Brevet FR2799974A1 — publié le 20010427

Complexe déglycosylé protéine env/CD4 et son utilisation pour la vaccination contre le VIH La présente invention a pour objet un nouvel antigène et son utilisation dans un vaccin contre le VIH et concerne plus particulièrement un complexe protéique déglycosylé capable d'induire des anticorps neutralisant les isolats primaires du VIH. Au cours des dix dernières années plusieurs vaccins contre la VIH ont été proposés et testés chez le singe ou chez l'homme. Aucun des vaccins proposés à ce jour n'a apporté de solution totalement satisfaisante. Les obstacles majeurs que sont la grande variabilité génétique du virus (SARAGOSTI S. 1997 Virologie 1 : 313-320 et la faible exposition au système immunitaire d'épitopes viraux neutralisant freinent considérablement l'élaboration d'un vaccin permettant l'induction d'une immunité neutralisante. La glycoprotéine d'enveloppe du VIH qui est requise pour conférer au virus son caractère infectieux représente la cible des anticorps neutralisants. Ces caractéristiques ont fait de cette dernière un sujet d'investigations intenses. Il a été montré que la glycoprotéine d'enveloppe du VIH est un oligomère composé d'un domaine extracellulaire, la gp 120, et d'un domaine transmembranaire, la gp 41, (Gallaher et al AIDS Research & Human Retroviruses. 11(2):191-202, 1995. La sous-unité gp120, responsable de la liaison du virion sur les récepteurs CD4 et chimiokines présents sur la cellule hôte, est une protéine fortement glycosylée. Les premières études structurales de la gp120 ont montré que la moitié du poids moléculaire de cette dernière correspondait aux résidus glycannes fixés sur la molécule. On estime que la gp120 comporte environ 24 sites potentiels de Nglycosylation répartis entre les domaines variables et constants La sous-unité gp41 qui induit la fusion des membranes cellulaire et virale est une protéine moins fortement glycosylée. On estime qu'elle comporte entre 4 et 7 sites potentiels de N-glycosylation. A la vue de cette glycosylation importante, l'hypothèse a très tôt été émise que ces résidus N-glycannes pouvaient constituer une barrière protégeant le virus d'une reconnaissance par le système immunitaire limitant notamment l'induction d'une réponse humorale efficace. Diverses expériences de déglysosylation ont donc été mises en #uvre pour tester le bien fondé de cette hypothèse. A ce jour peu de preuves ont été apportées pour conforter cette hypothèse et les résultats obtenus sont souvent contradictoires. A. Benjouad et al dans Journal of Virology 1992, p.2473-2483 ont comparé l'immunogénicité de la gp160 native à celle d'une gp160 déglycosylée par voie enzymatique par utilisation d'endo F-N glycannase, de neuraminidase ou d'amannosidase Les anticorps induits par ces différentes formes de gp160 déglycosylées ont été testés pour déterminer leur réactivité contre un panel de peptides synthétiques. Les résultats décrits montrent que, par rapport au sérum anti-gp160 native, la réactivité à l'égard de la majorité des peptides reste inchangée, ou peut dans certains cas diminuer ou augmenter D'après ces travaux seuls les anticorps issus d'antisérums produits contre la gp160 native ou la gp160 désialylée neutralisent le pouvoir infectieux du VIH-1 (TCLA) et inhibent la formation de syncytium entre les cellules infectées par le VIH-1 et les cellules CD4+ non-infectées. Bolmsted et al dans J. Acquired Immune Defic Syndr Hum. Retrovirol. 12, 213-220 (1996), ainsi que Benjouad et al dans FEBS letters 341, 244-250 (1994), pour n'en citer que quelques-uns, on conclut qu'une immunisation à l'aide de composants comprenant, ou exprimant, la protéine d'enveloppe partiellement déglycosylée n'améliorait pas les réponses en anticorps neutralisants des isolats primaires du virus . J N Reitter et al dans Nature Medecine, Vol. 4 (6), 679-684, 06/98, ont montré quant à eux que des gp160 mutantes du virus de l'immunodéficience simienne (VIS) dans lesquelles 2 sites de N-glycosylation ont été abolis au niveau et dans la partie V1 conduisent à une augmentation de la réponse immunitaire contre des déterminants structuraux de cette région et à une augmentation en anticorps neutralisants L'obtention de glycoprotéines gp160 ou gp120 mutantes partiellement déglycosylées dans leur partie C-terminale et leur utilisation pour induire une réponse immunitaire protectrice sont décrites dans W093/17705 W098/41536 faisant référence à W093/17705, décrit quant à lui que l'élimination sélective de résidus N-glycannes situés dans la partie N-terminale de la protéine gp120 du VIH-1 ou du VIS conduit à une glycoprotéine mutante capable d'induire une réponse humorale protectrice améliorée Les réponses en anticorps neutralisants, telles que décrites dans l'art antérieur mentionné ci-dessus, ont pour inconvénient d'être soit spécifiques d'un sérotype donné, soit d'être incapables de conduire à la neutralisation des isolats primaires du VIH. Du fait de la très grande variabilité génétique du virus du SIDA, de telles réponses immunitaires présentent donc peu, voire pas d'intérêt d'un point de vue vaccinal Il existe donc un besoin pour un vaccin capable d'induire une immunité neutralisante contre les isolats primaires du VIH. La présente invention a pour objet de pallier ce besoin et concerne donc un nouvel antigène déglycosylé capable d'induire des anticorps neutralisant les isolats primaires du VIH et son utilisation dans un vaccin contre le VIH La demanderesse a mis en évidence de façon surprenante qu'un complexe glycoprotéine env/CD4 déglycosylé permettait d'atteindre cet objectif. La présente invention concerne donc un complexe protéique déglycosylé composé de la glycoprotéine d'enveloppe du VIH -1 et du CD4 susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant les étapes de : (a) mélange de la glycoprotéine d'enveloppe et du CD4 selon un rapport molaire (mole de monomère de glycoprotéine d'enveloppe/mole de CD4 soluble) de 1/0,2 à 1/2 pour former un complexe glycoprotéine d'enveloppe/CD4 et (b) déglycosylation par voie enzymatique du complexe formé dans l'étape (a) Selon un mode de réalisation particulier, la glycoprotéine d'enveloppe est une gp160MN/LAI. Selon un autre mode de réalisation spécifique, la gp160MN/LAI est sous forme dimérique Selon un mode de réalisation différent le CD4 est un CD4 soluble Selon un autre mode de réalisation, le rapport molaire (mole de monomère de glycoprotéine d'enveloppe/mole de CD4 soluble) est de 1/1. Selon un autre mode de réalisation, le degré de déglycosylation exprimé en terme de diminution de la masse moléculaire (MM) de la glycoprotéine de l'étape (a) représente 1 à 50% (a) et plus avantageusement 20% (a) telle que déterminée par électrophorèse sur gel SDS PAGE. Selon un autre mode de réalisation l'étape de déglycosylation est réalisée par utilisation d'une enzyme, ou d'un mélange d'enzymes, sélectionnée(s) dans le groupe consistant en ; peptideN-glycosidase F, endoglycosidase F, et sialidase. Selon un mode spécifique de réalisation, l'étape de déglycosylation est réalisée par utilisation de peptide N-glycosidase (PNGase F) ou de sialidase. Selon un autre aspect, la présente invention concerne une composition comprenant un mélange de complexes déglycosylés. Selon un autre aspect, la présente invention est relative à un anticorps dirigé contre le complexe déglycosylé, cet anticorps étant de préférence monoclonal. Selon un quatrième aspect, la présente invention a pour objet un vaccin contre le VIH comprenant : (a) un complexe déglycosylé tel que défini ci-dessus ou une composition telle que définie ci-dessus, ou un anticorps tel que défini ci-dessus ou un mélange de ces anticorps, (b) un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable et (c) éventuellement un adjuvant ou mélange d'adjuvants. Selon un mode de réalisation particulier, le vaccin selon l'invention est utilisé pour induire des anticorps neutralisants le VIH chez un sujet humain à titre thérapeutique ou prophylactique. Selon un autre mode de réalisation, le vaccin selon la présente invention est utilisé pour induire une réponse cellulaire (CTL) protectrice chez un sujet humain à titre thérapeutique ou prophylactique. Les autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront dans la description détaillée qui suit. Par glycoprotéine d'enveloppe on entend dans le cadre de la présente invention une protéine glycosylée gp160, gp 120 ou gp 140. La protéine d'enveloppe peut être sous forme monomérique, dimérique ou multimérique, elle sera de préférence sous forme dimérique. Cette protéine d'enveloppe pouvant être une protéine recombinante ou non et peut également être constituée d'une protéine hybride ; le terme hybride étant utilisé ici dans son acceptation classique à savoir une protéine comprenant des séquences provenant de protéines d'enveloppe de différentes souches de virus adaptées en laboratoire ou d' isolats primaires du VIH. Les protéines d'enveloppe dont la séquence en acides aminés diffère de celle de la protéine native par des mutation(s), délétion(s), insertion(s), ou substitution (s) aminé (s) également inclues dans la définition ci- dessus pour autant que (1)ces modifications n'abolissent pas substantiellement la liaison de la protéine d'enveloppe au CD4, i.e. au moins 75% en masse, de préférence au moins 80% en masse du CD4 présent est associé à la glycoprotéine d'enveloppe, déterminé par mesure à l'aide d'un BiacoreTM (voir l'article suivant pour l'aspect technique des mesures : VanCott et al.. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 7(11):1103-15, 1994 Nov), et (2) que le complexe protéine d'enveloppe/CD4 ainsi formé conduisent à la formation d'anticorps susceptibles de neutraliser des isolats primaires du VIH. Ces deux caractéristiques sont aisément déterminables à l'aide des tests fournis dans la présente demande. On utilise de préférence la gp160MN/LAI. La glycoprotéine dans le cadre de la présente invention est utilisée sous une forme isolée substantiellement purifiée. On entend par protéine isolée et substantiellement purifiée, une protéine présentant un taux de pureté d'au moins 75% , de préférence d'au moins 80% , tel que déterminé par la méthode d'électrophorèse sur gel d'acrylamide (SDS PAGE) (LAEMMLI U. K. 1970. Nature 27 : 680-685. ) et analyse par densitométrie. Par CD4 on entend dans le cadre de la présente invention, une protéine CD4 comprenant l'intégralité ou une partie seulement de la séquence du récepteur CD4, ancrée ou non dans une membrane lipidique ou un fragment membranaire. Cette protéine CD4 peut également correspondre à une protéine recombinante. Les protéines CD4 dont la séquence en acides aminés diffère de celle de la protéine native par mutation(s), délétion(s), insertion(s), ou substitution(s) d'acide (s) aminé(s) sont également inclues dans la définition cidessus pour autant (1) que ces modifications n'abolissent pas substantiellement la liaison du CD4 à la protéine d'enveloppe telle que définie ci-dessus, i.e. au moins 75% en masse, de préférence au moins 80% en masse du CD4 présent est associé à la glycoprotéine d'enveloppe, et (2) que le complexe protéine d'enveloppe/CD4 ainsi formé conduise à la formation d'anticorps susceptibles de neutraliser des isolats primaires du VIH. Ces deux caractéristiques sont aisément déterminables à l'aide des tests fournis dans la présente demande. On peut citer à titre d'exemple non limitatifs de protéines CD4 utilisables dans le cadre de la présente invention, la protéine CD4 ancrée dans une membrane lipidique, ou le CD4 soluble vendu par Intracel sous la référence 13101. On utilise de préférence dans le cadre de la présente invention un CD4 soluble. La protéine CD4 dans le cadre de la présente invention est utilisée sous une forme isolée substantiellement purifiée. On entend par protéine isolée et substantiellement purifiée, une protéine présentant un taux de pureté d'au moins 75%, de préférence 80% , tel que déterminé par SDS PAGE et densitométrie. Dans le cadre de la présente invention on entend par complexe glycoprotéine d'enveloppe/CD4 , un complexe formé par l'association noncovalente entre une glycoprotéine d'enveloppe du VIH telle que définie ci-dessus et du CD4 tel que défini ci-dessus. La glycoprotéine d'enveloppe et le CD4 sont présents dans le complexe protéique tel que défini ci-dessus selon un rapport molaire (mole de monomère de glycoprotéine d'enveloppe/ mole de CD4) allant de 1/0,2 à 1/2 et de préférence dans un rapport molaire de 1/1. Dans le cas de figure où la glycoprotéine d'enveloppe comprend les deux types de sous-unités i.e. gp120 et gp41, le rapport ci-dessus doit être compris comme le rapport moles de monomères de gp120/moles de CD4. On entend par déglycosylation dans le cadre de la présente invention l'élimination, partielle ou totale, par voie enzymatique des glycannes présents sur la protéine glycosylée, de préférence la déglycosylation est une Ndéglycosylation. La déglycosylation peut par exemple être réalisée par action d'une ou de plusieurs des enzymes suivantes : sialidases, peptide N-glycosidase F, mannosidases, O-glycosidases, endoglycosidases F, H ou D, N-glycosidase A (PNGase A), fucosidases, galactosidases, N-acétyl-beta-D-glucosaminidase. Cette liste n'est pas limitative, toute enzyme susceptible de déglycosyler le complexe selon l'invention peut être utilisée sous réserve que l'enzyme ou le mélange enzymatique sélectionné conduise à un complexe déglycosylé susceptible d'induire des anticorps neutralisant les isolats primaires. Cette caractéristique peut être aisément vérifiée à l'aide du test de neutralisation auquel il est fait référence dans l'exemple 4 ci-dessous. De préférence la déglycosylation du complexe est réalisé par utilisation d'une enzyme ou d'un mélange d'enzymes sélectionnée(s) dans le groupe consistant en : peptide N-glycosidase F, endoglycosydase F et sialidase de préférence par utilisation de PNGase F ou de sialidase. Les paramètres de l'étape de glycosylation que sont le rapport enzyme/substrat, la température et le temps d'incubation du substrat avec l'enzyme sont sélectionnés de sorte que la déglycosylation entraîne une diminution de la masse moléculaire (MM) de la glycoprotéine de l'étape (a) représente 1 à 50% et plus avantageusement 20% tel que déterminé par SDS PAGE. Plus avantageusement on sélectionne les paramètres qui provoquent la diminution maximum du poids moléculaire du complexe glycoprotéine/CD4, tel que déterminé par électrophorèse sur gel d'acrylamide. Le rapport enzyme/substrat varie en fonction de l'activité spécifique de l'enzyme. A titre illustratif, les paramètres appropriés pour la déglycosylation d'un complexe gp160MN/LAI/ CD4 soluble par la sialidase présentant une activité de 30 unités sont de 1/116 (poids/poids) avec incubation du complexe pendant 3 heures à 37 C. Les conditions opératoires appropriées pour les différentes enzymes sont facilement déductibles par l'homme de l'art à partir de l'enseignement fourni ici et des renseignements contenus dans les fiches techniques accompagnant les enzymes. La déglycosylation est mise en #uvre par addition à la préparation contenant la glycoprotéine d'enveloppe de l'enzyme en solution dans un tampon approprié pour son activité enzymatique. Le choix du tampon est à la portée de l'homme de l'art et il est généralement indiqué par le fournisseur. La réaction est mise en #uvre par mélange des deux protéines i.e. CD4 et glycoprotéine d'enveloppe à la température ambiante et sous agitation. La nature du tampon et les paramètres de la réaction de déglycosylation peuvent être facilement déterminés par l'homme de l'art à partir de l'enseignement fourni ici. Cette étape de déglycosylation est décrite plus en détails dans les exemples qui suivent. Dans le cadre de la présente invention, on entend donc par complexe déglycosylé , un complexe glycosylé tel que défini ci-dessus qui, après sa formation (ie après l'association non-covalente des sous-unités glycoprotéine d'enveloppe et CD4) est soumis à une déglycosylation par voie enzymatique telle que définie ci-dessus. Une fois déglycosylé les complexes glycoprotéine d'enveloppe/CD4 en solution ont tendance à s'agréger formant ainsi des structures multimériques. La présente invention a également pour objet une composition comprenant un mélange d'au moins deux complexes déglycosylés tels que définis ci-dessus. Dans un tel cas de figure, ces complexes peuvent se différentier par exemple par la nature de la glycoprotéine d'enveloppe constitutive (par ex. les glycoproteines provenant de différentes souches ou isolats primaires, certaines pouvant correspondre également à des protéines hybrides) ou par le degré ou la nature de la déglycosylation ou par la nature du CD4. Tout mélange envisageable comprenant un ou plusieurs complexe est inclus dans la portée de la présente invention. La présente invention a également pour objet les anticorps dirigés contre les complexes déglycosylés tels que décrits ci-dessus. La préparation de tels anticorps est mise en #uvre par les techniques classiques d'obtention d'anticorps polyclonaux et monoclonaux (Kohler G et al European Journal of lmmunology. 6(7):511-9, 1976 Jul) Ces anticorps sont particulièrement appropriés pour être utilisés dans un schéma d'immunisation passive. La présente invention a également pour objet des vaccins utiles à des fins thérapeutiques et prophylactiques. Les vaccins selon la présente invention comprennent un complexe protéique déglycosylé tel que défini ci-dessus ou un mélange de complexes déglycosylés, un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable et éventuellement un adjuvant. Le vaccin selon la présente invention peut donc contenir un seul type de complexe protéique déglycosylé ou un mélange de divers types de complexes déglycosylés. Dans un tel cas de figure, ces complexes peuvent se différentier par exemple par la nature de la glycoprotéine d'enveloppe constitutive (par ex. les glycoprotéines provenant de différentes souches ou isolats primaires, certaines pouvant correspondre également à des protéines hybrides) ou par le degré ou la nature de la déglycosylation ou par la nature du CD4. Tout mélange envisageable comprenant un ou plusieurs complexe est inclus dans la portée de la présente invention. Selon un autre aspect, la présente invention comprend des anticorps anticomplexe protéique déglycosylé. Dans ce cas de figure également tout mélange d'anticorps, monoclonaux ou polyclonaux, dirigés contre différentes parties d'un même complexe déglycosylé ou contre différents complexes déglycosylés fait partie de la présente invention. La quantité de complexe protéique déglycosylé dans le vaccin selon la présente invention dépend de nombreux paramètres comme le comprendra l'homme de l'art, tels que la nature du complexe, la voie d'administration et l'état de la personne à traiter (poids, age, état clinique, etc...). Une quantité appropriée est une quantité telle qu'une réponse immunitaire humorale ou cellulaire capable de neutraliser des isolats primaires du VIH est induite après administration de cette dernière. Les vaccins selon la présente invention peuvent également contenir un adjuvant. Tout adjuvant ou mélange d'adjuvants pharmaceutiquement acceptable peut être utilisé à cette fin. On peut citer à titre d'exemple les sels d'aluminium tels que l'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate d'aluminium. Des agents auxiliaires classiques tels que agents mouillants, charges, émulsifiants, tampons etc. peuvent également être additionnés au vaccin selon l'invention. Les vaccins selon la présente invention peuvent être préparés par tout procédé classique connu de l'homme de d'art. Classiquement les antigènes sont mélangés avec un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable, tel que eau ou solution saline tamponnée au phosphate. Le support ou diluent va être sélectionné en fonction de forme galénique choisie, du mode et de la voie d'administration ainsi que de la pratique pharmaceutique. Les supports ou diluants appropriés ainsi que les exigences en matière de formulation pharmaceutique sont décrits en détails dans Remington's Pharmaceutical Sciences, représentant un ouvrage de référence dans ce domaine. Les vaccins mentionnés ci-dessus peuvent être administrés par toute voie classique, habituellement utilisée dans le domaine des vaccins, telle que la voie parentérale (intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, etc..) L'administration peut être réalisée par l'injection d'une dose unique ou de doses répétées, par exemple à JO, à 1 mois, à 3 mois, à 6mois et à 12 mois. On utilisera de préférence les injections à JO , à 1 mois et à 3 mois. La présente invention entend également couvrir le complexe déglycosylé tel que défini ci-dessus et le vaccin contenant un tel complexe ou mélange de complexes déglycosylés pour leur utilisation pour induire des anticorps neutralisant des isolats primaires du VIH ainsi que pour leur utilisation pour induire une réponse CTL contre le VIH. La demanderesse a mis en évidence de façon surprenante que les complexes déglycosylés selon l'invention étaient capable après administration d'induire des anticorps susceptibles de neutraliser des isolats primaires du VIH. Ces antigènes représentent donc des candidats de valeur pour l'élaboration d'un vaccin utilisable pour la protection et/ou le traitement d'un grand nombre, voire la totalité des sujets à risques ou infectés par le VIH. La présente invention va être décrite de façon plus détaillée dans les exemples qui suivent par référence aux figures suivantes dans lesquelles : La figure 1 représente les valeurs moyennes du dosage des immunoglobulines spécifiques de la gp160 MN/LAI-2 induites chez le cobaye par les complexes déglycosylés selon l'invention. Les exemples décrits ci-dessous sont donnés à titre purement illustratif de l'invention et ne peuvent en aucun cas être considérés comme limitant la portée de cette dernière. A des fins de clarté, les exemples sont limités à des complexes déglycosylés constitués de gp160MN/LAI/CD4. Exemple 1 Préparation de la glycoprotéine gp160MN/LAI La glycoprotéine gp160MN/LAI est une glycoprotéine soluble hybride dans laquelle la sous-unité gp120 dérive du VIH-1 MN et la sousunité gp41 dérive de l'isolat LAI. Les séquences d'ADN correspondant à ces deux composants sont fusionnés à l'aide d'un site de restriction Smal qui ne modifie ni la séquence en acides aminés de la gp120 ni celle de la gp41. La préparation de cette protéine est décrite ci-dessous. La séquence codant pour la gp120MN est amplifiée par PCR à partir des cellules SupT1 infectées par le VIH-MN, à l'aide d'oligonucléotides introduisant les sites de restrictions Sphl et Smal respectivement immédiatement en aval de la séquence codant pour le peptide leader et en amont des sites de clivage localisés entre la gp120 et la gp41. La séquence codant pour la sous-unité gp41 est produite de la façon suivante : la séquence complète codant pour la protéine env du VIH1-LAI est placée sous le contrôle du promoteur pH5R du virus de la vaccine. Plusieurs modifications sont introduites dans cette région codante. Un site de restriction Sphl est créé immédiatement en aval de la séquence codant pour le peptide leader, sans altération de la séquence des acides aminés. Un site de restriction Smal est créé immédiatement en amont de la séquence codant pour les sites de clivage situées entre gp120 et gp41, sans altération de la séquence en acides aminés. Les deux sites de clivage en position 507-516 (acides aminés numérotés selon la méthode de Myers et al, décrite dans Human retroviruses and AIDS (1994) Los Alamos National Lab. (USA)) ont été mutés (i.e. la séquence d'origine KRR ... REKR a été mutée en QNH... QEHN). La séquence codant pour le peptide hydrophobe transmembranaire IFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIV (i.e. acides aminés 689-710 selon Myers et al supra) a été délété. Enfin, le second codon E de la séquence codant pour PEGIEE a été remplacé par un codon stop (i.e. acides aminés 735-740 selon Myers et al (supra)), correspondant au 29ème acide aminé du domaine intracytoplasmique. Le plasmide dans lequel la séquence LAI est insérée entre les régions homologues du gène TK du virus de la vaccine est coupé par Sphl et Smal puis ligaturé avec la séquence de la gp120MN. Le virus WTG9150 est ensuite construit par une recombinaison homologue classique Le vecteur recombinant du virus de la vaccine, WTG9150, ainsi produit est utilisé pour la production de la gp160MN/LAI. Pour ce faire, le vecteur est propagé sur des cellules BHK21. La gp160 MN/LAI-2 est produite sur cellules BHK21 infectées pendant 72 heures par le virus de la vaccine recombinante WTG9150. Après culture en biogénérateur, le surnageant est récolté, filtré et ultrafiltré pour donner la récolte concentrée. La purification se déroule en trois étapes. Certains contaminants de la gp160 MN/LAI-2 sont fixés sur une colonne échangeuse d'anions. La fraction non fixée est chromatographiée sur colonne d'immunoaffinité à l'aide d'un anticorps monoclonal 5F3. Après élution, la gp160 MN/LAI-2 est dessalée par chromatographie de filtration sur gel en tampon PBS. Pour inactiver la vaccine résiduelle, la glycoprotéine est chauffée à 60 C pendant 1 heure avant d'être filtrée pour donner l'antigène purifié. La concentration de la gp160 MN/LAI-2 utilisée pour la réalisation des complexes déglycosylés est de 0,87 mg/ml de protéines (déterminée par dosage colorimétrique kit BCA, Pierce) et sa pureté de 77% (déterminée par électrophorèse SDS PAGE et analyse par densitométrie optique à l'aide du ScannerGS700 de BioradTM). La glycoprotéine est dans un tampon phosphate de composition suivante : NaCI 137 mM ; KCI 2,7 mM ; Na2HP04 6,5 mM ; KH2P04 1,5 mM , pH 7,4 (PBS). Chaque complexe est réalisé à partir de 150 g de gp160MN/LAI. La glycoprotéine est conservée à -20 C Exemple 2 : préparation des complexes déglycosylés Préparation des complexes ap160MN/LAI/CD4 Du CD4 soluble recombinant constitué des acides aminés 1-307 du domaine extracellulaire du CD4 humain (IntracellTM, No référence 13101) à 1mg/ml dans un tampon MES (50mM MES, 350 mM NaCl, pH6,0) est ajouté à la gp160 préparée dans l'exemple 1 selon un rapport molaire (mole de monomère de gp160/mole de CD4) de 1/1. Les conditions opératoires conduisant aux complexes déglycosylés selon l'invention (nommés respectivement BA34, BA35 et BA 36) et aux préparations témoins (nommées BA1, BA2, BA3, BA4 et BA33) sont résumées dans le tableau 1 ci-dessous. L'association du CD4 soluble (CD4s) à la glycoprotéine d'enveloppe du VIH induit un changement conformationnel important (Furuta et al., 1998). Il semble que l'association du CD4 à la préparation de gp160 MN/LAI-2 expose des épitopes auparavant cachés. L'analyse électrophorétique sur gel d'acrylamide, montre que le CD4 soluble ajouté à la préparation est formé d'une bande unique à 42 kDa. Le monomère de gp160 MN/LAI-2 se situe à 129 kDa Après traitement par l'éthylene glycol bis succinimidyl succinate (EGS) (GETHING et al 1989. Methods in ce// biology 32 : 185-206. ), la bande correspondant au CD4s disparaît indiquant que cette molécule est bien associée à la gp160 MN/LAI-2 en solution (bande à 243 kDa). L'état oligomérique de la gp160 MN/LAI n'est pas modifié par l'ajout du CD4s. Déglycosylation des complexes gp160MN/LAI/CD4 Les complexes gp160/CD4 ainsi formés sont ensuite déglycosylés. L'étape de déglycosylation est réalisée à l'aide des enzymes ou mélanges enzymatiques suivants ; peptide N-glycosidase F (PNGase F), mélange endoglycosidase F/peptide N-glycosidase F (endo F/PNGase F), et sialidase provenant de chez Oxford Glycosciences, Abingdon UK. L'activité de ces enzymes, exprimée en unités d'activité par mg d'enzyme, est pour la PNGase F de 20 unités pour le mélange endo F/PNGase F de 42 et 57 unités respectivementet pour la sialidase de 30 unités. (Rappel : 1 unité représente la quantité d'enzyme capable d'hydrolyser 1 micromole de substrat par minute dans les conditions de pH de température etc... définies). Ces glycosidases, à l'exception de la sialidase, agissent à pH 7,4 dans le tampon PBS de la gp160 MN/LAI-2 et sont ajoutées directement. La sialidase agit à pH 5, nécessitant d'abaisser le pH de la préparation de la gp160 MN/LAI-2 par de l'acétate de sodium 0,5 M à pH 5.. La sialidase est solubilisée en tampon acétate de sodium 0,1 M pH 5, puis ajoutée à la gp160 MN/LAI-2. Les déglycosylations sont réalisées en bain thermostaté à 37 C sous agitation douce. La réaction de déglycosylation est arrêtée par congélation à -20 C. Pour les antigènes traités par la sialidase le pH est augmenté à environ 7,4 par ajout de PBS 10 fois concentré. Les paramètres et les conditions opératoires utilisés pour mettre en #uvre la réaction de déglycosylation sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous dans lequel le rapport enzyme/gp160 est exprimé en poids/poids (p/p). Les complexes sont numérotés BA1, BA2, BA3, BA4 et BA33 pour les préparations témoins et BA 34, BA35 et BA36 pour les complexes selon l'invention. Tableau 1 Conditions opératoires de déglycosylation des préparations gp160MN/LAI préparées dans l'Exemple 1 BA2 BA3 BA4 BA33 BA34 BA35 BA36 gp160 MN/LAI-2 9791 9791 9791 9791 9791 9791 9791 Volume 172 NI 172 l 172 l 172 l 172 l 172 l 172 l Cprotéine 0,87 mg/ml 0,87 mg/ml 0,87 mg/ml 0,87 mg/ml 0,87 mg/ml 0,87 mg/ml 0,87 mg/ml Cgp 0,67 mg/ml 0,67 mg/ml 0,67 mg/ml 0,67 mg/ml 0,67 mg/ml 0,67 mg/ml 0,67 mg/ml 1-sCD4 - 33 l 33 l 33 l 33 NI Vortex Vortex 2-Tp 5x Sialidase- - 34 l - 25 pl VortexVortex 3-Enzymes (poids/poids)- @ Sialidase (1/116) - 15 l 15 NI PNGase F (1/385) 30 NI - 30 NI Endo F (1/401)/PNGase 14,4 NI 14,4 NI F (1/401) 14-4' VortexVortex 3-Incubation 24h à 37 C 18h à 37 C 3h à 37 C 3h à 37 C 24h à 37 C 18h à 37 C 4-Tp PBS 1x 48 NI 63,6 NI 29 NI 4- Tp PBS 10x - - - - 8 l Volume 250 l 250 l 250 l 205 l 253 NI 235 NI 219 pl C mg/ml en protéine 0,6 0,6 0,6 0,73 0,59 0,64 0,68 Cmg/ml en gp 0,46 0,46 0,46 0,56 0,45 0,49 0,52 5 Les complexes ainsi formés ont été analysés par SDS PAGE. Les résultats sont résumés dans le tableau 2 ci-dessous. Après action de la PNGase F (BA35), l'analyse électrophorétique montre que la mase moléculaire du monomère de gp160 MN/LAI est réduite de31 kDa semblablement à celle de BA2 (traitée PNGase F sans CD4s). La masse moléculaire du CD4s est légèrement réduite au cours de l'opération. Lorsque la préparation est traitée par de l'EGS, la bande correspondant au CD4s n'est plus visible montrant qu'il est associé avec la gp160 MN/LAI. L'analyse SDS-PAGE de la préparation BA36 traitée par l'endo F/PNGase F montre une diminution de la masse moléculaire de 40 kDa. Ces résultats suggèrent que l'ajout du CD4s réduit le clivage des N-glycannes en gênant l'accessibilité des enzymes. Le CD4s est déglycosylé par ces enzymes. Le traitement à l'EGS montre également que le CD4s reste fixé à la gp160MN/LAI. Le traitement de la gp160 par la sialidase en présence de CD4s provoque une très légère diminution de la masse moléculaire du complexe d'environ 3kDa, visible enSDS-PAGE. Tableau 2 : Masses moléculaires des complexes gp160MN/LAI/CD4s Complexes Traitement /addition de MasseMoléculaire MasseMoléculaire du n CD4s CD4s après ~~~ traitement BA1 Sans 136 kDa @ BA2 PNGase F 101 kDa BA3 Endo FIPNGase F 76kDa BA4 Sialidase 129kDa - - BA33 CD4 soluble 129 kDa 42 kDa BA34 CD4s+Sialidase 131 kDa 43 kDa BA35 CD4s+PNGase F 105 kDa 43/40/36 kDa BA36 CD4s+EndoF/PNGase F 94 kDa 45/41/37 kDa Exemple 3 : Analyse de l'immunogénicité chez le cobaye des complexes selon l'invention Formulation des complexes déglycosylés Les complexes déglycosylés sont dilués stérilement en milieu stabilisateur puis adsorbés sur du phosphate d'aluminium. Le mélange stabilisant est composé d'un mélange d'acides aminés et de milieu "Dulbecco's Modified Eagle Medium" DMEM-F12 (Gibco, France). Les complexes déglycosylés préparés dans l'exemple 2 (BA1, BA2, BA3, BA4 et BA33 et BA34, BA35 et BA36) sont dilués dans le mélange stabilisateur avant qu'un volume égal de phosphate d'aluminium à 6,3 mg/ml en PBS soit ajouté à ce mélange. Immunisations Pour chaque complexe, un groupe de 5 cobayes femelle albinos Dunkin-Hartley (Charles River) de 400 g, reçoivent 5 g d'antigène par voie intramusculaire, dans les cuisses droite et gauche (0,5 ml dans chaque cuisse) à J1 et à J29. Un volume de 3 ml de sang est prélevé par ponction cardiaque sous anesthésie aux jours-1, 28 et 56 (saignée finale environ 30 ml). Titrages des sérums par ELISA contre la gp160 MN/LAI-2 Les sérums des cobayes ainsi obtenus ont été analysés par dosage ELISA contre la gp160 MN/LAI native. La gp160 MN/LAI est immobilisée sur la phase solide à raison de 130 ng par cupule pendant 1 heure à 37 C. La plaque est vidée puis saturée par un tampon PBS, Tween 20 0,1% contenant 5% de lait écrémé en poudre. Chaque sérum est dilué sur la plaque selon des dilutions sériées de raison 3, entre 1/100e et 1/10000e selon les cas, en tampon de saturation et incubé pendant 1 heure 30 à 37 C. Un anticorps de lapin anti cobaye (Sigma, St Louis) couplé à la peroxydase, dilué au 1/3000e, permet de révéler la présence d'anticorps spécifiques de la gp160MN/LAI. Les titres sont calculés automatiquement par le lecteur à partir de la densité optique lue et de la droite obtenue avec un sérum étalon. Les valeurs moyennes du dosage des immunoglobulines spécifiques de la gp160 MN/LAI-2 pour chaque groupe de cobayes sont représentées sur la figure 1. Les groupes témoins injectés avec de la gp160 MN/LAI non traitée sont notés BA1, BA2, BA3, BA4 et BA33. Globalement les différentes préparations injectées induisent des anticorps spécifiques à des niveaux assez comparables. Aucun anticorps spécifique de la gp160 MN/LAI-2 n'a été détecté dans les sérums pré immuns. Ces résultats montrent clairement que les complexes déglycosylés selon la présente invention sont capables d'induire des anticorps reconnaissant spécifiquement la glycoprotéine d'enveloppe du VIH. Exemple 4 Test de neutralisation des isolats primaires de VIH Les tests de neutralisation des isolats primaires de VIH ont été mis en #uvre sur les isolats Bx17 et T051 par utilisation de la méthode de C. Moog et al, telle que décrite dans AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1997, 13,19-27 dont l'intégralité est incorporée ici à titre de référence. Ce test a été mis en #uvre contre plusieurs isolats primaires de VIH-1; seuls les résultats obtenus avec l' isolats Bx17 et T051 sont détaillés ici. Les résultats obtenus montrent clairement que les complexes selon la présente invention sont supérieurs aux glycoprotéines déglycosylées selon l'art antérieur et permettent la neutralisation d'isolats primaires du virus à partir d'antigènes fabriqués à l'aide d' une gp160 isolée à partir d'une souche adaptée en laboratoire (TCLA). On peut dans ces conditions raisonnablement penser que les mélanges de complexes selon l'invention puissent conduirent à la neutralisation de nombreux isolats primaires du VIH. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 3 ci-dessous : Tableau 3 : de neutralisation des isolats primaires des virus HIV1, exprimés en inverse de la dilution Sérums Bx17 T051 BA1 BA2 BA3 BA4 BA33 BA34 10 BA35 10 20 BA36 10 10 Revendications : 1.- un complexe protéique constitué d'une glycoprotéine d'enveloppe du VIH et de CD4 susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant les étapes de: (a) mélange de la glycoprotéine d'enveloppe et du CD4 selon un rapport molaire (mole de monomère de glycoprotéine d'enveloppe/mole de CD4 soluble) de 1/0,2 à 1/2 pour former un complexe glycoprotéine d'enveloppe/CD4 et (b) déglycosylation par voie enzymatique du complexe formé dans l'étape (a). 2. - Le complexe selon la revendication 1 dans lequel la glycoprotéine d'enveloppe est une gp160MN/LAI. 3. - Le complexe selon la revendication 2 dans lequel la gp160MN/LAI est sous forme dimérique. 4. - Le complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans lequel le CD4 est un CD4 soluble. 5. - Le complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans lequel le rapport molaire (mole de monomère de glycoprotéine d'enveloppe/mole de CD4 soluble) est de 1/1. 6. - Le complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le degré de déglycosylation exprimé en terme de diminution de la masse moléculaire de la glycoprotéine de l'étape (a) représente de 1 à 50% et de préférence 20% (a) telle que déterminée par électrophorèse SDS PAGE. 7. - Le complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel l'étape de déglycosylation est réalisée par utilisation d'une enzyme, ou d'un mélange d'enzymes, sélectionnée(s) dans le groupe consistant en, peptide N-glycosidase F, endoglycosidase F, et sialidase. 8. - Le complexe selon la revendication 6 dans lequel l'étape de déglycosylation est réalisée par utilisation de PNGase F. 9. - Une composition comprenant un mélange de complexes déglycosylés selon l'une quelconque des revendications précédentes. 10. - Un anticorps dirigé contre le complexe déglycosylé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 11.- Un vaccin contre le VIH comprenant : (d) un complexe déglycosylé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ou une composition selon la revendication 9, (e) un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable et (f) éventuellement un adjuvant ou mélange d'adjuvant. 12. - Le vaccin selon la revendication 11 comprenant un complexe déglycosylé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ou une composition selon la revendication 9 pour son utilisation pour induire des anticorps neutralisants le VIH chez un sujet humain à titre thérapeutique ou prophylactique. 13. - Le vaccin selon la revendication 11 comprenant un complexe déglycosylé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ou une composition selon la revendication 9 pour son utilisation pour induire une réponse CTL protectrice chez un sujet humain à titre thérapeutique ou prophylactique