Brevet FR2805826A1 — publié le 20010907

présente invention se rapporte à un système de puces à ADN pour détecter une mutation dans un acide nucléique cible de manière à ce que seul l'ADN comportant la mutation demeure sur la puce à l'issu du procédé. L'invention concerne un procédé dans lequel un ocS-phosphothioatedésoxynucléotide complémentaire de mutation est ajouté au moyen d'une ADN polymérase à l'extrémité 3' de la sonde hybridée à acide nucléique cible et dans lequel une exonucléase est ajoutée de sorte que seules les sondes élongées ne sont pas dégradées. La détection de la présence de l'absence de la mutation est effectuée par mesure directe ou indirecte de la présence ou de l'absence d'ADN en un site donné sur la puce. Avantageusement, la puce comprend des transistors du type ISFET ou des transducteurs piézo-électriques. Les mutations dans les cellules germinales ou dans les lignées somatiques peuvent avoir des conséquences redoutables sur l'organisme en provoquant par exemple des maladies génétiques héréditaires ou l'apparition de cancer. L'effet d'une mutation dépend étroitement de sa localisation dans l'ADN. Dans le cas d'une mutation dans région codante, on peut observer la perte de la fonction de la protéine codée. Si la mutation se trouve dans une région régulatrice, l'expression de l'ADN peut être abolit augmenter. Une mutation dans un gène impliqué dans le cancer au niveau de la lignée germinale ne signifie pas obligatoirement que l'individu concerné contractera effectivement une tumeur, mais seulement que le risque de celle-ci est accru. En outre, lorsque l'on cherche à diagnostiquer le potentiel invasif d'une tumeur déjà établie, on ne sait pas d'avance quelles mutations il faut attendre car celles-ci peuvent se trouver sur plusieurs gènes ou à plusieurs endroits d'un même gène. Dès lors, il apparaît nécessaire de pouvoir détecter simultanément de nombreuses mutations. Le besoin en une technique de détection de mutations, de typage ou encore d'étude du polymorphisme se fait de plus en plus ressentir dans l'industrie soit pour permettre la découverte de nouvelles cibles biologiques d'intérêts, soit pour connaître précisément le profil génétique d'une tumeur ou d'un patient et envisager des thérapies adaptées. Ce besoin a conduit au développement de diverses techniques telles que la LCR, la SSCP et la RFLP mais elles ne permettent pas une recherche systématique de nombreuses mutations au sein d'un échantillon. L'objectif à la base de la présente invention a été de mettre au point une technique permettant la détermination simultanée de plusieurs nucléotides à identifier et par conséquent le diagnostic de mutations et de polymorphismes de gènes, ou l'identification de micro-organismes pathogènes ou génétiquement modifiés. Plus spécifiquement, le problème réside une compilation de différentes techniques biochimiques, électroniques ou optiques au sein d'un même dispositif qui serait particulièrement facile d'utilisation, pourrait générer des signaux avec un faible ratio bruit/ signal sans pour autant nécessiter un traitement fastidieux et une interprétation compliquée. Il est également important de fournir un dispositif le plus intégré possible et de faible coût. Les puces à ADN pourraient répondre problèmes précités, mais telles qu'elles sont proposées dans l'état de la technique, elles comportent des limites inhérentes qui freinent leur exploitation à grande échelle. Une puce consiste en une multitude sondes nucléiques fixées avec précision à des endroits définis sur un support solide présentant sous la forme de surfaces planes ou poreuses composées de différents matériaux permettant une telle fixation. Jusqu'à présent, le choix du support etait conditionné par sa capacité à permettre la fixation des sondes. Des matériaux comme le verre, le silicium ou des polymères sont couramment utilisés dans l'état de la technique. Les sondes sont greffées sur ces surfaces lors d'une première étape appelée fonctionalisation dans laquelle on ajoute une couche intermédiaire de molécules réactives pour capter ou fixer les sondes. Le verre est un matériau de choix puisqu'il est inerte, non polaire et mécaniquement stable. Il été utilisé dans un procédé de synthèse in situ d'oligonucléotides par un adressage photochimique mis au point par la société Affymetrix. Cette technique consiste a utiliser une surface de verre activée par addition de silane portant des groupes NHZ ou OH; Sheldon E. L. (l993) Clin. Chem. 39 (4), 718-719. Une autre méthode consiste à recouvrir la surface de verre par la poly-L-lysine, de déposer les sondes puis d'effectuer la greffe par exposition aux UV. On peut également citer les polymères tels que les polypyrroles développés par CIS Bio- international. Une fois les sondes attachées au support solide, on permet ' l'ADN provenant d'échantillons de s'hybrider dans des conditions prédéfinies. composition en base du duplex est un élément essentiel influençant sa stabilité qui dépend étroitement de la température de fusion (Tm). Lorsque l'on cherche à détecter mutations ponctuelles, les mésappariements entraînent une chute du Tm, ce qui a pour conséquence une élimination des acides nucléiques qui ne se sont pas totalement hybridées lors de l'étape de lavage. Ainsi, il quasiment impossible de rechercher à détecter simultanément plusieurs mutations dans plusieurs gènes d'intérêts car les Tm varient d'un duplex à l'autre. De plus, la longueur des sondes représentent une difficulté technique non négligeable lorsque l'on souhaite détecter simultanément de nombreuses mutations à l'aide de différentes sondes de longueur différente. En ce qui concerne l'étape de détection des hybridations, l'utilisation de molécules fluorescentes, telles que la fluorescéine, constitue la méthode marquage la plus courante. Cette méthode permet une révélation directe ou indirecte de l'hybridation et l'utilisation de différents fluorochromes au sein d'une même experience. Cependant, elle reste coûteuse, car elle nécessite l'emploi de dispositifs assez lourds pour la lecture des longueurs émises et pour l'interprétation du signal. La détection de l'hybridation peut également être réalisée utilisant des marqueurs radioactifs. Toutefois, cette technique ne permet pas d'obtenir une définition satisfaisante lorsque l'on recherche une miniaturiser les puces. Une approche alternative consiste à utiliser les proprietés des matériaux semi conducteurs. Par exemple, on peut choisir un support solide à base de silicium (Si) recouvert d'un diélectrique (Si02) sur lequel on fixe les sondes. Dans certaines conditions de polarisation adéquates, un courant, sensible aux modifications de charge du semi-conducteur, circule normalement de la source vers le drain. L'hybridation entre les sondes et l'ADN de l'échantillon entraîne une modification de la densité de charge du semi-conducteur à l'interface Si/Si02. Cette variation peut être mesurée et permet de détecter l'hybridation spécifique entre sondes et acides nucléiques cibles ; Souteyrand et al. (1995) Lettre des Sciences Chimiques 54, 9-11. Cette technique est utilisée par le laboratoire IFOS de l'Ecole Centrale de Lyon. Une autre possibilité est l'utilisation de la puce développée par Bechman Instruments (Permittivity ChipsTM) qui bénéficie de la dispersion diélectrique due aux charges négatives des groupements phosphates présents dans le squelette nucléotidique. .Ce phénomène, dépendant de la longueur de la molécule d'ADN, peut être quantifié par la fréquence de relaxation de la molécule. Cette grandeur varie en effet d'un facteur 100 lorsque la quantité d'ADN varie d'un facteur 10 ; Beattie K. et al (1993) Clin Chem 39 (4), 719-72l. Dans cette technologie, on utilise un analyseur d'impédance pour mesurer l'énergie absorbée par les sondes lorsque celles-ci se trouvent appariées. Les puces destinées à l'analyse de mutations doivent être capables d'analyser à l'aide de sondes chaque base d'une séquence déjà connue ou de détecter des mutations identifiées au préalable comme étant impliquées dans des maladies telles que le cancer. Dans l'état de la technique, ces sondes sont décrites comme comprenant une partie homologue à la séquence de type sauvage et une modification (substitution, délétion, addition) localisée en milieu de séquence afin de standardiser les conditions d'hybridation. Dans le cas d'une analyse de substitution de base, les sondes sont organisées en tétrades, ensembles de quatre éléments dans lesquels une des sondes possède position centrale la base homologue au nucleotide se trouvant dans la séquence sauvage ; les trois autres sondes contenant les trois autres bases possibles. Cette analyse in extenso est décrite dans Chee M. et al. (1996) Science 274, 610-613. Selon cette technique, une puce à ADN a été mise au point pour détecter des mutations hétérozygotes dans le gène BRCAl par mesure de la fluorescence. Ce système comporte environ 105 oligonucléotides permettant la détection de substitutions et d'insertions de bases uniques, ainsi que des délétions longues de 1 à 5 nucléotides. Le système d'analyse des hybridations repose sur un marquage deux couleurs (vert par la fluorescéine et rouge par une association phycoérythrine et streptavidine) ; Hacia JG et al. (1996) Nature Genet 14, 44l-447. Comme evoquée précédemment, la constitution des puces doit être améliorée car l'analyse des hybridations est rendue difficile par l'adressage photochimique qui produit impuretés et par les variations de stabilité des hetéroduplex. De plus, les dispositifs actuellement disponibles dans le commerce sont relativement onéreux. Enfin, ce système est limité par le fait qu'une étape d'amplification des échantillons est nécessaire si l'on veut obtenir un signal détectable. Une revue sur les puces à ADN est présentée dans Gramsey Graham DNA Chips State of the Art Nature Biotechnology vol. 16, Janvier 1998, dans Hinfray G. Les puces à ADN Biofutur, avril 1997 n 166, cahier n 91 et dans Marshall A. and Hodgson J. ; Nature Biotechnology vol. 16, Janvier 1998. Dans le cadre de la présente invention, on a mis au point un système de puces à ADN qui repose sur l'hybridation spécifique de la sonde (servant dans le cas présent d'amorce oligonucléotidique) avec l'ADN cible, l'extension la sonde avec addition sélective d'au moins un dérivé d'oligonucléotide à l'extrémité 3' de l'amorce complémentaire de l'ADN cible ; l'amorce ainsi allongée étant résistante à la digestion par une exonucléase, en particulier par l'exonucléase III. On peut par exemple ajouter un aS-phosphothioatedésoxynucléotide grâce à une ADN polymérase ce empêche l'exonucléase III de digérer le duplex. Ainsi, l'ADN reste présent en un site donné sur la puce seulement lorsque les conditions suivantes sont réunies a) hybridation entre la sonde et l'ADN cible de l'échantillon, et b) présence d'une base complémentaire dans l'ADN cible permettant l'incorporation du aS-phosphothioatedésoxynucléotide dans la sonde ; ce qui empêche sa dégradation par la nucléase. Dans le cas où la sonde ne s'hybride pas avec l'ADN cible, il y a élimination de la sonde en un site donné (micropuits ou autre). De même, si l'ADN cible ne contient pas la base complémentaire du aS-phosphothioatedésoxynucléotide donné, ce dernier n'est pas incorporé et la sonde est ensuite digérée par la nucléase. On obtient ainsi des résultats simples à interpréter puisqu'ils sont seulement de deux type - ADN présent (1) - ou ADN absent (0). Cette technique associée avec un support solide électronique permet mesurer la différence de charge, de conductance, de résistance, d'impédance ou tout autre effet de variation électrique, de variation d'effet de champ ou encore toute variation de masse entraînant une variation électrique (transducteur piézoélectrique) sur le support solide. Par exemple, un tel support peut être un système semiconducteur, notamment un système ISFET (Ion Sensitive Field Effect Transistor). Ce système capte donc des signaux simples 0 (pas d'ADN) ou 1 (ADN) du type binaire qui peuvent être directement transmis à un système de traitement de donné, notamment à ordinateur. II est également possible de détecter la présence d'ADN en un site donné de la puce par lecture optique (modification des propriétés optiques du support telles que la réfraction, variation de la densité ou mesure de la fluorescence) par exemple couplant le dispositif à une caméra CCD. Dans un tel système, les résultats sont faciles à interpréter car ils se résument à des résultats ADN présent (1) ou ADN absent (0) tous les signaux entre 1 et 0 obtenus jusqu'à présent dans l'état de la technique sont éliminés. Les avantages conséquents de ce système résident dans le fait qu'un signal simple est détecté sans avoir obligatoirement recours à des marqueurs, que la sensibilité de détection se trouve accrue, qu'il existe moins de risque d'obtenir des faux négatifs ou positifs et que l'interprétation des signaux ne nécessite pas d'algorithme excessivement compliqué. D'autres avantages apparaîtront ci-après dans la description détaillée l'invention. Ainsi, la présente invention se rapporte à un procédé de détection d'une mutation position n dans un acide nucléique cible, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) hybridation d'une sonde liée en 5' à un support solide du type puce à ADN avec un acide nucléique cible, l'extrémité 3' de ladite sonde s'hybridant au maximum jusqu'au nucléotide n-1 de l'acide nucléique cible, b) élongation de la sonde hybridée à l'étape a) par incorporation dans la direction 5'- de nucléotides complémentaires dudit acide nucléique cible au moyen d'un mélange réactionnel comprenant au moins un dérivé de nucléotide résistant à la dégradation une exonucléase et une ADN polymérase, c) digestion par ladite exonucléase de sorte que seules les sondes élongées à l'étape ne sont dégradées, lavage, d) détection de la présence ou de l'absence de la mutation par mesure directe ou indirecte la présence ou de l'absence d'ADN. Les étapes clés de ce procédé sont illustrées dans l'exemple présenté à la figure 1 ci- après. On entend par ADN polymérise , tout enzyme naturel ou modifie ayant une activité polymérasique. On peut citer par exemple les ADN pol exo-, notamment la T7 ou le fragment de klenow. On entend par exonucléase tout enzyme naturel ou modifié ayant une activité exonucléasique. On peut citer par exemple l'exonucléase III. On peut également envisager l'utilisation des ADN polymérise possédant activité de pyrophophorolyse (en présence d'une forte concentration en pyrophosphate, cet enzyme ajoute un pyrophosphate sur la dernière liaison phosphodiester et relâche donc le nucléotide en 3'. Ce produit est disponible chez Promega sous la marque READITTM, et des variants utilisant un système de révélation à luciférase est disponible sous la marque READaseTM. Lors de l'etape d), la présence ou l'absence de la mutation peut être mise en évidence, selon une premier mode de réalisation, par la mesure de la modification d'une propriété support solide liée à la présence ou à l'absence d'ADN. Une autre solution, consiste à détecter la présence ou l'absence de la mutation par lecture optique de la présence ou à l'absence d'ADN. On entend par lecture optique, toute mesure d'absorption, de transmission ou d'émission de lumière qui peut éventuellement se trouver à une longueur d'onde spécifique (260 nm par exemple) soit directement de l'ADN, soit de toute molécule marqueur liée à la sonde. Cette définition comprend également toute mesure de la fluorescence émise par des marqueurs (fluorescéine et/ou phycoérythrine). On entend dérivé de nucléotides , tout analogue de nucléotides qui résiste à la dégradation par une nucléase. On peut citer par exemple les aS- phosphothioatedésoxynucléotides tels que #S-dATP, aS-dTTP, aS-dCTP, aS-dGTP, aS-dUTP et aS-dITP. Ces dérivés de nucléotides peuvent être marqués notamment avec un marqueur fluorescent. Une sonde se définie comme étant un fragment nucléotidique comprenant par exemple de 10 à 100 nucléotides, notamment de 15 à 35 nucléotides possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique cible. Les sondes selon l'invention, qu'elles soient spécifiques ou non-spécifiques, peuvent être immobilisées, directement ou indirectement, sur un support solide et peuvent porter un agent marqueur permettant ou améliorant leur détection. Bien entendu, la sonde sert d'amorce dans le cadre de l'invention puisque l'objectif est d'incorporer un nucléotide modifié en position n correspondant à position de la mutation que l'on recherche. L'extrémité 3' de la sonde se termine donc au maximum et de 'férence à n-1. La sonde est immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, par exemple par covalence, par adsorption, ou par synthèse directe sur support solide. Ces techniques sont notamment décrites dans la demande de brevet WO 92/10092. La sonde peut être marquée au moyen d'un marqueur choisi par exemple parmi les isotopes radioactifs, des enzymes, en particulier des enzymes susceptibles d'agir sur un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent (notamment une peroxydase ou une phosphatase alcaline) ou encore des enzymes produisant ou utilisant des protons (oxydase ou hydrolase) ; des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de base nucléotitiques, et des ligands tels que la biotine. Le marquage des sondes selon l'invention est réalisé par des éléments sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, l'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémiluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents. Une autre possibilité est de marquer la sonde avec un peptide comprenant un epltope reconnu par un anticorps donné. La présence de cet anticorps peut être révélé au moyen d'un second anticorps marqué. Selon la première alternative évoquée ci-dessus, l'étape d) comporte la mesure d'une variation d'une caractéristique physico-chimique, électrique, optique ou mécanique du support solide notamment choisit parmi la charge, le dopage, la conductivité, la résistance, l'impédance ou tout autre effet de variation électrique, de l'effet de champ ou encore toute variation de masse entraînant une variation de champ, de la fréquence de ésonance ou de l'admittance électroacoustique. En ce sens, le support solide consiste en une puce à ADN qui peut comporter un matériau sélectionné parmi les semiconducteurs, les diélectriques et les transducteurs piézo-électriques ou une structure or-prisme. On peut donc retrouver donc une structure de base du type Si/Si02 , des structures du type Métal-Oxyde Semiconducteur (MOS), de préférence El ectrolyte-Oxyde-Semiconducteur (EOS). De telles structures sont décrites Jaffrezic-Renault N. ISFET-ENFET, Microcapteurs et Microtechniques 225-235. En résumé, il s'agit de transistor à effet de champ (FET), notamment des transistors du type ISFET ou de préférence ENFET (Enzymatic Field Effect Transistor). Dans le cas d'un support ENFET, il peut ' e avantageux de lier à la sonde des enzymes de types hydrolases ou oxydases qui consomment ou produisent protons. On rajoute un substrat de ces enzymes et on mesure la variation de pH. Parmi les molécules permettant d'améliorer- et/ou de simplifier la détection. tin groupe contenant tin atonie métallique peut être greffé sur les sondes. notamment tin gi'otipe ferrocène. Par mesure d'une modification des propriétés optiques du support, on entend toute mesure de la variation d'une propriété optique du support solide liée à la présence ou à l'absence d'ADN sur ledit support. On peut citer par exemple la technologie de la s oci 'été Biacore 1 qui est notamment décrite 1 dans WO 97/38 1 _#2. Ce mode de réalisati 1 1011 de l'invention comprend donc la mesure d'indice de réfraction du sLIl)1)ol't. Oli peut mesurer par cette technique la reflection interne et externe, par exemple de l'el1ipsometrie, des ondes évanescentes comprenant la Mesure de la SPR (surface plasmon resonance), de l'angle de réfraction de Brewster, de l'angle critique de réflection, de la FTR (frustrated total reflection), ou la STIR (scattered total internai reflection). Ces analyses peuvent être réalisées au moyen du Biacore 3000TM. Conformément à la deuxième possibilité évoquée précédemment, l'étape consiste à mesurer la quantité de lumière transmise, absorbée ou émise. Dans ce le support est fait d'un matériau transparent, notamment du verre. Les techniques d'accrochage des sondes sur le verre sont bien connues de l'homme du métier. On peut exemple mesurer la fluorescence des sondes préalablement marquées et effectuer la lecture optique avec une caméra CCD. Dans un mode préféré de réalisation, un aS-phosphothioatedésoxynucléotide tel que aS-dATP, #S -dTTP, aS-dCTP, aS-dGTP, aS-dUTP ou aS-dITP est incorporé à l'extrémité 3'de la sonde. Cela peut s'effectuer par exemple par LCR, ou de préférence par PCR asymétrique, la sonde servant alors d'amorce étant dans chaque cas couplée chimiquement à son extrémité 5' à la phase solide en un site prédéterminé. Les aS phosphothioatedésoxynucléotides peuvent être aisément incorporés dans des polynucléotides par toutes les polymérases et transcriptases inverses testées, ce qui permet d'utiliser des ADN polymérases d'un prix de revient plus avantageux que dans d'autres détections de mutations. La fixation préalable des sondes en un site déterminé sur la puce peut être réalisée par les techniques d'adressage microfluidique développée par la société Orchid ou photochimique de la société Affimétrix ou encore d'electroadressage Cis-Bio international, lesdites techniques étant à la portée de l'homme du métier. Selon l'invention, l'ADN cible est hybridé avec une sonde de manière à ce que son extrémité 3' se termine immédiatement avant le nucléotide à identifier. Un aS phosphothioatedésoxynucléotide est rajouté à l'extrémité 3' de la sonde au moyen d'une ADN polymérase et est par conséquent complémentaire du nucléotide à identifier. L'étape b) peut être réalisée parallèlement sur 4 sites (en tétrades) pour chaque sonde, avec addition d'un mélange réactionnel comprenant un aS- phosphothioatedésoxynucléotide différent par site. Il est ainsi possible de détecter une mutation en une position donnée de l'ADN cible quelque soit la nature de la substitution de base. Concernant la digestion de l'ADN à l'étape c), on peut avantageusement utiliser l'exonucléase III. procédé selon l'invention est particulièrement destiné à la détection de mutations dans des gènes impliquées dans des maladies. On peut notamment citer les maladies genétiques héréditaires, en particulier l'hémochromatose, l'anémie à hématies falciformes, les (3 et a thalassemies, la fibrose kystique, l'hémophilie, des mutations dans les gènes impliqués dans le cancer, par exemple dans les gènes Ras p53, BRCA1. Une liste exhaustive des mutations dans ces gènes est donné sur site internet suivant : ftp://ncbi.nlm.nih. o v/repositorv/OMIM/morbidmap outre, le procédé selon l'invention est utile lors de l'étude du polymorphisme des gènes ou de toute région génétique et pour la détection et/ou l'identification d'organismes génétiquement modifiés (OGM). Un autre aspect de l'invention porte sur un dispositif permettant de mettre en aeuvre le procédé tel que décrit ci-dessus. Un tel procédé peut comprendre un système de détection de la présence ou de l'absence d'ADN en un site donné d'une puce, notamment un transducteur piezo-électrique, un transducteur à effet de champ, un lecteur de densité optique ou de fluorescence. Il peut être couplé à système de traitement de données, notamment à un ordinateur. Un autre aspect de l'invention concerne un kit comprenant une puce à ADN sur laquelle sont fixées des sondes et au moins un des éléments choisis parmi - un de 4 mélanges réactionnels comportant chacun un aS- phosphothioatedésoxynucléotide différent sélectionné parmi #S-dATP, aS-dTTP, aS-dCTP et #S-dGTP, - une polymérase, - une exonucléase, en particulier l'exonucléase III, - un lot solutions pour solubiliser l'ADN polymérase et/ou l'exonucléase dans le cas où ces enzymes se présentent sous la forme de poudre lyophilisée. Avantageusement, les puces de ce kit comportent un support solide du type ISFET, ENFET. Ce kit est destiné à la détection de mutations de gènes impliquées dans des maladies, notamment dans des maladies génétiques héréditaires et dans le cancer. Il peut également servir pour le typage génétique et l'étude du polymorphisme des gènes (pour la détection de SNPs (Single Nucleotide Polymorphisme)) et pour détection et/ou l'identification d'organismes génétiquement modifiés (OGM). Légendes des figures Figure 1 : Représentation schématique d'un mode particulier de mise oeuvre procédé selon l'invention. a) hybridation d'une sonde liée en 5' à un support solide du type puce à avec un acide nucléique cible, l'extrémité 3' de ladite sonde s'hybridant jusqu'au nucléotide n- 1 de l'acide nucléique cible, b) incorporation dans la direction 5'-3' d'un (xS-dATP c) digestion l'exonucléase III de sorte que seules les sondes élongées à l'étape b) ne sont pas dégradées et lavage, d) détection la présence ou de l'absence de la mutation par mesure directe ou indirecte de la présence ou de l'absence d'ADN. Figure 2 : structure classique d'un support du type Métal-Oxyde-Semiconducteur (MOS). Schémas tirés de Jaffrezic-Renault. Figure 3 : structures du type IFSET. A- IFSET tirée de JaffreziC-Renault B- DNAFET Figure 4 : principe des puces selon l'invention avec une série de tétrades pour détection de mutations dans le gène de l'hémochromatose. Exemple 1 : mode de réalisation particulier de l'invention L'ADN cible comportant un fragment d'ADN qui contient une mutation T--@G position n à identifier, est ajouté à la surface de la puce. Ledit fragment d'ADN s'hybride à la sonde oligonucléotidique complémentaire marquée au FITC (isothiocyanate de fluorescéine) immobilisée en un site défini sur le support de la puce. Lors de la réaction subséquente avec la polymérase, phosphothioatedésoxynucléotide (aSdATP) incorporé se trouve en position complémentaire par rapport au nucléotide T en position n. Si phosphothioatedésoxynucléotide qui se trouve dans le mélange réactionnel n'est pas complémentaire du nucléotide à identifier (différent de a.SdATP), la sonde n'est pas prolongée en 3'. L'exonucléase 111 dégrade ensuite toutes les sondes qui n'ont pas été prolongées par un phosphothioatedésoxynucléotide. On réalise ensuite la détection par la liaison d'un conjugué anti-FITC conjugué à la peroxydase. Une fois effectuée la réaction enzyme-substrat, un fort signal de mesure indique donc si le nucléotide à identifier (T) est complémentaire du phosphothioatedésoxynucléotide (aSdATP) qui a été ajouté au mélange réactionnel pour la réaction avec la polymérase. Exemple 2 : Utilisation d'un support type ISFET ou ENFET (Jaffrezic-Renault N., Microcapteurs et Microtechniques 225 5). La figure 3A (tirée de Jaffrezic-Renault) représente schématiquement la structure ISFET. Celle-ci dérive de la structure MOSFET (voir figure 2 ; Jaffrezic-Renault) en ce sens que la grille métallique est remplacée par les électrolytes et l'électrode de référence. L'expression de la tension de seuil est : = Wsc - Wref + (Po - (QS + QF)/Ci - 2(Pb VT est fonction des caractéristique chimique de la solution Po est la différence de potentiel entre la membrane sensible et la solution). Dans le circuit présenté à la figure 3A, le courant de drain est maintenu constant et on mesure la variation de tension VG qui est proportionnel à (po. La membrane sensible au pH consiste en des couches minces de A1203, Ta205, Si3N4. D'autres membranes sensibles aux ions Na+, Ag+, F-, Br, I", Ca2+ et N03' sont également disponibles. Dans le cadre de l'invention, on peut fixer le support les sondes marquées avec un enzyme qui produit des protons, système ENFET (Figure 3B). On obtient ainsi, une mesure de la présence ou de l'absence de 'ADN sur le support suite à la digestion par l'exonucléase III via une mesure de la variation du pH de la solution se traduisant directement par une variation de la tension Ce système peut éventuellement être couplé à un ou plusieurs ampli ficateur(s). La variation de tension dénote donc de la présence d'ADN. Le système peut être conçu de manière à ce qu'une variation seuil de tension provoque ou non la passage du courant par une série d'amplificateurs et de transistors et donne in fine un signal de type binaire (1) variation de la tension supérieure ou egale au seuil du transistor (ADN présent et mutation détectée), (0) variation inférieure au seuil du transistor (ADN absent et donc pas de mutation). Ces résultats peuvent ensuite être importés dans un système de traitement de données afin de compiler les résultats obtenus pour chaque site donné sur la puce. Exemple 3: Utilisation d'un support solide du type transducteurs piézo électrique. Certains matériaux tels que Si02, Ti03Ba, LiNb03 et les polymères pièzo-électrique (PVF2) ont la propriété de se déformer lorsqu'une contrainte physique est appliquée ; Perrot H. et Hoummady M., Transducteurs piézo-électrique. Il apparait alors un potentiel électrique mesurable du à la pression exercée par la masse des molécules d'ADN. Cette mesure peut être la fréquence de résonance ou l'admittance autour de la fréquence de résonance. Dans le cas de la présente invention, l'ADN trouve en milieu liquide. Dès lors, on peut également mesurer l'admittance électroacoustique ou la conductivité qui dépend notamment de la densité et de la viscosité la solution contenant les électrolytes. On peu ainsi détecter une différence de 100 pg en milieu liquide. Exemple 4: Utilisation du procédé selon l'invention pour la détection de mutations ponctuelles impliquées dans l'hémochromatose. Les mutations ponctuelles désignées HHP-1, HHP-19 et HHP-29 dans US 5,753,438 peuvent être détecter au moyen du procédé selon l'invention en utilisant une sonde dont l'extémité 3' se termine à n-1 de la position de la mutation HHP-1 séquence normale 5' TCTTTTCAGAGCCACTCACG64CTTCCAGAGAAAGAGCCT 3' (SEQ ID N 1) séquence mutée AG64 5' TCTTTTCAGAGCCACTCACA64CTTCCAGAGAAAGAGCCT 3' (SEQ ID N 2). On utilise donc une sonde de séquence 5' AGAAAAGTCTCGGTGAGTG63 3' (SEQ ID N 3) accroché en 4 sites prédéfini de la puce (site A, T, G, Sur le site où on applique le mélange réactionnel comprenant #S-dTTP (site T), obtient un signal dans le cas où il y a effectivement mutation dans l'ADN provenant de l'échantillon. Sur les autres sites A, G, et C , aucun signal n'est obtenu puisque ADN est digéré par l' exonucléase III. Pour HHP-19 (A-->G), on peut utiliser la sonde suivante 5'TATATAGATATTAGATATAAAGAA3' (SEQ ID N 4) Pour HHP-29 (A->G) ), on peut utiliser la sonde suivante 5'AACCCCTAAAATATCTAAAAT3' (SEQ ID N 5) On peut également détecter la mutation H63D, qui est due au remplacement d'une cystéine par une guanine sur le brin sens, avec les sondes SED ID N 6 et N 7 On peut également détecter la mutation C282Y, qui est due au remplacement d'une guanine par une adénine sur le brin sens, avec les sondes SED ID et N 9 Les quatre oligonucléotides SED ID N 6 à 9 peuvent être utilisés pour l'identification du nucléotide qui se trouve immédiatement après l'extrémité 3'de oligonucléotides. On peut prévoir à cet effet un système en tétrade (voir figure 4). Exemple 5 : détection mutations dans des gènes impliqués dans le cancer. a) Mutations dans le gene MLHI EST liées à l'apparition du cancer colorectal. Il existe à ce jour 60 mutations ponctuelles identifiées dans MLH1 comme étant impliquées dans le cancer colorectal ; Bronner (1994) Nature 368, 258, Papadopoulos (1994) Science 263, 1 625. On peut citer par exemple les mutations suivantes Accession Codon Nucleotide acide aminé CM950799 62 CAA-TAA Gln-Term CM960964 107 ATA-AGA Ile-Arg La liste complète est donnée online à www_uwcm-aç:uk/uwcm/mg/ns/1/249617 _html. Au vu du nombre importants de mutations pour un même gène, le procédé de détection selon l'invention avec puce comportant des sondes spécifiques pour chacune des mutations précitées apparaît donc indispensable pour garantir à un patient un diagnostic exact. b) Détection de mutations dans le gène K-ras. W0 91/13075 présente des sondes permettant de détecter des mutations ponctuelles dans le codon 12 de K-ras. Dans le cadre de l'invention, on peut greffé sur la puce les sondes suivantes et dès lors garantir une détection complète de toutes les mutations possibles - 5' AAGGCACTCTTGCCTACGCCA 3' (SEQ ID N 10) - 5' AGGCACTCTTGCCTACGCCAC 3' (SEQ ID N 11) - 5' AACTTGTGGTAGTTGGAGCT 3' (SEQ ID N 12) - 5' ACTTTGTGGTAGTTGGAGCTG 3' (SEQ ID N 13) - 5' ACTGGTGGTGGTTGGAGCAG 3' (SEQ ID N 14) REVENDICATIONS 1. Procédé de détection d'une mutation en position n dans un acide nucléique cible, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) hybridation d'une sonde liée en 5' à un support solide du type puce à ADN avec un acide nucléique cible, l'extrémité 3' de ladite sonde s'hybridant au maximum jusqu'au nucleotide n-1 de l'acide nucléique cible, b) élongation de la sonde hybridée à l'étape a) par incorporation dans la direction 5'-3' de nucléotides complémentaires dudit acide nucléique cible au moyen d'un 'lange réactionnel comprenant au moins un dérivé de nucléotide résistant à la dégradation par une exonucléase et une ADN polymérase, c) digestion par ladite exonucléase de sorte que seules les sondes élongées à l'étape b) ne sont pas dégradées, lavage, d) detection de la présence ou de l'absence de la mutation par mesure directe ou indirecte de la présence ou de l'absence d'ADN. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on détecte à l'étape d) la présence ou l'absence de la mutation par mesure de la modification d'une proprieté du support solide liée à la présence ou à l'absence d'ADN. 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on détecte à l'étape d) la présence ou l'absence de la mutation par lecture optique de la présence ou à l'absence d' 4. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'on mesure à l'étape d) une variation d'une caractéristique physico-chimique, électrique, optique ou mécanique du support solide notamment choisit parmi la charge, le dopage, la conductivité, la résistance, l'impédance ou tout autre effet de variation électrique, de l'effet de champ ou encore toute variation de masse entraînant une variation de champ, de la fréquence de résonance de l'admittance électroacoustique, de l'indice de réfraction du support notamment l'ellipsométrie, des ondes évanescentes comprenant la mesure de la (surface plasmon resonance), de l'angle de réfraction de Brewster, de l'angle critique de réflection, de la FTR (frustrated total reflection), ou la STIR (scattered total internal reflection). 5. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que le support solide consiste une puce à ADN comprenant un matériau sélectionné parmi les semiconducteurs les diélectriques et les transducteurs piézo-électrique ou une structure or-prisme. 6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le support solide comprend des structures du type Métal-Oxyde- Semiconducteur (MOS), de préférence Electrolyte-Oxyde-Semiconducteur (EOS). 7. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le support solide comprend des transistors à effet de champ (FET), notamment des transistors du type ISFET ou ENFET. 8. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'un groupe contenant un atome métallique est greffé sur les sondes, notamment un groupe ferrocène. 9. Procédé selon la revendication 3 caractérisé que ce que l'étape d) consiste à mesurer la quantité de lumière transmise à travers le support solide, ledit support étant fait matériau transparent, notamment du verre. 10. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que l'étape d) consiste à mesurer la fluorescence des sondes préalablement marquées. 11. Procédé selon l'une des revendications 9 et 10 caractérisé en ce que la lecture optique est effectuée par une caméra CCD. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisé en ce qu'on utilise à l'étape b) un -phosphothioatedésoxynucléotide, de préférence #S -dATP, #S -dTTP, -(xS-dCTP, #S dGTP, #S -dUTP ou (xS-dITP. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce qu'on utilise à l'étape c) l'exonucléase 111. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisé en ce que l'étape b) est réalisée parallèlement sur 4 sites pour chaque sonde, avec addition d'un mélange réactionnel comprenant un aS-phosphothioatedésoxynucléotide différent par site. 15. Procédé selon l'une des revendications précédentes destiné ' la détection de mutations de gènes impliquées dans des maladies, notamment dans des maladies génétiques heréditaires, en particulier l'hémochromatose, l'anemie à hématies falciformes, les (3 et a thalassemies, la fibrose kystique, l'hémophilie, et des mutations dans les gènes impliqués dans le cancer. 16. Procédé selon l'une des revendications précédentes destiné à l'étude du polymorphisme des gènes ou de toute région génétique. 17. Procédé selon l'une des revendications précédentes destiné à détection et/ou à l'identification d'organismes génétiquement modifiés (OGM). 18. Dispositif permettant de mettre en oeuvre le procédé selon l'une des revendications précédentes. 19. Dispositif selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'il comprend un système de détection de la présence ou de l'absence d'ADN en un site donné d'une puce. notamment un transducteur piezo-électrique, un transducteur à effet de champ, un lecteur de densité optique ou de fluorescence. 20. Kit comprenant une puce à ADN sur laquelle sont fixées sondes et au moins un éléments choisis parmi un lot de 4 mélanges réactionnels comportant chacun un aS- phosphothioatedésoxynucléotide différent sélectionné parmi #S-dATP, #S-dTTP, #S-dCTP, #S-dGTP, #S-dUTP et aS-dITP, une ADN polymérase, - une exonucléase, en particulier l'exonucléase III, - un lot de solutions pour solubiliser l'ADN polymérase et/ou l'exonucléase dans le cas où ces enzymes se présentent sous la forme de poudre. 21. Kit selon la revendication 20 caractérisé en ce que les puces comportent un support solide du type ISFET, ENFET. 22. Kit selon l'une des revendications 20 et 21 caractérisé en qu'il est destiné à la détection de mutations de gènes impliquées dans des maladies notamment dans des maladies génétiques héréditaires et dans le cancer. 23. Kit selon l'une des revendications 20 et 21 caractérisé en ce qu'il est destiné à la détection de SNPs (Single Nucletide Polymorphisme). 24. Kit selon l'une des revendications 20 et 21 caractérisé en ce qu'il est destiné à la détection et/ou l'identification d'organismes génétiquement modifiés (OGM).