Brevet FR2796952A1 — publié le 20010202

La présente invention est relative à de nouvelles applications de peptides issus du domaine cytoplasmique du précurseur de la protéine amyloïde (BAPP). Le précurseur de la protéine amyloïde ssAPP est une protéine de fonction inconnue, dont la forme neuronale comporte 695 acides aminés ; elle présente un seul domaine transmembranaire et un court domaine cytoplasmique de 47 acides aminés, représenté dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO :1. La maladie d'Alzheimer est un désordre neurodégénératif qui affecte de 1 à 6 % de la population âgée de plus de 65 ans. L'une de ses caractéristiques est la présence de plaques séniles qui contiennent du (3-amyloïde (BA4), produit toxique dérivé du BAPP et constitué de peptides de 39 à 42 acides aminés, engendrés par clivage du BAPP par deux protéases la ss et la y sécrétase. Par ailleurs, une troisième enzyme, dite a sécrétase clive le BAPP entre les sites ss et y rendant donc impossible la formation du BA4 supposé pathogène. Aucune de ces sécrétases n'a été identifiée à ce jour, même si des suspicions légitimes pèsent sur la protéine PSI (produit du gène Presenilin-1, muté dans des formes familiales de la maladie d'Alzheimer). En effet, PSIpourrait être soit la y sécrétase soit un de ses co-facteurs. Enfin, d'autres sites de clivage existent dans le domaine C-terminal dont le site des caspases (N. Barnes et al., J. Neuroscience, 1998, 18,15, 5869-5880), entre les résidus aspartate et alanine de la SEQ ID NO:1(positions 15 et 16). Il reste que les mécanismes responsables de la toxicité du BA4 ne sont pas connus et que la relation entre la présence du ssA4 dans les plaques et la pathologie n'est pas élucidée. Il est probable que d'autres facteurs et/ou d'autres domaines de la molécule entrent également enjeu. C'est la raison pour laquelle de nombreuses études ont essayé d'établir le rôle physiologique et/ou physiopathologique du BAPP et des différents produits de son métabolisme. En effet, le ligand physiologique - s'il existe - du domaine N-terminal n'a pas été identifié et les voies de signalisation sont encore mal définies. Une des stratégies d'accès à l'analyse de ces voies de signalisation est l'identification de partenaires moléculaires du domaine cytoplasmique. Le domaine cytoplasmique du ssAPP ainsi que différents peptides issus de ce domaine cytoplasmique ont en particulier été étudiés : - les séquences YTSI, KKKQYTSIHHGVVEV (SEQ ID NO :8), GYENPTY (SEQ ID N0:9) et NPTY ont été identifiées comme des signaux d'intemalisation ; de manière plus précise, elles sont considérées comme des séquences de transcytose du BAPP entre les compartiments basolatéral et apical des cellules épithéliales MDCK (Haass et al., J. Cell Biol., 1995,128, 4,537-547 ; Lai et al., J. Biol. Chem., 1995,270, 8, 3565-3573 ; Lai et al., J. Biol. Chem., 1998,273, 6, 3732-3739) ; - le domaine cytoplasmique C-terminal (APP-Cter) a été identifié comme : . intervenant dans la régulation de l'activité GTPasique de la sousunité ao de la protéine G hétérotrimérique (Brouillet et al., J. Neuroscience, 1999, 19, 5, 1717-1727) ; . interagissant avec plusieurs protéines : Pat-1 interagit avec le domaine juxtamembranaire (KKKQYTSIHHG) et avec le domaine C-terminal complet et interviendrait dans le transport d'APP le long des microtubules, vers la surface cellulaire (Zheng et al., PNAS, 1998, 95, 14745-14750) ; la sous-unité ao de la protéine G hétérotrimérique interagit avec la région médiane dudit domaine cytoplasmique C-terminal, au niveau du double d'histidines (HH) (Nishimoto et al., Nature, 1993, 362, 75-79) et la protéine Fe65 avec la région la plus distale du domaine APP-Cter (Fiore et al., J. Biol. Chem., 1995,270, 52, 30853-30856). Ces différents résultats montrent la complexité des mécanismes dans lesquels le précurseur de la protéine amyloïde (BAPP) est impliquée. Les Inventeurs ont maintenant montré, que de manière surprenante, des peptides comprenant le domaine juxtamembranaire du domaine cytoplasmique du précurseur de la protéine amyloïde (13APP), présentent, après internalisation dans des cellules, une activité apoptotique. La présente invention a pour objet des peptides, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des séquences incluant le domaine juxtamembranaire du domaine cytoplasmique du précurseur de la protéine amyloïde (BAPP) (code une lettre), sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences Y,KQYTSIHHGYo (SEQ ID NO :2), Y,KKQYTSIHHGYo (SEQ ID NO :3) et Y1KKKQYTSIHHGY0 (SEQ ID NO :4), dans lesquelles Yo est nul ou représente V, W, VVE WEV ou VVEVD et Y1 représente un peptide d'internalisation et d'adressage issu de la 3ème hélice des homéodomaines et de peptides structurellement apparentés et répond de préférence à la séquence X,XZX3X.X;X6X7XgX9X,pX"X,ZX,3X,X,;X16, dans laquelle X,, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, XIO, XII, X,2, X13. X,4, X15, X6 représentent chacun un acide a-aminé, 6 à 10 d'entre lesdits acides aminés étant hydrophobes et X6 représentant un tryptophane. Parmi les séquences Y, préférées, on peut citer la séquence KQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:5). Les peptides X,XzX3XX;X6X7XgX9X,pX"X,zX,3X,.X"X16 ont notamment été décrits dans la Demande Internationale WO 97/12912. Les peptides selon l'invention provoquent l'apoptose des cellules dans lesquelles ils sont internalisés et peuvent avantageusement être utilisés pour sélectionner et cribler des produits aptes à inhiber l'apoptose cellulaire. La présente invention a donc également pour objet l'utilisation d'un peptide comprenant le domaine juxtamembranaire du domaine cytoplasmique du précurseur de la protéine amyloïde (ssAPP), pour la sélection et le criblage de produits aptes à inhiber l'apoptose. Conformément à ladite utilisation, ledit peptide est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences (code une lettre) Y1KQYTSIHHGY0 (SEQ ID NO:2), 1 Y1KKQYTSIHHGYo (SEQ ID NO:3) et YIKKKQYTSIHHGYO (SEQ ID NO:4), dans lesquelles Yo est nul ou représente V, W, WE WEV ou WEVD et Y, est nul ou représente un peptide d'internalisation et d'adressage issu de la 3ème hélice des homéodomaines et de peptides structurellement apparentés et répond de préfé- rence à la séquence XIX2X3X4X5X6X7X8X9XIOXlIX12X[3Xl4Xl5X,6, dans laquelle XI, X2, X3, X4, X5, X6, X7, Xs, X9, XIO, XII, X12, X[3, X14, X15, X16 représentent chacun un acide a-aminé, 6 à 10 d'entre lesdits acides aminés étant hydrophobes et X6 représentant un tryptophane. Le peptide de SEQ ID NO:2 dans laquelle Y1 est nul et Yo est nul est dénommé peptide G (voir également figure 1). La présente invention a également pour objet l'utilisation de cellules, dans lesquelles un peptide tel que défini ci-dessus a été intemalisé, pour la sélection et le criblage de produits aptes à inhiber l'apoptose. La présente invention a également pour objet un procédé de criblage et de sélection de produits aptes à inhiber l'apoptose, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en contact de l'inhibiteur potentiel avec une cellule dans laquelle un peptide tel que défini ci-dessus a été internalisé et - la mesure du clivage de l'ADN ou de l'actine. La présente invention a en outre pour objet l'utilisation d'un peptide tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un médicament anti-cancéreux. L'invention sera mieux comprise à l'aide des figures annexées dans lesquelles : - la figure 1 représente la séquence du domaine cytoplasmique du précurseur de la protéine amyloïde (PAPP), - la figure 2 représente la quantification du clivage de l'ADN par la technique tunel 24 h après internalisation des peptides, - la figure 3 représente la quantification du clivage de l'actine par la caspase 3 à l'aide de l'anticorps anti-fractine, - la figure 4 représente l'image confocale d'un neurone après 24 h d'internalisation du peptide G (concentration IX) montrant dans le même plan le clivage de l'actine par la caspase 3 (révélé par un anticorps anti-fractin) et le clivage de l'ADN (révélé par le marquage tunel). EXEMPLE : - Préparation des peptides On utilise le vecteur VI (Penetratine = KQIKIWFQNRRl\fKWKK) (SEQ ID NO:5) comme peptide d'intemalisation qui, après fusion génétique ou chimique à un cargo, permet sa translocation à travers la membrane plasmique et son adressage cytoplasmique et nucléaire. Plusieurs peptides ont ainsi été préparés : . SEQ ID NO:5 + domaine cytoplasmique entier du ssAPP (SEQ ID NO :1). .Y1KKKQYTSIHHGY0: SEQ ID NO :4 dans laquelle Yo est nul et Y, représente la SEQ ID NO:5 ; la partie en gras correspond au peptide G de la figure 1 (=SEQ ID NO : 4 dans laquelle Yo est nul et Y, est nul). . YiKQYTSIHHGYo : SEQ ID NO : 2 dans laquelle Yo est nul et Y, représente la SEQ ID NO:5 ; la partie en gras correspond au peptide G de la figure 1 (=SEQ ID NO : 2 dans laquelle Yo est nul et Y1 est nul). . Y1KKQYTSIHHGY0: SEQ ID NO :3 dans laquelle Yo est nul et Y[ représente la SEQ ID NO:5 ; la partie en gras correspond au peptide G de la figure 1 (= SEQ ID NO : 2 dans laquelle Yo est nul et Y1 est nul). . SEQ ID NO:5 + domaine E (VDAAVTPEE, SEQ ID NO:6), souligné dans la séquence selon la figure 1. . SEQ ID NO:5 + domaine H (NGYENPTYK, SEQ ID NO:7), souligné dans la séquence selon la figure 1. Notons que, dans la mesure où les 2 derniers acides aminés de la séquence SEQ ID NO :5 sont des lysines (KK), le peptide G (KQYTSIHHG) se trouve artificiellement rallongé de 2 acides aminés. - Internalisation desdits peptides dans des neurones Les conditions d'internalisation sont les mêmes que celles décrites dans la Demande internationale WO 97/12912. - Résultats L'internalisation du domaine C-ter entier (APP-Cter) n'est pas toxique mais a, cependant, un effet négatif sur la croissance neuritique. L'internalisation des peptides E et H est sans effet alors que celle du peptide G, à des concentrations inférieures au M reproduit les effets du domaine C-terminal intact. Le résultat le plus intéressant est que le peptide G, à des concentrations de l'ordre de 1 à 1,5 M entraîne la mort des neurones et que cette mort correspond à un processus apoptotique, donc régulé. Le caractère apoptotique de la mort provoquée par l'internalisation du peptide G est démontré par la fragmentation de l'ADN, mise en évidence par la méthode dite TUNEL (figure 2), et par l'activation des caspases (figure 3). L'activation des caspases est démontrée par l'apparition de formes clivées de l'actine et par le blocage de l'apoptose par des inhibiteurs de caspase à large spectre d'activité comme le ZVAD. La figure 2 illustre la quantification du clivage de l'ADN par la technique tunel 24H après internalisation des peptides. Les peptides ont été internali- sés à 2 concentrations (IX et 2X) en présence ou en absence du ZVAD, un inhibiteur des caspases 1,3, 4,7. Chaque condition a été testée en triplicate. Le pourcentage de cellules positives a été évalué après 24H, par comptage d'environ 1 000 cellules par puits. Le graphe indique une augmentation significative du clivage de l'ADN en présence du peptide G seul (concentration IX : p La figure 3 illustre la quantification du clivage de l'actine par la caspase 3 à l'aide de l'anticorps anti-fractine, par immunocytochimie après fixation des cellules au paraformaldéhyde (F. Yang et al., Am. J. Pathol., 1998,152, 2,379- 389). L'anticorps anti-fractine reconnaît spécifiquement l'actine clivée par la caspase 3. Le pourcentage de neurones positifs pour la fractine a été déterminé après 24H d'internalisation des peptides, par comptage d'environ 1 000 cellules par puits en triplicate. En présence des peptides G (KQYTSIHHG = SEQ ID NO :2 dans laquelle Y1 représente un peptide d'internalisation et d'adressage, tel que défini ci-dessus et Yo est nul) (IX et 2X) et Gcasp (KKKQYTSIHHGWEVD= SEQ ID NO:4 dans laquelle Y1 représente un peptide d'internalisation et d'adressage, tel que défini cidessus et Yo VVEVD) (IX), il existe une augmentation significative du clivage par l'actine (G1X : p La figure 4 représente une image confocale d'un neurone après 24 heures d'internalisation du peptide G (concentration IX) montrant dans le même plan le clivage de l'actine par la caspase (révélé par un anticorps anti-fractin) et le clivage de l'ADN (révélé par le marquage tunel). Dans la mesure où le peptide G correspond à un signal de transcytose et comprend un résidu tyrosine (Y), le peptide a également été internalisé soit après phosphorylation de cette tyrosine (Y-P) soit après sa substitution par une alanine (Y#A) ou une aspartate (Y#D). Les deux substitutions abolissent totalement les effets physiologiques de G alors que la phosphorylation les amenuise sans les abolir. Dans la mesure où Y#D mime une phosphorylation on peut proposer comme hypothèse parcimonieuse que la tyrosine est nécessaire, mais que sa phosphorylation ne l'est probablement pas. L'effet intermédiaire de Y-P étant alors explicable par la désphosphorylation du peptide dans la cellule. On ne peut cependant pas exclure que la phosphorylation est nécessaire mais que la substitution Y#D n'est pas suffisante pour la mimer. Les Inventeurs ont donc bien montré le caractère pro-apoptotique du peptide G intemalisé grâce à sa liaison au vecteur VI. Une telle propriété est d'intérêt pour les raisons suivantes : 1. Le domaine C-terminal entier n'est pas pro-apoptotique 2. Il existe un site de clivage par les caspases entre les résidus aspartate (D) et alanine (A) marqués en gras dans la séquence de l'APP-Cter (figure 1). On peut donc émettre l'hypothèse que le clivage entre D et A démasque une séquence KKKQYTSIHHGVVEVD (= SEQ ID NO :4 dans laquelle Y1 est nul est Yo représente VVEVD) à activité apoptotique. Ceci est particulièrement important car cela met en évidence un mécanisme impliqué dans la perte neuronale qui accompagne des démences de type Alzheimer. Avoir identifié un peptide dérivé du BAPP correspondant à un domaine, normalement exposé après clivage in vivo et capable de provoquer l'entrée des cellules en apoptose, a comme premier avantage de proposer un mécanisme original susceptible d'éclairer certains aspects de la pathologie d'Alzheimer et donc de découvrir des voies thérapeutiques nouvelles (mise au point d'inhibiteurs). Par ailleurs la liaison de la séquence G au vecteur VIpermet de fabriquer un peptide qui, une fois internalisé par les neurones en culture, provoque leur apoptose. Du fait des propriétés de VI, l'entrée se fait dans 100% des cellules quel que soit leur degré de maturation in vitro et ces cellules sont normales (cultures primaires). Des applications in vivo, avec perfusion du peptide à l'aide de minipompes, sont aussi possibles. A partir de là, ce système constitue un test rapide et simple pour cribler des bibliothèques de produits agissant spécifiquement sur la mort apoptotique induite par ce peptide et inoffensif sur d'autres modèles d'apoptose. L'identification de telles substances est donc très utile pour la mise au point de traitements de l'apoptose accompagnant la maladie d'Alzheimer. REVENDICATIONS 1 ) Peptides, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des séquences incluant le domaine juxtamembranaire du domaine cytoplasmique du précurseur de la protéine amyloïde (f3APP) (code une lettre), sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences Y1KQYTSIHHGY0 (SEQ ID NO:2), Y;KKQYTSIHHGYo (SEQ ID NO :3) et YiKKKQYTSIHHGYo (SEQ ID NO :4), dans lesquelles Yo est nul ou représente V, W, WE VVEV ou VVEVD et Y, représente un peptide d'intemalisation et d'adressage, issu de la 3ème hélice des homéodomaines et de peptides structurellement apparentés. 2 ) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit peptide d'internalisation et d'adressage répond à la séquence XiX2X3X-iX5X6X7X8X9XtOXtiXl2Xt3Xt4XISX16 dans laquelle Xl, Xz, X3, )4, Xs, X6, X, X8, X9, Xio, X,, Xz, X,3, X,a, X,S, X,6 représentent chacun un acide a-aminé, 6 à 10 d'entre lesdits acides aminés étant hydrophobes et X6 représentant un tryptophane. 3 ) Peptides selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisés en ce que la séquence Y, correspond à la séquence KQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO : 5). 4 ) Utilisation d'un peptide comprenant le domaine juxtamembranaire du domaine cytoplasmique du précurseur de la protéine amyloïde (BAPP), pour la sélection et le criblage de produits aptes à inhiber l'apoptose. 5 ) Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit peptide est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences (code une lettre) YIKQYTSIHHGYO (SEQ ID NO:2), Y1KKQYTSIHHGY0 (SEQ ID N0:3) et Y1KKKQYTSIHHGY0 (SEQ ID NO :4), dans lesquelles Yo est nul ou représente V, VV, VVE WEV ou VVEVD et Y1 est nul ou représente un peptide d'internalisation et d'adressage, issu de la 3ème hélice des homéodomaines et de peptides structurellement apparentés. 6 ) Utilisation selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisée en ce que ledit peptide d'internalisation répond à la séquence XIX2X3xiX5X6X7X8X9X(OXllX12Xl3Xl4XI5X16 dans laquelle X,, X2, X3, X4, X;, X6, X7, X8, X9, X 10, XI l, X12, X13, Xi4~ Xi5, X[6 représentent chacun un acide a-aminé, 6 à 10 d'entre lesdits acides aminés étant hydrophobes et X6 représentant un tryptophane. 7 ) Utilisation de cellules, dans lesquelles un peptide tel que défini à la revendication 4,5 ou 6, a été internalisé, pour la sélection et le criblage de produits aptes à inhiber l'apoptose. 8 ) Procédé de criblage et de sélection de produits aptes à inhiber l'apoptose, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en contact de l'inhibiteur potentiel avec une cellule dans laquelle un peptide tel que défini à la revendication 4,5 ou 6, a été intemalisé et - la mesure du clivage de l'ADN ou de l'actine. 9 ) Utilisation d'un peptide tel que défini à la revendication 4, 5 ou 6, pour la préparation d'un médicament anti-cancéreux.