Brevet FR2806741A1 — publié le 20010928

La régulation et la manipulation de la teneur en saccharose dans la canne à sucre Arrière-plan technologique Cette invention est relative à la régulation et à la manipulation de la teneur en saccharose (sucrose) dans la canne à sucre. La teneur en saccharose qui s'accumule dans la tige ( culm ) de la canne à sucre est une fonction de la force d'absorption (force de sink ) et de la répartition du carbone entre des voies métaboliques compétitrices (Whittaker et Botha, 1997). Une de ces voies est le flux respiratoire. La phosphofructokinase dépendante du pyrophosphate (PFP) dont le code d'identification international est EC 2. 7.1.90, catalyse la conversion réversible du fructose 6-phosphate (F6P) et du pyrophosphate (PPi) en fructose 1,6-bisphosphate (Fru-1,6-P2) et en phosphate inorganique (Pi) (Carnal et Black, 1979). La teneur en PPi et celle en F6P peuvent toutes deux potentiellement contrôler le taux de glycolyse, c'est-à-dire le flux respiratoire (Plaxton, 1996 et références citées). De plus, la PFP est associée avec les tissus d'absorption (tissus de sink) et pourrait jouer un rôle pour déterminer la force d'absorption (Edwards et ap Rees, 1986 ; Botha et al., 1992 ; et al., 1995). De manière similaire à ce qui se passe pour la plupart des autres enzymes impliqués dans le métabolisme végétal, l'activité de la PFP dans la canne à sucre apparaît être en partie contrôlée par l'expression de la protéine PFP (Whittaker et Botha, 1999). Toutefois, ceci ne prouve pas que l'activité de la PFP dans une plante puisse influer sur la teneur en saccharose de la plante. De plus, des études précédentes ont montré que des PFP réduites dans des plants de tabac et de pommes de terre transgéniques ne conduisent pas à des caractéristiques phénotypiques différentes par rapport aux plants témoins (Hajirezaei et al, 1994; Sonnewald et al 1995). Un objet de l'invention est de réguler et de manipuler la teneur en saccharose dans une plante qui stocke le sucre, telle que la canne à sucre. Résumé de l' invention Il a été trouvé que la teneur en saccharose dans une plante qui stocke le sucre peut être régulé et manipuler en régulant l'activité de l'enzyme PFP dans la plante. Il a été trouvé que la régulation négative de l'enzyme PFP en diminuant la concentration d'une des sous-unités de l'enzyme conduisait à une augmentation de la teneur en saccharose de la plante. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'activité de l'enzyme PFP est régulée de manière négative en introduisant une forme non traduisible ou d'une forme anti-sens de la séquence nucléotidique présentée en figure 1, d'une séquence nucléotidique qui est complémentaire de la séquence nucléotidique de la figure 1, d'un variant de la séquence nucléotidique de la figure 1, d'une portion de la séquence nucléotidique de la figure 1, ou d'une séquence nucléotidique qui s'hybride à la séquence nucléotidique de la figure 1 en conditions stringentes d'hybridation. La séquence nucléotidique anti-sens ou non traduisible peut être introduite dans la plante en utilisant des vecteurs d'expression pour plantes tels que pUSPc 510 oupASPc510. Selon l'invention, une séquence nucléotidique isolée comprend : (i) une séquence nucléotidique telle que présentée en figure 1 ; (ii) une séquence nucléotidique qui est complémentaire de la séquence nucléotidique de (i) ; (iii) un variant de la séquence nucléotidique de (i) ; (iv) une portion de la séquence nucléotidique de (i) ; ou (v) une séquence nucléotidique qui s'hybride à la séquence nucléotidique de (i) dans des conditions stringentes d'hybridation. La séquence nucléotidique peut être la séquence nucléotidique telle que présentée en figure 2. La séquence nucléotidique peut être dans une orientation anti-sens. Selon un autre aspect de l'invention, une construction de gène comprend un promoteur et une séquence nucléotidique telle qu'ici définie dans une orientation sens, la construction de gène ne comportant pas de codon d'initiation de traduction en amont de la séquence nucléotidique, ou comprenant un codon de terminaison en cadre directement en aval du codon d' initiation. La construction de gène peut comprendre deux promoteurs. Les promoteurs peuvent être sélectionnés parmi les promoteurs CaMV35S et le promoteur de la polyubiquitine (UBI) du maïs. Selon un autre aspect de l'invention, une construction de gène comprend un promoteur, et une séquence nucléotidique telle que définie dans la présente, dans une orientation anti-sens. Les constructions de gène peuvent être des vecteurs d'expression pour plantes, pUSPc 510 et pASPc 510 respectivement. Selon un autre aspect de l'invention, une cellule végétale transformée comprend une construction de gène selon l'invention. Selon un autre aspect de l'invention, est fournie une plante transgénique ou une partie de plante transgénique qui contient ou dérive de la cellule végétale transformée. La partie transgénique de plante peut être un cal. La cellule végétale transformée, ou la plante transgénique, ou la partie de plante transgénique, peut être caractérisée par une teneur plus faible en protéine PFP ss. La cellule de canne à sucre transformée, ou la plante transgénique, ou la partie de plante transgénique, peut être caractérisée par un niveau d'activité PFP plus faible. La cellule de plante transformée, ou la plante transgénique ou la partie de plante transgénique, peut être caractérisée par une teneur plus forte en saccharose. Selon un autre aspect de l'invention, une méthode pour réguler ou manipuler la teneur en PFP active dans une cellule végétale comprend l'étape de transformer la cellule végétale avec au moins une construction de gène selon l'invention. Selon un autre aspect de l'invention, une méthode pour maintenir ou augmenter la teneur en saccharose dans un tissu de la canne à sucre comprend l'étape de transformer les cellules du tissu végétal avec au moins une construction de gène selon l'invention. Selon un autre aspect de l'invention, une méthode pour manipuler le métabolisme du saccharose dans une cellule végétale d'une plante qui stocke le sucre comprend l'étape de co-transformer la cellule avec chacune des constructions de gène de l'invention. La méthode peut mettre en jeu l'altération du métabolisme du saccharose dans une plante, ou partie de plante, qui a la propriété de stocker le sucre et qui contient du sucre stocké. La plante peut être la canne à sucre. Brève description des figures L'invention va être maintenant décrite en plus de détails, à titre d'illustration seulement, par référence aux figures ci-jointes dans lesquelles : La figure 1 représente la séquence nucléotidique du fragment d'ADNc de 1170 paires de bases (pb) du clone PFP#5, qui contient l'extrémité 3' du gène PFP-P de la canne à sucre qui est utilisé dans la construction des vecteurs d'expression pour plantes pUSPc 510 et pASPc 510 ; La figure 2 représente la séquence nucléotidique complète de l'ADNc du gène PFP-p de la canne à sucre ; La figure 3 est une représentation schématique du vecteur d'expression pour plante pUSPc 510, qui contient le fragment d'ADNc PFP-p de 1170 pb sous une forme non traduisible ; La figure 4 est une représentation schématique du vecteur d'expression pour plante pASPc 510, qui contient le fragment ADNc PFP-P de 1170 pb sous une forme anti-sens ; La figure 5 est un exemple d'une analyse par PCR qui a permis d'identifier des clones transgéniques ; La figure 6 est un exemple d'analyse par transfert de Northem qui montre que le transgène de l,2kb est transcrit dans la canne à sucre transgénique, et que les niveaux du transcrit endogène de 2,3kb ont été modulés chez les clones transgéniques ; La figure 7 est un exemple d'analyse par transfert de protéines qui montre les changements dans les niveaux de polypeptide PFP-P dans la canne à sucre transgénique. Description détaillée de l'invention Il a été démontré que la teneur en saccharose d'une plante qui stocke le sucre peut être altérée en régulant l'activité de l'enzyme PFP dans la plante. Bien que cette invention décrive la régulation de l'enzyme PFP dans la canne à sucre, la régulation de l'activité de l'enzyme PFP dans d'autres plantes qui stockent le sucre tel que le sorgho doux et la betterave sucrière affectera également la teneur en saccharose de la plante. L'enzyme PFP est un hétéro-tétramère avec deux sous-unités a et deux sousunités ss. La sous-unité (3 est la sous-unité catalytique de l'enzyme, et il a été montré que la suppression de la sous-unité (3 augmente la teneur en sucre d'une plante qui stocke le sucre, notamment la canne à sucre. Un effet similaire peut être atteint en altérant les sous-unités a de l'enzyme, que l'on pense être impliquées dans la régulation de l'activité enzymatique par l'intermédiaire du fructose 2,6-biphosphate (Fru-2,6-P2). Une première étape de l'invention a été le clonage et la caractérisation d'un fragment ADNc PFP-p de la canne à sucre. Un ensemble d'amorces dégénérées ont été construites sur la base du consensus des séquences du gène PFP-P de la pomme de terre et de la fève de castor ( castor bean ). Ces amorces ont été utilisées pour amplifier un fragment à partir de l'ARN d'enroulement de feuille ( leafroll ) de canne à sucre, qui a alors été utilisé comme sonde pour cribler une banque d'ADNc d'enroulement de feuille de canne à sucre dans le but d'identifier des clones PFP-p. La séquence de l'insert d'un tel clone est présentée à titre d'illustration en figure 1. Cette séquence contient un fragment d'ADNc de 1170 pb. La séquence codante complète de la PFP-P de la canne à sucre telle que représentée en figure 2 a été obtenue en séquençant d'autres clones de banques d'ADNc et d'ADNg (ADN génomique). Le fragment ADNc PFP-P présenté en figure 1 a été excisé et cloné dans le vecteur d'expression pour plante pUBI 510 qui confère un haut niveau d'expression du gène constitutif dans les cellules de canne à sucre. Un des vecteurs, appelé pUSPc 510, présenté en figure 3, contient un fragment dans l'orientation sens mais il lui manque un codon d'initiation de traduction et est donc non traduisible. L'autre vecteur appelé pASPc 510, présenté en figure 4, contient un fragment dans l'orientation anti-sens. Les vecteurs pUSPc 510 et pASPc 510 ont été utilisés pour transformer des cellules dans un cal de canne à sucre. Les cals transformés ont été sélectionnés et des plantes potentiellement transgéniques ont été régénérées. Les plantes ont été analysées pour confirmer la présence du transgène PFP-P. Les plantes contenant le transgène PFP-P ont été endurcies ( hardened off ) et cultivées en condition de serre. Ensuite, l'expression du transgène a été recherchée en utilisant l'analyse par transfert de Northen. Les résultats présentés en figure 6 indiquent que le transgène est exprimé dans tous les tissus analysés. L'expression de la protéine PFP a alors été recherchée au moyen de l'analyse par transfert de protéines. Les résultats qui sont présentés en figure 7 ont montré que les teneurs endogènes en PFP étaient diminuées dans les tissus inter-nodaux et dans les tissus d'enroulement de feuille. Enfin, l'influence des changements en teneur/activité de la protéine PFP-P, qui ont été ci-dessus mentionnés, sur l'accumulation du saccharose dans les plantes a été déterminée. Les résultats présentés dans le tableau 1 ci-dessous montrent une augmentation substantielle dans les teneurs en saccharose des clones qui ont des teneurs en protéine PFP-ss réduites. Exemples Clonage et caractérisation d'un fragment ADNc de PFP-P de canne à sucre De manière à assurer, chez la canne à sucre, une inhibition optimale de l'expression du gène par la voie anti-sens et/ou par co-suppression, la séquence du gène endogène PFP-P a été isolée. Un ensemble d'amorces dégénérées a été construit, en se basant sur la séquence consensus des séquences du gène PFP-P de la fève de castor ( castor bean ) et de la pomme de terre, lesquelles séquences étant disponibles sur la base de données internationale Genbank sous les numéros d'entrée Z32850 et M55191, respectivement (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Ces amorces ont été utilisées pour amplifier un fragment de 248pb à partir de l'ARN d'enroulement de feuille de canne à sucre, en utilisant le système de RT-PCR TitanTM en suivant les instructions du fabriquant (Boehringer Mannheim). Ce fragment amplifié d'ADNc PFP-P a été utilisé comme sonde pour cribler une banque d'ADNc d'enroulement de feuille de canne à sucre (Lambda ZAP II system, Stratagene) de manière à identifier des clones PFP-(3. Les inserts ADNc des clones isolés ont été séquences de manière à vérifier leur intégrité et leur identité. Un séquençage automatique d'ADN a été réalisé à l'aide de l'analyseur Applied Biosystem ABI Prism 373 Genetic Analyser, en utilisant un kit de réaction prêt pour le séquençage en cycle de terminaison ABI BigDyeTM, en suivant les instructions du fabriquant (Perkin-Elmer, part number 430 3152). La séquence de l'insert d'un tel clone, PFP#55, est représentée à titre illustratif en figure 1. En comparant cette séquence sur la base de données internationale, il a pu être confirmé qu'elle est identique à PFP-P (programme BLASTX ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/). Elle contient un fragment d'ADNc de 1170 pb qui représente plus de 50% de la séquence codante de PFP-p et qui inclut une séquence 3' non traduisible de 260 pb. La séquence codante complète de la PFP-p de la canne à sucre, telle que représentée en figure 2, a été obtenue en séquençant d'autres clones de banques d'ADNc et d'ADNg. Construction de vecteurs d'expression pour plante A titre illustratif, la construction d'un ensemble de vecteurs d'expression pour plante pour la régulation négative de l'activité de la PFP dans la canne à sucre va être décrite en détail. Ces constructions contiennent le fragment PFP-P du clone PFP#5 de la banque d'ADNc d'enroulement de feuille. L'insert d'ADNc de 1170 pb a été excisé en utilisant l'enzyme de restriction EcoR I et a été cloné au niveau du site EcoR I du vecteur d'expression pour plante pUBI510 (numéro de référence du dépôt auprès de l'ECACC: 00042603) qui confère un haut niveau d'expression du gène constitutif dans les cellules de canne à sucre. Le vecteur d'expression contient deux promoteurs, le CaMV 35S, et le promoteur de la polyubiquitine UBI du maïs. Un de ces vecteurs pUSPc 510, contient le fragment dans l'orientation sens, mais ne comprend pas de codon d'initiation de traduction, et l'autre vecteur pASPc 510, contient le fragment en orientation anti-sens. Des représentations schématiques des deux vecteurs d' expression sont présentées en figure 3 et 4 respectivement. Transformation de la canne à sucre La culture et la transformation des tissus de canne à sucre ont été réalisées comme décrit par Snyman et al. (1996). Un des vecteurs d'expression et un gène de marqueur de sélection, la néomycine phosphotransférase II (npt II), placé sous le contrôle du promoteur Emu synthétique (Chamberlain et al., 1994), ont été cotransformés dans un cal de la canne à sucre en utilisant un canon à flux de particules (Finer et al., 1992). Les cals transformés ont été sélectionnés sur un milieu contenant de la généticine, et les plantes potentiellement transgéniques ont été régénérées. Caractérisation des plantes de canne à sucre transgéniques A titre d'illustration, la caractérisation d'un ensemble de plantes transgéniques de canne à sucre transformées avec le vecteur d'expression pUSPc 510 va être décrite en détail. Ces clones ont été appelés OPu suivi par un numéro de clone spécifique à trois chiffres, par exemple OPu 501. En une première étape de caractérisation, l'ADN génomique (ADNg) a été extrait des plantes potentiellement transgéniques et soumis à analyse PCR pour confirmer la présence du transgène PFP-P avant que les plantes ne soient endurcies ( hardened off ) et placées en culture sous condition de serre. La figure 5 donne un exemple d'une analyse PCR qui a été utilisée pour détecter les transgènes dans des plantes de canne à sucre régénérées. Analyse PCR pour identifier les plantes transgéniques de canne à sucre. L'ADNg de neuf plantes potentiellement pUSPc 510-transgéniques (pistes 2-10) a été utilisé comme matrice de PCR spécifique. Le fragment de 484 pb au niveau des pistes 3-8 confirme la présence du transgène ADNc PFP-P dans ces clones. L'ADNg provenant d'une plante de canne à sucre non transformée NCo 310 a été utilisé comme témoin négatif (piste 11), et un témoin positif qui utilise le vecteur de transformation pUSPc 510, a aussi été inclus (piste 12). Dans cet exemple, l'amplification d'un fragment de 484 pb confirme la présence du transgène dérivé de l'ADNc. Du fait de la présence d'introns, les amorces utilisées amplifient un fragment d'environ 1250 pb à partir de la séquence génomique endogène (cf. piste 10). De plus, la séquence génomique sera amplifiée avec une faible efficacité parce que l'amorce amont, qui est basée sur la séquence ADNc, chevauche un site d'épissage exon/intro. Ensuite, l'expression du transgène à un niveau transcriptionnel et son effet potentiel sur les niveaux de transcrits endogènes PFP-p ont été étudiés en utilisant des analyses par transfert de Northem. L'ARN total a été isolé à partir d'enroulement de feuilles et de jeunes tissus inter-nodaux, comme cela a été décrit par Bugos et al. (1995). Après électrophorèse sur gel de 20 g d'ARN total par échantillon, l'ARN a été transféré sur des membranes en Nylon TM et sondé avec le fragment d'ADNc PFP-P de 1170 pb. Les résultats, tels que présentés en figure 6, montrent clairement que le transgène est exprimé dans tous les tissus analysés. Analyse par transfert de Northem de plantes de canne à sucre transgéniques transformées avec une forme instable du gène PFP-(3. Piste 1 : ARN d'enroulement de feuille de canne à sucre non transformées. Piste 2 : d'enroulement de feuille du clone transgénique OPu 503. De plus, le résultat montre que certains des tissus transgéniques présentent des taux réduits de transcrits endogènes PFP-(3. Le transcrit du transgène non traduisible est représenté par la bande à 1,2 kb et le transcrit du PFP-p endogène par la bande à 2,3kb. Les taux de la protéine PFP-P dans les clones transgéniques ont été comparés à une plante témoin non transformée au moyen d'analyses par transfert de protéines. Des extraits bruts de protéines ont été préparés à partir d'enroulement de feuille et de jeune tissu inter-nodal, comme décrit par Whittaker et Botha (1999). Dix microgrammes de protéines totales de chaque échantillon ont été analysés par SDS-PAGE, puis les protéines ont été transférées sur des membranes en nitrocellulose et sondées avec de l'antisérum de PFP-P de pomme de terre. Un polypeptide de 63 kDa a réagi de manière croisée avec l'anticorps, et les bandes obtenues ont été quantifiées par densitométrie de spot (Alphamager 2000TM Gel Documentation and Analysis System, Alpha Innotech). Les résultats présentés en figure 7 ont indiqué que le taux relatif de protéines PFP-(3 a diminué dans les plantes transgéniques. Ceci est particulièrement apparent dans les tissus qui présentent les plus faibles niveaux de PFP, par exemple l'inter-noeud 5. Finalement, l'influence des changements ci-dessus mentionnés en niveau/activité de protéine PFP-(3 sur l'accumulation de sucre a été déterminée. Les sucres ont été extraits des inter-noeuds 7 à 13 d'un témoin non transformé et des trois clones Opu, et ont été quantifiés de manière enzymatique. Les résultats présentés dans le tableau 1 montrent clairement une augmentation dans les teneurs en saccharose dans les clones qui présentent une teneur en protéine PFP-P réduite. Tableau 1. Teneur en sucre des tissus inter-nodaux de clones transgéniques de canne à sucre qui présentent une activité PVP réduite. Teneur en sucre ( mol g-1 poids frais) No. témoin non OPu 501 OPu 502 OPu 503 inter- transforme OPu 501 OPu 502 OPu noeud Saccha- ' Saccha- - Saccha- @ SacchaHexoses rose Hexoses . rose Hexoses rose Hexoses rose ~~~~~~~~~~~rosé~~~~~rosé~~~~~~~rosé~~~~~~~rosé 7 3. 30 385.93 114.24 238.23 151. 92 197. 22 50. 21 376. 15 9 2. 55 320.65 13.73 886.64 154. 60 228. 93 8. 70 796. 22 11 2. 40 344. 25 5. 58 750. 94 63. 64 412. 27 6. 14 894.22 13 4.86 295. 69 5.07 862.60 20. 69 372. 98 5. 58 881. 95 En conclusion, il a été démontré que les fragments isolés du gène PFP-P peuvent être utilisés pour réguler de manière négative le niveau de PFP active dans les cellules et par là, pour manipuler le métabolisme du saccharose dans les cellules. Références : Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (eds) (1998) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and sons, New York. Black CC, Loboda T, Chen J-Q, Sung S-JS (1995) Can saccharose cleavage enzymes serve as markers for sink strength and is saccharose a signal molecule during plant sink development ? In: Pontis HG, Salerno GL, Echeverria EJ (eds) Saccharose Metabolism : Biochemistry. Physiology and Molecular Biology. Waverley Press, Baltimore, MD, pp. 49-64. ISBN 0-943088-32-3. Botha FC, Small JGC, de Vries C. (1986) Isolation and Characterization of pyrophosphate : D-fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase from cucumber seeds. Plant Cell Physiology 27 : 1285-1295. Botha FC, O'Kennedy MM, du Plessis S (1992) Activity of key enzymes involved in carbohydrate metabolism in Phaseolus vulgaris cell suspension cultures. Plant Cell Physiol 33 : 477-483. Bugos RC, Chiang VL, Zhang XH, Campbell ER, Podila GK, Campbell WH (1995) RNA isolation from plant tissues récalcitrant to extraction in guanidine. Biotechniques 19 :734-737. Carlisle SM, Blakeley SD, Hemmingsen SM, Trevanion SJ, Hiyoshi T, Kruger NJ, Dennis DT (1990) Pyrophosphate-dependent phosphofructokinase. Conservation of protein séquence between the a- and ss-subunits and the ATP dependent phosphofructokinase. J Biol Chem 265 : 18366-18371.Camal NW, Black CC (1979) Pyrophosphate-dependent 6-phosphofructokinase, a new glycolytic enzyme in pineapple leaves. Biochem Biophys Res Commun 86 : 20-26. Chamberlain DA, Brettel RIS, Last DI, Witrzwns B, McElroy D, Dolferus R, Dennis ES (1994) The use of the Emu promoter with antibiotic and herbicide resistance genes for the selection of transgenic wheat callus and rice plants. Austral J Plant Phvsiol 21: 95-112. Edwards J, ap Rees T (1986) Saccharose partitioning in developing embryos of round and wrinkled varieties of Pisum sativum. Phytochemistry 25 : 2027-2032. Finer JJ, Vain P, Jones MW, McMullen MD (1992) Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells. Plant Cell Rep Il: 323 - 328. Iyer LM, Kumpatla SP, Chandrasekharan MB, Hall TC (2000) Transgene silencing in monocots. Plant Mol Biol 43:323-346. Kruger NJ, Dennis DT (1987) Molecular properties of pyrophosphate : phosphate phosphotransferase from potato tuber. Arch Biochem Biophvs 256 : 273- 279. Plaxton WC (1996) The organization and regulation of plant glycolysis. Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47: 185-214. Snyman SJ, Meyer GM, Carson DL, Botha FC (1996) Establishment of embryogenic callus and transient gène expression in selected sugarcane varieties. S Afr J Bot 62: 151-154. Vaucheret H, Béclin C, Elmayan T, Feuerbach F, Godon C, Morel J-B, Mourrain P, Palauqui J-C, Vernhettes S (1998) Transgene-induced gene silencing in plants. Plant J 16 : 651-659. Whittaker A, Botha FC (1999) Pyrophosphate:D-fructose-6-phosphate 1- phosphotransferase activity patterns in relation to saccharose storage across sugarcane varieties. Physiol Plant 107 : 379-386. Yan TFC, Tao M (1984) Multiple forms of pyrophosphate: D-fructose-6-phosphate 1- phosphotransferase from wheat seedlings. Regulation by fructose-2,6-bisphosphate. J Biol Chem 259 : Hajirezaei M, Sonnewald U, Viola R, Carlisle S, Dennis D, Stitt M (1994) Transgenic potato plants with strongly decreased expression of pyrophosphate: fructose-6-phosphate phosphotransferase show no visible phenotype and only minor changes in metabolic fluxes in their tubers. Planta 192 : Paul M, Sonnewald U, Hajirezaei M, Dennis D, Stitt M (1995) Transgenic tobacco plants with strongly decreased expression of pyrophosphate: fructose-6-phosphate phosphotransferase do not differ significantly from wild type in photosynthate partitioning, plant growth or their ability to cope with limiting phosphate, limiting nitrogen and suboptimal températures. Planta 196 : Le contenu de ces documents est ici incorporé par référence. REVENDICATIONS 1. Une méthode pour réguler et manipuler la teneur en saccharose dans une plante qui stocke le sucre, en régulant l'activité de l'enzyme PFP dans la plante. 2. Une méthode selon la revendication 1, dans laquelle la teneur en saccharose de la plante est augmentée par la régulation négative de l'enzyme PFP dans la plante. 3. Une méthode selon la revendication 2, dans laquelle l' enzyme PFP est régulé de manière négative par l'introduction d'une forme non traduisible ou d'une forme anti-sens de la séquence nucléotidique présentée en figure 1, d'une séquence nucléotidique qui est complémentaire de la séquence nucléotidique de la figure 1, d'un variant de la séquence nucléotidique de la figure 1, d'une portion de la séquence nucléotidique de la figure 1, ou d'une séquence nucléotidique qui s'hybride à la séquence nucléotidique de la figure 1 en conditions stringentes d'hybridation. 4. Méthode selon la revendication 3, dans laquelle la séquence nucléotidique non traduisible ou anti-sens est introduite dans la plante en utilisant un vecteur d'expression pour plante. 5. Une méthode selon la revendication 4, dans laquelle le vecteur d'expression pour plante est pUSPc 510 ou pASPc 510. 6. Une séquence nucléotidique isolée comprenant : (i) une séquence nucléotidique telle que présentée en figure 1 ; (ii) une séquence nucléotidique qui est complémentaire de la séquence nucléotidique de (i) ; (iii) un variant de la séquence nucléotidique de (i) ; (iv) une portion de la séquence nucléotidique de (i) ; ou (v) une séquence nucléotidique qui s'hybride à la séquence nucléotidique de (i) dans des conditions stringentes d'hybridation. 7. Une séquence nucléotidique isolée telle que présentée en figure 2. 8. Une séquence nucléotidique selon la revendication 6, qui est dans une orientation anti-sens. 9. Une construction de gène comprenant un promoteur et une séquence nucléotidique telle que définie en revendication 6 dans une orientation sens, ladite construction de gène ne présentant pas de codon d'initiation de traduction en amont de la séquence nucléotidique, ou comprenant un codon de terminaison en cadre directement en aval du codon d'initiation. 10. Une construction de gène selon la revendication 9 qui comprend deux promoteurs. 11. Une construction de gène selon la revendication 10 dans laquelle les promoteurs sont le promoteur CaMV35S et le promoteur de la polyubiquitine (UBI) de maïs. 12. Une construction de gène comprenant un promoteur et une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 6, dans une orientation antisens. 13. Une construction de gène selon la revendication 12, qui comprend deux promoteurs. 14. Une construction de gène selon la revendication 13, dans laquelle les promoteurs sont le promoteur CaMV35S et le promoteur de la polyubiquitine (UBI) de maïs. 15. Le vecteur d'expression pour plantes pUSPc 510 qui inclut la séquence nucléotidique de la figure 1 dans une orientation sens, mais sous une forme non traduisible. 16. Le vecteur d'expression pour plantes pASPc 510 qui inclut la séquence nucléotidique de la figure 1 dans une orientation anti-sens. 17. Une cellule végétale transformée qui inclut une construction de gène selon la revendication 9. 18. Une plante transgénique, ou une partie de plante transgénique, contenant ou dérivée de la cellule de plante transformée selon la revendication 17. 19. Une partie de plante transgénique selon la revendication 18 qui est un cal. 20. Une cellule de plante transformée selon la revendication 17 qui est caractérisée par une teneur plus faible en protéine PFP-ss. 21. Une plante transformée ou une partie de plante transformée selon la revendication 18, caractérisée par une teneur plus faible en protéine PFP-(3. 22. Une cellule de plante transformée selon la revendication 17, caractérisée par un niveau plus faible d'activité PFP. 23. Une plante transgénique ou une partie de plante transgénique selon la revendication 18, caractérisée par un niveau plus faible d'activité PFP. 24. Une cellule de plante transformée selon la revendication 17, caractérisée par une teneur plus forte en saccharose. 25. Une plante transgénique, ou une partie de plante transgénique selon la revendication 18, caractérisée par une teneur plus forte en saccharose. 26. Une méthode pour réguler ou manipuler le niveau de PFP active dans une cellule végétale, qui comprend l'étape de transformer la cellule végétale avec au moins une construction de gène selon la revendication 9. 27. Une méthode pour maintenir ou augmenter la teneur en saccharose dans un tissu végétal, qui comprend l'étape de transformer les cellules du tissu végétal avec au moins une construction de gène selon la revendication 9. 28. Une méthode pour manipuler le métabolisme du saccharose dans une cellule végétale d'une plante qui stocke le sucre, qui comprend l'étape de cotransformer la cellule avec une construction de gène selon la revendication 9. 29. Une méthode selon la revendication 18, dans laquelle le métabolisme du saccharose dans une plante ou dans une partie de plante qui a la propriété de stocker le sucre et qui contient du sucre stocké, est altéré. 30. Une méthode selon la revendication 16, dans laquelle la plante est la canne à sucre.