Brevet FR2807432A1 — publié le 20011012

La présente invention concerne un précurseur d'une sonde à marquage fluorescent, une sonde à marquage fluorerscent, et un plasmide et un brin d'ADN marqués avec cette sonde, ainsi qu'un procédé de préparation de ce plasmide. Dans le domaine de la thérapie génique et de la recherche génétique, il est très important d'estimer la quantité d'un gène introduit dans une cellule et d'observer la localisation intracellulaire du gène. Pour ce faire, il est très important de visualiser un ADN en marquant cet ADN avec une sonde à marquage fluorescent. Dans le cas d'un brin d'ADN linéaire, on connaît un procédé pour marquer l'extrémité 5' de cet ADN pour produire une sonde à marquage fluorescent destinée à être utilisée dans le but évoqué ci-dessus. Cependant, dans le cas d'un brin d'ADN circulaire, le procédé ci-dessus ne peut pas être appliqué car un tel brin d'ADN circulaire ne comporte pas d'extrémité 5'. Typiquement, le procédé appliqué pour un brin d'ADN circulaire met en jeu l'utilisation d'une réaction optique et comprend les étapes d'introduction d'une sonde à marquage fluorescent comprenant un groupe azide dans le brin d'ADN circulaire et de clivage du brin d'ADN circulaire au niveau du groupe aldéhyde d'un ribose de l'ADN par irradiation avec des rayons UV. Le procédé conventionnel utilisant une réaction optique qui est décrit ci-dessus exige des conditions réactionnelles sévères qui peuvent être nocives pour la fonction du gène cible. De ce fait, il serait souhaitable de disposer d'une sonde à marquage fluorescent capable de marquer un brin d'ADN circulaire tel qu'un plasmide généralement utilisé en thérapie génique, qui puisse être obtenue par un procédé simple dans des conditions douces. Pour répondre à ce souhait, la présente invention concerne un précurseur d'une sonde à marquage fluorescent pour un ADN obtenu par liaison covalente d'une substance fluorescente comme l'isothiocyanate de fluorescéine (FTTC) qui contient un groupe de conjugaison, avec une phénylamine aminoalkylée dont le groupe amino est ensuite converti en un sel de diazonium pour produire une sonde à marquage fluorescent pour l'ADN. La présente invention concerne également un plasmide à marquage fluorescent produit par conjugaison de cette sonde à marquage fluorerscent et du cycle purine de la guanine contenue dans le plasmide, par le biais du groupe diazonium. En utilisant la sonde à marquage fluorescent, il est possible de produire un ADN à marquage fluorescent sans détériorer les fonctions d'un gène. Par ailleurs, la sonde selon l'invention permet l'observation de l'absorption d'un gène au moyen d'un cytofluorimètre de flux ou d'un microscope à fluorescence. Ainsi, la présente invention concerne un précurseur d'une sonde à marquage fluorescent pour un ADN qui comprend un résidu d'une substance Fluorescente contenant un atome d'hydrogène qui est retiré de ladite substance fluorescente, un groupe de conjugaison qui se lie audit résidu, un groupe alkylamino dont le groupe amino est lié audit groupe de conjugaison et dont le groupe alkyle est un groupe alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 16 atomes de carbone, et une phénylamine à laquelle est lié ledit groupe alkyle en position para de son groupe amino. La structure d'un précurseur typique d'une sonde d'ADN selon la présente invention est représentée sur la figure 1 des dessins annexés qui représente l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) couplé à l'aminophényléthylamine. Sur la figure 1, le résidu de fluorescéine, le groupe thioamide, le groupe thylamine et le groupe aminophényle sont désignés respectivement par les signes le référence 1,2, 3 et 4. Les groupes fluorescéine, thioamide et éthylamine correspondent respectivement à la substance fluorescente, au groupe de conjugaison et au groupe alkylamino décrit ci-dessus. Le groupe alkyle peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 16 atomes de carbone, de préférence de 2 à 10 atomes de carbone et de préférence encore de 2 à 6 atomes de carbone. Le groupe de conjugaison peut inclure un groupe fonctionnel quelconque à condition qu'il soit capable de réagir avec un groupe amino. De préférence, le groupe de conjugaison est ou inclut un groupe thioamide, un groupe ulfonyle ou un groupe carbonyle. La substance fluorescente peut être une substance quelconque à condition qu'elle soit capable d'émettre une fluorescence et de se lier au groupe de conjugaison. De préférence, il s'agit de la fluorescéine, de la sulforhodamine, de la rhodamine, du chlorure de dansyle ou du 7-chloro-4-nitrobenzoxyazole. Par ailleurs, la présente invention concerne une sonde à marquage fluorescent pour un ADN qui comprend un résidu d'une substance fluorescente contenant un atome d'hydrogène qui est retiré de ladite substance fluorescente, un groupe de conjugaison qui se lie audit résidu, un groupe alkylamino dont le groupe amino est lié audit groupe de conjugaison et dont le groupe alkyle est un groupe alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 16 atomes de carbone, et un groupe phényldiazonium auquel est lié ledit groupe alkyle en position para du groupe diazonium. La structure d'une sonde d'ADN typique selon la présente invention est représentée sur la figure 2 des dessins annexés qui représente l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) couplé à un groupe aminoéthylphényldiazonium. Sur la figure 2, le résidu de fluorescéine, le groupe thioamide, le groupe éthylamine et le groupe phényldiazonium sont représentés respectivement par les signes de référence 5,6, 7 et 8 et le résidu de fluorescéine, le groupe thioamide et le groupe éthylamine correspondent à ladite substance fluorescente, audit groupe de conjugaison et audit groupe alkylamino respectivement. Le groupe alkyle peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 16 atomes de carbone, de préférence de 2 à 10 atomes de carbone et de préférence encore de 2 à 6 atomes de carbone. Par ailleurs, la présente invention concerne également un plasmide marqué avec la sonde fluorescente décrite ci-dessus. Il est possible de préparer ce plasmide en ligaturant la sonde fluorescente à un plasmide par le biais du cycle purine d'une guanine contenue dans l'ADN de ce plasmide. Le procédé de préparation d'un tel plasmide est inclus dans le cadre de la présente invention. Ce procédé de préparation est représenté sur la figure 3 dont les signes de référence sont les mêmes que ceux qui sont utilisés ci-dessous. Comme le montre la figure 3, un groupe actif d'une substance fluorescente (composé 1), comme le FITC, et un groupe amino d'un dérivé aminoalkylé de la phénylamine (composé 2), comme l'aminophényléthylamine, sont mis à réagir pour obtenir un composé fluorescent (composé 3) contenant un groupe phénylamino à son extrémité. Il est possible d'obtenir un composé diazoïque fluorescent (composé 4) en diazotant le groupe amino terminal du composé 3 avec NaN02. Quand le composé 4 est mis à réagir avec un ADN plasmidique, il se lie au cycle purine d'une guanine contenue dans l'ADN plasmidique car le composé 4 est un sel de diazonium. Ainsi, le procédé de préparation d'un plasmide à marquage fluorescent selon l'invention comprend les étapes de préparation de la sonde à marquage fluorescent décrites ci-dessus, de préparation d'un plasmide et de liaison dudit groupe phényldiazonium contenu dans la sonde à marquage fluorescent avec ledit plasmide par le biais du cycle purine d'une guanine contenue dans l'ADN du plasmide. Ainsi qu'on l'a déjà indiqué précédemment, la substance fluorescente est choisie de préférence dans le groupe consistant en la fluorescéine, la sulforhodamine, la rhodamine, le chlorure de dansyle et le 7-chloro-4-nitrobenzoxyazole et le groupe de conjugaison est de préférence choisi parmi un groupe thioamide, un groupe sulfonyle et un groupe carbonyle. Le procédé de préparation d'un plasmide marqué avec le FITC selon la présente invention présente l'avantage que les conditions réactionnelles mises en jeu sont douces, ce qui permet de marquer par fluorescence le gène cible sans en dégrader les fonctions. La présente invention va maintenant être illustrée de manière plus détaillée au moyen d'un exemple de production d'un plasmide marqué avec le FITC et des dessins annexés, dans lesquels : la figure 1 représente la formule chimique du précurseur de sonde à marquage fluorescent selon la présente invention où l'aminophényléthylamine est liée au FITC ; la figure 2 représente la formule chimique de la sonde à marquage fluorescent selon la présente invention où un sel d'aminophényléthyldiazonium est lié au FITC ; la figure 3 est un schéma illustrant un procédé de préparation d'un plasmide marqué avec le FITC selon la présente invention ; la figure 4 est un schéma représentant une plaque de chromatographie en couche mince utilisée pour l'analyse d'un composé de FITC p-aminophénylé ; la figure 5 représente un diagramme IR d'un composé de FITC p-aminophénylé ; la figure 6 représente un diagramme de spectrométrie de masse d'un composé de FITC p-aminophénylé ; la figure 7 représente une courbe d'élution d'un plasmide marqué avec le FITC obtenue au moyen d'une colonne de Sepharose 4B ; la figure 8 est une photographie montrant le résultat d'une électrophorèse en gel d'agarose d'un plasmide non marqué et d'un plasmide marqué avec le FITC ; la figure 9 représente un graphique montrant les activités d'expression de la luciférase d'un plasmide non marqué et d'un plasmide marqué avec le FITC ; la figure 10 représente un diagramme obtenu par cytofluorimétrie de flux pour l'étude de l'absorption intracellulaire d'un plasmide marqué avec le FITC ; et la figure Ilreprésente une photographie montrant une image de cofocalisation permettant la localisation d'un plasmide marqué avec le FITC dans des cellules HeLa. Préparation d'un plasmide marqué avec le FITC On a tout d'abord réalisé une réaction équimolaire en dissolvant 35,0 mg de 2-(4-aminophényl)-éthylamine (0,257 mmol, Aldrich Chemical Companies, Inc. composé 2) et 100 mg de FITC (type I) (composé 1) (0,257 mmol, Dojindo Molecular Technologies, Inc.) dans 1 ml de N,N-diméthylformamide (DMF) anhydre puis en agitant pendant une nuit à la température ambiante. On a suivi le déroulement de la réaction par chromatographie en couche mince (CCM, hexane : d'éthyle = 2 : On a analysé le composé résultant par résonance magnétique nucléaire (RMN) (appareil Varian, 300 MHz), spectrométrie de masse à temps de vol (TOF), (appareil Voyger-DE, Perspective Bio Systems Co., Ltd. ), et spectroscopie infrarouge (IR) (appareil JIR-7000, Nippon Denshi Co., Ltd. ). Puis, on a ajouté 1 ml de solution de NaN02 (7,7 mg/ml) à 1 ml de HCl IN, puis on a ajouté 150 l d'une solution dans le DMF (20,25 mg, 0,0386 mmol) contenant le composé de FITC p-aminophénylé (composé 3) obtenu par la réaction ci-dessus. On a ainsi obtenu un composé diazoté (composé 4). Ensuite, on a dissous un plasmide de luciférase (5 mg) dans 20 ml de tampon borate 0,1 M (pH 8,4) et on a introduit goutte à goutte le composé diazoté (composé 4) dans la solution obtenue. On a ajusté à 9,0 le pH du mélange réactionnel et on a maintenu ce pH avec NaOH. On a ajusté à 1 M la concentration saline du mélange réactionnel en ajoutant 1,18 g de NaCl. Puis, on a ajouté 50 ml d'éthanol froid au mélange réactionnel pour former un précipité. On a répété cette opération quatre fois pour laver le précipité que l'on a ensuite dissous dans du tampon Tris-HCl 0,01M (concentration saline 0,1M, pH 7,4) et on a purifié au moyen d'une colonne de Sepharose 4B (masse moléculaire fractionnée de 0,2 à 2 MDa, diamètre de la colonne 5 cm et longueur de la colonne 19 cm, Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd. ). On a analysé le produit par spectroscopie UV (appareil UV-2400P, Shimazu Co., Ltd. ), fluorescence (appareil RT-540, Shimazu Co., Ltd. ), chromatographie par perméation de gel CPG (colonne de Sepharose 4B), et électrophorèse en gel d'agarose (appareil Mupid, Cosmo Bio Co., Ltd. ). A titre d'expérience témoin, on a préparé un mélange du composé fluorescent (composé 3) et du plasmide en suivant le protocole décrit ci-dessus, à ceci près que le composé chimique 3 n'était pas diazoté. On a ensuite étudié la courbe d'élution du mélange. On a ainsi obtenu un rendement de 3,63 mg et une récupération de 72,6 %. Analyse par chromatographie en couche mince (CCM) La figure 4 montre le résultat de l'analyse par CCM du composé FITC (type I) (composé 1) et du composé de FITC p-aminophénylé (composé 3). Sur cette figure, la piste n 1 correspond au FITC (type I) et la piste n 2 correspond au composé de FITC p-aminophénylé. La pureté du FITC était supérieure ou égale à 90 % et on y a décelé des impuretés. On a supposé que tout le produit de départ avait réagi car un pic correspond au produit de départ consommé lors de la réaction équimolaire. Au contraire, après la réaction équimolaire, on n'a pas décelé de pic correspondant à l'aminophényléthylamine (composé 2) (Rf = 0,1), qui constitue l'autre matière première. Analyse IR La figure 5 montre les résultats de l'analyse IR du composé de FITC p-aminophénylé (composé 2) obtenus au moyen du procédé de coulée (formation d'une membrane sur un lit solide). Pour le FITC de type 1 (composé 1), on a observé une vibration d'allongement du groupe isothiocyanate NCS à la longueur d'onde de 2021 cm-1. Pour le composé de FITC p-aminophénylé (composé 3), on n'a observé aucune vibration d'allongement du groupe NCS mais on a observé une vibration d'allongement de C = S à une longueur d'onde de 1794 cm-1 d'où l'on a conclu que le groupe NCS avait réagi totalement. Analyse par spectrométrie de masse TOF La figure 6 montre les résultats de l'analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF ("matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight") du composé de FITC p-aminophénylé (composé 3) en mode positif et en utilisant CHCA comme matrice. Pour la mesure, on a utilisé 100 nmol de matrice et 20 pmol d'échantillon. On a dissous l'échantillon dans une solution contenant THF et H20 dans le rapport 1 : 1. Comme le montre la figure, on a détecté un pic correspondant à une masse moléculaire de 526,2031. La masse moléculaire du composé synthétique était 525,20. De ce fait, on a détecté le composé à la masse moléculaire de 526,20 accompagnée par addition d'un proton. Après avoir examiné soigneusement les données ci-dessus, on en a déduit que le composé voulu avait été synthétisé. Analyse par chromatographie sur gel On a soumis le plasmide modifié avec le FITC à un protocole de purification au moyen d'une colonne de Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd. ) et on a obtenu une courbe d'élution lors de la purification en mesurant l'absorption UV et la fluorescence de l'éluat. Dans cette purification, on a utilisé comme solution d'élution du tampon Tris-HCl 0,01 M (concentration saline 0,1M, pH 7,4). La figure 7 montre les résultats de l'absorption UV et de la fluorescence obtenus en faisant réagir le composé de FITC diazoté (composé 4) et le plasmide. On a réalisé la mesure à une longueur d'onde d'excitation de 495 nm et à une longueur d'onde fluorescente de 520 nm. Comme le montre la figure 7, pour le plasmide marqué avec le FITC, les deux courbes d'élution d'absorption UV et de fluorescence coïncidaient bien entre elles. Par ailleurs, concernant le FITC non diazoté, on n'a pas observé de fluorescence dans la fraction plasmidique. Ceci signifie que le réactif fluorescent était lié au plasmide par un liaison covalente et non pas par intercalation. On a déduit des résultats que 1,2 molécule de FITC était introduite dans un plasmide, en moyenne. Analyse par électrophorèse en gel d'agarose On a soumis le plasmide marqué avec le FITC et un plasmide non modifié (non marqué) à une électrophorèse au moyen d'un gel d'agarose à 1 %. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 8 sur laquelle la piste 1 correspond au plasmide non marqué et la piste 2 correspond au plasmide marqué avec le FITC. On a détecté une bande correspondant à la position du plasmide de luciférase témoin sur le plasmide marqué avec le FITC de la piste 2. De plus, il est apparu que la structure en superhélice était maintenue, ce qui est dû probablement au fait que la quantité de FITC liée à un plasmide n'est pas très importante (1,2 mol de FITC par plasmide). Le plasmide à marquage fluorescent selon la présente invention permet d'analyser par cytofluorimétrie de flux l'absorption intracellulaire d'un gène ou d'analyser par microscopie à laser confocale la localisation intracellulaire d'un gène. Jusqu'à maintenant, il n'était pas possible d'utiliser un plasmide exprimant un gène dans ce but, de sorte que l'on utilisait un ADN linéaire ou un oligonucléotide comme composé modèle. Il était donc impossible de faire une évaluation précise car il n'est pas possible de négliger la différence d'absorption ou de localisation du gène due à la différence structurale de l'ADN. La sonde selon la présente invention résout ce problème. Expression de l'activité luciférase dans le plasmide marqué avec le FITC On a réalisé la transfection en utilisant une lipofectine du commerce qui est utilisée pour le transfert de gènes (Gibco BRL). On a ajouté une certaine quantité de plasmide (1 mg/ml en solution aqueuse) et une certaine quantité de lipofectine (1mg/ml) à du milieu ASF-104 (1/10 volume de milieu utilisé pour la transection) ajusté à pH 6,5 à 37 C. On a incubé la solution pendant 20 min pour obtenir un complexe plasmide/lipofectine. On a mesuré l'activité d'expression du plasmide de luciférase selon le procédé conventionnel. On a distribué 5 ou 10 x 104 cellules dans chaque puits d'une plaque à 24 puits et on les a cultivées pendant 19 à 24 h avant la transfection. Après la culture, on a inoculé du milieu de culture à pH 7,0 avec ledit complexe à une certaine concentration et on a incubé pendant 4 h. Le volume du milieu de culture était 9 fois supérieur à celui de la solution de complexe. Puis on a retiré le milieu de culture contenant le complexe et on l'a lavé une fois avec du milieu à sérum. On a remplacé le milieu par du milieu à sérum frais (pH 7,0) puis on a cultivé pendant 24 h pour la transfection. Après la culture, on a retiré le surnageant et on l'a lavé trois fois avec du tampon PBS (sans ions Ca2+ et Mg2+), puis on a ajouté 100 l de solution de lyse (système de dosage de luciférase, Promega Corporation). On a récolté les cellules au moyen d'un policeman en caoutchouc et on les a introduites dans un tube Eppendorf. Puis on a centrifugé à 10 000 tr/min pendant 10s pour obtenir un surnageant sous forme d'une solution d'extraction de cellules dont on a introduit une portion aliquote de 40 ul dans un tube pour réaliser les mesures. Dans le même tube, on a ajouté également 100 l de solution de substrat (luciférine) et on a soumis le mélange immédiatement à une mesure au moyen d'un luminomètre TD-20/20 (Promega Corporation). Les résultats obtenus avec les cellules HeLa sont présentés sur la figure 9 sur laquelle l'axe vertical du graphique indique l'activité d'expression des plasmides en valeurs logarithmiques d'activité relative. Sur cette figure, l'activité d'expression observée sur des cellules HeLa transfectées avec un plasmide seul est égale à 100. Les barres d'erreurs indiquent les écarts-types évalués d'après 2 à 4 expériences indépendantes. En outre, les bâtons vides représentent les résultats obtenus avec un plasmide non marqué et les bâtons hachurés représentent les résultats obtenus avec un plasmide marqué avec le FITC. On a transfecté des cellules HeLa avec un plasmide seul ou avec un mélange plasmide/lipofectine (dans le rapport 1 : pour 10 ug/ml de plasmide) dans du milieu sans sérum (ASF-104, Ajinomoto Co., Ltd. ). On constate que le marquage avec FITC n'entraîne pas de réduction de l'activité d'expression sur les cellules HeLa transfectées avec le complexe plasmide/lipofectine Mesure de l'absorption intracellulaire On a préparé le complexe plasmide/lipofectine et on a incubé des cellules Hela de la manière décrite au sujet de la mesure de l'activité d'expression de la luciférase. Après avoir incubé des cellules HeLa avec le complexe, on a retiré le surnageant et on a lavé trois fois avec du tampon PBS le précipité obtenu. On a détaché les cellules en traitant avec 0,5 ml de tampon PBS contenant 0,05 % de trypsine et 0,02 % de EDTA-4Na, puis on a dilué avec 1,0 ml de tampon PBS pour obtenir une suspension de cellules que l'on a soumise à une analyse par cytofluorimétrie de flux. Les résultats sont présentés sur la figure 10. On a incubé des cellules HeLa pendant 2 h avec le complexe plasmide/lipofectine dans du milieu essentiel minimal de Eagle (MEM) contenant 10 % de sérum foetal bovin. Dans ce milieu, la concentration du plasmide était de 10 ug/ml et le rapport plasmide : lipofectine était 1 : en masse. Il est apparu que le diagramme de cytofluorimétrie de flux des cellules incubées avec le complexe plasmide/lipofectine était décalé vers les plus grandes intensités, par rapport aux cellules témoins. Ceci signifie que l'intensité de fluorescence du plasmide à marquage fluorescent est suffisante pour la détection par cytofluorimétrie de flux. Localisation intracellulaire observée au microscope à balayage à laser confocal On a distribué 5 x 104 cellules dans une boîte en verre de 35 mm (MatTek Co., Ltd. ), et on a fait adhérer les cellules à la boîte en les laissant reposer pendant 19 à 24 h. On a préparé le complexe plasmide/lipofectine et on a incubé les cellules avec le complexe de la manière décrite au sujet de la mesure de l'activité d'expression de la luciférase. Après avoir incubé les cellules avec le complexe pendant une certaine durée, on a retiré le milieu contenant le complexe et on l'a lavé une fois avec du milieu à sérum. Puis on a ajouté du milieu à sérum frais et on a observé la localisation du plasmide à marquage fluorescent au moyen d'un microscope à balayage à laser confocal (TCS NT, LAICA Co., Ltd. ). Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 11. On n'a pas détecté de fluorescence dans les cellules HeLa témoins incubées avec le plasmide à marquage fluorescent seul. Toutefois, on a observé dans le cytoplasme des cellules incubées avec le complexe des taches de fluorescence indiquant la présence de plasmide marqué incorporé dans les cellules par la lipofectine. On suppose que le plasmide a été incorporé dans les cellules par endocytose lorsque l'on a utilisé le complexe plasmide/lipofectine, si bien que la fluorescence disséminée observée ici semble refléter la localisation du complexe incorporé par endocytose. Ce résultat indique que l'intensité de fluorescence du plasmide à marquage fluorescent est suffisante pour la détection au moyen d'un microscope à balayage à laser confocal. REVENDICATIONS 1. Précurseur d'une sonde à marquage fluorescent pour un ADN, caractérisé en ce qu'il comprend un résidu (1) d'une substance fluorescente contenant un atome d'hydrogène qui est retiré de ladite substance fluorescente, un groupe de conjugaison (2) qui se lie audit résidu, un groupe alkylamino (3) dont le groupe amino est lié audit groupe de conjugaison et dont le groupe alkyle est un groupe alkyle linéaire ou ramifié ayant 1 à 16 atomes de carbone, et une phénylamine (4) à laquelle est lié ledit groupe alkyle en position para du groupe amino de la phénylamine. 2. Précurseur selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite substance fluorescente est choisie parmi la fluorescéine, la sulforhodamine, la rhodamine, le chlorure de dansyle et le 7-chloro-4-nitrobenzoxyazole. 3. Précurseur selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ledit groupe de conjugaison est choisi parmi un groupe thioamide, un groupe sulfonyle et un groupe carbonyle. 4. Sonde à marquage fluorescent pour un ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend un résidu (5) d'une substance fluorescente contenant un atome d'hydrogène qui est retiré de ladite substance fluorescente, un groupe de conjugaison (6) qui se lie audit résidu, un groupe alkylamino (7) dont le groupe amino est lié audit groupe de conjugaison et dont le groupe alkyle est un groupe alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 16 atomes de carbone, et un groupe phényldiazonium (8) auquel est lié ledit groupe alkyle en position para du groupe diazonium du groupe phényldiazonium. 5. Sonde à marquage fluorescent selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite substance fluorescente est choisie parmi la fluorescéine, la sulforhodamine, la rhodamine, le chlorure de dansyle et le 7-chloro-4nitrobenzoxyazole. 6. Sonde à marquage fluorescent selon l'une quelconque des revendications 4 et 5, caractérisée en ce que ledit groupe de conjugaison est choisi parmi un groupe thioamide, un groupe sulfonyle et un groupe carbonyle. 7. Plasmide à marquage fluorescent, caractérisé en ce qu'il comprend un résidu (5) d'une substance fluorescente contenant un atome d'hydrogène qui est retiré de ladite substance fluorescente, un groupe de conjugaison (6) qui se lie audit résidu, un groupe alkylamino (7) dont le groupe amino est lié audit groupe de conjuguaison et dont le groupe alkyle est un groupe alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 16 atomes de carbone, un groupe phényldiazonium (8) auquel ledit groupe alkyle est lié en position para de son groupe diazonium, et un plasmide composé d'un ADN contenant de la guanine auquel ledit groupe diazonium se lie par le cycle purine de ladite guanine. 8. Plasmide à marquage fluorescent selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite substance fluorescente est choisie parmi la fluorescéine, la sulforhodamine, la rhodamine, le chlorure de dansyle et le 7chloro-4-nitrobenzoxyazole. 9. Plasmide à marquage fluorescent selon l'une quelconque des revendications 7 et 8, caractérisé en ce que ledit groupe de conjugaison est choisi parmi un groupe thioamide, un groupe sulfonyle et un groupe carbonyle. 10. Brin d'ADN caractérisé en ce qu'il est marqué par une sonde à marquage fluorescent selon l'une quelconque des revendications 4 à 6.