Brevet FR2797876A1 — publié le 20010302

La présente invention concerne la production d'un anticorps monoclonal murin dirigé contre l'acide domoïque (responsable de l'intoxication amnésiante par les fruits de mer, IAFM) et son utilisation pour la détection ou le dosage de cette toxine dans les produits de la pêche en général. Elle concerne également toute procédure immunochimique de purification et enrichissement (par fixation covalente à des microbilles sur colonne ou en suspension) de l'acide domoïque à partir de diverses matrices alimentaire (produits de pêche) et fluides biologiques humains ou animaux (sérum et urine). Son utilisation pouvant être étendue à des expériences de marquage des organes cibles de la toxine ou de ses récepteurs sur des préparations ou par injection in vivo à des animaux de laboratoire. Pour des raisons de santé publique et d'intérêt économique, plusieurs voies de détection de l'acide domoïque ont été explorées auparavant. La souris étant nettement moins sensible que l'homme à l'acide domoïque et ses dérivés (Iverson et Truelove, 1994) et bien qu'un test souris (Iverson et coll., 1989,1990) ait permis l'identification de ces composés toxiques au Canada en 1987, cette méthodologie est inutilisable pour la sun-eillance des coquillages. La limite actuelle de commercialisation des coquillages de 20 gg d'acide domoïque par g de chair de coquillage, est bien au-dessous des quantités qui peuvent être détectées par le test souris. Pour le moment, la surveillance des coquillages est essentiellement assurée par des analyses chromatographiques (Lawrence et coll., 1989, 1991 ; Lawrence et Menard, 1991 ; Quilham et coll., 1989, 1995 ; Wright et coll., 1989 ; Pocklinton et coll., 1990). L'importante absorption dans l'ultraviolet (M de l'acide domoïque (Falk et colt, 1989, 1991) permet d'éviter la dérivation en composé fluorescent. Un test pharmacologique utilisant l'acide kaïnique tritié a été développé sur synaptosomes de cerveaux de grenouilles (Van Dolah et coll., 1994, 1997). Durant ces dernières années, plusieurs équipes ont travaillé sur la production d'anticorps spécifiques de l'acide domoïque (Newsome et coll., 1991 ; Smith et Kitts, 1994, 1995 ; Osada et coll., 1995 ; Garthwaite et coll., 1998a, b). En dépit des recherches effectuées, il n'existe pas actuellement de test à la fois simple, rapide, fiable, peu coûteux et transposable à grande échelle pour la détection de l'acide domoïque. La présente invention permet de remédier à l'absence de source inépuisable de réactifs standards pour l'élaboration d'un test de détection ou de dosage utilisable à grande échelle et possédant les caractéristiques souhaitées au paragraphe précédent. Les étapes nécessaires à l'obtention de ce produit biologique sont les suivantes: a) Préparation d'un immunogène (conjugué de l'acide domoïque à une protéine porteuse) Les conjugués ont été préparés comme décrit précédemment (Branaa et coll., 1999) en appliquant à 100 ou 200 pg (0,321 ou 0,642 pmoles) d'acide domoïque la méthode de conjugaison micellaire que nous avons mise au point pour la manipulation de micro-quantités d'haptènes (Pauillac et colt, 1998). Brièvement l'acide domoïque a été activé par la technique de l'anhydride mixte en utilisant fisobutyl chlorocarbonate et la tributylamine en condition anhydre dans le diméthyl sulfoxyde. La conjugaison aux protéines porteuses solubilisées dans un tampon borate pH 10,5, a été réalisée dans un milieu micellaire inversé obtenu par addition d'un grand volume de détergent AOT ou sodium bis (2-ethylhexyl) sulfosuccinate en heptane. Les conjugués obtenus ont été purifiés par précipitation acétonique. L'acide domoïque étant un chroinophore (Imax = 242 nm; s = 83,83 mgl cm@, la détermination de la densité épitopique (n) des conjugués de la sérumalbumine bovine ou BSA (immunogène) et de l'ovalbumine ou OVA (antigène cible) a été conduite par des mesures spectrophotométriques. La valeur de n est d'environ 20 et 10 pour la BSA et l'OVA, respectivement. b) Immunisation et production d'anticorps Deux souris Balb/c ont reçu un total de 6 injections intra-péritonéales de 50 pg de conjugué acide domoïque-BSA espacées de 3-4 semaines et une dernière stimulation par voie intra-splénique de 25 pg de conjugué. Des saignées régulières ont été effectuées pour apprécier la cinétique de production des anticorps spécifiques par ELISA en utilisant le conjugué cible acide domoïque-OVA et d'autres conjugués contrôles. En fin d'immunisation, le titre en anticorps (dilution sérique correspondant à un rapport signal/bruit de fond de 3) est de 1/350000. Des expériences conduites en ELISA de type compétitif ont révélé une ICso de 5 x 10-$ M d'acide domoïque. c) Production d'anticorps monoclonaux Une expérience de fusion des splénocytes d'une souris immunisée par injection du conjugué acide domoïque-BSA avec les cellules du myélome P3-X63-Ag8.653 a été réalisée à l'aide d'un kit canadien (ClonaCell - HY, Stemcell Technologies Inc.) dans un rapport 5:1. Sur les 285 hybridomes obtenus en milieu sélectif semi-solide, la totalité a supporté l'étape de transfert en milieu liquide et 26 d'entre eux ont produit des anticorps reconnaissant le conjugué acide domoïque-OVA. Une étude approfondie de leur spécificité a montré la présence d'anticorps reconnaissant l'acide domoïque libre dans 2 surnageants. Les hybridomes correspondants (1D12 et 3E1) ont été sous-clonés et leur spécificité a été recontrôlée. Les 2 populations d'hybridomes se sont révélées pures, et le plus affin fait l'objet de la présente invention. Le typage immunologique de cet anticorps monoclonal (1D12) réalisé à l'aide du kit Mouse Hybridoma Subtyping (Boehringer-Mannheim) a révélé qu'il s'agissait d'une IgG2a,K. d) Spécificité de l'anticorps monoclonal 1D12 L'induction d'ascites ID12 chez des souris histocompatibles a fourni environ 4 ml de fluide ascitique. Les anticorps monoclonaux ont été purifiés sur colonne de protéine A- Sepharose selon une technique classique. La spécificité des anticorps monoclonaux a été évaluée par ELISA de type compétitif utilisant des plaques de microtiration sensibilisées avec le conjugué acide domoïque-OVA et des concentrations croissantes d'inhibiteurs (d'une part les acides aspaitique, glutamique et kaïnique et d'autre part la proline et le tryptophane). Dans tous les cas, les anticorps contenus dans les surnageants d'hybridomes, dans le fluide ascitique brut ou sous forme purifiée ont montré une réactivité exclusive pour l'acide domoïque libre (standard certifié, DACS-1C, NRC-CNRC, Halifax, Canada) et n'ont réagi avec les autres composés même aux très fortes concentrations (10-' à 10-3 n. La gamme utile de dosage (20-80% d'inhibition) de l'acide domoïque par les techniques classiques de type ELISA compétitif ou autres utilisant des systèmes d'amplification basés sur des principes chromogéniques, fluorogéniques, luminométxiques ou radioimmunométriques est de 30-306 ng/ml. e) Détection de l'acide domoïque dans des extraits de moules La technique d'extraction de l'acide domoïque dans les moules (Afyiilus eduks) est celle décrite par Quilliam et coll. (1998). Brièvement 4 g de moules non contaminées sont homogénéisés dans 16 ml de méthanol-eau (1:1) à l'aide d'un broyeur du type Polytron. L'homogénéisat est centrifugé (5000 g pendant 10 mn) et le surnageant est filtré puis passé sur une cartouche échangeuse d'anions (Supelclean LC-SAX, Supelco Inc., Bellefonte, USA). Après plusieurs étapes de lavage, l'extrait est élué par passage de 2 ml d'un mélange méthanol- eau-acide formique (75:23:2). Après évaporation sous flux d'azote, le résidu est repris dans 1 ml d'un mélange acétonitrile-eau (1:9). Finalement, à cette suspension (équivalent à 1 g de tissus) est ajouté 20 pg d'acide domoïque standard pour générer des concentrations de 20000 à 2 ng/ml par dilutions géométriques de raison 5 en acétonitrile-eau (1:9). Parallèlement des dilutions d'acide domoïque standard ont été préparées directement en acétonitrile-eau (1:9) pour servir d'étalons. Ces extraits contaminés artificiellement et ces étalons ont été mélangés à un volume égal de dilution d'anticorps monoclonal 1D12 purifié et incubés une nuit à +4 C. La comparaison des 2 types de courbe de dosage de l'acide domoïque par ELISA de type compétitif montre qu'il n'y a pas d'effet de matrice et par conséquent la gamme utile de dosage de l'acide domoïque par cette technique est comprise entre 30 et 306 ng/ml d'extrait ce qui correspond à 0,03 jÀg et 0,306 #tg/g de tissus. La limite sanitaire fixée par la Commission Européenne étant de 20 pg de DA/g de coquillage, l'affinité des anticorps monoclonaux produits permet l'élaboration d'un test immun oenzymatique de détection de cette toxine dans des extraits de coquillage. Ce type de dosage a été réalisé avec succès aussi bien à partir de moules que d'huîtres, coquille St Jacques et anchois. Cet anticorps est également utilisable à la détection de l'acide domoïque dans l'eau de mer après filtration ainsi que sur des culots de sédiments contenants des diatomées ou à partir d'extraits de diatomées. Comme il va de soi et comme il en résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagées ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes notamment celles dans lesquelles les anticorps monoclonaux pourraient être utilisés d'une manière ou d'une autre pour la détection, le dosage, l'immunopurification (colonne d'affinité ou autre procédé selon des techniques courantes de laboratoire) et le marquage des cibles de la toxine (cellules nerveuses et leurs récepteurs) lors d'intoxications animales. REVENDICATIONS 1) Anticorps murin monoclonal caractérisé en ce qu'il est une immunoglobuline de type IgG2a, K, dénommée ID12, caractérisé en ce qu'il reconnaît spécifiquement l'acide domoïque et ne réagit pas avec les acides aspartique, glutamique, kaïnique, la proline et le tryptophane , et caractérisé par son affinité. 2) Utilisation de l'anticorps murin monoclonal ID12 selon la revendication 1 dans une technique immunologique utilisant un anticorps spécifique (technique classique de type FUSA compétitif ou autre utilisant des systèmes d'amplification basés sur des principes chromo géniques, fluorogéniques, luminométriques ou . radioimmunométriques), qui permet le dosage ou la détection de l'acide domoïque dans différentes matrices alimentaires (produits de la pêche). 3) Utilisation de l'anticorps murin monoclonal ID12 selon la revendication 1 pour réaliser des procédés d'immunopurification (par fixation covalente à des microbilles sur colonne ou en suspension) de l'acide domoïque à partir de diverses matrices alimentaires (produits de la pêche) et biologiques (sérum et urine). 4) Utilisation de l'anticorps murin monoclonal 1 D 12 selon la revendication 1 pour le dosage et la détection de l'acide domoïque dans les échantillons environnementaux (eau de mer ou sédiments contenant des diatomés). 5) Utilisation de l'anticorps murin monoclonal 1D12 selon la revendication 1 pour la détection in vitro de l'acide domoïque fixé sur les organes cibles ou leurs récepteurs lors d'intoxications animales.