Brevet FR2806417A1 — publié le 20010921

La présente invention a pour objet des particules de microorganismes enrobées à l'aide d'une matrice spécifique afin d'augmenter la résistance desdits microorganismes aux stress physico-chimiques tels que la chaleur, l'humidité, l'acidité, ou la compression. Elle a également pour objet un procédé de production de telles particules, les particules susceptibles d'être obtenues par ledit procédé, ainsi que l'application desdites particules dans des compositions pharmaceutiques, diététiques ou alimentaires. L'utilisation de microorganismes vivants déshydratés dans les applications pharmaceutiques, diététiques ou agro-alimentaires implique souvent que ces microorganismes soient soumis à des stress physico- chimiques tels que par exemple des conditions relativement élevée de températures, de pression, d'humidité ou d'acidité, ce qui a pour effet d'affecter leur viabilité. Des solutions ont été proposé, qui visent à protéger les microorganismes en les englobant dans des particules comportant une substance protectrice. On peut citer en particulier: - Le brevet US 99/06746 qui enseigne l'enrobage de bactéries par des polymères, tels que les polyacrylamides, des co-polymères associés à des phospholipides, etc...dont l'application ne peut être alimentaire. - Le brevet FR 96 06215 qui décrit l'enrobage de bactéries par des polymères ou des polysaccharides hydrosolubles, ce qui exclut toute stabilisation en milieu aqueux. - Le brevet US 93/17094 qui enseigne un procédé d'enrobage de microorganismes, consistant à déposer à la fois les microorganismes et l'enrobant à base d'acides gras en fusion au centre d'un disque en rotation rapide dans une enceinte réfrigérée, pour produire des microsphères. Ce procédé nécessite un appareillage spécifique, dont la mise à l'échelle industrielle est relativement complexe. De plus, selon ce document la taille des microsphères est de 75 à 300 pm, ce qui limite l'application du procédé à des particules initiales de taille inférieure à ces valeurs. Il apparaît donc, que jusqu'à présent, il n'a pas été possible de produire en grande quantité, à partir de particules préexistantes de microorganismes déshydratés, des particules enrobées présentant une résistance élevée aux stress physico-chimiques tels que la chaleur, l'humidité, l'acidité gastrique, ou la pression, et utilisables dans les applications de la diététique, la pharmacie, l'agroalimentaire. La solution au problème posé réside en la réalisation de particules enrobées, en déposant de façon homogène une couche protectrice hydrophobe de qualité alimentaire sur des particules préexistantes dont la taille et la forme peuvent varier dans des proportions importantes. Le procédé d'enrobage utilise un appareillage standard du commerce, disponible dans des tailles compatibles avec des volumes de production de quelques centaines de grammes à plusieurs centaines de kilogrammes par opération. Il a en effet trouvé de façon surprenante qu'il était possible d'obtenir, par injection de produits hydrophobes en fusion dans une enceinte o les particules étaient soumises à une agitation rotative et à un balayage par un flux d'air, les paramètres étant judicieusement choisis, des particules enrobées présentant les caractéristiques désirées de stabilité. On décrira les particules, leurs propriétés physico-chimiques, le procédé d'obtention, et leur application. Les particules initiales peuvent être sensiblement sphériques, ovoïdes ou allongées, lisses ou rugueuses, régulières ou irrégulières, de taille comprise entre quelques microns et plusieurs millimètres. Les particules obtenues par broyage après lyophilisation, par atomisation ou par séchage en lit fluidisé de microorganismes, cette liste n'étant pas limitative, conviennent comme matériel de départ. La matrice enrobante est constituée de produits hydrophobes, tels que par exemple des matières grasses, des acides gras ou des cires purs ou en mélange entre eux. Les caractéristiques essentielles de la matrice enrobante sont sa qualité alimentaire, et son point de fusion qui doit être compris entre 20 et 100 C, de préférence entre 30 et 80 C Les acides gras saturés sont préférés et en particulier l'acide stéarique. L'acide palmitique peut également être utilisé pour ses qualités techniques. A cette matrice il est possible d'ajouter d'autres molécules d'additifs, tels que des anti-oxydants, des sucres ou des protéines connus pour améliorer la stabilité des microorganismes dans les conditions citées. La proportion de matrice enrobante, par rapport à la quantité de particules de microorganismes varie selon l'application finale et est comprise entre 10 et 99% en poids, avantageusement entre 30 et 80%. Si la couche d'enrobage est trop fine, la protection sera insuffisante; inversement, si la couche est trop épaisse, la libération des microorganismes sera plus longue. Les particules finales ont une taille contrôlée, dépendant de celle des particules de départ, avec un diamètre moyen pouvant varier entre 100 et 5000 p.m, de préférence entre 200 et 2000 ptm. La taille pourra varier selon l'application. Le nombre de microorganismes/g est connu avant enrobage, puis déduit, par particule, connaissant la proportion de matrice enrobante. Parmi les microorganismes susceptibles d'entrer dans les différentes applications, citons les bactéries à usage alimentaire, diététique ou pharmaceutique telles que par exemple les lactobacilles des espèces Lactobacillus casei, L. casei rhamnosus, L. acidophilus, L.bulgaricus, L. brevis, L. helveticus, les bifidobactéries, Streptococcus thermophilus, Streptococcus salivarius; Lactococcus lactis; les pediocoques, les entérocoques, les levures des genres Saccharomyces (Saccharomyces cerevisiae, S. boulardii), Kluyveromyces, etc. Le choix d'un ou d'un mélange de ces microorganismes est déterminé par l'application finale. Ces microorganismes sont utilisés sous forme séchée par Iyophilisation, atomisation, ou sur lit fluidisé, de telle sorte qu'ils puissent être revivifiables. L'invention concerne également un procédé de production de particules enrobées de microorganismes, caractérisé en ce qu'il consiste à injecter de la matière hydrophobe en fusion, dans la masse de particules; celle-ci est brassée en permanence par rotation du disque faisant office de fond de l'enceinte, et balayée par un courant d'air sec. La figure 1 annexée donne une représentation schématique du dispositif. En référence à ce dessin, le dispositif comprend une enceinte (1) en acier inoxydable, dont le fond (2) est constitué d'un disque animé d'un mouvement rotatif par un moteur (3). Un flux d'air est injecté par l'espace (4) entre le fond et le corps de l'enceinte. L'air s'échappe par un filtre (5) en partie supérieure. La masse de particules (6) est brassée par la rotation du disque (2). Une buse (7) permet l'injection, par l'intermédiaire d'une pompe (8) du produit enrobant maintenu à une température supérieure à son point de fusion dans un récipient thermostaté (9). Les paramètres dont le choix est critique pour l'obtention d'un enrobage homogène sont la température du produit enrobant qui doit être supérieure à son point de fusion et de préférence comprise entre 30 et 110 C, la température de l'air qui est de préférence comprise entre 10 et 50 C, la vitesse de rotation de préférence comprise entre 50 et 500 RPM, le débit d'injection de l'enrobant, et les masses de produits mis en oeuvre. Ces paramètres sont ajustés en fonction de la forme des particules de départ, et de la nature du produit enrobant. Les exemples suivants mentionnent, de façon non limitative, les paramètres utilisés pour la production de différents types de particules. L'invention concerne également l'application des particules décrites précédemment dans les domaines pharmaceutique, diététique ou agroalimentaire. L'invention permet l'addition de microorganismes dans différents produits alimentaires comme les céréales, la confiserie, le lait en poudre, dans des comprimés, etc...tout en permettant une viabilité suffisante desdits microorganismes pendant la fabrication desdits produits et pendant la durée du stockage précédant la consommation. Elle permet également de protéger les microorganismes contre l'acidité gastrique pour une meilleure activité dans l'intestin. Exemple 1: Enrobaqe de Lactobacillus acidophilus 600 g d'une poudre lyophilisée de bactéries Lactobacillus acidophilus, souche R052, déposée à la CNCM sous le N 1-1722, commercialisée par l'institut Rosell, 8480, boulevard Saint-Laurent, Montréal, Canada, sont introduits dans un granulateur à flux d'air de marque Glatt, modèle GPCG1, en configuration " rotor ", ayant une capacité de 3 litres. 900 g d'acide stéarique (Fluka, référence 85683, point de fusion 69-71 C) sont déposés sur les particules, selon les paramètres suivants - vitesse de rotor:300rpm - température de l'acide stéarique 100 C - débit d'acide stéarique 40 g/minute - pression de pulvérisation:2 bars - température de l'air de pulvérisation:120 C température de l'air d'entrée 30 C - vitesse de l'air:3 à 4 m/s soit ouverture du clapet d'entrée à 40% - température produit 32-35 C A la fin de l'opération, les particules sont recueillies. Le diamètre moyen des particules obtenues est de 400 pLm, avec 92% compris entre 100 et 600 im. La teneur en enrobant est de 60%. La concentration en bactéries viables de la poudre de départ est de 3,2. 101T UFC/g (Unités Formant Colonies par gramme de poudre), celle des particules enrobées de 1,2.1011 UFC/g. Exemple 2: Enrobaqe de Lactobacillus casei 600 g d'une poudre lyophilisée de Lactobacillus casei, souche EQ 85 (déposée à la CNCM sous le N MA 64/4U), commercialisée par Lallemand SA, 15130 Saint Sirnon, sont introduits dans le même granulateur que celui mentionné dans l'exemple 1. Le produit enrobant est le mélange acide stéarique / acide palmitique, commercialisé par Exaflor ( 47, allée de Chanteraine, 91190 Gif sur Yvette), sous la dénomination Stéarine /50, (point de fusion 55 C). Les paramètres utilisés sont les mêmes que ceux mentionnés dans l'exemple 1, à l'exception de: - la température de l'acide gras: 80 C - la température de l'air d'entrée: 25 C - la température du produit: 28-32 C Les particules obtenues ont un diamètre moyen de 750 j.m, avec 90% compris entre 100 et 1000 lm. La teneur en acide gras est de 60% La concentration en bactéries viables de la poudre de départ est de 4,8.10" UFC/g, celle des particules enrobées de 1,6.1011 UFC/g. Exemple 3: Enrobaqe de Saccharomvces cerevisiae 750 g d'une préparation de levure sèche Saccharomyces cerevisiae souche déposée à la CNCM sous le N I 1079, commercialisée sous la marque Levucell SB, par Lallemand Sarl, 15130,Saint SIMON, sont introduits dans le même appareil que celui utilisé à l'exemple 1, et enrobés avec 750 g d'une cire végétale (cire de Carnauba, commercialisée par Exaflor, point de fusion 83-88 C). Les paramètres sont identiques à ceux de l'exemple 1, sauf: - la température de la cire:120 C - la température de l'air d'entrée 40 C - la température du produit: 45-48 C Les particules obtenues ont un diamètre moyen de 1.2 mm avec 90% compris entre 500 et 2500 pm. La teneur en acide gras est de 50% La concentration en cellules viables de la poudre de départ est de 3.101 UFC/g, celle des particules enrobées de 1,45.10 10 UFC/g. Exemple 4: Enrobage de Pediococcus acidilactici kg de poudre lyophilisée de Pediococcus acidilactici, souche déposée à la CNCM sous le N MA 18/5M, commercialisée par Lallemand SA, 15130, Saint SIMON, sous la marque Bactocell sont introduits dans un granulateur GLATT modèle CRG 200 de 450 litres de capacité, et enrobés avec 160 Kg de Stéarine 50 / 50 (Exaflor). Les paramètres sont: - vitesse du rotor 120 rpm - température de l'acide gras:80 C - débit de l'acide gras:800 g / min (400 g / min par buse, sur 2 buses) - pression de pulvérisation:5 bars - température de l'air de pulvérisation:120 C - température de l'air à l'entrée:25 C - débit d'air:1500 à 2000 m3 / h - température du produit régulée à 30 C +2 C Le diamètre moyen des particules obtenues est de 400 Fim, avec 87% comprises entre 100 et 600 pim. La teneur en enrobant est de 75%. La concentration en bactéries viables de la poudre de départ est de 3.10" UFC/g,celle des particules enrobées de 7,5.10 10 UFC/g. Exemple 5:Stabilité thermique La viabilité des bactéries Lactobacillus acidophilus dans la poudre lyophilisée utilisée dans l'exemple 1 d'une part, et dans les particules enrobées obtenues selon ce même exemplel d'autre part, a été étudiée dans les conditions suivantes: Des échantillons de 10 grammes de chaque préparation sont introduits dans des tubes hermétiques, maintenus dans un bain-marie à 50 C. Un tube de chaque préparation est retiré du bain-marie après 1 heure, 4 heures, 7 heures et 24 heures, et la concentration en bactéries viables est immédiatement déterminée. Les résultats sont consignés dans le tableau ci-après (exprimés en UFC/g et en pourcentage de la concentration initiale): Temps 0 1 h 4h 7h 24h Poudre 3,1. 10" 2,9.10" 1,1.1011 9.10'u 2,5.109 lyophilisée (100%) (93%) (35%) (29%) (8%) Particules 1,2. 10 1,2.1011 1,1. 1011 9.101u enrobées (100%) (100%) (100%) (92%) (69%) La stabilité à 50 C des bactéries dans les particules enrobées est nettement améliorée par rapport à la poudre lyophilisée de départ. Exemple 6: Stabilité dans le lait en poudre La viabilité des bactéries Pediococcus acidilactici dans la poudre lyophilisée utilisée dans l'exemple 4 d'une part, et dans les particules enrobées obtenues selon ce même exemple 4 d'autre part, a été étudiée dans les conditions suivantes: Les préparations de bactéries sont mélangées à de la poudre de lait (marque Régilait) à raison de 1% en poids de préparation bactérienne pour 99% de poudre de lait. Les mélanges sont répartis en échantillons de 100 grammes dans des sachets en polyéthylène soudés. Les sachets sont maintenus à 30 C dans une étuve. Chaque mois, un sachet de chaque mélange est analysé pour la teneur en bactéries viables. Les résultats sont consignés dans le tableau ci-après (exprimés en UFC/g et en pourcentage de la concentration initiale): Temps 0 1 mois 2 mois 3 mois 4 mois Poudre 3,1.109 1,3.10 1,2. 109 9,9.10 4,8.10 lyophilisée (100%) (42%) (38%) (32%) (15%) Particules 7, 5.100 6,4.10ó 5,5.100 5,3.100 5,2.100 enrobées (100%) (85%) (73%) (71%) (69%) ___________________________________ ____________________________________ ___________________________________ 'j ____________________________________ ___________________________________ La stabilité à 30 C en présence de lait en poudre des bactéries dans les particules enrobées est nettement améliorée par rapport à la poudre lyophilisée de départ. Exemple 7: Stabilité gastrique La stabilité des bactéries dans des conditions simulant le passage dans l'estomac a été étudiée selon le protocole suivant: 1 gramme de poudre lyophilisée ou de particules enrobées est introduit dans un flacon contenant 100ml d' une solution diluée d'acide chlorhydrique 0,1N (pH 1,2). Le flacon est placé sous agitation dans un bain-marie à 37 C. La suspension est ensuite centrifugée, et le culot est repris dans 100 ml de tampon à pH 7,0. La concentration résiduelle en bactéries viables est alors déterminée, et comparée à celle d'un témoin o l'acide chlorhydrique est remplacé par une solution tamponnée à pH 7,0. Dans ces conditions, les bactéries Lactobacillus acidophilus contenues dans la poudre lyophilisée telle qu'utilisée dans l'exemple 1 sont pratiquement entièrement détruites (survie inférieure à 0,01%), alors que les mêmes bactéries contenues dans les particules enrobées selon ce même exemple 1 présentent un taux de survie de 15%. De même, les bactéries Lactobacillus casei contenues dans la poudre lyophilisée telle qu'utilisée dans l'exemple 2 sont pratiquement entièrement détruites par le test gastrique (survie inférieure à 0,01%), alors que les mêmes bactéries contenues dans les particules enrobées selon ce même exemple 2 présentent un taux de survie à ce même test de 25%. Exemple 8: Stabilité à la compression Des comprimés à base de Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Saccharomyces cerevisiae et Pediococcus acidilactici telles que décrits dans les exemples 1, 2, 3 et 4 respectivement, sont préparés selon les conditions suivantes: Chaque préparation microbienne est introduite à raison de 5% en poids dans un mélange d'excipients composé de 49% de Sorbitol (référence Neosorb 60w, UPSA), 49% de lactose (référence Fast flow, Seppic) et 2% de stéarate de magnésium (UPSA). Chaque mélange est introduit successivement dans un appareil à comprimer de type alternatif: Korsch, modèle EKOD. Les forces de compression maximales exercées sont de 17500 N sur le piston supérieur et de 16400 N. sur le piston inférieur. Les concentrations en cellules viables sont déterminées dans chaque mélange avant compression, puis dans les comprimés. Les résultats, exprimés en pourcentage de survie après compression, sont consignés dans le tableau suivant: Espèce Lactobacillus Lactobacillus Saccharomyces Pediococcus acidophilus casei cerevisiae acidilactici Poudre non enrobée44% 3% 2% 48% enrobee Particules enrobées 98% 10% 16% 100% enrobees La survie après compression des bactéries ou levures contenues dans les particules enrobées est nettement améliorée par rapport aux poudres non enrobées correspondantes. REVENDICATIONS 1. Particules enrobées de microorganismes vivants déshydratés, caractérisées en ce que la couche d'enrobage est hydrophobe et est déposée de façon homogène sur les particules préexistantes. 2. Particules selon la revendication 1, caractérisées en ce que la couche d'enrobage est constituée de matériaux choisis parmi les matières grasses, les acides gras, les cires, purs ou en mélange entre eux. 3. Particules selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce que les microorganismes sont choisis parmi le groupe des lactobacilles, des bifidobactéries, des streptocoques, des entérocoques, des pédiocoques ou des levures. 4. Particules selon l'une des revendications précédentes, caractérisées en ce que le matériau d'enrobage a un point de fusion compris entre 20 et 100 C, avantageusement entre 30 et 80 C. 5. Particules selon l'une des revendications précédentes, caractérisées en ce que la proportion en matrice enrobante de la particule, est comprise entre 10 et 99% en poids, avantageusement entre 30 et 80%en poids. 6. Particules selon l'une des revendications précédentes, caractérisées en ce que le diamètre moyen des particules est compris entre 100 et 5000kLm, avantageusement entre 200 et 2000 pm. 7. Procédé d'enrobage de particules de microorganismes vivants déshydratés, caractérisé en ce qu'un produit hydrophobe en fusion est injecté dans la masse de particules brassées dans une enceinte par rotation du fond de ladite enceinte, et balayée par un flux d'air. 8. Procédé d'enrobage selon la revendication 7, caractérisé en ce que le produit hydrophobe est choisi parmi les matières grasses, les acides gras, les cires, purs ou en mélange entre eux. 9. Procédé d'enrobage selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que le produit hydrophobe est injecté à une température comprise entre 30 et 11 0 C. 10. Procédé d'enrobage selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que la quantité de produit hydrophobe injecté représente entre 10 et 99% en poids, avantageusement entre 30 et 80% en poids de particules finales. 11. Procédé d'enrobage selon l'une des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que le flux d'air est à une température comprise entre 10 et 50 C. 12. Procédé d'enrobage selon l'une des revendications 7 à 11, caractérisé en ce que la vitesse de rotation du fond de l'enceinte est comprise entre 50 et.500. RPM. 13. Particules enrobées de microorganismes susceptibles d'être obtenues selon l'une des revendications 7 à 12. 14. Application des particules selon l'une des revendications 1 à 6, à la réalisation de compositions pharmaceutiques, diététiques ou alimentaires.