Brevet FR2808442A1 — publié le 20011109

PROCEDE D'EXTRACTION PRINCIPE ACTIF A PARTIR DE TÉGUMENTS DE POMME, PRINCIPE ACTIF OBTENU ET COMPOSITION ADAPTÉE POUR LUTTER CONTRE LES CONSÉQUENCES DU STRESS OXYDATIF LA PEAU La présente invention concerne procédé d'extraction d'un principe actif à partir de téguments de pomme et le principe actif obtenu. Ce principe actif, dans une composition adaptée également revendiquée, notamment pour des applications cosmétiques, permet de lutter contre les effets du stress oxydatif de la peau, c'est à dire contre le vieillissement cutané de la peau. On sait que les radicaux libres de l'oxygène engendrent des pathologies, tout particulièrement au niveau cutané, plus encore lors du vieillissement. De tels radicaux libres peuvent provenir de différentes actions endogènes (activation du métabolisme de l'acide arachidonique, activation de la phagocytose ou accumulation de métabolites réduits), ou exogènes (radiations, rayonnements UV, pollution de l'air ou à certaines fumées notamment de cigarettes). En fonction de l'importance stress oxydatif, il peut y avoir une défense adaptée par libération d'enzymes antioxydantes en quantité suffisante pour compenser les actions de radicaux libres générés. Ces radicaux libres sont neutralisés au niveau des cellules grâce à des moyens chimiques ou enzymatiques, notamment des systèmes antioxydants qui leur permettent de se protéger de réguler les effets néfastes de ces radicaux. Néanmoins au delà d'un certain seuil, les systèmes antioxydants ne suffisent plus et se retrouvent submergés par le flux radicalaire conduisant ' des dégâts cellulaires irréversibles. On sait aussi que l'âge joue un rôle important et que les systèmes antioxydants sont de moins en moins performants pour lutter contre les radicaux libres produits en forte quantité. Ces dégâts occasionnés sur la cellule par le stress oxydatif non maîtrise sont de trois ordres essentiellement 1 l OXYDATION DES PROTEINES CELLULAIRES: Cette oxydation est associée à une inactivation parallèle du système enzymatique conduisant à une fragmentation protéique. Les modifications protéiques sont initiées généralement par des radicaux OH et les processus d'oxydation se poursuivent par intervention des radicaux 02 et 02-. Une telle oxydation se déroule selon trois mécanismes - oxydation par les radicaux libres des chaînes latérales des acides aminés. Plus particulièrement les acides aminés aromatiques sont oxydés en dérivés carbonyls. De plus, les réactions comme la glycation ou la peroxydation participent à l'oxydation des protéines. - rupture des liaisons peptidiques qui conduit à la fragmentation des protéines et à la formation de segments peptidiques inactifs. - formation de liaisons croisées covalentes entre protéines, sous l'action des radicaux libres OH, favorisées par des ponts disulfures ou tyrosiniques. Ces protéines endommagées ainsi modifiées dans leur structure comme dans leur fonctionnalité se trouvent inactivées. 2/ LESTONS DE L'ADN DES NOYAUX CELLULAIRES Les chaînes en hélice de l'ADN sont menacées dans leur intégrité en permanence par les radicaux libres endogènes, les agents chimiques, et les différents rayonnements UV. De telles lésions empêchent le bon fonctionnement des cellules et peuvent provoquer des mutations génétiques. II existe un système de réparation de l'ADN endommagé, notamment par excision mais les risques de mutation génétique demeurent si la lésion n'est pas reconnue ou si la réparation n'est pas complète. Aussi faut-il protéger les molécules d'ADN et limiter les mutations UV- induites. 3/ PEROXYDATION MEMBRANAIRE DE LA CELLULE . La membrane de la cellule est peu protégée et reste la cible privilégiée des radicaux libres qui induisent la peroxydation des acides gras polyinsaturés des membranes phospholipidiques. II y a alors formation de peroxydes cytotoxiques qui conduisent à une perméabilité membranaire et à la mort de la cellule. Ces trois actions induisent des dégâts majeurs intenses, cibles et surtout irréversibles. Aussi, de nombreux antioxydants naturels ou de synthèse sont utilisés pour tenter de pallier les actions des radicaux libres. Par contre ces antioxydants ont chacun une ou des actions spécifiques mais à l'encontre d'une famille de radicaux libres bien déterminée ou agissent à travers des mécanismes ciblés sur certaines séquences oxydatives ' bien qu'il s'avère difficile d'agir simultanément sur l'ensemble des effets du stress oxydatif. Ainsi, un antioxydant qui inhibe la peroxydation lipidique n'a pas d'action sur l'oxydation des protéines ou les lésions de l'ADN. C'est là un des intérêts principaux du principe actif selon la présente invention qui permet de lutter simultanément contre ces trois facteurs et donc permet de lutter contre le vieillissement cutané. La présente invention couvre un procédé d'extraction de ce principe actif. A cet effet, le procédé d'extraction d'un principe actif selon l'invention, en vue d'une action contre les conséquences du stress oxydatif permettant de lutter contre le vieillissement cutané, se caractérise en ce qu'il comprend les étapes suivantes - réduction en poudre fine de téguments séchés de pomme, - solubilisation de cette poudre avec un minimum de 8% en volume de poudre dans une solution aqueuse, - hydrolyses enzymatiques conjointes des sucres et des protéines, - chauffage permettant l'inactivation totale des enzymes, et - filtration stérilisante pour retenir les micro-organismes, levures moisissures ainsi que la flore mésophile totale. La solution obtenue peut être concentrée, lyophilisée ou atomisée. L'invention couvre aussi le principe actif obtenu par ce procédé et moins une composition cosmétique pour lutter simultanément contre l'oxydation des protéines cellulaires, contre les mutations induites par les rayonnements UV et contre la peroxydation membranaire des cellules de la peau, cette composition comprenant ce principe actif associé à toute forme galénique adaptée. L'invention couvre également un procédé de lutte contre vieillissement cutané, qui consiste à disposer préventivement sur la peau telle composition cosmétique. Les différentes figures annexées regroupent les résultats obtenus lors des différents essais de caractérisation du principe actif extrait et de son activité. - la figure 1 montre un état sur plaque des résultats de chimiluminescence des oxydations des différentes protéines, - la figure 2 montre un tableau des atténuations du taux d'oxydation, et - les figures 3A et 3B montrent les effets contre les mutations induites par les rayonnements UV dans le cas de Salmonella typhimurium et d'Escherichia coli. Le procédé d'extraction selon la présente invention est maintenant décrit en détail, suivi de la caractérisation du principe actif et des tests. I/ PROCEDE D'EXTRACTION Le procédé d'extraction du principe actif selon la présente invention consiste en la succession des étapes suivantes - réduction en poudre fine de téguments séchés de pomme, - solubilisation de cette poudre avec un minimum de 8% en volume de poudre dans une solution aqueuse, - hydrolyses enzymatiques conjointes des sucres et des protéines, - chauffage, plus particulièrement pendant une durée de 20 à 6 heures, à une température comprise entre 50 et 80 C, permettant l'inactivation totale des enzymes, - concentration éventuelle de la solution obtenue, - filtration stérilisante pour retenir les micro-organismes, levures, moisissures ainsi que la flore mésophile totale. La solution peut être concentrée sans que cela soit une nécessité ou même être lyophilisée ou atomisée. II/ CARACTERISATION DU PRINCIPE ACTIF Le principe actif issu de ce procédé se caractérise par la composition suivante et par les caractéristiques suivantes 1 / Matière sèche Le taux de matière sèche est supérieur à 100 g/1, notamment compris entre 100 et 300 g/1 et plus particulièrement entre140 et 200 g/1. Cette plage est déterminée par passage à l'étuve à 105 C jusqu'à obtention poids constant. 2/ pH La valeur du pH est comprise entre 4,0 et 10,0 plus particulièrement entre 5,0 et 7,0, obtenue par la méthode potentiométrique, à température ambiante. 3/ Teneur en sucres totaux La teneur en sucres totaux est obtenue par la méthode de DUBOIS (DUBOIS M & al, (1956) Analytical Chemistry, 28, N 3 p 350-356). En présence de phénol et d'acide sulfurique concentré, les sucres réducteurs donnent un composé jaune-orangé. Après refroidissement, la Densité Optique est lue au spectrophotomètre à 490 nm. Une courbe test est établie avec une gamme étalon d'une combinaison de 1/3 de mannose, 1/3 de glucose et 1/3 de galactose, avec des concentrations de 25 à 100 ,ug/I. Les valeurs du taux de sucre sont lues sur la courbe directement et dans le cas du principe actif selon la présente invention, on obtient des valeurs de sucres totaux comprises entre 40 et 300 g/1, préférentiellement entre 80 et 160 g/l. 41 Polyphénols totaux Les composés phénoliques forment des complexes colorés en présence de ferricyanure de potassium, dont l'intensité peut-être détectée à 5 nm. Ceci permet de déterminer la quantité de composés phénoliques une courbe étalon. Cette courbe est obtenue à partir d'une gamme étalon d'acide gallique allant de 40 à 120 mg/I. La teneur en composés phénoliques est ainsi exprimée en mg d'acide gallique. La valeur obtenue est comprise entre 900 et 2 000 mg/I 51 Stabilité Le principe actif obtenu est stable à un pH supérieur à 4,0. Le principe actif est stable à la température jusqu'à 80 C. Le principe actif est également stable dans un mélange éthanol/eau jusqu'à des concentrations de 40% en volume d'éthanol, ceci pour des concentrations de 3, 5 ou 7 % de principe actif. III/ EFFETS DU PRINCIPE ACTIF EXTRAIT ET CARACTERISE POUR LUTTER CONTRE LE VIEILLISSEMENT CUTANE On montre par les expérimentations et essais suivants que le principe actif selon l'invention présente des activités lui permettant de lutter contre les trois facteurs ainsi qu'énoncés en préambule. 1 / Effet contre l'oxydation des protéines cellulaires L'étude consiste à évaluer l'activité protectrice du principe actif. Elle est conduite en mesurant le taux d'oxydation des protéines d'expiants soumis à une irradiation UVA + UVB. Les expiants sont mis en contact avec les produits 2 heures avant l'irradiation et pendant l'irradiation. La concentration en principe actif est de 5 et 7%. Les analyses sont effectuées 24 heures après irradiation. Le protocole consiste à substituer le dinitrophénol sur les groupements --carbonyls qui sont caractéristiques des protéines oxydées. Puis le dinitrophénol est révélé à l'aide d'un anticorps anti dinitrophénol. La dérivatisation des groupements -carbonyls est obtenue avec une solution de couplage Oxyblot, commercialisée par la société américaine Oncor pendant 30 mn à 20 C. Après neutralisation, les échantillons sont transférés Immobilon, commercialisé par la société française Polylabo. Une fois la membrane saturée et incubée avec l'anti-corps anti- dinitrophénol puis conjuguée avec un anti-immunoglobuline de lapin- peroxydase, tous deux de la société Oncor, on révèle par chimiluminescence et on quantifie la densité des bandes des images saisies. On dose également les protéines de chaque extrait. L'étude montre qu'il existe des protéines naturellement oxydées car les témoins non irradiés présentent aussi des bandes protéiques entre 50 000 et 70 000 Daltons, ce qui correspond aux protéines oxydées. On se reporte à la figure 1 qui montre les résultats du film après chimiluminescence. PM : Poids Moléculaire, A : Témoin non irradié, B : Témoin irradié, A' : témoin non irradié en contact avec le principe actif à 7%, C : Témoin irradié au contact du principe actif à 5 %, et D : Témoin irradié au contact du principe actif à 7 %. L'expiant témoin irradié présente une oxydation beaucoup plus importante des protéines. De plus, on note que l'oxydation est plus faible dans le des expiants irradiés mais mis au contact du principe actif selon la présente invention. De plus, cette diminution est proportionnelle à la concentration du principe actif. On trouve les résultats dans le tableau de la figure 2. 2/ Effet contre les mutations induites par les rayonnement UV L'étude a pour but de mettre en évidence l'activité antimutagène du principe actif selon la présente invention vis à vis de mutations induites par des rayonnements UV. Le protocole prévoit de soumettre une suspension bactérienne de Salmonella typhimurium (TA 102) et d'Escherichia coli (WP2) à des rayonnements UVA/UVB ou UVC. Ensuite une partie de ces suspensions irradiées est coulée boîte de Pétri avec deux types de milieu a/ milieu minimum gélosé pour estimer les colonies révertantes X b/ milieu nutritif gélosé pour estimation des colonies viables, y. Après incubation, les colonies sont comptées au moyen appareil adapté. On calcule alors la fréquence de mutation qui est le rapport du nombre de colonies révertantes sur le nombre de colonies viables X/Y et la fréquence de mutation relative (FMR) qui est le rapport de la fréquence mutation (FMsusp=Xsusp/Ysusp) de la suspension irradiée mais traitée avec le principe actif selon la présente invention, sur la fréquence de mutation du témoin irradié mais non traité (FMtém = Xtém/Ytém,). Les résultats sont regroupés dans les tableaux des figures 3A et 3B respectivement pour la Salmonella typhimurium et l 'Escherichia coli. Le principe actif présente un potentiel anti-mutagène ' à vis des mutations induites par des UVA, UVB et UVC. 3/ Effet de protection de l'ADN L'étude vise à déterminer l'effet génoprotecteur du principe actif selon la présente invention. A cet effet, on effectue un test in vitro dit test 3D (Damaged DNA Detection) et commercialisé par la société française "SFRI laboratoire" pour détecter les agents génotoxiques en repérant les lésions l'ADN en reproduisant in vitro le processus de réparation desdites lésions. Dans ce test, des cellules HELA sont mises en culture puis incubées avec 2 ou 4% de principe actif . Une agression est réalisée au moyen d'une solution d'eau oxygénée. Les cellules sont ensuite lysées puis l'ADN génomique récupéré et analysé. test 3D consiste en une réparation des lésions par des complexes protéiques spécifiques à la réparation. Un nucléotide marqué à biotine est incorporé dans l'ADN lors de la resynthèse. reconnaissance de la biotine au moyen d'une molécule d'avidine couplée à une peroxydase puis une révélation par addition substrat chimiluminescent de la peroxydase. Un luminomètre permet ensuite de détecter et de mesurer l'intensité de cette luminescence. Les résultats montrent un pourcentage d'inhibition de l'effet lésionnel de 22% et de 75% respectivement pour des doses de principe actif de 2 et 4% sur des cellules HELA. Le principe actif selon la présente invention possède bien une activité anti-lésion importante. 4l Effet sur l'apparition-de cellules coup de soleil Les cellules "coup de soleil" ou "sunburn cells" sont des kératinocytes dyskératosiques de l'épiderme qui apparaissent après une irradiation aux UV. Ces cellules présentent des lésions de l'ADN et sont en apoptose Le protocole opératoire prévoit d'une part de conserver des témoins non irradiés et d'autre part d'irradier aux UVA et UVB des expiants mis en présence de 5 et 7% de principe actif selon la présente invention. Après rinçage et fixation, coupe histologique et coloration les cellules "coup de soleil", c'est à dire les kératinocytes apoptotiques, sont comptées au microscope. On constate un pourcentage de réduction de 49% et de 63 du rapport du nombre de cellules "coup de soleil" par rapport au témoin irradie. La peau se trouve ainsi protégée des effets délétères des radicaux libres induits par les UV. 51 Effet protecteur de fibroblastes et de kératinoc tes soums à es #V Des kératinocytes et des fibroblastes sont cultivés dans des milieux adaptés. Ces cellules sont irradiées par des UVA et UVB. La viabilité cellulaire permet d'estimer l'effet protecteur du principe actif selon présente invention. Fibroblastes : l'activité anti-radicalaire est de 30, 68 et 86% respectivement lors de la mise en contact avec 1, 3 et 5 % de principe actif. Kératinocytes : l'activité anti-radicalaire est de 53, 90 100% respectivement lors de la mise en contact avec 1, 3 et 5% de principe actif. principe actif selon la présente invention permet d'agir à l'encontre des trois facteurs simultanément et avec des niveaux tout à fait significatifs. Le principe actif peut être intégré dans des compositions cosmetiques à raison de 0,1 % à 10%. Un procédé de lutte contre le vieillissement cutané consiste à disposer sur la peau une composition cosmétique intégrant entre 0,1% et 10% de principe actif selon la présente invention. REVENDICATIONS 1. Procédé d'extraction d'un principe actif en vue d'une action contre les conséquences du stress oxydatif permettant de lutter contre le vieillissement cutané, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - réduction en poudre fine de téguments séchés de pomme, - solubilisation de cette poudre avec un minimum de 8% en volume de poudre dans une solution aqueuse, - hydrolyses enzymatiques conjointes des sucres et des protéines, - chauffage permettant l'inactivation totale des enzymes, - filtration stérilisante pour retenir les micro-organismes, levures, moisissures ainsi que la flore mésophile totale. 2. Procédé d'extraction selon la revendication 1, caractérisé en ce que le chauffage pour permettre l'inactivation totale des enzymes consiste à chauffer plus particulièrement pendant une durée de 20 mn à 6 heures à une température comprise entre 50 et 801C. 3. Procédé d'extraction selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la solution obtenue est concentrée, lyophilisée ou atomisée. 4. Principe actif obtenu par le procédé des revendications 1, 2 ou 3 caractérisé en ce qu'il comprend - taux de matières sèches supérieur à 100 g/1, notamment compris entre 100 et 300 g/1 et plus particulièrement 140 à 200 g/1, - pH compris entre 4,0 et 10,0, plus particulièrement entre 5,0 et 7,0, - teneur en sucres totaux comprise entre 40 et g/l et plus précisément compris entre 80 et 160 g/1, - taux de polyphénols totaux compris entre 900 et 2 000 g/1, exprimé en acide gallique. 5. Composition cosmétique pour lutter simultanément contre l'oxydation des protéines cellulaires, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins pour une part du principe actif selon la revendication 4, associé à toute forme galénique adaptée. 6. Composition cosmétique pour lutter contre les mutations induites les rayonnements UV, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins pour part du principe actif selon la revendication 4, concentré ou séché, associé à toute forme galénique adaptée. 7. Composition cosmétique pour lutter contre la peroxydation membranaire des cellules de la peau, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins pour une part du principe actif selon la revendication 4, concentré ou séché, associé à toute forme galénique adaptée. 8. Procédé de lutte contre le vieillissement cutané, caractérisé en ce que l'on dispose préventivement sur la peau une composition cosmétique selon la revendication 5,6 ou 7 à raison de 0,1 à 10% de principe actif.