Brevet FR2806802A1 — publié le 20010928

I() Procédé et installation pour confirmer l'absence dans la viande de protéines prion infectieuses La présente invention concerne un procédé pour confirmer l'absence de protéines prion (PrPsc ou PrPres) infectieuses20 spécifiques d'encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST), telles que l'encéphalopathie spongiforme bovine ou la maladie de scrapie ou la chronic wasting disease, dans des pièces de viande, autres que le cerveau ou la moelle épinière, issues notamment de bovins ou de moutons, et en cours de commercialisation ainsi qu'une installation pour la mise en oeuvre du procédé. Les maladies du prion ou encéphalopathies spongiformes transmissibles sont un groupe de maladies30 neurodégénératives qui affectent à la fois les humains et les animaux et qui peuvent être transmises entre mammifères en particulier par ingestion de tissus infectés. Ces maladies sont dues à l'altération de la configuration moléculaire d'une protéine prion PrP par un mécanisme35 inconnu qui transforme cette protéine en particules infectieuses appelées protéines prion PrPsc ou PrPres. Ces protéines infectieuses peuvent être distinguées des protéines normales par leur insolubilité, leur résistance 2 partielle aux protéases et identifiées par différents anticorps (kits immunologiques ELISA, Western Blot, etc.). Le fait que la maladie de Kreutzfeld Jacob chez l'humain puisse être initiée par l'ingestion de tissus d'animaux infectés d'encéphalopathie spongiforme transmissible génère une méfiance importante du consommateur à l'encontre de la consommation de viande. Il est donc devenu impératif, pour des raisons économiques et de santé publique, de mettre au10 point des procédés permettant de rassurer le consommateur et de certifier à ce dernier l'absence de protéines infectieuses dans la viande consommée. Toutefois, la difficulté réside aujourd'hui dans le fait que les pièces de viande commercialisées ne sont pas à ce jour directement analysables pour détecter la présence ou l'absence de protéines prion PrPsc infectieuses spécifiques d'encéphalopathies spongiformes transmissibles. En effet, les tests commercialisés ne permettent de détecter la20 présence de protéines prion infectieuses que dans le système nerveux central, en particulier le cerveau ou la moelle épinière, la sensibilité de ces tests étant insuffisante pour l'appliquer à d'autres parties de l'animal. On sait par ailleurs que les méthodes de25 traçabilité mises au point, qui consistent à indiquer sur chaque pièce de viande l'origine de cette pièce de viande et en particulier l'individu dont elle est issue, ne sont pas exemptes de fraude et sont difficiles à mettre en oeuvre en pratique pour les produits transformés.30 Un but de la présente invention est de proposer un procédé qui permet, de par sa mise en oeuvre, de garantir de manière certaine l'absence de protéines prion infectieuses dans la pièce de viande analysée, cette pièce de viande35 pouvant être un morceau quelconque de l'animal. Un autre but de la présente invention est de mettre au point un procédé du type précité qui permet de garantir un 3 tel résultat indépendamment de la transformation à laquelle la viande a été soumise. Un autre but de la présente invention est de proposer un procédé du type précité qui permet d'obtenir un tel résultat en l'absence de toute traçabilité et donc de tout marquage du produit final. A cet effet, l'invention a pour objet un procédé pour confirmer l'absence de protéines prion (PrPsc) infectieuses spécifiques d'encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST), telles que l'encéphalopathie spongiforme bovine ou la maladie de scrapie ou le chronic wasting disease, dans des pièces de viande, autres que le cerveau ou la moelle15 épinière, issues notamment de bovins, de moutons ou de gibier et en cours de commercialisation, caractérisé en ce qu'on pratique, à partir d'un échantillon de la pièce de viande, un test d'identification de la ou des empreintes génétiques du ou des individus dont la pièce de viande est20 issue, en ce qu'on compare la ou les empreintes génétiques à au moins une empreinte génétique obtenue à partir d'un échantillon, de préférence le cerveau ou la moelle épinière d'un animal, le cerveau ou la moelle épinière de cet animal ayant été soumis, après abattage, à un test de détection de25 protéines prion (PrPsc) spécifiques des encéphalopathies spongiformes transmissibles et en ce que, si les résultats de la comparaison révèlent 100 % d'homologie entre lesdites empreintes, on confirme de manière certaine l'absence de protéine prion (PrPsc) dans ladite pièce de viande.30 L'invention a encore pour objet une installation pour la mise en oeuvre du procédé précité, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins d'une part des moyens d'analyse pour la détermination d'empreintes génétiques et la35 détection de protéines prion spécifiques de l'encéphalopathie spongiforme transmissible, d'autre part des moyens informatiques pour le stockage et le traitement des résultats d'analyse. L'invention sera bien comprise à la lecture de la description suivante d'exemples de réalisation. Comme mentionné ci-dessus, le problème essentiel des encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST) résulte du fait que ces maladies ne sont à ce jour détectables que sur des parties particulières de l'animal, en particulier le cerveau et la moelle épinière. Il est donc impossible àl1 ce jour de confirmer, en l'absence d'éléments certains sur l'origine d'une pièce de viande, l'absence de contamination détectable de l'animal d'o est issue une telle pièce de viande. Le procédé, objet de l'invention, permet de résoudre ce problème technique. Ce procédé s'applique à15 tout produit à base de viande y compris des produits transformés. Ce procédé consiste de manière générale à pratiquer, à partir d'un échantillon de la pièce de viande, un test2() d'identification de la ou des empreintes génétiques du ou des individus dont la pièce de viande est issue, à comparer cette empreinte génétique à au moins une empreinte génétique obtenue à partir d'un échantillon de cerveau ou de moelle épinière d'un animal, ce cerveau ou cette moelle25 épinière ayant été soumis, après abattage de l'animal, à un test de détection de protéines prion spécifiques des encéphalopathies spongiformes transmissibles et à confirmer, si les résultats de la comparaison révèlent 100 % d'homologie entre lesdites empreintes, l'absence de protéines prion PrPsc dans la pièce de viande. Deux procédures peuvent être mises en oeuvre dans le cadre de ce procédé. La première procédure consiste à soumettre après abattage un échantillon de cerveau ou de moelle épinière d'un animal abattu à un test de détection de protéines prion PrPsc spécifiques de la maladie et à un test de détermination de l'empreinte génétique puis à stocker dans une base de données l'empreinte génétique obtenue et à comparer ultérieurement, au moyen d'un logiciel de traitement approprié, l'empreinte génétique obtenue à partir de la5 pièce de viande à certifier aux empreintes génétiques mémorisées dans la base de données. La confirmation de l'absence de protéines prion dans la pièce de viande est obtenue si le résultat de la comparaison révèle 100 % d'homologie entre lesdites empreintes.10 Dans la base de données, il sera possible d'associer si nécessaire, à chaque empreinte génétique obtenue sur un échantillon de cerveau ou de moelle épinière, les résultats du test de détection de protéines prion infectieuses effectué sur ce même échantillon. Toutefois, la législation actuelle obligeant les centres d'abattage à se débarrasser de carcasses d'animaux dont le test de détection de protéines prion infectieuses est positif, la base de données ne devrait contenir que des empreintes génétiques20 d'animaux testés négatifs. Si l'empreinte génétique n'est pas conforme à une empreinte génétique mémorisée, on ne pourra pas conclure car la pièce de viande pourrait être issue d'un animal infecté ou d'un animal qui n'a pas été testé par le procédé. A l'inverse, si l'empreinte génétique25 est conforme à une empreinte génétique mémorisée, on pourra conclure à l'absence de protéines prions spécifiques PrPsc. Cette première procédure consiste à effectuer des analyses systématiques sur tous les cerveaux ou moelles épinières d'animaux abattus et à procéder parallèlement à un test de30 détermination d'empreintes génétiques. Elle a l'avantage de pouvoir s'exempter de tout marquage de la pièce de viande notamment en ce qui concerne l'animal dont elle est issue. Cette procédure rend donc plus complexe les phases suivant la procédure d'abattage mais, à l'inverse, simplifie la35 traçabilité puisqu'elle peut s'en exempter totalement. Suivant une autre procédure permettant la mise en oeuvre du procédé, on soumet, après abattage, un échantillon de 6 cerveau ou de moelle épinière de l'animal abattu à un test de détection des protéines prion spécifiques de P'EST, on stocke ledit échantillon muni d'un code d'identification de l'animal, on identifie chaque pièce de viande issue de5 l'animal abattu par référence au code d'identification et, pour déterminer si une pièce de viande est bien issue de l'animal analysé et testé négatif dont elle porte le code d'identification, on pratique d'une part sur l'échantillon de cerveau ou de moelle épinière stocké, d'autre part sur10 la pièce de viande à certifier, un test de détermination de l'empreinte génétique et on vérifie l'homologie entre lesdites empreintes. Une absence d'homologie permettra d'affirmer de manière certaine que le marquage de la pièce de viande n'est pas conforme et qu'il y a donc peut être eu15 fraude. Cette seconde procédure oblige donc à mettre en oeuvre des opérations de traçabilité sur les pièces de viande commercialisées mais limite les procédures d'analyse après abattage. Le procédé, objet de l'invention, permet de garantir cette traçabilité.20 Dans le cas de la mise en oeuvre de la première procédure, le contenu des bases de données pourra être accessible à tous ou uniquement réservé à des laboratoires spécialisés. Dans les procédures décrites ci-dessus, on déterminera l'empreinte génétique généralement par séquençage ou par méthode RFLP (restriction fragment length polymorphism). Ces méthodes sont bien connues à ceux versés dans cet art et ne seront donc pas décrites plus en détail ciaprès. La30 méthode RFLP nécessite de disposer simplement d'une machine PCR standard. Cette technique est aujourd'hui largement utilisée en routine. La technique du séquençage est une technique plus onéreuse mais qui peut toutefois être appliquée dans le cadre des procédés décrits cidessus.35 Les tests de détection du prion pourront quant à eux être effectués au moyen de tests déjà commercialisés, en particulier par le CEA et Bio Rad ou par les Sociétés 7 Prionics et Enfer Scientific. D'autres méthodes de détection du prion ont notamment été décrites dans la demande internationale PCT WO/98.16834. La mise en oeuvre du procédé décrit ci-dessus peut être effectuée au moyen d'une installation relativement simple. Cette installation comprend au moins d'une part des moyens d'analyse pour la détermination d'empreintes génétiques et la détection de protéines prion spécifiques de10 l'encéphalopathie spongiforme transmissible, d'autre part des moyens informatiques pour le stockage et le traitement des résultats d'analyse. 8 REVENDICATIONS 1. Procédé pour confirmer l'absence de protéines prion (PrPsc) infectieuses spécifiques d'encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST), telles que l'encéphalopathie spongiforme bovine ou la maladie de scrapie ou le chronic wasting disease, dans des pièces de viande, autres que le cerveau ou la moelle épinière, issues notamment de bovins, de moutons ou de gibier, et en courso10 de commercialisation, caractérisé en ce qu'on pratique, à partir d'un échantillon de la pièce de viande, un test d'identification de la ou des empreintes génétiques du ou des individus dont la pièce de viande est issue, en ce qu'on compare la ou les15 empreintes génétiques à au moins une empreinte génétique obtenue à partir d'un échantillon, de préférence le cerveau ou la moelle épinière d'un animal, le cerveau ou la moelle épinière de cet animal ayant été soumis, après abattage, à un test de détection de protéines prion (PrPsc) spécifiques des encéphalopathies spongiformes transmissibles et en ce que, si les résultats de la comparaison révèlent 100 % d'homologie entre lesdites empreintes, on confirme de manière certaine l'absence de protéine prion (PrPsc) dans ladite pièce de viande.25 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on soumet, après abattage, un échantillon de cerveau ou de moelle épinière de l'animal abattu à un test de détection de protéines prion (PrPsc) spécifiques de la maladie et à un test de détermination de l'empreinte génétique, en ce qu'on stocke dans une base de données l'empreinte génétique obtenue, en ce qu'on associe si nécessaire à chaque empreinte le résultat du test de détection de prion, en ce qu'on compare, au moyen d'un35 logiciel de traitement approprié, l'empreinte génétique obtenue à partir de la pièce de viande à certifier aux empreintes génétiques mémorisées, en ce qu'on confirme, si le résultat de la comparaison révèle 100 % d'homologie 9 entre lesdites empreintes, l'absence de protéines prion (PrPsc) spécifiques dans la pièce de viande. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on soumet, après abattage, un échantillon de cerveau ou de moelle épinière de l'animal abattu à un test de détection des protéines prion spécifiques de l'EST, on stocke ledit échantillon muni d'un code d'identification, en ce qu'on identifie chaque pièce10 de viande issue de l'animal abattu par référence au code d'identification de l'animal et en ce que, pour vérifier si une pièce de viande est bien issue de l'animal testé négatif dont elle porte le code d'identification, on pratique d'une part sur l'échantillon de cerveau ou de15 moelle épinière stocké, d'autre part sur la pièce de viande à certifier, un test de détermination de l'empreinte génétique, et on vérifie l'homologie entre lesdites empreintes. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on détermine l'empreinte génétique par séquençage ou par méthode RFLP (restriction fragment length polymorphism). 5. Installation pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins d'une part des moyens d'analyse pour la détermination d'empreintes génétiques et la détection de protéines prion spécifiques30) de l'encéphalopathie spongiforme transmissible, d'autre part des moyens informatiques pour le stockage et le traitement des résultats d'analyse.