Brevet FR2796863A1 — publié le 20010202

PROCEDE ET DISPOSITIF PERMETTANT DE RÉALISER EN FLUX CONTINU UN PROTOCOLE DE TRAITEMENT THERMIQUE SUR UNE SUBSTANCE Domaine technique La présente invention concerne un procédé et un dispositif permettant de réaliser en flux continu un protocole de traitement thermique sur une substance. Elle se rapporte en particulier au domaine de l'analyse biologique ou chimique. Elle peut aussi se rapporter à la modification de paramètres physiques d'une substance. État de la technique antérieure La réalisation en flux continu d'un protocole de traitement thermique sur une substance peut soulever un certain nombre de problèmes. C'est le cas en particulier des protocoles biologiques incluant des étapes de cycles thermiques. A titre d'exemple, dans le domaine de l'analyse génétique, on utilise très largement le procédé de réaction de polymérisation en chaîne ou PCR (de l'anglais Polymerase Chain Reaction). Ce procédé utilise les propriétés physico-chimiques de l'ADN. L'ADN est une macromolécule composée d'un enchaînement de 4 nucléotides différents (A, C, G, T). Les 4 nucléotides sont capables de s'apparier 2 à 2 (A:T et G:C). On parle de complémentarité. Deux brins complémentaires sont capables de s'hybrider et de se séparer successivement à l'infini. L'état double ou simple brin dépend des conditions de pH, de température.... C'est cette capacité d'hybridation et de dénaturation (séparation) successives qui est utilisée au cours de la réaction de PCR (réaction de polymérisation en chaîne). Dans la nature, lors de la division cellulaire, l'ADN est dupliqué de façon à assurer la transmission de l'information génétique. La synthèse de cet ADN est assurée par des enzymes. Il s'agit des ADN polymérises. A partir d'un brin d'ADN matrice, elles incorporent en face de chaque nucléotide celui qui lui est complémentaire, créant ainsi un nouveau brin d'ADN. C'est l'élongation. Pour réaliser cette synthèse, il faut fournir à la polymérise en plus de la matrice et des désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP), une amorce qui permettra d'initier la polymérisation. Cette amorce est un court fragment d'ADN (une vingtaine de nucélotides environ) complémentaire d'une extrémité du fragment d'ADN matrice. Pour obtenir une séquence d'ADN déterminée, il faut deux amorces : une sur chaque brin, de part et d'autre du fragment que l'on veut amplifier. Le procédé PCR exploite les capacités de dénaturation et d'hybridation de l'ADN ainsi que l'élongation par une polymérise. Il utilise le principe suivant. L'ADN est dénaturé par chauffage à 94 C de façon à séparer complètement les deux brins d'ADN et pour éliminer les structures secondaires. Ensuite, l'amorce est hybridée sur le simple brin en abaissant la température (à environ 55 C) afin de permettre l'appariement spécifique. On obtient alors l'élongation d'un brin d'ADN en se plaçant à la température optimale d'activité de la polymérise thermostable, soit 72 C. Après ces trois étapes qui constituent un cycle, on procède à une nouvelle dénaturation. L'ADN néo- synthétisé va servir à son tour de matrice. Les cycles de traitement thermique sont répétés 20 à 30 fois. L'augmentation de la quantité de matrice est exponentielle. D'autres techniques d'amplification dérivées du procédé PCR nécessitent des traitements faisant intervenir des cycles de températures. On peut citer le procédé RT-PCR, le procédé PCR allèle spécifique, etc... On connaît également les techniques de LCR (Ligase Chain Reaction) et les techniques dérivées. On peut également citer les réactions de séquençage cyclique à partir de clones ou de réaction PCR. On peut encore citer les réactions de microséquençage cyclique. Différents dispositifs ont été conçus pour mettre en ceuvre les protocoles biologiques incluant des étapes de cycles thermiques. Dans un type de dispositif connu, l'échantillon biologique est placé dans un réservoir qui est porté successivement aux températures requises pour obtenir les traitement thermiques désirés. Certains dispositifs utilisent un système de thermostatisation par effet Peltier. Le temps de réponse thermique de ces dispositifs est de l'ordre de 3 C/s. La méthode utilisée par ces dispositifs est simple à mettre en ceuvre mais il en résulte des temps de cycle très longs pour réaliser l'ensemble du protocole. Cette solution ne permet pas d'augmenter les vitesses des réactions. L'article "Silicon microchambers for DNA amplification" de J. H. DANIEL et al., Sensors and Actuators A 71, 1998, pages 81-88, décrit une technique de ce type dans un réservoir ouvert, gravé dans un substrat de silicium. Le chauffage du réservoir est obtenu par une résistance électrique formée par un dépôt de platine. Le refroidissement du réservoir est obtenu par conduction permanente sur une plaque froide. Pour améliorer le temps de réponse thermique lors des cycles de température, le réservoir (ou chambre de réaction) est suspendu par des poutres en silicium réalisées par gravure chimique dans le substrat. Le temps de réponse thermique est supérieur à la dizaine de degrés par seconde (de 15 à 40 C/s). La technique utilisée est cependant difficilement compatible avec la notion de laboratoire sur puce où le principe est de faire circuler des liquides entre différentes réactions biologiques. En particulier, il n'est pas possible de travailler à flux continu de liquide biologique. Dans un autre type de dispositif connu, des micro-canaux permettant de faire circuler des fluides biologiques sont micro-usinés sur un substrat de silicium, de verre ou de matériau polymère. Ces micro- canaux ou capillaires permettent de faire circuler en permanence des échantillons. Le fluide traverse successivement des zones à températures fixées suivant les traitements thermiques nécessaires. Cette solution conduit à réaliser les micro-canaux sous forme de serpentins. Une telle solution est décrite par M.U. KOPP et al. dans "Continous flow PCR on a chip", Proceedings of the #iTAS'98 Workshop, Banff, Canada, 13 16 octobre 1998, pages 7-10, Ed. Kluwer Academic Publishers. La figure 1 illustre un dispositif de ce type. I1 s'agit d'une vue de dessus d'un substrat dans lequel un micro-canal 1, représenté de manière figurée, a été formé. Le micro-canal 1 forme un serpentin entre un orifice d'entrée 2 et un orifice de sortie 3. Les références 4, 5 et 6 représentent des zones soumises à des températures T1, T3 et T2 respectivement, par exemple 94 C, 72 C et 55 C respectivement. Le serpentin comporte des sections actives dans lesquelles le fluide à traiter subit le cycle dénaturation-hybridation- élongation, ces sections actives alternant avec des sections passives servant à ramener le fluide dans la zone à température de dénaturation. Un inconvénient majeur de cette disposition est qu'elle impose des limites rédhibitoires à la miniaturisation. En effet, il est nécessaire de disposer d'autant de zones thermiques qu'il y a de températures différentes dans un cycle thermique. De plus, chaque zone thermique doit être séparée d'une distance suffisante d'une autre zone thermique afin de garantir une température uniforme dans les zones isothermes. Un autre obstacle à la miniaturisation est dû au nombre de boucles du serpentin qui correspond au nombre de cycles thermiques désirés (typiquement 20 à 30 cycles pour le procédé PCR). La miniaturisation implique une diminution de la largeur des canaux, ce qui pose des problèmes fluidiques (risques de bouchage, pertes de charge). De plus, à débit de liquide imposé, les vitesses d'écoulement deviennent importantes, ce qui oblige à augmenter les dimensions des zones thermiques. En effet, la longueur d'une zone de chauffe doit être égale au temps de la réaction multiplié par la vitesse du liquide. Le document GB-A-2 325 464 divulgue encore un autre type de dispositif. Dans ce dispositif, la chambre de réaction comporte une pluralité de micro- canaux parallèles, ayant une entrée commune et une sortie commune. Le fluide à traiter passe dans la chambre de réaction et est soumis à trois températures différentes, soit dans trois zones séparées, soit dans une même zone. Le dispositif n'est pas conçu pour travailler en flux continu puisque le fluide est maintenu à l'arrêt durant les étapes du procédé. Au mieux, la circulation du fluide peut être reprise durant l'étape d'élongation. Cette solution implique des moyens séquentiels de mise en circulation du fluide assez complexes et qui doivent être parfaitement coordonnés avec les cycles de température. Aucun des dispositifs de l'art connu ne permet de traiter une substance par un protocole thermique à flux continu de substance circulant et en ayant le meilleur compromis entre les paramètres suivants - surface active minimale pour le dispositif, - débit de substance traitée maximum (volume de réaction par unité de temps), - section de canal maximale pour une surface interne des canaux minimale. Exposé de l'invention La présente invention permet de remédier aux inconvénients des dispositifs de l'art antérieur décrit ci-dessus. Un premier objet de l'invention consiste en un procédé permettant de réaliser en flux continu un protocole de traitement thermique sur une substance, caractérisé en ce qu'il consiste à faire circuler ladite substance dans une zone portée successivement à des températures définies pour soumettre ladite substance à au moins un cycle de température pendant sa circulation dans ladite zone. Avantageusement, la circulation de la substance dans ladite zone se fait selon un chemin rectiligne. Ladite zone peut être portée successivement à des températures définies grâce à des moyens de chauffage et grâce à des moyens de refroidissement. Le cycle de température peut être choisi pour obtenir une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) sur de l'ADN, pour obtenir une réaction chimique de ladite substance, ou pour obtenir une modification d'au moins un paramètre physique de ladite substance. Un deuxième objet de l'invention consiste en un dispositif permettant de réaliser en flux continu un protocole de traitement thermique sur une substance, caractérisé en ce qu'il comprend - des moyens permettant la circulation de ladite substance dans une zone du dispositif, - des moyens pour porter successivement ladite zone à des températures définies pour soumettre ladite substance à au moins un cycle de températures pendant sa circulation dans ladite zone. Avantageusement, les moyens permettant' la circulation de la substance dans ladite zone du dispositif comprennent au moins un canal rectiligne possédant un orifice d'alimentation en ladite substance et un orifice d'évacuation de ladite substance. De préférence, le dispositif comporte un premier élément et un deuxième élément fixés l'un à l'autre selon des faces de contact, la fixation desdits éléments entre eux définissant ledit canal. Selon une première variante, l'un des éléments présente une gravure réalisée à partir de sa face de contact pour définir ledit canal, l'autre élément servant d'élément de fermeture. Selon une deuxième variante, lesdits éléments présentent chacun une gravure réalisée à partir de leur face de contact et destinée à venir en correspondance l'une avec l'autre lors de la fixation des deux éléments l'un à l'autre afin de constituer ledit canal. Avantageusement, les moyens pour porter successivement ladite zone à des températures définies comprennent des moyens de chauffage et des moyens de refroidissement. Les moyens de chauffage peuvent être choisis parmi des éléments rapportés (accolés, collés ou déposés) et des éléments intégrés au dispositif. Au moins l'un desdits éléments peut être constitué par une plaquette de matériau semi conducteur. Dans ce cas, les moyens pour porter successivement ladite zone à des températures définies peuvent comprendre des moyens de chauffage constitués par des zones dopées de la plaquette de matériau semi conducteur, ces zones dopées pouvant être connectées à une source de courant de chauffage. Les moyens de chauffage peuvent aussi être constitués par des dépôts conducteurs pouvant être connectés à une source de courant de chauffage. L'eau et l'air peuvent aussi être utilisés comme moyen de chauffage. Les moyens pour porter successivement ladite zone à des températures définies peuvent comprendre des moyens de refroidissement. Ces moyens de refroidissement peuvent comprendre des circulations de fluide, par exemple de liquide thermostaté ou encore d'air. Ils peuvent aussi comprendre tout autre moyen, par exemple un moyen utilisant l'effet Peltier. Brève description des dessins L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages et particularités apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre, donnée à titre d'exemple non limitatif, accompagnée des dessins annexés parmi lesquels - la figure 1, déjà décrite, illustre un dispositif de réalisation en flux continu de protocoles de traitement thermique pour une application biologique, selon l'art connu ; - la figure 2 illustre, de manière schématique, un dispositif permettant de réaliser en flux continu un protocole de traitement thermique sur une substance selon l'invention ; - la figure 3 est un diagramme montrant l'évolution de la température en fonction du temps de la zone de traitement thermique du dispositif selon l'invention ; - la figure 4 illustre, de manière schématique, un dispositif à plusieurs canaux qui est une variante de la présente invention ; - la figure 5 illustre, de manière schématique, un dispositif selon la présente invention associé à des dispositifs amont et aval ; - la figure 6 illustre, de manière schématique, l'association en série de deux dispositifs selon l'invention pour réaliser deux protocoles thermiques distincts ; - la figure 7 illustre, de manière schématique, l'utilisation d'un dispositif selon la présente invention pour appliquer un protocole thermique à un mélange réalisé en amont du dispositif ; - la figure 8 est une vue en perspective d'un dispositif selon la présente invention réalisé à partir de la gravure d'un substrat de silicium. Description détaillée de modes de réalisation de l'invention La suite de la description va porter, à titre d'exemple, sur la réalisation d'analyseurs biologiques ou chimiques permettant d'effectuer des traitements thermiques cycliques sur des échantillons. La figure 2 est une vue de dessus d'un dispositif selon l'invention dont on n'a représenté que les éléments nécessaires à la compréhension de l'invention. Une vue plus détaillée d'un dispositif selon l'invention sera donnée plus loin. Le dispositif de la figure 2 comprend un canal ou conduit 10 pourvu d'un orifice d'alimentation il et d'un orifice d'évacuation 12. Le canal 10, destiné à véhiculer un fluide à traiter thermiquement, peut être usiné dans un substrat de silicium, de verre, de quartz ou de matériau polymère. I1 peut aussi être constitué d'un tube capillaire. I1 est situé dans une zone 13 dont on contrôle les variations de température. La zone 13 est par exemple soumise à un cycle de température caractéristique du procédé PCR tel que celui représenté à la figure 3. Selon ce cycle de température, la zone 13 est soumise à la température supérieure T1 pendant une durée déterminée, puis à une température inférieure T2 pendant une durée déterminée, ensuite à une température intermédiaire T3 pendant une autre durée déterminée. Un autre cycle peut alors débuter lorsque la zone 13 est soumise à nouveau à la température T1. Le fluide circulant dans le canal 10 en flux continu peut ainsi subir un nombre de cycles de température déterminé. Un échantillon de ce fluide peut par exemple subir, entre son entrée dans la zone 13 et sa sortie de la zone 13, 30 cycles de température T1-T2- T3. Comme le montre la figure 4, un dispositif selon l'invention peut comprendre plusieurs canaux 21, 22, ... traversant une même zone de traitement thermique 20. Dans ce cas, chaque canal possède un orifice d'alimentation en fluide particulier et un orifice d'évacuation de fluide particulier. En utilisation, on peut se servir d'un seul canal parmi la totalité, de plusieurs canaux ou de tous les canaux simultanément, chaque canal étant lui-même un réacteur indépendant. A un dispositif à simple canal ou à multiples canaux selon l'invention, on peut associer d'autres zones à température fixe, c'est-à-dire constante dans le temps, en amont ou en aval du dispositif. Ainsi, la figure 5 montre un dispositif présentant une zone à variation de température 30, du type de celui de la figure 4, comportant des canaux 31, 32, etc. En amont de la zone 30, les canaux traversent une zone 41 portée à une température constante. En aval de la zone 30, les canaux traversent une zone 42 portée à une température également constante. Cette association permet de commencer et de finir le protocole de réactions à des températures imposées et constantes dans le temps. La réalisation de plusieurs protocoles cycliques distincts peut se faire par mise en série d'autant de dispositifs élémentaires selon l'invention. C'est ce que montre la figure 6. La partie A de la figure 6 montre l'association en série de deux dispositifs élémentaires à canaux multiples présentant des zones à variation de température 40 et 50. La partie B de la figure 6 montre que les zones 40 et 50 de chaque dispositif élémentaire sont chacune soumises à des protocoles thermiques différents. Un ensemble comportant des zones à températures fixées (comme pour la figure 5) et des zones à températures variant selon un cycle (comme pour la figure 6) peut également être intégré sur un même support ou substrat. Le dispositif selon l'invention peut inclure un système de mélangeur ou de séparateur en amont ou en aval de la zone à variation de température. La figure 7 illustre un dispositif selon l'invention comportant, en amont de la zone à variation de température 60, un mélangeur 61 constitué par la jonction d'un premier canal 62 véhiculant un premier fluide et d'un deuxième canal 63 véhiculant un deuxième fluide. Après le mélangeur 61, le deuxième canal 63 véhiculant le mélange de fluides traverse la zone à variation de température 60. La figure 8 représente, en vue éclatée, un dispositif à quatre canaux selon la présente invention. Il est constitué par le scellement de deux plaques 70 et 80 effectué selon des faces de mise en contact respectivement 71 et 81. Les plaques 70 et 80 peuvent être en matériau semi-conducteur, en verre ou en plastique. Des rainures rectilignes 72, 73, 74 et 75 peuvent être obtenues par gravure chimique de la plaque 70 ou par une autre méthode d'usinage. La plaque 80 sert d'élément de fermeture pour les rainures afin de constituer des canaux. Elle comporte des ouvertures 82 et 821, 83 et 831, 84 et 841, 85 et 85' venant en vis- à-vis des extrémités des rainures respectivement 72, 73, 74 et 75. L'assemblage des plaques 70 et 80 peut se faire par scellement direct ou par une autre technique de collage. L'ensemble constitué par les plaques 70 et 80 scellées peut être placé sur une plaque chauffante 90 dont on contrôle les cycles de température. Ce contrôle peut être obtenu par l'une quelconque des techniques connues : effet Peltier, effet Joule, rayonnement, convection, conduction. I1 est possible d'intégrer les moyens de chauffage directement sur l'une des deux plaques 70 et 80. Ainsi des résistances chauffantes peuvent être prévues sur l'une des plaques et l'ensemble peut être placé sur une source froide pour évacuer la chaleur. I1 est avantageux d'utiliser des plaques en silicium. Ce matériau est un bon conducteur thermique, ce qui donne des temps de réponse en température très courts. De plus, les techniques du micro-usinage du silicium sont largement connues et permettent de contrôler parfaitement les dimensions des canaux. A titre d'exemple , la largeur des canaux peut être de 100 um mais peut aller de quelques dizaines de um à quelques centaines de um, par exemple 600 an. Leur longueur peut faire plusieurs centimètres. Le nombre de cycles thermiques que subit un liquide est fonction du temps de passage de ce liquide au travers de la zone thermique. I1 peut être important de bien contrôler les débits de liquide dans les canaux. Un bon contrôle peut être facilement obtenu par un pousse-seringue. L'invention permet de modifier facilement les durées des différentes étapes sans avoir à modifier le dispositif ou le mode de thermostatisation. Les durées de ces étapes peuvent être modifiées en agissant sur le débit du fluide à traiter. Des débits très lents peuvent être utilisés puisque la longueur du canal véhiculant le fluide peut être très courte. Ceci apporte beaucoup d'avantages notamment lorsque le fluide est déplacé par pression car les pertes de charge sont beaucoup plus faibles. REVENDICATIONS 1. Procédé permettant de réaliser en flux continu un protocole de traitement thermique sur une substance, caractérisé en ce qu'il consiste à faire circuler ladite substance dans une zone (13,20,30,60) portée successivement à des températures définies pour soumettre ladite substance à au moins un cycle de température pendant sa circulation dans ladite zone. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la circulation de la substance dans ladite zone se fait selon un chemin rectiligne. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite zone est portée successivement à des températures définies grâce à des moyens de chauffage et grâce à des moyens de refroidissement. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le cycle de température est choisi pour obtenir une réaction de .polymérisation en chaîne (PCR) sur de l'ADN. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le cycle de température est choisi pour obtenir une réaction chimique de ladite substance. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le cycle de température est choisi pour obtenir une modification d'au moins un paramètre physique de ladite substance. 7. Dispositif permettant de réaliser en flux continu un protocole de traitement thermique sur une substance, caractérisé en ce qu'il comprend - des moyens (10) permettant la circulation de ladite substance dans une zone (13) du dispositif, - des moyens pour porter successivement ladite zone à des températures définies pour soumettre ladite substance à au moins un cycle de températures pendant sa circulation dans ladite zone. 8. Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que les moyens (10) permettant la circulation de la substance dans ladite zone (13) du dispositif comprennent au moins un canal rectiligne possédant un orifice d'alimentation (11) en ladite substance et un orifice d'évacuation (12) de ladite substance. 9. Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comporte un premier élément (70) et un deuxième élément (80) fixés l'un à l'autre selon des faces de contact (71,81), la fixation desdits éléments entre eux définissant ledit canal (72, 73, 74, 75) . 10. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'un (70) des éléments présente une gravure réalisée à partir de sa face de contact (71) pour définir ledit canal (72,73,74,75), l'autre élément (80) servant d'élément de fermeture. 11. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en ce que lesdits éléments présentent chacun une gravure réalisée à partir de leur face de contact et destinée à venir en correspondance l'une avec l'autre lors de la fixation des deux éléments l'un à l'autre afin de constituer ledit canal. 12. Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que les moyens pour porter successivement ladite zone à des températures définies comprennent des moyens de chauffage et des moyens de refroidissement. 13. Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce que les moyens de chauffage sont choisis parmi des éléments rapportés (90) et des éléments intégrés au dispositif. 14. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'au moins l'un des éléments (70,80) est constitué par une plaquette de matériau semi conducteur. 15. Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce que les moyens pour porter successivement ladite zone à des températures définies comprennent des moyens de chauffage constitués par des zones dopées de la plaquette de matériau semi conducteur, ces zones dopées pouvant être connectées à une source de courant de chauffage. 16. Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que les moyens de chauffage sont constitués par des dépôts conducteurs pouvant être connectés à une source de courant de chauffage. 17. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en ce que les moyens pour porter successivement ladite zone à des températures définies comprennent des moyens de refroidissement.