Brevet FR2808802A1 — publié le 20011116

La présente invention a trait à une construction d'acide nucléique bloquant l'expression du récepteur minéralocorticoïde murin, et à un animal transgénique dans le génome duquel cette construction est intégrée. Le récepteur des hormones minéralocorticoïdes, appelé également récepteur minéralocorticoïde (MR), est exprimé dans une large variété de tissus, à savoir notamment dans les cellules épithéliales transportant le sodium, ou dans les cellules non épithéliales du système cardiovasculaire et du système nerveux central. Ce récepteur, cloné chez l'homme (WO 88/03 168) et chez le rat, est activé par l'aldostérone. Sous l'effet de son ligand, le récepteur subit une translocation dans le noyau cellulaire où il agit comme un facteur de transcription après interaction avec des séquences consensus GRE ("glucocorticoïde response element"). Les mécanismes moléculaires sousjacents à la voie de signalisation des minéralocorticoïdes ne sont pas pleinement identifiés. Des modèles animaux sont nécessaires pour comprendre ces mécanismes et seraient particulièrement intéressants notamment comme outils pour la recherche de médicaments agissant sur les pathologies dans lesquelles le récepteur MR est impliqué. Dans cette optique, ont été construites des souris transgéniques surexprimant de manière constitutive le récepteur MR humain (Le Menuet et al, 2000), ces souris présentant des lésions rénales et des altérations fonctionnelles cardiaques. La surexpression du récepteur dans ce modèle est généralisée à l'ensemble des organes testés, malgré l'utilisation d'un promoteur qui devrait être spécifique, ce qui complique l'étude des relations entre le récepteur et les fonctions de chacun de ces organes. A l'inverse, des souris "knock-out" dans lesquelles le gène murin du récepteur MR est invalidé, ont été obtenues (Berger et al, 1998), mais cette invalidation entraîne une mortalité précoce (10 jours après la naissance), du fait d'un déficit rénal. Il existait donc un besoin d'un modèle animal non humain présentant des altérations phénotypiques proches de celles observées dans des pathologies humaines dans lesquelles le récepteur MR est impliqué. Les auteurs de la présente invention sont parvenus à obtenir des animaux transgéniques qui répondent à ce besoin, en intégrant dans leur génome une construction d'acide nucléique bloquant l'expression du récepteur minéralocorticoïde. En bloquant l'expression du récepteur MR spécifiquement dans le coeur, ils ont réussi plus particulièrement à développer un modèle murin de fibrose cardiaque accompagné d'une cardiopathie. Les résultats obtenus sont d'autant plus surprenants que les données rapportées jusqu'à présent, dans les cas d'activation du récepteur chez le rat ou la souris, tendaient vers un enseignement contraire : des rats traités par de l'aldostérone, agoniste du récepteur MR, ont développé une fibrose cardiaque périvasculaire (Robert et al, 1995), tandis que des souris surexprimant le récepteur étaient atteintes de déficiences cardiaques (Le Menuet et al, 2000). L'invention a donc pour objet un acide nucléique, tel qu'un ARN antisens, bloquant l'expression du récepteur MR, de préférence le récepteur MR murin. Ce récepteur murin, cloné par les auteurs de l'invention, comprend la séquence nucléotidique SEQ ID n 1 et/ou SEQ ID n 2. La séquence SEQ ID n 1 code pour la partie N-terminale du récepteur MR, partie qui présente une divergence importante avec les autres récepteurs aux glucocorticoïdes. La séquence SEQ ID n 2 correspond également à un fragment de la partie 5' de l'ADNc du récepteur MR murin. Le blocage de l'expression du récepteur MR est spécifique, c'est- à-dire qu'il n'affecte pas l'expression des autres récepteurs aux glucocorticoïdes. L'acide nucléique qui bloque l'expression du récepteur MR comprend de préférence une séquence complémentaire, d'environ 50 à 2000 bases, à une séquence établie à partir du nucléotide n 1 de la séquence SEQ ID n 1. De préférence, il comprend, ou est constitué de, la séquence de 316 paires de bases (pb) complémentaire de la séquence SEQ ID n 1. Il peut également comprendre la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID n 2. Par "acide nucléique qui bloque l'expression du récepteur MR", on entend également un acide nucléique qui comprend une séquence nucléotidique qui diffère de la séquence complémentaire de la séquence native du récepteur MR endogène par un nombre réduit de modifications de nucléotides, par exemple par une substitution d'une ou plusieurs bases ou par une modification chimique d'une ou plusieurs bases, ou un couplage avec une molécule marqueur telle qu'une molécule fluorescente. Sont également compris dans l'invention, d'une part, les acides nucléiques qui inhibent la transcription en formant des triples hélices avec l'ADN ou d'autre part les oligonucléotides chimériques ARN-ADN. L'invention a également pour objet une construction d'acide nucléique, tel qu'un vecteur plasmidique, comprenant ladite séquence d'acide nucléique qui bloque l'expression du récepteur MR, ci-après également désignée "séquence antisens", en association avec des éléments permettant l'expression de cette séquence antisens. Par "construction d'acide nucléique", on entend notamment un acide nucléique tel qu'ADN ou ARN, linéaire ou circulaire. Parmi lesdits éléments permettant l'expression de la séquence antisens, on trouve un promoteur de la transcription, et éventuellement une ou plusieurs séquences de terminaison de la transcription. Par "séquence de terminaison de la transcription", on entend toute séquence qui permet d'arrêter la transcription, notamment un site STOP contenu dans une séquence de polyadénylation (polyA). Il peut s'agir d'une polyA provenant de virus, en particulier la polyA du "Simian Virus 40" (SV 40), ou d'une polyA provenant d'un gène eukaryote, en particulier la polyA du gène codant pour la Phosphoglycérate Kinase (pgk-1), ou de la polyA du gène codant pour la globine ss de lapin. La construction d'acide nucléique de l'invention peut également comprendre au moins une séquence de sélection. Par "séquence de sélection", on entend une séquence qui permet de trier entre les cellules qui auront intégré la construction d'acide nucléique de l'invention et celles chez qui la transfection aura échoué. Ces séquences de sélection peuvent être "positives" ou "négatives" et dominantes ou récessives. Une séquence de sélection "positive" se réfère à un gène codant pour un produit qui permet seulement aux cellules qui portent ce gène de survivre et/ou se multiplier dans certaines conditions. Parmi ces séquences de sélection "positives", on peut citer notamment les séquences de gènes de résistance à un antibiotique, comme par exemple la néomycine (neo), l'hygromycine, la puromycine, la zéoycine, la blasticidine ou la phléomycine. Une autre séquence de sélection possible est l'hypoxanthine phosphoribosyl transférase (HPRT). Les cellules qui portent le gène HPRT peuvent pousser sur un milieu HAT (contenant aminoptérine, hypoxanthine et thymidine), alors que les cellules HPRT-négatives meurent sur le milieu HAT. A l'inverse, une séquence de sélection "négative" se réfère à un gène codant pour un produit qui peut être induit pour tuer de manière sélective les cellules qui portent le gène. Des exemples non limitatifs de ce type de séquences de sélection incluent la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (HSV-tk) et HRPT. Les cellules qui portent le gène HSV-tk sont tuées en présence de gancyclovir ou de FIAU (1(1,2-désoxy-2-fluoro-ss-Drabinofuranosyl)-5-iodouracile). Les cellules qui portent le gène HPRT peuvent être tuées sélectivement par de la 6-thioguanine (6TG). D'autres exemples de séquences de sélection "positives" ou "négatives" sont bien connus de l'homme du métier. De manière avantageuse, la construction d'acide nucléique de l'invention peut comprendre également une séquence de détection. Par "séquence de détection", on entend une séquence codant pour une protéine détectable, utile comme marqueur pour évaluer facilement le niveau d'expression de la protéine d'intérêt. On parle également dans ce cas de "gène rapporteur". Il peut par exemple s'agir d'une séquence codant pour une enzyme comme la p-galactosidase (p-GAL), l'alcool déshydrogénase (ADH), (ADH), la phosphatase alcaline telle que la Phosphatase Alcaline humaine (APh), la protéine fluorescente verte (GFP), et la chloramphenicol acétyltransférase (CAT), , la luciférase, ou tout autre marqueur détectable bien connu de l'homme du métier. La construction d'acide nucléique selon l'invention peut également comprendre une séquence ISCE 1. Cette séquence de 18 paires de bases est une séquence qui n'est pas présente de façon naturelle dans le génome des mammifères. Elle correspond au site de reconnaissance de la méganucléase de levure I-Scel (Choulika et al., 1994 ; Cohen-Tannoudji et al., 1998 ; US 5,830,729). Elle peut être utilisée pour permettre une modification ciblée du locus dans lequel elle est insérée (ici dans le transgène intégré de façon stable dans le genome de l'animal transgénique ou de cellules dérivées). Dans le cas présent, cette séquence peut permettre de modifier le transgène et d'exprimer ainsi une autre séquence nucléotidique sous le contrôle du promoteur inductible ou d'un autre promoteur. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, cette construction comprend un ou des éléments qui rendent l'expression de la séquence antisens inductible ou conditionnelle. Il peut notamment s'agir d'éléments dits "accepteurs" du système d'induction par la tétracycline. La séquence antisens peut être pour cela associée à une séquence opératrice du système de résistance à la tétracycline du transposon bactérien Tn10. Dans les bactéries contenant ce transposon, en l'absence de tétracycline, la protéine TetR se lie sous forme d'un dimère à des séquences opératrices situées dans l'opéron tétracycline, bloquant ainsi la transcription du gène codant pour la protéine de résistance à la tétracycline. En présence de l'antibiotique, le tetR ne peut plus se lier aux séquences opératrices ; l'effet inhibiteur sur la transcription du gène de résistance est alors aboli. En 1992, Gossen et Bujard ont réalisé la fusion des protéines tetR et VP16 (protéine du virus Herpes Simplex Virus essentielle à la transcription des gènes viraux précoces). Dans des cellules eucaryotes génétiquement modifiées, la protéine chimérique résultante (tTA: "Tetracycline controlled TransActivator") est capable d'activer l'expression de gènes rapporteurs situés en aval de séquences opératrices tetO. En présence de tétracycline la protéine chimérique tTA ne se lie pas à tetO et n'active pas la transcription de ses gènes cibles. Le système rtTA (reverse tTA) peut également être utilisé. Il s'agit d'un mutant de tTA qui n'est pas actif de façon constitutive mais nécessite la présence de tétracycline ou de ses dérivés (comme la doxycycline) pour transactiver le promoteur minimal tetO (Furth et al., 1994 ; Gossen and Bujard, 1992 ; Gossen et al., 1995 ;Kistner et al., 1996). L'ensemble tTA ou rtTA peut être porté par la même construction ou par un autre vecteur. On préfère néanmoins utiliser deux constructions d'acide nucléique, l'une portant l'antisens et l'autre portant les éléments, tels que tTA, permettant l'inhibition de l'expression de l'antisens en présence de tétracycline. De manière avantageuse, la construction d'acide nucléique de l'invention portant l'antisens comprend, d'amont en aval : - une séquence de terminaison de la transcription telle que définie précédemment ; - une séquence antisens telle que définie précédemment ; - une séquence de détection telle que définie précédemment ; - une séquence de terminaison de la transcription telle que définie précédemment ; un promoteur minimal bidirectionnel tel que décrit dans Baron et al, (1995), fusionné à une séquence opératrice tetO, étant inséré entre la séquence antisens et la séquence de détection, afin de permettre la transcription de la séquence antisens en amont et de la séquence de détection en aval. D'autres systèmes rendant l'expression de la séquence antisens inductible ou conditionnelle peuvent être mis en #uvre. La construction d'acide nucléique de l'invention peut en particulier comprendre des éléments dits "accepteurs" reconnus par des éléments dits "inducteurs" apportés par une autre construction d'acide nucléique, l'ensemble des éléments accepteurs et inducteurs permettant la régulation de l'expression de l'antisens. De manière avantageuse on peut effectuer le croisement d'un animal "inducteur" et d'un animal "accepteur". Dans ce cas, l'expression de l'antisens, intégré sous forme de transgène dans l'animal accepteur, va dépendre de l'expression fonctionnelle de l'inducteur. On peut en particulier citer, à titre d'exemples d'éléments permettant la régulation de l'expression de l'antisens, le système GAL4 (Wang et al, 1997), le système ecdysone (No D., 1996), ou un système de recombinases. On peut par exemple utiliser la recombinase Cre du bactériophase P1 (Abremski et al, 1983), ou la recombinase Flp de levure (Logie et al, 1995). Dans le cas de la recombinase Cre (Metzger and Feil, 1999), la séquence de l'antisens peut être placée sous le contrôle d'un promoteur fort ou tissu-spécifique. Toutefois, la transcription est bloquée par la présence d'un site d'arrêt de la transcription, tel qu'un site de polyadenylation, flanqué de deux sites LoxP (sites de reconnaissance de la Cre recombinase). L'un des sites LoxP est situé entre le promoteur et la séquence antisens. Si la Cre recombinase n'est pas présente, ou non exprimée, ou encore non active, la transcription de l'antisens ne peut se produire. Dans le cas inverse, l'antisens est exprimé. L'expression de la Cre Recombinase peut être elle-même dépendante d'un promoteur fort constitutif, inductible et ou tissu-spécifique. L'expression peut également être secondaire à une infection locale ou générale par un adenovirus ou un retrovirus recombinant. Ces recombinases peuvent être modifiées ou liées de manière opérante (en particulier par fusion) à une séquence leur apportant une propriété d'induction par un agent exogène. On peut ainsi utiliser une recombinase fusionnée au domaine de fixation du ligand du récepteur aux #strogènes (ER), lequel a été préalablement muté pour ne plus fixer les #strogènes endogènes. En revanche, il peut être activé par le tamoxifène ou par l'un de ses analogues (Metzger et al, 1995). On peut également utiliser une recombinase fusionnée à d'autres domaines comme le domaine de fixation du ligand du récepteur à la progestérone (PR) (Kellendonk et al, 1999) ou le domaine de fixation du ligand du récepteur aux glucocorticoïdes (GR) (Brocard et al, 1998). Ces domaines sont préalablement mutés pour ne plus être activés par leur ligand naturel mais uniquement par des molécules synthétiques comme le dexamethasone ou le RU486. On peut par exemple utiliser la séquence Cre ERT2 (Indra et al, 1999) qui est une séquence codant pour une protéine dont l'activité recombinase est très facilement inductible par le tamoxifène ou par ses analogues. L'invention a également pour objet une cellule hôte dans laquelle au moins une construction d'acide nucléique telle que définie précédemment a été transférée de manière stable. Le terme "cellule hôte" comprend toute cellule de mammifère ou autre cellule eucaryote, en culture ou in vivo, en tant que partie d'un organisme, ladite cellule pouvant être préalablement fusionnée ou génétiquement modifiée. On peut également transférer dans la cellule hôte une construction d'acide nucléique portant une séquence antisens telle que définie précédemment, et au moins une construction d'acide nucléique comprenant des éléments inducteurs permettant la régulation de l'expression de l'antisens, de manière à ce que ces deux constructions soient cointégrées dans le génome de ladite cellule. Le transfert du vecteur dans la cellule hôte peut être réalisé au moyen des techniques standard connues de l'homme du métier, par exemple par électroporation, précipitation au phosphate de calcium (Sambrook et al, 1989), ou lipofection. De manière générale, les vecteurs nucléotidiques de l'invention peuvent être libérés sous forme nue, c'est-à-dire exempts de tout agent facilitant la transfection ou bien en association avec un tel agent, qu'il s'agisse par exemple d'un agent chimique qui modifie la perméabilité cellulaire (tel que la bupivacaïne), de liposomes, de lipides cationiques ou de microparticules par exemple d'or, de silice ou de tungstène. Le mode de transfert choisi dépend principalement de la cellule hôte, comme cela est bien connu de l'homme du métier. Plus particulièrement la présente invention vise le cas où la cellule hôte est un ovocyte, de préférence de souris. Les constructions d'acide nucléique de l'invention peuvent alors être transférées dans l'ovocyte fécondé par des techniques de micro-injection telles que décrites dans Hogan et al, 1994, ou par modification de gènes dans des cellules embryonnaires ou encore par transfert nucléaire avec le noyau de cellules génétiquement modifiées. La présente invention a également pour objet des animaux transgéniques dans le génome desquels au moins une construction d'acide nucléique de l'invention est intégrée. Ces animaux sont bien entendu des animaux non humains, de préférence des mammifères, et plus particulièrement des rongeurs, tels que souris, rats ou cobayes, lapins, des bovins, porcins ou ovins. Les souris sont plus particulièrement visées. Ces animaux peuvent être par exemple de génération FO, ou de préférence appartenir à des lignées F1. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, on fabrique un animal dit "accepteur", qui porte une construction d'acide nucléique comprenant une séquence antisens dont l'expression est bloquée, et un ou des éléments accepteurs d'un système de régulation de l'expression. Cet animal "simple transgénique" peut ensuite être croisé avec un animal dit inducteur portant une construction d'acide nucléique comportant des éléments dits inducteurs permettant la régulation de l'expression de la séquence antisens. L'animal, dit "double transgénique", ainsi obtenu, porte les deux types de constructions, et exprime la séquence antisens de manière régulée par lesdits éléments permettant la régulation de l'expression de la séquence antisens. L'invention a donc plus particulièrement pour objet un procédé d'obtention d'un animal double transgénique dans lequel l'expression du récepteur minéralocorticoïde est réprimée de manière inductible ou conditionnelle, procédé dans lequel on croise un animal simple transgénique dans le génome duquel a été intégrée une construction d'acide nucléique comprenant un acide nucléique tel que défini précédemment, dont la séquence est désignée "séquence antisens", avec un animal transgénique dans le génome duquel a été intégrée une construction d'acide nucléique portant des éléments permettant la régulation de l'expression de ladite séquence antisens, de manière inductible ou conditionnelle. De manière alternative, on peut directement obtenir un animal "double transgénique" par cointégration des deux types de constructions d'acide nucléique dans un ovocyte ou une cellule souche de cet animal. Conformément à la présente invention, on peut également fabriquer des animaux non humains par intégration d'une construction d'acide nucléique portant à la fois la séquence antisens et l'ensemble des éléments de régulation de son expression. De manière avantageuse, lesdits éléments de régulation de l'expression de la séquence antisens sont spécifiques d'un tissu de l'animal. Pour cela ils peuvent comprendre un promoteur tissu spécifique, qui permet une expression ciblée de l'antisens dans certains tissus par exemple le c#ur. L'invention a en outre pour objet l'utilisation d'animaux transgéniques telles que décrites plus haut pour le criblage d'agents thérapeutiques efficaces dans la prévention et/ou le traitement de troubles ou pathologies humaines ou animales dans lesquelles le récepteur minéralocorticoïde est impliqué. L'expression de la séquence antisens dans les cellules cardiaques de souris transgéniques a ainsi conduit au développement d'une fibrose cardiaque accompagnée d'une cardiopathie. Ce modèle présente des altérations phénotypiques proches de celles observées dans plusieurs pathologies cardiaques humaines. Ces animaux transgéniques sont donc particulièrement utiles pour comprendre le développement et les conséquences de ce type de maladies cardio-vasculaires, et pour mettre au point de nouvelles stratégies thérapeutiques, incluant la stratégie conventionnelle au moyen de substances pharmacologiques, et la stratégie par thérapie génique. L'invention a donc plus particulièrement pour objet un procédé de criblage d'agents actifs contre des maladies cardio-vasculaires, telles qu'une fibrose cardiaque et/ou une insuffisance cardiaque, dans lequel on teste l'effet desdits agents sur l'apparition et le développement d'altérations cardiaques chez les animaux transgéniques tels que décrits plus haut. Parmi les composés à cribler, on peut notamment citer les classes thérapeutiques impliquant les antagonistes ou agonistes des récepteurs stéroïdes (hormones minéralocorticoïdes, androgènes, glucocorticoïdes, oestrogènes, progestérones), les agents altérant la voie de signalisation de l'angiotensine (récepteur d'angiotensine 1 et 2, agents inhibant l'enzyme de conversion de l'angiotensiogène), ou encore les agents intervenant sur la voie de signalisation du monoxyde d'azote (par exemple l'endothéline et son récepteur). De la même manière, des animaux transgéniques exprimant la séquence antisens anti-récepteur MR dans le système nerveux central sont utiles pour l'étude de la mémoire, des troubles de l'humeur telles qu'anxiété, dépression, euphorie. On peut par exemple croiser une souris CamKII-tTA telle que décrit par Mansuy et al., (1998a) ; Mansuy et al., (1998b) ; Mayford et al., (1996) permettant l'expression conditionnelle de différents transgènes dans l'hippocampe, avec une souris simple transgénique selon l'invention portant une séquence antisens anti-récepteur MR en association avec l'opérateur tetO. Les souris obtenues expriment l'antisens anti-récepteur MR spécifiquement dans l'hippocampe. Des animaux transgéniques exprimant la séquence antisens dans les cellules rénales sont également utiles pour l'étude du contrôle de transport des sels, et pour l'étude de la tension artérielle. Par ailleurs, des animaux transgéniques exprimant la séquence antisens au niveau de la peau sont des modèles intéressants pour l'étude de la sécrétion des ions que l'observe par exemple chez des enfants atteints de mucoviscisdose, ainsi que pour l'étude de troubles de la différenciation des cellules de la peau. Une expression de la séquence antisens dans les cellules du colon d'animaux transgénique fournit également un modèle utile pour l'étude de cancers du colon, et pour celle de l'ensemble des troubles de la différenciation cellulaire à ce niveau. Des cultures de cellules obtenues à partir de ces animaux transgéniques peuvent être réalisées et mises à profit par exemple dans le cadre d'une stratégie de transplantation cellulaire. Il peut s'agir de cultures de cellules primaires, obtenues à partir des animaux "simple transgéniques" ou "double transgéniques" décrits ci-dessus. Il peut s'agir également de cellules obtenues à partir de croisement de ces animaux avec d'autres animaux transgéniques. Par exemple, on peut utiliser des animaux transgéniques permettant une immortalisation des cellules en culture. On obtient alors des cultures stables. On peut aussi utiliser des animaux transgéniques "humanisées" pour obtenir des cellules "humanisées". L'invention a alors également pour objet une méthode de traitement thérapeutique dans laquelle on implante dans un organisme receveur nécessitant un tel traitement des cellules cultivées issues de ces animaux transgéniques. Les cellules isolées à partir de ces animaux transgéniques peuvent également servir de modèle cellulaire pour remplacer l'expérimentation animale. On peut alors tester facilement la toxicité de molécules à potentiel thérapeutique sur ces cellules au lieu de la tester directement sur l'animal. Ces cellules isolées et éventuellement cultivées font donc également partie de l'invention. L'invention a par ailleurs pour objet l'utilisation de ces cellules pour le criblage d'agents thérapeutiques efficaces dans la prévention et/ou le traitement de troubles ou pathologies humaines ou animales dans lesquelles le récepteur minéralocorticoïde est impliqué. Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. LEGENDE DES FIGURES La figure 1 est un schéma des constructions d'acide nucléique de l'invention. La figure 1A représente le schéma de construction du transactivateur. La figure 1 B représente le schéma de construction du vecteur utilisé pour l'expression de l'antisens du récepteur MR murin. La figure 2 est un schéma de la stratégie d'obtention des souris doubles transgéniques . La figure 3A représente des coupes transversales de c#ur de deux lignées de souris "double transgéniques" aMHC-tTA/MR 9 et aMHCtTA/MR 27, traitées ou non avec de la doxycycline (Dox). La figure 3B est une analyse par protection à la RNase (RPA) de transcripts ARN lacZ observés dans le c#ur (C) et non dans le rein (R) de souris aMHC-tTA/MR 9 et aMHCtTA/MR 17, traitées ou non avec de la doxycycline. La figure 4A représente un diagramme montrant que l'expression de l'antisens du récepteur MR murin dans le c#ur des souris aMHC-tTA/MR 27 et MR 9 est inhibée par la doxycycline. La figure 4B représente un diagramme montrant que l'expression de l'antisens induit une diminution du taux de récepteur MR endogène chez les souris doubles transgéniques en comparaison des souris transgéniques exprimant le transactivateur seul. La figure 5 est un ensemble de diagrammes montrant une comparaison des effets phénotypiques observés chez les souris "double transgéniques" (aMHC-tTA/MR 27) par rapport aux souris simple transgénique (aMHC-tTA). La figure 5A montre l'augmentation du rapport poids du coeur/poids du corps. La figure 5B montre l'augmentation de la masse du ventricule gauche. La figure 5C montre une augmentation de diamètre du ventricule gauche cardiaque. La figure 5D révèle une diminution du paramètre de fraction d'éjection cardiaque. Les valeurs représentent les moyennes écarts-types (3 # n # 6). Les astérisques montrent la différence statistiquement significative entre les souris simple et double transgéniques à partir du même groupe (p La figure 6A représente une coupe histologique de c#ur de souris "double transgéniques" (aMHC-tTA/MR 27, désignées DT) comparée à une coupe de c#ur de souris "simple transgéniques" (aMHC-tTA, désignées ST), les coupes étant colorées au rouge Sirius. La figure 6B est un diagramme montrant une différence significative entre la quantité de collagène chez les souris double transgéniques, par rapport aux souris simple transgénique. Les valeurs représentent les moyennes écarts-types (3 # n # 6). Les astérisques montrent la différence statistiquement significative entre les souris simple et double transgéniques à partir du même groupe (p Les figures 7A et 7B sont des graphes montrant l'effet de la doxycycline sur le poids corporel de souris "double transgéniques" mâles et femelles (lignée MR 17). La figure 8 est un graphe montrant l'effet de la doxycycline sur la mortalité des souris mâles "double transgéniques" aMHC-tTA/MR 27. Les figures 9A et 9B sont des graphes montrant l'évolution du poids corporel des souris double transgéniques MR 17 vis à vis des contrôles. La figure 10 représente la courbe de mortalité des souris mâles MR 17 vis à vis des souris contrôles. EXEMPLES Exemple 1 : Construction nucléotidique porteuse de l'antisens La construction d'acide nucléique préparée par les auteurs de l'invention est représentée schématiquement sur la figure 1 B. Il s'agit d'un vecteur plasmidique pBI-3 (Clontech, référence 6150- 1), modifié comme suit : a) clonage de l'ADNc codant pour la partie N-terminale du récepteur minéralocorticoïde de souris. Une amplification inverse a été réalisée à partir d'ARN total extrait de cerveau de souris B6D2F1, en utilisant comme amorce des oligonucléotides codant pour deux régions conservées entre la séquence du récepteur minéralocorticoïde de rat et humain. Amorce sens : 5' GGCTACCACAGTCTCCCTGAAGG 3' (SEQ ID n 3) Amorce antisens : 5' CCATATATAAACCCATGGACTG 3' (SEQ ID n 4) Après transcription inverse et amplification, un fragment de 316 pb (SEQ ID n 1) est sous-cloné dans le vecteur PGEM-T Easy (Promega, France). Après séquençage, ce fragment est excisé du plasmide de clonage par digestion enzymatique Pstl-notl. Ce fragment est alors sous-cloné en orientation antisens (par rapport au promoteur inductible tet), dans le vecteur Pbi-3 coupé avec les mêmes sites de restriction. b) Un site de restriction pour la méganucléase I-Scel est introduit à l'aide d'un oligonucléotide dimère dans le site Sali, situé entre la séquence antisens du MR de souris et la séquence de polyadenylation SV40polyA. L'insert est excisé du vecteur par digestion Asel. puis purifié sur gel d'agarose 1,2% (kit d'élution Qiagen). Le fragment est ensuite purifié par Elutip. L'insert est quantifié sur gel d'agarose, dilué à la concentration de 4 ng/ 1 dans du tampon Tris 10 mM/EDTA 0,1mM et est prêt à être microinjecté. Exemple 2 : Production de souris transgénique Des lignées de souris "simple transgéniques" ont été obtenues en suivant le protocole ci-après : L'insert est microinjecté dans le pronucléus male d'ovocytes fécondés de souris B6D2F1 selon une procédure standard puis réimplanté dans une souris receveuse pseudogestante, (Hogan et al., 1994). Après la naissance, les animaux sont génotypés puis les animaux transgéniques FO (ayant intégré de façon stable l'insert) sont identifiés et croisés pour établir les lignées. Les animaux transgéniques de première génération F1 sont alors croisés avec des souris aMHC-tTA commercialisées par le Jackson Laboratory, USA, sous le numéro de référence 003170 (Figure 2). Ces souris aMHC-tTA sont également dénommées, par le Jackson Laboratory, souris FVB/N-TgN (MHCA tTA) 6 Smbf. La spécificité de cette lignée pour les myocytes cardiaques est déterminée par un gène dans lequel environ 2,9 kb de la séquence 5' flanquante du gène de la chaîne lourde de la myosine alpha de rat conduit l'expression du transactivateur contrôlé par la tétracycline (tTA, Figure 1A), spécifiquement dans les myocytes cardiaques (Yu et al, 1996). L'activité fonctionnelle du transactivateur est modulée par la présence d'un ligand exogène, qui n'est pas présent à l'état naturel chez les mammifères, la doxycycline et ses analogues. Si les animaux reçoivent de la doxycycline (par injection intra-péritonéale), dans l'eau de boisson, ou dans la nourriture) l'activité fonctionnelle de tTA décroît. On éteint alors progressivement l'expression du transgène secondaire dans les souris "double transgéniques", à savoir dans le cas présent l'antisens mMR. En plaçant les animaux sous doxycycline dès la gestation, on prévient l'expression de l'antisens, ce qui permet de choisir le moment où l'on désire enclencher le processus pathologique. Exemple 3 : Expression inductible de l'ARN antisens mMR a) Matériels et méthodes : Les analyses moléculaires et phénotypiques ont été réalisées sur des animaux de 14 semaines. Lorsque nécessaire, la docycycline a été administrée pendant 8 jours dans l'eau de boisson (2 mg/mi) et par injection péritonéale (2 mg/injection). Pour d'autres protocoles expérimentaux, les souris reçoivent la doxycycline dès le début de la gestation chez la mère. - Suivi de l'expression de transcrits : L'expression moléculaire du gène LacZ et de l'ARN antisens a été analysée par la technique de protection à la RNAse A à l'aide de sondes appropriées. L'expression du récepteur MR endogène a été suivie à l'aide de sondes oligonucléotidiques obtenues à partir de la séquence SEQ ID n 1 ou SEQ ID n 2. SEQ ID n 2 correspond à un fragment de l'ADNc, dans sa partie 5', de la séquence totale du récepteur MR endogène. Cette séquence a été clonée par amplification inverse à partir d'ARN total extrait de coeur de souris B6D2F1, en utilisant comme amorce des oligonucléotides codant pour deux régions hautement conservés entre la séquence du récepteur minéralocorticoide de rat et humain. Oligonucléotide sens : 5'-AAGAGCCCTATCATCTGTCATGAGAA-3' (SEQ ID n 5) Oligonucléotide Antisens: 5'-GGACTGGAGACTGGAGATTTTACACTGC-3' (SEQ ID n 6) Après transcription inverse et amplification par PCR, un fragment de 320 pb (SEQ ID n 2) est sous-cloné dans le vecteur pT-Adv (Clontech, france). Le fragment de PCR est ensuite séquence et son orientation confirmée. La construction est utilisée pour la synthèse d'une sonde antisense, utilisée en RNAse Protection Assay (RPA) pour la détection des transcrits mMR. - analyses complémentaires : L'expression fonctionnelle du gène LacZ a été obtenue par coloration X-Gal classique sur coupe congelée de c#ur. L'analyse histologique a été réalisée par coloration rouge Sirius sur coupe de c#ur congelé. L'analyse des paramètres fonctionnels a été évaluée par échographie cardiaque sur animaux anesthésiés. b) Résultats Des souris des lignées aMHC-tTA/MR 9, ou 27 ont été traitées ou non avec de la doxycycline (Dox) pendant huit jours. Les c#urs ont été recueillis et des coupes fines ont été fixées dans du paraformaldehyde à 4 % puis colorées dans une solution de X-Gal. On observe pour chacune des lignées MR 9 et MR 27 un coloration LacZ nucléaire dans tous les cardiomyocytes en l'absence de doxycycline, l'expression étant pratiquement complètement réprimée en présence de doxycycline (figure 3A). Par ailleurs, l'ARN du foie et du c#ur des souris double transgéniques MR 9 et MR 17 a été extrait, les animaux ayant été traités ou non avec de la doxycycline pendant huit jours. Le procédé de protection à la RNAse a été réalisé pour chacune de ces lignées transgéniques sur trois animaux dont deux en l'absence (-) de doxycycline et un en présence de doxycycline (+). Dans le c#ur (C) on observe une expression d'ARN fortement réduite par la doxycycline. Dans le rein (R) il n'y a aucune expression en présence ou en l'absence de doxycyline. L'intégrité de l'ARN est contrôlée en utilisant une sonde d'actine (figure 3B). La figure 4A montre par analyse d'un test par protection à la RNAse que l'expression de l'antisens mMR est détectée dans ces souris et que son expression est régulable par la doxycycline. La figure 4B montre la mesure, à l'état stable, de l'expression del'ARN codant pour le récepteur minéralocorticoïde. On observe une diminution d'environ 50 % de l'expression résiduelle de l'ARN MR chez des animaux double transgéniques , par rapport aux animaux contrôles simple transgéniques (MHC-tTA). Cet effet est présent chez les mâles et les femelles. Il faut noter que l'expression de base est plus élevée chez les femelles et que l'effet de l'ARN antisens rapproche le niveau d'expression du mMR endogène de celui observé chez les mâles contrôles (figure 4B). Ceci pourrait être important pour expliquer la différence phénotypique observée entre les mâles et les femelles, ces dernières étant moins affectées que les mâles. Exemple 4 : Conséquences sur la morphométrie et la fonction cardiaque - Lignée MR 27 Chez les animaux double transgéniques exprimant l'antisens mMR, on observe une augmentation importante du poids du c#ur, en comparaison avec des animaux contrôles mono-transgéniques (figure 5A) âgés de 3,5 mois. Ceci est observé chez les mâles et les femelles, avec une plus grande dispersion des mesures chez ces dernières. On observe également une augmentation du poids corporel des mâles double transgéniques par rapport aux mâles contrôles. Ceci pourrait refléter une rétention hydrosodée pouvant être associée à un début d'insuffisance cardiaque. D'un point de vue hémodynamique, les mesures échographiques effectuées sur les animaux une semaine avant le sacrifice révèlent une diminution significative de la fraction d'éjection systolique chez les mâles (figure 5D), ainsi que des paramètres évoquant une cardiopathie dilatée chez les animaux double transgéniques, en comparaison avec les animaux contrôles (figures 5B et 5C). L'analyse histologique du c#ur des animaux double transgéniques révèle en outre une fibrose importante (figures 6A et 6B). - Lignée MR 17 Les données présentées ci-dessus pour la lignée MR 27 ont été confirmées avec la lignée MR 17. La lignée MR 17 présente un phénotype beaucoup plus sévère, conduisant à la mort des animaux mâles en moins de trois mois (figure 8). L'administration de doxycycline, en continu dans l'eau de boisson, dès la gestation chez la mère puis chez les animaux après leur naissance, permet de contrôler et de prévenir l'apparition du phénotype drastique observé chez les animaux double transgéniques mâles. Il est possible de bloquer la prise de poids (reflet de l'insuffisance cardiaque secondaire à l'expression du transgène) et d'empêcher la mort des animaux. Ces animaux meurent d'une défaillance cardiaque majeure, attestée par des signes cliniques (figures 7A et 7B) et hémodynamiques (échographie cardiaque). Par contre, les femelles ne meurent pas. La mort des animaux mâles survient entre deux et trois mois par insuffisance cardiaque terminale. L'autopsie des animaux montre des signes typiques d'insuffisance cardiaque avancée (anasarque) #dème cutané, ascite, épanchement pleural, hépatomégalie. Les résultats ci-dessus indiqùent que les souris mâles sont plus sévèrement atteintes que les souris femelles. Ainsi les mâles sont, dans leur majorité, atteints d'une insuffisance cardiaque sévère, accompagnée de signes cliniques d'anasarque (observés en pathologie humaine), conduisant à la mort. Ces résultats suggèrent une participation du récepteur androgénique ou des hormones androgéniques dans l'apparition d'un phénotype plus sévère. Ceci pourrait également révéler une interaction moléculaire ou fonctionnelle, actuellement non décrite, entre le récepteur des minéralocorticoïdes et le récepteur aux androgènes. Ceci pourrait également expliquer l'effet bénéfique de la spironolactone chez les patients en insuffisance cardiaque (Pitt et al, 1999). En effet, bien que classiquement considéré comme un anti-minéralocorticoïde, la spironolactone est également un puissant antagoniste du récepteur androgénique expliquant son utilisation dans l'hirsutisme féminin ou ses effets secondaires à type de gynécomastie chez les hommes. En conséquence, la description et la compréhension de ces interactions moléculaires ou fonctionnelles pourraient conduire à l'utilisation ou au développement de molécules modifiant cette interaction. Les implications en thérapeutique humaine, en particulier dans le domaine cardio-vasculaire, sont importantes. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES - Abremski et al, (1983), Studies of the properties of P1 sitespecific recombination : evidence for topologically unlinked products following recombination, Cell, 32 :1301-1311 - Baron et al, (1995) Co-regulation of two gene activities by tetracycline, via a bidirectional promoter, Nucleic Acids Res. 17:3605-3606 - Brocard et al, A chimeric Cre recombinase inducible by synthetic,but not by natural ligands of the glucocorticoid receptor. Nucleic Acids Res. 1998 Sep 1;26(17):4086-90). - Berger et al, (1998). Mineralocorticoid receptor knockout mice : Pathophysiology of Na+ metabolism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95,9424- 9429 - Choulika et al, (1994). The yeast I-Sce @ meganuclease induces site-directed chromosomal recombination in mammalian cells. C. R. Acad. Sci. Paris 317, 1013-9. - Cohen-Tannoudji et al, (1998). I-Scel-induced gene replacement at a natural locus in embryonic stem cells. Molecular & Cellular Biology 18, 1444-8. - Furth et al, (1994). Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91, 9302-6. - Gossen et al, (1992). Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 89, 5547-51. - Gossen, et al, (1995). Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science 268, 1766-9. - Kistner et al, (1996). Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93,10933- 8. - Le Menuet et al, 2000. Transgenic mouse models to study human mineralcorticoid receptor function in vivo. Kidney International, vol. 57, 1299-1306. - Mansuy et al, (1998a). Restricted and regulated overexpression reveals calcineurin as a key component in the transition from short-term to long-term memory. Ce// 92, 39-49. - Mansuy et al, (1998b). Inducible and réversible gene expression with the rtTA system for the study of memory. Neuron 21, 257-65. - Mayford et al, (1996). Control of memory formation through regulated expression of a CaMKII transgene. Science 274, 1678-83. - Hogan, B., Beddington, R., Costantini, F. and Lacy, E. (1994). Manipulating the mouse embryo. Plainview, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. - Indra et al, Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis : comparison of the recombinase activity of the tamoxifène-inducible Cre-ER (T) and Cre-ER (T2) recorhbinases. Nucleic Acids Res. 1999 Nov 15;27(22):4324-7) - Kellendonk et al, Inducible site-specific recombination in the brain. J Mol Biol. 1999 Jan 8;285(1):175-82). - Logie et al, (1995) Ligand-regulated site-specific recombination, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(13):5940-5944 - Metzger et al, (1995), Proc. Natl. Acad. Sci., Conditional sitespecific recombination in mammalian cells using a ligand-dependant chimeric Cre recombinase, 92 :6991-6995 - Metzger, D. and Feil, R. (1999). Engineering the mouse genome by site-specific recombination. Current Opinion in Biotechnology 10, 470-6. - No et al, (1996). Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc. natl. Sci. USA 93,3346-3351. - Pitt et al, (1999), The effect of spironolactone of morbidity and mortality in patients with severe heart failure, the New England Journal of médecine, 341 :709-717. - Robert et al, (1995), Biological déterminants of Aldosteroneinduced cardiac fibrosis in rats. Hypertension, 26(1 ):971-978 - Sambrook et al, (1989) Molecular cloning, a laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press - Wang et al, (1997). Ligand-inducible and liver-specific target gene expression in transgenic mice. Nature Biotechnology 15,239-43. - Yu et al, (1996), Conditional transgene expresion in the heart. Circ. Res. Oct. 79(4):691-7 REVENDICATIONS 1. Acide nucléique codant pour le récepteur minéralocorticoïde murin, comprenant la séquence SEQ ID n 1 et/ou n 2. 2. Acide nucléique bloquant l'expression du récepteur minéralocorticoïde murin, ledit récepteur étant codé par l'acide nucléique de la revendication 1. 3. Acide nucléique selon la revendication 2, constitué d'une séquence complémentaire d'environ 50 à 2 000 bases, à la séquence SEQ ID n 1 ou n 2, à partir du nucléotide n 1 de SEQ ID n 1. 4. Acide nucléique selon la revendication 3, constitué de la séquence de 316 paires de bases (pb) complémentaire de la séquence SEQ ID n 1. 5. Construction d'acide nucléique comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 2 à 4, dont la séquence est désignée "séquence antisens", en association avec des éléments permettant l'expression de ladite séquence antisens. 6. Construction selon la revendication 5, comprenant en outre un ou des éléments qui rendent l'expression de ladite séquence antisens inductible ou conditionnelle. 7. Construction selon la revendication 5, dans laquelle la séquence antisens est associée à une séquence opératrice du système de résistance à la tétracycline du transposon bactérien Tn10. 8. Cellule hôte dans laquelle au moins une construction telle que définie à l'une des revendications 5 à 7 a été transférée de manière stable. 9. Cellule hôte selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un ovocyte de souris. 10. Animal non-humain transgénique, de préférence souris, dans le génome duquel au moins une construction d'acide nucléique selon l'une des revendications 5 à 7 est intégrée. 11. Procédé d'obtention d'un animal non-humain transgénique, de préférence souris, dans lequel l'expression du récepteur minéralocorticoïde est réprimée de manière inductible ou conditionnelle, comprenant une étape consistant à intégrer dans le génome d'un animal non humain une construction d'acide nucléique comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 2 à 4, dont la séquence est désignée "séquence antisens", et une étape consistant à croiser l'animal non-humain transgénique ainsi obtenu avec un animal non-humain transgénique dans le génome duquel a été intégrée une construction d'acide nucléique portant des éléments permettant la régulation de l'expression de ladite séquence antisens, de manière inductible ou conditionnelle. 12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel lesdits éléments permettant la régulation de l'expression de ladite séquence antisens sont spécifiques d'un tissu de l'animal. 13. Animal non-humain transgénique, de préférence souris, susceptible d'être obtenu par le procédé de la revendication 11 ou 12. 14. Animal non-humain selon la revendication 13, dans lequel l'expression du récepteur minéralocorticoïde est réprimée dans le c#ur. 15. Utilisation d'un animal non-humain selon l'une des revendications 10,13 ou 14 pour le criblage d'agents thérapeutiques efficaces dans la prévention et/ou le traitement de troubles ou pathologies humaines ou animales dans lesquelles le récepteur minéralocorticoïde est impliqué. 16. Utilisation selon la revendication 15, pour le criblage d'agents thérapeutiques efficaces dans la prévention et/ou le traitement d'une fibrose cardiaque et/ou d'une insuffisance cardiaque. 17. Cellules isolées et éventuellement cultivées à partir des animaux non-humains de l'une des revendications 10,13 ou 14. 18. Utilisation des cellules de la revendication 17 pour le criblage d'agents thérapeutiques efficaces dans la prévention et/ou le traitement de troubles ou pathologies humaines ou animales dans lesquelles le récepteur minéralocorticoïde est impliqué, ou pour tester la toxicité de molécules à potentiel thérapeutique.