Brevet FR2801792A1 — publié le 20010608

Un nouveau médicament, le dihydromikanolide. son obtention par extraction de la plante Mikania micrantha et son utilisation comme agent anti-prolifératif La présente invention concerne, en tant que médicament et notamment comme agent anti-prolifératif, le dihydromikanolide. Elle a aussi pour objet son obtention par extraction de la plante Mikania micrantha par un procédé décrit ci-après. Depuis longtemps, les plantes sont une source de produits pharmaceutiques et d'ingrédients de la médicine traditionnelle (Phillipson, J.D., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. (1994), 88 Suppl. 1, S17-S19). Les médicaments formés par des produits naturels ou leurs analogues synthétiques jouent un rôle très important. Par exemple, en oncologie, l'on trouve des produits comme le taxol (Paclitaxel#), la vincristine (Oncovin), la vinorelbine (Navelbine), le téniposide (Vumon), et plusieurs analogues de la camptothécine solubles dans l'eau (Pezzuto, J. M. Biochem. Pharmacol. (1997), 53,121-133). D'autres produits issus de plantes sont par ailleurs à l'étude pour la prévention de la resténose. Dans le domaine du traitement du cancer, par exemple, la camptothécine (CPT) est un alkaloïde pentacyclique isolé du bois de Camptotheca acuminata (Wall, M.E., Med. Res. Rev. (1998), 18, 299-314). Initialement, la CPT a été identifiée comme un inhibiteur de la prolifération tumorale dans des modèles de cellules humaines. Par la suite, le mécanisme d'action de la CPT a été identifié comme un poison de l'enzyme topoisomérase 1 impliquée dans la réplication de l'ADN. Un nombre croissant d'analogues de la CPT (topotécan, CPT-11, BN-80915) sont utilisés en traitement anticancéreux chez l'homme (Lavergne, O. et coll., J. Med. Chem. (1998), 41, 5410-5419). Un autre exemple est le taxol, un alkaloïde terpénique isolé de Taxus brevifolia. Le taxol est un cytotoxique puissant qui inhibe la tubuline, une protéine impliquée dans la mitose. C'est un produit particulièrement efficace dans les cancers de l'ovaire. Par ailleurs, les alkaloïdes vinca ont d'abord été extraits de Cantharanthus roseus . Ils étaient d'abord utilisés ethnobotaniquement pour d'autres indications que le traitement du cancer. En ce qui concerne la prévention de la resténose, des études indiquent qu'elle pourrait être obtenue grâce à une protéine issue de Saponaria officinalis, la saponine, recombinée au facteur de croissance du fibroblaste (FGF pour Fibroblast Growth Factor). Ce dernier permettrait le ciblage des cellules vasculaires du fait de son affinité pour le récepteur à FGF (Lin PH et coll., Atherosclerosis (April 1998), 137 (2), La méthode pour découvrir de tels produits est un fractionnement des molécules de l'extrait de plante suivi de l'évaluation de leurs activités biologiques. Mais en regard du nombre de genres, d'espèces et de variétés de plantes, et de la quantité impressionnante de molécules issues de ces plantes, l'identification d'une molécule et de son activité biologique reste une entreprise très difficile à mener. Mikania micrantha est une herbe pandémique dans les régions tropicales. Elle prolifère de façon extrêmement rapide, à tel point qu'elle est surnommée "a-mile-a-minute", c'est-àdire un mile par minute. Mikania scandens et cordata sont souvent confondues avec elle. Ces trois espèces contiennent notamment du mikanolide (1), du dihydromikanolide (II), du scandénolide (III) et du dihydroscandénolide (IV). Structures du mikanolide. du dihvdromikanolide. du scandénolide et du dihydroscandénolide L'extraction du mikanolide, du dihydromikanolide, du scandénolide et du dihydroscandénolide à partir de Mikania scandens, Mikania cordata et Mikania micrantha a été décrite dans les références suivantes respectivement : Herz, Tetrahedron Lett. (1967), 32, 3111-15 ; Kiang, Phytochemistry (1968), 7(6), 1035-7 ; et Cuenca, J. Nat. Prod. (1988), 51 (3), Les solvants utilisés comprennent le chloroforme et le diéthyléther qui ne sont pas utilisables de façon industrielle du fait de leur toxicité ou de leur inflammabilité. Ethnobotaniquement, Mikania scandens et cordata ont été et sont encore utilisées par la médicine traditionnelle comme agent anti-asthmatique, analgésique, anti-rhumatismal, anti-inflammatoire, anti-cancéreux, fébrifuge et vermifuge en Amérique centrale où son nom commun est le guaco. C'est seulement dans la dernière décennie que certaines de ces propriétés ont été étudiées scientifiquement, en particulier les extraits de Mikania cordata dans le domaine de l'inflammation. Récemment, la demanderesse a testé l'activité anti-proliférative et trouvé que, de façon surprenante, un extrait enrichi en dihydromikanolide ou ce dernier pur présentent une puissante activité. Selon l'invention, ledit extrait, obtenu à partir de feuilles de Mikania micrantha, Mikania scandens et Mikania cordata, comporte plus de 50%, et de préférence plus de 60 % de mikanolide et dihydromikanolide. De préférence, ledit extrait comporte moins de 10%, et plus préférentiellement moins de 5%, de scandénolide et de dihydroscandénolide. Par ailleurs, on préférera également les extraits comportant plus de 20% de dihydromikanolide. Ledit extrait peut être préparé selon la méthode d'extraction décrite ci-après à partir de Mikania micrantha, les espècesMikania scandens et Mikania cordata , n'étant toutefois pas éliminées. L'invention concerne donc tout d'abord un procédé de préparation d'un extrait selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes successives suivantes : - broyage et séchage de feuilles de Mikania micrantha, Mikania scandens et Mikania cordata ; - addition, aux feuilles broyées de Mikania micrantha, Mikania scandens et Mikania cordata, d'un solvant choisi parmi le toluène, l'acétate d'éthyle, des mélanges de toluène et d'acétate d'éthyle, des mélanges de toluène et d'acétone, des mélanges d'acétate d'éthyle et d'heptane, et des mélanges d'heptane et d'acétone dans des proportions de 7:3 à 3:7 ; - filtration et récupération du filtrat ; - concentration de l'extrait de la solution d'extrait primaire pour obtenir une concentration de 2,5 à 10% en extrait sec ; - partition de l'extrait concentré obtenu à l'étape précédente entre le solvant d'extraction et un mélange comprenant de 10% à 50% de méthanol ou d'éthanol dans l'eau ; - lavage de la phase alcool-eau avec du n-hexane ou de l'heptane ; - élimination de l'alcool de la phase alcool-eau ; - extraction de la phase aqueuse obtenue avec de l'acétate d'éthyle ; - séchage de la phase acétate d'éthyle avec un agent desséchant ; - évaporation des solvants et récupération de l'extrait sec ; - purification de l'extrait sec obtenu par une méthode de séparation physico-chimique ; et - obtention, après séchage, d'un extrait sec selon l'invention. Selon l'invention, la méthode de séparation physico-chimique peut être, par exemple, une filtration sur gel de silice, ou bien encore, selon une variante préférée, une cristallisation dans le méthanol, l'éthanol ou l'acétone. Si l'on choisit la filtration sur gel de silice, les éluants employés seront de préférence des mélanges heptane-acétate d'éthyle de proportions comprises entre 9:1 et 1:1. Dans le cas où l'on opte pour la cristallisation, celle-ci sera de préférence effectuée à une température comprise entre -10 et 5 C pendant une durée de préférence comprise entre 2 et 16 heures. Par ailleurs, selon une variante préférée du procédé ci-dessus, la partition de l'extrait concentré est réalisée à l'aide d'un mélange comprenant de 25 à 30% de méthanol dans l'eau. De préférence, la phase aqueuse inférieure sera chauffée pour faciliter la séparation de phases, par exemple à une température de 30 à 50 C. L'extrait sec tel qu'obtenu par le procédé ci-dessus peut être enrichi en dihydromikanolide par conversion du mikanolide en dihydromikanolide par hydrogénation catalytique. Par la suite, une re-cristallisation permettra d'obtenir le composé pur. L'invention a donc également pour objet un procédé de préparation d'un extrait enrichi en dihydromikanolide caractérisé en ce qu'il consiste en l'hydrogénation de l'extrait sec précédemment décrit, dissous dans de l'acétate d'éthyle, à une température comprise entre 10 et 35 C, en présence d'un catalyseur d'hydrogénation sous une pression de 1 à 2 atmosphères d'hydrogène pendant une durée de préférence comprise entre 4 et 16 heures. De préférence, le catalyseur d'hydrogénation sera Pd/CaC03. L'invention concerne de plus un extrait sec fortement enrichi en dihydromikanolide tel qu'obtenu par le procédé d'hydrogénation précédemment décrit suivi d'une évaporation des solvants de réaction après l'élimination du catalyseur par filtration, ledit extrait sec étant caractérisé en ce qu'il comprend au moins 50% de dihydromikanolide, et de préférence au moins 92% de dihydromikanolide (qualité pharmaceutique). Selon l'invention, après hydrogénation, on peut obtenir du dihydromikanolide directement par ajout d'un n-alcane liquide à la solution dans l'acétate d'éthyle de l'extrait enrichi en dihydromikanolide et récupération dudit dihydromikanolide par filtration. De préférence, le n-alcane employé pour obtenir la cristallisation sera du n-hexane ou du n-heptane, et plus préférentiellement du n-heptane. Le procédé décrit ci-dessus présente l'avantage de pouvoir obtenir du dihydromikanolide à un degré de pureté supérieur à 92%, sans avoir besoin de recourir nécessairement à une séparation de type chromatographique. Les différents procédés décrits ci-dessus ainsi que d'autres variantes possibles seront décrits en détail dans la partie intitulée "Préparation des produits de l'invention". La demanderesse vient donc de trouver que le dihydromikanolide, ainsi que les différents extraits de l'invention, possède des propriétés pharmacologiques intéressantes, en particulier en tant qu'agent anti-prolifératif, et notamment en tant qu'agent anti-cancéreux. Ces propriétés sont illustrées dans la partie intitulée "Etude pharmacologique des produits de l'invention". La présente invention a donc également pour objet, en tant que médicament, un extrait enrichi en dihydromikanolide tel que décrit précédemment ou le dihydromikanolide. Elle a aussi pour objet l'utilisation de ces derniers pour préparer un médicament destiné à traiter les maladies prolifératives, et en particulier le cancer. Elle a de plus pour objet une composition pharmaceutique comprenant un extrait enrichi en dihydromikanolide tel que décrit précédemment ou du dihydromikanolide en tant que principe actif, avec éventuellement un ou des excipients pharmaceutiquement acceptables. La composition pharmaceutique selon l'invention peut être sous forme d'un solide, par exemple des poudres, des granules, des comprimés, des gélules, des liposomes ou des suppositoires. Les supports solides appropriés peuvent être, par exemple, le phosphate de calcium, le stéarate de magnésium, le talc, les sucres, le lactose, la dextrine, l'amidon, la gélatine, la cellulose, la cellulose de méthyle, la cellulose carboxyméthyle de sodium, la polyvinylpyrrolidine et la cire. Les compositions pharmaceutiques contenant du dihydromikanolide peuvent aussi se présenter sous forme liquide, par exemple, des solutions, des émulsions, des suspensions ou des sirops. Les supports liquides appropriés peuvent être, par exemple, l'eau, les solvants organiques tels que le glycérol ou les glycols, de même que leurs mélanges, dans des proportions variées, dans l'eau. L'administration d'un médicament selon l'invention pourra se faire par voie topique, orale, parentérale, par injection intramusculaire, etc. La dose d'administration envisagée pour un médicament selon l'invention est comprise entre 0,1mg à 10 g suivant le type de composé actif utilisé. Préparation des produits de l'invention Les solvants suivants peuvent être employés pour l'extraction primaire : - groupe 1 : le toluène, l'acétate d'éthyle, des mélanges de toluène et d'acétate d'éthyle, des mélanges de toluène et d'acétone, des mélanges d'acétate d'éthyle et d'heptane, et des mélanges d'heptane et d'acétone dans des proportions de 7 :3 3 :7 de préférence en mélange 1:11 (proportions exprimées en volume pour volume) ; - groupe II : l'acétone, l'éthanol et le méthanol ; - groupe III : des mélanges d'acétone et d'eau, d'éthanol et d'eau ou de méthanol et d'eau dans des proportions de 9:1 à 1:1(proportions exprimées en volume pour volume, comme pour toute la suite du présent texte, sauf indication contraire). De préférence, le solvant employé dans la première phase d'extraction sera l'acétate d'éthyle. Selon l'invention, l'extrait primaire est partitionné dans un mélange comprenant de 10% à 50% de méthanol ou d'éthanol dans l'eau, et de préférence dans un mélange comprenant de 25% à 40% de méthanol dans l'eau à une température de préférence comprise entre 15 et 50 C. De préférence, on chauffera la phase aqueuse inférieure, par exemple à une température comprise entre 30 et 50 C, ceci afin d'obtenir une séparation de phases plus nette. Dans le cas où l'extraction primaire est effectuée à l'aide d'un solvant ou d'un mélange de solvants du groupe I, la partition est précédée d'une concentration de la solution d'extrait primaire pour obtenir une concentration de 2,5 à 10% en extrait sec. Dans le cas où l'extraction primaire est effectuée à l'aide d'un solvant du groupe II, on procède, préalablement à la partition de l'extrait primaire, à une concentration de la solution d'extrait primaire pour obtenir une concentration d'environ 50% en extrait sec suivie d'une dissolution de l'extrait concentré pour obtenir un extrait dilué contenant de 2,5 à 10% d'extrait sec, ladite dissolution étant effectuée à l'aide d'un solvant ou d'un mélange de solvants du groupe I, et de préférence dans l'acétate d'éthyle. Dans le cas où l'extraction primaire est effectuée à l'aide d'un solvant du groupe III, on procède, préalablement à la partition de l'extrait primaire, à une évaporation de la solution d'extrait primaire pour obtenir une concentration de 5 à 25% en extrait sec, ceci afin d'éliminer les solvants miscibles avec l'eau. On extrait alors à l'aide d'un solvant ou d'un mélange de solvants du groupe I, de préférence de l'acétate d'éthyle. Une fois effectuée la partition de l'extrait primaire (lequel a éventuellement subi les opérations préalables décrites ci-dessus), la phase alcool-eau est lavée avec du n-hexane ou de l'heptane, et de préférence avec de l'heptane, de sorte à éliminer les chlorophylles, stérols et autres lipides végétaux. L'alcool de la phase alcool-eau est éliminé par évaporation et une nouvelle extraction de la phase aqueuse résultante est effectuée à l'aide d'acétate d'éthyle. La phase acétate d'éthyle est ensuite séchée avec un agent desséchant tel que MgS04 ou Na2SO4 anhydre, filtrée et évaporée à sec. L'extrait sec résultant de l'étape précédente peut être purifié par filtration, par exemple par filtration sur gel de silice en utilisant une charge comprise de 2 à 20%, de préférence d'environ 5%, en éluant avec des mélanges heptane-acétate d'éthyle de proportions comprises entre 8 :2 et1:1, de préférence 7 :3, avec des mélanges toluène-acétone de proportions comprises entre 9:1 et 6 :4, de préférence 7 :3. filtrat est concentré à sec pour obtenir, selon l'invention, un extrait enrichi en mikanolide et dihydromikanolide. Alternativement, l'extrait sec peut être purifié par cristallisation dans le méthanol, l'éthanol ou l'acétone, par exemple dans une une solution méthanolique comprenant une concentration en extrait sec de l'ordre de 10%, le mélange étant laissé reposer pendant une durée de préférence comprise entre 12 et 16 heures à une température de préférence comprise entre-10 et 5 C. Après filtration (ou centrifugation), rinçage des cristaux avec un peu de méthanol et séchage, on obtient un extrait enrichi en mikanolide et dihydromikanolide. Afin de convertir le mikanolide en dihydromikanolide, une étape d'hydrogénation peut être effectuée, par exemple en dissolvant l'extrait obtenu précédemment dans de l'acétate d'éthyle à une température de préférence comprise entre 10 et 35 C en présence d'un catalyseur tel que Pd/CaC03 à 5% sous une pression de 1 à 2 atmosphères d'hydrogène. Cette étape d'hydrogénation présente par ailleurs l'avantage de faciliter la purification du mélange constitué par l'extrait enrichi en mikanolide et dihydromikanolide. La cristallisation du dihydromikanolide à partir de la solution concentrée dans l'acétate d'éthyle est alors réalisée par addition d'un n-alcane liquide, par exemple de n-heptane ou de n-hexane, et de préférence de n-heptane. On obtient alors du dihydromikanolide à un degré de pureté au moins égal à 92%. A moins qu'ils ne soient définis d'une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention. De même, toutes les publications, demandes de brevets, tous les brevets et toutes autres références mentionnées ici sont incorporées par référence. Les exemples suivants sont présentés pour illustrer les procédures ci-dessus et ne doivent en aucun cas être considérés comme une limite à la portée de l'invention. EXEMPLES Exemple 1: 100 g de feuilles sèches (contenant moins de 10% d'humidité) de Mikania micrantha (avec leurs tiges), récoltées entre mai et juillet dans la région autour de Sungei Ara, Penang (Malaisie) sont broyées dans un moulin pour donner des particules de taille inférieure à 4 mm. Après addition de 1 litre d'acétate d'éthyle, le mélange est agité vigoureusement pendant 30 minutes à une température de 55 à 60 C. Le résidu solide est séparé par filtration et soumis à une seconde extraction dans les mêmes conditions. Les extraits des première et deuxième étapes d'extraction sont combinés. L'extrait est concentré sous pression réduite pour obtenir une concentration en contenu solide d'environ 5%, ce qui correspond à un volume d'environ 110 ml. On ajoute alors 40 ml de n-heptane. 125 ml d'un mélange méthanol-eau 1 :2 ajouté à l'extrait et agité vigoureusement dans une ampoule à décanter puis laissé décanter. La phase aqueuse inférieure est chauffée à environ 40-50 C pour casser les émulsions éventuelles et faciliter la séparation de phases. La phase eau-méthanol est évacuée par le bas. La partition est répétée encore deux fois en utilisant à chaque fois 50 ml d'un mélange méthanol-eau 1:3. 20 ml de n-heptane sont alors ajoutés à la solution méthanol-eau. Après une agitation vigoureuse dans une ampoule à décanter, on laisse séparer les deux phases. La solution méthanol-eau dégraissée est ensuite évacuée par le bas. La solution méthanol-eau est alors concentrée sous pression réduite pour éliminer le méthanol et obtenir une suspension aqueuse. 100 ml d'acétate d'éthyle et 15 g de chlorure de sodium sont ajoutés à la suspension aqueuse. Le mélange est agité vigoureusement dans une ampoule à décanter puis laissé décanter. L'extraction liquide-liquide est répétée une fois avec 50 ml d'acétate d'éthyle. Les extraits acétate d'éthyle combinés sont séchés par addition d'environ 30 g MgS04, le mélange étant agité pendant environ 10-20 minutes avant d'être filtré (MgS04 étant rincé avec 2 fois 25 ml d'acétate d'éthyle). Le filtrat et l'acétate d'éthyle ayant servi au rinçage, combinés, sont ensuite évaporés à sec sous pression réduite. L'extrait solide obtenu est ensuite dissous dans 5 ml MeOH et laissé cristalliser à 4 C pendant 16 heures. On filtre alors sur fritté, les cristaux récupérés étant rincés avec 2 ml MeOH à 4 C. Après séchage dans un four à vide, on obtient 481,2 mg d'extrait sec. L'analyse par HPLC de l'extrait sec obtenu donne les résultats suivants : Composé Proportion en poids Mikanolide 68,0 % Dihydromikanolide 25 % Scandénolide 5 % Exemple 2: Le même processus que celui de l'exemple 1 est utilisé au début. Par contre, au lieu d'ajouter 5 ml MeOH après le séchage avec MgS04 et d'effectuer une cristallisation, on ajoute 2,8 g de célite et évapore à sec les solvants. On filtre alors sur un lit de silice (12 g Si02 35-70 m). On fait d'abord passer 4 fois 26 ml (soit quatre fois le volume de colonne) de mélange heptane/ acétate d'éthyle 2 :8 fractions correspondantes étant éliminées), puis 14 fois 26 ml de mélange heptane/ acétate d'éthyle 6 :4 fractions correspondantes étant récupérées). Les fractions récupérées sont combinées et évaporées à sec pour obtenir l'extrait sec final. Exemple 3: 330 mg d'extrait sec tel qu'obtenu dans l'exemple 1 sont dissous dans 80 ml d'acétate d'éthyle et la solution, à laquelle sont ajoutés 248 mg de Pd/CaC03 à 5%, est placée sous flux d'hydrogène (pression comprise entre 1 et 2 atmosphères). L'agitation et le flux d'hydrogène sont maintenus pendant la nuit et l'achèvement de la réaction contrôlé par chromatographie HPLC. Une fois la réaction terminée, on ajoute 1 g de célite et on agite pendant 10 minutes. On ajoute ensuite 5 g de MgS04 anhydre et on élimine les solides par filtration sur célite. La célite est rincée avec 2 fois 10 ml d'acétate d'éthyle, puis les solvants éliminés par évaporation à sec. On ajoute 3 ml d'acétone puis 3 ml d'heptane au solide récupéré. On évapore partiellement les solvants au rotavapeur à 50 C puis on refroidit à 0 C au moyen d'un bain de glace. Après filtration, on rince le solide avec 2 fois 1 ml d'un mélange 50/50 acétone/heptane. On évapore alors à sec et récupère 214 mg de dihydromikanolide. RMN 1H (DMSO d6,400 MHz, #) : 0,96 (s, 3H) ; 1,25-1,27 (d, 3H) ; 1,84-1,89 (m, 1H) ; 2,04-2,10 (m, 1H) ; 2,49-2,50 (t, 1H) ; 2,93-2,98 (m, 1H) ; 3,19 (s, 1H) ; 3,38-3,39 (d, 1H) ; 3,98-3,99 (d, 1H) ; 4,62-4,68 (m, 1H) ; 5,42-5,43 (d, 1H) ; 7,61-7,62 (d, 1H). RMN 13C (DMSO d6, 8) : 13,3 ; 20,9 ; 39,7 ; 41,1 ; 42,3 ; 50,3 ; 52,3 ; 54,9 ; 57,5 ; 76,7 ; 81,8 ; 128,7 ; 149,9 ; 171,1 ; 176,1. ETUDE PHARMACOLOGIQUE DES PRODUITS DE L'INVENTION A titre d'exemple, on étudiera l'effet d'un traitement sur deux lignées de cellules humaines Mia-Paca2 et DU145 par les produits des exemples 1 et 2 décrits précédemment. 1) Procédures Lignée cellulaire Les lignées cellulaires DU 145 (cellules humaines de cancer de la prostate) et Mia-PaCa2 (cellules humaines de cancer du pancréas) ont été acquises auprès de American Tissue Culture Collection (Rockville, Maryland, USA). Tests de prolifération cellulaire Les cellules placées dans 80 l de milieu Eagle modifié de Dulbecco (Gibco-Brl, Cergy-Pontoise, France) complété avec 10% de sérum foetal de veau inactivé par chauffage (Gibco-Brl, Cergy-Pontoise, France), 50000 unités/1 de pénicilline et 50 mg/1 streptomycine (Gibco-Brl, Cergy-Pontoise, France), et 2 mM de glutamine (Gibco-Brl, Cergy-Pontoise, France) ont été ensemencées sur une plaque de 96 puits au jour 0. Les cellules ont été traitées au jour 1 pendant 96 heures avec des concentrations croissantes de chacun des composés à tester jusqu'à 50 g/ml. A la fin de cette période, la quantification de la prolifération cellulaire est évaluée par test colorimétrique en se basant sur le clivage du sel de tétrazolium WST1 par les déhydrogénases mitochondriales dans les cellules viables conduisant à la formation de formazan (Boehringer Mannheim, Meylan, France). Ces tests sont effectués en double avec 8 déterminations par concentration testée. Pour chaque composé à tester, les valeurs incluses dans la partie linéaire de la sigmoïde ont été retenues pour une analyse en régression linéaire et utilisées pour estimer la concentration inhibitrice CI50. Les produits sont solubilisés dans le diméthylsulfoxide (DMSO) à 10-2 M et utilisés en culture avec 0,5% DMSO en final. 2) Résultats : On trouvera dans le tableau ci-dessous les valeurs in vitro des activités d'inhibition de la prolifération des composés par rapport à des cellules tumorales humaines DU 145 et Mia-Paca2. Concentration inhibitrice CI50 Composé ( M) Mia-Paca2 DU-145 Exemple 1 1,6 4,6 Exemple 2 1,3 4,3 Inhibition de la prolifération des cellules tumorales humaines traitées par les composés des exemples 1 et 2. Revendications 1. Extrait sec de feuilles de Mikania micrantha, Mikania scandens et Mikania cordata, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 50% en poids de mikanolide et de dihydromikanolide. 2. Extrait selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient moins de 5% en poids de scandénolide et dihydroscandénolide. 3. Extrait selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 20 % de dihydromikanolide. 4. Procédé d'obtention d'un extrait selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes successives suivantes : - broyage et séchage de feuilles de Mikania micrantha, Mikania scandens et Mikania cordata ; - addition, aux feuilles broyées de Mikania micrantha, Mikania scandens et Mikania cordata, d'un solvant choisi parmi le toluène, l'acétate d'éthyle, des mélanges de toluène et d'acétate d'éthyle, des mélanges de toluène et d'acétone, des mélanges d'acétate d'éthyle et d'heptane, et des mélanges d'heptane et d'acétone dans des proportions de 7:3 à 3:7 ; - filtration et récupération du filtrat ; - concentration de l'extrait de la solution d'extrait primaire pour obtenir une concentration de 2,5 à 10% en extrait sec ; - partition de l'extrait concentré obtenu à l'étape précédente entre le solvant d'extraction et un mélange comprenant de 10% à 50% de méthanol ou d'éthanol dans l'eau ; - lavage de la phase alcool-eau avec du n-hexane ou de l'heptane ; - élimination de l'alcool de la phase alcool-eau ; - extraction de la phase aqueuse obtenue avec de l'acétate d'éthyle ; - séchage de la phase acétate d'éthyle avec un agent desséchant ; - évaporation des solvants et récupération de l'extrait sec ; - purification de l'extrait sec obtenu par une méthode de séparation physico-chimique ; et - obtention, après élimination des solvants, d'un extrait sec selon l'une des revendications 1 à 3. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce la partition de l'extrait concentré est réalisée à l'aide d'un mélange comprenant de 25 à 30% de méthanol dans l'eau. 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que la méthode de séparation physico-chimique est une cristallisation dans le méthanol, l'éthanol ou l'acétone. 7. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que la méthode de séparation physico-chimique est une filtration sur gel de silice. 8. Procédé de préparation, à partir d'un extrait selon l'une des revendications 1 à 3, d'un extrait enrichi en dihydromikanolide, caractérisé en ce qu'il consiste en l'hydrogénation dudit extrait, dissous dans de l'acétate d'éthyle, à une température comprise entre 10 et 35 C, en présence d'un catalyseur d'hydrogénation sous une pression de 1 à 2 atmosphères d'hydrogène. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le catalyseur est Pd/CaC03. 10. Extrait sec enrichi en dihydromikanolide tel qu'obtenu selon un procédé selon l'une des revendications 8 ou 9 suivi d'une évaporation des solvants et de l'élimination du catalyseur par filtration, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 50% de dihydromikanolide. 11. Procédé de préparation du dihydromikanolide à partir d'un extrait selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes successives suivantes : - hydrogénation dudit extrait au moyen d'un procédé selon la revendication 8 ou 9 ; - cristallisation du dihydromikanolide par ajout d'un n-alcane liquide à la solution dans l'acétate d'éthyle de l'extrait enrichi en dihydromikanolide et récupération dudit dihydromikanolide par filtration. 12. En tant que médicament, un extrait selon l'une des revendications 1 à 3, un extrait selon la revendication 10 ou le dihydromikanolide. 13. Composition pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif, un extrait selon l'une des revendications 1 à 3, d'un extrait selon la revendication 10 ou du dihydromikanolide, avec éventuellement un ou des excipients pharmaceutiquement acceptables. 14. Utilisation d'un extrait selon l'une des revendications 1 à 3, d'un extrait selon la revendication 10 ou de dihydromikanolide pour préparer un médicament destiné à traiter les maladies prolifératives, et en particulier le cancer.