Brevet FR2801319A1 — publié le 20010525

La présente invention concerne un système régulé de production de protéines d'intérêt, qui permet à la fois une expression de ces protéines en fonction de la pression partielle en oxygène et une modulation par un agent pharmacologique. La régulation des transgènes est un sujet essentiel en thérapie génique. Les protéines thérapeutiques doivent en effet être produites dans des intervalles de concentration plus ou moins larges, la limite inférieure étant représentée par le seuil d'efficacité, la limite supérieure étant la dose toxique à ne pas dépasser. A ce jour, plusieurs systèmes de régulation ont été mis au point. L'expression des gènes peut notamment être contrôlée par la tétracycline, qui bloque l'activité d'une protéine régulatrice, tTa, capable d'activer un transgène en l'absence de l'antibiotique (US 5,814,618 ; Bujard et al, 1992 ; Shockett et al., 1995). L'article Rinsch et al., 1997 mentionne également la possibilité de réguler l'expression des gènes par la tétracycline, mais propose comme alternative un autre système de régulation, qui serait, lui, fonction de la pression partielle en oxygène apporté dans les tissus. La demande de brevet internationale WO 95/21927 divulgue dans ce sens une construction nucléotidique comprenant un transgène lié de manière opérante à une séquence de contrôle de l'expression inductible en hypoxie. Le système décrit vise à faire exprimer des protéines d'intérêt thérapeutique de manière spécifique dans des tissus hypoxiques. Cependant ce système ne prévoit aucun contrôle négatif pourtant primordial pour des raisons de sécurité, pour éviter de dépasser des doses toxiques. Les auteurs de la présente invention ont maintenant conçu un système de régulation qui répond à cette attente, système dont l'activité varie en fonction de l'état d'oxygénation des tissus et qui peut être inhibée par un agent pharmacologique. L'invention a plus particulièrement pour objet une construction d'acide nucléique comprenant au moins une séquence codant pour une protéine régulatrice de l'expression d'au moins un gène d'intérêt, dans laquelle l'activité de ladite protéine régulatrice est modulée en fonction de la présence ou de l'absence d'un agent pharmacologique et la quantité de ladite protéine régulatrice produite est fonction de la pression partielle en oxygène. Par "construction d'acide nucléique", on entend notamment un acide nucléique tel qu'ADN ou ARN, linéaire ou circulaire. Il peut s'agir par exemple d'un plasmide ou d'un vecteur viral modifié, tel qu'un vecteur adénovirus. Par "pression partielle en oxygène", on entend la pression partielle en oxygène dans les cellules dans lesquelles les constructions d'acide nucléique de l'invention sont transférées. Par "protéine régulatrice", on entend toute protéine capable d'activer la transcription dans des cellules eucaryotes (on parle alors de trasactivateur) ou toute protéine capable d'inhiber cette transcription (on parle alors de répresseur). De manière préférentielle, ladite protéine régulatrice est une protéine activatrice de l'expression dudit gène d'intérêt dans des conditions hypoxiques et en l'absence dudit agent pharmacologique. Dans un premier mode de réalisation de l'invention, ladite séquence codant pour une protéine régulatrice peut être associée à au moins un élément, désigné élément H , placé en amont ou en aval de ladite séquence, ledit élément H permettant une expression de la protéine régulatrice inductible dans des conditions hypoxiques. Les éléments H permettant une expression inductible dans des conditions hypoxiques peuvent être constitués de "HRE" ("Hypoxia Response Element"). Cet élément régulateur HRE des gènes induits par l'hypoxie a été identifié grâce à l'étude de la régulation du gène codant pour l'érythropoïétine (EPO). Situé en 3' de sa phase ouverte de lecture, il est reconnu par le complexe protéique transactivateur HIF1 ("Hypoxia Inducible Factor") dont l'activité de liaison à l'ADN dépend de la pression partielle en oxygène (Semenza et al., 1992). L'élément de réponse à l'oxygène HRE est nécessaire à l'induction hypoxique du gène de l'érythropoïétine dans le foie foetal, le rein et des lignées cellulaires hépatiques. Egalement présent dans d'autres gènes, il est reconnu par le complexe HIF1 dans tous les types cellulaires étudiés (Wang et al., 1993). La séquence consensus présente dans l'ensemble des gènes inductibles est la suivante : 5'-RCGTG-3' (Semenza et al., 1996). Elle constitue l'élément HRE. De préférence, au moins un élément HRE est placé en amont de ladite séquence codant pour une protéine régulatrice. De manière avantageuse, la construction selon l'invention comprend une ou plusieurs copies des éléments permettant une induction de l'expression dans des conditions hypoxiques, de préférence environ dix copies. La construction de l'invention peut également comprendre une ou plusieurs copies de tels éléments placées en aval de la séquence codant pour la protéine régulatrice. Dans un deuxième mode de réalisation de l'invention, on peut, en association avec ledit élément H ou indépendamment (en l'absence) de celui-ci, fournir une construction d'acide nucléique, dans laquelle ladite séquence codant pour une protéine régulatrice comprend au moins un élément, désigné élément D , qui déstabilise la protéine régulatrice en normoxie. Un tel élément D peut être notamment un fragment de la protéine HIF1a, en particulier une séquence codant pour tout ou partie du domaine ODD de 200 acides aminés de la protéine HIF1a,. L'ensemble des processus cellulaires résultant de la diminution de la concentration en oxygène ont pour effet la modulation de l'activité du complexe HIF1. L'activation de HIF1 nécessite non pas que le gène soit transcrit plus qu'il ne l'est déjà en normoxie mais que la protéine soit stabilisée et modifiée (Semenza et al., 1992). Lorsque des cellules Hep3B ou HeLa sont cultivées en hypoxie la quantité de HIF1[alpha] augmente considérablement et très rapidement (induction maximale en moins de 4 heures). Après retour en normoxie, la sous unité a disparaît en moins de 15 minutes. L'hypoxie a pour effet d'augmenter la stabilité de la protéine HIF1a. La protéine est dégradée en permanence en normoxie, la protéolyse étant due à la reconnaissance de HIF1a par l'ubiquitine puis à la dégradation du complexe par le protéasome (Salceda et al., 1997 ; Huang et al., 1998). Une région de 200 acides aminés de HIF1 a, le domaine ODD ("oxygen-dependant degradation") est la cible de la dégradation. Privé de ce domaine, HIF1a se lie à ARNT et active constitutivement l'expression de gènes contrôlés par un motif HRE (Huang et al., 1998). Ce domaine de 200 acides aminés a été étudié en terme de capacité de transactivation et d'induction (Jiang et al., 1997 ; Pugh et al., 1997). La région 549 à 575 de la protéine HIF1a d'origine humaine contient un domaine de transactivation relativement faible, inductible en hypoxie. L'inductibilité est principalement liée à la diminution de la stabilité de la protéine en normoxie, condition dans laquelle cette petite région protéique est la cible du protéasome (Salceda et al., 1997 ; Huang et al., 1998). L'agent pharmacologique utilisé peut être notamment la tétracycline, ladite séquence codant pour une protéine régularice de l'expression d'un gène d'intérêt comprenant alors avantageusement un élément tetR, du système de résistance à la tétracycline du transposon bactérien Tn10. Dans les bactéries contenant ce transposon, en l'absence de tétracycline, la protéine TetR se lie sous forme d'un dimère à des séquences opératrices situées dans l'opéron tétracycline, bloquant ainsi la transcription du gène codant pour la protéine de résistance à la tétracycline. En présence de l'antibiotique, le tetR ne peut plus se lier aux séquences opératrices ; l'effet inhibiteur sur la transcription du gène de résistance est alors aboli. En 1992, Gossen et Bujard ont réalisé la fusion des protéines tetR et VP16 (protéine du virus Herpes Simplex Virus essentielle à la transcription des gènes viraux précoces). Dans des cellules eucaryotes génétiquement modifiées, la protéine chimérique résultante (tTA: "Tetracycline controlled TransActivator") est capable d'activer l'expression de gènes rapporteurs situés en aval de séquences opératrices tetO. En présence de tétracycline la protéine chimérique tTA ne se lie pas à tetO et n'active pas la transcription de ses gènes cibles. Selon un mode de réalisation préféré, on utilise l'ensemble tTA, comme séquence codant pour une protéine régulatrice permettant une inhibition de l'expression par la tétracycline. De manière avantageuse, un élément D déstabilisant le transactivateur en normoxie peut être introduit dans tTA, par exemple entre les séquences codant pour tetR et VP16. On peut également utiliser conformément à la présente invention, des éléments d'un système inductible par la tétracycline qui dérivent, par modifications, de l'opéron contenant les séquences décrites ci-dessus (Gossen et al, 1995). De telles modifications ne sont admissibles que si elles n'affectent pas de manière sensible la fonctionnalité du système. L'agent pharmacologique utilisé peut être également un analogue de la tétracycline, tel que l'anhydrotétracycline, la doxycycline, la chlorotétracycline, l'épioxytétracycline, etc. La construction d'acide nucléique de l'invention portant le système de régulation décrit précédemment, peut être utilisée pour moduler l'expression d'au moins un gène d'intérêt, codant pour une protéine elle-même désignée "protéine d'intérêt", qui peut être une protéine endogène et/ou une protéine recombinante. Dans ce dernier cas, deux modes de réalisation sont possibles: (a) soit on insert dans la construction d'acide nucléique comprenant le système de régulation au moins une séquence codant pour une protéine recombinante d'intérêt, dont l'expression est régulée par la protéine régulatrice telle que définie précédemment ; (b) soit on associe à la construction d'acide nucléique comprenant le système de régulation tel que décrit précédemment, une deuxième construction d'acide nucléique comprenant au moins une séquence codant pour une protéine recombinante d'intérêt, dont l'expression est régulée par la protéine régulatrice telle que définie précédemment. L'invention a donc plus particulièrement pour objet, dans le premier mode de réalisation ci-dessus (a), une construction d'acide nucléique telle que définie précédemment comprenant en outre une séquence codant pour une protéine recombinante d'intérêt, dont l'expression est régulée par ladite protéine régulatrice. L'invention a en outre pour objet, dans le deuxième mode de réalisation (b), une composition d'acide nucléique, comprenant : i) une construction d'acide nucléique comprenant au moins une séquence codant pour une protéine régulatrice de l'expression d'au moins un gène d'intérêt, dans laquelle l'activité de ladite protéine régulatrice est inhibée en présence d'un agent pharmacologique et la quantité de ladite protéine régulatrice produite est fonction de la pression partielle en oxygène ;et ii) une construction d'acide nucléique comprenant au moins une séquence codant pour une protéine recombinante d'intérêt, dont l'expression est régulée par la protéine régulatrice portée par la construction d'acide nucléique du point i). L'invention a également pour objet un kit pour la production régulée d'au moins une protéine d'intérêt, comprenant : i) un premier récipient contenant une construction d'acide nucléique comprenant au moins une séquence codant pour une protéine régulatrice de l'expression d'au moins un gène d'intérêt, dans laquelle l'activité de ladite protéine régulatrice est inhibée en présence d'un agent pharmacologique et la quantité de ladite protéine régulatrice produite est fonction de la pression partielle en oxygène ; et ii) un second récipient contenant une construction d'acide nucléique comprenant au moins une séquence codant pour une protéine recombinante d'intérêt, dont l'expression est régulée par la protéine régulatrice portée par la construction d'acide nucléique du point i). Dans tous les cas, l'expression de la protéine recombinante d'intérêt doit pouvoir être modulée par ladite protéine régulatrice. Pour cela, la séquence nucléotidique codant pour la protéine recombinante est associée à des éléments cibles de la protéine régulatrice. Lorsque la protéine régulatrice comprend un élément tetR, la protéine recombinante d'intérêt est associée à un élément opérateur cible tetO. Un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention vise un système à deux vecteurs, à savoir une composition ou un kit comprenant : - une construction d'acide nucléique comprenant, d'amont en aval : dix motifs HRE, une séquence promoteur et le transactivateur tTA modifié par la présence d'un élément déstabilisant la protéine en normoxie, et - une construction d'acide nucléique comprenant, d'amont en aval, une séquence opératrice tetO, une séquence promoteur et une séquence codant pour une protéine d'intérêt. Le système de régulation de l'invention permet un degré élevé de régulation, sans atténuer l'expression du gène d'intérêt, qui peut au contraire être très forte. Ladite protéine d'intérêt peut être une protéine d'intérêt thérapeutique. Il peut par exemple s'agir de l'érythropoïétine (EPO), particulièrement utile dans le traitement des anémies ou bien d'un facteur stimulant la prolifération des cellules endothéliales, utile dans le traitement des ischémies. Il peut également s'agir d'une protéine cytotoxique ou cytostatique présentant une action contre la prolifération ou la survie de cellules indésirables, particulièrement utile dans le traitement des tumeurs, en particulier des tumeurs solides, comme des interleukines ou des interférons. La protéine d'intérêt peut aussi être une protéine capable de transformer une pro-drogue en un médicament efficace contre la prolifération ou la survie de cellules indésirables comme les cellules tumorales. Il est en outre possible d'utiliser la construction d'acide nucléique de l'invention comprenant au moins une séquence codant pour une protéine régulatrice de l'expression d'au moins un gène d'intérêt, dans laquelle l'activité de ladite protéine régulatrice est modulée en fonction de la présence ou de l'absence d'un agent pharmacologique et la quantité de ladite protéine régulatrice produite est fonction de la pression partielle en oxygène, pour moduler l'expression d'au moins une protéine endogène d'intérêt. A cette fin, on choisit ou on construit une séquence codant pour une protéine régulatrice de façon à ce que celle-ci puisse agir de manière spécifique sur le promoteur de la ou des protéines endogènes d'intérêt. Les constructions et compositions nucléotidiques selon l'invention sont utiles comme médicament, dans le cadre d'une thérapie génique. L'invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins une construction d'acide nucléique telle que définie précédemment, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation d'une construction d'acide nucléique ou d'une composition selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement, chez un patient, d'affections impliquant une hypoxie cellulaire. Parmi de telles affections, on peut citer notamment une anémie, une ischémie ou un cancer. L'invention a enfin pour objet une méthode de traitement thérapeutique dans laquelle on administre à un patient nécessitant un tel traitement une quantité efficace d'une composition ou d'une construction nucléotidique telle que décrite ci-dessus. Les constructions d'acide nucléique selon l'invention peuvent être administrées à un vertébré sous la forme d'un vecteur viral, ou peuvent être administrées en tant que telles. Les vertébrés visés sont de préférence des mammifères, de préférence encore des humains. La construction ou composition d'acide nucléique de l'invention peut en particulier être utilisée sous une forme nue, exempt de tout véhicule favorisant le transfert à la cellule cible, tels que des liposomes anioniques, des lipides cationiques, des microparticules, par exemple des microparticules d'or, des agents de précipitation, par exemple du phosphate de calcium, ou tout autre agent facilitant la transfection. Dans ce cas, le polynucléotide peut être simplement dilué dans une solution physiologiquement acceptable, telle qu'une solution stérile ou une solution stérile tampon, en présence ou en l'absence d'un véhicule. De manière alternative, une construction d'acide nucléique de l'invention peut être associée à des agents qui facilitent la transfection. Elle peut être, entre autres , (i) associée à un agent chimique qui modifie la perméabilité cellulaire tel que la bupivacaïne ; (ii) encapsulée dans des liposomes, éventuellement en présence de substances supplémentaires facilitant la transfection ; ou (iii) associée à des lipides cationiques ou des microparticules de silice, d'or ou de tungstène. Lorsque les constructions d'acide nucléique de l'invention recouvrent des microparticules, celles-ci peuvent être injectées par voie intradermique ou intraépidermique par la technique du canon à gènes, "gene gun" (WO 94/24263). La quantité à utiliser comme médicament dépend notamment de la construction d'acide nucléique elle-même, de l'individu auquel cet acide nucléique est administré, du mode d'administration et du type de formulation, et de la pathologie. De manière générale, une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace variant d'environ 0,1 g à environ 1 mg, de préférence d'environ 1 g à environ 800 g et, de manière préférentielle d'environ 25 g à environ 250 g, peut être administrée à des adultes humains. Les constructions d'acides nucléiques de l'invention peuvent être administrées par toute voie d'administration conventionnelle telle que notamment par voie parentérale. Le choix de la voie d'administration dépend en particulier de la formulation choisie, mais aussi de l'affection à traiter. Dans le cas d'un traitement d'une tumeur solide, il est avantageux d'injecter les constructions de l'invention au site de la tumeur. L'invention a également pour objet une cellule hôte modifiée par une construction d'acide nucléique telle que définie précédemment. Une telle cellule modifiée peut notamment être clonée. Il peut s'agir de lignées cellulaires, de cellules primaires, par exemple de type myoblastes ou fibroblastes. Des cellules eucaryotes modifiées ex vivo peuvent être utiles en vue d'une implantation chez des animaux ou humains receveurs. Il peut dans ce cas par exemple s'agir de cellules de mammifères de type myoblastes, fibroblastes ou de cellules hématopoïétiques. La présente invention a donc également pour objet un procédé d'obtention d'une cellule eucaryote modifiée ex vivo dans lequel on transfert au moins une construction d'acide nucléique telle que définie précédemment dans une cellule, de telle sorte que ladite construction pénètre de manière stable dans le noyau de ladite cellule. Une cellule peut également être modifiée par la présence d'au moins deux vecteurs : - l'un consistant en une construction d'acide nucléique comprenant au moins une séquence codant pour une protéine régulatrice de l'expression d'un gène d'intérêt, dans laquelle l'activité de ladite protéine régulatrice est inhibée en présence d'un agent pharmacologique et la quantité de ladite protéine régulatrice produite est fonction de la pression partielle en oxygène, - l'autre consistant en une construction d'acide nucléique comprenant une séquence codant pour une protéine recombinante d'intérêt, dont l'expression est régulée par ladite protéine régulatrice. Dans le cadre d'une thérapie "cellulaire", la présente invention a également pour objet une méthode de traitement thérapeutique dans laquelle on implante des cellules ainsi modifiées à des patients receveurs. De manière avantageuse, des cellules souches hématopoïétiques transformées produisant de l'érythropoïétine sous le contrôle du système de régulation tel que décrit précédemment peuvent par exemple être implantées chez des patients atteints d'anémie chronique. Les modes d'implantation des cellules dépendent notamment du type de cellules et de l'affection visée. Des cellules telles que des myoblastes ou fibroblastes peuvent être avantageusement incorporées dans des capsules biocompatibles. Parmi les systèmes capsulaires pouvant être utilisés, on peut citer notamment l'AN69 (poly(acrylonitrile-méthallylsulfonate de sodium), Serguera et al, 1999), le PTFE (polytétrafluoroéthylène, Brauker et al, 1998), LAPA (Alginate polylysine alginate, Hortelano et al, 1996), le silicone (Page et al, 1997), le polypropylène (Sagot et al, 1995), le PAN/PVC (polyacrylonitrile, polychlorure de vinyle, Kordower et al, 1997), le PES (polyéthersulfone, Rinsch et al, 1997) ou encore l'agarose (Taniguchi et al, 1997). Puis ces capsules peuvent être implantées en sous-cutané, en intrapéritonéal ou tout autre endroit approprié, compatible avec la thérapie envisagée. Les figures et exemples ci-après illustrent l'invention sans en limiter la portée. LEGENDES DES FIGURES : La figure 1 représente les schémas des constructions d'acides nucléiques de l'invention : vecteurs 3A, 8A, 12A et 12A-hH104 tels que décrits dans l'exemple 1 ci-après. La figure 2 représente un schéma illustrant l'association de 10 fragments double-brins (contenant la région du promoteur de PGK1 conférant l'inductibilité hypoxique) après clonage au site Sali de pBluescript Il KS +. L'orientation des flèches suit le sens de la séquence telle qu'elle se présente dans le promoteur du gène PGK1 murin, de l'amont vers l'aval. Dans les plasmides associant tTAk et HRE10, l'orientation est toujours la même : Clal vers Bsp120l de 5' vers 3' par rapport à tTAk. La figure 3 représente un graphe illustrant le résultat d'une expérience de transfections réalisées en parallèle avec cinq différents plasmides (20ng) contenant de multiples HREs placés en amont, ou en amont et en aval par rapport au transactivateur, 400ng de plasmide rapporteur et 50ng de plasmide pCMVss-Gal. Les deux dernières colonnes représentent l'expression du rapporteur en l'absence de transactivateur (bruit de fond). Les inductions sont indiquées pour chaque vecteur sur la première ligne. Les valeurs relatives Luciférase/-galactosidase en normoxie et en hypoxie sont indiquées sur les troisième et quatrième lignes. La figure 4A représente un graphe illustrant le résultat d'une étude de l'induction hypoxique en fonction du ratio rapporteur/transactivateur. La figure 4B représente un graphe illustrant le résultat d'une étude de l'effet de la présence d'un fragment déstabilisateur dans le transactivateur. Les cellules ont été transfectées avec 5 à 100ng des plasmides contenant le transactivateur sous contrôle des éléments HREs, 400ng de pTRE-Luc et 50ng de pCMV-pGal. Les barres d'erreur représentent l'écart type entre deux valeurs. Les quantités du plasmide transactivateur sont indiqués en-dessous du graphique, sur la première ligne. Les inductions hypoxiques sont indiquées sur la deuxième ligne. L'avant-dernière série de valeurs (-TA) correspond à l'expression du rapporteur en l'absence de transactivateur. La dernière série représente le niveau d'expression que l'on peut atteindre avec le plasmide pTet-tTAk (Schockett et al., 1995) non modifié par la présence des HREs. La figure 5 représente un graphique illustrant la double régulation, pharmacologique et hypoxique, en fonction de la quantité des plasmides 3A ou ptet-tTak. Les cellules ont été transfectées soit avec 5,20 ou 100 ng des plasmides transactivateurs 3A ou ptet-tTAk, 400ng de plasmide rapporteur pTRE-Luc et 50ng de plasmide normalisateur pCMV-pGal, soit avec 400ng de pGL3 et 50 ng de pCMV-pGal soit avec 400 ng de pTRE-Luc et 50 ng de pCMV-ssGal mais sans transactivateur (-TA). En dessous du graphique, sont indiqués les quantités de plasmides transactivateurs transfectés (5,20 ou 100 ng), l'induction hypoxique en l'absence de tétracycline (Hypo/Normo, -tet) et en présence de tétracycline (Hypo/Normo, +tet) ainsi que le degré d'inhibition de l'expression par la tétracycline en hypoxie (-/+tet, Hypo) et en normoxie (-/+tet, Normo). Les barres d'erreur représentent les écarts types calculés sur les résultats d'une expérience réalisée en triplicate. Est également annexé un listing de séquences, dans lequel la séquence SEQ ID n 1 représente la séquence de la phase ouverte de lecture de tTAk-hH104 (après introduction du fragment hH104 dans tTAk au site BsiWI correspondant à la séquence CGTACG). La séquence correspondant aux 104 acides aminés de HIF1a ainsi que les sites BsiWI sont surlignés et noircis. Les séquences SEQ ID n 3,4, 5,6, 7 et 8 correspondent aux oligonucléotides HRE1, HRE2, hH1, hH3, PTAK5 et PTAK6 respectivement. EXEMPLES : # - Constructions d'acides nucléiques : 1) Matériels : a) Plasmides pBluescript Il KS+ (Stratagene 212207), pTet-tTak et pTet-splice (Gibco, 10583-011), pTRE-Luc (Clontech, K1620-1), pTK-hygro (Clontech, 6153-1), pCMV-pGal (Stratagene, 200 388) et pGL3-Control (Promega, E1741) ont été achetés. pTet-tTak est une version modifiée (Shockett et al., 1995) du vecteur décrit en 1992 (Gossen et al., 1992). Il contient l'élément tetO et le promoteur minimal CMV en place du promoteur/enhancer CMV. Quelques nucléotides ont été modifiés de façon à ce que le premier ATG de tTA soit dans un contexte Kozak (tTAk). En aval de tTAk se trouvent la séquence intronique de l'Antigène petit t et la séquence de polyadénylation précoce de SV40. b) Cellules L'ensemble des constructions a été réalisé dans des cellules E.Coli JM109 (Promega) ou DH5[alpha] (Clontech). c) oligonucléotides (Genset) HRE1: 5'TCGAGTGTCACGTCCTGCACGACG3' (SEQ ID n 3) HRE2 : 5'TCGACGTCGTGCAGGACGTGACAC3' (SEQ ID n 4) hH1: 5' CAATCGTACGCCATTCAAGTTGGAATTGGTAGAAAAAC3' (SEQ ID n 5) hH3 : 5' TCAACGTACGAGGGTCTTCCATACGGTCTTTTGTCAC3' (SEQ ID n 6) PTAK5: 5'GGCCTTGAATTGATCATATGC3' (SEQ ID n 7) PTAK6 : 5'GTCGTCGTCCGGGAGATC3' (SEQ ID n 8) 2) Association HRE et tTAk a) pBS-HRE10 Les oligonucléotides HRE1 et HRE2 ont été phosphorylés, hybridés l'un sur l'autre puis sous-clonés au site Sali de pBluescript Il KS+. Après étude du nombre et de l'orientation des hybrides HRE1/HRE2, un plasmide contenant 10 copies de l'hybride (plasmide pBS-HRE10) a été sélectionné. Ce plasmide contient 10 fois la séquence suivante : (-313) 5'-CGTCGTGCAGGACGTGACA-3' (-295) (SEQ ID n 9) 3'-GCAGCACGTCCTGCACTGT-5' (SEQ ID n 10) Les numéros-295 et-313 correspondent aux positions des bases par rapport à l'ATG initiateur de la phase ouverte de lecture du gène PGK1 murin. La séquence-312 à-295 correspond à celle de l'oligonucléotide P18 capable de conférer à un promoteur minimal une inductibilité hypoxique (Firth et al., 1994, Dachs et al., 1997). La figure 2 illustre l'orientation des hybrides tels qu'ils ont été sous-clonés dans le plasmide pBluescript Il KS+, de T3 vers T7. L'orientation des flèches suit le sens de la séquence telle qu'elle se présente dans le promoteur du gène PGK1 murin, de l'amont vers l'aval. b) Fragments HRE10 B-CIK (Bsp120l-Clal/Klenow) et HRE10 A-H/K (Asp718l-HindIII/Klenow) Le plasmide pBS-HRE10 a été digéré par Bsp1201 + Clal ou bien par Asp7181 + Hindlll. Les extrémités cohésives des fragments contenant 10 copies de l'hybride HRE1/HRE2 ont été remplies par la Klenow puis purifiés . c) pHRE10(TATA)-tTAK (vecteur 3A) La boîte tetO (fragment Xhol-Stul) contenue dans le plasmide pTet-tTak a été éliminée et le site Xhol a été rempli par la Klenow. Le fragment HRE10 B-C/K a ensuite été introduit à la place des éléments tetO. le plasmide résultant contient 10 éléments de réponse à l'hypoxie situés en amont de la boîte TATA du promoteur CMV et de la phase ouverte de lecture de tTAk. d) pBSHRE10(TATA)-tTAk (vecteur 8A) Le fragment Stul/Notl de pTet-tTAk (boîte TATA + tTAk + intron + signal de polyadénylation) a été inséré dans pBS-HREio digéré par EcorV et Notl. Le plasmide résultant contient 10 éléments de réponse à l'hypoxie situés en amont de la boîte TATA du promoteur CMV et de la phase ouverte de lecture de tTAk et est très similaire au vecteur 3A. e) pBS(TATA)-tTAk Le fragment Stul/Notl de pTet-tTAk (boîte TATA + tTAk + intron + signal de polyadénylation) a été inséré dans pBluescript KS Il+ digéré par EcorV et Notl. f) Fragment 3'UTR-HREm Le fragment HRE10 A-H/K a été introduit au site Notl de pBS (TATA)tTAk dont les extrémités ont été rendues franches. Le plasmide résultant contient 10 éléments de réponse à l'hypoxie situés en aval du signal de polyadénylation précoce de SV40. Ce plasmide a ensuite été digéré par Spel et Nael et le fragment contenant l'intron, la séquence de polyadénylation ainsi que les 10 copies HRE a été purifié. g) pHRE10(TATA)-tTAkHRE10 (vecteur 12A) Le fragment 3'UTR-HREio a été introduit en place de l'intron et du signal de polyadénylation du plasmide 3A (digéré par Spel et Nael). Le plasmide résultant contient de 5' vers 3' : HRE, une boîte TATA, la phase ouverte de lecture de tTAk, un intron, un signal de polyadénylation et 10 autres HRE. 3) Association hH104. HRE et tTAk a) Production du fragment hH104 par PCR De l'ADNc obtenu à partir de cellules humaines tumorales mamaires a été préparé et soumis à 30 cycles d'amplification 30" 94 c, 30" 50 C, 30" 72 C avec le système "Expand High Fidelity PCR system" (Roche), en présence des oligonucléotides hH1 et hH3. Le produit de PCR a été digéré par BsiWI. b) Plasmide pTet(TATA)-hH104tTAk Le fragment hH104 digéré par BsiWI a été introduit au site BsiWI du plasmide pTet-tTAk, situé dans la phase ouverte de lecture de tTAk entre le domaine de liaison à l'ADN tetR et le domaine de transactivation VP16. Ce fragment contient 104 acides aminés issus de hHIF1 (aa 531 à 634). L'orientation et la séquence de hH104 ont été vérifiées par séquençage à l'aide des amorces HH1, HH3, PTAK5 et PTAK6. PTAK 5 et 6 sont situées de part et d'autre de hH104, dans tTA. La protéine résultante contient 444 acides aminés: tTAk (336 acides aminés) plus 108 aminoacides dont 104 appartenant à HIF1, une proline à chaque extrémité et deux aminoacides supplémentaires du fait de la création d'un deuxième site BsiWI (Arginine et Thréonine). c) Plasmides pHRE10(TATA)-hH104tTAkHRE10 (Vecteur 12AhH104) Le fragment Ndel-Spel de pTet(TATA)-hH104tTAk a été introduit dans le vecteur 12A digéré par Ndel et Spel. 4) Association pTet et érvthropoïétine murine : plasmide pTetmEPO L'ADNc de l'érythropoïétine murine se trouvant dans le plasmide pBluescript (Naffakh et al., 1995) a été purifié après digestion par Asp7181, remplissage de l'extrémité cohésive puis digestion par Sali et introduit entre les sites Sali et EcorV de pTet-Splice. Il - Induction hypoxique après transfection transitoire : 1 ) Matériel cellules C2C12 Cellules d'une lignée de myoblastes murins (ATCC, CRL-1772) cultivée dans : DMEM (Gibco), SVF 10% (Hyclone), pénicilline 100 iu/mi (Gibco), streptomycine 100 g/ml (Gibco), glutamine 2mM (Gibco). 2) Méthodes a) Transfections transitoires 50000 cellules C2C12 sont ensemencées par puits dans une plaque de 24 puits (T. P.P., ATGC). Le lendemain, les cellules sont transfectées avec de la polyéthylènimine (PEI: ExGen500, EUROMEDEX) de la façon suivante : les cellules sont rincées deux fois avec du PBS 1X puis mises en présence de 200 l d'OptiMEM (Gibco). Dans un tube A sont dispensés 2,5 l de PEI et 7,5 l de NaCI 0,9 % ; dansun tube B 300 à 600ng de plasmide sont dilués dans 10 l de NaCI 0,9 %. Les 10 l du tube A sont mélangés aux 10 l du tube B. Au bout de 10 minutes, 20 l du mélange de transfection sont répartis dans chaque puits à transfecter. Au bout de 2 heures, 1 ml de milieu de culture avec 10 % SVF est ajouté à chaque puits. Les surnageants de culture ainsi que les cellules sont récupérés environ 36 heures plus tard pour analyse. b) Dosage de la luciférase après transfections transitoires Pour mesurer l'efficacité de la régulation de l'expression du transactivateur dans différentes conditions (normoxie, hypoxie), les cellules sont transitoirement cotransfectées avec trois plasmides : l'un contient le transactivateur avec éventuellement les systèmes de régulation, l'autre est un vecteur rapporteur codant pour la luciférase (pTRE-luc), le troisième code pour la ss-galactosidase sous contrôle du promoteur/enhancer CMV et permet de normaliser les résultats les uns par rapport aux autres. Les activités luciférase et ss-galactosidase sont dosées respectivement avec le "Luciferase Assay Reagent" (Promega) et le "p-Gal reporter gene assay" (Roche). 3) Résultats : a) Effet de la présence des hybrides HRE sur l'expression du transactivateur tTAk Dans les vecteurs 3A et 8A, dix éléments successifs du promoteur du gène PGK1 murin sont situés en amont de la boîte TATA et de tTAk. Le vecteur 12A combine deux séries de ces éléments, en amont et en aval de tTAk. Afin de définir le meilleur vecteur en terme d'efficacité d'expression et de régulation dans des cellules musculaires murines, les auteurs de l'invention ont transfecté des cellules C2C12 avec trois types de plasmides: 20ng de vecteur codant pour le transactivateur régulé (TA), 400ng de pTRE-Luc (rapporteur) et 50ng pCMV-pGal (normalisateur). Les résultats sont présentés à la figure 3. S'il n'y a pas assez de rapporteur (par rapport à la quantité de transactivateur), il n'est pas possible de définir l'induction optimale. Pour cette raison les auteurs de l'invention ont étudié l'efficacité d'expression et d'induction en fonction de la quantité de transactivateur (5 à 100ng) et pour une quantité fixe de rapporteur (400ng). Les résultats de la figure 4A montrent qu'il existe un rapport optimal transactivateur/rapporteur. L'inductibilité maximale est obtenue avec 1/80ème à 1/20ème de transactivateur. Au delà, la quantité de rapporteur n'est plus suffisante pour satisfaire au grand nombre de molécules de transactivateur produites en hypoxie. Il s'en suit une augmentation plus rapide de l'expression en normoxie qu'en hypoxie et donc une diminution de l'induction. Dans cette expérience, il est à noter que les niveaux d'expression atteints par les vecteurs 3A, 8A et 12A peuvent être aussi forts que celui atteint avec 100ng du vecteur d'origine, pTet-tTAk. Il faut cependant 50 à 100ng de plasmide transactivateur pour égaler ce niveau, quantité pour laquelle l'induction n'est plus optimale. b) Effet de la présence d'un fragment déstabilisant sur le degré d'induction De façon à obtenir un niveau d'expression maximal (tel qu'il l'est avec 50 à 100ng de plasmide transactivateur) mais un niveau induit toujours élevé, un élément de déstabilisation protéique a été introduit dans le transactivateur. Théoriquement cet élément (hH104) est ubiquitinilé et dégradé par le protéasome en normoxie. Les résultats comparatifs de l'étude de l'expression de deux vecteurs, 12A et 12A-hH104 sont présentés figure 4B. Pour 100 ng de plasmide transactivateur, on observe une inductibilité quatre à cinq fois plus forte en présence de cet élément qu'en son absence. Ainsi grâce à l'introduction d'une partie de HIF1a dans le transactivateur tTAk, il est possible d'atteindre un haut niveau d'expression hypoxique tout en maintenant une expression minimale en normoxie. III - Régulation physiologique et pharmacologique en transfection transitoire 1 ) Matériel Identique à celui du paragraphe Il et tétracycline (Sigma, T-7660) 2) Méthodes Identiques à celles utilisées au paragraphe Il. La tétracycline est ajoutée aux milieux de culture à raison de 1 g/ml, après les deux heures de transfection. 3) Résultats Les degrés d'expression ainsi que les capacités du système de régulation à permettre à la fois l'induction hypoxique et l'inhibition pharmacologique de l'expression du gène rapporteur ont été étudiés par exemple par comparaison des vecteurs 3A et pTet-tTAk (figure 5). Les résultats obtenus confirment : - que le niveau d'expression obtenu en hypoxie avec le plasmide 3A est au moins aussi fort sinon plus qu'avec le vecteur d'origine ptet-tTAk. - que l'induction hypoxique est d'autant plus importante que la quantité de plasmide transactivateur 3A est faible. et montrent: - que les niveaux d'expression obtenus avec les plasmides 3A et ptettTAk sont largement supérieurs à ce que l'on observe avec une quantité équivalente d'un vecteur contenant le gène de la luciférase sous contrôle d'un promoteur et d'un enhancer issu du génome du virus SV40 (pGL3). - que la présence de tétracycline dans les milieux de culture permet d'inhiber totalement l'activité du transactivateur, que ce soit en normoxie ou en hypoxie (on peut dans ce sens comparer les niveaux d'expression atteints avec les vecteurs 3A ou ptet-tTAk, en normoxie ou en hypoxie sous tétracycline et les niveaux observés dans les mêmes conditions en l'absence de transactivateur). IV - Régulation physiologique et pharmacologique en transfection stable 1) Matériel : cellules DAE7 cellules d'un sous clone issu de la lignée cellulaire Da-1 (Setoguchi et al., 1987). Cellules proliférant dans le même milieu que celui dans lequel prolifèrent les cellules C2C12, avec en plus 2 u/ml d'érythropoïétine. 2) Méthodes : a) Transfections stables 100 000 cellules C2C12 sont ensemencées dans une boîte de pétri (10 cm, Beckton). Le lendemain les cellules sont transfectées de la façon suivante : dans le tube A sont dispensés 20 g d'ADN dans 750 l d'OptiMEM (Gibco). Dans le tube B 60 l de lipofectamine (Gibco) sont dilués dans 690 l d'OptiMEM. La solution B est mélangée à la solution A. Au bout de 45 minutes, 4,5 ml d'OptiMEM sont ajoutés au mélange de transfection. Les cellules sont rincées deux fois par une solution de PBS 1X puis mises en présence des 6 ml issus du mélange de transfection. Au bout de 2 heures, 24 ml de milieu de culture avec 10 % de sérum de veau foetal sont ajoutés à la boîte. Le milieu est changé 6 heures après la transfection. Au bout de 2 jours, les cellules sont trypsinées, comptées et réparties par 50 000 dans de nouvelle boîtes de pétri. Le lendemain, soit trois jours après la transfection, les cellules sont cultivées en présence d'hygromycine (Roche) 160 g/ml. Huit jours après le début de la sélection, les clones sont trypsinés et les cellules sont ensemencées dans des plaques à 6 puits en présence d'hygromycine. A 50 % de confluence environ, les cellules sont trypsinisées, congelées et éventuellement repiquées pour les analyses futures (dosage de l'érythropoïétine, degré de régulation). b) Dosage de l'érythropoïétine après transfection stable. Pour mesurer l'efficacité de l'expression et de la régulation de l'expression du transactivateur dans différentes conditions, 1000 cellules C2C12 sélectionnées sont ensemencées dans des plaques de 24 puits. Le lendemain, le milieu est changé. Trois jour plus tard, le milieu est prélevé et les cellules sont comptées. La quantité d'érythropoïétine est mesurée grâce à des cellules DaE7 qui prolifèrent en présence d'érythropoïétine (Sakaguchi et al., 1987). 3000 cellules DaE7 sont cultivées pendant trois jours en présence soit de quantités connues d'EPO recombinante humaine (EPREX) soit en présence de plusieurs dilutions des échantillons à doser. La viabilité cellulaire est mesurée grâce à un test colorimétrique (basé sur la métabolisation du substrat WST-1, Roche). Par comparaison des densités optiques des échantillons et de celles de la gamme de référence, la concentration d'érythropoïétine par mililitre de culture est déterminée. Elle peut être ramenée soit au nombre de cellules C2C12, soit à la quantité protéique de cellules C2C12 ainsi qu'au temps de sécrétion. 2) Résultats : Etablissement d'une lignée stable et mesure du degré de régulation Des cellules C2C12 ont été transfectées comme indiqué ci-dessus avec les trois plasmides suivants : 1,3 g pTK-Hygro, 18 g pTet-mEPO et 2 g 12A-hH104. Après sélection sous hygromycine, les auteurs de l'invention ont isolé et dosé la production d'érythropoïétine en normoxie et en hypoxie de 107 clones indépendants. Certains clones produisent beaucoup d'EPO mais de façon non régulée, d'autres produisent de l'EPO de façon régulée mais en quantité faible, et certains combinent les deux qualités. Deux clones (n E4B50 et E4B57) ont été sélectionnés. Pour ces deux clones mille cellules ont été ensemencées en présence ou en absence de tétracycline. Le lendemain, les milieux ont été changés (+/- tétracycline) et les cellules ont été placées en normoxie (20 % 02) ou en hypoxie (1 % 02), avec ou sans tétracycline pendant trois jours. Au bout de cette période (4 jours au total, dont 3 jours de sécrétion), les quantités d'érythropoïétine présentes dans les surnageants ont été dosées et les cellules ont été comptées. Les cellules des deux clones ont donc été placées dans quatre conditions différentes, normoxie sans tétracycline, normoxie avec tétracycline, hypoxie sans tétracycline, hypoxie avec tétracycline. Pour chaque condition et pour chaque clone, les expériences ont été réalisées six fois. L'étude des résultats obtenus avec les points de gammes permet de définir la quantité totale d'érythropoïétine sécrétée par puits. La valeur 22n/(1 + 2n + 22n), avec n = nombre de divisions par jour, est le facteur de normalisation qui permet de définir approximativement, après multiplication de cette valeur par la quantité d'EPO par puits, la quantité d'érythropoïétine sécrétée le dernier jour. Le compte du nombre de cellules en fin de sécrétion permet par ailleurs de normaliser les résultats par rapport à un nombre fixe de cellules. Les résultats sont donnés ici en unités d'érythropoïétine par million de cellules et par jour. Les moyennes des concentrations en érythropoïétine obtenues à partir d'une expérience réalisée six fois par condition sont données dans le tableau 1 ; les tableaux 2 et 3 donnent respectivement la significativité et le degré de régulation obtenu. Tableau 1 : Moyenne EPO (ul/106 cellules/jour) clone E4B50 clone E4B57 Normoxie - tet 10,2 +/- 2,2 1,2 +/- 0,2 Normoxie + tet 6,7 +/- 1,6 Tableau 2 : Significativité (t-student) clone E4B50 clone E4B57 Normoxie-tet/+tet p=0,08 Normo/Hypo - tet p=0,00009 p=0,000009 Hypoxie -tet/+tet p=0,00008 p Tableau 3 : Degré de régulation clone E4B50 clone E4B57 induction hypoxique 23,8 162 inhibition tétracycline 29,6 >162 Le calcul des moyennes des quantités d'érythropoïétine sécrétées montre qu'il est possible d'obtenir à la fois une forte induction hypoxique et une forte inhibition par la tétracycline, toutes les deux supérieures à 150 fois (clone E4B57). Les différences observées entre normoxie et hypoxie (sans tétracycline) ainsi qu'en hypoxie avec et sans tétracycline sont clairement significatives (p Enfin, les constructions plasmidiques utilisées lors de ce travail permettent de produire des quantités d'érythropoïétine comparables à ce qu'elles sont avec un promoteur fort et ubiquiste (Rinsh et al., 1997). V. Etude préclinique du potentiel de régulation par transfert ex vivo A. Implantation de myoblastes ou de fibroblastes modifiés ex vivo Des cellules (myoblastes, fibroblastes notamment) sont génétiquement modifiées par transformation par au moins une construction d'acide nucléique de l'invention, de telle sorte que ces cellules produisent de l'érythropoïétine (ou une autre protéine) sous le double contrôle de la pression partielle en oxygène et de la tétracycline (ou d'un analogue). Ces cellules sont insérées dans des capsules bio-compatibles d'environ un centimètre de long de type AN69 ((poly(acrylonitrile-méthallylsulfonate de sodium), Serguera et al, 1999), ou PES (polyéthersulfone, Rinsch et al, 1997), puis implantées en sous-cutané. B. Implantation de cellules hématopoïétiques modifiés ex vivo La modification puis l'implantation stable de cellules souches hématopoietiques ont le grand avantage d'assurer un traitement à long terme des patients atteints d'anémie chronique. Pour cette raison, des cellules souches hématopoïétiques sont transduites avec des vecteurs rétroviraux contenant au moins une construction d'acide nucléique telle que définie précédemment et transférées à des animaux receveurs préalablement irradiés. VI . Mise en évidence du potentiel de régulation par transfert direct L'introduction d'ADN dans les muscles par électrotransfert est un processus efficace et simple à mettre en oeuvre. Par ailleurs l'érythropoïétine sécrétée par des cellules musculaires est parfaitement active in vivo. Pour ces raisons, il est intéressant de tester les taux d'expression et de régulation par la pression partielle en oxygène et par la tétracycline de protéines produites à partir des vecteurs tels que décrits précédemment, après injection musculaire. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES - Brauker et al, Sustained expression of high levels of human factor IX from human cells implanted within an immunoisolation device into athymic rodents. Hum. Gene Ther. 1998 ; -Dachs GU, Patterson AV, Firth JD, Ratcliffe PJ, Townsend KM, Stratford IJ and Harris AL. Targeting gene expression to hypoxic tumor cells. Nat Med 1997; 3: 515-520. - Firth JD, Ebert BL, Pugh CW and Ratcliffe PJ. Oxygen-regulated control elements in the phosphoglycerate kinase 1 and lactate dehydrogenase A genes: similarities with the erythropoietin 3' enhancer. Proc Natl Acad Sci U S A 1994 ; 6496-500. - Gossen M and Bujard H. 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Construction d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 ou 2, dans laquelle ladite séquence codant pour une protéine régulatrice est associée à au moins un élément, désigné élément H , placé en amont ou en aval de ladite séquence, ledit élément H permettant une expression de la protéine régulatrice inductible dans des conditions hypoxiques. 4. Construction d'acide nucléique selon la revendication 3, dans laquelle ledit élément H est un élément hre, de préférence placé en amont de ladite séquence codant pour une protéine régulatrice. 5. Construction d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle ladite séquence codant pour une protéine régulatrice comprend au moins un élément, désigné élément D , qui déstabilise la protéine régulatrice en normoxie. 6. Construction d'acide nucléique selon la revendication 5, dans laquelle ledit élément D est une séquence codant pour tout ou partie du domaine ODD de 200 acides aminés de la protéine HIF1[alpha]. 7. Construction d'acide nucléique selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'activité de ladite protéine régulatrice est modulée par la tétracycline ou un analogue de la tétracycline, en tant qu'agent pharmacologique. 8. Construction d'acide nucléique selon la revendication 7, dans laquelle ladite séquence codant pour une protéine régulatrice de l'expression d'au moins un gène d'intérêt comprend un élément tetR. 9. Construction d'acide nucléique selon la revendication 8, comprenant, d'amont en aval, au moins une séquences hre, et une séquence tTA comprenant un élément tetR fusionné à une séquence codant pour une protéine régulatrice, la protéine VP16. 10. Construction d'acide nucléique selon l'une des revendications précédentes, comprenant en outre au moins une séquence codant pour une protéine recombinante d'intérêt, dont l'expression est régulée par ladite protéine régulatrice. 11. Construction d'acide nucléique selon la revendication 10, dans laquelle ladite séquence codant pour une protéine recombinante d'intérêt est associée à au moins un élément tetO. 12. Construction d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11, dans laquelle ladite protéine d'intérêt est une protéine d'intérêt thérapeutique, telle que l'érythropoïetine. 13. Composition d'acide nucléique comprenant au moins : - une construction d'acide nucléique telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 9 ; - une construction d'acide nucléique comprenant au moins une séquence codant pour une protéine recombinante d'intérêt, dont l'expression est régulée par la protéine régulatrice portée par la construction d'acide nucléique telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 9. 14. Composition d'acide nucléique selon la revendication 13, dans laquelle ladite séquence codant pour au moins une protéine recombinante d'intérêt est associée à au moins un élément tetO. 15. Composition d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14, dans laquelle ladite protéine d'intérêt est une protéine d'intérêt thérapeutique, telle que l'érythropoïetine. 16. Construction d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 ou composition selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, utile comme médicament. 17. Kit pour la production régulée d'une protéine d'intérêt, comprenant : un premier récipient contenant une construction d'acide nucléique telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 9 et un second récipient contenant une construction d'acide nucléique comprenant au moins une séquence codant pour une protéine recombinante d'intérêt, dont l'expression est régulée par la protéine régulatrice portée par la construction d'acide nucléique telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 9. 18. Cellule hôte modifiée par une construction d'acide nucléique telle que définie dans l'une des revendications 1 à 12. 19. Procédé d'obtention d'une cellule eucaryote modifiée ex vivo dans lequel on transfert une construction d'acide nucléique telle que définie dans l'une des revendications 1 à 12 et éventuellement une construction d'acide nucléique comprenant une séquence codant pour une protéine recombinante d'intérêt, dont l'expression est régulée par ladite protéine régulatrice dans une cellule, de telle sorte que ladite construction pénètre de manière stable dans le noyau de ladite cellule. 20. Utilisation d'une construction d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 13 à 15 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement, chez un patient, d'affections impliquant une hypoxie cellulaire. 21. Utilisation selon la revendication 20, dans laquelle ladite affection est une anémie, un cancer ou une ischémie.