Brevet FR2807523A1 — publié le 20011012

La présente invention concerne l'utilisation d'un reste PyA-(Z)x-pNF et de préférence PyA-pNF dans des substrats à des fins d'identification et/ou de caractérisation de composés et plus particulièrement dans une séquence peptidique reconnue par l'enzyme de conversion de l'endothéline pour doser et/ou identifier des inhibiteurs de cette enzyme. Le contrôle de la pression artérielle est sous la dépendance de plusieurs peptides qui possèdent soit des actions de vasoconstriction des vaisseaux (c'est le cas en particulier de l'angiotensine II, des endothélines, de l'urotensine), soit des actions vasodilatatrices (c'est le cas en particulier de la bradykinine ou du peptide atrial natriurétique qui joue de plus un rôle sur l'élimination d'eau et de chlorure de sodium). Parmi tous ces peptides, l'endothéline-1 (ET-1) qui est un peptide possédant une partie cyclique, assurée par deux ponts disulfure, et une courte partie linéaire (Figure 1) est considérée comme un très puissant vasoconstricteur par action sur les muscles lisses des parois des vaisseaux, en particulier au niveau cardiaque (artères coronaires). L'endothéline-1 fait partie d'une famille d'isopeptides où l'on trouve l'endothéline-2 (ET-2) et l'endothéline-3 (ET-3) qui ne diffèrent de l'ET-1 que par quelques changements ponctuels d'acides aminés (Figures 2). Les endothélines sont sécrétées par les cellules endothéliales sous forme de précurseurs inactifs, les "big-endothélines", qui sont clivées par des métallopeptidases à zinc dénommées enzyme de conversion de l'endothéline (ECE) pour donner naissance aux peptides actifs. Ainsi, si on prend l'exemple de l'ET-1, l'ECE-1 hydrolyse la liaison Trp21-Val22 de la big-endothéline-1 qui comporte 38 acides aminés pour générer deux fragments dont l'un, N-terminal, constitue l'endothéline-1 active. Dans le cas de l'ET-3, c'est la liaison Trp21-lle22 qui est clivée. La big-ET-1 et l'ET-1 sont détectées dans le plasma et l'ECE est une enzyme cytosolique ou membranaire caractérisée dans ce cas par un court fragment intracellulaire suivi d'une hélice transmembranaire d'environ 25 acides aminés et d'un domaine extracellulaire très important qui contient le site actif. L'enzyme est constituée par deux sous-unités identiques reliées par un pont disulfure (Shimada et al., Biochem. J. (1996) 315, 863-867). L'administration de faibles doses de big-endothéline provoque une forte augmentation de la pression artérielle démontrant le clivage du précurseur avec formation d'endothéline. Cette réponse peut être bloquée par un antagoniste du récepteur à l'ET-1. Il existe donc un intérêt considérable dans l'inhibition de l'ECE par des composés dont les applications sont potentiellement très nombreuses dans les affections cardiovasculaires. On peut citer en particulier le traitement de l'infarctus du myocarde, de l'angor, des spasmes vasculaires consécutifs à une hémorragie cérébrale, des spasmes des vaisseaux périphériques, de l'hypertension pulmonaire, de l'insuffisance cardiaque et/ou rénale, de troubles liés au diabète, de l'asthme, de la prévention des resténoses, des fibroses cardiaques et vasculaires. En l'espèce, certaines pathologies cardiovasculaires pourraient par conséquent être prévenues ou au moins réduites par une diminution de la concentration circulante d'endothélines en inhibant l'enzyme qui leur donne naissance, c'est-à-dire l'ECE. Toutefois, la recherche intensive de tels inhibiteurs exige de disposer d'un test d'identification simple et robotisable, de manière à permettre la réalisation d'un grand nombre d'essais en un temps réduit. Or, les tests actuels sont soit difficiles, longs, peu spécifiques et/ou onéreux. Les tests, où les deux fragments produits par action de l'ECE sur la big-ET sont dosés par HPLC, ont pour inconvénient majeur de nécessiter de grandes quantités d'enzyme et de big-ET. Le test basé sur le clivage de la big-ET marquée à l'iode 125 et donnant naissance à la 1251 ET-1 et sa détermination par fixation sur son récepteur n'est pas utilisable pour des essais à haut-flux (Fawzi, A.B. ; Clemen, R.M. & Wright, D.L. (1994) Anal. Biochem. 222, 342-350). Il en est de même de tests cellulaires mesurant l'augmentation de GMPc induite par la fixation d'ET-1 sur son récepteur. Les dosages radioimmunologiques RIA nécessitent pour leur part une série très complexe d'expériences successives, sont relativement peu sélectifs et exigent l'utilisation, à la fois de big-ET et de 125#ET-1. Ces dosages complexes ne se prêtent pas au tri à haut-flux de très grandes séries d'inhibiteurs potentiels avec robotisation du test et demandent la synthèse ou l'achat d'endothéline iodée radioactive, dont le temps d'utilisation est limité. Plus récemment, il a été proposé un test basé sur l'utilisation d'un substrat radioactif obtenu par fixation sur la partie N-terminale de peptides de 21 acides aminés contenant le site de clivage Trp-Val d'un reste propionyl tritié (FR n 96 02673). Le métabolite N-terminal radioactif formé est extrait par un solvant organique sous agitation et un échantillon de ce solvant est prélevé, mélangé à un liquide de scintillation puis la radioactivité mesurée à l'aide d'un compteur. La succession d'étapes ne permet pas là encore de robotiser l'essai et de plus exige l'utilisation d'un radioélément et donc la synthèse périodique du substrat tritié. La présente invention a précisément pour objet de proposer un nouveau test de diagnostic permettant de s'affranchir des inconvénients rencontrés avec les tests évoqués précédemment. La présente invention repose plus particulièrement sur la mise en évidence par les inventeurs que l'utilisation de la pyrenylalanine (PyA) associée à l'acide modifié L-paranitrophénylalanine (pNF) était particulièrement intéressante à des fins de diagnostic. La pyrenylalanine est un acide aminé synthétique qui possède une capacité de fluorescence importante. Avantageusement, cette fluorescence du reste PyA est quasi totalement éteinte lorsque PyA est placé à proximité et de préférence accolé au reste pNF. En conséquence, cette fluorescence naturelle du PyA ne peut se manifester qu'à partir du moment où ce reste n'est plus soumis à l'effet répresseur du reste pNF, par exemple lorsqu'il en est physiquement séparé, notamment par clivage. Un reste de type PyA-pNF apparaît donc comme un outil particulièrement intéressant lorsqu'il est introduit au niveau d'un substrat et plus particulièrement d'une séquence peptidique ou pseudopeptidique, pour visualiser par fluorescence la manifestation d'un clivage. Un premier aspect de l'invention concerne donc l'utilisation d'un reste PyA-(Z)x-pNF, avec Z représentant un enchaînement d'acides aminés de série L ou D, naturels ou non et x représentant 1 ou 0, dans un substrat à des fins de détection, identification et/ou dosage par fluorescence de composés susceptibles de cliver la ou une liaison établie entre PyA et pNF et/ou de composés à activité inhibitrice ou activatrice vis-à-vis de composés connus et capables de cliver cette liaison. La présente invention est donc basée sur l'apparition d'une fluorescence provoquée par la séparation de PyA et pNF par clivage d'une liaison établie entre eux. Z peut ainsi comprendre jusqu'à 4 acides aminés identiques ou différents. Toutefois, cette valeur en acides aminés n'est qu'une valeur indicatrice. La longueur de l'enchaînement d'acides aminés figurée par Z est en fait ajustée de manière à ce que la distance séparant PyA et pNF soit compatible avec la manifestation de l'effet répresseur de pNF sur la fluorescence naturellement émise par PyA. Un second critère pour cet ajustement est lié à la nécessité de préserver la spécificité et l'affinité du composé clivant naturellement le substrat incluant PyA-(Z)x-pNF. Le choix du reste PyA-(Z)x-pNF est par conséquent effectué en prenant en compte ces deux critères. Le substrat dans lequel est introduit le reste peptidyle PyA-(Z)x-pNF peut être peptidique ou pseudopeptidique. La présente invention vise plus particulièrement l'inclusion d'un reste PyA-(Z)x-pNF et de préférence PyA-pNF dans les séquences peptidiques reconnues par l'ECE qui les clivent au niveau du reste peptidyle et de préférence au niveau de la liaison PyA-pNF produisant ainsi une très intense augmentation de fluorescence (environ de 150 à 800 fois pour une dégradation de 5% du substrat). Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le reste dipeptidyle PyA-pNF est présent, dans la séquence peptidique reconnue par l'ECE, au niveau du site de clivage naturel auquel il se substitue. De manière inattendue, le reste dipeptidyle PyA-pNF se révèle clivable par l'ECE et n'altère pas l'affinité et la spécificité de cette enzyme vis-à-vis de la séquence peptidique qui l'inclue. Dans le cas particulier où la séquence peptidique correspond à celle de la big-endothéline-1 ou 2, la liaison substituée est la liaison Trp21-Val22 et de la big-endothéline-3, Trp21-lle22. La big-ET-1 (19-35) utilisée comme produit de départ peut être préparée selon les méthodes usuelles telles que notamment par un synthétiseur automatique en phase solide tel que le modèle, par exemple, 431A de Applied Biosystems utilisant la technologie Fmoc, tel que décrit dans la référence ATHERTON, E. et SHEPPARD, R.C. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis : a practical approach, IRL Press, Oxford. L'extrême sensibilité de l'utilisation revendiquée permet d'opérer dans des volumes très faibles, de l'ordre de 50 à 100 l, avec des concentrations réduites en substrat de l'ordre de 2 M à 50 M. Un second aspect de l'invention concerne des produits de formule # : Ac-(X1)n PyA-(Z)x-pNF-(X' 1)m-COR (1) dans laquelle - les symboles X1, et X'1 représentent des acides aminés, - Z représente un enchaînement d'acides aminés de série L ou D, naturels ou non et x représente 1 ou 0, - R représente un groupement OH ou NH2, - Ac un groupement acyle, - n est un entier variant de 2 à 6 et m de 3 à 13. Le test de la présente invention est ainsi basé sur l'utilisation de peptides de formule (I) dont la partie N-terminale est acylée ce qui présente au moins deux avantages : protéger du clivage par les aminopeptidases et renforcer l'hydrophobicité du fragment N-terminal qui sera généré par l'hydrolyse. Cette manifestation de fluorescence est liée à la génération dans le clivage d'un métabolite de formule générale Il : Ac-(X1 )n-PyA-(Z')x (ici) dans laquelle - X1 et n sont tels que définis précédemment, - Z' représente un ou plusieurs acides aminés de série L ou D, naturels ou non et - x représente 1 ou 0. Plus préférentiellement, x représente 0 dans les formules (I) et (II). Notamment, les composés de formule (I) répondent à la formule générale (la) Ac- (Z1 )-(Z2)-lle-lle-PyA-pNF -AsN- Thr- Pro-Glu-His- Val-Val-Pro- Tyr-Gly-Leu-Gly- Ser-(Z4)-(Z5)-(Z6)-COOH (SEQ ID N 1) (la) dans laquelle Z1, Z2, Z4, Z5 et Z6, identiques ou différents, représentent un acide aminé. Plus particulièrement, les composés de formules # ou la sont tels que : - Z1 et Z2 sont tels que : soit Z1 et Z2 représentent une simple liaison, soit Z1 représente une simple liaison et Z2 représente l'acide aminé Asp, soit Z1 et Z2 représentent respectivement les acides aminés Leu et Asp, - Z4, Z5 et Z6 sont tels que : soit Z4, Z5 et Z6 représentent une simple liaison, soit Z5 et Z6 représentent une simple liaison et Z4 représente l'acide aminé Pro, soit Z6 représente une simple liaison et Z4 et Z5 représentent respectivement les acides aminés Pro et Arg, soit Z4, Z5 et Z6 représentent respectivement les acides aminés Pro, Arg et Ser. A titre représentatif de ces composés, on peut plus particulièrement citer : Ac-lle-lle-Pya-pNF -Asn- Thr- Pro-Glu-His- Val- Val- Pro- Tyr-Gly-Leu-G ly-Ser-COOH (SEQ ID N 2) ou Ac-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Pya-pNF-Gly-Leu-Met-NH2 (SEQ ID N 3) De même, à titre représentatif des composés de formule Il, on peut notamment mentionner : Ac-Ile-Ile-PyA (SEQ ID N 4) ou Ac-Arg-Pro-Lys-Gln-Glu-PyA (SEQ ID N 5) La préparation des composés conformes à la présente invention relève des compétences de l'homme de l'art. Les composés revendiqués peuvent être obtenus par les méthodes usuelles de synthèse en phase solide selon la méthode de Merrifield sur un synthétiseur automatique comme par exemple l'appareil 431A de Applied Biosystems. La chimie utilisée correspond à la technologie Fmoc et la protection des chaînes latérales permettant leur clivage par l'acide trifluoroacétique tel que décrit par E. Atherton et R. C. Sheppard (1989) dans "Solid Phase Peptide Synthesis : a practical approach, IRL Press, Oxford". La réaction d'acylation pour conduire au composé de formule # peut être réalisée dans les conditions usuelles connues de l'homme du métier. La L-pyrenylalanine est obtenue selon un procédé de synthèse asymétrique décrit dans la publication Soleilhac, J. M. et al. Anal. Biochem. (1996) 241, 120-127. La pureté des peptides finaux est estimée supérieure à 99% par HPLC en phase inverse et l'identité des peptides par spectrométrie de masse electrospray. Les couplages sont effectués selon des techniques conventionnelles à l'aide d'agent de couplage comme HAUT, PyBrop et de préférence en utilisant dicyclohexylcarbodiimide / hydroxybenzotriazole. La présente invention a pour troisième objet l'utilisation d'un composé de formule générale I tel que défini ci-dessus pour la détection, l'identification et/ou le dosage de l'ECE ou d'un composé capable d'inhiber ou d'activer l'enzyme de conversion de l'endothéline. Selon une variante préférée de l'invention, le composé à doser est un composé capable d'inhiber l'enzyme de conversion de l'endothéline. La présente invention a également pour objet un procédé pour détecter, identifier et/ou doser un composé capable d'inhiber ou d'activer l'enzyme de conversion de l'endothéline, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en présence en solution d'un composé de formule générale I, et reconnue par l'enzyme de conversion de l'endothéline avec ladite enzyme de conversion de l'endothéline, et au moins un composé susceptible d'inhiber ou activer l'ECE, - la mesure de la fluorescence émise en présence, et le cas échéant en absence, du composé à détecter, identifier et/ou doser et - en ce que l'absence ou une diminution de fluorescence indique la présence d'un composé inhibiteur de l'enzyme de conversion de l'endothéline. En fait, l'ordre de mise en présence des trois composés n'est pas déterminant. On peut tout d'abord mettre en présence le composé de formule générale 1 avec l'ECE puis introduire en une étape ultérieure le présumé inhibiteur ou activateur. Selon une autre variante, le composé de formule générale 1 est d'abord mis en présence du composé à doser puis l'ECE. Le composé tel que défini ci-dessus auquel on applique le test défini ci-dessus pour déterminer son activité inhibitrice de l'ECE peut être de nature diverse, sans limitation, et par exemple, peut être choisi parmi les phosphonimides, les phosphamides et les dérivés de ces produits, ou encore les inhibiteurs de métalloprotéinases tels que les dérivés thiol, carboxylates ou hydroxamates. On peut également citer comme composé le phosphoramidon et le N-(phényl-éthylphosphonyl)-Leu- Trp (TAKEDA), dont les activités inhibitrices de l'ECE sont connues. Le composé à tester peut se présenter sous une forme isolée, être connu ou non et/ou être présent dans une banque de composés, un extrait biologique ou de l'eau. Selon une variante préférée, le substrat est : Ac-lle-lle-Pya-pNF -Asn- Thr- Pro-Glu- His- Val- Val-Pro- Tyr-Gly- Leu-Gly-Ser-COOH (SEQ ID N 2)(peptide 1s) ou Ac-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Pya-pNF-Gly-Leu-Met-NH2 (SEQ ID N 3) (peptide 2s). L'addition de doses croissantes d'un composé, capable d'inhiber l'activité enzymatique de l'ECE vis à vis du substrat de formule générale # par exemple, se traduira par une diminution de l'intensité de la fluorescence due au métabolite, formé par l'ECE, de formule Ac-Ile-Ile- PyA, dont la fluorescence n'est pas modifiée durant plusieurs heures. La mesure de cette intensité rapportée à une courbe étalon établie par mélanges du substrat et du métabolite fluorescent formé permet donc soit d'évaluer le pouvoir inhibiteur en pourcentage d'inhibition à une concentration donnée fixe du produit P, soit de déterminer précisément son IC50 puis son Kl à l'aide du Km du substrat et de plusieurs concentrations du produit P. L'extrême sensibilité du dosage permet d'opérer dans des volumes très faibles (100 l) avec des concentrations de l'ordre de 20 M du substrat 1 s (soit 2 nmole correspondant à 4.43 g par essai) ou 5 M du substrat 2s. Le test est donc très facilement utilisable en plaques à 96 puits ou plus, permettant sa robotisation avec détermination automatique des Kl lorsque le fluorimètre de lecture est relié à un ordinateur possédant un logiciel commercial approprié. Incubés avec l'ECE, les peptides 1s et 2s ne conduisent qu'à deux métabolites comme le montre l'analyse de la réaction par HPLC et correspondant au clivage unique au niveau de la liaison peptidique PyA- pNF. Avantageusement, ces substrats sont extrêmement sélectifs puisque aucun clivage n'est observé par HPLC après incubation durant 2 h à 37 C avec des métallopeptidases à zinc purifiées appartenant à la même famille que l'ECE, telles que par exemple la néprilysine (NEP) ou l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE). Enfin, la sensibilité et la spécificité du test est telle que l'on peut utiliser aussi bien des ECE purifiées (Takahashi et al. J. Biol. Chem. (1993) 268, 21395-21398), qu'une préparation membranaire de cellules CHO dans lesquelles l'ECE a été transfectée (Xu et al. Ce// (1994) 78, 473-485) ou même une préparation membranaire d'un tissu animal riche en ECE (poumon ou cerveau de rat). La séquence et la structure de l'ECE étant très conservées d'une espèce à l'autre, c'est en particulier le cas du rat et de l'homme, les résultats (Kl d'inhibiteurs par exemple), obtenus sur des ECE de rongeurs purifiées ou non, sont identiques à ceux obtenus sur l'enzyme humaine recombinante. La présente invention propose donc un test d'identification d'inhibiteurs de l'ECE ainsi que la détermination de leur pouvoirs inhibiteurs par un essai fluorimétrique, très rapide, reproductible et permettant des tests robotisables et très nombreux pouvant donc s'adapter à une sélection à haut débit de molécules inhibitrices. La présente invention propose également la production de produits industriels nouveaux, éventuellement utilisables sous forme de kits comprenant des plaques de 96,192 et 384 puits prêts à l'emploi et contenant soit l'ECE lyophilisée, soit un substrat tel que défini dans la formule générale et illustré dans le cas de 1 s et 2s, auxquels on ajoute, éventuellement par utilisation d'un robot, les réactifs nécessaires à la détermination des pouvoirs inhibiteurs de séries de molécules. Un autre aspect de l'invention concerne une méthode de diagnostic d'une pathologie liée à un taux plasmatique anormal en enzyme de conversion de l'endothéline, caractérisé en ce qu'elle met en #uvre un composé de formule # tel que défini précédemment. Les figures et exemples ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif de la présente invention. Figure 1 : séquence peptidique de la big-endothéline. Figure 2 : séquences peptidiques endothélines ET-1, ET-2 et ET-3. Figure 3 : graphes représentant le spectre d'émission fluorescente du peptide 1s et de son métabolite 1 m (figure 3a) et du peptide 2s et de son métabolite 2m (figure 3b). EXEMPLE 1 PREPARATION DES PEPTIDES. Les peptides identifiés ci-après 1 s et 2s et les métabolites fluorescents correspondants contenant le reste pyrenylalanine, sont préparés en phase solide par la méthode de Merrifield sur un synthétiseur automatique en utilisant la stratégie Fmoc et la protection des chaînes latérales généralement sous forme de reste t-butyl, ether ou ester, trityl ou Boc comme déjà décrit dans "Solid Phase Peptide Synthesis : A practical approach IRL Press Oxford". Les couplages sont effectués par utilisation de dicyclohexylcarbodiimide/hydroxybenzotriazole dans la N-méthyl- pyrrolidone. Le peptide final est obtenu après clivage et déprotection des chaînes latérales par l'acide trifluoroacétique. La solution est évaporée sous vide, le peptide précipité par l'ether et purifié par HPLC sur une colonne Vydac C18. Les peptides sont analysés par spectrométrie de masse et RMN 1H (400 ou 600 MHz). Composé 1s Ac-Ile-Ile-Pya-pNF-Asn-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro- Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-COOH (SEQ ID N 2) MH+(exp) : 2101.1 ;MH+(theo): 2102.7 Composé 2s Ac-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Pya-pNF-Gly-Leu-Met- NH2 (SEQ ID N 3) MH+(exp) : 1558.8 ; MH+(theo) : 1559. 7 Ces peptides peuvent se conserver après lyophilisation sous forme de poudre, à l'abri de la lumière et à 4 C ou à -20 C pendant plus de 6 mois sans altération. De même les solutions mères des substrats (10-3-10- 4 M) peuvent être conservées à 4 C et à l'abri de la lumière durant plusieurs semaines. EXEMPLE 2 2.1 : Matériels et méthodes. On peut utiliser diverses préparations contenant l'ECE comme par exemple l'ECE-1 c humaine recombinante exprimée dans des cellules Cos-1 (Shimada et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 18275-18278) ou CHO (Xu et al. Cell (1994) 78, 473-485). Dans tous les cas, la présence de l'enzyme est testée par Western blot à l'aide d'un anticorps et sa concentration évaluée par comparaison avec l'enzyme purifiée. L'activité ECE est déterminée dans des plaques à 96 puits généralement dans les conditions suivantes : 100 l de tampon 50 mM Tris-maleate, pH 6. 5, 20 M ou 5 M de peptide fluorescent 1s ou 2s et 10 l d'une solution de ECE diluée en fonction de sa pureté et de manière à ce que le clivage du substrat fluorescent reste inférieur à 5%. On incube de 20 minutes à 1 h selon le substrat utilisé de 20 C à 37 C, en présence ou en absence d'un inhibiteur potentiel en concentrations fixes (par exemple 5x10-6 M et 10-6 M) ou à des concentrations croissantes de 10-11 à 10-5 M pour déterminer un Kl. La réaction est stoppée de diverses manières, par exemple chauffage à 90 C, refroidissement brutal à 4 C, en addition d'un solvant organique comme le dioxane à 20% du volume final puis la lecture est effectuée à l'aide d'un fluorimètre (#ex = 340 nm ; #em = 400 nm) éventuellement couplé au système d'analyse robotisé. L'utilisation d'un fluorimètre à réseau accroît encore considérablement la sensibilité du dosage par lecture de la fluorescence à 377 nm. Les contrôles sont effectués en présence de tous les réactifs mais sans l'ECE ou avec l'ECE préalablement inactivée par chauffage à 90 C, 5 minutes. Les Km des substrats (constante d'affinité de l'enzyme pour un substrat) calculés par utilisation du programme ENZFITTER sont : 1s, Km = 22.1 ~ 0.9 M ; 2s, Km=20.5 M. Les valeurs de Kl des inhibiteurs peuvent être déterminées automatiquement à partir des pourcentages de dégradation à différentes concentrations et comparaison avec une gamme étalon. La fluorescence observée fournit directement après linéarisation, une valeur de IC50, elle- même transformée en Kl à partir de la relation de Cheng-Prussof, Kl = IC5o/1 + ([S]/Km), avec [S] étant la concentration en substrat. 2.2: Dosage de l'activité ECE vis-à-vis des peptides fluorescents 1s et 2s en absence d'inhibiteurs. La fluorescence des substrats 1 s et 2s ainsi que celle de leurs métabolites a été appréciée en absence d'inhibiteurs. Le protocole retenu est celui décrit précédemment. Les figures 3a et 3b rendent compte respectivement des spectres d'émission de fluorescence du peptide 1 s et de son métabolite 1 m et du peptide 2s et de son métabolite 2 m. En ce qui concerne les produits formés, leur analyse a été effectuée pour s'assurer de la sélectivité du substrat par HPLC sur colonne nucléosyl C18, 7 m/300 A (4. 6 x 70 mm) en utilisant un tampon B (0.038% de TFA dans CH3CN/H20, 9/1 en vol.) et un gradient de 40-47% de tampon B en 10 minutes (débit 1 ml/min). Dans tous les cas, un seul site de clivage au niveau du dipeptide L. PyA-Lp.NF a été observé, générant uniquement deux métabolites. EXEMPLE 3 En reproduisant le protocole décrit en exemple 2, il a été procédé à l'évaluation du comportement inhibiteur de plusieurs composés. Les composés testés sont : Témoins négatifs R = Rétrothiorphan T = Thiorphan C = Captopril L = Lysinopril Témoin positif P = Phosphoramidon Les conditions spécifiques retenues pour les essais figurent ci- après : Blanc * Témoin Test Tris maléate pH 6. 5 90 l 80 l 70 l Inhibiteur 10 l Enzyme 10 l 10 l * L'utilisation d'enzyme, dénaturée par HCI 6N ou par chauffage à 80 C, 10 minutes, ne modifie pas la fluorescence résiduelle du blanc. On préincube 10 minutes à 37 C. Le substrat ECE est ensuite rajouté à raison de 10 C. L'ensemble est incubé entre 20 minutes et 1 heure à 37 C et la réaction ensuite stoppée soit par refroidissement ou ajout de dioxane (20 l). La lecture sur cytofluor est réalisée à 4 C avec les spécificités suivantes : Excitation 340 nm, Emission 400 nm et avec un Gain 85. Les essais sont réalisés sur une microplaque de 96 puits. Le tableau 1 rend compte pour chaque puit de la nature du composé testé ainsi que de sa concentration. Les composés ont été testés à deux concentrations. TABLEAU # 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Blanc Témoin R R T T 10 6 M 5x10-6 M 10-6 M 5x10-6 M C C L L P P 10 6 M 5x10-6 M 10 6 M 5x106 M 5x10-6 M 10 6 M EXEMPLE 4 En tableau Il figure l'intensité de fluorescence mesurée pour chaque puits. Une valeur de fluorescence faible, témoigne d'une activité inhibitrice forte du composé testé. Le comportement inhibiteur du composé P est parfaitement vérifié. TABLEAU Il 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 67 68 1081 1094 1124 1106 1043 1077 1124 1127 1109 1121 1086 1089 1128 1121 1117 1093 1095 1119 140 133 455 459 REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un reste PyA-(Z)x-pNF, avec Z représentant un enchaînement d'acides aminés de série L ou D, naturels ou non et x représentant 1 ou 0, dans un substrat à des fins de détection, identification et/ou dosage par fluorescence de composés susceptibles de cliver la ou une liaison établie entre PyA et pNF et/ou de composés à activité inhibitrice ou activatrice vis-à-vis de composés connus et capables de cliver cette liaison. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le substrat est de nature peptidique ou pseudopeptidique et en ce que le composé susceptible ou capable de cliver le reste PyA- (Z)x-pNF une enzyme. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le substrat est une séquence peptidique reconnue par l'enzyme de conversion de l'endothéline (ECE) et en ce que l'on détecte, identifie et/ou dose l'ECE ou des inhibiteurs de l'ECE. 4. Utilisation selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que PyA-(Z)x-pNF est un reste peptidyle dans lequel x est égal à 1 et Z représente un groupement pouvant comprendre jusqu'à 4 acides aminés, identiques ou différents et possédant une longueur compatible avec la manifestation de l'effet répresseur de pNF sur PyA. 5. Utilisation selon l'une des revendications 1,2 ou 3, caractérisée en ce que dans le reste peptidyle PyA-(Z)x-pNF, x représente 0. 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le dipeptide PyA-pNF est présent dans la séquence peptidique reconnue par l'ECE au niveau du site de clivage naturel auquel il se substitue. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que la liaison substituée est la liaison Trp21-Val22 de la big-endothéline-1 ou big- endothéline-2. 8. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que la liaison substituée est la liaison Trp21-Ile22 de la big-endothéline 3. 9. Composé de formule (I) : Ac(X1)n PyA-(Z)x-pNE-(X'1)m-COR (I) dans laquelle : - X1 et X'1 représentent indépendamment l'un de l'autre un acide aminé, - Z représente un enchaînement d'acides aminés de série L ou D, naturels ou non et x représente 1 ou 0, - R représente un groupement OH ou NH2, - Ac un groupement acyle et - n un entier variant de 2 à 6 et m de 3 à 13. 10. Composé selon la revendication 9, caractérisé en ce que x est égal à 0. 11. Composé selon la revendication 9 ou 10, de formule (la) : Ac- (Z1 )- (Z2)-lle-lle-PyA-pNF-AsN- Thr-Pro-Glu- His- Val- Val-Pro- Tyr-Gly-Leu-Gly- Ser- (Z4)-(Z5)-(Z6)-COOH (la) (SEQ ID N 1) dans laquelle Z1, Z2, Z4, Z5 et Z6, identiques ou différents, représentent un acide aminé. 12. Composé selon la revendication 11, caractérisé en ce que - Z1 et Z2 sont tels que : soit Z1 et Z2 représentent une simple liaison, soit Z1 représente une simple liaison et Z2 représente l'acide aminé Asp, soit Z1 et Z2 représentent respectivement les acides aminés Leu et Asp, - Z4, Z5 et Z6 sont tels que : soit Z4, Z5 et Z6 représentent une simple liaison, soit Z5 et Z6 représentent une simple liaison et Z4 représente l'acide aminé Pro, soit Z6 représente une simple liaison et Z4 et Z5 représentent respectivement les acides aminés Pro et Arg, soit Z4, Z5 et Z6 représentent respectivement les acides aminés Pro, Arg et Ser. 13. Composé selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé en ce qu'il s'agit de : Ac-lle-lle-Pya-pNF-Asn- Thr- Pro-Glu-His- Val- Val-Pro- Tyr-Gly- Leu-Gly-Ser-COOH (SEQ ID N 2) ou Ac-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Pya-pNF-Gly-Leu-Met-NHZ (SEQ ID N 3) 14. Utilisation d'un composé tel que défini en revendications 9 à 13 pour la détection, l'identification et/ou le dosage de l'ECE ou d'un composé capable d'inhiber ou d'activer l'enzyme de conversion de l'endothéline. 15. Utilisation selon la revendication 14 pour la détection, l'identification et/ou le dosage d'un composé capable d'inhiber l'enzyme de conversion de l'endothéline. 16. Procédé pour détecter, identifier et/ou doser un composé capable d'inhiber ou d'activer l'enzyme de conversion de l'endothéline, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en présence en solution d'un composé de formule générale I, tel que défini en revendications 9 à 13 et reconnue par l'enzyme de conversion de l'endothéline avec ladite enzyme de conversion de l'endothéline et au moins un composé susceptible d'inhiber ou activer l'ECE, - la mesure de la fluorescence émise en présence, et le cas échéant en absence, du composé à détecter, identifier et/ou doser et - en ce que l'absence ou une diminution de fluorescence indique la présence d'un composé inhibiteur de l'enzyme de conversion de l'endothéline. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le composé de formule générale 1 est: Ac-Ile-Ile-Pya-pNF-Asn-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-COOH ou Ac-Arg- Pro- Lys- Pro-G ln-Gln- Pya - pNF -Gly- Leu-Met- N H2