Brevet FR2804326A1 — publié le 20010803

PROCEDE DE STERILISATION PAR TRAITEMENT SOUS HAUTES PRESSIONS DE PRINCIPES ACTIFS SENSIBLES La présente invention concerne un procédé de stérilisation par des hautes pressions de principes actifs sensibles notamment des peptides, des oligonucléotides, ou des protéines. On connaît la stérilisation de produits agro-alimentaires par la pression comme le procédé décrit dans la demande de brevet européen N 894440. Ce procédé permet de traiter des liquides en continu par traitement desdits liquides dans une série d'étages dans lesquels les pressions augmentent au fur et à mesure. Lorsque le liquide atteint le dernier étage de très haute pression, le liquide est soumis à une dépression rapide qui brise les micro-organismes. D'autres procédés prévoient de combiner la très haute pression avec les hautes températures. C'est ainsi que les aliments faiblement acides qui sont déjà conditionnés sont soumis à une température de pré-pressurisation puis pendant un instant bref, l'ensemble est porté à une très haute pression ce qui fait monter la température instantanément à des valeurs importantes puis la pression est ramenée à la pression de départ si bien que la température redescend immédiatement. Ces procédés permettent de détruire les micro-organismes tels que virus, bactéries et moisissures dans des liquides. En effet, les liquides transmettent parfaitement les pressions exercées, ceci de façon isostatique. Par contre, du point de vue économique, de tels procédés sont peu adaptés pour des produits à faible valeur ajoutée car ils engendrent des investissements importants qu'il est difficile d'amortir. On connaît d'autres moyens de stérilisation par des procédés radioactifs mais dans ce cas, si certains rayonnements peuvent donner satisfaction, ils posent des problèmes complexes quant à leur manipulation et surtout soulèvent des questions quant aux risques pour l'environnement, liés à leur utilisation. Les membranes stérilisantes sont aussi un bon moyen pour retenir les particules non souhaitées mais il faut aussi que le criblage convienne et que l'on puisse mécaniquement séparer les différentes catégories. De façon générale, les règles industrielles que la filtration impose, les rendent peu pratiques à mettre en ceuvre. La technique la plus courante consiste à stériliser par la chaleur sous pression comme indiqué ci-avant ou simplement par la chaleur, à la pression ambiante. Mais cette méthode n'est applicable qu'aux produits qui supportent la mise en température or de nombreux principes actifs sont sensibles à la chaleur. C'est les cas notamment des principes actifs issus des biotechnologies tels que les peptides ou les molécules issues des recherches sur l'ADN. Le procédé selon la présente invention propose des étapes permettant de stériliser par un traitement sous hautes pressions des principes actifs sensibles sans les dégrader, ceci dans des conditions de mise en oeuvre adaptées à l'industrie. Un tel procédé appliqué à des entités thérapeutiques à fortes valeurs ajoutées est économiquement adapté mais il subsiste un préjugé qui veut que les principes actifs sensibles sont dégradés par le passage à de très hautes pressions et que l'utilisation de très hautes pressions comme moyen bactéricide et virucide n'est pas adapté. A cet effet, le procédé de stérilisation d'au moins un principe actif sensible selon l'invention se caractérise en ce que le au moins un principe actif est soumis à des pressions comprises entre 3 000 et 6 000 bars. Les températures auxquelles sont simultanément portés les principes actifs sont comprises entre -30 C et + 30 1 C. L'application vise particulièrement les protéines, les anticorps et les peptides de poids moléculaire inférieur ou égal 170 000 g/mol et ceux qui ont été étudiés sont - insuline 40 UI (PM = 5 800 g/mol) - décapeptide :gramicidine (PM =1 140 g/mol) et - anticorps monoclonal comme l'anticorps antivirus grippe A (PM =150 000 g/mol). Le procédé selon la présente invention est maintenant décrit en détail en application à des principes actifs spécifiques et les courbes des différentes figures annexées montrent les résultats obtenus dans le cas des différents essais. Les essais portent sur a/ l'insuline, b/ un peptide et cl un anticorps monoclonal. a/ L'insuline a été choisie pour obtenir les premiers résultats de stérilisation à la pression. Il s'agit d'insuline à 40 UI du commerce et diluée à 1I100 au pH 2,5. Le passage pour la mesure est réalisé avec un débit de 1 ml/min dans un appareil d'HPLC (High Pressure Liquid Chromatographie). Différents échantillons sont soumis, à température ambiante, à - la pression atmosphérique pour le témoin, - 4 000 bars pendant 10 min, - 5 000 bars pendant 10 min, et - 6 000 bars pendant 10 min. Les échantillons, après traitement en atmosphère sous pression, sont ensuite analysés à 214 nm dans l'appareil de chromatographie avec une injection automatique. On obtient les résultats suivants montrés sur les figures 1 à4. On constate que dans les différentes courbes des échantillons soumis à une stérilisation par traitement sous haute pression, il apparaît les mêmes pics avec sensiblement les mêmes intensités et centrés sur les mêmes plages de temps que dans le cas du témoin à pression atmosphérique. II n'y a en effet pas de modifications ou d'altérations notables de la structure du produit. On sait par ailleurs et par analogie avec des résultats expérimentaux connus de l'homme de l'art que de telles conditions de pression sont stérilisantes. b/ Le peptide, en l'occurrence la Gramicidine, est soumis à un traitement sous haute pression de la même façon que l'insuline et sa pureté a été testée également par HPLC. Aucune dégradation n'est mesurée. c/ En ce qui concerne les anticorps monoclonaux, on a testé des anticorps monoclonaux dirigés contre le virus de la grippe A de poids moléculaire 150 000 g/mol que l'on a placés dans une atmosphère à 4 000, 5 000 et 6 000 bars pendant 10 min à température ambiante. Un test ELISA montre que l'activité imunologique des anticorps traités jusqu'à 5 000 bars est conservée tandis que cette activité tend à diminuer au- delà de 6 000 bars. C'est ce que montre les courbes de la figure 5. On note aussi que les traitements sous pression avec une température négative permettent d'améliorer les performances de stérilisation en particulier lorsque la température est portée à -20 C au lieu de la température ambiante pendant le traitement sous pression. Ceci est intéressant dans le cas des traitements à 5 000 bars notamment. Aussi le traitement de stérilisation sous pression entre 3 000 et 6 000 bars selon la présente invention peut être conduit dans une plage de températures couvrant -30 C et +30 C. REVENDICATIONS 1. Procédé de stérilisation d'au moins un principe actif sensible, caractérisé en ce que le au moins un principe actif est traité à des pressions comprises entre 3 000 et 6 000 bars. 2. Procédé de stérilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que la température est comprise entre -30 C et +30 C. 3. Procédé de stérilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le principe actif traité est d'un poids moléculaire inférieur ou égal à 170 000 g/mol. 4. Procédé de stérilisation selon la revendication 3, caractérisé en ce que le principe actif est de la famille des peptides. 5. Procédé de stérilisation selon la revendication 3, caractérisé en ce que le principe actif est de l'insuline. 6. Procédé de stérilisation selon la revendication 3, caractérisé en ce que le principe actif est un anticorps.