Brevet FR2800636A1 — publié le 20010511

La présente invention a pour objet des particules composites, leur procédé de préparation et leurs utilisations. Les microsphères de type polymère présentent un intérêt comme support, vecteur ou véhicule dans les domaines de l'ingénierie biologique, du diagnostic et de la pharmacie. A cet effet, elles ont été utilisées dans le diagnostic médical comme support solide pour des molécules biologiques. Les particules colloïdales présentent plusieurs avantages par rapport aux supports solides traditionnels, tels que tubes, plaques, billes notamment parce qu'elles permettent de disposer d'une grande surface pour des interactions spécifiques et parce qu'elles sont facilement modifiables chimiquement pour introduire à leur surface des groupements fonctionnels susceptibles de réagir avec d'autres molécules, par exemple des molécules biologiques telles que des anticorps ou des fragments d'anticorps, des protéines, des polypeptides, des polynucléotides, des acides nucléiques, des fragments d'acides nucléiques, des enzymes ou des molécules chimiques telles que des catalyseurs, des médicaments, des molécules cages, des chélatants. Parmi les particules colloïdales, les latex magnétiques ont suscité un grand intérêt dans le domaine analytique et sont utilisés par exemple comme moyen pour séparer et/ou détecter des analytes, tels que des antigènes, des anticorps, des molécules biochimiques, des acides nucléiques et autres. Les particules composites de type polymère/magnétique sont habituellement classées en trois catégories sur un critère de taille: les petites particules ayant un diamère Intérieur à 50 nm, les grosses particules ayant un diamètre supérieur à 2 m et les particules intermédiaires d'un diamètre compris entre 50 et 1000 nm. Mais pour qu'elles pl'i répondre à certains critères. D'un point de vue morphologique, il est préférable qu'elles soient relativement sphériques et que la charge magnétique soit répartie de façon relativement homogène dans la matrice polymère. Elles ne doivent pas s'agréger de manière irréversible sous l'action d'un champ magnétique, ce qui signifie qu'elles puissent être redispersées facilement, rapidement et de manière réversible. De même, elles doivent présenter une densité relativement faible pour réduire le phénomène de sédimentation. Avantageusement, elles doivent présenter une distribution granulométrique étroite. On parle encore de particules monodisperses ou isodisperses. Ainsi, en raison de leur taille et de leur densité, les grosses particules magnétiques en suspension dans une phase liquide ont tendance à rapidement sédimenter. Par ailleurs, elles tendent à s'agréger après avoir été soumises à un champ magnétique car elles sont susceptibles d'avoir été de ce fait magnétisées de manière permanente (aimantation rémanente). Elles ne constituent donc pas un bon candidat. A contrario, les petites particules magnétiques ont tendance à rester en suspension du fait de leur mouvement Brownien et sont difficilement attirées, voire pas du tout, par un aimant, en particulier si le champ magnétique appliqué est relativement faible. Elles ne sont donc pas bien appropriées pour les utilisations développées ci-dessus. Il existe donc un intérêt évident à produire des particules composites de type polymère/magnétique, présentant une taille intermédiaire entre 50 et 1000 nm, qui à la fois pallient les inconvénients précités et répondent aux critères établis ci-dessus. Mais l'invention n'est pas limitée à des particules composites magnétisables, comme décrit ci après. La demande de brevet EP 0 390 634 décrit des microsphères composites magnétisables de polymère vinylaromatique réticulé hydrophobe d'un diamètre de l'ordre de 50 à 10 000 nm et comprenant un c#ur solide constitué de particules magnétisables et d'une écorce constituée d'un copolymère hydrophobe dérivé d'au moins un monomère vinylaromatique hydrophobe et d'au moins un polymère émulsifiant polyéthyléniquement insaturé soluble dans le ou les monomères vinylaromatiques et susceptible de réticuler avec le ou lesdits monomères. Toutefois, bien qu'elles puissent répondre à l'exigence de la taille, elles présentent l'inconvénient de ne pas avoir une répartition homogène de la charge magnétique qui est localisée à l'intérieur du c#ur. Par ailleurs, et comme cela ressort à l'évidence des figures annexées, les particules ne sont pas homogène en taille. Il s'agit donc d'un ensemble de particules polydisperses qui devront être triées par application d'un champ magnétique pour ne retenir que les particules de taille attendue. On peut également citer les particules Dynal (nom commercial). Ces particules sont des microsphères constituées d'un c#ur poreux de polystyrène et d'oxydes de fer, les oxydes de fer ayant été déposés par imprégnation au niveau des pores disponibles à la surface du polystyrène, et d'une enveloppe en un autre polymère qui encapsule les oxydes de fer des microsphères poreuses. Elles présentent un diamètre respectivement de 2,8 m (particules M280) et de 4,5 m (particules M450) et sont relativement uniformes en taille. Elles sont donc considérées comme des particules isodisperses mais en raison de leur taille élevée présentent les inconvénients précités, principalement le phénomène de sédimentation. De plus, leur surface spécifique est faible. Selon l'invention on dispose maintenant de nouvelles particules composites qui répondent aux critères précités. Les particules composites e l'invention comprennent un polymère hydrophobe et des nanopariticules inorganiques et sont caractérisées en ce qu'elles présentent un diamètre de l'ordre d'environ 50 à 1000 nm, de préférence d'environ 100 à 500 nm, et avantageusement d'environ 100 à 250 nm, en ce que le polymère hydrophobe constitue une matrice polymère et en ce que les nanoparticules inorganiques sont stabilisées et distribuées de manière relativement homogène à l'intérieur de ladite matrice. Avantageusement, les particules composites de l'invention présentent un diamètre de 100 à 250 nm plus ou moins environ 5%, ce qui signifie que leur diamètre moyen en volume est défini à plus ou moins environ 5% près. Les matériaux inorganiques constituant les nanoparticules sont choisis parmi les oxydes métalliques, tels que les oxydes de fer, de titane, de chrome, de cobalt, de zinc, de cuivre, de manganèse, de nickel et en particulier parmi les oxydes métalliques magnétisables, tels que les oxydes de fer; la magnétite ; l'hématite ; les ferrites telles que les ferrites de manganèse, nickel, manganèse-zinc ; les alliages de cobalt, nickel. Avantageusement , les matériaux inorganiques sont choisis parmi les oxydes métalliques magnétisables, préférentiellement les oxydes de fer. Les nanoparticules inorganiques représentent 5 à 95%, de préférence 10 à 90% et avantageusement 20 à 90% en masse par rapport à la masse totale de la particule composite, de préférence 25 à 85%. Elles sont stabilisées par des agents de stabilisation choisis parmi les chaînes polymère amphiphiles, les agents tensio-actifs ioniques ou non ioniques, fonctionnels ou non fonctionnels, polymérisables ou non polymérisables. Les agents tensio-actifs fonctionnels sont en particulier choisis parmi les acides gras ou des dérivés d'acides gras, en particulier l'acide oléique ou ses dérivés, et un mélange d'agents tensio-actifs tels que définis précédemment. Les polymères appropriés de la matrice cont les polymères de type vinylaromatiques hydrophobes, c'est à dire- 'es homopolymères de monomères vinylaromatiques insolubles dans l'eau, tels que styrène, méthylstyrène, éthylstyrène, tertio-butyl-stvrtr.'? vinyltoluène, ainsi que les copolymères de ces monomères entre eux et/ou avec d'autres co- monomères, tels que les acrylates et les méthacrylates d'alkyle dans lequels le groupement alkyle comprend de 3 à 10 atomes de carbone, les esters d'acides éthyléniques possédant 4 ou 5 atomes de carbone et d'alkyle possédant 1 à 8 atomes de carbone, les acides méthacryliques, les dérivés styréniques, les composés diéniques. Préférentiellement, le polymère est un polymère réticulé. Ceci est obtenu en ajoutant dans le ou les monomères une faible quantité (inférieure à 10% en poids) de molécules ayant au moins deux doubles liaisons réactives, telles que le divinyl benzène, le méthacrylate de vinyle, le cyanurate de triallyle, le diacrylate de mono ou de polyéthylèneglycol. Les nanoparticules composites de l'invention peuvent également inclure un marqueur, tel qu'un marqueur fluorescent, luminescent ou radioactif, étant entendu que le marqueur est introduit lors de la préparation de l'émusion telle que décrite dans les exemples 1 et 2 qui suivent. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des particules composites précitées qui permet d'obtenir directement des particules de diamètre souhaité et isodisperses sans nécessiter d'étape de tri en fonction du diamètre. Selon le procédé de l'invention, (i) on dispose d'une émulsion de départ stable et isodisperse constituée de deux phases non miscibles, une phase A hydrophobe constituée de gouttelettes contenant des nanoparticules inorganiques dispersées dans une phase organique contenant un agent tensio-actif ; ladite phase A étant dispersée dans une phase B hydrophile; (ii) on introduit dans la phase hydrophile B des monomères hydrophobes qui pénètient à l'intérieur de la phase A ; (iii)on polymérise lesdits momomères hyd'ophobes à l'intérieur de la phase A en présence d'un agent amorceur choisi parmi les amorceurs organosolubles, insolubles ou faiblement solubles dans la phase hydrophile B et les amorceurs hydrosolubles dans des conditions prédéterminées. Les monomères mis en #uvre doivent former des polymères hydrophobes. Ils sont insolubles dans la phase hydrophile et choisis parmi les monomères vinylaromatiques tels que styrène, méthylstyrène, éthylstyrène, tertio-butyl-styrène, amino-méthylstyrène, vinyltoluène. Ils sont utilisés seuls ou en mélange ou bien encore en mélange avec d'autres monomères polymérisables insolubles dans l'eau tels que les acrylates, les méthacrylates d'alkyle, les esters d'acides éthyléniques et d'alkyle, les acides méthacryliques, les dérivés styréniques, les acides éthyléniques, les composés diéniques. Il est possible d'ajouter au monomère ou au mélange de monomères un agent de réticulation hydrophobe, par exemple un monomère réticulant de type divinylbenzène, diméthacrylate, en particulier diméthacrylate de vinyle. L'amorceur organosoluble est choisi parmi les amorceurs de type azobis, tels que les 2,2'-azobis(2,4-diméthyl valéronitrile), 2,2'azobis(4-méthoxy-2,4-diméthylvaléronitrile), 2, 2'-azobis(2cyclopropylpropionitrile), 2, 2'-azobis(2-méthylpropionitrile), 2, 2'-azobis(2- méthylbutyronitrile), 1, 1'-azobis(cyclohexane-1-carbonitrile), 1-((1-cyano- 1-méthyléthyl)azo)formamide, 2-phénylazo-4-méthoxy-2,4-diméthylvaléronitrile, diméthyl 2, 2'-azobis(2-méthylpropionate, 4,4'-azobis(4-acide cyanovalérique) et 2, 2'-azobis(2-(hydroxyméthyl)propionitrile). Si on choisit un amorceur hydrosoluble ou faiblement hydrosoluble, tels que les peroxydes, les hydroperoxydes et les persulfates, il engendre un début de polymérisation dans la phase hydrophile qui se propage dans la phase hydrophobe. Les persulfates, en particulier le persulfate d'ammonium, le persulfate de sodium et le persulfate de potassium sont solubles en phase aqueuse. Sous l'action de la chaleur, ils se décomposent et génèrent des anions à radicaux sulfate qui contribueront à charger la nanosphère composite. Le peroxyde d'hydrogène est soluble en phase aqueuse et génère des radicaux hydroxyles non chargés. La décomposition des hydroperoxydes génère un hydroxyle et un radical oxygéné qui se partageront dans une des phases en fonction de la nature du peroxyde utilisé. Ainsi, le peroxyde de cumène, dans le cas de la polymérisation du styrène, est supposé se décomposer au niveau de l'interface entre la particules de monomères et l'eau, les radicaux hydroxyles entrent dans la phase aqueuse et les radicaux non polaires diffusent vers la particule. De la nature cationique ou anionique de l'amorceur dépendra le caractère cationique ou anionique de la particule et du conjugué résultant de l'invention. L'amorceur est introduit dans la phase hydrophile et pénètre dans la phase hydrophobe (a) soit simultanément à l'introduction des monomères hydrophobes, (b) soit préalablement à l'étape d'introduction des monomères hydrophobes, (c) soit postérieurement à l'étape d'introduction desdits monomères hydrophobes. Dans un mode de réalisation préféré l'étape (iii) de polymérisation est effectuée par élévation de la température jusqu'à environ 60 à 90 C, en particulier à une température de 70 C en présence de l'amorceur de polymérisation, étant entendu que les conditions de la polymérisation seront déterminées par l'homme du métier en fonction de la nature de l'amorceur retenu, ou par photochimie à l'aide de rayonnements, par exemple de rayonnements ultra violets ou d'un faisceau laser ou d'autres sources d'énergie. La phase organique est une phase comprenant un hydrocarbure aliphatique ou cyclique choisi parmi les composés comprenant de 5 à 12 atomes de carbone, leurs isomères et leurs mélanges ou une phase comprenant tout ou partie d'ur composé organique polymérisable par voie radicalaire. De préférence, l'hydrocarbure est choisi parmi le pentane, l'hexane, l'heptane, l'octane, le nonane, le décane, le undécane et le dodécane, et le composé organique polymérisable par voie radicalaire est choisi parmi les monomères vinylaromatiques insolubles dans l'eau, tels que styrène, méthylstyrène, éthylstyrène, tertio-butyl-styrène, vinyltoluène, ainsi que les copolymères de ces monomères entre eux, étant entendu qu'il est à la portée de l'homme du métier d'adapter les conditions de polymérisation en fonction du choix du ou des hydrocarbure(s) retenu(s) et de la nature de l'amorceur choisi. En particulier, si la polymérisation est effectuée par élévation de la température ou engendre une élévation de température, le montage réactionnel devra être adapté aux solvants volatils, tels que le pentane. De manière préférentielle la phase hydrophile ést une phase aqueuse, telle que de l'eau. Dans des modes de réalisation préférentiels de la présente invention, les particules sont fonctionnalisées par introduction dans la phase B et pénétration dans la phase A de groupements réactifs fonctionnels. Les groupements réactifs fonctionnels sont apportés par exemple par des monomères faiblement hydrophiles susceptibles de polymériser avec les monomères hydrophobes de la matrice polymère. En particulier, les groupements réactifs fonctionnels sont apportés par des monomères hydrophiles choisis parmi les monomères des acides acryliques, méthacryliques, éthyléniques et sulfoniques, seuls ou en mélange, ou encore en mélange avec des monomères hydrophobes ; étant entendu qu'il est à la portée de l'homme du métier de déterminer la composition du mélange. Les groupements fonctionnels permettent les réactions ultérieures mais apportent également la stabilisation colloïdale nécessaire pour les applications ultérieures. Les groupements fonctionnels sont introduits dans la phase B et pénètrent à l'intérieur de la phase A (a) soit de manière simultanée à la pénétration des monomères hydrophobes de l'étape (ii), (b) soit préalablement à la pénétration des monomères hydrophobes de l'étape (ii), (c) soit postérieurement à la pénétration des monomères hydrophobes de l'étape (@@). Dans un mode de réalisation particulier, et si souhaité, l'étape (iii) est suivie d'une étape d'évaporation partielle ou totale de la phase organique A avec formation de particules composites poreuses. L'invention a aussi pour objet des particules composites fonctionnalisées qui présentent à leur surface des groupements fonctionnels réactifs, tels que des groupements carboxylique, amine, thiol, hydroxyl, tosyl hydrazine, susceptibles de réagir avec au moins un ligand. Les particules composites fonctionnalisées, non poreuses ou poreuses, ainsi -formées seront susceptibles d'immobiliser un ligand, par exemple une molécule biologique, telle qu'un anticorps, un fragment d'anticorps, une protéine, un polypeptide, une enzyme, un polynucléotide, une sonde, une amorce, un fragment d'acide nucléique ; des molécules chimiques, telles que des polymères chimiques, des substances médicamenteuses, des molécules cages, des agents chélatants, des catalyseurs, la biotine ; étant entendu que lorsque les particules composites sont dites poreuses , elles ont atteints un degré de porosité déterminé par évaporation totale ou partielle de la phase organique. Aussi, la présente invention a également pour objet des conjugués dérivés des particules composites couplés à au moins un ligand tel que défini ci-dessus et leurs utilisations. A titre d'exemple, lesdits conjugués sont utilisés dans des tests immunologiques pour la détection et/ou la quantification de protéines, d'antigènes, d'anticorps dans un échantillon biologique ou dans des essais utilisant la technologie des sondes pour la détection et/ou la quantification d'un fragment d'acide nucléique dans un échantillon biologique. L'utilisation de sondes pour la détection et/ou la quantification d'un acide nucléique dans un échantillon est bien connue de l'homme du métier et on peut citer à titre d'illustration la technique d'hybridation sandwich. De même, les conjugués de l'invention peuvent être utilisés comme agents porteurs d'amorces pour une réaction d'amplification d'acides nucléiques dans un échantillon, par exemple par PCR (Polymerase Chain Reaction) ou toute autre technique d'amplification appropriée, permettant ainsi la détection et/ou la quantification d'acides nucléiques dans l'échantillon biologique. La présente invention a donc également pour objet un réactif et une composition diagnostiques comprenant en outre lesdits conjugués et l'utilisation dudit réactif dans un essai diagnostique. Les conjugués trouvent également une application dans le domaine thérapeutique comme véhicule ou vecteur d'une substance médicamenteuse, d'un agent réparateur de gènes défectueux, d'un agent susceptible de bloquer l'expression d'un gène, tel qu'une sonde anti-sens en thérapie ou d'un agent susceptible de bloquer l'activité d'une protéine et de ce fait ils peuvent être utilisés dans une composition thérapeutique ou prophylactique. Ainsi, les conjugués de l'invention sont susceptibles de véhiculer une substance médicamenteuse dans une composition thérapeutique ou prophylactique qui comprend ledit conjugué en association avec un adjuvant et/ou diluant et/ou excipient approprié et pharmaceutiquement acceptable, ladite substance médicamenteuse étant capable d'être relarguée in vivo. Les définitions des excipients et adjuvants pharmaceutiquement acceptables sont décrits par exemple dans Remington's Pharmaceutical Sciences 16th ed., Mack Publishing Co. Les conjugués de l'invention sont également susceptibles de véhiculer un gène d'intérêt thérapeutique codant pour au moins une protéine d'intérêt ou un fragment d'une protéine d'intérêt, étant entendu que par protéine on entend à la fois une protéine dans sa définition la plus généralement utilisée et un anticorps. Bien entendu, un tel conjugué est incorporé dans une composition thérapeutique ou prophylactique qui comprend également les éléments nécessaires à l'expression dudit gène d'intérêt thérapeutique. Les conjugués de l'invention sont également utilisables, quand incorporés dans une composition thérapeutique ou prophylactique, pour le transfert in vivo de sondes ou oligonucléotides anti-sens. Les anti-sens sont capables d'interférer spécifiquement avec la synthèse d'une protéine cible d'intérêt, par inhibition de la formation et/ou du fonctionnement du polysome selon le positionnement de l'ARNm dans la cible. Donc le choix fréquent de la séquence entourant le codon d'initiation de la traduction comme cible pour une inhibition par un oligonucléotide anti-sens vise à prévenir la formation du complexe d'initiation. D'autres mécanismes dans l'inhibition par des oligonucléotides anti-sens impliquent une activation de la ribonucléase H qui digère les hybrides oligonucléotide anti-sens/ARNm ou une interférence au niveau de sites d'épissage par des oligonucléotides anti-sens dont la cible est un site d'épissage de l'ARNm. Les oligonucléotides anti-sens sont également complémentaires de séquences ADN et peuvent donc interférer au niveau de la transcription par la formation d'une triple hélice, l'oligonucléotide anti-sens s'appariant par des liaisons hydrogène dites de Hoogsteen au niveau du grand sillon de la double hélice d'ADN. Dans ce cas particulier, on parle plus précisément d'oligonucléotides antigènes. Il est bien entendu que les oligonucléotides anti-sens peuvent être strictement complémentaires de la cible ADN ou ARN à laquelle ils doivent s'hybrider, mais aussi non strictement complémentaires à la condition qu'ils s'hybrident à la cible. De même, il peut s'agir d'oligonucléotides anti-sens non modifiés ou modifiés au niveau des liaisons inter-nucléotidiques. Toutes ces notions font partie des connaissances générales de l'homme de l'art. La présente invention concerne donc une composition thérapeutique comprenant, entre autres, un conjugué vecteur d'un oligonucléotide anti-sens tel que définis ci-dessus. Enfin, les conjugués sont susceptibles de former des complexes du type molécule cage/cryptate, chélatant/molécule chélatée ou de servir de véhicule pour des catalyseurs dans une application chimique. Les particules composites et les conjugués de l'invention sont obtenus par polymérisation en émulsion in situ selon le protocole décrit dans les exemples qui suivent. Exemple 1 : Une émulsion de départ stable et isodisperse a été préparée conformément à l'un ou l'autre des protocoles décrits dans cet exemple. (i) L'émulsion primaire a été préparée à l'aide d'un procédé d'émulsification en incorporant progressivement, tout en cisaillant à l'aide d'un moulin colloïdal (Ika : nom commercial), la phase dispersée, formée de 45% en poids d'oxydes de fer dans de l'octane, à la phase continue formée de dodécyl sulfate de sodium à une concentration de 50% en poids dans l'eau jusqu'à l'obtention de fractions comprenant de 80% en poids de ferrofluide organique. Le mélange ainsi défini a été fragmenté dans une couette de type PG398 à un taux de cisaillement préalablement déterminé. L'émulsion primaire ainsi préparée est une émulsion polydisperse caractérisée par une distribution large du diamètre des gouttelettes qui est ensuite traitée par des tris magnétiques successifs pour l'obtention de l'émulsion de départ isodisperse en taille. (ii) L'émulsion primaire a été préparée à l'aide d'un procédé d'émulsification en ajoutant rapidement la phase dispersée, formée d'octane, de 73% en poids d'oxydes de fer et d'un agent tensio-actif lipophile de type monoglycérol ou polyglycérol de polyrisinoléate (1 à 10% en poids), à la phase continue formée de +ensio-actif de type tergitol NP10 (31 % en poids) grâce à une spatule. Le mélange ainsi défini est ensuite fragmenté dans une couette de type PG398 à un taux de cisaillement préalablement défini. L'émulsion primaire ainsi préparée est une émulsion relativement isodisperse caractérisée par une distribution faible du diamètre des gouttelettes qui est ensuite traitée par des tris magnétiques successifs pour l'obtention de l'émulsion de départ isodisperse en taille. Exemple 2 : 20 ml de l'émulsion de départ stable et isodisperse préparée selon le protocole de l'exemple 1 (i) et constituée de deux phases non miscibles : la phase A constituée de gouttelettes de 180 nm plus ou moins 5 nm de diamètre contenant des narioparticules d'oxydes de fer de 10 nm dans de l'octane et un mélange de tensio-actifs (dodécyl sulfate de sodium (SDS) et acide oléique), dispersée dans la phase aqueuse B (concentration 1 %, à 0,8 fois la concentration micellaire critique (CMC) du SDS) sont placés dans un réacteur de polymérisation. L'émulsion est dégazée pendant 7 heures à l'azote. Du 2,2'-azobis(2,4-diméthyl valéronitrile), comme amorceur de la polymérisation, solubilisé dans l'hexane (215 /il à 20 g/l) est introduit dans l'émulsion. Le mélange est soumis à homogénéisation pendant une heure et 80 mg de monomères de styrène sont ensuite introduits. Les monomères de styrène diffusent à l'intérieur de la phase A pendant deux heures. La polymérisation est amorcée par chauffage de la solution à une température de 70 C et poursuivie pendant 12 heures trente minutes, sous agitation lente. Après achèvement de la polymérisation, les particules composites obtenues présentent un diamètre de 188 nm et un indice de polydispersité de l'ordre de 1,1. Exemple 3 : 20 ml de If émulsion de départ stable et isodisperse préparée selon le protocole décrit dans l'exemple 1 (ii), constituée de deux phases non miscibles : la phase A constituée de gouttelettes de 206 nm plus ou moins 5 nm de diamètre contenant des nanoparticules d'oxydes de fer de 10 nm dans de l'octane et un mélange d'agents tensio-actifs (SDS et acide oléique), dispersée dans la phase aqueuse B (concentration 3,3%, à 0,8 fois la concentration micellaire critique (CMC) du SDS) sont placés dans un réacteur de polymérisation. L'émulsion est dégazée pendant 9 heures à l'azote. Du 2,2'-azobis(2,4-diméthyl valéronitrile), comme amorceur de la polymérisation, solubilisé dans l'heptane (215 l à 20 g/l) est introduit dans l'émulsion. Le mélange est soumis à homogénéisation pendant 30 minutes et 223 mg de monomère de styrène sont ensuite introduits. La diffusion des monomère de styrène dans la phase A s'effectue pendant 9 heures. La polymérisation est amorcée par chauffage de la solution à une température de 70 C et poursuivie pendant 12 heures, sous agitation lente. Après achèvement de la polymérisation, les particules composites obtenues présentent un diamètre de 238 nm plus ou moins 10 nm. Exemple 4 : 20 ml de l'émulsion de départ stable et isodisperse préparée selon le protocole de l'exemple 1 (ii), constituée de deux phases non miscibles : la phase A constituée de gouttelettes de 206 nm de diamètre contenant des nanoparticules d'oxydes de fer de 10 nm dans de l'octane et un mélange de SDS et d'acide oléique, dispersée dans la phase aqueuse B (concentration 3,3%, à 0,8 fois la concentration micellaire critique (CMC) du SDS) sont placés dans un réacteur de polymérisation. L'émulsion est dégazée pendant 14 heures à l'azote. 223 mg de monomères de styrène, puis 374 l à 57,5 g/l d'amino-méthyl styrène sont introduits dans le mélange réactionnel. Le mélange est soumis à homogénéisation pendant 5 minutes. Du 2,2'-azobis(2,4-diméthyl valéronitrile), comme amorceur de la polymérisation, solubilisé dans l'heptane (215 l à 20 g/l) est introduit dans le mélange qui est ensuite homogénéisé pendant 10 minutes. Le styrène et le dérivé styrénique diffusent dans la phase A par dant 9 heures. La polymérisation est amorcée par chauffage de la solution à une température de 70 C et poursuivie pendant 12 heures, sous agitation lente. Après achèvement de la polymérisation, les particules composites obtenues présentent un diamètre de 203 nmplus ou moins 5 nm. Exemple 5 : 20 ml de l'émulsion de départ stable et isodisperse préparée selon le protocole de l'exemple 1 (ii), constituée de deux phases non miscibles : la phase A constituée de gouttelettes de 206 nm de diamètre contenant des nanoparticules d'oxydes de fer de 10 nm dans de l'octane et un mélange de SDS et d'acide oléique, dispersée dans la phase aqueuse B (concentration 3,3%, à 0,8 fois la concentration micellaire critique (CMC) du SDS) sont placés dans un réacteur de polymérisation. L'émulsion est dégazée pendant 14 heures à l'azote. 240 mg de monomères de styrène sont ajoutés au mélange réactionnel qui subit ensuite une étape d'homogénéisation pendant 5 minutes. Du 2,2'azobis(2,4-diméthyl valéronitrile), comme amorceur de la polymérisation, solubilisé dans l'heptane (215 l à 20 g/l) est introduit dans le mélange qui est ensuite homogénéisé pendant 10 minutes. La pénétration des monomères de styrène dans la phase A s'effectue pendant 9 heures. La polymérisation est amorcée par chauffage de la solution à une température de 70 C et poursuivie pendant 12 heures, sous agitation lente. Après achèvement de la polymérisation, les particules composites obtenues présentent un diamètre de 206 nmplus ou moins 5 nm. Exemple 6 : 20 ml de !'ému)sion de départ stable et isodisperse préparée selon le protocole de l'exemple 1 (ii), constituée de deux phases non miscibles : la phase A constituée de gouttelettes de 206 nm plus ou moins 5 nm de diamètre contenant des nanoparticules d'oxydes de fer de 10 dans de l'octane et un mélange de SDS et d'acide oléique, dispersée dans la phase aqueuse B (concentration 3,3%, à 0,8 fois la concentration micellaire critique (CMC) du SDS) sont placés dans un réacteur de polymérisation. L'émulsion est dégazée pendant 9 heures à l'azote. Du 2,2'-azobis(2,4-diméthyl valéronitrile), comme amorceur de la polymérisation, solubilisé dans l'heptane (215 l à 20 g/l) est introduit dans le mélange qui est ensuite homogénéisé pendant 30 minutes. 223 mg de monomères de styrène, sont introduits dans le mélange réactionnel et on laisse diffuser les monomères de styrène dans la phase A pendant 9 heures. La polymérisation est amorcée par chauffage de la solution à une température de 70 C et poursuivie pendant 12 heures, sous agitation lente. Après achèvement de la polymérisation, les particules composites obtenues présentent un diamètre de 206 nm plus ou moins 5 nm. Exemple 7 : 20 ml de l'émulsion de départ stable et isodisperse préparée comme décrit dans l'exemple 1 (ii), constituée de deux phases non miscibles : la phase A constituée de gouttelettes contenant de 206 nm plus ou moins 5 nm de diamètre des nanoparticules d'oxydes de fer de 10 nm dans de l'octane et un mélange de SDS et d'acide oléique, dispersée dans la phase aqueuse B (concentration 3,3%, à 0,8 fois la concentration micellaire critique (CMC) du SDS) sont placés dans un réacteur de polymérisation. L'émulsion est dégazée pendant 14 heures à l'azote. 223 mg de monomères de styrène et 374 NI à 57,5 g/l d'amino-méthyl styrène sont introduits simultanément dans le mélange réactionnel. Le mélange est soumis à homogénéisation pendant 5 minutes. Du 2,2'-azobis(2,4-diméthyl valéronitrile), comme amorceur de la polymérisation, solubilisé dans l'heptane (215 l à 20 g/l) est introduit dans le mélange qui est ensuite homogénéisé pendant 10 minutes. Le styrène et le dérivé styrénique diffusent dans la phase A perdant 9 heures. La polymérisation est amorcée par chauffage de la solution à une température de 70 C et poursuivie pendant 12 heures, sous agitation lente. Après achèvement de la polymérisation, les particules composites obtenues présentent un diamètre de 206 nm plus ou moins 5 nm. Exemple 8 : 20 ml de l'émulsion de départ stable et isodisperse obtenue selon le protocole décrit dans l'exemple 1 (ii), constituée de deux phases non miscibles : la phase A constituée de gouttelettes de 206 nm plus ou moins 5 nm de diamètre contenant des nanoparticules d'oxydes de fer de 10 nm, de l'octane et un mélange de SDS et d'acide oléique, dispersée dans la phase aqueuse B (concentration 3,3%, à 0,8 fois la concentration micellaire critique (CMC) du SDS) sont placés dans un réacteur de polymérisation. L'émulsion est dégazée pendant 14 heures à l'azote. On introduit 240 mg de monomères de styrène puis on laisse le mélange s'homogénéiser pendant 5 minutes. Le (2,2'-azobis(2,4-diméthyl valéronitrile)) solubilisé dans l'heptane (215 l à 20 g/l) est ensuite ajouté et le mélange subit une homogénéisation pendant 10 minutes. On laisse le styrène diffuser dans la phase A pendant 9 heures. La polymérisation est ensuite amorcée par élévation de la température à 70 c et suivie pendant 12 heures, sous agitation lente. Les particules composites obtenues présentent un diamètre de 206 nm plus ou moins 5 nm. Exemple 9 : 20 ml de l'émulsion de départ stable et isodisperse péparée selon le protocole de l'exemple 1 (ii), constituée de deux phases non miscibles : la phase A constituée de gouttelettes de 206 nm plus ou moins 5 nm de diamètre contenant des nanoparticules d'oxydes de fer de 10 nm dans de l'octane et du SDS, dispersée dans la phase aqueuse B (concentration 3,3%, à 0,8 fois la concentration micellaire critique (CMC) du SDS) sont placés dans un réacteur de polymérisation. L'émulsion est dégazée pendant 14 heures à l'azote. 200 mg de monomères de styrène, puis 22 mg d'acide méthacrylique sont introduits dans le mélange réactionnel. Le mélange est soumis à homogénéisation pendant 5 minutes. Du 2,2'-azobis(2,4-diméthyl valéronitrile), comme amorceur de la polymérisation, solubilisé dans l'heptane (215 /il à 20 g/l) est introduit dans le mélange qui est ensuite homogénéisé pendant 10 minutes. Le styrène et l'acide méthacrylique diffusent dans la phase A pendant 9 heures. La polymérisation est amorcée par chauffage de la solution à une température de 70 C et poursuivie pendant 12 heures, sous agitation lente. Après achèvement de la polymérisation, les particules composites obtenues présentent un diamètre de 238 nm plus ou moins 10 nm. Exemple 10 : 20 ml de l'émulsion de départ stable et isodisperse préparée selon le protocole décrit dans l'exemple 1 (i), constituée de deux phases non miscibles : la phase A constituée de gouttelettes de 164 nm plus ou moins 5 nm de diamètre contenant des nanoparticules d'oxydes de fer de 10 nm dans de l'octane et du SDS, dispersée dans la phase aqueuse B (concentration 3,3%, à 0,8 fois la concentration micellaire critique (CMC) du SDS) sont placés dans un réacteur de polymérisation. L'émulsion est dégazée pendant 14 heures à l'azote. 79 mg de monomères de styrène, puis 22 mg d'acide méthacrylique sont introduits dans le mélange réactionnel. Le mélange est soumis à homogénéisation pendant 5 minutes. Du 2,2'-azobis(2,4-diméthyl valéronitrile), comme amorceur de la polymérisation, solubilisé dans l'heptane (215 l à 10 g/l) est introduit dans le mélange qui est ensuite homogénéisé pendant 10 minutes. Le styrène et l'acide méthacrylique diffusent dans la phase A pendant 9 heures. La polymérisation est amorcée par chauffage de la solution à une température de 70 C et poursuivie pendant 12 heures, sous agitation lente. Après achèvement de la polymérisation, les particules composites obtenues présentent un diamètre de 160 nmplus ou moins 5 nm. Exemple 11 : A 240 l d'un latex magnétique à 3%, obtenu comme décrit précédemment dans l'exemples 9, sont ajoutés successivement, 60 l de Tween 20 (1%), 636 l de tampon phosphate (10 mM à pH 6,9), 60 l de N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimidedihydrochlorure (25 mg/ml), 156 l de N-hydroxysulfosuccinimide (25 mg/ml) et de la streptavidine (48 l à 1 mg/ml). Le mélange est incubé pendant une heure à température ambiante et les particules sont ensuite concentrées par application d'un champ magnétique, puis redispersées dans le tampon contenant du tensioactif (phosphate 10 mM, pH 6,9 + Tween 20 0,05 %). 9,9 l d'un oligonucléotide biotinylé (ODN) de 17 mers présentant une masse de 5753 g/mole à une concentration de 338 nmoles/ml) sont ajoutés à 400 l de particules recouvertes de streptavidine synthétisées précédemment pour constituer le témoin positif. 20 l d'un oligonucléotide non biotinylé et non aminé de 17 mers (masse : 6452 g/mole à une concentration de 167 nmoles/ml) sont ajoutés à 400 l de particules recouvertes de streptavidine synthétisées précédemment pour constituer le témoin négatif. Les deux témoins sont incubés 30 minutes à température ambiante, séparés trois fois et redispersés la première fois avec un tampon basique (phosphate 10 mM, pH 9,9 + SDS, 5 fois la concentration micellaire critique, @a seconde fois avec un tampon à pH neutre (phosphate 10 mM, pH 6,9 -+ Tween 20 0,05%) et la troisième fois dans 280 l de PEG contenant de l'ADN de sperme de saumon. Dans les deux cas 20 l d'ODN complémentaire à l'ODN du témoin positif marqués à la peroxydase de raifort (17 mers, concentration 9 nmoles/ml) sont ajoutés. Les deux témoins sont à nouveau incubés une heure à température ambiante et sont encore séparés pour être dispersés de nouveau dans 400 l de PEG contenant de l'ADN de sperme de saumon. 50 l d'ortho-phénylènediamine sont ajoutés à 50 l de particules. La réaction enzymatique est effectuée pendant 5 minutes et arrêtée par l'addition de 50 /il d'acide sulfurique (1 M). Les particules sont séparés du surnageant et ce dernier est dosé par méthode colorimétrique sur un appareil Axia Microreader (nom commercial, bioMérieux) à 492 et 630 nm. Le témoin positif donne une densité optique de 2 000 unités de D.O, alors que le témoin négatif donne une densité de 1 000 unités de D.O. Dans les exemples ci-dessus, la taille a été mesurée par diffusion de la lumière. La fluctuation de la taille observée, avant et après polymérisation, est attribuée à la combinaison des deux phénomènes suivants : a) une éventuelle évaporation d'une partie de la phase organique et b) la conversion de la polymérisation d'un exemple à l'autre. Le taux d'oxyde de fer après polymérisation est relativement du même ordre de grandeur que dans l'émulsion utilisée avant la polymérisation. REVENDICATIONS 1. Particules composites comprenant un polymère hydrophobe et des nanoparticules inorganiques, caractérisées en ce qu'elles présentent un diamètre de l'ordre d'environ 50 à 1000 nm, de préférence d'environ 100 à 500 nm et avantageusement d'environ 100 à 250 nm, en ce que le polymère hydrophobe constitue une matrice polymère et en ce que les nanoparticules inorganiques sont stabilisées et distribuées de manière relativement homogène à l'intérieur de ladite matrice. 2. Particules selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles présentent une taille moyenne comprise entre 100 et 250 nm plus ou moins environ 5%. 3. Particules selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce que les nanoparticules sont constituées de matériaux inorganiques choisis parmi les oxydes métalliques de fer, de titane, de cobalt, de zinc, de cuivre, de manganèse, de nickel ; la magnétite ; l'hématite, les ferrites telles que les ferrites de manganèse, nickel, manganèse-zinc; les alliages de cobalt, nickel. 4. Particules selon la revendication 3, caractérisées en ce que les matériaux organiques sont choisis parmi les oxydes métalliques magnétisables, tels que l'oxyde de fer, la magnétite et l'hématite. 5. Particules selon la revendication 3 ou 4, caractérisées en ce que les matériaux inorganiques représentent de 5 à 95%, de préférence de 10 à 90%, de manière encore plus préférée de 20 à 90% et avantageusemant de 25 à 85% en masse par rapport à la masse totale desdites particules. 6. Particules selon l'une des revendications précédentes, caractérisées, an ce que les nanoparticules inorganiques sont stabilisées par des agents de stabilisation choisis parmi les groupements ioniques , les chaînes polymère, les agents tensio-actifs, les agents tensio-actifs fonctionnels, tels que les acides gras ou les dérivés d'acides gras, et les mélanges d'agents tensio-actifs. 7. Particules selon la revendication 6, caractérisées en ce que les agents tensio-actifs sont le dodécyl sulfate de sodium ou un mélange de dodécyl sulfate de sodium et d'acide oléique. 8. Particules selon la revendication 1, caractérisées en ce que la matrice polymère est une matrice de type polymère vinylaromatique hydrophôbe choisie parmi les homopolymères de monomères vinylaromatiques insolubles dans l'eau, tels que styrène, méthylstyrène, éthylstyrène, tertio-butyl-styrène, vinyltoluène, ainsi que les copolymères de ces monomères entre eux et/ou avec d'autres comonomères, tels que les acrylates d'alkyle et les méthacrylates d'alkyle dans lequels le groupement alkyle comprend de 3 à 10 atomes de carbone, les esters d'acides éthyléniques possédant 4 ou 5 atomes de carbone et d'alkyle possédant 1 à 8 atomes de carbone, les acides méthacryliques, les dérivés styréniques, les composés diéniques. 9. Particules selon la revendication 7, caractérisées en ce que le polymère est un polymère réticulé. 10. Particules selon les revendications précédentes, caractérisées en ce qu'elles comprennent de plus un marqueur choisi parmi les marqueurs fluorescent, luminescent ou radioactif. 11. Procédé de préparation de particules composites selon les revendications précédentes, caractérisé en ce que (i) on dispose d'une émulsion de départ stable et isodisperse constituée de deux phases non miscibles, une phase A hydrophobe constituée de gouttelettes contenant des nanoparticules inorganiques dispersées dans une phase organique contenant un agent tensio-actif ; ladite phase A étant disposée dans une phase B hydrophile ; (ii) on introduit dans la phase hydrophile B des monomères hydrophobes qui pénètrent à l'intérieur de la phase A ; (iii) on polymérise lesdits momomères hydrophobes à l'intérieur de la phase A en présence d'un agent amorceur choisi parmi les amorceurs organosolubles ou faiblement solubles dans la phase hydrophile et les amorceurs solubles dans la phase hydrophile dans des conditions prédéterminées. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que les monomères hydrophobes sont choisis parmi les monomères vinylaromatiques tels que styrène, méthylstyrène, éthylstyrène, tertiobutyl-styrène, amino-méthylstyrène, vinyltoluène, seuls ou en mélange, ou bien encore en mélange avec d'autres monomères polymérisables insolubles dans l'eau tels que les acrylates, les méthacrylates d'alkyle, les esters d'acides éthyléniques et d'alkyle, les acides méthacryliques, les dérivés styréniques, les acides éthyléniques, les composés diéniques. 13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que on ajoute au monomère ou au mélange de monomères un agent de réticulation hydrophobe, tel qu'un monomère réticulant de type divinylbenzène, diméthacrylate, en particulier diméthacrylate de vinyle. 14. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'agent amorceur organosoluble est choisi parmi amorceurs de type azobis, tels que les 2,2'-azobis(2,4-diméthylvaléronitrile), 2,2'-azobis(4-méthoxy- 2,4-diméthylvaléronitrile), 2, 2'-azobis(2-cyclopropylpropionitrile), 2,2'azobis(2-méthylpropionitrile), 2, 2'-azobis(2-méthylbutyronitrile), 1, 1'azobis(cyclohexane-1-carbonitrile), 1-((1-cyano-1- méthyléthyl)azo)formamide, 2-phénylazo-4-méthoxy-2,4-diméthyl- valéronitrile, diméthyl 2, 2'-azobis(2-méthylpropionate, 4, 4'-azobis(4-acide cyanovalérique) et 2, 2'-azobis(2-(hydroxyméthyl)propionitrile) et l'amorceur faiblement soluble ou soluble dans la phase hydrophile est choisi parmi les amorceurs radicalaires de type peroxyde, tels que les peroxydes, les hydroperoxydes, en particulier l'hydroperoxyde de cumène, et les amorceurs de type persel, tels que les persulfates, en particulier le perulfate d'ammonium, le persulfate de sodium et le persulfate de potassium. 15. Procédé selon les revendications 11 et 14, caractérisé en ce que l'agent amorceur est introduit dans la phase hydrophile soit simultanément à l'introduction des monomères hydrophobes décrite dans l'étape (ii), soit préalablement à l'étape (ii), soit postérieurement à l'étape (ii). 16. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la polymérisation (iii) est effectuée par chauffage jusqu'à une température de 60 à 90 C, de préférence de 70 C. 17. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la polymérisation (iii) est effectuée par photochimie. 18. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la phase organique hydrophobe A est une phase comprenant un hydrocarbure aliphatique ou cyclique choisi parmi les composés comprenant de 5 à 12 atomes de carbone, leurs isomères et leurs mélanges ou une phase comprenant tout ou partie d'un composé organique polymérisable par voie radicalaire choisi parmi les monomères vinylaromatiques insolubles dans l'eau, tels que styrène, méthylstyrène, éthylstyrène, tertio-butyl-styrène, vinyltoluène, ainsi que les copolymères de ces monomères entre eux. 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'hydrocarbure est choisi parmi le pentane, l'hexane, l'heptane, l'octane, le nonane, le décane, le urdécane, le dodécane, et le composé organique polymérisable par voie radicalaire est choisi parmi les . 20. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la phase B est une phase aqueuse, telle que de l'eau. 21. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend de plus une étape de fonctionalisation des particules composites par pénétration dans la phase organique A de groupements réactifs fonctionnels apportés par des monomères faiblement hydrophiles susceptibles de polymériser avec les monomères hydrophobes. 22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que les groupements réactifs fonctionnels sont des groupements acide apportés par des monomères faiblement hydrophiles choisis parmi les monomères des acides acryliques, méthacryliques, éthyléniques, sulfoniques et les monomères polymérisables choisis parmi les monomères vinylaromatiques insolubles dans l'eau, tels que styrène, méthylstyrène, éthylstyrène,tertiobutyl-styrène, vinyltoluène, ainsi que les copolymères de ces monomères entre eux, seuls ou en mélange avec d'autres monomères hydrophobes. 23. Procédé selon les revendications 11, 21 et 22, caractérisé en ce que lesdits monomères faiblement hydrophiles sont apportés dans la phase organique A, soit simultanément à l'étape (ii), soit préalablement à l'étape, ou postérieurement à l'étape (ii). 24. Procédé selon les revendications 11et 21, caractérisé en ce qu'il comprend de plus après l'étape de polymérisation (iii), une étape d'évaporation totale ou partielle de la phase organique A. 25. Particules composites telles que définies selon les revendications 1 à 10, caractérisées en ce qu'elles présentent de plus des groupements fonctionnels réactifs à leur surface, tels que des groupements carboxylique, amine, thiol, aldéhyde, hydroxyl, tosyl, hydrazine, susceptibles de réagir avec au moins un ligand. 26. Conjugués dérivés de particules composites telles que définies dans la revendication 25, caractérisés par le fait qu'ils sont couplés à au moins un ligand choisi parmi un anticorps, un fragment d'anticorps, une protéine, un polypeptide, une enzyme, un polynucléotide, un fragment d'acide nucléique et la biotine. 27. Réactif, comprenant en outre au moins un conjugué tel que défini dans la revendication 26. 28. Composition diagnostique comprenant en outre un réactif tel que défini dans la revendication 27. 29. Utilisation d'un réactif tel que défini dans la revendication 27 dans un test de diagnostic. 30. Conjugués dérivés de particules composites telles que définies dans la revendication 22, caractérisés par le fait qu'ils sont couplés à au moins un - ligand choisi parmi les substances médicamenteuses, les sondes anti-sens, les agents réparateurs de gènes, les agents bloquant ou inhibant une activité protéique. 31. Utilisation des conjugués tels que définis dans la revendication 27 dans une composition thérapeutique. 32. Conjugués dérivés de particules composites telles que définies dans la revendication 25, caractérisés par le fait qu'ils sont couplés à au moins un ligand choisi parmi les molécules cages, les agents chélatants et les catalyseurs.