Brevet FR2799839A1 — publié le 20010420

PROCEDE POUR DETERMINER LA CAPACITE ANTIOXYDANTE DE COMPOSES CHIMIQUES ET PROCEDES DE DOSAGE ET D'IMMOBILISATION UTILISABLES POUR CETTE DETERMINATON. DESCRIPTION Domaine technique La présente invention a pour objet un procédé pour déterminer la capacité antioxydante de divers composés chimiques, notamment vis-à-vis des Ladicaux HO'. Elle s'applique en particulier aux domaines de l'industrie pharmaceutique, de l'agro-alimentaire et de la cosmétologie, dans lesquels des composés antioxydants présentent un grand intérêt. Depuis de nombreuses années, on sait que les radicaux libres sont des espèces réactives à l'origine de plusieurs processus physiologiques normaux et pathologiques. Les radicaux libres, ou espèces radicalaires, générés dans les processus biologiques peuvent appartenir à la famille des espèces actives de l'oxygène (EAO), qui comprend le peroxyde d'hydrogène et des radicaux libres comme les radicaux peroxyles R00*, le radical hydroxyle H0" et le radical superoxyde OZ*-. Ces radicaux libres, en particulier les EAO, sont impliqués à la fois dans les procédés de vieillissement, dans les maladies neurodégénératives et dans le cancer. Aussi, l'un des moyens pour lutter contre les effets délétères de ces radicaux libres sur l'organisme vivant est de les détruire in vivo par des molécules capables de réagir chimiquement avec eux, qui sont des composés antioxydants. Il est donc nécessaire de tester in vitro la capacité antioxydante de divers composés pour vérifier s'ils sont intéressants ou non comme composés antioxydants pour les industries pharmaceutiques, agro- alimentaires et cosmétiques. On peut évaluer ce pouvoir antioxydant par différents tests qui sont soit spécifiques d'une espèce oxydante, soit asnécif iqües . Dans la présente invention, on s'intéresse aux tests spécifiques des EAO et en particulier du radical hydroxyle H0* car cette espèce radicalaire est la plus réactive (k = 109 à 101 L. mol-ls-1) . État de la technique antérieure on connaît plusieurs procédés pour tester la capacité antioxydante de composés vis-à-vis des radicaux hydroxyles. De tels procédés déterminent la quantité de radicaux hydroxyles en présence et en l'absence du composé à tester. Ces procédés sont basés soit sur la détection de radicaux secondaires engendrés par les radicaux hydroxyles, soit sur la détection de molécules engendrées par ces radicaux hydroxyles. Le document : Archives of Biochemistry and Biophysics, 15 septembre 1996, volume 333, n 2, pages 377-384 [1], décrit un procédé de détermination de la capacité antioxydante de composés vis-à-vis des radicaux hydroxyles, qui consiste à générer des radicaux hydroxyles soit par la réaction d'un complexe de Cu (II) avec du peroxyde d'hydrogène H202, soit par photolyse au moyen de rayons ultraviolets (UV) de H202, en présence ou non des composés à tester, et à déterminer ensuite la quantité de radicaux hydroxyles présents par différentes méthodes. Les méthodes utilisées sont la résonance paramagnétique électronique (RPE), la détection d'une substance réactive avec l'acide thiobarbiturique (TBARS) obtenue par décomposition du désoxyribose par des radicaux hydroxyles, et :une nithode faisant appel à la sciswir:n de brins d'ADN. La méthode utilisant la résonance paramagnétique électronique nécessite l'utilisation d'appareillages coûteux et cette technique sophistiquée est inadaptée à la mesure de séries de composés. La méthode basée sur la scission des brins d'ADN nécessite l'utilisation d'appareils d'électrophorèse sur gel d'agarose et rend difficile la comparaison entre les composés testés. La méthode basée sur la décomposition du désoxyribose ne peut être utilisée pour certaines mesures d'antioxydants. D'autres procédés de détermination de la capacité antioxydante de fluides faisant intervenir le piégeage de radicaux libres tels que les radicaux peroxyles sont décrits dans Methods in Enzymology, vol 234, pp. 279-293, 1994 [2]. Exposé de l'invention La présente invention a pour objet un procédé pour déterminer la capacité antioxydante d'un composé chimique, qui est facile à mettre en #uvre, ne nécessite pas un appareillage coûteux et peut être utilisé pour de nombreux composés antioxydants. Selon l'invention, le procédé pour déterminer la capacité antioxydante d'un composé consiste à mesurer le taux d'inhibition engendré par ce composé sur une réaction chimique de fixation d'une substance sur une phase utilisant des espèces actives de l'oxygène, en particulier des radicaux hydroxyles HO*, pour cette réaction de fixation. Ainsi, le procédé de l'invention comprend les trois opérations suivantes 1) production des espèces actives de l'oxygène (EAO) telles que des radicaux hydroxyles, 2) utilisation des EAO, par exemple des radicaux hydroxyles, pour effectuer la fixation d'une substance sur une phase solide, et 3) détermination de l'effet d'un composé antioxydant sur la réaction de fixation, c'est- à-dire du taux d'inhibition de cette réaction. Pour la production des radicaux hydroxyles 1), on peut utiliser différentes techniques telles que l'irradiation gamma, l'irradiation ultraviolette en présence ou non de peroxyde d'hydrogène, et d'autres réactions chimiques de formation de radicaux HO*. De préférence, selon l'invention, les radiaux hydroxyles sont produits par une réaction de type Fenton. Cette réaction correspond â l'oxydation de métaux M tels que le fer, le cuivre, le nickel, le chrome et le titane, par le peroxyde d'hydrogène, selon le schéma réactionnel suivant Mn+ + H202 --->M (n + 1) + + HO + HO". Pour mettre en oeuvre cette réaction, on utilise des sels ou complexes de métaux tels que Fe2+, Fe3+, Cu2+, Ni2+, Cr2+ , Ti3+ ou d'autres ions de métaux de transition, et du peroxyde d'hydrogène éventuellement stabilisé par l'urée. La réaction peut être effectuée en solution Salitlc üyant de préférence un pH de 5 à il. A titre d'exemple de solutions salines susceptibles d'être utilisées, on peut citer les tampons phosphate, carbonate et borate. Les sels de métaux utilisés peuvent être les sulfates, chlorures et acétates. Pour réaliser cette réaction, on préfère en particulier le sulfate de cuivre et l'eau oxygénée, de préférence stabilisée par l'urée, en présence de tampon carbonate 0,1 M, pH 9. Pour l'opération 2), on choisit une substance et une phase solide capables d'être fixées l'une sur l'autre sous l'action des radicaux hydroxyles. Selon l'invention, cette substance peut être en particulier un antigène ou un haptène, et la phase solide peut être une phase solide comprenant un anticorps spécifique de cette substance. On pourrait aussi utiliser comme substance et phase solide d'autres couples du même type, tels que les couples récepteurs-ligands, acides nucléiques- acides nucléiques et acides nucléiques-protéines. Dans tous les cas, la réaction de fixation par les radicaux hydroxyles équivaut à la formation d'une liaison covalente entre les deux éléments du couple. En effet, on a constaté que des liaisons covalentes étaient susceptibles de se former par irradiation UV entre un antigène (ou haptène) et un anticorps spécifique comme il est décrit dans Analytical Chemistry [3] T 1Ü suite de ces travaux, on a pensé que les radicaux libres mis en #uvre dans la formation de ces liaisons étaient sans doute des radicaux hydroxyles, ce qui semble être confirmé en réalisant cette réaction de fixation par irradiation U.V. en présence de peroxyde d'hydrogène, procédure qui permet de générer plus proprement des radicaux hydroxyles. Nous avons ainsi pu constater que la cinétique de formation de ces liaisons était améliorée en présence de peroxyde d'hydrogène, ce qui semble confirmer la mise en jeu de radicaux hydroxyles dans ce processus de fixation et nous a amené à les produire par une réaction de type Fenton. Aussi, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la substance est un antigène ou un haptène, la phase solide comprend un anticorps spécifique de cette substance, et la réaction chimique de fixation consiste en la formation d'une liaison covalente entre la substance et l'anticorps sous l'action des radicaux hydroxyles. Pour l'opération 3) de détermination de l'effet du composé à tester sur la réaction de fixation, il convient de pouvoir mesurer un paramètre directement lié à cette réaction. Ce paramètre peut être le taux de substance fixée sur la phase solide. Dans le cas où la substance est un antigène ou un haptène, ce taux de substance peut être mesuré en mettant en #uvre un dosage immunométrique, en présence et en l'absence du composé à tester. Aussi, dans le mode de réalisation préféré du procédé de l'invention, on détermine le taux d'inhibition engendré par le composé à tester sur la réaction de fixation de la substance sur l'anticorps, en effectuant des dosages immunométriques de la substance (antigène ou haptène), en présence et en l'absence du composé. Ce dosage immunométrique comprend les étapes successives suivantes . a) mettre en contact la substance avec une phase solide sur laquelle est fixé l'anticorps spécifique de cette substance, dit premier anticorps, pour lier immunologiquement la substance au premier anticorps, b) immobiliser la substance sur la phase solide par formation d'une liaison covalente entre la substance et le premier anticorps au moyen de radicaux H0* produits par une réaction de type Fenton, c) dénaturer la liaison immunologique entre la substance et le premier anticorps pour rendre accessible un épitope de cette substance en vue d'une nouvelle réaction immunologique, d) mettre en contact la phase solide ainsi traitée avec un anticorps marqué, dit second anticorps, spécifique de la substance, e) déterminer la quantité du second anticorps marqué fixé sur la phase solide, et f) effectuer à nouveau les étapes a) à e) ci-dessus en utilisant la même quantité de substance dans l'étape a) et en ajoutant dans l'étape b) le composé dont la capacité antioxydante est à déterminer, afin d' évaluer le taux d'inhibition du composé sur la réaction d'immobilisation de la substance. Un dosage immunométrique de ce type faisant intervenir une réaction antigène (ou haptène)- anticorps, suivie d'une fixation sur une phase solide pour libérer un épitope de la substance en cause en vue d'une nouvelle réaction immunologique est décrit en particulier dans le document FR-A- 2 700 855 [4] et dans Analytical Chemistry 71, n 5, 1999, pp. 1002-1008 [3]. Dans ce dernier document, la formation de liaisons covalentes entre l'antigène et l'anticorps était effectuée par irradiation au moyen de rayonnement ultraviolet. Dans l'invention, on reproduit les mêmes étapes que celles du dosage du document [4], mais on immobilise la substance sur la phase solide comprenant le premier anticorps au moyen de radicaux Ho' produits, de préférence, par une réaction de type Fenton. La substance utilisée dans le procédé de l'invention peut être tout antigène ou haptène, ou tout anticorps spécifique de ces antigènes ou haptènes, de préférence un anticorps monoclonal. A titre d'exemple, la substance peut être un haptène tel que l'estradiol, la substance P, le CGRP ( calcitonine gene related peptide ), le couple histamine-X (X étant par exemple un groupement tyrosyle ou une base nucléique). Les anticorps utilisés peuvent être des anticorps polyclonaux ou monoclonaux. De préférence, on utilisc- deux anticorps identiques, mr#noclciiaux dont l'un dénommé second anticorps, est un anticorps marqué. Ce dernier peut être marqué par différents marqueurs tels que des éléments radioactifs, des enzymes, des marqueurs fluorescents, des marqueurs luminescents et des molécules capables de réagir avec l'avidine ou la streptavidine. De préférence, on utilise un anticorps marqué par une enzyme, ce qui permet par exemple de déterminer l'anticorps marqué par une méthode colorimétrique. De préférence encore, l'enzyme est l'acétylcholinestérase et l'on mesure l'activité enzymatique en utilisant le réactif d'Ellman, constitué par un mélange d'acétylthiocholine et de DTNB, comme décrit par Pradelles et al dans Anal. Chem. 57, 1985, page 1170 [5] et en déterminant l'absorbance à 414 nanomètres. Les étapes a) et c) à e) du dosage peuvent être effectuées comme il est décrit dans le document [4]. Selon l'invention, le taux d'inhibition du composé testé sur la réaction d'immobilisation de la substance peut être déterminé en tant que pourcentage d'inhibition du signal So représentatif de la quantité de substance immobilisée en l'absence du composé. Selon l'invention, pour apprécier la capacité antioxydante du composé testé, on mesure de préférence le taux d'inhibition engendré par différentes concentrations de ce composé de façon à déterminer la concentration CISO de composé nécessaire pour obtenir 50 % d'inhibition de la réaction. Le procé--té de l'invention peut être mis en #uvre pour tester différents composés antioxydants ou vérifier la capacité antioxydante de composés. Ceux-ci peuvent être quelconques à condition bien entendu qu'ils ne perturbent pas et ne réagissent pas avec le complexe formé entre la substance et l'anticorps. L'invention a encore pour objet un procédé pour immobiliser une substance sur une phase solide comportant une molécule présentant une affinité spécifique vis-à-vis de la substance, qui consiste à former une liaison covalente entre la substance et ladite molécule au moyen d'espèces actives de l'oxygène, par exemple de radicaux hydroxyles produits par une réaction de type Fenton. Cette substance peut être un antigène ou un haptène, la molécule à affinité spécifique étant dans ce cas un anticorps spécifique de l'antigène ou de l'haptène. La substance peut aussi être un récepteur biologique, la molécule spécifique étant dans ce cas un ligand du récepteur. La substance peut être un acide nucléique ou un fragment de celui-ci, la molécule spécifique étant dans ce cas un acide nucléique ou un fragment d'acide nucléique complémentaire de la substance. La substance peut être un acide nucléique ou un fragment de celui-ci et la molécule spécifique étant dans ce cas une protéine. Bien entendu, la substance pourrait aussi bien être l'anticorps, le ligand ou la protéine, et la molécule pourrait être l'antigène, l'haptène, le récepteur, l'acide nucléique ou ifragment d'acide nucléique. En effet, il est seulement nécessaire que la substance et la molécule aient une affinité spécifique l'une vis-à-vis de l'autre. Pour mettre en #uvre ce procédé d'immobilisation, on met en contact la phase solide comportant la molécule à affinité spécifique avec la substance et une solution aqueuse contenant du peroxyde d'hydrogène, éventuellement stabilisé par de l'urée, et un sel ou complexe de fer, de cuivre, de nickel, de chrome ou de titane. De préférence, on utilise une solution aqueuse constituée par un tampon carbonate contenant le peroxyde d'hydrogène, éventuellement stabilisé par de l'urée, et un sel de cuivre tel que du sulfate de cuivre. Le procédé d'immobilisation décrit ci- dessus peut être utilisé en particulier dans le procédé de dosage immunométrique de FR-A-2 700 855. Ce procédé de dosage immunométrique d'une substance comprenant les étapes suivantes - 1) mettre en contact un échantillon contenant la substance avec une phase solide sur laquelle est fixé un anticorps spécifique de cette substance, dit premier anticorps, pour lier immunologiquement la substance au premier anticorps, - 2) immobiliser la substance sur là phase solide par formation d'une liaison covalente entre la substance et le premier anticorps, - 3) dénaturer la liaison immunolcg.i.nue. entre la substance et le premier anticorps pour rendre accessible un épitope de cette substance en vue d'une nouvelle réaction immunologique, - 4) mettre en contact la phase solide ainsi traitée avec un anticorps marqué, dit second anticorps, spécifique de la substance, - 5) déterminer la quantité du second anticorps marqué fixé sur la phase solide, et - 6) déterminer sur une courbe d'étalonnage la quantité de substance à doser présente dans l'échantillon à partir de la quantité du second anticorps mesurée dans l'étape 5), se caractérise en ce que l'on réalise l'étape 2) d'immobilisation de la substance en formant la liaison covalente au moyen d'espèces actives de l'oxygène telles que des radicaux H0* produits par une réaction de type Fenton. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture de la description qui suit, et des exemples de réalisation donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif, en référence aux dessins annexés. Brève description des dessins Les figures 1A à 1D illustrent schématiquement les différentes étapes du dosage immunométrique mis en ceuvre dans le procédé de l'invention. La figure 2 est une courbe illustrant le taux d'inhibition du signal (en %) d'un antioxydant en fonction de la concentration en antioxydant (en mM). La figure 3 est un diagramme illustrant les taux d'inhibition (en ô) de différents antioxydants en fonction de leur concentration (en mM). La figure 4 est une courbe d'étalonnage obtenue pour le dosage immunométrique de 17(3-estradiol. Exposé détaillé des modes de réalisation Sur la figure 1, on a représenté le principe de dosage immunométrique mis en #uvre dans l'invention. Comme on le voit sur la figure 1A, des anticorps 1, de préférence monoclonaux, sont immobilisés sur une phase solide 3, qui peut être par exemple une plaque de microtitration en plastique de 96 puits. Ces anticorps sont spécifiques d'un antigène ou d'un haptène 5 muni d'un épitope 5a. Par mise en contact de l'haptène avec les anticorps, on obtient une liaison immunologique entre l'hapténe 5 et l'anticorps 1. Après capture immunologique de cet haptène, on peut laver les puits, puis réaliser une réaction de type Fenton pour obtenir une liaison covalente entre l'haptène 5 et l'anticorps 1. La figure 1B représente la formation de cette liaison covalente 7, l'haptène 5 étant toujours associé à l'anticorps 1 par liaison immunologique. On procède alors à la dénaturation de cette liaison immunologique entre l'anticorps 1 et l'haptène 5 pour libérer l'épitope 5a. Cette étape peut être réalisée par addition d'un agent dissociant /dénaturant tel que la soude, et elle est illustrée sur la figure 1C. Dans l'étape suivante, illustrée par la figure 1D, on ajoute l'anticorps marqué 9 qui vient s'associer par liaison immunologique à l'haptène 5 au moyen de l'épitope 5a libéré précédemment. On peut alors déterminer la quantité d'anticorps marqué 9 présente dans le puits, qui correspond au signal de référence So et à la quantité d'antigène lié ou immobilisé. Pour mettre en #uvre le procédé de l'invention, on recommence alors les mêmes opérations en réalisant l'étape représentée sur la figure 1B en présence du composé à tester, c'est-à-dire en ajoutant ce composé à la concentration C1 aux réactifs de Fenton. Si ce composé a une activité antioxydante, il va inhiber la formation de liaisons 7 entre l'haptène 5 et l'anticorps 1. De la sorte lors de l'étape représentée sur la figure 1D, on détectera une quantité moindre d'anticorps marqué et le signal exprimé S1 sera inférieur au signal So correspondant à la même réaction en l'absence du composé. En effet, le signal obtenu en fin de procédé est en relation directe avec la quantité d'hapténe immobilisé sur la phase solide par une réaction de type Fenton. Si au cours de l'étape 1B, l'ajout d'un composé interfère sur la formation de ces liaisons covalentes, la quantité d'haptène immobilisé sur la phase solide sera inférieure et il en résultera un signal inférieur lors de la détection de l'anticorps marqué en 1D. Pour vérifier la capacité antioxydante du composé, on pourra effectuer le même dosage avec des quantités croissantes de composé à tester pour obtenir la courbe d'inhibition, c'est-à-dire la variation du pourcentage d'inhibition en fonction de la concentration en composé testé. Sur la figure 2, on a illustré une telle courbe d'inhibition. A partir de cette courbe, on peut déterminer la concentration CI5o en composé qui donne lieu à 50 % d'inhibition. Sur cette courbe, elle correspond à 0,06 mmol/l. Les exemples qui suivent illustrent l'invention. Exemple 1 : Détermination de la capacité antioxydante de divers composés. Dans cet exemple, on utilise le 17p estradiol comme substance et des anticorps monoclonaux de souris anti-17(3-estradiol, et on effectue les étapes suivantes illustrées sur la figure 1. 1. Capture immunologique (figure 1A) On utilise une plaque de microtitration comportant 96 puits que l'on a recouvert d'anticorps monoclonaux de souris anti-17(3-estradiol. On fait ensuite incuber dans les puits 100 u1 d'une solution d'estradiol dans le tampon de dosage (EIA) contenant du phosphate de potassium 0,1 M, pH 7, 4, 0,15 M de NaCl, 0,1 % de sérum albumine bovine et 0,01 % d'azoture de sodium, la concentration en estradiol `tant de 500 pg/ml. On laisse la réaction de capture immunologique du 17@-estradiol se poursuivre pendant 1 heure à 22 C et on réalise des témoins en incubant seulement 100 p1 de tampon de dosage. On lave ensuite tous les puits 3 fois avec du tampon de lavage phosphate de potassium 0,01 M, pH 7, 0, 0,05 % de Tween 20. On obtient ainsi la liaison immunologique de l'estradiol avec les anticorps monoclonaux représentée sur la figure 1A. 2. Immobilisation (figure 1B) Après le lavage décrit ci-dessus, on ajoute dans l'ordre dans les puits, 50 pl du composé à tester à la concentration C1, 50 p1 de CUS04 (30 mM), et 50 u1 de H202 stabilisé par de l'urée (15 mM). On dilue tous les produits dans du tampon carbonate 100 mM, pH 9 et on laisse réagir pendant 5 minutes, puis on lave de nouveau les puits en utilisant le même tampon de lavage que précédemment. On obtient ainsi la formation des liaisons covalentes 7 représentées sur la figure 1B. La quantité de liaisons formées dépend de la concentration en composé à tester. 3. Libération de l'épitope (figure 1C) On ajoute alors 200 u1 de NaOH 0,5 N dans les puits et on lave les puits. Ceci correspond à la dissociation et à la dénaturation des liaisons immunologiques entre l'anticorps 1 et l'haptène 5 avec libération de l'épitope 5a. Le lavage permet d'éliminer les molécules d'hapt`ne 5 non liées par liaison covalente aux_ anticorps 1. 4. Révélation (figure 1D) On ajoute alors dans les puits 100 u1 d'une solution de traceur enzymatique constitué par le second anticorps marqué qui est le même anticorps monoclonal anti-estradiol, couplé à l'acétylcholinestérase à raison de 4 unités Ellman/ml. L'unité Ellman est définie comme il est décrit par Pradelles et al dans [5]. On obtient ainsi la liaison immunologique de ce second anticorps marqué avec les molécules d'haptène 5, ce qui correspond à la figure 1D. On laisse réagir pendant 1 heure à 22 C, puis on lave les puits et on ajoute alors 200 pl du substrat enzymatique (réactif d'Ellman) et on laisse la couleur se développer pendant 10 minutes. On mesure alors la densité optique à 414 nanomètres dans un lecteur automatique de plaques de microtitration. On obtient ainsi un signal S1 correspondant à la concentration C1 du composé à tester. On a déterminé de la même façon le signal So obtenu sans addition du composé à tester. Le pourcentage d'inhibition est évalué par la formule suivante : S1/So x 100. On effectue ensuite les mêmes opérations avec des concentrations C2, C3 ... Cn en composé à tester, ce qui donne les signaux correspondant S2, S3 ... S,, et permet d'établir la courbe d'inhibition représentée sur la figure 2, à partir de laquellc on peut obtenir la valeur qui correspond à 50 % d'inhibition. Comme représenté sur la figure 2, on voit que la concentration CI5o qui correspond à 50 % d'inhibition est de 0,06 mM. On a réalisé ce dosage sur les composés suivants - albumine sérique bovine, - acide ascorbique, - mannitol, - thiourée, - diméthylsulfoxyde (DMSO), - cimétidine, - l'acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthyl chroman-2- carboxylique (TroloxOO), - tyrosine, - acide urique, et - glucose. Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 3 qui représente les courbes d'inhibition obtenues avec ces composés. On remarque ainsi que les composés antioxydants ayant les capacités antioxydantes les plus élevées sont l'albumine sérique bovine et la thiourée, qui ont des CI5p inférieures à 0,1 mM. Le Trolox , la cimétidine, la tyrosine, l'acide urique et l'acide ascorbique ont des CI50 inférieures à 1 mm. En revanche, le mannitol, le glucose et le diméthylsulfoxyde ont une capacité antioxydante beaucoup plus faible. Exemple 2 : Dosage immuncm4,trique du 17(3-estradicl. Cet exemple illustre l'utilisation du procédé d'immobilisation par une réaction de type Fenton dans le dosage immunométrique de 17(3-estradiol. Pour ce dosage, on utilise comme phase solide une plaque de microtitration à 96 puits revêtus de l'anticorps monoclonal de souris anti-17(3-estradiol comme dans l'exemple 1, et on réalise les étapes suivantes 1. Capture immunologique (figure 1A) On fait incuber dans les puits 100 pl du tampon de dosage EIA comme dans l'exemple 1, qui contient soit l'échantillon à doser, soit les sérums standards de 17p-estradiol, pendant 15 minutes à la température ambiante. 2. Immobilisation (figure 1B) Après lavage des puits comme dans l'exemple 1, on ajoute 50 pl peroxyde d'hydrogène stabilisé à l'urée 20 mM, puis 50 u1 de CuSO4 20 mM tous deux dissous dans le tampon carbonate 100 mM, pH 9. On laisse réagir pendant 2 minutes à la température ambiante. 3. Libération de l'épitope (figure 1C) Après lavage comme dans l'exemple 1, on ajoute 200 u1 de NaOH 0,5N et on laisse réagir pendant 2 minutes à température ambiante. 4. Révélation (figure 1D) Après lavage comme dans l'exemple 1, on ajoute 100 u1 d'anticorps monoclonaux anti-(3-estradiol marqués à l'acétylcholinestérase (4 unités Ellman par ml) et on laisse incuber pendant 1 heure à température ambiante. Après lavage comme dans l'exemple 1, on ajoute 200 u1 de réactif d'Ellman et on détermine l'absorbance à 414 nm exprimée en unités d'absorbance (UA), après 10 minutes de réaction enzymatique. A partir des mesures d'absorbances obtenues pour les sérums standards, on trace la courbe d'étalonnage représentée sur la figure 4 qui illustre l'absorbance à 414 nm (en UA) en fonction des concentrations en 175-estradiol (en pg/ml). A partir de l'absorbance obtenue pour l'échantillon, on peut déterminer sa concentration en 175-estradiol en se reportant à la courbe d'étalonnage de la figure 4. Références citées [1] Archives of Biochemistry and Biophysics, 15 septembre 1996, volume 333, n 2, pages 377-384. [2] : Methods in Enzymology, vol 234, pp. 279-293, 1994. [3] : Analytical Chemistry 71, n 5, 1999, pp. 1002-1008. [41 FR-A- 2 700 855. [5] Pradelles et al dans Anal. Chem. 57, 1985, page 1170. REVENDICATIONS 1. Procédé pour déterminer la capacité anti-oxydante d'un composé, consistant à mesurer le taux d'inhibition engendré par ce composé sur une réaction chimique de fixation d'une substance sur une phase solide utilisant des espèces actives de l'oxygène pour cette réaction de fixation. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les espèces actives de l'oxygène sont les radicaux hydroxyles HO". 3. Procédé selon la revendi.cat:ion 2, dans lequel les radicaux HO & utiles pour cette réaction chimique de fixation sont produits par une réaction de type Fenton. 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel on utilise tout sel métallique ou complexe métallique, et du peroxyde d'hydrogène pour produire les radicaux HO*par une réaction de type Fenton. 5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, dans lequel on réalise une réaction de type Fenton dans une solution saline ayant un pH de 5 à 11. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel la solution saline peut être un tampon phosphate, carbonate, ou borate. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la substance est un antigène ou un haptène, la phase solide comprend un anticorps spécifique de cette substance, et la réaction chimique de fixation consiste en la formation d'une liaison covalente entre la substance et l'anticorps. 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel on détermine le taux d'inhibition en effectuant un dosage immunométrique de la substance, en présence et en l'absence du composé, ledit dosage immunométrique comprenant les étapes successives suivantes a) mettre en contact la substance avec une phase solide sur laquelle est fixé l'anticorps spécifique de cette substance, dit premier anticorps, pour lier immunologiquement la substance au premier anticorps, b) immobiliser la substance sur la phase solide par formation d'une liaison covalente entre la substance et le premier anticorps au moyen de radicaux HO* produits par une réaction de type Fenton, c) dénaturer la liaison immunologique entre la substance et le premier anticorps pour rendre accessible un épitope de cette substance en vue d'une nouvelle réaction immunologique, d) mettre en contact la phase solide ainsi traitée avec un anticorps marqué, dit second anticorps, spécifique de la substance, e) déterminer la quantité du second anticorps marqué fixé sur la phase solide, et f) effectuer à nouveau les étapes a) à e) ci-dessus en utilisant la même quantité de substance dans l'étape a) et en ajoutant dans l'étape b) le composé dont la capacité anti-oxydante est à déterminer, afin d'évaluer le taux d'inhibition du composé sur la réaction d'immobilisation de la substance. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel le second anticorps est un anticorps marqué par une enzyme. 10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel l'enzyme est l'acétylcholinéstérase, et on détermine la quantité du second anticorps marqué par colorimétrie. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel on mesure le taux d'inhibition engendré par différentes concentrations du composé de façon à déterminer la quantité de composé nécessaire pour obtenir_ 50 % d'inhibition de la réaction. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel la substance est le 17(3-estradiol. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel le composé est choisi parmi l'albumine sérique bovine, l'acide ascorbique, le mannitol, la thiourée, le diméthylsulfoxyde (DMSO), l'acide urique, l'acide 6- hydroxy-2,5,7,8-tétraméthyl chroman-2-carboxylique, la tyrosine, la cimétidine et le glucose. 14. Procédé pour immobiliser une substance sur une phase solide comportant une molécule présentant une affinité spécifique vis-à-vis de la substance, qui consiste à former une liaison covalente entre la substance et ladite molécule au moyen d'espèces actives de l'oxygène. 15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel les espèces actives de l'oxygène sont des radicaux hydroxyles HOO produits par une réaction de type Fenton. 16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel on utilise un sel ou complexe de fer, de cuivre, de nickel, de chrome ou de titane et du peroxyde d'hydrogène pour produire les radicaux H0* par une réaction de type Fenton. 17. Procédé selon la revendication 15 ou 16, dans lequel on réalise une réaction de type Fenton dans une solution saline ayant un pH de 5 à 11. 18. Procédé selon la revendication 15, dans lequel ?_a solution saline est un tampon phosphate, carbonate ou borate. 19. Procédé de dosage immunométrique d'une substance comprenant les étapes suivantes - 1) mettre en contact un échantillon contenant la substance avec une phase solide sur laquelle est fixé un anticorps spécifique de cette substance, dit premier anticorps, pour lier immunologiquement la substance au premier anticorps, - 2) immobiliser la substance sur la phase solide par formation d'une liaison covalente entre la substance et le premier anticorps, - 3) dénaturer la liaison immunologique entre la substance et le premier anticorps pour rendre accessible un épitope de cette substance en vue d'une nouvelle réaction immunologique, - 4) mettre en contact la phase solide ainsi traitée avec un anticorps marqué, dit second anticorps, spécifique de la substance, - 5) déterminer la quantité du second anticorps marqué fixé sur la phase solide, et - 6) déterminer sur une courbe d'étalonnage la quantité de substance à doser présente dans l'échantillon à partir de la quantité du second anticorps mesurée dans l'étape 5), caractérisé en ce que l'on réalise l'étape 2) d'immobilisation de la substance en formant la liaison covalente au moyen d'espèces actives de l'oxygène. 20. Procédé selon la revendication 19, dans lequel les espèces actives de l'oxygène sont des radicaux hydzD:#yi.As_HO & produits par une réactic:# ne: type Fenton. 21. Procédé selon la revendication 20, dans lequel on utilise un sel ou complexe de fer, de cuivre, de nickel, de chrome ou de titane et du peroxyde d'hydrogène pour produire les radicaux HO* par une réaction de type Fenton. 22. Procédé selon la revendication 20 ou 21, dans lequel on réalise une réaction de type Fenton dans une solution saline ayant un pH de 5 à 11. 23. Procédé selon la revendication 22, dans lequel la solution saline est un tampon phosphate, carbonate ou borate. 24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 23, dans lequel la substance est le 17(3-estradiol.