant ce plasmide par l'enzyme Stul et en transformant, par le plasmide ainsi linéarisé, une souche de levure portant une mutation ponctuelle du gène trpl. 6.1.1. construction du plasmide pXylex : Le fragment d'ADN contenant le promoteur du gène GAL1dont les séquences activatrices de la transcription ont été remplacées par des sites de fixation de la protéine LexA de E. coli, dont la séquence est celle déposée à la banque EMBL, sous l'identificateur ECLEXA1 , sous le n J01643, a été amplifié par PCR à partir du plasmide pSH18-34 (Hanes S. D. et al., (1989), Cell, 57, 1275-1293) en utilisant les oligonucléotides olGALl de séquence SEQ ID N 12 5' GCCAAGCTTCTCCTTGACGTTAAAGTA 3' et olGALlO de séquence SEQ ID N 13 5' GCCGGATCCTTTGTAACTGAGCTGTCA 3'. L'ADN amplifié à été digéré par les enzymes de restriction BamHI et HindIII et inséré dans le vecteur pEMBLYe31-X (Jacquemin-Faure I. et al., (1994), Mol. Gen. Genet., 244, 519-529) préalablement digéré par les enzymes BamHI et HindIII, produisant le vecteur pXylex. 6.1.2. construction du plasmide pYi39 : Le vecteur pFL39 a été digéré par l'enzyme Clal et a été religaturé sur lui même et un plasmide ayant perdu le fragment C/aI-C/f/1 contenant l'origine de réplication ars-cen originale a été sélectionné, produisant le vecteur pYi39. 6.1.3. construction du plasmide pYi39Xylex : Le fragment d'ADN BamHI-PstI du vecteur pXylex préparé précédemment et contenant le gène XylE dont la séquence est celle déposée à la banque EMBL, sous l'identificateur PPXYLE , sous le n V01161 précédé de la région promoteur GAL1-LexA a été isolé et inséré dans le plasmide pYi39 préalablement digéré par les enzymes BamHI et PstI, produisant le plasmide pYi39Xyl-Lex. 6. 2. Construction du plasmide pYi44Xylex : 6.2.1. construction du plasmide pYi44 : Le vecteur pFL44 a été digéré par l'enzyme Clal et a été religaturé sur lui même et un plasmide ayant perdu le fragment Clal-Clal contenant l'origine de réplication 2 m originale a été sélectionné, produisant le vecteur pYi44. 6. 2.2. construction du plasmide pYi44Xylex Le fragment d'ADN BamHI-PstI du vecteur pXylex préparé selon le mode opératoire décrit au point 6.1.1 et contenant le gène XylE précédé de la région promoteur GAL1-LexA a été isolé et inséré dans le plasmide pYi44 préalablement digéré par les enzymes BamHI et PstI, produisant le plasmide pYi44Xyl-Lex. 6. 3. Construction du plasmide pLexM4-7 : 6.3.1. utilisation : Il permet l'expression chez la levure S. cerevisiae de la protéine Met4 comprenant à son extrémité amino terminale, les 202 résidus de la protéine LexA d'E.coli. La protéine hybride ainsi synthétisée est capable de se lier à des régions d'ADN comprenant des opérateurs LexA. 6. 3.2. construction : Le fragment d'ADN EcoRI-BamHl du vecteur pLexM4-1 codant pour les acides aminés 15 à 666 de la protéine Met4 a été cloné dans le plasmide pBTM116 (Margottin M. et al., (1998), Molecular Cell, 1, 565-574) préalablement digéré par les enzymes EcoRI et BamHI, produisant le plasmide pLexM4-7. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. 6. 4. Construction du plasmide pLexM4A239 6. 4.1. utilisation : Il permet l'expression chez la levure Saccharomyces cerevisiae d'un dérivé de la protéine Met4 amputé de ses résidus 212 à 231 comprenant à son extrémité amino terminale, les 202 résidus de la protéine LexA d'E.coli. La protéine hybride ainsi synthétisée est capable de se lier à des régions d'ADN comprenant des opérateurs LexA. 6. 4.2. construction : Le fragment d'ADN EcoRI-BamHl du vecteur pLexM430 codant pour un dérivé comprenant les acides aminés 15 à 211 et 232 à 666 de la protéine Met4 a été cloné dans le plasmide pBTM116 (Margottin M. et al., (1998), référence citée) préalablement digéré par les enzymes EcoRI et BamHI, produisant le plasmide pLexM4A239. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure. 6. 5. Construction du plasmide pM16Zl : Le fragment d'ADN contenant le promoteur du gène MET16 (comprenant les nucléotides-535 à +3, numérotés à partir du codon d'initiation du gène MET16) a été amplifié par PCR à partir du plasmide pM16-1 (Hanes S. D. et al., (1989), référence citée) en utilisant les oligonucléotides M160L2 de séquence SEQ ID N 14 5' CAACGAAGGATCCAATAATCGAAGCC 3' et M16OL4 de séquence SEQ ID N 15 5' GGGGAATTCCTTCATTTTATGAGTTGCT 3'. L'ADN amplifié à été digéré par les enzymes de restriction BamHI et EcoRI et inséré dans le vecteur Yep356R (Myers A. M. et al. (1986), Gène, 45, 299-310) préalablement digéré par les enzymes BamHI et EcoRII, produisant le vecteur pM16Zl. Ce plasmide peut se répliquer de façon autonome chez la levure et permet l'expression de la betagalactosidase de E. coli sous le contrôle du promoteur MET16. 6. 6. Construction du plasmide pM16Xyll : Le fragment d'ADN contenant le promoteur du gène MET16 (comprenant les nucléotides-535 à-1, numérotés à partir du codon d'initiation du gène lvfETl6) a été amplifié par PCR à partir du plasmide pNil6-1 (Thomas D. et al. (1990), J Biol. Chem., 265, 15518-15524) en utilisant les oligonucléotides M16OL5 de séquence SEQ ID N 16 5' CAACGAAGCTTTCAATAATCGAAGCACTTGG 3' et M 160L6 de séquence SEQ ID N 17 5' TTTATGAGAAGCTTTGGGTTGATACCTTTGC 3'. L'ADN amplifié a été digéré par l'enzyme de restriction HmdIII et inséré dans le vecteur pUC9-LEU2-X (Jacquemin-Faure I. et al., (1994), référence citée) produisant le plasmide pM16Xyll. L'intégration de ce plasmide dans le génome de la levure au locus LEU2, peut être dirigée en linéarisant ce plasmide par l'enzyme Asp718 et en transformant, par le plasmide ainsi linéarisé, une souche de levure portant une mutation ponctuelle du gène leu2. Ainsi ce plasmide permet-il d'obtenir une souche de levure modifiée, exprimant de façon stable la catéchol oxydase de P. putida, placée sous le contrôle du gène MET16. Exemple 7 : Souches de levure exprimant une protéine hybride GFP-Met4 Ces souches portent au niveau du locus URA3 (chromosome V, bras gauche), un gène artificiel permettant l'expression d'une protéine Met4, modifiée ou non, sous le contrôle du promoteur du gène GAL 1. L'intégration correcte au locus URA3 des fusions GAL-Met4-GFP a été vérifiée par des techniques classiques de biologie moléculaire et de génétique. Les souches qui ont été préparées sont rassemblées dans le tableau 1. 7.1. Préparation des souches à partir de pGal306GFPMet4 : L'intégration de ce plasmide dans le génome de la levure au locus URA3 peut être dirigée en linéarisant ce plasmide par l'enzyme Stu1 et en transformant, par le plasmide ainsi linéarisé, une souche de levure portant une mutation ponctuelle du gène ura3. La fusion GFP-Met4 ainsi intégrée au locus chromosomique URA3 est exprimée sous le contrôle du promoteur GAL1. 7.2. Préparation des souches à partir de pGal306GFPMet4A12 : Les souches sont transformées selon le mode opératoire décrit au point 7.1. à partir du plasmide pGal306GFPMet4A12. 7.3. Préparation des souches àpartir de pGa1306GFP:fet4130 : Les souches sont transformées selon le mode opératoire décrit au point 7.1. à partir du plasmide pGal306GFPMet4A30. 7. 4. Préparation des souches à partir de pGal306GFPMet4A37 : Les souches sont transformées selon le mode opératoire décrit au point 7.1. à partir du plasmide pGal306GFPMet4A37. Exemple 8 : Souches de levure portant le gène XyLE codant la catéchol oxydase sous le contrôle d'opérateurs LexA 8.1. Préparation des souches : Ces souches portent au niveau du locus URA3 (chromosome V, bras gauche) ou au niveau du locus TRPI (chromosome IV, bras droit) un gène artificiel comprenant le gène XylE de Pseudomonas putida placé sous le contrôle d'opérateurs LexA. L'expression de ce gène est dirigée par la protéine hybride LexA-Met4 exprimée à partir du plasmide réplicatif pLexM4-7. L'intégration correcte au locus URA3 des fusions GAL-Met4-GFP a été vérifiée per des techniques classiques de biologie moléculaire et de génétique. Les souches qui ont été préparées sont rassemblées dans le tableau 2. 8. 2. Préparation des souches à partir du plasmide pYi44XyLex : L'intégration de ce plasmide dans le génome de la levure au locus Mura3 peut être dirigée en linéarisant ce plasmide par l'enzyme Stul et en transformant par le plasmide ainsi linéarisé, une souche de levure portant une mutation ponctuelle du gène ura3 (Orr-Weaver T. L. et al. (1983) et Rothstein R. (1991), références citées). 8. 3. Préparation des souches à partir du plasmide pYi39XvLex L'intégration de ce plasmide dans le génome de la levure au locus 77?P7 peut être dirigée en linéarisant ce plasmide par l'enzyme Stul et en transformant par le plasmide ainsi linéansé, une souche de levure portant une mutation ponctuelle du gène trpl (Orr-Weaver T. L. et al. (1983) et Rothstein R. (1991), références citées). Exemple 9 : Souche de levure portant le gène XylE codant la catéchol oxydase sous le contrôle du promoteur du gène MET25 9.1. Préparation de la souche CC634-2D : Cette souche est issue du croisement entre la souche CI2-11D (Jacquemin-Faure I. et al., (1994), référence citée) et la souche CD 106 (Thomas D. et al., (1992), référence citée). Elle comporte, intégrée au locus LEU2 (chromosome III, bras gauche) un gène XylE placé sous le contrôle du promoteur du gène MET25. 9. 2. Caractéristiques de la souche CC634-2D : Le génotype de cette souche est le suivant : Mata, ade2, his3. trpl, ura3, met4::TRPI, leu2:.prolet2.i-XyIE.:LEU2. Exemple 10 : Souche de levure portant le gène HIS3 sous le contrôle d'opérateurs LexA Ces souches portent au niveau du locus LYS2 (chromosome II, bras droit) un gène artificiel comprenant le gène HIS3 de S. cerevisiae placé sous le contrôle d'opérateurs LexA. L'expression de ce gène est dirigée par la protéine hybride LexA-Met4 exprimée à partir du plasmide réplicatif pLexM4-7. 10.1. Préparation des souches 10. 1.1. Préparation de la souche CC817-4A : Cette souche est issue du croisement entre la souche L40 (Hollenberg S. M. et al., (1995), Mol. Cell Biol., 15,3813-3822) et la souche CC816- 1 D de génotype Mata, ade2, leu2, lys2, trp1, ura3. 10.1.2. Préparation de la souche CY25-1D : Cette souche est issue du croisement entre la souche CC817-4A préparée précédemment et la souche CD106 (Thomas D. et al., (1992), référence citée). 10. 2. Caractéristiques des souches : 10.2.1. Caractéristiques de la souche CC817-4A : Le génotype de cette souche est le suivant : Mata, armez, his3, leu2. trpl, ura3. /2..-J;/i2 10. 2.2. Caractéristiques de la souche CY25-1D: Le génotype de cette souche est le suivant : Mata, ade?, his3, leu2, trpl, ura3 met32::URA3, lys2::LexAop-HIS3::LYS2 Exemple 11 : Souche de levure portant le gène LacZ sous le contrôle d'opérateurs LexA Ces souches portent au niveau du locus URA3 (chromosome V, bras gauche) un gène artificiel comprenant le gène LacZ d'E. coli placé sous le contrôle d'opérateurs LexA. L'expression de ce gène est dirigée par la protéine hybride LexAMet4 exprimée à partir du plasmide réplicatif pLexM4-7. 11.1. Préparation de la souche CC801-3B Cette souche est issue du croisement entre la souche L40 (Hollenberg S. M. et al., (1995), référence citée) et la souche CD106 (Thomas D. et al., (1992), référence citée). 11. 2. Caractéristiques de la souche CC801-3B : Le génotype de cette souche est le suivant : Mata, ade2, his3, leu2, trpl, ura3 met4: : TRPI , ura3::LexAop-LacZ::URA3 Exemple 12: Détermination du niveau d'expression et de la stabilité des protéines exprimées à partir des séquences hybrides contenues dans les plasmides selon l'invention 12.1. Mode opératoire : 12.1.1. Détermination de la stabilité des protéines hybrides : a) Visualisation par le marqueur antigénique hémagglutinine (Ha) : Des cellules de levure comportant un plasmide codant pour les protéines marquées par Ha, sous le contrôle du promoteur GAL1, sont cultivées dans un milieu contenant du raffinose. L'induction de la protéine hybride, exprimée sous le contrôle du promoteur GAL 1, est réalisée pendant 2 à 10 heures, en transférant les cellules dans un milieu contenant 2 à5 % de galactose. Des prélèvements sont effectués à 0, 5, 10,20, 40,60 et 80 minutes après l'addition de glucose et éventuellement de méthionine, à une concentration répressive comprise entre 0,05 mM et 25 mM. La stabilité des protéines hybrides est mesurée par réaction avec des anticorps anti-Ha, selon des techniques classiques. b) Visualisation~par~la.protéine~GFP : Des cellules de levure comportant un plasmide codant pour les protéines marquées par la protéine GFP, sous le contrôle du promoteur GAL1, sont cultivées dans un milieu contenant du raffinose et l'induction de la protéine hybride est réalisée selon le mode opératoire décrit précédemment. La mesure de la fluorescence est réalisée après 20 minutes d'incubation en présence ou en absence de concentrations répressives de méthionine. c) yiAu?]À?ation~p~arJa~catéchql7~oxyda~se : L'activité du gène rapporteur LexAopXyle est mesurée dans une souche de levure (C190) exprimant la protéine hybride codée par le plamide pLexMet4-7 et cultivée dans les conditions décrites précédemment. L'activité est mesurée par une technique de visualisation basée sur la mesure de la catéchol-oxydase selon des techniques classiques. 12. 1.2. Mesure des ARNs totaux : Elle est réalisée par des techniques classiques connues de l'homme du métier. 12. 2. Résultats : 12. 2.1 Stabilité des protéines hybrides : a) Visualisation par le marqueur antigénique héma2(2lutinine (Ha) Ils sont rassemblés dans les figures 1 et 3B. * Expression de la protéine hybride Ha-Met4 La protéine Ha-Met4 a une demi-vie de l'ordre de 20 minutes en l'absence de méthionine (figure lA, - Met) et une demi-vie de l'ordre de 5 minutes dans des conditions répressives, c'est à dire en présence de méthionine (figure lA, + Met). La dégradation de la protéine Ha-Met4 est presque complète dans des conditions répressives au bout de 20 minutes (figure lA, + Met). * Expression de la protéine hybride Ha-Met28 La protéine Ha-Met28 a une demi-vie de l'ordre de 20 minutes en l'absence de méthionine (Figure lA, - Met). Les conditions répressives ne modifient pas la demi-vie de la protéine Ha-Met28 (Figure 1A, + Met). * Expression des protéines hybrides Ha-Met30 et Ha-Met30AF : La protéine Ha-Met30 a une demi-vie de l'ordre de 20 minutes en l'absence de méthionine (figure 3B, - Met). Les conditions répressives ne modifient pas la demi-vie de la protéine hybride Ha-Met30 (figure 3B, + Met). La protéine hybride Ha-Met30AF apparaît moins stable que la protéine hybride Ha-Met30, mais des conditions répressives ne diminuent pas la stabilité de cette protéine hybride. b) Visualisation par des protéine hybrides comprenant GFP Les résultats sont illustrés dans les figures 2 et 3B. * Localisation de la protéine hybride GFP-Met4 La protéine hybride GFP-Met4 est localisée dans le noyau quand les cellules sont cultivées en l'absence de méthionine. En revanche, dans des conditions répressives, c'est à dire en présence de méthionine. cette localisation n'est plus observée (figure 2A). Ces résultats sont en accord avec une dégradation rapide de la protéine hybride dans des conditions répressives. * Localisation de la protéine hybride GFP-Met28 La protéine hybride GFP-Met28 est toujours présente dans le noyau, que ce soit en absence ou en présence de méthionine (figure 2B). * Localisation de la protéine hybride GFP-Met30 La protéine hybride GFP-Met30 est toujours présente dans le noyau, que ce soit en absence ou en présence de méthionine (figure 3A). 12. 2.2. Expression des ARN totaux Les résultats sont illustrés dans les figures 1B et 1C Les taux de Met4 et de Met28 permettent l'activation de la transcription des gènes cibles. Ni l'expression de MET4, ni celle de MET28, sous le contrôle du promoteur GAL 1, ne modifie la répression induite par l'addition de méthionine. 12.2.3. Visualisation par la catéchol-oxydase Les résultats sont illustrés à la figure 4. En l'absence de méthionine, les cellules sont colorées en jaune, preuve que la protéine est exprimée. En présence de méthionine, les cellules sont blanches du fait de la répression. REVENDICATIONS 1. Procédés de criblages cellulaires fonctionnels d'agents aptes à moduler l'activité des complexes SCFMet30, caractérisés en ce qu'ils comprennent les étapes suivantes : (i) la mise en contact du produit à tester avec une souche de levure modifiée, comportant (a) une séquence hybride, comprenant une séquence codant pour une protéine Met4, sous sa forme sauvage ou mutée, fusionnée en phase avec au moins une séquence codant pour un marqueur approprié, ladite séquence hybride étant exprimée sous le contrôle d'un promoteur, actif chez la levure et éventuellement (b) un système transcriptionnel rapporteur, constitué par un gène rapporteur placé sous le contrôle d'une séquence opératrice appropriée ou d'un promoteur de levure approprié, (ii) l'addition de méthionine, à des concentrations répressives, comprises entre 0,03 mM et 20 mM, ou non répressives, et (iii) la détermination du niveau d'expression et de la stabilité de la protéine exprimée à partir de la séquence hybride, soit par visualisation et/ou quantification, soit par détermination de l'activité du gène rapporteur. 2. Procédés selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils comprennent, en parallèle, les étapes suivantes : (iv) la mise en contact du produit à tester avec une souche de levure modifiée, comportant une séquence hybride, comprenant une séquence codant pour une protéine Met30, sous sa forme sauvage ou mutée, fusionnée en phase avec au moins une séquence codant pour un marqueur approprié, ladite séquence hybride étant exprimée sous le contrôle d'un promoteur, actif chez la levure, (v) l'addition de méthionine, à des concentrations répressives, comprises entre 0,03 mM et 20 mM, ou non répressives, et (vi) la détermination du niveau d'expression et de la stabilité de la protéine exprimée à partir de la séquence hybride, soit par visualisation et/ou quantification, soit par détermination de l'activité du gène rapporteur 3. Procédés selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisés en ce qu'ils comprennent en outre, un moyen supplémentaire mettant en #uvre un système cellulaire de contrôle, ledit moyen comprenant les étapes suivantes : (vii) la mise en contact du produit à tester avec une souche de levure modifiée, comportant une séquence hybride, comprenant une séquence codant pour une protéine Met28, sous sa forme sauvage ou mutée, fusionnée en phase avec au moins une séquence codant pour un marqueur approprié, ladite séquence hybride étant exprimée sous le contrôle d'un promoteur, actif chez la levure, (viii) l'addition de méthionine, à des concentrations répressives, comprises entre 0,03 mM et 20 mM, ou non répressives, et (ix) la détermination du niveau d'expression et de la stabilité de la protéine exprimée à partir de la séquence hybride, soit par visualisation et/ou quantification, soit par détermination de l'activité du gène rapporteur. 4. Procédés selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce qu'ils comprennent en outre un moyen supplémentaire mettant en #uvre un système acellulaire de contrôle qui repose sur la mesure des taux de transcription des séquences hybrides et des gènes métaboliques MET 16 et MET] 5, ledit moyen comprenant les étapes les étapes suivantes : (x) l'extraction des ARNs totaux des souches modifiées utilisées soit à l'étape (i), soit à l'étape (iv), soit à l'étape (vii) et (xi) la mesure des taux de transcription de la séquence hybride et celle des gènes métaboliques MET16 et MET25. 5. Procédés de criblages cellulaires fonctionnels d'agents aptes à moduler l'activité des complexes SCFMet30, caractérisés en ce qu'ils comprennent les étapes suivantes : (xii) la mise en contact du produit à tester avec une souche de levure modifiée, comportant un système transcriptionnel rapporteur, constitué par un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur de levure approprié, (xiii) l'addition de méthionine, à des concentrations répressives, comprises entre 0,03 mM et 20 mM, ou non répressives, et (xiv) la détermination de l'activité du gène rapporteur. 6. Procédés selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que le marqueur, utilisé pour la construction de la séquence hybride est choisi dans le groupe constitué par : les peptides antigéniques, les protéines à fluorescence intrinsèque, les protéines à activité enzymatique mesurable et les facteurs de liaison à l'ADN. 7. Procédés selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et selon la revendication 6, caractérisés en ce que le promoteur permettant l'expression de la protéine hybride est choisi dans le groupe constitué par les promoteurs inductibles actifs chez S. cerevisiae et les promoteurs constitutifs. 8. Procédés selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisés en ce que le gène rapporteur présent dans le système rapporteur transcriptionnel est choisi dans le groupe constitué par les gènes rapporteurs dont l'activité est visualisable par une méthode colorimétrique et les gènes métaboliques, dont l'activité est mesurable par un test de croissance. 9. Procédés selon la revendication 5, caractérisé en ce que le promoteur, présent dans le système rapporteur transcriptionnel est choisi dans le groupe constitué par les gènes MET, notamment le groupe constitué par les gènes METM, MET25 et MET28. 10. Utilisation de composés sélectionnés par les procédés selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour la préparation de médicaments destinés au traitement des maladies liées à des troubles de l'activité des complexes SCF ou de la voie ubiquitine-protéasome. 11. Plasmides, caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence hybride, comprenant une séquence codant pour une protéine Met4, sous sa forme sauvage ou mutée, fusionnée en phase avec au moins une séquence codant pour un marqueur approprié, ladite séquence hybride pouvant être exprimée chez la levure, sous le contrôle d'un promoteur, constitutif ou inductible. 12. Plasmides, caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence hybride, comprenant une séquence codant pour une protéine Met28, sous sa forme sauvage ou mutée, fusionnée en phase avec au moins une séquence codant pour un marqueur approprié, ladite séquence hybride pouvant être exprimée chez la levure, sous le contrôle d'un promoteur, constitutif ou inductible. 13. Plasmides, caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence hybride, comprenant une séquence codant pour une protéine Met30, sous sa forme sauvage ou mutée, fusionnée en phase avec au moins une séquence codant pour un marqueur approprié, ladite séquence hybride pouvant être exprimée chez la levure, sous le contrôle d'un promoteur, constitutif ou inductible. 14. Plasmides, caractérisés en ce qu'ils contiennent un système transcriptionnel rapporteur, constitué par un gène rapporteur placé sous le contrôle d'une séquence opératrice appropriée ou d'un promoteur de levure approprié, pourvu que, quand la protéine hybride codée par la séquence contenue dans le plasmide, est LexAMet4, alors le gène de sélection de la levure est choisi dans le groupe constitué par le gène TRP1 et le gène LEU2. 15. Plasmides contenant un système transcriptionnel rapporteur, constitué par un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur de levure approprié, caractérisé en ce que le gène rapporteur est choisi dans le groupe constitué par LacZ et XylE et le promoteur est METl6. 16. Souches de levure, caractérisées en ce qu'elles sont modifiées, de façon stable, par un plasmide selon l'une quelconque des revendications 11 à 15.