Brevet FR2806304A1 — publié le 20010921

CONJUGUES POLYSACCHARIDIQUES DU PNEUMOCOQUE A USAGE VACCINAL CONTRE LE TETANOS ET LA DIPHTERIE. La présente invention se rapporte à l'utilisation de combinaisons vaccinales pour la prévention du tétanos et/ou de la diphtérie. Etat de la technique Dans les compositions vaccinales multivalentes, bien qu'il y ait beaucoup d'avantages à combiner les antigènes entre eux pour conférer une protection contre plusieurs pathogènes, il peut exister des interactions négatives entre les antigènes avec pour conséquence une baisse relative de l'immunogénicité d'un ou plusieurs composants. Ce risque est d'autant plus important que le nombre d'antigènes encore appelés "valences" est important. On connaît des vaccins multivalents comprenant notamment les valences de la diphtérie et du tétanos. La combinaison des antigènes de la diphtérie, du tétanos et de la coqueluche avec ceux du virus de la polio entraîne une diminution de la réponse immune à la coqueluche. On connaît également des combinaisons vaccinales dans lesquelles un antigène polysaccharidique est couplé à une protéine porteuse comme l'anatoxine tétanique ou l'anatoxine diphtérique. Certains auteurs se sont interrogés sur la réponse immunitaire obtenue vis à vis de la protéine porteuse. Homayoun S. et al., APMIS (1998); 106; 526-534 a remarqué que la réponse anticorps spécifique vis à vis de l'anatoxine tétanique variait considérablement selon que cette protéine était couplée à un polysaccharide capsulaire d'haemophilus influenzae type b de bas poids moléculaire ou de haut poids moléculaire. Anderson P et al., J. Immunol. (1989), 142, 2464-2468 a montré également que la taille du polysaccharide pouvait influer aussi sur la réponse à l'anatoxine diphtérique lorsque celle ci est utilisée comme molécule porteuse. La structure du polysaccharide, notamment sa taille, influe donc sur l'immunogénicité de la protéine porteuse. Il n'y a donc pas d'évidence que les réponses immunitaires induites par un conjugué polysaccharidique soient extrapolables à un autre conjugué. Schneerson R. et al., (Infection and Immunity (1986); 52, 519-528) montre la présence d'une réponse anticorps dirigée contre la protéine porteuse dans une étude d'immunogénicité relative à un polysaccharide capsulaire du pneumocoque de sérotype 6B conjugué à l'anatoxine tétanique mais la dose de protéine administrée (> 801g) est comparativement beaucoup plus importante que la dose usuelle de vaccination contre le tétanos, comprise entre 151xg et 30 Fg ou encore entre 5 et 10 Lf d'anatoxine tétanique. Le fait donc de coupler un polysaccharide à une molécule porteuse d'intérêt vaccinal, comme l'anatoxine tétanique ou l'anatoxine diphtérique, entraîne une perte au moins partielle de l'immunogénicité du porteur. Un conjugué polysaccharidique en tant que tel, ne suffit pas pour induire une immunité complète vis à vis du porteur. Le procédé, selon lequel un polysaccharide ou un oligosaccharide est couplé à un porteur antigénique d'intérêt vaccinal, ne représente donc pas une bonne solution pour l'homme de l'art, puisqu'il ne permet pas de s'affranchir de l'apport du porteur libre dans le vaccin pour induire une immunité complète vis à vis de celui ci ou requiert des quantités anormalement élevées en porteur conjugué. I1 existe donc un besoin d'identifier une composition vaccinale multivalente qui soit capable de prévenir et/ou de traiter les infections à Clostridium tetani et/ou à Corynebacterium diphteriae en même temps que les affections provoquées par des microorganismes exprimant des structures polysaccharidiques à leur surface et qui réponde au besoin de limiter la charge antigénique globale injectée, pour éviter les interactions négatives entre les antigènes. Résumé de l'invention A cet effet, la présente invention concerne l'utilisation d'une composition comprenant n polysaccharides de Streptococcus pneumoniae conjugués à l'anatoxine tétanique et p polysaccharides de Streptococcus pneumoniae conjugués à l'anatoxine diphtérique pour la fabrication d'un vaccin protégeant contre les infections à Clostridium tetani et/ou à Corynebacterium diphteriae dans laquelle: (1) n et p sont différents de 1 avec p étant toutefois présente dans une dose vaccinale est Dans un autre mode de réalisation, la quantité totale d'anatoxine diphtérique conjuguée présente dans une dose vaccinale est et 85lg. Dans un autre mode de réalisation n et p sont >2. Selon ce mode de réalisation, les polysaccharides conjugués à l'anatoxine tétanique sont identiques, différents ou partiellement différents des polysaccharides qui sont conjugués à l'anatoxine diphtérique. Dans un aspect particulier elle concerne l'utilisation d'une composition selon l'invention dans laquelle n est égal à 7, les polysaccharides conjugués à l'anatoxine tétanique étant constitués des polysaccharides capsulaires des serotypes 1, 4, 5, 7F, 9V, 19F et 23F et dans laquelle p est égal à 4, les polysaccharides conjugués à l'anatoxine diphtérique étant constitués des polysaccharides capsulaires des serotypes 3, 6B, 14 et 18C. Dans un autre mode de réalisation, elle concerne l'utilisation d'une composition telle que décrite dans laquelle p est égal à zéro. Dans un aspect particulier de ce mode de réalisation n est égal à 11 et les polysaccharides sont les polysaccharides capsulaires des serotypes 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F et 23F. Dans un autre mode de réalisation, elle concerne l'utilisation d'une composition telle que décrite dans laquelle n est égal à zéro. Dans un aspect particulier elle concerne l'utilisation d'une composition selon l'invention dans laquelle n est égal à zéro, p est égal à 11 et dans laquelle les polysaccharides sont les polysaccharides capsulaires des serotypes 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F et 23F. La présente invention concerne également une méthode pour induire une réponse immune à Clostridium tetani et/ou à Corynebacterium diphteriae chez un mammifère qui consiste à administrer une composition telle que décrite dans ses variantes ci dessus comprenant n polysaccharides provenant de Streptococcus pneumoniae conjugués à l'anatoxine tétanique et p polysaccharides de Streptococcus pneumoniae conjugués à l'anatoxine diphtérique. La présente invention concerne aussi une méthode pour protéger un mammifère contre une infection à Clostridium tetani et/ou à Corynebacterium diphteriae dans laquelle on administre une composition telle que décrite dans ses variantes ci dessus comprenant n polysaccharides provenant de Streptococcus pneumoniae conjugués à l'anatoxine tétanique et p polysaccharides de Streptococcus pneumoniae conjugués à l'anatoxine diphtérique Description détaillée de l'invention Dans le contexte de la présente invention, différents termes employés sont ci-après définis: Par "polysaccharide", on entend un polymère comprenant un enchaînement de plusieurs molécules d'oses identiques ou différentes réunies entre elles par des liaisons de covalence. Par ce terme on englobe aussi celui de polysaccharide et d'oligoside. Par "anatoxine", on entend une toxine modifiée chimiquement ou par génie génétique (par délétion, substitution ou insertion d'un ou plusieurs nucléotides), ayant perdu son pouvoir pathogène, mais induisant une réponse immune capable de neutraliser le pouvoir pathogène de la toxine naturelle. Par "conjugué polysaccharidique ou polysaccharide conjugué", on entend un polysaccharide couplé soit à l'anatoxine tétanique, soit à l'anatoxine diphtérique au moyen d'une ou plusieurs liaisons covalentes. D'après cette définition on exclut tout polysaccharide qui est conjugué à la fois à l'anatoxine tétanique et à l'anatoxine diphtérique. Par "dose de vaccin" ou "dose vaccinale", on entend la quantité de la composition selon l'invention qui est administrée chez l'homme en une fois. Par "la quantité totale d'anatoxine conjuguée présente dans une dose de vaccin, est suffisante pour induire une protection contre les infections à Clostridium tetani et/ou à Corynebacterium diphteriae" on entend la quantité totale d'anatoxine tétanique conjuguée contenue dans une dose de vaccin ou la quantité totale d'anatoxine diphtérique conjuguée contenue dans une demi dose de vaccin, qui lorsqu'elle est injectée, en une seule fois chez le cobaye sous la forme d'une composition selon l'invention, lui donne une chance de survie d'au moins 80% à 10 jours après un test d'épreuve qui contient 10 doses minimum mortelles (DMM) de toxine tétanique ou 10 DMM de toxine diphtérique. A titre d'illustration, si un sujet sain reçoit 3 doses d'un vaccin à intervalles réguliers (dans le cadre d'une primo vaccination par exemple) fabriqué à partir d'une composition comprenant n polysaccharides de Streptococcus pneumoniae conjugués à l'anatoxine tétanique et p polysaccharides de Streptococcus pneumoniae conjugués à l'anatoxine diphtérique dans laquelle une dose vaccinale contient au total 101lg d'anatoxine tétanique conjuguée et 60gtg d'anatoxine diphtérique conjuguée, cette quantité d'anatoxine tétanique conjuguée sera considérée comme induisant une protection vis à vis de Clostridium tetani si on observe, dans un groupe de cobayes, immunisés avec la même composition et recevant chacun l'équivalent de 10tg d'anatoxine tétanique conjuguée, un taux de survie à jours d'au moins 80% après injection à chaque cobaye de 10 DMM de toxine tétanique. De même, la quantité d'anatoxine diphtérique conjuguée contenue dans ladite dose vaccinale sera également considérée comme induisant une protection vis à vis de Corynebacterium diphteriae si on observe, dans un groupe de cobayes, immunisés avec la même composition et, recevant chacun l'équivalent de 30,ug d'anatoxine diphtérique conjuguée totale, un taux de survie à 10 jours d'au moins 80% après injection dans chaque cobaye de 10 DMM de toxine diphtérique. Pour les détails pratiques concernant le test de protection chez le cobaye, on pourra se référer à l'exemple 2. On observe une bonne correspondance entre les résultats des tests de protection pratiqués chez le cobaye et les taux de protection obtenus chez l'homme. "Par sérotype ou sérogroupe" on entend une souche d'une espèce bactérienne définie par la structure chimique du polysaccharide capsulaire ou au moyen de l'immunsérum spécifique du polysaccharide capsulaire. L'invention concerne l'utilisation d'une combinaison d'au moins deux polysaccharides de Streptococcus pneumoniae couplés à l'anatoxine tétanique et/ou d'au moins deux polysaccharides de Streptococcus pneumoniae couplés à l'anatoxine diphtérique dans une préparation vaccinale pour induire une immunité protectrice vis à vis de Clostridium tetani et/ou de Corynebacterium diphteriae sans qu'il soit nécessaire d'y ajouter en complément une quantité significative d'anatoxine tétanique et/ou diphtérique libre. Une composition selon l'invention n'a pas besoin d'être associée à de l'anatoxine tétanique et/ou diphtérique sous forme non-conjuguée et/ou sous forme conjuguée provenant d'un autre vaccin au moment de son administration pour produire son effet protecteur à l'égard du tétanos et/ou de la diphtérie. Une composition selon l'invention contribue ainsi à diminuer la charge antigénique globale vaccinale administrée dans la mesure o elle induit également une immunité protectrice vis à vis des différentes souches de Streptococcus pneumoniae exprimant à leur surface les polysaccharides correspondant à ceux de la combinaison de conjugués. Cette utilisation fait l'objet de la demande WO 98/51339. L'art antérieur enseigne que la conjugaison d'une molécule porteuse, comme l'anatoxine tétanique ou diphtérique, à un polysaccharide ou un oligosaccharide entraîne une perte d'immunogénicité de la molécule porteuse résultant du masquage des épitopes inducteurs d'anticorps neutralisants ou inducteurs d'une immunité protectrice. En conséquence il faut augmenter la quantité de molécule porteuse dans le conjugué pour obtenir une immunité protectrice équivalente à celle du porteur libre. Schneerson R. et al. dans Infection and Immunity (1986); 52, 519-528) mentionne des quantités d'anatoxine tétanique nécessaires comprises entre 80p.g et 250gg dans le conjugué polysaccharidique du pneumocoque de sérotype 6B pour observer une réponse immunitaire contre l'anatoxine tétanique chez l'homme. D'une façon surprenante, lorsque, au moins deux polysaccharides différents du pneumocoque sont utilisés pour la conjugaison à une molécule porteuse comme l'anatoxine tétanique, la demanderesse montre que la quantité totale de molécule porteuse nécessaire pour induire une immunité protectrice est nettement plus faible que celle présente dans une composition contenant un seul conjugué telle que mentionnée par Schneerson R. et al. Ainsi, la quantité totale d'anatoxine tétanique conjuguée comprise dans une combinaison d'au moins deux conjugués polysaccharidiques différents selon l'invention n'a pas besoin d'atteindre ou de dépasser 40gig pour induire une immunité protectrice contre le tétanos. D'une façon encore plus surprenante cette quantité totale maximale nécessaire est plus faible que la dose totale de 54gg d'anatoxine tétanique incluse dans le vaccin pentavalent DTP- IPV-PRP-T(diphtérie, tétanos, coqueluche, polio, conjugué haemophilus) déjà commercialisé (30gg d'anatoxine existe sous forme non conjuguée et 24ptg existe sous forme conjuguée au polysaccharide capsulaire d'haemophilus influenzae). L'association d'au moins deux polysaccharides différents du pneumocoque conjugués à une même protéine porteuse favorise donc le développement d'une immunité protectrice vis à vis du porteur. Pour réaliser la conjugaison de 1' anatoxine tétanique aux polysaccharides du pneumocoque on en choisit au moins deux parmi les 23 sérotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, O10A, IlA, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F, 33F, mais préférentiellement au moins deux parmi ceux du groupe constitué des 11 sérotypes 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, et 23F. Ainsi une composition de conjugués polysaccharidiques induisant une immunité protectrice vis à vis du tétanos contient de préférence entre 2 et 11 conjugués différents avec une quantité totale d'anatoxine tétanique conjuguée dans une dose vaccinale immunité protectrice vis à vis des sérotypes/sérogroupes correspondants du pneumocoque. Pour réaliser la conjugaison d'un polysaccharide de Streptococcus pneumoniae à l'anatoxine diphtérique il faut prendre en compte le fait que la quantité d'anatoxine diphtérique nécessaire pour obtenir une protection contre la diphtérie est environ entre 2 et 4 fois plus importante que celle requise pour l'anatoxine tétanique. La quantité totale d'anatoxine diphtérique conjuguée par dose vaccinale est ceux de la composition de conjugués. Une composition de polysaccharides conjugués selon l'invention peut également comprendre au moins deux polysaccharides conjugués à l'anatoxine tétanique et au moins deux polysaccharides conjugués à l'anatoxine diphtérique pour induire une immunité protectrice vis à vis de Clostridium tetani et vis à vis de Corynebacterium diphteriae. Les polysaccharides peuvent être tous différents et choisis parmi ceux correspondant aux 23 sérotypes du pneumocoque. Dans ce type de composition, le nombre total p de conjugués à l'anatoxine diphtérique peut varier entre 2 et 15 pour les raisons invoquées plus haut, le nombre total n de conjugués à l'anatoxine tétanique pouvant varier quant à lui entre 2 et 23-p, les quantités totales d'anatoxine tétanique et d'anatoxine diphtérique conjuguées contenues dans une dose vaccinale étant inférieures respectivement à 40[tg et à 130,g. De façon préférentielle, on restreint le choix des polysaccharides aux sérotypes 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, et 23F du pneumocoque. Dans ce type de composition, le nombre total n de polysaccharides conjugués à l'anatoxine tétanique variant de préférence entre 2 et 9, le nombre total p de conjugués à l'anatoxine diphtérique quant à lui variant de préférence entre 2 et 1 1-n, les quantités totales d'anatoxine tétanique et d'anatoxine diphtérique conjugués sont respectivement comprises de façon préférentielle entre 10 et 25tg et entre 20ptg et 85,tg par dose vaccinale. D'une manière tout particulièrement préférée, une composition de conjugués selon l'invention comprend 7 polysaccharides conjugués à l'anatoxine tétanique correspondant aux sérotypes 1, 4, 5, 7V, 9V, 19F, et 23F et 4 polysaccharides conjugués à l'anatoxine diphtérique correspondant aux sérotypes 3, 6B, 14 et 18C, les quantités totales d'anatoxine tétanique et diphtérique conjuguées contenues dans une dose vaccinale préparée à partir de cette composition étant respectivement comprises entre 10 et 15plg et entre 40jtg et 65[tg. Un ou plusieurs polysaccharides dans une composition selon l'invention peut(vent) servir à la préparation du conjugué à l'anatoxine tétanique et du conjugué à l'anatoxine diphtérique pour autant que la composition respecte les conditions de l'invention c'est à dire qu'elle contienne au moins deux conjugués à l'anatoxine tétanique différents et au moins deux conjugués à l'anatoxine diphtérique différents. Le nombre total de conjugués polysaccharides couplés à l'anatoxine tétanique et de conjugués polysaccharides couplés à l'anatoxine diphtérique peut être de 38, 23 conjugués étant couplés à l'anatoxine tétanique et conjugués couplés à l'anatoxine diphtérique. Dans un aspect particulier, tous les polysaccharides servant à la préparation des conjugués à l'anatoxine tétanique servent également à la préparation des conjugués à l'anatoxine diphtérique. Dans ce cas la composition vaccinale contient le même nombre de conjugués à l'anatoxine tétanique et de conjugués à l'anatoxine diphtérique, ce nombre étant compris entre 2 et 15 car le nombre de conjugués à l'anatoxine diphtérique ne peut pas dépasser 15 pour des raisons de charge antigénique globale. La composition comprenant l'association de polysaccharides conjugués à l'anatoxine tétanique et de polysaccharides conjugués à l'anatoxine diphtérique induit une immunité protectrice vis à vis de Clostridium tetani et de Corynebacterium diphteriae qui est la résultante de celle observée vis à vis de Clostridium tetani induite par le groupe de composants de la composition constitué des polysaccharides conjugués à l'anatoxine tétanique et de celle observée vis à vis de Corynebacterium diphteriae induite par le groupe de composants de la composition constitué des polysaccharides conjugués à l'anatoxine diphtérique. De plus cette association, par le biais des polysaccharides présents, contribue également à l'induction d'une immunité protectrice vis à vis des sérotypes correspondants du pneumocoque. Le fait de mélanger des polysaccharides conjugués à l'anatoxine tétanique avec des polysaccharides conjugués à l'anatoxine diphtériques n'entraîne pas, dans la mesure o les conditions sur n et p sont respectés, d'apparition d'interférences négatives sur le développement de la réponse immune aux différents polysaccharides. Les polysaccharides peuvent être avantageusement extraits des différentes souches de Streptococcus pneumoniae selon des procédés conventionnels et purifiés de même. Ces polysaccharides peuvent être utilisés sous forme brute après extraction/purification. Ou bien encore ils peuvent être fragmentés afin d'obtenir des polysaccharides de poids moléculaires moyens inférieurs à ceux des polysaccharides d'origine. Un procédé de fragmentation particulièrement avantageux est décrit dans WO 93/07178, incorporé par référence. Un conjugué dans lequel un polysaccharide est couplé par liaison covalente à une protéine peut être obtenu selon des procédés conventionnels bien connus de l'homme de l'art. Il peut être fait usage de "linker" ou de "spacer" afin d'assurer la conjugaison. Selon le mode de conjugaison mis en oeuvre, le conjugué qui en résulte peut être un conjugué dans lequel le polysaccharide est lié à la protéine par une seule fonction chimique (type soleil ou néoglyconjugué) ou par plusieurs fonctions (type pelote). Il est à la portée de l'homme de l'art de déterminer le mode de conjugaison le plus approprié en fonction de la nature du polysaccharide et plus particulièrement des groupements chimiques portés par le polysaccharide qui peuvent être mis enjeu au cours de la réaction de conjugaison. Ci-après on présente à titre d'exemple la préparation de différentes compositions selon l'invention, les polysaccharides choisis étant issus des sérotypes 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, et 23F. Les polysaccharides issus de ces sérotypes ont été fragmentés selon le procédé décrit dans WO 93/07178 et sont couplés à l'anatoxine tétanique (sauf le polysaccharide de typel) selon le procédé de conjugaison décrit dans WO 93/07178. Brièvement, un polysaccharide est soumis à une amination réductrice en présence de cyanoborohydrure de sodium afin de lier une molécule de diaminohexane à un groupe réducteur terminal. Puis le polysaccharide ainsi dérivé est activé par un groupe succinimide en utilisant du disuccinimidyl suberate (DSS). Le polysaccharide ainsi activé est mis à réagir directement avec la protéine porteuse. Le polysaccharide de sérotype 1 est couplé à l'anatoxine diphtérique ou à l'anatoxine tétanique selon le procédé de conjugaison décrit dans le brevet US n 5, 204,098 incorporé par référence. Les conditions expérimentales ont été contrôlées de manière à ce que l'on obtienne des conjugués dans lesquels la quantité de protéine représente entre 1 et 4 fois, de préférence 2 fois, la quantité de polysaccharide. Ainsi pour un conjugué polysaccharidique couplé à l'anatoxine tétanique, 1 pg d'un polysaccharide particulier peut être couplé à environ 2tg d'anatoxine tétanique. La quantité d'anatoxine tétanique résiduelle non couplée est très faible à l'issue de chaque réaction de conjugaison. On complète au besoin l'élimination de l'anatoxine libre résiduelle par une dialyse ou une ultrafiltration. La composition de polysaccharides conjugués à l'anatoxine tétanique est obtenue en mélangeant les différents conjugués entre eux de telle façon que la quantité de polysaccharide contenue dans chaque conjugué soit au moins celle nécessaire pour observer une immunité protectrice vis à vis du sérotype correspondant et que la quantité totale en anatoxine tétanique conjuguée comprise dans une dose vaccinale soit inférieure à 401Lg et de façon préférentielle comprise entre 10 et 25[tg. On contrôle également par électrophorèse capillaire ou par chromatographie que la quantité résiduelle d'anatoxine tétanique non conjuguée dans une composition selon l'invention représente moins de 5% de la quantité totale d'anatoxine tétanique conjuguée. La composition décrite dans l'exemple 1.1 est préparée selon les techniques opératoires susmentionnées. Les polysaccharides couplés à l'anatoxine diphtérique l'ont été comme suit: des groupes hydrazide sont incorporés sur le polysaccharide en faisant réagir le polysaccharide avec un excès d'acide adipique dihydrazide (ADH) en présence d'éthyl diméthylamino propyl carbodiimide (EDAC) et de cyanoborohydrure de sodium (pour tous les types sauf le 3) ou simplement en présence de cyanoborohydrure de sodium (pour le type 3). Le polysaccharide ainsi dérivé est mis à réagir avec la protéine porteuse en présence d'EDAC. Les conditions expérimentales ont été contrôlées de manière à ce que l'on obtienne des conjugués dans lesquels la quantité de protéine représente entre 1 et 4 fois la quantité de polysaccharide. La quantité d'anatoxine diphtérique résiduelle non couplée est très faible à l'issue de chaque réaction de conjugaison. On complète au besoin l'élimination de l'anatoxine libre résiduelle par une dialyse ou une ultrafiltration. La composition de polysaccharides conjugués à l'anatoxinediphtérique est obtenue en mélangeant les différents conjugués entre eux de telle façon que la quantité de polysaccharide contenue dans chaque conjugué soit au moins celle nécessaire pour observer une immunité protectrice vis à vis du sérotype correspondant et que la quantité totale en anatoxine diphtérique conjuguée comprise dans une dose vaccinale soit inférieure à 130gg et de façon préférentielle comprise entre 20 et 85[tg. On contrôle également par électrophorèse capillaire ou par chromatographie liquide haute performance que la quantité résiduelle d'anatoxine diphtérique non conjuguée dans une composition selon l'invention représente moins de 5% de la quantité totale d'anatoxine diphtérique conjuguée. L'anatoxine tétanique et l'anatoxine diphtérique ont été préparées par détoxification au formaldéhyde à partir des toxines extraites respectivement de Corynebacterium diphteriae et de Clostridium tetani bien connue de l'homme de métier. L'anatoxine diphtérique peut être également un mutant non toxique de la toxine diphtérique comme par exemple le composé CRM197. Les anatoxines tétaniques et diphtériques utilisées pour la préparation des conjugués polysaccharidiques ont un taux de pureté supérieur à 90%. Une composition selon l'invention qui comprend à la fois des conjugués polysaccharidiques couplés à l'anatoxine tétanique et des conjugués polysaccaridiques couplés à l'anatoxine diphtérique est fabriquée en mélangeant les différents conjugués polysaccharidiques qui ont été préparés individuellement et en prenant en compte que les conjugués polysaccharidiques couplés à l'anatoxine diphtérique sont proportionnellement en quantités plus importantes que les conjugués polysaccharidiques couplés à l'anatoxine tétanique. Ainsi, dans une composition qui comporte autant de conjugués polysaccharidiques couplés à l'anatoxine diphtérique, que de conjugués couplés à l'anatoxine tétanique le poids total des conjugués couplés à l'anatoxine diphtérique est en moyenne entre 3 et 6 fois plus important que le poids total des conjugués couplés à l'anatoxine tétanique. On a procédé de cette façon pour préparer la composition décrite dans l'exemple 1.2. Une composition selon l'invention peut être formulée avec un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique e.g, un hydroxyde d'aluminium, un phosphate d'aluminium ou un hydroxyphosphate d'aluminium, et le cas échéant un excipient de lyophilisation. En général, ces produits peuvent être sélectionnés en fonction du mode et de la voie d'administration et selon les pratiques pharmaceutiques standard. Les diluants appropriés ainsi que ce qui est indispensable à l'élaboration d'une composition pharmaceutique sont décrits dans Remington's Pharmaceutical Sciences, un livre de référence standard dans ce domaine. Une composition selon l'invention contient avantageusement un tampon phosphate et du chlorure de sodium et peut être adjuvanté par de l'hydroxyde d'aluminium. On peut également utiliser un conservateur tel que le phenoxyéthanolformol. Une dose vaccinale peut être préparée sous un volume de 0,1ml à 2ml, et de façon préférée sous un volume de 0,5ml et contenir 0,475mg d'ion pO42', 4,5mg de chlorure de sodium et éventuellement 300 F.g d'ions AL3+. L'invention concerne aussi une méthode pour protéger contre une infection humaine à Clostridium tetani et à Corynebacterium diphteriae dans laquelle on administre une composition comprenant au moins deux polysaccharides différents provenant de Streptococcus pneumoniae conjugués à l'anatoxine tétanique et au moins deux polysaccharides de Streptococcus pneumoniae différents conjugués à l'anatoxine diphtérique. Si l'on veut limiter la méthode de prévention à une seule des 2 infections on utilise alors une composition comprenant au moins deux polysaccharides provenant de Streptococcus pneumoniae conjugués à l'une des deux anatoxines, soit à l'anatoxine tétanique, soit à l'anatoxine diphtérique. La méthode de prévention des infections à Clostridium tetani et à Corynebacterium diphteriae est applicable aussi bien à l'homme adulte ou âgé qu'à des enfants en bas âge ou à des nourrissons. La méthode de protection selon l'invention est mise en oeuvre par administration d'au moins une dose vaccinale de la composition selon l'invention. Par exemple on peut pratiquer entre 1 et 3 injections, mais de préférence on pratique 3 injections en respectant un délai d'un mois d'intervalle entre chaque injection. Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier par voie systémique ie., parentérale e.g., par voie sous cutanée, intramusculaire, intradermique ou intraveineuse; ou par voie muqueuse e.g., par voie orale ou nasale. La quantité administrée tient compte de différents paramètres, notamment le nombre de conjugués présents dans la composition, la nature des polysaccharides utilisés, le type du ou des porteurs utilisés ou la voie d'administration. La dose de polysaccharide nécessaire contenue dans chaque conjugué pour observer une immunité protectrice vis à vis du sérotype correspondant consécutive à une administration parentérale est comprise généralement entre 0,S5tg et 0loig; mais de façon préférentielle entre 0,5 et 5jtg, et de façon encore plus préférée entre 0,5 p.g et 2gg pour des conjugués qui sont couplés à l'anatoxine tétanique. Exemplel: Composition de différentes compositions de polysaccharides capsulaires de Streptococcus pneumoniae couplés à l'anatoxine tétanique (ATT) et /ou à l'anatoxine diphtérique (DT) 1.1: Composition d'une dose vaccinale humaine d'une composition tétravalente constituée des polysaccharides capsulaires des sérotypes 23F, 14, 19, 6B conjugués à l'anatoxine tétanique Sérotype Quantité de Quantité d'ATT polysaccharide pour conjuguée pour une une dose vaccinale dose vaccinale humaine humaine (P-g) (kg) 23F 1 1,5 14 1 2 19F 1 1,5 6B 1 1,5 La quantité totale de polysaccharide conjugué dans la composition est de 4 g La quantité totale d'ATT conjugué dans la composition est de 6,5pg ATT= anatoxine tétanique Le volume total d'une dose vaccinale est de 0, 5ml 1.2: Composition d'une dose vaccinale humaine d'une composition à 11 valences constituée des polysaccharides capsulaires des sérotypes 1, 4, 5, 7F, 9V, 19F et 23F conjugués à l'anatoxine tétanique et des polysaccharides capsulaires des sérotypes 3, 6B, 14, 18C conjugués à l'anatoxine diphtérique sérotype Quantité de Quantité Quantité de polysaccharide d'ATT pour DT pour une pour une dose une dose dose vaccinale vaccinale vaccinale humaine humaine humaine (en tg) (en jig) (en lg) 1 1 2,7 3 3 15 4 1 1,7 1 6B 10 31 7F i 1,3 9V 1 1,6 14 3 8 18C 3 6 19F 1 2,5 23F 1 1,2 La quantité totale de polysaccharide conjugué dans une dose vaccinale de cette composition est de 26 p.g La quantité totale de DT conjuguée dans une dose vaccinale de cette composition est de 60 g La quantité totale d'ATT conjuguée dans une dose vaccinale de cette composition est de 12.tg DT= Anatoxine diphtérique Le volume total d'une dose vaccinale est de 0,5 ml Exemple 2: Protection des cobayes vis à vis du tétanos et/ou de la diphtérie à l'aide d'une composition de polysaccharides capsulaires de Streptococcuspneumoniae couplés à l'anatoxine tétanique (ATT) et /ou à l'anatoxine diphtérique (DT) Les compositions de polysaccharides capsulaires de Streptococcus pneumoniae couplés à l'anatoxine tétanique (ATT) et /ou à l'anatoxine diphtérique (DT) décrites dans l'exemple 1, ont été testées chez le Cobaye pour leur capacité à protéger ces animaux vis à vis du tétanos ou de la diphtérie. On a également testé des compositions bivalentes de polysaccharides couplées à l'anatoxine tétanique, dont celle constituée des polysaccharides capsulaires 4 et 19F mais également des compositions bivalentes de polysaccharides couplées à l'anatoxine diphtérique, notamment la composition constituée des sérotypes capsulaires 6B et 14. On a testé aussi des compositions à 11 valences de polysaccharides couplés à l'anatoxine tétanique, dont celle constituée des polysaccharides capsulaires 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F et 23F. Les compositions correspondantes à 11 valences de polysaccharides couplés à l'anatoxine diphtérique ont également été étudiés. On a testé une composition à 15 valences constituée des polysaccharides capsulaires des sérotypes 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 18C, 19F et 23F conjugués à l'anatoxine tétanique et des polysaccharides capsulaires des sérotypes 3, 6B, 9V, 14, 18C, 23F conjugués à l'anatoxine diphtérique. Enfin on a testé une composition à 15 valences constituée des polysaccharides capsulaires des sérotypes 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15, 18C, 19F, 22F, 23F qui sont tous couplés à l'anatoxine tétanique et la même composition de polysaccharides qui sont couplés à l'anatoxine diphtérique. Toutes ces compositions sont en milieu liquide. L'excipient utilisé contient un tampon phosphate et du chlorure de sodium. On constitue des groupes de 10 cobayes pour chaque composition testée. Les animaux reçoivent par voie sous cutanée, 1/3 d'une dose vaccinale humaine totale lorsqu'il est prévu ensuite de les éprouver avec la toxine tétanique. La dose vaccinale humaine totale est en effet la somme des 3 doses vaccinales que le sujet reçoit lors d'un schéma de primo vaccination à 3 injections. Chaque cobaye reçoit en définitive une injection d'une dose vaccinale humaine sous 0,5 ml. Les animaux reçoivent par voie sous cutanée, le 1/6 d'une dose vaccinale humaine totale lorsqu'il est prévu ensuite de les éprouver avec la toxine diphtérique ce qui correspond à une injection d'une demi dose vaccinale humaine sous 0, 25 ml. Cela correspond par exemple à l'administration d'une dose vaccinale de la composition à 11 valences telle que décrite dans l'exemple 1.2 pour les animaux éprouvés avec la toxine tétanique et à l'administration d'une demi dose vaccinale de la composition à 11 valences telle que décrite dans l'exemple 1.2 pour les animaux éprouvés à la toxine diphtérique. jours après l'injection des compositions vaccinales testées, les animaux immunisés sont éprouvés par injection sous cutanée dans chaque animal de 10 doses minimum mortelles (DMM) de toxine tétanique ou de 10 DMM de toxine diphtérique. En parallèle, deux groupes témoins d'animaux non immunisés constitués de 2 et 3 cobayes sont éprouvés respectivement avec 1 DMM de toxine tétanique et 1 DMM de toxine diphtérique. Ces groupes témoins servent à valider la DMM des 2 toxines sur les animaux témoins qui doivent être tous morts dans les 96 heures qui suivent l'épreuve. On dénombre également les animaux morts dans les autres groupes de cobayes immunisés éprouvés. La combinaison vaccinale testée est considérée comme protectrice vis à vis du tétanos et/ou de la diphtérie si un taux minimum de % de survie est constatée au bout de 10 jours. Les études de survie réalisées chez les cobayes immunisés avec les différentes compositions de conjugués polysaccharidiques mentionnées, montrent un taux de survie supérieur à 80% après épreuve avec la toxine tétanique ou diphtérique. Exemple 3: Etude du pouvoir protecteur d'un pool d'immun sérums obtenus à partir de cobayes immunisés avec une composition à 11 valences adjuvée avec de l'alun. On a testé la composition telle que décrite dans l'exemple 1.2 mélangée avec un gel d'alun en utilisant un test de protection légèrement différent. La préparation du mélange est décrite dans l'exemple 4. Selon que l'on cherche à évaluer le pouvoir protecteur de cette formulation adjuvée vis à vis d'une infection à Clostridium tetani ou à Corynebacterium diphteriae, les animaux éprouvés avec un mélange constitué d'immunsérums de cobayes et de toxine, soit tétanique soit diphtérique, sont respectivement des souris ou des cobayes, la première partie du protocole expérimental restant la même dans les deux cas. Le test tel que pratiqué chez la souris tient compte des recommandations publiées par le NIH lors d'une 4è révision effectuée le 15/12/1952. Pour le test pratiqué chez le cobaye, on a tenu compte des recommandations du NIH publiée dans une 4ème révision du 1/03/1947. Dans une première partie en effet, un groupe de cobayes est immunisé par une demi dose vaccinale humaine totale de la composition adjuvée. Les immunsérums de chaque cobaye sont collectés et rassemblés en un seul pool. Pour évaluer le pouvoir protecteur de ce pool de sérum chez la souris, on réalise une dilution au 1/10 du pool et on prépare un sérum étalon de référence titrant 0,1 UI/ml d'anticorps anti-tétaniques. On réalise ensuite un titrage d'anticorps anti-tétaniques du pool de sérum par séroneutralisation in vivo chez la souris grâce au sérum étalon de référence. On vérifie au préalable que l'injection, sous un volume de 0, 5ml, d'un mélange constitué de 0,01UI du sérum étalon et d'une dose létale 100 de toxine tétanique dans la veine caudale de chaque souris provoque la mort en 96 heures de toutes les souris qui ont reçu ce mélange. Le pool de sérum est considéré comme protecteur et par voie de conséquence la formulation adjuvée s'il a un titre > 2UI/ml. Pour évaluer le pouvoir protecteur du pool de sérum chez le cobaye, on réalise un titrage d'anticorps anti-diphtériques du pool de sérum par séroneutralisation in vivo chez le cobaye grâce à un sérum anti-diphtérique de référence qui titre 6UI/ml. On vérifie au préalable que l'injection sous-cutanée, sous un volume de 3 ml, d'un mélange qui contient 1U du sérum antidiphtérique de référence et une dose létale 100 de toxine diphtérique tue en 96 heures tous les cobayes qui ont reçu ce mélange. On évalue ensuite le titre du pool de sérum qui doit être supérieur à 2UI/ml pour être protecteur. Le pool de sérums obtenue à partir de la formulation adjuvée testée a un titre en anticorps anti-tétaniques et anti-diphtériques supérieur à 2UI/ml, évalué dans les test de séroneutralisation in vivo chez la souris ou le cobaye. Exemple 4: Etude de la réponse immune vis à vis de l'anatoxine tétanique et/ou de l'anatoxine diphtérique après injection d'une composition de polysaccharides capsulaires de Streptococcus pneumoniae couplés à l'anatoxine tétanique (ATT) et /ou à l'anatoxine diphtérique (DT) Différentes compositions de polysaccharides capsulaires de Streptococcus pneumoniae couplés à l'anatoxine tétanique (ATT) et /ou à l'anatoxine diphtérique (TD) ont été testées pour leur capacité à induire une réponse anticorps spécifique dirigée contre l'anatoxine tétanique et/ ou l'anatoxine diphtérique. Dans ces études on a inclus notamment les combinaisons mentionnées dans l'exemple 2. Chez le singe 2 groupes de deux singes macaques (Macacafascicularis) reçoivent, sous un volume de 0,65ml, par voie intra musculaire, à 4 semaines d'intervalle, 2 injections d'une combinaison à 11 valences décrite dans l'exemple 1.2 adjuvée ou non avec un gel d'alun. La dose administrée à chaque injection correspond à une dose vaccinale humaine (le diluant utilisé est un tampon phosphate 0lmM, pH 6,8, réalisé dans du chlorure de sodium à 0,9%). La combinaison adjuvée est préparée par mélange d'une dose vaccinale humaine avec un volume de gel d'alumine contenant l'équivalent de 300jxg d'Al3+. Des prélèvements sanguins sont effectués le jour de la première immunisation (J0), le jour de la deuxième immunisation (J28) et 4 semaines après la deuxième immunisation (J56) pour analyser le contenu en anticorps spécifiques dirigés contre l'anatoxine tétanique et l'anatoxine diphtérique. Le dosage des anticorps spécifiques de type IgG est réalisé par ELISA. De façon classique et connue, le dosage est réalisé en sensibilisant des microplaques à l'aide d'une solution d'anatoxine tétanique ou diphtérique purifiée diluée, suivie d'une phase de saturation des plaques. On réalise ensuite, pour chaque sérum de singe testé une gamme de dilution que l'on dépose dans les micropuits. En parallèle on prépare une gamme de référence à partir d'un pool d'immunsérums humains ainsi que les contrôles de qualité (comprenant notamment des sérums anti-tétaniques et anti-diphtériques ayant des titres connus, provenant du National Institute for Biological Standard and Control). Après une nouvelle phase d'incubation, suivie de plusieurs lavages pour éliminer les anticorps non spécifiques on dépose dans chaque puits un volume d'une solution diluée d'un anticorps monoclonal anti-IgG humaines couplé à la peroxydase qui reconnaît également les IgG de macaques. Après incubation du conjugué suivie de lavages et révélation du conjugué fixé par coloration à l'aide de l'O-phénylène diamine, on mesure l'intensité de la coloration de chaque puits par lecture spectrophotométrique. Les résultats sont exprimés en unités internationales par ml (UI/ml). Le tableau ci dessous regroupe les valeurs des taux d'anticorps spécifiques obtenus avec la combinaison à 11 valences décrites dans l'exemple 1.2 adjuvée ou non avec le gel d'alun IgG anti-diphtériques IgG anti-tétaniques UI/ml UVi/ml JO J30 J60 O J30 J60 Sans adjuvant SINGE I 0,181 6,375 5,461 0,916 49,135 35,843 SINGE 2 0,033 0,702 0,398 0,048 0,699 0,773 SINGE 3 0,368 8,22 7,708 0,921 32,506 28,324 + alun SINGE 4 0,414 16,469 10,173 0,891 19,667 20,851 Les résultats montrent une augmentation très nette du taux d'anticorps spécifiques antitétaniques et antidiphtériques. On note aussi un effet adjuvant du gel d'alun car les titres en anticorps spécifiques sont plus élevés. Chez l'homme Un groupe de 12 adultes sains ont reçu 2 doses vaccinales à 4 semaines d'intervalle d'une combinaison vaccinale tétravalente telle que décrite dans l'exemple 1.1. Des prélèvements sanguins ont été effectués avant la première immunisation (J0), le jour de la deuxième immunisation (J28) et 4 semaines après la deuxième immunisation (J56) pour analyser le contenu en anticorps spécifiques dirigés contre l'anatoxine tétanique. Le dosage des anticorps spécifiques de type IgG est réalisé par ELISA comme décrit précédemment. A J0 le titre moyen en anticorps spécifiques de l'anatoxine tétanique est de 5,01 UI/ml. Ce titre s'élève à 9,15 UI/ml à J28. La deuxième immunisation n'a pas d'effet sur le titre en anticorps anti-tétaniques (à J56 il est de 8,71 UI/ml). La combinaison vaccinale induit donc une réponse immune spécifique vis à vis de la molécule porteuse. Des études d'immunogénicité similaires ont été réalisées chez le nourrisson, le jeune enfant et la personne âgée avec d'autres compositions, notamment celles mentionnées dans l'exemple 2. Elles montrent également que ces combinaisons induisent des réponses immunes spécifiques dirigées contre l'anatoxine tétanique et/ou l'anatoxine diphtérique. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'une composition comprenant n polysaccharides de Streptococcus pneumoniae conjugués à l'anatoxine tétanique et p polysaccharides de Streptococcus pneumoniae conjugués à l'anatoxine diphtérique pour la fabrication d'un vaccin protégeant contre les infections à Clostridium tetani et/ou à Corynebacterium diphteriae dans laquelle: (1) n et p sont différents de 1 avec p étant toutefois et 25gg. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle la quantité totale d'anatoxine diphtérique conjuguée présente dans une dose vaccinale est entre 20 et 85ltg. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle n et p sont > 2. 5. Utilisation selon la revendication 4 dans laquelle les polysaccharides conjugués à l'anatoxine tétanique sont tous différents, partiellement différents ou identiques aux polysaccharides qui conjugués à l'anatoxine diphtérique. 6. Utilisation selon la revendication 5 dans laquelle n est égal à 7, les polysaccharides qui sont conjugués à l'anatoxine tétanique étant constitués des polysaccharides capsulaires des serotypes 1, 4, 5, 7F, 9V, 19F et 23F et dans laquelle p est égal à 4, les polysaccharides qui sont conjugués à l'anatoxine diphtérique étant constitués des polysaccharides capsulaires des serotypes 3, 6B, 14 et 18C. 7. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2 dans laquelle p est égal à zéro. 8. Utilisation selon la revendication 7 dans laquelle n est égal à 11 et les polysaccharides sont les polysaccharides capsulaires des serotypes 1, 3, 6B, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18C, 19F et 23F. 9. Utilisation selon l'une des revendication 1 ou 3 dans laquelle n est égal à zéro. 10. Utilisation selon la revendication 9 dans laquelle p est égal à 11 et les polysaccharides sont les polysaccharides capsulaires des serotypes 1, 3, 6B, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18C, 19F et 23F.